1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 1
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►B SIEBTE RICHTLINIE DER KOMMISSION
vom 1. März 1976
zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futter-
mitteln
(76/372/EWG)
(ABl. L 102 vom 15.4.1976, S. 8)
Geändert durch:
Amtsblatt
Nr. Seite Datum
►M1Richtlinie 81/680/EWG der Kommission vom 30. Juli 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Richtlinie 92/95/EWG der Kommission vom 9. November 1992 L 327 54 13.11.1992
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SIEBTE RICHTLINIE DER KOMMISSION
vom 1. März 1976
zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die
amtliche Untersuchung von Futtermitteln
(76/372/EWG)
DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN —
gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsge-
meinschaft,
gestützt auf die Richtlinie des Rates vom 20. Juli 1970 über die Einfüh-
rung gemeinschaftlicher Probenahmeverfahren und Analysemethoden
für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln(1), zuletzt geändert
durch die Beitrittsakte(2), insbesondere auf Artikel 2,
in Erwägung nachstehender Gründe:Die obengenannte Richtlinie bestimmt, daß die amtlichen Untersu-
chungen von Futtermitteln zur Feststellung, ob die auf Grund derRechts- oder Verwaltungsvorschriften festgelegten Anforderungenhinsichtlich Beschaffenheit und Zusammensetzung der Futtermittel
erfüllt sind, nach gemeinschaftlichen Probenahmeverfahren und Analy-
semethoden durchgeführt werden.
Die Richtlinien 71/250/EWG, 71/393/EWG, 72/199/EWG, 73/46/EWG,
74/203/EWG und 75/84/EWG der Kommission vom 15. Juni 1971(
3),
vom 18. November 1971(4), vom 27. April 1972(5), vom 5. Dezember
1972(6), vom 25. März 1974(7) und vom 20. Dezember 1974(8) haben
bereits eine Reihe von Analysemethoden festgelegt. Der Stand der
seitdem durchgeführten Arbeiten ermöglicht es nunmehr, eine siebenteReihe von Analysemethoden festzulegen.
Die in dieser Richtlinie vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der
Stellungnahme des Ständigen Futtermittelausschusses —
HAT FOLGENDE RICHTLINIE ERLASSEN:
Artikel 1
Die Mitgliedstaaten schreiben vor, daß die Analysen für die amtliche
Untersuchung von Futtermitteln auf ihren Gehalt an Aflatoxin B1nach
den in der Anlage zu dieser Richtlinie beschriebenen Methoden durch-
geführt werden.
Artikel 2
Die Mitgliedstaaten setzen spätestens zum 1. Oktober 1976 die erfor-
derlichen Rechts- oder Verwaltungsvorschriften in Kraft, um denBestimmungen dieser Richtlinie nachzukommen. Sie setzen dieKommission unverzüglich hiervon in Kenntnis.
Artikel 3
Diese Richtlinie ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet.1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 2
(1) ABl. Nr. L 170 vom 3. 8. 1970, S. 2.
(2) ABl. Nr. L 73 vom 27. 3. 1972, S. 14.
(3) ABl. Nr. L 155 vom 12. 7. 1971, S. 13.
(4) ABl. Nr. L 279 vom 20. 12. 1971, S. 7.
(5) ABl. Nr. L 123 vom 29. 5. 1972, S. 6.
(6) ABl. Nr. L 83 vom 30. 3. 1973, S. 21.
(7) ABl. Nr. L 108 vom 22. 4. 1974, S. 7.
(8) ABl. Nr. L 32 vom 5. 2. 1975, S. 26.▼M1
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ANLAGE
BESTIMMUNG VON AFLATOXIN B1
A. METHODE MIT EINDIMENSIONALER DÜNNSCHICHTCHROMATO-
GRAPHIE
1. Zweck und Anwendungsbereich
Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Aflatoxin B1in Rohstoffen und Einzelfuttermitteln. Diese Methode kann nicht
angewendet werden, wenn Citrustrester vorhanden ist. Die untere
Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 0,01 mg/kg (10 ppb).
Wenn Störsubstanzen vorhanden sind, welche die Auswertung
erschweren, muß die Analyse nach der Methode B (Hochleistungs-
flüssigkeitschromatographie) wiederholt werden.
2. Prinzip
Die Probe wird mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird filtriert
und ein aliquoter Teil durch Chromatographie an einer Kiesel-
gelsäule gereinigt. Das Eluat wird eingedampft und der Rückstand
in einer definierten Menge Chloroform oder Benzol-Acetonitrilge-
misch gelöst. Ein aliquoter Teil dieser Lösung wird
dünnschichtchromatographisch untersucht. Die Aflatoxin-B1-Menge
wird im UV-Licht visuell oder fluorodensitometrisch im Vergleich
zu bekannten Mengen Aflatoxin-B1-Standard ermittelt. Die Identität
von Aflatoxin B1im Futtermittelextrakt muß durch das angegebene
Verfahren bestätigt werden.
3. Reagenzien
Anmerkung: Wenn nichts anderes angegeben ist, sind Reagenzien
von „p.a.“-Qualität zu verwenden.
3.1. Aceton
3.2. Chloroform, mit 0,5 bis 1,0 % Äthanol 96 % ig (V/V) stabilisiert3.3. n-Hexan3.4. Methanol
3.5. Diäthyläther, wasserfrei, peroxidfrei
3.6. Benzol-Acetonitril-Gemisch 98:2 (V/V)3.7. Mischung aus Chloroform (3.2) und Methanol (3.4) 97:3 (V/V)3.8. Kieselgel für Säulenchromatographie, 0,05 bis 0,20 mm Teil-
chengröße
3.9. Watte, hydrophil und mit Chloroform entfettet, oder Glaswolle3.10. Natriumsulfat, wasserfrei, gekörnt3.11. Inertgas, z.B. Stickstoff3.12. 1 N-Salzsäure
3.13. Schwefelsäure 50 % (V/V)
3.14. Kieselgur (Hyflosupercel), mit Säure gewaschen3.15. Kieselgel G-HR oder gleichwertiges für Dünnschichtchromatogra-
phie
3.16. Standardlösung mit etwa 0,1 µg Aflatoxin B
1je ml in Chloroform
(3.2) oder in Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6), hergestellt und
kontrolliert nach Punkt 7.
3.17. Qualitative Standardlösung mit etwa 0,1 µg Aflatoxin B1und B2je
ml in Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6).
Diese Konzentrationen sind als Anhaltspunkte gegeben. Sie sind,
entsprechend dem unterschiedlichen Fluoreszenzvermögen, so zu
wählen, daß sich für beide Aflatoxine dieselbe Fluoreszenzinten-
sität ergibt.
3.18. Fließmittel:1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 3
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3.18.1. Mischung aus Chloroform (3.2) und Aceton (3.1) 9:1 (V/V). Tren-
nkammer mit nicht gesättigter Atmosphäre
3.18.2. Mischung aus Diäthyläther (3.5), Methanol (3.4) und Wasser 96:3:1
(V/V/V). Trennkammer mit nicht gesättigter Atmosphäre
3.18.3. Mischung aus Diäthyläther (3.5), Methanol (3.4) und Wasser
94:4,5:1,5 (V/V/V). Trennkammer mit gesättigter Atmosphäre
3.18.4. Mischung aus Chloroform (3.2) und Methanol (3.4) 94:6 (V/V).
Trennkammer mit gesättigter Atmosphäre.
3.18.5. Mischung aus Chloroform (3.2) und Methanol (3.4) 97:3 (V/V).
Trennkammer mit gesättigter Atmosphäre
4. Geräte
4.1. Mahl- und Mischgerät4.2. Schüttelmaschine oder Magnetrührer4.3. Faltenfilter, Schleicher & Schüll Nr. 588 oder gleichwertige Filter,
Durchmesser 24 cm
4.4. Chromatographierohr aus Glas, (innerer Durchmesser 22 mm,
Länge 300 mm), mit Teflonhahn und 250-ml-Vorratsbehälter
4.5. Vacuumrotationsverdampfer mit 500-ml-Rundkolben4.6. 500-ml-Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen4.7. Ausrüstung für Dünnschicht-Chromatographie4.8. Glasplatten für Dünnschicht-Chromatographie, 200 × 200 mm. Sie
werden wie folgt vorbereitet (die angegebenen Mengen reichen für
fünf Platten): 30 g Kieselgel G-HR (3.15) werden in einem Erlen-
meyerkolben mit 60 ml destilliertem Wasser versetzt, der Kolben
wird verschlossen und eine Minute geschüttelt. Die Suspension
wird in einer einheitlichen Schichtdicke von 0,25 mm auf die
Platten aufgetragen. Man läßt die Platten an der Luft trocknen und
bewahrt sie dann im Exsikkator über Kieselgel als Trocknungs-
mittel auf. Vor Verwendung werden sie eine Stunde im
Trockenschrank bei 110 ºC aktiviert.
Fertigplatten können verwendet werden, sofern sie einen ähnlichen
Trenneffekt ergeben wie die in der oben beschriebenen Weise
hergestellten.
4.9. Analysenlampe für langwelligen UV-Bereich (360 nm). Die Lich-
tintensität muß ausreichen, um einen Aflatoxin-B
1-Fleck von 1,0 ng
auf einer Dünnschichtplatte in 10 cm Entfernung von der Lampe
noch deutlich zu erkennen.
4.10. 10-ml-Reagenzgläser, graduiert, mit Schliff und Polyäthylenstopfen4.11. UV-Spektralphotometer4.12. Fluorodensitometer (wahlweise)
5. Ausführung
5.1. Vorbereitung derProbe(siehe unterBemerkungen, TeilC,Punkt 1)
Die Probe wird gemahlen, so daß sie vollständig durch ein 1-mm-
Sieb (gem. ISO-Empfehlung R 565) hindurchgeht.
5.2. Extraktion
50,0 g der gemahlenen und homogenisierten Probe werden in einen
500 ml-Erlenmeyerkolben (4.6) eingewogen, man fügt 25 g
Kieselgur (3.14), 25 ml Wasser und 250 ml Chloroform (3.2) hinzu.
Der Kolben wird verschlossen und 30 Minuten mit dem Gerät (4.2)
geschüttelt bzw. gerührt. Anschließend filtriert man durch ein
Faltenfilter (4.3), die ersten 10 ml des Filtrats werden verworfen,
die nächsten 50 ml aufgefangen.
5.3. Säulenchromatographische Reinigung
Das untere Ende des Chromatographie-Rohrs (4.4) wird mit einem
Watte- oder Glaswollepfropfen (3.9) versehen, das Rohr zu etwa
zwei Dritteln mit Chloroform (3.2) gefüllt, dann fügt man 5 g
Natriumsulfat (3.10) hinzu, wobei darauf zu achten ist, daß die
Natriumsulfatschicht eine ebene Fläche bildet. Anschließend gibt
man 10 g Kieselgel (3.8) in kleinen Portionen hinzu. Nach jeder1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 4
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Zugabe ist vorsichtig zu rühren, um Luftblasen zu entfernen. Man
läßt das Kieselgel 15 Minuten absetzen und fügt dann vorsichtig
15 g Natriumsulfat (3.10) hinzu. Man läßt dann die Flüssigkeit bis
unmittelbar an die Oberfläche des Natriumsulfats ablaufen.
50 ml des nach 5.2 erhaltenen Filtrats werden mit 100 ml n-Hexan
(3.3) gemischt. Man gibt die Mischung quantitativ auf die. Säule
und läßt die Flüssigkeit bis zur Oberfläche des Natriumsulfats
einsickern. Anschließend fügt man 100 ml Diäthyläther (3.5) hinzu
und läßt die Flüssigkeit wieder bis zur Oberfläche des Natriumsul-
fats einsickern. Die Durchflußgeschwindigkeit soll 8 bis 12 ml/
Minute betragen, ein Trockenlaufen der Säule ist zu vermeiden.
Der Durchlauf wird verworfen. Man eluiert danach mit 150 ml
Chloroform-Methanol-Gemisch (3.7), wobei das gesamte Eluat
aufgefangen wird.
Das Eluat wird im Vakuumrotationsverdampfer (4.5) bei einer
Temperatur von weniger als 50º C unter einem inerten Gasstrom
(3.11) bis fast zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit
Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6) quantitativ
in ein 10-ml-Reagenzglas (4.10) überführt, die Lösung im inerten
Gasstrom (3.11) eingeengt und anschließend mit Chloroform (3.2)
oder Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6) auf ein Volumen von 2,0 ml
aufgefüllt.
5.4. Dünnschicht-Chromatographie
Auf einer Dünnschicht-Platte (4.8) werden 2 cm vom unteren Rand
entfernt nebeneinander im Abstand von 2 cm folgende Mengen der
Standardlösung und des Extraktes punktförmig aufgetragen:
— 10, 15, 20, 30 und 40 µl der Aflatoxin-B1-Standardlösung
(3.16);
— 10 µl des nach 5.3 gewonnenen Extrakts und 20 µl der Stand-
ardlösung (3.16) übereinander auf denselben Punkt;
— 10 und 20 µl des nach 5.3 gewonnenen Extrakts.
Die Platte wird vor Licht geschützt, mit einem der Fließmittel
(3.18) entwickelt. Zur Auswahl eines geeigneten Fließmittels trägt
man vorher 25 µl der qualitativen Standardlösung (3.17) auf eine
der Platten auf und prüft, ob bei der Entwicklung eine vollständige
Trennung der Aflatoxine B1und B2erreicht wird.
Man läßt das Fließmittel im Dunkeln verdampfen und betrachtet
dann die Platte im UV-Licht in 10 cm Abstand von der Lampe
(4.9). Die Flecke von Aflatoxin B1weisen eine blaue Fluoreszenz
auf.
5.5. Quantitative Bestimmung
Die Bestimmung ist entweder visuell oder durch Fluorodensitome-
trie, wie nachstehend beschrieben, vorzunehmen.
5.5.1. Visuelle Bestimmung
Die im Extrakt enthaltene Menge Aflatoxin B1wird bestimmt,
indem man die Fluoreszenzintensität der Flecke des Extrakts mit
denen der Standardlösung vergleicht. Falls erforderlich, ist zu inter-
polieren. Die durch Übereinanderauftragen von Extrakt und
Standardlösung erzielte Fluoreszenzintensität muß stärker sein als
die von 10 µl des Extrakts und es darf nur ein einziger Fleck
erkennbar sein. Ist die Fluoreszenz-Intensität von 10 µl Extrakt
stärker als die von 40-µl-Standardlösung, so ist der Extrakt auf das
10- oder 100fache mit Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitril-
Gemisch (3.6) zu verdünnen und erneut in der beschriebenen Weise
auf eine Dünnschichtplatte aufzutragen.
5.5.2. Durch Fluorodensitometrische Messung
Die Fluoreszenzintensität der Aflatoxin-B1-Flecke wird mit Hilfe
des Fluorodensitometers (4.12) bei 443 nm gemessen bei einer
Anregung mit 365 nm. Durch Vergleich der Fluoreszenzintensitäten
von Extrakt- und Standardflecken bestimmt man die in den Extrakt-
Flecken enthaltene Menge von Aflatoxin B1.
5.6. Identifizierung von Aflatoxin B1
Die Identifizierung von Aflatoxin B1im Extrakt erfolgt durch nach-
stehend beschriebene Verfahren.1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 5
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5.6.1. Behandlung mit Schwefelsäure
Das nach 5.4 erhaltene Chromatogramm wird mit Schwefelsäure
(3.13) besprüht. Die Fluoreszenz der Aflatoxin-B1-Flecke muß im
UV-Licht von blau nach gelb umschlagen.
5.6.2. Zweidimensionale Chromatographie mit Bildung von
Aflatoxin B1-hemiacetal (Aflatoxin B2a)
Anmerkung: Die nachfolgend beschriebenen Arbeitsgänge müssen
genau nach der in Abbildung 3 wiedergegebenen
Skizze durchgeführt werden.
5.6.2.1. Auftragen der Lösungen
In eine Platte (4.8) werden, parallel zu zwei angrenzenden Seiten
(jeweils 6 cm vom Rand entfernt), zwei gerade Linien als Bregren-
zung für die Lösungsmittelfronten geritzt. Auf die Platte trägt man
mit Hilfe einer Kapillarpipette oder einer Mikroliterspritze folgende
Lösungen auf
—bei Punkt A: Ein Volumen des nach 5.3 erhaltenen gereinigten
Probenextraktes, das etwa 2,5 Nanogramm Aflatoxin B1enthält;
—bei Punkt Bund C: Jeweils 25 µl der Standardlösung (3.16).
5.6.2.2. Entwicklung
Das Chromatogramm wird mit dem Fließmittel (3.18.1) (1-cm-
Schicht in einer Trennkammer mit nicht gesättigter Atmosphäre)
im Dunkeln in Richtung I entwickelt bis die Lösungsmittelfront
die Begrenzungslinie erreicht. Man nimmt danach die Platte aus
der Trennkammer und läßt sie im Dunkeln fünf Minuten bei Raum-
temperatur trocknen. Während man den Rest der Platte mit einer
Glasscheibe abdeckt, besprüht man einen 2,5 cm breiten Streifen
(schraffierte Fläche in der Abbildung 3), der die Punkte A und B
überdeckt, mit Salzsäure (3.12), bis eine Dunkelfärbung auftritt.
Man läßt 10 Minuten im Dunkeln reagieren und trocknet die Platte
dann in einem Luftstrom bei Raumtemperatur.
Anschließend entwickelt man das Chromatogramm mit dem Fließ-
mittel (3.18.1) (1-cm-Schicht in einer Trennkammer mitungesättigter Atmosphäre) in Richtung II, bis die Lösungsmittel-
front die Begrenzungslinie erreicht. Man nimmt die Platte aus der
Trennkammer und läßt sie bei Raumtemperatur trocknen.
5.6.2.3. Interpretation des Chromatogramms
Man betrachtet das Chromatogramm unter UV-Licht (4.9) und prüft
auf nachfolgende Merkmale:
a) Vorhandensein eines blau fluoreszierenden Flecks von Aflatoxin
B
1, von der bei C aufgetragenen Standardlösung stammend
(gewandert in Richtung I).
b) Vorhandensein eines blau fluoreszierenden Flecks von Aflatoxin
B1(nicht mit Salzsäure umgesetzt) und eines intensiven blau
fluoreszierenden Flecks von Aflatoxin B1-hemiacetal beide von
der bei B aufgetragenen Standardlösung stammend und in Rich-
tung II gewandert.
c) Vorhandensein ähnlicher Flecke, wie unter b) beschrieben, die
von dem bei A aufgetragenen Probenextrakt stammen. Die
Lage dieser Flecke ergibt sich erstens aus der Laufstrecke des
Aflatoxins B1von Punkt A in Richtung I (dieselbe Strekke, die
der bei C aufgetragene Standard zurückgelegt hat) und zweitens
aus der Laufstrecke von dort in Richtung II des nicht umge-
setzten Aflatoxins B1und des Aflatoxin B1-hemiacetals
(dieselben Strecken, die von dem bei B aufgetragenen Standard
zurückgelegt wurden). Die Fluoreszenz-Intensitäten der beiden,
von dem Extrakt und der bei B aufgetragenen Standardlösung
stammenden Halbacetalflecke sollten dabei einander entspre-
chen.
6. Berechnung der Ergebnisse
6.1. Visuelle Messung
Der Aflatoxin-B1-Gehalt der Probe in Mikrogramm pro kg (ppb)
wird nach folgender Formel berechnet:1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 6
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S/C1Y/C1V
W/C1X
Hierbei sind:
Y und X die Mengen — in Mikroliter — der Aflatoxin-B1-Stand-
ardlösung (3.16) bzw. des Extrakts, deren Fluoreszenz-Intensität
identisch ist.
S = Konzentration in Mikrogramm Aflatoxin B1je ml der Stand-
ardlösung (3.16);
V = Endvolumen des Extrakts in Mikroliter, unter Berücksichti-
gung etwaiger Verdünnung;
W = Gewicht der Probe in Gramm, bezogen auf die für die
säulenchromatographische Reinigung verwendete Extrakt-
menge.
6.2. Messungen durch Fluorodensitometrie
Der Gehalt an Aflatoxin B1der Probe in Mikrogramm pro kg (ppb)
wird nach folgender Formel berechnet:
S/C1V
W/C1Y
Hierbei sind:
Y = Volumen des auf die Platte aufgetragenen Extrakts in
Mikroliter (10 oder 20 µl);
S = Aflatoxin-B1-Gehalt des Extraktflecks in Nanogramm, den
man aus der Messung erhält (bezogen auf das angewendete
Volumen Y);
V = Endvolumen des Extrakts in Mikroliter, unter Berücksichti-
gung etwaiger Verdünnung;
W = Gewicht der Probe in Gramm, bezogen auf die für die
säulenchromatographische Reinigung verwendete Extrakt-
menge.
7. Herstellung und Kontrolle der Standardlösung (3.16)
7.1. Bestimmung der Aflatoxin-B1-Konzentration
Eine Aflatoxin-B1-Standardlösung wird in Chloroform (3.2) oder
Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6) mit einer Konzentration von 8
bis 10 µg je ml hergestellt. Das Absorptionsspektrum wird
zwischen 330 und 370 nm mit einem Spektralphotometer (4.11)
gemessen.
Die Extinktion (A) ist im Fall einer Chloroformlösung bei 363 nm,
im Fall einer Lösung in Benzol-Acetonitril-Gemisch bei 348 nm zu
messen.
Die Aflatoxin-B1-Konzentration in Mikrogramm je ml Lösung wird
nach folgenden Formeln berechnet:
312/C1A/C11000
20600bei der Chloroformlösung;
312/C1A/C11000
19800bei der Lösung im Benzol-Acetonitril-Gemisch.
Die zur Herstellung einer Standardarbeitslösung mit einer Afla-
toxin-B1-Konzentration von etwa 0,1 µg je ml erforderlichen
Verdünnungen werden im Dunkeln vorgenommen. Diese Lösung
ist, bei 4º C im Kühlschrank aufbewahrt, zwei Wochen haltbar.
7.2. Kontrolle der chromatographischen Reinheit
Auf einer Dünnschichtplatte (4.8) werden 5 µl der Aflatoxin-B1-
Standardlösung, die 8—10 µg Aflatoxin B1je ml enthält (siehe
7.1) aufgetragen. Das Chromatogramm wird nach 5.4 entwickelt.
Im UV-Licht darf nur ein einziger Fleck erkennbar sein; außerdem
darf an der Stelle der ursprünglichen Auftragung keine Fluoreszenz
wahrnehmbar sein.1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 7
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8. Wiederholbarkeit
Der Unterschied zwischen den Ergebnissen zweier Parallelbestim-
mungen eines Analytikers sollte in derselben Probe bei Gehalten
von
— 10 bis 20 µg/kg Aflatoxin B125 v.H. des höheren Resultats,
— mehr als 20 bis 50 µg/kg Aflatoxin B15 µg/kg absolut,
— mehr als 50 µg/kg Aflatoxin B110 v.H. des höheren Resultats
nicht überschreiten.
9. Vergleichbarkeit
Siehe unter Bemerkungen, Teil C, Punkt 2,
B. BESTIMMUNG VON AFLATOXIN B1DURCH HOCHLEISTUNGS-
FLÜSSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE
1. Zweck und Anwendungsbereich
Die Methode dient der Bestimmung von Aflatoxin B1in Futtermit-
teln, einschließlich solchen, die Citrustrester enthalten. Die untere
Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 0,001 mg/kg (1 ppb).
2. Prinzip
Die Probe wird mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird filtriert
und ein allquoter Teil über eine Florisil-Kartusche und anschlie-
ßend über eine C18-Kartusche gereinigt. Die endgültige Trennung
und Bestimmung erfolgen mit einer C18-Umkehrphasen-HPLC-
Säule und anschließender Nachsäulenderivatisierung mit Jod in
Wasser sowie Fluoreszenzdetektion.
Anmerkung: Mykotoxine sind äußerst toxische Substanzen. Alle
Arbeiten sollten in einem dafür vorgesehenen Abzug durchgeführt
werden. Besondere Vorsichtsmaßnahmen sollten getroffen werden,
wenn die Toxine in fester Form vorliegen, wegen ihrer elektrostati-
schen Eigenschaft und der daraus resultierenden Tendenz, sich auf
Arbeitsflächen zu verteilen.
3. Reagenzien
3.1. Chloroform, stabilisiert mit 0,5 bis 1,0 % Ethanol (m/m). Siehe
Bemerkung 10.2.
3.2. Methanol, für die HPLC zur Herstellung von 3.6.3.3. Aceton.
3.4. Acetonitril für die HPLC.
3.5. Elutionsmittel: Sie werden einen Tag vor der Verwendung bereitet,
oder die Luft in den Lösemitteln wird mit Hilfe von Ultraschall
entfernt.
3.5.1. Mischung aus Aceton (3.3) und Wasser, 98 + 2 (V + V).
3.5.2. Mischung aus Wasser und Methanol (3.2), 80 + 20 (V + V).
3.5.3. Mischung aus Wasser und Aceton (3.3), 85 + 15 (V + V).3.6. Mobile Phase für die HPLC.
Mischung aus Wasser, Methanol (3.2) und Acetonitril (3.4),
130 + 70 + 40 (V + V + V).
N.B.:Gegebenenfalls muß das Mischungsverhältnis der mobilen
Phase der Charakteristik der verwendeten HPLC-Säule angepaßt
werden.
3.7. Gesättigte Jodlösung: 2 g Jod werden in 400 ml Wasser gegeben,
mindestens 90 Minuten gemischt und durch ein Membranfilter
(4.15) filtriert. Die gesättigte Lösung ist vor Licht zu schützen, um
einen fotochemischen Abbau zu verhindern.
3.8. Celite 545, mit Säure gewaschen, oder gleichwertiges Material.
3.9. Florisil-Kartusche (Waters SEP-PAK) oder gleichwertiges Material.3.10. C
18-Kartusche (Waters SEP-PAK) oder gleichwertiges Material.
3.11. Inertgas, z. B. Stickstoff.1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 8
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▼M2
3.12. Aflatoxin-B1-Standardlösung in Chloroform, Konzentration 10 µg/
ml.
Die Konzentration der Lösung wird folgendermaßen überprüft:
Bestimmung des Absorptionsspektrums der Lösung zwischen 330
und 370 nm mit Hilfe des Spektralphotometers (4.23). Messung
der Extinktion (E) bei 363 nm. Berechnung der Konzentration von
Aflatoxin B1in 1 µg/ml mit der Formel:
Konzentration èmg =ml ðÞ ¼312/C2E/C21000
22300¼13;991/C2E
3.12.1. Aflatoxin-B1-Stammlösung in Chloroform.
2,5 ml der Aflatoxin-B1-Standardlösung (3.12) werden in einen 50-
ml-Meßkolben überführt und der Kolben mit Chloroform (3.1) zur
Marke aufgefüllt. Diese Stammlösung wird kühl (4 ºC), dunkel,
dicht verschlossen und mit Alufolie umwickelt aufbewahrt.
3.13. Aflatoxin-B1-Eichlösungen für die HPLC.
Anmerkung: Für die Herstellung dieser Lösungen sind säurege-
waschene Glasgeräte zu verwenden (siehe 4, Geräte).
3.13.1. Eichlösung, 4 ng/ml.
Man läßt den mit Alufolie umwickelten Kolben mit der Stamm-
lösung (3.12.1) auf Raumtemperatur erwärmen (einige Stunden).
400 µl der Stammlösung (200 ng Aflatoxin B1) werden in einen
50-ml-Meßkolben überführt und in einem Strom von Inertgas
(3.11) zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in
ca. 20 ml Wasser-Aceton-Gemisch (3.5.3) gelöst, bis zur Marke
mit Wasser-Aceton-Gemisch (3.5.3) aufgefüllt und gut durch-
mischt.
3.13.2. Eichlösung, 3 ng/ml.
7,5 ml der Eichlösung (3.13.1) werden quantitativ in einen 10-ml-
Meßkolben überführt. Es wird mit Wasser-Aceton-Gemisch (3.5.3)
zur Marke aufgefüllt und der Kolbeninhalt gut durchmischt.
3.13.3. Eichlösung, 2 ng/ml.
25 ml der Eichlösung (3.13.1) werden quantitativ in einen 50-ml-
Meßkolben überführt. Es wird mit Wasser-Aceton-Gemisch (3.5.3)
zur Marke aufgefüllt, und der Kolbeninhalt wird gut durchmischt.
Diese Lösung gilt auch als Bezugsstandard, der für die wiederholte
Einspritzung während der HPLC-Bestimmung (5.5) verwendet
wird.
3.13.4. Eichlösung, 1 ng/ml.
2,5 ml Eichlösung (3.13.1) werden quantitativ in einen 10-ml-
Meßkolben überführt. Es wird mit Wasser-Aceton-Gemisch (3.5.3)
zur Marke aufgefüllt und der Kolbeninhalt gut durchmischt.
3.14. Ampulle mit einer Mischung der Aflatoxine B1,B2,G1und G2in
Konzentrationen von ca. 1; 0,5; 1 bzw. 0,5 µg/ml in 1 ml Chloro-
form.
3.14.1. Testlösung für die HPLC.
Der Inhalt der Ampulle (3.14) wird in ein Reagenzglas mit Schliff-
stopfen oder Schraubverschluß überführt. 40 µl dieser Lösung
werden in einen 10-ml-Meßkolben oder in ein Reagenzglas mit
Schliffstopfen (mit Säure gewaschen) (4.22) überführt. Nach
Abdampfen des Chloroforms im Inertgasstrom (3.11) wird der
Rückstand in 10 ml Wasser-Aceton-Gemisch (3.5.3) gelöst.
3.15. Reagenzien für die Identitätsbestätigung (6).3.15.1. Gesättigte Natriumchloridlösung.3.15.2. Natriumsulfat, wasserfrei, gekörnt.
4. Geräte
Achtung: Die Verwendung von Glasgeräten, die nicht mit Säure
gewaschen wurden, kann bei wäßrigen Aflatoxinlösungen zu Verlu-
sten führen. Besondere Sorgfalt ist bei neuen Glasgeräten und
Einweg-Glasgeräten wie Ampullen für automatische Probengeber
und Pasteurpipetten geboten. Daher müssen Laborgeräte aus Glas,1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 9
▼M2
die mit wäßrigen Aflatoxinlösungen in Berührung kommen,
mehrere Stunden in verdünnter Säure (z. B. Schwefelsäure, c
= 2 mol/l) liegen und dann zur Beseitigung sämtlicher Säurereste
sorgfältig mit destilliertem Wasser gespült werden (z. B. dreimal,
mit pH-Papier prüfen). In der Praxis ist diese Behandlung erforder-
lich bei Rundkolben (4.4), Meßkolben, Meßzylindern,
Reagenzgläsern oder Gefäßen, die für Eichlösungen und Endex-
trakte verwendet werden (insbesondere bei Ampullen für
automatische Probengeber) sowie für Pasteurpipetten, die zur
Überführung von Eichlösungen und Extrakten benutzt werden.
4.1. Mahl- und Mischgerät.
4.2. Sieb mit einer Maschenweite von 1,0 mm (ISO R 565).
4.3. Schüttelmaschine.
4.4. Vakuumrotationsverdampfer mit 150- bis 250-ml-Rundkolben.
4.5. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatograph, Injektor mit Probens-
chleife, geeignet für die Injektion von 250 µl. Die Angaben des
Herstellers für teilweise oder vollständige Schleifenfüllung sind zu
beachten.
4.6. HPLC-Trennsäule: C18-Füllmaterial, Teilchengröße 3 µm oder 5 µm.
4.7. Pulsationsfreie Pumpe für das Nachsäulen-Jodreagenz.
4.8. Totvolumenfreies T-Stück(Valco)ausEdelstahl, (1/16 ″×0,75mm).
4.9. Spiralreaktionsrohr aus Teflon oder Edelstahl. Abmessungen von
3 000 × 0,5 mm bis 5000 × 0,5 mm sind in Verbindung mit 5 µm
oder 3 µm HPLC-Säulen erwiesenermaßen geeignet.
4.10. Thermostatgesteuertes, auf 60 ºC eingestelltes Wasserbad, Tempe-
raturregelung genauer als 0,1 ºC.
4.11. Fluoreszenzdetektor mit 365 nm Anregungs- und 435 nm Emissi-
onswellenlänge (bei Filtergeräten: Emissionswellenlänge > 400 nm).
Ein Nachweis von mindestens 0,05 ng Aflatoxin B1sollte möglich
sein. Unter Umständen kann ein Gegendruck erforderlich sein (z.
B. Restriktor bzw. Teflon- oder Edelstahlrohr ausreichender Länge
am Detektorauslaß), um Luftblasen in der Durchflußzelle zu
vermeiden.
4.12. Schreiber.
4.13. Elektronischer Integrator (wahlweise).
4.14. Faltenfilter, Durchmesser 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4, oder
gleichwertiges Filter.
4.15. Membran-Filter mit einer Porengröße von 0,45 µm, Millipore
(H.A.W.P. 04700) oder gleichwertiges Filter.
4.16. 500-ml-Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen.
4.17. Glassäule, Innendurchmesser ca. 1 cm, Länge ca. 30 cm, mit Luer-
Endstück.
4.18. Chloroformbeständiger Luer-Absperrhahn aus Nylon (z. B. BIO-
RAD 7328017; Analytichem A1 6078; J. T. Baker 4514).
4.19. Chemisch inerte Spritze, 10 ml, mit Luer-Anschluß.
4.20. Spritze geeignet für Injektionen von 250 µl (siehe 4.5).
4.21. 100-µl-Spritze für die Herstellung der Eichlösungen. Durch
Wägung ist zu überprüfen, daß die Genauigkeit innerhalb von 2 %
liegt.
4.22. 10-ml-Reagenzgläser, graduiert, mit Schliffstopfen.
4.23. UV-Spektralphotometer.
4.24. Geräte für die Identitätsbestätigung (6).
4.24.1. Mit Säure gespülter 100-ml-Scheidetrichter mit Teflon-Absperr-
hahn.
4.24.2. Heizblock, 40-50 ºC.1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 10
▼M2
5. Ausführung
5.1. Vorbereitung der Probe
Die Probe wird gemahlen, so daß sie vollständig durch das Sieb
(4.2) hindurchgeht.
5.2. Untersuchungsprobe
50 g der vorbereiteten Probe werden in einen Erlenmeyerkolben
(4.16) eingewogen.
5.3. Extraktion
Zu der Untersuchungsprobe (5.2) werden 25 g Celite (3.8), 250 ml
Chloroform (3.1) und 25 ml Wasser gegeben. Der Kolben wird
verschlossen, und es wird 30 Minuten mit einer Schüttelmaschine
(4.3) gemischt. Anschließend wird durch ein Faltenfilter (4.14) filt-
riert, und 50 ml des Filtrats werden aufgefangen.
Erforderlichenfalls wird ein aliquoter Teil des Filtrats mit Chloro-
form auf 50 ml verdünnt, so daß die Konzentration von Aflatoxin
B1nicht größer als 4 ng/ml ist.
5.4. Reinigung
Die Reinigung sollte ohne nennenswerte Unterbrechungen durchge-
führt werden.
Achtung:
— Das Labor, in dem die Analysen durchgeführt werden, ist vor
Tageslicht zu schützen. Dies kann durch folgende Maßnahmen
erreicht werden:
1) UV-absorbierende Folie an den Fenstern in Verbindung mit
gedämpftem Licht (keine direkte Sonneneinstrahlung!);
2) Vorhänge oder Jalousien und künstliches Licht (Leucht-
stoffröhren können verwendet werden).
Aflatoxinhaltige Lösungen müssen so gut wie möglich vor Licht
geschützt werden (Aufbewahrung im Dunkeln, Verwendung von
Alufolie).
5.4.1. Florisil-SEP-PAK-Reinigung
5.4.1.1. Vorbereitung der Säulen-Kartuschen-Kombination.
Am kürzeren Ende der Florisil-Kartusche (3.9) wird ein Absperr-
hahn (4.18) angebracht (siehe Abbildung 1). Die Kartusche wird
gewaschen und die Luft entfernt, indem von 10 ml Chloroform
(3.1) 8 ml mit einer Spritze (4.19) über den Absperrhahn schnell
durch die Kartusche hineingedrückt werden. Das längere Ende der
Kartusche wird mit einer Glassäule (4.17) verbunden und die
verbleibenden 2 ml Chloroform durch die Kartusche in die Glas-
säule gedrückt. Der Absperrhahn wird geschlossen und die Spritze
entfernt.
5.4.1.2. Reinigung.
Das unter 5.3 gewonnene Filtrat wird in die Säulen-Kartuschen-
Kombination gegeben, und man läßt es durch Schwerkraft ablaufen.
Es wird mit 5 ml Chloroform (3.1) und anschließend mit 20 ml
Methanol (3.2) gespült. Die Eluate werfen verworfen. Dabei ist
ein Trockenlaufen der Säulen-Kartuschen-Kombination zu
vermeiden. Das Aflatoxin B1wird mit 40 ml Aceton-Wasser-
Gemisch (3.5.1) eluiert und das gesamte Eluat im Rundkolben des
Vakuum-Rotationsverdampfers (4.4) aufgefangen. Das Eluat wird
am Vakuum-Rotationsverdampfer bei 40-50 ºC eingeengt, bis kein
Aceton mehr übergeht. ( Anmerkung: etwa 0,5 ml der Flüssigkeit
verbleiben dabei im Kolben. Versuche haben ergeben, daß ein
weiteres Abdampfen sich nicht nachteilig auswirkt und daß die
verbleibenden 0,5 ml Flüssigkeit keine nennenwerte Acetonmenge
enthalten. Acetonreste können zu Verlusten von Aflatoxin B1in
der C18-Kartusche führen.)
Nach Zugabe von 1 ml Methanol (3.2) wird der Kolben
geschwenkt, um das Aflatoxin B1an den Gefäßwänden zu lösen.
Anschließend werden 4 ml Wasser zugegeben, und der Kolbenin-
halt wird durchmischt. Die Kartusche wird abgenommen und
verworfen. Die Glassäule wird mit Wasser gespült und für den
Reinigungsschnitt mit C18bereitgehalten.1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 11
▼M2
5.4.2. C18-SEP-PAK-Reinigung
5.4.2.1. Vorbereitung der Säule-Kartuschen-Kombination.
Das kürzere Ende einer C18-Kartusche (3.10) wird mit einem
Absperrhahn (4.18) versehen (siehe Abbildung 1). Die Kartusche
wird vorbereitet und die Luft entfernt, indem mit einer Spritze
(4.19) 10 ml Methanol (3.2) schnell über den Absperrhahn durch
die Kartusche gedrückt werden. (Luftblasen in der Kartusche sind
als helle Flecken vor dem ansonsten gräulichen Hintergrund
erkennbar). Von 10 ml Wasser werden 8 ml durch die Kartusche
gedrückt. (Beim Übergang von Methanol auf Wasser ist das
Eindringen von Luft in die Kartusche zu vermeiden.) Das längere
Ende der Kartusche wird mit einer Glassäule (4.17) verbunden
und die restlichen 2 ml durch die Kartusche in die Glassäule
gedrückt. Der Absperrhahn wird geschlossen und die Spritze
entfernt.
5.4.2.2. Reinigung.
Der unter 5.4.1.2 erhaltene Exrakt wird quantitativ in die Glassäule
(4.17) überführt. Der Kolben wird zweimal mit 5 ml Wasser-
Methanol-Gemisch (3.5.2) gespült, und es wird durch Schwerkraft
ablaufen gelassen. Während dieses Arbeitsgangs ist ein Trocken-
laufen der Säulen-Kartuschen-Kombination zu vermeiden. (Wenn
sich in der Verengung nahe der Kartusche Luftblasen bilden, wird
der Fluß unterbrochen, und die Luftblasen werden durch leichtes
Klopfen an das obere Ende der Glassäule entfernt.) Anschließend
wird mit 25 ml Wasser-Methanol-Gemisch (3.5.2) eluiert, und das
Eluat wird verworfen. Das Aflatoxin B1wird mit 50 ml Wasser-
Aceton-Gemisch (3.5.3) eluiert und das gesamte Eluat in einem
50-ml-Meßkolben aufgefangen. Der Kolben wird mit Wasser bis
zur Marke aufgefüllt und der Kolbeninhalt gut durchmischt. Die
so erhaltene Lösung wird für die HPLC (5.5) verwendet.
Achtung: Eine Filtration des Endextrakts vor der HPLC ist norma-
lerweise nicht erforderlich. Wird dies für notwendig
gehalten, dürfen keine Cellulosefilter verwendet werden,
da diese zu Aflatoxin-B1-Verlusten führen können.
Teflonfilter können verwendet werden.
5.5. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(Aufbau der Anlage siehe Abbildung 2.) Es ist genügend Zeit zur
Konditionierung und Stabilisierung der Geräte vorzusehen.
Anmerkung 1:
Die Flußraten für die mobile Phase und das Nachsäulenreagenz
sind nur Anhaltspunkte. Sie sind der Art und Dimension der
HPLC-Säule entsprechend anzupassen.
Anmerkung 2:
Der Detektorresponse des Aflatoxins B1ist temperaturabhängig,
daher sollten Korrekturen für die Abweichungen vorgenommen
werden (siehe Abbildung 3). Durch Einspritzung einer bestimmten
Menge des Aflatoxin-B1-Bezugsstandards (3.13.3) in regelmäßigen
Abständen (z. B. jede dritte Einspritzung) können die Aflatoxin-
B1-Peakwerte zwischen diesen Bezugsstandards mit Hilfe des mitt-
leren Responses korrigiert werden. Voraussetzung ist, daß der
Unterschied der Response aufeinanderfolgenden Bezugsstandards
sehr klein (10 %) ist. Daher müssen die Einspritzungen ohne Unter-
brechung erfolgen. Ist eine Unterbrechung notwendig, muß die
letzte Einspritzung vor der Unterbrechung und die erste danach
mit dem Bezugsstandard (3.13.3) durchgeführt werden. Da die
Eichkurve linear ist und durch den Nullpunkt verläuft, werden die
Aflatoxin-B1-Mengen in den Probenextrakten unmittelbar mit Hilfe
der benachbarten Standards bestimmt.
5.5.1. Einstellung der HPLC-Pumpe
Die HPLC-Pumpe (4.5) wird so eingestellt, daß sich bei Verwen-
dung der mobilen Phase (3.6) eine Flußrate von 0,5 bzw. 0,3 ml/
min für die 5-µm- bzw. 3-µm-HPLC-Säule (4.6) ergibt.
5.5.2. Einstellung der Nachsäule npumpe
Die Pumpe (4.7) wird so eingestellt, daß sich eine Flußrate von 0,2
bis 0,4 ml/min der gesättigten Jod-Wasser-Lösung (3.7) ergibt. Als
grober Anhaltspunkt können Flußraten von ca. 0,4 bzw. 0,2 ml/min
bei Flußraten von 0,5 bzw. 0,3 ml/min der mobilen Phase (3.6)
empfohlen werden.1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 12
▼M2
5.5.3. Fluoreszenzdetektor
Der Fluoreszenzdetektor (4.11) wird auf eine Anregungswel-
lenlänge von 365 nm und eine Emissionswellenlänge von 435 nm
(Filterinstrument: > 400 nm) eingestellt. Die Detektorabschwä-
chung wird so eingestellt, daß 1 ng Aflatoxin B1ca 80 %
Vollausschlag des Schreibers ergibt.
5.5.4. Injektor
Von allen Lösungen werden Volumina von 250 µl gemäß den
Herstellerangaben eingespritzt.
5.5.5. Überprüfung der chromatographischen Tre nnung
Die Testlösung für die Chromatographie (3.14.1) wird eingespritzt.
Der Abstand der Täler sollte weniger als 5 % der Summe der
Peakhöhlen der benachbarten Peaks betragen.
5.5.6. Überprüfung der Systemstabilität
Vor jeder Analysenreihe wird der Bezugsstandard (3.13.3) wieder-
holt eingespritzt, bis konstante Peakflächen erhalten werden.
Anmerkung:
Die Peakflächen von Aflatoxin B1sollten bei aufeinanderfolgenden
Einspritzungen um nicht mehr als 6 % voneinander abweichen. Es
ist unverzüglich mit der Überprüfung der Linearität (5.5.7) fortzu-
fahren.
5.5.7. Überprüfung der Linearität
Die Aflatoxin-B1-Eichlösungen (3.13.1 bis 3.13.4) werden einge-
spritzt. Für jede dritte Einspritzung ist der Bezugsstandard 3.13.3
zu verwenden, um Responseabweichungen zu korrigieren ( Anmer-
kung:Die Peak-Response für diesen Bezugsstandard dürfen nicht
mehr als 10 % innerhalb von 90 Minuten voneinander abweichen.)
Die Abweichungen werden gemäß der Formel in Punkt 7 korrigiert.
Die Eichkurve sollte linear sein und innerhalb des zweifachen
Standardfehlers des y-Wertes durch den Nullpunkt verlaufen. Die
ermittelten Werte dürfen nicht mehr als 3 % von den Nennwerten
abweichen. Sind diese Anforderungen erfüllt, ist unverzüglich mit
Punkt 5.5.8 fortzufahren; wenn nicht, sind vorher die Fehlerquellen
festzustellen und zu beseitigen.
5.5.8. Einspritzung der Probenextrakte
Die gereinigten Probenextrakte (5.4.2.2) werden eingespritzt. Nach
je zwei Probenextrakten ist die Einspritzung des Bezugsstandards
(3.13.3) zu wiederholen, also: Bezugsstandard, Extrakt Extrakt,
Bezugsstandard, Ektrakt, Ektrakt, Bezugsstandard usw.
6. Identitätsbestätigung
6.1. Weitere Behandlung des Extraktes (5.4.2.2)
Dem nach 5.4.2.2 gewonnen Endextrakt werden 5 ml Natriumchlo-
ridlösung (3.15.1) zugesetzt. Man schüttelt in einem Scheidetricher
(4.24.1) dreimal mit je 2 ml Chloroform (3.1) jeweils eine Minute.
Die vereinigten Chloroformextrakte werden über ca. 1 g Natrium-
sulfat (3.15.2) in ein 10-ml-Reagenzglas gegossen. Es kann ein
kleiner Trichter (Durchmesser 4 cm) verwendet werden, in dessen
Auslauf sich ein Wattepfropf, der mit 1 g Natriumsulfat (3.15.2)
bedeckt ist, befindet.
Die Natriumsulfatschicht wird mit einigen ml Chloroform ausgewa-
schen und die Waschlösung im gleichen Reagenzglas aufgefangen.
Der Chloroformextrakt wird in diesem Reagenzglas in einem Heiz-
block (4.24.2) zur Trockne eingedampft und erneut in 1 ml
Chloroform gelöst.
6.2. Herstellung der Derivate und Dünnschichtchromatographie
Vergleiche Richtlinie 76/372/EWG des Rates, Anhang, Methode A
unter Punkt 5.6.2.
7. Berechnung der Ergebnisse
Der Aflatoxin-B1-Gehalt der Probe (µg/kg) wird mit folgender
Formel berechnet:1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 13
▼M2
Aflatoxin-B 1-Gehalt in èmg =kg¼m/C2Vext
Vm/C2M/C2Vf
Vc
Hierbei sind:
m = die Menge an Aflatoxin B1in ng, dargestellt durch
den B1-Peak der Probe, die folgendermaßen berechnet
wird:
m¼P ProbeðÞ
Ps t1ðÞ þPs t2ðÞ/C22rs tðÞ
P(Probe) = Peakfläche des Aflatoxins B1der Probe
P(st1) = Peakfläche des Aflatoxins B1bei der vorange-
gangenen Einspritzung des Bezugsstandards (3.13.3)
P(st2) = Peakfläche des Aflatoxins B1bei der nachfolgenden
Einspritzung des Bezugsstandards (3.13.3)
r(st) = eingespritzte Menge Aflatoxin B1im Bezugsstandard
(3.13.3) in ng
Vm= Volumen des eingespritzten Probenextrakts in ml
Vext= Endvolumen des Probenextrakts in ml, unter Berücks-
ichtigung der Verdünnung (5.3)
M = Probeneinwaage in g
Vf= Volumen des auf die Florisilkartusche (5.4.1.2) gege-
benen Filtrats in ml
Vc= Volumen des zur Extraktion der Probe verwendeten
Chloroforms in ml
Wird dem in diesem Protokoll angegebenen Verfahren gefolgt,
kann die Formel folgendermaßen verkürzt werden:
Aflatoxin-B1-Gehalt in µg/kg = 20 × m
7.1. Die Ergebnisse können auch durch Messung der Peak-Höhen ermit-
telt werden.
8. Wiederholbarkeit
Siehe 10.1 (Bemerkungen).
9. Vergleichbarkeit
Siehe 10.1 (Bemerkungen).
10. Bemerkungen
10.1. Reproduzierbarkeit
Eine auf internationaler Ebene durchgeführte Ringuntersuchung(1)
an Mischfuttermitteln ergab hinsichtlich der Wiederholbarkeit und
Vergleichbarkeit die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse. Der
hier verwendete Begriff Wiederholbarkeit (r) bezeichnet das größte
Verhältnis, das bei 95%iger Wahrscheinlichkeit im Vergleich von 2
Ergebnissen der gleichen Probe und unter gleichen Laborbedin-
gungen nicht signifikant ist. Der Begriff Vergleichbarkeit (R) ist
ähnlich definiert für den Vergleich zweier verschiedener Laborato-
rien. Gemäß ISO 3534 — 1977, Ziffer 2.35(2) und der
Entscheidung 89/610/EWG der Kommission(3) sind in Tabelle 1 r
und R auch als Variationskoeffizienten angegeben.1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 14
(1) Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. und Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and
Contaminants 8, S. 17-29.
(2) ISO 3534-1977.
(3) ABl. Nr. L 351 vom 2. 12. 1989, S. 39.
▼M2
Tabelle 1
Wiederholbarkeit (r) und Vergleichbarkeit (R), ausgedrückt als
Verhältniszahlen und als Variationskoeffizienten
(15 Laboratorien)
Niveau r R CVr(*) CVR(*)
(µg/kg) (%) (%)
8 und 14 1,4 1,7 11 18
(*) CV = Variationskoeffizient.
10.2. Stabilisierung des Chloroforms (3.1)
Die Absorptionseigenschaften der Florisilkartusche (3.9) können
sich verändern, wenn ein anderer Stabilisator als Ethanol verwendet
wird. Dieses sollte gemäß Punkt 10.3 überprüft werden für den
Fall, daß das beschriebene Chloroform nicht erhältlich ist.
10.3. Richtigkeit
Die korrekte Durchführung des Verfahrens ist zu überprüfen, indem
wiederholte Bestimmungen an zertifizierten Referenzmaterialien
durchgeführt werden. Sind diese nicht verfügbar, sollte die
Leistungsfähigkeit des Verfahrens durch Wiederfindungsversuche
an dotierten Blindproben überprüft werden. Die Abweichung des
Mittelwerts vom Sollwert, ausgedrückt in Prozenten des Sollwerts,
soll einen Rahmen von −20 bis + 10 % nicht überschreiten.1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 15
▼M2
Abbildung 1: Säulen-Kartuschen-Kombination
Abbildung 2: Flußschema des LC-Systems mit Einrichtung zur
Nachsäulenderivatisierung mit Jod1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 16
▼M2
Abbildung 3: Korrektur der Abweichung des Aflatoxin-B1-
Responses durch Einspritzung des Bezugsstandards (3.13.3) in
regelmäßigen Abständen
C. BEMERKUNGEN BETREFFEND METHODE A UND B
1.Entfettung
Proben mit mehr als 5 v.H. Fett sind nach der unter 5.1 beschriebenen
Vorbereitung mit Petroläther (Kp 40—60º C) zu entfetten. In diesem Fall
sind die Ergebnisse auf das Gewicht der nicht entfetteten Originalprobe zu
beziehen.
2.Vergleichbarkeit der Ergebnisse
Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse, das heißt die Abweichung zwischen den
von 2 oder mehr Laboratorien bei derselben Probe erhaltenen Ergebnisse,
wurde wie folgt bewertet:
± 50 v.H. des Mittelwertes der Ergebnisse bei Mittelwerten an Aflatoxin B1von 10 bis 20 µg/kg;± 10 µg/kg vom Mittelwert bei Mittelwerten von mehr als 20 bis 50 µg/kg;
± 20 v.H. des Mittelwertes bei Mittelwerten von mehr als 50 µg/kg.1976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 17
▼B
▼B
ANLAGE
Abbildung 1
Abbildung 21976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 18
▼B
Abbildung 31976L0372 — DE — 10.11.1992 — 002.001 — 19