02009R0152 — DE — 28.06.2022 — 008.001

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►B VERORDNUNG (EG) Nr. 152/2009 DER KOMMISSION vom 27. Januar 2009 zur Festlegung der Probenahmeverfahren und Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (Text von Bedeutung für den EWR) (ABl. L 054 vom 26.2.2009, S. 1)

Geändert durch:









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VERORDNUNG (EG) Nr. 152/2009 DER KOMMISSION

vom 27. Januar 2009

zur Festlegung der Probenahmeverfahren und Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln

(Text von Bedeutung für den EWR)







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Artikel 1

Die Probenahmen für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln, insbesondere auf ihre Bestandteile, eingeschlossen Material, das genetisch veränderte Organismen (GVO) enthält, aus ihnen besteht oder aus ihnen hergestellt ist, Futtermittelzusatzstoffe gemäß der Verordnung (EG) Nr. 1831/2003 des Europäischen Parlaments und des Rates ( 1 ) und unerwünschte Stoffe gemäß der Richtlinie 2002/32/EG des Europäischen Parlaments und des Rates ( 2 ), erfolgen nach den in Anhang I aufgeführten Verfahren.

Das in Anhang I beschriebene Probenahmeverfahren gilt für die Untersuchung von Futtermitteln auf Pflanzenschutzmittelrückstände gemäß der Verordnung (EG) Nr. 396/2005 des Europäischen Parlaments und des Rates ( 3 ) und für die Überprüfung der Einhaltung der Verordnung (EU) Nr. 619/2011.

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Artikel 2

Die Vorbereitung der Analyseproben und die Formulierung der Ergebnisse erfolgen nach den in Anhang II aufgeführten Methoden.

Artikel 3

Die Analyse für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln erfolgt nach den Methoden, die in Anhang III (Analysemethoden zur Untersuchung der Zusammensetzung von Futtermittel-Ausgangserzeugnissen und Mischfuttermitteln), Anhang IV (Analysemethoden zur Untersuchung von Futtermitteln auf ihren Gehalt an zugelassenen Zusatzstoffen), Anhang V (Analysemethoden zur Untersuchung von Futtermitteln auf unerwünschte Stoffe) und Anhang VI (Analysemethoden zur Bestimmung der Bestandteile tierischen Ursprungs bei der amtlichen Untersuchung von Futtermitteln) aufgeführt sind.

Artikel 4

Der Energiegehalt von Mischfuttermitteln für Geflügel wird in Übereinstimmung mit Anhang VII berechnet.

Artikel 5

Die in Anhang VIII aufgeführten Analysemethoden für die Untersuchung auf rechtswidriges Vorhandensein von nicht mehr zugelassenen Zusatzstoffen in Futtermitteln werden zu Bestätigungszwecken verwendet.

Artikel 6

Die Richtlinien 71/250/EWG, 71/393/EWG, 72/199/EWG, 73/46/EWG, 76/371/EWG, 76/372/EWG, 78/633/EWG, 81/715/EWG, 84/425/EWG, 86/174/EWG, 93/70/EWG, 93/117/EG, 98/64/EG, 1999/27/EG, 1999/76/EG, 2000/45/EG, 2002/70/EG und 2003/126/EG werden aufgehoben.

Verweise auf die aufgehobenen Richtlinien gelten als Verweise auf die vorliegende Verordnung nach den Entsprechungstabellen in Anhang IX.

Artikel 7

Diese Verordnung tritt am zwanzigsten Tag nach ihrer Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Union in Kraft.

Sie gilt ab dem 26. August 2009.

Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedem Mitgliedstaat.

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ANHANG I

PROBENAHMEVERFAHREN

1. ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH

Die zur amtlichen Untersuchung bestimmten Futtermittelproben werden gemäß den nachstehenden Verfahren entnommen. Die so gewonnenen Proben gelten als repräsentativ für die Teilpartien.

Zweck der repräsentativen Beprobung ist es, einen kleinen Teil einer Partie zu untersuchen und durch die Bestimmung eines spezifischen Merkmals bei diesem Teil den Durchschnittswert des Merkmals für die gesamte Partie zu ermitteln. Die Partie wird mittels wiederholter Entnahme von Einzelproben an verschiedenen Stellen der Partie untersucht. Diese Einzelproben werden zu einer Sammelprobe gemischt, aus der durch repräsentative Teilung repräsentative Endproben herzustellen sind.

Wenn bei der Sichtprüfung Teile des zu untersuchenden Futtermittels einen Qualitätsunterschied zum übrigen Futtermittel derselben Partie aufweisen, werden diese Teile vom übrigen Futtermittel abgesondert und als getrennte Teilpartie behandelt. Ist eine Aufteilung des Futtermittels in getrennte Teilpartien nicht möglich, so wird das Futtermittel als eine einzige Partie beprobt. In solchen Fällen ist dies im Probenahmebericht zu vermerken.

Ist ein Futtermittel, das gemäß den Bestimmungen der vorliegenden Verordnung beprobt wurde und nachweislich die EU-Anforderungen nicht erfüllt, Teil einer Futtermittelpartie derselben Gruppe oder Bezeichnung, so muss davon ausgegangen werden, dass das Ergebnis der Beprobung für die gesamte Futtermittelpartie gilt, es sei denn, eine eingehende Bewertung erbringt keinen Nachweis darüber, dass die restliche Partie den EU-Anforderungen nicht genügt.

2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN

— Partie (oder Charge) : identifizierbare Menge an Futtermitteln, die nachweislich gemeinsame Eigenschaften haben, wie Ursprung, Sorte, Art der Verpackung, Verpacker, Übersender oder Kennzeichnung; im Falle eines Herstellungsverfahrens bezeichnet „Partie“ eine Einheit der Herstellung aus einer einzigen Anlage unter Verwendung einheitlicher Herstellungsparameter oder eine Reihe solcher Einheiten, sofern sie in kontinuierlicher Reihenfolge hergestellt und zusammen gelagert werden.

— Teilpartie : Partie oder identifizierbare Teilmenge der Partie bzw. Teilpartie.

— Verplombte Probe : Probe, die solchermaßen mit einer Plombe verschlossen wurde, dass kein Zugriff auf sie möglich ist, ohne die Plombe zu beschädigen oder zu entfernen.

— Einzelprobe : Menge, die an einer Stelle der Teilpartie entnommen wird.

— Sammelprobe : Gesamtmenge der aus derselben Teilpartie entnommenen Einzelproben.

— Reduzierte Probe : Teilmenge der Sammelprobe, die aus letzterer durch repräsentative Reduktion gewonnen wird.

— Endprobe : Teilmenge der reduzierten Probe oder der homogenisierten Sammelprobe.

— Laborprobe : für das Labor bestimmte (beim Labor eingegangene) Probe, bei der es sich um die Endprobe, die reduzierte Probe oder die Sammelprobe handeln kann.

3. ALLGEMEINE BESTIMMUNGEN

— Probenahmepersonal: Die Probenahme erfolgt durch die von der zuständigen Behörde zu diesem Zweck bevollmächtigten Personen.

— Die Probe muss so verplombt werden, dass kein Zugriff auf sie möglich ist, ohne die Plombe zu beschädigen oder zu entfernen. Der Plombenstempel sollte eindeutig identifizierbar und gut sichtbar sein. Alternativ kann die Probe in einen Behälter verfüllt werden, der so verschließbar ist, dass er nicht geöffnet werden kann, ohne das Gefäß bzw. den Behälter dabei irreversibel zu beschädigen. Eine mehrmalige Verwendung des Gefäßes bzw. Behälters ist zu vermeiden.

— Identifizierung der Probe: Die Probe muss mit einer dauerhaften Kennzeichnung versehen und so identifiziert werden, dass eine eindeutige Verbindung zum Probenahmebericht besteht.

— Aus jeder Sammelprobe werden mindestens zwei Endproben entnommen: mindestens eine Probe zur Kontrolle (Vollzug) und eine für den Futtermittelunternehmer (Gegenprobe). Gegebenenfalls kann eine Endprobe zu Referenzzwecken entnommen werden. Im Fall einer Homogenisierung der vollständigen Sammelprobe werden die Endproben aus der homogenisierten Sammelprobe entnommen, es sei denn, dass dieses Verfahren den Vorschriften der Mitgliedstaaten hinsichtlich der Rechte des Futtermittelunternehmers zuwiderläuft.

4. GERÄTE

4.1. Die Geräte zur Probenahme müssen aus Materialien bestehen, die die zu beprobenden Erzeugnisse nicht kontaminieren können. Geräte, die für eine mehrfache Anwendung vorgesehen sind, müssen leicht zu reinigen sein, damit eine Kreuzkontamination vermieden wird.

4.2. Empfohlene Geräte für die Probenahme fester Futtermittel 4.2.1. Manuelle Probenahme 4.2.1.1. Schaufel mit ebenem Boden und rechteckig hochgebogenem Rand. 4.2.1.2. Probenahmestab mit langem Schlitz oder Kammern. Die Dimensionierung des Probenahmestabes ist den Merkmalen der Teilpartie (Tiefe des Behälters, Größe des Sacks usw.) und der Partikelgröße des Futtermittels anzupassen. Falls es sich um einen Probenahmestab mit mehreren Öffnungen handelt, sollten diese durch Kammern oder fortlaufend versetzte Öffnungen voneinander getrennt sein, damit sichergestellt ist, dass die Probe an verschiedenen Stellen entlang des Probenahmestabes entnommen wird. 4.2.2. Mechanische Probenahme Geeignete mechanische Geräte dürfen zur Probenahme aus in Bewegung befindlichen Futtermitteln verwendet werden. „Geeignet“ bedeutet, dass mindestens der gesamte Fließquerschnitt beprobt wird. Die Probenahme aus in Bewegung befindlichen Futtermitteln (bei hohen Durchflussraten) kann mittels automatischer Probenehmer erfolgen. 4.2.3. Probenteiler Soweit möglich und sinnvoll, sollten zur Herstellung reduzierter Proben Geräte verwendet werden, die zur Zerlegung der Probe in ungefähr gleiche Teile in repräsentativer Form bestimmt sind.

5. QUANTITATIVE ANFORDERUNGEN HINSICHTLICH DER ANZAHL VON EINZELPROBEN

— Die in den Nummern 5.1 und 5.2 genannten quantitativen Anforderungen hinsichtlich der Anzahl von Einzelproben gelten für Teilpartien bis zu 500 t, die einer repräsentativen Probenahme unterzogen werden können. Das beschriebene Probenahmeverfahren gilt in gleicher Weise für Mengen, die die festgelegte maximale Teilpartie überschreiten, sofern die in den nachstehenden Tabellen vorgegebene Höchstanzahl der Einzelproben außer Acht gelassen wird und statt dessen die Anzahl der Einzelproben anhand der Quadratwurzelformel für den entsprechenden Verfahrensabschnitt (siehe Nummer 5.3) bestimmt und die Mindestgröße der Sammelprobe proportional erhöht wird. Ungeachtet dessen kann eine große Partie in kleinere Teilpartien aufgeteilt und jede Teilpartie nach dem in den Nummern 5.1 und 5.2 beschriebenen Verfahren beprobt werden.

— Die Teilpartie muss so gewählt werden, dass eine Beprobung aller Einzelbestandteile möglich ist.

— Bei sehr großen Partien bzw. Teilpartien (> 500 t) und bei Partien, die so befördert oder gelagert werden, dass eine Probenahme gemäß dem Verfahren der Nummern 5.1 und 5.2 dieses Kapitels nicht erfolgen kann, ist das Probenahmeverfahren nach Nummer 5.3 anzuwenden.

— Ist der Futtermittelunternehmer im Rahmen eines obligatorischen Überwachungssystems gesetzlich zur Einhaltung der vorliegenden Verordnung verpflichtet, so kann er von den in diesem Kapitel festgelegten quantitativen Anforderungen abweichen, um funktionsspezifischen Besonderheiten Rechnung zu tragen, sofern er zur Zufriedenheit der zuständigen Behörde die Gleichwertigkeit des Probenahmeverfahrens in Bezug auf den Repräsentationsgrad nachgewiesen hat, und nachdem eine entsprechende Genehmigung seitens der zuständigen Behörde erteilt wurde.

— Ist es nicht möglich, das festgelegte Probenahmeverfahren im Hinblick auf die quantitativen Anforderungen anzuwenden, da sich aus einer Beschädigung der Partie unannehmbare Folgen für den Handel ergeben würden (wegen der Verpackungsart, der Transportweise, der Lagerungsform usw.), so kann ausnahmsweise ein alternatives Probenahmeverfahren angewandt werden, sofern dieses so repräsentativ wie möglich ist und umfassend beschrieben und dokumentiert wird.

5.1. Quantitative Anforderungen an Einzelproben bezüglich der Untersuchung auf Stoffe oder Erzeugnisse, die gleichmäßig im Futtermittel verteilt sind

5.1.1. Feste Futtermittel in loser Form







Teilpartie Mindestanzahl der Einzelproben ≤ 2,5 t 7 > 2,5 t √20-mal die Anzahl von Tonnen, aus denen die Teilpartie besteht (*1), bis zu 40 Einzelproben ( *1 ) Wenn sich hierbei eine Bruchzahl ergibt, ist diese auf die nächsthöhere ganze Zahl aufzurunden.

5.1.2. Flüssige Futtermittel in loser Form







Teilpartie Mindestanzahl der Einzelproben ≤ 2,5 t bzw. ≤ 2 500 l 4 (*1) > 2,5 t bzw. > 2 500 l 7 (*1) ( *1 ) Ist eine Homogenisierung der Flüssigkeit nicht möglich, so muss die Anzahl der Einzelproben erhöht werden.

5.1.3. Verpackte Futtermittel

Futtermittel (fest und flüssig) können in Beuteln, Säcken, Dosen, Fässern usw. verpackt sein, die in der Tabelle als Einheiten bezeichnet werden. Große Einheiten (≥ 500 kg bzw. l) sind nach den Vorschriften für lose Futtermittel (siehe Nummern 5.1.1 und 5.1.2) zu beproben.







Teilpartie Mindestanzahl der Einheiten, aus denen (mindestens) eine Einzelprobe zu entnehmen ist (*1) 1 bis 20 Einheiten 1 Einheit (*2) 21 bis 150 Einheiten 3 Einheiten (*2) 151 bis 400 Einheiten 5 Einheiten (*2) > 400 Einheiten ¼ der √-Anzahl von Einheiten, aus der die Teilpartie besteht (*3), bis zu 40 Einheiten ( *1 ) Kann durch das Öffnen einer Einheit die Analyse beeinträchtigt werden (z. B. leicht verderbliches Nassfutter), so gilt die ungeöffnete Einheit als Einzelprobe. ( *2 ) Bei Einheiten, deren Inhalt höchstens 1 kg bzw. 1 l beträgt, gilt der Inhalt einer Originaleinheit als Einzelprobe. ( *3 ) Wenn sich hierbei eine Bruchzahl ergibt, ist diese auf die nächsthöhere ganze Zahl aufzurunden.

5.1.4. Futterblöcke und Lecksteine

Zu beproben ist mindestens ein Futterblock oder Leckstein je Teilpartie zu 25 Einheiten, die Höchstzahl beträgt vier Futterblöcke oder Lecksteine.

Bei Futterblöcken oder Lecksteinen mit einem Gewicht von jeweils maximal 1 kg gilt der Inhalt eines Futterblocks oder Lecksteins als Einzelprobe.

5.1.5. Raufutter/Grünfutter







Teilpartie Mindestanzahl der Einzelproben (*1) ≤ 5 t 5 > 5 t √5-mal die Anzahl von Tonnen, aus der die Teilpartie besteht (*2), bis zu 40 Einzelproben ( *1 ) In bestimmten Fällen (z. B. bei Silage) können die vorgeschriebenen Einzelproben nicht ohne eine unannehmbare Beschädigung der Partie entnommen werden. In diesen Fällen ist ein alternatives Probenahmeverfahren zulässig, und entsprechende Leitlinien für die Beprobung solcher Partien werden vor dem Geltungsbeginn dieser Verordnung erarbeitet. ( *2 ) Wenn sich hierbei eine Bruchzahl ergibt, ist diese auf die nächsthöhere ganze Zahl aufzurunden.

5.2. Quantitative Anforderungen an Einzelproben bezüglich der Untersuchung auf Bestandteile oder Stoffe, die ungleichmäßig im Futtermittel verteilt sein können

Diese quantitativen Anforderungen an Einzelproben gelten in folgenden Fällen:

— Untersuchung auf Aflatoxine, Mutterkorn, andere Mykotoxine und schädliche botanische Unreinheiten in Futtermittel-Ausgangserzeugnissen;

— Untersuchung auf Kreuzkontamination durch einen Bestandteil, einschließlich genetisch veränderter Ausgangserzeugnisse, oder einen Stoff, bei dem eine ungleichmäßige Verteilung in Futtermittel-Ausgangserzeugnissen anzunehmen ist.

Hat die Untersuchungsbehörde den starken Verdacht, dass eine solche ungleichmäßige Verteilung auch im Fall einer Kreuzkontamination durch einen Bestandteil oder einen Stoff in einem Futtermittel-Ausgangserzeugnis auftritt, so können die in der nachstehenden Tabelle festgelegten quantitativen Anforderungen gestellt werden.







Teilpartie Mindestanzahl der Einzelproben < 80 t Siehe quantitative Anforderungen in Nummer 5.1. Die Anzahl der zu entnehmenden Einzelproben ist mit dem Faktor 2,5 zu multiplizieren. ≥ 80 t 100

5.3. Quantitative Anforderungen an Einzelproben bei sehr großen Partien

Bei großen Teilpartien (> 500 t) ist die Anzahl der zu entnehmenden Einzelproben wie folgt zu festzulegen: 40 Einzelproben + √-Tonnen für die Untersuchung auf Stoffe oder Erzeugnisse, die im gesamten Futtermittel gleichmäßig verteilt sind, oder 100 Einzelproben + √-Tonnen für die Untersuchung auf Bestandteile oder Stoffe, die ungleichmäßig in Futtermittel-Ausgangserzeugnissen verteilt sein können.

6. QUANTITATIVE ANFORDERUNGEN AN SAMMELPROBEN







Je Teilpartie ist eine einzelne Sammelprobe erforderlich. Art des Futtermittels Mindestgröße der Sammelprobe (*1) (*2) 6.1. Lose Futtermittel 4 kg 6.2. Verpackte Futtermittel 4 kg (*3) 6.3. Flüssige oder halbflüssige Futtermittel 4 l 6.4. Futterblöcke oder Lecksteine 6.4.1. mit einem Einzelgewicht von mehr als 1 kg 4 kg 6.4.2. mit einem Einzelgewicht von höchstens 1 kg Gewicht von 4 Originalblöcken oder -steinen 6.5. Raufutter/Grünfutter 4 kg (*4) ( *1 ) Ist das beprobte Futtermittel hochwertig, kann eine kleinere Menge als Sammelprobe gewählt werden, sofern dies im Probenahmebericht beschrieben und dokumentiert wird. ( *2 ) Gemäß der Verordnung (EU) Nr. 619/2011 der Kommission vom 24. Juni 2011 zur Festlegung der Probenahme- und Analyseverfahren für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln im Hinblick auf genetisch veränderte Ausgangserzeugnisse, für die ein Zulassungsverfahren anhängig ist oder deren Zulassung abläuft (ABl. L 166 vom 25.6.2011, S. 9) muss die Sammelprobe für die Untersuchung auf genetisch veränderte Ausgangserzeugnisse mindestens 35 000 Samen/Körner enthalten. Dies bedeutet, dass die Größe der Sammelprobe bei Mais mindestens 10,5 kg und bei Sojabohnen 7 kg betragen muss. Bei anderen Samen und Körnern wie Gerste, Hirse, Hafer, Reis, Roggen, Weizen und Raps entspricht die Größe der Sammelprobe von 4 kg mehr als 35 000 Samen/Körnern. ( *3 ) Bei verpackten Futtermitteln kann es ebenfalls vorkommen, dass — abhängig von der Größe der einzelnen Einheiten — die für die Sammelprobe vorgeschriebene Größe von 4 kg nicht erreicht werden kann. ( *4 ) Handelt es sich um Raufutter oder Grünfutter mit geringer relativer Dichte (z. B. Heu, Stroh), sollte die Probengröße mindestens 1 kg betragen.

7. QUANTITATIVE ANFORDERUNGEN AN ENDPROBEN

Endproben

Mindestens eine Endprobe muss analysiert werden. Die Menge der zur Analyse bestimmten Endproben darf nicht unter den nachstehend festgelegten Mindestmengen liegen:







Feste Futtermittel 500 g (*1) (*2) (*3) Flüssige oder halbflüssige Futtermittel 500 ml (*1) ( *1 ) Gemäß der Verordnung (EU) Nr. 619/2011 muss die Endprobe für die Untersuchung auf genetisch veränderte Ausgangserzeugnisse mindestens 10 000 Samen/Körner enthalten. Dies bedeutet, dass die Größe der Endprobe bei Mais mindestens 3 000 g und bei Sojabohnen 2 000 g betragen muss. Bei anderen Samen und Körnern wie Gerste, Hirse, Hafer, Reis, Roggen, Weizen und Raps entspricht die Größe der Endprobe von 500 g mehr als 10 000 Samen/Körnern. ( *2 ) Liegt die Größe der Sammelprobe erheblich unter 4 kg bzw. 4 l (siehe Fußnoten in Nummer 6), kann als Endprobe auch eine geringere Menge entnommen werden, sofern dies im Probenahmebericht beschrieben und dokumentiert wird. ( *3 ) Bei der Beprobung von Hülsenfrüchten, Getreidekörnern und Schalenfrüchten zur Bestimmung der Pflanzenschutzmittelrückstände muss gemäß der Richtlinie 2002/63/EG der Kommission (ABl. L 187 vom 16.7.2002, S. 30) die Mindestgröße der Endprobe 1 kg betragen.

8. PROBENAHMEVERFAHREN FÜR SEHR GROSSE PARTIEN ODER PARTIEN, DIE SO GELAGERT ODER BEFÖRDERT WERDEN, DASS EINE BEPROBUNG DER GESAMTEN PARTIE NICHT PRAKTIKABEL IST

8.1. Allgemeine Grundsätze

Falls es die Art der Beförderung oder Lagerung einer Partie nicht gestattet, Einzelproben aus der gesamten Partie zu entnehmen, sollte die Beprobung solcher Partien vorzugsweise dann erfolgen, wenn sich die Partie im Fluss befindet.

Falls es sich um Großlager für Futtermittel handelt, sollten die Unternehmer dazu angehalten werden, Einrichtungen im Lager zu installieren, die eine (automatische) Beprobung der gesamten gelagerten Partie ermöglichen.

Im Fall der Anwendung der Probenahmeverfahren nach Kapitel 8 wird der Futtermittelunternehmer oder sein Vertreter über das Probenahmeverfahren informiert. Wird dieses Probenahmeverfahren von dem Futtermittelunternehmer oder seinem Vertreter in Frage gestellt, so muss er es der zuständigen Behörde auf eigene Kosten ermöglichen, die gesamte Partie zu beproben.

8.2. Große Partien, die per Schiff befördert werden

8.2.1. Dynamische Beprobung großer Partien, die per Schiff befördert werden

Die Beprobung großer Partien auf Schiffen ist vorzugsweise durchzuführen, wenn sich das Erzeugnis im Fluss befindet (dynamische Probenahme).

Die Probenahme hat je Laderaum (physisch abtrennbare Einheit) zu erfolgen. Die Laderäume werden allerdings nacheinander geleert, so dass die ursprüngliche physische Trennung nach der Weiterbeförderung in die Lagereinrichtungen nicht mehr besteht. Die Probenahme kann daher unter Bezug auf die ursprüngliche physische Trennung oder auf die Trennung nach der Beförderung in die Lagereinrichtungen erfolgen.

Das Löschen einer Schiffsladung kann mehrere Tage in Anspruch nehmen. In der Regel muss die Beprobung in regelmäßigen Abständen während der gesamten Dauer des Löschvorgangs erfolgen. Es ist jedoch nicht immer praktikabel oder sinnvoll, dass sich ein amtlicher Inspektor während des gesamten Löschvorgangs für die Probenahme vor Ort aufhält. Daher ist die Beprobung eines Teils (einer Teilpartie) der gesamten Partie zulässig. Die Anzahl der Einzelproben wird unter Berücksichtigung des Umfangs der Teilpartie festgelegt.

Wird ein Teil einer Futtermittelpartie derselben Gruppe oder Bezeichnung beprobt und erfüllt diese Teilpartie nachweislich nicht die EU-Anforderungen, so muss davon ausgegangen werden, dass das Ergebnis der Beprobung für die gesamte Futtermittelpartie gilt, es sei denn, eine eingehende Bewertung erbringt keinen Nachweis darüber, dass die restliche Partie den EU-Anforderungen nicht genügt.

Auch wenn die amtliche Probe automatisch entnommen wird, muss ein Inspektor anwesend sein. Erfolgt die automatische Probenahme jedoch anhand voreingestellter Parameter, die während der Probenahme nicht verändert werden können, und werden die Einzelproben in einem verplombten Behälter gesammelt, was einen möglichen Betrug ausschließt, so ist die Anwesenheit eines Inspektors nur zu Beginn der Probenahme, bei jedem Wechsel des Probenbehälters und am Ende der Probenahme erforderlich.

8.2.2. Beprobung von Partien, die per Schiff befördert werden, durch statische Probenahme

Bei einer statischen Probenahme ist dasselbe Verfahren anzuwenden wie bei Lagereinrichtigungen (Silos), die von oben zugänglich sind (siehe Nummer 8.4.1).

Die Probenahme muss am zugänglichen Teil der Partie/des Laderaums erfolgen (von oben). Die Anzahl der Einzelproben wird unter Berücksichtigung des Umfangs der Teilpartie festgelegt. Wird ein Teil einer Futtermittelpartie derselben Gruppe oder Bezeichnung beprobt und erfüllt diese Teilpartie nachweislich nicht die EU-Anforderungen, so muss davon ausgegangen werden, dass das Ergebnis der Beprobung für die gesamte Futtermittelpartie gilt, es sei denn, eine eingehende Bewertung erbringt keinen Nachweis darüber, dass die restliche Partie den EU-Anforderungen nicht genügt.

8.3. Beprobung großer Partien in Lagern

Die Probenahme muss am zugänglichen Teil der Partie erfolgen. Die Anzahl der Einzelproben wird unter Berücksichtigung des Umfangs der Teilpartie festgelegt. Wird ein Teil einer Futtermittelpartie derselben Gruppe oder Bezeichnung beprobt und erfüllt diese Teilpartie nachweislich nicht die EU-Anforderungen, so muss davon ausgegangen werden, dass das Ergebnis der Beprobung für die gesamte Futtermittelpartie gilt, es sei denn, eine eingehende Bewertung erbringt keinen Nachweis darüber, dass die restliche Partie den EU-Anforderungen nicht genügt.

8.4. Beprobung von Lagereinrichtungen (Silos)

8.4.1. Beprobung von Silos mit (leichtem) Zugang von oben

Die Probenahme muss am zugänglichen Teil der Partie erfolgen. Die Anzahl der Einzelproben wird unter Berücksichtigung des Umfangs der Teilpartie festgelegt. Wird ein Teil einer Futtermittelpartie derselben Gruppe oder Bezeichnung beprobt und erfüllt diese Teilpartie nachweislich nicht die EU-Anforderungen, so muss davon ausgegangen werden, dass das Ergebnis der Beprobung für die gesamte Futtermittelpartie gilt, es sei denn, eine eingehende Bewertung erbringt keinen Nachweis darüber, dass die restliche Partie den EU-Anforderungen nicht genügt.

8.4.2. Beprobung von Silos ohne Zugang von oben (geschlossene Silos)

8.4.2.1. Silos ohne Zugang von oben (geschlossene Silos) mit einer Größe über 100 Tonnen

In solchen Silos gelagerte Futtermittel können nicht statisch beprobt werden. Wenn das im Silo gelagerte Futtermittel beprobt werden muss und keine Möglichkeit besteht, die Sendung zu bewegen, ist eine Vereinbarung mit dem Unternehmer dahin gehend zu treffen, dass dieser den Inspektor darüber informiert, wann das Silo geleert wird, damit eine Probenahme erfolgen kann, wenn sich das Futtermittel im Fluss befindet.

8.4.2.2. Silos ohne Zugang von oben (geschlossene Silos) mit einer Größe unter 100 Tonnen

Im Rahmen des Probenahmeverfahrens ist eine Menge von 50 bis 100 kg in einen Behälter abzufüllen und anschließend zu beproben. Die Größe der Sammelprobe entspricht der gesamten Partie, und die Anzahl der Einzelproben muss im Verhältnis zu der Menge stehen, die zur Probenahme aus dem Silo in einen Behälter abgefüllt wird. Wird ein Teil einer Futtermittelpartie derselben Gruppe oder Bezeichnung beprobt und erfüllt diese Teilpartie nachweislich nicht die EU-Anforderungen, so muss davon ausgegangen werden, dass das Ergebnis der Beprobung für die gesamte Futtermittelpartie gilt, es sei denn, eine eingehende Bewertung erbringt keinen Nachweis darüber, dass die restliche Partie den EU-Anforderungen nicht genügt.

8.5. Beprobung loser Futtermittel in großen geschlossenen Containern

Solche Partien können häufig erst nach dem Entladen beprobt werden. In bestimmten Fällen ist das Entladen am Einfuhrort oder am Kontrollpunkt nicht möglich, weshalb die Probenahme erfolgen sollte, wenn die betreffenden Container entladen sind.

9. ANWEISUNGEN FÜR DIE ENTNAHME, VORBEREITUNG UND VERPACKUNG DER PROBEN

9.1. Allgemeines

Die Proben müssen so schnell wie möglich entnommen und vorbereitet werden, wobei die nötigen Vorkehrungen zu treffen sind, um sicherzustellen, dass das Erzeugnis weder verändert noch verunreinigt wird. Die für die Probenahme bestimmten Geräte, Flächen und Behälter müssen sauber und trocken sein.

9.2. Einzelproben

Die Einzelproben sind nach dem Zufallsprinzip aus der gesamten Teilpartie zu entnehmen. Ihre Größe muss ungefähr gleich sein.

Die Größe der Einzelprobe muss mindestens 100 g bzw. 25 g bei Raufutter oder Grünfutter mit geringem spezifischem Gewicht betragen.

Sind nach dem Probenahmeverfahren gemäß Nummer 8 weniger als 40 Einzelproben zu entnehmen, muss die Größe der Einzelprobe im Verhältnis zur erforderlichen Größe der Sammelprobe festgelegt werden (siehe Nummer 6).

Bei der Beprobung kleiner Partien verpackter Futtermittel, bei der entsprechend den quantitativen Anforderungen eine begrenzte Anzahl von Einzelproben zu entnehmen ist, umfasst eine Einzelprobe den Inhalt einer Originaleinheit, der 1 kg bzw. 1 Liter nicht überschreitet.

Bei der Beprobung verpackter Futtermittel, die aus kleinen Einheiten bestehen (z. B. < 250 g) ist die Größe der Einzelprobe von der Größe der Einheit abhängig.

9.2.1. Lose Futtermittel

Die Probenahme kann gegebenenfalls auch bei einer Teilpartie erfolgen, die sich in Bewegung (Einladen oder Entladen) befindet.

9.2.2. Verpackte Futtermittel

Nach Auswahl der erforderlichen Anzahl der zu beprobenden Einheiten gemäß Kapitel 5 wird aus jeder dieser Einheiten ein Teil des Inhalts mit einem Probenahmestab oder einer Schaufel entnommen. Gegebenenfalls sind die Proben zu entnehmen, nachdem die Einheiten getrennt entleert worden sind.

9.2.3. Homogene oder homogenisierbare flüssige oder halbflüssige Futtermittel

Nach Auswahl der erforderlichen Anzahl der zu beprobenden Einheiten gemäß Kapitel 5 wird der Inhalt falls nötig homogenisiert und aus jeder Einheit eine Menge entnommen.

Die Einzelproben können auch beim Ablassen des Inhalts entnommen werden.

9.2.4. Nicht homogenisierbare flüssige oder halbflüssige Futtermittel

Nach Auswahl der erforderlichen Anzahl der zu beprobenden Einheiten gemäß Kapitel 5 werden in unterschiedlicher Höhe Proben entnommen.

Die Probenahme kann auch beim Ablassen des Inhalts erfolgen, wobei jedoch die ersten Fraktionen zu verwerfen sind.

In beiden Fällen muss das Gesamtvolumen mindestens 10 l betragen.

9.2.5. Futterblöcke und Lecksteine

Nach Auswahl der erforderlichen Anzahl der zu beprobenden Blöcke oder Steine gemäß Kapitel 5 kann jedem Block oder Stein ein Teil entnommen werden. Besteht die Vermutung, dass es sich um einen nicht homogenen Block bzw. Stein handelt, so kann der ganze Block bzw. Stein als Probe genommen werden.

Bei Futterblöcken oder Lecksteinen mit einem Gewicht von jeweils maximal 1 kg gilt der Inhalt eines Futterblocks oder Lecksteins als Einzelprobe.

9.3. Vorbereitung der Sammelproben

Die Einzelproben werden gemischt und zu einer einzigen Sammelprobe zusammengestellt.

9.4. Vorbereitung der Endproben

Das Material in der Sammelprobe ist sorgfältig zu mischen ( 4 ).

— Jede Probe wird in einen geeigneten Container/Behälter gefüllt. Es sind alle notwendigen Vorkehrungen zu treffen, damit jede Veränderung der Zusammensetzung bzw. jede Verunreinigung oder Verfälschung der Probe während des Transports oder der Lagerung vermieden wird.

— Bei der Untersuchung auf Bestandteile oder Stoffe, die im Futtermittel gleichmäßig verteilt sind, kann die Sammelprobe repräsentativ auf mindestens 2,0 kg bzw. 2,0 l reduziert werden (reduzierte Probe) ( 5 ), vorzugsweise mit Hilfe eines mechanischen oder automatischen Probenteilers. Bei der Beprobung von Hülsenfrüchten, Getreidekörnern und Schalenfrüchten auf Pflanzenschutzmittelrückstände beträgt die Mindestgröße der reduzierten Probe 3 kg. Falls aufgrund der Art des Futtermittels die Verwendung eines Probenteilers nicht möglich oder ein Probenteiler nicht verfügbar ist, kann die Probe nach dem Vierteilungsverfahren reduziert werden. Dann werden aus den reduzierten Proben ungefähr gleich große Endproben (für Kontroll-, Verteidigungs- und Referenzzwecke) entsprechend den quantitativen Anforderungen in Kapitel 7 hergestellt. Bei der Untersuchung auf Bestandteile, einschließlich genetisch veränderter Ausgangserzeugnisse, oder auf Stoffe, die ungleichmäßig in Futtermittel-Ausgangserzeugnissen verteilt sein können, muss die Sammelprobe folgende Anforderungen erfüllen: — Sie wird vollständig homogenisiert und anschließend in Endproben aufgeteilt oder — mit Hilfe eines mechanischen oder automatischen Probenteilers auf mindestens 2 kg bzw. 2 l ( 6 ) reduziert. Nur dann, wenn aufgrund der Art des Futtermittels die Verwendung eines Probenteilers nicht möglich ist, kann die Probe falls nötig nach dem Vierteilungsverfahren reduziert werden. Für die Untersuchung auf genetisch veränderte Ausgangserzeugnisse im Rahmen der Verordnung (EU) Nr. 619/2011 muss die reduzierte Probe mindestens 35 000 Samen/Körner enthalten, damit die Endproben für Durchsetzungs-, Verteidigungs- und Referenzzwecke im Umfang von mindestens 10 000 Samen/Körnern hergestellt werden können (siehe Fußnote (**) in Kapitel 6 und Fußnote (*) in Kapitel 7).

9.5. Verpackung der Proben

Die Behälter oder Packungen sind so zu verplomben und zu kennzeichnen, dass sie nicht ohne Beschädigung der Plombe geöffnet werden können. Hierbei muss die gesamte Kennzeichnung von der Plombe erfasst werden.

9.6. Versendung der Proben an das Labor

Die Probe ist — zusammen mit den untersuchungsrelevanten Angaben — so schnell wie möglich an das benannte Analyselabor zu versenden.

10. PROBENAHMEPROTOKOLL

Für jede Probe ist ein Probenahmeprotokoll zu erstellen, aus dem die Identität und der Umfang der Teilpartie eindeutig hervorgehen.

Im Protokoll wird außerdem jede Abweichung von den in dieser Verordnung festgelegten Probenahmeverfahren vermerkt.

Das Protokoll wird dem amtlichen Kontrolllabor sowie dem Futtermittelunternehmer und/oder dem vom Futtermittelunternehmer benannten Labor zur Verfügung gestellt.









ANHANG II

ALLGEMEINE BESTIMMUNGEN HINSICHTLICH DER METHODEN ZUR ANALYSE VON FUTTERMITTELN

A. VORBEREITUNG DER PROBEN ZUR ANALYSE

1. Zweck

Die nachfolgend beschriebenen Verfahren betreffen die Vorbereitung der zur Analyse bestimmten Proben, die nach der Probenahme gemäß den Bestimmungen in Anhang I an die Kontrolllabors versandt wurden.

Die Vorbereitung der Laborproben muss so erfolgen, dass die in den Analysemethoden vorgesehenen Einwaagen homogen und repräsentativ für die Endproben sind.

2. Vorsichtsmaßnahmen

Die Wahl des Verfahrens für die Probenvorbereitung hängt von der Art der anzuwendenden Analysemethode und den zu untersuchenden Bestandteilen oder Stoffen ab. Daher ist es äußerst wichtig, sicherzustellen, dass das angewandte Probenvorbereitungsverfahren für die jeweilige Analysemethode und für die zu untersuchenden Bestandteile oder Stoffe geeignet ist.

Alle notwendigen Schritte sind so durchzuführen, dass eine Verunreinigung der Probe und eine Veränderung ihrer Zusammensetzung weitestmöglich vermieden werden.

Das Zerkleinern, Mischen und Sieben muss unverzüglich erfolgen, wobei die Probe möglichst wenig Luft und Licht ausgesetzt werden darf. Die Verwendung von Mühlen oder Zerkleinerungsgeräten, die zu einer merklichen Erwärmung der Probe führen könnten, ist nicht zulässig.

Für besonders hitzeempfindliche Futtermittel wird manuelles Zerkleinern empfohlen. Es ist außerdem darauf zu achten, dass die verwendeten Geräte keine Kontaminationsquelle bilden.

Kann die Probe nicht ohne eine signifikante Veränderung ihres Feuchtigkeitsgehalts vorbereitet werden, so ist dieser vor und nach der Vorbereitung gemäß der in Anhang III Teil A festgelegten Methode zu bestimmen.

3. Verfahren

3.1. Allgemeines Verfahren

Das Testaliquot ist der Endprobe zu entnehmen. Das Kegeln und das Vierteilungsverfahren werden nicht empfohlen, da dies mit einer hohen Teilungsfehlerquote bei den Testaliquoten einhergehen kann.

3.1.1. Futtermittel, die direkt gemahlen werden können

— Die gesiebte Endprobe wird gemischt und in einen geeigneten sauberen, trockenen, luftdicht verschließbaren Behälter abgefüllt. Um eine vollständige Homogenisierung zu gewährleisten, muss die Probe unmittelbar vor der Einwaage (Testaliquot) erneut gemischt werden.

3.1.2. Futtermittel, die nach Trocknung gemahlen werden können

— Sofern in der Analysemethode nicht anders festgelegt, wird die Endprobe nach dem in Nummer 4.3 der Methode zur Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts (siehe Anhang III Teil A) vorgesehenen Vortrocknungsverfahren bis auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 8-12 % getrocknet. Die weitere Vorbereitung erfolgt gemäß Nummer 3.1.1.

3.1.3. Flüssige oder halbflüssige Futtermittel

— Die Endprobe wird in einen geeigneten sauberen, trockenen, luftdicht verschließbaren Behälter abgefüllt. Um eine vollständige Homogenisierung zu gewährleisten, muss die Probe unmittelbar vor der Einwaage (Testaliquot) gründlich gemischt werden.

3.1.4. Andere Futtermittel

— Endproben, die nach keinem der oben genannten Verfahren vorbereitet werden können, sind nach einem anderen Verfahren zu behandeln, das gewährleistet, dass die Einwaagen (Testaliquote) homogen und repräsentativ für die Endproben sind.

3.2. Besonderes Verfahren bei Sichtprüfungen oder mikroskopischen Untersuchungen oder im Fall einer Homogenisierung der vollständigen Sammelprobe

— Bei einer Sichtprüfung (ohne Zuhilfenahme eines Mikroskops) wird die vollständige Laborprobe untersucht.

— Bei einer mikroskopischen Untersuchung kann das Labor die Sammelprobe reduzieren bzw. die reduzierte Probe noch weiter reduzieren. Die Endproben für die Gegenprobe und gegebenenfalls für Referenzzwecke werden nach einem Verfahren entnommen, das dem Verfahren zur Herstellung der Endprobe für den Vollzug gleichwertig ist.

— Im Fall einer Homogenisierung der vollständigen Sammelprobe werden die Endproben aus der homogenisierten Sammelprobe entnommen.

4. Lagerung der Proben

Die Proben müssen bei einer Temperatur gelagert werden, die ihre Zusammensetzung nicht beeinflusst. Proben, die zur Analyse von Vitaminen oder besonders lichtempfindlichen Stoffen bestimmt sind, sind so zu lagern, dass die Probe nicht durch Licht beeinträchtigt wird.

B. BESTIMMUNGEN ÜBER IN ANALYSEVERFAHREN VERWENDETE REAGENZIEN UND GERÄTE

1. Sofern in den Analysemethoden nicht anders festgelegt, müssen alle zur Analyse verwendeten Reagenzien von analysenreiner (p. a.) Qualität sein. Bei der Analyse von Spurenelementen muss die Reinheit der Reagenzien durch Mitführen von Blindproben überprüft werden. Je nach den ermittelten Werten kann eine weitere Reinigung der Reagenzien erforderlich sein.

2. Bei jedem in den Analysemethoden genannten Lösungs-, Verdünnungs-, Spül- oder Auswaschvorgang, bei dem keine Angabe über die Art des zu verwendenden Lösungs- oder Verdünnungsmittels gemacht wird, ist Wasser zu verwenden. Im Allgemeinen wird demineralisiertes oder destilliertes Wasser verwendet. In besonderen Fällen, die in den Analysemethoden angegeben werden, ist das Wasser speziellen Reinigungsverfahren zu unterziehen.

3. Da die übliche Ausstattung von Kontrolllabors vorausgesetzt wird, werden nur besondere Instrumente und Geräte oder solche, die eine spezifische Verwendung erfordern, in den Analysemethoden aufgeführt. Sie müssen gut gereinigt sein, vor allem bei der Bestimmung sehr geringer Stoffmengen.

C. ANWENDUNG VON ANALYSEMETHODEN UND FORMULIERUNG DER ERGEBNISSE

1. Extraktionsverfahren

Einige Methoden geben ein spezifisches Extraktionsverfahren vor. Generell können andere Extraktionsverfahren als das in der Methode genannte Verfahren angewandt werden, und zwar unter der Bedingung, dass das angewandte Extraktionsverfahren für die analysierte Matrix eine vergleichbare Extraktionseffizienz aufweist wie das in der Methode genannte Verfahren.

2. Clean-up-Verfahren

Einige Methoden geben ein spezifisches Clean-up-Verfahren vor. Generell können andere Clean-up-Verfahren als das in der Methode genannte Verfahren angewandt werden, und zwar unter der Bedingung, dass das angewandte Clean-up-Verfahren für die analysierte Matrix zu vergleichbaren Analyseergebnissen führt wie das in der Methode genannte Verfahren.

3. Anzahl der Bestimmungen

Bei der Analyse auf unerwünschte Stoffe sind — sofern das Ergebnis der ersten Bestimmung deutlich (> 50 %) unter dem zu kontrollierenden Sollwert liegt — keine weiteren Bestimmungen erforderlich, vorausgesetzt, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden. In anderen Fällen ist eine Zweitanalyse (Zweitbestimmung) erforderlich, um eine interne Kreuzkontamination oder eine versehentliche Vermischung der Proben auszuschließen. Anhand des Mittelwerts der beiden Bestimmungen wird — unter Berücksichtigung der Messunsicherheit — die Einhaltung der Höchstgehalte überprüft.

Bei der Kontrolle des angegebenen Gehalts an einem Stoff oder einer Zutat sind — sofern das Ergebnis der Erstbestimmung den angegebenen Gehalt bestätigt, d. h., wenn das Analyseergebnis innerhalb des akzeptablen Toleranzbereichs für den angegebenen Gehalt liegt — keine weiteren Bestimmungen erforderlich, vorausgesetzt, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden. In anderen Fällen ist eine Zweitanalyse (Zweitbestimmung) erforderlich, um eine interne Kreuzkontamination oder eine versehentliche Vermischung der Proben auszuschließen. Anhand des Mittelwerts der beiden Bestimmungen wird — unter Berücksichtigung der Messunsicherheit — die Einhaltung der Höchstgehalte überprüft.

In einigen Fällen ist der Toleranzbereich in Rechtsvorschriften definiert, beispielsweise in der Verordnung (EG) Nr. 767/2009 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 13. Juli 2009 über das Inverkehrbringen und die Verwendung von Futtermitteln, zur Änderung der Verordnung (EG) Nr. 1831/2003 des Europäischen Parlaments und des Rates und zur Aufhebung der Richtlinien 79/373/EWG des Rates, 80/511/EWG der Kommission, 82/471/EWG des Rates, 83/228/EWG des Rates, 93/74/EWG des Rates, 93/113/EG des Rates und 96/25/EG des Rates und der Entscheidung 2004/217/EG der Kommission ( 7 ).

4. Berichterstattung über die angewandte Analysemethode

Im Analysebericht ist anzugeben, welche Analysemethode angewandt wurde.

5. Bericht über die Analyseergebnisse

Das Ergebnis ist gemäß den Anweisungen in der Analysemethode mit einer angemessenen Zahl an signifikanten Ziffern anzugeben und, falls nötig, auf den Feuchtigkeitsgehalt der Endprobe vor deren Vorbereitung umzurechnen.

6. Messunsicherheit und Wiederfindungsrate bei der Analyse auf unerwünschte Stoffe

Hinsichtlich unerwünschter Stoffe im Sinne der Richtlinie 2002/32/EG erfüllt ein zur Verfütterung bestimmtes Erzeugnis die Bestimmung bezüglich des festgelegten Höchstgehalts nicht, wenn das Analyseergebnis, bezogen auf ein Futtermittel mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 12 %, unter Berücksichtigung der erweiterten Messunsicherheit und der Berichtigung um die Wiederfindungsrate den Höchstgehalt überschreitet. Zur Beurteilung der Einhaltung der Höchstgehalte wird die gemessene Konzentration — nach Berichtigung um die Wiederfindungsrate und nach Abzug der erweiterten Messunsicherheit — herangezogen. Dieses Verfahren wird nur dann angewandt, wenn die Analysemethode die Schätzung der Messunsicherheit und die Berichtigung um die Wiederfindungsrate ermöglicht (z. B. nicht möglich bei mikroskopischer Analyse).

Das Analyseergebnis ist wie folgt festzuhalten (soweit die angewandte Analysemethode die Schätzung der Messunsicherheit und der Wiederfindungsrate ermöglicht):

a) Berichtigung um die Wiederfindungsrate, wobei diese anzugeben ist. Eine Berichtigung um die Wiederfindungsrate ist nicht erforderlich, wenn letztere 90-110 % beträgt;

b) als „x +/– U“, wobei x das Analyseergebnis und U die erweiterte Messunsicherheit bezeichnet und ein Faktor von 2 verwendet wird, der zu einem Konfidenzniveau von ca. 95 % führt.

Liegt jedoch das Analyseergebnis deutlich (> 50 %) unter dem zu kontrollierenden Sollwert — und unter der Bedingung, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden und die Analyse lediglich dem Zweck der Überprüfung der Einhaltung der Rechtsvorschriften dient —, können die Analyseergebnisse ohne Berichtigung um die Wiederfindungsrate angegeben werden, und die Angabe der Wiederfindungsrate und der Messunsicherheit kann in diesen Fällen entfallen.

▼B









ANHANG III

ANALYSEMETHODEN ZUR UNTERSUCHUNG DER ZUSAMMENSETZUNG VON FUTTERMITTEL-AUSGANGSERZEUGNISSEN UND MISCHFUTTERMITTELN

A. BESTIMMUNG DES FEUCHTIGKEITSGEHALTS

1. Zweck und Anwendungsbereich

Diese Methode erlaubt die Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts von Futtermitteln. Bei Futtermitteln, die flüchtige Stoffe wie z. B. organische Säuren enthalten, ist zu beachten, dass zusammen mit dem Feuchtigkeitsgehalt auch bedeutende Mengen an flüchtigen Stoffen bestimmt werden.

Sie betrifft nicht die Untersuchung von Milcherzeugnissen als Futtermittel-Ausgangserzeugnisse, die Untersuchung von Mineralstoffen und Mischungen, die überwiegend aus Mineralstoffen bestehen, die Untersuchung von tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen oder die Untersuchung von Ölsaaten und Ölfrüchten.

2. Prinzip

Die Probe wird unter definierten Bedingungen getrocknet, die von der Art des Futtermittels abhängen. Der Gewichtsverlust wird durch Wiegen bestimmt. Bei festen Futtermitteln mit einem hohen Feuchtigkeitsgehalt ist eine zusätzliche Vortrocknung erforderlich.

3. Geräte

3.1. Zerkleinerungsgerät aus einem Material, das keine Feuchtigkeit absorbiert, leicht zu reinigen ist, eine schnelle und gleichmäßige Zerkleinerung ermöglicht, ohne eine merkliche Erwärmung hervorzurufen, das so weit wie möglich den Kontakt mit der Außenluft verhindert und den unter 4.1.1 und 4.1.2 gestellten Anforderungen entspricht (z. B. Mikroschlagkreuzmühlen, Mikrozerkleinerer mit Wasserkühlung, zerlegbare Kegelmühlen, langsam laufende Kegelmühlen oder Zahnscheibenmühlen).

3.2. Analysenwaage, Genauigkeit 1 mg.

3.3. Trockene Gefäße aus korrosionsbeständigem Metall oder Glas, mit luftdicht schließenden Deckeln; die Nutzfläche muss eine Verteilung der Probe von ca. 0,3 g/cm2 ermöglichen.

3.4. Elektrisch beheizter, temperaturgeregelter Trockenschrank (± 2 oC), der eine schnelle Regelung der Temperatur gewährleistet und eine gute Lüftung besitzt ( 8 ).

3.5. Elektrisch beheizter regulierbarer Vakuumtrockenschrank mit einer Ölpumpe, der entweder mit einer Vorrichtung für die Zufuhr warmer und getrockneter Luft oder mit einem Trocknungsmittel (z. B. Calciumoxid) ausgestattet ist.

3.6. Exsikkator mit dicker, perforierter Platte aus Metall oder Porzellan, der ein wirksames Trocknungsmittel enthält.

4. Verfahren

Anmerkung : Die Verfahren, die in diesem Abschnitt beschrieben werden, müssen unverzüglich nach dem Öffnen der Packungen, die die Proben enthalten, durchgeführt werden. Die Analysen sind mindestens doppelt auszuführen.

4.1. Vorbereitung

4.1.1. Futtermittel, außer den unter 4.1.2 und 4.1.3 genannten

Mindestens 50 g der Probe werden entnommen und erforderlichenfalls unter Vermeidung von Feuchtigkeitsänderungen entsprechend zerkleinert oder geteilt (siehe 6).

4.1.2. Getreide und Grütze

Mindestens 50 g der Probe werden entnommen. Diese Menge wird so gemahlen, dass zumindest 50 % der Teilchen durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,5 mm passiert werden können und dass beim Passieren durch ein Rundlochsieb mit einem Lochdurchmesser von 1 mm ein Rückstand von höchstens 10 % verbleibt.

4.1.3. Flüssige oder breiige Futtermittel; Futtermittel, die überwiegend aus Ölen und Fetten bestehen

Etwa 25 g der Probe, auf 10 mg genau gewogen, werden entnommen, mit einer entsprechenden, auf 10 mg genau gewogenen Menge wasserfreiem Sand vermischt, bis ein homogenes Produkt entsteht.

4.2. Trocknung

4.2.1. Futtermittel, außer den unter 4.2.2 und 4.2.3 genannten

Ein Gefäß (3.3) wird mit seinem Deckel auf 1 mg genau gewogen. Etwa 5 g der Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 103 oC vorgeheizten Trockenschrank gestellt. Damit die Temperatur des Trockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen. Es wird 4 h lang getrocknet, wobei die Trocknungszeit von dem Zeitpunkt an gerechnet wird, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 103 oC erreicht hat. Nach Öffnen des Trockenschranks wird das Gefäß sofort mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, 30 bis 45 min lang zum Abkühlen in den Exsikkator (3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen.

Bei Futtermitteln, die überwiegend aus Ölen und Fetten bestehen, wird eine zusätzliche Trocknung von 30 min im Trockenschrank bei 130 oC vorgenommen. Der Unterschied zwischen den beiden Wägeergebnissen darf höchstens 0,1 % Feuchtigkeit betragen.

4.2.2. Getreide, Mehl, Grütze und Grieß

Ein Gefäß (3.3) wird mit seinem Deckel auf 0,5 mg genau gewogen. Etwa 5 g der zerkleinerten Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 130 oC vorgeheizten Trockenschrank gestellt. Damit die Temperatur des Trockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen. Es wird 2 h lang getrocknet, wobei die Trocknungszeit von dem Zeitpunkt an gerechnet wird, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 130 oC erreicht hat. Nach Öffnen des Trockenschranks wird das Gefäß sofort mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, 30 bis 45 min lang zum Abkühlen in den Exsikkator (3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen.

4.2.3. Mischfuttermittel mit einem Saccharose- oder Lactosegehalt von mehr als 4 %: Futtermittel-Ausgangserzeugnisse wie z. B. Johannisbrotschrot, hydrolysierte Getreideerzeugnisse, Malzkeime, Zuckerrübenschnitzel, Fisch- und Zuckerpresssäfte; Mischfuttermittel mit einem Gehalt an kristallwasserhaltigen Mineralstoffen von mehr als 25 %.

Ein Gefäß (3.3) wird mit seinem Deckel auf 0,5 mg genau gewogen. Etwa 5 g der Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 80 bis 85 oC vorgeheizten Vakuumtrockenschrank (3.5) gestellt. Damit die Temperatur des Vakuumtrockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen.

Der Druck wird auf 100 Torr eingestellt. Die Probe wird 4 h lang bei diesem Druck entweder unter Zufuhr von heißer trockener Luft oder mittels eines Trocknungsmittels (etwa 300 g für 20 Proben) getrocknet. Im letzteren Fall wird beim Erreichen des vorgeschriebenen Drucks die Verbindung zur Vakuumpumpe unterbrochen. Die Trocknungszeit wird von dem Zeitpunkt an gerechnet, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 80 bis 85 oC erreicht hat. Nach Ablauf der Trocknungszeit wird der Vakuumtrockenschrank vorsichtig wieder auf atmosphärischen Druck gebracht. Nach Öffnen des Vakuumtrockenschranks wird das Gefäß sofort mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, zum Abkühlen 30 bis 45 min lang in den Exsikkator (3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen. Es wird im Vakuumtrockenschrank weitere 30 min bei 80 bis 85 oC getrocknet und erneut gewogen. Der Unterschied zwischen den beiden Wägeergebnissen darf höchstens 0,1 % Feuchtigkeit betragen.

4.3. Vortrocknung

4.3.1. Futtermittel, außer den unter 4.3.2 genannten

Bei festen Futtermitteln mit einem hohen Feuchtigkeitsgehalt, deren Zerkleinerung schwierig ist, ist eine Vortrocknung wie folgt vorzunehmen:

Von der nicht zerkleinerten Probe (sofern erforderlich können gepresste oder klumpenhaltige Futtermittel grob zerkleinert werden) werden 50 g auf 10 mg genau in ein geeignetes Gefäß (z. B. eine Aluminiumschale von 20 × 12 cm mit einem Rand von 0,5 cm) eingewogen und in einem Trockenschrank bei einer Temperatur von 60 bis 70 oC getrocknet, bis der Feuchtigkeitsgehalt einen Wert zwischen 8 und 12 % erreicht hat. Anschließend wird das Gefäß aus dem Trockenschrank genommen, im Labor 1 h lang offen abkühlen gelassen und dann auf 10 mg genau gewogen. Im Folgenden wird die Probe unverzüglich, wie unter 4.1.1 angegeben, zerkleinert und je nach Art des Futtermittels entsprechend den Angaben unter 4.2.1 oder 4.2.3 getrocknet.

4.3.2. Getreide

Körner, deren Feuchtigkeitsgehalt höher als 17 % ist, müssen wie folgt vorgetrocknet werden:

Von den nicht gemahlenen Körnern werden 50 g auf 10 mg genau in ein geeignetes Gefäß (z. B. in eine Aluminiumschale von 20 × 12 cm mit einem Rand von 0,5 cm) eingewogen und in einem Trockenschrank bei einer Temperatur von 130 oC 5 bis 7 min getrocknet. Anschließend wird das Gefäß aus dem Trockenschrank genommen, im Labor 2 h lang offen abkühlen gelassen und dann auf 10 mg genau gewogen. Im Folgenden wird die Probe unverzüglich, wie unter 4.1.2 angegeben, gemahlen und entsprechend den Angaben unter 4.2.2 getrocknet.

5. Berechnung der Ergebnisse

Der Feuchtigkeitsgehalt (X) der Probe als Prozentsatz wird nach folgenden Formeln berechnet:

5.1. Trocknung ohne Vortrocknung

wobei:

m = Anfangsgewicht der Probe in g,

m0 = Gewicht der trockenen Probe in g.

5.2. Trocknung mit Vortrocknung

wobei:

m = Anfangsgewicht der Probe in g,

m1 = Gewicht der Probe nach der Vortrocknung in g,

m2 = Gewicht der Probe nach der Zerkleinerung oder dem Zermahlen in g,

m0 = Gewicht der trockenen Probe in g.

5.3. Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 0,2 % Feuchtigkeit (absolut) nicht überschreiten.

6. Bemerkung

Wenn eine Zerkleinerung sich als notwendig erweist und dabei mit einer Änderung des Feuchtigkeitsgehalts des Materials gerechnet werden muss, so sind die Analyseergebnisse, die die Bestandteile des Futtermittels betreffen, auf den Feuchtigkeitsgehalt der Originalprobe umzurechnen.

B. BESTIMMUNG DES FEUCHTIGKEITSGEHALTS IN TIERISCHEN UND PFLANZLICHEN FETTEN UND ÖLEN

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Wasser und flüchtigen Stoffen in tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen.

2. Prinzip

Die Probe wird bei 103 oC getrocknet, bis kein Gewichtsverlust mehr eintritt (der Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Wägungen darf 1 mg nicht überschreiten). Der Gewichtsverlust wird durch Wiegen bestimmt.

3. Geräte

3.1. Schale mit flachem Boden, aus korrosionsbeständigem Material, Durchmesser: 8 bis 9 cm, Höhe ca. 3 cm.

3.2. Thermometer mit verstärkter Kugel und Ausdehnungsraum am oberen Ende, von ca. 80 bis mindestens 110 oC graduiert, Länge ca. 10 cm.

3.3. Sandbad oder elektrische Heizplatte.

3.4. Exsikkator, der ein wirksames Trocknungsmittel enthält.

3.5. Analysenwaage.

4. Verfahren

Etwa 20 g der homogenisierten Probe werden auf 1 mg genau in die trockene, gewogene Schale (3.1.) eingewogen, die das Thermometer (3.2) enthält, und auf dem Sandbad oder der elektrischen Heizplatte (3.3) unter ständigem Rühren mit dem Thermometer so erhitzt, dass in ca. 7 min eine Temperatur von 90 oC erreicht wird.

Entsprechend der Häufigkeit, mit der Gasblasen vom Boden der Schale aufsteigen, wird die Heizintensität verringert. Die Temperatur darf 105 oC nicht überschreiten. Unter ständigem Abkratzen des Bodens der Schale wird weiter umgerührt, bis sich keine Blasen mehr bilden.

Um sicherzustellen, dass keine Feuchtigkeit mehr vorhanden ist, wird mehrmals auf 103 oC ± 2 oC erhitzt und zwischen aufeinanderfolgenden Erhitzungen jeweils auf 93 oC gekühlt. Anschließend wird bis zur Raumtemperatur im Exsikkator (3.4) abkühlen gelassen und gewogen. Dieses Verfahren ist so oft zu wiederholen, bis der Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Wägungen 2 mg nicht mehr überschreitet.

Anmerkung : Eine Gewichtserhöhung der Probe nach wiederholter Erwärmung zeigt eine Oxidation des Fettes an. In diesem Fall wird der Berechnung das Ergebnis der Wägung zugrunde gelegt, die unmittelbar vor dem Auftreten der Gewichtszunahme ausgeführt wurde.

5. Berechnung der Ergebnisse

Der Feuchtigkeitsgehalt (X) der Probe als Prozentsatz wird nach folgender Formel berechnet:

wobei:

m = Probeneinwaage in g,

m1 = Gewicht der Schale mit Inhalt in g vor dem Erhitzen,

m2 = Gewicht der Schale mit Inhalt in g nach dem Erhitzen.

Ergebnisse unter 0,05 % sollten mit der Bezeichnung „weniger als 0,05 %“ angegeben werden.

Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 0,05 % Feuchtigkeit (absolut) nicht überschreiten.

C. BESTIMMUNG DES ROHPROTEINGEHALTS

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Berechnung des Rohproteingehalts von Futtermitteln anhand des nach Kjeldahl bestimmten Stickstoffgehalts.

2. Prinzip

Die Probe wird durch Schwefelsäure in Anwesenheit eines Katalysators aufgeschlossen. Der saure Aufschluss wird durch eine Natriumhydroxidlösung alkalisiert. Das Ammoniak wird durch Destillation abgetrennt und in einer definierten Menge Schwefelsäure aufgefangen, deren Überschuss durch eine Standard-Natriumhydroxidlösung titriert wird.

Alternativ wird das freigesetzte Ammoniak in überschüssiger Borsäurelösung destilliert, gefolgt von einer Titration mit Salz- oder Schwefelsäurelösung.

3. Reagenzien

3.1. Kaliumsulfat.

3.2. Katalysator: Kupfer(II)-oxid, CuO, oder Kupfer(II)-sulfatpentahydrat, CuSO4 5H2O.

3.3. Zinkgranulat.

3.4. Schwefelsäure, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6. Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7. Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8. Methylrot-Indikator; 300 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol (σ = 95 bis 96 %) gelöst.

3.9. Natriumhydroxidlösung (Verwendung technischer Qualität möglich), β = 40 g/100 ml (40 %).

3.10. Natriumhydroxid, volumetrische Standardlösung, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11. Natriumhydroxid, volumetrische Standardlösung, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12. Bimssteinkörner, mit Salzsäure gewaschen und geglüht.

3.13. Acetanilid (Schmelzpunkt = 114 oC, N-Gehalt = 10,36 %).

3.14. Saccharose (stickstofffrei).

3.15. Borsäure (H3BO3).

3.16. Methylrot-Indikatorlösung: 100 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol oder Methanol gelöst.

3.17. Bromkresolgrünlösung: 100 mg Bromkresolgrün werden in 100 ml Ethanol oder Methanol gelöst.

3.18. Borsäurelösung (10 bis 40 g/l in Abhängigkeit vom eingesetzten Gerät)

Bei einer kolorimetrischen Endpunktbestimmung sind der Borsäurelösung Methylrot- und Bromkresolindikatoren zuzufügen. Wird 1 l Borsäurelösung zubereitet, sind vor dem Auffüllen zur Marke 7 ml Methylrot-Indikatorlösung (3.16) und 10 ml Bromkresolgrünlösung (3.17) zuzufügen.

In Abhängigkeit von dem verwendeten Wasser kann sich der pH-Wert von einer Borsäurelösung zur anderen unterscheiden. Häufig ist eine Einstellung des pH-Werts mithilfe einer geringen Menge Alkali erforderlich, um eine positive Blindprobe zu erhalten.

Anmerkung : Eine Zugabe von rund 3 ml NaOH (3.11) zu 1 l Borsäure von 10 g/l führt in der Regel zu guten Einstellungen. Die Lösung ist bei Raumtemperatur aufzubewahren und während der Aufbewahrung vor Lichteinfall und Ammoniakdämpfen zu schützen.

3.19. Salzsäure, volumetrische Standardlösung, c(HCl) = 0,10 mol/l.

Anmerkung : Andere Konzentrationen volumetrischer Lösungen (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 und 3.19) können verwendet werden, sofern die Berechnungen entsprechend berichtigt werden. Die Konzentrationen sind stets auf 4 Dezimalstellen genau anzugeben.

4. Geräte

Für Aufschluss, Destillation und Titration nach dem Kjeldahl-Verfahren geeignete Geräte.

5. Verfahren

5.1. Aufschluss

Von der Probe wird 1 g auf 0,001 g genau gewogen und in den Kolben des Aufschlussgeräts gegeben. Anschließend werden 15 g Kaliumsulfat (3.1), eine geeignete Katalysatormenge (3.2) (0,3 bis 0,4 g Kupfer(II)-oxid oder 0,9 bis 1,2 g Kupfer(II)-sulfatpentahydrat), 25 ml Schwefelsäure (3.4) und ggf. einige Bimssteinkörnchen (3.12) zugesetzt und vermischt.

Der Kolben wird, wenn notwendig, unter regelmäßigem Schwenken zunächst mäßig erhitzt, bis die Substanz verkohlt ist und das Schäumen aufgehört hat. Dann wird die Flüssigkeit stärker erhitzt und gleichmäßig am Sieden gehalten. Bei korrekter Erhitzung kondensiert die siedende Säure auf der Kolbenwand. Ein Überhitzen der Kolbenwände und Ansetzen organischer Partikel ist zu vermeiden.

Sobald die Lösung klar ist und sich hellgrün färbt, wird sie noch weitere 2 h am Sieden gehalten und danach abkühlen gelassen.

5.2. Destillation

Es wird vorsichtig so viel Wasser zugegeben, dass die Sulfate vollständig gelöst werden. Nach dem Abkühlen werden ggf. einige Körner Zinkgranulat (3.3) zugesetzt. Es wird entweder gemäß 5.2.1 oder 5.2.2 weiterverfahren.

5.2.1. Destillation von Schwefelsäure

In den Auffangkolben des Destillationsapparats werden je nach dem zu erwartenden Stickstoffgehalt genau 25 ml Schwefelsäure (3.5 oder 3.7) gebracht und einige Tropfen Methylrot-Indikator (3.8) hinzugefügt.

Der Aufschlusskolben wird mit dem Kühler des Destillationsapparats verbunden und das Ende des Kühlers mindestens 1 cm tief in die Flüssigkeit des Auffangkolbens gesenkt (siehe Bemerkung 8.3). Dann werden 100 ml Natriumhydroxidlösung (3.9) langsam in den Aufschlusskolben eingefüllt, wobei kein Ammoniak entweichen darf (siehe Bemerkung 8.1). Der Kolben wird so lange erhitzt, bis alles Ammoniak überdestilliert ist.

5.2.2. Destillation von Borsäure

Wird der Ammoniakgehalt des Destillats von Hand titriert, findet das im Folgenden beschriebene Verfahren Anwendung. Bei einem voll automatisierten Destilliergerät, das auch die Titration des Ammoniakgehalts des Destillats vornimmt, ist die Betriebsanleitung des Herstellers zu befolgen.

Ein Auffangkolben mit 25 bis 30 ml Borsäurelösung (3.18) wird so unter den Ablauf des Kühlers gestellt, dass sich das Ablaufrohr unter der Oberfläche der überschüssigen Borsäurelösung befindet. Das Destilliergerät wird so eingestellt, dass es 50 ml Natriumhydroxidlösung (3.9) abgibt. Die Bedienung des Destilliergeräts erfolgt entsprechend den Anleitungen des Herstellers. Anschließend wird das durch die Zugabe der Natriumhydroxidlösung freigesetzte Ammoniak abdestilliert. Das Destillat wird in der Borsäure (Auffangsäure) aufgefangen. Die Destillatmenge (Dauer der Dampfdestillation) hängt von der in der Probe enthaltenen Menge Stickstoff ab. Hierbei sind die Anleitungen des Herstellers zu befolgen.

Anmerkung : In einem halbautomatischen Destilliergerät erfolgen die Zugabe von überschüssigem Natriumhydroxid und die Dampfdestillation automatisch.

5.3. Titration

Es wird entweder gemäß 5.3.1 oder 5.3.2 weiterverfahren.

5.3.1. Schwefelsäure

Die überschüssige Schwefelsäure im Auffangkolben wird mit Natriumhydroxidlösung (3.10 oder 3.11) in Abhängigkeit von der Konzentration der verwendeten Schwefelsäure) titriert, bis der Endpunkt erreicht ist.

5.3.2. Borsäure

Der Inhalt des Auffangkolbens wird mit der volumetrischen Standardlösung der Salzsäure (3.19) oder mit der volumetrischen Standardlösung der Schwefelsäure (3.6) unter Verwendung einer Bürette titriert und die Menge des eingesetzten Titrationsmittels abgelesen.

Bei der kolorimetrischen Endpunktbestimmung ist der Endpunkt erreicht, wenn sich der Inhalt erstmals pink verfärbt. Die Bürette ist auf 0,05 ml genau abzulesen. Eine beleuchtete Magnetrührplatte oder ein fotometrischer Detektor können bei der Visualisierung des Endpunkts hilfreich sein.

Dies kann automatisch erfolgen bei Verwendung eines Wasserdampfdestillators mit automatischer Titration.

Hinsichtlich des Betriebs des jeweiligen Destillators bzw. des Destillier-/Titriergeräts sind die Anleitungen des Herstellers zu befolgen.

Anmerkung : Bei Verwendung eines automatischen Titrationssystems beginnt die Titration unmittelbar mit dem Start der Destillation, und es wird die 1 %ige Borsäurelösung (3.18) eingesetzt. Wird ein vollautomatisches Destilliergerät eingesetzt, kann die automatische Titration des Ammoniaks auch mittels Endpunktbestimmung unter Verwendung eines potenziometrischen pH-Systems durchgeführt werden. In diesem Fall wird eine automatische Titriervorrichtung mit einem pH-Meter verwendet. Das pH-Meter ist nach dem üblichen Labor-pH-Kalibrierverfahren ordnungsgemäß im Bereich pH 4 bis ph 7 zu kalibrieren. Der pH-Endpunkt der Titration ist bei einem pH-Wert von 4,6 erreicht, dem steilsten Punkt der Titrationskurve (Wendepunkt).

5.4. Blindversuch

Zur Bestätigung, dass die Reagenzien stickstofffrei sind, wird ein Blindversuch (Aufschluss, Destillation und Titration) mit 1 g Saccharose (3.14) anstelle der Probe durchgeführt.

6. Berechnung der Ergebnisse

Die Berechnungen werden gemäß 6.1 oder 6.2 durchgeführt.

6.1. Berechnung für die Titration nach 5.3.1

Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet:

wobei:

V0 = Volumen NaOH (3.10 oder 3.11), das im Blindversuch eingesetzt wurde, in ml,

V1 = Volumen NaOH (3.10 oder 3.11), das in der Titration der Probe eingesetzt wurde, in ml,

c = Konzentration des Natriumhydroxids (3.10 oder 3.11), in mol/l,

m = Probeneinwaage in g.

6.2. Berechnung für die Titration nach 5.3.2

6.2.1. Titration mit Salzsäure

Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet:

wobei:

m = Probeneinwaage in g,

c = Konzentration der volumetrischen Standardlösung von Salzsäure (3.19), in mol/l,

V0 = Volumen der Salzsäure, die im Blindversuch eingesetzt wurde, in ml,

V1 = Volumen der Salzsäure, die für die Probenmenge eingesetzt wurde, in ml.

6.2.2. Titration mit Schwefelsäure

Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet:

wobei:

m = Probeneinwaage in g,

c = Konzentration der volumetrischen Standardlösung von Schwefelsäure (3.6), in mol/l,

V0 = Volumen der Schwefelsäure (3.6), die im Blindversuch eingesetzt wurde, in ml,

V1 = Volumen der Schwefelsäure (3.6), die für die Probenmenge eingesetzt wurde, in ml.

7. Beurteilung des Verfahrens

7.1. Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

— 0,2 % absolut bei Gehalten von weniger als 20 % Rohprotein,

— 1,0 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 20 bis 40 % Rohprotein,

— 0,4 % absolut bei Gehalten von mehr als 40 % Rohprotein.

7.2. Genauigkeit

Die Analyse (Aufschluss, Destillation und Titration) wird mit 1,5 bis 2,0 g Acetanilid (3.13) in Gegenwart von 1 g Saccharose (3.14) durchgeführt; 1 g Acetanilid verbraucht 14,80 ml Schwefelsäure (3.5). Die Wiederfindung muss mindestens 99 % betragen.

8. Bemerkungen

8.1. Es können manuelle, halbautomatische oder automatische Geräte verwendet werden. Bei Geräten, die ein Umfüllen zwischen Aufschluss und Destillation erfordern, ist darauf zu achten, dass dies verlustlos geschieht. Verfügt der Destillationsapparat nicht über einen Tropftrichter, so erfolgt die Zugabe der Natriumhydroxidlösung unmittelbar vor dem Anschließen des Kolbens an den Kühler; die Flüssigkeit ist in diesem Fall langsam an den Kolbenwänden entlang laufen zu lassen.

8.2. Kommt es während des Aufschlusses zur Verfestigung der Mischung, ist mit der Bestimmung von vorn zu beginnen und eine größere als die oben genannte Menge an Schwefelsäure (3.4) zu verwenden.

8.3. Bei stickstoffarmen Proben kann die in den Auffangkolben einzufüllende Menge Schwefelsäure (3.7) gegebenenfalls auf 10 oder 15 ml verringert und mit Wasser auf 25 ml aufgefüllt werden.

8.4. Für Routineanalysen können auch andere Methoden zur Bestimmung des Rohproteins herangezogen werden; die in diesem Teil C beschriebene Kjeldahl-Methode ist jedoch die Referenzmethode. Die Gleichwertigkeit der Ergebnisse der alternativen Methode (z. B. DUMAS) im Vergleich zur Referenzmethode muss für jede Matrix einzeln nachgewiesen werden. Da die Ergebnisse einer alternativen Methode auch nach Feststellung ihrer Gleichwertigkeit leicht von den Ergebnissen der Referenzmethode abweichen können, muss im Analysebericht angegeben werden, welche Analyse zur Bestimmung des Rohproteins verwendet wurde.

D. BESTIMMUNG DES HARNSTOFFGEHALTS

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Harnstoffgehalts von Futtermitteln.

2. Prinzip

Die Probe wird unter Zusatz eines Klärungsmittels in Wasser suspendiert. Die Suspension wird filtriert. Nach Zugabe von 4-Dimethylaminobenzaldehyd (4-DMAB) wird der Gehalt an Harnstoff im Filtrat durch Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 420 nm bestimmt.

3. Reagenzien

3.1. 4-Dimethylaminobenzaldehydlösung: 1,6 g 4-DMAB werden in 100 ml 96 %igen Ethanols gelöst und 10 ml Salzsäure (ρ20 = 1,19 g/ml) hinzugefügt. Das Reagenz ist höchstens 2 Wochen haltbar.

3.2. Carrez-Lösung I: 21,9 g Zinkazetat, Zn(CH3COO)2·2H2O und 3 g Eisessig werden in Wasser gelöst und auf 100 ml mit Wasser aufgefüllt.

3.3. Carrez-Lösung II: 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat (II), K4Fe(CN)6·3H2O, werden in Wasser gelöst und auf 100 ml mit Wasser aufgefüllt.

3.4. Aktivkohle, keinen Harnstoff adsorbierend (zu prüfen).

3.5. Harnstofflösung (Massenkonzentration = 0,1 %).

4. Geräte

4.1. Mechanisches Schüttelgerät, ca. 35 bis 40 min-1.

4.2. Reagenzgläser: 160 × 16 mm, mit Schliffstopfen.

4.3. Spektralfotometer.

5. Verfahren

5.1. Analysengang der Probe

Von der Probe werden 2 g auf 1 mg genau eingewogen und mit 1 g Aktivkohle (3.4) in einen 500-ml-Messkolben gebracht. Hierzu werden 400 ml Wasser und 5 ml Carrez-Lösung I (3.2) gegeben, ca. 30 s gemischt und dann 5 ml Carrez-Lösung II (3.3) zugesetzt. Das Ganze wird 30 min lang im Schüttelgerät rotiert. Dann wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt, geschüttelt und filtriert.

Von den klaren und farblosen Filtraten werden je 5 ml in je ein Reagenzglas mit Schliffstopfen pipettiert, 5 ml 4-DMAB-Lösung (3.1) zugesetzt und gemischt. Die Gläser werden in einem Wasserbad bei 20 oC (+/– 4 oC) temperiert. Nach 15 min wird die Extinktion der Probenlösung im Vergleich mit der Blindprobenlösung der Reagenzien im Spektralfotometer bei 420 nm gemessen.

5.2. Kalibrationskurve

Volumen von 1, 2, 4, 5 bzw. 10 ml Harnstofflösung (3.5) werden entnommen, in je 100-ml-Messkolben gebracht und mit Wasser zur Marke aufgefüllt. Von jeder Lösung werden 5 ml mit je 5 ml 4-DMAB-Lösung (3.1) gemischt. Die Extinktion wird, wie oben angegeben, im Vergleich mit einer Lösung, die 5 ml 4-DMAB und 5 ml harnstofffreies Wasser enthält, gemessen. Es wird eine Kalibrationskurve aufgestellt.

6. Berechnung der Ergebnisse

Mithilfe der Kalibrationskurve ist die Menge an Harnstoff in der Versuchsprobe zu bestimmen.

Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken.

7. Bemerkungen

7.1. Bei einem Harnstoffgehalt von mehr als 3 % ist die Einwaage auf 1 g zu reduzieren bzw. die Anfangslösung so weit zu verdünnen, dass in 500 ml höchstens 50 mg Harnstoff enthalten sind.

7.2. Bei niedrigen Harnstoffgehalten wird die Einwaage erhöht, soweit das Filtrat klar und farblos bleibt.

7.3. Enthält die Probe einfache Stickstoffverbindungen, insbesondere Aminosäuren, so ist die Extinktion bei 435 nm zu messen.

E. BESTIMMUNG DES GEHALTS AN FLÜCHTIGEN STICKSTOFFHALTIGEN BASEN

I. DURCH MIKRODIFFUSION

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an flüchtigen stickstoffhaltigen Basen, ausgedrückt als Ammoniak, in Futtermitteln.

2. Prinzip

Die Probe wird mit Wasser extrahiert, die Lösung geklärt und filtriert. Die flüchtigen stickstoffhaltigen Basen werden nach Zusatz von Kaliumcarbonatlösung durch Mikrodiffusion abgetrennt, in einer Borsäurelösung aufgefangen und mit Schwefelsäure titriert.

3. Reagenzien

3.1. Trichloressigsäurelösung (Massenkonzentration = 20 %).

3.2. Indikator: 33 mg Bromkresolgrün und 65 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol (Volumenkonzentration = 95 bis 96 %) gelöst.

3.3. Borsäurelösung: 10 g Borsäure werden in einem 1-l-Messkolben in 200 ml Ethanol (Volumenkonzentration = 95 bis 96 %) und 700 ml Wasser gelöst. Vom Indikator (3.2) werden 10 ml hinzugefügt. Die Lösung wird gemischt und nötigenfalls unter Zusatz von Natriumhydroxidlösung auf eine hellrote Farbe gebracht. Von dieser Lösung kann 1 ml bis zu 300 μg NH3 binden.

3.4. Gesättigte Kaliumkarbonatlösung: 100 g Kaliumcarbonat werden in 100 ml siedendem Wasser gelöst. Nach dem Abkühlen wird die Lösung filtriert.

3.5. 0,01 mol/l Schwefelsäure.

4. Geräte

4.1. Mechanisches Schüttelgerät, ca. 35 bis 40 min-1.

4.2. Conwayschalen (vgl. Skizze) aus Glas oder Plastik.

4.3. Mikrobüretten mit 0,01 -ml-Einteilung.

5. Verfahren

Von der Probe werden 10 g auf 1 mg genau gewogen, mit 100 ml Wasser in einen 200-ml-Messkolben gegeben und 30 min lang im Schüttelgerät gemischt oder verrührt. Dann werden 50 ml Trichloressigsäurelösung (3.1) hinzugefügt, mit Wasser zur Marke aufgefüllt, kräftig geschüttelt und durch einen Faltenfilter filtriert.

In die Mitte der Conwayschale wird 1 ml Borsäurelösung (3.3) und in den Ring der Schale 1 ml des Probenfiltrats pipettiert. Die Schale wird mit dem angefetteten Deckel teilweise bedeckt; dann wird schnell 1 ml der gesättigten Kaliumcarbonatlösung (3.4) in den Ring gegeben und die Schale luftdicht verschlossen. Um mit Sicherheit eine Mischung der beiden Reagenzien zu erreichen, wird die Schale vorsichtig in waagerechter Stellung gedreht. Darauf lässt man das Ganze mindestens 4 h lang bei Raumtemperatur oder 1 h lang bei 40 oC stehen.

Die in der Borsäurelösung enthaltenen flüchtigen Basen werden anschließend mit Schwefelsäure (3.5) unter Verwendung einer Mikrobürette (4.3) titriert.

Nach demselben Verfahren ist ein Blindversuch ohne die zu analysierende Probe durchzuführen.

6. Berechnung der Ergebnisse

1 ml H2SO4 (0,01 mol/l) entspricht 0,34 mg Ammoniak.

Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken.

Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

— 10 % relativ bei Ammoniakgehalten von weniger als 1,0 %,

— 0,1 % absolut bei Ammoniakgehalten von 1,0 % oder mehr.

7. Bemerkung

Enthält die Probe mehr als 0,6 % Ammoniak, ist das ursprüngliche Filtrat zu verdünnen.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II. DURCH DESTILLATION

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an flüchtigen stickstoffhaltigen Basen, ausgedrückt als Ammoniak, in Fischmehl, das praktisch keinen Harnstoff enthält. Sie ist nur anzuwenden bei Gehalten < 0,25 % Ammoniak.

2. Prinzip

Die Probe wird mit Wasser extrahiert, die Lösung geklärt und filtriert. Die flüchtigen stickstoffhaltigen Basen werden nach Zusatz von Magnesiumoxid in der Siedehitze abgetrennt und in einer definierten Menge Schwefelsäure aufgefangen, deren Überschuss durch Natriumhydroxidlösung zurücktitriert wird.

3. Reagenzien

3.1. Trichloressigsäurelösung (Massenkonzentration = 20 %).

3.2. Magnesiumoxid.

3.3. Antischaumemulsion (z. B. Silikon).

3.4. 0,05 mol/l Schwefelsäure.

3.5. 0,1 mol/l Natriumhydroxidlösung.

3.6. Methylrotlösung 0,3 %, in Ethanol (Volumenkonzentration = 95 bis 96 %).

4. Geräte

4.1. Mechanisches Schüttelgerät, ca. 35 bis 40 min-1.

4.2. Destillationsapparatur nach Kjeldahl.

5. Verfahren

Von der Probe werden 10 g auf 1 mg genau gewogen, mit 100 ml Wasser in einen 200-ml-Messkolben gegeben und 30 min lang im Schüttelgerät gemischt oder gerührt. Dann werden 50 ml Trichloressigsäurelösung (3.1) hinzugefügt, es wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt, kräftig geschüttelt und durch einen Faltenfilter filtriert.

Je nach dem vermuteten Gehalt an flüchtigen stickstoffhaltigen Basen wird eine entsprechende Menge (im Allgemeinen 100 ml) des klaren Filtrats auf 200 ml verdünnt und 2 g Magnesiumoxid (3.2) sowie einige Tropfen Antischaumemulsion (3.3) hinzugefügt. Die Lösung muss gegen Lackmuspapier alkalisch reagieren; anderenfalls ist noch Magnesiumoxid (3.2) zuzusetzen. Es ist gemäß 5.2 und 5.3 der Analysenmethode zur Bestimmung des Rohproteingehalts (Teil C dieses Anhangs) weiterzuverfahren.

Nach demselben Verfahren ist ein Blindversuch ohne die zu analysierende Probe durchzuführen.

6. Berechnung der Ergebnisse

1 ml H2SO4 (0,05 mol/l) entspricht 1,7 mg Ammoniak.

Das Ergebnis ist als Prozentsatz der Probe auszudrücken.

Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 10 % (relativ) Ammoniak nicht überschreiten.

F. BESTIMMUNG DES GEHALTS AN AMINOSÄUREN (AUSSER TRYPTOPHAN)

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an freien (synthetischen und natürlichen) sowie der gesamten (peptidgebundenen und freien) Aminosäuren in Futtermitteln unter Verwendung eines Aminosäureanalysators. Die Methode ist für folgende Aminosäuren anwendbar: Cyst(e)in, Methionin, Lysin, Threonin, Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Tyrosin und Valin.

Die Methode unterscheidet nicht zwischen Salzen von Aminosäuren und dient auch nicht zur Unterscheidung der D- und L-Formen der Aminosäuren. Sie ist nicht zur Bestimmung des Gehalts an Tryptophan oder Hydroxyanaloga der Aminosäuren anwendbar.

2. Prinzip

2.1. Freie Aminosäuren

Die freien Aminosäuren werden mit verdünnter Salzsäure extrahiert. Mitextrahierte stickstoffhaltige Makromoleküle werden mit Sulfosalicylsäure ausgefällt und durch Filtrieren entfernt. Die filtrierte Lösung wird auf einen pH-Wert von 2,20 eingestellt. Die Aminosäuren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrennt und nach Reaktion mit Ninhydrin durch fotometrischen Nachweis bei 570 nm bestimmt.

2.2. Gesamtaminosäuren

Die gewählte Methode hängt von den zu untersuchenden Aminosäuren ab. Cyst(e)in und Methionin müssen vor der Hydrolyse zu Cysteinsäure bzw. Methioninsulfon oxidiert werden. Tyrosin muss im Hydrolysat der nicht oxidierten Probe bestimmt werden. Alle übrigen unter 1 genannten Aminosäuren können aus dem Hydrolysat der oxidierten oder der nicht oxidierten Probe bestimmt werden.

Die Oxidation wird bei 0 oC mit einer Perameisensäure-Phenol-Mischung durchgeführt. Überschüssiges Oxidationsreagenz wird mit Natriumdisulfit zerstört. Die oxidierte bzw. die nicht oxidierte Probe wird mit Salzsäure (3.20) 23 h lang hydrolysiert. Das Hydrolysat wird auf einen pH-Wert von 2,20 eingestellt. Die Aminosäuren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrennt und nach Reaktion mit Ninhydrin fotometrisch bei 570 nm (bei Prolin 440 nm) bestimmt.

3. Reagenzien

Es ist bidestilliertes Wasser oder Wasser gleichwertiger Qualität zu verwenden (Leitfähigkeit < 10 μS/cm).

3.1. Wasserstoffperoxid, w (Massenanteil) = 30 %.

3.2. Ameisensäure, w (Massenanteil) = 98 bis 100 %.

3.3. Phenol.

3.4. Natriumdisulfit.

3.5. Natriumhydroxid.

3.6. 5-Sulfosalicylsäure-Dihydrat.

3.7. Salzsäure, Dichte ca. 1,18 g/ml.

3.8. Tri-Natriumcitrat-Dihydrat.

3.9. 2,2 ′-Thiodiethanol (Thiodiglycol).

3.10. Natriumchlorid.

3.11. Ninhydrin.

3.12. Petrolether, Siedeintervall 40 bis 60 oC.

3.13. Norleucin oder sonstige für die Verwendung als interner Standard geeignete Verbindung.

3.14. Stickstoffgas (< 10 ppm Sauerstoff).

3.15. 1-Octanol.

3.16. Aminosäuren.

3.16.1. Standardstoffe gemäß Auflistung unter 1. Es dürfen nur reine Verbindungen ohne Kristallwasser verwendet werden. Sie sind vor der Verwendung im Vakuum über P2O5 oder H2SO4 1 Woche lang zu trocknen.

3.16.2. Cysteinsäure.

3.16.3. Methioninsulfon.

3.17. Natriumhydroxidlösung, c = 7,5 mol/l:

300 g NaOH (3.5) in Wasser lösen und auf 1 l auffüllen.

3.18. Natriumhydroxidlösung, c = 1 mol/l:

40 g NaOH (3.5) in Wasser lösen und auf 1 l auffüllen.

3.19. Phenolhaltige Ameisensäurelösung:

889 g Ameisensäure (3.2) werden mit 111 g Wasser gemischt; anschließend werden 4,73 g Phenol (3.3) hinzugefügt.

3.20. Hydrolysemischung, c = 6 mol HCl/l unter Zusatz von 1 g Phenol/l:

Zu 492 ml HCl (3.7) wird 1 g Phenol (3.3) hinzugefügt und mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.21. Extraktionslösung, c = 0,1 mol HCl/l, 2 % Thiodiglycol enthaltend: 8,2 ml HCl (3.7) werden in ca. 900 ml Wasser gegeben, 20 ml Thiodiglycol (3.9) hinzugefügt, und es wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt (3.7 und 3.9 dürfen nicht unmittelbar gemischt werden).

3.22. 5-Sulfosalicylsäurelösung, β = 6 %:

60 g 5-Sulfosalicylsäure (3.6) in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 l auffüllen.

3.23. Oxidationsmischung (Perameisensäure-Phenol):

0,5 ml Wasserstoffperoxid (3.1) werden mit 4,5 ml phenolhaltiger Ameisensäurelösung (3.19) in einem kleinen Becherglas gemischt. Es wird bei 20 bis 30 oC 1 h stehen gelassen, um die Bildung von Perameisensäure zu bewirken. Anschließend wird die Lösung 15 min in ein Eisbad gestellt, bevor sie der Probe zugegeben wird.

Vorsicht: Hautkontakt vermeiden und Schutzkleidung tragen.

3.24. Citratpufferlösung, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20 :

19,61 g Natriumcitrat (3.8), 5 ml Thiodiglycol (3.9), 1 g Phenol (3.3) und 16,50 ml HCl (3.7) werden in ca. 800 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert wird auf 2,20 eingestellt. Mit Wasser auf 1 l auffüllen.

3.25. Elutionspuffer entsprechend den Anforderungen des verwendeten Gerätes (4.9).

3.26. Ninhydrinreagenz entsprechend den Bedingungen des verwendeten Gerätes (4.9).

3.27. Aminosäuren-Standardlösungen: Diese Lösungen sind bei < 5 oC aufzubewahren.

3.27.1. Aminosäuren-Standard-Stammlösung (3.16.1):

c = 2,5 μmol/ml je Aminosäure in Salzsäure

Diese Lösung ist im Handel erhältlich.

3.27.2. Standard-Stammlösung von Cysteinsäure und Methioninsulfon, c = 1,25 μmol/ml:

0,2115 g Cysteinsäure (3.16.2) und 0,2265 g Methioninsulfon (3.16.3) werden in Citratpufferlösung (3.24) in einem 1 000 -ml-Messkolben gelöst, und es wird mit Citratpufferlösung zur Marke aufgefüllt. Die Lösung ist bei < 5 oC höchstens 12 Monate haltbar. Sie wird nicht benötigt, falls die Standard-Stammlösung (3.27.1) bereits Cysteinsäure und Methioninsulfon enthält.

3.27.3. Stammlösung des internen Standards, z. B. Norleucin, c = 20 μmol/ml:

0,6560 g Norleucin (3.13) werden in Citratpufferlösung (3.24) in einem Messkolben gelöst, und es wird mit Citratpufferlösung auf 250 ml aufgefüllt. Diese Lösung ist bei < 5 oC höchstens 6 Monate haltbar.

3.27.4. Aminosäurenkalibrierlösung zur Verwendung bei Hydrolysaten, c = 5 nmol/50 μl Cysteinsäure und Methioninsulfon und c = 10 nmol/50 μl der übrigen Aminosäuren: 2,2 g Natriumchlorid (3.10) werden in einem 100-ml-Becherglas in 30 ml Citratpufferlösung (3.24) gelöst. Es werden 4,00 ml Standard-Stammlösung der Aminosäuren (3.27.1), 4,00 ml Standard-Stammlösung von Cysteinsäure und Methinoninsulfon (3.27.2), und, falls verwendet, 0,50 ml Stammlösung des internen Standards (3.27.3) hinzugefügt. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid (3.18) auf 2,20 eingestellt.

Die Lösung wird quantitativ in einen 50-ml-Messkolben überführt, und es wird mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt und gemischt.

Die Lösung ist bei < 5 oC höchstens 3 Monate haltbar.

Siehe auch Bemerkungen unter 9.1.

3.27.5. Aminosäurenkalibrierlösung zur Verwendung bei Hydrolysaten gemäß 5.3.3.1 und bei Extrakten gemäß 5.2. Die Kalibrierlösung wird gemäß 3.27.4 hergestellt, jedoch ohne Zugabe von Natriumchlorid.

Die Lösung ist bei < 5 oC höchstens 3 Monate haltbar.

4. Geräte

4.1. 100- oder 250-ml-Rundkolben mit Rückflusskühler.

4.2. 100-ml-Borosilikat-Glasflaschen mit Schraubverschluss mit Gummidichtung/teflonbeschichteter Dichtung (z. B. Duran, Schott).

4.3. Trockenschrank mit forcierter Umluft, auf ± 2 oC regelbar.

4.4. pH-Meter (auf drei Dezimalstellen genau).

4.5. Membranfilter, 0,22 μm Porengröße.

4.6. Zentrifuge.

4.7. Vakuum-Rotationsverdampfer.

4.8. Mechanischer Schüttler oder Magnetrührer.

4.9. Aminosäureanalysator oder HPLC-Einrichtung mit Ionenaustauschersäule, Einrichtung für Ninhydrin-Nachsäulenderivatisierung und Fotometer.

Die Säule wird mit sulfoniertem Polystyrolharz gefüllt, das die Trennung der einzelnen Aminosäuren und deren Abtrennung von sonstigen Ninhydrin-positiven Substanzen ermöglicht. Die Pumpen für die Ninhydrin- und für die Pufferlösungen müssen über den Zeitraum des Kalibrationslaufes und des Probenlaufes eine Flussstabilität von ±0,5 % gewährleisten.

Bei einigen Aminosäureanalysatoren können auch Hydrolyseverfahren angewandt werden, wenn die Hydrolysate Natriumionenkonzentrationen von c = 0,8 mol/l aufweisen und die restliche Ameisensäure des Oxidationsschrittes enthalten. Andere Analysatoren bieten keine befriedigende Abtrennung bestimmter Aminosäuren, falls das Hydrolysat überschüssige Ameisensäure und/oder hohe Natriumionenkonzentrationen aufweist. In diesem Fall wird das Säurevolumen nach der Hydrolyse und vor der pH-Wert-Einstellung durch Einengen auf ca. 5 ml reduziert. Das Einengen ist unter Vakuum bei höchstens 40 oC vorzunehmen.

5. Verfahren

5.1. Vorbereitung der Probe

Die Probe wird so fein vermahlen, dass sie ein Sieb mit 0,5 mm Maschenweite passieren kann. Proben mit hohem Feuchtigkeitsgehalt müssen vor dem Vermahlen entweder bei einer Temperatur von höchstens 50 oC luftgetrocknet oder aber gefriergetrocknet werden. Proben mit hohem Fettgehalt sind vor dem Vermahlen mit Petrolether (3.12) zu extrahieren.

5.2. Bestimmung des Gehalts an freien Aminosäuren in Futtermitteln und Vormischungen

Eine geeignete Menge (1 bis 5 g) der vorbereiteten Probe (5.1) auf 0,2 mg genau in einen Erlenmeyerkolben einwiegen und 100,0 ml Extraktionslösung (3.21) hinzufügen. Mit einem mechanischen Schüttler 60 min schütteln bzw. mit einem Magnetrührer (4.8) rühren. Nach dem Absetzen lassen werden mit einer Pipette 10,0 ml der überstehenden Lösung in ein 100-ml-Becherglas gegeben.

Es werden 5,0 ml Sulfosalicylsäurelösung (3.22) unter Rühren hinzugefügt, und mithilfe des Magnetrührers wird 5 min weitergerührt. Die überstehende Lösung wird filtriert oder zentrifugiert, um alle Ausfällungen zu entfernen. Von der klaren Lösung werden 10,0 ml in ein 100-ml-Becherglas gegeben, und unter Verwendung von Natriumhydroxidlösung (3.18) wird der pH-Wert auf 2,20 eingestellt. Die Lösung wird mit Citratpufferlösung (3.24) in einen Messkolben geeigneter Größe überführt und mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt.

Bei Verwendung eines internen Standards werden vor dem Auffüllen 1,00 ml der Stammlösung des internen Standards (3.27.3) für jeweils 100 ml Endlösung hinzugefügt und mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt.

Anschließend wird die Chromatografie gemäß 5.4 durchgeführt.

Werden die Extrakte nicht am selben Tag chromatografiert, sind sie bei < 5 oC aufzubewahren.

5.3. Bestimmung des Gehalts an Gesamtaminosäuren

5.3.1. Oxidation

0,1 bis 1 g der vorbereiteten Probe (5.1) werden auf 0,2 mg genau eingewogen

— in einen 100-ml-Rundkolben (4.1) für die offene Hydrolyse (5.3.2.3) oder

— in einen 250-ml-Rundkolben (4.1), falls eine niedrige Natriumionenkonzentration (5.3.3.1) erforderlich ist, oder

— in eine 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss (4.2) für die geschlossene Hydrolyse (5.3.2.4).

Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von etwa 10 mg und einen Feuchtigkeitsgehalt von höchstens 100 mg haben.

Der Kolben/die Flasche wird in ein Eisbad gestellt und auf 0 oC abgekühlt. Dann werden 5 ml der Oxidationsmischung (3.23) hinzugefügt, und es wird mithilfe eines Glasspatels mit gebogener Spitze gemischt. Der Behälter, der den Spatel enthält, wird mit einer luftdichten Folie verschlossen, das Eiswasserbad mit dem verschlossenen Behälter in einen Kühlschrank mit einer Temperatur von 0 oC gestellt und 16 h stehen gelassen. Nach 16 h wird der Behälter aus dem Kühlschrank genommen und das überschüssige Oxidationsreagenz durch Zusatz von 0,84 g Natriumdisulfit (3.4) zersetzt.

Es wird gemäß 5.3.2.1 weiterverfahren.

5.3.2. Hydrolyse

5.3.2.1. Hydrolyse der oxidierten Proben

Zu der oxidierten Probe (die gemäß 5.3.1 vorbereitet wurde) werden 25 ml Hydrolysemischung (3.20) gegeben. Dabei ist darauf zu achten, dass alle Probenrückstände, die an den Seitenwänden des Gefäßes sowie am Spatel haften, abgewaschen werden.

Je nach dem verwendeten Hydrolyseverfahren wird gemäß 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 weiterverfahren.

5.3.2.2. Hydrolyse der nicht oxidierten Proben

In einen 100-ml- oder 250-ml-Rundkolben (4.1) bzw. in eine 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss (4.2) werden 0,1 bis 1 g der vorbereiteten Probe (5.1) auf 0,2 mg genau eingewogen. Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von ca. 10 mg aufweisen. Vorsichtig 25 ml Hydrolysemischung (3.20) hinzufügen und mit der Probe vermischen. Es wird entweder gemäß 5.3.2.3 oder gemäß 5.3.2.4 weiterverfahren.

5.3.2.3. Offene Hydrolyse (Rückflusshydrolyse)

Zu der nach 5.3.2.1 oder 5.3.2.2 hergestellten Mischung werden 3 Glasperlen hinzugegeben. Sie wird zum Sieden erhitzt und unter Rückfluss genau 23 h am Sieden gehalten. Nach Beendigung der Hydrolyse wird der Rückflusskühler mit 5 ml Citratpufferlösung (3.24) gespült und der abgehängte Kolben im Eisbad gekühlt.

Es wird gemäß 5.3.3 weiterverfahren.

5.3.2.4. Geschlossene Hydrolyse

Die Flasche mit der nach 5.3.2.1 oder 5.3.2.2 vorbereiteten Mischung wird bei 110 oC in den Trockenschrank (4.3) gestellt. Um einen durch Gasentwicklung hervorgerufenen Druckaufbau zu vermeiden und eine Explosion zu verhindern, wird der Schraubverschluss während der ersten Stunde nur lose auf die Flasche gelegt. Die Flasche darf nicht verschlossen werden. Nach 1 h wird die Flasche mit dem Deckel fest verschlossen und 23 h im Trockenschrank (4.3) belassen. Nach Beendigung der Hydrolyse wird die Flasche aus dem Trockenschrank genommen, der Verschluss vorsichtig geöffnet, die Flasche in ein Eisbad gestellt und abkühlen gelassen.

Je nach dem Verfahren für die pH-Wert-Einstellung (5.3.3) wird der Inhalt der Flasche quantitativ mit Citratpufferlösung (3.24) in ein 250-ml-Becherglas oder in einen 250-ml-Rundkolben überführt.

Es wird gemäß 5.3.3 weiterverfahren.

5.3.3. pH-Wert-Einstellung

Je nach der Natriumionentoleranz des Aminosäureanalysators (4.9) wird die pH-Wert-Einstellung gemäß 5.3.3.1 oder 5.3.3.2 vorgenommen.

5.3.3.1. Für Aminosäureanalysatoren oder HPLC-Einrichtungen (4.9), die eine niedrige Natriumionenkonzentration erfordern

Werden Aminosäureanalysatoren verwendet, bei denen eine geringe Natriumionenkonzentration erforderlich ist (wenn also das Säurevolumen reduziert werden muss), wird die Verwendung einer Stammlösung eines internen Standards (3.27.3) empfohlen.

In diesem Fall sind dem Hydrolysat vor dem Verdampfen 2,00 ml der internen Standardlösung (3.27.3) hinzuzufügen.

Zu dem nach 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 erhaltenen Hydrolysat werden 2 Tropfen 1-Octanol (3.15) gegeben.

Das Volumen wird am Rotationsverdampfer (4.7) unter Vakuum bei 40 oC auf 5 bis 10 ml reduziert. Wurde das Volumen beim Einengen versehentlich auf weniger als 5 ml reduziert, wird das Hydrolysat verworfen und die Analyse wiederholt.

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung (3.18) auf 2,20 eingestellt, und es wird gemäß 5.3.4 weiterverfahren.

5.3.3.2. Für alle sonstigen Aminosäureanalysatoren (4.9)

Die nach 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 erhaltenen Hydrolysate werden durch vorsichtige Zugabe unter Rühren von 17 ml Natriumhydroxidlösung (3.17) teilweise neutralisiert, wobei eine Temperatur von unter 40 oC eingehalten werden muss.

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung (3.17 und anschließend 3.18) bei Raumtemperatur auf 2,20 eingestellt, und es wird gemäß 5.3.4 weiterverfahren.

5.3.4. Probenlösung für die Chromatografie

Das auf pH 2,20 eingestellte Hydrolysat (5.3.3.1 oder 5.3.3.2) wird mit Citratpufferlösung (3.24) quantitativ in einen 200-ml-Messkolben überführt und mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt.

Falls bisher noch kein interner Standard hinzugefügt worden ist, werden vor dem Auffüllen 2,00 ml des internen Standards (3.27.3) hinzugegeben und dann mit Citratpufferlösung (3.24) zur Marke aufgefüllt. Es wird sorgfältig gemischt.

Anschließend wird die Chromatografie gemäß 5.4 durchgeführt.

Falls die Probenlösungen nicht am selben Tag chromatografiert werden, sind sie bei < 5 oC aufzubewahren.

5.4. Chromatografie

Falls erforderlich, wird der Extrakt (5.2) oder das Hydrolysat (5.3.4) vor der Chromatografie auf Raumtemperatur gebracht. Die Mischung wird geschüttelt und eine geeignete Menge durch einen 0,22 -μm-Membranfilter (4.5) filtriert. Die so erhaltene klare Lösung wird der Ionenaustauschchromatografie unter Verwendung eines Aminosäureanalysators bzw. einer HPLC-Einrichtung (4.9) unterzogen.

Die Einspritzung kann von Hand oder automatisch erfolgen. Wesentlich ist, dass jeweils die gleiche Menge ± 0,5 % der Standardlösung und der Probenlösung eingespritzt wird, es sei denn, es wird ein interner Standard verwendet. Das Verhältnis der Konzentrationen von Natriumionen und Aminosäuren sollte in der Standard- und der Probenlösung so ähnlich wie möglich sein.

Die Häufigkeit von Kalibrationsläufen hängt von der Stabilität des Ninhydrinreagenzes und des Analysatorsystems ab. Die Standardlösung oder die Probenlösung wird mit Citratpufferlösung (3.24) so verdünnt, dass die Peakfläche des Standards etwa 30 bis 200 % der Peakfläche der einzelnen Aminosäuren in der Probenlösung ausmacht.

Die Chromatografie der Aminosäuren unterscheidet sich leicht je nach Art des verwendeten Analysators und des eingesetzten Harzes. Das System muss in der Lage sein, die Aminosäuren vollständig voneinander und von den sonstigen Ninhydrin-positiven Substanzen zu trennen. Im Betriebsbereich muss das chromatografische System bei Änderungen der Aminosäuremengen, die der Säule hinzugefügt wird, eine lineare Reaktion aufweisen.

Wird eine equimolare Lösung der zu bestimmenden Aminosäuren analysiert, sollten bei der Chromatografie die unten angegebenen Verhältnisse von Tal zu Peakhöhe zwischen den überlappenden Peaks erreicht werden. Diese equimolare Lösung muss mindestens 30 % der maximalen Menge jeder Aminosäure enthalten, die mit dem jeweiligen Aminosäureanalysator (4.9) noch präzise bestimmt werden kann.

Für die Trennung von Threonin-Serin darf das Verhältnis von Tal zur Peakhöhe des niedrigeren der 2 sich überlappenden Peaks auf dem Chromatogramm nicht mehr als 2:10 betragen (wenn nur Cyst(e)in, Methionin, Threonin und Lysin bestimmt werden, beeinträchtigt eine unzureichende Trennung von angrenzenden Peaks die Bestimmung). Für alle übrigen Aminosäuren sollte die Trennung besser als 1:10 sein.

Das System muss gewährleisten, dass Lysin von „Lysinartefakten“ und Omithin abgetrennt wird.

6. Berechnung der Ergebnisse

Die Flächen der Proben- und der Kalibrationsstandardpeaks werden für jede einzelne Aminosäure bestimmt und der Gehalt (X) in g Aminosäure je kg Probe berechnet:

Bei Verwendung eines internen Standards ist zu multiplizieren mit

A = Peakfläche, Hydrolysat oder Extrakt

B = Peakfläche, Kalibrierstandardlösung

C = Peakfläche, interner Standard im Hydrolysat oder Extrakt

D = Peakfläche, interner Standard, Kalibrierstandardlösung

M = Molmasse der zu bestimmenden Aminosäure

c = Konzentration des Standards in μmol/ml

m = Probeneinwaage (auf Originalgewicht berichtigt, falls getrocknet oder entfettet), in g

V = Gesamtvolumen des Hydrolysats (5.3.4) in ml oder errechnetes Gesamtverdünnungsvolumen des Extrakts (6.1) in ml

Sowohl Cystin als auch Cystein werden im Hydrolysat der oxidierten Probe als Cysteinsäure bestimmt, jedoch als Cystin (C6H12N2O4S2, M = 240,30 g/mol) unter Verwendung der Molmasse von 120,15 g/mol (0,5 × 240,30 g/mol) berechnet.

Methionin wird als Methioninsulfon in Hydrolysaten der oxidierten Probe bestimmt, aber unter Verwendung des M von Methionin (149,21 g/mol) als Methionin berechnet.

Zugesetztes freies Methionin wird nach Extraktion als Methionin bestimmt, wobei für die Berechnung das gleiche M verwendet wird.

6.1. Das Gesamtverdünnungsvolumen der Extrakte (F) für die Bestimmung des Gehalts an freien Aminosäuren (5.2) wird wie folgt berechnet:

V = Volumen des Endextrakts.

7. Beurteilung des Verfahrens

Das Verfahren ist in einem auf internationaler Ebene im Jahr 1990 durchgeführten Vergleichstest an 4 verschiedenen Futtermitteln (Mischfuttermittel für Schweine, Mischfuttermittel für Mastküken, Eiweißkonzentrat und einer Vormischung) erprobt worden. Die nach der Eliminierung von Ausreißern erhaltenen Ergebnisse (Mittelwerte und Standardabweichungen) sind in den Tabellen unter diesem Punkt dargestellt.







Mittelwerte in g/kg Referenzmaterial Aminosäure Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Schweinemischfutter 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Mastkükenmischfutter 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Eiweißkonzentrat 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Vormischung 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.

7.1. Wiederholbarkeit

Für die untersuchten Aminosäuren wurde die Wiederholbarkeit ermittelt. Sie ist, ausgedrückt als Standardabweichung der Wiederholbarkeit, für den oben genannten Vergleichstest in der folgenden Tabelle dargestellt.







Standardabweichung der Wiederholbarkeit (sr) in g/kg Referenzmaterial Aminosäure Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Schweinemischfutter 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Mastkükenmischfutter 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Eiweißkonzentrat 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Vormischung 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.







Variationskoeffizient (%) für die Standardabweichung der Wiederholbarkeit (sr) Referenzmaterial Aminosäure Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Schweinemischfutter 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Mastkükenmischfutter 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Eiweißkonzentrat 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Vormischung 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.

7.2. Vergleichbarkeit

Die Ergebnisse hinsichtlich der Standardabweichung der Vergleichbarkeit, die sich aus den oben genannten Untersuchungen ergeben, sind in nachstehender Tabelle dargestellt.







Standardabweichung der Vergleichbarkeit (sR) in g/kg Referenzmaterial Aminosäure Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Schweinemischfutter 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Mastkükenmischfutter 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Eiweißkonzentrat 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Vormischung 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.







Variationskoeffizient (%) für die Standardabweichung der Vergleichbarkeit (sR) Referenzmaterial Aminosäure Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin Schweinemischfutter 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Mastkükenmischfutter 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Eiweißkonzentrat 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Vormischung 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = Anzahl der beteiligten Laboratorien.

8. Verwendung von Referenzmaterialien

Die korrekte Anwendung der Methode ist durch Mehrfachbestimmungen an zertifizierten Referenzmaterialien (soweit verfügbar) zu überprüfen. Für die Kalibration wird die Verwendung einer zertifizierten Aminosäurestandardlösung empfohlen.

9. Bemerkungen

9.1. Wegen der Unterschiede zwischen den Aminosäureanalysatoren sind die Endkonzentrationen der Aminosäurenkalibrierlösungen (3.27.4 und 3.27.5) und der Hydrolysate (5.3.4) als Richtwerte anzusehen.

Der lineare Reaktionsbereich des Geräts muss für alle Aminosäuren geprüft werden.

Die Standardlösung wird mit Citratpufferlösung verdünnt, um Peakflächen in der Mitte des Bereichs zu erhalten.

9.2. Falls Geräte für die Hochleistungsflüssigkeitschromatografie zur Analyse der Hydrolysate eingesetzt werden, sind die Versuchsbedingungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers zu optimieren.

9.3. Wird diese Methode für Futtermittel angewandt, die mehr als 1 % Chlorid enthalten (Kraftfuttermittel, Mineralfuttermittel, Ergänzungsfuttermittel), so könnte der Methioningehalt unterschätzt werden, und es ist eine modifizierte Oxidation erforderlich.

G. BESTIMMUNG DES TRYPTOPHANGEHALTS

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gesamtgehalts an Tryptophan und des Gehalts an freiem Tryptophan in Futtermitteln. Sie dient nicht zur Unterscheidung zwischen D- und L-Formen.

2. Prinzip

Zur Bestimmung des Gesamtgehalts an Tryptophan wird die Probe unter alkalischen Bedingungen mit gesättigter Bariumhydroxid-Lösung hydrolysiert, auf 110 oC erhitzt und 20 h auf dieser Temperatur gehalten. Nach der Hydrolyse wird ein interner Standard zugegeben.

Zur Bestimmung des Gehalts an freiem Tryptophan wird die Probe unter leicht sauren Bedingungen in Gegenwart eines internen Standards extrahiert.

Tryptophan und der interne Standard im Hydrolysat bzw. im Extrakt werden durch HPLC mit Fluoreszenzdetektor bestimmt.

3. Reagenzien

3.1. Es ist bidestilliertes Wasser oder Wasser gleichwertiger Qualität zu verwenden (Leitfähigkeit < 10 μS/cm).

3.2. Standardsubstanz: Tryptophan (Reinheit/Gehalt ≥ 99 %), im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.

3.3. Interner Standard: α-Methyl-Tryptophan (Reinheit/Gehalt ≥ 99 %), im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.

3.4. Bariumhydroxid-Octahydrat (das Ba(OH)2·8H2O darf nicht übermäßig der Luft ausgesetzt werden, um die Bildung von BaCO3 zu vermeiden, das die Bestimmung beeinträchtigen könnte) (siehe Bemerkung 9.3).

3.5. Natriumhydroxid.

3.6. Orthophosphorsäure, w (Massenanteil) = 85 %.

3.7. Salzsäure, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8. Methanol, HPLC-Qualität.

3.9. Petrolether, Siedeintervall 40 bis 60 oC.

3.10. Natriumhydroxidlösung, c = 1 mol/l:

40,0 g NaOH (3.5) in Wasser lösen und mit Wasser (3.1) auf 1 l auffüllen.

3.11. Salzsäure, c = 6 mol/l:

492 ml HCl (3.7) mit Wasser auf 1 l auffüllen.

3.12. Salzsäure, c = 1 mol/l:

82 ml HCl (3.7) mit Wasser auf 1 l auffüllen.

3.13. Salzsäure, c = 0,1 mol/l:

8,2 ml HCl (3.7) mit Wasser auf 1 l auffüllen.

3.14. Orthophosphorsäure, c = 0,5 mol/l:

34 ml Orthophosphorsäure (3.6) mit Wasser (3.1) auf 1 l auffüllen.

3.15. Konzentrierte Tryptophanlösung (3.2), c = 2,50 μmol/ml:

0,2553 g Tryptophan (3.2) in einem