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übernehmen  
►B VERORDNUNG (EG) Nr. 440/2008 DER KOMMISSION  
vom 30. Mai 2008  
zur Festlegung von Prüfmethoden gemäß der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen 
Parlaments und des Rates zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer 
Stoffe (REACH)  
(Text von Bedeutung für den EWR)  
(ABl. L 142 vom 31.5.2008, S. 1)  
Geändert durch:  
Amtsblatt  
Nr. Seite  Datum  
►M1 Verordnung (EG) Nr. 761/2009 der Kommission vom 23. Juli 2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Verordnung (EU) Nr. 1152/2010 der Kommission vom 8. Dezember 
2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Verordnung (EU) Nr. 640/2012 der Kommission vom 6. Juli 2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Verordnung (EU) Nr. 260/2014 des Europäischen Parlaments und des 
Rates vom 26. Februar 2014  L 81  1  19.3.2014  2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1
VERORDNUNG (EG) Nr. 440/2008 DER KOMMISSION  
vom 30. Mai 2008  
zur Festlegung von Prüfmethoden gemäß der Verordnung (EG) 
Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung 
chemischer Stoffe (REACH)
 
(Text von Bedeutung für den EWR)  
DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN —  
gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft,  
gestützt auf die Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Par ­
laments und des Rates vom 18. Dezember 2006 zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH), zur Schaffung einer Europäischen Agentur für chemische Stoffe, zur Änderung der Richtlinie 1999/45/EG und zur Aufhebung der Verord ­
nung (EWG) Nr. 793/93 des Rates, der Verordnung (EG) Nr. 1488/94 
der Kommission, der Richtlinie 76/769/EWG des Rates sowie der Richt ­
linien 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/EG und 2000/21/EG der Kommission (
 1 ), insbesondere auf Artikel 13 Absatz 3,  
in Erwägung nachstehender Gründe:  
(1) Für die Prüfung von Stoffen sind gemäß der Verordnung (EG) 
Nr. 1907/2006 auf Gemeinschaftsebene Prüfmethoden festzule ­
gen, wenn solche Prüfungen erforderlich sind, um Informationen über inhärente Stoffeigenschaften zu gewinnen.
 
(2) Die Richtlinie 67/548/EWG des Rates vom 27. Juni 1967 zur An ­
gleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften für die Einstu ­
fung, Verpackung und Kennzeichnung gefährlicher Stoffe (  2 ) ent­
hält in Anhang V Methoden zur Bestimmung der physikalisch-che ­
mischen Eigenschaften, der Toxizität und der Ökotoxizität von Stoffen und Zubereitungen. Anhang V der Richtlinie 67/548/EWG ist mit der Richtlinie 2006/121/EG mit Wirkung vom 1. Juni 2008 aufgehoben worden.
 
(3) Die in Anhang V der Richtlinie 67/548/EWG enthaltenen Prüf ­
methoden sind in die vorliegende Verordnung einzubeziehen.  
(4) Diese Verordnung schließt die Anwendung anderer Prüfmethoden 
nicht aus, sofern deren Anwendung mit Artikel 13 Absatz 3 der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 im Einklang steht.  ▼
B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 2  
( 1 ) ABl. L 396 vom 30.12.2006, S. 1. Berichtigte Fassung im ABl. L 136 vom 
29.5.2007, S. 3. 
( 2 ) ABl. 196 vom 16.8.1967, S. 1. Richtlinie zuletzt geändert durch die Richt ­
linie 2006/121/EG des Europäischen Parlaments und des Rates (ABl. L 396 
vom 30.12.2006, S. 850. Berichtigte Fassung im ABl. L 136 vom 29.5.2007, S. 281) –  mit den geeigneten Bezugnahmen zu aktualisieren, sobald das 
30. ATP veröffentlicht ist.
 (5) Bei der Ausarbeitung der Prüfmethoden sind die Grundsätze, 
nach denen die Verwendung von Tieren bei Verfahren ersetzt, verringert und verfeinert werden soll, umfassend zu berücksich ­
tigen, insbesondere, wenn geeignete validierte Verfahren zur Ver ­
fügung stehen, mit denen Tierversuche ersetzt, verringert oder verfeinert werden können.
 
(6) Die in dieser Verordnung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen 
der Stellungnahme des gemäß Artikel 133 der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 eingesetzten Ausschusses —
 
HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN:  
Artikel 1  
Die im Sinne der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 anzuwendenden 
Prüfmethoden sind im Anhang der vorliegenden Verordnung aufgeführt.  
Artikel 2  
Die Kommission nimmt gegebenenfalls eine Überprüfung der in der 
vorliegenden Verordnung enthaltenen Prüfmethoden im Hinblick auf eine Ersetzung, Verringerung oder Verfeinerung von Versuchen an Wir ­
beltieren vor.
 
Artikel 3  
Alle Bezugnahmen auf Anhang V der Richtlinie 67/548/EWG gelten als 
Bezugnahmen auf diese Verordnung.  
Artikel 4  
Diese Verordnung tritt am Tag nach ihrer Veröffentlichung im  Amtsblatt 
der Europäischen Union  in Kraft.  
Sie gilt ab dem 1. Juni 2008.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 3
 
ANHANG  
TEIL A: METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER PHYSIKALISCH- 
CHEMISCHEN EIGENSCHAFTEN  
INHALTSVERZEICHNIS 
A.1. SCHMELZ-/GEFRIERTEMPERATUR 
A.2. SIEDETEMPERATUR 
A.3. RELATIVE DICHTE 
A.4. DAMPFDRUCK A.5. OBERFLÄCHENSPANNUNG 
A.6. WASSERLÖSLICHKEIT 
A.8. VERTEILUNGSKOEFFIZIENT A.9. FLAMMPUNKT 
A.10. ENTZÜNDLICHKEIT (FESTE STOFFE) 
A.11. ENTZÜNDLICHKEIT (GASE) A.12. ENTZÜNDLICHKEIT (BERÜHRUNG MIT WASSER) A.13. PYROPHORE EIGENSCHAFTEN VON FESTEN UND FLÜS ­
SIGEN STOFFEN 
A.14. EXPLOSIONSGEFAHR 
A.15. ZÜNDTEMPERATUR (FLÜSSIGKEITEN UND GASE) 
A.16. RELATIVE SELBSTENTZÜNDUNGSTEMPERATUR FÜR 
FESTSTOFFE 
A.17. BRANDFÖRDERNDE EIGENSCHAFTEN (FESTSTOFFE) A.18. ZAHLENGEMITTELTE MOLMASSE UND MOLMASSEN ­
VERTEILUNG VON POLYMEREN 
A.19. NIEDERMOLEKULARER ANTEIL VON POLYMEREN 
A.20. LÖSUNGS-/EXTRAKTIONSVERHALTEN VON POLYMEREN 
IN WASSER 
A.21. BRANDFÖRDERNDE EIGENSCHAFTEN (FLÜSSIGE 
STOFFE) 
A.22. LÄNGENGEWICHTETER MITTLERER GEOMETRISCHER 
DURCHMESSER VON FASERN
 
▼M4 
A.23. 1-OCTANOL/WASSER-VERTEILUNGSKOEFFIZIENT: ME ­
THODE ZUR PRÜFUNG UNTER LANGSAMEM RÜHREN  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 4
 
A.1. SCHMELZ-/GEFRIERTEMPERATUR  
1. METHODEN  
Den meisten der hier beschriebenen Methoden liegt die OECD-Prüf ­
richtlinie (1) zugrunde. Die Grundprinzipien sind in (2) und (3) 
angegeben.  
1.1. EINLEITUNG  
Die hier beschriebenen Methoden und Geräte sind zur Bestimmung 
der Schmelztemperatur der Substanzen ohne jede Einschränkung in 
Bezug auf ihren Reinheitsgrad anzuwenden.  
Die Wahl der bestgeeigneten Methode hängt von der Natur der Prüf ­
substanz ab. Die Anwendbarkeit ist davon abhängig, ob sich der betref ­
fende Stoff leicht, schwierig oder überhaupt nicht pulverisieren lässt.  
Für bestimmte Stoffe bietet sich eher eine Bestimmung der Gefrier- 
oder Erstarrungstemperatur an: Folglich wurden Vorschriften für diese Bestimmungen gleichfalls in diese Methodik aufgenommen.
 
Wo sich aufgrund der besonderen Eigenschaften des Stoffes keiner 
der oben genannten Parameter ohne weiteres messen lässt, kann die Messung eines Stockpunktes angebracht sein.
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Als Schmelztemperatur bezeichnet man diejenige Temperatur, bei 
der unter atmosphärischem Druck der Übergang zwischen fester und flüssiger Phase stattfindet; unter idealen Bedingungen entspricht 
diese Temperatur der Gefriertemperatur.
 
Da bei vielen Stoffen der Phasenübergang in einem Temperatur ­
bereich stattfindet, wird dieser Übergang auch oft als Schmelzbereich 
bezeichnet.  
Umrechnung der Einheiten (K in  o C): 
t = T - 273,15  
t: Celsius-Temperatur, in Grad Celsius (  o C) 
T: thermodynamische Temperatur, in Kelvin (K)  
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Referenzsubstanzen müssen nicht in allen Fällen verwendet werden, 
in denen eine neue Prüfsubstanz untersucht wird. Die Referenzsub ­
stanzen sollten in erster Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu Zeit zu überprüfen und einen Vergleich mit den Ergebnissen aus anderen Methoden zu ermöglichen.
 
Einige der Eichsubstanzen sind in der Literatur (4) zu finden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 5
 
1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Man bestimmt die Temperatur (den Temperaturbereich) der Phasen ­
umwandlung vom festen in den flüssigen Zustand oder vom flüssigen in den festen Zustand. In der Praxis wird eine Probe der zu untersuchen ­
den Substanz bei Atmosphärendruck erhitzt/abgekühlt, und dabei wer ­
den die Temperaturen des Schmelz-/Gefrierbeginns sowie des vollstän ­
digen Schmelzens/Gefrierens bestimmt. Fünf Typen von Methoden wer ­
den beschrieben: Kapillarmethode, Heiztischmethoden, Gefriertempera ­
turbestimmungen, Methoden der thermischen Analyse und Bestimmung 
des Stockpunktes (entwickelt für Erdöl).
 
In einigen Fällen kann es von Nutzen sein, statt der Schmelztem ­
peratur die Gefriertemperatur zu messen.  
1.4.1.  Die Kapillarmethode  
1.4.1.1.  Schmelztemperaturgeräte mit Flüssigkeitsbad  
Eine geringe Menge der fein zerriebenen Substanz wird in ein Ka ­
pillarröhrchen gegeben und durch Klopfen verdichtet. Das Röhrchen 
wird zusammen mit einem Thermometer erhitzt, und dabei wird der 
Temperaturanstieg so eingestellt, dass er während des eigentlichen Schmelzvorgangs weniger als 1 K pro Minute beträgt. Man notiert die Temperaturen bei Schmelzbeginn und bei Schmelzende.
 
1.4.1.2.  Schmelztemperaturgeräte mit Metallblock  
Wie in 1.4.1.1, jedoch mit dem Unterschied, dass das Kapillarröhr ­
chen und das Thermometer in einem erwärmten Metallblock befes ­
tigt sind und sich durch Öffnungen in dem Block beobachten lassen.  
1.4.1.3.  Bestimmung mit Fotozelle  
Die in dem Kapillarröhrchen befindliche Substanzprobe wird in einem 
Metallzylinder automatisch erwärmt. In dem Zylinder befindet sich eine 
Öffnung, und ein gebündelter Lichtstrahl wird auf diesem Wege durch die Probe auf eine genauestens geeichte Fotozelle gerichtet. Die opti ­
schen Eigenschaften der meisten Substanzen ändern sich beim Schmel ­
zen von opak nach durchsichtig. In diesem Augenblick steigt also die 
Lichtintensität in der Fotozelle, und ein Stoppsignal wird zur Digital ­
anzeige übertragen, die die Temperatur des in der Heizkammer befind ­
lichen Platin-Widerstandsthermometers anzeigt. Allerdings eignet sich 
diese Methode nicht für einige stark gefärbte Substanzen.
 
1.4.2.  Heiztische  
1.4.2.1.  Kofler-Heizbank  
Die Wirkungsweise der Kofler-Heizbank beruht auf zwei elektrisch be ­
heizten Metallblöcken unterschiedlicher Wärmeleitfähigkeit, wobei die 
Bank selbst so ausgelegt ist, dass auf ihrer gesamten Länge ein fast 
linearer Temperaturgradient herrscht. Der Temperaturbereich der Heiz ­
bank liegt im Allgemeinen zwischen 283 K und 573 K. Die Bank verfügt über eine spezielle Temperaturableseeinrichtung, bestehend aus einem 
Zeiger und einer für die jeweilige Heizbank ausgelegten Skala. Zur 
Schmelztemperaturbestimmung wird die betreffende Substanz in einer dünnen Schicht direkt auf die Oberfläche der Heizbank aufgebracht. In wenigen Sekunden zeichnet sich eine scharfe Trennlinie zwischen der 
flüssigen und der festen Phase ab. Zur Ablesung der Temperatur wird der 
Zeiger auf die Trennlinie eingestellt.
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1.4.2.2.  Das Schmelzmikroskop  
Zur Schmelztemperaturbestimmung mit sehr kleinen Stoffmengen sind 
verschiedene Heiztische mit Mikroskop im Gebrauch. Die meisten Heiz ­
tische bedienen sich zur Temperaturablesung empfindlicher Thermoele ­
mente, doch werden gelegentlich auch Quecksilberthermometer verwen ­
det. Das typische Schmelztemperaturbestimmungsgerät mit Heiztisch besitzt eine Heizkammer mit einer Metallplatte, auf welcher die auf einem Objektträger befindliche Probe angebracht wird. Durch eine Öff ­
nung im Mittelpunkt der Metallplatte wird über den Beleuchtungsspiegel 
des Mikroskops ein Lichtbündel gerichtet. Bei Messungen wird die Heizkammer durch eine Glasplatte abgedeckt, damit der Probenbereich 
vor Lufteinflüssen geschützt wird.
 
Das Aufheizen der Probe wird durch einen Regelwiderstand kontrol ­
liert. Für sehr genaue Messungen an optisch anisotropen Substanzen 
kann polarisiertes Licht verwendet werden.  
1.4.2.3.  Die Meniskusmethode  
Diese Methode wird vor allem für Polyamide angewandt.  
Die Temperatur, bei der sich ein zwischen dem Heiztisch und einem 
durch die Polyamidprobe getragenen Deckglas eingeschlossener Si ­
likonölmeniskus verlagert, wird visuell bestimmt.  
1.4.3.  Methode zur Bestimmung der Gefriertemperatur  
Die Probe wird in ein dazu bestimmtes Reagenzglas gefüllt und in 
ein Gerät zur Bestimmung der Gefriertemperatur gestellt. Während des Abkühlens wird die Probe langsam und kontinuierlich gerührt 
und die Temperatur in geeigneten Zeitabständen gemessen. Diejenige 
Temperatur, korrigiert um den Thermometerfehler, bei der der Tem ­
peraturverlauf während einiger Ablesungen konstant bleibt, wird als Gefriertemperatur notiert.
 
Eine Unterkühlung ist durch Erhalt des Gleichgewichts zwischen der 
festen und der flüssigen Phase zu vermeiden.  
1.4.4.  Thermische Analyse  
1.4.4.1.  Differentialthermoanalyse (DTA)  
Mit diesem Verfahren wird der Temperaturunterschied zwischen der 
Substanz und einem Referenzmaterial in Abhängigkeit von der Tem ­
peratur aufgezeichnet, während die Substanz und das Referenzmate ­
rial demselben kontrollierten Temperaturprogramm ausgesetzt wer ­
den. Wenn die Probe eine Phasenumwandlung mit Änderung der Enthalpie durchläuft, dann wird diese Änderung durch ein endother ­
mes (Schmelzen) oder exothermes (Gefrieren) Abweichen vom Aus ­
gangsniveau der Temperaturaufzeichnung angezeigt.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 7
 
1.4.4.2.  Differentialscanningkalorimetrie (DSK)  
Mit diesem Verfahren wird der Unterschied in der Energieaufnahme 
zwischen einer Substanz und einem Referenzmaterial in Abhängigkeit von der Temperatur aufgezeichnet, während die Substanz und das Re ­
ferenzmaterial demselben kontrollierten Temperaturprogramm aus ­
gesetzt werden. Bei der Energie handelt es sich um diejenige Energie, die notwendig ist, um einen Temperaturabgleich zwischen der Substanz und dem Referenzmaterial zu erreichen. Wenn die Probe eine Phasen ­
umwandlung mit Änderung der Enthalpie durchläuft, dann wird diese 
Änderung durch ein endothermes (Schmelzen) oder exothermes (Gefrie ­
ren) Abweichen vom Ausgangsniveau des Wärmeflussbildes angezeigt.
 
1.4.5.  Stockpunkt  
Dieses Verfahren wurde zur Verwendung bei Erdölen entwickelt; es 
eignet sich für ölige Substanzen mit einer niedrigen Schmelztemperatur.  
Die Probe wird nach vorherigem Aufheizen mit einer bestimmten Ge ­
schwindigkeit abgekühlt und in Abständen von 3 K auf ihre Fließeigen ­
schaften untersucht. Die niedrigste Temperatur, bei der noch eine Bewe ­
gung der Substanz beobachtet wird, wird als Stockpunkt notiert.  
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Der Anwendungsbereich und die Genauigkeit der verschiedenen Me ­
thoden zur Bestimmung von Schmelztemperatur/Schmelzbereich sind nachstehender Tabelle zu entnehmen:
 
TABELLE: ANWENDBARKEIT DER BESCHRIEBENEN METHODEN  
A. Kapillarmethoden  
Messmethode Pulverisierbare 
Substanzen Nicht ohne wei ­
teres pulverisier ­
bare Substanzen Temperaturbe ­
reich Geschätzte 
Genauigkeit (  1 ) Existierende Me ­
thode oder Norm  
Schmelztempera ­
turgeräte mit Flüs ­
sigkeitsbad ja nur wenige 273 K bis 
573 K ± 0,3 K JIS K 0064 
Schmelztempera ­
turgeräte mit Me ­
tallblock ja nur wenige 293 K bis 
> 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Fotozellengeräte ja verschiedene, 
unter Verwen ­
dung verschie ­
dener Zusatz ­
geräte 253 K bis 
573 K ± 0,5 K  
( 1 ) Je nach dem verwendeten Gerätetyp und dem Reinheitsgrad des verwendeten Stoffes.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 8
 
B. Heiztische und Gefriertemperaturbestimmungen  
Messmethode Pulverisierbare 
Substanzen Nicht ohne wei ­
teres pulverisier ­
bare Substanzen Temperaturbe ­
reich Geschätzte 
Genauigkeit (  1 ) Existierende Me ­
thode oder Norm  
Kofler-Heizbank ja nein 283 K bis 
>573 K ± 1,0 K ANSI/ASTM D 
3451-76 
Schmelzmikro ­
skop ja nur wenige 273 K bis 
>573 K ± 0,5 K DIN 53736 
Meniskusmethode nein speziell für Po ­
lyamide 293 K bis 
>573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Gefriertemperatur ­
methoden ja ja 223 K bis 
573 K ± 0,5 K zum Beispiel BS 
4695  
( 1 ) Je nach dem verwendeten Gerätetyp und dem Reinheitsgrad des verwendeten Stoffes.  
C. Thermische Analyse  
Messmethode Pulverisierbare 
Substanzen Nicht ohne wei ­
teres pulverisier ­
bare Substanzen Temperaturbe ­
reich Geschätzte 
Genauigkeit (  1 ) Existierende Me ­
thode oder Norm  
Differentialther ­
moanalyse ja ja 173 K bis 
1 273 K bis 600 K: 
± 0,5 K bis 
1 273 K: 
± 2,0 K ASTM E 537-76 
Differentialscan ­
ningkalorimetrie ja ja 173 K bis 
1 273 K bis 600 K: 
± 0,5 K bis 
1 273 K: 
± 2,0 K ASTM E 537-76  
( 1 ) Je nach dem verwendeten Gerätetyp und dem Reinheitsgrad des verwendeten Stoffes.  
D. Stockpunkt  
Messmethode Pulverisierbare 
Substanzen Nicht ohne wei ­
teres pulverisier ­
bare Substanzen Temperaturbe ­
reich Geschätzte 
Genauigkeit (  1 ) Existierende Me ­
thode oder Norm  
Stockpunkt für Erdöl und 
ölige Substan ­
zen für Erdöl und 
ölige Substan ­
zen 223 K bis 
323 K ± 3,0 K ASTM D 97-66  
( 1 ) Je nach dem verwendeten Gerätetyp und dem Reinheitsgrad des verwendeten Stoffes.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODEN  
Die Durchführung fast aller hier aufgeführten Prüfmethoden ist in 
nationalen und internationalen Normen beschrieben (siehe Anlage).  
1.6.1.  Methoden mit Kapillarrohr  
Fein pulverisierte Substanzen lassen im Verlauf eines langsamen 
Temperaturanstiegs im Allgemeinen die in Abbildung 1 dargestellten 
Schmelzstadien erkennen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 9
 
Abbildung 1
  
Während der Bestimmung der Schmelztemperatur werden die Tem ­
peraturen zu Beginn und zu Ende des Schmelzvorgangs registriert.  
1.6.1.1.  Schmelztemperaturbestimmungsgeräte mit Flüssigkeitsbad  
Abbildung 2 zeigt eine genormte Glasapparatur zur Bestimmung der 
Schmelztemperatur (JIS K 0064). Alle Dimensionsangaben in mm.  
Abbildung 2
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 10
 
Badflüssigkeit  
Es sollte eine geeignete Flüssigkeit gewählt werden. Die Wahl der 
Flüssigkeit hängt von der zu bestimmenden Schmelztemperatur ab, 
z. B. flüssiges Paraffin für Schmelztemperaturen nicht über 473 K, Silikonöl für Schmelztemperaturen nicht über 573 K.
 
Für Schmelztemperaturen über 523 K kann eine Mischung aus drei 
Gewichtsteilen Schwefelsäure und zwei Gewichtsteilen Kaliumsulfat 
benutzt werden. Bei Verwendung einer solchen Mischung sollten 
geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.  
Thermometer  
Es sollten nur solche Thermometer verwendet werden, die den An ­
forderungen der nachstehenden oder anderer gleichwertiger Normen 
entsprechen:  
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Durchführung  
Die getrocknete Substanz wird in einem Mörser fein zerrieben und 
anschließend in ein an einem Ende zugeschmolzenes Kapillarröhr ­
chen gefüllt. Nach Verdichten durch Klopfen sollte die Füllhöhe 
etwa 3 mm betragen. Zu diesem Zweck lässt man das Kapillarröhr ­
chen aus ca. 700 mm Höhe durch ein Glasrohr auf ein Uhrglas fallen.
 
Das gefüllte Kapillarröhrchen wird derart in das Bad eingebracht, 
dass der mittlere Teil der Quecksilberkugel des Thermometers das 
Kapillarröhrchen an der Stelle berührt, an der sich die Probe befin ­
det. Gewöhnlich führt man das Kapillarröhrchen etwa 10 K vor Erreichen der Schmelztemperatur in das Gerät ein.
 
Das Flüssigkeitsbad wird so beheizt, dass der Temperaturanstieg 
etwa 3 K pro Minute beträgt. Dabei soll die Flüssigkeit gerührt 
werden. Etwa 10 K vor Erreichen der erwarteten Schmelztemperatur 
wird der Temperaturanstieg auf maximal 1 K pro Minute reduziert.  
Berechnung  
Die Berechnung der Schmelztemperatur wird folgendermaßen durch ­
geführt:  
T = T  D + 0,00016 (T  D - T E ) n 
Darin bedeuten:  
T = korrigierte Schmelztemperatur in K  
T D = Temperaturablesung am Thermometer D in K  
T E = Temperaturablesung am Thermometer E in K  
n = Anzahl der Grade, die der Quecksilberfaden des Thermo ­
meters D aus der Flüssigkeit herausragt  
1.6.1.2.  Schmelztemperaturbestimmungsgeräte mit Metallblock  
Gerät  
Das Gerät besteht aus:  
— einem zylindrischen Metallblock, dessen oberer Teil hohl ist und 
eine Heizkammer bildet (vgl. Abbildung 3),  
— einer Abdeckplatte aus Metall mit zwei oder mehreren Öffnun ­
gen, durch welche die Schmelzpunktröhrchen in den Metallblock 
eingebracht werden können,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 11
 
— einem Heizsystem für den Metallblock, beispielsweise mit einem 
in den Metallblock eingeschlossenen elektrischen Heizwider ­
stand,  
— einem Regelwiderstand zur Regulierung der Leistungsaufnahme 
bei elektrischer Heizung,  
— vier Fenstern aus hitzebeständigem Glas, die sich an den Seiten ­
wänden der Heizkammer rechtwinklig gegenüberliegen. Vor ei ­
nem dieser Fenster befindet sich ein Okular zur Beobachtung des Kapillarröhrchens. Die drei anderen Fenster dienen zur Beleuch ­
tung des Innenraumes mittels Lampen, und
 
— einem an einem Ende zugeschmolzenen Kapillarröhrchen aus 
hitzebeständigem Glas (siehe 1.6.1.1).  
Thermometer  
Siehe die Normen in 1.6.1.1. Es können ebenfalls thermoelektrische 
Messgeräte mit vergleichbarer Genauigkeit verwendet werden.  
Abbildung 3
  
1.6.1.3.  Bestimmung mit Fotozelle (automatisch)  
Gerät und Verfahren  
Das Gerät besteht aus einer Metallkammer mit automatischer Heiz ­
vorrichtung. Drei Kapillarröhrchen werden nach 1.6.1.1 gefüllt und 
in die Heizkammer gestellt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 12
 
Zur Kalibrierung des Gerätes stehen mehrere lineare Temperatur ­
anstiegsraten zur Verfügung; der geeignete Temperaturanstieg wird 
elektrisch auf eine im Voraus festgelegte lineare Anstiegsrate ge ­
bracht. Die jeweilige Temperatur der Heizkammer und die Tempera ­
tur des in den Kapillarröhrchen enthaltenen Stoffes werden mit Re ­
gistriergeräten aufgezeichnet.  
1.6.2.  Heiztische  
1.6.2.1.  Kofler-Heizbank  
Siehe Anlage.  
1.6.2.2.  Schmelzmikroskop  
Siehe Anlage.  
1.6.2.3.  Meniskusmethode (Polyamide)  
Siehe Anlage.  
Im Bereich der Schmelztemperatur sollte die Heizgeschwindigkeit 
weniger als 1 K/min betragen.  
1.6.3.  Methoden zur Bestimmung der Gefriertemperatur  
Siehe Anlage.  
1.6.4.  Thermoanalyse  
1.6.4.1.  Differentialthermoanalyse  
Siehe Anlage.  
1.6.4.2.  Differentialscanningkalorimetrie  
Siehe Anlage.  
1.6.5.  Stockpunktbestimmung  
Siehe Anlage.  
2. DATEN  
In bestimmten Fällen ist eine Thermometeranpassung erforderlich.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— verwendetes Verfahren,  
— genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunrei ­
nigungen), ggf. Vorreinigung,  
— eine ungefähre Angabe zur Genauigkeit.  
Der Mittelwert mindestens zweier Messungen, deren Werte im Be ­
reich der ungefähren Genauigkeit (siehe Tabellen) liegen, ist als 
Schmelztemperatur anzugeben.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 13
 
Liegt der Temperaturunterschied zwischen der Anfangs- und der 
Endphase des Schmelzens innerhalb der Genauigkeitsgrenzen der 
Methode, so ist die Anfangstemperatur als Schmelztemperatur an ­
zugeben; andernfalls sind beide Temperaturen anzugeben.  
Wenn sich der Stoff vor Erreichen der Schmelztemperatur zersetzt 
oder sublimiert, ist die Temperatur anzugeben, bei der dies beobach ­
tet wird.  
Alle zur Bewertung der Ergebnisse notwendigen Informationen und 
Bemerkungen sind zu notieren, insbesondere diejenigen über Ver ­
unreinigungen und den Aggregatzustand des Stoffes.  
4. LITERATUR  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) IUP AC, B. Le Neindre, B. Vodar (Hrsg.): Experimental ther ­
modynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II, 803-834.  
(3) R. Weissberger (Hrsg.): Technique of organic Chemistry, Phy ­
sical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
 
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, 505-515.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 14
 
Anlage  
Weitere technische Einzelheiten können z. B. den folgenden Normen entnommen 
werden:  
1. Kapillarmethoden  
1.1. Schmelztemperaturbestimmungsgeräte mit Flüssigkeitsbad 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and the mel ­
ting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of mel ­
ting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalls von 
Harzen nach Kapillarverfahren 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products  
1.2. Schmelztemperaturbestimmungsgeräte mit Metallblock 
DEN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststof ­
fen 
ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determina ­
tion of „melting point“  
2. Heiztische  
2.1. Kofler-Heizbank 
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for 
testing polymeric powder coatings  
2.2. Schmelzmikroskop 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststof ­
fen 
2.3. Meniskusmethode (Polyamide) 
ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determina ­
tion of „melting point“  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion ma ­
terials 
NT T 51 050 Résines de polyamides. Détermination 
du „point de fusion“. Méthode du mé ­
nisque  
3. Methoden zur Gefriertemperaturbestimmung  
BS 4633 Method for the determination of cry ­
stallizing point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of Petroleum Wax (Cooling Curve) 
DIN S1421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und 
Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la 
température de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsäuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de 
cristallisation (point de congélation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point
 
4. Thermoanalyse  
4.1. Differentialthermoanalyse 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by me ­
thods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermo ­
analytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2. Differentialscanningkalorimetrie 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by me ­
thods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermo ­
analytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
5. Stockpunktbestimmung  
NBN 52014 Échantillonnage et analyse des pro ­
duits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite — Monster ­
neming en ontleding van aardoliepro ­
ducten: Troebelingspunt en vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils — Determination of 
pour point
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 17
 
A.2. SIEDETEMPERATUR  
1. METHODEN  
Den meisten der hier beschriebenen Methoden liegt die OECD-Prüf ­
richtlinie (1) zugrunde. Die Grundprinzipien sind in (2) und (3) 
angegeben.  
1.1. EINLEITUNG  
Die hier beschriebenen Methoden und Geräte können für flüssige 
und niedrig schmelzende Substanzen verwendet werden, wenn diese nicht unterhalb der Siedetemperatur chemisch reagieren (z. B. Auto ­
oxidation, Umlagerung, Zersetzung usw.). Die Methoden können auf 
reine und unreine Flüssigkeiten angewendet werden.
 
Bevorzugt werden die Methoden mit Fotozellendetektion und Ther ­
moanalyse, da diese sowohl die Bestimmung der Schmelz- als auch 
der Siedetemperatur ermöglichen. Darüber hinaus können die Mes ­
sungen automatisch durchgeführt werden.  
Die „dynamische Methode“ hat den Vorteil, dass sie auch zur Be ­
stimmung des Dampfdrucks verwendet werden kann; dabei ist es 
nicht erforderlich, die Siedetemperatur auf den Normaldruck (101,325 kPa) zu berichtigen, da der Normdruck während der Mes ­
sung durch einen Manostaten eingestellt werden kann.
 
Bemerkungen  
Der Einfluss von Verunreinigungen auf die Bestimmung der Siede ­
temperatur hängt weitgehend von der Art der Verunreinigung ab. 
Wenn hochflüchtige Verunreinigungen in der Probe vertreten sind, 
die die Ergebnisse beeinträchtigen könnten, kann der Stoff gereinigt werden.
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Als Standardsiedetemperatur wird diejenige Temperatur definiert, bei 
der der Dampfdruck einer Flüssigkeit 101,325 kPa beträgt.  
Wenn die Siedetemperatur nicht bei normalem Atmosphärendruck 
gemessen wird, kann die Temperaturabhängigkeit des Dampfdrucks durch die Clausius-Clapeyron-Gleichung beschrieben werden:
 
log p ¼ Δ H v 
2; 3 RT þ const : 
Darin bedeuten:  
p = Dampfdruck des Stoffes in Pascal  
ΔH v = Verdampfungswärme in J mol  -1 
R = universelle molare Gaskonstante = 8,314 J mol  -1 K -1 
T = thermodynamische Temperatur in K  
Die Siedetemperatur wird entsprechend dem Umgebungsdruck bei 
der Messung eingesetzt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 18
 
Umrechnungen  
Druck (Einheit: kPa)  
100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa 
(„bar“ ist weiterhin zulässig, wird aber nicht empfoh ­
len.) 
133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr 
(Die Einheiten „mm Hg“ und „Torr“ sind nicht zuge ­
lassen.)  
1 atm = Standard-Atmosphäre = 101 325 Pa 
(Die Einheit „atm“ ist nicht zugelassen.)  
Temperatur (Einheit: K)  
t = T - 273,15  
t: Celsius-Temperatur, in Grad Celsius (  o C) 
T: thermodynamische Temperatur, in Kelvin (K)  
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Referenzsubstanzen müssen nicht in allen Fällen verwendet werden, 
in denen eine neue Prüfsubstanz untersucht wird. Die Referenzsub ­
stanzen sollten in erster Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu Zeit zu überprüfen und einen Vergleich mit den Ergebnissen aus anderen Methoden zu ermöglichen.
 
Einige der Eichsubstanzen sind in den in der Anlage aufgeführten 
Methoden zu finden.  
1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Fünf Methoden zur Bestimmung der Siedetemperatur (Siedebereich) 
beruhen auf der Messung der Siedetemperatur, zwei weitere auf der 
Thermoanalyse.  
1.4.1.  Bestimmung mit dem Ebulliometer  
Ebulliometer wurden ursprünglich zur Bestimmung des Molekular ­
gewichtes durch Erhöhung der Siedetemperatur entwickelt, eignen 
sich aber auch für genaue Messungen der Siedetemperatur. In ASTM D 1120-72 wird ein sehr einfaches Gerät beschrieben (siehe Anlage). Die Flüssigkeit wird in diesem Gerät unter Gleichgewichts ­
bedingungen bei atmosphärischem Druck erhitzt, bis sie siedet.
 
1.4.2.  Dynamische Methode  
Messung der Rekondensationstemperatur des Dampfes mit Hilfe ei ­
nes geeigneten Thermometers im Rückfluss während des Siedepro ­
zesses. Bei dieser Methode kann der Druck geändert werden.  
1.4.3.  Destillationsmethode für die Siedetemperatur  
Destillation der Flüssigkeit und Messung der Rekondensationstem ­
peratur des Dampfes sowie Bestimmung der Destillatmenge.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 19
 
1.4.4.  Verfahren nach Siwoloboff  
Erhitzung einer Probe in einem Probenröhrchen, das in ein Wär ­
mebad eingetaucht wird. Ein zugeschmolzenes Kapillarröhrchen, in dessen unterem Teil ein Luftbläschen enthalten ist, wird in das Pro ­
benröhrchen getaucht.
 
1.4.5.  Fotozellendetektion  
Entsprechend dem Prinzip nach Siwoloboff wird unter Verwendung 
der aufsteigenden Bläschen eine automatische fotoelektrische Mes ­
sung durchgeführt.  
1.4.6.  Differentialthermoanalyse  
Mit diesem Verfahren wird der Temperaturunterschied zwischen der 
Substanz und einem Referenzmaterial in Abhängigkeit von der Tem ­
peratur aufgezeichnet, während die Substanz und das Referenzmaterial demselben kontrollierten Temperaturprogramm ausgesetzt werden. Wenn die Probe eine Phasenumwandlung mit Änderung der Enthalpie 
durchläuft, dann wird diese Änderung durch ein endothermes Abwei ­
chen (Sieden) von der Basis der Temperaturaufzeichnung angezeigt.
 
1.4.7.  Differentialscanningkalorimetrie  
Mit diesem Verfahren wird der Unterschied in der Energieaufnahme 
zwischen einer Substanz und einem Referenzmaterial in Abhängig ­
keit von der Temperatur aufgezeichnet, während die Substanz und das Referenzmaterial demselben kontrollierten Temperaturprogramm ausgesetzt werden. Bei der Energie handelt es sich um diejenige 
Energie, die notwendig ist, um einen Temperaturabgleich zwischen 
der Substanz und dem Referenzmaterial zu erreichen. Wenn die Probe eine Phasenumwandlung mit Änderung der Enthalpie durch ­
läuft, dann wird diese Änderung durch ein endothermes Abweichen 
(Sieden) von der Basis des Wärmeflussbildes angezeigt.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Der Anwendungsbereich und die Genauigkeit der Methoden zur Be ­
stimmung von Siedetemperatur/Siedebereich sind Tabelle 1 zu ent ­
nehmen:  
Tabelle 1  
Vergleich der Methoden  
Messmethode Geschätzte Genauigkeit Existierende Methoden oder Normen  
Ebulliometer ± 1,4 K (bis 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (bis 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Dynamische Methode ± 0,5 K (bis 600 K) (  2 ) 
Destillationsmethode (Siedebereich) ± 0,5 K (bis 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
nach Siwoloboff ± 2 K (bis 600 K) (  2 ) 
Fotozellendetektion ± 0,3 K (bei 373 K) (  2 ) 
Differentialthermoanalyse ± 0,5 K (bis 600 K) 
± 2,0 K (bis 1 273 K) ASTM E 537-76 
Differentialscanningkalorimetrie ± 0,5 K (bis 600 K) 
± 2,0 K (bis 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Diese Genauigkeit gilt nur für das einfache Gerät, wie es z. B. in ASTM D 1120-72 beschrieben wird; sie kann durch 
verfeinerte Ebulliometergeräte verbessert werden. 
( 2 ) Gilt nur für reine Substanzen. Die Verwendung in anderen Fällen ist zu begründen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 20
 
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODEN  
Die Durchführung einiger der hier aufgeführten Prüfmethoden ist in 
nationalen und internationalen Normen beschrieben (siehe Anlage).  
1.6.1.  Ebulliometer  
Siehe Anlage.  
1.6.2.  Dynamische Methode  
Siehe Prüfmethode A.4 für die Bestimmung des Dampfdrucks.  
Die bei einem Druck von 101,325 kPa beobachtete Siedetemperatur 
wird notiert.  
1.6.3.  Destillationsverfahren (Siedebereich)  
Siehe Anlage.  
1.6.4.  Verfahren nach Siwoloboff  
Die Probe wird in einem Probenröhrchen — Durchmesser etwa 
5 mm — in einer Apparatur zur Bestimmung der Schmelztemperatur 
erhitzt (Abbildung 1).  
Abbildung 1 zeigt einen Typ einer genormten Apparatur zur Bestim ­
mung der Schmelz- und Siedetemperatur (JIS K 0064); (Glas, alle Dimensionsangaben in mm).
 
Abbildung 1
  
Ein etwa 1 cm über dem unteren Ende zugeschmolzenes Kapillar ­
röhrchen (Siedekapillare) wird in das Probenröhrchen gegeben. Der 
Pegel, bis zu dem die Prüfsubstanz aufgefüllt wird, ist so zu wählen, dass der zugeschmolzene Abschnitt der Kapillare unter der Flüssig ­
keitsoberfläche liegt. Das die Siedekapillare enthaltende Probenröhr ­
chen wird entweder mit einem Gummiband am Thermometer oder an 
einer seitlichen Halterung befestigt (siehe Abbildung 2).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 21
 
Abbildung 2  
Prinzip nach Siwoloboff  Abbildung 3  
Modifiziertes Prinzip
  
Die Badflüssigkeit wird entsprechend der Siedetemperatur aus ­
gewählt. Bei Temperaturen bis zu 573 K kann Silikonöl verwendet werden. Paraffinöl darf nur bis 473 K verwendet werden. Die Er ­
hitzung der Badflüssigkeit sollte zunächst mit einer Temperaturrate 
von 3 K/min erfolgen. Die Badflüssigkeit muss gerührt werden. Ca. 
10 K unterhalb der erwarteten Siedetemperatur wird die Erhitzung verlangsamt, so dass die Temperaturerhöhung bei weniger als 1 K/ ­
min liegt. Beim Erreichen der Siedetemperatur beginnen Bläschen 
schnell aus der Siedekapillare aufzusteigen.
 
Als Siedetemperatur ist diejenige anzugeben, bei welcher die Bläs ­
chenkette unter Kühlung abbricht und die Flüssigkeit plötzlich in der Kapillare aufzusteigen beginnt. Der entsprechende Thermometerstand 
ist gleich der Siedetemperatur der Substanz.
 
Beim modifizierten Prinzip (Abbildung 3) wird die Siedetemperatur 
in einem Schmelztemperaturröhrchen bestimmt. Es ist bis auf eine etwa 2 cm lange feine Spitze ausgezogen (a): Eine geringe Menge 
der Probe wird angesaugt. Das offene Ende des freien Röhrchens 
wird zugeschmolzen, so dass sich am Ende ein feines Luftbläschen befindet. Bei der Erhitzung in der Apparatur zur Bestimmung der Schmelztemperatur (b) dehnt sich das Luftbläschen aus. Die Siede ­
temperatur entspricht der Temperatur, bei der der Pfropfen der Sub ­
stanz den Oberflächenpegel der Badflüssigkeit erreicht (c).
 
1.6.5.  Fotozellendetektion  
Die Probe wird in einem Kapillarröhrchen in einem Metallblock 
erhitzt.  
Durch entsprechende Öffnungen im Block wird ein Lichtstrahl durch 
die Substanz auf eine genau kalibrierte Fotozelle ausgerichtet.  
Bei der Erhöhung der Temperatur der Probe steigen einzelne Luft ­
bläschen aus der Siedekapillare auf. Wenn die Siedetemperatur er ­
reicht ist, nimmt die Zahl der Bläschen stark zu. Dies führt zu einer 
von einer Fotozelle aufgezeichneten Änderung in der Lichtintensität 
und löst ein Signal im Messgerät aus, das die Temperatur eines im Block gelegenen Platin-Widerstandsthermometers anzeigt.
 
Dieses Verfahren ist besonders nützlich, da es Bestimmungen unter ­
halb der Raumtemperatur bis zu 253,15 K (– 20  o C) ohne jede 
apparative Änderung ermöglicht. Das Instrument muss lediglich in 
ein Kühlbad gestellt werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 22
 
1.6.6.  Thermoanalyse  
1.6.6.1.  Differentialthermoanalyse  
Siehe Anlage.  
1.6.6.2.  Differentialscanningkalorimeter  
Siehe Anlage.  
2. DATEN  
Bei geringfügigen Abweichungen vom Normaldruck (maximal 
± 5 kPa) werden die Siedetemperaturen mit Hilfe der nachstehenden 
Sidney-Young-Zahlen-Wert-Gleichung auf T  n umgerechnet:  
T n = T + (f  T × Δp) 
Darin bedeuten:  
Δp = (101,325 - p) [Vorzeichen beachten]  
p = Barometermessung in kPa  
f T = Korrekturfaktor für die Änderung der Siedetemperatur in 
Abhängigkeit vom Druck in K/kPa  
T = gemessene Siedetemperatur in K  
T n = Siedetemperatur, berichtigt auf Normaldruck in K  
Die Temperatur-Korrekturfaktoren f  T und die Gleichungen für ihre 
Näherung sind für zahlreiche Stoffe in den erwähnten internationalen 
und nationalen Normen (Anlage) aufgeführt.  
So gibt beispielsweise die Vorschrift nach DIN 53171 die folgenden 
ungefähren Korrekturen für Lösungsmittel in Anstrichstoffen.  
Tabelle 2  
Temperatur-Korrekturfaktoren f  T 
Temperatur T (K) Korrekturfaktor f  T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 373,15 0,31 
398,15 0,33 
423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 23
 
3. ABSCHLUSSBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— verwendetes Verfahren,  
— genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunrei ­
nigungen), ggf. Vorreinigung,  
— eine ungefähre Angabe zur Genauigkeit.  
Der Mittelwert mindestens zweier Messungen, deren Werte im Be ­
reich der ungefähren Genauigkeit (siehe Tabelle 1 oben) liegen, ist als Siedetemperatur anzugeben.
 
Die gemessenen Siedetemperaturen und ihr Mittelwert sowie der 
Druck (die Drücke) in kPa, bei dem (bei denen) die Messungen 
durchgeführt wurden, sind anzugeben. Der Druck sollte möglichst 
nahe beim Normaldruck liegen.  
Alle zur Bewertung der Ergebnisse notwendigen Informationen und 
Bemerkungen sind zu notieren, insbesondere diejenigen über Ver ­
unreinigungen und den Aggregatzustand des Stoffes.  
4. LITERATUR  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar (Hrsg.): Experimental thermo ­
dynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II.  
(3) R. Weissberger (Hrsg.): Technique of organic Chemistry, Phy ­
sical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., 
New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 24
 
Anlage  
Zu weiteren technischen Einzelheiten können beispielsweise folgende Normen 
herangezogen werden:  
1. Ebulliometer  
1.1. Schmelztemperaturbestimmungsgeräte mit Flüssigkeitsbad 
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Destillationsverfahren (Siedebereich)  
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distilla ­
tion characteristics 
DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siedeverlaufs 
NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement 
et de l'intervalle de distillation  
3. Differentialthermoanalyse und Differentialscanningkalorimetrie  
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of dif ­
ferential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoana ­
lytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 25
 
A.3. RELATIVE DICHTE  
1. METHODEN  
Den hier beschriebenen Methoden liegt die OECD-Prüfrichtlinie (1) 
zugrunde. Die Grundprinzipien sind in (2) angegeben.  
1.1. EINLEITUNG  
Die hier beschriebenen Methoden zur Bestimmung der relativen 
Dichte gelten für Feststoffe und Flüssigkeiten ohne jede Einschrän ­
kung in Bezug auf ihren Reinheitsgrad. Die verschiedenen zu ver ­
wendenden Methoden sind in Tabelle 1 aufgeführt.  
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Die relative Dichte von Feststoffen oder Flüssigkeiten ist das Ver ­
hältnis zwischen der Masse eines bestimmten Volumens der Prüf ­
substanz, gemessen bei 20  o C, und der Masse des gleichen Volu ­
mens Wasser, bestimmt bei 4  o C. Die relative Dichte hat keine 
Einheit.  
Die Dichte ρ eines Stoffes ist gleich dem Quotienten aus seiner 
Masse m und seinem Volumen v.  
Die Dichte ρ wird in SI-Einheiten (kg/m  3 ) angegeben.  
1.3. REFERENZSUBSTANZEN (1) (3)  
Bei der Messung der relativen Dichte von Prüfsubstanzen brauchen 
im Allgemeinen Referenzsubstanzen nicht verwendet zu werden. Die 
Referenzsubstanzen sollten in erster Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu Zeit zu überprüfen und einen Vergleich mit den Ergeb ­
nissen aus anderen Methoden zu ermöglichen.
 
1.4. PRINZIP DER METHODEN  
Es werden vier Messprinzipien verwendet.  
1.4.1.  Auftriebsmethoden  
1.4.1.1.  Aräometer  (für Flüssigkeiten)  
Hinreichend genaue und schnelle Bestimmungen der Dichte können 
mit Aräometern erreicht werden, bei denen die Dichte einer Flüssig ­
keit durch Ablesen der Eintauchtiefe des Schwimmkörpers an einer 
graduierten Skala ermittelt werden kann.  
1.4.1.2.  Hydrostatische Waage  (für Flüssigkeiten und Feststoffe)  
Der Unterschied zwischen dem Gewicht eines in Luft und in einer 
geeigneten Flüssigkeit (z. B. Wasser) gemessenen Prüfkörpers kann zur Bestimmung seiner Dichte verwendet werden.
 
Bei Feststoffen ist die gemessene Dichte nur für die verwendete 
Probe repräsentativ. Zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten 
wird ein Körper eines bekannten Volumens v zunächst in der Luft und dann in der Flüssigkeit gewogen.
 
1.4.1.3.  Tauchkörpermethode  (für Flüssigkeiten) (4)  
Bei dieser Methode wird die Dichte einer Flüssigkeit aus der Diffe ­
renz zwischen den Ergebnissen der Wägung des Tauchkörpers be ­
kannten Volumens vor und nach dem Eintauchen dieses Körpers in 
die Prüfflüssigkeit ermittelt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 26
 
1.4.2.  Pyknometer-Methoden  
Für Feststoffe oder Flüssigkeiten können Pyknometer verschiedener 
Formen mit bekannten Volumina verwendet werden. Die Dichte wird aus der Differenz zwischen der Wägung des vollen und des leeren 
Pyknometers und seinem bekannten Volumen errechnet.
 
1.4.3.  Luftvergleichspyknometer  (für Feststoffe)  
Die Dichte eines Feststoffes beliebiger Form kann bei Raumtempera ­
tur mit dem Gasvergleichspyknometer gemessen werden. Das Volu ­
men einer Substanz wird in der Luft oder in einem Inertgas in einem 
Zylinder mit veränderbarem kalibrierten Volumen gemessen. Zur Berechnung der Dichte wird nach Abschluss der Volumenmessung eine Wägung durchgeführt.
 
1.4.4.  Schwingungsdichtemesser  (5) (6) (7)  
Die Dichte einer Flüssigkeit kann mit einem Schwingungsdichtemesser 
gemessen werden. Ein in Form eines U-Rohres gebauter mechanischer Oszillator wird in Schwingungen versetzt; die Resonanzfrequenz des Oszillators hängt von dessen Masse ab. Bei Einführung einer Probe in 
das U-Rohr ändert sich die Resonanzfrequenz des Oszillators. Das Gerät 
muss mit Hilfe von zwei Flüssigkeiten bekannter Dichte kalibriert wer ­
den. Diese Flüssigkeiten sollten möglichst so gewählt werden, dass ihre Dichte den zu messenden Bereich einschließt.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Der Anwendungsbereich der verschiedenen zur Bestimmung der re ­
lativen Dichte verwendeten Methoden ist der nachstehenden Tabelle zu entnehmen.
 
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODEN  
Die als Beispiel aufgeführten Normen, die im Hinblick auf weitere 
technische Einzelheiten herangezogen werden müssen, sind als An ­
lage beigefügt.  
Die Prüfungen sind bei 20  o C durchzuführen, wobei mindestens zwei 
Messungen vorzunehmen sind.  
2. DATEN  
Siehe Normen.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— verwendetes Verfahren,  
— genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunrei ­
nigungen), ggf. Vorreinigung.  
Die relative Dichte  D 20 
4 soll gemäß 1.2 zusammen mit dem Aggre ­
gatzustand des gemessenen Stoffes angegeben werden.  
Alle zur Bewertung der Ergebnisse notwendigen Informationen und 
Bemerkungen sind zu notieren, insbesondere diejenigen über Ver ­
unreinigungen des Stoffes.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 27
 
Tabelle  
Anwendbarkeit der Methoden  
Messmethode Dichte Möglicher Höchst ­
wert der dyna ­
mischen Viskosität Existierende Normen 
Feststoffe Flüssigkeit  
1.4.1.1. Aräometer ja 5 Pa s ISO 387, 
ISO 649-2, 
NF T 20-050 
1.4.1.2. Hydrostatische Waage 
a) Feststoffe ja ISO 1183 (A) b) Flüssigkeit ja 5 Pa s ISO 901 und 758 1.4.1.3. Tauchkörpermethode ja 20 Pa s DIN 53217 1.4.2. Pyknometer ISO 3507, 
a) Feststoffe ja ISO 1183 (B), 
NF T 20-053, 
b) Flüssigkeit ja 500 Pa s ISO 758 1.4.3. Luftvergleichspyknometer ja DIN 55990 Teil 3, 
DIN 53243 
1.4.4. Schwingungsdichte ­
messer ja 5 Pa s
 
4. LITERATUR  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger (Hrsg.), Technique of organic Chemistry, Phy ­
sical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., 
New York, 1959, vol. I, Part 1.  
(3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, 
vol. 48, 508,  
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen (tm), 1979, vol. 11, 427-430.
 
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektro ­
nik, 1970, vol. 19, 297-302.  
(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeug ­
nissen — Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Pro ­
dukten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726.
 
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Braue ­
reilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 28
 
Anlage  
Für weitere technische Einzelheiten können beispielsweise folgende Normen 
herangezogen werden:  
1. Auftriebsmethoden  
1.1. Aräometer 
DIN 12790, ISO 387 Aräometer; allgemeine Bestimmungen 
DIN 12791 Teil 1: Dichte-Aräometer; Grundserien, 
Ausführung, Justierung und Anwendung 
Teil 2: Dichte-Aräometer; Normgrößen, 
Bezeichnungen 
Teil 3: Anwendung und Prüfung 
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydro ­
meters for general purpose 
NF T 20-050 Chemical products for industrial use — 
Determination of density of liquids — 
Areometric method 
DIN 12793 Laborgeräte aus Glas: Sucharäometer für 
Vormessung und rohe Betriebsmessung  
1.2. Hydrostatische Waage  
Für Feststoffe:  
ISO 1183 Method A: Methods for determining the 
density and relative density of plastics ex ­
cluding cellular plastics 
NF T 20-049 Chemical products for industrial use — 
Determination of the density of solids ot ­
her than powders and cellular products — Hydrostatic balance method 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Prüfung von Kunststoffen und Elastome ­
ren; Bestimmung der Dichte
 
Für Flüssigkeiten:  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 29
 
DIN 51757 Prüfung von Mineralölen und verwandten 
Stoffen; Bestimmung der Dichte 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 und ASTM D 1481-62 ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum pro ­
ducts by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum pro ­
ducts by hydrometer method
 
1.3. Tauchkörpermethode 
DIN 53217 Prüfung von Anstrichstoffen; Bestimmung 
der Dichte; Tauchkörpermethode  
2. Pyknometer-Methoden  
2.1. Für Flüssigkeiten: 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20  o C 
DIN 12797 Pyknometer nach Gay-Lussac (für nicht 
besonders viskose, nicht flüchtige Flüssig ­
keiten) 
DIN 12798 Pyknometer nach Lipkin (für Flüssigkei ­
ten mit einer kinematischen Viskosität 
von weniger als 100, 10  -6 m 2 s -1 bei 
15 o C) 
DIN 12800 Pyknometer nach Sprengel (für Flüssig ­
keiten wie in DIN 12798) 
DIN 12801 Pyknometer nach Reischauer (für Flüssig ­
keiten mit einer kinematischen Viskosität 
von weniger als 100, 10  -6 m 2 s -1 bei 
20 o C; kann insbesondere auf Kohlenwas ­
serstoffe sowie auf Flüssigkeiten mit ho ­
hem Dampfdruck — etwa 1 bar bei 90  o C 
— angewendet werden)  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 30
 
DIN 12806 Pyknometer nach Hubbard (für viskose 
Flüssigkeiten aller Arten, die keinen zu 
hohen Dampfdruck aufweisen, insbeson ­
dere auch für Anstrichstoffe und Bitumen) 
DIN 12807 Pyknometer nach Bingham (für Flüssig ­
keiten wie in DIN 12801) 
DIN 12808 Pyknometer nach Jaulmes (insbesondere 
für Ethanol-Wasser-Gemisch) 
DIN 12809 Pyknometer mit eingeschliffenem Ther ­
mometer und Seitenkapillaren (für nicht besonders viskose Flüssigkeiten) 
DIN 53217 Prüfung von Anstrichstoffen; Bestimmung 
der Dichte mit dem Pyknometer 
DIN 51757 Punkt 7: Prüfung von Mineralölen und 
verwandten Stoffen; Bestimmung der Dichte 
ASTM D 297 (Section 15: Rubber products — chemical 
analysis) 
ASTM D 2111 (Method C: Halogenated organic com ­
pounds) 
BS 4699 Method for determination of specific 
gravity and density of petroleum products 
(graduated bicapillary pycnometer me ­
thod) 
BS 5903 Method for determination of relative den ­
sity and density of petroleum products by 
the capillary-stoppered pycnometer me ­
thod 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use — 
Determination of density of solids in powder and liquids — Pycnometric me ­
thod
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 31
 
2.2. Für Feststoffe: 
ISO 1183 Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics ex ­
cluding cellular plastics 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use — 
Determination of density of solids in 
powder and liquids — Pycnometric me ­
thod 
DIN 19683 Bestimmung der Dichte von Böden  
3. Luftvergleichspyknometer  
DIN 55990 Teil 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 32
 
A.4. DAMPFDRUCK  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht der Prüfrichtlinie OECD TG 104 (2004).  
1.1. EINLEITUNG  
Diese geänderte Fassung von Methode A.4 (1) beinhaltet als zusätz ­
liche Methode die „Effusionsmethode: isotherme Thermogravime ­
trie“; diese Methode wurde entwickelt für Substanzen mit sehr nied ­
rigen Drücken (bis zu einem Mindestdruck von 10  –10 Pa). Ange ­
sichts der Verfahrenserfordernisse, insbesondere bei der Ermittlung 
des Dampfdrucks für Substanzen mit niedrigem Dampfdruck, werden auch andere Verfahren zur Anwendung dieser Methode im Hinblick auf sonstige Einsatzbereiche neu bewertet.
 
Bei thermodynamischem Gleichgewicht hängt der Dampfdruck einer 
reinen Substanz ausschließlich von der Temperatur ab. Die zugrunde liegenden Prinzipien werden an anderer Stelle erläutert (2)(3).
 
Kein einzelnes Messverfahren ist für sämtliche Dampfdrucke von 
unter 10  –10 Pa bis zu 10  5 Pa geeignet. Entsprechend umfasst diese 
Beschreibung acht Methoden zur Messung des Dampfdrucks, die in verschiedenen Dampfdruckbereichen eingesetzt werden können. Die vorgesehenen Einsatzmöglichkeiten und Messbereiche der einzelnen 
Methoden sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Die Methoden kön ­
nen nur im Zusammenhang mit Verbindungen eingesetzt werden, bei denen unter den Testbedingungen kein Abbau erfolgt. In Fällen, in denen die Versuchsmethoden aus technischen Gründen nicht einge ­
setzt werden können, kann der Dampfdruck auch geschätzt werden; 
eine empfohlene Schätzmethode wird in der Anlage beschrieben.
 
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN UND EINHEITEN  
Als Dampfdruck einer Substanz wird der Sättigungsdruck über einer 
festen oder flüssigen Substanz bezeichnet.  
In den Messungen sollte die Einheit Pascal (Pa) als SI-Einheit für 
Druckwerte verwendet werden. Im Folgenden sind weitere, früher 
verwendete Einheiten jeweils mit den entsprechenden Umrechnungs ­
faktoren zusammengestellt: 
1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 10  2 Pa 
1 Atmosphäre = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
Die SI-Einheit der Temperatur ist Kelvin (K). Angaben in Grad 
Celsius werden mit folgender Formel in Kelvin umgerechnet:  
T = t + 273,15  
wobei T = Kelvin oder thermodynamische Temperatur und t = Tem ­
peratur in Grad Celsius  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 33
 
Tabelle 1  
Messmethode Substanzen Geschätzte Wie ­
derholbarkeit Geschätzte Re ­
produzierbarkeit Empfohlener Bereich 
Fest Flüssig  
Dynamische Me ­
thode niedriger 
Schmelz­
punkt ja bis zu 25 % 
1 bis 5 % bis zu 25 % 
1 bis 5 % 10 3 Pa bis 
2 × 10  3 Pa 
2 × 10  3 Pa 
bis 10  5 Pa 
Statische Methode ja ja 5 bis 10 % 5 bis 10 % 10 Pa bis 10  5 Pa 
10 –2 Pa 
bis 10  5 Pa (  1 ) 
Isoteniskopmethode ja ja 5 bis 10 % 5 bis 10 % 10  2 Pa bis 10  5 Pa 
Effusionsmethode: 
Dampfdruckgleich ­
gewicht ja ja 5 bis 20 % bis zu 50 % 10  –3 bis 1 Pa 
Effusionsmethode: 
Knudsen-Zelle ja ja 10 bis 30 % — 10  –10 bis 1 Pa 
Effusionsmethode: 
isotherme Thermo ­
gravimetrie ja ja 5 bis 30 % bis zu 50 % 10  –10 bis 1 Pa 
Gassättigungs ­
methode ja ja 10 bis 30 % bis zu 50 % 10  –10 bis 10  3 Pa 
Rotationsmethode ja ja 10 bis 20 % — 10  –4 bis 0,5 Pa  
( 1 ) In Verbindung mit einem Kapazitätsmanometer.  
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Im Allgemeinen wird der Dampfdruck bei verschiedenen Tempera ­
turen gemessen. In einem begrenzten Temperaturbereich ist der Lo ­
garithmus des Dampfdrucks einer reinen Substanz eine lineare Um ­
kehrfunktion der thermodynamischen Temperatur gemäß der verein ­
fachten Clapeyron-Clausius-Gleichung:  
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ constant  
wobei  
p = Dampfdruck in Pascal  
ΔHv = Verdampfungswärme in J mol  –1 
R = universale Gaskonstante, 8,314 J mol  –1 K –1 
T = Temperatur in K  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 34
 
1.4. REFERENZSUBSTANZEN  
Referenzsubstanzen brauchen nicht unbedingt verwendet zu werden. 
Sie dienen in erster Linie zur gelegentlichen Überprüfung der Leis ­
tungsfähigkeit einer Methode und sollen Vergleiche der mit unter ­
schiedlichen Methoden erzielten Ergebnisse ermöglichen.  
1.5. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.5.1.  Dynamische Methode (Cottrell-Verfahren)  
1.5.1.1.  Prinzip  
Der Dampfdruck wird durch die Messung der Siedetemperatur einer 
Substanz bei verschiedenen vorgegebenen Drücken zwischen etwa 
10 3 und 10  5 Pa gemessen. Diese Methode wird auch für die Be ­
stimmung der Siedetemperatur empfohlen. Für diesen Zweck kann die Methode bei Temperaturen bis zu 600 K eingesetzt werden. 
Wegen des hydrostatischen Drucks der Flüssigkeitssäule liegen die 
Siedetemperaturen von Flüssigkeiten bei einer Tiefe von 3 bis 4 cm etwa 0,1 °C höher als an der Oberfläche. Beim Cottrell-Verfahren (4) wird das Thermometer über der Flüssigkeit in den Dampf gebracht 
und die siedende Flüssigkeit kontinuierlich über die Thermometer ­
kugel gepumpt. Eine dünne Flüssigkeitsschicht, die sich bei Atmo ­
sphärendruck im Gleichgewicht mit dem Dampf befindet, bedeckt die Kugel. Das Thermometer gibt dann den echten Siedepunkt an; 
Fehler durch Überhitzung oder hydrostatischen Druck werden aus ­
geschlossen. Die ursprünglich von Cottrell verwendete Pumpe ist in Abbildung 1 dargestellt. Rohr A enthält die siedende Flüssigkeit. Ein Platindraht B, der in den Boden eingesiegelt wurde, begünstigt ein 
gleichmäßiges Siedeverhalten. Das seitliche Rohr C führt zu einem 
Kondensator, und der Spritzschutz D verhindert, dass das kalte Kon ­
densat in das Thermometer E gelangt. Wenn die Flüssigkeit in A siedet, werden die entstehenden Blasen und die Flüssigkeit mit dem 
Trichter abgetrennt und über die beiden Arme der Pumpe F über die 
Thermometerkugel gegossen.  
Abbildung 1
 Abbildung 2
  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 35
 
Cottrell-Pumpe (4)  
A: Thermoelement  
B: Vakuum-Puffervolumen  
C: Druckmesser  
D: Unterdruck  
E: Messpunkt  
F: Heizelement ca. 150 W  
1.5.1.2.  Apparatur  
In Abbildung 2 ist eine sehr genaue Apparatur dargestellt, die auf 
dem Cottrell-Prinzip beruht. Die Apparatur besteht aus einem Rohr mit einem Siedebereich im unteren Teil, einem Kühler im mittleren 
Bereich und einem Auslass und einem Flansch im oberen Bereich. 
Die Cottrell-Pumpe befindet sich im Siedebereich, der mit einer elektrischen Patrone beheizt wird. Die Temperatur wird mit einem ummantelten Thermoelement oder einem Widerstandsthermomenter 
gemessen, das über den oben befindlichen Flansch in das Gerät 
geführt wird. Der Auslass ist mit einem Druckregelsystem verbun ­
den. Letzteres besteht aus einer Vakuumpumpe, einem Puffervolu ­
men, einem Druckwächter zur Druckregulierung unter Stickstoffein ­
leitung und einem Druckmesser.
 
1.5.1.3.  Verfahren  
Die Substanz wird in den Siedebereich gebracht. Bei nicht pulveri ­
gen Feststoffen können Probleme auftreten, die sich gelegentlich 
aber durch Beheizung des Kühlmantels beheben lassen. Die Appara ­
tur ist am Flansch versiegelt, und die Prüfsubstanz wird entgast. Schäumende Substanzen können mit dieser Methode nicht gemessen 
werden.
 
In der Apparatur wird der niedrigste gewünschte Druck eingestellt 
und die Heizung eingeschaltet. Dann wird der Temperatursensor mit einem Aufzeichnungsgerät verbunden.
 
Das Gleichgewicht ist dann erreicht, wenn eine gleichbleibende Sie ­
detemperatur bei konstantem Druck aufgezeichnet wird. Insbeson ­
dere ist darauf zu achten, dass während des Siedevorgangs nicht 
gegen die Apparatur gestoßen wird. Außerdem muss auf dem Kühler eine vollständige Kondensation erfolgen. Bei der Bestimmung des Dampfdrucks von niedrigschmelzenden Feststoffen ist darauf zu ach ­
ten, dass der Kondensator nicht verblockt.
 
Nach der Aufzeichnung dieses Gleichgewichtspunkts wird ein höhe ­
rer Druck eingestellt. Der Prozess wird auf diese Weise fortgesetzt, bis ein Druck von 10
 5 Pa erreicht ist (insgesamt etwa 
5 bis 10 Messpunkte). Zur Kontrolle sind die Gleichgewichtspunkte 
bei abnehmenden Drücken zu reproduzieren.  
1.5.2.  Statische Methode  
1.5.2.1.  Prinzip  
Bei der statischen Methode (5) wird der Dampfdruck bei thermo ­
dynamischem Gleichgewicht und einer gegebenen Temperatur be ­
stimmt. Diese Methode eignet sich für Substanzen und für aus meh ­
reren Bestandteilen bestehende Flüssigkeiten und Feststoffe im 
Druckbereich von 10  –1 bis 10  5 Pa sowie bei entsprechend sorgfälti ­
ger Vorgehensweise auch im Bereich von 1 bis 10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 36
 
1.5.2.2.  Apparatur  
Die Apparatur besteht aus einem Bad mit konstanter Temperatur 
(Genauigkeit ± 0,2 K), einem mit einer Unterdruckleitung verbunde ­
nen Probenbehälter, einem Druckmesser und einem System zur 
Druckregelung. Die Probenkammer (Abbildung 3a) ist über ein Ven ­
til und einen Differenzdruckmesser (ein U-Rohr mit einer geeigneten Manometerflüssigkeit) verbunden, das als Nullpunktanzeige dient. Im Differenzdruckmesser können Quecksilber, Silikone und Phtha ­
late verwendet werden; maßgeblich sind der jeweilige Druckbereich 
und das chemische Verhalten der Prüfsubstanz. Aus Gründen des Umweltschutzes sollte nach Möglichkeit jedoch auf Quecksilber ver ­
zichtet werden. Die Prüfsubstanz darf sich nicht merklich in der im 
U-Rohr enthaltenen Flüssigkeit auflösen oder mit dieser reagieren. Statt eines U-Rohrs kann auch ein Druckmesser verwendet werden (Abbildung 3b). Für den Druckmesser kann Quecksilber im Bereich 
des Atmosphärendrucks bis zu einem Mindestdruck von 10
 2 Pa ein­
gesetzt werden; Silikon-Flüssigkeiten und Phthalate sind für Drücke unter 10
 2 Pa bis zu 10 Pa geeignet. Unter 10  2 Pa können sonstige 
Druckmesser eingesetzt werden; Kapazitätsmanometer mit Heizmem ­
bran können sogar bei Drücken unter 10  –1 Pa verwendet werden. Die 
Temperatur wird an der Außenwand des Probenbehälters oder im Behälter selbst gemessen.
 
1.5.2.3.  Verfahren  
In der in Abbildung 3a beschriebenen Apparatur wird das U-Rohr 
mit der gewählten Flüssigkeit gefüllt; vor Durchführung der Messun ­
gen ist die Flüssigkeit bei höherer Temperatur zu entgasen. Die Prüfsubstanz wird in die Apparatur gebracht und bei niedrigerer Temperatur entgast. Bei aus mehreren Bestandteilen bestehenden 
Proben sollte die Temperatur so niedrig sein, dass die Zusammenset ­
zung des jeweiligen Materials erhalten bleibt. Durch Rühren kann das erforderliche Gleichgewicht schneller herbeigeführt werden. Die Probe kann dann mit flüssigem Stickstoff oder mit Trockeneis abge ­
kühlt werden. Dabei ist allerdings sicherzustellen, dass die Luft oder 
die Pumpflüssigkeit nicht kondensieren. Bei geöffnetem Ventil über der Probe wird über mehrere Minuten ein Sog ausgeübt, um die 
eingeschlossene Luft zu entfernen. Wenn erforderlich, wird die Ent ­
gasung mehrmals wiederholt.  
Abbildung 3a
 Abbildung 3b
  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 37
 
Wenn die Probe bei geschlossenem Ventil beheizt wird, erhöht sich 
der Dampfdruck. Dadurch ändert sich das Gleichgewicht der Flüssig ­
keit im U-Rohr. Um die Änderung auszugleichen, wird Stickstoff oder Luft in die Apparatur geleitet, bis die Differenzdruckanzeige wieder auf null steht. Der dazu erforderliche Druck kann an einem 
Druckmesser oder an einem genaueren Messgerät abgelesen werden. 
Dieser Druck entspricht dem Dampfdruck der Substanz bei der Messtemperatur. Bei der in Abbildung 3b dargestellten Apparatur wird der Dampfdruck direkt abgelesen.
 
Der Dampfdruck wird in geeigneten geringen Temperaturintervallen 
(insgesamt etwa 5 bis 10 Messpunkte) bis zur gewünschten Höchst ­
temperatur gemessen.  
Zur Kontrolle sind Messungen bei niedrigen Temperaturen durch ­
zuführen. Wenn die in den mehrfachen Messungen ermittelten Werte nicht auf der Kurve liegen, die sich bei den höheren Temperaturen 
ergibt, kann dies auf eine der folgenden Ursachen zurückzuführen 
sein:
 
i) Die Probe enthält noch Luft (z. B. bei hoch viskosen Materialien) 
oder Substanzen mit niedrigem Siedepunkt, die während der Er ­
wärmung freigesetzt werden.  
ii) Die Substanz durchläuft im untersuchten Temperaturbereich eine 
chemische Reaktion (z. B. eine Zersetzung oder eine Polymeri ­
sierung).  
1.5.3.  Isoteniskopmethode  
1.5.3.1.  Prinzip  
Das Isoteniskop (6) beruht auf dem Prinzip der statischen Methode. 
Bei dieser Methode wird eine Probe in einen Kolben gebracht, in 
dem eine gleichbleibende Temperatur besteht, und der mit einem Druckmesser und einer Vakuumpumpe verbunden ist. Verunrei ­
nigungen mit höherer Flüchtigkeit als die Prüfsubstanz werden durch 
Entgasen bei reduziertem Druck entfernt. Der Dampfdruck der Probe 
bei bestimmten Temperaturen wird durch einen mit einem inerten Gas ausgeübten bekannten Druck ausgeglichen. Das Isoteniskop wurde entwickelt, um den Dampfdruck bestimmter flüssiger Kohlen ­
wasserstoffe zu messen, kann aber auch zur Untersuchung von Fest ­
stoffen eingesetzt werden. Für Systeme mit mehreren Bestandteilen ist diese Methode im Allgemeinen nicht geeignet. Die Ergebnisse weisen nur leichte Fehler bei Proben mit nicht flüchtigen Verunrei ­
nigungen auf. Die Methode wird für den Bereich 10
 2 bis 10  5 Pa 
empfohlen.  
1.5.3.2.  Apparatur  
In Abbildung 4 wird ein Messsystem dargestellt. Eine vollständige 
Beschreibung ist ASTM D 2879-86 (6) zu entnehmen.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 38
 
1.5.3.3.  Verfahren  
Bei Flüssigkeiten dient die Substanz selbst als Flüssigkeit im Differenz ­
druckmesser. In das Isoteniskop wird so viel Flüssigkeit eingebracht, dass der Kolben und der kurze Fuß des Druckmessers gefüllt sind. Das Isoteniskop wird mit einem Vakuumsystem verbunden und mit 
Hilfe des Vakuumsystems vollständig entleert. Anschließend wird das 
Isoteniskop mit Stickstoff gefüllt. Die Absaugung und die Reinigung des Systems wird zweimal wiederholt, um den verbliebenen Sauerstoff zu entfernen. Das befüllte Isoteniskop wird in horizontal ausgerichtet, damit 
sich die Probe in Kolben und Druckmesser als dünne Schicht ausbreitet. 
Der Systemdruck wird auf 133 Pa reduziert, und die Probe wird all ­
mählich erwärmt, bis eben der Siedepunkt erreicht ist (Abtrennung ge ­
löster Gase). Danach wird das Isoteniskop so ausgerichtet, dass die Probe 
wieder in den Kolben zurückfließt und den kurzen Fuß des Druckmes ­
sers ausfüllt. Dabei wird ein Druck von 133 Pa aufrechterhalten. Die vorgezogene Spitze des Probenkolbens wird mit kleiner Flamme er ­
wärmt, bis sich der freigesetzte Probendampf hinreichend ausgedehnt 
hat, um einen Teil der Probe aus dem oberen Bereich des Kolbens 
und des Druckmesserarms in den Druckmesser hinein zu verdrängen und somit einen stickstofffreien Raum mit Dampf gefüllt hat. Darauf wird das Isoteniskop in ein Bad mit konstanter Temperatur gebracht, und 
Druck und Stickstoffzufuhr werden so eingestellt, dass sie mit dem 
Druck und dem Stickstoffanteil der Probe übereinstimmen. Wenn das erwünschte Gleichgewicht erreicht ist, entspricht der Stickstoffdruck dem Dampfdruck der Prüfsubstanz.
 
Abbildung 4
  
Bei Feststoffen sowie je nach Druck- und Temperaturbereich werden 
Manometerflüssigkeiten wie z. B. Silikon-Flüssigkeiten oder Phtha ­
late verwendet. Die entgaste Manometerflüssigkeit wird in eine dafür 
vorgesehene Aufwölbung am langen Arm des Isoteniskops gebracht. Anschließend wird der zu prüfende Feststoff in den Probenkolben gegeben und bei einer höheren Temperatur entgast. Darauf wird das 
Isoteniskop so geneigt, dass die Manometerflüssigkeit in das U-Rohr 
fließen kann.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 39
 
1.5.4.  Effusionsmethode: Dampfdruckgleichgewicht  (7) 
1.5.4.1.  Prinzip  
Eine Probe der Prüfsubstanz wird in einem kleinen Ofen erhitzt und in 
eine Gasglocke gebracht, in der ein Unterdruck hergestellt wurde. Der Ofen wird mit einem Deckel verschlossen, in dem sich kleine Löcher mit einem bestimmten Durchmesser befinden. Der aus der Substanz erzeugte 
Dampf entweicht durch eines dieser Löcher und wird unmittelbar auf die 
Schale einer hoch empfindlichen Waage geleitet, die sich ebenfalls im Vakuum der Glasglocke befindet. Bei manchen Ausführungen ist die Waagschale von einem Kühlgefäß umgeben, über das die Wärme ther ­
misch abgeleitet und unter Abstrahlung der Wärme so gekühlt wird, dass 
sich der entweichende Dampf darauf niederschlägt. Die Energie des Dampfstrahls wirkt als Kraft auf die Waage. Der Dampfdruck kann auf zweierlei Weise ermittelt werden: entweder direkt aus der auf die 
Waagschale wirkenden Kraft oder mit Hilfe der Hertz-Knudsen-Glei ­
chung aufgrund der Verdampfungsgeschwindigkeit (2):
 
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
wobei  
G = Verdampfungsgeschwindigkeit (kg s  –1 m –2 ) 
M = Molmasse (g mol  –1 ) 
T = Temperatur (K)  
R = Universale Gaskonstante (J mol  –1 K –1 ) 
P = Dampfdruck (Pa)  
Der empfohlene Bereich liegt zwischen 10  –3 und 1 Pa.  
1.5.4.2.  Apparatur  
Abbildung 5 veranschaulicht das Grundprinzip der Apparatur:  
Abbildung 5
  
A: Bodenplatte F: Kühlgehäuse und Kühlschiene 
B: Bewegliches Kühlinstrument G: Verdampfungsofen C: Gasglocke H: Dewargefäß mit flüssigem Stickstoff D: Waage mit Waagschale I: Messung der Probentemperatur E: Vakuummessgerät J: Prüfsubstanz
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 40
 
1.5.5.  Effusionsmethode: Knudsen-Zelle  
1.5.5.1.  Prinzip  
Die Methode beruht auf der Schätzung der Masse der Prüfsubstanz, 
die im Ultravakuum pro Zeiteinheit aus einer Knudsen-Zelle (8) als 
Dampf durch eine Mikrobohrung strömt. Die Masse des ausströmen ­
den Dampfs kann entweder aufgrund des Masseverlustes der Zelle oder durch Kondensation des Dampfs bei niedriger Temperatur und anschließende chromatographische Messung der Menge der verflüch ­
tigten Substanz bestimmt werden. Der Dampfdruck wird mit Hilfe 
der Hertz-Knudsen-Gleichung (siehe Abschnitt 1.5.4.1) unter Be ­
rücksichtigung von Korrekturfaktoren berechnet, die von den Para ­
metern der jeweiligen Apparatur abhängen (9). Empfohlen wird diese 
Methode für den Bereich 10
 –10 bis 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14).  
1.5.5.2.  Apparatur  
Abbildung 6 veranschaulicht das Grundprinzip der Apparatur:  
Abbildung 6
  
1: Verbindung zum Vakuum 7: Deckel mit Schraubgewinde 
2: Bohrungen des Platinwiderstand-Thermo ­
meters oder Temperaturmessung und 
Kontrolle 8: Flügelmuttern 
3: Deckel Vakuumtank 9: Schrauben 
4: O-Ring 10: Edelstahl-Effusionszellen 5: Aluminum-Vakuumtank 11: Heizpatrone 
6: Vorrichtung zum Einsetzen und Abneh ­
men der Effusionszellen
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 41
 
1.5.6.  Effusionsmethode: isotherme Thermogravimetrie  
1.5.6.1.  Prinzip  
Die Methode beruht auf der Bestim mung der Geschwindigkeit einer be ­
schleunigten Verdampfung der Prüfsubstanz bei höheren Temperaturen 
und bei Umgebungsdruck durch Thermogravimetrie (10)(15)(16)(17)(18) ­
(19)(20). Die Verdampfungsgeschwindigkeiten v  T ergeben sich daraus, 
dass die jeweils ausgewählte Verbindung einer Atmosphäre mit einem langsam strömenden inerten Gas ausgesetzt wird; bei gegebenen isother ­
men Temperaturen T (ausgedrückt in Kelvin) wird dann über bestimmte 
Zeitspannen der Gewichtsverlust überwacht. Die Dampfdrücke p
 T werden 
aus den Werten für v  T aufgrund der linearen Beziehung zwischen dem 
Logarithmus des Dampfdrucks und dem Logarithmus der Verdampfungs ­
geschwindigkeit bestimmt. Wenn erfo rderlich, kann durch eine Regressi ­
onsanalyse von log p  T bezogen auf 1/T eine Extr apolierung auf Tempera ­
turen von 20 und 25 °C erfolgen. Diese Methode kommt für Substanzen 
mit Mindestdampfdrücken bis zu 10  –10 Pa (10  –12 mbar) in Betracht; um 
Fehlinterpretationen der gemessenen Gewichtsverluste zu vermeiden, sollte die Reinheit annähernd 100 % betragen.
 
1.5.6.2.  Apparatur  
In Abbildung 7 wird das allgemeine Prinzip der Apparatur dargestellt:  
Abbildung 7
  
Die in einer Kammer mit Temperaturüberwachung an einer Mikro ­
waage aufgehängte Probenträgerplatte wird von trockenem Stick ­
stoffgas umströmt, in dem die verdampften Moleküle der Prüfsub ­
stanz geführt werden. Nach dem Verlassen der Kammer wird der Gasstrom durch eine Sorptionseinheit gereinigt.
 
1.5.6.3.  Verfahren  
Die Prüfsubstanz wird als homogene Schicht auf eine aufgeraute Glas ­
platte aufgebracht. Bei Feststoffen wird die Platte gleichförmig mit 
einer Lösung befeuchtet, in der die Prüfsubstanz in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst wurde; anschließend wird die Lösung in einer inerten Atmosphäre getrocknet. Für die Messung wird die beschichtete 
Platte in den Thermogravimetrie-Analysator gehängt, dort wird der 
Gewichtsverlust kontinuierlich als zeitabhängige Funktion bestimmt.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 42
 
Aus dem Gewichtsverlust Δm der Probenplatte wird die Verdamp ­
fungsgeschwindigkeit v  T bei einer bestimmten Temperatur mit der 
folgenden Formel berechnet:  
v T ¼ Δm 
F Ö t gcm  –2 h –1 Ê Ì  
wobei F = Oberfläche der beschichteten Prüfsubstanzen (im All ­
gemeinen die Oberfläche der Probenplatte) und t = Dauer des Ge ­
wichtsverlusts Δm 
Der Dampfdruck p  T wird ausgehend von der Funktion der 
Verdampfungsgeschwindigkeit v  T wie folgt berechnet:  
Log p  T = C + D log v  T 
wobei C und D spezifische Konstanten für die jeweilige Apparatur 
sind und vom Durchmesser der Messkammer sowie vom Gasstrom abhängen. Diese Konstanten sind einmal zu bestimmen, indem eine Reihe von Verbindungen mit bekanntem Dampfdruck gemessen und 
dann durch Regressionsanalyse log p
 T gegenüber log v  T ermittelt 
wird (11)(21)(22).  
Die Beziehung zwischen dem Dampfdruck p  T und der Temperatur T 
in Kelvin wird wie folgt ausgedrückt:  
Log p  T = A + B 1/T  
Dabei sind A und B Konstanten, die sich aus der Regressionsanalyse 
von log p  T gegenüber 1/T ergeben. Mit dieser Formel kann der 
Dampfdruck für jede beliebige Temperatur extrapoliert werden.  
1.5.7.  Gassättigungsmethode  (23)  
1.5.7.1.  Prinzip  
Das inerte Gas wird bei Raumtemperatur und mit einer bekannten 
Durchflussgeschwindigkeit so langsam durch bzw. über eine Probe 
der Prüfsubstanz geleitet, dass eine Sättigung eintreten kann. Die Her ­
beiführung der Sättigung in der Gasphase ist von entscheidender Be ­
deutung. Die mitgeführte Substanz wird eingeschlossen (im Allgemei ­
nen mit einem Sorptionsmittel); anschließend wird die Menge der ab ­
getrennten Substanz bestimmt. Alternativ zum Dampfeinschluss mit anschließender Analyse kommen in den Gasstrom integrierte Analyse ­
verfahren wie z. B. die Gaschromatographie zur quantitativen Bestim ­
mung des mitgeführten Materials in Betracht. Der Dampfdruck wird ausgehend von der Annahme berechnet, dass sich der Gasstrom ent ­
sprechend dem idealen Gasgesetz verhält und dass der Gesamtdruck 
eines Gasgemischs mit der Summe der Drücke der einzelnen enthalte ­
nen Gase übereinstimmt. Der Teildruck der Prüfsubstanz, d. h. der Dampfdruck, wird aus dem bekannten Volumen des gesamten Gas ­
stroms und aus dem Gewicht des mitgeführten Materials berechnet.
 
Das Gassättigungsverfahren ist für feste und flüssige Substanzen 
geeignet. Es kann bei Mindestdampfdrücken bis zu 10  –10 Pa 
genutzt werden (10)(11)(12)(13)(14). Bei Dampfdrücken 
unter 10  3 Pa ist diese Methode die zuverlässigste Methode. 
Über 10  3 Pa werden die Dampfdrücke im Allgemeinen über ­
schätzt; dies ist wahrscheinlich auf die Bildung von Aerosolen 
zurückzuführen. Da die Dampfdruckmessungen bei Raumtempera ­
tur erfolgen, brauchen keine Extrapolierungen hoher Temperatu ­
ren vorgenommen zu werden; entsprechend entfallen die häufig mit der Extrapolierung hoher Temperaturen verbundenen schwer ­
wiegenden Fehler.
 
1.5.7.2.  Apparatur  
Für das Verfahren wird ein Behälter mit konstanter Temperatur 
benötigt. In Abbildung 8 ist ein Behälter mit Haltern für jeweils drei feste und flüssige Proben skizziert, in dem jeweils drei wahlweise feste oder flüssige Proben analysiert werden können. 
Die Temperatur wird mit einer Genauigkeit von mindestens 
± 0,5 °C überwacht.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 43
 
Abbildung 8
  
Im Allgemeinen wird Stickstoff als inertes Trägergas verwendet; 
gelegentlich können aber auch sonstige Gase erforderlich sein 
(24). Das Trägergas muss trocken sein. Der Gasstrom wird in sechs Teilströme getrennt, die jeweils durch Kegelventile (mit Bohrungen von ca. 0,79 mm) geregelt und über ein Kupferrohr 
mit einem Innendurchmesser von 3,8 mm in den Behälter gelei ­
tet werden. Nach dem Temperaturausgleich strömt das Gas durch die Probe und verlässt den Behälter durch die Adsorptionsfalle.
 
Feste Proben werden in ein mit Glaswollestopfen verschlossenes Glas ­
rohr mit einem Innendurchmesser von 5 mm gegeben (siehe Abbildung 9). In Abbildung 10 sind ein Halter für feste Proben und ein Sorptions ­
system dargestellt. Die am besten reproduzierbare Methode zur Mes ­
sung des Dampfdrucks von Flüssigkeiten besteht darin, die zu prüfende Flüssigkeit auf Glasperlen oder auf ein inertes Sorptionsmittel wie z. B. Kieselerde aufzubringen und den Halter mit diesen Perlen zu packen. 
Alternativ kann das Trägergas auch über eine grobe Fritte und eine 
Blase durch die Säule mit der flüssigen Prüfsubstanz geleitet werden.  
Abbildung 9
 Abbildung 10
  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 44
 
Das Sorptionssystem enthält einen vorderen und einen hinteren Sorp ­
tionsabschnitt. Bei sehr niedrigen Dampfdrücken werden nur geringe 
Anteile vom Sorptionsmittel abgetrennt; dabei kann die Adsorption auf der Glaswolle und im Glasrohr zwischen der Probe und dem Sorptionsmittel ein ernsthaftes Problem sein.
 
Mit festem CO  2 gekühlte Abscheider stellen eine weitere wirksame 
Möglichkeit zur Aufnahme des verdampften Materials dar. Diese 
Abscheider verursachen keinerlei Gegendruck auf die Sättigungssäu ­
le; außerdem lässt sich das abgetrennte Material leicht quantitativ bestimmen.
 
1.5.7.3.  Verfahren  
Die Durchflussgeschwindigkeit des ausströmenden Trägergases wird 
bei Raumtemperatur gemessen. Während der Messung wird die Durchflussgeschwindigkeit häufig geprüft, um sicherzustellen, dass 
das Gesamtvolumen des Trägergases zuverlässig ermittelt wird. Vor ­
zugsweise erfolgt eine kontinuierliche Überwachung mit einem Men ­
gendurchflussmesser. Die Sättigung der Gasphase kann eine be ­
trächtliche Kontaktzeit und entsprechend verhältnismäßig geringe 
Gasdurchflüsse erfordern (25).
 
Im Anschluss an die Messungen werden der vordere und der hintere 
Sorptionsabschnitt getrennt analysiert. Die Verbindungen in den ein ­
zelnen Abschnitten werden durch Zugabe eines Lösungsmittels de ­
sorbiert. Die entstehenden Lösungen werden einer quantitativen Ana ­
lyse unterzogen, um die jeweils aus den Abschnitten desorbierten 
Gewichte zu bestimmen. Die Wahl der Analysemethode (sowie die Wahl des Sorptionsmittels und des desorbierenden Lösungsmittels) hängt von der Beschaffenheit des zu prüfenden Materials ab. Die 
Desorptionsleistung wird bestimmt, indem eine bekannte Proben ­
menge auf das Sorptionsmittel gespritzt, die Substanz desorbiert und anschließend die zurückgewonnene Menge analysiert wird. Die Desorptionsleistung muss mit der gleichen oder zumindest annähernd 
gleichen Probenkonzentration wie in der eigentlichen Prüfung be ­
stimmt werden.
 
Um sicherzustellen, dass das Trägergas mit der Prüfsubstanz gesättigt 
ist, werden drei verschiedene Durchflussgeschwindigkeiten einge ­
stellt. Wenn sich der berechnete Dampfdruck auch bei unterschied ­
lichen Durchflüssen nicht ändert, wird angenommen, dass das Gas 
gesättigt ist.  
Der Dampfdruck wird mit folgender Gleichung berechnet:  
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
wobei  
p = Dampfdruck (Pa)  
W = Gewicht der verdampften Prüfsubstanz (g)  
V = Volumen des gesättigten Gases (m  3 ) 
R = universale Gaskonstante 8,314 (J mol  –1 K –1 ) 
T = Temperatur (K)  
M = Molmasse der Prüfsubstanz (g mol  –1 ) 
Die gemessenen Volumina sind unter Berücksichtigung von Druck- 
und Temperaturunterschieden zwischen Durchflussmesser und Sätti ­
gungssäule zu korrigieren.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 45
 
1.5.8.  Rotationsmethode  
1.5.8.1.  Prinzip  
Bei dieser Methode wird ein Rotationsviskosimeter eingesetzt, bei 
dem das Messelement aus einer kleinen Stahlkugel besteht, die in 
einem Magnetfeld aufgehängt durch Drehfelder in Drehungen ver ­
setzt wird (26)(27)(28). Aufnehmerspulen ermöglichen eine Messung der Drehzahl. Wenn die Kugel eine bestimmte Drehzahl erreicht hat (in der Regel etwa 400 Umdrehungen pro Sekunde), wird die Erre ­
gung unterbrochen, und infolge der Gasreibung erfolgt eine Verzöge ­
rung. Der Rückgang der Drehzahl wird zeitabhängig gemessen. Aus der druckabhängigen Verlangsamung der Stahlkugel wird der 
Dampfdruck abgeleitet. Diese Methode wird für den Bereich von 
10
 –4 bis 0,5 Pa empfohlen.  
1.5.8.2.  Apparatur  
In Abbildung 11 ist die Apparatur schematisch dargestellt. Der Mess ­
fühler wird in ein Gehäuse mit konstanter Temperatur gebracht, in 
dem die Temperatur mit einer Genauigkeit von 0,1 °C geregelt wird. 
Der Probenbehälter wird in ein getrenntes Gehäuse gesetzt, dessen Temperatur ebenfalls mit einer Genauigkeit von 0,1 °C geregelt wird. Alle übrigen Teile der Apparatur werden auf einer höheren 
Temperatur gehalten, um eine Kondensatbildung auszuschließen. 
Die gesamte Apparatur ist mit einem Hochvakuumsystem verbunden.
 
Abbildung 11
  
2. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT  
2.1. DATEN  
Der Dampfdruck sollte mit den genannten Methoden jeweils bei 
mindestens zwei Temperaturen gemessen werden. Im Bereich 0 
bis 50 °C werden Messungen vorzugsweise bei drei Temperaturen durchgeführt, um zu prüfen, ob die Dampfdruckkurve linear verläuft. Bei der Effusionsmethode (Knudsen-Zelle und isotherme Thermo ­
gravimetrie) und bei der Gassättigungsmethode wird statt des übli ­
chen Bereichs von 0 bis 50 °C ein Temperaturbereich von 120 bis 150 °C empfohlen.
 
2.2. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten:  
— eingesetzte Methode;  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 46
 
— genaue Spezifizierung der Substanz (Beschreibung 
und Verunreinigungen); ggf. ist eine vorläufige Reinigung zu 
protokollieren;  
— mindestens zwei Dampfdruck- und Temperaturwerte — vorzugs ­
weise drei oder mehr — im Temperaturbereich 0 bis 50 °C (bzw. 
120 bis 150 °C);  
— mindestens einer der Temperaturwerte sollte 25 °C oder weniger 
betragen, wenn bei der jeweils gewählten Methode technisch möglich;
 
— alle Originaldaten;  
— eine Kurve log p vs. 1/T;  
— eine Schätzung des Dampfdrucks bei 20 oder 25 °C.  
Wenn ein Übergang (Änderung des Aggregatzustandes oder Zerset ­
zung) beobachtet wird, sollten folgende Informationen vermerkt wer ­
den: 
— Art der Änderung;  
— Temperatur, bei der die Änderung bei Atmosphärendruck auftritt;  
— Dampfdruck bei 10 und 20 °C unter der Übergangstemperatur 
und bei 10 und 20 °C über dieser Temperatur (wenn der Über ­
gang nicht vom festen Zustand in den gasförmigen Zustand er ­
folgt).  
Alle für die Auswertung der Ergebnisse maßgeblichen Informationen 
und Bemerkungen sind zu protokollieren; dies gilt insbesondere für Verunreinigungen und für die physikalische Beschaffenheit der Prüf ­
substanz.
 
3. LITERATUR  
1. Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften  L 383 A, S. 26- 
47 (1992).  
2. Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London.  
3. Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3  rd ed., Vol I, Part I. 
Chapter IX, Interscience Publ., New York.  
4. Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2  nd ed., 
Van Nostrand Company, New York.  
5. NF T 20-048 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10
 –1 to 10  5 Pa — Static 
method.  
6. ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure 
— temperature relationship and initial decomposition tempera ­
ture of liquids by isoteniscope.  
7. NF T 20-047 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use — Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa — Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 47
 
8. Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 
593. 
9. Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, S. 1173.  
10. Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest 
Management Science 56, S. 521-532.  
11. Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition 
(2000).  
12. Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 
S. 22-28.  
13. Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
S. 269-278.  
14. Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-di ­
oxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), S. 117-122.  
15. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for De ­
termining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973), S. 137-147.
 
16. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for De ­
termining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974), S. 393-400.
 
17. Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A 
Method for Determining the Volatility of Active Ingredients 
Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relations ­
hip between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982), S. 161-168.
 
18. Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide 
Science 45 (1995), S. 27-31.
 
19. Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science 53 (1998), S. 300-310.
 
20. Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87 ­
(12) (1998), S. 1512-20.
 
21. Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 
81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range — 25 °C to 150 °C.
 
22. Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, 
Vol. 88 (2002).  
23. 40 CFR, 796. (1993). S. 148-153, Office of the Federal Re ­
gister, Washington DC.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 48
 
24. Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, S. 435.  
25. Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, S. 1375.  
26. Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), S. 2440.  
27. Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. 
Sci. Technol. 17(2), S. 642.  
28. Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), S. 1715.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 49
 
Anlage  
Schätzmethode  
EINLEITUNG  
Geschätzte Dampfdrücke können verwendet werden,  
— um zu entscheiden, welche Prüfmethode im Einzelfall am besten geeignet ist, 
und 
— um in den Fällen einen Schätz- oder Grenzwert angeben zu können, in denen 
eine Prüfmethode aus technischen Gründen nicht zur Anwendung kommen kann.
 
SCHÄTZMETHODE  
Der Dampfdruck von Flüssigkeiten und Feststoffen kann aufgrund der modifi ­
zierten Watson-Korrelation geschätzt werden (a). In diesem Fall braucht als Prüf ­
wert nur der normale Siedepunkt bestimmt zu werden. Diese Methode kommt im Druckbereich 10
 5 Pa bis 10  –5 Pa in Betracht.  
Detaillierte Informationen zu dieser Methode sind dem „Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods“ zu entnehmen (b). Außerdem wird auf die OECD Environmental Monograph No. 67 verwiesen (c).
 
BERECHNUNGSVERFAHREN  
Der Dampfdruck wird wie folgt berechnet:  
ln P  vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – 3 – 2  T 
T b Í Î  m 
T 
T b – 2m 3 – 2  T 
T b Í Î  m – 1 
ln T 
T b 2 
6 6 4 3 
7 7 5
 
wobei  
T = maßgebliche Temperatur  
T b = normaler Siedepunkt  
P VP = Dampfdruck bei Temperatur T  
ΔH Vb = Verdampfungswärme  
ΔZ b = Kompressibilitätsfaktor (geschätzt 0,97)  
m = empirischer Faktor, abhängig von der physikalischen Beschaffenheit 
bei der maßgeblichen Temperatur  
Außerdem ist folgende Berechnung vorzunehmen:  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
wobei K  F ein empirischer Faktor ist, der die Polarität der Substanz berücksich ­
tigt; im Anhang sind die Faktoren K  F für verschiedene Verbindungen zusammen ­
gestellt.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 50
 
Verhältnismäßig häufig sind Daten verfügbar, bei denen ein Siedepunkt bei 
reduziertem Druck angegeben wird. In diesen Fällen wird der Dampfdruck wie 
folgt berechnet:  
ln P vp ≈ ln P 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 – 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m T 1 
T – 2m 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m – 1 
ln T 
T 1 " #  
wobei T  1 = Siedepunkt bei reduziertem Druck P  1 . 
BERICHT  
Bei der Schätzmethode sollte die vorgenommene Berechnung im Bericht umfas ­
send dokumentiert werden.  
LITERATUR  
a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398.  
b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D. H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill.  
c) OECD Environmental Monograph No. 67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assess ­
ment (1993).  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 51
 
A.5. OBERFLÄCHENSPANNUNG  
1. METHODEN  
Den meisten der hier beschriebenen Methoden liegt die OECD-Prüf ­
richtlinie (1) zugrunde. Die Grundprinzipien sind in (2) angegeben.  
1.1. EINLEITUNG  
Die hier beschriebenen Methoden sind zur Messung der Oberflä ­
chenspannung wässriger Lösungen anzuwenden.  
Zweckdienlich ist, dass vor der Durchführung dieser Prüfungen Vor ­
abinformationen über die Wasserlöslichkeit, die Struktur, die Hydro ­
lyseeigenschaften und die kritische Konzentration für Mizellbildung des Stoffes vorliegen.
 
Die nachstehenden Methoden können für die meisten chemischen 
Substanzen ohne Einschränkung in Bezug auf ihren Reinheitsgrad 
angewendet werden.  
Die Messung der Oberflächenspannung nach der Ringmethode be ­
schränkt sich auf wässrige Lösungen mit einer dynamischen Visko ­
sität unter ca. 200 mPa s.  
1.2. DEFINITION UND EINHEITEN  
Die freie Oberflächenenthalpie pro Oberflächeneinheit bezeichnet 
man als Oberflächenspannung.  
Die Oberflächenspannung wird in folgenden Einheiten angegeben:  
N/m (SI-Einheit) oder  
mN/m (SI-Untereinheit)  
1 N/m = 10  3 dyn/cm  
1 mN/m = 1 dyn/cm im veralteten CGS-System  
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Referenzsubstanzen müssen nicht in allen Fällen verwendet werden, 
in denen eine neue Prüfsubstanz untersucht wird. Die Referenzsub ­
stanzen sollten in erster Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu 
Zeit zu überprüfen und einen Vergleich mit den Ergebnissen aus anderen Methoden zu ermöglichen.
 
Referenzsubstanzen, die einen weiten Bereich von Oberflächenspan ­
nungen abdecken, sind in der Literatur (1) (3) aufgeführt.  
1.4. PRINZIP DER METHODEN  
Gemessen wird die maximale Kraft, die in vertikaler Richtung auf 
einen Bügel oder einen Ring ausgeübt werden muss, um diesen aus 
seinem Kontakt mit der Oberfläche der in ein Messgerät gefüllten 
Prüfflüssigkeit zu ziehen, bzw. die auf eine Platte ausgeübt werden muss, deren einer Rand in Kontakt mit der Oberfläche steht, um den gebildeten Film hochzuziehen.
 
Stoffe, die mindestens in einer Konzentration von 1 mg/l in Wasser 
löslich sind, werden in wässriger Lösung in einer einzigen Konzen ­
tration geprüft.  
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Die Genauigkeit dieser Methoden überschreitet wahrscheinlich alle 
Kontrollerfordernisse des Umweltschutzes.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 52
 
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODEN  
Eine Lösung der Prüfsubstanz wird in destilliertem Wasser zuberei ­
tet. Die Konzentration dieser Lösung sollte bei 90 % der Sättigungs ­
löslichkeit der Substanz in Wasser liegen; wenn diese Konzentration 
höher liegt als 1 g/l, wird für die Prüfung eine Konzentration von 
1 g/l verwendet. Substanzen mit einer Wasserlöslichkeit unter 1 mg/1 brauchen nicht geprüft zu werden.
 
1.6.1.  Plattenmethode  
Siehe ISO 304 und NF T 73-060 (Surface active agents — determi ­
nation of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.2.  Bügelmethode  
Siehe ISO 304 und NF T 73-060 (Surface active agents — determi ­
nation of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.3.  Ringmethode  
Siehe ISO 304 und NF T 73-060 (Surface active agents — determi ­
nation of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.4.  OECD-Ringmethode  
1.6.4.1.  Apparatur  
Zur Ausführung der in Betracht kommenden Messungen eignen 
sich handelsübliche Tensiometer. Sie bestehen aus folgenden Tei ­
len: 
— einem beweglichen Probentisch,  
— einem Kraftmesssystem,  
— einem Messkörper (Ring),  
— einem Messgefäß.  
1.6.4.1.1. B e w e g l i c h e r P r o b e n t i s c h  
Der bewegliche Probentisch dient als Untersatz für das thermostati ­
sierte Messgefäß, in welchem sich die zu untersuchende Flüssigkeit 
befindet. Er ist zusammen mit dem Kraftmesssystem auf ein Stativ montiert.
 
1.6.4.1.2. K r a f t m e s s s y s t e m  
Das Kraftmesssystem (siehe Abbildung) befindet sich über dem Pro ­
bentisch. Der Fehler der Kraftmessung sollte einen Wert von  ± 10 -6 
N nicht übersteigen, was einer Fehlergrenze von ± 0,1 mg bei der 
Massenbestimmung entspricht. In den meisten Fällen erfolgt die Ein ­
teilung der Messskala handelsüblicher Tensiometer in mN/m, so dass 
die Oberflächenspannung direkt in mN/m mit einer Genauigkeit von 
0,1 mN/m abgelesen werden kann.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 53
 
1.6.4.1.3. M e s s k ö r p e r ( R i n g )  
Üblicherweise wird der Ring aus Platin-Iridium-Draht mit einer 
Stärke von etwa 0,4 mm und einem mittleren Umfang von 
60 mm hergestellt. Der Drahtring ist horizontal mittels einer Befestigungsgabel aus Draht und einem Metallstift aufgehängt, welche die Verbindung zum Kraftmesssystem darstellen (siehe 
Abbildung).
 
Abbildung  
Messkörper  
(alle Abmessungen in mm)
  
1.6.4.1.4. M e s s g e f ä ß  
Zur Aufnahme der Prüflösung bei den Messungen sollte ein ther ­
mostatisiertes Glasgefäß benutzt werden. Die Anordnung sollte so 
ausgelegt werden, dass während der Messung die Temperatur sowohl der Prüflösung wie auch die der sich über deren Oberfläche befind ­
lichen Gasphase konstant bleiben und die Probe nicht verdampfen 
kann. Hierfür sollten zylindrische Glasgefäße mit einem Innendurch ­
messer von nicht weniger als 45 mm zur Anwendung kommen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 54
 
1.6.4.2.  Vorbereitung der Apparatur  
1.6.4.2.1. R e i n i g u n g  
Die Glasgefäße müssen sorgfältig gereinigt werden. Falls notwendig, 
sollten sie mit heißer Chromschwefelsäure und anschließend mit sirupartiger Phosphorsäure (83 bis 98 Gew.- % H
 3 PO 4 ) gewaschen, 
sorgfältig mit Leitungswasser gespült und schließlich nochmals mit 
doppelt destilliertem Wasser ausgewaschen werden, bis man eine 
neutrale Reaktion erhält. Daraufhin trocknet man das Gefäß oder spült es mit der zu untersuchenden Probenlösung aus.
 
Der Ring sollte zunächst sorgfältig mit Wasser abgewaschen werden, 
um alle wasserlöslichen Substanzen zu entfernen. Anschließend wird 
er kurzzeitig in Chromschwefelsäure getaucht, in doppelt destillier ­
tem Wasser bis zur neutralen Reaktion gespült und schließlich kurz über einer Methanolflamme erhitzt.
 
Anmerkung  
Verunreinigungen durch Substanzen, die weder durch Chromschwe ­
felsäure noch Phosphorsäure gelöst oder zersetzt werden, wie bei ­
spielsweise Silikone, sind mittels geeigneter organischer Lösungsmit ­
tel zu entfernen.  
1.6.4.2.2. E i c h u n g d e r A p p a r a t u r  
Die Validierung der Apparatur besteht in einer Überprüfung des 
Nullpunktes. Dieser sollte so eingestellt werden, dass die Instrumen ­
tenanzeige eine zuverlässige Bestimmung in mN/m zulässt.  
Aufstellung  
Das Gerät muss waagerecht aufgestellt werden, was sich beispiels ­
weise unter Zuhilfenahme einer Wasserwaage, die man auf die Grundplatte des Tensiometers legt, und entsprechender Einstellungen 
mit den dort vorgesehenen Stellschrauben erzielen lässt.
 
Nullpunkteinstellung  
Nach der Befestigung des Rings an der Apparatur und vor dem 
Eintauchen in die Flüssigkeit sind der Nullpunkt der Tensiometer ­
anzeige einzustellen und die Parallelität des Rings zur Flüssigkeits ­
oberfläche zu überprüfen. Dazu kann man die Flüssigkeitsoberfläche 
als Spiegel benutzen.  
Eichen  
Das eigentliche Eichen vor den Untersuchungen lässt sich auf zwei ­
erlei Weise durchführen:  
a) Benutzung einer Masse: Bei diesem Verfahren verwendet man 
Reiter bekannter Masse zwischen 0,1 g und 1,0 g, die auf diesem 
Ring angebracht werden. Der Eichfaktor Φ a , mit dem alle am 
Instrument abgelesenen Werte multipliziert werden müssen, lässt sich entsprechend der Gleichung (1) bestimmen:
 
Φ a ¼ σ r 
σ a (1) 
Hierbei ist:  
σ r ¼ mg 
2b (mN/m)  
m = Masse des Reiters  
g = Erdbeschleunigung (981 cm s  -2 in Meereshöhe)  
b = mittlerer Umfang des Rings (cm)  
σ a = abgelesener Wert am Tensiometer nach dem Anbringen 
des Reiters auf dem Ring (mN/m)  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 55
 
b) Verwendung von Wasser: Bei diesem Verfahren benutzt man 
reines Wasser, dessen Oberflächenspannung bei 23  o C einen 
Wert von 72,3 mN/m besitzt. Dieses Verfahren ist bei weitem schneller durchführbar als die Eichung mit Gewichten, doch läuft man hierbei immer Gefahr, dass die Oberflächenspannung des 
Wassers durch Spurenverunreinigungen mit oberflächenaktiven 
Substanzen verfälscht wird.
 
Der Eichfaktor Φ b , mit dem alle am Instrument abgelesenen 
Werte multipliziert werden müssen, lässt sich entsprechend der 
Gleichung (2) bestimmen:  
Φ b ¼ σ o 
σ g (2) 
Hierbei ist:  
σ o = angegebener Literaturwert für die Oberflächenspannung 
von Wasser (mN/m)  
σ g = gemessener Wert der Oberflächenspannung von Wasser 
(mN/m) beide bei der gleichen Temperatur.  
1.6.4.3.  Vorbereitung der Proben  
Von den zu untersuchenden Substanzen sind wässrige Lösungen in 
den erforderlichen Konzentrationen herzustellen. Die Lösungen dür ­
fen keine ungelösten Bestandteile enthalten.  
Die Lösung ist bei konstanter Temperatur zu halten (± 0,5  o C). Da 
sich die Oberflächenspannung der im Messbehälter befindlichen Lö ­
sung im Verlauf der Zeit verändert, sollten Messungen zu verschie ­
denen Zeitpunkten vorgenommen und entsprechend eine Kurve er ­
stellt werden, die die Oberflächenspannung in Abhängigkeit von der 
Zeit darstellt. Ein Gleichgewichtszustand ist erreicht, sobald keine 
weiteren Änderungen auftreten.  
Verschmutzung durch Staub oder gasförmige Substanzen beeinträch ­
tigt die Messung. Aus diesem Grunde sollten die Arbeiten unter 
einer Schutzhaube vorgenommen werden.  
1.6.5.  Prüfbedingungen  
Die Messungen sind bei etwa 20  o C auszuführen, und die Tempera ­
turkonstanz sollte mit ± 0,5  o C eingehalten werden.  
1.6.6.  Durchführung der Prüfung  
Die zu messenden Lösungen werden in das sorgfältig gereinigte Mess ­
gefäß gefüllt, wobei darauf geachtet werden sollte, Schaumbildung zu 
vermeiden. Anschließend wird das Messgefäß auf den Tisch der Test ­
apparatur gestellt. Das Tischoberteil mit dem Messgefäß wird nun so weit hochgeschraubt, bis der Ring unter die Oberfläche der zu messen ­
den Lösung taucht. Daraufhin wird das Tischoberteil langsam und 
gleichmäßig abgesenkt (mit einer Geschwindigkeit von ca. 0,5 cm/min), 
um den Ring aus der Oberfläche herauszuziehen, bis ein maximaler Wert der Kraft erreicht ist. Der am Ring haftende Flüssigkeitsfilm darf nicht von ihm abreißen. Nach Beendigung der Messung wird der Ring wieder 
unter die Oberfläche getaucht und der Vorgang wiederholt, bis ein kon ­
stanter Wert der Oberflächenspannung erreicht ist. Bei jeder Bestim ­
mung sollte die Zeitmessung mit dem Einfüllen der Lösung in das Mess ­
gefäß beginnen. Die Ablesung erfolgt jeweils zu dem Zeitpunkt, bei dem 
die Maximalkraft beim Herausziehen des Rings aus der Flüssigkeits ­
oberfläche erreicht ist.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 56
 
2. DATEN  
Zur Berechnung der Oberflächenspannung wird zunächst der in 
mN/m an der Apparatur abgelesene Wert mit dem Eichfaktor Φ a 
oder Φ b (je nach dem verwendeten Eichverfahren) multipliziert. 
Man erhält einen Wert, der jedoch nur annähernd gilt und infolge ­
dessen einer Korrektur bedarf.  
Harkins und Jordan (4) haben empirische Korrekturfaktoren für 
Oberflächenspannungswerte bestimmt, die mit der Ringmethode ge ­
messen wurden. Diese Faktoren sind von den Ringdimensionen, der Dichte der Flüssigkeit und ihrer Oberflächenspannung abhängig.
 
Da es umständlich ist, für jede einzelne Messung den Korrekturfak ­
tor aus den Tabellen von Harkins und Jordan zu bestimmen, um die Oberflächenspannung wässriger Lösungen zu berechnen, kann eine 
vereinfachte Methode angewandt werden, die darin besteht, die kor ­
rigierten Werte für die Oberflächenspannung direkt aus der nach ­
stehenden Tabelle abzulesen. (Für Ablesewerte, die zwischen den Tabellenwerten liegen, ist eine Interpolation möglich.)
 
Tabelle  
Korrektur der gemessenen Oberflächenspannungswerte  
Nur für wässrige Lösungen, ρ = 1 g/cm  3 
R = 9,55 mm (mittlerer Ringradius) 
r = 0,185 mm (Radius des Ringdrahtes)  
Experimenteller Wert (mN/m) Korrigierter Wert (mN/m) 
Eichung mit Gewichten (vgl. 1.6.4.2.2 a) Eichung mit Wasser (vgl.1.6.4.2.2 b)  
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 
28 24,3 26,1 
30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 
34 29,9 32,1 
36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 
42 37,6 40,3 
44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 
48 43,4 46,5 
50 45,3 48,6 52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 
56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 57
 
Experimenteller Wert (mN/m) Korrigierter Wert (mN/m) 
Eichung mit Gewichten (vgl. 1.6.4.2.2 a) Eichung mit Wasser (vgl.1.6.4.2.2 b)  
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 
62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 
66 61,2 65,5 
68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 
74 69,2 — 
76 71,2 — 78 73,2 —
 
Die Zusammenstellung dieser Tabelle erfolgte auf der Grundlage der 
Harkins-Jordan-Korrekturen und entsprechend der DIN-Norm (DIN 53914) für Wasser und wässrige Lösungen (Dichte ρ = 1 g/cm
 3 ). Sie 
gilt für einen handelsüblichen Ring mit folgenden Abmessungen: R 
= 9,55 mm (mittlerer Ringradius) und r = 0,185 mm (Radius des 
Ringdrahtes). Die Tabelle enthält korrigierte Werte für Oberflächen ­
spannungsmessungen nach einer Eichung entweder mit Gewichten oder mit Wasser.
 
Alternativ lässt sich die Oberflächenspannung ohne vorhergehende 
Eichung nach der folgenden Gleichung berechnen:  
σ ¼ f Ü F 
4πR 
Hierbei ist:  
F = die vom Kraftmesssystem angegebene Kraft beim Abreißen 
des Films  
R = der Ringradius  
f = der Korrekturfaktor (1)  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— verwendete Methode,  
— Art des verwendeten Wassers oder der verwendeten Lösung,  
— genaue Spezifizierung der Substanz (Identifizierung und Ver ­
unreinigungen),  
— Messergebnisse: abgelesene Oberflächenspannungswerte mit An ­
gabe sowohl der Einzelmesswerte und ihres arithmetischen Mit ­
tels wie auch des korrigierten Mittelwertes (wobei der Eichfaktor 
und die Korrekturtabelle berücksichtigt werden),  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 58
 
— die Konzentration der Lösung,  
— die Prüftemperatur,  
— das Alter der untersuchten Lösung, insbesondere die Zeitspanne 
zwischen Zubereitung und Messung der Lösung,  
— die Darstellung der Zeitabhängigkeit der Oberflächenspannung 
nach Einfüllen der Lösung in das Messgefäß,  
— alle für die Auswertung der Ergebnisse sachdienlichen Informa ­
tionen und Bemerkungen, insbesondere in Bezug auf Verunrei ­
nigungen und Aggregatzustand des Stoffes.  
3.2. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Ausgehend davon, dass destilliertes Wasser bei 20  o C eine Oberflä ­
chenspannung von 72,75 mN/m hat, sollten Stoffe mit einer Ober ­
flächenspannung unter 60 mN/m unter den Bedingungen dieses Ver ­
fahrens als oberflächenaktiv betrachtet werden.  
4. LITERATUR  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger (Hrsg.), Technique of Organic Chemistry, Phy ­
sical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV.
 
(3) Pure Appl. Chem., 1976, Vol. 48, 511.  
(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc, 1930, Vol. 
52, 1751.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 59
 
A.6 WASSERLÖSLICHKEIT  
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 105 (1995). Sie 
ist eine überarbeitete Fassung der ursprünglichen TG 105, die 1981 an ­
genommen wurde. Es gibt keine inhaltlichen Unterschiede zwischen der 
derzeitigen Fassung und der von 1981. Geändert wurde hauptsächlich das 
Format. Die Überarbeitung stützte sich auf die EU-Prüfmethode „Wasser ­
löslichkeit“ (  1 ). 
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN  
2. Die Wasserlöslichkeit eines Stoffs kann durch Verunreinigungen erheblich 
beeinflusst werden. Diese Prüfmethode behandelt die Bestimmung der Was ­
serlöslichkeit von im Wesentlichen reinen Substanzen, die in Wasser stabil 
und nicht flüchtig sind. Vor Bestimmung der Wasserlöslichkeit sollten Vor ­
informationen über die Strukturformel, den Dampfdruck, die Dissoziations ­
konstante und das Hydrolyseverhalten (als Funktion des pH-Wertes) des 
Stoffes vorliegen.  
3. Die beiden nachstehend beschriebenen Methoden, d. h. die Säulen-Elutions- 
Methode und die Kolbenmethode, decken Löslichkeiten von unter bzw. über 
10 –2 g/l ab. Ein einfacher Vorversuch wird ebenfalls beschrieben. Er er ­
möglicht die Bestimmung der bei der eigentlichen Prüfung zu verwendenden ungefähren Probenmenge und die zum Erreichen der Sättigungskonzentra ­
tion notwendige Zeit.
 
DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
4. Die Wasserlöslichkeit einer Substanz wird durch ihre 
Massen-Sättigungskonzentration in Wasser bei einer bestimmten Temperatur angegeben.
 
5. Die Wasserlöslichkeit wird als Masse des gelösten Stoffs je Lösungsvolu ­
men ausgedrückt. Die SI-Einheit ist kg/m  3 , aber g/l kann auch verwendet 
werden.  
REFERENZSUBSTANZEN  
6. Bei der Untersuchung der Prüfsubstanz brauchen keine Referenzsubstanzen 
verwendet zu werden.  
BESCHREIBUNG DER METHODEN  
Prüfbedingungen  
7. Die Prüfung wird vorzugsweise bei 20 ° C ± 0,5 ° C durchgeführt. Die 
gewählte Temperatur ist in allen wichtigen Teilen der Apparatur konstant zu halten.
 
Vorversuch  
8. Etwa 0,1 g der Probe (feste Prüfsubstanzen müssen pulverisiert sein) werden 
in einen mit Glasstopfen verschließbaren 10-ml-Messzylinder gegeben. 
Dann werden portionsweise zunehmende Volumen Wasser von Raumtem ­
peratur zugesetzt. Nach jedem Zusatz einer Wassermenge wird die Mi ­
schung 10 Minuten geschüttelt und mit bloßem Auge auf ungelöste Teilchen der Probe untersucht. Wenn nach Zusatz von 10 ml Wasser die Probe oder 
Teile von ihr ungelöst bleiben, ist der Versuch in einem 100-ml-Messzylin ­
der zu wiederholen. Die ungefähre Löslichkeit ist in Tabelle 1 unter
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 60
 
demjenigen Volumen Wasser angegeben, bei dem die Probe vollständig 
gelöst wird. Bei geringer Löslichkeit kann es lange (bis zu 24 Stunden) 
dauern, bis die Prüfsubstanz gelöst ist. Ist die Prüfsubstanz nach 24 Stunden noch nicht gelöst, sollte der Versuch verlängert werden (maximal 96 Stun ­
den) oder es sollte weiter verdünnt werden, um festzustellen, ob die Säulen- 
Elutions- oder die Kolben-Methode zu benutzen ist.
 
Tabelle 1  
ml Wasser auf 0,1 g lösliche 
Substanz 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
Ungefähre Löslichkeit in g/l > 1 000 1 000- 
200 200-100 100-50 50-10 10-1 < 1  
Säulen-Elutions-Methode  
Prinzip  
9. Diese Methode basiert auf der Elution einer Prüfsubstanz mit Wasser aus 
einer Mikrosäule, die mit einem inerten Trägermaterial gefüllt ist, welches mit einem Überschuss an Prüfsubstanz beschichtet ist (2). Die Wasserlös ­
lichkeit wird durch die Massenkonzentration des Eluats ausgedrückt, wenn 
dieses ein Plateau in Abhängigkeit von der Zeit erreicht hat.
 
Apparatur  
10. Die Apparatur besteht aus einer Mikrosäule (Abbildung 1), die auf konstan ­
ter Temperatur gehalten wird. Sie ist entweder mit einer Umwälzpumpe (Abbildung 2) oder mit einem Niveaugefäß (Abbildung 3) verbunden. Die 
Mikrosäule enthält ein inertes Trägermaterial, das durch einen kleinen Pfrop ­
fen aus Glaswolle in der Säule gehalten wird, der gleichzeitig zum Heraus ­
filtern von Partikeln dient. Als Trägermaterial können Glaskugeln, Dia ­
tomeenerde oder andere inerte Stoffe verwendet werden.
 
11. Die Mikrosäule in Abbildung 1 eignet sich für die Apparatur mit Umwälz ­
pumpe. Sie hat einen Kopfraum für fünf Säulenbett-Volumina (werden zu Beginn des Versuchs verworfen) und das Volumen von fünf Proben (werden 
während des Versuchs entnommen). Der Kopfraum kann kleiner gehalten 
werden, wenn während des Versuchs Wasser zugegeben werden kann, um die anfänglich mit Verunreinigungen entnommenen fünf Säulenbett-Volu ­
mina zu ersetzen. Die Säule ist durch einen Schlauch aus inertem Material 
mit der Umwälzpumpe verbunden, die mit einem Fluss von etwa 25 ml/h 
fördern kann. Die Umwälzpumpe kann z. B. eine Schlauch- oder eine Membranpumpe sein. Dabei ist darauf zu achten, dass es nicht zu einer Verunreinigung und/oder Absorption durch das Schlauchmaterial kommt.
 
12. Abbildung 3 zeigt die schematische Darstellung mit Verwendung eines 
Niveaugefäßes. In dieser Darstellung ist die Mikrosäule mit einem Einweg ­
hahn versehen. Sie wird mit einem Glasschliff-Verbindungsstück und einem 
Schlauch aus inertem Material an das Niveaugefäß angeschlossen. Die 
Durchflussrate vom Niveaugefäß sollte etwa 25 ml/h betragen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 61
 
Abbildung 1
  
Abmessungen in mm  
A. Anschluss für Glasschliff-Stopfen  
B. Kopfraum  
C. Innenmaß 5  
D. Außenmaß 19  
E. Glaswollpfropfen  
F. Absperrhahn  
Abbildung 2
  
A. atmosphärischer Druckausgleich  
B. Durchflussmesser  
C. Mikrosäule  
D. thermostatgeregelte Pumpe  
E. Umwälzpumpe  
F. 2-Wege-Hahn zur Probenentnahme  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 62
 
Abbildung 3
  
A. Niveaugefäß (z. B. 2,5-Liter-Kolben)  
B. Säule  
C. Fraktionssammler  
D. Thermostat  
E. Teflonschlauch  
F. Glasschliff-Stopfen  
G. Wasserschlauch (zwischen Thermostat und Säule, Innendurchmesser un ­
gefähr 8 mm)  
13. Etwa 600 mg Trägermaterial werden in einen 50-ml-Rundkolben eingefüllt. 
Eine geeignete Menge Prüfsubstanz wird in einem flüchtigen Lösungsmittel 
von Analysenqualität gelöst, und eine ausreichende Menge dieser Lösung wird zum Trägermaterial hinzugefügt. Das Lösungsmittel muss vollständig abgezogen werden, z. B. in einem Rotationsverdampfer, da sonst während 
der Elutionsphase wegen Verteilungseffekten auf der Oberfläche keine voll ­
ständige Sättigung dieses Materials mit Wasser erzielt wird. Das beladene Trägermaterial lässt man etwa 2 Stunden lang in etwa 5 ml Wasser quellen. Dann wird die Suspension in die Mikrosäule gefüllt. Es ist auch möglich, 
das trockene, beladene Trägermaterial in die mit Wasser gefüllte Mikrosäule 
zu geben. Auch hier wird der Quellvorgang von etwa 2 Stunden abgewartet.
 
14. Das Aufbringen der Prüfsubstanz auf das Trägermaterial kann problematisch 
werden und zu fehlerhaften Ergebnissen führen, z. B. wenn sich die Prüf ­
substanz ölartig auf dem Träger niederschlägt. Diese Probleme sollten un ­
tersucht und Einzelheiten dazu dokumentiert werden.  
Verfahren mit Umwälzpumpe  
15. Der Säulenfluss wird in Gang gesetzt. Eine Durchflussleistung von etwa 25 
ml/h wird empfohlen (etwa zehn Säulenbett-Volumina/h bei der beschriebe ­
nen Säule). Mindestens die ersten fünf Säulenbett-Volumina werden ver ­
worfen, um wasserlösliche Verunreinigungen zu entfernen. Danach lässt man die Umwälzpumpe bis zur Einstellung des Gleichgewichts laufen. 
Das Gleichgewicht ist erreicht, wenn bei fünf aufeinander folgenden Proben 
die Konzentrationen um nicht mehr als ± 30 % streuen. Diese Proben sollten in solchen zeitlichen Abständen genommen werden, in denen mindestens zehn Säulenbett-Volumina die Säule durchlaufen haben. Je nach verwende ­
ter Analysemethode kann es ratsam sein, eine Konzentrations-Zeit-Kurve zu 
erstellen, um zu zeigen, dass das Gleichgewicht erreicht ist.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 63
 
Verfahren mit Niveaugefäß  
16. Aufeinander folgende Eluatfraktionen werden gesammelt und ihre Konzen ­
trationen mit der gewählten Analysemethode bestimmt. Fraktionen des mitt ­
leren Eluatbereichs, bei denen die Konzentrationen in mindestens fünf auf ­
einander folgenden Proben konstant bleiben (± 30 %), werden zur Bestim ­
mung der Wasserlöslichkeit benutzt.  
17. Das bevorzugte Elutionsmittel ist bidestilliertes Wasser. Es kann auch deio ­
nisiertes Wasser mit einem spezifischen Widerstand von mehr als 10 Me ­
gaohm/cm und einem Gesamtgehalt an organischem Kohlenstoff unter 0,01 
% verwendet werden.  
18. Bei beiden Verfahren wird ein zweiter Durchlauf mit halber Durchflussrate 
durchgeführt. Stimmen die Ergebnisse der beiden Versuche überein, wird 
das Prüfergebnis als zufriedenstellend betrachtet. Ist die gemessene Löslich ­
keit bei dem niedrigeren Durchfluss höher, muss die Durchflussleistung so lange weiter halbiert werden, bis zwei aufeinander folgende Versuchsdurch ­
läufe die gleiche Löslichkeit ergeben.
 
19. Bei beiden Verfahren sollten die Fraktionen durch Prüfung des 
Tyndall-Effekts auf kolloidale Substanzpartikel untersucht werden. Wenn solche Substanzpartikel vorkommen, ist das Prüfergebnis unbrauchbar. Die Prüfung sollte dann wiederholt werden, nachdem die Filterfunktion der 
Säule verbessert wurde.
 
20. Der pH-Wert jeder Probe sollte vorzugsweise mit speziellen Indikatorstäb ­
chen bestimmt werden.  
Kolben-Methode  
Prinzip  
21. Die Prüfsubstanz (Feststoffe müssen pulverisiert werden) wird bei einer 
Temperatur in Wasser aufgelöst, die leicht über der Prüftemperatur liegt. Wenn die Sättigung erreicht ist, wird die Lösung abgekühlt und auf der Prüftemperatur gehalten. Alternativ kann die Messung direkt bei der Prüf ­
temperatur durchgeführt werden, wenn durch entsprechende Probenahme 
gesichert ist, dass das Sättigungsgleichgewicht erreicht ist. Dann wird die Massenkonzentration der Prüfsubstanz in der wässrigen Lösung, die keine ungelösten Substanzpartikel enthalten darf, mit einer geeigneten Analyse ­
methode (3) bestimmt.
 
Geräte  
22. Folgende Geräte werden benötigt:  
— übliche Laborglasgeräte und -instrumente,  
— eine Vorrichtung zum Schütteln der Lösungen bei konstanter Tempera ­
tur, 
— eine Zentrifuge (möglichst thermostatisiert), falls diese bei Emulsionen 
erforderlich wird, und  
— Analysegeräte.  
Verfahren  
23. Die zur Sättigung des vorgegebenen Wasservolumens erforderliche Prüfsub ­
stanzmenge wird anhand der Ergebnisse des Vorversuches abgeschätzt. Etwa das Fünffache dieser Menge wird jeweils in drei mit Glasstopfen versehene Glasgefäße eingewogen (z. B. Zentrifugenröhrchen oder Kolben). 
Jedem Gefäß wird ein je nach Analysemethode und Löslichkeitsbereich 
gewähltes Wasservolumen zugesetzt. Die Gefäße werden fest verschlossen und dann bei 30 °C geschüttelt. Hierzu sollte ein Schüttel- oder Rührgerät verwendet werden, das bei einer konstanten Temperatur arbeitet, z. B. Mag ­
netrührstäbe in einem thermostatisierten Wasserbad. Nach einem Tag wird 
eines der Gefäße 24 Stunden unter gelegentlichem Schütteln bei Prüftem ­
peratur stehen gelassen, bis sich das Gleichgewicht eingestellt hat. Dann wird der Inhalt des Gefäßes bei Prüftemperatur zentrifugiert und die Kon ­
zentration der Prüfsubstanz in der klaren wässrigen Phase mit einem geeig ­
neten Analyseverfahren bestimmt. Mit den beiden anderen Kolben wird
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 64
 
nach zwei bzw. drei Tagen genauso verfahren, nachdem zuvor das Sätti ­
gungsgleichgewicht bei 30 °C eingestellt wurde. Weichen die gemessenen 
Konzentrationen bei mindestens den letzten beiden Gefäßen um nicht mehr als 15 % voneinander ab, ist die Prüfung als zufriedenstellend anzusehen. Wenn die Prüfergebnisse der Gefäße 1, 2 und 3 eine steigende Tendenz 
aufweisen, sollte die gesamte Prüfung unter Verlängerung der Zeiten für die 
Gleichgewichtseinstellung wiederholt werden.
 
24. Die Prüfung kann auch ohne Präinkubation bei 30 °C durchgeführt werden. 
Um den Grad des erreichten Sättigungsgleichgewichts zu bestimmen, wer ­
den so lange Proben entnommen, bis die gemessenen Konzentrationen nicht länger von der Rührzeit beeinflusst werden.
 
25. Der pH-Wert jeder Probe sollte vorzugsweise mit speziellen Indikatorstäb ­
chen bestimmt werden.  
Analytische Bestimmungen  
26. Eine substanzspezifische Methode ist vorzuziehen, da bereits kleine Mengen 
von löslichen Verunreinigungen große Fehler bei der Bestimmung der Lös ­
lichkeit verursachen können. Beispiele für solche Analysemethoden sind: Gas- oder Flüssigchromatographie, Titrierverfahren, fotometrische Metho ­
den, voltametrische Verfahren.
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Daten  
Säulen-Elutions-Methode  
27. Für jeden Durchlauf werden der Mittelwert und die Standardabweichung 
von mindestens fünf aufeinander folgenden Proben aus dem Bereich des 
Sättigungsplateaus berechnet. Die für zwei Prüfungen mit unterschiedlichen 
Durchflussleistungen berechneten Mittelwerte sollten nicht um mehr als 30 % voneinander abweichen.
 
Kolben-Methode  
28. Die einzelnen Ergebnisse für jeden der drei Kolben, die nicht um mehr als 
15 % voneinander abweichen sollten, werden gemittelt.  
Prüfbericht  
Säulen-Elutions-Methode  
29. Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten:  
— die Ergebnisse des Vorversuchs,  
— Angaben zur Prüfsubstanz (Identität und Verunreinigungen), gegebenen ­
falls Vorreinigung,  
— die Konzentrationen, Durchflussraten und pH-Werte jeder Probe,  
— die Mittelwerte und Standardabweichungen von mindestens fünf Proben 
aus dem Bereich des Sättigungsplateaus eines jeden Durchlaufs,  
— den Durchschnitt von mindestens zwei aufeinanderfolgenden Durchläu ­
fen, 
— die Wassertemperatur während des Sättigungsvorgangs,  
— die Analysemethode,  
— die Art des verwendeten Trägermaterials,  
— die Beladung des Trägermaterials,  
— das verwendete Lösungsmittel,  
— gegebenenfalls Hinweise auf eine chemische Instabilität der Prüfsubstanz 
während des Prüfungsvorgangs,  
— alle für die Auswertung der Ergebnisse sachdienlichen Informationen 
und Bemerkungen, insbesondere in Bezug auf Verunreinigungen und 
den Aggregatzustand der Prüfsubstanz.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 65
 
Kolben-Methode  
30. Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten:  
— die Ergebnisse des Vorversuchs,  
— Angaben zur Prüfsubstanz (Identität und Verunreinigungen), gegebenen ­
falls Vorreinigung,  
— die einzelnen Analysenergebnisse und die Durchschnittswerte, wenn pro 
Kolben mehr als ein Wert bestimmt wurde,  
— den pH-Wert jeder Probe,  
— den Mittelwert derjenigen Kolben, deren Ergebnisse übereinstimmen,  
— die Prüftemperatur,  
— die Analysemethode,  
— gegebenenfalls Hinweise auf eine chemische Instabilität der Prüfsubstanz 
während des Prüfungsvorgangs,  
— alle für die Auswertung der Ergebnisse sachdienlichen Informationen 
und Bemerkungen, insbesondere in Bezug auf Verunreinigungen und den Aggregatzustand der Prüfsubstanz.
 
LITERATUR:  
1. Richtlinie 92/69/EWG der Kommission vom 31. Juli 1992 zur siebzehnten 
Anpassung der Richtlinie 67/548/EWG des Rates zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften für die Einstufung, Verpackung und 
Kennzeichnung gefährlicher Stoffe an den technischen Fortschritt, 
ABl.L 383 vom 29.12.1992, S. 113.
 
2. NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solu ­
bility — Column elution method.  
3. NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 66
 
A.8. VERTEILUNGSKOEFFIZIENT  
1. METHODE  
Der hier beschriebenen Schüttelmethode liegt die OECD-Prüfricht ­
linie (1) zugrunde.  
1.1. EINLEITUNG  
Zur Durchführung der Prüfung ist es nützlich, Vorinformationen über 
die Strukturformel, die Dissoziationskonstante, die Wasserlöslichkeit, das Hydrolyseverhalten, die n-Oktanol-Löslichkeit und die Oberflä ­
chenspannung des Stoffes in wässriger Lösung zu haben.
 
Messungen von ionischen Substanzen sollten nur an deren nicht 
ionisierter Form (freie Säure oder freie Base) durch Verwendung 
eines geeigneten Puffers mit einem pH-Wert von mindestens einer pH-Einheit unter (freie Säure) oder über (freie Base) dem pK-Wert durchgeführt werden.
 
Diese Prüfmethode beinhaltet zwei getrennte Verfahren: die Schüttel ­
methode und die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie (HPLC). Die erste findet dann Anwendung, wenn der log-P
 ow -Wert (Defini ­
tionen siehe unten) im Bereich — 2 bis 4 liegt, die letzte dann, wenn 
dieser Wert im Bereich 0 bis 6 liegt. Vor der Messung mit einer der beiden Methoden sollte eine Vorab-Schätzung des Verteilungskoef ­
fizienten durchgeführt werden.
 
Die Schüttelmethode gilt nur für im Wesentlichen reine Substanzen, 
die in Wasser und n-Oktanol löslich sind. Sie ist nicht auf oberflä ­
chenaktive Stoffe anwendbar (für diese sollte ein berechneter oder 
ein geschätzter Wert auf der Grundlage der einzelnen Löslichkeiten in n-Oktanol und Wasser vorgelegt werden).
 
Die HPLC-Methode ist nicht für starke Säuren und Basen, Metall ­
komplexe, oberflächenaktive Stoffe oder für Substanzen anwendbar, die mit dem Eluenten reagieren. Für diese Stoffe sollte ein berech ­
neter oder ein geschätzter Wert auf der Grundlage der einzelnen 
Löslichkeiten in n-Oktanol und Wasser vorgelegt werden.
 
Die HPLC-Methode ist bezüglich Verunreinigungen in der Prüfsub ­
stanz weniger empfindlich als die Schüttelmethode. Dennoch kann 
die Interpretation der Ergebnisse in einigen Fällen durch das Vor ­
liegen von Verunreinigungen erschwert werden, weil die Zuordnung der Peaks nicht eindeutig ist. Für Mischungen, die ein nicht auf ­
gelöstes Band ergeben, sollten die obere und die untere Grenze 
des Zehnerlogarithmus (log P) angegeben werden.
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Als Verteilungskoeffizient (P) bezeichnet man das Verhältnis der 
Gleichgewichtskonzentrationen (c  i ) einer gelösten Substanz in einem 
Zweiphasensystem aus zwei weitgehend unmischbaren Lösungsmit ­
teln. Im Falle von n-Oktanol und Wasser ergibt sich:  
P ow ¼ c n Ä Oktanol 
c Wasser  
Der Verteilungskoeffizient (P) ist somit der Quotient zweier 
Konzentrationen. Er wird gewöhnlich in Form seines Zehnerlogarith ­
mus (log P) angegeben.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 67
 
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Schüttelmethode  
Referenzsubstanzen müssen nicht in allen Fällen verwendet werden, 
in denen eine neue Prüfsubstanz untersucht wird. Die Referenzsub ­
stanzen sollten in erster Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu 
Zeit zu überprüfen und einen Vergleich mit den Ergebnissen aus 
anderen Methoden zu ermöglichen.  
HPLC-Methode  
Um die HPLC-Messdaten einer Substanz mit deren P-Wert zu kor ­
relieren, ist eine Eichkurve log P/chromatografische Daten unter Ver ­
wendung von mindestens sechs Bezugspunkten aufzustellen. Die 
Wahl der geeigneten Referenzsubstanzen obliegt dem Benutzer. So ­
weit möglich, sollte mindestens eine Referenzsubstanz einen P  ow - 
Wert über dem der Prüfsubstanz und eine andere einen P  ow -Wert 
unter dem der Prüfsubstanz haben. Für log-P-Werte unter 4 kann 
bei der Eichung von Daten ausgegangen werden, die mit Hilfe der Schüttelmethode erhalten worden sind. Für log-P-Werte über 4 kann man sich bei der Eichung auf kalibrierte Literaturwerte stützen, so ­
fern diese mit den berechneten Werten übereinstimmen. Aus Grün ­
den einer größeren Genauigkeit sollten vorzugsweise Referenzsub ­
stanzen verwendet werden, die strukturell mit der Prüfsubstanz ver ­
wandt sind.
 
Es liegen umfangreiche Listen mit log-P  ow -Werten für zahlreiche 
Gruppen von Chemikalien vor (2) (3). Wenn keine Verteilungskoef ­
fizienten zu strukturell verwandten Verbindungen vorhanden sind, kann eine allgemeinere Eichung auf der Grundlage anderer Referenz ­
substanzen vorgenommen werden.
 
Eine Liste der empfohlenen Referenzsubstanzen und deren P  ow -Wer­
ten ist in Anlage 2 enthalten.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
1.4.1.  Schüttelmethode  
Zur Bestimmung des Verteilungskoeffizienten müssen nach Einstel ­
lung des Gleichgewichts zwischen allen wechselwirkenden Kom ­
ponenten des Verteilungssystems die Konzentrationen der in beiden 
Phasen gelösten Substanz ermittelt werden. Die einschlägige Litera ­
tur zeigt, dass hierfür verschiedene Techniken vorhanden sind, wie z. B. die gründliche Mischung der beiden Phasen mit anschließender Phasentrennung zur Bestimmung der Gleichgewichtskonzentration 
der untersuchten Substanz.
 
1.4.2.  HPLC-Methode  
Die HPLC-Methode wird an Analysensäulen durchgeführt, die mit 
einer handelsüblichen festen Phase mit langen, chemisch an Silizi ­
umdioxid gebundenen Kohlenwasserstoffketten (z. B. C  8 , C 18 ) ge­
füllt sind. Chemikalien, die in eine solche Säule eingespritzt werden, bewegen sich darin wegen der unterschiedlichen Verteilungsgrade 
zwischen der mobilen und der stationären (Kohlenwasserstoffe) 
Phase mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. Substanzgemische wer ­
den entsprechend dem hydrophoben Charakter der Bestandteile elu ­
iert — zuerst die wasserlöslichen und zuletzt die öllöslichen; dabei 
erfolgt die Elution proportional zum jeweiligen Kohlenwasserstoff- 
Wasser-Verteilungskoeffizienten. Dadurch kann die Beziehung zwi ­
schen der Retentionszeit an einer solchen (Phasenumkehr-)Säule und dem Verteilungskoeffizienten für n-Oktanol/Wasser aufgestellt wer ­
den. Der Verteilungskoeffizient wird vom Kapazitätsfaktor k über die 
Formel
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 68
 
k ¼ t r Ä t o 
t o 
abgeleitet, wobei t  R die Retentionszeit der Prüfsubstanz und t  o die 
durchschnittliche Zeit ist, die ein Lösungsmittelmolekül für die Wan ­
derung durch die Säule benötigt (Totzeit).  
Quantitative Analysenmethoden sind nicht erforderlich; es müssen 
lediglich die Elutionszeiten bestimmt werden.  
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
1.5.1.  Wiederholbarkeit  
Schüttelmethode  
Um die Genauigkeit des Verteilungskoeffizienten zu gewährleisten, 
sind Doppelbestimmungen bei drei verschiedenen Prüfbedingungen 
durchzuführen. Dazu sollen sowohl die eingesetzte Menge der un ­
tersuchten Substanz als auch das Verhältnis der Lösungsmittelvolu ­
mina verändert werden. Die so ermittelten Werte des Verteilungs ­
koeffizienten, angegeben als deren Zehnerlogarithmus, sollen in ei ­
nem Bereich von ± 0,3 log-Einheiten liegen.  
HPLC-Methode  
Um die Zuverlässigkeit der Messung zu erhöhen, sind Doppelbestim ­
mungen durchzuführen. Die aus den Einzelmessungen abgeleiteten log-P-Werte sollen in einem Bereich von ± 0,1 log-Einheiten liegen.
 
1.5.2.  Empfindlichkeit  
Schüttelmethode  
Der Messbereich der Methode wird durch die Nachweisgrenze des 
Analysenverfahrens festgelegt. Dieses sollte die Bestimmung von 
log-P  ow -Werten innerhalb eines Bereichs von — 2 bis 4 erlauben 
(sofern es die Bedingungen zulassen, kann dieser Bereich gelegent ­
lich auf P  ow -Werte bis 5 erweitert werden, wenn die Konzentration 
der gelösten Substanz in keiner Phase größer als 0,01 Mol/l ist).  
HPLC-Methode  
Die HPLC-Methode erlaubt die Bestimmung von Verteilungskoeffi ­
zienten innerhalb eines P  ow -Bereichs von 0 bis 6.  
Normalerweise lässt sich der Verteilungskoeffizient einer Verbin ­
dung innerhalb eines Bereichs von ± 1 log-Einheit des bei der Schüt ­
telmethode gewonnenen Wertes bestimmen. Typische Korrelationen sind in der Literatur angegeben (4) (5) (6) (7) (8). Eine höhere 
Genauigkeit ist gewöhnlich zu erreichen, wenn die Korrelationskur ­
ven von strukturell verwandten Referenzsubstanzen ausgehen (9).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 69
 
1.5.3.  Anwendbarkeit  
Schüttelmethode  
Das Nernst'sche Verteilungsgesetz gilt nur für verdünnte Lösungen 
bei konstanter Temperatur, konstantem Druck und pH-Wert. Es gilt streng nur für eine reine Substanz, die zwischen zwei reinen Lö ­
sungsmitteln verteilt ist. Wenn mehrere gelöste Stoffe in einer oder 
beiden Phasen gleichzeitig vorkommen, kann dadurch das Ergebnis beeinflusst werden.
 
Dissoziation oder Assoziation gelöster Moleküle führen zu Abwei ­
chungen vom Nernst'schen Verteilungsgesetz. Solche Abweichungen 
zeigen sich darin, dass der Verteilungskoeffizient von der Konzen ­
tration der Lösung abhängig wird.  
Wegen der auftretenden multiplen Verteilungsgleichgewichte sollte 
diese Prüfmethode für ionische Verbindungen nicht ohne entspre ­
chende Korrekturen angewendet werden. Für derartige Verbindungen 
sollte die Benutzung von Pufferlösungen anstelle von Wasser erwo ­
gen werden; dabei sollte der pH-Wert des Puffers mindestens 1 pH- Einheit vom pKa-Wert der Substanz entfernt sein und die Bedeutung dieses pH-Wertes für die Umwelt berücksichtigt werden.
 
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.6.1.  Abschätzung des Verteilungskoeffizienten  
Der Verteilungskoeffizient wird vorzugsweise durch ein Berech ­
nungsverfahren abgeschätzt (siehe Anlage 1); wo möglich, kann er aus dem Löslichkeitsverhältnis der Prüfsubstanz in den reinen Lö ­
sungsmitteln abgeschätzt werden (10).
 
1.6.2.  Schüttelmethode  
1.6.2.1.  Vorbereitung  
n-Oktanol: Die Bestimmung des Verteilungskoeffizienten soll mit 
sehr reinem Reagens durchgeführt werden.  
Wasser: Es soll in Glas- oder Quarzgefäßen destilliertes bzw. doppelt 
destilliertes Wasser verwendet werden. Für ionische Verbindungen sollten, wenn begründbar, anstelle von Wasser Pufferlösungen ver ­
wendet werden.
 
Anmerkung  
Direkt aus einem Ionenaustauscher entnommenes Wasser soll nicht 
benutzt werden.  
1.6.2.1.1. V o r s ä t t i g u n g d e r L ö s u n g s m i t t e l  
Vor der Bestimmung des Verteilungskoeffizienten werden die Pha ­
sen des Lösungsmittelsystems durch Schütteln bei Prüftemperatur 
gegenseitig gesättigt. Dazu ist es zweckmäßig, zwei große Vorrats ­
flaschen gefüllt mit sehr reinem n-Oktanol bzw. Wasser mit jeweils einer ausreichenden Menge des anderen Lösungsmittels zu versetzen, mit einem mechanischen Schüttelapparat 24 Stunden zu schütteln 
und dann so lange stehen zu lassen, bis sich die Phasen getrennt 
haben und der Sättigungszustand erreicht ist.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 70
 
1.6.2.1.2. V o r b e r e i t u n g d e r P r ü f u n g  
Das Gesamtvolumen des Zweiphasensystems soll das Prüfgefäß na ­
hezu ausfüllen. Dadurch können Materialverluste aufgrund von Ver ­
dampfung verhindert werden. Das Volumenverhältnis und die ein ­
zusetzenden Mengen der Substanz werden durch die folgenden An ­
gaben festgelegt:  
— der vorläufige Schätzwert des Verteilungskoeffizienten (siehe 
1.6.1),  
— die für das Analysenverfahren erforderliche Mindestmenge an 
Prüfsubstanz und  
— die Begrenzung der Konzentration in jeder Phase auf maximal 
0,01 Mol/l.  
Es sind drei Prüfungen durchzuführen. Bei der ersten wird das be ­
rechnete Volumenverhältnis n-Oktanol/Wasser eingesetzt, bei der zweiten wird dieses Verhältnis halbiert, bei der dritten verdoppelt 
(z. B. 1:1, 1:2, 2:1).
 
1.6.2.1.3. P r ü f s u b s t a n z  
Es wird eine Vorratslösung in mit Wasser vorgesättigtem n-Oktanol 
hergestellt. Die Konzentration dieser Vorratslösung soll vor deren 
Gebrauch zur Bestimmung des Verteilungskoeffizienten exakt be ­
stimmt werden. Diese Lösung soll so gelagert werden, dass ihre Stabilität gewährleistet ist.
 
1.6.2.2.  Prüfbedingungen  
Die Prüftemperatur sollte zwischen 20 und 25  o C liegen und kon ­
stant (± 1  o C) gehalten werden.  
1.6.2.3.  Messverfahren  
1.6.2.3.1. E i n s t e l l e n d e s V e r t e i l u n g s g l e i c h g e w i c h t s  
Für jede der Prüfbedingungen sollen zwei Prüfgefäße vorbereitet 
werden, die jeweils die erforderlichen, genau abgemessenen Mengen 
der beiden Lösungsmittel sowie die erforderliche Menge an Vorrats ­
lösung enthalten.  
Die n-Oktanol-Phasen sollten volumetrisch bestimmt werden. Die 
Prüfgefäße sollten entweder mit einem geeigneten Schüttelapparat 
oder von Hand geschüttelt werden. Bei Verwendung eines Zentrifu ­
genglases besteht ein empfohlenes Verfahren darin, das Glas rasch um 180
 o C um seine Querachse zu drehen, so dass eventuell einge ­
schlossene Luft durch beide Phasen aufsteigt. Erfahrungsgemäß rei ­
chen im Allgemeinen 50 solcher Umdrehungen zur Einstellung des 
Verteilungsgleichgewichts aus. Zur Sicherheit werden 100 Umdre ­
hungen in 5 Minuten empfohlen.  
1.6.2.3.2. P h a s e n t r e n n u n g  
Zur Trennung der Phasen sollte die Mischung, sofern erforderlich, in 
einer Laborzentrifuge bei Raumtemperatur zentrifugiert werden. Wenn eine Zentrifuge ohne Thermostat benutzt wird, sollten die 
Zentrifugengläser vor der Analyse mindestens 1 Stunde bei Prüftem ­
peratur aufbewahrt werden, damit sich das Gleichgewicht einstellt.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 71
 
1.6.2.4.  Analyse  
Zur Ermittlung des Verteilungskoeffizienten müssen die Konzentra ­
tionen der Prüfsubstanz in beiden Phasen analysiert werden. Dies kann dadurch geschehen, dass von jeder der beiden Phasen aus 
jedem Glas und für jede Prüfbedingung ein aliquoter Teil entnom ­
men und mit dem gewählten Verfahren analysiert wird. Die in den beiden Phasen vorhandene Gesamtmenge der Substanz ist zu berech ­
nen und mit der eingesetzten Menge zu vergleichen.
 
Die Probenahme aus der wässrigen Phase sollte so erfolgen, dass die 
Gefahr des Einschlusses von Spuren an n-Oktanol möglichst weit ­
gehend vermindert wird; z. B. kann eine Glasspritze mit auswechsel ­
barer Nadel zur Probenahme verwendet werden. Zuerst sollte die 
Spritze teilweise mit Luft gefüllt werden. Diese Luft sollte vorsichtig herausgedrückt werden, während die Nadel durch die n-Oktanol- Schicht hindurchgeführt wird. Ein ausreichendes Volumen an wäss ­
riger Phase wird in die Spritze gezogen. Die Spritze wird schnell aus 
der Lösung entfernt und die Nadel abgenommen. Der Inhalt der Spritze kann dann als wässrige Probe weiterverwendet werden. Die Konzentration in den beiden voneinander getrennten Phasen sollte 
am besten mit einem substanzspezifischen Verfahren ermittelt wer ­
den. Beispiele für möglicherweise geeignete Analysenverfahren sind:
 
— fotometrische Verfahren,  
— Gaschromatografie,  
— Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie.  
1.6.3.  HPLC-Methode  
1.6.3.1.  Vorbereitung  
Apparatur  
Erforderlich ist ein mit einer pulsfreien Pumpe und einem geeigneten 
Detektor ausgestatteter Flüssigkeitschromatograf. Dabei wird die Verwendung eines Einspritzventils mit Dosierschleife empfohlen. 
Die Leistung der HPLC-Säule kann durch das Vorhandensein polarer 
Gruppen in der stationären Phase ernsthaft beeinträchtigt werden. Deshalb sollten die stationären Phasen ein Minimum an polaren Gruppen haben (11). Es können handelsübliche Mikroteilchenfüllun ­
gen für die Umkehrphasenchromatografie oder Fertigsäulen verwen ­
det werden. Zwischen dem Dosiersystem und der Analysensäule kann eine Vorsäule angebracht werden.
 
Mobile Phase  
Zur Zubereitung des Elutionsmittels werden für die HPLC-Methode 
ausreichend reines Methanol und Wasser verwendet; das Elutions ­
mittel wird vor seiner Verwendung entgast. Es sollte das Verfahren 
der isokratischen Elution angewendet werden. Dabei werden Metha ­
nol-Wasser-Verhältnisse mit einem Mindestgehalt an Wasser von 25 % empfohlen. Im Normalfall ist eine Methanol-Wasser-Mischung im Volumenverhältnis 3:1 für die Eluierung von Verbindungen mit 
einem log-P-Wert von 6 bei einer Elutionszeit von einer Stunde 
ausreichend (Durchflussrate: 1 ml/min). Für Verbindungen mit einem hohen log-P-Wert kann eine Verkürzung der Elutionszeit (auch der der Referenzsubstanzen) durch Senkung der Polarität der mobilen 
Phase oder Kürzung der Säulenlänge erforderlich sein.
 
Stoffe mit einer sehr geringen Löslichkeit in n-Oktanol ergeben bei 
der HPLC-Methode häufig anormal niedriger log-P  ow -Werte; die Pe ­
aks dieser Stoffe begleiten mitunter die Lösungsmittelfront. Dies 
liegt wahrscheinlich daran, dass der Verteilungsprozess zu langsam 
ist, um innerhalb der normalerweise für eine HPLC-Trennung benö ­
tigten Zeit den Gleichgewichtszustand zu erreichen. In solchen Fäl ­
len kann die Verminderung der Durchflussrate und/oder des Metha ­
nol-Wasser-Verhältnisses ein wirksames Verfahren sein, um zu ei ­
nem zuverlässigen Wert zu gelangen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 72
 
Prüf- und Referenzsubstanz sollten in der mobilen Phase in ausrei ­
chender Konzentration lösbar sein, um nachgewiesen werden zu 
können. Nur in Ausnahmefällen dürfen in der Methanol-Wasser-Mi ­
schung Zusatzstoffe verwendet werden, da diese Zusatzstoffe die Eigenschaften der Säule verändern. Für Chromatogramme, die mit 
Zusatzstoffen erhalten wurden, ist der Einsatz einer weiteren Säule 
desselben Typs zwingend vorgeschrieben. Wenn die Methanol-Was ­
ser-Mischung ungeeignet ist, können andere Mischungen aus einem organischen Lösungsmittel und Wasser verwendet werden, so z. B. 
Ethanol-Wasser oder Acetonitril-Wasser.
 
Der pH-Wert des Lösungsmittels ist für ionische Verbindungen kri ­
tisch. Er sollte innerhalb des pH-Betriebsbereichs der Säule liegen, 
der sich im Allgemeinen zwischen 2 und 8 bewegt. Die Anwendung eines Puffers ist ratsam. Dabei muss darauf geachtet werden, dass 
kein Salz ausfällt und es nicht zur Beschädigung der Säule kommt, 
was bei einer Reihe von Mischungen von organischer Phase und Puffer möglich ist. HPLC-Messungen mit an Siliziumdioxid gebun ­
dener stationärer Phase und einem pH-Wert über 8 sind nicht emp ­
fehlenswert, da die Verwendung einer alkalischen mobilen Phase zu 
einem rapiden Nachlassen der Leistung der Säule führen kann.
 
Referenz-/Prüfsubstanzen  
Die Referenzsubstanzen sollten den höchstmöglichen Reinheitsgrad 
haben. Das für Prüf- oder Eichzwecke zu verwendende Substanzge ­
misch wird, wenn möglich, in der mobilen Phase gelöst.  
Prüfbedingungen  
Die Temperatur sollte im Verlauf der Messungen um nicht mehr als 
± 2 K schwanken.  
1.6.3.2.  Messung  
Berechnung der Totzeit t  o 
Die Totzeit lässt sich entweder durch Verwendung einer homologen 
Reihe (z. B. n-Alkyl-Methyl-Ketone) oder durch nicht chromatogra ­
fisch verzögerte organische Verbindungen (z. B. Thioharnstoff oder 
Formamid) bestimmen. Zur Berechnung der Totzeit t  o mit Hilfe einer 
homologen Reihe werden mindestens 7 Komponenten einer homo ­
logen Reihe eingespritzt und die jeweiligen Retentionszeiten gemes ­
sen. Die Retentionszeiten t  r(nc + 1)  werden in Abhängigkeit von t  r(nc) 
aufgetragen und anschließend der Schnittpunkt a und die Steigung b 
der Regressionsgleichung:  
t r(nc + 1) = a + b t  r(nc) 
bestimmt (n  c = Anzahl der Kohlenstoffatome). Die Totzeit t  o ergibt 
sich dann aus:  
t o = a/(1 - b)  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 73
 
Eichkurve  
Der nächste Schritt besteht in der Aufstellung einer Korrelations ­
kurve log k/log P für geeignete Referenzsubstanzen. In der Praxis werden dazu zwischen 5 und 10 Standard-Referenzsubstanzen, deren log-P-Wert in der Nähe des erwarteten Bereichs liegt, gleichzeitig 
eingespritzt und die Retentionszeiten am besten mit Hilfe eines mit 
dem Nachweissystem gekoppelten registrierenden Integrators be ­
stimmt. Die Logarithmen der entsprechenden Kapazitätsfaktoren (log k) werden berechnet und gegen die mittels der Schüttelmethode 
bestimmten log-P-Werte aufgezeichnet. Die Eichung wird in regel ­
mäßigen Abständen, mindestens einmal täglich, vorgenommen, so dass eventuelle Veränderungen in der Leistung der Säule berück ­
sichtigt werden können.
 
Bestimmung des Kapazitätsfaktors der Prüfsubstanz  
Die Prüfsubstanz wird in möglichst geringer Menge der mobilen Phase 
eingespritzt. Die Retentionszeit wird (doppelt) bestimmt zur Berechnung 
des Kapazitätsfaktors k. Aus der Korrelationskurve der Referenzsubstan ­
zen kann der Verteilungskoeffizient der Prüfsubstanz interpoliert wer ­
den. Bei sehr niedrigen und sehr hohen Verteilungskoeffizienten ist eine 
Extrapolation erforderlich. In diesen Fällen ist besonders auf die Ver ­
trauensgrenzen der Regressionsgeraden zu achten.  
2. DATEN  
Schüttelmethode  
Die Zuverlässigkeit der ermittelten P-Werte kann durch Vergleich 
der Mittelwerte der Doppelbestimmungen mit dem Gesamtmittelwert 
geprüft werden.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben  
— genaue Spezifizierung der Substanz (Identität und Verunreinigun ­
gen);  
— wenn die Methoden nicht anwendbar sind (z. B. bei oberflächen ­
aktivem Material), sollte ein errechneter Wert oder ein Schätz ­
wert auf der Grundlage der einzelnen n-Oktanol- und Wasser ­
löslichkeiten vorgelegt werden;  
— alle für die Auswertung der Ergebnisse sachdienlichen Informa ­
tionen und Bemerkungen, insbesondere in Bezug auf Verunrei ­
nigungen und den Aggregatzustand des Stoffes.  
Für die Schüttelmethode:  
— das Ergebnis der Abschätzung (wenn vorhanden);  
— die Prüftemperatur;  
— Angaben über die zur Konzentrationsbestimmung verwendeten 
Analysenverfahren;  
— die Zentrifugationszeit und -geschwindigkeit (wenn zutreffend);  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 74
 
— die in beiden Phasen bei jeder Bestimmung gemessenen Konzen ­
trationen (d. h. insgesamt 12 Konzentrationen sollten angegeben 
werden);  
— die Einwaage an Prüfsubstanz, das Volumen jeder Phase in je ­
dem Prüfgefäß und die berechnete Gesamtmenge an Prüfsub ­
stanz, die in jeder Phase nach Erreichen des Gleichgewichts ent ­
halten ist;  
— die berechneten Werte des Verteilungskoeffizienten (P) für jede 
Prüfung, der Mittelwert für jede Prüfbedingung und der Mittel ­
wert aus allen Prüfungen sind anzugeben. Hinweise auf eine 
Konzentrationsabhängigkeit des Verteilungskoeffizienten sollten 
im Bericht vermerkt werden;  
— die Standardabweichung der einzelnen P-Werte vom Mittelwert 
sollte angegeben werden;  
— der Mittelwert P aus allen Prüfungen sollte auch als Zehnerloga ­
rithmus angegeben werden;  
— der mit einem Berechnungsverfahren ermittelte theoretische P  ow - 
Wert sollte angegeben werden, wenn er bestimmt wurde oder 
wenn der Messwert > 10  4 ist; 
— der pH-Wert des verwendeten Wassers und der wässrigen Phase 
während des Versuchs;  
— bei Verwendung von Pufferlösungen: Begründung der Verwen ­
dung von Pufferlösungen anstelle von Wasser, Zusammenset ­
zung, Konzentration und pH-Wert der Pufferlösungen, pH-Wert der wässrigen Phase vor und nach dem Versuch.
 
Für die HPLC-Methode:  
— das Ergebnis der Abschätzung (wenn vorhanden);  
— Prüf- und Referenzsubstanzen und deren Reinheitsgrad;  
— Temperaturbereich der Prüfungen;  
— pH-Wert, bei dem die Prüfungen vorgenommen wurden;  
— nähere Angaben zur Analysen- und zur Vorsäule, zur mobilen 
Phase sowie zum Nachweisverfahren;  
— Retentionswerte und log-P-Werte aus der Literatur für die bei der 
Eichung verwendeten Referenzsubstanzen;  
— nähere Angaben zur Anpassung der Regressionsgeraden (log k/ ­
log P);  
— durchschnittliche Retentionswerte und interpolierter log-P-Wert 
für die Prüfsubstanz;  
— Beschreibung der Ausrüstungen und der Betriebsbedingungen;  
— Elutionsprofile;  
— Mengen der auf die Säule gegebenen Prüf- und 
Referenzsubstanzen;  
— Totzeit und entsprechendes Messverfahren.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 75
 
4. LITERATUR  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) C. Hansch und A.J. Leo, Substitution Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
 
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir.) — Erhältlich bei Pomona College Medicinal Chemistry Pro ­
ject, 1982, Pomona College, Claremont, California, 91711.
 
(4) L. Renberg, G. Sundström und K. Sundh-Nygärd, Chemosphe ­
re, 1980, vol. 80, 683.  
(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt und R. Fuerer, Pesric. Sei., 1981, 
vol. 12, 219.  
(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.  
(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatog., 1982, vol. 247, 1.  
(8) J.E. Haky und A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 
675. 
(9) S. Fujisawa und E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 
15, 787.  
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in: Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratori ­
umspraxis (herausgegeben von E. Müller), Georg Thieme Ver ­
lag, Stuttgart, 1958, Band I/l, 223-339.  
(11) R.F. Rekker und H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, 479.  
(12) A. Leo, C. Hansch und D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
(13) R.F. Rekker, The Hydrophobie Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977.  
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of partition coefficient — Flask shaking method.
 
(15) C.V. Eadsforth und P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1 
459. 
(16) A. Leo, C. Hansch und D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 
525. 
(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani und 
E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1 207.  
(18) W.B. Neely, D.R. Branson und G.E. Blau, Environ. Sei. Tech ­
nol., 1974, vol. 8, 1 113.  
(19) D.S. Brown und E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 
382. 
(20) J.K. Seydel und K.J. Schaper, Chemische Struktur und biolo ­
gische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York, 1979.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 76
 
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Ams ­
terdam, 1984.  
(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Basel, 1978.  
(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, CT. Murphy und P.J. Taylor, J. 
Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 77
 
Anlage 1  
Berechnungs-/Schätzverfahren  
EINLEITUNG  
Eine allgemeine Einführung in die Berechnungsverfahren, Daten und Beispiele 
werden im Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a) gegeben.  
Berechnete P  ow -Werte können verwendet werden:  
— zur Entscheidung darüber, welche der Versuchsmethoden die geeignete ist 
(Bereich der Schüttelmethode: log P  ow : - 2 bis 4; Bereich der HPLC-Metho ­
de: log P  ow : 0 bis 6);  
— zur Wahl der geeigneten Prüfbedingungen (z. B. Referenzsubstanzen für die 
HPLC-Verfahren, Volumenverhältnis n-Oktanol/Wasser für die Schüttel ­
methode);  
— zur laborinternen Überprüfung eventueller Versuchsfehler;  
— zur P  ow -Bestimmung in solchen Fällen, wo die Prüfmethoden aus technischen 
Gründen nicht anwendbar sind.  
ABSCHÄTZVERFAHREN  
Vorläufige Abschätzung des Verteilungskoeffizienten  
Der Wert des Verteilungskoeffizienten kann durch Verwendung der Löslichkeits ­
werte der Prüfsubstanz in den reinen Lösungsmitteln abgeschätzt werden:  
Dafür gilt:  
P Schätzwert ¼ Sättigung c  nÄOktand  
Sättigung c  Wasser  
BERECHNUNGSVERFAHREN  
Prinzip der Berechnungsverfahren  
Sämtliche Berechnungsverfahren beruhen auf der formalen Aufspaltung des Mo ­
leküls in geeignete Substrukturen, für die zuverlässige log-P  ow -Inkremente be ­
kannt sind. Der log-P  ow -Wert des gesamten Moleküls wird danach als Summe 
seiner entsprechenden Teilwerte plus Summe der Korrekturglieder für intramole ­
kulare Wechselwirkungen berechnet.  
Aufstellungen über die Konstanten von Substrukturen und den Korrekturgliedern 
liegen vor (b) (c) (d) (e). Einige davon werden regelmäßig aktualisiert (b).  
Qualitätskriterien  
Im Allgemeinen nimmt die Zuverlässigkeit des Berechnungverfahrens in dem 
Maße ab, in dem die Komplexität der Prüfsubstanz zunimmt. Bei einfachen 
Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht und einer oder zwei funktioneller 
Gruppen ist mit einer Abweichung von 0,1 bis 0,3 log-P  ow -Einheiten von den 
Ergebnissen der verschiedenen Fragmentmethoden gegenüber dem Messwert zu rechnen. Bei komplexeren Substanzen kann die Fehlerspanne größer sein. Dies 
hängt von der Zuverlässigkeit und der Verfügbarkeit der Konstanten für die 
Substrukturen sowie von der Fähigkeit der Erkennung intramolekularer Wechsel ­
wirkungen (z. B. Wasserstoffbindungen) und der richtigen Anwendung der Kor ­
rekturglieder ab (was mit dem Computer-Programm CLOGP-3 ein geringeres 
Problem ist) (b). Bei ionischen Substanzen ist die richtige Berücksichtigung 
der Ladung oder des Ionisierungsgrades wichtig.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 78
 
Berechnungsverfahren  
Hansch'sche π-Methode  
Die ursprünglich für hydrophobe Substituenten verwendete Konstante π, einge­
führt von Fujita et al. (f), wird wie folgt definiert:  
π x = log P  ow (PhX) - log P  ow (PhH)  
wobei P  ow (PhX) der Verteilungskoeffizient eines aromatischen Abkömmlings 
und P  ow (PhH) derjenige der Ausgangssubstanz ist:  
(z.B. π Cl = log P  ow (C 6 H 5 Cl) - log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 - 2,13 = 0,71).  
Nach seiner Definition ist die π-Methode vorwiegend bei der aromatischen Sub ­
stitution anwendbar. Die π-Werte liegen für eine große Anzahl von Substituenten 
tabelliert vor (b) (c) (d). Sie werden für die Berechnung der log-P  ow -Werte für 
aromatische Moleküle oder Substrukturen verwendet.  
Rekker-Methode  
Nach Rekker (g) wird der log-P  ow -Wert wie folgt berechnet:  
(Wechselwirkungsglieder)  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j 
wobei f  i die verschiedenen Konstanten der Substrukturen und a  i die Häufigkeit 
ihres Vorkommens in der Prüfsubstanz darstellen. Die Korrekturglieder lassen 
sich als ein ganzes Vielfaches einer einzigen Konstante C  m (der so genannten 
„magischen Konstante“) angeben. Die Substrukturkonstanten f  i und C  m wurden 
aus einer Liste von 1 054 experimentell ermittelten P  ow -Werten 
(825 Verbindungen) mit Hilfe der mehrfachen Regressionsanalyse bestimmt (c) 
(h). Die Bestimmung der Glieder für die Wechselwirkungen erfolgt auf der Grundlage der in der Literatur angegebenen Regeln (e) (h) (i).
 
Hansch-Leo-Methode  
Nach Hansch und Leo (c) wird der log-P  ow -Wert aus der Beziehung  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j b j F j 
errechnet, wobei f  i die verschiedenen Konstanten der Substrukturen, F  j die Kor­
rekturglieder und a  i , b j die entsprechenden Vorkommenshäufigkeiten sind. Eine 
Liste der Substrukturwerte für einzelne Atome und Gruppen, abgeleitet aus ex ­
perimentell bestimmten P  ow -Werten, und eine Liste der Korrekturglieder F  j (so 
genannte „Faktoren“) wurden durch die Trial-and-error-Methode erhalten. Die 
Korrekturglieder sind in mehrere unterschiedliche Kategorien eingeordnet worden (a) (c). Es ist relativ kompliziert und zeitraubend, alle Regeln und Korrektur ­
glieder zu berücksichtigen. Software-Pakete sind entwickelt worden (b).
 
Kombinierte Methode  
Die Berechnung der log-P  ow -Werte komplexer Substanzen kann beträchtlich ver ­
bessert werden, wenn das Molekül in größere Substrukturen zerlegt wird, für die zuverlässige log-P
 ow -Werte vorliegen, sei es aus Tabellen (b) (c), sei es aus 
eigenen Messungen. Solche Substrukturen (z. B. Heterozyklen, Anthrakinon, 
Azobenzen) können dann mit den Hansch'schen π-Werten oder mit den Sub ­
strukturkonstanten nach Rekker oder Leo kombiniert werden.  
Anmerkungen  
i) Die Berechnungsmethoden können auf teilweise oder vollständig ionisierte 
Substanzen nur dann angewendet werden, wenn die erforderlichen Korrek ­
turfaktoren berücksichtigt werden können.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 79
 
ii) Wenn von intramolekularen Wasserstoffbindungen ausgegangen werden 
kann, müssen die entsprechenden Korrekturglieder (etwa + 0,6 bis + 1,0 
log-P  ow -Einheiten) addiert werden (a). Hinweise auf das Vorliegen solcher 
Bindungen lassen sich aus Stereo-Modellen oder spektroskopischen Daten der Substanz gewinnen.
 
iii) Wenn mehrere tautomere Formen möglich sind, sollte als Berechnungs ­
grundlage die wahrscheinlichste Form verwendet werden.  
iv) Die Überarbeitungen der Listen der Substrukturkonstanten sollten sorgfältig 
verfolgt werden.  
Abschlussbericht  
Bei der Verwendung der Berechnungs-/Abschätzmethoden sollte der Prüfbericht, 
wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— Beschreibung der Substanz (Gemisch, Verunreinigungen usw.),  
— Hinweis auf eine eventuell vorliegende intramolekulare Wasserstoffbindung, 
Dissoziation, Ladung oder irgendwelche anderen ungewöhnlichen Effekte (z. B. Tautomerie),
 
— Beschreibung des Berechnungsverfahrens,  
— Identität oder Bereitstellung der Datenbasis,  
— Besonderheiten bei der Wahl der Substrukturen,  
— ausführliche Dokumentation zur Berechnung.  
LITERATUR  
(a) WJ. Lyman, W.F. Reehl und D.H. Rosenblatt (Hrsg.), Handbook of Che ­
mical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).  
(c) C. Hansch und A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology. John Wiley, New York, 1979.  
(d) A. Leo und C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev. 1971, vol. 71, 525.  
(e) R.F. Rekker und H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther., 1979, 
vol. 14, 479.  
(f) T. Fujita, J. Iwasa und C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc, 1964, vol. 86, 5175.  
(g) R.F. Rekker, The Hydrophopic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, vol. 1, Elsevier, New York, 1977.  
(h) C.V. Eadsforth und P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.  
(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, 
Symposium Series 255, 225.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 80
 
Anlage 2  
Empfohlene Referenzsubstanzen für die HPLC-Methode  
Nr. Referenzsubstanz log P  ow pKa 
1 2-Butanon 0,3 
2 4-Acetylpyridin 0,5 3 Anilin 0,9 4 Acetanilid 1,0 
5 Bcnzylalkohol 1,1 
6 p-Methoxyphenol 1,3 pKa = 10,26 7 Phenoxyessigsäure 1,4 pKa = 3,12 8 Phenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-Dinitrophenol 1,5 pKa = 3,96 
10 Benzonitril 1,6 11 Phenylacetonitril 1,6 12 4-MethyIbenzylalkohol 1,6 13 Acetophenon 1,7 14 2-Nitrophenol 1,8 pKa = 7,17 
15 3-Nitrobenzoesäure 1,8 pKa = 3,47 
16 4-Chloranilin 1,8 pKa = 4,15 17 Nitrobenzol 1,9 18 Zinnamylalkohol 1,9 19 Benzoesäure 1,9 pKa = 4,19 20 p-Kresol 1,9 pKa = 10,17 21 Zinnamylalkohol 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 Anisol 2,1 23 Methylbenzoat 2,1 24 Benzol 2,1 
25 3-Methylbenzoesäure 2,4 pKa = 4,27 
26 4-Chlorphenol 2,4 pKa = 9,1 27 Trichlorethylen 2,4 28 Atrazin 2,6 29 Ethylbenzoat 2,6 30 2,6-Dichlorbenzonitril 2,6 31 3-Chlorbenzoesäure 2,7 pKa = 3,82 32 Toluol 2,7 33 1-Naphthol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-Dichloranilin 2,8 
35 Chlorbenzol 2,8 
36 Allyl-Phenylether 2,9 37 Bromobenzol 3,0
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 81
 
Nr. Referenzsubstanz log P  ow pKa 
38 Ethylbenzol 3,2 
39 Benzophenon 3,2 
40 4-Phenylphenol 3,2 pKa = 9,54 
41 Thymol 3,3 
42 1,4-Dichlorbenzol 3,4 
43 Diphenylamin 3,4 pKa = 0,79 44 Naphthalen 3,6 45 Phenylbenzoat 3,6 46 Isopropylbenzol 3,7 47 2,4,6-Trichlorphenol 3,7 pKa = 6 48 Biphenyl 4,0 49 Benzylbenzoat 4,0 50 2,4-Dinitro-6 sec. butylphenol 4,1 51 1,2,4-Trichlorbenzol 4,2 52 Dodekansäure 4,2 
53 Diphenylether 4,2 
54 n-Butylbenzol 4,5 55 Phenanthren 4,5 56 Fluoranthen 4,7 57 Dibenzyl 4,8 58 2,6-Diphenylpyridin 4,9 59 Triphenylamin 5,7 60 DDT 6,2 
Sonstige Referenzsubstanzen mit niedrigem log-P
 ow -Wert 
1 Nikotinsäure - 0,07  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 82
 
A.9. FLAMMPUNKT  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Es ist sinnvoll, vor Durchführung einer Flammpunktbestimmung 
Vorinformationen über die Entzündlichkeit der Prüfsubstanz zu ha ­
ben. Das Prüfverfahren ist auf flüssige Substanzen anwendbar, deren Dämpfe durch Zündquellen entflammt werden können. Die in diesem Text beschriebenen Prüfmethoden ergeben nur für diejenigen 
Flammpunktbereiche, die bei den einzelnen Verfahren angegeben 
werden, zuverlässige Werte.
 
Bei der Wahl der anzuwendenden Methode sollten eventuelle che ­
mische Reaktionen zwischen der Substanz und dem Probentiegel berücksichtigt werden.
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Der Flammpunkt ist die niedrigste Temperatur, bezogen auf einen 
Druck von 101,325 kPa, bei der sich unter den bei der Prüfmethode 
angegebenen Bedingungen aus einer Flüssigkeit Dämpfe in einer 
solchen Menge entwickeln, dass sich im Tiegel ein durch Fremdzün ­
dung entflammbares Dampf-Luft-Gemisch bildet.  
Einheiten:  o C 
t = T - 273,15  
(t in  o C und T in K)  
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Referenzsubstanzen müssen nicht in allen Fällen verwendet werden, 
in denen eine neue Prüfsubstanz untersucht wird. Die Referenzsub ­
stanzen sollten in erster Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu 
Zeit zu überprüfen, ob bei der Prüftemperatur eine Entzündung statt ­
finden kann oder nicht.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Die Prüfsubstanz wird in einen Tiegel gefüllt und nach dem bei der 
jeweiligen Prüfmethode angegebenen Verfahren auf die Prüftempera ­
tur erwärmt oder abgekühlt. Zündversuche werden ausgeführt, um festzustellen, ob bei der Prüftemperatur eine Zündung stattgefunden 
hat oder nicht.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
1.5.1.  Wiederholbarkeit  
Die Wiederholbarkeit hängt ab vom Flammpunktbereich und der 
angewandten Prüfmethode; max. ± 2  o C. 
1.5.2.  Empfindlichkeit  
Die Empfindlichkeit hängt von der angewandten Prüfmethode ab.  
1.5.3.  Anwendbarkeit  
Die Anwendbarkeit einiger Flammpunktprüfmethoden ist auf be ­
stimmte Flammpunktbereiche beschränkt und hängt von substanzspe ­
zifischen Eigenschaften ab (z. B. hohe Viskosität).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 83
 
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.6.1.  Vorbereitungen  
Die zu prüfende Substanz wird in den jeweiligen Prüftiegel (siehe 
1.6.3.1 und/oder 1.6.3.2) eingefüllt.  
Aus Sicherheitsgründen wird empfohlen, für energiereiche oder to ­
xische Substanzen ein Verfahren mit einer kleinen Probengröße (etwa 2 cm
 3 ) anzuwenden.  
1.6.2.  Versuchsbedingungen  
Soweit dies aus Sicherheitsgründen möglich ist, sollte das Prüfgerät 
vor Zugluft geschützt aufgestellt werden.  
1.6.3.  Versuchsausführung  
1.6.3.1.  Gleichgewichtsmethode  
Siehe dazu: ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.  
1.6.3.2.  Nicht-Gleichgewichtsmethode  
Gerät nach Abel  
Siehe dazu: BS 2000 Teil 170, NF M07-011, NF T66-009.  
Gerät nach Abel-Pensky  
Siehe dazu: EN 57, DIN 51755 Teil 1 (für Temperaturen von 
5 o C bis 65  o C), DIN 51755 Teil 2 (für Temperaturen unter 5  o C), 
NF M07-036.  
Gerät nach Tag  
Siehe dazu: ASTM D 56.  
Gerät nach Pensky-Martens  
Siehe dazu: ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000- 
34, NF M07-019.  
Anmerkungen  
Wird mit einer Nicht-Gleichgewichtsmethode wie in 1.6.3.2 ein 
Flammpunkt von (0 ± 2)  o C, (21 ± 2)  o C oder (55 ± 2)  o C ermittelt, 
sollte das Prüfergebnis mit dem gleichen Gerät, jedoch unter Ver ­
wendung einer Gleichgewichtsmethode, bestätigt werden.  
Für eine Anmeldung dürfen nur diejenigen Methoden angewandt 
werden, bei denen der Zahlenwert des Flammpunktes bestimmt wird.  
Zur Bestimmung des Flammpunktes viskoser Flüssigkeiten (Farben, 
Klebstoffe und Ähnliches), die Lösemittel enthalten, dürfen nur sol ­
che Prüfgeräte und Prüfmethoden angewandt werden, die zur Be ­
stimmung des Flammpunktes viskoser Flüssigkeiten geeignet sind.  
Siehe dazu: ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 Teil 1.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 84
 
2. DATEN  
3. BERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunrei ­
nigungen),  
— die angewandte Prüfmethode sowie eventuelle Abweichungen 
davon,  
— die Ergebnisse sowie alle zusätzlichen Bemerkungen, die für die 
Interpretation der Ergebnisse von Bedeutung sind.  
4. LITERATUR  
Keine.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 85
 
A.10.  ENTZÜNDLICHKEIT (FESTE STOFFE)  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Es ist zweckdienlich, vor Ausführung der Prüfung Informationen 
über mögliche explosive Eigenschaften der Prüfsubstanz einzuholen.  
Diese Methode kann nur bei pulverförmigen, körnigen oder pasten ­
förmigen Substanzen angewendet werden.  
Um nicht alle Stoffe zu erfassen, die entzündet werden können, 
sondern nur solche, die schnell brennen oder deren Brennverhalten besonders gefährlich ist, sollen nur diejenigen Stoffe als leichtent ­
zündlich eingestuft werden, deren Abbrandgeschwindigkeit einen be ­
stimmten Grenzwert überschreitet.
 
Es kann besonders gefährlich sein, wenn sich das Glühen in einem 
Metallpulver ausbreitet, weil glühende Metallpulver schwer zu lö ­
schen sind. Metallpulver sind als leichtentzündlich zu beurteilen, 
wenn sie über die gesamte Länge der Schüttung innerhalb einer 
festgelegten Zeit durchglühen.  
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Die Abbrandzeit wird in Sekunden ausgedrückt.  
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Nicht spezifiziert.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Die Substanz wird zu einem durchgehenden Strang oder einer Schüt ­
tung von etwa 250 mm Länge geformt; danach wird ein Vorversuch 
vorgenommen, um zu prüfen, ob es bei Entzündung mit einer Gas ­
flamme zu einer Ausbreitung des Brandes mit Flammen oder durch Glimmen kommt. Wenn es innerhalb einer festgelegten Zeit zu einer 
Ausbreitung über 200 mm der Schüttung kommt, wird ein vollstän ­
diges Testprogramm zur Bestimmung der Brenngeschwindigkeit durchgeführt.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Nicht genannt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 86
 
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.6.1.  Vorversuch  
Die Substanz wird auf einer nicht brennbaren und nichtporösen 
Platte mit geringer Wärmeleitfähigkeit zu einem durchgehenden 
Strang oder einer Schüttung von 250 mm Länge, 20 mm Breite 
und 10 mm Höhe geformt. Danach wird die heiße Flamme eines Gasbrenners (Mindestdurchmesser 5 mm) auf ein Ende der Schüt ­
tung gerichtet, bis sich das Pulver entzündet, maximal 2 Minuten (5 
Minuten für Pulver von Metallen oder Metalllegierungen). Dabei ist 
festzustellen, ob sich der Brand innerhalb des Prüfzeitraumes von 4 Minuten (40 Minuten bei Metallpulvern) über eine Länge von 
200 mm der Schüttung ausbreitet. Wenn sich die Substanz nicht 
entzündet und sich keine Verbrennung mit einer Flamme oder mit Glimmen innerhalb von 4 Minuten (bzw. 40 Minuten) über eine Länge von 200 mm der Schüttung ausbreitet, ist die Substanz nicht 
als leichtentzündlich zu beurteilen, und es ist keine weitere Prüfung 
erforderlich. Wenn sich der Brand in der Substanz in weniger als 4 Minuten (bzw. in weniger als 40 Minuten für Metallpulver) über eine Länge von 200 mm der Schüttung ausbreitet, ist das nachstehend 
beschriebene Verfahren (Punkt 1.6.2 und folgende) auszuführen.
 
1.6.2.  Prüfung der Brenngeschwindigkeit  
1.6.2.1.  Vorbereitung  
Pulverförmige oder körnige Substanzen werden locker in eine Form 
von 250 mm Länge und einem dreieckigen Querschnitt mit einer 
inneren Höhe von 10 mm und einer Breite von 20 mm gefüllt. 
Die Form wird an beiden Längsseiten von zwei Metallblechen be ­
grenzt, die die dreieckige Form um 2 mm überragen (siehe Abbil ­
dung). Die gefüllte Form wird dreimal aus einer Höhe von 2 cm auf 
eine feste Unterlage fallen gelassen. Falls nötig, wird die Form da ­
nach aufgefüllt. Dann werden die seitlichen Begrenzungen entfernt, und die überschüssige Substanzmenge wird abgetrennt. Schließlich wird eine nicht brennbare und nichtporöse Platte mit geringer Wär ­
meleitfähigkeit auf die Form gelegt, das Ganze um 180
 o gedreht und 
die Form entfernt.  
Pastenförmige Substanzen werden in Form eines Stranges von 
250 mm Länge und mit einem Querschnitt von etwa 1 cm  2 auf 
eine nicht brennbare und nichtporöse Platte mit geringer Wärmeleit ­
fähigkeit aufgebracht.  
1.6.2.2.  Versuchsbedingungen  
Hygroskopische Prüfsubstanzen sollen so schnell wie möglich nach 
der Entnahme aus dem Behälter geprüft werden.  
1.6.2.3.  Versuchsausführung  
Die Schüttung wird quer zur Zugrichtung in einem Abzug angeord ­
net. 
Die Absauggeschwindigkeit muss so hoch sein, dass Rauch nicht in 
das Labor dringen kann; sie soll auch während des Versuchs nicht verändert werden. Um die Versuchsanordnung herum ist ein Wind ­
schutz aufzustellen.
 
Zum Anzünden der Schüttung an einem Ende wird die heiße 
Flamme eines Gasbrenners (Mindestdurchmesser 5 mm) verwendet. 
Nach einem Abbrand über eine Länge von 80 mm der Schüttung ist 
die Abbrandzeit über die folgenden 100 mm zu messen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 87
 
Der Versuch ist sechsmal auszuführen, wenn nicht vorher ein posi ­
tives Ergebnis beobachtet wird. Für jeden Versuch ist eine saubere, 
kalte Platte zu verwenden.  
2. DATEN  
Die Abbrandzeit aus dem Vorversuch (1.6.1) und die kürzeste Ab ­
brandzeit aus sechs Versuchen (1.6.2.3) sind maßgebend für die Beurteilung.
 
3. BERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— eine genaue Spezifizierung der Prüfsubstanz (Identität und Ver ­
unreinigungen),  
— eine Beschreibung der Prüfsubstanz, deren Aggregatzustand, ein ­
schließlich Feuchtegehalt,  
— die Ergebnisse des Vorversuchs und der Prüfung der Brenn ­
geschwindigkeit (wenn durchgeführt),  
— alle zusätzlichen Bemerkungen, die für die Interpretation der 
Ergebnisse von Bedeutung sind.  
3.2. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Pulverförmige, körnige oder pastenförmige Prüfsubstanzen werden 
als leichtentzündlich beurteilt, wenn die Abbrandzeit bei einem der unter 1.6.2 beschriebenen Versuche kürzer ist als 45 Sekunden. Pul ­
ver von Metallen oder Metalllegierungen werden als leichtentzünd ­
lich beurteilt, wenn sie entzündet werden können und sich die Flamme oder die Reaktionszone innerhalb von 10 Minuten oder darunter über die gesamte Probe ausbreitet.
 
4. LITERATUR  
(1) NF T 20-042 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. De ­
termination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 88
 
Anlage  
Abbildung  
Form und Zubehör zur Herstellung der Schüttung  
(alle Maßangaben in mm)
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 89
 
A.11.  ENTZÜNDLICHKEIT (GASE)  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Mit dieser Methode lässt sich bestimmen, ob Gase im Gemisch mit 
Luft bei atmosphärischem Druck und Raumtemperatur (etwa 20  o C) 
einen Explosionsbereich haben. Gemische mit steigender Konzentra ­
tion des zu prüfenden Gases mit Luft werden einem elektrischen Funken ausgesetzt, und man beobachtet, ob eine Entzündung erfolgt.
 
1.2. DEFINITION UND EINHEITEN  
Der Explosionsbereich ist der Konzentrationsbereich zwischen der 
unteren und der oberen Explosionsgrenze. Die untere und die obere 
Explosionsgrenze bezeichnen die beiden Grenzwerte des Brenngas ­
gehaltes im Brenngas/Luft-Gemisch, bei denen eine selbständige Flammenausbreitung von der Zündquelle her gerade nicht mehr auf ­
tritt.
 
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Nicht spezifiziert.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Der Gasanteil im Gas/Luft-Gemisch wird stufenweise erhöht und das 
Gemisch jeweils einem elektrischen Funken ausgesetzt.  
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Nicht spezifiziert.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.6.1.  Gerät  
Das Versuchsgefäß ist ein aufrecht stehender Glaszylinder mit einem 
inneren Durchmesser von mindestens 50 mm und einer Mindesthöhe von 300 mm. Die Zündelektroden befinden sich 60 mm über dem Boden des Zylinders und haben einen Abstand von 3 mm bis 5 mm 
voneinander. Der Zylinder ist mit einer Druckentlastungsöffnung ver ­
sehen. Das Gerät ist mit einem Schutzschirm versehen, um Explosi ­
onsschäden zu vermeiden.
 
Ein Induktionsfunken von 0,5 s Dauer, der mittels eines Hochspan ­
nungstransformators von 10 bis 15 kV Sekundärspannung (maximale 
Leistungsaufnahme: 300 W) erzeugt wird, dient als Zündquelle. Ein 
Beispiel eines geeigneten Gerätes ist in (2) beschrieben.  
1.6.2.  Versuchsbedingungen  
Der Versuch muss bei Raumtemperatur (etwa 20  o C) ausgeführt 
werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 90
 
1.6.3.  Versuchsausführung  
Mit Hilfe von Dosierpumpen wird ein Gas/Luft-Gemisch bekannter 
Konzentration in den Glaszylinder geleitet. Danach wird mit dem Induktionsfunken gezündet und beobachtet, ob sich eine Flamme 
von der Zündquelle ablöst und selbständig ausbreitet oder nicht. 
Der Gasanteil wird beginnend bei 1 % Volumenanteil) stufenweise um 1 % erhöht, bis eine wie oben beschriebene Entzündung erfolgt.
 
Wenn die chemische Struktur auf ein nicht entzündbares Gas schlie ­
ßen lässt und die Zusammensetzung des stöchiometrischen Ge ­
misches mit Luft errechnet werden kann, dann brauchen nur Ge ­
mische in einem Bereich zwischen 10 % unterhalb und 10 % ober ­
halb der stöchiometrischen Zusammensetzung in 1 %-Stufen geprüft 
zu werden.  
2. DATEN  
Das Auftreten der Flammenablösung ist die einzige relevante Infor ­
mation zur Bestimmung dieser Eigenschaft.  
3. BERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunrei ­
nigungen),  
— eine Beschreibung des benutzten Gerätes (mit Abmessungen),  
— die Temperatur, bei der der Versuch durchgeführt wurde,  
— die geprüften Konzentrationen und die erhaltenen Ergebnisse,  
— das Versuchsergebnis: nicht entzündbares oder leichtentzündli ­
ches Gas,  
— wenn das Ergebnis „nicht entzündbar“ lautet, ist der Konzentra ­
tionsbereich, über den es in 1 %-Schritten geprüft wurde, an ­
zugeben,  
— alle Informationen und Bemerkungen, die für die Interpretation 
der Ergebnisse von Bedeutung sind.  
4. LITERATUR  
(1) NF T 20-041 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases.  
(2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. 
Redeker und H. Schacke. „Entwicklung einer Standard-Appara ­
tur zur Messung von Explosionsgrenzen“. Chem.-Ing.-Tech., 
1984, vol. 56, 2, 126/127.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 91
 
A.12.  ENTZÜNDLICHKEIT (BERÜHRUNG MIT WASSER)  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Diese Prüfmethode kann angewendet werden, um festzustellen, ob 
die Reaktion eines Stoffes mit Wasser oder feuchter Luft zur Ent ­
wicklung gefährlicher Mengen von leichtentzündlichen Gasen führt.  
Das Verfahren kann sowohl für feste als auch für flüssige Stoffe 
angewendet werden. Dieses Verfahren gilt jedoch nicht für Stoffe, die sich bei Berührung mit Luft selbst entzünden.
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Leichtentzündlich: Stoffe, die bei Berührung mit Wasser oder feuch ­
ter Luft leichtentzündliche Gase in gefährlichen Mengen (mindestens 1 l/kg.h) entwickeln.
 
1.3. PRINZIP DER METHODE  
Die Prüfsubstanz wird in der nachfolgend beschriebenen Reihenfolge 
geprüft; erfolgt auf irgendeiner Stufe eine Entzündung, so ist keine 
weitere Prüfung mehr notwendig. Wenn bekannt ist, dass die Sub ­
stanz bei Berührung mit Wasser keine heftige Reaktion zeigt, kann man zu Stufe 4 übergehen (1.3.4).
 
1.3.1.  Stufe 1  
Die Prüfsubstanz wird in eine Schale gegeben, die destilliertes Was ­
ser mit einer Temperatur von 20  o C enthält; dabei wird festgestellt, 
ob sich das hierbei entwickelte Gas entzündet oder nicht.  
1.3.2.  Stufe 2  
Die Prüfsubstanz wird auf ein Filterpapier gegeben, das auf der 
Oberfläche des Wassers einer mit destilliertem Wasser von 20  o C 
gefüllten Schale schwimmt; dabei wird festgestellt, ob sich das ent ­
wickelte Gas entzündet oder nicht. Das Filterpapier dient nur dazu, die Substanz an der betreffenden Stelle zu halten, wodurch die Mög ­
lichkeit einer Entzündung erhöht wird.
 
1.3.3.  Stufe 3  
Mit der Prüfsubstanz wird eine kleine Schüttung von etwa 2 cm 
Höhe und 3 cm Durchmesser hergestellt. Es werden einige Tropfen 
Wasser auf diese Schüttung gegeben, und es wird festgestellt, ob 
sich das entwickelte Gas entzündet oder nicht.  
1.3.4.  Stufe 4  
Die Prüfsubstanz wird mit destilliertem Wasser (20  o C) versetzt, und 
die entwickelte Gasmenge wird über einen Zeitraum von 7 Stunden 
in Abständen von je einer Stunde gemessen. Ist die Gasentwicklung ungleichmäßig oder nimmt sie nach 7 Stunden noch zu, so ist der Versuchszeitraum bis zu einer Dauer von 5 Tagen zu verlängern. Die 
Prüfung kann abgebrochen werden, wenn die Gasentwicklungsrate 
zu irgendeinem Zeitpunkt 1 l/kg.h übersteigt.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 92
 
1.4. REFERENZSUBSTANZEN  
Nicht spezifiziert.  
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine Angabe.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.6.1.  Stufe 1  
1.6.1.1.  Versuchsbedingungen  
Der Versuch wird bei Raumtemperatur (etwa 20  o C) ausgeführt.  
1.6.1.2.  Versuchsausführung  
Eine geringe Menge (etwa 2 mm Durchmesser) der Prüfsubstanz 
wird in eine Schale mit destilliertem Wasser gegeben. Es wird no ­
tiert, i) ob sich Gas entwickelt und ii) ob sich das Gas entzündet. Entzündet sich das Gas, so braucht die Substanz nicht weiter geprüft 
zu werden, da sie als gefährlich zu betrachten ist.
 
1.6.2.  Stufe 2  
1.6.2.1.  Gerät  
Ein Filterpapier wird flach auf die Oberfläche des in ein geeignetes 
Gefäß gefüllten destillierten Wassers gelegt; als Gefäß kann z. B. 
eine Abdampfschale mit ca. 100 mm Durchmesser dienen.  
1.6.2.2.  Versuchsbedingungen  
Der Versuch wird bei Raumtemperatur (etwa 20  o C) durchgeführt.  
1.6.2.3.  Versuchsausführung  
Eine geringe Menge (etwa 2 mm Durchmesser) der Prüfsubstanz 
wird mitten auf das Filterpapier gelegt. Es wird notiert, i) ob sich Gas entwickelt und ii) ob sich das Gas entzündet. Entzündet sich das Gas, so braucht die Substanz nicht weiter geprüft zu werden, da sie 
als gefährlich zu betrachten ist.
 
1.6.3.  Stufe 3  
1.6.3.1.  Versuchsbedingungen  
Der Versuch wird bei Raumtemperatur (etwa 20  o C) durchgeführt.  
1.6.3.2.  Versuchsausführung  
Mit der Prüfsubstanz wird eine kleine Schüttung von etwa 2 cm 
Höhe und 3 cm Durchmesser mit einer Vertiefung an der Spitze hergestellt. Man gießt einige Tropfen Wasser in die Vertiefung und notiert, i) ob sich Gas entwickelt und ii) ob sich das Gas entzündet. 
Entzündet sich das Gas, so braucht die Substanz nicht weiter geprüft 
zu werden, da sie als gefährlich zu betrachten ist.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 93
 
1.6.4.  Stufe 4  
1.6.4.1.  Gerät  
Die Apparatur wird gemäß der Abbildung aufgebaut.  
1.6.4.2.  Versuchsbedingungen  
Man stellt fest, ob sich in dem Behälter mit der Prüfsubstanz Pulver 
mit einer Korngröße von < 500 μm befindet. Macht dieses Pulver 
mehr als insgesamt 1 % (Massenanteil) aus oder ist die Probe zer ­
reibbar, so ist die gesamte Probe vor dem Versuch zu einem Pulver zu mahlen, um eine Zerkleinerung der Teilchen (durch Abrieb) bei 
Lagerung und Handhabung zu berücksichtigen; andernfalls ist die 
Substanz im Anlieferungszustand zu verwenden. Der Versuch ist bei Raumtemperatur (etwa 20
 o C) und Atmosphärendruck auszufüh ­
ren. 
1.6.4.3.  Versuchsausführung  
Es werden 10 bis 20 ml Wasser in den Tropftrichter der Apparatur 
gegeben und 10 g Prüfsubstanz in den Erlenmeyer-Kolben. Die ent ­
wickelte Gasmenge kann mit einer beliebigen geeigneten Apparatur gemessen werden. Der Hahn des Tropftrichters wird geöffnet, um das Wasser in den Kolben zu geben; gleichzeitig wird eine Stoppuhr 
in Gang gesetzt. Die entwickelte Gasmenge wird über einen Zeit ­
raum von 7 Stunden in Abständen von je einer Stunde gemessen. Ist die Gasentwicklung in dieser Zeit ungleichmäßig oder nimmt sie nach 7 Stunden noch zu, so ist der Versuchszeitraum bis zu einer 
Dauer von 5 Tagen zu verlängern. Die Prüfung kann abgebrochen 
werden, wenn die Entwicklungsrate zu irgendeinem Zeitpunkt 1 l/ ­
kg.h übersteigt. Der Versuch ist dreimal auszuführen.
 
Ist die chemische Zusammensetzung des Gases nicht bekannt, so 
muss es analysiert werden. Enthält es leichtentzündliche Komponen ­
ten und ist nicht bekannt, ob das ganze Gemisch leichtentzündlich ist, so ist ein Gemisch mit gleicher Zusammensetzung herzustellen und nach dem Verfahren A.11 zu prüfen.
 
2. DATEN  
Der Stoff wird als gefährlich betrachtet, wenn es  
— auf einer beliebigen Stufe des Prüfverfahrens zu einer Entzün ­
dung oder  
— zu einer Entwicklung von leichtentzündlichem Gas mit einer 
Entwicklungsrate von mehr als 1 l/kg.h kommt.  
3. BERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunrei ­
nigungen),  
— Einzelheiten zu einer eventuellen Vorbehandlung der Prüfsub ­
stanz,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 94
 
— die Versuchsergebnisse (Stufen 1, 2, 3 und 4),  
— die chemische Zusammensetzung des entwickelten Gases,  
— die Gasentwicklungsrate, wenn Stufe 4 (1.6.4) ausgeführt wird,  
— alle zusätzlichen Bemerkungen, die für die Interpretation der 
Ergebnisse von Bedeutung sind.  
4. LITERATUR  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) NF T 20-040 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases formed by the hy ­
drolysis of solid and liquid products.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 95
 
Anlage  
Abbildung  
Apparatur
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 96
 
A.13.  PYROPHORE EIGENSCHAFTEN VON FESTEN UND 
FLÜSSIGEN STOFFEN  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Das Prüfverfahren ist anwendbar auf feste und flüssige Stoffe, die 
sich in kleinen Mengen nach kurzer Zeit an der Luft bei Raumtem ­
peratur (etwa 20  o C) selbst entzünden.  
Dieses Verfahren gilt nicht für Stoffe, die sich bei Raumtemperatur 
oder höheren Temperaturen erst nach Stunden oder Tagen selbst entzünden.
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Substanzen werden als pyrophor betrachtet, wenn sie sich unter den 
in 1.6 beschriebenen Bedingungen selbst entzünden oder eine Ver ­
kohlung hervorrufen.  
Nichtpyrophore Flüssigkeiten sind im Hinblick auf ihre Selbstent ­
zündlichkeit nach dem Verfahren A.15 (Zündtemperatur von Flüssig ­
keiten und Gasen) zu prüfen.  
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Nicht spezifiziert.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Die Prüfsubstanz — fest oder flüssig — wird auf eine inerte Träger ­
substanz gegeben und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang mit der Luft in Berührung gebracht. Wenn sich flüssige Stoffe nicht entzün ­
den, werden sie auf ein Filterpapier gegossen und bei Raumtempera ­
tur (etwa 20
 o C) 5 Minuten lang der Luft ausgesetzt. Wenn ein fester 
oder flüssiger Stoff sich entzündet oder ein flüssiger Stoff ein Filter ­
papier entzündet oder verkohlt, dann wird die Substanz als pyrophor 
beurteilt.  
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Wiederholbarkeit: Aus sicherheitstechnischen Gründen genügt ein 
einziges positives Ergebnis, um die Substanz als pyrophor zu beur ­
teilen.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.6.1.  Gerät  
Eine Porzellanschale mit einem Durchmesser von etwa 10 cm wird 
bei Raumtemperatur (etwa 20  o C) etwa 5 mm hoch mit Diatomeen ­
erde gefüllt.  
Bemerkung  
Diatomeenerde oder irgendein anderer, allgemein verfügbarer ähn ­
licher inerter Stoff soll repräsentativ für Erde sein, mit der bei einem 
Unfall ausgelaufene Stoffe in Berührung kommen können.  
Ein trockenes Filterpapier wird für die Prüfung von solchen Flüssig ­
keiten benötigt, die sich auf der inerten Trägersubstanz an der Luft 
nicht entzünden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 97
 
1.6.2.  Versuchsausführung  
a) Pulverförmige feste Stoffe  
1 bis 2 cm  3 der zu prüfenden pulverförmigen Substanz werden aus 
etwa 1 m Höhe auf eine nicht brennbare Unterlage geschüttet, und es 
wird beobachtet, ob sich die Substanz beim Fallen oder innerhalb 
von 5 Minuten nach Ablagerung entzündet.  
Wenn es nicht zu einer Entzündung kommt, wird der Versuch sechs ­
mal ausgeführt.  
b) Flüssigkeiten  
Etwa 5 cm  3 der zu prüfenden Flüssigkeit werden in die vorbereitete 
Porzellanschale gegossen, und es wird beobachtet, ob sich die Prüf ­
substanz innerhalb von 5 Minuten entzündet.  
Wenn es bei den sechs Versuchen nicht zu einer Entzündung kommt, 
sind folgende Prüfungen durchzuführen:  
Eine Probenmenge von 0,5 ml wird aus einer Spritze auf ein einge ­
rissenes Filterpapier gegeben, und es wird beobachtet, ob es inner ­
halb von 5 Minuten nach Zugeben der Flüssigkeit zu einer Entzün ­
dung oder zur Verkohlung des Filterpapiers kommt. Wenn es nicht zu einer Entzündung oder zur Verkohlung des Filterpapiers kommt, 
wird der Versuch dreimal ausgeführt.
 
2. DATEN  
2.1. FOLGERUNG AUS DEN ERGEBNISSEN  
Die Prüfungen können abgebrochen werden, sobald einer der Ver ­
suche ein positives Ergebnis zeigt.  
2.2. AUSWERTUNG  
Wenn sich die Substanz innerhalb von 5 Minuten nach dem Auf ­
bringen auf eine inerte Trägersubstanz bei Berührung mit Luft ent ­
zündet oder wenn eine Flüssigkeit innerhalb von 5 Minuten nach 
dem Aufbringen an der Luft das Filterpapier entzündet oder verkohlt, 
dann wird sie als pyrophor beurteilt.  
3. BERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunrei ­
nigungen),  
— die Versuchsergebnisse,  
— alle zusätzlichen Bemerkungen, die für die Interpretation der 
Ergebnisse von Bedeutung sind.  
4. LITERATUR  
(1) NF T 20-039 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.
 
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 98
 
A.14.  EXPLOSIONSGEFAHR  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Die Methode stellt ein Prüfschema dar zur Feststellung, ob feste oder 
pastenförmige Stoffe bei Flammenzündung (thermische Empfindlich ­
keit) oder bei Einwirkung von Schlag oder Reibung (mechanische Empfindlichkeit) und ob Flüssigkeiten bei Flammenzündung oder bei Einwirkung von Schlag eine Explosionsgefahr darstellen.
 
Die Methode besteht aus drei Teilen:  
a) Prüfung der thermischen Empfindlichkeit (1),  
b) Prüfung der mechanischen Empfindlichkeit bei Schlagbeanspru ­
chung (1),  
c) Prüfung der mechanischen Empfindlichkeit bei Reibbeanspru ­
chung (1).  
Die Methode liefert Ergebnisse, mit denen die Möglichkeit der Aus ­
lösung einer Explosion bei Einwirkung bestimmter, nicht außerge ­
wöhnlicher Beanspruchungen festgestellt werden kann. Sie dient nicht zur Feststellung, ob ein Stoff unter beliebigen Bedingungen explosionsfähig ist.
 
Die Methode eignet sich zur Feststellung, ob ein Stoff unter den 
besonderen, in der Richtlinie festgelegten Bedingungen eine Explo ­
sionsgefahr darstellt (thermische und mechanische Empfindlichkeit). 
Sie beruht auf der Verwendung mehrerer Arten von Apparaturen, die international weit verbreitet sind (1) und die im Allgemeinen aus ­
sagekräftige Ergebnisse ergeben. Dabei wird eingeräumt, dass die 
Methode keine endgültige Lösung darstellt. Es können andere als 
die genannten Apparaturen verwendet werden, wenn diese interna ­
tional anerkannt sind und die Ergebnisse in angemessener Form mit denen aus den genannten Apparaturen korreliert werden können.
 
Die Prüfungen brauchen nicht vorgenommen zu werden, wenn ver ­
fügbare thermodynamische Daten (z. B. Bildungs-, Zersetzungsent ­
halpie) und/oder das Fehlen bestimmter reaktiver Gruppen (2) in der 
Strukturformel zweifelsfrei erkennen lassen, dass sich der Stoff nicht unter Bildung von Gasen oder Freisetzung von Wärme schnell zer ­
setzen kann (d. h. die Substanz keine Explosionsgefahr darstellt). 
Eine Prüfung der mechanischen Empfindlichkeit bei Reibbeanspru ­
chung ist für Flüssigkeiten nicht erforderlich.
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Explosionsgefährlich:  
Stoffe, die durch Flammenzündung zur Explosion gebracht werden 
können oder die gegen Schlag oder Reibung in den genannten Ap ­
paraturen empfindlich sind (oder die in alternativen Apparaturen eine 
höhere mechanische Empfindlichkeit zeigen als 1,3-Dinitrobenzol).  
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
1,3-Dinitrobenzol, kristallin, gesiebt auf Korngröße 0,5 mm, tech ­
nisches Produkt für die Prüfung der Schlag- und Reibempfindlich ­
keit. 
Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX, Hexogen, Cyclonit — 
CAS 121-82-4), umkristallisiert aus wässrigem Cyclohexanon, nass gesiebt durch ein Sieb 250 μm und als Rückstand auf einem Sieb 
150 μm gewonnen, anschließend bei 103 ± 2
 o C (über 4 Stunden) 
getrocknet für die zweite Reihe der Prüfung auf Schlag- und Reib ­
empfindlichkeit.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 99
 
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Um sichere Bedingungen für die Ausführung der drei Empfindlich ­
keitsprüfungen zu finden, ist die Durchführung von Vorversuchen erforderlich.
 
1.4.1.  Prüfung auf die Sicherheit des Umgangs mit der Substanz (3)  
Aus sicherheitstechnischen Gründen werden vor Durchführung der 
Hauptprüfungen sehr kleine Proben (etwa 10 mg) der Prüfsubstanz ohne Einschluss mit einer Gasbrennerflamme erhitzt, in einem ge ­
eigneten Gerät einem Schlag ausgesetzt und unter Verwendung eines 
Reibstiftes und eines Widerlagers oder in einer beliebigen Reib ­
maschine gerieben. Das Ziel dieser Vorversuche ist, festzustellen, ob der Stoff so empfindlich und so explosiv ist, dass zur Vermei ­
dung von Verletzungen des Prüfenden bei der Durchführung der 
vorgeschriebenen Empfindlichkeitsprüfungen, insbesondere der Prü ­
fung der thermischen Empfindlichkeit, besondere Schutzmaßnahmen vorzusehen sind.
 
1.4.2.  Thermische Empfindlichkeit  
Für die Prüfung wird die Prüfsubstanz in einer Stahlhülse erhitzt, die 
durch Düsenplatten mit Öffnungen verschiedenen Durchmessers ver ­
schlossen ist. Auf diese Weise wird bestimmt, ob der Stoff unter intensiver thermischer Beanspruchung bei definiertem Einschluss ex ­
plodieren kann.
 
1.4.3.  Mechanische Empfindlichkeit (Schlag)  
Die Prüfung besteht darin, die Prüfsubstanz dem Schlag eines fest ­
gelegten Fallgewichtes aus einer festgelegten Höhe auszusetzen.  
1.4.4.  Mechanische Empfindlichkeit (Reibung)  
Bei dieser Prüfung werden feste oder pastenförmige Substanzen der 
Reibung zwischen standardisierten Oberflächen unter festgelegten 
Bedingungen der Belastung und der relativen Bewegung ausgesetzt.  
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Nicht festgelegt.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.6.1.  Thermische Empfindlichkeit (Flammenzündung)  
1.6.1.1.  Apparatur  
Die Apparatur besteht aus einer nicht wieder verwendbaren Stahl ­
hülse mit deren wieder verwendbarer Verschraubung (Abbildung 1), 
die in eine Heiz- und Schutzvorrichtung eingesetzt wird. Jede Hülse wird aus Blech im Tiefziehverfahren hergestellt (siehe Anlage) und hat einen inneren Durchmesser von 24 mm, eine Länge von 75 mm 
und eine Wanddicke von 0,5 mm. Am offenen Ende sind die Hülsen 
mit einem Bund versehen, an dem sie mit der Düsenplatte verschlos ­
sen werden können. Der Verschluss besteht aus einer druckfesten Düsenplatte mit einer zentrischen Bohrung, die mit der aus Gewin ­
dering und Mutter bestehenden Verschraubung fest mit einer Hülse 
verbunden wird. Gewindering und Mutter bestehen aus Chrom-Man ­
gan-Stahl (siehe Anlage), der bis 800
 o C zunderfest ist. Die Düsen ­
platten sind 6 mm dick, bestehen aus warmfestem Stahl (siehe An ­
lage) und stehen mit verschiedenen Öffnungsdurchmessern zur Ver ­
fügung.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 100
 
1.6.1.2.  Versuchsbedingungen  
Normalerweise wird die Substanz im Auslieferungszustand geprüft, 
obwohl in einigen Fällen, z. B. bei gepressten, gegossenen oder anderweitig verdichteten Stoffen, vor der Prüfung ein Zerkleinern 
erforderlich werden kann.
 
Bei Feststoffen wird die Menge des pro Prüfung zu verwendenden 
Materials durch ein zweistufiges Probeverfahren für die Befüllung 
bestimmt. Dabei wird eine gewogene Hülse mit 9 cm  3 Prüfsubstanz 
gefüllt und die Prüfsubstanz unter Anwendung einer Kraft von 80 N, bezogen auf den Gesamtquerschnitt der Hülse, angedrückt. Aus si ­
cherheitstechnischen Gründen oder in solchen Fällen, wo der Aggre ­
gatzustand der Probe durch Druck verändert werden kann, können 
andere Füllverfahren angewendet werden; wenn z. B. die Substanz sehr reibempfindlich ist, empfiehlt sich das Andrücken nicht. Wenn der Stoff sich als kompressibel erweist, wird weitere Substanz hin ­
zugefügt und angedrückt, bis die Hülse bis zu einer Höhe von 
55 mm vom Rand gefüllt ist. Danach wird die Gesamtmenge be ­
stimmt, die für die Füllung bis zum Niveau von 55 mm unter dem Rand benötigt wurde, und es werden zwei weitere gleich große 
Portionen zugegeben, wobei auch diese unter Anwendung einer 
Kraft von je 80 N angedrückt werden. Schließlich wird Substanz entweder zugefügt (unter Andrücken) oder ggf. entnommen, bis die Hülse bis zu einer Höhe von 15 mm unter dem Rand gefüllt ist. 
Dann wird eine zweite Probebefüllung durchgeführt, die mit einer 
angedrückten Menge von einem Drittel der Gesamtmenge der ersten Probebefüllung beginnt. Danach werden zwei weitere solche Portio ­
nen unter Anwendung von 80 N hinzugefügt und die Höhe der 
Substanz in der Hülse durch Hinzufügen oder Entnehmen bis auf 
15 mm unter dem Rand gebracht. Die bei der zweiten Probebefül ­
lung ermittelte Feststoffmenge wird für jeden der eigentlichen Ver ­
suche verwendet, wobei das Füllen mit drei gleich großen Mengen 
vorgenommen wird, deren jede durch Anwendung der erforderlichen 
Kraft auf 9 cm
 3 komprimiert wird. (Dies kann durch Verwendung 
von Abstandsringen erleichtert werden.)  
Flüssigkeiten und gelatinöse Substanzen werden in die Hülse bis zu 
einer Höhe von 60 mm eingefüllt, wobei im letzteren Fall besondere 
Sorge dafür zu tragen ist, dass keine Lunker gebildet werden. Der Gewindering wird von unten auf die Hülse aufgeschoben, die geeig ­
nete Düsenplatte eingesetzt und die Mutter nach Aufbringen eines 
Schmiermittels auf Molybdändisulfid-Basis angezogen. Es muss da ­
rauf geachtet werden, dass keine Substanz zwischen dem Bund und der Platte oder im Gewinde eingeschlossen ist.
 
Zum Aufheizen wird Propangas verwendet, das aus einer handels ­
üblichen Stahlflasche mit Druckminderer (60 bis 70 mbar) entnom ­
men und über einen Durchflussmesser und einen Verteiler gleich ­
mäßig vier Brennern zugeführt wird (was durch Beobachtung der 
Flammen der einzelnen Brenner festgestellt werden kann). Die Bren ­
ner sind entsprechend Abbildung 1 an dem Schutzkasten angeordnet. Die vier Brenner haben zusammen einen Verbrauch von etwa 3,2 l Propan pro Minute. Die Verwendung alternativer Heizgase und 
Brenner ist möglich, doch muss die Heizgeschwindigkeit der in Ab ­
bildung 3 genannten entsprechen. Für alle Apparaturen ist die Heiz ­
geschwindigkeit regelmäßig unter Verwendung von Hülsen mit Di ­
butylphthalat-Füllung zu kontrollieren (vgl. Abbildung 3).
 
1.6.1.3.  Versuchsausführung  
Jeder Versuch wird fortgeführt, bis die Stahlhülse entweder zerlegt 
oder 5 Minuten erhitzt worden ist. Ein Versuch, der zu einer Zerle ­
gung der Hülse in drei oder mehr Teile führt (diese können in einigen Fällen noch durch schmale Metallstreifen miteinander ver ­
bunden sein — vgl. Abbildung 2), wird als Explosion eingestuft. Ein 
Versuch mit weniger Teilen oder überhaupt keiner Zerlegung wird 
nicht als Explosion eingestuft.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 101
 
Zunächst wird eine erste Reihe mit drei Versuchen unter Verwen ­
dung einer Düsenplatte mit einem Öffnungsdurchmesser von 6,0 mm 
durchgeführt; wenn es hier zu keiner Explosion kommt, folgt eine zweite Reihe, ebenfalls mit drei Versuchen, mit einer Düsenplatte von 2,0 mm Öffnungsdurchmesser. Tritt während einer dieser Ver ­
suchsreihen eine Explosion ein, kann auf die Durchführung weiterer 
Versuche verzichtet werden.
 
1.6.1.4.  Auswertung  
Das Versuchsergebnis wird als positiv eingestuft, wenn es in einer 
der genannten Versuchsreihen zu einer Explosion kommt.  
1.6.2.  Mechanische Empfindlichkeit (Schlag)  
1.6.2.1.  Apparatur (Abbildung 4)  
Die wesentlichen Teile eines typischen Fallhammers sind der Block 
aus Gussstahl mit Fuß, der Amboss, die Säule, die Führungsschie ­
nen, die Fallgewichte, die Auslösevorrichtung und ein Probenhalter. 
Der Stahlamboss — 100 mm (Durchmesser) × 70 mm (Höhe) — ist 
oben auf einen Stahlblock — 230 mm (Länge) × 250 mm (Breite) × 200 mm (Höhe) — mit Fuß — 450 mm (Länge) × 450 mm (Breite) × 60 mm (Höhe) — aufgeschraubt. Eine Säule aus nahtlos gezoge ­
nem Stahlrohr ist in einer Halterung befestigt, die auf der Rückseite 
des Stahlblocks angeschraubt ist. Der Fallhammer ist mit 4 Steinschrauben auf einem massiven Betonsockel — 60 cm × 60 cm × 60 cm — so verankert, dass die Führungsschienen absolut 
senkrecht stehen und das Fallgewicht leicht geführt wird. Fall ­
gewichte zu 5 kg und 10 kg aus massivem Stahl stehen zur Ver ­
fügung. Der Schlageinsatz jedes Gewichts besteht aus gehärtetem 
Stahl, HRC 60 bis 63, und hat einen Mindestdurchmesser von 
25 mm.
 
Die zu untersuchende Probe ist in eine Stempelvorrichtung ein ­
zuschließen, die aus zwei koaxial übereinander stehenden Stahlstem ­
peln und einem Hohlzylinder aus Stahl als Führungsring besteht. Die Stahlstempel, Abmessung 10 (– 0,003, - 0,005) mm Durchmesser 
und 10 mm Höhe, müssen polierte Flächen, abgerundete Kanten 
(Krümmungsradius 0,5 mm) und eine Härte HRC 58 bis 65 haben. Der Hohlzylinder muss einen äußeren Durchmesser von 16 mm, eine geschliffene Bohrung von 10 (+ 0,005, + 0,010) mm und eine Höhe 
von 13 mm haben. Die Stempelvorrichtung ist auf einen Zwischen ­
amboss (26 mm Durchmesser, 26 mm Höhe) aus Stahl zu stellen und durch einen Zentrierring mit einem Lochkranz zum Abströmen der 
Explosionsschwaden zu zentrieren.
 
1.6.2.2.  Versuchsbedingungen  
Die Probe muss ein Volumen von 40 mm  3 oder ein der verwendeten 
Alternativapparatur angepasstes Volumen haben. Feststoffe sind im 
trockenen Zustand zu prüfen und wie folgt vorzubereiten:  
a) Pulverförmige Substanzen sind zu sieben (Maschenweite 
0,5 mm); der gesamte Siebdurchgang ist zur Prüfung zu ver ­
wenden.  
b) Gepresste, gegossene oder anderweitig verdichtete Substanzen 
sind zu zerkleinern und zu sieben; zur Prüfung ist die Siebfrak ­
tion 0,5 bis 1 mm Durchmesser zu verwenden; sie muss für die Originalsubstanz repräsentativ sein.
 
Substanzen, die in der Regel pastenförmig geliefert werden, sollten, 
wenn möglich, im trockenen Zustand geprüft werden, auf jeden Fall aber nach Entfernen der größtmöglichen Menge an Verdünnungs ­
mittel. Bei der Prüfung flüssiger Substanzen ist zwischen dem oberen 
und dem unteren Stahlstempel ein Abstand von 1 mm zu halten.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 102
 
1.6.2.3.  Versuchsausführung  
Es werden sechs Einzelversuche unter Verwendung des Fallgewichts 
von 10 kg und Anwendung einer Fallhöhe von 0,40 m (40 J) aus ­
geführt. Wenn es während der sechs Versuche bei 40 J zu einer 
Explosion kommt, sind weitere sechs Einzelversuche mit einem Fall ­
gewicht von 5 kg und einer Fallhöhe von 0,15 m (7,5 J) auszufüh ­
ren. Bei Verwendung einer anderen Apparatur wird die Probe mit der gewählten Referenzsubstanz unter Benutzung einer anerkannten 
Auswertungsmethode (z. B. Up-and-down-Technik usw.) verglichen.
 
1.6.2.4.  Auswertung  
Das Prüfergebnis wird als positiv eingestuft, wenn es mit der be ­
schriebenen Apparatur zumindest in einem der genannten Versuche 
zu einer Explosion (eine Entflammung und/oder ein Knall steht einer Explosion gleich) kommt oder wenn bei Verwendung einer alterna ­
tiven Apparatur die Probe empfindlicher ist als 1,3-Dinitrobenzol 
oder Hexogen (RDX).
 
1.6.3.  Mechanische Empfindlichkeit (Reibung)  
1.6.3.1.  Apparatur (Abbildung 5)  
Der Reibapparat besteht aus einer Grundplatte (Gussstahl), auf der 
die Reibvorrichtung, bestehend aus einem feststehenden Porzellan ­
stift und einem beweglichen Porzellanplättchen, montiert ist. Das Porzellanplättchen ist in einem Schlitten befestigt, der in zwei Gleit ­
schienen geführt wird. Der Schlitten wird mit einem Elektromotor 
über eine Schubstange, eine Exzenterscheibe und ein geeignetes Ge ­
triebe so angetrieben, dass das Porzellanplättchen unter dem Porzel ­
lanstift eine einmalige Hin- und Rückbewegung von 10 mm Länge 
ausführt. Der Porzellanstift kann z. B. mit 120 oder 360 N belastet 
werden.
 
Die flachen Porzellanplättchen sind aus rein weißem technischem 
Porzellan gefertigt (Rautiefe 9 μm bis 32 μm) und haben die Ab ­
messungen 25 mm (Länge) × 25 mm (Breite) × 5 mm (Höhe). Der 
zylindrische Porzellanstift ist ebenfalls aus rein weißem technischem 
Porzellan gefertigt. Er ist 15 mm lang, hat einen Durchmesser von 10 mm und eine raue sphärische Endfläche mit einem Krümmungs ­
radius von 10 mm.
 
1.6.3.2.  Versuchsbedingungen  
Die Probe muss ein Volumen von 10 mm  3 oder ein der verwendeten 
Alternativapparatur angepasstes Volumen haben.  
Feststoffe sind im trockenen Zustand zu prüfen und wie folgt vor ­
zubereiten:  
a) Pulverförmige Substanzen sind zu sieben (Maschenweite 
0,5 mm); der gesamte Siebdurchgang ist zur Prüfung zu ver ­
wenden.  
b) Gepresste, gegossene oder anderweitig verdichtete Substanzen 
sind zu zerkleinern und zu sieben; zur Prüfung ist die Siebfrak ­
tion < 0,5 mm Durchmesser zu verwenden.  
Pastenförmige Substanzen sollten, wenn möglich, im trockenen Zu ­
stand geprüft werden. Falls das nicht möglich ist, muss die Paste, nach Entfernen der größtmöglichen Menge an Verdünnungsmittel, 
als 0,5 mm dicker, 2 mm breiter und 10 mm langer Film, der mit 
einem speziellen Formteil hergestellt wird, geprüft werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 103
 
1.6.3.3.  Versuchsausführung  
Der Porzellanstift wird auf die zu untersuchende Probe gesetzt und 
belastet. Bei Durchführung des Versuchs muss der Schwammstrich des Porzellanplättchens quer zu dessen Bewegungsrichtung liegen. 
Es ist darauf zu achten, dass der Stift auf der Probe steht und dass 
so viel Prüfsubstanz vor dem Stift liegt, dass bei der Plättchenbewe ­
gung genügend Prüfsubstanz unter den Stift gelangt. Pastenförmige Substanzen werden mittels einer Lehre (Dicke: 0,5 mm) mit einer 
Öffnung von 2 mm × 10 mm auf das Plättchen aufgetragen. Das 
Porzellanplättchen wird unter dem Porzellanstift in einer Zeit von 0,44 s je 10 mm hin- und herbewegt. Jeder Oberflächenbezirk des 
Plättchens und des Stiftes darf nur einmal verwendet werden; die 
beiden Enden eines jeden Stiftes können für zwei Versuche und die beiden Oberflächen eines jeden Plättchens können für je drei Versuche benutzt werden.
 
Es werden sechs Einzelversuche unter Verwendung einer Belastung 
von 360 N ausgeführt. Wenn es während der sechs Versuche zu 
einer positiven Reaktion kommt, sind weitere sechs Einzelversuche 
mit einer Belastung von 120 N auszuführen. Bei Verwendung einer anderen Apparatur wird die Probe mit der gewählten Referenzsub ­
stanz unter Benutzung einer anerkannten Auswertungsmethode (z. B. 
Up-and-down-Technik usw.) verglichen.
 
1.6.3.4.  Auswertung  
Das Prüfergebnis wird als positiv eingestuft, wenn es mit dem be ­
schriebenen Reibapparat zumindest in einem der genannten Versuche 
zu einer Explosion (ein Knistern und/oder ein Knall oder eine Ent ­
flammung stehen einer Explosion gleich) kommt oder wenn bei Ver ­
wendung einer alternativen Reibprüfung die äquivalenten Kriterien erfüllt werden.
 
2. DATEN  
Grundsätzlich gilt ein Stoff als im Sinne dieser Richtlinie explosions ­
gefährlich, wenn bei der Prüfung auf thermische, Schlag- oder Reib ­
empfindlichkeit ein positives Ergebnis erzielt wird.  
3. BERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— die Bezeichnung, die Zusammensetzung, die Reinheit, der Feuch ­
tigkeitsgehalt usw. der Prüfsubstanz,  
— der Aggregatzustand der Probe und die Angabe, ob die Probe 
zerkleinert und/oder gesiebt worden ist,  
— die Beobachtungen während der Prüfungen auf thermische Emp ­
findlichkeit (z. B. Probenmasse, Anzahl der Splitter usw.),  
— die Beobachtungen während der Prüfungen auf mechanische 
Empfindlichkeit (z. B. größere Rauchentwicklung oder vollstän ­
dige Zersetzung ohne einen Knall, Flammen, Funken, Knistern 
usw.),  
— die Ergebnisse jedes Einzelversuchs,  
— bei Anwendung einer Alternativapparatur: die wissenschaftliche 
Begründung sowie die Beweisführung für die Vergleichbarkeit 
der Ergebnisse zwischen der beschriebenen und der Alternativ ­
apparatur,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 104
 
— alle nützlichen Hinweise auf Versuche mit ähnlichen Substanzen, 
die für die richtige Interpretation der erhaltenen Versuchsergeb ­
nisse von Bedeutung sein können,  
— alle zusätzlichen Bemerkungen, die für die Interpretation der 
Ergebnisse von Bedeutung sind.  
3.2. INTERPRETATION UND BEWERTUNG DER ERGEBNISSE  
Im Prüfbericht sind alle Ergebnisse anzugeben, die als falsch, anor ­
mal oder nicht repräsentativ angesehen werden. Wird ein Versuchs ­
ergebnis nicht in die Bewertung einbezogen, so ist dies zu begrün ­
den, und es sind die Ergebnisse anderer oder zusätzlicher Versuche aufzuführen. Kann die Abnormität eines Ergebnisses nicht erklärt werden, muss das Ergebnis als solches akzeptiert und der Stoff ent ­
sprechend eingestuft werden.
 
4. LITERATUR  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) Bretherick, L., Handbook of Reaaive Chemical Hazards, 
4. Auflage, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.  
(3) Koenen, H., Ide, K.H. und Swatt, K.H., Explosivstoffe, 1961, 
Bd. 3, 6-13 und 30-42.  
(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use — 
Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 105
 
Anlage  
Beispiel für Werkstoffspezifikation zur Prüfung auf thermische 
Empfindlichkeit (vgl. DIN 1623)  
(1) Hülse: Werkstoffspezifikation Nr. 1.0336.505 g  
(2) Düsenplatte: Werkstoffspezifikation Nr. 1.4873  
(3) Gewindering und Mutter: Werkstoffspezifikation Nr. 1.3817  
Abbildung 1  
Apparatur für die Prüfung auf thermische Empfindlichkeit  
(alle Abmessungen in mm)
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 106
 
Abbildung 2  
Prüfung auf thermische Empfindlichkeit  
Beispiele für Splitterbilder
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 107
 
Abbildung 3  
Kalibrierung der Heizgeschwindigkeit für die Prüfung auf thermische Empfindlichkeit
  
Temperatur-/Zeitkurve bei Erwärmung von Dibutylphthalat (27 cm  3 ) in einer (mit einer Düsen ­
platte mit Öffnungsdurchmesser 1,5 mm) verschlossenen Hülse bei einem Propanverbrauch von 
3,2 l/min. Die Temperatur wird mit einem Chromel-/Alumel-Thermoelement (Durchmesser: 
1 mm) in einer Hülse aus rostfreiem Stahl gemessen, das zentral 43 mm unter dem Hülsenrand angebracht ist. Die Heizgeschwindigkeit muss im Bereich von 135
 o C bis 285  o C zwischen 185 
K/min und 215 K/min liegen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 108
 
Abbildung 4  
Apparatur zur Prüfung auf Schlagempfindlichkeit  
(alle Abmessungen in mm)
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 109
 
Abbildung 4  
Fortsetzung
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 110
 
Abbildung 5  
Apparatur zur Prüfung auf Reibempfindlichkeit
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 111
 
A.15.  ZÜNDTEMPERATUR (FLÜSSIGKEITEN UND GASE)  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Diese Prüfmethode gilt nicht für explosive Stoffe und solche, die sich bei Raumtem ­
peratur spontan entzünden. Das Prüfverfahren ist auf Gase, Flüssigkeiten und Dämpfe 
anwendbar, die sich in Gegenwart von Luft an einer heißen Oberfläche entzünden können.
 
Die Zündtemperatur kann durch katalytisch wirkende Verunreinigungen, durch das 
Oberflächenmaterial oder durch ein größeres Volumen des Prüfgefäßes erheblich herab ­
gesetzt werden.  
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Die Zündtemperatur stellt ein Maß für die Selbstentzündlichkeit dar. Die Zündtempera ­
tur ist die niedrigste Temperatur, bei der sich die Prüfsubstanz im Gemisch mit Luft unter den im Prüfverfahren definierten Bedingungen entzündet.
 
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Referenzsubstanzen sind in den Normen angegeben (siehe 1.6.3). Sie sollten in erster 
Linie dazu dienen, die Methode von Zeit zu Zeit zu überprüfen und einen Vergleich mit den Ergebnissen aus anderen Methoden zu ermöglichen.
 
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Die Methode dient der Bestimmung der Mindesttemperatur von Behälterinnenflächen, 
durch die in diesem Behältnis befindliche Gase, Dämpfe oder Flüssigkeiten entzündet 
werden können.  
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Die Wiederholbarkeit hängt ab vom Zündtemperaturbereich und der angewandten Prüf ­
methode.  
Die Empfindlichkeit und Spezifität hängen von der angewandten Prüfmethode ab.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.6.1.  Geräte  
Die Prüfgeräte sind in den unter 1.6.3 genannten Methoden beschrieben.  
1.6.2.  Versuchsbedingungen  
Die zu prüfende Substanz wird entsprechend den unter 1.6.3 genannten Methoden 
geprüft.  
1.6.3.  Versuchsausführung  
Siehe IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF F 20-037.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 112
 
2. DATEN  
Registrieren von Versuchstemperatur, Luftdruck, Menge der eingesetzten Probe und 
Zündverzögerungszeit.  
3. BERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— genaue Angaben über die Prüfsubstanz (Identität und Verunreinigungen),  
— die Probenmenge, der Luftdruck,  
— die verwendete Apparatur,  
— die Messergebnisse (Prüftemperaturen, Ergebnisse hinsichtlich Zündung, entspre ­
chender Zeitverzug),  
— alle zusätzlichen Bemerkungen, die für die Interpretation der Ergebnisse 
wichtig sind.  
4. LITERATUR  
Keine.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 113
 
A.16.  RELATIVE SELBSTENTZÜNDUNGSTEMPERATUR FÜR 
FESTSTOFFE  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Diese Prüfmethode gilt nicht für explosive Stoffe und solche, die 
sich bei Raumtemperatur an der Luft selbst entzünden.  
Zweck dieser Prüfung ist der Erhalt von vorläufigen Informationen 
über die Selbstentzündlichkeit von festen Stoffen bei erhöhter Tem ­
peratur.  
Wird die bei der Reaktion des Stoffes mit Sauerstoff oder bei der 
exothermen Zersetzung des Stoffes entstehende Wärme nicht schnell 
genug an die Umgebung abgegeben, so kommt es zur Selbsterhit ­
zung mit nachfolgender Selbstentzündung. Selbstentzündung tritt so ­
mit ein, wenn die Wärmeentwicklung größer ist als die Wärmeab ­
leitung.  
Die Prüfmethode wird als Vorversuch für feste Substanzen angewen ­
det. Wegen der komplexen Natur der Entzündung und Verbrennung von festen Stoffen ist die mit dieser Methode bestimmte Selbstent ­
zündungstemperatur nur für Vergleichszwecke zu benutzen.
 
1.2. DEFINITION UND EINHEITEN  
Die mit dieser Methode bestimmte Selbstentzündungstemperatur ist 
die minimale Umgebungstemperatur in  o C, bei der sich unter de ­
finierten Bedingungen eine bestimmte Menge einer Substanz entzündet.
 
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Keine.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Eine bestimmte Menge der Prüfsubstanz wird bei Raumtemperatur in 
einen Ofen eingebracht. Während die Temperatur des Ofens mit einer Rate von 0,5 K/min auf 400
 o C oder bis zum Schmelzpunkt 
(wenn dieser niedriger liegt) erhöht wird, wird die Temperatur im 
Inneren der Probe gemessen und als Temperatur/Zeit-Kurve regis ­
triert. Bei diesem Verfahren wird diejenige Ofentemperatur, bei der die Probentemperatur durch Selbsterhitzung 400
 o C erreicht, als 
Selbstentzündungstemperatur bezeichnet.  
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.6.1.  Gerät  
1.6.1.1.  Ofen  
Ein Laboratoriumsofen (Volumen etwa 2 l) mit Temperaturprogram ­
mierung, natürlicher Luftzirkulation und Explosionsdruckentlastung. 
Um Explosionsgefahr zu vermeiden, dürfen Schwelgase auf keinen 
Fall mit den elektrischen Heizdrähten in Berührung kommen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 114
 
1.6.1.2.  Drahtnetz-Kubus  
Ein Stück Drahtnetz aus rostfreiem Stahl mit einer Maschenweite 
von 0,045 mm wird entsprechend der Darstellung in Abbildung 1 zugeschnitten. Dieses Drahtnetz wird zu einem oben offenen Kubus 
gefaltet; die Kanten des Kubus werden fest mit Draht verbunden.
 
1.6.1.3.  Thermoelemente  
Geeignete Thermoelemente.  
1.6.1.4.  Registriergerät  
Jedes Registriergerät mit zwei Messkanälen, das für Temperaturen 
von 0 bis 600  o C oder den entsprechenden Thermospannungs-Be ­
reich kalibriert ist.  
1.6.2.  Versuchsbedingungen  
Die Stoffe werden in ihrem Anlieferungszustand geprüft.  
1.6.3.  Versuchsausführung  
Der Kubus wird mit der Prüfsubstanz gefüllt und der Inhalt durch 
leichtes Aufstoßen verdichtet; es wird weitere Prüfsubstanz dazugegeben, bis der Kubus vollständig gefüllt ist. Der Kubus wird dann bei Raumtemperatur in die Mitte des Ofens eingesetzt. 
Ein Thermoelement wird in die Mitte des Kubus und das andere zur 
Registrierung der Ofentemperatur zwischen dem Kubus und der Ofenwand angebracht.
 
Während die Temperatur des Ofens mit einer Rate von 0,5 K/mm 
auf 400  o C oder bis zum Schmelzpunkt (wenn dieser niedriger liegt) 
gesteigert wird, wird die Temperatur des Ofens und der Probe kon ­
tinuierlich aufgezeichnet.  
Wenn sich die Prüfsubstanz entzündet, zeigt das Thermoelement 
der Probe einen starken Temperaturanstieg über die Ofentempera ­
tur hinaus.  
2. DATEN  
Diejenige Temperatur des Ofens, bei der die Probentemperatur durch 
Selbsterhitzung 400  o C erreicht, ist für die Beurteilung maßgebend 
(siehe Abbildung 2).  
3. BERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— eine Beschreibung der Prüfsubstanz,  
— die Messergebnisse einschließlich der Temperatur/Zeit-Kurve,  
— alle zusätzlichen Bemerkungen, die für die Interpretation der 
Ergebnisse wichtig sind.  
4. LITERATUR  
(1) NF T 20-036 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous 
flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 115
 
Abbildung 1  
Muster des Testkubus (Kantenlänge 20 mm)
  
Abbildung 2  
Typische Temperatur/Zeit-Kurve
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 116
 
A.17.  BRANDFÖRDERNDE EIGENSCHAFTEN (FESTSTOFFE)  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Es ist zweckdienlich, vor Ausführung dieses Versuchs Informationen 
über mögliche explosive Eigenschaften der Substanz zu haben.  
Dieses Verfahren kann nicht auf Flüssigkeiten, Gase, explosive oder 
leichtentzündliche Substanzen oder organische Peroxide angewendet 
werden.  
Die Prüfung braucht nicht ausgeführt zu werden, wenn die Prüfung 
der Strukturformel zweifelsfrei ergibt, dass die Substanz mit brenn ­
barem Material nicht exotherm reagieren kann.  
Zur Ermittlung der Sicherheitsvorkehrungen für die Versuchsausfüh ­
rung ist es notwendig, einen Vorversuch durchzuführen.  
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Abbrandzeit: diejenige Zeit in Sekunden, in der sich die Reaktions ­
zone über die Schüttung ausbreitet, gemäß dem unter 1.6 beschrie ­
benen Verfahren.  
Abbrandgeschwindigkeit: anzugeben in mm/s.  
Höchste Abbrandgeschwindigkeit: die höchsten Werte der Abbrand ­
geschwindigkeiten von Gemischen mit Massenanteilen an Oxidati ­
onsmitteln von 10 bis 90 %.  
1.3. REFERENZSUBSTANZ  
Als Referenzsubstanz für die Prüfung und den Vorversuch wird 
Bariumnitrat (analysenrein) verwendet.  
Referenzgemisch ist dasjenige Gemisch aus Bariumnitrat und Cellu ­
losepulver, das gemäß 1.6 hergestellt wurde und die höchste Ab ­
brandgeschwindigkeit hat (üblicherweise ein Gemisch mit einem 
Massenanteil an Bariumnitrat von 60 %).  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Der Vorversuch wird aus Gründen der Sicherheit ausgeführt. Wenn 
der Vorversuch eindeutig ergibt, dass die Substanz brandfördernde 
Eigenschaften hat, sind keine weiteren Prüfungen erforderlich. Liegt 
ein solches eindeutiges Ergebnis nicht vor, so ist mit der Substanz der Hauptversuch auszuführen.
 
Für den Hauptversuch werden die Prüfsubstanz und eine definierte 
brennbare Substanz in verschiedenen Gewichtsverhältnissen ge ­
mischt. Jedes Gemisch wird dann zu Schüttungen geformt und diese Schüttungen werden an einem Ende gezündet. Die höchste ermittelte 
Abbrandgeschwindigkeit wird mit der höchsten Abbrandgeschwin ­
digkeit des Referenzgemisches verglichen.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Es ist jede Methode der Zerkleinerung und Mischung geeignet, die 
dazu führt, dass bei den sechs getrennten Versuchen die maximale 
Abbrandgeschwindigkeit vom arithmetischen Mittelwert um nicht 
mehr als 10 % abweicht.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 117
 
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.6.1.  Vorbereitung  
1.6.1.1.  Prüfsubstanz  
Die Prüfsubstanz wird nach dem folgenden Verfahren auf eine Korn ­
größe von < 0,125 mm gebracht: Substanz sieben, verbleibende 
Kornfraktion zerkleinern, das Verfahren so lange wiederholen, bis die gesamte Probe das Sieb passiert hat.
 
Es kann jedes Zerkleinerungs- und Siebverfahren eingesetzt werden, 
das den Qualitätskriterien genügt.  
Vor der Herstellung des Gemisches wird die Substanz bei 105  o C bis 
zur Gewichtskonstanz getrocknet. Wenn die Zersetzungstemperatur der Substanz unterhalb 105
 o C liegt, ist die Substanz bei entspre ­
chend niedrigerer Temperatur zu trocknen.  
1.6.1.2.  Brennbare Substanz  
Cellulosepulver wird als brennbare Substanz verwendet. Es sollte 
dies ein Cellulosepulver sein, das für die Dünnschicht- oder Säulen ­
chromatografie verwendet wird. Als geeignet hat sich eine Sorte mit einer Faserlänge von mehr als 85 % zwischen 0,020 und 0,075 mm erwiesen. Das Cellulosepulver wird unter Verwendung eines Siebes 
mit einer Maschenweite von 0,125 mm gesiebt. Für die gesamte 
Prüfung ist dieselbe Cellulosepartie zu verwenden.
 
Vor der Herstellung der Mischung wird das Cellulosepulver bei 
105  o C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.  
Wenn im Vorversuch Sägemehl verwendet wird, ist derjenige Anteil 
von Weichholzsägemehl zu verwenden, der ein Sieb mit einer Ma ­
schenweite von 1,6 mm passiert. Dieses Sägemehl wird sorgfältig gemischt und in einer Schichtdicke von maximal 25 mm bei 105
 o C 
4 Stunden lang getrocknet. Abkühlen lassen und bis zur Verwendung 
(möglichst innerhalb von 24 Stunden nach dem Trocknen) in einem luftdichten Behälter aufbewahren, der so voll wie möglich gefüllt sein soll.
 
1.6.1.3.  Zündquelle  
Als Zündquelle wird die Flamme eines Gasbrenners (Mindestdurch ­
messer 5 mm) benutzt. Bei Verwendung einer anderen Zündquelle (z. B. bei Prüfungen in einer inerten Atmosphäre) ist eine entspre ­
chende Beschreibung mit Begründung dem Bericht beizufügen.
 
1.6.2.  Versuchsausführung  
Bemerkung  
Gemische aus Oxidationsmitteln und Cellulose oder Sägemehl müs ­
sen als potenziell explosionsgefährlich angesehen und mit großer 
Sorgfalt behandelt werden.  
1.6.2.1.  Vorversuch  
Die getrocknete Substanz wird mit der getrockneten Cellulose oder 
mit getrocknetem Sägemehl (Gewichtsverhältnis: 2 Teile Prüfsub ­
stanz, 1 Teil Cellulose oder Sägemehl) gründlich gemischt. Das Ge ­
misch wird zu einer kegelförmigen Schüttung mit 3,5 cm Durch ­
messer (Durchmesser der Grundfläche) und 2,5 cm Höhe geformt, indem es ohne besonderes Andrücken in eine kegelförmige Form 
eingefüllt wird (z. B. in einen Laboratoriums-Glastrichter mit ver ­
stopftem Abflussrohr).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 118
 
Die Schüttung wird auf einer kalten, nicht brennbaren, nichtporösen 
Grundplatte mit geringer Wärmeleitfähigkeit angeordnet. Der Ver ­
such ist gemäß 1.6.2.2 in einem Abzug auszuführen.  
Der Kegel wird mit einer Zündquelle entzündet. Heftigkeit und 
Dauer der eintretenden Reaktion werden beobachtet und notiert.  
Die Substanz wird als brandfördernd beurteilt, wenn die Reaktion 
heftig ist.  
In allen Fällen, in denen Zweifel am Ergebnis möglich sind, ist das 
nachstehend beschriebene vollständige Prüfverfahren anzuwenden.  
1.6.2.2.  Hauptversuch  
Es werden Gemische aus Oxidationsmittel und Cellulose hergestellt, 
mit Massenanteilen an Oxidationsmitteln von 10 % bis 90 %, in 10 %-Intervallen. Für Grenzfälle sollten Gemische von Oxidations ­
mitteln und Cellulose mit dazwischen liegender Zusammensetzung 
hergestellt werden, um bei der Bestimmung der höchsten Abbrand ­
geschwindigkeit genauere Werte zu erhalten.
 
Die Schüttung wird mittels einer Form hergestellt. Die Form besteht 
aus Metall, hat eine Länge von 250 mm und einen dreieckigen Querschnitt mit einer inneren Höhe von 10 mm und einer inneren 
Breite von 20 mm. Die Form wird an beiden Längsseiten von zwei 
Metallblechen begrenzt, die den dreieckigen Querschnitt um 2 mm überragen (siehe Abbildung). Diese Anordnung wird mit einem ge ­
ringen Überschuss lose gefüllt. Nach dem Fallenlassen der Form aus 
2 cm Höhe auf eine feste Unterlage wird die überstehende Substanz 
mit einem flachen Blech abgestrichen. Dann werden die seitlichen Begrenzungen entfernt und die verbleibende Schicht wird mit einer Rolle geglättet. Nun wird eine nichtbrennbare und nichtporöse Platte 
mit geringer Wärmeleitfähigkeit auf die Form gelegt, das Ganze um 
180
 o gedreht und die Form entfernt.  
Die Schüttung wird quer zur Zugrichtung in einem Abzug 
angeordnet.  
Die Absauggeschwindigkeit muss so hoch sein, dass Rauch nicht in 
das Labor dringen kann; sie soll auch während des Versuchs nicht verändert werden. Um die Versuchsanordnung herum ist ein Wind ­
schutz aufzustellen.
 
Wegen der Hygroskopizität der Cellulose und mancher Prüfsubstan ­
zen soll die Prüfung so schnell wie möglich ausgeführt werden.  
Die Schüttung wird an einem Ende mit der Gasflamme gezündet.  
Es wird die Abbrandzeit über eine Strecke von 200 mm gemessen, 
nachdem die Reaktionszone eine Strecke von 30 mm vom Start 
zurückgelegt hat.  
Die Prüfung wird mit der Referenzsubstanz und mindestens einmal 
mit jedem der abgestuften Gemische Prüfsubstanz/Cellulose aus ­
geführt.  
Wenn festgestellt wird, dass die Abbrandgeschwindigkeit signifikant 
größer ist als die des Referenzgemisches, kann die Prüfung beendet werden. Andernfalls muss mit den drei Gemischen, die die höchsten 
Abbrandgeschwindigkeiten ergeben haben, der Abbrandversuch je ­
weils fünfmal wiederholt werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 119
 
Wenn der Verdacht auf ein falsches positives Ergebnis besteht, muss 
die Prüfung wiederholt werden und zwar anstelle von Cellulose mit 
einer inerten Substanz ähnlicher Korngröße, z. B. Kieselgur. Alter ­
nativ ist das Gemisch Prüfsubstanz/Cellulose mit der höchsten Ab ­
brandgeschwindigkeit in einer inerten Atmosphäre zu prüfen 
(< 2 % Volumenanteile Sauerstoff).  
2. DATEN  
Aus sicherheitstechnischen Gründen ist die höchste Abbrand ­
geschwindigkeit — nicht der Mittelwert — als charakteristisches Merkmal für das brandfördernde Verhalten der Prüfsubstanz anzuse ­
hen.
 
Der höchste Wert der Abbrandgeschwindigkeit in einer Serie von 
sechs Versuchen mit einer bestimmten Mischung ist maßgebend 
für die Ausweitung.  
Die höchsten Werte der Abbrandgeschwindigkeit für jede Mischung 
werden gegen den Gehalt an Prüfsubstanz aufgetragen. Aus dieser Kurve wird dann die höchste Abbrandgeschwindigkeit ermittelt.
 
Die sechs in einer Serie gemessenen Werte für die Abbrand ­
geschwindigkeit desjenigen Gemisches, das die höchste Abbrand ­
geschwindigkeit aufweist, dürfen nicht mehr als 10 % vom arithme ­
tischen Mittelwert abweichen. Andernfalls müssen die Methoden der 
Zerkleinerung und Mischung überprüft werden.  
Die höchste gemessene Abbrandgeschwindigkeit wird mit der höchs ­
ten Abbrandgeschwindigkeit des Referenzgemisches verglichen 
(siehe 1.3).  
Bei Prüfungen in inerter Atmosphäre wird die höchste Reaktions ­
geschwindigkeit mit derjenigen des Referenzgemisches in einer iner ­
ten Atmosphäre verglichen.  
3. BERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— Identität, Zusammensetzung, Reinheit, Feuchtegehalt usw. der 
Prüfsubstanz,  
— sämtliche Vorbehandlungen der Prüfsubstanz (z. B. Mahlung, 
Trocknung usw.),  
— die bei den Prüfungen verwendete Zündquelle,  
— die Ergebnisse der Messungen,  
— die Art der Reaktion (z. B. schnelle Brandausbreitung an der 
Oberfläche, Brennen durch das gesamte Volumen, sämtliche An ­
gaben über Verbrennungsprodukte usw.),  
— die Ergebnisse der Prüfungen mit einem inerten Stoff (wenn 
ausgeführt),  
— alle zusätzlichen Bemerkungen, die für die Interpretation der 
Ergebnisse wichtig sind, einschließlich einer Beschreibung der Heftigkeit (Aufflammen, Funkenwurf, Rauchentwicklung, lang ­
sames Schwelen usw.) und der ungefähren Dauer der Reaktion 
beim Vorversuch mit Prüf- und Bezugssubstanz,
 
— die Ergebnisse der Prüfungen mit einem inerten Stoff (wenn 
ausgeführt),  
— die Ergebnisse der Prüfungen in inerter Atmosphäre (wenn aus ­
geführt).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 120
 
3.2. INTERPRETATION DES ERGEBNISSES  
Eine Substanz wird als brandfördernd beurteilt, wenn  
a) sie im Vorversuch eine heftige Reaktion zeigt;  
b) beim vollständigen Prüfverfahren die höchste Abbrandgeschwin ­
digkeit der Prüfgemische größer oder gleich der höchsten Ab ­
brandgeschwindigkeit des Referenzgemisches aus Cellulose und 
Bariumnitrat ist.  
Um ein falsches positives Ergebnis zu vermeiden, sind bei der Inter ­
pretation der Ergebnisse auch die Prüfergebnisse für das Gemisch 
aus Prüfsubstanz und einem inerten Stoff und/oder von Prüfungen in 
einer inerten Atmosphäre zu berücksichtigen.  
4. LITERATUR  
(1) NF T 20-035 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 121
 
Anlage  
Abbildung  
Form und Zubehör zur Herstellung der Schüttung  
(alle Maßangaben in mm)
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 122
 
A.18.  ZAHLENGEMITTELTE MOLMASSE UND MOLMASSENVER ­
TEILUNG VON POLYMEREN  
1. METHODE  
Diese gelpermeationschromatografische Methode entspricht der 
OECD TG 118 (1996). Die wichtigsten Grundsätze und weitere 
technische Informationen werden in den Literaturhinweisen (1) ge ­
nannt.  
1.1. EINLEITUNG  
Da die Eigenschaften von Polymeren so unterschiedlich sind, ist es 
unmöglich, nur eine einzige Methode zu nennen, die alle Bedingun ­
gen für die Trennung und Auswertung erfüllt und somit sämtliche Eventualitäten und Besonderheiten bei der Trennung von Polymeren berücksichtigt. Insbesondere für komplexe polymere Systeme ist die 
Gelpermeationschromatografie (GPC) häufig nicht geeignet. Wenn 
die GPC nicht anwendbar ist, kann die Molmasse mit Hilfe anderer Methoden bestimmt werden (siehe Anlage). In solchen Fällen muss die verwendete Methode in allen Einzelheiten beschrieben und die 
Gründe für deren Verwendung genannt werden.
 
Die beschriebene Methode beruht auf DIN-Norm 55672 (1). Diese 
Norm enthält ausführliche Informationen darüber, wie die Versuche durchgeführt und wie die Daten ausgewertet werden müssen. Wenn 
Änderungen der Versuchsbedingungen notwendig sein sollten, müs ­
sen diese Änderungen begründet werden. Es können andere Normen herangezogen werden, diese müssen jedoch belegt werden. Im be ­
schriebenen Verfahren werden Polystyrolproben bekannter Polydis ­
persität zur Kalibrierung verwendet; es kann jedoch vorkommen, 
dass das Verfahren für bestimmte Polymere, z. B. wasserlösliche und langkettige, verzweigte Polymere, angepasst werden muss.
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Die zahlengemittelte Molmasse M  n und die gewichtsgemittelte Mol ­
masse werden anhand folgender Gleichungen bestimmt: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i ÜM i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
Dabei ist:  
H i = die Höhe des Detektorsignals von der Grundlinie für das Re ­
tentionsvolumen V  i 
M i = die Molmasse der Polymerfraktion bei dem 
Retentionsvolumen V  i 
n = die Zahl der Datenpunkte  
Die Breite der Molmassenverteilung, die ein Maß für die Dispersität 
des Systems ist, wird durch das Verhältnis M  w /M n ausgedrückt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 123
 
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Da es sich bei der GPC um eine relative Methode handelt, muss eine 
Kalibrierung vorgenommen werden. Hierzu werden in der Regel eng verteilte, linear aufgebaute Polystyrolstandards mit bekannten mitt ­
leren Molmassen M
 n und M  w und einer bekannten Molmassenver ­
teilung verwendet. Die Eichkurve kann für die Bestimmung der Molmassen unbekannter Proben nur herangezogen werden, wenn die Bedingungen für die Trennung der Probe und der Standards 
identisch sind.
 
Ein fester Bezug zwischen der Molmasse und dem Elutionsvolumen 
ist nur unter den spezifischen Bedingungen des betreffenden Ver ­
suchs zulässig. Diese Bedingungen umfassen vor allem die Tempera ­
tur, das Lösungsmittel (oder die Lösungsmittelmischung), die chro ­
matografischen Bedingungen und die Trennsäule bzw. das Trenn ­
säulensystem.  
Bei den auf diese Weise ermittelten Molmassen der Probe handelt es 
sich um relative Werte, die als „polystyrol-äquivalente“ Molmasse 
bezeichnet werden. Das bedeutet, dass — in Abhängigkeit von den 
strukturellen und chemischen Unterschieden zwischen der Probe und den Standards — die Molmassen mehr oder weniger von den abso ­
luten Werten abweichen können. Werden andere Standards verwen ­
det, z. B. Polyethylenglykol, Polyethylenoxid, Polymethylmethacry ­
lat, Polyacrylsäure, so muss dies begründet werden.
 
1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Sowohl die Molmassenverteilung der Probe als auch die mittleren 
Molmassen (M  n , M  w ) können mit Hilfe der GPC bestimmt werden. 
Bei der GPC handelt es sich um eine besondere Form der Flüssig ­
chromatografie, bei der die Probe nach den hydrodynamischen Vo ­
lumina der einzelnen Bestandteile (2) aufgetrennt wird.  
Die Trennung erfolgt, indem die Probe durch eine Säule läuft, die 
mit einem porösen Material, in der Regel einem organischen Gel, gefüllt ist. Kleine Moleküle durchdringen die Poren, während große 
Moleküle ausgeschlossen werden. Der Weg der großen Moleküle ist 
daher kürzer, und folglich werden diese zuerst eluiert. Die Moleküle mittlerer Größe durchdringen einige der Poren und werden zu einem 
späteren Zeitpunkt eluiert. Die kleinsten Moleküle, mit einem durch ­
schnittlichen hydrodynamischen Radius, der kleiner ist als die Poren des Gels, können alle Poren durchdringen. Diese werden zuletzt eluiert.
 
Im Idealfall erfolgt die Trennung ausschließlich über die Größe der 
Moleküle, doch ist es in der Praxis schwierig, gewisse störende 
Absorptionseffekte zu vermeiden. Ungleichmäßige Säulenfüllungen und Totvolumen können zur weiteren Verschlechterung der Tren ­
nung führen (2).
 
Die Detektion erfolgt beispielsweise über den Brechungsindex oder 
die UV-Absorption und ergibt eine einfache Verteilungskurve. Um 
tatsächliche Molmassenwerte für die Kurve zu erhalten, ist es not ­
wendig, die Säule zu kalibrieren, indem Polymere mit bekannter Molmasse und idealerweise auch mit im großen und ganzen ver ­
gleichbarer Struktur, z. B. verschiedene Polystyrolstandards, auf 
diese Säule aufgegeben werden. In der Regel ergibt sich eine Gauß ­
sche Kurve, die manchmal durch einen kleinen Schwanz in Richtung der niedrigen Molmassen verzerrt ist; die vertikale Achse zeigt die 
Häufigkeit der verschiedenen eluierten Molmassenfraktionen, die ho ­
rizontale Achse log Molmasse.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 124
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Die Wiederholbarkeit (Relative Standardabweichung: RSA) für den 
Wert des Elutionsvolumens sollte besser als 0,3 % sein. Die gefor ­
derte Wiederholbarkeit der Analyse muss durch Korrektur mittels 
eines internen Standards gewährleistet sein, wenn ein Chromato ­
gramm zeitabhängig ausgewertet wird und nicht dem oben genannten Kriterium (1) entspricht. Die Polydispersitäten sind von den Molmas ­
sen der Standards abhängig. Für die Polystyrolstandards sind fol ­
gende Werte charakteristisch: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w/ /M n < 1,20  
(M p bezeichnet die Molmasse des Standards am Peakmaximum.)  
1.6. BESCHREIBUNG DER TESTMETHODE  
1.6.1.  Vorbereitung der Standardpolystyrollösungen  
Die Polystyrolstandards werden vorsichtig im gewählten Elutions ­
mittel gelöst. Die Empfehlungen des Herstellers müssen bei der Vor ­
bereitung der Lösungen berücksichtigt werden.  
Die Konzentrationen der gewählten Standards sind von verschiede ­
nen Faktoren abhängig, z. B. Injektionsvolumen, Viskosität der Lö ­
sung und Empfindlichkeit des analytischen Detektors. Das maximale 
Injektionsvolumen muss der Länge der Säule angepasst werden, um 
eine Überladung zu vermeiden. Normalerweise liegen die Injektions ­
volumina für analytische Trennungen mittels GPC durch eine Säule von 30 cm × 7,8 mm zwischen 40 und 100 μl. Größere Volumen 
sind möglich, doch sollten 250 μl nicht überschritten werden. Das 
optimale Verhältnis zwischen Injektionsvolumen und Konzentration muss vor der eigentlichen Kalibrierung der Säule bestimmt werden.
 
1.6.2.  Vorbereitung der Probelösung  
Im Prinzip gelten die zuvor genannten Anforderungen auch für die 
Vorbereitung der Probelösungen. Die Probe wird in einem geeig ­
neten Lösungsmittel, z. B. Tetrahydrofuran (THF), durch vorsichti ­
ges Schütteln gelöst. Das Polymer sollte unter keinen Umständen 
mittels Ultraschallbad gelöst werden. Wenn nötig, wird die Probelö ­
sung mit Hilfe eines Membranfilters mit einer Porengröße von 0,2 bis 2 μm gereinigt.
 
Die Anwesenheit ungelöster Partikel muss im Abschlußbericht do ­
kumentiert werden, da diese auf hohe Molmassenfraktionen zurück ­
zuführen sein könnte. Es sollte ein geeignetes Verfahren verwendet werden, um die Gewichtsanteile der ungelösten Partikel zu bestim ­
men. Die Lösung sollte innerhalb von 24 Stunden verbraucht wer ­
den.
 
1.6.3.  Apparatur  
— Lösungsmittelvorratsgefäß  
— Vorrichtung zum Entgasen (gegebenenfalls)  
— Pumpe  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 125
 
— Pulsationsdämpfer (gegebenenfalls)  
— Injektionssystem  
— Chromatografiesäulen  
— Detektor  
— Durchflussmesser (gegebenenfalls)  
— Datenaufzeichnungs-/-verarbeitungsgerät  
— Abfallbehältnis  
Es muss sichergestellt sein, dass das GPC-System gegenüber dem 
verwendeten Lösungsmittel inert ist (z. B. durch die Verwendung von Stahlkapillaren für das Lösungsmittel THF).
 
1.6.4.  Injektion und Lösungsmittelzugabesystem  
Auf die Säule wird eine bestimmte Menge der Probelösung, entwe ­
der automatisch oder manuell in einer scharf begrenzten Zone auf ­
gegeben. Ein zu schnelles Zurückziehen oder Drücken des Spritzen ­
kolbens (bei manueller Ausführung) kann Veränderungen in der be ­
obachteten Molmassenverteilung zur Folge haben. Die Lösungsmit ­
telzugabe sollte möglichst pulsationsfrei erfolgen, wobei idealerweise 
ein Pulsationsdämpfer eingesetzt wird. Die Durchflussgeschwindig ­
keit liegt in der Größenordnung von 1 ml/min.  
1.6.5.  Säule  
Je nach Art der Probe wird das Polymer durch Verwendung einer 
einfachen oder mehrerer in Reihe geschalteter Säulen charakterisiert. 
Im Handel ist eine Reihe poröser Säulenmaterialien mit definierten 
Eigenschaften (z. B. Porengröße, Ausschlussgrenzen) erhältlich. Die Wahl des Trenngels oder der Länge der Säule ist sowohl von den Eigenschaften der Probe (hydrodynamisches Volumen, Molmassen ­
verteilung) als auch von den spezifischen Bedingungen für die Tren ­
nung wie z. B. Lösungsmittel, Temperatur und Durchflussgeschwin ­
digkeit (1) (2) (3) abhängig.
 
1.6.6.  Theoretische Böden  
Die für die Trennung verwendete Säule bzw. Säulenkombination 
muss durch die Anzahl der theoretischen Böden charakterisiert sein. 
Dies umfasst (wenn THF als Elutionsmittel verwendet wird) die 
Aufgabe einer Lösung von Ethylenbenzol oder einer anderen geeig ­
neten nichtpolaren Substanz auf die Säule. Die Zahl der theoreti ­
schen Böden ergibt sich aus folgender Gleichung: 
N ¼ 5; 54 Í V e 
W 1=2 Î 2 
oder N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
Dabei ist:  
N = die Zahl der theoretischen Böden  
V e = das Elutionsvolumen am Peakmaximum  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 126
 
W = die Peakbreite an der Grundlinie  
W 1/2 = die Peakbreite in halber Höhe  
1.6.7.  Trennleistung  
Außer der Zahl der theoretischen Böden, die für die Bestimmung der 
Bandbreite notwendig ist, spielt auch die Trennleistung eine Rolle, 
die sich aus der Steilheit der Eichkurve ergibt. Die Trennleistung einer Säule wird aus folgender Beziehung abgeleitet:
 
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
Querschnittsfläche der Säule ≥ 6; 0 cm 3 
cm 2 " #  
Dabei ist:  
V e, M x = das Elutionsvolumen für Polystyrol mit der Molmasse 
M x 
V e,(10.M x) = das Elutionsvolumen für Polystyrol mit einer zehnmal 
größeren Molmasse  
Die Auflösung (R) des Systems wird allgemein wie folgt definiert:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
Dabei ist:  
V e1 , V e2 = die Elutionsvolumen der beiden Polystyrolstandards am 
Peakmaximum  
W 1 , W  2 = die Peakbreite an der Grundlinie  
M 1 , M  2 = die Molmassen am Peakmaximum (sollten um den 
Faktor 10 differieren)  
Der R-Wert für das Säulensystem sollte größer als 1,7 (4) sein.  
1.6.8.  Lösungsmittel  
Alle Lösungsmittel müssen von höchster Reinheit sein (T'HF wird in 
einer Reinheit von 99,5 % verwendet). Die Größe des Lösungsmittel ­
reservoirs (gegebenenfalls in einer Inertgasatmosphäre) muss für die Kalibrierung der Säule und mehrere Probenanalysen ausreichend 
sein. Das Lösungsmittel muss entgast werden, bevor es mit Hilfe 
der Pumpe auf die Säule aufgegeben wird.
 
1.6.9.  Temperaturkontrolle  
Die Temperatur von Injektionsschleife, Säulen, Detektor und Säulen ­
material sollte konstant und auf das gewählte Lösungsmittel abge ­
stimmt sein.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 127
 
1.6.10.  Detektor  
Der Detektor dient zur mengenmäßigen Erfassung der Konzentration 
der aus der Säule eluierten Probe. Um eine unnötige Verbreiterung der Peaks zu vermeiden, muss das Kuvettenvolumen der Detektor ­
zelle so klein wie möglich gehalten werden. Außer bei Lichtstreu ­
ungs- und Viskositätsdetektoren sollte es nicht mehr als 10 μl be­
tragen. Für die Detektion wird in der Regel die Differentialrefrakto ­
metrie eingesetzt. Wenn es die spezifischen Eigenschaften der Probe 
oder des Elutionsmittels erfordern, können auch andere Detektor ­
typen verwendet werden, z. B. UV/VIS-, IR-, Viskositätsdetektoren etc.
 
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
2.1. DATEN  
Im Hinblick auf die detaillierten Auswertungskriterien wie auch für 
die Anforderungen bezüglich Datenerfassung und -Verarbeitung 
sollte die DIN-Norm (1) angewendet werden.  
Für jede Probe müssen zwei unabhängige Versuche durchgeführt 
werden, die getrennt analysiert werden.  
M n , M  w , M  w /M n und M  p müssen für jede der Messungen bekannt 
sein. Es ist ausdrücklich darauf hinzuweisen, dass es sich bei den 
gemessenen Werten um Relativwerte handelt, die der Molmasse des verwendeten Standards äquivalent sind.
 
Nach der Bestimmung der Retentionsvolumina oder der Retentions ­
zeiten (u. U. mit Hilfe eines internen Standards korrigiert) werden 
die log M  p Werte (wobei M  p das Peakmaximum des Eichstandards 
ist) gegen eine dieser Größen aufgetragen. Mindestens zwei Eich ­
punkte sind pro Molmassendekade notwendig, und mindestens fünf Messpunkte sind für die Gesamtkurve erforderlich, durch die die 
geschätzte Molmasse der Probe erfasst werden soll. Der niedermole ­
kulare Endpunkt der Eichkurve wird durch n-Hexylbenzol oder eine andere geeignete nichtpolare Substanz definiert. Zahlenmittel und Gewichtsmittel der Molmasse werden im Allgemeinen mittels elek ­
tronischer Datenverarbeitung auf der Grundlage der in Abschnitt 1.2 
genannten Formeln ermittelt. Bei manueller Auswertung kann die ASTM D 3536-91 herangezogen werden (3).
 
Die Verteilungskurve muss in Form einer Tabelle oder als Abbildung 
(differentielle Häufigkeit oder Summenprozent gegen log M) dar ­
gestellt werden. Bei einer grafischen Darstellung sollte eine Molmas ­
sendekade in der Regel 4 cm breit sein, und das Peakmaximum sollte etwa 8 cm sein. Bei integralen Verteilungskurven sollte der 
Abstand auf der Ordinate zwischen 0 und 100 % bei ca. 10 cm 
liegen.
 
2.2. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten:  
2.2.1.  Prüfsubstanz  
— verfügbare Informationen über die Prüfsubstanz (Identität, Zu ­
satzstoffe, Verunreinigungen)  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 128
 
— Beschreibung der Probenbehandlung, Beobachtungen, Probleme  
2.2.2.  Instrumentierung  
— Reservoir des Elutionsmittels, Inertgas, Entgasung des Elutions ­
mittels, Zusammensetzung des Elutionsmittels, Verunreinigungen  
— Pumpe, Pulsationsdämpfer, Injektionssystem  
— Trennsäulen (Hersteller, alle Angaben zu den Säuleneigenschaf ­
ten, z. B. Porengröße, Art des Trennmaterials etc., Zahl, Länge und Anordnung der verwendeten Säulen)
 
— Zahl der theoretischen Böden der Säule (oder Säulenkombinati ­
on), Trennleistung (Auflösungsvermögen des Systems)  
— Angaben über die Peaksymmetrie  
— Säulentemperatur, Art der Temperaturkontrolle  
— Detektor (Messprinzip, Typ, Kuvettenvolumen)  
— gegebenenfalls Durchflussmesser (Hersteller, Messprinzip)  
— Datenaufzeichnungs- und -Verarbeitungssystem (Hardware und 
Software)  
2.2.3.  Systemkalibrierung  
— detaillierte Beschreibung des für die Erstellung der Eichkurve 
verwendeten Verfahrens  
— Angaben zu Qualitätskriterien dieses Verfahrens (z. B. Korrela ­
tionskoeffizient, Quadratsummenfehler usw.)  
— Angaben über alle Extrapolationen und Näherungen während des 
Versuchsablaufs sowie in der Auswertung und Verarbeitung der 
Daten  
— alle Messungen zur Erstellung der Eichkurve müssen in einer 
Tabelle dokumentiert sein, die für jeden Eichpunkt folgende An ­
gaben enthält:  
— Name der Probe,  
— Hersteller der Probe,  
— charakteristische Werte der Standards M  p , M  n , M  w , M  w /M n , 
wie sie vom Hersteller genannt oder aus Messungen abge ­
leitet wurden, sowie alle Einzelheiten zur Bestimmungs ­
methode,  
— Injektionsvolumen und Injektionskonzentration,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 129
 
— für die Kalibrierung verwendeter M  p -Wert,  
— am Peakmaximum gemessenes Elutionsvolumen oder kor ­
rigierte Retentionszeit,  
— M  p , berechnet am Peakmaximum,  
— prozentualer Fehler von berechneten M  p und Kalibrierwert 
M p. 
2.2.4.  Auswertung  
— Auswertung über die Zeit: verwendete Verfahren zur Gewähr ­
leistung der geforderten Reproduzierbarkeit (Korrekturverfahren, 
interner Standard etc.)  
— Angaben darüber, ob die Bewertung auf der Grundlage des Elu ­
tionsvolumens oder der Retentionszeit vorgenommen wurde  
— Angaben zu den Grenzen der Auswertung, wenn ein Peak nicht 
vollständig analysiert wurde  
— Beschreibung der Glättungsmethoden, falls verwendet  
— Vorbereitung und Vorbehandlung der Probe  
— Angaben zur Anwesenheit ungelöster Partikel, falls vorhanden  
— Injektionsvolumen ( μl) und Injektionskonzentration (mg/ml)  
— Beobachtungen von Effekten, die zu Abweichungen vom idealen 
GPC-Profil führen  
— ausführliche Beschreibung aller Änderungen im Prüfverfahren  
— Einzelheiten zu den Fehlerbereichen  
— alle weiteren Angaben und Beobachtungen, die für die Auswer ­
tung der Ergebnisse relevant sind.  
3. LITERATURHINWEISE  
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatografie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid 
Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Poly ­
styrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 130
 
Anlage  
Beispiele anderer Methoden zur Bestimmung der zahlengemittelten 
Molmasse (M  n ) von Polymeren  
Die Gelpermeationschromatografie (GPC) ist die bevorzugte Methode zur 
Bestimmung von M  n , insbesondere wenn eine Reihe von Standards zur Ver ­
fügung steht, deren Struktur mit der des Polymers vergleichbar ist. Wo jedoch 
praktische Schwierigkeiten beim Einsatz der GPC auftreten oder wo zu erwarten ist, dass kein korrekter Wert für M
 n erhalten wird (und was bestätigt werden 
soll), stehen Alternativen zur Verfügung, wie z. B.:  
1. Nutzung kolligativer Eigenschaften  
1.1. Ebullioskopie/Kryoskopie  
besteht in der Messung der Siedepunkterhöhung (Ebullioskopie) oder 
Gefrierpunkterniedrigung (Kryoskopie) eines Lösungsmittels, wenn das Polymer zugefügt wird. Die Methode beruht auf der Tatsache, dass der Siede-/Gefrierpunkt des Lösungsmittels von der Molmasse 
des gelösten Polymers abhängig ist (1) (2).
 
Anwendungsbereich: M  n < 20 000.  
1.2. Dampfdruckerniedrigung  
besteht in der Messung des Dampfdrucks einer gewählten Bezugs ­
flüssigkeit vor und nach der Zugabe einer bekannten Menge des 
Polymers (1) (2).  
Anwendungsbereich: M  n < 20 000 (theoretisch; in der Praxis jedoch 
nur von eingeschränktem Bedeutungswert).  
1.3. Membranosmometrie  
beruht auf dem Prinzip der Osmose, d. h. der natürlichen Tendenz 
von Lösungsmittelmolekülen, eine semipermeable Membran von ei ­
ner verdünnten in Richtung einer konzentrierten Lösung zu durch ­
dringen, um ein Gleichgewicht zu erreichen. In dem Test hat die verdünnte Lösung die Konzentration Null, während die konzentrierte 
Lösung das Polymer enthält. Die Wanderung des Lösungsmittels 
durch die Membran verursacht eine Druckdifferenz, die von der Konzentration und der Molmasse des Polymers (1) (3) (4) 
abhängig ist.
 
Anwendungsbereich: M  n < 20 000-200 000.  
1.4. Dampfphasen-Osmometrie  
besteht im Vergleich der Verdunstungsgeschwindigkeit eines reinen 
Lösungsmittelaerosols mit mindestens drei Aerosolen, die das Poly ­
mer in unterschiedlichen Konzentrationen (1) (5) (6) enthalten.  
Anwendungsbereich: M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 131
 
2. Endgruppen-Analyse  
Um diese Methode verwenden zu können, muss sowohl die Gesamt ­
struktur des Polymermoleküls als auch die Art der Endgruppe der Kette bekannt sein (die beispielsweise mittels NMR oder Titration/ ­
Derivatisierung vom Hauptgerüst unterschieden werden muss). Über 
die Endgruppenzahl kann die Molmasse des Polymers errechnet wer ­
den (7) (8) (9).
 
Anwendungsbereich: M  n bis zu 50 000 (mit abnehmender Zuverläs ­
sigkeit).  
Literaturhinweise  
(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd 
ed., John Wiley, New York.  
(2) Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. 
Kapitel 4. In: Polymer Molecular Weights, Teil I, P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.
 
(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Mem ­
brane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 
(4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, 25-52.  
(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure. Ame ­
rican Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsyl ­
vania.  
(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: 
Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.
 
(7) Schröder, E., Müller, G, und Arndt, K.-F., (1989). Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, München.  
(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, 
Kapitel 3. In: Polymer Molecular Weights, Teil I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.
 
(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139- 
2146.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 132
 
A.19.  NIEDERMOLEKULARER ANTEIL VON POLYMEREN  
1. METHODE  
Diese gelpermeationschromatografische Methode entspricht der 
OECD TG 119 (1996). Die wichtigsten Grundsätze und weitere 
technische Informationen werden in den Literaturhinweisen (1) ge ­
nannt.  
1.1. EINLEITUNG  
Da die Eigenschaften von Polymeren so unterschiedlich sind, ist es 
unmöglich, nur eine einzige Methode zu nennen, die alle Bedingun ­
gen für die Trennung und Auswertung erfüllt und somit sämtliche 
Eventualitäten und Besonderheiten bei der Trennung von Polymeren berücksichtigt. Insbesondere für komplexe polymere Systeme ist die Gelpermeationschromatografie (GPC) häufig nicht geeignet. Wenn 
die GPC nicht anwendbar ist, kann die Molmasse mit Hilfe anderer 
Methoden bestimmt werden (siehe Anlage). In solchen Fällen muss die verwendete Methode in allen Einzelheiten beschrieben und die Gründe für deren Verwendung genannt werden.
 
Die beschriebene Methode beruht auf DIN-Norm 55672 (1). Diese 
Norm enthält ausführliche Informationen darüber, wie die Versuche 
durchgeführt und wie die Daten ausgewertet werden müssen. Wenn Änderungen der Versuchsbedingungen notwendig sein sollten, müs ­
sen diese Änderungen begründet werden. Es können andere Normen 
herangezogen werden, diese müssen jedoch belegt werden. Im be ­
schriebenen Verfahren werden Polystyrolproben bekannter Polydis ­
persität zur Kalibrierung verwendet; es kann jedoch vorkommen, dass das Verfahren für bestimmte Polymere, z. B. wasserlösliche 
und langkettige, verzweigte Polymere, angepasst werden muss.
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Der niedermolekulare Anteil wird willkürlich auf unter 1 000 Dalton 
festgelegt.  
Die zahlengemittelte Molmasse M  n und die gewichtsgemittelte Mol ­
masse M  w werden anhand folgender Gleichungen bestimmt: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i ÜM i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
Dabei ist:  
H i = die Höhe des Detektorsignals von der Grundlinie für das 
Retentionsvolumen V  i 
M i , = die Molmasse der Polymerfraktion bei dem Retentionsvolu ­
men V  i 
n = die Zahl der Datenpunkte  
Die Breite der Molmassenverteilung, die ein Maß für die Dispersität 
des Systems ist, wird durch das Verhältnis M  w /M n ausgedrückt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 133
 
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Da es sich bei der GPC um eine relative Methode handelt, muss eine 
Kalibrierung vorgenommen werden. Hierzu werden in der Regel eng verteilte, linear aufgebaute Polystyrolstandards mit bekannten mitt ­
leren Molmassen M
 n und M  w und einer bekannten Molmassenver ­
teilung verwendet. Die Eichkurve kann für die Bestimmung der Molmassen unbekannter Proben nur herangezogen werden, wenn die Bedingungen für die Trennung der Probe und der Standards 
identisch sind.
 
Ein fester Bezug zwischen der Molmasse und dem Elutionsvolumen 
ist nur unter den spezifischen Bedingungen des betreffenden Ver ­
suchs zulässig. Diese Bedingungen umfassen vor allem die Tempera ­
tur, das Lösungsmittel (oder die Lösungsmittelmischung), die chro ­
matografischen Bedingungen und die Trennsäule bzw. das Trenn ­
säulensystem.  
Bei den auf diese Weise ermittelten Molmassen der Probe handelt es 
sich um relative Werte, die als „polystyrol-äquivalente Molmasse“ 
bezeichnet werden. Das bedeutet, dass — in Abhängigkeit von den 
strukturellen und chemischen Unterschieden zwischen der Probe und den Standards — die Molmassen mehr oder weniger von den abso ­
luten Werten abweichen können. Werden andere Standards verwen ­
det, z. B. Polyethylenglykol, Polyethylenoxid, Polymethylmethacry ­
lat, Polyacrylsäure, so muss dies begründet werden.
 
1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Sowohl die Molmassenverteilung der Probe als auch die mittleren 
Molmassen (M  n , M  w ) können mit Hilfe der GPC bestimmt werden. 
Bei der GPC handelt es sich um eine besondere Form der Flüssig ­
chromatografie, bei der die Probe nach den hydrodynamischen Vo ­
lumina der einzelnen Bestandteile (2) aufgetrennt wird.  
Die Trennung erfolgt, indem die Probe durch eine Säule läuft, die 
mit einem porösen Material, in der Regel einem organischen Gel, gefüllt ist. Kleine Moleküle durchdringen die Poren, während große 
Moleküle ausgeschlossen werden. Der Weg der großen Moleküle ist 
daher kürzer, und folglich werden diese zuerst eluiert. Die Moleküle mittlerer Größe durchdringen einige der Poren und werden zu einem 
späteren Zeitpunkt eluiert. Die kleinsten Moleküle, mit einem durch ­
schnittlichen hydrodynamischen Radius, der kleiner ist als die Poren des Gels, können alle Poren durchdringen. Diese werden zuletzt eluiert.
 
Im Idealfall erfolgt die Trennung ausschließlich über die Größe der 
Moleküle, doch ist es in der Praxis schwierig, gewisse störende 
Absorptionseffekte zu vermeiden. Ungleichmäßige Säulenfüllungen und Totvolumen können zur weiteren Verschlechterung der Tren ­
nung führen (2).
 
Die Detektion erfolgt beispielsweise über den Brechungsindex oder 
die UV-Absorption und ergibt eine einfache Verteilungskurve. Um 
tatsächliche Molmassenwerte für die Kurve zu erhalten, ist es not ­
wendig, die Säule zu kalibrieren, indem Polymere mit bekannter Molmasse sowie idealerweise auch mit im Großen und Ganzen ver ­
gleichbarer Struktur, z. B. verschiedene Polystyrolstandards, auf 
diese Säule aufgegeben werden. In der Regel ergibt sich eine Gauß ­
sche Kurve, die gelegentlich durch einen kleinen Schwanz in Rich ­
tung der niedrigen Molmassen verzerrt ist; die vertikale Achse zeigt 
die Häufigkeit der verschiedenen eluierten Molmassenfraktionen, die 
horizontale Achse log Molmasse.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 134
 
Der niedermolekulare Anteil wird aus dieser Kurve abgeleitet. Die 
Berechnung kann nur dann genau sein, wenn die niedermolekularen 
Fraktionen in Bezug auf die Masse äquivalent zum Polymer als Ganzes sind.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Die Wiederholbarkeit (Relative Standardabweichung: RSA) für den 
Wert des Elutionsvolumens sollte besser als 0,3 % sein. Die gefor ­
derte Wiederholbarkeit der Analyse muss durch Korrektur mittels eines internen Standards gewährleistet sein, wenn ein Chromato ­
gramm zeitabhängig ausgewertet wird und nicht dem oben genannten 
Kriterium (1) entspricht. Die Polydispersitäten sind von den Molmas ­
sen der Standards abhängig. Für die Polystyrolstandards sind fol ­
gende Werte charakteristisch: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p bezeichnet die Molmasse des Standards am Peakmaximum)  
1.6. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.6.1.  Vorbereitung der Standardpolystyrollösungen  
Die Polystyrolstandards werden vorsichtig im gewählten Elutions ­
mittel gelöst. Die Empfehlungen des Herstellers müssen bei der Vor ­
bereitung der Lösungen berücksichtigt werden.  
Die Konzentrationen der gewählten Standards sind von verschiedenen 
Faktoren abhängig, z. B. Injektionsvolumen, Viskosität der Lösung und Empfindlichkeit des analytischen Detektors. Das maximale Injektions ­
volumen muss der Länge der Säule angepasst werden, um eine Über ­
beladung zu vermeiden. Normalerweise liegen die Injektionsvolumina 
für analytische Trennungen mittels GPC durch eine Säule von 30 cm × 7,8 mm zwischen 40 und 100 μl. Größere Volumen sind möglich, doch 
sollten 250 μl nicht überschritten werden. Das optimale Verhältnis zwi ­
schen Injektionsvolumen und Konzentration muss vor der eigentlichen 
Kalibrierung der Säule bestimmt werden.
 
1.6.2.  Vorbereitung der Probelösung  
Im Prinzip gelten die zuvor genannten Anforderungen auch für die 
Vorbereitung der Probelösungen. Die Probe wird in einem geeig ­
neten Lösungsmittel, z. B. Tetrahydrofuran (THF), durch vorsichti ­
ges Schütteln gelöst. Die Lösung sollte unter keinen Umständen 
mittels Ultraschallbad gelöst werden. Wenn nötig, wird die Probelö ­
sung mit Hilfe eines Membranfilters mit einer Porengröße von 0,2 bis 2 μm gereinigt.
 
Die Anwesenheit ungelöster Partikel muss im Abschlussbericht doku ­
mentiert werden, da diese auf hohe Molmassenfraktionen zurückzufüh ­
ren sein könnte. Es sollte ein geeignetes Verfahren verwendet werden, 
um die Gewichtsanteile der ungelösten Partikel zu bestimmen. Die Lö ­
sung sollte innerhalb von 24 Stunden verbraucht werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 135
 
1.6.3.  Berichtigungen aufgrund von Verunreinigungen und 
Zusatzstoffen  
Die Korrektur des Gehalts an Fraktionen mit M < 1 000 aufgrund 
bestimmter vorhandener nichtpolymerer Komponenten (z. B. Ver ­
unreinigungen und/oder Zusatzstoffe) ist in der Regel notwendig, 
sofern der gemessene Gehalt nicht bereits < 1 % ist. Dies wird durch die direkte Analyse der Polymerlösung oder des GPC-Eluats erreicht.
 
Wenn das Eluat nach Durchlaufen der Säule für eine weitere Analyse 
zu verdünnt ist, muss es konzentriert werden. Es kann u. U. erfor ­
derlich sein, das Eluat bis zur Trocknung einzudampfen und den Rückstand neu aufzulösen. Die Konzentrierung des Eluats muss un ­
ter Bedingungen erfolgen, die sicherstellen, dass im Eluat keine Ver ­
änderungen auftreten. Die Behandlung des Eluats nach der GPC ist 
abhängig davon, welches analytische Verfahren für die quantitative Bestimmung eingesetzt wird.
 
1.6.4.  Apparatur  
Die GPC-Apparatur besteht aus folgenden Komponenten:  
— Lösungsmittelvorratsgefäß,  
— Vorrichtung zum Entgasen (gegebenenfalls),  
— Pumpe,  
— Pulsationsdämpfer (gegebenenfalls),  
— Injektionssystem,  
— Chromatografiesäulen,  
— Detektor,  
— Durchflussmesser (gegebenenfalls),  
— Datenaufzeichnungs-/-verarbeitungsgerät,  
— Abfallbehältnis.  
Es muss sichergestellt sein, dass das GPC-System gegenüber dem 
verwendeten Lösungsmittel inert ist (z. B. durch die Verwendung von Stahlkapillaren für das Lösungsmittel THF).
 
1.6.5.  Injektion und Lösungsmittelzugabesystem  
Auf die Säule wird eine bestimmte Menge der Probelösung, entwe ­
der automatisch oder manuell in einer scharf begrenzten Zone auf ­
gegeben. Ein zu schnelles Zurückziehen oder Drücken des Spritzen ­
kolbens (bei manueller Ausführung) kann Veränderungen in der be ­
obachteten Molmassenverteilung zur Folge haben. Die Lösungsmit ­
telzugabe sollte möglichst pulsationsfrei sein, wobei idealerweise ein 
Pulsationsdämpfer eingesetzt wird. Die Durchflussgeschwindigkeit 
liegt in der Größenordnung von 1 ml/min.  
1.6.6.  Säule  
Je nach Art der Probe wird das Polymer durch Verwendung einer 
einfachen oder mehrerer in Reihe geschalteter Säulen charakterisiert. Im Handel ist eine Reihe poröser Säulenmaterialien mit definierten 
Eigenschaften (z. B. Porengröße, Ausschlussgrenzen) erhältlich. Die 
Wahl des Trenngels oder der Länge der Säule ist sowohl von den Eigenschaften der Probe (hydrodynamisches Volumen, Molmassen ­
verteilung) als auch von den spezifischen Bedingungen für die Tren ­
nung wie z. B. Lösungsmittel, Temperatur und Durchflussgeschwin ­
digkeit (1) (2) (3) abhängig.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 136
 
1.6.7.  Theoretische Böden  
Die für die Trennung verwendete Säule bzw. Säulenkombination 
muss durch die Anzahl der theoretischen Böden charakterisiert sein. Dies umfasst (wenn THF als Elutionsmittel verwendet wird) die 
Aufgabe einer Lösung von Ethylenbenzol oder einer anderen geeig ­
neten nichtpolaren Substanz auf die Säule. Die Zahl der theoreti ­
schen Böden ergibt sich aus folgender Gleichung: 
N ¼ 5; 54 Í
 V e 
W 1=2 Î 2 
oder N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
Dabei ist:  
N = die Zahl der theoretischen Böden  
V e = das Elutionsvolumen am Peakmaximum  
W = die Peakbreite an der Grundlinie  
W 1/2 = die Peakbreite in halber Höhe  
1.6.8.  Trennleistung  
Außer der Zahl der theoretischen Böden, die für die Bestimmung der 
Bandbreite notwendig ist, spielt auch die Trennleistung eine Rolle, die sich aus der Steilheit der Eichkurve ergibt. Die Trennleistung 
einer Säule wird aus folgender Beziehung abgeleitet:
 
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
Querschnittsfläche der Säule ≥ 6; 0 cm 3 
cm 2 " #  
Dabei ist:  
V e, M x = das Elutionsvolumen für Polystyrol mit der Molmasse 
M x 
V e,(10.M x) = das Elutionsvolumen für Polystyrol mit einer zehnmal 
größeren Molmasse  
Die Auflösung (R) des Systems wird allgemein wie folgt definiert:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
Dabei ist:  
V e1 , V e2 = die Elutionsvolumen der beiden Polystyrolstandards am 
Peakmaximum  
W 1 , W  2 = die Peakbreite an der Grundlinie  
M 1 , M  2 = die Molmassen am Peakmaximum (sollten um den 
Faktor 10 differieren)  
Der R-Wert für das Säulensystem sollte größer als 1,7 (4) sein.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 137
 
1.6.9.  Lösungsmittel  
Alle Lösungsmittel müssen von höchster Reinheit sein (THF wird in 
einer Reinheit von 99,5 % verwendet). Die Größe des Lösungsmittel ­
reservoirs (gegebenenfalls in einer Inertgasatmosphäre) muss für die 
Kalibrierung der Säule und mehrere Probenanalysen ausreichend 
sein. Das Lösungsmittel muss entgast werden, bevor es mit Hilfe der Pumpe auf die Säule aufgegeben wird.
 
1.6.10.  Temperaturkontrolle  
Die Temperatur von Injektionsschleife, Säulen, Detektor und Säulen ­
material sollte konstant und auf das gewählte Lösungsmittel abge ­
stimmt sein.  
1.6.11.  Detektor  
Der Detektor dient zur mengenmäßigen Erfassung der Konzentration 
der aus der Säule eluierten Probe. Um eine unnötige Verbreiterung der Peaks zu vermeiden, muss das Kuvettenvolumen der Detektor ­
zelle so klein wie möglich gehalten werden. Außer bei Lichtstreu ­
ungs- und Viskositätsdetektoren sollte es nicht mehr als 10 μl be­
tragen. Für die Detektion wird in der Regel die Differentialrefrakto ­
metrie eingesetzt. Wenn es die spezifischen Eigenschaften der Probe 
oder des Elutionsmittels erfordern, können auch andere Detektor ­
typen verwendet werden, z. B. UV/VIS-, IR-, Viskositätsdetektoren usw.
 
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
2.1. DATEN  
Im Hinblick auf die detaillierten Auswertungskriterien wie auch für 
die Anforderungen bezüglich Datenerfassung und -Verarbeitung sollte die DIN-Norm (1) angewendet werden.
 
Für jede Probe müssen zwei unabhängige Versuche durchgeführt 
werden, die getrennt analysiert werden. Ferner ist es absolut un ­
erlässlich, auch Daten aus Blindproben zu ermitteln, die unter den 
gleichen Bedingungen getestet werden wie die Probe.  
Es ist ausdrücklich darauf hinzuweisen, dass es sich bei den gemes ­
senen Werten um Relativwerte handelt, die der Molmasse des ver ­
wendeten Standards äquivalent sind.  
Nach der Bestimmung der Retentionsvolumina oder der Retentions ­
zeiten (u. U. mit Hilfe eines internen Standards korrigiert) werden die log M
 p Werte (wobei M  p das Peakmaximum des Eichstandards 
ist) gegen eine dieser Größen aufgetragen. Mindestens zwei Eich ­
punkte sind pro Molmassendekade notwendig, und mindestens fünf Messpunkte sind für die Gesamtkurve erforderlich, durch die die geschätzte Molmasse der Probe erfasst werden soll. Der niedermole ­
kulare Endpunkt der Eichkurve wird durch n-Hexylbenzol oder eine 
andere geeignete nichtpolare Substanz definiert. Zahlenmittel und Gewichtsmittel der Molmasse werden im Allgemeinen mittels elek ­
tronischer Datenverarbeitung auf der Grundlage der in Abschnitt 1.2 
genannten Formeln ermittelt. Bei manueller Auswertung kann die 
ASTM D 3536-91 herangezogen werden (3).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 138
 
Wenn unlösliche Polymeranteile in der Säule zurückgehalten werden, 
ist ihre Molmasse wahrscheinlich höher als die der löslichen Frakti ­
on. Wird dies nicht berücksichtigt, kann der niedermolekulare Anteil zu hoch eingeschätzt werden; in der Anlage ist beschrieben, wie der unlösliche Polymeranteil berücksichtigt werden kann.
 
Die Verteilungskurve muss in Form einer Tabelle oder als Zahl 
(differentielle Häufigkeit oder Summenprozent gegen log M) dar ­
gestellt werden. Bei der grafischen Darstellung sollte eine Molmas ­
sendekade in der Regel 4 cm breit sein, und das Peakmaximum sollte etwa 8 cm sein. Bei integralen Verteilungskurven sollte der Abstand auf der Ordinate zwischen 0 und 100 % ca. 10 cm betragen.
 
2.2. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten:  
2.2.1.  Prüfsubstanz  
— Verfügbare Informationen über die Prüfsubstanz (Identität, Zu ­
satzstoffe, Verunreinigungen)  
— Beschreibung der Probenbehandlung, Beobachtungen, Probleme  
2.2.2.  Instrumentierung  
— Reservoir des Elutionsmittels, Inertgas, Entgasung des Elutions ­
mittels, Zusammensetzung des Elutionsmittels, Verunreinigungen  
— Pumpe, Pulsationsdämpfer, Injektionssystem  
— Trennsäulen (Hersteller, alle Angaben zu den Säuleneigenschaf ­
ten, z. B. Porengröße, Art des Trennmaterials etc., Zahl, Länge 
und Anordnung der verwendeten Säulen)  
— Zahl der theoretischen Böden der Säule (oder Säulenkombinati ­
on), Trennleistung (Auflösungsvermögen des Systems)  
— Angaben über die Peaksymmetrie  
— Säulentemperatur, Art der Temperaturkontrolle  
— Detektor (Messprinzip, Typ, Kuvettenvolumen)  
— gegebenenfalls Durchflussmesser (Hersteller, Messprinzip)  
— Datenaufzeichnungs- und -Verarbeitungssystem (Hardware und 
Software)  
2.2.3.  Systemkalibrierung  
— Detaillierte Beschreibung des für die Erstellung der Eichkurve 
verwendeten Verfahrens  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 139
 
— Angaben zu Qualitätskriterien dieses Verfahrens (z. B. Korrela ­
tionskoeffizient, Quadratsummenfehler usw.)  
— Angaben über alle Extrapolationen und Näherungen während des 
Versuchsablaufs sowie in der Auswertung und Verarbeitung der Daten
 
— Alle Messungen zur Erstellung der Eichkurve müssen in einer 
Tabelle dokumentiert sein, die für jeden Eichpunkt folgende An ­
gaben enthält:  
— Name der Probe,  
— Hersteller der Probe,  
— charakteristische Werte der Standards M  p , M  n , M  w , M  w /M n , 
wie sie vom Hersteller genannt oder aus Messungen abge ­
leitet wurden, sowie alle Einzelheiten zur Bestimmungs ­
methode,  
— Injektionsvolumen und Injektionskonzentration,  
— für die Kalibrierung verwendeter M  p -Wert,  
— am Peakmaximum gemessenes Elutionsvolumen oder kor ­
rigierte Retentionszeit,  
— M  p , berechnet am Peakmaximum,  
— prozentualer Fehler vom berechneten M  p und Kalibrier ­
wert M  p . 
2.2.4.  Angaben zum niedermolekularen Anteil  
— Beschreibung der für die Analyse verwendeten Methoden sowie 
der Art und Weise, wie die Versuche durchgeführt wurden  
— Angaben zu dem prozentuellen Anteil der niedermolekularen 
Fraktionen (w/w) im Verhältnis zur Gesamtprobe  
— Angaben zu Verunreinigungen, Zusatzstoffen und anderen nicht ­
polymeren Fraktionen ( % w/w) im Verhältnis zur Gesamtprobe  
2.2.5.  Auswertung  
— Auswertung über die Zeit: verwendete Verfahren zur Gewähr ­
leistung der geforderten Reproduzierbarkeit (Berichtigungsverfah ­
ren, interner Standard usw.)  
— Angaben darüber, ob die Bewertung auf der Grundlage des Elu ­
tionsvolumens oder der Retentionszeit vorgenommen wurde  
— Angaben zu den Grenzen der Auswertung, wenn ein Peak nicht 
vollständig analysiert wurde  
— Beschreibung der Glättungsmethoden, falls verwendet  
— Vorbereitung und Vorbehandlung der Probe  
— Angaben zur Anwesenheit ungelöster Partikel, falls vorhanden  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 140
 
— Injektionsvolumen ( μl) und Injektionskonzentration (mg/ml)  
— Beobachtungen von Effekten, die zu Abweichungen vom idealen 
GPC-Profil führen  
— Ausführliche Beschreibung aller Änderungen im Prüfverfahren  
— Einzelheiten zu den Fehlerbereichen  
— Alle weiteren Angaben und Beobachtungen, die für die Auswer ­
tung der Ergebnisse relevant sind  
3. LITERATURHINWEISE  
(1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatografie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography 
— GPC). American Society for Testing and Materials, Philadel ­
phia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Poly ­
styrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 141
 
Anlage  
Korrektur des niedermolekularen Anteils um unlösliche Polymerfraktionen  
Sind unlösliche Polymeranteile in einer Probe vorhanden, so führt dies zu Masse ­
verlusten während der GPC-Analyse. Das unlösliche Polymer kann an der Säule bzw. im Probenfilter zurückgehalten werden, während der lösliche Teil der Probe 
die Säule durchläuft. Wenn das Brechungsindexinkrement (dn/dc) des Polymers 
geschätzt oder gemessen werden kann, kann auch der Masseverlust der Probe in der Säule abgeschätzt werden. In diesem Fall wird eine Korrektur anhand einer externen Kalibrierung mit Standardmaterialien bekannter Konzentration und be ­
kanntem dn/dc zur Eichung des Refraktometers vorgenommen. In dem folgenden 
Beispiel wird ein Polymethylmethacrylat (pMMA)-Standard verwendet.
 
Bei der externen Kalibrierung zur Analyse von Acrylpolymeren wird ein pMMA- 
Standard bekannter Konzentration in Tetrahydrofuran mittels GPC untersucht; die sich daraus ergebenden Daten dienen der Ermittlung der Refraktometerkonstanten 
mit folgender Gleichung:
 
K = R/(C × V × dn/dc)  
Dabei ist:  
K = die Refraktometerkonstante (in Mikrovoltsekunde/ml)  
R = die Messgröße für den pMMA-Standard (in Mikrovoltsekunde)  
C = die Konzentration des pMMA-Standards (in mg/ml)  
V = das Injektionsvolumen (in ml)  
dn/dc = das Brechungsindexinkrement für pMMA in Tetrahydrofuran (in ml/ ­
mg) 
Die folgenden Daten sind für einen pMMA-Standard charakteristisch:  
R = 2 937 891  
C = 1,07 mg/ml  
V = 0,1 ml  
dn/ac = 9 × 10  -5 ml/mg.  
Der sich daraus ergebende Wert K = 3,05 × 10  11 wird dann zur Berechnung des 
theoretischen Detektorsignals herangezogen, wenn 100 % des injizierten Poly ­
mers den Detektor passiert haben.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 142
 
A.20.  LÖSUNGS-/EXTRAKTIONSVERHALTEN VON POLYMEREN 
IN WASSER  
1. METHODE  
Die beschriebene Methode entspricht der geänderten Fassung der 
OECD TG 120 (1997). Weitere technische Informationen werden 
in den Literaturhinweisen (1) gegeben.  
1.1. EINLEITUNG  
Bestimmte Polymere, wie z. B. Emulsionspolymere, müssen eventu ­
ell vorbehandelt werden, bevor die nachstehend beschriebene Me ­
thode verwendet werden kann. Die Methode ist nicht anwendbar 
für flüssige Polymere und Polymere, die unter den Testbedingungen 
mit Wasser reagieren.  
Wenn die Methode nicht praktikabel oder nicht möglich ist, sollte 
das Lösungs-/Extraktionsverhalten mittels anderer Methoden unter ­
sucht werden. In diesem Fall muss die verwendete Methode in allen 
Einzelheiten beschrieben und ihre Verwendung begründet werden.  
1.2. REFERENZSUBSTANZEN  
Keine.  
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Das Lösungs-/Extraktionsverhalten von Polymeren in einem wäss ­
rigen Medium wird mit Hilfe der Kolbenmethode ermittelt (siehe A.6 Wasserlöslichkeit, Kolbenmethode), wobei die unten beschriebe ­
nen Änderungen vorgenommen wurden.
 
1.4. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.5. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.5.1.  Ausstattung  
Für die Durchführung der Methode ist folgende Ausstattung erfor ­
derlich:  
— Zerkleinerungsgerät, z. B. Mühle zur Herstellung von Partikeln 
bekannter Größe,  
— Schüttelgerät mit der Möglichkeit zur Temperaturkontrolle,  
— Membranfiltersystem,  
— geeignete Analysegeräte,  
— genormte Siebe.  
1.5.2.  Probenvorbereitung  
Eine repräsentative Probe muss zunächst mit Hilfe geeigneter Siebe 
auf eine Partikelgröße zwischen 0,125 und 0,25 mm reduziert wer ­
den. Für die Stabilität der Probe oder für den Zerkleinerungsprozess kann dazu u. U. eine Kühlung erforderlich sein. Gummiartige Ma ­
terialien können bei der Temperatur von Flüssigstickstoff (1) zer ­
kleinert werden.
 
Wenn die erforderliche Partikelgrößenfraktion nicht erreicht werden 
kann, sollten Maßnahmen ergriffen werden, um die Partikelgröße so weit wie möglich zu reduzieren; die Ergebnisse sollten dokumentiert 
werden. Im Bericht muss festgehalten werden, wie die zerkleinerte 
Probe vor dem Test aufbewahrt wurde.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 143
 
1.5.3.  Verfahren  
Je 10 g Prüfsubstanz werden in drei mit einem Glasstopfen ver ­
sehene Gefäße gegeben; jedes Gefäß wird mit 1 000 ml Wasser aufgefüllt. Wenn sich eine Polymermenge von 10 g als unpraktikabel 
erweist, sollte die nächstgrößere Menge, die verarbeitet werden kann, 
eingesetzt und mit Wasser entsprechend aufgefüllt werden.
 
Die Gefäße werden fest verschlossen und dann bei 20  o C geschüttelt. 
Es sollte ein Schüttel- oder Rührgerät verwendet werden, das bei einer konstanten Temperatur arbeitet. Nach 24 Stunden wird der 
Inhalt eines jeden Gefäßes zentrifugiert oder filtriert und die Poly ­
merkonzentration in der klaren wässrigen Phase mit Hilfe eines ge ­
eigneten analytischen Verfahrens bestimmt. Sollten keine geeigneten analytischen Verfahren für die wässrige Phase zur Verfügung stehen, 
kann die Gesamtlöslichkeit/-extrahierbarkeit anhand der Trocken ­
masse des Filterrückstands oder des zentrifugierten Niederschlags abgeschätzt werden.
 
Es ist in der Regel notwendig, quantitativ zwischen Verunreinigun ­
gen und Zusatzstoffen einerseits und den niedermolekularen Fraktio ­
nen andererseits zu differenzieren. Im Fall einer gravimetrischen Be ­
stimmung ist es ferner wichtig, eine Blindprobe durchzuführen, in 
der keine Prüfsubstanz eingesetzt wird, um Rückstände aus dem Versuchsverfahren zu berücksichtigen.
 
Das Lösungs-/Extraktionsverhalten von Polymeren in Wasser bei 
37 o C bei pH-Werten von 2 und 9 kann auf gleiche Weise bestimmt 
werden wie für die Untersuchung bei 20  o C beschrieben. Die pH- 
Werte können entweder durch Zugabe einer geeigneten Pufferlösung 
oder entsprechender Säuren bzw. Basen wie z. B. Salzsäure, Essig ­
säure, Natrium- oder Kaliumhydroxid oder NH  3 p. a. erreicht 
werden.  
In Abhängigkeit von der eingesetzten Analysemethode sollten ein 
oder zwei Tests durchgeführt werden. Wenn hinreichend genaue 
Methoden zur direkten Analyse der wässrigen Phase der Polymer ­
komponente zur Verfügung stehen, sollte ein Test (wie oben be ­
schrieben) ausreichen. Wenn solche Methoden jedoch nicht verfüg ­
bar sind und die Bestimmung des Lösungs-/Extraktionsverhaltens 
des Polymers auf indirekte Analysen beschränkt ist, bei denen ledig ­
lich der gesamte organische Kohlenstoff (TOC) des wässrigen Ex ­
trakts bestimmt wird, sollte ein zusätzlicher Test durchgeführt wer ­
den. Dieser zusätzliche Test sollte ebenfalls dreimal durchgeführt 
werden, wobei zehnmal kleinere Polymerproben und die gleichen Mengen Wasser wie im ersten Test verwendet werden.
 
1.5.4.  Analyse  
1.5.4.1.  Test mit einer Probengröße  
Es ist möglich, dass Methoden für die direkte Analyse von Poly ­
merkomponenten in der wässrigen Phase zur Verfügung stehen. Al ­
ternativ können auch indirekte Analysen der gelösten/extrahierten 
Polymerkomponenten durchgeführt werden, in denen der Gesamt ­
gehalt der löslichen Anteile bestimmt und eine Berichtigung um nichtpolymerspezifische Bestandteile vorgenommen wird.
 
Eine Analyse der wässrigen Phase für das gesamte Polymer ist 
möglich entweder durch ein hinreichend empfindliches Verfahren, 
wie z. B.  
— TOC unter Verwendung eines Peroxosulfat- oder Dichromatauf ­
schlusses zur Darstellung von CO  2 und einer IR-Analyse oder 
chemischen Analyse,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 144
 
— Atomabsorptionsspektrometrie (AAS) oder das ICP-Emissions ­
äquivalent (Inductively Coupled Plasma) für silizium- oder me ­
tallhaltige Polymere,  
— UV-Absorption der Spektrofluorimetrie für Arylpolymere,  
— LC-MS für Proben mit geringer niedriger Molmasse,  
oder durch Eindampfen des wässrigen Extrakts im Vakuum und 
Analyse des Rückstands mit Hilfe der Spektroskopie (IR, UV usw.) 
oder AAS/ICP.  
Wenn eine Analyse der wässrigen Phase als solche nicht praktikabel 
ist, sollte der wässrige Extrakt mittels eines nicht mit Wasser misch ­
baren organischen Lösungsmittels, z. B. einem chlorierten Kohlen ­
wasserstoff, extrahiert werden. Das Lösungsmittel wird anschließend 
abgezogen, der Rückstand wird (wie oben für den Polymergehalt 
beschrieben) analysiert. Alle Bestandteile dieses Rückstands, die als Verunreinigungen oder Zusatzstoffe identifiziert werden, müssen für die Bestimmung des Lösungs-/Extraktionsgrades des Polymers 
subtrahiert werden.
 
Wenn relativ große Mengen solcher Stoffe vorhanden sind, kann es 
u. U. notwendig sein, den Rückstand beispielsweise einer HPLC- 
oder GC-Analyse zu unterwerfen, um die Verunreinigungen von 
den vorhandenen Monomeren bzw. Monomerderivaten zu unter ­
scheiden, um deren tatsächlichen Gehalt zu bestimmen.  
In einigen Fällen ist es u. U. ausreichend, das organische Lösungs ­
mittel abzuziehen und den trockenen Rückstand auszuwiegen.  
1.5.4.2.  Test mit zwei unterschiedlichen Probengrößen  
Alle wässrigen Extrakte werden auf ihren TOC analysiert.  
An dem nichtgelösten/nichtextrahierten Teil einer Probe wird eine 
gravimetrische Analyse durchgeführt. Wenn nach der Zentrifugation oder Filtration noch Polymerablagerungen an den Wänden des Ge ­
fäßes zu finden sind, sollte das Gefäß so lange mit dem Filtrat 
gespült werden, bis es frei von allen sichtbaren Rückständen ist. Im Anschluss wird das Filtrat erneut zentrifugiert oder filtriert. Die auf dem Filter oder im Zentrifugenglas verbliebenen Rückstände 
werden bei 40
 o C im Vakuum getrocknet und gewogen. Die Trock ­
nung wird fortgesetzt, bis ein konstantes Gewicht erzielt wurde.  
2. DATEN  
2.1. TEST MIT EINER PROBENGRÖSSE  
Die einzelnen Ergebnisse für die drei Kolben und die Durchschnitts ­
werte sollten in Masseeinheiten pro Lösungsvolumen (mg/1) bzw. Masseeinheiten pro Masse der Polymerprobe (mg/g) angegeben wer ­
den. Außerdem sollte der Gewichtsverlust der Probe (berechnet als 
Quotient aus der Masse des eluierten Anteils und der Masse der 
ursprünglichen Probe) angegeben werden. Die relativen Standard ­
abweichungen (RSA) sollten berechnet werden. Die Zahlen sollten sowohl für die gesamte Substanz (Polymer + Additive usw.) als auch 
für das Polymer allein (d. h. nach Abzug der Zusatzstoffe) genannt 
werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 145
 
2.2. TEST MIT ZWEI UNTERSCHIEDLICHEN PROBENGRÖSSEN  
Die einzelnen TOC-Werte der wässrigen Extrakte der beiden Drei ­
fachversuche sowie der Durchschnittswert für jeden Versuch sollten sowohl in Masseeinheiten pro Lösungsvolumen (normalerweise mg 
C/l) als auch in Maßeinheiten pro Gewicht der ursprünglichen Probe 
(normalerweise mg C/g) ausgedrückt werden.
 
Wenn es keinen Unterschied zwischen den Ergebnissen mit hohem 
bzw. niedrigem Probe-Wasser-Verhältnis gibt, deutet dies darauf hin, 
dass alle extrahierbaren Komponenten auch tatsächlich extrahiert 
worden sind. In diesem Fall ist eine direkte Analyse in der Regel nicht erforderlich.
 
Die Massen der einzelnen Rückstände sollten als prozentualer Anteil 
der Ausgangsmasse der Proben angegeben werden. Die Durch ­
schnittswerte sollten ermittelt werden. Die Differenz zwischen 100 
und den gefundenen Prozentsätzen stellt den Prozentgehalt des lös ­
lichen und extrahierbaren Materials der ursprünglichen Probe dar.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. TESTBERICHT  
Der Testbericht muss folgende Angaben enthalten:  
3.1.1.  Prüfsubstanz  
— Verfügbare Angaben zur Prüfsubstanz (Identität, Zusatzstoffe, 
Verunreinigungen, Gehalt der niedermolekularen Spezies)  
3.1.2.  Versuchsbedingungen  
— Beschreibung der verwendeten Verfahren und Versuc ­
hsbedingungen  
— Beschreibung der Analyse- und Nachweismethoden  
3.1.3.  Ergebnisse  
— Ergebnisse der Löslichkeit/Extrahierbarkeit in mg/1; Einzel- und 
Durchschnittswerte für die Extraktionstests in den verschiedenen Lösungen, aufgeschlüsselt nach Polymergehalt und Verunrei ­
nigungen, Zusatzstoffen usw.
 
— Ergebnisse der Löslichkeit/Extrahierbarkeit in mg/g Polymer  
— TOC-Werte der wässrigen Extrakte, Masse des eluierten Teils 
und errechnete Prozentsätze (gegebenenfalls)  
— pH-Wert der einzelnen Proben  
— Angaben zu den Werten der Blindproben  
— Gegebenenfalls Hinweise auf die chemische Instabilität der Prüf ­
substanz sowohl während der Prüfung als auch während des 
Analyseverfahrens  
— Alle Informationen, die für die Auswertung der Ergebnisse von 
Bedeutung sind  
4. HINWEISE  
(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen 
für Prüfzwecke.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 146
 
A.21.  BRANDFÖRDERNDE EIGENSCHAFTEN (FLÜSSIGE 
STOFFE)  
1. VERFAHREN  
1.1. EINLEITUNG  
Mit diesem Prüfverfahren soll festgestellt werden, inwieweit ein flüs ­
siger Stoff die Verbrennungsgeschwindigkeit oder die Verbrennungs ­
intensität eines brennbaren Stoffes erhöhen kann oder ein Gemisch mit einem brennbaren Stoff bilden kann, welches sich spontan ent ­
zündet, wenn beide sorgfältig gemischt werden. Es beruht auf dem 
UN-Test auf brandfördernde (oxidierende) Eigenschaften für flüssige Stoffe (1) und ist ihm gleichwertig. Da dieses Verfahren A.21 jedoch 
in erster Linie für die Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 eingeführt 
wurde, ist lediglich der Vergleich mit einem Referenzstoff vor ­
geschrieben. Weitere Tests und der Vergleich mit zusätzlichen Re ­
ferenzstoffen können erforderlich sein, wenn die Testergebnisse für 
andere Zwecke verwendet werden sollen (
 1 ). 
Dieser Test muss nicht durchgeführt werden, wenn anhand der 
Strukturformel hinreichend nachgewiesen wurde, dass der Stoff mit anderen brennbaren Stoffen nicht exotherm reagieren kann.
 
Es ist nützlich, Vorausinformationen über die potenziellen explosi ­
ven Eigenschaften der Stoffe zu haben, bevor dieser Test durch ­
geführt wird.  
Dieser Test ist nicht auf feste Stoffe, Gase, explosive oder leicht ­
entzündliche Stoffe oder auf organische Peroxide anwendbar.  
Dieser Test muss nicht durchgeführt werden, wenn bereits Ergeb ­
nisse für den getesteten Stoff aus dem UN-Test auf brandfördernde 
(oxidierende) Eigenschaften für flüssige Stoffe (1) vorliegen.  
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Die durchschnittliche Druckanstiegszeit ist der Durchschnitt der ge ­
messenen Zeiten, die vergehen, bis ein Gemisch bei einem Test 
einen Druckanstieg von 690 kPa auf 2 070 kPa über atmosphäri ­
schem Druck erzeugt.  
1.3. REFERENZSTOFF  
Als Referenzstoff ist 65 % (w/w) Salpetersäure in wässriger Lösung 
(analysenrein) erforderlich (  2 ). ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 147  
( 1 ) Beispielsweise im Rahmen der UN-Beförderungsbestimmungen. 
( 2 ) Die Säure ist vor dem Test zu titrieren, um die genaue Konzentration zu überprüfen.
 Wenn der Experimentator davon ausgeht, dass die Ergebnisse dieses 
Tests auch für andere Zwecke verwendet werden sollen (  1 ), kann die 
Prüfung zusätzlicher Referenzstoffe sinnvoll sein (  2 ). 
1.4. PRINZIP DES PRÜFVERFAHRENS  
Die Testflüssigkeit wird in einem Massenverhältnis von 1:1 mit Fa ­
sercellulose gemischt und in ein Druckgefäß gefüllt. Kommt es beim 
Mischen oder beim Einfüllen spontan zur Entzündung, sind keine 
weiteren Tests mehr nötig.  
Kommt es nicht spontan zur Entzündung, so wird der gesamte 
Test durchgeführt. Das Gemisch wird in einem Druckgefäß erhitzt, 
und die Zeit, die im Durchschnitt vergeht, bis der Druck von 690 kPa auf 2 070 kPa über atmosphärischen Druck angestiegen ist, wird ermittelt. Diese Zeit wird mit der durchschnittlichen Druck ­
anstiegszeit für das 1:1-Gemisch des/der Referenzstoffe(s) und der 
Cellulose verglichen.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
In fünf hintereinander erfolgten Prüfungen mit ein und demselben 
Stoff sollten die Ergebnisse um nicht mehr als 30 % vom arithme ­
tischen Mittel abweichen. Ergebnisse, die um mehr als 30 % abwei ­
chen, sind nicht zu berücksichtigen. Misch- und Einfüllverfahren sollten verbessert und die Testreihe sollte wiederholt werden.
 
1.6. BESCHREIBUNG DES VERFAHRENS  
1.6.1.  Vorbereitung  
1.6.1.1.  Brennbarer Stoff  
Getrocknete Fasercellulose mit einer Faserlänge von 50 bis 250 μm 
und einem durchschnittlichen Durchmesser von 25 μm (  3 ) wird als 
brennbares Material verwendet. Sie wird in einer Schicht von nicht 
mehr als 25 mm Dicke bei 105  o C 4 Stunden lang bis zur Gewichts ­
konstanz getrocknet und in einem Exsikkator mit Trocknungsmittel aufbewahrt, bis sie vollkommen abgekühlt ist und benötigt wird. Der 
Wassergehalt der getrockneten Cellulose sollte weniger als 0,5 % der 
Trockenmasse (
 4 ) betragen. Gegebenenfalls sollte die Trocknungszeit 
verlängert werden (  5 ). Während des gesamten Tests ist Cellulose aus 
derselben Vorbereitungsprozedur zu verwenden,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 148  
( 1 ) Beispielsweise im Rahmen der UN-Beförderungsbestimmungen. 
( 2 ) Beispiel: 50 % (w/w) Perchlorsäure und 40 % (w/w) Natriumchlorat werden in Bezugs ­
dokument 1 verwendet. 
( 3 ) Zum Beispiel Cellulosestaub aus der Whatman-Säulen-Chromatografie CF 11, 
Katalognr. 4021 050. 
( 4 ) Was beispielsweise durch Karl-Fischer-Titration zu bestätigen ist. 
( 5 ) Als Alternative kann der Wassergehalt beispielsweise auch durch Vakuumerhitzen auf 
105  o C während 24 Stunden erreicht werden.
 1.6.1.2.  Apparatur  
1.6.1.2.1. D r u c k g e f ä ß  
Ein Druckgefäß ist erforderlich. Das Gefäß besteht aus einem zylin ­
drischen Druckgefäß aus Stahl von einer Länge von 89 mm und einem Außendurchmesser von 60 mm (siehe Abbildung 1). Seitlich ist der Kolben an zwei gegenüberliegenden Seilen abgeflacht (wo 
sich der Durchmesser des Gefäßes auf 50 mm verringert), um die 
Handhabung bei der Einführung von Zündstopfen und Entlüftungs ­
stopfen zu erleichtern. Das Gefäß, das eine Bohrung von 20 mm im Durchmesser hat, ist an einem Ende in einer Tiefe von 19 mm ver ­
größert und mit einem Gewinde versehen, so dass ein 1" British 
Standard Pipe (BSP) oder eine metrische Entsprechung eingeführt werden kann. Ein Druckablassarm wird in die nicht abgeflachte Seite des Druckgefäßes 35 mm von einem Ende und im Winkel von 
90
 o zu den abgeflachten Seiten eingeschraubt. Dazu ist eine Bohrung 
von 12 mm Tiefe vorgesehen, die mit einem Gewinde versehen ist, in das das 1/2"-BSP-Gewinde (oder metrische Entsprechung) am unteren Ende des Seitenarms eingeschraubt werden kann. Gegebe ­
nenfalls wird eine Dichtung aus inertem Material angebracht, um den 
Arm gasundurchlässig zu machen. Der Seitenarm ragt 55 mm aus dem Druckgefäß heraus und hat eine Bohrung von 6 mm. Das Ende des Seitenarms ist vergrößert und mit einem Gewinde versehen, so 
dass ein Membrandruckaufnehmer eingeschraubt werden kann. Jedes 
beliebige Druckmessgerät kann verwendet werden, sofern es gegen die heißen Gase oder Spaltprodukte beständig ist und auf eine Druckanstiegsgeschwindigkeit von 690 bis 2 070 kPa in höchstens 
5 ms anspricht.
 
Das weiter vom Seitenarm entfernte Ende wird mit einem Zünds ­
topfen verschlossen, an den zwei Elektroden angebracht sind. Die eine ist vom Stopfen isoliert, die andere ist über diesen geerdet. Das andere Ende des Druckgefäßes wird mit einer Berstscheibe (Berst ­
druck rund 2 200 kPa) verschlossen, die von einem Stopfen mit einer 
Bohrung von 20 mm gehalten wird. Gegebenenfalls wird am Zünds ­
topfen eine Dichtung aus inertem Material verwendet, um Gasun ­
durchlässigkeit zu gewährleisten. Ein Ständer (Schaubild 2) hält die 
Vorrichtung beim Gebrauch in der richtigen Position. Er besteht in 
der Regel aus einer Weichstahl-Grundplatte mit der Abmessung 235 mm × 184 mm × 6 mm und einem 185 mm langen quadrati ­
schen Hohlkörper mir der Abmessung 70 mm × 70 mm × 4 mm.
 
Von zwei gegenüberliegenden Seiten des Hohlkörpers wird an einem 
Längsende jeweils ein Seitenteil abgeschnitten, so dass ein Gestell 
mit zwei flachwandigen Beinen und einem 86 mm langen ganzen Kasten darauf entsteht. Die Enden dieser flachwandigen Beine wer ­
den in einem Winkel von 60
 o zur Horizontalen abgeschnitten und an 
die Grundplatte angeschweißt. Ein 22 mm weiter und 46 mm tiefer 
Spalt wird in eine Seite am oberen Ende des Kastens geschnitten, so dass bei der Einführung der Druckgefäßvorrichtung mit dem Zünds ­
topfen voran in den Kastenteil der Vorrichtung der Seitenarm in den 
Spalt passt. Ein Stahlstück von 30 mm Länge und 6 mm Dicke wird 
als Zwischenstück unten an der Innenseite des Kastens angeschweißt. Zwei Flügelschrauben von 7 mm sind an der gegenüberliegenden Seite eingeschraubt und halten das Druckgefäß. Zwei 12 mm breite 
Streifen von 6 mm dickem Stahl, die an die Seitenteile am Boden 
des Kastens angeschweißt sind, halten das Druckgefäß von unten.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 149
 
1.6.1.2.2. Z ü n d v o r r i c h t u n g  
Die Zündvorrichtung besteht aus einem 25 cm langem Ni/Cr-Draht 
mit einem Durchmesser von 0,6 mm und einem Widerstand von 3,85 
Ohm/m. Der Draht wird mit Hilfe eines Stabes von 5 mm Durch ­
messer zu einer Wendel gedreht und wird an den am Zündstopfen befindlichen Elektroden befestigt. Die Wendel sollte einer der Dar ­
stellungen in Abbildung 3 entsprechen. Die Unterseite der Zündwen ­
del sollte 20 mm vom Boden des Gefäßes entfernt sein. Wenn die Elektroden nicht nachstellbar sind, sollten die Enden des Zünddrah ­
tes zwischen der Wendel und dem Boden des Gefäßes mit einer 
Keramikumhüllung isoliert werden. Der Draht wird durch konstante 
Stromversorgung von mindestens 10 A erhitzt.
 
1.6.2.  Durchführung des Tests  ( 1 ) 
Die Apparatur, die komplett mit Druckaufnehmer und Heizsystem 
montiert ist, bei der jedoch die Berstscheibe nicht eingeführt ist, wird mit dem Zündstopfen nach unten auf dem Ständer befestigt. 2,5 g 
der zu testenden Flüssigkeit werden mit 2,5 g getrockneter Cellulose 
in einem Becherglas mit einem Rührstab aus Glas gemischt (
 2 ). Aus 
Sicherheitsgründen sollte der Mischvorgang mit einem Schutzschirm zwischen Experimentator und Gemisch durchgeführt werden. Ent ­
zündet sich das Gemisch beim Mischen oder beim Einfüllen, sind 
keine weiteren Tests erforderlich. Das Gemisch wird in kleinen Por ­
tionen mit leichtem Klopfen in das Druckgefäß gefüllt, wobei darauf geachtet werden muss, dass das Gemisch die Zündwendel ausrei ­
chend umhüllt und damit ein guter Kontakt gewährleistet ist. Es ist 
wichtig, dass sich die Wendel während des Füllens nicht verformt, da das zu falschen Ergebnissen führen kann (
 3 ). Die Berstscheibe 
wird in die vorgesehene Druckgefäßöffnung eingelegt und mit dem 
Halterungsstopfen fest eingeschraubt. Das gefüllte Gefäß wird auf 
den Ständer montiert, wobei das Ende mit der Berstscheibe nach oben zeigt. Der Ständer sollte sich in einem geeigneten gepanzerten Abzugsschrank oder in einer Brennkammer befinden. Das Strom ­
kabel ist an den äußeren Anschlusssteckern am Zündstopfen an ­
geschlossen. Die Stromstärke beträgt 10 A. Zwischen dem Beginn des Mischens und dem Anschalten des Stroms sollten nicht mehr als 10 Minuten vergehen.
 
Das vom Druckaufnehmer erzeugte Signal wird durch ein geeignetes 
Messdatenerfassungssystem aufgezeichnet, das sowohl die Messung 
als auch die Aufzeichnung eines Zeit-Druck-Profils ermöglicht (z. B. ein Transientenrecorder in Verbindung mit einem grafischen Dru ­
cker). Das Gemisch wird mindestens 60 s lang oder so lange, bis 
die Berstscheibe aufreißt, erhitzt. Reißt die Scheibe nicht auf, so 
sollte man das Gemisch abkühlen lassen, bevor die Apparatur vor ­
sichtig abgebaut werden kann, wobei Vorkehrungsmaßnahmen gegen 
einen eventuellen Druckaufbau getroffen werden sollten. Es werden 
fünf Prüfgänge mit dem Prüfstoff und dem/den Referenzstoff(en) durchgeführt. Es wird festgehalten, wie viel Zeit vergeht, bis der Druck von 690 kPa auf 2 070 kPa über atmosphärischem Druck 
steigt. Die durchschnittliche Druckanstiegszeit wird berechnet.
 
In manchen Fällen können Stoffe einen (zu hohen oder zu niedrigen) 
Druckanstieg erzeugen, der nicht auf die brandfördernden Eigen ­
schaften des Stoffes zurückzuführen ist. In diesen Fällen muss der Test gegebenenfalls mit einem inerten Stoff, z. B. Diatomit (Kiesel ­
gur), anstelle der Cellulose wiederholt werden, um die Art der Re ­
aktion festzustellen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 150  
( 1 ) Gemische von Oxidationsmitteln und Cellulose sind als potenziell explosiv zu behandeln 
und mit Vorsicht zu handhaben. 
( 2 ) Dazu kann auch ein Gemisch der zu testenden Flüssigkeit und der Cellulose im Ver ­
hältnis 1:1 in größerer Menge zubereitet werden, wovon dann 5 ± 0,1 g in das Druck ­
gefäß gefüllt werden. Das Gemisch ist für jeden Prüfgang frisch zuzubereiten. 
( 3 ) Insbesondere muss vermieden werden, dass nebeneinander liegende Schleifen der Wen ­
del miteinander in Kontakt kommen.
 2. DATEN  
Druckanstiegszeiten für die Testsubstanz und den/die Referenz ­
stoff(e), Druckanstiegszeiten für die Tests mit einem inerten Stoff, soweit durchgeführt.
 
2.1. ERGEBNISVERARBEITUNG  
Sowohl für die Testsubstanz als auch für den/die Referenzstoff(e) 
werden die durchschnittlichen Druckanstiegszeiten berechnet.  
Die durchschnittliche Druckanstiegszeit wird für die Tests mit einem 
inerten Stoff berechnet (sofern durchgeführt).  
In Tabelle 1 sind einige Ergebnisbeispiele aufgeführt.  
Tabelle 1  
Ergebnisbeispiele  ( a ) 
Stoff (  b ) Durchschnittliche Druckanstiegszeit für ein 1:1-Gemisch 
mit Cellulose 
(ms) 
Ammoniumdichromat, gesättigte wässrige Lösung 20 800 
Calciumnitrat, gesättigte wässrige Lösung 6 700 
Eisentrinitrat, gesättigte wässrige Lösung 4 133 
Lithiumperchlorat, gesättigte wässrige Lösung 1 686 Magnesiumperchlorat, gesättigte wässrige Lösung 777 
Nickelnitrat, gesättigte wässrige Losung 6 250 
Salpetersäure, 65 % 4 767 (
 c ) 
Perchlorsäure, 50 % 121 (  c ) 
Perchlorsäure, 55 % 59 
Kaliumnitrat, 30 % wässrige Lösung 26 690 
Silbernitrat, gesättigte wässrige Lösung (  d ) 
Natriumchlorat, 40 % wässrige Lösung 2 555 (  c ) 
Natriumnitrat, 45 % wässrige Lösung 4 133  
Inerter Stoff  
Wasser: Cellulose (  d ) 
( a ) Siehe Bezugsdokument (1) zur Klassifizierung nach den Beförderungsbestimmungen der UN. 
( b ) Gesättigte Lösungen sollten bei 20  o C zubereitet werden. 
( c ) Durchschnittswert aus Testreihen verschiedener Labors. 
( d ) Höchstdruck von 2 070 kPa nicht erreicht.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 151
 
3. BERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht sollte folgende Angaben enthalten:  
— Art der Testsubstanz, ihre Zusammensetzung, ihre Reinheit usw.,  
— Konzentration der Testsubstanz,  
— das für die Cellulose verwendete Trocknungsverfahren,  
— den Wassergehalt der verwendeten Cellulose,  
— die Messergebnisse,  
— gegebenenfalls die Ergebnisse der Tests mit einem inerten Stoff,  
— die errechneten durchschnittlichen Druckanstiegszeiten,  
— eventuelle Abweichungen von diesem Verfahren unter Angabe 
der Gründe,  
— sämtliche zusätzlichen Informationen oder Bemerkungen, die für 
die Analyse der Ergebnisse relevant sind.  
3.2. ANALYSE DER ERGEBNISSE (  1 ) 
Bei der Bewertung der Prüfergebnisse ist Folgendes zu beachten:  
a) ob sich das Gemisch von Testsubstanz und Cellulose spontan 
entzündet, und  
b) der Vergleich der durchschnittlichen Zeit, bis der Druck von 690 
kPa auf 2 070 kPa gestiegen ist, mit der Druckanstiegszeit des/der Referenzstoffe(s).
 
Ein flüssiger Stoff wird als brandfördernd beurteilt, wenn  
a) ein Gemisch des Stoffes und der Cellulose mit einem Massen ­
verhältnis von 1:1 spontan in Brand gerät oder  
b) ein Gemisch des Stoffes und der Cellulose mit einem Massen ­
verhältnis von 1:1 eine durchschnittliche Druckanstiegszeit von höchstens der durchschnittlichen Druckanstiegszeit aufweist wie 
ein Gemisch 65 %iger Salpetersäure (w/w) in wässriger Lösung 
und Cellulose im Massenverhältnis von 1:1.
 
Um falsche positive Ergebnisse zu vermeiden, sollten die beim Test 
des Stoffes mit einem inerten Stoff erhaltenen Ergebnisse in die Analyse der Ergebnisse mit einbezogen werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 152  
( 1 ) Siehe Bezugsdokument 1 zur Analyse der Ergebnisse nach den Beförderungsbestimmun ­
gen der UN bei Verwendung verschiedener Referenzstoffe.
 4. BEZUGSDOKUMENTE  
(1) UN-Empfehlungen für die Beförderung gefährlicher Güter, Test- 
und Kriterienhandbuch, 3. geänderte Ausgabe. UN-Veröffent ­
lichungsnummer: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, S. 342. Test 
O.2: Test auf oxidierende Eigenschaften für flüssige Stoffe.  
Abbildung 1  
Druckgefäß
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 153
 
Abbildung 2  
Ständer
  
Abbildung 3  
Zündvorrichtung
  
Anmerkung : Eines dieser Systeme kann verwendet werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 154
 
A.22.  LÄNGENGEWICHTETER MITTLERER GEOMETRISCHER 
DURCHMESSER VON FASERN  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Mit dieser Testmethode wird ein Verfahren zur Messung des längenge ­
wichteten mittleren geometrischen Durchmessers (GWGMD — Length 
Weighted Geometric Mean Diameter) von künstlichen Mineralfasern (MMMF — Man Made Mineral Fibres) beschrieben. Da der LWGMD der Population mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % zwischen den 
95 %-Vertrauensintervallen (LWGMD ± 2 Standardfehler) der Probe 
liegt, entspricht der im Bericht angegebene Wert (der Testwert) der unteren 95 %-Vertrauensgrenze der Probe (d. h. LWGMD — 2 Standardfehler). Diese Methode basiert auf einer aktualisierten Fas ­
sung (Juni 1994) des Entwurfs einer HSE-Industrieverfahrensweisung, 
die am 26. September 1993 in Chester zwischen ECFIA und HSE ver ­
einbart und für und aus einem zweiten laborinternen Versuch entwickelt wurde (1, 2). Diese Messmethode kann zur Kennzeichnung des Faser ­
durchmessers von Schüttgutstoffen oder Produkten verwendet werden, 
die MMMF enthalten, z. B. feuerfeste Keramikfasern (PCF — Re ­
fractory Ceramic Fibres), künstliche Glasfasern (MMVF — Man- 
Made Vitreous Fibres), kristalline und polykristalline Fasern.
 
Die Längengewichtung dient zur Kompensation der Auswirkungen 
auf die Durchmesserverteilung, zu denen es durch den Bruch langer Fasern bei der Probenahme oder beim Umgang mit dem Material 
kommt. Die Größenverteilung der Durchmesser der MMMF wird 
durch geometrische statistische Verfahren (geometrisches Mittel) ge ­
messen, da diese Durchmesser normalerweise Größenverteilungen 
aufweisen, die näherungsweise dem Lognormal entsprechen.
 
Die Messung der Länge und des Durchmessers ist ein mühsamer, 
zeitaufwändiger Prozess, werden jedoch nur jene Fasern gemessen, die eine unendlich dünne Linie in einem REM-Sichtfeld berühren, so 
ist die Wahrscheinlichkeit, eine bestimmte Faser auszuwählen, pro ­
portional zu deren Länge. Da damit die Länge in den Berechnungen der Längengewichtung berücksichtigt wird, muss lediglich der 
Durchmesser gewichtet werden; der LWGMD — 2SF kann dann 
auf die beschriebene Weise berechnet werden.
 
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Partikel : Ein Objekt mit einem Länge-Breite-Verhältnis von weniger 
als 3:1.  
Faser : Ein Objekt mit einem Länge-Breite-Verhältnis (Seitenverhält ­
nis) von mindestens 3:1.  
1.3. UMFANG UND EINSCHRÄNKUNGEN  
Durch diese Methode sollen die Durchmesserverteilungen untersucht 
werden, deren mittlerer Durchmesser zwischen 0,5 μm und 6 μm 
liegt. Größere Durchmesser können mithilfe geringerer REM-Vergrö ­
ßerungsfaktoren gemessen werden, allerdings stößt diese Methode bei feineren Faserverteilungen zunehmend an seine Grenzen; bei 
mittleren Durchmessern unter 0,5 μm wird die Messung mit Trans ­
missions-Elektronenmikroskopen (TEM) empfohlen.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 155
 
1.4. PRINZIP DER TESTMETHODE  
Aus der Fasermatte oder aus losen Fasern wird eine bestimmte An ­
zahl repräsentativer Kernproben entnommen. Die Länge der losen Fasern wird durch Brechen verringert und es wird eine repräsentative 
Teilprobe in Wasser dispergiert. Aliquote Teile werden extrahiert 
und durch ein Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm 
gefiltert und zur Untersuchung unter einem Rasterelektronenmikro ­
skop (SEM) vorbereitet. Die Faserdurchmesser werden mit einem 
Rastervergrößerungsfaktor von × 10 000 oder mehr (
 1 ) nach einem 
Line-Intercept-Verfahren gemessen, das eine unverfälschte Schätzung des mittleren Durchmessers ergibt. Das untere 95 %-Vertrauensinter ­
vall (auf der Basis eines einseitigen Tests) wird so berechnet, dass 
ein Schätzwert für den niedrigsten Wert des mittleren geometrischen Faserdurchmessers des Materials entsteht.
 
1.5. BESCHREIBUNG DER TESTMETHODE  
1.5.1.  Sicherheits-/Vorsichtsmaßnahmen  
Die Belastung des menschlichen Organismus durch Schwebfasern ist 
zu minimieren; daher ist bei der Arbeit mit den trockenen Fasern ein Abzugsschrank oder eine Glove-Box zu verwenden. In periodischen Abständen ist die Belastung des menschlichen Organismus zu über ­
wachen, um die Wirkung der Schutzverfahren zu überprüfen. Bei der 
Handhabung von MMMF sind Einweghandschuhe zu tragen, um Hautreizungen zu verringern und eine Querkontaminierung zu ver ­
meiden.
 
1.5.2.  Geräte/Apparatur  
— Press- und Formwerkzeug (für 10 MPa).  
— Polycarbonat-Kapillarporenfilter mit 0,2 μm Porengröße (Durch ­
messer 25 mm).  
— Zelluloseestermembranfilter mit 5 μm Porengröße zur Verwen ­
dung als Zusatzfilter.  
— Glasfiltervorrichtung (oder Einwegfiltersysteme) für die Auf ­
nahme von Filtern mit 25 mm Durchmesser (z. B. Millipore- 
Glasmikroanalyse-Filtersatz, Typ XX10 025 00).  
— Frisch destilliertes Wasser, das zur Ausfilterung von Mikroorga ­
nismen durch einen Filter mit 0,2 μm Porengröße gefiltert wurde.  
— Sputter-Beschichtungsvorrichtung mit Gold- oder Gold/ ­
Palladium-Target.  
— Rasterelektronenmikroskop mit einem Auflösevermögen 
bis 10 nm und Vergrößerungsfaktor bis x 10 000.  
— Diverses: Spatel, Skalpellmesser Typ 24, Pinzette, REM-Röhr ­
chen, Kohlenstoffkleber oder Kohlenstoffklebeband, Kolloidalsil ­
ber („Silver dag“).  
— Ultraschallsonde oder Tisch-Ultraschallbad.  
— Kernbohrer oder Korkbohrer für die Entnahme von Kernproben 
aus MMMF-Fasermatten.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 156  
( 1 ) Dieser Vergrößerungsfaktor bezieht sich auf 3 μm-Fasern; bei 6 μm-Fasern ist ein Ver ­
größerungsfaktor von × 5 000 möglicherweise geeigneter.
 1.5.3.  Testverfahren  
1.5.3.1.  Probenahme  
Bei Fasermatten und Platten wird ein 25 mm-Kernbohrer oder Kork ­
bohrer zur Entnahme von Proben aus dem Querschnitt verwendet. 
Diese Proben sind gleichmäßig über die Breite a der Schmalseite der 
Matte anzuordnen oder, wenn lange Abschnitte der Matte zur Ver ­
fügung stehen, aus beliebigen Stellen zu entnehmen. Die gleichen Hilfsmittel können auch für die Entnahme von Zufallsproben aus 
losen Fasern verwendet werden. Es sind sechs Stichproben möglichst 
so zu entnehmen, das räumliche Schwankungen im losen Material damit wiedergegeben werden.
 
Die sechs Kernproben sind in einem Stempel mit 50 mm Durch ­
messer unter 10 MPa zu zerkleinern. Das Material wird mit einem 
Spachtel durchmischt und bei 10 MPa erneut gepresst. Anschließend wird das Material aus dem Stempel entnommen und in einer ver ­
schlossenen Glasflasche gelagert.
 
1.5.3.2.  Vorbereitung der Probe  
Falls erforderlich, können organische Bindemittel entzogen werden, 
indem die Faser ca. eine Stunde lang bei 450 °C in einen Ofen 
eingelegt wird.  
Die Probe nach dem Cone-and-Quarter-Verfahren in vier gleiche 
Teile unterteilen (dieser Schritt sollte in einem Staubschrank erfolgen).
 
Mit einem Spatel eine geringe Menge (< 0,5 g) der Probe in 100 ml 
frisch destilliertes Wasser geben, das durch einen 0,2 μm-Membran ­
filter gefiltert wurde (andere Beschaffungsquellen von hochreinem Wasser sind ebenfalls zulässig, wenn sie nachgewiesenermaßen von ausreichender Qualität sind). Die Probe mithilfe einer mit 
100 W betriebenen Ultraschallsonde, die so eingestellt ist, dass 
eine Kavitation eintritt, gründlich dispergieren (Steht keine Sonde zur Verfügung, ist wie folgt vorzugehen: 30 Sekunden lang mehr ­
mals schütteln und umkehren; fünfminütige Ultraschallbehandlung in 
einem Tisch-Ultraschallbad; dann wieder 30 Sekunden lang mehr ­
mals schütteln und umkehren).
 
Sofort nach der Dispersion der Faser mehrere aliquote Teile (z. B. 
drei aliquote Teile mit 3, 6 und 10 ml) mit einer breiten Pipette 
(Aufnahmevermögen 2-5 ml) entnehmen.  
Jeder aliquote Teil wird durch einen 0,2 μm-Polycarbonatfilter mit 
MEC-Zusatzfilter mit 5 μm-Poren unter Verwendung eines 25-mm- 
Glasfiltertrichters mit zylindrischem Vorratsbehälter vakuumgefiltert. Rund 5 ml des gefilterten destillierten Wassers wird in den Trichter 
gegeben und den aliquoten Teil langsam in das Wasser gegeben, 
wobei die Pipettenspitze unterhalb des Meniskus gehalten wird. Pi ­
pette und Vorratsbehälter müssen nach dem Pipettieren gründlich gespült werden, da dünne Fasern dazu neigen, sich eher an der 
Oberfläche anzusammeln.
 
Filter vorsichtig entnehmen und vom Zusatzfilter trennen, bevor er 
zum Trocknen in einen Behälter eingelegt wird.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 157
 
Einen Viertel- oder halben Filterquerschnitt der Filterrückstände mit 
ruckartigen Bewegungen mit einem Skalpell Typ 24 ausschneiden. 
Den ausgeschnittenen Querschnitt mit Kohlenstoffklebeband oder Kohlenstoffkleber vorsichtig auf dem Träger („Stub“) des REM be ­
festigen. An mindestens drei Stellen ist Kolloidalsilber zur Verbes ­
serung des elektrischen Kontakts der Filterränder und des „Stub“ 
aufzubringen. Wenn der Klebstoff bzw. das Kolloidalsilber getrock ­
net ist, durch Sputter-Beschichtung ca. 50 nm Gold oder Gold/ ­
Palladium auf die Oberfläche des Filterrückstands aufbringen.
 
1.5.3.3.  Kalibrierung und Betrieb des REM  
1.5.3.3.1. K a l i b r i e r u n g  
Die Kalibrierung des REM ist mindestens einmal wöchentlich (idea ­
lerweise täglich) anhand eines freigegebenen Kalibriergitters zu kon ­
trollieren. Die Kalibrierung ist anhand eines freigegebenen Normals zu kontrollieren; stimmt der Messwert (REM) nicht auf ± 2 % mit dem zertifizierten Wert überein, muss die Kalibrierung des REM 
nachjustiert und erneut kontrolliert werden.
 
Das REM muss bei Verwendung einer Probenmatrix mindestens die 
Auflösung eines sichtbaren Mindestdurchmessers von 0,2 μm bei 
einem Vergrößerungsfaktor × 2 000 ermöglichen.  
1.5.3.3.2. B e t r i e b  
Das REM ist mit einem Vergrößerungsfaktor von 10 000 (  1 ) unter 
Bedingungen zu betrieben, die eine gute Auflösung und eine akzep ­
table Bildqualität bei geringer Abtastgeschwindigkeit von beispiels ­
weise 5 Sekunden je Aufnahme ergeben. Da die Betriebsvorausset ­
zungen unterschiedlicher REM sich voneinander unterscheiden kön ­
nen, sind bei Materialien mit relativ geringer Atommasse Beschleu ­
nigungsspannungen von 5-10 keV zu verwenden, um eine möglichst gute Sichtbarkeit und Auflösung zu erreichen; dabei ist eine geringe 
Punktgröße und ein kurzer Arbeitsabstand einzustellen. Wird ein 
Linear-Trverse-Verfahren angewandt, ist eine Neigung von 0
 o zu 
verwenden, um Refokussierung auf ein Minimum zu beschränken; weist das REM eine euzentrische Stufe auf, ist der euzentrische 
Arbeitsabstand zu verwenden. Ein geringerer Vergrößerungsfaktor 
kann verwendet werden, wenn das Material keine kleinen Fasern (mit geringem Durchmesser) enthält und große Faserdurchmesser 
(> 5 μm) vorliegen.
 
1.5.3.4.  Größenbestimmung  
1.5.3.4.1. B e w e r t u n g d e r P r o b e b e i g e r i n g e r V e r g r ö ß e r u n g  
Zunächst ist die Probe mit einem geringen Vergrößerungsfaktor auf 
Anzeichen von Klumpenbildung größerer Fasern zu untersuchen und die Faserndichte zu ermitteln. Bei übermäßiger Klumpenbildung wird empfohlen, eine neue Probe herzustellen.
 
Aus Gründen der statistischen Genauigkeit muss eine bestimmte 
Mindestzahl Fasern gemessen werden, eine hohe Faserndichte ist 
dabei erstrebenswert, da die Untersuchung leerer Felder zeitaufwän ­
dig ist und keinen Beitrag zum Analyseergebnis liefert. Ist der Filter jedoch überladen, ist die Messung aller messbaren Fasern erschwert und es besteht die Gefahr, dass kleinere Fasern durch größere Fasern 
überdeckt und dadurch übersehen werden.
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( 1 ) Siehe vorherige Fußnote zu 3 μm-Fasern.
 Eine Verfälschung in Richtung einer zu hoch geschätzten LWGMD 
kann dann eintreten, wenn Faserdichten von mehr als 150 Fasern je 
Millimeter Linear-Traverse vorliegen. Durch geringe Faserkonzentra ­
tionen nimmt andererseits die Dauer der Analyse zu, weshalb es oft kostengünstiger ist, eine Probe herzustellen, deren Faserdichte näher 
am Optimum liegt, statt ständig die Faserzahlen in Filtern geringer 
Konzentrationen zu zählen. Die optimale Faserdichte soll durch ­
schnittlich ca. 1 oder 2 zählbare Fasern je Sichtfeld bei einer 5000-fachen Vergrößerung ergeben. Allerdings ist die optimale 
Dichte von der Größe (Durchmesser) der Fasern abhängig, also 
muss der Bediener mit entsprechendem Sachverstand entscheiden, ob die Faserdichte dem Optimum nahekommt oder nicht.
 
1.5.3.4.2. L ä n g e n g e w i c h t u n g d e r F a s e r d u r c h m e s s e r  
Es werden nur diejenigen Fasern gezählt, die eine (unendlich) dünne 
Linie auf dem Raster des REM berühren (oder kreuzen). Hierzu wird 
eine waagerechte (oder vertikale) Linie durch die Rastermitte 
gezogen.  
Alternativ dazu wird ein einzelner Punkt in der Mitte des Rasters 
angeordnet und ein kontinuierlicher Abtastvorgang in einer Richtung über den Filter hinweg gestartet. Der Durchmesser jeder Faser mit einem Seitenverhältnis von mehr als 3:1, die diesen Punkt berührt 
oder kreuzt, wird gemessen und aufgezeichnet.
 
1.5.3.4.3. B e s t i m m u n g d e r F a s e r g r ö ß e  
Es wird empfohlen, mindestens 300 Fasern zu messen. Jede Faser 
wird nur ein einziges Mal am Schnittpunkt mit der auf dem Bild gezeichneten Linie oder Punkt (oder nahe dem Schnittpunkt, wenn die Faserkanten verdeckt sind) gemessen. Werden Fasern mit unein ­
heitlichen Querschnitten festgestellt, ist eine Messung am durch ­
schnittlichen Faserdurchmesser zugrundezulegen. Bei der Festlegung des Randes und der Messung des geringsten Abstands zwischen den Faserrändern ist vorsichtig vorzugehen. Die Größenbestimmung kann 
online oder offline an gespeicherten Bildern oder Fotoaufnahmen 
erfolgen. Die Verwendung von halbautomatischen Bildmesssyste ­
men, bei denen die Daten direkt in eine Tabellenkalkulation geladen werden, ist zu empfehlen, da diese Verfahren Zeit sparen, Abschrift ­
fehler vermeiden und eine automatische Berechnung ermöglichen.
 
Die Enden langer Fasern sind bei geringer Vergrößerung zu prüfen, 
damit sichergestellt ist, dass sie sich nicht in den Sichtbereich des 
Messfeldes rollen und nur einmal gemessen werden.  
2. DATEN  
2.1. BEHANDLUNG DER ERGEBNISSE  
Die Faserdurchmesser weisen normalerweise keine Normalverteilung 
auf. Mit Hilfe einer Log-Transformation kann jedoch eine Verteilung ermittelt werden, die näherungsweise der Normalverteilung ent ­
spricht.
 
Das arithmetische Mittel (mittlerer lnD) und die Standardabweichung 
(SD  lnD ) der lnD-Werte (log to base e) der n Faserdurchmesser (D) 
wird berechnet. 
mittl : lnD ¼ ΣlnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
ΣðlnD – mittl : lnDÞ 2 
n – 1 s 
(2) 
Die Standardabweichung wird durch die Quadratwurzel der Anzahl 
Messungen (n) dividiert und daraus der Standardfehler (SE  lnD ) 
ermittelt. 
SE lnD ¼ SD 
ﬃﬃﬃ n p (3) 
Das Zweifache des Standardfehlers wird vom Mittelwert abgezogen 
und der Exponentialwert dieses Wertes (Mittelwert minus dem Zwei ­
fachen des Standardfehlers) berechnet; dies ergibt den geometrischen Mittelwert minus zwei geometrischen Standardfehlern. 
LWGMD – 2SE ¼ e
 ðmittl : lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. BERICHTSERSTELLUNG  
TESTBERICHT  
Der Testbericht muss mindestens folgende Angaben enthalten:  
— den Wert für LWGMD-2SE,  
— etwaige Abweichungen, vor allem jene, die sich auf Präzision 
oder Genauigkeit der Ergebnisse auswirken (mit entsprechenden Begründungen).
 
4. LITERATUR  
1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. 
February 1999.  
2. G. Burdett und G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Re ­
sults of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/ ­
07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research 
and Laboratory Services Division, 1994.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 160
 
A.23  1-OCTANOL/WASSER-VERTEILUNGSKOEFFIZIENT: METHODE 
ZUR PRÜFUNG UNTER LANGSAMEM RÜHREN  
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 123 (2006). Die 
P OW -Werte (P  OW = 1-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizient) konnten mit 
der Methode zur Prüfung unter langsamem Rühren bis zu log P  OW 8,2 
genau bestimmt werden (1). Entsprechend kommt diese Methode für die direkte Bestimmung der P
 OW -Werte stark hydrophober Substanzen in Be ­
tracht.  
2. Weitere Methoden zur Bestimmung des 1-Octanol/Wasser-Verteilungskoef ­
fizienten (P  OW ) sind die „Schüttelmethode“ (2) und die Bestimmung des 
P OW aufgrund des Retentionsverhaltens bei der HPLC mit Phasenumkehr 
(3). Die „Schüttelmethode“ ist wegen der Übertragung von 
Octanol-Mikrotröpfchen in die wässrige Phase jedoch fehleranfällig. Mit 
steigenden P  OW -Werten führt das Vorhandensein dieser Tröpfchen in der 
wässrigen Phase zu einer zunehmenden Überschätzung der Konzentration der Prüfsubstanz im Wasser. Daher ist diese Methode nur bei Substanzen 
mit log P
 OW < 4 geeignet. Die zweite Methode beruht auf direkt bestimmten 
P OW -Werten, die zur Kalibrierung der Beziehung zwischen dem Retentions ­
verhalten in der HPLC und den gemessenen P  OW -Werten verwendet werden. 
Es gab einen Entwurf einer OECD-Richtlinie zur Bestimmung des 1-Octa ­
nol/Wasser-Verteilungskoeffizienten ionisierbarer Substanzen (4), der aber 
nicht mehr verwendet werden soll.  
3. Diese Prüfmethode wurde in den Niederlanden entwickelt. Die Genauigkeit 
der in dieser Prüfmethode beschriebenen Verfahren wurde in einer 
Ringtest-Validierungsstudie unter Beteiligung von 15 Labors validiert und 
optimiert (5).  
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN  
Bedeutung und Anwendung  
4. Bei inerten organischen Substanzen wurden hoch signifikante Beziehungen 
zwischen den 1-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten (P  OW ) und der je ­
weiligen Bioakkumulation in Fischen festgestellt. Außerdem wurde eine Korrelation zwischen den P
 OW -Werten und der Toxizität für Fische sowie 
zwischen den P  OW -Werten und der Sorption chemischer Stoffe in Feststof ­
fen wie z. B. in Böden und in Sedimenten nachgewiesen. Das Literatur ­
verzeichnis enthält eine umfassende Übersicht über die verschiedenen Zu ­
sammenhänge (6).  
5. Zwischen dem 1-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten und sonstigen für 
die Umwelttoxizität und für das chemische Verhalten erheblichen Merkma ­
len von Substanzen wurden vielfältige Beziehungen festgestellt. Entspre ­
chend hat sich der 1-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizient zum Schlüssel ­
parameter für die Bewertung des mit chemischen Stoffen verbundenen Um ­
weltrisikos sowie zur Prognose der Persistenz chemischer Stoffe in der Umwelt entwickelt.
 
Anwendungsbereich  
6. Bei der Methode zur Prüfung unter langsamem Rühren soll die Bildung von 
1-Octanol-Mikrotröpfchen in der wässrigen Phase verringert werden. Ent ­
sprechend ist ausgeschlossen, dass die Konzentration in der wässrigen Phase 
wegen der ansonsten mit diesen Tröpfchen verbundenen Moleküle der Prüf ­
substanz überschätzt wird. Daher eignet sich die Methode zur Prüfung unter langsamem Rühren insbesondere zur Bestimmung der P
 OW -Werte von Sub ­
stanzen, bei denen log P  OW -Werte im Bereich von mindestens 5 zu erwarten 
sind und bei denen die Schüttelmethode (2) eher fehleranfällig wäre.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 161
 
DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
7. Der Verteilungskoeffizient einer Substanz für Wasser und ein lipophiles 
Lösungsmittel (1-Octanol) beschreibt die Gleichgewichtsverteilung des je ­
weiligen chemischen Stoffs zwischen den beiden Phasen. Der Verteilungs ­
koeffizient für Wasser und 1-Octanol (P  OW ) wird definiert als Verhältnis der 
Gleichgewichtskonzentrationen der Prüfsubstanz in mit Wasser gesättigtem 1-Octanol (C
 O ) und in mit 1-Octanol gesättigtem Wasser (C  W ). 
P OW ¼ C O=C W 
Für das Konzentrationsverhältnis wird keine Einheit angegeben. Meist wird 
das Verhältnis als Zehnerlogarithmus (log P  OW ) ausgedrückt. P  OW ist tem­
peraturabhängig; entsprechend sollte die Messtemperatur berücksichtigt wer ­
den. 
PRINZIP DER METHODE  
8. Um den Verteilungskoeffizienten zu bestimmen, werden Wasser, 1-Octanol 
und die Prüfsubstanz bei einer konstanten Temperatur in ein Gleichgewicht 
gebracht. Anschließend werden die Konzentrationen der Prüfsubstanz in den beiden Phasen bestimmt.
 
9. Die bei der Prüfung mit der Schüttelmethode auftretenden Schwierigkeiten 
infolge der Entstehung von Mikrotröpfchen können mit der hier vorgeschla ­
genen Methode unter langsamem Rühren verringert werden. Bei der Prüfung unter langsamem Rühren werden Wasser, 1-Octanol und die Prüfsubstanz in 
einem thermostatgeregelten Rührbehälter in ein Gleichgewicht gebracht. 
Durch das Rühren wird der Austausch zwischen den Phasen beschleunigt. Beim Rühren entstehen begrenzte Turbulenzen, welche den Austausch zwi ­
schen 1-Octanol und Wasser begünstigen, ohne dass Mikrotröpfchen ent ­
stehen können (1).
 
ANWENDBARKEIT DER PRÜFMETHODE  
10. Da sich das Vorhandensein anderer Substanzen auf den Aktivitätskoeffizien ­
ten der Prüfsubstanz auswirken kann, sollte die Prüfsubstanz als reine Sub ­
stanz untersucht werden. Daher sollte die jeweilige Substanz für die Mes ­
sung der 1-Octanol/Wasser-Verteilung in der höchsten auf dem Markt ver ­
fügbaren Reinheit verwendet werden.  
11. Diese Methode ist anzuwenden bei reinen Substanzen, bei denen weder eine 
Dissoziation noch eine Assoziation erfolgt und die keine erhebliche Grenz ­
flächenaktivität aufweisen. Die Methode kann zur Bestimmung der 1-Octa ­
nol/Wasser-Verteilung dieser Substanzen und von Gemischen eingesetzt 
werden. Wenn die Methode für Gemische eingesetzt wird, hängt die 1- 
Octanol/Wasser-Verteilung von der chemischen Zusammensetzung des zu prüfenden Gemischs sowie von der Zusammensetzung des als wässrige Phase genutzten Elektrolyten ab. Wenn die Methode um verschiedene 
Schritte ergänzt wird, kann sie auch für dissoziierende und assoziierende 
Verbindungen eingesetzt werden (siehe Nummer 12).
 
12. Aufgrund der unterschiedlichen Gleichgewichte in Wasser und 1-Octanol, 
die sich bei der 1-Octanol-/Wasser-Verteilung dissoziierender Substanzen 
wie z. B. organischer Säuren und Phenole, organischer Basen und organo ­
metallischer Substanzen ergeben, ist das Verteilungsverhältnis für 1-Octanol/ Wasser ebenfalls in hohem Maße von der Zusammensetzung des Elektroly ­
ten abhängig (7)(8). Die Bestimmung des Verteilungsverhältnisses für 1- 
Octanol/Wasser setzt voraus, dass pH-Wert und Elektrolytzusammensetzung während der Messung überwacht und protokolliert werden. Die Bewertung der Verteilungsverhältnisse muss durch Fachleute erfolgen. Unter Berück ­
sichtigung der Dissoziationskonstante(n) müssen geeignete pH-Werte so 
ausgewählt werden, dass für jedes Ionisierungsstadium ein Verteilungsver ­
hältnis bestimmt werden kann. Zur Prüfung organometallischer Verbindun ­
gen müssen Pufferlösungen eingesetzt werden, die nicht als Komplexbildner 
wirken (8). Unter Berücksichtigung des aktuellen Kenntnisstandes bezüglich 
der Chemie der wässrigen Phase (Komplexbildungskonstanten, Dissoziati ­
onskonstanten) sollten die Versuchsbedingungen so gewählt werden, dass die Speziation der Prüfsubstanz in der wässrigen Phase bestimmt werden 
kann. Die Ionenkonzentration sollte in allen Prüfungen gleich sein; um dies 
zu gewährleisten, sollte ein Hintergrundelektrolyt eingesetzt werden.
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13. Schwierigkeiten können sich bei der Prüfung in Verbindung mit der Unter ­
suchung von Substanzen mit geringer Wasserlöslichkeit oder mit hohem 
P OW ergeben, weil die Konzentrationen im Wasser sehr gering werden 
und eine genaue Bestimmung entsprechend problematisch ist. Diese Prüf ­
methode erläutert, wie diesem Problem begegnet werden kann.  
INFORMATIONEN ZUR PRÜFSUBSTANZ  
14. Die chemischen Reagenzien sollten mindestens Analysequalität besitzen. Es 
wird empfohlen, nicht markierte Prüfsubstanzen mit bekannter chemischer Zusammensetzung und einer Reinheit von mindestens 99 % oder radioaktiv 
markierte Prüfsubstanzen mit bekannter chemischer Zusammensetzung und 
radiochemischer Reinheit einzusetzen. Beim Einsatz von Indikatorsubstan ­
zen mit kurzer Halbwertszeit sollten Korrekturen unter Berücksichtigung des Zerfallsverhaltens vorgenommen werden. Wenn die Prüfsubstanzen radio ­
aktiv markiert wurden, sollte eine speziell für den jeweiligen chemischen 
Stoff vorgesehene Analysemethode eingesetzt werden, um sicherzustellen, dass die gemessene Radioaktivität unmittelbar auf die Prüfsubstanz zurück ­
zuführen ist.
 
15. Log P  OW kann mit einer im Handel erhältlichen und für diesen Zweck 
vorgesehenen Software geschätzt werden; alternativ kann die Schätzung 
auch aufgrund des Verhältnisses der Löslichkeiten in beiden Lösungsmitteln 
erfolgen.  
16. Bevor P  OW durch eine Prüfung unter langsamem Rühren bestimmt wird, 
sollten die folgenden Informationen zur Prüfsubstanz bekannt sein:  
a) die Strukturformel,  
b) geeignete Analysemethoden zur Bestimmung der Konzentration der Sub ­
stanz in Wasser und in 1-Octanol,  
c) die Dissoziationskonstante(n) ionisierbarer Substanzen (OECD-Richtlinie 
112) (9),  
d) die Wasserlöslichkeit (10),  
e) Informationen zur abiotischen Hydrolyse (11),  
f) die leichte biologische Abbaubarkeit (12),  
g) der Dampfdruck (13).  
BESCHREIBUNG DER METHODE  
Geräte und Apparatur  
17. Für die Prüfungen werden Standardlaborgeräte benötigt; insbesondere sind 
folgende Geräte erforderlich:  
— Magnetrührer sowie Magnetrührstäbe mit Teflonbeschichtung zum Um ­
rühren der wässrigen Phase,  
— geeignete Analyseinstrumente zur Bestimmung der Konzentration der 
Prüfsubstanz in den erwarteten Konzentrationen,  
— Rührgefäße mit einem Absperrhahn unten am Gefäß. Abhängig vom 
geschätzten Wert für log P  OW und von der Nachweisgrenze (LOD) 
der zu prüfenden Verbindung ist der Einsatz eines Reaktionsbehälters mit identischer Geometrie, aber mit einem Volumen von mehr als einem 
Liter in Betracht zu ziehen, damit hinreichend Wasser für die chemische 
Extraktion und für die durchzuführende Analyse entnommen werden kann. Dies führt zu höheren Konzentrationen im Wasserextrakt und 
ermöglicht entsprechend zuverlässigere Analysen. Anlage 1 enthält 
eine Tabelle mit Schätzwerten für die erforderlichen Mindestvolumina, der Nachweisgrenze der Verbindung, dem geschätzten log P
 OW und der 
Löslichkeit in Wasser. Die Tabelle beruht auf der Beziehung zwischen 
log P  OW und dem Verhältnis zwischen der Löslichkeit in Octanol und in 
Wasser gemäß Pinsuwan u. a. (14):  
Log P  OW ¼ 0; 88 log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 163
 
Dabei ist  
SR ¼ S oct=S w (Molarität)  
sowie auf der von Lyman (15) definierten Beziehung für die Prognose 
der Löslichkeit in Wasser. Die mit der in Anlage 1 genannten Formel 
bestimmten Wasserlöslichkeiten sind als erste Schätzung zu betrachten. 
Der Prüfende kann die Wasserlöslichkeit auch aufgrund einer sonstigen Beziehung schätzen, die er für besser geeignet hält, Auskunft über die Beziehung zwischen Hydrophobizität und Löslichkeit zu geben. Bei 
festen Verbindungen wird z. B. die Berücksichtigung des Schmelzpunk ­
tes bei der Prognose der Löslichkeit empfohlen. Wenn eine modifizierte Formel verwendet wird, sollte sichergestellt werden, dass die Gleichung zur Berechnung der Löslichkeit in Octanol noch gültig ist. In Anlage 2 
ist ein Rührgefäß mit Glasmantel und einem Inhalt von etwa einem Liter 
dargestellt. Die Proportionen des in Anlage 2 dargestellten Gefäßes ha ­
ben sich als günstig erwiesen und sollten auch dann beibehalten werden, wenn eine anders dimensionierte Apparatur verwendet wird,
 
— entscheidend ist eine Vorrichtung, mit der während der Prüfung unter 
langsamem Rühren eine konstante Temperatur aufrechterhalten werden 
kann.  
18. Die Gefäße sollten aus einem inerten Material bestehen, damit die Adsorp ­
tion durch die Oberfläche der Gefäße vernachlässigt werden kann.  
Herstellung der Prüflösungen  
19. Der Wert für P  OW sollte mit 1-Octanol der höchsten im Handel erhältlichen 
Reinheit (mindestens + 99 %) bestimmt werden. Die Reinigung von 1-Octa ­
nol durch die Extraktion mit einer Säure, einer Base und Wasser und eine anschließende Trocknung werden empfohlen. Außerdem kann 1-Octanol 
auch durch Destillation gereinigt werden. Zur Herstellung der Standard ­
lösungen der Prüfsubstanzen ist gereinigtes 1-Octanol zu verwenden. Das für die Bestimmung von P
 OW zu verwendende Wasser sollte durch Glas 
oder Quarz destilliert oder mit einem Reinigungssystem hergestellt worden 
sein; alternativ kann auch HPLC-Wasser verwendet werden. Destilliertes 
Wasser sollte durch ein 0,22- μm-Filter gefiltert werden; mit Blindproben 
sollte sichergestellt werden, dass die konzentrierten Extrakte keine Verunrei ­
nigungen enthalten, welche die Prüfsubstanz verändern könnten. Wenn ein 
Glasfaserfilter verwendet wird, sollte das Filter durch mindestens dreistün ­
dige Erhitzung auf 400 °C gereinigt werden.  
20. Beide Lösungsmittel werden vor Durchführung der Prüfung wechselseitig 
gesättigt, indem sie in einem hinreichend großen Gefäß in ein Gleichgewicht gebracht werden. Dazu wird das aus zwei Phasen bestehende System zwei Tage lang langsam gerührt.
 
21. Eine geeignete Konzentration der Prüfsubstanz wird ausgewählt und in 1- 
Octanol (mit Wasser gesättigt) gelöst. Der 1-Octanol/Wasser-Verteilungs ­
koeffizient ist in verdünnten Lösungen mit 1-Octanol und Wasser zu be ­
stimmen. Daher sollte die Konzentration der Prüfsubstanz höchstens 70 % ihrer Löslichkeit bei einer Höchstkonzentration von 0,1 M in beiden Phasen 
betragen (1). Die für die Prüfungen verwendeten 1-Octanol-Lösungen dürfen 
keine suspendierten Feststoffe aus der Prüfsubstanz enthalten.
 
22. Eine geeignete Menge der Prüfsubstanz wird in 1-Octanol (mit Wasser 
gesättigt) gelöst. Wenn die Schätzung für log P  OW einen Wert über fünf 
ergibt, ist besonders darauf zu achten, dass die für die Prüfung verwendeten 
1-Octanol-Lösungen keine suspendierten Feststoffe aus der Prüfsubstanz 
enthalten. Dazu ist bei chemischen Stoffen mit einem geschätzten log P
 OW > 5 wie folgt zu verfahren:  
— Die Prüfsubstanz wird in 1-Octanol (mit Wasser gesättigt) gelöst.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 164
 
— Es wird hinreichend Zeit gelassen, damit sich suspendierte Feststoffe 
absetzen können. Während des Absetzens wird die Konzentration der 
Prüfsubstanz überwacht.  
— Nachdem sich die gemessenen Konzentrationen der 1-Octanol-Lösung 
stabilisiert haben, wird die Stammlösung mit einer geeigneten Menge 1- Octanol verdünnt.
 
— Anschließend wird die Konzentration der verdünnten Stammlösung ge ­
messen. Wenn die gemessene Konzentration mit der Verdünnung über ­
einstimmt, kann die verdünnte Stammlösung zur Prüfung unter lang ­
samem Rühren verwendet werden.  
Extraktion und Analyse der Proben  
23. Für die Untersuchung der Prüfsubstanz sollte eine validierte Analyse ­
methode verwendet werden. Der Prüfende muss nachweisen, dass die Kon ­
zentrationen in dem mit Wasser gesättigten 1-Octanol sowie in der mit 1- 
Octanol gesättigten wässrigen Phase während der Prüfung über der bei dem 
eingesetzten Analyseverfahren für die Methode festgesetzten Quantifizie ­
rungsgrenze liegen. In Fällen, in denen Extraktionsmethoden erforderlich sind, muss die analytische Wiederfindung der Prüfsubstanzen aus der wäss ­
rigen Phase und aus der 1-Octanol-Phase vor der Prüfung erfolgen. Die 
Anforderungen an die Analysesignale sind aufgrund von Blindwerten zu korrigieren; dabei ist darauf zu achten, dass keine Analytübertragungen zwischen den Proben vorkommen können.
 
24. Bei hydrophoben Prüfsubstanzen sind wegen der eher niedrigen Konzen ­
trationen der Prüfsubstanzen in der wässrigen Phase vor der Analyse wahr ­
scheinlich eine Extraktion der wässrigen Phase mit einem organischen Lö ­
sungsmittel und eine Vorkonzentration des Extrakts vorzunehmen. Aus dem ­
selben Grund müssen die eventuell verwendeten Blindprobenkonzentratio ­
nen reduziert werden. Dazu sind hochreine und vorzugsweise für Rück ­
standsanalysen vorgesehene Lösungsmittel zu verwenden. Die Verwendung sorgfältig vorgereinigter Glasgeräte (z. B. durch Spülen mit einem Lösungs ­
mittel oder unter starker Erwärmung) kann zusätzlich helfen, Kreuzkontami ­
nation zu vermeiden.
 
25. Log P  OW kann mit einem geeigneten Programm ermittelt oder von Fachleu ­
ten mit entsprechender Erfahrung geschätzt werden. Bei Werten über 6 müssen Blindwert-Korrekturen und Analyteintragungen sorgfältig überwacht werden. Wenn der geschätzte Wert für log P
 OW über 6 liegt, muss ein 
Surrogatstandard für die Wiederfindungskorrektur verwendet werden, damit 
die erforderlichen hohen Vorkonzentrationsfaktoren erreicht werden können. Auf dem Markt werden verschiedene Computer-Programme zur Schätzung 
von log P
 OW angeboten (  1 ) (z. B. Clog P(16), KOWWIN(17), ProLogP(18) 
und ACD log P(19)). Das Literaturverzeichnis enthält Beschreibungen der verschiedenen Schätzverfahren (20-22).
 
26. Die Quantifizierungsgrenzen (LOQ) für die Bestimmung der Prüfsubstanz in 
1-Octanol und Wasser werden mit anerkannten Methoden bestimmt. Als 
Faustregel kann die Konzentration in Wasser oder 1-Octanol, bei der sich 
ein Signal-/Rauschverhältnis von 10 ergibt, als Quantifizierungsgrenze für die betreffende Methode angenommen werden. Entsprechend sollten eine geeignete Methode zur Extraktion und zur Vorkonzentration ausgewählt 
und Verfahren für die analytische Wiederfindung spezifiziert werden. Der 
Vorkonzentrationsfaktor ist so auszuwählen, dass sich bei der Analyse ein Signal der geforderten Stärke ergibt.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 165  
( 1 ) Die Angaben dienen nur zur Information. Wenn mit anderen Programmen nachweislich 
dieselben Ergebnisse ermittelt werden, können auch diese Programme verwendet werden.
 27. Ausgehend von den Parametern der Analysemethode und von den erwarte ­
ten Konzentrationen wird die Probengröße bestimmt, die für eine genaue 
Bestimmung der Konzentration der jeweiligen Verbindung ungefähr erfor ­
derlich ist. Wasserproben, die so klein sind, dass kein hinreichendes Ana ­
lysesignal festgestellt werden kann, sollten nicht verwendet werden. Ebenso 
sollte die Verwendung zu großer Wasserproben vermieden werden, weil 
ansonsten möglicherweise zu wenig Wasser für die erforderlichen Analysen (n = 5) verbleibt. In Anlage 1 wird das Proben-Mindestvolumen abhängig vom Gefäßvolumen, von der Nachweisgrenze der Prüfsubstanz und von der 
Löslichkeit der Prüfsubstanz angegeben.
 
28. Die Quantifizierung der Prüfsubstanzen erfolgt durch den Vergleich mit 
Kalibrierungskurven der entsprechenden Verbindung. Die Konzentrationen 
in den analysierten Proben müssen innerhalb der Bandbreite der Standard ­
konzentrationen liegen.  
29. Bei Prüfsubstanzen mit log P  OW -Werten über 6 muss der Wasserprobe vor 
der Extraktion ein Surrogatstandard zugesetzt werden, um die bei der Ex ­
traktion und bei der Vorkonzentration der Wasserprobe auftretenden Ver ­
luste zu erfassen. Für exakte Wiederfindungskorrekturen müssen die Surro ­
gate Merkmale aufweisen, die denen der Prüfsubstanz möglichst ähnlich 
sind oder vollständig mit deren Merkmalen übereinstimmen. Dazu werden 
vorzugsweise mit einem (stabilen) Isotop markierte, den Prüfsubstanzen analoge Verbindungen verwendet (z. B. deuterierte oder mit
 13 C markierte 
Verbindungen). Wenn mit einem stabilen Isotop (d. h. mit  13 C oder  2 H) 
markierte Verbindungen nicht verwendet werden können, sollte anhand zu ­
verlässiger Daten in der Fachliteratur nachgewiesen werden, dass die physikalisch-chemischen Merkmale der Surrogate den Merkmalen der Prüf ­
substanzen sehr nahekommen. Bei der Flüssig-flüssig-Extraktion der wäss ­
rigen Phase können Emulsionen entstehen. Diese Emulsionen können durch 
die Zugabe von Salz und Ausfällen der Emulsion über Nacht verringert werden. Die Methoden zur Extraktion und zur Vorkonzentration der Proben sind zu protokollieren.
 
30. Aus der 1-Octanol-Phase gezogene Proben können vor der Analyse erfor ­
derlichenfalls mit einem geeigneten Lösungsmittel verdünnt werden. Die Verwendung von Surrogatstandards zur Wiederfindungskorrektur wird für 
Substanzen empfohlen, bei denen in Wiederfindungsprüfungen starke 
Schwankungen zu verzeichnen waren (relative Standardabweichung > 10 %).
 
31. Die Analysemethode ist detailliert zu protokollieren. Zu erfassen sind unter 
anderem die Extraktionsmethode, Vorkonzentrations- und Verdünnungsfak ­
toren, Geräteparameter, die Kalibrierungsroutine, der Kalibrierungsbereich, Angaben zur analytischen Wiederfindung der Prüfsubstanzen aus dem Was ­
ser, Zugaben von Surrogatstandards zur Wiederfindungskorrektur, Blindwer ­
te, Nachweisgrenzen und Quantifizierungsgrenzen.
 
Durchführung der Prüfung  
Optimale 1-Octanol-/Wasser-Verhältnisse  
32. Bei der Auswahl der Volumina von Wasser und 1-Octanol sollten die fol ­
genden Punkte berücksichtigt werden: die Quantifizierungsgrenze (LOQ) in 1-Octanol und Wasser, die Vorkonzentrationsfaktoren der Wasserproben, 
das Volumen der aus 1-Octanol und aus Wasser genommenen Proben und 
die zu erwartenden Konzentrationen. Aus durchführungspraktischen Grün ­
den sollte das 1-Octanol-Volumen bei dem System zur Prüfung unter lang ­
samem Rühren so gewählt werden, dass die 1-Octanol-Schicht hinreichend 
stark (> 0,5 cm) ist, damit die Proben ohne Beeinträchtigung aus der 1- 
Octanol-Phase entnommen werden können.
 
33. Typische Phasenverhältnisse für die Bestimmung von Verbindungen mit log 
P OW -Werten von mindestens 4,5 sind 20 bis 50 ml 1-Octanol und 950 bis 
980 ml Wasser in einem 1-l-Gefäß.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 166
 
Prüfbedingungen  
34. Während der Prüfung wird das Reaktionsgefäß mit einem Thermostaten so 
geregelt, dass die Temperaturschwankungen unter 1 °C liegen. Die Unter ­
suchung sollte bei einer Temperatur von 25 °C durchgeführt werden.  
35. Das Prüfsystem sollte vor Tageslichteinfall geschützt werden, indem die 
Prüfungen entweder im Dunkeln durchgeführt werden oder das Reaktions ­
gefäß mit einer Aluminiumfolie bedeckt wird.  
36. Außerdem sollte die Prüfung in (möglichst) staubfreier Umgebung erfolgen.  
37. Das 1-Octanol-Wasser-System wird gerührt, bis das erforderliche Gleichge ­
wicht hergestellt ist. In einem Pilottest unter langsamem Rühren bei regel ­
mäßiger Entnahme von Proben aus der wässrigen Phase und aus der 1- 
Octanol-Phase wird die Zeitspanne bis zur Herstellung des Gleichgewichts 
ermittelt. Zwischen den verschiedenen Probenahmen sollten jeweils mindes ­
tens 5 Stunden liegen.  
38. Die P  OW -Werte sind in mindestens drei unabhängig voneinander durch ­
zuführenden Prüfungen unter langsamem Rühren zu bestimmen.  
Bestimmung der zur Herstellung des Gleichgewichts erforderlichen Zeit ­
spanne  
39. Es wird angenommen, dass das Gleichgewicht dann erreicht ist, wenn das 
Konzentrationsverhältnis für 1-Octanol und Wasser in einem Zeitraum mit 
vier Messzeitpunkten bei einem p-Wert von 0,05 so weit zurückgegangen 
ist, dass der Endwert nicht mehr signifikant von 0 abweicht. Die Zeitspanne zur Herstellung des Gleichgewichts beträgt mindestens einen Tag. Erst dann kann mit der Probenahme begonnen werden. Als Faustregel kann davon 
ausgegangen werden, dass bei Substanzen, bei denen log P
 OW auf unter 5 
geschätzt wird, die Probenahme am zweiten und am dritten Tag erfolgen kann. Bei stärker hydrophoben Verbindungen dauert die Herstellung des Gleichgewichts unter Umständen länger. Bei einer Verbindung mit log 
P
 OW 8,23 (Decachlorbiphenyl) wurde das Gleichgewicht nach 144 Stunden 
erreicht. Ob das Gleichgewicht hergestellt ist, wird anhand mehrfacher Pro ­
benahmen aus einem einzigen Gefäß beurteilt.  
Beginn der Prüfung  
40. Zu Beginn der Prüfung wird das Reaktionsgefäß Wasser befüllt, das mit 1- 
Octanol gesättigt wurde. Dabei sollte genügend Zeit zum Erreichen der thermostatgeregelten Temperatur gelassen werden.
 
41. Die gewünschte Menge der Prüfsubstanz (im erforderlichen Volumen des 
mit Wasser gesättigten 1-Octanol) wird vorsichtig in das Reaktionsgefäß 
gegeben. Dies ist ein entscheidender Schritt bei der Prüfung, da bei der 
Mischung der beiden Phasen Verwirbelungen vermieden werden müssen. Dazu kann die 1-Octanol-Phase langsam mit einer Pipette dicht über der Wasseroberfläche gegen die Wand des Prüfgefäßes getropft werden. Die 1- 
Octanol-Phase fließt dann an der Glaswand hinab und bildet einen Film auf 
der wässrigen Phase. Eine direkte Dekantierung von 1-Octanol in den Kol ­
ben sollte in jedem Fall vermieden werden; unter keinen Umständen sollten 1-Octanol-Tropfen direkt auf die Wasseroberfläche fallen.
 
42. Nach dem Beginn des Rührvorgangs sollte die Rührgeschwindigkeit lang ­
sam gesteigert werden. Wenn die Rührmotoren nicht in geeigneter Weise 
eingestellt werden können, sollte der Einsatz eines Transformators in Erwä ­
gung gezogen werden. Die Rührgeschwindigkeit sollte so eingestellt wer ­
den, dass am Übergang zwischen Wasser und 1-Octanol ein Wirbel mit 
einer Tiefe von 0,5 cm bis höchstens 2,5 cm entsteht. Die Rührgeschwindig ­
keit ist zu verringern, wenn der Wirbel tiefer als 2,5 cm wird; andernfalls können 1-Octanol-Mikrotröpfchen in der wässrigen Phase entstehen und dazu führen, dass die Konzentration der Prüfsubstanz im Wasser überschätzt 
wird. Die Rührgeschwindigkeit, bei der ein Wirbel mit einer Tiefe von 
höchstens 2,5 cm entsteht, wird ausgehend von den Ergebnissen der Ringtest-Validierungsstudie empfohlen (5). Diese Rührgeschwindigkeit ge ­
währleistet einen Kompromiss zwischen der möglichst raschen Herstellung 
des erforderlichen Gleichgewichts und der Vermeidung von 1-Octanol-Mi ­
krotröpfchen.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 167
 
Probenahme und Behandlung der Proben  
43. Vor der Probenahme sollte der Rührmotor ausgeschaltet und gewartet wer ­
den, bis die Flüssigkeiten zur Ruhe gekommen sind. Nach der Probenahme wird der Rührmotor bei geringer Rührgeschwindigkeit wieder eingeschaltet 
und die Rührgeschwindigkeit wie oben beschrieben langsam gesteigert.
 
44. Die Probenahme aus der wässrigen Phase erfolgt aus einem Absperrhahn 
unten am Reaktionsgefäß. Dabei ist das Totvolumen des im Hahn enthalte ­
nen Wassers (in dem in Anlage 2 abgebildeten Gefäß etwa 5 ml) zu ver ­
werfen. Das im Hahn enthaltene Wasser wurde nicht umgerührt und befindet 
sich daher nicht im Gleichgewicht mit der übrigen Flüssigkeit. Das Volumen 
der Wasserproben wird protokolliert; außerdem ist die Menge der im ver ­
worfenen Wasservolumen enthaltenen Prüfsubstanz bei der Berechnung der Massenbilanz zu berücksichtigen. Verdampfungsverluste sollten vermieden 
werden; dazu sollte dem Wasser Gelegenheit gegeben werden, ruhig in den 
Abscheidetrichter abzufließen, damit die Wasser-1-Octanol-Schicht nicht ge ­
stört wird.
 
45. Die Probenahme aus der 1-Octanol-Phase erfolgt, indem eine kleine Ali ­
quote (ca. 100 μl) mit einer 100-Mikroliter-Glas-Metall-Spritze aus der 1- 
Octanol-Schicht gezogen wird. Dabei ist darauf zu achten, dass der Über ­
gangsbereich nicht berührt wird. Anschließend wird das Volumen der als Probe entnommenen Flüssigkeit protokolliert. Eine kleine Aliquote ist aus ­
reichend, da die 1-Octanol-Probe verdünnt wird.
 
46. Bei der Handhabung der Proben sollten unnötige Übertragungsschritte ver ­
mieden werden. Daher sollte das Probenvolumen gravimetrisch bestimmt 
werden. Bei Wasserproben kann dies geschehen, indem die Wasserproben in einem Abscheidetrichter gesammelt werden, der bereits die erforderliche 
Lösungsmittelmenge erhält.
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
47. Bei der hier beschriebenen Prüfmethode wird P  OW aufgrund von drei Prü ­
fungen der zu untersuchenden Verbindung (drei Prüfeinheiten) unter lang ­
samem Rühren bestimmt; dabei müssen jeweils identische Bedingungen 
gegeben sein. Die zum Nachweis des hergestellten Gleichgewichts vor ­
genommene Regression sollte auf den Ergebnissen von mindestens vier C
 O /C W -Werten zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten beruhen. Anhand die ­
ser Ergebnisse kann eine Varianz als Maß für die Unsicherheit des pro 
Prüfeinheit ermittelten Durchschnittswerts berechnet werden.  
48. P  OW kann über die Varianz der in den einzelnen Prüfeinheiten ermittelten 
Daten beschrieben werden. Aufgrund dieser Information wird P  OW nämlich 
als gewichteter Durchschnitt der Ergebnisse der einzelnen Prüfeinheiten be ­
rechnet. Dazu wird der Kehrwert der Varianz der Ergebnisse der Prüfein ­
heiten als Gewichtung angenommen. Dies hat zur Folge, dass sich Daten mit großen Schwankungen (ausgedrückt in einer hohen Varianz) und ent ­
sprechend geringerer Zuverlässigkeit weniger auf das Ergebnis auswirken 
als Daten mit niedriger Varianz.
 
49. In entsprechender Weise wird die gewichtete Standardabweichung berech ­
net. Die Standardabweichung beschreibt die Wiederholbarkeit der P  OW -Mes­
sung. Eine niedrige gewichtete Standardabweichung ist Ausdruck einer sehr hohen Wiederholbarkeit der P
 OW -Bestimmung in ein und demselben Labor. 
Im Folgenden wird die formale statistische Behandlung der Daten beschrie ­
ben. ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 168
 
Auswertung der Ergebnisse  
Nachweis der Herstellung des Gleichgewichts  
50. Für jeden Probenahmezeitpunkt wird der Logarithmus des Verhältnisses der 
Konzentration der Prüfsubstanz in 1-Octanol und Wasser (log (C  O /C W )) 
berechnet. Die Herstellung des chemischen Gleichgewichts wird nachgewie ­
sen, indem dieses Verhältnis bezogen auf die betreffende Zeit dargestellt 
wird. Ein Plateau in der aus Messungen zu mindestens vier aufeinander ­
folgenden Zeitpunkten erstellten Kurve zeigt, dass ein Gleichgewicht er ­
reicht und die Verbindung tatsächlich in 1-Octanol gelöst ist. Andernfalls sind die Prüfungen fortzusetzen, bis sich aus den Werten von vier aufeinan ­
derfolgenden Zeitpunkten eine Kurve ergibt, deren Steigung sich bei einem 
p-Wert von 0,05 nicht mehr signifikant von null unterscheidet, und die entsprechend zeigt, dass log C
 O /C W nicht mehr zeitabhängig ist.  
Berechnung von Log P  OW 
51. Log P  OW der Versuchseinheit wird als gewichteter Durchschnitt von log 
C o /C w für den Teil der Kurve zur Darstellung des Verhältnisses von log 
C o /C w zur Zeitspanne berechnet, in dem das Gleichgewicht nachgewiesen 
wurde. Zur Berechnung des gewichteten Durchschnitts werden die Daten 
mit dem Kehrwert der Varianz so berechnet, dass der Einfluss der Daten auf 
das Endergebnis umgekehrt proportional zur Unsicherheit der Daten ist.  
Durchschnittlicher Wert für log P  OW 
52. Der durchschnittliche Wert für log P  OW bei verschiedenen Versuchseinhei ­
ten wird als Durchschnitt der Ergebnisse der einzelnen mit der jeweiligen 
Varianz gewichteten Versuchseinheiten berechnet.  
Die Berechnung erfolgt nach der nachstehenden Formel:  
Log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
Dabei ist  
Log P  OW,i = log P  OW der jeweiligen Versuchseinheit i,  
log P  OW,Av  = gewichteter Durchschnitt der jeweils ermittelten Werte für 
log P  OW , 
w i = statistische Gewichtung von log P  OW der Versuchseinheit i.  
Der Kehrwert der Varianz von log P  OW,i wird als w  i eingesetzt 
(w i ¼ varðlogP  OW ;i Þ –1 ). 
53. Der Fehler des Durchschnitts von log P  OW wird geschätzt als die in den 
einzelnen Versuchseinheiten während der Gleichgewichtsphase ermittelte Wiederholbarkeit von log C
 O /C W und als gewichtete Standardabweichung 
von log P  OW,Av  (σ log POW,Av  ) ausgedrückt, die wiederum ein Maß für den 
mit log P  OW,Av  verbundenen Fehler ist. Die gewichtete Standardabweichung 
kann wie folgt aus der gewichteten Varianz (var  log POW,Av  ) berechnet wer ­
den: 
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
Dabei steht n für die Anzahl der Versuchseinheiten.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 169
 
Prüfbericht  
54. Der Prüfbericht sollte folgende Informationen enthalten:  
Prüfsubstanz:  
— Handelsname (Common name), chemischer Name, CAS-Nummer, 
Strukturformel (mit Angabe der Lage der Markierung bei Verwendung 
radioaktiv markierten Materials) und relevante physikalisch-chemische Eigenschaften (siehe Nummer 17),
 
— Reinheit (Verunreinigungen) der Prüfsubstanz,  
— Reinheit der Markierung von markierten Chemikalien und molare Ak ­
tivität (soweit zutreffend),  
— vorläufige Schätzung von log P  OW sowie Methode zur Ableitung des 
Wertes.  
Prüfbedingungen:  
— Daten der Durchführung der Untersuchungen,  
— Temperatur während der Prüfung,  
— Volumina an 1-Octanol und Wasser bei Beginn der Prüfung,  
— Volumina der entnommenen 1-Octanol- und Wasserproben,  
— in den Prüfgefäßen verbliebene Volumina an 1-Octanol und Wasser,  
— Beschreibung der Prüfgefäße und der Rührbedingungen (Geometrie von 
Rührstab und Prüfgefäß, Wirbeltiefe in mm und — wenn bekannt — 
Rührgeschwindigkeit),  
— Analysemethoden zur Bestimmung der Prüfsubstanz und Methode zur 
Bestimmung der Quantifizierungsgrenze,  
— Probenahmezeiten,  
— pH-Wert der wässrigen Phase und verwendete Pufferlösungen, wenn der 
pH-Wert unter Berücksichtigung der ionisierbaren Moleküle korrigiert 
wurde,  
— Anzahl der Wiederholungen.  
Ergebnisse:  
— Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit der verwendeten Analysemetho ­
den, 
— bestimmte Konzentrationen der Prüfsubstanz in 1-Octanol und in Wasser 
abhängig von der Zeit,  
— Berechnung der Massenbilanz,  
— Temperatur und Standardabweichung oder Temperaturbereich während 
der Prüfung,  
— zeitabhängige Regression des Konzentrationsverhältnisses,  
— durchschnittlicher Wert log P  OW,Av  und Standardfehler,  
— Diskussion und Auswertung der Ergebnisse,  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 170
 
— beispielhafte Rohdaten repräsentativer Analysen (sämtliche Rohdaten 
sind gemäß den GLP-Standards zu speichern); u. a. Daten zur Wieder ­
findung von Surrogaten, Anzahl der bei der Kalibrierung verwendeten Konzentrationen (sowie Kriterien für den Korrelationskoeffizienten der Kalibrierungskurve) und Ergebnisse der Qualitätssicherung/Qualitätskon ­
trolle (QA/QC),
 
— wenn verfügbar: Validierungsbericht zum Untersuchungsverfahren (im 
Literaturverzeichnis anzugeben).  
LITERATUR:  
1. De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of 
octanol/water partition coefficients with the ’slow-stirring“ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.
 
2. Kapitel A.8 dieses Anhangs, Verteilungskoeffizient.  
3. Kapitel A.8 dieses Anhangs, Verteilungskoeffizient.  
4. OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.
 
5. Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
 
6. Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.  
7. Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental 
Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.  
8. Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwar ­
zenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of 
tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition.  Environ. Sci. 
Technol.  31: 2596-2602.  
9. OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dis ­
sociation Constants in Water. Paris.  
10. Kapitel A.6 dieses Anhangs, Wasserlöslichkeit.  
11. Kapitel C.7 dieses Anhangs, Abbaubarkeit — abiotischer Abbau: Hydrolyse 
in Abhängigkeit vom pH-Wert.  
12. Kapitel C.4 — Teile II — VII (Methoden A bis F) dieses Anhangs -Be ­
stimmung der „leichten“ biologischen Abbaubarkeit.  
13. Kapitel A.4 dieses Anhangs, Dampfdruck.  
14. Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  40: 623-626.  
15. Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Ly ­
man WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Wa ­
shington, DC, 2-1 to 2-52.  
16. Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical 
Information Systems, Irvine, CA.  
17. Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.  
18. Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.  
19. ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Canada, 2001.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 171
 
20. Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl 
WF, Rosenblatt DH, eds,  Handbook of chemical property estimation , Ame­
rican Chemical Society, Washington, D.C.  
21. Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An 
extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  14: 479- 
488. 
22. Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed,  Methoden der Organischen Chemie : 
386-390.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 172
 
Anlage 1  
Tabelle zur Berechnung der für den Nachweis von prüfsubstanzen mit 
unterschiedlichen logP  OW -Werten in der wässrigen Phase mindestens 
erforderlichen Volumina  
Voraussetzungen:  
— Maximales Volumen der einzelnen Aliquoten = 10 % des Gesamtvolumens; 
5 Aliquoten = 50 % des Gesamtvolumens.  
— Konzentration der Prüfsubstanzen = 0,7 × Löslichkeit in beiden Phasen; bei 
niedrigeren Konzentrationen sind größere Volumina erforderlich.  
— Zur Bestimmung der Nachweisgrenze verwendetes Volumen = 100 ml.  
— log P  OW vs. Log S  W und log P  OW vs. SR (S  OCT /S W ) sind sinnvolle Darstel ­
lungen der Beziehungen zwischen den Prüfsubstanzen.  
Geschätzter Wert für S  w 
log P  ow Formel log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 3,192 6,427E-04  
Geschätzter Wert für S  oct 
log P  ow Formel S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 173
 
Gesamtmasse der 
Prüfsubstanz 
(mg) Masse  Oct / 
Masse  Wasser  Masse  H2O 
(mg) Konz  H2O 
(mg/l) Masse  oct 
(mg) Konz  oct 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 
3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 
4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Berechnung der Volumina  
Erforderliches Mindestvolumen der H  2 O-Phase bei den verschiedenen LOD-Konzentrationen  
log K  ow LOD (μg/l)→ 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Volumen für 
Nachweis ­
grenze LOD (l) 0,1 
Erläuterungen  
< 10 % des Gesamtvolumens der wässrigen Phase, 1-l-Ausgleichsgefäß.  
< 10 % des Gesamtvolumens der wässrigen Phase, 2-l-Ausgleichsgefäß.  
< 10 % des Gesamtvolumens der wässrigen Phase, 5-l-Ausgleichsgefäß.  
< 10 % des Gesamtvolumens der wässrigen Phase, 10-l-Ausgleichsgefäß.  
Mehr als 10 % des Volumens eines 10-l-Ausgleichsgefäßes.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 174
 
Übersicht über die benötigten Volumina abhängig von der Wasserlöslichkeit und von log P  OW 
Erforderliches Mindestvolumen der H  2 O-Phase bei den verschiedenen LOD-Konzentrationen (ml)  
log P  ow S w (mg/l) LOD ( μg/l)→ 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 
1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 
0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l) LOD ( μg/l)→ 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Volumen für Nachweis ­
grenze LOD (l) 0,1 
Anlage 2  
Beispiel eines Prüfgefäßes mit Glasmantel zur Bestimmung von P  OW unter 
langsamem Rühren
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 176
 
TEIL B: METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER TOXIZITÄT UND 
SONSTIGER AUSWIRKUNGEN AUF DIE GESUNDHEIT  
INHALTSVERZEICHNIS 
ALLGEMEINE EINLEITUNG 
B.1 bis. AKUTE ORALE TOXIZITÄT — FEST-DOSIS-METHODE 
B.1 tris. AKUTE ORALE TOXIZITÄT — AKUT-TOXISCHE KLAS ­
SENMETHODE 
B.2. AKUTE INHALATIONSTOXIZITÄT 
B.3. AKUTE TOXIZITÄT (DERMAL) B.4. AKUTE TOXIZITÄT: HAUTREIZUNG/-VERÄTZUNG 
B.5. AKUTE TOXIZITÄT: AUGENREIZUNG/-VERÄTZUNG 
B.6. SENSIBILISIERUNG DER HAUT B.7. 28-TAGE-TOXIZITÄTSSTUDIE MIT WIEDERHOLTER ORA ­
LER VERABREICHUNG AN NAGETIEREN 
B.8. PRÜFUNG AUF SUBAKUTE TOXIZITÄT NACH INHALA ­
TION — 28-TAGE-TEST 
B.9. TOXIZITÄT NACH 28-TÄGIGER GABE (DERMAL) 
B.10. MUTAGENITÄT —  IN-VITRO -TEST AUF CHROMOSOME ­
NABERRATIONEN IN SÄUGETIERZELLEN 
B.11. MUTAGENITÄT —  IN-VIVO -TEST AUF CHROMOSOMENA ­
BERRATIONEN IN SÄUGETIERKNOCHENMARKZELLEN 
B.12. MUTAGENITÄT —  IN-VIVO -ERYTHROZYTEN-MIKRO ­
KERNTEST BEI SÄUGERN 
B.13./14. MUTAGENITÄT — RÜCKMUTATIONSTEST UNTER VER ­
WENDUNG VON BAKTERIEN 
B.15. MUTAGENITÄT (EINSCHLIESSLICH PRESCREENING BE ­
TREFFEND KREBSERZEUGENDE EIGENSCHAFTEN) — GENMUTATION —  SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
B.16. MITOTISCHE REKOMBINATION —  SACCHAROMYCES CE ­
REVISIAE  
B.17. MUTAGENITÄT — IN VITRO-GENMUTATIONSTEST AN 
SÄUGETIERZELLEN 
B.18. DNS-SCHÄDIGUNG UND REPARATUR — UNPLANMÄS ­
SIGE DNS-SYNTHESE (UDS) — SÄUGETIERZELLEN — IN VITRO 
B.19.  IN-VITRO -SCHWESTERCHROMATIDAUSTAUSCH-TEST 
B.20. TEST ZUR ERFASSUNG GESCHLECHTSGEBUNDENER RE ­
ZESSIVER LETALMUTATIONEN AN  DROSOPHILA MELA ­
NOGASTER
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 177
 
B.21.  IN-VITRO -ZELLTRANSFORMATIONSTEST 
B.22. SÄUGER- IN-VIVO -DOMINANT-LETAL-TEST 
B.23. SPERMATOGONIEN-CHROMOSOMENABERRATIONSTEST 
BEI SÄUGETIEREN 
B.24.  IN-VIVO -SÄUGER-FELLFLECKENTEST DER MAUS 
B.25.  IN-VIVO -SÄUGER-TRANSLOKATIONSTEST 
B.26. PRÜFUNG AUF SUB-CHRONISCHE ORALE TOXIZITÄT — 
90-TAGE-TOXIZITÄTSSTUDIE BEI WIEDERHOLTER ORA ­
LER VERABREICHUNG AN NAGETIEREN 
B.27. PRÜFUNG AUF SUB-CHRONISCHE ORALE TOXIZITÄT — 
90-TAGE-TOXIZITÄTSSTUDIE BEI WIEDERHOLTER ORA ­
LER VERABREICHUNG AN NICHT-NAGETIEREN 
B.28. PRÜFUNG AUF SUB-CHRONISCHE TOXIZITÄT NACH 
DERMALER APPLIKATION — 90-TAGE-TEST MIT NA ­
GERN 
B.29. PRÜFUNG AUF SUB-CHRONISCHE TOXIZITÄT NACH IN ­
HALATION — 90-TAGE-TEST 
B.30. PRÜFUNGEN AUF CHRONISCHE TOXIZITÄT B.31. STUDIE ZUR PRÜFUNG AUF PRÄNATALE ENTWICK ­
LUNGSTOXIZITÄT 
B.32. PRÜFUNGEN AUF KANZEROGENITÄT 
B.33. KOMBINIERTE STUDIEN ZUR PRÜFUNG AUF CHRO ­
NISCHE TOXIZITÄT UND KANZEROGENITÄT 
B.34. PRÜFUNG AUF REPRODUKTIONSTOXIZITÄT WÄHREND 
EINER GENERATION 
B.35. ZWEIGENERATIONENSTUDIE ZUR PRÜFUNG AUF RE ­
PRODUKTIONSTOXIZITÄT 
B.36. TOXIKOKINETIK 
B.37. VERZÖGERTE NEUROTOXIZITÄT PHOSPHORORGANI ­
SCHER SUBSTANZEN NACH AKUTER EXPOSITION 
B.38. VERZÖGERTE NEUROTOXIZITÄT PHOSPHORORGANI ­
SCHER SUBSTANZEN BEI WIEDERHOLTER GABE ÜBER 
28 TAGE 
B.39.  IN-VIVO -TEST ZUR UNPLANMÄSSIGEN DNA-SYNTHESE 
(UDS) IN SÄUGETIERLEBERZELLEN 
B.40.  IN-VITRO -PRÜFUNG AUF HAUTÄTZENDE WIRKUNG: TER- 
TEST (TRANSCUTANEOUS ELECTRICAL RESISTANCE 
TEST) 
B.40 bis.  IN-VITRO -PRÜFUNG AUF HAUTÄTZENDE WIRKUNG: 
TEST MIT MENSCHLISCHEM HAUTMODELL
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 178
 
B.41.  IN-VITRO -3T3-NRU-FOTOTOXIZITÄTSTEST 
B.42. HAUTSENSIBILISIERUNG: LOKALER LYMPHKNOTEN ­
TEST 
B.43. PRÜFUNG AUF NEUROTOXIZITÄT BEI NAGETIEREN 
B.44. HAUTRESORPTION:  IN-VIVO -METHODE 
B.45. HAUTRESORPTION:  IN-VITRO -METHODE 
B.46.  IN-VITRO -HAUTREIZUNG: TEST AN REKONSTRUIERTEN 
MODELLEN HUMANER EPIDERMIS 
B.47. TRÜBUNGS- UND DURCHLÄSSIGKEITSTEST AN DER ISO ­
LIERTEN RINDERHORNHAUT ZWECKS IDENTIFIZIERUNG VON STOFFEN MIT AUGENVERÄTZENDER UND STARK AUGENREIZENDER WIRKUNG 
B.48. TEST AM ISOLIERTEN HÜHNERAUGE ZUR IDENTIFIZIE ­
RUNG VON STOFFEN MIT AUGENVERÄTZENDER UND 
STARK AUGENREIZENDER WIRKUNG 
B.49.  IN VITRO -MIKRONUKLEUSTEST AN SÄUGETIERZELLEN 
B.50. HAUTSENSIBILISIERUNG: LOKALER LYMPHKNOTEN ­
TEST: DA 
B.51. HAUTSENSIBILISIERUNG: LOKALER LYMPHKNOTEN ­
TEST: BRDU-ELISA
 
▼M4 
B.52. AKUTE INHALATIONSTOXIZITÄT — AKUT-TOXISCHE 
KLASSENMETHODE  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 179
 
ALLGEMEINE EINLEITUNG  
A. CHARAKTERISIERUNG DER PRÜFSUBSTANZ  
Die Zusammensetzung der Prüfsubstanz, einschließlich der Haupt ­
verunreinigungen, ihre relevanten physikalisch-chemischen Eigen ­
schaften sowie die Stabilität der Substanz müssen vor Beginn einer 
Toxizitätsuntersuchung bekannt sein.  
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz sind 
mitentscheidend für die Auswahl des Verabreichungsweges, die Art 
der einzelnen Prüfungen sowie für die Handhabung und Lagerung 
der Prüfsubstanz.  
Der eigentlichen Untersuchung sollte daher die Entwicklung eines 
Analyseverfahrens zur qualitativen und quantitativen Bestimmung 
der Prüfsubstanz (möglichst einschließlich der Hauptverunreinigun ­
gen) im Verabreichungsmedium und im biologischen Material vo ­
rausgehen.  
Alle Angaben bezüglich der Identifikation, der physikalisch-che ­
mischen Eigenschaften, der Reinheit und des Verhaltens der Prüf ­
substanz sollten im Prüfbericht enthalten sein.  
B. TIERPFLEGE  
Eine strenge Kontrolle der Umweltbedingungen sowie eine den je ­
weiligen Tierarten angemessene Tierhaltung sind wesentliche Vo ­
raussetzungen für toxikologische Untersuchungen.  
i) Haltungsbedingungen  
Die Umgebungsbedingungen in den Versuchstierräumen sind der 
jeweiligen Tierart anzupassen. Für Ratten, Mäuse und Meerschwein ­
chen ist eine Raumtemperatur von 22  o C ± 3  o C bei einer relativen 
Luftfeuchtigkeit von 30-70 % angezeigt; bei Kaninchen sollte die 
Temperatur 20 ± 3  o C bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 30- 
70 % betragen.  
Einige Untersuchungsmethoden sind besonders empfindlich gegen ­
über Temperatureinflüssen. Für diese Fälle sind Einzelheiten über die 
entsprechenden Umgebungsbedingungen in der Beschreibung des 
Prüfverfahrens enthalten. Bei allen Untersuchungen auf toxische Wirkungen sind Temperatur und Luftfeuchtigkeit zu überwachen, aufzuzeichnen und in den Abschlussbericht der Untersuchung auf ­
zunehmen.
 
Die Beleuchtung sollte künstlich sein und die Hell- und Dunkelpha ­
sen sollten sich im Abstand von 12 Stunden abwechseln. Einzel ­
heiten des Beleuchtungsmusters sind aufzuzeichnen und in den Ab ­
schlussbericht der Studie aufzunehmen.  
Sofern in der Beschreibung der Prüfmethode nichts anderes angege ­
ben ist, sollten die Tiere einzeln oder in kleinen Gruppen aus Tieren desselben Geschlechts in Käfigen untergebracht sein. Bei Gruppen ­
haltung sollten maximal fünf Tiere in einem Käfig untergebracht 
sein.
 
In Berichten über Tierversuche ist unbedingt die Art der Käfighal ­
tung sowie die Anzahl der in einem Käfig untergebrachten Tiere 
sowohl während der Exposition gegenüber der Prüfsubstanz als 
auch während der darauf folgenden Beobachtungszeit anzugeben.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 180
 
ii) Fütterungsbedingungen  
Das Futter muss allen ernährungswissenschaftlichen Anforderungen 
für die jeweils eingesetzte Spezies entsprechen. Werden den Tieren Prüfsubstanzen im Futter verabreicht, so kann der Nährwert durch 
Wechselwirkung zwischen der jeweiligen Substanz und einem Fut ­
terbestandteil eingeschränkt sein. Die Möglichkeit einer solchen Re ­
aktion muss bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt wer ­
den. Es kann herkömmliches Labortierfutter verwendet werden bei 
uneingeschränkter Versorgung mit Trinkwasser. Die Auswahl des 
Futters kann auch dadurch mitbestimmt werden, dass eine geeignete Beimischung der Prüfsubstanz gewährleistet sein muss, wenn die 
Prüfsubstanz auf diese Art verabreicht werden soll.
 
Verunreinigungen im Futter, die sich nachweislich auf die Toxi ­
zität auswirken, dürfen nicht in störenden Konzentrationen vor ­
handen sein.  
C. ALTERNATIVE PRÜFMETHODEN  
Die Europäische Union ist fest entschlossen, die Entwicklung und 
Validierung alternativer Verfahren, welche dieselben Informationen 
liefern können wie die gegenwärtigen Tierversuche, aber weniger 
Tiere erfordern, weniger Leiden verursachen oder die Verwendung von Tieren völlig überflüssig machen, zu fördern.
 
Solche Methoden müssen, sobald sie zur Verfügung stehen, nach 
Möglichkeit für die Charakterisierung von Gefahren und die an ­
schließende Einstufung und Kennzeichnung im Hinblick auf substan ­
zeigene Gefahren in Betracht gezogen werden.  
D. BEWERTUNG UND INTERPRETATION  
Bei der Auswertung und Interpretation von Tests sind gewisse Gren ­
zen hinsichtlich der direkten Extrapolation der Ergebnisse der Tier- und In-vitro -Versuche auf den Menschen zu berücksichtigen; deshalb 
können Belege für unerwünschte Wirkungen beim Menschen, soweit 
solche vorliegen, zur Bestätigung der Versuchsergebnisse herangezo ­
gen werden.
 
E. LITERATURHINWEISE  
Die meisten dieser Methoden werden im Rahmen des OECD-Pro ­
gramms für Prüfrichtlinien entwickelt und sollten in Übereinstim ­
mung mit den Grundsätzen der guten Laborpraxis durchgeführt wer ­
den, um eine möglichst breite gegenseitige Datenakzeptanz zu ge ­
währleisten.  
Weitere Informationen finden sich in den in den OECD-Richtlinien 
genannten Literaturangaben sowie in der an anderen Stellen publi ­
zierten einschlägigen Literatur.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 181
 
B.1 bis — AKUTE ORALE TOXIZITÄT — FEST-DOSIS-METHODE  
1. METHODE  
Diese Prüfmethode entspricht der OECD TG 420 (2001).  
1.1. EINLEITUNG  
Herkömmliche Methoden zur Bewertung der akuten Toxizität ver ­
wenden den Tod der Versuchstiere als Endpunkt. 1984 hat die Bri ­
tish Toxicology Society einen neuen Ansatz zur Bewertung der aku ­
ten Toxizität vorgeschlagen, der von der Verabreichung einer Serie fester Dosen ausging (1). Dieser Ansatz bezog sich nicht auf den Tod der Versuchstiere als Endpunkt, sondern stützte sich auf die 
Beobachtung deutlicher Toxizitätszeichen, die bei einer bestimmten 
Dosis aus einer Serie fester Dosierungen auftraten. Nach  In-vivo - 
Validierungsstudien im Vereinigten Königreich (2) sowie in interna ­
tionalem Rahmen (3) wurde das Verfahren im Jahre 1992 als Prüf ­
methode anerkannt. Später wurden die statistischen Eigenschaften der Fest-Dosis-Methode mit Hilfe mathematischer Modelle in einer Reihe von Studien berechnet (4) (5) (6). Mit  In-vivo -Studien und 
anhand von Modellstudien konnte nachgewiesen werden, dass das 
Verfahren reproduzierbar ist, mit einer geringeren Anzahl an Ver ­
suchstieren auskommt und weniger Leiden verursacht als die her ­
kömmlichen Methoden und eine ähnliche Bewertung der Substanzen 
ermöglicht wie die sonstigen Methoden zur Prüfung der akuten To ­
xizität.
 
Leitlinien für die Auswahl der geeignetsten Testmethode für einen 
bestimmten Zweck enthält das Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (7). Dieser Leitfaden beinhaltet darüber hinaus wei ­
tere Informationen zur Durchführung und Auswertung der Prüf ­
methode B.1 bis.
 
Eines der Prinzipien der Methode besteht darin, dass in der Haupt ­
studie nur mäßig toxische Dosen eingesetzt werden und dass die 
Verabreichung von voraussichtlich letalen Dosen vermieden werden 
sollte. Außerdem brauchen keine Dosierungen verabreicht zu wer ­
den, die aufgrund ätzender oder stark reizender Wirkungen bekann ­
termaßen starke Schmerzen und schweres Leiden verursachen. Mo ­
ribunde Tiere oder Tiere, die offensichtlich unter Schmerzen leiden 
oder Anzeichen von schwerem und anhaltendem Leiden zeigen, sind auf humane Weise zu töten und werden bei der Auswertung der Testergebnisse auf die gleiche Weise gewertet wie während des Tests 
gestorbene Tiere. Kriterien für die Entscheidung, moribunde oder 
schwer leidende Tiere zu töten, sowie Hinweise zur Erkennung des absehbaren oder bevorstehenden Todes sind Gegenstand eines ge ­
sonderten Leitfadens (8).
 
Die Methode führt zu Informationen über die gefährlichen Eigen ­
schaften und ermöglicht die Bewertung und Klassifizierung der Sub ­
stanz gemäß dem Globalen Harmonisierten System (GHS) zur Klas ­
sifizierung chemischer Stoffe mit akut toxischer Wirkung (9).  
Das Prüflabor soll vor der Durchführung der Studie sämtliche ver ­
fügbaren Informationen berücksichtigen. Zu diesen Informationen 
gehören die Identität und die chemische Struktur der zu testenden Substanzen, die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substan ­
zen, die Ergebnisse sonstiger  In-vivo - oder  In-vitro -Toxizitätstests in 
Verbindung mit den betreffenden Substanzen, toxikologische Daten 
über strukturverwandte Substanzen sowie die vorgese ­
hene(n) Verwendung(en) der Substanzen. Diese Informationen wer ­
den benötigt, um die zuständigen Stellen zu überzeugen, dass der 
Test für den Schutz der menschlichen Gesundheit wichtig ist und bei 
der Wahl der geeigneten Startdosis hilft.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 182
 
1.2. DEFINITIONEN  
Akute orale Toxizität:  Schädliche Wirkungen, die nach der oralen 
Verabreichung einer Einzeldosis oder mehrerer innerhalb von 24 Stunden verabreichter Dosen einer Substanz auftreten.
 
Verzögerter Tod:  Das betreffende Tier stirbt zwar nicht binnen 48 
Stunden und wirkt in diesem Zeitraum nicht moribund; der Tod tritt jedoch später während des 14-tägigen Beobachtungszeitraums ein.
 
Dosis:  Verabreichte Menge der Testsubstanz; die Dosis wird als 
Gewicht der Testsubstanz pro Gewichtseinheit des Versuchstiers aus ­
gedrückt (z. B. mg/kg).  
Evidente Toxizität:  Ein allgemeiner Begriff, der deutliche Anzei ­
chen von Toxizität nach der Verabreichung einer Testsubstanz dahin gehend beschreibt, dass bei der nächsthöheren festen Dosis entweder 
starke Schmerzen und anhaltende Anzeichen für schweres Leiden, 
ein moribunder Zustand (Kriterien siehe Humane Endpoints Gui ­
dance Document (8)) oder wahrscheinlich der Tod der meisten Ver ­
suchstiere zu erwarten sind (siehe z. B. (3)).
 
GHS:  Globally Harmonised Classification System for Chemical Sub ­
stances and Mixtures (Weltweit harmonisiertes Klassifizierungssys ­
tem für chemische Substanzen und Gemische); ein gemeinsames Projekt von OECD (Menschliche Gesundheit und Umwelt), UN-Ex ­
pertenausschuss für den Transport von Gefahrgütern (physikalisch- 
chemische Eigenschaften) und ILO (Gefahrenanzeige) koordiniert im Rahmen des Interorganisation Programme for the Sound Manage ­
ment of Chemicals (IOMC).
 
Bevorstehender Tod:  Der moribunde Zustand oder Tod ist vor dem 
nächsten vorgesehenen Beobachtungszeitpunkt zu erwarten. Anzei ­
chen für diesen Zustand können bei Nagetieren Krämpfe, Seitenlage, liegende Stellung und Tremor sein (siehe Humane Endpoint Gui ­
dance Document (8)).
 
LD 50 (mittlere Letaldosis):  Statistisch ermittelte Einzeldosis einer 
Substanz, bei der davon ausgegangen werden kann, dass sie bei oraler Verabreichung den Tod von 50 % der Tiere verursacht; der LD
 50 -Wert wird als Gewicht der Testsubstanz pro Gewichtseinheit 
der Versuchstiere ausgedrückt (mg/kg).  
Limit-Dosis:  Dosis am oberen Grenzwert für den betreffenden Ver ­
such (2 000 oder 5 000 mg/kg)  
Moribunder Zustand: Zustand des Sterbens oder des Unvermögens, 
(selbst bei Behandlung) zu überleben (siehe Humane Endpoint Gui ­
dance Document (8))  
Voraussagbarer Tod:  Vorhandensein klinischer Zeichen, die auf 
den Eintritt des Todes zu einem bekannten Zeitpunkt in der Zukunft — vor dem planmäßigen Ende des Experiments — hinweisen, z. B. 
das Unvermögen, Wasser oder Nahrung aufzunehmen (siehe Hu ­
mane Endpoint Guidance Document (8))
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 183
 
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
An Gruppen von Versuchstieren eines Geschlechts wird in einem 
schrittweisen Verfahren jeweils die feste Dosis 5, 50, 300 und 2 000 mg/kg verabreicht. (Im Ausnahmefall kann eine weitere feste 
Dosis von 5 000 mg/kg in Betracht gezogen werden (siehe 
Abschnitt 1.6.2)). Als Startdosis wird auf der Grundlage einer Vor ­
studie die Dosis gewählt, die voraussichtlich gewisse Toxizitätsanzei ­
chen verursachen wird, ohne schwere toxische Wirkungen oder Mor ­
talität hervorzurufen. Klinische Anzeichen und Zustände, die mit 
Schmerzen, Leiden und bevorstehendem Tod verbunden sind, wer ­
den in einem gesonderten OECD-Leitfaden (8) ausführlich beschrie ­
ben. Weiteren Versuchstiergruppen können höhere oder niedrigere 
feste Dosen in Abhängigkeit davon verabreicht werden, ob Anzei ­
chen von Toxizität oder Mortalität zu erkennen sind. Diese Vor ­
gehensweise wird fortgesetzt, bis die Dosis ermittelt ist, die offen ­
sichtlich toxisch wirkt oder den Tod maximal eines Versuchstieres 
verursacht hat, bzw. bis bei der höchsten Dosis keine Wirkungen zu erkennen sind oder bis bereits bei der niedrigsten Dosis der Tod von Versuchstieren eintritt.
 
1.4. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.4.1.  Auswahl der Tierspezies  
Die bevorzugte Nagetierspezies ist die Ratte, es können aber auch 
andere Spezies verwendet werden. In der Regel werden weibliche Tiere verwendet (7). Weibliche Tiere werden bevorzugt, da die in der Literatur zitierten Untersuchungen zu konventionellen LD
 50- Tests 
zwischen den Geschlechtern in der Regel nur geringfügige Unter ­
schiede hinsichtlich der Empfindlichkeit belegen, in den Fällen, in denen Unterschiede beobachtet werden, jedoch zeigen, dass weibli ­
che Tiere im Allgemeinen etwas empfindlicher sind (10). Wenn 
jedoch die vorhandenen Informationen über die toxikologischen 
oder toxikokinetischen Eigenschaften von strukturverwandten Che ­
mikalien darauf hinweisen, dass vermutlich die männlichen Tiere empfindlicher sind, sollten männliche Tiere verwendet werden. 
Wird ein Versuch an männlichen Tieren durchgeführt, sollte dies 
hinreichend begründet werden.
 
Es sollen junge, gesunde, ausgewachsene Tiere aus üblicherweise 
eingesetzten Laborstämmen verwendet werden. Die weiblichen Tiere 
dürfen weder bereits geworfen haben noch momentan trächtig sein. 
Alle Tiere müssen zu Beginn der Verabreichung zwischen 8 und 12 Wochen alt sein; ihre Gewichtswerte müssen im Bereich von ± 20 % des mittleren Gewichts sämtlicher zuvor verwendeter Tiere liegen.
 
1.4.2.  Haltung und Fütterung  
Die Temperatur des Versuchstierraums soll 22  o C (± 3  o C) betragen. 
Die relative Luftfeuchtigkeit soll mindestens 30 % betragen und außer während der Reinigung vorzugsweise nicht über 70 % liegen; anzustreben ist ein Wert von 50-60 %. Der Raum soll künstlich 
beleuchtet sein, wobei die Beleuchtung im 12-Stunden-Rhythmus 
ein- und ausgeschaltet werden soll. An die Versuchstiere kann her ­
kömmliches Laborfutter verfüttert werden, wobei eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung zu gewährleisten ist. Die Tiere können in den 
Käfigen nach Verabreichungsdosen gruppiert werden, wobei aber die 
Anzahl der Tiere pro Käfig noch eine genaue Beobachtung der ein ­
zelnen Tiere ermöglichen muss.
 
1.4.3.  Vorbereitung der Versuchstiere  
Die Tiere werden nach Zufallskriterien ausgewählt, zwecks Identifi ­
zierung markiert und für die Dauer von mindestens 5 Tagen vor 
Versuchsbeginn in ihren Käfigen gehalten, damit sie sich an die 
Laborbedingungen gewöhnen können.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 184
 
1.4.4.  Vorbereitung der Dosen  
Generell sollen die Testsubstanzen mit einem für den gesamten zu 
testenden Dosierungsbereich gleichbleibenden Volumen verabreicht werden, indem jeweils die Konzentration der Dosiszubereitung vari ­
iert wird. Wenn jedoch ein flüssiges Endprodukt oder Gemisch zu 
testen ist, kann die Anwendung der unverdünnten, d. h. mit gleich ­
bleibender Konzentration verabreichten Testsubstanz für die an ­
schließende Risikobewertung der betreffenden Substanz größere Re ­
levanz haben und wird daher von verschiedenen Behörden vor ­
geschrieben. In jedem Fall darf das maximal zu verabreichende Do ­
sisvolumen nicht überschritten werden. Welches Flüssigkeitsvolumen 
jeweils höchstens auf einmal verabreicht werden kann, hängt von der 
Größe des Versuchstiers ab. Bei Nagetieren soll das Volumen im Normalfall 1 ml pro 100 g Körpergewicht nicht überschreiten; bei wässrigen Lösungen können aber auch 2 ml pro 100 g Körper ­
gewicht in Betracht gezogen weiden. Bezüglich der Formulierung 
wird, wenn dies möglich ist, eine wässrige Lösung/Suspension/ ­
Emulsion empfohlen, danach in der Reihenfolge der Präferenz eine Lösung/Suspension/Emulsion in Öl (z. B. Maisöl) sowie an dritter 
Stelle eventuell eine Lösung in anderen Vehikeln. Bei anderen Ve ­
hikeln als Wasser sollen die toxikologischen Eigenschaften des je ­
weiligen Vehikels bekannt sein. Die Dosen dürfen erst kurz vor der Verabreichung zubereitet werden, sofern die Zubereitung über den 
Zeitraum, in dem sie angewandt werden soll, nicht bekanntermaßen 
eine annehmbare Stabilität aufweist.
 
1.5. VERFAHRENSWEISE  
1.5.1.  Verabreichung der Dosen  
Die Testsubstanz wird als Einzeldosis mit einer Sonde über eine 
Magensonde oder über eine geeignete Intubationskanüle verabreicht. 
In dem seltenen Fall, dass die Verabreichung als Einzeldosis nicht 
möglich ist, kann die Dosis über einen Zeitraum von maximal 24 Stunden in kleineren Teilmengen verabreicht werden.
 
Die Versuchstiere sollten vor der Verabreichung nüchtern sein (z. B. 
sollte Ratten das Futter (nicht das Wasser) über Nacht vorenthalten 
werden; Mäusen sollte das Futter (nicht das Wasser) 3-4 Stunden zuvor vorenthalten werden). Nach diesem Futterentzug sollen die Tiere gewogen werden und die Testsubstanz verabreicht bekommen. 
Nach der Verabreichung der Substanz kann das Futter bei Ratten 
weitere 3-4 Stunden bzw. bei Mäusen weitere 1-2 Stunden zurück ­
gehalten werden. Wenn die Dosis über einen bestimmten Zeitraum hinweg in Teilmengen verabreicht wird, kann es je nach Länge 
dieses Zeitraums erforderlich sein, die Tiere mit Futter und Wasser 
zu versorgen.
 
1.5.2.  Vorstudie  
Zweck der Sichtungsstudie ist die Ermittlung der zweckmäßigen 
Ausgangsdosis für die Hauptuntersuchung, Die Testsubstanz wird 
einzelnen Tieren in einem sequenziellen Verfahren gemäß den Fluss ­
diagrammen in Anlage 1 verabreicht. Die Sichtungsstudie ist abge ­
schlossen, wenn eine Entscheidung über die Ausgangsdosis für die Hauptstudie getroffen werden kann (oder wenn bereits bei der nied ­
rigsten festen Dosis der Tod eines Versuchstiers eintritt).
 
Als Ausgangsdosis für die Sichtungsstudie wird von den festen Do ­
sierungen 5, 50, 300 und 2 000 mg/kg die Dosis ausgewählt, die voraussichtlich eine evidente Toxizität bewirken wird, wobei nach 
Möglichkeit die Erkenntnisse aus  In-vivo - und  In-vitro -Daten für 
denselben chemischen Stoff sowie für strukturverwandte chemische Stoffe zugrunde liegen sollten. Wenn keine entsprechenden Informa ­
tionen vorliegen, wird die Ausgangsdosis 300 mg/kg verwendet.
 
Zwischen den Versuchen an jedem einzelnen Tier liegt ein zeitlicher 
Abstand von mindestens 24 Stunden. Alle Tiere sollten mindestens 
14 Tage lang beobachtet werden,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 185
 
In Ausnahmefallen — und nur, wenn dies durch konkrete Vorschrif ­
ten begründet ist — kann die Anwendung einer weiteren festen 
oberen Dosis von 5 000 mg pro kg Körpergewicht in Erwägung gezogen werden (siehe Anlage 3). Aus Tierschutzgründen wird von Tierversuchen im Bereich der GHS-Kategorie 5 (2 000 — 
5 000 mg/kg) abgeraten; diese Versuche sollten nur dann in Betracht 
gezogen werden, wenn die Ergebnisse eines solchen Tests für den Schutz der Gesundheit von Menschen oder Tieren oder der Umwelt mit hoher Wahrscheinlichkeit direkt relevant sind.
 
Wenn ein Versuchstier, das mit der niedrigsten festen Dosis 
(5 mg/kg) getestet wird, bei der Sichtungsstudie stirbt, wird die 
Studie normalerweise beendet und die Substanz der GHS-Kategorie 
1 zugewiesen (wie in Anlage 1 dargestellt). Ist jedoch eine weitere Bestätigung dieser Klassifizierung erforderlich, kann das folgende ergänzende Verfahren in Betracht gezogen werden: Ein zweites Ver ­
suchstier wird mit der Dosis 5 mg/kg getestet. Wenn dieses zweite 
Tier stirbt, wird die GHS-Kategorie 1 bestätigt und die Studie sofort beendet. Wenn das zweite Tier überlebt, wird maximal drei weiteren Tieren die Dosis 5 mg/kg verabreicht. Da ein hohes Mortalitätsrisiko 
besteht, sollten diese Tiere aus Tierschutzgründen nacheinander ge ­
testet werden. Der zeitliche Abstand zwischen den Versuchen an den einzelnen Tieren sollte groß genug sein, um die Überlebenswahr ­
scheinlichkeit des vorherigen Tieres bestätigen zu können. Wenn 
ein zweites Tier stirbt, wird die Versuchsreihe sofort beendet, und 
es werden keine weiteren Tiere getestet. Da der Tod eines zweiten Tieres (unabhängig davon, wie viele Tiere bis zum Zeitpunkt der Beendigung getestet wurden) zu Ergebnis A zählt (2 oder mehr 
tote Tiere), wird nach der Klassifizierungsregel aus Anlage 2 für 
die feste Dosis 5 mg/kg vorgegangen (Kategorie 1 bei zwei oder mehr toten Versuchstieren bzw. Kategorie 2, wenn nur ein Tier stirbt). Zur Ergänzung wird in Anlage 4 die Klassifizierung im 
EU-System bis zur Einführung des neuen GHS erläutert.
 
1.5.3.  Hauptstudie  
1.5.3.1.  Anzahl der Versuchstiere und Dosierung  
Welche Maßnahmen nach dem Versuch mit der Anfangsdosierung 
durchgeführt werden sollen, ist den Flussdiagrammen in Anlage 2 zu 
entnehmen. In Betracht kommt jeweils eine von drei Maßnahmen: Versuch beenden und die entsprechende Gefahrenklassifikations ­
klasse zuweisen, mit einer höheren festen Dosis testen oder mit einer 
niedrigeren festen Dosis testen. Aus Tierschutzgründen wird jedoch 
eine Dosierung, die in der Sichtungsstudie zum Tod geführt hat, in der Hauptstudie nicht wiederholt (siehe Anlage 2). Die bisher ge ­
machten Erfahrungen lassen als wahrscheinlichstes Ergebnis bei der 
Ausgangsdosierung vermuten, dass die Substanz ohne weitere Tests 
klassifiziert werden kann.
 
Im Normalfall werden für jede untersuchte Dosierung insgesamt fünf 
Tiere gleichen Geschlechts verwendet. Zu diesen fünf Tieren gehö ­
ren ein Tier aus der Sichtungsstudie, dem die gewählte Dosierung verabreicht wurde, sowie vier weitere Tiere (außer wenn im Aus ­
nahmefall eine in der Hauptstudie verwendete Dosierung in der Sich ­
tungsstudie nicht enthalten war).
 
Der Zeitabstand zwischen den Versuchen mit der jeweiligen Dosie ­
rung richtet sich nach dem Einsetzen, der Dauer und dem Schwere ­
grad der Toxizitätsanzeichen. Die Behandlung der Versuchstiere mit der nächsten Dosis sollte hinausgezögert werden, bis angenommen 
werden kann, dass die zuvor verwendeten Tiere überlebt haben. Bei 
Bedarf wird ein Abstand von drei bis vier Tagen zwischen den Versuchen mit den einzelnen Dosierungen empfohlen, um die Fest ­
stellung einer zeitverzögerten Toxizität zu ermöglichen. Dieser Zeit ­
abstand kann nach Bedarf angepasst werden, wenn z. B. die be ­
obachteten Reaktionen keine Schlussfolgerungen zulassen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 186
 
Wenn eine obere feste Dosis von 5 000 mg/kg in Erwägung gezogen 
wird, sollte verfahren werden, wie in Anlage 3 beschrieben (siehe 
auch Abschnitt 1.6.2).  
1.5.3.2.  Limit-Test  
Der Limit-Test wird hauptsächlich dann eingesetzt, wenn die Person, 
die den Test durchführt, nach ihr vorliegenden Informationen anneh ­
men kann, dass das zu testende Material wahrscheinlich nicht toxisch 
ist, d. h. nur oberhalb der in Vorschriften festgelegten Grenzdosen 
toxisch wirkt. Informationen über die Toxizität des Testmaterials können aus Kenntnissen über ähnliche getestete Verbindungen, Ge ­
mische oder Produkte gewonnen werden, wobei Art und Prozent ­
anteil der Komponenten zu berücksichtigen sind, deren toxikologi ­
sche Relevanz bekannt ist. In den Fällen, in denen nur wenige oder keine Informationen über die Toxizität des Testmaterials vorliegen 
oder in denen von einer Toxizität des Testmaterials ausgegangen 
wird, sollte der Haupttest durchgeführt werden.
 
Bei der normalen Vorgehensweise wird für den Limit-Test im Rah ­
men dieses Leitfadens eine Ausgangsdosis von 2 000 mg/kg (bzw. 
im Ausnahmefall 5 000 mg/kg) für die Sichtungsstudie verwendet; 
anschließend werden vier weitere Tiere dieser Dosis ausgesetzt.  
1.6. BEOBACHTUNGEN  
Die Tiere werden nach der Verabreichung einzeln beobachtet: min ­
destens einmal während der ersten 30 Minuten, in regelmäßigen 
Abständen während der ersten 24 Stunden, wobei die ersten vier 
Stunden besonders zu beachten sind, sowie anschließend täglich während einer Gesamtdauer von 14 Tagen, sofern die Tiere nicht aus Tierschutzgründen aus dem Versuch genommen und auf humane 
Weise gelötet werden müssen oder ihr Tod festgestellt wird. Die 
Beobachtungsdauer sollte nicht strikt festgelegt werden, sondern ab ­
hängig von den toxischen Reaktionen, vom Zeitpunkt des Einsetzens dieser Reaktionen und von der Länge der Erholungsdauer festgelegt 
werden und kann daher ausgedehnt werden, wenn dies erforderlich 
scheint. Der Zeitpunkt, zu dem die Anzeichen von Toxizität auftreten und wieder verschwinden, ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn eine Tendenz zur zeitlichen Verzögerung der Toxizitätsanzei ­
chen besteht (11). Sämtliche Beobachtungen werden für die Tiere 
systematisch jeweils in Einzelprotokollen dokumentiert.
 
Zusätzliche Beobachtungen sind erforderlich, wenn bei den Tieren 
weiterhin Anzeichen für Toxizität zu beobachten sind. Die Beobach ­
tungen sollten Veränderungen an Haut und Fell, Augen und Schleim ­
häuten erfassen und auch die Atmung, den Kreislauf, das vegetative und zentrale Nervensystem sowie somatomotorische Aktivitäten und Verhaltensmuster berücksichtigen. Auf Symptome wie Tremores, 
Krämpfe, Speichelfluss, Durchfall, Lethargie, Schlaf und Koma 
sollte geachtet werden. Die im Humane Endpoints Guidance Docu ­
ment (8) zusammengefassten Prinzipien und Kriterien sind zu be ­
rücksichtigen. Tiere, bei denen ein moribunder Zustand festgestellt 
wird, sowie Tiere, die starke Schmerzen haben oder anhaltende An ­
zeichen von schwerem Leiden zeigen, sollten auf humane Weise getötet werden. Wenn Tiere aus humanen Gründen getötet werden 
oder ihr Tod festgestellt wird, sollte der Todeszeitpunkt so genau wie 
möglich registriert werden.
 
1.6.1.  Körpergewicht  
Das Gewicht der einzelnen Tiere soll kurz vor der Verabreichung der 
Testsubstanz sowie spätestens eine Woche danach ermittelt werden. Gewichtsveränderungen sollen berechnet und registriert werden. Am 
Ende des Tests werden die überlebenden Tiere gewogen und an ­
schließend auf humane Weise getötet.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 187
 
1.6.2.  Pathologie  
Alle Versuchstiere (einschließlich der Tiere, die während des 
Tests sterben oder aus Tierschutzgründen aus der Studie genom ­
men werden) sollen auf makrologische Veränderungen untersucht 
werden. Alle makrologischen Veränderungen sollen für jedes ein ­
zelne Tier registriert werden. Bei Tieren, die 24 oder mehr Stunden lang überlebt haben, kann auch eine mikroskopische Untersuchung von Organen mit makropathologischen Befunden 
in Erwägung gezogen werden, da sich hieraus eventuell nützliche 
Informationen gewinnen lassen.
 
2. DATEN  
Es sollen Daten zu den einzelnen Tieren bereitgestellt werden. Da ­
rüber hinaus sollen sämtliche Daten in tabellarischer Form zusam ­
mengefasst werden, wobei für jede Testgruppe die folgenden Daten 
zu erfassen sind; Anzahl der verwendeten Tiere, Anzahl der Tiere mit Anzeichen für eine toxische Wirkung, Anzahl der Tiere, deren Tod während des Versuchs festgestellt wurde oder die aus humanen 
Gründen getötet wurden, Todeszeitpunkt der einzelnen Tiere, Be ­
schreibung und Zeitverlauf der toxischen Wirkungen und ihrer Re ­
versibilität sowie pathologische Befunde.
 
3. BERICHT  
3.1. TESTBERICHT  
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten (soweit an ­
gemessen):  
Testsubstanz:  
— physikalische Beschaffenheit, Reinheit und, sofern relevant, phy ­
sikalisch-chemische Eigenschaften (einschließlich Isomerisie ­
rung),  
— Identifizierungsdaten, einschließlich CAS-Nummer.  
Vehikel (wenn verwendet):  
— Begründung für die Auswahl des Vehikels (außer bei Wasser).  
Versuchstiere:  
— verwendete Spezies/Stamm,  
— mikrobiologischer Zustand der Tiere, sofern bekannt,  
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere (gegebenenfalls mit Be ­
gründung für den Einsatz von männlichen statt weiblichen Tie ­
ren), 
— Bezugsquelle der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.  
Testbedingungen:  
— Angaben über die Zubereitung der Testsubstanz, einschließlich 
Angaben über die physikalische Beschaffenheit des verabreichten 
Stoffs,  
— Angaben über die Verabreichung der Testsubstanz, einschließlich 
Applikationsvolumen und Zeitpunkt der Verabreichung,  
— Angaben zur Futter- und Wasserqualität (einschließlich Art/ ­
Herkunft des Futters, Herkunft des Wassers),  
— Begründung für die Wahl der Startdosis.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 188
 
Ergebnisse:  
— tabellarische Erfassung der erhobenen Daten und der Dosis für 
jedes einzelne Tier (d. h. Tiere, die Anzeichen für Toxizität 
zeigen, einschließlich Mortalität sowie Art, Schweregrad und 
Dauer der Wirkungen),  
— tabellarische Erfassung des Körpergewichts und der Änderungen 
des Körpergewichts,  
— Gewicht der einzelnen Tiere am Tag der Verabreichung, danach 
in wöchentlichen Abständen sowie am Tag des Todes bzw. der Tötung,
 
— Datum und Uhrzeit des Todes, sofern vor der planmäßigen Tö ­
tung eingetreten,  
— zeitlicher Verlauf des Einsetzens von Toxizitätsanzeichen sowie 
Angabe, ob diese reversibel waren (für jedes Tier gesondert),  
— Obduktionsergebnisse und histopathologische Ergebnisse für je ­
des einzelne Tier (wenn vorhanden).  
Diskussion und Interpretation der Ergebnisse.  
Schlussfolgerung.  
4. LITERATUR  
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report: a new approach to the classification of sub ­
stances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.
 
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. 
(1987), Evaluation of the BTS approach to the testing of sub ­
stances and preparations for their acute toxicity. Human Toxi ­
col., 6, 279-291.  
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walter, 
AP. (1990). The international validation of a fixed-dose pro ­
cedure as an alternative to the classical LD  50 test. Fd. Chem. 
Toxicol. 28, 469-482.  
(4) Whitehead, A. and Cumow, R.N. (1992). Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.  
(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers 
in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 
315-323. Human Exptl. Toxicol.  
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statisti ­
cal evaluation of the revised fixed dose procedure. Human 
Exptl. Toxicol., 21, 183-196.  
(7) OECD (200l). Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 189
 
(9) OECD (1998), Harmonised Integrated Hazard Classification 
for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Che ­
micals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, S. 11 (http://webnet1.oecd.org/oecd/ 
pages/home/displaygener; d/0,3380,EN- documents-521-14-no- 
24-no-0,FF.html).
 
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N.; Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and- 
Down, Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity 
Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.  
(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity 
and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3
 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd, New York, 
USA.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 190
 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 191
 ▼B 
Anlage 1  
PRÜFVERFAHREN FÜR DIE VORSTUDIE

 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 193
 ▼B 
Anlage 2  
PRÜFVERFAHREN FÜR DIE HAUPTSTUDIE

 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 194
 ▼B

 
Anlage 3  
KRITERIEN FÜR DIE KLASSIFIZIERUNG VON TESTSUBSTANZEN 
MIT ERWARTETEN LD  50 -WERTEN ÜBER 2 000 MG/KG OHNE 
ERFORDERLICHE TESTS  
Die Kriterien für die Gefahrenkategorie 5 sollen die Identifikation von Testsub ­
stanzen ermöglichen, die eine vergleichsweise geringe akute Toxizitätsgefahr 
aufweisen, aber unter bestimmten Umstanden eine Gefahr für anfällige Bevölke ­
rungsgruppen darstellen. Bei diesen Substanzen wird von einer oralen oder der ­
malen LD  50 im Bereich 2 000-5 000 mg/kg bzw. von vergleichbaren Dosen für 
andere Verabreichungswege ausgegangen. Die Testsubstanzen sollte in den fol ­
genden Fällen in die Gefahrenkategorie 2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg 
(GHS-Kategorie 5) eingestuft werden:  
a) wenn eines der Prüfschemata aus Anlage 2 aufgrund von Mortalitätsfällen 
dieser Kategorie zuzuordnen ist;  
b) wenn bereits zuverlässige Erkenntnisse dafür vorliegen, dass der LD  50 -Wert 
im Bereich der Kategorie 5 liegt, oder wenn andere Tierversuche oder toxi ­
sche Wirkungen auf Menschen akute Folgen für die menschlichen Gesundheit erwarten lassen;
 
c) wenn nach Extrapolierung, Schätzung oder Messung von Daten die Zuord ­
nung zu einer höheren Gefahrenklasse nicht gerechtfertigt ist und  
— zuverlässige Informationen vorliegen, die auf signifikante toxische Wir ­
kungen beim Menschen hinweisen, oder  
— Mortalitäten bei oraler Verabreichung in Versuchen mit Dosen bis zu der 
Kategorie 4 auftreten, oder  
— eine fachkundige Beurteilung bei Versuchen mit Dosierungen bis zu den 
in Kategorie 4 genannten Werten signifikante klinische Toxizitätsanzei ­
chen bestätigt (außer Durchfall, Haaraufrichtung oder zerzaustes Fell), oder
 
— eine fachkundige Beurteilung verlässliche Informationen bestätigt, die aus 
den anderen Tierversuchen ein Potenzial für signifikante akute Wirkungen 
erkennen lassen.  
VERSUCHE MIT DOSEN ÜBER 2 000 mg/kg  
In Ausnahmefällen — und nur, wenn dies durch konkrete Vorschriften begründet 
ist — kann die Anwendung einer weiteren festen oberen Dosis von 5 000 mg 
pro kg Körpergewicht in Erwägung gezogen werden. Aus Tierschutzgründen wird von Versuchen mit 5 000 mg/kg abgeraten; diese Versuche sollen nur dann in Erwägung gezogen werden, wenn die Ergebnisse eines solchen Versuchs 
für den Schulz der Gesundheit von Menschen oder Tieren oder der Umwelt mit 
hoher Wahrscheinlichkeit direkt relevant sind (9).
 
Vorstudie  
Die Entscheidungsgrundlagen für das in Anlage 1 vorgestellte sequenzielle Ver ­
fahren werden auf eine Dosis von 5 000 mg/kg erweitert: Wenn eine Startdosis 
von 5 000 mg/kg für die Vorstudie verwendet wird, bedingt Ergebnis A (Tod) den Test eines zweiten Tieres mit 2 000 mg/kg; die Ergebnisse B und C (evi ­
dente Toxizität oder keine Toxizität) führen zum Einsatz von 5 000 mg/kg als 
Startdosis für die Hauptstudie. Analog wird bei Verwendung einer anderen Start ­
dosis als 5 000 mg/kg der Versuch mit 5 000 mg/kg fortgesetzt, wenn bei 2 000 mg/kg Ergebnis B oder C eintritt; wenn anschließend bei 5 000 mg/kg Ergebnis A eintritt, bedingt dies eine Startdosis von 2 000 mg/kg bei der Hauptstudie, 
während die Ergebnisse B und C zu einer Startdosis von 5 000 mg/kg bei der 
Hauptstudie führen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 195
 
Hauptstudie  
Die Entscheidungsgrundlagen für das in Anlage 2 vorgestellte sequenzielle Ver ­
fahren werden auf eine Dosierung von 5 000 mg/kg erweitert: Wenn in der Hauptstudie eine Startdosis von 5 000 mg/kg verwendet wird, ist bei Ergebnis A (≥ 2 tote Versuchstiere) eine zweiten Gruppe mit 2 000 mg/kg zu testen; die 
Ergebnisse B (evidente Toxizität und/oder ≤ 1 totes Versuchstier) oder C (keine 
Toxizität) fuhren dazu, dass die Substanz keine Klassifizierung gemäß GHS erhält. Analog wird bei Verwendung einer anderen Startdosis als 5 000 mg/kg der Versuch mit 5 000 mg/kg fortgesetzt, wenn bei 2 000 mg/kg Ergebnis C 
eintritt; führt eine Gabe von 5 000 mg/kg zu Ergebnis A, wird die Substanz 
GHS-Kategorie 5 zugewiesen; bei den Ergebnissen B und C wird die Substanz nicht klassifiziert.
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 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 197
 ▼B 
Anlage 4  
PRÜFMETHODE B.l bis  
Anleitung für die Klassifizierung gemäß dem EU-System zur Überbrückung des Übergangszeitraums bis zur vollständigen Umsetzung d es „Globalen Harmonisierten Systems“ (GHS) 
(Auszug aus Literaturhinweis (8))

 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 198
 ▼B

 
B.1.tris.  AKUTE ORALE TOXIZITÄT — AKUT-TOXISCHE 
KLASSENMETHODE  
1. METHODE  
Diese Prüfmethode entspricht der OECD TG 423 (2001).  
1.1. EINLEITUNG  
Die hier beschriebene Akut-Toxische Klassenmethode (1) besteht aus 
einem schrittweisen Verfahren, bei dem pro Einzelschritt jeweils drei Tiere des gleichen Geschlechts verwendet werden. Je nach Mortalität und/oder moribundem Zustand der Tiere können im Mittel zwei bis 
vier Schritte erforderlich sein, um eine Beurteilung der akuten Toxi ­
zität der Testsubstanz zu ermöglichen. Dieses Verfahren ist repro ­
duzierbar, erfordert nur sehr wenige Tiere und ermöglicht eine 
gleichartige Bewertung der Substanzen wie andere Methoden zur 
Prüfung der akuten Toxizität. Die Akut-Toxische Klassenmethode basiert auf biometrischen Berechnungen (2) (3) (4) (5) mit fest ­
gesetzten Dosen, die sich hinreichend unterscheiden, um die Einord ­
nung einer Substanz zu Klassifizierungszwecken und zur Bewertung 
des Gefährdungspotenzials zu ermöglichen. Die Methode, wie sie 1996 anerkannt wurde, wurde durch umfassende  In-vivo -Versuche 
im Vergleich mit LD
 50 -Daten aus der Literatur sowohl auf nationaler 
(6) als auch auf internationaler (7) Ebene validiert.  
Leitlinien für die Auswahl der geeignetsten Testmethode für einen 
bestimmten Zweck enthält das Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8). Dieser Leitfaden beinhaltet darüber hinaus wei ­
tere Informationen zur Durchführung und Auswertung der Prüf ­
methode B.1 tris.
 
Testsubstanzen sind nicht in Dosen zu verabreichen, wenn diese 
aufgrund ätzender oder stark reizender Wirkungen bekanntermaßen 
starke Schmerzen und schweres Leiden verursachen. Moribunde Tiere oder Tiere, die offensichtlich unter Schmerzen leiden oder Anzeichen von schwerem und anhaltendem Leiden zeigen, sind auf 
humane Weise zu töten und werden bei der Auswertung der Test ­
ergebnisse auf die gleiche Weise gewertet wie während des Tests gestorbene Tiere. Kriterien für die Entscheidung, moribunde oder schwer leidende Tiere zu töten, sowie Hinweise zur Erkennung des 
absehbaren oder bevorstehenden Todes sind Gegenstand eines ge ­
sonderten Leitfadens (9).
 
Die Methode beruht auf festgesetzten Dosen, und die Ergebnisse 
ermöglichen die Bewertung und Klassifizierung von Substanzen ge ­
mäß dem Globalen Harmonisierten System (GHS) zur Klassifizie ­
rung chemischer Stoffe mit akut-toxischen Wirkungen (10).  
Vom Prinzip her ist die Methode nicht zur Berechnung eines exakten 
LD 50 -Wertes geeignet, sondern zur Bestimmung definierter Exposi ­
tionsbereiche, in denen eine Letalität auftreten kann, da der Tod eines Teils der Tiere noch immer den wichtigsten Endpunkt dieser Methode darstellt. Ein LD
 50 -Wert kann nur dann mit dieser Methode 
bestimmt werden, wenn mindestens zwei Dosen zu einer Mortalität 
von über 0 %, aber unter 100 % führen. Die Auswahl von fest ­
gesetzten Dosen unabhängig von der Testsubstanz zusammen mit der Koppelung an eine Anzahl von Tieren in unterschiedlichem Zu ­
stand an eine Klassifizierung verbessert die Konsistenz und die Re ­
produzierbarkeit zwischen den Laboratorien.
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Das Prüflabor soll vor der Durchführung der Studie sämtliche ver ­
fügbaren Informationen berücksichtigen. Zu diesen Informationen 
gehören die Identität und die chemische Struktur der Substanz, ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften, das Ergebnis anderer  
In-vivo - oder  In-vitro -Toxizitätstests der betreffenden Substanz, toxi ­
kologische Daten über die strukturverwandten Substanzen sowie die 
vorgesehene(n) Verwendung(en) der Substanz. Diese Informationen werden benötigt, um die zuständigen Stellen zu überzeugen, dass der Test für den Schutz der menschlichen Gesundheit wichtig ist und bei 
der Wahl der geeigneten Startdosis hilft.
 
1.2. DEFINITIONEN  
Akute orale Toxizität:  Schädliche Wirkungen, die nach der oralen 
Verabreichung einer Einzeldosis oder mehrerer innerhalb von 24 Stunden verabreichter Dosen einer Substanz auftreten.
 
Verzögerter Tod:  Das betreffende Tier stirbt zwar nicht binnen 48 
Stunden und wirkt in diesem Zeitraum nicht moribund; der Tod tritt jedoch später während des 14-tägigen Beobachtungszeitraums ein.
 
Dosis:  Verabreichte Menge der Testsubstanz; die Dosis wird als 
Gewicht der Testsubstanz pro Gewichtseinheit des Versuchstiers aus ­
gedrückt (z. B. mg/kg).  
GHS:  Globally Harmonised Classification System for Chemical Sub ­
stances and Mixtures (Weltweit harmonisiertes Klassifizierungssys ­
tem für chemische Substanzen und Gemische); ein gemeinsames 
Projekt von OECD (Menschliche Gesundheit und Umwelt), UN-Ex ­
pertenausschuss für den Transport von Gefahrgütern (physikalisch- chemische Eigenschaften) und ILO (Gefahrenanzeige) koordiniert im Rahmen des Interorganisation Programme for the Sound Manage ­
ment of Chemicals (IOMC).
 
Bevorstehender Tod:  Der moribunde Zustand oder Tod ist vor dem 
nächsten vorgesehenen Beobachtungszeitpunkt zu erwarten. Anzei ­
chen für diesen Zustand können bei Nagetieren Krämpfe, Seitenlage, 
liegende Stellung und Tremores sein (siehe Humane Endpoint Gui ­
dance Document (9)).  
LD 50 (mittlere orale Letaldosis):  Eine statistisch ermittelte Einzel ­
dosis einer Substanz, bei der davon ausgegangen werden kann, dass sie bei oraler Verabreichung den Tod von 50 % der Tiere verursacht; der LD
 50 -Wert wird als Gewicht der Testsubstanz pro Gewichtsein ­
heit der Versuchstiere ausgedrückt (mg/kg).  
Limit-Dosis:  Dosis am oberen Grenzwert für den betreffenden Ver ­
such (2 000 oder 5 000 mg/kg).  
Moribunder Zustand:  Zustand des Sterbens oder des Unvermögens, 
(selbst bei Behandlung) zu überleben (siehe Humane Endpoint Gui ­
dance Document (9)).  
Voraussagbarer Tod:  Vorhandensein klinischer Zeichen, die auf 
den Eintritt des Todes zu einem bekannten Zeitpunkt in der Zukunft — vor dem planmäßigen Ende des Experiments — hinweisen, z. B. 
das Unvermögen, Wasser oder Nahrung aufzunehmen (siehe Hu ­
mane Endpoint Guidance Document (9)).
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1.3. PRINZIP DER PRÜFMEHODE  
Das Versuchsprinzip besteht darin, in einem schrittweisen Verfahren 
bei Verwendung einer minimalen Anzahl von Tieren pro Einzel ­
schritt genügend Informationen über die akute Toxizität der Testsub ­
stanz zu gewinnen, um ihre Klassifizierung zu ermöglichen, Die 
Substanz wird einer Gruppe von Versuchstieren oral mit einer der festgelegten Dosen verabreicht. Die Substanz wird in einem schritt ­
weisen Verfahren getestet, wobei für jeden Schritt jeweils drei Tiere 
des gleichen Geschlechts (normalerweise weibliche Tiere) verwendet 
werden. Das Eintreten oder Nichteintreten von prüfsubstanzbedingten Todesfällen bei dem in einem Schritt behandelten Tieren bestimmt 
über den nächsten Schritt, d. h.:
 
— ob keine weiteren Tests erforderlich sind,  
— ob drei weitere Tiere mit der gleichen Dosis zu behandeln sind,  
— ob der nächste Schritt an drei weiteren Tieren mit der nächst ­
höheren oder nächstniedrigeren Dosis durchzuführen ist.  
In Anlage 1 ist die Testmethode im Einzelnen beschrieben. Die 
Methode ermöglicht die Beurteilung, eine Testsubstanz innerhalb einer Reihe von Toxizitätsklassen einzuordnen, die durch feste LD
 50 -Abgrenzungswerte definiert sind.  
1.4. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.4.1.  Auswahl der Tierspezies  
Die bevorzugte Nagetierspezies ist die Ratte, es können aber auch 
andere Spezies verwendet werden. In der Regel werden weibliche 
Tiere verwendet (9). Weibliche Tiere werden bevorzugt, da die in der Literatur zitierten Untersuchungen zu konventionellen LD
 50 - 
Tests zwischen den Geschlechtern in der Regel nur geringfügige 
Unterschiede hinsichtlich der Empfindlichkeit belegen, in den Fällen, 
in denen Unterschiede beobachtet werden, jedoch zeigen, dass weib ­
liche Tiere im Allgemeinen etwas empfindlicher sind (11). Wenn jedoch die vorhandenen Informationen über die toxikologischen 
oder toxikokinetischen Eigenschaften von strukturverwandten Che ­
mikalien darauf hinweisen, dass vermutlich die männlichen Tiere empfindlicher sind, sollten männliche Tiere verwendet werden. Wenn der Versuch an männlichen Tieren durchgeführt wird, sollte 
dies hinreichend begründet werden.
 
Es sollen junge, gesunde, ausgewachsene Tiere aus üblicherweise 
eingesetzten Laborstämmen verwendet werden. Die weiblichen Tiere 
dürfen weder bereits geworfen haben noch momentan trächtig sein. Alle Tiere müssen zu Beginn der Verabreichung zwischen 8 und 12 Wochen all sein; ihre Gewichtswerte müssen im Bereich von ± 20 % 
des mittleren Gewichts sämtlicher zuvor verwendeter Tiere liegen.
 
1.4.2.  Haltung und Fütterung  
Die Temperatur im Versuchstierraum soll 22  o C (± 3  o C) betragen. 
Die Temperatur des Versuchstierraums soll 22  o C (± 3  o C) betragen. 
Die relative Luftfeuchtigkeit soll mindestens 30 % betragen und 
außer während der Reinigung vorzugsweise nicht über 70 % liegen; anzustreben ist ein Wert von 50-60 %. Der Raum soll künstlich beleuchtet sein, wobei die Beleuchtung im 12-Stunden-Rhythmus 
ein- und ausgeschaltet werden soll. An die Versuchstiere kann her ­
kömmliches Laborfutter verfüttert werden, wobei eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung zu gewährleisten ist. Die Tiere können in den Käfigen nach Verabreichungsdosen gruppiert werden, wobei aber die 
Anzahl der Tiere pro Käfig noch eine genaue Beobachtung der ein ­
zelnen Tiere ermöglichen muss.
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1.4.3.  Vorbereitung der Versuchstiere  
Die Tiere werden nach Zufallskriterien ausgewählt, zwecks Identifi ­
zierung markiert und für die Dauer von mindestens 5 Tagen vor Versuchsbeginn in ihren Käfigen gehalten, damit sie sich an die 
Laborbedingungen gewöhnen können.
 
1.4.4.  Vorbereitung der Dosen  
Generell sollen die Testsubstanzen mit einem für den gesamten zu 
testenden Dosierungsbereich gleichbleibenden Volumen verabreicht werden, indem jeweils die Konzentration der Dosiszubereitung vari ­
iert wird. Wenn jedoch ein flüssiges Endprodukt oder Gemisch zu 
testen ist, kann die Anwendung der unverdünnten, d. h. mit gleich ­
bleibender Konzentration verabreichten Testsubstanz für die an ­
schließende Risikobewertung der betreffenden Substanz größere Re ­
levanz haben und wird daher von verschiedenen Behörden vor ­
geschrieben. In jedem Fall darf das maximal zu verabreichende Do ­
sisvolumen nicht überschritten werden. Welches Flüssigkeitsvolumen jeweils höchstens auf einmal verabreicht werden kann, hängt von der 
Größe des Versuchstiers ab. Bei Nagetieren soll das Volumen im 
Normalfall 1 ml pro 100 g Körpergewicht nicht überschreiten; bei wässrigen Lösungen können aber auch 2 ml pro 100 g Körper ­
gewicht in Betracht gezogen werden. Bezüglich der Formulierung 
wird, wenn dies möglich ist, eine wässrige Lösung/Suspension/ 
Emulsion empfohlen, danach in der Reihenfolge der Präferenz eine Lösung/Suspension/Emulsion in Öl (z. B. Maisöl) sowie an dritter Stelle eventuell eine Lösung in anderen Vehikeln. Bei anderen Ve ­
hikeln als Wasser sollen die toxikologischen Eigenschaften des je ­
weiligen Vehikels bekannt sein. Die Dosen dürfen erst kurz vor der Verabreichung zubereitet werden, sofern die Zubereitung über den Zeitraum, in dem sie angewandt werden soll, nicht bekanntermaßen 
eine annehmbare Stabilität aufweist.
 
1.5. VERFAHRENSWEISE  
1.5.1.  Verabreichung der Dosen  
Die Testsubstanz wird als Einzeldosis mit einer Sonde über einen 
Magensonde oder über eine geeignete Intubationskanüle verabreicht. 
In dem seltenen Fall, dass die Verabreichung als Einzeldosis nicht 
möglich ist, kann die Dosis über einen Zeitraum von maximal 24 Stunden in kleineren Teilmengen verabreicht werden.
 
Die Versuchstiere sollten vor der Verabreichung nüchtern sein (z. B. 
sollte Ratten das Futter (nicht das Wasser) über Nacht vorenthalten 
werden; Mäusen sollte das Futter (nicht das Wasser) 3-4 Stunden zuvor vorenthalten werden). Nach diesem Futterentzug sollen die Tiere gewogen werden und die Testsubstanz verabreicht bekommen. 
Nach der Verabreichung der Substanz kann das Futter bei Ratten 
weitere 3-4 Stunden bzw. bei Mäusen weitere 1-2 Stunden zurück ­
gehalten werden. Wenn die Dosis über einen bestimmten Zeitraum hinweg in Teilmengen verabreicht wird, kann es je nach Länge 
dieses Zeitraums erforderlich sein, die Tiere mit Futter und Wasser 
zu versorgen.
 
1.5.2.  Anzahl der Versuchstiere und Dosierung  
Für jeden Schritt werden drei Tiere verwendet. Die als Ausgangs ­
dosis zu verwendende Dosis wird aus vier festen Dosiswerten ge ­
wählt: 5, 50, 300 und 2 000 mg pro kg Körpergewicht. Als Start ­
dosis soll die Dosis gewählt werden, die mit der größten Wahr ­
scheinlichkeit zur Mortalität einiger der behandelten Tiere führt. Die Prüfschemata in Anlage 1 beschreiben für jede dieser Ausgangs ­
dosen die jeweils zu befolgende Vorgehensweise. Zur Ergänzung 
wird in Anlage 4 die Klassifizierung im EU-System bis zur Einfüh ­
rung des neuen GHS erläutert.
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Wenn bereits verfügbare Informationen vermuten lassen, dass bei der 
höchsten Startdosis (2 000 mg pro kg Körpergewicht) keine Morta ­
lität zu erwarten ist, soll ein Limit-Test durchgeführt werden. Wenn für eine zu testende Substanz keine Informationen zur Verfügung stehen, wird aus Tierschutzgründen empfohlen, als Ausgangsdosis 
300 mg pro kg Körpergewicht zu verwenden.
 
Der Zeitabstand zwischen den einzelnen Behandlungsgruppen richtet 
sich nach dem Einsetzen, der Dauer und dem Schweregrad der to ­
xischen Zeichen. Die Behandlung der Versuchstiere mit der nächsten Dosis soll so lange abgewartet werden, bis angenommen werden kann, dass die zuvor behandelten Tiere überleben.
 
In Ausnahmefällen — und nur, wenn dies durch konkrete Vorschrif ­
ten begründet ist — kann die Anwendung einer weiteren oberen 
Dosis von 5 000 mg pro kg Körpergewicht in Erwägung gezogen werden (siehe Anlage 2). Aus Tierschutzgründen wird von Tierver ­
suchen im Bereich der GHS-Kategorie 5 (2 000 - 5 000 mg/kg) 
abgeraten; diese Versuche sollen nur dann in Betracht gezogen wer ­
den, wenn die Ergebnisse eines solchen Tests für den Schutz der Gesundheit von Menschen oder Tieren oder der Umwelt mit hoher Wahrscheinlichkeit direkt relevant wären.
 
1.5.3.  Limit-Test  
Der Limit-Test wird hauptsächlich dann eingesetzt, wenn die Person, 
die den Test durchführt, nach ihr vorliegenden Informationen davon 
ausgehen kann, dass das zu testende Material wahrscheinlich nicht 
toxisch ist, d. h. nur oberhalb der regulatorisch festgelegten Grenz ­
dosen toxisch wirkt. Informationen über die Toxizität des Testmate ­
rials können aus Kenntnissen über ähnliche getestete Verbindungen, 
Mischungen oder Produkte gewonnen werden, wobei Art und Pro ­
zentanteil der Komponenten zu berücksichtigen sind, deren toxiko ­
logische Relevanz bekannt ist. In den Fällen, in denen nur wenige oder keine Informationen über die Toxizität des Testmaterials vor ­
liegen oder in denen von einer Toxizität des Testmaterials ausgegan ­
gen wird, sollte der Haupttest durchgeführt werden.
 
Ein Limit-Test mit einer Dosis von 2 000 mg pro kg Körpergewicht 
kann mit sechs Tieren durchgeführt werden (drei Tiere pro Schritt). In Ausnahmefällen kann ein Limit-Test mit einer Dosis von 5 000 mg/kg mit drei Tieren durchgeführt werden (siehe Anlage 2). Wenn 
eine mit der Testsubstanz in Zusammenhang stehende Mortalität 
ermittelt wird, müssen eventuell weitere Prüfungen mit der nächst ­
niedrigeren Dosis durchgeführt werden.
 
1.6. BEOBACHTUNGEN  
Die Tiere werden nach der Verabreichung einzeln beobachtet: min ­
destens einmal während der ersten 30 Minuten, in regelmäßigen Abständen während der ersten 24 Stunden, wobei die ersten vier 
Stunden besonders zu beachten sind, sowie anschließend täglich 
während einer Gesamtdauer von 14 Tagen, sofern die Tiere nicht aus Tierschutzgründen aus dem Versuch genommen und auf humane Weise getötet werden müssen oder ihr Tod festgestellt wird. Die 
Beobachtungsdauer sollte jedoch nicht strikt festgelegt werden; viel ­
mehr sollte sie in Abhängigkeit von den toxischen Reaktionen, vom Zeitpunkt des Einsetzens dieser Reaktionen und von der Länge der Erholungsdauer festgelegt werden und kann daher ausgedehnt wer ­
den, wenn dies erforderlich scheint. Der Zeitpunkt, zu dem die An ­
zeichen von Toxizität auftreten und wieder verschwinden, ist von Bedeutung, und zwar insbesondere dann, wenn eine Tendenz zur zeitlichen Verzögerung der Toxizitätsanzeichen besteht (12). Sämtli ­
che Beobachtungen werden für die Tiere systematisch jeweils in 
Einzelprotokollen dokumentiert.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 203
 
Zusätzliche Beobachtungen sind erforderlich, wenn bei den Tieren 
weiterhin Anzeichen für Toxizität zu beobachten sind. Die Beobach ­
tungen sollten Veränderungen an Haut und Fell, Augen und Schleim ­
häuten erfassen und auch die Atmung, den Kreislauf, das vegetative und zentrale Nervensystem sowie somatomotorische Aktivitäten und 
Verhaltensmuster berücksichtigen. Auf Beobachtungen wie Tremo ­
res, Krämpfe, Speichelfluss, Durchfall, Lethargie, Schlaf und Koma sollte geachtet werden. Die im Humane Endpoints Guidance Docu ­
ment (9) zusammengefassten Prinzipien und Kriterien sind zu be ­
rücksichtigen. Tiere, bei denen ein moribunder Zustand festgestellt 
wird, sowie Tiere, die starke Schmerzen haben oder anhaltende An ­
zeichen von schwerem Leiden zeigen, sollten auf humane Weise getötet werden. Wenn Tiere aus humanen Gründen getötet werden 
oder ihr Tod festgestellt wird, sollte der Todeszeitpunkt so genau wie 
möglich registriert werden.
 
1.6.1.  Körpergewicht  
Das Gewicht der einzelnen Tiere sollte kurz vor der Verabreichung 
der Testsubstanz sowie spätestens eine Woche danach ermittelt wer ­
den. Gewichtsveränderungen sollen berechnet und registriert werden. 
Am Ende des Tests werden die überlebenden Tiere gewogen und auf humane Weise getötet.
 
1.6.2.  Pathologie  
Alle Versuchstiere (einschließlich der Tiere, die während des Tests 
sterben oder aus Tierschutzgründen aus der Studie genommen wer ­
den) sollen auf makroskopische Veränderungen untersucht werden. Alle makroskopischen Veränderungen sollen für jedes einzelne Tier registriert werden. Bei Tieren, die 24 oder mehr Stunden lang über ­
lebt haben, kann auch eine mikroskopische Untersuchung von Orga ­
nen mit makropathologischen Befunden in Erwägung gezogen wer ­
den, da sich hieraus eventuell nützliche Informationen gewinnen lassen.
 
2. DATEN  
Es sollen Daten zu den einzelnen Tieren bereitgestellt werden. Da ­
rüber hinaus sollen sämtliche Daten in tabellarischer Form zusam ­
mengefasst werden, wobei für jede Testgruppe die folgenden Daten 
zu erfassen sind: Anzahl der verwendeten Tiere, Anzahl der Tiere 
mit Anzeichen für eine toxische Wirkung, Anzahl der Tiere, deren Tod während des Versuchs festgestellt wurde oder die aus humanen Gründen getötet wurden, Todeszeitpunkt der einzelnen Tiere, Be ­
schreibung und Zeitverlauf der toxischen Wirkungen und ihrer Re ­
versibilität sowie pathologische Befunde.
 
3. BERICHT  
3.1. Prüfbericht  
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten (soweit an ­
gemessen):  
Testsubstanz:  
— physikalische Beschaffenheit, Reinheit und, wenn maßgeblich, 
physikalisch-chemische Eigenschaften (einschließlich Isomerisie ­
rung),  
— Identifizierungsdaten, einschließlich CAS-Nummer.  
Vehikel (wenn verwendet):  
— Begründung für die Auswahl des Vehikels (außer bei Wasser).  
Versuchstiere:  
— verwendete Spezies/Stamm,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 204
 
— mikrobiologischer Zustand der Tiere (wenn bekannt),  
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere (gegebenenfalls mit Be ­
gründung für den Einsatz von männlichen statt weiblichen Tie ­
ren), 
— Bezugsquelle der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.  
Testbedingungen:  
— Angaben über die Zubereitung der Testsubstanz, einschließlich 
Angaben über die physikalische Beschaffenheit des verabreichten Stoffs,
 
— Angaben über die Verabreichung der Testsubstanz, einschließlich 
Applikationsvolumen und Zeitpunkt der Verabreichung,  
— Angaben zur Futter- und Wasserqualität (einschließlich 
Art/Herkunft des Futters, Herkunft des Wassers),  
— Begründung für die Wahl der Startdosis.  
Ergebnisse:  
— tabellarische Erfassung der erhobenen Daten und der Dosis für 
jedes einzelne Tier (d. h. Tiere, die Anzeichen für Toxizität zeigen, einschließlich Mortalität sowie Art, Schweregrad und 
Dauer der Wirkungen),
 
— tabellarische Erfassung des Körpergewichts und der Änderungen 
des Körpergewichts,  
— Gewicht der einzelnen Tiere am Tag der Verabreichung, danach 
in wöchentlichen Abständen sowie am Tag des Todes bzw. der Tötung,
 
— Datum und Uhrzeit des Todes, sofern vor der planmäßigen Tö ­
tung eingetreten,  
— zeitlicher Verlauf des Einsetzens von Toxizitätsanzeichen sowie 
Angabe, ob diese reversibel waren, für jedes einzelne Tier,  
— Obduktionsergebnisse und histopathologische Ergebnisse für je ­
des einzelne Tier (wenn vorhanden).  
Diskussion und Interpretation der Ergebnisse.  
Schlussfolgerung.  
4. LITERATURHINWEISE  
(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. and Kayser D. (1986). New Per ­
spectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86
 
(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Che ­
mikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.  
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schiede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610
 
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schiede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the 
Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.  
(5) Diener W. and Schiede E. (1999) Acute Toxicity Class Me ­
thods: Alterations to LD/LC  50 Tests. ALTEX 16, 129-134  
(6) Schiede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A 
National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Me ­
thod — An Alternative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 
66, 455-470.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 205
 
(7) Schiede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Me ­
thod (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.  
(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, As ­
sessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints 
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.
 
(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Che ­
mical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in 
November 1998, Part 2, S. 11 (http://webnet1.oecd.org/oecd/ 
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no- 24-no-0,FF.html),
 
(11) Lipnick R.L., Cotruvo, J.A., Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel 
K.A., Walker A.P., Chu I.; Goddard M., Segal L., Springer 
J.A. and Myers R.C. (1995) Comparison of the Up-and Down, 
Conventional LD  50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedu ­
res. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.  
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute To ­
xicity and Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxi ­
cology.  Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, 
Ltd, New York, USA.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 206
 
Anlage 1  
ZU BEACHTENDE VORGEHENSWEISE FÜR ALLE STARTDOSEN  
ALLGEMEINE HINWEISE  
Die in dieser Anlage dargestellten Prüfschemata geben für jede Ausgangsdosis 
die jeweils zu beachtende Vorgehensweise an.  
— Anlage 1A: Startdosis 5 mg pro kg Körpergewicht  
— Anlage 1B: Startdosis 50 mg pro kg Körpergewicht  
— Anlage 1C: Startdosis 300 mg pro kg Körpergewicht  
— Anlage 1D: Startdosis 2 000 mg pro kg Körpergewicht  
Der Testverlauf folgt je nach Anzahl der auf humane Weise getöteten oder 
gestorbenen Versuchstiere den angegebenen Pfeilen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 207
 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 208
 ▼B 
Anlage 1A  
PRÜFVERFAHREN BEI EINER STARTDOSIS VON 5 MG PRO KG KÖRPERGEWICHT

 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 209
 ▼B 
Anlage 1B  
PRÜFVERFAHREN BEI EINER STARTDOSIS VON 50 mg PRO kg KÖRPERGEWICHT

 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 210
 ▼B 
Anlage 1C  
PRÜFVERFAHREN BEI EINER STARTDOSIS VON 300 mg PRO kg KÖRPERGEWICHT

 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 211
 ▼B 
Anlage 1D  
PRÜFVERFAHREN-BEI EINER STARTDOSIS VON 2 000 mg PRO kg KÖRPERGEWICHT

Anlage 2  
KRITERIEN FÜR DIE KLASSIFIZIERUNG VON TESTSUBSTANZEN 
MIT ERWARTETEN LD  50 -WERTEN ÜBER 2 000 mg/kg OHNE 
ERFORDERLICHE TESTS  
Die Kriterien für die Gefahrenkategorie 5 sollen die Identifikation von Testsub ­
stanzen ermöglichen, die eine vergleichsweise geringe akute Toxizitätsgefahr 
aufweisen, die aber unter bestimmten Umständen eine Gefahr für anfällige Be ­
völkerungsgruppen darstellen. Bei diesen Substanzen wird von einer oralen oder dermalen LD
 50 im Bereich 2 000-5 000 mg/kg bzw. von vergleichbaren Dosen 
für andere Verabreichungswege ausgegangen. Die Testsubstanz sollte in den 
folgenden Fällen in die Gefahrenkategorie 2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg 
(GHS-Kategorie 5) eingestuft werden:  
a) wenn eines der Prüfschemata — aus Anlage 1A-1D aufgrund von Mortalitäts ­
fällen zu dieser Kategorie führt;  
b) wenn bereits zuverlässige Erkenntnisse dafür vorliegen, dass der LD  50 -Wert 
im Bereich der Kategorie 5 liegt, oder wenn andere Tierversuche oder toxi ­
sche Wirkungen auf Menschen akute Folgen für die menschlichen Gesundheit erwarten lassen;
 
c) wenn nach Extrapolierung, Schätzung oder Messung von Daten die Zuord ­
nung zu einer höheren Gefahrenklasse nicht gerechtfertigt ist und  
— zuverlässige Informationen vorliegen, die auf signifikante toxische Wir ­
kungen bei Menschen hinweisen, oder  
— Mortalitäten bei oraler Verabreichung in Versuchen mit Dosen bis zu der 
Kategorie 4 auftreten, oder  
— eine fachkundige Beurteilung bei Versuchen mit Dosen bis zu den in 
Kategorie 4 genannten Werten signifikante klinische Toxizitätsanzeichen 
bestätigt (außer Durchfall, Haaraufrichtung oder zerzaustes Fell), oder  
— eine fachkundige Beurteilung verlässliche Informationen bestätigt, die aus 
den anderen Tierversuchen ein Potenzial für signifikante akute Wirkungen erkennen lassen.
 
VERSUCHE MIT DOSEN ÜBER 2 000 mg/kg  
Aus Tierschutzgründen wird von Tierversuchen im Bereich der Kategorie 5 
(5 000 mg/kg) abgeraten; diese Versuche sollen nur dann in Erwägung gezogen 
werden, wenn die Ergebnisse eines solchen Versuchs für den Schutz der Ge ­
sundheit von Menschen oder Tieren oder der Umwelt mit hoher Wahrscheinlich ­
keit direkt relevant wären (10). Weitere Versuche mit noch höheren Dosierungen sollen nicht durchgeführt werden.
 
Wenn Versuche mit einer Dosis von 5 000 mg/kg notwendig sind, ist nur ein 
Schritt (d. h. drei Tiere) erforderlich. Wenn das erste Versuchstier stirbt, wird der 
Versuch mit einer Dosis von 2 000 mg/kg gemäß den Prüfschemata in Anlage 1 fortgesetzt. Wenn das erste Tier überlebt, wird die Substanz zwei weiteren Tieren verabreicht. Wenn nur eines der drei Tiere stirbt, wird ein LD
 50 -Wert von über 
5 000 mg/kg angenommen. Wenn beide Tiere sterben, wird der Versuch mit der 
Dosis von 2 000 mg/kg fortgesetzt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 212
 
Anlage 3  
PRÜFVERFAHREN B.l tris Anleitung für die Klassifizierung gemäß dem EU-System zur 
Überbrückung des Übergangszeitraums bis zur vollständigen Umsetzung des „Globalen 
Harmonisierten Systems“ (GHS) (Auszug aus Literaturhinweis (8))
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 213
 
▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 214
 
▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 215
 
▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 216
 
B.2 AKUTE INHALATIONSTOXIZITÄT  
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie 403 (2009) (1). Die 
ursprüngliche Prüfrichtlinie 403 (TG 403) zur akuten Inhalation wurde 1981 angenommen. Diese überarbeitete Prüfmethode B.2 (die der überarbeiteten 
TG 403 entspricht) ist dazu ausgelegt, mehr Flexibilität zu bieten, die Ver ­
wendung von Versuchstieren zu reduzieren und die Regulierungsanforde ­
rungen zu erfüllen. Die überarbeitete Prüfmethode umfasst zwei Arten von Versuchen: ein traditionelles LC
 50 -Protokoll und ein Konzentration-x-Zeit- 
Protokoll (c × t). Die Hauptmerkmale dieser Prüfmethode sind die Möglich ­
keit, eine Konzentrations-Wirkungs-Beziehung aufzustellen, die von nicht ­
letalen zu letalen Ergebnissen reicht, um eine mittlere letale Konzentration (LC
 50 ), eine nichtletale Schwellenkonzentration (z. B. LC  01 ) und die Stei ­
gung der Kurve zu bestimmen und eine eventuelle geschlechtsspezifische 
Empfindlichkeit festzustellen. Das c-x-t-Protokoll sollte angewendet werden, wenn wegen einer spezifischen Regelung oder aus wissenschaftlicher Not ­
wendigkeit eine Prüfung von Tieren über unterschiedliche Zeiträume erfor ­
derlich ist, z. B. für Zwecke der Notfallplanung [z. B. zur Ableitung von 
Störfallbeurteilungswerten (Acute Exposure Guideline Levels — AEGL, Emergency Response Planning Guidelines — ERPG oder Acute Exposure Threshold Levels — AETL)] oder für die Flächennutzungsplanung.
 
2. Eine Anleitung für die Durchführung und Auswertung dieser Prüfmethoden 
ist im Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing (GD 39 (2)) enthalten.
 
3. Die im Zusammenhang mit dieser Prüfmethode verwendeten Begriffe wer ­
den am Ende dieses Kapitels und im GD 39 (2) definiert.  
4. Diese Prüfmethode ermöglicht die Charakterisierung von Prüfsubstanzen 
und eine quantitative Risikobewertung und sie erlaubt die Einstufung von Prüfsubstanzen nach der Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 (3). Das GD 39 
(2) enthält Hinweise zur Auswahl der geeigneten Prüfmethode für akute 
Prüfungen. Wenn nur Informationen über die Einstufung und Kennzeich ­
nung benötigt werden, wird im Allgemeinen Kapitel B.52 dieses Anhangs (4) empfohlen [siehe GD 39 (2)]. Diese Prüfmethode B.2 ist nicht speziell 
für die Prüfung von Spezialmaterialien wie schwer löslichen isometrischen 
oder Fasermaterialien oder hergestellten Nanomaterialien bestimmt.
 
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN  
5. Bevor Versuche nach dieser Prüfmethode in Betracht gezogen werden, sollte 
das Prüflabor alle verfügbaren Informationen über die Prüfsubstanz, ein ­
schließlich bereits vorliegender Studien (z. B. Kapitel B.52 dieses Anhangs 
(4)), deren Ergebnisse darauf hindeuten, dass auf weitere Versuche verzich ­
tet werden kann, auswerten, damit möglichst wenig Tiere verwendet werden. Für die Auswahl der in Bezug auf Art, Stamm und Geschlecht am besten geeigneten Tiere sowie der geeigneten Expositionsart und Prüfkonzentratio ­
nen sollten u. a. Informationen wie die Identität, die chemische Struktur und 
die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, Ergebnisse jeglicher In-vitro- oder In-vivo-Toxizitätsprüfungen, vorgesehene Verwen ­
dungen und die Möglichkeit der Exposition des Menschen, (Q)SAR-Daten 
und toxikologische Daten über strukturverwandte Substanzen herangezogen 
werden [siehe GD 39 (2)].
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 217
 
6. Die Prüfung hautätzender und/oder reizender Prüfsubstanzen in Konzentra ­
tionen, die voraussichtlich starke Schmerzen und/oder Qualen verursachen, 
sollte soweit wie möglich vermieden werden. Die hautätzenden/reizenden Eigenschaften sollten von Fachleuten auf der Grundlage von Erfahrungs ­
werten bei Mensch und Tier (z. B. Studien mit wiederholter Verabreichung 
in nicht hautätzenden/reizenden Konzentrationen), vorliegenden In-vitro-Da ­
ten (z. B. aus den Kapiteln B.40 (5), B.40bis (6) dieses Anhangs oder OECD TG 435 (7)), den pH-Werten sowie Informationen über ähnliche Substanzen oder anderen sachdienlichen Daten beurteilt werden, damit un ­
tersucht werden kann, ob auf weitere Versuche verzichtet werden kann. Bei 
spezifischen Regulierungsanforderungen (z. B. für Zwecke der Notfallpla ­
nung) kann diese Prüfmethode verwendet werden, um Tiere diesen Stoffen auszusetzen, weil die Methode dem Studienleiter oder Hauptprüfer die Kon ­
trolle über die Auswahl der Zielkonzentrationen gibt. Die Zielkonzentratio ­
nen sollten jedoch keine schwerwiegenden reizenden/hautätzenden Wirkun ­
gen hervorrufen; sie sollten aber ausreichen, um die Konzentrations-Wirkungs-Kurve so zu erweitern, dass das regulatorische 
und wissenschaftliche Ziel der Prüfung erreicht wird. Diese Konzentrationen 
sollten von Fall zu Fall ausgewählt werden; die Wahl der Konzentration ist zu begründen [siehe GD 39 (2)].
 
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
7. Diese überarbeitete Prüfmethode B.2 wurde entwickelt, um ausreichende 
Informationen über die akute Toxizität einer Prüfsubstanz zu gewinnen, 
damit sie eingestuft werden kann, und um Letalitätsdaten (z. B. LC  50 , 
LC 01 und Steigung) für eines oder beide Geschlechter zu erhalten, die für 
quantitative Risikobewertungen benötigt werden. Die Prüfmethode umfasst 
zwei Methoden. Bei der ersten Methode handelt es sich um ein traditionelles 
Protokoll, bei dem Gruppen von Tieren für eine im Voraus festgelegte Dauer von üblicherweise 4 Stunden einer Grenzkonzentration (Limit-Test) oder schrittweise einer Reihe von Konzentrationen ausgesetzt werden. Für 
spezifische Regulierungszwecke sind andere Expositionszeiten möglich. Die 
zweite Methode ist ein Protokoll (c × t), bei dem Gruppen von Tieren über mehrere unterschiedliche Zeiträume einer Konzentration (Grenzkonzentrati ­
on) oder einer Reihe unterschiedlicher Konzentrationen ausgesetzt werden.
 
8. Moribunde Tiere oder Tiere, die offensichtlich unter Schmerzen leiden oder 
Anzeichen von schwerem und anhaltendem Leiden zeigen, sollten auf hu ­
mane Weise getötet werden und sind bei der Auswertung der Testergebnisse 
auf die gleiche Weise zu werten wie während des Tests gestorbene Tiere. Kriterien für die Entscheidung, moribunde oder schwer leidende Tiere zu töten, sowie Hinweise zur Erkennung des absehbaren oder bevorstehenden 
Todes sind Gegenstand des OECD Guidance Document No. 19 on Humane 
Endpoints (8).
 
BESCHREIBUNG DER METHODE  
Auswahl von Versuchstierarten  
9. Es sind junge, gesunde, adulte Tiere aus üblicherweise eingesetzten Labor ­
stämmen zu verwenden. Bevorzugtes Versuchstier ist die Ratte. Die Ver ­
wendung anderer Tierarten ist zu begründen.  
Vorbereitung der Tiere  
10. Die weiblichen Tiere dürfen weder bereits geworfen haben noch momentan 
trächtig sein. Am Tag der Exposition sollten die jungen, adulten Tiere 8 bis 12 Wochen alt sein; ihr Körpergewicht sollte innerhalb von ± 20 % des mittleren Gewichts für jedes Geschlecht aller zuvor exponierten Tiere des ­
selben Alters liegen. Die Tiere werden nach Zufallskriterien ausgewählt, zur 
individuellen Identifizierung markiert und vor Beginn der Prüfung für einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen in ihren Käfigen an die Laborbedin ­
gungen gewöhnt. Die Tiere sollten auch für einen kurzen Zeitraum vor der 
Prüfung an die Versuchsapparatur gewöhnt werden, da dies den Stress durch 
die Umsetzung in eine neue Umgebung verringert.
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Tierhaltung  
11. Die Temperatur in dem Raum, in dem die Versuchstiere gehalten werden, 
sollte 22 ± 3 °C betragen. Die relative Luftfeuchtigkeit sollte im Idealfall zwischen 30 und 70 % liegen; bei Verwendung von Wasser als Vehikel 
könnte dies jedoch unmöglich sein. Die Tiere sollten vor und nach den 
Expositionen im Allgemeinen nach Geschlecht und Konzentration in Käfi ­
gen gruppiert werden, wobei aber die Anzahl der Tiere pro Käfig noch eine genaue Beobachtung der einzelnen Tiere ermöglichen muss und Verluste 
aufgrund von Kannibalismus oder Kämpfen minimiert werden sollten. Wenn 
die Tiere der Prüfsubstanz nur mit der Nase ausgesetzt werden sollen, müssen sie möglicherweise an die Restrainer gewöhnt werden. Die Restrai ­
ner sollten die Tiere weder körperlich noch in Bezug auf Wärme oder 
Fixierung übermäßig beeinträchtigen. Die Fixierung kann physiologische Endpunkte wie Körpertemperatur (Hyperthermie) und/oder das Atemminu ­
tenvolumen beeinflussen. Wenn generische Daten zeigen, dass keine der ­
artigen Veränderungen in nennenswertem Ausmaß vorkommen, ist eine 
Eingewöhnung an die Restrainer nicht erforderlich. Bei der Ganzkörper ­
exposition gegen ein Aerosol sollten die Tiere während der Exposition einzeln untergebracht sein, damit sie die Prüfsubstanz nicht durch das Fell 
ihrer Käfiggenossen filtriert einatmen. Außer während der Exposition kann 
herkömmliches und zertifiziertes Labortierfutter verwendet werden bei un ­
eingeschränkter Versorgung mit Trinkwasser. Die Beleuchtung sollte künst ­
lich sein und die Hell- und Dunkelphasen sollten sich im Abstand von 12 
Stunden abwechseln.
 
Inhalationskammern  
12. Bei der Auswahl einer Inhalationskammer sind die Art der Prüfsubstanz und 
das Ziel der Prüfung zu berücksichtigen. Das bevorzugte Verfahren ist die 
„Nose-only“-Exposition (dieser Begriff umfasst „nur Kopf“, „nur Nase“ 
oder „nur Schnauze“). Für die Untersuchung von Flüssigkeits- oder Fest ­
stoffaerosolen und für Dämpfe, die zu Aerosolen kondensieren können, wird im Allgemeinen die „Nose-only“-Exposition bevorzugt. Besondere Ziele der 
Untersuchung können möglicherweise mit einer Ganzkörperexposition bes ­
ser erreicht werden, doch dies sollte im Prüfbericht begründet werden. Um bei Verwendung einer Ganzkörperkammer die Stabilität der Atmosphäre sicherzustellen, sollte das Gesamtvolumen der Versuchstiere 5 % des Volu ­
mens der Kammer nicht übersteigen. Die Prinzipien der „Nose-only“- und 
der Ganzkörperexposition sowie ihre jeweiligen Vor- und Nachteile sind in GD 39 (2) beschrieben.
 
EXPOSITIONSBEDINGUNGEN  
Verabreichung der Konzentrationen  
13. „Nose-only“-Expositionen können bei Ratten bis zu 6 Stunden dauern. Bei 
Mäusen sollten „Nose-only“-Expositionen im Allgemeinen 4 Stunden nicht überschreiten. Wenn Studien mit längerer Expositionsdauer erforderlich sind, ist dies zu begründen [siehe GD 39 (2)]. Bei Ganzkörperexpositionen 
gegen Aerosole sollten die Tiere einzeln untergebracht sein, um eine Auf ­
nahme der Prüfsubstanz durch das Putzen von Käfiggenossen zu verhindern. Während der Exposition sollte kein Futter verabreicht werden. Wasser kann während einer Ganzkörperexposition angeboten werden.
 
14. Die Tiere werden der Prüfsubstanz in Form von Gas, Dampf, Aerosol oder 
einer Kombination dieser Formen ausgesetzt. Der zu prüfende Aggregat ­
zustand hängt von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsub ­
stanz, der gewählten Konzentration und/oder der physikalischen Form ab, in der die Prüfsubstanz bei der Handhabung und Verwendung am wahrschein ­
lichsten vorliegt. Hygroskopische und chemisch reaktive Prüfsubstanzen 
sollten bei geringer Luftfeuchtigkeit geprüft werden. Dabei ist darauf zu 
achten, dass keine explosionsfähigen Konzentrationen erzeugt werden.
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Partikelgrößenverteilung  
15. Bei allen Aerosolen und bei Dämpfen, die zu Aerosolen kondensieren kön ­
nen, sollte die Partikelgröße bestimmt werden. Damit alle relevanten Regio ­
nen der Atemwege der Prüfsubstanz ausgesetzt werden, werden mittlere 
aerodynamische Massendurchmesser (Mass Median Aerodynamic Diameter 
— MMAD) von 1 bis 4 μm mit einer geometrischen Standardabweichung 
(σ g ) von 1,5 bis 3,0 empfohlen (2) (9) (10). Wenngleich nach Möglichkeit 
versucht werden sollte, diese Werte zu erreichen, ist Fachwissen erforder ­
lich, falls sie nicht erzielt werden können. Metalldämpfe können z. B. unter 
diesen Werten liegen, und geladene Partikel, Fasern und hygroskopische Stoffe (die sich in der feuchten Umgebung der Atemwege ausdehnen) kön ­
nen diese Werte überschreiten.
 
Vorbereitung der Prüfsubstanz in einem Vehikel  
16. Um die gewünschte Konzentration und Partikelgröße der Prüfsubstanz in der 
Atmosphäre herzustellen, kann ein Vehikel verwendet werden. Hierbei ist in 
der Regel Wasser zu bevorzugen. Partikel können durch mechanische Pro ­
zesse auf die erforderliche Partikelgrößenverteilung gebracht werden. Dabei ist darauf zu achten, dass die Prüfsubstanz nicht zersetzt oder verändert wird. Wenn angenommen wird, dass die Zusammensetzung der Prüfsubstanz 
durch mechanische Prozesse verändert wurde (z. B. hohe Temperaturen 
aufgrund von Reibung durch übermäßiges Mahlen), sollte die Zusammenset ­
zung der Prüfsubstanz analytisch überprüft werden. Es ist darauf zu achten, 
dass die Prüfsubstanz nicht kontaminiert wird. Nicht brüchige Granulate, die 
speziell so formuliert sind, dass sie nicht eingeatmet werden können, brau ­
chen nicht geprüft zu werden. Mit einem Abriebtest sollte nachgewiesen werden, dass beim Umgang mit dem Granulat keine lungengängigen Par ­
tikel entstehen. Entstehen bei einem Abriebtest lungengängige Partikel, so 
sollte eine Inhalationstoxizitätsprüfung durchgeführt werden.
 
Kontrolltiere  
17. Eine gleichzeitige negative (Luft-)Kontrollgruppe ist nicht erforderlich. 
Wenn zur Erzeugung der Prüfatmosphäre ein anderes Vehikel als Wasser 
verwendet wird, sollte nur dann eine Vehikelkontrollgruppe verwendet wer ­
den, wenn keine historischen Daten über Inhalationstoxizität vorliegen. Er ­
gibt eine Toxizitätsstudie einer in einem Vehikel formulierten Prüfsubstanz, 
dass keine Toxizität vorliegt, ist das Vehikel folglich in der geprüften Kon ­
zentration nicht toxisch. Daher ist keine Vehikelkontrolle erforderlich.  
ÜBERWACHUNG DER EXPOSITIONSBEDINGUNGEN  
Luftstrom in der Inhalationskammer  
18. Der Luftstrom durch die Kammer sollte während jeder Exposition sorgfältig 
geregelt, kontinuierlich überwacht und mindestens stündlich protokolliert wer ­
den. Die Überwachung der Konzentration (oder Stabilität) der Prüfatmosphäre ist eine integrale Messung aller dynamischen Parameter und gibt indirekt die Möglichkeit, alle relevanten dynamischen Parameter der Erzeugung der Prüf ­
atmosphäre zu messen. Es sollte besonders darauf geachtet werden, das er ­
neute Einatmen in „Nose-only“-Expositionskammern zu vermeiden, wenn die Luftströmung durch das Expositionssystem nicht ausreicht, um eine dyna ­
mische Strömung der Prüfsubstanzatmosphäre zu erreichen. Es gibt fest ­
gelegte Methoden, mit denen nachgewiesen werden kann, dass es unter den 
gewählten Bedingungen nicht zu erneutem Einatmen kommt (2) (11). Die Sauerstoffkonzentration sollte mindestens 19 % betragen, und die Kohlen ­
dioxidkonzentration sollte 1 % nicht überschreiten. Gibt es Grund zu der 
Annahme, dass diese Werte nicht eingehalten werden können, sind die 
Sauerstoff- und die Kohlendioxidkonzentrationen zu messen.
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Temperatur und relative Luftfeuchtigkeit in der Inhalationskammer  
19. Die Temperatur in der Inhalationskammer sollte 22 ± 3 °C betragen. Sowohl 
bei der „Nose-only“- als auch bei der Ganzkörperexposition sollte die rela ­
tive Luftfeuchtigkeit im Atembereich der Tiere für Zeiträume von bis zu 4 
Stunden mindestens dreimal und für kürzere Zeiträume stündlich überwacht 
und dokumentiert werden. Die relative Luftfeuchtigkeit sollte im Idealfall zwischen 30 und 70 % liegen, was jedoch möglicherweise nicht erreichbar ist (z. B. bei der Prüfung von wasserbasierten Mischungen) oder wegen 
chemischer Interferenz mit der Prüfmethode nicht gemessen werden kann.
 
Prüfsubstanz: nominale Konzentration  
20. Die nominale Konzentration in der Expositionskammer sollte möglichst be ­
rechnet und protokolliert werden. Die nominale Konzentration ist die Masse der erzeugten Prüfsubstanz dividiert durch das Gesamtvolumen der durch das Kammersystem geleiteten Luft. Sie wird nicht zur Beschreibung der 
Exposition der Tiere verwendet; vielmehr gibt ein Vergleich der nominalen 
Konzentration und der tatsächlichen Konzentration Aufschluss über die Ef ­
fizienz des Prüfsystems bei der Erzeugung der Prüfkonzentration und kann 
daher für die Aufdeckung von Problemen bei dieser Erzeugung verwendet 
werden.
 
Prüfsubstanz: tatsächliche Konzentration  
21. Die tatsächliche Konzentration ist die Konzentration der Prüfsubstanz im 
Atembereich der Tiere in einer Inhalationskammer. Die tatsächlichen Kon ­
zentrationen können durch spezifische Methoden (z. B. direkte Probenahme, 
adsorptive Methoden oder chemische Reaktionsverfahren mit anschließender 
analytischer Charakterisierung) oder durch unspezifische Methoden wie Gra ­
vimetrie bestimmt werden. Die gravimetrische Methode ist lediglich für Aerosole mit nur einem Bestandteil in Pulverform oder Aerosole von Flüs ­
sigkeiten mit geringer Flüchtigkeit akzeptabel und sollte sich auf geeignete, 
vor der Studie zu erstellende und für die Prüfsubstanz spezifische Beschrei ­
bungen stützen. Die Konzentration von Aerosolen mit mehreren Bestand ­
teilen in Pulverform kann ebenfalls gravimetrisch bestimmt werden. Hierzu 
muss jedoch mit Analysedaten belegt werden, dass die Schwebstoffe eine 
ähnliche Zusammensetzung haben wie das Ausgangsmaterial. Liegen diese Angaben nicht vor, muss die Prüfsubstanz (im Idealfall im Schwebezustand) möglicherweise im Verlauf der Studie in regelmäßigen Abständen neu ana ­
lysiert werden. Bei aerosolisierten Agenzien, die verdunsten oder sublimie ­
ren können, sollte gezeigt werden, dass alle Phasen von der gewählten Methode erfasst wurden. Im Prüfbericht sollten die Zielkonzentration sowie die nominale und die tatsächliche Konzentration angegeben werden, aber 
nur die tatsächlichen Konzentrationen werden für statistische Analysen zur 
Berechnung letaler Konzentrationswerte verwendet.
 
22. Es sollte möglichst eine Partie der Prüfsubstanz verwendet werden; die 
Probe sollte unter Bedingungen aufbewahrt werden, die ihre Reinheit, Ho ­
mogenität und Stabilität gewährleisten. Die Prüfsubstanz sollte vor Beginn 
der Studie mit Angaben zur Reinheit und, falls technisch machbar, zur Identität sowie zu den Mengen identifizierter Schadstoffe und Verunrei ­
nigungen beschrieben werden. Hierzu können unter anderem die folgenden 
Daten verwendet werden: Retentionszeit und relative Peakfläche, durch 
Massenspektrometrie oder Gaschromatographie bestimmtes Molekularge ­
wicht oder andere Werte. Das Prüflabor ist zwar nicht für die Identität der Probe verantwortlich, doch es kann ratsam sein, dass es die Beschrei ­
bung des Auftraggebers zumindest in gewissen Grenzen (z. B. Farbe, phy ­
sikalische Beschaffenheit usw.) überprüft.
 
23. Die Expositionsatmosphäre ist so konstant wie möglich zu halten und je 
nach Analysemethode kontinuierlich und/oder intermittierend zu über ­
wachen. Bei der intermittierenden Probenahme sollten in einer vierstündigen 
Studie mindestens zweimal Proben der Atmosphäre in der Kammer genom ­
men werden. Ist dies wegen begrenzter Luftdurchflussraten oder niedriger Konzentrationen nicht möglich, kann während der gesamten Expositionszeit 
eine einzige Probe genommen werden. Weichen die einzelnen Proben stark 
voneinander ab, sollten bei den nächsten geprüften Konzentrationen vier
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 221
 
Proben je Exposition gezogen werden. Die einzelnen Proben der Konzen ­
tration in der Kammer sollten bei Gasen und Dämpfen nicht mehr als 
± 10 % und bei Flüssig- oder Feststoffaerosolen nicht mehr als ± 20 % von der mittleren Kammerkonzentration abweichen. Die Zeit bis zum Errei ­
chen eines Gleichgewichts in der Kammer (t
 95 ) ist zu berechnen und zu 
dokumentieren. Die Expositionsdauer erstreckt sich über den Zeitraum, in 
dem die Prüfsubstanz erzeugt wird; dazu gehört die zur Erreichung von t  95 
erforderliche Zeit. GD 39 (2) enthält Hinweise zur Einschätzung von t  95 . 
24. Bei sehr komplexen Mischungen aus Gasen/Dämpfen und Aerosolen (z. B. 
Verbrennungsatmosphären und Prüfsubstanzen, die aus hierzu bestimmten 
Endverbraucherprodukten/-geräten gesprüht werden), kann sich jede Phase 
in einer Inhalationskammer anders verhalten, so dass mindestens eine Indi ­
katorsubstanz (Analyt), normalerweise der wichtigste Wirkstoff in der Mi ­
schung, von jeder Phase (Gas/Dampf und Aerosol) ausgewählt werden soll ­
te. Wenn die Prüfsubstanz eine Mischung ist, sollte die Analysekonzentra ­
tion für die Mischung und nicht nur für den Wirkstoff oder den Bestandteil (Analyt) dokumentiert werden. Weitere Informationen zu tatsächlichen Kon ­
zentrationen sind in GD 39 (2) zu finden.
 
Prüfsubstanz: Partikelgrößenverteilung  
25. Die Partikelgrößenverteilung von Aerosolen sollte während jeder 4-stündi ­
gen Exposition mindestens zweimal mit einem Kaskaden-Impaktor oder 
einem anderen Messgerät wie einem APS bestimmt werden. Kann nach ­
gewiesen werden, dass die mit einem Kaskaden-Impaktor und einem alter ­
nativen Messgerät erzielten Ergebnisse gleichwertig sind, so kann das alter ­
native Instrument während der gesamten Studie verwendet werden. Parallel 
zum Hauptinstrument ist ein zweites Gerät wie ein Gravimetriefilter oder 
eine Gaswaschflasche zu verwenden, um den Abscheidegrad des Haupt ­
instruments zu bestätigen. Die durch die Partikelgrößenanalyse bestimmte Massenkonzentration sollte innerhalb vertretbarer Grenzen um die durch die 
Filteranalyse bestimmte Massenkonzentration liegen [siehe DG 39 (2)]. 
Wenn die Gleichwertigkeit zu Beginn der Studie nachgewiesen werden kann, kann auf weitere bestätigende Messungen verzichtet werden. Aus Tierschutzgründen sollten Vorkehrungen getroffen werden, um unklare Da ­
ten zu minimieren, die dazu führen könnten, dass eine Exposition wiederholt 
werden muss. Wenn die Möglichkeit besteht, dass Dampfkondensation zur Bildung eines Aerosols führen kann, oder wenn in einer Dampfatmosphäre mit dem Potenzial für gemischte Phasen Partikel nachgewiesen werden, 
sollte eine Partikelgrößenbestimmung für Dämpfe vorgenommen werden 
(siehe Nummer 15).
 
VERFAHREN  
26. Nachstehend werden zwei Prüfungsarten beschrieben: das traditionelle Pro ­
tokoll und das C-×-t-Protokoll. Beide Protokolle können eine Vorstudie, eine Hauptstudie und/oder einen Limit-Test (traditionelles Protokoll) bzw. eine Prüfung bei einer Grenzkonzentration (c × t) umfassen. Wenn bekannt 
ist, dass ein Geschlecht empfindlicher reagiert, kann der Studienleiter ent ­
scheiden, diese Prüfungen nur unter Verwendung dieses Geschlechts durch ­
zuführen. Wenn für eine „Nose-only“-Exposition andere Nagetierarten als Ratten verwendet werden, kann die maximale Expositionsdauer angepasst 
werden, um artenspezifisches Leiden zu minimieren. Damit möglichst wenig 
Tiere verwendet werden, sollten vor Beginn der Prüfung alle verfügbaren Daten ausgewertet werden. Mit Ergebnissen der Methode gemäß Kapitel B.52 dieses Anhangs (4) kann möglicherweise die Notwendigkeit einer Vor ­
studie ausgeräumt und gezeigt werden, ob ein Geschlecht empfindlicher 
reagiert als das andere [siehe GD 39 (2)].
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TRADITIONELLES PROTOKOLL  
Allgemeine Überlegungen: traditionelles Protokoll  
27. In einer traditionellen Studie werden Gruppen von Tieren einer Prüfsubstanz 
für einen festgelegten Zeitraum (im Allgemeinen 4 Stunden) entweder in einer „Nose-only“- oder einer Ganzkörperexpositionskammer ausgesetzt. Die Tiere werden entweder einer Grenzkonzentration (Limit-Test) oder schritt ­
weise mindestens drei Konzentrationen (Hauptstudie) ausgesetzt. Wenn 
nicht bereits Informationen über die Prüfsubstanz vorliegen, wie z. B. aus einer zuvor durchgeführten Prüfung nach Kapitel B.52, kann vor der Haupt ­
studie eine Vorstudie durchgeführt werden [siehe GD 39 (2)].
 
Vorstudie: traditionelles Protokoll  
28. Eine Vorstudie dient dazu, die Wirkstärke der Prüfsubstanz einzuschätzen, 
geschlechtsspezifische Unterschiede bei der Empfindlichkeit festzustellen und die Festlegung der Expositionskonzentrationen für die Hauptstudie 
oder den Limit-Test zu erleichtern. Die Auswahl der Konzentrationen für 
die Vorstudie sollte sich auf alle verfügbaren Informationen, einschließlich verfügbarer (Q)SAR-Daten und Daten für ähnliche Chemikalien stützen. Jeder Konzentration der Prüfsubstanz sollten höchstens drei männliche 
und drei weibliche Tiere ausgesetzt werden (drei Tiere je Geschlecht können 
erforderlich sein, um einen geschlechtsspezifischen Unterschied festzustel ­
len). Es ist möglich, dass in einer Vorstudie nur eine einzige Konzentration 
geprüft wird, erforderlichenfalls können aber auch mehr Konzentrationen 
geprüft werden. In einer Vorstudie sollten nicht so viele Tiere und Konzen ­
trationen untersucht werden, dass sie quasi einer Hauptstudie gleichkommt. Statt einer Vorstudie kann auf die Ergebnisse einer zuvor durchgeführten 
Prüfung gemäß Kapitel B.52 (4) zurückgegriffen werden [siehe GD 39 (2)].
 
Limit-Test: traditionelles Protokoll  
29. Ein Limit-Test wird verwendet, wenn bekannt oder zu erwarten ist, dass die 
Prüfsubstanz praktisch nicht toxisch ist, d. h. nur über der regulatorisch 
festgelegten Grenzkonzentration eine toxische Wirkung hervorruft. Beim 
Limit-Test wird eine einzige Gruppe von drei männlichen und drei weibli ­
chen Tieren der Prüfsubstanz bei einer Grenzkonzentration ausgesetzt. In ­
formationen über die Toxizität der Prüfsubstanz können aus Kenntnissen 
über ähnliche geprüfte Stoffe gewonnen werden, wobei Art und prozentualer 
Anteil der Komponenten zu berücksichtigen sind, deren toxikologische Re ­
levanz bekannt ist. In den Fällen, in denen nur wenige oder keine Informa ­
tionen über die Toxizität der Prüfsubstanz vorliegen oder in denen von einer 
Toxizität der Prüfsubstanz ausgegangen wird, sollte der Haupttest durch ­
geführt werden.  
30. Die Wahl der Grenzkonzentrationen hängt im Allgemeinen von den Regu ­
lierungsanforderungen ab. Wird die Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 zu ­
grunde gelegt, so betragen die Grenzkonzentrationen für Gase, Dämpfe und Aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l bzw. 5 mg/l (oder die höchste erreich ­
bare Konzentration) (3). Bei bestimmten Prüfsubstanzen, insbesondere bei 
Dämpfen und Aerosolen, kann es technisch schwierig sein, Grenzkonzen ­
trationen zu erzeugen. Bei der Prüfung von Aerosolen sollte das Hauptziel darin bestehen, eine lungengängige Partikelgröße (d. h. ein MMAD von 1- 
4 μm) zu erreichen. Dies ist bei den meisten Prüfsubstanzen bei einer Kon ­
zentration von 2 mg/l der Fall. Aerosole sollten nur dann bei mehr als 2 mg/l geprüft werden, wenn eine lungengängige Partikelgröße erreicht wer ­
den kann [siehe DG 39 (2)]. Die Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 rät aus 
Tierschutzgründen von der Prüfung über einer Grenzkonzentration ab (3). 
Die Grenzkonzentration sollte nur in Betracht gezogen werden, wenn eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass die Ergebnisse einer solchen Prüfung von unmittelbarer Relevanz für den Schutz der menschlichen Gesundheit 
sind (3); dies ist im Prüfbericht zu begründen. Bei potenziell explosiven 
Prüfsubstanzen ist darauf zu achten, dass keine explosionsfördernden Bedin ­
gungen geschaffen werden. Um eine unnötige Verwendung von Versuchs ­
tieren zu vermeiden und sicherzustellen, dass die Kammerbedingungen für 
einen Limit-Test erreicht werden können, sollte vor dem Limit-Test ein 
Probedurchlauf ohne Tiere vorgenommen werden.
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31. Werden bei der Grenzkonzentration Mortalität oder Siechtum beobachtet, 
können die Ergebnisse der Prüfung bei dieser Konzentration als Vorstudie 
für weitere Prüfungen bei anderen Konzentrationen dienen (siehe Haupt ­
studie). Wenn eine Grenzkonzentration wegen der physikalischen oder che ­
mischen Eigenschaften einer Prüfsubstanz nicht erreicht werden kann, sollte 
die höchste erreichbare Konzentration geprüft werden. Wenn bei der höchs ­
ten erreichbaren Konzentration eine Letalität von weniger als 50 % auftritt, sind keine weiteren Prüfungen erforderlich. Konnte die Grenzkonzentration nicht erreicht werden, sollte der Prüfbericht eine Erklärung und entspre ­
chende Daten enthalten. Wenn die höchste erreichbare Konzentration eines 
Dampfs keine Toxizität hervorruft, muss die Prüfsubstanz möglicherweise als Flüssigkeitsaerosol angewendet werden.
 
Hauptstudie: traditionelles Protokoll  
32. Eine Hauptstudie wird normalerweise mit fünf männlichen und fünf weib ­
lichen Tieren (oder, falls bekannt, fünf Tieren des empfindlicheren Ge ­
schlechts) je Konzentrationsstufe mit mindestens drei Konzentrationsstufen 
durchgeführt. Für eine robuste statistische Analyse sollten ausreichend hohe 
Konzentrationsstufen verwendet werden. Der Zeitabstand zwischen den ein ­
zelnen Expositionsgruppen richtet sich nach Einsetzen, Dauer und Schwe ­
regrad der toxischen Zeichen. Die Tiere sollten erst dann der nächsten 
Konzentrationsstufe ausgesetzt werden, wenn mit angemessener Gewissheit 
vom Überleben der zuvor getesteten Tiere ausgegangen werden kann. Dies gibt dem Studienleiter die Möglichkeit, die Zielkonzentration für die nächste Expositionsgruppe anzupassen. Wegen der Abhängigkeit von hochent ­
wickelter Technologie ist dies in Inhalationsstudien nicht immer praktikabel. 
Deshalb sollte die Exposition von Tieren gegen die nächste Konzentrations ­
stufe auf Erfahrungswerten und wissenschaftlichem Sachverstand beruhen. Bei der Prüfung von Mischungen ist das GD 39 (2) zu konsultieren.
 
KONZENTRATION-×-ZEIT-PROTOKOLL (C × T)  
Allgemeine Überlegungen: C-×-t-Prokokoll  
33. Bei der Bewertung der Inhalationstoxizität kann als Alternative zu einem 
traditionellen Protokoll eine schrittweise C-×-t-Studie in Betracht gezogen werden (12) (13) (14). Bei dieser Methode werden die Tiere der Prüfsub ­
stanz in unterschiedlichen Konzentrationsstufen und für unterschiedliche 
Zeiträume ausgesetzt. Für alle Prüfungen werden „Nose-only“-Kammern verwendet (Ganzkörperkammern sind bei diesem Protokoll nicht praktika ­
bel). Ein Fließdiagramm in Anlage 1 veranschaulicht dieses Protokoll. Eine 
Simulationsanalyse hat gezeigt, dass sowohl das traditionelle Protokoll und 
als auch das C-×-t-Protokoll robuste LC
 50 -Werte ergeben können, aber das 
C-×-t-Protokoll bei robusten LC  01 - und LC  10 -Werten im Allgemeinen über ­
legen ist (15).  
34. Einer Simulationsanalyse zufolge ist die Verwendung von zwei Tieren je 
C-×-t-Intervall (ein Tier je Geschlecht bei Verwendung beider Geschlechter 
oder zwei Tiere des empfindlicheren Geschlechts) im Allgemeinen ausrei ­
chend, wenn in einer Hauptstudie 4 Konzentrationen und 5 Expositions ­
zeiträume geprüft werden. Unter bestimmten Umständen kann der Studien ­
leiter beschließen, je zwei Ratten beider Geschlechter je C-×-t-Intervall zu 
verwenden (15). Die Verwendung von zwei Tieren je Geschlecht je Kon ­
zentration und Zeitpunkt kann Verzerrungen und Schwankungen der Schät ­
zungen verringern, die Quote der zutreffenden Schätzungen erhöhen und die 
Abdeckung des Konfidenzintervalls verbessern. Wenn die Daten jedoch 
keine ausreichende Annäherung für eine Schätzung erlauben (bei Verwen ­
dung von je einem Tier beider Geschlechter oder von zwei Tieren des empfindlicheren Geschlechts), kann auch eine fünfte Expositionskonzentra ­
tion ausreichen. Das GD 39 (2) enthält weitere Hinweise zur Zahl der Tiere 
und zu den Konzentrationen, die in einer C-×-t-Studie zu verwenden sind.
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Vorstudie: C-×-t-Protokoll  
35. Eine Vorstudie dient dazu, die Wirkstärke der Prüfsubstanz einzuschätzen 
und die Festlegung der Expositionskonzentrationen für die Hauptstudie zu erleichtern. Um eine geeignete Ausgangskonzentration für die Hauptstudie 
festzulegen und möglichst wenig Tiere zu verwenden, kann eine Vorstudie 
mit bis zu drei Tieren/Geschlecht/Konzentration [Einzelheiten siehe Anlage III von GD 39 (2)] erforderlich sein. Zur Feststellung eines geschlechts ­
spezifischen Unterschieds müssen gegebenenfalls drei Tiere je Geschlecht 
verwendet werden. Diese Tiere sind für einen einzigen Zeitraum, im All ­
gemeinen 240 Minuten, zu exponieren. Die Erzeugung geeigneter Prüfatmo ­
sphären ist in technischen Vorversuchen ohne Tiere zu erproben. Wenn 
Mortalitätsdaten aus einer Studie nach B.52 (4) vorliegen, braucht normaler ­
weise keine Vorstudie durchgeführt zu werden. Bei der Festlegung der anfänglichen Zielkonzentration einer Studie nach B.2 sollte der Studienleiter die in allen verfügbaren B.52-Studien (4) beobachteten Mortalitätsmuster für 
beide Geschlechter und für alle geprüften Konzentrationen berücksichtigen 
[siehe GD 39 (2)].
 
Ausgangskonzentration: C-×-t-Protokoll  
36. Die Ausgangskonzentration (Exposition I) (Anlage 1) ist entweder eine 
Grenzkonzentration oder eine vom Studienleiter auf Basis der Vorstudie gewählte Konzentration. Gruppen von je einem Tier beider Geschlechter 
werden dieser Konzentration für unterschiedliche Zeiträume ausgesetzt (z. 
B. 15, 30, 60, 120 oder 240 Minuten), so dass insgesamt 10 Tiere verwendet werden (Exposition I) (Anlage 1).
 
37. Die Wahl der Grenzkonzentrationen hängt im Allgemeinen von den Regu ­
lierungsanforderungen ab. Wird die Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 zu ­
grunde gelegt, so betragen die Grenzkonzentrationen für Gase, Dämpfe und Aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l bzw. 5 mg/l (oder die höchste erreich ­
bare Konzentration) (3). Bei bestimmten Prüfsubstanzen, insbesondere bei 
Dämpfen und Aerosolen, kann es technisch schwierig sein, Grenzkonzen ­
trationen zu erzeugen. Bei der Prüfung von Aerosolen sollte eine lungen ­
gängige Partikelgröße (d. h. ein MMAD von 1-4 μm) bei einer Grenzkon ­
zentration von 2 mg/l erreicht werden. Dies ist bei den meisten Prüfsub ­
stanzen möglich. Aerosole sollten nur dann bei mehr als 2 mg/l geprüft werden, wenn eine lungengängige Partikelgröße erreicht werden kann [siehe DG 39 (2)]. Die Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 rät aus Tierschutzgründen 
von der Prüfung über einer Grenzkonzentration ab (3). Prüfungen über der 
Grenzkonzentration sollten nur in Betracht gezogen werden, wenn eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass die Ergebnisse einer solchen Prüfung von unmittelbarer Relevanz für den Schutz der menschlichen Gesundheit sind 
(3); dies ist im Prüfbericht zu begründen. Bei potenziell explosiven Prüf ­
substanzen ist darauf zu achten, dass keine explosionsfördernden Bedingun ­
gen geschaffen werden. Vor der Prüfung bei der Ausgangskonzentration sollte ein Probedurchlauf ohne Tiere vorgenommen werden, um eine unnö ­
tige Verwendung von Versuchstieren zu vermeiden und sicherzustellen, dass 
die Kammerbedingungen für diese Konzentration erreicht werden können.
 
38. Werden bei der Ausgangskonzentration Mortalität oder Siechtum beobach ­
tet, können die Ergebnisse dieser Konzentration als Ausgangspunkt für wei ­
tere Prüfungen bei anderen Konzentrationen dienen (siehe Hauptstudie). 
Wenn eine Grenzkonzentration wegen der physikalischen oder chemischen Eigenschaften einer Prüfsubstanz nicht erreicht werden kann, sollte die höchste erreichbare Konzentration geprüft werden. Wenn bei der höchsten 
erreichbaren Konzentration eine Letalität von weniger als 50 % auftritt, sind 
keine weiteren Prüfungen erforderlich. Konnte die Grenzkonzentration nicht erreicht werden, sollte der Prüfbericht eine Erklärung und entsprechende Daten enthalten. Wenn die höchste erreichbare Konzentration eines Dampfs 
keine Toxizität hervorruft, muss die Prüfsubstanz möglicherweise als Flüs ­
sigkeitsaerosol angewendet werden.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 225
 
Hauptstudie: C-×-t-Protokoll  
39. Die in der Hauptstudie geprüfte Ausgangskonzentration (Exposition I) (An ­
lage 1) ist entweder eine Grenzkonzentration oder eine vom Studienleiter auf Basis der Vorstudie gewählte Konzentration. Wenn während oder nach der 
Exposition I Mortalität beobachtet wurde, gilt die Mindestexposition (c × t), 
die zu Mortalität führt, als Anhaltspunkt für die Festlegung der Expositions ­
konzentration und -dauer für die Exposition II. Jede folgende Exposition hängt von der vorhergehenden Exposition ab (siehe Anlage 1).
 
40. Bei vielen Prüfsubstanzen sind die bei der Ausgangskonzentration erzielten 
Ergebnisse zusammen mit drei zusätzlichen Expositionen mit einem kleine ­
ren Zeitraster (das ist der geometrische Abstand von Expositionsperioden, 
der angegeben wird durch den Faktor zwischen aufeinanderfolgenden Peri ­
oden, im Allgemeinen √2) ausreichend, um die C-×-t-Mortalitätsbeziehung 
festzulegen (15), aber es kann hilfreich sein, eine fünfte Expositionskonzen ­
tration zu verwenden [siehe Anlage 1 und GD 39 (2)]. Anlage 1 enthält 
Hinweise zur mathematischen Aufbereitung der Ergebnisse für das C-×-t- 
Protokoll.  
BEOBACHTUNGEN  
41. Die Tiere sollten während der Exposition häufig auf klinische Zeichen be ­
obachtet werden. Nach der Exposition sollten klinische Beobachtungen min ­
destens zweimal am Tag der Exposition oder, falls es aufgrund der Reaktion 
der Tiere auf die Behandlung angezeigt erscheint, häufiger und danach für 
einen Zeitraum von insgesamt 14 Tagen mindestens einmal täglich vor ­
genommen werden. Die Länge des Beobachtungszeitraums ist nicht fest ­
gelegt; sie sollte nach Art und Zeitpunkt des Einsetzens klinischer Zeichen 
und der Länge der Erholungsphase bestimmt werden. Der Zeitpunkt, zu dem 
die Toxizitätszeichen auftreten und wieder abklingen, ist von Bedeutung, insbesondere dann, wenn Anzeichen für ein verzögertes Auftreten von To ­
xizitätszeichen erkennbar sind. Sämtliche Beobachtungen werden systema ­
tisch in Einzelprotokollen dokumentiert, die für jedes Tier geführt werden. 
Tiere, bei denen ein moribunder Zustand festgestellt wird, sowie Tiere, die starke Schmerzen haben oder anhaltende Anzeichen von schwerem Leiden zeigen, sollten aus Tierschutzgründen auf humane Weise getötet werden. 
Bei den Untersuchungen auf klinische Toxizitätszeichen ist darauf zu ach ­
ten, dass ein anfänglich schlechtes Aussehen und vorübergehende Atemver ­
änderungen, die auf das Expositionsverfahren zurückzuführen sind, nicht mit einer durch die Prüfsubstanz bedingten Toxizität verwechselt werden, die 
eine vorzeitige Tötung der Tiere erfordern würde. Die im Guidance Docu ­
ment on Humane Endpoints (GD 19) zusammengefassten Prinzipien und Kriterien sind zu berücksichtigen (7). Wenn Tiere aus humanen Gründen getötet werden oder ihr Tod festgestellt wird, sollte der Todeszeitpunkt so 
genau wie möglich registriert werden.
 
42. Bei den Beobachtungen ist auf Veränderungen von Haut, Fell, Augen und 
Schleimhäuten sowie Atmung, Kreislauf, autonomes und zentrales Nerven ­
system, Somatomotorik und Verhaltensmuster zu achten. Soweit möglich, ist 
auf Differenzierungen zwischen lokalen und systemischen Wirkungen zu 
achten. Besonderes Augenmerk ist auf Tremor, Konvulsionen, Salivation, Diarrhö, Lethargie, Schlaf und Koma zu richten. Die Messung der Rektal ­
temperatur kann zusätzliche Belege für mit der Behandlung oder Unterbrin ­
gung zusammenhängende Reflex-Bradypnoe oder Hypo-/Hyperthermie lie ­
fern.
 
Körpergewicht  
43. Das Körpergewicht der einzelnen Tiere sollte einmal während der Einge ­
wöhnungszeit, am Tag der Exposition vor der Exposition (Tag 0) und mindestens an den Tagen 1, 3 und 7 (und danach wöchentlich) sowie 
zum Zeitpunkt des Todes oder der Tötung, falls später als Tag 1, dokumen ­
tiert werden. Das Körpergewicht gilt als kritischer Indikator für Toxizität; Tiere, die gegenüber ihrem Gewicht vor der Prüfung eine dauerhafte Ab ­
nahme um ≥ 20 % aufweisen, sollten sorgfältig überwacht werden. Die 
überlebenden Tiere werden gewogen und am Ende der 
Post-Expositionsphase auf humane Weise getötet.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 226
 
Pathologie  
44. Alle Versuchstiere (einschließlich der Tiere, die während des Tests sterben 
oder aus Tierschutzgründen getötet und aus der Studie genommen werden) sind auf makroskopische Veränderungen zu untersuchen. Kann die Nekrop ­
sie nicht unmittelbar nach Auffinden eines toten Tieres erfolgen, sollte der 
Körper auf eine Temperatur gekühlt (nicht eingefroren) werden, die tief genug ist, um die Autolyse zu minimieren. Die Nekropsie ist baldmöglichst, in der Regel innerhalb von einem oder zwei Tagen durchzuführen. Alle 
makroskopischen Veränderungen sollten für jedes Tier protokolliert werden, 
wobei besonders auf Veränderungen der Atemwege zu achten ist.
 
45. Es kann in Betracht gezogen werden, von vorneherein zusätzliche Unter ­
suchungen in die Studienauslegung aufzunehmen, die die Aussagekraft der Studie erhöhen, z. B. die Messung des Lungengewichts überlebender Ratten und/oder den Nachweis einer Reizwirkung durch mikroskopische Unter ­
suchung der Atemwege. Untersucht werden können auch diejenigen Organe, 
die bei 24 Stunden oder länger überlebenden Tieren makroskopische Be ­
funde aufweisen, sowie Organe, die bekanntermaßen oder vermutlich be ­
troffen sind. Eine mikroskopische Untersuchung des gesamten Atemtrakts 
kann nützliche Informationen über Prüfsubstanzen liefern, die mit Wasser 
reagieren, z. B. Säuren und hygroskopische Prüfsubstanzen.
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Daten  
46. Das Körpergewicht der einzelnen Tiere und Sektionsbefunde sollten ange ­
geben werden. Die Daten der klinischen Beobachtung sollten in tabellari ­
scher Form zusammengefasst werden. Daraus müssen für jede Prüfgruppe 
die Anzahl der verwendeten Tiere, die Anzahl der Tiere mit spezifischen Toxizitätszeichen, die Anzahl der Tiere, die während der Prüfung tot auf ­
gefunden oder vorzeitig getötet wurden, der Todeszeitpunkt der einzelnen 
Tiere, eine Beschreibung und der zeitliche Verlauf der toxischen Wirkungen 
und deren Reversibilität sowie die Sektionsbefunde ersichtlich sein.
 
Prüfbericht  
47. Der Prüfbericht sollte, soweit zutreffend, die folgenden Informationen ent ­
halten:  
Versuchstiere und Tierhaltung  
— Beschreibung der Haltungsbedingungen mit Angaben zu Anzahl (oder 
Veränderung der Anzahl) der Tiere je Käfig, Einstreu, Umgebungstem ­
peratur und relativer Luftfeuchtigkeit, Photoperiode und Futter,  
— Art/Stamm und Begründung für die Verwendung einer anderen Art als 
der Ratte,  
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere,  
— Randomisierungsmethode,  
— Angaben über Futter- und Wasserqualität (einschließlich Art/Herkunft 
des Futters, Wasserquelle),  
— Beschreibung etwaiger Vorbereitung vor der Prüfung, einschließlich Er ­
nährung, Quarantäne und Behandlung von Krankheiten.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 227
 
Prüfsubstanz  
— physikalische Beschaffenheit, Reinheit und, wenn maßgeblich, 
physikalisch-chemische Eigenschaften (einschließlich Isomerisierung),  
— Angaben zur Identifikation und CAS-Nummer (Chemical Abstract Ser ­
vices), falls bekannt.  
Vehikel  
— Begründung für die Verwendung eines Vehikels sowie für die Wahl des 
Vehikels (falls nicht Wasser),  
— historische oder parallel erzeugte Daten, die belegen, dass das Vehikel 
keinen Einfluss auf das Ergebnis der Studie hat.  
Inhalationskammer  
— Beschreibung der Inhalationskammer mit Angabe von Abmessungen und 
Volumen,  
— Herkunft und Beschreibung der für die Exposition der Tiere sowie für 
die Erzeugung der Atmosphäre verwendeten Ausrüstung,  
— Ausrüstung für die Messung von Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Partikel ­
größe und tatsächlicher Konzentration,  
— Herkunft der Luft und Behandlung der eingeleiteten/entzogenen Luft 
sowie Klimatisierungssystem,  
— für die Kalibrierung der Ausrüstung verwendete Methoden, um eine 
homogene Prüfatmosphäre sicherzustellen,  
— Druckunterschied (positiv oder negativ),  
— Expositions-Öffnungen je Kammer („Nose-only“-Exposition); Anord ­
nung der Tiere im System (Ganzkörperexposition),  
— zeitliche Homogenität/Stabilität der Prüfatmosphäre,  
— Lage von Temperatur- und Feuchtigkeitssensoren und Ort der Pro ­
benahme der Prüfatmosphäre in der Kammer,  
— Luftdurchflussraten, Luftdurchflussrate/Expositions-Öffnung („Nose-on ­
ly“-Exposition) oder Anzahl der Tiere je Kammer (Ganzkörperexpositi ­
on), 
— Angaben zur Ausrüstung für die Messung des Sauerstoff- und Kohlen ­
dioxidgehalts, falls zutreffend,  
— bis zum Erreichen des Gleichgewichts in der Inhalationskammer benö ­
tigte Zeit (t  95 ), 
— Zahl der Volumenänderungen pro Stunde,  
— Messgeräte (falls zutreffend).  
Expositionsdaten  
— Begründung für die Wahl der Zielkonzentration in der Hauptstudie,  
— nominale Konzentrationen (Gesamtmasse der in die Inhalationskammer 
eingeleiteten Prüfsubstanz dividiert durch das Volumen der durch die 
Kammer geleiteten Luft),  
— im Atembereich der Tiere ermittelte tatsächliche Konzentrationen der 
Prüfsubstanz; bei Gemischen mit heterogenen physikalischen Formen 
(Gase, Dämpfe, Aerosole) kann jede Form getrennt analysiert werden,  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 228
 
— alle Luftkonzentrationen sollten in Masseneinheiten angegeben werden 
(z. B. mg/l, mg/m  3 usw.), Volumeneinheiten können in Klammern eben ­
falls angegeben werden (z. B. ppm, ppb usw.),  
— Partikelgrößenverteilung, mittlerer aerodynamischer 
Massendurchmesser (MMAD) und geometrische Standardabweichung (σg), einschließlich der Berechnungsmethoden. Einzelne Partikelgrößen ­
analysen sind zu protokollieren.
 
Prüfbedingungen  
— Angaben zur Vorbereitung der Prüfsubstanz, einschließlich Angaben zu 
den Verfahren zur Reduzierung der Partikelgröße von Feststoffen oder zur Herstellung von Lösungen der Prüfsubstanz. Wenn die Zusammen ­
setzung der Prüfsubstanz durch mechanische Prozesse verändert worden 
sein kann, sind die Ergebnisse der Analysen zur Überprüfung der Zu ­
sammensetzung der Prüfsubstanz beizufügen,
 
— eine Beschreibung (möglichst mit Diagramm) der Ausrüstung, die zur 
Erzeugung der Prüfatmosphäre und zur Exposition der Tiere gegen die 
Prüfatmosphäre verwendet wurde,  
— Angaben zur verwendeten chemischen Analysemethode und zur Validie ­
rung der Methode (einschließlich der Effizienz der Wiederfindung der Prüfsubstanz im Medium),
 
— Begründung für die Wahl der Prüfkonzentrationen.  
Ergebnisse  
— tabellarische Darstellung von Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Luft ­
strom in der Kammer,  
— tabellarische Darstellung von Daten zur nominalen und tatsächlichen 
Konzentration in der Kammer,  
— tabellarische Darstellung der Partikelgrößendaten einschließlich Daten 
zur analytischen Probenahme, Partikelgrößenverteilung und Berechnung 
des MMAD und der σ g , 
— tabellarische Darstellung der erhobenen Daten und der Konzentration für 
jedes einzelne Tier (d. h. Tiere, die Anzeichen für Toxizität zeigen, 
einschließlich Mortalität sowie Art, Schweregrad, Zeitpunkt des Einset ­
zens und Dauer der Wirkungen),  
— während der Prüfung erfasstes Körpergewicht der einzelnen Tiere, Da ­
tum und Zeitpunkt des Todes, falls vor geplanter Tötung; zeitlicher Verlauf des Einsetzens von Toxizitätsanzeichen sowie Angabe, ob diese 
reversibel waren, für jedes einzelne Tier,
 
— Sektionsbefunde und histopathologische Ergebnisse für jedes einzelne 
Tier, falls vorhanden,  
— Letalitätsschätzungen (z. B. LC  50 , LD  01 ), einschließlich Konfidenzinter ­
valle von 95 %, und Steigung (falls von der Bewertungsmethode vor ­
gesehen),  
— statistische Beziehung, einschließlich Schätzung des Exponenten n (c- 
×-t-Protokoll). Die verwendete Statistiksoftware ist anzugeben.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 229
 
Diskussion und Auswertung der Ergebnisse  
— Besondere Aufmerksamkeit sollte der Beschreibung der Methoden gel ­
ten, die verwendet wurden, um die Kriterien dieser Prüfmethode zu erfüllen, z. B. die Grenzkonzentration oder die Partikelgröße.
 
— Die Lungengängigkeit von Partikeln vor dem Hintergrund der Gesamt ­
befunde sollte behandelt werden, insbesondere, wenn die Partikelgrößen ­
kriterien nicht erfüllt werden konnten.  
— Falls Tiere, die unter Schmerzen litten oder Zeichen für schweres und 
anhaltendes Leiden aufwiesen, auf humane Weise getötet werden muss ­
ten, ist eine Erklärung auf der Grundlage der Kriterien im OECD Gui ­
dance Document on Humane Endpoints (8) zu geben.  
— Wenn eine Prüfung nach Kapitel B.52 dieses Anhang (4) zugunsten 
dieser Prüfmethode B.2 abgebrochen wurde, ist dies zu begründen.  
— Die Kohärenz der Methoden zur Bestimmung der nominalen und der 
tatsächlichen Konzentration sowie die Beziehung der tatsächlichen Kon ­
zentration zur nominalen Konzentration sind in die Gesamtbewertung der Studie aufzunehmen.
 
— Die wahrscheinliche Todesursache und die vorherrschende Wirkungs ­
weise (systemisch oder lokal) sollten behandelt werden.  
LITERATUR:  
1. OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Tes ­
ting of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
2. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/ testguidelines]
 
3. Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 des Europäischen Parlaments und des Rates 
vom 16. Dezember 2008 über die Einstufung, Kennzeichnung und Ver ­
packung von Stoffen und Gemischen, zur Änderung und Aufhebung der Richtlinien 67/548/EWG und 1999/45/EG und zur Änderung der 
Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 (ABl. L 353 vom 31.12.2008, S. 1).
 
4. Kapitel B.52 dieses Anhangs, Akute Inhalationstoxizität — akut toxische 
Klassenmethode.  
5. Kapitel B.40 dieses Anhangs, In-vitro-Prüfung auf hautätzende Wirkung: 
TER-Test (transcutaneous electrical resistance test)  
6. Kapitel B.40bis dieses Anhangs, In-vitro-Prüfung auf hautätzende Wirkung: 
Test mit menschlichem Hautmodell)  
7. OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. 
OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
8. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http:// www.oecd.org/env/testguidelines]
 
9. SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, So ­
ciety of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.
 
10. Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 230
 
11. Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160- 
167. 
12. Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative 
Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with 
Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.
 
13. Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Deter ­
mination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.
 
14. Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute 
Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.  
15. OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
16. Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
London/New York.  
DEFINITION  
Prüfsubstanz:  jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode 
getestet wird.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 231
 
Anlage 1  
C-×-t-Protokoll  
1. Bei der Bewertung der Inhalationstoxizität kann als Alternative zu einem 
traditionellen Protokoll eine schrittweise Konzentrations-×-Zeit-Studie (c × t) in Betracht gezogen werden (12) (13) (14). Sie sollte vorzugsweise dann angewendet werden, wenn wegen einer spezifischen Regelung oder aus 
wissenschaftlicher Notwendigkeit eine Prüfung von Tieren über unterschied ­
liche Zeiträume erforderlich ist, z. B. für Zwecke der Notfallplanung oder für die Flächennutzungsplanung. Diese Methode beginnt normalerweise mit der Prüfung der Prüfsubstanz in einer Grenzkonzentration (Exposition I), bei 
der die Tiere der Prüfsubstanz für fünf Zeiträume ausgesetzt werden (z. B. 
15, 30, 60, 120 und 240 Minuten), so dass innerhalb einer Exposition Ergebnisse für mehrere Zeiträume erzielt werden (siehe Abbildung 1). Wird die Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 zugrunde gelegt, so betragen 
die Grenzkonzentrationen für Gase, Dämpfe und Aerosole 20 000 ppm, 20 
mg/l bzw. 5 mg/l. Diese Werte dürfen nur überschritten werden, wenn eine regulatorische oder wissenschaftliche Notwendigkeit für die Prüfung mit diesen höheren Werten besteht (siehe Nummer 37 im Haupttext von Kapitel 
B.2).
 
2. Liegen nur wenig oder keine Informationen über die Toxizität einer Prüf ­
substanz vor, sollte eine Vorstudie durchgeführt werden, bei der Gruppen 
von höchstens drei Tieren beider Geschlechter den vom Studienleiter fest ­
gelegten Zielkonzentrationen im Allgemeinen für 240 Minuten ausgesetzt werden.
 
3. Wenn bei der Exposition I eine Grenzkonzentration geprüft wird und die 
Mortalität bei unter 50 % liegt, sind keine weiteren Prüfungen erforderlich. 
Besteht eine regulatorische oder wissenschaftliche Notwendigkeit zur Fest ­
legung der Konzentrations-/Zeit-/Wirkungs-Beziehung bei höheren Werten als der angegebenen Grenzkonzentration, sollte die nächste Exposition auf 
einem höheren Niveau, z. B. dem Doppelten der Grenzkonzentration, durch ­
geführt werden (d. h. 2L in Abbildung 1).
 
4. Wenn bei der Grenzkonzentration Toxizität beobachtet wird, sind zusätzli ­
che Prüfungen (Hauptstudie) erforderlich. Diese zusätzlichen Expositionen 
werden entweder bei niedrigeren Konzentrationen (in Abbildung 1: Exposi ­
tionen II, III oder IV‘) oder bei höheren Konzentrationen von kürzerer Dauer (in Abbildung 1: Exposition IV) durchgeführt, wobei angepasste 
Zeiträume mit geringerem Abstand verwendet werden.
 
5. Die Prüfung (Ausgangskonzentration und zusätzliche Konzentrationen) wird 
mit je einem Tier beider Geschlechter je Konzentration/Zeitpunkt oder zwei Tieren des empfindlicheren Geschlechts je Konzentration/Zeitpunkt durch ­
geführt. Unter bestimmten Umständen kann der Studienleiter entscheiden, je 
zwei Ratten beider Geschlechter je Konzentration/Zeitpunkt (oder vier Tiere des empfindlicheren Geschlechts je Konzentration/Zeitpunkt) zu verwenden (15). Die Verwendung von zwei Tieren je Geschlecht je Konzentration/Zeit ­
punkt verringert im Allgemeinen Verzerrungen und Schwankungen der 
Schätzungen, erhöht die Quote der zutreffenden Schätzungen und verbessert die Abdeckung des Konfidenzintervalls gegenüber dem hier beschriebenen Protokoll. GD 39 (2) enthält nähere Hinweise.
 
6. Im Idealfall wird jede Exposition innerhalb eines Tages durchgeführt. Bei 
dieser Vorgehensweise kann die nächste Exposition auf einen Zeitpunkt gelegt werden, an dem mit angemessener Gewissheit vom Überleben der Tiere ausgegangen werden kann. Außerdem kann der Studienleiter die Ziel ­
konzentration und Dauer der nächsten Exposition anpassen. Es empfiehlt 
sich, jede Exposition mit der Gruppe zu beginnen, die am längsten exponiert sein wird, z. B. die 240-Minuten-Gruppe, gefolgt von der 120-Minuten- Gruppe usw. Wenn beispielsweise Tiere in der 240-Minuten-Gruppe nach 
90 Minuten sterben oder deutliche Toxizitätszeichen aufweisen (wie extreme 
Veränderungen der Atmung, z. B. Atemnot), wäre es nicht sinnvoll, eine Gruppe für 120 Minuten der Prüfsubstanz auszusetzen, da die Mortalität wahrscheinlich 100 % betragen würde. Der Studienleiter sollte dann für 
diese Konzentration eine kürzere Expositionsdauer festlegen (z. B. 90, 65, 
45, 33 und 25 Minuten).
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 232
 
7. Die Konzentration in der Kammer sollte häufig gemessen werden, um für 
jede Expositionsdauer die zeitgewichtete Durchschnittskonzentration zu be ­
stimmen. Soweit möglich, sollte bei jedem Tier der Todeszeitpunkt (nicht die Expositionsdauer) für die statistische Analyse verwendet werden.
 
8. Die Ergebnisse der ersten vier Expositionen sollten auf Datenlücken in der 
Konzentrations-Zeit-Kurve geprüft werden (siehe Abbildung 1). Wenn eine unzureichende Annäherung gegeben ist, kann eine zusätzliche Exposition (fünfte Konzentration) durchgeführt werden. Konzentration und Expositions ­
dauer der fünften Exposition sollten so gewählt werden, dass diese Lücke 
geschlossen wird.
 
9. Die Konzentrations-Zeit-Wirkungsbeziehung wird durch statistische Analyse 
unter Einbeziehung aller Expositionen (einschließlich der Exposition I) be ­
rechnet (16). Soweit möglich, sollten für jedes c-×-t-Intervall die zeitgewich ­
tete Durchschnittskonzentration und die Expositionsdauer bis zum Tod (falls 
der Tod während der Exposition eintritt) verwendet werden.  
Abbildung 1  
Hypothetische Darstellung einer Konzentrations-Zeit-Mortalitäts-Beziehung 
bei Ratten
  
Offene Symbole = überlebende Tiere; geschlossene Symbole = tote Tiere  
Dreiecke = Weibchen; Kreise = Männchen  
Durchgezogene Linie = LC  50 -Werte (Bereich 7,5-240 min) für männliche Tiere 
mit n = 1  
Gestrichelte Linie = LC  50 -Werte (Bereich 7,5-240 min) für weibliche Tiere mit 
n = 1  
Gestrichelt-gepunktete Linien = hypothetische LC  50 -Werte für männliche und 
weibliche Tiere, falls n = 2 war (12).  
Glossar  
Konzentration:  
Dauer der Exposition:  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 233
 
10. Beispiel für das schrittweise Verfahren:  
Exposition I — Prüfung bei der Grenzkonzentration (siehe Abbildung 1)  
— 1 Tier/Geschlecht je Konzentration/Zeitpunkt; 10Tiere insgesamt (  a ) 
— Zielkonzentration (  b ) = Grenzkonzentration  
— Exposition von fünf Gruppen von Tieren bei dieser Zielkonzentration für 
eine Dauer von 15, 30, 60, 120 bzw. 240 Minuten  
↓ 
Exposition II  ( c )— Hauptstudie  
— 1 Tier/Geschlecht je Konzentration/Zeitpunkt; 10 Tiere insgesamt  
— Exposition von fünf Gruppen von Tieren bei niedrigerer Konzentrati ­
on (  d ) (1/2L) mit etwas längerer Expositionsdauer (Abstand Faktor √2; 
siehe Abbildung 1).  
↓ 
Exposition III — Hauptstudie  
— 1 Tier/Geschlecht je Konzentration/Zeitpunkt; 10 Tiere insgesamt  
— Exposition von fünf Gruppen von Tieren bei niedrigerer Konzentrati ­
on (  d ) (1/4L) mit etwas längerer Expositionsdauer (Abstand Faktor √2; 
siehe Abbildung 1).  
↓ 
Exposition IV‘ — Hauptstudie  
— 1 Tier/Geschlecht je Konzentration/Zeitpunkt; 10 Tiere insgesamt  
— Exposition von fünf Gruppen von Tieren bei niedrigerer Konzentrati ­
on (  d ) (1/8L) mit etwas längerer Expositionsdauer (Abstand Faktor √2; 
siehe Abbildung 1).  
↓ oder  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 234  
( a ) Liegen keine Informationen über geschlechtsspezifische Empfindlichkeit vor, sind Ratten 
beider Geschlechter zu verwenden, d. h. 1 Tier/Geschlecht je Konzentration. Auf der Grundlage der vorhandenen Informationen, oder falls sich im Laufe der Exposition zeigt, 
dass ein Geschlecht empfindlicher ist, werden während der weiteren Prüfung auf jeder 
Konzentrationsstufe 10 Tiere des empfindlichen Geschlechts (2 Tiere je Konzentration/ 
Zeitpunkt) verwendet. 
(
 b ) Wird die Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 zugrunde gelegt, so betragen die Grenzkon ­
zentrationen für Gase, Dämpfe und Aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l bzw. 5 mg/l. Wenn 
mit Toxizität gerechnet wird oder die Ergebnisse der Vorstudie darauf hindeuten, sollten 
niedrigere Ausgangskonzentrationen gewählt werden. Bei regulatorischer oder wissen ­
schaftlicher Notwendigkeit können höhere Konzentrationen verwendet werden. 
( c ) Im Idealfall sollten die Tiere erst dann der nächsten Konzentrationsstufe ausgesetzt 
werden, wenn mit angemessener Gewissheit vom Überleben der zuvor getesteten Tiere 
ausgegangen werden kann. Dies gibt dem Studienleiter die Möglichkeit, Zielkonzentra ­
tion und Dauer für die nächste Exposition anzupassen. 
( d ) Die kleinste Dosis (Konzentration × Zeit), die während der Prüfung bei der Ausgangs ­
konzentration (Exposition I) zu einem Todesfall geführt hat, dient als Anhaltspunkt für 
die Festlegung der nächsten Kombination von Konzentration und Expositionsdauer. 
Normalerweise wird die Konzentration halbiert (1/2L), und die Tiere werden für eine 
neue, feiner unterteilte Zeitspanne exponiert, wobei die Expositionszeiten eine geometri ­
sche Folge mit dem Faktor 1,4 ( √2, siehe Literaturangabe 11) bilden, in deren Mitte 
diejenige Zeitdauer liegt, die der kleinsten letalen Dosisstufe (Zeit × Konzentration) entspricht, die bei der ersten Exposition beobachtet wurde. In dieser Abbildung 1 wurde 
bei der Exposition I nach 15 Minuten der erste Todesfall beobachtet. Die Zeiträume der 
Exposition II liegen daher um 30 Minuten und betragen 15, 21, 30, 42 und 60 Minuten. 
Es wird dringend empfohlen, die Daten nach den ersten beiden Expositionen wie in der 
obigen Abbildung grafisch darzustellen und zu prüfen, ob die Beziehung zwischen Kon ­
zentration und Zeit einen Winkel von 45° (n = 1) aufweist oder ob die 
Konzentrations-Zeit-Wirkungsbeziehung weniger steil (z. B. n = 2) oder steiler (z. B. 
n = 0,8) ist. In den letztgenannten Fällen wird dringend empfohlen, die nächsten Kon ­
zentrationen und Expositionszeiträume entsprechend anzupassen.
 Exposition IV — Hauptstudie  
— 1 Tier/Geschlecht je Konzentration/Zeitpunkt; 10 Tiere insgesamt  
— Exposition von fünf Gruppen von Tieren bei höherer Konzentration (  e ) 
(2L) mit etwas kürzerer Expositionsdauer (Abstand Faktor √2; siehe 
Abbildung 1).  
Mathematische Aufbereitung der Ergebnisse für das c-×-t-Protokoll  
11. Ein c-×-t-Verfahren mit 4 oder 5 Expositionskonzentrationen und fünf Ex ­
positionszeiträumen ergibt 20 bzw. 25 Datenpunkte. Anhand dieser Daten ­
punkte kann die c-×-t-Beziehung durch statistische Analyse berechnet wer ­
den (16):  
Gleichung 1  
ProbitðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
dabei ist: C = Konzentration; t = Expositionsdauer oder  
Gleichung 2  
Response ¼ ƒðC n tÞ 
dabei ist:  n ¼ b 1=b 2: 
Mit der Gleichung 1 kann der LC  50 -Wert für einen bestimmten Zeitraum (z. 
B. 4 Stunden, 1 Stunde, 30 Minuten oder jeden Zeitraum innerhalb des 
geprüften Zeitbereichs) unter Verwendung von P = 5 (50 % Response) berechnet werden. Die Habersche Regel gilt nur, wenn n = 1. Der LC
 01 - 
Wert kann unter Verwendung von P = 2,67 berechnet werden.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 235  
( e ) In bestimmten Fällen muss möglicherweise die Konzentration erhöht (2L) und eine neue, 
noch feiner unterteilte Zeitspanne festgelegt werden, wobei die Expositionszeiten eine 
geometrische Folge mit dem Faktor 1,4 ( √2) bilden, in deren Mitte diejenige Zeitdauer 
liegt, die der kleinsten letalen Dosis entspricht, die bei der ersten Exposition beobachtet 
wurde. Die Mindestexpositionsdauer sollte möglichst mehr als 5 Minuten betragen; die 
Höchstexpositionsdauer sollte 8 Stunden nicht überschreiten.
 B.3. AKUTE TOXIZITÄT (DERMAL)  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B (Punkt A).  
1.2. DEFINITIONEN  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B (Punkt B).  
1.3. BEZUGSSUBSTANZEN  
Keine.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Die Prüfsubstanz wird in abgestuften Dosierungen mehreren Ver ­
suchstiergruppen auf die Haut aufgetragen, und zwar eine Dosierung 
je Gruppe. Anschließend werden die beobachteten Vergiftungs ­
erscheinungen und Todesfälle registriert. Tiere, die während des Versuchs sterben, sowie die bei Versuchsende überlebenden Tiere 
werden seziert.
 
Tiere mit starken und anhaltenden Anzeichen von Leiden und 
Schmerzen können vorzeitig getötet werden; Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie auf diesem Wege aufgrund ihrer ätzenden oder 
reizenden Wirkungen ausgeprägte Schmerzen und Leiden verursa ­
chen, brauchen nicht geprüft zu werden.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.6.1.  Vorbereitung  
Vor der Untersuchung werden die Tiere für einen Zeitraum von 
mindestens 5 Tagen unter experimentellen Haltungs- und Fütterungs ­
bedingungen in geeigneten Käfigen eingewöhnt. Vor Versuchsbeginn 
werden gesunde, junge erwachsene Tiere randomisiert und den ein ­
zelnen Behandlungsgruppen zugeordnet. Etwa 24 Stunden vor Ver ­
suchsbeginn wird das Fell der Versuchstiere auf dem Rücken durch 
Scheren oder Rasieren entfernt. Beim Scheren oder Abrasieren des 
Fells ist darauf zu achten, dass die Haut nicht verletzt wird, da dies zu einer Veränderung der Durchlässigkeit führen könnte. Mindestens 10 % der Körperoberfläche wird für die Applikation der Prüfsub ­
stanz vorbereitet. Werden feste Stoffe verwendet, die gegebenenfalls 
pulverisiert werden können, sollte die Prüfsubstanz ausreichend mit Wasser oder ggf. einem geeigneten Vehikel angefeuchtet werden, um einen guten Kontakt mit der Haut sicherzustellen. Bei der Verwen ­
dung eines Vehikels ist dessen Einfluss auf das Eindringen der Prüf ­
substanz in die Haut zu berücksichtigen. Flüssige Prüfsubstanzen werden im Allgemeinen unverdünnt angewendet.
 
1.6.2.  Prüfbedingungen  
1.6.2.1.  Versuchstiere  
Es können erwachsene Ratten oder Kaninchen verwendet werden. 
Auch andere Tierarten können verwendet werden, jedoch muss 
ihre Verwendung begründet werden. Es sollen bekannte Versuchs ­
tierstämme verwendet werden. Für jedes Geschlecht sollte die Schwankung des Körpergewichts der Tiere des jeweiligen Versuchs 
bei Versuchsbeginn nicht mehr als ± 20 % vom entsprechenden 
Mittelwert betragen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 236
 
1.6.2.2.  Anzahl und Geschlecht  
Mindestens 5 Tiere sind für jede Konzentration zu verwenden. Sie 
sollten alle vom gleichen Geschlecht sein. Wenn weibliche Tiere benutzt werden, dürfen diese weder geworfen haben noch trächtig 
sein. Wenn es Hinweise darauf gibt, dass ein Geschlecht deutlich 
empfindlicher reagiert, sollten Tiere dieses Geschlechts verwendet werden.
 
Anmerkung:  Bei Prüfungen der akuten Toxizität an Tieren, die einer 
höheren Ordnung angehören als Nagetiere, sollte die Verwendung 
einer geringeren Anzahl an Tieren in Betracht gezogen werden. Die Dosierungen sollten sorgfältig ausgewählt und großer Wert darauf gelegt werden, mäßig toxische Dosierungen nicht zu überschreiten. 
Bei solchen Versuchen sollte die Verabreichung der Prüfsubstanz in 
letalen Dosen vermieden werden.
 
1.6.2.3.  Dosierungen  
Die Dosisgruppen (mindestens 3) sollten ausreichen, um nach ent ­
sprechenden Abstufungen Versuchsgruppen mit unterschiedlichen to ­
xischen Wirkungen und Mortalitätsraten zu erhalten. Bei der Fest ­
legung der Dosierungen sollte eine mögliche reizende oder ätzende 
Wirkung berücksichtigt werden. Die erhaltenen Daten sollten ausrei ­
chen, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve aufzuzeigen und — soweit möglich — eine annehmbare Bestimmung der LD
 50 erlauben.  
1.6.2.4.  Limit-Test  
Es kann ein Limit-Test mit einer einzigen Dosierung von mindestens 
2 000 mg/kg Körpergewicht an einer Gruppe von 5 männlichen und 
5 weiblichen Tieren unter Verwendung der oben beschriebenen Ver ­
fahren durchgeführt werden. Wenn substanzbedingte Todesfälle fest ­
gestellt werden, sollte ein vollständiger Test erwogen werden.  
1.6.2.5.  Beobachtungszeitraum  
Der Beobachtungszeitraum sollte mindestens 14 Tage betragen. Die 
Dauer der Beobachtung soll jedoch nicht starr festgelegt werden. Sie soll von der Art des Vergiftungsbildes, dem zeitlichen Auftreten der 
Symptome und der Dauer der Erholungsphase abhängig gemacht 
werden. Die Beobachtungszeit ist zu verlängern, falls es sich als notwendig erweist. Der Zeitpunkt, zu dem Vergiftungserscheinungen auftreten und wieder abklingen, ihre Dauer sowie der Zeitpunkt des 
Todes sind von Bedeutung, vor allem dann, wenn Anzeichen für 
eine verzögerte Mortalität erkennbar sind.
 
1.6.3.  Versuchsdurchführung  
Die Tiere sollen einzeln in Käfigen gehalten werden. Die Prüfsub ­
stanz ist einheitlich auf einen Bereich aufzutragen, der etwa 10 % der Körperoberfläche entspricht. Bei hochtoxischen Substanzen kann die behandelte Oberfläche kleiner sein; es sollte jedoch ein möglichst 
großer Bereich mit einer möglichst dünnen und einheitlichen Schicht 
behandelt werden.
 
Die Prüfsubstanz muss während einer Expositionszeit von 24 Stun ­
den mittels eines porösen Mullverbandes und eines nicht reizenden Pflasters Kontakt mit der Haut haben. Die Versuchsfläche ist außer ­
dem auf geeignete Art abzudecken, um den Mullverband und die 
Prüfsubstanz zu fixieren und sicherzustellen, dass die Tiere die Prüf ­
substanz nicht oral aufnehmen können. Es können auch Mittel zur Einschränkung der Bewegungsfreiheit angewendet werden, damit die 
Tiere die Prüfsubstanz nicht oral aufnehmen können; eine vollstän ­
dige Immobilisierung ist jedoch nicht zu empfehlen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 237
 
Nach Ablauf der Expositionszeit werden die Reste der Prüfsubstanz 
entfernt, soweit möglich unter Verwendung von Wasser oder mit 
einem anderen geeigneten Hautreinigungsverfahren.  
Die Beobachtungen sind systematisch aufzuzeichnen. Für jedes Tier 
sind individuelle Aufzeichnungen anzufertigen. Am ersten Tag sind 
die Tiere häufig zu beobachten. Mindestens einmal pro Werktag sollte eine sorgfältige klinische Untersuchung erfolgen. Andere täg ­
liche Beobachtungen und entsprechende Vorkehrungen sollen dem 
Ziel dienen, den Verlust an Tieren für die Studie weitestgehend einzuschränken, z. B. durch Autopsie oder Kühlung tot aufgefunde ­
ner Tiere und durch Isolierung oder Tötung schwacher oder 
sterbender Tiere.
 
Die Beobachtungen beinhalten Veränderungen von Fell, behandelter 
Haut, Augen, Schleimhäuten, Atmung und Kreislauf, autonomem 
und zentralem Nervensystem sowie an der Somatomotorik und am Verhaltensmuster. Besonderes Augenmerk ist auf Tremor, Konvul ­
sionen, Salivation, Diarrhö, Lethargie, Schlaf und Koma zu richten. 
Der Zeitpunkt des Todes ist so genau wie möglich festzuhalten. Die 
während des Versuchs gestorbenen und die bis zum Abschluss des Versuchs überlebenden Tiere werden seziert. Alle pathologischen Veränderungen sind zu protokollieren. Falls erforderlich, sollten Ge ­
webe für eine histopathologische Untersuchung entnommen werden.
 
Bewertung der Toxizität beim jeweils anderen Geschlecht  
Nach Beendigung des Versuchs mit Tieren eines bestimmten 
Geschlechts wird die Prüfsubstanz mindestens einer Gruppe von 5 Tieren des jeweils anderen Geschlechts verabreicht, um festzustellen, ob Tiere dieses Geschlechts nicht deutlich empfindlicher auf die 
Substanz reagieren. Unter bestimmten Bedingungen kann die Ver ­
wendung einer geringeren Anzahl von Tieren gerechtfertigt sein. Wenn ausreichend Hinweise dafür vorliegen, dass die Tiere des ge ­
prüften Geschlechts deutlich empfindlicher reagieren, kann auf eine 
Prüfung der Tiere des jeweils anderen Geschlechts verzichtet werden.
 
2. DATEN  
Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus 
müssen für jede Versuchsgruppe die Zahl der Tiere zu Beginn des 
Versuchs, der Zeitpunkt des Todes der einzelnen Tiere, die Zahl der Tiere mit weiteren Anzeichen der Giftwirkung, die Beschreibung der toxischen Wirkungen und die Sektionsbefunde hervorgehen. Die Be ­
stimmung des Gewichts der einzelnen Tiere erfolgt unmittelbar vor 
Verabreichung der Prüfsubstanz, danach in wöchentlichen Abständen und zum Zeitpunkt des Todes. Gewichtsveränderungen sind zu be ­
stimmen und aufzuzeichnen, sofern die Tiere länger als einen Tag 
überleben. Tiere, die aufgrund substanzbedingter Leiden und 
Schmerzen vorzeitig getötet werden, werden als substanzbedingte Todesfälle registriert. Die LD
 50 ist mit einer anerkannten Methode 
zu berechnen.  
Die Auswertung sollte auch — soweit vorhanden — die Beziehung 
zwischen Verabreichungsdosis sowie Auftreten und Schweregrad al ­
ler Abnormitäten einschließlich Verhaltensänderungen, klinischer 
Symptome, schwerer Schäden, Körpergewichtsveränderungen, Mor ­
talität und sonstiger toxikologischer Wirkungen umfassen.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 238
 
— Tierart, Stamm, Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter, usw.;  
— Versuchsbedingungen (einschließlich des Hautreinigungsverfah ­
rens und der Art des Verbandes: okklusiv oder semi-okklusiv);  
— Dosierungen (ggf. mit Vehikel, falls verwendet, und Konzentra ­
tionen);  
— Geschlecht der behandelten Tiere;  
— Auflistung der Daten nach Geschlecht und Dosierung (Zahl der 
während des Versuchs gestorbenen oder getöteten Tiere, Zahl der 
Tiere mit Vergiftungserscheinungen, Zahl der exponierten Tiere);  
— Zeitpunkt des Todes nach Auftragen der Prüfsubstanz, Gründe 
und Kriterien für das vorzeitige Töten der Tiere;  
— sämtliche Beobachtungen;  
— LD  50 -Wert für das Geschlecht, das einem vollständigen Versuch 
unterzogen wurde, Bestimmung nach 14 Tagen (unter Angabe 
der Berechnungsmethode);  
— 95 %-Vertrauensbereich für die LD  50 (soweit möglich);  
— Dosis/Mortalitätskurve und Slope-Faktor (falls durch die Bestim ­
mungsmethode möglich);  
— Sektionsbefunde;  
— ggf. histopathologische Befunde;  
— ggf. Ergebnisse aus Versuchen mit Tieren des jeweils anderen 
Geschlechts;  
— Diskussion der Ergebnisse (besondere Beachtung sollte dem Ein ­
fluss geschenkt werden, der das vorzeitige Töten von Tieren während des Versuchs auf den errechneten LD
 50 -Wert haben 
kann);  
— Interpretation der Ergebnisse.  
3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B (Punkt D).  
4. LITERATUR  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B (Punkt E).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 239
 
B.4. AKUTE TOXIZITÄT: HAUTREIZUNG/-VERÄTZUNG  
1. METHODE  
Diese Prüfmethode entspricht der OECD TG 404 (2002).  
1.1. EINLEITUNG  
Bei der Erarbeitung dieser aktualisierten Methode wurde besonderes 
Augenmerk auf mögliche Verbesserungen im Hinblick auf Belange 
des Tierschutzes und auf die Auswertung aller bereits vorhandenen 
Angaben über den Stoff gelegt, um unnötige Prüfungen an Labor ­
tieren zu vermeiden. Die vorliegende Methode beinhaltet die Emp ­
fehlung, vor der Durchführung des beschriebenen In-vivo-Tests zur 
Ermittlung des Verätzungs-/Reizungspotenzials des Stoffs eine kriti ­
sche Analyse der vorhandenen einschlägigen Daten vorzunehmen. Sofern dazu nicht genügend Daten zur Verfügung stehen, können diese mit Hilfe sequenzieller Tests erzeugt werden (1). Die empfoh ­
lene Prüfstrategie enthält die Durchführung validierter und anerkann ­
ter In-vitro-Tests und wird in der Anlage zu dieser Methode ausführ ­
lich dargestellt. Zudem wird empfohlen, beim In-vivo-Vorversuch nach Möglichkeit die drei Mullläppchen, mit denen die Prüfsubstanz 
aufgetragen wird, nacheinander und nicht gleichzeitig am Körper des 
Tieres zu fixieren.
 
Im Interesse wissenschaftlicher Verlässlichkeit und des Tierschutzes 
sollen In-vivo-Tests erst dann durchgeführt werden, wenn alle für 
das Hautverätzungs-/-reizungspotenzial des Stoffs zur Verfügung ste ­
henden einschlägigen Daten im Rahmen einer kritischen Analyse ausgewertet worden sind. Zu diesen Daten gehören unter anderem Erkenntnisse aus bereits durchgeführten Untersuchungen am Men ­
schen und/oder an Labortieren; Hinweise auf Verätzungen/Reizungen 
durch strukturell verwandte Substanzen bzw. Gemische aus diesen Substanzen; Daten, die eine starke Azidität oder Alkalinität der Sub ­
stanz belegen (2) (3), und die Ergebnisse validierter und anerkannter 
In-vitro- und Ex-vivo-Tests (4) (5) (5a). Diese Analyse soll dazu 
führen, dass weniger In-vivo-Untersuchungen zum Hautverätzungs- /-reizungspotenzial von Stoffen durchgeführt werden, wenn bereits andere Studien zu diesen beiden Endpunkten ausreichende Belege 
geliefert haben.
 
In der Anlage zu dieser Methode wird eine bevorzugte sequenzielle 
Prüfstrategie vorgestellt, welche die Durchführung validierter und anerkannter In-vitro- und Ex-vivo-Tests auf Verätzungs-/ ­
Reizungswirkungen einbezieht. Diese Strategie wurde während eines 
OECD-Workshops (6) entwickelt und von den Teilnehmern einmütig 
empfohlen. Sie wurde als empfohlene Prüfstrategie für das Globale Harmonisierte System der Einstufung und Kennzeichnung Che ­
mischer Stoffe (Globally Harmonised System for the Classification 
of Chemical Substances = GHS) (7) angenommen. Es wird empfoh ­
len, dass diese Prüfstrategie vor einem In-vivo-Test durchgeführt wird. Bei neuen Substanzen wird sie als stufenweiser Prüfansatz empfohlen, mit dessen Hilfe verlässliche wissenschaftliche Daten 
über die durch die Prüfsubstanz hervorgerufene Verätzung/Reizung 
erzielt werden können. Bei bereits bekannten Stoffen, für die nicht genügend Daten zum Hautverätzungs-/-reizungspotenzial vorliegen, soll die Strategie genutzt werden, um Datenlücken zu schließen. Der 
Einsatz einer anderen Prüfstrategie bzw. eines anderen Prüfverfah ­
rens oder die Entscheidung gegen einen stufenweisen Prüfansatz soll gerechtfertigt werden.
 
Falls das Verätzungs-/Reizungspotenzial anhand einer gewichteten 
Analyse nicht ermittelt werden kann, die den Anforderungen der 
sequentiellen Prüfstrategie gerecht wird, soll ein In-vivo-Test ins 
Auge gefasst werden (siehe Anlage).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 240
 
1.2. DEFINITIONEN  
Hautreizung:  Das Auslösen einer reversiblen Hautschädigung nach 
Applikation einer Prüfsubstanz für die Dauer von bis zu 4 Stunden.  
Hautverätzung:  Das Auslösen einer irreversiblen Hautschädigung, 
d. h. einer sichtbaren, bis in das Corium reichenden Nekrose der Epidermis nach Applikation einer Prüfsubstanz für die Dauer 
von bis zu 4 Stunden. Verätzungsreaktionen sind gekennzeichnet 
durch Geschwüre, Blutungen, blutige Verschorfungen und am Ende des Beobachtungszeitraums von 14 Tagen durch eine auf ein Ausbleichen der Haut zurückzuführende Verfärbung, komplett haar ­
lose Bereiche und Narben. Bei unklaren Schädigungen sollen his ­
topathologische Untersuchungen in Erwägung gezogen werden.
 
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Die Prüfsubstanz wird in einer einmaligen Dosierung auf die Haut 
eines Versuchstiers aufgetragen; nicht behandelte Hautareale dienen als Kontrolle. Der Grad der Reizung/Verätzung wird in zuvor fest ­
gelegten Zeitabständen bestimmt und bewertet und anschließend be ­
schrieben, um eine umfassende Beurteilung der Wirkung vornehmen 
zu können. Die Beobachtungsdauer soll ausreichend sein, um die Reversibilität bzw. Irreversibilität der Wirkungen vollständig zu er ­
fassen,
 
Tiere mit starken und anhaltenden Anzeichen von Leiden und/oder 
Schmerzen können jederzeit wahrend des Versuchs human getötet 
werden, wobei die Substanz entsprechend einzustufen ist. Kriterien 
für die humane Tötung moribunder Tiere mit starken Anzeichen von Leiden sind dem Literaturhinweis (8) zu entnehmen.
 
1.4. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.4.1.  Vorbereitung des In-vivo-Tests  
1.4.1.1.  Auswahl der Tierspezies  
Das bevorzugte Labortier ist das Albino-Kaninchen, wobei für den 
Test gesunde junge erwachsene Kaninchen verwendet werden. Die 
Verwendung anderer Spezies ist zu begründen.  
1.4.1.2.  Vorbereitung der Versuchstiere  
Etwa 24 Stunden vor dem Versuch wird das Fell auf dem Rücken 
der Versuchstiere gründlich geschoren. Dabei ist darauf zu achten, 
dass die Haut nicht verletzt wird. Es sind nur Tiere mit einer gesun ­
den, unverletzten Haut zu verwenden.  
Einige Kaninchenrassen haben Stellen mit dichtem Fellbewuchs, die 
zu bestimmten Zeiten im Jahr deutlicher hervortreten. An diesen Stellen soll keine Prüfung durchgeführt werden.
 
1.4.1.3.  Haltungs- und Fütterungsbedingungen  
Die Tiere sollen einzeln gehalten werden. Die Temperatur im Ver ­
suchstierraum soll für Kaninchen 20  o C (± 3  o C) betragen. Obwohl 
die relative Luftfeuchtigkeit mindestens 30 % betragen und zu an ­
deren Zeiten als wahrend der Reinigung vorzugsweise nicht über 
70 % liegen sollte, ist ein Wert von 50-60 % anzustreben. Der Raum soll künstlich beleuchtet sein, wobei die Beleuchtung im 12- Stunden-Rhythmus ein- und ausgeschaltet werden soll. An die Ver ­
suchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert werden, wobei 
eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung zu gewährleisten ist.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 241
 
1.4.2.  Prüfverfahren  
1.4.2.1.  Applikation der Prüfsubstanz  
Die Prüfsubstanz soll auf eine kleine Hautfläche (etwa 6 cm  2 ) auf­
getragen und mit einem Mullläppchen abgedeckt werden, das mit 
einem nicht reizenden Pflaster fixiert wird. Sofern eine direkte Ap ­
plikation nicht möglich ist (z. B. bei Flüssigkeiten oder bestimmten Pasten), soll die Prüfsubstanz zunächst auf das Mullläppchen gege ­
ben werden, das anschließend auf der Haut fixiert wird. Für die 
Dauer der Exposition soll das Läppchen mit einem geeigneten Ok ­
klusiv- oder Semi-Okklusiv-Verband lose auf der Haut gehalten wer ­
den. Wird die Prüfsubstanz auf ein Läppchen aufgebracht, so ist 
dieses so auf der Haut zu fixieren, dass ein guter Hautkontakt und 
die gleichmäßige Verteilung der Substanz auf der Haut gewährleistet sind. Es ist zu vermeiden, dass das Tier an das Mullläppchen gelangt und die Prüfsubstanz oral aufnehmen bzw. inhalieren kann.
 
Flüssige Prüfsubstanzen werden im Allgemeinen unverdünnt ange ­
wendet. Wird der Versuch mit Feststoffen durchgeführt (die im Be ­
darfsfall pulverisiert werden können), dann soll die Prüfsubstanz mit gerade so viel Wasser (bzw. gegebenenfalls mit einem anderen ge ­
eigneten Vehikel) angefeuchtet werden, dass ein guter Kontakt mit 
der Haut sichergestellt ist. Bei Verwendung eines anderen Vehikels als Wasser soll dessen möglicher Einfluss auf eine Reizung der Haut minimal sein.
 
Nach Ablauf der Expositionszeit, die in der Regel 4 Stunden beträgt, 
wird die restliche Prüfsubstanz möglichst mit Wasser oder einem geeigneten Lösungsmittel entfernt, ohne dass die bestehende Re ­
aktion oder die Integrität der Epidermis beeinträchtigt wird.
 
1.4.2.2.  Dosierungen  
Im Falle von Flüssigkeiten werden 0,5 ml und im Falle von Fest ­
stoffen oder Pasten 0,5 g auf die vorbereitete Hautstelle aufgetragen.  
1.4.2.3.  Vorversuch (In-vivo-Test auf Hautreizung/-verätzung an einem Tier)  
Es empfiehlt sich dringend, den In-vivo-Test zunächst nur an einem 
Tier durchzuführen. Dies gilt insbesondere, wenn der Verdacht be ­
steht, dass der Stoff ein Verätzungspotenzial hat. Damit wird den 
Anforderungen der sequenziellen Prüfstrategie entsprochen (siehe 
Anlage 1).  
Sofern ein Stoff anhand einer kritischen Analyse vorhandener Daten 
als ätzend eingestuft wurde, brauchen keine weiteren Tierversuche 
durchgeführt zu werden. Bei den meisten Stoffen mit einer vermute ­
ten Ätzungswirkung erübrigen sich in der Regel In-vivo-Tests. Al ­
lerdings können in den Fällen, in denen angesichts einer unzurei ­
chenden Datenlage die Ermittlung zusätzlicher Daten gerechtfertigt 
scheint, in begrenztem Umfang Tierversuche durchgeführt werden, 
wobei folgendermaßen vorzugehen ist: Bis zu drei Läppchen werden nacheinander appliziert. Das erste Läppchen wird nach drei Minuten entfernt. Wird keine schwere Hautreaktion festgestellt, erfolgt die 
Applikation eines zweiten Läppchens, das nach einer Stunde entfernt 
wird. Lassen die Beobachtungen zu diesem Zeitpunkt den Schluss zu, dass eine Exposition für die Dauer von vier Stunden ethisch verantwortbar ist, wird ein drittes Läppchen appliziert und nach 
vier Stunden entfernt. Anschließend wird die Reaktion bewertet.
 
Der Versuch wird sofort abgebrochen, falls nach einer der drei se ­
quenziellen Expositionen eine ätzende Wirkung beobachtet wird. Ist nach der Entfernung des letzten Läppchens keine Verätzung feststell ­
bar, wird das Tier 14 Tage lang beobachtet, sofern nicht vor Ablauf 
dieser Zeit Verätzungen auftreten.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 242
 
Geht man davon aus, dass die Prüfsubstanz zwar keine ätzende 
Wirkung hat, aber Hautreizungen hervorrufen kann, sollte nur ein 
Tier verwendet werden, dem ein einziges Läppchen für die Dauer von vier Stunden appliziert wird.
 
1.4.2.4.  Bestätigungstest (In-vivo-Test auf hautreizende Wirkungen an zusätz ­
lichen Tieren)  
Wird im Vorversuch keine ätzende Wirkung beobachtet, dann soll 
die Reizungsreaktion bzw. die negative Reaktion an bis zu zwei 
weiteren Tieren mit jeweils einem Läppchen bei einer Expositions ­
dauer von vier Stunden bestätigt werden. Ergibt der Vorversuch eine Reizungswirkung, kann der Bestätigungstest als sequenzieller Ver ­
such bzw. durch gleichzeitige Exposition von zwei weiteren Tieren 
durchgeführt werden. Findet ausnahmsweise kein Vorversuch statt, 
können zwei bzw. drei Tiere mit einem Läppchen behandelt werden, das nach vier Stunden entfernt wird. Bei Verwendung von zwei Versuchstieren, die beide die gleiche Reaktion zeigen, erübrigen 
sich weitere Untersuchungen. Andernfalls wird auch das dritte Tier 
getestet. Unklare Reaktionen könnten möglicherweise bewertet wer ­
den, indem Versuche mit weiteren Tieren durchgeführt werden.
 
1.4.2.5.  Beobachtungszeitraum  
Die Beobachtungszeit soll so bemessen sein, dass die Reversibilität 
der festgestellten Wirkungen vollständig bewertet werden kann. Al ­
lerdings sollte der Versuch abgebrochen werden, sobald das Tier 
starke und anhaltende Anzeichen von Leiden und Schmerzen zeigt. 
Um feststellen zu können, ob die Wirkungen reversibel sind, sollen die Tiere für die Dauer von bis zu 14 Tagen nach Entfernung der 
Läppchen beobachtet werden. Bilden sich die Schäden vor Ablauf 
dieser 14 Tage zurück, soll der Versuch zu dem betreffenden Zeit ­
punkt beendet werden.
 
1.4.2.6.  Klinische Beobachtungen und Bewertung von Hautreaktionen  
Die Tiere sind auf Anzeichen von Hautrötungen und Ödemen zu 
untersuchen, wobei die Reaktion 60 Minuten sowie 24, 48 und 72 Stunden nach Entfernen des Läppchens bewertet wird. Beim Vor ­
versuch an einem Tier wird die behandelte Stelle auch unmittelbar 
nach Entfernen des Läppchens untersucht. Die Hautreaktionen wer ­
den bewertet und anhand der Punkteskala in der unten stehenden Tabelle dokumentiert. Im Falle von Hautschädigungen, die nach 72 
Stunden weder als Reizung noch als Verätzung eingestuft werden 
können, ist unter Umständen die Beobachtung bis zum 14. Tag er ­
forderlich, um Aussagen zur Reversibilität der Wirkungen treffen zu können. Neben Hautreizungen sollen alle örtlich begrenzten toxi ­
schen Wirkungen (z. B. Entfettung der Haut) und alle negativen 
systemischen Wirkungen (z. B. klinische Anzeichen für Toxizität und Veränderungen des Körpergewichts) vollständig beschrieben und dokumentiert werden. Unklare Reaktionen sollen gegebenenfalls 
durch eine histopathologische Untersuchung abgeklärt werden.
 
Die Bewertung von Hautreaktionen ist zwangsläufig subjektiv. Um 
die Einstufung von Hautreaktionen stärker zu vereinheitlichen und den Prüflabors und allen an den Versuchen und an der Interpretation der Versuchsergebnisse Beteiligten die Arbeit zu erleichtern, müssen 
die Prüfer im Umgang mit der Bewertungsskala (siehe unten ste ­
hende Tabelle) entsprechend geschult werden. Dabei könnte sich ein Leitfaden mit Abbildungen zur Bewertung von Hautreizungen und anderen Schädigungen als hilfreich erweisen (9).
 
2. DATEN  
2.1. ERGEBNISDARSTELLUNG  
Die Untersuchungsergebnisse sollen im Abschlussbericht in Tabel ­
lenform dargestellt werden und alle in Abschnitt 3.1 genannten 
Punkte umfassen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 243
 
2.2. ERGEBNISBEWERTUNG  
Die Bewertung der Hautreizung soll anhand der Art und des Schwe ­
regrads der Schädigung und deren Reversibilität bzw. Irreversibilität vorgenommen werden. Die einzelnen ermittelten Schweregrade stel ­
len keinen allein gültigen Maßstab für die hautreizenden Eigenschaf ­
ten eines Stoffs dar, denn es werden auch andere Effekte der Prüf ­
substanz beurteilt. Vielmehr sollten diese einzelnen Graduierungs ­
werte als Referenzwerte betrachtet werden, die zusammen mit allen 
anderen Ergebnissen der Studie zu beurteilen sind.
 
Bei der Bewertung von hautreizenden Reaktionen spielt auch die 
Reversibilität der Hautschädigung eine Rolle. Bestehen Reaktionen wie (begrenzter) Haarausfall, Hyperkeratose, Hyperplasie und 
Schuppung bis zum Ende des 14-tägigen Beobachtungszeitraums, 
soll die Prüfsubstanz als hautreizender Stoff betrachtet werden.
 
3. BERICHTERSTATTUNG  
3.1. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss folgende Angaben enthalten:  
Begründung für den In-vivo-Test: Kritische Analyse von Daten aus 
früheren Versuchen unter Einbeziehung von Ergebnissen aus der 
sequenziellen Prüfstrategie:  
— Beschreibung aller einschlägigen Daten aus früheren Versuchen;  
— Daten, die in den einzelnen Stufen der Prüfstrategie erhoben 
wurden;  
— Beschreibung der durchgeführten In-vitro-Tests mit Einzelheiten 
zu angewandten Verfahren sowie zu den Ergebnissen für Prüf- 
/Referenzsubstanzen;  
— Gewichtungsanalyse als Grundlage für die Durchführung einer 
In-vivo-Studie.  
Prüfsubstanz:  
— Angaben zur Identität (z. B. CAS-Nummer, Bezugsquelle, Rein ­
heit, bekannte Verunreinigungen; Chargennummer);  
— physikalische Beschaffenheit und physikalisch-chemische Eigen ­
schaften (z. B. pH-Wert, Flüchtigkeit, Löslichkeit, Stabilität);  
— bei Gemischen Zusammensetzung und relative Anteile der 
Bestandteile in Prozent,  
Vehikel:  
— Angaben zur Identität, (gegebenenfalls) Konzentration; Einsatz ­
volumen;  
— Begründung der Auswahl des Vehikels.  
Versuchstiere:  
— verwendete Spezies/Rasse, Begründung für den Verzicht auf die 
Verwendung von Albino-Kaninchen und die Nutzung anderer 
Tiere;  
— Anzahl der Versuchstiere pro Geschlecht;  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Versuchsbeginn und -ende;  
— Alter der Tiere bei Beginn der Studie;  
— Herkunft der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 244
 
Prüfbedingungen:  
— Methode der Vorbereitung des Hautareals, auf das die Mullläpp ­
chen appliziert werden;  
— Angaben zu dem für die Läppchen verwendeten Material und zur 
Abdeckmethode;  
— Angaben zur Herstellung, Applikation und Entfernung der Prüf ­
substanz,  
Ergebnisse:  
— tabellarische Erfassung der Bewertung des Schweregrades von 
Hautreizungs-/-verätzungsreaktionen zu allen Messzeitpunkten 
für jedes einzelne Versuchstier;  
— Beschreibung aller beobachteten Schädigungen;  
— ausführliche Beschreibung von Art und Schwere der festgestell ­
ten Hautreizung bzw. -verätzung sowie Angaben zu eventuellen 
histopathologischen Befunden;  
— Beschreibung anderer örtlich begrenzter negativer (z, B. Entfet ­
tung der Haut) und systemischer Wirkungen neben den Hautrei ­
zungen bzw. -verätzungen.  
— Diskussion der Ergebnisse  
4. LITERATURHINWEISE  
(1) Banatt, M.D., Castell, J.V., Chamberiain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Genier, I., Giuliani, A., Gray, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Ver ­
haar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alter ­
native Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM 
Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.  
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 -26.
 
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation 
of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720.
 
(4) ECETOC (1990) Monographie Nr. 15, „Skin Irritation“ (Haut ­
reizung), Umwelt- und Technologiezentrum der Europäischen 
Chemischen Industrie, Brüssel.  
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G., und Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology in Vitro 12, S. 483-524.
 
(5a) Prüfmethode B.40: Hautverätzung.  
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicologi ­
cal Test Methods. Solna, Schweden, 22.-24. Januar 1996 
(http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 
(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Che ­
mical Substances, bestätigt auf der 28. Gemeinsamen Tagung des Chemikalien-Ausschusses und der Arbeitsgruppe Chemika ­
lien, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 245
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, As ­
sessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD En ­
vironmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/ 
monos.htm).
 
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United 
States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.
 
(auf Anfrage beim OECD-Sekretariat erhältlich).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 246
 
Tabelle I  
BEWERTUNG VON HAUTREAKTIONEN  
Bildung von Erythemen und Schorf  
Kein Erythem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Sehr leichtes Erythem (kaum wahrnehmbar) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Klar abgegrenztes Erythem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Mäßiges bis ausgeprägtes Erythem 3 Ausgeprägtes Erythem (dunkelrot) bis hin zur Schorfbildung, so dass 
eine Bewertung nicht möglich ist . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Höchstmögliche Punktzahl: 4  
Bildung von Ödemen  
Kein Ödem 0 
Sehr leichtes Ödem (kaum wahrnehmbar) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Leichtes Ödem (Ränder des betroffenen Areals durch deutliche Schwel ­
lung klar abgegrenzt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Mäßiges Ödem (Schwellung etwa 1 mm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Ausgeprägtes Ödem (Schwellung mehr als 1 mm und über den Exposi ­
tionsbereich hinaus) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4  
Höchstmögliche Punktzahl: 4  
Zur Klärung unklarer Reaktionen kann eine histopathologische Untersuchung 
erfolgen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 247
 
Anlage  
Sequenzielle Prüfstrategie für Hautreizungen und -Verätzungen  
ALLGEMEINE ÜBERLEGUNGEN  
Im Interesse wissenschaftlicher Verlässlichkeit und des Tierschutzes muss die 
unnötige Verwendung von Versuchstieren verhindert und die Durchführung 
von Versuchen, die bei den Tieren wahrscheinlich schwere Reaktionen hervor ­
rufen, auf ein Mindestmaß beschränkt werden. Bevor ein In-vivo-Test ins Auge gefasst wird, sollen zunächst alle einschlägigen Informationen über die potenziell hautätzenden/-reizenden Wirkungen eines Stoffs bewertet werden. Möglicher ­
weise liegen bereits genügend Kriterien für die Einstufung einer Prüfsubstanz 
anhand ihres Hautätzungs-/-reizungspotenzials vor, so dass sich Versuche an Labortieren erübrigen. Folglich schränkt die Durchführung einer kritischen Ana ­
lyse bereits vorliegender Daten und die Anwendung einer sequenziellen Prüf ­
strategie die Notwendigkeit von In-vivo-Tests deutlich ein. Dies gilt umso mehr, 
wenn davon auszugehen ist, dass der Stoff schwere Reaktionen hervorruft.
 
Zur Beurteilung bereits vorhandener Informationen über die hautreizenden/-ätzenden 
Wirkungen von Substanzen soll das Instrument der Gewichtungsanalyse herangezo ­
gen werden. Ausgehend davon ist zu entscheiden, ob zusätzliche Studien, bei denen es sich nicht um In-vivo-Hautuntersuchungen handelt, als Beitrag zur Charakterisie ­
rung dieses Potenzials erfolgen sollen. Sofern weitere Studien durchgeführt werden 
müssen, empfiehlt es sich, zur Erzeugung der sachdienlichen Versuchsdaten die 
sequenzielle Prüfstrategie zu nutzen. Bei noch nicht geprüften Stoffen soll die se ­
quenzielle Prüfstrategie herangezogen werden, um die Datensätze zu erzeugen, die für die Beurteilung des hautätzenden/-reizenden Potenzials benötigt werden. Die in dieser 
Anlage beschriebene Prüfstrategie wurde während eines OECD-Workshops (1) ent ­
wickelt. Sie wurde im Rahmen des „Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances“ be ­
stätigt und weiter ausgebaut, das im November 1998 von den Teilnehmern der 
28. Gemeinsamen Tagung des Chemikalien-Ausschusses und der Arbeitsgruppe Che ­
mikalien gebilligt wurde (2).
 
Diese sequenzielle Prüfstrategie gehört zwar nicht zu den integralen Bestandteilen 
von Prüfmethode B.4, sie stellt aber den empfohlenen Ansatz zur Ermittlung von hautreizenden/-ätzenden Merkmalen dar. In diesem Ansatz spiegelt sich zum einen die beste Praxis wider. Zum anderen ist er ein ethischer Richtwert für 
In-vivo-Tests auf hautreizende/-ätzende Wirkungen. Die Prüfmethode bietet nicht 
nur eine Anleitung zur Durchführung des In-vivo-Tests, sondern auch eine Über ­
sicht über die Faktoren, die vor der Durchführung eines solchen Versuchs über ­
prüft werden sollen. Die Strategie liefert einen Ansatz für die Bewertung bereits 
vorhandener Daten über die hautreizenden/-ätzenden Eigenschaften von Prüfsub ­
stanzen und einen stufenweisen Ansatz für die Erzeugung sachdienlicher Daten über Stoffe, die im Rahmen zusätzlicher Studien untersucht werden müssen bzw. noch gar nicht untersucht wurden. Zudem wird empfohlen, in bestimmten Fällen 
validierte und anerkannte In-vitro- und Ex-vivo-Tests auf hautreizende/-ätzende 
Wirkungen durchzuführen.
 
BESCHREIBUNG DER BEWERTUNGS- UND PRÜFSTRATEGIE  
Vor der Durchführung von Versuchen im Rahmen der sequenziellen Prüfstrategie 
(Fließbild) sollen sämtliche vorhandenen Informationen ausgewertet werden, um die Notwendigkeit von In-vivo-Hauttests zu klären. Auch wenn wichtige Infor ­
mationen aus der Beurteilung einzelner Parameter (z. B. extreme pH-Werte) 
gewonnen werden können, sollten die bereits vorliegenden Angaben in ihrer Gesamtheit betrachtet werden. Alle relevanten Daten über die Wirkungen des betreffenden Stoffs oder seiner Analoge sollen mit Hilfe einer Gewichtungsana ­
lyse bewertet werden, und diese Entscheidung soll begründet werden. Dabei 
sollten bereits vorliegende Angaben zur Wirkung der Substanz auf Mensch und Tier im Vordergrund stehen, gefolgt von den Ergebnissen von In-vitro- und Ex-vivo-Tests. In-vivo-Studien mit hautätzenden Substanzen sollten nach 
Möglichkeit immer vermieden werden. Folgende Faktoren werden in der Prüf ­
strategie erörtert:
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 248
 
Beurteilung bereits vorliegender Angaben zur Wirkung der Substanz auf Mensch 
und Tier (Stufe 1).  Zunächst sollen bereits vorhandene Informationen über die 
Wirkung auf den Menschen, z. B. klinische Studien oder Studien zur Exposition am Arbeitsplatz, sowie Fallberichte und/oder Ergebnisse von Tierversuchen, bei ­
spielsweise von Untersuchungen zur Toxizität nach einmaliger oder mehrmaliger 
Hautexposition, bewertet werden, denn sie liefern Hinweise, die unmittelbar die 
Hautwirkungen betreffen. Bei Stoffen mit bekannter hautätzender/reizender Wir ­
kung und Substanzen, die nachweislich weder Hautreizungen noch -Verätzungen hervorrufen, brauchen keine In-vivo-Studien durchgeführt zu werden.
 
Analyse der Zusammenhänge zwischen Struktur und Aktivität (SAR) (Stufe 2 ). 
Die gegebenenfalls vorhandenen Ergebnisse von Untersuchungen an strukturell verwandten Substanzen sollen berücksichtigt werden. Liegen genügend Daten 
über das hautätzende/-reizende Potenzial von strukturell verwandten Substanzen 
oder Gemischen aus diesen Substanzen bei Mensch und/oder Tier vor, kann davon ausgegangen werden, dass die zu beurteilende Prüfsubstanz die gleichen 
Reaktionen hervorrufen wird. In diesen Fällen braucht die Prüfsubstanz mögli ­
cherweise nicht getestet zu werden. Für die Zwecke der sequenziellen Prüfstra ­
tegie reichen negative Daten aus Untersuchungen an strukturell verwandten Sub ­
stanzen oder Gemischen als Nachweis für ein Nichtvorhandensein hautätzender/- 
reizender Wirkungen nicht aus. Zur Ermittlung des hautätzenden und -reizenden 
Potenzials sollen validierte und anerkannte SAR-Verfahren herangezogen werden
 
Physikalisch-chemische Eigenschaften und chemische Reaktivität (Stufe 3).  Stoffe 
mit extremen pH-Werten ( ≤ 2,0 bzw. ≥ 11,5) können starke lokale Reaktionen 
induzieren. Gilt ein extremer pH-Wert als Anhaltspunkt für die ätzende Wirkung eines Stoffs, so kann dessen Potenzial zur Veränderung der Azidität/Alkalinität (bzw. das Pufferungsvermögen) ebenfalls berücksichtigt werden (3) (4), Lässt das 
Pufferungsvermögen darauf schließen, dass eine Substanz möglicherweise keine 
hautätzende Wirkung hat, sollen weitere Prüfungen zur Bestätigung dieser Ver ­
mutung durchgeführt worden. Dafür sollten wenn möglich validierte und an ­
erkannte In-vitro- oder Ex-vivo-Tests genutzt werden (siehe Stufen 5 und 6).
 
Dermale Toxizität (Stufe 4).  Hat sich ein chemischer Stoff als sehr giftig bei 
Hautkontakt erwiesen, ist eine In-vivo-Studie zur Hautreizung/-Verätzung unter 
Umständen nicht angezeigt, weil bei Applikation der Prüfsubstanz in der üblichen 
Menge die sehr toxische Dosis überschritten wird, was letztlich dazu führt, dass die Tiere sterben oder ihnen schwere Leiden zugefügt werden. Wenn darüber hinaus bereits Studien zur dermalen Toxizität mit Dosierungen von bis zu 2 000 
mg/kg Körpergewicht oder darüber an Albino-Kaninchen durchgeführt wurden, 
ohne dass Hautreizungen oder -Verätzungen feststellbar waren, sind zusätzliche Prüfungen auf hautreizende/-ätzende Wirkungen möglicherweise nicht vonnöten. In die Bewertung der akuten dermalen Toxizität anhand der Ergebnisse früherer 
Studien sollen mehrere Überlegungen einbezogen werden, So können die Anga ­
ben über Hautschädigungen unvollständig sein. Die Prüfungen und Beobachtun ­
gen können an anderen Tierarten erfolgt sein, und die Reaktionen der verschie ­
denen Arten weisen eventuell große Unterschiede auf. Überdies war die appli ­
zierte Prüfsubstanz für eine Bewertung der Hautreizung/-verätzung unter Umstän ­
den nicht geeignet (z. B. Verdünnung der Substanzen zur Untersuchung der dermalen Toxizität) (5). Wurden jedoch sorgfältig geplante Studien zur dermalen 
Toxizität an Kaninchen durchgeführt, die negative Ergebnisse erbrachten, reicht 
dies gegebenenfalls als Nachweis für das Nichtvorhandensein eines hautreizenden/-ätzenden Potenzials aus.
 
Ergebnisse von In-vitro- und Ex-vivo-Tests (Stufen 5 und 6).  Substanzen, deren 
ätzende oder schwer hautreizende Eigenschaften in validierten und anerkannten, auf die Ermittlung dieser bestimmten Wirkungen ausgerichteten In-vitro- oder Ex-vivo-Tests (6) (7) nachgewiesen wurden, brauchen nicht an Tieren geprüft 
zu werden. Man kann davon ausgehen, dass diese Substanzen  in vivo  vergleich ­
bare schwere Wirkungen hervorrufen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 249
 
In-vivo-Tests an Kaninchen (Stufen 7 und 8).  Beruht die Entscheidung, einen In- 
vivo-Test durchzuführen, auf einer Gewichtungsanalyse, sollte zunächst ein Vor ­
versuch an nur einem Tier stattfinden. Es sollen keine weiteren Tests erfolgen, wenn der Vorversuch ergibt, dass die Substanz ätzend auf die Haut wirkt. Liefen der Vorversuch keine Anhaltspunkte für eine ätzende Wirkung, soll die reizende 
oder negative Reaktion durch Tests an bis zu zwei weiteren Tieren bei einer 
Expositionsdauer von vier Stunden bestätigt werden. Wenn im Vorversuch eine hautreizende Wirkung beobachtet wird, kann der Bestätigungstest entweder se ­
quenziell oder durch gleichzeitige Exposition von zwei weiteren Tieren erfolgen.
 
LITERATURHINWEISE  
(1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Al ­
ternative Toxicological Test Methods. Solna, Schweden, 22.-24. Januar 1996 
(http://www1.oecd.org/ehs/tests/background.htm).  
(2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Hu ­
man Health and Environmental Effects of Chemical Substances, bestätigt auf der 28. Gemeinsamen Tagung des Chemikalien-Ausschusses und der Ar ­
beitsgruppe Chemikalien, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/ 
HCLfi.htm).
 
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709-720.
 
(4) Young, J.R., How, M.I., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classi ­
fication as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing 
Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic  In 
Vitro , 2 (1) 19-26.  
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and  In Vitro  
Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli und 
Howard I. Maibach (Herausgeber): Dermatotoxicology. 5. Auflage, ISBN 
1-56032-356-6, Kapitel 31, 411-436.  
(6) Prüfmethode B.40.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G., und Liebsch, M. (1998) The ECVAM 
international validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results 
and evaluation by the Management Team. Toxicology  in Vitro  12, 483-524.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 250
 
Fliessbild  
PRÜF- UND BEWERTUNGSSTRATEGIE: HAUTREIZUNG/-VERÄTZUNG
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 251
 
B.5. AKUTE TOXIZITÄT: AUGENREIZUNG/-VERÄTZUNG  
1. METHODE  
Diese Prüfmethode entspricht der OECD TG 405 (2002).  
1.1. EINLEITUNG  
Bei der Erarbeitung dieser aktualisierten Methode wurde besonderes 
Augenmerk auf mögliche Verbesserungen durch die Auswertung aller bereits vorhandenen Angaben über den Stoff gelegt, um unnö ­
tige Prüfungen an Labortieren zu vermeiden und somit auch Belange 
des Tierschutzes zu berücksichtigen. Die vorliegende Methode be ­
inhaltet die Empfehlung, vor der Durchführung des beschriebenen In-vivo-Tests zur Ermittlung der akuten Reiz-/Ätzwirkung des Stoffs für die Augen eine kritische Analyse (1) der bereits vorhandenen 
einschlägigen Daten vorzunehmen. Sofern nicht genügend Daten 
zur Verfügung stehen, können diese mit Hilfe sequentieller Tests erzielt werden (2) (3). Die empfohlene Prüfstrategie, die in der An ­
lage zur Prüfmethode dargelegt wird, enthalt die Durchführung va ­
lidierter und anerkannter In-vitro-Tests. Zudem wird empfohlen, ei ­
nen In-vivo-Test auf Hautreizung/-verätzung durchzuführen, ehe die Möglichkeit eines In-vivo-Augentests in Betracht gezogen wird.
 
Im Interesse wissenschaftlicher Verlässlichkeit und des Tierschutzes 
sollen In-vivo-Tests erst dann in Erwägung gezogen werden, wenn alle für das Augenverätzungs-/-reizungspotenzial des Stoffs zur Ver ­
fügung stehenden einschlägigen Daten im Rahmen einer kritischen 
Analyse ausgewertet worden sind Zu diesen Daten gehören unter 
anderem Erkenntnisse aus bereits durchgeführten Untersuchungen am Menschen und/oder an Labortieren; Hinweise auf Verätzungen/ Reizungen durch eine oder mehrere strukturell verwandte Substanzen 
bzw. Gemische aus diesen Substanzen; Daten, die eine starke Azi ­
dität oder Alkalinität der Substanz belegen (4) (5), und Ergebnisse validierter und anerkannter In-vitro- und Ex-vivo-Tests auf Hautver ­
ätzungen und -reizungen (6) (6a). Diese Studien können sowohl 
bereits vorgelegen haben als auch auf Grand einer kritischen Analyse 
der vorhandenen Daten erstellt worden sein.
 
Im Hinblick auf bestimmte Substanzen ergibt eine solche Analyse 
möglicherweise, dass deren Augenverätzungs-/-reizungspotenzial im 
Rahmen von In-vivo-Studien untersucht werden muss. In all diesen Fällen sollen vorzugsweise zunächst die dermalen Wirkungen der Substanz in einem In-vivo-Test untersucht und in Übereinstimmung 
mit der Prüfmethode B.4 (7) bewertet werden, bevor ein In-vivo- 
Augentest in Erwägung gezogen wird. Die kritische Analyse und die sequenzielle Prüfstrategie sollen dazu führen, dass weniger In- vivo-Untersuchungen zum Augenverätzungs-/-reizungspotenzial von 
Stoffen durchgeführt werden, wenn bereits andere Studien ausrei ­
chende Belege geliefert haben. Kann die augenätzende oder -rei ­
zende Wirkung auch nach einer In-vivo-Studie der Hautverätzung und -reizung nicht mit Hilfe der sequenziellen Prüfstrategie ermittelt 
werden, besteht die Möglichkeit, einen In-vivo-Test auf 
Augenverätzung/-reizung durchzuführen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 252
 
In der Anlage zu dieser Methode wird eine bevorzugte sequenzielle 
Prüfstrategie vorgestellt, welche die Durchführung validierter und an ­
erkannter In-vitro- und Ex-vivo-Tests auf Verätzungs-/Reizungs ­
wirkungen einbezieht. Diese Strategie wurde während eines OECD- Workshops (8) entwickelt und von den Teilnehmern einmütig empfoh ­
len. Sie wurde als empfohlene Prüfstrategie für das Globale Harmoni ­
sierte System der Einstufung und Kennzeichnung Chemischer Stoffe (Globally Harmonised System for the Classification of Chemical Sub ­
stances = GHS) (9) angenommen. Es wird empfohlen, dass diese se ­
quenzielle Prüfstrategie vor einem In-vivo-Test durchgeführt wird. Bei 
neuen Substanzen wird sie als stufenweiser Prüfansatz empfohlen, mit dessen Hilfe verlässliche wissenschaftliche Daten über die durch die Prüfsubstanz hervorgerufene Verätzung/Reizung erzielt werden können. 
Bei bereits bekannten Stoffen, für die nicht genügend Daten zum Haut ­
verätzungs-/-reizungspotenzial bzw. Augenverätzungs-/-reizungspo ­
tenzial vorliegen, soll die Strategie genutzt werden, um Datenlücken zu schließen. Der Einsatz einer anderen Prüfstrategie bzw. eines anderen 
Prüfverfahrens oder die Entscheidung gegen einen stufenweisen Prüf ­
ansatz soll gerechtfertigt werden.
 
1.2. DEFINITIONEN  
Augenreizung:  ist das Auslösen von Veränderungen am Auge nach 
Applikation einer Prüfsubstanz auf die Oberfläche des Auges, die innerhalb von 21 Tagen nach der Applikation vollständig reversibel sind.
 
Augenverätzung:  ist das Auslösen einer irreversiblen Gewebeschä ­
digung im Auge oder einer massiven Verschlechterung des Sehver ­
mögens nach Applikation einer Prüfsubstanz auf die Oberfläche des 
Auges, die innerhalb von 21 Tagen nach Applikation nicht vollstän ­
dig reversibel sind.  
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Die Prüfsubstanz wird in einer einmaligen Dosierung in ein Auge 
jedes Versuchstiers eingebracht; das unbehandelte Auge dient als Kontrolle. Der Grad der Reizung/Verätzung wird bestimmt, indem 
in zuvor festgelegten Zeitabständen Schädigungen der Bindehaut, der 
Hornhaut und der Iris anhand einer Punkteskala bewertet werden. Darüber hinaus werden auch andere Reaktionen des Auges und sys ­
temische Schäden beschrieben, um die Wirkungen vollständig beur ­
teilen zu können. Die Beobachtungsdauer soll ausreichend sein, um 
die Reversibilität bzw. Irreversibilität der Wirkungen vollständig zu erfassen.
 
Tiere mit starken und anhaltenden Anzeichen von Leiden und/oder 
Schmerzen können jederzeit während des Versuchs human getötet werden, wobei die Substanz entsprechend einzustufen ist. Kriterien 
für die humane Tötung moribunder Tiere mit starken Anzeichen von 
Leiden sind dem Literaturhinweis (10) zu entnehmen.
 
1.4. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.4.1.  Vorbereitung des In-vivo-Tests  
1.4.1.1.  Auswahl der Tierspezies  
Das bevorzugte Labortier ist das Albino-Kaninchen, wobei für den 
Test gesunde junge erwachsene Kaninchen verwendet werden. Die 
Verwendung anderer Rassen oder Spezies soll begründet werden.  
1.4.1.2.  Vorbereitung der Versuchstiere  
24 Stunden vor dem Versuch werden bei jedem der ausgewählten 
Versuchstiere beide Augen untersucht. Tiere, bei denen bereits eine 
Augenreizung, okulare Defekte oder eine Schädigung der Cornea 
vorliegen, sollen nicht verwendet werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 253
 
1.4.1.3.  Haltungs- und Fütterungsbedingungen  
Die Tiere sollen einzeln gehalten werden. Die Temperatur im Ver ­
suchstierraum soll 20  o C (±3  o C) betragen. Obwohl die relative Luft ­
feuchtigkeit mindestens 30 % betragen und zu anderen Zeiten als 
während der Reinigung vorzugsweise nicht über 70 % liegen sollte, 
ist ein Wert von 50-60 % anzustreben. Der Raum soll künstlich beleuchtet sein, wobei die Beleuchtung im 12-Stunden-Rhythmus ein- und ausgeschaltet werden soll. An die Versuchstiere kann her ­
kömmliches Laborfutter verfüttert werden, wobei eine unbegrenzte 
Trinkwasserversorgung zu gewährleisten ist.
 
1.4.2.  Prüfverfahren  
l.4.2.1.  Applikation der Prüfsubstanz  
Die Prüfsubstanz wird bei jedem Tier in den Bindehautsack eines 
Auges appliziert, indem man das untere Lid leicht vom Augapfel wegzieht. Die Lider werden dann etwa eine Sekunde lang leicht zusammengedrückt, damit keine Substanz verloren geht. Das andere, 
unbehandelte Auge dient als Kontrolle.
 
1.4.2.2.  Ausspülen  
Die Augen der Versuchstiere sollen frühestens 24 Stunden nach 
Applikation der Prüfsubstanz ausgewaschen werden; Ausnahmen gelten für Feststoffe (siehe Abschnitt 1.4.2.3.2) und bei sofortigem 
Eintritt von ätzenden oder reizenden Wirkungen. Nach 24 Stunden 
kann gegebenenfalls eine Augenspülung erfolgen.
 
Der Einsatz einer zusätzlichen Versuchstiergruppe, an der der Ein ­
fluss des Ausspülens untersucht wird, wird nicht empfohlen außer in 
wissenschaftlich begründeten Fällen. Sollte eine zusätzliche Ver ­
suchstiergruppe tatsächlich benötigt werden, so sollen zwei Kanin ­
chen verwendet werden. Die Bedingungen, unter denen die Augen ­
spülung erfolgte, sollen sorgfältig dokumentiert werden, z. B. Zeit ­
punkt, Zusammensetzung und Temperatur der Spüllösung, Dauer, Volumen und Geschwindigkeit der Applikation.
 
1.4.2.3.  Dosierungen  
1.4.2.3.1.  Prüfung von Flüssigkeiten  
Bei der Prüfung von Flüssigkeiten wird eine Dosis von 0,1 ml ver ­
wendet. Liegt die Prüfsubstanz in Form eines Pumpsprays vor, soll 
sie nicht direkt ins Auge eingebracht werden, sondern mittels Sprüh ­
stoß entnommen und in einem Behälter aufgefangen werden. Anschließend werden 0,1 ml in das Auge eingebracht.
 
1.4.2.3.2.  Prüfung von Feststoffen  
Bei Feststoffen, Pasten und partikelförmigen Substanzen soll die 
Prüfmenge ein Volumen von 0,1 ml oder ein Gewicht von höchstens 100 mg haben. Das Prüfmaterial soll zu einem feinen Pulver zer ­
mahlen werden. Das Volumen von Feststoffen soll erst nach vor ­
sichtigem Kompaktieren, z. B. durch Klopfen des Messbehälters, 
bestimmt werden, ist die in Form eines Feststoffs vorliegende Prüfsubstanz bis zum ersten Beobachtungszeitpunkt, d. h. 1 Stunde nach der Applikation, nicht aufgrund physiologischer Vorgänge aus 
dem Auge entfernt worden, kann das Auge mit Kochsalzlösung oder 
destilliertem Wasser ausgespült werden.
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1.4.2.3.3.  Prüfung von Aerosolen  
Es wird empfohlen, alle als Pumpspray oder Aerosol vorliegenden 
Prüfsubstanzen mittels Sprühstoß zu entnehmen, in einem Behälter 
aufzufangen und anschließend zu applizieren. Die einzige Aus ­
nahme sind Substanzen in Aerosol-Druckbehältern, die aufgrund der Vaporisierung nicht aufgefangen werden können. In diesen 
Fällen soll das Auge offen gehalten werden und die Prüfsubstanz 
mit einem einzigen Sprühstoß etwa eine Sekunde lang aus 10 cm Entfernung vom Auge verabreicht werden. In Abhängigkeit vom Druck und vom Behälterinhalt kann dieser Abstand variieren. Es 
ist darauf zu achten, dass das Auge durch den Sprühdruck nicht 
verletzt wird, unter Umständen muss das Risiko „mechanischer“ Augenschäden, die auf den Sprühdruck zurückzuführen sind, beur ­
teilt werden.
 
Bei Aerosolen kann die Dosis anhand einer Schätzung ermittelt 
werden, indem der Test folgendermaßen simuliert wird: Die Sub ­
stanz wird durch eine Öffnung in der Größe eines Kaninchenauges 
auf Wägepapier gesprüht, wobei sich die Öffnung unmittelbar vor 
dem Papier befindet. Anhand des Gewichtsanstiegs des Papiers wird ein Näherungswert für die ins Auge gesprühte Menge ermittelt. Bei flüchtigen Stoffen kann ein Schätzwert für die Dosierung ermittelt 
werden, indem man einen Auffangbehälter vor und nach Entnahme 
des Prüfmaterials wiegt.
 
1.4.2.4.  Vorversuch (In-vivo-Test auf Augenreizung/-Verätzung an einem 
Tier)  
Es empfiehlt sich dringend, den In-vivo-Test zunächst nur an einem 
Tier durchzuführen. Dies entspricht den Anforderungen der sequen ­
ziellen Prüfstrategie (siehe Anlage 1).  
Sofern das beschriebene Verfahren ergibt, dass der Stoff ätzend auf 
das Auge wirkt oder schwere Augenreizungen auslöst, sollen keine 
weiteren Prüfungen auf Augenreizung durchgeführt werden.  
1.4.2.5.  Lokale Anästhetika  
Im Einzelfall können lokale Anästhetika eingesetzt werden. Ergibt 
die kritische Analyse aller bereits vorliegenden Daten, dass die Sub ­
stanz Schmerzen auslösen kann, oder zeigt der Vorversuch, dass eine Schmerzreaktion auftreten wird, kann vor dem Einträufeln der Prüf ­
substanz ein lokales Anästhetikum verabreicht werden. Die Entschei ­
dung über Art, Konzentration und Dosis des lokalen Anästhetikums 
soll sorgfältig abgewogen werden, um zu gewährleisten, dass keine Abweichungen in der Reaktion auf die Prüfsubstanz auftreten. Das als Kontrolle dienende Auge soll ebenfalls mit dem Anästhetikum 
behandelt werden.
 
1.4.2.6.  Bestätigungstest (In-vivo-Test auf augenreizende Wirkungen an 
zusätzlichen Tieren)  
Wird im Vorversuch keine ätzende Wirkung beobachtet, soll die 
Reizungsreaktion bzw. die negative Reaktion an bis zu zwei weiteren 
Tieren bestätigt werden. Ergibt der Vorversuch eine schwere Rei ­
zungswirkung, was auf eine möglicherweise schwere (irreversible) Wirkung im Bestätigungstest schließen lässt, soll der Bestätigungs ­
test nach Möglichkeit als sequenzieller Versuch an jeweils einem 
Tier zu einem bestimmten Zeitpunkt und nicht durch gleichzeitige 
Exposition der zwei weiteren Tiere erfolgen. Der Test ist abzubre ­
chen, wenn beim zweiten Tier Anzeichen einer Verätzung oder einer schweren Reizung festgestellt werden. Zur Bestätigung schwacher 
oder mäßiger Reizungsreaktionen werden unter Umständen zusätzli ­
che Tiere gebraucht.
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1.4.2.7.  Beobachtungszeitraum  
Die Beobachtungszeit soll so bemessen sein, dass das Ausmaß und 
die Reversibilität der festgestellten Wirkungen vollständig bewertet werden kann. Allerdings soll der Versuch abgebrochen werden, so ­
bald das Tier starke und anhaltende Anzeichen von Leiden und 
Schmerzen zeigt (9). Um feststellen zu können, ob die Wirkungen reversibel sind, sollen die Tiere in der Regel für die Dauer von 21 Tagen nach Applikation der Prüfsubstanz beobachtet werden. Bilden 
sich die Schäden vor Ablauf dieser 21 Tage zurück, soll der Versuch 
zu dem betreffenden Zeitpunkt beendet werden.
 
1.4.2.7.1.  Klinische Beobachtungen und Bewertung von Augenreaktionen  
Die Augen sollen 1, 24, 48 und 72 Stunden nach Aufbringen der 
Prüfsubstanz untersucht werden. Sobald aussagekräftige Informatio ­
nen gewonnen worden sind, soll der Versuch nicht länger als nötig fortgesetzt werden. Tiere mit starken und anhaltenden Anzeichen von Schmerzen oder Leiden sollen unverzüglich human getötet werden, 
wobei die Substanz entsprechend einzustufen ist. Bei Tieren mit 
folgenden Augenschädigungen nach Applikation der Prüfsubstanz ist eine humane Tötung angezeigt: Hornhautperforation oder signifi ­
kante Hornhautulzeration mit Staphylom; Blut in der vorderen Au ­
genkammer; Hornhauttrübung Grad 4, die 48 Stunden bestehen 
bleibt; fehlender Pupillenreflex (Irisreaktion Grad 2) für die Dauer von 72 Stunden; Ulzeration der Bindehaut; Nekrose der Bindehaut oder der Nickhaut; oder Gewebsdemarkierung. Diese Schäden sind 
im Allgemeinen irreversibel.
 
Tiere, bei denen keine Augenschädigungen auftreten, dürfen frühes ­
tens 3 Tage nach der Behandlung getötet werden. Bei leichten bis mäßigen Schädigungen sollen die Tiere bis zum Abklingen bzw. für 
die Dauer von 21 Tagen beobachtet werden. Danach wird die Studie 
abgeschlossen. Untersuchungen sollen am 7., 14. und 21. Tag erfol ­
gen, um den Status der Schädigungen zu ermitteln und um zu klären, ob sie reversibel oder irreversibel sind.
 
Der jeweilige Grad der Augenreaktion (Bindehaut, Hornhaut und 
Iris) soll bei jeder Untersuchung dokumentiert werden (Tabelle I). 
Auch alle anderen Augenschädigungen (z. B. Pannus, Verfärbungen) oder systemischen Folgen sollen protokolliert werden.
 
Als Hilfsmittel können bei den Untersuchungen Binokularlupen, 
Handspaltlampen, Biomikroskope und andere geeignete Geräte be ­
nutzt werden. Nach Aufzeichnung der Beobachtungen nach 24 Stun ­
den können die Augen einiger bzw. aller Kaninchen außerdem mit Fluorescein untersucht werden.
 
Die Bewertung von Augenreaktionen ist zwangsläufig subjektiv. Um 
die Einstufung von Augenreaktionen stärker zu vereinheitlichen und 
den Prüflabors und allen an den Versuchen und an der Interpretation der Versuchsergebnisse Beteiligten die Arbeit zu erleichtern, müssen die Prüfer im Umgang mit der Bewertungsskala entsprechend 
geschult werden.
 
2. DATEN  
2.2. ERGEBNISBEWERTUNG  
Die Bewertung der Augenreizung sollte anhand der Art und des 
Schweregrads der Schädigung und deren Reversibilität bzw. Irrever ­
sibilität vorgenommen werden. Die einzelnen ermittelten Schwere ­
grade stellen keinen allein gültigen Maßstab für die reizenden 
Eigenschaften eines Stoffs dar, denn es werden auch andere Effekte der Prüfsubstanz beurteilt. Vielmehr sollten die einzelnen Graduie ­
rungswerte als Referenzwerte betrachtet weiden, die nur dann sinn ­
voll sind, wenn sämtliche Beobachtungen vollständig beschrieben 
und beurteilt werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 256
 
3. BERICHTERSTATTUNG  
3.1. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss folgende Angaben enthalten;  
Begründung für den In-vivo-Test: Kritische Analyse von Daten aus 
früheren Versuchen unter Einbeziehung von Ergebnissen aus der sequenziellen Prüfstrategie:
 
— Beschreibung aller einschlägigen Daten aus früheren Versuchen;  
— Daten, die in den einzelnen Stufen der Prüfstrategie erhoben 
wurden;  
— Beschreibung der durchgeführten In-vitro-Tests mit Einzelheiten 
zu den angewendeten Verfahren sowie zu den Ergebnissen für Prüf-/Referenzsubstanzen;
 
— Beschreibung der durchgeführten In-vivo-Tests auf 
Hautreizung/-verätzung mit Einzelheiten zu den Ergebnissen;  
— Gewichtungsanalyse als Grundlage für die Durchführung einer 
In-vivo-Studie.  
Prüfsubstanz:  
— Angaben zur Identität (z. B. CAS-Nummer, Bezugsquelle, Rein ­
heit, bekannte Verunreinigungen; Chargennummer):  
— physikalische Beschaffenheit und physikalisch-chemische Eigen ­
schaften (z. B. pH-Wert, Flüchtigkeit, Löslichkeit, Stabilität, Re ­
aktionsvermögen mit Wasser);  
— bei Gemischen Zusammensetzung und relative Anteile der 
Bestandteile in Prozent;  
— bei lokalen Anästhetika Identität, Reinheit, Art, Dosis und 
potenzielle Interaktion mit der Prüfsubstanz.  
Vehikel:  
— Angaben zur Identität, (gegebenenfalls) Konzentration; Einsatz ­
volumen;  
— Begründung der Auswahl des Vehikels.  
Versuchstiere:  
— verwendete Spezies/Rasse, Begründung für den Verzicht auf die 
Verwendung von Albino- Kaninchen und die Nutzung anderer 
Tiere;  
— Alter der Tiere bei Beginn der Studie;  
— Anzahl der Versuchstiere pro Geschlecht in den Prüf- und Kon ­
trollgruppen (falls erforderlich);  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Versuchsbeginn und -ende;  
— Herkunft der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.  
Ergebnisse:  
— Beschreibung der Methode zur Bewertung von Reizungen zu den 
jeweiligen Beobachtungszeiten (z. B. Handspaltlampe, Biomikro ­
skop, Fluorescein);  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 257
 
— tabellarische Erfassung der Bewertung von Reizungs-/Verätzungs ­
reaktionen zu allen Messzeitpunkten für jedes einzelne 
Versuchstier bis hin zum Ausscheiden des Tiers aus dem Versuch;  
— ausführliche Beschreibung von Art und Schweregrad der fest ­
gestellten Reizung bzw. Verätzung;  
— Beschreibung aller anderen im Auge festgestellten Schädigungen 
(z. B. Vaskularisierung, Pannus, Verklebungen, Verfärbungen);  
— Beschreibung sonstiger lokaler und systemischer Folgen au ­
ßerhalb des Auges und ggf. vorliegender histopathologischer Befunde.
 
Diskussion der Ergebnisse  
3.2. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Eine Extrapolation der Ergebnisse von Untersuchungen zur Augen ­
reizung an Labortieren auf den Menschen ist nur bedingt möglich. Oftmals reagiert das Albino-Kaninchen empfindlicher als der Mensch auf Stoffe mit augenreizenden oder -verätzenden Eigenschaften.
 
Bei der Interpretation von Daten ist darauf zu achten, dass Reizun ­
gen aufgrund einer sekundären Infektion nicht berücksichtigt werden.  
4. LITERATURHINWEISE  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, L., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., 
Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.
 
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G., Gerner, I., Schiede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of 
Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing 
Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164.
 
(3) Worth, A.P., und Fentem, J.H. (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.  
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances Without Testing on 
Animals. Toxicol.  In Vitro, 2,  19-26.
 
(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. 
Ocular Toxicol. 12, 227-231.  
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G., und Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology in Vitro 12, 483-524.
 
(6a) Prüfmethode B.40 Hautverätzung.  
(7) Prüfmethode B.4. Akute Toxizität: Hautreizung/-verätzung.  
(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Va ­
lidation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicologi ­
cal Test Methods. Solna, Schweden, 22.-24. Januar 1996 
(http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 258
 
(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification Sys ­
tem for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances, bestätigt auf der 28. Gemeinsamen Tagung des Chemikalien-Ausschusses und der Arbeitsgruppe Chemikalien, November 1998 (http:/www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
 
(10) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, As ­
sessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints 
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Tes ­
ting and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/ 
monos.htm).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 259
 
Tabelle I  
BEWERTUNG VON AUGENSCHÄDIGUNGEN  
Cornea  
Trübung: Trübungsgrad (für die Auswertung wird der am stärksten betroffene 
Bereich genommen) (*) 
Keine Ulzeration oder Trübung 0 
Punktförmige oder diffuse Trübungsbereiche (ohne leichte Trübung des 
normalen Glanzes); Einzelheiten der Iris deutlich erkennbar . . . . . . . . . . 1 
Leicht erkennbarer durchlässiger Bereich, Einzelheiten der Iris etwas 
verschattet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  2 
Perlmuttartige Bereiche, keine Einzelheiten der Iris sichtbar, Größe der 
Pupille kaum erkennbar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Trübe Hornhaut; Iris aufgrund der Trübung nicht erkennbar . . . . . . . . . 4  
Höchstmögliche Punktzahl: 4  
ANMERKUNGEN  
(*) Die Größe des von der Hornhauttrübung betroffenen Areals soll doku ­
mentiert werden.  
Iris 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Deutlich vertiefte Rugae, Kongestion, Schwellung, mäßige circumcor ­
neale Hyperämie oder Injektion; Iris reagiert auf Licht (träge Reaktion 
ist positiv) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Blutungen, großflächige Zerstörung, keine Reaktion auf Licht . . . . . . . 2  
Höchstmögliche Punktzahl: 2  
Conjunctivae  
Rötung (der Augenlidbindehaut und der Augapfelbindehaut; ohne Hornhaut und 
Iris) 
normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Einige Blutgefäße zeigen Hyperämie (Injektion) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Diffuse karmesinrote Farbe; einzelne Gefäße nur schwer erkennbar . . 2 Diffuse dunkelrote Verfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
 
Höchstmögliche Punktzahl: 3  
Chemosis  
Schwellung (der Augenlider und/oder Nickhäute) 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Über dem Normalen liegende Schwellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Deutliche Schwellung mit partieller Auswärtskehrung der Lider . . . . . . 2 
Schwellung mit etwa halbgeschlossenen Lidern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Schwellung mit mehr als halbgeschlossenen Lidern . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Höchstmögliche Punktzahl: 4  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 260
 
Anlage  
Sequenzielle Prüfstrategie für Augenreizungen und -Verätzungen  
ALLGEMEINE ÜBERLEGUNGEN  
Im Interesse wissenschaftlicher Verlässlichkeit und des Tierschutzes muss die 
unnötige Verwendung von Versuchstieren verhindert und die Durchführung 
von Versuchen, die bei den Tieren wahrscheinlich schwere Reaktionen hervor ­
rufen, auf ein Mindestmaß beschränkt werden. Bevor ein  In-vivo -Test ins Auge 
gefasst wird, sollen zunächst alle einschlägigen Informationen über die potenziell augenreizenden/-verätzenden Wirkungen eines Stoffs ausgewertet werden, Mög ­
licherweise liegen bereits genügend Kriterien für die Einstufung einer Prüfsub ­
stanz anhand ihres Augenreizungs-/-verätzungspotenzials vor, so dass sich Ver ­
suche an Labortieren erübrigen. Folglich schränkt die Durchführung einer kriti ­
schen Analyse bereits vorliegender Daten und die Anwendung einer sequenziel ­
len Prüfstrategie die Notwendigkeit von  In-vivo -Tests deutlich ein. Dies gilt umso 
mehr, wenn davon auszugehen ist, dass der Stoff schwere Reaktionen hervorruft.
 
Zur Beurteilung bereits vorhandener Informationen über die augenreizenden/-ver ­
ätzenden Wirkungen von Substanzen soll das Instrument der Gewichtungsanalyse 
herangezogen werden. Ausgehend davon ist zu entscheiden, ob zusätzliche Studien, bei denen es sich nicht um  In-vivo -Augenuntersuchungen handelt, als Beitrag zur 
Beurteilung dieses Potenzials erfolgen sollen. Sofern weitere Studien durchgeführt 
werden müssen, empfiehlt es sich, zur Erzeugung der sachdienlichen Versuchsdaten 
die sequenzielle Prüfstrategie zu nutzen. Bei noch nicht geprüften Stoffen soll die sequenzielle Prüfstrategie herangezogen weiden, um die Daten zu erzeugen, die für die Beurteilung des augenverätzenden/-reizenden Potenzials benötigt werden. Die 
in dieser Anlage beschriebene Prüfstrategie wurde während eines OECD-Work ­
shops (1) entwickelt Sie wurde im Rahmen des „Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances“ bestätigt und weiter ausgebaut, das im November 1998 von den Teil ­
nehmern der 28. Gemeinsamen Tagung des Chemikalien-Ausschusses und der 
Arbeitsgruppe Chemikalien gebilligt wurde (2).
 
Diese sequenzielle Prüfstrategie gehört zwar nicht zu den integralen Bestandteilen 
von Prüfmethode B.5, stellt aber gleichwohl den empfohlenen Ansatz zur Ermitt ­
lung von augenreizenden/-verätzenden Merkmalen dar. In diesem Ansatz spiegelt sich zum einen die beste Praxis wider. Zum anderen ist er ein ethischer Richtwert für In-vivo -Tests auf augenreizende/-verätzende Wirkungen. Die Prüfmethode 
bietet nicht nur eine Anleitung zur Durchführung des  In-vivo -Tests, sondern 
auch eine Übersicht über die Faktoren, die vor der Durchführung eines solchen Versuchs überprüft werden sollen. Die sequenzielle Prüfstrategie liefert einen auf einer Gewichtungsanalyse basierenden Ansatz für die Bewertung bereits vorhan ­
dener Daten über die augenreizenden/-verätzenden Eigenschaften von Prüfsub ­
stanzen und einen stufenweisen Ansatz für die Erzeugung sachdienlicher Daten über Stoffe, die im Rahmen zusätzlicher Studien untersucht werden müssen bzw. noch gar nicht untersucht wurden. Die Strategie umfasst die Durchführung vali ­
dierter und anerkannter  In-vitro - und  Ex-vivo -Tests, in bestimmten Fällen gefolgt 
von Untersuchungen zur hautreizenden/-verätzenden Wirkung von Stoffen nach Prüfmethode B.4 (Hautreizung/-verätzung) (3) (4).
 
BESCHREIBUNG DER STUFENWEISEN PRÜFSTRATEGIE  
Sämtliche vorhandenen Informationen sollen vor der Durchführung von Ver ­
suchen im Rahmen der sequenziellen Prüfstrategie (Fließbild) bewertet werden, um die Notwendigkeit von  In-vivo -Augentests zu klären. Auch wenn wichtige 
Informationen aus der Beurteilung einzelner Parameter (z. B. extreme pH-Werte) 
gewonnen werden können, sollen die bereits vorliegenden Angaben in ihrer Gesamtheit betrachtet werden. Alle relevanten Daten über die Wirkungen des betreffenden Stoffs und Struktur verwandter Verbindungen sollen mit Hilfe einer 
Gewichtungsanalyse bewertet werden, und die Entscheidung soll begründet wer ­
den. Dabei sollen bereits vorliegende Angaben zur Wirkung der Substanz auf Mensch und Tier im Vordergrund stehen, gefolgt von den Ergebnissen von  
In-vitro - und  Ex-vivo -Tests.  In-vivo -Untersuchungen mit Stoffen mit ätzenden 
Eigenschaften sollten nach Möglichkeit immer vermieden werden. Folgende Fak ­
toren werden in der Prüfstrategie erörtert:
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Beurteilung bereite vorliegender Angaben zur Wirkung der Substanz auf Mensch 
und Tier (Stufe 1).  Zunächst sollen vorhandene Informationen über die Wirkung 
auf den Menschen, z. B. klinische Studien oder Studien zur Exposition am Arbeitsplatz sowie Fallberichte und/oder Ergebnisse von Tierversuchen (Unter ­
suchungen am Auge) bewertet werden, denn sie liefern Hinweise, die unmittelbar 
die Wirkungen auf das Auge betreffen. Danach sollen vorhandene Daten aus 
Untersuchungen an Menschen und/oder Tieren zu Hautverätzungen/-reizungen bewertet werden. Stoffe mit bekannter augenätzender oder schwer augenreizender Wirkung sollen nicht in die Augen von Tieren geträufelt werden. Dies gilt ebenso 
für Substanzen, die Hautreizungen oder -Verätzungen hervorrufen. Alle diese 
Substanzen sollen auch als augenverätzende und/oder -reizende Stoffe betrachtet werden. Auch mit Substanzen, von denen in früheren Augenuntersuchungen hinreichend nachgewiesen wurde, dass sie weder Verätzungen noch Reizungen 
hervorrufen, sollen keine  In-vivo -Studien durchgeführt werden.
 
Analyse der Zusammenhänge zwischen Struktur und Aktivität (SAR) (Stufe 2).  
Die gegebenenfalls vorhandenen Ergebnisse von Untersuchungen an strukturell verwandten Substanzen sollen berücksichtigt werden. Liegen genügend Daten 
über das augenverätzende/-reizende Potenzial von strukturell verwandten Sub ­
stanzen oder Gemischen aus diesen Substanzen aus Untersuchungen an Men ­
schen und/oder Tieren vor, kann davon ausgegangen werden, dass die zu beur ­
teilende Prüfsubstanz die gleichen Reaktionen hervorrufen wird. In diesen Fällen 
braucht die Prüfsubstanz nicht getestet zu werden. Für die Zwecke der sequen ­
ziellen Prüfstrategie reichen negative Daten aus Untersuchungen an strukturell verwandten Substanzen oder Gemischen als Nachweis für ein Nichtvorhanden ­
sein augenverätzender/-reizender Wirkungen nicht aus. Zur Ermittlung des Ver ­
ätzungs- und Reizungspotenzials in Bezug auf die Haut und die Augen sollten 
validierte und anerkannte SAR-Verfahren herangezogen werden.
 
Physikalisch-Chemische Eigenschaften und chemische Reaktivität (Stufe 3).  
Stoffe mit extremen pH-Werten ( ≤ 2,0 bzw. ≥ 11,5) können starke lokale Re ­
aktionen induzieren. Gilt ein extremer pH-Wert als Anhaltspunkt für die augen ­
verätzende oder -reizende Wirkung eines Stoffs, so kann dessen Potenzial zur Veränderung der Azidität/Alkalinität (bzw. das Pufferungsvermögen) ebenfalls berücksichtigt werden (5) (6). Lässt das Pufferungsvermögen darauf schließen, 
dass eine Substanz möglicherweise
 keine augenverätzende Wirkung hat, sollen 
weitere Prüfungen zur Bestätigung dieser Vermutung durchgeführt werden. Dafür sollen validierte und anerkannte  In-vitro - oder  Ex-vivo -Tests genutzt werden 
(siehe Stufen 5 und 6).
 
Einbeziehung weiterer wichtiger Informationen (Stufe 4).  In dieser Phase sollen 
alle verfügbaren Informationen über die systemische Toxizität bei Applikation auf die Haut bewertet werden. Die akute dermale Toxizität der Prüfsubstanz soll ebenfalls beurteilt werden. Hat sich die Prüfsubstanz als sehr giftig bei Haut ­
kontakt erwiesen, braucht sie nicht am Auge getestet zu werden. Auch wenn 
nicht unbedingt ein Zusammenhang zwischen akuter dermaler Toxizität und Augenreizung/-verätzung besteht, kann man davon ausgehen, dass ein Stoff, der bei Hautapplikation sehr giftig ist, auch beim Einträufeln in das Auge eine 
starke Toxizität aufweist. Diese Daten können auch zwischen den Stufen 2 und 3 
bewertet werden.
 
Ergebnisse von In-vitro- und Ex-vivo-Tests (Stufen 5 und 6).  Substanzen, deren 
ätzende oder stark reizende Eigenschaften in validierten und anerkannten, auf die 
Ermittlung der Augen- oder Hautverätzung/-reizung ausgerichteten  In-vitro - oder  
Ex-vivo -Tests (7) (8) nachgewiesen wurden, brauchen nicht an Tieren geprüft zu 
werden. Man kann davon ausgehen, dass diese Substanzen in vivo vergleichbare schwere Wirkungen hervorrufen. Stehen validierte und anerkannte  In-vitro -/Ex- 
vivo-Tests nicht zur Verfügung, können die Stufen 5 und 6 übersprungen und die 
Auswertungen direkt auf Stufe 7 fortgesetzt werden.
 
Bewertung der hautreizenden oder -verätzenden Wirkung der Substanz in vivo 
(Stufe 7).  Reichen die aus den vorstehend genannten Studien gewonnenen 
Erkenntnisse nicht aus, um eine schlüssige Gewichtungsanalyse des Augenrei ­
zungs-/-verätzungspotenzials eines Stoffs vornehmen zu können, soll zunächst das In-vivo -Hautreizungs-/-verätzungspotenzial anhand von Prüfmethode B.4 (4) 
und der dazugehörigen Anlage (9) bewertet werden. Wird der Nachweis erbracht, 
dass die Substanz Verätzungen oder schwere Hautreizungen verursacht, soll sie 
so lange als Stoff mit augenverätzenden/-reizenden Eigenschaften betrachtet werden, bis weitere Erkenntnisse einen anderen Schluss zulassen. Folglich braucht ein  In-vivo -Augentest nicht durchgeführt zu werden. Verursacht die Sub ­
stanz keine Verätzung oder starke Reizung der Haut, soll ein  In-vivo -Augentest 
erfolgen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 262
 
In-vivo-Test an Kaninchen (Stufen 8 und 9).  Vor dem eigentlichen In-vivo-Au ­
gentest soll zunächst ein Vorversuch an nur einem Tier stattfinden. Es sollen 
keine weiteren Tests erfolgen, wenn der Vorversuch ergibt, dass die Substanz schwere Augenreizungen oder -Verätzungen hervorruft. Liefert der Vorversuch keine Anhaltspunkte für eine ätzende Wirkung oder schwere Reizungen, wird ein 
Bestätigungstest an zwei weiteren Tieren durchgeführt.
 
LITERATURHINWEISE  
(1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria 
for Alternative Toxicological Test Methods. Solna, Schweden, 22.- 
24. Januar 1996 (http://www.oecd.org/ehs/testAjackground.htin).  
(2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Hu ­
man Health and Environmental Effects of Chemical Substances, bestätigt auf der 28. Gemeinsamen Tagung des Chemikalien-Ausschusses und der Ar ­
beitsgruppe Chemikalien, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm).
 
(3) Worth, A.P., und Fentem, J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA  27, 161-177.  
(4) Prüfmethode B.4. Akute Toxizität: Hautreizung/-verätzung.  
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substances Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, 19-26.  
(6) Neun, D.J. (t993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of 
Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 
227-231.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G., und Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, 483-524.
 
(8) Prüfmethode B.40 Hautverätzung.  
(9) Anlage zur Prüfmethode B.4: Sequenzielle Prüfstrategie für Hautreizungen 
und -Verätzungen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 263
 
Fliessbild  
Prüf- und bewertungsstrategie: augenreizung/-verätzung
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 265
 
B.6. SENSIBILISIERUNG DER HAUT  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Bemerkungen  
Die Empfindlichkeit und Fähigkeit von Tests, potenzielle Sensibili ­
satoren der menschlichen Haut zu ermitteln, sind von besonderer 
Bedeutung für ein Klassifizierungssystem der Toxizität im Bereich 
des öffentlichen Gesundheitswesens.  
Es gibt kein alleiniges Prüfverfahren, das geeignet ist, alle Substan ­
zen mit einer potenziellen Sensibilisierungswirkung auf die mensch ­
liche Haut hinreichend zu ermitteln, und das zudem für alle Sub ­
stanzen relevant ist.  
Bei der Auswahl eines Tests sind Faktoren wie die physikalischen 
Eigenschaften einer Substanz, einschließlich ihrer Fähigkeit, die Haut zu durchdringen, zu berücksichtigen.
 
Es wurden zwei Arten von Tests mit Meerschweinchen entwickelt: 
die Adjuvans-Tests, bei denen ein allergischer Zustand durch Auf ­
lösung oder Suspension der Prüfsubstanz im kompletten Freundschen Adjuvans (FCA) potenziert wird, und die Tests ohne Adjuvans.
 
Die Adjuvans-Tests haben bei der Bestimmung einer wahrscheinli ­
chen Hautsensibilisierungswirkung einer Substanz beim Menschen voraussichtlich eine größere Vorhersagewahrscheinlichkeit als Me ­
thoden ohne das komplette Freundsche Adjuvans. Sie sind daher 
die bevorzugten Tests.
 
Bei dem Maximierungstest am Meerschweinchen (GPMT) handelt es 
sich um ein weit verbreitetes Adjuvans-Verfahren. Obwohl es noch 
zahlreiche andere Verfahren gibt, mit deren Hilfe sich feststellen lässt, ob eine Substanz eine Sensibilisierungsreaktion der Haut her ­
vorzurufen vermag, gilt der GPMT als der bevorzugte Adjuvans- 
Test.
 
Bei zahlreichen chemischen Substanzklassen gelten die Tests ohne 
Adjuvans (von denen der Bühler-Test der bevorzugte ist) als weniger 
empfindlich.  
In bestimmten Fällen kann es gute Gründe für die Wahl des Bühler- 
Tests geben, bei dem die äußerliche Applikation Anwendung findet, 
anstelle der intradermalen Injektion beim Maximierungstest am Meerschweinchen. Die Anwendung des Bühler-Tests sollte wissen ­
schaftlich begründet werden.
 
In der vorliegenden Methode werden der Meerschweinchen-Maxi ­
mierungstest (GPMT) und der Bühler-Test beschrieben. Andere Tests können verwendet werden, sofern sie gut validiert sind und eine 
wissenschaftliche Begründung gegeben wird.
 
Wenn ein positives Ergebnis mit einem anerkannten Screening-Test 
erhalten wird, kann eine Testsubstanz als potenziell sensibilisierend 
bewertet werden. Somit kann ein weiterer Test mit Meerschweinchen 
nicht notwendig sein. Wird aber ein negatives Ergebnis mit einem Screening-Test erhalten, ist ein Test mit Meerschweinchen entspre ­
chend dem hier beschriebenen Verfahren durchzuführen.
 
Siehe auch allgemeine Einleitung zu Teil B.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 266
 
1.2. DEFINITIONEN  
Hautsensibilisierung: (allergische Kontaktdermatitis) immunologisch 
vermittelte Hautreaktion auf eine Substanz. Beim Menschen kann die Reaktion gekennzeichnet sein durch Pruritus, Erytheme, Ödeme, Pa ­
pula, Vesiculae, Bullae oder eine Kombination dieser Erscheinungen. 
Bei anderen Spezies können die Reaktionen anderer Art sein und nur aus Erythemen und Ödemen bestehen.
 
Induktionsexposition: experimentelle Exposition eines Probanden 
gegenüber einer Prüfsubstanz mit der Absicht, eine Überempfindlich ­
keit zu induzieren.  
Induktionsphase: Zeitraum von mindestens einer Woche nach einer 
Induktionsexposition, während dem sich eine Überempfindlichkeit 
entwickeln kann.  
Provokationsexposition: experimentelle Exposition eines zuvor 
behandelten Tieres gegenüber einer Prüfsubstanz nach einer Induk ­
tionsphase, um zu bestimmen, ob das Tier überempfindlich reagiert.  
1.3. BEZUGSSUBSTANZEN  
Die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit des verwendeten Testver ­
fahrens sollte alle sechs Monate unter Verwendung von Substanzen 
mit bekannten leichten bis mittelgradigen hautsensibilisierenden Eigenschaften überprüft werden.
 
In einem ordnungsgemäß durchgeführten Test ist bei leichten/ 
mittelgradigen Sensibilisatoren eine Reaktion von mindestens 30 % (Adjuvans-Test) bzw. mindestens 15 % (Test ohne Adjuvans) zu 
erwarten.
 
Die folgenden Substanzen werden bevorzugt:  
CAS-Nummer EINECS-Nummer EINECS-Bezeichnungen Freinamen  
101-86-0 202-983-3 α -Hexylcinnam-aldehyd α-Hexyl-cinnamaldehyd 
149-30-4 205-736-8 Benzothiazol-2-thiol (Mercap ­
tobenzothiazol) Kaptax 
94-09-7 202-303-5 Benzocain Norcain  
Unter bestimmten Umständen können bei entsprechender Begrün ­
dung andere Kontrollsubstanzen, die die obigen Kriterien erfüllen, verwendet werden.
 
1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Die Versuchstiere werden zunächst durch intradermale Injektion 
und/oder epidermale Applikation der Prüfsubstanz ausgesetzt (Induk ­
tionsexposition). Nach einer Ruhephase von 10 bis 14 Tagen (Induktionsphase), in deren Verlauf sich eine Immunreaktion ent ­
wickeln kann, werden die Tiere einer Provokationsdosis ausgesetzt. 
Ausmaß und Grad der Hautreaktion auf die Provokationsexposition bei den Versuchstieren wird mit der Reaktion bei Kontrolltieren ver ­
glichen, die einer Scheininduktion unterzogen wurden und die Pro ­
vokationsexposition erhalten.
 
1.5. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODEN  
Wenn die Entfernung der Prüfsubstanz für notwendig erachtet wird, 
sollte dies mit Hilfe von Wasser oder einem geeigneten Lösungs ­
mittel geschehen, ohne dass die vorhandene Reaktion bzw. die 
Unversehrtheit der Epidermis beeinträchtigt wird.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 267
 
1.5.1.  Meerschweinchen-Maximierungstest (GPMT)  
1.5.1.1. V o r b e r e i t u n g e n  
Gesunde junge erwachsene Albino-Meerschweinchen werden vor 
dem Test für die Dauer von mindestens 5 Tagen an die Laborbedin ­
gungen akklimatisiert. Vor Testbeginn werden die Tiere randomisiert 
und den Behandlungsgruppen zugeteilt. Die Behaarung wird je nach Prüfmethode durch Scheren, Rasieren oder, falls möglich, chemische Enthaarung entfernt. Dabei ist darauf zu achten, dass es nicht zu 
Hautabschürfungen kommt. Die Tiere werden vor Testbeginn und 
nach Abschluss des Tests gewogen.
 
1.5.1.2. V e r s u c h s b e d i n g u n g e n  
1.5.1.2.1. Versuchstiere  
Es werden gängige Laborstämme des Albino-Meerschweinchens 
verwendet.  
1.5.1.2.2. Anzahl und Geschlecht  
Es können männliche und/oder weibliche Tiere verwendet werden. 
Die weiblichen Tiere dürfen weder geworfen haben noch trächtig 
sein. 
Die behandelte Gruppe besteht aus mindestens 10 Tieren, die Kon ­
trollgruppe aus mindestens 5 Tieren. Wenn weniger als 20 Tiere in 
der Prüfgruppe und 10 Tiere in der Kontrollgruppe verwendet wur ­
den und es nicht möglich ist, zu entscheiden, ob die Prüfsubstanz sensibilisierend wirkt, sind Prüfungen an weiteren Tieren unbedingt zu empfehlen, bis insgesamt mindestens 20 Tiere in der Prüfgruppe 
und 10 Kontrolltiere getestet sind.
 
1.5.1.2.3. Dosierungen  
Die für jede Induktionsexposition verwendete Konzentration der 
Prüfsubstanz sollte systemisch gut verträglich sein, und es sollte sich um die höchste Dosis handeln, die noch eine leichte bis mittel ­
gradige Hautreizung hervorruft. Die für die Provokationsexposition 
verwendete Konzentration sollte die höchste nicht reizende Dosis sein. Wenn notwendig, können die entsprechenden Konzentrationen mit einer Pilotstudie unter Verwendung von zwei bis drei Tieren 
ermittelt werden. Für diesen Zweck kommt die Verwendung von 
FCA-behandelten Tieren in Betracht.
 
1.5.1.3. V e r s u c h s d u r c h f ü h r u n g  
1.5.1.3.1. Induktion  
Tag 0 — behandelte Gruppe  
Drei paarweise Injektionen von 0,1 ml werden jeweils rechts und 
links von der Mittellinie intradermal in die enthaarte Schulterregion injiziert.
 
Injektion 1: 1:1-Mischung (v/v) aus FCA/Wasser oder physiologi ­
scher Kochsalzlösung;  
Injektion 2: Prüfsubstanz in geeignetem Vehikel in der gewählten 
Konzentration;  
Injektion 3: Prüfsubstanz in der gewählten Konzentration in einer 
1:1-Mischung (v/v) aus FCA/Wasser oder physiologischer Kochsalz ­
lösung.  
Bei der Injektion 3 werden die wasserlöslichen Substanzen vor der 
Mischung mit FCA in der wässrigen Phase gelöst. Fettlösliche oder unlösliche Substanzen werden vor der Zugabe der wässrigen Phase 
in FCA suspendiert. Die Endkonzentration der Prüfsubstanz ent ­
spricht der der Injektion 2.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 268
 
Die Injektionen 1 und 2 werden nahe beieinander im kranialen Teil, 
die Injektion 3 im kaudalen Teil des Applikationsbereichs gesetzt.  
Tag 0 — Kontrollgruppe  
Drei paarweise Injektionen von 0,1 ml werden an denselben Stellen 
wie bei den behandelten Tieren injiziert.  
Injektion 1: 1:1-Mischung (v/v) aus FCA/Wasser oder physiologi ­
scher Kochsalzlösung;  
Injektion 2: unverdünntes Vehikel;  
Injektion 3: 50 %ige Zubereitung (w/v) des Vehikels in einer 1:1- 
Mischung (v/v) aus FCA/Wasser oder physiologischer Kochsalzlö ­
sung.  
Tag 5-7 — behandelte und Kontrollgruppe  
Etwa 24 Stunden vor der topischen Induktionsapplikation wird, wenn 
die Substanz nicht hautreizend ist, der kurzgeschorene oder rasierte Applikationsbereich mit 0,5 ml Natriumlaurylsulfat 10 % in Vaseline bestrichen, um eine örtliche Reizung hervorzurufen.
 
Tag 6-8 — behandelte Gruppe  
Der Applikationsbereich wird erneut enthaart. Ein Filterpapier (2 × 
4 cm) wird vollständig mit der Prüfsubstanz in einem geeigneten Vehikel beladen, auf den Applikationsbereich aufgetragen und mit einem Okklusivverband für 48 Stunden fixiert. Die Wahl des Vehi ­
kels ist zu begründen. Feststoffe werden fein pulverisiert und in ein 
geeignetes Vehikel eingebracht. Flüssigkeiten können ggf. unver ­
dünnt appliziert werden.
 
Tag 6-8 — Kontrollgruppe  
Der Applikationsbereich wird erneut enthaart. Das Vehikel allein 
wird in entsprechender Weise auf den Applikationsbereich auf ­
gebracht und mit einem Okklusivverband für 48 Stunden fixiert.  
1.5.1.3.2. Provokation  
Tag 20-22 — behandelte und Kontrollgruppe  
Die Flanken der behandelten Tiere und der Kontrolltiere werden 
enthaart. Ein Läppchen oder eine Kammer mit der Prüfsubstanz wird auf eine Flanke der Tiere aufgebracht, und ein Läppchen oder eine Kammer mit dem Vehikel allein kann ggf. auf die andere 
Flanke aufgetragen werden. Die Läppchen werden mit einem Okklu ­
sivverband für 24 Stunden in Kontakt mit der Haut gehalten.
 
1.5.1.3.3. Beobachtung und Bewertung: behandelte Gruppe und Kontroll ­
gruppe  
— etwa 21 Stunden nach Entfernung des Läppchens wird der Pro ­
vokationsbereich gereinigt und kurzgeschoren und/oder rasiert und bei Bedarf depiliert;
 
— etwa 3 Stunden später (etwa 48 Stunden nach Beginn der Pro ­
vokationsexposition) wird die Hautreaktion bewertet und gemäß 
den in der Anlage aufgeführten Schweregraden dokumentiert;  
— etwa 24 Stunden nach dieser Beobachtung erfolgt eine zweite 
Beobachtung (72 Stunden nach Beginn), die ebenfalls dokumen ­
tiert wird.  
Es empfiehlt sich eine Blindablesung der behandelten Tiere und der 
Kontrolltiere.  
Falls eine Klärung der Ergebnisse der ersten Provokation erforderlich 
ist, sollte eine zweite Provokation (d. h. eine Reprovokation), ggf. mit einer neuen Kontrollgruppe, etwa eine Woche nach der ersten in 
Betracht gezogen werden. Eine Reprovokation kann auch mit der 
ursprünglichen Kontrollgruppe durchgeführt werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 269
 
Alle Hautreaktionen und auffälligen Befunde, einschließlich systemi ­
scher Reaktionen, infolge der Induktion und der Provokation sollten 
beobachtet und entsprechend der Bewertungsskala nach Magnusson/ ­
Kligman (siehe Anlage) dokumentiert werden. Weitere Verfahren, wie z. B. die histopathologische Untersuchung oder die Messung 
der Hautfaltendicke, können verwendet werden, um zweifelhafte Re ­
aktionen zu klären.
 
1.5.2.  Bühler-Test  
1.5.2.1. V o r b e r e i t u n g e n  
Gesunde junge erwachsene Albino-Meerschweinchen werden vor 
dem Test für die Dauer von mindestens 5 Tagen an die Laborbedin ­
gungen akklimatisiert. Vor Testbeginn werden die Tiere randomisiert 
und den Behandlungsgruppen zugeteilt Die Behaarung wird je nach Prüfmethode durch Scheren, Rasieren oder, falls möglich, chemische Enthaarung, entfernt. Dabei ist darauf zu achten, dass die Haut nicht 
verletzt wird. Die Tiere werden vor Testbeginn und nach Abschluss 
des Tests gewogen.
 
1.5.2.2. V e r s u c h s b e d i n g u n g e n  
1.5.2.2.1. Versuchstiere  
Es werden gängige Laborstämme des Albino-Meerschweinchens ver ­
wendet.  
1.5.2.2.2. Anzahl und Geschlecht  
Es können männliche und/oder weibliche Tiere verwendet werden. 
Die weiblichen Tiere dürfen weder geworfen haben noch trächtig 
sein. 
Die behandelte Gruppe besteht aus mindestens 20 Tieren, die Kon ­
trollgruppe aus mindestens 10 Tieren.  
1.5.2.2.3. Dosierungen  
Die für jede Induktionsexposition verwendete Konzentration der 
Prüfsubstanz sollte die höchstmögliche Dosis sein, die noch eine leichte, aber nicht zu starke Hautreizung hervorruft. Die für die Pro ­
vokationsexposition verwendete Konzentration sollte die höchste 
nicht reizende Dosis sein. Wenn notwendig, können die entsprechen ­
den Konzentrationen mit einer Pilotstudie unter Verwendung von zwei bis drei Tieren ermittelt werden.
 
Bei wasserlöslichen Prüfsubstanzen ist es zweckmäßig, Wasser oder 
eine verdünnte, nicht reizende Surfactant-Lösung als Vehikel zu ver ­
wenden. Bei sonstigen Prüfsubstanzen wird 80 % Ethanol/Wasser für die Induktion und Azeton für die Provokation bevorzugt.
 
1.5.2.3. V e r s u c h s d u r c h f ü h r u n g  
1.5.2.3.1. Induktion  
Tag 0 — behandelte Gruppe  
Eine Flanke wird enthaart (kurzgeschoren). Das Testläppchensystem 
sollte vollständig mit der Prüfsubstanz in einem geeigneten Vehikel 
beladen sein (die Auswahl des Vehikels muss begründet sein; flüs ­
sige Prüfsubstanzen können ggf. unverdünnt aufgetragen werden).  
Das Testläppchen wird auf den Applikationsbereich aufgetragen und 
durch ein Okklusivpflaster oder eine Okklusivkammer und einen 
geeigneten Verband für 6 Stunden in Kontakt mit der Haut gehalten.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 270
 
Das Testläppchensystem muss okklusiv sein. Eine runde oder quadra ­
tische Wattekompresse ist geeignet, sollte aber mindestens 4-6 cm  2 
groß sein. Die Fixierung der Tiere mit einem geeigneten Fixator wird 
jedoch zur Okklusion bevorzugt. Bei Verwendung einer Umhüllung sind unter Umständen weitere Expositionen erforderlich.
 
Tag 0 — Kontrollgruppe  
Eine Flanke wird enthaart (kurzgeschoren). Das Vehikel allein wird 
auf die gleiche Weise wie bei der behandelten Gruppe aufgebracht. Das Testläppchensystem wird durch ein Okklusivpflaster bzw. eine 
Okklusivkammer und einen geeigneten Verband für 6 Stunden in 
Kontakt mit der Haut gehalten. Wenn nachweisbar ist, dass eine scheinbehandelte Kontrollgruppe nicht erforderlich ist, kann eine un ­
behandelte Kontrollgruppe verwendet werden.
 
Tage 6-8 und 13-15 — behandelte Gruppe und Kontrollgruppe  
Dieselbe Applikation wie am Tag 0 erfolgt am Tag 6-8 sowie erneut 
am Tag 13-15 auf demselben Applikationsbereich (bei Bedarf ent ­
haart) derselben Flanke.  
1.5.2.3.2. Provokation  
Tag 27-29 — behandelte Gruppe und Kontrollgruppe  
Die unbehandelte Flanke der behandelten Tiere und der Kontrolltiere 
wird enthaart (kurz geschoren). Ein Okklusivpflaster bzw. eine Ok ­
klusivkammer mit der entsprechenden Menge an Prüfsubstanz wird in der maximalen nicht hautreizenden Konzentration auf die hintere 
unbehandelte Flanke der behandelten Tiere und der Kontrolltiere 
aufgetragen.
 
Gegebenenfalls kann ein Okklusivpflaster bzw. eine Okklusivkam ­
mer mit dem Vehikel allein auf die vordere unbehandelte Flanke der 
behandelten Tiere und der Kontrolltiere aufgetragen werden. Die 
Läppchen bzw. Kammern werden mit einem geeigneten Verband für 6 Stunden in Kontakt mit der Haut gehalten.
 
1.5.2.3.3. Beobachtung und Bewertung  
— etwa 21 Stunden nach Entfernung des Läppchens wird der Pro ­
vokationsbereich enthaart;  
— etwa 3 Stunden später (etwa 30 Stunden nach Applikation des 
Provokationspflasters) werden die Hautreaktionen bewertet und 
gemäß den in der Anlage aufgeführten Schweregraden dokumen ­
tiert;  
— etwa 24 Stunden nach dieser ersten Beobachtung (d. h. 54 Stun ­
den nach Applikation des Provokationspflasters) werden die 
Hautreaktionen erneut bewertet und dokumentiert.  
Es empfiehlt sich eine Blindablesung der behandelten Tiere und der 
Kontrolltiere.  
Falls eine Klärung der Ergebnisse der ersten Provokation erforderlich 
ist, sollte eine zweite Provokation (d. h. eine Reprovokation), ggf. mit einer neuen Kontrollgruppe, etwa eine Woche nach der ersten in 
Betracht gezogen werden. Eine Reprovokation kann auch mit der 
ursprünglichen Kontrollgruppe durchgeführt werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 271
 
Alle Hautreaktionen und auffälligen Befunde, einschließlich systemi ­
scher Reaktionen, infolge der Induktion und der Provokation sollten 
beobachtet und entsprechend der Bewertungsskala nach Magnusson/ ­
Kligman (siehe Anlage) dokumentiert werden. Weitere Verfahren, wie z. B. die histopathologische Untersuchung oder die Messung 
der Hautfaltendicke, können verwendet werden, um zweifelhafte Re ­
aktionen zu klären.
 
2. DATEN (GPMT und Bühler-test)  
Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Aus den 
Daten müssen für jedes Versuchstier die Hautreaktionen zu jedem Beobachtungszeitpunkt hervorgehen.
 
3. ABSCHLUSSBERICHT (GPMT und Bühler-test)  
Wenn ein Screening-Test (z. B. Lokaler Lymphknotentest [LLNA], 
Maus-Ohrschwellungstest [MEST]) vor dem Meerschweinchentest 
durchgeführt wird, muss die Beschreibung oder Literaturstelle des Tests mit Angaben zum Verfahren neben den mit den Prüf- und Referenzsubstanzen gewonnenen Ergebnissen angegeben werden.
 
Prüfbericht (GPMT und Bühler-Test)  
Der Prüfbericht soll nach Möglichkeit folgende Angaben enthalten:  
Versuchstiere:  
— verwendeter Meerschweinchenstamm;  
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere;  
— Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.;  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Beginn der Prüfung.  
Prüfbedingungen:  
— Methode der Vorbereitung der Applikationsstelle;  
— Angaben zur Art der verwendeten Läppchen sowie zur Patching- 
Technik;  
— Ergebnis der Pilotstudie mit den für den eigentlichen Test ermit ­
telten Induktions- und Provokationskonzentrationen,  
— Angaben zur Vorbereitung, Applikation und Entfernung der Prüf ­
substanz;  
— Begründung der Auswahl des Vehikels;  
— Konzentrationen des Vehikels und der Prüfsubstanz für die In ­
duktions- und die Provokationsexposition sowie applizierte Ge ­
samtmenge an Substanz zur Induktion und Provokation.  
Ergebnisse:  
— Zusammenfassung der Ergebnisse der letzten Überprüfung der 
Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit des Tests (siehe 1.3) mit 
Angaben über verwendete Substanzen, Konzentrationen und Ve ­
hikel;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 272
 
— Beobachtungen der einzelnen Tiere mit Angabe des Bewertungs ­
systems;  
— ausführliche Beschreibung der Art und des Schweregrades der 
beobachteten Wirkungen;  
— eventuelle histopathologische Befunde.  
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  
4. LITERATUR  
Diese Methode entspricht der OECD TG 406.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 273
 
Anlage  
TABELLE  
Bewertungsskala nach Magnusson/Kligman für Reaktionen auf 
Provokations-Läppentests  
0 = keine sichtbare Veränderung  
1 = leichtes oder fleckiges Erythem  
2 = mittelgradiges und konfluierendes Erythem  
3 = starkes Erythem und Schwellung  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 274
 
B.7 28-TAGE-TOXIZITÄTSSTUDIE MIT WIEDERHOLTER ORALER 
VERABREICHUNG AN NAGETIEREN  
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie 407 (2008). Die ur ­
sprüngliche Prüfrichtlinie 407 wurde 1981 angenommen. 1995 wurde eine 
überarbeitete Fassung angenommen mit dem Ziel, insbesondere in Bezug 
auf Neurotoxizität und Immunotoxizität zusätzliche Informationen von den in der Studie verwendeten Tieren zu gewinnen.
 
2. Die OECD leitete 1998 mit hoher Priorität eine Überarbeitung der beste ­
henden Prüfrichtlinien und die Ausarbeitung neuer Prüfrichtlinien für Scree ­
ning und Prüfung potenzieller endokriner Disruptoren ein (8). Ein Aspekt dieser Maßnahme war die Aktualisierung der bestehenden OECD-Prüfrichtlinie für eine „28-Tage-Toxizitätsstudie mit wiederholter 
oraler Verabreichung an Nagetieren“ (TG 407) durch Parameter, mit denen 
eine endokrine Wirkung von Prüfsubstanzen festgestellt werden kann. Die ­
ses Verfahren wurde in einem umfangreichen internationalen Programm auf Relevanz und Praktikabilität der zusätzlichen Parameter, ihre Leistungsfähig ­
keit in Bezug auf chemische Stoffe mit (anti)östrogener, (anti)androgener 
und (anti)thyroider Wirkung, die Intra- und Interlabor-Reproduzierbarkeit und die Interferenz der neuen Parameter mit den zuvor nach der TG 407 vorgesehenen Parametern geprüft. Die dabei gewonnene umfangreiche Da ­
tenmenge wurde in einem umfassenden OECD-Bericht zusammengestellt 
und ausführlich bewertet (9). Diese aktualisierte Prüfmethode B.7 (die der TG 407 entspricht) ist das Ergebnis der im internationalen Prüfprogramm gesammelten Erfahrungen und Erkenntnisse. Mithilfe dieser Prüfmethode 
können bestimmte endokrin vermittelte Wirkungen in einen Gesamtzusam ­
menhang mit anderen toxikologischen Wirkungen gestellt werden.
 
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN UND BEGRENZUNGEN  
3. Bei der Beurteilung und Bewertung der toxischen Merkmale eines che ­
mischen Stoffs kann die orale Toxizität nach wiederholter Verabreichung des Stoffs bestimmt werden, nachdem zunächst durch Prüfungen auf akute 
Toxizität erste Toxizitätsdaten gewonnen wurden. Diese Prüfmethode ist 
dazu bestimmt, die Wirkungen auf ein sehr breites Spektrum potenzieller Toxizitätsziele zu untersuchen. Sie gibt Aufschluss über die möglichen Ge ­
sundheitsgefahren, einschließlich der Wirkungen auf das Nervensystem, das 
Immunsystem und das endokrine System, die durch wiederholte Exposition 
über einen relativ begrenzten Zeitraum auftreten können. In Bezug auf diese speziellen Endpunkte sollte die Methode es ermöglichen, chemische Stoffe mit neurotoxischem Potenzial, die in dieser Hinsicht eingehender untersucht 
werden sollten, und chemische Stoffe, die die Physiologie der Schilddrüse 
beeinflussen, zu identifizieren. Sie kann auch Daten über Stoffe liefern, die die Fortpflanzungsorgane männlicher und/oder weiblicher junger, adulter Tiere beeinträchtigen, und Hinweise auf immunologische Wirkungen geben.
 
4. Die Ergebnisse dieser Prüfmethode B.7 sollten für die Identifizierung von 
Gefahren und zur Risikobewertung verwendet werden. Die Ergebnisse in Bezug auf die endokrinen Parameter sind im Kontext des „OECD Concep ­
tual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Che ­
micals“ (11) zu interpretieren. Die Methode umfasst die Basisstudie zur 
Prüfung auf Toxizität bei wiederholter Verabreichung, die für chemische Stoffe, bei denen eine 90-Tage-Studie nicht gerechtfertigt ist (z. B. wenn das Produktionsvolumen bestimmte Grenzen nicht überschreitet), oder als 
Vorstudie zu einer Langzeitstudie verwendet werden kann. Die Expositions ­
dauer sollte 28 Tage betragen.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 275
 
5. Das internationale Programm für die Validierung der Parameter, die geeignet 
sind, möglicherweise eine endokrine Wirkung einer Prüfsubstanz nach ­
zuweisen, hat gezeigt, dass die Qualität der mit dieser Prüfmethode B.7 gewonnenen Daten weitgehend von der Erfahrung des Prüflabors abhängt. Dies gilt insbesondere für die histopathologische Bestimmung von zykli ­
schen Veränderungen der weiblichen Fortpflanzungsorgane und für die Ge ­
wichtsbestimmung bei den kleinen hormonabhängigen Organen, die schwie ­
rig zu sezieren sind. Es wurde ein Leitfaden zur Histopathologie entwickelt (19), der auf der öffentlichen OECD-Website für Prüfrichtlinien abrufbar ist. 
Er soll Pathologen bei Untersuchungen helfen und die Empfindlichkeit der 
Prüfungen verbessern. Es wurde festgestellt, dass verschiedene Parameter auf endokrine Toxizität hindeuten; diese wurden in die Prüfrichtlinie auf ­
genommen. Andere Parameter, deren Nutzen wegen unzureichender Daten 
nicht erwiesen ist oder deren Fähigkeit zur Feststellung endokriner Disrup ­
toren im Validierungsprogramm nur unzureichend belegt wurde, werden als fakultative Endpunkte vorgeschlagen (siehe Anlage 2).
 
6. Die Ergebnisse des Validierungsprozesses deuten darauf hin, dass diese 
Prüfung nicht empfindlich genug ist, um alle Stoffe mit (anti)androgener oder (anti)östrogener Wirkungsweise zu identifizieren (9). Diese Prüf ­
methode wird nicht in einer für endokrine Störungen sehr empfindlichen 
Lebensphase durchgeführt. Während des Validierungsprozesses konnten 
zwar Substanzen mit schwacher oder starker Wirkung auf die Schilddrüsen ­
funktion und solche, die das endokrine System über östrogene oder andro ­
gene Rezeptoren mehr oder weniger stark beeinflussen, identifiziert werden; 
in den meisten Fällen konnten Stoffe mit endokriner Wirkung, die diese 
Rezeptoren nur geringfügig beeinträchtigen, mit der Methode aber nicht erkannt werden. Aus diesem Grund kann sie nicht als Screening-Test für endokrine Aktivität bezeichnet werden.
 
7. Die Tatsache, dass keine mit diesen Wirkungsweisen verbundenen Effekte 
festgestellt werden, ist daher kein Nachweis dafür, dass es keine Wirkungen auf das endokrine System gibt. Die Charakterisierung der Substanz in Bezug 
auf endokrin vermittelte Wirkungen darf sich deshalb nicht allein auf die 
Ergebnisse dieser Prüfmethode stützen; es ist vielmehr ein WoE-Ansatz anzuwenden, der alle vorhandenen Daten über einen chemischen Stoff zur Bestimmung seiner potenziellen endokrinen Aktivität einbezieht. Aus die ­
sem Grund dürfen sich Regulierungsentscheidungen über endokrine Aktivi ­
tät (Charakterisierung von Substanzen) nicht allein auf die Ergebnisse aus der Anwendung dieser Prüfmethode stützen, sondern müssen auf einer brei ­
ten Grundlage basieren.
 
8. Bei allen Verfahren, bei denen Tiere verwendet werden, sind die örtlichen 
Standards der Versuchstierpflege einzuhalten. Die nachstehenden Beschrei ­
bungen der Tierpflege und -behandlung sind Mindeststandards; wenn örtli ­
che Bestimmungen strenger sind, gehen diese vor. Die OECD hat einen 
Leitfaden über die humane Behandlung von Versuchstieren herausgegeben (14).
 
9. Die verwendeten Begriffe sind in Anlage 1 definiert.  
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
10. Die Prüfsubstanz wird mehreren Gruppen von Versuchstieren über einen 
Zeitraum von 28 Tagen täglich in abgestuften Dosen oral verabreicht, und zwar eine Dosisstufe je Gruppe. Während des Verabreichungszeitraums 
werden die Tiere täglich sorgfältig auf Toxizitätszeichen beobachtet. Tiere, 
die im Verlauf der Prüfung sterben, und vorzeitig getötete Tiere werden seziert; die nach Abschluss des Tests überlebenden Tiere werden getötet und ebenfalls seziert. Eine 28-Tage-Studie gibt Aufschluss über die Wirkun ­
gen einer wiederholten oralen Exposition und kann Aufschluss darüber ge ­
ben, ob weitere Studien über längere Zeiträume erforderlich sind. Sie kann
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 276
 
auch Informationen über die Wahl der Konzentrationen für Langzeitstudien 
liefern. Die mit dieser Prüfmethode gewonnenen Daten sollten es ermögli ­
chen, die Toxizität der Prüfsubstanz zu beschreiben, Aufschluss über die Dosis-Wirkungs-Beziehung zu erhalten und den NOAEL (No Observed Ad ­
verse Effect Level) zu bestimmen.
 
BESCHREIBUNG DER METHODE  
Auswahl von Versuchstierarten  
11. Die bevorzugte Nagetierart ist die Ratte, aber auch andere Nagetierarten sind 
geeignet. Wenn die in dieser Prüfmethode B.7 genannten Parameter an einer anderen Nagetierart untersucht werden, ist dies ausführlich zu begründen. Es 
ist zwar biologisch plausibel, dass andere Arten ähnlich auf toxische Stoffe 
reagieren dürften wie die Ratte, aber die Verwendung kleinerer Arten kann wegen der technisch schwierigeren Sektion kleinerer Organe zu größeren Schwankungen bei den Ergebnissen führen. Im internationalen Validierungs ­
programm für den Nachweis von endokrinen Disruptoren wurde nur die 
Ratte als Versuchstier verwendet. Es sind junge, gesunde, adulte Tiere aus üblicherweise eingesetzten Laborstämmen zu verwenden. Die weiblichen Tiere dürfen weder bereits geworfen haben noch momentan trächtig sein. 
Mit der Dosierung sollte möglichst bald nach dem Absetzen begonnen 
werden, auf jeden Fall jedoch, bevor die Tiere 9 Wochen alt sind. Bei Beginn der Studie sollten die Gewichtsunterschiede der Tiere möglichst gering sein und ± 20 % des geschlechtsspezifischen Durchschnittsgewichts 
nicht überschreiten. Wenn eine Studie mit wiederholter oraler Gabe als 
Vorstudie zu einer Langzeitstudie durchgeführt wird, sollten in beiden Stu ­
dien vorzugsweise Tiere desselben Stamms und derselben Herkunft verwen ­
det werden.
 
Haltung und Fütterung  
12. Bei allen Verfahren sind die örtlichen Standards der Versuchstierpflege ein ­
zuhalten. Die Temperatur im Tierversuchsraum sollte 22 °C (± 3 °C) betra ­
gen. Die relative Luftfeuchtigkeit sollte mindestens 30 % betragen und — außer beim Reinigen des Raums — 70 % nicht überschreiten. Angestrebt werden sollte eine Luftfeuchtigkeit von 50-60 %. Die Beleuchtung sollte 
künstlich sein und die Hell- und Dunkelphasen sollten sich im Abstand 
von 12 Stunden abwechseln. An die Versuchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert werden, und eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung ist zu gewährleisten. Die Auswahl des Futters wird eventuell dadurch beein ­
flusst, dass eine geeignete Beimischung der Prüfsubstanz sichergestellt wer ­
den muss, wenn die Prüfsubstanz auf diese Art verabreicht werden soll. Die Tiere sollten in kleinen gleichgeschlechtlichen Gruppen untergebracht wer ­
den; sie können auch einzeln gehalten werden, wenn dies wissenschaftlich 
gerechtfertigt ist. Bei Gruppenhaltung sollten maximal fünf Tiere in einem 
Käfig untergebracht sein.
 
13. Das Futter ist regelmäßig auf Schadstoffe zu analysieren. Eine Probe des 
Futters ist bis zur Fertigstellung des Abschlussberichts aufzubewahren.  
Vorbereitung der Tiere  
14. Gesunde, junge, adulte Tiere werden randomisiert und den einzelnen 
Kontroll- bzw. Behandlungsgruppen zugeteilt. Die Käfige sollten so an ­
geordnet werden, dass etwaige Einflüsse der Käfigplatzierung minimiert 
werden. Die Tiere werden eindeutig gekennzeichnet und vor Beginn der Behandlungsstudie in ihren Käfigen über einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen unter Laborbedingungen eingewöhnt.
 
Herstellung der Dosen  
15. Die Prüfsubstanz wird über eine Schlundsonde, mit der Nahrung oder dem 
Trinkwasser verabreicht. Die Methode der oralen Verabreichung hängt vom 
Zweck der Studie und von den physikalischen/chemischen/toxikokinetischen 
Eigenschaften der Prüfsubstanz ab.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 277
 
16. Bei Bedarf wird die Prüfsubstanz in einem geeigneten Vehikel gelöst oder 
suspendiert. Es empfiehlt sich, nach Möglichkeit zunächst die Verwendung 
einer wässrigen Lösung/Suspension, dann eine Lösung/Suspension in Öl (z. B. Maisöl) und erst dann eine Lösung in einem anderen Vehikel in Betracht zu ziehen. Bei anderen Vehikeln als Wasser müssen seine toxischen Merk ­
male bekannt sein. Die Stabilität der Prüfsubstanz im Vehikel sollte be ­
stimmt werden.
 
VERFAHREN  
Zahl und Geschlecht der Versuchstiere  
17. Für jede Dosisstufe sind mindestens zehn Tiere (fünf weibliche und fünf 
männliche) zu verwenden. Sollen im Verlauf der Prüfung Tiere getötet 
werden, ist die Zahl der Tiere um die Zahl zu erhöhen, die vor Abschluss der Studie getötet werden sollen. Zur Beobachtung der Reversibilität, der Persistenz oder des verzögerten Auftretens toxischer Wirkungen für mindes ­
tens 14 Tage nach der Behandlung ist die Einbeziehung einer zusätzlichen 
Satellitengruppe von zehn Tieren (fünf je Geschlecht) in der Kontrollgruppe und in der Gruppe mit der höchsten Dosis in Betracht zu ziehen.
 
Dosierung  
18. Im Allgemeinen sind mindestens drei Prüfgruppen und eine Kontrollgruppe 
zu verwenden; wenn aber angesichts der Beurteilung anderer Daten bei einer Dosis von 1 000 mg pro kg Körpergewicht und Tag keine Wirkungen zu 
erwarten sind, kann ein Limit-Test durchgeführt werden. Liegen keine ent ­
sprechenden Daten vor, kann eine Dosisfindungsstudie (Tiere desselben Stamms und derselben Herkunft) durchgeführt werden, um die zu verwen ­
denden Dosen zu bestimmen. Abgesehen von der Behandlung mit der Prüf ­
substanz sollen die Tiere in der Kontrollgruppe unter identischen Bedingun ­
gen behandelt werden wie die Versuchstiere in der Prüfgruppe. Wird die Prüfsubstanz mit einem Vehikel verabreicht, muss die Kontrollgruppe das Vehikel im höchsten verwendeten Volumen erhalten.
 
19. Bei der Wahl der Dosisstufen sind sämtliche für die Prüfsubstanz oder 
verwandte Stoffe vorliegenden Daten zur Toxizität und (Toxiko-)Kinetik zu berücksichtigen. Die höchste Dosisstufe ist so zu wählen, dass zwar toxische Wirkungen, aber keine Todesfälle oder schweres Leiden hervor ­
gerufen werden. Anschließend ist eine absteigende Folge von Dosisstufen zu 
wählen, um dosisabhängige Wirkungen und die niedrigste Dosisstufe ohne zu beobachtende unerwünschte Wirkungen (NOAEL) nachzuweisen. Zwei- bis vierfache Abstände erweisen sich häufig als optimale Dosisabstufungen, 
und meist ist eine zusätzliche vierte Prüfgruppe der Verwendung von sehr 
großen Dosisabständen (z. B. um mehr als den Faktor 10) vorzuziehen.
 
20. Bei allgemeiner Toxizität (z. B. vermindertes Körpergewicht, Wirkungen auf 
Leber, Herz, Lungen oder Nieren usw.) oder anderen Veränderungen, die möglicherweise keine toxischen Reaktionen sind (z. B. verminderte Futter ­
aufnahme, Lebervergrößerung) sind die beobachteten Wirkungen auf immu ­
nologische, neurologische oder endokrine Endpunkte mit Vorsicht zu inter ­
pretieren.
 
Limit-Test  
21. Verursacht die Prüfung bei einer Dosisstufe von mindestens 1 000 mg/kg 
Körpergewicht pro Tag bzw. eine entsprechende Konzentration im Futter oder Trinkwasser (in Abhängigkeit vom jeweiligen Körpergewicht) unter 
Verwendung der für diese Studie beschriebenen Verfahren keine feststell ­
baren toxischen Wirkungen und ist aufgrund der Daten strukturverwandter Substanzen keine Toxizität zu erwarten, kann auf eine vollständige Studie mit drei Dosisstufen gegebenenfalls verzichtet werden. Der Limit-Test findet 
allerdings keine Anwendung, wenn die Exposition des Menschen die Prü ­
fung in einer höheren Dosisstufe angezeigt erscheinen lassen.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 278
 
Verabreichung der Dosen  
22. Die Tiere erhalten die Prüfsubstanz an sieben Tagen in der Woche über 
einen Zeitraum von 28 Tagen. Wird die Prüfsubstanz über eine Sonde ver ­
abreicht, so sollte dies in einer einmaligen Dosis unter Verwendung einer 
Schlundsonde oder einer geeigneten Intubationskanüle erfolgen. Das maxi ­
male Flüssigkeitsvolumen, das einem Versuchstier jeweils verabreicht wer ­
den kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Das Volumen sollte 1 ml/100 g Körpergewicht nicht überschreiten, außer bei wässrigen Lösungen, 
von denen 2 ml/100 g Körpergewicht gegeben werden können. Abgesehen 
von reizenden oder ätzenden Stoffen, die in der Regel bei höheren Konzen ­
trationen eine verstärkte Wirkung hervorrufen, ist die Variabilität des Prüf ­
volumens dadurch auf ein Mindestmaß zu reduzieren, dass eine Konzen ­
tration gewählt wird, die auf allen Dosisstufen ein konstantes Volumen gewährleistet.
 
23. Bei mit dem Futter oder dem Trinkwasser verabreichten Stoffen ist unbe ­
dingt sicherzustellen, dass die Mengen der jeweiligen Prüfsubstanz die nor ­
male Nahrungsaufnahme oder den Wasserhaushalt nicht beeinträchtigen. 
Wenn die Prüfsubstanz im Futter verabreicht wird, kann entweder eine konstante Konzentration im Futter (ppm) oder eine konstante Dosis, bezogen auf das Körpergewicht des Tieres, verwendet werden; die jeweils gewählte 
Verfahrensweise muss angegeben werden. Eine mit einer Schlundsonde ver ­
abreichte Dosis sollte jeweils zu denselben Tageszeiten gegeben und so angepasst werden, dass eine konstante Dosis in Relation zum Körpergewicht aufrechterhalten wird. Wenn eine Studie mit wiederholter Gabe als Vor ­
studie zu einer Langzeitstudie durchgeführt wird, sollten die beiden Studien 
bezüglich des Futters der Tiere vergleichbar sein.
 
Beobachtungen  
24. Die Tiere sollten 28 Tage beobachtet werden. Tiere in einer Satellitengrup ­
pe, bei denen Nachfolgebeobachtungen vorgesehen sind, sollten für mindes ­
tens weitere 14 Tage ohne Behandlung gehalten werden, um ein verzögertes 
Auftreten, die Persistenz oder die Reversibilität von toxischen Wirkungen 
festzustellen.  
25. Allgemeine klinische Beobachtungen sollten mindestens einmal täglich er ­
folgen, vorzugsweise jeweils zur gleichen Zeit und unter Berücksichtigung 
des Zeitraums nach der Verabreichung, in dem voraussichtlich der Wir ­
kungsgipfel zu erwarten ist. Der Gesundheitszustand der Tiere ist zu doku ­
mentieren. Mindestens zweimal täglich werden alle Tiere auf Erkrankungen oder Todesfälle überprüft.
 
26. Alle Tiere sollten einmal vor der ersten Exposition (um intraindividuelle 
Vergleiche zu ermöglichen) und danach mindestens einmal wöchentlich 
eingehend klinisch untersucht werden. Die Beobachtungen sind außerhalb des Käfigs, in dem die Tiere gehalten werden, in stets gleicher Umgebung und vorzugsweise stets zur gleichen Tageszeit vorzunehmen. Sie sind sorg ­
fältig zu dokumentieren, am besten nach einer speziell vom Prüflabor ent ­
wickelten Bewertungsskala. Durch geeignete Maßnahmen ist sicherzustellen, dass die Prüfbedingungen möglichst konstant bleiben und dass die Beobach ­
tungen vorzugsweise von Personen vorgenommen werden, denen die Be ­
handlung der Tiere nicht bekannt ist. Zu achten ist insbesondere auf Ver ­
änderungen an Haut, Fell, Augen, Schleimhäuten, auf Sekrete und Exkrete sowie autonome Aktivitäten (z. B. Tränensekretion, Piloerektion, Pupillen ­
größe, ungewöhnliche Atemmuster). Gang- und Haltungsstörungen, ferner 
Reaktionen auf den Umgang mit den Tieren sowie etwaige klonische oder tonische Bewegungen, Stereotypien (z. B. übermäßiges Putzen, wiederholte Kreisbewegungen) oder abnormes Verhalten (z. B. Selbstverstümmelung, 
Rückwärtsgehen) sollten auch dokumentiert werden (2).
 
27. In der vierten Expositionswoche sollten die sensorische Reaktivität auf 
Reize verschiedener Art (2) (z. B. akustische, visuelle und propriozeptive Reize) (3)(4)(5), die Greifkraft (6) und die motorische Aktivität (7) bewertet werden. Weitere Einzelheiten zu den möglichen Untersuchungen finden sich 
in der Literatur. Allerdings können auch andere als dort genannte Verfahren 
angewendet werden.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 279
 
28. Die funktionellen Beobachtungen in der vierten Expositionswoche können 
entfallen, wenn es sich um eine Vorstudie für eine nachfolgende Prüfung auf 
subchronische Toxizität (90 Tage) handelt. In diesem Fall sollten die funk ­
tionellen Beobachtungen im Rahmen dieser Folgestudie vorgenommen wer ­
den. Andererseits könnten die Daten über funktionelle Beobachtungen aus 
der Studie mit wiederholter Verabreichung aber die Wahl der Dosisstufen 
für eine nachfolgende Prüfung auf subchronische Toxizität erleichtern.  
29. In Ausnahmefällen können funktionelle Beobachtungen auch bei Gruppen 
entfallen, die so starke sonstige Toxizitätsanzeichen aufweisen, dass die 
Leistungen in Funktionstests dadurch signifikant beeinträchtigt würden.  
30. Bei der Nekropsie kann der Östruszyklus aller weiblichen Tiere (fakultativ) 
durch Vaginalabstriche bestimmt werden. Diese Beobachtungen geben Auf ­
schluss über die Phase des Östruszyklus zum Zeitpunkt der Tötung und 
erleichtern die histologische Beurteilung östrogenempfindlicher Gewebe [siehe Leitfaden zur Histopathologie (19)].
 
Körpergewicht und Futter-/Trinkwasseraufnahme  
31. Alle Tiere sind mindestens einmal wöchentlich zu wiegen. Die Futterauf ­
nahme wird mindestens wöchentlich gemessen. Wenn die Prüfsubstanz über 
das Trinkwasser verabreicht wird, wird auch die Wasseraufnahme mindes ­
tens einmal wöchentlich gemessen.  
Hämatologische Untersuchung  
32. Die folgenden hämatologischen Parameter sind am Ende der Prüfung zu 
bestimmen: Hämatokrit, Hämoglobinkonzentration, Erythrozytenzahl, Reti ­
kulozyten, Gesamt- und Differential-Leukozytenzahl, Thrombozytenzahl und 
Blutgerinnungszeit/-fähigkeit. Wenn die Prüfsubstanz oder ihre möglichen Metaboliten oxidierende Eigenschaften haben oder diese vermutet werden, sollten zusätzlich die Methämoglobinkonzentration und die Heinz-Körper 
bestimmt werden.
 
33. Die Blutproben müssen an einer benannten Stelle unmittelbar vor oder bei 
der Tötung der Tiere entnommen und fachgerecht gelagert werden. In der Nacht vor der Tötung sollten die Tiere kein Futter erhalten (
 2 ). 
Klinisch-biochemische Untersuchungen  
34. Zur Untersuchung der wesentlichen toxischen Wirkungen in Geweben und 
insbesondere der Wirkungen auf Leber und Nieren sollten 
klinisch-biochemische Parameter in Blutproben aller Tiere bestimmt werden, die unmittelbar vor oder bei der Tötung der Tiere (mit Ausnahme von 
Tieren, die moribund aufgefunden und/oder vor Beendigung der Studie 
getötet werden) entnommen werden. Die Plasma- oder Serumuntersuchun ­
gen umfassen die Parameter Natrium, Kalium, Glucose, Gesamtcholesterin, Harnstoff, Kreatinin, Gesamtprotein und Albumin, mindestens zwei Enzy ­
me, die auf hepatozelluläre Wirkungen schließen lassen (wie 
Alanin-Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase, alkalische Phosphata ­
se, γ-Glutamyltranspeptidase und Glutamatdehydrogenase) sowie Gallensäu ­
ren. Die Bestimmung weiterer Enzyme (aus Leber oder anderen Organen) 
sowie von Bilirubin kann unter bestimmten Umständen ebenfalls wertvolle 
Hinweise liefern.
 
35. Optional können in der letzten Woche der Studie am Urin, der zu fest ­
gelegten Zeiten gesammelt wird, folgende Analysebestimmungen durch ­
geführt werden: Aussehen, Volumen, Osmolalität oder spezifisches Gewicht, 
pH-Wert, Protein, Glucose und Blut/Blutzellen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 280  
( 2 ) Für eine Reihe von Serum- und Plasmabestimmungen, insbesondere der Glucose, ist eine 
Futterkarenz der Tiere über Nacht zu empfehlen. Der Hauptgrund dafür ist, dass die bei 
fehlender Futterkarenz unweigerlich zunehmende Variabilität zu einer Maskierung sub ­
tilerer Wirkungen führen und die Interpretation erschweren könnte. Andererseits jedoch 
kann die nächtliche Futterkarenz den allgemeinen Stoffwechsel der Tiere beeinflussen 
und, insbesondere in Futterstudien, die tägliche Exposition gegen die Prüfsubstanz beein ­
trächtigen. Wenn man sich für die nächtliche Futterkarenz entscheidet, sollten die 
klinisch-biochemischen Parameter nach Durchführung der funktionellen Beobachtungen 
in Woche 4 der Studie bestimmt werden.
 36. Darüber hinaus sollten Untersuchungen zur Bestimmung von Plasma- oder 
Serummarkern für eine allgemeine Gewebsschädigung erwogen werden. Des 
Weiteren sollten, wenn die bekannten Eigenschaften der Prüfsubstanz im Verdacht stehen, die entsprechenden Stoffwechselprofile zu beeinflussen, die Parameter Calcium, Phosphat, Triglyzeride, spezifische Hormone und 
Cholinesterase bestimmt werden. Die jeweiligen Parameter sind je nach 
Prüfsubstanzklasse bzw. von Fall zu Fall zu bestimmen.
 
37. Wenngleich in der internationalen Bewertung der endokrinen Endpunkte 
kein klarer Vorteil der Bestimmung von Schilddrüsenhormonen (T3, T4) 
und TSH nachgewiesen werden konnte, kann es hilfreich sein, Plasma- oder Serumproben zur Messung von T3, T4 und TSH (fakultativ) aufzube ­
wahren, wenn es einen Hinweis auf eine Wirkung auf die 
Hypophysen-Schilddrüsen-Achse gibt. Diese Proben können zur Lagerung 
bei - 20 °C eingefroren werden. Die folgenden Faktoren können die Varia ­
bilität und die absoluten Konzentrationen der Hormonbestimmungen beein ­
flussen:
 
— der Zeitpunkt der Tötung wegen Schwankungen der Hormonkonzentra ­
tionen im Tagesverlauf,  
— Methode der Tötung, die gewählt wird, um übermäßigen Stress für die 
Tiere zu vermeiden, der die Hormonkonzentrationen beeinflussen könn ­
te, 
— Testkits für Hormonbestimmungen mit unterschiedlichen Standardkur ­
ven. 
Schilddrüsenaktive Substanzen können durch histopathologische Unter ­
suchungen zuverlässiger identifiziert werden als über die Hormonspiegel.  
38. Plasmaproben, die speziell zur Hormonbestimmung vorgesehen sind, sollten 
immer zur gleichen Tageszeit gewonnen werden. Es wird empfohlen, die 
durch histopathologische Veränderungen der Schilddrüse verursachten T3-, 
T4- und TSH-Spiegel zu bestimmen. Die verschiedenen im Handel erhält ­
lichen Assay-Kits können bei der Analyse der Hormonkonzentration unter ­
schiedliche numerische Werte ergeben. Aus diesem Grund können mögli ­
cherweise keine Leistungskriterien auf der Grundlage einheitlicher histori ­
scher Daten angegeben werden. Die Labors sollten stattdessen anstreben, die Variationskoeffizienten für T3 und T4 unter 25 und für TSH unter 35 zu halten. Alle Konzentrationen sind in ng/ml zu protokollieren.
 
39. Erweisen sich die Daten aus vorangegangenen Versuchen als ungeeignet, 
sollte eine Bestimmung hämatologischer und klinisch-biochemischer Para ­
meter vor Versuchsbeginn oder vorzugsweise an einer nicht in die Versuchs ­
gruppen einbezogenen Gruppe von Tieren in Betracht gezogen werden.  
PATHOLOGIE  
Makroskopische Untersuchung  
40. Alle an der Studie beteiligten Tiere müssen einer vollständigen, eingehenden 
makroskopischen Untersuchung unterzogen werden, die die sorgfältige Un ­
tersuchung der äußeren Körperoberfläche, aller Körperöffnungen sowie der Schädel-, Brust- und Bauchhöhlen und ihres Inhalts umfasst.
 Leber, Nieren,  
Nebennieren, Hoden, Nebenhoden, Prostata und Samenbläschen mit Koagu ­ 
lationsdrüsen als Ganzes,  Thymus, Milz, Gehirn und Herz aller Tiere (mit 
Ausnahme von Tieren, die moribund aufgefunden und/oder vor Beendigung der Studie getötet werden) sind in angemessener Form von anhaftendem 
Gewebe zu befreien, und ihr Nassgewicht ist so rasch wie möglich nach 
der Sektion festzustellen, um ein Austrocknen zu verhindern. Bei der Ent ­
fernung der anhaftenden Gewebe von der Prostata ist sorgfältig darauf zu achten, die mit Flüssigkeit gefüllten Samenbläschen nicht zu perforieren. 
Alternativ können Samenbläschen und Prostata auch nach der Fixierung 
von anhaftendem Gewebe befreit und gewogen werden.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 281
 
41. Darüber hinaus können fakultativ auch zwei weitere Organe baldmöglichst 
nach der Sektion gewogen werden, um ein Austrocknen zu verhindern: die 
Ovarien (Nassgewicht) und der Uterus mit Zervix (Anleitung zur Entfernung und Aufbereitung des Uterusgewebes für die Gewichtsbestimmung in OECD TG 440 (18)).
 
42. Das Gewicht der Schilddrüse (fakultativ) kann nach der Fixierung bestimmt 
werden. Anhaftendes Gewebe ist sehr vorsichtig und erst nach der Fixierung zu entfernen, um Gewebeschäden zu vermeiden. Eine Gewebeschädigung könnte die histopathologische Analyse beeinträchtigen.
 
43. Die folgenden Gewebe sind in dem für die betreffende Gewebeart und die 
vorgesehene anschließende histopathologische Untersuchung am besten ge ­
eigneten Fixierungsmittel aufzubewahren (siehe Nummer 47): alle Gewebe 
mit makroskopischen Veränderungen, Hirn (typische Regionen einschließ ­
lich Cerebrum, Cerebellum und Pons),  Rückenmark, Auge, Magen, Dünn-  
und Dickdarm (mit Peyer’schen-Platten),  Leber, Nieren, Nebennieren, Milz,  
Herz, Thymus, Schilddrüse, Trachea und Lungen (konserviert durch Infla ­
tion mit Fixierungsmittel und Immersion), Gonaden ( Hoden und Ovarien),  
akzessorische Geschlechtsorgane (Uterus und Zervix, Nebenhoden, Prostata und Samenbläschen mit Koagulationsdrüsen),
 Vagina,Harnblase,Lymphkno ­ 
ten [je nach Erfahrung des Labors sollte neben dem proximalsten drainie ­
renden Lymphknoten ein weiterer Lymphknoten entnommen werden (15)],  
periphere Nerven (N. ischiadicus oder N. tibialis) vorzugsweise in der Nähe des Muskels,
 Skelettmuskel und  Knochen mit  Knochenmark (Schnitt oder 
wahlweise ein frisch fixiertes Knochenmarkaspirat). Es wird empfohlen, die 
Hoden durch Immersion in Bouin’scher Lösung oder modifizierter Davidson-Lösung zu fixieren (16) (17). Damit das Fixierungsmittel rasch eindringen kann, muss die Tunica albuginea an beiden Enden des Organs 
vorsichtig und flach mit einer Nadel punktiert werden. Die klinischen und 
sonstigen Befunde können weitere Gewebeuntersuchungen erforderlich ma ­
chen. Auch Organe, die aufgrund der bekannten Eigenschaften der Prüfsub ­
stanz als mögliche Zielorgane in Frage kommen, sollten aufbewahrt werden.
 
44. Die folgenden Gewebe können wichtige Hinweise auf endokrine Wirkungen 
geben: Gonaden (Ovarien und Hoden), akzessorische Geschlechtsorgane (Uterus mit Zervix, Nebenhoden, Samenbläschen mit Koagulationsdrüsen, 
Prostata dorsolateral und ventral), Vagina, Hypophose, männliche Brustdrü ­
se, Schilddrüse und Nebennieren. Veränderungen der männlichen Brustdrü ­
sen sind nicht ausreichend dokumentiert, aber dieser Parameter kann sehr empfindlich auf Stoffe mit östrogener Wirkung reagieren. Die Beobachtung 
von nicht unter Nummer 43 genannten Organen/Geweben ist fakultativ 
(siehe Anlage 2).
 
45. Der Leitfaden zur Histopathologie (19) enthält zusätzliche Informationen zur 
Sektion, Fixierung, Schnittherstellung und Histopathologie endokriner Ge ­
webe.  
46. Das internationale Prüfprogramm hat Hinweise darauf ergeben, dass subtile 
endokrine Wirkungen chemischer Stoffe, die die Homöostase der Ge ­
schlechtshormone geringfügig beeinträchtigen können, eher durch die Stö ­
rung der Synchronisation des Östruszyklus als durch deutliche histopatho ­
logische Veränderungen in weiblichen Geschlechtsorganen identifiziert wer ­
den können. Wenngleich diese Wirkungen nicht eindeutig nachgewiesen 
werden konnten, wird empfohlen, Hinweise auf eine mögliche Asynchronie 
des Östruszyklus bei der Auswertung der histopathologischen Untersuchung von Ovarien (Follikelzellen, Theca-Zellen und Granulosazellen), Uterus, Zervix und Vagina zu berücksichtigen. Falls die Phase des Östruszyklus 
durch Vaginalabstriche bestimmt wird, kann sie auch in diesen Vergleich 
einbezogen werden.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 282
 
Histopathologie  
47. Bei allen Tieren der Kontrollgruppe und der Hochdosisgruppe sind die kon ­
servierten Organe und Gewebe umfassend histopathologisch zu untersuchen. Diese Untersuchungen sind auch auf die Tiere aller anderen Dosisgruppen 
auszudehnen, wenn behandlungsbedingte Veränderungen in der Hochdosis ­
gruppe festgestellt werden.
 
48. Alle makroskopischen Läsionen sind zu untersuchen.  
49. Umfasst eine Prüfung auch eine Satellitengruppe, sind bei den Tieren dieser 
Gruppe die Gewebe und Organe histopathologisch zu untersuchen, bei de ­
nen in den Behandlungsgruppen Wirkungen aufgetreten sind.  
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Daten  
50. Es sollten Einzeldaten zur Verfügung gestellt werden. Darüber hinaus soll ­
ten alle Daten in Form einer Tabelle zusammengefasst werden, aus der für jede Prüfgruppe folgende Angaben hervorgehen: die Zahl der Tiere bei Beginn der Prüfung und die Zahl der während der Prüfung tot aufgefunde ­
nen oder aus Tierschutzgründen getöteten Tiere, ferner der Zeitpunkt des 
Todes oder der Tötung, die Zahl der Tiere, die Toxizitätszeichen aufweisen, eine Beschreibung der beobachteten Toxizitätszeichen, einschließlich des Zeitpunkts, zu dem die toxischen Wirkungen erstmalig aufgetreten sind, 
ihrer Dauer und ihres Schweregrads, die Zahl der Tiere mit Läsionen, die 
Art der Läsionen und ihr Schweregrad sowie der Prozentsatz der von jeder Läsion betroffenen Tiere.
 
51. Wenn möglich, sollen die numerischen Ergebnisse mittels einer geeigneten 
und allgemein anerkannten statistischen Methode ausgewertet werden. 
Durch Vergleiche der Wirkungen in einem Dosisbereich sollte die Anwen ­
dung multipler t-Tests vermieden werden. Die Statistikmethoden sind bei der Planung der Studie festzulegen.
 
52. Für die Qualitätskontrolle wird vorgeschlagen, historische Kontrolldaten zu 
sammeln und Variationskoeffizienten für numerische Daten zu berechnen, 
insbesondere für die Parameter, die mit dem Nachweis der Störung des endokrinen Systems zusammenhängen. Diese Daten können für Vergleichs ­
zwecke verwendet werden, wenn tatsächliche Studien bewertet werden.
 
Prüfbericht  
53. Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten:  
Prüfsubstanz:  
— physikalische Beschaffenheit, Reinheit und physikalisch-chemische Ei ­
genschaften,  
— Identifizierungsdaten.  
Vehikel (wenn verwendet):  
— Begründung der Wahl des Vehikels, sofern anders als Wasser.  
Versuchstiere:  
— Tierart/Stamm,  
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere,  
— Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.,  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Versuchsbeginn,  
— Begründung für die Wahl einer anderen Art als der Ratte.  
Prüfbedingungen:  
— Begründung der gewählten Dosisstufen,  
— Angaben zur Zubereitungsform der Prüfsubstanz/des Futters, der erreich ­
ten Konzentration, Stabilität und Homogenität der Zubereitung,  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 283
 
— Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz,  
— gegebenenfalls Angaben zur Umrechnung der Konzentration der Prüf ­
substanz im Futter/Wasser (ppm) in die entsprechende Dosis (mg/kg 
Körpergewicht/Tag),  
— Angaben zu Futter- und Wasserqualität.  
Untersuchte fakultative Endpunkte  
— Liste der untersuchten fakultativen Endpunkte.  
Ergebnisse:  
— Körpergewicht/Änderungen des Körpergewichts,  
— gegebenenfalls Angaben zur Futter- und Wasseraufnahme,  
— Daten der toxischen Reaktionen nach Geschlecht und Dosisstufe, ein ­
schließlich Toxizitätszeichen,  
— Art, Schweregrad und Dauer der klinischen Beobachtungen (mit Anga ­
ben zur Reversibilität),  
— Bewertung von sensorischer Aktivität, Greifkraft und motorischer Akti ­
vität,  
— hämatologische Parameter mit entsprechenden Ausgangswerten,  
— klinisch-biochemische Parameter mit entsprechenden Ausgangswerten,  
— Körpergewicht beim Töten der Tiere sowie Organgewichte,  
— Sektionsbefunde,  
— ausführliche Beschreibung aller histopathologischen Befunde,  
— Angaben zur Resorption, falls vorliegend,  
— statistische Auswertung der Ergebnisse, wenn möglich.  
Erörterung der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 284
 
Anlage 1  
DEFINITIONEN  
Androgene Wirkung:  die Fähigkeit einer Chemikalie, in einem Säugetierorga ­
nismus wie ein natürliches androgenes Hormon zu wirken (z. B. Testosteron).  
Antiandrogene Wirkung:  die Fähigkeit einer Chemikalie, die Wirkung eines 
natürlichen androgenen Hormons (z. B. Testosteron) in einem Säugetierorganis ­
mus zu unterdrücken.  
Antiöstrogene Wirkung:  die Fähigkeit einer Chemikalie, die Wirkung eines 
natürlichen östrogenen Hormons (z. B. Östradiol 17ß) in einem Säugetierorga ­
nismus zu unterdrücken.  
Antithyroide Wirkung:  die Fähigkeit einer Chemikalie, die Wirkung eines na ­
türlichen Schilddrüsenhormons (z. B. T  3 ) in einem Säugetierorganismus zu unter ­
drücken.  
Dosierung:  ein allgemeiner Begriff, der die Dosis, ihre Häufigkeit und die Dauer 
der Verabreichung umfasst.  
Dosis:  die Menge der verabreichten Prüfsubstanz. Die Dosis wird ausgedrückt als 
Masse der Prüfsubstanz je Einheit Körpergewicht des Versuchstiers pro Tag (z. 
B. mg/kg Körpergewicht/Tag) oder als konstante Konzentration im Futter.  
Offensichtliche Toxizität:  ein allgemeiner Begriff zur Beschreibung deutlicher 
Toxizitätszeichen nach Verabreichung einer Prüfsubstanz. Diese Zeichen sollten für eine Bewertung der Gefährdung ausreichen und so schwerwiegend sein, dass 
bei einer Steigerung der verabreichten Dosis die Entwicklung schwerer Toxizi ­
tätszeichen und der wahrscheinliche Tod zu erwarten wären.
 
NOAEL:  die Abkürzung für no observed adverse effect level. Dies ist die 
höchste Dosis, bei der keine schädigenden behandlungsbedingten Wirkungen festgestellt werden.
 
Östrogene Wirkung:  die Fähigkeit einer Chemikalie, in einem Säugetierorga ­
nismus wie ein natürliches östrogenes Hormon zu wirken (z. B. Östradiol 17ß).  
Prüfsubstanz:  jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode 
getestet wird.  
Thyroide Wirkung:  die Fähigkeit einer Chemikalie, in einem Säugetierorganis ­
mus wie ein natürliches Schilddrüsenhormon (z. B. T  3 ) zu wirken.  
Validierung:  ein wissenschaftlicher Prozess zur Beschreibung der operationellen 
Anforderungen und Grenzen einer Prüfmethode und zum Nachweis ihrer Zuver ­
lässigkeit und Eignung für einen bestimmten Zweck.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 285
 
Anlage 2  
Empfohlene Endpunkte für den Nachweis endokriner Disruptoren in dieser 
Prüfmethode b.7  
Obligatorische Endpunkte Fakultative Endpunkte 
Gewicht  
— Hoden 
— Nebenhoden 
— Nebennieren 
— Prostata und Samenbläschen mit 
Koagulationsdrüsen — Ovarien 
— Uterus mit Zervix 
— Schilddrüse  
Histopathologie  
— Gonaden: 
— Hoden und — Ovarien 
— akzessorische Geschlechtsorgane: 
— Nebenhoden — Prostata und Samenbläschen mit 
Koagulationsdrüsen 
— Uterus mit Zervix 
— Nebenniere — Schilddrüse 
— Vagina — Vaginalabstriche 
— männliche Brustdrüsen — Hypophyse
 
Hormonbestimmung  
— T  3 -, T  4 -Spiegel im Blut 
— TSH-Spiegel im Blut  
LITERATUR:  
1. OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc 
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuroto ­
xicity.  
2. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Do ­
cument No. 60  
3. Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rates. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
4. Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.  
5. Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Com ­
parisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
 
6. Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rates and Mice. 
Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 286
 
7. Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Tera ­
tol. 13: 599-609.  
8. OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Dis ­
rupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11 March 1998, 
ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
9. OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: 
Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rates. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
 
10. OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for 
Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.  
11. OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endo ­
crine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/ 0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.ht ml
 
12. OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Ma ­
nagement Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.  
13. OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endo ­
crine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.  
14. OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MO ­
NO(2000)7.  
15. Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, 
Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice 
Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. 
Toxicol Pathol 33: 404-407.  
16. Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the 
Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.
 
17. Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM (2002). Fixation of 
testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.
 
18. OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No 440: Utero ­
trophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic 
properties.  
19. OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endo ­
crine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 287
 
B.8 PRÜFUNG AUF SUBAKUTE TOXIZITÄT NACH INHALATION — 
28-TAGE-TEST  
ZUSAMMENFASSUNG  
Diese überarbeitete Prüfmethode B.8 wurde entwickelt, um die Toxizität der 
Prüfsubstanz nach wiederholter Exposition durch Inhalation über einen begrenz ­
ten Zeitraum (28 Tage) umfassend zu beschreiben und um Daten für die Be ­
wertung des quantitativen Inhalationsrisikos zu gewinnen. Gruppen von mindes ­
tens fünf männlichen und fünf weiblichen Nagern werden über einen Zeitraum 
von 28 Tagen 6 Stunden am Tag a) der Prüfsubstanz in drei oder mehr Kon ­
zentrationsstufen, b) gefilterter Luft (negative Kontrolle) und/oder c) dem Vehikel (Vehikelkontrolle) ausgesetzt. Im Allgemeinen werden die Tiere der Prüfsubstanz an fünf Tagen pro Woche ausgesetzt, aber auch sieben Tage pro Woche sind 
zulässig. Es werden immer männliche und weibliche Tiere geprüft, aber sie 
können unterschiedlichen Konzentrationsstufen ausgesetzt werden, wenn bekannt ist, dass ein Geschlecht empfindlicher auf eine bestimmte Prüfsubstanz reagiert als das andere. Bei dieser Methode hat der Studienleiter die Möglichkeit, Satel ­
litengruppen (Reversibilitätsprüfung) aufzunehmen sowie eine bronchoalveoläre 
Lavage (BAL), neurologische Tests, zusätzliche klinische Pathologieuntersuchun ­
gen und histopathologische Untersuchungen durchzuführen, um die Toxizität einer Prüfsubstanz besser beschreiben zu können.
 
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie 412 (2009). Die ur ­
sprüngliche Prüfrichtlinie 412 (TG 412) zur subakuten Inhalation wurde 1981 angenommen (1). Diese Prüfmethode B.8 (die der überarbeiteten TG 412 entspricht) wurde aktualisiert, um dem neuesten Stand der Wissenschaft 
Rechnung zu tragen und derzeitige und künftige Regulierungsanforderungen 
zu erfüllen.
 
2. Die Methode ermöglicht die Beschreibung der schädlichen Wirkungen nach 
wiederholter täglicher inhalativer Exposition gegen eine Prüfsubstanz für 
einen Zeitraum von 28 Tagen. Die in Prüfungen auf subakute Toxizität 
nach Inhalation über 28 Tage gewonnenen Daten können für quantitative Risikobewertungen verwendet werden [wenn im Anschluss keine Prüfung 
auf subchronische Toxizität nach Inhalation über 90 Tage erfolgt (Kapitel 
B.29 dieses Anhangs)]. Die Daten können auch Informationen für die Wahl der Konzentrationen für längerfristige Studien wie die Prüfung auf subchro ­
nische Toxizität nach Inhalation über 90 Tage liefern. Diese Prüfmethode ist 
nicht speziell für die Prüfung von Nanomaterialien bestimmt. Die im Zu ­
sammenhang mit dieser Prüfmethode verwendeten Begriffe werden am Ende dieses Kapitels und im Guidance Document 39 (2) definiert.
 
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN  
3. Um die Qualität der Studie zu verbessern und möglichst wenig Versuchs ­
tiere zu verwenden, sollte das Prüflabor vor Durchführung der Studie alle 
verfügbaren Informationen über die Prüfsubstanz berücksichtigen. Für die 
Auswahl der am besten geeigneten Prüfkonzentrationen könnten u. a. Infor ­
mationen wie die Identität, die chemische Struktur und die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, Ergebnisse jegli ­
cher In-vitro- oder In-vivo-Toxizitätsprüfungen, vorgesehene Verwendungen 
und die Möglichkeit der Exposition des Menschen, (Q)SAR-Daten und toxikologische Daten über strukturverwandte Substanzen sowie Daten aus Versuchen zur Prüfung der akuten Toxizität nach Inhalation herangezogen 
werden. Falls Neurotoxizität erwartet oder im Verlauf der Studie beobachtet 
wird, kann der Studienleiter beschließen, geeignete Untersuchungen wie eine FOB (functional observational battery) und die Messung der motorischen Aktivität aufzunehmen. Obwohl die Expositionszeit bei bestimmten Unter ­
suchungen ein kritischer Aspekt sein kann, darf die Durchführung dieser 
zusätzlichen Versuche die Auslegung der Hauptstudie nicht beeinträchtigen.
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4. Verdünnungen ätzender oder reizender Prüfsubstanzen können in Konzen ­
trationen geprüft werden, die den gewünschten Toxizitätsgrad erzielen [siehe 
GD 39 (2)]. Wenn Versuchstiere diesen Stoffen ausgesetzt werden, sollten die Zielkonzentrationen so niedrig sein, dass sie keine starken Schmerzen oder Leiden verursachen; sie sollten aber ausreichen, um die Konzentrati ­
ons-Wirkungs-Kurve so zu erweitern, dass das regulatorische und wissen ­
schaftliche Ziel der Prüfung erreicht wird. Diese Konzentrationen sollten von Fall zu Fall festgelegt werden, möglichst auf Basis einer entsprechend ausgelegten Dosisfindungsstudie, die Informationen über den kritischen End ­
punkt, eine etwaige Reizschwelle und den Zeitpunkt des Einsetzens der 
Wirkung liefert (siehe Nummern 11, 12 und 13). Die Wahl der Konzen ­
tration ist zu begründen.
 
5. Moribunde Tiere oder Tiere, die Anzeichen starker und andauernder Qualen 
zeigen, sollten tierschutzgerecht getötet werden. Moribunde Tiere werden auf die gleiche Weise gewertet wie während des Tests gestorbene Tiere. Kriterien für die Entscheidung, moribunde oder schwer leidende Tiere zu 
töten, sowie Hinweise zur Erkennung des absehbaren oder bevorstehenden 
Todes sind Gegenstand des OECD Guidance Document on Humane End ­
points (3).
 
BESCHREIBUNG DER METHODE  
Auswahl von Versuchstierarten  
6. Es sind junge, gesunde, adulte Nagetiere aus üblicherweise eingesetzten 
Laborstämmen zu verwenden. Bevorzugtes Versuchstier ist die Ratte. 
Wird eine andere Tierart eingesetzt, ist dies zu begründen.  
Vorbereitung der Tiere  
7. Die weiblichen Tiere dürfen weder bereits geworfen haben noch momentan 
trächtig sein. Am Tag der Randomisierung sollten die jungen, adulten Tiere 
7 bis 9 Wochen alt sein; ihr Körpergewicht sollte innerhalb von ± 20 % des 
mittleren Gewichts für jedes Geschlecht liegen. Die Tiere werden nach Zufallskriterien ausgewählt, zur individuellen Identifizierung markiert und vor Beginn der Prüfung für einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen in 
ihren Käfigen an die Laborbedingungen gewöhnt.
 
Tierhaltung  
8. Um die Beobachtungen zu erleichtern und Verwechslungen auszuschließen, 
sollten die Tiere möglichst mit einem subkutanen Transponder einzeln ge ­
kennzeichnet werden. Die Temperatur in dem Raum, in dem die Versuchs ­
tiere gehalten werden, sollte 22 ± 3 °C betragen. Die relative Luftfeuchtig ­
keit sollte im Idealfall im Bereich zwischen 30 und 70 % liegen; bei Ver ­
wendung von Wasser als Vehikel könnte dies jedoch unmöglich sein. Die Tiere sollten vor und nach den Expositionen im Allgemeinen nach Ge ­
schlecht und Konzentration in Käfigen gruppiert werden, wobei aber die 
Anzahl der Tiere pro Käfig noch eine genaue Beobachtung der einzelnen Tiere ermöglichen muss und Verluste aufgrund von Kannibalismus oder Kämpfen minimiert werden sollten. Wenn die Tiere der Prüfsubstanz nur 
mit der Nase ausgesetzt werden sollen, müssen sie möglicherweise an die 
Restrainer gewöhnt werden. Die Restrainer sollten die Tiere weder körper ­
lich noch in Bezug auf Wärme oder Fixierung übermäßig beeinträchtigen. Die Fixierung kann physiologische Endpunkte wie Körpertemperatur (Hy ­
perthermie) und/oder das Atemminutenvolumen beeinflussen. Wenn generi ­
sche Daten zeigen, dass keine derartigen Veränderungen in nennenswertem Ausmaß vorkommen, ist eine Eingewöhnung an die Restrainer nicht erfor ­
derlich. Bei der Ganzkörperexposition gegen ein Aerosol sollten die Tiere 
während der Exposition einzeln untergebracht sein, damit sie die Prüfsub ­
stanz nicht durch das Fell ihrer Käfiggenossen filtriert einatmen. Außer während der Exposition kann herkömmliches und zertifiziertes Labortierfut ­
ter bei uneingeschränkter Versorgung mit Trinkwasser verwendet werden. 
Die Beleuchtung sollte künstlich sein und die Hell- und Dunkelphasen 
sollten sich im Abstand von 12 Stunden abwechseln.
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Inhalationskammern  
9. Bei der Auswahl einer Inhalationskammer sind die Art der Prüfsubstanz und 
der Gegenstand der Prüfung zu berücksichtigen. Das bevorzugte Verfahren ist die „Nose-only“-Exposition (dieser Begriff umfasst „nur Kopf“, „nur 
Nase“ oder „nur Schnauze“). Für die Untersuchung von Flüssigkeits- oder 
Feststoffaerosolen und für Dämpfe, die zu Aerosolen kondensieren können, wird im Allgemeinen die „Nose-only“-Exposition bevorzugt. Besondere Ziele der Untersuchung können möglicherweise mit einer Ganzkörperexpo ­
sition besser erreicht werden, doch dies sollte im Prüfbericht begründet 
werden. Um bei Verwendung einer Ganzkörperkammer die Stabilität der Atmosphäre sicherzustellen, sollte das „Gesamtvolumen“ der Versuchstiere 
5 % des Volumens der Kammer nicht übersteigen. Die Grundzüge der 
„Nose-only“- und der Ganzkörperexposition sowie ihre jeweiligen Vor- und Nachteile sind in GD 39 (2) beschrieben.
 
TOXIZITÄTSSTUDIEN  
Grenzkonzentrationen  
10. Anders als bei Studien zur akuten Toxizität gibt es bei Prüfungen auf sub ­
akute Toxizität nach Inhalation über 28 Tage keine festgelegten Grenzkon ­
zentrationen. Bei der Festlegung der maximalen Prüfkonzentration ist Fol ­
gendes zu beachten: 1) die höchste erreichbare Konzentration, 2) das maxi ­
male Expositionsniveau von Menschen (‚worst case), 3) die Notwendigkeit, 
eine ausreichende Sauerstoffversorgung aufrechtzuerhalten, und/oder 4) Tierschutzerwägungen. Gibt es keine auf Daten basierenden Grenzwerte, können die akuten Grenzwerte der Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 (13) 
zugrunde gelegt werden (d. h. bis zu einer Höchstkonzentration von 5 mg/l 
bei Aerosolen, 20 mg/l bei Dämpfen und 20 000 ppm bei Gasen); siehe GD 39 (2). Wenn diese Grenzen bei der Prüfung von Gasen oder hochflüchtigen Prüfsubstanzen (z. B. Kältemitteln) überschritten werden müssen, ist dies zu 
begründen. Die Grenzkonzentration muss eine eindeutige Toxizität hervor ­
rufen, ohne den Tieren übermäßigen Stress zu bereiten oder ihre Lebens ­
dauer zu beeinträchtigen (3).
 
Dosisfindungsstudie  
11. Vor Beginn der Hauptstudie muss möglicherweise eine Dosisfindungsstudie 
durchgeführt werden. Diese ist umfassender als eine Vorstudie, weil sie nicht auf die Wahl der Konzentration begrenzt ist. Die in einer Dosisfin ­
dungsstudie gewonnenen Erkenntnisse können zu einer erfolgreichen Haupt ­
studie führen. Sie kann z. B. technische Informationen zu den Analyse ­
methoden, zur Partikelgröße, zur Erkennung toxischer Mechanismen, kli ­
nische Pathologiedaten und histopathologische Daten sowie Schätzungen 
möglicher NOAEL- und MTC-Konzentrationen in einer Hauptstudie liefern. 
Der Studienleiter kann entscheiden, mithilfe der Dosisfindungsstudie die Schwelle für die Reizung der Atemwege (z. B. durch histopathologische Untersuchung der Atemwege, Lungenfunktionsprüfung oder bronchoalveo ­
läre Lavage), die höchste Konzentration, die von den Tieren ohne über ­
mäßigen Stress toleriert wird, und die Parameter, die die Toxizität der Prüf ­
substanz am besten beschreiben, zu identifizieren.
 
12. Eine Dosisfindungsstudie kann eine oder mehrere Konzentrationsstufen um ­
fassen. Auf jeder Konzentrationsstufe sollten höchstens drei männliche und 
drei weibliche Tiere der Prüfsubstanz ausgesetzt werden. Eine Dosisfin ­
dungsstudie sollte mindestens fünf Tage und im Allgemeinen nicht mehr als 14 Tage dauern. Die Wahl der Konzentrationen für die Hauptstudie ist im Prüfbericht zu begründen. Ziel der Hauptstudie ist es, nachzuweisen, dass 
eine Beziehung zwischen der Konzentration und der Wirkung besteht, die 
am voraussichtlich empfindlichsten Endpunkt auftritt. Die niedrigste Kon ­
zentration sollte im Idealfall eine Konzentration sein, bei der keine zu be ­
obachtenden schädlichen Wirkungen auftreten, und die höchste Konzentra ­
tion sollte eine eindeutige Toxizität hervorrufen, ohne den Tieren übermäßi ­
gen Stress zu bereiten oder ihre Lebensdauer zu beeinträchtigen (3).
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13. Bei der Auswahl der Konzentrationsstufen für die Dosisfindungsstudie soll ­
ten alle verfügbaren Informationen berücksichtigt werden, einschließlich der 
Struktur-Wirkungs-Beziehungen und der Daten über ähnliche Stoffe (siehe Nummer 3). Eine Dosisfindungsstudie kann bestätigen/widerlegen, welche Endpunkte nach mechanistischen Kriterien als die empfindlichsten End ­
punkte angesehen werden, z. B. die Cholinesterasehemmung durch Organo ­
phosphate, die Methämoglobinbildung durch für Erythrozyten toxische Stof ­
fe, Schilddrüsenhormone (T
 3 , T 4 ) im Fall von thyrotoxischen Stoffen, Pro ­
teine, LDH oder Neutrophile in bronchoalveolärer Lavage im Fall schwach 
löslicher unschädlicher Partikel oder lungenreizender Aerosole.  
Hauptstudie  
14. Die Hauptstudie zur Prüfung auf subakute Toxizität umfasst im Allgemeinen 
drei Konzentrationsstufen sowie, falls erforderlich, eine gleichzeitige nega ­
tive (Luft-)Kontrolle und/oder eine Vehikelkontrolle (siehe Nummer 17). 
Die Festlegung der geeigneten Expositionsstufen sollte sich auf alle verfüg ­
baren Daten stützen, einschließlich der Ergebnisse systemischer Toxizitäts ­
prüfungen, des Metabolismus und der Kinetik (hohe Konzentrationsstufen, 
die kinetische Prozesse sättigen, sind zu vermeiden). Jede Prüfgruppe um ­
fasst mindestens zehn Nagetiere (fünf Männchen und fünf Weibchen), die der Prüfsubstanz für einen Zeitraum von 4 Wochen an fünf Tagen in der Woche jeweils 6 Stunden pro Tag ausgesetzt werden (Gesamtdauer der 
Prüfung 28 Tage). Die Tiere können auch an sieben Tagen in der Woche 
exponiert werden (z. B. wenn inhalierte Arzneimittel geprüft werden). Ist bekannt, dass ein Geschlecht empfindlicher auf eine bestimmte Prüfsubstanz reagiert, können die Geschlechter unterschiedlichen Konzentrationsstufen 
ausgesetzt werden, um die Konzentrations-Wirkungs-Beziehung genauer 
zu bestimmen (siehe Nummer 15). Wenn für eine „Nose-only“-Exposition andere Nagetierarten als Ratten verwendet werden, kann die maximale Ex ­
positionsdauer angepasst werden, um artenspezifisches Leiden zu minimie ­
ren. Eine Expositionsdauer von weniger als 6 Stunden/Tag oder die Not ­
wendigkeit einer Ganzkörperexpositionsstudie mit Langzeitexposition (z. B. 22 Stunden/Tag) ist zu begründen [siehe GD 39 (2)]. Während der Exposi ­
tion sollte kein Futter verabreicht werden, es sei denn die Exposition dauert 
länger als 6 Stunden. Wasser kann während einer Ganzkörperexposition 
jederzeit angeboten werden.
 
15. Die gewählten Zielkonzentrationen sollen es ermöglichen, die Zielorgane zu 
identifizieren und eine deutliche Konzentrations-Wirkungs-Beziehung zu be ­
legen:  
— Die hohe Konzentrationsstufe sollte toxische Wirkungen hervorrufen, 
aber keine anhaltenden Symptome oder Todesfälle verursachen, die eine Auswertung der Ergebnisse beeinträchtigen würden.
 
— Der Abstand zwischen den mittleren Konzentrationsstufen muss eine 
Abstufung der toxischen Wirkungen zwischen der niedrigen und der 
hohen Konzentration ermöglichen.  
— Die untere Konzentrationsstufe sollte praktisch keine Toxizitätszeichen 
hervorrufen.  
Satellitenstudie (Reversibilität)  
16. Es kann eine Satellitenstudie durchgeführt werden, um die Tiere für einen 
angemessenen Zeitraum nach der Behandlung (mindestens 14 Tage) auf Reversibilität, Persistenz oder ein verzögertes Auftreten von Toxizität zu 
beobachten. Satellitengruppen bestehen aus fünf männlichen und fünf weib ­
lichen Tieren, die der Prüfsubstanz gleichzeitig mit den Versuchstieren der Hauptstudie ausgesetzt werden. Dabei sollten sie der Prüfsubstanz auf der höchsten Konzentrationsstufe ausgesetzt werden; erforderlichenfalls sollte es 
auch gleichzeitige Luft- und/oder Vehikelkontrollen geben (siehe Nummer 
17).
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Kontrolltiere  
17. Eine gleichzeitige negative (Luft-)Kontrollgruppe ist genauso zu behandeln 
wie die Prüfgruppe, außer dass die Tiere nicht der Prüfsubstanz, sondern gefilterter Luft ausgesetzt werden. Wenn die Prüfatmosphäre mithilfe von 
Wasser oder einem anderen Stoff erzeugt wird, ist statt der negativen (Luft- 
)Kontrollgruppe eine Vehikelkontrollgruppe zu verwenden. Wenn möglich sollte Wasser als Vehikel benutzt werden. In diesem Fall sind die Tiere Luft mit derselben relativen Luftfeuchtigkeit auszusetzen wie die exponierten 
Gruppen. Das geeignete Vehikel ist auf der Grundlage einer geeigneten 
Vorstudie oder von historischen Daten auszuwählen. Ist die Toxizität eines Vehikels unklar, kann der Studienleiter beschließen, sowohl eine negative 
(Luft-)Kontrolle als auch eine Vehikelkontrolle zu verwenden; hiervon wird 
jedoch dringend abgeraten. Wenn historische Daten belegen, dass ein Ve ­
hikel nicht toxisch ist, besteht keine Notwendigkeit für eine negative (Luft- )Kontrollgruppe und es sollte nur eine Vehikelgruppe verwendet werden. 
Ergibt eine Vorstudie einer in einem Vehikel formulierten Prüfsubstanz, dass 
keine Toxizität vorliegt, ist das Vehikel folglich in der geprüften Konzen ­
tration nicht toxisch, und diese Vehikelkontrolle sollte verwendet werden.
 
EXPOSITIONSBEDINGUNGEN  
Verabreichung der Konzentrationen  
18. Die Tiere werden der Prüfsubstanz in Form von Gas, Dampf, Aerosol oder 
einer Kombination dieser Formen ausgesetzt. Der zu prüfende Aggregat ­
zustand hängt von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsub ­
stanz, der gewählten Konzentration und/oder der physikalischen Form ab, in der die Prüfsubstanz bei der Handhabung und Verwendung am wahrschein ­
lichsten vorliegt. Hygroskopische und chemisch reaktive Prüfsubstanzen 
sollten bei geringer Luftfeuchtigkeit geprüft werden. Dabei ist darauf zu 
achten, dass keine explosionsfähigen Konzentrationen erzeugt werden. Bei Partikeln kann die Partikelgröße durch mechanische Prozesse verringert werden. GD 39 (2) enthält nähere Hinweise.
 
Partikelgrößenverteilung  
19. Bei allen Aerosolen und bei Dämpfen, die zu Aerosolen kondensieren kön ­
nen, sollte die Partikelgröße bestimmt werden. Damit alle relevanten Regio ­
nen der Atemwege der Prüfsubstanz ausgesetzt werden, werden mittlere 
aerodynamische Massendurchmesser (Mass Median Aerodynamic Diameter 
— MMAD) von 1 bis 3 μm mit einer geometrischen Standardabweichung 
(σ g ) von 1,5 bis 3,0 empfohlen (4). Wenngleich nach Möglichkeit versucht 
werden sollte, diese Werte zu erreichen, ist Fachwissen erforderlich, falls sie 
nicht erzielt werden können. Metalldampfpartikel können z. B. unter diesen 
Werten liegen, geladene Partikel und Fasern dagegen können diese Werte überschreiten.
 
Vorbereitung der Prüfsubstanz in einem Vehikel  
20. Im Idealfall sollte die Prüfsubstanz ohne ein Vehikel geprüft werden. Wenn 
für die Erzeugung einer geeigneten Prüfsubstanzkonzentration oder Partikel ­
größe ein Vehikel verwendet werden muss, ist Wasser zu bevorzugen. Wird eine Prüfsubstanz in einem Vehikel gelöst, so ist seine Stabilität nachzuwei ­
sen.
 
ÜBERWACHUNG DER EXPOSITIONSBEDINGUNGEN  
Luftstrom in der Inhalationskammer  
21. Der Luftstrom durch die Kammer sollte während jeder Exposition sorgfältig 
geregelt, kontinuierlich überwacht und mindestens stündlich protokolliert werden. Die Echtzeit-Überwachung der Konzentration (oder zeitliche Stabi ­
lität) der Prüfatmosphäre ist eine integrale Messung aller dynamischen Pa ­
rameter und gibt indirekt die Möglichkeit, alle relevanten dynamischen 
Inhalationsparameter zu messen. Wenn die Konzentration in Echtzeit
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überwacht wird, kann die Frequenz der Messung der Luftströme auf eine 
einzige Messung je Exposition und Tag reduziert werden. Es sollte beson ­
ders darauf geachtet werden, das erneute Einatmen in „Nose-only“-Exposi ­
tionskammern zu vermeiden. Die Sauerstoffkonzentration sollte mindestens 19 % betragen, und die Kohlendioxidkonzentration sollte 1 % nicht über ­
schreiten. Gibt es Grund zu der Annahme, dass diese Werte nicht einge ­
halten werden können, sind die Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentratio ­
nen zu messen. Wenn die Messungen am ersten Expositionstag die richtigen Werte dieser Gase bestätigen, sollten keine weiteren Messungen erforderlich 
sein.
 
Temperatur und relative Luftfeuchtigkeit in der Inhalationskammer  
22. Die Temperatur in der Inhalationskammer sollte 22 ± 3 °C betragen. Sowohl 
bei der „Nose-only“- als auch bei der Ganzkörperexposition sollte die rela ­
tive Luftfeuchtigkeit im Atembereich der Tiere kontinuierlich überwacht und 
während jeder Exposition möglichst stündlich dokumentiert werden. Die 
relative Luftfeuchtigkeit sollte möglichst zwischen 30 und 70 % liegen, was jedoch möglicherweise nicht erreichbar ist (z. B. bei der Prüfung von wasserbasierten Mischungen) oder wegen chemischer Interferenz mit der 
Prüfmethode nicht gemessen werden kann.
 
Prüfsubstanz: nominale Konzentration  
23. Die nominale Konzentration in der Expositionskammer sollte möglichst be ­
rechnet und protokolliert werden. Die nominale Konzentration ist die Masse der erzeugten Prüfsubstanz dividiert durch das Gesamtvolumen der durch 
die Inhalationskammer geleiteten Luft. Sie wird nicht zur Beschreibung der 
Exposition der Tiere verwendet; vielmehr gibt ein Vergleich der nominalen Konzentration und der tatsächlichen Konzentration Aufschluss über die Ef ­
fizienz des Prüfsystems bei der Erzeugung der Prüfkonzentration und kann 
daher für die Aufdeckung von Problemen bei dieser Erzeugung verwendet 
werden.
 
Prüfsubstanz: tatsächliche Konzentration  
24. Die tatsächliche Konzentration ist die Konzentration der Prüfsubstanz im 
Atembereich der Tiere in einer Inhalationskammer. Die tatsächlichen Kon ­
zentrationen können entweder durch spezifische Methoden (z. B. direkte Probenahme, adsorptive Methoden oder chemische Reaktionsverfahren mit anschließender analytischer Charakterisierung) oder durch unspezifische Me ­
thoden wie Gravimetrie bestimmt werden. Die gravimetrische Methode ist 
lediglich für Aerosole mit nur einem Bestandteil in Pulverform oder Aero ­
sole von Flüssigkeiten mit geringer Flüchtigkeit akzeptabel und sollte sich auf geeignete, vor der Studie zu erstellende und für die Prüfsubstanz spezi ­
fische Beschreibungen stützen. Die Konzentration von Aerosolen mit meh ­
reren Bestandteilen in Pulverform kann ebenfalls gravimetrisch bestimmt werden. Hierzu muss jedoch mit Analysedaten belegt werden, dass die Schwebstoffe eine ähnliche Zusammensetzung haben wie das Ausgangs ­
material. Liegen diese Angaben nicht vor, muss die Prüfsubstanz (im Ideal ­
fall im Schwebezustand) möglicherweise im Verlauf der Studie in regel ­
mäßigen Abständen neu analysiert werden. Bei aerosolisierten Agenzien, die verdunsten oder sublimieren können, sollte gezeigt werden, dass alle 
Phasen von der gewählten Methode erfasst wurden.
 
25. Für die gesamte Dauer der Studie sollte möglichst eine Partie der Prüfsub ­
stanz verwendet werden; die Probe sollte unter Bedingungen aufbewahrt 
werden, die ihre Reinheit, Homogenität und Stabilität gewährleisten. Die 
Prüfsubstanz sollte vor Beginn der Studie mit Angaben zur Reinheit und, falls technisch machbar, zur Identität sowie zu den Mengen identifizierter Schadstoffe und Verunreinigungen beschrieben werden. Hierzu können un ­
ter anderem die folgenden Daten verwendet werden: Retentionszeit und 
relative Peakfläche, durch Massenspektrometrie oder Gaschromatographie bestimmtes Molekulargewicht oder andere Werte. Das Prüflabor ist zwar nicht für die Identität der Probe verantwortlich, doch es kann ratsam sein, 
dass es die Beschreibung des Auftraggebers zumindest in gewissen Grenzen 
(z. B. Farbe, physikalische Beschaffenheit usw.) überprüft.
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26. Die Expositionsatmosphäre ist so konstant wie möglich zu halten. Um die 
Stabilität der Expositionsbedingungen nachzuweisen, kann ein Echtzeitüber ­
wachungsgerät verwendet werden, z. B. ein Aerosol-Photometer für Aero ­
sole oder ein Gesamtkohlenwasserstoff-Analysator (THC) für Dämpfe. Die tatsächliche Konzentration in der Kammer sollte an jedem Expositionstag 
für jede Expositionsstufe mindestens dreimal gemessen werden. Falls dies 
wegen geringer Luftdurchflussraten oder niedriger Konzentrationen nicht möglich ist, reicht eine Probe je Expositionsperiode. Im Idealfall sollte diese Probe dann über die gesamte Expositionszeit gewonnen werden. Die einzel ­
nen Proben der Konzentration in der Kammer sollten bei Gasen und Dämp ­
fen nicht mehr als ± 10 % und bei Flüssig- oder Feststoffaerosolen nicht mehr als ± 20 % von der mittleren Kammerkonzentration abweichen. Die Zeit bis zum Erreichen eines Gleichgewichts in der Kammer (t
 95 ) ist zu 
berechnen und zu dokumentieren. Die Expositionsdauer erstreckt sich über 
den Zeitraum, in dem die Prüfsubstanz erzeugt wird. Dies schließt die Zeiten zur Erreichung des Gleichgewichts in der Kammer (t
 95 ) und zum Abbau der 
Konzentrationen ein. GD 39 (2) enthält Hinweise zur Einschätzung von t  95 . 
27. Bei sehr komplexen Mischungen aus Gasen/Dämpfen und Aerosolen (z. B. 
Verbrennungsatmosphären und Prüfsubstanzen, die aus hierzu bestimmten Endverbraucherprodukten/-geräten gesprüht werden) kann sich jede Phase in 
einer Inhalationskammer anders verhalten. Daher sollte mindestens eine In ­
dikatorsubstanz (Analyt), normalerweise der wichtigste Wirkstoff in der Mischung, von jeder Phase (Gas/Dampf und Aerosol) ausgewählt werden. Wenn die Prüfsubstanz eine Mischung ist, sollte die Analysekonzentration 
für die gesamte Mischung und nicht nur für den Wirkstoff oder die Indika ­
torsubstanz (Analyt) dokumentiert werden. Weitere Informationen zu tat ­
sächlichen Konzentrationen sind in GD 39 (2) zu finden.
 
Prüfsubstanz: Partikelgrößenverteilung  
28. Die Partikelgrößenverteilung von Aerosolen sollte auf jeder Konzentrations ­
stufe mindestens wöchentlich mit einem Kaskaden-Impaktor oder einem 
anderen Messgerät wie einem APS bestimmt werden. Kann nachgewiesen werden, dass die mit einem Kaskaden-Impaktor und dem alternativen Mess ­
gerät erzielten Ergebnisse gleichwertig sind, so kann das alternative Instru ­
ment während der gesamten Studie verwendet werden.
 
29. Parallel zum Hauptinstrument ist ein zweites Gerät wie ein Gravimetriefilter 
oder eine Gaswaschflasche zu verwenden, um den Abscheidegrad des 
Hauptinstruments zu bestätigen. Die durch die Partikelgrößenanalyse be ­
stimmte Massenkonzentration sollte innerhalb vertretbarer Grenzen um die durch die Filteranalyse bestimmte Massenkonzentration liegen [siehe GD 39 
(2)]. Wenn die Gleichwertigkeit bei allen geprüften Konzentrationen zu 
Beginn der Studie nachgewiesen werden kann, kann auf weitere bestäti ­
gende Messungen verzichtet werden. Aus Tierschutzgründen sollten Vor ­
kehrungen getroffen werden, um unklare Daten zu minimieren, die dazu 
führen könnten, dass eine Studie wiederholt werden muss.
 
30. Wenn die Möglichkeit besteht, dass Dampfkondensation zur Bildung eines 
Aerosols führen kann, oder wenn in einer Dampfatmosphäre mit dem Po ­
tenzial für gemischte Phasen Partikel nachgewiesen werden, sollte eine Par ­
tikelgrößenbestimmung für Dämpfe vorgenommen werden.  
BEOBACHTUNGEN  
31. Die Tiere sollten vor, während und nach der Exposition auf klinische Zei ­
chen beobachtet werden. Je nach Reaktion der Tiere während der Exposition 
können häufigere Beobachtungen angezeigt sein. Wenn die Beobachtung der 
Tiere durch die Verwendung von Restrainern, wegen schlecht beleuchteter Ganzkörperkammern oder getrübter Atmosphäre erschwert ist, sind die Tiere nach der Exposition sorgfältig zu beobachten. Durch Beobachtungen vor der 
Exposition am folgenden Tag kann beurteilt werden, ob toxische Wirkungen 
sich zurückgebildet oder verschlimmert haben.
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32. Sämtliche Beobachtungen werden in Einzelprotokollen dokumentiert, die für 
jedes Tier geführt werden. Wenn Tiere aus humanen Gründen getötet wer ­
den oder ihr Tod festgestellt wird, sollte der Todeszeitpunkt so genau wie möglich registriert werden.
 
33. Die Beobachtungen der Tiere sollten sich insbesondere auf Veränderungen 
an Haut, Fell, Augen, Schleimhäuten, des Atmungs- und Kreislaufsystems, 
des Nervensystems sowie auf Somatomotorik und Verhaltensmuster erstre ­
cken. Besonderes Augenmerk ist auf Tremor, Konvulsionen, Salivation, Diarrhö, Lethargie, Schlaf und Koma zu richten. Die Messung der Rektal ­
temperatur kann zusätzliche Belege für mit der Behandlung oder Unterbrin ­
gung zusammenhängende Reflex-Bradypnoe oder Hypo-/Hyperthermie lie ­
fern. Darüber hinaus können zusätzliche Aspekte wie Kinetik, Biomonito ­
ring, Lungenfunktion, Retention schlecht löslicher Stoffe, die im Lungenge ­
webe akkumulieren, und Verhaltensstörungen in das Studienprotokoll auf ­
genommen werden.
 
KÖRPERGEWICHT  
34. Das Körpergewicht der einzelnen Tiere sollte kurz vor der ersten Exposition 
(Tag 0), danach zweimal wöchentlich (z. B. freitags und montags, um die Erholung während eines expositionsfreien Wochenendes nachzuweisen, oder 
in einem Zeitintervall, das die Beurteilung der systemischen Toxizität er ­
möglicht) und zum Zeitpunkt des Todes oder der Tötung dokumentiert werden. Treten in den ersten zwei Wochen keine Wirkungen auf, kann das Körpergewicht während der restlichen Studiendauer wöchentlich gemes ­
sen werden. Satellitentiere (Reversibilitätsprüfung) (falls verwendet) sollten 
während der gesamten Erholungsphase weiterhin wöchentlich gewogen wer ­
den. Am Ende der Studie sollten alle Tiere kurz vor der Tötung gewogen werden, um eine objektive Berechnung der Organ-Körpergewicht-Verhält ­
nisse zu ermöglichen.
 
FUTTER- UND WASSERAUFNAHME  
35. Die Futteraufnahme sollte wöchentlich gemessen werden. Auch die Wasser ­
aufnahme kann gemessen werden.  
KLINISCHE PATHOLOGIE  
36. An allen Tieren, auch an Kontroll- und Satellitentieren (Reversibilitätprü ­
fung), sollten klinische Pathologieuntersuchungen durchgeführt werden, wenn sie getötet werden. Der Zeitraum zwischen dem Ende der Exposition 
und der Blutentnahme ist zu protokollieren, insbesondere wenn der betref ­
fende Endpunkt rasch zu seinem ursprünglichen Wert zurückkehrt. Für Pa ­
rameter mit einer kurzen Plasmahalbwertszeit (z. B. COHb, CHE und MetHb) ist die Probenahme nach Ende der Exposition angezeigt.
 
37. In Tabelle 1 sind die im Allgemeinen für alle Toxikologiestudien erforder ­
lichen klinischen Pathologieparameter aufgeführt. In der Regel ist eine Urin ­
analyse nicht notwendig, kann aber durchgeführt werden, wenn sie wegen erwarteter oder festgestellter Toxizität für nützlich gehalten wird. Der Stu ­
dienleiter kann beschließen, zusätzliche Parameter zu bestimmen, um die 
Toxizität einer Prüfsubstanz genauer zu beschreiben (z. B. Cholinesterase, Lipide, Hormone, Säure-Basen-Gleichgewicht, Methämoglobin oder Heinz-Körper, Creatin-Kinase, Verhältnis von myeloiden zu erythroiden 
Zellen, Troponin, arterielle Blutgase, Lactatdehydrogenase, Sorbitdehydro ­
genase, Glutamatdehydrogenase und γ-Glutamyltranspeptidase).
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Tabelle 1  
Klinische Standardpathologieparameter  
Hämatologische Untersuchung  
Erythrozytenzahl 
Hämatokrit 
Hämoglobinkonzentration 
Mittleres korpuskuläres Hämoglobin Mittleres Erythrozyteneinzelvolumen 
Mittlere korpuskuläre Hämoglobinkon ­
zentration 
Retikulozyten Gesamtleukozytenzahl 
Differentialleukozytenzahl 
Thrombozytenzahl 
Gerinnungsfähigkeit (einen Wert 
wählen): 
— Prothrombinzeit 
— Blutgerinnungszeit 
— Partielle Thromboplastinzeit
 
Klinische Chemie  
Glucose (*) 
Gesamtcholesterin Triglyceride 
Harnstoff-N 
Gesamtbilirubin Kreatinin Gesamtprotein 
Albumin 
Globulin Alanin-Aminotransferase 
Aspartat-Aminotransferase Alkalische Phosphatase 
Kalium 
Natrium Calcium Phosphor 
Chlorid
 
Urinuntersuchung (fakultativ)  
Aussehen (Farbe und Trübung) 
Menge Spezifisches Gewicht oder Osmolarität 
pH-Wert Gesamtprotein 
Glucose Blut/Blutzellen
 
(*) Da ein längerer Futterentzug die Glucosemessungen bei den behandelten gegen ­
über den Kontrolltieren verzerren kann, sollte der Studienleiter entscheiden, ob 
eine Futterkarenz angezeigt ist. Die Dauer des Futterentzugs muss auf die ver ­
wendete Art abgestimmt sein; bei der Ratte kann sie 16 Stunden betragen (nächt ­
liche Futterkarenz). Der Nüchternglucosewert kann nach nächtlicher Futterkarenz 
in der letzten Expositionswoche oder nach nächtlicher Futterkarenz vor der Nek ­
ropsie (in letzterem Fall zusammen mit allen anderen klinischen Pathologiepara ­
metern) bestimmt werden.  
38. Gibt es Anhaltspunkte dafür, dass die unteren Atemwege (d. h. die Alveo ­
len) die Hauptablagerungs- und Retentionsorte sind, kann die bronchoalveo ­
läre Lavage (BAL) die Methode der Wahl sein, um hypothesenbasierte 
Dosis-Wirkungs-Parameter quantitativ zu analysieren, wobei Alveolitis, Lungenentzündung und Phospholipidose im Vordergrund stehen. Auf diese Weise können Veränderungen der Dosis-Wirkungs-Beziehung und des zeit ­
lichen Verlaufs alveolärer Läsionen angemessen untersucht werden. Die 
BAL-Flüssigkeit kann auf Gesamt- und Differenzialleukozytenzahl, Gesamt ­
protein und Laktatdehydrogenase analysiert werden. In Betracht gezogen werden können auch Parameter, die auf lysosomale Schäden, Phospholipi ­
dose, Fibrose und reizende oder allergische Entzündung hindeuten; dazu 
kann auch die Bestimmung entzündungsfördernder Zytokine/Chemokine ge ­
hören. BAL-Messungen dienen im Allgemeinen zur Ergänzung der Ergeb ­
nisse histopathologischer Untersuchungen, können sie aber nicht ersetzen. 
Eine Anleitung zur Durchführung der Lungenlavage ist in GD 39 (2) ent ­
halten.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 296
 
MAKROSKOPISCHE PATHOLOGIE UND ORGANGEWICHTE  
39. Alle Versuchstiere, einschließlich der Tiere, die während der Prüfung ster ­
ben oder aus Tierschutzgründen getötet und aus der Studie genommen wer ­
den, sind (falls möglich) vollständig zu entbluten und auf makroskopische 
Veränderungen zu untersuchen. Der Zeitabstand zwischen dem Ende der 
letzten Exposition eines Tiers und seiner Tötung ist zu dokumentieren. Kann die Nekropsie nicht unmittelbar nach Auffinden eines toten Tieres erfolgen, sollte der Körper auf eine Temperatur gekühlt (nicht eingefroren) 
werden, die tief genug ist, um die Autolyse zu minimieren. Die Nekropsie 
ist baldmöglichst, in der Regel innerhalb von einem oder zwei Tagen durch ­
zuführen. Alle makroskopischen Veränderungen sollten für jedes Tier pro ­
tokolliert werden, wobei besonders auf Veränderungen der Atemwege zu 
achten ist.
 
40. In Tabelle 2 sind die Organe und Gewebe aufgeführt, die bei der Nekropsie 
zur histopathologischen Untersuchung in einem geeigneten Medium auf ­
bewahrt werden sollten. Die Aufbewahrung der in [Klammern] gesetzten 
Organe und Gewebe sowie aller sonstigen Organe und Gewebe liegt im 
Ermessen den Studienleiters. Die durch  Fettdruck  hervorgehobenen Organe 
sind so bald wie möglich nach der Sektion von anhaftendem Gewebe zu befreien und feucht zu wiegen, um ein Austrocknen zu verhindern. Die 
Schilddrüse und die Nebenhoden sind nur zu wiegen, wenn dies notwendig 
ist, da ihre Befreiung von anhaftendem Gewebe die histopathologische Be ­
wertung erschweren kann. Gewebe und Organe sind unmittelbar nach der Nekropsie und je nach verwendetem Fixierungsmittel mindestens 24-48 
Stunden vor der Befreiung von anhaftendem Gewebe in 10 %ig gepuffertem 
Formalin oder einem anderen geeigneten Fixierungsmittel zu fixieren.
 
Tabelle 2  
Bei der Nekropsie aufbewahrte Organe und Gewebe  
Nebennieren  
Knochenmark (und/oder frisches Aspirat)  
Gehirn  (mit Schnitten von Cerebrum, Cere ­
bellum und Medulla/Pons)  
[Augen (Netzhaut, Sehnerv) und Lider]  
Herz  
Nieren  
Larynx (3 Ebenen, 1 Ebene, die die Basis der 
Epiglottis enthält)  
Leber  
Lunge  (alle Lungenlappen auf einer Ebene, 
einschließlich der Hauptbronchien)  
Lymphknoten aus der Hilusregion der Lunge, 
insbesondere bei schlecht löslichen Prüfsub ­
stanzen, die in Partikelform vorliegen. Für gründlichere Untersuchungen und/oder Stu ­
dien mit immunologischem Schwerpunkt 
können zusätzliche Lymphknoten in Betracht 
gezogen werden, z. B. aus der mediastinalen, der cervicalen/submandibulären und/oder der aurikularen Region.
 
Nasopharyngeale Gewebe (mindestens 4 Ebe ­
nen; 1 Ebene muss den Nasen-Rachen-Gang 
und das Lymphgewebe des Nasen-Rachen- Raums (NALT) umfassen.
 
Speiseröhre  
[Riechkolben]  
Ovarien  Samenbläschen  
Rückenmark (zervical, mittlerer Thorax ­
bereich und lumbar)  
Milz  
Magen  
Hoden  
Thymus  
Schilddrüse  
Trachea (mindestens 2 Ebenen mit einem 
Längsschnitt durch die Carina und 1 Quer ­
schnitt)  
[Harnblase]  
Uterus  
Alle makroskopischen Veränderungen  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 297
 
41. Die Lungen sind in intaktem Zustand zu entfernen, zu wiegen und mit 
einem geeigneten Fixierungsmittel bei einem Druck von 20-30 cm Wasser 
zu behandeln, damit die Lungenstruktur erhalten bleibt (5). Die Schnitte werden bei allen Lungenlappen auf einer Ebene einschließlich der Haupt ­
bronchien hergestellt; wenn eine Lungenlavage durchgeführt wird, ist der 
nicht gewaschene Lappen jedoch auf drei Ebenen zu schneiden (keine se ­
riellen Schnitte).
 
42. Mindestens vier Ebenen der nasopharyngealen Gewebe sind zu untersuchen; 
eine der Ebenen sollte den Nasen-Rachen-Gang umfassen (5, 6, 7, 8, 9), damit das Plattenepithel, das (nicht Zilien-tragende respiratorische) Über ­
gangsepithel, das (Zilien-tragende respiratorische) Flimmerepithel und das 
Riechepithel sowie das Lymphgewebe (NALT; 10,11) gründlich untersucht werden können. Drei Ebenen des Larynx sind zu untersuchen; eine dieser Ebenen sollte die Basis der Epiglottis enthalten (12). Mindestens zwei Ebe ­
nen der Trachea sind zu untersuchen, darunter ein Längsschnitt durch die 
Carina der Bifurkation der extrapulmonalen Bronchien und ein Querschnitt.
 
HISTOPATHOLOGIE  
43. Die in Tabelle 2 aufgeführten Organe und Gewebe der Tiere in der Kontroll ­
gruppe und der Gruppe mit der höchsten Konzentration und aller während der Studie gestorbenen oder getöteten Tiere sollten histopathologisch unter ­
sucht werden. Besonderes Augenmerk ist auf Atemwege, Zielorgane und 
makroskopische Veränderungen zu richten. Die Organe und Gewebe, die in 
der höchsten Konzentrationsgruppe makroskopische Veränderungen aufwei ­
sen, sollten in allen Gruppen untersucht werden. Der Studienleiter kann beschließen, histopathologische Untersuchungen bei zusätzlichen Gruppen 
durchzuführen, um eine eindeutige Konzentrationswirkung nachzuweisen. 
Umfasst eine Prüfung auch eine Satellitengruppe (Reversibilitätsprüfung), sind alle Gewebe und Organe histopathologisch zu untersuchen, bei denen in den Behandlungsgruppen Wirkungen aufgetreten sind. Treten in der 
Gruppe mit der höchsten Konzentration übermäßig viele frühzeitige Todes ­
fälle oder andere Probleme auf, die die Signifikanz der Daten beeinträchti ­
gen, so ist die Gruppe mit der nächstniedrigeren Konzentration histopatho ­
logisch zu untersuchen. Man sollte versuchen, die makroskopischen Befunde 
mit den Ergebnissen der mikroskopischen Untersuchung zu korrelieren.
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Daten  
44. Körpergewichte, Futteraufnahme, Ergebnisse der klinischen Pathologie, ma ­
kroskopische Befunde, Organgewichte und Ergebnisse der Histopathologie 
sind für die einzelnen Tiere anzugeben. Die Daten der klinischen Beobach ­
tung sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus müssen für jede Prüfgruppe die Anzahl der verwendeten Tiere, die Anzahl der Tiere mit spezifischen Toxizitätszeichen, die Anzahl der Tiere, die während der Prü ­
fung tot aufgefunden oder vorzeitig getötet wurden, der Todeszeitpunkt der 
einzelnen Tiere, eine Beschreibung und der zeitliche Verlauf der toxischen Wirkungen und deren Reversibilität sowie die Sektionsbefunde ersichtlich sein. Sowohl die quantitativen als auch die gelegentlich erzielten Ergebnisse 
sind anhand eines geeigneten statistischen Verfahrens zu bewerten. Hierzu 
ist eine allgemein anerkannte Statistikmethode heranzuziehen; die Statistik ­
methoden sind bei der Auslegung der Studie festzulegen.
 
Prüfbericht  
45. Der Prüfbericht sollte, soweit zutreffend, die folgenden Informationen ent ­
halten:  
Versuchstiere und Tierhaltung  
— Beschreibung der Haltungsbedingungen mit Angaben zu Anzahl (oder 
Veränderung der Anzahl) der Tiere je Käfig, Einstreu, Umgebungstem ­
peratur und relativer Luftfeuchtigkeit, Photoperiode und Futter,  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 298
 
— Art/Stamm und Begründung für die Verwendung einer anderen Art als 
der Ratte; Daten zur Herkunft der Tiere und historische Daten können 
angegeben werden, wenn sie von Tieren mit ähnlichen Expositions-, Unterbringungs- und Futterkarenzbedingungen stammen,
 
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere,  
— Randomisierungsmethode,  
— Beschreibung etwaiger Vorbereitung vor der Prüfung, einschließlich Er ­
nährung, Quarantäne und Behandlung von Krankheiten.  
Prüfsubstanz  
— physikalische Beschaffenheit, Reinheit und, wenn maßgeblich, 
physikalisch-chemische Eigenschaften (einschließlich Isomerisierung),  
— Angaben zur Identifikation und CAS-Nummer (Chemical Abstract Ser ­
vices), falls bekannt.  
Vehikel  
— Begründung für die Verwendung eines Vehikels sowie für die Wahl des 
Vehikels (falls nicht Wasser),  
— historische oder parallel erzeugte Daten, die belegen, dass das Vehikel 
keinen Einfluss auf das Ergebnis der Studie hat.  
Inhalationskammer  
— ausführliche Beschreibung der Inhalationskammer mit Angabe des Vo ­
lumens sowie ein Diagramm,  
— Herkunft und Beschreibung der für die Exposition der Tiere sowie für 
die Erzeugung der Atmosphäre verwendeten Ausrüstung,  
— Ausrüstung für die Messung von Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Partikel ­
größe und tatsächlicher Konzentration,  
— Herkunft der Luft und Klimatisierungssystem,  
— für die Kalibrierung der Ausrüstung verwendete Methoden, um eine 
homogene Prüfatmosphäre sicherzustellen,  
— Druckunterschied (positiv oder negativ),  
— Expositions-Öffnungen je Kammer („Nose-only“-Exposition); Anord ­
nung der Tiere in der Kammer (Ganzkörperexposition),  
— Stabilität der Prüfatmosphäre,  
— Lage von Temperatur- und Feuchtigkeitssensoren und Ort der Pro ­
benahme der Prüfatmosphäre in der Kammer,  
— Behandlung der zugeführten/entzogenen Luft,  
— Luftdurchflussraten, Luftdurchflussrate/Expositions-Öffnung („Nose-on ­
ly“-Exposition) oder Anzahl der Tiere je Kammer (Ganzkörperexpositi ­
on), 
— Zeit bis zum Erreichen des Gleichgewichts in der Inhalationskammer 
(t 95 ), 
— Zahl der Volumenänderungen pro Stunde,  
— Messgeräte (falls zutreffend).  
Expositionsdaten  
— Begründung für die Wahl der Zielkonzentration in der Hauptstudie,  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 299
 
— nominale Konzentrationen (Gesamtmasse der in die Inhalationskammer 
eingeleiteten Prüfsubstanz dividiert durch das Volumen der durch die 
Kammer geleiteten Luft),  
— im Atembereich der Tiere ermittelte tatsächliche Konzentrationen der 
Prüfsubstanz; bei Gemischen mit heterogenen physikalischen Formen 
(Gase, Dämpfe, Aerosole) kann jede Form getrennt analysiert werden,  
— alle Luftkonzentrationen sollten in Masseneinheiten (z. B. mg/l, mg/m  3 
usw.) und nicht in Volumeneinheiten (z. B. ppm, ppb usw.) angegeben 
werden,  
— Partikelgrößenverteilung, mittlerer aerodynamischer 
Massendurchmesser (MMAD) und geometrische Standardabweichung 
(σg), einschließlich der Berechnungsmethoden. Einzelne Partikelgrößen ­
analysen sind zu protokollieren.  
Prüfbedingungen  
— Angaben zur Vorbereitung der Prüfsubstanz, einschließlich Angaben zu 
den Verfahren zur Reduzierung der Partikelgröße von Feststoffen oder 
zur Herstellung von Lösungen der Prüfsubstanz,  
— eine Beschreibung (möglichst mit Diagramm) der Ausrüstung, die zur 
Erzeugung der Prüfatmosphäre und zur Exposition der Tiere gegen die 
Prüfatmosphäre verwendet wird,  
— Angaben zur Ausrüstung, die für die Überwachung von Temperatur, 
Luftfeuchtigkeit und Luftstrom in der Kammer verwendet wird (Erstel ­
lung einer Kalibrationskurve),  
— Angaben zur Ausrüstung, mit der die Proben zur Bestimmung der Kon ­
zentration in der Kammer und der Partikelgrößenverteilung genommen werden,
 
— Angaben zur verwendeten chemischen Analysemethode und zur Validie ­
rung der Methode (einschließlich der Effizienz der Wiederfindung der Prüfsubstanz im Medium),
 
— Randomisierungsmethode für die Einteilung der Tiere in Prüf- und Kon ­
trollgruppen,  
— Angaben über Futter- und Wasserqualität (einschließlich Art/Herkunft 
des Futters, Wasserquelle),  
— Begründung für die Wahl der Prüfkonzentrationen.  
Ergebnisse  
— tabellarische Darstellung von Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Luft ­
strom in der Kammer,  
— tabellarische Darstellung von Daten zur nominalen und tatsächlichen 
Konzentration in der Kammer,  
— tabellarische Darstellung der Partikelgrößendaten einschließlich Daten 
zur analytischen Probenahme, Partikelgrößenverteilung und Berechnung 
des MMAD und der σ g , 
— tabellarische Darstellung der erhobenen Daten und der Konzentration für 
jedes einzelne Tier (d. h. Tiere, die Anzeichen für Toxizität zeigen, 
einschließlich Mortalität sowie Art, Schweregrad, Zeitpunkt des Einset ­
zens und Dauer der Wirkungen),  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 300
 
— tabellarische Darstellung des Körpergewichts der einzelnen Tiere,  
— tabellarische Darstellung der Futteraufnahme,  
— tabellarische Darstellung der klinischen Pathologieparameter,  
— Sektionsbefunde und histopathologische Ergebnisse für jedes einzelne 
Tier, falls vorhanden,  
— tabellarische Darstellung aller anderen gemessenen Parameter.  
Diskussion und Auswertung der Ergebnisse  
— Besondere Aufmerksamkeit sollte der Beschreibung der Methoden gel ­
ten, die verwendet wurden, um die Kriterien dieser Prüfmethode zu erfüllen, z. B. die Grenzkonzentration oder die Partikelgröße.
 
— Die Lungengängigkeit von Partikeln vor dem Hintergrund der Gesamt ­
befunde sollte behandelt werden, insbesondere, wenn die Partikelgrößen ­
kriterien nicht erfüllt werden konnten.  
— Die Kohärenz der Methoden zur Bestimmung der nominalen und der 
tatsächlichen Konzentration sowie die Beziehung der tatsächlichen Kon ­
zentration zur nominalen Konzentration sind in die Gesamtbewertung 
der Studie aufzunehmen.  
— Die wahrscheinliche Todesursache und die vorherrschende Wirkungs ­
weise (systemisch oder lokal) sollten behandelt werden.  
— Falls Tiere, die unter Schmerzen litten oder Zeichen für schweres und 
anhaltendes Leiden aufwiesen, auf humane Weise getötet werden muss ­
ten, ist eine Erklärung auf der Grundlage der Kriterien im OECD Gui ­
dance Document on Humane Endpoints (3) zu geben.  
— Die Zielorgane sollten identifiziert werden.  
— Der NOAEL und der LOAEL sollten bestimmt werden.  
LITERATUR:  
1. OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guide ­
line No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
3. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
4. Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Pro ­
grams, United States Environmental Protection Agency.  
5. Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled 
Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258.
 
6. Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.  
7. Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labora ­
tory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231- 
238. ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 301
 
8. Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in hu ­
mans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
 
9. Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal dia ­
grams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. 
Toxicol. Pathol. 22: 353-372.  
10. Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn 
AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.
 
11. Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lym ­
phoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
12. Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
13. Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 des Europäischen Parlaments und des Rates 
vom 16. Dezember 2008 über die Einstufung, Kennzeichnung und Ver ­
packung von Stoffen und Gemischen, zur Änderung und Aufhebung der 
Richtlinien 67/548/EWG und 1999/45/EG und zur Änderung der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 (ABl. L 353 vom 31.12.2008, S. 1).
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 302
 
Anlage 1  
DEFINITION  
Prüfsubstanz:  jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode 
getestet wird.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 303
 
B.9. TOXIZITÄT NACH 28-TÄGIGER GABE (DERMAL)  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B (Punkt A).  
1.2. DEFINITIONEN  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B (Punkt B)  
1.3. BEZUGSSUBSTANZEN  
Keine.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Die Prüfsubstanz wird täglich in abgestuften Dosen mehreren Ver ­
suchstiergruppen auf die Haut aufgetragen, und zwar eine Dosierung 
je Gruppe über einen Zeitraum von 28 Tagen. Während des Ver ­
suchszeitraums werden die Tiere täglich beobachtet, um Symptome toxischer Wirkungen festzustellen. Tiere, die während des Versuchs 
sterben, sowie bei Versuchsende überlebende Tiere werden seziert.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.6.1.  Vorbereitung  
Die Tiere werden vor Versuchsbeginn für einen Zeitraum von min ­
destens 5 Tagen unter experimentellen Haltungs- oder Fütterungs ­
bedingungen eingewöhnt. Vor dem Versuch werden gesunde junge Tiere randomisiert und den einzelnen Behandlungs- und Kontroll ­
gruppen zugeordnet. Kurz vor Versuchsbeginn wird das Fell auf 
dem Rücken der Versuchstiere geschoren. Ein Abrasieren des Fells ist ebenfalls möglich, sollte jedoch 24 Stunden vor dem Versuch erfolgen. Das Scheren oder Rasieren muss normalerweise wöchent ­
lich wiederholt werden. Es ist darauf zu achten, dass dabei die Haut 
nicht verletzt wird. Mindestens 10 % der Körperoberfläche wird für die Applikation vorbereitet. Bei der Bestimmung des zu scherenden Bereichs und der Applikationsfläche ist das Gewicht der Tiere zu 
berücksichtigen. Werden feste Stoffe verwendet, die gegebenenfalls 
pulverisiert werden können, sollte die Prüfsubstanz ausreichend mit Wasser oder ggf. in anderer geeigneter Form angefeuchtet werden, um einen guten Kontakt mit der Haut sicherzustellen. Flüssige Prüf ­
substanzen werden im Allgemeinen unverdünnt angewendet. Die 
Applikation erfolgt täglich an 5 bis 7 Tagen pro Woche.
 
1.6.2.  Versuchsbedingungen  
1.6.2.1.  Versuchstiere  
Es können geschlechtsreife Ratten oder Kaninchen verwendet wer ­
den. Auch andere Tierarten können verwendet werden, jedoch muss 
ihre Verwendung begründet werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 304
 
Die Schwankung des Körpergewichts der Tiere des jeweiligen Ver ­
suchs sollte bei Versuchsbeginn nicht mehr als  ± 20 % vom ent ­
sprechenden Mittelwert betragen.  
1.6.2.2.  Anzahl und Geschlecht  
Mindestens 10 Tiere (5 weibliche und 5 männliche) mit gesunder 
unbeschädigter Haut sind für jede Dosierung zu verwenden. Die 
weiblichen Tiere dürfen weder geworfen haben noch trächtig sein. Sollen im Verlauf des Versuchs Tiere getötet werden, so muss die Gesamtzahl der Tiere um die Zahl an Tieren erhöht werden, die 
schon vor Versuchsende getötet werden sollen. Darüber hinaus 
kann eine zusätzliche Gruppe (Satellitengruppe) von 10 Tieren (5 Tiere pro Geschlecht) über 28 Tage mit der höchsten Dosierung behandelt werden. Während der darauf folgenden behandlungsfreien 
14 Tage wird auf Reversibilität, Fortbestehen oder verzögertes Auf ­
treten toxischer Wirkungen geachtet. Eine Satellitengruppe von 10 Kontrolltieren (5 Tiere pro Geschlecht) wird ebenfalls verwendet.
 
1.6.2.3.  Dosierungen  
Es sind mindestens drei Dosierungen sowie eine Kontrollgruppe oder 
— sofern ein Vehikel benutzt wurde — eine Vehikel-Kontrollgruppe zu wählen. Die Einwirkungszeit sollte mindestens 6 Stunden pro Tag 
betragen. Die Applikation der Prüfsubstanz sollte täglich zur glei ­
chen Zeit erfolgen. Eine Anpassung der Dosierung an das Körper ­
gewicht ist in festgesetzten Intervallen (wöchentlich oder zweimal wöchentlich) vorzunehmen, um in Relation zum Körpergewicht des 
Tieres ein konstantes Dosierungsniveau zu erhalten. Abgesehen von 
der Applikation der Prüfsubstanz sind die Tiere der Kontrollgruppe genauso zu behandeln wie die Versuchstiere. Wird zur Erleichterung der Applikation ein Vehikel benutzt, so wird der Kontrollgruppe das 
Vehikel in gleicher Weise verabreicht wie den behandelten Tieren, 
und zwar in der Menge, die die Gruppe mit der höchsten Dosierung erhält. Die höchste Dosierung sollte so gewählt werden, dass auf jeden Fall toxische Effekte auftreten, die Tiere jedoch nicht oder 
nur in geringer Zahl sterben. Die niedrigste Dosierung sollte keine 
Anzeichen von Toxizität hervorrufen. Liegen brauchbare Schätzun ­
gen über die Höhe der Exposition beim Menschen vor, so sollte die 
niedrigste Dosis diesen Wert überschreiten. Nach Möglichkeit sollte 
die mittlere Dosierung nur geringe toxische Effekte verursachen. Werden mehrere Zwischendosierungen verabreicht, so sollten sie so gewählt werden, dass es zu einer graduellen Abstufung der toxi ­
schen Wirkungen kommt. In den Gruppen mit niedriger oder mitt ­
lerer Dosierung sowie in den Kontrollgruppen sollte die Anzahl der Todesfälle gering sein, um eine aussagekräftige Bewertung der Er ­
gebnisse zu ermöglichen.
 
Führt die Applikation der Prüfsubstanz zu schweren Hautreizungen, 
sollte die Konzentration herabgesetzt werden, was bei hoher Dosie ­
rung zu einer Verminderung oder einem Ausbleiben sonstiger toxi ­
scher Wirkungen führen könnte. Wurde überdies die Haut stark be ­
schädigt, ist es u. U. notwendig, den Versuch abzubrechen und mit einer geringeren Konzentration erneut durchzuführen.
 
1.6.2.4.  Limit-Test  
Verursacht bei Durchführung einer Vorstudie die Verabreichung ei ­
ner Dosis von 1 000 mg/kg bzw. einer höheren Dosis, die einer 
möglichen Exposition beim Menschen entspricht, keine toxischen 
Auswirkungen, so ist eine weitere Prüfung nicht erforderlich.  
1.6.2.5.  Beobachtungszeitraum  
Alle Tiere sind täglich auf Symptome toxischer Wirkungen zu be ­
obachten. Der Eintritt des Todes und der Zeitpunkt, zu dem Symp ­
tome auftreten und/oder wieder abklingen, sind festzuhalten.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 305
 
1.6.3.  Versuchsdurchführung  
Die Tiere sollten einzeln in Käfigen gehalten werden. Sie erhalten 
die Prüfsubstanz vorzugsweise an 7 Tagen pro Woche über einen Zeitraum von 28 Tagen. Die Tiere einer Satellitengruppe, die für 
eine Nachbeobachtung vorgesehen sind, sollten für weitere 14 
Tage ohne Behandlung gehalten werden, um die Reversibilität bzw. das Fortbestehen toxischer Wirkungen zu beobachten. Die Ex ­
positionszeit beträgt mindestens 6 Stunden pro Tag.
 
Die Prüfsubstanz ist einheitlich auf einen Bereich, der etwa 10 % der 
Körperoberfläche entspricht, aufzutragen. Bei hochtoxischen Sub ­
stanzen kann die behandelte Oberfläche kleiner sein, es sollte jedoch 
ein möglichst großer Bereich mit einer möglichst dünnen und ein ­
heitlichen Schicht exponiert werden.  
Die Prüfsubstanz ist während der Expositionszeit mit einem porösen 
Mullverband und einem hautschonenden Pflaster in Kontakt mit der Haut zu halten. Die Versuchsfläche ist außerdem auf eine geeignete 
Art abzudecken, um den Mullverband und die Prüfsubstanz zu fixie ­
ren und sicherzustellen, dass die Tiere die Prüfsubstanz nicht oral aufnehmen können. Es können auch Mittel zur Einschränkung der Bewegungsfreiheit angewendet werden, eine vollständige Immobili ­
sierung ist jedoch nicht zu empfehlen. Als Alternative kann eine 
„Halsmanschette“ verwendet werden.
 
Nach Ablauf der Expositionszeit entfernt man — soweit möglich — 
den Rest der Prüfsubstanz, und zwar unter Verwendung von Wasser oder eines anderen geeigneten Hautreinigungsverfahrens.
 
Alle Tiere sollen täglich beobachtet und Zeichen toxischer Wirkun ­
gen, darunter der Zeitpunkt des Auftretens sowie Grad und Dauer, aufgezeichnet werden. Die Beobachtungen sollten sich insbesondere 
auf Veränderung an Haut, Fell, Augen und Schleimhäuten, Atmung, 
Kreislauf, autonomem und zentralem Nervensystem sowie an der Somatomotorik und am Verhaltensmuster erstrecken. Die Futterauf ­
nahme und das Gewicht der Tiere werden wöchentlich bestimmt. 
Eine regelmäßige Beobachtung der Tiere ist erforderlich, um so 
weit wie möglich sicherzustellen, dass Tiere während des Versuchs nicht durch Kannibalismus, Autolyse der Gewebe oder Fehler beim Umsetzen verloren gehen. Nach Abschluss des Versuchszeitraums 
werden alle überlebenden Tiere mit Ausnahme der Satellitengruppe 
seziert. Sterbende Tiere sowie Tiere, bei denen Anzeichen von star ­
kem Leiden und Schmerzen, festgestellt werden, sollten daraufhin sofort ausgesondert und unter Verwendung einer tierschutzgerechten 
Methode getötet und seziert werden.
 
Am Ende des Versuchs werden alle Tiere, einschließlich der Kon ­
trolltiere, folgenden Untersuchungen unterzogen:  
1. Die Hämatologie sollte mindestens die Bestimmung des Hämato ­
kritwerts und Hämoglobinkonzentrat der Erythrozytenzahl, der 
Gesamt- und Differenzial-Leukozytenzahl sowie die Messung der Gerinnungsfähigkeit umfassen;
 
2. klinisch-biochemische Analyse des Blutes: Zur Beurteilung der 
Leber- und Nierenfunktion sollte zumindest je einer der folgenden Parameter bestimmt werden: Alanin-Aminotransferase (früher be ­
kannt als Serum-Glutamat-Pyruvat-Transaminase), Aspartat-Ami ­
notransferase (früher bekannt als Serum-Glutamat-Oxalazetat- Transaminase), Harnstoff-Stickstoff, Albumin, Kreatinin, Ge ­
samt-Bilirubin und Gesamt-Serum-Protein.
 
Bestimmungen weiterer blutchemischer Parameter, die ggf. für eine 
adäquate toxikologische Bewertung erforderlich sind, umfassen: Kal ­
zium, Phosphor, Chlorid, Natrium, Kalium, Nüchternglukose, Lipide, 
Hormone, Säuren-Basen-Gleichgewicht, Methämoglobin, Cholineste ­
raseaktivität.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 306
 
Zusätzliche klinisch-biochemische Analysen können ggf. notwendig 
sein, um die Untersuchung der beobachteten Effekte zu vertiefen.  
1.6.4.  Autopsie  
An allen am Versuch beteiligten Tieren wird eine vollständige Au ­
topsie vorgenommen. Zumindest die Leber, die Nieren, die Neben ­
nieren und die Hoden werden so bald wie möglich nach der Sektion 
feucht gewogen, um ein Austrocknen zu verhindern. Organe und 
Gewebe, d. h. unbehandelte und behandelte Haut, Leber, Nieren, Milz, Hoden, Nebennieren, Herz und Zielorgane (Organe mit makro ­
skopischen Veränderungen und Größenveränderungen) sind in einem 
geeigneten Medium für mögliche spätere histopathologische Unter ­
suchungen aufzubewahren.
 
1.6.5.  Histopathologische Untersuchungen  
Bei allen Tieren der Gruppe mit der höchsten Dosierung sowie bei 
den Tieren der Kontrollgruppe ist eine histologische Untersuchung der konservierten Organe und Gewebe durchzuführen. Alle Organe und Gewebe, die in der Gruppe mit der höchsten Dosierung prüf ­
substanzbedingte Schädigungen aufweisen, müssen auch bei allen 
anderen Gruppen bei geringerer Dosierung untersucht werden. Bei den Tieren der Satellitengruppe sind jene Organe und Gewebe mit besonderer Aufmerksamkeit zu untersuchen, bei denen in den anders 
behandelten Gruppen Vergiftungssymptome auftraten.
 
2. DATEN  
Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus 
müssen für jede Dosisgruppe und Kontrollgruppe die Anzahl der 
Tiere zu Beginn des Versuchs und die Anzahl der Tiere mit den 
einzelnen Schädigungsformen zu entnehmen sein.  
Alle ermittelten Ergebnisse sind durch ein geeignetes statistisches 
Verfahren zu bewerten. Dazu kann jede anerkannte statistische Me ­
thode herangezogen werden.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— Angaben zu den Tieren (Tierart, Stamm, Herkunft, Haltungs ­
bedingungen, Futter usw.);  
— Versuchsbedingungen (einschließlich Art des Verbandes; okklu ­
siv oder nicht okklusiv);  
— Dosierungen (ggf. Vehikel) und Konzentrationen;  
— No effect-level (NEL), falls möglich;  
— Daten über toxische Reaktionen, nach Geschlecht und Konzen ­
tration;  
— Zeitpunkt des Todes während des Versuchs bzw. Angabe, ob die 
Tiere den Versuch überlebten;  
— toxische und andere Wirkungen;  
— Zeitpunkt der Beobachtung der einzelnen Zeichen toxischer Wir ­
kungen und deren weiterer Verlauf;  
— Angaben über Fütterung und Körpergewicht;  
— hämatologische Tests und deren Ergebnisse;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 307
 
— klinisch-biochemische Tests und deren Ergebnisse;  
— Sektionsbefunde;  
— detaillierte Beschreibung der histopathologischen Befunde;  
— statistische Auswertung der Ergebnisse, sofern möglich;  
— Diskussion der Ergebnisse;  
— Bewertung der Ergebnisse.  
3.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B (Punkt D).  
4. LITERATUR  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B (Punkt E).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 308
 
B.10.  MUTAGENITÄT — IN-VITRO-TEST AUF CHROMOSOMENA ­
BERRATIONEN IN SÄUGETIERZELLEN  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht der OECD TG 473, In vitro Mammalian 
Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1. EINLEITUNG  
Der In-vitro-Test auf Chromosomenaberrationen dient zum Nachweis 
von Agenzien, die in Säugerzellkulturen strukturelle Chromsomena ­
berrationen auslösen. (1) (2) (3). Dabei ist zwischen strukturellen Chromosomentyp- und Chromatidentypaberrationen zu unterschei ­
den. Bei der Mehrzahl der chemischen Mutagene sind die Aberra ­
tionen dem Chromatidentyp zuzuordnen, doch kommen auch Chro ­
mosomentypaberrationen vor. Eine Zunahme der Polyploidie ist möglicherweise ein Hinweis darauf, dass ein chemischer Stoff nu ­
merische Aberrationen hervorzurufen vermag. Allerdings ist diese 
Methode nicht zur Messung numerischer Aberrationen bestimmt und wird daher auch nicht routinemäßig dafür eingesetzt. Chromso ­
menmutationen und ähnliche Vorgänge sind die Ursache für zahlrei ­
che humangenetische Erkrankungen. Es spricht manches dafür, dass 
Chromsomenmutationen und ähnliche Vorgänge, die Änderungen in Onkogenen und Tumorsuppressorgenen somatischer Zellen auslösen, an der Entstehung von Krebs bei Menschen und Versuchstieren be ­
teiligt sind.
 
Beim In-vitro-Chromosomenaberrationstest können Kulturen von 
etablierten Zelllinien und Zellstämmen oder primäre Zellkulturen 
zum Einsatz kommen. Die verwendeten Zellen werden unter dem Gesichtspunkt der Wachstumsfähigkeit in Kultur, der Karyotypstabi ­
lität, der Chromosomenzahl, der Chromosomenvielfalt und der spon ­
tanen Häufigkeit von Chromosomenaberrationen ausgewählt.
 
In vitro durchgeführte Versuche erfordern in der Regel den Zusatz 
eines exogenen Fremdstoff-Metabolisierungssystems. Mit diesem System lassen sich aber die In-vivo-Bedingungen bei Säugetieren nicht gänzlich nachvollziehen. Es sind unbedingt Bedingungen zu 
vermeiden, bei denen positive Ergebnisse auftreten, die nicht die 
intrinsische Mutagenität widerspiegeln und möglicherweise aus Ver ­
änderungen des pH-Wertes bzw. der Osmolalität oder hochgradiger Zytotoxizität herrühren (4) (5).
 
Dieser Test dient zum Nachweis möglicher Mutagene und Kanzero ­
gene in Säugetierzellen. Viele chemische Verbindungen, bei denen 
der Test positiv ausfällt, haben eine kanzerogene Wirkung auf Säu ­
getiere, doch besteht keine absolute Korrelation zwischen Test und Kanzerogenität. Die Korrelation ist von der chemischen Klasse ab ­
hängig, und es gibt zunehmende Anzeichen dafür, dass bestimmte 
Kanzerogene durch diesen Test nicht nachweisbar sind, da ihre Wir ­
kung anscheinend auf anderen Mechanismen als einer direkten DNA-Schädigung beruht.
 
Siehe auch allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Chromatidentypaberration:  strukturelle Chromsomenanomalie, ge ­
kennzeichnet durch Bruch einzelner Chromatiden oder Bruch und 
Reunion zwischen Chromatiden.  
Chromosomentypaberration:  strukturelle Chromosomenanomalie, 
gekennzeichnet durch Bruch oder Bruch und Reunion beider Chro ­
matiden an gleicher Position.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 309
 
Endoreduplikation:  Prozess, bei dem der Kern nach einer S-Phase 
der DNA-Replikation keine Mitose durchläuft, sondern in eine wei ­
tere S-Phase eintritt. Das Ergebnis sind Chromosomen mit 4, 8, 16, ... Chromatiden.
 
Gap:  achromatische Läsion von geringerer Breite als eine Chroma ­
tide und mit minimaler Verlagerung der Chromatide(n).  
Mitoseindex:  Anteil der Zellen einer Zellpopulation, die sich zum 
Beobachtungszeitpunkt in Metaphase befinden: Gradmesser für den 
Vermehrungsgrad dieser Population.  
Numerische Aberration:  Abweichung der Chromosomenzahl vom 
Normalwert, der für die verwendeten Zellen charakteristisch ist.  
Polyploidie:  Vorhandensein von mehr als zwei haploiden Chromo ­
somensätzen (n) (z. B. 3n, 4n usw.).  
Strukturelle Aberration:  Veränderung der Chromosomenstruktur, 
nachweisbar durch mikroskopische Untersuchung des Metaphase- Stadiums der Zellteilung, äußert sich in Form von Deletionen und Fragmenten, intra-chromosomalen oder reziproken Translokationen.
 
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Die Behandlung der Zellkulturen mit der Prüfsubstanz erfolgt mit 
und ohne Zusatz eines Fremdstoff-Metabolisierungssystems. Nach Ablauf eines vorher festgelegten Zeitraums werden die Zellkulturen 
mit einem Spindelgift (z. B. Colcemid
 ® oder Colchicin) behandelt, 
gewonnen und gefärbt, woraufhin die Metaphasezellen mikrosko ­
pisch auf Chromosomenaberrationen untersucht werden.  
1.4. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.4.1.  Vorbereitungen  
1.4.1.1.  Zellen  
Es können verschiedene Zelllinien, Zellstämme oder primäre Zell ­
kulturen, auch menschliche Zellen, Verwendung finden (z. B. Fibro ­
blasten des chinesischen Hamsters, Lymphozyten aus dem periphe ­
ren Blut von Menschen oder anderen Säugern).  
1.4.1.2.  Kulturmedien und Inkubationsbedingungen  
Zur Kultivierung sind geeignete Kulturmedien und Inkubationsbedin ­
gungen (Kulturgefäße, CO  2 -Konzentration, Temperatur und Feuch ­
tigkeit) zu verwenden. Etablierte Zelllinien und -stämme sind routi ­
nemäßig auf Stabilität der modalen Chromosomenzahl und Myco ­
plasmaverunreinigung zu überprüfen und sollten bei Verunreinigung nicht herangezogen werden. Die normale Dauer des Zellzyklus bei 
den gewählten Zellen und Inkubationsbedingungen sollte bekannt 
sein.
 
1.4.1.3.  Vorbereitung der Kulturen  
Etablierte Zelllinien und -stamme: die Zellen werden aus Stamm ­
kulturen gewonnen, im Kulturmedium in einer solchen Dichte über ­
impft, dass die Kultur vor dem Zeitpunkt der Gewinnung nicht kon ­
fluent wird, und bei 37  o C inkubiert.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 310
 
Lymphozyten: mit einem Antikoagulans (z. B. Heparin) behandeltes 
Vollblut oder separierte Lymphozyten von gesunden Probanden wer ­
den dem Kulturmedium beigegeben, das ein Mitogen (z. B. Phyto ­
hämagglutinin) enthält, und bei 37  o C inkubiert.  
1.4.1.4.  Stoffwechselaktivierung  
Die Behandlung der Zellen mit der Prüfsubstanz sollte sowohl mit 
als auch ohne Zusatz eines geeigneten Fremdstoff-Metabolisierungs ­
systems erfolgen. Das am häufigsten verwendete System ist eine 
durch Ko-Faktoren ergänzte post-mitochondriale Fraktion (S9) aus 
der Leber von Nagetieren, die mit enzyminduzierenden Agenzien wie Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) oder einem Gemisch aus Phenobar ­
biton und β-Naphtoflavon (10) (11) (12) vorbehandelt wurde.
 
Die post-mitochondriale Fraktion wird im Endmedium in der Regel 
in Konzentrationen von 1 bis 10 % v/v verwendet. Der Zustand des Stoffwechselsystems ist möglicherweise von der geprüften che ­
mischen Klasse abhängig. In bestimmten Fällen ist es ggf. zweck ­
mäßig, mehr als eine Konzentration der post-mitochondrialen Frak ­
tion zu verwenden.
 
Eine Reihe von Entwicklungen, darunter die Herstellung gentech ­
nisch veränderter Zelllinien zur Expression spezifischer Aktivie ­
rungsenzyme, eröffnen vielleicht die Möglichkeit für eine endogene 
Aktivierung. Die Wahl der verwendeten Zelllinien sollte wissen ­
schaftlich begründet sein (z. B. durch die Relevanz des Isoenzyms Cytochrom P450 für den Stoffwechsel der Prüfsubstanz).
 
1.4.1.5.  Prüfsubstanz/Zubereitung  
Feste Prüfsubstanzen sollten vor der Zellbehandlung in geeigneten 
Lösungsmitteln oder Vehikeln gelöst oder suspendiert und ggf. ver ­
dünnt werden. Flüssige Prüfsubstanzen können den Versuchssyste ­
men vor der Behandlung direkt beigegeben und/oder verdünnt wer ­
den. Es sind frische Zubereitungen der Prüfsubstanz zu verwenden, es sei denn, die Stabilität der Substanz bei Lagerung wird nach ­
gewiesen.
 
1.4.2.  Prüfbedingungen  
1.4.2.1.  Lösungsmittel/Vehikel  
Die Lösungsmittel/Vehikel sollten nicht im Verdacht stehen, mit der 
Prüfsubstanz eine chemische Reaktion einzugehen, und sie sollten mit dem Überleben der Zellen und der S9-Aktivität kompatibel sein. Werden keine allgemein bekannten Lösungsmittel/Vehikel verwen ­
det, so sind Daten zur Kompatibilität beizubringen. Es ist zu emp ­
fehlen, als erste Wahl möglichst die Verwendung eines wässrigen Lösungsmittels/Vehikels in Erwägung zu ziehen. Bei der Prüfung wasserinstabiler Substanzen sollten die verwendeten organischen Lö ­
sungsmittel frei von Wasser sein. Das Wasser lässt sich durch Zusatz 
eines Molekularsiebs entfernen.
 
1.4.2.2.  Expositionskonzentration  
Zu den Kriterien, die bei der Bestimmung der höchsten Konzentra ­
tion zu berücksichtigen sind, zählen die Zytotoxizität, die Löslichkeit im Versuchssystem und die Veränderungen des pH-Wertes oder der 
Osmolalität.
 
Die Zytotoxizität sollte im Hauptversuch mit und ohne Stoffwechsel ­
aktivierung unter Verwendung eines geeigneten Indikators für Zel ­
lintegrität und -wachstum wie Konfluenzgrad, Anzahl der lebensfähi ­
gen Zellen oder Mitoseindex bestimmt werden. Es ist möglicher ­
weise sinnvoll, die Zytotoxizität und Löslichkeit in einem Vorver ­
such zu bestimmen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 311
 
Es sind mindestens drei analysierbare Konzentrationen zu verwen ­
den. Wenn Zytotoxizität auftritt, sollten diese Konzentrationen den 
Bereich vom Höchstwert bis zu geringer oder nicht vorhandener Toxizität umfassen. Im Normalfall bedeutet dies, dass sich die Kon ­
zentrationen maximal um einen Faktor zwischen 2 und 10 unter ­
scheiden. Zum Zeitpunkt der Gewinnung sollte die höchste Konzen ­
tration eine deutliche Verminderung des Konfluenzgrades, der An ­
zahl der Zellen oder des Mitoseindexes (jeweils um mehr als 50 %) erkennen lassen. Der Mitoseindex ist nur ein indirekter Gradmesser 
für zytotoxische/zytostatische Wirkungen und hängt davon ab, wie 
viel Zeit seit der Behandlung vergangen ist. Allerdings ist der Mitos ­
eindex für Suspensionskulturen vertretbar, bei denen andere Metho ­
den zur Toxizitätsbestimmung möglicherweise umständlich oder un ­
praktisch sind. Informationen über die Zellzykluskinetik, z. B. die 
mittlere Generationszeit (MGZ), könnten als zusätzliche Angaben herangezogen werden. Bei der MGZ handelt es sich jedoch um einen Gesamtdurchschnittswert, der nicht immer das verspätete Auftreten 
von Teilpopulationen erkennen lässt, und schon ein leichter Anstieg 
der mittleren Generationszeit kann eine erhebliche Verzögerung des Zeitpunkts der optimalen Ausbeute an Aberrationen zur Folge haben.
 
Bei relativ nichtzytotoxischen Substanzen sollte die Höchstkonzen ­
tration bei Versuchen 5 μl/ml, 5 mg/ml oder 0,01 M betragen, je 
nachdem, welcher Wert am niedrigsten ist.  
Im Falle relativ unlöslicher Substanzen, die bei Konzentrationen un ­
terhalb der unlöslichen Konzentration nicht toxisch sind, sollte die 
höchste verwendete Dosis eine Konzentration oberhalb der Löslich ­
keitsgrenze im Endmedium nach Ablauf der Behandlungszeit sein. In bestimmten Fällen (z. B. wenn die Toxizität nur bei einer Konzen ­
tration auftritt, die über der geringsten unlöslichen Konzentration 
liegt) ist es ratsam, die Prüfung bei mehr als einer Konzentration 
mit sichtbarer Ausfällung vorzunehmen. Möglicherweise ist es sinn ­
voll, die Löslichkeit zum Anfang und Abschluss der Behandlung zu bestimmen, da sich die Löslichkeit im Versuchssystem während der 
Exposition aufgrund des Vorhandenseins von Zellen, S9, Serum usw. 
verändern kann. Die Unlöslichkeit ist mit dem bloßen Auge erkenn ­
bar. Die Ausfällung sollte die Bewertung nicht beeinträchtigen.
 
1.4.2.3.  Negativ- und Positivkontrollen  
Für jeden Versuch sind gleichzeitig Positiv- und Negativ-(Lösungs ­
mittel- oder Vehikel-)Kontrollen mit und ohne Zusatz eines Stoff ­
wechselaktivierungssystems anzulegen. Bei Stoffwechselaktivierung sollte die Positivkontrollsubstanz jene Substanz sein, die zur mutage ­
nen Reaktion eine Aktivierung benötigt.
 
Zur Positivkontrolle sollte ein bekanntes Clastogen in Expositions ­
konzentrationen verwendet werden, die voraussichtlich eine repro ­
duzierbare und erkennbare Zunahme gegenüber dem Hintergrund ergeben, womit sich die Empfindlichkeit des Versuchssystems de ­
monstrieren lässt.
 
Die Positivkontrollkonzentrationen sollten so gewählt werden, dass 
die Wirkungen eindeutig sind, aber beim Ablesen nicht sofort die 
Identität der kodierten Objektträger erkennen lassen. Es kommen 
beispielsweise folgende Positivkontrollsubstanzen in Frage:  
Stoffwechselaktivierungsstatus Substanz CAS-Nummer EINECS-Nummer  
Ohne exogene Stoffwechselakti ­
vierung Methylmethansulfonat 66-27-3 200-625-0 
Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 312
 
Stoffwechselaktivierungsstatus Substanz CAS-Nummer EINECS-Nummer  
Ethylnitrosoharnstoff 759-73-9 212-072-2 
Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
4-Nitroquinolin-N-oxid 56-57-5 200-281-1 
Mit exogener Stoffwechselakti ­
vierung Benzo[a]pyren 50-32-8 200-028-5 
CyclophosphamidCyclophos ­
phamidmonohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4  
Es können auch andere geeignete Positivkontrollsubstanzen verwen ­
det werden. Gegebenenfalls sollten Positivkontrollen herangezogen 
werden, die der gleichen chemischen Klasse angehören wie der Prüf ­
stoff.  
Bei jedem Gewinnungszeitpunkt sind Negativkontrollen hinzuzuzie ­
hen, bei denen das Behandlungsmedium lediglich Lösungsmittel oder Vehikel enthält und die auf die gleiche Weise wie die Behandlungs ­
kulturen behandelt werden. Darüber hinaus sollten auch unbehan ­
delte Kontrollen verwendet werden, wenn nicht historische Kontroll ­
daten belegen, dass das gewählte Lösungsmittel keine schädlichen oder mutagenen Wirkungen hervorruft.
 
1.4.3.  Verfahren  
1.4.3.1.  Behandlung mit der Prüfsubstanz  
Proliferierende Zellen werden mit und ohne Zusatz eines Stoffwech ­
selaktivierungssystems mit der Prüfsubstanz behandelt. Die Behand ­
lung der Lymphozyten sollte ca. 48 Stunden nach der mitogenen Stimulierung beginnen.
 
1.4.3.2. Im Normalfall sollten für jede Konzentration zwei parallele Kulturen 
verwendet werden, die auch nachdrücklich für Negativ-(Lösungsmit ­
tel-)Kontrollkulturen empfohlen werden. Lässt sich anhand von his ­
torischen Daten nachweisen, dass zwischen den Zweifachkulturen nur eine minimale Abweichung besteht (13) (14), so ist ggf. die 
Verwendung von Einfachkulturen für jede Konzentration vertretbar.
 
Gasförmige oder flüchtige Substanzen sind mit Hilfe geeigneter Me ­
thoden zu prüfen, z. B. in hermetisch verschlossenen Kulturgefäßen (15) (16).
 
1.4.3.3.  Zeitpunkt der Gewinnung der Kulturen  
Beim ersten Versuch sollten die Zellen 3 bis 6 Stunden lang mit und 
ohne Zusatz eines Metabolisierungssystems mit der Prüfsubstanz behandelt werden, wobei eine Aufarbeitung nach Ablauf eines Zeit ­
raums erfolgt, der etwa der 1,5-fachen Dauer des normalen Zell ­
zyklus nach Behandlungsbeginn entspricht (12). Ergibt dieses Pro ­
tokoll sowohl mit als auch ohne Zusatz eines Metabolisierungssys ­
tems negative Ergebnisse, so sollte ein weiterer Versuch ohne 
Aktivierung vorgenommen werden, bei dem eine kontinuierliche 
Behandlung bis hin zur Probenahme nach Ablauf eines Zeitraums erfolgt, der etwa der 1,5-fachen Dauer des normalen Zellzyklus ent ­
spricht. Bestimmte Stoffe sind möglicherweise leichter nachweisbar, 
wenn der Zeitraum für die Behandlung/Probenahme mehr als die 
l,5-fache Dauer des normalen Zellzyklus beträgt. Negative Befunde bei Zusatz eines Metabolisierungssystems bedürfen der Bestätigung durch Einzelfallprüfung. In jenen Fällen, in denen eine Bestätigung 
negativer Befunde nicht für erforderlich gehalten wird, ist eine 
Begründung anzugeben.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 313
 
1.4.3.4.  Chromosomenpräparation  
Die Zellkulturen werden vor der Gewinnung in der Regel ein bis drei 
Stunden lang mit Colcemid  ® oder Colchicin behandelt. Für die Chro ­
mosomenpräparation wird jede Zellkultur gesondert gewonnen und 
aufgearbeitet. Zur Chromosomenpräparation gehören die Behandlung 
der Zellen mit hypotoner Lösung, die Fixierung und Färbung.  
1.4.3.5.  Analyse  
Alle Objektträger, auch die für die Positiv- und Negativkontrollen, 
sind vor der mikroskopischen Untersuchung von unabhängiger Seite zu kodieren. Da es bei der Fixierung häufig zum Bruch eines Teils 
der Metaphasezellen unter Verlust von Chromosomen kommt, sollten 
die ausgewerteten Zellen daher eine Zentromerzahl enthalten, die bei allen Zelltypen dem Modalwert ± 2 entspricht. Es sind mindestens 200 gut gespreitete Metaphasen je Konzentration und Kontrolle zu 
analysieren und bei Zweifachkulturen gleichmäßig auf diese zu ver ­
teilen. Eine Reduzierung dieser Zahl ist möglich, wenn eine hohe Zahl von Aberrationen beobachtet wird.
 
Obwohl es bei der Prüfung um den Nachweis struktureller Chromo ­
somenaberrationen geht, ist das Auftreten von Polyploidie und 
Endoreduplikation unbedingt zu vermerken.  
2. DATEN  
2.1. AUFBEREITUNG DER ERGEBNISSE  
Versuchseinheit ist die Zelle, und daher ist der Anteil der Zellen mit 
struktureller Chromosomenaberration bzw. strukturellen Chromoso ­
menaberrationen zu bewerten. Für die Versuchs- und Kontrollkultu ­
ren sind die unterschiedlichen Typen struktureller Chromosomena ­
berrationen mit Anzahl und Häufigkeit aufzuführen. Gaps werden getrennt erfasst und angegeben, aber in der Regel nicht bei der Gesamthäufigkeit der Aberrationen berücksichtigt.
 
Zu erfassen sind auch Maßnahmen, die in den Hauptprüfungen auf 
Aberrationen gleichzeitig zur Bestimmung der Zytotoxizität aller be ­
handelten und Negativkontrollkulturen durchgeführt werden.  
Es sind die Daten für die einzelnen Kulturen zu dokumentieren. 
Zusätzlich sollten alle Daten in tabellarischer Form zusammengefasst werden.
 
Bei einer eindeutigen positiven Reaktion ist eine Verifizierung nicht 
erforderlich. Nicht eindeutige Ergebnisse sind durch weitere Prüfun ­
gen abzuklären, möglichst unter Abänderung der Versuchsbedingun ­
gen. Die Notwendigkeit der Bestätigung negativer Ergebnisse wurde in 1.4.3.3 dargelegt. Bei Folgeversuchen sollte die Abänderung der 
Studienparameter zur Erweiterung des Umfangs der bewerteten Be ­
dingungen in Betracht gezogen werden. Zu den Studienparametern, die für eine Abänderung in Frage kommen, gehören die Abstände der Konzentrationen und die Stoffwechselaktivierungsbedingungen.
 
2.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Es gibt mehrere Kriterien für die Bestimmung eines positiven Ergeb ­
nisses, wie z. B. eine konzentrationsbezogene Zunahme oder repro ­
duzierbare Zunahme der Anzahl der Zellen mit Chromosomenaber ­
rationen. Zunächst sollte die biologische Relevanz der Ergebnisse untersucht werden. Als Hilfsmittel bei der Bewertung der Versuchs ­
ergebnisse können statistische Methoden dienen (3) (13). Die statis ­
tische Signifikanz sollte aber nicht der einzige bestimmende Faktor 
für eine positive Reaktion sein.
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Eine zahlenmäßige Zunahme der polyploiden Zellen deutet mögli ­
cherweise darauf hin, dass die Prüfsubstanz mitotische Prozesse zu 
hemmen und numerische Chromosomenaberrationen hervorzurufen vermag. Eine zahlenmäßige Zunahme der Zellen mit endoreduplizier ­
ten Chromosomen ist möglicherweise ein Anzeichen dafür, dass die 
Prüfsubstanz die Zellzyklusprogression zu hemmen vermag (17) 
(18).
 
Eine Prüfsubstanz, bei der die Ergebnisse nicht den oben genannten 
Kriterien entsprechen, gilt in diesem System als nichtmutagen.  
Auch wenn die meisten Versuche eindeutig positive oder negative 
Ergebnisse liefern, erlaubt der Datensatz in seltenen Fällen keine definitive Aussage über die Aktivität der Prüfsubstanz. Es kommt vor, dass sich die Ergebnisse unabhängig davon, wie oft der Versuch 
wiederholt wird, weiterhin als nicht eindeutig oder als fragwürdig 
erweisen.
 
Positive Befunde beim In-vitro-Chromosomenaberrationstest deuten 
darauf hin, dass die Prüfsubstanz in kultivierten somatischen Säuge ­
tierzellen strukturelle Chromosomenaberrationen hervorruft. Negative Befunde sind ein Anzeichen dafür, dass die Prüfsubstanz unter die ­
sen Versuchsbedingungen keine Chromosomenaberrationen in kulti ­
vierten somatischen Säugetierzellen hervorruft.
 
3. ABSCHLUSSBERICHT  
PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:  
Lösungsmittel/Vehikel:  
— Begründung für die Wahl des Vehikels;  
— Löslichkeit und Stabilität der Prüfsubstanz im Lösungsmittel/ 
Vehikel, falls bekannt.  
Zellen:  
— Typ und Herkunft der Zellen;  
— Karyotypmerkmale und Eignung des verwendeten Zelltyps;  
— ggf. Nichtvorhandensein von Mycoplasma;  
— Angaben über die Dauer des Zellzyklus;  
— Geschlecht der Blutspender, Vollblut oder separierte Lymphozy ­
ten, verwendetes Mitogen;  
— ggf. Passagenanzahl;  
— ggf. zum Erhalt der Zellkultur verwendete Verfahren;  
— Modalwert der Chromosomen.  
Prüfbedingungen:  
— Bezeichnung der Spindelgifte, deren Konzentration und Dauer 
der Zellexposition;  
— Begründung für die Auswahl der Konzentrationen und die An ­
zahl der Kulturen, darunter z. B. Angaben zur Zytotoxizität und 
Löslichkeitsgrenze, falls vorhanden;  
— Medienzusammensetzung, ggf. CO  2 -Konzentration;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 315
 
— Konzentration der Prüfsubstanz;  
— Volumen des Vehikels und der beigegebenen Prüfsubstanz;  
— Inkubationstemperatur;  
— Inkubationszeit;  
— Behandlungsdauer;  
— ggf. Zelldichte bei der Beimpfung;  
— Art und Zusammensetzung des Stoffwechselaktivierungssystems 
einschließlich Eignungskriterien;  
— Positiv- und Negativkontrollen;  
— Methoden zur Präparation des Objektträgers;  
— Kriterien für die Auswertung der Aberrationen;  
— Anzahl der analysierten Metaphasen;  
— Methoden zur Bestimmung der Toxizität;  
— Kriterien zur Einstufung der Studien als positiv, negativ oder 
nicht eindeutig.  
Ergebnisse:  
— Toxizitätszeichen, z. B. Konfluenzgrad, Angaben zum Zell ­
zyklus, Zellzahlen, Mitoseindex;  
— Ausfällungszeichen;  
— Angaben zum pH-Wert und zur Osmolalität des Behandlungs ­
mediums, falls ermittelt;  
— Begriffsbestimmungen für Aberrationen, einschließlich Lücken;  
— Anzahl der Zellen mit Chromosomenaberrationen mit getrennter 
Angabe des Chromosomenaberrationstyps für jede behandelte Kultur und Kontrollkultur;
 
— ggf. beobachtete Veränderungen der Ploidie;  
— nach Möglichkeit Dosis-Wirkungs-Verhältnis;  
— ggf. statistische Analysen;  
— Daten zu gleichzeitigen Negativ-(Lösungsmittel-/Vehikel-)Kon ­
trollen und Positivkontrollen;  
— Daten zu historischen Negativ-(Lösungsmittel-/Vehikel-)Kontrol ­
len und Positivkontrollen mit Bereichen, Mittelwerten und Stan ­
dardabweichungen.  
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  
4. LITERATURHINWEISE  
(1) Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Che ­
mical Mutagens, in:  Chemical mutagens,  Principles  and Me­
thods for their Detection,  Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum 
Press, New York and London, 1-29.  
(2) Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T. (1985), The  In Vitro  Chro­
mosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in:  Progress  in Mutation 
Research,  Vol. 5. Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science 
Publishers, Amsterdam-New York-Oxford. 427-432.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 316
 
(3) Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., 
Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Andersen, G. and Zeiger, E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary 
cells: Evaluation of 108 chemicals,  Environs.  Molec.  Mu­
tagen  10 (suppl. 10), 1-175.
 
(4) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9.  Mutation Res.,  257, 147-204.
 
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells, Mutation Res., 268, 297-305.  
(6) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the 
Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mu ­
tation Res., 31, 347-364.  
(7) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation  Res.,  113, 
173-215.  
(8) Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, 
M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of 
Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal Sys ­
tem In Vitro,  J. Induction of Chromosome Aberrations and 
Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Pre ­
sence of Rat-Liver Microsomes,  Mutation Res.,  37, 83-90.
 
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with 
S9 Mix In Vitro,  Mutation Res.,  66, 277-290.  
(10) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK environmental Mutagen Society Working Par ­
ty. Alternatives to Aroclar 1254-induced S9 in  In Vitro  Ge­
notoxicity Assays,  Mutagenesis,  7, 175-177.
 
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as 
an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J., Fouts, J. R., Berid, J. R. and Philpot, R. M. (eds), In Vitro  
Metabolic  Activation  in Mutagenesis  Testing,  Elsevier, 
North-Holland, 85-88.
 
(12) Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Iven, J. L, 
Kirkland, D. J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994), 
Report from Working Group on in  In Vitro  Tests for Chro ­
mosomal Aberrations,  Mutation Res.,  312, 241-261.  
(13) Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., 
Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, in:  Statistical Evaluation 
of Mutagenicity Test Data , Kirkland, D. J., (ed) Cambridge 
University Press, Cambridge, 141-154.
 
(14) Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks 
are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration As ­
says in CHO Cells, Mutation Res, 312, 139-149.  
(15) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Vo ­
latile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L, Schaich, K. M. 
(eds),  Genotoxic Effects of Airborne Agents,  New York, Ple ­
num, 91-103.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 317
 
(16) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells 
Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mu ­
tagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, 795-801.
 
(17) Locke-Huhle, C. (198 3), Endoreduplication in Chinese 
hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mu ­
tation Res., 119, 403-413.  
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (198 3), Aphidico ­
lin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Can ­
cer Res., 43, 1362-1364.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 318
 
B.11.  MUTAGENITÄT — IN-VIVO-TEST AUF CHROMOSOMENA ­
BERRATIONEN IN SÄUGETIERKNOCHENMARKZEL LEN  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht der OECD TG 475, Mammalian Bone 
Marrow Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1. EINLEITUNG  
Der In-vivo-Test auf Chromosomenaberrationen in Säugetierzellen 
dient zum Nachweis von strukturellen Chromosomenaberrationen, 
die von der Prüfsubstanz im Knochenmark von Säugetieren, in der 
Regel Nagetieren, ausgelöst werden (1) (2) (3) (4). Dabei ist zwi ­
schen strukturellen Chromosomen- und Chromatidentypaberrationen 
zu unterscheiden. Eine Zunahme der Polyploidie ist möglicherweise 
ein Hinweis darauf, dass ein chemischer Stoff numerische Aberra ­
tionen hervorzurufen vermag. Bei der Mehrzahl der chemischen Mu ­
tagene sind die Aberrationen dem Chromatidentyp zuzuordnen, doch 
kommen auch Chromosomentypaberrationen vor. Chromosomenmu ­
tationen und ähnliche Vorgänge sind die Ursache für zahlreiche humangenetische Erkrankungen. Es spricht manches dafür, dass Chromosomenmutationen und ähnliche Vorgänge, die Änderungen 
in Onkogenen und Tumorsuppressorgenen auslösen, an der Entste ­
hung von Krebs bei Menschen und in Versuchssystemen beteiligt sind.
 
Bei dieser Prüfung werden routinemäßig Nagetiere eingesetzt. Ziel ­
gewebe ist dabei das Knochenmark, da es sich dabei um ein gefäß ­
reiches Gewebe mit einer Population rasch proliferierender Zellen handelt, die sich leicht isolieren und aufarbeiten lassen. Andere Ver ­
suchstiere und Zielgewebe sind nicht Gegenstand dieser Methode.
 
Dieser Chromosomenaberrationstest ist insbesondere für die Bewer ­
tung der mutagenen Eigenschaften von Relevanz, da er die Berück ­
sichtigung von Faktoren des In-vivo-Stoffwechsels, der Pharmakoki ­
netik und der DNA-Reparaturprozesse ermöglicht, auch wenn diese bei den einzelnen Spezies und Geweben unterschiedlich sind. Ein In- 
vivo-Test ist auch für die weitere Untersuchung einer bei In-vitro- 
Prüfungen festgestellten mutagenen Wirkung von Nutzen.
 
Wenn Anzeichen dafür bestehen, dass die Prüfsubstanz oder ein 
reaktiver Metabolit das Zielgewebe nicht erreicht, ist dieser Test nicht geeignet.
 
Siehe auch allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Chromatidentypaberration:  strukturelle Chromosomenanomalie, 
gekennzeichnet durch Bruch einzelner Chromatiden oder Bruch 
und Reunion zwischen Chromatiden.  
Chromosomentypaberration:  strukturelle Chromosomenanomalie, 
gekennzeichnet durch Bruch oder Bruch und Reunion beider Chro ­
matiden an gleicher Position.  
Endoreduplikation:  Prozess, bei dem der Kern nach einer S-Phase 
der DNA-Replikation keine Mitose durchläuft, sondern in eine wei ­
tere S-Phase eintritt. Das Ergebnis sind Chromosomen mit 4, 8, 16 ... Chromatiden.
 
Gap:  achromatische Läsion von geringerer Breite als eine Chroma ­
tide und mit minimaler Verlagerung der Chromatide(n).  
Numerische Aberration:  Abweichung der Chromosomenzahl vom 
Normalwert, der für die verwendeten Zellen charakteristisch ist.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 319
 
Polyploidie:  Vorhandensein von mehr als zwei haploiden Chromo ­
somensätzen (n) (z. B. 3n, 4n. usw.).  
Strukturelle Aberration:  Veränderung der Chromosomenstruktur, 
nachweisbar durch mikroskopische Untersuchung des Metaphase- Stadiums der Zellteilung, äußert sich in Form von Deletionen und Fragmenten, intra-chromosalen oder reziproken Translokationen.
 
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Die Tiere erhalten die Prüfsubstanz mittels einer geeigneten Exposi ­
tionsform verabreicht und werden zu einem geeigneten Zeitpunkt 
nach der Behandlung getötet. Vor der Tötung werden die Tiere mit einem Spindelgift (z. B. Colchicin oder Colcemid
 ® behandelt. 
Aus den Knochenmarkzellen werden dann Chromosomen präpariert 
und gefärbt, und die Metaphasezellen werden auf Chromosomena ­
berrationen untersucht.  
1.4. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.4.1.  Vorbereitungen  
1.4.1.1.  Versuchstiere  
Gewöhnlich werden Ratten, Mäuse und chinesische Hamster verwen ­
det, doch kommen auch andere geeignete Säugetierarten in Frage. Es sollten gesunde und geschlechtsreife junge Tiere üblicher Labortier ­
stämme zum Einsatz kommen. Zu Beginn des Versuchs sollte die 
Abweichung des Körpergewichts der Tiere vom Mittelwert so gering 
wie möglich sein und bei beiden Geschlechtern nicht mehr als ± 20 % betragen.
 
1.4.1.2.  Haltungs- und Fütterungsbedingungen  
Es gelten die allgemeinen Bedingungen in der allgemeinen Einlei ­
tung zu Teil B, doch ist bei der Luftfeuchtigkeit ein Wert um 50- 
60 % anzustreben.  
1.4.1.3.  Vorbereitung der Tiere  
Gesunde und geschlechtsreife junge Tiere werden randomisiert und 
den einzelnen Kontroll- bzw. Behandlungsgruppen zugeteilt. Die Käfige sind so anzuordnen, dass sich ihre Position möglichst wenig auswirkt. Es erfolgt eine Einzelidentifizierung der Tiere. Die Tiere 
werden über einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen unter La ­
borbedingungen eingewöhnt.
 
1.4.1.4.  Vorbereitung der Dosierung  
Feste Prüfsubstanzen sollten vor der Verabreichung an die Tiere in 
geeigneten Lösungsmitteln oder Vehikeln gelöst oder suspendiert und ggf. verdünnt werden. Flüssige Prüfsubstanzen können direkt 
verabreicht oder zuvor verdünnt werden. Es sind frische Zubereitun ­
gen der Prüfsubstanz zu verwenden, es sei denn die Stabilität der Substanz bei Lagerung wird nachgewiesen.
 
1.4.2.  Prüfbedingungen  
1.4.2.1.  Lösungsmittel/Vehikel  
Das Lösungsmittel/Vehikel sollte bei den gewählten Dosierungen 
keine toxischen Wirkungen hervorrufen und nicht im Verdacht ste ­
hen, mit der Prüfsubstanz eine chemische Reaktion einzugehen. Wer ­
den keine allgemein bekannten Lösungsmittel/Vehikel verwendet, so sind Daten zur Kompatibilität beizubringen. Es ist zu empfehlen, als 
erste Wahl möglichst die Verwendung eines wässrigen 
Lösungsmittels/Vehikels in Erwägung zu ziehen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 320
 
1.4.2.2.  Kontrollen  
Für jeden Versuch und jedes Geschlecht sind gleichzeitig Positiv- 
und Negativ-(Lösungsmittel/Vehikel)-Kontrollen anzulegen. Bis auf die Verabreichung der Prüfsubstanz sind die Tiere der Kontrollgrup ­
pen ebenso zu behandeln wie die Tiere der behandelten Gruppen.
 
Die Positivkontrollen sollten in vivo strukturelle Aberrationen bei 
Expositionskonzentrationen hervorrufen, die voraussichtlich eine er ­
kennbare Zunahme gegenüber dem Hintergrund ergeben. Die Posi ­
tivkontrollkonzentrationen sollten so gewählt werden, dass die Wir ­
kungen eindeutig sind, aber beim Auswerten nicht sofort die Identität 
der kodierten Objektträger erkennen lassen. Es ist vertretbar, dass die Positivkontrolle auf anderem Wege als die Prüfsubstanz verabreicht wird und nur eine Probenahme erfolgt. Ggf. könnte eine zusätzliche 
Positivkontrolle herangezogen werden, die der gleichen chemischen 
Klasse angehört wie die zu prüfende Substanz. Es kommen beispiels ­
weise folgende Positivkontrollsubstanzen in Frage:
 
Substanz CAS-Nummer EINECS-Nummer  
Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7 
Ethylnitrosoharnstoff 759-73-9 212-072-2 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
Cyclophosphamid 
Cyclophosphamidmonohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Triethylenmelamin 51-18-3 200-083-5
 
Zu jedem Zeitpunkt der Probenahme sind Tiere der Negativkontrolle 
einzubeziehen, die nur ein Lösungsmittel erhalten und ansonsten 
ebenso wie die Behandlungsgruppen behandelt werden, soweit nicht aus historischen Kontrolldaten akzeptable Werte zur Variabilität der 
Tiere und Häufigkeit der Zellen mit Chromosomenaberrationen vor ­
liegen. Erfolgt bei den Negativkontrollen nur eine einzige Probenah ­
me, so ist dafür die erste Probenahme der günstigste Zeitpunkt. Darüber hinaus sollten auch unbehandelte Kontrolltiere verwendet 
werden, soweit nicht historische oder veröffentlichte Kontrolldaten 
belegen, dass das gewählte Lösungsmittel/Vehikel keine schädlichen oder mutagenen Wirkungen hervorruft.
 
1.5. VERFAHREN  
1.5.1.  Anzahl und Geschlecht der Tiere  
Jede Behandlungs- und Kontrollgruppe muss pro Geschlecht mindes ­
tens 5 analysierbare Tiere umfassen. Wenn zum Zeitpunkt der Studie 
Daten aus Untersuchungen zur gleichen Spezies und Expositions ­
form vorliegen, die belegen, dass zwischen den Geschlechtern kein nennenswerter Unterschied der Toxizität feststellbar ist, reicht die Prüfung von Tieren nur eines Geschlechts aus. Sollte es sich beim 
Menschen um eine geschlechtsspezifische Exposition handeln, z. B. 
bei bestimmten pharmazeutischen Wirkstoffen, ist der Versuch an Tieren des betreffenden Geschlechts durchzuführen.
 
1.5.2.  Behandlungsplan  
Die Prüfsubstanzen sind möglichst auf einmal zu verabreichen. Die 
Gabe kann aber auch in Form von zwei Teilmengen erfolgen, die am gleichen Tag im Abstand von wenigen Stunden verabreicht werden, 
wenn es sich um ein großes Materialvolumen handelt. Andere Ver ­
abreichungsschemata sollten wissenschaftlich begründet sein.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 321
 
Wenn die Testsubstanz an einem Tag verabreicht wird, sollte zu 
zwei unterschiedlichen Zeitpunkten aufgearbeitet werden. Bei Na ­
gern erfolgt die erste Probenahme im Anschluss an die Behandlung nach Ablauf eines Zeitraums, der der l,5-fachen Dauer des normalen Zellzyklus (der in der Regel 12 bis 18 Std. dauert) entspricht. Da die 
für die Aufnahme und Metabolisierung der Prüfsubstanz sowie für 
die Wirkung auf die Zellzykluskinetik benötigte Zeit den optimalen Zeitpunkt für die Feststellung von Chromosomenaberrationen beein ­
flussen kann, wird empfohlen, 24 Stunden nach der ersten Aufarbei ­
tung eine weitere Aufarbeitung vorzunehmen. Werden Verabrei ­
chungsschemata gewählt, die über einen Tag hinausgehen, sollte die Probenahme im Anschluss an die letzte Behandlung nach Ablauf eines Zeitraums erfolgen, der der l,5-fachen Dauer des normalen 
Zellzyklus entspricht.
 
Vor der Tötung wird den Tieren intraperitoneal eine geeignete Dosis 
eines Spindelgifts (z. B. Colcemid  ® oder Colchicin) verabreicht. Die 
Tiere werden dann zu einem geeigneten Zeitpunkt aufgearbeitet. Bei 
Mäusen beträgt der Zeitabstand ca. 3 bis 5 Stunden, beim chinesi ­
schen Hamster ca. 4 bis 5 Stunden. Aus dem Knochenmark werden Zellen gewonnen und auf Chromosomenaberrationen untersucht.
 
1.5.3.  Dosierungen  
Wird eine Studie zur Dosisfindung durchgeführt, weil keine geeig ­
neten Daten verfügbar sind, so sollte sie im gleichen Labor unter Verwendung der gleichen Spezies, des gleichen Stammes und Ge ­
schlechts und der gleichen Behandlungsform wie im Hauptversuch 
erfolgen (5). Liegt Toxizität vor, so sind zum ersten Zeitpunkt der 
Aufarbeitung drei Dosisstufen zu verwenden. Die Dosisstufen sollten den Bereich vom Höchstwert bis zu geringer oder nicht vorhandener Toxizität umfassen. Bei der späteren Aufarbeitung muss nur die 
Höchstdosis verwendet werden. Unter der Höchstdosis ist jene Dosis 
zu verstehen, die so deutliche Toxizitätszeichen hervorruft, dass hö ­
here Dosisstufen bei gleichem Verabreichungsschema voraussichtlich zum Tode führen. Substanzen mit spezifischen biologischen Aktivi ­
täten bei geringen nichttoxischen Dosen (wie Hormone und Mitoge ­
ne) entsprechen möglicherweise nicht den Dosierungskriterien und sollten anhand einer Einzelfallprüfung bewertet werden. Die Höchst ­
dosis kann auch als jene Dosis definiert werden, die bestimmte An ­
zeichen von Toxizität im Knochenmark hervorruft (z. B. eine Redu ­
zierung des Mitoseindex um mehr als 50 %).
 
1.5.4.  Limit-Test  
Verursacht die Prüfung bei einer Dosis von mindestens 2 000 mg/kg 
Körpergewicht bei Einmalgabe oder Gabe von zwei Teilmengen am 
gleichen Tag keine feststellbaren toxischen Wirkungen und ist auf ­
grund der Daten strukturverwandter Substanzen keine Gentoxizität zu erwarten, kann auf eine vollständige Studie mit drei Dosisstufen 
verzichtet werden. Bei Studien von längerer Dauer beträgt die Limit- 
Dosis 2 000 mg/kg Körpergewicht/Tag bei einer Behandlungsdauer von bis zu 14 Tagen und 1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag bei einer Behandlungsdauer von mehr als 14 Tagen. Die voraussichtlichen 
Expositionswirkungen beim Menschen können aber beim Limit- 
Test eine höhere Dosis angezeigt erscheinen lassen.
 
1.5.5.  Verabreichung  
Die Prüfsubstanz wird in der Regel mittels Magen- oder Schlund ­
sonde bzw. durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Auch andere 
Expositionsformen können bei entsprechender Begründung vertretbar 
sein. Das maximale Flüssigkeitsvolumen, das jeweils durch Sonde oder Injektion verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Das Volumen sollte 2 ml/100 g Körpergewicht 
nicht übersteigen. Die Verwendung eines höheren Volumens ist zu 
begründen. Abgesehen von reizenden oder ätzenden Stoffen, die in der Regel bei höheren Konzentrationen eine verstärkte Wirkung her ­
vorrufen, ist die Variabilität des Prüfvolumens dadurch auf ein Mi ­
nimum zu reduzieren, dass eine Konzentration gewählt wird, die auf 
allen Dosisstufen ein konstantes Volumen gewährleistet.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 322
 
1.5.6.  Chromosomenpräparation  
Unmittelbar nach der Tötung wird das Knochenmark gewonnen, mit 
hypotoner Lösung behandelt und fixiert. Die Zellen werden dann auf Objektträger aufgetropft und gefärbt.
 
1.5.7.  Analyse  
Bei allen behandelten Tieren (einschließlich der Positivkontrollen) 
und unbehandelten Tieren der Negativkontrollgruppe ist der Mitos ­
eindex als Gradmesser der Zytotoxizität in mindestens 1 000 Zellen 
pro Tier zu bestimmen.  
Bei jedem Tier sind mindestens 100 Zellen zu analysieren. Eine 
Reduzierung dieser Zahl ist möglich, wenn eine hohe Zahl von 
Aberrationen beobachtet wird. Alle Objektträger, auch die für die Positiv- und Negativkontrollen, sind vor der mikroskopischen Unter ­
suchung von unabhängiger Seite zu kodieren. Da es bei der Fixie ­
rung häufig zum Bruch eines Teils der Metaphasezellen unter Ver ­
lust von Chromosomen kommt, sollten die ausgewerteten Zellen daher eine Zentromerzahl enthalten, die der Zahl 2n ± 2 entspricht.
 
2. DATEN  
2.1. AUFBEREITUNG DER ERGEBNISSE  
Die Daten für die einzelnen Tiere sind in tabellarischer Form 
darzustellen. Versuchseinheit ist das Tier. Für jedes Tier sind die Anzahl der bewerteten Zellen, die Zahl der Aberrationen 
pro Zelle und der Anteil der Zellen mit strukturellen Chromo ­
somenaberrationen anzugeben. Für die Versuchs- und Kontroll ­
gruppen sind die unterschiedlichen Typen struktureller Chrom ­
somenaberrationen mit Anzahl und Häufigkeit aufzuführen. 
Gaps werden getrennt erfasst und angegeben, aber in der Re ­
gel nicht bei der Gesamthäufigkeit der Aberrationen berück ­
sichtigt. Gibt es keine Anhaltspunkte für unterschiedliche Re ­
aktionen der Geschlechter, so können die Daten für beide 
Geschlechter zur statistischen Analyse zusammengefasst werden.
 
2.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Es gibt mehrere Kriterien für die Bestimmung eines positiven Ergeb ­
nisses, wie z. B. eine dosisbezogene Zunahme der Anzahl der Zellen 
mit Chromosomenaberrationen oder eine eindeutige Zunahme der 
Anzahl der Zellen mit Aberrationen in einer bestimmten Dosisgruppe zu einem bestimmten Zeitpunkt der Probenahme. Zunächst sollte die biologische Relevanz der Ergebnisse untersucht werden. Als Hilfs ­
mittel bei der Bewertung der Versuchsergebnisse können statistische 
Methoden dienen (6). Die statistische Signifikanz sollte aber nicht der einzige bestimmende Faktor für eine positive Reaktion sein. Nicht eindeutige Ergebnisse sollten durch weitere Prüfungen abge ­
klärt werden, möglichst unter Abänderung der Versuchsbedingungen.
 
Eine zahlenmäßige Zunahme der Polyploidie deutet möglicherweise 
darauf hin, dass die Prüfsubstanz numerische Chromosomenaberra ­
tionen hervorzurufen vermag. Eine zahlenmäßige Zunahme der En ­
doreduplikation ist möglicherweise ein Anzeichen dafür, dass die Prüfsubstanz die Zellzyklusprogression zu hemmen vermag (7) (8).
 
Eine Prüfsubstanz, bei denen die Ergebnisse nicht den oben genann ­
ten Kriterien entsprechen, gilt in diesem System als nichtmutagen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 323
 
Auch wenn die meisten Versuche eindeutig positive oder negative 
Ergebnisse liefern, erlaubt der Datensatz in seltenen Fällen keine 
definitive Aussage über die Aktivität der Prüfsubstanz. Es kommt vor, dass sich die Ergebnisse unabhängig davon, wie oft der Versuch wiederholt wird, weiterhin als nicht eindeutig oder als fragwürdig 
erweisen.
 
Positive Befunde des In-vivo-Chromosomenaberrationstests deuten 
darauf hin, dass die Prüfsubstanz im Knochenmark der untersuchten Spezies Chromosomenaberrationen hervorruft. Negative Befunde 
sind ein Anzeichen dafür, dass die Prüfsubstanz unter diesen Ver ­
suchsbedingungen keine Chromosomenaberrationen im Knochen ­
mark der untersuchten Spezies hervorruft.
 
Zu erörtern ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Prüfsubstanz oder 
ihre Metaboliten in den allgemeinen Blutkreislauf bzw. in das spezi ­
fische Zielgewebe gelangen (z. B. systemische Toxizität).  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:  
Lösungsmittel/Vehikel:  
— Begründung für die Wahl des Vehikels;  
— Löslichkeit und Stabilität der Prüfsubstanz im Lösungsmittel/ 
Vehikel, falls bekannt.  
Versuchstiere:  
— Spezies/Stamm:  
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere;  
— Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.;  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Prüfungsbeginn, einschließlich 
Bereich des Körpergewichts, Mittelwert und Standardabweichung für jede Gruppe.
 
Prüfbedingungen:  
— Positiv- und Negativ-(Vehikel-/Lösungsmittel-)Kontrollen;  
— Daten aus einer ggf. durchgeführten Dosisfindungsstudie;  
— Begründung der gewählten Dosisstufen;  
— Angaben zur Zubereitung der Prüfsubstanz;  
— Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz;  
— Begründung für den Verabreichungsweg;  
— ggf. Methoden zur Überprüfung, ob die Prüfsubstanz in den all ­
gemeinen Kreislauf oder in das Zielgewebe gelangt;  
— ggf. Angaben zur Umrechnung der Konzentration der Prüfsub ­
stanz im Futter/Wasser (ppm) in die entsprechende Dosis (mg/kg Körpergewicht/Tag);
 
— Angaben über Futter- und Wasserqualität;  
— nähere Angaben zum Behandlungs- und Stichprobenentnahme ­
plan;  
— Methoden zur Bestimmung der Toxizität;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 324
 
— Bezeichnung des Spindelgifts, Konzentration und Behandlungs ­
dauer;  
— Methoden zur Präparation des Objektträgers;  
— Kriterien zur Bewertung von Aberrationen;  
— Anzahl der analysierten Zellen pro Tier;  
— Kriterien zur Einstufung der Studien als positiv, negativ oder 
nicht eindeutig.  
Ergebnisse:  
— Toxizitätszeichen;  
— Mitoseindex;  
— Typ und Anzahl der Aberrationen, für jedes Tier gesondert an ­
zugeben;  
— Gesamtzahl der Aberrationen pro Gruppe mit Mittelwerten und 
Standardabweichungen;  
— Anzahl der Zellen mit Aberrationen pro Gruppe mit Mittelwerten 
und Standardabweichungen;  
— ggf. beobachtete Veränderungen der Ploidie;  
— nach Möglichkeit Dosis-Wirkungs-Verhältnis;  
— ggf. statistische Analysen;  
— Daten zu gleichzeitigen Negativkontrollen;  
— Daten zu historischen Negativkontrollen mit Bereichen, Mittel ­
werten und Standardabweichungen;  
— Daten zu gleichzeitigen Positivkontrollen  
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  
4. LITERATURHINWEISE  
(1) Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutage ­
nicity Testing:  a Practical Approach,  S. Venitt and J. M. Parry 
(eds.). IRL Press, Oxford, Washington D. C, 275-306.  
(2) Preston. R. J., Dean, B. I., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. 
F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In  Vivo  Cytogenetic 
Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation  Res.,  189. 157-165.
 
(3) Richold, M., Chandly, A., Ashby, J., Gatehouse D. G., Boot ­
man, J., and Henderson, L. (1990),  In Vivo  Cytogenetic Assays, 
in: D. J. Kirkland, (ed.), Basic Mutagenicity  Tests, UKEMS 
Recommended Procedures.  UKEMS  Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing Report. Part I revised,  Cambridge 
University Press, Cambridge, New Cork, Port Chester, Mel ­
bourne, Sydney, 115-141.  
(4) Tice, R. R. Hayashi, M., MacGregor, J. T., Anderson, D., Bla ­
key, D. H., Holden, H. E., Kirch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Paccierotti, F., Preston R. J., Romagna F., Shimada, H., Sutou, 
S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on 
the In Vivo  Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration 
Test, Mutation  Res.,  312, 305-312.
 
(5) Fielder, R. J., Alleen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker. G., Mor ­
ton, D, B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK, Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose setting in In  Vivo  Mutagenicity Assays,  
Mutagenesis,  7, 313-319.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 325
 
(6) Lovell, D. P. Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and 
Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In  Vivo  Cytoge­
netic Assays, in:  UKEMS Sub-Commitee on Guidelines for  Mu­
tagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation  of Mu­
tagenicity Test Data,  D. J. Kirkland, (ed.) Cambridge University 
Press, Cambridge, 184-232.  
(7) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res. 119, 403-413.
 
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells,  Cancer 
Res.,  43, 1363-1364.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 326
 
B.12.  MUTAGENITÄT — IN-VIVO-ERYTHROZYTEN-MIKRO ­
KERNTEST BEI SÄUGERN  
1. METHODE  
Die Methode entspricht der OECD TG 474, Mammalian Erythrocyte 
Micronucleus Test (1997).  
1.1. EINLEITUNG  
Der In-vivo-Mikrokerntest bei Säugern dient zum Nachweis einer 
von der Prüfsubstanz in den Chromosomen oder im mitotischen Apparat von Erythroblasten hervorgerufenen Schädigung durch Ana ­
lyse der Erythrozyten aus dem Knochenmark und/oder dem periphe ­
ren Blut von Tieren, in der Regel Nagern.
 
Zweck des Mikrokerntests ist der Nachweis von Substanzen, die 
zytogenetische Schäden hervorrufen, durch die es zur Bildung von Mikrokernen mit zurückgebliebenen Chromosomenfragmenten oder 
ganzen Chromosomen kommt.
 
Wenn sich ein Knochenmarkerythroblast zu einem polychromati ­
schen Erythrozyten entwickelt, wird der Hauptkern ausgestoßen. Da ­
bei kann aber ein möglicherweise entstandener Mikrokern im ansons ­
ten entkernten Zytoplasma verbleiben. Die Sichtbarmachung der Mi ­
krokerne wird in diesen Zellen dadurch erleichtert, dass sie keinen Hauptkern aufweisen. Eine Zunahme der Häufigkeit von polychro ­
matischen mikrokernhaltigen Erythrozyten in behandelten Tieren 
deutet auf die Verursachung einer Chromosomenschädigung hin.
 
Routinemäßig wird bei diesem Test das Knochenmark von Nagern 
verwendet, da in diesem Gewebe polychromatische Erythrozyten er ­
zeugt werden. Zur Bestimmung von nicht ausgereiften (polychroma ­
tischen) mikrokernhaltigen Erythrozyten im peripheren Blut kann 
aber auch jede Spezies herangezogen werden, bei der erwiesenerma ­
ßen die Milz keine mikrokernhaltigen Erythrozyten abzubauen ver ­
mag oder eine ausreichende Sensibilität für den Nachweis von Agen ­
zien, die strukturelle oder numerische Chromosomenaberrationen 
verursachen, gegeben ist. Mikrokerne lassen sich mit Hilfe einer Reihe von Kriterien differenzieren. Dazu zählen die Feststellung des Vorhandenseins oder Fehlens einer Kinetochor- bzw. Zentro ­
mer-DNA in den Mikrokernen. Hauptendpunkt ist die Häufigkeit 
der nicht ausgereiften (polychromatischen) mikrokernhaltigen Ery ­
throzyten. Werden die Tiere kontinuierlich über einen Zeitraum von 4 Wochen oder länger behandelt, kommt aber auch der Anteil 
der Mikrokerne enthaltenden ausgereiften (normochromatischen) 
Erythrozyten an einer bestimmten Zahl ausgereifter Erythrozyten im peripheren Blut als Endpunkt des Tests in Betracht.
 
Der In-vivo-Mikrokerntest bei Säugetieren ist für die Bewertung des 
mutagenen Risikos von besonderer Bedeutung, da er die Berück ­
sichtigung von Faktoren des In-vivo-Stoffwechsels, der Pharmakoki ­
netik und der DNA-Reparaturprozesse ermöglicht, auch wenn diese bei den einzelnen Spezies, Gewebearten und genetischen Endpunkten 
unterschiedlich sind. Ein In-vivo-Versuch ist auch für weitere Unter ­
suchungen der mittels In-vitro-System festgestellten mutagenen Wir ­
kungen von Nutzen.
 
Gibt es Anzeichen dafür, dass die Prüfsubstanz oder ein reakti ­
ver Metabolit das Zielgewebe nicht erreicht, ist dieser Test nicht 
geeignet.  
Siehe auch allgemeine Einleitung zu Teil B.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 327
 
1.2. DEFINITIONEN  
Zentromer (Kinetochor):  Region(en) eines Chromosoms, an die 
während der Zellteilung die Spindelfasern anhaften, wodurch die ordnungsgemäße Beförderung der Tochterchromosomen zu den Po ­
len der Tochterzellen ermöglicht wird.
 
Mikrokerne:  kleine Kerne zusätzlich zu den Hauptkernen der Zellen 
und von diesen getrennt, die während der Telophase der Mitose 
(Meiose) durch zurückgebliebene Chromosomenteile oder ganze 
Chromosomen gebildet werden.  
Normochromatischer Erythrozyt:  reifer Erythrozyt, der keine Ri ­
bosomen aufweist und sich von unreifen polychromatischen Erythro ­
zyten mit Hilfe ribosomenselektiver Farbstoffe unterscheiden lässt.  
Polychromatischer Erythrozyt:  unreifer Erythrozyt, der sich in sei ­
ner Zwischenstufe der Entwicklung befindet und noch Ribosomen 
enthält, so dass er sich mit Hilfe ribosomenselektiver Farbstoffe von 
reifen normochromatischen Erythrozyten unterscheiden lässt.  
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Die Prüfsubstanz wird den Tieren über einen geeigneten Applikati ­
onsweg verabreicht. Bei Verwendung von Knochenmark werden sie zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der Behandlung getötet. Das 
Knochenmark wird entnommen, präpariert und gefärbt (1) (2) (3) 
(4) (5) (6) (7). Findet peripheres Blut Verwendung, so wird es zu geeigneten Zeitpunkten nach der Behandlung entnommen, und es werden Ausstrichpräparate hergestellt und gefärbt (4) (8) (9) (10). 
Bei Versuchen mit peripherem Blut sollte zwischen der letzten Ex ­
position und der Zellgewinnung möglichst wenig Zeit vergehen. Die Präparate werden auf das Vorhandensein von Mikrokernen unter ­
sucht.
 
1.4. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.4.1.  Vorbereitungen  
1.4.1.1.  Versuchstiere  
Bei Verwendung von Knochenmark ist der Einsatz von Mäusen oder 
Ratten zu empfehlen, doch kommt jede geeignete Säugerspezies in 
Betracht. Wird peripheres Blut verwendet, so empfiehlt sich der Ein ­
satz von Mäusen. Es kommt aber auch jede andere geeignete Säu ­
gerspezies in Frage, wenn es sich um eine Spezies handelt, bei der erwiesenermaßen die Milz keine mikrokernhaltigen Erythrozyten ab ­
baut oder eine ausreichende Empfindlichkeit für den Nachweis von 
Agenzien, die strukturelle oder numerische Chromosomenaberratio ­
nen verursachen, gegeben ist. Es sollten junge gesunde Tiere übli ­
cher Labortierstämme zum Einsatz kommen. Zu Beginn des Ver ­
suchs sollte die Abweichung des Körpergewichts der Tiere vom Mittelwert möglichst gering sein und bei beiden Geschlechtern nicht mehr als ± 20 % betragen.
 
1.4.1.2.  Haltungs- und Fütterungsbedingungen  
Es gelten die allgemeinen Bedingungen in der allgemeinen Einlei ­
tung zu Teil B, doch ist bei der Luftfeuchtigkeit ein Wert von 50- 
60 % anzustreben.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 328
 
1.4.1.3.  Vorbereitung der Tiere  
Gesunde und geschlechtsreife junge Tiere werden randomisiert und 
den einzelnen Kontroll- bzw. Behandlungsgruppen zugeteilt. Es er ­
folgt eine Einzelidentifizierung der Tiere. Die Tiere werden über 
einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen unter Laborbedingungen 
eingewöhnt. Die Käfige sind so anzuordnen, dass sich ihre Position möglichst wenig auswirkt.
 
1.4.1.4.  Vorbereitung der Dosierung  
Feste Prüfsubstanzen sollten vor der Verabreichung an die Tiere in 
geeigneten Lösungsmitteln oder Vehikeln gelöst oder suspendiert 
und ggf. verdünnt werden. Flüssige Prüfsubstanzen können direkt verabreicht oder zuvor verdünnt werden. Es sind frische Zubereitun ­
gen der Prüfsubstanz zu verwenden, es sei denn, die Stabilität der 
Substanz bei Lagerung wird nachgewiesen.
 
1.4.2.  Prüfbedingungen  
1.4.2.1.  Lösungsmittel/Vehikel  
Das Lösungsmittel/Vehikel sollte bei den gewählten Dosierungen 
keine toxischen Wirkungen hervorrufen und nicht in Verdacht ste ­
hen, mit der Prüfsubstanz eine chemische Reaktion einzugehen. Wer ­
den keine allgemein bekannten Lösungsmittel/Vehikel verwendet, so sind Referenzdaten zur Kompatibilität beizubringen. Es ist zu emp ­
fehlen, als erste Wahl möglichst die Verwendung eines wässrigen 
Lösungsmittels/Vehikels in Erwägung zu ziehen.
 
1.4.2.2.  Kontrollen  
Bei jedem Versuch sind gleichzeitig Positiv- und Negativkontrollen 
für jedes Geschlecht anzulegen. Bis auf die Verabreichung der Prüf ­
substanz sind die Tiere der Kontrollgruppen ebenso zu behandeln wie die Tiere der Behandlungsgruppen.
 
Die Positivkontrollen sollten in vivo Mikrokerne bei Expositionskon ­
zentrationen hervorrufen, die voraussichtlich eine erkennbare Zu ­
nahme gegenüber dem Hintergrund ergeben. Die Positivkontrollkon ­
zentrationen sollten so gewählt werden, dass die Wirkungen eindeu ­
tig sind, aber beim Auswerten nicht sofort die Identität der kodierten Objektträger erkennen lassen. Es ist vertretbar, dass die Positivkon ­
trolle auf anderem Wege als die Prüfsubstanz verabreicht wird und 
nur eine Aufarbeitung erfolgt. Gegebenenfalls könnte eine zusätzli ­
che Positivkontrolle herangezogen werden, die der gleichen che ­
mischen Klasse angehört wie die zu prüfende Substanz. Es kommen beispielsweise folgende Positivkontrollsubstanzen in Frage:
 
Substanz CAS-Nummer EINECS-Nummer  
Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7 
N-ethyl-N-nitrosoharnstoff 759-73-9 212-072-2 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 Cyclophosphamid 
Cyclophosphamidmonohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Triethylenmelamin 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 329
 
Zu jedem Zeitpunkt der Probenahme sind Tiere der Negativkontrolle 
einzubeziehen, die nur ein Lösungsmittel oder Vehikel erhalten und 
ansonsten ebenso wie die Behandlungsgruppen behandelt werden, soweit nicht aus historischen Kontrolldaten akzeptable Werte zur Variabilität der Tiere und Häufigkeit der Zellen mit Mikrokernen 
vorliegen. Erfolgt bei den Negativkontrollen nur eine einzige Auf ­
arbeitung, so ist dafür die erste Aufarbeitung der günstigste Zeit ­
punkt. Darüber hinaus sollten auch unbehandelte Kontrolltiere ver ­
wendet werden, soweit nicht historische oder veröffentlichte Kon ­
trolldaten belegen, dass das gewählte Lösungsmittel/Vehikel keine 
schädlichen oder mutagenen Wirkungen hervorruft.
 
Bei Verwendung von peripherem Blut ist als gleichzeitige Negativ ­
kontrolle möglicherweise auch eine vor der Behandlung entnommene 
Probe vertretbar, jedoch nur bei Kurzzeitstudien an peripherem Blut 
(z. B. 1 bis 3 Gaben) und unter der Voraussetzung, dass sich die gewonnenen Daten in dem Bereich bewegen, den die historische Kontrolle erwarten lässt.
 
1.5. VERFAHREN  
1.5.1.  Anzahl und Geschlecht der Tiere  
Jede Behandlungs- und Kontrollgruppe muss pro Geschlecht mindes ­
tens 5 analysierbare Tiere umfassen (11). Wenn zum Zeitpunkt der Studie Daten aus Untersuchungen zur gleichen Spezies und Exposi ­
tionsform vorliegen, die belegen, dass zwischen den Geschlechtern 
kein nennenswerter Unterschied der Toxizität feststellbar ist, reicht 
die Prüfung von Tieren nur eines Geschlechts aus. Sollte es sich beim Menschen um eine geschlechtsspezifische Exposition handeln, 
z. B. bei bestimmten pharmazeutischen Wirkstoffen, ist der Versuch 
an Tieren des betreffenden Geschlechts durchzuführen.
 
1.5.2.  Behandlungsplan  
Es lässt sich kein Standard-Behandlungsplan (d. h. 1, 2 oder mehr 
Gaben im Abstand von 24 Stunden) empfehlen. Die bei längerer Verabreichung entnommenen Stichproben sind akzeptabel, solange 
für diese Studie ein positives Ergebnis nachgewiesen wurde bzw. 
solange bei einer negativen Studie Toxizität nachgewiesen oder die Limit-Testdosis verwendet wurde und die Verabreichung bis zum Zeitpunkt der Probenahme erfolgt Die Gabe kann aber auch in 
Form von zwei Teilmengen erfolgen, die am gleichen Tag im Ab ­
stand von wenigen Stunden verabreicht werden, wenn es sich um ein großes Materialvolumen handelt.
 
Die Prüfung kann auf zweierlei Weise durchgeführt werden:  
a) Die Tiere erhalten die Prüfsubstanz einmal. Knochenmark wird 
mindestens zweimal aufgearbeitet, wobei die erste Aufarbeitung frühestens 24 Stunden nach Applikation und die letzte spätestens 48 Stunden nach Applikation erfolgen muss. Zwischen den Auf ­
arbeitungsweiten müssen angemessene Abstände sein. Wird eine 
Probe bereits früher als 24 Stunden nach der Behandlung entnom ­
men, so ist dies zu begründen. Bei Verwendung peripheren Bluts werden mindestens zweimal Proben entnommen, wobei die erste 
Probenahme frühestens 36 Stunden nach der Behandlung und die 
letzte spätestens 72 Stunden nach der Behandlung zu erfolgen hat und nach der ersten Probenahme entsprechende Abstände ein ­
zuhalten sind. Wird bei einer Probenahme eine positive Reaktion 
verzeichnet, so ist die Entnahme weiterer Proben nicht erforder ­
lich.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 330
 
b) Bei zwei oder mehr Gaben pro Tag (d. h. zwei oder mehr Gaben 
im Abstand von 24 Stunden) sind die Proben bei der Verwen ­
dung von Knochenmark einmal zwischen 18 und 24 Stunden nach der letzten Gabe und bei Verwendung von peripherem Blut einmal zwischen 36 und 48 Stunden nach der letzten Gabe 
zu entnehmen (12).
 
Bei Bedarf können zu anderen Zeitpunkten weitere Probenahmen 
erfolgen.  
1.5.3.  Dosierungen  
Wird eine Studie zur Dosisfindung durchgeführt, weil keine geeig ­
neten Daten verfügbar sind, so sollte sie im gleichen Labor unter 
Verwendung der gleichen Spezies, des gleichen Stammes und Ge ­
schlechts und der gleichen Behandlungsform wie im Hauptversuch erfolgen (13). Liegt Toxizität vor, so sind zum ersten Zeitpunkt der 
Probenahme drei Dosisstufen zu verwenden. Die Dosisstufen sollten 
den Bereich vom Höchstwert bis zu geringer oder nicht vorhandener Toxizität umfassen. Bei der späteren Probenahme muss nur die Höchstdosis verwendet werden. Unter der Höchstdosis ist jene Dosis 
zu verstehen, die so deutliche Toxizitätszeichen hervorruft, dass hö ­
here Dosisstufen bei gleichem Verabreichungsschema voraussichtlich zum Tode führen. Substanzen mit spezifischen biologischen Aktivi ­
täten bei geringen nichttoxischen Dosen (wie Hormone und Mitoge ­
ne) entsprechen möglicherweise nicht den Dosierungskriterien und 
sollten anhand einer Einzelfallprüfung bewertet werden. Die Höchst ­
dosis kann auch als jene Dosis definiert werden, die bestimmte An ­
zeichen von Toxizität im Knochenmark hervorruft (z. B. eine Redu ­
zierung des Anteils unreifer Erythrozyten an der Gesamtzahl der 
Erythrozyten im Knochenmark oder peripheren Blut).
 
1.5.4.  Limit-Test  
Verursacht die Prüfung einer Dosis von mindestens 2 000 mg/kg 
Körpergewicht bei Einmalgabe oder Gabe von zwei Teilmengen am gleichen Tag keine feststellbaren toxischen Wirkungen und ist 
eine Gentoxizität angesichts von Daten für strukturverwandte Sub ­
stanzen nicht zu erwarten, kann auf eine vollständige Studie mit drei Dosisstufen verzichtet werden. Bei Studien von längerer Dauer be ­
trägt die Limit-Dosis 2 000 mg/kg Körpergewicht/Tag bei einer Be ­
handlungsdauer von bis zu 14 Tagen und 1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag bei einer Behandlungsdauer von mehr als 14 Tagen. Die voraussichtlichen Expositionswirkungen beim Menschen 
können aber beim Limit-Test eine höhere Dosis angezeigt erscheinen 
lassen.
 
1.5.5.  Verabreichung  
Die Prüfsubstanz wird in der Regel mittels Magen- oder 
Schlundsonde bzw. durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Auch andere Expositionsformen können bei entsprechender Be ­
gründung vertretbar sein. Das maximale Flüssigkeitsvolumen, 
das jeweils durch Sonde oder Injektion verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Das Volu ­
men sollte 2 ml/100 g Körpergewicht nicht übersteigen. Die 
Verwendung eines höheren Volumens ist zu begründen. Abge ­
sehen von reizenden oder ätzenden Stoffen, die in der Regel bei höheren Konzentrationen eine verstärkte Wirkung hervor ­
rufen, ist die Variabilität des Prüfvolumens dadurch auf ein 
Minimum zu reduzieren, dass eine Konzentration gewählt wird, 
die auf allen Dosisstufen ein konstantes Volumen gewährleistet.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 331
 
1.5.6.  Knochenmark/Blutpräparation  
Die Knochenmarkzellen werden in der Regel unmittelbar nach der 
Tötung aus den Oberschenkel- oder Schienbeinknochen gewonnen. Dabei werden die Zellen gewöhnlich aus den Oberschenkel- oder 
Schienbeinknochen entnommen und unter Verwendung erprobter 
Methoden präpariert und gefärbt. Das periphere Blut wird aus der Schwanzvene oder einem anderen geeigneten Blutgefäß entnommen. Die Blutzellen werden sofort supravital gefärbt (8) (9) (10), oder es 
werden Ausstrichpräparate hergestellt und dann gefärbt. Durch Ver ­
wendung eines DNA-spezifischen Farbstoffs (z. B. Acridin Orange (14) oder Hoechst 33258 plus pyronin-Y (15)) lassen sich bestimmte 
Artefakte vermeiden, die bei Verwendung eines nicht DNA-spezi ­
fischen Farbstoffs auftreten. Trotz dieses Vorteils ist aber die Ver ­
wendung herkömmlicher Farbstoffe (z. B. Giemsa) nicht aus ­
geschlossen. Zusätzliche Systeme (z. B. Cellulosesäulen zur Entfer ­
nung kernhaltiger Zellen (16)) können ebenfalls verwendet werden, 
falls sich diese Systeme nachweislich bei der Mikrokernpräparation im Labor bewährt haben.
 
1.5.7.  Analyse  
Der Anteil unreifer Erythrozyten an der Gesamtzahl 
(unreife + reife Erythrozyten) wird für jedes Tier bestimmt, 
indem bei Verwendung von Knochenmark mindestens 200 Ery ­
throzyten und bei Verwendung von peripherem Blut mindestens 1 000 Erythrozyten gezählt werden (17). Alle Objektträger, auch 
die für Positiv und Negativkontrollen, sind vor der mikroskopi ­
schen Analyse von unabhängiger Seite zu kodieren. Je Tier werden mindestens 2 000 unreife Erythrozyten auf das Vorhan ­
densein von unreifen mikrokernhaltigen Erythrozyten untersucht. 
Zusätzlichen Aufschluss kann die Untersuchung reifer Erythrozy ­
ten auf Mikrokerne geben. Bei der Analyse der Objektträger sollte der Anteil der unreifen Erythrozyten nicht weniger als 
20 % des Kontrollwerts betragen. Werden die Tiere kontinuier ­
lich über einen Zeitraum von 4 Wochen oder länger behandelt, können auch mindestens 2 000 reife Erythrozyten pro Tier auf das Vorhandensein von Mikrokernen untersucht werden. Auto ­
matisierte Analysesysteme (Bildanalyse und Zellsuspensions- 
Durchflusszytometrie) stellen bei entsprechender Begründung und Validierung vertretbare Alternativen zur manuellen Auswer ­
tung dar.
 
2. DATEN  
2.1. AUFBEREITUNG DER ERGEBNISSE  
Die Daten für die einzelnen Tiere sind in tabellarischer Form dar ­
zustellen. Versuchseinheit ist das Tier. Für jedes Tier gesondert sind die Anzahl der bewerteten unreifen Erythrozyten, die Anzahl der 
unreifen mikrokernhaltigen Erythrozyten und der Anteil der unreifen 
Erythrozyten an der Gesamterythrozytenzahl anzugeben. Werden die Tiere kontinuierlich über einen Zeitraum von 4 Wochen oder länger behandelt, sollten auch die Daten über die reifen Erythrozyten ange ­
geben werden, wenn sie erfasst wurden. Für jedes Tier wird der 
Anteil der unreifen Erythrozyten an der Gesamterythrozytenzahl und ggf. der Anteil der mikrokernhaltigen Erythrozyten angegeben. Gibt es keine Anhaltspunkte für unterschiedliche Reaktionen der 
Geschlechter, so können die Daten für beide Geschlechter zur statis ­
tischen Analyse zusammengefasst werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 332
 
2.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Es gibt mehrere Kriterien für die Bestimmung eines positiven Ergeb ­
nisses, wie z. B. eine dosisbezogene Zunahme der Anzahl von Mi ­
krokernzellen oder eine deutliche Zunahme der Anzahl von Mikro ­
kernzellen in einer bestimmten Dosisgruppe zu einem bestimmten 
Zeitpunkt der Probenahme. Zunächst sollte die biologische Relevanz der Ergebnisse untersucht werden. Als Hilfsmittel bei der Bewertung der Versuchsergebnisse können statistische Methoden dienen (18) 
(19). Die statistische Signifikanz sollte aber nicht der einzige bestim ­
mende Faktor für eine positive Reaktion sein. Nicht eindeutige Er ­
gebnisse sollten durch weitere Prüfungen abgeklärt werden, mög ­
lichst unter Abänderung der Versuchsbedingungen.
 
Eine Prüfsubstanz, bei der die Ergebnisse nicht den oben genannten 
Kriterien entsprechen, gilt bei diesem Test als nichtmutagen.  
Auch wenn die meisten Versuche eindeutig positive oder negative 
Ergebnisse liefern, erlaubt der Datensatz in seltenen Fällen keine 
definitive Aussage über die Aktivität der Prüfsubstanz. Es kommt vor, dass sich die Ergebnisse unabhängig davon, wie oft der Versuch wiederholt wird, weiterhin als nicht eindeutig oder als fragwürdig 
erweisen.
 
Positive Ergebnisse des Mikrokerntests deuten darauf hin, dass die 
Prüfsubstanz Mikrokerne verursacht, die infolge einer Chromoso ­
menschädigung oder einer Schädigung des mitotischen Apparats in den Erythroblasten der geprüften Spezies entstehen. Negative Be ­
funde sind ein Anzeichen dafür, dass die Prüfsubstanz unter diesen 
Versuchsbedingungen in den unreifen Erythrozyten der geprüften 
Spezies keine Mikrokerne verursacht.
 
Zu erörtern ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Prüfsubstanz oder 
ihre Metaboliten in den allgemeinen Blutkreislauf oder in das spezi ­
fische Zielgewebe gelangen (z. B. systemische Toxizität).  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:  
Lösungsmittel/Vehikel:  
— Begründung für die Wahl des Vehikels;  
— Löslichkeit und Stabilität der Prüfsubstanz im Lösungsmittel/ ­
Vehikel, falls bekannt;  
Versuchstiere:  
— Spezies/Stamm;  
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere;  
— Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.;  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Prüfungsbeginn, einschließlich 
Bereich des Körpergewichts, Mittelwert und Standardabweichung 
für jede Gruppe;  
Prüfbedingungen:  
— Positiv- und Negativ-(Vehikel-/Lösungsmittel-)Kontrollen;  
— Daten aus einer ggf. durchgeführten Dosisfindungsstudie;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 333
 
— Begründung der gewählten Dosisstufen;  
— Angaben zur Zubereitung der Prüfsubstanz;  
— Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz:  
— Begründung für den Verabreichungsweg;  
— ggf. Methoden zur Überprüfung, ob die Prüfsubstanz in den all ­
gemeinen Kreislauf oder in das Zielgewebe gelangt;  
— ggf. Angaben zur Umrechnung der Konzentration der Prüfsub ­
stanz im Futter/Wasser (ppm) in die entsprechende Dosis (mg/kg Körpergewicht/Tag);
 
— Angaben über Futter- und Wasserqualität;  
— nähere Angaben zum Behandlungs- und Stichprobenentnahme ­
plan;  
— Methoden zur Präparation des Objektträgers;  
— Methoden zur Bestimmung der Toxizität;  
— Kriterien zur Bewertung unreifer mikrokernhaltiger Erythrozyten:  
— Zahl der analysierten Zellen pro Tier;  
— Kriterien zur Bewertung der Studien als positiv, negativ oder 
nicht eindeutig.  
Ergebnisse:  
— Toxizitätszeichen;  
— Anteil der unreifen Erythrozyten an der Gesamtzahl der Erythro ­
zyten;  
— Anzahl der unreifen mikrokernhaltigen Erythrozyten, für jedes 
Tier gesondert anzugeben;  
— Mittelwert ± Standardabweichung der unreifen mikrokernhaltigen 
Erythrozyten je Gruppe;  
— nach Möglichkeit Dosis-Wirkungs-Verhältnis;  
— verwendete statistische Analysen und Methoden;  
— Daten zu gleichzeitigen und historischen Negativkontrollen;  
— Daten zu gleichzeitigen Positivkontrollen.  
— Diskussion der Ergebnisse.  
— Schlussfolgerungen.  
4. LITERATURHINWEISE  
(1) Heddle, J. A. (1973), A Rapid  In Vivo  Test for Chromosomal 
Damage,  Mutation Res.,  18, 187-190.  
(2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test,  Mutation Res ., 31, 
9-15.  
(3) Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Ma ­
vournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The 
Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity,  Muta­
tion Res.  123, 61-118.  
(4) Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C, Salamone, 
M. F. and Heddle, J. A. (1990), The  In Vivo  Micronucleus 
Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A 
report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox 
Program,  Mutation Res.,  239, 29-80.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 334
 
(5) MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N., and Wehr, C. M. 
(1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in:  Developments in Science and Practice 
of Toxicology,  ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya, 
Elsevier, Amsterdam, 555-558.
 
(6) MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., 
Ramel, C., Salamone, M. F., Tice, R. R. and Wild, D. (1987), 
Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mam ­
malian Bone Marrow Erythrocytes,  Mutation Res.,  189, 103- 
112. 
(7) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., and Shelby, M. 
E. (1990), The in  vivo  Erythrocyte Micronucleus Test: Measu ­
rement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl.  Toxicol.  14, 
513-522.
 
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, 
M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral 
Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides,  
Mutation Res.,  245, 245-249.  
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Ery ­
throcytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Sum ­
mary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/ ­
JEMMS, MMS,  Mutation Res.,  278, 83-98.  
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study 
Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) 
(1995). Protocol recommended for the short-term mouse peri ­
pheral blood micronucleus test,  Mutagenesis,  10, 153-159.  
(11) Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., 
Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., 
Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and 
Vannier, B. (1994),  In Vivo,  Rodent Erythrocyte Micronucleus 
Assay,  Mutation Res ., 312, 293-304.  
(12) Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised 
sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse 
peripheral blood micronucleus test,  Mutagenesis, 10,  313-319.  
(13) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Mor ­
ton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen So ­
ciety Working Group: Dose Setting in  In Vivo  Mutagenicity 
Assays,  Mutagenesis,  7, 313-319.
 
(14) Hayashi, M, Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Ap ­
plication of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Mi ­
cronucleus Test, Mutation Res., 120, 241-247.  
(15) MacGregor, J. T., Wehr, C M. and Langlois, R. G. (1983), A 
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and 
RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  
Mutation Res ., 120, 269-275.  
(16) Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone 
marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, 91-104.  
(17) Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for 
the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte 
ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation  Res ., 
347, 97-99.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 335
 
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D. G. and Henderson, L. (1990),  In Vivo  Cytogenetics Assay, 
in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests.  UKEMS 
Recommended Procedures. UKEMS  Sub-Committee  on Guide­
lines  for Mutagenicity Testing. Report,  Part I, revised,  Cam­
bridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, 
Melbourne, Sydney, 115-141.  
(19) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of in Vivo Cyto ­
genetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical  Evaluation 
of Mutagenicity Test  Data.  UKEMS Sub-Committee  on Gui­
delines  for Mutagenicity  Testing. Report, Part  III, Cambridge 
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Mel ­
bourne, Sydney, 184-232.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 336
 
B.13./14.  MUTAGENITÄT — RÜCKMUTATIONSTEST UNTER 
VERWENDUNG VON BAKTERIEN  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht den OECD TG 471, Bacterial Reverse 
Mutation Test (1997).  
1.1. EINLEITUNG  
Beim Rückmutationstest an Bakterien werden Stämme von Sal ­
monella typhimurium und Escherichia coli, die Aminosäure be ­
nötigen, zum Nachweis von Punktmutationen verwendet, die 
Substitution, Addition oder Deletion eines oder mehrerer DNA- 
Basenpaare umfassen (1) (2) (3). Der unter Verwendung von Bakterien durchgeführte Rückmutationstest beruht auf dem Nach ­
weis von Mutationen, durch die Mutationen in den entsprechen ­
den Stämmen rückgängig gemacht und die funktionale Kapazität 
der Bakterien zur Synthetisierung einer essenziellen Aminosäure wiederhergestellt wird. Die Revertanten-Bakterien lassen sich an ihrer Fähigkeit zum Wachstum ohne die vom Elternstamm be ­
nötigte Aminosäure erkennen.
 
Punktmutationen sind die Ursache für zahlreiche humangenetische 
Erkrankungen. Es spricht manches dafür, dass Punktmutationen in 
Onkogenen und Tumorsuppressorgenen somatischer Zellen an der 
Entstehung von Krebs bei Menschen und Versuchstieren beteiligt sind. Der Rückmutationstest an Bakterien ist wenig zeitaufwendig, kostengünstig und relativ leicht durchzuführen. Viele Versuchs ­
stämme weisen mehrere Merkmale auf, die ihnen eine größere Emp ­
findlichkeit beim Nachweis von Mutationen verleihen, darunter re ­
aktive DNA-Sequenzen an den Reversionsorten, erhöhte Zelldurch ­
lässigkeit gegenüber großen Molekülen und Eliminierung von DNA- 
Reparatursystemen oder Anstieg der fehlerhaften DNA-Reparaturpro ­
zesse. Die Spezifität der Versuchsstämme kann wertvollen Auf ­
schluss über die Typen der von gentoxischen Agenzien ausgelösten Mutationen liefern. Für Rückmutationstests unter Verwendung von 
Bakterien steht ein sehr umfangreicher Bestand an Ergebnissen für 
eine Vielzahl von Strukturen zur Verfügung, und es wurden gründ ­
lich erprobte Methoden zur Prüfung von Chemikalien mit unter ­
schiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften, darunter flüch ­
tige Verbindungen, entwickelt.
 
Siehe auch allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Ein Rückmutationstest  bei Salmonella typhimurium oder Escheri ­
chia coli dient zum Nachweis von Mutationen, die in einem Stamm 
auftreten, der eine Aminosäure (Histidin bzw. Tryptophan) benötigt, 
und zur Bildung eines Stammes führen, der nicht auf eine Amino ­
säurezufuhr von außen angewiesen ist.  
Basenpaaraustauschmutagene  sind Agenzien, die in DNA eine 
Basenveränderung verursachen. Bei einem Reversionstest kann diese 
Veränderung am Ort der ursprünglichen Mutation oder an einem zweiten Ort des bakteriellen Genoms auftreten.
 
Rasterschubmutagene  sind Agenzien, die eine Addition oder Dele ­
tion von einem oder mehreren Basenpaaren in der DNA verursachen, 
wodurch sich der Leseraster der RNS verändert.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 337
 
1.3. AUSGANGSÜBERLEGUNGEN  
Beim Rückmutationstest an Bakterien werden prokaryotische Zellen 
verwendet, die sich im Hinblick auf Faktoren wie Aufnahme. Stoff ­
wechsel, Chromosomenstruktur und DNA-Reparaturprozesse von 
Säugetierzellen unterscheiden. In vitro durchgeführte Versuche erfor ­
dern in der Regel den Zusatz eines exogenen Fremdstoff-Metaboli ­
sierungssystems. Mit einem ln-vitro-Metabolisierungssystem lassen sich aber die In-vivo-Bedingungen bei Säugetieren nicht gänzlich 
nachvollziehen. Der Test gibt daher keinen direkten Aufschluss 
über das mutagene und kanzerogene Potential einer Substanz bei Säugetieren.
 
Der unter Verwendung von Bakterien durchgeführte Rückmutations ­
test dient in der Regel zur Erstuntersuchung auf gentoxische Aktivi ­
tät, insbesondere auf Punktmutationen. Aus dem umfangreichen Da ­
tenbestand geht hervor, dass sich zahlreiche chemische Stoffe, die bei diesem Test einen positiven Befund ergeben, auch bei anderen 
Prüfungen als mutagen erweisen. Es gibt allerdings Beispiele dafür, 
dass mutagene Agenzien nicht durch diesen Test nachgewiesen wer ­
den. Zurückzuführen ist dies auf die spezifische Art des ermittelten Endpunkts und auf Unterschiede in der Stoffwechselaktivierung bzw. 
in der Bioverfügbarkeit. Andererseits können Faktoren, die eine ver ­
stärkte Empfindlichkeit des Rückmutationstests an Bakterien bewir ­
ken, zu einer Überbewertung der mutagenen Wirkung führen.
 
Der Rückmutationstest an Bakterien eignet sich möglicherweise nicht 
zur Bewertung bestimmter Klassen von chemischen Substanzen, so 
etwa von stark bakteriziden Verbindungen (z. B. bestimmten Anti ­
biotika) und Stoffen, die vermutlich (oder nachweislich) in das Zell ­
replikationssystem von Säugetieren eingreifen (z. B. bestimmten To ­
poisomerasehemmern und Nucleosidanalogen). In diesen Fällen sind 
wohl Mutationstests an Säugetieren eher angebracht.  
Zahlreiche Verbindungen, die bei diesem Test einen positiven Be ­
fund ergeben, haben zwar eine kanzerogene Wirkung auf Säugetiere, doch besteht keine absolute Korrelation. Ausschlaggebend ist die chemische Klasse, und bestimmte Kanzerogene sind durch diesen 
Test nicht nachweisbar, weil ihre Wirkung auf anderen, nicht gen ­
toxischen Mechanismen oder in Bakterienzellen fehlenden Mecha ­
nismen beruht.
 
1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Suspensionen von Bakterienzellen werden mit und ohne ein exo ­
genes Stoffwechselaktivierungssystem mit der Prüfsubstanz behan ­
delt. Bei der Platteninkorporationsmethode werden die Suspensionen 
mit Schichtagar vermischt und unmittelbar danach auf einem Mini ­
malmedium ausgestrichen. Bei der Vorinkubationsmethode wird das Prüfgemisch bebrütet und dann mit Schichtagar vermischt, bevor es auf einem Minimalmedium ausgestrichen wird. Bei beiden Verfahren 
wird nach einer Inkubationszeit von zwei oder drei Tagen die Anzahl 
der Revertanten-Kolonien bestimmt und mit der Anzahl der sponta ­
nen Revertanten-Kolonien auf den Lösungsmittel-Kontrollplatten verglichen.
 
Es wurden verschiedene Verfahren zur Durchführung des Rückmuta ­
tionstests an Bakterien beschrieben. Zu den gebräuchlichsten Ver ­
fahren zählen die Platteninkorporationsmethode (1) (2) (3) (4), die Vorinkubationsmethode (2) (3) (5) (6) (7) (8), die Fluktuations ­
methode (9) (10) und die Suspensionsmethode (11). Beschrieben 
wurden auch Abänderungen zur Untersuchung von Gasen oder 
Dämpfen (12).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 338
 
Die hier beschriebenen Verfahren beziehen sich im Wesentlichen auf 
die Platteninkorporations- und Vorinkubationsmethode. Beide sind 
für die Durchführung von Versuchen mit und ohne Stoffwechselakti ­
vierungssystem geeignet. Einige Substanzen lassen sich möglicher ­
weise besser mit der Vorinkubationsmethode nachweisen. Sie gehö ­
ren chemischen Klassen an, zu denen unter anderem kurzkettige 
aliphatische Nitrosamine, bivalente Metalle, Aldehyde, Azofarbstoffe und Diazoverbindungen, Pyrollizidinalkaloide, Allylverbindungen und Nitroverbindungen zählen (3). Dabei wird anerkannt, dass be ­
stimmte Klassen von Mutagenen bei Anwendung von Standardver ­
fahren wie der Platteninkorporations- oder Vorinkubationsmethode nicht immer nachweisbar sind. Diese sind als „Sonderfälle“ anzuse ­
hen, zu deren Nachweis unbedingt alternative Verfahren eingesetzt 
werden sollten. Es könnten sich die folgenden „Sonderfälle“ ergeben 
(mit Beispielen für möglicherweise geeignete Nachweisverfahren): Azofarbstoffe und Diazoverbindungen (3) (5) (6) (13), Gase und flüchtige chemische Stoffe (12) (14) (15) (16) sowie Glycoside 
(17) (18). Abweichungen von den Standardverfahren sind wissen ­
schaftlich zu begründen.
 
1.5. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.5.1.  Vorbereitungen  
1.5.1.1.  Bakterien  
Frische Bakterienkulturen sollten bis zur späten exponentiellen oder 
frühen stationären Wachstumsphase kultiviert werden (ca. 10  9 Zellen 
pro ml). Kulturen, die sich im Spätstadium der stationären Phase befinden, sind nicht heranzuziehen. Entscheidend ist dabei, dass die zur Prüfung verwendeten Kulturen einen hohen Anteil an lebens ­
fähigen Bakterien enthalten. Der Anteil lässt sich entweder anhand 
historischer Kontrolldaten über Wachstumskurven bestimmen oder aber für jeden Versuch gesondert durch Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen mittels eines Plattentests.
 
Die empfohlene Inkubationstemperatur beträgt 37  o C. 
Es sind mindestens fünf Bakterienstämme zu verwenden. Dazu soll ­
ten vier Stämme von S. typhimurium (TA 1535; TA 1537 oder TA 97a oder TA 97; TA 98; und TA 100) gehören, die erwiesener ­
maßen zuverlässige und in anderen Labors reproduzierbare Ergeb ­
nisse liefern. Diese vier Stämme von S. typhimurium weisen am 
primären Reversionslocus GC-Basenpaare auf. Bekannt ist, dass möglicherweise bestimmte oxidierende Mutagene, cross-linking in ­
duzierende Agenzien und Hydrazine damit nicht nachzuweisen sind. 
Diese Substanzen lassen sich durch Stämme von E. Coli WP2 oder 
S. typhimurium TA 102 (19) nachweisen, die am primären Rever ­
sionslocus ein AT-Basenpaar aufweisen. Empfohlen wird daher eine Kombination folgender Stämme:
 
— S. typhimurium TA 1535 und  
— S. typhimurium TA 1537 oder TA 97 oder TA 97a und  
— S. typhimurium TA 98 und  
— S. typhimurium TA 100 und  
— E. coli WP2 uvrA oder E. coli WP2 uvrA (pKMI01) oder S. 
typhimurium TA 102.  
Zum Nachweis cross-linking induzierender Mutagene ist es vielleicht 
ratsam, TA 102 einzubeziehen oder einen reparatur-profizienten 
Stamm von E. coli (z. B. E. coli WP 2 oder E. coli WP2 (pKM101)) 
hinzuzugeben.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 339
 
Zur Vorbereitung der Stammkulturen, zur Verifizierung der Marker 
und zur Lagerung sollten bewährte Verfahren verwendet werden. Der 
wachstumsbedingte Aminosäurebedarf ist für jedes tiefgefrorene Stammkulturpräparat nachzuweisen (Histidin bei Stämmen von S. typhimurium und Tryptophan bei Stämmen von E. coli). Auch an ­
dere phänotypische Merkmale sind zu überprüfen, so ggf. das Vor ­
handensein oder Fehlen von R-Faktor-Plasmiden (d. h. die Ampicil ­
linresistenz bei den Stämmen TA 98, TA 10Ü und TA 97a oder TA 97, WP2 uvrA und WP2 uvrA (pKM101) und die Ampicillin- 
+ Tetracyclinresistenz bei den Stämmen TA 102); das Vorhanden ­
sein charakteristischer Mutationen (d. h. rfa-Mutation bei S. typhi ­
murium durch Empfindlichkeit gegenüber Kristallviolett und uvr A- Mutation bei E. coli oder uvrB-Mutation bei S. typhimurium durch 
Empfindlichkeit gegenüber ultraviolettem Licht) (2) (3). Zudem soll ­
ten die Stämme eine Anzahl von Spontan-Revertanten-Kolonien in Häufigkeitsbereichen aufweisen, die anhand der historischen Kon ­
trolldaten des Labors zu erwarten sind, und möglichst innerhalb 
des in der Literatur angegebenen Bereichs liegen.
 
1.5.1.2.  Medium  
Verwendet werden geeigneter Minimalagar (z. B. aus Vogel-Bonner- 
Minimalmedium E und Glucose) und Schichtagar mit Histidin und 
Biotin oder Tryptophan, damit mehrere Zellteilungen erfolgen kön ­
nen (1) (2) (9).  
1.5.1.3.  Stoffwechselaktivierung  
Die Behandlung der Bakterien mit der Prüfsubstanz sollte sowohl 
mit als auch ohne Zusatz eines geeigneten Stoffwechselaktivierungs ­
systems erfolgen. Das am häufigsten verwendete System ist eine 
durch Ko-Faktoren ergänzte post-mitochondriale Fraktion (S9) aus der Leber von Nagetieren, die mit enzyminduzierenden Agenzien wie Aroclor 1254 (1) (2) oder einem Gemisch aus Phenobarbital 
und β-Naphthoflavon (18) (20) (21) vorbehandelt wurden. Die 
post-mitochondriale Fraktion wird im S9-Gemisch in der Regel in Konzentrationen von 5 bis 30 % v/v verwendet. Wahl und Status des Stoffwechselaktivierungssystems sind möglicherweise von der ge ­
prüften chemischen Klasse abhängig. In bestimmten Fällen ist es 
ggf. zweckmäßig, mehr als eine Konzentration der post-mitochon ­
drialen Fraktion zu verwenden. Bei Azofarbstoffen und Diazover ­
bindungen ist möglicherweise eher der Einsatz eines reduktiven 
Stoffwechselaktivierungssystems angebracht (6) (13).
 
1.5.1.4.  Prüfsubstanz/Zubereitung  
Feste Prüfsubstanzen sollten vor der Behandlung der Bakterien in 
geeigneten Lösungsmitteln oder Vehikeln gelöst oder suspendiert 
und ggf. verdünnt werden. Flüssige Prüfsubstanzen können den Ver ­
suchssystemen vor der Behandlung direkt beigegeben und/oder ver ­
dünnt werden. Es sind frische Zubereitungen der Prüfsubstanz zu 
verwenden, es sei denn, die Stabilität der Substanz bei Lagerung 
wird nachgewiesen.  
Das Lösungsmittel/Vehikel sollte nicht im Verdacht stehen, mit der 
Prüfsubstanz eine chemische Reaktion einzugehen, und es sollte mit dem Überleben der Bakterien und der S9-Aktivität kompatibel sein 
(22). Werden keine allgemein bekannten Lösungsmittel/Vehikel ver ­
wendet, so sind Daten zur Kompatibilität beizubringen. Es ist zu empfehlen, als erste Wahl möglichst die Verwendung eines wäss ­
rigen Lösungsmittels/Vehikels in Erwägung zu ziehen. Bei der Prü ­
fung wasserinstabiler Substanzen sollten die verwendeten organi ­
schen Lösungsmittel frei von Wasser sein.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 340
 
1.5.2.  Prüfbedingungen  
1.5.2.1.  Versuchsstämme (siehe 1.5.1.1)  
1.5.2.2.  Expositionskonzentrationen  
Zu den Kriterien, die bei der Bestimmung der höchsten Konzentra ­
tion der Prüfsubstanz zu berücksichtigen sind, zählen die Zytotoxi ­
zität und die Löslichkeit im Endgemisch.  
Es ist möglicherweise sinnvoll, die Zytotoxizität und Unlöslichkeit in 
einem Vorversuch zu bestimmen. Aufschluss über die Zytotoxizität geben der zahlenmäßige Rückgang der Revertanten-Kolonien, der Wegfall bzw. die Verkleinerung des Hintergrundrasens oder die 
Überlebensrate der behandelten Kulturen. Die Zytotoxizität einer 
Substanz verändert sich möglicherweise bei Zusatz eines Stoffwech ­
selaktivierungssystems. Die Unlöslichkeit sollte als Ausfällung im Endgemisch unter realen Prüfbedingungen ermittelt werden und 
mit dem bloßen Auge erkennbar sein.
 
Bei löslichen nicht zytotoxischen Substanzen wird eine maximale 
Prüfkonzentration von 5 mg/Platte bzw. 5 μl/Platte empfohlen. Im 
Falle nicht zytotoxischer Substanzen, die bei 5 mg/Platte bzw. 5 μl/­
Platte nicht löslich sind, sollte eine oder mehrere der geprüften Kon ­
zentrationen im Endgemisch unlöslich sein. Prüfsubstanzen, die sich 
bereits unter 5 mg/Platte bzw. 5 μl/Platte als zytotoxisch erweisen, 
sind bis zu einer zytotoxischen Konzentration zu prüfen. Die Aus ­
fällung sollte die Bewertung nicht beeinträchtigen.  
Es sind mindestens fünf verschiedene analysierbare Konzentrationen 
der Prüfsubstanz zu verwenden, wobei beim ersten Versuch der Abstand zwischen den Prüfpunkten etwa eine halbe Log-Phase 
(d. h. √10) beträgt. Kleinere Abstände sind ggf. angebracht, wenn 
eine Konzentrations-Effekt-Beziehung untersucht wird. Bei der Be ­
wertung von Substanzen, die größere Mengen an potenziell mutage ­
nen Verunreinigungen enthalten, ist die Prüfung bei Konzentrationen 
über 5 mg/Platte bzw. 5 μl/Platte in Betracht zu ziehen.
 
1.5.2.3.  Negativ- und Positivkontrollen  
Für jeden Versuch sind gleichzeitig stammspezifische Positiv- und 
Negativ-(Lösungsmittel- oder Vehikel-)Kontrollen mit oder ohne Zu ­
satz eines Stoffwechselaktivierungssystems anzulegen. Für die Posi ­
tivkontrollen sind Konzentrationen zu wählen, die die Wirksamkeit des jeweiligen Versuchs belegen.
 
Bei Versuchen mit Stoffwechselaktivierungssystem sollten die Posi ­
tivkontrollsubstanzen anhand der verwendeten Bakterienstämme aus ­
gewählt werden.  
Die folgenden Substanzen gelten als Beispiele für geeignete Positiv ­
kontrollen bei Versuchen mit Stoffwechselaktivierung:  
Substanz CAS-Nummer EINECS-Nummer  
9,10-Dimethylanthracen 781-43-1 212-308-4 
7,12-Dimethylbenz[ α]anthracen 57-97-6 200-359-5 
Benzo[a]pyren 50-32-8 200-028-5 
2-Aminoantracen 613-13-8 210-330-9  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 341
 
Substanz CAS-Nummer EINECS-Nummer  
Cyclophosphamid 50-18-0 200-015-4 
Cyclophosphamidmonohydrat 6055-19-2  
Die folgende Substanz eignet sich als Positivkontrolle bei der reduk ­
tiven Stoffwechselaktivierungsmethode  
Substanz CAS-Nummer EINECS-Nummer  
Kongorot 573-58-0 209-358-4  
2-Aminoantracen sollte nicht als alleiniger Gradmesser für die Wirk ­
samkeit des S9-Gemischs dienen. Bei Verwendung von 2-Aminoan ­
thracen sollte jede Charge von S9 ebenfalls durch ein Mutagen ge ­
kennzeichnet sein, das eine Stoffwechselaktivierung durch mikroso ­
male Enzyme, z. B. Benzo[a]pyren oder Dimethylbenzanthracen, er ­
fordert.  
Die folgenden Substanzen sind Beispiele für stammspezifische Po ­
sitivkontrollen bei Versuchen ohne exogenes Stoffwechselaktivie ­
rungssystem:  
Substanz CAS-Nummer EINECS-Nummer Stamm  
Natriumazid 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 und TA 100 
2-Nitrofluoren 607-57-8 210-138-5 TA 98 
9-Aminoacridin 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 und TA 97a 
ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 und TA 97a 
Cumolhydroper ­
oxid 80-15-9 201-254-7 TA 102 
Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 WP2uvrA und TA 102 
N-ethyl-N-nitro- 
N-nitrosoguanidin 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2uvrA und WP2uvrA 
(pKM101) 
4-Nitroquinolin-l- 
oxid 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2uvrA und WP2uvrA 
(pKM101) 
Furylfuramid 
(AF2) 3688-53-7 Plasmide enthaltende Stämme  
Es können auch andere geeignete Positivkontrollsubstanzen verwen ­
det werden. Ggf. sollten Positivkontrollen herangezogen werden, die der gleichen chemischen Klasse angehören wie der Prüfstoff.
 
Es sind Negativkontrollen, die allein aus dem Lösungsmittel oder 
Vehikel ohne Prüfsubstanz bestehen und auf die gleiche Weise wie die Behandlungskulturen behandelt werden, anzulegen. Darüber hi ­
naus sollten auch unbehandelte Kontrollen verwendet werden, wenn 
nicht historische Kontrolldaten belegen, dass das gewählte Lösungs ­
mittel keine schädlichen oder mutagenen Wirkungen hervorruft.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 342
 
1.5.3.  Verfahren  
Bei der Platteninkorporationsmethode (1) (2) (3) (4) ohne Stoffwech ­
selaktivierung werden gewöhnlich 0,05 ml oder 0,1 ml Prüflösung, 0,1 ml frische Bakterienkultur (mit ca. 10
 8 lebensfähigen Zellen) und 
0,5 ml sterile Pufferlösung mit 2,0 ml Schichtagar vermischt. Für 
Ansätze mit Stoffwechselaktivierung werden gewöhnlich 0,5 ml Stoffwechselaktivierungsgemisch, das eine ausreichende Menge post-mitochondrialer Fraktion (im Bereich von 5 bis 30 % v/v im 
Stoffwechselaktivierungsgemisch) enthält, mit Schichtagar (2,0 ml) 
und zugleich mit den Bakterien und der Prüfsubstanz/Prüflösung vermischt. Der Inhalt jedes Röhrchens wird vermischt und auf der 
Oberfläche einer Minimalagarplatte ausgegossen. Vor der Inkubation 
lässt man den Schichtagar verfestigen.
 
Bei der Vorinkubationsmethode (2) (3) (5) (6) wird die 
Prüfsubstanz/Prüflösung ca. 20 Minuten oder länger bei 30-37  o C 
mit dem Versuchsstamm (der ca. 10  8 lebensfähige Zellen enthält) 
und der sterilen Pufferlösung oder dem Stoffwechselaktivierungssys ­
tem (0,5 ml) vorinkubiert, bevor sie mit dem Schichtagar vermischt 
und auf der Oberfläche einer Minimalagarplatte ausgegossen wird. Gewöhnlich werden 0,05 oder 0,1 ml Prüfsubstanz/Prüflösung, 0,1 ml Bakterien und 0,5 ml S9-Gemisch oder sterile Pufferlösung mit 
2,0 ml Schichtagar vermischt. Die Röhrchen sind während der Vor ­
inkubation mit Hilfe eines Schüttlers zu belüften.
 
Um die Schwankungsbreite hinreichend beurteilen zu können, sind 
für jede Dosisstufe drei Platten anzulegen. Die Verwendung von zwei Platten ist vertretbar, wenn dies wissenschaftlich begründet 
wird. Durch den gelegentlichen Verlust einer Platte wird der Versuch 
nicht zwangsläufig entwertet.
 
Gasförmige oder flüchtige Substanzen sind mit Hilfe geeigneter Me ­
thoden zu prüfen, z. B. in hermetisch verschlossenen Gefäßen (12) (14) (15) (16).
 
1.5.4.  Inkubation  
Sämtliche Platten des jeweiligen Versuchs sind 48 bis 72 Stunden 
bei 37  o C zu bebrüten. Nach Ablauf der Inkubationszeit wird die 
Anzahl der Revertanten-Kolonien je Platte ermittelt.  
2. DATEN  
2.1. AUFBEREITUNG DER ERGEBNISSE  
Die Daten sind als Anzahl der Revertanten-Kolonien je Platte an ­
zugeben. Die Anzahl der Revertanten-Kolonien sowohl auf den Ne ­
gativkontrollplatten (Lösungsmittelkontrolle und ggf. unbehandelte Kontrolle) als auch auf den Positivkontrollplatten ist ebenfalls zu dokumentieren. Für die Prüfsubstanz und die Positivkontrollen sowie 
Negativkontrollen (unbehandelte und/oder Lösungsmittelkontrollen) 
sind die Zahlenwerte der einzelnen Platten, die mittlere Anzahl der Revertanten-Kolonien je Platte und die Standardabweichung auf ­
zuführen.
 
Bei einer eindeutigen positiven Reaktion ist eine Verifizierung nicht 
erforderlich. Nicht eindeutige Ergebnisse sind durch weitere Prüfun ­
gen abzuklären, möglichst unter Abänderung der Versuchsbedingun ­
gen. Negative Befunde sind durch Einzelfallprüfung zu bestätigen. In jenen Fällen, in denen eine Bestätigung negativer Befunde nicht für notwendig erachtet wird, ist dies zu begründen. Bei Folgeversuchen 
sollte die Abänderung der Studienparameter zur Erweiterung des 
Umfangs der bewerteten Bedingungen in Betracht gezogen werden. Zu den Studienparametern, die für eine Abänderung in Frage kom ­
men, gehören die Abstände der Konzentrationen, die Prüfmethode 
(Platteninkorporation oder flüssige Vorinkubation) und der Stoff ­
wechselaktivierungsstatus.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 343
 
2.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Es gibt mehrere Kriterien für die Bestimmung eines positiven Ergeb ­
nisses, wie z. B. eine konzentrationsbezogene Zunahme im Prüf ­
bereich und/oder eine reproduzierbare Zunahme der Anzahl der Re ­
vertanten-Kolonien je Platte bei einer oder mehreren Konzentrationen 
in mindestens einem Stamm mit oder ohne Stoffwechselaktivierungs ­
system (23). Zunächst sollte die biologische Relevanz der Ergebnisse untersucht werden. Als Hilfsmittel bei der Bewertung der Versuchs ­
ergebnisse können statistische Methoden dienen (24). Die statistische 
Signifikanz sollte aber nicht der einzige bestimmende Faktor für eine positive Reaktion sein.
 
Eine Prüfsubstanz, bei der die Ergebnisse nicht den oben genannten 
Kriterien entsprechen, gilt bei diesem Versuch als nichtmutagen.  
Auch wenn die meisten Versuche eindeutig positive oder negative 
Ergebnisse liefern, erlaubt der Datensatz in seltenen Fällen keine 
definitive Aussage über die Aktivität der Prüfsubstanz. Es kommt vor, dass sich die Ergebnisse unabhängig davon, wie oft der Versuch wiederholt wird, weiterhin als nicht eindeutig oder als fragwürdig 
erweisen.
 
Positive Befunde beim Rückmutationstest an Bakterien deuten darauf 
hin, dass die Prüfsubstanz durch Basenaustausch oder Rasterver ­
schiebungen Punktmutationen im Genom von Salmonella typhimu ­
rium und/oder Escherichia coli hervorruft. Negative Befunde sind ein Anzeichen dafür, dass die Prüfsubstanz unter diesen Versuchsbedin ­
gungen bei den geprüften Spezies keine mutagene Wirkung auslöst.
 
3. ABSCHLUSSBERICHT  
PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:  
Lösungsmittel/Vehikel  
— Begründung für die Wahl des Vehikels;  
— Löslichkeit und Stabilität der Prüfsubstanz im Lösungsmittel/ ­
Vehikel, falls bekannt.  
Stämme:  
— verwendete Stämme;  
— Anzahl der Zellen je Kultur;  
— Merkmale des Stammes.  
Prüfbedingungen:  
— Menge der Prüfsubstanz je Platte (mg/Platte oder μl/Platte) mit 
Begründung für die Wahl der Dosis und Anzahl der Platten je 
Konzentration;  
— verwendete Medien;  
— Art und Zusammensetzung des Stoffwechselaktivierungssystems 
einschließlich Eignungskriterien;  
— Behandlungsverfahren.  
Ergebnisse:  
— Toxizitätszeichen;  
— Ausfällungszeichen;  
— Zählwerte der einzelnen Platten;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 344
 
— mittlere Anzahl der Revertanten-Kolonien je Platte und Standard ­
abweichung;  
— nach Möglichkeit Dosis-Wirkungs-Verhältnis;  
— ggf. statistische Analysen;  
— Daten zu gleichzeitigen Negativ-(Lösungsmittel-/Vehikel-)Kon ­
trollen und Positivkontrollen mit Bereichen, Mittelwerten und 
Standardabweichungen;  
— Daten zu historischen Negativ-(Lösungsmittel-/Vehikel-)Kontrol ­
len und Positivkontrollen mit Bereichen, Mittelwerten und Stan ­
dardabweichungen.  
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  
4. LITERATURHINWEISE  
(1) Arnes, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test,  Mutation Res.,  31, 
347-364.  
(2) Maron, D. M. and Arnes, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test,  Mutation Res.,  113, 173- 
215. 
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, 
E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays,  Mutation Res.,  312, 217-233.
 
(4) Kier, L. D., Brusick, D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., 
Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mor ­
telmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The  
Salmonella  typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A 
Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene- 
Tox Program,  Mutation Res.,  168, 69-240.  
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives,  Cancer Letters,  1, 
91-96.
 
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutageni ­
city Microbial Tests, in: Short-term  Test  Systems  for Detecting 
Carcinogens,  ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C., Springer, 
Berlin-Heidelberg-New York, 273-285.  
(7) Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. 
and Foster R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in:  Basic 
Mutagenicity Tests: UKEMS Part  1 Revised, ed. D. J. Kirk ­
land, Cambridge University Press., 13-61.  
(8) Aeschacher. H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods,  J. Food Safety,  8, 
167-177.  
(9) Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use 
of a simplified fluctuation test to detect low levels of mu ­
tagens,  Mutations Res ., 38, 33-42.  
(10) Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, 
J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in:  Handbook 
of Mutagenicity Test Procedures , 2nd Edition, ed. Kilbey, B. 
J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C. Elsevier, Ams ­
terdam-New York-Oxford, 141-161.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 345
 
(11) Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination 
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with 
Strains of  Salmonella typhimurium, Environmental Mutagene ­
sis, 3, 453-465.  
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Com ­
pounds by Using a Gas Sampling Bag,  Mutation Res ., 307, 
335-344.  
(13) Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and 
Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Ben ­
zidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Mo ­
dified Salmonella Assay,  Mutation Res.,  136, 33-47.  
(14) Zeiger, E., Anderson B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mor ­
telmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results 
from the Testing of 311 Chemicals,  Environ. Mol. Mutagen.,  
19, 2-141.  
(15) Simmon, V., Kauhanen K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutage ­
nic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in  
Progress in Genetic Toxicology,  D. Scott, B. Bridges and F. 
Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, 249-258.  
(16) Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, 
L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic 
Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/ Salmonella Assay,  Environmental  Mutagenesis, 9, 421-441.
 
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M. and 
Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Con ­
jugates in  Salomonella typhimurium, Cancer Res.,  39, 3780- 
3782.
 
(18) Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Arnes, B. N. (1980), 
Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to 
Mutagens by Intestinal Flora,  Proc. Natl. Acad. Sa. USA , 77, 
4961-4965.  
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. 
(1990), Comparison of  Salmonella typhimurium  TA 102 with  
Escherichia coli  WP2 Tester strains,  Mutagenesis,  5, 285-291.  
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as 
an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In Vitro  Me­
tabolic  Activation  in Mutagenesis Testing,  eds. F. J. de Serres 
et al. Elsevier, North Holland, 85-88.  
(21) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Tatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxi ­
city Assays,  Mutagenesis,  7, 175-177.
 
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Arnes, B. N. (1981), 
Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/ 
Microsome Test, Mutation Res., 88, 343-350.  
(23) Claxton, L. D., Allen J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nest ­
mann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the  Salmonella 
typhimurium /Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mu ­
tagenicity, Mutation Res., 189, 83-91.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 346
 
(24) Mahon, G. A. T., Green, M. H. L, Middleton, B., Mitchell, I., 
Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays, in:  UKEMS Sub-Committee on 
Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Eva ­
luation of Mutagenicity Test Data,  ed. Kirkland, D. J., Cam ­
bridge University Press, 28-65.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 347
 
B.15.  MUTAGENITÄT (EINSCHLIESSLICH PRESCREENING 
BETREFFEND KREBSERZEUGENDE EIGENSCHAFTEN) — 
GENMUTATION —  SACCHAROMYCES CEREVISIAE  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.3. BEZUGSSUBSTANZEN  
Keine.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Verschiedene haploide und diploide Stämme der Hefe  Saccharomy ­
ces cerevisiae  können zur Ermittlung chemisch induzierter Genmu ­
tationen verwendet werden. Die Versuche können sowohl mit oder ohne exogenes metabolisierendes System durchgeführt werden.
 
Vorwärtsmutationssysteme an haploiden Stämmen, wie die Messung 
der Mutation von roten, adeninabhängigen Mutanten  (ade -1, ade-2) 
zu doppelt adeninabhängigen weißen Mutanten, und Selektivsyste ­
me, wie die Induktion einer Cycloheximid- und Kanavaninresistenz, 
werden verwendet.  
Bei dem am besten validierten Rückmutationssystem wird der haplo ­
ide Stamm XV 185-14C verwendet. Er weist die „ochre“. Nonsense- Mutationen  ade 2-1,  arg 4-17,  lys 1-1 und  trp 5-48, die durch Basen ­
austauschmutagene, die ortsspezifische Mutationen oder „ochre“ 
-Suppressor-Mutationen induzieren, reversibel sind. XV 185-14C 
weist außerdem den Marker  his 1-7, eine Missense-Mutation, die 
hauptsächlich durch Mutationen an einem zweiten Genort reversibel ist, sowie den Marker  hom  3-10 auf, der durch Rasterschubmutagene 
reversibel ist.
 
Der einzige gut validierte Stamm ist D  7 , der für  ilv 1-92 homozygot 
ist. 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
Vorbereitung  
Die Prüfsubstanzen und die Kontroll- oder Bezugssubstanzen sind 
unmittelbar vor der Prüfung in einem geeigneten Lösungsmittel zu 
lösen. Bei wasserunlöslichen organischen Verbindungen sind organi ­
sche Lösungsmittel wie Ethanol, Aceton und Dimethylsulfoxid (DMSO) zu verwenden, wobei die Konzentration 2 % v/v nicht überschreiten darf. Die Endkonzentration des Lösungsmittels soll 
die Überlebensrate und die Wachstumseigenschaften der Zellen nicht 
signifikant verändern.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 348
 
S t o f f w e c h s e l a k t i v i e r u n g  
Die Behandlung der Zellen mit den Prüfsubstanzen sollte sowohl mit 
als auch ohne Zusatz eines geeigneten exogenen Stoffwechselakti ­
vierungssystems erfolgen.  
Das am häufigsten verwendete System ist eine durch Ko-Faktoren 
ergänzte post-mitochondriale Fraktion aus Lebern von Nagetieren, 
die mit enzyminduzierenden Agenzien vorbehandelt wurden. Auch andere Arten, Gewebe, post-mitochondriale Fraktionen oder Verfah ­
ren können sich für die Stoffwechselaktivierung eignen.
 
Versuchsbedingungen  
V e r s u c h s s t ä m m e  
In Genmutationsuntersuchungen werden am häufigsten der haploide 
Stamm XV 185-14 C und der diploide Stamm D  7 verwendet. Auch 
andere Stämme können sich eignen.  
M e d i e n  
Zur Bestimmung der Überlebensrate und Mutantenzahl sind geeig ­
nete Kulturmedien zu verwenden.  
V e r w e n d u n g v o n N e g a t i v - u n d P o s i t i v k o n t r o l l e n  
Positivkontrollen, unbehandelte und Lösungsmittelkontrollen sind 
gleichzeitig anzulegen. Für jeden spezifischen Mutationsendpunkt sind geeignete Positivkontrollsubstanzen zu verwenden.
 
K o n z e n t r a t i o n e n  
Es sind mindestens fünf deutlich unterschiedliche Konzentrationen 
der Prüfsubstanz zu verwenden. Bei toxischen Substanzen sollte die 
höchste Konzentration die Überlebensrate nicht unter 5 bis 10 % senken. Relativ wasserunlösliche Substanzen sind mit geeigneten Verfahren bis zur Löslichkeitsgrenze zu testen. Bei voll wasserlösli ­
chen, nichttoxischen Substanzen ist die höchste Konzentration von 
Fall zu Fall festzulegen.
 
I n k u b a t i o n s b e d i n g u n g e n  
Die Platten werden für 4-7 Tage bei 28 bis 30  o C im Dunkeln 
inkubiert.  
H ä u f i g k e i t e n v o n S p o n t a n m u t a t i o n e n  
Es sind Subkulturen zu verwenden, in denen sich die Spontanmuta ­
tionshäufigkeiten im üblichen Rahmen bewegen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 349
 
A n z a h l d e r P l a t t e n  
Mindestens 3 Platten pro Konzentration sind für den Nachweis pro ­
totropher Zellen, die durch Genmutation erzeugt werden, und zur Ermittlung der Überlebensrate anzulegen. Bei Versuchen, die Marker wie hom  3-10 mit einer geringen Mutationsrate verwenden, ist die 
Anzahl gleich behandelter Platten zu erhöhen, um statistisch rele ­
vante Daten zu erhalten.
 
Versuchsdurchführung  
Die Behandlung von  S. cerevisiae- Stämmen wird im Allgemeinen 
mit einem Flüssigtest unter Verwendung von stationären oder wach ­
senden Zellen durchgeführt. Das Ausgangsexperiment sollte mit wachsenden Zellen durchgeführt werden. 1- bis 5-mal 10
 7 Zellen/ml 
werden bis zu 18 Stunden bei 28 bis 37  o C gegenüber der Prüf ­
substanz unter Schütteln exponiert. Während der Behandlung wird 
eine angemessene Menge des exogenen metabolisierenden Systems beigefügt. Nach der Behandlung werden die Zellen zentrifugiert, gewaschen und auf einem geeigneten Kulturmedium ausgesät. 
Nach der Inkubation wird die Überlebensrate und die Genmutations ­
induktion auf den Platten quantitativ erfasst. Sind die Befunde des ersten Experiments negativ, so ist ein weiterer Versuch durchzufüh ­
ren mit Zellen, die sich in der stationären Phase befinden. Sind die 
Befunde des ersten Experiments positiv, so ist dies durch einen 
geeigneten unabhängigen Versuch zu bestätigen.
 
2. DATEN  
Die Daten sind in tabellarischer Form darzustellen. Anzugeben sind 
die Anzahl der gezählten Konidien, die Anzahl der Mutanten, die Überlebensrate und die Mutantenhäufigkeit. Alle Ergebnisse sind in 
einem unabhängigen Versuch zu bestätigen. Die Auswertung der 
Daten sollte unter Verwendung geeigneter statistischer Methoden erfolgen.
 
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— verwendeter Stamm;  
— Versuchsbedingungen: Zellen der stationären Phase oder wach ­
sende Zellen, Medienzusammensetzung, Inkubationstemperatur 
und -dauer, Stoffwechselaktivierungssysteme;  
— Behandlungsbedingungen: Konzentrationen, Behandlungsverfah ­
ren und -dauer, Behandlungstemperatur, Positiv- und Negativ ­
kontrollen;  
— Anzahl der gezählten Kolonien, Anzahl der Mutanten, Über ­
lebensrate und Mutantenhäufigkeit, ggf. Dosis-Wirkungs-Bezie ­
hung, statistische Auswertung der Daten;  
— Diskussion der Ergebnisse;  
— Bewertung der Ergebnisse.  
3.2. INTERPRETATION  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
4. LITERATUR  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 350
 
B.16.  MITOTISCHE REKOMBINATION —  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.3. BEZUGSSUBSTANZEN  
Keine.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Bei Saccharomyces cerevisiae  lässt sich mitotische Rekombination 
zwischen verschiedenen Genen (oder allgemeiner zwischen einem 
Gen und dem Zentromer) und innerhalb eines Gens feststellen. Im ersten genannten Fall wird sie mitotisches Crossing-over genannt und erzeugt Reziprokprodukte, während sie im letzteren Fall meis ­
tens keine reziproken Ergebnisse hat und als Genkonversion bezeich ­
net wird. Das Crossing-over wird anhand der Bildung rezessiver homozygoter Kolonien oder Sektoren in einem heterozygoten Stamm 
bestimmt, die Genkonversion hingegen anhand der Bildung prototro ­
pher Revertanten mit zwei verschiedenen defekten Allelen des glei ­
chen Gens in einem auxotrophen heteroallelen Stamm. Die am häu ­
figsten zur Ermittlung der mitotischen Genkonversion verwendeten 
Stämme sind  D
 4 (heteroallel für  ade 2 und  trp 5), BZ  34 (heteroallel 
für arg 4), D  7 (heteroallel für  trp 5) und JD1 (heteroallel für  his 4 
und trp 5). Mitotisches Crossing-over, das rote („red“) und rosafar ­
bene („pink“) homozygote Sektoren erzeugt, lässt sich mit D  5 oder 
mit D 7 (der auch zur Messung von mitotischer oder Genkonversion 
und von Rückmutationen an  ilv 1-92 dient) ermitteln. Beide Stämme 
sind heteroallel in Bezug für einander komplimentierende Allele von  
ade 2. 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
Vorbereitung  
Die Prüfsubstanzen und die Kontroll- und Bezugssubstanzen sind 
unmittelbar vor der Prüfung in einem geeigneten Lösungsmittel zu lösen. Bei wasserunlöslichen organischen Verbindungen sind organi ­
sche Lösungsmittel wie Ethanol, Aceton oder Dimethylsulfoxid 
(DMSO) zu verwenden, wobei die Konzentration 2 % v/v nicht überschreiten darf. Die Endkonzentration des Lösungsmittels soll die Überlebensrate und die Wachstumseigenschaften der Zellen nicht 
signifikant verändern.
 
S t o f f w e c h s e l a k t i v i e r u n g  
Die Behandlung der Zellen mit den Prüfsubstanzen soll sowohl mit 
als auch ohne Zusatz eines geeigneten exogenen Stoffwechselakti ­
vierungssystems erfolgen. Das am häufigsten verwendete System ist 
eine durch Ko-Faktoren ergänzte post-mitochondriale Fraktion aus Lebern von Nagetieren, die mit enzyminduzierenden Agenzien vor ­
behandelt wurden. Auch andere Arten, Gewebe, post-mitochondriale 
Fraktionen oder Verfahren können sich für die Stoffwechselaktivie ­
rung eignen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 351
 
Prüfbedingungen  
V e r s u c h s s t ä m m e  
Die am häufigsten verwendeten Stämme sind die diploiden Stämme 
D 4 , D 5 , D 7 und JD1. Auch andere Stämme können sich eignen.  
M e d i e n  
Zur Bestimmung der Überlebensrate und der Häufigkeit der mitoti ­
schen Rekombination werden geeignete Kulturmedien verwendet.  
V e r w e n d u n g v o n N e g a t i v - u n d P o s i t i v k o n t r o l l e n  
Positivkontrollen, unbehandelte und Lösungsmittelkontrollen sind 
gleichzeitig durchzuführen. Für jeden spezifischen Rekombinations ­
endpunkt sind geeignete Bezugssubstanzen zu verwenden.  
K o n z e n t r a t i o n e n  
Mindestens fünf deutlich unterschiedliche Konzentrationen der Prüf ­
substanz sind zu verwenden. Unter anderem sind Zytotoxizität und 
Löslichkeit zu berücksichtigen. Die niedrigste Konzentration darf 
sich in keiner Weise auf die Überlebensrate der Zellen auswirken. Bei toxischen Substanzen sollte die höchste geprüfte Konzentration die Überlebensrate nicht unter 5 bis 10 % senken. Relativ wasser ­
unlösliche Substanzen sind mit geeigneten Verfahren bis zur Löslich ­
keitsgrenze zu testen. Bei voll wasserlöslichen, nichttoxischen Sub ­
stanzen ist die höchste Konzentration von Fall zu Fall festzulegen.
 
Zellen können entweder in der stationären oder in der 
Wachstumsphase bis zu 18 Stunden gegenüber der Prüfsubstanz ex ­
poniert werden. Wird für einen längeren Zeitraum exponiert, sind die 
Kulturen mikroskopisch auf Sporenbildung zu untersuchen, da deren 
Vorhandensein den Versuch invalidiert.  
I n k u b a t i o n s b e d i n g u n g e n  
Die Platten werden im Dunkeln vier bis sieben Tage lang bei 28 bis 
30 o C inkubiert. Die zur Bestimmung der durch mitotisches Cros ­
sing-over erzeugten roten („red“) und rosafarbenen („pink“) homo ­
zygoten Sektoren verwendeten Schalen sind weitere ein bis zwei 
Tage gekühlt (4  o C) zu halten, um die Entwicklung der entsprechen ­
den pigmentierten Kolonien zu ermöglichen; erst dann sollte die quantitative Erfassung erfolgen.
 
H ä u f i g k e i t v o n S p o n t a n m u t a t i o n e n  
Es sind Subkulturen zu verwenden, bei denen sich die Häufigkeit 
spontaner mitotischer Rekombinationen im üblichen Rahmen 
bewegen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 352
 
A n z a h l d e r P l a t t e n  
Mindestens 3 Platten pro Konzentration sind für den Nachweis pro ­
totropher Zellen, die durch mitotische Genkonversion erzeugt wur ­
den, und zur Bestimmung der Überlebensrate anzulegen. Bei der Bestimmung der durch mitotisches Crossing-over erzeugten rezessi ­
ven Homozygotie ist die Anzahl an Platten zu erhöhen, um eine 
geeignete Anzahl an Kolonien zu erhalten.
 
Versuchsdurchführung  
Die Behandlung von  S. cerevisiae- Stämmen erfolgt gewöhnlich in 
einem Flüssigtest unter Verwendung von stationären oder wachsen ­
den Zellen. Das Ausgangsexperiment sollte mit wachsenden Zellen 
durchgeführt werden. 1- bis 5-mal 10  7 Zellen/ml werden bis zu 18 
Stunden bei 28 bis 37  o C gegenüber der Prüfsubstanz unter Schütteln 
exponiert. Während der Behandlung wird eine angemessene Menge 
des exogenen metabolisierenden Systems zugegeben.  
Nach der Behandlung werden die Zellen zentrifugiert, gewaschen 
und auf ein geeignetes Kulturmedium ausgesät. Nach der Inkubation wird die Überlebensrate und die Induktion mitotischer Rekombina ­
tionen quantitativ erfasst.
 
Sind die Befunde des ersten Experiments negativ, so ist ein weiterer 
Versuch durchzuführen mit Zellen, die sich in der stationären Phase 
befinden. Sind die Befunde des ersten Experiments positiv, so ist dies durch einen geeigneten unabhängigen Versuch zu bestätigen.
 
2. DATEN  
Die Daten sind in tabellarischer Form unter Angabe der Anzahl der 
gezählten Konidien, der Anzahl der Rekombinationen, der Über ­
lebensrate und der Rekombinationshäufigkeit darzustellen.  
Alle Ergebnisse sind in einem unabhängigen Versuch zu bestätigen.  
Die Auswertung der Daten sollte unter Verwendung geeigneter sta ­
tistischer Verfahren erfolgen.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— verwendeter Stamm;  
— Versuchsbedingungen: Zellen der stationären Phase oder wach ­
sende Zellen, Medienzusammensetzung, Inkubationstemperatur und -dauer, Stoffwechselaktivierungssystem;
 
— Behandlungsbedingungen: Konzentrationen, Behandlungsverfah ­
ren und -dauer, Behandlungstemperatur, Positiv- und Negativ ­
kontrollen;  
— Anzahl der gezählten Kolonien, Anzahl der Rekombinanten, 
Überlebensrate und Rekombinationshäufigkeit, ggf. Dosis-Wir ­
kungsbeziehung, statistische Auswertung der Daten;  
— Diskussion der Ergebnisse;  
— Bewertung der Ergebnisse.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 353
 
3.2. INTERPRETATION  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
4. LITERATUR  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 354
 
B.17.  MUTAGENITÄT — IN-VITRO-GENMUTATIONSTEST AN 
SÄUGETIERZELLEN  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht der OECD TG 476, In Vitro Mammalian 
Cell Gene Mutation Test (1997).  
1.1. EINLEITUNG  
Der In-vitro-Genmutationstest an Säugetierzellen kann zum Nach ­
weis von chemisch induzierten Genmutationen herangezogen wer ­
den. Zu den geeigneten Zelllinien gehören Maus-Lymphomazellen 
L5178Y, die Zelllinien CHO, CHO-AS52 und V79 des chinesischen Hamsters und menschliche Lymphoblastoidzellen TK6 (1). Mit die ­
sen Zelllinien werden in den gebräuchlichsten Systemen Mutationen 
an den Loci für Thymidinkinase (TK) und Hypoxanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase (HPRT) sowie für ein Transgen von Xan ­
thin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (XPRT) nachgewiesen. Durch 
den TK-, HPRT- und XPRT-Mutationstest lassen sich unterschiedli ­
che Spektren genetischer Ereignisse ermitteln. Die Autosomenloka ­
tion von TK und XPRT ermöglicht ggf. den Nachweis genetischer Ereignisse (z. B. großer Deletionen), die nicht am HPRT-Locus auf 
den X-Chromosomen feststellbar sind (2) (3) (4) (5) (6).
 
Beim In-vitro-Genmutationstest an Säugetierzellen können Kulturen 
von etablierten Zelllinien oder Zellstämmen zum Einsatz kommen. 
Die verwendeten Zellen werden unter dem Gesichtspunkt der Wachs ­
tumsfähigkeit in Kultur und der Stabilität der Spontanmutationshäu ­
figkeit ausgewählt.  
In vitro durchgeführte Versuche erfordern in der Regel den Zusatz 
eines exogenen Fremdstoff-Metabolisierungssystems. Mit diesem System lassen sich aber die In-vivo-Bedingungen bei Säugetieren 
nicht gänzlich nachvollziehen. Es sind unbedingt Bedingungen zu 
vermeiden, bei denen positive Ergebnisse auftreten, die nicht die intrinsische Mutagenität widerspiegeln und möglicherweise aus Ver ­
änderungen des pH-Werts bzw. der Osmolalität oder hochgradiger 
Zytotoxizität herrühren (7).
 
Dieser Test dient zum Nachweis möglicher Mutagene und Karzino ­
gene in Säugetierzellen. Viele chemische Verbindungen, bei denen 
der Test positiv ausfällt, haben eine karzinogene Wirkung auf Säu ­
getiere, doch besteht keine absolute Korrelation zwischen Test und Karzinogenität. Die Korrelation ist von der chemischen Klasse ab ­
hängig, und es gibt zunehmende Anzeichen dafür, dass bestimmte 
Karzinogene durch diesen Test nicht nachweisbar sind, da ihre Wir ­
kung anscheinend auf anderen, nicht gentoxischen Mechanismen oder in Bakterienzellen fehlenden Mechanismen beruht (6).
 
Siehe auch allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Vorwärtsmutation:  Genmutation vom Elterntyp zur mutierten 
Form, die eine Veränderung oder den Ausfall der Enzymaktivität 
der Funktion des kodierten Proteins bewirkt.  
Basenpaaraustauschmutagene:  Agenzien, die den Austausch eines 
oder mehrerer Basenpaare in der DNA verursachen.  
Rasterschubmutagene:  Agenzien, die die Addition oder Deletion 
von einem oder mehreren Basenpaaren im DNA-Molekül verursa ­
chen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 355
 
Expressionszeit des Phänotyps:  Zeitraum, in dem aus neu mutierten 
Zellen unveränderte Genprodukte abgebaut werden.  
Mutantenhäufigkeit:  Verhältnis der Anzahl der mutierten Zellen zur 
Anzahl der lebensfähigen Zellen.  
Relative Gesamtwachstumsrate:  Anstieg der Zellpopulation im 
Zeitverlauf gegenüber einer Kontrollzellpopulation; ermittelt durch Multiplikation der Suspensionswachstumsrate im Verhältnis zur Ne ­
gativkontrolle mit der Klonierungseffizienz im Verhältnis zur Nega ­
tivkontrolle.
 
Relative Suspensionswachstumsrate:  Anstieg der Zellpopulation 
während der Expressionszeit gegenüber der Negativkontrolle.  
Lebensfähigkeit:  Klonierungseffizienz der behandelten Zellen zum 
Zeitpunkt der Ausplattierung unter selektiven Bedingungen nach der Expressionszeit.
 
Überlebensrate:  Klonierungseffizienz der behandelten Zellen beim 
Ausplattieren nach Ablauf der Behandlungszeit; die Überlebensrate wird gewöhnlich in Relation zur Überlebensrate der Kontrollzell ­
population angegeben.
 
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Zellen, die infolge der Mutation TK  +/- → TK-/- keine Thymidinki ­
nase (TK) enthalten, sind gegenüber der zytotoxischen Wirkung des 
Pyrimidinanalogons Trifluorthymidin (TFT) resistent. Bei Anwesen ­
heit von Thymidinkinase sind Zellen hingegen empfindlich gegen ­
über TFT, das die Hemmung des Zellstoffwechsels verursacht und eine weitere Zellteilung verhindert. So können die Mutantenzellen 
bei Anwesenheit von TFT proliferieren, während die normalen Zel ­
len, die Thymidinkinase enthalten, nicht dazu in der Lage sind. In ähnlicher Weise werden HPRT- oder XPRT-defiziente Zellen durch Resistenz gegenüber 6-Thioguanin (TG) oder 8-Azaguanin (AG) se ­
lektiert. Die Eigenschaften der Prüfsubstanz sind sorgfältig zu be ­
achten, wenn bei einem Genmutationstest an Säugetierzellen ein mit dem selektierenden Agens verwandtes Basenanalogon bzw. eine da ­
mit verwandte Verbindung geprüft wird. Beispielsweise sollte jedem 
Verdacht auf selektive Toxizität der Prüfsubstanz bei mutierenden 
und nichtmutierenden Zellen nachgegangen werden. Bei der Prüfung von Chemikalien, die strukturell mit dem selektierenden Agens ver ­
wandt sind, muss die Leistungsfähigkeit des Selektivsystems bzw. 
des selektierenden Agens bestätigt werden (8).
 
Zellen in Suspensions- oder Monoschichtkultur werden über einen 
angemessenen Zeitraum mit und ohne Metabolisierungssystem mit 
der Prüfsubstanz behandelt und subkultiviert, um die Zytotoxizität zu 
bestimmen und vor der Mutantenselektion die Expression des Phäno ­
typs zu ermöglichen (9) (10) (11) (12) (13). Die Zytotoxizität wird gewöhnlich durch Bestimmung der relativen Klonierungseffizienz 
(Überlebensrate) oder des relativen Gesamtwachstums der Kulturen 
nach Ablauf der Behandlungszeit ermittelt. Die behandelten Kulturen werden für einen ausreichenden Zeitraum, der für den jeweils ge ­
wählten Locus und Zelltyp charakteristisch ist, in einem Wachstums ­
medium gehalten, um eine annähernd optimale phänotypische Ex ­
pression der induzierten Mutationen zu ermöglichen. Die Mutanten ­
häufigkeit wird bestimmt, indem man eine bekannte Anzahl von Zellen auf ein Medium mit dem selektierenden Agens zur Bestim ­
mung der Mutantenzahl und auf ein Medium ohne selektierendes 
Agens zur Bestimmung der Klonierungseffizienz (Lebensfähigkeit) aufimpft. Nach einer geeigneten Inkubationszeit werden die Kolo ­
nien gezählt. Die Mutantenhäufigkeit wird aus der Anzahl der Mu ­
tantenkolonien im selektiven Medium und der Anzahl der Kolonien 
im nichtselektiven Medium berechnet.
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1.4. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.4.1.  Vorbereitungen  
1.4.1.1.  Zellen  
Für diesen Versuch steht eine Reihe von Zelltypen zur Verfügung. 
Dazu gehören Subklone von L5178Y, CHO-, CHO-AS52-, V79- 
oder TK6-Zellen. Die bei diesem Test verwendeten Zelltypen sollten nachweislich eine Empfindlichkeit für chemische Mutagene, eine hohe Klonierungseffizienz und eine geringe Spontanmutationshäufig ­
keit aufweisen. Die Zellen sind auf Mycoplasmaverunreinigung zu 
überprüfen und bei Verunreinigung nicht heranzuziehen.
 
Der Test sollte so angelegt werden, dass er ausreichende Sensitivität 
hat. Die Anzahl der Zellen, die verwendeten Kulturen und Konzen ­
trationen der Prüfsubstanz sollten den vorgegebenen Parametern ent ­
sprechen (14). Die Mindestzahl der lebensfähigen Zellen, die die 
Behandlung überstehen und im jeweiligen Stadium der Prüfung ver ­
wendet werden, sollte auf der Spontanmutationshäufigkeit beruhen. Als allgemeine Faustregel gilt die Verwendung einer Anzahl von 
Zellen, die mindestens dem Zehnfachen des reziproken Wertes der 
Spontanmutationshäufigkeit entspricht. Es wird aber empfohlen, min ­
destens 10
 6 Zellen zu verwenden. Es sollten angemessene historische 
Daten zum verwendeten Zellsystem vorhanden sein, um die durch ­
gängige Aussagefähigkeit des Tests zu belegen.  
1.4.1.2.  Kulturmedien und Inkubationsbedingungen  
Zur Kultivierung sind geeignete Kulturmedien und Inkubationsbedin ­
gungen (Kulturgefäße, CO  2 -Konzentration, Temperatur und Feuch ­
tigkeit) zu verwenden. Die Medien sind entsprechend dem beim Test verwendeten Selektivsystem und Zelltyp auszuwählen. Vor allem ist für Inkubationsbedingungen zu sorgen, die ein optimales Zellwachs ­
tum während der Expressionszeit und die Fähigkeit der mutierenden 
und nichtmutierenden Zellen zur Koloniebildung gewährleisten.
 
1.4.1.3.  Vorbereitung der Kulturen  
Die Zellen werden aus Stammkulturen gewonnen, auf das Kulturme ­
dium aufgeimpft und bei 37  o C inkubiert. Vor der Verwendung bei 
diesem Test sind die Kulturen ggf. von bereits vorhandenen Mutan ­
tenzellen zu reinigen.  
1.4.1.4.  Stoffwechselaktivierung  
Die Behandlung der Bakterien mit der Prüfsubstanz sollte sowohl 
mit als auch ohne Zusatz eines geeigneten Metabolisierungssystems 
erfolgen. Das am häufigsten verwendete System ist eine durch Ko- Faktoren ergänzte post-mitochondriale Fraktion (S9) aus der Leber von Nagetieren, die mit enzyminduzierenden Agenzien wie Aroclor 
1254 (15) (16) (17) (18) oder einem Gemisch aus Phenobarbiton und 
β-Naphtoflavon (19) (20) vorbehandelt wurde.
 
Im Endmedium wird die post-mitochondriale Fraktion in der Regel 
in Konzentrationen von 1 bis 10 % v/v verwendet. Wahl und Be ­
dingungen des Metabolisierungssystems können von der geprüften chemischen Klasse abhängig sein. In bestimmten Fällen ist es ggf. 
zweckmäßig, mehr als eine Konzentration der postmitochondrialen 
Fraktion zu verwenden.
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Eine Reihe von Entwicklungen, darunter die Herstellung gentech ­
nisch veränderter Zelllinien zur Expression spezifischer Aktivie ­
rungsenzyme, eröffnen vielleicht die Möglichkeit für eine endogene Aktivierung. Die Wahl der verwendeten Zelllinien sollte wissen ­
schaftlich begründet sein (z. B. durch die Relevanz des Isoenzyms 
Cytochrom P450 für den Stoffwechsel der Prüfsubstanz).
 
1.4.1.5.  Prüfsubstanz/Zubereitung  
Feste Prüfsubstanzen sollten vor der Zellbehandlung in geeigneten 
Lösungsmitteln oder Vehikeln gelöst oder suspendiert und ggf. ver ­
dünnt werden. Flüssige Prüfsubstanzen können den Versuchssyste ­
men vor der Behandlung direkt beigegeben und/oder verdünnt wer ­
den. Es sind frische Zubereitungen der Prüfsubstanz zu verwenden, 
es sei denn, die Stabilität der Substanz bei Lagerung wird nach ­
gewiesen.  
1.4.2.  Prüfbedingungen  
1.4.2.1.  Lösungsmittel/Vehikel  
Die Lösungsmittel/Vehikel sollten nicht im Verdacht stehen, mit der 
Prüfsubstanz eine chemische Reaktion einzugehen, und sie sollten mit dem Überleben der Zellen und der S9-Aktivität kompatibel sein. Werden keine allgemein bekannten Lösungsmittel/Vehikel verwen ­
det, so sind Daten zur Kompatibilität beizubringen. Es ist zu emp ­
fehlen, als erste Wahl möglichst die Verwendung eines wässrigen Lösungsmittels/Vehikels in Erwägung zu ziehen. Bei der Prüfung 
wasserinstabiler Substanzen sollten die verwendeten organischen Lö ­
sungsmittel frei von Wasser sein. Das Wasser lässt sich durch Zusatz eines Molekularsiebs entfernen.
 
1.4.2.2.  Expositionskonzentrationen  
Zu den Kriterien, die bei der Bestimmung der höchsten Konzentra ­
tion zu berücksichtigen sind, zählen die Zytotoxizität, die Löslichkeit im Versuchssystem und die Veränderungen des pH-Werts oder der Osmolalität.
 
Die Zytotoxizität sollte im Hauptversuch mit und ohne Stoffwechsel ­
aktivierung unter Verwendung eines geeigneten Indikators für Zel ­
lintegrität und -Wachstum wie relative Klonierungseffizienz (Über ­
lebensrate) oder relatives Gesamtwachstum bestimmt werden. Es ist möglicherweise sinnvoll, die Zytotoxizität und Löslichkeit in einem 
Vorversuch zu bestimmen.
 
Es sind mindestens vier analysierbare Konzentrationen zu verwen ­
den. Wenn Zytotoxizität auftritt, sollten diese Konzentrationen den 
Bereich vom Höchstwert bis zu geringer oder nicht vorhandener Toxizität umfassen. Im Normalfall bedeutet dies, dass sich die Kon ­
zentrationen maximal um einen Faktor zwischen 2 und 10 unter ­
scheiden. Beruht die höchste Konzentration auf der Zytotoxizität, 
sollte sie eine relative Überlebensrate (relative Klonierungseffizienz) oder relative Gesamtwachstumsrate von ca. 10 bis 20 % (aber min ­
destens 10 %) ergeben. Bei relativ nichtzytotoxischen Substanzen 
sollte die maximale Prüfkonzentration 5 mg/ml, 5 μl/ml oder 0,01 
M betragen, je nachdem, welcher Wert am niedrigsten ist.
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Relativ unlösliche Substanzen sind unter Kulturbedingungen bis zur 
Löslichkeitsgrenze und darüber hinaus zu testen. Eine etwaige Un ­
löslichkeit ist im Endmedium zu bestimmen, dem die Zellen aus ­
gesetzt werden. Möglicherweise ist es sinnvoll, die Löslichkeit zum Anfang und Abschluss der Behandlung zu bewerten, da sich die 
Löslichkeit im Versuchssystem während der Exposition aufgrund 
des Vorhandenseins von Zellen, S9, Serum usw. verändern kann. Die Unlöslichkeit ist mit dem bloßen Auge erkennbar. Die Ausfäl ­
lung sollte die Bewertung nicht beeinträchtigen.
 
1.4.2.3.  Kontrollen  
Für jeden Versuch sind gleichzeitig Positiv- und Negativ-(Lösungs ­
mittel- oder Vehikel-)Kontrollen mit oder ohne Zusatz eines Stoff ­
wechselaktivierungssystems anzulegen. Bei Stoffwechselaktivierung sollte die Positivkontrollsubstanz jene Substanz sein, die zur mutage ­
nen Reaktion eine Aktivierung benötigt.
 
Es kommen beispielsweise folgende Positivkontrollsubstanzen in 
Frage:  
Stoffwechselaktivie ­
rungsstatus Ort Substanz CAS-Nummer EINECS-Num ­
mer 
Ohne exogene 
Stoffwechselakti ­
vierung HPRT Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7 
Ethylnitrosoharnstoff 759-73-9 212-072-2 
TK (kleine 
und große 
Kolonien) Methylmethansulfonat 66-27-3 200-625-0 
XPRT Ethylmethansulfonat 62-50-0 200-536-7 
Ethylnitrosoharnstoff 759-73-9 212-072-2 
Mit exogener 
Stoffwechselakti ­
vierung HPRT 3-Methylcholanthren 56-49-5 200-276-4 
N-Nitrosodimethylamin 62-75-9 200-549-8 
7,12-Dimethylbenzanthracen 57-97-6 200-359-5 
TK (kleine 
und große 
Kolonien) Cyclophosphamid 50-18-0 200-015-4 
Cyclophosphamidmonohydrat 6055-19-2 Benzo[a]pyren 50-32-8 200-028-5 3-Methylcholanthren 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-Nitrosodimethylamin (für hohe 
Konzentrationen von S9) 62-75-9 200-549-8 
Benzo[a]pyren 50-32-8 200-028-5
 
Es kommen auch andere geeignete Positivkontrollsubstanzen in Be ­
tracht. Wenn z. B. ein Labor über historische Datenbestände zu 
5-Bromo 2’-deoxyuridin (CAS-Nummer 59-14-3, EINECS-Nummer 200-415-9) verfügt, könnte auch diese Bezugssubstanz zum Einsatz kommen. Gegebenenfalls sollten Positivkontrollen herangezogen 
werden, die der gleichen chemischen Klasse angehören wie der Prüf ­
stoff.
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Es sind Negativkontrollen zu verwenden, bei denen das Behand ­
lungsmedium lediglich Lösungsmittel oder Vehikel enthält und die 
auf die gleiche Weise wie die Behandlungskulturen behandelt wer ­
den. Darüber hinaus sollten auch unbehandelte Kontrollen verwendet werden, wenn nicht historische Kontrolldaten belegen, dass das ge ­
wählte Lösungsmittel keine schädlichen oder mutagenen Wirkungen 
hervorruft.
 
1.4.3.  Verfahren  
1.4.3.1.  Behandlung mit der Prüfsubstanz  
Proliferierende Zellen werden mit und ohne Zusatz eines Metaboli ­
sierungssystems mit der Prüfsubstanz behandelt. Die Exposition sollte über einen geeigneten Zeitraum (gewöhnlich 3 bis 6 Stunden) 
erfolgen. Die Expositionszeit kann sich über einen oder mehrere 
Zellzyklen erstrecken.
 
Es sollten für jede überprüfte Konzentration behandelte Zweifach- 
oder Einfachkulturen herangezogen werden. Bei Einfachkulturen ist die Anzahl der Konzentrationen zu erhöhen, damit eine ausreichende 
Anzahl von Kulturen zur Analyse vorliegt (d. h. mindestens 8 ana ­
lysierfähige Konzentrationen). Es sind zweifache Negativ-(Lösungs ­
mittel-)Kontrollkulturen zu verwenden.
 
Gasförmige oder flüchtige Substanzen sind mit Hilfe geeigneter Me ­
thoden zu prüfen, z. B. in hermetisch verschlossenen Kulturgefäßen 
(21) (22).  
1.4.3.2.  Bestimmung der Überlebensrate, der Lebensfähigkeit und der Mu ­
tantenhäufigkeit  
Am Ende der Expositionszeit werden die Zellen gewaschen und 
kultiviert, um die Überlebensrate zu bestimmen und die Expression des Mutantenphänotyps zu ermöglichen. Die Bestimmung der Zyto ­
toxizität durch Ermittlung der relativen Klonierungseffizienz (Über ­
lebensrate) oder des relativen Gesamtwachstums der Kulturen erfolgt in der Regel nach Ablauf der Behandlungszeit.
 
Jeder Locus hat eine bestimmte Mindestzeit, um eine annähernd 
optimale phänotypische Expression der neu induzierten Mutanten 
zu ermöglichen (HPRT und XPRT benötigen mindestens 6 bis 8 
Tage, TK mindestens 2 Tage). Die Zellen werden in Medien mit und ohne selektierende Agenzien kultiviert, um die Mutantenzahl bzw. die Klonierungseffizienz zu bestimmen. Die Bestimmung der 
Lebensfähigkeit (zur Berechnung der Mutantenhäufigkeit) erfolgt 
nach dem Ablauf der Expressionszeit durch Ausplattieren in einem nicht selektierenden Medium.
 
Wenn die Prüfsubstanz im L5178Y-TK  +/- -Test einen positiven Be ­
fund ergibt, sollte zumindest bei einer der Prüfkulturen (der höchsten 
positiven Konzentration) und bei den Negativ- und Positivkontrollen 
eine Größeneinteilung der Kolonien erfolgen. Ergibt die Prüfsubstanz beim L5178Y-TK
 +/- -Test einen negativen Befund, so ist eine Kolo ­
niegrößeneinstufung bei den Negativ- und Positivkontrollen durch ­
zuführen. Eine Koloniegrößeneinstufung ist ggf. auch bei Studien 
mit TK6TK  +/- vorzunehmen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 360
 
2. DATEN  
2.1. AUFBEREITUNG DER ERGEBNISSE  
Anzugeben sind die Zytotoxizität, die Lebensfähigkeit, die Kolonie ­
zahlen und die Mutantenhäufigkeit für die Prüf- sowie Kontrollkul ­
turen. Ergibt der L5178/Y-TK  +/- -Test einen positiven Befund, wer ­
den die Kolonien bei mindestens einer Konzentration der Prüfsub ­
stanz (der höchsten positiven Konzentration) sowie bei den Negativ- und Positivkontrollen nach dem Kriterium kleine oder große Kolonie 
ausgewertet. Die molekulare und zellgenetische Beschaffenheit von 
Mutanten mit Bildung großer und Mutanten mit Bildung kleiner Kolonien ist gründlich erforscht (23) (24). Beim TK
 +/- -Test werden 
die Kolonien nach dem Kriterium normal wachsende (große) oder 
langsam wachsende (kleine) Kolonie eingestuft (25). Mutantenzellen mit einer erheblichen genetischen Schädigung weisen eine längere Generationszeit auf und bilden daher kleine Kolonien. Die Schädi ­
gung kann vom Verlust eines kompletten Gens bis zu karyotypisch 
erkennbaren Chromosomenaberrationen reichen. Mutanten mit der Bildung kleiner Kolonien treten vor allem bei Chemikalien auf, die starke Chromosomenaberrationen hervorrufen (26). Weniger stark 
betroffene Mutantenzellen wachsen in ähnlichem Tempo wie die 
Elternzellen und bilden große Kolonien.
 
Es ist die Überlebensrate (relative Klonierungseffizienz) oder das 
relative Gesamtwachstum anzugeben. Unter der Mutantenhäufigkeit ist der zahlenmäßige Anteil der Mutantenzellen an den überlebenden 
Zellen zu verstehen.
 
Es sind die Daten für die einzelnen Kulturen zu dokumentieren. 
Zusätzlich sollten alle Daten in tabellarischer Form zusammengefasst 
werden.  
Bei einer eindeutigen positiven Reaktion ist eine Verifizierung nicht 
erforderlich. Nicht eindeutige Ergebnisse sind durch weitere Prüfun ­
gen abzuklären, möglichst unter Abänderung der Versuchsbedingun ­
gen. Negative Ergebnisse sind durch Einzelfallprüfung zu bestätigen. 
In jenen Fällen, in denen eine Bestätigung negativer Ergebnisse nicht für notwendig erachtet wird, ist dies zu begründen. Bei Folgever ­
suchen sollte die Abänderung der Studienparameter zur Erweiterung 
des Umfangs der bewerteten Bedingungen in Betracht gezogen wer ­
den. Zu den Studienparametern, die für eine Abänderung in Frage kommen, gehören die Abstände der Konzentrationen und der Stoff ­
wechselaktivierungsstatus.
 
2.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Es gibt mehrere Kriterien für die Bestimmung eines positiven Ergeb ­
nisses, wie z. B. eine konzentrationsbezogene Zunahme und/oder 
eine reproduzierbare Zunahme der Mutationsrate. Zunächst sollte die biologische Relevanz der Ergebnisse untersucht werden. Als Hilfsmittel bei der Bewertung der Versuchsergebnisse können statis ­
tische Methoden dienen. Die statistische Signifikanz sollte aber nicht 
der einzige bestimmende Faktor für eine positive Reaktion sein.
 
Eine Prüfsubstanz, bei der die Ergebnisse nicht den oben genannten 
Kriterien entsprechen, gilt bei diesem System als nichtmutagen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 361
 
Auch wenn die meisten Versuche eindeutig positive oder negative 
Ergebnisse liefern, erlaubt der Datensatz in seltenen Fällen keine 
definitive Aussage über die Aktivität der Prüfsubstanz. Es kommt vor, dass sich die Ergebnisse unabhängig davon, wie oft der Versuch wiederholt wird, weiterhin als nicht eindeutig oder als fragwürdig 
erweisen.
 
Positive Ergebnisse aus dem In-vitro-Genmutationstest an Säugetier ­
zellen deuten darauf hin, dass die Prüfsubstanz in den verwendeten kultivierten Säugetierzellen Genmutationen hervorruft. Eine repro ­
duzierbare positive Relation zwischen Konzentration und Wirkung 
ist sehr bedeutsam. Negative Ergebnisse sind ein Anzeichen dafür, 
dass die Prüfsubstanz unter diesen Versuchsbedingungen in den ver ­
wendeten kultivierten Säugetierzellen keine Genmutation auslöst.
 
3. ABSCHLUSSBERICHT  
PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:  
Lösungsmittel/Vehikel:  
— Begründung für die Wahl des Vehikels/Lösungsmittels;  
— Löslichkeit und Stabilität der Prüfsubstanz im Lösungsmittel/ ­
Vehikel, falls bekannt.  
Zellen:  
— Typ und Herkunft der Zellen;  
— Anzahl der Zellkulturen;  
— ggf. Passagenanzahl;  
— ggf. zum Erhalt der Zellkultur verwendete Verfahren;  
— Nichtvorhandensein von Mycoplasma.  
Prüfbedingungen:  
— Begründung für die Auswahl der Konzentrationen und die An ­
zahl der Kulturen, darunter z. B. Angaben zur Zytotoxizität und Löslichkeitsgrenze, falls vorhanden;
 
— Medienzusammensetzung, CO  2 -Konzentration;  
— Konzentration der Prüfsubstanz;  
— Volumen des Vehikels und der beigegebenen Prüfsubstanz;  
— Inkubationstemperatur;  
— Inkubationszeit;  
— Behandlungsdauer;  
— Zelldichte während der Behandlung;  
— Art und Zusammensetzung des Stoffwechselaktivierungssystems 
einschließlich Eignungskriterien;  
— Positiv- und Negativkontrollen;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 362
 
— Dauer der Expressionszeit (ggf. einschließlich Anzahl der über ­
impften Zellen, Subkulturen und Medienwechsel);  
— selektierende Agenzien;  
— Kriterien zur Einstufung der Tests als positiv, negativ oder nicht 
eindeutig;  
— Methoden zur Zählung der lebensfähigen und mutierten Zellen;  
— Angaben zur Berücksichtigung der Kolonien nach Größe und 
Typ (ggf. einschließlich Kriterien für, kleine' und, große' Kolo ­
nien).  
Ergebnisse:  
— Toxizitätszeichen;  
— Ausfällungszeichen;  
— Angaben zum pH-Wert und zur Osmolalität des Behandlungs ­
mediums, falls ermittelt;  
— Koloniegröße, falls bewertet, zumindest für Negativ- und Positiv ­
kontrollen;  
— ggf. Voraussetzungen des Labors zur Bestimmung von Mutanten 
mit geringer Koloniebildung durch das L5178Y-TK  +/- -System;  
— nach Möglichkeit Dosis-Wirkungs-Verhältnis;  
— ggf. statistische Analysen;  
— Daten zu gleichzeitigen Negativ-(Lösungsmittel-/Vehikel-)Kon ­
trollen und Positivkontrollen;  
— Daten zu historischen Negativ-(Lösungsmittel-/Vehikel-)Kontrol ­
len und Positivkontrollen mit Bereichen, Mittelwerten und Stan ­
dardabweichungen;  
— Mutantenhäufigkeit.  
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  
4. LITERATURHINWEISE  
(1) Moore, M.M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindall, 
K. R. (eds.) (1987),  Banbury Report 28: Mammalian Cell Mu ­
tagenesis,  Cold Spring Harbor Laboratory, New York.  
(2) Chu, E. H. Y. and Malling, H. V. (1968), Mammalian Cell 
Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations 
in Chinese Hamster Cells In Vitro,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  
61, 1306-1312.  
(3) Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts,  
Mutation Res.,  94, 467-485.  
(4) Moore, M. M., Harington-Brock, K, Doerr, C. L. and Dear ­
field, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the 
Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci,  Mutagenesis,  
4, 394-403.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 363
 
(5) Aaron, C. S. and Stankowski, Jr. L. F. (1989), Comparison of 
the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of 
Six Drug Candidates, Mutation Res., 223, 121-128.  
(6) Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, 
Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Re ­
port. Report of the International Workshop on Standardisation 
of Genotoxicity Test Procedures.  Mutation Res., 3 12, 235-239.
 
(7) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., 
Brusick. D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity 
Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC 
Task Group 9,  Mutation Res.,  257, 147-204.  
(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Ma ­
vournin, K. H. (198 3), Specific Gene Mutations in L5178Y 
Cells in Culture. A Report of the U. S. Environmental Pro ­
tection Agency Gene-Tox Program,  Mutation Res.,  115, 225- 
251. 
(9) Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. 
(1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster 
Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase Sys ­
tem to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U. S. Environment Protection 
Agency Gene-Tox Program,  Mutation Res.,  196, 17-36.
 
(10) Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. 
S., Loveday, K. S., O'Neill, J. R, Riddle, J. C, Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of 
the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Cuanine Phos ­
phoribosyl Transferase Gene Mutation Assay,  Mutation Res.,  
189, 135-141.
 
(11) Liber, H. L, Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Com ­
parison of Mutation Induction at the TSC and HPRT Loci in 
Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are 
Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus,  Mutation Res.,  216, 9-17.
 
(12) Stankowski, L. F. Jr., Tindall, K. R. and Hsie, A. W. (1986), 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulpho ­
nate — and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and JCR 191-lnduced Mutation in AS52 Cells,  Mutation Res.,  160, 133-147.
 
(13) Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedures 
for the L5178Y/TK  +/- — TK  +/- Mouse Lymphoma Cell Mu ­
tagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.)  Handbook of 
Mutagenicity Test Procedures,  Elsevier Science Publishers, 
New York, 239-268.  
(14) Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., 
Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith, J. C. (1989), Mamma ­
lian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formati ­
on, in:  Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data,  Kirk­
land D. J., ed., Cambridge University Press, 66-101.  
(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccaro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine- 
Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse- 
Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine,  Mutation 
Res.,  46, 365-373.  
(16) Arnes, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test,  Mutation Res ., 31, 
347-364.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 364
 
(17) Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson, A. G. and 
Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of 
the L5178Y/TK  +/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System,  
Mutat. Res ., 59, 61-108.  
(18) Maron, D. M. and Arnes, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test,  Mutation Res ., 113, 173- 
215. 
(19) Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcome, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in  In Vitro  Genoto­
xicity Assays,  Mutagenesis , 7, 175-177.
 
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in  In Vitro Me ­
tabolic Activation in Mutagenesis Testing,  de Serres, F. J., 
Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot. R. M. (eds.) Elsevier, 
North-Holland, 85-88.
 
(21) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Vola ­
tile Liquids, In: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. 
(eds.),  Genotoxic Effects of Airborne Agents.  New York, Ple ­
num, 91-103.  
(22) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown 
on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in 
the CHO/HGPRT Mutation Assay,  Environmental Mutagene ­
sis, 5, 795-801.  
(23) Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. 
and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at 
the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lym ­
phoma Cells,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87.  51-55.  
(24) Moore, M. M., Clive, D., Hozier, J. C., Howard, B. E., Batson, 
A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Tri ­
fluorothymidine-Resistant (TFT) and Mutants of L5178Y/TK 
Mouse Lymphoma Cells,  Mutation Res.,  151, 161-174.  
(25) Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells,  Mutation Res.,  229, 89-102.
 
(26) Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chro ­
mosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient 
Mutant Frequency in L5178Y/TK — 3.7.2C Mouse Lym ­
phoma Cells, Mutagenesis 5, 609-614.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 365
 
B.18.  DNS-SCHÄDIGUNG UND -REPARATUR — UNPLANMÄSSIGE 
DNS-SYNTHESE (UDS) — SÄUGETIERZELLEN — IN VITRO  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.3. BEZUGSSUBSTANZEN  
Keine.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Mit dem Test zur unplanmäßigen DNS-Synthese (UDS)-Test wird 
die DNS-Reparatursynthese nach Ausschneiden und Entfernen des Abschnitts eines DNS-Strangs gemessen, in dem sich die durch che ­
mische und physikalische Agenzien induzierte Schädigung befindet. 
Der UDS-Test eignet sich zur Ermittlung der „long patch“-Reparatur. 
Die „short patch“ -Reparatur oder Insertion einzelner Nukleotidbasen lässt sich damit nicht oder nur mit einem sehr geringen Empfindlich ­
keitsgrad feststellen. Der Test beruht auf dem Einbau von tritium ­
markiertem Thymidin (
 3 H-TdR) in die DNS von Säugetierzellen, die 
sich außerhalb der S-Phase des Zellzyklus befinden. Die  3 H-TdR- 
Aufnahme lässt sich durch Autoradiografie oder eine Flüssigkeits ­
szintillationszählung (LSC = Liquid Scintillation Counting) der DNS 
behandelter Zellen bestimmen. Säugetierzellen in Kultur werden, 
sofern es sich nicht um primäre Rattenhepatozyten handelt, mit der Prüfsubstanz mit oder ohne Zusatz eines exogenen Stoffwechselakti ­
vierungssystems behandelt. Die UDS lässt sich auch in  In-vivo -Sys­
temen messen.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
Vorbereitung  
Die Prüfsubstanzen und die Kontroll- oder Bezugssubstanzen sollten 
in Medien oder in geeigneten Lösungsmitteln gelöst oder suspendiert werden. Die endgültige Lösungsmittelkonzentration darf die Über ­
lebensrate der Zellen nicht beeinträchtigen.
 
In diesem Versuch können primäre Kulturen von Rattenhepatozyten, 
menschlichen Lymphozyten oder etablierten Zelllinien (z. B. 
menschliche diploide Fibroblasten) verwendet werden.  
Die Behandlung der Zellen mit der Prüfsubstanz sollte sowohl mit 
als auch ohne Zusatz eines geeigneten Stoffwechselaktivierungssys ­
tems erfolgen.  
Versuchsbedingungen  
A n z a h l d e r K u l t u r e n  
Für jeden experimentellen Punkt werden mindestens zwei Zellkultu ­
ren für die Autoradiografie verwendet und mindestens sechs Zell ­
kulturen (wenn es wissenschaftlich begründbar ist, können weniger 
verwendet werden) für das LSC-Verfahren.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 366
 
V e r w e n d u n g v o n N e g a t i v - u n d P o s i t i v k o n t r o l l e n  
Für jeden Versuch sind gleichzeitig Positiv- und (unbehandelte und/ ­
oder Lösungsmittel) Negativkontrollen mit oder ohne Zusatz eines Metabolisierungssystems anzulegen.
 
Beispiele für die Positivkontrollen für den Rattenhepatozytenversuch 
sind: 7,12-Dimethylbenzanthracen (7,12-DMBA) oder 2-Azetylami ­
nofluoren (2-AAF). Werden etablierte Zelllinien verwendet, kann 4- 
Nitochinolin-N-oxid (4-NAO) als Positivkontrolle für Autoradiogra ­
fie- und LSC-Versuche ohne Stoffwechselaktivierung dienen. Ein Beispiel für eine Positivkontrolle bei Verwendung von Stoffwechsel ­
aktivierungssystemen ist N-Dimethylnitrosamin.
 
K o n z e n t r a t i o n e n  
Es sind mehrere unterschiedliche Konzentrationen der Prüfsubstanz 
zu verwenden. Die höchste Konzentration sollte zytotoxisch wirken. Relativ wasserunlösliche Verbindungen sind bis zur Löslichkeits ­
grenze zu testen. Bei voll wasserlöslichen, nichttoxischen Substanzen 
ist die höchste Konzentration von Fall zu Fall festzulegen.
 
Z e l l e n  
Die Kulturen sind unter geeigneten Bedingungen (Wachstums ­
medien, CO  2 -Konzentration, Temperatur und Feuchtigkeit) zu halten. 
Etablierte Zelllinien sind periodisch auf Mycoplasmaverunreinigung 
zu überprüfen. Weiterhin ist eine periodische Überprüfung der Zellen auf Karyotypstabilität ratsam.
 
S t o f f w e c h s e l a k t i v i e r u n g  
Bei primären Hepatozytenkulturen wird kein exogenes Stoffwechsel ­
aktivierungssystem verwendet. Die Behandlung etablierter Zelllinien 
und Lymphozyten mit der Prüfsubstanz erfolgt sowohl mit als auch ohne Zusatz eines geeigneten exogenen Stoffwechselaktivierungssys ­
tems.
 
Versuchsdurchführung  
V o r b e r e i t u n g d e r K u l t u r e n  
Etablierte Zelllinien werden aus Stammkulturen gewonnen (z. B. 
durch Trypsinierung bzw. Abschütteln), in Kulturgefäße in angemes ­
sener Zelldichte überimpft und bei 37  o C inkubiert.  
Kurzzeitkulturen von Rattenhepatozyten werden dadurch angelegt, 
dass man es frisch gewonnenen Hepatozyten ermöglicht, sich in 
einem geeigneten Medium an die Wachstumsfläche festzuheften.  
Kulturen von menschlichen Lymphozyten werden mit geeigneten 
Verfahren angelegt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 367
 
B e h a n d l u n g d e r K u l t u r e n m i t d e r P r ü f s u b s t a n z  
Primäre Rattenhepatozyten  
Frisch isolierte Rattenhepatozyten werden in einem  3 H-TdR enthal ­
tenden Medium während eines angemessenen Zeitraums mit der Prüfsubstanz behandelt. Nach Ende der Behandlung wird das Me ­
dium entfernt, die Zellen werden gewaschen, fixiert und getrocknet. 
Die Objektträger werden in Autoradiografieemulsion getaucht (alter ­
nativ dazu können „stripping“-Filme verwendet werden), „belichtet“, entwickelt, gefärbt und ausgewertet.
 
Etablierte Zelllinien und Lymphozyten  
Autoradiografieverfahren: Die Zellkulturen werden jeweils während 
einer angemessenen Zeitdauer mit der Prüfsubstanz behandelt und dann mit
 3 H-TdR behandelt. Die Zeiten richten sich nach Art der 
Substanz, Aktivität des Stoffwechselsystems und Zelltyp. Zur Ermitt ­
lung des UDS-Maximums ist  3 H-TdR entweder gleichzeitig mit der 
Prüfsubstanz oder innerhalb weniger Minuten danach zuzugeben. Für welches dieser beiden Verfahren man sich entscheidet, hängt von der Möglichkeit einer Interaktion zwischen Prüfsubstanz und
 3 H-TdR ab. 
Um zwischen UDS und semikonservativer DNS-Replikation zu un ­
terscheiden, kann letztere z. B. durch Verwendung eines arginin ­
freien Mediums, durch geringen Serumgehalt oder Hydroxyharnstoff im Kulturmedium gehemmt werden.
 
Messungen der UDS mit dem LSC-Verfahren: Vor Behandlung mit 
der Prüfsubstanz sollte der Eintritt der Zellen in die S-Phase wie 
oben beschrieben blockiert werden. Anschließend sind die Zellen 
wie bei der Autoradiografie beschrieben mit der Prüfsubstanz zu behandeln. Nach Ende der Inkubationszeit extrahiert man die DNS aus den Zellen und bestimmt den gesamten DNS-Gehalt sowie 
die
 3 H-TdR-Einbaurate.  
Bei Verwendung nichtstimulierter menschlicher Lymphozyten erübri ­
gen sich die oben genannten Verfahren zur Hemmung der semikon ­
servativen DNS-Replikation.  
Analyse  
Autoradiografiebestimmung  
Bei der Bestimmung der UDS an Zellen in Kultur werden die S- 
Phasen-Kerne nicht gezählt. Pro Konzentration sind bei der Zählung 
mindestens 50 Zellen zu erfassen. Die Objektträger sollten vor der Zählung kodiert werden. Auf jedem Objektträger sind mehrere weit auseinander liegende, nach dem Zufallsprinzip ausgewählte Felder zu 
zählen. Das Ausmaß der Hintergrund-Markierung im Zytoplasma ist 
durch Zählung von drei Bereichen von der Größe eines Kerns im Zytoplasma jeder gezählten Zelle zu bestimmen.
 
B e s t i m m u n g e n m i t d e m L S C - V e r f a h r e n  
Bei Bestimmungen der UDS mit dem LSC-Verfahren ist eine an ­
gemessene Anzahl von Kulturen pro Konzentration und in den Kon ­
trollen zu verwenden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 368
 
Alle Ergebnisse sind in einem unabhängigen Versuch zu bestätigen.  
2. DATEN  
Die Daten sind in tabellarischer Form darzustellen.  
2.1. AUTORADIOGRAFIEBESTIMMUNGEN  
Das Ausmaß des  3 H-TdR-Einbaus im Zytoplasma und die Anzahl der 
Körner über dem Zellkern sind getrennt zu vermerken.  
Zur Beschreibung der Verteilung der  3 H-TdR-Hintergrundmarkierung 
und der Anzahl der Granula pro Kern können Mittelwert, Median ­
wert und Modalwert verwendet werden.  
2.2. BESTIMMUNGEN MIT DEM LSC-VERFAHREN  
Bei der Bestimmung mit dem LSC-Verfahren ist der  3 H-TdR-Einbau 
in dpm/μg DNS anzugeben. Zur Beschreibung der Einbauverteilung 
kann der Mittelwert für dpm/ μg DNS mit Standardabweichung ver ­
wendet werden.  
Die Auswertung der Daten sollte unter Verwendung geeigneter sta ­
tistischer Verfahren erfolgen.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— verwendete Zellen, Dichte und Passagenanzahl und Zeitpunkt der 
Behandlung, Anzahl der Zellkulturen;  
— zur Erstellung der Zellkulturen verwendete Verfahren einschließ ­
lich Medium, Temperatur und CO  2 -Konzentrationen;  
— Prüfsubstanz, Lösungsmittelkonzentrationen und Begründung für 
die Wahl der in dem Versuch verwendeten Konzentrationen;  
— nähere Angaben zu den Stoffwechselaktivierungssystemen;  
— Behandlungsplan;  
— Positiv- und Negativkontrollen;  
— verwendetes Autoradiografieverfahren;  
— zur Blockierung des Eintritts der Zellen in die S-Phase verwen ­
dete Verfahren;  
— zur DNS-Extraktion und Bestimmung des gesamten DNS-Ge ­
halts im Rahmen des LSC-Verfahrens verwendete Methoden;  
— ggf. Dosis-Wirkungs-Beziehung;  
— statistische Auswertung;  
— Diskussion der Ergebnisse;  
— Bewertung der Ergebnisse.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 369
 
3.2. INTERPRETATION  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
4. LITERATUR  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 370
 
B.19.  IN-VITRO-SCHWESTERCHROMATIDAUSTAUSCH-TEST  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.3. BEZUGSSUBSTANZEN  
Keine.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Bei dem Schwesterchromatidaustausch-Test (SCE = Sister Chroma ­
tid Exchange) handelt es sich um einen Kurzzeittest zur Ermittlung 
reziproker Austausche der DNS zwischen zwei Schwesterchromati ­
den eines sich replizierenden Chromosoms. SCE stellt den Austausch von DNS-Replikationsprodukten an anscheinend homologen Loci dar. Der Austauschprozess umfasst vermutlich Bruch und Reunion 
der DNS-Stränge, aber über seine Molekulargrundlage ist wenig 
bekannt. Zur Erkennung des SCE ist es erforderlich, die Schwester ­
chromatiden unterschiedlich zu markieren, was sich durch Einbau von Bromdesoxyuridin (BrdU) in die Chromosomen-DNS während 
eines oder zwei Zellzyklen erreichen lässt.
 
Die Säugetierzellen werden  in vitro  mit und ohne Zusatz eines exo ­
genen Säuger-Metabolisierungssystems mit der Prüfsubstanz behan ­
delt und während eines oder zweier Replikationszyklen in BrdU 
enthaltendem Medium kultiviert. Nach Behandlung mit einem Spin ­
delgift (z. B. Colchicin) zur Akkumulierung der Zellen in einem metaphasenähnlichen Stadium der Mitose (C-Metaphase) werden die Zellen gewonnen und Chromosomenpräparationen hergestellt.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
Vorbereitung  
— Für diese Versuche können Primärkulturen (z. B. menschliche 
Lymphozyten) oder etablierte Zelllinien (z. B. Ovarzellen des Chinesischen Hamsters) verwendet werden. Zelllinien sind auf Mycoplasmaverunreinigung zu überprüfen;
 
— der Versuch ist mit geeigneten Kulturmedien und unter angemes ­
senen Inkubationsbedingungen (z. B. Temperatur, Kulturgefäße, CO
 2 -Konzentration und Feuchtigkeit) durchzuführen;  
— die Prüfsubstanzen können in Kulturmedien oder in geeigneten 
Lösungsmitteln gelöst oder suspendiert werden, bevor die Be ­
handlung der Zellen beginnt. Die endgültige Konzentration eines Lösungsmittels im Kultursystem darf die Lebensfähigkeit der Zellen bzw. die Wachstumsrate nicht signifikant beeinflussen. 
Die Beeinflussung der SCE-Häufigkeit ist durch eine Lösungs ­
mittelkontrolle zu überwachen;
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 371
 
— die Behandlung der Zellen mit der Prüfsubstanz sollte sowohl mit 
als auch ohne Zusatz eines exogenen Säuger-Metabolierungssys ­
tems erfolgen. Werden Zelltypen mit endogener Stoffwechsel ­
aktivität verwendet, sollte bekannt sein, dass die Substanzen der entsprechenden chemischen Klasse zu metabolisieren ver ­
mögen.
 
Versuchsbedingungen  
A n z a h l d e r K u l t u r e n  
Für jeden experimentellen Punkt sind mindestens zwei Kulturen zu 
verwenden.  
V e r w e n d u n g v o n P o s i t i v - u n d N e g a t i v k o n t r o l l e n  
Bei jedem Versuch sind Positivkontrollen heranzuziehen sowohl un ­
ter Verwendung einer direkt wirksamen Substanz als auch einer Sub ­
stanz, die eine Stoffwechselaktivierung erfordert. Auch eine Lö ­
sungsmittelkontrolle ist zu verwenden.  
Folgende Substanzen können beispielsweise als Positivkontrollen 
verwendet werden:  
— direkt wirksame Verbindungen:  
— Ethylmethansulfonat,  
— indirekt wirksame Verbindungen:  
— Cyclophosphamid.  
Gegebenenfalls kann eine zusätzliche Positivkontrolle mit einer Sub ­
stanz durchgeführt werden, die der gleichen chemischen Klasse an ­
gehört wie die Prüfsubstanz.  
K o n z e n t r a t i o n e n  
Es sind mindestens drei geeignete Konzentrationen der Prüfsubstanz 
zu verwenden. Die höchste Konzentration sollte eine signifikant to ­
xische Wirkung ausüben, muss jedoch noch eine adäquate Zellrepli ­
kation zulassen. Relativ wasserunlösliche Substanzen sind mit geeig ­
neten Verfahren bis zur Löslichkeitsgrenze zu testen. Bei voll was ­
serlöslichen, nichttoxischen Substanzen ist die höchste Prüfsubstanz ­
konzentration von Fall zu Fall festzulegen.  
Versuchsdurchführung  
V o r b e r e i t u n g d e r K u l t u r e n  
Zellen etablierter Zelllinien werden aus Stammkulturen isoliert (z. B. 
durch Trypsinierung bzw. Abschütteln), in Kulturgefäße in geeig ­
neter Dichte ausgesät und bei 37  o C inkubiert. Bei einschichtigen 
Kulturen ist die Anzahl der Zellen pro Kulturgefäß so zu wählen, 
dass die Kulturen zum Zeitpunkt der Aufarbeitung zu nicht viel mehr als 50 % konfluent sind. Die Zellen können auch in einer Suspen ­
sionskultur gehalten werden. Kulturen von menschlichen Lymphozy ­
ten werden unter Verwendung geeigneter Verfahren mit heparinisier ­
tem Blut angelegt und bei 37
 o C inkubiert.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 372
 
B e h a n d l u n g  
Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase werden während einer 
angemessenen Zeitdauer mit der Prüfsubstanz behandelt. In den meisten Fällen reichen ein bis zwei Stunden aus, doch kann die Behandlungszeit in bestimmten Fällen auf maximal zwei vollständige 
Zellzyklen verlängert werden. Zellen ohne ausreichende Stoffwech ­
selaktivität sind sowohl mit als auch ohne Zugabe eines geeigneten Metabolisierungssystems mit der Prüfsubstanz zu behandeln. Nach Ende der Behandlungszeit wird durch Waschen der Zellen die Prüf ­
substanz entfernt. Die Zellen werden während eines oder zweier 
Replikationszyklen in Anwesenheit von BrdU kultiviert. Alternativ kann die Behandlung der Zellen während der gesamten Kultivie ­
rungszeit von zwei Zellzyklen mit der Prüfsubstanz und BrdU 
gleichzeitig erfolgen.
 
Kulturen von menschlichen Lymphozyten werden behandelt, wäh ­
rend sie sich in semisynchronem Zustand befinden.  
Die Aufarbeitung der Zellen erfolgt zum Zeitpunkt ihrer zweiten 
Teilung nach der Behandlung, wobei sicherzustellen ist, dass die empfindlichsten Stadien des Zellzyklus mit der Substanz behandelt wurden. An allen Kulturen, denen BrdU beigegeben wurde, sind die 
entsprechenden Verrichtungen bis zur Gewinnung der Zellen im 
Dunkeln oder bei entsprechend schwacher Beleuchtung vorzuneh ­
men, um die Fotolyse von BrdU-haltiger DNS so gering wie möglich 
zu halten.
 
G e w i n n u n g d e r Z e l l e n  
Ein bis vier Stunden vor der Aufarbeitung werden die Zellkulturen 
mit einem Spindelgift (z. B. Colchicin) behandelt. Jede Kultur wird einzeln gewonnen und getrennt zur Chromosomenpräparation auf ­
gearbeitet.
 
P r ä p a r a t i o n u n d F ä r b u n g v o n C h r o m o s o m e n  
Die Chromosomenpräparate werden mit zytogenetischen Standard ­
verfahren angefertigt. Die Färbung der Objektträger zur Darstellung 
der SCE ist mit verschiedenen Verfahren möglich (z. B. dem Fluo ­
reszensplus-Giemsa-Verfahren).  
A n a l y s e  
Die Anzahl der zu analysierenden Zellen ist unabhängig von der 
spontanen SCE-Häufigkeit. Normalerweise werden die SCE in min ­
destens 25 gut gespreiteten Metaphasen pro Kultur gezählt. Vor der 
Auswertung werden die Objektträger kodiert. Bei Verwendung menschlicher Lymphozyten wertet man nur die Metaphasen mit 46 Zentromeren aus. Bei Verwendung etablierter Zelllinien werden nur 
Metaphasen ausgewertet, deren Zentromerzahl dem häufigsten Wert 
± 2 entspricht. Er ist anzugeben, ob Farbsprünge im Zentromer ­
bereich als SCE gezählt wurden oder nicht. Alle Ergebnisse sind in einem unabhängigen Versuch zu bestätigen.
 
2. DATEN  
Die Daten sind in tabellarischer Form darzustellen. Für alle behan ­
delten und Kontrollkulturen sind die SCE-Anzahl pro Metaphase und 
die SCE-Anzahl pro Chromosom für jede Kultur getrennt anzugeben.  
Die Auswertung der Daten sollte unter Verwendung geeigneter sta ­
tistischer Verfahren erfolgen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 373
 
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— verwendete Zellen, Zellkulturbedingungen;  
— Versuchsbedingungen: verwendete Medien, CO  2 -Konzentratio ­
nen, Konzentration der Prüfsubstanz, verwendete Lösungsmittel, 
Inkubationstemperatur, Inkubationsdauer, verwendetes Spindel ­
gift (Konzentration und Behandlungsdauer), Typ des verwende ­
ten Säugetier-Metabolisierungssystems, Positiv- und Negativkon ­
trollen;  
— Anzahl der Zellkulturen für jeden experimentellen Punkt;  
— nähere Angaben über die Herstellung der Chromosom ­
enpräparate;  
— Anzahl der analysierten Metaphasen (die Werte sind für jede 
Kultur getrennt anzugeben);  
— SCE-Anzahl pro Metaphase und pro Chromosom (die Werte sind 
für jede Kultur getrennt anzugeben);  
— Kriterien für die Auswertung der SCE;  
— Begründung der Dosierungswahl;  
— ggf. Dosis-Wirkungs-Beziehung;  
— statistische Auswertung;  
— Diskussion der Ergebnisse;  
— Bewertung der Ergebnisse.  
3.2. INTERPRETATION  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
4. LITERATUR  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 374
 
B.20.  TEST ZUR ERFASSUNG GESCHLECHTSGEBUNDENER 
REZESSIVER LETALMUTATIONEN AN  DROSOPHILA 
MELANOGASTER  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.3. BEZUGSSUBSTANZEN  
Keine.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Mit dem Test zur Erfassung geschlechtsgebundener rezessiver Letal ­
mutationen (sex-linked recessive lethal test = SLRL-Test) an  Droso­
phila melanogaster  lassen sich Mutationen — sowohl Punktmutatio ­
nen als auch kleine Deletionen — in der Keimbahn des Insekts 
feststellen. Es handelt sich um einen Vorwärtsmutationstest, mit 
dem eine Untersuchung auf Mutationen an etwa 800 Loci auf dem X-Chromosom (etwa 80 % aller X-Chromosom-Loci) möglich ist. Das X-Chromosom enthält etwa ein Fünftel des gesamten haploiden 
Genoms.
 
Mutationen im X-Chromosom von Drosophila melanogaster werden 
in männlichen Trägern des Mutantengens phänotypisch exprimiert. 
Wenn eine letale Mutation in hemizygotem Zustand vorliegt, fehlt 
eine der beiden Klassen männlicher Nachkommen, die ein heterozy ­
gotes Weibchen normalerweise hervorbringt. Im SLRL-Test erkennt man diese Tatsachen mit Hilfe besonders markierter und angeord ­
neter Chromosomen.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
Vorbereitung  
Z u c h t e n  
Es können Männchen einer genau definierten Wildtypzucht und 
Weibchen der Zucht Muller-5 verwendet werden. Auch die Verwen ­
dung von anderen entsprechend markierten Weibchen mit multiplen 
invertierten X-Chromosomen ist möglich.  
P r ü f s u b s t a n z  
Die Prüfsubstanzen sind in Wasser zu lösen. Wasserunlösliche Sub ­
stanzen können in geeigneten Lösungsmitteln (z. B. einer Mischung aus Ethanol und Tween-60 oder 80) gelöst oder suspendiert und dann vor der Verabreichung mit Wasser oder Kochsalzlösung ver ­
dünnt werden. Die Verwendung von Dimethylsulfoxid (DMSO) als 
Lösungsmittel ist zu vermeiden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 375
 
A n z a h l d e r T i e r e  
Empfindlichkeit und Signifikanzgrad des Tests sind vorher festzule ­
gen. Die Anzahl der zu analysierenden behandelten Chromosomen hängt in hohem Maß von der spontanen Mutationsrate in entspre ­
chenden Kontrollen ab.
 
B e h a n d l u n g  
Die Verabreichung kann oral, durch Injektion oder durch Exposition 
gegenüber Gasen oder Dämpfen erfolgen. Bei oraler Verabreichung 
kann die Prüfsubstanz in Zuckerlösung gegeben werden. Erforderli ­
chenfalls können die Substanzen in einer 0,7 %igen NaCl-Lösung gelöst und in Thorax oder Abdomen injiziert werden.
 
V e r w e n d u n g v o n N e g a t i v - u n d P o s i t i v k o n t r o l l e n  
Negativ-(Vehikel-) und Positivkontrollen sind zu verwenden. Stehen 
jedoch entsprechende Laborkontrollen zur Verfügung, sind keine gleichzeitigen Kontrollen erforderlich.
 
K o n z e n t r a t i o n e n  
Es sind drei Konzentrationen zu verwenden. Zur vorläufigen Ab ­
schätzung kann eine einzige Konzentration verwendet werden, und 
zwar entweder die höchste noch verträgliche Konzentration der Prüf ­
substanz oder eine Konzentration, die gewisse Toxizitätsanzeichen hervorruft. Bei nichttoxischen Substanzen sollte die Behandlung ge ­
genüber der höchstmöglichen Konzentration erfolgen.
 
V e r s u c h s d u r c h f ü h r u n g  
Wildtypmännchen (3 bis 5 Tage alt) werden mit der Prüfsubstanz 
behandelt und einzeln mit mehreren jungfräulichen Weibchen aus der Muller-5-Zucht oder aus einer anderen entsprechend markierten Zucht (mit multiplen invertierten X-Chromosomen) gepaart. Die 
Weibchen werden alle zwei bis drei Tage durch neue jungfräuliche 
Tiere ersetzt, um den gesamten Keimzellzyklus abzudecken. Durch die Untersuchung der Nachkommen dieser Weibchen werden Letal ­
effekte in reifen Spermien, Spermatiden des mittleren oder späten 
Stadiums, frühen Spermatiden, Spermatozyten und Spermatogonien 
der behandelten Männchen erfasst.
 
Heterozygote F  1 -Weibchen aus den obigen Kreuzungen werden ein ­
zeln (d. h. ein Weibchen pro Flasche) mit ihren Brüdern gepaart. In der F
 2 -Generation wird in jeder Kultur festgestellt, ob Wildtypmänn ­
chen auftreten oder nicht. Gelangt man aufgrund der Tatsache, dass 
in einer Kultur keine F  2 -Männchen mit dem behandelten Chromo ­
som (Wildtyp) beobachtet werden, zu der Annahme, dass das F  2 - 
Weibchen Träger eines Letalgens im väterlichen X-Chromosom ist, sind die Töchter dieses Weibchens mit dem gleichen Genotyp zu 
testen, um festzustellen, ob die Letalität auch in der nächsten Gene ­
ration wieder auftritt.
 
2. DATEN  
Die Daten sind in tabellarischer Form darzustellen. Anzugeben ist 
die Anzahl der getesteten X-Chromosomen, die Anzahl der unfrucht ­
baren Männchen und die Anzahl der Letalmutationen für jede Kon ­
zentration, für jede Paarungsperiode und jedes behandelte Männchen. Auch sind Cluster verschiedener Größen pro Männchen anzugeben. 
Die Versuchsergebnisse sind in einem getrennten Versuch zu bestä ­
tigen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 376
 
Bei der Auswertung der SLRL-Tests sind geeignete statistische Ver ­
fahren zu verwenden. Cluster-Bildung rezessiver Letalmutationen, 
die von einem Männchen ausgehen, sind mit einem geeigneten sta ­
tistischen Verfahren zu untersuchen und auszuwerten.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— Zucht: verwendete  Drosophila -Zuchten oder -Stämme, Alter der 
Insekten, Anzahl der behandelten Männchen, Anzahl der sterilen 
Männchen, Anzahl der etablierten F  2 -Kulturen, Anzahl der F  2 - 
Kulturen ohne Nachkommen, Anzahl der in den einzelnen Keim ­
zellstadien festgestellten Chromosomen mit einer Letalmutation;  
— Kriterien für die Festlegung der Größe der behandelten Gruppen;  
— Versuchsbedingungen: eingehende Beschreibung des Behand ­
lungs- und Stichprobenentnahmeplans, Expositionskonzentratio ­
nen, Toxitätsdaten, ggf. Negativ-(Lösungsmittel-) und Positiv ­
kontrollen;  
— Kriterien für die Erfassung der Letalmutationen;  
— ggf. Dosis-Wirkungs-Beziehung;  
— statistische Auswertung;  
— Diskussion der Ergebnisse;  
— Bewertung der Ergebnisse.  
3.2. INTERPRETATION  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
4. LITERATUR  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 377
 
B.21.  IN-VITRO-ZELLTRANSFORMATIONSTEST  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.3. BEZUGSSUBSTANZEN  
KEINE.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Mit Säugetierzell-Kultursystemen können durch chemische Substan ­
zen induzierte phänotypische Veränderungen  in vitro  ermittelt wer ­
den, die mit malignen Transformationen  in vivo  in Zusammenhang 
gebracht werden. Häufig verwendete Zellen sind: C3H10T 1/2, 
3T3, SHE, Fisher-Ratten-Zellen. Die Tests beruhen auf Verände ­
rungen der Zellmorphologie, Fokusbildung oder der Eigenschaft, im Weichagar wachsen zu können. Mit einigen weniger häufig verwendeten Systemen lassen sich andere physiologische oder mor ­
phologische Veränderungen der Zellen nach Exposition gegenüber 
karzinogenen Substanzen feststellen. Für keinen der In-vitro-Test- Endpunkte wurde eine kausale Beziehung zu Krebs nachgewiesen. Mit einigen der Testsysteme lassen sich Tumorpromotoren ermit ­
teln. Die Zytotoxizität kann festgestellt werden anhand der Aus ­
wirkung der Prüfsubstanz auf das Koloniebildungsvermögen (Klo ­
nierungseffizienz) oder die Wachstumsraten der Kulturen. Durch Ermittlung der Zytotoxizität kann man feststellen, ob die Exposi ­
tion gegenüber der Prüfsubstanz toxikologisch relevant war, man 
kann damit jedoch nicht in allen Versuchen die Transformations ­
häufigkeit berechnen, da bei einigen längere Inkubationszeiten und/oder Neuplattierungen erforderlich sind.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
Vorbereitung  
Z e l l e n  
Je nach verwendetem Transformationstest stehen verschiedene Zell ­
linien oder primäre Zellen zur Verfügung. Der Untersucher muss sicherstellen, dass die Zellen in dem durchzuführenden Versuch 
nach der Exposition gegenüber bekannten Karzinogenen die entspre ­
chenden phänotypischen Veränderungen aufweisen und dass Validi ­
tät und Zuverlässigkeit des Tests in seinem Labor nachgewiesen und dokumentiert wurden.
 
M e d i e n  
Die Medien und Versuchsbedingungen müssen für den durchzufüh ­
renden Transformationsversuch geeignet sein.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 378
 
P r ü f s u b s t a n z  
Die Prüfsubstanzen können in einem Kulturmedium oder in geeig ­
neten Vehikeln gelöst oder suspendiert werden, bevor die Behand ­
lung der Zellen beginnt. Die Endkonzentration des Lösungsmittels im Kultursystem darf weder die Überlebensrate noch die Wachs ­
tumsrate der Zellen oder die Transformationsinzidenz beeinflussen.
 
S t o f f w e c h s e l a k t i v i e r u n g  
Die Behandlung der Zellen mit der Prüfsubstanz sollte sowohl mit 
als auch ohne Zusatz eines exogenen Säugetier-Metabolierungssys ­
tems erfolgen. Werden Zelltypen mit endogener Stoffwechselaktivität 
verwendet, sollte bekannt sein, dass diese Zellen Substanzen der entsprechenden chemischen Klasse zu metabolisieren vermögen.
 
Versuchsbedingungen  
V e r w e n d u n g v o n P o s i t i v - u n d N e g a t i v k o n t r o l l e n  
Jeder Versuch sollte Positivkontrollen umfassen unter Verwendung 
sowohl einer direkt wirkenden Substanz als auch einer Substanz, bei 
der eine Stoffwechselaktivierung erforderlich ist. Auch eine Negativ- 
(Vehikel-)Kontrolle sollte angelegt werden.  
Folgende Substanzen können beispielsweise als Positivkontrollen 
dienen:  
— Direkt wirksame Verbindungen:  
— Ethylmethansulfonat,  
— β-Propiolacton,  
— Verbindungen, bei denen eine Stoffwechselaktivierung erforder ­
lich ist:  
— 2-Acetylaminofluoren,  
— 4-(Dimethylamino)-azobenzol,  
— 7,12-Dimethylbenzanthracen.  
Gegebenenfalls ist eine weitere Positivkontrolle erforderlich, die der 
gleichen chemischen Klasse angehört, wie die zu untersuchende Sub ­
stanz.  
K o n z e n t r a t i o n e n  
Es sind mehrere Konzentrationen der Prüfsubstanz zu verwenden. 
Diese Konzentrationen sollten eine konzentrationsabhängige toxische Wirkung ausüben, wobei die höchste Konzentration eine geringe 
Überlebensrate ergibt und die Überlebensrate in der niedrigsten Kon ­
zentration etwa der in der negativen Kontrolle entspricht. Relativ wasserunlösliche Substanzen sind mit geeigneten Verfahren bis zur Löslichkeitsgrenze zu testen. Bei voll wasserlöslichen, nichttoxischen 
Substanzen ist die höchste Prüfkonzentration von Fall zu Fall fest ­
zulegen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 379
 
Versuchsdurchführung  
Die Zellen sind je nach verwendetem Testsystem während einer 
angemessenen Zeitdauer zu exponieren; bei längerer Exposition kann deshalb eine Neudosierung mit Erneuerung des Mediums (und ggf. des Stoffwechselaktivierungsgemischs) erforderlich wer ­
den. Die Behandlung der Zellen ohne ausreichende eigene Stoff ­
wechselaktivität mit der Prüfsubstanz sollte sowohl mit als auch ohne Zusatz eines geeigneten Stoffwechselaktivierungssystems erfol ­
gen. Nach Ende der Behandlungszeit wird die Prüfsubstanz durch 
Waschen von den Zellen entfernt. Dann werden die Zellen unter 
Bedingungen kultiviert, die es ermöglichen, den veränderten Phäno ­
typ zu erfassen. Anschließend wird die Transformationsinzidenz er ­
mittelt. Alle Ergebnisse sind in einem unabhängigen Versuch zu 
bestätigen.
 
2. DATEN  
Die Daten sind in tabellarischer Form darzustellen. Je nach Versuch 
sind zum Beispiel Anzahl der Platten, Platten mit Transformation oder Anzahl der transformierten Zellen anzugeben. Gegebenenfalls ist die Überlebensrate als Prozentsatz der Überlebensrate in den Kon ­
trollkulturen und die Transformationshäufigkeit als Anzahl der trans ­
formierten Zellen pro Anzahl der überlebenden Zellen auszudrücken. Die Daten sind unter Verwendung geeigneter statistischer Verfahren abzusichern.
 
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— verwendeter Zelltyp, Anzahl der Zellenkulturen, Zellkulturbedin ­
gungen;  
— Versuchsbedingungen, Konzentration der Prüfsubstanz, verwen ­
detes Lösungsmittel, Inkubationstemperatur, Inkubationsdauer, Behandlungsdauer und -häufigkeit, Zelldichte während der Be ­
handlung, Art des verwendeten exogenen Stoffwechselaktivie ­
rungs-Systems, Positiv- und Negativkontrollen, genaue Beschrei ­
bung des zu erfassenden Phänotyps, ggf. verwendetes Selektiv ­
system, Begründung für die Wahl der Konzentrationen;
 
— das zur Zählung der lebenden und transformierten Zellen ver ­
wendete Verfahren;  
— statistische Auswertung;  
— Diskussion der Ergebnisse;  
— Bewertung der Ergebnisse.  
3.2. INTERPRETATION  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
4. LITERATUR  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 380
 
B.22.  SÄUGER-IN-VIVO-DOMINANT-LETAL-TEST  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.3. BEZUGSSUBSTANZEN  
Keine.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Dominante Letaleffekte bewirken den Tod des Embryos bzw. des 
Fötus. Die Induktion dominanter Letalgene durch Behandlung mit 
einer chemischen Substanz weist darauf hin, dass die Substanz das 
Keimgewebe der Tierart geschädigt hat. Man geht allgemein davon aus, dass dominante Letalgene auf Chromosomenschäden (struktu ­
relle und numerische Anomalien) zurückgehen. Das Absterben des 
Embryos in behandelten Weibchen kann auch durch toxische Effekte 
bedingt sein.
 
Im Allgemeinen werden die männlichen Tiere mit der Prüfsubstanz 
behandelt und dann mit unbehandelten jungfräulichen Weibchen ge ­
paart. Die verschiedenen Keimzellstadien können durch Verwendung 
aufeinander folgender Paarungsintervalle getrennt getestet werden. Die Differenz zwischen der Anzahl der toten Implantate pro Weib ­
chen in der behandelten Gruppe und der Anzahl toter Implantate pro 
Weibchen in der Kontrollgruppe entspricht dem Postimplantations ­
verlust. Der Präimplantationsverlust kann abgeschätzt werden auf der Grundlage der  Corpora lutea  oder durch den Vergleich der Gesamt ­
implantate pro Weibchen in der behandelten und der Kontrollgruppe. 
Der gesamte dominante Letaleffekt entspricht der Summe der Prä- 
und Postimplantationsverluste. Die Berechnung des gesamten domi ­
nanten Letaleffekts beruht auf einem Vergleich der Zahl der leben ­
den Implantate pro Weibchen in der Versuchsgruppe mit der Zahl 
der lebenden Implantate pro Weibchen in der Kontrollgruppe. Eine Verringerung der Implantatenanzahl in bestimmten Paarungsgruppen kann darauf zurückzuführen sein, dass Zellen (z. B. Spermatozyten 
und/oder Spermatogonien) abgetötet wurden.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
Vorbereitung  
Die Prüfsubstanzen sind möglichst in isotonischer Kochsalzlösung zu 
lösen oder zu suspendieren. Wasserunlösliche Substanzen können in geeigneten Vehikeln gelöst öder suspendiert werden. Das verwendete Vehikel darf weder die Wirkung der Prüfsubstanz beeinträchtigen 
noch eine toxische Wirkung ausüben. Es sind frische Lösungs- 
oder Suspensionsansätze zu verwenden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 381
 
Versuchsbedingungen  
V e r a b r e i c h u n g s w e g  
Die Prüfsubstanz sollte im Allgemeinen nur einmal verabreicht wer ­
den. Wenn toxikologische Gründe dafür sprechen, ist eine wieder ­
holte Behandlung möglich. Die üblichen Verabreichungswege sind 
per os oder intraperitoneal. Auch andere Verabreichungswege kön ­
nen geeignet sein.  
V e r s u c h s t i e r e  
Als Versuchstiere werden Ratten oder Mäuse empfohlen. Gesunde, 
voll geschlechtsreife Tiere werden randomisiert und Behandlungs- 
und Kontrollgruppen zugeordnet.  
A n z a h l u n d G e s c h l e c h t  
Man sollte eine ausreichende Anzahl behandelter Männchen verwen ­
den, um der spontanen Variation des auszuwertenden biologischen Merkmals Rechnung zu tragen. Die Entscheidung über die Anzahl 
sollte auf der vorher festgelegten Erkennungsgenauigkeit und ge ­
wünschten Signifikanz-Schranke beruhen. So sollte in einem typi ­
schen Versuch die Anzahl der Männchen in jeder Dosierungsgruppe ausreichen, um 30 bis 50 trächtige Weibchen pro Paarungsintervall 
zu erzielen.
 
V e r w e n d u n g v o n N e g a t i v - u n d P o s i t i v k o n t r o l l e n  
Normalerweise sind für jeden Versuch gleichzeitige Positiv- und 
Negativkontrollen erforderlich. Stehen Ergebnisse von positiven 
Kontrollen zur Verfügung, die in letzter Zeit im selben Labor er ­
hoben wurden, so können anstelle einer gleichzeitigen Positivkon ­
trolle diese Ergebnisse verwendet werden. Bekannte Mutagene sind als Positivkontrollen mit einer angemessenen niedrigeren Dosierung 
(z. B. MMS, i. p., mit 10 mg/kg) zum Nachweis der Testempfind ­
lichkeit zu verwenden.
 
D o s i e r u n g  
Normalerweise sind drei verschiedene Dosierungen zu verwenden. 
Die hohe Dosierung sollte Toxizitätsanzeichen oder verringerte 
Fruchtbarkeit bei den behandelten Tieren hervorrufen. In bestimmten 
Fällen kann eine einmalige hohe Dosierung ausreichen.  
L i m i t - T e s t  
Nichttoxische Substanzen sind mit 5 g/kg bei einmaliger Verabrei ­
chung oder mit 1 g/kg pro Tag bei mehrmaliger Verabreichung zu 
testen.  
Versuchsdurchführung  
Man kann nach verschiedenen Behandlungsplänen vorgehen. Am 
weitesten verbreitet ist die einmalige Verabreichung der Prüfsub ­
stanz, doch kann man auch andere Behandlungspläne anwenden.  
Einzelne Männchen werden in angemessenen Abständen der Be ­
handlung mit einem oder zwei unbehandelten virginellen Weibchen 
verpaart. Die Weibchen und Männchen sollten mindestens während der Dauer eines Östruszyklus zusammenbleiben oder so lange, bis die Paarung stattgefunden hat. Eine erfolgte Paarung wird durch 
Anwesenheit von Sperma in der Vagina oder anhand eines Vaginal ­
pfropfes festgestellt.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 382
 
Die Anzahl der Paarungen nach der Behandlung richtet sich nach 
dem Behandlungsplan; sie muss ausreichen, um alle Keimzellensta ­
dien nach der Behandlung zu erfassen.  
Die Weibchen werden in der zweiten Hälfte der Trächtigkeit getötet. 
Der Uterusinhalt wird zur Bestimmung der Anzahl toter und leben ­
der Implantate untersucht. Eine Untersuchung der Ovarien zur Be ­
stimmung der Anzahl der  Corpora lutea  ist möglich.  
2. DATEN  
Die Daten sind in tabellarischer Form unter Angabe der Anzahl der 
Männchen, der Anzahl der trächtigen Weibchen und der Anzahl nicht trächtiger Weibchen darzustellen. Die Ergebnisse jeder Paarung einschließlich der Identität jedes Männchens und Weibchens sind 
einzeln durchzuführen. Für jedes Weibchen ist die Paarungswoche, 
die den Männchen verabreichte Dosis und die Häufigkeit der leben ­
den und der toten Implantate anzugeben.
 
Die Berechnung des gesamten dominanten Letaleffekts beruht auf 
einem Vergleich der Anzahl der lebenden Implantate pro Weibchen 
in der Versuchsgruppe mit der Anzahl der lebenden Implantate pro Weibchen in der Kontrollgruppe. Eine Analyse des Verhältnisses von toten und lebenden Implantaten aus der behandelten Gruppe vergli ­
chen mit dem gleichen Verhältnis aus der Kontrollgruppe ergibt den 
Postimplantationsverlust.
 
Werden frühes oder spätes Absterben gesondert erfasst, muss dies 
aus den Tabellen hervorgehen. Wird der Präimplantationsverlust be ­
rechnet, ist er anzugeben. Der Präimplantationsverlust kann als Dif ­
ferenz zwischen der Anzahl der  Corpora lutea  und der Anzahl der 
Implantate oder als Verringerung der Durchschnittsanzahl der Im ­
plantate pro Uterus gegenüber den Kontrollpaarungen berechnet wer ­
den. 
Die Auswertung der Daten erfolgt mit geeigneten statistischen Ver ­
fahren.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— Art, Stamm, Alter und Gewicht der verwendeten Tiere, Anzahl 
der Männchen und Weibchen in Versuchs- und Kontrollgruppen;  
— Prüfsubstanz, Lösungsmittel, getestete Dosierungen und Begrün ­
dung für die Wahl der Dosierung, Negativ- und Positivkontrol ­
len, Toxizitätsdaten;  
— Behandlungsart und -dauer;  
— Paarungsplan;  
— Verfahren zur Feststellung, ob die Paarung erfolgt ist;  
— Zeitpunkt der Tötung;  
— Kriterien für die Erfassung der dominanten Letaleffekte;  
— ggf. Dosis-Wirkungs-Beziehung;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 383
 
— statistische Auswertung;  
— Diskussion der Ergebnisse;  
— Bewertung der Ergebnisse.  
3.2. INTERPRETATION  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
4. LITERATUR  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 384
 
B.23.  SPERMATOGONIEN-CHROMOSOMENABERRAT IONSTEST 
BEI SÄUGETIEREN  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht der OECD TG 483, Mammalian Sperma ­
togonial Chromosome Aberration Test (1997).  
1.1. EINLEITUNG  
Der In-vivo-Spermatogenientest auf Chromosomenaberrationen bei 
Säugetieren dient zum Nachweis von Agenzien, die bei Säugetieren 
strukturelle Chromosomenaberrationen in den Spermatogonien aus ­
lösen (1) (2) (3) (4) (5). Dabei ist zwischen strukturellen Chromo ­
somentyp- und Chromatidentypaberrationen zu unterscheiden. Bei 
der Mehrzahl der chemischen Mutagene sind die Aberrationen dem 
Chromatidentyp zuzuordnen, doch kommen auch Chromosomentypa ­
berrationen vor. Allerdings ist diese Methode nicht zur Messung numerischer Aberrationen bestimmt und wird folglich auch nicht 
routinemäßig dafür eingesetzt. Chromosomenmutationen und ähn ­
liche Vorgänge sind die Ursache für zahlreiche humangenetische Erkrankungen.
 
Mit diesem Test werden Chromosomenveränderungen in Spermato ­
gonien ermittelt, so dass Prognosen zur Auslösung vererbbarer Mu ­
tationen in Keimzellen möglich sind.  
Bei dieser Prüfung werden routinemäßig Nagetiere eingesetzt. Mit 
diesem zytogenetischen In-vivo-Test werden Chromosomenaberratio ­
nen in Mitosen von Spermatogonien ermittelt. Andere Zielzellen sind 
nicht Gegenstand dieser Methode.  
Zum Nachweis von Chromatidentypaberrationen in Spermatogonien 
ist die erste mitotische Zellteilung nach der Behandlung zu unter ­
suchen, bevor diese Läsionen bei anschließenden Zellteilungen ver ­
loren gehen. Die meiotische Chromosomenanalyse der Spermatozy ­
ten in der Diakinese-Metaphase I auf Chromosomenaberrationen 
nach Behandlung der Spermatogoniestammzellen kann weitere nütz ­
liche Informationen liefern.  
Mit dem In-vivo-Test soll ermittelt werden, ob Mutagene für soma ­
tische Zellen auch in Keimzellen aktiv sind. Darüber hinaus ist der Keimzellentest für die Bewertung des mutagenen Risikos von Rele ­
vanz, da er die Berücksichtigung von Faktoren des in-vivo-Stoff ­
wechsels, der Pharmakokinetik und der DNA-Reparaturprozesse er ­
möglicht.
 
In den Hoden finden sich mehrere Generationen von Spermatogonien 
mit einem Spektrum der Empfindlichkeit gegenüber chemischer Be ­
handlung. Die festgestellten Aberrationen stellen also eine Gesamt ­
reaktion der behandelten Spermatogoniepopulationen dar, wobei die 
zahlreicheren differenzierten Spermatogonien dominieren. Je nach ihrer Position im Hoden sind einzelne Generationen von Spermato ­
gonien dem allgemeinen Kreislauf ausgesetzt oder nicht, und zwar 
wegen der physischen und physiologischen Sertoli-Zellen-Schranke 
und der Blut-Hoden-Schranke.
 
Wenn Anzeichen dafür bestehen, dass die Prüfsubstanz oder ein 
reaktiver Metabolit das Zielgewebe nicht erreicht, ist dieser Test nicht geeignet.
 
Siehe auch allgemeine Einleitung zu Teil B.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 385
 
1.2. DEFINITIONEN  
Chromatidentypaberration:  strukturelle Chromosomenanomalie, 
gekennzeichnet durch Bruch einzelner Chromatiden oder Bruch und Reunion von Chromatiden.
 
Chromosomentypaberration:  strukturelle Chromosomenanomalie, 
gekennzeichnet durch Bruch oder Bruch und Reunion beider Chro ­
matiden an gleicher Position.  
Lücke:  achromatische Läsion von geringerer Breite als eine Chro ­
matide und mit minimaler Verlagerung der Chromatiden.  
Numerische Aberration:  Abweichung der Chromosomenzahl vom 
Normalwert, der für die verwendeten Tiere charakteristisch ist.  
Polyploidie:  Vorhandensein von mehr als zwei haploiden Chromo ­
somensätzen (n) (z. B. 3n, 4n usw.).  
Strukturelle Aberration:  Veränderung der Chromosomenstruktur, 
nachweisbar durch mikroskopische Untersuchung des Metaphase- Stadiums der Zellteilung, äußert sich in Form von Deletionen, intra ­
chromosalen oder reziproken Translokationen.
 
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Die Tiere erhalten die Prüfsubstanz mittels einer geeigneten Exposi ­
tionsform verabreicht und werden zu einem geeigneten Zeitpunkt 
nach der Behandlung getötet. Vor der Tötung werden die Tiere 
mit einem Spindelgift (z. B. Colchicin oder Colcemid  ® ) behandelt. 
Aus den Keimzellen werden dann Chromosomen präpariert und ge ­
färbt, und die Metaphasezellen werden auf Chromosomenaberratio ­
nen untersucht.  
1.4. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.4.1.  Vorbereitungen  
1.4.1.1.  Versuchstiere  
Gewöhnlich werden männliche chinesische Hamster und Mäuse ver ­
wendet, doch kommen auch männliche Tiere anderer geeigneter Säu ­
getierarten in Frage. Es sollten junge gesunde und geschlechtsreife 
Tiere üblicher Labortierstämme zum Einsatz kommen. Zu Beginn des Versuchs sollte die Abweichung des Körpergewichts der Tiere vom Mittelwert so gering wie möglich sein und nicht mehr als 
± 20 % betragen.
 
1.4.1.2.  Haltungs- und Fütterungsbedingungen  
Es gelten die allgemeinen Bedingungen in der allgemeinen Einlei ­
tung zu Teil B, doch ist bei der Luftfeuchtigkeit ein Wert von 50- 
60 % anzustreben.  
1.4.1.3.  Vorbereitung der Tiere  
Gesunde und geschlechtsreife junge Männchen werden randomisiert 
und den einzelnen Kontroll- bzw. Behandlungsgruppen zugeteilt. Die Käfige sind so anzuordnen, dass sich ihre Position möglichst wenig auswirkt. Es erfolgt eine Einzelidentifizierung der Tiere. Die Tiere 
werden vor Beginn der Studie über einen Zeitraum von mindestens 
fünf Tagen unter Laborbedingungen eingewöhnt.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 386
 
1.4.1.4.  Vorbereitung der Dosierung  
Feste Prüfsubstanzen sollten vor der Verabreichung an die Tiere in 
geeigneten Lösungsmitteln oder Vehikeln gelöst oder suspendiert und ggf. verdünnt werden. Flüssige Prüfsubstanzen können direkt 
verabreicht oder zuvor verdünnt werden. Es sind frische Zubereitun ­
gen der Prüfsubstanz zu verwenden, es sei denn, die Stabilität der Substanz bei Lagerung wird nachgewiesen.
 
1.4.2.  Prüfbedingungen  
1.4.2.1.  Lösungsmittel/Vehikel  
Das Lösungsmittel/Vehikel sollte bei den gewählten Dosierungen 
keine toxischen Wirkungen hervorrufen und nicht im Verdacht ste ­
hen, mit der Prüfsubstanz eine chemische Reaktion einzugehen. Wer ­
den keine allgemein bekannten Lösungsmittel/Vehikel verwendet, so sind Referenzdaten zur Kompatibilität beizubringen. Es ist zu emp ­
fehlen, als erste Wahl möglichst die Verwendung eines wässrigen 
Lösungsmittels/Vehikels in Erwägung zu ziehen.
 
1.4.2.2.  Kontrollen  
Für jeden Versuch und jedes Geschlecht sind gleichzeitig Positiv- 
und Negativ-(Lösungsmittel-/Vehikel-)Kontrollen anzulegen. Bis auf die Verabreichung der Prüfsubstanz sind die Tiere der Kontrollgrup ­
pen ebenso zu behandeln wie die Tiere der Behandlungsgruppen.
 
Die Positivkontrollen sollten in vivo strukturelle Chromosomenaber ­
rationen in Spermatogonien hervorrufen, wenn sie in Expositions ­
konzentrationen verabreicht werden, die voraussichtlich eine erkenn ­
bare Zunahme gegenüber dem Hintergrund ergeben.  
Die Positivkontrollkonzentrationen sollten so gewählt werden, dass 
die Wirkungen eindeutig sind, aber beim Ablesen nicht sofort die 
Identität der kodierten Objektträger erkennen lassen. Es ist vertretbar, dass die Positivkontrolle auf anderem Wege als die Prüfsubstanz verabreicht wird und nur eine Probenahme erfolgt. Gegebenenfalls 
könnte eine zusätzliche Positivkontrolle herangezogen werden, die 
der gleichen chemischen Klasse angehört wie die zu prüfende Sub ­
stanz. Es kommen beispielsweise folgende Positivkontrollsubstanzen in Frage:
 
Substanz CAS-Nummer EINECS-Nummer  
Cyclophosphamid 
Cyclophosphamidmonohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Cyclohexylamin 108-91-8 203-629-0 
Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 Monomeres Acrylamid 79-06-1 201-173-7 Triethylenmelamin 51-18-3 200-083-5
 
Zu jedem Zeitpunkt der Probenahme sind Tiere der Negativkontrolle 
einzubeziehen, die lediglich ein Lösungsmittel oder Vehikel erhalten und ansonsten ebenso wie die Behandlungsgruppen behandelt wer ­
den, soweit nicht aus historischen Kontrolldaten akzeptable Werte 
zur Variabilität der Tiere und Häufigkeit der Zellen mit Chromoso ­
menaberrationen vorliegen. Darüber hinaus sollten auch unbehan ­
delte Kontrolltiere verwendet werden, soweit nicht historische oder veröffentlichte Kontrolldaten belegen, dass das gewählte 
Lösungsmittel/Vehikel keine schädlichen oder mutagenen Wirkungen 
hervorruft.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 387
 
1.5. VERFAHREN  
1.5.1.  Anzahl der Tiere  
Jede Behandlungs- und Kontrollgruppe muss mindestens 5 analysier ­
bare Tiere umfassen.  
1.5.2.  Behandlungsplan  
Die Prüfsubstanzen sind möglichst als Einmal- oder Zweimalgabe zu 
verabreichen. Die Gabe kann in Form von zwei Teilmengen erfol ­
gen, die am gleichen Tag im Abstand von wenigen Stunden ver ­
abreicht werden, wenn es sich um ein großes Materialvolumen han ­
delt. Andere Verabreichungsschemata sollten wissenschaftlich be ­
gründet sein.  
In der Gruppe mit der höchsten Dosis wird nach der Behandlung zu 
zwei verschiedenen Zeitpunkten eine Stichprobe entnommen. Da die 
Zellzykluskinetik von der Prüfsubstanz beeinflusst werden kann, er ­
folgt eine Probenahme ca. 24 Stunden und die andere ca. 48 Stunden nach der Behandlung. Bei den übrigen Dosen sollte die Probenahme 
24 Stunden nach der Behandlung oder nach Ablauf eines Zeitraums 
erfolgen, der der l,5fachen Dauer des normalen Zellzyklus entspricht, wenn nicht ein anderer Zeitpunkt erwiesenermaßen zur Feststellung von Effekten günstiger ist (6).
 
Für die Probenahme kommen auch andere Zeitpunkte in Frage. Bei 
Chemikalien, die eine Chromosomenverzögerung bewirken oder S- unabhängige Effekte auslösen können, ist möglicherweise eine Pro ­
benahme zu einem früheren Zeitpunkt angebracht (1).
 
Die Zweckmäßigkeit einer wiederholten Behandlung ist im Einzelfall 
zu prüfen. Bei wiederholter Behandlung sind die Tiere 24 Stunden (l,5facher Zellzyklus) nach der letzten Gabe zu töten. Ggf. sind zu ­
sätzliche Zeiten für die Probenahme vorzusehen.
 
Vor der Tötung wird den Tieren intraperitoneal eine geeignete Dosis 
eines Spindelgiftes (z. B. Colcemid  ® oder Colchicin) verabreicht. 
Eine Stichprobe wird den Tieren danach zu einem geeigneten Zeit ­
punkt entnommen. Bei Mäusen beträgt der Zeitabstand ca. 3 bis 5 
Stunden, bei chinesischen Hamstern ca. 4 bis 5 Stunden.  
1.5.3.  Dosierungen  
Wird eine Studie zur Dosisfindung durchgeführt, weil keine geeig ­
neten Daten verfügbar sind, so sollte sie im gleichen Labor unter 
Verwendung der gleichen Spezies, des gleichen Stammes und Ge ­
schlechts und der gleichen Behandlungsform wie im Hauptversuch erfolgen (7). Liegt Toxizität vor, so sind zum ersten Zeitpunkt der Probenahme drei Dosisstufen zu verwenden. Die Dosisstufen sollten 
den Bereich vom Höchstwert bis zu geringer oder nicht vorhandener 
Toxizität umfassen. Bei der späteren Probenahme muss nur die Höchstdosis verwendet werden. Unter der Höchstdosis ist jene Dosis zu verstehen, die so deutliche Toxizitätszeichen hervorruft, dass hö ­
here Dosisstufen bei gleichem Verabreichungsschema voraussichtlich 
zum Tode führen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 388
 
Substanzen mit spezifischen biologischen Aktivitäten bei geringen 
nichttoxischen Dosen (wie Hormone und Mitogene) entsprechen 
möglicherweise nicht den Dosierungskriterien und sollten anhand einer Einzelfallprüfung bewertet werden. Die Höchstdosis kann auch als jene Dosis definiert werden, die bestimmte Anzeichen 
von Toxizität in den Spermatogonien hervorruft (z. B. eine Reduzie ­
rung des Verhältnisses der Spermatogonienmitosen zur ersten und zweiten meiotischen Metaphase; diese Reduzierung sollte nicht mehr als 50 % betragen).
 
1.5.4.  Limit-Test  
Verursacht die Prüfung einer Dosis von mindestens 2 000 mg/kg 
Körpergewicht bei Einmalgabe oder Gabe von zwei Teilmengen 
am gleichen Tag keine feststellbaren toxischen Wirkungen und ist aufgrund der Daten strukturverwandter Substanzen keine Gentoxizi ­
tät zu erwarten, kann auf eine vollständige Studie mit drei Dosis ­
stufen verzichtet werden. Die voraussichtlichen Expositionswirkun ­
gen beim Menschen können aber beim Limit-Test eine höhere Dosis angezeigt erscheinen lassen.
 
1.5.5.  Verabreichung  
Die Prüfsubstanz wird in der Regel mittels Magen- oder Schlund ­
sonde bzw. durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Auch andere 
Expositionsformen können bei entsprechender Begründung vertretbar sein. Das maximale Flüssigkeitsvolumen, das jeweils durch Sonde oder Injektion verabreicht werden kann, hängt von der Größe des 
Versuchstieres ab. Das Volumen sollte 2 ml/100 g Körpergewicht 
nicht übersteigen. Die Verwendung eines höheren Volumens ist zu begründen. Abgesehen von Reizstoffen oder ätzenden Stoffen, die in der Regel bei höheren Konzentrationen eine verstärkte Wirkung her ­
vorrufen, ist die Variabilität des Prüfvolumens dadurch auf ein Min ­
destmaß zu reduzieren, dass eine Konzentration gewählt wird, die auf allen Dosisstufen ein konstantes Volumen gewährleistet.
 
1.5.6.  Chromosomenpräparation  
Unmittelbar nach der Tötung werden aus einem oder beiden Hoden 
Zellsuspensionen gewonnen, mit hypotoner Lösung behandelt und 
fixiert. Die Zellen werden dann auf Objektträger aufgetropft und gefärbt.
 
1.5.7.  Analyse  
Es sind mindestens 100 gut gespreitete Metaphasen je Tier (d. h. 
mindestens 500 Metaphasen je Gruppe) zu analysieren. Eine zahlen ­
mäßige Reduzierung ist möglich, wenn eine hohe Zahl von Aberra ­
tionen beobachtet wird. Alle Objektträger, auch die für die Positiv- und Negativkontrollen, sind vor der mikroskopischen Untersuchung 
von unabhängiger Seite zu kodieren. Da es bei der Fixierung häufig 
zum Bruch eines Teils der Metaphasezellen unter Verlust von Chro ­
mosomen kommt, sollten die ausgewerteten Zellen daher eine Zen ­
tromerzahl enthalten, die bei allen Zelltypen der Zahl 2n ± 2 ent ­
spricht.
 
2. DATEN  
2.1. AUFBEREITUNG DER ERGEBNISSE  
Die Daten für die einzelnen Tiere sind in tabellarischer Form dar ­
zustellen. Versuchseinheit ist das Tier. Für jedes Tier sind die An ­
zahl der Zellen mit strukturellen Chromosomenaberrationen und die 
Anzahl der Chromosomenaberrationen je Zelle anzugeben. Für die 
Versuchs- und Kontrollgruppen sind die unterschiedlichen Typen struktureller Chromosomenaberrationen mit Anzahl und Häufigkeit aufzuführen. Lücken werden getrennt erfasst und angegeben, aber 
in der Regel nicht bei der Gesamthäufigkeit der Aberrationen berück ­
sichtigt.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 389
 
Wird Mitose sowie Meiose beobachtet, ist das Verhältnis der Sper ­
matogonienmitosen zur ersten und zweiten meiotischen Metaphase 
als Gradmesser der Zytotoxizität bei allen behandelten Tieren und Tieren der Negativkontrolle in einer Gesamtstichprobe von 100 sich teilenden Zellen zu bestimmen, um eine mögliche zytotoxische Wir ­
kung festzustellen. Wird nur Mitose beobachtet, so ist der Mitos ­
eindex für mindestens 1 000 Zellen je Tier zu bestimmen.
 
2.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Es gibt mehrere Kriterien für die Bestimmung eines positiven Ergeb ­
nisses, wie z. B. eine dosisbezogene Zunahme der Anzahl der Zellen mit Chromosomenaberrationen oder eine eindeutige Zunahme der Anzahl der Zellen mit Aberrationen in einer bestimmten Dosisgruppe 
zu einem bestimmten Zeitpunkt der Probenahme. Zunächst sollte die 
biologische Relevanz der Ergebnisse untersucht werden. Als Hilfs ­
mittel bei der Bewertung der Versuchsergebnisse können statistische Methoden dienen (8). Die statistische Signifikanz sollte aber nicht 
der einzige bestimmende Faktor für eine positive Reaktion sein. 
Nicht eindeutige Ergebnisse sollten durch weitere Prüfungen abge ­
klärt werden, möglichst unter Abänderung der Versuchsbedingungen.
 
Eine Prüfsubstanz, bei der die Ergebnisse nicht den oben genannten 
Kriterien entsprechen, gilt bei diesem Versuch als nichtmutagen.  
Auch wenn die meisten Versuche eindeutig positive oder negative 
Ergebnisse liefern, erlaubt der Datensatz in seltenen Fällen keine definitive Aussage über die Aktivität der Prüfsubstanz. Es kommt vor, dass sich die Ergebnisse unabhängig davon, wie oft der Versuch 
wiederholt wird, weiterhin als nicht eindeutig oder als fragwürdig 
erweisen.
 
Positive Befunde des In-vivo-Keimzellentests auf Chromosomena ­
berrationen deuten darauf hin, dass die Prüfsubstanz in den Keim ­
zellen der untersuchten Spezies Chromosenaberrationen hervorruft. 
Negative Befunde sind ein Anzeichen dafür, dass die Prüfsubstanz 
unter diesen Versuchsbedingungen keine Chromosomenaberrationen in den Keimzellen der untersuchten Spezies hervorruft.
 
Zu erörtern ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Prüfsubstanz oder 
ihre Metaboliten in das spezifische Zielgewebe gelangen.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:  
Lösungsmittel/Vehikel:  
— Begründung für die Wahl des Vehikels;  
— Löslichkeit und Stabilität der Prüfsubstanz im Lösungsmittel/ ­
Vehikel, falls bekannt.  
Versuchstiere:  
— Spezies/Stamm;  
— Anzahl und Alter der Tiere;  
— Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.;  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Prüfungsbeginn, einschließlich 
Bereich des Körpergewichts, Mittelwert und Standardabweichung 
für jede Gruppe.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 390
 
Prüfbedingungen:  
— Daten aus einer ggf. durchgeführten Dosisfindungsstudie;  
— Begründung der gewählten Dosisstufen;  
— Begründung für den Verabreichungsweg;  
— Angaben zur Zubereitung der Prüfsubstanz;  
— Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz;  
— Begründung für die Tötungszeiten;  
— ggf. Angaben zur Umrechnung der Konzentration der Prüfsub ­
stanz im Futter/Wasser (ppm) in die entsprechende Dosis (mg/kg 
Körpergewicht/Tag);  
— Angaben über Futter- und Wasserqualität;  
— nähere Angaben zum Behandlungs- und Stichprobenentnahme ­
plan;  
— Methoden zur Bestimmung der Toxizität;  
— Bezeichnung des Spindelgifts, Konzentration und Behandlungs ­
dauer;  
— Methoden zur Präparation des Objektträgers;  
— Kriterien zur Bewertung von Aberrationen;  
— Anzahl der analysierten Zellen pro Tier;  
— Kriterien zur Einstufung der Studien als positiv, negativ oder 
nicht eindeutig.  
Ergebnisse:  
— Toxizitätszeichen;  
— Mitoseindex;  
— Verhältnis der Spermatogenienmitosen zur ersten und zweiten 
meiotischen Metaphase;  
— Typ und Anzahl der Aberrationen, für jedes Tier gesondert an ­
zugeben;  
— Gesamtzahl der Aberrationen pro Gruppe;  
— Anzahl der Zellen mit Aberrationen pro Gruppe;  
— nach Möglichkeit Dosis-Wirkungs-Verhältnis;  
— ggf. statistische Analysen;  
— Daten zu gleichzeitigen Negativkontrollen;  
— Daten zu historischen Negativkontrollen mit Bereichen, Mittel ­
werten und Standardabweichungen;  
— Daten zu gleichzeitigen Positivkontrollen;  
— ggf. beobachtete Veränderungen der Ploidie.  
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 391
 
4. LITERATURHINWEISE  
(1) Adler, I. D. (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermato ­
gonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Speci ­
fications, in:  Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, 
Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis,  Ramel, C, 
Lambert B., and Magnusson, J. (eds.) Liss, New York, 477-484.  
(2) Adler, I. D. (1984), Cytogenic tests in Mammals, in:  Mutage­
nicity Testing: a Practical Approach,  ed. S. Venitt and J. M. 
Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, 275-306.  
(3) Evans, E. P.. Breckon. G. and Ford, C. E. (1964), An Air- 
drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Tes ­
tes, Cytogenetics and Cell Genetics.  3. 289-294.  
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A,, Gatehouse, D. G. and 
Henderson, L. (1990),  In Vivo  Cytogenetic Assays, in: D. J. 
Kirkland (ed.),  Basic Mutagenicity  Tests,  UKEMS Recommen ­
ded Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mu ­
tagenicity Testing.  Report. Part I  revised,  Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
115-141.  
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes,  Mu­
tation Res.,  52, 207-209.  
(6) Adler, I. D., Shelby. M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, 
W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka, N. (1994), Interna ­
tional Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Pro ­
cedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian 
Germ Cell Tests,  Mutation  Res., 312, 313-318.  
(7) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D.)., Gatehouse, D. G., Hodson- Walker, G., Mor ­
ton, D. B., Kirkland D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays,  
Mutagenesis,  7, 313-319.
 
(8) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M, Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.),  Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III,  Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
184-232.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 392
 
B.24.  IN-VIVO-SÄUGER-FELLFLECKENTEST DER MAUS  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.3. BEZUGSSUBSTANZEN  
Keine.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Es handelt sich um einen In-vivo-Test mit Mäusen, bei dem in der 
Entwicklung befindliche Embryonen in utero mit den Prüfsubstanzen 
behandelt werden. Die Zielzellen in diesen Embryonen sind die Me ­
lanoblasten, die Zielgene diejenigen Gene, die die Pigmentierung der Fellhaare steuern. Die in der Entwicklung befindlichen Embryonen 
sind heterozygot für eine Anzahl dieser Fellfarbgene. Eine Mutation 
oder der Verlust (ausgelöst durch verschiedene genetische Ereignis ­
se) des dominanten Allels eines derartigen Gens in einem Melano ­
blasten führt zur Expression des rezessiven Phänotyps. Im Fell der 
aus dem Embryo entstandenen Maus ist an einer Stelle ein Fleck mit 
einer anderen Farbe zu sehen. Die Anzahl der Nachkommen mit andersfarbigen Flecken wird erfasst. Ihre Häufigkeit wird mit der Häufigkeit beim Nachkommen aus der Lösungsmittelkontrolle ver ­
glichen. Mit dem „Mouse Spot Test“ lassen sich mutmaßliche soma ­
tische Mutationen in fetalen somatischen Zellen feststellen.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
Vorbereitung  
Die Prüfsubstanzen sind möglichst in isotonischer Kochsalzlösung zu 
lösen oder zu suspendieren. Wasserunlösliche Substanzen werden in geeigneten Lösungsmitteln gelöst oder suspendiert. Das verwendete 
Lösungsmittel darf weder die Wirkung der Prüfsubstanz beeinträch ­
tigen noch eine toxische Wirkung ausüben. Es sind frische Lösungen oder Suspensionen der Prüfsubstanz zu verwenden.
 
V e r s u c h s t i e r e  
Mäuse des Teststammes T (nonagouti, a/a; Chinchilla, pink eye, 
c ch p/c ch p; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting, 
s/s) werden entweder mit dem Harwell-Test-Stamm HT (pallid, no ­
nagouti, brachypodi, pa a bp/pa a bp; leaden, fuzzy, ln fz/ln fz; pearl pe/pe) oder mit C57 BL (nonagouti, a/a) gepaart. Auch andere ge ­
eignete Kreuzungen, wie zwischen NMRI (nonagouti, a/a; albino, 
c/c) und DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute, d/d), können ver ­
wendet werden, sofern die nonagouti-Nachkommen hervorbringen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 393
 
A n z a h l u n d G e s c h l e c h t  
Es sind so viele trächtige Weibchen zu behandeln, dass für jede 
verwendete Dosierung eine geeignete Anzahl Nachkommen geboren wird. Welche Stichprobengröße angemessen ist, hängt von der an den behandelten Mäusen beobachteten Fleckenrate und der Größe 
der Kontrolldaten ab. Ein negatives Ergebnis ist nur dann annehm ­
bar, wenn mindestens 300 Nachkommen von Weibchen, die mit der höchsten Dosierung behandelt wurden, erfasst worden sind.
 
V e r w e n d u n g v o n N e g a t i v - u n d P o s i t i v k o n t r o l l e n  
Es sollten gleichzeitig erhobene Kontrolldaten von Mäusen, die nur 
mit dem Lösungsmittel behandelt wurden (negative Kontrollen), ver ­
fügbar sein. Zur Erhöhung der Testempfindlichkeit können die Daten 
der in der Vergangenheit im selben Labor durchgeführten Kontrollen zusammengefasst werden, sofern sie homogen sind. Lässt sich eine Mutagenität der Prüfsubstanz nicht feststellen, sollten Positivkontroll ­
daten zur Verfügung stehen, die in letzter Zeit im selben Labor mit 
einer Substanz ermittelt wurden, deren Mutagenität sich nachweislich mit diesem Test feststellen lässt.
 
V e r a b r e i c h u n g s w e g  
Normalerweise wird die Prüfsubstanz den trächtigen Weibchen per 
os oder intraperitoneal verabreicht. Ggf. erfolgt die Exposition durch 
Inhalation, oder es wird eine andere Verabreichung verwendet.  
D o s i e r u n g  
Es kommen mindestens zwei Dosierungen zur Anwendung, von de ­
nen eine Anzeichen von Toxizität hervorruft oder eine verringerte Wurfgröße bewirkt. Bei nichttoxischen Substanzen sollte die Be ­
handlung mit der höchstmöglichen Dosierung erfolgen.
 
Versuchsdurchführung  
Normalerweise erfolgt eine einmalige Behandlung an Tag 8, 9 oder 
10 der Trächtigkeit, wobei als Tag 1 der Tag gewählt wird, an dem 
der Vaginalpfropf festgestellt wird. Diese Tage entsprechen 7,25, 8,25 und 9,25 Tagen nach Empfängnis. Es können sukzessive Be ­
handlungen an diesen Tagen durchgeführt werden.
 
A n a l y s e  
Die Nachkommen werden kodiert und drei bis vier Wochen nach der 
Geburt auf Fellflecken untersucht. Man unterscheidet zwischen drei 
Kategorien von Flecken:  
a) weiße Flecken im Bereich von 5 mm um die mittlere Ventrallinie, 
die vermutlich auf das Abtöten von Zellen zurückzuführen sind 
(WMVS);  
b) gelbe, agouti-ähnliche Flecken im Mamma-, Genitalien-, vorderen 
Hals-, Axillar- und Inguinalbereich sowie auf der Mitte der Stirn, 
die vermutlich durch Fehldifferenzierung bedingt sind (MDS);  
c) über das gesamte Fell verteilt auftretende pigmentierte und weiße 
Flecken, die vermutlich auf somatische Mutationen zurückgehen 
(RS).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 394
 
Alle drei Kategorien werden quantitativ erfasst, doch ist nur die 
letzte, die Kategorie RS, von genetischer Relevanz. Probleme bei 
der Unterscheidung zwischen MDS und RS lassen sich durch Fluo ­
reszenzmikroskopie von Haarproben lösen.  
Deutliche makroskopische morphologische Abnormalitäten der 
Nachkommen sind zu vermerken.  
2. DATEN  
Anzugeben ist die Gesamtzahl der erfassten Nachkommen und die 
Anzahl der Nachkommen, die einen oder mehrere, vermutlich durch 
somatische Mutationen bedingte Flecken aufweisen. Die Daten, be ­
zogen auf die Wurfgröße, sollten ebenfalls angegeben werden. Die Behandlungs- und Negativkontrolldaten werden mit geeigneten sta ­
tistischen Verfahren verglichen.
 
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— die zur Kreuzung verwendeten Stämme;  
— Anzahl der trächtigen Weibchen in den Versuchs- und Kontroll ­
gruppen;  
— die durchschnittliche Wurfgröße in den Versuchs- und Kontroll ­
gruppen bei der Geburt und beim Absetzen;  
— Dosierung(en) der Prüfsubstanz;  
— verwendetes Lösungsmittel;  
— Tag der Trächtigkeit, an dem die Behandlung durchgeführt 
wurde;  
— Verabreichungsweg;  
— Gesamtzahl der erfassten Nachkommen und Anzahl der Nach ­
kommen mit MWVS, MDS und RS in den Versuchs- und Kon ­
trollgruppen;  
— makroskopische morphologische Abnormitäten;  
— ggf. Dosis-Wirkungs-Beziehung für RS;  
— statistische Auswertung;  
— Diskussion der Ergebnisse;  
— Bewertung der Ergebnisse.  
3.2. INTERPRETATION  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
4. LITERATUR  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 395
 
B.25.  IN-VIVO-SÄUGER-TRANSLOKATIONSTEST  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.3. BEZUGSSUBSTANZEN  
Keine.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Mit dem Translokationstest der Maus lassen sich strukturelle und 
numerische Chromosomenveränderungen, die in Säugetier-Keimzel ­
len auftreten, unter Nachkommen der ersten Generation ermitteln. Bei den beobachteten Chromosomenveränderungen handelt es sich um reziproke Translokationen und — bei weiblichen Nachkommen 
— um X-Chromosomenverlust. Träger von Translokationen und XO- 
Weibchen weisen eine verringerte Fertilität auf, die man zur Aus ­
wahl von F
 1 -Nachkommen für die zytogenetische Analyse nutzt. 
Bestimmte Translokationstypen (X-Autosomentranslokation und 
Zentromer-/Telomer-Translokation) verursachen vollständige Sterili ­
tät. Translokationen werden zytogenetisch in meiotischen Zellen in der Diakinese-Metaphase I männlicher Tiere (entweder F
 1 -Männchen 
oder Söhne von F  1 -Weibchen) beobachtet. Die XO-Weibchen lassen 
sich zytogenetisch aufgrund der Anwesenheit von 39 statt 40 Chro ­
mosomen in Knochenmarksmitosen identifizieren.  
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
Vorbereitung  
Die Prüfsubstanz wird in isotonischer Kochsalzlösung gelöst. Was ­
serunlösliche Substanzen werden in geeigneten Lösungsmitteln ge ­
löst oder suspendiert. Es sind frisch zubereitete Lösungen oder Sus ­
pensionen der Prüfsubstanzen zu verwenden. Wird zur Erleichterung 
der Dosierung ein Lösungsmittel verwendet, darf dieses weder die Wirkung der Prüfsubstanz beeinträchtigen noch eine toxische Wir ­
kung ausüben.
 
V e r a b r e i c h u n g s w e g  
Die Prüfsubstanz wird normalerweise per os oder intraperitoneal ver ­
abreicht. Auch andere Verabreichungswege können geeignet sein.  
V e r s u c h s t i e r e  
Die Versuche werden an Mäusen durchgeführt, da deren Zucht und 
zytologische Untersuchung relativ einfach sind. Ein bestimmter Stamm ist nicht vorgeschrieben.
 
Bei Anwendung der Fertilitätsuntersuchung sollte jedoch die durch ­
schnittliche Wurfgröße des verwendeten Stammes mehr als acht 
Junge betragen und relativ konstant sein. Es werden gesunde, ge ­
schlechtsreife Tiere verwendet.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 396
 
A n z a h l d e r T i e r e  
Die erforderliche Anzahl der Versuchstiere hängt von der spontanen 
Translokationshäufigkeit und der für ein positives Ergebnis erforder ­
lichen Erhöhung der Translokationshäufigkeit ab.  
Normalerweise umfasst der Test die Untersuchung der männlichen 
F 1 -Nachkommen. Pro Dosierungsgruppe sind mindestens 
500 männliche F  1 -Nachkommen zu testen. Werden auch weibliche 
F 1 -Nachkommen berücksichtigt, sind 300 Männchen und 300 Weib ­
chen erforderlich.  
V e r w e n d u n g v o n N e g a t i v - u n d P o s i t i v k o n t r o l l e n  
Geeignete Daten gleichzeitig durchgeführter und historischer Kon ­
trollen sollten vorliegen. Stehen Ergebnisse von Positivkontrollen zur Verfügung, die in letzter Zeit im selben Labor erhoben wurden, so können diese Ergebnisse anstelle einer gleichzeitigen Positivkon ­
trolle verwendet werden.
 
D o s i e r u n g  
Getestet wird eine Dosierung. Dabei handelt es sich normalerweise 
um die höchste Dosis, die eine minimale toxische Wirkung ausübt, ohne jedoch das reproduktive Verhalten oder die Überlebensrate der behandelten Tiere zu beeinträchtigen. Zur Erstellung einer Dosis- 
Wirkungs-Beziehung sind zwei zusätzliche niedrigere Dosierungen 
erforderlich. Bei nichttoxischen Substanzen sollte die Behandlung mit der höchstmöglichen Dosierung erfolgen.
 
Versuchsdurchführung  
B e h a n d l u n g u n d P a a r u n g  
Es stehen zwei Behandlungspläne zur Verfügung. Am häufigsten 
wird die einmalige Verabreichung der Prüfsubstanz gewählt. Auch die Verabreichung an 7 Tagen/Woche während 35 Tagen ist mög ­
lich. Die Anzahl der Paarungen nach der Behandlung richtet sich 
nach dem gewählten Behandlungsplan; es ist sicherzustellen, dass 
alle behandelten Keimzellstadien erfasst werden. Nach dem Ende der Paarungsperiode werden die Weibchen einzeln in Käfigen unter ­
gebracht. Für jeden Wurf werden Geburtsdatum, Wurfgröße und 
Geschlecht der Jungen aufgezeichnet. Alle männlichen Jungen wer ­
den abgesetzt, alle weiblichen Jungen ausgesondert, sofern sie nicht in dem Versuch verwendet werden.
 
U n t e r s u c h u n g a u f T r a n s l o k a t i o n s h e t e r o z y g o t i e  
Es stehen zwei Verfahren zur Auswahl:  
— Fertilitätsuntersuchung der F  1 -Nachkommen und anschließende 
Ermittlung möglicher Translokationsträger durch zytogenetische Analyse,
 
— zytogenetische Analyse aller männlichen F  1 -Nachkommen ohne 
vorherige Auswahl der Fertilitätsuntersuchung.  
a) Fertilitätsuntersuchung  
Die verringerte Fertilität eines F  1 -Tieres lässt sich durch Be ­
obachtung der Wurfgröße bzw. Analyse des Uterusinhalts des 
mit diesem Tier gepaarten Weibchens feststellen.  
Die Kriterien für die Bestimmung der normalen und reduzierten 
Fertilität sind jeweils für den verwendeten Mäusestamm 
festzulegen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 397
 
Beobachtung der Wurfgröße:  Die zu untersuchenden F  1 -Männ­
chen werden einzeln mit Weibchen aus dem gleichen Versuch 
oder aus der Kolonie gepaart. Die Käfige werden ab dem 18. Tag nach der Paarung täglich inspiziert. Wurfgröße und Geschlecht der F
 2 -Nachkommen werden bei der Geburt aufgezeichnet; die 
Würfe werden danach ausgesondert. Bei der Untersuchung weib ­
licher F  1 -Nachkommen behält man die F  2 -Nachkommen kleiner 
Würfe zur weiteren Untersuchung. Weibliche Translokationsträ ­
ger werden durch zytogenetischen Nachweis einer Translokation 
in wenigstens einem ihrer männlichen Nachkommen identifiziert. 
XO-Weibchen erkennt man daran, dass sich bei ihren Nachkom ­
men das Geschlechtsverhältnis von 1:1 zu 1:2 (Männchen; Weib ­
chen) ändert. Bei einem sequenziellen Verfahren werden normale 
F 1 -Tiere nicht weiter untersucht, wenn der erste F  2 -Wurf einen 
vorher festgelegten Normalwert erreicht oder überschreitet. An ­
derenfalls wird ein zweiter oder dritter F  2 -Wurf untersucht.  
F 1 -Tiere, die nach Inspektion von bis zu drei F  2 -Würfen nicht als 
normal eingestuft werden können, werden entweder durch Ana ­
lyse des Uterusinhaltes der mit ihnen gepaarten Weibchen weiter untersucht oder direkt einer zytogenetischen Analyse unterzogen.
 
Analyse des Uterusinhalts: Die Verringerung der Wurfgröße bei 
Translokationsträgern ist auf das Absterben von Embryonen zu ­
rückzuführen. Eine hohe Anzahl toter Implantate weist also auf 
eine Translokation in dem Versuchstier hin. Die zu untersuchen ­
den F  1 -Männchen werden jeweils mit zwei oder drei Weibchen 
gepaart. Ob eine Empfängnis stattgefunden hat, wird durch täg ­
liche Untersuchung auf Vaginalpfropf zwischen 8 und 10 Uhr 
morgens festgestellt. 14 bis 16 Tage danach werden die Weib ­
chen getötet; die Anzahl der lebenden und toten Implantate in ihren Uteri wird aufgezeichnet.
 
b) Zytogenetische Analyse  
Es werden luftgetrocknete Hodenpräparate hergestellt. Transloka ­
tionsträger lassen sich durch das Vorhandensein von Multivalent ­
konfigurationen in der Diakinese-Metaphase I in primären Sper ­
matozyten identifizieren. Werden mindestens zwei Zellen mit Translokationsmultivalenten beobachtet, ist damit der erforderli ­
che Nachweis erbracht, dass es sich bei dem untersuchten Tier 
um einen Translokationsträger handelt.
 
Erfolgt keine Zuchtauswahl, werden F  1 -Männchen zytogenetisch 
untersucht. Mindestens 25 Diakinese-Metaphasen I pro Männ ­
chen sind mikroskopisch auszuwerten. Bei F  1 -Männchen mit 
kleinen Hoden und Zusammenbruch der Meiose vor der Dia ­
kinese oder bei F  1 -Weibchen, bei denen XO-Verdacht besteht, 
ist eine Untersuchung der mitotischen Metaphasen in Spermato ­
gonien oder im Knochenmark erforderlich. Das Vorhandensein 
eines ungewöhnlich langen und/oder kurzen Chromosoms in je ­
der von 10 Zellen beweist, dass eine bestimmte, für Männchen steril wirkende Translokation (Typ c/t) vorliegt. Einige X-Auto ­
somentranslokationen, die männliche Sterilität verursachen, las ­
sen sich nur durch Bandenanalyse mitotischer Chromosomen er ­
mitteln. Das Vorhandensein von 39 Chromosomen in jeder von 10 Mitosen ist ein Beweis dafür, dass es sich um ein XO-Weib ­
chen handelt.
 
2. DATEN  
Die Daten werden in tabellarischer Form dargestellt.  
Für jeden Paarungsabschnitt sind die durchschnittliche Wurfgröße 
und das Geschlechtsverhältnis bei der Geburt und beim Absetzen 
anzugeben.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 398
 
Die Angaben der Fertilitätsuntersuchung von F  1 -Tieren müssen die 
durchschnittliche Wurfgröße aus allen normalen Paarungen und die 
jeweiligen Wurfgrößen bei F  1 -Translokationsträgern umfassen. Zur 
Analyse des Uterininhalts sind die durchschnittliche Anzahl der le ­
benden und toten Implantate aus normalen Paarungen und die An ­
zahl der lebenden und toten Implantate aus jeder Paarung von F  1 - 
Translokationsträgern anzugeben.  
Die Angaben zur zytogenetischen Analyse der Diakinese-Metaphase 
I sollten für jeden Translokationsträger die Anzahl der Multivalent ­
konfigurationstypen sowie die Gesamtzahl der Zellen umfassen.  
Für sterile F  1 -Tiere sind die Gesamtzahl der Paarungen und die 
Dauer der Paarungsperiode anzugeben, ebenso die Hodengewichte und nähere Einzelheiten über die zytogenetische Analyse.
 
Für XO-Weibchen sind die durchschnittliche Wurfgröße, das Ge ­
schlechtsverhältnis unter den F  2 -Nachkommen und die Ergebnisse 
der zytogenetischen Analyse aufzuführen.  
Erfolgt eine Vorauswahl möglicher F  1 -Translokationsträger aufgrund 
von Fertilitätsuntersuchungen, müssen die Tabellen auch Angaben 
darüber enthalten, bei wie vielen dieser Tiere die Translokations ­
heterozygotie bestätigt wurde.  
Auch die Daten aus Negativkontrollen und die Positivkontrollver ­
suche sind anzuführen.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— Mäusestamm, Alter der Tiere, Gewicht der behandelten Tiere;  
— Anzahl der Elterntiere beiderlei Geschlechts in Versuchs- und 
Kontrollgruppen;  
— Prüfbedingungen, genaue Beschreibung der Behandlung, Dosie ­
rungen, Lösungsmittel, Paarungsplan;  
— Anzahl und Geschlecht der Jungen pro Weibchen, Anzahl und 
Geschlecht der zur Translokationsanalyse aufgezogenen Jungen;  
— Zeitpunkt der und Kriterien für die Translokationsanalyse;  
— Anzahl und eingehende Beschreibung der Translokationsträger 
einschließlich Zuchtdaten und ggf. Daten über den Uterusinhalt;  
— Zytogenetische Verfahren und nähere Angaben über die mikro ­
skopische Analyse, möglichst mit Abbildungen;  
— statistische Auswertung;  
— Diskussion der Ergebnisse;  
— Bewertung der Ergebnisse.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 399
 
3.2. INTERPRETATION  
Siehe allgemeine Einhaltung zu Teil B.  
4. LITERATUR  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 400
 
B.26.  PRÜFUNG AUF SUBCHRONISCHE ORALE TOXIZITÄT — 
90-TAGE-TOXIZITÄTSSTUDIE BEI WIEDERHOLTER 
ORALER VERABREICHUNG AN NAGETIEREN  
1. METHODE  
Diese Methode zur Prüfung auf subchronische orale Toxizität ent ­
spricht der OECD TG 408 (1998).  
1.1. EINLEITUNG  
Bei der Beurteilung und Bewertung der toxischen Merkmale eines 
chemischen Stoffs kann die Bestimmung der subchronischen Toxi ­
zität bei wiederholter oraler Verabreichung von Wirkstoffgaben 
durchgeführt werden, nachdem erste Toxizitätsdaten anhand von Prü ­
fungen auf akute Toxizität oder 28-Tage-Tests auf Toxizität bei wiederholter Verabreichung erzielt wurden. Die 90-Tage-Studie lie ­
fert Informationen über mögliche gesundheitliche Schädigungen, die 
durch wiederholte Exposition über einen längeren Zeitraum, ein ­
schließlich der Entwicklung nach dem Abstillen bis zum Erwachsen ­
sein, entstehen können. Die Studie liefert ferner Informationen über 
die wichtigsten toxischen Wirkungen, zeigt die Zielorgane und eine mögliche Akkumulation auf und kann zur Ableitung einer NOAEL (NOAEL — Dosis ohne beobachtete schädigende Wirkung) beitra ­
gen, die zur Wahl der Dosierungen für Untersuchungen der chro ­
nischen Toxizität und zur Festlegung von Sicherheitskriterien für die Humanexposition herangezogen werden kann.
 
Die Methode legt außerdem den Schwerpunkt auf neurologische 
Endpunkte und liefert Hinweise auf immunologische und fortpflan ­
zungsspezifische Wirkungen. Ferner wird die Notwendigkeit sorgfäl ­
tiger klinischer Beobachtung der Tiere hervorgehoben, um möglichst umfangreiche Informationen zu erhalten. Durch diese Studie sollten 
chemische Stoffe mit potenzieller neurotoxischer und immunologi ­
scher Wirkung sowie Wirkung auf die Fortpflanzungsorgane ermit ­
telt werden, die gegebenenfalls weitergehende Untersuchungen erfor ­
derlich machen.
 
Siehe auch allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Dosis  ist die Menge der verabreichten Prüfsubstanz. Die Dosis wird 
als Gewicht (g, mg) oder als Gewicht der Prüfsubstanz je Gewichts ­
einheit des Versuchstiers (z. B. mg/kg) oder als konstante Futterkon ­
zentration (ppm) ausgedrückt.  
Dosierung  ist ein allgemeiner Begriff, der die Dosis, ihre Häufigkeit 
und die Dauer der Verabreichung umfasst.  
NOAEL  ist die Abkürzung für „no-observed-adverse-effect level“ 
und entspricht der höchsten Dosis, bei der keine schädigenden be ­
handlungsbedingten Wirkungen festgestellt werden.  
1.3. PRINZIP DER METHODE  
Die Prüfsubstanz wird täglich über einen Zeitraum von 90 Tagen in 
abgestuften Dosen an mehrere Gruppen von Versuchstieren ver ­
abreicht, und zwar eine Dosisstufe je Gruppe. Während des Ver ­
abreichungszeitraums werden die Tiere sorgfältig auf Toxizitätsanzei ­
chen beobachtet. Während der Prüfung verendete oder getötete Tiere 
werden seziert. Am Ende der Prüfung werden alle noch lebenden 
Tiere getötet und ebenfalls seziert.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 401
 
1.4. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.4.1.  Vorbereitung der Tiere  
Zu verwenden sind gesunde Tiere, die mindestens fünf Tage an die 
Laborbedingungen gewöhnt und bisher nicht für Tierversuche ver ­
wendet wurden. Von den Versuchstieren sollten Art, Stamm, Her ­
kunft, Geschlecht, Gewicht und/oder Alter festgestellt werden. Die Tiere werden nach dem Zufallsprinzip in Kontroll- und Behand ­
lungsgruppen eingeteilt. Die Käfige sind so aufzustellen, dass et ­
waige durch den Standort bedingte Auswirkungen so gering wie 
möglich sind. Jedes Versuchstier sollte zur sicheren Identifizierung eine eigene Nummer erhalten.
 
1.4.2.  Zubereitung der Dosen  
Die Prüfsubstanz wird über eine Magensonde, mit der Nahrung oder 
dem Trinkwasser verabreicht. Die Methode der oralen Verabreichung 
hängt von dem Zweck der Studie und den physikalischen/ ­
chemischen Eigenschaften des Prüfmaterials ab.  
Die Prüfsubstanz wird über eine Magensonde, mit der Nahrung oder 
dem Trinkwasser verabreicht. Die Methode der oralen Verabreichung 
hängt von dem Zweck der Studie und den physikalischen/ ­
chemischen Eigenschaften des Prüfmaterials ab.  
1.4.3.  Prüfbedingungen  
1.4.3.1.  Versuchstiere  
Die bevorzugte Nagetierart ist die Ratte, doch können als Versuchs ­
tiere auch andere Nagetierarten, z. B. die Maus, verwendet werden. 
Es sind junge, gesunde und ausgewachsene Tiere üblicher Labor ­
stämme zu verwenden. Die weiblichen Tiere dürfen weder geworfen haben noch trächtig sein. Mit der Dosierung sollte möglichst bald 
nach der Entwöhnung begonnen werden, auf jeden Fall jedoch, be ­
vor die Tiere neun Wochen alt sind. Bei Beginn der Studie sollten die Gewichtsunterschiede der Tiere möglichst gering sein und ± 20 % des geschlechtsspezifischen Durchschnittsgewichts nicht über ­
schreiten. Wenn die Studie als Vorstudie für eine Langzeitstudie über 
chronische Toxizität durchgeführt wird, sollten in beiden Studien Tiere desselben Stamms und derselben Herkunft verwendet werden.
 
1.4.3.2.  Zahl und Geschlecht der Versuchstiere  
Für jede Dosisstufe sind mindestens 20 Tiere (10 weibliche und 
10 männliche) zu verwenden. Sollen im Verlauf der Prüfung Tiere 
getötet werden, ist die Zahl der Tiere um die Zahl zu erhöhen, die 
bereits vor Abschluss der Studie getötet werden sollen. Aufgrund bereits bekannter Wirkungen des chemischen Stoffs oder eines eng verwandten Analogons sollte darüber hinaus für die Kontrollgruppe 
und die Gruppe mit der höchsten Dosis die Aufnahme einer Satelli ­
tengruppe von 10 Tieren (fünf jeden Geschlechts) zwecks Behand ­
lung und anschließender Beobachtung der Reversibilität oder Persis ­
tenz etwaiger toxischer Wirkungen erwogen werden. Die Dauer die ­
ses Zeitraums nach der Behandlung sollte den beobachteten Wirkun ­
gen angemessen sein.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 402
 
1.4.3.3.  Dosierung  
Es sollten mindestens drei Dosierungen und eine gleichzeitige Kon ­
trolle verwendet werden, es sei denn, ein Limit-Test wird durch ­
geführt (siehe 1.4.3.4). Die Dosierungen können auf der Grundlage 
der Ergebnisse von Studien mit wiederholter Verabreichung oder 
Studien zur Ermittlung des Dosisbereichs festgelegt werden und soll ­
ten sämtliche für die Prüfsubstanz oder verwandte Materialien ver ­
fügbaren toxikologischen und toxikokinetischen Daten berücksichti ­
gen. Außer wenn dies wegen der physikalisch-chemischen Eigen ­
schaften oder der biologischen Wirkungen der Prüfsubstanz unmög ­
lich ist, sollte die höchste Dosierung gewählt werden, um Toxizität, 
jedoch nicht Tod oder schweres Leiden der Tiere zu induzieren. Zum 
Nachweis dosisabhängiger Reaktionen und einer NOAEL bei nied ­
rigster Dosierung, sollten die Dosierungen in absteigender Folge ver ­
abreicht werden. Zwei- bis vierfache Abstände haben sich oft als 
optimale Dosisabstufungen erwiesen, auch ist meist eine vierte Test ­
gruppe der Anwendung sehr großer Dosisabstände (z. B. mehr als ein Faktor von ca. 6-10) vorzuziehen.
 
Die Kontrollgruppe sollte eine unbehandelte Gruppe oder eine Ve ­
hikelkontrollgruppe sein, sofern ein Vehikel zur Verabreichung der Prüfsubstanz verwendet wird. Abgesehen von der Behandlung mit der Prüfsubstanz sollten die Tiere der Kontrollgruppe identisch mit 
denen der Testgruppen behandelt werden. Wird ein Vehikel verwen ­
det, erhält die Kontrollgruppe das Vehikel im höchsten verwendeten Volumen. Wird eine Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht, und führt dies zu einer verminderten Futteraufnahme, kann eine paar ­
weise gefütterte Kontrollgruppe nützlich sein, wobei zwischen einer 
verminderten Futteraufnahme aus geschmacklichen Gründen oder wegen toxikologischer Veränderungen im Prüfmodell unterschieden wird.
 
Zu berücksichtigen sind gegebenenfalls folgende Merkmale des Ve ­
hikels und anderer Additive: Wirkungen auf die Absorption, die Verteilung, den Stoffwechsel oder die Retention der Prüfsubstanz; 
Wirkungen auf die chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, die 
zur Änderung von toxischen Eigenschaften führen können; ferner Wirkungen auf die Futter- oder Wasseraufnahme oder den Ernäh ­
rungszustand der Versuchstiere.
 
1.4.3.4.  Limit-Test  
Ergibt eine Prüfung bei einer einzigen Dosis von mindestens 1 000 
mg/kg Körpergewicht/Tag unter Anwendung der für diese Studie beschriebenen Verfahren keine adversen Effekte und ist aufgrund 
der Daten strukturverwandter Stoffe keine Toxizität zu erwarten, 
kann auf eine vollständige Studie mit drei Dosisstufen gegebenen ­
falls verzichtet werden. Der Limit-Test ist anzuwenden, außer wenn die Expositionswirkungen beim Menschen die Prüfung bei einer 
höheren Dosis erforderlich erscheinen lässt.
 
1.5. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG  
1.5.1.  Verabreichung der Dosen  
Die Versuchstiere erhalten die Prüfsubstanz an sieben Tagen der 
Woche über einen Zeitraum von 90 Tagen. Jede Abweichung von 
diesem Dosierungsplan, z. B. fünf Tage je Woche, ist zu begründen. Wird die Prüfsubstanz über eine Sonde verabreicht, so sollte dies in einer einmaligen Dosis unter Verwendung einer Magensonde oder 
einer geeigneten Intubationskanüle erfolgen. Das maximale Flüssig ­
keitsvolumen, das einem Versuchstier mit einer Gabe verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Das Volu ­
men sollte 1 ml/100g Körpergewicht nicht überschreiten, außer bei 
wässrigen Lösungen, von denen 2 ml/100g Körpergewicht gegeben 
werden können. Außer für Reizungen auslösende oder ätzende Stof ­
fe, die in der Regel bei höheren Konzentrationen eine Verschlimme ­
rung bewirken, sollte die Variabilität des Prüfvolumens durch An ­
passung der Konzentration möglichst gering gehalten werden, um ein 
konstantes Volumen bei allen Dosen zu gewährleisten.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 403
 
Für mit dem Futter oder dem Trinkwasser verabreichte Stoffe ist 
unbedingt sicherzustellen, dass die Mengen der jeweiligen Prüfsub ­
stanz die normale Nahrungsaufnahme oder den Wasserhaushalt nicht beeinträchtigen. Wenn die Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht wird, können entweder eine konstante Futterkonzentration (ppm) 
oder eine konstante Dosierung in Relation zum Körpergewicht des 
Versuchstiers verwendet werden. Die angewandte Alternative ist zu spezifizieren. Eine mit einer Magensonde verabreichte Dosis sollte jeweils zu denselben Tageszeiten gegeben und so angepasst werden, 
dass eine konstante Dosis in Relation zum Körpergewicht aufrecht ­
erhalten wird. Wird eine 90-Tage-Studie als Vorstudie für eine Lang ­
zeitstudie über chronische Toxizität verwendet, sollte in beiden Stu ­
dien die gleiche Nahrung gegeben werden.
 
1.5.2.  Beobachtungen  
Der Beobachtungszeitraum sollte mindestens 90 Tage betragen. Tiere 
einer Satellitengruppe, die für Nachfolgebeobachtungen vorgesehen 
sind, sollten für einen angemessenen Zeitraum ohne Behandlung 
bleiben, um festzustellen, ob die toxischen Wirkungen fortbestehen oder sich als reversibel erweisen.
 
Allgemeine klinische Beobachtungen sollten mindestens einmal täg ­
lich, vorzugsweise zur selben Tageszeit, unter Berücksichtigung des Zeitraums, in dem der Wirkungsgipfel nach Verabreichung der Dosis 
zu erwarten ist, vorgenommen werden. Der klinische Zustand der 
Tiere ist zu dokumentieren. Alle Tiere sind mindestens zweimal täglich, in der Regel morgens und abends, auf Anzeichen von Mor ­
bidität und Mortalität hin zu untersuchen.
 
Mindestens einmal vor der ersten Exposition (für intraindividuelle 
Vergleiche) und danach einmal pro Woche sollten bei allen Tieren 
eingehende klinische Beobachtungen vorgenommen werden. Diese Beobachtungen sollten außerhalb des Käfigs erfolgen, in dem die Tiere gehalten werden, und zwar vorzugsweise in einem Standard ­
gehege jeweils zu denselben Zeiten. Sie sind sorgfältig zu dokumen ­
tieren, am besten nach einer speziell vom Prüflabor entwickelten Bewertungsskala. Es ist dafür zu sorgen, dass die Beobachtungs ­
bedingungen möglichst konstant bleiben. Die Beobachtungen sollten 
sich insbesondere beziehen auf Veränderungen an Haut, Fell, Augen, 
Schleimhäuten, auf Sekrete und Exkrete sowie auf autonome Re ­
aktionen (z. B. Tränenfluss, Piloerektion, Pupillengröße, anormale Atmung). Gang- und Haltungsstörungen, ferner Reaktionen auf den 
Umgang mit den Tieren sowie etwaige klonische oder tonische Be ­
wegungen, Stereotypien (z. B. übermäßiges Putzen, wiederholte Kreisbewegungen) oder abnormes Verhalten (z. B. Selbstverstümme ­
lung, Rückwärtsgehen) sollten auch dokumentiert werden (1).
 
Ophthalmologische Untersuchungen unter Verwendung eines Oph ­
thalmoskops oder eines entsprechenden geeigneten Geräts sollten 
vorgenommen werden, bevor die Prüfsubstanz verabreicht wird, so ­
wie zum Abschluss der Studie, vorzugsweise an allen Tieren, doch zumindest in den höchstdosierten Gruppen und den Kontrollgruppen. 
Sofern Veränderungen an den Augen beobachtet werden, sollten alle 
Tiere untersucht werden.
 
Zum Ende des Expositionszeitraums, jedenfalls nicht früher als in 
der 11. Woche, sollten sensorische Reaktionen auf Reize verschie ­
dener Art (1) (z. B. akustische, visuelle und propriozeptive Reize) (2) 
(3) (4) sowie die Greifstärke (5) und die motorische Aktivität (6) 
erfasst werden. Weitere Einzelheiten zu den möglichen Untersuchun ­
gen finden sich in der Literatur. Allerdings können auch andere als dort genannte Verfahren angewendet werden.
 
Funktionelle Beobachtungen zum Abschluss der Studie können ent ­
fallen, wenn Daten über funktionelle Beobachtungen aus anderen 
Studien vorliegen und die täglichen klinischen Beobachtungen keine 
Funktionsdefizite aufweisen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 404
 
In Ausnahmefällen können funktionelle Beobachtungen auch bei 
Gruppen entfallen, die so starke sonstige Toxizitätsanzeichen auf ­
weisen, dass die Leistungen in Funktionstests dadurch signifikant beeinträchtigt würden.
 
1.5.2.1.  Körpergewicht und Futter-/Wasseraufnahme  
Alle Tiere sollten mindestens einmal wöchentlich gewogen werden. 
Messungen der Futteraufnahme sollten mindestens wöchentlich vor ­
genommen werden. Wenn die Prüfsubstanz über das Trinkwasser verabreicht wird, sollte auch die Wasseraufnahme mindestens einmal 
wöchentlich gemessen werden. Die Wasseraufnahme kann auch in 
Fütterungsstudien oder in Studien mit Sondenapplikation berücksich ­
tigt werden, bei denen sich das Trinkverhalten ändern kann.
 
1.5.2.2.  Hämatologische und klinisch-biochemische Untersuchungen  
Die Blutproben sind an einer zu benennenden Stelle zu entnehmen 
und möglichst unter geeigneten Bedingungen zu lagern. Am Ende des Prüfzeitraums werden bei den Versuchstieren Blutproben kurz vor der Tötung oder als Teil des Tötungsvorgangs entnommen.
 
Folgende hämatologische Untersuchungen sind am Ende des Prüf ­
zeitraums und bei etwaigen zwischenzeitlich entnommenen Blutpro ­
ben durchzuführen: Hämatokritwert, Hämoglobinkonzentration, Ery ­
throzytenzahl, Leukozytenzahl (Gesamt- und Differenzialblutbild), Thrombozytenzahl und Messung der Blutgerinnungszeit/ ­
Blutgerinnungsfähigkeit.
 
Klinisch-biochemische Bestimmungen zur Untersuchung der wich ­
tigsten toxischen Wirkungen in Geweben, insbesondere der Wirkun ­
gen auf Nieren und Leber, sind an Blutproben durchzuführen, die 
von jedem Tier unmittelbar vor der Tötung oder als Teil des Tö ­
tungsvorgangs entnommen werden (dies gilt nicht für Tiere, die sterbend aufgefunden und/oder zwischenzeitlich getötet werden). 
Vergleichbar zu den hämatologischen Untersuchungen können kli ­
nisch-biochemische Untersuchungen bei den zwischenzeitlich ent ­
nommenen Blutproben durchgeführt werden. Es empfiehlt sich eine Futterkarenz der Tiere über Nacht, bevor die Blutproben entnommen 
werden (
 1 ). Die Plasma- oder Serumbestimmungen umfassen die Pa ­
rameter Natrium, Kalium, Glukose, Gesamtcholesterin, Harnstoff, Harnstoff-Stickstoff im Blut, Kreatinin, Gesamtprotein und Albumin sowie mehr als zwei Enzyme, die auf hepatozelluläre Wirkungen 
(wie Alanin-Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase, alkalische 
Phosphatase, Gammaglutamyl-Transpeptidase und Sorbitoldehydro ­
genase) schließen lassen. Ferner kann die Bestimmung weiterer En ­
zyme (der Leber oder sonstiger Organe) und der Gallensäuren, die 
unter bestimmten Bedingungen ebenfalls nützliche Informationen lie ­
fern, durchgeführt werden.
 
Optional können in der letzten Woche der Studie am Urin, der zu 
festgelegten Zeiten gesammelt wird, folgende Analysebestimmungen 
durchgeführt werden: Aussehen, Volumen, Osmolalität oder spezi ­
fisches Gewicht, pH-Wert, Eiweiß, Glukose und Blut/Blutzellen.  
Darüber hinaus sollten Untersuchungen zur Bestimmung von Serum ­
markern für eine allgemeine Gewebsschädigung erwogen werden. Des Weiteren sollten, wenn die bekannten Eigenschaften der Prüf ­
substanz die entsprechenden Stoffwechselprofile beeinträchtigen kön ­
nen oder wenn mit einer solchen Beeinträchtigung zu rechnen ist, die Parameter Calcium, Phosphor, Nüchtern-triglyzeride, spezifische Hormone, Methämoglobin und Cholinesterase bestimmt werden. 
Die jeweiligen Parameter sind je nach Prüfsubstanzklasse bzw. von 
Fall zu Fall zu bestimmen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 405  
( 1 ) Für eine Reihe von Serum- und Plasmabestimmungen, insbesondere der Glukose, ist eine 
Futterkarenz der Tiere über Nacht zu empfehlen. Der Hauptgrund dafür ist, dass die bei 
fehlender Futterkarenz unweigerlich zunehmende Variabilität zu einer Maskierung sub ­
tilerer Wirkungen führen und die Interpretation erschweren konnte. Andererseits könnte 
jedoch eine nächtliche Futterkarenz den allgemeinen Stoffwechsel der Tiere, insbeson ­
dere in Futterstudien, die tägliche Exposition gegenüber der Prüfsubstanz beeinträchtigen. 
Wenn man sich für die nächtliche Futterkarenz entscheidet, sollten die klinisch-bioche ­
mischen Parameter nach Durchführung der funktionellen Beobachtungen der Studie be ­
stimmt werden.
 Insgesamt jedoch ist je nach der Versuchstierart und den beobachte ­
ten und/oder erwarteten Wirkungen der Prüfsubstanz mit der ent ­
sprechenden Flexibilität vorzugehen.  
Bei unzureichender Datenlage zu den Normalwerten sollte die Be ­
stimmung hämatologischer und klinisch-biochemischer Parameter ge ­
gebenenfalls auch vor Verabreichung der Prüfsubstanz erwogen wer ­
den. In der Regel empfiehlt es sich nicht, diese Daten vor der Be ­
handlung zu bestimmen (7).  
1.5.2.3.  Autopsie  
Alle an der Studie beteiligten Tiere müssen einer vollständigen, ein ­
gehenden Autopsie unterzogen werden, die die sorgfältige Unter ­
suchung der äußeren Körperoberfläche, aller Körperöffnungen sowie der Schädel-, Brust- und Bauchhöhlen und ihres Inhalts umfasst. 
Leber, Nieren, Nebennieren, Hoden, Nebenhoden, Uterus, Eierstö ­
cke, Thymus, Milz, Gehirn und Herz aller Tiere (außer der tot auf ­
gefundenen und/oder zwischenzeitlich getöteten Tiere) sind in an ­
gemessener Form von anhaftendem Gewebe zu befreien, und ihr 
Nassgewicht ist so rasch wie möglich nach der Sektion festzustellen, 
um ein Austrocknen zu verhindern.
 
Die folgenden Gewebe sind in dem für Gewebsarten und die vor ­
gesehene nachfolgende histopathologische Untersuchung am besten 
geeigneten Fixierungsmedium aufzubewahren: alle Gewebe mit ma ­
kroskopischen Läsionen, Gehirn (repräsentative Bereiche, insbeson ­
dere Cerebrum, Cerebellum und Medulla/Pons), Rückenmark (auf drei Ebenen: cervical, mittlerer Thoraxbereich, und lumbar), Hypo ­
physe, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Thymusdrüse, Speiseröhre, 
Speicheldrüsen, Magen, Dünn- und Dickdarm (einschließlich Pey ­
er'schen Platten), Leber, Bauchspeicheldrüse, Nieren, Nebennieren, 
Milz, Herz, Luftröhre und Lungen (durch Inflation mit Fixiermittel 
und anschließende Immersion konserviert), Aorta, Gonaden, Uterus akzessorische Geschlechtsorgane, weibliche Brustdrüsen, Prostata, Harnblase, Gallenblase (Maus), Lymphknoten (vorzugsweise ein 
Lymphknoten des Verabreichungsweges und ein weiterer vom Ver ­
abreichungsweg entfernter Lymphknoten, um systemische Wirkun ­
gen abzudecken), periphere Nerven (N. ischiadicus oder N. tibialis), vorzugsweise in der Nähe des Muskels, ein Knochenmarksschnitt 
(und/oder ein frisches Knochenmark-Aspirat) Haut und Augen (so ­
fern bei den ophthalmologischen Untersuchungen Veränderungen beobachtet wurden). Die klinischen und sonstigen Befunde können weitere Gewebsuntersuchungen erforderlich machen. Auch Organe, 
die aufgrund der bekannten Eigenschaften der Prüfsubstanz als wahr ­
scheinliche Zielorgane in Frage kommen, sollten aufbewahrt werden.
 
1.5.2.4.  Histopathologische Untersuchungen  
Bei allen Tieren der Gruppe mit der höchsten Dosis sowie bei den 
Tieren der Kontrollgruppe ist eine umfassende histopathologische 
Untersuchung der konservierten Organe und Gewebe durchzuführen. 
Diese Untersuchungen sind auch auf die Tiere aller anderen Dosis ­
gruppen auszudehnen, wenn behandlungsbedingte Veränderungen in der Gruppe mit der höchsten Dosis festgestellt werden.
 
Alle makroskopischen Läsionen sind zu untersuchen.  
Umfasst eine Prüfung auch eine Satellitengruppe, sind bei den Tieren 
dieser Gruppe die Gewebe und Organe histopathologisch zu unter ­
suchen, bei denen in den Behandlungsgruppen toxische Wirkungen 
aufgetreten sind.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 406
 
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
2.1. DATEN  
Es sollten Daten für jedes einzelne Tier vorgelegt werden. Außerdem 
sollten alle Daten in Tabellenform zusammengefasst werden, aus 
denen für jede Prüfgruppe folgende Angaben hervorgehen: die 
Zahl der Tiere bei Beginn der Prüfung und die Zahl der während der Prüfung tot aufgefundenen oder aus Gründen des Tierschutzes getöteten Tiere, ferner der Zeitpunkt des eingetretenen Todes oder 
der aus Tierschutzgründen vorgenommenen Tötung, die Zahl der 
Tiere, die Anzeichen von Toxizität aufweisen, eine Beschreibung der beobachteten Toxizität, einschließlich des Zeitpunkts, zu dem 
die toxischen Wirkungen erstmalig aufgetreten sind, deren Dauer 
und Schweregrad, die Zahl der Tiere mit Läsionen, die Art der Läsionen und der Prozentsatz der davon betroffenen Tiere.
 
Wenn möglich sind die numerischen Daten durch eine geeignete 
allgemein annehmbare statistische Methode auszuwerten. Die statis ­
tischen Methoden und die zu analysierenden Daten sollten bei der Planung der Studie festgelegt werden.
 
2.2. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss folgende Angaben enthalten:  
2.2.1.  Prüfsubstanz  
— Physikalische Beschaffenheit, Reinheit und physikalisch-che ­
mische Eigenschaften;  
— Identifizierungsdaten;  
— Vehikel (sofern zutreffend): Begründung der Wahl des Vehikel, 
sofern anders als Wasser.  
2.2.2.  Versuchstierart  
— Tierart und Stamm;  
— Zahl, Alter und Geschlecht der Tiere;  
— Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.;  
— individuelles Gewicht der Tiere zu Beginn der Prüfung.  
2.2.3.  Prüfbedingungen  
— Begründung der Wahl der Dosisstufen;  
— Einzelheiten der Formulierung der Prüfsubstanz/ ­
Futterzubereitung, erzielte Konzentration, Stabilität und Homoge ­
nität der Zubereitung;  
— Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz;  
— tatsächliche Dosen (mg/kg Körpergewicht/Tag) und, sofern zu ­
treffend, Angaben zur Umrechnung der Konzentration der Prüf ­
substanz im Futter/Trinkwasser (ppm) in die tatsächliche Dosis;  
— Einzelheiten der Futter- und Wasserqualität.  
2.2.4.  Ergebnisse  
— Körpergewicht und Änderungen des Körpergewichts;  
— gegebenenfalls Angaben zur Futter- und Wasseraufnahme;  
— Daten der toxischen Wirkung nach Geschlecht und Dosis, ein ­
schließlich Toxizitätsanzeichen;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 407
 
— Art, Schweregrad und Dauer der klinischen Beobachtungen (mit 
Angaben zur Reversibilität);  
— Ergebnisse aus der ophthalmologischen Untersuchung;  
— Bewertung der Sensorik, Greifstärke und motorische Aktivität 
(sofern zutreffend);  
— hämatologische Tests mit entsprechenden Normalwerten;  
— klinisch-biochemische Tests mit entsprechenden Normalwerten;  
— terminales Körpergewicht, Organgewichte und Verhältnis Organ- 
/Körpergewicht;  
— Sektionsbefunde;  
— ausführliche Beschreibung aller histopathologischen  
— Befunde;  
— statistische Auswertung der Ergebnisse, wenn möglich.  
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  
3. LITERATUR  
(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No 60.  
(2) Tupper, D. E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003.  
(3) Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indus ­
trial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.  
(4) Moser. V. C, Mc Daniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational 
Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol 108, 267-283.
 
(5) Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C, Riley M. T. (1979). A 
Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb 
grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, 233- 
236. 
(6) Crofton K. M., Howard J. L., Moser V. C, Gill M. W., Reiter L. 
W., Tilson H. A., MacPhail R. C. (1991). Interlaboratory Com ­
parison of Motor Activity Experiments: lmplication for Neuro ­
toxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol, 13, 599-609.  
(7) Weingand K., Brown G., Hall R. et al (1996). „Harmonisation 
of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Stu ­
dies“, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, 198-201.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 408
 
B.27.  PRÜFUNG AUF SUBCHRONISCHE ORALE TOXIZITÄT — 
90-TAGE-TOXIZITÄTSSTUDIE BEI WIEDERHOLTER 
ORALER VERABREICHUNG AN NICHT-NAGETIEREN  
1. METHODE  
Diese Methode zur Prüfung auf subchronische orale Toxizität ent ­
spricht der OECD TG 409 (1998).  
1.1. EINLEITUNG  
Bei der Beurteilung und Bewertung der toxischen Merkmale eines 
chemischen Stoffs kann die Bestimmung der subchronischen Toxi ­
zität bei wiederholter oraler Verabreichung von Wirkstoffgaben durchgeführt werden, nachdem erste Toxizitätsdaten anhand von Prü ­
fungen auf akute Toxizität oder 28-Tage-Tests auf Toxizität bei 
wiederholter Verabreichung erzielt wurden. Die 90-Tage-Studie lie ­
fert Informationen über mögliche gesundheitliche Schädigungen, die 
durch wiederholte Exposition über einen Zeitraum des schnellen 
Wachstums bis zum frühen Stadium des Erwachsenseins entstehen können. Die Studie liefert ferner Informationen über die wichtigsten toxischen Wirkungen, zeigt die Zielorgane und eine mögliche Akku ­
mulation auf und kann zur Ableitung einer NOAEL (NOAEL — 
Dosis ohne beobachtete schädigende Wirkung) beitragen, die zur Wahl der Dosierungen für Untersuchungen der chronischen Toxizität und zur Festlegung von Sicherheitskriterien für die Humanexposition 
herangezogen werden kann.
 
Die Prüfmethode soll dazu beitragen, die schädigenden Wirkungen 
einer Exposition gegenüber Chemikalien bei Nicht-Nagetieren fest ­
zustellen und sollte nur in folgenden Fällen angewandt werden:  
— wenn in anderen Studien beobachtete Wirkungen eine Klärung/ 
Charakterisierung an einer zweiten Tierart, den Nicht-Nagetieren, erforderlich machen;
 
— wenn toxikokinetische Studien darauf hindeuten, dass die Ver ­
wendung einer spezifischen Art von Nicht-Nagetieren die rele ­
vanteste Wahl von Versuchstieren ist, oder  
— wenn andere spezifische Gründe die Verwendung einer Nicht- 
Nagetierart rechtfertigen.  
Siehe auch allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Dosis  ist die Menge der verabreichten Prüfsubstanz. Die Dosis wird 
als Gewicht (g, mg) oder als Gewicht der Prüfsubstanz je Gewichts ­
einheit des Versuchstiers (z. B. mg/kg) oder als konstante Futterkon ­
zentration (ppm) ausgedrückt.  
Dosierung  ist ein allgemeiner Begriff, der die Dosis, ihre Häufigkeit 
und die Dauer der Verabreichung umfasst.  
NOAEL  ist die Abkürzung für  no-observed-adverse-effect level  und 
entspricht der höchsten Dosis, bei der keine schädigenden behand ­
lungsbedingten Wirkungen festgestellt werden.  
1.3. PRINZIP DER METHODE  
Die Prüfsubstanz wird täglich über einen Zeitraum von 90 Tagen in 
abgestuften Dosen an mehrere Gruppen von Versuchstieren ver ­
abreicht, und zwar eine Dosisstufe je Gruppe, Während des Ver ­
abreichungszeitraums werden die Tiere sorgfältig auf Toxizitätsanzei ­
chen beobachtet. Während der Prüfung verendete oder getötete Tiere 
werden seziert. Am Ende der Prüfung werden alle noch lebenden 
Tiere getötet und ebenfalls seziert.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 409
 
1.4. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.4.1.  Auswahl von Versuchstierarten  
Die am häufigsten verwendete Nicht-Nagetierart ist der Hund, der 
einer bestimmten Rasse angehören sollte. Häufig wird der Beagle 
verwendet. Ferner können Tierarten wie Schwein oder Minischwein 
verwendet werden. Primaten werden nicht empfohlen, und ihre Ver ­
wendung ist zu begründen. Es sollten junge und gesunde Tiere ver ­
wendet werden. Bei Hunden sollte mit der Dosierung vorzugsweise 
im Alter von vier bis sechs Monaten, jedoch nicht später als neun 
Monaten begonnen werden. Wird die Studie als Vorstudie für eine Langzeitstudie über chronische Toxizität durchgeführt, sollten in bei ­
den Studien dieselbe Art/Rasse verwendet werden.
 
1.4.2.  Vorbereitung der Tiere  
Zu verwenden sind gesunde Jungtiere, die an die Laborbedingungen 
gewöhnt und bisher nicht für Tierversuche verwendet wurden. Die 
Dauer der Gewöhnung hängt von der für die Prüfung gewählten Art und der Herkunft der Tiere ab. Empfohlen werden mindestens fünf Tage für Hunde oder für speziell zu diesem Zweck gezüchtete 
Schweine aus einer internen Kolonie und mindestens zwei Wochen 
für Tiere externer Herkunft. Von den Versuchstieren sollten Art, Stamm, Herkunft, Geschlecht, Gewicht und/oder Alter festgestellt werden. Die Tiere werden nach dem Zufallsprinzip in Kontroll- 
und Behandlungsgruppen eingeteilt. Die Käfige sind so aufzustellen, 
dass etwaige durch den Standort bedingte Auswirkungen möglichst gering sind. Jedes Versuchstier sollte zur sicheren Identifizierung eine eigene Nummer erhalten.
 
1.4.3.  Zubereitung der Dosen  
Die Prüfsubstanz wird mit dem Futter oder im Trinkwasser über eine 
Magensonde oder in Kapseln verabreicht. Die Methode der oralen 
Verabreichung hängt von dem Zweck der Studie und den physika ­
lisch-chemischen Eigenschaften des Prüfmaterials ab.  
Bei Bedarf wird die Prüfsubstanz in einem geeigneten Medium ge ­
löst oder suspendiert. Es empfiehlt sich, nach Möglichkeit zunächst 
die Verwendung einer wässrigen Lösung/Suspension, sodann eine 
Lösung/Emulsion in Öl (z. B. Maisöl) und erst dann eine Lösung in anderen Medien in Betracht zu ziehen. Bei anderen Medien als Wasser müssen seine toxischen Merkmale bekannt sein. Die Stabi ­
lität der Prüfsubstanz unter den Verabreichungsbedingungen ist fest ­
zustellen.
 
1.5. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG  
1.5.1.  Zahl und Geschlecht der Versuchstiere  
Für jede Dosisstufe sind mindestens acht Tiere (vier weibliche und 
vier männliche) zu verwenden. Sollten im Verlauf der Prüfung Tiere getötet werden, ist die Zahl der Tiere um die Zahl zu erhöhen, die 
bereits vor Abschluss der Studie getötet werden sollen. Die Zahl der 
Tiere bei Beendigung der Studie muss für eine sinnvolle Bewertung der toxischen Wirkungen angemessen sein. Aufgrund bereits bekann ­
ter Wirkungen der Substanz oder eines eng verwandten Analogons 
sollte darüber hinaus für die Kontrollgruppe und die Gruppe mit der 
höchsten Dosis die Aufnahme einer Satellitengruppe von acht Tieren (vier jeden Geschlechts) zwecks Behandlung und anschließender Be ­
obachtung der Reversibilität oder Persistenz etwaiger toxischer Wir ­
kungen erwogen werden. Die Dauer dieses Zeitraums nach der Be ­
handlung sollte den beobachteten Wirkungen angemessen sein.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 410
 
1.5.2.  Dosierung  
Es sollten mindestens drei Dosierungen und eine gleichzeitige Kon ­
trolle verwendet werden, es sei denn, ein Limit-Test wird durch ­
geführt (siehe 1.4.3.4). Die Dosierungen können auf der Grundlage 
der Ergebnisse von Studien mit wiederholter Verabreichung oder 
Studien zur Ermittlung des Dosisbereichs festgelegt werden und soll ­
ten sämtliche für die Prüfsubstanz oder verwandte Materialien ver ­
fügbaren toxikologischen und toxikokinetischen Daten berücksichti ­
gen. Außer wenn dies wegen der physikalisch-chemischen Eigen ­
schaften oder der biologischen Wirkungen der Prüfsubstanz unmög ­
lich ist, sollte die höchste Dosierung gewählt werden, um Toxizität, 
jedoch nicht Tod oder schweres Leiden der Tiere zu induzieren. Zum 
Nachweis dosis-abhängiger Reaktionen und einer NOAEL bei nied ­
rigster Dosierung sollten die Dosierungen in absteigender Folge ver ­
abreicht werden. Zwei- bis vierfache Abstände haben sich oft als 
optimale Dosisabstufungen erwiesen, auch ist meist eine vierte Test ­
gruppe der Anwendung sehr großer Dosisabstände (z. B. mehr als ein Faktor von ca. 6-10) vorzuziehen.
 
Die Kontrollgruppe sollte eine unbehandelte Gruppe oder eine Ve ­
hikelkontrollgruppe sein, sofern ein Vehikel zur Verabreichung der Prüfsubstanz verwendet wird. Abgesehen von der Behandlung mit 
der Prüfsubstanz sollten die Tiere der Kontrollgruppe identisch mit 
denen der Testgruppen behandelt werden. Wird ein Vehikel verwen ­
det, erhält die Kontrollgruppe das Vehikel im höchsten verwendeten Volumen. Wird eine Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht, und 
führt dies zu einer verminderten Futteraufnahme, kann eine paar ­
weise gefütterte Kontrollgruppe nützlich sein, wobei zwischen einer verminderten Futteraufnahme aus geschmacklichen Gründen oder wegen toxikologischer Veränderungen im Prüfmodell unterschieden 
wird.
 
Zu berücksichtigen sind gegebenenfalls folgende Merkmale des Ve ­
hikels und anderer Additive: Wirkungen auf die Absorption, die 
Verteilung, den Stoffwechsel oder die Retention der Prüfsubstanz; 
Wirkungen auf die chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, die zur Änderung von toxischen Eigenschaften führen können; ferner 
Wirkungen auf die Futter- oder Wasseraufnahme oder den Ernäh ­
rungszustand der Versuchstiere.
 
1.5.3.  Limit-Test  
Ergibt eine Prüfung bei einer einzigen Dosis von mindestens 1 000 
mg/kg Körpergewicht/Tag unter Anwendung der für diese Studie 
beschriebenen Verfahren keine adversen Effekte und ist aufgrund der Daten strukturverwandter Stoffe keine Toxizität zu erwarten, kann auf eine vollständige Studie mit drei Dosisstufen gegebenen ­
falls verzichtet werden. Der Limit-Test ist anzuwenden, außer wenn 
die Expositionswirkungen beim Menschen die Prüfung bei einer höheren Dosis erforderlich erscheinen lässt.
 
1.5.4.  Verabreichung der Dosen  
Die Versuchstiere erhalten die Prüfsubstanz an sieben Tagen der 
Woche über einen Zeitraum von 90 Tagen. Jede Abweichung von diesem Dosierungsplan, z. B. fünf Tage je Woche, ist zu begründen. Wird die Prüfsubstanz über eine Sonde verabreicht, so sollte dies in 
einer einmaligen Dosis unter Verwendung einer Magensonde oder 
einer geeigneten Intubationskanüle erfolgen. Das maximale Flüssig ­
keitsvolumen, das einem Versuchstier mit einer Gabe verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Generell 
sollte das Volumen möglichst gering sein. Außer für Reizungen 
auslösende oder ätzende Stoffe, die in der Regel bei höheren Kon ­
zentrationen eine Verschlimmerung bewirken, sollte die Variabilität des Prüfvolumens durch Anpassung der Konzentration möglichst 
gering gehalten werden, um ein konstantes Volumen bei allen Dosen 
zu gewährleisten.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 411
 
Für mit dem Futter oder dem Trinkwasser verabreichte Stoffe ist 
unbedingt sicherzustellen, dass die Mengen der jeweiligen Prüfsub ­
stanz die normale Nahrungsaufnahme oder den Wasserhaushalt nicht beeinträchtigen. Wenn die Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht wird, können entweder eine konstante Futterkonzentration (ppm) 
oder eine konstante Dosierung in Relation zum Körpergewicht ver ­
wendet werden. Jede angewandte Alternative ist zu spezifizieren. Eine mit einer Magensonde oder in Kapseln verabreichte Substanz sollte jeweils zu denselben Tageszeiten gegeben und so angepasst 
werden, dass eine konstante Dosis in Relation zum Körpergewicht 
aufrechterhalten bleibt. Wird eine 90-Tage-Studie als Vorstudie für eine Langzeitstudie über chronische Toxizität verwendet, sollte in beiden Studien die gleiche Nahrung verabreicht werden.
 
1.5.5.  Beobachtungen  
Der Beobachtungszeitraum sollte mindestens 90 Tage betragen. Tiere 
einer Satellitengruppe, die für Nachfolgebeobachtungen vorgesehen 
sind, sollten für einen angemessenen Zeitraum ohne Behandlung 
bleiben, um festzustellen, ob die toxischen Wirkungen fortbestehen oder sich als reversibel erweisen.
 
Allgemeine klinische Beobachtungen sollten mindestens einmal täg ­
lich, vorzugsweise zur selben Tageszeit, unter Berücksichtigung des Zeitraums, in dem der Wirkungsgipfel nach Verabreichung der Dosis 
zu erwarten ist, vorgenommen werden. Der klinische Zustand der 
Tiere ist zu dokumentieren. Alle Tiere sind mindestens zweimal täglich, in der Regel morgens und abends, auf Anzeichen von Mor ­
bidität und Mortalität hin zu untersuchen.
 
Mindestens einmal vor der ersten Exposition (für intraindividuelle 
Vergleiche) und danach einmal pro Woche sollten bei allen Tieren 
umfassende klinische Beobachtungen vorgenommen werden. Diese Beobachtungen sollten, sofern praktisch durchführbar, außerhalb des Käfigs erfolgen, in dem die Tiere gehalten werden, und zwar vor ­
zugsweise in einem Standardgehege jeweils zu denselben Zeiten. Die 
Beobachtungsbedingungen sollten möglichst konstant sein. Anzei ­
chen von Toxizität sind sorgfältig zu dokumentieren, insbesondere Beginn, Schweregrad und Dauer. Die Beobachtungen sollten sich 
insbesondere beziehen auf Veränderungen an Haut, Fell, Augen, 
Schleimhäuten, auf Sekrete und Exkrete sowie auf autonome Re ­
aktionen (z. B. Tränenfluss, Piloerektion, Pupillengröße, anormale Atmung). Gang- und Haltungsstörungen, ferner Reaktionen auf den 
Umgang mit den Tieren sowie etwaige klonische oder tonische Be ­
wegungen, Stereotypien (z. B. übermäßiges Putzen, wiederholte Kreisbewegungen) oder abnormes Verhalten (z. B. Selbstverstümme ­
lung, Rückwärtsgehen) sollten auch dokumentiert werden.
 
Ophthalmologische Untersuchungen unter Verwendung eines Oph ­
thalmoskops oder eines entsprechenden geeigneten Geräts sollten 
vorgenommen werden, bevor die Prüfsubstanz verabreicht wird, so ­
wie zum Abschluss der Studie, vorzugsweise an allen Tieren, zu ­
mindest jedoch in den höchstdosierten Gruppen und den Kontroll ­
gruppen. Sofern behandlungsbedingte Veränderungen an den Augen 
beobachtet werden, sollten alle Tiere untersucht werden.  
1.5.5.1.  Körpergewicht und Futter-/Wasseraufnahme  
Alle Tiere sollten mindestens einmal wöchentlich gewogen werden. 
Messungen der Futteraufnahme sollten mindestens wöchentlich vor ­
genommen werden. Wenn die Prüfsubstanz über das Trinkwasser verabreicht wird, sollte auch die Wasseraufnahme mindestens einmal wöchentlich gemessen werden. Die Wasseraufnahme kann auch in 
Fütterungsstudien oder in Studien mit Sondenapplikation berücksich ­
tigt werden, bei denen sich das Trinkverhalten ändern kann.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 412
 
1.5.5.2.  Hämatologische und klinisch-biochemische Untersuchungen  
Die Blutproben sind an einer zu benennenden Stelle zu entnehmen 
und möglichst unter geeigneten Bedingungen zu lagern. Am Ende des Prüfzeitraums werden bei den Versuchstieren Blutproben kurz 
vor der Tötung oder als Teil des Tötungsvorgangs entnommen.
 
Hämatologische Untersuchungen sind zu Beginn der Studie und an ­
schließend entweder monatlich oder zur Halbzeit und schließlich am Ende des Prüfzeitraums vorzunehmen: Hämatokritwert, Hämoglobin ­
konzentration, Erythrozytenzahl, Leukozytenzahl (Gesamt- und Dif ­
ferenzialblutbild), Thrombozytenzahl und Bestimmung des Gerin ­
nungspotenzials, wie Gerinnungszeit, Prothrombinzeit oder Throm ­
boplastinzeit.
 
Klinisch-biochemische Bestimmungen zur Untersuchung der wich ­
tigsten toxischen Wirkungen in Geweben, insbesondere der Wirkun ­
gen auf Nieren und Leber, sind an Blutproben durchzuführen, die von jedem Tier zu Beginn und anschließend entweder monatlich oder zur Halbzeit und schließlich am Ende des Prüfzeitraums ent ­
nommen werden. Die Prüfungen sollten folgende Bereiche abdecken: 
Elektrolythaushalt, Kohlehydratstoffwechsel sowie Leber- und Nie ­
renfunktion. Die Wahl der spezifischen Prüfungen hängt von den Beobachtungen über die Wirkungsweise der Prüfsubstanz ab. Vor 
der Blutentnahme empfiehlt sich eine der Tierart angemessene Fut ­
terkarenz. Es wird empfohlen, Bestimmungen insbesondere für fol ­
gende Parameter durchzuführen: Calcium, Phosphor, Chlor, Natrium, Kalium, Nüchternglukose, Alanin-Aminotransferase, Aspartat-Ami ­
notransferase, Ornithindecarboxylase, Gammaglutamyl-Transpeptida ­
se, Harnstoff-Stickstoff, Albumin, Blutkreatinin, Gesamtbilirubin und Messungen des Serum-Gesamtproteins.
 
Untersuchungen zur Urinanalyse sind zumindest zu Beginn, anschlie ­
ßend zur Halbzeit und schließlich zum Abschluss der Studie an zu 
festgelegten Zeiten gesammeltem Urin durchzuführen: Aussehen, 
Volumen, Osmolarität oder spezifisches Gewicht, pH-Wert, Glukose und Blut/Blutzellen. Sofern erforderlich, können zusätzliche Parame ­
ter verwendet werden, um die Untersuchung beobachteter Wirkungen 
zu erweitern.
 
Darüber hinaus sollten Untersuchungen zur Bestimmung von Serum ­
markern für eine allgemeine Gewebsschädigung erwogen werden. Sonstige Bestimmungen, die für eine angemessene toxikologische Bewertung erforderlich sein können, umfassen Analysen von Lipi ­
den, Hormonen, Säure-/Basengleichgewicht, Methämoglobin und 
Cholinesteraseinhibitation. Weitere klinisch-biochemische Unter ­
suchungen können, sofern erforderlich, durchgeführt werden, um die Untersuchung der beobachteten Wirkungen zu erweitern. Die 
jeweiligen Parameter sind je nach Prüfsubstanzklasse bzw. von Fall 
zu Fall zu bestimmen.
 
Insgesamt ist je nach Versuchstierart und den beobachteten und/oder 
erwarteten Wirkungen der Prüfsubstanz mit der entsprechenden Fle ­
xibilität vorzugehen.  
1.5.5.3.  Autopsie  
Alle an der Studie beteiligten Tiere müssen einer vollständigen, ein ­
gehenden Autopsie unterzogen werden, die die sorgfältige Unter ­
suchung der äußeren Körperoberfläche, aller Körperöffnungen sowie der Schädel-, Brust- und Bauchhöhlen und ihres Inhalts umfasst. Leber und Gallenblase, Nieren, Nebennieren, Hoden, Nebenhoden, 
Uterus, Eierstöcke, Schilddrüse, (mit Nebenschilddrüse), Thymus, 
Milz, Gehirn und Herz aller Tiere (außer der tot aufgefundenen und/oder zwischenzeitlich getöteten Tiere) sind in angemessener Form von anhaftendem Gewebe zu befreien, und ihr Nassgewicht 
ist so rasch wie möglich nach der Sektion festzustellen, um ein 
Austrocknen zu verhindern.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 413
 
Die folgenden Gewebe sind in dem für Gewebsarten und die vor ­
gesehene nachfolgende histopathologische Untersuchung am besten 
geeigneten Fixierungsmedium aufzubewahren: alle Gewebe mit ma ­
kroskopischen Läsionen, Gehirn (repräsentative Bereiche, insbeson ­
dere Cerebrum, Cerebellum und Medulla/Pons), Rückenmark (auf 
drei Ebenen: cervical, mittlerer Thoraxbereich, und lumbar), Hypo ­
physe, Augen, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Thymusdrüse, Speise ­
röhre, Speicheldrüsen, Magen, Dünn- und Dickdarm (einschließlich Peyer'schen Platten), Leber, Gallenblase, Bauchspeicheldrüse, Nie ­
ren, Nebennieren, Milz, Herz, Luftröhre und Lungen, Aorta, Gona ­
den, Uterus, akzessorische Geschlechtsorgane, weibliche Brustdrü ­
sen, Prostata, Harnblase, Lymphknoten (vorzugsweise ein Lymph ­
knoten des Verabreichungswegs und ein weiterer vom Verabrei ­
chungsweg entfernter, um systemische Wirkungen abzudecken), pe ­
riphere Nerven (N. ischiadicus oder N. tibialis), vorzugsweise in der Nähe des Muskels, ein Knochenmarksschnitt (und/oder ein frisches Knochenmark-Aspirat) und Haut. Die klinischen und sonstigen Be ­
funde können weitere Gewebsuntersuchungen erforderlich machen. 
Auch Organe, die aufgrund der bekannten Eigenschaften der Prüf ­
substanz als mögliche Zielorgane in Frage kommen, sollten auf ­
bewahrt werden.
 
1.5.5.4.  Histopathologische Untersuchungen  
Bei allen Tieren der Gruppe mit der höchsten Dosis sowie bei den 
Tieren der Kontrollgruppe ist eine umfassende histopathologische 
Untersuchung der konservierten Organe und Gewebe durchzuführen. Diese Untersuchungen sind auch auf die Tiere aller Dosisgruppen auszudehnen, wenn behandlungsbedingte Veränderungen in der 
Gruppe mit der höchsten Dosis festgestellt werden.
 
Alle makroskopischen Läsionen sind zu untersuchen.  
Umfasst eine Prüfung auch eine Satellitengruppe, sind bei den Tieren 
dieser Gruppe die Gewebe und Organe histopathologisch zu unter ­
suchen, bei denen in den Behandlungsgruppen Wirkungen aufgetre ­
ten sind.  
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
2.1. DATEN  
Es sollten Daten für jedes einzelne Tier vorgelegt werden. Außerdem 
sollten alle Daten in Tabellenform zusammengefasst werden, aus 
denen für jede Prüfgruppe folgende Daten hervorgehen: die Zahl der Tiere bei Beginn der Prüfung und die Zahl der während der 
Prüfung tot aufgefundenen oder aus Gründen des Tierschutzes getö ­
teten Tiere, ferner der Zeitpunkt des eingetretenen Todes oder der aus Tierschutzgründen vorgenommenen Tötung, die Zahl der Tiere, die Anzeichen von Toxizität aufweisen, eine Beschreibung der be ­
obachteten Toxizität, einschließlich des Zeitpunkts, zu dem die toxi ­
schen Wirkungen erstmalig aufgetreten sind, deren Dauer und Schweregrad, die Zahl der Tiere mit Läsionen, die Art der Läsionen und der Prozentsatz der davon betroffenen Tiere.
 
Wenn möglich, sind die numerischen Daten durch eine geeignete 
allgemein annehmbare statistische Methode auszuwerten. Die statis ­
tischen Methoden und die zu analysierenden Daten sollten bei der Planung der Studie festgelegt werden.
 
2.2. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten:  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 414
 
2.2.1.  Prüfsubstanz  
— Physikalische Beschaffenheit, Reinheit und physikalisch-che ­
mische Eigenschaften;  
— Identifizierungsdaten;  
— Vehikel (sofern zutreffend): Begründung der Wahl des Vehikels, 
sofern anders als Wasser.  
2.2.2.  Versuchstierart  
— Tierart und Stamm:  
— Zahl, Alter und Geschlecht der Tiere:  
— Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.;  
— individuelles Gewicht der Tiere zu Beginn der Prüfung.  
2.2.3.  Prüfbedingungen  
— Begründung der Wahl der Dosisstufen;  
— Einzelheiten der Formulierung der Prüfsubstanz/Futterzubereitung, 
erzielte Konzentration, Stabilität und Homogenität der Zubereitung;  
— Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz;  
— tatsächliche Dosen (mg/kg Körpergewicht/Tag) und, sofern zu ­
treffend, Angaben zur Umrechnung der Konzentration der Prüf ­
substanz im Futter/Trinkwasser (ppm) in die tatsächliche Dosis;  
— Einzelheiten der Futter- und Wasserqualität.  
2.2.4.  Ergebnisse  
— Körpergewicht und Änderungen des Körpergewichts;  
— gegebenenfalls Angaben zur Futter- und Wasseraufnahme;  
— Daten der toxischen Wirkung nach Geschlecht und Dosis, ein ­
schließlich Toxizitätsanzeichen;  
— Art, Schweregrad und Dauer der klinischen Beobachtungen (mit 
Angaben zur Reversibilität);  
— Ergebnisse aus der ophthalmologischen Untersuchung;  
— hämatologische Tests mit entsprechenden Normalwerten;  
— klinisch-biochemische Tests mit entsprechenden Normalwerten;  
— terminales Körpergewicht, Organgewichte und Verhältnis Organ- 
/Körpergewicht;  
— Sektionsbefunde;  
— ausführliche Beschreibung aller histopathologischen Befunde;  
— Absorptionsdaten, sofern zutreffend;  
— statistische Bearbeitung der Ergebnisse, wenn möglich.  
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 415
 
B.28.  PRÜFUNG AUF SUBCHRONISCHE TOXIZITÄT NACH 
DERMALER APPLIKATION — 90-TAGE-TEST MIT NAGERN  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.3. BEZUGSSUBSTANZEN  
Keine.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Die Prüfsubstanz wird mehreren Versuchstiergruppen täglich in ab ­
gestuften Dosierungen auf die Haut aufgetragen, und zwar eine Do ­
sierung je Gruppe über einen Zeitraum von 90 Tagen. Während des Verabreichungszeitraums werden die Tiere täglich auf Vergiftungs ­
erscheinungen beobachtet. Tiere, die während des Versuchs sterben, 
sowie die bei Versuchsende überlebenden Tiere werden seziert.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
Vorbereitung  
Die Tiere werden vor Versuchsbeginn für einen Zeitraum von min ­
destens 5 Tagen unter experimentellen Haltungs- und Fütterungs ­
bedingungen eingewöhnt. Vor Versuchsbeginn werden gesunde 
junge Tiere randomisiert und den einzelnen Behandlungs- und Kon ­
trollgruppen zugeteilt. Kurz vor Beginn des Tests wird das Rücken ­
fell der Versuchstiere geschoren. Ein Abrasieren des Fells ist eben ­
falls möglich, sollte jedoch etwa 24 Stunden vor dem Versuch er ­
folgen. Das Scheren oder Rasieren muss normalerweise wöchentlich wiederholt werden. Es ist darauf zu achten, dass dabei die Haut nicht verletzt wird. Mindestens 10 % der Körperoberfläche wird für die 
Applikation der Prüfsubstanz vorbereitet. Bei der Bestimmung des zu 
scherenden Bereichs und der Applikationsfläche ist das Gewicht der Tiere zu berücksichtigen. Werden Versuche mit festen Stoffen durch ­
geführt, die ggf. pulverisiert werden können, sollte die Prüfsubstanz 
ausreichend mit Wasser oder, falls erforderlich, mit einem geeigneten 
Vehikel angefeuchtet werden, um einen guten Kontakt mit der Haut zu gewährleisten. Flüssige Prüfsubstanzen werden gewöhnlich unver ­
dünnt angewendet. Die Applikation erfolgt normalerweise an fünf bis 
sieben Tagen pro Woche.
 
Versuchsbedingungen  
V e r s u c h s t i e r e  
Es können erwachsene Ratten, Kaninchen oder Meerschweinchen 
verwendet werden. Andere Tierarten sind ebenfalls geeignet, jedoch 
muss ihre Verwendung begründet werden. Zu Beginn des Versuchs sollte die Abweichung im Körpergewicht nicht mehr als ± 20 % vom Mittelwert betragen. Wird eine subchronische dermale Toxizitätsstu ­
die einer Langzeitstudie vorgeschaltet, sollten in beiden Fällen die 
gleichen Tierarten bzw. Versuchstierstämme benutzt werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 416
 
A n z a h l u n d G e s c h l e c h t  
Mindestens 20 Tiere (10 weibliche und 10 männliche) mit gesunder 
Haut sind für jede Dosierung zu verwenden. Die Weibchen dürfen weder geworfen haben noch trächtig sein. Sollen im Verlauf des Versuchs Tiere getötet werden, so muss die Gesamtzahl der Tiere 
um die Zahl an Tieren erhöht werden, die schon vor Versuchsende 
getötet werden sollen. Darüber hinaus kann eine zusätzliche Gruppe (Satellitengruppe) von 20 Tieren (10 Tiere pro Geschlecht) über 90 Tage mit der höchsten Dosierung behandelt werden, um während 
eines Zeitraums von 28 Tagen nach der Behandlung auf Reversibi ­
lität, Fortbestehen oder verzögertes Auftreten toxischer Wirkungen achten zu können.
 
D o s i e r u n g e n  
Es sind mindestens drei Dosisgruppen und eine Kontrollgruppe und 
— sofern ein Vehikel benutzt wird — eine Vehikelkontrollgruppe erforderlich. Die Applikation der Prüfsubstanz sollte täglich zur glei ­
chen Zeit und in festgesetzten Intervallen (wöchentlich oder 14-tä ­
gig) erfolgen, um ein in Relation zum Körpergewicht des Tieres 
konstantes Dosierungsniveau zu gewährleisten. Abgesehen von der Applikation der Prüfsubstanz sind die Tiere der Kontrollgruppe ge ­
nauso zu behandeln wie die Versuchstiere. Wird zur Erleichterung 
der Verabreichung ein Vehikel benutzt, so ist dieses der entsprechen ­
den Kontrollgruppe in gleicher Weise zu verabreichen wie den be ­
handelten Tieren und zwar in der Menge, die die Gruppe mit der höchsten Dosierung erhält. Die höchste Dosierung ist so zu wählen, 
dass auf jeden Fall toxische Wirkungen eintreten, die Tiere jedoch 
nicht oder nur in geringer Zahl sterben. Die niedrigste Dosierung darf keine Anzeichen von Toxizität hervorrufen. Liegen brauchbare Schätzungen über die Höhe der Exposition beim Menschen vor, so 
sollte die niedrigste Dosierung diesen Wert nicht überschreiten. Nach 
Möglichkeit sollte die mittlere Dosierung nur geringe toxische Wir ­
kungen verursachen. Werden mehrere Zwischendosierungen ver ­
abreicht, so sollten sie so gewählt werden, dass sich eine graduelle 
Abstufung der toxischen Wirkungen ergibt. In den Gruppen mit 
niedriger und mittlerer Dosierung sowie in den Kontrollgruppen sollte die Anzahl von Todesfällen gering sein, um eine aussagekräf ­
tige Bewertung der Ergebnisse zu ermöglichen.
 
Führt die Applikation der Prüfsubstanz zu schweren Hautreizungen, 
sollten die Konzentrationen herabgesetzt werden, was bei hoher Do ­
sierung zu einer Verminderung oder einem Ausbleiben weiterer to ­
xischer Wirkungen führen dürfte. Wurde die Haut stark beschädigt, ist es unter Umständen notwendig, den Versuch abzubrechen und mit 
einer niedrigeren Konzentration erneut zu beginnen.
 
L i m i t - T e s t  
Hat im Rahmen einer Vorstudie die Verabreichung einer Dosis von 
1 000 mg/kg bzw. einer höheren Dosis, die einer bekannten Exposi ­
tion beim Menschen entspricht, keine toxischen Auswirkungen, so ist 
eine weitere Prüfung nicht erforderlich.  
B e o b a c h t u n g s z e i t r a u m  
Alle Tiere sind täglich auf Vergiftungssymptome zu beobachten. Der 
Eintritt des Todes und der Zeitpunkt, zu dem Vergiftungssymptome 
auftreten und/oder wieder abklingen, sind festzuhalten.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 417
 
V e r s u c h s d u r c h f ü h r u n g  
Die Tiere sind in Einzelkäfigen zu halten; die Prüfsubstanz wird 
ihnen vorzugsweise an 7 Tagen pro Woche während eines Zeitraums von 90 Tagen verabreicht.
 
Tiere einer Satellitengruppe, die für eine Nachbeobachtung vorgese ­
hen sind, sollten für weitere 28 Tage ohne Behandlung gehalten werden, um die Reversibilität von toxischen Effekten bzw. deren 
Fortbestehen festzustellen. Die Expositionszeit beträgt 6 Stunden 
pro Tag.
 
Die Prüfsubstanz ist gleichmäßig auf einen Bereich, der etwa 10 % 
der Körperoberfläche entspricht, aufzutragen. Bei hochtoxischen 
Substanzen kann die behandelte Oberfläche kleiner sein, es sollte jedoch ein möglichst großer Bereich mit einer möglichst dünnen 
und einheitlichen Schicht bedeckt werden.
 
Die Prüfsubstanz ist während der Expositionszeit mittels eines porö ­
sen Mullverbandes und eines hautschonenden Pflasters in Kontakt 
mit der Haut zu halten. Die Versuchsfläche ist außerdem auf eine 
geeignete Art abzudecken, um den Mullverband und die Prüfsub ­
stanz zu fixieren und sicherzustellen, dass die Tiere die Prüfsubstanz nicht verschlucken können. Zu diesem Zweck können ggf. Mittel zur 
Einschränkung der Bewegungsfreiheit angewendet werden; eine voll ­
ständige Immobilisierung ist jedoch nicht zu empfehlen.
 
Nach Ablauf der Expositionszeit entfernt man — soweit möglich — 
den Rest der Prüfsubstanz mit Hilfe von Wasser oder eines anderen geeigneten Hautreinigungsverfahrens.
 
Alle Tiere müssen täglich beobachtet und Vergiftungssymptome so ­
wie deren Beginn, Grad und Dauer aufgezeichnet werden. Die Be ­
obachtungen sollten sich insbesondere auf Veränderungen von Haut, 
Fell, Augen, Schleimhäuten, des Atmungs- und Kreislaufssystems, 
des autonomen und zentralen Nervensystems sowie auf Somatomoto ­
rik und Verhaltensmuster erstrecken. Die Futteraufnahme und das Gewicht der Tiere werden wöchentlich bestimmt. Eine regelmäßige 
Beobachtung der Tiere ist erforderlich, um sicherzustellen, dass sich 
der Bestand an Tieren während der Studie nicht durch Kannibalis ­
mus, Autolyse der Gewebe bzw. Fehler beim Umsetzen der Tiere 
verringert. Nach Abschluss der Studie werden alle überlebenden 
Tiere, mit Ausnahme der Tiere der Satellitengruppe, seziert. Mori ­
bunde Tiere sollten ausgesondert, getötet und seziert werden.
 
Bei allen Tieren, einschließlich der Kontrolltiere, sind üblicherweise 
folgende Untersuchungen durchzuführen:  
a) Eine ophthalmologische Untersuchung mit Hilfe eines Ophthal ­
moskops oder eines gleichwertigen geeigneten Geräts sollte vor der Exposition gegenüber der Prüfsubstanz und zum Abschluss der Studie — vorzugsweise bei allen Tieren, zumindest jedoch in 
der Gruppe mit der höchsten Dosierung und in der Kontroll ­
gruppe — durchgeführt werden. Sind bei Versuchsende Verände ­
rungen der Augen feststellbar, sind alle Tiere zu untersuchen.
 
b) Am Ende des Versuchs sind hämatologische Untersuchungen, 
einschließlich Hämatokritwert und Hämoglobinkonzentration, Erythrozytenzahl, Leukozytenzahl, Differenzialblutbild, Messun ­
gen der Gerinnungsfähigkeit, z. B. Gerinnungszeit, Prothrombin ­
zeit, Thromboplastinzeit oder Thrombozytenzahl, durchzuführen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 418
 
c) Am Ende des Versuchs sind ebenfalls klinisch-chemische Unter ­
suchungen des Blutes durchzuführen. Für diese Untersuchungen 
eignen sich folgende Analysen: Elektrolytbilanz, Kohlenhydrat ­
stoffwechsel, Leber- und Nierenfunktion. Die Durchführung spe ­
zifischer Analysen richtet sich nach der festgestellten Wirkungs ­
weise der Prüfsubstanz. Vorgeschlagen werden folgende Bestim ­
mungen: Kalzium, Phosphor, Chlorid, Natrium, Kalium, Nüch ­
ternglukose (mit auf die Tierart abgestimmter Fastenperiode), Se ­
rum-Glutamat-Pyruvat-Transaminase (  1 ), Serum-Glutamat-Oxal ­
acetat-Transaminase (  2 ), Ornithin-Dekarboxylase, Gamma-Gluta ­
myl-transpeptidase, Harnstickstoff, Albumin, Blutkreatinin, Ge ­
samtbilirubin- und -serumeiweißmessungen. Weitere Analysen, die gegebenenfalls für eine geeignete toxikologische Bewertung 
erforderlich sind, umfassen: Lipide, Hormone, Säuren-Basen- 
Gleichgewicht, Methämoglobin, Cholinesteraseaktivität. Zusätzli ­
che klinisch-chemische Analysen können erforderlich sein, um die Untersuchung der beobachteten Wirkungen zu vertiefen.
 
d) In der Regel ist eine Urinanalyse nicht notwendig, erscheint je ­
doch erforderlich, sofern eine toxische Wirkung zu erwarten oder 
zu beobachten ist.  
Erweisen sich Daten aus vorangegangenen Versuchen als ungeeignet, 
sollte eine Bestimmung hämatologischer und klinisch-chemischer 
Parameter vor Versuchsbeginn in Betracht gezogen werden.  
A u t o p s i e  
Bei allen im Versuch befindlichen Tieren wird eine vollständige 
Autopsie vorgenommen, einschließlich einer Untersuchung der Kör ­
peroberfläche, aller Körperöffnungen, sowie der Schädel, Brust- und 
Bauchhöhle einschließlich der jeweiligen Organe. Leber, Nieren, Ne ­
bennieren und Hoden werden so bald wie möglich nach der Sektion feucht gewogen, um ein Austrocknen zu verhindern. Die folgenden 
Organe und Gewebe sind für eine eventuelle spätere histopathologi ­
sche Untersuchung in einem geeigneten Medium aufzubewahren: alle Organe mit makroskopischen Veränderungen, Gehirn, einschließlich Medulla/Pons, der Kleinhirn- und Großhirnrinde, der Hypophyse, der 
Schilddrüse/Nebenschilddrüse, des Thymusgewebes, von Trachea 
und Lungen, Herz, Aorta, (Speicheldrüse), Leber, Milz, Nieren, Ne ­
bennieren, Pankreas, Gonaden, Uterus, akzessorische Geschlechts ­
organe, Gallenblase (sofern vorhanden), Oesophagus, Magen, Duo ­
denum, Jejunum, Ileum, Coecum, Kolon, Rektum, Harnblase, reprä ­
sentative Lymphknoten (weibliche Brustdrüse), (Oberschenkelmus ­
kulatur), Nerven des peripheren Systems, Brustbein mit Knochen ­
mark (Augen), (Femur, einschließlich Gelenkoberfläche), (Wirbel ­
säule in drei Ebenen: Hals-, mittlerer Thorax- und Lendenbereich) 
sowie (extraorbitale Tränendrüse). Die in Klammern angegebenen Gewebe sind nur bei Anzeichen von Toxizität oder bei Einbeziehung des Zielorgans zu untersuchen.
 
H i s t o p a t h o l o g i s c h e U n t e r s u c h u n g  
a) Bei allen Tieren der Kontrollgruppe und den Tieren mit der 
höchsten Dosis ist eine vollständige histopathologische Unter ­
suchung der behandelten und der unbehandelten Hautflächen so ­
wie der Organe und Gewebe durchzuführen.  
b) Alle Organe mit makroskopischen Veränderungen sind zu unter ­
suchen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 419  
( 1 ) Neuerdings als Serum-Alanin-Aminotransferase bezeichnet. 
( 2 ) Neuerdings als Serum-Aspartat-Aminotransferase bezeichnet.
 c) Die Zielorgane der Tiere der anderen Dosisgruppen sind zu unter ­
suchen.  
d) Werden Ratten benutzt, sind die Lungen der Tiere in der Gruppe 
mit niedriger und mittlerer Dosierung zur Feststellung einer mög ­
lichen Infektion histopathologisch so zu untersuchen, dass eine geeignete Beurteilung des Gesundheitszustandes der Tiere mög ­
lich ist. Weitere histopathologische Untersuchungen der Tiere 
dieser Gruppen sind routinemäßig nicht erforderlich, müssen je ­
doch bei den Tieren der Gruppe mit der höchsten Dosierung stets für alle geschädigten Organe durchgeführt werden.
 
e) Bei den Tieren der Satellitengruppe sind jene Organe und Ge ­
webe histopathologisch zu untersuchen, die in den behandelten Gruppen auf die Prüfsubstanz reagierten.
 
2. DATEN  
Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus 
muss für jede Versuchsgruppe die Zahl der Tiere zu Beginn des Versuchs, die Zahl der Tiere mit Veränderungen, die Art der Ver ­
änderungen sowie der Prozentsatz der Tiere für jede Art der Ver ­
änderung hervorgehen. Die Ergebnisse sind durch ein geeignetes statistisches Verfahren zu bewerten. Hierzu ist eine anerkannte sta ­
tistische Methode heranzuziehen.
 
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— Tierarten, Tierstamm, Herkunft, Haltungsbedingungen, Fütterung;  
— Versuchsbedingungen;  
— Dosierungen (ggf. Vehikel) und Konzentrationen;  
— Daten über toxische Reaktionen nach Geschlecht und Dosierung;  
— nichttoxische Dosis, sofern möglich;  
— Zeitpunkt des Todes während des Versuchs bzw. Angabe, ob die 
Tiere den Versuch überlebten;  
— Beschreibung toxischer oder anderer Wirkungen;  
— Zeitpunkt der Beobachtung der einzelnen Vergiftungssymptome 
und deren weiterer Verlauf;  
— Angaben über Futterverbrauch und Körpergewichtsentwicklung;  
— ophthalmologische Befunde;  
— hämatologische Tests und deren Ergebnisse;  
— klinisch-chemische Tests und deren Ergebnisse (einschließlich 
Ergebnis einer evtl. Urinanalyse);  
— Sektionsbefunde;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 420
 
— detaillierte Beschreibung aller histopathologischen Befunde;  
— statistische Auswertung der Ergebnisse, sofern möglich;  
— Diskussion der Ergebnisse;  
— Bewertung der Ergebnisse.  
3.2. INTERPRETATION  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
4. LITERATUR  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 421
 
B.29  PRÜFUNG AUF SUB-CHRONISCHE TOXIZITÄT NACH 
INHALATION — 90-TAGE-TEST  
ZUSAMMENFASSUNG  
Diese überarbeitete Prüfmethode B.29 wurde entwickelt, um die Toxizität der 
Prüfsubstanz nach Inhalation über einen subchronischen Zeitraum (90 Tage) 
umfassend zu beschreiben und um robuste Daten für die quantitative Bewertung 
des Inhalationsrisikos zu gewinnen. Gruppen von zehn männlichen und zehn weiblichen Nagern werden über einen Zeitraum von 90 Tagen (13 Wochen) 6 Stunden am Tag a) der Prüfsubstanz in drei oder mehr Konzentrationsstufen, b) 
gefilterter Luft (negative Kontrolle) und/oder c) dem Vehikel (Vehikelkontrolle) 
ausgesetzt. Im Allgemeinen werden die Tiere der Prüfsubstanz an fünf Tagen pro Woche ausgesetzt, aber auch sieben Tage pro Woche sind zulässig. Es werden immer männliche und weibliche Tiere geprüft, aber sie können unterschiedlichen 
Konzentrationsstufen ausgesetzt werden, wenn bekannt ist, dass ein Geschlecht 
empfindlicher auf eine bestimmte Prüfsubstanz reagiert als das andere. Bei dieser Methode hat der Studienleiter die Möglichkeit, Satellitengruppen (Reversibilitäts ­
prüfung) aufzunehmen, Tiere im Verlauf der Studie zu töten, sowie eine bron ­
choalveoläre Lavage (BAL), neurologische Tests, zusätzliche klinische Patholo ­
gieuntersuchungen und histopathologische Untersuchungen durchzuführen, um die Toxizität einer Prüfsubstanz besser beschreiben zu können.
 
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie 413 (2009). Die ur ­
sprüngliche Prüfrichtlinie 413 (TG 413) zur subchronischen Inhalation 
wurde 1981 angenommen (1). Diese Prüfmethode B.29 (die der überarbei ­
teten TG 413 (2009) entspricht), wurde aktualisiert, um dem neuesten Stand der Wissenschaft Rechnung zu tragen und derzeitige und künftige Regulie ­
rungsanforderungen zu erfüllen.
 
2. Prüfungen auf subchronische Toxizität nach Inhalation haben hauptsächlich 
den Zweck, die in Vorschriften festzusetzenden Konzentration zu bestim ­
men, nach denen das Risiko für Arbeitnehmer im beruflichen Umfeld beur ­
teilt wird. Sie werden auch verwendet, um das mit einer Exposition ver ­
bundene Risiko für den Menschen am Wohnort, im Verkehr und in der 
Umwelt zu beurteilen. Diese Methode ermöglicht die Beschreibung der 
schädlichen Wirkungen nach wiederholter täglicher inhalativer Exposition gegen eine Prüfsubstanz für einen Zeitraum von 90 Tagen (etwa 10 % der Lebenszeit einer Ratte). Die in Prüfungen auf subchronische Toxizität 
nach Inhalation gewonnenen Daten können für quantitative Risikobewertun ­
gen und für die Auswahl von Konzentrationen für chronische Prüfungen verwendet werden. Diese Prüfmethode ist nicht speziell für die Prüfung von Nanomaterialien bestimmt. Die im Zusammenhang mit dieser Prüf ­
methode verwendeten Begriffe werden am Ende dieses Kapitels und im 
Guidance Document (GD 39 (2)) definiert.
 
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN  
3. Um die Qualität der Studie zu verbessern und möglichst wenig Versuchs ­
tiere zu verwenden, sollte das Prüflabor vor Durchführung der Studie alle 
verfügbaren Informationen über die Prüfsubstanz berücksichtigen. Für die 
Auswahl der am besten geeigneten Prüfkonzentrationen könnten u. a. Infor ­
mationen wie die Identität, die chemische Struktur und die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, Ergebnisse jegli ­
cher In-vitro- oder In-vivo-Toxizitätsprüfungen, vorgesehene Verwendungen 
und die Möglichkeit der Exposition des Menschen, (Q)SAR-Daten und toxikologische Daten über strukturverwandte Substanzen sowie Daten aus anderen Studien mit wiederholter Exposition herangezogen werden. Falls 
Neurotoxizität erwartet oder im Verlauf der Studie beobachtet wird, kann 
der Studienleiter beschließen, geeignete Untersuchungen wie eine FOB (functional observational battery) und die Messung der motorischen Aktivi ­
tät aufzunehmen. Obwohl die Expositionszeit bei bestimmten Untersuchun ­
gen ein kritischer Aspekt sein kann, darf die Durchführung dieser zusätzli ­
chen Versuche die Auslegung der Hauptstudie nicht beeinträchtigen.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 422
 
4. Verdünnungen ätzender oder reizender Prüfsubstanzen können in Konzen ­
trationen geprüft werden, die den gewünschten Toxizitätsgrad erzielen. Wei ­
tere Informationen sind GD 39 (2) zu entnehmen. Wenn Versuchstiere diesen Stoffen ausgesetzt werden, sollten die Zielkonzentrationen so niedrig sein, dass sie keine starken Schmerzen oder Leiden verursachen; sie sollten 
aber ausreichen, um die Konzentrations-Wirkungs-Kurve so zu erweitern, 
dass das regulatorische und wissenschaftliche Ziel der Prüfung erreicht wird. Diese Konzentrationen sollten von Fall zu Fall festgelegt werden, möglichst auf Basis einer entsprechend ausgelegten Dosisfindungsstudie, die Informa ­
tionen über den kritischen Endpunkt, eine etwaige Reizschwelle und den 
Zeitpunkt des Einsetzens der Wirkung liefert (siehe Nummern 11, 12 und 13). Die Wahl der Konzentration ist zu begründen.
 
5. Moribunde Tiere oder Tiere, die Anzeichen starker und andauernder Qualen 
zeigen, sollten tierschutzgerecht getötet werden. Moribunde Tiere werden auf die gleiche Weise gewertet wie während des Tests gestorbene Tiere. Kriterien für die Entscheidung, moribunde oder schwer leidende Tiere zu 
töten, sowie Hinweise zur Erkennung des absehbaren oder bevorstehenden 
Todes sind Gegenstand des OECD Guidance Document on Humane End ­
points (3).
 
BESCHREIBUNG DER METHODE  
Auswahl von Versuchstierarten  
6. Es sind junge, gesunde, adulte Nagetiere aus üblicherweise eingesetzten 
Laborstämmen zu verwenden. Bevorzugtes Versuchstier ist die Ratte. 
Wird eine andere Tierart eingesetzt, ist dies zu begründen.  
Vorbereitung der Tiere  
7. Die weiblichen Tiere dürfen weder bereits geworfen haben noch momentan 
trächtig sein. Am Tag der Randomisierung sollten die jungen, adulten Tiere 
7 bis 9 Wochen alt sein; ihr Körpergewicht sollte innerhalb von ± 20 % des 
mittleren Gewichts für jedes Geschlecht liegen. Die Tiere werden nach Zufallskriterien ausgewählt, zur individuellen Identifizierung markiert und vor Beginn der Prüfung für einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen in 
ihren Käfigen an die Laborbedingungen gewöhnt.
 
Tierhaltung  
8. Um die Beobachtungen zu erleichtern und Verwechslungen auszuschließen, 
sollten die Tiere möglichst mit einem subkutanen Transponder einzeln ge ­
kennzeichnet werden. Die Temperatur in dem Raum, in dem die Versuchs ­
tiere gehalten werden, sollte 22 ± 3 °C betragen. Die relative Luftfeuchtig ­
keit sollte im Idealfall im Bereich zwischen 30 und 70 % liegen; bei Ver ­
wendung von Wasser als Vehikel könnte dies jedoch unmöglich sein. Die Tiere sollten vor und nach den Expositionen im Allgemeinen nach Ge ­
schlecht und Konzentration in Käfigen gruppiert werden, wobei aber die 
Anzahl der Tiere pro Käfig noch eine genaue Beobachtung der einzelnen Tiere ermöglichen muss und Verluste aufgrund von Kannibalismus oder Kämpfen minimiert werden sollten. Wenn die Tiere der Prüfsubstanz nur 
mit der Nase ausgesetzt werden sollen, müssen sie möglicherweise an die 
Restrainer gewöhnt werden. Die Restrainer sollten die Tiere weder körper ­
lich noch in Bezug auf Wärme oder Fixierung übermäßig beeinträchtigen. Die Fixierung kann physiologische Endpunkte wie Körpertemperatur (Hy ­
perthermie) und/oder das Atemminutenvolumen beeinflussen. Wenn generi ­
sche Daten zeigen, dass keine derartigen Veränderungen in nennenswertem Ausmaß vorkommen, ist eine Eingewöhnung an die Restrainer nicht erfor ­
derlich. Bei der Ganzkörperexposition gegen ein Aerosol sollten die Tiere 
während der Exposition einzeln untergebracht sein, damit sie die Prüfsub ­
stanz nicht durch das Fell ihrer Käfiggenossen filtriert einatmen. Außer während der Exposition kann herkömmliches und zertifiziertes Labortierfut ­
ter verwendet werden bei uneingeschränkter Versorgung mit Trinkwasser. 
Die Beleuchtung sollte künstlich sein und die Hell- und Dunkelphasen 
sollten sich im Abstand von 12 Stunden abwechseln.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 423
 
Inhalationskammern  
9. Bei der Auswahl einer Inhalationskammer sind die Art der Prüfsubstanz und 
der Gegenstand der Prüfung zu berücksichtigen. Das bevorzugte Verfahren ist die „Nose-only“-Exposition (dieser Begriff umfasst „nur Kopf“, „nur 
Nase“ oder „nur Schnauze“). Für die Untersuchung von Flüssigkeits- oder 
Feststoffaerosolen und für Dämpfe, die zu Aerosolen kondensieren können, wird im Allgemeinen die „Nose-only“-Exposition bevorzugt. Besondere Ziele der Untersuchung können möglicherweise mit einer Ganzkörperexpo ­
sition besser erreicht werden, doch dies sollte im Prüfbericht begründet 
werden. Um bei Verwendung einer Ganzkörperkammer die Stabilität der Atmosphäre sicherzustellen, sollte das Gesamtvolumen der Versuchstiere 
5 % des Volumens der Kammer nicht übersteigen. Die Grundzüge der 
„Nose-only“- und der Ganzkörperexposition sowie ihre jeweiligen Vor- und Nachteile sind in GD 39 (2) beschrieben.
 
TOXIZITÄTSSTUDIEN  
Grenzkonzentrationen  
10. Anders als bei Studien zur akuten Toxizität gibt es bei Prüfungen auf sub ­
chronische Toxizität nach Inhalation keine festgelegten Grenzkonzentratio ­
nen. Bei der Festlegung der maximalen Prüfkonzentration ist Folgendes zu 
beachten: 1) die höchste erreichbare Konzentration, 2) das maximale Ex ­
positionsniveau von Menschen (‚worst case), 3) die Notwendigkeit, eine ausreichende Sauerstoffversorgung aufrechtzuerhalten, und 4) Tierschutz ­
erwägungen. Gibt es keine auf Daten basierenden Grenzwerte, können die 
akuten Grenzwerte der Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 (13) zugrunde ge ­
legt werden (d. h. bis zu einer Höchstkonzentration von 5 mg/l bei Aero ­
solen, 20 mg/l bei Dämpfen und 20 000 ppm bei Gasen); siehe GD 39 (2). 
Wenn diese Grenzen bei der Prüfung von Gasen oder hochflüchtigen Prüf ­
substanzen (z. B. Kältemitteln) überschritten werden müssen, ist dies zu begründen. Die Grenzkonzentration muss eine eindeutige Toxizität hervor ­
rufen, ohne den Tieren übermäßigen Stress zu bereiten oder ihre Lebens ­
dauer zu beeinträchtigen (3).
 
Dosisfindungsstudie  
11. Vor Beginn der Hauptstudie muss in der Regel eine Dosisfindungsstudie 
durchgeführt werden. Diese ist umfassender als eine Vorstudie, weil sie nicht auf die Wahl der Konzentration begrenzt ist. Die in einer Dosisfin ­
dungsstudie gewonnenen Erkenntnisse können zu einer erfolgreichen Haupt ­
studie führen. Sie kann z. B. technische Informationen zu den Analyse ­
methoden, zur Partikelgröße, zur Erkennung toxischer Mechanismen, kli ­
nische Pathologiedaten und histopathologische Daten sowie Schätzungen 
möglicher NOAEL- und MTC-Konzentrationen in einer Hauptstudie liefern. Der Studienleiter kann entscheiden, mithilfe der Dosisfindungsstudie die Schwelle für die Reizung der Atemwege (z. B. durch histopathologische 
Untersuchung der Atemwege, Lungenfunktionsprüfung oder bronchoalveo ­
läre Lavage), die höchste Konzentration, die von den Tieren ohne über ­
mäßigen Stress toleriert wird, und die Parameter, die die Toxizität der Prüf ­
substanz am besten beschreiben, zu identifizieren.
 
12. Eine Dosisfindungsstudie kann aus einer oder mehreren Konzentrationsstu ­
fen bestehen. Auf jeder Konzentrationsstufe sollten je nach den gewählten Endpunkten drei bis sechs männliche und drei bis sechs weibliche Tiere der 
Prüfsubstanz ausgesetzt werden. Eine Dosisfindungsstudie sollte mindestens 
fünf Tage und im Allgemeinen nicht mehr als 28 Tage dauern. Die Wahl der Konzentrationen für die Hauptstudie ist im Prüfbericht zu begründen. Ziel der Hauptstudie ist es, nachzuweisen, dass eine Beziehung zwischen der 
Konzentration und der Wirkung besteht, die am voraussichtlich empfind ­
lichsten Endpunkt auftritt. Die niedrigste Konzentration sollte im Idealfall eine Konzentration sein, bei der keine zu beobachtenden schädlichen Wir ­
kungen auftreten, und die höchste Konzentration sollte eine eindeutige To ­
xizität hervorrufen, ohne den Tieren übermäßigen Stress zu bereiten oder 
ihre Lebensdauer zu beeinträchtigen (3).
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 424
 
13. Bei der Auswahl der Konzentrationsstufen für die Dosisfindungsstudie soll ­
ten alle verfügbaren Informationen berücksichtigt werden, einschließlich der 
Struktur-Wirkungs-Beziehungen und der Daten über ähnliche Stoffe (siehe Nummer 3). Eine Dosisfindungsstudie kann bestätigen/widerlegen, welche Endpunkte nach mechanistischen Kriterien als die empfindlichsten End ­
punkte angesehen werden, z. B. die Cholinesterasehemmung durch Organo ­
phosphate, die Methämoglobinbildung durch für Erythrozyten toxische Stof ­
fe, Schilddrüsenhormone (T
 3 , T 4 ) im Fall von thyrotoxischen Stoffen, Pro ­
teine, LDH oder Neutrophile in bronchoalveolärer Lavage im Fall schwach 
löslicher unschädlicher Partikel oder lungenreizender Aerosole.  
Hauptstudie  
14. Die Hauptstudie zur Prüfung auf subchronische Toxizität umfasst im All ­
gemeinen drei Konzentrationsstufen sowie, falls erforderlich, eine gleich ­
zeitige negative (Luft-)Kontrolle und/oder eine Vehikelkontrolle (siehe 
Nummer 18). Die Festlegung der geeigneten Expositionsstufen sollte sich 
auf alle verfügbaren Daten stützen, einschließlich der Ergebnisse systemi ­
scher Toxizitätsprüfungen, des Metabolismus und der Kinetik (hohe Kon ­
zentrationsstufen, die kinetische Prozesse sättigen, sind zu vermeiden). Jede 
Prüfgruppe umfasst zehn männliche und zehn weibliche Nager, die der 
Prüfsubstanz für einen Zeitraum von 13 Wochen an fünf Tagen in der Woche jeweils 6 Stunden pro Tag ausgesetzt werden (Gesamtdauer der Prüfung 90 Tage). Die Tiere können auch an sieben Tagen in der Woche 
exponiert werden (z. B. wenn inhalierte Arzneimittel geprüft werden). Ist 
bekannt, dass ein Geschlecht empfindlicher auf eine bestimmte Prüfsubstanz reagiert, können die Geschlechter unterschiedlichen Konzentrationsstufen ausgesetzt werden, um die Konzentrations-Wirkungs-Beziehung genauer 
zu bestimmen (siehe Nummer 15). Wenn für eine „Nose-only“-Exposition 
andere Nagetierarten als Ratten verwendet werden, kann die maximale Ex ­
positionsdauer angepasst werden, um artenspezifisches Leiden zu minimie ­
ren. Eine Expositionsdauer von weniger als 6 Stunden/Tag oder die Not ­
wendigkeit einer Ganzkörperexpositionsstudie mit Langzeitexposition (z. B. 
22 Stunden/Tag) ist zu begründen (siehe GD 39 (2). Während der Exposi ­
tion sollte kein Futter verabreicht werden, es sei denn die Exposition dauert länger als 6 Stunden. Wasser kann während einer Ganzkörperexposition 
jederzeit angeboten werden.
 
15. Die gewählten Zielkonzentrationen sollen es ermöglichen, die Zielorgane zu 
identifizieren und eine deutliche Konzentrations-Wirkungs-Beziehung zu be ­
legen:  
— Die hohe Konzentrationsstufe sollte toxische Wirkungen hervorrufen, 
aber keine anhaltenden Symptome oder Todesfälle verursachen, die 
eine Auswertung der Ergebnisse beeinträchtigen würden.  
— Der Abstand zwischen den mittleren Konzentrationsstufen muss eine 
Abstufung der toxischen Wirkungen zwischen der niedrigen und der 
hohen Konzentration ermöglichen.  
— Die untere Konzentrationsstufe sollte praktisch keine Toxizitätszeichen 
hervorrufen.  
Tötungen im Verlauf der Studie  
16. Sollen im Verlauf des Versuchs Tiere getötet werden, so muss die Zahl der 
Tiere jeder Expositionsstufe um die Zahl der Tiere erhöht werden, die schon vor Versuchsende getötet werden sollen. Tötungen im Verlauf der Studie 
sind zu begründen und in den statistischen Analysen entsprechend zu be ­
rücksichtigen.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 425
 
Satellitenstudie (Reversibilität)  
17. Es kann eine Satellitenstudie durchgeführt werden, um die Tiere für einen 
angemessenen Zeitraum nach der Behandlung (mindestens 14 Tage) auf Reversibilität, Persistenz oder ein verzögertes Auftreten von Toxizität zu 
beobachten. Satellitengruppen bestehen aus zehn männlichen und zehn 
weiblichen Tieren, die der Prüfsubstanz gleichzeitig mit den Versuchstieren der Hauptstudie ausgesetzt werden. Dabei sollten sie der Prüfsubstanz auf der höchsten Konzentrationsstufe ausgesetzt werden, und erforderlichenfalls 
sollte es gleichzeitige Luft- und/oder Vehikelkontrollen geben (siehe Num ­
mer 18).
 
Kontrolltiere  
18. Eine gleichzeitige negative (Luft-)Kontrollgruppe ist genauso zu behandeln 
wie die Prüfgruppe, außer dass die Tiere nicht der Prüfsubstanz, sondern gefilterter Luft ausgesetzt werden. Wenn die Prüfatmosphäre mithilfe von Wasser oder einem anderen Stoff erzeugt wird, ist statt der negativen (Luft- 
)Kontrollgruppe eine Vehikelkontrollgruppe zu verwenden. Wenn möglich 
sollte Wasser als Vehikel benutzt werden. In diesem Fall sind die Tiere Luft mit derselben relativen Luftfeuchtigkeit auszusetzen wie die exponierten Gruppen. Das geeignete Vehikel ist auf der Grundlage einer geeigneten 
Vorstudie oder von historischen Daten auszuwählen. Ist die Toxizität eines 
Vehikels unklar, kann der Studienleiter beschließen, sowohl eine negative (Luft-)Kontrolle als auch eine Vehikelkontrolle zu verwenden; hiervon wird jedoch dringend abgeraten. Wenn historische Daten belegen, dass ein Ve ­
hikel nicht toxisch ist, besteht keine Notwendigkeit für eine negative (Luft- 
)Kontrollgruppe und es sollte nur eine Vehikelgruppe verwendet werden. Ergibt eine Vorstudie einer in einem Vehikel formulierten Prüfsubstanz, dass keine Toxizität vorliegt, ist das Vehikel folglich in der geprüften Konzen ­
tration nicht toxisch, und diese Vehikelkontrolle sollte verwendet werden.
 
EXPOSITIONSBEDINGUNGEN  
Verabreichung der Konzentrationen  
19. Die Tiere werden der Prüfsubstanz in Form von Gas, Dampf, Aerosol oder 
einer Kombination dieser Formen ausgesetzt. Der zu prüfende Aggregat ­
zustand hängt von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsub ­
stanz, den gewählten Konzentrationen und/oder der physikalischen Form ab, 
in der die Prüfsubstanz bei der Handhabung und Verwendung am wahr ­
scheinlichsten vorliegt. Hygroskopische und chemisch reaktive Prüfsubstan ­
zen sollten bei geringer Luftfeuchtigkeit geprüft werden. Dabei ist darauf zu 
achten, dass keine explosionsfähigen Konzentrationen erzeugt werden. Bei 
Partikeln kann die Partikelgröße durch mechanische Prozesse verringert werden. GD 39 (2) enthält nähere Hinweise.
 
Partikelgrößenverteilung  
20. Bei allen Aerosolen und bei Dämpfen, die zu Aerosolen kondensieren kön ­
nen, sollte die Partikelgröße bestimmt werden. Damit alle relevanten Regio ­
nen der Atemwege der Prüfsubstanz ausgesetzt werden, werden mittlere aerodynamische Massendurchmesser (Mass Median Aerodynamic Diameter 
— MMAD) von 1 bis 3 μm mit einer geometrischen Standardabweichung 
(σ
 g ) von 1,5 bis 3,0 empfohlen (4). Wenngleich nach Möglichkeit versucht 
werden sollte, diese Werte zu erreichen, ist Fachwissen erforderlich, falls sie nicht erzielt werden können. Metalldampfpartikel liegen z. B. unter diesen 
Werten, geladene Partikel und Fasern dagegen können diese Werte über ­
schreiten.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 426
 
Vorbereitung der Prüfsubstanz in einem Vehikel  
21. Im Idealfall sollte die Prüfsubstanz ohne ein Vehikel geprüft werden. Wenn 
für die Erzeugung einer geeigneten Prüfsubstanzkonzentration oder Partikel ­
größe ein Vehikel verwendet werden muss, ist Wasser zu bevorzugen. Wird 
eine Prüfsubstanz in einem Vehikel gelöst, so ist seine Stabilität nachzuwei ­
sen. 
ÜBERWACHUNG DER EXPOSITIONSBEDINGUNGEN  
Luftstrom in der Inhalationskammer  
22. Der Luftstrom durch die Kammer sollte während jeder Exposition sorgfältig 
geregelt, kontinuierlich überwacht und mindestens stündlich protokolliert werden. Die Echtzeit-Überwachung der Konzentration (oder zeitlichen Sta ­
bilität) der Prüfatmosphäre ist eine integrale Messung aller dynamischen 
Parameter und gibt indirekt die Möglichkeit, alle relevanten dynamischen 
Inhalationsparameter zu messen. Wenn die Konzentration in Echtzeit über ­
wacht wird, kann die Frequenz der Messung der Luftströme auf eine einzige Messung je Exposition und Tag reduziert werden. Es sollte besonders darauf 
geachtet werden, das erneute Einatmen in „Nose-only“-Expositionskammern 
zu vermeiden. Die Sauerstoffkonzentration sollte mindestens 19 % betragen, und die Kohlendioxidkonzentration sollte 1 % nicht überschreiten. Gibt es 
Grund zu der Annahme, dass diese Werte nicht eingehalten werden können, 
sind die Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen zu messen. Wenn die Messungen am ersten Expositionstag die richtigen Werte dieser Gase be ­
stätigen, sollten keine weiteren Messungen erforderlich sein.
 
Temperatur und relative Luftfeuchtigkeit in der Inhalationskammer  
23. Die Temperatur in der Inhalationskammer sollte 22 ± 3 °C betragen. Sowohl 
bei der „Nose-only“- als auch bei der Ganzkörperexposition sollte die rela ­
tive Luftfeuchtigkeit im Atembereich der Tiere kontinuierlich überwacht und während jeder Exposition möglichst stündlich dokumentiert werden. Die relative Luftfeuchtigkeit sollte möglichst zwischen 30 und 70 % liegen, 
was jedoch möglicherweise nicht erreichbar ist (z. B. bei der Prüfung von 
wasserbasierten Mischungen) oder wegen chemischer Interferenz mit der Prüfmethode nicht gemessen werden kann.
 
Prüfsubstanz: nominale Konzentration  
24. Die nominale Konzentration in der Expositionskammer sollte möglichst be ­
rechnet und protokolliert werden. Die nominale Konzentration ist die Masse 
der erzeugten Prüfsubstanz dividiert durch das Gesamtvolumen der durch 
die Inhalationskammer geleiteten Luft. Sie wird nicht zur Beschreibung der Exposition der Tiere verwendet; vielmehr gibt ein Vergleich der nominalen Konzentration und der tatsächlichen Konzentration Aufschluss über die Ef ­
fizienz des Prüfsystems bei der Erzeugung der Prüfkonzentration und kann 
daher für die Aufdeckung von Problemen bei dieser Erzeugung verwendet werden.
 
Prüfsubstanz: tatsächliche Konzentration  
25. Die tatsächliche Konzentration ist die Konzentration der Prüfsubstanz im 
Atembereich der Tiere in einer Inhalationskammer. Die tatsächlichen Kon ­
zentrationen können entweder durch spezifische Methoden (z. B. direkte 
Probenahme, adsorptive Methoden oder chemische Reaktionsverfahren mit anschließender analytischer Charakterisierung) oder durch unspezifische Me ­
thoden wie Gravimetrie bestimmt werden. Die gravimetrische Methode ist 
lediglich für Aerosole mit nur einem Bestandteil in Pulverform oder Aero ­
sole von Flüssigkeiten mit geringer Flüchtigkeit akzeptabel und sollte sich auf geeignete, vor der Studie zu erstellende und für die Prüfsubstanz spezi ­
fische Beschreibungen stützen. Die Konzentration von Aerosolen mit meh ­
reren Bestandteilen in Pulverform kann ebenfalls gravimetrisch bestimmt 
werden. Hierzu muss jedoch mit Analysedaten belegt werden, dass die
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Schwebstoffe eine ähnliche Zusammensetzung haben wie das Ausgangs ­
material. Liegen diese Angaben nicht vor, muss die Prüfsubstanz (im Ideal ­
fall im Schwebezustand) möglicherweise im Verlauf der Studie in regel ­
mäßigen Abständen neu analysiert werden. Bei aerosolisierten Agenzien, die verdunsten oder sublimieren können, sollte gezeigt werden, dass alle 
Phasen von der gewählten Methode erfasst wurden.
 
26. Für die gesamte Dauer der Studie sollte möglichst eine Partie der Prüfsub ­
stanz verwendet werden; die Probe sollte unter Bedingungen aufbewahrt werden, die ihre Reinheit, Homogenität und Stabilität gewährleisten. Die 
Prüfsubstanz sollte vor Beginn der Studie mit Angaben zur Reinheit und, 
falls technisch machbar, zur Identität sowie zu Mengen identifizierter Schad ­
stoffe und Verunreinigungen beschrieben werden. Hierzu können unter an ­
derem die folgenden Daten verwendet werden: Retentionszeit und relative 
Peakfläche, durch Massenspektrometrie oder Gaschromatographie bestimm ­
tes Molekulargewicht oder andere Werte. Das Prüflabor ist zwar nicht für die Identität der Probe verantwortlich, doch es kann ratsam sein, dass es die Beschreibung des Auftraggebers zumindest in gewissen Grenzen (z. B. Far ­
be, physikalische Beschaffenheit usw.) überprüft.
 
27. Die Expositionsatmosphäre ist so konstant wie möglich zu halten. Um die 
Stabilität der Expositionsbedingungen nachzuweisen, kann ein Echtzeitüber ­
wachungsgerät verwendet werden, z. B. ein Aerosol-Photometer für Aero ­
sole oder ein Gesamtkohlenwasserstoff-Analysator (THC) für Dämpfe. Die 
tatsächliche Konzentration in der Kammer sollte an jedem Expositionstag für jede Expositionsstufe mindestens dreimal gemessen werden. Falls dies 
wegen geringer Luftdurchflussraten oder niedriger Konzentrationen nicht 
möglich ist, reicht eine Probe je Expositionsperiode. Im Idealfall sollte diese Probe dann über die gesamte Expositionszeit gewonnen werden. Die einzel ­
nen Proben der Konzentration in der Kammer sollten bei Gasen und Dämp ­
fen nicht mehr als ± 10 % und bei Flüssig- oder Feststoffaerosolen nicht 
mehr als ± 20 % von der mittleren Kammerkonzentration abweichen. Die Zeit bis zum Erreichen eines Gleichgewichts in der Kammer (t
 95 ) ist zu 
berechnen und zu dokumentieren. Die Expositionsdauer erstreckt sich über 
den Zeitraum, in dem die Prüfsubstanz erzeugt wird. Dies schließt die Zeiten 
zur Erreichung des Gleichgewichts in der Kammer (t  95 ) und zum Abbau der 
Konzentrationen ein. GD 39 (2) enthält Hinweise zur Einschätzung von t  95 . 
28. Bei sehr komplexen Mischungen aus Gasen/Dämpfen und Aerosolen (z. B. 
Verbrennungsatmosphären und Prüfsubstanzen, die aus hierzu bestimmten 
Endverbraucherprodukten/-geräten gesprüht werden), kann sich jede Phase in einer Inhalationskammer anders verhalten. Daher sollte mindestens eine Indikatorsubstanz (Analyt), normalerweise der wichtigste Wirkstoff in der 
Mischung, von jeder Phase (Gas/Dampf und Aerosol) ausgewählt werden. 
Wenn die Prüfsubstanz eine Mischung ist, sollte die Analysekonzentration für die gesamte Mischung und nicht nur für den Wirkstoff oder die Indika ­
torsubstanz (Analyt) dokumentiert werden. Weitere Informationen zu tat ­
sächlichen Konzentrationen sind in GD 39 (2) zu finden.
 
Prüfsubstanz: Partikelgrößenverteilung  
29. Die Partikelgrößenverteilung von Aerosolen sollte auf jeder Konzentrations ­
stufe mindestens wöchentlich mit einem Kaskaden-Impaktor oder einem anderen Messgerät wie einem APS bestimmt werden. Kann nachgewiesen werden, dass die mit einem Kaskaden-Impaktor und dem alternativen Mess ­
gerät erzielten Ergebnisse gleichwertig sind, so kann das alternative Instru ­
ment während der gesamten Studie verwendet werden.
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30. Parallel zum Hauptinstrument ist ein zweites Gerät wie ein Gravimetriefilter 
oder eine Gaswaschflasche zu verwenden, um den Abscheidegrad des 
Hauptinstruments zu bestätigen. Die durch die Partikelgrößenanalyse be ­
stimmte Massenkonzentration sollte innerhalb vertretbarer Grenzen um die durch die Filteranalyse bestimmte Massenkonzentration liegen [siehe GD 39 
(2)]. Wenn die Gleichwertigkeit bei allen geprüften Konzentrationen zu 
Beginn der Studie nachgewiesen werden kann, kann auf weitere bestäti ­
gende Messungen verzichtet werden. Aus Tierschutzgründen sollten Vor ­
kehrungen getroffen werden, um unklare Daten zu minimieren, die dazu 
führen könnten, dass eine Exposition wiederholt werden muss.
 
31. Wenn die Möglichkeit besteht, dass Dampfkondensation zur Bildung eines 
Aerosols führen kann, oder wenn in einer Dampfatmosphäre mit dem Po ­
tenzial für gemischte Phasen Partikel nachgewiesen werden, sollte eine Par ­
tikelgrößenbestimmung für Dämpfe vorgenommen werden.  
BEOBACHTUNGEN  
32. Die Tiere sollten vor, während und nach der Exposition auf klinische Zei ­
chen beobachtet werden. Je nach Reaktion der Tiere während der Exposition 
können häufigere Beobachtungen angezeigt sein. Wenn die Beobachtung der 
Tiere durch die Verwendung von Restrainern, wegen schlecht beleuchteter Ganzkörperkammern oder getrübter Atmosphäre erschwert ist, sind die Tiere nach der Exposition sorgfältig zu beobachten. Durch Beobachtungen vor der 
Exposition am folgenden Tag kann beurteilt werden, ob toxische Wirkungen 
sich zurückgebildet oder verschlimmert haben.
 
33. Sämtliche Beobachtungen werden in Einzelprotokollen dokumentiert, die für 
jedes Tier geführt werden. Wenn Tiere aus humanen Gründen getötet wer ­
den oder ihr Tod festgestellt wird, sollte der Todeszeitpunkt so genau wie 
möglich registriert werden.  
34. Die Beobachtungen der Tiere sollten sich insbesondere auf Veränderungen 
an Haut, Fell, Augen, Schleimhäuten, des Atmungs- und Kreislaufsystems, des Nervensystems sowie auf Somatomotorik und Verhaltensmuster erstre ­
cken. Besonderes Augenmerk ist auf Tremor, Konvulsionen, Salivation, 
Diarrhö, Lethargie, Schlaf und Koma zu richten. Die Messung der Rektal ­
temperatur kann zusätzliche Belege für mit der Behandlung oder Unterbrin ­
gung zusammenhängende Reflex-Bradypnoe oder Hypo-/Hyperthermie lie ­
fern. Darüber hinaus können zusätzliche Aspekte wie Kinetik, Biomonito ­
ring, Lungenfunktion, Retention schlecht löslicher Stoffe, die im Lungenge ­
webe akkumulieren, und Verhaltensstörungen in das Studienprotokoll auf ­
genommen werden.
 
KÖRPERGEWICHT  
35. Das Körpergewicht der einzelnen Tiere sollte kurz vor der ersten Exposition 
(Tag 0), danach zweimal wöchentlich (z. B. freitags und montags, um die 
Erholung während eines expositionsfreien Wochenendes nachzuweisen, oder 
in einem Zeitintervall, das die Beurteilung der systemischen Toxizität er ­
möglicht) und zum Zeitpunkt des Todes oder der Tötung dokumentiert werden. Treten in den ersten vier Wochen keine Wirkungen auf, kann das 
Körpergewicht während der restlichen Studiendauer wöchentlich gemessen 
werden. Satellitentiere (Reversibilitätsprüfung) (falls verwendet) sollten wäh ­
rend der gesamten Erholungsphase weiterhin wöchentlich gewogen werden. Am Ende der Studie sollten alle Tiere kurz vor der Tötung gewogen wer ­
den, um eine objektive Berechnung der Organ-Körpergewicht-Verhältnisse 
zu ermöglichen.
 
FUTTER- UND WASSERAUFNAHME  
36. Die Futteraufnahme sollte wöchentlich gemessen werden. Auch die Wasser ­
aufnahme kann gemessen werden.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 429
 
KLINISCHE PATHOLOGIE  
37. An allen Tieren, auch an Kontroll- und Satellitentieren (Reversibilitätsprü ­
fung) sollten klinische Pathologieuntersuchungen durchgeführt werden, wenn sie getötet werden. Der Zeitraum zwischen dem Ende der Exposition 
und der Blutentnahme ist zu protokollieren, insbesondere wenn der betref ­
fende Endpunkt rasch zu seinem ursprünglichen Wert zurückkehrt. Für Pa ­
rameter mit einer kurzen Plasmahalbwertszeit (z. B. COHb, CHE und MetHb) ist die Probenahme nach Ende der Exposition angezeigt.
 
38. In Tabelle 1 sind die im Allgemeinen für alle Toxikologiestudien erforder ­
lichen klinischen Pathologieparameter aufgeführt. In der Regel ist eine Urin ­
analyse nicht notwendig, kann aber durchgeführt werden, wenn sie wegen erwarteter oder festgestellter Toxizität für nützlich gehalten wird. Der Stu ­
dienleiter kann beschließen, zusätzliche Parameter zu bestimmen, um die 
Toxizität einer Prüfsubstanz genauer zu beschreiben (z. B. Cholinesterase, 
Lipide, Hormone, Säure-Basen-Gleichgewicht, Methämoglobin oder Heinz-Körper, Creatin-Kinase, Verhältnis von myeloiden zu erythroiden 
Zellen, Troponin, arterielle Blutgase, Lactatdehydrogenase, Sorbitdehydro ­
genase, Glutamatdehydrogenase und γ-Glutamyltranspeptidase).
 
Tabelle 1  
Klinische Standardpathologieparameter  
Hämatologische Untersuchung  
Erythrozytenzahl 
Hämatokrit Hämoglobinkonzentration 
Mittleres korpuskuläres Hämoglobin 
Mittleres Erythrozyteneinzelvolumen Mittlere korpuskuläre Hämoglobinkon ­
zentration 
Retikulozyten Gesamtleukozytenzahl 
Differentialleukozytenzahl Thrombozytenzahl 
Gerinnungsfähigkeit (einen Wert 
wählen): 
— Prothrombinzeit — Blutgerinnungszeit 
— Partielle Thromboplastinzeit
 
Klinische Chemie  
Glucose (*) 
Gesamtcholesterin 
Triglyceride Harnstoff-N Gesamtbilirubin 
Kreatinin 
Gesamteiweiß Albumin 
Globulin Alanin-Aminotransferase 
Aspartat-Aminotransferase 
Alkalische Phosphatase Kalium Natrium 
Calcium 
Phosphor Chlorid
 
Urinuntersuchung (fakultativ)  
Aussehen (Farbe und Trübung) 
Menge 
Spezifisches Gewicht oder Osmolarität 
pH-Wert Gesamtprotein 
Glucose 
Blut/Blutzellen  
(*) Da ein längerer Futterentzug die Glucosemessungen bei den behandelten gegen ­
über den Kontrolltieren verzerren kann, sollte der Studienleiter entscheiden, ob 
eine Futterkarenz angezeigt ist. Die Dauer des Futterentzugs muss auf die ver ­
wendete Art abgestimmt sein; bei der Ratte kann sie 16 Stunden betragen (nächt ­
liche Futterkarenz). Der Nüchternglucosewert kann nach nächtlicher Futterkarenz 
in der letzten Expositionswoche oder nach nächtlicher Futterkarenz vor der Nek ­
ropsie (in letzterem Fall zusammen mit allen anderen klinischen Pathologiepara ­
metern) bestimmt werden.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 430
 
39. Gibt es Anhaltspunkte dafür, dass die unteren Atemwege (d. h. die Alveo ­
len) die Hauptablagerungs- und Retentionsorte sind, kann die bronchoalveo ­
läre Lavage (BAL) die Methode der Wahl sein, um hypothesenbasierte Dosis-Wirkungs-Parameter quantitativ zu analysieren, wobei Alveolitis, Lungenentzündung und Phospholipidose im Vordergrund stehen. Auf diese 
Weise können Veränderungen der Dosis-Wirkungs-Beziehung und des zeit ­
lichen Verlaufs alveolärer Läsionen angemessen untersucht werden. Die BAL-Flüssigkeit kann auf Gesamt- und Differenzialleukozytenzahl, Gesamt ­
protein und Laktatdehydrogenase analysiert werden. In Betracht gezogen 
werden können auch Parameter, die auf lysosomale Schäden, Phospholipi ­
dose, Fibrose und reizende oder allergische Entzündung hindeuten; dazu kann auch die Bestimmung entzündungsfördernder Zytokine/Chemokine ge ­
hören. BAL-Messungen dienen im Allgemeinen zur Ergänzung der Ergeb ­
nisse histopathologischer Untersuchungen, können sie aber nicht ersetzen. 
GD 39 (2) enthält eine Anleitung zur Durchführung der Lungenlavage.
 
OPHTHALMOLOGISCHE UNTERSUCHUNG  
40. Mit einem Ophthalmoskop oder einem gleichwertigen Gerät werden vor der 
Verabreichung der Prüfsubstanz bei allen Tieren und nach Abschluss der Prüfung bei allen Hochkonzentrations- und Kontrollgruppen der Augenhin ­
tergrund, die brechenden Medien, die Iris und die Bindehaut untersucht. 
Werden Veränderungen der Augen festgestellt, sind alle Tiere in den ande ­
ren Gruppen, einschließlich der Satellitengruppe (Reversibilität) ebenfalls zu untersuchen.
 
MAKROSKOPISCHE PATHOLOGIE UND ORGANGEWICHTE  
41. Alle Versuchstiere, einschließlich der Tiere, die während der Prüfung ster ­
ben oder aus Tierschutzgründen getötet und aus der Studie genommen wer ­
den, sind (falls möglich) vollständig zu entbluten und auf makroskopische 
Veränderungen zu untersuchen. Der Zeitabstand zwischen dem Ende der letzten Exposition des Tiers und seiner Tötung ist zu dokumentieren. Kann die Nekropsie nicht unmittelbar nach Auffinden eines toten Tieres 
erfolgen, sollte der Körper auf eine Temperatur gekühlt (nicht eingefroren) 
werden, die tief genug ist, um die Autolyse zu minimieren. Die Nekropsie ist baldmöglichst, in der Regel innerhalb von einem oder zwei Tagen durch ­
zuführen. Alle makroskopischen Veränderungen sollten für jedes Tier pro ­
tokolliert werden, wobei besonders auf Veränderungen der Atemwege zu 
achten ist.
 
42. In Tabelle 2 sind die Organe und Gewebe aufgeführt, die bei der Sektion 
zur histopathologischen Untersuchung in einem geeigneten Medium auf ­
bewahrt werden sollten. Die Aufbewahrung der in  [Klammern ] gesetzten 
Organe und Gewebe sowie aller sonstigen Organe und Gewebe liegt im 
Ermessen des Studienleiters. Die durch  Fettdruck  hervorgehobenen Organe 
sind so bald wie möglich nach der Sektion von anhaftendem Gewebe zu befreien und feucht zu wiegen, um ein Austrocknen zu verhindern. Die 
Schilddrüse und die Nebenhoden sind nur zu wiegen, wenn dies notwendig 
ist, da ihre Befreiung von anhaftendem Gewebe die histopathologische Be ­
wertung erschweren kann. Gewebe und Organe sind unmittelbar nach der Nekropsie und je nach verwendetem Fixierungsmittel mindestens 24-48 
Stunden vor der Befreiung von anhaftendem Gewebe in 10 %ig gepuffertem 
Formalin oder einem anderen geeigneten Fixierungsmittel zu fixieren.
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Tabelle 2  
Bei der Nekropsie aufbewahrte Organe und Gewebe  
Nebennieren  
Aorta  
Knochenmark (und/oder frisches Aspirat)  
Gehirn  (mit Schnitten von Cerebrum, Cere ­
bellum und Medulla/Pons)  
Caecum  
Kolon  
Duodenum  
[Nebenhoden ] 
[Augen (Netzhaut, Sehnerv) und Lider]  
Femur und Kniegelenk  
Gallenblase (falls vorhanden)  
[Hardersche Drüsen]  
Herz  
Ileum  
Jejunum  
Nieren  
[Tränendrüsen (extraorbital)]  
Larynx (3 Ebenen einschließlich der Basis der 
Epiglottis)  
Leber  
Lunge  (alle Lungenlappen auf einer Ebene, 
einschließlich der Hauptbronchien)  
Lymphknoten aus der Hilusregion der Lunge, 
insbesondere bei schlecht löslichen Prüfsub ­
stanzen, die in Partikelform vorliegen. Für 
gründlichere Untersuchungen und/oder Stu ­
dien mit immunologischem Schwerpunkt können zusätzliche Lymphknoten in Betracht gezogen werden, z. B. aus der mediastinalen, 
der cervicalen/submandibulären und/oder der 
aurikularen Region.
 
Lymphknoten (distal vom Eingangsort)  
Brustdrüsen (weibliche)  
Muskel (Oberschenkel)  
Nasopharyngeale Gewebe (mindestens 4 Ebe ­
nen; 1 Ebene muss den Nasen-Rachen-Gang und das Lymphgewebe des Nasen-Rachen- Raums (NALT) umfassen.
 Speiseröhre  
[Riechkolben]  
Ovarien  
Pankreas  
Nebenschilddrüsen  
Periphere Nerven (N. ischiadicus oder N. 
tibialis, vorzugsweise in der Nähe des Mus ­
kels)  
Hypophyse  
Prostata  
Rectum  
Speicheldrüsen  
Samenbläschen  
Haut  
Rückenmark (zervical, mittlerer Thorax ­
bereich und lumbar)  
Milz  
Brustbein  
Magen  
Zähne  
Hoden  
Thymus  
Schilddrüse  
[Zunge]  
Trachea (mindestens 2 Ebenen mit einem 
Längsschnitt durch die Carina und 1 Quer ­
schnitt)  
[Harnleiter]  
[Harnröhre]  
Harnblase  
Uterus  
Zielorgane  
Alle makroskopischen Läsionen und Massen  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 432
 
43. Die Lungen sind in intaktem Zustand zu entfernen, zu wiegen und mit 
einem geeigneten Fixierungsmittel bei einem Druck von 20-30 cm Wasser 
zu behandeln, damit die Lungenstruktur erhalten bleibt (5). Die Schnitte werden bei allen Lungenlappen auf einer Ebene einschließlich der Haupt ­
bronchien hergestellt; wenn eine Lungenlavage durchgeführt wird, ist der 
nicht gewaschene Lappen jedoch auf drei Ebenen zu schneiden (keine se ­
riellen Schnitte).
 
44. Mindestens vier Ebenen der nasopharyngealen Gewebe sind zu untersuchen; 
eine der Ebenen sollte den Nasen-Rachen-Gang umfassen (5, 6, 7, 8, 9), damit das Plattenepithel, das (nicht Zilien-tragende respiratorische) Über ­
gangsepithel, das (Zilien-tragende respiratorische) Flimmerepithel und das 
Riechepithel sowie das Lymphgewebe (NALT; 10,11) gründlich untersucht werden können. Drei Ebenen des Larynx sind zu untersuchen; eine dieser Ebenen sollte die Basis der Epiglottis enthalten (12). Mindestens zwei Ebe ­
nen der Trachea sind zu untersuchen, darunter ein Längsschnitt durch die 
Carina der Bifurkation der extrapulmonalen Bronchien und ein Querschnitt.
 
HISTOPATHOLOGIE  
45. Die in Tabelle 2 aufgeführten Organe und Gewebe der Tiere in der Kontroll ­
gruppe und der Gruppe mit der höchsten Konzentration und aller während der Studie gestorbenen oder getöteten Tiere sollten histopathologisch unter ­
sucht werden. Besonderes Augenmerk ist auf Atemwege, Zielorgane und 
makroskopische Veränderungen zu richten. Die Organe und Gewebe, die in der Gruppe mit der höchsten Konzentration makroskopische Veränderungen aufweisen, sollten in allen Gruppen untersucht werden. Der Studienleiter 
kann beschließen, histopathologische Untersuchungen bei zusätzlichen 
Gruppen durchzuführen, um eine eindeutige Konzentrationswirkung nach ­
zuweisen. Umfasst eine Prüfung auch eine Satellitengruppe (Reversibilitäts ­
prüfung), sind alle Gewebe und Organe histopathologisch zu untersuchen, 
bei denen in den Behandlungsgruppen Wirkungen aufgetreten sind. Treten 
in der Gruppe mit der höchsten Konzentration übermäßig viele frühzeitige Todesfälle oder andere Probleme auf, die die Signifikanz der Daten beein ­
trächtigen, so ist die nächstniedrigere Konzentration histopathologisch zu 
untersuchen. Man sollte versuchen, die makroskopischen Befunde mit den 
Ergebnissen der mikroskopischen Untersuchung zu korrelieren.
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Daten  
46. Körpergewichte, Futteraufnahme, Ergebnisse der klinischen Pathologie, ma ­
kroskopische Befunde, Organgewichte und Ergebnisse der Histopathologie sind für die einzelnen Tiere anzugeben. Die Daten der klinischen Beobach ­
tung sollten in tabellarischer Form zusammengefasst werden. Daraus müssen 
für jede Prüfgruppe die Anzahl der verwendeten Tiere, die Anzahl der Tiere 
mit spezifischen Toxizitätszeichen, die Anzahl der Tiere, die während der Prüfung tot aufgefunden oder vorzeitig getötet wurden, der Todeszeitpunkt der einzelnen Tiere, eine Beschreibung und der zeitliche Verlauf der toxi ­
schen Wirkungen und deren Reversibilität sowie die Sektionsbefunde er ­
sichtlich sein. Sowohl die quantitativen als auch die gelegentlich erzielten Ergebnisse sind anhand eines geeigneten statistischen Verfahrens zu bewer ­
ten. Hierzu ist eine allgemein anerkannte Statistikmethode heranzuziehen; 
die Statistikmethoden sind bei der Auslegung der Studie festzulegen.
 
Prüfbericht  
47. Der Prüfbericht sollte, soweit zutreffend, die folgenden Informationen ent ­
halten:  
Versuchstiere und Tierhaltung  
— Beschreibung der Haltungsbedingungen mit Angaben zu Anzahl (oder 
Veränderung der Anzahl) der Tiere je Käfig, Einstreu, Umgebungstem ­
peratur und relativer Luftfeuchtigkeit, Photoperiode und Futter,  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 433
 
— Art/Stamm und Begründung für die Verwendung einer anderen Art als 
der Ratte; Daten zur Herkunft der Tiere und historische Daten können 
angegeben werden, wenn sie Tiere mit ähnlichen Expositions-, Unterbringungs- und Futterkarenzbedingungen betreffen,
 
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere,  
— Randomisierungsmethode,  
— Beschreibung etwaiger Vorbereitung vor der Prüfung, einschließlich Er ­
nährung, Quarantäne und Behandlung von Krankheiten.  
Prüfsubstanz  
— physikalische Beschaffenheit, Reinheit und, wenn maßgeblich, 
physikalisch-chemische Eigenschaften (einschließlich Isomerisierung),  
— Angaben zur Identifikation und CAS-Nummer (Chemical Abstract Ser ­
vices), falls bekannt.  
Vehikel  
— Begründung für die Verwendung eines Vehikels sowie für die Wahl des 
Vehikels (falls nicht Wasser),  
— historische oder parallel erzeugte Daten, die belegen, dass das Vehikel 
keinen Einfluss auf das Ergebnis der Studie hat.  
Inhalationskammer  
— ausführliche Beschreibung der Inhalationskammer mit Angabe des Vo ­
lumens sowie ein Diagramm,  
— Herkunft und Beschreibung der für die Exposition der Tiere sowie für 
die Erzeugung der Atmosphäre verwendeten Ausrüstung,  
— Ausrüstung für die Messung von Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Partikel ­
größe und tatsächlicher Konzentration,  
— Herkunft der Luft und Klimatisierungssystem,  
— für die Kalibrierung der Ausrüstung verwendete Methoden, um eine 
homogene Prüfatmosphäre sicherzustellen,  
— Druckunterschied (positiv oder negativ),  
— Expositions-Öffnungen je Kammer („Nose-only“-Exposition); Anord ­
nung der Tiere in der Kammer (Ganzkörperexposition),  
— Stabilität der Prüfatmosphäre,  
— Lage von Temperatur- und Feuchtigkeitssensoren und Ort der Pro ­
benahme der Prüfatmosphäre in der Kammer,  
— Behandlung der zugeführten/entzogenen Luft,  
— Luftdurchflussraten, Luftdurchflussrate/Expositions-Öffnung („Nose-on ­
ly“-Exposition) oder Anzahl der Tiere je Kammer (Ganzkörperexpositi ­
on), 
— Zeit bis zum Erreichen des Gleichgewichts in der Inhalationskammer 
(t 95 ), 
— Zahl der Volumenänderungen pro Stunde,  
— Messgeräte (falls zutreffend).  
Expositionsdaten  
— Begründung für die Wahl der Zielkonzentration in der Hauptstudie,  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 434
 
— nominale Konzentrationen (Gesamtmasse der in die Inhalationskammer 
eingeleiteten Prüfsubstanz dividiert durch das Volumen der durch die 
Kammer geleiteten Luft),  
— im Atembereich der Tiere ermittelte tatsächliche Konzentrationen der 
Prüfsubstanz; bei Gemischen mit heterogenen physikalischen Formen 
(Gase, Dämpfe, Aerosole) kann jede Form getrennt analysiert werden,  
— alle Luftkonzentrationen sollten in Masseneinheiten (z. B. mg/l, mg/m  3 
usw.) und nicht in Volumeneinheiten (z. B. ppm, ppb usw.) angegeben 
werden,  
— Partikelgrößenverteilung, mittlerer aerodynamischer 
Massendurchmesser (MMAD) und geometrische Standardabweichung 
(σg), einschließlich der Berechnungsmethoden. Einzelne Partikelgrößen ­
analysen sind zu protokollieren.  
Prüfbedingungen  
— Angaben zur Vorbereitung der Prüfsubstanz, einschließlich Angaben zu 
den Verfahren zur Reduzierung der Partikelgröße von Feststoffen oder 
zur Herstellung von Lösungen der Prüfsubstanz,  
— eine Beschreibung (möglichst mit Diagramm) der Ausrüstung, die zur 
Erzeugung der Prüfatmosphäre und zur Exposition der Tiere gegen die 
Prüfatmosphäre verwendet wurde,  
— Angaben zur Ausrüstung, die für die Überwachung von Temperatur, 
Luftfeuchtigkeit und Luftstrom in der Kammer verwendet wird (Erstel ­
lung einer Kalibrationskurve),  
— Angaben zur Ausrüstung, mit der die Proben zur Bestimmung der Kon ­
zentration in der Kammer und der Partikelgrößenverteilung genommen werden,
 
— Angaben zur verwendeten chemischen Analysemethode und zur Validie ­
rung der Methode (einschließlich der Effizienz der Wiederfindung der Prüfsubstanz im Medium),
 
— Randomisierungsmethode für die Einteilung der Tiere in Prüf- und Kon ­
trollgruppen,  
— Angaben über Futter- und Wasserqualität (einschließlich Art/Herkunft 
des Futters, Wasserquelle),  
— Begründung für die Wahl der Prüfkonzentrationen.  
Ergebnisse  
— tabellarische Darstellung von Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Luft ­
strom in der Kammer,  
— tabellarische Darstellung von Daten zur nominalen und tatsächlichen 
Konzentration in der Kammer,  
— tabellarische Darstellung der Partikelgrößendaten einschließlich Daten 
zur analytischen Probenahme, Partikelgrößenverteilung und Berechnung 
des MMAD und der σ g , 
— tabellarische Erfassung der erhobenen Daten und der Konzentration für 
jedes einzelne Tier (d. h. Tiere, die Anzeichen für Toxizität zeigen, 
einschließlich Mortalität, sowie Art, Schweregrad, Zeitpunkt des Einset ­
zens und Dauer der Wirkungen),  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 435
 
— tabellarische Darstellung des Körpergewichts der einzelnen Tiere,  
— tabellarische Darstellung der Futteraufnahme,  
— tabellarische Darstellung der klinischen Pathologieparameter,  
— Sektionsbefunde und histopathologische Ergebnisse für jedes einzelne 
Tier, falls vorhanden.  
Diskussion und Auswertung der Ergebnisse  
— Besondere Aufmerksamkeit sollte der Beschreibung der Methoden gel ­
ten, die verwendet wurden, um die Kriterien dieser Prüfmethode zu erfüllen, z. B. die Grenzkonzentration oder die Partikelgröße.
 
— Die Lungengängigkeit von Partikeln vor dem Hintergrund der Gesamt ­
befunde sollte behandelt werden, insbesondere, wenn die Partikelgrößen ­
kriterien nicht erfüllt werden konnten.  
— Die Kohärenz der Methoden zur Bestimmung der nominalen und der 
tatsächlichen Konzentration sowie die Beziehung der tatsächlichen Kon ­
zentration zur nominalen Konzentration sind in die Gesamtbewertung 
der Studie aufzunehmen.  
— Die wahrscheinliche Todesursache und die vorherrschende Wirkungs ­
weise (systemisch oder lokal) sollten behandelt werden.  
— Falls Tiere, die unter Schmerzen litten oder Zeichen für schweres und 
anhaltendes Leiden aufwiesen, auf humane Weise getötet werden muss ­
ten, ist eine Erklärung auf der Grundlage der Kriterien im OECD Gui ­
dance Document on Humane Endpoints (3) zu geben.  
— Die Zielorgane sollten identifiziert werden.  
— Der NOAEL und der LOAEL sollten bestimmt werden.  
LITERATUR:  
1. OECD (1981).  Subchronic Inhalation Toxicity Testing , Original Test Guide ­
line No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2. OECD (2009).  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing,  
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.  
3. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
4. Whalan E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Pro ­
grams, United States Environmental Protection Agency.  
5. Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in  Toxicology of Inhaled 
Material,  Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
pp. 229-258.  
6. Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.  
7. Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labora ­
tory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231- 
238. ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 436
 
8. Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in hu ­
mans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
 
9. Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal dia ­
grams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
 
10. Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn 
AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal 
lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.  
11. Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lym ­
phoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.  
12. Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419-428.  
13. Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 des Europäischen Parlaments und des Rates 
vom 16. Dezember 2008 über die Einstufung, Kennzeichnung und Ver ­
packung von Stoffen und Gemischen, zur Änderung und Aufhebung der 
Richtlinien 67/548/EWG und 1999/45/EG und zur Änderung der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 (ABl. L 353 vom 31.12.2008, S. 1).
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 437
 
Anlage 1  
DEFINITION  
Prüfsubstanz:  jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode 
getestet wird.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 438
 
B.30  PRÜFUNGEN AUF CHRONISCHE TOXIZITÄT  
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 452 (2009). Die 
ursprüngliche TG 452 wurde 1981 angenommen. Die Entwicklung dieser 
überarbeiteten Prüfmethode B.30 wurde für notwendig gehalten, um neueren 
Entwicklungen auf dem Gebiet des Tierschutzes sowie Regulierungsanfor ­
derungen Rechnung zu tragen (1) (2) (3) (4). Diese Prüfmethode B.30 wurde parallel zur Überarbeitung von Kapitel B.32 dieses Anhang „Prüfun ­
gen auf Kanzerogenität“ und Kapitel B.33 dieses Anhangs „Kombinierte 
Studien zur Prüfung auf chronische Toxizität und Kanzerogenität“ aktuali ­
siert mit dem Ziel, zusätzliche Informationen von den in der Untersuchung verwendeten Tieren und detailliertere Angaben zur Wahl der Dosis zu ge ­
winnen. Diese Prüfmethode ist dazu ausgelegt, für die Prüfung eines breiten 
Spektrums von chemischen Stoffen, einschließlich Pestiziden und Industrie ­
chemikalien, verwendet zu werden.
 
2. Bei den meisten Prüfungen auf chronische Toxizität werden Nagetierarten 
verwendet; diese Prüfmethode gilt daher hauptsächlich für Prüfungen an 
diesen Arten. Wenn solche Prüfungen an Nichtnagern erforderlich sind, können die in dieser Prüfmethode beschriebenen Grundsätze und Verfahren in Kombination mit denen des Kapitels B.27 dieses Anhangs „Prüfung auf 
subchronische orale Toxizität — 90-Tage-Toxizitätsstudie mit wiederholter 
Verabreichung an Nicht-Nagetieren“ (5), mit entsprechenden Änderungen, wie im OECD Guidance Document No. 116 on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (6) beschrieben, ebenfalls 
angewendet werden.
 
3. Bei Prüfungen auf chronische Toxizität finden im Wesentlichen die orale, 
die dermale und die inhalative Verabreichung Anwendung. Die Wahl des Verabreichungswegs hängt von den physikalischen und chemischen Eigen ­
schaften der Prüfsubstanz und der vorherrschenden Art der Exposition beim 
Menschen ab. Zusätzliche Informationen zur Wahl des Expositionswegs sind im OECD Guidance Document No. 116 (6) enthalten.
 
4. Bei dieser Prüfmethode steht die Exposition auf oralem Weg im Vorder ­
grund. Dies ist der bei Prüfungen auf chronische Toxizität am häufigsten 
verwendete Expositionsweg. Zwar sind Prüfungen auf Langzeittoxizität mit Exposition über die Haut oder durch Inhalation möglicherweise auch not ­
wendig, um das Risiko für die menschliche Gesundheit zu beurteilen, und/ 
oder im Rahmen bestimmter Regelungen vorgeschrieben, aber diese beiden 
Expositionswege sind aus technischer Sicht außerordentlich komplex. Der ­
artige Prüfungen sind von Fall zu Fall zu konzipieren, wobei die hier be ­
schriebene Prüfmethode für die Bewertung und Evaluierung chronischer 
Toxizität bei oraler Verabreichung allerdings mit Bezug auf Empfehlungen 
für Behandlungszeiten, klinische und Pathologieparameter usw. als Grund ­
lage für ein Protokoll für Inhalations- und/oder dermale Prüfungen dienen könnte. Es gibt OECD-Leitlinien für die Verabreichung von Prüfsubstanzen 
durch Inhalation (6) (7) und über die Haut (6). Bei der Konzeption länger 
dauernder Prüfungen mit Exposition durch Inhalation sind insbesondere Kapitel B.8 dieses Anhangs (8) und Kapitel B.29 dieses Anhangs (9) sowie das OECD Guidance Document über Prüfungen auf akute Toxizität nach 
Inhalation (7) zu berücksichtigen. Bei Prüfungen mit dermaler Applikation 
ist Kapitel B.9 dieses Anhangs (10) zu beachten.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 439
 
5. Die Prüfung auf chronische Toxizität liefert Informationen über mögliche 
gesundheitliche Schädigungen, die durch wiederholte Exposition über einen 
beträchtlichen Teil der Lebensdauer der verwendeten Art entstehen können. Sie liefert Informationen über die toxischen Wirkungen der Prüfsubstanz und gibt Hinweise auf Zielorgane und die Möglichkeit der Akkumulation. 
Außerdem kann sie zur Ableitung eines NOAEL-Werts (Dosis ohne be ­
obachtete schädigende Wirkung) beitragen, der zur Festlegung von Sicher ­
heitskriterien für die Humanexposition herangezogen werden kann. Ferner wird die Notwendigkeit sorgfältiger klinischer Beobachtung der Tiere her ­
vorgehoben, damit so viele Informationen wie möglich gewonnen werden 
können.
 
6. Zu den Zielen von Prüfungen nach dieser Prüfmethode gehören  
— die Feststellung der chronischen Toxizität einer Prüfsubstanz,  
— die Identifizierung von Zielorganen,  
— die Beschreibung der Dosis-Wirkungs-Beziehung,  
— die Bestimmung eines NOAEL-Werts (Dosis ohne beobachtete schädi ­
gende Wirkung) oder eines Ausgangspunkts für die Festlegung einer 
Benchmark-Dosis (BMD),  
— die Vorhersage der Wirkungen chronischer Toxizität beim Expositions ­
niveau von Menschen,  
— die Gewinnung von Daten zur Prüfung von Hypothesen über die Wir ­
kungsweise (6).  
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN  
7. Bei der Beurteilung und Bewertung der toxikologischen Eigenschaften einer 
Prüfsubstanz sollte das Prüflabor vor Durchführung der Studie alle verfüg ­
baren Informationen über die Prüfsubstanz berücksichtigen, damit die Stu ­
dienauslegung auf eine effizientere Prüfung des Potenzials für chronische 
Toxizität ausgerichtet und die Verwendung von Versuchstieren minimiert 
werden kann. Für die Auslegung der Studie könnten u. a. Informationen wie die Identität, die chemische Struktur und die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, sämtliche Informationen über die Wirkungs ­
weise, Ergebnisse jeglicher In-vitro- oder In-vivo-Toxizitätsprüfungen, vor ­
gesehene Verwendungen und die Möglichkeit der Exposition des Menschen, (Q)SAR-Daten und toxikologische Daten über strukturverwandte Substanzen, toxikokinetische Daten (Kinetik bei Einzel- und Mehrfachdo ­
sierung) sowie Daten aus anderen Studien mit wiederholter Exposition he ­
rangezogen werden. Die chronische Toxizität sollte erst bestimmt werden, wenn erste Informationen über die Toxizität aus Toxizitätsprüfungen mit wiederholter Gabe über 28 Tage und/oder 90 Tage vorliegen. Im Rahmen 
der Gesamtbewertung der potenziellen schädlichen Wirkungen einer be ­
stimmten Prüfsubstanz auf die Gesundheit sollte bei der Prüfung auf chro ­
nische Toxizität etappenweise vorgegangen werden (11) (12) (13) (14).
 
8. Vor Beginn der Prüfung ist festzulegen, welche Statistikmethoden ange ­
sichts der Versuchsauslegung und der Ziele am besten für die Analyse der Ergebnisse geeignet sind. Dabei ist unter anderem festzulegen, ob bei der statistischen Auswertung Anpassungen in Bezug auf die Überlebensrate zu 
berücksichtigen sind und welche Art der Analyse bei vorzeitigem Tod der 
Tiere einer oder mehrerer Gruppen durchzuführen ist. Hinweise zu den geeigneten statistischen Analysen und wichtige Literaturverweise zu interna ­
tional anerkannten Statistikmethoden sind im Guidance Document No. 116 
(6) sowie im Guidance Document No. 35 on the analysis and evaluation of 
chronic toxicity and carcinogenicity studies (15) zu finden.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 440
 
9. Bei der Durchführung einer Prüfung auf chronische Toxizität sind stets die 
im OECD Guidance Document No. 19 on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation (16), insbesondere in Absatz 62, genannten Grundsätze und Erwägungen zu befolgen. In diesem Absatz heißt es:  Wenn ein Tier 
in Studien mit wiederholter Verabreichung progressive klinische Anzeichen 
für eine fortschreitende Verschlechterung seines Zustands aufweist, ist eine informierte Entscheidung zu treffen, ob das Tier tierschutzgerecht getötet werden sollte oder nicht. Bei dieser Entscheidung sind Faktoren wie der 
Wert der Informationen, die bei Verbleiben des Tiers in der Studie gewon ­
nen werden können, und der allgemeine Gesundheitszustand des Tiers ge ­
geneinander abzuwägen. Wird beschlossen, das Tier in der Studie zu be ­
lassen, ist es entsprechend den Erfordernissen häufiger zu beobachten. Zur 
Linderung von Schmerzen oder Qualen kann auch die Verabreichung der 
Prüfsubstanz unterbrochen oder die Dosis verringert werden, sofern dabei der Zweck der Prüfung nicht beeinträchtigt wird.
 
10. Ausführliche Informationen und eine Diskussion der Prinzipien der Dosis ­
wahl bei Prüfung auf chronische Toxizität und Kanzerogenität sind im Guidance Document No. 116 (6) sowie in zwei Veröffentlichungen des 
International Life Sciences Institute (17) (18) zu finden. Die grundlegende 
Strategie der Dosiswahl hängt von den Hauptzielen der Studie ab (Nummer 6). Bei der Auswahl der geeigneten Dosisstufen ist ein Gleichgewicht zwi ­
schen Gefahrenidentifizierung einerseits und der Beschreibung von Wirkun ­
gen bei geringer Dosierung und ihrer Relevanz andererseits herzustellen. 
Dieses Gleichgewicht ist bei einer kombinierten Studie zur Prüfung auf chronische Toxizität und auf Kanzerogenität (Kapitel B.33 dieses Anhangs) besonders wichtig (Nummer 11).
 
11. Es sollte in Betracht gezogen werden, statt der getrennten Durchführung 
einer Prüfung auf chronische Toxizität (diese Prüfmethode B.30) und einer 
Prüfung auf Kanzerogenität (Kapitel B.32 dieses Anhangs) eher eine kom ­
binierte Prüfung auf chronische Toxizität und Kanzerogenität (Kapitel B.33 dieses Anhangs) durchzuführen. Die kombinierte Methode ist zeit- und kos ­
teneffizienter als zwei getrennte Studien, ohne dass dabei die Qualität der 
Daten der chronischen Komponente oder der Kanzerogenitätskomponente beeinträchtigt würde. Bei Durchführung einer kombinierten Prüfung auf chronische Toxizität und Kanzerogenität (Kapitel B.33 dieses Anhangs) 
sind die Grundsätze der Dosiswahl (Nummer 9 und Nummern 20-25) jedoch 
genau zu beachten. Es wird allerdings anerkannt, dass im Rahmen bestimm ­
ter Regelungen möglicherweise getrennte Prüfungen vorgeschrieben sind.
 
12. Die im Zusammenhang mit dieser Prüfmethode verwendeten Begriffe wer ­
den am Ende dieses Kapitels und im Guidance Document 116 (6) definiert.  
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
13. Die Prüfsubstanz wird mehreren Gruppen von Versuchstieren täglich in 
abgestuften Dosen verabreicht, und zwar normalerweise über einen Zeitraum von 12 Monaten, wobei je nach Regulierungsanforderungen (siehe Nummer 33) auch eine längere oder kürzere Dauer gewählt werden kann. Die Dauer 
sollte ausreichend lang sein, damit sich etwaige Wirkungen kumulativer 
Toxizität manifestieren können, ohne dass sich die verzerrenden Wirkungen geriatrischer Veränderungen bemerkbar machen. Abweichungen von der 12- monatigen Expositionsdauer sind zu begründen, insbesondere wenn eine 
kürzere Dauer gewählt wird. Die Prüfsubstanz wird in der Regel oral ver ­
abreicht, aber auch die Verabreichung durch Inhalation oder auf dermalem Weg kann angebracht sein. Die Studienauslegung kann auch eine oder mehrere zwischenzeitliche Tötungen vorsehen, z. B. nach 3 und 6 Monaten; 
außerdem können zu diesem Zweck auch zusätzliche Gruppen von Ver ­
suchstieren aufgenommen werden (siehe Nummer 19). Während des Ver ­
abreichungszeitraums werden die Tiere sorgfältig auf Toxizitätszeichen be ­
obachtet. Tiere, die im Verlauf der Prüfung sterben, und vorzeitig getötete 
Tiere werden seziert; die nach Abschluss der Prüfung überlebenden Tiere 
werden getötet und ebenfalls seziert.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 441
 
BESCHREIBUNG DER METHODE  
Auswahl von Versuchstierarten  
14. Diese Prüfmethode betrifft hauptsächlich die Bewertung und Evaluierung 
chronischer Toxizität bei Nagetieren (Nummer 2). Bestimmte Regelungen können jedoch ähnliche Studien an Nichtnagern vorschreiben. Die Wahl der Tierart ist zu begründen. Wenn Prüfungen auf chronische Toxizität bei 
Nichtnagern erforderlich sind, sollten Auslegung und Durchführung der Ver ­
suche auf den Grundsätzen der vorliegenden Prüfmethode sowie denen von Kapitel B.27 dieses Anhangs — Prüfung auf subchronische orale Toxizität — 90-Tage-Toxizitätsstudie mit wiederholter Verabreichung an 
Nicht-Nagetieren (5) basieren. Zusätzliche Informationen zur Wahl der Tier ­
art und des Stamms sind im Guidance Document No. 116 (6) enthalten.
 
15. Bei dieser Prüfmethode ist die Ratte die bevorzugte Nagetierart, doch kön ­
nen auch andere Nagetierarten, z. B. die Maus, verwendet werden. Ratten 
und Mäuse sind wegen ihrer relativ kurzen Lebenszeit, der weit verbreiteten 
Verwendung in pharmakologischen und toxikologischen Studien, ihrer An ­
fälligkeit für die Entstehung von Tumoren und der Verfügbarkeit ausrei ­
chend beschriebener Stämme die bevorzugten Versuchsmodelle. Daher lie ­
gen über ihre Physiologie und Pathologie umfangreiche Informationen vor. 
Es sind junge, gesunde, adulte Tiere aus üblicherweise eingesetzten Labor ­
stämmen zu verwenden. Für die Prüfung auf chronische Toxizität sollten Tiere desselben Stamms und derselben Herkunft verwendet werden wie für 
die kürzere(n) Toxizitätsvorstudie(n). Die weiblichen Tiere dürfen weder 
bereits geworfen haben noch trächtig sein.
 
Haltungs- und Fütterungsbedingungen  
16. Die Tiere können entweder einzeln oder in kleinen gleichgeschlechtlichen 
Gruppen in Käfigen untergebracht werden. Eine Einzelunterbringung ist nur in Betracht zu ziehen, wenn sie wissenschaftlich gerechtfertigt ist (19) (20) 
(21). Die Käfige sollten so angeordnet werden, dass etwaige Einflüsse der 
Käfigplatzierung minimiert werden. Die Temperatur im Versuchstierraum sollte 22 °C (± 3 °C) betragen. Die relative Luftfeuchtigkeit sollte mindes ­
tens 30 % betragen und — außer beim Reinigen des Raums — 70 % nicht 
überschreiten. Angestrebt werden sollte eine Luftfeuchtigkeit von 50-60 %. 
Die Beleuchtung sollte künstlich sein und die Hell- und Dunkelphasen sollten sich im Abstand von 12 Stunden abwechseln. An die Versuchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert werden, und eine unbegrenzte 
Trinkwasserversorgung ist zu gewährleisten. Das Futter sollte den Nährstoff ­
bedarf der eingesetzten Tierart decken und möglichst wenig Schadstoffe wie z. B. Pestizidrückstände, persistente organische Schadstoffe, Phytoöstrogene, Schwermetalle und Mykotoxine enthalten, die das Ergebnis der Prüfung 
beeinflussen könnten. Das Futter ist regelmäßig, und zwar zumindest zu 
Beginn der Prüfung und bei Verwendung einer anderen Charge, auf den Nährstoff- und Schadstoffgehalt hin zu analysieren; die Ergebnisse sind im 
Abschlussbericht anzugeben. Ergebnisse von Analysen des in der Prüfung 
verwendeten Trinkwassers sind ebenfalls anzugeben. Die Auswahl des Fut ­
ters wird eventuell dadurch beeinflusst, dass eine geeignete Beimischung einer Prüfsubstanz und die Deckung des Nährstoffbedarfs der Tiere sicher ­
gestellt werden muss, wenn die Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht 
wird.
 
Vorbereitung der Tiere  
17. Es sind gesunde Tiere zu verwenden, die mindestens sieben Tage an die 
Laborbedingungen gewöhnt und zuvor nicht für andere Experimente ver ­
wendet wurden. Bei Nagetieren sollte die Verabreichung so bald wie mög ­
lich nach dem Absetzen und der Eingewöhnung beginnen, vorzugsweise 
bevor die Tiere 8 Wochen alt sind. Art, Stamm, Herkunft, Geschlecht, 
Gewicht und Alter der Versuchstiere sind anzugeben. Bei Beginn der Studie sollten die Gewichtsunterschiede bei den Tieren beider Geschlechter mög ­
lichst gering sein und ± 20 % des geschlechtsspezifischen Durchschnitts ­
gewichts aller Tiere in der Studie nicht überschreiten. Die Tiere werden 
nach dem Zufallsprinzip in Kontroll- und Behandlungsgruppen eingeteilt.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 442
 
Nach der Randomisierung sollte sich das Durchschnittsgewicht der Tiere 
desselben Geschlechts von Gruppe zu Gruppe nicht signifikant unterschei ­
den. Gibt es statistisch signifikante Unterschiede, sollte die Randomisierung möglichst wiederholt werden. Jedes Versuchstier erhält zur sicheren Identi ­
fizierung eine eigene Nummer und wird durch Tätowierung, Mikrochipim ­
plantat oder auf eine andere geeignete Weise mit dieser Nummer gekenn ­
zeichnet.
 
VERFAHREN  
Zahl und Geschlecht der Versuchstiere  
18. Es sind Tiere beider Geschlechter zu verwenden. Es sind so viele Tiere zu 
verwenden, dass am Ende der Studie in jeder Gruppe genug Tiere für eine gründliche biologische und statistische Auswertung zur Verfügung stehen. 
Bei Nagern sind in der Regel auf jeder Dosisstufe je Gruppe mindestens je 
20 Tiere beider Geschlechter zu verwenden, bei Nichtnagern werden pro Gruppe mindestens je 4 Tiere beider Geschlechter empfohlen. Bei Studien an Mäusen werden in jeder Dosisgruppe möglicherweise zusätzliche Tiere 
benötigt, um alle erforderlichen hämatologischen Bestimmungen vornehmen 
zu können.
 
Tötungen im Verlauf der Studie, Satellitengruppen und Sentineltiere  
19. Es kann vorgesehen werden, dass im Verlauf der Studie, z. B. nach sechs 
Monaten, Tiere getötet werden (mindestens 10 Tiere/Geschlecht/Gruppe), 
um Erkenntnisse über den Fortgang toxikologischer Veränderungen und 
mechanistische Informationen zu gewinnen, falls dies wissenschaftlich ge ­
rechtfertigt ist. Wenn diese Informationen bereits aus vorherigen Studien mit wiederholter Gabe der Prüfsubstanz vorliegen, sind zwischenzeitliche Tötun ­
gen möglicherweise wissenschaftlich nicht gerechtfertigt. Es können auch 
Satellitengruppen aufgenommen werden, um die Reversibilität etwaiger to ­
xikologischer Veränderungen zu beobachten, die durch die Prüfsubstanz hervorgerufen werden. Satellitengruppen sind normalerweise auf die höchste 
Dosisgruppe der Studie zuzüglich einer Kontrolle beschränkt. Der Krank ­
heitsstatus während der Studie kann erforderlichenfalls auch mit einer zu ­
sätzlichen Gruppe von Sentineltieren (normalerweise je fünf Tiere beider Geschlechter) überwacht werden (22). Sollen im Verlauf der Prüfung Tiere 
getötet werden oder Satelliten- oder Sentinelgruppen aufgenommen werden, 
ist die Zahl der Tiere in der Studienauslegung um die Zahl zu erhöhen, die vor Abschluss der Studie getötet werden sollen. Diese Tiere sind normaler ­
weise in Bezug auf die Bestimmung des Körpergewichts und der 
Futter-/Wasseraufnahme, hämatologische und klinisch-biochemische Bestim ­
mungen sowie pathologische Untersuchungen genauso zu behandeln wie die Tiere in der chronischen Toxizitätsphase der Hauptstudie; es kann allerdings vorgesehen werden, die Messungen (in den Gruppen mit im Verlauf der 
Studie zu tötenden Tieren) auf bestimmte Schlüsselaspekte wie Neurotoxi ­
zität oder Immunotoxizität zu beschränken.
 
Dosisgruppen und Dosierung  
20. Das Guidance Document No. 116 (6) enthält Hinweise zu allen Aspekten 
der Dosiswahl und zu den Abständen der Dosisstufen. Es sollten mindestens 
drei Dosisstufen und eine gleichzeitige Kontrolle verwendet werden, es sei 
denn, ein Limit-Test wird durchgeführt (siehe Nummer 27). Die Dosisstufen werden im Allgemeinen auf der Grundlage der Ergebnisse von Studien mit kurzzeitiger wiederholter Verabreichung oder Dosisfindungsstudien fest ­
gelegt und sollten alle vorliegenden toxikologischen und toxikokinetischen 
Daten für die Prüfsubstanz oder verwandte Stoffe berücksichtigen.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 443
 
21. Soweit keine Beschränkungen aufgrund der physikalisch-chemischen Be ­
schaffenheit oder der biologischen Wirkungen der Prüfsubstanz bestehen, 
ist die höchste Dosisstufe normalerweise so zu wählen, dass zwar die Haupt ­
zielorgane und die toxischen Wirkungen identifiziert werden können, aber Leiden, schwere Toxizität, Morbidität oder Tod der Tiere vermieden wer ­
den. Unter Berücksichtigung der unter Nummer 22 beschriebenen Faktoren 
ist die höchste Dosisstufe so zu wählen, dass Anzeichen von Toxizität her ­
vorgerufen werden, die sich z. B. in einer verzögerten Körpergewichtsent ­
wicklung äußern (etwa 10 %).
 
22. Je nach den Zielen der Studie (siehe Nummer 6) kann jedoch eine Höchst ­
dosis festgelegt werden, die unter der zu Toxizitätszeichen führenden Dosis 
liegt, z. B. wenn eine Dosis eine besorgniserregende Wirkung auslöst, die 
sich aber nur geringfügig auf Lebensdauer oder Körpergewicht auswirkt.  
Die Höchstdosis darf 1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag nicht übersteigen 
(Grenzdosis siehe Nummer 27).  
23. Die Dosisstufen und die Abstände der Dosisstufen können so gewählt wer ­
den, dass auf der niedrigsten Dosisstufe eine Dosis-Wirkungs-Beziehung 
und ein NOAEL-Wert oder andere angestrebte Studienergebnisse, z. B. ein BMD (siehe Nummer 25), festgestellt werden können. Zu den Faktoren, die bei der Festlegung niedrigerer Dosen zu berücksichtigen sind, gehören 
die voraussichtliche Steigung der Dosis-Wirkungs-Kurve, die Dosen, bei 
denen wichtige Änderungen des Metabolismus oder der toxischen Wir ­
kungsweise eintreten können, und das Niveau, bei dem eine Schwelle oder ein Ausgangspunkt für eine Extrapolation niedriger Dosen erwartet 
wird.
 
24. Welche Dosisstufenabstände gewählt werden, hängt von den Merkmalen der 
Prüfsubstanz ab und kann in dieser Prüfmethode nicht vorgeschrieben wer ­
den. Abstände mit einem Faktor von 2 bis 4 erweisen sich jedoch oft als gut geeignet für die Festsetzung abnehmender Dosisstufen. Außerdem ist es oft 
besser, statt der Verwendung sehr großer Intervalle (z. B. mit einem Faktor 
zwischen 6 und 10) zwischen den Dosierungen eine vierte Prüfgruppe ein ­
zurichten. Die Verwendung von Faktoren über 10 sollte im Allgemeinen vermieden bzw. gegebenenfalls begründet werden.
 
25. Entsprechend dem Guidance Document No. 116 (6) sind bei der Dosisfest ­
legung u. a. folgende Faktoren zu berücksichtigen:  
— bekannte oder vermutete Nichtlinearitäten oder Wendepunkte der 
Dosis-Wirkungs-Kurve;  
— Toxikokinetik und Dosisbereiche, bei denen die metabolische Induktion, 
die Sättigung oder die Nichtlinearität zwischen externen und internen Dosen auftritt oder nicht auftritt;
 
— Vorläuferläsionen, Wirkungsmarker oder Indikatoren für den Ablauf zu ­
grunde liegender biologischer Schlüsselprozesse;  
— wichtige (oder vermutete) Aspekte der Wirkungsweise, z. B. Dosen, ab 
denen Zytotoxizität auftritt, Hormonspiegel beeinflusst werden, homö ­
ostatische Mechanismen gestört werden usw.;  
— Bereiche der Dosis-Wirkungs-Kurve, bei denen eine besonders genaue 
Schätzung erforderlich ist, z. B. im Bereich der voraussichtlichen BMD oder einer vermuteten Schwelle;
 
— Berücksichtigung voraussichtlicher Expositionsniveaus von Menschen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 444
 
26. Die Kontrollgruppe ist eine unbehandelte Gruppe oder eine Vehikelkontroll ­
gruppe, sofern ein Vehikel zur Verabreichung der Prüfsubstanz verwendet 
wird. Abgesehen von der Behandlung mit der Prüfsubstanz sollten die Tiere der Kontrollgruppe genauso behandelt werden wie die Tiere in den Prüf ­
gruppen. Wird ein Vehikel verwendet, erhält die Kontrollgruppe das Vehikel 
im höchsten bei den Dosisgruppen verwendeten Volumen. Wird eine Prüf ­
substanz mit dem Futter verabreicht, und führt dies aus geschmacklichen Gründen zu einer verminderten Futteraufnahme, kann eine paarweise gefüt ­
terte Kontrollgruppe nützlich und eine bessere Kontrolle sein.
 
27. Wenn aufgrund von Informationen aus Vorstudien davon ausgegangen wer ­
den kann, dass eine Prüfung bei einer einzigen Dosisstufe von mindestens 
1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag unter Anwendung der für diese Studie 
beschriebenen Verfahren wahrscheinlich keine schädlichen Wirkungen her ­
vorrufen wird und wenn aufgrund der Daten strukturverwandter Stoffe keine Toxizität zu erwarten ist, kann auf eine vollständige Studie mit drei Dosis ­
stufen gegebenenfalls verzichtet werden. Sofern die Exposition des Men ­
schen nicht die Prüfung bei einer höheren Dosis erforderlich erscheinen lässt, kann eine Grenze von 1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag angewandt werden.
 
Zubereitung der Dosen und Verabreichung der Prüfsubstanz  
28. Die Prüfsubstanz wird in der Regel oral, d. h. mit der Nahrung oder dem 
Trinkwasser, oder über eine Schlundsonde verabreicht. Zusätzliche Informa ­
tionen zu Verabreichungswegen und -methoden sind im Guidance Docu ­
ment No. 116 (6) enthalten. Verabreichungsweg und -methode richten 
sich nach dem Zweck der Studie, den physikalisch-chemischen Eigenschaf ­
ten der Prüfsubstanz, ihrer Bioverfügbarkeit und der vorherrschenden Art der Exposition beim Menschen. Der gewählte Verabreichungsweg und die 
Methode sollten begründet werden. Aus Tierschutzgründen sollte die 
Schlundsonde nur für Agenzien gewählt werden, bei denen dieser Weg und diese Methode der Verabreichung die potenzielle Humanexposition annähernd repräsentieren (z. B. Arzneimittel). Nahrungs- oder Umweltche ­
mikalien einschließlich Pestizide werden normalerweise mit dem Futter oder 
dem Trinkwasser verabreicht. Für bestimmte Szenarios, z. B. berufliche Exposition, können andere Applikationswege besser geeignet sein.
 
29. Bei Bedarf wird die Prüfsubstanz in einem geeigneten Vehikel gelöst oder 
suspendiert. Zu berücksichtigen sind gegebenenfalls folgende Merkmale des 
Vehikels und anderer Additive: Auswirkungen auf die Resorption, die Ver ­
teilung, den Stoffwechsel oder die Retention der Prüfsubstanz, Auswirkun ­
gen auf die chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, die deren toxische Eigenschaften verändern können, und ferner Auswirkungen auf die Futter- 
oder Wasseraufnahme oder den Ernährungszustand der Versuchstiere. Es 
empfiehlt sich, nach Möglichkeit zunächst die Verwendung einer wässrigen Lösung/Suspenion, sodann eine Lösung/Emulsion in Öl (z. B. Maisöl) und erst dann eine Lösung in anderen Vehikeln in Betracht zu ziehen. Bei 
anderen Vehikeln als Wasser müssen deren toxische Merkmale bekannt sein. 
Es sollten Informationen über die Stabilität der Prüfsubstanz und die Ho ­
mogenität der Lösungen oder Futterrationen, die (je nach Fall) die Dosie ­
rung enthalten, unter den Verabreichungsbedingungen (z. B. mit dem Futter) 
vorliegen.
 
30. Für mit dem Futter oder dem Trinkwasser verabreichte Stoffe ist unbedingt 
sicherzustellen, dass die Mengen der jeweiligen Prüfsubstanz die normale 
Nahrungsaufnahme oder den Wasserhaushalt nicht beeinträchtigen. Um eine unausgewogene Ernährung zu vermeiden, sollte die Konzentration der Prüf ­
substanz in Langzeittoxizitätsstudien mit Verabreichung über die Nahrung 
normalerweise eine Obergrenze von 5 % der Gesamtnahrung nicht überstei ­
gen. Wenn die Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht wird, kann entweder eine konstante Futterkonzentration (mg/kg Futter oder ppm) oder eine kon ­
stante Dosierung in Relation zum Körpergewicht des Tiers (mg/kg Körper ­
gewicht), berechnet auf Wochenbasis, verwendet werden. Die jeweils ge ­
wählte Verfahrensweise ist anzugeben.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 445
 
31. Bei oraler Verabreichung erhalten die Tiere die Prüfsubstanz täglich (sieben 
Tage in der Woche), in der Regel für einen Zeitraum von 12 Monaten (siehe 
auch Nummer 33); je nach Regulierungsanforderungen kann auch eine län ­
gere Dauer erforderlich sein. Jede Abweichung von diesem Dosierungsplan, z. B. fünf Tage pro Woche, ist zu begründen. Bei dermaler Applikation 
werden die Tiere, wie in Kapitel B.9 dieses Anhangs (10) beschrieben, für 
einen Zeitraum von 12 Monaten an sieben Tagen in der Woche mindestens 6 Stunden pro Tag mit der Prüfsubstanz behandelt. Die Inhalationsexpo ­
sition wird an sieben Tagen in der Woche für 6 Stunden pro Tag durch ­
geführt, aber auch fünf Tage in der Woche sind möglich, wenn dies gerecht ­
fertigt ist. Die Expositionsdauer beträgt normalerweise 12 Monate. Wenn für eine „Nose-only“-Exposition andere Nagetierarten als Ratten verwendet wer ­
den, kann die maximale Expositionsdauer angepasst werden, um artenspezi ­
fisches Leiden zu minimieren. Eine Expositionsdauer von weniger als 6 
Stunden pro Tag ist zu begründen. Siehe auch Kapitel B.8 dieses Anhangs (8).
 
32. Wird die Prüfsubstanz über eine Sonde verabreicht, so sollte dies unter 
Verwendung einer Schlundsonde oder einer geeigneten Intubationskanüle jeweils zur gleichen Tageszeit erfolgen. Normalerweise wird einmal am Tag eine einzige Dosis verabreicht; wenn es sich bei der Prüfsubstanz z. 
B. um einen lokal reizenden Stoff handelt, kann die Tagesdosis auf zwei 
Teilmengen aufgeteilt werden. Das maximale Flüssigkeitsvolumen, das ei ­
nem Versuchstier jeweils verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Das Volumen sollte so gering wie möglich sein und bei 
Nagetieren normalerweise 1 ml/100 g Körpergewicht nicht überschreiten 
(22). Die Variabilität der Prüfvolumina sollte durch Anpassung der Konzen ­
tration auf ein konstantes Volumen bei allen Dosen möglichst gering ge ­
halten werden. Davon ausgenommen sind potenziell ätzende oder reizende 
Stoffe, die zur Vermeidung schwerwiegender lokaler Wirkungen verdünnt 
werden müssen. Die Prüfung in Konzentrationen, die wahrscheinlich eine ätzende oder reizende Wirkung für den Magen-Darm-Trakt haben, ist zu vermeiden.
 
Versuchsdauer  
33. Diese Prüfmethode ist zwar hauptsächlich zur Prüfung auf chronische To ­
xizität über 12 Monate ausgelegt, aber je nach den Anforderungen bestimm ­
ter Regulierungsregelungen oder für spezifische mechanistische Zwecke sind auch kürzere (z. B. 6 oder 9 Monate) oder längere (z. B. 18 oder 24 
Monate) Zeiträume möglich. Abweichungen von der 12-monatigen Exposi ­
tionsdauer sind zu begründen, insbesondere wenn eine kürzere Dauer ge ­
wählt wird. Satellitengruppen zur Beobachtung der Reversibilität von toxi ­
kologischen Veränderungen, die durch die Prüfsubstanz hervorgerufen wer ­
den, sollten nach Beendigung der Exposition noch für einen Zeitraum von 
mindestens 4 Wochen, aber nicht länger als ein Drittel der Gesamtstudien ­
dauer ohne Behandlung beibehalten werden. Weitere Hinweise, insbeson ­
dere in Bezug auf das Überleben der Versuchstiere, sind im Guidance 
Document No. 116 (6) zu finden.
 
BEOBACHTUNGEN  
34. Alle Tiere sind in der Regel jeden Tag morgens und abends, auch am 
Wochenende und an Feiertagen, auf Anzeichen von Morbidität und Morta ­
lität hin zu untersuchen. Allgemeine klinische Beobachtungen sollten min ­
destens einmal täglich, vorzugsweise zur selben Tageszeit, unter Berück ­
sichtigung des Zeitraums, in dem der Wirkungsgipfel nach Verabreichung 
der Dosis über eine Schlundsonde zu erwarten ist, vorgenommen werden.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 446
 
35. Bei allen Tieren sind mindestens einmal vor der ersten Exposition (für 
intraindividuelle Vergleiche), am Ende der ersten Studienwoche und danach 
monatlich gründliche klinische Beobachtungen vorzunehmen. Das Beobach ­
tungsprotokoll ist so zu gestalten, dass Abweichungen zwischen den Be ­
obachtern minimiert werden und von der Prüfgruppe unabhängig stattfinden. 
Diese Beobachtungen sollten außerhalb des Käfigs erfolgen, in dem die 
Tiere gehalten werden, und zwar vorzugsweise in einem Standardgehege jeweils zu denselben Zeiten. Sie sind sorgfältig zu dokumentieren, am bes ­
ten nach einer speziell vom Prüflabor entwickelten Bewertungsskala. Die 
Beobachtungsbedingungen sollten möglichst konstant sein. Zu achten ist 
insbesondere auf Veränderungen an Haut, Fell, Augen, Schleimhäuten, auf Sekrete und Exkrete sowie autonome Aktivitäten (z. B. Tränensekretion, Piloerektion, Pupillengröße, ungewöhnliche Atemmuster). Gang- und Hal ­
tungsstörungen, ferner Reaktionen auf den Umgang mit den Tieren sowie 
etwaige klonische oder tonische Bewegungen, Stereotypien (z. B. übermäßi ­
ges Putzen, wiederholte Kreisbewegungen) oder abnormes Verhalten (z. B. Selbstverstümmelung, Rückwärtsgehen) sollten auch dokumentiert werden 
(24).
 
36. Alle Tiere sind vor der ersten Verabreichung der Prüfsubstanz mit einem 
Ophthalmoskop oder einem anderen geeigneten Instrument ophthalmolo ­
gisch zu untersuchen. Am Ende der Studie ist diese Untersuchung möglichst bei allen, aber mindestens bei der Hochdosisgruppe und der Kontrollgruppe 
zu wiederholen. Wenn behandlungsbedingte Veränderungen an den Augen 
beobachtet werden, sind alle Tiere zu untersuchen. Wenn eine Strukturana ­
lyse oder andere Informationen auf eine Toxizität für die Augen hindeuten, ist die Frequenz der Augenuntersuchungen zu erhöhen.
 
37. Bei Chemikalien, für die vorangegangene Toxizitätsprüfungen mit wieder ­
holter Gabe über 28 und/oder 90 Tage auf potenzielle neurotoxische Wir ­
kungen hindeuten, können vor Studienbeginn, in Abständen von drei Mo ­
naten nach Beginn einer Studie von bis zu 12 Monaten einschließlich sowie bei Beendigung der Studie (falls länger als 12 Monate) fakultativ die sen ­
sorische Reaktivität auf Reize verschiedener Art (24) (z. B. akustische, 
visuelle und propriozeptive Reize) (25), (26), (27), die Greifkraft (28) und die motorische Aktivität (29) bewertet werden. Weitere Einzelheiten zu den möglichen Untersuchungen finden sich in der Literatur. Allerdings können 
auch andere als dort genannte Verfahren angewendet werden.
 
38. Bei Chemikalien, für die vorangegangene Toxizitätsprüfungen mit wieder ­
holter Gabe über 28 und/oder 90 Tage auf potenzielle immunotoxische Wirkungen hindeuten, können bei Beendigung der Studie fakultativ weitere Untersuchungen durchgeführt werden.
 
Körpergewicht, Futter-/Wasseraufnahme und Futtereffizienz  
39. Alle Tiere sollten zu Beginn der Behandlung, in den ersten 13 Wochen 
mindestens einmal wöchentlich und danach mindestens monatlich gewogen werden. Futteraufnahme und Futtereffizienz sollten in den ersten 13 Wochen 
mindestens wöchentlich und danach mindestens monatlich bestimmt werden. 
Die Trinkwasseraufnahme sollte in den ersten 13 Wochen mindestens wö ­
chentlich und danach mindestens monatlich gemessen werden, wenn die Prüfsubstanz mit dem Trinkwasser verabreicht wird. Bei Studien, in denen 
das Trinkverhalten der Tiere verändert ist, sollte auch die Trinkwasserauf ­
nahme gemessen werden.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 447
 
Hämatologie und klinische Biochemie  
40. Bei Prüfungen an Nagetieren sind die hämatologischen Untersuchungen bei 
mindestens zehn männlichen und zehn weiblichen Tieren je Gruppe nach 3, 6 und 12 Monaten sowie bei Beendigung der Studie (falls sie länger als 12 
Monate dauert) durchzuführen, wobei immer dieselben Tiere zu verwenden 
sind. Bei Mäusen werden möglicherweise Satellitentiere benötigt, um alle erforderlichen hämatologischen Bestimmungen vornehmen zu können (siehe Nummer 18). Bei Prüfungen an Nichtnagern werden die Proben wie bei 
Nagetieren beschrieben in den Zwischenphasen und bei Beendigung der 
Studie von einer kleineren Anzahl Tieren (z. B. vier Tiere je Geschlecht und je Gruppe in Hundestudien) genommen. Weder bei Nagern noch bei 
Nichtnagern brauchen Messungen nach drei Monaten vorgenommen zu wer ­
den, wenn bei den hämatologischen Parametern in einer vorangegangenen 90-Tage-Studie mit vergleichbaren Dosisstufen keine Wirkung erkennbar war. Die Blutproben müssen unter Anästhesie an einer benannten Stelle, 
z. B. durch Herzpunktion oder aus dem retrobulbären Venenplexus entnom ­
men werden.
 
41. Die folgenden Parameter sind zu bestimmen (30): Gesamt- und Differenzi ­
alleukozytenzahl, Erythrozytenzahl, Thrombozytenzahl, Hämoglobinkonzen ­
tration, Hämatokrit, mittleres Erythrozyteneinzelvolumen (MCV), mittleres 
korpuskuläres Hämoglobin (MCH), mittlere korpuskuläre 
Hämoglobinkonzentration (MCHC), Prothrombinzeit und aktivierte partielle Thromboplastinzeit. Je nach Toxizität der Prüfsubstanz können gegebenen ­
falls auch weitere hämatologische Parameter wie Heinz-Körper oder andere 
atypische Erythrozytenmorphologie oder Methämoglobin gemessen werden. 
Insgesamt ist je nach den beobachteten und/oder erwarteten Wirkungen der Prüfsubstanz mit der entsprechenden Flexibilität vorzugehen. Wenn die Prüfsubstanz Auswirkungen auf die Hämatopoese hat, können auch eine 
Bestimmung der Retikulozytenzahl und eine Knochenmarkzytologie ange ­
zeigt sein; sie müssen aber nicht routinemäßig durchgeführt werden.
 
42. Klinisch-biochemische Bestimmungen zur Untersuchung der wichtigsten to ­
xischen Wirkungen in Geweben, insbesondere der Wirkungen auf Nieren und Leber, sind an Blutproben durchzuführen, die von mindestens zehn 
männlichen und zehn weiblichen Tieren je Gruppe in den für die hämato ­
logischen Untersuchungen angegebenen gleichen Zeitabständen entnommen werden, wobei immer dieselben Tiere zu verwenden sind. Bei Mäusen werden möglicherweise Satellitentiere benötigt, um alle erforderlichen 
klinisch-biochemischen Bestimmungen vornehmen zu können. Bei Prüfun ­
gen an Nichtnagern werden die Proben wie bei Nagetieren beschrieben in den Zwischenphasen und bei Beendigung der Studie von einer kleineren Anzahl Tieren (z. B. vier Tiere je Geschlecht und je Gruppe in Hunde ­
studien) genommen. Weder bei Nagern noch bei Nichtnagern brauchen 
Messungen nach drei Monaten vorgenommen zu werden, wenn bei den klinisch-biochemischen Parametern in einer vorangegangenen 90-Tage-Stu ­
die mit vergleichbaren Dosisstufen keine Wirkung erkennbar war. Es emp ­
fiehlt sich eine Futterkarenz der Tiere (ausgenommen Mäuse) über Nacht, 
bevor die Blutproben entnommen werden. Die folgenden Parameter sind zu bestimmen (30): Glucose, Harnstoff (Harnstoff-Stickstoff), Kreatinin, Ge ­
samtprotein, Albumin, Calcium, Natrium, Kalium, Gesamtcholesterin, min ­
destens zwei geeignete Parameter für die hepatozelluläre Evaluierung (Ala ­
nin-Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase, Glutamatdehydrogenase, Gesamtgallensäuren) (31) und mindestens zwei geeignete Parameter für die hepatobiliäre Evaluierung (alkalische Phosphatase, γ-Glutamyltransfera ­
se, 5’-Nucleotidase, Gesamtbilirubin, Gesamtgallensäuren) (31). Je nach To ­
xizität der Prüfsubstanz können gegebenenfalls auch weitere klinisch-chemische Parameter wie Nüchtern-Triglyceride, spezifische Hor ­
mone und Cholinesterase bestimmt werden. Insgesamt ist je nach den be ­
obachteten und/oder erwarteten Wirkungen der Prüfsubstanz mit der ent ­
sprechenden Flexibilität vorzugehen.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 448
 
43. An Proben, die von mindestens zehn männlichen und zehn weiblichen Tie ­
ren je Gruppe in den gleichen Abständen entnommen wurden wie die Pro ­
ben für die hämatologische und die klinisch-chemische Untersuchung, sind Urinanalysen durchzuführen. Es brauchen keine Messungen nach drei Mo ­
naten vorgenommen zu werden, wenn bei der Urinanalyse in einer voran ­
gegangenen 90-Tage-Studie mit vergleichbaren Dosisstufen keine Wirkung 
erkennbar war. Eine Empfehlung von Sachverständigen zu klinischen Pa ­
thologiestudien (30) enthält die folgende Liste von Parametern: Aussehen, Volumen, Osmolalität oder spezifisches Gewicht, pH-Wert, Gesamteiweiß 
und Glucose. Außerdem können Ketone, Urobilinogen, Bilirubin und okkul ­
tes Blut bestimmt werden. Sofern erforderlich, können weitere Parameter verwendet werden, um die Untersuchung beobachteter Wirkungen zu erwei ­
tern.
 
44. Bei Studien an Hunden werden im Allgemeinen Bestimmungen der Aus ­
gangsdaten hämatologischer und klinisch-biochemischer Parameter für not ­
wendig gehalten; bei Studien an Nagern müssen sie aber nicht bestimmt werden (30). Wenn keine ausreichenden historischen Ausgangsdaten vor ­
liegen (siehe Nummer 50), sollten sie jedoch bestimmt werden.
 
Pathologie  
Makroskopische Untersuchung  
45. Normalerweise sind alle an der Studie beteiligten Tiere einer vollständigen, 
eingehenden makroskopischen Untersuchung zu unterziehen, die die sorg ­
fältige Untersuchung der äußeren Körperoberfläche, aller Körperöffnungen 
sowie der Schädel-, Brust- und Bauchhöhlen und ihres Inhalts umfasst. Es 
kann jedoch auch vorgesehen werden, die Untersuchungen (in den Gruppen der Tiere, die im Verlauf der Studie getötet werden sollen, und in den Satellitengruppen) auf spezifische Schlüsselaspekte wie Neurotoxizität oder 
Immunotoxizität zu beschränken (siehe Nummer 19). Diese Tiere brauchen 
weder seziert noch den nachstehend beschriebenen Verfahren unterzogen zu werden. Sentineltiere können nach Ermessen des Studienleiters von Fall zu 
Fall seziert werden.
 
46. Die Organgewichte aller Tiere sind zu erfassen, außer von denen, die gemäß 
dem letzten Teil von Nummer 45 ausgenommen sind. Nebennieren, Gehirn, Nebenhoden, Herz, Nieren, Leber, Ovarien, Milz, Hoden, Schilddrüse (nach Fixierung gewogen, mit Nebenschilddrüsen) und Uterus (außer von mori ­
bund aufgefundenen und/oder zwischenzeitlich getöteten Tieren) sind in 
angemessener Form von anhaftendem Gewebe zu befreien, und ihr Nass ­
gewicht ist so rasch wie möglich nach der Sektion festzustellen, um ein Austrocknen zu verhindern. Bei einer Studie an Mäusen ist das Wiegen der 
Nebennieren fakultativ.
 
47. Die folgenden Gewebe sind in dem für die betreffende Gewebeart und die 
vorgesehene anschließende histopathologische Untersuchung am besten ge ­
eigneten Fixierungsmittel aufzubewahren (32) (Gewebe in eckigen Klam ­
mern sind fakultativ): 
alle makroskopischen Ver ­
änderungen Herz Pankreas Magen (Vormagen, Drüsen ­
magen) 
Nebennieren Ileum Nebenschilddrüse [Zähne] 
Aorta Jejunum periphere Nerven Hoden Gehirn (mit Schnitten von 
Cerebrum, Cerebellum und Medulla/Pons) Nieren Hypophyse Thymus 
Caecum Tränendrüse (exorbital) Prostata Schilddrüse 
Zervix Leber Rectum [Zunge]
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 449
 
Koagulationsdrüse Lunge Speicheldrüse Trachea 
Kolon Lymphknoten (sowohl 
oberflächliche als auch tiefe) Samenbläschen Harnblase 
Duodenum Brustdrüse (obligatorisch 
für Weibchen und, falls bei der Sektion erkenn ­
bar, für Männchen) Skelettmuskel Uterus (mit Zervix) 
Nebenhoden [obere Atemwege, ein ­
schließlich Nase, Nasen ­
muscheln und Nasen ­
nebenhöhlen] Haut [Harnleiter] 
Auge (mit Netzhaut) Speiseröhre Rückenmark (auf 3 
Ebenen: zervical, mitt ­
lerer Thoraxbereich und lumbar) [Harnröhre] 
[Femur mit Gelenk] [Riechkolben] Milz Vagina 
Gallenblase (bei anderen 
Arten als Ratten) Ovarien [Brustbein] Knochenmarkschnitt und/ 
oder ein frisches Knochenmark-Aspirat 
Hardersche Drüse
 
Bei paarigen Organen, z. B. Nieren, Nebennieren, sind beide Organe auf ­
zubewahren. Die klinischen und sonstigen Befunde können weitere Gewebe ­
untersuchungen erforderlich machen. Auch Organe, die aufgrund der be ­
kannten Eigenschaften der Prüfsubstanz als mögliche Zielorgane in Frage 
kommen, sollten aufbewahrt werden. In Studien mit dermaler Applikation 
sind die in der Liste für orale Verabreichung aufgeführten Organe aufzube ­
wahren; außerdem sind Proben der Haut an der Applikationsstelle zu neh ­
men und aufzubewahren. Bei Inhalationsstudien entspricht die Liste der 
aufzubewahrenden und zu untersuchenden Gewebe des Atemtrakts den 
Empfehlungen von Kapitel B.8 dieses Anhangs (8) und Kapitel B.29 dieses Anhangs (9). Was andere Organe/Gewebe betrifft, so sollten (zusätzlich zu den speziell konservierten Geweben aus dem Atemtrakt) die in der Liste für 
die orale Verabreichung genannten Organe untersucht werden.
 
Histopathologie  
48. Es gibt Leitlinien für bewährte Praktiken bei der Durchführung toxikologi ­
scher Pathologiestudien (32). Histopathologisch zu untersuchen sind min ­
destens  
— alle Gewebe der Tiere aus der Hochdosisgruppe und der Kontrollgruppe,  
— alle Gewebe von während der Studie gestorbenen oder getöteten Tieren,  
— alle Gewebe mit makroskopischen Abnormitäten,  
— Zielgewebe oder Gewebe, die in der Hochdosisgruppe behandlungs ­
bedingte Veränderungen aufwiesen, von allen Tieren in allen anderen 
Dosisgruppen,  
— bei paarigen Organen, z. B. Nieren, Nebennieren, sind beide Organe zu 
untersuchen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 450
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Daten  
49. Für alle bestimmten Parameter sollen Daten zu den einzelnen Tieren ange ­
geben werden. Darüber hinaus sollten alle Daten in Form einer Tabelle zusammengefasst werden, aus der für jede Prüfgruppe folgende Angaben hervorgehen: die Zahl der Tiere bei Beginn der Prüfung und die Zahl der 
während der Prüfung tot aufgefundenen oder aus Tierschutzgründen getöte ­
ten Tiere, ferner der Zeitpunkt des Todes oder der Tötung, die Zahl der Tiere, die Toxizitätszeichen aufweisen, eine Beschreibung der beobachteten Toxizitätszeichen, einschließlich des Zeitpunkts, zu dem die toxischen Wir ­
kungen erstmalig aufgetreten sind, ihrer Dauer und ihres Schweregrads, die 
Zahl der Tiere mit Läsionen, die Art der Läsionen und der Prozentsatz der von jeder Läsion betroffenen Tiere. Die Mittelwerte und Standardabwei ­
chungen (für kontinuierliche Versuchsdaten) von Tieren, die toxische Wir ­
kungen oder Läsionen aufweisen, sind zusätzlich zum Schweregrad der 
Läsionen in Übersichtstabellen anzugeben.
 
50. Historische Kontrolldaten können die Auswertung der Studienergebnisse 
erleichtern, z. B. wenn die Daten der gleichzeitigen Kontrollen erheblich von neueren Daten von Kontrolltieren aus derselben Versuchseinrichtung 
abweichen. Wenn historische Kontrolldaten bewertet werden, sollten sie 
von demselben Labor stammen, sich auf Tiere desselben Alters und Stamms beziehen und höchstens fünf Jahre vor der fraglichen Studie erhoben worden sein.
 
51. Wenn möglich, sind die numerischen Daten durch eine geeignete allgemein 
annehmbare statistische Methode auszuwerten. Die statistischen Methoden 
und die zu analysierenden Daten sind bei der Planung der Studie festzulegen 
(Nummer 8). Diese Auswahl sollte es ermöglichen, erforderlichenfalls An ­
passungen je nach Überlebensrate vorzunehmen.  
Prüfbericht  
52. Der Prüfbericht sollte folgende Informationen enthalten:  
Prüfsubstanz:  
— physikalische Beschaffenheit, Reinheit und physikalisch-chemische Ei ­
genschaften,  
— Daten zur Identifikation,  
— Herkunft des Stoffs,  
— Chargennummer,  
— Bescheinigung der chemischen Analyse.  
Vehikel (wenn verwendet):  
— Begründung der Wahl des Vehikel, sofern anders als Wasser.  
Versuchstiere:  
— Art/Stamm und Begründung für die getroffene Wahl,  
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere bei Versuchsbeginn,  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 451
 
— Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.,  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Versuchsbeginn.  
Prüfbedingungen:  
— Begründung für Verabreichungsweg und Festlegung der Dosis,  
— gegebenenfalls die statistischen Methoden zur Analyse der Daten,  
— Angaben zur Formulierung der Prüfsubstanz/Futterzubereitung,  
— Analysedaten über die erreichte Konzentration, Stabilität und Homoge ­
nität der Zubereitung,  
— Verabreichungsweg und Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz,  
— bei Inhalationsstudien: „Nose-only“- oder Ganzkörperexposition,  
— tatsächliche Dosen (mg/kg Körpergewicht/Tag) und, sofern zutreffend, 
Angaben zur Umrechnung der Konzentration der Prüfsubstanz im Futter/ Trinkwasser (mg/kg oder ppm) in die tatsächliche Dosis,
 
— Angaben zu Futter- und Wasserqualität.  
Ergebnisse (zusammenfassende Übersichtstabellen und Daten für die einzel ­
nen Tiere):  
— Überlebensdaten,  
— Körpergewicht/Änderungen des Körpergewichts,  
— Futteraufnahme, gegebenenfalls Berechnungen der Futtereffizienz und 
der Wasseraufnahme, falls erfasst,  
— Daten der toxischen Reaktionen nach Geschlecht und Dosis, einschließ ­
lich Toxizitätszeichen,  
— Art, Inzidenz (und, falls bewertet, Schweregrad) sowie Dauer der kli ­
nischen Beobachtungen (sowohl vorübergehend als auch dauerhaft),  
— Ergebnisse der ophthalmologischen Untersuchung,  
— hämatologische Untersuchungen,  
— klinisch-biochemische Untersuchungen,  
— Urinuntersuchungen,  
— Ergebnisse etwaiger Neurotoxizitäts- oder Immunotoxizitätsuntersuchun ­
gen, 
— terminales Körpergewicht,  
— Organgewichte (und gegebenenfalls Verhältnis Organ-/Körpergewicht),  
— Sektionsbefunde,  
— ausführliche Beschreibung aller behandlungsbedingten histopathologi ­
schen Befunde,  
— Angaben zur Resorption, falls vorhanden.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 452
 
Statistische Auswertung der Ergebnisse, soweit zutreffend  
Diskussion der Ergebnisse einschließlich  
— Dosis-Wirkungs-Beziehungen,  
— Prüfung aller Informationen über die Wirkungsweise,  
— Diskussion von Modellierungsansätzen,  
— Bestimmung von BMD, NOAEL oder LOAEL,  
— historische Kontrolldaten,  
— Relevanz für Menschen.  
Schlussfolgerungen  
LITERATUR:  
1. OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2. Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163-208.  
3. Barlow SM, Greig JB, Bridges JW  et al.  (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191.  
4. Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: 
an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.  
5. Kapitel B.27 dieses Anhangs, Prüfung auf sub-chronische orale Toxizität — 
90-Tage-Toxizitätsstudie mit wiederholter Verabreichung an Nicht-Nagetieren
 
6. OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
abrufbar auf der öffentlichen OECD-Website für Prüfrichtlinien: 
www.oecd.org/env/testguidelines.
 
7. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, 
Paris.  
8. Kapitel B.8 dieses Anhangs, Prüfung auf subakute Toxizität nach Inhalation 
-28-Tage-Test.  
9. Kapitel B.29 dieses Anhangs, Prüfung auf sub-chronische Toxizität nach 
Inhalation — 90-Tage-Test.  
10. Kapitel B.9 dieses Anhangs, Toxizität nach 28-tägiger Gabe (dermal)  
11. Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural Chemical 
Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human 
Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.  
12. Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and Ap ­
plication of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) 
Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in To ­
xicology 36: 9-35.  
13. Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al.  (2006). A Tiered Approach to Sys ­
temic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 37-68.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 453
 
14. Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al . (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Re ­
views in Toxicology 36: 69-98.  
15. OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
16. OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.  
17. Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpre ­
tation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Ap ­
proaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729-837.
 
18. ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Se ­
lection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
19. Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 
22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwen ­
deten Tiere (ABl. L 276 vom 20.10.2010, S. 33).  
20. National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health 
and Human Services.  
21. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
 
22. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in 
various housing systems.  
23. Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
 
24. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Do ­
cument No. 60.  
25. Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rates. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
26. Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
27. Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Com ­
parisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
 
28. Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rates and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
 
29. Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Tera ­
tol. 13: 599-609.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 454
 
30. Weingand K, Brown G, Hall R  et al.  (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. 
Toxicol. 29: 198-201.  
31. EMEA (draft) document ‘Non-clinical guideline on drug-induced hepatoto ­
xicity“ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
32. Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126- 131.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 455
 
Anlage 1  
DEFINITION  
Prüfsubstanz:  jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode 
getestet wird.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 456
 
B.31.  STUDIE ZUR PRÜFUNG AUF PRÄNATALE 
ENTWICKLUNGSTOXIZITÄT  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht der OECD TG 414 (2001).  
1.1. EINLEITUNG  
Die vorliegende Methode zur Prüfung auf Entwicklungstoxizität ist 
darauf ausgerichtet, allgemeine Informationen über die Auswirkun ­
gen einer pränatalen Exposition auf das trächtige Versuchstier und 
den sich im Uterus entwickelnden Organismus zu liefern; dabei 
können sowohl Auswirkungen auf das Muttertier als auch Tod, strukturelle Abnormitäten oder Wachstumsstörungen im Fetus unter ­
sucht werden. Die Erfassung funktioneller Defizite ist kein integraler 
Bestandteil dieser Prüfmethode, auch wenn funktionelle Aspekte ei ­
nen wichtigen Teil der Entwicklung darstellen. Diese können in einer gesonderten Studie untersucht oder als Ergänzung zu der vorliegen ­
den Studie behandelt werden unter Einsatz der Methode zur Prüfung 
auf Entwicklungsneurotoxizität. Zur Information über die Prüfung auf Funktionsmängel und andere postnatale Auswirkungen ist gege ­
benenfalls die Methode zur Prüfung der Reproduktion über zwei 
Generationen sowie die Studie über die Entwicklungsneurotoxizität 
heranzuziehen.
 
In Einzelfällen bei Vorliegen spezieller Kenntnisse, z. B. über phy ­
sikalisch-chemische oder toxikologische Eigenschaften der Prüfsub ­
stanz, können bei dieser Prüfmethode besondere Anpassungen erfor ­
derlich sein. Eine solche Anpassung ist dann akzeptabel, wenn über ­
zeugende wissenschaftliche Anhaltspunkte dafür sprechen, dass die 
Prüfung durch die Anpassung aussagekräftiger wird. Diese wissen ­
schaftlichen Anhaltspunkte sind in einem solchen Fall im Prüfbericht sorgfältig zu dokumentieren.
 
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Entwicklungstoxikologie:  ist die Untersuchung schädigender Wir ­
kungen auf den sich entwickelnden Organismus, die aus einer Ein ­
wirkung vor der Empfängnis, während der pränatalen Entwicklung oder postnatal bis zur Geschlechtsreife auftreten können. Entwick ­
lungstoxizität äußert sich in der Hauptsache durch 1) den Tod des 
Organismus, 2) strukturelle Abnormitäten, 3) Wachstumsstörungen und 4) Funktionsdefizite. Entwicklungstoxikologie wurde früher häu ­
fig als Teratologie bezeichnet.
 
Schädigende Wirkung;  behandlungsbedingte Veränderung gegen ­
über dem Normalzustand, bei der die Fähigkeit eines Organismus zu überleben, sich fortzupflanzen oder an die Umwelt anzupassen 
beeinträchtigt wird. Im weitesten Sinne sind im Begriff Entwick ­
lungstoxikologie auch alle Wirkungen mit eingeschlossen, die die normale Entwicklung des Conceptus vor und auch nach der Geburt stören.
 
Wachstumsstörung:  Veränderung von Organ- oder Körpergröße 
oder -gewicht der Nachkommen.  
Veränderungen (Anomalien) : strukturelle Veränderungen in der 
Entwicklung, zu denen sowohl Fehlbildungen als auch Variationen gehören (28).
 
Fehlbildung/größere Abnormität : strukturelle Veränderung, die als 
für das Tier schädlich angesehen wird (und auch zum Tode führen 
kann) und im Allgemeinen in seltenen Fällen auftritt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 457
 
Variation/kleinere Abnormität : strukturelle Veränderung, bei der 
man von geringen oder gar keinen schädlichen Auswirkungen auf 
das Tier ausgeht; dabei kann es sich um eine vorübergehende Er ­
scheinung handeln, und sie kann in der Kontrollpopulation relativ häufig vorkommen.
 
Conceptus : die Summe der Derivate eines befruchteten Eis zu jedem 
Zeitpunkt der Entwicklung von der Befruchtung bis zur Geburt, dazu gehören auch die extraembryonalen Membranen sowie der Embryo oder der Fetus.
 
Implantation (Einnistung ): Anhaftung der Blastozyste an der Epi ­
thelauskleidung der Gebärmutter; dazu gehört auch die Wanderung der Blastozyste durch das Gebärmutterepithel und deren Einbettung 
in der Gebärmutterschleimhaut.
 
Embryo : das Frühstadium oder Entwicklungsstadium eines jeden 
Organismus, speziell das sich entwickelnde Produkt aus der Befruch ­
tung eines Eis nach dem Entstehen der Längsachse und bis alle 
größeren Strukturen vorhanden sind.  
Embryotoxizität : schädigend für die normale Struktur, die Entwick ­
lung, das Wachstum und/oder die Lebensfähigkeit eines Embryos.  
Fetus : der ungeborene Nachkomme in der postembryonalen Phase.  
Fetotoxizität : schädigend für die normale Struktur, die Entwicklung, 
das Wachstum und/oder die Lebensfähigkeit eines Fetus.  
Abort : die vorzeitige Ausstoßung der Empfängnisprodukte aus der 
Gebärmutter, d. h. des Embryos oder eines nicht lebensfähigen Fetus.  
Resorption : ein Conceptus, der nach der Einnistung in der Gebär ­
mutter abgestorben ist und resorbiert wird oder bereits resorbiert wurde.
 
Frühresorption : Anzeichen für eine Implantation, ohne dass ein 
Embryo/Fetus erkennbar ist.  
Spätresorption : Toter Embryo oder Fetus mit äußeren degenerativen 
Veränderungen.  
NOAEL : Abkürzung für  no-observed-adverse-effect level  und ent­
spricht der höchsten Dosis oder Exposition, bei der keine schädigen ­
den behandlungsbedingten Wirkungen festgestellt werden.  
1.3. REFERENZSTOFF  
Keiner.  
1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Im Normalfall wird die Prüfsubstanz trächtigen Tieren mindestens 
vom Zeitpunkt der Implantation bis einen Tag vor der geplanten Tötung verabreicht, welche möglichst unmittelbar vor dem normalen 
Tag der Geburt erfolgen soll, und ohne dabei Gefahr zu laufen, 
Daten infolge vorzeitiger Geburt zu verlieren. Mit der Prüfmethode sollen nicht nur die Phase der Organogenese (z. B. Tag 5 bis 15 bei Nagern und Tag 6 bis 18 bei Kaninchen), sondern auch Wirkungen 
während der Zeit vor der Einnistung, soweit angebracht, und über 
die gesamte Dauer der Gravidität bis zum Tag vor dem Kaiserschnitt untersucht werden. Kurz vor dem Kaiserschnitt werden die Weib ­
chen getötet, der Gebärmutterinhalt untersucht und die Feten im 
Hinblick auf äußerlich erkennbare Anomalien sowie auf Veränderun ­
gen an Weichteilen und Skelett beurteilt.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 458
 
1.5. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.5.1.  Auswahl der Versuchstierarten  
Es wird empfohlen, die Prüfung mit den geeignetsten Tierarten 
durchzuführen und Labortierspezies und -stämme zu verwenden, 
die üblicherweise bei Untersuchungen zur pränatalen Entwicklungs ­
toxizität zum Einsatz kommen. Die bevorzugte Nagerart ist die Ratte, die bevorzugte Nicht-Nagerart ist das Kaninchen, Wird eine andere Tierart eingesetzt, ist dies zu begründen.
 
1.5.2.  Haltung und Fütterung  
Die Temperatur im Versuchstierraum soll bei Nagern 22  o C (± 3  o C) 
und bei Kaninchen 18  o C (± 3  o C) betragen. Obwohl die relative 
Luftfeuchte wenigstens 30 % betragen sollte und außer bei Rei ­
nigung des Raumes 70 % nicht übersteigen sollte, sollte sie vorzugs ­
weise bei 50 bis 60 % liegen. Es ist eine künstliche Beleuchtung vorzusehen, wobei ein Hell-Dunkel-Zyklus von jeweils 12 Stunden eingehalten werden soll. Zur Fütterung kann übliches Laborfutter 
verwendet werden, und Trinkwasser kann in unbeschränkter Menge 
gegeben werden.
 
Die Verpaarung erfolgt in für diese Zwecke geeigneten Käfigen. 
Auch wenn verpaarte Tiere nach Möglichkeit einzeln untergebracht 
werden sollten, so ist auch eine Unterbringung in kleinen Gruppen akzeptabel.
 
1.5.3.  Vorbereitung der Tiere  
Zu verwenden sind gesunde Tiere, die mindestens fünf Tage an die 
Laborbedingungen gewöhnt und zuvor nicht für andere Experimente verwendet wurden. Art, Stamm, Herkunft, Geschlecht, Gewicht und/ ­
oder Alter der Versuchstiere sind anzugeben. Die Tiere aller Test ­
gruppen sollen so weit wie möglich gleiches Gewicht und Alter 
aufweisen. Jede Dosierung ist an jungen ausgewachsenen Weibchen einzusetzen, die vorher noch nicht geworfen haben. Die Weibchen werden mit Männchen derselben Art und desselben Stamms verpaart, 
die Verpaarung von Geschwistern ist zu vermeiden. Bei Nagern ist 
der Tag 0 der Gravidität der Tag, an dem ein Vaginalpfropf und/oder Spermien beobachtet werden; bei Kaninchen ist der Tag 0 im All ­
gemeinen der Tag des Koitus oder der künstlichen Befruchtung, 
sofern dieses Verfahren zum Einsatz kommt. Die Käfige sind so 
aufzustellen, dass etwaige durch den Standort bedingte Auswirkun ­
gen möglichst gering sind. Jedes Versuchstier erhält zur sicheren Identifizierung eine eigene Nummer. Nach der Verpaarung werden 
die Weibchen nach dem Zufallsprinzip auf die Kontroll- und Be ­
handlungstiergruppen verteilt; erfolgt die Verpaarung der Weibchen in Gruppen, werden die Tiere in jeder Gruppe gleichmäßig auf die vorstehend genannten Gruppen verteilt. Entsprechend werden Weib ­
chen, die von demselben Männchen begattet wurden, gleichmäßig 
auf die Gruppen verteilt.
 
1.6. VERFAHREN  
1.6.1  Anzahl und Geschlecht der Versuchstiere  
Jede Versuchs- und Kontrollgruppe soll eine ausreichende Zahl von 
Weibchen enthalten, so dass etwa 20 Weibchen mit Implantations ­
stellen bei der Sektion zur Verfügung stehen. Gruppen mit weniger als 16 Tieren mit Implantationsstellen sind unter Umständen unzurei ­
chend. Durch Mortalität bei den Muttertieren wird die Studie nicht 
zwangsläufig invalide, sofern diese nicht mehr als etwa 10 % beträgt.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 459
 
1.6.2.  Zubereitung der Dosen  
Wird ein Vehikel oder ein anderer Zusatz zur leichterer Verabrei ­
chung der Prüfsubstanz verwendet, sind die folgenden Merkmale zu berücksichtigen: Auswirkungen auf die Absorption, die Verteilung, 
den Stoffwechsel und die Retention oder Exkretion der Prüfsubstanz; 
Auswirkungen auf die chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, die deren toxische Eigenschaften verändern können; ferner Auswir ­
kungen auf die Futter- oder Wasseraufnahme oder den Ernährungs ­
zustand der Versuchstiere. Das Vehikel soll weder entwicklungs ­
toxisch sein noch Auswirkungen auf die Reproduktion haben.
 
1.6.3  Dosierung  
Normalerweise soll die Prüfsubstanz täglich ab der Implantation 
(z. B. Tag 5 nach der Verpaarung) bis zum Tag vor dem geplanten 
Kaiserschnitt verabreicht werden. Sofern aus eventuell vorliegenden 
Vorstudien kein hohes Risiko eines Präimplantationsverlusts hervor ­
geht, kann die Behandlung auf die gesamte Graviditätszeit von der Verpaarung bis zum Tag vor der geplanten Tötung ausgeweitet wer ­
den. Bekanntermaßen kann eine unangemessene Behandlung oder 
Stress während der Gravidität zu pränatalen Verlusten führen. Zum Schutz vor pränatalen Verlusten durch nicht behandlungsbedingte Faktoren sind die unnötige Handhabung von trächtigen Tieren sowie 
Stress infolge von äußeren Faktoren, wie Lärm, zu vermeiden.
 
Mindestens drei Dosen und eine gleichzeitige Kontrolle werden ver ­
wendet. Gesunde Tiere werden nach dem Zufallsprinzip auf die Kon ­
troll- und Behandlungstiergruppen verteilt. Die Dosierungen sollten so gewählt werden, dass eine Abstufung der toxischen Wirkungen erkennbar ist. Soweit keine Beschränkungen aufgrund der 
physikalischen/chemischen Beschaffenheit oder der biologischen Ei ­
genschaften der Prüfsubstanz bestehen, wird die höchste Dosis so gewählt, dass zwar eine gewisse Entwicklungstoxizität und/oder ma ­
ternale Toxizität (klinische Anzeichen oder eine Abnahme des Kör ­
pergewichts), jedoch kein Tod oder schweres Leiden herbeigeführt wird. Mindestens eine unter der höchsten Dosis liegende Dosis soll zu minimalen wahrnehmbaren toxischen Auswirkungen führen. Die 
niedrigste Dosis soll keine Anzeichen von Toxizität bei den Mutter ­
tieren oder Entwicklungstoxizität hervorrufen. Eine absteigende Folge von Dosierungen sollte so ausgewählt werden, dass die Dosis ­
abhängigkeit der Reaktion und ein NOAEL belegt werden können. 
Dosisintervalle mit dem Faktor 2 bis 4 haben sich für die Festlegung 
absteigender Dosierungen häufig als optimal erwiesen. Gegenüber der Verwendung sehr großer Intervalle (z. B. mehr als Faktor 10) ist die Hinzunahme einer vierten Testgruppe häufig vorzuziehen. 
Auch wenn die Bestimmung eines NOAEL für die Muttertiere das 
Ziel ist, können auch Studien, bei denen eine solche Dosis nicht ermittelt wird, akzeptiert werden (1).
 
Bei der Auswahl der Dosierungen sollen eventuell vorliegende To ­
xizitätsdaten sowie zusätzliche Informationen über den Stoffwechsel 
und die Toxikokinetik der Prüfsubstanz oder verwandter Stoffe be ­
rücksichtigt werden. Diese Angaben sind außerdem nützlich, die Angemessenheit des Dosierungsplans zu belegen.
 
Eine gleichzeitige Kontrollgruppe soll verwendet werden. Diese 
Kontrollgruppe soll eine scheinbehandelte Gruppe oder eine Vehikel ­
kontrollgruppe sein, sofern ein Vehikel zur Verabreichung der Prüf ­
substanz verwendet wird. Allen Gruppen ist die gleiche Menge der 
Prüfsubstanz beziehungsweise des Vehikels zu verabreichen. Tiere der Kontrollgruppe(n) werden genauso behandelt wie die Tiere in der Prüfgruppe. Vehikelkontrollgruppen erhalten das Vehikel in der 
höchsten verwendeten Menge (wie die Behandlungsgruppe mit der 
niedrigsten Dosierung).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 460
 
1.6.4.  Limit-Test  
Ergibt eine Prüfung mit einer einzigen Dosierung von mindestens 
1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag bei oraler Verabreichung nach den für diese Studie beschriebenen Verfahren keine wahrnehmbare To ­
xizität bei den trächtigen Tieren oder deren Nachkommen und ist 
aufgrund von vorliegenden Daten Struktur- und/oder stoffwechsel ­
verwandter Stoffe keine Toxizität zu erwarten, kann auf eine voll ­
ständige Studie mit drei Dosisstufen gegebenenfalls verzichtet wer ­
den. Ist eine Exposition des Menschen zu erwarten, kann die Not ­
wendigkeit einer höheren oralen Dosis im Limit-Test angezeigt sein. Bei anderen Arten der Verabreichung, wie z. B. Inhalation oder 
dermale Applikation, kann durch die physikalisch-chemischen Eigen ­
schaften der Prüfsubstanz häufig die maximal erreichbare Expositi ­
onsdosis vorbestimmt und somit limitiert sein (beispielsweise soll ein Auftragen auf die Haut keine schwere lokale Toxizität verursachen).
 
1.6.5.  Verabreichung der Dosen  
Die Prüfsubstanz oder das Lösungsmittel wird im Allgemeinen oral 
durch Schlundsonde verabreicht. Wird eine andere Form der Ver ­
abreichung gewählt, hat der Prüfer seine Wahl zu begründen, unter Umständen sind dann entsprechende Änderungen erforderlich (2) (3) 
(4). Die Prüfsubstanz ist jeden Tag in etwa zur selben Zeit zu ver ­
abreichen.
 
Die Dosis für das einzelne Tier beruht normalerweise auf dessen 
zuletzt bestimmtem Körpergewicht. Vorsicht ist jedoch bei der An ­
passung der Dosis im letzten Trimester der Gravidität geboten. Zur 
Vermeidung von übermäßiger Toxizität bei den Muttertieren sind 
vorliegende Daten bei der Dosisauswahl heranzuziehen. Wird bei den behandelten Muttertieren übermäßige Toxizität festgestellt, sind diese Tiere auf humane Weise zu töten. Weisen verschiedene träch ­
tige Tiere Anzeichen von übermäßiger Toxizität auf, ist die Tötung 
der ganzen Dosisgruppe zu erwägen. Wird die Prüfsubstanz über eine Sonde verabreicht, so soll dies möglichst in einer einmaligen Dosis unter Verwendung einer Magensonde oder einer geeigneten 
Intubationskanüle erfolgen. Das maximale Flüssigkeitsvolumen, das 
einem Versuchstier jeweils verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Das Volumen soll 1 ml/100 g Körper ­
gewicht nicht überschreiten, außer bei wässrigen Lösungen, bei de ­
nen 2 ml/100 g Körpergewicht gegeben werden können. Bei Ver ­
wendung von Maisöl als Lösungsmittel soll das Volumen 0,4 ml/ ­
100 g Körpergewicht nicht übersteigen. Schwankungen beim Appli ­
kationsvolumen sind durch entsprechende Dosierung so gering wie 
möglich zu halten, so dass bei allen Dosen ein gleich bleibendes Volumen gewährleistet ist.
 
1.6.6.  Beobachtung der Muttertiere  
Klinische Beobachtungen sollen mindestens einmal täglich, vorzugs ­
weise zum gleichen Zeitpunkt und unter Berücksichtigung des Zeit ­
raums, in dem der Wirkungsgipfel nach Verabreichung der Dosis zu 
erwarten ist, vorgenommen und protokolliert werden. Der Zustand der Tiere ist dabei festzuhalten, d. h. Mortalität, Siechtum, relevante 
Verhaltensänderungen und alle Anzeichen akuter Toxizität.
 
1.6.7.  Körpergewicht und Futteraufnahme  
Die Tiere sind am Tag 0 der Gravidität beziehungsweise nicht später 
als am Tag 3 der Gravidität, wenn gepaarte Tiere von einem exter ­
nen Züchter unter Angabe der Paarungszeit geliefert werden, zu wiegen; weiterhin am ersten Tag der Verabreichung, mindestens 
alle drei Tage während der Verabreichungszeit und am Tag der 
geplanten Tötung.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 461
 
Der Futterverbrauch ist in Abständen von drei Tagen zu protokollie ­
ren, an denselben Tagen ist auch das Körpergewicht zu bestimmen.  
1.6.8.  Autopsie  
Die Weibchen sind einen Tag vor der erwarteten Geburt zu töten. 
Weibchen, bei denen Anzeichen für einen Abort oder eine vorzeitige Geburt vor der geplanten Tötung vorliegen, sind zu töten und sorg ­
fältig makroskopisch zu untersuchen.
 
Zum Zeitpunkt der Tötung oder bei vorzeitigem Tod im Verlauf der 
Studie ist das Muttertier makroskopisch auf etwaige strukturelle Ab ­
normitäten oder pathologische Veränderungen zu untersuchen. Die 
Beurteilung der Muttertiere während des Kaiserschnitts und die an ­
schließenden Untersuchungen der Feten sollen möglichst ohne Kenntnis der Behandlungsgruppe erfolgen, um etwaige Einflüsse durch Befangenheit so gering wie möglich zu halten.
 
1.6.9.  Untersuchung des Uterusinhalts  
Unmittelbar nach der Tötung beziehungsweise so bald wie möglich 
nach dem Tod ist der Uterus zu entfernen und der Trächtigkeitsstatus des Tiers zu erheben. Weist der Uterus keine Anzeichen von Träch ­
tigkeit auf, ist dieser weiter zu untersuchen (z. B. Färbung mit Am ­
moniumsulfid bei Nagern oder Salewski-Färbung oder ein geeignetes 
alternatives Verfahren für Kaninchen), um den nichtträchtigen Zu ­
stand zu bestätigen (5).
 
Der schwangere Uterus einschließlich der Zervix des trächtigen Tiers 
ist zu wiegen. Bei Tieren, die während der Studie tot aufgefunden 
werden, ist dieses Gewicht nicht zu bestimmen.  
Bei den trächtigen Tieren ist die Anzahl der Gelbkörper zu bestim ­
men.  
Der Uterusinhalt ist auf die Anzahl toter Embryonen oder Feten und 
lebensfähiger Feten zu untersuchen. Der Grad der Resorption ist zu beschreiben, um den relativen Todeszeitpunkt des Conceptus (siehe 
1.2) zu bestimmen.
 
1.6.10.  Untersuchung der Feten  
Für jeden Fetus sind Geschlecht und Körpergewicht zu bestimmen.  
Jeder Fetus ist auf äußere Veränderungen zu untersuchen (6).  
Die Feten sind auf Veränderungen an Skelett und Weichteilen (z. B. 
Abweichungen und Fehlbildungen oder Anomalien) zu untersuchen 
(7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). Nach Möglichkeit ist eine Kategorisierung fetaler Veränderungen vorzunehmen, auch wenn dies nicht zwingend erfor ­
derlich ist. Erfolgt eine Kategorisierung, sind die Kriterien zur Be ­
stimmung jeder Kategorie eindeutig anzugeben. Besondere Beach ­
tung erfordert der Reproduktionstrakt, der auf Anzeichen für eine veränderte Entwicklung zu untersuchen ist.
 
Bei Nagern sollte etwa eine Hälfte jedes Wurfs präpariert und auf 
Veränderungen am Skelett untersucht werden. Der Rest ist zu prä ­
parieren und auf Veränderungen an den Weichteilen zu untersuchen, wobei akzeptierte oder geeignete Methoden der Serienschnittherstel ­
lung oder sorgfältige makroskopische Schnitttechniken anzuwenden 
sind.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 462
 
Bei anderen Tieren als Nagern, z. B. Kaninchen, sind sämtliche 
Feten sowohl auf Weichteil- als auch auf Skelettveränderungen zu 
untersuchen. Die Körper dieser Feten werden sorgfältig seziert und auf Weichteilveränderungen untersucht; das kann auch Verfahren zur weiteren Beurteilung der inneren Herzstruktur umfassen (25). Bei der 
Hälfte der auf diese Weise untersuchten Feten entfernt man die 
Köpfe und präpariert sie zur Untersuchung auf Weichteilveränderun ­
gen (einschließlich Augen, Hirn, Nasenwege und Zunge) unter Ver ­
wendung von Standardschnitttechniken (26) oder eines gleicherma ­
ßen empfindlichen Verfahrens. Die Körper dieser Feten und der 
übrigen intakten Feten werden präpariert und mit denselben Metho ­
den wie für Nager beschrieben auf Skelettveränderungen untersucht.
 
2. DATEN  
2.1. VERARBEITUNG DER ERGEBNISSE  
Für die Muttertiere und deren Nachkommen werden die Daten je ­
weils einzeln protokolliert und in tabellarischer Form zusammenge ­
fasst; dabei werden für jede Prüfgruppe die Anzahl der Tiere zu Beginn der Prüfung, die Anzahl der während der Prüfung tot auf ­
gefundenen Tiere beziehungsweise der aus humanen Gründen getö ­
teten Tiere, der jeweilige Zeitpunkt des Todes beziehungsweise der 
Tötung, die Anzahl der trächtigen Weibchen, die Anzahl der Tiere mit Anzeichen von Toxizität, eine Beschreibung der beobachteten Anzeichen von Toxizität, einschließlich des Zeitpunkts, zu dem die 
toxischen Wirkungen eingetreten sind, deren Dauer und Schwere ­
grad, die Arten von Beobachtungen an Embryonen/Feten und alle relevanten Daten zu den Würfen angegeben.
 
Numerische Ergebnisse werden mit Hilfe eines geeigneten statisti ­
schen Verfahrens ausgewertet, wobei als Bezugsgröße für die Daten ­
analyse der Wurf verwendet wird. Anzuwenden ist ein allgemein 
anerkanntes statistisches Verfahren; die statistischen Verfahren sind im Rahmen der Studienplanung auszuwählen und zu begründen. 
Auch Daten über Tiere, die nicht bis zur geplanten Tötung überlebt 
haben, sind zu protokollieren, Soweit relevant, können solche Daten in Gruppenmittelwerten berücksichtigt werden. Die Relevanz der von solchen Tieren stammenden Daten und demzufolge deren Einbezie ­
hung in oder Ausschluss aus (einem) etwaig(en) Gruppenmittel ­
wert(en) sind zu begründen und jeweils im Einzelfall zu beurteilen.
 
2.2. BEWERTUNG DER ERGEBNISSE  
Die Befunde der Studie zur pränatalen Entwicklungstoxizität sind 
anhand der beobachteten Wirkungen zu beurteilen. Die Bewertung soll die folgenden Informationen beinhalten:
 
— Ergebnisse von Prüfungen an Muttertieren und Embryonen/Feten, 
einschließlich Bewertung des bestehenden beziehungsweise nicht 
bestehenden Zusammenhangs zwischen der Exposition der Tiere gegenüber der Prüfsubstanz und der Häufigkeit und Schwere alter Befunde;
 
— Kriterien, die zur Kategorisierung von äußerlichen Veränderun ­
gen sowie von Weichteil- und Skelettveränderungen bei Feten 
herangezogen wurden, sofern eine Kategorisierung erfolgte;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 463
 
— falls angebracht, historische Kontrolldaten zur besseren Interpre ­
tation der Studienergebnisse;  
— die Zahlen, die bei der Berechnung alter Prozentangaben oder 
Indizes verwendet wurden;  
— eine angemessene statistische Analyse der Studienbefunde, so ­
weit angebracht, wobei hinreichende Informationen über die 
Analysemethode anzugeben sind, so dass ein unabhängiger 
Überprüfer/Statistiker die Analyse nachbewerten und nachvoll ­
ziehen kann.  
Für Prüfungen, bei denen keine toxischen Wirkungen nachgewiesen 
werden, sind weitere Untersuchungen zur Bestimmung von Absorp ­
tion und Bioverfügbarkeit der Prüfsubstanz in Erwägung zu ziehen.  
2.3. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Eine Studie zur Prüfung auf pränatale Entwicklungstoxizität liefert 
Informationen über die Auswirkungen einer wiederholten Exposition 
gegenüber einer Substanz während der Trächtigkeit auf die Mutter ­
tiere und auf die intrauterine Entwicklung ihrer Nachkommen. Die Ergebnisse der Studie sind in Verbindung mit Befunden aus Studien zur subchronischen Toxizität, Reproduktionstoxizität und Toxikoki ­
netik sowie anderen Studien zu interpretieren. Da der Schwerpunkt 
sowohl auf allgemeine Toxizität im Sinne maternaler Toxizität als auch auf die Entwicklungstoxizität gelegt wird, bieten die Ergebnisse der Studie zu einem bestimmten Maß die Möglichkeit zur Unter ­
scheidung zwischen Auswirkungen auf die Entwicklung, die nur 
bei Dosierungen ausgelöst werden, die auch für das Muttertier to ­
xisch sind, und solchen ohne allgemeine Toxizität.
 
3. BERICHTERSTATTUNG  
3.1. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss die folgenden konkreten Angaben enthalten: 
Prüfsubstanz:  
Physikalische Beschaffenheit und, soweit relevant, physikalisch-che ­
mische Eigenschaften;  
— Identifizierung einschließlich CAS-Nummer, sofern bekannt/ ­
festgelegt;  
— Reinheit.  
— Vehikel (sofern zutreffend):  
Begründung der Wahl des Vehikels, sofern nicht Wasser verwendet 
wurde.  
— Versuchstiere:  
Art und Stamm;  
— Zahl und Alter der Versuchstiere;  
— Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.;  
— Einzelgewicht der Tiere zu Beginn der Prüfung.  
— Prüfbedingungen:  
Begründung der Wahl der Dosisabstufung;  
— Einzelheiten der Formulierung der Prüfsubstanz/ ­
Futterzubereitung, erzielte Konzentration, Stabilität und Homoge ­
nität der Zubereitung;  
— Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 464
 
— Umrechnung der Prüfsubstanzkonzentration in Futter/Trinkwasser 
(ppm) auf die tatsächliche Dosis (mg/kg Körpergewicht/Tag), 
soweit zutreffend;  
— Umgebungsbedingungen;  
— Einzelheiten zur Futter- und Wasserqualität.  
— Ergebnisse:  
Dosisbezogene Daten zur toxischen Reaktion der Muttertiere, unter 
anderem:  
Anzahl der Tiere zu Beginn der Prüfung, Anzahl der überlebenden 
Tiere, Anzahl der trächtigen Tiere sowie Anzahl der Aborte und Anzahl der Frühgeburten;
 
— Tag des Todes im Verlauf der Studie oder Angabe, ob Tiere bis 
zum Schluss überlebt haben;  
— Daten von Tieren, die nicht bis zur geplanten Tötung überlebten, 
sind zwar zu protokollieren, nicht jedoch in die gruppenübergrei ­
fenden statistischen Vergleiche mit einzubeziehen;  
— Tag der Beobachtung jedes anormalen klinischen Anzeichens 
und dessen weiterer Verlauf;  
— Körpergewicht, Veränderung des Körpergewichts und Gewicht 
des Uterus in trächtigem Zustand, wahlweise einschließlich Ver ­
änderung der Körpergewichts korrigiert um das Gewicht des Uterus in trächtigem Zustand;
 
— Futteraufnahme und, sofern gemessen, Wasseraufnahme;  
— Sektionsbefunde einschließlich Uterusgewicht;  
— NOAEL-Werte für Auswirkungen auf die Muttertiere und auf die 
Entwicklung sind anzugeben.  
— Dosisbezogene Entwicklungsparameter für Würfe mit Implanta ­
tionen, einschließlich:  
Anzahl Gelbkörper;  
— Anzahl Implantationen, Anzahl und prozentualer Anteil von le ­
benden und toten Feten sowie von Resorptionen;  
— Anzahl und prozentualer Anteil von Prä- und Postimplantations ­
verlusten.  
— Dosisbezogene Entwicklungsparameter für Würfe mit lebenden 
Feten einschließlich:  
Anzahl und prozentualer Anteil lebender Nachkommen;  
— Verhältnis der Geschlechter;  
— fetales Körpergewicht, möglichst jeweils getrennt nach Ge ­
schlechtern und für beide Geschlechter  
— zusammen;  
— äußere Weichteil- und Skelettmissbildungen und sonstige rele ­
vante Veränderungen;  
— Kriterien für die Kategorisierung, sofern zutreffend;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 465
 
— Gesamtanzahl und prozentualer Anteil von Feten und Würfen mit 
äußerlichen Veränderungen, Weichteil- oder Skelettveränderun ­
gen sowie Arten und Häufigkeiten einzelner Anomalien und sonstiger relevanter Veränderungen.
 
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  
4. LITERATURHINWEISE  
(1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence 
of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for 
Developmental Toxicity,  Risk Analysis  16; 399-410.  
(2) Kimmel, C.A, and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal 
Developmental Toxicity Studies.  Fundamental and Applied 
Toxicology  14; 386-398.  
(3) Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems.  CIIT 
Activities  17; 1-8.  
(4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E-Speci ­
fic Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation De ­
velopmental Toxicity Study.  
(5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum makroskopischen 
Nachweis von Implantationsstellen am Uterus der Ratte.  Nau­
nyn-Schmeidebergs Archiv für Pharmakologie und Experimen ­
telle Pathologie  247, 367.  
(6) Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo. In  Advances in Teratology.  D.H.M. Woolam 
(ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.  
(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S.  
Congenital Anomalies  16; 171-173.  
(8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Technique for Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses,  Con­
genital Anomalies  32; 381-391.
 
(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat.  Teratology  47, 229-242.  
(10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats.  Teratology  37; 476.
 
(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses.  Journal of Morpho ­
logy 127, 291-306.  
(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits as Indicative 
of Foetal Maturity.  Teratology  11; 313-320.  
(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies.  Toxicology and Applied Pharmacology  9; 398-408.  
(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations?  Teratology  8; 309-316.  
(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to 
Ethylene Glycol.  Teratology  46; 169-181.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 466
 
(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foe ­
tuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and His ­
tological Study of Viscera.  Supplement to Teratology Work ­
shop Manual,  163-173.  
(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Pos ­
sible Influence of the Sex Factor.  American Journal of Ana ­
tomy  41; 411-445.
 
(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone.  Stain Technology  39; 61-63.
 
(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) 
Skeleton.  American Journal of Anatomy  36; 313-355.  
(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Exa ­
mination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing.  Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis  4; 
181-188.
 
(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957)  The Genesis of the 
Rat Skeleton.  Thomas, Springfield, IL.  
(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Terato ­
logy. In  Teratology: Principles and Techniques,  Wilson J.G. 
and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, 251-277.
 
(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977)  Handbook of 
Teratology,  Vol. 4. Plenum, NY.  
(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Tech ­
niques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity.  Acta Vet. 
Acad. Sci. Hung,  28; 233-239.  
(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mam ­
malian Foetuses.  Teratology  9; 37-38.  
(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In:  Methods in Prenatal Toxicology  Neubert, D., Mer ­
ker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, 
Chicago, IL, 126-144.
 
(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment.  Federal Register  
56; 63798-63826.  
(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Ab ­
normalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) 
Teratology 55; 249-292.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 467
 
B.32  PRÜFUNGEN AUF KANZEROGENITÄT  
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 451 (2009). Die 
ursprüngliche TG 451 über Prüfungen auf Kanzerogenität wurde 1981 an ­
genommen. Die Entwicklung dieser überarbeiteten Prüfmethode B.32 wurde 
für notwendig gehalten, um neueren Entwicklungen auf dem Gebiet des 
Tierschutzes sowie Regulierungsanforderungen Rechnung zu tragen (2) (3) (4) (5) (6). Diese Prüfmethode B.32 wurde parallel zur Überarbeitung von Kapitel B.30 dieses Anhangs „Prüfungen auf chronische Toxizität“ und 
Kapitel B.33 dieses Anhang „Kombinierte Studien zur Prüfung auf chro ­
nische Toxizität und Kanzerogenität“ aktualisiert mit dem Ziel, zusätzliche Informationen von den in der Untersuchung verwendeten Tieren und detail ­
liertere Angaben zur Wahl der Dosis zu gewinnen. Diese Prüfmethode B.32 
ist dazu ausgelegt, für die Prüfung eines breiten Spektrums von chemischen 
Stoffen, einschließlich Pestiziden und Industriechemikalien, verwendet zu werden. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass bestimmte Details und An ­
forderungen für Pharmazeutika abweichen können (siehe Internationale 
Harmonisierungskonferenz (ICH) Guidance S1B on Testing for Carcinoge ­
nicity of Pharmaceuticals).
 
2. Bei den meisten Prüfungen auf Kanzerogenität werden Nagetierarten ver ­
wendet; diese Prüfmethode gilt daher hauptsächlich für Prüfungen, die an diesen Arten durchgeführt werden. Wenn solche Prüfungen an Nichtnagern 
erforderlich sind, gelten die Grundsätze und Verfahren dieser Prüfmethode 
in Kombination mit denen des Kapitels B.27 dieses Anhangs „Prüfung auf subchronische orale Toxizität — 90-Tage-Toxizitätsstudie mit wiederholter Verabreichung an Nicht-Nagetieren“ (6) mit entsprechenden Änderungen. 
Weitere Hinweise sind dem OECD Guidance Document No. 116 on the 
Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (7) zu entnehmen.
 
3. Bei Prüfungen auf Kanzerogenität finden im Wesentlichen die orale, die 
dermale und die inhalative Verabreichung Anwendung. Die Wahl des Ver ­
abreichungswegs hängt von den physikalischen und chemischen Eigenschaf ­
ten der Prüfsubstanz und der vorherrschenden Art der Exposition beim Menschen ab. Zusätzliche Informationen zur Wahl des Expositionswegs sind im Guidance Document No. 116 (7) enthalten.
 
4. Bei dieser Prüfmethode steht die Exposition auf oralem Weg im Vorder ­
grund. Dies ist der bei Prüfungen auf Kanzerogenität am häufigsten ver ­
wendete Expositionsweg. Zwar sind Prüfungen auf Kanzerogenität mit Ex ­
position über die Haut oder durch Inhalation möglicherweise auch notwen ­
dig, um das Risiko für die menschliche Gesundheit zu beurteilen, und/oder 
im Rahmen bestimmter Regelungen vorgeschrieben, aber diese beiden Ex ­
positionswege sind aus technischer Sicht außerordentlich komplex. Derartige Prüfungen sind von Fall zu Fall zu konzipieren, wobei die hier beschriebene Prüfmethode für die Bewertung und Evaluierung der Kanzerogenität bei 
oraler Verabreichung allerdings mit Bezug auf Empfehlungen für Behand ­
lungszeiten, klinische und Pathologieparameter usw. als Grundlage für ein Protokoll für Inhalations- und/oder dermale Prüfungen dienen könnte. Es gibt OECD-Leitlinien für die Verabreichung von Prüfsubstanzen durch In ­
halation (7) (8) und über die Haut (7). Bei der Konzeption längerfristiger 
Prüfungen mit Exposition durch Inhalation sind insbesondere Kapitel B.8 dieses Anhangs (9) und Kapitel B.29 dieses Anhangs (10) sowie das OECD Guidance Document über Prüfungen auf akute Toxizität nach Inhalation (8) 
zu berücksichtigen. Bei Prüfungen mit dermaler Applikation ist Kapitel B.9 
dieses Anhangs (11) zu beachten.
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5. Die Prüfung auf Kanzerogenität liefert Informationen über mögliche gesund ­
heitliche Schädigungen, die durch wiederholte Exposition über einen Zeit ­
raum entstehen können, der sich über die gesamte Lebensdauer der ver ­
wendeten Art erstrecken kann. Sie liefert Informationen über die toxischen Wirkungen der Prüfsubstanz, einschließlich der potenziellen Kanzerogenität, 
und kann Hinweise auf Zielorgane und die Möglichkeit der Akkumulation 
geben. Außerdem kann sie zur Ableitung eines NOAEL-Werts (Dosis ohne beobachtete schädigende Wirkung) für toxische Wirkungen und, im Fall von nicht genotoxischen Karzinogenen, für Tumorreaktionen beitragen, der zur 
Festlegung von Sicherheitskriterien für die Humanexposition herangezogen 
werden kann. Ferner wird die Notwendigkeit sorgfältiger klinischer Be ­
obachtung der Tiere hervorgehoben, damit so viele Informationen wie mög ­
lich gewonnen werden können.
 
6. Zu den Zielen von Prüfungen auf Kanzerogenität nach dieser Prüfmethode 
gehören  
— die Identifizierung der kanzerogenen Eigenschaften einer Prüfsubstanz, 
die im Vergleich zu gleichzeitigen Kontrollgruppen zu einer erhöhten Inzidenz von Neoplasmen, einem erhöhten Anteil maligner Neoplasmen oder einem schnelleren Auftreten von Neoplasmen führen,
 
— die Identifizierung des Zielorgans/der Zielorgane der Kanzerogenität,  
— die Ermittlung der Zeit bis zum Auftreten von Neoplasmen,  
— die Beschreibung der Beziehung zwischen der Dosis und der Tumorre ­
aktion,  
— die Bestimmung eines NOAEL-Werts (Dosis ohne beobachtete schädi ­
gende Wirkung) oder eines Ausgangspunkts für die Festlegung einer Benchmark-Dosis (BMD),
 
— die Extrapolation kanzerogener Wirkungen auf Expositionsniveaus von 
Menschen bei geringer Dosis,  
— die Gewinnung von Daten zur Prüfung von Hypothesen über die Wir ­
kungsweise (2) (7) (12) (13) (14) (15).  
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN  
7. Bei der Beurteilung und Bewertung des Kanzerogenitätspotenzials einer 
Prüfsubstanz sollte das Prüflabor vor Durchführung der Studie alle verfüg ­
baren Informationen über die Prüfsubstanz berücksichtigen, damit die Stu ­
dienauslegung auf eine effizientere Prüfung des Kanzerogenitätspotenzials ausgerichtet und die Verwendung von Versuchstieren minimiert werden 
kann. Es ist wichtig, die Wirkungsweise eines vermutlichen Karzinogens 
zu kennen und zu berücksichtigen (2) (7) (12) (13) (14) (15), da die opti ­
male Studienauslegung je nachdem, ob die Prüfsubstanz ein bekanntes oder vermutliches genotoxisches Karzinogen ist, unterschiedlich sein kann. Nä ­
here Hinweise zu Aspekten der Wirkungsweise sind im Guidance Document 
No. 116 (7) zu finden.
 
8. Für die Auslegung der Studie könnten u. a. Informationen wie die Identität, 
die chemische Struktur und die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, Ergebnisse jeglicher In-vitro- oder In-vivo-Toxizitätsprüfungen 
einschließlich Genotoxizitätsprüfungen, vorgesehene Verwendungen und die 
Möglichkeit der Exposition des Menschen, (Q)SAR-Daten, Daten über Mu ­
tagenität/Genotoxizität, Kanzerogenität und andere toxikologische Daten über strukturverwandte Substanzen, toxikokinetische Daten (Kinetik bei 
Einzel- und Mehrfachdosierung) sowie Daten aus anderen Studien mit wie ­
derholter Exposition herangezogen werden. Die Kanzerogenität sollte erst
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beurteilt werden, wenn erste Informationen über die Toxizität aus Toxizitäts ­
prüfungen mit wiederholter Gabe über 28 Tage und/oder 90 Tage vorliegen. 
Auch Kurzzeitversuche zur Krebsinitiation-/promotion können nützliche In ­
formationen liefern. Im Rahmen der Gesamtbewertung der potenziellen schädlichen Wirkungen einer bestimmten Prüfsubstanz auf die Gesundheit 
sollte bei der Prüfung auf Kanzerogenität etappenweise vorgegangen werden 
(16) (17) (18) (19).
 
9. Vor Beginn der Prüfung ist festzulegen, welche Statistikmethoden ange ­
sichts der Versuchsauslegung und der Ziele am besten für die Analyse der Ergebnisse geeignet sind. Dabei ist u. a. zu entscheiden, ob die Statistiken 
Anpassungen in Bezug auf die Überlebensrate, die Analyse kumulativer 
Tumorrisiken bezogen auf die Überlebensdauer, die Analyse des Zeitraums bis zum Auftreten eines Tumors und die Analyse bei vorzeitigem Tod der Tiere einer oder mehrerer Gruppen umfassen sollten. Hinweise zu den ge ­
eigneten statistischen Analysen und wichtige Literaturverweise zu interna ­
tional anerkannten Statistikmethoden sind im Guidance Document No. 116 (7) sowie im Guidance Document No. 35 on the analysis and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity studies (20) zu finden.
 
10. Bei der Durchführung einer Prüfung auf Kanzerogenität sind stets die im 
OECD Guidance Document No. 19 on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation (21), insbesondere in Absatz 62, genannten Grundsätze und Erwägungen zu befolgen. In diesem Absatz heißt es:  Wenn ein Tier 
in Studien mit wiederholter Verabreichung progressive klinische Anzeichen 
für eine fortschreitende Verschlechterung seines Zustands aufweist, ist eine informierte Entscheidung zu treffen, ob das Tier tierschutzgerecht getötet werden sollte oder nicht. Bei dieser Entscheidung sind Faktoren wie der 
Wert der Informationen, die bei Verbleiben des Tiers in der Studie gewon ­
nen werden können, und der allgemeine Gesundheitszustand des Tiers ge ­
geneinander abzuwägen. Wird beschlossen, das Tier in der Studie zu be ­
lassen, ist es entsprechend den Erfordernissen häufiger zu beobachten. Zur 
Linderung von Schmerzen oder Qualen kann auch die Verabreichung der Prüfsubstanz unterbrochen oder die Dosis verringert werden, sofern dabei der Zweck der Prüfung nicht beeinträchtigt wird.
 
11. Ausführliche Informationen und eine Diskussion der Prinzipien der Dosis ­
wahl bei Studien zur Prüfung auf chronische Toxizität und Kanzerogenität 
sind im Guidance Document No. 116 (7) sowie in zwei Veröffentlichungen des International Life Sciences Institute (22) (23) zu finden. Die grund ­
legende Strategie der Dosiswahl hängt von den Hauptzielen der Studie ab 
(Nummer 6). Bei der Auswahl der geeigneten Dosisstufen ist ein Gleichge ­
wicht zwischen Gefahrenidentifizierung einerseits und der Beschreibung von Wirkungen bei geringer Dosierung und ihrer Relevanz andererseits herzu ­
stellen. Dieses Gleichgewicht ist bei einer kombinierten Studie zur Prüfung 
auf chronische Toxizität und auf Kanzerogenität (Kapitel B.33 dieses An ­
hangs) besonders wichtig (Nummer 12).
 
12. Es sollte in Betracht gezogen werden, statt einer getrennten Durchführung 
einer Prüfung auf chronische Toxizität (Kapitel B.30 dieses Anhangs) und einer Prüfung auf Kanzerogenität (diese Prüfmethode B.32) eher eine kom ­
binierte Prüfung auf chronische Toxizität und Kanzerogenität (Kapitel B.33 
dieses Anhangs) durchzuführen. Die kombinierte Methode ist zeit- und kos ­
teneffizienter als zwei getrennte Studien, ohne dass dabei die Qualität der Daten der chronischen Komponente oder der Kanzerogenitätskomponente 
beeinträchtigt würde. Bei Durchführung einer kombinierten Prüfung auf 
chronische Toxizität und Kanzerogenität (Kapitel B.33 dieses Anhangs) sind die Grundsätze der Dosiswahl (Nummer 11 und Nummern 22-25) jedoch genau zu beachten. Es wird allerdings anerkannt, dass im Rahmen 
bestimmter Regelungen möglicherweise getrennte Prüfungen vorgeschrieben 
sind.
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13. Die im Zusammenhang mit dieser Prüfmethode verwendeten Begriffe wer ­
den am Ende dieses Kapitels und im Guidance Document 116 (7) definiert.  
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
14. Die Prüfsubstanz wird mehreren Gruppen von Versuchstieren für den grö ­
ßeren Teil ihrer Lebenszeit täglich in abgestuften Dosen in der Regel oral 
verabreicht. Die Verabreichung durch Inhalation oder auf dermalem Weg kann ebenfalls angebracht sein. Die Tiere werden sorgfältig auf Toxizitäts ­
zeichen und das Auftreten neoplastischer Veränderungen beobachtet. Tiere, 
die im Verlauf der Prüfung sterben, und vorzeitig getötete Tiere werden 
seziert; die nach Abschluss der Prüfung überlebenden Tiere werden getötet und ebenfalls seziert.
 
BESCHREIBUNG DER METHODE  
Auswahl von Versuchstierarten  
15. Diese Prüfmethode betrifft hauptsächlich die Bewertung und Evaluierung 
der Kanzerogenität bei Nagetieren (Nummer 2). Die Verwendung anderer Arten als Nagetiere kann in Betracht gezogen werden, wenn die vorliegen ­
den Daten darauf hindeuten, dass sie für die Vorhersage gesundheitlicher 
Wirkungen beim Menschen von größerer Relevanz sind. Die Wahl der Tier ­
art ist zu begründen. Die bevorzugte Nagetierart ist die Ratte, doch können auch andere Nagetierarten, z. B. die Maus, verwendet werden. Obwohl die 
Verwendung der Maus in Prüfungen auf Kanzerogenität nur von begrenztem 
Nutzen sein mag (24) (25) (26), schreiben einige geltende Regulierungs ­
programme nach wie vor Kanzerogenitätsprüfungen an der Maus vor, sofern nicht gezeigt werden kann, dass eine solche Studie wissenschaftlich nicht 
erforderlich ist. Ratten und Mäuse sind wegen ihrer relativ kurzen Lebens ­
zeit, der weit verbreiteten Verwendung in pharmakologischen und toxikolo ­
gischen Studien, ihrer Anfälligkeit für die Entstehung von Tumoren und der Verfügbarkeit ausreichend beschriebener Stämme die bevorzugten Versuchs ­
modelle. Daher liegen über ihre Physiologie und Pathologie umfangreiche 
Informationen vor. Zusätzliche Informationen zur Wahl der Tierart und des Stamms sind im Guidance Document No. 116 (7) enthalten.
 
16. Es sind junge, gesunde, adulte Tiere aus üblicherweise eingesetzten Labor ­
stämmen zu verwenden. Für die Prüfung auf Kanzerogenität sollten mög ­
lichst Tiere desselben Stamms und derselben Herkunft verwendet werden wie für die kürzere(n) Toxizitätsvorstudie(n). Wenn jedoch bekannt ist, dass Tiere dieses Stamms und dieser Herkunft die allgemein anerkannten Über ­
lebenskriterien für Langzeitstudien [siehe Guidance Document No. 116 (7)] 
nicht erfüllen, ist die Verwendung eines Tierstamms mit ausreichender Überlebensrate für die Langzeitstudie in Betracht zu ziehen. Die weiblichen Tiere dürfen weder bereits geworfen haben noch trächtig sein.
 
Haltung und Fütterung  
17. Die Tiere können entweder einzeln oder in kleinen gleichgeschlechtlichen 
Gruppen in Käfigen untergebracht werden. Eine Einzelunterbringung ist nur 
in Betracht zu ziehen, wenn dies wissenschaftlich gerechtfertigt ist (27) (28) (29). Die Käfige sollten so angeordnet werden, dass etwaige Einflüsse der Käfigplatzierung minimiert werden. Die Temperatur im Versuchstierraum 
sollte 22 °C (± 3 °C) betragen. Die relative Luftfeuchtigkeit sollte mindes ­
tens 30 % betragen und — außer beim Reinigen des Raums — 70 % nicht überschreiten. Angestrebt werden sollte eine Luftfeuchtigkeit von 50-60 %. Die Beleuchtung sollte künstlich sein und die Hell- und Dunkelphasen 
sollten sich im Abstand von 12 Stunden abwechseln. An die Versuchstiere 
kann herkömmliches Laborfutter verfüttert werden, und eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung ist zu gewährleisten. Das Futter sollte den Nährstoff ­
bedarf der eingesetzten Tierart decken und möglichst wenig Schadstoffe wie 
z. B. Pestizidrückstände, persistente organische Schadstoffe, Phytoöstrogene, 
Schwermetalle und Mykotoxine enthalten, die das Ergebnis der Prüfung
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beeinflussen könnten. Das Futter ist regelmäßig, und zwar zumindest zu 
Beginn der Prüfung und bei Verwendung einer anderen Charge, auf den 
Nährstoff- und Schadstoffgehalt hin zu analysieren; die Ergebnisse sind im Abschlussbericht anzugeben. Ergebnisse von Analysen des in der Prüfung verwendeten Trinkwassers sind ebenfalls anzugeben. Die Auswahl des Fut ­
ters wird eventuell dadurch beeinflusst, dass eine geeignete Beimischung 
einer Prüfsubstanz und die Deckung des Nährstoffbedarfs der Tiere sicher ­
gestellt werden muss, wenn die Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht wird.
 
Vorbereitung der Tiere  
18. Es sind gesunde Tiere zu verwenden, die mindestens sieben Tage an die 
Laborbedingungen gewöhnt und zuvor nicht für andere Experimente ver ­
wendet wurden. Bei Nagetieren sollte die Verabreichung so bald wie mög ­
lich nach dem Absetzen und der Eingewöhnung beginnen, vorzugsweise bevor die Tiere 8 Wochen alt sind. Art, Stamm, Herkunft, Geschlecht, Gewicht und Alter der Versuchstiere sind anzugeben. Bei Beginn der Studie 
sollten die Gewichtsunterschiede bei den Tieren beider Geschlechter mög ­
lichst gering sein und ± 20 % des geschlechtsspezifischen Durchschnitts ­
gewichts aller Tiere in der Studie nicht überschreiten. Die Tiere werden nach dem Zufallsprinzip in Kontroll- und Behandlungsgruppen eingeteilt. 
Nach der Randomisierung sollte sich das Durchschnittsgewicht der Tiere 
desselben Geschlechts von Gruppe zu Gruppe nicht signifikant unterschei ­
den. Gibt es statistisch signifikante Unterschiede, sollte die Randomisierung möglichst wiederholt werden. Jedes Versuchstier erhält zur sicheren Identi ­
fizierung eine eigene Nummer und wird durch Tätowierung, Mikrochipim ­
plantat oder auf eine andere geeignete Weise mit dieser Nummer gekenn ­
zeichnet.
 
VERFAHREN  
Zahl und Geschlecht der Versuchstiere  
19. Es sind Tiere beider Geschlechter zu verwenden. Es sollten so viele Tiere 
verwendet werden, dass eine gründliche biologische und statistische Auswer ­
tung möglich ist. Jede Dosisgruppe und jede gleichzeitige Kontrollgruppe sollte daher mindestens 50 Tiere je Geschlecht umfassen. Je nach Ziel der 
Studie kann die statistische Aussagekraft von Schlüsselwerten durch ungleiche 
Verteilung der Tiere auf die verschiedenen Dosisgruppen erhöht werden, wobei z. B. zur Einschätzung des karzinogenen Potenzials bei niedrigen Dosen mehr als 50 Tiere in die Gruppen mit niedriger Dosis eingeteilt wer ­
den. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass eine mäßige Erhöhung der Grup ­
pengröße nur zu einer relativ geringen Erhöhung der statistischen Aussage ­
kraft der Studie führt. Weitere Informationen zur statistischen Auslegung der Studie und zur Wahl der Dosisstufen zwecks Maximierung der statistischen 
Aussagekraft sind im Guidance Document No. 116 (7) enthalten.
 
Tötungen im Verlauf der Studie und Satelliten-(Sentinel-)Gruppen  
20. Es kann vorgesehen werden, dass Tiere im Verlauf der Studie, z. B. nach 
zwölf Monaten, getötet werden, um Erkenntnisse über den Fortgang neo ­
plastischer Veränderungen und mechanistische Informationen zu gewinnen, falls dies wissenschaftlich gerechtfertigt ist. Wenn diese Informationen be ­
reits aus vorherigen Toxizitätsstudien mit wiederholter Gabe der Prüfsub ­
stanz vorliegen, sind zwischenzeitliche Tötungen möglicherweise wissen ­
schaftlich nicht gerechtfertigt. Wenn vorgesehen ist, dass Tiere im Verlauf der Studie getötet werden, beträgt die Zahl der für derartige Tötungen vor ­
gesehenen Tiere in jeder Dosisgruppe normalerweise je zehn Tiere beider 
Geschlechter, und die Gesamtzahl der Tiere in der Studie sollte um die Zahl 
der Tiere erhöht werden, die vor Beendigung der Studie getötet werden sollen. Der Krankheitsstatus während der Studie kann erforderlichenfalls mit einer zusätzlichen Gruppe von Sentineltieren (normalerweise je fünf 
Tiere beider Geschlechter) überwacht werden (30). Das Guidance Document 
No. 116 (7) enthält nähere Hinweise.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 472
 
Dosisgruppen und Dosierung  
21. Das Guidance Document No. 116 (7) enthält Hinweise zu allen Aspekten 
der Dosiswahl und zu den Abständen der Dosisstufen. Mindestens drei Dosisstufen und eine gleichzeitige Kontrolle sollten verwendet werden. 
Die Dosisstufen werden im Allgemeinen auf der Grundlage der Ergebnisse 
von Studien mit kurzzeitiger wiederholter Verabreichung oder Dosisfin ­
dungsstudien festgelegt und sollten alle vorliegenden toxikologischen und toxikokinetischen Daten für die Prüfsubstanz oder verwandte Stoffe berück ­
sichtigen.
 
22. Soweit keine Beschränkungen aufgrund der physikalisch-chemischen Be ­
schaffenheit oder der biologischen Wirkungen der Prüfsubstanz bestehen, ist die höchste Dosisstufe so zu wählen, dass zwar die Hauptzielorgane und die toxischen Wirkungen identifiziert werden können, aber Leiden, 
schwere Toxizität, Morbidität oder Tod der Tiere vermieden werden. Unter 
Berücksichtigung der unter Nummer 23 beschriebenen Faktoren ist die höchste Dosisstufe normalerweise so zu wählen, dass Anzeichen von Toxi ­
zität hervorgerufen werden, die sich z. B. in einer verzögerten Körper ­
gewichtsentwicklung äußern (etwa 10 %). Je nach den Zielen der Studie 
(siehe Nummer 6) kann jedoch eine Höchstdosis festgelegt werden, die unter der zu Toxizitätszeichen führenden Dosis liegt, z. B. wenn eine Dosis eine besorgniserregende Wirkung auslöst, die sich aber nur geringfügig auf 
Lebensdauer oder Körpergewicht auswirkt.
 
23. Die Dosisstufen und die Abstände der Dosisstufen können so gewählt wer ­
den, dass auf der niedrigsten Dosisstufe eine Dosis-Wirkungs-Beziehung 
und, je nach Wirkungsweise der Prüfsubstanz, ein NOAEL-Wert oder an ­
dere angestrebte Studienergebnisse, z. B. ein BMD (siehe Nummer 25), festgestellt werden können. Zu den Faktoren, die bei der Festlegung nied ­
rigerer Dosen zu berücksichtigen sind, gehören die voraussichtliche Stei ­
gung der Dosis-Wirkungs-Kurve, die Dosen, bei denen wichtige Änderun ­
gen des Metabolismus oder der toxischen Wirkungsweise eintreten können, und das Niveau, bei dem eine Schwelle oder ein Ausgangspunkt für eine 
Extrapolation niedriger Dosen erwartet wird.
 
24. Welche Dosisstufenabstände gewählt werden, hängt von den Merkmalen der 
Prüfsubstanz ab und kann in dieser Prüfmethode nicht vorgeschrieben wer ­
den. Abstände mit einem Faktor von 2 bis 4 erweisen sich jedoch oft als gut geeignet für die Festsetzung abnehmender Dosisstufen. Außerdem ist es oft besser, statt der Verwendung sehr großer Intervalle (z. B. mit einem Faktor 
zwischen 6 und 10) zwischen den Dosierungen eine vierte Prüfgruppe ein ­
zurichten. Die Verwendung von Faktoren über 10 sollte im Allgemeinen vermieden bzw. gegebenenfalls begründet werden.
 
25. Entsprechend dem Guidance Document No. 116 (7) sind bei der Dosisfest ­
legung u. a. folgende Faktoren zu berücksichtigen:  
— bekannte oder vermutete Nichtlinearitäten oder Wendepunkte der 
Dosis-Wirkungs-Kurve;  
— Toxikokinetik und Dosisbereiche, bei denen die metabolische Induktion, 
die Sättigung oder die Nichtlinearität zwischen externen und internen 
Dosen auftritt oder nicht auftritt;  
— Vorläuferläsionen, Wirkungsmarker oder Indikatoren für den Ablauf zu ­
grunde liegender biologischer Schlüsselprozesse;  
— wichtige (oder vermutete) Aspekte der Wirkungsweise, z. B. Dosen, ab 
denen Zytotoxizität auftritt, Hormonspiegel beeinflusst werden, homö ­
ostatische Mechanismen gestört werden usw.;  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 473
 
— Bereiche der Dosis-Wirkungs-Kurve, bei denen eine besonders genaue 
Schätzung erforderlich ist, z. B. im Bereich der vorgesehenen BMD oder 
einer vermuteten Schwelle;  
— Berücksichtigung voraussichtlicher Expositionsniveaus von Menschen.  
26. Die Kontrollgruppe ist eine unbehandelte Gruppe oder eine Vehikelkontroll ­
gruppe, sofern ein Vehikel zur Verabreichung der Prüfsubstanz verwendet 
wird. Abgesehen von der Behandlung mit der Prüfsubstanz sollten die Tiere 
der Kontrollgruppe genauso behandelt werden wie die Tiere in den Prüf ­
gruppen. Wird ein Vehikel verwendet, erhält die Kontrollgruppe das Vehikel im höchsten bei den Dosisgruppen verwendeten Volumen. Wird eine Prüf ­
substanz mit dem Futter verabreicht und führt dies aus geschmacklichen 
Gründen zu einer verminderten Futteraufnahme, kann eine paarweise gefüt ­
terte Kontrollgruppe nützlich und eine bessere Kontrolle sein.
 
Zubereitung der Dosen und Verabreichung der Prüfsubstanz  
27. Die Prüfsubstanz wird in der Regel oral, d. h. mit der Nahrung oder dem 
Trinkwasser, oder über eine Schlundsonde verabreicht. Zusätzliche Informa ­
tionen zu Verabreichungswegen und -methoden sind im Guidance Docu ­
ment No. 116 (7) enthalten. Verabreichungsweg und -methode richten sich nach dem Zweck der Studie, den physikalisch-chemischen Eigenschaf ­
ten der Prüfsubstanz, ihrer Bioverfügbarkeit und der vorherrschenden Art 
der Exposition beim Menschen. Der gewählte Verabreichungsweg und die 
Methode sollten begründet werden. Aus Tierschutzgründen sollte die Schlundsonde nur für Agenzien gewählt werden, bei denen dieser Weg und diese Methode der Verabreichung die potenzielle Humanexposition 
annähernd repräsentieren (z. B. Arzneimittel). Nahrungs- oder Umweltche ­
mikalien einschließlich Pestizide werden normalerweise mit dem Futter oder dem Trinkwasser verabreicht. Für bestimmte Szenarios, z. B. berufliche Exposition, können andere Applikationswege besser geeignet sein.
 
28. Bei Bedarf wird die Prüfsubstanz in einem geeigneten Vehikel gelöst oder 
suspendiert. Zu berücksichtigen sind gegebenenfalls folgende Merkmale des Vehikels und anderer Additive: Auswirkungen auf die Resorption, die Ver ­
teilung, den Stoffwechsel oder die Retention der Prüfsubstanz; Auswirkun ­
gen auf die chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, die deren toxische 
Eigenschaften verändern können, und ferner Auswirkungen auf die Futter- oder Wasseraufnahme oder den Ernährungszustand der Versuchstiere. Es empfiehlt sich, nach Möglichkeit zunächst die Verwendung einer wässrigen 
Lösung/Suspenion, sodann eine Lösung/Emulsion in Öl (z. B. Maisöl) und 
erst dann eine Lösung in anderen Vehikeln in Betracht zu ziehen. Bei anderen Vehikeln als Wasser müssen deren toxische Merkmale bekannt sein. Es sollten Informationen über die Stabilität der Prüfsubstanz und die Ho ­
mogenität der Lösungen oder Futterrationen, die (je nach Fall) die Dosie ­
rung enthalten, unter den Verabreichungsbedingungen (z. B. mit dem Futter) vorliegen.
 
29. Für mit dem Futter oder dem Trinkwasser verabreichte Stoffe ist unbedingt 
sicherzustellen, dass die Mengen der jeweiligen Prüfsubstanz die normale 
Nahrungsaufnahme oder den Wasserhaushalt nicht beeinträchtigen. Um eine unausgewogene Ernährung zu vermeiden, sollte die Konzentration der Prüf ­
substanz in Langzeittoxizitätsstudien mit Verabreichung über die Nahrung 
normalerweise eine Obergrenze von 5 % der Gesamtnahrung nicht überstei ­
gen. Wenn die Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht wird, kann entweder eine konstante Futterkonzentration (mg/kg Futter oder ppm) oder eine kon ­
stante Dosierung in Relation zum Körpergewicht des Tiers (mg/kg Körper ­
gewicht), berechnet auf Wochenbasis, verwendet werden. Die jeweils ge ­
wählte Verfahrensweise ist anzugeben.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 474
 
30. Bei oraler Verabreichung erhalten die Tiere die Prüfsubstanz täglich (sieben 
Tage in der Woche), im Fall von Nagetieren in der Regel für einen Zeitraum 
von 24 Monaten (siehe auch Nummer 32). Jede Abweichung von diesem Dosierungsplan, z. B. fünf Tage pro Woche, ist zu begründen. Bei dermaler Applikation werden die Tiere, wie in Kapitel B.9 dieses Anhangs (11) 
beschrieben, für einen Zeitraum von 24 Monaten an sieben Tagen in der 
Woche mindestens 6 Stunden pro Tag mit der Prüfsubstanz behandelt. Die Inhalationsexposition wird an sieben Tagen in der Woche für 6 Stunden pro Tag durchgeführt, aber auch fünf Tage in der Woche sind möglich, wenn 
dies gerechtfertigt ist. Die Expositionsdauer beträgt normalerweise 24 Mo ­
nate. Wenn für eine „Nose-only“-Exposition andere Nagetierarten als Ratten verwendet werden, kann die maximale Expositionsdauer angepasst werden, um artenspezifisches Leiden zu minimieren. Eine Expositionsdauer von we ­
niger als 6 Stunden pro Tag ist zu begründen. Siehe auch Kapitel B.8 dieses 
Anhangs (9).
 
31. Wird die Prüfsubstanz über eine Sonde verabreicht, so sollte dies unter 
Verwendung einer Schlundsonde oder einer geeigneten Intubationskanüle jeweils zur gleichen Tageszeit erfolgen. Normalerweise wird einmal täglich 
eine Einzeldosis verabreicht. Wenn es sich bei der Prüfsubstanz z. B. um 
einen lokal reizenden Stoff handelt, kann die Tagesdosis auf zwei Teilmen ­
gen aufgeteilt werden. Das maximale Flüssigkeitsvolumen, das einem Ver ­
suchstier jeweils verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Ver ­
suchstiers ab. Das Volumen sollte so gering wie möglich sein und bei 
Nagetieren normalerweise 1 ml/100 g Körpergewicht nicht überschreiten (31). Die Variabilität der Prüfvolumina sollte durch Anpassung der Konzen ­
tration auf ein konstantes Volumen bei allen Dosen möglichst gering ge ­
halten werden. Davon ausgenommen sind potenziell ätzende oder reizende 
Stoffe, die zur Vermeidung schwerwiegender lokaler Wirkungen verdünnt werden müssen. Die Prüfung in Konzentrationen, die wahrscheinlich eine verätzende oder reizende Wirkung für den Magen-Darm-Trakt haben, ist zu 
vermeiden.
 
Versuchsdauer  
32. Die Studie dauert bei Nagetieren in der Regel 24 Monate, was dem größten 
Teil der normalen Lebenszeit der verwendeten Tiere entspricht. Eine kürzere 
oder längere Studiendauer ist je nach Lebenszeit der in der Studie verwen ­
deten Tierart möglich, sollte aber begründet werden. Bei bestimmten Stäm ­
men von Mäusen, z. B. die Stämme AKR/J, C3H/J oder C57BL/6J, ist eine 
Dauer von 18 Monaten möglicherweise besser geeignet. Im Folgenden wer ­
den Hinweise zu Dauer und Beendigung der Studie und dem Überleben der Tiere gegeben. Weitere Hinweise, u. a. zu der Frage, wieweit ein aus der Überlebensrate der Tiere resultierendes negatives Ergebnis einer Kanzeroge ­
nitätsstudie akzeptiert werden kann, sind im OECD Guidance Document No. 
116 on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (7) zu finden.
 
— Wenn die Anzahl der überlebenden Tiere in den Gruppen mit niedrigerer 
Dosierung oder in der Kontrollgruppe unter 25 % sinkt, ist die Beendi ­
gung der Studie in Betracht zu ziehen.  
— Ist lediglich in der Hochdosisgruppe ein vorzeitiger Tod aufgrund von 
Toxizität festzustellen, muss dies nicht zwangsläufig zur Beendigung der Studie führen.
 
— Die Überlebensrate sollte nach Geschlechtern getrennt ausgewertet wer ­
den. 
— Die Studie sollte nicht über den Punkt hinaus fortgesetzt werden, an dem 
die Daten aus der Studie nicht mehr ausreichen, um eine statistisch 
valide Bewertung vorzunehmen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 475
 
BEOBACHTUNGEN  
33. Alle Tiere sind in der Regel jeden Tag morgens und abends, auch am 
Wochenende und an Feiertagen, auf Anzeichen von Morbidität und Morta ­
lität hin zu untersuchen. Darüber hinaus sind die Tiere einmal am Tag auf 
spezielle Anzeichen von toxikologischer Bedeutung zu untersuchen, wobei 
der Zeitpunkt zu berücksichtigen ist, zu dem nach Verabreichung per Schlundsonde mit den maximalen Wirkungen zu rechnen ist. Die Entwick ­
lung von Tumoren ist besonders aufmerksam zu verfolgen; dabei sind der 
Zeitpunkt der Entstehung, die Lokalisierung, das Ausmaß, das Erschei ­
nungsbild und die Progression jedes deutlich sichtbaren oder fühlbaren Tu ­
mors festzuhalten.
 
Körpergewicht, Futter-/Wasseraufnahme und Futtereffizienz  
34. Alle Tiere sollten zu Beginn der Behandlung, in den ersten 13 Wochen 
mindestens einmal wöchentlich und danach mindestens monatlich gewogen werden. Futteraufnahme und Futtereffizienz sollten in den ersten 13 Wochen mindestens wöchentlich und danach mindestens monatlich bestimmt werden. 
Die Trinkwasseraufnahme sollte in den ersten 13 Wochen mindestens wö ­
chentlich und danach mindestens monatlich gemessen werden, wenn die Prüfsubstanz mit dem Trinkwasser verabreicht wird. Bei Studien, in denen das Trinkverhalten der Tiere verändert ist, sollte auch die Trinkwasserauf ­
nahme gemessen werden.
 
Hämatologie, klinische Biochemie und sonstige Messungen  
35. Um möglichst viele Informationen aus der Studie zu gewinnen, insbesondere 
in Bezug auf die Wirkungsweise der Prüfsubstanz, können nach Ermessen des Studienleiters Blutproben für hämatologische und klinisch-biochemische 
Untersuchungen genommen werden. Urinuntersuchungen können ebenfalls 
angezeigt sein. Weitere Hinweise zum Nutzen dieser Probenahmen im Rah ­
men einer Kanzerogenitätsprüfung sind im Guidance Document No. 116 (7) zu finden. Falls sie für angezeigt gehalten werden, können die Blutproben 
für hämatologische und klinisch-chemische Untersuchungen und Urinunter ­
suchungen im Rahmen einer Tötung im Verlauf der Studie (siehe Nummer 20) oder bei Beendigung der Studie bei mindestens je zehn Tieren beider Geschlechter je Gruppe genommen werden. Die Blutproben müssen unter 
Anästhesie an einer benannten Stelle, z. B. durch Herzpunktion oder aus 
dem retrobulbären Venenplexus entnommen und gegebenenfalls fachgerecht gelagert werden. Es können auch Blutausstriche zur Untersuchung angefer ­
tigt werden, insbesondere wenn das Knochenmark das Zielorgan zu sein 
scheint. Der Nutzen dieser Untersuchung für die Einschätzung des karzino ­
genen/onkogenen Potenzials ist jedoch fraglich (32).
 
PATHOLOGIE  
Makroskopische Untersuchung  
36. Alle an der Studie beteiligten Tiere, ausgenommen Sentineltiere (siehe Num ­
mer 20) und andere Satellitentiere, sind einer vollständigen, eingehenden makroskopischen Untersuchung zu unterziehen, die die sorgfältige Unter ­
suchung der äußeren Körperoberfläche, aller Körperöffnungen sowie der 
Schädel-, Brust- und Bauchhöhlen und ihres Inhalts umfasst. Sentineltiere und andere Satellitentiere können nach Ermessen des Studienleiters von Fall zu Fall seziert werden. Organgewichte werden bei einer Prüfung auf Kan ­
zerogenität normalerweise nicht erfasst, da der Nutzen dieser Daten durch 
geriatrische Veränderungen und in späteren Stadien durch die Entstehung von Tumoren beeinträchtigt wird. Sie können jedoch für die Durchführung einer Weight-of-Evidence-Bewertung und insbesondere für Fragen der Wir ­
kungsweise von Bedeutung sein. Wenn sie Teil einer Satellitenstudie sind, 
sollten sie nicht später als ein Jahr nach Studienbeginn erfasst werden.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 476
 
37. Die folgenden Gewebe sind in dem für die betreffende Gewebeart und die 
vorgesehene anschließende histopathologische Untersuchung am besten ge ­
eigneten Fixierungsmittel aufzubewahren (33) (Gewebe in eckigen Klam ­
mern sind fakultativ): 
alle makroskopischen Ver ­
änderungen Herz Pankreas Magen (Vormagen, Drüsen ­
magen) 
Nebennieren Ileum Nebenschilddrüse [Zähne] Aorta Jejunum periphere Nerven Hoden Gehirn (mit Schnitten von 
Cerebrum, Cerebellum und Medulla/Pons) Nieren Hypophyse Thymus 
Caecum Tränendrüse (exorbital) Prostata Schilddrüse 
Zervix Leber Rectum [Zunge] Koagulationsdrüse Lunge Speicheldrüse Trachea Kolon Lymphknoten (sowohl 
oberflächliche als auch tiefe) Samenbläschen Harnblase 
Duodenum Brustdrüse (obligatorisch 
für Weibchen und, falls 
bei der Sektion erkenn ­
bar, für Männchen) Skelettmuskel Uterus (mit Zervix) 
Nebenhoden [obere Atemwege, ein ­
schließlich Nase, Nasen ­
muscheln und Nasen ­
nebenhöhlen] Haut [Harnleiter] 
Auge (mit Netzhaut) Speiseröhre Rückenmark (auf 3 
Ebenen: zervical, mitt ­
lerer Thoraxbereich 
und lumbar) [Harnröhre] 
[Femur mit Gelenk] [Riechkolben] Milz Vagina 
Gallenblase (bei anderen 
Arten als Ratten) Ovarien [Brustbein] Knochenmarkschnitt und/ 
oder ein frisches Knochenmark-Aspirat 
Hardersche Drüse
 
Bei paarigen Organen, z. B. Nieren, Nebennieren, sind beide Organe auf ­
zubewahren. Die klinischen und sonstigen Befunde können weitere Gewebe ­
untersuchungen erforderlich machen. Auch Organe, die aufgrund der be ­
kannten Eigenschaften der Prüfsubstanz als mögliche Zielorgane in Frage 
kommen, sollten aufbewahrt werden. In Studien mit dermaler Applikation sind die in der Liste für orale Verabreichung aufgeführten Organe aufzube ­
wahren; es sind Proben der Haut an der Applikationsstelle zu nehmen und 
aufzubewahren. Bei Inhalationsstudien sollte sich die Liste der aufzubewah ­
renden und zu untersuchenden Gewebe des Atemtrakts an den Empfehlun ­
gen der Kapitel B.8 und B.29 dieses Anhangs orientieren. Was andere Organe/Gewebe betrifft, so sollten (zusätzlich zu den speziell konservierten 
Geweben aus dem Atemtrakt) die in der Liste für die orale Verabreichung 
genannten Organe untersucht werden.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 477
 
Histopathologie  
38. Es gibt Leitlinien für bewährte Praktiken bei der Durchführung toxikologi ­
scher Pathologiestudien (33). Zu untersuchen sind mindestens folgende Ge ­
webe:  
— alle Gewebe der Tiere aus der Hochdosisgruppe und der Kontrollgruppe,  
— alle Gewebe von während der Studie gestorbenen oder getöteten Tieren,  
— alle Gewebe mit makroskopischen Abnormitäten einschließlich Tumo ­
ren, 
— wenn behandlungsbedingte histopathologische Veränderungen in der 
Hochdosisgruppe festgestellt werden, sind diese Gewebe von allen Tie ­
ren in allen anderen Dosisgruppen zu untersuchen,  
— bei paarigen Organen, z. B. Nieren, Nebennieren, sind beide Organe zu 
untersuchen.  
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Daten  
39. Für alle bestimmten Parameter sollen Daten zu den einzelnen Tieren ange ­
geben werden. Darüber hinaus sollten alle Daten in Form einer Tabelle zusammengefasst werden, aus der für jede Prüfgruppe folgende Angaben 
hervorgehen: die Zahl der Tiere bei Beginn der Prüfung und die Zahl der 
während der Prüfung tot aufgefundenen oder aus Tierschutzgründen getöte ­
ten Tiere, ferner der Zeitpunkt des Todes oder der Tötung, die Zahl der Tiere, die Toxizitätszeichen aufweisen, eine Beschreibung der beobachteten 
Toxizitätszeichen, einschließlich des Zeitpunkts, zu dem die toxischen Wir ­
kungen erstmalig aufgetreten sind, ihrer Dauer und ihres Schweregrads, die Zahl der Tiere mit Läsionen, die Art der Läsionen und der Prozentsatz der von jeder Läsion betroffenen Tiere. Die Mittelwerte und Standardabwei ­
chungen (für kontinuierliche Versuchsdaten) von Tieren, die toxische Wir ­
kungen oder Läsionen aufweisen, sind zusätzlich zum Schweregrad der Läsionen in Übersichtstabellen anzugeben.
 
40. Historische Kontrolldaten können die Auswertung der Studienergebnisse 
erleichtern, z. B. wenn die Daten der gleichzeitigen Kontrollen erheblich 
von neueren Daten von Kontrolltieren aus derselben Versuchseinrichtung abweichen. Wenn historische Kontrolldaten bewertet werden, sollten sie von demselben Labor stammen, sich auf Tiere desselben Alters und Stamms 
beziehen und höchstens fünf Jahre vor der fraglichen Studie erhoben worden 
sein.
 
41. Wenn möglich, sind die numerischen Daten durch eine geeignete allgemein 
annehmbare statistische Methode auszuwerten. Die statistischen Methoden 
und die zu analysierenden Daten sind bei der Planung der Studie festzulegen 
(Nummer 9). Diese Auswahl sollte es ermöglichen, erforderlichenfalls An ­
passungen je nach Überlebensrate vorzunehmen.  
Prüfbericht  
42. Der Prüfbericht sollte folgende Informationen enthalten:  
Prüfsubstanz:  
— physikalische Beschaffenheit, Reinheit und physikalisch-chemische Ei ­
genschaften,  
— Daten zur Identifikation,  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 478
 
— Herkunft des Stoffs,  
— Chargennummer,  
— Bescheinigung der chemischen Analyse.  
Vehikel (wenn verwendet):  
— Begründung der Wahl des Vehikel, sofern anders als Wasser.  
Versuchstiere:  
— Art/Stamm und Begründung für die getroffene Wahl,  
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere bei Versuchsbeginn,  
— Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.,  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Versuchsbeginn.  
Prüfbedingungen:  
— Begründung für Verabreichungsweg und Festlegung der Dosis,  
— gegebenenfalls die statistischen Methoden zur Analyse der Daten,  
— Angaben zur Formulierung der Prüfsubstanz/Futterzubereitung,  
— Analysedaten über die erreichte Konzentration, Stabilität und Homoge ­
nität der Zubereitung,  
— Verabreichungsweg und Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz,  
— bei Inhalationsstudien: „Nose-only“- oder Ganzkörperexposition,  
— tatsächliche Dosen (mg/kg Körpergewicht/Tag) und, sofern zutreffend, 
Angaben zur Umrechnung der Konzentration der Prüfsubstanz im Futter/ 
Trinkwasser (mg/kg oder ppm) in die tatsächliche Dosis,  
— Angaben zur Futter- und Wasserqualität.  
Ergebnisse (zusammenfassende Übersichtstabellen und Daten für die einzel ­
nen Tiere):  
Allgemeines  
— Überlebensdaten,  
— Körpergewicht/Änderungen des Körpergewichts,  
— Futteraufnahme, gegebenenfalls Berechnungen der Futtereffizienz und 
der Wasseraufnahme, falls erfasst,  
— toxikokinetische Daten, falls vorhanden,  
— Ophthalmoskopie (falls zutreffend),  
— Hämatologie (falls zutreffend),  
— klinische Chemie (falls zutreffend).  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 479
 
Klinische Befunde  
— Toxizitätszeichen,  
— Inzidenz (und, falls bewertet, Schweregrad) jeder Abnormität,  
— Art, Schweregrad und Dauer der klinischen Beobachtungen (sowohl 
vorübergehend als auch dauerhaft).  
Nekropsiedaten  
— terminales Körpergewicht,  
— Organgewichte (und gegebenenfalls Verhältnis Organ-/Körpergewicht),  
— Sektionsbefunde; Inzidenz und Schweregrad von Abnormitäten.  
Histopathologie  
— nicht neoplastische histopathologische Befunde,  
— neoplastische histopathologische Befunde,  
— Korrelation zwischen makroskopischen und mikroskopischen Befunden,  
— ausführliche Beschreibung aller behandlungsbedingten histopathologi ­
schen Befunde mit Einstufung des Schweregrads,  
— Bericht über eventuelle Peer-Reviews von Objektträgern.  
Statistische Auswertung der Ergebnisse, soweit zutreffend  
Diskussion der Ergebnisse einschließlich  
— Diskussion von Modellierungsansätzen,  
— Dosis-Wirkungs-Beziehungen,  
— historische Kontrolldaten,  
— Prüfung aller Informationen über die Wirkungsweise,  
— Bestimmung von BMD, NOAEL oder LOAEL,  
— Relevanz für Menschen.  
Schlussfolgerungen  
LITERATUR:  
1. OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2. EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
3. Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
 
4. Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191.  
5. Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: 
an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 480
 
6. Kapitel B.27 dieses Anhangs, Prüfung auf sub-chronische orale Toxizität — 
90-Tage-Toxizitätsstudie mit wiederholter Verabreichung an 
Nicht-Nagetieren  
7. OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ 
env/testguidelines.
 
8. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Paris.  
9. Kapitel B.8 dieses Anhangs, Prüfung auf subakute Toxizität nach Inhalation 
— 28-Tage-Test.  
10. Kapitel B.29 dieses Anhangs, Prüfung auf sub-chronische Toxizität nach 
Inhalation — 90-Tage-Test.  
11. Kapitel B.9 dieses Anhangs, Toxizität nach 28-tägiger Gabe (dermal).  
12. Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
 
13. Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA (2003). 
The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An 
Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.  
14. Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent 
Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.  
15. Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
 
16. Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical 
Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
 
17. Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and Ap ­
plication of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) 
Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in To ­
xicology 36: 9-35.  
18. Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Systemic 
Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Re ­
views in Toxicology 36: 37-68.  
19. Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Re ­
views in Toxicology 36: 69-98.  
20. OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
21. OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 481
 
22. Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Interpreta ­
tion of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Ap ­
proaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729-837.
 
23. ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Se ­
lection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, 
Washington, DC.  
24. Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharma ­
ceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
25. Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the 
assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF 
& Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.
 
26. Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of 
Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agroche ­
mical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203.
 
27. Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 
22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwen ­
deten Tiere (ABl. L 276 vom 20.10.2010, S. 33).  
28. National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, D.C., US Dept. of Health 
and Human Services.  
29. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal 
Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04- 2.
 
30. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in 
various housing systems.  
31. Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
 
32. Weingand K,  et al.  (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201.  
33. Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P,  et al.  (2004). Best Practices Gui ­
deline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 482
 
Anlage 1  
DEFINITION  
Prüfsubstanz:  jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode 
getestet wird.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 483
 
B.33  KOMBINIERTE STUDIEN ZUR PRÜFUNG AUF CHRONISCHE 
TOXIZITÄT UND KANZEROGENITÄT  
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 453 (2009). Die 
ursprüngliche TG 453 wurde 1981 angenommen. Die Entwicklung dieser 
aktualisierten Prüfmethode B.33 wurde für notwendig gehalten, um neueren Entwicklungen auf dem Gebiet des Tierschutzes sowie Regulierungsanfor ­
derungen Rechnung zu tragen (1) (2) (3) (4) (5). Diese Prüfmethode B.33 
wurde parallel zur Überarbeitung von Kapitel B.32 dieses Anhang „Prüfun ­
gen auf Kanzerogenität“ und Kapitel B.30 dieses Anhangs „Prüfungen auf chronische Toxizität“ aktualisiert mit dem Ziel, zusätzliche Informationen von den in der Untersuchung verwendeten Tieren und detailliertere Angaben 
zur Wahl der Dosis zu gewinnen. Diese Prüfmethode ist dazu ausgelegt, für 
die Prüfung eines breiten Spektrums von chemischen Stoffen, einschließlich Pestiziden und Industriechemikalien, verwendet zu werden. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass bestimmte Details und Anforderungen für Phar ­
mazeutika abweichen können [siehe Internationale Harmonisierungskon ­
ferenz (ICH) Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceu ­
ticals].
 
2. Bei den meisten Prüfungen auf chronische Toxizität und Kanzerogenität 
werden Nagetierarten verwendet; diese Prüfmethode gilt daher hauptsächlich für Prüfungen, die an diesen Arten durchgeführt werden. Wenn solche Prü ­
fungen an Nichtnagern erforderlich sind, können die beschriebenen Grund ­
sätze und Verfahren mit entsprechenden Änderungen in Kombination mit 
denen des Kapitels B.27 dieses Anhangs „Prüfung auf subchronische orale Toxizität — 90-Tage-Toxizitätsstudie mit wiederholter Verabreichung an Nicht-Nagetieren“ (6), wie im OECD Guidance Document No. 116 on the 
Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (7) 
beschrieben, ebenfalls angewendet werden.
 
3. Bei Prüfungen auf chronische Toxizität/Kanzerogenität finden im Wesentli ­
chen die orale, die dermale und die inhalative Verabreichung Anwendung. Die Wahl des Verabreichungswegs hängt von den physikalischen und che ­
mischen Eigenschaften der Prüfsubstanz und der vorherrschenden Art der 
Exposition beim Menschen ab. Zusätzliche Informationen zur Wahl des 
Expositionswegs sind im Guidance Document No. 116 (7) enthalten.
 
4. Bei dieser Prüfmethode steht die Exposition auf oralem Weg im Vorder ­
grund. Dies ist der bei Prüfungen auf chronische Toxizität und Kanzeroge ­
nität am häufigsten verwendete Expositionsweg. Zwar sind Langzeitprüfun ­
gen mit Exposition über die Haut oder durch Inhalation möglicherweise auch notwendig, um das Risiko für die menschliche Gesundheit zu beur ­
teilen, und/oder im Rahmen bestimmter Regelungen vorgeschrieben, aber 
diese beiden Expositionswege sind aus technischer Sicht außerordentlich komplex. Derartige Prüfungen sind von Fall zu Fall zu konzipieren, wobei die hier beschriebene Prüfmethode für die Bewertung und Evaluierung von 
Kanzerogenität und chronischer Toxizität bei oraler Verabreichung aller ­
dings mit Bezug auf Empfehlungen für Behandlungszeiten, klinische und Pathologieparameter usw. als Grundlage für ein Protokoll für Inhalations- und/oder dermale Prüfungen dienen könnte. Es gibt OECD-Leitlinien für die 
Verabreichung von Prüfsubstanzen durch Inhalation (7) (8) und über die 
Haut (7). Bei der Konzeption längerfristiger Prüfungen mit Exposition durch Inhalation sind insbesondere Kapitel B.8 dieses Anhangs (9) und Kapitel B.29 dieses Anhangs (10) sowie das OECD Guidance (8) zu berücksichti ­
gen. Bei Prüfungen mit dermaler Applikation ist Kapitel B.9 dieses Anhangs 
(11) zu beachten.
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5. Die kombinierte Studie zur Prüfung auf chronische Toxizität/Kanzerogenität 
liefert Informationen über mögliche gesundheitliche Schädigungen, die 
durch wiederholte Exposition über einen Zeitraum entstehen können, der sich über die gesamte Lebensdauer der verwendeten Art erstrecken kann. Sie liefert Informationen über die toxischen Wirkungen der Prüfsubstanz, 
einschließlich der potenziellen Kanzerogenität, und gibt Hinweise auf Ziel ­
organe und die Möglichkeit der Akkumulation. Außerdem kann sie zur Ableitung eines NOAEL-Werts (Dosis ohne beobachtete schädigende Wir ­
kung) für toxische Wirkungen und, im Fall von nicht genotoxischen Karzi ­
nogenen, für Tumorreaktionen beitragen, der zur Festlegung von Sicher ­
heitskriterien für die Humanexposition herangezogen werden kann. Ferner wird die Notwendigkeit sorgfältiger klinischer Beobachtung der Tiere her ­
vorgehoben, damit so viele Informationen wie möglich gewonnen werden 
können.
 
6. Zu den Zielen von Prüfungen auf chronische Toxizität/Kanzerogenität nach 
dieser Prüfmethode gehören  
— die Identifizierung der kanzerogenen Eigenschaften einer Prüfsubstanz, 
die im Vergleich zu gleichzeitigen Kontrollgruppen zu einer erhöhten 
Inzidenz von Neoplasmen, einem erhöhten Anteil maligner Neoplasmen 
oder einem schnelleren Auftreten von Neoplasmen führen,  
— die Ermittlung der Zeit bis zum Auftreten von Neoplasmen,  
— die Feststellung der chronischen Toxizität der Prüfsubstanz,  
— die Identifizierung des Zielorgans/der Zielorgane der chronischen Toxi ­
zität und der Kanzerogenität,  
— die Beschreibung der Dosis-Wirkungs-Beziehung,  
— die Bestimmung eines NOAEL-Werts (Dosis ohne beobachtete schädi ­
gende Wirkung) oder eines Ausgangspunkts für die Festlegung einer 
Benchmark-Dosis (BMD),  
— die Extrapolation kanzerogener Wirkungen auf Expositionsniveaus von 
Menschen bei geringer Dosis,  
— die Vorhersage der Wirkungen chronischer Toxizität beim Expositions ­
niveau von Menschen,  
— die Gewinnung von Daten zur Prüfung von Hypothesen über die Wir ­
kungsweise (2) (7) (12) (13) (14) (15).  
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN  
7. Bei der Beurteilung und Bewertung des Kanzerogenitätspotenzials und der 
chronischen Toxizität einer Prüfsubstanz sollte das Prüflabor vor Durchfüh ­
rung der Studie alle verfügbaren Informationen über die Prüfsubstanz be ­
rücksichtigen, damit die Studienauslegung auf eine effizientere Prüfung ihrer 
toxikologischen Eigenschaften ausgerichtet und die Verwendung von Ver ­
suchstieren minimiert werden kann. Es ist wichtig, die Wirkungsweise eines vermutlichen Karzinogens zu kennen und zu berücksichtigen (2) (7) (12) 
(13) (14) (15), da die optimale Studienauslegung je nachdem, ob die Prüf ­
substanz ein bekanntes oder vermutliches genotoxisches Karzinogen ist, unterschiedlich sein kann. Nähere Hinweise zu Aspekten der Wirkungsweise sind im Guidance Document No. 116 (7) zu finden.
 
8. Für die Auslegung der Studie könnten u. a. Informationen wie die Identität, 
die chemische Struktur und die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, sämtliche Informationen über die Wirkungsweise, Ergebnisse 
jeglicher In-vitro- oder In-vivo-Toxizitätsprüfungen einschließlich Genotoxi ­
zitätsprüfungen, vorgesehene Verwendungen und die Möglichkeit der Ex ­
position des Menschen, (Q)SAR-Daten, Daten über Mutagenität/Genotoxi ­
zität, Kanzerogenität und andere toxikologische Daten über strukturver ­
wandte Substanzen, toxikokinetische Daten (Kinetik bei Einzel- und 
Mehrfachdosierung) sowie Daten aus anderen Studien mit wiederholter
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Exposition herangezogen werden. Die chronische Toxizität/Kanzerogenität 
sollte erst bestimmt werden, wenn erste Informationen über die Toxizität aus 
Toxizitätsprüfungen mit wiederholter Gabe über 28 Tage und/oder 90 Tage vorliegen. Auch Kurzzeitversuche zur Krebsinitiation-/promotion können nützliche Informationen liefern. Im Rahmen der Gesamtbewertung der po ­
tenziellen schädlichen Wirkungen einer bestimmten Prüfsubstanz auf die 
Gesundheit sollte bei der Prüfung auf Kanzerogenität etappenweise vor ­
gegangen werden (16) (17) (18) (19).
 
9. Vor Beginn der Prüfung ist festzulegen, welche Statistikmethoden ange ­
sichts der Versuchsauslegung und der Ziele am besten für die Analyse der Ergebnisse geeignet sind. Dabei ist u. a. zu entscheiden, ob die Statistiken 
Anpassungen in Bezug auf die Überlebensrate, die Analyse kumulativer 
Tumorrisiken bezogen auf die Überlebensdauer, die Analyse des Zeitraums bis zum Auftreten eines Tumors und die Analyse bei vorzeitigem Tod der Tiere einer oder mehrerer Gruppen umfassen sollten. Hinweise zu den ge ­
eigneten statistischen Analysen und wichtige Literaturverweise zu interna ­
tional anerkannten Statistikmethoden sind im Guidance Document No. 116 (7) sowie im Guidance Document No. 35 on the analysis and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity studies (20) zu finden.
 
10. Bei der Durchführung einer Prüfung auf Kanzerogenität sind stets die im 
OECD Guidance Document No. 19 on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation (21), insbesondere in Absatz 62, genannten Grundsätze und Erwägungen zu befolgen. In diesem Absatz heißt es:  Wenn ein Tier 
in Studien mit wiederholter Verabreichung progressive klinische Anzeichen 
für eine fortschreitende Verschlechterung seines Zustands aufweist, ist eine 
informierte Entscheidung zu treffen, ob das Tier tierschutzgerecht getötet werden sollte oder nicht. Bei dieser Entscheidung sind Faktoren wie der Wert der Informationen, die bei Verbleiben des Tiers in der Studie gewon ­
nen werden können, und der allgemeine Gesundheitszustand des Tiers ge ­
geneinander abzuwägen. Wird beschlossen, das Tier in der Studie zu be ­
lassen, ist es entsprechend den Erfordernissen häufiger zu beobachten. Zur 
Linderung von Schmerzen oder Qualen kann auch die Verabreichung der 
Prüfsubstanz unterbrochen oder die Dosis verringert werden, sofern dabei der Zweck der Prüfung nicht beeinträchtigt wird.
 
11. Ausführliche Informationen und eine Diskussion der Prinzipien der Dosis ­
wahl bei Studien zur Prüfung auf chronische Toxizität und Kanzerogenität sind im Guidance Document No. 116 (7) sowie in zwei Veröffentlichungen 
des International Life Sciences Institute (22) (23) zu finden. Die grund ­
legende Strategie der Dosiswahl hängt von den Hauptzielen der Studie ab (Nummer 6). Bei der Auswahl der geeigneten Dosisstufen ist ein Gleichge ­
wicht zwischen Gefahrenidentifizierung einerseits und der Beschreibung von 
Wirkungen bei geringer Dosierung und ihrer Relevanz andererseits herzu ­
stellen. Dieses Gleichgewicht ist bei einer kombinierten Studie zur Prüfung auf chronische Toxizität und auf Kanzerogenität besonders wichtig.
 
12. Es sollte in Betracht gezogen werden, statt einer getrennten Durchführung 
einer Prüfung auf chronische Toxizität (Kapitel B.30 dieses Anhangs) und einer Prüfung auf Kanzerogenität (Kapitel B.32 dieses Anhangs) eher diese 
kombinierte Prüfung auf chronische Toxizität und Kanzerogenität durch ­
zuführen. Die kombinierte Methode ist zeit- und kosteneffizienter und be ­
nötigt weniger Versuchstiere als zwei getrennte Studien, ohne dass dabei die Qualität der Daten der chronischen Komponente oder der Kanzerogenitäts ­
komponente beeinträchtigt würde. Bei Durchführung einer kombinierten 
Prüfung auf chronische Toxizität und Kanzerogenität sind die Grundsätze der Dosiswahl (Nummer 11 und Nummern 22-26) jedoch genau zu beach ­
ten. Es wird allerdings anerkannt, dass im Rahmen bestimmter Regelungen 
möglicherweise getrennte Prüfungen vorgeschrieben sind. Weitere Hinweise 
zur Planung der kombinierten Studie zur Prüfung auf chronische Toxizität und Kanzerogenität mit dem Ziel, die Effizienz der Studie zu maximieren, indem möglichst wenig Tiere verwendet und die verschiedenen Versuchs ­
verfahren gestrafft werden, sind im Guidance Document No. 116 (7) zu 
finden.
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13. Die im Zusammenhang mit dieser Prüfmethode verwendeten Begriffe wer ­
den am Ende dieses Kapitels und im Guidance Document No. 116 (7) 
definiert.  
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
14. Die Studie umfasst zwei parallele Phasen: eine chronische Phase und eine 
Kanzerogenitätsphase (zur jeweiligen Dauer siehe Nummern 34 bzw. 35). 
Die Prüfsubstanz wird in der Regel oral verabreicht, aber auch die Ver ­
abreichung durch Inhalation oder auf dermalem Weg kann angebracht sein. In der chronischen Phase wird die Prüfsubstanz mehreren Gruppen von 
Versuchstieren täglich in abgestuften Dosen verabreicht, eine Dosisstufe je 
Gruppe, und zwar normalerweise über einen Zeitraum von 12 Monaten, wobei je nach Regulierungsanforderungen (siehe Nummer 34) auch eine längere oder kürzere Dauer gewählt werden kann. Die Dauer sollte ausrei ­
chend lang sein, damit sich etwaige Wirkungen kumulativer Toxizität mani ­
festieren können, ohne dass sich die verzerrenden Wirkungen geriatrischer Veränderungen bemerkbar machen. Die Studienauslegung kann auch eine oder mehrere zwischenzeitliche Tötungen vorsehen, z. B. nach 3 und 6 
Monaten; außerdem können zu diesem Zweck auch zusätzliche Gruppen 
von Versuchstieren aufgenommen werden (siehe Nummer 20). In der Kan ­
zerogenitätsphase wird die Prüfsubstanz mehreren Gruppen von Versuchs ­
tieren für den größeren Teil ihrer Lebenszeit täglich verabreicht. In beiden 
Phasen werden die Tiere sorgfältig auf Toxizitätszeichen und das Auftreten neoplastischer Veränderungen beobachtet. Tiere, die im Verlauf der Prüfung sterben, und vorzeitig getötete Tiere werden seziert; die nach Abschluss der 
Prüfung überlebenden Tiere werden getötet und ebenfalls seziert.
 
BESCHREIBUNG DER METHODE  
Auswahl von Versuchstierarten  
15. Diese Prüfmethode betrifft hauptsächlich die Bewertung und Evaluierung 
der chronischen Toxizität und der Kanzerogenität bei Nagetieren (Nummer 2). Die Verwendung anderer Arten als Nagetiere kann in Betracht gezogen 
werden, wenn die vorliegenden Daten darauf hindeuten, dass sie für die 
Vorhersage gesundheitlicher Wirkungen beim Menschen von größerer Re ­
levanz sind. Die Wahl der Tierart ist zu begründen. Die bevorzugte Nage ­
tierart ist die Ratte, doch können auch andere Nagetierarten, z. B. die Maus, 
verwendet werden. Obwohl die Verwendung der Maus in Prüfungen auf 
Kanzerogenität nur von begrenztem Nutzen sein mag (24) (25) (26), schrei ­
ben einige geltende Regulierungsprogramme nach wie vor Kanzerogenitäts ­
prüfungen an der Maus vor, sofern nicht gezeigt werden kann, dass eine 
solche Studie wissenschaftlich nicht erforderlich ist. Ratten und Mäuse sind 
wegen ihrer relativ kurzen Lebenszeit, der weit verbreiteten Verwendung in pharmakologischen und toxikologischen Studien, ihrer Anfälligkeit für die Entstehung von Tumoren und der Verfügbarkeit ausreichend beschriebener 
Stämme die bevorzugten Versuchsmodelle. Daher liegen über ihre Physio ­
logie und Pathologie umfangreiche Informationen vor. Wenn Prüfungen auf chronische Toxizität/Kanzerogenität bei Nichtnagern erforderlich sind, soll ­
ten Auslegung und Durchführung der Versuche auf den Grundsätzen der 
vorliegenden Prüfmethode sowie denen von Kapitel B.27 dieses Anhangs — 
Prüfung auf subchronische orale Toxizität — 90-Tage-Toxizitätsstudie mit wiederholter Verabreichung an Nicht-Nagetieren (6) basieren. Zusätzliche Informationen zur Wahl der Tierart und des Stamms sind im Guidance 
Document No. 116 (7) enthalten.
 
16. Es sind junge, gesunde, adulte Tiere aus üblicherweise eingesetzten Labor ­
stämmen zu verwenden. Für die kombinierte Prüfung auf chronische Toxi ­
zität/Kanzerogenität sollten Tiere desselben Stamms und derselben Herkunft verwendet werden wie für die kürzere(n) Toxizitätsvorstudie(n). Wenn je ­
doch bekannt ist, dass Tiere dieses Stamms und dieser Herkunft die all ­
gemein anerkannten Überlebenskriterien für Langzeitstudien [siehe Gui ­
dance Document No. 116 (7)] nicht erfüllen, ist die Verwendung eines Tierstamms mit ausreichender Überlebensrate für die Langzeitstudie in Be ­
tracht zu ziehen. Die weiblichen Tiere dürfen weder bereits geworfen haben 
noch trächtig sein.
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Haltungs- und Fütterungsbedingungen  
17. Die Tiere können entweder einzeln oder in kleinen gleichgeschlechtlichen 
Gruppen in Käfigen untergebracht werden. Eine Einzelunterbringung ist nur in Betracht zu ziehen, wenn dies wissenschaftlich gerechtfertigt ist (27) (28) 
(29). Die Käfige sollten so angeordnet werden, dass etwaige Einflüsse der 
Käfigplatzierung minimiert werden. Die Temperatur im Versuchstierraum sollte 22 °C (± 3 °C) betragen. Die relative Luftfeuchtigkeit sollte mindes ­
tens 30 % betragen und — außer beim Reinigen des Raums — 70 % nicht 
überschreiten. Angestrebt werden sollte eine Luftfeuchtigkeit von 50-60 %. 
Die Beleuchtung sollte künstlich sein und die Hell- und Dunkelphasen sollten sich im Abstand von 12 Stunden abwechseln. An die Versuchstiere 
kann herkömmliches Laborfutter verfüttert werden, und eine unbegrenzte 
Trinkwasserversorgung ist zu gewährleisten. Das Futter sollte den Nährstoff ­
bedarf der eingesetzten Tierart decken und möglichst wenig Schadstoffe wie z. B. Pestizidrückstände, persistente organische Schadstoffe, Phytoöstrogene, 
Schwermetalle und Mykotoxine enthalten, die das Ergebnis der Prüfung 
beeinflussen könnten. Das Futter ist regelmäßig, und zwar zumindest zu Beginn der Prüfung und bei Verwendung einer anderen Charge, auf den Nährstoff- und Schadstoffgehalt hin zu analysieren; die Ergebnisse sind im 
Abschlussbericht anzugeben. Ergebnisse von Analysen des in der Prüfung 
verwendeten Trinkwassers sind ebenfalls anzugeben. Die Auswahl des Fut ­
ters wird eventuell dadurch beeinflusst, dass eine geeignete Beimischung einer Prüfsubstanz und die Deckung des Nährstoffbedarfs der Tiere sicher ­
gestellt werden muss, wenn die Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht 
wird.
 
Vorbereitung der Tiere  
18. Es sind gesunde Tiere zu verwenden, die mindestens sieben Tage an die 
Laborbedingungen gewöhnt und zuvor nicht für andere Experimente ver ­
wendet wurden. Bei Nagetieren sollte die Verabreichung so bald wie mög ­
lich nach dem Absetzen und der Eingewöhnung beginnen, vorzugsweise bevor die Tiere 8 Wochen alt sind. Art, Stamm, Herkunft, Geschlecht, 
Gewicht und Alter der Versuchstiere sind anzugeben. Bei Beginn der Studie 
sollten die Gewichtsunterschiede bei den Tieren beider Geschlechter mög ­
lichst gering sein und ± 20 % des geschlechtsspezifischen Durchschnitts ­
gewichts aller Tiere in der Studie nicht überschreiten. Die Tiere werden 
nach dem Zufallsprinzip in Kontroll- und Behandlungsgruppen eingeteilt. 
Nach der Randomisierung sollte sich das Durchschnittsgewicht der Tiere desselben Geschlechts von Gruppe zu Gruppe nicht signifikant unterschei ­
den. Gibt es statistisch signifikante Unterschiede, sollte die Randomisierung 
möglichst wiederholt werden. Jedes Versuchstier erhält zur sicheren Identi ­
fizierung eine eigene Nummer und wird durch Tätowierung, Mikrochipim ­
plantat oder auf eine andere geeignete Weise mit dieser Nummer gekenn ­
zeichnet.
 
VERFAHREN  
Zahl und Geschlecht der Versuchstiere  
19. Es sind Tiere beider Geschlechter zu verwenden. Es sollten so viele Tiere 
verwendet werden, dass eine gründliche biologische und statistische Aus ­
wertung möglich ist. Bei Nagetieren sollte daher jede Dosisgruppe (siehe Nummer 22) und jede gleichzeitige Kontrollgruppe für die Kanzerogenitäts ­
phase der Studie mindestens je 50 Tiere beider Geschlechter umfassen. Je 
nach Ziel der Studie kann die statistische Aussagekraft von Schlüsselwerten 
durch ungleiche Verteilung der Tiere auf die verschiedenen Dosisgruppen erhöht werden, wobei z. B. zur Einschätzung des karzinogenen Potenzials bei niedrigen Dosen mehr als 50 Tiere in die Gruppen mit niedriger Dosis 
eingeteilt werden. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass eine mäßige Er ­
höhung der Gruppengröße nur zu einer relativ geringen Erhöhung der sta ­
tistischen Aussagekraft der Studie führt. Bei Nagetieren sollte jede Dosis ­
gruppe (siehe Nummer 22) und jede gleichzeitige Kontrollgruppe für die 
chronische Toxizitätsphase der Studie mindestens je 10 Tiere beider Ge ­
schlechter umfassen. Dies sind weniger Tiere als in der Studie zur Prüfung
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auf chronische Toxizität (Kapitel B.30 dieses Anhangs). Die Auswertung 
der Daten von der geringeren Anzahl Tiere je Gruppe in der chronischen 
Toxizitätsphase dieser kombinierten Studie wird jedoch durch die Daten von der größeren Anzahl Tiere in der Kanzerogenitätsphase unterstützt. Bei Studien an Mäusen sind in jeder Dosisgruppe der chronischen Toxizitäts ­
phase möglicherweise zusätzliche Tiere nötig, um alle erforderlichen häma ­
tologischen Bestimmungen vornehmen zu können. Weitere Informationen zur statistischen Auslegung der Studie und zur Wahl der Dosisstufen zwecks Maximierung der statistischen Aussagekraft sind im Guidance Document 
No. 116 (7) enthalten.
 
Tötungen im Verlauf der Studie, Satellitengruppen und Sentineltiere  
20. Es kann vorgesehen werden, dass Tiere im Verlauf der Studie für die chro ­
nische Toxizitätsphase, z. B. nach sechs Monaten, getötet werden, um Er ­
kenntnisse über den Fortgang nicht neoplastischer Veränderungen und me ­
chanistische Informationen zu gewinnen, falls dies wissenschaftlich gerecht ­
fertigt ist. Wenn diese Informationen bereits aus vorherigen Toxizitätsstu ­
dien mit wiederholter Gabe der Prüfsubstanz vorliegen, sind zwischenzeit ­
liche Tötungen möglicherweise wissenschaftlich nicht gerechtfertigt. Die 
Tiere, die in der normalerweise 12 Monate dauernden chronischen Toxizi ­
tätsphase der Studie verwendet werden (Nummer 34) liefern Daten über zwischenzeitliche Tötungen für die Kanzerogenitätsphase, so dass insgesamt weniger Tiere verwendet werden müssen. In der chronischen Toxizitätsphase 
der Studie kann die Reversibilität toxikologischer Veränderungen, die durch 
die Prüfsubstanz hervorgerufen werden, auch mithilfe von Satellitengruppen überwacht werden. Diese können auf die höchste Dosisgruppe der Studie zuzüglich einer Kontrolle beschränkt werden. Der Krankheitsstatus während 
der Studie kann erforderlichenfalls mit einer zusätzlichen Gruppe von Sen ­
tineltieren (normalerweise je fünf Tiere beider Geschlechter) überwacht wer ­
den (30). Weitere Hinweise zur Planung der Studie in Bezug auf die Auf ­
nahme von Tieren, die im Verlauf der Studie getötet werden sollen, sowie 
von Satelliten- und Sentineltieren unter gleichzeitiger Minimierung der Zahl 
der insgesamt verwendeten Tiere sind im Guidance Document No. 116 (7) zu finden.
 
21. Wenn Satellitentiere und/oder Tötungen von Tieren im Verlauf der Studie 
vorgesehen sind, beträgt die Zahl der für diese Zwecke aufgenommenen Tiere in jeder Dosisgruppe normalerweise je zehn Tiere beider Geschlechter, 
und die Gesamtzahl der Tiere in der Studie sollte um die Zahl der Tiere 
erhöht werden, die vor Beendigung der Studie getötet werden sollen. Tiere, die im Verlauf der Studie getötet werden sollen, und Satellitentiere sind normalerweise in Bezug auf die Bestimmung des Körpergewichts und der 
Futter-/Wasseraufnahme, hämatologische und klinisch-biochemische Bestim ­
mungen sowie pathologische Untersuchungen genauso zu behandeln wie die Tiere in der chronischen Toxizitätsphase der Hauptstudie; es kann allerdings vorgesehen werden, die Messungen (in den Gruppen mit im Verlauf der 
Studie zu tötenden Tieren) auf bestimmte Schlüsselaspekte wie Neurotoxi ­
zität oder Immunotoxizität zu beschränken.
 
Dosisgruppen und Dosierung  
22. Das Guidance Document No. 116 (7) enthält Hinweise zu allen Aspekten 
der Dosiswahl und zu den Abständen der Dosisstufen. Sowohl für die chro ­
nische als auch für die Kanzerogenitätsphase werden mindestens drei Dosis ­
stufen und eine gleichzeitige Kontrolle verwendet. Die Dosisstufen werden im Allgemeinen auf der Grundlage der Ergebnisse von Studien mit kurz ­
zeitiger wiederholter Verabreichung oder Dosisfindungsstudien festgelegt 
und sollten alle vorliegenden toxikologischen und toxikokinetischen Daten 
für die Prüfsubstanz oder verwandte Stoffe berücksichtigen.
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23. Für die chronische Toxizitätsphase der Studie ist u. U. keine vollständige 
Prüfung mit drei Dosisstufen erforderlich, wenn davon ausgegangen werden 
kann, dass ein Versuch mit einer Dosisstufe, die mindestens 1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag entspricht, wahrscheinlich keine schädlichen Wirkungen hervorruft. Die Entscheidung sollte sich auf Informationen aus Vorstudien 
stützen und darauf, dass angesichts der Daten für strukturverwandte Stoffe 
keine Toxizität zu erwarten ist. Sofern die Exposition des Menschen nicht die Prüfung bei einer höheren Dosis erforderlich erscheinen lässt, kann eine Grenze von 1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag angewandt werden.
 
24. Soweit keine Beschränkungen aufgrund der physikalisch-chemischen Be ­
schaffenheit oder der biologischen Wirkungen der Prüfsubstanz bestehen, ist die höchste Dosisstufe so zu wählen, dass zwar die Hauptzielorgane und die toxischen Wirkungen identifiziert werden können, aber Leiden, 
schwere Toxizität, Morbidität oder Tod der Tiere vermieden werden. Die 
höchste Dosisstufe ist normalerweise so zu wählen, dass Anzeichen von Toxizität hervorgerufen werden, die sich z. B. in einer verzögerten Körper ­
gewichtsentwicklung äußern (etwa 10 %). Je nach den Zielen der Studie 
(siehe Nummer 6) kann jedoch eine Höchstdosis festgelegt werden, die 
unter der zu Toxizitätszeichen führenden Dosis liegt, z. B. wenn eine Dosis eine besorgniserregende Wirkung auslöst, die sich aber nur geringfügig auf Lebensdauer oder Körpergewicht auswirkt.
 
25. Die Dosisstufen und die Abstände der Dosisstufen können so gewählt wer ­
den, dass eine Dosis-Wirkungs-Beziehung und, je nach Wirkungsweise der Prüfsubstanz, ein NOAEL-Wert oder andere angestrebte Studienergebnisse, z. B. ein BMD (siehe Nummer 27), festgestellt werden können. Zu den 
Faktoren, die bei der Festlegung niedrigerer Dosen zu berücksichtigen sind, 
gehören die voraussichtliche Steigung der Dosis-Wirkungs-Kurve, die Do ­
sen, bei denen wichtige Änderungen des Metabolismus oder der toxischen Wirkungsweise eintreten können, und das Niveau, bei dem eine Schwelle 
oder ein Ausgangspunkt für eine Extrapolation niedriger Dosen erwartet 
wird. Bei Durchführung einer kombinierten Prüfung auf Kanzerogenität und chronische Toxizität liegt der Schwerpunkt auf der Gewinnung von Informationen für die Einschätzung des Kanzerogenitätsrisikos, während 
die Gewinnung von Informationen über die chronische Toxizität normaler ­
weise ein nachrangiges Ziel ist. Dies ist zu berücksichtigen, wenn die Dosis ­
stufen und ihre Abstände für die Studie festgelegt werden.
 
26. Welche Dosisstufenabstände gewählt werden, hängt von den Zielen der 
Studie und den Merkmalen der Prüfsubstanz ab und kann in dieser Prüf ­
methode nicht im Einzelnen vorgeschrieben werden. Abstände mit einem Faktor von 2 bis 4 erweisen sich jedoch oft als gut geeignet für die Fest ­
setzung abnehmender Dosisstufen. Außerdem ist es oft besser, statt der 
Verwendung sehr großer Intervalle (z. B. mit einem Faktor zwischen 6 und 10) zwischen den Dosierungen eine vierte Prüfgruppe einzurichten. Die Verwendung von Faktoren über 10 sollte im Allgemeinen vermieden 
bzw. gegebenenfalls begründet werden.
 
27. Entsprechend dem Guidance Document No. 116 (7) sind bei der Dosisfest ­
legung u. a. folgende Faktoren zu berücksichtigen:  
— bekannte oder vermutete Nichtlinearitäten oder Wendepunkte der 
Dosis-Wirkungs-Kurve;  
— Toxikokinetik und Dosisbereiche, bei denen die metabolische Induktion, 
die Sättigung oder die Nichtlinearität zwischen externen und internen Dosen auftritt oder nicht auftritt;
 
— Vorläuferläsionen, Wirkungsmarker oder Indikatoren für den Ablauf zu ­
grunde liegender biologischer Schlüsselprozesse;  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 490
 
— wichtige (oder vermutete) Aspekte der Wirkungsweise, z. B. Dosen, ab 
denen Zytotoxizität auftritt, Hormonspiegel beeinflusst werden, homö ­
ostatische Mechanismen gestört werden usw.;  
— Bereiche der Dosis-Wirkungs-Kurve, bei denen eine besonders genaue 
Schätzung erforderlich ist, z. B. im Bereich der vorgesehenen BMD oder 
einer vermuteten Schwelle;  
— Berücksichtigung der voraussichtlichen Expositionsniveaus von Men ­
schen, insbesondere bei der Wahl mittlerer und niedriger Dosen.  
28. Die Kontrollgruppe ist eine unbehandelte Gruppe oder eine Vehikelkontroll ­
gruppe, sofern ein Vehikel zur Verabreichung der Prüfsubstanz verwendet wird. Abgesehen von der Behandlung mit der Prüfsubstanz sollten die Tiere der Kontrollgruppe genauso behandelt werden wie die Tiere in den Prüf ­
gruppen. Wird ein Vehikel verwendet, erhält die Kontrollgruppe das Vehikel 
im höchsten bei den Dosisgruppen verwendeten Volumen. Wird eine Prüf ­
substanz mit dem Futter verabreicht, und führt dies aus geschmacklichen Gründen zu einer verminderten Futteraufnahme, kann eine paarweise gefüt ­
terte Kontrollgruppe nützlich und eine bessere Kontrolle sein.
 
Zubereitung der Dosen und Verabreichung der Prüfsubstanz  
29. Die Prüfsubstanz wird in der Regel oral, d. h. mit der Nahrung oder dem 
Trinkwasser, oder über eine Schlundsonde verabreicht. Zusätzliche Informa ­
tionen zu Verabreichungswegen und -methoden sind im Guidance Docu ­
ment No. 116 (7) enthalten. Verabreichungsweg und -methode richten 
sich nach dem Zweck der Studie, den physikalisch-chemischen Eigenschaf ­
ten der Prüfsubstanz, ihrer Bioverfügbarkeit und der vorherrschenden Art der Exposition beim Menschen. Der gewählte Verabreichungsweg und die 
Methode sollten begründet werden. Aus Tierschutzgründen sollte die 
Schlundsonde nur für Agenzien gewählt werden, bei denen dieser Weg und diese Methode der Verabreichung die potenzielle Humanexposition annähernd repräsentieren (z. B. Arzneimittel). Nahrungs- oder Umweltche ­
mikalien einschließlich Pestizide werden normalerweise mit dem Futter oder 
dem Trinkwasser verabreicht. Für bestimmte Szenarios, z. B. berufliche Exposition, können andere Applikationswege besser geeignet sein.
 
30. Bei Bedarf wird die Prüfsubstanz in einem geeigneten Vehikel gelöst oder 
suspendiert. Zu berücksichtigen sind gegebenenfalls folgende Merkmale des 
Vehikels und anderer Additive: Auswirkungen auf die Resorption, die Ver ­
teilung, den Stoffwechsel oder die Retention der Prüfsubstanz; Auswirkun ­
gen auf die chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, die deren toxische 
Eigenschaften verändern können, und ferner Auswirkungen auf die Futter- oder Wasseraufnahme oder den Ernährungszustand der Versuchstiere. Es empfiehlt sich, nach Möglichkeit zunächst die Verwendung einer wässrigen 
Lösung/Suspension, dann eine Lösung/Emulsion in Öl (z. B. Maisöl) und 
erst dann eine Lösung in einem anderen Vehikel in Betracht zu ziehen. Bei anderen Vehikeln als Wasser müssen deren toxische Merkmale bekannt sein. Es sollten Informationen über die Stabilität der Prüfsubstanz und die Ho ­
mogenität der Lösungen oder Futterrationen, die (je nach Fall) die Dosie ­
rung enthalten, unter den Verabreichungsbedingungen (z. B. mit dem Futter) vorliegen.
 
31. Für mit dem Futter oder dem Trinkwasser verabreichte Stoffe ist unbedingt 
sicherzustellen, dass die Mengen der jeweiligen Prüfsubstanz die normale 
Nahrungsaufnahme oder den Wasserhaushalt nicht beeinträchtigen. Um eine unausgewogene Ernährung zu vermeiden, sollte die Konzentration der Prüf ­
substanz in Langzeittoxizitätsstudien mit Verabreichung über die Nahrung 
normalerweise eine Obergrenze von 5 % der Gesamtnahrung nicht überstei ­
gen. Wenn die Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht wird, kann entweder eine konstante Futterkonzentration (mg/kg Futter oder ppm) oder eine kon ­
stante Dosierung in Relation zum Körpergewicht des Tiers (mg/kg Körper ­
gewicht), berechnet auf Wochenbasis, verwendet werden. Die jeweils ge ­
wählte Verfahrensweise ist anzugeben.
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32. Bei oraler Verabreichung erhalten die Tiere die Prüfsubstanz täglich (sieben 
Tage in der Woche) für einen Zeitraum von 12 Monaten (chronische Phase) 
oder 24 Monaten (Kanzerogenitätsphase), siehe auch Nummern 33 und 34. Jede Abweichung von diesem Dosierungsplan, z. B. fünf Tage pro Woche, ist zu begründen. Bei dermaler Applikation werden die Tiere, wie in Kapitel 
B.9 dieses Anhangs (11) beschrieben, für einen Zeitraum von 12 Monaten 
(chronische Phase) oder 24 Monaten (Kanzerogenitätsphase) an sieben Ta ­
gen in der Woche mindestens 6 Stunden pro Tag mit der Prüfsubstanz behandelt. Die Inhalationsexposition wird an sieben Tagen in der Woche 
für 6 Stunden pro Tag durchgeführt, aber auch fünf Tage in der Woche sind 
möglich, wenn dies gerechtfertigt ist. Die Expositionsdauer beträgt norma ­
lerweise 12 Monate (chronische Phase) oder 24 Monate (Kanzerogenitäts ­
phase). Wenn für eine „Nose-only“-Exposition andere Nagetierarten als 
Ratten verwendet werden, kann die maximale Expositionsdauer angepasst 
werden, um artenspezifisches Leiden zu minimieren. Eine Expositionsdauer von weniger als 6 Stunden pro Tag ist zu begründen. Siehe auch Kapitel B.8 dieses Anhangs (9).
 
33. Wird die Prüfsubstanz über eine Sonde verabreicht, so sollte dies unter 
Verwendung einer Schlundsonde oder einer geeigneten Intubationskanüle 
jeweils zur gleichen Tageszeit erfolgen. Normalerweise wird einmal am 
Tag eine einzige Dosis verabreicht; wenn es sich bei der Prüfsubstanz z. B. um einen lokal reizenden Stoff handelt, kann die Tagesdosis auf zwei Teilmengen aufgeteilt werden. Das maximale Flüssigkeitsvolumen, das ei ­
nem Versuchstier jeweils verabreicht werden kann, hängt von der Größe des 
Versuchstiers ab. Das Volumen sollte so gering wie möglich sein und bei Nagetieren normalerweise 1 ml/100 g Körpergewicht nicht überschreiten (31). Die Variabilität der Prüfvolumina sollte durch Anpassung der Konzen ­
tration auf ein konstantes Volumen bei allen Dosen möglichst gering ge ­
halten werden. Davon ausgenommen sind potenziell ätzende oder reizende Stoffe, die zur Vermeidung schwerwiegender lokaler Wirkungen verdünnt werden müssen. Die Prüfung in Konzentrationen, die wahrscheinlich eine 
verätzende oder reizende Wirkung für den Magen-Darm-Trakt haben, ist zu 
vermeiden.
 
Versuchsdauer  
34. Dosierungszeitraum und Dauer der chronischen Phase dieser Studie betragen 
normalerweise 12 Monate, aber je nach den Anforderungen bestimmter 
Regulierungsregelungen oder für spezifische mechanistische Zwecke sind 
auch kürzere (z. B. 6 oder 9 Monate) oder längere (z. B. 18 oder 24 Monate) Zeiträume möglich. Abweichungen von der 12-monatigen Exposi ­
tionsdauer sind zu begründen, insbesondere wenn eine kürzere Dauer ge ­
wählt wird. Zur Bewertung der chronischen Toxizität und nicht neoplas ­
tischer pathologischer Läsionen wird die Behandlung aller Dosisgruppen dieser Phase zum festgelegten Zeitpunkt beendet. Satellitengruppen zur Be ­
obachtung der Reversibilität von toxikologischen Veränderungen, die durch 
die Prüfsubstanz hervorgerufen werden, sollten nach Beendigung der Ex ­
position noch für einen Zeitraum von mindestens 4 Wochen, aber nicht länger als ein Drittel der Gesamtstudiendauer ohne Behandlung beibehalten 
werden.
 
35. Die Kanzerogenitätsphase dieser Studie dauert bei Nagetieren in der Regel 
24 Monate, was dem größten Teil der normalen Lebenszeit der verwendeten 
Tiere entspricht. Eine kürzere oder längere Studiendauer ist je nach Lebens ­
zeit der in der Studie verwendeten Tierart möglich, sollte aber begründet werden. Bei bestimmten Stämmen von Mäusen, z. B. die Stämme AKR/J, C3H/J oder C57BL/6J, ist eine Dauer von 18 Monaten möglicherweise 
besser geeignet. Im Folgenden werden Hinweise zu Dauer und Beendigung 
der Studie und dem Überleben der Tiere gegeben. Weitere Hinweise, u. a. zu der Frage, wieweit ein aus der Überlebensrate der Tiere resultierendes negatives Ergebnis einer Kanzerogenitätsstudie akzeptiert werden kann, sind 
im OECD Guidance Document No. 116 on the Design and Conduct of 
Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (7) zu finden.
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— Wenn die Anzahl der überlebenden Tiere in den Gruppen mit niedrigerer 
Dosierung oder in der Kontrollgruppe unter 25 % sinkt, ist die Beendi ­
gung der Studie in Betracht zu ziehen.  
— Ist lediglich in der Hochdosisgruppe ein vorzeitiger Tod aufgrund von 
Toxizität festzustellen, muss dies nicht zwangsläufig zur Beendigung der Studie führen.
 
— Die Überlebensrate sollte nach Geschlechtern getrennt ausgewertet wer ­
den. 
— Die Studie sollte nicht über den Punkt hinaus fortgeführt werden, an 
dem die Daten aus der Studie nicht mehr ausreichen, um eine statistisch 
valide Bewertung vorzunehmen.  
BEOBACHTUNGEN (CHRONISCHE TOXIZITÄTSPHASE)  
36. Alle Tiere sind in der Regel jeden Tag morgens und abends, auch am 
Wochenende und an Feiertagen, auf Anzeichen von Morbidität und Morta ­
lität hin zu untersuchen. Allgemeine klinische Beobachtungen sollten min ­
destens einmal täglich, vorzugsweise zur selben Tageszeit, unter Berück ­
sichtigung des Zeitraums, in dem der Wirkungsgipfel nach Verabreichung 
der Dosis über eine Schlundsonde zu erwarten ist, vorgenommen werden.  
37. Bei allen Tieren sind mindestens einmal vor der ersten Exposition (für 
intraindividuelle Vergleiche), am Ende der ersten Studienwoche und danach monatlich gründliche klinische Beobachtungen vorzunehmen. Das Beobach ­
tungsprotokoll ist so zu gestalten, dass Abweichungen zwischen den Be ­
obachtern minimiert werden und von der Prüfgruppe unabhängig sind. Diese Beobachtungen sollten außerhalb des Käfigs erfolgen, in dem die Tiere gehalten werden, und zwar vorzugsweise in einem Standardgehege jeweils 
zu denselben Zeiten. Sie sind sorgfältig zu dokumentieren, am besten nach 
einer speziell vom Prüflabor entwickelten Bewertungsskala. Die Beobach ­
tungsbedingungen sollten möglichst konstant sein. Zu achten ist insbeson ­
dere auf Veränderungen an Haut, Fell, Augen, Schleimhäuten, auf Sekrete 
und Exkrete sowie autonome Aktivitäten (z. B. Tränensekretion, Piloerekti ­
on, Pupillengröße, ungewöhnliche Atemmuster). Gang- und Haltungsstörun ­
gen, ferner Reaktionen auf den Umgang mit den Tieren sowie etwaige klonische oder tonische Bewegungen, Stereotypien (z. B. übermäßiges Put ­
zen, wiederholte Kreisbewegungen) oder abnormes Verhalten (z. B. Selbst ­
verstümmelung, Rückwärtsgehen) sollten auch dokumentiert werden (32).
 
38. Alle Tiere sind vor der ersten Verabreichung der Prüfsubstanz mit einem 
Ophthalmoskop oder einem anderen geeigneten Instrument ophthalmolo ­
gisch zu untersuchen. Am Ende der Studie ist diese Untersuchung möglichst 
bei allen Tieren, aber mindestens bei der Hochdosisgruppe und der Kontroll ­
gruppe zu wiederholen. Wenn behandlungsbedingte Veränderungen an den Augen beobachtet werden, sind alle Tiere zu untersuchen. Wenn eine Struk ­
turanalyse oder andere Informationen auf eine Toxizität für die Augen hin ­
deuten, ist die Frequenz der Augenuntersuchungen zu erhöhen.
 
39. Bei Chemikalien, für die vorangegangene Toxizitätsprüfungen mit wieder ­
holter Gabe über 28 und/oder 90 Tage auf potenzielle neurotoxische Wir ­
kungen hindeuten, können vor Studienbeginn, in Abständen von drei Mo ­
naten nach Beginn einer Studie von bis zu 12 Monaten einschließlich sowie 
bei Beendigung der Studie (falls länger als 12 Monate) fakultativ die sen ­
sorische Reaktivität auf Reize verschiedener Art (32) (z. B. akustische, visuelle und propriozeptive Reize) (33), (34), (35), die Greifkraft (36) und die motorische Aktivität (37) bewertet werden. Weitere Einzelheiten zu den 
möglichen Untersuchungen finden sich in der Literatur. Allerdings können 
auch andere als dort genannte Verfahren angewendet werden.
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40. Bei Chemikalien, für die vorangegangene Toxizitätsprüfungen mit wieder ­
holter Gabe über 28 und/oder 90 Tage auf potenzielle immunotoxische 
Wirkungen hindeuten, können bei Beendigung der Studie fakultativ weitere Untersuchungen dieses Endpunkts durchgeführt werden.
 
Körpergewicht, Futter-/Wasseraufnahme und Futtereffizienz  
41. Alle Tiere sollten zu Beginn der Behandlung, in den ersten 13 Wochen 
mindestens einmal wöchentlich und danach mindestens monatlich gewogen 
werden. Futteraufnahme und Futtereffizienz sollten in den ersten 13 Wochen mindestens wöchentlich und danach mindestens monatlich bestimmt werden. 
Die Trinkwasseraufnahme sollte in den ersten 13 Wochen mindestens wö ­
chentlich und danach mindestens monatlich gemessen werden, wenn die Prüfsubstanz mit dem Trinkwasser verabreicht wird. Bei Studien, in denen das Trinkverhalten der Tiere verändert ist, sollte auch die Trinkwasserauf ­
nahme gemessen werden.
 
Hämatologie und klinische Biochemie  
42. Bei Prüfungen an Nagetieren sind die hämatologischen Untersuchungen an 
allen Versuchstieren (10 männliche und 10 weibliche Tiere je Gruppe) nach 
3, 6 und 12 Monaten sowie bei Beendigung der Studie (falls sie länger als 
12 Monate dauert) durchzuführen. Bei Mäusen werden möglicherweise Sa ­
tellitentiere benötigt, um alle erforderlichen hämatologischen Bestimmungen vornehmen zu können (siehe Nummer 19). Bei Prüfungen an Nichtnagern 
werden die Proben wie bei Nagetieren beschrieben in den Zwischenphasen 
und bei Beendigung der Studie von einer kleineren Anzahl Tiere (z. B. vier Tiere je Geschlecht und je Gruppe in Hundestudien) genommen. Weder bei Nagern noch bei Nichtnagern brauchen Messungen nach drei Monaten vor ­
genommen zu werden, wenn bei den hämatologischen Parametern in einer 
vorangegangenen 90-Tage-Studie mit vergleichbaren Dosisstufen keine Wir ­
kung erkennbar war. Die Blutproben müssen unter Anästhesie an einer benannten Stelle, z. B. durch Herzpunktion oder aus dem retrobulbären 
Venenplexus entnommen werden.
 
43. Die folgenden Parameter sind zu bestimmen (38): Gesamt- und Differenzi ­
alleukozytenzahl, Erythrozytenzahl, Thrombozytenzahl, Hämoglobinkonzen ­
tration, Hämatokrit, mittleres Erythrozyteneinzelvolumen (MCV), mittleres korpuskuläres Hämoglobin (MCH), mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration (MCHC), Prothrombinzeit und aktivierte partielle 
Thromboplastinzeit. Je nach Toxizität der Prüfsubstanz können gegebenen ­
falls auch weitere hämatologische Parameter wie Heinz-Körper oder andere atypische Erythrozytenmorphologie oder Methämoglobin gemessen werden. Insgesamt ist je nach den beobachteten und/oder erwarteten Wirkungen der 
Prüfsubstanz mit der entsprechenden Flexibilität vorzugehen. Wenn die 
Prüfsubstanz Auswirkungen auf die Hämatopoese hat, können auch eine Bestimmung der Retikulozytenzahl und eine Knochenmarkzytologie ange ­
zeigt sein; sie müssen aber nicht routinemäßig durchgeführt werden.
 
44. Klinisch-biochemische Bestimmungen zur Untersuchung der wichtigsten to ­
xischen Wirkungen in Geweben, insbesondere der Wirkungen auf Nieren 
und Leber, sind an Blutproben durchzuführen, die von jedem Versuchstier 
(10 männliche und 10 weibliche Tiere je Gruppe) in den für die hämatolo ­
gischen Untersuchungen angegebenen gleichen Zeitabständen entnommen werden. Bei Mäusen werden möglicherweise Satellitentiere benötigt, um 
alle erforderlichen klinisch-biochemischen Bestimmungen vornehmen zu 
können. Bei Prüfungen an Nichtnagern werden die Proben wie bei Nagetie ­
ren beschrieben in den Zwischenphasen und bei Beendigung der Studie von einer kleineren Anzahl Tiere (z. B. vier Tiere je Geschlecht und je Gruppe 
in Hundestudien) genommen. Weder bei Nagern noch bei Nichtnagern brau ­
chen Messungen nach drei Monaten vorgenommen zu werden, wenn bei den
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klinisch-biochemischen Parametern in einer vorangegangenen 90-Tage-Stu ­
die mit vergleichbaren Dosisstufen keine Wirkung erkennbar war. Es emp ­
fiehlt sich eine Futterkarenz der Tiere (ausgenommen Mäuse) über Nacht, bevor die Blutproben entnommen werden (
 1 ). Die folgenden Parameter sind 
zu bestimmen (38): Glucose, Harnstoff (Harnstoff-Stickstoff), Kreatinin, 
Gesamtprotein, Albumin, Calcium, Natrium, Kalium, Gesamtcholesterin, 
mindestens zwei geeignete Parameter für die hepatozelluläre Evaluierung (Alanin-Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase, Glutamatdehydroge ­
nase, Gesamtgallensäuren) (39) und mindestens zwei geeignete Parameter 
für die hepatobiliäre Evaluierung (alkalische Phosphatase, γ-Glutamyltrans ­
ferase, 5’-Nucleotidase, Gesamtbilirubin, Gesamtgallensäuren) (39). Je nach Toxizität der Prüfsubstanz können gegebenenfalls auch weitere klinisch-chemische Parameter wie Nüchtern-Triglyceride, spezifische Hor ­
mone und Cholinesterase bestimmt werden. Insgesamt ist je nach den be ­
obachteten und/oder erwarteten Wirkungen der Prüfsubstanz mit der ent ­
sprechenden Flexibilität vorzugehen.
 
45. An Proben, die allen Tieren in der Studie (zehn männliche und zehn weib ­
liche Tiere je Gruppe) in den gleichen Abständen entnommen wurden wie die Proben für die hämatologische und die klinisch-chemische Unter ­
suchung, sind Urinanalysen durchzuführen. Es brauchen keine Messungen 
nach drei Monaten vorgenommen zu werden, wenn bei der Urinanalyse in einer vorangegangenen 90-Tage-Studie mit vergleichbaren Dosisstufen keine Wirkung erkennbar war. Eine Empfehlung von Sachverständigen zu kli ­
nischen Pathologiestudien (38) enthält die folgende Liste von Parametern: 
Aussehen, Volumen, Osmolalität oder spezifisches Gewicht, pH-Wert, Ge ­
samteiweiß und Glucose. Außerdem können Ketone, Urobilinogen, Bilirubin und okkultes Blut bestimmt werden. Sofern erforderlich, können weitere 
Parameter verwendet werden, um die Untersuchung beobachteter Wirkungen 
zu erweitern.
 
46. Bei Studien an Hunden werden im Allgemeinen Bestimmungen der Aus ­
gangsdaten hämatologischer und klinisch-biochemischer Parameter vor der Behandlung für notwendig gehalten; bei Studien an Nagern müssen sie aber 
nicht bestimmt werden (38). Wenn keine ausreichenden historischen Aus ­
gangsdaten vorliegen (siehe Nummer 58), sollten sie jedoch bestimmt wer ­
den.
 
PATHOLOGIE  
Makroskopische Untersuchung  
47. Alle an der Studie beteiligten Tiere müssen normalerweise einer vollständi ­
gen, eingehenden makroskopischen Untersuchung unterzogen werden, die 
die sorgfältige Untersuchung der äußeren Körperoberfläche, aller Körperöff ­
nungen sowie der Schädel-, Brust- und Bauchhöhlen und ihres Inhalts um ­
fasst. Es kann jedoch auch vorgesehen werden, die Untersuchungen (in den 
Gruppen der Tiere, die im Verlauf der Studie getötet werden sollen, und in 
den Satellitengruppen) auf spezifische Schlüsselaspekte wie Neurotoxizität oder Immunotoxizität zu beschränken (siehe Nummer 21). Diese Tiere brau ­
chen weder seziert noch den nachstehend beschriebenen Verfahren unterzo ­
gen zu werden. Sentineltiere können nach Ermessen des Studienleiters von 
Fall zu Fall seziert werden.
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( 1 ) Für eine Reihe von Serum- und Plasmabestimmungen, insbesondere der Glucose, ist eine 
Futterkarenz der Tiere über Nacht zu empfehlen. Der Hauptgrund dafür ist, dass die bei 
fehlender Futterkarenz unweigerlich zunehmende Variabilität zu einer Maskierung sub ­
tilerer Wirkungen führen und die Interpretation erschweren könnte. Andererseits jedoch 
kann die nächtliche Futterkarenz den allgemeinen Metabolismus der Tiere beeinflussen 
und, insbesondere in Futterstudien, die tägliche Exposition gegen die Prüfsubstanz beein ­
trächtigen. Alle Tiere sind in demselben physiologischen Zustand zu bewerten; daher 
sollten ausführliche oder neurologische Untersuchungen für einen anderen Tag geplant 
werden als die Probenahmen für klinisch-biochemische Untersuchungen.
 48. Die Organgewichte aller Tiere sind zu erfassen, außer von denen, die gemäß 
dem letzten Teil von Nummer 47 ausgenommen sind. Nebennieren, Gehirn, 
Nebenhoden, Herz, Nieren, Leber, Ovarien, Milz, Hoden, Schilddrüse (nach Fixierung gewogen, mit Nebenschilddrüsen) und Uterus (außer der mori ­
bund aufgefundenen und/oder zwischenzeitlich getöteten Tiere) sind in an ­
gemessener Form von anhaftendem Gewebe zu befreien, und ihr Nass ­
gewicht ist so rasch wie möglich nach der Sektion festzustellen, um ein Austrocknen zu verhindern.
 
49. Die folgenden Gewebe sind in dem für die betreffende Gewebeart und die 
vorgesehene anschließende histopathologische Untersuchung am besten ge ­
eigneten Fixierungsmittel aufzubewahren (40) (Gewebe in eckigen Klam ­
mern sind fakultativ): 
alle makro-skopischen Ver ­
änderungen Herz Pankreas Magen (Vormagen, Drüsen ­
magen) 
Nebennieren Ileum Nebenschilddrüse [Zähne] 
Aorta Jejunum periphere Nerven Hoden 
Gehirn (mit Schnitten von 
Cerebrum, Cerebellum und Medulla/Pons) Nieren Hypophyse Thymus 
Caecum Tränendrüse (exorbital) Prostata Schilddrüse 
Zervix Leber Rectum [Zunge] 
Koagulationsdrüse Lunge Speicheldrüse Trachea 
Kolon Lymphknoten (sowohl 
oberflächliche als auch 
tiefe) Samenbläschen Harnblase 
Duodenum Brustdrüse (obligatorisch 
für Weibchen und, falls 
bei der Sektion erkenn ­
bar, für Männchen) Skelettmuskel Uterus (mit Zervix) 
Nebenhoden [obere Atemwege, ein ­
schließlich Nase, Nasen ­
muscheln und Nasen ­
nebenhöhlen] Haut [Harnleiter] 
Auge (mit Netzhaut) Speiseröhre Rückenmark (auf 3 
Ebenen: zervical, mitt ­
lerer Thoraxbereich und lumbar) [Harnröhre] 
[Femur mit Gelenk] [Riechkolben] Milz Vagina 
Gallenblase (bei anderen 
Arten als Ratten) Ovarien [Brustbein] Knochenmarkschnitt und/ 
oder ein frisches 
Knochenmark-Aspirat 
Hardersche Drüse
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 496
 
Bei paarigen Organen, z. B. Nieren, Nebennieren, sind beide Organe auf ­
zubewahren. Die klinischen und sonstigen Befunde können weitere Gewebe ­
untersuchungen erforderlich machen. Auch Organe, die aufgrund der be ­
kannten Eigenschaften der Prüfsubstanz als mögliche Zielorgane in Frage kommen, sollten aufbewahrt werden. In Studien mit dermaler Applikation 
sind die in der Liste für orale Verabreichung aufgeführten Organe zu unter ­
suchen; außerdem sind Proben der Haut an der Applikationsstelle zu neh ­
men und aufzubewahren. Bei Inhalationsstudien entspricht die Liste der aufzubewahrenden und zu untersuchenden Gewebe des Atemtrakts den 
Empfehlungen von Kapitel B.8 dieses Anhangs (9) und Kapitel B.29 dieses 
Anhangs (10). Was andere Organe/Gewebe betrifft, so sollten (zusätzlich zu den speziell konservierten Geweben aus dem Atemtrakt) die in der Liste für die orale Verabreichung genannten Organe untersucht werden.
 
Histopathologie  
50. Es gibt Leitlinien für bewährte Praktiken bei der Durchführung toxikologi ­
scher Pathologiestudien (40). Histopathologisch zu untersuchen sind min ­
destens  
— alle Gewebe der Tiere aus der Hochdosisgruppe und der Kontrollgruppe,  
— alle Gewebe von während der Studie gestorbenen oder getöteten Tieren,  
— alle Gewebe mit makroskopischen Abnormitäten,  
— Zielgewebe oder Gewebe, die in der Hochdosisgruppe behandlungs ­
bedingte Veränderungen aufwiesen, von allen Tieren in allen anderen Dosisgruppen,
 
— bei paarigen Organen, z. B. Nieren, Nebennieren, sind beide Organe zu 
untersuchen.  
BEOBACHTUNGEN (Kanzerogenitätsphase)  
51. Alle Tiere sind in der Regel jeden Tag morgens und abends, auch am 
Wochenende und an Feiertagen, auf Anzeichen von Morbidität und Morta ­
lität hin zu untersuchen. Darüber hinaus sind die Tiere einmal am Tag auf spezielle Anzeichen von toxikologischer Bedeutung zu untersuchen. Bei 
Studien mit Sondenapplikation sind die Tiere unmittelbar nach der Dosie ­
rung zu kontrollieren. Die Entwicklung von Tumoren ist mit besonderer Aufmerksamkeit zu verfolgen; dabei sind der Zeitpunkt der Entstehung, die Lokalisierung, das Ausmaß, das Erscheinungsbild und die Progression 
jedes deutlich sichtbaren oder fühlbaren Tumors festzuhalten.
 
52. Alle Tiere sollten zu Beginn der Behandlung, in den ersten 13 Wochen 
mindestens einmal wöchentlich und danach mindestens monatlich gewogen werden. Futteraufnahme und Futtereffizienz sollten in den ersten 13 Wochen 
mindestens wöchentlich und danach mindestens monatlich bestimmt werden. 
Die Trinkwasseraufnahme sollte in den ersten 13 Wochen mindestens wö ­
chentlich und danach mindestens monatlich gemessen werden, wenn die Prüfsubstanz mit dem Trinkwasser verabreicht wird. Bei Studien, in denen 
das Trinkverhalten der Tiere verändert ist, sollte auch die Trinkwasserauf ­
nahme gemessen werden.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 497
 
Hämatologie, klinische Biochemie und sonstige Messungen  
53. Um möglichst viele Informationen aus der Studie zu gewinnen, insbesondere 
in Bezug auf die Wirkungsweise der Prüfsubstanz, können nach Ermessen des Studienleiters Blutproben für hämatologische und klinisch-biochemische 
Untersuchungen genommen werden. Urinuntersuchungen können ebenfalls 
angezeigt sein. Daten über die Tiere, die in der normalerweise 12 Monate dauernden chronischen Toxizitätsphase der Studie (Nummer 34) verwendet wurden, liefern Informationen über diese Parameter. Weitere Hinweise zum 
Nutzen dieser Probenahmen im Rahmen einer Kanzerogenitätsprüfung sind 
im Guidance Document No. 116 (7) zu finden. Wenn Blutproben genom ­
men werden, sollten sie am Ende des Prüfzeitraums kurz vor der Tötung 
oder als Teil des Tötungsvorgangs genommen werden. Sie müssen unter 
Anästhesie an einer benannten Stelle, z. B. durch Herzpunktion oder aus dem retrobulbären Venenplexus entnommen werden. Es können auch Blut ­
ausstriche zur Untersuchung angefertigt werden, insbesondere wenn das 
Knochenmark das Zielorgan zu sein scheint. Der Nutzen dieser Unter ­
suchung von Blutausstrichen in der Kanzerogenitätsphase für die Einschät ­
zung des karzinogenen/onkogenen Potenzials ist jedoch fraglich (38).
 
PATHOLOGIE  
Makroskopische Untersuchung  
54. Alle an der Studie beteiligten Tiere, ausgenommen Sentineltiere und andere 
Satellitentiere (siehe Nummer 20), müssen einer vollständigen, eingehenden makroskopischen Untersuchung unterzogen werden, die die sorgfältige Un ­
tersuchung der äußeren Körperoberfläche, aller Körperöffnungen sowie der 
Schädel-, Brust- und Bauchhöhlen und ihres Inhalts umfasst. Sentineltiere und andere Satellitentiere können nach Ermessen des Studienleiters von Fall zu Fall seziert werden. Organgewichte werden bei einer Prüfung auf Kan ­
zerogenität normalerweise nicht erfasst, da der Nutzen dieser Daten durch 
geriatrische Veränderungen und in späteren Stadien durch die Entstehung von Tumoren beeinträchtigt wird. Sie können jedoch für die Durchführung 
einer Weight-of-Evidence-Bewertung und insbesondere für Fragen der Wir ­
kungsweise von Bedeutung sein. Wenn sie Teil einer Satellitenstudie sind, sollten sie nicht später als ein Jahr nach Studienbeginn erfasst werden.
 
55. Die folgenden Gewebe sind in dem für die betreffende Gewebeart und die 
vorgesehene anschließende histopathologische Untersuchung am besten ge ­
eigneten Fixierungsmittel aufzubewahren (40) (Gewebe in eckigen Klam ­
mern sind fakultativ): 
alle makro-skopischen Ver ­
änderungen Herz Pankreas Magen (Vormagen, Drüsen ­
magen) 
Nebennieren Ileum Nebenschilddrüse [Zähne] Aorta Jejunum periphere Nerven Hoden Gehirn (mit Schnitten von 
Cerebrum, Cerebellum und Medulla/Pons) Nieren Hypophyse Thymus 
Caecum Tränendrüse (exorbital) Prostata Schilddrüse 
Zervix Leber Rectum [Zunge] Koagulationsdrüse Lunge Speicheldrüse Trachea Kolon Lymphknoten (sowohl 
oberflächliche als auch tiefe) Samenbläschen Harnblase
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 498
 
Duodenum Brustdrüse (obligatorisch 
für Weibchen und, falls 
bei der Sektion erkenn ­
bar, für Männchen) Skelettmuskel Uterus (mit Zervix) 
Nebenhoden [obere Atemwege, ein ­
schließlich Nase, Nasen ­
muscheln und Nasen ­
nebenhöhlen] Haut [Harnleiter] 
Auge (mit Netzhaut) Speiseröhre Rückenmark (auf 3 
Ebenen: zervical, mitt ­
lerer Thoraxbereich und lumbar) [Harnröhre] 
[Femur mit Gelenk] [Riechkolben] Milz Vagina 
Gallenblase (bei anderen 
Arten als Ratten) Ovarien [Brustbein] Knochenmarkschnitt und/ 
oder ein frisches 
Knochenmark-Aspirat 
Hardersche Drüse
 
Bei paarigen Organen, z. B. Nieren, Nebennieren, sind beide Organe auf ­
zubewahren. Die klinischen und sonstigen Befunde können weitere Gewebe ­
untersuchungen erforderlich machen. Auch Organe, die aufgrund der be ­
kannten Eigenschaften der Prüfsubstanz als mögliche Zielorgane in Frage kommen, sollten aufbewahrt werden. In Studien mit dermaler Applikation 
sind die in der Liste für orale Verabreichung aufgeführten Organe zu unter ­
suchen; außerdem sind Proben der Haut an der Applikationsstelle zu neh ­
men und aufzubewahren. Bei Inhalationsstudien entspricht die Liste der aufzubewahrenden und zu untersuchenden Gewebe des Atemtrakts den 
Empfehlungen von Kapitel B.8 dieses Anhangs (8) und Kapitel B.29 dieses 
Anhangs (9). Was andere Organe/Gewebe betrifft, so sollten (zusätzlich zu den speziell konservierten Geweben aus dem Atemtrakt) die in der Liste für die orale Verabreichung genannten Organe untersucht werden.
 
Histopathologie  
56. Es gibt Leitlinien für bewährte Praktiken bei der Durchführung toxikologi ­
scher Pathologiestudien (40). Zu untersuchen sind mindestens folgende Ge ­
webe:  
— alle Gewebe der Tiere aus der Hochdosisgruppe und der Kontrollgruppe,  
— alle Gewebe von während der Studie gestorbenen oder getöteten Tieren,  
— alle Gewebe mit makroskopischen Abnormitäten einschließlich Tumo ­
ren, 
— wenn behandlungsbedingte histopathologische Veränderungen in der 
Hochdosisgruppe festgestellt werden, sind diese Gewebe von allen Tie ­
ren in allen anderen Dosisgruppen zu untersuchen,  
— bei paarigen Organen, z. B. Nieren, Nebennieren, sind beide Organe zu 
untersuchen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 499
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG (KANZEROGENITÄT UND 
CHRONISCHE TOXIZITÄT)  
Daten  
57. Für alle bestimmten Parameter sollen Daten zu den einzelnen Tieren ange ­
geben werden. Darüber hinaus sollten alle Daten in Form einer Tabelle zusammengefasst werden, aus der für jede Prüfgruppe folgende Angaben 
hervorgehen: die Zahl der Tiere bei Beginn der Prüfung und die Zahl der 
während der Prüfung tot aufgefundenen oder aus Tierschutzgründen getöte ­
ten Tiere, ferner der Zeitpunkt des Todes oder der Tötung, die Zahl der Tiere, die Toxizitätszeichen aufweisen, eine Beschreibung der beobachteten 
Toxizitätszeichen, einschließlich des Zeitpunkts, zu dem die toxischen Wir ­
kungen erstmalig aufgetreten sind, ihrer Dauer und ihres Schweregrads, die Zahl der Tiere mit Läsionen, die Art der Läsionen und der Prozentsatz der von jeder Läsion betroffenen Tiere. Die Mittelwerte und Standardabwei ­
chungen (für kontinuierliche Versuchsdaten) von Tieren, die toxische Wir ­
kungen oder Läsionen aufweisen, sind zusätzlich zum Schweregrad der Läsionen in Übersichtstabellen anzugeben.
 
58. Historische Kontrolldaten können die Auswertung der Studienergebnisse 
erleichtern, z. B. wenn die Daten der gleichzeitigen Kontrollen erheblich von neueren Daten von Kontrolltieren aus derselben Versuchseinrichtung abweichen. Wenn historische Kontrolldaten bewertet werden, sollten sie 
von demselben Labor stammen, sich auf Tiere desselben Alters und Stamms 
beziehen und höchstens fünf Jahre vor der fraglichen Studie erhoben worden sein.
 
59. Wenn möglich, sind die numerischen Daten durch eine geeignete allgemein 
annehmbare statistische Methode auszuwerten. Die statistischen Methoden und die zu analysierenden Daten sind bei der Planung der Studie festzulegen (Nummer 9). Diese Auswahl sollte es ermöglichen, erforderlichenfalls An ­
passungen je nach Überlebensrate vorzunehmen.
 
60. Der Prüfbericht sollte folgende Informationen enthalten:  
Prüfsubstanz:  
— physikalische Beschaffenheit, Reinheit und physikalisch-chemische Ei ­
genschaften,  
— Daten zur Identifikation,  
— Herkunft des Stoffs,  
— Chargennummer,  
— Bescheinigung der chemischen Analyse.  
Vehikel (wenn verwendet):  
— Begründung der Wahl des Vehikel, sofern anders als Wasser.  
Versuchstiere:  
— Art/Stamm und Begründung für die getroffene Wahl,  
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere bei Versuchsbeginn,  
— Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.,  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Versuchsbeginn.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 500
 
Prüfbedingungen:  
— Begründung für Verabreichungsweg und Festlegung der Dosis,  
— gegebenenfalls die statistischen Methoden zur Analyse der Daten,  
— Angaben zur Formulierung der Prüfsubstanz/Futterzubereitung,  
— Analysedaten über die erreichte Konzentration, Stabilität und Homoge ­
nität der Zubereitung,  
— Verabreichungsweg und Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz,  
— bei Inhalationsstudien: „Nose-only“- oder Ganzkörperexposition,  
— tatsächliche Dosen (mg/kg Körpergewicht/Tag) und, sofern zutreffend, 
Angaben zur Umrechnung der Konzentration der Prüfsubstanz im Futter/ 
Trinkwasser (mg/kg oder ppm) in die tatsächliche Dosis,  
— Angaben zu Futter- und Wasserqualität.  
Ergebnisse (zusammenfassende Übersichtstabellen und Daten für die einzel ­
nen Tiere):  
Allgemeines  
— Überlebensdaten,  
— Körpergewicht/Änderungen des Körpergewichts,  
— Futteraufnahme, gegebenenfalls Berechnungen der Futtereffizienz und 
der Wasseraufnahme, falls erfasst,  
— toxikokinetische Daten, falls vorhanden,  
— Ophthalmoskopie (falls zutreffend),  
— Hämatologie (falls zutreffend),  
— klinische Chemie (falls zutreffend).  
Klinische Befunde  
— Toxizitätszeichen,  
— Inzidenz (und, falls bewertet, Schweregrad) jeder Abnormität,  
— Art, Schweregrad und Dauer der klinischen Beobachtungen (sowohl 
vorübergehend als auch dauerhaft).  
Nekropsiedaten  
— terminales Körpergewicht,  
— Organgewichte (und gegebenenfalls Verhältnis Organ-/Körpergewicht),  
— Sektionsbefunde; Inzidenz und Schweregrad von Abnormitäten.  
Histopathologie  
— nicht neoplastische histopathologische Befunde,  
— neoplastische histopathologische Befunde,  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 501
 
— Korrelation zwischen makroskopischen und mikroskopischen Befunden,  
— ausführliche Beschreibung aller behandlungsbedingten histopathologi ­
schen Befunde mit Einstufung des Schweregrads,  
— Bericht über eventuelle Peer-Reviews von Objektträgern.  
Statistische Auswertung der Ergebnisse, soweit zutreffend  
Diskussion der Ergebnisse einschließlich  
— Diskussion von Modellierungsansätzen  
— Dosis-Wirkungs-Beziehungen  
— historische Kontrolldaten  
— Prüfung aller Informationen über die Wirkungsweise  
— Bestimmung von BMD, NOAEL oder LOAEL  
— Relevanz für Menschen  
Schlussfolgerungen  
LITERATUR:  
1. OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2. EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
3. Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163-208  
4. Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191  
5. Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: 
an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445  
6. Kapitel B.27 dieses Anhangs, Prüfung auf sub-chronische orale Toxizität — 
90-Tage-Toxizitätsstudie mit wiederholter Verabreichung an Nicht-Nagetie ­
ren 
7. OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, abrufbar auf der öffentlichen OECD-Website für Prüfrichtlinien: 
www.oecd.org/env/testguidelines.
 
8. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
9. Kapitel B.8 dieses Anhangs. Prüfung auf subakute Toxizität nach Inhalation 
— 28-Tage-Test.  
10. Kapitel B.29 dieses Anhangs, Prüfung auf sub-chronische Toxizität nach 
Inhalation — 90-Tage-Test.  
11. Kapitel B.9 dieses Anhangs, Toxizität nach 28-tägiger Gabe (dermal).  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 502
 
12. Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
 
13. Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). The 
human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Over ­
view. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.  
14. Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.
 
15. Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
 
16. Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural Chemical 
Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7.
 
17. Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and Ap ­
plication of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) 
Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit. Rev. Toxicol. 36: 9- 
35. 
18. Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al . (2006). A Tiered Approach to Sys ­
temic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. 
Rev. Toxicol. 36: 37-68.  
19. Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al.  (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. To ­
xicol. 36: 69-98.  
20. OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
21. OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.  
22. Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpre ­
tation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Ap ­
proaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729-837.
 
23. ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Se ­
lection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington DC.
 
24. Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharma ­
ceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
25. Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the 
assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF 
& Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.
 
26. Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of 
Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results 
and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agroche ­
mical Industry. Environ Health Perspect 105:1196-1203.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 503
 
27. Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 
22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwen ­
deten Tiere (ABl. L 276 vom 20.10.2010, S. 33).  
28. National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
 
29. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Structure 
of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 
906255-06-9.  
30. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
 
31. Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15-23.  
32. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Do ­
cument No. 60.  
33. Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rates. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.  
34. Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.  
35. Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Com ­
parisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
 
36. Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rates and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
 
37. Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Tera ­
tol. 13: 599-609.  
38. Weingand K, Brown G, Hall R  et al . (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. 
Toxicol. 29: 198-201.  
39. EMEA-Dokument (Entwurf) „Non-clinical guideline on drug-induced hepa ­
totoxicity“ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
40. Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK  et al.  (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 504
 
Anlage 1  
DEFINITION  
Prüfsubstanz:  jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode 
getestet wird.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 505
 
B.34.  PRÜFUNG AUF REPRODUKTIONSTOXIZITÄT WÄHREND 
EINER GENERATION  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.3. BEZUGSSUBSTANZEN  
Keine.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Die Prüfsubstanz wird mehreren Gruppen männlicher und weiblicher 
Versuchstiere in abgestuften Dosierungen verabreicht. Den männ ­
lichen Tieren wird die Prüfsubstanz während der Wachstumsperiode 
und mindestens eines vollständigen Spermatogenesezyklus (etwa 56 Tage bei der Maus und 70 Tage bei der Ratte) verabreicht, um auf diese Weise negative Wirkungen der Prüfsubstanz auf die Spermio ­
genese feststellen zu können.
 
Den weiblichen Tieren der P-Generation wird die Prüfsubstanz wäh ­
rend mindestens zweier vollständiger Östruszyklen verabreicht, um negative Wirkungen der Prüfsubstanz auf den Östrus beurteilen zu können, Anschließend werden die Tiere verpaart. Während der Paa ­
rungszeit wird die Prüfsubstanz beiden Geschlechtern verabreicht, 
anschließend nur den weiblichen Tieren während der Gravidität und der Laktation. Bei inhalativer Exposition sind Änderungen der Methode erforderlich.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Keine.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
Vorbereitungen  
Vor Testbeginn werden gesunde, junge, ausgewachsene Tiere rando ­
misiert und den Behandlungsgruppen zugeteilt. Die Tiere werden 
dann für einen Zeitraum von mindestens 5 Tagen vor dem Test unter versuchsnahen Unterbringungs- und Fütterungsbedingungen gehal ­
ten. Es wird empfohlen, die Prüfsubstanz mit dem Futter oder im 
Trinkwasser zu verabreichen. Andere Verabreichungswege sind 
ebenfalls zulässig. Während des eigentlichen Versuchsteils muss al ­
len Tieren die Prüfsubstanz auf dem gleichen Wege appliziert wer ­
den. Wird ein Vehikel oder ein sonstiger Zusatz zur Erleichterung 
der Verabreichung benutzt, muss deren nichttoxische Wirkung gesi ­
chert sein. Die Verabreichung erfolgt an 7 Tagen pro Woche.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 506
 
V e r s u c h s t i e r e  
Auswahl der Tierarten  
Bevorzugte Tierarten sind Ratte oder Maus. Tierstämme mit geringer 
Fruchtbarkeit sind auszuschließen und nur gesunde Tiere, die bisher noch keinen Versuchen unterzogen worden waren, einzusetzen. Die 
Versuchstiere sind nach Tierart, Tierstamm, Geschlecht, Gewicht 
und/oder Alter auszuwählen.
 
Um die Fruchtbarkeit ausreichend beurteilen zu können, müssen so ­
wohl männliche als auch weibliche Tiere untersucht werden. Alle Versuchs- und Kontrolltiere müssen vor Verabreichung der Prüfsub ­
stanz vom Muttertier entwöhnt sein.
 
Anzahl und Geschlecht  
Jede Versuchstier- und Kontrollgruppe muss so viele Tiere enthalten, 
dass darin etwa 20 trächtige Weibchen kurz vor bzw. zum Zeitpunkt 
der Geburt enthalten sind.  
Auf diese Weise soll gewährleistet werden, dass genügend Gravidi ­
täten und Nachkommen erzeugt werden, um eine aussagekräftige Bewertung des Schädigungspotenzials der Prüfsubstanz für die Fer ­
tilität, Schwangerschaft, Verhalten des Muttertiers in der P-Genera ­
tion sowie Säugen, Wachstum und Entwicklung der F
 1 -Generation 
von der Konzeption bis zum Absetzen vom Muttertier vornehmen zu können.
 
V e r s u c h s b e d i n g u n g e n  
Futter und Wasser ist den Tieren  ad libitum  bereitzustellen. Kurz vor 
dem Geburtstermin werden die trächtigen Weibchen einzeln in Ge ­
burtskäfigen untergebracht, die gegebenenfalls mit Nestmaterial aus ­
gestattet sind.  
D o s i e r u n g e n  
Es sollten mindestens drei Behandlungs- und eine Kontrollgruppe 
eingesetzt werden. Wird ein Vehikel benutzt, muss die Kontroll ­
gruppe das in der höchsten Dosierung applizierte Volumen erhalten. Wird die Nahrungsaufnahme oder -verwertung durch die Prüfsub ­
stanz beeinträchtigt, könnte der Einsatz einer entsprechend restriktiv 
gefütterten Kontrollgruppe sinnvoll sein. Sofern die physikalisch- 
chemischen Eigenschaften bzw. die biologische Wirkungsweise der Prüfsubstanz es zulassen, sollte die höchste Dosierung möglichst so gewählt werden, dass bei den Elterntieren (P) zwar Vergiftungs ­
erscheinungen auftreten, aber keine Mortalität verursacht wird. Im 
günstigsten Falle sollte(n) die mittlere(n) Dosierung(en) minimale prüfsubstanzbedingte Vergiftungserscheinungen bewirken, die nied ­
rigste Dosierung hingegen weder bei den Elterntieren noch bei den 
Nachkommen feststellbare negative Auswirkungen zeigen. Wird die 
Prüfsubstanz per Magensonde oder in Form von Kapseln verabreicht, muss die jeweilige Dosis entsprechend dem Körpergewicht unter 
Berücksichtigung der Veränderungen des Körpergewichts wöchent ­
lich angepasst werden. Während der Gravidität kann die Dosierung bei den weiblichen Tieren entweder aufgrund des Körpergewichts am Tag 0 oder am Tag 6 der Gravidität bestimmt werden.
 
L i m i t - T e s t  
Wenn im Falle einer Prüfsubstanz mit geringer Toxizität eine Dosie ­
rung von mindestens 1 000 mg/kg Körpergewicht nachweisbar kei ­
nen Einfluss auf die Reproduktionsfähigkeit hat, sind Untersuchun ­
gen mit anderen Dosierungen nicht notwendig. Konnten in einer 
Vorstudie mit hoher Dosierung, die eindeutige, prüfsubstanzbedingte Vergiftungserscheinungen beim Muttertier hervorrief, keinerlei nach ­
teilige Auswirkungen auf die Fertilität festgestellt werden, können 
auch hier Untersuchungen mit anderen Dosierungen als nicht not ­
wendig erachtet werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 507
 
Versuchsdurchführung  
V o r g e h e n s w e i s e  
Die tägliche Verabreichung der Prüfsubstanz an die männlichen El ­
terntiere (P) sollte nach der Entwöhnung vom Muttertier und einer mindestens 5-tägigen Akklimatisierung im Alter von 5 bis 9 Wochen 
beginnen. Bei den Ratten wird die Applikation für weitere 10 Wo ­
chen (bei Mäusen 8 Wochen) bis zur Paarungszeit fortgesetzt. Die männlichen Tiere werden nach der Verpaarung entweder getötet und untersucht oder weiterhin bei der Versuchsdiät belassen, um gegebe ­
nenfalls zur Erzeugung eines zweiten Wurfs zur Verfügung zu ste ­
hen, sollten jedoch noch vor Abschluss der Studie getötet und un ­
tersucht werden. Die weiblichen Elterntiere (P) erhalten die Prüfsub ­
stanz nach einer mindestens 5-tägigen Akklimatisierung bis mindes ­
tens 2 Wochen vor der Paarung. Die Behandlung der P-Weibchen 
wird während der 3-wöchigen Paarungszeit, der gesamten Gravidität bis zur Entwöhnung der F
 1 -Nachkommen fortgesetzt. 
Eine Änderung des Verabreichungsschemas kann aufgrund sonstiger 
verfügbarer Informationen über die Prüfsubstanz, z. B. über Stoff ­
wechselmechanismen oder Bioakkumulation, erforderlich sein.  
V e r p a a r u n g  
Bei Reproduktionsstudien über die toxikologischen Auswirkungen 
kann die Verpaarung entweder im Verhältnis 1:1 (ein männliches und ein weibliches Tier) oder 1:2 (ein männliches und zwei weibli ­
che Tiere) erfolgen.
 
Bei der 1:1-Verpaarung wird das weibliche mit einem männlichen 
Tier bis zum Eintritt der Gravidität oder bis nach Ablauf von 3 
Wochen zusammengebracht. Jeden Morgen werden die weiblichen 
Tiere auf Sperma oder Vaginalpfröpfe untersucht. Als Tag 0 der Gravidität gilt der Tag, an dem Vaginalpfröpfe oder Sperma fest ­
gestellt werden konnten.
 
Bei erfolgloser Verpaarung sollten die entsprechenden Tiere zur Be ­
urteilung der Ursache für die Unfruchtbarkeit untersucht werden.  
Dies bedeutet gegebenenfalls eine weitere Verpaarung mit einem 
Tier mit nachgewiesener Fruchtbarkeit, die mikroskopische Unter ­
suchung der Reproduktionsorgane und die Untersuchung der Östrus ­
zyklen oder der Spermiogenese.  
W u r f g r ö ß e n  
Die während der Fruchtbarkeitsstudie behandelten Tiere können ihre 
Jungen auf natürlichem Wege zur Welt bringen und ohne jeden äußeren Eingriff bis zum Zeitpunkt der Entwöhnung großziehen.
 
Soll die Anzahl der geworfenen Jungtiere reduziert werden, wird 
folgendes Verfahren vorgeschlagen: Zwischen Tag 1 und Tag 4 
nach der Geburt werden aus jedem Wurf so viele Jungtiere ausgesondert, bis möglichst 4 männliche und 4 weibliche Tiere ver ­
bleiben.
 
Ist es aufgrund der Geschlechter-Verteilung nicht möglich, in jedem 
Wurf 4 männliche und 4 weibliche Junge zu belassen, so ist eine partielle Anpassung zulässig (z. B. 5 männliche und 3 weibliche 
Tiere). Für Würfe mit weniger als 8 Jungtieren gilt diese Anpassung 
nicht.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 508
 
B e o b a c h t u n g e n  
Während der gesamten Testperiode werden die Tiere mindestens 
einmal täglich beobachtet. Auffallende Verhaltensstörungen, Anzei ­
chen einer schweren oder verzögerten Geburt, alle Vergiftungs ­
erscheinungen, einschließlich Mortalität, sind aufzuzeichnen. Vor 
und während der Paarungszeit ist die Futteraufnahme wöchentlich 
zu bestimmen. Wahlweise kann die tägliche Bestimmung der Nah ­
rungsaufnahme auch während der Gravidität durchgeführt werden. Nach der Geburt und während der Stillperiode soll die Bestimmung 
der Nahrungsaufnahme (und der Wasseraufnahme, sofern die Prüf ­
substanz mit dem Trinkwasser verabreicht wird) am gleichen Tag wie das Wiegen der Jungtiere erfolgen. Männliche und weibliche Tiere der P-Generation müssen am ersten Tag der Behandlung und 
anschließend in wöchentlichen Abständen gewogen werden. Die Be ­
obachtungen sind für jedes erwachsene Tier einzeln aufzuzeichnen.
 
Die Trächtigkeitsdauer wird vom Tag 0 der Gravidität an berechnet. 
Jeder Wurf ist so bald wie möglich nach der Geburt zu untersuchen, um die Anzahl und das Geschlecht der Nachkommen, Lebend- und 
Totgeburten und auffallende Anomalien feststellen zu können.
 
Tote und am Tag 4 getötete Jungtiere müssen asserviert und auf 
mögliche Fehlbildungen untersucht werden. Die lebend geborenen Jungtiere werden gezählt und der gesamte Wurf und die einzelnen 
Tiere am Morgen nach der Geburt, an den Tagen 4 und 7 und 
anschließend in wöchentlichen Abständen gewogen.
 
Bei den Muttertieren oder den Nachkommen zu beobachtende kör ­
perliche Anomalien oder Verhaltensstörungen müssen aufgezeichnet werden.
 
P a t h o l o g i e  
A u t o p s i e  
Die Tiere der P-Generation sollten zum Zeitpunkt der Tötung bzw. 
bei Eintritt des Todes während der Studie makroskopisch auf Ano ­
malien oder pathologische Veränderungen, unter besonderer Berück ­
sichtigung der Fortpflanzungsorgane, untersucht werden. Auch tote oder kranke Jungtiere sind auf Fehlbildungen zu untersuchen.
 
H i s t o p a t h o l o g i e  
Eierstöcke, Uterus, Zervix, Vagina, Hoden, Nebenhoden, Samenbläs ­
chen, Prostata, Koagulationsdrüse, Hirnanhangdrüse und Zielorgan(e) 
aller Tiere der P-Generation werden für die mikroskopische Unter ­
suchung asserviert. Sollten diese Organe bisher nicht im Rahmen einer sonstigen Studie mit Mehrfachdosierung untersucht worden sein, ist in allen Versuchstiergruppen mit hoher Dosierung, bei den 
Kontrolltieren und den während der Studie gestorbenen Tieren — 
sofern durchführbar — eine mikroskopische Untersuchung vorzuneh ­
men.
 
Alle Organe, die bei dieser Untersuchung pathologische Veränderun ­
gen aufweisen, müssen anschließend ebenfalls bei allen übrigen Tie ­
ren der P-Generation untersucht werden. In diesem Fall sollte eine mikroskopische Untersuchung aller Gewebe mit auffallenden patho ­
logischen Veränderungen erfolgen.
 
Wie bereits im Abschnitt über die Verpaarung vorgeschlagen, sollten 
die Fortpflanzungsorgane aller Tiere bei Verdacht auf Unfruchtbar ­
keit mikroskopischen Untersuchungen unterzogen werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 509
 
2. DATEN  
Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Daraus 
müssen für jede Versuchsgruppe folgende Angaben hervorgehen: die Anzahl der Tiere zu Beginn des Versuchs, die Anzahl der frucht ­
baren männlichen Tiere, die Anzahl der trächtigen Weibchen, die 
jeweilige Art der Veränderungen und der Prozentsatz der Tiere mit der jeweiligen Veränderung.
 
Sofern möglich, sollten die numerischen Ergebnisse anhand eines 
geeigneten statistischen Verfahrens bewertet werden. Hierzu ist 
eine anerkannte statistische Methode heranzuziehen.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— verwendete Tierarten/Tierstamm;  
— Daten über toxische Reaktionen nach Geschlecht und Dosierung, 
einschließlich Fruchtbarkeit, Trächtigkeit und Lebensfähigkeit;  
— Zeitpunkt des Todes während der Studie bzw. Angabe, ob die 
Tiere bis zur geplanten Tötung bzw. zum Abschluss der Studie überlebten;
 
— Tabelle mit Gewichtsangaben für jeden Wurf, das durchschnitt ­
liche Gewicht der Jungtiere sowie das individuelle Gewicht der 
Jungtiere bei Abschluss der Studie;  
— toxische oder andere Auswirkungen auf die Reproduktion, die 
Nachkommenschaft, das postnatale Wachstum usw.;  
— Zeitpunkt der Beobachtung der jeweiligen Vergiftungssymptome 
und deren weiterer Verlauf;  
— Körpergewicht der Tiere der P-Generation;  
— Sektionsbefunde;  
— detaillierte Beschreibung der mikroskopischen Befunde;  
— statistische Auswertung der Ergebnisse, sofern möglich;  
— Diskussion der Ergebnisse;  
— Bewertung der Ergebnisse.  
3.2. INTERPRETATION  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  
4. LITERATUR  
Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 510
 
B.35.  ZWEIGENERATIONENSTUDIE ZUR PRÜFUNG AUF 
REPRODUKTIONSTOXIZITAT  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht der OECD TG 416 (2001).  
1.1. EINLEITUNG  
Diese Methode zur Prüfung der Reproduktion über zwei Ge ­
nerationen ist darauf ausgerichtet, allgemeine Informationen über 
die Auswirkungen einer Prüfsubstanz auf die Integrität und die 
Leistung des männlichen und weiblichen Fortpflanzungssystems zu liefern; dazu gehören die Funktion der Keimdrüsen, der Östruszyklus, das Paarungsverhalten, die Empfängnis, die Gra ­
vidität, der Geburtsvorgang, das Säugen und Entwöhnen sowie 
das Wachstum und die Entwicklung der Nachkommen. Die Studie kann außerdem Informationen über die Auswirkungen der Prüfsubstanz auf die neonatale Morbidität und Mortalität 
sowie vorläufige Daten über die prä- und postnatale Entwick ­
lungstoxizität erbringen und als Richtschnur für Anschlussprü ­
fungen dienen. Neben der Untersuchung von Wachstum und Entwicklung der F
 1 -Generation soll diese Prüfmethode des 
Weiteren dazu dienen, Integrität und Leistung des männlichen 
und weiblichen Fortpflanzungssystems sowie Wachstum und Entwicklung der F
 2 -Generation zu beurteilen. Im Hinblick auf 
weitere Informationen über die Entwicklungstoxizität oder Funk ­
tionsdefizite können zusätzliche Studiensegmente in dieses Pro ­
tokoll aufgenommen werden, wobei gegebenenfalls die Methode für die Prüfung auf pränatale Entwicklungstoxizität und/oder die Studie auf Entwicklungsneurotoxizität heranzuziehen sind; 
diese Endpunkte könnten aber auch mit Hilfe geeigneter Prüf ­
methoden in gesonderten Studien untersucht werden.
 
1.2. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Die Prüfsubstanz wird verschiedenen Gruppen von männlichen 
und weiblichen Tieren in abgestuften Dosen verabreicht. Männ ­
chen der P-Generation (Elterntiere) erhalten die Dosen während des Wachstums und mindestens über einen vollständigen Sper ­
matogenesezyklus hinweg (etwa 56 Tage bei der Maus und 70 
Tage bei der Ratte), um etwaige schädigende Wirkungen auf 
die Spermatogenese zu klären. Auswirkungen auf die Samen ­
zellen werden anhand verschiedener Spermienparameter (bei ­
spielsweise Spermienmorphologie und -motilität) und anhand 
von Gewebepräparaten mit ausführlicher histopathologischer Un ­
tersuchung bestimmt. Liegen Daten zur Spermatogenese aus einer früheren Studie mit wiederholter Verabreichung von hin ­
reichender Dauer vor, beispielsweise einer 90-Tage-Studie, müs ­
sen Männchen der P-Generation nicht mit in die Beurteilung 
einbezogen werden. Empfohlen wird allerdings, Proben oder digitale Aufzeichnungen von Spermien der P-Generation für eine eventuelle spätere Beurteilung aufzuheben. Weibchen der 
P-Generation erhalten die Dosen während des Wachstums und 
über mehrere vollständige Östruszyklen hinweg, um eventuelle schädigende Auswirkungen auf den normalen Östruszyklus durch die Prüfsubstanz festzustellen. Die Prüfsubstanz wird 
den Elterntieren (P) während der Verpaarung, während der 
daraus entstehenden Trächtigkeit und während der Entwöhnung ihrer F
 1 -Nachkommen verabreicht. Nach der Entwöhnung wird 
die Substanz den F  1 -Nachkommen während des Wachstums bis 
zum Erwachsenenalter, während der Paarung und Produktion 
einer F  2 -Generation weiter verabreicht, bis die F  2 -Generation 
entwöhnt wird.  
Bei allen Tieren erfolgen klinische Beobachtungen und pathologi ­
sche Untersuchungen auf Anzeichen für Toxizität; einen besonde ­
ren Schwerpunkt bilden dabei die Auswirkungen auf die Integrität und Leistung des männlichen und weiblichen Fortpflanzungssys ­
tems sowie auf das Wachstum und die Entwicklung der Nach ­
kommen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 511
 
1.3. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.3.1. Auswahl der Versuchstierarien  
Die bevorzugte Versuchstierart ist die Ratte. Die Verwendung ande ­
rer Tierarten ist zu begründen und entsprechende Änderungen sind 
vorzunehmen. Stämme mit geringer Fruchtbarkeit oder bekannter 
hoher Häufigkeit von Entwicklungsdefekten sind nicht zu verwen ­
den. Bei Beginn der Studie sollen die Gewichtsunterschiede der Tiere möglichst gering sein und 20 % des geschlechtsspezifischen 
mittleren Gewichts nicht überschreiten.
 
1.3.2.  Haltung und Fütterung  
Die Temperatur im Versuchstierraum soll 22  o C (± 3  o C) betragen. 
Obwohl die relative Luftfeuchte wenigstens 30 % betragen sollte und außer bei Reinigung des Raumes 70 % nicht übersteigen sollte, sollte sie vorzugsweise bei 50 bis 60 % liegen. Es ist eine künstliche 
Beleuchtung vorzusehen, wobei ein Hell-Dunkel-Zyklus von jeweils 
12 Stunden eingehalten werden soll. Zur Fütterung kann übliches Laborfutter verwendet werden, und Trinkwasser kann in unbe ­
schränkter Menge gegeben werden. Die Auswahl des Futters kann 
dadurch beeinflusst werden, dass eine geeignete Beimischung einer 
Prüfsubstanz gewährleistet werden muss, wenn diese über das Futter verabreicht wird.
 
Die Tiere können einzeln oder in Käfigen mit kleinen Gruppen von 
Tieren gleichen Geschlechts untergebracht werden. Die Verpaarung erfolgt in für diesen Zweck geeigneten Käfigen. Wenn Anhaltungs ­
punkte für die stattgefundene Kopulation vorliegen, sind die verpaar ­
ten Weibchen jeweils einzeln in Geburtskäfigen oder speziellen Kä ­
figen für Muttertiere zu halten. Ratten können nach der Verpaarung auch in kleinen Gruppen gehalten und einen oder zwei Tage vor der 
Geburt getrennt werden. Kurz vor der Geburt soll verpaarten Tieren 
geeignetes und definiertes Material für den Nestbau zur Verfügung gestellt werden.
 
1.3.3.  Vorbereitung der Tiere  
Zu verwenden sind junge gesunde Tiere, die mindestens 5 Tage an 
die Laborbedingungen gewöhnt und zuvor nicht für Experimente 
verwendet wurden. Art, Stamm, Herkunft, Geschlecht, Gewicht und/ ­
oder Alter der Versuchstiere sind anzugeben. Geschwisterbeziehun ­
gen unter den Tieren sollten bekannt sein, so dass eine Verpaarung von Geschwistern vermieden wird. Die Tiere sind den Kontroll- und 
Behandlungsgruppen nach dem Zufallsprinzip zuzuordnen (empfoh ­
len wird eine körpergewichtsabhängige Gruppenbildung). Die Käfige sind so aufzustellen, dass etwaige durch den Standort bedingte Aus ­
wirkungen möglichst gering sind. Jedes Versuchstier erhält zur si ­
cheren Identifizierung eine eigene Nummer. Für die P-Generation 
erfolgt dies, bevor mit der Behandlung begonnen wird. Für die F
 1 - 
Generation wird dies nach Absetzen der Tiere, die für die Verpaa ­
rung ausgewählt wurden, durchgeführt. Für alle ausgewählten F  1 - 
Tiere sind Aufzeichnungen, aus denen der Wurf, dem sie entstam ­
men, hervorgeht, zu führen. Darüber hinaus wird eine einzelne Kennzeichnung der Jungen so bald wie möglich nach der Geburt empfohlen, wenn ein Wiegen der einzelnen Jungen oder Funktions ­
prüfungen erwogen werden.
 
Die Elterntiere (P) sind bei Beginn der Verabreichung etwa 5 bis 9 
Wochen alt. Die Tiere aller Testgruppen sollen so weit wie möglich 
gleiches Gewicht und Alter aufweisen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 512
 
1.4. VERFAHREN  
1.4.1.  Anzahl und Geschlecht der Versuchstiere  
Jede Prüf- und Kontrollgruppe soll eine ausreichende Anzahl von 
Tieren umfassen, damit möglichst nicht weniger als 20 trächtige 
Weibchen, die gebären oder kurz davor stehen, vorhanden sind. 
Bei Substanzen, die unerwünschte behandlungsbedingte Wirkungen hervorrufen (z. B. Sterilität, übermäßige Toxizität bei hoher Dosis), ist dies unter Umständen nicht möglich. Es sollen genügend trächtige 
Weibchen vorhanden sein, so dass eine aussagekräftige Bewertung 
des Potenzials der Substanz, Fruchtbarkeit, Trächtigkeit, Verhalten des Muttertiers und Säugen, Wachstum und Entwicklung der F
 1 - 
Generation von der Empfängnis bis zur Reife sowie die Entwicklung 
von deren Nachkommen (F  2 ) bis zur Entwöhnung zu beeinträchti ­
gen, sichergestellt ist. Wird die gewünschte Zahl an trächtigen Tieren (d. h. 20) nicht erreicht, bedeutet dies daher nicht notwendigerweise, 
dass die Studie invalide ist, dies ist jeweils von Fall zu Fall zu 
beurteilen.
 
1.4.2.  Zubereitung der Dosen  
Empfohlen wird, die Prüfsubstanz oral (im Futter oder Trinkwasser 
oder über eine Magensonde) zu verabreichen, sofern nicht eine an ­
dere Form (z. B. Auftragen auf die Haut oder Einatmen) für besser geeignet gehalten wird.
 
Bei Bedarf wird die Prüfsubstanz in einem geeigneten Vehikel gelöst 
oder suspendiert. Es empfiehlt sich, nach Möglichkeit zunächst die Verwendung einer wässerigen Lösung/Suspension, dann eine 
Lösung/Emulsion in Öl (z. B. Maisöl) und erst dann eine Lösung 
in einem anderen Vehikel in Betracht zu ziehen. Bei anderen Vehi ­
keln als Wasser müssen dessen toxische Merkmale bekannt sein. Die Stabilität der Prüfsubstanz in dem Vehikel ist zu bestimmen.
 
1.4.3.  Dosierung  
Mindestens drei Dosen und eine entsprechende Kontrolle werden 
verwendet. Soweit keine Beschränkungen aufgrund der physika ­
lisch-chemischen Beschaffenheit oder der biologischen Wirkungen 
der Prüfsubstanz bestehen, ist die höchste Dosierung so zu wählen, dass zwar Toxizität, jedoch nicht Tod oder schweres Leiden der Tiere herbeigeführt wird. Im Falle unerwarteter Mortalität wären 
Studien mit einer Mortalitätsrate von weniger als etwa 10 % bei 
den Elterntieren (P) normalerweise immer noch annehmbar. Eine absteigende Folge von Dosierungen sollte so ausgewählt werden, dass die Dosisabhängigkeit der Reaktion und ein NOAEL belegt 
werden können. Dosisintervalle mit dem Faktor 2 bis 4 haben sich 
für die Festlegung absteigender Dosierungen häufig als optimal er ­
wiesen. Gegenüber der Verwendung sehr großer Intervalle (z. B. mehr als Faktor 10) ist die Hinzunahme einer vierten Testgruppe 
häufig vorzuziehen. Bei Fütterungsstudien soll der Konzentrations ­
unterschied nicht mehr als das Dreifache betragen. Bei der Auswahl der Dosen sind vorliegende Toxizitätsdaten, insbesondere Ergebnisse aus Studien mit wiederholter Dosierung, zu berücksichtigen. Vor ­
handene Informationen über den Stoffwechsel und die Kinetik der 
Prüfsubstanz oder verwandter Stoffe sind ebenfalls in Betracht zu ziehen. Diese Angaben helfen außerdem, die Angemessenheit des Dosierungsplans nachzuweisen. Die Kontrollgruppe ist eine unbe ­
handelte Gruppe oder eine Vehikelkontrollgruppe, sofern ein Vehikel 
zur Verabreichung der Prüfsubstanz verwendet wird. Abgesehen von
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der Behandlung mit der Prüfsubstanz sollen die Tiere der Kontroll ­
gruppe genauso wie die Tiere in den Testgruppen behandelt werden. 
Wird ein Vehikel verwendet, erhält die Kontrollgruppe das Vehikel im höchsten verwendeten Volumen. Wird eine Prüfsubstanz zusam ­
men mit dem Futter verabreicht und führt dies zu einer geringeren 
Futteraufnahme oder -Verwertung, ist unter Umständen eine paar ­
weise Fütterungskontrolle erforderlich. Alternativ können Daten aus kontrollierten Studien zur Bewertung der Auswirkungen einer ver ­
ringerten Futteraufnahme auf Reproduktionsparameter anstelle einer 
gleichzeitigen paarweisen Fütterungskontrolle herangezogen werden.
 
Zu berücksichtigen sind die folgenden Merkmale des Vehikels und 
anderer Zusätze: Auswirkungen auf die Absorption, die Verteilung, den Stoffwechsel oder die Retention der Prüfsubstanz; Auswirkungen auf die chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, die deren toxi ­
sche Eigenschaften verändern können; ferner Auswirkungen auf die 
Futter- oder Wasseraufnahme oder den Ernährungszustand der Ver ­
suchstiere.
 
1.4.4.  Limit-Test  
Ergibt eine orale Prüfung mit einer einzigen Dosierung von mindes ­
tens 1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag oder bei einer Verabreichung 
in Futter oder Trinkwasser ein gleichwertiger prozentualer Anteil im 
Futter oder Trinkwasser nach den für diese Studie beschriebenen Verfahren keine wahrnehmbare Toxizität bei den Elterntieren oder deren Nachkommen und ist aufgrund von Daten struktur- und/oder 
stoffwechselverwandter Stoffe keine Toxizität zu erwarten, kann auf 
eine vollständige Studie mit verschiedenen Dosisabstufungen gege ­
benenfalls verzichtet werden. Der Limit-Test kann angebracht sein, 
es sei denn, die Exposition beim Menschen lässt die Prüfung bei 
einer höheren oralen Dosis angezeigt erscheinen. Bei anderen Arten der Verabreichung, wie z. B. Inhalation oder dermale Applikation, kann die maximal erreichbare Expositionsdosis in vielen Fällen ge ­
gebenenfalls durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften der 
Prüfsubstanz, wie beispielsweise die Löslichkeit, vorbestimmt und somit limitiert sein.
 
1.4.5.  Verabreichung der Dosen  
Den Tieren ist die Prüfsubstanz an 7 Tagen pro Woche zu verabrei ­
chen. Die Prüfsubstanz soll möglichst oral (im Futter oder Trink ­
wasser oder über eine Magensonde) verabreicht werden. Die Ver ­
wendung einer anderen Form der Verabreichung ist zu begründen und es sind unter Umständen entsprechende Änderungen vorzuneh ­
men. Allen Tieren sind die Dosen während des entsprechenden Ver ­
suchszeitraums nach derselben Methode zu verabreichen. Wird die 
Prüfsubstanz über eine Sonde verabreicht, ist eine Magensonde zu verwenden. Das maximale Flüssigkeitsvolumen, das einem Ver ­
suchstier jeweils verabreicht wird, soll 1 ml/100 g Körpergewicht 
(maximal 0,4 ml/100 g Körpergewicht bei Maisöl) nicht übersteigen; 
bei wässrigen Lösungen können 2 ml/100 g Körpergewicht ver ­
abreicht werden. Außer für reizende oder ätzende Stoffe, die in der Regel bei höheren Konzentrationen eine Verschlimmerung der Wir ­
kungen hervorrufen, soll die Veränderlichkeit des Prüfvolumens 
durch die Dosierung möglichst gering gehalten werden, um ein kon ­
stantes Volumen bei allen Dosen zu gewährleisten. Bei Studien, bei denen die Prüfsubstanz über eine Magensonde verabreicht wird, er ­
halten die Jungtiere die Prüfsubstanz im Normalfall nur indirekt über 
die Milch, bis für sie die direkte Verabreichung bei ihrer Entwöh ­
nung beginnt. Bei Studien, bei denen die Prüfsubstanz über das Futter oder Trinkwasser verabreicht wird, erhalten die Jungtiere au ­
ßerdem die Prüfsubstanz direkt, wenn sie selbst in der letzten Woche 
der Laktationszeit zu fressen beginnen.
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Für mit dem Futter oder dem Trinkwasser verabreichte Stoffe ist 
unbedingt sicherzustellen, dass die Mengen der jeweiligen Prüfsub ­
stanz den normalen Nahrungs- oder Wasserhaushalt nicht beeinträch ­
tigen. Wenn die Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht wird, kann entweder auf eine konstante Futterkonzentration (ppm) oder eine 
konstante Dosierung im Verhältnis zum Körpergewicht des Ver ­
suchstiers geachtet werden. Welche Methode angewandt wird, ist zu spezifizieren. Eine mit einer Magensonde verabreichte Dosis soll jeweils zu denselben Tageszeiten gegeben und mindestens ein ­
mal pro Woche so angepasst werden, dass eine konstante Dosis im 
Verhältnis zum Körpergewicht aufrechterhalten wird. Bei einer An ­
passung der über die Magensonde verabreichten Dosis an das Ge ­
wicht sind Informationen über die Verteilung in der Plazenta zu 
berücksichtigen.
 
1.4.6.  Versuchsablauf  
Die Verabreichung der täglichen Dosis an die Männchen und Weib ­
chen der Elterngeneration (P) beginnt, wenn diese zwischen 5 und 9 
Wochen alt sind. Die Verabreichung der täglichen Dosis an die Männchen und Weibchen der F
 1 -Generation beginnt bei der Entwöh ­
nung; nicht vergessen werden sollte, dass bei einer Verabreichung 
der Prüfsubstanz über das Futter oder Trinkwasser F  1 -Nachkommen 
möglicherweise der Prüfsubstanz bereits während der Säugezeit un ­
mittelbar ausgesetzt werden. Bei beiden Geschlechtern (P- und F  1 - 
Generation) wird die Verabreichung über einen Zeitraum von min ­
destens 10 Wochen vor der Paarungszeit durchgeführt. Die Verabrei ­
chung wird bei beiden Geschlechtern während der 2-wöchigen Paa ­
rungszeit fortgesetzt. Die Männchen sind, wenn sie für die Beurtei ­
lung der Auswirkungen auf die Fortpflanzung nicht mehr benötigt 
werden, auf humane Weise zu töten und zu untersuchen. Bei den 
Weibchen der Elterngeneration (P) wird die Verabreichung während der Gravidität bis zur Entwöhnung der F
 1 -Nachkommen fortgesetzt. 
Gegebenenfalls sind Änderungen am Dosierungsplan vorzunehmen 
aufgrund von vorliegenden Informationen über die Prüfsubstanz, wie 
z. B. vorhandene Toxizitätsdaten, Induktion des Stoffwechsels oder Bioakkumulation. Die Dosis für einzelne Tiere beruht normalerweise auf deren zuletzt bestimmtem Körpergewicht. Vorsicht ist allerdings 
bei der Anpassung der Dosis im letzten Trimester der Gravidität 
geboten.
 
Die Behandlung der Männchen und Weibchen der P- und F  1 -Gene­
ration wird fortgesetzt, bis die Tiere getötet werden. Alle ausgewach ­
senen Männchen und Weibchen der P- und F  1 -Generation werden 
auf humane Weise getötet, wenn sie zur Beurteilung der Auswirkun ­
gen auf die Fortpflanzung nicht mehr benötigt werden. F  1 -Nachkom ­
men, die nicht für die Verpaarung ausgewählt werden, und alle F  2 - 
Nachkommen werden nach der Entwöhnung auf humane Weise ge ­
tötet.  
1.4.7.  Verpaarung  
1.4.7.1.  Verpaarung der Elterngeneration (P)  
Für die Verpaarung wird jedes Weibchen zusammen mit einem 
Männchen, das die gleiche Dosierung erhallen hat (1:1-Paarung), 
zusammengebracht, bis es zur Kopulation kommt beziehungsweise ein Zeitraum von 2 Wochen verstrichen ist. Die Weibchen werden täglich auf vorhandene Spermien oder Vaginalpfropfen hin unter ­
sucht. Der Tag 0 der Trächtigkeit ist definiert als der Tag, an dem 
ein Vaginalpfropf oder Spermien gefunden werden. Bei einer erfolg ­
losen Verpaarung kann gegebenenfalls die erneute Verpaarung von Weibchen mit bewährten Männchen der gleichen Gruppe erwogen 
werden. Miteinander verpaarte Paare sind in den Daten eindeutig zu 
kennzeichnen. Eine Verpaarung von Geschwistern ist zu vermeiden.
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1.4.7.2.  Verpaarung der F  1 -Generation  
Bei der Verpaarung der F  1 -Nachkommen werden mindestens ein 
Männchen und ein Weibchen zum Zeitpunkt der Entwöhnung aus jedem Wurf zur Verpaarung mit Jungtieren, die die gleiche Dosis 
erhalten haben, jedoch aus einem anderen Wurf stammen, für die 
Zeugung der F
 2 -Generation ausgewählt. Die Auswahl der Jungtiere 
aus jedem Wurf erfolgt nach dem Zufallsprinzip, wenn sich die Tiere eines Wurfs in Bezug auf Körpergewicht oder Erscheinungsbild 
nicht nennenswert voneinander unterscheiden. Werden solche Unter ­
schiede beobachtet, sind aus jedem Wurf die besten Vertreter aus ­
zuwählen. Pragmatisch erfolgt dies am besten anhand des Körper ­
gewichts, unter Umständen kann jedoch das Erscheinungsbild besser 
geeignet sein. Eine Verpaarung der F
 1 -Nachkommen soll erst dann 
erfolgen, wenn sie die volle Geschlechtsreife erreicht haben.  
Bei Paaren ohne Nachkommen ist, soweit möglich, die Ursache der 
Unfruchtbarkeit zu ermitteln. Dazu können Verfahren wie zusätzliche 
Verpaarungsgelegenheiten mit anderen bewährten Vater- oder Mut ­
tertieren, eine mikroskopische Untersuchung der Fortpflanzungs ­
organe und die Untersuchung der Östruszyklen oder der Spermato ­
genese eingesetzt werden.  
1.4.7.3.  Zweite Verpaarung  
Unter gewissen Umständen wie z. B. bei behandlungsbedingten Ver ­
änderungen an der Wurfgröße oder der Beobachtung unklarer Aus ­
wirkungen bei der ersten Verpaarung wird eine zweite Verpaarung der ausgewachsenen P- oder F
 1 -Tiere empfohlen, um einen zweiten 
Wurf zu produzieren. Empfohlen wird, Weibchen oder Männchen, 
die keinen Wurf gezeugt haben, mit Tieren des jeweils anderen 
Geschlechts erneut zu verpaaren, die ihre Fortpflanzungsfähigkeit unter Beweis gestellt haben. Wird ein zweiter Wurf in einer Gene ­
ration für notwendig befunden, sind die Tiere etwa eine Woche nach 
der Entwöhnung des letzten Wurfs erneut zu verpaaren.
 
1.4.7.4.  Wurfgröße  
Man lässt die Tiere normal werfen und ihre Nachkommen bis zur 
Entwöhnung aufziehen. Wahlweise kann eine Standardisierung der 
Wurfgrößen vorgenommen werden. Sofern standardisiert wird, ist 
das dabei verwendete Verfahren im Einzelnen zu beschreiben.  
1.5. BEOBACHTUNGEN  
1.5.1.  Klinische Beobachtungen  
Allgemeine klinische Beobachtungen sind einmal täglich vorzuneh ­
men; wird die Dosis über die Magensonde verabreicht, ist der Wir ­
kungsgipfel nach Verabreichung der Dosis bei der Wahl des Zeit ­
punkts zu berücksichtigen. Änderungen am Verhalten, Anzeichen für 
eine schwere oder langwierige Geburt sowie alle Anzeichen für To ­
xizität sind zu protokollieren. Darüber hinaus ist jedes Tier mindes ­
tens einmal pro Woche gründlicher zu untersuchen, dies kann beim Wiegen des Tiers erfolgen. Zweimal pro Tag, am Wochenende ein ­
mal täglich, soweit zutreffend, sind alle Tiere auf Morbidität und 
Mortalität zu überprüfen.
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1.5.2.  Körpergewicht und Futter-/Wasseraufnahme der Elterntiere  
Die Elterntiere (P und F  1 ) werden am ersten Tag der Verabreichung 
und anschließend mindestens einmal pro Woche gewogen. Weibchen der Elterngeneration (P und F
 1 ) werden mindestens an den Gravidi ­
tätstagen 0, 7, 14 und 20 oder 21 und während der Laktationszeit an 
den gleichen Tagen wie die Würfe sowie an dem Tag gewogen, an dem die Tiere getötet werden. Diese Beobachtungen sind für jedes ausgewachsene Tier einzeln zu protokollieren. In der Zeit vor der 
Verpaarung und während der Gravidität ist die Futteraufnahme min ­
destens einmal pro Woche zu messen. Sofern die Prüfsubstanz im Wasser verabreicht wird, ist die Wasseraufnahme zumindest einmal 
pro Woche zu messen.
 
1.5.3  Östruszyklus  
Bei den Weibchen der Generation P und F  1 werden Länge und 
normaler Verlauf des Östruszyklus mit Hilfe von Vaginalabstrichen 
vor der Verpaarung und optional während der Verpaarung beurteilt, bis Anhaltspunkte für eine stattgefundene Besamung gefun ­
den werden. Vaginal-/Zervixzellen sind vorsichtig zu entnehmen, 
damit die Schleimhäute nicht gestört und dadurch anschließend 
eine Scheinträchtigkeit hervorgerufen wird (1).
 
1.5.4.  Spermienparameter  
Bei allen Männchen der P- und F  1 -Generation wird das Gewicht von 
Hoden und Nebenhoden protokolliert, jeweils ein Organ wird für eine histopathologische Untersuchung konserviert (siehe 1.5.7 und 1.5.8.1). Von einer Teilmenge von mindestens 10 Männchen jeder 
Gruppe von P- und F
 1 -Männchen werden die übrigen Hoden und 
Nebenhoden zur Zählung der homogenisierungsresistenten Spermati ­
den beziehungsweise der Spermien aus den Samenspeichern im Ne ­
benhodenschwanz verwendet. Bei derselben Teilmenge von Männ ­
chen werden Spermien aus dem Nebenhodenschwanz oder dem Sa ­
menleiter zur Beurteilung von Spermienmotilität und -morphologie entnommen. Werden behandlungsbedingte Auswirkungen beobachtet oder liegen Anhaltspunkte für mögliche Auswirkungen auf die Sper ­
matogenese aus anderen Studien vor, ist die Spermienuntersuchung 
an allen Männchen jeder Dosisgruppe durchzuführen; andernfalls kann die Zählung auf die P- und F
 1 -Männchen der Kontrollgruppe 
und der Gruppe mit der hohen Prüfsubstanzdosis beschränkt werden.  
Die Gesamtanzahl an homogenisierungsresistenten Hodenspermati ­
den und Spermien aus dem Nebenhodenschwanz ist zu bestimmen 
(2) (3). Samenspeicher im Nebenhodenschwanz lassen sich anhand 
von Spermienkonzentration und -volumen in der Suspension, die zur Vervollständigung der qualitativen Beurteilungen verwendet wird, und der Anzahl der Spermien ableiten, die bei der anschließenden 
Zerkleinerung und/oder Homogenisierung des restlichen Neben ­
hodenschwanzgewebes gewonnen werden. Die Zählung ist an der ausgewählten Teilmenge von Männchen aus allen Dosisgruppen un ­
mittelbar nach der Tötung der Tiere vorzunehmen, ausgenommen es 
werden Videobilder oder digitale Aufzeichnungen gemacht oder die 
Proben werden eingefroren und später analysiert. Unter diesen Um ­
ständen können die Kontrolltiere und die Gruppe mit der hohen Dosierung zuerst analysiert werden. Werden keine behandlungs ­
bedingten Auswirkungen (z. B. Auswirkungen auf Spermienzahl, 
-motilität oder -morphologie) festgestellt, brauchen die anderen Do ­
sierungsgruppen nicht untersucht zu werden. Sind bei der Gruppe mit der hohen Dosierung behandlungsbedingte Auswirkungen fest ­
zustellen, dann sind auch die Gruppen mit den niedrigen Dosierun ­
gen zu beurteilen.
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Die Motilität von Nebenhodenspermien (oder Spermien aus dem 
Samenleiter) ist unmittelbar nach der Tötung zu beurteilen oder auf 
Video aufzunehmen. Bei der Gewinnung der Spermien ist darauf zu achten, dass diese so wenig wie möglich geschädigt werden; für die Motilitätsanalyse sind die Spermien nach anerkannten Verfahren zu 
verdünnen (4). Der prozentuale Anteil an progressiv motilen Sper ­
mien ist subjektiv oder objektiv zu bestimmen. Bei einer computer ­
unterstützten Spermienbewegungsanalyse (5) (6) (7) (8) (9) (10) be ­
ruht die Ableitung der progressiven Motilität auf benutzerdefinierten 
Schwellen für die durchschnittliche Streckengeschwindigkeit und Di ­
rektheit oder einem linearen Index. Werden zum Zeitpunkt der Sek ­
tion die Proben auf Video (11) aufgenommen oder die Bilder auf andere Weise aufgezeichnet, kann die Analyse der P- und F
 1 -Männ­
chen der Kontrollgruppe und der Gruppe, der die hohe Dosis ver ­
abreicht wurde, anschließend vorgenommen werden, es sei denn, behandlungsbedingte Auswirkungen wurden beobachtet; in diesem Fall sind auch die Gruppen mit den niedrigeren Dosierungen zu 
beurteilen. Liegt kein Video- oder digitales Bildmaterial vor, sind 
alle Proben aus allen Behandlungsgruppen bei der Sektion zu ana ­
lysieren.
 
An einer Probe von Nebenhodenspermien (oder Spermien aus dem 
Samenleiter) ist eine morphologische Untersuchung durchzuführen. 
Dabei sind die Spermien (mindestens 200 je Probe) als fixierte Nas ­
spräparate (12) zu untersuchen und als normal oder abnorm zu klas ­
sifizieren. Beispiele für morphologische Spermienabnormitäten sind Verschmelzungen, isolierte Köpfe und missgebildete Köpfe und/oder 
Schwänze. Die Untersuchungen sind an der ausgewählten Teilmenge 
von Männchen aller Dosisgruppen entweder unmittelbar nach der Tötung der Tiere oder zu einem späteren Zeitpunkt durchzuführen, sofern Videobilder oder digitale Aufzeichnungen vorliegen. Fixierte 
Abstriche können ebenfalls später ausgewertet werden. Unter diesen 
Umständen können die Kontrolltiere und die Gruppe mit der hohen Dosierung zuerst analysiert werden. Werden keine behandlungs ­
bedingten Auswirkungen (z. B. Auswirkungen auf die Spermienmor ­
phologie) festgestellt, brauchen die anderen Dosierungsgruppen nicht 
untersucht zu werden. Sind bei der Gruppe mit der hohen Dosierung behandlungsbedingte Auswirkungen festzustellen, dann sind auch die Gruppen mit den niedrigen Dosierungen zu beurteilen.
 
Wurden oben genannte Spermienparameter bereits im Rahmen einer 
systemischen Toxizitätsstudie von einer Dauer von mindestens 90 
Tagen untersucht, kann auf eine Wiederholung in der Zweigenera ­
tionenstudie verzichtet werden. Empfohlen wird allerdings, Proben oder digitale Aufzeichnungen von Spermien der P-Generation für eine eventuell später erforderliche Beurteilung aufzuheben.
 
1.5.5.  Nachkommen  
Jeder Wurf ist so bald wie möglich nach der Geburt (Laktationstag 
0) zu untersuchen, um Anzahl und Geschlecht der Jungtiere, Tot- 
und Lebendgeburten sowie eventuell vorhandene makroskopische Anomalien festzustellen. Jungtiere, die am Tag 0 tot aufgefunden werden und noch nicht mazeriert sind, sind möglichst auf Defekte 
und die Todesursache zu untersuchen und zu konservieren. Lebende 
Jungtiere sind zu zählen und jeweils einzeln bei der Geburt (Lakta ­
tionstag 0) oder am Tag 1 und danach regelmäßig z. B. am Lakta ­
tionstag 4, 7, 14 und 21 zu wiegen. Beobachtete körperliche oder 
Verhaltensabnormitäten bei den Muttertieren oder Nachkommen sind 
zu protokollieren.
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Die körperliche Entwicklung der Nachkommen ist in der Hauptsache 
anhand der Körpergewichtszunahme festzuhalten. Andere körperliche 
Parameter (z. B. Öffnung von Ohren und Augen, Zahndurchbruch, Haarwachstum) können zwar zusätzliche Informationen bieten, diese Daten sind aber möglichst im Zusammenhang mit Daten zur Ge ­
schlechtsreife zu bewerten (z. B. Alter und Körpergewicht zum Zeit ­
punkt der Vaginalöffnung oder der Balano-Präputial-Separation) (13). Funktionelle Untersuchungen der F
 1 -Nachkommen (z. B. Mo ­
torik, Sensorik und Reflexontogenese) vor und/oder nach der Ent ­
wöhnung, insbesondere solche, die mit der Geschlechtsreife in Zu ­
sammenhang stehen, werden empfohlen, sofern derartige Unter ­
suchungen nicht Bestandteil gesonderter Studien sind. Bei entwöhn ­
ten F  1 -Tieren, die für die Verpaarung ausgewählt wurden, ist das 
Alter zum Zeitpunkt der Vaginalöffnung und der Präputial-Separa ­
tion zu bestimmen. Bei F  2 -Nachkommen ist der Anogenitalabstand 
am Tag 0 nach der Geburt zu messen, wenn Veränderungen am Verhältnis der Geschlechter in der F
 1 -Generation oder dem Zeitpunkt 
der Geschlechtsreife aufgetreten sind.  
Bei Gruppen, die ansonsten eindeutige Anzeichen für schädigende 
Auswirkungen aufweisen (z. B. signifikante Verminderung der Ge ­
wichtszunahme usw.), kann von funktionellen Beobachtungen Ab ­
stand genommen werden. Sofern funktionelle Untersuchungen erfol ­
gen, sind sie nicht an den Jungtieren vorzunehmen, die für die Ver ­
paarung ausgewählt wurden.  
1.5.6.  Nekropsie  
Bei der Tötung oder bei vorzeitigem Tod im Verlauf der Studie 
werden alle Elterntiere (P und F  1 ) und alle Jungtiere mit äußeren 
Abnormitäten oder klinischen Anzeichen sowie jeweils ein nach dem 
Zufallsprinzip ausgewähltes Jungtier/Geschlecht/Wurf sowohl aus der F
 1 - als auch aus der F  2 -Generation makroskopisch auf struktu ­
relle Abnormitäten oder pathologische Veränderungen untersucht. 
Besondere Beachtung ist dabei den Fortpflanzungsorganen zu schen ­
ken. Auf humane Weise getötete moribunde Jungtiere und noch nicht mazerierte tote Jungtiere werden auf mögliche Defekte und/oder die Todesursache untersucht und konserviert.
 
Die Gebärmutter aller erstgebärenden Weibchen wird auf Vorhan ­
densein und Anzahl von Implantationsstellen in einer Weise unter ­
sucht, die keine Auswirkungen auf die histopathologische Bewertung 
hat. 
1.5.7.  Organgewichte  
Bei der Tötung werden das Körpergewicht und das Gewicht der 
folgenden Organe bei allen P- und F  1 -Elterntieren bestimmt (paar ­
weise vorhandene Organe sind einzeln zu wiegen):  
— Uterus; Ovarien,  
— Hoden und Nebenhoden (gesamt und Schwanzteil),  
— Prostata,  
— Samenbläschen mit Koagulationsdrüsen und deren Flüssigkeiten 
und Prostata (als eine Einheit),  
— Gehirn, Leber, Nieren, Milz, Hypophyse, Schilddrüse und Ne ­
bennieren sowie bekannte Zielorgane.  
Bei den F  1 - und F  2 -Jungtieren, die für die Nekropsie ausgewählt 
werden, ist das Körpergewicht bei der Tötung zu bestimmen. Das Gewicht folgender Organe ist an je einem Jungtier/Geschlecht/Wurf 
(siehe 1.5.6) zu bestimmen, das nach dem Zufallsprinzip ausgewählt 
wurde: Gehirn, Milz und Thymusdrüse.
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Die Ergebnisse der Nekropsie und die Organgewichte sind, sofern 
möglich, im Zusammenhang mit Beobachtungen aus anderen Studien 
mit wiederholter Exposition zu bewerten.  
1.5.8.  Histopathologische Untersuchungen  
1.5.8.1.  Elterntiere  
Die folgenden Organe und Gewebe von Elterntieren (P und Fl) 
beziehungsweise repräsentative Proben hiervon sind für die histopa ­
thologische Untersuchung zu fixieren und in einem geeigneten Me ­
dium aufzubewahren:  
— Vagina, Uterus mit Zervix, Ovarien (konserviert in einem geeig ­
neten Fixativ),  
— ein Hoden (konserviert in Bouinschem Fixiermittel oder einem 
vergleichbaren Fixativ), ein Nebenhoden, Samenbläschen, Pros ­
tata und Koagulationsdrüse,  
— zuvor ermittelte(s) Zielorgan(e) von allen P- und F  1 -Tieren, die 
für die Verpaarung ausgewählt wurden.  
Eine vollständige histopathologische Untersuchung der oben genann ­
ten konservierten Organe und Gewebe ist bei allen P-und F  1 -Tieren 
aus der Gruppe mit der hohen Dosis und der Kontrollgruppe durch ­
zuführen, die für die Verpaarung ausgewählt wurden. Die Unter ­
suchung der Ovarien der P-Tiere kann wahlweise durchgeführt wer ­
den. Organe, bei denen man behandlungsbedingte Veränderungen 
feststellt, sind auch bei Tieren aus den Gruppen mit der niedrigen und mittleren Dosis zu untersuchen, um bei der Ermittlung des NOAEL zu helfen. Des weiteren sind die Fortpflanzungsorgane 
von Tieren mit der niedrigen und der mittleren Dosis, die im Ver ­
dacht einer verringerten Fertilität stehen, einer histopathologischen Untersuchung zu unterziehen, beispielsweise die Tiere, die sich nicht gepaart haben, die nicht empfangen oder gezeugt oder gesunde 
Nachkommen geboren haben oder bei denen die Regelmäßigkeit 
des Östruszyklus oder die Spermienanzahl, -motilität oder -morpho ­
logie beeinträchtigt waren. Alle makroskopischen Läsionen wie Atro ­
phien oder Tumore sind zu untersuchen.
 
An den Hoden ist eine eingehende histopathologische Untersuchung 
vorzunehmen (z. B. Verwendung des Bouinschen Fixiermittels, Ein ­
bettung in Paraffin und transversale Schnitte von 4 bis 5 μm Dicke), 
um behandlungsbedingte Auswirkungen wie Retention von Sperma ­
tiden, fehlende Keimzellenschichten oder -typen, mehrkernige Rie ­
senzellen oder die Ablösung von spermatogenen Zellen in das Lu ­
men festzustellen (14). Bei der Untersuchung des intakten Neben ­
hodens sind Kopf, Körper und Schwanz mit einzubeziehen; dies 
kann durch Beurteilung eines Längsschnitts erfolgen. Der Neben ­
hoden ist auf die Infiltration mit Leukozyten, Veränderungen in der Prävalenz von Zelltypen, aberrante Zellarten und Phagozytose von Spermien zu untersuchen. Für die Untersuchung der männlichen 
Fortpflanzungsorgane kann eine PAS- und Hämatoxylinfärbung ver ­
wendet werden.
 
Nach Absetzen der Jungtiere sollte der Eierstock Primordialfollikel 
und wachsende Follikel sowie die großen Gelbkörper der Laktations ­
periode enthalten. Bei der histopathologischen Untersuchung sollte 
die Abnahme der Primordialfollikel qualitativ erfasst werden. Bei den F
 1 -Weibchen ist eine quantitative Beurteilung der Primordialfol ­
likel vorzunehmen; die Anzahl der Tiere, die Auswahl der Eierstock ­
querschnitte und die Querschnittprobengröße sollten dabei für das 
herangezogene Bewertungsverfahren statistisch angemessen sein. Untersucht wird unter anderem die Anzahl der Primordialfollikel, die mit kleinen wachsenden Follikeln zusammengenommen werden 
können; dabei werden die Eierstöcke von behandelten Tieren und 
Kontrolltieren miteinander verglichen (15) (16) (17) (18) (19).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 520
 
1.5.8.2.  Entwöhnte Tiere  
Makroskopisch abnorme Gewebe und Zielorgane von allen Jungtie ­
ren mit äußerlich sichtbaren Abnormitäten oder klinischen Anzeichen sowie von je einem nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Jungtier/ ­
Geschlecht/Wurf aus der F
 1 - und der F  2 -Generation, die nicht für die 
Paarung ausgewählt wurden, werden für die histopathologische Un ­
tersuchung fixiert und in einem geeigneten Medium aufbewahrt. An dem konservierten Gewebe ist eine vollständige histopathologische 
Untersuchung durchzuführen, wobei besonderes Schwergewicht auf 
die Fortpflanzungsorgane gelegt wird.
 
2. DATEN  
2.1. VERARBEITUNG DER ERGEBNISSE  
Die Daten sind jeweils einzeln zu protokollieren und in tabellarischer 
Form zusammenzufassen; dabei werden für jede Prüfgruppe und für 
jede Generation die Anzahl der Tiere zu Beginn der Prüfung, die 
Anzahl der während der Prüfung tot aufgefundenen Tiere bezie ­
hungsweise der aus humanen Gründen getöteten Tiere, der jeweilige Zeitpunkt des Todes beziehungsweise der Tötung, die Anzahl der 
fruchtbaren Tiere, die Anzahl der trächtigen Weibchen, die Anzahl 
der Tiere mit Anzeichen von Toxizität, eine Beschreibung der be ­
obachteten Anzeichen von Toxizität, einschließlich des Zeitpunkts, zu dem die toxischen Wirkungen eingetreten sind, deren Dauer und 
Schweregrad, die Arten von Beobachtungen an Elterntieren und 
Nachkommen, die Arten von histopathologischen Veränderungen und alle relevanten Daten zu den Würfen angegeben.
 
Zur Auswertung der numerischen Ergebnisse wird ein allgemein 
anerkanntes statistisches Verfahren angewendet; die statistischen Verfahren sind im Rahmen der Studienplanung auszuwählen und 
zu begründen. Für die Analyse der Daten können Verfahren zur 
Modellierung der Dosis-Wirkungs-Beziehung hilfreich sein. Der Be ­
richt sollte hinreichende Informationen über das herangezogene Ana ­
lyseverfahren und das verwendete Computerprogramm beinhalten, so 
dass ein unabhängiger Überprüfer/Statistiker die Analyse nachbewer ­
ten und nachvollziehen kann.
 
2.2. BEWERTUNG DER ERGEBNISSE  
Die Befunde dieser Zweigenerationenstudie zur Reproduktionstoxizi ­
tät sind im Hinblick auf die beobachteten Wirkungen, einschließlich Nekropsie- und Mikroskopiebefunde, zu bewerten. Die Bewertung 
beinhaltet den vorhandenen beziehungsweise nicht vorhandenen Zu ­
sammenhang zwischen der Prüfsubstanzdosis und vorhandenen be ­
ziehungsweise nicht vorhandenen Abnormitäten sowie deren Häufig ­
keit und Schwere, einschließlich der makroskopischen Läsionen, 
identifizierten Zielorgane, beeinträchtigten Fertilität, klinischen Ab ­
normitäten, beeinträchtigten Reproduktions- und Wurfleistungen, Körpergewichtsveränderungen, Auswirkungen auf die Mortalität und etwaige sonstige toxische Auswirkungen. Die physikalisch-che ­
mischen Eigenschaften der Prüfsubstanz und Daten zur Toxikokine ­
tik, soweit verfügbar, sind bei der Bewertung der Prüfergebnisse zu berücksichtigen.
 
Aus einer ordnungsgemäß durchgeführten Prüfung der Reprodukti ­
onstoxizität sollte der NOAEL in angemessener Weise abgeschätzt werden können und sollten schädigende Wirkungen auf Reprodukti ­
on, Geburtsvorgang, Laktation, postnatale Entwicklung einschließlich 
Wachstum und Geschlechtsentwicklung klar werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 521
 
2.3. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Eine Zweigenerationenstudie zur Reproduktionstoxizität liefert Infor ­
mationen über die Auswirkungen einer wiederholten Exposition ge ­
genüber einem Stoff während aller Phasen des Reproduktionszyklus. 
Die Studie vermittelt insbesondere Informationen über die Reproduk ­
tionsparameter sowie über Entwicklung, Wachstum, Reifung und Überleben der Nachkommen. Die Ergebnisse der Studie sind in Ver ­
bindung mit Befunden aus Studien zur subchronischen Toxizität, 
pränatalen Entwicklungstoxizität und Toxikokinetik sowie anderen 
vorliegenden Studien zu interpretieren. Die Ergebnisse dieser Studie können bei der Beurteilung der Frage, ob Bedarf an einer weiteren 
Prüfung einer Chemikalie besteht, herangezogen werden. In gewis ­
sem Grad ist auch eine Extrapolation der Studienergebnisse auf den Menschen zulässig. Sie sind am besten für Informationen über NOA ­
EL-Werte und zulässige Expositionen für den Menschen zu verwen ­
den (20) (21) (22) (23).
 
3. BERICHTERSTATTUNG  
3.1. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten:  
Prüfsubstanz:  
— physikalische Beschaffenheit und, soweit relevant, physikalisch- 
chemische Eigenschaften,  
— Daten zur Identifikation;  
— Reinheit.  
Vehikel (sofern zutreffend):  
— Begründung der Wahl des Vehikels, sofern nicht Wasser ver ­
wendet wurde.  
Versuchstiere:  
— Art und Stamm;  
— Zahl, Alter und Geschlecht der Tiere;  
— Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter, Material für den Nestbau 
usw.;  
— Einzelgewicht der Tiere zu Beginn der Prüfung.  
Prüfbedingungen:  
— Begründung der Wahl der Dosisabstufung;  
— nähere Angaben zur Prüfsubstanzformulierung/Futterzubereitung, 
erreichte Konzentrationen;  
— Stabilität und Homogenität der Zubereitung;  
— Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz;  
— Umrechnung der Prüfsubstanzkonzentration in Futter/Trinkwasser 
(ppm) auf die tatsächliche Dosis (mg/kg Körpergewicht/Tag), soweit zutreffend;
 
— Einzelheiten zur Futter- und Wasserqualität.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 522
 
Ergebnisse:  
— Futter- und Wasseraufnahme, soweit vorhanden, Futtereffizienz 
(Zunahme des Körpergewichts je Gramm aufgenommenes Futter) 
und Prüfsubstanzaufnahme bei P- und F  1 -Tieren, ausgenommen 
in der Zeit der Kohabitation und mindestens des letzten Drittels der Laktationszeit;
 
— Absorptionsdaten, soweit vorhanden;  
— Körpergewichtsdaten für P- und F  1 -Tiere, die für die Verpaarung 
ausgewählt wurden;  
— Gewichtsdaten für Wurf und Jungtiere;  
— Körpergewicht bei Tötung sowie absolute und relative Organge ­
wichtsdaten für die Elterntiere;  
— Art, Schweregrad und Dauer der klinischen Beobachtungen (mit 
Angaben zur Reversibilität);  
— Zeitpunkt des Todes im Verlauf der Studie oder Angabe, ob 
Tiere bis zum Schluss überlebt haben;  
— Angaben zur geschlechts- und dosisspezifischen toxischen Re ­
aktion, einschließlich Indizes zu Verpaarung, Fertilität, Gravidi ­
tät, Geburt, Lebensfähigkeit und Laktation; der Bericht beinhaltet die Zahlen, die bei der Berechnung dieser Indizes verwendet 
wurden;
 
— toxische oder sonstige Wirkungen auf Reproduktion, Nachkom ­
men, postnatales Wachstum usw.;  
— Sektionsbefunde;  
— ausführliche Beschreibung aller histopathologischen Befunde;  
— Anzahl der P- und F  1 -Weibchen mit normalem Zyklusverlauf 
und Zykluslänge;  
— Gesamtanzahl von Spermien im Nebenhodenschwanz, progressiv 
motile Spermien in Prozent, morphologisch normale Spermien in 
Prozent und abnorme Spermien in Prozent mit Angabe der je ­
weiligen festgestellten Abnormität;  
— Zeit bis zur Besamung, einschließlich Anzahl Tage bis zur Be ­
samung;  
— Graviditätslänge;  
— Anzahl Implantationen, Gelbkörper, Wurfgröße;  
— Anzahl Lebendgeburten und Postimplantationsverluste;  
— Anzahl Jungtiere mit makroskopisch erkennbaren Abnormitäten; 
sofern ermittelt, ist die Anzahl der Kümmerlinge eines Wurfs 
anzugeben;  
— Daten zu physischen Entwicklungsmerkmalen bei Jungtieren und 
sonstige Daten zur postnatalen Entwicklung, physische Entwick ­
lungsmerkmale, die erhoben wurden, sind zu begründen;  
— Daten zu funktionellen Beobachtungen an Jungtieren und Er ­
wachsenen, soweit machbar;  
— statistische Bearbeitung der Ergebnisse, soweit angebracht.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 523
 
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen einschließlich NOAEL-Werte für Auswirkungen 
bei Elterntieren und Nachkommen.  
4. LITERATURHINWEISE  
(l) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In:  Repro­
duction in Mammals:  I. Germ Cells and Fertilization, C.R. 
Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.  
(2) Gray, L.E. et al. (1989). A Dose-Response Analysis of Me ­
thoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development 
and Function in the Rat.  Fundamental and Applied Toxicology  
12, 92-108.  
(3) Robb, G.W. et al. (1978). Daily Sperm Production and Epidi ­
dymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats.  Journal of 
Reproduction and Fertility  54, 103-107.  
(4) Klinefelter, G.R. et al. (1991). The Method of Sperm Col ­
lection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Fol ­
lowing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat.  
Reproductive Toxicology  5, 39-44.  
(5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Con ­
sensus Report.  Reproductive Toxicology  10(3), 237-244.  
(6) Chapin, R.E. et al. (1992). Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility.  Reproductive Toxicology  6, 267-273.  
(7) Klinefelter, G.R. et al. (1992). Direct Effects of Ethane Di ­
methanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  
In Vitro  Demonstration.  Journal of Andrology  13, 409-421.  
(8) Slott, V.L. et al. (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Metho ­
dologic Considerations.  Reproductive Toxicology  5, 449-458.  
(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In:  Methods in Toxico ­
logy,  Part A., Academic, Orlando, Florida, 319-333.
 
(10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm 
Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andro ­
logy 10, 401-415.
 
(11) Working, P.K. and M. Hurtt (1987). Computerized Video ­
micrographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of An ­
drology 8, 330-337.  
(12) Linder, R.E. et al. (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6, 491-505.
 
(10) (13) Korenbrot, C.C. et al. (1977). Preputial Separation as an 
External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Bio ­
logical Reproduction 17, 298303.  
(14) Russell, L.D. et al. (1990). Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.  
(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Or ­
lando, Florida.  
(16) Heindel, J.J. et al. (1989) Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: 
Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, 
New York, 421-426.  
(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang (1989). Test Methods for Asses ­
sing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: 
Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Ra ­
ven, New York.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 524
 
(18) Smith, B.J. et al. (1991). Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive To ­
xicology 5, 379-383.  
(19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histolo ­
gy. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive End ­
points for Human Health Risk Assessment, G. Daston, and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.
 
(20) Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive 
System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. 
Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.  
(21) Zenick, H. and E.D. Clegg (1989). Assessment of Male Re ­
productive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Princi ­
ples and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven 
Press, New York.  
(22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, 
C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.  
(23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. 
Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 525
 
B.36  TOXIKOKINETIK  
EINLEITUNG  
1. Diese Methode entspricht der OECD TG 417 (2010). Studien zur Unter ­
suchung der Toxikokinetik einer Prüfsubstanz werden durchgeführt, um geeignete Informationen über ihre Resorption, Verteilung, Biotransformation 
(d. h. ihren Metabolismus) und ihre Ausscheidung zu erhalten, um die 
Konzentration oder Dosis zur beobachteten Toxizität in Beziehung zu setzen und um mehr Erkenntnisse über den Mechanismus der Toxizität zu gewin ­
nen. Die Toxikokinetik kann zum besseren Verständnis der Toxikologie ­
studien beitragen, indem gezeigt wird, dass die Versuchstiere der Prüfsub ­
stanz systemisch ausgesetzt werden, und indem die Anteile des Ausgangs ­
stoffs bzw. der Metaboliten im Blutkreislauf bestimmt werden. Die grund ­
legenden toxikokinetischen Parameter, die mithilfe dieser Studien bestimmt 
werden, geben auch Aufschluss über das Potenzial der Prüfsubstanz zur 
Akkumulation in Geweben und/oder Organen und über das Potenzial zur Induktion von Biotransformationsprozessen infolge der Exposition gegen die Prüfsubstanz.
 
2. Toxikokinetik-Daten können dazu beitragen, die Eignung und Relevanz von 
Toxizitätsdaten aus Tierversuchen für die Extrapolation von Gefahren für den Menschen und/oder die Risikobewertung zu beurteilen. Darüber hinaus 
können Toxikokinetikstudien wichtige Informationen für die Bestimmung 
der Dosisstufen in Toxizitätsstudien (lineare oder nicht-lineare Kinetik), mit dem Verabreichungsweg zusammenhängende Wirkungen und andere Aspekte der Studienauslegung liefern. Bestimmte toxikokinetische Daten 
können für die Entwicklung von physiologisch-basierten toxikokinetischen 
Modellen verwendet werden.
 
3. Daten über Metaboliten und Toxikokinetik sind in vielerlei Hinsicht von 
Bedeutung. Sie können insbesondere Aufschluss über eventuelle Toxizitäten 
und Wirkungsweisen sowie deren Zusammenhang mit der Dosisstufe und dem Expositionsweg geben. Ferner können Metabolismusdaten auch hilf ­
reiche Informationen für die Einschätzung der toxikologischen Bedeutung 
der Exposition gegen exogene Metaboliten der Prüfsubstanz liefern.
 
4. Angemessene toxikokinetische Daten können die Akzeptanz und Anwend ­
barkeit von quantitativen Struktur-Wirkungs-Beziehungen, Read-across- 
oder Grouping-Ansätzen bei der Sicherheitsbewertung von chemischen Stof ­
fen unterstützen. Kinetikdaten können auch zur Bewertung der toxikologi ­
schen Relevanz anderer Studien (z. B.  in vivo/in vitro ) herangezogen wer ­
den. 
5. Wenn kein anderer Verabreichungsweg genannt wird (siehe insbesondere 
die Nummern 74-78), wird die Prüfsubstanz bei dieser Prüfmethode oral verabreicht.
 
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN  
6. Anforderungen und Erfordernisse in Bezug auf die Endpunkte und toxiko ­
kinetischen Parameter, die für verschiedene Klassen von Chemikalien (z. B. 
Pestizide, Biozide, Industriechemikalien) zu bestimmen sind, unterscheiden sich je nach Regulierungssystem. Anders als bei den meisten Prüfmethoden werden bei der vorliegenden Methode Versuche zur Toxikokinetik beschrie ­
ben, die mehrere Messungen und Endpunkte erfordern. In Zukunft könnten 
mehrere neue Prüfmethoden und/oder Leitfäden erarbeitet werden, um jeden Endpunkt einzeln und ausführlicher zu beschreiben. Welche Versuche oder Bewertungen vorgenommen werden, richtet sich bei dieser Prüfmethode 
nach den Anforderungen und/oder Erfordernissen jedes Regulierungssys ­
tems.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 526
 
7. Es gibt zahlreiche Studien, mit denen das toxikokinetische Verhalten einer 
Prüfsubstanz zu Regulierungszwecken bestimmt werden könnte. Je nach 
Regulierungsanforderung oder Einzelfall sind jedoch möglicherweise nicht alle diese Studien für die Bewertung einer Prüfsubstanz erforderlich. Bei der Planung von Toxikokinetikstudien ist daher Flexibilität erforderlich, und die 
Eigenschaften der Prüfsubstanz müssen berücksichtigt werden. In manchen 
Fällen kann eine bestimmte Reihe von Fragen ausreichen, um die mit der Prüfsubstanz verbundenen Gefahren und Risiken zu ermitteln. Manchmal können die Toxikokinetikdaten bei der Auswertung anderer Toxikologiestu ­
dien erfasst werden. In anderen Fällen können je nach Regulierungsanfor ­
derungen und/oder wenn bei der Bewertung einer Prüfsubstanz neue Fragen auftreten, zusätzliche und/oder ausführlichere Toxikokinetikstudien erforder ­
lich sein.
 
8. Um die Qualität der Studie zu verbessern und eine unnötige Verwendung 
von Versuchstieren zu vermeiden, sollte das Prüflabor vor Durchführung der Studie alle verfügbaren Informationen über die Prüfsubstanz und relevante Metaboliten und analoge Stoffe berücksichtigen. Dies kann Daten aus an ­
deren relevanten Prüfmethoden umfassen ( In-vivo -Studien,  In-vitro -Studien 
und/oder  In-silico -Bewertungen) Für die Studienplanung und die Interpreta ­
tion der Ergebnisse können physikalisch-chemische Eigenschaften wie der Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient (ausgedrückt als P
 OW ), pKa, die 
Wasserlöslichkeit, der Dampfdruck und das Molekulargewicht eines che ­
mischen Stoffs von Nutzen sein. Diese können mit geeigneten Methoden, die in den betreffenden Prüfmethoden beschrieben sind, bestimmt werden.
 
GRENZEN  
9. Diese Prüfmethode ist weder für besondere Fälle wie trächtige oder säu ­
gende Weibchen oder Nachkommen noch für die Bewertung eventueller 
Rückstände in zur Lebensmittelerzeugung genutzten exponierten Tieren be ­
stimmt. Die Daten aus der Studie gemäß Kapitel B.36 können jedoch als Orientierungshilfe für die Planung spezifischer Studien für derartige Unter ­
suchungen dienen. Diese Prüfmethode ist nicht für die Prüfung von Nano ­
materialien bestimmt. Ein Bericht über eine Vorprüfung von 
OECD-Prüfrichtlinien auf ihre Anwendbarkeit auf Nanomaterialien deutet darauf hin, dass die TG 417 (die dieser Prüfmethode B.36 entspricht) mög ­
licherweise nicht auf Nanomaterialien anwendbar ist (1).
 
DEFINITIONEN  
10. Die für die Zwecke dieser Prüfmethode verwendeten Begriffe sind in der 
Anlage definiert.  
TIERSCHUTZERWÄGUNGEN  
11. Hinweise zur tierschutzgerechten Behandlung von Tieren sind im OECD 
Guidance Document (GD) 19 (2) zu finden. Es wird empfohlen, das OECD GD 19 für alle in dieser Prüfmethode beschriebenen  In-vivo - und  
In-vitro -Studien zu beachten.
 
BESCHREIBUNG DER METHODEN  
Pilotstudien  
12. Es wird empfohlen, die Versuchsparameter für die Toxikokinetikstudien (z. 
B. Metabolismus, Massenbilanz, Analyseverfahren, Dosisfindung, Aus ­
atmung von CO  2 usw.) auf der Grundlage von Pilotstudien festzulegen. 
Die Bestimmung dieser Parameter erfordert nicht in allen Fällen die Ver ­
wendung radiomarkierter Stoffe.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 527
 
Auswahl von Versuchstieren  
Tierart  
13. Für die toxikokinetische Prüfung sollte möglichst dieselbe Tierart (und der ­
selbe Stamm) verwendet werden wie für andere toxikologische Prüfungen der betreffenden Prüfsubstanz. Normalerweise sollte dies die Ratte sein, da sie häufig in toxikologischen Studien verwendet wird. Die Verwendung 
anderer oder zusätzlicher Tierarten kann gerechtfertigt sein, wenn wichtige 
Toxikologiestudien Hinweise auf starke Toxizität bei diesen Tierarten er ­
geben oder wenn gezeigt werden kann, dass die Toxizität/Toxikokinetik bei diesen Tierarten von größerer Bedeutung ist, um die Wirkungen bei Men ­
schen einschätzen zu können. Die Wahl der Tierart und des Stamms ist zu 
begründen.
 
14. Sofern nichts anderes erwähnt ist, wird bei dieser Prüfmethode die Ratte als 
Versuchstier verwendet. Bei Verwendung anderer Versuchstierarten müssen 
bestimmte Aspekte der Methode möglicherweise geändert werden.  
Alter und Stamm  
15. Es sind junge, gesunde, adulte Tiere (zum Zeitpunkt der Dosierung norma ­
lerweise 6-12 Wochen alt) zu verwenden (siehe auch Nummern 13 und 14). 
Die Verwendung anderer als junger, adulter Tiere ist zu begründen. Alle Tiere sollten zu Beginn der Studie annähernd gleich alt sein. Das Gewicht der einzelnen Tiere sollte nicht um mehr als ± 20 % vom mittleren Gewicht 
der Prüfgruppe abweichen. Im Idealfall sollte derselbe Stamm verwendet 
werden wie für die Ableitung der toxikologischen Datenbasis für die Prüf ­
substanz.
 
Zahl und Geschlecht der Versuchstiere  
16. Für jede geprüfte Dosis sollten mindestens vier Tiere eines Geschlechts 
verwendet werden. Die Wahl des Geschlechts der verwendeten Tiere ist zu begründen. Gibt es Hinweise auf signifikante geschlechtsspezifische Un ­
terschiede der Toxizität, ist die Verwendung beider Geschlechter (vier 
männliche und vier weibliche Tiere) in Betracht zu ziehen.
 
Haltungs- und Fütterungsbedingungen  
17. Die Tiere sollten während der Prüfzeitraums im Allgemeinen einzeln unter ­
gebracht werden. Eine Unterbringung in Gruppen könnte unter besonderen Bedingungen gerechtfertigt sein. Die Beleuchtung sollte künstlich sein, und die Hell- und Dunkelphasen sollten sich im Abstand von 12 Stunden ab ­
wechseln. Die Temperatur im Versuchstierraum sollte 22 °C (± 3 °C) und 
die relative Luftfeuchtigkeit 30-70 % betragen. An die Versuchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert werden, wobei eine unbegrenzte Trink ­
wasserversorgung zu gewährleisten ist.
 
Prüfsubstanz  
18. Für alle Aspekte der Studie, die mit der Massenbilanz und der Identifizie ­
rung von Metaboliten zusammenhängen, sollte eine mit  14 C radioaktiv mar ­
kierte Prüfsubstanz verwendet werden. Wenn jedoch nachgewiesen werden 
kann, dass  
— die Massenbilanz und die Identifizierung von Metaboliten mit der nicht 
markierten Prüfsubstanz hinreichend beurteilt werden kann,  
— die analytische Spezifität und Sensitivität der Methode, bei der eine nicht 
radioaktive Prüfsubstanz verwendet wird, genau so gut oder besser sind 
als die, die mit einer radiomarkierten Prüfsubstanz erzielt werden könn ­
ten, ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 528
 
braucht keine radioaktiv markierte Prüfsubstanz verwendet zu werden. Fer ­
ner können andere stabile radioaktive Isotope verwendet werden, insbeson ­
dere dann, wenn das Element für den toxischen Anteil der Prüfsubstanz verantwortlich oder Teil des toxischen Anteils ist. Die Radiomarkierung sollte möglichst in einen Kernbereich des Moleküls eingebaut werden, der 
metabolisch stabil ist (d. h. er ist nicht austauschbar, wird nicht metabolisch 
als CO
 2 ausgeschieden und wird nicht Teil des Einkohlenstoff-Pools des 
Organismus). Um die Metabolisierung der Prüfsubstanz zu verfolgen, müs ­
sen eventuell mehrere Stellen oder spezifische Regionen des Moleküls mar ­
kiert werden.  
19. Die radiomarkierten und nichtmarkierten Prüfsubstanzen sollten mit geeig ­
neten Methoden analysiert werden, um ihre Reinheit und Identität festzustel ­
len. Die radioaktive Prüfsubstanz sollte die höchste für die spezielle Sub ­
stanz erreichbare radioaktive Reinheit aufweisen (im Idealfall über 95 %), und es sollte nach Möglichkeit versucht werden, Verunreinigungen von 2 % oder mehr zu identifizieren. Der Reinheitsgrad sowie Identität und Anteil 
etwaiger Verunreinigungen sind zu dokumentieren. Einzelne Regulierungs ­
programme können zusätzliche Orientierungshilfen für die Festlegung und Spezifikation von aus Gemischen bestehenden Prüfsubstanzen sowie Metho ­
den zur Bestimmung der Reinheit vorsehen.
 
Wahl der Dosis  
Pilotstudie  
20. Für die Pilotstudie ist in der Regel eine einzige orale Dosis ausreichend. Die 
Dosis sollte nicht toxisch, aber dennoch hoch genug sein, dass die Metabo ­
liten in den Exkreta (und gegebenenfalls im Plasma) identifiziert werden können und dass der Zweck der Pilotstudie gemäß Nummer 12 dieser Prüf ­
methode erfüllt ist.
 
Hauptstudien  
21. Bei den Hauptstudien sollten mindestens zwei Dosen verabreicht werden, da 
die Informationen aus mindestens zwei Dosisgruppen die Dosisfestsetzung in anderen Toxizitätsstudien erleichtern und zur Bewertung der 
Dosis-Wirkungs-Beziehung von bereits vorliegenden Toxizitätsversuchen 
beitragen können.
 
22. Wenn zwei Dosen verabreicht werden, sollten beide hoch genug sein, dass 
die Metaboliten in den Exkreta (und gegebenenfalls im Plasma) identifiziert werden können. Für die Festlegung der Dosis sind Informationen aus vor ­
liegenden Toxizitätsdaten heranzuziehen. Liegen keine Informationen vor (z. 
B. aus Prüfungen auf akute orale Toxizität, die klinische Toxizitätszeichen 
identifizieren, oder aus Toxizitätsstudien mit wiederholter Verabreichung), so kann für die höhere Dosis ein Wert angesetzt werden, der unter dem Schätzwert für die LD
 50 (orale und dermale Verabreichung) oder die LC  50 
(Inhalation) oder unter dem unteren Wert des geschätzten Bereichs der 
akuten Toxizität liegt. Die niedrigere Dosis sollte ein Bruchteil der höheren Dosis sein.
 
23. Wird nur eine Dosisstufe geprüft, sollte die Dosis möglichst hoch genug 
sein, dass die Metaboliten in den Exkreta (und gegebenenfalls im Plasma) identifiziert werden können; sie sollte allerdings keine offensichtliche Toxi ­
zität hervorrufen. Es ist zu begründen, warum keine zweite Dosisstufe ver ­
wendet wurde.
 
24. Wenn die Wirkung der Dosis auf kinetische Prozesse bestimmt werden 
muss, reichen zwei Dosen möglicherweise nicht aus; mindestens eine Dosis 
sollte hoch genug sein, um diese Prozesse zu sättigen. Ist die Fläche unter der Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve (AUC) zwischen zwei in der Haupt ­
studie verwendeten Dosisstufen nicht linear, so kann daraus geschlossen 
werden, dass zwischen diesen beiden Dosisstufen die Sättigung eines oder 
mehrerer der kinetischen Prozesse stattfindet.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 529
 
25. Bei schwach toxischen Prüfsubstanzen ist eine Höchstdosis von 1 000 
mg/kg Körpergewicht (orale und dermale Verabreichung) zu verwenden 
(bei Verabreichung durch Inhalation siehe Kapitel B.2 dieses Anhangs; diese Dosis sollte normalerweise nicht über 2 mg/l liegen). Je nach Regulierungs ­
anforderungen können mit den chemischen Eigenschaften des Stoffs zusam ­
menhängende Gründe eine höhere Dosis erfordern. Die Dosiswahl ist stets 
zu begründen.
 
26. Für die Bestimmung des Akkumulations- und/oder Persistenzpotenzials kön ­
nen Daten über die Toxikokinetik und die Gewebeverteilung auf der Grund ­
lage einer Einzeldosis ausreichen. Unter bestimmten Umständen kann jedoch 
eine mehrmalige Verabreichung erforderlich sein, i) um das Akkumulations- und/oder Persistenzpotenzial oder Veränderungen der Toxikokinetik (z. B. 
Enzyminduktion und -hemmung) genauer zu untersuchen oder ii) um Regu ­
lierungsanforderungen zu erfüllen. In Studien mit mehrmaliger Dosierung ist die Verabreichung niedriger Dosen zwar im Allgemeinen ausreichend, aber unter bestimmten Umständen kann auch die mehrmalige Verabreichung hoher 
Dosen notwendig sein (siehe auch Nummer 57).
 
Verabreichung der Prüfsubstanz  
27. Die Prüfsubstanz sollte homogen in demselben Vehikel gelöst oder suspen ­
diert werden, das für die anderen mit dieser Prüfsubstanz durchgeführten Toxizitätsstudien mit oraler Gabe über eine Schlundsonde verwendet wurde, wenn diese Informationen vorliegen. Die Wahl des Vehikels ist zu begrün ­
den. Die Wahl des Vehikels und des Dosierungsvolumens sollten bei der 
Planung der Studie berücksichtigt werden. Die übliche Verabreichungs ­
methode ist die Schlundsonde. In bestimmten Fällen kann jedoch die Ver ­
abreichung in einer Gelatinekapsel oder als Futterbeimischung von Vorteil 
sein (beides ist zu begründen). Die jedem Versuchstier verabreichte tatsäch ­
liche Dosis ist zu überprüfen.
 
28. Das maximale Flüssigkeitsvolumen, das einem Versuchstier auf einmal oral 
über eine Schlundsonde verabreicht werden kann, hängt von der Größe des 
Versuchstiers, der Art des Vehikels und einer etwaigen Futterkarenz vor der Verabreichung der Prüfsubstanz ab. Die Verabreichung oder Einschränkung von Futter vor der Dosierung ist zu begründen. Sowohl bei wässrigen als 
auch bei nichtwässrigen Vehikeln ist das Volumen so gering wie möglich zu 
halten. Bei Nagetieren sollte das Dosisvolumen normalerweise 10 ml/kg Körpergewicht nicht übersteigen. Bei Vehikeln für lipophilere Prüfsubstan ­
zen können Volumina ab 4 ml/kg Körpergewicht verwendet werden. Bei 
mehrmaliger Dosierung, wenn täglicher Futterentzug kontraindiziert wäre, 
sind geringere Dosisvolumen zu verwenden (z. B. 2-4 ml/kg Körper ­
gewicht). Soweit möglich, sollten Dosisvolumen verwendet werden, die mit denen im Einklang stehen, die in anderen Studien mit oraler Gabe einer 
Prüfsubstanz über eine Schlundsonde verabreicht wurden.
 
29. Die Prüfsubstanz kann intravenös (IV) verabreicht und im Blut und/oder in 
den Exkreta gemessen werden, um die Bioverfügbarkeit oder die relative 
orale Resorption zu bestimmen. Bei dieser Art von Studie wird eine Einzel ­
dosis der Prüfsubstanz (die normalerweise der unteren oralen Dosis ent ­
spricht, diese aber nicht übersteigt — siehe Dosiswahl) unter Verwendung eines geeigneten Vehikels verabreicht. Diese Dosis wird mindestens vier 
Tieren des geeigneten Geschlechts (falls gerechtfertigt, können beide Ge ­
schlechter verwendet werden — siehe Nummer 16) in einem geeigneten Volumen (z. B. 1 ml/kg Körpergewicht) an der gewählten Verabreichungs ­
stelle verabreicht. Für die intravenöse Verabreichung muss die Prüfsubstanz 
vollständig in der Dosiszubereitung aufgelöst oder suspendiert sein. Das 
Vehikel für die intravenöse Verabreichung sollte die Integrität der Blutzellen oder die Durchblutung nicht beeinträchtigen. Wenn die Prüfsubstanz infun ­
diert wird, ist die Infusionsgeschwindigkeit zu protokollieren; sie sollte für 
alle Tiere gleich sein, vorausgesetzt, es wird eine Infusionspumpe verwen ­
det. Beim Legen einer Kanüle in die Vena jugularis (zur Verabreichung der
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Prüfsubstanz und/oder zur Blutabnahme) oder bei Verwendung der Arteria 
femoralis für die Verabreichung sollten die Tiere narkotisiert werden. Die 
Wahl der Anästhesieart muss wohl überlegt sein, da sie Auswirkungen auf die Toxikokinetik haben kann. Vor Injektion der Prüfsubstanz mit dem Vehikel müssen sich die Tiere ausreichend von der Anästhesie erholen 
können.
 
30. Für bestimmte Prüfsubstanzen können je nach ihren physikalisch-che ­
mischen Eigenschaften und der voraussichtlichen Verwendung durch Men ­
schen oder die Exposition von Menschen auch andere Verabreichungswege wie die Verabreichung über die Haut oder durch Inhalation (siehe Nummern 
74-78) angebracht sein.
 
Messungen  
Massenbilanz  
31. Die Massenbilanz wird aufgestellt durch Addition des prozentualen Anteils 
der verabreichten (radioaktiven) Dosis, die in Urin, Fäzes und ausgeatmeter 
Luft ausgeschieden wurde, und des in Geweben, Tierkörper und Käfigrei ­
nigungsrückständen (siehe Nummer 46) vorliegenden prozentualen Anteils. Im Allgemeinen gilt eine Gesamtwiederfindungsrate im Bereich von > 90 % der verabreichten Prüfsubstanz (Radioaktivität) als ausreichend.
 
Resorption  
32. Eine erste Schätzung der Resorption ergibt sich, wenn man den Prozentsatz 
der Dosis im Magen-Darm-Trakt und/oder in den Fäzes aus der Bestimmung 
der Massenbilanz ausschließt. Für die Berechnung der prozentualen Resorp ­
tion siehe Nummer 33. Für die Untersuchung der Exkreta siehe Nummern 44-49. Wenn das genaue Ausmaß der Resorption nach oraler Gabe nicht auf der Grundlage der Massenbilanz festgestellt werden kann (z. B. wenn die 
Fäzes mehr als 20 % der verabreichten Dosis enthalten), könnten weitere 
Untersuchungen erforderlich sein. Hierbei kann es sich handeln 1) um die orale Verabreichung einer Prüfsubstanz und ihre Messung in der Gallen ­
flüssigkeit oder 2) um die orale und intravenöse Verabreichung einer Prüf ­
substanz und die Messung der Nettomenge der Substanz im Urin, in der 
ausgeatmeten Luft und im Körper bei beiden Verabreichungswegen. In bei ­
den Fällen wird die Radioaktivitätsmessung als Ersatzmethode für die chemisch-spezifische Analyse der Prüfsubstanz und ihrer Metaboliten durch ­
geführt.
 
33. Zur Prüfung der biliären Ausscheidung wird die Prüfsubstanz normalerweise 
oral verabreicht. In dieser Studie sind Kanülen in die Gallengänge von mindestens vier Tieren des geeigneten Geschlechts (oder beider Geschlech ­
ter, falls gerechtfertigt) zu legen, und es ist eine Einzeldosis der Prüfsub ­
stanz zu verabreichen. Nach Verabreichung der Prüfsubstanz ist die Aus ­
scheidung der Radioaktivität/Prüfsubstanz in der Gallenflüssigkeit so lange zu überwachen, wie erforderlich ist, um den Prozentsatz der über diesen 
Weg ausgeschiedenen Dosis zu bestimmen; mit diesem Wert kann mithilfe 
nachstehender Formel unmittelbar das Ausmaß der oralen Resorption be ­
rechnet werden:
 
Prozentuale Resorption  ¼ ðMenge in Gallenflüssigkeit  þ Urin þ 
ausgeatmeter Luft þ Tierkörper ohne Inhalt des 
Magen Ä Darm Ä TraktsÞ=verabreichte Menge  Ü 100 
34. Bei bestimmten Klassen von Prüfsubstanzen kann eine direkte Sekretion der 
resorbierten Dosis durch die Darmmembranen erfolgen. In diesen Fällen gilt 
die Messung der prozentualen Dosis in den Fäzes nach einer oralen Dosis 
im kanülierten Gallengang der Ratte nicht als repräsentativ für die nicht resorbierte Dosis. Für Fälle, in denen von einer intestinalen Sekretion aus ­
gegangen wird, wird empfohlen, den Prozentsatz der resorbierten Dosis auf 
die Resorption zu stützen, die aus einem Vergleich der Ausscheidung nach 
oraler und nach intravenöser Verabreichung (intakte Ratte oder Ratte mit Gallengangkanülierung) berechnet wird (siehe Nummer 35). Wenn die in ­
testinale Sekretion quantifiziert werden muss, wird auch empfohlen, die 
Exkretion bei der Ratte mit Gallengangkanülierung nach IV-Verabreichung 
der Dosis zu messen.
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Bioverfügbarkeit  
35. Die Bioverfügbarkeit kann wie unter den Nummern 50, 51 und 52 beschrie ­
ben, aufgrund der Plasma-/Blutkinetik der oralen und intravenösen Gruppen durch spezifische chemische Analyse der Prüfsubstanz und/oder des/der 
relevanten Metaboliten bestimmt werden, d. h. es ist keine radiomarkierte 
Prüfsubstanz erforderlich. Die Bioverfügbarkeit (F) der Prüfsubstanz oder des/der relevanten Metaboliten kann dann wie folgt berechnet werden:
 
F ¼ ðAUC  exp=AUC  IV Þ Ü ðDosis  V=Dosis  exp Þ 
Dabei ist AUC die Fläche unter der Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve und 
exp der Verabreichungsweg (oral, dermal oder Inhalation).  
36. Für die Bewertung der Risiken in Bezug auf systemische Wirkungen wird 
im Allgemeinen die Bioverfügbarkeit der toxischen Komponente gegenüber 
der prozentualen Resorption bevorzugt, um die systemischen Konzentratio ­
nen aus Tierstudien mit analogen Biomonitoring-Daten aus Studien über die Exposition von Arbeitnehmern zu vergleichen. Die Situation kann allerdings 
komplizierter werden, wenn die Dosen im nicht linearen Bereich liegen. 
Daher ist es wichtig, dass die toxikokinetische Prüfung Dosen im linearen Bereich bestimmt.
 
Gewebeverteilung  
37. Kenntnisse über die Verteilung einer Prüfsubstanz und/oder ihrer Metaboli ­
ten im Gewebe sind wichtig für die Identifizierung der Zielgewebe, für das 
Verständnis der zugrunde liegenden Toxizitätsmechanismen und für die 
Einschätzung des Akkumulations- und Persistenzpotenzials der Prüfsubstanz und ihrer Metaboliten. Der Prozentsatz der (radioaktiven) Gesamtdosis in 
den Geweben und im restlichen Tierkörper wird mindestens am Ende des 
Ausscheidungsversuchs gemessen (z. B. normalerweise sieben Tage nach der Dosierung oder weniger je nach spezifischem Verhalten der Prüfsub ­
stanz). Wird am Ende der Studie keine Prüfsubstanz in den Geweben ge ­
funden (z. B. weil die Prüfsubstanz wegen einer kurzen Halbwertzeit vor 
Ende der Studie eliminiert worden sein könnte), ist darauf zu achten, dass die Daten nicht falsch interpretiert werden. In diesem Fall ist die Gewebe ­
verteilung zum Zeitpunkt der maximalen Plasma-/Blutkonzentration (T
 max ) 
der Prüfsubstanz (und/oder Metaboliten) oder der maximalen Urinausschei ­
dungsrate zu untersuchen (siehe Nummer 38). Darüber hinaus können Ge ­
webeentnahmen zu zusätzlichen Zeitpunkten erforderlich sein, um die Ge ­
webeverteilung der Prüfsubstanz und/oder ihrer Metaboliten zu bestimmen, 
(gegebenenfalls) die Zeitabhängigkeit zu beurteilen und die Aufstellung der 
Massenbilanz zu erleichtern und/oder wenn eine zuständige Behörde sie vorschreibt. Zu den zu entnehmenden Geweben gehören u. a. Leber, Fett, Magen-Darm-Trakt, Nieren, Milz, Vollblut, der restliche Tierkörper, Ziel ­
organgewebe und sonstige Gewebe (z. B. Schilddrüse, Erythrozyten, Fort ­
pflanzungsorgane, Haut, Augen (insbesondere bei pigmentierten Tieren)), die für die toxikologische Bewertung der Prüfsubstanz potenziell von Be ­
deutung sind. Die Analyse zusätzlicher Gewebe zu denselben Zeitpunkten 
ist in Betracht zu ziehen, um die Nutzung der Tiere zu maximieren und falls 
bei subchronischen oder chronischen Toxizitätsstudien Zielorgantoxizität festgestellt wird. Die Konzentration (radioaktiver) Rückstände und die Ge ­
webe/Plasma-Verhältnisse (Gewebe/Blut-Verhältnisse) sollten ebenfalls an ­
gegeben werden.
 
38. Eine zuständige Behörde kann auch die Bewertung der Gewebeverteilung zu 
weiteren Zeitpunkten wie dem Zeitpunkt der maximalen Plasma-/Blutkonzentration (z. B. T
 max ) oder der maximalen Urinausschei ­
dungsrate, die in kinetischen Studien zu Plasma/Blut oder Ausscheidungen 
bestimmt wurde, benötigen oder vorschreiben. Diese Informationen können hilfreich sein, um die Toxizität und das Akkumulations- und Persistenz ­
potenzial der Prüfsubstanz und ihrer Metaboliten zu verstehen. Die Wahl 
der Proben ist zu begründen. Die zu analysierenden Proben sollten im All ­
gemeinen dieselben sein wie unter Nummer 37.
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39. Für die Gewebeverteilungsstudien kann die Radioaktivität mithilfe von Or ­
gansektion, Homogenisierung, Verbrennung und/oder Solubilisierung und 
anschließender Flüssigszintillationszählung von aufgefangenen Rückständen quantitativ bestimmt werden. Bestimmte Techniken, die sich zurzeit in un ­
terschiedlichen Entwicklungsphasen befinden, z. B. die quantitative Ganz ­
körper-Autoradiographie oder die mikroskopische Autoradiographie der Re ­
zeptoren, können nützlich sein, um die Verteilung einer Prüfsubstanz in den Organen und/oder Geweben zu bestimmen (3) (4).
 
40. Bei anderer Exposition als auf oralem Weg sollten spezifische Gewebe 
entnommen und analysiert werden, z. B. die Lungen bei Inhalationsstudien 
und Haut bei Studien mit dermaler Applikation. Siehe Nummern 74-78.  
Metabolismus  
41. Zur Identifizierung und Quantifizierung der unveränderten Prüfsubstanz und 
der Metaboliten sollten Exkreta (und gegebenenfalls Plasma) gesammelt 
werden (siehe Nummern 44-49). Das Poolen von Exkreta zur leichteren Identifizierung von Metaboliten innerhalb eines Dosisgruppe ist zulässig. Es wird empfohlen, das Profil der Metaboliten jedes Zeitabschnitts der 
Studie zu erstellen. Ist dies mangels Proben und/oder Radioaktivität nicht 
möglich, können Urin und Fäzes von unterschiedlichen Zeitpunkten, aber nur von Tieren desselben Geschlechts, die die gleiche Dosis erhalten haben, gepoolt werden. Bei der Untersuchung von Urin, Fäzes, ausgeatmeter Ra ­
dioaktivität von behandelten Tieren und gegebenenfalls Gallenflüssigkeit 
sind geeignete qualitative und quantitative Methoden anzuwenden.
 
42. Es sollte nach Möglichkeit versucht werden, alle Metaboliten, die zu 5 % 
oder mehr der verabreichten Dosis vorhanden sind, zu identifizieren und ein 
Metabolismusschema für die Prüfsubstanz zu erstellen. Prüfsubstanzen, von 
denen beschrieben wurde, dass sie zu 5 % oder mehr der verabreichten Dosis in Exkreta enthalten sind, sollten identifiziert werden. Die Identifizie ­
rung bezieht sich auf die genaue strukturelle Bestimmung der Komponenten. 
Die Identifizierung erfolgt normalerweise entweder durch 
Co-Chromatographie des Metaboliten mit bekannten Standards unter Ver ­
wendung von zwei unterschiedlichen Systemen oder durch Techniken, mit denen eine positive strukturelle Identifizierung erreicht werden kann, wie 
Massenspektrometrie, Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) usw. Bei der 
Co-Chromatographie sind Verfahren, die zur Bestimmung der Identität von Metaboliten die gleiche stationäre Phase mit zwei unterschiedlichen Lö ­
sungsmittelsystemen verwenden, zu vermeiden, da die Methoden dann nicht 
unabhängig sind. Bei der Identifizierung mithilfe der Co-Chromatographie 
sind zwei unterschiedliche, analytisch unabhängige Systeme wie die Umkehr- und Normalphasen-Dünnschichtchromatographie (TLC) und die Hochleistungsflüssigchromatograpie (HPLC) anzuwenden. Wenn die chro ­
matographische Trennung gut genug ist, braucht das Ergebnis nicht spek ­
troskopisch bestätigt zu werden. Eine eindeutige Identifizierung auf der Grundlage struktureller Informationen kann auch mit folgenden Methoden erzielt werden: Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie (LC-MS) oder 
Flüssigchromatographie/Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), Gas ­
chromatographie/Massen-spektrometrie (GC/MS) und Kernspinresonanz ­
spektroskopie (NMR).
 
43. Ist die Identifizierung von Metaboliten, die 5 % oder mehr der verabreichten 
Dosis ausmachen, nicht möglich, ist dies im Abschlussbericht zu begründen/ 
erläutern. Auch die Identifizierung von Metaboliten, die weniger als 5 % der 
verabreichten Dosis ausmachen, kann angezeigt sein, um den Metabolismus ­
weg besser zu verstehen und die Gefahren und/oder Risiken der Prüfsub ­
stanz bewerten zu können. Soweit möglich, ist eine Bestätigung der Struktur 
der Metaboliten anzugeben. Hierzu kann es erforderlich sein, ihr Profil im 
Plasma, im Blut oder in anderen Geweben zu erstellen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 533
 
Ausscheidung  
44. Geschwindigkeit und Ausmaß der Ausscheidung der verabreichten Dosis 
sollten durch Messung der Prozentsatzes der aus Urin, Fäzes und ausgeat ­
meter Luft wiedergewonnenen (radioaktiven) Dosis bestimmt werden. Diese 
Daten tragen auch zur Aufstellung der Massenbilanz bei. Die Mengen der 
mit Urin, Fäzes und ausgeatmeter Luft ausgeschiedenen Prüfsubstanz (Ra ­
dioaktivität) sollte in geeigneten Zeitabständen bestimmt werden (siehe Nummern 47, 48 und 49). Versuche mit wiederholter Verabreichung sollten 
so ausgelegt sein, dass Ausscheidungsdaten erfasst werden können, die die 
unter Nummer 26 genannten Ziele erfüllen. Dann können Vergleich mit Einzeldosisversuchen angestellt werden.
 
45. Wenn eine Pilotstudie ergeben hat, dass mit der ausgeatmeten Luft keine 
nennenswerten Mengen der Prüfsubstanz (Radioaktivität) (nach Nummer 49) ausgeschieden werden, braucht die ausgeatmete Luft in der Hauptstudie nicht aufgefangen zu werden.
 
46. Die Tiere sind getrennt in Stoffwechselkäfigen zu halten, damit die Exkreta 
(Urin, Fäzes und ausgeatmete Luft) aufgefangen werden können. Am Ende jedes Auffangzeitraums (siehe Nummern 47, 48 und 49) sind die Stoff ­
wechselkäfige mit einem geeigneten Lösungsmittel durchzuspülen, um mög ­
lichst viel von der Prüfsubstanz (Radioaktivität) zurückzugewinnen. Das Auffangen von Exkreta sollte nach sieben Tagen beendet werden, oder wenn mindestens 90 % der verabreichten Dosis wiedergewonnen wurde, 
je nachdem was zuerst eintritt.
 
47. Die Gesamtmengen der Prüfsubstanz (Radioaktivität) im Urin sind am ersten 
Tag des Auffangens zu mindestens zwei Zeitpunkten, von denen einer 24 
Stunden nach der Dosierung liegen sollte, und danach täglich bis zum Ende 
der Studie zu bestimmen. Es wird empfohlen, die Proben zu mehr als zwei Zeitpunkten am ersten Tag zu nehmen (z. B. nach 6, 12 und 24 Stunden). Die Ergebnisse der Pilotstudien sind auf Informationen zu alternativen oder 
zusätzlichen Auffangzeitpunkten zu analysieren. Die Auffangzeitpläne sind 
zu begründen.
 
48. Die Gesamtmengen der Prüfsubstanz (Radioaktivität) in den Fäzes sollte 
täglich und zwar erstmals 24 Stunden nach der Dosierung bis zum Ende 
der Studie bestimmt werden, es sei denn, aufgrund von Pilotstudien erschei ­
nen andere oder zusätzliche Zeitpunkte für das Auffangen angebracht. Al ­
ternative Auffangzeitpläne sind zu begründen.  
49. Ausgeatmetes CO  2 und andere flüchtige Stoffe brauchen in einer Studie 
nicht mehr aufgefangen zu werden, wenn in der innerhalb von 24 Stunden aufgefangenen ausgeatmeten Luft weniger als 1 % der verabreichten Dosis 
gefunden wird.
 
Zeitverlaufsstudien  
Plasma-/Blutkinetik  
50. Zweck dieser Studien ist die Bestimmung grundlegender Toxikokinetikpara ­
meter [z. B. C  max , T max Halbwertszeit (t  1/2 ), AUC] der Prüfsubstanz. Die 
Studien können mit einer Einzeldosis durchgeführt werden, im Allgemeinen werden jedoch zwei oder mehr Dosen verwendet. Die Dosis ist je nach Art 
des Versuchs und/oder der zu untersuchenden Frage festzusetzen. Zur Klä ­
rung von Fragen wie z. B. zur Bioverfügbarkeit der Prüfsubstanz und/oder zur Feststellung des Effekts der Dosis auf die Clearance (z. B. um fest ­
zustellen, ob die Sättigung der Clearance dosisabhängig ist) können kineti ­
sche Daten benötigt werden.
 
51. Für diese Studien sind mindestens vier Tiere eines Geschlechts je Dosis ­
gruppe zu verwenden. Die Wahl des Geschlechts der verwendeten Tiere ist zu begründen. Gibt es Hinweise auf signifikante geschlechtsspezifische Un ­
terschiede der Toxizität, ist die Verwendung beider Geschlechter (vier 
männliche und vier weibliche Tiere) in Betracht zu ziehen.
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52. Nach Verabreichung der (radiomarkierten) Prüfsubstanz werden jedem Tier 
zu angemessenen Zeitpunkten mit der geeigneten Methode Blutproben ent ­
nommen. Volumen und Anzahl der Blutproben, die je Tier genommen werden können, sind möglicherweise durch die potenziellen Wirkungen wiederholter Probenahmen auf die Gesundheit/Physiologie des Tiers und/ 
oder durch die Sensitivität der Analysemethode begrenzt. Die Proben sind 
für jedes einzelne Tier zu analysieren. In bestimmten Fällen (z. B. Charak ­
terisierung von Metaboliten) müssen Proben von mehreren Tieren gepoolt werden. Gepoolte Proben sind deutlich zu kennzeichnen, und das Poolen ist 
zu begründen. Wird eine radiomarkierte Prüfsubstanz verwendet, kann eine 
Analyse der vorhandenen Gesamtradioaktivität angebracht sein. In diesem Fall ist die Gesamtradioaktivität im Vollblut und im Plasma oder im Plasma und in den Erythrozyten zu bestimmen, damit das Blut/Plasmaverhältnis 
berechnet werden kann. In anderen Fällen können spezifischere Unter ­
suchungen, die die Identifizierung der Ausgangssubstanz und/oder der Me ­
taboliten erfordern, oder die Bewertung der Proteinbindung notwendig sein.
 
Sonstige Gewebekinetik  
53. Diese Studien sollen Informationen über den zeitlichen Verlauf liefern, um 
so über die Bestimmung der Konzentrationen der Prüfsubstanz in verschie ­
denen Geweben Fragen zur Art und Weise der toxischen Wirkungen, zur Bioakkumulation und zur Biopersistenz klären zu können. Die Auswahl der Gewebe und die Anzahl der zu bewertenden Zeitpunkte richtet sich danach, 
welcher Aspekt untersucht werden soll und welche toxikologischen Daten 
über die Prüfsubstanz vorliegen. Bei der Planung dieser zusätzlichen gewe ­
bekinetischen Studien sind die gemäß den Nummern 37-40 gewonnenen Informationen zu berücksichtigen. Die Studien können mit einfacher oder 
mehrmaliger Dosierung durchgeführt werden. Die gewählte Methode ist 
ausführlich zu begründen.
 
54. Mögliche Gründe für die Durchführung weiterer gewebekinetischer Studien:  
— Hinweise auf eine längere Halbwertszeit im Blut, die auf die Möglich ­
keit einer Akkumulation der Prüfsubstanz in verschiedenen Geweben 
hindeutet, oder  
— Interesse daran herauszufinden, ob in bestimmten Geweben ein konstan ­
tes Niveau erreicht wurde. (In Studien mit wiederholter Verabreichung kann es z. B. selbst wenn sich offenbar ein konstanter Spiegel der Prüf ­
substanz im Blut eingestellt hat, von Interesse sein, sich zu vergewis ­
sern, dass auch in den Zielgeweben ein konstantes Niveau erreicht wur ­
de.)
 
55. Bei dieser Art von Zeitverlaufsstudien ist eine geeignete orale Dosis der 
Prüfsubstanz an mindestens vier Tiere je Dosis je Zeitpunkt zu verabreichen. 
Dann ist der zeitliche Verlauf der Verteilung in den ausgewählten Geweben zu überwachen. Sofern keine geschlechtsspezifische Toxizität beobachtet wird, braucht nur ein Geschlecht verwendet zu werden. Ob die Gesamtradio ­
aktivität oder die Ausgangssubstanz und/oder ihre Metaboliten bestimmt 
werden, richtet sich nach der zu untersuchenden Fragestellung. Die Gewebe ­
verteilung ist mithilfe der geeigneten Verfahren zu bewerten.
 
Enzyminduktion/-inhibition  
56. Studien zu den möglichen Wirkungen der Enzyminduktion/-inhibition oder 
zur Biotransformation der Prüfsubstanz können in einem oder mehreren der folgenden Fälle erforderlich sein:
 
1. Die vorliegenden Erkenntnisse deuten auf eine Beziehung zwischen der 
Biotransformation der Prüfsubstanz und erhöhter Toxizität hin;  
2. die vorliegenden Toxizitätsdaten deuten auf eine nicht lineare Beziehung 
zwischen Dosis und Metabolismus hin;  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 535
 
3. die Ergebnisse der Studien zur Metabolitenidentifizierung ergeben einen 
potenziell toxischen Metaboliten, der durch einen Enzymweg produziert 
worden sein könnte, der durch die Prüfsubstanz induziert wurde;  
4. zur Erklärung der Wirkungen, die mit Phänomenen der Enzyminduktion 
verbunden sein sollen;  
5. Wenn in In-vitro- oder In-vivo-Versuchen mit unterschiedlichen Tierarten 
oder unter unterschiedlichen Bedingungen toxikologisch signifikante Ver ­
änderungen des Metabolismusprofils der Prüfsubstanz beobachtet wer ­
den, kann eine Bestimmung des beteiligten Enzyms bzw. der beteiligen 
Enzyme erforderlich sein (z. B. Phase-I-Enzyme wie Isozyme des 
Cytochrom-P450-Monooxygenasesystems, Phase-II-Enzyme wie Isozyme von Sulfotransferase oder Uridin-Diphosphat-Glucuronosyltransferase oder jedes andere relevante Enzym). Diese Informationen können zur 
Beurteilung der Relevanz von Extrapolationen von einer Tierart zu einer 
anderen Tierart verwendet werden.
 
57. Zur Beurteilung der mit der Prüfsubstanz zusammenhängenden toxikokine ­
tischen Veränderungen sind geeignete Studienprotokolle zu verwenden, die 
entsprechend validiert und gerechtfertigt sind. Die Studien können z. B. 
zwecks Bestimmung des Metabolismusprofils die mehrmalige Dosierung einer unmarkierten Prüfsubstanz, gefolgt von einer einzigen radiomarkierten Dosis an Tag 14 oder die mehrmalige Dosierung einer radiomarkierten 
Prüfsubstanz mit Probenahme an den Tagen 1, 7 und 14 vorsehen. Die 
mehrmalige Dosierung einer radiomarkierten Prüfsubstanz kann auch Auf ­
schluss über die Bioakkumulation geben (siehe Nummer 26).
 
ZUSÄTZLICHE METHODEN  
58. Mithilfe zusätzlicher Methoden, die über die in dieser Prüfmethode beschrie ­
benen  In-vivo -Versuche hinausgehen, können nützliche Informationen über 
Resorption, Verteilung, Metabolismus und Elimination einer Prüfsubstanz 
bei bestimmten Tierarten gewonnen werden.  
Nutzung von  in-vitro -informationen  
59. Durch  In-vitro -Studien mit geeigneten Testsystemen können mehrere Fra ­
gestellungen zum Metabolismus der Prüfsubstanz geklärt werden. Zur Unter ­
suchung möglicher Metaboliten können frisch isolierte oder gezüchtete He ­
patozyten und subzelluläre Fraktionen (z. B. Mikrosomen und Cytosol oder 
S9 Fraktion) von der Leber verwendet werden. Der lokale Metabolismus im Zielorgan, z. B. in der Lunge, kann für die Risikobewertung von Interesse sein. Für diese Zwecke können mikrosomale Fraktionen von Zielgeweben 
nützlich sein. Studien mit Mikrosomen können nützlich sein, um Unterschie ­
de, die mit dem Geschlecht oder der Lebensphase zusammenhängen könn ­
ten, zu klären und Enzymparameter (K
 m und V  max ) zu beschreiben, die die 
Bewertung der Dosisabhängigkeit des Metabolismus bezogen auf die Ex ­
positionsstufen erleichtern können. Darüber hinaus können Mikrosome hilf ­
reich sein, um die am Metabolismus der Prüfsubstanz beteiligten spezi ­
fischen mikrosomalen Enzyme zu identifizieren, die für die Extrapolation von einer Tierart zu einer anderen relevant sein können (siehe auch Nummer 
56). Das Potenzial für die Induktion der Biotransformation kann auch mit ­
hilfe von subzellulären Fraktionen der Leber (z. B. Mikrosomen und Cyto ­
sol) von mit der Prüfsubstanz vorbehandelten Tieren durch In-vitro-Induk ­
tionsstudien an Hepatozyten oder auf der Grundlage spezifischer Zelllinien, 
die relevante Enzyme exprimieren untersucht werden. Unter bestimmten 
Bedingungen kann die Verwendung subzellulärer Fraktionen von mensch ­
lichen Geweben für die Bestimmung potenzieller artspezifischer Unter ­
schiede in Betracht gezogen werden. Die Ergebnisse von  In-vitro -Unter­
suchungen können auch für die Entwicklung von physiologisch-basierten 
toxikokinetischen Modellen von Nutzen sein (5).
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60. In-vitro -Hautresorptionsstudien können zusätzliche Informationen zur Be ­
schreibung der Resorption liefern (6).  
61. Mit primären Zellkulturen von Leberzellen und frischen Gewebeschnitten 
können ähnliche Fragen untersucht werden wie mit Lebermikrosomen. In bestimmten Fällen kann es möglich sein, spezifische Fragen mithilfe von 
Zelllinien, die das betreffende Enzym exprimieren, oder mit genetisch ver ­
änderten Zelllinien zu beantworten. In anderen Fällen kann es hilfreich sein, die Inhibition und Induktion spezifischer Cytochrom-P450-Isozyme (z. B. CYP1A1, 2E1, 1A2 und andere) und/oder Phase-II-Enzyme durch die Aus ­
gangsverbindung mittels In-vitro-Studien zu untersuchen. Die so gewonne ­
nen Informationen können für strukturverwandte Verbindungen nützlich sein.
 
Verwendung toxikokinetischer Daten aus Toxizitätsstudien als ergän ­
zende Informationen  
62. Die Analyse von Blut-, Gewebe- und/der Ausscheidungsproben, die im 
Verlauf anderer Toxizitätsstudien genommen wurden, kann Daten zur Bio ­
verfügbarkeit, zu Veränderungen der Plasmakonzentration im Zeitverlauf (AUC, C
 max ), zum Bioakkumulationspotenzial, zu den Clearance-Raten 
und zu Veränderungen des Metabolismus und der Kinetik liefern, die mit 
dem Geschlecht oder der Lebensphase der Tiere zusammenhängen.  
63. Die Studienauslegung kann auch im Hinblick auf die Klärung folgender 
Aspekte angepasst werden: Sättigung der Resorption, Biotransformations- 
oder Ausscheidungswege bei höheren Dosisstufen, Funktion neuer Stoff ­
wechselwege bei höheren Dosen und Begrenzung toxischer Metaboliten auf höhere Dosen.
 
64. Weitere Aspekte, die zur Beurteilung der Gefahren untersucht werden kön ­
nen: 
— die altersbedingte Empfindlichkeit, die vom Zustand der Blut-Hirn- 
Schranke, der Nieren und/oder der Detoxifizierungskapazität abhängt;  
— die Empfindlichkeit bestimmter Unterpopulationen aufgrund unterschied ­
licher Biotransformationskapazitäten oder anderer toxikokinetischer Un ­
terschiede;  
— Ausmaß der Exposition des Fötus durch transplazentare Übertragung 
von chemischen Stoffen oder der Exposition von Neugeborenen durch das Säugen.
 
Verwendung toxikokinetischer Modelle  
65. Toxikokinetische Modelle können für verschiedene Aspekte der Gefahren- 
und Risikobewertung von Nutzen sein, z. B. für die Vorhersage der syste ­
mischen Exposition und der die inneren Gewebe erreichenden Dosis. Au ­
ßerdem können spezifische Fragen zur Wirkungsweise untersucht werden. Die Modelle können als Grundlage für die Extrapolation zwischen Tierarten, Expositionswegen und Dosierungsmustern sowie für die Bewertung des 
Risikos für den Menschen dienen. Zu den nützlichen Daten für die Entwick ­
lung von physiologisch-basierten toxikokinetischen Modellen für eine Prüf ­
substanz bei einer bestimmten Tierart gehören 1) die Verteilungskoeffizien ­
ten, 2) biochemische Konstanten und physiologische Parameter, 3) die für 
die verschiedenen Verabreichungswege spezifischen Resorptionsparameter 
und 4)  In-vivo -Kinetikdaten für die Evaluierung der Modelle [z. B. 
Clearance-Parameter für relevante (> 10 %) Ausscheidungswege, K
 m und 
V max für den Metabolismus]. Die Versuchsdaten, die zur Entwicklung des 
Modells verwendet werden, sind mit wissenschaftlich fundierten Methoden 
zu erzeugen, und die Modellergebnisse sind zu validieren. Prüfsubstanz- und tierartspezifische Parameter wie Resorptionsraten, Blut-Gewebe-Verteilungs ­
koeffizient und metabolische Umsatzraten werden oft bestimmt, um die 
Entwicklung von Nicht-Kompartiment-Modellen oder physiologisch basier ­
ten Modellen zu erleichtern (7).
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DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
66. Der Prüfbericht sollte ein Inhaltsverzeichnis enthalten.  
Hauptteil des Berichts  
67. Der Hauptteil des Berichts sollte die unter diese Prüfmethode fallenden 
Informationen enthalten, die wie folgt in Abschnitte und Absätze zu gliedern 
sind:  
Zusammenfassung  
68. Dieser Abschnitt des Berichts sollte eine Zusammenfassung der Studienaus ­
legung und eine Beschreibung der angewandten Methoden enthalten. Er sollte außerdem die wichtigsten Erkenntnisse in Bezug auf die Massen ­
bilanz, die Art und Menge der Metaboliten, die Rückstände der Prüfsubstanz 
in den Geweben, die Clearance-Rate, das Bioakkumulationspotenzial, ge ­
schlechtsspezifische Unterschiede usw. behandeln. Die Zusammenfassung muss so ausführlich sein, dass eine Bewertung der Ergebnisse möglich ist.
 
Einleitung  
69. Dieser Abschnitt des Berichts sollte die Ziele der Studie, die Begründung 
und Auslegung sowie geeignete Literaturhinweise und Hintergrundinforma ­
tionen enthalten.  
Material und Methoden  
70. Dieser Abschnitt des Berichts sollte ausführliche Erläuterungen aller ein ­
schlägigen Informationen enthalten. Dazu gehören:  
a) Prüfsubstanz  
Dieser Unterabschnitt sollte Angaben zur Prüfsubstanz enthalten: che ­
mische Bezeichnung, Molekülstruktur, qualitative und quantitative Be ­
stimmung der chemischen Zusammensetzung, chemische Reinheit und, 
soweit möglich, Art und Mengen etwaiger Verunreinigungen. Er sollte auch Angaben zu den physikalischen/chemischen Eigenschaften, ins ­
besondere Aggregatzustand, Farbe, Löslichkeits- und/oder Verteilungs ­
koeffizient, Stabilität und gegebenenfalls Ätzwirkung enthalten. Soweit 
vorhanden, sind Informationen zu Isomeren anzugeben. Ist die Prüfsub ­
stanz radiomarkiert, sollte dieser Unterabschnitt folgende Informationen enthalten: Art des Radionuklids, Position der Markierung, spezifische 
Aktivität und radiochemische Reinheit.
 
Die Art des Vehikels, etwaige Verdünnungsmittel, Suspendierhilfen und 
Emulgatoren oder andere Stoffe, die zur Verabreichung der Prüfsubstanz 
verwendet werden, sind anzugeben.  
b) Versuchstiere  
Dieser Unterabschnitt sollte Informationen über die Versuchstiere mit 
Angaben zur Auswahl von Art, Stamm und Alter zu Beginn der Studie, 
Geschlecht, Körpergewicht, Gesundheitszustand und Tierhaltung sowie die entsprechenden Begründungen enthalten.
 
c) Methoden  
Dieser Unterabschnitt sollte Angaben zur Studienauslegung und zur ver ­
wendeten Methodik enthalten. Hierzu gehört Folgendes:  
1. Begründung für jede Änderung des Expositionswegs und der Ex ­
positionsbedingungen, falls zutreffend;  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 538
 
2. Begründung für die Auswahl der Dosisstufen;  
3. falls zutreffend, Erläuterung der Pilotstudien, die für die Konzeption 
von Follow-up-Studien verwendet wurden; die den Pilotstudien zu ­
grunde liegenden Daten sind anzugeben;  
4. Zubereitungsweise der Dosierungslösung und Art des Lösungsmittels 
oder Vehikels, sofern verwendet;  
5. Anzahl der Behandlungsgruppen und Anzahl der Tiere je Gruppe;  
6. Dosierungsstufen und -volumen (sowie die spezifische Aktivität der 
Dosis bei Anwendung von Radioaktivität);  
7. Verabreichungsweg(e) und -methode(n);  
8. Frequenz der Dosierung;  
9. Futterkarenz (falls zutreffend);  
10. Gesamtradioaktivität je Tier;  
11. Umgang mit den Tieren;  
12. Entnahme/Auffangen von Proben und Aufbereitung;  
13. für die Trennung, quantitative Bestimmung und Identifizierung von 
Metaboliten verwendete Analysemethoden;  
14. Nachweisgrenzen der verwendeten Methoden;  
15. sonstige durchgeführte experimentelle Messungen und Verfahren 
(einschließlich der Validierung von Methoden für die Analyse von 
Metaboliten).  
d) Statistische Analysen  
Werden die Studienergebnisse statistisch analysiert, so müssen ausrei ­
chende Informationen über das herangezogene Analyseverfahren und das verwendete Computerprogramm angegeben werden, damit ein un ­
abhängiger Überprüfer/Statistiker die Analyse nachbewerten und nach ­
vollziehen kann.
 
Bei Studien mit Systemmodellierung wie einem physiologisch-basierten 
toxikokinetischen Modell ist eine umfassende Beschreibung des Modells anzugeben, um eine unabhängige Rekonstruktion und Validierung des Modells zu ermöglichen (siehe Nummer 65 und Anlage: Definitionen).
 
Ergebnisse  
71. Alle Daten sind entsprechend der Beschreibung im vorliegenden Absatz 
zusammenzufassen und mit einer angemessenen statistischen Auswertung 
in Tabellenform darzustellen. Die Daten der Radioaktivitätsmessung sind 
zusammenzufassen und in für die Studie geeigneter Weise darzustellen, d. h. normalerweise als Mikrogramm- oder Milligrammäquivalent je Proben ­
masse; es können auch andere Einheiten verwendet werden. Dieser Ab ­
schnitt sollte grafische Darstellungen der Befunde, die repräsentativen 
Chromatographie- und Spektrometriedaten, Angaben zur Identität/Menge der Metaboliten und den möglichen Stoffwechselwegen, einschließlich der Molekülstruktur der Metaboliten enthalten. Darüber hinaus sollte dieser Ab ­
schnitt, soweit zutreffend, die folgenden Informationen enthalten:
 
1. Menge und prozentualer Anteil der Wiedergewinnung der Radioaktivität 
in Urin, Fäzes, ausgeatmeter Luft und Käfigreinigungsrückständen.  
— Bei Studien mit dermaler Applikation sind auch Daten über die Wie ­
dergewinnung der Prüfsubstanz von der behandelten Haut und vom Abwaschen der Haut, Daten über die restliche Radioaktivität auf der Hautabdeckung und in den Stoffwechselkäfigen sowie die Ergebnisse 
der Hautwaschstudie anzugeben. Für weitere Erläuterungen siehe 
Nummern 74-77.
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— Bei Inhalationsstudien sind auch Daten über die Wiedergewinnung 
der Prüfsubstanz aus den Lungen und Nasengeweben anzugeben (8). 
Für weitere Erläuterungen siehe Nummer 78;  
2. die Gewebeverteilung, angegeben als Prozentsatz der verabreichten Dosis 
und als Konzentration (Mikrogrammäquivalent je Gramm Gewebe) und 
die Gewebe/Blut- oder Gewebe/Plasma-Verhältnisse;  
3. die für jede Studie aufgestellte Materialbilanz mit Untersuchung von 
Körpergeweben und Ausscheidungen;  
4. Plasmakonzentrationen und toxikokinetische Parameter (Bioverfügbar ­
keit, AUC, C  max , T max , Clearance, Halbwertszeit) nach Verabreichung 
über den/die jeweilige(n) Expositionsweg(e);  
5. Geschwindigkeit und Ausmaß der Resorption der Prüfsubstanz nach Ver ­
abreichung über den/die jeweilige(n) Expositionsweg(e);  
6. in Ausscheidungen gefundene Mengen der Prüfsubstanz und Metaboliten 
(angegeben als Prozentsatz der verabreichten Dosis);  
7. Verweis auf Daten in der Anlage, die Daten zu allen gemessenen End ­
punkten für die einzelnen Tiere enthalten (z. B. Dosisverabreichung, prozentuale Wiedergewinnung, Konzentrationen, toxikokinetische Para ­
meter usw.);
 
8. grafische Darstellung der vorgeschlagenen Stoffwechselwege und der 
Molekülstrukturen der Metaboliten.  
Diskussion und Schlussfolgerungen  
72. In diesem Abschnitt sollte(n) der/die Verfasser  
1. auf der Grundlage des Metabolismus und der Eliminierung der Prüfsub ­
stanz einen Stoffwechselweg vorschlagen;  
2. potenzielle tierart- und geschlechtsspezifische Unterschiede bei der Eli ­
minierung und/oder Biotransformation der Prüfsubstanz untersuchen;  
3. die Identität und Bedeutung von Metaboliten, die Clearance-Raten, das 
Bioakkumulationspotenzial, die Menge an Rückständen des Ausgangs ­
stoffs und/oder von Metaboliten in Geweben sowie gegebenenfalls dosis ­
abhängige Veränderungen von toxikokinetischen Parametern tabellarisch darstellen und erläutern;
 
4. alle relevanten Toxikokinetik-Daten aufnehmen, die bei der Durchfüh ­
rung von Toxizitätsstudien gewonnen wurden;  
5. eine kurze Schlussfolgerung formulieren, die durch die Ergebnisse der 
Studie gestützt werden kann;  
6. (falls notwendig oder angebracht) Abschnitte hinzufügen.  
73. Für bibliografische Angaben, Tabellen, Abbildungen, Anhänge usw. sind 
zusätzliche Abschnitte zu verwenden.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 540
 
ALTERNATIVE EXPOSITIONSWEGE  
Dermal  
Dermale Applikation  
74. Dieser Abschnitt enthält spezifische Informationen zur Untersuchung der 
Toxikokinetik der Prüfsubstanz bei dermaler Applikation. Für die Hautre ­
sorption ist Kapitel B.44 dieses Anhangs [Hautresorption:  In-vivo -Methode 
(9)] zu beachten. Für andere Endpunkte wie Verteilung und Metabolismus kann diese Prüfmethode B.36 verwendet werden. Bei dermaler Applikation 
sollten eine oder mehrere Dosisstufen der Prüfsubstanz verwendet werden. 
Die Prüfsubstanz (z. B. reines, verdünntes oder formuliertes Material, das die auf die Haut aufgetragene Prüfsubstanz enthält) muss der Substanz ent ­
sprechen (oder ein realistisches Surrogat hiervon bilden), der Menschen oder 
andere mögliche Zielarten ausgesetzt sein können. Die Dosisstufe(n) ist/sind 
gemäß den Nummern 20-26 dieser Prüfmethode festzulegen. Dabei kann berücksichtigt werden, mit welcher Exposition von Menschen zu rechnen ist und/oder bei welchen Dosen in anderen Studien zur dermalen Toxizität 
Toxizitätszeichen beobachtet wurden. Die dermale Dosis ist erforderlichen ­
falls in einem geeigneten Vehikel aufzulösen und in einem angemessenen Volumen zu applizieren. Kurz vor Versuchsbeginn wird das Fell auf dem Rücken der Versuchstiere geschoren. Ein Abrasieren des Fells ist ebenfalls 
möglich, sollte jedoch etwa 24 Stunden vor dem Versuch erfolgen. Beim 
Scheren oder Abrasieren des Fells ist darauf zu achten, dass die Haut nicht verletzt wird, da dies ihre Durchlässigkeit verändern könnte. Etwa 10 % der Körperoberfläche sollten für die Applikation der Prüfsubstanz enthaart wer ­
den. Bei hochtoxischen Substanzen kann die behandelte Oberfläche kleiner 
als etwa 10 % sein, es sollte jedoch ein möglichst großer Bereich mit einer dünnen und einheitlichen Schicht bedeckt werden. Bei allen Gruppen, die der dermalen Prüfung unterzogen werden, sollte die gleiche Fläche behan ­
delt werden. Die Bereiche, auf denen die Prüfsubstanz appliziert wurde, sind 
mit einer geeigneten Abdeckung, die befestigt wird, zu schützen. Die Tiere sind getrennt unterzubringen.
 
75. Um die Menge der applizierten Dosis der Prüfsubstanz zu bestimmen, die 
mit milder Seife und Wasser von der behandelten Hautfläche abgewaschen werden kann, ist eine Hautwaschstudie durchzuführen. Diese Studie kann 
auch bei der Aufstellung der Massenbilanz helfen, wenn die Prüfsubstanz 
über die Haut verabreicht wird. Bei dieser Hautwaschstudie wird zwei Tie ­
ren eine Einzeldosis der Prüfsubstanz appliziert. Die Dosisstufe ist gemäß 
Nummer 23 dieser Prüfmethode festzulegen (für die Dauer des Hautkontakts 
siehe auch Nummer 76). Anhand der beim Abwaschen wiedergewonnenen Menge der Prüfsubstanz kann die Wirksamkeit der Entfernung der Prüfsub ­
stanz durch das Abwaschen bestimmt werden.
 
76. Sofern die Prüfsubstanz keine hautätzende Wirkung hat, sollte sie nach dem 
Auftragen mindestens 6 Stunden auf der Haut verbleiben. Dann ist die Abdeckung abzunehmen und die behandelte Fläche nach dem in der Haut ­
waschstudie beschriebenen Verfahren zu waschen (siehe Nummer 75). So ­
wohl die Abdeckung als auch die Waschflüssigkeit sind auf Rückstände der Prüfsubstanz zu analysieren. Am Ende der Studie werden die Tiere gemäß 
(2) tierschutzgerecht getötet und die behandelte Haut wird entfernt. Ein 
angemessener Teil der behandelten Haut ist auf Rückstände der Prüfsubstanz (Radioaktivität) zu analysieren.
 
77. Für die toxikokinetische Bewertung von Arzneimitteln können je nach Re ­
gulierungssystem unterschiedliche Verfahren erforderlich sein.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 541
 
Inhalation  
78. Für diese Prüfung ist eine einzige Konzentration der Prüfsubstanz zu ver ­
wenden (oder mehrere, falls erforderlich). Die Konzentration(en) ist/sind gemäß den Nummern 20-26 dieser Prüfmethode festzulegen. Um eine Re ­
sorption über andere Expositionswege zu verhindern, sind Inhalationsprü ­
fungen mit einem „Nasentrichter“ oder einer „Head-only“-Vorrichtung durchzuführen (8). Wenn bei der Inhalationsexposition andere Bedingungen angewandt werden, ist die Änderung zu begründen. Die Dauer der Inhala ­
tionsexposition ist festzulegen und beträgt normalerweise 4-6 Stunden.
 
LITERATUR:  
1. OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Ap ­
plicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manu ­
factured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.  
2. OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of 
Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series 
on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
 
3. Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the 
pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and re ­
gulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81.  
4. Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor microsco ­
pic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25- 40.
 
5. Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, Buist 
H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. 
(2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regula ­
tory Toxicology and Pharmacology 50: 400-411.
 
6. Kapitel B.45 dieses Anhangs, Hautresorption:  In-vitro -Methode.  
7. IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS 
Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, 
International Programme on Chemical Safety.  
8. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
9. Kapitel B.44 dieses Anhangs, Hautresorption:  In-vivo -Methode.  
10. Barton HA,  et al.  (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Che ­
mical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.  
11. Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel 
Dekker, Inc., New York.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 542
 
Anlage  
DEFINITIONEN  
Resorption : Prozess(e) der Aufnahme von Chemikalien in oder über Gewebe. 
Die Resorption bezieht sich auf die Ausgangssubstanz und alle ihre Metaboliten. 
Nicht mit „Bioverfügbarkeit“ zu verwechseln.  
Akkumulation  (Bioakkumulation): Zunahme der Menge einer Prüfsubstanz in 
den Geweben im Laufe der Zeit (normalerweise im Fettgewebe, nach wieder ­
holter Exposition); wenn die Prüfsubstanz dem Körper in größeren Mengen 
zugeführt wird, als er sie ausscheidet, akkumuliert der Organismus die Prüfsub ­
stanz, und es können toxische Konzentrationen des Stoffs erreicht werden.  
ADME : Akronym für „Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion“ 
(Resorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung).  
AUC : (Fläche unter der Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve): die Fläche unter der 
Konzentrations-Zeit-Kurve einer Prüfsubstanz im Plasma. Diese Fläche entspricht der Gesamtmenge der Prüfsubstanz, die vom Körper innerhalb eines festgelegten Zeitraums resorbiert wurde. Unter linearen Bedingungen ist die AUC (vom Zeit ­
punkt Null bis unendlich) proportional zur Gesamtmenge einer vom Körper 
resorbierten Prüfsubstanz, unabhängig von der Resorptionsgeschwindigkeit.
 
Autoradiographie : (Ganzkörper-Autoradiographie): wird verwendet zur qualita ­
tiven und/oder quantitativen Bestimmung des Aufenthaltsorts einer radioaktiven Prüfsubstanz im Gewebe. Bei dieser Technik werden Röntgenfilme oder in jün ­
gerer Zeit digitale Phosphorbildplatten verwendet, um radioaktiv markierte Mo ­
leküle oder Molekülfragmente durch Aufzeichnung der im untersuchten Objekt 
emittierten Strahlung sichtbar zu machen. Die quantitative Ganzkörper-Auto ­
radiographie ist für die Evaluierung der Verteilung der Prüfsubstanz und die Bewertung der Gesamtrückgewinnung und Auflösung von radioaktivem Material 
in Geweben möglicherweise besser geeignet als die Organsektion. Ein wichtiger 
Vorteil ist beispielsweise, dass sie in einem Versuchsmodell mit einem pigmen ­
tierten Tier verwendet werden kann, um die mögliche Assoziation der Prüfsub ­
stanz mit Melanin zu bewerten, das sich an bestimmte Moleküle binden kann. 
Zwar lassen sich mit dieser Technik die Bindungsstellen mit hoher Kapazität und 
geringer Affinität im gesamten Körper gut darstellen, aber sie ist möglicherweise weniger gut geeignet für die Identifizierung bestimmter Zielorte wie Rezeptor ­
bindungsstellen, an denen für den Nachweis eine relativ hohe Auflösung und 
eine hohe Sensitivität erforderlich sind. Wenn die Autoradiographie zum Einsatz 
kommt, sollten Versuche zur Aufstellung der Massenbilanz der verabreichten Verbindung mit einer getrennten Gruppe oder in einer von der Gewebevertei ­
lungsstudie getrennten Studie durchgeführt werden, bei der alle Ausscheidungen 
(zu denen auch die ausgeatmete Luft gehören kann) und ganze Tierkörper ho ­
mogenisiert und mithilfe der Flüssigszintillationszählung analysiert werden.
 
Biliäre Ausscheidung : Ausscheidung über die Gallengänge.  
Bioakkumulation : siehe „Akkumulation“.  
Bioverfügbarkeit : der Anteil einer verabreichten Dosis, die in den systemischen 
Kreislauf gelangt oder am Wirkort zur Verfügung gestellt wird. Die Bioverfüg ­
barkeit einer Prüfsubstanz bezieht sich normalerweise auf den Ausgangsstoff; sie kann sich aber auch auf seine Metaboliten beziehen. Sie betrifft nur eine che ­
mische Form.  Hinweis:  Bioverfügbarkeit und Resorption sind nicht identisch. 
Der Unterschied zwischen z. B. der oralen Resorption (d. h. dem Vorhandensein 
in der Darmwand und in der portalen Zirkulation) und der Bioverfügbarkeit (d. h. dem Vorhandensein im systemischen Blut und in Geweben) kann neben anderen Faktoren auf den chemischen Abbau aufgrund des Metabolismus der Darmwand 
oder auf Effluxtransport zurück zum Darmlumen oder auf präsystemischen Me ­
tabolismus in der Leber zurückzuführen sein (10). Die Bioverfügbarkeit der toxischen Komponente (Ausgangsstoff oder ein Metabolit) ist bei der Bewertung der Risiken für die menschliche Gesundheit ein kritischer Parameter (Extrapola ­
tion von hoher zu niedriger Dosis, Extrapolation von einem Verabreichungsweg 
zu einem anderen) für die Ableitung eines internen Werts vom externen NOAEL- oder BMD-Wert (applizierte Dosis). Für die Untersuchung der Wirkungen auf die Leber bei oraler Verabreichung reicht die orale Resorption aus. Bei jeder anderen 
Wirkung als am Eingangsort ist die Bioverfügbarkeit jedoch im Allgemeinen ein 
zuverlässigerer Parameter für die weitere Risikobewertung als die Resorption.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 543
 
Biopersistenz : siehe „Persistenz“.  
Biotransformation : (normalerweise enzymatische) chemische Umwandlung ei ­
ner Prüfsubstanz in einen anderen Stoff innerhalb des Körpers. Synonym „Me ­
tabolismus“.  
C max : entweder maximale (Peak-)Konzentration im Blut (Plasma/Serum) nach 
der Verabreichung oder maximale (Peak-)Ausscheidung (in Urin oder Fäzes) nach der Verabreichung.
 
Clearance-Rate : quantitatives Maß der Geschwindigkeit, mit der eine Prüfsub ­
stanz je Zeiteinheit aus dem Blut, dem Plasma oder einem bestimmten Gewebe 
eliminiert wird.  
Kompartiment : struktureller oder biochemischer Teil (oder strukturelle oder bio ­
chemische Einheit) eines Körpers, eines Gewebes oder einer Zelle, die vom Rest 
abgetrennt ist.  
Detoxifizierungswege : eine Reihe von Schritten, durch die toxische Stoffe aus 
dem Körper eliminiert werden, entweder durch metabolische Umwandlung oder 
durch Ausscheidung.  
Verteilung : Verbreitung einer Prüfsubstanz und ihrer Derivate im Organismus.  
Enzyme/Isozyme : Proteine, die chemische Reaktionen katalysieren. Isozyme 
sind Enzyme, die ähnliche chemische Reaktionen katalysieren, sich aber in ihrer Aminosäurensequenz unterscheiden.
 
Enzymparameter : K  m : Michaeliskonstante und V  max : maximale Geschwindig ­
keit. 
Ausscheidung : Prozess(e), mit dem/denen eine verabreichte Prüfsubstanz und/ 
oder ihre Metaboliten aus dem Körper entfernt werden.  
Exogen : von außen in den Organismus oder das System eingebracht oder außer ­
halb des Organismus oder des Systems erzeugt.  
Extrapolation : Folgerung eines oder mehrerer unbekannter Werte aus dem, was 
bekannt ist oder beobachtet wurde.  
Halbwertszeit (t  1/2 ): Zeit, in der die Konzentration der Prüfsubstanz in einem 
Kompartiment um die Hälfte sinkt. Die Halbwertszeit bezieht sich normalerweise 
auf die Plasmakonzentration oder die Menge der Prüfsubstanz im gesamten Kör ­
per. 
Induktion/Enzyminduktion : Enzymsynthese als Reaktion auf einen Umweltreiz 
oder ein Induktormolekül.  
Linearität/lineare Kinetik : In der Kinetik ist ein Prozess linear, wenn die Ge ­
schwindigkeiten aller Übertragungen zwischen den Kompartimenten proportional 
zu den vorhandenen Mengen oder Konzentrationen sind, d. h. 1. Ordnung. Folg ­
lich sind die Clearance- und Verteilungsvolumen konstant, ebenso die Halbwerts ­
zeiten. Die erreichten Konzentrationen sind proportional zur Dosierungsrate (Ex ­
position), und die Akkumulation kann leichter vorhergesagt werden. Ob Linea ­
rität oder Nichtlinearität vorliegt, kann durch Vergleich der relevanten Parameter, 
z. B. AUC, nach unterschiedlichen Dosen oder nach Einzel- oder Mehrfachexpo ­
sition festgestellt werden. Besteht keine Dosisabhängigkeit, so kann dies auf die Sättigung der an der Metabolisierung der Verbindung beteiligten Enzyme hin ­
deuten; eine Vergrößerung der AUC nach wiederholter Exposition im Vergleich 
zu einer Einmalexposition kann ein Hinweis auf eine Stoffwechselhemmung, eine Verkleinerung der AUC ein Hinweis auf eine Stoffwechselinduktion sein [siehe auch (11)].
 
Massenbilanz : Erfassung der Massen der Prüfsubstanz, die in das System ein ­
gehen und es verlassen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 544
 
Materialbilanz : siehe „Massenbilanz“.  
Toxizitätsmechanismus/Wirkungsmechanismus (Wirkungsweise) : Wirkungs ­
mechanismus bezieht sich auf spezifische biochemische Wechselwirkungen, 
durch die eine Prüfsubstanz ihre Wirkung entfaltet. Wirkungsweise bezieht sich 
auf allgemeinere Phänomene, die zur Toxizität einer Prüfsubstanz führen.  
Metabolismus : Synonym „Biotransformation“.  
Metaboliten : Produkte des Metabolismus oder metabolischer Prozesse.  
Orale Resorption : der Prozentsatz der Dosis der Prüfsubstanz, die ab dem Ver ­
abreichungsort (z. B. Magen-Darm-Trakt) resorbiert wird. Mit diesem wichtigen 
Parameter kann bestimmt werden, welcher Anteil der verabreichten Prüfsubstanz die Pfortader und anschließend die Leber erreicht.
 
Verteilungskoeffizient : ein Maß für die unterschiedliche Löslichkeit eines che ­
mischen Stoffs in zwei Lösungsmitteln.  
Maximale Blut-(Plasma-/Serum-)Spiegel : maximale (Peak-)Konzentration im 
Blut (Plasma/Serum) nach Verabreichung (siehe auch „C  max “). 
Persistenz (Biopersistenz) : das langfristige Vorhandensein einer Chemikalie (in 
einem biologischen System) aufgrund ihrer Abbau-/Eliminationsresistenz.  
Read-across : Die Endpunktinformationen für eine oder mehrere Chemikalien 
werden verwendet, um eine Prognose über den Endpunkt für die Zielchemikalie 
abzugeben.  
Rezeptor-Mikroautoradiographie : Mit dieser Technik kann die xenobiotische 
Interaktion mit spezifischen Gewebestellen oder Zellpopulationen untersucht wer ­
den, wie z. B. in Studien zur Rezeptorbindung oder zur spezifischen Wirkungs ­
weise, die eine hohe Auflösung und hohe Sensitivität erfordern, die bei anderen Verfahren wie der Ganzkörperautoradiographie möglicherweise nicht erreichbar 
sind.
 
Verabreichungsweg  (oral, IV, dermal, Inhalation usw.): bezieht sich darauf, auf 
welche Weise chemische Stoffe dem Körper verabreicht werden (z. B. oral über eine Sonde, oral mit dem Futter, dermal, durch Inhalation, intravenös usw.)
 
Sättigung : Zustand, in dem sich einer oder mehrere kinetische Prozesse (z. B. 
Resorption, Metabolismus oder Clearance) an einem Maximum befinden (d. h. „gesättigt“ sind).
 
Sensitivität : Fähigkeit einer Methode oder eines Messinstruments, zwischen 
Reaktionen zu unterscheiden, die verschiedene Niveaus einer Zielvariablen 
darstellen.  
Konstanter Blutspiegel (Plasmaspiegel) : Nichtgleichgewichtszustand eines of ­
fenen Systems, bei dem alle auf das System einwirkenden Kräfte genau durch entgegenwirkende Kräfte ausgeglichen werden, so dass alle Komponenten des Systems eine konstante Konzentration aufweisen, obwohl Materie durch das 
System fließt.
 
Systemmodellierung  (physiologisch-basiert toxikokinetisch, pharmakokinetisch- 
basiert, physiologisch-basiert pharmakokinetisch, biologisch-basiert usw.): abs ­
traktes Modell, das das Verhalten eines Systems mathematisch beschreibt.  
Zielgewebe : Gewebe, in dem sich eine wichtige schädliche Wirkung eines toxi ­
schen Stoffs manifestiert.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 545
 
Prüfsubstanz : jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode 
getestet wird.  
Gewebeverteilung : reversible Positionsveränderung einer Prüfsubstanz von einer 
Stelle im Körper an eine andere. Die Gewebeverteilung kann mithilfe von Or ­
gansektion, Homogenisation, Verbrennung und Flüssigkeitsszintillationszählung oder durch qualitative und/oder quantitative Ganzkörperautoradiographie unter ­
sucht werden. Die erste Methode ist gut geeignet, um die Konzentration und die 
prozentuale Wiedergewinnung in den Geweben und im Körper derselben Tiere 
zu bestimmen, hat aber möglicherweise eine zu geringe Auflösung für alle Ge ­
webe und eine unter dem Idealwert liegende Gesamtwiedergewinnungsrate (< 90 %). Siehe auch die Definition der Autoradiographie.
 
T max : Zeit bis zum Erreichen von C  max . 
Toxikokinetik  (Pharmakokinetik): Untersuchung von Resorption, Verteilung, 
Metabolismus und Ausscheidung von chemischen Stoffen im Zeitverlauf.  
Validierung von Modellen : 
Verfahren zur Bewertung der Eignung eines Modells, die verfügbaren toxikoki ­
netischen Daten angemessen zu beschreiben. Modelle können durch einen statis ­
tischen und visuellen Vergleich ihrer Prognosen mit experimentellen Werten gegenüber einer gemeinsamen unabhängigen Variablen (z. B. der Zeit) bewertet 
werden. Der Umfang der Bewertung sollte in Bezug auf die vorgesehene Ver ­
wendung des Modells gerechtfertigt sein.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 546
 
B.37.  VERZÖGERTE NEUROTOXIZITÄT PHOSPHORORGANI ­
SCHER SUBSTANZEN NACH AKUTER EXPOSITION  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Bei der Abschätzung und Bewertung der toxischen Wirkungen von 
Substanzen muss auch das Potenzial bestimmter Substanzklassen für spezifische neurotoxische Wirkungen, die in anderen Toxizitätsstu ­
dien möglicherweise nicht nachweisbar sind, untersucht werden. Bei 
einigen phosphororganischen Verbindungen wurden verzögerte neu ­
rotoxische Wirkungen beobachtet, diese Substanzen kommen für eine Untersuchung mit der vorliegenden Methode in Frage.
 
In-vitro-Screening-Tests könnten verwendet werden, um Substanzen 
zu identifizieren, die eine verzögerte Polyneuropathie hervorrufen 
können; allerdings lassen negative Ergebnisse von In-vitro-Studien nicht darauf schließen, dass die Prüfsubstanz kein Neurotoxikum ist.
 
Siehe auch allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Zu den phosphororganischen Substanzen zählen ungeladene phos ­
phororganische Ester, Thioester oder Anhydride von Phosphinsäuren, 
Phosphonsäuren bzw. Phosphoramidsäuren oder die engverwandten Thiophosphinsäuren, Thiophosphonsäuren bzw. Thiophosphoramid ­
säuren oder sonstige Substanzen, welche die bei dieser Substanz ­
klasse bisweilen zu beobachtende verzögerte Neurotoxizität aufwei ­
sen können.
 
Verzögerte Neurotoxizität ist ein Syndrom, das mit langsamem, ver ­
zögertem Auftreten von Ataxien, distalen Axonopathien in Rücken ­
marks- und peripheren Nerven sowie einer Hemmung und Alterung 
der Neuropathy Target Esterase (NTE) im Nervengewebe verbunden 
ist. 
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Eine Referenzsubstanz kann mit einer positiven Kontrollgruppe ge ­
testet werden, um nachzuweisen, dass sich die Reaktion der geprüf ­
ten Spezies unter den Laborversuchsbedingungen nicht wesentlich 
verändert hat.  
Ein Beispiel für ein weit verbreitetes Neurotoxikum ist das Tri-o- 
tolylphosphat (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, CAS-Bezeich ­
nung: Tris(2-methylphenyl)phosphorsäureester), das auch als Tris-o- 
cresylphosphat bezeichnet wird.  
1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Die Prüfsubstanz wird oral als Einmalgabe an Haushühner ver ­
abreicht, die ggf. gegen akute cholinergische Wirkungen geschützt wurden. Die Tiere werden für die Dauer von 21 Tagen auf Ver ­
haltensauffälligkeiten, Ataxien und Paralysen hin beobachtet. Bio ­
chemische Parameter, insbesondere die Neuropathy Target Esterase 
(NTE), werden im allgemeinen 24 und 48 Stunden nach Verabrei ­
chung bei Hennen bestimmt, die nach Zufallskriterien aus jeder Gruppe ausgewählt werden. 21 Tage nach der Exposition werden 
die verbliebenen Hennen getötet, und ausgewählte Nervengewebe 
werden histopathologisch untersucht.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 547
 
1.5. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.5.1.  Vorbereitungen  
Gesunde junge erwachsene Hennen, die frei von störenden Virus ­
erkrankungen und Arzneimitteln sind und keine Gangstörungen auf ­
weisen, werden randomisiert, der Behandlungs- oder der Kontroll ­
gruppe zugeteilt und für die Dauer von mindestens 5 Tagen vor Beginn der Studie an die Laborbedingungen akklimatisiert.
 
Die Käfige oder Gehege sollten so groß sein, dass sich die Tiere frei 
bewegen können und ihr Gangbild gut zu beobachten ist.  
Die Gabe der Prüfsubstanz erfolgt normalerweise auf oralem Wege 
mittels Magensonde, Gelatinekapseln oder einer vergleichbaren Me ­
thode. Flüssigkeiten können unverdünnt oder aufgelöst in einem ge ­
eigneten Vehikel wie z. B. Maisöl verabreicht werden. Feste Sub ­
stanzen sollten nach Möglichkeit aufgelöst werden, da größere Dosen fester Stoffe in Gelatinekapseln möglicherweise nicht wirksam resor ­
biert werden. Bei nichtwässrigen Vehikeln sollten deren toxische 
Eigenschaften bekannt sein. Ist dies nicht der Fall, müssen sie vor 
der Prüfung bestimmt werden.
 
1.5.2.  Prüfbedingungen  
1.5.2.1.  Versuchstiere  
Junge erwachsene Legehennen (Gallus gallus domesticus) im Alter 
von 8 bis 12 Monaten werden für den Test empfohlen. Normalgroße 
Rassen sollten verwendet werden, und die Hennen sollten in der Regel unter Bedingungen aufgewachsen sein, unter denen sie sich frei bewegen konnten.
 
1.5.2.2.  Anzahl und Geschlecht  
Neben der Behandlungsgruppe sollte eine Vehikelkontrollgruppe und 
eine positive Kontrollgruppe getestet werden. Die Vehikelkontroll ­
gruppe ist, abgesehen von der Verabreichung der Prüfsubstanz, ge ­
nauso zu behandeln wie die Behandlungsgruppe.  
Die Anzahl der Tiere in jeder Gruppe sollte so bemessen sein, dass 
mindestens sechs Tiere zur Bestimmung biochemischer Parameter (jeweils drei Tiere zu zwei Beobachtungszeitpunkten) getötet werden können und sechs Tiere für die pathologische Untersuchung bis zum 
21. Tag überleben.
 
Die positive Kontrollgruppe kann gleichzeitig getestet werden oder 
es kann sich um eine bereits zuvor untersuchte Kontrollgruppe han ­
deln. Die Gruppe sollte aus mindestens sechs Hennen bestehen, die mit einem bekannten verzögerten Neurotoxikum behandelt wurden. 
Drei der Tiere sind für biochemische, drei für pathologische Unter ­
suchungen nach Ende des Tests vorgesehen. Es empfiehlt sich eine regelmäßige Aktualisierung der Archivdaten. Neue positive Kontroll ­
daten sollten erarbeitet werden, wenn ein wesentlicher Aspekt des 
Testablaufs (z. B. Rasse, Futter, Haltungsbedingungen) vom durch ­
führenden Labor geändert wurde.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 548
 
1.5.2.3.  Dosierungen  
In einer Vorstudie an einer geeigneten Zahl von Tieren und Dosis ­
gruppen ist die in der Hauptstudie zu verwendende Dosis zu ermit ­
teln. Hierbei sind in der Regel einige Todesfälle erforderlich, um 
eine angemessene Dosis für die Hauptstudie festlegen zu können. 
Um aber Todesfälle durch akute cholinerge Wirkungen zu vermei ­
den, kann Atropin oder ein anderer schützender Wirkstoff, von dem man weiß, dass er keinen Einfluss auf verzögerte neurotoxische 
Wirkungen hat, verabreicht werden. Zur Abschätzung der maximalen 
nicht letalen Dosis der Prüfsubstanz stehen eine Reihe verschiedener Methoden zur Auswahl (siehe Methode B.1 bis). Bereits vorliegende 
frühere Daten für Hennen oder andere toxikologische Daten können 
ebenfalls bei der Wahl der Dosis von Bedeutung sein.
 
Die Dosis der Prüfsubstanz in der Hauptstudie sollte unter Berücksich ­
tigung der Ergebnisse der Vorstudie zur Dosisfindung sowie der oberen Grenzdosis von 2 000 mg/kg Körpergewicht möglichst hoch sein. Auch 
wenn Todesfälle auftreten, sollten bis zum 21. Tag genügend Tiere für 
die biochemischen (sechs) und die histologischen Untersuchungen (sechs) überleben. Um Todesfälle infolge akuter cholinergischer Wir ­
kungen auszuschließen, sollte Atropin oder ein anderer schützender 
Wirkstoff, der nachgewiesenermaßen keinen Einfluss auf verzögerte 
neurotoxische Wirkungen hat, gegeben werden.
 
1.5.2.4.  Limit-Test  
Verursacht die Prüfung einer Dosis von mindestens 2 000 mg/kg 
Körpergewicht pro Tag unter Verwendung der für diese Studie be ­
schriebenen Verfahren keine feststellbaren toxischen Wirkungen und 
ist aufgrund der Daten strukturverwandter Substanzen keine Toxizität zu erwarten, kann auf eine Studie mit einer höheren Dosis gegebe ­
nenfalls verzichtet werden. Der Limit-Test findet allerdings keine 
Anwendung, wenn die Expositionswirkungen beim Menschen die 
Prüfung in einer höheren Dosis angezeigt erscheinen lassen.
 
1.5.2.5.  Beobachtungszeitraum  
Der Beobachtungszeitraum sollte 21 Tage betragen.  
1.5.3.  Versuchsdurchführung  
Nach Verabreichung eines schützenden Wirkstoffs zur Verhinderung 
von Todesfällen durch akute cholinergische Wirkungen wird die 
Prüfsubstanz als Einmalgabe verabreicht.  
1.5.3.1. Allgemeine Beobachtungen  
Die Beobachtungen sollten unmittelbar nach der Exposition begin ­
nen. Alle Hennen sind in den ersten beiden Tagen mehrmals am Tag 
und danach bis zum 21. Tag oder bis zur vorgesehenen Tötung 
mindestens einmal täglich zu beobachten. Alle Toxizitätszeichen, einschließlich Zeitpunkt des Beginns, Art, Schweregrad und Dauer von Verhaltensauffälligkeiten, sind zu dokumentieren. Die Ataxie 
wird auf einer Ordinalskala aus mindestens vier Stufen bewertet, 
und Paralysen werden dokumentiert. Mindestens zweimal wöchent ­
lich sollten die für die pathologische Untersuchung vorgesehenen Hennen aus dem Käfig genommen und für einen bestimmten Zeit ­
raum zu verstärkter motorischer Aktivität, z. B. durch Begehen einer 
Leiter, gezwungen werden, um die Beobachtung bereits geringster toxischer Wirkungen zu erleichtern. Moribunde Tiere und Tiere, bei denen schweres Leiden oder starke Schmerzen festgestellt werden, 
sollten ausgesondert, unter Verwendung einer tierschutzgerechten 
Methode getötet und seziert werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 549
 
1.5.3.2. Körpergewicht  
Alle Hennen müssen unmittelbar vor der Verabreichung der Prüf ­
substanz und danach mindestens einmal wöchentlich gewogen wer ­
den. 
1.5.3.3. Biochemische Untersuchungen  
Je sechs Hennen, die nach Zufallskriterien aus der Behandlungs- und 
der Vehikelkontrollgruppe ausgewählt werden, sowie drei Hennen 
aus der positiven Kontrollgruppe (wenn diese Gruppe gleichzeitig getestet wird), sollten einige Tage nach der Gabe der Prüfsubstanz getötet werden, um Gehirn und lumbales Rückenmark zu präparieren 
und auf hemmende Aktivität gegen Neuropathy Target Esterase zu 
untersuchen. Auch die Präparation und Untersuchung des Ischias ­
nervengewebes auf hemmende Aktivität gegen Neuropathy Target Esterase kann aufschlussreich sein. In der Regel werden drei Tiere 
der Negativkontrolle sowie jeder Behandlungsgruppe nach 24 Stun ­
den und drei nach 48 Stunden getötet, während die drei Hennen der Positivkontrolle nach 24 Stunden getötet werden sollten. Zeigt die Beobachtung der klinischen Zeichen der Intoxikation (z. B. durch 
Beobachtung des zeitlichen Beginns der cholinergen Zeichen), dass 
der toxische Wirkstoff möglicherweise ausgesprochen langsam eli ­
miniert wird, empfiehlt es sich gegebenenfalls, von je drei Tieren zu jeweils zwei Zeitpunkten innerhalb von 24 bis spätestens 72 Stunden 
nach der Verabreichung der Prüfsubstanz Gewebeproben zu entneh ­
men.
 
An diesen Proben können auch Bestimmungen der Acetylcholines ­
terase (AChE) vorgenommen werden, wenn dies angezeigt erscheint. Allerdings kann es in vivo zur spontanen Reaktivierung von AChE kommen, so dass die Wirksamkeit der Prüfsubstanz als AChE-Hem ­
mer unterschätzt wird.
 
1.5.3.4. Autopsie  
Alle Versuchstiere (sowohl die nach Plan getöteten als auch die 
aufgrund ihres moribunden Zustands getöteten) werden einer Autop ­
sie zur Untersuchung von Gehirn und Rückenmark unterzogen.  
1.5.3.5. Histopathologische Untersuchung  
Nervengewebe von Tieren, die die Beobachtungsdauer überleben 
und nicht für biochemische Untersuchungen vorgesehen sind, wird mikroskopisch untersucht. Die Gewebe werden in situ mittels Per ­
fusionsverfahren fixiert. Gewebeschnitte werden unter anderem von 
Cerebellum (mittlere Längsebene), Medulla oblongata, Rückenmark und peripheren Nerven angefertigt. Die Rückenmarkschnitte sind vom oberen Halswirbelsegment, der mittleren thorakalen und der 
lumbosakralen Region zu entnehmen. Auch vom distalen Bereich 
des Nervus tibialis und seiner Verzweigungen zum Musculus gas ­
trocnemius sowie vom Nervus sciaticus sollten Schnitte angefertigt werden. Die Schnitte werden mit geeigneten myelin- und axonspezi ­
fischen Färbemitteln angefärbt.
 
2. DATEN  
Negative Ergebnisse für die in dieser Methode gewählten Endpunkte 
(Biochemie, Histopathologie und Verhaltensbeobachtung) erfordern 
normalerweise keine weiteren Untersuchungen auf eine verzögerte Neurotoxizität. Zweifelhafte oder unklare Ergebnisse für diese End ­
punkte erfordern ggf. weitere Untersuchungen.
 
Die Daten für die einzelnen Tiere sollten aufgeführt werden. Ferner 
sollten alle Daten in tabellarischer Form zusammengefasst werden. 
Daraus müssen für jede Prüfgruppe folgende Angaben hervorgehen: 
die Anzahl der verwendeten Tiere bei Beginn der Prüfung, die An ­
zahl der Tiere mit Läsionen, verhaltensbezogenen oder bioche ­
mischen Wirkungen, die Arten und Schweregrade dieser Läsionen 
bzw. Wirkungen sowie der Anteil der von den verschiedenen Arten 
und Schweregraden der Läsionen bzw. Wirkungen betroffenen Tiere.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 550
 
Die Ergebnisse dieser Studie sind im Hinblick auf Häufigkeit, 
Schweregrad und Korrelation der verhaltensbezogenen, bioche ­
mischen und histopathologischen Wirkungen sowie sonstiger ver ­
zeichneter Wirkungen in den Behandlungs- und Kontrollgruppen zu bewerten.
 
Die numerischen Daten sind nach Möglichkeit durch geeignete und 
allgemein akzeptierte statistische Verfahren auszuwerten. Diese sta ­
tistischen Verfahren sollten bei der Festlegung des Designs der Stu ­
die ausgewählt werden.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht soll nach Möglichkeit folgende Angaben enthalten:  
Versuchstiere:  
— verwendete Rasse;  
— Anzahl und Alter;  
— Herkunft, Haltungsbedingungen usw.;  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Prüfungsbeginn.  
Prüfbedingungen:  
— Angaben zur Zubereitung der Prüfsubstanz, zur Stabilität und 
ggf. zur Homogenität;  
— Begründung für die Wahl des Vehikels;  
— Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz;  
— Angaben über Futter- und Wasserqualität;  
— Begründung für die Wahl der Dosis;  
— Angabe der verabreichten Dosen mit Angaben zu Vehikel, Vo ­
lumen und physikalischer Form des verabreichten Stoffes;  
— Identität und Angaben zur Verabreichung eventueller schützender 
Wirkstoffe.  
3.3. Ergebnisse:  
— Angaben zum Körpergewicht;  
— Daten der toxischen Reaktionen nach Gruppen, einschließlich 
Todesfälle;  
— Art, Schweregrad und Dauer der klinischen Beobachtungen (mit 
Angaben zur Reversibilität);  
— ausführliche Beschreibung der biochemischen Methoden und Be ­
funde;  
— Sektionsbefunde;  
— ausführliche Beschreibung aller histopathologischen Befunde;  
— ggf. statistische Auswertung der Ergebnisse.  
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  
4. LITERATUR  
Diese Methode entspricht der OHCD TG 418.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 551
 
B.38.  VERZÖGERTE NEUROTOXIZITÄT PHOSPHORORGANI ­
SCHER SUBSTANZEN BEI WIEDERHOLTER GABE ÜBER 
28 TAGE  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Bei der Abschätzung und Bewertung der toxischen Wirkungen von 
Substanzen muss auch das Potenzial bestimmter Substanzklassen für spezifische neurotoxische Wirkungen, die in anderen Toxizitätsstu ­
dien möglicherweise nicht nachweisbar sind, untersucht werden. Bei 
einigen phosphororganischen Verbindungen wurden verzögerte neu ­
rotoxische Wirkungen beobachtet; diese Substanzen kommen für 
eine Untersuchung mit der vorliegenden Methode in Frage.
 
In-vitro-Screening-Tests könnten verwendet werden, um Substanzen 
zu identifizieren, die eine verzögerte Polyneuropathie hervorrufen können; allerdings lassen negative Ergebnisse von In-vitro-Studien 
nicht darauf schließen, dass die Prüfsubstanz kein Neurotoxikum ist.
 
Diese Prüfung auf verzögerte Neurotoxizität nach 28-tägiger Gabe 
gibt Aufschluss über mögliche Gesundheitsgefahren infolge wieder ­
holter Exposition über einen begrenzten Zeitraum. Die Prüfung er ­
laubt Rückschlüsse auf die Dosis-Wirkungs-Beziehung und ermög ­
licht die Abschätzung einer Schwellendosis, unterhalb der keine to ­
xische Wirkung mehr feststellbar ist (NOAEL). Mit Hilfe des NOAEL lassen sich Sicherheitskriterien für die Exposition beim 
Menschen festlegen.
 
Siehe auch allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
Zu den phosphororganischen Substanzen zählen ungeladene phos ­
phororganische Ester, Thioester oder Anhydride von Phosphinsäuren, 
Phosphonsäuren bzw. Phosphoramidsäuren oder die eng verwandten Thiophosphinsäuren, Thiophosphonsäuren bzw. Thiophosphoramid ­
säuren oder sonstige Substanzen, welche die bei dieser Substanz ­
klasse bisweilen zu beobachtende verzögerte Neurotoxizität hervor ­
rufen können.
 
Verzögerte Neurotoxizität ist ein Syndrom, das mit langsamem, ver ­
zögertem Auftreten von Ataxien, distalen Axonopathien in Rücken ­
marks- und peripheren Nerven sowie einer Hemmung und Alterung der Neuropathy Target Esterase (NTE) im Nervengewebe verbunden ist.
 
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Die Prüfsubstanz wird 28 Tage lang einmal täglich oral an Haus ­
hühner verabreicht. Die Tiere werden bis 14 Tage nach der letzten Gabe mindestens einmal täglich auf auffälliges Verhalten, Ataxie und Paralysen hin beobachtet. Biochemische Parameter, insbesondere die 
Neuropathy Target Esterase (NTE), werden im allgemeinen 24 und 
48 Stunden nach Verabreichung der letzten Dosis bei Hennen be ­
stimmt, die nach Zufallskriterien aus jeder Gruppe ausgewählt wer ­
den. Zwei Wochen nach der letzten Gabe werden die verbliebenen 
Hennen getötet, und ausgewählte Nervengewebe werden histopatho ­
logisch untersucht.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 552
 
1.4. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.4.1.  Vorbereitungen  
Gesunde junge erwachsene Hennen, die frei von störenden Virus ­
erkrankungen und Arzneimitteln sind und keine Gangstörungen auf ­
weisen, werden randomisiert, der Behandlungs- oder der Kontroll ­
gruppe zugeteilt und für die Dauer von mindestens 5 Tagen vor Beginn der Studie an die Laborbedingungen akklimatisiert.
 
Die Käfige oder Gehege sollten so groß sein, dass sich die Tiere frei 
bewegen können und ihr Gangbild gut zu beobachten ist.  
Die orale Gabe der Prüfsubstanz an 7 Tagen in der Woche sollte 
vorzugsweise mittels Magensonde oder Verabreichung von Gelatine ­
kapseln erfolgen. Flüssigkeiten können unverdünnt oder aufgelöst in 
einem geeigneten Vehikel wie z. B. Maisöl verabreicht werden. Feste Substanzen sollten nach Möglichkeit aufgelöst werden, da größere Dosen fester Stoffe in Gelatinekapseln möglicherweise nicht wirksam 
resorbiert werden. Bei nichtwässrigen Vehikeln sollten deren toxi ­
sche Eigenschaften bekannt sein. Ist dies nicht der Fall, müssen sie vor der Prüfung bestimmt werden.
 
1.4.2.  Prüfbedingungen  
1.4.2.1.  Versuchstiere  
Junge erwachsene Legehennen (Gallus gallus domesticus) im Alter 
von 8 bis 12 Monaten werden für den Test empfohlen. Normalgroße Rassen sollten verwendet werden, und die Hennen sollten normaler ­
weise unter Bedingungen aufgewachsen sein, unter denen sie sich 
frei bewegen konnten.
 
1.4.2.2.  Anzahl und Geschlecht  
In der Regel sollten mindestens drei Behandlungsgruppen sowie eine 
Vehikelkontrollgruppe getestet werden. Die Vehikelkontrollgruppe 
ist, abgesehen von der Verabreichung der Prüfsubstanz, genauso zu behandeln wie die Behandlungsgruppen.
 
Die Anzahl der Tiere in jeder Gruppe sollte so bemessen sein, dass 
mindestens sechs zur Bestimmung biochemischer Parameter (jeweils drei Tiere zu zwei Beobachtungszeitpunkten) getötet werden können und mindestens sechs Tiere für die pathologische Untersuchung bis 
14 Tage nach der letzten Gabe überleben.
 
1.4.2.3.  Dosierungen  
Bei der Wahl der Dosisstufen sind die Ergebnisse einer Akutprüfung 
auf verzögerte Neurotoxizität sowie weitere vorliegende Daten zur Toxizität oder Kinetik der Prüfsubstanz berücksichtigt worden. Die 
höchste Dosis sollte so gewählt werden, dass zwar toxische Wirkun ­
gen, vorzugsweise eine verzögerte Neurotoxizität, aber keine Todes ­
fälle oder schweres Leiden hervorgerufen werden. Anschließend sollte eine absteigende Folge von Dosisstufen gewählt werden, um 
dosisabhängige Wirkungen und die niedrigste Dosis ohne zu be ­
obachtende unerwünschte Wirkungen nachzuweisen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 553
 
1.4.2.4.  Limit-Test  
Verursacht die Prüfung einer Dosis von mindestens 1 000 mg/kg 
Körpergewicht pro Tag unter Verwendung der für diese Studie be ­
schriebenen Verfahren keine feststellbaren toxischen Wirkungen und 
ist aufgrund der Daten strukturverwandter Substanzen keine Toxizität 
zu erwarten, kann auf eine Studie mit einer höheren Dosis gegebe ­
nenfalls verzichtet werden. Der Limit-Test findet allerdings keine Anwendung, wenn die Expositionswirkungen beim Menschen die 
Prüfung in einer höheren Dosis angezeigt erscheinen lassen.
 
1.4.2.5.  Beobachtungszeitraum  
Alle Tiere werden während der Expositionsdauer und bis 14 Tage 
danach mindestens täglich beobachtet, sofern sie nicht für die Sek ­
tion vorgesehen sind.  
1.4.3.  Versuchsdurchführung  
Die Tiere erhalten die Prüfsubstanz für die Dauer von 28 Tagen an 7 
Tagen in der Woche.  
1.4.3.1.  Allgemeine Beobachtungen  
Die Beobachtungen sollten unmittelbar nach Behandlungsbeginn be ­
ginnen. Alle Hennen sind an jedem der 28 Behandlungstage und an 
den 14 Tagen nach der letzten Gabe oder bis zur vorgesehenen 
Tötung mindestens einmal täglich zu beobachten. Alle Toxizitätszei ­
chen, einschließlich Zeitpunkt ihres Beginns sowie Art, Schweregrad und Dauer, sind zu dokumentieren. Die Beobachtungen sollten auch, 
jedoch nicht nur, Verhaltensauffälligkeiten einschließen. Die Ataxie 
wird auf einer Ordinalskala aus mindestens vier Stufen bewertet, und Paralysen werden ebenfalls dokumentiert. Mindestens zweimal wö ­
chentlich sollten die Hennen aus dem Käfig genommen und für 
einen bestimmten Zeitraum zu verstärkter motorischer Aktivität, 
z. B. durch Begehen einer Leiter, gezwungen werden, um die Be ­
obachtung bereits geringster toxischer Wirkungen zu erleichtern. Mo ­
ribunde Tiere und Tiere, bei denen schweres Leiden oder starke 
Schmerzen festgestellt werden, sollten ausgesondert, unter Verwen ­
dung einer tierschutzgerechten Methode getötet und seziert werden.
 
1.4.3.2.  Körpergewicht  
Alle Hennen müssen unmittelbar vor der ersten Gabe der Prüfsub ­
stanz und danach mindestens einmal wöchentlich gewogen werden.  
1.4.3.3.  Biochemische Untersuchungen  
Je sechs Hennen, die nach Zufallskriterien aus der Behandlungs- und 
der Vehikelkontrollgruppe ausgewählt werden, sollten einige Tage nach der letzten Gabe der Prüfsubstanz getötet werden, um Gehirn 
und lumbales Rückenmark zu präparieren und auf hemmende Akti ­
vität gegen Neuropathy Target Esterase (NTE) zu untersuchen. Auch die Präparation und Untersuchung des Ischiasnervengewebes auf hemmende Aktivität gegen Neuropathy Target Esterase kann auf ­
schlussreich sein. In der Regel werden drei Tiere der Kontrollgruppe 
sowie jeder Behandlungsgruppe nach 24 Stunden und drei 48 Stun ­
den nach der letzten Dosis getötet. Sind aufgrund der Daten aus der Akutstudie oder aus anderen Untersuchungen (z. B. zur Toxikokine ­
tik) andere Tötungszeiten nach der letzten Gabe der Prüfsubstanz 
angezeigt, sollte entsprechend vorgegangen und das geänderte Vor ­
gehen begründet werden.
 
An diesen Proben können auch Bestimmungen der Acetylcholines ­
terase (AChE) vorgenommen werden, wenn dies angezeigt erscheint. Allerdings kann es in vivo zur spontanen Reaktivierung von AChE 
kommen, so dass die Wirksamkeit der Prüfsubstanz als AChE-Hem ­
mer unterschätzt wird.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 554
 
1.4.3.4.  Autopsie  
Alle Versuchstiere (sowohl die nach Plan getöteten als auch die 
aufgrund ihres moribunden Zustands getöteten) werden einer Autop ­
sie zur Untersuchung von Gehirn und Rückenmark unterzogen.  
1.4.3.5.  Histopathologische Untersuchung  
Nervengewebe von Tieren, die die Beobachtungsdauer überleben 
und nicht für biochemische Untersuchungen vorgesehen sind, wird 
mikroskopisch untersucht. Die Gewebe werden in situ mittels Per ­
fusionsverfahren fixiert. Gewebeschnitte werden unter anderem von Cerebellum (mittlere Längsebene), Medulla oblongata, Rückenmark und peripheren Nerven angefertigt. Die Rückenmarkschnitte sind 
vom oberen Halswirbelsegment, der mittleren thorakalen und der 
lumbosakralen Region zu entnehmen. Auch vom distalen Bereich des Nervus tibialis und seiner Verzweigungen zum Musculus gas ­
trocnemius sowie vom Nervus sciaticus sollten Schnitte angefertigt 
werden. Die Schnitte werden mit geeigneten myelin- und axonspezi ­
fischen Färbemitteln angefärbt. Die mikroskopischen Untersuchun ­
gen sind zunächst an den konservierten Geweben aller Tiere in der Kontrollgruppe sowie der höchsten Dosisgruppe vorzunehmen. Er ­
geben sich Anhaltspunkte für Wirkungen in der höchsten Dosisgrup ­
pe, sollte die mikroskopische Untersuchung auch bei den Hennen aus der mittleren und niedrigen Dosisgruppe erfolgen.
 
2. DATEN  
Negative Ergebnisse für die in dieser Methode gewählten Endpunkte 
(Biochemie, Histopathologie und Verhaltensbeobachtung) erfordern normalerweise keine weiteren Untersuchungen auf eine verzögerte 
Neurotoxizität. Zweifelhafte oder unklare Ergebnisse für diese End ­
punkte erfordern ggf. weitere Untersuchungen.
 
Die Daten für die einzelnen Tiere sollten aufgeführt werden. Ferner 
sollten alle Daten in tabellarischer Form zusammengefasst werden. 
Daraus müssen für jede Prüfgruppe folgende Angaben hervorgehen: die Anzahl der verwendeten Tiere bei Beginn der Prüfung, die An ­
zahl der Tiere mit Läsionen, verhaltensbezogenen oder bioche ­
mischen Wirkungen, die Arten und Schweregrade dieser Läsionen 
bzw. Wirkungen sowie der Anteil der von den verschiedenen Arten und Schweregraden der Läsionen bzw. Wirkungen betroffenen Tiere.
 
Die Ergebnisse dieser Studie sind im Hinblick auf Häufigkeit, Schwe ­
regrad und Korrelation der verhaltensbezogenen, biochemischen und histopathologischen Wirkungen sowie sonstiger verzeichneter Wirkun ­
gen in den Behandlungs- und Kontrollgruppen zu bewerten.
 
Die numerischen Daten sind nach Möglichkeit durch geeignete und 
allgemein akzeptierte statistische Verfahren auszuwerten. Diese sta ­
tistischen Verfahren sollten bei der Festlegung des Designs der Stu ­
die ausgewählt werden.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht soll nach Möglichkeit folgende Angaben enthalten:  
Versuchstiere:  
— verwendete Rasse;  
— Anzahl und Alter der Tiere;  
— Herkunft, Haltungsbedingungen usw.;  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Prüfungsbeginn.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 555
 
Prüfbedingungen:  
— Angaben zur Zubereitung der Prüfsubstanz, zur Stabilität und zur 
Homogenität;  
— Begründung für die Wahl des Vehikels;  
— Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz;  
— Angaben über Futter- und Wasserqualität;  
— Begründung für die Wahl der Dosis;  
— Angabe der verabreichten Dosen mit Angaben zu Vehikel, Vo ­
lumen und physikalischer Form des verabreichten Stoffes;  
— Begründung für die Wahl anderer Zeitpunkte zur Bestimmung 
der biochemischen Parameter (falls nicht nach 24 und 48 Stun ­
den).  
Ergebnisse:  
— Angaben zum Körpergewicht;  
— Daten der toxischen Reaktionen nach Dosisstufen, einschließlich 
Todesfälle;  
— NOAEL;  
— Art, Schweregrad und Dauer der klinischen Beobachtungen (mit 
Angaben zur Reversibilität);  
— ausführliche Beschreibung der biochemischen Methoden und Be ­
funde;  
— Sektionsbefunde;  
— ausführliche Beschreibung aller histopathologischen Befunde;  
— ggf. statistische Auswertung der Ergebnisse.  
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  
4. LITERATUR  
Diese Methode entspricht der OECD TG 419.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 556
 
B.39.  IN-VIVO-TEST ZUR UNPLANMÄSSIGEN DNA-SYNTHESE 
(UDS) IN SÄUGETIERLEBERZELLEN  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht der OECD TG 486, Unscheduled DNA 
Synthesis (UDS) Test with Mammalian Liver Cells In Vivo (1997).  
1.1. EINLEITUNG  
Der In-vivo-Test zur unplanmäßigen DNA-Synthese in Säugetierle ­
berzellen dient zum Nachweis von Agenzien, die in den Leberzellen der behandelten Tiere eine DNA-Reparatur auslösen (1) (2) (3) (4).
 
Dieser In-vivo-Test ermöglicht die Untersuchung der gentoxischen 
Wirkung von Chemikalien in der Leber. Der ermittelte Endpunkt deutet auf eine DNA-Schädigung und anschließende Reparatur in Leberzellen hin. Die Leber ist in der Regel Hauptort des Stoffwech ­
sels der resorbierten Verbindungen. Sie eignet sich also gut zur In- 
vivo-Bestimmung einer DNA-Schädigung.
 
Wenn Anzeichen dafür bestehen, dass die Prüfsubstanz das Zielge ­
webe nicht erreicht, ist dieser Test nicht geeignet.  
Der Endpunkt der unplanmäßigen DNA-Synthese (UDS) wird durch 
die Bestimmung der Aufnahme markierter Nukleoside in Zellen, die keine planmäßige (S-Phasen-)DNA-Synthese durchlaufen, ermittelt. Das gängigste Verfahren ist die Bestimmung der Aufnahme von 
tritiummarkiertem Thymidin
 3 H-TdR) durch Autoradiografie. Für In- 
vivo-UDS-Tests wird vorzugsweise die Leber von Ratten verwendet. Neben Lebergewebe kann auch anderes Gewebe Verwendung finden, doch ist dieses nicht Gegenstand dieser Methode.
 
Der Nachweis einer UDS-Reaktion hängt von der Zahl der aus ­
geschnittenen und ersetzten DNA-Basen am Ort der Schädigung ab. Der UDS-Test eignet sich daher insbesondere zum Nachweis der von einer Substanz induzierten „Long-patch“-Reparatur (20-30 
Basen). Die „Short-patch“-Reparatur (1-3 Basen) lässt sich hingegen 
nur mit einem wesentlich geringeren Empfindlichkeitsgrad feststel ­
len. Zudem können mutagene Ereignisse aus der Nichtreparatur, fehlerhaften Reparatur oder fehlerhaften Replikation der DNA-Läsio ­
nen herrühren. Das Ausmaß der UDS-Reaktion gibt keinen Auf ­
schluss über die Genauigkeit des Reparaturprozesses. Darüber hinaus ist es möglich, dass ein Mutagen mit der DNA reagiert, die DNA- Schädigung aber nicht über einen Exzisionsreparaturprozess behoben 
wird. Die Tatsache, dass der UDS-Test keine spezifischen Informa ­
tionen zur mutagenen Aktivität liefert, wird durch die potenzielle Empfindlichkeit dieses Endpunkts kompensiert, denn er wird im ge ­
samten Genom ermittelt.
 
Siehe auch allgemeine Einleitung zu Teil B.  
1.2. DEFINITIONEN  
In Reparatur befindliche Zellen:  Nettokörnerzahl über dem Zell ­
kern (NNG) oberhalb eines vorher festgelegten Schwellenwerts, der von dem jeweiligen Labor zu begründen ist.
 
Nettokörnerzahl über dem Zellkern (NNG):  quantitative Maßzahl 
der UDS-Aktivität von Zellen bei autoradiografischen UDS-Tests, 
errechnet durch Subtraktion der durchschnittlichen Körnerzahl über kernäquivalenten Bereichen des Zytoplasmas (CG) von der Körner ­
zahl über dem Zellkern (NG): NNG = NG — CG. Die NNG wird 
für einzelne Zellen bestimmt, dann für alle Zellen in einer Kultur, in 
Parallelkulturen usw.
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Unplanmäßige DNA-Synthese (UDS):  DNA-Reparatursynthese 
nach Ausschneiden und Entfernen des Abschnitts eines DNA- 
Strangs, der eine Region mit einer durch chemische Substanzen oder physikalische Agenzien induzierten Schädigung enthält.
 
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Der In-vivo-UDS-Test an Säugetierleberzellen erbringt den Nachweis 
einer DNA-Reparatursynthese nach Ausschneiden und Entfernen ei ­
nes DNA-Abschnitts, der eine Region mit einer durch chemische 
Substanzen oder physikalische Agenzien induzierten Schädigung ent ­
hält. Der Test beruht gewöhnlich auf dem Einbau von  3 H-TdR in die 
DNA von Leberzellen, wo sich nur wenige Zellen in der S-Phase des 
Zellzyklus befinden. Die Aufnahme von  3 H-TdR wird in der Regel 
durch Autoradiografie bestimmt, da dieses Verfahren nicht so anfäl ­
lig für eine Einwirkung durch S-Phasen-Zellen ist wie beispielsweise die Flüssigkeitsszintillationszählung (LSC).
 
1.4. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.4.1.  Vorbereitungen  
1.4.1.1.  Versuchstiere  
Gewöhnlich werden Ratten verwendet, doch kommen auch andere 
geeignete Säugetierarten in Frage. Es sollten junge gesunde und 
geschlechtsreife Tiere üblicher Labortierstämme zum Einsatz kom ­
men. Zu Beginn des Versuchs sollte die Abweichung des Körper ­
gewichts der Tiere vom Mittelwert so gering wie möglich sein und bei beiden Geschlechtern nicht mehr als ± 20 % betragen.
 
1.4.1.2.  Haltungs- und Fütterungsbedingungen  
Es gelten die allgemeinen Bedingungen in der allgemeinen Einlei ­
tung zu Teil B, doch ist bei der Luftfeuchtigkeit ein Wert von 50- 60 % anzustreben.
 
1.4.1.3.  Vorbereitung der Tiere  
Gesunde und geschlechtsreife junge Tiere werden randomisiert und 
den einzelnen Kontroll- bzw. Behandlungsgruppen zugeteilt. Die 
Käfige sind so anzuordnen, dass sich ihre Position möglichst wenig auswirkt. Es erfolgt eine Einzelidentifizierung der Tiere. Vor Beginn der Studie werden die Tiere in ihren Käfigen über einen Zeitraum 
von mindestens 5 Tagen unter Laborbedingungen eingewöhnt.
 
1.4.1.4.  Prüfsubstanz/Vorbereitung  
Feste Prüfsubstanzen sollten vor der Verabreichung an die Tiere in 
geeigneten Lösungsmitteln oder Vehikeln gelöst oder suspendiert und ggf. verdünnt werden. Flüssige Prüfsubstanzen können direkt 
verabreicht oder zuvor verdünnt werden. Es sind frische Zubereitun ­
gen der Prüfsubstanz zu verwenden, wenn die Stabilitätsdaten gegen eine Lagerung sprechen.
 
1.4.2.  Prüfbedingungen  
1.4.2.1.  Lösungsmittel/Vehikel  
Das Lösungsmittel/Vehikel sollte bei den gewählten Dosierungen 
keine toxischen Wirkungen hervorrufen und nicht im Verdacht ste ­
hen, mit der Prüfsubstanz eine chemische Reaktion einzugehen. Wer ­
den keine allgemein bekannten Lösungsmittel/Vehikel verwendet, so sind Referenzdaten zur Kompatibilität beizubringen. Es ist zu emp ­
fehlen, als erste Wahl möglichst die Verwendung eines wässrigen 
Lösungsmittels/Vehikels in Erwägung zu ziehen.
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1.4.2.2.  Kontrollen  
Für jeden gesondert vorgenommenen Teil des Versuchs sind gleich ­
zeitig Positiv- und Negativ-(Lösungsmittel-/Vehikel-)Kontrollen an ­
zulegen. Bis auf die Verabreichung der Prüfsubstanz sind die Tiere 
der Kontrollgruppe ebenso zu behandeln wie die Tiere der Behand ­
lungsgruppen.  
Die als Positivkontrollen verwendeten Substanzen sollten erwiesener ­
maßen eine UDS bei Expositionskonzentrationen hervorrufen, die 
voraussichtlich eine erkennbare Zunahme gegenüber dem Hinter ­
grund ergeben. Positivkontrollen, die eine Stoffwechselaktivierung benötigen, sollten in Dosen verwendet werden, die eine mäßige Re ­
aktion hervorrufen (4). Die Dosen sollten so gewählt werden, dass 
die Wirkungen eindeutig sind, aber beim Auswerten nicht sofort die 
Identität der kodierten Objektträger erkennen lassen. Es kommen beispielsweise folgende Positivkontrollsubstanzen in Frage:
 
Zeitpunkt der Probenahme Substanz CAS-Nr. EINECS-Nr.  
Früh (2-4 Std.) N-Nitrosodimethylamin 62-75-9 200-249-8 
Spät (12-16 Std.) N-2-Fluorenylacetamid (2-AAF) 53-96-3 200-188-6  
Auch andere geeignete Positivkontrollsubstanzen kommen in Be ­
tracht. Es ist vertretbar, dass die Positivkontrolle auf anderem Weg als die Prüfsubstanz verabreicht wird.
 
1.5. VERFAHREN  
1.5.1.  Anzahl und Geschlecht der Tiere  
Es ist eine ausreichende Anzahl von Tieren zu verwenden, um die 
natürliche biologische Schwankungsbreite der Testreaktion zu be ­
rücksichtigen. Jede Gruppe sollte mindestens 3 analysierbare Tiere 
umfassen. Liegt ein größerer Bestand an historischen Daten vor, so 
sind für die gleichzeitigen Negativ- und Positivkontrollgruppen nur 1 oder 2 Tiere erforderlich.
 
Wenn zum Zeitpunkt der Studie Daten aus Untersuchungen zur 
gleichen Spezies und Expositionsform vorliegen, die belegen, dass 
zwischen den Geschlechtern kein nennenswerter Unterschied der Toxizität feststellbar ist, reicht die Prüfung von Tieren nur eines — vorzugsweise des männlichen — Geschlechts aus. Sollte es sich 
beim Menschen um eine geschlechtsspezifische Exposition handeln, 
z. B. bei bestimmten pharmazeutischen Wirkstoffen, ist der Versuch an Tieren des betreffenden Geschlechts durchzuführen.
 
1.5.2.  Behandlungsplan  
Die Prüfsubstanzen werden in der Regel als Einmalgabe verabreicht.  
1.5.3.  Dosierungen  
Im Normalfall sind mindestens zwei Dosisstufen zu verwenden. Un ­
ter der Höchstdosis ist jene Dosis zu verstehen, die so deutliche Toxizitätszeichen hervorruft, dass höhere Dosisstufen bei gleichem Verabreichungsschema voraussichtlich zum Tode führen. Die gerin ­
gere Dosis sollte in der Regel 50 % bis 25 % der hohen Dosis 
entsprechen.
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Substanzen mit spezifischen biologischen Aktivitäten bei geringen 
nichttoxischen Dosen (wie Hormone und Mitogene) entsprechen 
möglicherweise nicht den Dosierungskriterien und sollten anhand einer Einzelfallprüfung bewertet werden. Wird eine Studie zur Do ­
sisfindung durchgeführt, weil keine geeigneten Daten verfügbar sind, 
so sollte sie im gleichen Labor unter Verwendung der gleichen Spe ­
zies, des gleichen Stammes und Geschlechts und der gleichen Be ­
handlungsform wie im Hauptversuch erfolgen.
 
Die Höchstdosis kann auch als jene Dosis definiert werden, die 
bestimmte Anzeichen von Toxizität in der Leber hervorruft (z. B. pyknotische Kerne).
 
1.5.4.  Limit-Test  
Verursacht die Prüfung einer Dosis von mindestens 2 000 mg/kg 
Körpergewicht bei Einmalgabe oder Gabe von zwei Teilmengen am gleichen Tag keine feststellbaren toxischen Wirkungen und ist 
aufgrund der Daten strukturverwandter Substanzen keine Gentoxizi ­
tät zu erwarten, kann auf eine vollständige Studie verzichtet werden. Die voraussichtlichen Expositionswirkungen beim Menschen können aber beim Limit-Test eine höhere Dosis angezeigt erscheinen lassen.
 
1.5.5.  Verabreichung  
Die Prüfsubstanz wird in der Regel mittels Magen- oder Schlund ­
sonde verabreicht. Auch andere Expositionsformen können bei ent ­
sprechender Begründung vertretbar sein. Eine intraperitoneale Injek ­
tion ist allerdings nicht zu empfehlen, da die Leber damit möglicher ­
weise der Prüfsubstanz direkt und nicht über das Kreislaufsystem ausgesetzt wird. Das maximale Flüssigkeitsvolumen, das jeweils durch Sonde oder Injektion verabreicht werden kann, hängt von 
der Größe des Versuchstiers ab. Das Volumen sollte 2 ml/100 g 
Körpergewicht nicht übersteigen. Die Verwendung eines höheren Volumens ist zu begründen. Abgesehen von Reizstoffen oder ätzen ­
den Stoffen, die in der Regel bei höheren Konzentrationen eine ver ­
stärkte Wirkung hervorrufen, ist die Variabilität des Prüfvolumens 
dadurch auf ein Mindestmaß zu reduzieren, dass eine Konzentration gewählt wird. die auf allen Dosisstufen ein konstantes Volumen gewährleistet.
 
1.5.6.  Präparation der Leberzellen  
Die Präparation der Leberzellen behandelter Tiere erfolgt in der 
Regel 12-16 Stunden nach der Verabreichung. Im Allgemeinen ist zusätzlich eine frühere Aufarbeitung (gewöhnlich 2-4 Stunden nach 
der Behandlung) erforderlich, wenn nicht nach 12-16 Stunden eine 
eindeutige positive Reaktion vorliegt. Auf der Grundlage der toxiko ­
kinetischen Daten sind aber bei entsprechender Begründung auch Aufarbeitungen zu anderen Zeitpunkten möglich.
 
Kurzzeitkulturen von Säugetier-Leberzellen werden in der Regel da ­
durch angelegt, dass eine Perfusion der Leber in situ mit Collagenase 
erfolgt und es frisch gewonnenen Leberzellen ermöglicht wird, sich 
an eine geeignete Wachstumsfläche festzuheften. Die Leberzellen von Tieren der Negativkontrollgruppe sollten eine Lebensfähigkeit (5) von mindestens 50 % aufweisen.
 
1.5.7.  Bestimmung der UDS  
Frisch isolierte Säugetier-Leberzellen werden über einen angemesse ­
nen Zeitraum, z. B. 3-8 Stunden, in einem  3 H-TdR enthaltenden Me ­
dium inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit sollte das Medium 
aus den Zellen entfernt werden, die dann mit einem überschüssiges 
unmarkiertes Thymidin enthaltenden Medium inkubiert werden kön ­
nen, um die nicht inkorporierte Radioaktivität zu verringern („cold chase“). Anschließend werden die Zellen gewaschen, fixiert und 
getrocknet. Bei längeren Inkubationszeiten ist eine „cold chase“ 
möglicherweise nicht erforderlich. Die Objektträger werden in Auto ­
radiografieemulsion getaucht, im Dunkeln „belichtet“ (z. B. gekühlt für 7-14 Tage), entwickelt und gefärbt, und es werden die belichteten 
Silberkörner gezählt. Von jedem Tier werden zwei bis drei Objekt ­
träger hergestellt.
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1.5.8.  Analyse  
Die Objektträgerpräparate sollten eine ausreichende Anzahl von mor ­
phologisch normalen Zellen enthalten, um eine aussagefähige Be ­
wertung der UDS zu ermöglichen. Die Präparate werden mikrosko ­
pisch auf Zeichen offener Zytotoxizität (z. B. Pyknose, verringerte 
Werte der radioaktiven Markierung) untersucht.  
Vor der Bestimmung der Körnerzahl sind die Objektträger zu kodie ­
ren. In der Regel werden je Tier 100 Zellen von mindestens zwei 
Objektträgern ausgewertet. Die Auswertung von weniger als 100 
Zellen/Tier ist zu begründen. Bei der Körnerzahlbestimmung erfolgt keine Zählung der S-Phasen-Kerne, doch kann der Anteil der S- Phasen-Zellen erfasst werden.
 
Das Ausmaß des  3 H-TdR-Einbaus im Zellkern und Zytoplasma mor ­
phologisch normaler Zellen, das an der Ablagerung von Silberkör ­
nern ablesbar ist, sollte durch geeignete Verfahren ermittelt werden.  
Die Körnerzahl wird über dem Zellkern (NG) und über kernäquiva ­
lenten Bereichen des Zytoplasmas (CG) ermittelt. Als CG-Wert 
kommt entweder die für den am stärksten markierten Bereich des Zytoplasmas ermittelte Körnerzahl oder der Durchschnittswert von zwei bis drei nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Bereichen in 
Nähe des Zellkerns in Frage. Auch andere Zählverfahren (z. B. 
Ganzzellenzählung) können bei entsprechender Begründung ange ­
wendet werden (6).
 
2. DATEN  
2.1. AUFBEREITUNG DER ERGEBNISSE  
Es sind die Daten für die einzelnen Objektträger und Tiere zu do ­
kumentieren. Zusätzlich sollten alle Daten in tabellarischer Form 
zusammengefasst werden. Die Nettokörnerzahl über dem Zellkern (NNG) ist für jede Zelle, für jedes Tier und für jede Dosis und jeden Zeitpunkt zu bestimmen, indem der CG-Wert vom NG-Wert sub ­
trahiert wird. Werden die „in Reparatur befindlichen Zellen“ gezählt, 
so sollten die Kriterien für die Definition der „in Reparatur befind ­
lichen Zellen“ begründet werden und auf historischen oder gleich ­
zeitigen Negativkontrolldaten beruhen. Numerische Ergebnisse kön ­
nen mit Hilfe statistischer Verfahren bewertet werden. Kommen sta ­
tistische Tests zur Anwendung, so sind sie vor Durchführung der Studie auszuwählen und zu begründen.
 
2.2. BEWERTUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Als Beispiele für Kriterien zur Bestimmung positiver/negativer Re ­
aktionen seien genannt: 
positiv i) NNG Werte oberhalb eines vorher festgeleg ­
ten Schwellenwerts, der auf der Grundlage 
von historischen Daten des Labors zu begrün ­
den ist; oder 
ii) NNG Werte, die deutlich über den Werten der 
gleichzeitigen Kontrolle liegen; 
negativ i) NNG Werte, die unterhalb des historisch be ­
gründeten Schwellenwerts liegen; oder 
ii) NNG Werte, die nicht wesentlich über den 
Werten der gleichzeitigen Kontrolle liegen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 561
 
Es ist die biologische Relevanz der Daten zu untersuchen, d. h., es 
sind Parameter wie Variabilität der Tiere, Dosis-Wirkungs-Verhältnis 
und Zytotoxizität zu berücksichtigen. Als Hilfsmittel bei der Bewer ­
tung der Versuchsergebnisse können statistische Methoden dienen. Die statistische Signifikanz sollte aber nicht der einzige bestimmende 
Faktor für eine positive Reaktion sein.
 
Auch wenn die meisten Versuche eindeutig positive oder negative 
Ergebnisse liefern, erlaubt der Datensatz in seltenen Fällen keine definitive Aussage über die Aktivität der Prüfsubstanz. Es kommt 
vor, dass sich die Ergebnisse unabhängig davon, wie oft der Versuch 
wiederholt wird, weiterhin als nicht eindeutig oder als fragwürdig erweisen.
 
Ein positiver Befund des In-vivo-UDS-Tests an Säugetierleberzellen 
deutet darauf hin, dass die Prüfsubstanz in vivo bei Säugetierleber ­
zellen eine DNA-Schädigung hervorruft, die in vitro durch unplan ­
mäßige DNA-Synthese repariert werden kann. Ein negativer Befund ist ein Anzeichen dafür, dass die Prüfsubstanz unter diesen Versuchs ­
bedingungen keine mit diesem Test nachweisbare DNA-Schädigung 
induziert.
 
Zu erörtern ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Prüfsubstanz in den 
allgemeinen Blutkreislauf bzw. in das spezifische Zielgewebe gelangt 
(z. B. systemische Toxizität).  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:  
Lösungsmittel/Vehikel:  
— Begründung für die Wahl des Vehikels;  
— Löslichkeit und Stabilität der Prüfsubstanz im Lösungsmittel/ ­
Vehikel, falls bekannt.  
Versuchstiere:  
— Spezies/Stamm;  
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere;  
— Herkunft, Haltungsbedingungen, Futter usw.;  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Prüfungsbeginn, einschließlich 
Bereich des Körpergewichts, Mittelwert und Standardabweichung für jede Gruppe.
 
Prüfbedingungen:  
— Positiv- und Negativ-(Vehikel-/Lösungsmittel-)Kontrollen;  
— Daten aus einer ggf. durchgeführten Dosisfindungsstudie;  
— Begründung der gewählten Dosisstufen;  
— Angaben zur Zubereitung der Prüfsubstanz;  
— Angaben zur Verabreichung der Prüfsubstanz;  
— Begründung für den Verabreichungsweg;  
— ggf. Methoden zur Überprüfung, ob die Prüfsubstanz in den all ­
gemeinen Kreislauf oder in das Zielgewebe gelangt;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 562
 
— ggf. Angaben zur Umrechnung der Konzentration der Prüfsub ­
stanz im Futter/Wasser (ppm) in die entsprechende Dosis (mg/kg 
Körpergewicht/Tag);  
— Angaben über Futter- und Wasserqualität;  
— nähere Angaben zum Behandlungs- und Stichprobenentnahme ­
plan;  
— Methoden zur Bestimmung der Toxizität;  
— Methoden zur Leberzellenpräparation und -kultur;  
— verwendetes autoradiografisches Verfahren;  
— Anzahl der präparierten Objektträger und der ausgewerteten Zei ­
len; 
— Bewertungskriterien;  
— Kriterien zur Einstufung der Studien als positiv, negativ oder 
nicht eindeutig.  
Ergebnisse:  
— Mittelwerte der Körnerzahlen über dem Zellkern und über dem 
Zytoplasma sowie der Nettokörnerzahlen über dem Zellkern für 
jeden einzelnen Objektträger, jedes Tier und jede Gruppe;  
— nach Möglichkeit Dosis-Wirkungs-Verhältnis;  
— ggf. statistische Auswertung;  
— Toxizitätszeichen;  
— Daten zur gleichzeitigen Negativ-(Lösungsmittel-/Vehikel-)Kon ­
trollen und Positivkontrollen;  
— Daten zu historischen Negativ-(Lösungsmittel-/Vehikel-)Kontrol ­
len und Positivkontrollen mit Bereichen, Mittelwerten und Stan ­
dardabweichungen;  
— Anzahl der „in Reparatur befindlichen Zellen“, falls ermittelt;  
— Anzahl der S-Phasen-Zellen, falls ermittelt;  
— Lebensfähigkeit der Zellen.  
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  
4. LITERATURHINWEISE  
(1) Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. 
(1985), An Assessment of the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA 
Repair Assay,  Mutation Res., 156,  1-18.  
(2) Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., 
Mirsalis, J., Probst G. and Williams, G. (1987), A Protocol 
and Guide for the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay,  
Mutation Res., 189,  123-133.  
(3) Kennelly. J. C, Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson 
B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell I. de G. (1993), In 
Vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and Fox M., 
(eds.), Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM  Recommen ­
ded Procedures. UKEMS  Subcommittee  on Guidelines for Mu ­
tagenicity Testing Report. Part II revised,  Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
52-77.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 563
 
(4) Madle, S., Dean, S. W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, 
B., Doolittle, D. J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C. A. 
and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests  In Vitro  and In Vivo. Mutations Res.,  312, 263-285.
 
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, 
C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initital Via ­
bility and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes 
Used for the  In Vivo/ln Vitro  DNA Repair Assay (UDS),  Mu­
tation Res.,  291, 21-27.  
(6) Mirsalis, J. C, Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), 
Detection of Genotoxic Carcinogens in the  In Vivo/In Vitro  
Hepatocyte DNA Repair Assay,  Environ Mutagen,  4, 553-562.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 564
 
B.40.  IN-VITRO-PRÜFUNG AUF HAUTÄTZENDE WIRKUNG: TER- 
TEST (TRANSCUTANEOUS ELECTRICAL RESISTANCE 
TEST)  
1. METHODE  
Diese Testmethode entspricht OECD TG 430 (2004).  
1.1. EINLEITUNG  
Unter hautätzender Wirkung versteht man die irreversible Schädi ­
gung eines getesteten Gewebes nach Anwendung eines Testmaterials (gemäß Definition im Weltweit harmonisierten System zur Einstu ­
fung und Kennzeichnung von chemischen Substanzen und Ge ­
mischen (GHS — Globally Harmonised System for the Classification and Labelling of Chemical Substances and Mixtures)) (1). Die vor ­
liegende Methode umfasst ein Verfahren, nach dem die Beurteilung 
der hautätzenden Wirkung nicht an lebenden Tieren durchgeführt 
wird.
 
Bei der Beurteilung der hautätzenden Wirkung wurden üblicherweise 
Labortiere als Versuchstiere eingesetzt (2). Bedenken hinsichtlich der 
Schmerzen und Leiden der hierfür verwendeten Tiere wurden bei der 
Überarbeitung von Testmethode B.4 berücksichtigt, mit der die hau ­
tätzende Wirkung durch alternative In-vitro-Methoden ermittelt wer ­
den kann und somit unnötige Schmerzen und Leiden vermieden 
werden.  
Als erster Schritt auf dem Weg zur Erarbeitung alternativer Tests, die 
unter gesetzgeberischen Aspekten für die Prüfung auf hautätzende Wirkung eingesetzt werden können, werden Vorvalidierungsstudien 
(3) durchgeführt. Im Anschluss hieran erfolgte eine formelle Vali ­
dierungsstudie von In-vitro-Methoden zur Beurteilung der hautätzen ­
den Wirkung (4) (5) (6) (7) (8). Auf der Grundlage der Ergebnisse dieser Studien sowie weiterer Veröffentlichungen erging die Emp ­
fehlung, die nachstehenden Tests als geeignet für die In-vivo-Beur ­
teilung auf hautätzende Wirkung einzustufen (9) (10) (11): der Test mit einem menschlichen Hautmodell (siehe Testmethode B.40 bis) sowie der TER-Test (transcutaneous electrical resistance test — die 
hier beschriebene Methode).
 
In einer Validierungsstudie und weiteren veröffentlichten Studien 
wurde festgestellt, dass beim TER-Test (transcutaneous electrical resistance assay) an Ratten (12) (13) zuverlässig zwischen bekannten 
hautätzenden Stoffen und solchen, die diese Eigenschaften nicht auf ­
weisen, unterschieden werden kann (5) (9).
 
Der in der vorliegenden Methode beschriebene Test ermöglicht die 
Feststellung ätzend wirkender chemischer Stoffe und Gemische. Au ­
ßerdem können damit Stoffe und Gemische festgestellt werden, die 
keine ätzende Wirkung aufweisen, wenn dies durch eine Weight-of- 
Evidence-Ermittlung unter Auswertung anderer vorliegender Infor ­
mationen untermauert wird (z. B. pH-Struktur-Wirkungs-Beziehun ­
gen, menschliche und/oder tierische Daten) (1) (2) (11) (14). Infor ­
mationen zu Hautreizungen vermittelt dieser Test nicht; außerdem 
ermöglicht er auch nicht die Unterkategorisierung hautätzender Stoffe gemäß den Zulässigkeitskriterien des GHS-Systems (1).
 
Zur umfassenden Beurteilung lokaler Wirkungen auf die Haut nach 
einmaliger dermaler Exposition wird empfohlen, die sequenzielle 
Teststrategie einzuhalten, die in der Anlage zu Testmethode B.4 (2) und im GHS-System (1) festgelegt ist. Diese Teststrategie um ­
fasst die Durchführung von In-vitro-Tests auf hautätzende Wirkung 
(wie sie in dieser Methode beschrieben werden) und Hautreizungen, 
bevor Tests an lebenden Tieren in Betracht gezogen werden.
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1.2. DEFINITION  
In-vivo-Prüfung auf hautätzende Wirkung:  Herbeiführung irre ­
versibler Schädigung des Hautgewebes: sichtbare Nekrose durch die Epidermis und in die Dermis nach Auftragen eines Teststoffs 
über einen Zeitraum von bis zu vier Stunden. Hautätzende Re ­
aktionen sind typischerweise begleitet von Geschwüren, Blutungen, blutigem Schorf sowie am Ende des 14-tägigen Beobachtungszeit ­
raums von Verfärbungen als Folge der Ausbleichung der Haut, 
Bereichen vollständiger Alopezie sowie Narbenbildung. Bei der 
Beurteilung fragwürdiger Schädigungen ist die Histopathologie mit zu berücksichtigen.
 
TER (Transcutaneous Electrical Resistance):  ein Maß für den 
elektrischen Widerstand der Haut, angegeben als Widerstand in Ohm. Ein einfaches und stabiles Verfahren zur Beurteilung der Sperrfunktion, indem der Ionendurchtritt durch die Haut mithilfe 
einer Wheatstone-Messbrücke aufgezeichnet wird.
 
1.3. REFERENZSTOFFE  
Tabelle 1  
Referenzchemikalien  
Bezeichnung EINECS-Nr. CAS-Nr.  
1,2-Diaminopropan 201-155-9 78-90-0 Stark hautätzend 
Acrylsäure 201-177-9 79-10-7 Stark hautätzend 
2-tert. Butylphenol 201-807-2 88-18-6 Hautätzend 
Kaliumhydroxid(10 %) 215-181-3 1310-58-3 Hautätzend Schwefelsäure (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Hautätzend Octansäure (Caprylsäure) 204-677-5 124-07-02 Hautätzend 4-Amino-1,2,4-Triazol 209-533-5 584-13-4 Nicht hautätzend Eugenol 202-589-1 97-53-0 Nicht hautätzend 
Phenethylbromid 203-130-8 103-63-9 Nicht hautätzend 
Tetrachlorethylen 204-825-9 27-18-4 Nicht hautätzend Isostearinsäure 250-178-0 30399-84-9 Nicht hautätzend 4-(Methylthio)-Benzaldehyd 222-365-7 3446-89-7 Nicht hautätzend
 
Die meisten der in obiger Liste angegebenen Chemikalien wurden 
der Liste der für die internationale Validierungsstudie der CEVMA ausgewählten Chemikalien entnommen (4). Die Auswahl stützt sich 
auf folgende Kriterien:
 
i) gleiche Anzahl hautätzender und nicht hautätzender Stoffe,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 566
 
ii) gewerblich erhältliche Stoffe, die die meisten maßgeblichen che ­
mischen Klassen abdecken,  
iii) Aufnahme sowohl stark hautätzender als auch weniger hautätzen ­
der Stoffe, um eine Unterscheidung nach dem Grad der hautät ­
zenden Wirkung zu ermöglichen,  
iv) Auswahl von Chemikalien, die für eine Laborverwendung geeig ­
net sind, ohne dass dabei — außer der hautätzenden Wirkung — 
anderweitige schwer wiegende Gefahren auftreten.  
1.4. PRINZIP DER TESTMETHODE  
Das Testmaterial wird in einem Zweikammersystem bis zu 24 Stun ­
den lang auf den Epidermisflächen von Hautstücken aufgebracht, wobei die Hautstücke als Trennwand zwischen den beiden Kammern 
fungieren. Die Hautstücke werden 28-30 Tage alten Ratten entnom ­
men, die zuvor tierschutzgerecht getötet wurden. Hautätzende Mate ­
rialien werden anhand ihrer Fähigkeit ermittelt, einen Verlust der normalen Beschaffenheit und Sperrfunktion der Hornhaut (Stratum 
Corneum) herbeizuführen, welcher als Senkung des TER unter einen 
bestimmten Schwellenwert (12) gemessen wird. Beim TER von Rat ­
ten wurde ein Grenzwert von 5 k Ω auf der Grundlage umfangreicher 
Datenbestände für ein breites Spektrum unterschiedlicher Chemika ­
lien gewählt, wobei die überwiegende Mehrzahl der Werte entweder 
eindeutig deutlich oberhalb dieses Grenzwerts lag (oft > 10 k Ω) oder 
aber deutlich unterhalb dieses Werts (oft < 3 k Ω) (12). Im Allgemei ­
nen sinkt der TER bei Materialien, die bei Tieren nicht hautätzend 
wirken, aber hautreizende bzw. nicht hautreizende Eigenschaften auf ­
weisen, nicht bis unter diesen Schwellenwert. Außerdem kann sich durch die Verwendung anderer Hautherstellungen oder anderer Test ­
geräte der Schwellenwert verändern, wodurch eine zusätzliche Vali ­
dierung notwendig wird.
 
Im Testverfahren ist zur Bestätigung der Tests auf positive Ergebnisse 
im TER (einschließlich Werten um ca. 5 k Ω) ein Farbbindungsschritt 
vorgesehen. Durch den Farbbindungsschritt wird festgestellt, ob die steigende Ionenpermeabilität auf die materielle Zerstörung der Horn ­
haut (Stratum Corneum) zurückzuführen ist. Durch die TER-Methode 
mit Rattenhaut konnte eine gute Vorhersagegenauigkeit der hautätzen ­
den In-vivo-Wirkung bei dem nach Testmethode B.4 (2) untersuchten Kaninchen nachgewiesen werden. Zu beachten ist dabei, dass der In- vivo-Test an Hasen hinsichtlich der hautätzenden Wirkung und Haut ­
reizung im Vergleich zum Test mit menschlichen Hautstücken aus ­
gesprochen konservativ angelegt ist (15).
 
1.5. BESCHREIBUNG DER TESTMETHODE  
1.5.1.  Tiere  
Für diesen Test werden Ratten verwendet, da die Empfindlichkeit der 
Haut dieser Tiere gegenüber Chemikalien in diesem Test bereits 
früher nachgewiesen wurde (10). Alter (wenn sich die Haut voll ­
ständig gebildet hat) und Abstammung der Ratte sind von besonderer Bedeutung, damit gewährleistet ist, dass sich die Fellfollikel in der 
Ruhephase befinden, bevor das Fellwachstum der erwachsenen Tiere 
beginnt.
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An den jungen, ca. 22 Tage alten männlichen oder weiblichen Ratten 
(Wistar-Ratten oder vergleichbare Abstammung) wird das Fell am 
Rücken und an den Flanken mit einem geeigneten Instrument sorg ­
fältig geschoren. Anschließend werden die Tiere mit vorsichtigen Wischbewegungen gewaschen, wobei die geschorenen Flächen in 
eine Antibiotikalösung getaucht werden (die Lösung enthält bei ­
spielsweise Streptomycin, Penicillin, Chloramphenicol und Ampho ­
tericin in Konzentrationen, die ein bakterielles Wachstum verhin ­
dern). Die Tiere werden dann am dritten oder vierten Tag nach 
dem ersten Waschvorgang erneut gewaschen und innerhalb von 3 
Tagen nach dem zweiten Waschvorgang verwendet, wenn sich die Hornhaut vom Schervorgang erholt hat.
 
1.5.2.  Gewinnung der Hautstücke  
Die Versuchstiere werden im Alter von 28-30 Tagen tierschutz ­
gerecht getötet; dieses Alter ist von entscheidender Bedeutung. Die dorsal-laterale Haut der Tiere wird entfernt und von überschüssigem 
subkutanem Fett befreit, das von der Haut sorgfältig abgeschält wird. 
Es werden Hautstücke mit einem Durchmesser von je ca. 20 mm entnommen. Die Haut kann vor der Verwendung der Hautstücke eingelagert werden, wenn es sich zeigt, dass die positiven und ne ­
gativen Kontrolldaten mit den an frischer Haut ermittelten Daten 
übereinstimmen.
 
Jedes Hautstück wird so über das Ende eines PTFE-(Polytetrafluore ­
thylen)-Rohres gelegt, dass die Epidermisoberfläche auf dem Ende des Rohres aufliegt. Zur Fixierung des Hautstücks wird ein O-Ring aus Gummi straff über das Rohrende gezogen, so dass die Haut 
fixiert wird, und überflüssiges Hautgewebe wird abgeschnitten. Die 
Abmessungen des Rohrs und des O-Rings sind in Abbildung 2 angegeben. Der O-Ring wird sodann mit gereinigter Naturvaseline zum Ende des PTFE-Rohrs hin gründlich abgedichtet. Das Rohr wird 
durch eine Federklemme in einer Rezeptorkammer gehalten, die 
Magnesiumsulfatlösung (154 mM) enthält (Abbildung 1). Das Haut ­
stück ist vollständig in die MgSO
 4 -Lösung einzutauchen. Aus einer 
einzigen Rattenhaut können bis zu 10-15 Hautstücke entnommen 
werden.  
Vor Beginn der Tests wird zu Qualitätssicherungszwecken bei jeder 
Tierhaut der elektrische Widerstand an zwei Hautstücken gemessen. Beide Hautstücke müssen einen Widerstand von mehr als 10 k Ω für 
die übrigen für den Test verwendeten Hautstücke aufweisen. Liegt 
der Widerstand unter 10 k Ω, sind die übrigen Hautstücke der betref ­
fenden Tierhaut zu vernichten.
 
1.5.3.  Aufbringen der Test- und Kontrollsubstanzen  
Für jede Studie sind gleichzeitige Positiv- und Negativ-Kontrollen zu 
verwenden, um eine angemessene Eignung des Experimentalmodells sicherzustellen. Es sind Hautstücke eines einzigen Tieres zu verwen ­
den. Als Positiv- und Negativ-Kontrollsubstanzen werden 10 M 
Chlorwasserstoffsäure bzw. destilliertes Wasser zu verwenden.
 
Die flüssigen Testsubstanzen (150 μl) werden im Rohrinneren 
gleichmäßig auf die epidermale Oberfläche aufgebracht. Bei Tests 
an Feststoffen wird eine ausreichende Menge des Feststoffs gleich ­
mäßig auf das Hautstück aufgebracht, so dass gewährleistet ist, dass die gesamte Epidermisoberfläche bedeckt ist. Auf den Feststoff wird 
entionisiertes Wasser (150 μl) aufgebracht und das Rohr vorsichtig 
bewegt. Um optimalen Kontakt der Testsubstanzen mit der Haut zu erreichen, müssen einige Feststoffe gegebenenfalls auf 30
 o C er­
wärmt werden, so dass die Testsubstanz schmilzt oder weich wird, 
oder die Testsubstanz muss zu einem Granulat oder Pulver zermah ­
len werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 568
 
Für jede Test- und Kontrollsubstanz werden je drei Hautstücke ver ­
wendet. Die Testsubstanzen werden 24 Stunden lang bei 20-23  o C 
aufgebracht. Die Testsubstanz wird durch Waschen unter fließendem Wasser bei maximal 30
 o C gewaschen, bis kein weiteres Material 
mehr entfernt werden kann.  
1.5.4.  TER-Messungen  
Der Hautwiderstand wird als TER mit einer Wheatstone'schen Wech ­
selstrom-Messbrücke mit niedriger Spannung gemessen (13). Die Kenndaten der Messbrücke lauten: Betriebsspannung 1-3 Volt, sinus- 
oder rechteckförmiger Wechselstrom mit 50-1 000 Hz, Messbereich 
mindestens 0,1-30 k Ω. Die in der Validierungsstudie verwendete 
Datenbrücke misst Induktivität, Kapazität und Widerstand bis 2 000 H, 2 000 μF bzw. 2 M Ω bei Frequenzen von 100 Hz oder 
1 kHz unter Verwendung serieller oder paralleler Werte. Für die 
TER-Messungen werden Messungen der hautätzenden Wirkung in Widerständen bei einer Frequenz von 100 Hz und unter Verwendung serieller Werte verwendet. Vor der Messung des elektrischen Wider ­
stands wird die Oberflächenspannung der Haut durch Zugabe einer 
ausreichenden Menge von 70 %igem Ethanol verringert, so dass die Epidermis bedeckt ist. Nach einigen Sekunden wird das Ethanol aus 
dem Rohr entfernt und das Hautgewebe durch Hinzufügen von 3 ml 
MgSO
 4 -Lösung (154 mM) befeuchtet. Zur Messung des Widerstands 
in kΩ/Hautstück (Abbildung 1) werden die Elektroden der Daten ­
brücke auf beiden Seiten des Hautstücks angebracht. Die Gesamt ­
abmessungen der Elektroden sowie die Länge der Elektrode unter ­
halb der Abgreifklemmen sind in Abbildung 2 dargestellt. Die an der Innenelektrode angebrachte Abgreifklemme liegt während der Wider ­
standsmessung oben auf dem PTFE-Rohr auf, so dass stets eine 
gleich bleibende Elektrodenlänge in die MgSO
 4 -Lösung eingetaucht 
bleibt. Die äußere Elektrode ist in der Rezeptorkammer so angeord ­
net, dass sie am Kammerboden ansteht. Der Abstand zwischen der Federklemme und dem unteren Ende des PTFE-Rohrs bleibt konstant 
(Abbildung 2), da dieser Abstand den erzielten Widerstandswert 
beeinflusst. Folglich muss auch der Abstand zwischen der Innenelek ­
trode und dem Hautstück konstant und möglichst gering sein (1- 2 mm).
 
Ist der gemessene Widerstand größer als 20 k Ω, so kann dies daran 
liegen, dass ein Rest der Testsubstanz die Epidermisoberfläche des 
Hautstücks bedeckt. Zur weiteren Entfernung dieser Schicht kann 
beispielsweise versucht werden, das PTFE-Rohr mit dem durch einen Gummihandschuh geschützten Daumen zu verschließen und das Rohr ca. 10 Sekunden lang zu schütteln; anschließend wird die 
MgSO
 4 –Lösung weggeschüttet und die Widerstandsmessung mit fri ­
scher MgSO  4 -Lösung wiederholt.  
Eigenschaften und Abmessungen der Testapparatur und das verwen ­
dete Versuchsverfahren können die ermittelten TER-Werte beeinflus ­
sen. Der Schwellenwert von 5 k Ω für hautätzende Wirkung wurde 
aus Daten entwickelt, die mit der/dem in dieser Methode beschrie ­
benen speziellen Versuchsanordnung und Versuchsverfahren ermit ­
telt wurden. Abweichende Schwellen- und Kontrollwerte gelten möglicherweise, wenn sich die Testbedingungen ändern oder eine andere Versuchsanordnung verwendet wird. Daher müssen die 
Schwellenwerte für die Methodik und den Widerstand durch Prüfung 
einer Reihe von Referenznormalen kalibriert werden, die aus den in der Validierungsstudie (4) (5) verwendeten Chemikalien ausgewählt wurden, oder aus Chemikalienklassen, die den untersuchten Che ­
mikalien ähneln. Tabelle 1 gibt eine Übersicht über geeignete Refe ­
renzchemikalien.
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1.5.5.  Farbbindungsmethoden  
Bei bestimmten nicht hautätzenden Materialien, denen die Haut aus ­
gesetzt ist, kann der Widerstand unter den Schwellenwert von 5 k Ω 
sinken, wodurch es zum Ionendurchtritt durch die Hornhaut kommt 
und der elektrische Widerstand absinkt (5). So können beispielsweise 
neutrale organische Stoffe und Chemikalien mit oberflächenaktiven Eigenschaften (u. a. Detergenzien, Emulgatoren und andere Tenside) die Hautlipide entziehen, wodurch die Trennschicht ionendurchlässi ­
ger wird. Liegen die TER-Werte der Testsubstanzen also unter oder 
um 5 kΩ und sind keine optischen Anzeichen einer Schädigung zu 
erkennen, ist eine Beurteilung des Farbeindringvermögens an den 
Kontroll- und behandelten Hautgeweben durchzuführen, um fest ­
zustellen, ob die ermittelten TER-Werte durch gestiegene Hautper ­
meabilität oder durch hautätzende Wirkung zustande kamen (3) (5). In letzterem Fall dringt, wenn eine Unterbrechung der Hornhaut vor ­
liegt, der auf die Hautoberfläche aufgetragene Farbstoff Sulforhoda ­
min B rasch ein und verursacht eine Verfärbung des darunter liegen ­
den Hautgewebes. Dieser Farbstoff ist gegenüber einer breiten Pa ­
lette von Chemikalien stabil und wird durch das nachstehend be ­
schriebene Extraktionsverfahren nicht beeinflusst.
 
1.5.5.1.  Anwendung und Entfernung von Sulforhodamin-B-Farbstoff  
Nach der Beurteilung der TER-Tests wird das Magnesiumsulfat aus 
dem Röhrchen abgeschüttet und die Haut sorgfältig auf erkennbare Schäden untersucht. Sind keine erkennbaren größeren Schädigungen 
festzustellen, wird Farbstoff Sulforhodamin B (Acid Red 52; C.I. 
45100; EINECS-Nummer 222-529-8; CAS-Nummer 3520-42-1), 150 μl in einer 10 %igen (w/v) Verdünnung in destilliertem Wasser 
2 Stunden lang auf die Epidermisoberfläche jedes Hautstücks auf ­
getragen. Diese Hautstücke werden anschließend bei einer 
Temperatur bis zur Raumtemperatur unter fließendem Wasser ca. 10 Sekunden lang abgewaschen, um überschüssige/ungebundene Farbe zu entfernen. Jedes Hautstück wird sorgfältig vom PTFE- 
Rohr entfernt und in ein Gefäß (z. B. ein 20-ml-Szintillationsfläsch ­
chen) eingelegt, das entionisiertes Wasser (8 ml) enthält. Die Fläsch ­
chen werden 5 Minuten lang vorsichtig geschüttelt, um restliche ungebundene Farbe zu entfernen. Nach Wiederholung des Spülvor ­
gangs werden die Hautstücke entnommen und in Fläschchen einge ­
legt, die 5 ml 30 %iges (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) in des ­
tilliertem Wasser enthalten, und über Nacht bei 60
 o C aufbewahrt.  
Nach dieser Inkubation werden die einzelnen Hautstücke entnommen 
und entsorgt und die verbleibende Lösung 8 Minuten lang bei 21  o C 
zentrifugiert (relative Zentrifugalkraft ~175 × g). Eine 1-ml-Probe des oberflächenaktiven Stoffs wird 1:5 (v/v) (d. h. 1 ml + 4 ml) 
mit 30 %igem (w/v) SDS in destilliertem Wasser verdünnt. Die 
optische Dichte (OD) der Lösung wird bei 565 nm gemessen.
 
1.5.5.2.  Berechnung des Farbgehalts  
Der Gehalt an Sulforhodamin-B-Farbstoff je Hautstück wird mittels 
der OD-Werte (5) berechnet (molarer Extinktionskoeffizient von Sul ­
forhodamin B bei 565 nm = 8,7 × 10  4 , Molekulargewicht = 580). 
Der Farbstoffgehalt wird für jedes der drei Hautstücke durch eine entsprechende Kalibrierungskurve bestimmt und dann der mittlere Farbstoffgehalt für die Wiederholungs-Gleichtests berechnet.
 
2. DATEN  
Die Widerstandswerte (k Ω) und ggf. der mittlere Farbstoffgehalt 
(μg/Hautstück) für das Testmaterial sowie für Positiv- und Negativ ­
kontrollen sind in Tabellenform (Einzelversuchsdaten und Mittel ­
werte ± statistische Abweichung) einschließlich der Daten für Wie ­
derholungs-Gleichtests und Mehrfachbestimmungen sowie der Mit ­
telwerte und Einzelwerte in Berichten zusammenzufassen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 570
 
2.1. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Die mittleren TER-Werte werden akzeptiert, wenn die Ergebnisse der 
gleichzeitigen Positiv- und Negativkontrollen innerhalb der akzepta ­
blen Bereiche für die Methode im Testlabor liegen. Die akzeptablen 
Widerstandsbereiche für die oben beschriebene Methode und Ver ­
suchsanordnung lauten wie folgt:  
Kontrolle Substanz Widerstandsbe ­
reich (kΩ) 
Positiv 10M Chlorwasserstoffsäure 0,5 - 1,0 
Negativ Destilliertes Wasser 10-25  
Die ermittelten Mittelwerte der Farbbindung werden nur akzeptiert, 
sofern die Ergebnisse der gleichzeitig getesteten Kontrollen innerhalb 
definierter Akzeptanzgrenzen der betreffenden Methode liegen. Für 
die Kontrollsubstanzen der oben beschriebenen Methodik und Ver ­
suchsanordnung werden folgende Akzeptanzbereiche vorgeschlagen:  
Kontrolle Substanz Farbgehaltsbe ­
reich (μg/Haut­
stück)  
Positiv 10M Chlorwasserstoffsäure 40-100 
Negativ Destilliertes Wasser 15-35  
Die Testsubstanz gilt als nicht hautätzend:  
i) wenn der Mittelwert des für die Testsubstanz ermittelten TER- 
Werts größer als 5 k Ω ist oder  
ii) wenn der Mittelwert des TER-Werts gleich 5 k Ω oder kleiner ist 
und 
— das Hautstück keine wahrnehmbaren Veränderungen erkennen 
lässt, und  
— der mittlere Farbstoffgehalt des Hautstücks deutlich unter dem 
mittleren Farbstoffgehalt des Hautstücks der gleichzeitig mit 
10M HCl durchgeführten Positivkontrolle liegt.  
Die Testsubstanz gilt als hautätzend:  
i) wenn der Mittelwert des TER-Werts gleich 5 k Ω oder kleiner ist 
und das Hautstück offensichtliche Schädigungen aufweist oder  
ii) wenn der Mittelwert des TER-Werts gleich 5 k Ω oder kleiner ist 
und 
— das Hautstück keine offensichtlichen Schädigungen aufweist, 
aber 
— der mittlere Farbstoffgehalt größer oder gleich dem mittleren 
Farbstoffgehalt der gleichzeitig mit 10M HCl ermittelten Po ­
sitivkontrolle ist.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 571
 
3. BERICHTERSTATTUNG  
3.1. TESTBERICHT  
Der Testbericht muss folgende Informationen enthalten:  
Test- und Kontrollsubstanzen:  
— chemische Bezeichnung(en) wie IUPAC oder CAS-Bezeichnung 
und CAS-Nummer, sofern bekannt;  
— Reinheit und Zusammensetzung der Substanz oder Zubereitung 
(in Gewichts- %), physikalische Eigenschaften;  
— physikalisch-chemische Eigenschaften wie physikalischer Zu ­
stand, pH-Wert, Stabilität, Wasserlöslichkeit, die für die Durch ­
führung der Untersuchung relevant sind;  
— Behandlung der Test-/Kontrollsubstanzen vor dem Test, sofern 
relevant (z. B. Erwärmen, Mahlen);  
— Stabilität, sofern bekannt.  
Versuchstiere:  
— Abstammung und Geschlecht;  
— Alter der Tiere zum Zeitpunkt der Verwendung als Spendertiere;  
— Herkunft, Unterbringungsbedingungen, Ernährung usw.;  
— Details der Herstellung der Hautstücke.  
Testbedingungen:  
— Eichkurven für die Versuchsapparaturen;  
— Eichkurven für die Durchführung des Farbbindungstests;  
— Details des Testverfahrens für die TER-Messungen;  
— Details des Testverfahrens für die Beurteilung der Farbbinde ­
fähigkeit (sofern relevant);  
— Beschreibung etwaiger an den Testverfahren vorgenommener 
Änderungen;  
— Beschreibung der zugrunde gelegten Beurteilungskriterien.  
Ergebnisse:  
— Darstellung der Daten der TER- und Farbbindungstests in Tabel ­
lenform (sofern relevant) für Einzeltiere und einzelne Hautpro ­
ben; 
— Beschreibung etwaiger beobachteter Wirkungen.  
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  
4. LITERATURHINWEISE  
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Ha zards of Chemical Substances 
and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 
33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/ 
2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 572
 
(2) Testmethode B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corrosion 
(Akute Toxizität: Hautreizung/hautätzende Wirkung).  
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, 
M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. 
(1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity tes ­
ting. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219-255.
 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international va ­
lidation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxic. in Vitro 12, 471- 
482. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. in Vitro 12, 483-524.
 
(6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Har ­
monization of Validation and Acceptance Criteria for Alterna ­
tive Toxicological Test Methods, 62 S.  
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., 
Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
 
(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the 
Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environ ­
mental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. 
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
 
(9) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 
275-280.  
(10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm
 TM , EPISKIN  TM (EPI-200), and the Rat Skin 
Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro 
test methods for assessing dermal corrosivity potential of che ­
micals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental 
Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
(11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st 
–2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
27. März 2002, OECD ENV/EHS; auf Anfrage beim Sekreta ­
riat erhältlich.  
(12) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A. and Rhodes, C. (1986). An  in 
vitro  skin corrosivity test — modifications and validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, 507-512.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 573
 
(13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J. and Gardner, 
J. (1992). The skin corrosivity test  in vitro:  results of an inter ­
laboratory trial. Toxic, in Vitro 6, 191-194.  
(14) Worth A.P, Fentem J.H., Balls M, Botham P.A, Curren R.D, 
Earl L.K, Esdaile D.J, Liebsch M. (1998). An Evaluation of 
the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. 
ATLA 26: 709-720.  
(15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, 
M., Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845-852.
 
(16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A. and Rhodes C. (1988). An In 
Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial Validation. Toxic, in Vitro. 2, 7-17.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 574
 
Abbildung 1  
Apparatur für den TER-Test mit Rattenhaut
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 575
 
Abbildung 2  
Abmessungen der Polytetrafluorethylen- (PFTE-) und Rezeptorrohre und der 
verwendeten Elektroden
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 576
 
Kritische Faktoren der obigen Apparaturen  
— Innendurchmesser des PTFE-Rohrs,  
— Länge der Elektroden in Relation zum PTFE-Rohr und zum 
Rezeptorrohr, so dass die Hautscheibe nicht mit den Elektroden 
in Kontakt kommt und die Elektrode auf einer Standardlänge mit der MgSO
 4 -Lösung in Kontakt steht,  
— die Menge an MgSO  4 -Lösung im Rezeptorrohr muss in Relation 
zum Füllstand im PTFE-Rohr den in Abbildung 1 dargestellten 
Flüssigkeitsstand ergeben,  
— das Hautstück muss so am PTFE-Rohr befestigt sein, dass der 
elektrische Widerstand ein richtiges Maß für die Hauteigenschaf ­
ten darstellt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 577
 
B.40.bis.  IN-VITRO-PRÜFUNG AUF HAUTÄTZENDE WIRKUNG: 
TEST MIT MENSCHLICHEM HAUTMODELL  
1. METHODE  
Diese Testmethode entspricht OECD TG 431 (2004).  
1.1. EINLEITUNG  
Unter hautätzender Wirkung versteht man die irreversible Schädi ­
gung eines getesteten Gewebes nach Anwendung eines Testmaterials 
(gemäß Definition im weltweit harmonisierten System zur Einstufung und Kennzeichnung von chemischen Substanzen und Gemischen (GHS — Globally Harmonised System for the Classification and 
Labelling of Chemical Substances and Mixtures)) (1). Bei dieser 
Testmethode ist die Verwendung lebender Tiere oder tierischen Ge ­
webes für die Beurteilung der hautätzenden Wirkung nicht erforder ­
lich.
 
Bei der Beurteilung der hautätzenden Wirkung wurden üblicherweise 
Labortiere als Versuchstiere eingesetzt (2). Bedenken hinsichtlich der 
Schmerzen und Leiden der hierfür verwendeten Tiere wurden bei der Überarbeitung von Testmethode B.4 berücksichtigt, mit der die hau ­
tätzende Wirkung durch alternative In-vitro-Methoden ermittelt wer ­
den kann und somit unnötige Schmerzen und Leiden vermieden 
werden.
 
Als erster Schritt auf dem Weg zur Erarbeitung alternativer Tests, die 
unter gesetzgeberischen Aspekten für die Prüfung auf hautätzende Wirkung eingesetzt werden können, wurden Vorvalidierungsstudien 
(3) durchgeführt. Im Anschluss hieran erfolgte eine formelle Vali ­
dierungsstudie von In-vitro-Methoden zur Beurteilung der hautätzen ­
den Wirkung (4) (5) (6) (7) (8). Auf der Grundlage der Ergebnisse dieser Studien sowie weiterer Veröffentlichungen (9) erging die 
Empfehlung, die nachstehenden Tests als geeignet für die In-vivo- 
Beurteilung auf hautätzende Wirkung einzustufen (10) (11) (12) (13): den Test mit einem menschlichen Hautmodell (die hier beschriebene Testmethode) sowie den TER-Test (transcutaneous electrical resis ­
tance test — siehe Testmethode B.40).
 
In Validierungsstudien wurde festgestellt, dass bei Tests mit dem 
menschlichen Hautmodell (3) (4) (5) (9) zuverlässig zwischen be ­
kannten hautätzenden Stoffen und solchen, die diese Eigenschaften nicht aufweisen, unterschieden werden kann. Das Testprotokoll kann 
auch Angaben zur Unterscheidung zwischen stark und weniger stark 
hautätzend wirkenden Substanzen liefern.
 
Der in der vorliegenden Methode beschriebene Test ermöglicht die 
Feststellung ätzend wirkender chemischer Stoffe und Gemische. Au ­
ßerdem können damit Stoffe und Gemische festgestellt werden, die 
keine ätzende Wirkung aufweisen, wenn dies durch eine Weight-of- 
Evidence-Ermittlung unter Auswertung anderer vorliegender Infor ­
mationen untermauert wird (z. B. pH, Struktur-Wirkungs-Beziehun ­
gen, menschliche und/oder tierische Daten) (1) (2) (13) (14). Infor ­
mationen zu Hautreizungen vermittelt dieser Test normalerweise 
nicht; außerdem ermöglicht er auch nicht die Unterkategorisierung hautätzender Stoffe gemäß den Zulässigkeitskriterien des GHS-Sys ­
tems (1).
 
Zur umfassenden Beurteilung lokaler Wirkungen auf die Haut nach 
einmaliger dermaler Exposition wird empfohlen, die sequenzielle 
Teststrategie einzuhalten, die in der Anlage zu Testmethode B.4 (2) und im GHS-System (1) festgelegt ist. Diese Teststrategie um ­
fasst die Durchführung von In-vitro-Tests auf hautätzende Wirkung 
(wie sie in dieser Methode beschrieben werden) und Hautreizungen, 
bevor Tests an lebenden Tieren in Betracht gezogen werden.
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1.2. DEFINITIONEN  
In-vivo-Prüfung auf hautätzende Wirkung:  Herbeiführung irrever ­
sibler Schädigung des Hautgewebes: sichtbare Nekrose durch die Epidermis und in die Dermis nach Auftragen eines Teststoffs über 
einen Zeitraum von bis zu 4 Stunden. Hautätzende Reaktionen sind 
typischerweise begleitet von Geschwüren, Blutungen, blutigem Schorf sowie am Ende des 14-tägigen Beobachtungszeitraums von Verfärbungen als Folge der Ausbleichung der Haut, Bereichen voll ­
ständiger Alopezie sowie Narbenbildung. Bei der Beurteilung frag ­
würdiger Schädigungen ist die Histopathologie mit zu berücksichti ­
gen.
 
Viabilität der Zellen:  Parameter zur Messung der Gesamtaktivität 
einer Zellenpopulation (z. B. Fähigkeit der zellulären mitochondria ­
len Dehydrogenasen, die lebenswichtige Farbstoff-MTT zu reduzie ­
ren), die je nach gemessenem Endpunkt und verwendetem Testauf ­
bau mit der Gesamtzahl und/oder Vitalität der Zellen korreliert.  
1.3. REFERENZSTOFFE  
Tabelle 1  
Referenzchemikalien  
Bezeichnung EINECS-Nr. CAS-Nr.  
1,2-Diaminopropan 201-155-9 78-90-0 Stark hautätzend 
Acrylsäure 201-177-9 79-10-7 Stark hautätzend 2-tert. Butylphenol 201-807-2 88-18-6 Hautätzend 
Kaliumhydroxid (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Hautätzend 
Schwefelsäure (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Hautätzend Octansäure (Caprylsäure) 204-677-5 124-07-02 Hautätzend 4-Amino-1,2,4-Triazol 209-533-5 584-13-4 Nicht hautätzend Eugenol 202-589-1 97-53-0 Nicht hautätzend Phenethylbromid 203-130-8 103-63-9 Nicht hautätzend 
Tetrachlorethylen 204-825-9 27-18-4 Nicht hautätzend 
Isostearinsäure 250-178-0 30399-84-9 Nicht hautätzend 4-(Methylthio)-Benzaldehyd 222-365-7 3446-89-7 Nicht hautätzend
 
Die meisten der in obiger Liste angegebenen Chemikalien wurden 
der Liste der für die internationale Validierungsstudie der CEVMA 
ausgewählten Chemikalien entnommen (4). Die Auswahl stützt sich 
auf folgende Kriterien:  
i) gleiche Anzahl hautätzender und nicht hautätzender Stoffe,  
ii) gewerblich erhältliche Stoffe, die die meisten maßgeblichen che ­
mischen Klassen abdecken,  
iii) Aufnahme sowohl stark hautätzender als auch weniger hautätzen ­
der Stoffe, um eine Unterscheidung nach dem Grad der hautät ­
zenden Wirkung zu ermöglichen,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 579
 
iv) Auswahl von Chemikalien, die für eine Laborverwendung geeig ­
net sind, ohne dass dabei — außer der hautätzenden Wirkung — 
anderweitige schwer wiegende Gefahren auftreten.  
1.4. PRINZIP DER TESTMETHODE  
Die Testsubstanz wird topisch auf ein dreidimensionales Modell 
menschlicher Haut aufgebracht, das mindestens eine rekonstruierte 
Epidermis mit funktionsfähiger Hornhaut aufweist. Ätzende Materia ­
lien werden aufgrund ihrer Fähigkeit ermittelt, bei einer spezifischen Expositionsdauer eine Verringerung der Viabilität (Lebensfähigkeit) der Zellen (dies kann beispielsweise mit dem MTT-Reduktionstest 
festgestellt werden (15)) unter festgelegte Schwellenwerte herbei ­
zuführen. Dieses Testprinzip basiert auf der Hypothese, dass ätzende Chemikalien in der Lage sind, durch Diffusion oder Erosion die Hornhaut zu durchdringen, und darüber hinaus eine zytotoxische 
Wirkung auf die darunter liegenden Zellschichten ausüben.
 
1.4.1.  Testverfahren  
1.4.1.1.  Modelle menschlicher Haut  
Modelle menschlicher Haut können gewerblich aufgebaut oder be ­
zogen werden (z. B. die Modelle EpiDerm™ und EPISKIN™) (16) 
(17) (18) (19) oder im Versuchslabor entwickelt oder aufgebaut werden (20) (21). Es versteht sich, dass die Verwendung mensch ­
licher Haut einzelstaatlichen und internationalen ethischen Kriterien 
und Auflagen unterliegt. Jedes neue Modell ist zu validieren (min ­
destens in dem unter 1.4.1.1.2 beschriebenen Umfang). Modelle menschlicher Haut, die für diese Tests verwendet werden, müssen folgende Auflagen erfüllen:
 
1.4.1.1.1. A l l g e m e i n e B e d i n g u n g e n f ü r d i e M o d e l l e  
Die Epithelschicht ist aus menschlichen Keratinozyten aufzubauen. 
Unter der funktionsfähigen Hornhaut müssen mehrere Lagen lebens ­
fähiger Epithelzellen vorhanden sein. Das Hautmodell kann außer ­
dem eine Schicht aus Stromalkomponenten aufweisen. Die Hornhaut muss aus mehreren Schichten bestehen und das notwendige Lipid ­
profil für den Aufbau einer funktionsfähigen Sperre aufweisen, die 
gegen das rasche Durchdringen zytotoxischer Markerstoffe beständig 
ist. Die Rückhalteeigenschaften des Modells müssen so gestaltet sein, dass der Durchtritt von Material rund um die Hornhaut in das lebens ­
fähige Gewebe verhindert wird. Durch den Durchtritt der Testche ­
mikalien um die Hornhaut kommt es zu einer mangelhaften Model ­
lierung der Einwirkung auf die Haut. Das Hautmodell muss frei von bakterieller Kontamination (einschließlich Mykoplasma) und Pilz ­
kontamination sein.
 
1.4.1.1.2. B e d i n g u n g e n f ü r d a s F u n k t i o n s m o d e l l  
Die Größenordnung der Viabilität wird normalerweise durch die 
MTT oder andere metabolisch konvertierte vitale Farbstoffe quanti ­
fiziert. In diesen Fällen muss die optische Dichte (OD) des extra ­
hierten (solubilisierten) Farbstoffs des negativen Kontrollgewebes mindestens dem Zwanzigfachen der OD des Extraktionslösemittels entsprechen (siehe Übersicht unter (22)). Das negative Kontroll ­
gewebe muss während der Testexpositionsdauer in der Kultur stabile 
Eigenschaften aufweisen (d. h. zu ähnlichen Viabilitätsmessergebnis ­
sen führen). Die Hornhaut muss so robust sein, dass sie gegen das rasche Eindringen bestimmter zytotoxischer Markerchemikalien 
(z. B. 1 % Triton X-100) ausreichend beständig ist. Diese Eigen ­
schaft kann anhand der Expositionszeit bestimmt werden, die not ­
wendig ist, um die Zellviabilität um 50 % (ET
 50 ) zu reduzieren (bei 
den Modellen EpiDerm™ und EPISKIN™ liegt sie beispielsweise 
bei > 2 Stunden). Die Reproduktionsfähigkeit des Gewebes muss im 
zeitlichen Verlauf und vorzugsweise zwischen den Labors nach ­
gewiesen werden. Darüber hinaus muss das Gewebe sich für die Vorhersage der hautätzenden Eigenschaften der Referenzchemikalien 
(siehe Tabelle 1) bei Verwendung im ausgewählten Testprotokoll 
eignen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 580
 
1.4.1.2.  Anwendung der Test- und Kontrollsubstanzen  
Für jede Behandlung (Expositionszeit) einschließlich der Kontrollen 
werden zwei Wiederholungs-Gleichtests des Gewebes verwendet. Bei flüssigen Materialien muss eine ausreichende Menge der Test ­
substanz gleichmäßig aufgetragen werden, so dass die Hautoberflä ­
che bedeckt ist; hierfür ist eine Mindestmenge von 25 μl/cm
 2 zu 
verwenden. Bei Feststoffen ist eine ausreichende Menge der Test ­
substanz gleichmäßig aufzutragen, so dass die Haut gleichmäßig 
bedeckt ist, und anschließend mit entionisiertem oder destilliertem 
Wasser zu befeuchten, so dass guter Kontakt mit der Haut gewähr ­
leistet ist. Soweit zweckmäßig, sind Feststoffe vor der Applikation 
zu einem Pulver zu mahlen. Es ist eine für die Testsubstanz geeig ­
nete Applikationsmethode zu wählen (siehe beispielsweise (5)). Am Ende der Expositionszeit ist das Testmaterial mit einer geeigneten Pufferlösung oder 0,9 %iger NaCl-Lösung sorgfältig von der Haut ­
oberfläche abzuwaschen.
 
Zu jeder Studie sind gleichzeitige Positiv- und Negativkontrollen 
durchzuführen, damit eine angemessene Eignung des Experimental ­
modells gewährleistet ist. Als Substanz für die Positivkontrolle wird 
Eisessig oder 8N KOH empfohlen. Als Substanz für die Negativ ­
kontrollen wird 0,9 %ige NaCl-Lösung oder Wasser empfohlen.  
1.4.1.3.  Messungen der Zellviabilität  
Zur Messung der Zellviabilität dürfen nur quantitative, validierte 
Methoden eingesetzt werden. Außerdem muss das Maß für die Via ­
bilität mit der Verwendung in einem dreidimensionalen Gewebekon ­
strukt kompatibel sein. Eine unspezifische Farbstoffbindung darf die 
Viabilitätsmessung nicht beeinträchtigen. Protein-Bindefarbstoffe und 
solche Farbstoffe, bei denen keine metabolische Konversion erfolgt (z. B. Neutralrot), sind daher nicht geeignet. Der am häufigsten ver ­
wendete Test ist die MTT-Reduktion — 3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)- 
2,5-Diphenyltetrazol-Bromid, Thiazolylblau: EINECS-Nummer 206- 
069-5, CAS-Nummer 298-93-1 —, die nachweislich genaue und reproduzierbare Ergebnisse liefert (5); allerdings ist auch die Ver ­
wendung anderer Substanzen zulässig. Die Hautprobe wird ca. 3 
Stunden in eine MTT-Lösung geeigneter Konzentration (z. B. 0,3- 
1 mg/ml) bei einer geeigneten Inkubationstemperatur eingelegt. Die blaue Formazonausfällung wird anschließend mit einem Lösemittel (Isopropanol) extrahiert und die Formazonkonzentration durch Be ­
stimmung des OD-Wertes bei einer Wellenlänge zwischen 540 und 
595 nm gemessen.
 
Die chemische Wirkung des Testmaterials auf den Vitalfarbstoff 
kann die Wirkung des Zellmetabolismus nachahmen, wodurch es 
zu falschen Viabilitätsschätzungen kommen kann. Derartige Erschei ­
nungen wurden in Fällen beobachtet, in denen das Testmaterial 
durch Spülen nicht vollständig von der Haut entfernt wurde (9). 
Wenn das Testmaterial direkt auf den Vitalfarbstoff wirkt, ist durch zusätzliche Kontrollen festzustellen, ob die Testsubstanzen die Via ­
bilitätsmessungen beeinflussen (9) (23), und es sind ggf. entspre ­
chende Korrekturen vorzunehmen.
 
2. DATEN  
Für jedes Gewebe sind die OD-Werte und die berechnete prozentuale 
Zellviabilität des Testmaterials, Positiv- und Negativkontrollen in Tabellenform im Bericht anzugeben, einschließlich der Daten von 
Mehrfachbestimmungen und Wiederholungstests sowie der Mittel ­
werte und Einzeldaten.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 581
 
2.1. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Die für jede Testprobe ermittelten OD-Werte können zur Berechnung 
einer prozentualen Viabilität im Vergleich zur Negativkontrolle he ­
rangezogen werden, die willkürlich gleich 100 % gesetzt wird. Der 
Schwellenwert der prozentualen Zellviabilität, der zur Unterschei ­
dung zwischen ätzenden und nicht ätzenden Testsubstanzen verwen ­
det wird (bzw. zur Differenzierung des ätzenden Potenzials in wei ­
teren Unterklassen), oder die statistischen Verfahren zur Beurteilung 
der Ergebnisse und Bestimmung ätzender Materialien müssen in ein ­
deutiger Form definiert und dokumentiert werden, und es muss die Richtigkeit dieser Werte bestätigt werden. Im Allgemeinen werden 
diese Schwellenwerte bei der Testoptimierung festgelegt, während 
einer Vorvalidierungsphase getestet und in einer Validierungsstudie bestätigt. Die Vorhersage der hautätzenden Wirkung beim Epi ­
Derm™-Modell lautet beispielsweise (9):
 
Die Testsubstanz gilt als „hautätzend“:  
i) wenn die Viabilität nach einer 3-minütigen Exposition weniger 
als 50 % beträgt oder  
ii) wenn die Viabilität nach einer 3-minütigen Exposition gleich 
50 % oder höher ist und die Viabilität nach einer einstündigen Exposition weniger als 15 % beträgt.
 
Die Testsubstanz gilt als „nicht hautätzend“:  
i) wenn die Viabilität nach einer 3-minütigen Exposition gleich 
50 % oder höher ist und die Viabilität nach einer einstündigen 
Exposition gleich 15 % oder höher ist.  
3. BERICHTERSTATTUNG  
3.1. TESTBERICHT  
Der Testbericht muss folgende Informationen enthalten:  
Test- und Kontrollsubstanzen:  
— chemische Bezeichnung(en) wie IUPAC oder CAS-Bezeichnung 
und CAS-Nummer, sofern bekannt;  
— Reinheit und Zusammensetzung der Substanz oder Zubereitung 
(in Gewichtsprozent);  
— physikalisch-chemische Eigenschaften wie physikalischer Zu ­
stand, pH-Wert, Stabilität, Wasserlöslichkeit, die für die Durch ­
führung der Untersuchung relevant sind;  
— Behandlung der Test-/Kontrollsubstanzen vor dem Test, sofern 
relevant (z. B. Erwärmen, Mahlen);  
— Stabilität, sofern bekannt.  
Begründung für das verwendete Hautmodell und Protokoll.  
Testbedingungen:  
— verwendetes Zellsystem;  
— Eichdaten für das zur Messung der Zellviabilität verwendete 
Messgerät (z. B. Spektrofotometer);  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 582
 
— umfassende Begleitinformationen für das verwendete spezifische 
Hautmodell (einschließlich der Validität des Modells);  
— Details zum verwendeten Testverfahren;  
— verwendete Testdosen;  
— Beschreibung etwaiger Änderungen am Testverfahren;  
— Verweis auf historische Verlaufsdaten zu dem Modell.  
— Beschreibung der zugrunde gelegten Beurteilungskriterien.  
Ergebnisse:  
— tabellarische Darstellung der Daten aus Einzelproben;  
— Beschreibung sonstiger beobachteter Wirkungen.  
Diskussion der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  
4. HINWEISE  
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical 
Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001 doc.nsf/LinkTo/env-jm- 
mono(2001)6.
 
(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/ 
Corrosion (akute Toxizität: Hautreizung/hautätzende Wirkung).  
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. 
(1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity tes ­
ting. The report recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23, 219-255.
 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international va ­
lidation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxic. In Vitro 12, 471-482.
 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team Toxic. In Vitro 12, 483-524.
 
(6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Har ­
monization of Validation and Acceptance Criteria for Alterna ­
tive Toxicological Test Methods, 62 S.  
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., 
Lovell, D.P., Reinhardt, CA., Repetto, G., Sladowski, D., 
Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
 
(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publi ­
cation No. 97-3981. National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam. 
niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 583
 
(9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C, Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C, Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM pre ­
validation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, 371-401.
 
(10) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275- 
280. 
(11) ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365-67.  
(12) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of 
EpiDerm™, EPISKIN™ (EPI-200) and the Rat Skin Transcuta ­
neous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publica ­
tion No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Cen ­
ter for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, Na ­
tional Institute of Environmental Health Sciences, Research Tri ­
angle Park, NC, USA. http:/iccvam.niehs.nih.gov/methods/ epiddocs/epis^rd.pdf.
 
(13) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st 
- 2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27
 th March 2002, OECD ENV/EHS, auf Anfrage beim Sekre ­
tariat erhältlich.  
(14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Pro ­
posed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709-720.
 
(15) Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytotoxi ­
city asssays. J.Immunol. Meth. 65, 55-63.  
(16) Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klaus ­
ner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy tes ­
ting. Toxic. In Vitro 8, 889-891.  
(17) Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural charac ­
terization of reconstructed skin models. International Journal of 
Pharmaceutics. 203, 211-225.  
(18) Tinois E., Gaetani Q., Gayraud B., Dupont D., Rougier A., 
Pouradier D.X. (1994). The Episkin model: Successful recon ­
struction of human epidermis in vitro. In vitro Skin Toxicolo ­
gy. Edited by A. Rougier, A.M. Goldberg and H.I. Maibach: 
133-140.  
(19) Tinois E., Tiollier J., Gaucherand M., Dumas H., Tardy M., 
Thivolet J. (1991). In vitro and post -transplantation differen ­
tiation of human keratinocytes grown on the human type IV 
collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental Cell Research 193, 310-319.
 
(20) Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and Ro ­
senberg, H. (1992). The organotypic culture of human skin 
keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology 9, 163-171.
 
(21) Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., Pa ­
rentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living skin 
construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengi ­
neering 43/8, 747-756.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 584
 
(22) Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A critical 
assessment of the use of microculture tetrazolium assays to 
measure cell growth and function. Growth Regulation 5, 69-84.  
(23) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne', C, Elliot, G.R., Harbell, 
J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation study on  in 
vitro  tests for acute skin irritation: results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. InVitro 15, 57-93.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 585
 
B.41.  IN-VITRO-3T3-NRU-FOTOTOXIZITÄTSTEST  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht OECD TG 432 (2004).  
1.1. EINLEITUNG  
Unter Fototoxizität versteht man die toxische Reaktion eines auf den 
Körper aufgebrachten chemischen Stoffs, die bei anschließender Lichtexposition (in einer bei niedrigerer Dosierung wahrnehmbaren 
Form) entsteht oder verstärkt wird oder die durch Bestrahlung der 
Haut nach systematischer Verabreichung eines chemischen Stoffs induziert wird.
 
Der In-vitro-3T3-NRU-Fototoxizitätstest dient zur Erfassung des fo ­
totoxischen Potenzials einer Testsubstanz, das nach Lichtexposition 
durch die erkannte Chemikalie induziert wird. Bei diesem Test wird 
die Fotozytotoxizität anhand der relativen Reduktion der Viabilität der Zellen, die der Chemikalie ausgesetzt sind, unter Einwirkung bzw. Nichteinwirkung von Licht beurteilt. Die durch diesen Test 
festgestellten Substanzen zeigen nach systemischer Verabreichung 
und Aufbringung auf der Haut oder nach topischer Anwendung in vivo voraussichtlich fototoxische Wirkung.
 
Fototoxische Wirkung wurde bei zahlreichen Arten von Chemikalien 
beobachtet (1) (2) (3) (4). Gemeinsames Merkmal dieser Chemika ­
lien ist, dass sie Lichtenergie im Sonnenlichtbereich absorbieren 
können. Nach dem ersten fotochemischen Gesetz (dem Grotthaus- 
Draperschen-Gesetz) ist für eine Fotoreaktion eine ausreichende Lichtquantenabsorption erforderlich. Bevor biologische Tests in Frage kommen, muss daher nach OECD Test Guideline 101 ein 
UV/vis-Absorptionsspektrum der Testchemikalie ermittelt werden. 
Es wird davon ausgegangen, dass — wenn der molare Extinktions- /Absorptionskoeffizient unter 10 Liter × mol
 -1 × cm  -1 liegt — der 
chemische Stoff kein fotoreaktives Potenzial besitzt. Diese Chemika ­
lie braucht dann evtl. nicht durch den In-vitro-3T3-NRU-Fototoxizi ­
tätstest oder einen anderen biologischen Test auf schädliche fotoche ­
mische Wirkungen getestet zu werden (1) (5). Siehe auch Anlage 1.  
Zuverlässigkeit und Relevanz des In-vitro-3T3-NRU-Fototoxizitäts ­
tests wurden in neuerer Zeit untersucht (6) (7) (8) (9). Es wurde 
nachgewiesen, dass mit dem In-vitro-3T3-NRU-Fototoxizitätstest 
akute fototoxische Wirkungen bei Tieren und Menschen in vivo vorhergesagt werden können. Der Test ist nicht für die Vorhersage schädlicher Wirkungen ausgelegt, die sich aus einer kombinierten 
Wirkung eines chemischen Stoffs und von Licht ergeben, d. h., Fo ­
togenotoxizität, Fotoallergie oder Fotokarzinogenität und andere Er ­
scheinungen werden durch diesen Test nicht erfasst, und auch die Beurteilung der fototoxischen Potenz ist damit nicht möglich. Auch 
indirekte Mechanismen der Fototoxizität, Wirkungen der Stoffwech ­
selprodukte der Testsubstanz oder Wirkungen der Gemische deckt dieser Test nicht ab.
 
Die Verwendung von metabolisierenden Systemen ist bei sämtlichen 
In-vitro-Tests eine generelle Voraussetzung für die Vorhersage des genotoxischen und karzinogenen Potenzials; allerdings liegen bis 
jetzt in der Fototoxikologie nur seltene Fälle vor, in denen eine 
metabolische Transformation erforderlich ist, damit die Chemikalie als In-vivo- oder In-vitro-Fototoxin wirken kann. Daher ist es derzeit weder notwendig noch wissenschaftlich gerechtfertigt, dass der vor ­
liegende Test mit einem Stoffwechselaktivierungssystem durch ­
geführt wird.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 586
 
1.2. DEFINITIONEN  
Bestrahlungsstärke:  die Intensität des auf eine Oberfläche auftref ­
fenden ultravioletten (UV) oder sichtbaren Lichts, gemessen in W/m  2 
oder mW/cm  2 . 
Lichtdosis:  die Menge (= Intensität × Zeit) der auf eine Oberfläche 
auftreffenden ultravioletten (UV) oder sichtbaren Strahlung, aus ­
gedrückt in Joule (= W × s) je Fläche, z. B. J/m  2 oder J/cm  2 . 
UV-Licht, Bandbreiten:  Die von der Internationalen Beleuchtungs ­
kommission (CIE) empfohlenen Bezeichnungen sind: UVA (315- 400 nm), UVB (280-315 nm) und UVC (100-280 nm). Andere Bezeichnungen werden ebenfalls verwendet; die Trennung zwischen 
UVB und UVA erfolgt oft bei 320 nm; UVA kann in UV-A1 und 
UV-A2 unterteilt werden, wobei die Trennung bei ca. 340 nm liegt.
 
Zellviabilität:  Parameter zur Messung der Gesamtaktivität einer 
Zellpopulation (z. B. Aufnahme des Vitalfarbstoffs „Neutralrot“ in 
Zell-Lysosomen), die je nach dem gemessenen Endpunkt und der 
angewandten Versuchsauslegung mit der Gesamtzahl und/oder der Vitalität der Zellen korreliert.
 
Relative Zellviabilität:  Zellviabilität, ausgedrückt in Relation zu 
Negativkontrollen (Lösemittel), die das gesamte Testverfahren (ent ­
weder +Irr oder –Irr) durchlaufen, jedoch nicht mit einer Testche ­
mikalie behandelt wurden.  
PIF (Fotoirritationsfaktor):  ein Faktor, der durch Vergleich von 
zwei gleich wirksamen zytotoxischen Konzentrationen (IC  50 ) der 
chemischen Testsubstanz in Abwesenheit (–Irr) und in Anwesenheit (+Irr) nicht zytotoxischer Strahlung mit UVA/vis-Licht ermittelt 
wird.
 
IC 50 : Konzentration der Testchemikalie, bei der die Zellviabilität um 
50 % reduziert wird.  
MPE (Mean Photo Effect):  eine Messgröße, die von einer mathe ­
matischen Analyse der Konzentrations-Wirkungs-Kurven hergeleitet wurde, die in Abwesenheit (–Irr) und in Anwesenheit (+Irr) nicht zytotoxischer Strahlung mit UVA/vis-Licht erzielt wurden.
 
Fototoxizität:  eine akute toxische Reaktion, die nach der ersten 
Exposition der Haut mit bestimmten chemischen Stoffen bei an ­
schließender Lichtexposition eintritt oder die auf ähnliche Weise durch Bestrahlung der Haut nach systemischer Verabreichung eines 
chemischen Stoffs induziert wird.
 
1.3. PRINZIP DER TESTMETHODE  
Der In-vitro-3T3-NRU-Fototoxizitätstest basiert auf dem Vergleich 
der Zytotoxizität eines chemischen Stoffs, der mit Exposition und ohne Exposition einer nicht zytotoxischen Dosis simulierten Sonnen ­
lichts getestet wird. Die Zytotoxizität wird bei diesem Test aus ­
gedrückt als konzentrationsabhängige Reduktion der Aufnahme des Vitalfarbstoffs Neutralrot, wenn diese 24 Stunden nach der Behand ­
lung mit der Testchemikalie und Bestrahlung gemessen wird (10). 
Neutralrot (NR) ist ein schwach kationischer Farbstoff, der durch 
Nichtdiffusion rasch in Zellmembranen eindringt und sich intrazel ­
lulär in Lysosomen ansammelt. Veränderungen der Zellenoberfläche der sensitiven Lysosomalmembran führen zu lysosomaler Fragilität 
und weiteren Veränderungen, die nach und nach irreversibel werden. 
Derartige, durch die Wirkung von Xenobiotika verursachte Verände ­
rungen bewirken eine verringerte Aufnahme und Bindung von Neu ­
tralrot (NR). Auf diese Weise ist eine Unterscheidung zwischen 
lebensfähigen (viablen), geschädigten und toten Zellen möglich; 
auf dieser Unterscheidung baut auch der hier beschriebene Test auf.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 587
 
Balb/c-3T3-Zellen werden zwecks Bildung eines Monolayers 24 
Stunden kultiviert. Zwei „96-well“-Platten je Testchemikalie werden 
sodann mit acht verschiedenen Konzentrationen der Chemikalie 1 Stunde lang vorinkubiert. Daraufhin wird eine der zwei Platten mit der höchsten nicht zytotoxischen Bestrahlungsdosis bestrahlt, wäh ­
rend die andere Platte im Dunkeln aufbewahrt wird. In beiden Plat ­
ten wird dann das Behandlungsmedium durch ein Kulturmedium ersetzt, und nach weiteren 24 Stunden Inkubation wird die Zellvia ­
bilität anhand der Neutralrot-Aufnahme bestimmt. Die Zellviabilität, 
ausgedrückt als Prozentsatz unbehandelter Lösemittelkontrollen, wird 
für jede Testkonzentration berechnet. Um das fototoxische Potenzial vorherzusagen, wird die mit und ohne Strahlung erzielte Konzentra ­
tions-Wirkungs-Kurve verglichen, in der Regel für den IC
 50 -Wert 
(d. h. die Konzentration, die die Zellviabilität gegenüber unbehan ­
delten Kontrollen um 50 % vermindert).  
1.4. BESCHREIBUNG DER TESTMETHODE  
1.4.1.  Zubereitungen  
1.4.1.1.  Zellen  
Eine permanente Mäuse-Fibroblastenzelllinie — Balb/c 3T3, Klon 
31 — entweder von der American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA, oder von der European Collection of Cell 
Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Vereinigtes Königreich — 
wurde in der Validierungsstudie verwendet und wird daher zur Be ­
schaffung aus einem qualifizierten Zellendepot empfohlen. Andere Zellen oder Zelllinien können erfolgreich mit demselben Testverfah ­
ren verwendet werden, wenn die Kulturbedingungen den spezi ­
fischen Bedürfnissen der Zellen angepasst werden, jedoch muss die gleichwertige Eignung der Zellen nachgewiesen werden.
 
Zellen sollten regelmäßig auf die Abwesenheit von Mykoplasma- 
Kontamination hin geprüft und nur verwendet werden, wenn keine derartige Kontamination festgestellt wird (11).
 
Die UV-Empfindlichkeit der Zellen muss regelmäßig nach den in der 
vorliegenden Verfahrensbeschreibung dargestellten Qualitätssiche ­
rungsverfahren kontrolliert werden. Da die UVA-Sensitivität von 
Zellen mit der erreichbaren Passagenzahl zunehmen kann, sollten 
Balb/c-3T3-Zellen mit einer möglichst niedrigen Passagenzahl, vor ­
zugsweise weniger als 100, verwendet werden (siehe 1.4.2.2.2 und Anlage 2).
 
1.4.1.2.  Medien und Kulturbedingungen  
Für Routine-Zellpassagen und während des Testverfahrens sollten 
geeignete Kulturmedien und Inkubationsbedingungen angewendet werden. Bei Balb/c-3T3-Zellen sind dies DMEM (Dulbecco's Modi ­
fied Eagle's Medium) mit einem Zusatz von 10 % Serum neugebo ­
rener Kälber, 4 mM Glutamin, Penicillin (100 IU) und Streptomycin 
(100 (μg/ml) sowie Feuchtinkubation bei 37
 o C, 5-7,5 % CO  2 (je 
nach Puffer, siehe Abschnitt 1.4.1.4, zweiter Absatz). Es ist dabei 
besonders wichtig, dass die Zell-Kulturbedingungen eine Zellzyklus ­
zeit innerhalb des normalen historischen Bereichs der verwendeten Zellen oder Zelllinien sicherstellen.
 
1.4.1.3.  Ansetzen der Kulturen  
Zellen aus tiefgefrorenen Mutterkulturen werden in einem Kulturme ­
dium in angemessener Dichte ausgesät und mindestens einmal vor 
ihrer Verwendung im In-vitro-3T3-NRU-Fototoxizitätstest passagiert.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 588
 
Für den Fototoxizitätstest werden Zellen in einem Kulturmedium in 
einer geeigneten Dichte ausgesät, die sicherstellt, dass die Kulturen 
zum Ende des Tests, d. h. wenn die Zellviabilität 48 Stunden nach dem Aussäen der Zellen bestimmt wird, ihre maximale Dichte (Kon ­
fluenz) noch nicht erreicht haben. Für Balb/c 3-T3-Zellen, die in 
„96-well“-Platten kultiviert werden, beträgt die empfohlene Zell ­
dichte 1 × 10
 4 Zellen je „well“.  
Für jede Testchemikalie werden Zellen identisch in zwei separate 
„96-well“-Platten ausgesät, die sodann gleichzeitig während des ge ­
samten Testverfahrens unter identischen Kulturbedingungen behan ­
delt werden, abgesehen von dem Zeitraum, in dem eine der Platten 
(+Irr) bestrahlt und die andere im Dunkeln (–Irr) aufbewahrt wird.  
1.4.1.4.  Zubereitung der Testsubstanzen  
Testchemikalien müssen unmittelbar vor ihrer Verwendung frisch 
zubereitet werden, es sei denn, Haltbarkeitsdaten rechtfertigen eine Lagerung der Präparation. Es wird empfohlen, die Behandlung sämt ­
licher Chemikalien und die Erstbehandlung der Zellen unter Aus ­
leuchtungsbedingungen durchzuführen, bei denen eine Fotoaktivie ­
rung oder Degradation der Testsubstanz vor der Bestrahlung vermie ­
den wird.
 
Die Testchemikalien sollten in einer gepufferten Salzlösung, z. B. 
EBSS (Earle's Balanced Salt Solution), oder anderen physiologisch 
ausgewogenen Pufferlösungen, gelöst werden, die, um Interferenzen 
während der Bestrahlung zu vermeiden, frei sein müssen von Pro ­
teinbestandteilen und Licht absorbierenden Bestandteilen (z. B. pH- Indikationsfarben und Vitaminen). Da die Zellen während der Be ­
strahlung ca. 50 Minuten lang außerhalb des CO
 2 -Inkubators auf ­
bewahrt werden, ist sorgfältig darauf zu achten, dass eine Alkalisie ­
rung vermieden wird. Werden schwache Pufferlösungen wie EBSS verwendet, lässt sich dies erreichen, indem die Inkubation der Zellen 
unter 7,5 %igem CO
 2 erfolgt. Werden die Zellen bei nur 5 %igem 
CO 2 inkubiert, ist eine stärkere Pufferlösung zu verwenden.  
Testchemikalien mit eingeschränkter Wasserlöslichkeit sind in einem 
geeigneten Lösemittel zu lösen. Wird ein Lösemittel verwendet, muss es in allen Kulturen mit konstantem Volumen vorhanden sein, 
d. h. in den Negativkontrollen (Lösemittelkontrollen) sowie in sämt ­
lichen Konzentrationen der Testchemikalie, und darf bei dieser Kon ­
zentration keine zytotoxische Wirkung zeigen. Die Konzentrationen der Testchemikalien sind so zu wählen, dass Ausfällungen oder Trü ­
bungen der Lösung vermieden werden.
 
Dimethylsulfoxid (DMSO) und Ethanol (EtOH) werden als Lösemit ­
tel empfohlen. Andere Lösemittel mit geringer Zytotoxizität sind unter Umständen ebenfalls geeignet. Vor der Verwendung sind je ­
doch alle Lösemittel sorgfältig auf spezifische Eigenschaften zu un ­
tersuchen, wie Reaktion mit der Testchemikalie, Auslöschen der 
fototoxischen Wirkung, Einfangen von Radikalen und/oder Stabilität der Chemikalie im Lösemittel.
 
Wirbelmischung (Vortex) und/oder Anwendung von Ultraschall 
und/oder Erwärmung auf geeignete Temperaturen kommen als Mög ­
lichkeiten in Betracht, um die Löslichkeit zu fördern, sofern hier ­
durch nicht die Stabilität der Testchemikalie beeinträchtigt wird.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 589
 
1.4.1.5.  Bestrahlungsbedingungen  
1.4.1.5.1. L i c h t q u e l l e  
Die Wahl der geeigneten Lichtquelle und geeigneter Filter ist ein 
kritischer Faktor bei den Fototoxizitätstests. Für fototoxische In-vi ­
vo-Reaktionen sind in der Regel UVA und sichtbare Bereiche ver ­
antwortlich (3) (12), während UVB weniger relevant, aber selbst 
hochgradig zytotoxisch ist, da seine Zytotoxizität zwischen 313 
und 280 nm um ein Tausendfaches zunimmt (13). Kriterien für die Wahl einer geeigneten Lichtquelle müssen die wesentliche Voraus ­
setzung einschließen, dass die Lichtquelle Wellenlängen aussendet, 
die von der chemischen Testsubstanz absorbiert werden (Absorpti ­
onsspektrum), und dass die (in einer akzeptablen Zeit erreichbare) Lichtdosis für den Nachweis bekannter fotozytotoxischer Chemika ­
lien ausreichen muss. Darüber hinaus dürfen die jeweils verwendeten 
Wellenlängen und Dosen, z. B. der Wärmeemission (Infrarotbereich), 
für das Testsystem nicht unnötig schädlich sein.
 
Die Simulierung von Sonnenlicht mit Solarsimulatoren wird als op ­
timale Kunstlichtquelle betrachtet. Die Strahlungsleistungsverteilung des gefilterten Solarsimulators muss der in (14) dargestellten Ver ­
teilung von Tageslicht im Freien entsprechen. Sowohl Xenon-Licht ­
bogenlampen als auch (dotierte) Quecksilber-Metallhalogenid-Licht ­
bogenlampen werden in Solarsimulatoren verwendet (15). Letztere haben den Vorteil, dass sie weniger Wärme emittieren und preis ­
werter sind, doch ist die Übereinstimmung mit dem Sonnenlicht 
weniger perfekt als bei Xenon-Lichtbogenlampen. Da alle Solarsimu ­
latoren signifikante Mengen UVB aussenden, müssen sie mit geeig ­
neten Filtern versehen werden, um die hoch zytotoxischen UVB- Wellenlängen zu mindern. Da die Kunststoffmaterialien für Zellkul ­
turen UV-Stabilisatoren enthalten, muss das Spektrum durch den 
gleichen „96-well“-Plattendeckel gemessen werden, wie er auch in dem Versuch verwendet wird. Unabhängig von Maßnahmen zur Dämpfung eines Teils des Spektrums durch Filterung oder durch 
unvermeidbare Filtereffekte der Testeinrichtungen darf das unterhalb 
dieser Filter aufgezeichnete Spektrum nicht vom standardisierten Ta ­
geslicht im Freien abweichen (14). Die spektrale Energieverteilung des in der Validierungsstudie zum In-vitro-3T3-NRU-Fototoxizitäts ­
test verwendeten gefilterten Solarsimulators wurde als Beispiel ver ­
öffentlicht (8) (16). Siehe dazu auch Anlage 2, Abbildung 1.
 
1.4.1.5.2. D o s i m e t r i e  
Die Lichtintensität (Bestrahlungsstärke) sollte regelmäßig vor jedem 
Fototoxizitätstest unter Verwendung eines geeigneten Breitband-UV- Meters geprüft werden. Die Lichtintensität ist durch die gleiche Aus ­
führung der „96-well“-Plattendeckel zu messen, wie sie auch in dem 
Versuch verwendet wird. Das UV-Meter muss für die Lichtquelle kalibriert sein. Die Leistungsfähigkeit des UV-Meters ist sicher ­
zustellen. Zu diesem Zweck wird die Verwendung eines zweiten 
Referenz-UV-Meters des gleichen Typs und der gleichen Kalibrie ­
rung empfohlen. Im Idealfall sollte in größeren Abständen mit einem Spektroradiometer die spektrale Energieverteilung der gefilterten Lichtquelle gemessen und die Kalibrierung des Breitband-UV-Meters 
geprüft werden.
 
Eine Dosis von 5 J/cm  2 (im UVA-Bereich gemessen) wurde als nicht 
zytotoxisch gegenüber Balb/c-3T3-Zellen und als ausreichend stark 
ermittelt, um fototoxische Chemikalien zu erkennen und damit foto ­
toxische Reaktionen auszulösen (6) (17); so wurde beispielsweise die Bestrahlungsstärke auf 1,7 mW/cm
 2 eingestellt, um innerhalb von 50 
Minuten 5 J/cm  2 zu erreichen. Siehe hierzu Anlage 2, Abbildung 
2. Wenn eine andere Zelllinie oder eine unterschiedliche Lichtquelle verwendet wird, muss die UVA-Dosis ggf. so angepasst werden, dass Unschädlichkeit gegenüber Zellen und eine ausreichende Stärke 
zur Erkennung von Standardfototoxinen gegeben ist. Die Zeit der 
Lichtexposition wird auf folgendem Wege berechnet:
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 590
 
tðminÞ ¼ Strahlungsdosis ðJ=cm 2 Þ Ü 1000 
Strahlung ðmW =cm 2 Þ Ü 60 (1 J = 1 Wsec)  
1.4.2.  Testbedingungen  
1.4.2.1.  Konzentrationen der Testsubstanz  
Die in Anwesenheit (+Irr) und in Abwesenheit (–Irr) von Licht zu 
testenden Konzentrationsbereiche eines chemischen Stoffs sollten in Dosis-Vorversuchen auf angemessene Weise ermittelt werden. Ggf. empfiehlt es sich, die Löslichkeit eingangs und nach 60 min (bzw. 
nach der jeweils zugrunde gelegten Behandlungszeit) zu ermitteln, da 
sich die Löslichkeit zeitabhängig oder im Belichtungsverlauf ändern kann. Um eine durch ungeeignete Bedingungen der Kulturen oder hochgradig saure oder alkalische Chemikalien verursachte Toxizität 
zu vermeiden, muss der pH-Wert der Zellkulturen mit zugesetzter 
Testchemikalie im Bereich zwischen 6,5 und 7,8 liegen.
 
Die höchste Konzentration der Testsubstanz muss innerhalb der phy ­
siologischen Testbedingungen liegen, d. h., osmotischer Stress und pH-Stress sind zu vermeiden. Je nach Testchemikalie sind ggf. an ­
dere physikalisch-chemische Eigenschaften als Faktoren in Betracht 
zu ziehen, durch die die höchste Testkonzentration begrenzt wird. Bei relativ unlöslichen Substanzen, die bei Konzentrationen bis zum Sättigungspunkt nicht toxisch sind, ist die höchste erreichbare Kon ­
zentration zu verwenden. Grundsätzlich ist eine Ausfällung der Test ­
chemikalie bei einer der Testkonzentrationen zu vermeiden. Die Ma ­
ximalkonzentration der Testsubstanz darf 1 000 ( μg/ml nicht über ­
schreiten; die Osmolalität darf 10 mmol nicht überschreiten. Es ist 
eine geometrische Verdünnungsreihe von 8 Testsubstanzenkonzen ­
trationen mit konstantem Verdünnungsfaktor zu verwenden (siehe Abschnitt 2.1, zweiter Absatz).
 
Liegen (aus Vorversuchen) Informationen darüber vor, dass die 
Testchemikalie bis zur Grenzkonzentration im Dunkelversuch (–Irr) 
nicht zytotoxisch ist, aber bei Bestrahlung (+Irr) hochgradig zytoto ­
xisch ist, können die Konzentrationsbereiche, die für den (+Irr)-Ver ­
such zugrunde gelegt werden müssen, von den Bereichen für den 
(–Irr)-Versuch abweichen, damit die Forderung einer ausreichenden 
Datenqualität erfüllt ist.  
1.4.2.2.  Kontrollen  
1.4.2.2.1. S t r a h l u n g s e m p f i n d l i c h k e i t d e r Z e l l e n , E r m i t t ­
l u n g h i s t o r i s c h e r D a t e n  
Die Zellen sind regelmäßig (etwa jede fünfte Passage) auf Empfind ­
lichkeit gegenüber der Lichtquelle zu kontrollieren; dazu wird ihre Viabilität nach Belichtung mit steigenden Strahlungsdosen beurteilt. Bei dieser Beurteilung sind mehrere verschiedene Strahlungsdosen 
— einschließlich Dosen, die deutlich über denen des 3T3-NRU-Fo ­
totoxizitätstests liegen — zu verwenden. Eine Quantifizierung dieser Dosen ist am einfachsten durch Messung der UV-Anteile der Licht ­
quelle möglich. Die Zellen werden mit der im In-vitro-3T3-NRU- 
Fototoxizitätstest verwendeten und am darauf folgenden Tag be ­
strahlten Dichte ausgesät. Die Zellviabilität wird einen Tag später anhand der Aufnahme von Neutralrot ermittelt. Es muss sich nach ­
weisen lassen, dass die resultierende höchste nicht zytotoxische Do ­
sis (z. B. in der Validierungsstudie: 5 J/cm
 2 (UVA)) für eine korrekte 
Klassifizierung der Referenzchemikalien (Tabelle 1) ausreicht.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 591
 
1.4.2.2.2. S t r a h l u n g s e m p f i n d l i c h k e i t , K o n t r o l l e d e s l a u ­
f e n d e n T e s t s  
Der Test erfüllt die Qualitätskriterien, wenn die bestrahlten Negativ- 
/Lösemittelkontrollen im Vergleich zu nicht bestrahlten Negativ-/ ­
Lösemittelkontrollen eine Viabilität von mehr als 80 % aufweisen.  
1.4.2.2.3. V i a b i l i t ä t d e r L ö s e m i t t e l k o n t r o l l e n  
Die absolute optische Dichte (OD  540 NRU  ) des aus den Lösemittel ­
kontrollen extrahierten Neutralrot gibt an, ob die je „well“ ausgesä ­
ten 1 × 10  4 Zellen bei normaler Verdopplungszeit während der zwei 
Tages des Tests gut gewachsen sind. Der Test erfüllt die Akzeptanz ­
kriterien, wenn der mittlere OD  540 NRU  der unbehandelten Kontrollen 
> 0,4 ist (d. h. rund das Zwanzigfache des Hintergrund-Lösemittel ­
absorptionsmaßes).  
1.4.2.2.4. P o s i t i v k o n t r o l l e  
Ein bekannter fototoxischer chemischer Stoff soll zeitgleich mit je ­
dem In-vitro-3T3-NRU-Fototoxizitätstest getestet werden. Chlorpro ­
mazin (CPZ) wird empfohlen. Für mit dem Standardprotokoll im In- 
vitro-3T3-NRU-Fototoxizitätstest getestetes CPZ wurden folgende Test-Akzeptanzkriterien festgelegt: bestrahltes CPZ (+Irr): IC
 50 = 
0,1 bis 2,0 μg/ml, nicht bestrahltes CPZ (–Irr): IC  50 = 7,0 bis 90,0 
μg/ml. Der Fotoirritationsfaktor (PIF) sollte > 6 sein. Das historische 
Verhalten der Positivkontrolle ist zu überwachen.  
Andere bekannte, für die Chemikalienklasse oder Löslichkeitsmerk ­
male der bewerteten Chemikalie geeignete fototoxische Chemikalien 
können an Stelle von Chlorpromazin als gleichzeitige Positivkontrol ­
len verwendet werden.  
1.4.3.  Testverfahren (6) (7) (8) (16) (17)  
1.4.3.1.  l. Tag  
100 μl Kulturmedium werden in die peripheren „wells“ einer „96- 
well“-Gewebekultur-Mikrotiterplatte gegeben (= Blindproben). In die übrigen „wells“ werden 100 μl der Zellsuspension von 1 × 10
 5 
Zellen/ml (= 1 × 10  4 Zellen/well) pipettiert. Für jede Reihe einzelner 
Testsubstanzkonzentrationen werden zwei Platten zubereitet; eine weitere Platte wird für die Lösemittel- und Positivkontrollen zuberei ­
tet.
 
Die Zellen werden 24 Stunden lang (siehe 1.4.1.2) inkubiert, bis sie 
einen halbkonfluenten Monolayer bilden. Diese Inkubationszeit er ­
möglicht die Erholung der Zellen, das Anhaften und ein exponen ­
tielles Wachstum.  
1.4.3.2.  2. Tag  
Nach der Inkubation wird das Kulturmedium dekantiert. Darauf folgt 
ein Waschgang mit der für die Inkubation verwendeten Pufferlösung. 
100 μl der Pufferlösung, welche die geeignete Konzentration der 
Testchemikalie oder des Lösemittels (Lösemittelkontrolle) enthält, werden hinzugefügt. Es sind 8 verschiedene Konzentrationen der Testchemikalie zu verwenden. Die Zellen werden mit der Testche ­
mikalie im Dunkeln 60 Minuten lang inkubiert (siehe 
Abschnitt 1.4.1.2 und Abschnitt 1.4.1.4, zweiter Absatz).
 
Aus den zwei für jede Reihe der Testsubstanzkonzentrationen und 
Kontrollen vorbereiteten Platten wird — normalerweise willkürlich — eine Platte für die Bestimmung der Zytotoxizität (–Irr) ausgewählt 
(d. h. die Kontrollplatte) sowie eine Platte (die Behandlungsplatte) 
für die Bestimmung der Fotozytotoxizität (+Irr).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 592
 
Zur Durchführung der +Irr-Belichtung werden die Zellen bei Raum ­
temperatur 50 Minuten lang durch den Deckel der „96-well“-Platte 
mit der höchsten Strahlungsdosis bestrahlt, die nicht zytotoxisch ist (siehe auch Anlage 2). Nicht bestrahlte Platten (–Irr) werden 50 Minuten lang (= Lichtexpositionszeit) bei Raumtemperatur in einem 
dunklen Kasten gehalten.
 
Die Testflüssigkeit wird dekantiert. Es folgen zwei Waschgänge mit 
150 μl der für die Inkubation verwendeten Pufferlösung, jedoch ohne 
das Testmaterial. Die Pufferlösung wird durch ein Kulturmedium ersetzt und über Nacht (18-22 h) inkubiert (siehe 1.4.1.2).
 
1.4.3.3.  3. Tag  
1.4.3.3.1. M i k r o s k o p i s c h e E v a l u i e r u n g  
Die Zellen werden unter einem Phasen-Kontrast-Mikroskop auf 
Wachstum, Morphologie und Intaktheit der Monolayer untersucht. Morphologische Veränderungen der Zelle und Wirkungen auf das Zellwachstum sind aufzuzeichnen.
 
1.4.3.3.2. N e u t r a l r o t - A u f n a h m e - T e s t  
Die Zellen werden mit 150 μl vorgewärmter Pufferlösung ge ­
waschen. Die Waschlösung wird durch vorsichtiges Absaugen ent ­
fernt. 100 μl einer 50 μg/ml Neutralrotsubstanz (NR) (3-Amino-7- 
Dimethylamino-2-Methylphenazin-Hydrochlorid, EINECS-Nummer 
209-035-8, CAS-Nummer 553-24-2, C.I. 50040) in einem Medium 
ohne Serum werden hinzugefügt (16) und 3 Stunden lang gemäß den Angaben in Abschnitt 1.4.1.2 inkubiert. Nach der Inkubation wird das NR-Medium entfernt, und die Zellen werden mit 150 μl Puff­
erlösung gewaschen. Die überschüssige Pufferlösung wird vollkom ­
men dekantiert und durch Absaugen oder Zentrifugieren entfernt.
 
Es werden genau 150 μl NR-Desorptionslösung (frisch zubereitet aus 
49 Teilen Wasser + 50 Teilen Ethanol + 1 Teil Essigsäure) hin ­
zugefügt.  
Die Mikrotiter-Platte wird 10 Minuten lang auf einem Mikrotiter- 
Platten-Schüttler vorsichtig geschüttelt, bis das NR aus den Zellen 
extrahiert ist und eine homogene Lösung bildet.  
Die optische Dichte der NR-Extrakte wird bei 540 nm in einem 
Spektralfotometer gemessen, wobei die Blindproben als Referenz verwendet werden. Die Daten sind in angemessenem Dateiformat 
für spätere Analysen aufzuzeichnen.
 
2. DATEN  
2.1. QUALITÄT UND QUANTITÄT DER DATEN  
Die Testdaten sollten eine sinnvolle Analyse der in Anwesenheit und 
in Abwesenheit von Strahlung ermittelten Konzentrations-Wirkungs- Reaktionen sowie, wenn möglich, die Konzentration der Testche ­
mikalien, bei der die Zellviabilität auf 50 % (IC
 50 ) sinkt, ermögli ­
chen. Sofern Zytotoxizität festgestellt wird, sollten sowohl der Kon ­
zentrationsbereich als auch der Abstand einzelner Konzentrationen so gewählt sein, dass die experimentellen Daten in einer Kurve dar ­
gestellt werden können.
 
Bei klar positiven und klar negativen Ergebnissen (siehe 
Abschnitt 2.3, erster Absatz) ist gegebenenfalls der Hauptversuch 
— begleitet von einem oder mehreren Vorversuchen — ausreichend.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 593
 
Mehrdeutige, grenzwertige oder unklare Ergebnisse sind durch wei ­
tere Tests abzuklären (siehe hierzu auch Abschnitt 2.4, zweiter Ab ­
satz). In derartigen Fällen ist auch eine Änderung der Versuchsbedin ­
gungen in Betracht zu ziehen. Zu den Versuchsbedingungen, die geändert werden könnten, zählen der Konzentrationsbereich und 
-raum, die Vorinkubationszeit und die Strahlungsexpositionszeit. 
Für Chemikalien, die in Wasser instabil sind, ist evtl. eine kürzere Expositionszeit ausreichend.
 
2.2. ERGEBNISBEWERTUNG  
Zur Evaluierung der Daten kann ein Fotoirritationsfaktor (PIF) oder 
der Mean Photo Effect (MPE) berechnet werden.  
Zur Berechnung der Maße für die Fotozytotoxizität (siehe unten) 
müssen die Dosis-Wirkungs-Werte näherungsweise durch eine geeig ­
nete kontinuierliche Dosis-Wirkungs-Kurve (Modell) dargestellt wer ­
den. Die Anpassung der Kurve an die Daten erfolgt normalerweise 
nach dem nichtlinearen Regressionsverfahren (18). Zur Beurteilung des Einflusses der Datenvariabilität auf die angepasste Kurve wird die Verwendung eines Bootstrap-Verfahrens empfohlen.
 
Der Fotoirritationsfaktor (PIF) wird nach der folgenden Formel be ­
rechnet:  
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
Ist die Berechnung von IC  50 bei Anwesenheit oder Abwesenheit von 
Licht nicht möglich, kann der PIF des Testmaterials nicht ermittelt 
werden. Der MPE (Mean Photo Effect) basiert auf dem Vergleich der vollständigen Konzentrations-Wirkungs-Kurven (19). Er wird de ­
finiert als der gewichtete Durchschnitt einer repräsentativen Gruppe 
von Fotoeffektwerten.
 
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
Der Fotoeffekt PE  c bei einer beliebigen Konzentration C ist definiert 
als das Produkt des Wirkungseffekts RE  c und des Dosiseffekts DE  c , 
d. h. PE  c = RE  c × DE  c . Der Wirkungseffekt RE  c bezeichnet die 
Differenz zwischen den bei Abwesenheit und Anwesenheit von Licht 
ermittelten Wirkungen, d. h. RE  c = R  c (–Irr) — R  c (+Irr). Der Dosis ­
effekt wird ausgedrückt durch  
DE  c ¼ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ
 
Dabei stellt C* die Äquivalenzkonzentration dar, d. h. die Konzen ­
tration, bei der die +Irr-Wirkung der –Irr-Wirkung bei Konzentration C entspricht. Kann C* nicht ermittelt werden, weil die Wirkungs ­
werte der +Irr-Kurve systematisch über oder unter RC(–Irr) liegen, 
wird der Dosiseffekt gleich 1 gesetzt. Die Gewichtungsfaktoren w
 i 
werden durch den höchsten Wirkungswert ausgedrückt, d. h. w  i = 
MAX {R  i (+Irr), R  i (–Irr)}. Das Konzentrationsgitter C  i wird so 
gewählt, dass die gleiche Anzahl Punkte in jedes der Konzentrations ­
intervalle fällt, die durch die im Versuch verwendeten Konzentrati ­
onswerte definiert sind. Die Berechnung von MPE wird auf den maximalen Konzentrationswert beschränkt, bei dem mindestens eine der beiden Kurven noch einen Wirkungswert von mindestens 
10 % aufweist. Liegt diese Maximalkonzentration über der höchsten 
Konzentration, die im +Irr-Versuch verwendet wurde, wird der rest ­
liche Teil der +Irr-Kurve gleich dem Wirkungswert „0“ gesetzt. Je nachdem, ob der MPE-Wert größer als ein auf geeignete Weise 
gewählter Schwellenwert (MPEc = 0,15) ist oder nicht, wird die 
Chemikalie als fototoxisch eingestuft.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 594
 
Ein Softwarepaket für die Berechnung von PIF und MPE ist bei (20) 
erhältlich.  
2.3. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Nach der Validierungsstudie (8) bedeutet eine Testsubstanz mit PIF 
< 2 oder MPE < 0,1 die Prognose „keine Fototoxizität“. Ein PIF > 2 und < 5 oder ein MPE > 0,1 und < 0,15 entspricht der Prognose: 
„Fototoxizität wahrscheinlich“; ein PIF > 5 oder ein MPE > 0,15 
bedeutet: „Fototoxizität“.
 
Bei jedem Labor, das den einleitenden Aufbau dieses Versuchs vor ­
nimmt, sind die in Tabelle 1 aufgeführten Referenzmaterialien zu testen, bevor die Testsubstanzen zur fototoxischen Beurteilung getes ­
tet werden. Die PIF- oder MPE-Werte müssen in Nähe der in Tabelle 
1 angegebenen Werte liegen.
 
Tabelle 1  
Bezeichnung der 
Chemikalie EINECS-Nr. CAS-Nr. PIF MPE Absorptions ­
peak Lösemittel (  1 ) 
Amiodaron HCl 243-293-2 [19774-82-4] >3,25 0,27 - 0,54 242 nm 
300 nm 
(Schulter) Ethanol 
Choloropro ­
mazin HCl 200-701-3 [69-09-0] >14,4 0,33 - 0,63 309 nm Ethanol 
Norfloxacin 274-614-4 [70458-96-7] >71,6 0,34 - 0,90 316 nm Acetonitril 
Anthracen 204-371-1 [120-12-7] >18,5 0,19 - 0,81 356 nm Acetonitril 
Protoporphyrin 
IX, Dinatrium 256-815-9 [50865-01-5] >45,3 0,54 - 0,74 402 nm Ethanol 
L-Histidin [7006-35-1] kein PIF 0,05 - 0,10 211 nm Wasser 
Hexacholoro ­
phen 200-733-8 [70-30-4] 1,1 - 1,7 0,00 - 0,05 299 nm 
317 nm 
(Schulter) Ethanol 
Natriumlauryl ­
sulfat 205-788-1 [151-21-3] 1,0 - 1,9 0,00 - 0,05 Keine Ab ­
sorption Wasser  
( 1 ) Lösemittel für die Messung der Absorption.  
2.4. INTERPRETATION DER DATEN  
Werden fototoxische Wirkungen nur bei der höchsten Testkonzen ­
tration festgestellt (insbesondere bei wasserlöslichen Testchemika ­
lien), sind zur Gefahrenbeurteilung evtl. noch weitere Gesichtspunkte in Betracht zu ziehen, so z. B. Daten zur Absorption über die Haut sowie zur Ansammlung der Chemikalie in der Haut und/oder Daten 
aus anderen Tests, z. B. In-vitro-Tests der Chemikalie auf tierischer 
bzw. menschlicher Haut oder Hautmodellen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 595
 
Wird keine Toxizität nachgewiesen (+Irr und –Irr) und sind die 
Konzentrationen, die getestet werden können, durch mangelhafte 
Löslichkeit begrenzt, ist die Vergleichbarkeit der Testsubstanz mit dem durchgeführten Test zweifelhaft; in diesem Fall ist die Durch ­
führung konfirmativer Tests, z. B. mit einem anderen Modell, in 
Betracht zu ziehen.
 
3. BERICHTERSTATTUNG  
TESTBERICHT  
Der Testbericht muss mindestens folgende Informationen umfassen:  
Testsubstanz:  
— Kenndaten, übliche generische Namen und IUPAC- und CAS- 
Nummern, sofern bekannt,  
— physikalische Eigenschaften und Reinheit,  
— physikalisch-chemische Eigenschaften, die für die Durchführung 
der Studie relevant sind,  
— UV/vis-Absorptionsspektrum,  
— Stabilität und Fotostabilität, sofern bekannt;  
Lösemittel:  
— Begründung der Wahl des Lösemittels,  
— Löslichkeit der Testchemikalie in diesem Lösemittel,  
— Prozentsatz des in dem Behandlungsmedium vorhandenen Löse ­
mittels;  
Zellen:  
— Art und Quelle der Zellen,  
— Fehlen von Mykoplasma,  
— Zahl der Zellpassagen, sofern bekannt,  
— Strahlungssensitivität von Zellen, bestimmt mit dem im In-vitro- 
3T3-NRU-Fototoxizitätstest verwendeten Bestrahlungsgerät;  
Testbedingungen (1);  Inkubation vor und nach der Behandlung:  
— Art und Zusammensetzung des Kulturmediums,  
— Inkubationsbedingungen (CO  2 -Konzentration, Temperatur, 
Feuchtigkeit),  
— Inkubationsdauer (Vorbehandlung, Nachbehandlung);  
Testbedingungen (2);  Behandlung mit der Chemikalie:  
— Begründung der Wahl der in Anwesenheit und in Abwesenheit 
von Strahlungseinwirkung verwendeten Konzentrationen der 
Testchemikalie,  
— im Falle beschränkter Löslichkeit der Testchemikalie und bei 
Abwesenheit von Zytotoxizität: Begründung der höchsten getes ­
teten Konzentration,  
— Art und Zusammensetzung des Behandlungsmediums (gepufferte 
Salzlösung),  
— Dauer der chemischen Behandlung;  
Testbedingungen (3);  Bestrahlung:  
— Begründung der Wahl der verwendeten Lichtquelle,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 596
 
— Hersteller und Art der Lichtquelle und des Radiometers,  
— Charakterisierung der spektralen Energieverteilung der 
Lichtquelle,  
— Durchlass-/Absorptionsmerkmale des bzw. der verwendeten 
Filter  
— Merkmale des Strahlenmessgeräts und Einzelheiten der Kalibrie ­
rung,  
— Abstand der Lichtquelle vom Testsystem,  
— UVA-Strahlung bei dieser Entfernung, ausgedrückt in mW/cm  2 , 
— Dauer der UV/vis-Lichtexposition,  
— UVA-Dosis (Strahlung × Zeit), ausgedrückt in J/cm  2 , 
— Temperatur der Zellkulturen während der Bestrahlung und der 
gleichzeitig im Dunkeln gehaltenen Zellkulturen;  
Testbedingungen (4);  Neutralrot-Viabilitätstest:  
— Zusammensetzung des Neutralrot-Mediums,  
— Dauer der Neutralrot-Inkubation,  
— Inkubationsbedingungen (CO  2 -Konzentration, Temperatur, 
Feuchtigkeit),  
— Neutralrot-Extraktionsbedingungen (Extraktionsmittel, Dauer),  
— Wellenlänge, die für die fotometrische Messung der optischen 
Dichte von Neutralrot verwendet wurde,  
— zweite Referenzwellenlänge, sofern verwendet,  
— Inhalt der fotometrischen Referenz (Blindprobe), sofern verwen ­
det; 
Ergebnisse:  
— bei den einzelnen Konzentrationen der Testchemikalie ermittelte 
Zellviabilität, ausgedrückt als Prozentsatz der mittleren Viabilität 
der Lösemittelkontrollen,  
— Konzentrations-Wirkungs-Kurven (Konzentration der Testche ­
mikalie vs. relative Zellviabilität) der gleichzeitig durchgeführten 
+Irr- und –Irr-Versuche,  
— Analyse der Konzentrations-Wirkungs-Kurven: sofern möglich, 
Angabe der IC  50 (+Irr)- und IC  50 (–Irr)-Werte,  
— Vergleich der zwei in Anwesenheit und in Abwesenheit von 
UVA/vis-Bestrahlung ermittelten Konzentrations-Wirkungs-Kur ­
ven entweder durch Berechnung des Fotoirritationsfaktors (PIF) 
oder durch Berechnung des Mean Photo Effect (MPE),  
— Testakzeptanzkriterien; Lösemittelkontrolle des Tests,  
— absolute Viabilität (optische Dichte des NR-Extrakts) von be ­
strahlten und nicht bestrahlten Zellen,  
— historische Daten zur Negativkontrolle, Mittelwerte und Stan ­
dardabweichungen,  
— Testakzeptanzkriterien, Positivkontrolle des Tests,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 597
 
— IC  50 (+Irr) und IC  50 (–Irr) und PIF/MPE der Positivkontroll-Che ­
mikalie,  
— historische Daten zur Positivkontroll-Chemikalie: IC  50 (+Irr) und 
IC 50 (–Irr) und PIF/MPE, Mittelwerte und Standardabweichungen;  
Diskussion der Ergebnisse;  
Schlussfolgerungen.  
4. LITERATURHINWEISE  
(1) Lovell W.W. (1993). A scheme for  in vitro  screening of sub ­
stances for photoallergenic potential. Toxic. In Vitro 7, 95-102.  
(2) Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In „Research Progress in Organic, Biological and Medicinal Chemistry“ Vol. 3 part 1. North Holland Publishing Co. Amsterdam, XI-XXXV.
 
(3) Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., Mau ­
rer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and Sla ­
dowski, D. (1994).  In vitro  phototoxicity testing: The report 
and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 314-348.
 
(4) Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In „The science of 
Photobiology“ Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New York. 2nd edition, 79-110.
 
(5) OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No.7 „Guidance Document On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water“ Envi ­
ronment Directorate, OECD, Paris.
 
(6) Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., Kal ­
weit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, 
W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on  in vitro  photo­
toxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell 
phototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8, 793-796.
 
(7) Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European 
Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3. November 1997, ATLA, 26, 7-8.
 
(8) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pecho ­
vitch, G. De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, 
P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., 
Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EU/ ­
COLIPA  In vitro  phototoxicity validation study: results of 
phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. 
Toxic. In Vitro 12, 305-327.
 
(9) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Ber ­
lin, 30th-31th October 2001, Secretariat's Final Summary Re ­
port, 15  th March 2002, OECD ENV/EHS; auf Anfrage beim 
Sekretariat erhältlich.  
(10) Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determina ­
tion in vitro  by morphological alterations and neutral red ab ­
sorption. Toxicology Lett., 24, 119-124.  
(11) Hay, RJ. (1988) The seed stock concept and quality control for 
cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225-237.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 598
 
(12) Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In „Dermatotoxicology“, edi ­
ted by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, 515-530.
 
(13) Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epi ­
dermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825-1829.  
(14) ISO 10977. (1993). Photography — Processed photographic 
colour films and paper prints — Methods for measuring image stability.
 
(15) Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, Vienna, 1993, ISBN 3900734275
 
(16) ZEBET/ECVAM/COLIPA — Standard Operating Procedure:  
In Vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 Sep ­
tember, 1998. 18 S.  
(17) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter 
chemicals from Annex VII of the European Union  Directive 
76/768/EEC,  in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test. 
ATLA 26, 679-708.
 
(18) Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical mo ­
deling of cellular responses to external signals. J. Biol. Sys ­
tems 3, 127-138.  
(19) Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of  in vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, 445-462.
 
(20) http://www.oecd.org/document/55/0.2340.en_2649_34377_234 
9687_l_l_l_1.00. html  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 599
 
Anlage 1  
Rolle des 3T3 NRU-PT in einer sequenziellen Prüfstrategie für Fototoxizitätstests 
von Chemikalien
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 600
 
Anlage 2  
Abbildung 1  
Spektrale Leistungsverteilung eines gefilterten Solarsimulators
  
(Siehe 1.4.1.5, zweiter Absatz)  
Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für eine akzeptable spektrale Leistungsverteilung eines gefilterten 
Solarsimulators. Sie stammt aus der Quelle mit dotiertem Metallhalid, die im Validierungsversuch 
des 3T3-NRU-PT verwendet wurde (6) (8) (17). Die Wirkung der beiden verschiedenen Filter und der zusätzliche Filtereffekt des Deckels einer „96-well“-Zellkulturplatte werden hier dargestellt. Der H2-Filter wurde nur mit Testsystemen verwendet, die eine größere UVB-Menge tolerieren können 
(Hautmodelltest und Fotohämolysetest mit roten Blutzellen). Im 3T3-NRU-PT wurde der H1-Filter 
verwendet. Die Abbildung zeigt, dass der zusätzliche Filtereffekt des Plattendeckels in erster Linie im UVB-Bereich beobachtet wurde, so dass im Bestrahlungsspektrum noch genug UVB verbleibt, um Chemikalien zu erkennen, die typischerweise im UVB-Bereich absorbiert werden, z. B. Amio ­
daron (siehe Tabelle 1).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 601
 
Abbildung 2  
Bestrahlungsempfindlichkeit von Balb/c-3T3-Zellen (im UVA-Bereich gemessen)  
Zellviabilität (Aufnahme von Neutralrot in % bei Dunkelkontrollen)
  
(Siehe 1.4.1.5.2, zweiter Absatz, 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2)  
Empfindlichkeit der Balb/c-3T3-Zellen gegen Bestrahlung durch den Solarsimulator, der im Vali ­
dierungsversuch des 3T3-NRU-Fototoxizitätstests (nach Messung im UVA-Bereich) verwendet wird. Die Abbildung zeigt die in sieben verschiedenen Labors in der Vorvalidierungsstudie ermit ­
telten Ergebnisse (1). Die beiden Kurven mit offenen Symbolen wurden mit gealterten Zellen 
ermittelt (hohe Passagenzahl), die durch neue Zellenbestände ersetzt werden mussten. Die Kurven mit fett gedruckten Symbolen zeigen Zellen mit einer ausreichenden Bestrahlungstoleranz.
 
Aus diesen Daten wurde die höchste nicht zytotoxische Bestrahlungsdosis von 5 J/cm  2 abgeleitet 
(senkrechte gestrichelte Linie). Die waagerechte gestrichelte Linie zeigt zusätzlich die in 
Abschnitt 1.4.2.2 angegebene maximal zulässige Bestrahlungswirkung.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 602
 
B.42.  HAUTSENSIBILISIERUNG: LOKALER LYMPHKNOTENTEST  
EINLEITUNG  
1. Die OECD-Richtlinien für die Prüfung von Chemikalien und die auf ihnen 
beruhenden EU-Prüfmethoden werden regelmäßig überarbeitet, um dem 
wissenschaftlichen Fortschritt, sich ändernden Rechtsvorgaben und Belan ­
gen des Tierschutzes gerecht zu werden. Die ursprüngliche Prüfmethode zur Bestimmung der Hautsensibilisierung bei der Maus, der Lokale Lymphkno ­
tentest (Local Lymph Node Assay bzw. LLNA; OECD-Prüfrichtlinie 429; 
Kapitel B.42 dieses Anhangs), wurde bereits vor einiger Zeit zugelassen (1). 
Verschiedene Veröffentlichungen (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) gehen genauer auf die Validierung des LLNA und auf die mit ihm ver ­
bundenen wissenschaftlichen Arbeiten ein. Der aktualisierte LLNA beruht 
auf der Auswertung von Experimenten und wissenschaftlichen Daten (12). 
Es handelt sich um die zweite Prüfmethode zur Bewertung des Hautsensi ­
bilisierungspotenzials von Chemikalien (Stoffen und Gemischen) bei Tieren. Die andere Prüfmethode (OECD-Prüfrichtlinie 406; Kapitel B.6 dieses An ­
hangs), namentlich der Meerschweinchen-Maximierungstest und der Bühler- 
Test, stützt sich auf Tests am Meerschweinchen (13). Der LLNA bietet gegenüber B.6 und OECD-Prüfrichtlinie 406 (13) gewisse Vorteile im Hin ­
blick auf den Tierschutz. Die vorliegende aktualisierte LLNA-Prüfmethode 
beinhaltet eine Reihe von Leistungsstandards (Anlage 1) in Übereinstim ­
mung mit den Grundsätzen des OECD-Leitliniendokuments Nr. 34 (14). Diese können zur Bewertung des Validierungsstatus neuer und/oder modi ­
fizierter Prüfmethoden herangezogen werden, die dem LLNA in funktiona ­
ler oder mechanistischer Weise ähnlich sind.
 
2. Bei dem LLNA wird die Induktionsphase der Hautsensibilisierung unter ­
sucht, und der Test liefert quantitative Daten für die Dosis-Wirkungs-Be ­
wertungen. Es wird darauf hingewiesen, dass die leichten/mittelgradigen Sensibilisatoren, die als geeignete Positivkontrollen bei Prüfmethoden für Meerschweinchen empfohlen werden (B.6; OECD-Prüfrichtlinie 406) (13), 
ebenfalls für die Verwendung beim LLNA geeignet sind (6) (8) (15). Eine 
LLNA-Methode mit reduziertem Versuchstierbedarf (rLLNA), bei der bis zu 40 % weniger Tiere eingesetzt werden, wird ebenfalls als Option dieser 
Prüfmethode beschrieben (16) (17) (18). Der rLLNA kann verwendet wer ­
den, wenn aufgrund von Rechtsvorschriften lediglich die Bestätigung einer negativen Prädiktion des Hautsensibilisierungspotenzials gefordert ist, vo ­
rausgesetzt dass alle anderen Spezifikationen des LLNA-Protokolls, wie in 
dieser Prüfmethode beschrieben, eingehalten werden. Die Prädiktion eines 
negativen Ergebnisses sollte auf der Grundlage aller verfügbaren Informa ­
tionen vorgenommen werden, wie in Absatz 4 beschrieben. Vor Anwen ­
dung der rLLNA-Methode sollten entsprechende Erläuterungen und eine 
wissenschaftliche Begründung für ihre Verwendung vorgelegt werden. 
Sollte der rLLNA entgegen allen Erwartungen zu einem positiven oder nicht eindeutigen Ergebnis führen, können weitere Tests erforderlich sein, um diese Daten zu deuten oder zu präzisieren. Der rLLNA sollte nicht für 
die Feststellung schädlicher Wirkungen von Prüfsubstanzen mit Hautsensi ­
bilisierungspotenzial verwendet werden, wenn Informationen über die Dosis-Wirkungs-Beziehung benötigt werden, wie z. B. als Unterkategorisie ­
rung für die Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 über die Einstufung, Kenn ­
zeichnung und Verpackung von Stoffen und Gemischen und das Global 
Harmonisierte System zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien der Vereinten Nationen.
 
BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
3. Die verwendeten Begriffsbestimmungen sind in Anlage 2 aufgeführt.  
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN UND BEGRENZUNGEN  
4. Mit dem LLNA steht eine alternative Methode zum Nachweis von Che ­
mikalien mit potenziell hautsensibilisierenden Eigenschaften zur Verfügung. Dies bedeutet nicht notwendigerweise, dass der LLNA zwingend in jedem Fall anstelle der Meerschweinchen-Tests (B.6; OECD-Prüfrichtlinie 406) 
(13) eingesetzt werden muss. Vielmehr erweist er sich als gleichermaßen 
wertvoller Test und kann als Alternative gewählt werden, bei der im All ­
gemeinen keine weitere Bestätigung von positiven wie auch negativen Er ­
gebnissen erforderlich ist. Das Prüflabor sollte vor der Durchführung der 
Studie alle verfügbaren Informationen über die Prüfsubstanz auswerten und 
berücksichtigen. Zu diesen Informationen zählen die Identität und die
 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 603
 
chemische Struktur der Prüfsubstanz, ihre physikalisch-chemischen Eigen ­
schaften, die Ergebnisse aller sonstigen  in vitro - oder  in vivo -Toxizitäts ­
prüfungen der Prüfsubstanz sowie toxikologische Daten zu strukturell ver ­
wandten Chemikalien. Diese Informationen sind zu berücksichtigen, um die Eignung des LLNA für die jeweilige Substanz festzustellen (bestimmte che ­
mische Stoffe sind mit dem LLNA nicht kompatibel — siehe Absatz 5) und die 
Festlegung der Dosis zu erleichtern.
 
5. Beim LLNA handelt es sich um eine  in vivo -Methode. Das bedeutet, dass die 
kontaktsensibilisierenden Eigenschaften weiterhin an Tieren bewertet werden. 
Der Test erlaubt es jedoch, die Anzahl der für diesen Zweck benötigten Tiere zu 
reduzieren. Es kommt hinzu, dass der LLNA eine substanzielle Verfeinerung (weniger Schmerzen und Leiden) im Hinblick auf die Behandlung der Ver ­
suchstiere bei Tests auf allergische Kontaktsensibilisierung darstellt. Der 
LLNA beruht auf der Bewertung immunologischer Reaktionen, die während der Induktionsphase der Sensibilisierung durch chemische Stoffe ausgelöst wer ­
den. Anders als die Tests an Meerschweinchen (B.6; OECD-Prüfrichtlinie 
406) (13), erfordert der LLNA nicht, dass provozierte Überempfindlichkeits ­
reaktionen der Haut ausgelöst werden. Außerdem wird beim LLNA, anders als beim Meerschweinchen-Maximierungstest, auf den Einsatz eines Adjuvans ver ­
zichtet (13). Daher erleiden die Tiere beim LLNA weniger Schmerzen und 
Qualen. Trotz der Vorteile, die der LLNA gegenüber B.6 und 
OECD-Prüfrichtlinie 406 aufweist, sollte nicht verkannt werden, dass er mit gewissen Einschränkungen behaftet ist, die die Anwendung von Kapitel B.6 oder OECD-Prüfrichtlinie 406 (13) erforderlich machen können ( z. B. falsch 
negative Ergebnisse des LLNA bei bestimmten Metallen, falsch positive Ergeb ­
nisse bei bestimmten hautreizenden Stoffen [wie etwa bei tensidähnlichen Che ­
mikalien] (19) (20), oder Löslichkeit der Prüfsubstanz). Zudem können che ­
mische Klassen oder Substanzen mit Funktionsgruppen, die erwiesenermaßen 
als potenzielle Verwechslungsfaktoren wirken können (21), den Einsatz von 
Meerschweinchen-Tests erforderlich machen (B.6; OECD-Prüfrichtlinie 406) (13). Angesichts der begrenzten Validierungsdaten, die im Wesentlichen auf Pestizidformulierungen beruhen, ist die Wahrscheinlichkeit positiver Ergeb ­
nisse für diese Art von Prüfsubstanzen beim LLNA größer als beim 
Meerschweinchen-Test (22). Bei der Prüfung von Formulierungen könnte man jedoch in Erwägung ziehen, ähnliche Stoffe mit bekannten Ergebnissen als Vergleichssubstanzen einzuschließen, um das ordnungsgemäße Funktionie ­
ren des LLNA nachzuweisen (siehe Absatz 16). Abgesehen von diesen bekann ­
ten Beschränkungen dürfte der LLNA für die Prüfung aller Substanzen geeignet sein, sofern mit diesen Substanzen keine Eigenschaften verbunden sind, die die Genauigkeit des LLNA beeinträchtigen könnten.
 
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
6. Der LLNA beruht auf dem Prinzip, dass sensibilisierende Stoffe eine Lym ­
phozytenproliferation in den drainierenden Lymphknoten an der Stelle der Applikation des chemischen Stoffes induzieren. Diese Proliferation verläuft 
proportional zur Dosis und zur Wirkstärke des applizierten Allergens und 
bietet sich als einfache Möglichkeit an, eine quantitative Messung der Sen ­
sibilisierung zu erhalten. Die Proliferation wird gemessen, indem man die mittlere Proliferation jeder Prüfgruppe mit der mittleren Proliferation der mit 
Vehikel behandelten Kontrollgruppe (VK) vergleicht. Das Verhältnis der 
mittleren Proliferation in jeder Behandlungsgruppe zu dem in der gleich ­
zeitigen Vehikelkontrollgruppe, auch als Stimulationsindex (SI) bezeichnet, wird festgelegt und sollte ≥ 3 betragen, ehe eine Prüfsubstanz als poten ­
zieller Hautsensibilisator klassifiziert wird. Die hier beschriebenen Metho ­
den beruhen auf der Nutzung der radioaktiven  in vivo -Markierung zur 
Messung einer erhöhten Anzahl proliferierender Zellen in den drainierenden aurikulären Lymphknoten. Allerdings kann man sich bei der Bewertung der 
Anzahl proliferierender Zellen auch auf andere Endpunkte stützen, sofern 
die Leistungsstandards vollständig eingehalten werden (Anlage 1).
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BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
Auswahl von Versuchstierarten  
7. Für diesen Test ist die Maus die Spezies der Wahl. Es werden junge aus ­
gewachsene weibliche Mäuse (CBA/Ca- oder CBA/J-Stamm) verwendet, 
die weder geworfen haben noch trächtig sind. Bei Versuchsbeginn sollten die Tiere 8-12 Wochen alt sein; die Gewichtsunterschiede sollten minimal sein und 20 % des mittleren Gewichts nicht übersteigen. Alternativ können 
Tests an anderen Stämmen und männlichen Tieren erfolgen, wenn anhand 
von hinlänglich großen Datenangaben nachgewiesen werden kann, dass keine signifikanten stamm- und/oder geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Reaktion auf den LLNA bestehen.
 
Haltungs- und Fütterungsbedingungen  
8. Mäuse sollten in Gruppen gehalten werden (23), wenn nicht angemessene 
wissenschaftliche Begründungen eine Einzelhaltung nahelegen. Die Tem ­
peratur im Versuchsraum sollte 22 ± 3 °C betragen. Obwohl die relative Luftfeuchtigkeit mindestens 30 % betragen und zu anderen Zeiten als wäh ­
rend der Reinigung vorzugsweise nicht über 70 % liegen soll, ist ein Wert 
von 50-60 % anzustreben. Die Beleuchtung sollte künstlich sein und die 
Hell- und Dunkelphasen sollten sich im Abstand von 12 Stunden abwech ­
seln. An die Versuchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert wer ­
den, und eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung ist zu gewährleisten.
 
Vorbereitung der Tiere  
9. Die Tiere werden nach Zufallskriterien ausgewählt, zur individuellen Iden ­
tifizierung gekennzeichnet (aber nicht am Ohr) und vor Beginn der Dosie ­
rung für einen Zeitraum von mindestens 5 Tagen in ihren Käfigen an die Laborbedingungen gewöhnt. Vor Behandlungsbeginn werden alle Tiere un ­
tersucht, um sicherzustellen, dass keine sichtbaren Hautverletzungen beste ­
hen.
 
Vorbereitung der Dosierlösungen  
10. Feste Chemikalien sollten vor der Applikation in ein Mäuseohr in Lösungs ­
mitteln/Vehikeln gelöst oder suspendiert und ggf. verdünnt werden. Flüssige 
Chemikalien können direkt appliziert oder zuvor verdünnt werden. Unlös ­
liche Chemikalien, wie sie in der Regel in Medizinprodukten vorliegen, sollten vor der Applikation in ein Mäuseohr in einem geeigneten Lösungs ­
mittel einer übertrieben starken Extraktion unterzogen werden, um alle ex ­
trahierbaren Inhaltsstoffe vor der Prüfung sichtbar zu machen. Die Prüfsub ­
stanzen sollten täglich zubereitet werden, es sei denn, die Stabilität der 
Substanz bei Lagerung wird nachgewiesen.
 
Überprüfung der Zuverlässigkeit:  
11. Anhand von positiven Kontrollchemikalien (PC) wird die ordnungsgemäße 
Leistung des Tests nachgewiesen. Hierzu ist eine angemessene und repro ­
duzierbare Empfindlichkeit der Reaktion auf eine sensibilisierende Prüfsub ­
stanz erforderlich, wobei die Reaktionsstärke gut charakterisiert ist. Es wird die Einbeziehung einer gleichzeitigen Positivkontrolle empfohlen, da diese 
die Fähigkeit des Labors belegt, jeden Test erfolgreich durchzuführen und 
eine Bewertung der Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit zwischen ver ­
schiedenen Labors ermöglicht. Eine Positivkontrolle für jede Studie wird auch von einigen Regulierungsbehörden vorgeschrieben. Daher wird An ­
wendern empfohlen, vor Durchführung des LLNA die zuständigen Behör ­
den zu konsultieren. Dementsprechend wird die routinemäßige Verwendung einer gleichzeitigen Positivkontrolle angeraten, um die Notwendigkeit zu ­
sätzlicher Tierversuche zur Erfüllung von Anforderungen, die aus der Ver ­
wendung einer nur periodischen Positivkontrolle resultieren könnten, zu 
vermeiden (siehe Absatz 12). Die PC sollte eine positive Reaktion auf den LLNA bei einem Expositionsniveau hervorrufen, das einen Anstieg des Stimulationsindex (SI > 3 im Vergleich zur Negativkontrollgruppe, 
NK) bewirkt. Die positive Kontrolldosis soll so gewählt werden, dass sie 
keine übermäßige Hautreizung oder systemische Toxizität verursacht und
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die Induktion reproduzierbar, aber nicht exzessiv ist ( d. h. ein SI > 20 wäre 
exzessiv). Bevorzugte positive Kontrollstoffe sind 25 % Hexylcinnaminal ­
dehyd (Chemical Abstracts Service [CAS]-Nr. 101-86-0) in Aceton: Oli ­
venöl (4:1, v/v) und 5 % Mercaptobenzothiazol (CAS-Nr. 149-30-4) in  
N,N-Dimethylformamid (siehe Anhang 1, Tabelle 1). Unter bestimmten 
Umständen können in ausreichend begründeten Fällen andere Kontrollsub ­
stanzen eingesetzt werden, die den genannten Kriterien entsprechen.  
12. Obwohl die Einbeziehung einer gleichzeitigen Positivkontrollgruppe emp ­
fohlen wird, können in gewissen Situationen periodische Prüfungen ( d. h. in 
Abständen ≤ 6 Monaten) der Positivkontrolle für Labors ausreichen, die den 
LLNA regelmäßig ( d. h.  mindestens einmal pro Monat) durchführen und 
über eine etablierte historische Kontrolldatenbasis verfügen, die die Fähig ­
keit des Labors bestätigt, reproduzierbare und genaue Ergebnisse mit Po ­
sitivkontrollen zu erzielen. Eine angemessene Beherrschung des LLNA kann erfolgreich nachgewiesen werden, indem durchgehend positive Ergeb ­
nisse mit den positiven Kontrollchemikalien in mindestens 10 unabhängigen 
Prüfungen erzielt werden, die innerhalb eines angemessenen Zeitraums ( d. 
h. in weniger als einem Jahr) durchgeführt wurden.
 
13. Eine gleichzeitige Positivkontrollgruppe sollte immer einbezogen werden, 
wenn Verfahrensänderungen im LLNA auftreten ( z. B.  Wechsel des ge ­
schulten Personals, Änderung der Materialien bei den Prüfmethoden und/ oder der Reagenzien, Änderung der Ausrüstung, Änderung der Herkunft der Versuchstiere). Solche Änderungen sollten in Laborberichten dokumentiert 
werden. Ferner ist der Einfluss dieser Änderungen auf die Aussagefähigkeit 
der zuvor eingerichteten historischen Datenbank zu bedenken. Dabei sollte die Notwendigkeit überdacht werden, eine neue historische Datenbank ein ­
zurichten, um die gleichbleibende Qualität der positiven Kontrollergebnisse 
zu dokumentieren.
 
14. Die Prüfer sollten sich der Tatsache bewusst sein, dass die Entscheidung, 
eine PC-Studie periodisch statt gleichzeitig durchzuführen, Auswirkungen 
auf die Aussagefähigkeit und Akzeptanz negativer Studienergebnisse haben kann, die ohne gleichzeitige Positivkontrolle im Zeitraum zwischen den einzelnen periodischen PC-Studien auftreten können. Wenn zum Beispiel 
ein falsch negatives Ergebnis in der periodischen PC-Studie auftritt, können 
negative Ergebnisse für die Prüfsubstanz, die in dem Zeitraum zwischen der letzten akzeptablen periodischen PC-Studie und der inakzeptablen periodi ­
schen PC-Studie aufgetreten waren, in Frage gestellt werden. Die Auswir ­
kungen solcher Ergebnisse sollten sorgfältig bedacht werden, wenn ent ­
schieden wird, ob gleichzeitige oder nur periodische PC-Studien durch ­
geführt werden sollen. Auch ist die Verwendung einer geringeren Anzahl an Versuchstieren bei der gleichzeitigen Positivkontroll-Gruppe zu beden ­
ken, wenn dies wissenschaftlich zu begründen ist und wenn das Labor auf 
der Grundlage laborspezifischer historischer Daten nachweist, dass eine geringere Anzahl an Mäusen ausreicht (12).
 
15. Obwohl eine positive Kontrollchemikalie in dem Vehikel geprüft werden 
sollte, von dem bekannt ist, dass es eine gleichbleibende Reaktion hervor ­
ruft ( z. B.  Aceton: Olivenöl; 4:1, v/v), können in bestimmten Rechtssitua ­
tionen auch Prüfungen in einem Nichtstandard-Vehikel (klinisch/chemisch 
relevante Formulierung) erforderlich sein (24). Wenn die gleichzeitige Po ­
sitivkontrolle in einem anderen Vehikel als der Prüfsubstanz getestet wird, sollte eine gesonderte Vehikelkontrolle für die gleichzeitige PC einbezogen werden.
 
16. In Fällen, in denen Prüfsubstanzen einer bestimmten chemischen Klasse 
oder eine Reihe von Reaktionen bewertet werden, können Referenzsubstan ­
zen nützlich sein, um nachzuweisen, dass die Prüfmethode zur Feststellung 
des Hautsensibilisierungspotenzials dieser Art von Substanzen ordnungs ­
gemäß funktioniert. Geeignete Referenzsubstanzen sollten die folgenden Eigenschaften haben:
 
— strukturelle und funktionale Ähnlichkeit mit der Klasse der getesteten 
Prüfsubstanz;  
— bekannte physikalische/chemische Eigenschaften;  
— zugrunde liegende Daten aus dem LLNA;  
— zugrunde liegende Daten aus anderen Tiermodellen und/oder von Men ­
schen.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 606
 
TESTVERFAHREN  
Anzahl der Versuchstiere und Dosierungen  
17. Mindestens vier Tiere pro Dosisgruppe mit jeweils mindestens drei Kon ­
zentrationen der Prüfsubstanz werden benötigt; zusätzlich braucht man eine 
Negativkontrollgruppe, die nur mit dem Vehikel für die Prüfsubstanz be ­
handelt wird, sowie eine Positivkontrolle (gleichzeitig oder jüngeren Da ­
tums, auf der Grundlage der Laborvorschriften in den relevanten Abschnit ­
ten 11-14. Tests mit Mehrfachdosen der PC sollten in Erwägung gezogen 
werden, insbesondere wenn die Positivkontrolle intermittierend getestet wird. Bis auf die Verabreichung der Prüfsubstanz sind die Tiere der Kon ­
trollgruppen ebenso zu behandeln wie die Tiere der Behandlungsgruppen.
 
18. Die Auswahl der Dosis und des Vehikels soll anhand der Empfehlungen in 
(3) (5) erfolgen. Für aufeinanderfolgende Dosierungen werden normaler ­
weise geeignete abgestufte Konzentrationen gewählt, wie z. B. 100 %, 
50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % usw. Die Auswahl der Kon ­
zentrationsfolge sollte angemessen wissenschaftlich begründet werden. Alle vorhandenen toxikologischen Angaben ( z. B.  über die akute Toxizität und 
Hautreizung) sowie strukturelle und physiochemische Angaben zu der je ­
weiligen Prüfsubstanz (und/oder strukturverwandten Substanzen) sollten bei 
der Festlegung von drei aufeinander folgenden Konzentrationen berücksich ­
tigt werden, so dass bei der höchsten Konzentration einerseits die Exposi ­
tion maximiert und andererseits eine systemische Toxizität und/oder eine 
übermäßige lokale Hautreizung ausgeschlossen werden (3) (25). Mangels solcher Informationen kann ein anfänglicher Dosisfindungstest erforderlich sein (siehe Absätze 21-24).
 
19. Das Vehikel sollte das Testergebnis nicht beeinflussen oder beeinträchtigen 
und sollte so gewählt werden, dass die Löslichkeit zur Erzielung einer möglichst hohen Konzentration maximiert und gleichzeitig eine für das 
Applizieren der Prüfsubstanz geeignete Lösung/Suspension hergestellt wer ­
den kann. Empfohlene Vehikel sind Aceton: Olivenöl (4:1, v/v),  N,N -Di­
methylformamid, Methylethylketon, Propylenglykol und Dimethylsulphoxid (19), wobei mit hinreichender wissenschaftlicher Begründung auch andere 
Vehikel verwendet werden können. Unter bestimmten Umständen muss ein 
klinisch relevantes Lösungsmittel oder die handelsübliche Zubereitung, in der die Prüfsubstanz vermarktet wird, als zusätzliche Kontrolle genutzt werden. Besondere Sorgfalt sollte darauf verwendet werden, zu gewährleis ­
ten, dass in das Vehikelsystem durch die Verwendung geeigneter Lösungs ­
vermittler ( z. B. 1 % Pluronic
 ® L92) hydrophile Stoffe eingearbeitet werden, 
die die Haut befeuchten und nicht sofort ablaufen. Folglich sind vollständig wässrige Vehikel zu vermeiden.
 
20. Die Bearbeitung von Lymphknoten einzelner Mäuse ermöglicht die Bewer ­
tung der Variabilität von Tieren sowie einen statistischen Vergleich zwi ­
schen der Prüfsubstanz und Messungen an der Vehikelkontrollgruppe (siehe 
Absatz 35). Zudem besteht eine realistische Möglichkeit, die Anzahl der 
Mäuse in der Positivkontrollgruppe zu verringern, wenn Einzeltierdaten erhoben werden (12). Außerdem verlangen einige Regulierungsbehörden die Erhebung von Daten einzelner Tiere. Dennoch werden gepoolte Tier ­
daten von einigen Regulierungsbehörden als akzeptabel erachtet. In dieser 
Situation können Benutzer wahlweise einzelne oder gepoolte Tierdaten ver ­
wenden.
 
Dosisfindungstest  
21. Wenn über die höchst mögliche Dosierung keine Informationen vorliegen 
(siehe Absatz 18), sollte ein Dosisfindungstest durchgeführt werden, um die geeignete Dosierung für den LLNA festzulegen. Der Dosisfindungstest soll eine Orientierung bei der Auswahl der höchst möglichen Dosisstufe für die 
Hauptuntersuchung des LLNA in Fällen liefern, in denen keine Informatio ­
nen über Konzentrationen vorliegen, die zur systemischen Toxizität (siehe Absatz 24) und/oder zu übermäßiger Hautreizung führen (siehe Absatz 23). Die höchsten geprüften Dosisstufen sollten 100 % der Prüfsubstanz bei 
Flüssigkeiten bzw. die höchst möglichen Konzentrationen bei Feststoffen 
oder Suspensionen sein.
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22. Der Dosisfindungstest wird unter Bedingungen durchgeführt, die denen der 
Hauptstudie des LLNA genau entsprechen. Allerdings gibt es hier keine 
Bewertung der Lymphknotenproliferation und es können weniger Tiere pro Dosisgruppe eingesetzt werden. Es werden ein oder zwei Tiere pro Dosisgruppe empfohlen. Alle Mäuse werden täglich auf klinische Zeichen 
für systemische Toxizität oder lokale Reizungen an der Applikationsstelle 
untersucht. Das Körpergewicht wird vor dem Test und vor dem Abschluss (Tag 6) protokolliert. Beide Ohren jeder Maus werden auf Anzeichen für Erytheme untersucht und mit Hilfe von Tabelle 1 bewertet (25). Die Ohr ­
dicke wird mit Hilfe eines Ohrdickenmessgeräts ( z. B. digitaler Mikrometer 
oder Peacock Dickenmessuhr) an Tag 1 vor der Dosierung, Tag 3 (ca. 48 Stunden nach der ersten Dosis) und Tag 6 bestimmt. Zusätzlich kann an Tag 6 die Ohrdicke durch die Gewichtsbestimmung von Ohrstanzproben 
ermittelt werden. Dies sollte nach der tierschutzgerechten Tötung der Tiere 
erfolgen. Eine übermäßige lokale Hautreizung wird durch eine Erythem-Punktzahl von ≥ 3 und/oder eine Zunahme der Ohrdicke von ≥ 
25 % an jedem beliebigen Messtag angezeigt (26) (27). Als höchste Dosis 
für die Hauptuntersuchung des LLNA wird die nächst niedrigere Dosis in 
der Konzentrationsreihe des Dosisfindungstests gewählt (siehe Absatz 18), die keine systemische Toxizität und/oder übermäßige lokale Hautreizung verursacht.
 
Tabelle 1  
Erythem-Klassifizierung  
Beobachtung Punktzahl  
Kein Erythem 0 
Sehr leichtes Erythem (kaum wahrnehmbar) 1 
Klar abgegrenztes Erythem 2 Mäßiges bis ausgeprägtes Erythem 3 Schweres Erythem (dunkelrot) bis hin zur Schorfbildung, so 
dass eine Bewertung nicht möglich ist 4
 
23. Zusätzlich zu einer Zunahme der Ohrdicke um 25 % (26) (27) wurde ein 
statistisch signifikanter Anstieg der Ohrdicke bei den behandelten Mäusen 
im Vergleich zu den Kontrollmäusen zugrunde gelegt, um Reizstoffe in 
dem LLNA zu identifizieren (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Obwohl ein statistisch signifikanter Anstieg der Ohrdicke von weniger als 25 % auftreten kann, konnte kein spezifischer Zusammenhang mit einer über ­
mäßigen Hautreizung festgestellt werden (30) (32) (33) (34).
 
24. Die folgenden klinischen Beobachtungen können, sofern sie Bestandteil 
einer Gesamtbewertung sind, auf systemische Toxizität hinweisen (35) 
(36) und somit die höchst mögliche Dosisstufe für die Hauptuntersuchung des LLNA anzeigen: Änderungen der Funktionen des Nervensystems ( z. B. 
Piloerektion, Ataxie, Tremor und Krämpfe); Verhaltensänderungen ( z. B.  
Aggressivität, Änderungen bei der Fellpflege, auffallende Änderung des 
Aktivitätsniveaus); Änderungen des Atemmusters (d. h. Änderung der Häu ­
figkeit und Intensität des Atmens wie Dyspnoe, Keuchen, rasselnder Atem) sowie Änderungen der Futter- und Wasseraufnahme. Zusätzlich sollten An ­
zeichen von Lethargie und/oder Teilnahmslosigkeit sowie alle klinischen 
Anzeichen für mehr als leichte oder momentane Schmerzen und Qual, eine Gewichtsreduktion von > 5 % zwischen Tag 1 und Tag 6 und die Sterblichkeit in der Bewertung berücksichtigt werden. Moribunde Tiere oder 
Tiere, die Anzeichen starker und andauernder Qualen zeigen, sollten tier ­
schutzgerecht getötet werden (37).
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Versuchsplan der Hauptuntersuchung  
25. Der Versuchsplan des Tests ist wie folgt:  
— Tag 1: Jedes Tier wird einzeln gekennzeichnet und das Gewicht sowie 
jede klinische Beobachtung werden protokolliert. Es werden 25 μL der 
Prüfsubstanz in der geeigneten Verdünnung, des Vehikels allein oder 
der Positivkontrolle (gleichzeitig oder jüngeren Datums gemäß den La ­
borvorschriften in den relevanten Abschnitten 11-15) auf die Rückseite jedes Ohrs appliziert.
 
— Tage 2 und 3: Die am Tag 1 durchgeführte Applikationsprozedur wird 
wiederholt.  
— Tage 4 und 5: Keine Behandlung.  
— Tag 6: Das Gewicht jedes Tiers wird protokolliert. Es werden 250 μL 
sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 20 μCi (7,4×10  5 
Bq) von tritiiertem (  3 H)-Methylthymidin in die Schwanzvenen aller 
Mäuse in den Prüf- und Kontrollgruppen injiziert. Alternativ dazu kön ­
nen 250 μL sterile PBS mit 2 μCi (7,4×10  4 Bq) von  125 I-Ioddeoxyuridin 
und 10  -5 M Fluorodeoxyuridin in die Schwanzvenen aller Mäuse injiziert 
werden. Fünf Stunden (5 h) später werden die Tiere tierschutzgerecht 
getötet. Die drainierenden aurikulären Lymphknoten jedes Mäuseohrs 
werden entfernt und für jedes Tier in PBS gepoolt (Einzeltiermethode); alternativ hierzu können auch die Lymphknoten jedes Ohrs entfernt und für jede der Versuchsgruppen in PBS gepoolt werden (Methode der 
gepoolten Behandlungsgruppe). Einzelheiten und Diagramme der 
Lymphknotenidentifikation und -entfernung sind unter Referenz (12) aufgeführt. Zur weiteren Kontrolle der lokalen Hautreaktion in der Hauptuntersuchung können zusätzliche Parameter wie die Auswertung 
des Ohr-Erythems oder Ohrdickemessungen (mittels eines Dickenmess ­
geräts oder durch die Gewichtsbestimmung von Ohrstanzproben bei der Nekropsie) in das Untersuchungsprotokoll aufgenommen werden.
 
Vorbereitung der Zellsuspensionen  
26. Aus den Lymphknotenzellen (LNC), die mittels der Einzeltiermethode oder 
mittels der Methode der gepoolten Behandlungsgruppe paarweise entnom ­
men wurden, wird durch vorsichtigen mechanischen Aufschluss in einem 
Edelstahlfilter mit einer Maschenweite von 200 Mikron oder mittels einer 
anderen geeigneten Technik eine Einzelzellsuspension hergestellt. Die LNC werden zweimal mit einem Überschuss an PBS gewaschen und die DNA 
wird bei 4 °C 18 Stunden lang mit 5 %iger Trichloressigsäure (TCA) aus ­
gefällt (3). Die Pellets werden entweder in 1 mL TCA resuspendiert und in Szintillationsfläschchen eingetragen, die 10 mL einer Szintillationsflüssig ­
keit für die
 3 H-Zählung enthalten, oder direkt in Gammazähler zur  125 I- 
Bestimmung überführt.  
Bestimmung der Zellproliferation (der aufgenommenen Radioaktivität)  
27. Die Aufnahme von  3 H-Methylthymidin wird mittels β-Szintillationszählung 
als Zerfallsereignisse pro Minute (disintegrations per minute; DPM) gemes ­
sen. Die Aufnahme von  125 I-Ioddeoxyuridin wird mittels  125 I-Zählung be ­
stimmt und ebenfalls als DPM angegeben. In Abhängigkeit von der genutz ­
ten Methode wird die Aufnahme als DPM/Maus (Einzeltiermethode) oder 
als DPM/Behandlungsgruppe (Methode der gepoolten Behandlungsgruppe) 
angegeben.  
Reduzierter LLNA  
28. In gewissen Situationen, in denen aufgrund von Rechtsvorschriften lediglich 
die Bestätigung einer negativen Prädiktion über das Hautsensibilisierungs ­
potenzial gefordert ist, kann ein optionales rLLNA-Protokoll (16) (17) (18) mit weniger Versuchstieren verwendet werden, vorausgesetzt dass alle an ­
deren Protokollspezifikationen für den LLNA in dieser Prüfmethode einge ­
halten werden. Vor Einsatz des rLLNA sollten entsprechende Erläuterungen und eine wissenschaftliche Begründung für seine Verwendung vorgelegt werden. Sollte ein positives oder nicht eindeutiges Ergebnis erzielt werden, 
können weitere Tests erforderlich sein, um diese Daten zu deuten oder zu 
klären.
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29. Die zahlenmäßige Reduktion der Dosisgruppen ist der einzige Unterschied 
zwischen den Prüfmethodenprotokollen des LLNA und des rLLNA. Aus 
diesem Grund liefert der rLLNA keine Informationen über die Dosis-Wirkungs-Beziehung. Der rLLNA sollte folglich nicht eingesetzt wer ­
den, wenn Informationen über die Dosis-Wirkungs-Beziehung benötigt wer ­
den. Ebenso wie im Multidosis-LLNA sollte die im rLLNA bewertete Kon ­
zentration der Prüfsubstanz die höchst mögliche Konzentration sein, die keine offensichtliche systemische Toxizität und/oder übermäßige lokale Hautreizung bei der Maus verursacht (siehe Absatz 18).
 
BEOBACHTUNGEN  
Klinische Beobachtungen  
30. Jede Maus sollte mindestens einmal täglich sorgfältig auf klinische Zeichen, 
d. h. lokale Reizung an der Applikationsstelle, oder auf systemische Toxi ­
zität untersucht werden. Alle Beobachtungen werden systematisch in Einzel ­
protokollen dokumentiert, die für jedes Tier geführt werden. Die Über ­
wachungspläne sollten Kriterien beinhalten, anhand derer Mäuse mit syste ­
mischer Toxizität, übermäßiger lokaler Hautreizung oder Hautätzung schnell 
zu Zwecken der schmerzlosen Tötung identifiziert werden können (37).  
Körpergewicht  
31. In Abschnitt 25 wurde bereits ausgeführt, dass das Körpergewicht der ein ­
zelnen Tiere zu Versuchsbeginn und zum Zeitpunkt der tierschutzgerechten Tötung der Tiere laut Versuchsplan festgestellt werden soll.
 
BERECHNUNG DER ERGEBNISSE  
32. Die Ergebnisse für jede Behandlungsgruppe werden als 
Stimulationsindex (SI) angegeben. Bei Einsatz der Einzeltiermethode erhält 
man den SI durch Teilen der mittleren DPM pro Maus innerhalb jeder 
Prüfgruppe und der Positivkontrollgruppe durch die mittleren DPM pro Maus für die Lösungsmittel/Vehikelkontrollgruppe. Der durchschnittliche SI beträgt demnach für die mit Vehikel behandelten Kontrollen 1. Bei 
Einsatz der Methode der gepoolten Behandlungsgruppe erhält man den 
SI, indem die für jede Behandlungsgruppe ermittelte Gesamtaufnahme an Radioaktivität durch die Aufnahme in der gepoolten Vehikelkontrollgruppe dividiert wird; hieraus ergibt sich der mittlere SI.
 
33. In dem Entscheidungsprozess gilt ein Ergebnis als positiv, wenn der SI ≥ 3 
ist. Die Stärke der Dosis-Wirkung, die statistische Signifikanz und die 
gleichbleibende Qualität der Lösungsmittel-/Vehikel-Reaktion sowie der Re ­
aktion der Positivkontrolle können aber auch benutzt werden, um festzule ­
gen, ob ein Grenzergebnis als positiv bezeichnet werden soll (4) (5) (6).  
34. Sofern Klärungsbedarf in Bezug auf die Ergebnisse besteht, sollten die 
verschiedenen Eigenschaften der Prüfsubstanz beachtet werden, wobei es 
unter anderem zu klären gilt, ob ein struktureller Zusammenhang mit be ­
kannten Hautsensibilisatoren besteht, ob sie eine übermäßige lokale Hautrei ­
zung bei der Maus hervorruft und wie die festgestellte Art der Reaktion bezüglich der Dosis ist. Diese und weitere Aspekte werden an anderer Stelle 
ausführlich erörtert (7).
 
35. Werden die Daten zur Radioaktivität für jede einzelne Maus erhoben, kann 
eine statistische Analyse zu Vorhandensein und Grad des Dosis-Wirkungs- 
Verhältnisses in den Daten durchgeführt werden. Jede statistische Auswer ­
tung könnte eine Bewertung der Dosis-Wirkungs-Beziehung sowie geeig ­
nete Testgruppen-Vergleiche beinhalten ( z. B.  Gruppe mit paarweiser Do ­
sierung gegen gleichzeitige Vehikelkontrollgruppe). Die statistischen Ana ­
lysen könnten z. B. die lineare Regression, den Williams-Test zur Bewer ­
tung von Dosis-Wirkungs-Trends oder den Dunnett-Test für paarweise Ver ­
gleiche beinhalten. Bei der Auswahl einer geeigneten Methode für die 
statistische Analyse sollte sich der Prüfer möglicher ungleicher Varianzen 
und anderer damit zusammenhängender Probleme stets bewusst sein, denn diese erfordern unter Umständen eine Datentransformation oder ein nicht-parametrisches statistisches Verfahren. Auf jeden Fall muss der Prüfer 
unter Umständen SI-Berechnungen und statistische Analysen mit und ohne 
bestimmte Datenpunkte (manchmal als „Ausreißer“ bezeichnet) vornehmen.
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DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Daten  
36. Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Bei Einsatz der 
Einzeltiermethode sollten sie die DPM-Einzelwerte, die mittleren 
DPM-Gruppenwerte pro Tier, die damit verbundene Fehlervariable ( z. B.  
SD, SEM) und den mittleren SI für jede Dosisgruppe, verglichen mit der gleichzeitigen Vehikelkontrollgruppe angeben. Bei Einsatz der Methode der 
gepoolten Behandlungsgruppe werden die mittleren/medianen DPM und der 
mittlere SI für jede Dosisgruppe mit der gleichzeitigen Vehikelkontroll ­
gruppe verglichen.
 
Prüfbericht  
37. Der Testbericht sollte folgende Angaben enthalten:  
Prüf- und Kontrollsubstanzen:  
— Angaben zur Identität ( z. B. CAS-Nummer und EG-Nummer, falls vor ­
handen; Bezugsquelle; Reinheit; bekannte Verunreinigungen; Chargen ­
nummer);  
— physikalische Beschaffenheit und physikalisch-chemische Eigenschaften 
(z. B.  Flüchtigkeit, Stabilität, Löslichkeit);  
— bei Mischungen Zusammensetzung und relative Anteile der Bestandteile 
in Prozent;  
Lösungsmittel/Vehikel:  
— Angaben zur Identität (Reinheit, Konzentration, gegebenenfalls verwen ­
dete Mengen);  
— Begründung für die Wahl des Vehikels;  
Versuchstiere:  
— Herkunft der CBA-Mäuse;  
— mikrobiologischer Status der Tiere, soweit bekannt;  
— Anzahl und Alter der Tiere;  
— Herkunft der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.;  
Prüfbedingungen:  
— Angaben zur Vorbereitung und Applikation der Prüfsubstanz;  
— Begründung der gewählten Dosierung (mit Ergebnissen des eventuell 
durchgeführten Dosisfindungstests);  
— verwendete Konzentrationen des Vehikels und der Prüfsubstanz sowie 
Gesamtmenge der applizierten Prüfsubstanz;  
— Angaben über Futter- und Wasserqualität (einschließlich Art/Herkunft 
des Futters, Wasserquelle);  
— nähere Angaben zum Behandlungs- und Stichprobenentnahmeplan;  
— Methoden zur Bestimmung der Toxizität;  
— Kriterien zur Einstufung der Studien als positiv oder negativ;  
— Einzelheiten zu eventuellen Protokollabweichungen und eine Erklärung 
dazu, wie sich diese Abweichung auf Prüfdesign und Ergebnisse aus ­
wirkt.  
Überprüfung der Zuverlässigkeit:  
— Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse der letzten Überprüfung 
der Zuverlässigkeit mit Angaben zu verwendeten Prüfsubstanzen, Kon ­
zentration und Vehikel;  
— gleichzeitige und/oder historische PC und gleichzeitige Daten zur NK 
für das Prüflabor;  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 611
 
— wenn keine gleichzeitige PC eingeschlossen war, Datum und Laborbe ­
richt über die jüngste periodische PC sowie ein Bericht mit ausführ ­
lichen Angaben über die historischen positiven Kontrolldaten des La ­
bors mit Angabe der Gründe, warum keine gleichzeitige PC genutzt wurde;
 
Ergebnisse:  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Beginn der Prüfung und zum Zeitpunkt 
der Tötung laut Versuchsplan, sowie mittlere und zugehörige Fehler ­
variable ( z. B.  SD, SEM) für jede Behandlungsgruppe;  
— Beginn und zeitlicher Verlauf der toxischen Erscheinungen für jedes 
Tier, einschließlich gegebenenfalls Hautreizungen an der Stelle der Ver ­
abreichung;  
— eine Tabelle der DPM-Werte sowie der SI-Werte jeder einzelnen Maus 
(Einzeltiermethode) oder der mittleren/medianen Werte (Methode der gepoolten Behandlungsgruppe) jeder Behandlungsgruppe;
 
— mittlere verbundene Fehlervariable ( z. B. SD, SEM) für DPM/Maus für 
jede Behandlungsgruppe sowie die Ergebnisse der Ausreißer-Analyse 
für jede Behandlungsgruppe bei Einsatz der Einzeltiermethode;  
— berechneter SI und geeignete Messung der Variabilität, welche die Va ­
riabilität der Tiere sowohl in der Behandlungsgruppe als auch in der Kontrollgruppe berücksichtigt, sofern die Einzeltiermethode benutzt 
wird;
 
— Dosis-Wirkungs-Beziehung;  
— gegebenenfalls statistische Analysen;  
Diskussion der Ergebnisse:  
— kurze Kommentierung der Ergebnisse, der Dosis-Wirkungs-Beziehung 
und gegebenenfalls statistische Analysen mit Schlussfolgerungen zur 
Frage, ob die Prüfsubstanz als Hautsensibilisator eingestuft werden soll.  
LITERATUR  
(1) OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Gui ­
deline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(2) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary,  Food Chem. To ­
xicol ., 30, 165-169.  
(3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications,  Toxicol ., 93, 13-31.  
(4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise,  J. 
Toxicol. Environ. Health , 53, 563-79.  
(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation,  Food Chem. Toxicol ., 34, 999-1002.  
(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests,  Food Chem. Toxicol ., 34, 985-997.
 
(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests,  Food Chem. 
Toxicol ., 36, 327-33.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 612
 
(8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins,  Toxicol ., 146, 49-59.
 
(9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 258-273.
 
(10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods,  Reg. Toxicol. 
Pharmacol , 34, 274-286.  
(11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM eva ­
luation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 249-257.
 
(12) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Abrufbar unter: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]
 
(13) OECD (1992),  Skin Sensitisation . OECD Guideline for Testing of Che ­
micals No 406, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  
(14) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , En­
vironment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assess ­
ment No. 34, ENV/JM/MONO (2005)14, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kim ­
ber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde,  J. Appl. Toxicol ., 18, 281-284.
 
(16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, 
P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments?  Contact Dermatitis , 54, 181-185.
 
(17) ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay 
(rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Cen ­
tre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Validation of Alternative Methods, April 2007. Abrufbar unter: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]
 
(18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Me ­
thod Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Po ­
tential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Re ­
search Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sci ­
ences. Abrufbar unter: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
 
(19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method 
for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Com ­
pounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordina ­
ted by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alter ­
native Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Intera ­
gency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Abrufbar 
unter: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 613
 
(20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
 
(21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing dis ­
cordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Phar ­
macol., 55, 90-96.
 
(22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other 
Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication 
Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Envi ­
ronmental Health Sciences, Abrufbar unter: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]  
(23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
 
(24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71-89.  
(25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing 
of Chemicals No. 404, Paris, France. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/ 
document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]  
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.  
(27) ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute 
of Environmental Health Sciences. Abrufbar unter: [http://iccvam. niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]
 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.  
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the 
differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions,  To­
xicol. Appl. Pharmacol ., 153, 83-94.  
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals,  Toxicol. Meth ., 8, 245-256.
 
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods,  Drug. Chem. Toxicol ., 22, 491-506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, 
R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alter ­
native endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 
212, 60-68.  
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721-728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract,  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023-1028.  
(35) OECD (1987),  Acute Dermal Toxicity , OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 402, Paris, France. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 614
 
(36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro 
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Abrufbar unter: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm]
 
(37) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph, 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, 
Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 615
 
Anlage 1  
Leistungsstandards für die Bewertung vorgeschlagener ähnlicher oder mo ­
difizierter Llna-Prüfmethoden zur Einschätzung der Hautsensibilisierung  
EINLEITUNG  
1. Ziel der Leistungsstandards (Performance Standards; PS) ist es, die Grund ­
lage zu vermitteln, auf der neue Prüfmethoden, seien diese geschützt (d. h. 
per Urheberrecht, Handelsmarken, eingetragene Marken) oder nicht ge ­
schützt, als ausreichend genau und zuverlässig für spezifische Prüfzwecke beurteilt werden können. Diese auf validierten und akzeptierten Prüfmetho ­
den basierenden Leistungsstandards können verwendet werden, um die Zu ­
verlässigkeit und Genauigkeit anderer vergleichbarer Methoden (umgangs ­
sprachlich als „Me-too“-Tests bezeichnet) zu bewerten, die auf ähnlichen wissenschaftlichen Prinzipien beruhen und denselben biologischen oder to ­
xischen Effekt messen oder vorhersagen (14).
 
2. Vor der Annahme modifizierter Methoden (d. h. vorgeschlagener potenziel ­
ler Verbesserungen einer genehmigten Prüfmethode) sollte eine Bewertung erfolgen, um die Auswirkung der vorgeschlagenen Änderungen auf die 
Leistung des Tests und das Maß zu bewerten, in dem eine solche Änderung 
die verfügbare Information für andere Elemente des Validierungsprozesses beeinflusst. Je nach Anzahl und Art der vorgeschlagenen Änderungen, den generierten Daten und der Begleitdokumentation für diese Änderungen, 
sollten sie entweder dem für neue Tests beschriebenen Validierungsprozess, 
oder — gegebenenfalls — einer begrenzten Zuverlässigkeits- und Relevanz ­
prüfung nach etablierten Leistungsstandards unterzogen werden (14).
 
3. Vorgeschlagene vergleichbare oder modifizierte Methoden zur Verwendung 
nach der vorliegenden Prüfmethode sollten anhand von Chemikalien, die die 
volle Bandbreite der LLNA-Einstufungen repräsentieren, auf ihre Zuverläs ­
sigkeit und Genauigkeit untersucht werden. Um den ungerechtfertigten Ein ­
satz von Tieren zu vermeiden, wird Modell-Entwicklern nachdrücklich emp ­
fohlen, sich vor Beginn der Validierungsstudien in Übereinstimmung mit 
den in dieser Prüfmethode niedergelegten Leistungsstandards und Leitlinien 
an die zuständigen Behörden zu wenden.  
4. Diese Leistungsstandards beruhen auf den US-ICCVAM, EC-ECVAM so ­
wie den harmonisierten japanischen Leistungsstandards JaCVAM (12) und 
können zur Bewertung der Validität vergleichbarer oder modifizierter Ver ­
sionen des LLNA herangezogen werden. Diese Leistungsstandards umfas ­
sen die wesentlichen Elemente der Prüfmethoden, empfohlene Referenzsub ­
stanzen und die Standards für Genauigkeit und Zuverlässigkeit, welche die 
vorgeschlagene Methode erfüllen oder übertreffen sollten.  
I. Wesentliche Elemente der Prüfmethode  
5. Um sicherzustellen, dass eine vergleichbare oder modifizierte 
LLNA-Methode dem LLNA funktionell und mechanistisch entspricht und dass sie dieselben biologischen Wirkungen misst, sollten die folgenden 
Elemente in das Protokoll der Prüfmethode aufgenommen werden:
 
— Die Prüfsubstanz sollte oberflächlich an beiden Mäuseohren appliziert 
werden.  
— Die Lymphozytenproliferation sollte in den drainierenden Lymphknoten 
an der Stelle der Applikation der Prüfsubstanz gemessen werden.  
— Die Lymphozytenproliferation sollte während der Induktionsphase der 
Hautsensibilisierung gemessen werden.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 616
 
— Bei Prüfsubstanzen sollte die gewählte Höchstdosis die höchstmögliche 
Konzentration sein, die keine systemische Toxizität und/oder über ­
mäßige lokale Hautreizung bei der Maus verursacht. Bei positiven Re ­
ferenzsubstanzen sollte die höchste Dosis mindestens so hoch sein wie die LLNA EC3-Werte der entsprechenden Referenzsubstanzen (siehe 
Tabelle 1), ohne dass eine systemische Toxizität und/oder übermäßige 
lokale Hautreizung bei der Maus verursacht wird.
 
— In jede Studie sollte eine gleichzeitige Vehikelkontrolle aufgenommen 
werden sowie gegebenenfalls eine gleichzeitige Positivkontrolle.  
— Es sollten mindestens vier Tiere pro Dosisgruppe verwendet werden.  
— Es können entweder Einzeltierdaten oder gepoolte Daten verwendet 
werden.  
Ist eines dieser Kriterien nicht erfüllt, können diese Leistungsstandards nicht 
zur Validierung der vergleichbaren oder modifizierten Methode verwendet werden.
 
II. Mindestliste der Referenzsubstanzen  
6. Die US-ICCVAM, EC-ECVAM und die harmonisierten japanischen Leis ­
tungsstandards JaCVAM PS (12) geben 18 Mindest-Referenzsubstanzen an, 
die verwendet werden sollten, sowie vier wahlfreie in den Leistungsstan ­
dards des LLNA enthaltene Referenzsubstanzen (Substanzen, die im Ver ­
gleich zu den Ergebnissen von Tests am Menschen oder am Meerschwein ­
chen (B.6, oder OECD-Prüfrichtlinie 406) (13) im LLNA entweder falsch 
positive oder falsch negative Ergebnisse hervorriefen und daher möglicher ­
weise eine gleichwertige oder bessere Leistung als der LLNA nachweisen könnten). Die Auswahl dieser chemischen Stoffe erfolgte nach folgenden 
Kriterien:
 
— die Liste der Referenzsubstanzen enthielt die Typen von Stoffen, die 
üblicherweise auf ihr Hautsensibilisierungspotenzial untersucht werden sowie die ganze Bandbreite der Reaktionen, die mittels des LLNA gemessen oder vorhergesagt werden können;
 
— die Substanzen hatten klar definierte chemische Strukturen;  
— für jede Substanz lagen LLNA-Daten aus Meerschweinchen-Tests (B.6; 
OECD-Prüfrichtlinie 406) (13) und (soweit möglich) Daten aus Tests am Menschen vor, und
 
— die Substanzen waren problemlos im Handel erhältlich.  
Die empfohlenen Referenzsubstanzen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Studien 
mit den vorgeschlagenen Referenzsubstanzen sollten in dem Vehikel be ­
wertet werden, mit dem sie in Tabelle 1 aufgelistet sind. Sollte eine ange ­
gebene Substanz nicht verfügbar sein, können andere Substanzen, die die genannten Auswahlkriterien erfüllen, mit entsprechender Begründung ver ­
wendet werden.
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 ▼M3 
Tabelle 1  
Empfohlene chemische Rreferenzsubstanzen für die Leistungsstandards des LLNA  
Nummer Chemikalien (  1 ) CAS-Nr. Form Veh (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5 x — 2,0 x EC3 Tatsächlicher 
EC3-Bereich LLNA vs. 
GP LLNA vs. 
Test am 
Menschen  
1 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-on (CMI)/2- 
methyl-4-isothiazolin-3-on (MI) (  5 ) 26172- 
55-4/2682-20-4 Liq DMF 0,009 1 0,0045-0,018 NC +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 Sol AOO 0,049 15 0,025-0,099 0.02-0.094 +/+ +/+ 
3 4-Phenylenediamin 106-50-3 Sol AOO 0,11 6 0,055-0,22 0.07-0.16 +/+ +/+ 4 Cobaltchlorid 7646-79-9 Sol DMSO 0,6 2 0,3-1,2 0.4-0.8 +/+ +/+ 5 Isoeugenol 97-54-1 Liq AOO 1,5 47 0,77-3,1 0.5-3.3 +/+ +/+ 
6 2-Mercaptobenzothiazol 149-30-4 Sol DMF 1,7 1 0,85-3,4 NC +/+ +/+ 
7 Citral 5392-40-5 Liq AOO 9,2 6 4,6-18,3 5,1-13 +/+ +/+ 8 HCA 101-86-0 Liq AOO 9,7 21 4,8-19,5 4,4-14,7 +/+ +/+ 9 Eugenol 97-53-0 Liq AOO 10,1 11 5,05-20,2 4,9-15 +/+ +/+ 
10 Phenylbenzoat 93-99-2 Sol AOO 13,6 3 6,8-27,2 1,2-20 +/+ +/+ 11 Zimtalkohol 104-54-1 Sol AOO 21 1 10,5-42 NC +/+ +/+ 
12 Imidazolidinylharnstoff 39236-46-9 Sol DMF 24 1 12-48 NC +/+ +/+ 
13 Methylmethacrylat 80-62-6 Liq AOO 90 1 45-100 NC +/+ +/+ 14 Chlorbenzol 108-90-7 Liq AOO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 15 Isopropanol 67-63-0 Liq AOO 50 1 NA NA –/– –/+
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 ▼M3 
Nummer Chemikalien (  1 ) CAS-Nr. Form Veh (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5 x — 2,0 x EC3 Tatsächlicher 
EC3-Bereich LLNA vs. 
GP LLNA vs. 
Test am 
Menschen  
16 Milchsäure 50-21-5 Liq DMSO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
17 Methylsalicylat 119-36-8 Liq AOO 20 9 NA NA –/– –/– 18 Salicylsäure 69-72-7 Sol AOO 25 1 NA NA –/– –/– 
Wahlfreie Substanzen zum Nachweis einer verbesserten Leistung im Vergleich zum LLNA 
19 Natriumlaurylsulphat 151-21-3 Sol DMF 8,1 5 4,05-16,2 1,5-17,1 +/– +/– 20 Ethylenglykoldimethacrylat 97-90-5 Liq MEK 28 1 14-56 NC +/– +/+ 
21 Xylol 1330-20-7 Liq AOO 95,8 1 47,9-100 NC +/ (**) +/– 
22 Nickelchlorid 7718-54-9 Sol DMSO 5 2 NA NA –/+ –/+
 
Abkürzungen: AOO = Aceton: Olivenöl (4:1, v/v); CAS-Nr. = Chemical Abstracts Service Number; DMF =  N,N -Dimethylformamid; DMSO = Dimethylsulfoxid; DNCB = 2,4-Dinitrochlorobenzol; EC3 = geschätzte 
Konzentration, die zur Erzeugung des Stimulationsindex von 3 benötigt wird; GP = Ergebnis des Meerschweinchen-Tests (B. 6 oder OECD-Prüfrichtlinie 406) (13); HCA = Hexylcinnaminaldehyd; Liq = flüssig; LLNA = 
Ergebnis des lokalen Lymphknotentests an der Maus (B. 42 oder OECD-Prüfrichtlinie 429) (1); MEK = Methylethylketon; NA = nicht zutreffend, da Stimulationsindex < 3; NC = nicht berechnet, da Daten aus Einzelstudie 
stammen; Sol = fest; Veh = Testvehikel. 
(*) Gilt als nicht sensibilisierend beim Menschen, da keine Ergebnisse klinischer Epikutantests (Patch-Tests) vorliegen, da es nicht als Allergen im Patch-Test-System aufgeführt ist und keine Fallberichte für die Sensibilisierung 
beim Menschen verfügbar sind. 
(**) GP-Daten nicht verfügbar. 
( 1 ) Die Prüfsubstanzen sollten täglich zubereitet werden, es sei denn, die Stabilität der Substanz bei Lagerung wird nachgewiesen . 
( 2 ) Aufgrund der potenziellen Beeinträchtigung der Leistung des LLNA durch die Verwendung abweichender Vehikel sollte stets das e mpfohlene Vehikel für jede Referenzsubstanz verwendet werden (24) (32). 
( 3 ) Mittelwert wenn mehr als ein EC3-Wert vorlag. Bei negativen Substanzen ( d. h.  mit einem Stimulationsindex < 3) wird die höchste getestete Konzentration angegeben. 
( 4 ) Zahl der LLNA-Studien, von denen Daten vorliegen. 
( 5 ) Im Handel als Kathon CG (CAS-Nr. 55965-84-9) erhältlich; es handelt sich um ein 3:1-Gemisch aus CMI und MI. Die relativen Kon zentrationen jedes Bestandteils liegen zwischen 1,1 % und 1,25 % (CMI) bzw. 0,3 % und 
0,45 % (MI). Die nicht wirksamen Bestandteile sind Magnesiumsalze (21,5 % bis 24 %) und Kupfernitrat (0,15 % bis 0,17 %); 74 % bis 77 % sind Wasser. Kathon CG ist bei Sigma-Aldrich und Rohm and Haas (nun Dow 
Chemical Corporation) erhältlich.
 III. Vorgegebene Zuverlässigkeits- und Genauigkeitsstandards  
7. Die Genauigkeit einer vorgeschlagenen vergleichbaren oder modifizierten 
LLNA-Methode sollte bei ihrer Bewertung anhand der 18 zu verwendenden 
Mindest-Referenzsubstanzen die Genauigkeit der LLNA-Leistungsstandards erreichen oder übertreffen. Die neue oder modifizierte Methode sollte zu der richtigen Einstufung auf der Grundlage einer „Ja/Nein“-Entscheidung führen. 
Es könnte allerdings sein, dass die neue oder modifizierte Methode nicht zur 
richtigen Einstufung aller zu verwendenden Mindest-Referenzsubstanzen führt. Wenn zum Beispiel einer der schwach sensibilisierenden Stoffe falsch klassifiziert wird, sollten eine wissenschaftliche Begründung für die falsche 
Einstufung sowie die Vorlage zusätzlicher Daten (z. B. Testergebnisse, die 
korrekte Einstufungen für andere Stoffe mit physikalischen, chemischen und sensibilisierenden Eigenschaften zeigen, die denen der falsch eingestuften Referenzsubstanz gleichen) in Erwägung gezogen werden, um eine gleich ­
wertige Leistung nachzuweisen. Unter diesen Umständen würde der Validie ­
rungsstatus der neuen oder modifizierten LLNA-Prüfmethode für jeden Ein ­
zelfall bewertet werden.
 
Intra-Labor-Reproduzierbarkeit  
8. Zur Bestimmung der Intra-Labor-Reproduzierbarkeit sollte eine neue oder 
modifizierte LLNA-Methode unter Verwendung einer sensibilisierenden 
Substanz beurteilt werden, die im LLNA bereits gut bekannt ist. Daher basieren die LLNA-Leistungsstandards auf der Variabilität der Ergebnisse aus wiederholten Tests an Hexylcinnaminaldehyd (HCA). Um die 
Intra-Labor-Zuverlässigkeit zu bewerten, werden die Werte für die ge ­
schätzte Konzentrationsschwelle (ECt) für HCA zu vier verschiedenen Zeit ­
punkten ermittelt, zwischen denen jeweils mindestens eine Woche liegen sollte. Eine akzeptable Intra-Labor-Reproduzierbarkeit zeigt sich in der Fä ­
higkeit eines Labors, in jedem HCA-Test ECt-Werte zwischen 5 % und 
20 % zu erzielen, was einer Bandbreite von 0,5-2,0 mal dem mittleren spezifizierten EC3-Wert für HCA (10 %) im LLNA entspricht (siehe Ta ­
belle 1).
 
Inter-Labor-Reproduzierbarkeit  
9. Zur Bestimmung der Inter-Labor-Reproduzierbarkeit sollte eine neue oder 
modifizierte LLNA-Methode unter Verwendung von zwei sensibilisierenden Substanzen beurteilt werden, die im LLNA bereits gut bekannt sind. Die LLNA-Leistungsstandards basieren auf der Variabilität der Ergebnisse aus 
Tests an HCA und 2,4-Dinitrochlorobenzol (DNCB) in unterschiedlichen 
Laboratorien. Die ECt-Werte sollten unabhängig aus einer einzelnen Studie abgeleitet werden, die in mindestens drei gesonderten Laboratorien durch ­
geführt wurde. Zum Nachweis einer akzeptablen Inner-Labor-Reproduzier ­
barkeit sollte jedes Labor ECt-Werte zwischen 5 % und 20 % für HCA und 
0,025 % bis 0,1 % für DNCB erzielen, was einer Bandbreite von jeweils 0,5-2,0 mal den mittleren spezifizierten EC3-Konzentrationen für HCA (10 %) und DBCB (0,05 %) im LLNA entspricht (siehe Tabelle 1).
 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 620
Anlage 2  
Begriffsbestimmungen  
Genauigkeit:  Der Grad an Übereinstimmung zwischen Testergebnissen und ak ­
zeptierten Referenzwerten. Die Genauigkeit ist ein Maß der Leistung der Prüf ­
methode und ein Aspekt der Relevanz. Der Begriff wird oft im Sinne von 
„Übereinstimmung“ verwendet und bezeichnet den Anteil der korrekten Ergeb ­
nisse einer Prüfmethode (14).  
Vergleichssubstanz:  Eine sensibilisierende oder nicht sensibilisierende Substanz, 
die als Standard zu Vergleichszwecken für eine Prüfsubstanz verwendet wird. 
Eine Vergleichssubstanz sollte die folgenden Eigenschaften haben: i) gleichblei ­
bende und verlässliche Quelle(n); ii) strukturelle und funktionelle Ähnlichkeit mit der Klasse der zu prüfenden Stoffe; iii) bekannte physikalisch-chemische Eigen ­
schaften; iv) unterstützende Daten zu bekannten Effekten und v) bekannte Wirk ­
samkeit im Bereich der erwünschten Reaktion.
 
Geschätzte Konzentrationsschwelle (ECt):  Geschätzte Konzentration einer Prüf ­
substanz, die benötigt wird, um einen Stimulationsindex zu erzeugen, der eine 
positive Reaktion anzeigt.  
Effektive Konzentration drei (EC3):  Geschätzte Konzentration einer Prüfsubstanz, 
die benötigt wird, um einen Stimulationsindex von drei hervorzurufen.  
Falsch negativ:  Eine Prüfsubstanz, die durch eine Prüfmethode fälschlich als 
negativ oder nicht wirksam charakterisiert wird, obwohl sie in Wirklichkeit po ­
sitiv bzw. wirksam ist.  
Falsch positiv:  Eine Prüfsubstanz, die durch eine Prüfmethode fälschlich als 
positiv oder wirksam charakterisiert wird, obwohl sie in Wirklichkeit negativ 
bzw. nicht wirksam ist.  
Gefahr:  Potenzial eines schädlichen Effekts für Gesundheit oder Umwelt. Die 
schädliche Wirkung manifestiert sich nur, wenn es zu einem ausreichenden Ex ­
positionsniveau kommt.  
Inter-Labor-Reproduzierbarkeit:  Das Ausmaß, in dem unterschiedliche qualifi ­
zierte Laboratorien, die dasselbe Protokoll verwenden und dieselben Prüfsubstan ­
zen testen, qualitativ und quantitativ vergleichbare Ergebnisse erzielen können. Die Inter-Labor-Reproduzierbarkeit wird während der Prävalidierungs- und Vali ­
dierungsverfahren ermittelt und zeigt das Maß an, in dem ein Test erfolgreich 
zwischen Laboratorien übertragen werden kann. Im englischen Sprachgebrauch 
spricht man in diesem Zusammenhang auch von „Between-laboratory reproduci ­
bility“ (14).
 
Intra-Labor-Reproduzierbarkeit:  Das Ausmaß, in dem qualifizierte Personen in ­
nerhalb desselben Labors, die dasselbe spezifische Protokoll zu unterschiedlichen Zeiten verwenden, erfolgreich dieselben Ergebnisse replizieren können. In diesem Zusammenhang spricht man auch von laborinterner Reproduzierbarkeit (14).
 
Me-too-Test:  Umgangssprachliche Bezeichnung einer Prüfmethode, die struktu ­
rell und funktionell mit einer validierten und akzeptierten Referenzprüfmethode vergleichbar ist. Eine solche Prüfmethode käme für die Catch-up-Validierung in 
Frage. Gleichbedeutend mit vergleichbarer Prüfmethode verwendet (14).
 
Ausreißer:  Ein Ausreißer ist ein Messwert, der sich beträchtlich von anderen 
Werten in einem zufällig ausgewählten Muster in einer Population unterscheidet.  
Leistungsstandards (PS):  Auf einer validierten Prüfmethode beruhende Normen, 
auf deren Grundlage die Vergleichbarkeit einer vorgeschlagenen, funktionell und mechanistisch ähnlichen Prüfmethode bewertet werden kann. Sie umfassen i) 
wesentliche Elemente der Prüfmethode; ii) ein Mindestverzeichnis von Referenz ­
substanzen, ausgewählt aus den Substanzen, die zum Nachweis der akzeptablen Leistung der validierten Referenzmethode verwendet werden; und iii) je nach den für die validierte Referenzmethode erzielten Ergebnissen ähnliche Genauigkeits- 
und Zuverlässigkeitswerte, die die vorgeschlagene Prüfmethode bei der Bewer ­
tung anhand des Mindestverzeichnisses von Referenzsubstanzen demonstrieren sollte (14).
 
Geschützte Prüfmethode:  Eine Prüfmethode, deren Herstellung und Vertrieb 
durch Patente, Urheberrechte, Handelsmarken usw. beschränkt sind.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 621
 
Qualitätssicherung:  Ein Managementprozess, mittels dessen die Einhaltung von 
Laborprüfnormen, Anforderungen und Aufzeichnungsverfahren sowie die Genau ­
igkeit des Datentransfers durch Individuen bewertet wird, die von den testenden Personen unabhängig sind.
 
Referenzsubstanzen:  Chemikalien, die zur Verwendung im Validierungsprozess 
ausgewählt werden und für die die Reaktionen innerhalb des  in vitro - oder  in 
vivo-Referenztestsystems oder der untersuchten Spezies bereits bekannt sind. 
Diese Chemikalien sollten repräsentativ für die Chemikalienklassen sein, für die die Prüfmethode voraussichtlich verwendet werden soll; ferner sollten sie die ganze Bandbreite an Reaktionen abdecken, die von den Zielchemikalien 
erwartet werden kann — von stark über schwach bis negativ. Für die unter ­
schiedlichen Stadien des Validierungsprozesses, für verschiedene Prüfmethoden und Testverwendungen können unterschiedliche Reihen von Referenzchemikalien benötigt werden (14).
 
Relevanz:  Dieser Begriff bezieht sich auf das Verhältnis zwischen dem Test und 
der betreffenden Wirkung und auf die Frage, ob er aussagekräftig und nützlich 
für einen bestimmten Zweck ist. Er beschreibt das Ausmaß, in dem der Test die untersuchte biologische Wirkung korrekt misst oder vorhersagt. Die Relevanz 
beinhaltet eine Beurteilung der Genauigkeit (Übereinstimmung) einer Prüf ­
methode (14).
 
Zuverlässigkeit:  Maß der Verlässlichkeit der Reproduzierbarkeit der Prüfmethode 
innerhalb von und zwischen Laboratorien in einem bestimmten Zeitintervall bei einheitlichem Protokoll. Sie wird durch Berechnung der Intra- und 
Interlabor-Reproduzierbarkeit bewertet (14).
 
Hautsensibilisierung:  Ein immunologischer Prozess, der auftritt, wenn ein emp ­
findliches Individuum oberflächlich einem induzierenden chemischen Allergen ausgesetzt ist, das eine kutane Immunreaktion auslöst, die zur Entwicklung einer Kontaktsensibilisierung führen kann.
 
Stimulationsindex (SI):  Ein Wert, der zur Bewertung des Hautsensibilisierungspoten ­
zials einer Prüfsubstanz berechnet wird. Der SI ist das Verhältnis der Proliferation in behandelten Gruppen zu dem der gleichzeitigen Vehikelkontrollgruppe.
 
Prüfsubstanz (auch Prüfchemikalie):  Jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit 
dieser Prüfmethode getestet wird.  
Validierte Prüfmethode:  Eine Prüfmethode, für die Validierungsstudien durch ­
geführt wurden, um die Relevanz (einschließlich Genauigkeit) und Zuverlässig ­
keit für einen bestimmten Verwendungszweck zu bestimmen. Es ist zu beachten, dass die Leistungsfähigkeit einer validierten Prüfmethode im Hinblick auf Ge ­
nauigkeit und Zuverlässigkeit unter Umständen nicht den Anforderungen eines 
vorgeschlagenen Verwendungszwecks genügt (14).
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B.43.  PRÜFUNG AUF NEUROTOXIZITÄT BEI NAGETIEREN  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht der OECD TG 424 (1997).  
Diese Prüfmethode wurde zur Gewinnung von Informationen ent ­
wickelt, die benötigt werden, um die potenzielle Neurotoxizität von 
Chemikalien bei ausgewachsenen Tieren zu bestätigen oder näher zu 
charakterisieren. Sie kann entweder mit bestehenden Testmethoden für Prüfungen auf Toxizität bei wiederholter Verabreichung kom ­
biniert oder als Einzelstudie durchgeführt werden. Es wird empfoh ­
len, das OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Stra ­
tegies and Methods (1) als Hilfe hinzuzuziehen, wenn auf der Basis dieser Prüfmethode Studien entwickelt werden. Dies ist besonders dann wichtig, wenn Änderungen der für die routinemäßige Anwen ­
dung dieser Methode empfohlenen Beobachtungen und Testverfah ­
ren in Betracht gezogen werden. Das Guidance Document wurde erarbeitet, um die Auswahl abweichender Testverfahren für spezi ­
fische Anwendungsbedingungen zu vereinfachen.
 
Die Beurteilung einer Entwicklungs-Neurotoxizität ist nicht Ziel die ­
ser Methode.  
1.1. EINLEITUNG  
Bei der Beurteilung und Bewertung der toxischen Eigenschaften von 
Chemikalien muss das Potenzial für neurotoxische Wirkungen be ­
rücksichtigt werden. Die Prüfmethode für systemische Toxizität bei wiederholter Verabreichung umfasst bereits Untersuchungen, mit de ­
nen auf potenzielle Neurotoxizität getestet wird. Diese Prüfmethode 
kann zur Entwicklung einer Studie eingesetzt werden, die zu wei ­
teren Informationen über neurotoxische Wirkungen führt, die bei den Studien zur systemischen Toxizität bei wiederholter Verabreichung beobachtet wurden, oder diese Wirkungen bestätigt. Überlegungen 
zur potenziellen Neurotoxizität bestimmter Chemikalienklassen kön ­
nen jedoch zu der Vermutung führen, dass mit Hilfe dieser Methode eine zweckmäßigere Auswertung möglich ist, auch wenn vorherige Studien zur systemischen Toxizität bei wiederholter Verabreichung 
nicht auf eine potenzielle Neurotoxizität dieser Chemikalien hinge ­
wiesen haben. Anhaltspunkte für Überlegungen dieser Art können beispielsweise sein:
 
— Beobachtung neurologischer Anzeichen oder neuropathologische 
Befunde bei anderen Toxizitätsstudien als Studien zur systemi ­
schen Toxizität bei wiederholter Verabreichung oder  
— strukturelle Verwandtschaft mit bekannten neurotoxischen Sub ­
stanzen oder sonstige Informationen, durch die sie mit diesen in 
Verbindung gebracht werden.  
Darüber hinaus sind weitere Fälle vorstellbar, in denen die Anwen ­
dung dieser Prüfmethode sinnvoll ist (siehe (1)).  
Bei der Entwicklung dieser Methode wurde darauf geachtet, dass sie 
in spezielle Anforderungen angepasst werden kann, um die spezi ­
fische histopathologische und verhaltensbezogene Neurotoxizität ei ­
ner Chemikalie zu bestätigen und eine Charakterisierung und Quan ­
tifizierung der neurologischen Wirkungen zu ermöglichen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 623
 
In der Vergangenheit wurde Neurotoxizität mit Neuropathie in Form 
von neuropathologischen Befunden oder neurologischen Funktions ­
störungen wie Krämpfen, Lähmungen oder Tremor gleichgesetzt. Neuropathie ist eine wichtige Ausprägung einer neurotoxischen Wir ­
kung; heute ist jedoch unstrittig, dass noch viele weitere Anzeichen 
toxischer Wirkungen auf das Nervensystem in Betracht kommen 
(z. B. Verlust der motorischen Koordination, sensorische Defizite, Funktionsstörungen hinsichtlich Lernfähigkeit und Gedächtnis), die in der Neuropathie oder in anderweitigen Studien eventuell nicht 
berücksichtigt werden.
 
Diese Methode zur Prüfung auf Neurotoxizität wurde für die Erken ­
nung deutlicher verhaltensbezogener und neuropathologischer Wir ­
kungen bei ausgewachsenen Nagetieren entwickelt. Verhaltensbezo ­
gene Wirkungen können einen schädlichen Einfluss auf den Orga ­
nismus widerspiegeln, selbst wenn keine morphologischen Verände ­
rungen auftreten; nicht aber alle Verhaltensänderungen sind für das 
Nervensystem spezifisch. Daher sollen alle beobachteten Änderungen im Zusammenhang mit korrelierenden histopathologischen, hämato ­
logischen oder biochemischen Daten sowie mit Daten zu anderen 
Arten systemischer Toxizität ausgewertet werden. Die Untersuchun ­
gen, die bei dieser Methode zur Charakterisierung und Quantifizie ­
rung der neurotoxischen Wirkungen erforderlich sind, beinhalten spezifische histopathologische und verhaltensbezogene Verfahren, 
die durch elektrophysiologische und/oder biochemische Unter ­
suchungen (1) (2) (3) (4) weiter unterstützt werden können.
 
Innerhalb des Nervensystems können neurotoxische Stoffe über eine 
Vielzahl von Mechanismen und auf eine Anzahl verschiedener Ziel ­
gewebe wirken. Da keine einzelne Versuchsreihe in der Lage ist, das 
neurotoxische Potenzial sämtlicher Substanzen umfassend zu testen, 
kann der Einsatz weiterer In-vivo- oder In-vitro-Tests erforderlich sein, die für den beobachteten oder erwarteten Typ einer Neurotoxi ­
zität spezifisch sind.
 
Diese Prüfmethode kann auch in Verbindung mit den Hinweisen im 
OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and 
Methods (1) für die Entwicklung von Studien verwendet werden, welche die Dosis-Wirkungs-Quantifizierung näher charakterisieren oder ihre Empfindlichkeit erhöhen sollen, um eine Dosis ohne be ­
obachtete schädliche Wirkungen (NOAEL) besser abschätzen oder 
bekannte oder vermutete Gefahren einer Chemikalie bestätigen zu können. Beispielsweise können Studien entwickelt werden, die zur Ermittlung und Beurteilung der neurotoxischen Mechanismen oder 
zur Ergänzung der aus der Anwendung grundlegender verhaltens ­
bezogener und neuropathologischer Beobachtungsverfahren bereits gewonnenen Daten dienen. Derartige Studien sollen keine Daten replizieren, die bei der Anwendung der in dieser Methode empfoh ­
lenen Standardverfahren gewonnen würden, wenn entsprechende Da ­
ten bereits vorliegen und nicht als erforderlich für die Interpretation der Ergebnisse der Studie angesehen werden.
 
Diese Prüfung auf Neurotoxizität führt, sowohl für sich allein als 
auch in Kombination mit anderen Studien, zu Informationen,  
— mit denen beurteilt werden kann, ob das Nervensystem durch die 
getestete Chemikalie dauerhaft oder reversibel geschädigt wird,  
— die dazu beitragen können, die Veränderungen des Nervensys ­
tems zu charakterisieren, die mit der Exposition gegenüber der 
Chemikalie in Verbindung stehen, und die zugrunde liegenden 
Mechanismen zu verstehen, und  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 624
 
— die helfen können, den Zusammenhang zwischen Dosis/Zeit und 
Dosis/Wirkung zu bestimmen, um eine Dosis ohne beobachtete 
schädliche Wirkungen (NOAEL) abzuschätzen (die dann für die Festlegung von Sicherheitskriterien für die betreffende Chemika ­
lie genutzt werden kann).
 
Bei dieser Prüfmethode wird die Testsubstanz oral verabreicht. An ­
dere Verabreichungswege (z. B. dermal oder inhalativ) können bes ­
ser geeignet sein und eine Modifizierung der empfohlenen Verfahren erforderlich machen. Überlegungen zur Wahl des Verabreichungs ­
wegs sind vom menschlichen Expositionsprofil und von den verfüg ­
baren toxikologischen oder kinetischen Informationen abhängig.
 
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Schädliche Wirkung:  jede behandlungsbedingte Abweichung von 
den Basiswerten, welche die Fähigkeit eines Organismus herabsetzt, 
zu überleben, sich zu vermehren oder sich an die Umgebung an ­
zupassen.  
Dosis : verabreichte Menge der Testsubstanz; die Dosis wird als Ge ­
wicht (g, mg), als Gewicht der Testsubstanz, pro Gewichtseinheit des Versuchstiers (z. B. mg/kg) oder als konstante Konzentration in der Nahrung (ppm) angegeben.
 
Dosierung : ein genereller Begriff, der sich aus Dosis, Häufigkeit und 
Dauer der Verabreichung zusammensetzt.  
Neurotoxizität: s chädliche Veränderung der Struktur oder Funktion 
des Nervensystems, die infolge der Exposition gegenüber einem che ­
mischen, biologischen oder physikalischen Agens entsteht.  
Neurotoxisches Agens : jedes chemische, biologische oder physika ­
lische Agens, das neurologisch wirken kann.  
NOAEL : ist die Abkürzung für „No-Observed-Adverse-Effect Le ­
vel“ (Dosis ohne beobachtete schädigende Wirkung); entspricht der 
höchsten Dosis, bei der keine behandlungsbedingten schädigenden 
Wirkungen festgestellt werden.  
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Die Testchemikalie wird bei oralem Applikationsweg in einer Reihe 
von Dosierungen mehreren Gruppen von Labor-Nagetieren ver ­
abreicht. In der Regel ist eine wiederholte Gabe erforderlich, wobei 
der Dosierungszeitplan 28 Tage, 90 Tage (subchronisch) oder 1 Jahr und mehr (chronisch) abdecken kann. Das für diese Prüfmethode beschriebene Verfahren kann auch für eine Studie zur akuten Neu ­
rotoxizität angewandt werden. Durch die Tests an den Versuchstieren 
soll die Erkennung oder Charakterisierung von verhaltensbezogenen und/oder neurologischen Anomalien ermöglicht werden. In jedem Beobachtungszeitraum wird eine Reihe von Verhaltensmerkmalen 
beurteilt, die durch ein neurotoxisches Agens beeinträchtigt werden 
könnten. Am Ende des Versuchs wird aus jeder Gruppe eine Teil ­
menge von Tieren beiderlei Geschlechts in situ mittels Perfusion fixiert, und es werden Gewebeschnitte von Gehirn, Rückenmark 
und peripheren Nerven angefertigt und untersucht.
 
Wenn die Untersuchung als Einzelstudie durchgeführt wird, um eine 
Prüfung auf Neurotoxizität durchzuführen oder um neurotoxische 
Wirkungen zu charakterisieren, können die Tiere in jeder Gruppe, 
die nicht für eine Perfusionsfixation und anschließende Histopatho ­
logie verwendet werden (siehe Tabelle 1), für spezifische verhaltens ­
bezogene, neuropathologische, neurochemische oder elektrophysiolo ­
gische Verfahren eingesetzt werden, die als Ergänzung zu den Daten 
dienen können, die bei den für diese Methode erforderlichen Stan ­
darduntersuchungen gewonnen wurden (1). Diese ergänzenden Ver ­
fahren können dann besonders nützlich sein, wenn empirische Be ­
obachtungen oder erwartete Wirkungen auf einen spezifischen Typ 
oder ein spezifisches Zielgewebe für die Neurotoxizität einer Che ­
mikalie hindeuten. Alternativ können die verbleibenden Tiere für Auswertungen verwendet werden, wie sie bei Prüfmethoden an Na ­
getieren zur Prüfung der Toxizität bei wiederholter Verabreichung 
erforderlich sind.
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Wenn die Verfahren dieser Prüfmethode mit denen anderer Prüfun ­
gen kombiniert werden, muss die Anzahl der Versuchstiere ausrei ­
chend groß sein, um die Anforderungen für die Untersuchungen beider Studien zu erfüllen,
 
1.4. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.4.1.  Auswahl der Tierspezies  
Die bevorzugte Nagetierspezies ist die Ratte, es können aber bei 
entsprechender Begründung auch andere Spezies verwendet werden. 
Es sind junge, gesunde, ausgewachsene Tiere üblicher Laborstämme 
zu verwenden. Die weiblichen Tiere dürfen weder bereits geworfen haben noch trächtig sein. Die Verabreichung soll normalerweise so bald wie möglich nach der Entwöhnung beginnen, vorzugsweise 
spätestens im Alter von 6 Wochen, in jedem Fall aber vor dem Alter 
von 9 Wochen. Wenn diese Studie allerdings mit anderen Studien kombiniert wird, müssen diese Altersanforderungen eventuell ange ­
passt werden. Zu Beginn der Studie sollen die Gewichtsunterschiede 
zwischen den Tieren ± 20 % des geschlechtsspezifischen Durch ­
schnittsgewichts nicht überschreiten. Wenn eine kurzzeitige Studie mit wiederholter Verabreichung als Vorstudie für eine Langzeitstudie durchgeführt wird, sollen bei beiden Studien Tiere des gleichen 
Stamms und derselben Herkunft verwendet werden.
 
1.4.2.  Haltung und Fütterung  
Die Temperatur im Versuchstierraum soll 22  o C (± 3  o C) betragen. 
Die relative Luftfeuchtigkeit soll mindestens 30 % betragen und 
außer während der Reinigung vorzugsweise nicht über 70 % liegen; anzustreben ist ein Wert von 50-60 %. Die Beleuchtung soll künst ­
lich sein, und die Heil- und Dunkelphasen sollen sich im Abstand 
von 12 Stunden abwechseln. Kurzzeitige laute Geräusche sollen auf 
ein Minimum reduziert werden. An die Versuchstiere kann her ­
kömmliches Laborfutter verfüttert werden, wobei eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung zu gewährleisten ist. Die Auswahl des Fut ­
ters wird eventuell dadurch beeinflusst, dass eine geeignete Bei ­
mischung der Testsubstanz sichergestellt werden muss, wenn die Testsubstanz auf diese Art verabreicht werden soll. Die Tiere können entweder einzeln oder in kleinen gleichgeschlechtlichen Gruppen in 
Käfigen untergebracht werden.
 
1.4.3.  Vorbereitung der Versuchstiere  
Für die Behandlungs- und Kontrollgruppen werden gesunde Jung ­
tiere nach Zufallskriterien ausgewählt. Die Käfige sollen so angeord ­
net werden, dass etwaige Einflüsse der Käfigplatzierung minimiert werden. Die Tiere werden eindeutig gekennzeichnet und für eine Dauer von mindestens 5 Tagen vor Versuchsbeginn in ihren Käfigen 
gehalten, damit sie sich an die Laborbedingungen gewöhnen können.
 
1.4.4.  Verabreichungsweg und Vorbereitung der Testsubstanz  
Diese Prüfmethode behandelt ausdrücklich die orale Verabreichung 
der Testsubstanz. Die orale Verabreichung kann per Sondenfütterung 
(„gavage“), im Futter, im Trinkwasser oder in Form von Kapseln erfolgen. Andere Verabreichungswege (z. B. dermal oder inhalativ) können ebenfalls verwendet werden, machen aber eventuell eine 
Modifizierung der empfohlenen Verfahren erforderlich. Die Wahl 
des Verabreichungswegs ist vom zu erwartenden menschlichen Ex ­
positionsprofil und von den verfügbaren toxikologischen oder kine ­
tischen Informationen abhängig. Die Entscheidung für einen geeig ­
neten Verabreichungsweg sowie entsprechende Änderungen der Ver ­
fahrensweisen bei dieser Prüfmethode sind zu begründen.
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Im Bedarfsfall kann die Testsubstanz gelöst oder in einem geeigneten 
Vehikel suspendiert werden. Es wird empfohlen, zunächst die Verwen ­
dung einer wässrigen Lösung/Suspension in Betracht zu ziehen, dann eine Lösung/Suspension in Öl (z. B. Maisöl) und erst an dritter Stelle eine Lösung/Suspension in einem anderen Vehikel. Die toxischen Ei ­
genschaften des Vehikels müssen bekannt sein. Darüber hinaus sollen 
die folgenden Eigenschaften des Vehikels berücksichtigt werden: Wir ­
kungen des Vehikels auf Absorption, Verteilung, Verstoffwechslung oder Retention der Testsubstanz, durch die sich ihre toxischen Eigen ­
schaften ändern können, sowie Wirkungen auf den Futter- oder Trink ­
wasserverzehr oder den Ernähungszustand der Tiere.
 
1.5. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG  
1.5.1.  Anzahl und Geschlecht der Tiere  
Wenn die Untersuchung als Einzelstudie durchgeführt wird, sind min ­
destens 20 Tiere (10 weibliche und 10 männliche Tiere) in jeder Dosie ­
rungs- und Kontrollgruppe zur Auswertung der detaillierten klinischen und funktionsbezogenen Beobachtungen einzusetzen. Mindestens 
5 männliche und 5 weibliche Tiere, die aus diesen 10 männlichen und 
10 weiblichen Tieren ausgewählt wurden, sollen am Ende der Studie in situ mittels Perfusion fixiert und für eine ausführliche Neurohistopatho ­
logie verwendet werden. In Fällen, wo nur eine begrenzte Anzahl von 
Tieren in einer bestimmten Dosierungsgruppe Anzeichen für neurotoxi ­
sche Wirkungen zeigt, sollte erwogen werden, diese Tiere gleichfalls in die Gruppe der für die Perfusionsfixation ausgewählten Tiere aufzuneh ­
men. Wenn die Studie in Verbindung mit einer Prüfung auf Toxizität bei 
wiederholter Verabreichung durchgeführt wird, sollte die Anzahl der Versuchstiere groß genug sein, um die Zielvorgaben beider Studien erfüllen zu können. Die Mindestzahl der Tiere pro Gruppe ist in Tabelle 
1 für verschiedene Kombinationen von Studien angegeben, Wenn zwi ­
schenzeitliche Tötungen oder Erholungsgruppen zur Beobachtung von Reversibilität, Persistenz oder verzögertem Auftreten von toxischen Wir ­
kungen nach der Behandlung vorgesehen sind oder wenn ergänzende 
Untersuchungen erwogen werden, sollte die Anzahl der Versuchstiere 
erhöht werden, um zu gewährleisten, dass genügend Tiere zur Beobach ­
tung und für die Histopathologie zur Verfügung stehen.
 
1.5.2.  Behandlungs- und Kontrollgruppe  
Es sollen mindestens drei Dosierungsgruppen und eine Kontrollgruppe 
eingesetzt werden; wenn aber angesichts der Beurteilung anderer Daten bei einer wiederholten Dosis von 1 000 mg pro kg Körpergewicht und Tag keine Wirkungen zu erwarten sind, kann ein Limit-Test durch ­
geführt werden. Wenn keine geeigneten Daten zur Verfügung stehen, 
kann als Hilfe zur Ermittlung der zu verwendenden Dosierungen eine Dosisfindungsstudie durchgeführt werden. Abgesehen von der Be ­
handlung mit der Testsubstanz sollen die Tiere in der Kontrollgruppe 
unter identischen Bedingungen behandelt werden wie die Versuchs ­
tiere in der Testgruppe. Wenn bei der Verabreichung der Testsubstanz ein Vehikel verwendet wird, sollte die Kontrollgruppe die grö βte ver­
wendete Volumenmenge des Vehikels erhalten.
 
1.5.3.  Überprüfung der Zuverlässigkeit  
Das Labor, das die Untersuchung durchführt, soll Daten vorlegen, die 
seine Befähigung zur Durchführung der Studie sowie die Empfindlich ­
keit der eingesetzten Verfahren belegen. Diese Daten sollen zeigen, 
dass Änderungen bei den verschiedenen für die Beobachtung empfoh ­
lenen Endpunkten erkannt und quantifiziert weiden können, z. B. auto ­
nome Anzeichen, sensorisches Reaktionsvermögen, Greifkraft der Ex ­
tremitäten und motorische Aktivität. Informationen zu Chemikalien, 
die neurotoxische Reaktionen verschiedener Art auslösen und als po ­
sitive Kontrollsubstanzen eingesetzt werden können, sind den Quellen (2) bis (9) zu entnehmen. Historische Kontrolldaten können verwendet 
werden, wenn die wesentlichen Aspekte der Versuchsabläufe gleich 
bleiben. Eine regelmäßige Aktualisierung der historischen Kontroll ­
daten wird empfohlen. Wenn ein wesentliches Element der Versuchs ­
durchführung oder der Verfahrensweisen durch das ausführende Labor 
verändert wurde, sollen neue Daten erarbeitet werden, welche die un ­
veränderte Empfindlichkeit der Verfahren belegen.
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1.5.4.  Wahl der Dosierungen  
Bei der Wahl der Dosierungen sollen zuvor ermittelte toxikologische 
und kinetische Daten berücksichtigt werden, die für die zu testende Verbindung oder verwandte Materialien zur Verfügung stehen, Die 
höchste Dosis solle mit dem Ziel gewählt werden, neurotoxische 
Wirkungen oder deutliche systemische toxische Wirkungen auszulö ­
sen. Anschließend soll eine absteigende Folge von Dosierungsstufen ausgewählt werden, um dosisabhängige Wirkungen und die nied ­
rigste Dosis ohne zu beobachtende schädliche Wirkungen (NOAEL) 
zu bestimmen. Grundsätzlich sollen die Dosierungen so gewählt werden, dass primäre toxische Wirkungen auf das Nervensystem 
von Wirkungen in Zusammenhang mit systemischer Toxizität unter ­
schieden werden können. Häufig sind zwei bis drei Intervalle das Optimum, und die Ergänzung durch eine vierte Testgruppe ist häufig der Anwendung sehr langer Intervalle (d. h. größer als Faktor 10) 
zwischen den Verabreichungen vorzuziehen. Sofern eine realistische 
Expositionsabschätzung für Menschen vorhanden ist, soll diese eben ­
falls berücksichtigt weiden.
 
1.5.5.  Limit-Test  
Wenn bei einer Untersuchung mit einer Dosierung von mindestens 
1 000 mg pro kg Körpergewicht und Tag bei Anwendung der be ­
schriebenen Verfahren keine neurotoxischen Wirkungen festzustellen 
und aufgrund der Daten für strukturverwandte Verbindungen keine 
toxischen Wirkungen zu erwarten sind, ist eine vollständige Unter ­
suchung mit drei Dosierungen eventuell nicht erforderlich. Je nach der für Menschen zu erwartenden Exposition kann die Verwendung 
einer höheren oralen Dosierung beim Limit-Test notwendig sein. Bei 
anderen Verabreichungsformen, z. B. Inhalation oder dermale Appli ­
kation, wird der maximal erzielbare Expositionsgrad in vielen Fällen durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Testsubstanz 
bestimmt. Bei der Durchführung einer Studie zur akuten oralen To ­
xizität soll die Dosis für einen Limit-Test mindestens 2 000 mg/kg betragen,
 
1.5.6.  Verabreichung der Dosen  
Die Testsubstanz wird den Tieren mindestens 28 Tage lang, sieben 
Tage pro Woche, täglich verabreicht. Wenn eine Verabreichung an 
nur fünf Tagen pro Woche oder eine kürzere Expositionsdauer ge ­
wählt wird, muss dies begründet werden. Wenn die Testsubstanz per Sondenfütterung verabreicht wird, soll dies in Form einer Einzeldosis über einen Magenschlauch oder eine geeignete Intubationskanüle 
erfolgen. Welches Flüssigkeitsvolumen jeweils höchstens auf einmal 
verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Das Volumen soll 1 ml pro 100 g Körpergewicht nicht überschreiten. Bei wässrigen Lösungen kann jedoch auch die Verwendung von bis 
zu 2 ml pro 100 g Körpergewicht in Betracht gezogen werden. 
Außer bei reizenden oder ätzenden Stoffen, die bei höheren Konzen ­
tration normalerweise heftigere Wirkungen hervorrufen, sollen Ver ­
änderungen des Testvolumens durch Anpassung der Konzentration 
so minimiert werden, dass bei allen Dosierungen ein gleich bleiben ­
des Volumen gewährleistet ist.
 
Bei Substanzen, die im Futter oder Trinkwasser verabreicht werden, 
ist es wichtig, sicherzustellen, dass die eingesetzte Menge der Test ­
substanz die normale Nahrungsaufnahme oder den Wasserhaushalt 
nicht beeinträchtigt. Wenn die Testsubstanz im Futter verabreicht 
wird, kann entweder eine konstante Konzentration im Futter (ppm) oder eine konstante Dosis, bezogen auf das Körpergewicht des Tie ­
res, verwendet werden; die jeweils gewählte Verfahrensweise muss 
angegeben werden. Bei Verabreichung der Prüfsubstanz durch Son ­
denfütterung soll die Dosis jeden Tag zu ähnlichen Zeiten gegeben und nach Bedarf angepasst werden, um, bezogen auf das Körper ­
gewicht der Tiere, eine konstante Dosierung einzuhalten, Wenn eine 
Prüfung mit wiederholter Verabreichung als Vorbereitung zu einer 
Langzeituntersuchung durchgeführt wird, soll bei beiden Studien ein ähnliches Futter verwendet werden. Bei Studien zur akuten Toxizität kann die Dosis, sofern die Verabreichung als Einzeldosis nicht mög ­
lich ist, über einen Zeitraum von maximal 24 Stunden in kleineren 
Teilmengen verabreicht werden,
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1.6. BEOBACHTUNGEN  
1.6.1.  Häufigkeit der Beobachtungen und Untersuchungen  
Bei Prüfungen mit wiederholter Verabreichung soll der Beobach ­
tungszeitraum den gesamten Verabreichungszeitraum abdecken. Bei 
Studien zur akuten Toxizität soll ein Zeitraum von 14 Tagen nach 
der Behandlung beobachtet werden. Bei Tieren in Satelittengruppen, die wahrend eines auf die Behandlung folgenden Zeitraums ohne Exposition gehalten werden, sollen die Beobachtungen diesen Zeit ­
raum ebenfalls abdecken.
 
Die Beobachtungen sollen ausreichend häufig erfolgen, damit ver ­
haltensbezogene und/oder neurologische Anomalien mit möglichst großer Wahrscheinlichkeit erkannt werden. Die Beobachtungen sol ­
len vorzugsweise jeden Tag zur gleichen Uhrzeit erfolgen, wobei die 
Zeit der nach der Verabreichung erwarteten maximalen Wirkungen zu berücksichtigen ist. Die Häufigkeit der klinischen Beobachtungen und Funktionstests ist in Tabelle 2 zusammengefasst. Wenn kineti ­
sche oder andere Daten, die aus einer früheren Studie gewonnen 
wurden, es notwendig erscheinen lassen, abweichende Beobach ­
tungs- oder Testzeitpunkte oder andere Zeiträume nach der Beobach ­
tung zu verwenden, sollte ein alternativer Zeitplan verwendet wer ­
den, um möglichst viele Informationen gewinnen zu 
können. Änderungen des Zeitplans sollen begründet werden.
 
1.6.1.1.  Beobachtungen zum allgemeinen Gesundheitszustand und zur 
Mortalität/Morbidität  
Alle Versuchstiere sollen mindestens einmal täglich gründlich auf 
ihren Gesundheitszustand sowie mindestens zweimal täglich auf 
Morbidität und Mortalität untersucht werden.  
1.6.1.2.  Detaillierte klinische Beobachtungen  
Detaillierte klinische Beobachtungen sollen an allen für diesen 
Zweck ausgewählten Tieren durchgeführt werden (siehe Tabelle 1), und zwar einmal vor der ersten Exposition (um Vergleiche zwischen 
den Versuchstieren zu ermöglichen) sowie anschließend je nach 
Dauer der Untersuchung in unterschiedlichen Intervallen (siehe Ta ­
belle 2). Am Ende des Erholungszeitraums sollen detaillierte kli ­
nische Beobachtungen an den Satellitengruppen vorgenommen wer ­
den. Die detaillierten klinischen Beobachtungen sollen außerhalb des 
Unterbringungskäfigs in einer üblichen Untersuchungsumgebung er ­
folgen. Diese Beobachtungen sollen anhand von Bewertungssyste ­
men sorgfältig registriert werden, die Kriterien oder Bewertungsska ­
len für jede bei den Beobachtungen vorgenommene Messung ent ­
halten. Die verwendeten Kriterien oder Skalen sollen vom Versuchs ­
labor explizit festgelegt werden. Es soll versucht werden, dafür zu sorgen, dass Abweichungen der Versuchsbedingungen minimal sind 
(und nicht systematisch mit der Behandlung in Verbindung stehen) 
und dass die Beobachtungen von geschulten Beobachtern durch ­
geführt werden, denen die Behandlung des gegenwärtig beobachteten Tieres nicht bekannt ist.
 
Es wird empfohlen, die Beobachtungen in einer strukturierten Form 
durchzuführen, wobei auf jedes Versuchstier zu jedem Beobach ­
tungszeitpunkt genau definierte Kriterien (einschließlich der Defini ­
tion des „Normalbereichs“) auf systematische Weise angewandt wer ­
den. Der „Normalbereich“ soll auf geeignete Weise dokumentiert 
werden. Alle beobachteten Anzeichen sollen registriert werden. Wann immer möglich, sollte auch die Größenordnung der beobach ­
teten Anzeichen registriert werden. Die klinischen Beobachtungen 
sollen mindestens, aber nicht ausschließlich Veränderungen an Haut, 
Fell, Augen und Schleimhäuten sowie das Auftreten von Sekreten, Ausscheidungen und autonomen Aktivitäten umfassen (z. B. Tränen ­
fluss, Haaraufrichtung, Pupillengrö βe, ungewöhnliche Atemmuster 
und/oder Mundatmung, ungewöhnliche Anzeichen von Urin- oder 
Kotabsonderung sowie Urin mit Farbabweichungen).
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Ungewöhnliche Reaktionen hinsichtlich Körperhaltung, Aktivitäts ­
grad (z. B. verminderte oder verstärkte Erkundung der üblichen Un ­
tersuchungsumgebung) sowie Bewegungskoordination sollen eben ­
falls vermerkt werden. Veränderungen des Gangs (z. B. watschelnder Gang, Ataxie), der Haltung (z. B. Buckelhaltung) und des Reaktions ­
verhaltens beim Aufnehmen oder Umsetzen des Versuchstiers oder 
anderen Umgebungsstimuli sowie Auftreten von klonischen oder to ­
nischen Bewegungen, Krämpfen oder Tremors, Stereotypien (z. B. übermäßige Fellpflege, ungewöhnliche Kopfbewegungen, repetitives 
Laufen im Kreis) oder auffälliges Verhalten (z. B. Beißen oder über ­
mäßiges Lecken, Selbstverstümmelung, Rückwärtslaufen, Lautäuße ­
rungen) oder Aggressionen sollen registriert werden.
 
1.6.1.3.  Funktionstests  
Ähnlich wie die detaillierten klinischen Beobachtungen sollen auch 
die Funktionstests bei allen für diesen Zweck ausgewählten Ver ­
suchstieren einmal vor der ersten Exposition und mehrmals danach durchgeführt werden (siehe Tabelle 1). Die Häufigkeit der Funk ­
tionstests ist ebenfalls von der Dauer der Studie abhängig (siehe 
Tabelle 2). Zusätzlich zu den in Tabelle 2 genannten Beobachtungs ­
zeiträumen sollen auch funktionsbezogene Beobachtungen an wei ­
teren Erholungsgruppen so nahe wie möglich am Zeitpunkt der end ­
gültigen Tötung erfolgen. Funktionstests sollen die sensorische Re ­
aktionsfähigkeit auf Stimuli verschiedener Art (z. B. akustische, vi ­
suelle und propriozeptive Stimuli (5) (6) (7)) berücksichtigen und die Beurteilung der Greifkraft der Extremitäten (8) sowie die Beurteilung 
der motorischen Aktivität (9) beinhalten. Die motorische Aktivität 
soll mit Hilfe eines automatischen Geräts gemessen werden, mit dem sowohl eine Abnahme als auch eine Zunahme der Aktivität festgestellt werden kann. Wenn ein anderes definiertes System einge ­
setzt wird, sollte es quantitativ ausgerichtet sein; Empfindlichkeit und 
Zuverlässigkeit des Systems sollen nachgewiesen werden. Jedes Ge ­
rät soll getestet. werden, um die Langzeit-Zuverlässigkeit und die Vergleichbarkeit unterschiedlicher Geräte sicherzustellen. Weitere In ­
formationen zu den anwendbaren Verfahren sind den jeweiligen Li ­
teraturhinweisen zu entnehmen. Wenn keine Daten (z. B. Struktur ­
aktivität, epidemiologische Daten, weitere toxikologische Studien) vorhanden sind, die auf potenzielle neurotoxische Wirkungen hin ­
deuten, soll die Einbeziehung speziellerer Tests der sensorischen und 
motorischen Funktionen sowie der Lern- und Gedächtnisfähigkeit in Betracht gezogen werden, um diese möglichen Wirkungen gründli ­
cher zu untersuchen. Weitere Informationen über speziellere Tests 
und ihre Anwendung sind (1) zu entnehmen.
 
Im Ausnahmefall können Tiere, die Anzeichen für Toxizität in einem 
Maß aufweisen, das die Funktionstests deutlich beeinträchtigen wür ­
de, von dem betreffenden Test ausgeschlossen werden. Wenn ein ­
zelne Tiere von einem Funktionstest ausgeschlossen wurden, sollte hierfür eine Begründung angegeben werden.
 
1.6.2.  Körpergewicht und Futter-/Trinkwasserverbrauch  
Bei Prüfungen mit einer Dauer von bis zu 90 Tagen sollen alle Tiere 
mindestens einmal wöchentlich gewogen werden, und es sollen min ­
destens in wöchentlichem Abstand Messungen des Futterverbrauchs 
(sowie des Wasserverbrauchs, wenn die Testsubstanz auf diesem 
Wege verabreicht wird) durchgeführt werden. Bei Langzeitstudien sollen alle Tiere während der ersten 13 Wochen mindestens einmal wöchentlich sowie anschließend mindestens einmal alle 4 Wochen 
gewogen werden. Messungen des Futterverbrauchs (sowie des Was ­
serverbrauchs, wenn die Testsubstanz auf diesem Wege verabreicht wird) sollen während der ersten 13 Wochen mindestens einmal sowie anschließend in etwa dreimonatigem Abstand durchgeführt werden, 
sofern der Gesundheitszustand oder Veränderungen des Körper ­
gewichts nicht ein anderes Vorgehen erforderlich machen.
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1.6.3.  Ophthalmologie  
Bei Prüfungen mit einer Dauer von über 28 Tagen soll vor der 
Verabreichung der Testsubstanz und am Ende der Studie eine oph ­
thalmologische Untersuchung mit einem Ophthalmoskop oder einem 
vergleichbaren Instrument durchgeführt werden; die Untersuchung 
soll vorzugsweise bei allen Versuchstieren, zumindest aber bei den Tieren in der Gruppe mit hoher Dosierung und in der Kontrollgruppe vorgenommen werden. Wenn Veränderungen an den Augen fest ­
gestellt werden oder wenn klinische Anzeichen dies erforderlich er ­
scheinen lassen, sollen alle Tiere untersucht werden. Bei Langzeit ­
studien soll außerdem nach 13 Wochen eine ophthalmologische Un ­
tersuchung durchgeführt werden. Ophthalmologische Untersuchun ­
gen sind nicht erforderlich, wenn diese Daten bereits aus anderen Studien mit ähnlicher Dauer und ähnlichen Dosierungen zur Ver ­
fügung stehen.
 
1.6.4.  Hämatologie und klinische Biochemie  
Wenn die Prüfung auf Neurotoxizität in Verbindung mit einer Studie 
zur systemischen Toxizität bei wiederholter Verabreichung durch ­
geführt wird, sollen hämatologische Untersuchungen und klinische 
biochemische Untersuchungen durchgeführt werden, wie in der ent ­
sprechenden Methode für die Prüfung auf systemische Toxizität be ­
schrieben. Die Werte sollen so erfasst werden, dass potenzielle ver ­
haltensbezogene Wirkungen minimiert werden.  
1.6.5.  Histopathologie  
Die neuropathologische Untersuchung soll darauf abzielen, die wäh ­
rend der In-vivo-Phase der Studie gemachten Beobachtungen zu 
ergänzen und zu erweitern. Gewebeproben von mindestens 5 Tieren 
pro Geschlecht und Gruppe (siehe Tabelle 1 und nächsten Abschnitt) sollen mit Hilfe allgemein anerkannter Perfusions- und Fixierungs ­
verfahren in situ perfundiert und fixiert werden (siehe (3), Kapitel 5, 
und (4), Kapitel 50). Alle erkennbaren makroskopischen Verände ­
rungen sollen registriert werden. Wenn die Studie als Einzeltest auf Neurotoxizität oder zur Charakterisierung von neurotoxischen Wir ­
kungen durchgeführt wird, können die restlichen Tiere entweder für 
spezifische verhaltensbezogene (10) (11), neuropathologische (10) 
(11) (12) (13), neurochemische (10) (11) (14) (15) oder elektrophy ­
siologische (10) (11) (16) (17) Untersuchungen verwendet werden, die eine Ergänzung zu den hier beschriebenen Verfahren und Unter ­
suchungen bilden, oder für histopathologische Untersuchungen ein ­
gesetzt werden, um die Anzahl der Versuchstiere zu vergrößern. Diese ergänzenden Untersuchungen sind dann besonders sinnvoll, wenn empirische Beobachtungen oder erwartete Wirkungen auf ei ­
nen bestimmten Typ oder ein bestimmtes Zielgewebe für die Neu ­
rotoxizität einer Chemikalie hindeuten (2) (3). Alternativ können die verbleibenden Tiere auch für pathologische Routineauswertungen verwendet werden, wie bei der Methode für Studien mit wiederholter 
Verabreichung beschrieben.
 
Bei allen in Paraffin eingebetteten Gewebeproben soll ein übliches 
Färbeverfahren, z. B. Hämatoxylin und Eosin (H&E), angewandt und 
eine mikroskopische Untersuchung durchgeführt werden. Wenn An ­
zeichen einer peripheren Neuropathie beobachtet oder vermutet wer ­
den, sollen an Kunststoff eingebettete Proben des peripheren Nerven ­
gewebes untersucht werden. Klinische Anzeichen können auch auf 
weitere zu untersuchende Bereiche hinweisen oder die Anwendung von speziellen Färbeverfahren nahelegen. Hinweise zu weiteren zu untersuchenden Bereichen finden sich in (3) (4). Geeignete Spezial- 
Färbeverfahren zur Sichtbarmachung bestimmter pathologischer Ver ­
änderungen können ebenfalls nützlich sein (18).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 631
 
Repräsentative Gewebeschnitte aus dem zentralen und peripheren 
Nervensystem sollen histologisch untersucht werden (siehe (3), 
Kapitel 5, und (4), Kapitel 50). Dabei sollen normalerweise die folgenden Bereiche untersucht werden: Vorderhirn, Mitte des Groß ­
hirns einschließlich eines Anschnitts durch den Hippokampus, Mit ­
telhirn, Kleinhirn, Brücke, verlängertes Mark, Auge mit Sehnerv und 
Netzhaut, Rückenmark an den zervikalen und lumbalen Verdickun ­
gen, dorsale Wurzelganglien, dorsale und ventrale Nervenwurzelfa ­
sern, proximaler Ischiasnerv, proximaler Schienbeinnerv (am Knie) 
und Wadenmuskel-Äste des Schienbeinnervs. Die Gewebeschnitte 
durch Rückenmark und peripheres Nervengewebe sollen sowohl Quer- als auch Längsschnitte umfassen. Auf die Gefäßversorgung des Nervensystems soll geachtet werden. Es soll auch eine Probe 
eines Skelettmuskels, insbesondere eines Wadenmuskels, untersucht 
werden. Bereiche mit Zell- und Faserstruktur und -muster im ZNS und PNS, bei denen eine besondere Anfälligkeit für neurotoxische Stoffe bekannt ist, sollen besonders beachtet werden.
 
Anmerkungen zu neuropathologischen Veränderungen, die typischer ­
weise durch Exposition gegenüber neurotoxischen Stoffen entstehen, 
sind den Quellen (3) (4) zu entnehmen. Es wird eine schrittweise Untersuchung der Gewebeproben empfohlen, wobei zunächst Gewe ­
beschnitte aus der Gruppe mit hoher Dosis mit denen der Kontroll ­
gruppe verglichen werden. Wenn bei den Proben aus diesen Gruppen 
keine neuropathologischen Veränderungen festgestellt werden, ist eine anschließende Analyse nicht erforderlich. Wenn bei der Gruppe mit hoher Dosis neuropathologische Veränderungen beobachtet wer ­
den, soll anschließend eine Probe von jedem der potenziell betroffe ­
nen Gewebebereiche aus der Gruppe mit mittlerer und niedriger Dosis kodiert und nacheinander untersucht werden.
 
Wenn sich bei der qualitativen Untersuchung ein Hinweis auf neuro ­
pathologische Veränderungen ergibt, sollte in allen Bereichen des Ner ­
vensystems, die diese Veränderungen zeigen, eine zweite Untersuchung 
durchgeführt werden, Gewebeschnitte aus allen Dosierungsgruppen und aus jeder der potenziell betroffenen Regionen sollen kodiert und ohne Kenntnis des Kodes nach Zufallskriterien untersucht werden. Die Häu ­
figkeit und der Schweregrad jedes Befunds sollen registriert werden. 
Nachdem in allen Dosierungsgruppen sämtliche Regionen bewertet wur ­
den, kann die Kodierung aufgehoben und eine statistische Analyse durchgeführt werden, um die Dosis-Wirkungs-Beziehungen auszuwer ­
ten. Beispiele für die unterschiedlichen Schweregrade der einzelnen Be ­
funde sollen beschrieben werden.
 
Die neuropathologischen Ergebnisse sollen in Zusammenhang mit 
verhaltensbezogenen Beobachtungen und Messungen sowie mit an ­
deren Daten ausgewertet werden, die aus vorausgegangenen und 
gleichzeitig durchgeführten Studien zur systemischen Toxizität der Testsubstanz stammen.
 
2. DATEN  
2.1. BEHANDLUNG DER ERGEBNISSE  
Es sollen Einzeldaten zur Verfügung gestellt werden. Darüber hinaus 
sollen sämtliche Daten in Form einer Tabelle zusammengefasst wer ­
den, die für jede Test- oder Kontrollgruppe die folgenden Informa ­
tionen enthält: die Anzahl der Tiere zu Beginn des Tests, die Anzahl der Tiere, deren Tod während des Tests festgestellt wurde oder die aus Gründen des Tierschutzes getötet wurden, sowie der jeweilige 
Todes- oder Tötungszeitpunkt, die Anzahl der Tiere mit Anzeichen 
einer toxischen Wirkung, eine Beschreibung der beobachteten Toxi ­
zitätszeichen einschließlich des Zeitpunkts des Einsetzens, der Dauer und des Schweregrads etwaiger toxischer Wirkungen, die Anzahl der 
Tiere, die pathologische Befunde aufweisen, einschließlich der Art 
und des Schweregrads.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 632
 
2.2. AUSWERTUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Die Ergebnisse der Studie sollen hinsichtlich Häufigkeit, Schwere ­
grad und Wechselbeziehung der verhaltensbezogenen und neuro ­
pathologischen Wirkungen (auch der neurochemischen oder elektro ­
physiologischen Wirkungen, sofern ergänzende Untersuchungen 
ebenfalls durchgeführt wurden) sowie im Hinblick auf sonstige be ­
obachtete schädliche Wirkungen ausgewertet werden. Wenn möglich, sollen die numerischen Ergebnisse mittels einer geeigneten und all ­
gemein anerkannten statistischen Methode ausgewertet werden. Die 
statistische Methode soll in der Entwurfsphase der Studie ausgewählt werden.
 
3. BERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss folgende Angaben enthalten:  
Testsubstanz:  
— physikalische Beschaffenheit (einschließlich Isomerie, Reinheit 
und physikalisch-chemischen Eigenschaften);  
— Identifizierungsdaten.  
Vehikel (wenn verwendet):  
— Begründung für die Wahl des Vehikels.  
Versuchstiere:  
— verwendete Spezies/Stamm;  
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere;  
— Herkunft/Züchter der Tiere, Haltungsbedingungen, Eingewöh ­
nung, Futter usw.;  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Versuchsbeginn.  
Testbedingungen:  
— Angaben über die Zubereitung der Testsubstanz/ ­
Futterzubereitung, erzielte Konzentration, Stabilität und Homoge ­
nität der Zubereitung;  
— Angabe zu den verabreichten Dosen, einschließlich Angaben 
über Vehikel, Volumen und physikalische Form des verabreich ­
ten Materials;  
— Angaben über die Verabreichung der Testsubstanz;  
— Begründung für die gewählten Dosierungen;  
— Begründung für den gewählten Applikationsweg und die Dauer 
der Exposition;  
— Umrechnung von der Konzentration der Testsubstanz im Futter/ ­
Trinkwasser (ppm) auf die tatsächliche Dosis (mg pro kg Kör ­
pergewicht und Tag), wenn maßgeblich;  
— Angaben über die Futter- und Trinkwasserqualität.  
Beobachtungen- und Testverfahren:  
— Angaben über die Zuordnung der Tiere in den einzelnen Gruppen 
zu den Untergruppen für die Perfusionsfixation;  
— Angaben über die Bewertungssysteme, einschließlich der Krite ­
rien und Bewertungsskalen für jede Messung im Rahmen der 
detaillierten klinischen Beobachtungen;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 633
 
— Angaben zu den Funktionstests für die sensorische Reaktions ­
fähigkeit auf Stimuli verschiedener Art (z. B. akustisch, visuell 
und propriozeptiv), für die Beurteilung der Greifkraft der Extre ­
mitäten, für die Beurteilung der motorischen Aktivität (ein ­
schließlich Angaben über automatische Geräte zur Aktivitäts ­
erkennung) sowie Angaben zu anderen eingesetzten Verfahren;  
— Angaben zu ophthalmologischen Untersuchungen und gegebe ­
nenfalls hämatologischen Untersuchungen und klinischen bioche ­
mischen Tests mit den entsprechenden Nominalwerten;  
— Angaben zu den einzelnen verhaltensbezogenen, neuropathologi ­
schen, neurochemischen oder elektrophysiologischen Unter ­
suchungen.  
Ergebnisse:  
— Körpergewicht/Änderungen des Körpergewichts einschließlich 
Körpergewicht zum Zeitpunkt der Tötung;  
— Futterverbrauch und Trinkwasserverbrauch, wenn maßgeblich;  
— Daten zur toxischen Wirkung nach Geschlecht und Dosierung, 
einschließlich Anzeichen für Toxizität oder Mortalität;  
— Art, Schweregrad und Dauer (Zeitpunkt des Einsetzens und wei ­
terer Verlauf) der detaillierten klinischen Beobachtungen (rever ­
sibel oder irreversibel);  
— detaillierte Beschreibung sämtlicher Ergebnisse der Funktions ­
tests;  
— Sektionsbefunde;  
— ausführliche Beschreibung sämtlicher verhaltensbezogenen, neu ­
ropathologischen und neurochemischen oder neurophysiologi ­
schen Ergebnisse, sofern verfügbar;  
— Angaben zur Resorption und Metabolismus, sofern verfügbar;  
— statistische Auswertung der Ergebnisse, wenn möglich.  
Diskussion der Ergebnisse:  
— Dosis-Wirkungs-Informationen;  
— Zusammenhang zwischen anderen toxischen Wirkungen und ei ­
ner Schlussfolgerung bezüglich des neurotoxischen Potenzials der 
Testchemikalie;  
— Dosis ohne beobachtete schädigende Wirkungen (NOAEL).  
Schlussfolgerungen:  
— Eine konkrete Aussage über die Gesamt-Neurotoxizität der Test ­
chemikalie ist wünschenswert.  
4. LITERATUR  
(1) OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strate ­
gies and Test Methods. OECD, Paris, in Vorbereitung.  
(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, 
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, in Vorberei ­
tung.  
(3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental He ­
alth Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure  to Che­
micals.
 
(4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980) Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, 
H.H. eds, Williams and Wilkins, Baltimore/London.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 634
 
(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neuro ­
logical Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999- 
1003.  
(6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indus ­
trial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691704.  
(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observatio ­
nal Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. 
Appl. Pharmacol., 108, 267-283.  
(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. 
(1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and 
Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. To ­
xicol., 1, 233-236.  
(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., GUI, M.W., Reirer, 
L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlabotatory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments, Neurotoxicol. Teratol., 13, 
599-609.
 
(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.  
(11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Mar ­
cel Dekker, New York.  
(12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxi ­
city Assessment. J. Amer. Coll, Toxicol.,  U), 689-695.  
(13) Moser, V.C, Anthony, D.C., Sette, W.R and MacPhail, R.C, 
(1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2- Hydro ­
xyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 
18, 343-352.  
(14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurorypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452.
 
(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378.
 
(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Elect ­
rophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp 299-335.
 
(17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neuro ­
loxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicolo ­
gy. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and 
Wilkins Co., Baltimore/London, 726- 742.  
(18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Tech ­
niques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Living ­
stone.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 635
 
Tabelle 1  
Benötigte Mindestanzahl der Tiere pro Gruppe, abhängig davon, ob die Prüfung auf Neurotoxizität als 
Einzelstudie oder in Verbindung mit anderen Studien durchgeführt wird  
DURCHFÜHRUNG DER PRÜFUNG AUF NEUROTOXIZITÄT ALS: 
Einzelstudie Kombinierte Prüfung in 
Verbindung mit 28-Ta ­
ge-Studie Kombinierte Prüfung in 
Verbindung mit 90-Ta ­
ge-Studie Kombinierte Prüfung in 
Verbindung mit Studie 
zur chronischen Toxizi ­
tät 
Gesamtzahl der Tiere pro 
Gruppe 10 männliche und 
10 weibliche Tiere 10 männliche und 
10 weibliche Tiere 15 männliche und 
15 weibliche Tiere 25 männliche und 25 
weibliche Tiere 
Anzahl der für Funktions ­
tests einschließlich detail ­
lierter klinischer Beobach ­
tungen ausgewählten Tiere 10 männliche und 
10 weibliche Tiere 10 männliche und 
10 weibliche Tiere 10 männliche und 
10 weibliche Tiere 10 männliche und 10 
weibliche Tiere 
Anzahl der für ln-situ-Per ­
fusionsfixation und Neuro ­
histopathologie ausgewähl ­
ten Tiere 5 männliche und 5 
weibliche Tiere 5 männliche und 5 
weibliche Tiere 5 männliche und 5 
weibliche Tiere 5 männliche und 5 
weibliche Tiere 
Anzahl der für die Be ­
obachtungen (Toxizität bei 
wiederholter Verabrei ­
chung/subchronische Toxi ­
zität/chronische Toxizität, 
Hämatologie, klinische Bio ­
chemie, Histopathologie usw.) ausgewählten Tiere, wie in den entsprechenden 
Prüfrichtlinien  (Guidelines)  
angegeben 5 männliche und 5 
weibliche Tiere 10 männliche (
 † ) 
und 10 weibliche 
Tiere (  † ) 20 männliche (  † ) und 
20 weibliche Tiere ­
( † ) 
Ergänzende Beobachtungen 
nach Bedarf 5 männliche und 5 
weibliche Tiere  
( † ) Einschließlich 5 Tiere, die für Funktionstests und detaillierte klinische Beobachtungen im Rahmen der Neurotoxizitätsstudie 
ausgewählt werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 636
 
Tabelle 2  
Häufigkeit der klinischen Beobachtungen und Funktionstests  
Art der Beobachtung Dauer der Studie 
Akut 28 Tage 90 Tage Chronisch  
Bei allen Tieren Allgemeiner Ge ­
sundheitszustand Täglich Täglich Täglich Täglich 
Mortalität/Mor ­
bidität Zweimal täglich Zweimal täglich Zweimal täglich Zweimal täglich 
Bei den für Funk ­
tionsbeobachtungen ausgewählten Tie ­
ren Detaillierte kli ­
nische Beobach ­
tungen — vor der ers ­
ten Exposi ­
tion 
— binnen 8 
Stunden 
nach Ver ­
abreichung zum Zeit­
punkt der 
erwarteten maximalen Wirkung 
— am 7 und 
14. Tag nach Verabrei­
chung — vor der ers ­
ten Exposi ­
tion 
— anschließend 
einmal wö ­
chentlich — vor der ers ­
ten Exposi ­
tion 
— einmal wäh ­
rend der ers ­
ten oder zweiten Ex ­
positions­
woche 
— anschließend 
monatlich — vor der ersten 
Exposition 
— einmal am 
Ende des ers ­
ten Expositi ­
onsmonats 
— anschließend 
alle drei Mo ­
nate 
Funktionstests — vor der ers ­
ten Exposi ­
tion 
— binnen 8 
Stunden 
nach Ver ­
abreichung zum Zeit­
punkt der 
erwarteten 
maximalen Wirkung 
— am 7. und 
14. Tag nach 
Verabrei­
chung — vor der ers ­
ten Exposi ­
tion 
— während der 
vierten Be ­
handlungs
­
woche mög ­
lichst nahe am Ende des 
Expositions ­
zeitraums — vor der ers ­
ten Exposi ­
tion 
— einmal wäh ­
rend der ers ­
ten oder 
zweiten Ex ­
positions­
woche 
— anschließend 
monatlich — vor der ersten 
Exposition 
— einmal am 
Ende des ers ­
ten Expositi ­
onsmonats 
— anschließend 
alle drei Mo ­
nate
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B.44.  HAUTRESORPTION: IN-VIVO-METHODE  
1. METHODE  
Diese Testmethode entspricht OECD TG 427 (2004).  
1.1. EINLEITUNG  
Die meisten Chemikalien wirken über die Haut auf den Körper ein, 
während bei den meisten an Labortieren durchgeführten toxikologi ­
schen Studien die Chemikalie oral verabreicht wird. Die in dieser Richtlinie beschriebene Untersuchung der perkutanen In-vivo-Re ­
sorption stellt die Verbindung her, die bei der Sicherheitsbewertung 
im Anschluss an dermale Exposition für die Extrapolation der Ergeb ­
nisse oraler Studien notwendig ist.
 
Eine Substanz muss eine große Zahl von Hautschichten durchdrin ­
gen, bevor sie in den Kreislauf gelangen kann. Bei den meisten Substanzen wird die Penetrationsgeschwindigkeit durch die aus toten Zellen bestehende Hornhaut  (Stratum Corneum)  bestimmt. Die Per ­
meabilität der Haut wird sowohl von der Lipophilie der Chemikalie 
als auch von der Dicke der äußeren Epidermisschicht sowie durch Faktoren wie dem Molgewicht und der Stoffkonzentration bestimmt. Im Allgemeinen ist die Haut von Ratten und Hasen permeabler als 
die menschliche Haut, während die Permeabilität der Haut von Meer ­
schweinchen und Affen der Permeabilität der menschlichen Haut ähnelt.
 
Die Methoden zur Messung der perkutanen Resorption lassen sich in 
zwei Kategorien einteilen: in vivo und in vitro. Die In-vivo-Methode liefert bei unterschiedlichen Labortierarten gute Informationen zur Hau ­
tresorption. In jüngerer Zeit wurden ergänzend In-vitro-Methoden ent ­
wickelt. Bei diesen wird der Transport durch die menschliche oder tie ­
rische Haut in ihrer vollständigen oder teilweisen Dicke in einem Flüs ­
sigkeitsbehälter untersucht. Die In-vitro-Methode wird in einer separaten 
Testverfahrensbeschreibung (1) beschrieben. Es wird empfohlen, das 
OECD Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies (2) als Hilfe bei der Wahl der für den jeweiligen Fall geeignetsten Me ­
thode zu Rate zu ziehen; dieses Dokument enthält nähere Angaben zur 
Eignung der In-vivo- und In-vitro-Methoden.
 
Die hier beschriebene In-vivo-Methode ermöglicht die Bestimmung 
der Penetration der Testsubstanz durch die Haut in den Kreislauf. 
Dieses Verfahren findet seit Jahren weithin Anwendung (3) (4) (5) 
(6) (7). Zwar sind In-vitro-Studien zur perkutanen Resorption in zahlreichen Fällen geeignet, doch können die benötigten Daten in bestimmten Fällen nur durch In-vivo-Studien gewonnen werden.
 
Die Vorteile der In-vivo-Methode bestehen darin, dass dabei ein 
physiologisch und metabolisch intaktes System und eine zahlreichen Toxizitätsstudien gemeinsame Tierart verwendet wird und dass diese 
Methode für die Verwendung mit anderen Arten modifiziert werden 
kann. Nachteile sind die Verwendung lebender Tiere und die Not ­
wendigkeit, radioaktiv markiertes Material einzusetzen, damit zuver ­
lässige Ergebnisse gewährleistet sind, ferner Schwierigkeiten bei der 
Bestimmung der Frühresorptionsphase und die unterschiedliche Per ­
meabilität der Haut der bevorzugt verwendeten Art (Ratten) und der menschlichen Haut. Tierische Haut ist im Allgemeinen durchlässiger, d. h., die perkutane Resorption der menschlichen Haut könnte dem ­
zufolge überschätzt werden (6) (8) (9). Ätzende Materialien sollten 
an lebenden Tieren nicht getestet werden.
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1.2. DEFINITIONEN  
Unresorbierte Dosis:  Dies entspricht der nach der Exposition von 
der Hautoberfläche abgewaschenen Dosis sowie der ggf. in der nicht okkludierten Abdeckung enthaltenen Dosis, einschließlich etwaiger 
Dosen, bei denen nachgewiesen wird, dass sie sich während der 
Exposition auf der Haut verflüchtigen.
 
Resorbierte Dosis  (in vivo): Diese umfasst die im Urin, in Käfig ­
reinigungsrückständen, Fäzes, ausgeatmeter Luft (soweit diese ge ­
messen wird), im Blut, Gewebe (sofern erfasst) und dem übrigen Körper verbliebene Dosis nach Entfernung der Haut an der Stelle, an der die Substanz aufgetragen wurde.
 
Resorbierbare Dosis:  Diese stellt die nach dem Waschen auf oder 
in der Haut vorhandene Dosis dar.  
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Die Testsubstanz wird — möglichst in radioaktiv markierter Form — 
in einer oder mehreren geeigneten Dosierungen als repräsentative 
praktische Präparation auf der geschorenen Haut der Tiere auf ­
gebracht. Die Testpräparation bleibt während einer bestimmten Zeit ­
dauer unter einer geeigneten (nicht okklusiven, semi-okklusiven oder okklusiven) Abdeckung mit der Haut in Kontakt. Am Ende des 
Expositionszeit wird die Abdeckung entfernt und die Haut mit einem 
geeigneten Reinigungsmittel gereinigt; Abdeckung und Reinigungs ­
mittel werden zur Analyse aufbewahrt, und es wird eine frische Abdeckung angebracht. Die Tiere werden vor, während und nach 
der Expositionszeit in Stoffwechsel-Einzelkäfigen untergebracht, 
und die während dieses Zeitraums anfallenden Exkremente und die ausgeatmete Luft werden zu Analysezwecken gesammelt. Die Sammlung der ausgeatmeten Luft kann entfallen, wenn ausreichende 
Angaben darüber vorliegen, dass nur wenig oder gar keine flüchtigen 
radioaktiven Stoffwechselprodukte gebildet werden. Im Rahmen der Studien werden normalerweise mehrere Tiergruppen der Testpräpara ­
tion ausgesetzt. Eine Gruppe wird am Ende der Expositionszeit ge ­
tötet. Andere Gruppen werden zu festgelegten späteren Zeitpunkten 
getötet (2). Am Ende der Probenahmephase werden die verbleiben ­
den Tiere getötet, Blut zu Analysezwecken entnommen, die Auf ­
tragsstelle zur Analyse entnommen und der Körper auf etwaige nicht 
ausgeschiedene Stoffe untersucht. Die Stichproben werden durch ent ­
sprechende Mittel untersucht und der Grad der perkutanen Resorp ­
tion näherungsweise ermittelt (6) (8) (9).
 
1.4. BESCHREIBUNG DER TESTMETHODE  
1.4.1.  Auswahl von Versuchstierarten  
Üblicherweise werden Ratten verwendet, allerdings können auch 
haarlose Stämme und Arten, deren Hautresorptionsrate denen der menschlichen Haut näherkommt, verwendet werden (3) (6) (7) (8) (9). Es sind junge, ausgewachsene und gesunde Tiere gleichen Ge ­
schlechts (standardmäßig männliche Tiere) üblicherweise verwende ­
ter Laborstämme zu verwenden. Zu Beginn der Studie dürfen die Gewichtsunterschiede der verwendeten Tiere eine Grenze von ± 20 % des mittleren Gewichts nicht überschreiten. So sind beispiels ­
weise männliche Ratten mit einem Gewicht von 200-250 g geeignet, 
insbesondere Tiere in der oberen Hälfte dieses Gewichtsbereichs.
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1.4.2.  Zahl und Geschlecht der Versuchstiere  
Zur Vorbereitung des Tests und für jeden Beendigungszeitpunkt ist 
je eine Gruppe von mindestens 4 Tieren gleichen Geschlechts zu verwenden. Jede Gruppe von Tieren wird nach unterschiedlichen 
Zeitintervallen getötet, beispielsweise nach Ende der Expositionszeit 
(typischerweise 6 oder 24 Stunden) bzw. zu späteren Zeitpunkten (z. B. nach 48 und 72 Stunden). Liegen Daten vor, anhand deren erhebliche Unterschiede der dermalen Toxizität bei männlichen und 
weiblichen Tieren nachgewiesen werden, ist das empfindlichere Ge ­
schlecht zu wählen. Liegen keine diesbezüglichen Daten vor, ist die Wahl des Geschlechts freigestellt.
 
1.4.3.  Unterbringungs- und Fütterungsbedingungen  
Die Temperatur im Tierversuchsraum muss 22  o C (± 3  o C) betragen. 
Die relative Luftfeuchte muss mindestens 30 % betragen und sollte 
70 % — außer beim Reinigen des Raums — nicht überschreiten. 
Angestrebt werden sollte eine Luftfeuchte von 50-60 %. Für die Beleuchtung ist Kunstlicht zu verwenden und so zu schalten, dass sich 12 Stunden Licht mit 12 Stunden Dunkelheit abwechseln. Zur 
Ernährung sind herkömmliche Labornahrungsmittel zu verwenden, 
die unrationiert mit einer unbegrenzten Menge Trinkwasser zur Ver ­
fügung stehen sollten. Während der Studie sowie vorzugsweise auch während der Eingewöhnungsphase werden die Tiere einzeln in Stoff ­
wechselkäfigen untergebracht. Da die Ergebnisse durch verschüttetes 
Nahrungsmittel und Wasser beeinträchtigt würden, ist die Wahr ­
scheinlichkeit derartiger Störungen zu minimieren.
 
1.4.4.  Präparation der Tiere  
Die Tiere werden markiert, damit sie einzeln identifiziert werden 
können. Vor Beginn der Studie werden sie mindestens 5 Tage 
lang in ihren Käfigen gehalten, so dass eine Gewöhnung an die 
Laborbedingungen erfolgen kann.  
Nach der Akklimatisierungsphase und rund 24 Stunden vor der Ver ­
abreichung der Dosis wird an jedem Tier ein Hautbereich im Schul ­
ter- und Rückenbereich geschoren. Da geschädigte Haut andere Per ­
meationseigenschaften als intakte Haut aufweist, ist Abrieb der Haut ­
oberfläche zu vermeiden. Nach der Schur und rund 24 Stunden vor Auftragen der Testsubstanz auf die Haut (siehe Abschnitt 1.4.7) ist die Hautoberfläche mit Aceton abzuwischen, um das Sebum zu ent ­
fernen. Zusätzliches Waschen mit Seife und Wasser ist nicht zu 
empfehlen, da Seifenrückstände die Resorption der Testsubstanz för ­
dern könnten. Der Bereich muss so groß sein, dass eine zuverlässige Berechnung der resorbierten Menge der Testchemikalie je cm
 2 Haut 
gewährleistet ist, vorzugsweise also mindestens 10 cm  2 . Ein solcher 
Bereich kann an Ratten mit einem Körpergewicht von 200-250 g hergestellt werden. Nach der Vorbereitung werden die Tiere wieder in die Stoffwechselkäfige platziert.
 
1.4.5.  Testsubstanz  
Als Testsubstanz wird der Stoff verwendet, dessen Penetrationseigen ­
schaften untersucht werden sollen. Idealerweise ist die Testsubstanz 
radioaktiv zu markieren.  
1.4.6.  Testpräparation  
Die Präparation der Testsubstanz (z. B. reines, verdünntes oder for ­
muliertes Material, das die auf der Haut aufgetragene Testchemikalie enthält) muss der Substanz entsprechen (oder ein realistisches Sur ­
rogat hiervon bilden), der Menschen oder andere betroffene Gruppen 
ausgesetzt sein können. Etwaige Abweichungen von der in der Pra ­
xis verwendeten Präparation sind zu begründen. Bei Bedarf wird die Prüfsubstanz in einem geeigneten Medium gelöst oder suspendiert. Bei anderen Trägermedien als Wasser müssen die Resorptionseigen ­
schaften und mögliche Wechselwirkungen mit der Testsubstanz be ­
kannt sein
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1.4.7.  Aufbringen auf die Haut  
Auf der Hautoberfläche wird eine Applikationsstelle mit einer be ­
stimmten Fläche festgelegt. Eine bekannte Menge der Testpräpara ­
tion wird gleichmäßig auf dieser Stelle aufgetragen. Diese Menge 
muss im Regelfall die potenzielle Exposition wiedergeben, der der 
Mensch ausgesetzt ist, typischerweise bei Feststoffen 1-5 mg/cm  2 
oder bei Flüssigkeiten bis zu 10 μl/cm  2 . Abweichende Mengen müs ­
sen aufgrund der zu erwartenden Verwendungsbedingungen, der Un ­
tersuchungsziele oder der physikalischen Eigenschaften der Testprä ­
paration gerechtfertigt sein. Nach dem Auftrag ist die behandelte Stelle gegen Überstreichen zu schützen. Eine typische Vorrichtung 
hierfür ist in Abbildung 1 dargestellt; normalerweise wird die Haut ­
stelle, an der der Auftrag erfolgte, durch eine nicht okklusive Ab ­
deckung geschützt (z. B. eine permeable Nylongazeabdeckung). Bei infiniter Applikation ist die Applikationsstelle jedoch zu okkludieren. 
Falls durch die Verdunstung semiflüchtiger Testsubstanzen die Rück ­
gewinnungsrate der Testsubstanz in einem inakzeptablen Maß ver ­
ringert wird (siehe auch Abschnitt 1.4.10, erster Absatz), muss die verdunstete Substanz in einem Aktivkohlefilter über der Applikati ­
onsvorrichtung aufgefangen werden (siehe Abbildung 1). Derartige 
Vorrichtungen dürfen die Haut nicht schädigen und die Testpräpara ­
tion weder absorbieren noch mit ihr reagieren. Die Tiere werden anschließend wieder in ihre Stoffwechsel-Einzelkäfige gesetzt, damit 
die Exkremente aufgefangen werden können.
 
1.4.8.  Dauer der Exposition und Probenahme  
Die Expositionsdauer entspricht der Zeitdauer zwischen Auftrag und 
Entfernung der Testpräparation durch Waschen der Haut. Dabei ist 
eine aussagefähige Expositionszeit (normalerweise 6 oder 24 Stun ­
den) entsprechend der beim Menschen zu erwartenden Expositions ­
dauer einzuhalten. Nach der Expositionsdauer verbleiben die Tiere bis zum planmäßigen Ende der Studie in den Stoffwechselkä ­
figen. Während der gesamten Dauer der Studie sind die Tiere in 
regelmäßigen Intervallen auf Anzeichen toxischer Wirkungen/ ­
abnormaler Reaktionen zu beobachten. Am Ende der Expositionszeit ist die behandelte Hautfläche auf sichtbare Anzeichen einer Reizung 
zu untersuchen.
 
Die Stoffwechselkäfige müssen so eingerichtet sein, dass Urin und 
Fäzes während der gesamten Untersuchungsdauer separat gesammelt 
werden können. Die Sammlung von  14 C-Kohlendioxid und flüchti ­
gen  14 C-Kohlenstoffverbindungen muss möglich sein; diese Verbin ­
dungen sind, wenn sie in entsprechender Menge anfallen (> 5 %), zu 
analysieren. Urin, Exkremente und in der Auffangvorrichtung zu ­
rückgehaltene Flüssigkeiten (z. B.  14 C-Kohlendioxid und flüchtige  
14 C-Verbindungen) sind zu den einzelnen Probenahmezeitpunkten 
aus jeder Gruppe einzeln zu sammeln. Liegen ausreichende Angaben 
darüber vor, dass kaum oder keine flüchtigen radioaktiven Stoff ­
wechselprodukte gebildet werden, können auch offene Käfige ver ­
wendet werden.  
Die Exkremente werden während der Dauer der Exposition, bis zu 
24 Stunden nach dem erstmaligen Hautkontakt und anschließend täglich bis zum Ende des Versuchs gesammelt. Normalerweise sind 
drei Intervalle für die Sammlung von Exkrementen ausreichend, je 
nach beabsichtigtem Zweck der Testpräparation oder vorliegenden kinetischen Daten können jedoch auch geeignetere oder zusätzliche Zeitpunkte für eine Untersuchung in Betracht kommen.
 
Am Ende des Expositionszeitraums wird die Schutzvorrichtung von 
den Tieren entfernt und separat zur weiteren Analyse verwahrt. An 
allen Tieren ist die behandelte Haut mindestens dreimal mit geeig ­
neten Tupfern zu waschen. Dabei ist darauf zu achten, dass keine anderen Körperteile kontaminiert werden. Das Reinigungsmittel muss typisch für die bei normaler Körperhygiene verwendeten Pro ­
dukte sein, z. B. eine wässrige Seifenlösung. Abschließend ist die 
Haut zu trocknen. Sämtliche Tupfer und Waschrückstände sind zur Analyse aufzubewahren. Bei Tieren jener Gruppen, die bis zu einem späteren Zeitpunkt untersucht werden, ist zum Schutz der behandel ­
ten Hautstelle eine neue Abdeckung anzubringen, bevor diese wieder 
in ihre Einzelkäfige verbracht werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 641
 
1.4.9.  Abschließende Schritte  
Die Tiere der einzelnen Gruppen sind zum festgelegten Zeitpunkt zu 
töten, und das Blut ist zur Analyse aufzufangen. Die Schutzvorrich ­
tung bzw. -abdeckung ist zur Analyse zu entfernen. Die Haut an der 
Applikationsstelle und ein ähnlicher Bereich unbehandelter, rasierter 
Haut sind zur separaten Analyse bei jedem Tier zu entfernen. Die Applikationsstelle kann zerlegt werden, wobei das  Stratum corneum  
von der darunter liegenden Epidermis getrennt wird und daraus wei ­
tere Informationen zur Verteilung der Testchemikalie gewonnen wer ­
den. Durch die Ermittlung der Ablagerung über einen bestimmten Zeitraum nach der Expositionszeit lassen sich Angaben zum Verbleib 
bzw. Verhalten der einzelnen Testchemikalien im  Stratum corneum  
gewinnen. Um die Fraktionierung der Haut zu erleichtern (nachdem die Haut letztmalig gewaschen und das Tier getötet wurde), werden die einzelnen Schutzabdeckungen entfernt. Die Applikationsstelle auf 
der Haut sowie ein angrenzender ringförmiger Hautbereich werden 
aus dem Rattenkörper herausgeschnitten und auf einer Unterlage befestigt. Ein Klebestreifen wird mit leichtem Druck auf der Haut ­
oberfläche angedrückt und das Klebeband zusammen mit einem Teil 
des Stratum corneum  abgezogen. Anschließend werden weitere Kle ­
bestreifen aufgebracht, bis das Klebeband nicht mehr an der Haut ­
oberfläche haftet; dann ist das gesamte  Stratum corneum  entfernt. 
Sämtliche Klebestreifen eines jeden Tieres können in einem einzigen 
Behälter gemeinsam verwahrt werden; diesem Behälter wird ein Ge ­
webeauflösungsmittel zur Auflösung des  Stratum corneum  zugesetzt. 
Bestimmte für die Untersuchung bestimmte Gewebe können zur se ­
paraten Messung entnommen werden, bevor der Tierkörper auf die 
resorbierte Körperdosis untersucht wird. Die Körper der einzelnen 
Tiere sind zu Analysezwecken aufzubewahren. Normalerweise reicht die Analyse des Gesamtgehalts aus. Zur Untersuchung vorgesehene Organe können zur separaten Analyse entnommen werden (wenn 
dies durch andere Studien angezeigt ist). Der zum Zeitpunkt der 
Tötung in der Blase enthaltene Urin ist zu dem zuvor gesammelten Urin zu geben. Nachdem die Exkremente zum Zeitpunkt der Tötung aus den Stoffwechselkäfigen gesammelt wurden, sind die Käfige und 
ihre Auffangvorrichtungen mit einem geeigneten Lösemittel zu wa ­
schen. Andere möglicherweise verunreinigte Geräte sind ebenfalls zu analysieren.
 
1.4.10.  Analyse  
In allen Studien ist eine ausreichende Rückgewinnung (d. h. ein 
Mittelwert von 100 ± 10 % der Radioaktivität) anzustreben. Rück ­
gewinnungsraten außerhalb dieses Sollbereichs sind zu begründen. 
Die Menge der in jeder Probe verabreichten Dosis ist durch in ge ­
eigneter Weise validierte Verfahren zu analysieren.  
Als Teil der statistischen Untersuchung ist bei den Wiederholungen 
jeder Anwendung ein Maß für die Streuung zu berücksichtigen.  
2. DATEN  
An sämtlichen Tieren sind bei jeder Probenahme der Testchemikalie 
und/oder der Stoffwechselprodukte die unten stehenden Messungen durchzuführen. Zusätzlich zu Einzeldaten sind die entsprechend den 
Probenahmezeiten zu Gruppen zusammengefassten Daten als Mittel ­
werte in den Bericht aufzunehmen:
 
— Menge, die den Schutzvorrichtungen zugeordnet wird,  
— Menge, die aus der Haut gelöst werden kann,  
— Menge in/auf der Haut, die nicht von der Haut abgewaschen 
werden kann,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 642
 
— Menge in der Blutprobe,  
— Menge in den Exkrementen und der ausgeatmeten Luft (falls 
maßgeblich),  
— im Körper und in zu separaten Analysen entnommenen Organen 
verbleibende Menge.  
Anhand der in den Exkrementen, der ausgeatmeten Luft, im Blut und 
im Körper enthaltenen Menge der Testsubstanz und/oder der Meta ­
boliten kann die zu den jeweiligen Zeitpunkten resorbierte Gesamt ­
menge bestimmt werden. Außerdem ist eine Berechnung der Menge 
der Testchemikalie möglich, die je cm  2 der während der Expositions ­
zeit der Testsubstanz ausgesetzten Haut resorbiert wurde.  
3. BERICHTERSTATTUNG  
3.1. ABSCHLUSSBERICHT  
Der Testbericht muss die im Protokoll festgelegten Anforderungen 
einschließlich einer Begründung für das verwendete Testsystem so ­
wie folgende Angaben enthalten:  
Prüfsubstanz  
— Kenndaten, z. B. CAS-Nummer, sofern vorhanden, Quelle, Rein ­
heit (radiochemische Reinheit), bekannte Verunreinigungen, Par ­
tienummer;  
— physikalische Beschaffenheit, physikalisch-chemische Eigen ­
schaften (z. B. pH-Wert, Flüchtigkeit, Löslichkeit, Stabilität, Molgewicht und log Pow).
 
Testpräparation:  
— Formulierung und Begründung für die Verwendung;  
— Details der Testpräparation, aufgetragene Menge, erreichte Kon ­
zentration, Vehikel, Stabilität und Homogenität.  
Versuchstier:  
— Art/Stamm;  
— Zahl, Alter und Geschlecht der Tiere;  
— Herkunft der Tiere, Unterbringungsbedingungen, Ernährung 
usw.;  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Versuchsbeginn.  
Prüfbedingungen:  
— Details zur Verabreichung der Testpräparation (Applikationsort, 
Testmethoden, Okklusion/Nicht-Okklusion, Volumen, Extraktion, Nachweis);
 
— Angaben zu Futter- und Wasserqualität.  
Ergebnisse:  
— etwaige Anzeichen von Toxizität;  
— in Tabellenform dargestellte Resorptionsdaten (angegeben als 
Geschwindigkeit, Menge oder Prozentwert);  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 643
 
— Gesamtrückgewinnungsrate aus dem Versuch;  
— Auswertung der Ergebnisse, Vergleich mit bereits vorliegenden 
Daten zur perkutanen Resorption der Testverbindung.  
Erörterung der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  
4. LITERATURHINWEISE  
1. Testing Method B.45. Skin Absorption:  In vitro  Method.  
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
3. ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for 
Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No. 20.  
4. Zendzian R.P. (1989) Skin Penetration Method suggested for 
Environmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. 
Toxicol.  8(5), 829-835.  
5. Kemppainen B.W., Reifenrath W.G. (1990) Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.  
6. EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Appli ­
cations. Exposure Assessment Group, Office of Health and En ­
vironmental Assessment.  
7. EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pesticides and Toxic 
Substances.  
8. Bronaugh R.L., Wester R.C., Bucks D., Maibach H.I. and Sara ­
son R. (1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance in ­
gredients in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic.  28, 
369-373.  
9. Feldman R.J. and Maibach H.I. (1970) Absorption of some or ­
ganic compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol.  
54, 399-404.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 644
 
Abbildung 1  
Beispiel für die Gestaltung einer typischen Vorrichtung zur Begrenzung und zum 
Schutz der dermalen Applikationsstelle bei In-vivo-Studien zur perkutanen 
Resorption
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 645
 
B.45.  HAUTRESORPTION:  IN-VITRO-METHODE  
1. METHODE  
Diese Testmethode entspricht OECD TG 428 (2004).  
1.1. EINLEITUNG  
Diese Methode soll Aufschluss über die Resorption einer auf ein 
ausgeschnittenes Hautstück aufgebrachten Testsubstanz geben. Sie kann entweder mit der Hautresorptionsmethode: In-vivo-Methode 
(1) kombiniert oder separat durchgeführt werden. Für die Gestaltung 
von Studien auf der Grundlage dieser Methode wird empfohlen, das OECD Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies (2) zu Rate zu ziehen. Diese Richtlinie soll Hilfestellung 
bei der Wahl geeigneter In-vitro-Verfahren für bestimmte Anwen ­
dungsfälle leisten, damit die Zuverlässigkeit der durch dieses Ver ­
fahren gewonnenen Ergebnisse gewährleistet ist.
 
Die Methoden zur Messung der Hautresorption und des dermalen 
Eintrags lassen sich in zwei Kategorien unterteilen: in vivo und in 
vitro. In-vivo-Methoden zur Untersuchung der Hautresorption sind 
seit langem etabliert und liefern pharmakokinetische Angaben zu verschiedenen Tierarten. Eine In-vivo-Methode wird in einer wei ­
teren Testmethode (1) beschrieben. In-vitro-Methoden werden seit 
Jahren ebenfalls zur Messung der Hautresorption eingesetzt. Offi ­
zielle Validierungsstudien der In-vitro-Methoden, die unter die vor ­
liegende Testmethode fallen, wurden zwar nicht durchgeführt, doch wurde von den OECD-Experten im Jahr 1999 festgestellt, dass der 
Umfang der evaluierten Daten als Bestätigung der In-vitro-Methode 
ausreicht (3). Weitere Details zur Untermauerung dieser Bestätigung — darunter umfangreiche direkte Vergleiche von In-vitro- und In- vivo-Methoden — sind in der unter (2) angegebenen Richtlinie (Gui ­
dance Document) enthalten. Dieses Thema wurde bereits in zahlrei ­
chen Monografien dargestellt, die auch ausführliche Hintergrund ­
informationen zum Einsatz von In-vitro-Methoden enthalten (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12). Mit In-vitro-Methoden wird die Dif ­
fusion von Chemikalien in und durch die Haut in einen Flüssigkeits ­
tank gemessen, wobei an nicht lebensfähiger Haut die reine Diffu ­
sion oder an frischer, stoffwechselaktiver Haut gleichzeitig Diffusion und Hautstoffwechsel gemessen werden können. Derartige Methoden 
finden insbesondere Verwendung als Raster für den Vergleich des 
Eintrags von Chemikalien aus unterschiedlichen Formulierungen in und durch die Haut und bieten sich darüber hinaus als nützliche Modelle für die Beurteilung der perkutanen Resorption beim Men ­
schen an.
 
Die In-vitro-Methode eignet sich möglicherweise nicht für sämtliche 
Situationen und Chemikalienklassen. Möglicherweise kann die In- vitro-Testmethode zur einleitenden qualitativen Evaluierung der Pe ­
netration durch die Haut verwendet werden. In bestimmten Fällen 
muss dies durch In-vivo-Daten untermauert werden. Zur weiteren 
Vertiefung jener Fälle, in denen die In-vitro-Methode geeignet wäre, ist die unter (2) angegebene Richtlinie (Guidance Document) heran ­
zuziehen. Weitere detaillierte Informationen zur Untermauerung der 
Entscheidungsfindung sind in (3) nachzulesen.
 
Die hier beschriebene Methode gibt Aufschluss über die grundlegen ­
den Prinzipien der Messung der dermalen Resorption und des Ein ­
trags einer Testsubstanz auf ausgeschnittenen Hautstücken. Hierfür können Hautproben zahlreicher Säugetierarten — auch menschliche Haut — verwendet werden. Die Permeabilitätseigenschaften der Haut 
bleiben nach dem Ausschneiden des Hautstücks aus dem Körper 
erhalten, da die abgestorbene Hornhaut  (Stratum corneum)  die 
Hauptdiffusionssperre bildet; ein aktiver Transport von Chemikalien durch die Haut wurde nicht festgestellt. Es wurde nachgewiesen, 
dass die Haut in der Lage ist, bei der perkutanen Resorption be ­
stimmte Chemikalien in Stoffwechselprodukte umzusetzen (6); aller ­
dings tritt bei diesem Prozess hinsichtlich der tatsächlich resorbierten Dosis keine Begrenzung der Geschwindigkeit ein, jedoch kann die 
Art des in den Blutkreislauf gelangenden Materials davon beeinflusst 
werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 646
 
1.2. DEFINITIONEN  
Unresorbierte Dosis:  Dies entspricht der nach der Exposition von 
der Hautoberfläche abgewaschenen Dosis sowie der ggf. in der nicht okkludierten Abdeckung enthaltenen Dosis, einschließlich etwaiger 
Dosen, bei denen nachgewiesen wird, dass sie sich während der 
Exposition auf der Haut verflüchtigen.
 
Resorbierte Dosis (in vitro):  Masse der Testsubstanz, die innerhalb 
einer bestimmten Zeit in den Rezeptor-Flüssigkeits- oder -System ­
kreislauf gelangt.  
Resorbierbare Dosis (in vitro):  die nach dem Abwaschen auf oder 
in der Haut vorhandene Dosis.  
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Die Testsubstanz, die radioaktiv markiert werden kann, wird auf die 
Oberfläche eines Hautprobestücks aufgetragen, das die beiden Kam ­
mern einer Diffusionszelle voneinander trennt. Die Chemikalie ver ­
bleibt unter festgelegten Bedingungen eine bestimmte Zeit lang auf der Haut, bevor sie durch ein geeignetes Reinigungsverfahren ent ­
fernt wird. Von der Rezeptorflüssigkeit werden zu bestimmten Zeit ­
punkten während des Versuchs Proben genommen und auf die Test ­
chemikalie und/oder Metaboliten analysiert.
 
Bei Verwendung stoffwechselaktiver Systeme können die Metaboli ­
ten der Testchemikalie durch geeignete Verfahren analysiert werden. 
Am Ende des Experiments werden die Verteilung der Testchemikalie und ggf. deren Metaboliten quantifiziert.
 
Unter entsprechenden Bedingungen, die in der vorliegenden Me ­
thode und in Richtlinie (2) beschrieben sind, wird durch Analyse der Rezeptorflüssigkeit und der behandelten Haut die während eines bestimmten Zeitraums erfolgte Resorption einer Testsubstanz gemes ­
sen. Die auf der Haut verbleibende Testsubstanz ist als resorbiert zu 
betrachten, es sei denn, es kann nachgewiesen werden, dass die Resorption anhand der Werte der Rezeptorflüssigkeit alleine ermittelt werden kann. Anhand der Analyse der übrigen Bestandteile (von der 
Haut abgewaschenes und zwischen den Hautschichten verbleibendes 
Material) kann eine weitere Evaluierung der Daten vorgenommen werden, unter anderem auch die Gesamtverteilung der Testsubstanz und die prozentuale Rückgewinnung.
 
Als Nachweis für die Leistungsfähigkeit und Zuverlässigkeit des 
Testsystems müssen die Ergebnisse der relevanten Referenzchemika ­
lien vorliegen und mit dem veröffentlichten Schrifttum zu der ver ­
wendeten Methode übereinstimmen. Diese Anforderung könnte er ­
füllt werden, indem die Tests mit einer geeigneten Referenzsubstanz (deren Lipophilie vorzugsweise den Werten der Testsubstanz nähe ­
rungsweise entsprechen sollte) zeitgleich mit der Testsubstanz durch ­
geführt werden oder indem ausreichende historische Daten für ver ­
schiedene Referenzsubstanzen unterschiedlicher Lipophilie vorgelegt werden (z. B. Koffein, Benzoesäure und Testosteron).
 
1.4. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.4.1.  Diffusionszelle  
Die Diffusionszelle besteht aus einer Spenderkammer und einer Re ­
zeptorkammer, zwischen denen die Haut angeordnet wird (ein Bei ­
spiel für einen typischen Aufbau einer solchen Kammer ist in Ab ­
bildung 1 dargestellt). Die Zelle muss so aufgebaut werden, dass die 
Haut dicht umschlossen wird, die Probenahme auf einfache Weise 
möglich ist und eine gute Durchmischung der Rezeptorlösung er ­
reicht wird, die mit der Hautunterseite in Berührung kommt, und außerdem eine gute Temperaturregelung der Zelle und ihres Inhalts 
möglich ist. Es sind sowohl statische Diffusionszellen als auch 
Durchfluss-Diffusionszellen zulässig. Normalerweise sind die Spen ­
derkammern bei der Exposition gegenüber einer finiten Dosis einer Testpräparation nicht okkludiert. Bei infiniten Applikationen und 
bestimmten bei finiten Dosen vorkommenden Szenarien können die 
Spenderkammern jedoch auch okkludiert werden.
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1.4.2.  Rezeptorflüssigkeit  
Vorzugsweise ist eine physiologisch geeignete Rezeptorflüssigkeit zu 
verwenden, allerdings sind auch andere Flüssigkeitsarten zulässig, sofern deren Verwendung begründet werden kann. Die genaue Zu ­
sammensetzung der Rezeptorflüssigkeit ist anzugeben. Eine ausrei ­
chende Löslichkeit der Testchemikalie in der Rezeptorflüssigkeit ist nachzuweisen, damit sie nicht als Resorptionssperre wirkt. Außerdem darf die Rezeptorflüssigkeit die Intaktheit des Hautstücks nicht be ­
einträchtigen. In einem Durchflusssystem darf die Durchfluss ­
geschwindigkeit die Diffusion der Testsubstanz in die Rezeptorflüs ­
sigkeit nicht behindern. In einem statischen Zellensystem muss die 
Flüssigkeit ständig umgerührt werden, und es sind regelmäßig Pro ­
ben zu entnehmen. Wird der Stoffwechsel untersucht, muss die Re ­
zeptorflüssigkeit so beschaffen sein, dass die Viabilität der Haut während des gesamten Verlaufs des Experiments unterstützt wird.
 
1.4.3.  Herstellung der Hautstücke  
Es kann menschliche oder tierische Haut verwendet werden. Natür ­
lich unterliegt die Verwendung menschlicher Haut einzelstaatlichen 
und internationalen ethischen Kriterien und Auflagen. Vorzugsweise sollte lebensfähige Haut verwendet werden, allerdings ist auch die Verwendung von abgestorbener Haut zulässig, sofern die Intaktheit 
der Haut nachgewiesen werden kann. Es sind entweder Epidermis ­
membranen (die durch Enzyme, durch Wärme oder auf chemischem Wege separiert wurden) oder geteilte Hautlagen (typischerweise mit einer Dicke von 200-400 μm), die mit einem Dermatom hergestellt 
wurden, zulässig. Es kann auch die volle Hautdicke verwendet wer ­
den, allerdings ist eine übermäßige Hautdicke (ca. > 1 mm) zu ver ­
meiden, sofern dies nicht zur Feststellung der Testchemikalie in den einzelnen Hautlagen erforderlich ist. Die Wahl der Arten, die ana ­
tomische Entnahmestelle und das Präparationsverfahren sind zu be ­
gründen. Es müssen akzeptable Daten aus mindestens vier Wieder ­
holungs-Gleichtests je Testpräparation vorliegen.
 
1.4.4.  Intakte Beschaffenheit des hergestellten Hautstücks  
Eine sachgemäße Herstellung des Hautstücks ist von größter Bedeu ­
tung. Durch unsachgemäße Handhabung kann die Hornhaut  (Stratum 
corneum)  beschädigt werden; daher ist das hergestellte Hautstück auf 
intakte Beschaffenheit zu kontrollieren. Bei der Untersuchung des Hautstoffwechsels ist die frisch ausgeschnittene Haut möglichst zeit ­
nah und unter Bedingungen, die nachgewiesenermaßen eine Stoff ­
wechselaktivität unterstützen, zu verwenden. Als Richtwert gilt da ­
bei, dass frisch ausgeschnittene Haut innerhalb von 24 Stunden zu verwenden ist; die zulässige Lagerungsdauer kann jedoch je nach dem an der Metabolisierung beteiligten Enzymsystem und den La ­
gertemperaturen variieren (13). Wurden die hergestellten Hautstücke 
vor der Verwendung gelagert, ist nachzuweisen, dass die Barriere ­
funktion erhalten bleibt.
 
1.4.5.  Testsubstanz  
Als Testsubstanz gilt der Stoff, dessen Penetrationseigenschaften un ­
tersucht werden sollen. Idealerweise sollte die Testsubstanz radio ­
aktiv markiert werden.  
1.4.6.  Testpräparation  
Die Präparation der Testsubstanz (z. B. reines, verdünntes oder for ­
muliertes Material, das die auf der Haut aufgetragene Testchemikalie enthält) muss der Substanz entsprechen (oder ein realistisches Sur ­
rogat hiervon bilden), der Menschen oder andere mögliche Zielarten 
ausgesetzt sein können. Etwaige Abweichungen von der in der Pra ­
xis verwendeten Präparation sind zu begründen.
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1.4.7.  Konzentrationen und Formulierungen von Testsubstanzen  
Normalerweise wird mehr als eine Konzentration der Testsubstanz 
verwendet; dies deckt die Obergrenze der potenziell beim Menschen auftretenden Expositionswerte ab. Analog ist die Durchführung von 
Tests mit verschiedenen typischen Formulierungen in Betracht zu 
ziehen.
 
1.4.8.  Aufbringen auf die Haut  
Unter den normalen Bedingungen der Chemikalienexposition beim 
Menschen kommen üblicherweise finite Dosen vor. Bei Applikatio ­
nen, bei denen die Exposition beim Menschen nachgestellt wird, sind bei Feststoffen normalerweise 1-5 mg/cm
 2 Haut und bei 
Flüssigkeiten bis zu 10 μl/cm  2 anzusetzen. Die verwendete Menge 
ist durch die zu erwartenden Einsatzbedingungen, die Ziele der Stu ­
die und die physikalischen Kenngrößen der Testpräparation zu be ­
gründen. So kann das Aufbringen auf die Haut beispielsweise in 
infiniter Form erfolgen, wenn größere Volumina je Flächeneinheit 
aufgebracht werden.  
1.4.9.  Temperatur  
Die passive Diffusion der Chemikalien (und damit ihre Hautresorp ­
tion) wird durch die Temperatur beeinflusst. Die Diffusionskammer 
und die Haut müssen auf konstanter Temperatur in Nähe der norma ­
len Hauttemperatur von 32 ±1  o C gehalten werden. Bei unterschied ­
lichem Zellaufbau sind auch unterschiedliche Wasserbad- oder Heiz ­
blocktemperaturen erforderlich, damit sich der Rezeptor bzw. die 
Haut innerhalb der physiologischen Normbedingungen befindet. Die Luftfeuchte sollte möglichst zwischen 30 und 70 % liegen.
 
1.4.10.  Dauer der Exposition und Probenahme  
Die Exposition der Haut gegenüber der Testpräparation kann sich 
über die gesamte Versuchsdauer oder über kürzere Zeiträume erstre ­
cken (z. B. zur Nachahmung einer bestimmten Expositionsart beim Menschen). Überschüssige Rückstände der Testpräparation sind mit 
einem geeigneten Reinigungsmittel von der Haut abzuwaschen und 
die Spülrückstände zur Analyse aufzufangen. Das Verfahren zur Entfernung der Testpräparation ist von den erwarteten Einsatzbedin ­
gungen abhängig und ist zu begründen. Normalerweise ist eine 24- 
stündige Probenahmephase erforderlich, um das Resorptionsprofil 
angemessen charakterisieren zu können. Da bereits nach 24 Stunden eine Verschlechterung der Hautbeschaffenheit eintreten kann, sollte die Probenahmedauer normalerweise einen Zeitraum von 24 Stunden 
nicht überschreiten. Bei Testsubstanzen, die rasch in die Haut ein ­
dringen, ist dies möglicherweise nicht erforderlich, bei Testsubstan ­
zen mit einer sehr langsamen Penetrationsgeschwindigkeit ist evtl. ein längerer Untersuchungszeitraum erforderlich. Die Probenahme ­
frequenz der Rezeptorflüssigkeit muss so ausgelegt sein, dass das 
Resorptionsprofil der Testsubstanz grafisch dargestellt werden kann.
 
1.4.11.  Abschließende Schritte  
Alle Komponenten des Testsystems sind zu analysieren, und die Rück ­
gewinnungsrate ist zu ermitteln. Hierin einbezogen werden die Spen ­
derkammer, die Spülung der Hautoberfläche, das hergestellte Haut ­
stück und die Rezeptorflüssigkeit/-kammer. In bestimmten Fällen kann die Haut in den der Testsubstanz ausgesetzten Hautbereich und 
den Hautbereich unter dem Zellenflansch sowie zu separaten Analysen 
in die Hornhaut, die Epidermis und die Dermis aufgeteilt werden.
 
1.4.12.  Analyse  
In sämtlichen Studien sollte eine angemessene Rückgewinnungsrate 
angestrebt werden (anzustreben ist ein Mittelwert von 100 ± 10 % 
der radioaktiven Substanz; etwaige Abweichungen sind zu begrün ­
den). Die Menge der Testsubstanz in der Rezeptorflüssigkeit, in dem hergestellten Hautstück, den Waschrückständen von der Hautoberflä ­
che und dem Spülwasser aus dem Versuchsaufbau sind durch ein 
geeignetes Verfahren zu analysieren.
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2. DATEN  
Die Analyse der Rezeptorflüssigkeit, die Verteilung der Testsubstanz 
im Testsystem und der zeitliche Verlauf des Resorptionsprofils sind darzustellen. Im Fall einer Exposition mit finiten Dosen sind die von 
der Haut abgewaschene Menge, die der Haut zugeordnete Menge 
(und die Menge in den verschiedenen Lagen der Haut, sofern diese analysiert werden) und die in der Rezeptorflüssigkeit enthaltene Menge (Geschwindigkeit und Menge bzw. Prozentsatz der applizier ­
ten Dosis) zu berechnen. Die Hautresorption kann in bestimmten 
Fällen auch nur anhand der Rezeptorflüssigkeitsdaten alleine aus ­
gedrückt werden. Verbleibt die Testsubstanz am Ende der Studie 
jedoch in der Haut, muss sie evtl. in die resorbierte Gesamtmenge 
einbezogen werden (siehe Abschnitt 66 in Quelle (3)). Im Fall einer Exposition mit infiniten Dosen kann mithilfe der Daten die Permea ­
bilitätskonstante (Kp) ermittelt werden. Unter den letzteren Bedin ­
gungen ist der resorbierte Prozentsatz nicht relevant.
 
3. BERICHTERSTATTUNG  
3.1. ABSCHLUSSBERICHT  
Der Testbericht muss die im Protokoll angegebenen Anforderungen 
erfüllen und eine Begründung für das verwendete Testsystem sowie 
folgende Einzelangaben enthalten:  
Testsubstanz:  
— physikalische Beschaffenheit, physikalisch-chemische Eigen ­
schaften (zumindest Molgewicht und log Pow), Reinheit (radio ­
chemische Reinheit);  
— Kenndaten (z. B. Chargennummer);  
— Löslichkeit in der Rezeptorflüssigkeit.  
Testpräparation:  
— Formulierung und Begründung für die Verwendung;  
— Homogenität.  
Prüfbedingungen:  
— Herkunft und Lage der Haut, Herstellungsmethode, Lagerungs ­
bedingungen vor der Verwendung, etwaige Vorbehandlung (Rei ­
nigung, Antibiotikabehandlungen usw.), Messung der Unver ­
sehrtheit der Haut, Stoffwechselstatus, Begründung der Verwen ­
dung;  
— Zellenaufbau, Zusammensetzung der Rezeptorflüssigkeit, Durch ­
flussrate der Rezeptorflüssigkeit bzw. Probenahmezeiten und 
-verfahren;  
— Details für die Aufbringung der Testpräparation und Quantifizie ­
rung der aufgebrachten Dosis;  
— Expositionsdauer;  
— Details zur Entfernung der Testpräparation von der Haut, z. B. 
Spülen der Haut;  
— Details zur Hautanalyse und zu den zum Nachweis der Vertei ­
lung in der Haut verwendeten Fraktionierungstechniken;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 650
 
— Verfahren zum Waschen der Zelle und der Geräte;  
— Testmethoden, Extraktionsverfahren, Detektionsgrenzen und Va ­
lidierung der Analysenmethoden.  
Ergebnisse:  
— Gesamtrückgewinnungsrate aus dem Experiment (aufgebrachte 
Dosis = Waschrückstände von der Haut + Haut 
+ Rezeptorflüssigkeit + Waschrückstände aus der Zelle);  
— tabellarische Darstellung der rückgewonnenen Mengen für die 
einzelnen Zellen in jeder Zellenkammer;  
— Resorptionsprofil;  
— tabellarische Darstellung der Resorptionsdaten (als Rate, Betrag 
oder Prozentwert angegeben).  
Erörterung der Ergebnisse.  
Schlussfolgerungen.  
4. LITERATURHINWEISE  
1. Testing Method B.44. Skin Absorption:  In vivo  Method.  
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
3. OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, An ­
nex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.  
4. Kemppainen B.W and Reifenrath W.G. (1990). Methods for 
skin absorption. CRC Press, Boca Raton.  
5. Bronaugh R.L. and Collier, S.W. (1991). Protocol for  In vitro  
Percutaneous Absorption Studies, in  In vitro Percutaneous Ab ­
sorption: Principles, Fundamentals and Applications,  R.L. Bro ­
naugh and H.I. Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, 237- 241.
 
6. Bronaugh R.L. and Maibach H.I.. (1991).  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications.  CRC 
Press, Boca Raton.  
7. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Che ­
micals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, ECETOC, Brussels.
 
8. Diembeck W., Beck H., Benech-Kieffer F., Courtellemont P., 
Dupuis J., Lovell W., Paye M., Spengler J., Steiling W. (1999). 
Test Guidelines for In  Vitro  Assessment of Dermal Absorption 
and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, 191-205.
 
9. Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65.  
10. Howes D., Guy R., Hadgraft J., Heylings J.R.  et al.  (1996). 
Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM Work ­
shop Report ATLA 24, 81 R10.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 651
 
11. Schaefer H. and Redelmeier T.E. (1996). Skin barrier: principles 
of percutaneous absorption. Karger, Basel.  
12. Roberts M.S. and Walters K.A. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.  
13. Jewell, C., Heylings, J.R., Clowes, H.M. and Williams, F.M. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitro ­
chlorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74: 356-365.  
Abbildung 1  
Beispiel für den typischen Aufbau einer statischen Diffusionszelle für perkutane 
In-vitro-Resorptionsstudien
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 652
 
B.46.  IN-VITRO -HAUTREIZUNG: TEST AN REKONSTRUIERTEN 
MODELLEN HUMANER EPIDERMIS  
EINLEITUNG  
1. Unter einer Hautreizung versteht man das Auslösen einer reversiblen Haut ­
schädigung nach Applikation einer Prüfsubstanz für die Dauer von bis zu 4 
Stunden [Definition nach dem Globalen Harmonisierten System (GHS) zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien der Vereinten Nationen (UN) und nach Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 des Europäischen 
Parlaments und des Rates vom 16. Dezember 2008 über die Einstufung, 
Kennzeichnung und Verpackung von Stoffen und Gemischen (1) (3)]. Mit der vorliegenden Prüfmethode steht ein  in vitro -Verfahren zur Verfügung, 
das zur Ermittlung schädlicher Wirkungen von hautreizenden Chemikalien 
(Stoffen und Gemischen) gemäß UN GHS und EU CLP-Verordnung Kate ­
gorie 2 (1) (2) (3) herangezogen werden kann. In der EU und in anderen Regionen, die die optionale Kategorie (leichte Reizstoffe) nach UN GHS 
nicht übernommen haben, kann diese Prüfmethode auch zur Identifizierung 
nicht klassifizierter Chemikalien, d. h. „Keine Kategorie“ nach UN GHS und EU CLP, verwendet werden (1) (3). Die vorliegende Prüfmethode kann außerdem als eigenständiger Ersatztest für  in vivo -Tests auf Hautreizungen 
innerhalb einer sequenziellen Teststrategie eingesetzt werden, um das Haut ­
reizungspotenzial von Chemikalien zu bestimmen (4 und Kapitel B.4 in diesem Anhang).
 
2. Hautreizungen werden bislang in der Regel anhand von Versuchstieren 
bewertet [OECD-Prüfrichtlinie 404; Kapitel B.4 in diesem Anhang] (4). Um dem Tierschutzaspekt Rechnung zu tragen, wurde Methode B.4 2004 überarbeitet und sieht nun vor, dass Hautätzungen/-reizungen auch im Wege 
einer sequenziellen Teststrategie bestimmt werden können, bei der validierte  
in vitro - oder  ex vivo -Prüfmethoden angewandt werden, die den Tieren 
Schmerzen und Leiden ersparen. Drei validierte  in vitro -Prüfmethoden wur ­
den als OECD-Prüfrichtlinien 430, 431 und 435 (5) (6) (7) verabschiedet, 
und zwei von ihnen — Kapitel B.40 und B.40bis dieses Anhangs — 
können für den Hautätzungen betreffenden Teil der sequenziellen Teststra ­
tegie der Testmethode in Kapitel B.4 oder der OECD-Prüfrichtlinie 404 (4) eingesetzt werden.
 
3. Die vorliegende Prüfmethode bezieht sich auf Hautreizungen mit dem End ­
punkt der menschlichen Gesundheit. Sie beruht auf Modellen rekonstruierter 
humaner Epidermis (RhE), die in ihrer allgemeinen Ausgestaltung (Ver ­
wendung von menschlichen, nicht transformierten Keratinozyten als zellu ­
lärem Ausgangsmaterial zum Aufbau einer repräsentativen Gewebe- und Zellarchitektur) die biochemischen und physiologischen Eigenschaften der 
menschlichen Oberhaut, d. h. der Epidermis, weitgehend widerspiegeln. 
Diese Prüfmethode umfasst auch eine Reihe von Leistungsstandards (An ­
lage 2) für die Bewertung ähnlicher und modifizierter Verfahren auf der Grundlage von RhE-Modellen, die vom Europäischen Zentrum zur Validie ­
rung alternativer Methoden (EC-ECVAM) (8) in Übereinstimmung mit den 
Grundsätzen des OECD-Leitliniendokuments Nr. 34 (9) entwickelt wurden.
 
4. Drei validierte Verfahren entsprechen derzeit der vorliegenden Prüfmethode. 
Für ein  in vitro  Verfahren (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) 
(20), das ein rekonstruiertes Modell menschlicher Epidermis verwendet und im Handel als EpiSkin
 TM erhältlich ist (auch als validierte Referenzmetho ­
de; VRM bezeichnet), wurden Prävalidierungs-, Optimierungs- und Validie ­
rungsstudien abgeschlossen. Zwei weitere im Handel erhältliche  in vitro - 
Verfahren auf der Grundlage von RhE-Modellen zeigten nach Validierungs ­
studien auf der Basis der Leistungsstandards (21) ähnliche Ergebnisse wie das VRM. Hierbei handelt es sich um die auf rekonstruierten Modellen 
menschlicher Epidermis beruhenden Methoden EpiDerm
 TM SIT (EPI-200) 
und SkinEthic  TM (22). ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 653
 
5. Bevor ein ähnliches oder modifiziertes  in vitro  Verfahren mit anderen 
RhE-Modellen — außer der VRM und außer EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
oder SkinEthic  TM — für regulatorische Zwecke verwendet werden kann, 
sollten nach den in der vorliegenden Prüfmethode vorgegebenen Leistungs ­
standards (Anlage 2) Verlässlichkeit, Relevanz (Genauigkeit) und die Gren ­
zen des Verfahrens für den vorgeschlagenen Verwendungszweck bestimmt 
werden, um sicherzustellen, dass es mit der VRM vergleichbar ist. Zudem empfiehlt es sich, das OECD-Hintergrunddokument („Explanatory Back ­
ground Document“) (23) über  in vitro -Hautreizungstests zu konsultieren, 
bevor ähnliche oder modifizierte  in vitro -Methoden mit RhE-Modellen ent ­
wickelt, validiert und den Regulierungsbehörden zur Anerkennung vor ­
gelegt werden.
 
BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
6. Die verwendeten Begriffsbestimmungen sind in Anlage 1 aufgeführt.  
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN UND BEGRENZUNGEN  
7. Eine Begrenzung der Prüfmethode, wie durch die Validierungsstudie (16) 
nachgewiesen, besteht insofern, als keine Einstufung von Stoffen in die 
optionale Kategorie 3 (leichte Reizstoffe) des UN GHS-Systems möglich ist (1). Sollte sie in diesen Fällen als teilweiser Ersatztest verwendet werden, könnten weitere  in vivo -Tests erforderlich sein, um das Hautreizungspoten ­
zial vollständig zu charakterisieren (4 und Kapitel B.4 in diesem Anhang). 
Die Verwendung menschlicher Haut unterliegt anerkanntermaßen ethischen Überlegungen und Bedingungen auf nationaler und internationaler Ebene.
 
8. Diese Prüfmethode bezieht sich auf die  in vitro -Komponente von Hautrei ­
zungen innerhalb der sequenziellen Teststrategie nach B.4 (OECD-Prüf ­
richtlinie 404) zur Ermittlung von Hautätzung/Hautreizung (4). Obwohl 
diese Prüfmethode keine angemessene Information über Hautätzungen 
liefert, wird darauf hingewiesen, dass B.40bis (OECD-Prüfrichtlinie 431) über Hautätzung auf demselben Testsystem anhand eines RhE-Modells beruht, aber ein anderes Protokoll verwendet (Kapitel B.40bis). Die vor ­
liegende Methode beruht auf Modellen unter Verwendung menschlicher 
Keratinozyten, die  in vitro  das Zielorgan der zu schützenden Spezies 
repräsentieren. Darüber hinaus bildet sie den Anfangsschritt der Entzün ­
dungskaskade bzw. des Wirkmechanismus ab (Zell- und Gewebeschädi ­
gung mit resultierendem lokalisiertem Trauma), der während der Reizung  
in vivo  auftritt. Für die dieser Prüfmethode zugrunde liegende Validierung 
wurden Chemikalien unterschiedlicher Klassen getestet. Die empirische Datenbasis der Validierungsstudie umfasste insgesamt 58 chemische 
Stoffe (16) (18) (23), einschließlich Feststoffen, Flüssigkeiten, halbfesten 
Stoffe und Wachsen. Flüssigkeiten können wässrig oder nicht wässrig sein; Feststoffe in Wasser löslich oder unlöslich. Sofern möglich, sollten Feststoffe vor der Applikation zu Feinpulver gemahlen werden; eine wei ­
tere Behandlung der Probe ist nicht nötig. Gase und Aerosole wurden 
bislang in keiner Validierungsstudie bewertet (24). Obwohl deren Prüfung mit den RhE-Verfahren prinzipiell vorstellbar ist, erlaubt die vorliegende Prüfmethode das Testen von Gasen und Aerosolen nicht. Zu beachten ist 
auch, dass stark gefärbte Chemikalien mit den Zellviabilitätsmessungen 
interferieren können und daher die Verwendung geeigneter Kontrollen zur Korrektur erfordern (siehe Absätze 24-26).
 
9. Vorausgesetzt der Test liefert ein eindeutiges Ergebnis, genügt ein einziger 
Testdurchlauf mit drei parallel geprüften Replikat-Geweben. Bei Grenz ­
ergebnissen, wie z. B. nicht übereinstimmenden Replikatmessungen und/ oder einer mittleren prozentualen Viabilität von 50 ± 5 %, sollte ein zweiter 
Durchlauf in Betracht gezogen werden bzw. ein dritter bei abweichenden 
Ergebnissen der ersten beiden Durchläufe.
 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 654
 
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
10. Die Prüfsubstanz wird oberflächlich auf ein RhE-Modell aufgetragen, be ­
stehend aus nicht veränderten humanen epidermalen Keratinozyten, die zu 
einem mehrschichtigen, ausdifferenzierten Modell humaner  Epidermis  kulti­
viert wurden, das aus geordneten Basal-, Stachel- und Körnerzellschichten und einer mehrlagigen Hornschicht ( stratum corneum ) besteht, die inter ­
zelluläre lamellare Fettschichten enthält, deren dominierende Lipidklassen 
dem in vivo  gefundenen Lipidmuster entsprechen.
 
11. Durch Chemikalien hervorgerufene Reizungen der Haut manifestieren sich 
als Erytheme und Ödeme. Diese Symptome sind das Ergebnis einer Kas ­
kade von Ereignissen, an deren Beginn das Eindringen in das  stratum 
corneum  mit nachfolgender Schädigung der darunter liegenden Keratinozy ­
tenschicht steht. Die absterbenden Keratinozyten setzen Mediatorsubstanzen frei, die die Entzündungskaskade in den Zellen der  Dermis , insbesondere in 
den Stromalzellen und Endothelzellen, einleiten. Die Dilatation und erhöhte 
Durchlässigkeit der Endothelzellen erzeugen letztendlich das festgestellte Erythem bzw. Ödem (24). Die Verfahren auf der Grundlage des RhE Mo ­
dells erlauben die Messung der Ereignisse zu Beginn der Kaskade.
 
12. Die Zellviabilität an Modellen rekonstruierter menschlicher Epidermis wird 
durch Enzymkonversion des Vitalfarbstoffs MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2- yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid, Thiazolyl-Blau; CAS-Nummer 298-93- 1], zu einem blauen Formazan-Salz gemessen, das nach seiner Extraktion 
aus Geweben quantifiziert wird (25). Reizstoffe werden anhand ihrer Fähig ­
keit erkannt, die Zellviabilität unter vorgegebene Schwellenwerte zu senken (d. h. ≤ 50 % bei Reizstoffen der UN GHS-/EU CLP Kategorie 2). Bezogen 
auf die regulatorischen Rahmenbedingungen, in denen die Ergebnisse dieser 
Prüfmethode verwendet werden, können Chemikalien, die eine Zellviabilität 
oberhalb des vorgegebenen Grenzwerts erzeugen, als nicht-reizend einge ­
stuft werden (d. h. > 50 %, Keine Kategorie).
 
NACHWEIS DER LEISTUNGFÄHIGKEIT  
13. Bevor eines der drei validierten Verfahren, die den Anforderungen der 
vorliegenden Prüfmethode genügen, routinemäßig angewandt werden kann, sollten Laboratorien anhand von zehn der in Tabelle 1 aufgeführten Refe ­
renzsubstanzen die technische Leistungsfähigkeit der Methode nachweisen. 
Für im Rahmen dieser Prüfmethode entwickelte ähnliche Verfahren oder für 
Modifikationen einer der drei validierten Methoden sollten die in Anlage 2 dieser Prüfmethode beschriebenen Leistungsstandards erfüllt werden, bevor die Methode für Regulierungszwecke eingesetzt wird.
 
14. Als Teil des Nachweises der Leistungsfähigkeit sollte der Benutzer die von 
dem Hersteller des Hautmodells spezifizierten Barriereeigenschaften der Gewebe nach Erhalt überprüfen. Dies ist besonders wichtig, wenn die Ge ­
webe über große Entfernungen/Zeiträume transportiert werden. Sobald eine 
Methode erfolgreich etabliert und ihre Leistungsfähigkeit demonstriert wur ­
de, ist diese Überprüfung nicht mehr routinemäßig erforderlich. Allerdings empfiehlt es sich auch bei routinemäßig angewandten Methoden, die Bar ­
riereeigenschaften in regelmäßigen Abständen zu kontrollieren.
 
Tabelle 1  
Referenzsubstanzen  ( 1 ) 
Substanz CAS-Nr.  In vivo - Punkt­
zahl (  2 ) Aggregatzustand UN GHS/EU CLP 
Kategorie  
Naphthalen-Essigsäure 86-87-3 0 fest Keine Kat. 
Isopropanol 67-63-0 0,3 flüssig Keine Kat.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 655
 
Substanz CAS-Nr.  In vivo - Punkt­
zahl (  2 ) Aggregatzustand UN GHS/EU CLP 
Kategorie  
Methylstearat 112-61-8 1 fest Keine Kat. 
Heptyl-Butyrat 5870-93-9 1,7 flüssig Keine Kat.  
(wahlfrei Kat. 
3) ( 3 ) ( 4 ) 
Hexyl-Salicylat 6259-76-3 2 flüssig Keine Kat.  
(wahlfrei 
Kat.3) ( 3 ), ( 4 ) 
Cyclamenaldehyd 103-95-7 2,3 flüssig Kat. 2 1-Bromohexan 111-25-1 2,7 flüssig Kat. 2 
Kaliumhydroxid (5 % aq.) 1310-58-3 3 flüssig Kat. 2 
1-Methyl-3-phenyl-1-piperazin; 5271-27-2 3,3 fest Kat. 2 Heptanal 111-71-7 3,4 flüssig Kat. 2
 
( 1 ) Diese Referenzsubstanzen sind eine Untergruppe der in der Validierungsstudie verwendeten Referenzsubstanzen. 
( 2 ) In vivo - Punktzahl in Übereinstimmung mit B.4 und OECD-Prüfrichtlinie 404 (4). 
( 3 ) Im Rahmen dieser Prüfmethode wird die wahlfreie UN GHS Kategorie 3 (leichte Reizstoffe) (1) als Keine Einstufung betrachtet. 
( 4 ) Die wahlfreie UN GHS Kategorie 3 ist auf das EU CLP nicht anwendbar.  
VERFAHREN  
15. Es folgt eine Beschreibung der Elemente und Verfahrensschritte eines Haut ­
reizungstests am RhE-Modell. Ein RhE-Modell sollte rekonstruiert sein und 
kann selbst hergestellt oder im Handel erworben werden. Standardarbeits ­
weisen (SOP's) für EpiSkin  TM , EpiDerm  TM SIT (EPI-200) und SkinEthic  TM 
RHE sind verfügbar (26) (27) (28). Die Tests sollten wie folgt durchgeführt 
werden:  
Elemente der RhE-Prüfmethode  
Allgemeine Bedingungen  
16. Die Epithelschicht sollte aus normalen menschlichen Keratinozyten 
gebildet werden. Unter der funktionsfähigen Hornschicht ( stratum cor ­
neum ) sollten mehrere Lagen lebensfähiger Epithelzellen (Basalzell ­
schicht,  stratum spinosum, stratum granulosum ) vorhanden sein. Die 
Hornschicht sollte mehrlagig sein und das zur Erzeugung einer funk ­
tionsfähigen Barriere essenzielle Lipidprofil aufweisen. Die Barriere 
muss robust genug sein, um das schnelle Eindringen zytotoxischer 
Markersubstanzen wie Natriumdodecylsulfat (SDS) oder Triton X-100 zu verhindern. Die Barrierefunktion kann entweder durch Bestimmung der Konzentration, in der eine Markersubstanz die Viabilität der 
Gewebe nach einer vorgegebenen Expositionsdauer um 50 % verrin ­
gert (IC
 50 ), oder durch die Bestimmung der Expositionszeit bewertet 
werden, die erforderlich ist, um die Zellviabilität bei Anwendung der Markersubstanz in einer vorgegebenen festen Konzentration um 50 % 
zu reduzieren (ET
 50 ). Die Konstruktionseigenschaften des Behältnisses 
zum RhE-Modell muss ausschließen, dass Material rund um die Hornschicht in lebensfähiges Gewebe eindringt, was zu einer man ­
gelhaften Modellierung der Hautexposition führen würde. Das 
RhE-Modell sollte nicht mit Bakterien, Viren, Mykoplasma oder Pil ­
zen kontaminiert sein.
 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 656
 
Funktionale Bedingungen  
Viabilität  
17. Die Größenordnung der Viabilität wird vorzugsweise anhand des 
MTT-Tests bestimmt (25). Die Anwender des RhE-Modells sollten sicher ­
stellen, dass jede Charge des verwendeten Modells die vorgegebenen Kri ­
terien für die Negativkontrolle (NK) erfüllt. Die optische Dichte (OD) des Extraktionslösungsmittels allein sollte ausreichend gering sein, d. h. OD 
< 0,1. Von dem Entwickler/Hersteller des Hautmodells wird ein Akzeptanz ­
bereich (obere und untere Grenze) für OD-Werte der Negativkontrolle (un ­
ter den gleichen Bedingungen der Prüfmethode für Hautreizungen) bereit ­
gestellt. Die Akzeptanzbereiche für die 3 validierten Verfahren sind in 
Tabelle 2 aufgeführt. Es sollte dokumentiert werden, dass die mit der Ne ­
gativkontrolle behandelten Gewebe über die gesamte Dauer der Exposition stabil bleiben (bzw. vergleichbare Viabilitätsmessungen ergeben).
 
Tabelle 2  
Akzeptanzbereiche für OD-Werte der Negativkontrolle  
Untere Akzeptanzgrenze Obere Akzeptanzgrenze  
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Barrierefunktion  
18. Das  stratum corneum  und die Zusammensetzung seiner Fette sollten das 
schnelle Eindringen zytotoxischer Markersubstanzen wie z. B. SDS oder 
Triton X-100 verhindern. Dies wird durch die Ermittlung von IC  50 oder 
ET 50 bestimmt (Tabelle 3).  
Morphologie  
19. Bei der histologischen Untersuchung des RhE-Modells sollte nachgewiesen 
werden, dass das Modell eine der menschlichen  Epidermis  ähnliche Struktur 
(einschließlich mehrlagigem  stratum corneum ) aufweist.  
Reproduzierbarkeit  
20. Die Ergebnisse der Positivkontrolle (PK) und der Negativkontrollen (NK) 
der Prüfmethode sollen die Reproduzierbarkeit über längere Zeit belegen.  
Qualitätskontrolle (QK)  
21. Der Entwickler/Hersteller des RhE-Modells sollte sicherstellen und nach ­
weisen, dass jede Charge des verwendeten Hautmodells bestimmten Frei ­
gabekriterien genügt, von denen die Kriterien der  Viabilität  (Absatz 17), der  
Barrierefunktion  (Absatz 18) und der  Morphologie  (Absatz 19) die wich ­
tigsten sind. Diese Daten sollten den Benutzern der Methode zur Verfügung gestellt werden, damit diese sie in ihre Prüfberichte aufnehmen können. Der 
Entwickler/Hersteller des Hautmodells (oder — bei Verwendung eines 
hauseigenen Modells — der Prüfer) sollte eine Akzeptanzspanne (oberer und unterer Grenzwert) für IC
 50 oder ET  50 festlegen. Nur mit geeigneten 
Geweben erzielte Ergebnisse können für eine zuverlässige Vorhersage für 
die Einstufung von Reizwirkungen akzeptiert werden. Beispiele für Akzep ­
tanzspannen für die drei validierten Verfahren sind in Tabelle 3 aufgeführt.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 657
 
Tabelle 3  
Beispiele für Chargenfreigabekriterien im Rahmen der Qualitätskontrolle  
Untere Akzeptanzgrenze Obere Akzeptanzgrenze  
EpiSkin  TM (SM) 
(18-stündige Behandlung mit SDS) 
(26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % Triton X-100) (27) ET 50 = 4,8 h ET  50 = 8,7 h 
SkinEthic  TM RHE 
(1 % Triton X-100) (28) ET 50 = 4,0 h ET  50 = 9,0 h  
Applikation der Prüf- und Kontrollsubstanzen  
22. Für jede Prüfsubstanz und für die Kontrollen bei jedem Durchgang sollten 
mindestens drei Replikate verwendet werden. Bei flüssigen und festen Sub ­
stanzen sollte eine ausreichende Menge Prüfsubstanz gleichmäßig auf die 
gesamte Oberfläche der  Epidermis  aufgetragen werden; überschüssige Do ­
sen sind zu vermeiden, d. h. es sollten mindestens 25 μL/cm  2 oder 25 
mg/cm  2 verwendet werden. Bei festen Stoffen sollte die  Epidermis -Ober­
fläche vor der Applikation mit deionisiertem oder destilliertem Wasser an ­
gefeuchtet werden, um guten Hautkontakt zu gewährleisten. Feststoffe soll ­
ten nach Möglichkeit als Feinpulver getestet werden. Am Ende der Exposi ­
tionszeit sollte die Prüfsubstanz mit wässriger Pufferlösung oder 0,9 % NaCl von der Hautoberfläche abgewaschen werden. Je nachdem, welches 
Modell rekonstruierter menschlicher Epidermis verwendet wird, kann die 
Expositionszeit 15 bis 60 Minuten betragen und die Inkubationstemperatur zwischen 20 und 37 °C liegen. Diese Expositionszeiten und -temperaturen werden für jedes RhE-Verfahren der jeweiligen Hautmodelle optimiert und 
bilden die Unterschiede der Verfahren dieser Prüfmethode ab. Für Einzel ­
heiten siehe Standardarbeitsanweisungen (Standard Operating Procedures; SOP) der Methoden (26) (27) (28).
 
23. Bei jeder Studie sollten gleichzeitig Negativkontrollen (NK) und 
Positivkontrollen (PK) verwendet werden, um nachweisen zu können, 
dass die Viabilität (mit der NK), die Barrierefunktion und die daraus resul ­
tierende Empfindlichkeit der Gewebe (mit der PK) innerhalb einer vorgege ­
benen historischen Akzeptanzspanne liegen. Als PK-Substanz wird 5 % wässrige SDS empfohlen. Als NK-Substanzen empfehlen sich Wasser 
oder Phosphatpuffer (PBS).
 
Zellviabilitätsmessungen  
24. Wichtigstes Element des Testverfahrens ist es, dass Viabilitätsmessungen 
nicht unmittelbar nach dem Kontakt mit den Prüfsubstanzen, sondern nach 
einer ausreichend langen Inkubationszeit der abgespülten Gewebe (nach der Behandlung) in einem frischen Medium erfolgen. Während dieser Zeit kann sich das Gewebe von milden zytotoxischen Wirkungen erholen bzw. deut ­
liche zytotoxische Effekte können sich herausbilden. Während der Phase der 
Testoptimierung (11) (12) (13) (14) (15) hat sich eine Inkubationszeit von 42 Stunden nach der Behandlung als optimal erwiesen.
 
25. Der MTT-Test ist eine validierte quantitative Methode, die zur Messung der 
Zellviabilität nach dieser Prüfmethode angewandt werden sollte. Sie ist zur Anwendung in einem dreidimensionalen Gewebemodell geeignet. Die Ge ­
webeprobe wird für 3 Stunden in eine MTT-Lösung geeigneter Konzentra ­
tion ( z. B.  0,3-1 mg/mL) gelegt. Der blaue Formazan-Niederschlag wird 
sodann mit Hilfe eines Lösungsmittels ( z. B.  Isopropanol, Säure-Isopro ­
panol) aus dem Gewebe extrahiert, und die Formazankonzentration wird 
durch Bestimmung des OD-Werts bei 570 nm innerhalb einer 
Filter-Bandbreite von maximal ± 30 nm gemessen.
 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 658
 
26. Optische Eigenschaften der Prüfsubstanz oder ihre chemische Wirkung 
auf MTT können mit dem Test interferieren und (weil die Prüfsubstanz 
die Farbbildung sowohl verhindern oder auch hervorrufen kann) zu einer falschen Viabilitätsschätzung führen. Dies kann der Fall sein, wenn eine bestimmte Prüfsubstanz nicht komplett von dem Gewebe abgewaschen 
wurde oder wenn sie in die  Epidermis  eindringt. Wirkt sich die Prüf ­
substanz unmittelbar auf MTT aus (MTT-Reduktionsmittel), ist sie natür ­
lich gefärbt oder verfärbt sie sich während der Gewebebehandlung, so sollten zum Nachweis und zur Korrektur einer etwaigen Interferenz der 
Prüfsubstanz mit der Viabilitätsmesstechnik zusätzliche Kontrollen ver ­
wendet werden. Für eine genaue Beschreibung der richtigen Durchfüh ­
rung der Korrektur der direkten MTT-Reduktion und der Interferenzen durch Färbemittel siehe die Standardarbeitsanweisungen für die drei vali ­
dierten Methoden (26) (27) (28).
 
Akzeptanzkriterien  
27. Bei jeder Prüfung mit validen Chargen des betreffenden RhE-Modells (siehe 
Absatz 21) sollten mit der Negativkontrolle behandelte Gewebe OD-Werte 
aufweisen, die die Gewebequalität nach abgeschlossenen Beförderungs- und 
Annahmevorgängen und sämtlichen Schritten des Protokolls belegen. Die OD-Werte der Kontrollen sollten nicht unter historisch etablierten unteren Grenzwerten liegen. Gleichzeitig sollten mit der Positivkontrolle, d. h. 5 % 
wässrige SDS, behandelte Gewebe die Fähigkeit der Gewebe reflektieren, 
unter den Bedingungen der Prüfmethode auf hautreizende Chemikalien zu reagieren (26) (27) (28). Es sollten entsprechende und geeignete Maße der Variabilität zwischen Gewebereplikaten festgelegt werden (werden z. B. 
Standardabweichungen (SD) verwendet, sollten sie innerhalb des aufgrund 
historischer Daten berechneten einseitigen Toleranzintervalls von 95 % lie ­
gen; für die VRM gilt, dass die SD < 18 % betragen sollen).
 
Auswertung der Ergebnisse und Prädiktionsmodell  
28. Die für jede Prüfsubstanz erhaltenen OD-Werte können zur Berechnung 
einer prozentualen Zellviabilität im Vergleich zur Negativkontrolle, die auf 100 % festgesetzt ist, herangezogen werden. Der Grenzwert der pro ­
zentualen Zellviabilität, der zwischen Reizstoff und bisher nicht klassifi ­
zierten Prüfsubstanzen unterscheidet, und das (die) statistische(n) Verfah ­
ren zur Auswertung der Ergebnisse und zur Identifizierung von Reizstof ­
fen sollten genau definiert und dokumentiert werden und nachweislich 
geeignet sein. Die Grenzwerte für die Vorhersage der Reizung sind nach ­
stehend angegeben:
 
— Die Prüfsubstanz gilt als hautreizend im Sinne von UN GHS/EU CLP 
Kategorie 2, wenn die Gewebeviabilität nach der Exposition und der 
Inkubation nach der Behandlung weniger als oder gleich ( ≤) 50 % 
beträgt.  
— Je nach dem regulatorischen Rahmen, in dem die Ergebnisse dieser 
Prüfmethode verwendet werden, gilt die Prüfsubstanz als nicht hautrei ­
zend im Sinne der Einstufung  Keine Kategorie  nach UN GHS/EU CLP, 
wenn die Gewebeviabilität nach der Exposition und der Inkubation nach 
der Behandlung mehr als (>) 50 % beträgt.  
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Daten  
29. Für jeden Durchgang sollten Daten aus einzelnen Replikatgeweben ( z. B.  
OD-Werte und Daten über die berechnete prozentuale Zellviabilität für 
jede Prüfsubstanz, einschließlich Einstufung), gegebenenfalls auch Daten 
aus Wiederholungsversuchen, tabellarisch zusammengefasst werden. Darü ­
ber hinaus sollten für jeden Durchgang die Mittelwerte ± Standardabwei ­
chung übermittelt werden. Außerdem sollten für jede geprüfte Substanz 
festgestellte Interaktionen mit dem MTT-Reagens und Testfarbstoffen be ­
richtet werden.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 659
 
Prüfbericht  
30. Der Prüfbericht sollte folgende Angaben enthalten:  
Prüf- und Kontrollsubstanzen:  
— Chemische Bezeichnung(en) wie CAS-Bezeichnung und CAS-Nummer, 
EG-Name und EG-Nummer, soweit bekannt;  
— Reinheit und Zusammensetzung der Substanz (in Gewichtsprozent);  
— physikalisch-chemische Eigenschaften ( z. B. Aggregatzustand, Stabilität, 
Flüchtigkeit, pH-Wert, Wasserlöslichkeit, soweit bekannt), die für die 
Durchführung der Studie relevant sind;  
— Behandlung der Prüf-/Kontrollsubstanzen vor dem Test, sofern relevant 
(z. B.  Erwärmen, Mahlen);  
— Lagerbedingungen;  
Gründe für die Verwendung des betreffenden Hautmodells und Protokolle  
Prüfbedingungen:  
— Verwendetes Zellsystem;  
— umfassende Begleitdokumentation für das betreffende Hautmodell, ein ­
schließlich seiner Leistung. Diese sollte unter anderem die folgenden Aspekte beinhalten:
 
i) Viabilität  
ii) Barrierefunktion  
iii) Morphologie  
iv) Reproduzierbarkeit und Prädiktivität  
v) Qualitätskontrollen (QK) des Modells  
— Einzelheiten der angewandten Methode;  
— verwendete Testdosen, Dauer der Exposition und der Inkubationszeit 
nach der Behandlung;  
— Beschreibung etwaiger Änderungen im Prüfverfahren;  
— Verweis auf historische Modelldaten. Diese sollte unter anderem die 
folgenden Aspekte beinhalten:  
i) Akzeptanz der QK-Daten mit Verweis auf historische Chargendaten  
ii) Akzeptanz der Positiv- und Negativkontrollwerte mit Verweis auf 
die Mittelwerte und Spannbreiten der Positiv- und Negativkontrollen  
— Beschreibung der angewandten Auswertungskriterien, einschließlich Be ­
gründung der Wahl des (der) Schwellenwerte(s) für das Vorhersagemo ­
dell; 
— Verweis auf historische Kontrolldaten.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 660
 
Ergebnisse:  
— Tabellarische Darstellung der Daten aus Einzelproben für jeden Durch ­
gang und jede Replikatmessung;  
— Angabe verwendeter Kontrollen für direkte MTT-Reduktionsmittel und/ 
oder Testfarbstoffe;  
— Beschreibung sonstiger beobachteter Wirkungen.  
Diskussion der Ergebnisse  
Schlussfolgerung  
LITERATUR  
(1) Globales Harmonisiertes System (GHS) zur Einstufung und Kennzeichnung 
von Chemikalien der Vereinten Nationen (UN) 2009, dritte überarbeitete Fassung, UN New York und Genf. Abrufbar unter: [http://www.unece. org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]
 
(2) EC-ECVAM (2009), Statement on the „Performance under UN GHS of 
three  in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the 
Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards“, issued by the ECVAM Scientific Advi ­
sory Committee (ESAC30), 9 April 2009. Abrufbar unter: [http:// 
ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(3) Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 des Europäischen Parlaments und des 
Rates vom 16. Dezember 2008 über die Einstufung, Kennzeichnung und 
Verpackung von Stoffen und Gemischen, zur Änderung und Aufhebung der Richtlinien 67/548/EWG und 1999/45/EG, und zur Änderung der 
Verordnung (EG) Nr. 1907/2006. ABl. L 353 vom 31.12.2008, S. 1.
 
(4) OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(5) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(6) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Abrufbar 
unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(7) OECD (2006),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(8) EC-ECVAM (2009), Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE). Abrufbar unter: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(9) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Abrufbar 
unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(10) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, 
J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A 
prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93.  
(11) Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement 
of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of 
chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 
16, 765–770.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 661
 
(12) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, 
B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for 
the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, 
ALTEX 21, 107–114.  
(13) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests — An assessment 
of the performance of the optimised test, ATLA 33, 351-367.
 
(14) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. 
(2005), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation 
process, ATLA 33, 329-349.  
(15) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., 
Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, 
R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to 
the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, 
The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irri ­
tation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129.  
(16) Spielmann, H., mailto: Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto: Gamer, A., Remmele, M., Curren, 
R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The 
ECVAM international validation study on  in vitro  tests for acute skin irri ­
tation: Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559-601.
 
(17) Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and 
Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  tests 
for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603-619.  
(19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E. 
and Leclaire, J. (2007),  In vitro  acute skin irritancy of chemicals using the 
validated EPISKIN model in a tiered strategy — Results and performances 
with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351-358.  
(20) EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Abrufbar unter: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(21) EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin 
models to  in vitro  skin irritation testing. Abrufbar unter: [http://ecvam.jrc. 
ec.europa.eu]  
(22) EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of  in vitro  tests for 
skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC29), 5 November 2008. Abrufbar unter: [http://ecvam.jrc.ec.europa. 
eu]
 
(23) OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and Assess ­
ment, No. 137, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/document/ 
24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html]  
(24) Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004),  In vitro  skin irrita ­
tion: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, 
Toxicol. in Vitro 18, 231-243.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 662
 
(25) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. 
Methods 65, 55-63.  
(26) EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation 
Validation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 min — 42 
hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Abrufbar unter: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(27) EpiDerm  TM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for:  In vitro  
EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corpo ­
ration’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Abruf ­
bar unter: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(28) SkinEthic  TM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irri ­
tation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Abrufbar un ­
ter: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(29) Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc 
Graw-Hill, New York.  
(30) Richtlinie 2001/59/EG der Kommission vom 6. August 2001 zur 28. An ­
passung der Richtlinie 67/548/EWG des Rates zur Angleichung der Rechts- 
und Verwaltungsvorschriften der Mitgliedstaaten für die Einstufung, Ver ­
packung und Kennzeichnung gefährlicher Stoffe an den technischen Fort ­
schritt, ABl. L 225 vom 21.8.2001, S. 1.  
(31) Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Con ­
tact Dermatitis 51, 1-4.  
(32) Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., 
Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irrita ­
tion and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and 
animal in vivo  data, ALTEX, 14, 359-365.  
(33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data, Contact Der ­
matitis, 62, 109-116.
 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 663
 
Anlage 1  
Begriffsbestimmungen  
Genauigkeit:  Der Grad an Übereinstimmung zwischen Testergebnissen und ak ­
zeptierten Referenzwerten. Die Genauigkeit ist ein Maß der Leistung der Prüf ­
methode und ein Aspekt der Relevanz. Der Begriff wird oft im Sinne von 
„Übereinstimmung“ verwendet und bezeichnet den Anteil der korrekten Ergeb ­
nisse einer Prüfmethode (9).  
Zellviabilität:  Parameter zur Messung der Gesamtaktivität einer Zellpopulation, z. 
B. Fähigkeit zellulärer mitochondrialer Dehydrogenasen, den Vitalfarbstoff MTT 
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid, Thiazolyl-Blau) zu 
reduzieren, der je nach gemessenem Endpunkt und angewandtem Testkonzept der Gesamtzahl und/oder der Vitalität lebender Zellen entspricht.
 
Übereinstimmung:  Die Übereinstimmung ist ein Maß der Leistung einer Prüf ­
methode für Prüfverfahren mit kategorialen Ergebnissen und ein Aspekt der 
Relevanz. Der Begriff wird gleichbedeutend mit Genauigkeit verwendet und wird als Anteil aller geprüften Chemikalien definiert, die korrekt als positiv oder negativ eingestuft werden. (9).
 
ET 50 : Die Expositionszeit, die erforderlich ist, um die Zellviabilität bei Anwen ­
dung der Markersubstanz in vorgegebener fester Konzentration um 50 % zu reduzieren, siehe auch IC
 50 . 
EU CLP (Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 des Europäischen Parlaments und 
des Rates vom 16. Dezember 2008 über die Einstufung, Kennzeichnung und 
Verpackung von Stoffen und Gemischen):  führt das UN GHS-System über die 
Einstufung, Kennzeichnung und Verpackung von Chemikalien (Stoffe und Ge ­
mische) in der Europäischen Union ein (3).  
GHS (Globales Harmonisiertes System zur Einstufung und Kennzeichnung von Che ­
mikalien der Vereinten Nationen (UN)):  Ein System zur Klassifizierung von Substan ­
zen und Gemischen nach standardisierten Typen und Stufen physikalischer, gesund ­
heitlicher und ökologischer Gefahren un d zur entsprechenden Kennzeichnung durch 
Piktogramme, Signalwörter, Gefahrenhinweise, Sicherheitshinweise und Sicherheits ­
datenbögen, um zum Schutz des Menschen (e inschließlich Arbeitgeber, Arbeiter, Spe ­
diteure, Verbraucher und Notfall-Einsatzkräfte) und der Umwelt Informationen über die 
schädlichen Wirkungen der betreffenden Chemikalien zu verbreiten (1).  
IC 50 : Die Konzentration, bei der eine Markersubstanz die Viabilität der Ge ­
webe nach einer vorgegebenen Expositionszeit um 50 % (IC  50 ) reduziert, siehe 
auch ET  50 . 
Überschüssige Dosis:  Die Menge der auf die Haut aufgetragenen Prüfsubstanz, 
die über die zur vollständigen und gleichmäßigen Bedeckung der Hautoberfläche erforderliche Menge hinausgeht.
 
Me-too-Test:  Umgangssprachliche Bezeichnung einer Prüfmethode, die struktu ­
rell und funktionell mit einer validierten und akzeptierten Referenzprüfmethode 
vergleichbar ist. Eine solche Prüfmethode käme für die Catch-up-Validierung in Frage. Gleichbedeutend mit vergleichbarer Prüfmethode verwendet (9).
 
Leistungsstandards (PS):  Auf einer validierten Prüfmethode beruhende Normen, auf 
deren Grundlage die Vergleichbarkeit einer vorgeschlagenen, mechanistisch und 
funktionell ähnlichen Prüfmethode bewertet werden kann. Sie umfassen (i) wesent ­
liche Elemente der Prüfmethode; (ii) ein Mindestverzeichnis von Referenzsubstanzen, ausgewählt aus den Substanzen, die zum Nachweis der akzeptablen Leistung der 
validierten Referenzmethode verwendet werden; und (iii) je nach den für die vali ­
dierte Referenzmethode erzielten Ergebnissen die vergleichbaren Genauigkeits- und Zuverlässigkeitswerte, die die vorgeschlagene Prüfmethode bei der Bewertung an ­
hand des Mindestverzeichnisses von Referenzsubstanzen demonstrieren sollte (9).
 
Referenzsubstanzen:  Chemikalien, die zur Verwendung im Validierungsprozess 
ausgewählt werden und für die die Reaktionen innerhalb des  in vitro - oder  in 
vivo-Referenztestsystems oder der untersuchten Spezies bereits bekannt sind. 
Diese Chemikalien sollten repräsentativ für die Chemikalienklassen sein, für 
die die Prüfmethode voraussichtlich verwendet werden soll; ferner sollten sie 
die ganze Bandbreite an Reaktionen abdecken, die von den Zielchemikalien erwartet werden kann — von stark über schwach bis negativ. Für die unter ­
schiedlichen Stadien des Validierungsprozesses, für verschiedene Prüfmethoden 
und Testverwendungen können unterschiedliche Reihen von Referenzchemikalien 
benötigt werden (9).
 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 664
 
Relevanz:  Dieser Begriff bezieht sich auf das Verhältnis zwischen dem Test und 
der betreffenden Wirkung und auf die Frage, ob er aussagekräftig und nützlich 
für einen bestimmten Zweck ist. Er beschreibt das Ausmaß, in dem der Test die untersuchte biologische Wirkung korrekt misst oder vorhersagt. Die Relevanz schließt eine Beurteilung der Genauigkeit (Übereinstimmung) einer Prüfmethode 
ein (9).
 
Zuverlässigkeit:  Maß der Verlässlichkeit der Reproduzierbarkeit der Prüfmethode 
innerhalb von und zwischen Laboratorien in einem bestimmten Zeitintervall bei einheitlichem Protokoll. Sie wird durch Berechnung der Intra- und Interlabor-Reproduzierbarkeit bewertet (9).
 
Ersatztest:  Ein Test der einen routinemäßig angewandten Test zur Identifikation 
von Gefahren und/oder zur Risikobewertung ersetzen soll, und der im Vergleich 
zu dem akzeptierten Test nachweislich in allen möglichen Prüfsituationen und mit allen Stoffen einen gleichwertigen oder besseren Schutz der Gesundheit von Mensch oder Tier oder der Umwelt gewährleistet, je nachdem, was zutrifft (9).
 
Sensitivität:  Der Anteil aller positiven/wirkenden Prüfsubstanzen, die durch den 
Test korrekt eingestuft werden. Die Sensitivität ist ein Maß der Genauigkeit einer Prüfmethode mit kategorialen Ergebnissen und ein wichtiger Aspekt bei der Bewertung ihrer Relevanz (9).
 
Hautreizung:  Das Auslösen einer reversiblen Hautschädigung nach Applikation 
einer Prüfsubstanz für die Dauer von bis zu 4 Stunden. Eine Hautreizung ist eine 
lokal auftretende, nicht immunogene Reaktion, die kurz nach der Stimulation eintritt (29). Ihr Hauptmerkmal ist ihr umkehrbarer Prozess, der mit Entzün ­
dungsreaktionen und den bei Entzündungen gängigsten klinischen Reizsympto ­
men (Erythema, Ödeme, Juckreiz und Schmerzen) einhergeht.
 
Spezifizität:  Der Anteil aller negativen/wirkungslosen Prüfsubstanzen, die durch 
den Test korrekt eingestuft werden. Die Spezifität ist ein Maß der Genauigkeit einer Prüfmethode mit kategorialen Ergebnissen und ein wichtiger Aspekt bei der 
Bewertung ihrer Relevanz (9).
 
Sequenzielle Teststrategie:  Teststrategie, in der Prüfmethoden in aufeinanderfol ­
gender Weise eingesetzt werden; dabei werden die in jeder folgenden Stufe gewählten Prüfmethoden auf der Grundlage der in früheren Stufen erzielten Ergebnisse ausgewählt (9).
 
Prüfchemikalie (auch Prüfsubstanz):  Jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit 
dieser Prüfmethode getestet wird.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 665
 
Anlage 2  
Leistungsstandards zur Bewertung vorgeschlagener vergleichbarer oder mo ­
difizierter Prüfmethoden für die Hautreizung, die auf  in vitro  rekonstruierter 
humaner E pidermis  beruhen (RhE)  
EINLEITUNG  
1. Ziel der Leistungsstandards (Performance Standards; PS) ist es, die Grund ­
lage zu vermitteln, auf der neue Methoden, seien diese geschützt (d. h. per 
Urheberrecht, Handelsmarken, eingetragene Marken) oder nicht geschützt, als ausreichend genau und zuverlässig für spezifische Prüfzwecke beurteilt werden können. Diese auf validierten und akzeptierten Methoden basieren ­
den Leistungsstandards können auch verwendet werden, um die Zuverläs ­
sigkeit und Genauigkeit anderer analoger Methoden (umgangssprachlich als „Me-too“-Tests bezeichnet) zu bewerten, die auf ähnlichen wissenschaftli ­
chen Prinzipien beruhen und denselben biologischen oder toxischen Effekt 
messen oder vorhersagen (9).
 
2. Vor der Anerkennung modifizierter Methoden (d. h. vorgeschlagener po ­
tenzieller Verbesserungen einer anerkennten Prüfmethode) sollten die Aus ­
wirkung der vorgeschlagenen Änderungen auf die Leistung des Tests, sowie das Maß in dem Änderungen die verfügbare Information für andere Ele ­
mente des Validierungsprozesses beeinflusst, bewertet werden. Je nach An ­
zahl und Art der vorgeschlagenen Änderungen, den generierten Daten und der Begleitdokumentation für diese Änderungen, sollten sie entweder dem für neue Tests beschriebenen Validierungsprozess, oder — gegebenenfalls 
— einer begrenzten Zuverlässigkeits- und Relevanzprüfung nach etablierten 
Leistungsstandards unterzogen werden (9).
 
3. Vergleichbare (Me-too-) oder modifizierte Verfahren in Bezug auf die drei 
validierten Verfahren [EpiSkin  TM (Validierte Referenzmethode; VRM), Epi ­
Derm  TM SIT (EPI-200) und SkinEthic  TM RHE], deren Verwendung in der 
vorliegenden Prüfmethode empfohlen wird, sollten anhand von Chemika ­
lien, die die volle Bandbreite der Draize-Reizstufen repräsentieren, auf ihre Zuverlässigkeit und Genauigkeit untersucht werden. Vorgeschlagene ver ­
gleichbare oder modifizierte Methoden, die mittels der 20 empfohlenen 
Referenzsubstanzen der Leistungsstandards (Tabelle 1) bewertet werden, 
sollten Zuverlässigkeits- und Genauigkeitswerte haben, die die Werte nach der VRM (Tabelle 2) erreichen oder übertreffen (2) 16). Die Zuver ­
lässigkeits- und Genauigkeitswerte, die erreicht werden sollten, sind in den 
Absätzen 8 bis 12 dieser Anlage aufgeführt. Nicht eingestufte chemische 
Stoffe (UN GHS/EU CLP Keine Kategorie) und eingestufte chemische Stoffe der Kategorie 2 (UN GHS/EU CLP) (1), die unterschiedliche che ­
mische Klassen bilden, werden ebenfalls einbezogen, so dass Zuverlässig ­
keit und Genauigkeit (Empfindlichkeit, Spezifizität und Gesamtgenauigkeit) 
der vorgeschlagenen Methode mit der der validierten Referenzmethode ver ­
glichen werden können. Die Zuverlässigkeit der Methode sowie ihre Fähig ­
keit, Reizstoffe der UN GHS/EU CLP Kategorie 2 korrekt einzustufen, und 
— je nach dem regulatorischen Rahmen, für den die Daten erzeugt werden 
— ebenso ihre Fähigkeit, chemische Stoffe mit der Einstufung Keine Ka ­
tegorie nach UN GHS/EU CLP korrekt einzustufen, sollte vor ihrer Ver ­
wendung zum Testen neuer Prüfsubstanzen nachgewiesen werden.
 
4. Diese Leistungsstandards basieren auf den EC-ECVAM Leistungsstandards 
(8), aktualisiert nach den UN GHS- und EU CLP-Systemen zur Einstufung und Kennzeichnung (1) (3). Die ursprünglichen Leistungsstandards wurden nach Abschluss der Validierungsstudie (21) festgelegt und beruhen auf dem 
Einstufungssystem der EU gemäß der Richtlinie 2001/59/EG der Kommis ­
sion vom 6. August 2001 zur 28. Anpassung der Richtlinie 67/548/EWG des Rates zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften der Mitgliedstaaten für die Einstufung, Verpackung und Kennzeichnung gefähr ­
licher Stoffe an den technischen Fortschritt (
 1 ). Infolge der Annahme des  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 666  
( 1 ) ABl. L 225 vom 21.8.2001, S. 1.
 UN GHS-Systems für die Einstufung und Kennzeichnung durch die EU 
(EU CLP) (3), die zwischen der Finalisierung der Validierungsstudie und 
dem Abschluss dieser Prüfmethode erfolgte, wurden die Leistungsstandards aktualisiert (8). Diese Überarbeitung bezieht sich hauptsächlich auf Ände ­
rungen (i) der Reihe der Referenzsubstanzen für die Leistungsstandards und 
(ii) der vorgegebenen Zuverlässigkeits- und Genauigkeitswerte (2) (23).
 
LEISTUNGSSTANDARDS FÜR PRÜFMETHODEN ANHAND VON  IN VI­
TRO  REKONSTRUIERTEN MODELLEN MENSCHLICHER EPIDERMIS 
ZUR BEWERTUNG DER HAUTREIZUNG  
5. Die Leistungsstandards umfassen die folgenden drei Elemente (9):  
I) Wesentliche Elemente der Prüfmethode  
II) Mindestliste der Referenzsubstanzen  
III) Vorgegebene Zuverlässigkeits- und Genauigkeitswerte  
I) Wesentliche Elemente der Prüfmethode  
6. Diese bestehen aus wesentlichen strukturellen, funktionellen und verfahrens ­
technischen Elementen einer validierten Methode, die in das Protokoll einer 
vorgeschlagenen, mechanistisch und funktionell vergleichbaren oder modi ­
fizierten Methode aufgenommen werden sollten. Diese Elemente beinhalten spezifische Merkmale der Methode, kritische verfahrenstechnische Angaben sowie Maßnahmen zur Qualitätskontrolle. Die Einhaltung der wesentlichen 
Elemente der Prüfmethode trägt dazu bei, zu gewährleisten, dass eine vor ­
geschlagene vergleichbare oder modifizierte Methode auf denselben Kon ­
zepten beruht wie die entsprechende validierte Referenzmethode (9). Die wesentlichen Elemente der Prüfmethode sind ausführlich in den Absätzen 
16 bis 21 der Prüfmethode beschrieben. Die Tests sollten unter Einhaltung 
der folgenden Bestandteile erfolgen:
 
— Allgemeine Bedingungen (Absatz 16)  
— Funktionelle Bedingungen, darunter:  
— Viabilität (Absatz 17);  
— Barrierefunktion (Absatz 18);  
— Morphologie (Absatz 19);  
— Reproduzierbarkeit (Absatz 20) und  
— Qualitätskontrolle (Absatz 21)  
II) Mindestliste der Referenzsubstanzen  
7. Referenzsubstanzen werden genutzt, um festzustellen, ob Zuverlässigkeit 
und Genauigkeit eines vorgeschlagenen vergleichbaren oder modifizierten Verfahrens, das in Struktur und Funktion nachweislich mit der VRM ver ­
gleichbar ist oder sich geringfügig von einer der drei validierten Verfahren 
unterscheidet, mit denen der VRM vergleichbar oder besser sind (2) (8) (16) 
(23). Die in Tabelle 1 aufgeführten 20 empfohlenen Referenzsubstanzen umfassen Stoffe aus unterschiedlichen chemischen Klassen (d. h. che ­
mischen Kategorien auf der Basis funktioneller Gruppen) und repräsentieren 
die volle Bandbreite der Draize-Reizstufen (von nicht reizend bis stark 
reizend). Die in dieser Liste enthaltenen Stoffe umfassen 10 Chemikalien der UN GHS/EU CLP Kategorie 2 und 10 nicht kategorisierte Chemikalien, darunter 3 Stoffe der optionalen UN GHS Kategorie 3. Im Rahmen dieser 
Prüfmethode wird die optionale UN GHS Kategorie 3 als Keine Kategorie 
bezeichnet. Die in Tabelle 1 aufgeführten Chemikalien werden im Hinblick auf Funktionalität und Aggregatzustand unter den Stoffen ausgewählt, die in der Optimierungsphase nach der Prävalidierung, sowie in der Validierungs ­
studie der VRM verwendet wurden (14) (18). Diese Referenzsubstanzen 
bilden die Mindestzahl an Chemikalien, die zur Bewertung der Genauigkeit
 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 667
 
und Zuverlässigkeit einer vorgeschlagenen vergleichbaren oder modifizier ­
ten Methode herangezogen werden sollten. Sie sollten jedoch nicht zur 
Entwicklung neuer Methoden verwendet werden. Sollte ein aufgeführter chemischer Stoff nicht verfügbar sein, können andere Substanzen verwendet werden, für die angemessene  in vivo -Referenzdaten vorliegen. Diese sind 
vorzugsweise unter den Stoffen auszuwählen, die in der Optimierungsphase 
nach der Prävalidierung, oder in der Validierungsstudie der VRM verwendet wurden. Um die Genauigkeit der vorgeschlagenen Methode weitergehend zu bewerten, kann die Mindestliste der Referenzsubstanzen auf Wunsch um 
zusätzliche Chemikalien anderer chemischer Klassen erweitert werden, so ­
fern für diese entsprechende  in vivo -Referenzdaten vorliegen.
 
Tabelle 1  
Mindestliste der Referenzsubstanzen für die Bestimmung der Genauigkeits- und Zuverlässigkeitswerte für 
vergleichbare oder modifizierte Verfahren zur Untersuchung von Hautreizungen auf der Grundlage von 
RhE-Modellen  ( 1 ) 
Substanz CAS-Nummer Aggregatzustand  In vivo-  
Punktzahl VRM  in vitro  
Kat. UN GHS/EU CLP  in 
vivo Kat. 
1-Bromo-4-chlorobutan 6940-78-9 Flüssig 0 Kat. 2 Keine Kat. 
Diethylphthalat 84-66-2 Flüssig 0 Keine Kat. Keine Kat. 
Naphthalen-Essigsäure 86-87-3 Fest 0 Keine Kat. Keine Kat. Allylphenoxyacetat 7493-74-5 Flüssig 0,3 Keine Kat. Keine Kat. 
Isopropanol 67-63-0 Flüssig 0,3 Keine Kat. Keine Kat. 
4-Methylthiobenzaldehyd 3446-89-7 Flüssig 1 Kat. 2 Keine Kat. 
Methylstearat 112-61-8 Fest 1 Keine Kat. Keine Kat. 
Heptyl-Butyrat 5870-93-9 Flüssig 1,7 Keine Kat. Keine Kat. Hexyl-Salicylat 6259-76-3 Flüssig 2 Keine Kat. Keine Kat. 
Cinnamaldehyd 104-55-2 Flüssig 2 Kat. 2 Keine Kat.  
(wahlfrei Kat .3) (
 3 ) 
1-Decanol  ( 2 ) 112-30-1 Flüssig 2,3 Kat. 2 Kat. 2  
Cyclamenaldehyd 103-95-7 Flüssig 2,3 Kat. 2 Kat. 2 
1-Bromohexan 111-25-1 Flüssig 2,7 Kat. 2 Kat. 2 2-Chloromethyl-3,5-di ­
methyl-4-methoxypyridin 
HCl 86604-75-3 Fest 2,7 Kat. 2 Kat. 2  
Di-n-Propyldisulphid  (
 2 ) 629-19-6 Flüssig 3 Keine Kat. Kat. 2  
Kaliumhydroxid (5 % aq.) 1310-58-3 Flüssig 3 Kat. 2 Kat. 2 
Benzenethiol, 5-(1,1-Di ­
methylethyl)-2-methyl 7340-90-1 Flüssig 3,3 Kat. 2 Kat. 2 
1-Methyl-3-phenyl-1-pipera ­
zin; 5271-27-2 Fest 3,3 Kat. 2 Kat. 2  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 668
 
Substanz CAS-Nummer Aggregatzustand  In vivo-  
Punktzahl VRM  in vitro  
Kat. UN GHS/EU CLP  in 
vivo Kat. 
Heptanal 111-71-7 Flüssig 3,4 Kat. 2 Kat. 2 
Tetrachloroethylen 127-18-4 Flüssig 4 Kat. 2 Kat. 2  
( 1 ) Die Auswahl der Chemikalien basiert auf den folgenden Kriterien: i) die Substanzen sind im Handel erhältlich; ii) sie repräse ntieren 
die volle Bandbreite der Draize-Reizstufen (von nicht reizend bis stark reizend); iii) sie haben eine klar definierte chemische  
Struktur; iv) sie sind repräsentativ für die im Validierungsprozess verwendete chemische Funktionalität, v) sie weisen kein ext rem 
toxisches Profil auf ( z. B.  krebserregend oder toxisch für das Reproduktionssystem) und sie sind nicht mit unerschwinglichen 
Entsorgungskosten verbunden. 
( 2 ) Chemische Stoffe, die beim Kaninchen reizend sind, deren nicht reizende Wirkung beim Menschen jedoch zuverlässig nachgewie ­
sen wurde (31) (32) (33). 
( 3 ) Nach dem UN GHS, nicht im EU CLP.  
III) Vorgegebene Zuverlässigkeits- und Genauigkeitswerte  
8. Zur Bewertung der Zuverlässigkeit und Relevanz vorgeschlagener ver ­
gleichbarer oder modifizierter Verfahren, die zwischen einzelnen Laborato ­
rien ausgetauscht werden sollen, müssen alle 20 Referenzsubstanzen in Tabelle 1 in mindestens drei Laboratorien getestet werden. Wenn die vor ­
geschlagene Methode allerdings nur in einem einzigen Labor verwendet 
werden soll, sind Prüfungen in mehreren Laboratorien zu Validierungszwe ­
cken nicht erforderlich. Wesentlich ist jedoch, dass solche Validierungs ­
studien unabhängig von internationalen Validierungsstellen in Übereinstim ­
mung mit internationalen Leitlinien bewertet werden (9). In jedem Labor 
sollten alle 20 Referenzsubstanzen in drei unabhängigen Durchgängen mit 
unterschiedlichen Gewebechargen und zu ausreichend weit auseinander lie ­
genden Zeitpunkten getestet werden. Jeder Durchgang sollte mindestens drei gleichzeitig getestete Gewebereplikate für jede in der Prüfung enthal ­
tene Prüfsubstanz, sowie Negativkontrolle und Positivkontrolle, umfassen.
 
9. Die Berechnung der Zuverlässigkeits- und Genauigkeitswerte des vor ­
geschlagenen Verfahrens sollte unter Berücksichtigung aller vier unten ge ­
nannten Kriterien erfolgen, wobei sicherzustellen ist, dass die Zuverlässig ­
keits- und Relevanzwerte auf vorgegebene und gleichbleibende Weise be ­
rechnet werden:  
1. Nur die Daten von vollständigen Durchgangsfolgen kommen für die 
Berechnung der Intra- und Inter-Labor-Variabilität und für die Vorher ­
sagefähigkeit (Genauigkeit) in Frage.  
2. Die abschließende Einstufung für alle Referenzsubstanzen in jedem teil ­
nehmenden Labor sollte ermittelt werden, indem bei sämtlichen Durch ­
gängen einer vollständigen Durchgangsfolge der mittlere Viabilitätswert zugrunde gelegt wird.
 
3. Nur die ermittelten Daten für Substanzen mit vollständigen Durchgangs ­
folgen in allen teilnehmenden Laboratorien kommen für die Berechnung 
der Inter-Labor-Variabilität in Frage.  
4. Die Berechnung der Genauigkeitswerte sollte auf der Grundlage der 
individuellen Laborvorhersagen für die 20 Referenzsubstanzen durch die unterschiedlichen teilnehmenden Laboratorien erfolgen.
 
In diesem Zusammenhang besteht eine  Durchgangsfolge  aus drei unabhän ­
gigen Durchgängen eines Labors für eine Prüfsubstanz. Eine  vollständige 
Durchgangsfolge  ist eine Durchgangsfolge eines Labors für eine Prüfsub ­
stanz, in der alle drei Durchgänge gültig sind. Das bedeutet, dass jeder 
einzelne ungültige Durchgang eine ganze Durchgangsfolge von drei Durch ­
gängen ungültig macht.  
Laborinterne Reproduzierbarkeit  
10. Bei der Bewertung der laborinternen Reproduzierbarkeit sollte die Überein ­
stimmung der Einstufungen (UN GHS/EU CLP Kategorie 2 und  Keine 
Kategorie ), aus unterschiedlichen und voneinander unabhängigen Test ­
durchgängen innerhalb eines Labors mit den 20 Referenzsubstanzen ermit ­
telt, gleich oder höher ( ≥) 90 % sein.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 669
 
Inter-Labor-Reproduzierbarkeit  
11. Eine Bewertung der Inter-Labor-Reproduzierbarkeit ist nicht erforderlich, 
wenn die vorgeschlagene Methode nur in einem einzigen Labor verwendet 
werden soll. Für Methoden, die zwischen Laboratorien ausgetauscht werden sollen, sollte die Übereinstimmung zwischen den Einstufungen (UN GHS/EU CLP Kategorie 2 und Keine Kategorie) aus unterschiedlichen 
und voneinander unabhängigen Testdurchgängen mit den 20 Referenzsub ­
stanzen, die vorzugsweise in mindestens drei Laboratorien durchgeführt wurden, zwischen diesen Laboratorien gleich oder höher ( ≥) 80 % sein.
 
Vorhersagefähigkeit (Genauigkeit)  
12. Die Genauigkeit (Sensitivität, Spezifizität und Gesamtgenauigkeit) der vor ­
geschlagenen vergleichbaren oder modifizierten Methode sollte die der va ­
lidierten Referenzmethode erreichen oder übertreffen, wobei auch zusätzli ­
che Informationen zur Relevanz für die betreffende Spezies zu berücksich ­
tigen sind (Tabelle 2). Die Sensitivität sollte gleich oder höher ( ≥) 80 % 
sein (2) (8) (23). Eine weitere spezifische Einschränkung gilt allerdings für 
die Sensitivität der vorgeschlagenen  in vitro -Methode insofern, als nur zwei 
Chemikalien der  in vivo -Kategorie 2,  1-Decanol  und  D-n-propyldisulphid,  
von mehr als einem teilnehmenden Labor als  Keine Kategorie  fehleingestuft 
werden dürfen. Die Spezifizität sollte gleich oder höher ( ≥) 70 % sein (2) 
(8) (23). Es gibt keine weitere Einschränkung für die Spezifizität der vor ­
geschlagenen  in vitro -Methode, d. h. jedes teilnehmende Labor kann jede 
Chemikalie mit der in vivo Einstufung  Keine Kategorie  fehleinstufen, so ­
lange die Endspezifizität der Prüfmethode innerhalb der akzeptablen Band ­
breite liegt. Die Gesamtgenauigkeit sollte gleich oder höher ( ≥) 75 % sein 
(2) (8) (23). Obwohl die Empfindlichkeit der validierten Referenzmethode für die in Tabelle 1 aufgeführten 20 Referenzsubstanzen gleich 90 % ist, 
wird der vorgegebene minimale Empfindlichkeitswert, der erreicht werden 
muss, damit ein vergleichbares oder modifiziertes Verfahren als valide an ­
gesehen werden kann, auf 80 % festgelegt, da sowohl  1-Decanol  (eine 
Grenzchemikalie) als auch  Di-n-propyldisulphid  (ein falsch negatives Er ­
gebnis der VRM) als nicht reizend beim Menschen bekannt sind (31) 
(32) (33), obgleich sie im Kaninchentest als Reizstoffe eingestuft wurden. Da rekonstruierte Modelle menschlicher Epidermis auf Zellen menschlichen Ursprungs basieren, können sie die nicht reizenden Eigenschaften dieser 
Chemikalien vorhersagen (UN GHS/EU CLP Keine Kategorie).
 
Tabelle 2  
Für die Gültigkeit einer vergleichbaren oder modifizierten Methode benötigte prädiktive 
Werte im Hinblick auf Empfindlichkeit, Spezifizität und Gesamtgenauigkeit.  
Empfindlichkeit Spezifizität Gesamtgenauigkeit  
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Akzeptanzkriterien der Studie  
13. Es ist möglich, dass einer oder mehrere Tests im Zusammenhang mit einer 
oder mehreren Prüfsubstanzen die Akzeptanzkriterien für die Prüf- und Kontrollsubstanzen nicht erfüllt/erfüllen oder aus anderen Gründen nicht akzeptabel ist/sind. Um fehlende Daten zu ergänzen, sind für jede Prüfsub ­
stanz maximal zwei zusätzliche Prüfungen zulässig („Erneute Prüfung“). 
Genauer gesagt, da im Fall einer erneuten Prüfung auch PK und NK gleich ­
zeitig getestet werden müssen, dürfen maximal zwei zusätzliche Durch ­
gänge für jede Prüfsubstanz durchgeführt werden.
 
14. Möglicherweise wird selbst nach der erneuten Prüfung die für jede Prüf ­
substanz vorgeschriebene Mindestzahl von drei gültigen Durchgängen nicht 
für jede Referenzsubstanz in jedem beteiligten Labor erreicht, was zu einer unvollständigen Datenmatrix führen würde. In solchen Fällen sollten alle 
folgenden drei Kriterien erfüllt werden, damit die Datensätze akzeptiert 
werden können:
 
1. Alle 20 Referenzsubstanzen sollten mindestens eine vollständige Durch ­
gangsfolge haben.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 670
 
2. In jedem der mindestens drei teilnehmenden Laboratorien müssen min ­
destens 85 % der Durchgangsfolgen vollständig sein (für 20 Chemika ­
lien; d. h. in einem einzelnen Labor sind 3 ungültige Durchgangsfolgen zulässig).
 
3. Mindestens 90 % aller möglichen Durchgangsfolgen aus mindestens drei 
Laboratorien müssen vollständig sein (für 20 Chemikalien, die in 3 
Laboratorien geprüft werden; d. h. insgesamt sind 6 ungültige Durch ­
gangsfolgen zulässig).  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 671
 
B. 47  TRÜBUNGS- UND DURCHLÄSSIGKEITSTEST AN DER ISO ­
LIERTEN RINDERHORNHAUT ZWECKS IDENTIFIZIERUNG VON STOFFEN MIT AUGENVERÄTZENDER UND STARK AU ­
GENREIZENDER WIRKUNG
 
EINLEITUNG  
1. Der Trübungs- und Durchlässigkeitstest an der isolierten Rinderhornhaut 
(Bovine Corneal Opacity and Permeability , BCOP) ist eine  In-vitro -Prüf­
methode, die unter bestimmten Bedingungen und mit bestimmten Grenzen 
eingesetzt werden kann, um Stoffe und Gemische als Stoffe und Gemische 
mit „augenverätzender und stark augenreizender Wirkung“ (1) (2) (3) ein ­
zustufen. Für die Zwecke dieser Prüfmethode sind Stoffe mit starker Reiz ­
wirkung Stoffe, welche Augenläsionen verursachen, die beim Kaninchen 
nach der Applikation mindestens 21 Tage lang anhalten. Auch wenn der 
Test den  In-vivo -Kaninchenaugentest nicht absolut ersetzen kann, wird der 
BCOP innerhalb eines spezifischen Anwendungsbereichs dennoch als Teil einer gestuften Prüfstrategie zur vorschriftsmäßigen Einstufung und Kenn ­
zeichnung empfohlen (4) (5). Prüfsubstanzen und –gemische (6) können 
als augenverätzend oder stark augenreizend eingestuft werden, ohne dass weitere Tests am lebenden Kaninchen erforderlich sind. Eine Prüfsubstanz mit negativem Testergebnis müsste allerdings nach einer sequenziellen 
Prüfstrategie, wie in der OECD-Testrichtlinie 405 (7) (Kapitel B. 5 dieses 
Anhangs) dargelegt, am Kaninchen getestet werden.
 
2. Diese Prüfmethode beschreibt die Verfahrensschritte für die Beurteilung 
des augenverätzenden oder stark augenreizenden Potenzials einer Prüfsub ­
stanz, gemessen als seine Fähigkeit, bei isolierten Rinderhornhäuten Trü ­
bungs- und verstärkte Durchlässigkeitseffekte hervorzurufen. Toxische Ef ­
fekte für die Hornhaut sind messbar durch i) verminderte Lichtübertragung 
(Trübung) und ii) den verstärkten Durchtritt von Fluorescein-Natrium- Farbstoff (Durchlässigkeit). Die Trübungs- und Durchlässigkeitsbewertun ­
gen der Hornhaut nach Applikation einer Prüfsubstanz ergeben in Kom ­
bination einen  In-Vitro -Reizwert ( In Vitro  Irritancy Score, IVIS), der für 
die Einstufung des Reizpotenzials der Prüfsubstanz maßgeblich ist.
 
3. Augenreizende Stoffe, die Läsionen hervorrufen, die in weniger als 21 
Tagen abklingen, sowie Stoffe ohne Reizwirkung wurden ebenfalls nach 
der BCOP-Methode untersucht. Die Genauigkeit und Zuverlässigkeit des BCOP bei Stoffen dieser Kategorien wurden jedoch nicht offiziell evaluiert.
 
4. Für Definitionen siehe Anlage 1.  
VORBEMERKUNGEN UND EINSATZGRENZEN  
5. Diese Prüfmethode basiert auf dem BCOP-Testprotokoll des Organisati ­
onsübergreifenden Koordinationsausschusses zur Validierung alternativer 
Methoden ( Interagency Coordinating Committee on the Validation of Al ­
ternative Methods , ICCVAM) (8), das im Anschluss an eine internationale 
Validierungsstudie (4)(5)(9) und unter Mitwirkung des Europäischen Zen ­
trums zur Validierung alternativer Methoden ( European Centre for the 
Validation of Alternative Methods , (ECVAM) und des Japanischen Zen ­
trums zur Validierung alternativer Methoden ( Japanese Center for the 
Validation of Alternative Methods , JaCVAM) entwickelt wurde. Das Pro ­
tokoll beruht auf Informationen des Instituts für  In-vitro -Forschung ( Insti­
tute for In Vitro Sciences , IIVS) und auf dem INVITTOX-Protokoll 124 
(10), das für die von der Europäischen Gemeinschaft finanzierte BCOP-Prävalidierungsstudie aus den Jahren 1997-1998 herangezogen wur ­
de. Beide Protokolle beruhen auf der BCOP-Prüfmethodik, wie sie von 
Gautheron  et al.  (11) erstmals beschrieben wurde.
 ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 672
 
6. Die anerkannten Einsatzgrenzen dieser Prüfmethode beruhen auf den aus 
den Validierungsdaten hervorgehenden hohen Falsch-Positiv-Raten für Al ­
kohole und Ketone und der hohen Falsch-Negativ-Rate für Feststoffe (siehe Punkt 44) (5). Durch Ausschluss von Stoffen dieser chemischen und physikalischen Klassen aus der Datenbank lässt sich die Genauigkeit 
des BCOP in allen Klassifizierungssystemen (EU, EPA und GHS) erheb ­
lich verbessern (5). Für die Zwecke dieser Prüfung (d. h. ausschließliche Identifizierung augenverätzender/stark augenreizender Stoffe) sind Falsch-Negativ-Raten nicht maßgeblich, da diese Stoffe anschließend an 
Kaninchen oder - je nach Vorschriften - im Rahmen anderer angemessen 
validierter  In-vitro -Tests nach einer sequenziellen Prüfstrategie mit einem 
evidenzbasierten Bewertungsansatz ( weight of evidence approach ) getestet 
werden. Außerdem konnten bestimmte Chemikalien- oder Produktklassen 
(z. B. Gemische) mit den derzeitigen Validierungsdaten nicht angemessen 
evaluiert werden. Prüfer könnten diese Prüfmethode jedoch für alle Arten von Prüfmaterial (auch Gemische) einsetzen und ein Positivergebnis als Indikator einer augenverätzenden oder stark augenreizenden Wirkung ak ­
zeptieren. Positivergebnisse bei Verwendung von Alkohol oder Ketonen 
sollten angesichts des Risikos von Falsch-Positiv-Prognosen ( over-predicti ­
on) jedoch mit einer gewissen Zurückhaltung interpretiert werden.
 
7. Bei allen Verfahren, die Rinderaugen und Rinderhornhäute involvieren, 
sollten die geltenden Regeln und Verfahrensvorschriften der Prüfanstalt für den Umgang mit Tiermaterial eingehalten werden, das auch Gewebe 
und Gewebeflüssigkeiten umfasst, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Uni ­
verselle Laborregeln sollten beachtet werden (12).
 
8. Eine Grenze der Prüfmethode liegt darin, dass, obgleich zwar einige der 
im Kaninchenaugentest evaluierten Reizwirkungen und bis zu einem ge ­
wissen Grad auch deren Schwere berücksichtigt werden, Bindehaut- und Irisverletzungen außer Acht gelassen werden. Auch wurde – obwohl sich 
die Reversibilität von Hornhautläsionen  per se  mit dem BCOP nicht beur ­
teilen lässt –auf der Grundlage von Kaninchenaugenstudien dennoch vor ­
geschlagen, eine Bewertung der anfänglichen Tiefe der Hornhautverlet ­
zung heranzuziehen, um zwischen irreversiblen und reversiblen Wirkungen 
zu unterscheiden (13). Schließlich sei auch zu erwähnen, dass eine poten ­
ziell mit der Augenexposition einhergehende systemische Toxizität nach der BCOP-Methode nicht bewertet werden kann.
 
9. Es laufen Arbeiten, um Eignung und Grenzen des BCOP zur Identifizie ­
rung von Stoffen mit schwacher Reizwirkung oder von Stoffen ohne Reiz ­
wirkung genauer zu charakterisieren (siehe auch Punkt 45). Ferner wird 
empfohlen, dass Anwender den Validierungsorganisationen Exemplare und/oder Daten zur formellen Evaluierung etwaiger künftiger Anwen ­
dungsbereiche des BCOP übermitteln, auch um Stoffe mit schwacher Reiz ­
wirkung oder Stoffe ohne Reizwirkung identifizieren zu können.
 
10. Laboratorien, die diese Prüfmethode zum ersten Mal anwenden, sollten die 
in Anlage 2 genannten Leistungschemikalien verwenden. Laboratorien 
können diese Chemikalien verwenden, um ihre technische Kompetenz zur Durchführung des BCOP zu demonstrieren, bevor sie BCOP-Testdaten zum Zwecke der vorgeschriebenen Gefahrenklassifizie ­
rung einreichen.
 
TESTPRINZIP  
11. Die BCOP-Prüfmethode ist ein organtypisches Modell, das die kurzfristige 
Aufrechterhaltung der normalen physiologischen und biochemikalischen 
Funktionen von Rinderhornhäuten  in vitro  gewährleistet. Bei dieser Methode 
werden durch die Prüfsubstanz hervorgerufene Schäden bewertet, indem Ver ­
änderungen von Trübung und Durchlässigkeit der Hornhaut mithilfe eines 
Opazimeters bzw. eines VIS-Spektrofotometers quantitativ gemessen werden. 
Die beiden Messwerte dienen der Berechnung eines  In-vitro - 
Reizwertes (IVIS), der seinerseits herangezogen wird, um zwecks Prädiktion des Augenreizpotenzials einer Prüfsubstanz am lebenden Objekt ( in vivo ) eine 
Zuordnung zu einer Gefahrenkategorie aufgrund des  In-vitro -Reizungspoten ­
zials des Stoffes vorzunehmen (siehe Entscheidungskriterien).
 ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 673
 
12. Für die BCOP-Prüfmethode werden isolierte Hornhäute der Augen frisch 
geschlachteter Rinder verwendet. Die Hornhauttrübung wird quantitativ 
bestimmt als Menge der die Hornhaut durchdringenden Lichtstrahlung. Die Durchlässigkeit der Hornhaut wird quantitativ bestimmt als die Menge an Natrium-Fluorescein, die die gesamte Dicke der Hornhaut durchdringt 
und im Medium in der Hinterkammer nachgewiesen wird. Die Applikation 
der Prüfsubstanzen auf die Epitheloberfläche der Hornhaut erfolgt durch Zugabe der Stoffe in die Vorderkammer des Hornhauthalters. Anlage 3 enthält eine Beschreibung sowie ein Schaubild einer Halterung, wie sie für 
den BCOP verwendet wird. Hornhauthalter sind im Handel erhältlich oder 
können als Bausatz bezogen werden.
 
Bezugsquelle und Alter der Rinderaugen und Auswahl der Tiere  
13. Schlachtrinder werden in der Regel für den menschlichen Verzehr oder für 
andere gewerbliche Zwecke getötet. Nur gesunde und für die menschliche 
Nahrungskette geeignet befundene Tiere kommen als Bezugsquelle für 
Augenhornhäute für den BCOP-Test in Frage. Da Rinder je nach Rasse, Alter und Geschlecht eine große Gewichtsspanne aufweisen, gibt es keine Gewichtsempfehlung für die Tiere zum Zeitpunkt der Schlachtung.
 
14. Augenhornhäute von Tieren verschiedener Altersklassen sind mitunter un ­
terschiedlich groß. Hornhäute mit einem horizontalen Durchmesser von > 30,5 mm und einer zentralen Hornhautdicke (CCT) von ≥ 1 100 μm 
stammen in der Regel von über acht Jahre alten Rindern, während Horn ­
häute mit einem horizontalen Durchmesser von < 28,5 mm und einer 
zentralen Hornhautdicke von < 900 μm im Allgemeinen von weniger als 
fünf Jahre alten Tieren stammen (14). Deshalb werden Augen von über 60 Monate alten Tieren in der Regel nicht verwendet. Traditionsgemäß wer ­
den keine Augen von weniger als 12 Monate alten Rindern verwendet, da 
die Augen dieser Tiere noch nicht ausgewachsen sind und Hornhautdicke sowie Hornhautdurchmesser wesentlich kleiner sind als bei ausgewachse ­
nen Rindern. Hornhäute von Jungtieren (d. h. Tiere im Alter von sechs bis 
12 Monaten) sind aufgrund ihrer Vorteile jedoch zulässig: Sie sind bei ­
spielsweise leichter erhältlich, die Altersspanne ist geringer und das Labor ­
personal ist in geringerem Maße BSE-gefährdet (15). Da eine weitere 
Evaluierung des Einflusses von Hornhautgröße oder Hornhautdicke auf 
die Wirkung verätzender oder reizender Stoffe nützlich wäre, sollten An ­
wender das geschätzte Alter und/oder das Gewicht der Tiere, von denen die für eine Studie verwendeten Hornhäute stammen, mitteilen.
 
Gewinnung und Beförderung der Augen zum Labor  
15. Die Rinderaugen werden im Schlachthof gewonnen. Um jede mechanische 
und sonstige Schädigung der Augen auf ein Minimum zu beschränken, sollten die Augen nach der Tötung des Tieres so bald wie möglich aus ­
geschält werden. Damit die Augen nicht mit potenziellen Reizstoffen in 
Berührung kommen, sollte das Schlachthofpersonal zum Abspülen des 
Schädels keine Detergenzien verwenden.
 
16. Die Augen sollten in einem angemessen großen Behältnis vollständig in 
HBSS eingelegt und so zum Labor befördert werden, dass sich ihr Zustand 
möglichst nicht verschlechtert und/oder es möglichst nicht zu einer bakte ­
riellen Kontamination kommt. Da die Augen während des Schlachtprozes ­
ses gewonnen werden, könnten sie mit Blut und anderen biologischen Stoffen wie Bakterien und sonstigen Mikroorganismen in Berührung kom ­
men. Deshalb muss unbedingt sichergestellt werden, dass das Kontamina ­
tionsrisiko auf ein Mindestmaß begrenzt wird (z. B. indem das für die Beförderung der Augen verwendete Behältnis auf Nasseis gelagert und die zur Lagerung der Augen während der Beförderung verwendete 
HBSS-Lösung mit Antibiotika (z. B. 100 IU/mL Penizillin und 100 μg/mL 
Streptomycin) angereichert wird).
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17. Der Zeitabstand zwischen der Gewinnung der Augen und der Verwendung 
der Hornhäute im BCOP sollte möglichst gering sein (im Idealfall sollten 
die Hornhäute am selben Tag gewonnen und verwendet werden) und die Testergebnisse nachweislich nicht kompromittieren. Letztere basieren auf den Auswahlkriterien für die Augen sowie auf den Reaktionen der Positiv- 
und Negativkontrollen. Alle für die Prüfung verwendeten Augen sollten 
aus einer an ein und demselben Tag gewonnenen Partie Augen stammen.
 
Auswahlkriterien für Augen, die im BCOP-Test eingesetzt werden  
18. Unmittelbar nach ihrer Ankunft im Labor werden die Augen sorgfältig auf 
Mängel wie unter anderem verstärkte Trübung, Kratzer und Neovaskula ­
risation untersucht. Nur Hornhäute von Augen, die keine derartigen Män ­
gel aufweisen, dürfen verwendet werden.  
19. Die Qualität jeder Hornhaut wird auch in späteren Testphasen geprüft. 
Hornhäute, die nach einer ersten einstündigen Äquilibrierung mehr als sieben Trübungseinheiten aufweisen (ANMERKUNG: der Opazimeter sollte nach den Trübungsnormen kalibriert werden, die auch zur Fest ­
legung der Trübungseinheiten verwendet werden; siehe Anlage 3), sind 
zu verwerfen.
 
20. Jede Behandlungsgruppe (Prüfsubstanz sowie konkurrierende Negativ- und 
Positivkontrollen) umfasst mindestens drei Augen. Für die Negativkontrol ­
len des BCOP sollten drei Hornhäute verwendet werden. Da die Hornhäute operativ vom Augapfel entfernt und in die Hornhautkammern eingespannt werden, kann es infolge dieser Handgriffe bei einzelnen Hornhäuten zu 
veränderten Trübungs- und Durchlässigkeitswerten kommen (auch bei der 
Negativkontrolle). Außerdem werden die Trübungs- und Durchlässigkeits ­
werte von Hornhäuten der Negativkontrolle dazu verwendet, die Trübungs- und Durchlässigkeitswerte des Prüfobjekts und der Positivkontrolle bei den 
IVIS-Berechnungen zu korrigieren.
 
VERFAHREN  
Vorbereitung der Augen  
21. Unbeschädigte Hornhäute werden seziert, wobei ein 2 bis 3 mm breiter 
Sklera-Rand belassen wird, um das anschließende Manipulieren zu erleich ­
tern; dabei ist darauf zu achten, dass die Epithel- und Endothelzellschicht 
der Hornhaut nicht beschädigt wird. Die isolierten Hornhäute werden in speziell entwickelte Hornhauthalter eingespannt, die aus Vorder- und Hin ­
terkammern bestehen, welche die Schnittstellen zur Epithel- bzw. Endot ­
helseite der Hornhäute bilden. Beide Kammern (Hinterkammer zuerst) 
werden bis zum Überlaufen mit vorgewärmtem EMEM-Medium gefüllt, wobei sicherzustellen ist, dass sich keine Luftblasen bilden. Das Gerät wird sodann bei 32 ± 1 °C für mindestens eine Stunde äquilibriert, um 
die Hornhäute mit dem Medium zu äquilibrieren und so weit wie möglich 
eine normale Stoffwechseltätigkeit zu gewährleisten (die ungefähre Tem ­
peratur der Hornhautoberfläche beträgt  in vivo  32 °C).
 
22. Nach der Äquilibrierung wird frisches vorgewärmtes EMEM-Medium in 
beide Kammern gegeben, und für jede Hornhaut werden Referenztr ­
übungswerte abgelesen. Hornhäute, die makroskopische Gewebeschäden (z. B. Kratzer, Pigmentierung, Neovaskularisation) oder über sieben Trü ­
bungseinheiten aufweisen, werden verworfen. Sodann wird die Durch ­
schnittstrübung aller äquilibrierten Hornhäute berechnet. Mindestens drei Hornhäute mit Trübungswerten nahe am Mittelwert sämtlicher Hornhäute werden für die Negativ-(oder Lösungsmittel-)Kontrolle ausgewählt. Die 
restlichen Hornhäute werden in Behandlungs- und Positivkontrollgruppen 
aufgeteilt.
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23. Da die Wärmekapazität von Wasser höher ist als die Wärmekapazität von 
Luft, bietet Wasser stabilere Temperaturbedingungen für die Inkubation. 
Deshalb wird ein Wasserbad empfohlen, um Hornhauthalter samt Inhalt auf einer Temperatur von 32 ± 1 °C zu halten. Es können jedoch auch Luftinkubatoren verwendet werden, sofern alle erforderlichen Vorkehrun ­
gen getroffen wurden, um die Temperatur stabil zu halten (z. B. durch 
Vorwärmen der Halterungen und Medien).
 
Applikation der Prüfsubstanz  
24. Es werden zwei unterschiedliche Behandlungsprotokolle verwendet – eines 
für Flüssigkeiten und Tenside (Feststoffe oder Flüssigkeiten) und eines für 
nichttensidische Feststoffe.  
25. Flüssigkeiten werden unverdünnt, Tenside in einer Konzentration von 
10 % w/v in 0,9 % Natriumchloridlösung, destilliertem Wasser oder einem anderen Lösungsmittel, welches das Testsystem nachweislich nicht beein ­
trächtigt, getestet. Halbfeste Stoffe, Cremes und Wachse werden in der 
Regel wie Flüssigkeiten getestet. Sofern alternative Lösungskonzentratio ­
nen verwendet werden, ist dies angemessen zu begründen. Die Hornhäute werden den Flüssigkeiten und Tensiden für die Dauer von zehn Minuten 
ausgesetzt. Bei anderen Expositionszeiten sollten diese wissenschaftlich 
begründet werden.
 
26. Nichttensidische Feststoffe werden in der Regel wie Lösungen oder Sus ­
pensionen in einer Konzentration von 20 % in 0,9 % Natriumchloridlö ­
sung, destilliertem Wasser oder einem anderem Lösungsmittel, welches 
das Testsystem nachweislich nicht beeinträchtigt, getestet. Unter bestimm ­
ten Bedingungen und sofern wissenschaftlich begründet, können Feststoffe auch unverdünnt durch direkte Applikation auf die Hornhautoberfläche 
getestet werden, wobei die offene Methode ( open chamber method , siehe 
Punkt 29) angewandt wird. Die Hornhäute werden den Feststoffen für die Dauer von vier Stunden ausgesetzt; soweit wissenschaftlich fundiert kön ­
nen jedoch auch, wie bei Flüssigkeiten und Tensiden, alternative Exposi ­
tionszeiten verwendet werden.
 
27. Je nach den physikalischen und chemischen Eigenschaften der Prüfsub ­
stanz (z. B. fest, flüssig, zähflüssig oder nicht zähflüssig) können unter ­
schiedliche Behandlungsmethoden angewandt werden. Der kritische Faktor besteht darin sicherzustellen, dass die Prüfsubstanz die Epitheloberfläche 
angemessen bedeckt und während der Spülungen sachgemäß entfernt wird. 
Die geschlossene Methode ( closed chamber method ) wird in der Regel für 
nicht zähflüssige bis leicht zähflüssige Prüfsubstanzen eingesetzt, während 
die offene Methode eher für halbzähflüssige und zähflüssige Prüfsubstan ­
zen sowie für unverdünnte Feststoffe verwendet wird.
 
28. Bei der geschlossenen Methode wird über die Dosieröffnungen auf der 
Oberseite der Kammer so viel Prüfsubstanz (750 μL) in die Vorderkammer 
gegeben, dass die Epithelseite der Hornhaut bedeckt ist; die Öffnungen 
werden anschließend für die gesamte Expositionsdauer mit den Kammer ­
verschlüssen abgedichtet. Es muss unbedingt sichergestellt werden, dass alle Hornhäute der Prüfsubstanz für eine angemessene Dauer ausgesetzt werden.
 
29. Bei der offenen Methode werden vor der Behandlung Scheibenverschluss ­
ring und Glasscheibe von der Vorderkammer entfernt. Die Kontroll- oder die Prüfsubstanz (750 μL bzw. genügend Prüfsubstanz, um die Hornhaut 
komplett zu bedecken) wird mit einer Mikropipette direkt auf die Epithel ­
oberfläche der Hornhaut appliziert. Erweist sich das Pipettieren einer Prüf ­
substanz als schwierig, so kann dieser zur leichteren Dosierung mittels Druckausgleich in eine Direktverdrängungspipette geladen werden. Die Spitze der Direktverdrängungspipette wird in die Dosierspitze der Spritze 
eingeführt, damit das Material unter Druck in die Spitze der Verdrän ­
gungspipette geladen werden kann. Lässt man den Bedienknopf langsam zurückgleiten, fährt der Kolben der Pipette nach oben. Treten in der Pi ­
pettenspitze Luftbläschen auf, wird das Prüfobjekt verworfen (ausgesto ­
ßen) und der Prozess wird so lange wiederholt, bis die Spitze ohne Luft ­
blasen gefüllt ist. Erforderlichenfalls kann eine normale Spritze (ohne Nadel) verwendet werden, denn sie gestattet das Abmessen einer akkuraten Menge Prüfsubstanz und erleichtert die Applikation auf die Epithelober ­
fläche der Hornhaut. Nach der Dosierung wird die Glasscheibe wieder auf 
die Vorderkammer gesetzt, um das System wieder zu schließen.
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Inkubation nach der Exposition  
30. Nach Ablauf der Expositionszeit werden Prüfsubstanz, Negativkontrolle 
oder Positivkontrolle aus der Vorderkammer entfernt, und das Epithel 
wird mindestens drei Mal (oder bis keine Prüfsubstanz mehr sichtbar ist) mit (phenolrot-haltigem) EMEM-Medium gewaschen. Phenolrot wird zum Abspülen verwendet, da sich aufgrund der Farbveränderung bei Phenolrot 
die Wirksamkeit des Abspülens säurehaltiger oder alkalischer Materialien 
bestimmen lässt. Die Hornhäute werden mindestens drei Mal gewaschen, wenn die Farbveränderung (ins Gelbe oder Lila) anhält oder wenn die Prüfsubstanz nach wie vor sichtbar ist. Sobald das Medium frei von Prüf ­
substanz ist, werden die Hornhäute ein letztes Mal mit EMEM-Medium 
(ohne Phenolrot) abgespült. EMEM-Medium (ohne Zusatz von Phenolrot) wird als letzte Spülung verwendet, um sicherzustellen, dass der Phenolrot-Farbstoff vor der Trübungsmessung aus der Vorderkammer ent ­
fernt wurde. Die Vorderkammer wird sodann wieder mit nicht 
phenolrot-haltigem frischem EMEM-Medium aufgefüllt.
 
31. Bei Flüssigkeiten oder Tensiden werden die Hornhäute nach dem Abspü ­
len für weitere zwei Stunden bei 32 ± 1 °C inkubiert. Unter bestimmten 
Umständen könnte sich nach der Exposition eine längere Inkubationszeit 
als zweckdienlich erweisen; dies sollte auf Fallbasis geprüft werden. Mit Feststoffen behandelte Hornhäute werden nach Ablauf der vierstündigen Exposition gründlich abgespült; eine längere Inkubation ist nicht erforder ­
lich.
 
32. Nach Ablauf der auf die Exposition folgenden Inkubation (Flüssigkeiten 
und Tenside) bzw. nach Ablauf der vierstündigen Exposition (nichttensi ­
dische Feststoffe) werden Trübung und Durchlässigkeit der einzelnen 
Hornhäute aufgezeichnet. Außerdem wird jede Hornhaut visuell geprüft, 
und relevante Befunde (z. B. Gewebeabschälung, Reste von Prüfsubstanz, uneinheitliche Trübungsmuster) werden aufgezeichnet. Diese Daten könn ­
ten insofern wichtig sein, als sie Abweichungen der Opazimeter-Messwerte 
bestätigen könnten.
 
Kontrollstoffe  
33. Jeder Versuch beinhaltet konkurrierende Negativ- oder Lösungsmittel-/ 
Vehikelkontrollen und Positivkontrollen.  
34. Für Tests von Flüssigstoffen zu 100 % sieht der BCOP eine konkurrie ­
rende Negativkontrolle (z. B. 0,9 % Natriumchloridlösung oder destilliertes 
Wasser) vor, damit unspezifische Veränderungen im Testsystem fest ­
gestellt werden können und ein Referenzwert für die Test-Endpunkte er ­
mittelt werden kann: Auf diese Weise wird auch sichergestellt, dass die Testbedingungen nicht zu einer unerwünschten Reizwirkung führen.
 
35. Für Tests von verdünnten Flüssigkeiten, Tensiden oder Feststoffen sieht 
der BCOP eine Gruppe konkurrierender Lösungsmittel-/Vehikelkontrollen vor, damit unspezifische Veränderungen im Testsystem festgestellt werden können und ein Referenzwert für die Test-Endpunkte ermittelt werden 
kann. Es sind nur Lösungsmittel/Vehikel zulässig, die das Testsystem 
nachweislich nicht beeinträchtigen.
 
36. Jeder Versuch beinhaltet als konkurrierende Positivkontrolle einen bekann ­
ten Augenreizstoff, um überprüfen zu können, dass eine adäquate Wirkung 
eintritt. Da bei dieser Prüfmethode der BCOP zur Identifizierung augen ­
verätzender oder stark augenreizender Stoffe angewandt wird, sollte es sich bei der Positivkontrolle idealerweise um eine Referenzsubstanz handeln, der bei dieser Prüfmethode eine starke Wirkung hervorruft. Um sicher ­
zustellen, dass im Zeitverlauf auftretende Wirkungsschwankungen bei der 
Positivkontrolle bewertet werden können, sollte die Reaktion jedoch nicht zu heftig sein.
 
37. Beispiele für Positivkontrollen für flüssige Prüfsubstanzen sind Dimethyl ­
formamid oder 1 %iges Natriumhydroxid. Für feste Prüfsubstanzen käme 
20 %iges (Gewichtsprozent) Imidazol in 0,9 % Natriumchloridlösung als 
Positivkontrolle in Frage.  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 677
 
38. Referenzsubstanzen sind nützlich für die Bewertung des Augenreizpoten ­
zials unbekannter Chemikalien einer spezifischen Chemikalien- oder Pro ­
duktklasse oder die Bewertung des relativen Reizpotenzials eines Augen ­
reizstoffes innerhalb einer spezifischen Spanne von Reizwirkungen.  
Gemessene Endpunkte  
39. Die Trübung wird durch Messung der durch die Hornhaut durchgehenden 
Lichtstrahlung bestimmt. Die quantitative Messung der Hornhauttrübung 
erfolgt mithilfe eines Opazimeters, eines Messgeräts, bei dem die Trü ­
bungswerte kontinuierlich gemessen werden.  
40. Die Durchlässigkeit wird durch Messung der Menge Fluorescein-Natrium 
bestimmt, die alle Zellschichten der Hornhaut (d. h. von der Epithelzell ­
schicht auf der äußeren Hornhautoberfläche bis zur Endothelzellschicht auf 
der inneren Hornhautfläche) passiert. Die Vorderkammer des Hornhauth ­
alters, die die Verbindung zur Epithelseite der Hornhaut bildet, wird mit 1 mL Fluorescein-Natrium-Lösung (4 oder 5 mg/mL bei Flüssigkeiten und Tensiden bzw. nichttensidischen Feststoffen) aufgefüllt, während die Hin ­
terkammer, die die Verbindung zur Endothelseite der Hornhaut bildet, mit 
frischem EMEM-Medium gefüllt wird. Die Halterung wird sodann in ho ­
rizontaler Position für 90 ± 5 Minuten bei 32 ± 1 °C inkubiert. Die Menge an Fluorescein-Natrium, die in die Hinterkammer eindringt, wird mithilfe 
eines UV/VIS-Spektrofotometers gemessen. Bei 490 nm ausgewertete 
spektrofotometrische Messungen werden als Werte für optische Dichte (OD
 490 ) oder Absorbanzwerte aufgezeichnet, die kontinuierlich gemessen 
werden. Zur Bestimmung der Fluorescein-Durchlässigkeit werden OD  490 - 
Werte herangezogen, die mithilfe eines VIS-Spektrofotometers bei einer 
Standardpfadlänge von 1 cm ermittelt wurden.  
41. Alternativ kann ein Plattenleser für 96-Mulden-Mikrotiterplatten verwendet 
werden, sofern i) der lineare Messbereich des Plattenlesers für die Bestim ­
mung der Fluorescein-OD  490 -Werte festgelegt werden kann und ii) in der 
96-Mulden-Mikrotiterplatte Fluorescein-Proben in der richtigen Menge 
verwendet werden, um OD  490 -Werte zu ergeben, die der Standardpfad ­
länge von 1 cm entsprechen (dies könnte vollständig gefüllte Mulden [in der Regel 360 μL] erfordern).
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Datenauswertung  
42. Sobald die Trübungs- und die durchschnittlichen Durchlässigkeits-(OD  490 - 
)Werte um die Hintergrundtrübungswerte und die OD  490 -Durchlässigkeits ­
werte der Negativkontrolle korrigiert wurden, werden die durchschnitt ­
lichen Trübungs- und OD  490 -Durchlässigkeitswerte für jede Behandlungs ­
gruppe in einer empirisch abgeleiteten Formel kombiniert, um für jede 
Behandlungsgruppe einen  In-vitro -Reizwert (IVIS) zu berechnen:  
IVIS = durchschnittl. Trübungswert + (15 × durchschnittl. OD  490 -Durch­
lässigkeitswert)  
Nach Sina  et al . (16) wurde diese Formel aus Labor- und Interlaborstudien 
abgeleitet. Die für eine Serie von 36 Verbindungen in einer Multilabor ­
studie generierten Daten wurden einer multivariaten Analyse unterzogen, 
um die  Best-fit -Gleichung zwischen  In-vivo - und  In-vitro -Daten zu ermit ­
teln. Diese Analyse wurde von Wissenschaftlern zweier separater Unter ­
nehmen durchgeführt, die zu quasi identischen Gleichungsergebnissen ge ­
langten.  
43. Die Trübungs- und Durchlässigkeitswerte sollten auch unabhängig von ­
einander bestimmt werden, um feststellen zu können, ob eine Prüfsubstanz 
für nur einen der beiden Endpunkte (siehe Entscheidungskriterien) eine 
augenverätzende oder stark augenreizende Wirkung verursachte.  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 678
 
Entscheidungskriterien  
44. Ein Stoff, der einen IVIS-Wert ≥ 55,1 bewirkt, gilt als Stoff mit verätzen ­
der oder stark reizender Wirkung. Wie bereits unter Punkt 1 erwähnt, 
sollten, wenn die Prüfsubstanz nicht als Stoff mit augenverätzender oder stark augenreizender Wirkung identifiziert wird, für Klassifizierungs- und Kennzeichnungszwecke zusätzliche Testungen vorgenommen werden. Ge ­
messen an Daten aus  In-vivo -Kaninchenaugentests, die nach den EPA (1)-, 
EU (2)- oder GHS (3)-Klassifizierungssystemen klassifiziert wurden, zeichnet sich der BCOP durch eine allgemeine Genauigkeit von 79 % (113/143) bis 81 % (119/147), eine Falsch-Positiv-Rate von 19 % (20/103) 
bis 21 % (22/103) und eine Falsch-Negativ-Rate von 16 % (7/43) bis 25 % 
(10/40) aus. Werden Stoffe bestimmter Chemikalienklassen (d. h. Alkoho ­
le, Ketone) oder bestimmter physikalischer Klassen (d. h. Feststoffe) aus der Datenbank ausgeschlossen, so liegen die Genauigkeit des BCOP ge ­
messen an den EU-, EPA- und GHS-Klassifizierungssystemen zwischen 
87 % (72/83) und 92 % (78/85), die Falsch-Positiv-Raten zwischen 12 % (7/58) und 16 % (9/56) und die Falsch-Negativ-Raten zwischen 0 % (0/27) und 12 % (3/26).
 
45. Selbst wenn die augenverätzende oder stark augenreizende Wirkung einer 
Prüfsubstanz nicht klassifiziert werden kann, können Daten aus dem BCOP in Kombination mit Testdaten aus dem  In-vivo -Kaninchenaugentest 
oder aus einem angemessen validierten  In-vitro -Test zweckdienlich sein, 
um Eignung und Einsatzgrenzen des BCOP zur Identifizierung von 
schwach reizenden Stoffen und von Stoffen ohne Reizwirkung genauer zu prüfen (ein Leitfaden für die Anwendung von  In-vitro -Prüfmethoden 
zur Untersuchung auf okulare Toxizität wird zur Zeit erarbeitet).
 
Studienakzeptanzkriterien  
46. Ein Test gilt als akzeptabel, wenn die Positivkontrolle einen IVIS-Wert 
innerhalb von zwei Standardabweichungen des geltenden historischen Mit ­
telwertes ergibt, der mindestens alle drei Monate bzw. immer dann aktua ­
lisiert werden muss, wenn Laboratorien, die nur selten Testungen vorneh ­
men (d. h. weniger als einmal im Monat), einen akzeptablen Test durch ­
führen. Die Negativ- oder Lösungsmittel-/Vehikelkontrollen sollten Trü ­
bungs- und Durchlässigkeitswerte ergeben, die geringer sind als die Ober ­
grenzen, die für Hintergrundtrübungs- und Durchlässigkeitswerte für Rin ­
derhornhäute vorgegeben sind, welche mit der jeweiligen Negativ- bzw. Lösungsmittel-/Vehikelkontrolle behandelt wurden.
 
Testbericht  
47. Der Testbericht sollte die folgenden Informationen umfassen, soweit sie 
für die Studie relevant sind:  
Prüfsubstanzen und Kontrollsubstanzen  
chemische Bezeichnung(en) wie der vom  Chemical Abstracts 
Service  (CAS) benutzte strukturelle Name, gefolgt von anderen Bezeich ­
nungen, soweit bekannt;  
die CAS-Registrierungsnummer (CAS-Nr.), soweit bekannt;  
Reinheit und Zusammensetzung des Stoffes oder des Gemisches (in Ge ­
wichtsprozent(en)), soweit diesbezügliche Informationen vorliegen;  
physiko-chemikalische Eigenschaften wie physikalischer Zustand, Flüch ­
tigkeit, pH-Wert, Stabilität, Chemikalienklasse, Wasserlöslichkeit, soweit sie für die Studie relevant sind;
 
Behandlung der Prüfsubstanzen/Kontrollsubstanzen vor der Testung, so ­
weit zutreffend (z. B. Erwärmung, Zerkleinerung);  
Stabilität, soweit bekannt.  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 679
 
Informationen zum Auftraggeber und Prüfanstalt  
Name und Anschrift des Auftraggebers, der Prüfanstalt und des Studien ­
leiters;  
Angaben zur Identifizierung der Bezugsquelle der Augen (d. h. die Ein ­
richtung, in der sie gewonnen wurden);  
Lager- und Transportbedingungen der Augen (z. B. Datum und Uhrzeit 
der Gewinnung, Zeitspanne vor Testbeginn, Transportmedien und Tem ­
peraturbedingungen, eventuell verwendete Antibiotika);  
soweit verfügbar, spezifische Angaben zu den Tieren, von denen die 
Augen gewonnen wurden (z. B. Alter, Geschlecht, Gewicht des 
Spendertieres).  
Begründung der Prüfmethode und des angewandten Protokolls  
Integrität der Prüfmethode  
Das zur Gewährleistung der Integrität (d. h. der Genauigkeit und Zuver ­
lässigkeit) der Prüfmethode im Zeitverlauf angewandte Verfahren (z. B. 
regelmäßige Testung von Leistungsstoffen, Hinzuziehung historischer Da ­
ten aus Negativ- und Positivkontrollen).  
Testakzeptanzkriterien  
Akzeptable konkurrierende Positiv- und Negativkontrollen aufgrund his ­
torischer Daten;  
gegebenenfalls akzeptable Reihen konkurrierender Referenzkontrollen auf ­
grund historischer Daten.  
Testbedingungen  
Beschreibung des angewandten Testsystems;  
Typ des verwendeten Hornhauthalters;  
Kalibrierungsdaten zu den für die Messung der Trübung und Durchlässig ­
keit verwendeten Geräte (z. B. Opazimeter und Spektrofotometer);  
Angaben zu den verwendeten Rinderhornhäuten, einschließlich Qualitäts ­
bestätigungen;  
Einzelheiten des angewandten Testverfahrens;  
verwendete Prüfsubstanzkonzentration(en);  
Beschreibung etwaiger Änderungen des Testverfahrens;  
Verweis auf historische Modelldaten (z. B. Negativ- und Positivkontrollen, 
Leistungsstoffe, Referenzsubstanzen);  
Beschreibung der angewandten Bewertungskriterien.  
Ergebnisse  
Tabellarische Aufstellung von Daten aus einzelnen Testproben (z. B. Trü ­
bungs- und OD  490 -Werte und berechnete IVIS-Werte für die Prüfsubstanz 
und die Positiv-, Negativ- und Referenzkontrollen [soweit einbezogen], einschließlich Daten aus Wiederholungsversuchen, soweit durchgeführt, 
sowie Mittelwerte ± Standardabweichung für jeden Versuch);
 
Beschreibung anderer beobachteter Wirkungen.  
Erörterung der Ergebnisse  
Schlussfolgerung  
LITERATURANGABEN  
(1) U.S. EPA (1996).  Label Review Manual : Zweite Ausgabe. EPA737- 
B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 680
 
(2) Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 des Europäischen Parlaments und 
des Rates vom 16. Dezember 2008 über die Einstufung, Kennzeich ­
nung und Verpackung von Stoffen und Gemischen, zur Änderung und Aufhebung der Richtlinien 67/548/EWG und 1999/45/EG und zur Änderung der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006. ABl. L 353 vom 
31.12.2008, S. 1.
 
(3) UN (2007).  Globally Harmonized System of Classification and La ­
belling of Chemicals (GHS) . Zweite überarbeitete Ausgabe, New 
York & Genf: United Nations Publications, 2007. Verfügbar unter:  
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/ 
02files_e.html]  
(4) ESAC (2007).  Statement on the conclusion of the ICCVAM retro ­
spective study on organotypic in vitro assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants . Verfüg­
bar unter:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(5) ICCVAM (2007).  Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM) . NIH-Veröffentlichung Nr. 07- 
4517. Verfügbar unter:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(6) Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und 
des Rates vom 18. Dezember 2006 zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH), zur Schaffung einer Europäischen Agentur für chemische Stoffe, zur 
Änderung der Richtlinie 1999/45/EG und zur Aufhebung der 
Verordnung (EWG) Nr. 793/93 des Rates, der Verordnung (EG) Nr. 1488/94 der Kommission, der Richtlinie 76/769/EWG des Rates sowie der Richtlinien 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/EG und 
2000/21/EG der Kommission. ABl. L 396 vom 30.12.2006, S. 1.
 
(7) OECD (2002). Testrichtlinie 405.  OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion . Verfügbar unter:  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368 
_1_1_1_1,00.html]  
(8) ICCVAM (2007).  ICCVAM Recommended BCOP Test Method 
Protocol.  In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro 
Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Ir ­
ritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the Na ­
tional Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the 
Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM) . 
NIH-Veröffentlichung Nr. 07-4517. Verfügbar unter:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(9) ICCVAM. (2006).  Current Status of In Vitro Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opa ­
city and Permeability Test Method . NIH-Veröffentlichung Nr. 06- 
4512.  Research Triangle Park: National Toxicology Program . Ver­
fügbar unter:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_ice.htm]  
(10) INVITTOX (1999). Protokoll Nr. 124:  Bovine Corneal Opacity and 
Permeability Assay  – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, 
Italien: Europäisches Zentrum für die Validierung alternativer 
Methoden (ECVAM).  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 681
 
(11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. und Sina, J.F. (1992).  Bovine 
corneal opacity and permeability test : An in vitro assay of ocular 
irritancy . Fundam. Appl. Toxicol.  18:442-449.  
(12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., und das He ­
althcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007).  
Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of In ­
fectious Agents in Healthcare Settings . Verfügbar unter:  
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].  
(13) Maurer, J.K., Parker, R.D. und Jester, J.V. (2002).  Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays . Reg. 
Tox. Pharmacol.  36:106-117.
 
(14) Doughty, M.J., Petrou, S. und Macmillan, H. (1995).  Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse . 
Can. J. Zool.  73:2159-2165.  
(15) Collee, J. und Bradley, R. (1997).  BSE: A decade on  - Part I. The 
Lancet 349: 636-641.  
(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, 
E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D. und Miller, K. (1995).  
A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates . Fundam Appl To ­
xicol  26:20-31.
 
(17) ICCVAM (2006). Background review document,  Current Status of 
In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method . Verfügbar unter:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm]  
(18) ICCVAM (2006). Background review document,  Current Status of 
In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method . Verfügbar unter:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm]  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 682
 
Anlage 1  
BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Genauigkeit:  Der Grad der Übereinstimmung zwischen Testergebnissen und 
anerkannten Referenzwerten. Die Genauigkeit ist ein Maß der Leistung der Prüf ­
methode und ein Aspekt der „Relevanz“. Der Begriff wird oft im Sinne von „Übereinstimmung“ verwendet und bezeichnet den Anteil der korrekten Ergeb ­
nisse einer Prüfmethode.
 
Referenzsubstanz:  Eine zum Vergleich mit einer Prüfsubstanz verwendete Be ­
zugsgröße. Eine Referenzsubstanz sollte die folgenden Eigenschaften aufweisen: 
i) beständige und zuverlässige Quelle(n); ii) strukturelle und funktionelle Ähn ­
lichkeit zur Klasse der geprüften Stoffe; iii) bekannte physikalische/chemische Eigenschaften; iv) unterstützende Daten zu bekannten Wirkungen; v) bekannte Potenz innerhalb der erwünschten Wirkungsspanne.
 
Hornhaut:  Der Iris und Pupille überdeckende transparente vordere Teil des 
Augapfels, über den Licht ins Augeninnere übertragen wird.  
Hornhauttrübung:  Messwert für die Undurchsichtigkeit der Hornhaut nach Ap ­
plikation einer Prüfsubstanz. Eine stärkere Hornhauttrübung ist ein Indikator für die Schädigung der Hornhaut. Die Trübung kann subjektiv (Draize-Kaninchen ­
augentest) oder objektiv (mithilfe eines Messgeräts, z. B. eines Opazimeters) 
bestimmt werden.
 
Hornhautdurchlässigkeit:  Quantitativer Messwert für die Schädigung der Epi ­
thelzellschicht der Hornhaut, ermittelt durch Bestimmung der Menge an 
Fluorescein-Natrium, die alle Zellschichten der Hornhaut durchdringt.  
EPA-Kategorie 1:  Verätzende Wirkung (irreversible Schädigung des Augengewe ­
bes) oder Hornhautkomplikation oder -reizung, die über 21 Tage lang anhält (1).  
EU-Kategorie R41:  Schädigung des Augengewebes oder schwere physikalische 
Beeinträchtigung des Sehvermögens nach Applikation einer Prüfsubstanz auf die 
Vorderfläche des Auges, die innerhalb von 21 Tagen nach der Applikation nicht vollständig zurückgeht (2).
 
Falsch-Negativ-Rate:  Der Anteil aller positiven Substanzen, die durch eine Prüf ­
methode fälschlicherweise als negativ identifiziert werden. Die Falsch-Negativ- Rate ist ein Leistungsindikator der Prüfmethode.
 
Falsch-Positiv-Rate:  Der Anteil aller negativen Substanzen, die durch eine Prüf ­
methode fälschlicherweise als positiv identifiziert werden. Die Falsch-Positiv- Rate ist ein Leistungsindikator der Prüfmethode.
 
GHS (Globales Harmonisiertes System zur Einstufung und Kennzeichnung 
von Chemikalien):  Ein System zur Klassifizierung von Chemikalien (Stoffe und 
Gemische) nach standardisierten Typen und Stufen physikalischer, gesundheitli ­
cher und ökologischer Gefahren und zur entsprechenden Kennzeichnung durch 
Piktogramme, Signalwörter, Gefahrenhinweise, Sicherheitshinweise und Sicher ­
heitsdatenblätter, um zum Schutz des Menschen (einschließlich Arbeitgeber, Ar ­
beiter, Spediteure, Verbraucher und Notfall-Einsatzkräfte) und der Umwelt Infor ­
mationen über die schädlichen Wirkungen der betreffenden Chemikalien zu ver ­
breiten (3).  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 683
 
GHS-Kategorie 1:  Schädigung des Augengewebes oder schwere physikalische 
Beeinträchtigung des Sehvermögens nach Applikation einer Prüfsubstanz auf die 
Vorderfläche des Auges, die innerhalb von 21 Tagen nach der Applikation nicht vollständig zurückgeht (3).
 
Gefahr:  Inhärente Eigenschaft eines Stoffes oder eines Umfelds mit dem Poten ­
zial, einen Organismus, ein System oder eine (Sub)population bei Exposition 
gegenüber diesem Stoff zu schädigen.  
In-vitro -Reizwert (IVIS):  Eine empirisch abgeleitete Formel zur Verwendung im 
BCOP, bei der der durchschnittliche Trübungs- und der durchschnittliche Durch ­
lässigkeitswert für jede Behandlungsgruppe in einem einzigen  In-vitro -Wert zu­
sammengefasst werden.  IVIS  = durchschnittlicher Trübungswert + (15 x durch ­
schnittlicher Durchlässigkeitswert).  
Negativkontrolle:  Ein unbehandeltes Replikat, das alle Komponenten eines Test ­
systems enthält. Diese Probe wird mit prüfsubstanzbehandelten Proben oder an ­
deren Kontrollproben mitgeführt, um festzustellen, ob das Lösungsmittel mit dem Testsystem interagiert.
 
Stoffe ohne Reizwirkung:  Stoffe, die nicht als Augenreizstoffe der 
EPA-Kategorien I, II oder III, der EU-Kategorien R41 oder R36 oder der 
GHS-Kategorien 1, 2A oder 2B eingestuft sind.  
Augenverätzende Stoffe:  a) Stoffe, die das Augengewebe irreversibel schädigen; 
b) Stoffe, die als Augenreizstoffe der GHS-Kategorie 1, der EPA-Kategorie I 
oder der EU-Kategorie R41 eingestuft sind (1) (2) (3).  
Augenreizende Stoffe:  a) Stoffe, die nach Applikation auf die Vorderfläche des 
Auges eine reversible Augenschädigung verursachen; b) Stoffe, die als Augen ­
reizstoffe der EPA-Kategorien II oder III, der EU-Kategorie R36 oder der 
GHS-Kategorien 2A oder 2B eingestuft sind (1) (2) (3).  
Stark augenreizende Stoffe:  a) Stoffe, die nach Applikation auf die Vorderflä ­
che des Auges das Augengewebe derart schädigen, dass die Schädigung nicht innerhalb von 21 Tagen nach der Applikation des Stoffes zurückgeht oder dass 
das Sehvermögen schwer beeinträchtigt ist; b) Stoffe, die als Augenreizstoffe der 
GHS-Kategorie 1, der EPA-Kategorie I oder der EU-Kategorie R41 eingestuft sind (1) (2) (3).
 
Opazimeter:  Ein Instrument zur Messung der „Hornhauttrübung“ durch quanti ­
tative Evaluierung der Lichtübertragung durch die Hornhaut. Das Gerät besteht in 
der Regel aus zwei Kammern, beide mit eigener Lichtquelle und Fotozelle. Eine Kammer wird für die behandelte Hornhaut verwendet, die zweite zur Kalibrie ­
rung und Nulleinstellung des Instruments. Licht aus einer Halogenleuchte wird 
durch eine Kontrollkammer (leere Kammer ohne Fenster oder Flüssigkeit) zu 
einer Fotozelle geleitet und mit dem durch die Versuchskammer, die die Kammer mit der Hornhaut enthält, zu einer Fotozelle geleiteten Lichtstrahl verglichen. Der Unterschied bei der Lichtübertragung aus den Fotozellen wird errechnet und als 
numerischer Trübungswert digital angezeigt.
 
Positivkontrolle:  Ein Replikat, das alle Komponenten eines Testsystems ent ­
hält und mit einem Stoff behandelt wird, der bekanntermaßen eine positive Reaktion hervorruft. Um sicherzustellen, dass Abweichungen bei der Positiv ­
kontrollreaktion im Zeitverlauf bewertet werden können, sollte die Reaktion 
nicht zu heftig sein.
 ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 684
 
Zuverlässigkeit:  Maß der Reproduzierbarkeit einer Prüfmethode innerhalb von 
und zwischen Laboratorien über einen längeren Zeitraum und bei einheitlichem 
Protokoll. Die Zuverlässigkeit wird durch Berechnung der Intra- und Interlabor-Reproduzierbarkeit bewertet.
 
Lösungsmittel-/Vehikelkontrolle:  Eine unbehandelte Probe, die alle Komponen ­
ten eines Testsystems enthält, einschließlich des Lösungsmittels oder Vehikels, 
und die mit den Prüfsubstanzbehandelten Proben und anderen Kontrollproben 
mitgeführt wird, um die Referenzreaktion für die mit der Prüfsubstanz behandel ­
ten Proben, die im selben Lösungsmittel oder Vehikel aufgelöst wurden, zu bestimmen. Bei der Testung mit einer konkurrierenden Negativkontrolle zeigt 
diese Probe außerdem an, ob das Lösungsmittel oder Vehikel mit dem Test ­
system interagiert.
 
Stufenweiser Prüfansatz:  Eine schrittweise Prüfstrategie, bei der alle vorhande ­
nen Informationen über eine Prüfsubstanz in einer vorgegebenen Reihenfolge überprüft werden, wobei auf jeder Stufe nach dem evidenzbasierten Bewertungs ­
ansatz ( weight-of-evidence ) vorgegangen wird, um feststellen zu können, ob ge ­
nügend Informationen für einen Gefahrenklassifizierungsbeschluss vorliegen, be ­
vor zur nächsten Stufe übergangen wird. Wenn das Reizpotenzial einer Prüfsub ­
stanz auf Basis der vorliegenden Informationen zugeordnet werden kann, sind 
keine weiteren Testungen erforderlich. Ist dies nicht der Fall, müssen schrittweise sequenzielle Tierversuche durchgeführt werden, bis eine eindeutige Klassifizie ­
rung vorgenommen werden kann.
 
Validierte Prüfmethode:  Eine Prüfmethode, für die zwecks Bestimmung ihrer 
Relevanz (einschließlich Genauigkeit) und Zuverlässigkeit für einen bestimmten 
Zweck Validierungsstudien abgeschlossen wurden. Es wird jedoch darauf hinge ­
wiesen, dass eine validierte Prüfmethode möglicherweise nicht genau und zuver ­
lässig genug ist, um für den vorgeschlagenen Zweck akzeptiert zu werden.  
Evidenzbasierte Bewertung:  Der Prozess der Prüfung der Stärken und Schwä ­
chen verschiedener Informationen, um über das Gefahrenpotenzial eines Stoffes 
entscheiden zu können und diese Entscheidung zu untermauern.  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 685
 
Anlage 2  
Leistungsstoffe für den BCOP  
Vor der routinemäßigen Anwendung eines Tests, der den Anforderungen der 
vorliegenden Prüfmethode genügt, können Laboratorien ihre technische Kom ­
petenz demonstrieren, indem sie die zehn in Tabelle 1 empfohlenen Stoffe in die richtige Ätzwirkungsklasse einstufen. Die Stoffe wurden so ausgewählt, dass sie die Bandbreite lokaler Augenreizungs-/Augenverätzungswirkungen repräsen ­
tieren, die auf den Ergebnissen des  In-vivo -Kaninchenaugentests basiert (TG 405) 
(d. h. Kategorien 1, 2A, 2B oder „nicht eingestuft und nicht gekennzeichnet“ nach dem UN-GHS-System (3) (7). Angesichts der validierten Eignung dieser Tests (d. h. zur ausschließlichen Identifizierung augenverätzender/stark augen ­
reizender Stoffe) kann die Kompetenz des Labors jedoch nur anhand von zwei 
Klassifizierungsergebnissen (verätzend/stark reizend oder nicht verätzend/ ­
schwach reizend) demonstriert werden. Weitere Auswahlkriterien betrafen die Erhältlichkeit der Stoffe im Handel, die Verfügbarkeit hochwertiger  In-vivo -Re­
ferenzdaten und das Vorhandensein hochwertiger Daten aus zwei  In-vitro -Me­
thoden, für die zurzeit Testrichtlinien erarbeitet werden. Aus diesem Grunde wurden die Reizstoffe aus der von der ICCVAM empfohlenen Liste von 122 
Referenzsubstanzen für die Validierung von  In-vitro -Prüfmethoden zur Unter ­
suchung auf okulare Toxizität ausgewählt (siehe Anhang H: von ICCVAM emp ­
fohlene Referenzsubstanzen) (5). Referenzdaten können aus den  Background 
Review Documents  der ICCVAM für die BCOP- und die ICE-Prüfmethode (Test 
am isolierten Hühnerauge) bezogen werden (17) (18).
 
Tabelle 1  
Empfohlene Stoffe für die Demonstration der technischen Kompetenz von Laboratorien zur Durchführung des BCOP  
Stoff CAS-Nr. Chemikalien klas ­
se (  1 ) Physikalischer 
Zustand  In-vivo -Klassifi­
zierung (  2 ) In-vitro -Klassifizierung (  3 ) 
Benzalkonium ­
chlorid (5 %) 8001-54-5 Oniumverbin ­
dung flüssig Kategorie 1 verätzend/stark reizend 
Chlorhexidin 55-56-1 Amin, Amidin fest Kategorie 1 verätzend/stark reizend 
Dibenzoyl-D- 
Weinsäure 2743-38-6 Carbonsäure, 
Ester fest Kategorie 1 verätzend/stark reizend 
Imidazol 288-32-4 heterocyclisch fest Kategorie 1 verätzend/stark reizend 
Trichloressigsäure 
(30 %) 76-03-9 Carbonsäure flüssig Kategorie 1 verätzend/stark reizend 
2,6-Dichlorben ­
zoyl-chlorid 4659-45-4 Acylhalolenid flüssig Kategorie 
2A Nicht verätzend/ schwach 
reizend 
Ethyl-2-methyla ­
ceto-acetat 609-14-3 Ketone, Ester flüssig Kategorie 
2B Nicht verätzend/ schwach 
reizend 
Ammoniumnitrat 6484-52-2 Anorganisches 
Salz fest Kategorie 
2A Nicht verätzend/ schwach 
reizend  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 686
 
Stoff CAS-Nr. Chemikalien klas ­
se (  1 ) Physikalischer 
Zustand  In-vivo -Klassifi­
zierung (  2 ) In-vitro -Klassifizierung (  3 ) 
Glyzerin 56-81-5 Alkohol flüssig Nicht einge ­
stuft Nicht verätzend/ schwach 
reizend 
n-Hexan 110-54-3 Kohlenwasser ­
stoff 
(acyclisch) flüssig Nicht einge ­
stuft Nicht verätzend/ schwach 
reizend  
Abkürzungen: CAS-Nr. = Registrierungsnummer des  Chemical Abstracts Service  
( 1 ) Jede Prüfsubstanz wurde anhand einer Standard-Klassifizierungsregelung auf Basis des Klassifizierungssystems der  National Library 
of Medicine Medical Subject Headings  (MeSH) einer Chemikalienklasse zugeordnet (abrufbar über http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) gestützt auf Ergebnisse aus dem  In-vivo -Kaninchenaugentest (OECD TG 405) unter Verwendung des UN-GHS-Klassifizierungs ­
systems (3)(7). 
( 3 ) gestützt auf Ergebnisse der BCOP- und ICE-Prüfmethoden.  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 687
 
Anlage 3  
BCOP-HORNHAUTHALTER  
1. BCOP-Hornhauthalter sind aus einem trägen Material (z. B. Polypropylen) 
gefertigt. Sie bestehen aus zwei Hälften (einer Vorder- und einer Hinter ­
kammer) sowie zwei identischen zylindrischen Innenkammern. Jede Kam ­
mer hat ein Fassungsvermögen von 5 mL und schließt mit einer Glasscheibe 
ab, durch die die Trübungsmesswerte abgelesen werden. Jede Innenkammer 
hat einen Durchmesser von 1,7 cm und ist 2,2 cm tief (  1 ). Ein auf der 
Hinterkammer positionierter Dichtungsring verhindert Leckagen. Die Horn ­
häute werden mit der Endothelseite nach unten auf den Dichtungsring der 
Hinterkammern platziert, während die Vorderkammern auf die Epithel-Seite 
der Hornhäute gesetzt werden. Die Kammern werden mit drei nichtrosten ­
den Schrauben an den Außenkanten der Kammer fixiert. Jede Kammer schließt mit einer Glasscheibe ab, die für den leichten Zugang zur Hornhaut 
abgenommen werden kann. Um Leckagen zu verhindern, befindet sich zwi ­
schen Glasscheibe und Kammer ein weiterer Dichtungsring. Zwei Öffnun ­
gen auf der Oberseite jeder Kammer gestatten den Ein- und Auslass des Mediums und der Testverbindungen. Sie werden während der Behandlung 
und der Inkubation mit Gummistöpsel verschlossen.
 
Glossar  
Glass disc: Glasscheibe  
PTFE-O-ring: PTFE-Dichtungsring  
Refill: Einlassöffnung  
Hanger: Aufhänger  
Cap: Stöpsel  
Nut: Sicherungsmutter  
O-ring: Dichtungsring  
Posterior compartment: Hinterkammer  
Anterior compartment: Vorderkammer  
Fixing screws: Fixierschrauben  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 688  
( 1 ) Es handelt sich um Abmessungen einer Halterung für Hornhäute von Kühen im Alter 
von 12 bis 16 Monaten. Soweit Tiere im Alter von sechs bis 12 Monaten verwendet 
werden, müsste die Halterung so konzipiert sein, dass jede Kammer 4 mL fasst und jede 
Innenkammer einen Durchmesser von 1,5 cm aufweist und 2,2 cm tief ist. Bei jedem 
neuen Halterungsmodell ist ausschlaggebend, dass das Verhältnis zwischen der exponier ­
ten Hornhautoberfläche und dem Fassungsvermögen der Hinterkammer dem jeweiligen 
Verhältniswert bei traditionellen Hornhauthaltern entspricht. Dadurch wird sichergestellt, 
dass die Durchlässigkeitswerte zwecks Berechnung des IVIS-Wertes nach der vor ­
geschlagenen Formel korrekt bestimmt werden.
 OPAZIMETER  
2. Der Opazimeter ist ein Gerät zur Messung der Lichtübertragung. Licht aus 
einer Halogenleuchte wird durch eine Kontrollkammer (leere Kammer ohne 
Fenster oder Flüssigkeit) zu einer Fotozelle geleitet und mit dem Lichtstrahl verglichen, der durch die Versuchskammer, welche die Kammer mit der Hornhaut enthält, zu einer Fotozelle geleitet wird. Der Unterschied bei der 
Lichtübertragung aus den Fotozellen wird berechnet und als numerischer 
Trübungswert digital angezeigt. Die Trübungseinheiten sind vorgegeben.
 
3. Der Opazimeter sollte mittels eine Reihe von Trübungsmesswerten eine 
lineare Reaktion ergeben, die den Schwellenwerten für die vom Prognose ­
modell beschriebenen unterschiedlichen Klassifizierungen (d. h. bis zu dem 
Schwellenwert, der die verätzende/stark reizende Wirkung bestimmt) Rech ­
nung trägt. Um lineare und akkurate Messwerte bis zu 75-80 Trübungsein ­
heiten zu gewährleisten, muss der Opazimeter mit einer Reihe von Kali ­
bratoren geeicht werden. Die Kalibratoren (undurchsichtige Polyesterfolien) 
werden in die Kalibrierkammer (eine für die Aufnahme der Kalibratoren 
konzipierte Hornhautkammer) platziert und auf dem Opazimeter abgelesen. Die Kalibrierkammer ist derart konzipiert, dass die Kalibratoren in ungefähr 
demselben Abstand zu Lichtquelle und Fotozelle gehalten werden, in dem 
sich die Hornhäute bei der Trübungsmessung befinden würden. Der Opazi ­
meter wird zunächst auf null Trübungseinheiten geeicht, wobei die Kali ­
brierkammer ohne Kalibrator verwendet wird. Anschließend werden nach ­
einander drei unterschiedliche Kalibratoren in die Kalibrierkammer gesetzt, 
und die Trübungswerte werden gelesen. Die Kalibratoren 1, 2 und 3 sollten Trübungswerte ergeben, die ihren eingestellten Werten von 75, 150 bzw. 225 Trübungseinheiten ± 5 % entsprechen.
 ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 689
 
B. 48  TEST AM ISOLIERTEN HÜHNERAUGE ZUR IDENTIFIZIE ­
RUNG VON STOFFEN MIT AUGENVERÄTZENDER UND 
STARK AUGENREIZENDER WIRKUNG  
EINLEITUNG  
1. Der Test am isolierten Hühnerauge ( Isolated Chicken Eye , ICE) ist eine  In- 
vitro -Prüfmethode, die unter bestimmten Bedingungen und mit bestimmten 
Grenzen eingesetzt werden kann, um Stoffe und Gemische als Stoffe und 
Gemische mit augenverätzender und stark augenreizender Wirkung ein ­
zustufen (1) (2) (3). Für die Zwecke dieser Prüfmethode sind Stoffe mit starker Reizwirkung Stoffe, welche Augenläsionen verursachen, die beim Kaninchen nach der Applikation mindestens 21 Tage lang anhalten. Auch 
wenn der Test den  In-vivo -Kaninchenaugentest nicht absolut ersetzen 
kann, wird der ICE innerhalb eines spezifischen Anwendungsbereichs dennoch als Teil einer gestuften Prüfstrategie zur vorschriftsmäßigen Ein ­
stufung und Kennzeichnung empfohlen (4) (5). Bei diesem Test positiv 
testende Prüfsubstanzen und -gemische (6) können als Stoffe und Ge ­
mische mit augenverätzender oder stark augenreizender Wirkung eingestuft werden, ohne dass weitere Tests am lebenden Kaninchen erforderlich sind. 
Ein Stoff mit negativem Testergebnis müsste nach einer sequenziellen 
Prüfstrategie, wie in der OECD-Testrichtlinie 405 (7) (Kapitel B. 5 dieses Anhangs) dargelegt, am Kaninchen getestet werden.
 
2. Diese Prüfmethode beschreibt die Verfahrensschritte für die Beurteilung 
des augenverätzenden oder stark augenreizenden Potenzials einer Prüfsub ­
stanz, gemessen als seine Fähigkeit, im isolierten Hühnerauge toxische 
Wirkung zu zeigen. Toxische Wirkungen auf die Hornhaut werden gemes ­
sen durch i) qualitative Bewertung der Trübung, ii) qualitative Bewertung der Schädigung der Epithel-Zellschicht durch Applikation von Fluorescein 
auf das Auge (Fluorescein-Verfärbung), iii) quantitative Messung verstärk ­
ter Dicke (Schwellung) und iv) qualitative Beurteilung makroskopischer morphologischer Oberflächenschädigungen. Hornhauttrübungen, Hornhaut ­
schwellungen und Hornhautschädigungen nach Applikation einer Prüfsub ­
stanz werden zunächst einzeln bewertet und anschließend zwecks Klassi ­
fizierung des Augenreizwertes ( Eye Irritancy Classification ) kombiniert.
 
3. Augenreizende Stoffe, die Läsionen hervorrufen, welche in weniger als 21 
Tagen abklingen, und Stoffe ohne augenreizende Wirkung wurden eben ­
falls nach der ICE-Methode untersucht. Die Genauigkeit und Zuverlässig ­
keit des ICE bei Stoffen in diesen beiden Kategorien wurden jedoch nicht 
offiziell evaluiert.  
4. Für Definitionen siehe Anhang 1.  
VORBEMERKUNGEN UND EINSATZGRENZEN  
5. Diese Prüfmethode basiert auf dem ICE-Testprotokoll des Organisations ­
übergreifenden Koordinationsausschusses zur Validierung alternativer Me ­
thoden ( Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alter ­
native Methods , ICCVAM) (8), das im Anschluss an eine internationale 
Validierungsstudie (4) (5) (9) und unter Mitwirkung des Europäischen Zentrums zur Validierung alternativer Methoden ( European Centre for 
the Validation of Alternative Methods ), des Japanischen Zentrums zur 
Validierung alternativer Methoden ( Japanese Center for the Validation 
of Alternative Methods ) und der Abteilung Toxikologie und angewandte 
Pharmakologie des niederländischen Forschungsinstituts TNO  Quality of 
Life entwickelt wurde. Das Protokoll beruht auf Informationen aus ver ­
öffentlichten Protokollen und auf dem von TNO derzeit verwendeten Pro ­
tokoll (10) (11) (12) (13) (14).
 ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 690
 
6. Die anerkannten Einsatzgrenzen dieser Prüfmethode beruhen auf der 
Falsch-Positiv-Rate für Alkohole und den Falsch-Negativ-Raten für Fest ­
stoffe und Tenside (siehe Punkt 47) (4). Durch Ausschluss von Stoffen dieser chemischen und physikalischen Klassen aus der Datenbank lässt sich die Genauigkeit des ICE in allen Klassifizierungssystemen (EU, 
EPA und GHS) erheblich verbessern (4). Für die Zwecke dieser Prüfung 
(d. h. ausschließliche Identifizierung augenverätzender/stark augenreizen ­
der Stoffe) sind Falsch-Negativ-Raten nicht maßgeblich, da diese Stoffe anschließend an Kaninchen oder - je nach Vorschriften - im Rahmen 
anderer angemessen validierter  In-vitro -Tests anhand einer sequenziellen 
Prüfstrategie mit einem evidenzbasierten Bewertungsansatz ( weight of evi ­
dence approach ) geprüft werden. Außerdem konnten bestimmte Chemika ­
lien- oder Produktklassen (z. B. Gemische) mit den derzeitigen Validie ­
rungsdaten nicht angemessen evaluiert werden. Prüfer könnten diese Prüf ­
methode jedoch für alle Arten von Prüfmaterial (auch Gemische) einsetzen und ein Positivergebnis als Indikator einer augenverätzenden oder stark augenreizenden Wirkung akzeptieren. Positivergebnisse bei Verwendung 
von Alkohol sollten angesichts des Risikos von Falsch-Positiv-Prognosen 
(over-prediction ) jedoch mit einer gewissen Zurückhaltung interpretiert 
werden.
 
7. Bei allen Verfahren, die Hühneraugen involvieren, sollten die geltenden 
Regeln und Verfahrensvorschriften der Prüfanstalt für den Umgang mit 
Human- bzw. Tiermaterial eingehalten werden, das auch Gewebe und Gewebeflüssigkeiten umfasst, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Univer ­
selle Laborregeln sollten beachtet werden (15).
 
8. Eine Grenze der Prüfmethode liegt darin, dass, obgleich zwar einige der 
im Kaninchenaugentest evaluierten Reizwirkungen und bis zu einem ge ­
wissen Grad auch deren Schwere berücksichtigt werden, Bindehaut- und Irisverletzungen außer Acht gelassen werden. Auch wurde –obwohl sich 
die Reversibilität von Hornhautläsionen  per se  mit dem ICE nicht beur ­
teilen lässt - ausgehend von Kaninchenaugenstudien dennoch vorgeschla ­
gen, eine Bewertung der anfänglichen Dicke der Hornhautverletzung he ­
ranzuziehen, um zwischen irreversiblen und reversiblen Wirkungen zu 
unterscheiden (16). Schließlich sei auch zu erwähnen, dass eine potenziell 
mit der Augenexposition verbundene systemische Toxizität nach der ICE-Methode nicht bewertet werden kann.
 
9. Es laufen Arbeiten, um Eignung und Grenzen des ICE zur Identifizierung 
von Stoffen mit schwacher Reizwirkung oder von Stoffen ohne Reizwir ­
kung genauer zu charakterisieren (siehe auch Punkt 48). Ferner wird emp ­
fohlen, dass Anwender den Validierungsorganisationen Exemplare und/ ­
oder Daten zur formellen Prüfung etwaiger künftiger Anwendungsbereiche 
des ICE übermitteln, auch um Stoffe mit schwacher Reizwirkung oder 
Stoffe ohne Reizwirkung identifizieren zu können.  
10. Laboratorien, die diese Prüfmethode zum ersten Mal anwenden, sollten die 
in Anlage 2 genannten Leistungschemikalien verwenden. Laboratorien 
können diese Chemikalien verwenden, um ihre technische Kompetenz 
zur Durchführung des ICE zu demonstrieren, bevor sie ICE-Testdaten zum Zwecke der vorschriftsmäßigen Gefahrenklassifizierung einreichen.
 
TESTPRINZIP  
11. Die ICE-Prüfmethode ist ein organtypisches Modell, das die Zellstruktur 
des Hühnerauges  in vitro  kurzfristig funktionsfähig hält. Bei dieser Prüf ­
methode werden durch die Prüfsubstanz hervorgerufene Schäden als Horn ­
hautschwellungen, Hornhauttrübung und korneale Fluorescein-Verfärbung festgestellt. Während die beiden letztgenannten Parameter eine qualitative 
Bewertung erfordern, muss die Hornhautschwellung quantitativ bestimmt 
werden. Jedes Messergebnis wird entweder in einen quantitativen Wert umgerechnet, der seinerseits für die Berechnung eines Gesamtreizindexes (Overall Irritancy Index ) zugrunde gelegt wird, oder einer Qualitätskate ­
gorie zugeordnet, die wiederum für die Einordnung in Klassen für Stoffe 
mit in vitro  augenverätzender und stark augenreizender Wirkung heran ­
gezogen wird. Jedes dieser Ergebnisse kann alsdann verwendet werden, um das Potenzial einer Prüfsubstanz,  in vivo  Augenverätzungen und starke 
Augenreizungen hervorzurufen, vorauszusagen (siehe Entscheidungskrite ­
rien).
 ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 691
 
Bezugsquelle und Alter der Hühneraugen  
12. Traditionell werden für diesen Test Augen von Hühnern verwendet, die in 
einer Schlächterei für den menschlichen Verzehr geschlachtet wurden; auf 
diese Weise wird der Einsatz von Versuchstieren vermieden. Nur Augen von gesunden Tieren, die für die Nahrungskette geeignet angesehen wer ­
den, dürfen verwendet werden.
 
13. Es wurde keine kontrollierte Studie zur Bestimmung des optimalen Alters 
der Hühner durchgeführt, doch werden für diesen Test traditionsgemäß 
Hühner verwendet, bei denen es sich nach Alter und Gewicht um Jung ­
hühner handelt (d. h. Hühner im Alter von ungefähr sieben Wochen mit einem Gewicht von 1,5 bis 2,5 kg), die in der Regel in einer Geflügel ­
schlächterei geschlachtet werden.
 
Gewinnung und Beförderung der Augen zum Labor  
14. Die Köpfe sollten unmittelbar nach dem Betäuben der Tiere, normaler ­
weise durch Elektroschock, und nach dem Entbluten durch Nackenstich abgesetzt werden. Sie sollten aus einer in Nähe des Labors gelegenen Quelle bezogen werden, um die Köpfe möglichst schnell vom Schlachthof 
zum Labor befördern zu können, damit sich ihr Zustand nicht verschlech ­
tert und/oder Bakterienkontaminationen auf ein Mindestmaß begrenzt wer ­
den. Der Zeitabstand zwischen der Gewinnung der Hühnerköpfe und der Verwendung der Augen im ICE sollte möglichst gering sein (d. h. höchs ­
tens zwei Stunden betragen) und die Testergebnisse nachweislich nicht 
kompromittieren. Letztere hängen von den Auswahlkriterien für die Augen sowie von den Reaktionen der Positiv- und Negativkontrollen ab. Alle im Test verwendeten Augen sollten aus derselben Partie Augen stammen, die 
an ein und demselben Tag gewonnen wurden.
 
15. Da die Augen im Labor seziert werden, sind die intakten Köpfe in Kunst ­
stoffbehältnissen, die mit Tüchern, welche in isotonischer Kochsalzlösung getränkt wurden, ausgeschlagen sind, und bei Umgebungstemperatur vom Schlachthof zum Labor zu befördern.
 
Auswahlkriterien für Augen, die im ICE-Test eingesetzt werden  
16. Augen mit starker Ausgangs-Fluorescein-Verfärbung (d. h. > 0,5) oder mit 
starker Hornhauttrübung (d. h. > 0,5) nach der Ausschälung werden ver ­
worfen.  
17. Jede Behandlungsgruppe und die konkurrierende Positivkontrolle umfassen 
mindestens drei Augen. Die Negativkontrollen bzw. die Lösungsmittelkon ­
trolle (wenn ein anderes Lösungsmittel als Kochsalzlösung verwendet 
wird) bestehen aus mindestens einem Auge.  
VERFAHREN  
Präparieren der Augen  
18. Die Augenlider werden sorgfältig weggeschnitten, wobei darauf zu achten ist, 
dass die Hornhaut nicht beschädigt wird. Die Unversehrtheit der Hornhaut wird mithilfe eines Tropfens von 2 %igem (w/v) Natrium-Fluorescein, der 
für einige Sekunden auf die Hornhautoberfläche appliziert und anschließend 
mit isotonischer Kochsalzlösung abgespült wird, schnell überprüft. Fluorescein-behandelte Augen werden sodann mit einem Spaltlampenmikro ­
skop auf Hornhautschädigung untersucht (d. h. Fluorescein-Verfärbung und 
Hornhauttrübungswerte müssen ≤ 0,5 betragen).
 
19. Liegt keine Schädigung vor, wird das Auge weiter freigelegt, wobei dafür 
Sorge zu tragen ist, dass die Hornhaut nicht beschädigt wird. Der Augapfel wird aus der Augenhöhle herausgezogen, indem die Nickhaut mithilfe einer chirurgischen Zange festgehalten und die Augenmuskulatur mit einer 
gebogenen, stumpfendigen Schere durchtrennt wird. Dieser Schritt ist 
wichtig, um zu vermeiden, dass die Hornhaut durch übermäßigen Druck geschädigt wird (Kompressionsartefakte).
 
20. Beim Herauslösen des Auges aus der Augenhöhle sollte ein sichtbarer Teil 
des Sehnervs noch anhaften. Das Auge wird anschließend auf eine saug ­
fähige Unterlage gesetzt, und Nickhaut sowie anderes Bindegewebe wer ­
den weggeschnitten.  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 692
 
21. Das auf diese Weise ausgeschälte Auge wird in einer Klemme aus rost ­
freiem Stahl fixiert, wobei die Hornhaut vertikal positioniert sein muss. 
Die Klemme wird sodann in eine Kammer des Superfusionsgeräts gesetzt (16). Im Superfusionsgerät sollten die Klemmen so positioniert werden, dass die gesamte Hornhaut mit der Kochsalzinfusion versorgt wird. Die 
Temperatur in den Kammern des Superfusionsgeräts sollte auf 32 ± 1,5 °C 
gehalten werden. Anlage 3 zeigt ein Schaubild eines typischen Superfusi ­
onsgeräts mit Augenklemmen; das Gerät ist im Handel fertig oder als Bausatz erhältlich. Es kann den Bedürfnissen des jeweiligen Labors ange ­
passt werden (z. B. um Augen in verschiedener Anzahl aufzunehmen).
 
22. Nach dem Einsetzen ins Superfusionsgerät werden die Augen erneut mit 
einem Spaltlampenmikroskop untersucht, um sicherzustellen, dass sie wäh ­
rend des Sezierens nicht beschädigt wurden. Bei dieser Gelegenheit sollte 
mit dem Pachometeraufsatz des Spaltlampenmikroskops auch die Horn ­
hautdicke im Apex gemessen werden. Augen mit i) einer Fluorescein-Verfärbung von > 0,5, ii) einer Hornhauttrübung von > 0,5 
oder iii) etwaigen anderen Anzeichen einer Schädigung sollten ersetzt 
werden. Einzelne Augen, auf die keines der genannten Kriterien zutrifft, werden verworfen, wenn sie eine Hornhautdicke aufweisen, die mehr als 10 % vom durchschnittlichen Dickenwert aller Augen zusammengerechnet 
abweicht. Anwender sollten sich darüber im Klaren sein, dass Spaltlam ­
penmikroskope mit unterschiedlicher Spaltbreiteneinstellung unterschiedli ­
che Dickenmesswerte ergeben können. Die Spaltbreite sollte auf 0,095 mm eingestellt sein.
 
23. Sobald alle Augen untersucht und für einwandfrei befunden wurden, wer ­
den sie zwecks Äquilibrierung des Testsystems vor Applikation der Prüf ­
substanz für ungefähr 45 bis 60 Minuten inkubiert. Nach der Äquilibrie ­
rung werden Referenzmessungen von Hornhautdicke und Hornhauttrübung zum Zeitpunkt Null vorgenommen, welche als Referenzszenario dienen (d. h. Zeitpunkt = 0). Der beim Sezieren ermittelte Fluorescein-Wert wird als 
Referenzmesswert für diesen Endpunkt verwendet.
 
Applikation der Prüfsubstanz  
24. Unmittelbar nach den Referenzmessungen zum Null-Zeitpunkt wird das 
Auge (in seiner Halterung) aus dem Superfusionsgerät entnommen, und 
zur Applikation der Prüfsubstanz auf die Hornhaut horizontal positioniert.  
25. Flüssige Prüfsubstanzen werden in der Regel unverdünnt getestet, können 
jedoch verdünnt werden, sofern dies für notwendig gehalten wird (z. B. als 
Teil des Studienkonzepts). Bevorzugtes Lösungsmittel für verdünnte Stoffe ist physiologische Kochsalzlösung. Unter kontrollierten Bedingungen kön ­
nen auch alternative Lösungsmittel verwendet werden, deren Eignung je ­
doch nachgewiesen werden sollte.
 
26. Flüssige Prüfsubstanzen werden so auf die Hornhaut appliziert, dass die 
gesamte Hornhautoberfläche gleichmäßig von der Prüfsubstanz bedeckt ist; 
das Standardvolumen beträgt 0,03 mL.  
27. Feste Prüfsubstanzen sollten wenn möglich im Mörser oder mit einem 
vergleichbaren Zerkleinerungsgerät so fein wie möglich gemahlen werden. 
Das Pulver wird so auf die Hornhaut appliziert, dass die Oberfläche von der Prüfsubstanz gleichmäßig bedeckt ist; die Standardmenge beträgt 0,03 g.
 
28. Die Prüfsubstanz (flüssig oder fest) wird für 10 Sekunden appliziert und 
anschließend mit isotonischer Kochsalzlösung (ungefähr 20 mL) bei Um ­
gebungstemperatur vom Auge abgespült. Das Auge (in seiner Halterung) 
wird anschließend wieder in aufrechter Ausgangsstellung in das Superfusi ­
onsgerät eingesetzt.  
Kontrollsubstanzen  
29. Jeder Versuch sollte konkurrierende Negativ- oder Lösungsmittel-/ ­
Vehikelkontrollen und konkurrierende Positivkontrollen umfassen.  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 693
 
30. Beim Prüfen unverdünnter (100 % iger) Flüssigkeiten oder Feststoffe wird 
als konkurrierende Negativkontrolle im ICE-Test physiologische Kochsalz ­
lösung verwendet, um unspezifische Veränderungen im Testsystem fest ­
zustellen und um sicherzustellen, dass die Testbedingungen keine unge ­
rechtfertigten Reizwirkungen hervorrufen.  
31. Zum Testen verdünnter Flüssigkeiten umfasst der Test auch eine Gruppe 
konkurrierender Lösungsmittel-/Vehikelkontrollen, um unspezifische Ver ­
änderungen im Testsystem nachzuweisen und um sicherzustellen, dass die 
Testbedingungen keine ungerechtfertigten Reizwirkungen hervorrufen. Wie 
unter Punkt 25 erwähnt, sind nur Lösungsmittel/Vehikel zulässig, die das Testsystem nachweislich nicht beeinträchtigen.
 
32. Jeder Versuch umfasst als konkurrierende Positivkontrolle einen bekannten 
Augenreizstoff, damit überprüft werden kann, ob eine adäquate Wirkung eintritt. Da der ICE-Test bei dieser Prüfmethode eingesetzt wird, um ver ­
ätzende oder stark reizende Stoffe zu identifizieren, sollte es sich bei der 
Positivkontrolle um eine Referenzsubstanz handeln, die bei dieser Prüf ­
methode eine starke Wirkung hervorruft. Um zu gewährleisten, dass die Veränderlichkeit der Reaktion der Positivkontrolle im Zeitverlauf bewertet werden kann, sollte die Reaktionsstärke nicht allzu heftig sein. Es sollten 
genügend  In-vitro -Daten für die Positivkontrolle generiert werden, damit 
eine statistisch vorgegebene vertretbare Spanne für die Positivkontrolle berechnet werden kann. Liegen für eine bestimmte Positivkontrolle keine angemessenen historischen Daten zur ICE-Prüfmethode vor, so können 
Studien erforderlich werden, um die erforderlichen Daten zu generieren.
 
33. Beispiele für Positivkontrollen für flüssige Prüfsubstanzen sind 10 % ige 
Essigsäure oder 5 % iges Benzalkoniumchlorid, während für Positivkon ­
trollen für feste Prüfsubstanzen Natriumhydroxid oder Imidazol in Frage 
kommen.  
34. Referenzsubstanzen sind nützlich für die Evaluierung des AugenReiz ­
potenzials unbekannter Chemikalien einer bestimmten Chemikalien- oder 
Produktklasse oder zur Evaluierung des relativen Reizpotenzials eines Au ­
genreizstoffes innerhalb einer spezifischen Spanne von Reizwirkungen.  
Gemessene Endpunkte  
35. Behandelte Hornhäute werden vor der Behandlung evaluiert sowie in Ab ­
ständen von 30, 75, 120, 180 und 240 Minuten (± 5 Minuten) nach dem Abspülen im Anschluss an die Behandlung. Diese Zeitreihe gestattet eine angemessene Anzahl von Messungen während des vierstündigen Behand ­
lungszeitraums und lässt genügend Zeit zwischen den Messungen, um alle 
Augen vorschriftsgemäß beobachten zu können.
 
36. Die evaluierten Endpunkte sind Hornhauttrübung, Hornhautschwellung, 
Fluorescein-Verfärbung und morphologische Effekte (z. B. durchlöchertes 
oder abgelöstes Epithel). Alle Endpunkte mit Ausnahme der Fluorescein-Verfärbung (die ausschließlich vor der Behandlung sowie 30 Minuten nach Applikation der Prüfsubstanz ermittelt wird) werden zu 
jedem der vorgenannten Zeitpunkte bestimmt.
 
37. Hornhauttrübung, Fluorescein-Verfärbung, morphologische Effekte und, 
sofern sie vorliegen, histopathologische Befunde sollten fotografiert 
werden.  
38. Nach der abschließenden Untersuchung am Ende des vierstündigen Be ­
handlungszeitraums sollten die Augen in einer geeigneten Fixierlösung 
(z. B. neutrales gepuffertes Formalin) aufbewahrt werden, damit sie gege ­
benenfalls histopathologisch untersucht werden können.  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 694
 
39. Hornhautschwellungen werden durch Hornhautdickenmessungen bestimmt, 
die mit dem optischen Pachometeraufsatz eines Spaltlampenmikroskops 
vorgenommen werden. Der Schwellungsmesswert wird als Prozentsatz ausgedrückt und auf Basis der Hornhautdickenmesswerte nach folgender Formel berechnet:
 
" 
Hornhaut Ä Dicke zum Zeitpunkt t  Ä Hornhaut Ä Dicke zum Zeitpunkt  ¼ 0 
Hornhaut Ä Dicke zum Zeitpunkt  ¼ 0 # 
Ü 100  
40. Für alle getesteten Augen wird die durchschnittliche Hornhautschwellung 
(in Prozent) für sämtliche Beobachtungszeitpunkte berechnet. Auf Basis des höchsten Mittelwertes für die Hornhautschwellung (beliebiger Be ­
obachtungszeitpunkt) wird jeder Prüfsubstanz ein Gesamtwert für die Ka ­
tegorie ( overall category score ) zugeordnet.
 
41. Die Hornhauttrübung wird anhand der Hornhautfläche berechnet, die am 
stärksten getrübt ist. Für alle getesteten Augen wird der durchschnittliche Trübungswert für jeden Beobachtungszeitpunkt berechnet. Auf Basis des 
höchsten Mittelwertes für die Hornhauttrübung (beliebiger Beobachtungs ­
zeitpunkt) wird anschließend jede Prüfsubstanz ein Gesamtwert für die Kategorie ( overall category score ) zugeordnet (Tabelle 1).
 
Tabelle 1  
Hornhauttrübungswerte  
Wert Beobachtung  
0 keine Trübung 
0,5 sehr schwache Trübung 1 gestreute oder diffuse Strukturen; Iris deutlich sichtbar 2 leicht erkennbare lichtdurchlässige Struktur; Iris weniger deutlich sichtbar 3 starke Hornhauttrübung; Einzelheiten der Iris nicht sichtbar; Pupillengröße kaum 
erkennbar 
4 vollständige Trübung/Iris unsichtbar
 
42. Für alle getesteten Augen wird die durchschnittliche Fluorescein-Verfärbung 
nur für den 30-minütigen Beobachtungszeitpunkt berechnet, der zur Berech ­
nung des jeder Prüfsubstanz zugeordneten Gesamtwertes für die Kategorie 
herangezogen wird (Tabelle 2).  
Tabelle 2  
Fluorescein-Verfärbung  
Wert Beobachtung  
0 keine Fluorescein-Verfärbung 
0,5 sehr geringfügige Verfärbung einzelner Zellen 
1 Verfärbung einzelner Zellen auf der gesamten behandelten Fläche der Hornhaut 
2 punktuelle oder konfluierende dichte Zellverfärbung 3 konfluierende großflächige Fluorescein-Verfärbung der Hornhaut
 ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 695
 
43. Morphologische Effekte umfassen „durchlöcherte“ Hornhaut-Epithelzellen, 
„abgelöste“ Epithelzellen, „aufgeraute“ Hornhautoberfläche und „Verkle ­
bung“ der Hornhaut mit der Prüfsubstanz. Diese Befunde können unter ­
schiedlich stark ausgeprägt sein und gleichzeitig auftreten. Ihre Einstufung erfolgt subjektiv je nach Auswertung des Prüfers.
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Datenauswertung  
44. Die Ergebnisse für die Hornhauttrübung, die Hornhautschwellung und die 
Fluorescein-Verfärbung sollten einzeln evaluiert werden, um für jeden Endpunkt eine ICE-Klasse zu generieren. Kombiniert ergeben die ICE-Klassen für die einzelnen Endpunkte eine Reizklasse ( Irritancy Clas ­
sification ) für die einzelnen Prüfsubstanzen.
 
Entscheidungskriterien  
45. Nach der Evaluierung jedes Endpunktes können die ICE-Klassen entspre ­
chend einer vorgegebenen Spanne zugeordnet werden. Die Auswertung der Hornhautdicke (Tabelle 3), der Hornhauttrübung (Tabelle 4) und der Fluorescein-Verfärbung (Tabelle 5) und ihre Einstufung in vier 
ICE-Klassen erfolgen in folgender Rangordnung:
 
Tabelle 3  
Kriterien für die Einstufung in ICE-Klassen - Hornhautdicke  
Durchschnittliche Hornhautschwellung (in %) (*) ICE-Klasse  
0 bis 5 I 
> 5 bis 12 II > 12 bis 18 (> 75 Minuten nach der Behand ­
lung) II 
> 12 bis 18 ( ≤ 75 Minuten nach der Behand ­
lung) III 
> 18 bis 26 III 
> 26 bis 32 (> 75 nach der Behandlung) III 
> 26 bis 32 ( ≤ 75 Minuten nach der Behand ­
lung) IV 
> 32 IV
 
(*) Die Werte für die Hornhautschwellung sind nur gültig, wenn die Dicke mit einem Haag-Streit-BP900- 
Spaltlampenmikroskop mit Tiefenmessgerät Nr. I und einer Spaltbreiteneinstellung 9,5 (= 0,095 mm) 
gemessen wird. Anwender sollten sich darüber im Klaren sein, dass Spaltlampenmikroskope mit unter ­
schiedlicher Spaltbreiteneinstellung unterschiedliche Dickenmesswerte ergeben können.  
Tabelle 4  
Kriterien für die Einstufung in ICE-Klassen - Hornhauttrübung  
Durchschnittlicher Höchstwert für die Hornhauttr ­
übung (*) ICE-Klasse  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-4,0 IV
 
(*) Siehe Tabelle 1.  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 696
 
Tabelle 5  
Kriterien für die Einstufung in ICE-Klassen - durchschnittliche Fluorescein-Verfärbung  
Durchschnittliche Verfärbung 30 Minuten nach der 
Behandlung (*) ICE-Klasse  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-3,0 IV
 
(*) Siehe Tabelle 2.  
46. Die Gesamtklassifizierung des  In-vitro -Reizpotenzials ( overall in vitro ir ­
ritancy classification ) einer Prüfsubstanz richtet sich nach der Reizklasse 
(irritancy classification ), die der Kombination von Kategorien entspricht, 
die für die Hornhautschwellung, die Hornhauttrübung und die Fluorescein-Verfärbung ermittelt wurden, und wird nach dem Schema in 
Tabelle 6 vorgenommen.
 
Tabelle 6  
Gesamtklassifizierung des  In-vitro -Reizpotenzials  
Klassifizierung Kombinationen der drei Endpunkte  
verätzend / stark reizend 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 2 × IV, 1 × II (*) 2 × IV, 1 × I (*) 
Hornhauttrübung ≥ 3 nach 30 Min. (bei mindes ­
tens zwei Augen) Hornhauttrübung = 4 zu beliebigem Zeitpunkt (bei mindestens zwei Augen) 
starkes Ablösen der Epithel-Zellschicht (bei 
mindestens einem Auge)
 
(*) weniger gängige Kombinationen.  
47. Wie unter Punkt 1 bereits erwähnt, sollte die Prüfsubstanz, soweit er nicht als 
Stoff mit augenverätzender oder stark augenreizender Wirkung identifiziert 
wurde, zu Einstufungs- und Kennzeichnungszwecken zusätzlich getestet werden. Gemessen an Daten aus  In-vivo -Kaninchenaugentests, die nach 
den EPA-(1)-, EU-(2)- oder GHS-(3)-Klassifizierungssystemen eingestuft 
wurden, zeichnet sich der ICE hinsichtlich der Identifizierung von Stoffen 
mit augenverätzender oder stark augenreizender Wirkung durch eine all ­
gemeine Genauigkeit von 83 % (120/144) bis 87 % (134/154), eine Falsch-Positiv-Rate von 6 % (7/122) bis 8 % (9/116) und eine 
Falsch-Negativ-Rate von 41 % (13/32) bis 50 % (15/30) aus. Werden Stoffe 
einer bestimmten Chemikalienklasse (d. h. Alkohole und Tenside) oder einer bestimmten physikalischen Klasse (d. h. Feststoffe) aus der Datenbank aus ­
geschlossen, so liegen die Genauigkeit des ICE gemessen an den EU-, EPA- 
und GHS-Klassifizierungssystemen zwischen 91 % (75/82) und 92 % (69/ ­
75), die Falsch-Positiv-Raten zwischen 5 % (4/73) und 6 % (4/70) und die Falsch-Negativ-Raten zwischen 29 % (2/7) und 33 % (3/9) (4).
 
48. Selbst wenn die augenverätzende oder stark augenreizende Wirkung einer 
Prüfsubstanz nicht klassifiziert werden kann, können Daten aus dem ICE 
in Kombination mit Testdaten aus dem  In-vivo -Kaninchenaugentest oder 
aus einem angemessen validierten  In-vitro -Test zweckdienlich sein, um 
Eignung und Grenzen des ICE zur Identifizierung von schwach augen ­
reizenden Stoffen und von Stoffen ohne Reizwirkung besser zu evaluieren 
(ein Leitfaden für die Anwendung von  In-vitro -Prüfmethoden zur Unter ­
suchung auf okulare Toxizität wird zur Zeit erarbeitet).  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 697
 
Studienakzeptanzkriterien  
49. Ein Test gilt als akzeptabel, wenn die konkurrierenden Negativ- oder 
Vehikel-/Lösungsmittelkontrollen sowie die konkurrierenden Positivkon ­
trollen eine Reizklasse ergeben, die unter die Kategorien „Stoffe ohne Reizwirkung“ bis hin zu „Stoffe mit starker Reizwirkung/Ätzwirkung“ fällt.
 
Testbericht  
50. Der Testbericht sollte die folgenden Informationen umfassen, soweit sie 
für die Studie relevant sind:  
Prüfsubstanzen und Kontrollsubstanzen  
Chemische Bezeichnung(en) wie der vom  Chemical Abstracts 
Service  (CAS) benutzte strukturelle Name, gefolgt von anderen Bezeich ­
nungen, soweit bekannt;  
die CAS-Registrierungsnummer (CAS-Nr.), soweit bekannt;  
Reinheit und Zusammensetzung des Stoffes oder des Gemisches (in Ge ­
wichtsprozent(en)), soweit diesbezügliche Informationen vorliegen;  
Physiko-chemikalische Eigenschaften wie physikalischer Zustand, Flüch ­
tigkeit, pH-Wert, Stabilität, Chemikalienklasse, Wasserlöslichkeit, soweit 
sie für die Studie relevant sind;  
Behandlung der Prüfsubstanzen/Kontrollsubstanzen vor der Testung, so ­
weit zutreffend (z. B. Erwärmung, Zerkleinerung);  
Stabilität, soweit bekannt.  
Informationen zu Auftraggeber und Prüfanstalt  
Name und Anschrift des Auftraggebers, der Prüfanstalt und des Studien ­
leiters;  
Angaben zur Identifizierung der Bezugsquelle der Augen (d. h. Einrich ­
tung, in der sie gewonnen wurden);  
Lager- und Transportbedingungen der Augen (z. B. Datum und Uhrzeit 
der Gewinnung, Zeitspanne vor Testbeginn);  
soweit bekannt, spezifische Daten betreffend die Tiere, von denen die 
Augen gewonnen wurden (z. B. Alter, Geschlecht, Gewicht des Spender ­
tieres).  
Begründung der Prüfmethode und des angewandten Protokolls  
Integrität der Prüfmethode  
Das zur Gewährleistung der Integrität (d. h. Genauigkeit und Zuverlässig ­
keit) der Prüfmethode im Zeitverlauf angewandte Verfahren (z. B. regel ­
mäßige Testung von Leistungsstoffen, Hinzuziehung historischer Daten 
über Negativ- und Positivkontrollen).  
Testakzeptanzkriterien  
gegebenenfalls akzeptable Reihen konkurrierender Referenzkontrollen auf ­
grund historischer Daten;  
Testbedingungen  
Beschreibung des angewandten Testsystems;  
verwendetes Spaltlampenmikroskop (z. B. Modell);  
Einstellungen des verwendeten Spaltlampenmikroskops;  
Angaben zu den verwendeten Hühneraugen, einschließlich Qualitätsbestä ­
tigungen;  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 698
 
Einzelheiten des angewandten Testverfahrens;  
verwendete Prüfsubstanzkonzentration(en);  
Beschreibung etwaiger Änderungen am Testverfahren;  
Verweis auf historische Modelldaten (z. B. Negativ- und Positivkontrollen, 
Leistungsstoffe, Referenzsubstanzen);  
Beschreibung der angewandten Bewertungskriterien;  
Ergebnisse  
Beschreibung sonstiger festgestellter Wirkungen;  
gegebenenfalls Aufnahmen vom Auge;  
Erörterung der Ergebnisse  
Schlussfolgerung  
LITERATURANGABEN  
(1) U.S. EPA (1996).  Label Review Manual : Zweite Ausgabe. EPA737- 
B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  
(2) Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 des Europäischen Parlaments und 
des Rates vom 16. Dezember 2008 über die Einstufung, Kennzeich ­
nung und Verpackung von Stoffen und Gemischen, zur Änderung und Aufhebung der Richtlinien 67/548/EWG und 1999/45/EG und 
zur Änderung der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006. ABl. L 353 vom 
31.12.2008, S. 1.
 
(3) (UN) (2007).  Globally Harmonized System of Classification and 
Labelling of Chemicals (GHS) . Zweite überarbeitete Ausgabe, New 
York & Genf, 2007. Verfügbar unter:  
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]  
(4) ICCVAM (2007).  Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM) . NIH-Veröffentlichung Nr. 07- 
4517. Verfügbar unter:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(5) ESAC (2007).  Statement on the conclusion of the ICCVAM retro ­
spective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants . Verfüg­
bar unter:
 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(6) Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und 
des Rates vom 18. Dezember 2006 zur Registrierung, Bewertung, 
Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH), zur 
Schaffung einer Europäischen Agentur für chemische Stoffe, zur Änderung der Richtlinie 1999/45/EG und zur Aufhebung der Verordnung (EWG) Nr. 793/93 des Rates, der Verordnung (EG) 
Nr. 1488/94 der Kommission, der Richtlinie 76/769/EWG des Rates 
sowie der Richtlinien 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/EG und 2000/21/EG der Kommission. ABl. L 396 vom 30.12.2006, S. 1.
 
(7) OECD (2002). Testrichtlinie 405.  OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion . Verfügbar unter:  
[http://www.oecd.org/document/40/0, 2340, en 2649 34377 
37051368 1 1 1 1,00.html]  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 699
 
(8) ICCVAM (2007).  ICCVAM Recommended ICE Test Method Pro ­
tocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM) . NIH-Veröffentlichung Nr. 07- 
4517. Verfügbar unter:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(9) ICCVAM. (2006).  Current Status of In Vitro Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method . NIH-Veröffentlichung Nr. 06-4513.  Research Triangle 
Park: National Toxicology Program . Verfügbar unter:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_ice.htm]  
(10) Prinsen, M.K. und Koëter, B.W.M. (1993).  Justification of the enu ­
cleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alterna ­
tive to the Draize eye irritation test with rabbits . Fd. Chem. Toxicol.  
31:69-76.  
(11) INVITTOX (1994). Protokoll Nr. 80:  Chicken enucleated eye 
test (CEET). Verfügbar unter:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. und Spielmann H. (1995).  The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test . Toxicol. In Vitro  9:871-929.
 
(13) Prinsen, M.K. (1996).  The chicken enucleated eye test  (CEET):  A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion 
potential of test materials . Food Chem. Toxicol . 34:291-296.  
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. und Prinsen, M.K. 
(1997). IRAG-Arbeitsgruppe I:  Organotypic models for the 
assessment/prediction of ocular irritation . Food Chem. Toxicol.  
35:23-37.  
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L. und das He ­
althcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007).  
Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of In ­
fectious Agents in Healthcare Settings . Verfügbar unter:  
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].  
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. und Jester, J.V. (2002).  Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and 
recommendations for the development of alternative assays . Reg. 
Tox. Pharmacol.  36:106-117.  
(17) Burton, A.B.G., M. York und R.S. Lawrence (1981).  The in vitro 
assessment of severe irritants . Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471-480.  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background review document,  Current Status of 
In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method . Verfügbar unter:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm]  
(19) ICCVAM (2006). Background review document,  Current Status of 
In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method . Verfügbar unter:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm]  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 701
 
Anlage 1  
BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Genauigkeit:  Der Grad der Übereinstimmung zwischen Testergebnissen und 
anerkannten Referenzwerten. Die Genauigkeit ist ein Maß der Leistung der Prüf ­
methode und ein Aspekt der „Relevanz“. Der Begriff wird oft im Sinne von „Übereinstimmung“ verwendet und bezeichnet den Anteil der korrekten Ergeb ­
nisse einer Prüfmethode.
 
Referenzsubstanz:  Eine zum Vergleich mit einer Prüfsubstanz verwendete Be ­
zugsgröße. Eine Referenzsubstanz sollte die folgenden Eigenschaften aufweisen: i) beständige und zuverlässige Quelle(n); ii) strukturelle und funktionelle Ähn ­
lichkeit zur Klasse der geprüften Stoffe; iii) bekannte physikalische/chemische 
Eigenschaften; (iv) unterstützende Daten zu bekannten Wirkungen; v) bekannte Potenz innerhalb der erwünschten Wirkungsspanne.
 
Hornhaut:  Der Iris und Pupille überdeckende transparente vordere Teil des 
Augapfels, über den Licht ins Augeninnere übertragen wird.  
Hornhauttrübung:  Messwert für die Undurchsichtigkeit der Hornhaut nach Ap ­
plikation einer Prüfsubstanz. Eine verstärkte Hornhauttrübung ist ein Indikator für 
die Schädigung der Hornhaut.  
Hornhautschwellung:  Objektiver Messwert im Rahmen des ICE für die Umfangs ­
zunahme der Hornhaut nach Applikation einer Prüfsubstanz. Der Wert wird als 
Prozentsatz ausgedrückt und auf Basis von Referenz-Hornhautdickenmessungen 
(Messung vor der Applikation) und der in regelmäßigen Abständen nach der Applikation der Prüfsubstanz im ICE aufgezeichneten Dicke berechnet. Das Aus ­
maß der Hornhautschwellung ist ein Indikator der Hornhautschädigung.
 
EPA-Kategorie 1:  Verätzende Wirkung (irreversible Schädigung des Augen ­
gewebes) oder Hornhautkomplikation oder -reizwirkung, die über 21 Tage lang anhält (1).
 
EU-Kategorie R41:  Schädigung des Augengewebes oder schwere physikalische 
Beeinträchtigung des Sehvermögens nach Applikation einer Prüfsubstanz auf die Vorderfläche des Auges, die innerhalb von 21 Tagen nach der Applikation nicht 
vollständig zurückgeht (2).
 
Falsch-Negativ-Rate:  Der Anteil aller positiven Substanzen, die von einer Prüf ­
methode fälschlicherweise als negativ identifiziert werden. Die Falsch-Negativ- Rate ist ein Leistungsindikator der Prüfmethode.
 
Falsch-Positiv-Rate:  Der Anteil aller negativen Substanzen, die von einer Prüf ­
methode fälschlicherweise als positiv identifiziert werden. Die Falsch-Positiv- Rate ist ein Leistungsindikator der Prüfmethode.
 
Fluorescein-Verfärbung:  Subjektiver Messwert im Rahmen des ICE für die 
Fluorescein-Natrium-Verfärbung der Epithel-Zellen in der Hornhaut nach Appli ­
kation einer Prüfsubstanz. Das Ausmaß der Fluorescein-Verfärbung ist ein Indi ­
kator der Schädigung der kornealen Epithel-Zellen.  
GHS (Globales Harmonisierte System zur Einstufung und Kennzeichnung 
von Chemikalien):  Ein System zur Klassifizierung von Chemikalien (Stoffe und 
Gemische) nach standardisierten Typen und Stufen physikalischer, gesundheitli ­
cher und ökologischer Gefahren und zur entsprechenden Kennzeichnung durch 
Piktogramme, Signalwörter, Gefahrenhinweise, Sicherheitshinweise und Sicher ­
heitsdatenblätter, um zum Schutz des Menschen (einschließlich Arbeitgeber, Ar ­
beiter, Spediteure, Verbraucher und Notfall-Einsatzkräfte) und der Umwelt Infor ­
mationen über die schädlichen Wirkungen der betreffenden Chemikalien zu ver ­
breiten (3).  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 702
 
GHS-Kategorie 1:  Schädigung des Augengewebes oder schwere physikalische 
Beeinträchtigung des Sehvermögens nach Applikation einer Prüfsubstanz auf die 
Vorderfläche des Auges, die innerhalb von 21 Tagen nach der Applikation nicht vollständig zurückgeht (3).
 
Gefahr:  Inhärente Eigenschaft eines Stoffes oder eines Umfelds mit dem Poten ­
zial, einen Organismus, ein System oder eine (Sub)population bei Exposition gegenüber diesem Stoff zu schädigen.
 
Negativkontrolle:  Ein unbehandeltes Replikat, das alle Komponenten eines Test ­
systems enthält. Diese Probe wird mit Prüfsubstanzbehandelten Proben oder 
anderen Kontrollproben mitgeführt, um festzustellen, ob das Lösungsmittel mit 
dem Testsystem interagiert.  
Stoffe ohne Reizwirkung:  Stoffe, die nicht als Augenreizstoffe der 
EPA-Kategorien I, II oder III, der EU-Kategorien R41 oder R36 oder der GHS-Kategorien 1, 2A oder 2B eingestuft sind (1) (2) (3).
 
Augenverätzende Stoffe:  a) Stoffe, die das Augengewebe irreversibel schädigen; 
b) Stoffe, die als Augenreizstoffe der GHS-Kategorie 1, der EPA-Kategorie I 
oder der EU-Kategorie R41 eingestuft sind (1) (2) (3).  
Augenreizende Stoffe:  a) Stoffe, die nach Applikation auf die Vorderfläche des 
Auges eine reversible Augenschädigung verursachen; b) Stoffe, die als Augen ­
reizstoffe der EPA-Kategorie II oder III, der EU-Kategorie R36 oder der GHS-Kategorien 2A oder 2B eingestuft sind (1) (2) (3).
 
Stark augenreizende Stoffe:  a) Stoffe, die nach Applikation auf die Vorderflä ­
che des Auges das Augengewebe derart schädigen, dass die Schädigung nicht 
innerhalb von 21 Tagen nach der Applikation des Stoffes zurückgeht oder dass 
das Sehvermögen schwer beeinträchtigt ist; b) Stoffe, die als Augenreizstoffe der GHS-Kategorie 1, der EPA-Kategorie I oder der EU-Kategorie R41 eingestuft sind (1) (2) (3).
 
Positivkontrolle:  Ein Replikat, das alle Komponenten eines Testsystems enthält 
und mit einem Stoff behandelt wird, der bekanntermaßen eine positive Reaktion 
hervorruft. Um sicherzustellen, dass Abweichungen bei der Positivkontrollreak ­
tion im Zeitverlauf bewertet werden können, sollte die Reaktion nicht zu heftig sein.
 
Zuverlässigkeit:  Maß der Reproduzierbarkeit einer Prüfmethode innerhalb von 
und zwischen Laboratorien über einen längeren Zeitraum und bei einheitlichem 
Protokoll. Die Zuverlässigkeit wird durch Berechnung der Intra- und 
Interlabor-Reproduzierbarkeit bewertet.  
Spaltlampen-Mikroskop:  Ein Instrument zur direkten Untersuchung des Auges, 
vergrößert mit einem binokularen Aufrechtbild-Stereomikrosop. Beim ICE-Test wird dieses Instrument eingesetzt, um die Vorderkammern des Hühnerauges visuell zu untersuchen und um die Hornhautdicke anhand eines 
Pachometer-Aufsatzes objektiv zu messen.
 
Lösungsmittel-/Vehikelkontrolle:  Eine unbehandelte Probe, die alle Komponen ­
ten eines Testsystems enthält, einschließlich des Lösungsmittels oder Vehikels 
und die mit den Prüfsubstanzbehandelten und anderen Kontrollproben mitgeführt wird, um die Referenzreaktion für die mit der Prüfsubstanz behandelten Proben, die im selben Lösungsmittel oder Vehikel aufgelöst wurden, zu bestimmen. Bei 
der Testung mit einer konkurrierenden Negativkontrolle zeigt diese Probe außer ­
dem an, ob das Lösungsmittel oder Vehikel mit dem Testsystem interagiert.
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Stufenweiser Prüfansatz:  Eine schrittweise Prüfstrategie, bei der allen vorhan ­
denen Informationen über eine Prüfsubstanz in einer vorgegebenen Reihenfolge 
überprüft werden, wobei auf jeder Stufe nach dem evidenzbasierten Bewertungs ­
ansatz ( weight-of-evidence ) vorgegangen wird, um feststellen zu können, ob ge ­
nügend Informationen für eine Gefahrenklassifizierung vorliegen, bevor zur 
nächsten Stufe übergangen wird. Wenn das Reizpotenzial einer Prüfsubstanz 
auf Basis der vorliegenden Informationen zugeordnet werden kann, sind keine weiteren Testungen erforderlich. Ist dies nicht der Fall, müssen schrittweise sequenzielle Tierversuche durchgeführt werden, bis eine eindeutige Klassifizie ­
rung vorgenommen werden kann.
 
Validierte Prüfmethode:  Eine Prüfmethode, für die zwecks Bestimmung ihrer 
Relevanz (einschließlich Genauigkeit) und Zuverlässigkeit für einen bestimmten Zweck Validierungsstudien abgeschlossen wurden. Es wird darauf hingewiesen, dass eine validierte Prüfmethode möglicherweise nicht genau und zuverlässig 
genug ist, um für den vorgeschlagenen Zweck akzeptiert zu werden.
 
Evidenzbasierte Bewertung:  Der Prozess der Prüfung der Stärken und Schwä ­
chen verschiedener Informationen, um über das Gefahrenpotenzial eines Stoffes entscheiden zu können und diese Entscheidung zu untermauern.
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Anlage 2  
LEISTUNGSSTOFFE FÜR DEN ICE  
Vor der routinemäßigen Anwendung eines Tests, der den Anforderungen der 
vorliegenden Prüfmethode genügt, können Laboratorien ihre technische Kom ­
petenz demonstrieren, indem sie die zehn in Tabelle 1 empfohlenen Stoffe in die richtige Ätzwirkungsklasse einstufen. Die Stoffe wurden so ausgewählt, dass sie die Bandbreite lokaler Augenreizungs-/Augenverätzungswirkungen repräsen ­
tieren, die auf den Ergebnissen des  In-vivo -Kaninchenaugentests basieren (TG 
405) (d. h. Kategorien 1, 2A, 2B oder „nicht eingestuft und nicht gekennzeich ­
net“ nach dem UN-GHS-System (3) (7). Angesichts der validierten Eignung dieser Tests (d. h. Tests zur ausschließlichen Identifizierung augenverätzender/ ­
stark augenreizender Stoffe) kann die Kompetenz des Labors jedoch nur anhand 
von zwei Klassifizierungsergebnissen (verätzend/stark reizend oder nicht verätzend/schwach reizend) demonstriert werden. Weitere Auswahlkriterien be ­
trafen die Erhältlichkeit der Stoffe im Handel, die Verfügbarkeit hochwertiger  In- 
vivo-Referenzdaten und das Vorhandensein hochwertiger Daten aus zwei  In-vitro - 
Methoden, für die zurzeit Testrichtlinien erarbeitet werden. Aus diesem Grunde wurden die Reizstoffe aus der von der ICCVAM empfohlenen Liste von 122 
Referenzsubstanzen für die Validierung von  In-vitro -Prüfmethoden zur Unter ­
suchung auf okulare Toxizität ausgewählt (siehe Anhang H: von ICCVAM emp ­
fohlene Referenzsubstanzen) (4). Referenzdaten können aus den  Background 
Review Documents  der ICCVAM für die BCOP-Prüfmethode (Test an der iso ­
lierten Rinderhornhaut) und die ICE-Prüfmethode bezogen werden (18) (19).
 
Tabelle 1  
Empfohlene Stoffe für die Demonstration der technischen Kompetenz von Laboratorien zur Durchführung des ICE  
Stoff CAS-Nr. Chemikalien- 
klasse (  1 ) Physikalischer 
Zustand  In-vivo -Klassifizie ­
rung (  2 ) In-vitro - 
Klassifizierung (  3 ) 
Benzalkoniumchlorid 
(5 %) 8001-54-5 Oniumverbin ­
dung flüssig Kategorie 1 verätzend/stark 
reizend 
Chlorhexidin 55-56-1 Amin, Amidin fest Kategorie 1 verätzend/stark 
reizend 
Dibenzoyl-D-Wein ­
säure 2743-38-6 Carbonsäure, 
Ester fest Kategorie 1 verätzend/stark 
reizend 
Imidazol 288-32-4 heterocyclisch fest Kategorie 1 verätzend/stark 
reizend 
Trichloressigsäure 
(30 %) 76-03-9 Carbonsäure flüssig Kategorie 1 verätzend/stark 
reizend 
2,6-Dichlorbenzoyl- 
chlorid 4659-45-4 Acylhalolenid flüssig Kategorie 2A Nicht verätzend/ 
schwach reizend 
Ethyl-2-methylaceto- 
acetat 609-14-3 Ketone, Ester flüssig Kategorie 2B Nicht verätzend/ 
schwach reizend 
Ammoniumnitrat 6484-52-2 Anorganisches 
Salz fest Kategorie 2A Nicht verätzend/ 
schwach reizend  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 705
 
Stoff CAS-Nr. Chemikalien- 
klasse (  1 ) Physikalischer 
Zustand  In-vivo -Klassifizie ­
rung (  2 ) In-vitro - 
Klassifizierung (  3 ) 
Glyzerin 56-81-5 Alkohol flüssig Nicht eingestuft Nicht verätzend/ 
schwach reizend 
n-Hexan 110-54-3 Kohlenwasser ­
stoff 
(acyclisch) flüssig Nicht eingestuft Nicht verätzend/ 
schwach reizend  
Abkürzungen: CAS-Nr. = Registrierungsnummer des  Chemical Abstracts Service  
( 1 ) Jede Prüfsubstanz wurde anhand einer Standard-Klassifizierungsregelung auf Basis des Klassifizierungssystems der  National 
Library of Medicine Medical Subject Headings  (MeSH) einer Chemikalienklasse zugeordnet (abrufbar über http// 
www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) gestützt auf Ergebnisse aus dem  In-vivo -Kaninchenaugentest (OECD TG 405) unter Verwendung des UN-GHS-Klassifizierungs ­
systems (3)(7). 
( 3 ) gestützt auf Ergebnisse der BCOP- und ICE-Prüfmethoden.  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 706
 
Anlage 3  
Schaubilder des ICE-Superfusionsgeräts und der ICE-Augenklemmen  
(Siehe Burton et al. (17) für weitere generische Beschreibungen von Superfusionsgeräten 
und Augenklemmen)
  ▼M2 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 707
 
B.49.  IN VITRO -MIKRONUKLEUSTEST AN SÄUGETIERZELLEN  
EINLEITUNG  
1. Der  in vitro -Mikronukleustest (MNvit) ist ein Genotoxizitätstest zum Nach ­
weis von Mikronuklei im Zytoplasma von Interphasezellen. Mikronuklei 
oder Mikrokerne können aus azentrischen Chromosomenfragmenten 
(d. h. Chromosomen, denen ein Zentromer fehlt) oder aus ganzen Chromo ­
somen entstehen, die während der Anaphase der Zellteilung nicht zu den Polen wandern können. Der Test weist die Aktivität klastogener und aneu ­
gener chemischer Substanzen (Stoffe und Gemische) (1) (2) in Zellen nach, 
die während oder nach Kontakt mit der Prüfsubstanz eine Zellteilung durch ­
laufen haben. Die vorliegende Prüfmethode gestattet die Verwendung von Protokollen mit und ohne den Aktin-Polymerisationsinhibitor Cytochalasin 
B (cytoB). Die Hinzufügung von cytoB vor der angestrebten Mitose er ­
möglicht die Identifizierung und selektive Analyse der Mikrokernfrequenz in Zellen, die eine Mitose durchlaufen haben, da solche Zellen zwei Kerne 
aufweisen (3) (4). Diese Prüfmethode gestattet auch die Verwendung von 
Protokollen ohne Zytokinese-Block, vorausgesetzt es gibt Beweise dafür, dass die analysierte Zellpopulation eine Mitose durchlaufen hat.
 
2. Zusätzlich zum MNvit-Test zur Identifizierung chemischer Substanzen 
(Stoffe und Gemische), die Mikrokerne erzeugen, können auch ein Zytokinese-Block, die immunchemische Markierung von Kinetochoren 
oder die Hybridisierung mit Zentromer- bzw. Telomer-Sonden (Fluores ­
zenz- in-situ -Hybridisierung (FISH)) Informationen über die Mechanismen 
der Chromosomenschädigung und der Bildung von Mikrokernen liefern (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Die Markierungs- 
und Hybridisierungsverfahren können angewandt werden, wenn eine ver ­
stärkte Mikrokernbildung festgestellt wird und der Prüfer erkennen will, ob diese Zunahme das Ergebnis klastogener und/oder aneugener Ereignisse ist.
 
3. Mikrokerne stellen auf Tochterzellen übertragene Schäden dar, während in 
Metaphasezellen festgestellte Chromosomenaberrationen unter Umständen nicht übertragen werden. Da Mikrokerne in Zellen im Stadium der Inter ­
phase mit relativer Objektivität bewertet werden können, muss das Labor ­
personal nur feststellen, ob die Zellen eine Teilung durchlaufen haben oder nicht, und wie viele Zellen einen Mikrokern enthalten. Infolgedessen kön ­
nen die Zubereitungen relativ schnell bewertet werden und die Analyse lässt 
sich automatisieren. Dies macht es praktisch möglich, Tausende statt Hun ­
derte von Zellen pro Behandlung zu bewerten und so die Aussagekraft des Tests zu erhöhen. Da schließlich die Mikrokerne von verzögert transpor ­
tierten Chromosomen herrühren können, besteht die Möglichkeit, Aneuploi ­
die induzierende Agenzien nachzuweisen, deren Untersuchung in konven ­
tionellen Chromosomenaberrationstests nur schwer möglich ist, z. B. OECD-Prüfrichtlinie 473 (Kapitel B.10 dieses Anhangs) (17). Allerdings gestattet der MNvit-Test die Differenzierung zwischen Polyploidie induzie ­
renden und Klastogenizität verursachenden Chemikalien nur, wenn beson ­
dere Techniken wie die in Absatz 2 beschriebene FISH eingesetzt werden.
 
4. Der MNvit-Test ist eine  in vitro -Methode, bei der in der Regel kultivierte 
menschliche Zellen oder Nagetierzellen zum Einsatz kommen. Der Test bildet eine breite Basis für die  in vitro -Erforschung potenzieller Chromoso ­
menschädigungen, da sowohl Aneugene als auch Klastogene nachgewiesen 
werden können.
 
5. Der MNvit-Test ist zuverlässig und wirksam bei einer Vielfalt von Zell ­
typen und kann mit oder ohne Zusatz von cytoB durchgeführt werden. 
Umfassende Daten belegen die Validität des MNvit-Tests im Zusammen ­
hang mit unterschiedlichen Nagetier-Zelllinien (CHO, V79, CHL/IU und L5178Y) sowie menschlichen Lymphozyten (18) (19) (20) (21) (22) (23) 
(24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Hierzu zählen insbesondere die 
internationalen Validierungsstudien, koordiniert durch die Société Française
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de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22), und die Berichte 
des International Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). Die verfüg ­
baren Daten wurden außerdem vom Europäischen Zentrum zur Validierung von Alternativmethoden (ECVAM) der Europäischen Kommission in einer retrospektiven Validierungsstudie nach dem  Weight-of-Evidence -Ansatz neu 
bewertet, und die Prüfmethode wurde vom Wissenschaftlich Beratenden 
Ausschuss (ESAC) des ECVM als wissenschaftlich validiert anerkannt (32) (33) (34). Die Verwendung von menschlichen Lymphoblastoidzellen der Zelllinie TK6 (35), von HepG2-Zellen (36) (37) und von primären 
Embryonalzellen des Syrischen Hamsters (38) wurde beschrieben, obwohl 
diese Zellen nicht in Validierungsstudien verwendet wurden.
 
DEFINITIONEN  
6. Es gelten die Definitionen gemäß Anlage 1.  
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN  
7. In vitro  durchgeführte Versuche erfordern in der Regel den Zusatz eines 
exogenen Stoffwechsel-Aktivierungssystems, sofern die Zellen nicht im Hinblick auf die zu prüfenden Substanzen metabolisch kompetent sind. Mit diesem exogenen Stoffwechsel-Aktivierungssystem lassen sich die  in 
vivo-Bedingungen jedoch nicht gänzlich nachvollziehen. Es sind auch Be ­
dingungen zu vermeiden, die zu künstlich positiven Ergebnissen führen, die nicht die intrinsische Mutagenität widerspiegeln und möglicherweise aus Faktoren wie markanten Veränderungen des pH-Wertes bzw. der Osmola ­
lität oder hochgradiger Zytotoxizität herrühren (39) (40) (41). Wenn die 
Prüfsubstanz zum Zeitpunkt der Hinzufügung eine Änderung im pH-Wert des Mediums auslöst, sollte der pH-Wert entsprechend angepasst werden, vorzugsweise durch Pufferung der Stammlösung, so dass alle Volumina bei 
allen Prüfkonzentrationen und für sämtliche Kontrollen gleich bleiben.
 
8. Zur Analyse der Mikrokerninduktion ist es wesentlich, dass sowohl die 
behandelten als auch die unbehandelten Kulturen eine Mitose durchlaufen haben. Das informativste Stadium für die Auswertung von Mikrokernen 
liegt in Zellen vor, die eine Mitose während oder nach der Behandlung 
mit der Prüfsubstanz vollzogen haben.
 
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
9. Zellkulturen menschlichen Ursprungs oder von Säugetieren werden sowohl mit 
als auch ohne Zusatz eines exogenen Fremdstoff-Metabolisierungssystems in 
Kontakt mit der Prüfsubstanz gebracht, außer wenn Zellen mit eigener adäquater 
Metabolisierungskapazität verwendet werden. Für alle Tests sind parallellau ­
fende Lösungsmittel-/Vehikelkontrollen (VK) und Positivkontrollen (PK) an ­
zulegen.  
10. Während oder nach dem Kontakt mit der Prüfsubstanz werden die Zellen so 
lange kultiviert, dass Chromosomen- oder Spindelschäden zur Bildung von Mikrokernen in Interphasezellen führen können. Zur Induktion einer Aneu ­
ploidie sollte die Prüfsubstanz während der Mitose vorhanden sein. Geern ­
tete und gefärbte Interphasezellen werden auf das Vorhandensein von Mi ­
krokernen untersucht. Im Idealfall sollten Mikrokerne nur in Zellen aus ­
gewertet werden, die während oder ggf. nach Kontakt mit der Prüfsubstanz eine Mitose durchlaufen haben. In Kulturen, die mit einem 
Zytokinese-Blocker behandelt wurden, werden deshalb nur zweikernige Zel ­
len ausgewertet. Wenn kein Zytokinese-Blocker verwendet wurde, ist es wichtig nachzuweisen, dass die analysierten Zellen mutmaßlich während oder nach dem Kontakt mit der Prüfsubstanz eine Zellteilung durchlaufen 
haben. Bei allen Protokollen ist es wichtig nachzuweisen, dass sowohl in 
den Kontrollkulturen als auch in den behandelten Kulturen eine Zellpro ­
liferation stattgefunden hat. Das Ausmaß der von der Prüfsubstanz induzier ­
ten Zytotoxizität oder Zytostase sollte in den Kulturen (oder Parallelkultu ­
ren) bewertet werden, die auf das Vorhandensein von Mikrokernen unter ­
sucht werden.
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BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
Vorbereitungen  
11. Es können kultivierte primäre Lymphozyten aus dem peripheren Blut von 
Menschen (5) (19) (42) (43) sowie verschiedene Zelllinien von Nagetieren 
wie CHO, V79, CHL/IU und L5178Y verwendet werden (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Die Verwendung anderer Zelllinien und -typen sollte anhand ihrer nachgewiesenen Leistung im Test begründet werden, wie 
im Abschnitt „Akzeptanzkriterien“ beschrieben. Da die Hintergrundfrequenz 
von Mikrokernen die Empfindlichkeit des Tests beeinflusst, empfiehlt es sich, Zelltypen mit einer niedrigen und stabilen Hintergrundfrequenz der Mikrokernbildung zu verwenden.
 
12. Lymphozyten aus dem peripheren Blut von Menschen sollten jungen (ca. 
18- bis 35-jährigen) gesunden, nicht rauchenden Individuen entnommen werden, die bekanntermaßen in letzter Zeit nicht mit genotoxischen Che ­
mikalien oder Strahlung in Kontakt standen. Wenn Zellen von mehr als 
einem Spender zur Verwendung gepoolt werden, sollte die Zahl der Spen ­
der angegeben werden. Die Mikrokernfrequenz nimmt mit fortschreitendem Alter zu. Dieser Trend ist bei Frauen ausgeprägter als bei Männern (44), was bei der Auswahl von Spenderzellen für die gepoolte Auswertung be ­
rücksichtigt werden sollte.
 
Kulturmedien und Inkubationsbedingungen  
13. Zur Kultivierung sind geeignete Kulturmedien- und Inkubationsbedingun ­
gen (Kulturgefäße, CO  2 -Konzentration, Temperatur und Feuchtigkeit) zu 
verwenden. Etablierte Zelllinien und -stämme sind routinemäßig auf Stabi ­
lität der modalen Chromosomenzahl und Mykoplasmaverunreinigung zu 
überprüfen und sollten bei Verunreinigung oder bei Veränderungen der 
modalen Chromosomenzahl nicht herangezogen werden. Die normale Zell ­
zyklusdauer sollte zur Festlegung der Inkubationsbedingungen im Prüflabor 
bekannt sein. Bei Anwendung der Zytokinese-Block-Methode sollte die 
Konzentration des Zytokinese-Hemmers für den betreffenden Zelltyp opti ­
miert werden und nachweislich eine gute Ausbeute an zweikernigen Zellen zur Auswertung ergeben.
 
Vorbereitung der Kulturen  
14. Etablierte Zelllinien und -stämme: Die Zellen werden aus Stammkulturen 
gewonnen und im Kulturmedium in einer solchen Dichte überimpft, dass 
vor dem Zeitpunkt der Gewinnung Kulturen in Monolagen nicht konfluent werden und Suspensionskulturen keine übermäßige Dichte erreichen. Die Kulturen werden bei 37 °C inkubiert.
 
15. Lymphozyten: Mit einem Antikoagulans ( z. B.  Heparin) behandeltes Voll ­
blut oder separierte Lymphozyten werden vor dem Kontakt mit der Prüf ­
substanz und cytoB unter Einwirkung eines Mitogens ( z. B.  Phytohämag ­
glutinin) inkubiert.  
Stoffwechsel-Aktivierung  
16. Bei Zellen mit ungeeigneter endogener Stoffwechselkapazität sollten exo ­
gene metabolisierende Systeme eingesetzt werden. Das am häufigsten ver ­
wendete System ist eine durch Ko-Faktoren ergänzte post-mitochondriale Fraktion (S9) aus der Leber von Nagetieren, die mit enzyminduzierenden Agenzien wie Aroclor 1254 (45) (46) oder einem Gemisch aus Phenobar ­
bital und β-Naphthoflavon (46) (47) (48) (49) vorbehandelt wurden. Das 
letztgenannte Gemisch verstößt weder gegen das Stockholmer Übereinkom ­
men über persistente organische Schadstoffe (50) noch gegen die Verordnung (EG) Nr. 850/2004 über persistente organische Schadstoffe 
(66) und hat sich bei der Induktion von Mischfunktionsoxidasen als ebenso 
wirksam wie Aroclor 1254 erwiesen (46) (47) (48) (49). Im Endmedium wird die S9-Fraktion in der Regel in Konzentrationen von 1 bis 10 % v/v verwendet. Die Bedingungen des Metabolisierungssystems können von der 
geprüften chemischen Klasse abhängig sein. In manchen Fällen ist es sinn ­
voll, mehr als eine S9-Konzentration zu verwenden.
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17. Gentechnisch veränderte Zelllinien zur Expression spezifischer Aktivie ­
rungsenzyme bei Menschen oder Nagetieren machen möglicherweise den 
Einsatz exogener Metabolisierungssysteme entbehrlich und könnten als Prüfzellen verwendet werden. In solchen Fällen sollte die Auswahl der verwendeten Zelllinien wissenschaftlich begründet werden, z. B. mit der 
Relevanz der Mischfunktionsoxidasen für den Stoffwechsel der Prüfsub ­
stanz (51) und mit ihrer Reaktionsfähigkeit auf bekannte Klastogene und Aneugene (siehe besonderer Abschnitt über Akzeptanzkriterien). Es ist zu beachten, dass die geprüfte Substanz unter Umständen nicht von der/den zur 
Expression gebrachten Mischfunktionsoxidase(n) verstoffwechselt wird; in 
diesem Fall würden die negativen Ergebnisse nicht anzeigen, dass die Prüf ­
substanz keine Mikrokerne induzieren kann.
 
Prüfsubstanzvorbereitung  
18. Feste Chemikalien sollten vor der Zellbehandlung in geeigneten Lösungs ­
mitteln oder Vehikeln gelöst und ggf. verdünnt werden. Flüssige Chemika ­
lien können den Versuchssystemen vor der Behandlung direkt beigegeben und/oder verdünnt werden. Gasförmige oder flüchtige Chemikalien sind mit 
Hilfe geeigneter Änderungen der Standardprotokolle, wie z. B. Behandlung 
in hermetisch verschlossenen Kulturgefäßen (52) (53), zu prüfen. Es sind frische Zubereitungen der Prüfsubstanz zu verwenden, es sei denn, die Lagerungsstabilität der Substanz wird nachgewiesen.
 
Prüfbedingungen  
Lösungsmittel/Vehikel  
19. Das Lösungsmittel/Vehikel sollte mit der Prüfsubstanz keine chemische 
Reaktion eingehen, und es sollte mit dem Überleben der Zellen und der 
S9-Aktivität in der verwendeten Konzentration kompatibel sein. Werden 
keine allgemein bekannten Lösungsmittel/Vehikel verwendet ( z. B. Wasser, 
ein Zellkulturmedium, Dimethylsulfoxid), so sind Daten über ihre Kompati ­
bilität mit der Prüfsubstanz und über das Nichtvorliegen einer genetischen 
Toxizität beizubringen. Es ist zu empfehlen, als erste Wahl möglichst die 
Verwendung eines wässrigen Lösungsmittels/Vehikels in Erwägung zu zie ­
hen. 
Verwendung von cytoB als Zytokinese-Blocker  
20. Eine der wichtigsten Überlegungen bei der Durchführung des MNvit-Tests 
gilt der Vergewisserung, dass die bewerteten Zellen während der Behand ­
lung oder ggf. während der Inkubationszeit nach der Behandlung eine Mi ­
tose durchlaufen haben. CytoB ist das am häufigsten verwendete Agens zur 
Zytokinese-Blockierung, da es den Aktinaufbau hemmt und somit die Tren ­
nung der Tochterzellen nach der Mitose verhindert, was wiederum zur Bildung zweikerniger Zellen führt (5) (54) (55). Die Auswertung von Mi ­
krokernen kann daher auf Zellen beschränkt werden, die während oder nach 
der Behandlung eine Mitose vollzogen haben. Zugleich kann die Auswir ­
kung der Prüfsubstanz auf die Zellproliferationskinetik gemessen werden. CytoB sollte bei der Verwendung menschlicher Lymphozyten als Zytokinese-Blocker eingesetzt werden, da die Zellzyklendauer innerhalb 
der Kulturen und zwischen einzelnen Spendern variiert und da nicht alle 
Lymphozyten auf Phytohämagglutinin reagieren. Andere Methoden wurden für Tests an Zelllinien eingesetzt, um zu bestimmen, ob die bewerteten Zellen eine Teilung durchlaufen haben; diese Methoden werden weiter 
unten erläutert (siehe Absatz 26).
 
21. Für jeden Zelltyp sollte das Labor die geeignete cytoB-Konzentration fest ­
legen, um in den Lösungsmittel-/Vehikelkontrollkulturen eine optimale Fre ­
quenz der zweikernigen Zellen zu erreichen. Die geeignete 
cytoB-Konzentration liegt in der Regel zwischen 3 und 6 μg/ml. ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 711
 
Messung von Zellproliferation und Zytotoxizität und Auswahl der Exposi ­
tionskonzentrationen  
22. Bei der Festlegung der höchsten zu testenden Konzentration der Prüfsub ­
stanz sind Konzentrationen zu vermeiden, die zu künstlich positiven Re ­
aktionen führen können, wie z. B. zu übermäßiger Zytotoxizität, Ausfäl ­
lungen im Kulturmedium oder ausgeprägten Änderungen des pH-Werts 
oder der Osmolalität (39) (40) (41).  
23. Es werden Messungen der Zellproliferation durchgeführt, um sicherzustel ­
len, dass die behandelten Zellen während des Tests eine Mitose durchlaufen haben und dass die Behandlungen bei geeigneten Zytotoxizitätsniveaus durchgeführt werden (siehe Absatz 29). Die Zytotoxizität sollte mit und 
ohne Stoffwechsel-Aktivierung in Zellen bestimmt werden, die eine 
Stoffwechsel-Aktivierung benötigen. Hierzu wird die relative Erhöhung der Zellzahl (RICC) oder die relative Populationsverdopplung (RPD) ver ­
wendet (entsprechende Formeln vgl. Anlage 2), wenn nicht cytoB zum 
Einsatz kommt. Wenn cytoB verwendet wird, kann die Zytotoxizität mittels 
des Replikationsindex (RI) bestimmt werden (entsprechende Formel vgl. Anlage 2).
 
24. Die Behandlung von Kulturen mit cytoB und die Messung der relativen 
Frequenzen von einkernigen, zweikernigen und mehrkernigen Zellen in der 
Kultur sind ein genaues Verfahren zur Quantifizierung des Effekts auf die 
Zellproliferation und die zytotoxische oder zytostatische Wirkung einer Be ­
handlung (5) und stellen sicher, dass nur Zellen bewertet werden, die wäh ­
rend oder nach der Behandlung eine Teilung vollzogen haben.  
25. In Studien mit cytoB kann die Zytostase/Zytotoxizität mittels des 
Zytokinese-Block-Proliferationsindex (CBPI) quantifiziert werden (5) (26) (56) oder vom RI bei mindestens 500 Zellen pro Kultur abgeleitet werden (entsprechende Formeln vgl. Anlage 2). Wenn cytoB zur Bewertung der 
Zellproliferation verwendet wird, sollte von mindestens 500 Zellen pro 
Kultur ein CBPI oder RI festgelegt werden. Diese Messungen können unter anderen verwendet werden, um die Zytotoxizität durch den Vergleich der Werte in behandelten Kulturen und Kontrollkulturen zu bewerten. Die Be ­
wertung anderer Zytotoxizitäts-Marker ( z. B. Konfluenz, Zellzahl, Apoptose, 
Nekrose, Metaphasezählung) kann ebenfalls nützliche Informationen liefern.
 
26. In Studien ohne cytoB muss nachgewiesen werden, dass die in der Kultur 
bewerteten Zellen während oder nach Behandlung mit der Prüfsubstanz eine Teilung durchlaufen haben. Andernfalls kann es zu falsch negativen Re ­
aktionen kommen. Um die Auswertung geteilter Zellen sicherzustellen, 
werden folgende Methoden eingesetzt: die Hinzufügung und der spätere Nachweis von Bromodeoxyuridin (BrdU) zur Identifikation replizierter Zel ­
len (57), die Bildung von Klonen, wenn Zellen permanenter Zelllinien 
behandelt und  in situ  auf einem Mikroskop-Objektträger ausgewertet wer ­
den (Proliferationsindex (PI)) (25) (26) (27) (28), oder die Messung der Relativen Populationsverdopplung (RPD) bzw. der Relativen Erhöhung der Zellzahl (RICC) sowie andere bewährte Methoden (16) (56) (58) (59) 
(entsprechende Formeln vgl. Anlage 2). Die Bewertung anderer Marker für 
Zytotoxizität oder Zytostase ( z. B. Konfluenz, Zellzahl, Apoptose, Nekrose, 
Metaphasezählung) kann ebenfalls nützliche Informationen liefern.
 
27. Es sind mindestens drei analysierbare Prüfkonzentrationen zu bewerten. Um 
dies zu erreichen, kann es notwendig sein, den Versuch mit einer größeren 
Zahl dicht aufeinander folgender Konzentrationen durchzuführen und die 
Mikrokernbildung in den Konzentrationen zu analysieren, die die geeignete Bandbreite der Zytotoxizitätswerte ergeben. Eine alternative Strategie wäre ein vorläufiger Zytotoxizitätstest zur Einengung des Spektrums für den 
definitiven Test.
 
28. Die Höchstkonzentration sollte darauf abzielen, eine Zytotoxizität von 55 ± 
5 % hervorzurufen. Höhere Niveaus könnten Chromosomenschäden als Se ­
kundäreffekt der Zytotoxizität induzieren (60). Wenn Zytotoxizität auftritt, sollten die ausgewählten Prüfkonzentrationen die Bandbreite von der Erzeu ­
gung einer Zytotoxizität von 55 ± 5 % bis zu geringer oder nicht vorhan ­
dener Zytotoxizität umfassen.
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29. Wenn keine Zytotoxizität oder keine Ausfälle festgestellt werden, sollte die 
Höchstkonzentration bei Versuchen 0,01 M, 5 mg/mL oder 5 μl/ml betra ­
gen, je nachdem, welcher Wert am niedrigsten ist. Zwischen den für die Analyse gewählten Konzentrationen sollten im Allgemeinen Abstände von jeweils höchstens 10 liegen. Bei Prüfsubstanzen mit einer steilen 
Konzentrations-Wirkungs-Kurve kann es notwendig sein, die Konzentrati ­
onsabstände der Prüfsubstanz enger zu bemessen, damit auch Kulturen im mäßigen und niedrigen Toxizitätsbereich ausgewertet werden.
 
30. Falls die Löslichkeit ein begrenzender Faktor ist, sollte die Höchstkonzen ­
tration — falls keine Einschränkung durch Zytotoxizität gegeben ist — die 
geringste Konzentration sein, bei der eine minimale Ausfällung in den 
Kulturen sichtbar ist, sofern dabei keine Interferenzen mit der Auswertung auftreten. Die Bewertung von Ausfällungen sollte mit Methoden wie der Lichtmikroskopie erfolgen, wobei festzustellen ist, ob Ausfällungen wäh ­
rend der Inkubation andauern oder (gegen Ende der Behandlung) auftreten.
 
Kontrollen  
31. Für jeden Versuch sind parallel laufende Positiv- und Lösungsmittel-/Vehi ­
kelkontrollen mit und ohne Zusatz eines Stoffwechsel-Aktivierungssystems anzulegen.
 
32. Positivkontrollen werden benötigt, um die Fähigkeit der verwendeten Zellen 
und des Testprotokolls zur Identifizierung von Klastogenen und Aneugenen 
nachzuweisen und die Stoffwechselkapazität der S9-Zubereitung zu bestäti ­
gen. Zur Positivkontrolle sollten bekannte Induktoren der Mikrokernbildung in Konzentrationen verwendet werden, die voraussichtlich eine geringe, aber 
reproduzierbare Zunahme gegenüber dem Hintergrund ergeben, womit sich 
die Empfindlichkeit des Versuchssystems nachweisen lässt. Die PK-Konzentrationen sollten so gewählt werden, dass die Wirkungen ein ­
deutig sind, aber beim Ablesen nicht sofort die Identität der kodierten 
Objektträger erkennen lassen.
 
33. Zum Nachweis der Stoffwechselkapazität und der Fähigkeit des Testsystems 
zur Erkennung von Klastogenen sollte ein Klastogen verwendet werden, das eine Stoffwechsel-Aktivierung benötigt ( z. B.  Zyklophosphamid; Ben ­
zo[a]pyren). Sofern begründet, können weitere Positivkontrollen verwendet 
werden. Da einige Positivkontrollen, die eine Stoffwechsel-Aktivierung be ­
nötigen, unter bestimmten Behandlungsbedingungen oder in bestimmten Zelllinien auch ohne exogene Stoffwechsel-Aktivierung wirken können, 
sollten die Notwendigkeit der Stoffwechsel-Aktivierung und die Wirkung 
der S9-Zubereitung in der gewählten Zelllinie und den gewählten Konzen ­
trationen geprüft werden.
 
34. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind keine Aneugene bekannt, die zu ihrer 
genotoxischen Wirkung eine Stoffwechsel-Aktivierung benötigen (16). Im 
Allgemeinen akzeptierte Positivkontrollen für eine aneugene Wirkung sind 
zum Beispiel Colchicin und Vinblastin. Es können auch andere Chemika ­
lien verwendet werden, sofern sie Mikrokerne nur oder primär durch ihre aneugene Wirkung induzieren. Um zu vermeiden, dass zwei PK (für Klas ­
togenizität und Aneugenizität) ohne Stoffwechsel-Aktivierung benötigt wer ­
den, kann die Aneugenizitätskontrolle als PK ohne S9 dienen, und die Klastogenizitätskontrolle kann verwendet werden, um die Eignung des ein ­
gesetzten Stoffwechsel-Aktivierungssystems zu prüfen. Positivkontrollen für 
Klastogenizität und Aneugenizität sollten in Zellen verwendet werden, die 
kein S9 benötigen. Die vorgeschlagenen Positivkontrollen sind in Anlage 3 aufgeführt.
 
35. Die Verwendung einer Positivkontrolle derselben chemischen Klasse kann 
in Erwägung gezogen werden, wenn geeignete Chemikalien zur Verfügung 
stehen. Alle Positivkontrollen sollten für den Zelltyp und die Aktivierungs ­
bedingungen geeignet sein.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 713
 
36. Für jeden Erntezeitpunkt sind Lösungsmittel-/Vehikelkontrollen anzulegen. 
Darüber hinaus sollten auch unbehandelte Negativkontrollen (ohne Lö ­
sungsmittel/Vehikel) verwendet werden, soweit nicht veröffentlichte oder laborspezifische historische Kontrolldaten belegen, dass das gewählte Lö ­
sungsmittel in den verwendeten Konzentrationen keine genotoxischen oder 
sonstigen schädlichen Wirkungen hervorruft.
 
TESTVERFAHREN  
Behandlungsplan  
37. Um die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, dass ein Aneugen oder Klasto ­
gen in einem bestimmten Stadium des Zellzyklus erkannt wird, muss eine 
ausreichende Anzahl an Zellen während aller Stadien ihrer Zellzyklen mit der Prüfsubstanz behandelt werden. Der Behandlungsplan für Zelllinien und primäre Zellkulturen kann daher in gewisser Weise von dem für Lympho ­
zyten abweichen, die für den Beginn ihres Zellzyklus einer mitogenen Sti ­
mulation bedürfen. Hierauf wird in den Absätzen 41-43 genauer eingegan ­
gen (16).
 
38. Theoretische Überlegungen und veröffentlichte Daten (18) legen nahe, dass 
die meisten Aneugene und Klastogene entdeckt werden, wenn eine kurze Behandlung von 3 bis 6 Stunden mit oder ohne Vorhandensein von S9 erfolgt, worauf die Prüfsubstanz entfernt wird und sich eine Wachstums ­
periode von 1,5-2,0 Zellzyklen anschließt (6). Die Zellen werden in einem 
Zeitraum beprobt, der etwa der 1,5-fachen bis 2-fachen Dauer des normalen (d. h.  unbehandelten) Zellzyklus entweder nach Behandlungsbeginn oder 
nach Ende der Behandlung entspricht (siehe Tabelle 1). Die Zeiträume 
für die Probenahme oder Regenerierung können ausgedehnt werden, wenn 
bekannt ist oder der Verdacht besteht, dass die Prüfsubstanz die Dauer des Zellzyklus beeinflusst ( z. B.  bei der Prüfung von Nucleosidanalogen).
 
39. Aufgrund der potenziellen zytotoxischen Wirkung von S9-Zubereitungen 
auf kultivierte Säugetierzellen wird eine verlängerte Expositionsbehandlung der 1,5-fachen bis 2-fachen Dauer des normalen Zellzyklus nur ohne Vor ­
handensein von S9 vorgenommen. Bei der verlängerten Behandlung werden 
Optionen angeboten, um eine Behandlung der Zellen mit der Prüfsubstanz 
mit oder ohne cytoB zu ermöglichen. Diese Optionen gelten für Situationen, in denen Befürchtungen hinsichtlich der möglichen Wechselwirkung zwi ­
schen der Prüfsubstanz und cytoB bestehen.
 
40. Die empfohlenen Zellbehandlungspläne sind in Tabelle 1 aufgeführt. Es 
handelt sich um allgemeine Behandlungspläne, die je nach der Stabilität oder Reaktivität der Prüfsubstanz oder den besonderen Wachstumseigen ­
schaften der verwendeten Zellen modifiziert werden können. Alle Behand ­
lungen sollten während des exponentiellen Wachstums der Zellen einsetzen und enden. Die genannten Pläne werden ausführlicher in den nachstehenden Absätzen 41-47 vorgestellt.
 
Tabelle 1  
Pläne für Zellbehandlung und -gewinnung beim MNvit-Test  
Lymphozyten, Primärzellen und Zelllinien, 
die mit cytoB behandelt wurden + S9 3-6 Stunden Behandlung in Anwesenheit von 
S9; 
Entfernung von S9 und Behandlungsmedium; Zugabe von neuem Medium und cytoB; 
Zellgewinnung nach 1,5-2,0 normalen Zell ­
zyklen. 
– S9 
Kurze Exposition 3-6 Stunden Behandlung; 
Entfernung des Behandlungsmediums; 
Zugabe von neuem Medium und cytoB; Zellgewinnung nach 1,5-2,0 normalen Zell ­
zyklen.
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– S9 
Verlängerte Exposi ­
tion Option A:  Behandlung über 1,5-2,0 normale 
Zellzyklen in Anwesenheit von cytoB; 
Gewinnung am Ende der Expositionsdauer.  
Option B:  Behandlung über 1,5-2,0 normale 
Zellzyklen; 
Entfernung der Prüfsubstanz; 
Zugabe von neuem Medium und cytoB; Zellgewinnung nach 1,5-2,0 normalen Zell ­
zyklen. 
Zelllinien, die ohne cytoB behandelt wurden 
(Ebenso wie die oben genannten Behandlungspläne mit der Ausnahme, dass kein cytoB zugegeben wird)
 
Lymphozyten, Primärzellen und Zelllinien mit cytoB  
41. Bei Lymphozyten ist es am wirksamsten, die Exposition gegenüber der 
Prüfsubstanz 44-48 Stunden nach der PHA-Stimulation zu beginnen, 
wenn die Zyklussynchronisierung nicht mehr vorhanden ist (5). Bei dem 
anfänglichen Test werden die Zellen über einen Zeitraum von 3-6 Stunden mit und ohne Zusatz von S9 mit der Prüfsubstanz behandelt. Das Behand ­
lungsmedium wird entfernt und durch ein frisches Medium, das cytoB 
enthält, ersetzt. Die Zellgewinnung erfolgt nach weiteren 1,5-2,0 normalen 
Zellzyklen.
 
42. Wenn beide anfänglichen Tests nach der kurzen (3- bis 6-stündigen) Be ­
handlung zu negativen oder nicht eindeutigen Ergebnissen führen, erfolgt 
eine weitere verlängerte Expositionsbehandlung ohne S9. Zwei weitere Be ­
handlungsoptionen sind verfügbar und gleichermaßen akzeptabel. Mögli ­
cherweise ist es jedoch sinnvoller, Option A mit stimulierten Lymphozyten anzuwenden, da das exponentielle Wachstum 96 Stunden nach der Stimula ­
tion abnehmen dürfte. Ebenso sollten die Zellkulturen zum Zeitpunkt der 
abschließenden Probenahme in Option B noch nicht konfluent geworden sein.
 
— Option A: Die Zellen werden über 1,5 bis 2,0 normale Zellzyklen mit 
der Prüfsubstanz behandelt und die Gewinnung erfolgt am Ende der 
Behandlungsdauer.  
— Option B: Die Zellen werden über 1,5 bis 2,0 normale Zellzyklen mit 
der Prüfsubstanz behandelt. Das Behandlungsmedium wird entfernt und durch ein frisches Medium ersetzt. Die Zellgewinnung erfolgt nach 
zusätzlichen 1,5-2,0 normalen Zellzyklen.
 
43. Primärzellen und Zelllinien sollten ähnlich wie Lymphozyten behandelt 
werden. Es ist allerdings nicht notwendig, sie für 44-48 Stunden mit PHA zu stimulieren. Andere Zellen als Lymphozyten sollten so exponiert 
werden, dass sich die Zellen bei Abschluss des Versuchs immer noch im 
Log-Phase-Wachstum befinden.
 
Zelllinien ohne cytoB  
44. Die Zellen sollten über einen Zeitraum von 3-6 Stunden mit und ohne 
Zusatz von S9 behandelt werden. Das Behandlungsmedium wird entfernt 
und durch ein frisches Medium ersetzt. Die Zellgewinnung erfolgt nach 
zusätzlichen 1,5-2,0 normalen Zellzyklen.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 715
 
45. Wenn beide anfänglichen Tests nach der kurzen (3- bis 6-stündigen) Be ­
handlung zu negativen oder nicht eindeutigen Ergebnissen führen, erfolgt 
eine weitere verlängerte Expositionsbehandlung (ohne S9). Zwei weitere Behandlungsoptionen sind verfügbar und beide gleichermaßen akzeptabel:
 
— Option A: Die Zellen werden über 1,5 bis 2,0 normale Zellzyklen mit 
der Prüfsubstanz behandelt und die Gewinnung erfolgt am Ende der Behandlungsdauer.
 
— Option B: Die Zellen werden über 1,5 bis 2,0 normale Zellzyklen mit 
der Prüfsubstanz behandelt. Das Behandlungsmedium wird entfernt und 
durch ein frisches Medium ersetzt. Die Zellgewinnung erfolgt nach 
zusätzlichen 1,5-2,0 normalen Zellzyklen.  
46. In Monolagern können am Ende der 3- bis 6-stündigen Behandlung mito ­
tische Zellen vorhanden sein (diese sind daran zu erkennen, dass sie rund sind und sich von der Oberfläche lösen). Da diese mitotischen Zellen sich leicht lösen, können sie bei Entfernung des Mediums mit der Prüfsubstanz 
verloren gehen. Es ist sorgfältig darauf zu achten, diese Zellen beim Spülen 
der Kulturen aufzufangen und sie in die Kulturen zurückzugeben, damit nicht in Mitose befindliche Zellen, die das Risiko einer Mikrokernbildung aufweisen, zum Zeitpunkt der Gewinnung unberücksichtigt bleiben.
 
Anzahl der Kulturen  
47. Für jede Konzentration der Prüfsubstanz sowie für die 
Vehikel-/Lösungsmittelkulturen und Kontrollkulturen sollten zwei gleichzei ­
tige Kulturen angelegt werden. Lässt sich anhand von historischen Labor ­
daten nachweisen, dass zwischen den Zweifachkulturen nur eine minimale Abweichung besteht, so ist ggf. die Verwendung von Einfachkulturen ver ­
tretbar. Wenn Einfachkulturen verwendet werden, wird die Analyse einer 
erhöhten Anzahl von Konzentrationen empfohlen.
 
Zellgewinnung und Präparation des Objektträgers  
48. Jede Kultur wird gesondert gewonnen und aufgearbeitet. Die Zellpräpara ­
tion kann eine Behandlung mit hypotoner Lösung beinhalten, dieser Schritt ist jedoch nicht notwendig, wenn eine angemessene Ausbreitung der Zellen 
anderweitig sichergestellt wird. Bei der Präparation der Objektträger können 
verschiedene Techniken verwendet werden, vorausgesetzt, es werden Zell ­
präparate hoher Qualität zur Auswertung bereitgestellt. Dabei sollte Zyto ­
plasma zurückgehalten werden, um die Erkennung von Mikrokernen sowie 
(bei der Zytokinese-Block-Methode) die zuverlässige Identifizierung zwei ­
kerniger Zellen zu ermöglichen.
 
49. Die Objektträger können mit verschiedenen Verfahren gefärbt werden, wie 
zum Beispiel mit Giemsa oder fluoreszierenden DNA-spezifischen Farbstof ­
fen (59). Durch Verwendung eines DNA-spezifischen Farbstoffs ( z. B.  
Acridin Orange (61) oder Hoechst 33258 Plus Pyronin-Y (62)) lassen 
sich bestimmte Artefakte vermeiden, die bei Verwendung eines nicht 
DNA-spezifischen Farbstoffs auftreten. Zur Identifizierung des Inhalts (Chromosomen/Chromosomenfragmente) von Mikrokernen können 
Anti-Kinetochor-Antikörper, FISH mit panzentromerischen DNA-Sonden 
oder eine präparierte  in situ -Markierung mit panzentromer-spezifischen Pri ­
mern, zusammen mit der geeigneten DNA-Gegenfärbung, verwendet wer ­
den, wenn mechanistische Informationen zu ihrer Bildung benötigt werden 
(15) (16). Andere Methoden zur Unterscheidung zwischen Klastogenen und 
Aneugenen können ebenfalls verwendet werden, wenn sie sich als wirksam erwiesen haben.
 
Analyse  
50. Alle Objektträger, auch die für die Lösungsmittel-/Vehikelgruppen und die 
Kontrollen, sind vor der mikroskopischen Untersuchung von unabhängiger Seite zu kodieren. Alternativ dazu können kodierte Proben mittels eines 
validierten automatisierten Analysesystems (Durchflusszytometrie oder 
Bildanalyse) untersucht werden.
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51. In Kulturen, die mit cytoB behandelt wurden, sollten die Mikrokernfrequen ­
zen von mindestens 2 000 zweikernigen Zellen pro Konzentration (mindes ­
tens 1 000 zweikernige Zellen pro Kultur; zwei Kulturen pro Konzentration) analysiert werden. Wenn Einfachkulturen verwendet werden, sollten in einer solchen Kultur mindestens 2 000 zweikernige Zellen pro Konzentration 
ausgewertet werden. Wenn wesentlich weniger als 1 000 zweikernige Kel ­
len pro Kultur, bzw. 2 000 bei Einfachkulturen, in jeder Konzentration für die Auswertung zur Verfügung stehen, und wenn keine signifikante Zu ­
nahme an Mikrokernen festgestellt wird, sollte der Versuch mit einer hö ­
heren Anzahl an Zellen oder mit weniger toxischen Konzentrationen durch ­
geführt werden, je nachdem, was angemessen ist. Es sollte darauf geachtet werden, keine zweikernigen Zellen auszuwerten, die unregelmäßige Formen aufweisen oder deren zwei Kerne in der Größe beträchtlich voneinander 
abweichen; außerdem sollten zweikernige Zellen nicht mit schlecht auf 
dem Träger verteilten mehrkernigen Zellen verwechselt werden. Zellen mit mehr als zwei Hauptkernen sollten nicht auf Mikrokerne untersucht werden, da in diesen Zellen die zugrunde liegende Mikrokernfrequenz höher 
sein könnte (63) (64). Die Auswertung einkerniger Zellen ist akzeptabel, 
wenn die Prüfsubstanz nachweislich mit der Wirkung von cytoB interferiert.
 
52. In Zelllinien, die ohne cytoB-Behandlung getestet wurden, sollten die Mi ­
krokerne in mindestens 2 000 Zellen pro Konzentration (mindestens 1 000 Zellen pro Kultur; zwei Kulturen pro Konzentration) ausgewertet werden. Wenn nur eine Kultur pro Konzentration verwendet wird, sollten in dieser 
Kultur mindestens 2 000 Zellen ausgewertet werden.
 
53. Wenn cytoB verwendet wird, sollte von mindestens 500 Zellen pro Kultur 
ein CBPI oder RI zur Bewertung der Zellproliferation (siehe Anlage 2) 
festgelegt werden. Wenn die Behandlungen in Abwesenheit von cytoB durchgeführt werden, muss unbedingt nachgewiesen werden, dass die aus ­
gewerteten Zellen proliferiert haben, wie in den Absätzen 24-27 erläutert.
 
Akzeptanzkriterien  
54. Ein Labor, das die Durchführung des in dieser Prüfmethode beschriebenen 
MNvit-Tests anbietet, sollte nachweisen, dass es in der Lage ist, mit Hilfe 
der in Anlage 3 aufgeführten Referenzsubstanzen Chemikalien mit bekann ­
ter aneugener und klastogener Wirkung, mit und ohne Stoffwechsel-Aktivierung, sowie auch bekannte negative Chemikalien, zu ­
verlässig und genau festzustellen. Als Nachweis seiner Fähigkeit, diese 
Prüfmethode ordnungsgemäß anzuwenden, sollte das Labor belegen, dass 
die auf Mikrokernbildung untersuchten Zellen eine Kernteilung durchlaufen haben, wenn der Test ohne cytoB durchgeführt wird.
 
55. Die Substanzen in Anlage 3 sind die zur Verwendung empfohlenen Refe ­
renzsubstanzen. Ersatzstoffe oder zusätzliche Chemikalien können einbezo ­
gen werden, wenn ihre Wirkung bekannt ist, wenn sie Mikrokerne mittels 
derselben Wirkmechanismen induzieren und wenn sie sich als relevant für 
die Chemikalien erweisen, die mit dem MNvit-Verfahren geprüft werden. Die Begründung könnte eine Validierungsstudie enthalten, die entweder auf einer breiten Auswahl an Substanzen beruht oder sich auf ein engeres 
Spektrum auf der Grundlage der chemischen Klasse der Prüfsubstanz 
oder des untersuchten Schädigungsmechanismus konzentriert.
 
56. Lösungsmittel-/Vehikelkontrollen und unbehandelte Kulturen sollten repro ­
duzierbar niedrige und gleichbleibende Mikrokernfrequenzen zeigen (in der Regel 5-25 Mikrokerne pro 1 000 Zellen für die in Absatz 11 genannten Zelltypen). Andere Zelltypen können hiervon abweichende Reaktionsberei ­
che aufweisen, die bei ihrer Validierung zur Verwendung im MNvit-Test 
bestimmt werden sollten. Daten von Negativ-, Lösungsmittel- und Positiv ­
kontrollen sollten herangezogen werden, um historische Kontrollbereiche festzulegen. Diese Werte sollten bei Entscheidungen über die Eignung einer 
gleichzeitigen Negativkontrolle/Positivkontrolle für einen Versuch zugrunde 
gelegt werden.
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57. Wenn für den Test geringfügige Änderungen des Protokolls vorgeschlagen 
werden ( z. B.  Verwendung automatisierter statt manueller Auswertungsver ­
fahren; Verwendung eines neuen Zelltyps), sollte die Wirksamkeit der Än ­
derung nachgewiesen werden, bevor das geänderte Protokoll als einsatz ­
tauglich befunden werden kann. Der Wirksamkeitsnachweis beinhaltet den 
Beweis, dass wesentliche Mechanismen wie Chromosomenbrüche oder Hin ­
zugewinn bzw. Verlust von Chromosomenmaterial festgestellt werden kön ­
nen, und dass die entsprechenden positiven und negativen Ergebnisse für die Klasse der einzelnen Prüfsubstanz oder für die gesamte Bandbreite der 
zu testenden Substanzen erzielt werden können.
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Behandlung der Ergebnisse  
58. Bei Verwendung des Zytokinese-Block-Verfahrens werden nur die Frequen ­
zen zweikerniger Zellen mit Mikrokernen (unabhängig von der Anzahl der 
Mikrokerne pro Zelle) zur Bewertung der Mikrokern-Induktion herangezo ­
gen. Die Auswertung der Anzahl an Zellen mit einem, zwei oder mehr Mikrokernen könnte nützliche Informationen liefern, ist jedoch nicht zwin ­
gend notwendig.
 
59. Festzulegen sind auch Maßnahmen, die gleichzeitig zur Bestimmung der 
Zytotoxizität und/oder Zytostase aller behandelten und Lösungsmittel-/Ve ­
hikelkontrollkulturen durchgeführt werden (58). Der CBPI oder der RI sollte für alle behandelten Kulturen und Kontrollkulturen berechnet werden, 
da sich bei Verwendung des Zytokinese-Block-Verfahrens die Messungen 
des Zellzyklus verzögern. Kommt cytoB nicht zum Einsatz, sollten die Relative Populationsverdopplung (RPD), die Relative Erhöhung der Zellzahl (RICC) oder der Proliferationsindex (PI) herangezogen werden 
(siehe Anlage 2).
 
60. Es sind die Daten für die einzelnen Kulturen zu dokumentieren. Zusätzlich 
sollten alle Daten in tabellarischer Form zusammengefasst werden.  
61. Wenn Chemikalien im MNvit-Test Mikrokerne induzieren, könnte dies da ­
rauf zurückzuführen sein, dass sie Chromosomenbrüche, Chromosomenver ­
lust oder eine Kombination aus beidem verursachen. Deshalb können wei ­
tere Analysen unter Einsatz von Anti-Kinetochor-Antikörpern, zentromer-spezifischen  in situ -Sonden oder mit Hilfe sonstiger Methoden 
vorgenommen werden, um festzustellen, ob der Mechanismus der 
Mikrokern-Induktion von einer klastogenen und/oder aneugenen Wirkung herrührt.
 
Bewertung und Interpretation der Ergebnisse  
62. Bei einer eindeutigen positiven oder negativen Reaktion ist eine Verifizie ­
rung durch zusätzliche Versuche nicht erforderlich. Zur Klärung nicht ein ­
deutiger Ergebnisse empfiehlt sich die Analyse von weiteren 1 000 Zellen aller Kulturen, um die erforderliche Verblindung aufrechtzuerhalten. Sollte 
diese Methode nicht zur Klärung des Ergebnisses führen, müssen weitere 
Tests durchgeführt werden. Bei Folgeversuchen sollte die Abänderung der Studienparameter mit Erweiterung oder Verengung des Bedingungsumfangs in Betracht gezogen werden. Zu den Studienparametern, die für eine Ab ­
änderung in Frage kommen, gehören die Abstände der Prüfkonzentrationen, 
der Zeitplan für Behandlung und Zellgewinnung und/oder die Bedingungen für die Stoffwechsel-Aktivierung.
 
63. Es gibt mehrere Kriterien für die Bestimmung eines positiven Ergebnisses, wie 
z. B. eine konzentrationsbezogene Zunahme oder eine statistisch signifikante 
Zunahme der Anzahl der Zellen mit Mikrokernen. Zunächst sollte die biologi ­
sche Relevanz der Ergebnisse untersucht werden. Die Betrachtung der Frage, ob die festgestellten Werte innerhalb oder außerhalb des historischen Kontroll ­
bereichs liegen, kann Anhaltspunkte für die Bewertung der biologischen Rele ­
vanz der Reaktion liefern. Als Hilfsmittel bei der Bewertung der Versuchsergeb ­
nisse können geeignete statistische Methoden dienen (65). Allerdings sollten die Ergebnisse statistischer Untersuchungen im Hinblick auf die Dosis-Wirkungs- 
Beziehung bewertet werden. Dabei ist auch der Reproduzierbarkeit und den 
historischen Daten Rechnung zu tragen.
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64. Auch wenn die meisten Versuche eindeutig positive oder negative Ergeb ­
nisse liefern, erlaubt der Datensatz in manchen Fällen keine definitive Aus ­
sage über die Aktivität der Prüfsubstanz. Es kommt vor, dass unabhängig davon, wie oft der Versuch wiederholt wird, weiterhin nicht eindeutige oder fragwürdige Ergebnisse auftreten.
 
65. Positive Befunde beim MNvit-Test deuten darauf hin, dass die Prüfsubstanz 
in kultivierten Säugetierzellen Chromosomenbrüche oder Chromosomenver ­
lust hervorruft. Negative Befunde sind ein Anzeichen dafür, dass die Prüf ­
substanz unter den zugrunde gelegten Versuchsbedingungen keine Chromo ­
somenbrüche und/oder Gewinn bzw. Verlust von Chromosomenmaterial in 
kultivierten Säugetierzellen hervorruft.  
Prüfbericht  
66. Der Prüfbericht sollte mindestens folgende Informationen enthalten, wenn 
diese für die Durchführung der Studie relevant sind:  
Prüfchemikalie  
— Angaben zur Identifikation und CAS- (Chemical Abstract Services) 
Nummer sowie EG-Nummer;  
— physikalische Eigenschaft und Reinheit;  
— physikalisch-chemische Eigenschaften, die für die Durchführung der 
Studie relevant sind;  
— Reaktionsfähigkeit der Substanz mit dem Lösungsmittel/Vehikel oder 
dem Zellkulturmedium;  
Lösungsmittel/Vehikel  
— Begründung für die Wahl des Vehikels/Lösungsmittels;  
— Löslichkeit und Stabilität der Prüfsubstanz im Lösungsmittel/Vehikel, 
falls bekannt;  
Zellen  
— Typ und Herkunft der verwendeten Zellen;  
— Eignung des verwendeten Zelltyps;  
— ggf. Nichtvorhandensein von Mykoplasma;  
— Informationen zu Zellzyklusdauer, Verdopplungsdauer oder Proliferati ­
onsindex;  
— bei Verwendung von Lymphozyten: Geschlecht, Alter und Anzahl der 
Blutspender soweit zutreffend;  
— bei Verwendung von Lymphozyten: Angaben darüber, ob Vollblut oder 
separierte Lymphozyten in Kontakt mit der Prüfsubstanz gebracht wer ­
den; 
— ggf. Passagenanzahl;  
— ggf. zum Erhalt der Zellkultur verwendete Verfahren;  
— Modalwert der Chromosomen;  
— normale Zellzyklusdauer (Negativkontrolle);  
Prüfbedingungen  
— Bezeichnung der Zytokinese-Block-Substanz (z. B. cytoB), falls ver ­
wendet, deren Konzentration und Dauer der Zellexposition;  
— Begründung für die Auswahl der Konzentrationen und die Anzahl der 
Kulturen, darunter z. B. Angaben zur Zytotoxizität und Löslichkeits ­
grenze, falls vorhanden;  
— Medienzusammensetzung, ggf. CO  2 -Konzentration;  
— Konzentrationen der Prüfsubstanz;  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 719
 
— Konzentration (und/oder Volumen) des Vehikels und der beigegebenen 
Prüfsubstanz;  
— Inkubationstemperatur und -dauer;  
— Behandlungsdauer;  
— Zeitpunkt der Gewinnung nach der Behandlung;  
— ggf. Zelldichte bei der Beimpfung;  
— Art und Zusammensetzung des Stoffwechsel-Aktivierungssystems ein ­
schließlich Akzeptanzkriterien;  
— Positivkontrollsubstanzen und Negativkontrollen;  
— Methoden der Objektträger-Präparation und verwendetes 
Färbeverfahren;  
— Kriterien für die Identifizierung von Mikrokernen;  
— Anzahl der analysierten Zellen;  
— Methoden zur Bestimmung der Zytotoxizität;  
— alle zusätzliche Angaben zur Zytotoxizität;  
— Kriterien zur Einstufung der Studien als positiv, negativ oder nicht 
eindeutig;  
— verwendete statistische Analysemethode(n);  
— Methoden, z. B. die Verwendung von Kinetochor-Antikörpern, um ggf. 
zu beschreiben, ob Mikrokerne ganze oder fragmentierte Chromosomen 
enthalten;  
Ergebnisse  
— Verwendete Messung der Zytotoxizität, z. B. CBPI oder RI bei der 
Zytokinese-Block-Methode; RICC, RPD oder PI, wenn keine Zytokinese-Block-Verfahren verwendet werden; sonstige Beobachtun ­
gen bei Bedarf, z. B. Zell-Konfluenz, Apoptose, Nekrose, Metaphase ­
zählung, Frequenz zweikerniger Zellen;
 
— Ausfällungszeichen;  
— Angaben zum pH-Wert und zur Osmolalität des Behandlungsmediums, 
falls ermittelt;  
— Definition geeigneter Zellen für die Analyse;  
— Verteilung einkerniger, zweikerniger und mehrkerniger Zellen, falls ein 
Zytokinese-Block-Verfahren verwendet wird;  
— Anzahl der Zellen mit Mikrokernen, gesondert für jede behandelte Kul ­
tur und Kontrollkultur, und Angabe, ob diese von zweikernigen oder einkernigen Zellen stammen, sofern zutreffend;
 
— nach Möglichkeit Konzentrations-Wirkungs-Verhältnis;  
— chemische Daten zu gleichzeitigen Negativ-(Lösungsmittel-/Vehikel-) 
Kontrollen und Positivkontrollen (Konzentrationen und Lösungsmittel);  
— Daten zu historischen Negativ-(Lösungsmittel-/Vehikel-)Kontrollen und 
Positivkontrollen mit Bereichen, Mittelwerten, Standardabweichungen 
sowie Konfidenzniveau (z. B. 95 %).  
— ggf. statistische Analysen; p-Werte;  
Diskussion der Ergebnisse  
Schlussfolgerungen  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 720
 
LITERATUR  
(1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res. , 392, 1-4.  
(2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the 
aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community 
aneuploidy project,  Mutation Res. , 287, 3-15.  
(3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in 
the micronucleus assay,  Cytobios. , 43, 233-246.  
(4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen ., 35, 167-172.
 
(5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols, 2  (5), 1084-1104.  
(6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus me ­
thod in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation,  Mutation Res. , 161, 193-198.  
(7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen. , 13, 34-43.
 
(8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  in- 
situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation Res. , 
234, 9-20.  
(9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), 
Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with 
biotinylated gamma satellite DNA,  Mutagenesis , 6, 297-302.
 
(10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluores ­
cence  in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in 
cytokinesis-blocked mouse splenocytes,  Mutagenesis , 8, 329-334.  
(11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytoge ­
netic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds 
and micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with a 
centromeric probe,  Mutation Res. , 319, 205-213.  
(12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by 
antikinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesis , 8, 519-525.  
(13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyper ­
diploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes fol ­
lowing exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor 
fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes,  Mutation Res. , 322, 
9-20.  
(14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), 
Fluorescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific cen ­
tromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation Res. , 
372, 233-245.  
(15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res. , 
372, 211-219.  
(16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res. , 540, 153-163.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 721
 
(17) OECD (1997),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test , Test 
Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, 
Paris. Abrufbar unter: [www.oecd.org/env/testguidelines]  
(18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  Mutation Res. , 607, 13-36.
 
(19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res. , 607, 37-60.
 
(20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., 
Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, 
D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res. , 607, 61-87.  
(21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobay ­
ashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and 
Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  
micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res. , 607, 88-124.
 
(22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells,  Mutation Res. , 607, 125-152.
 
(23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data 
on in vitro  MNT and  in vitro  CA: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
187-208.  
(24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Com ­
parative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the  in vitro  chromosome 
aberration test: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 45-59.  
(25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and 
Madle, S. (1998), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alter ­
native to the  in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM 
Working Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res. , 410, 81-116.  
(26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Che ­
mically induced micronucleus formation in V79 cells — comparison of 
three different test approaches,  Mutation Res.  439, 183-190.  
(27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. 
(1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, 55-71.  
(28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells — results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res ., 468, 137-163.
 
(29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 517, 123-134.
 
(30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and 
Sofuni, T. (1999), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in a 
Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesis , 14, 569-580.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 722
 
(31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International col ­
laborative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 607, 1-152.  
(32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to 
the in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 
25 th meeting, 16-17 November, 2006. Abrufbar unter: [http://ecvam.jrc.it/ 
index.htm]  
(33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Re ­
view, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, Summary 
and Conclusions of the Peer Review Panel. Abrufbar unter: [http:// 
ecvam.jrc.it/index.htm]  
(34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesis , 23, 271-283.  
(35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and So ­
funi, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  
Mutation Res. , 347, 105-115.
 
(36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and 
Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B  1 is genotoxic in human derived hep ­
atoma (HepG2) cells,  Mutagenesis , 17, 257-260.  
(37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol. , 198, 315-328.
 
(38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., 
Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation 
assay for National Toxicology Program test chemicals,  Mutation Res. , 392, 
61-70.
 
(39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under ex ­
treme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation 
Res., 257, 147-205.
 
(40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity 
of low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res. , 268, 297- 
305. 
(41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen ., 8, 789-886.  
(42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lym ­
phocytes,  Mutation Res. , 147, 29-36.  
(43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res. , 392, 11-18.  
(44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhale ­
vich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, 
M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of 
laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of 
micronuclei,  Environ. Mol. Mutagen.  37, 31-45.
 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 723
 
(45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res. , 113, 173-215.  
(46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. Toxicol. , 
4, 55-65.
 
(47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, 
G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254- induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis , 7, 175-177.
 
(48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Acti ­
vation Systems,  In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, 
R.M. (eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, pp. 85-88.  
(49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9,  
Environ. Mol. Mutagen. , 28, 51-59.  
(50) UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, 
United Nations Environment Programme (UNEP). Abrufbar unter: [http:// 
www.pops.int/]  
(51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investi ­
gation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells,  Mutagenesis , 11, 247- 
274.
 
(52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mu ­
tation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  In: Tice, R.R., 
Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. 
New York, Plenum, pp. 91-103.  
(53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation 
of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. 
Mutagenesis  5, 795-801.
 
(54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detai ­
led description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res. , 285, 35-44.
 
(55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 521, 103-112.  
(56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to „Report from the  in vitro  micronucleus assay working group“,  Mutation 
Res., 564, 97-100.
 
(57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear 
assay in lymphocytes,  Mutation Res. , 139, 61-65.  
(58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison 
of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in 
vitro  micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res. , 655, 1-3.  
(59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. 
(1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 341, 
169-184.
 
(60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis  35, 191-201.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 724
 
(61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res., 120, 241-247.  
(62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple 
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  Mutation Res. , 120, 269-275.
 
(63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of 
acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation Res. , 
120, 241-247.  
(64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and 
Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lympho ­
cyte cultures,  Mutation Res. , 534, 65-75.  
(65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003),  In vitro  micronucleus 
test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. 
Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463-467.  
(66) Verordnung (EG) Nr. 850/2004 des Europäischen Parlaments und des Rates 
vom 29. April 2004 über persistente organische Schadstoffe und zur Än ­
derung der Richtlinie 79/117/EWG, ABl. 229 vom 30.4.2004, S. 5.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 725
 
Anlage 1  
Begriffsbestimmungen  
Aneugen:  Substanz oder Prozess, die/der durch Wechselwirkung mit den Kom ­
ponenten des mitotischen oder meiotischen Zellteilungszyklus zu Aneuploidie in Zellen oder Organismen führt.
 
Aneuploidie:  Abweichung von der normalen diploiden (oder haploiden) Chromo ­
somenzahl durch ein einziges Chromosom oder mehr, nicht aber durch einen 
ganzen (oder mehrere) Chromosomensatz/-sätze (Polyploidie).  
Apoptose:  Programmierter Zelltod, der durch eine Reihe von Schritten charakte ­
risiert ist, an deren Ende eine Desintegration von Zellen in membranumschlos ­
sene Partikel steht, die schließlich durch Phagozytose oder Shedding abgebaut 
werden.  
Zellproliferation:  Zunahme der Anzahl von Zellen als Ergebnis der mitotischen 
Zellteilung.  
Zentromer:  DNA-Bereich eines Chromosoms, an dem die beiden Chromatiden 
zusammengehalten werden, und an dem beide Kinetochoren Seite an Seite an ­
geordnet sind.  
Klastogen:  Substanz oder Prozess, die/der strukturelle Chromosomenaberrationen 
in Zell- oder Organismenpopulationen verursacht.  
Zytokinese:  Prozess der Zellteilung unmittelbar nach der Mitose, in dem zwei 
Tochterzellen, jeweils mit einem einzigen Kern, gebildet werden.  
Zytokinese-Block-Proliferationsindex (CBPI):  Anteil der Zellen aus zweiter Tei ­
lung in der behandelten Population im Verhältnis zur nicht behandelten Kontroll ­
gruppe (entsprechende Formel vgl. Anlage 2).  
Zytostase:  Hemmung des Zellwachstums (entsprechende Formel vgl. Anlage 2).  
Zytotoxizität:  schädliche Auswirkungen auf Zellstruktur und -funktion, die letzt ­
lich zum Zelltod führen.  
Genotoxisch:  allgemeiner Begriff, der alle Typen von DNA- oder Chromoso ­
menschädigungen umfasst, einschließlich Brüchen, Addukt-Neubildungen, Muta ­
tionen, Chromosomenaberrationen sowie Aneuploidie. Nicht alle genotoxischen Effekte führen zu Mutationen oder stabilen Chromosomenschäden.
 
Interphasezellen:  Zellen, die sich nicht im Stadium der Mitose befinden.  
Kinetochor:  proteinhaltige Struktur, die sich am Zentromer eines Chromosoms 
sammelt, an der während der Zellteilung die Spindelfasern anhaften, wodurch die ordnungsgemäße Beförderung der Tochterchromosomen zu den Polen der Toch ­
terzellen ermöglicht wird.
 
Mikronuklei/Mikrokerne:  kleine Kerne zusätzlich zu den Hauptkernen der Zellen 
und von diesen getrennt, die während der Telophase der Mitose oder Meiose durch zurückgebliebene Chromosomenteile oder ganze Chromosomen gebildet 
werden.
 
Mitose:  Teilung des Zellkerns, die in der Regel in Prophase, Prometaphase, 
Metaphase, Anaphase und Telophase gegliedert ist.  
Mitoseindex:  Anteil der Zellen einer Zellpopulation, die sich zum Beobachtungs ­
zeitpunkt in Metaphase befinden; zugleich Hinweis auf den Grad der Zellpro ­
liferation in dieser Population.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 726
 
Mutagen:  Auslöser einer Erbgutveränderung der DNA-Basenpaarsequenz(en) in 
Genen oder in der Chromosomenstruktur (Chromosomenaberrationen).  
Non-Disjunktion:  Unvermögen der paarweise angeordneten Chromatiden, sich zu 
trennen und sich auf die in Entwicklung begriffenen Tochterzellen aufzuteilen. Dabei entstehen Tochterzellen mit abweichenden Chromosomenzahlen.
 
Polyploidie:  Zahlenmäßige Chromosomenaberrationen in Zellen oder Organis ­
men, von denen ein oder mehrere ganze Chromosomensätze betroffen sind, im 
Gegensatz zur Aneuploidie, bei der nur ein oder mehrere einzelne Chromosomen 
betroffen sind.  
Proliferationsindex (PI):  Verfahren zur Messung der Zytotoxizität, wenn kein 
cytoB verwendet wird (entsprechende Formel vgl. Anlage 2).  
Relative Erhöhung der Zellzahl (RICC):  Verfahren zur Messung der Zytotoxizi ­
tät, wenn kein cytoB verwendet wird (entsprechende Formel vgl. Anlage 2).  
Relative Populationsverdopplung (RPD):  Verfahren zur Messung der Zytotoxizi ­
tät, wenn kein cytoB verwendet wird (entsprechende Formel vgl. Anlage 2).  
Replikationsindex (RI):  Anteil der abgeschlossenen Zellteilungszyklen in einer 
behandelten Kultur im Verhältnis zur nicht behandelten Kontrollgruppe während 
der Expositions- und Regenerationsphase (entsprechende Formel vgl. Anlage 2).  
Prüfchemikalie (auch Prüfsubstanz):  Jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit 
dieser Prüfmethode getestet wird.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 727
 
Anlage 2  
Formeln zur Bewertung der Zytotoxizität  
1. Wenn cytoB zum Einsatz kommt , sollte die Bewertung der Zytotoxizität auf dem 
Zytokinese-Block-Proliferationsindex (CBPI) oder dem Replikationsindex (RI) beru ­
hen (16) (58). Der CBPI gibt die mittlere Zahl der Zellzyklen pro Zelle während der 
Exposition gegenüber cytoB an und kann zur Berechnung der Zellproliferation einge ­
setzt werden. Der RI gibt die relative Zahl der Zellkerne in behandelten Kulturen im Vergleich zu Kontrollkulturen an und kann zur Berechnung der Zytostase in % ver ­
wendet werden:
 
% Zytostase = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)}  
Und:  
T = mit der Prüfchemikalie behandelte Kultur  
C = Vehikel-Kontrollkultur  
Dabei gilt:  
CBPI ¼ ððZahl der einkernigen Zellen Þ þ ð2 Ü Zahl der zweikernigen Zellen Þ þ ð3 Ü Zahl der mehrkernigen Zellen ÞÞ 
ðGesamtzellzahlÞ 
Damit entspricht ein CBPI von 1 (alle Zellen sind einkernig) einer Zytostase von 
100 %.  
Zytostase = 100 – RI  
RI ¼ ððZahl der zweikernigen Zellen Þ þ ð2 Ü Zahl der mehrkernigen Zellen ÞÞ ö ðGesamtzellzahlÞ T 
ððZahl der zweikernigen Zellen Þ þ ð2 Ü Zahl der mehrkernigen Zellen ÞÞ ö ðGesamtzellzahlÞ C Ü 100  
T = behandelte Kulturen  
C = Kontrollkulturen  
2. Folglich bedeutet ein RI von 53 %: von 100 % der Zellen in der Kontroll ­
kultur, die sich geteilt und anschließend zweikernige und mehrkernige Zellen 
gebildet haben, haben sich in der behandelten Kultur nur 53 % geteilt, d. h. es 
ergibt sich für die Zytostase ein prozentualer Wert von 47 %.  
3. Wenn kein cytoB zum Einsatz kommt , wird eine Bewertung der Zytotoxizität 
auf der Basis der Relativen Erhöhung der Zellzahl (RICC) oder der Relativen 
Populationsverdopplung (RPD) empfohlen (58), da bei beiden der Anteil der Zellpopulation berücksichtigt wird, die eine Teilung vollzogen hat.
 
RICC ¼ ðErhöhung der Zellzahl in behandelten Kulturen  ðEnde — BeginnÞÞ 
ðErhöhung der Zellzahl in Kontrollkulturen  ðEnde — BeginnÞÞ Ü 100  
RPD ¼ ðZahl der Populationsverdopplungen in behandelten Kulturen Þ 
ðZahl der Populationsverdopplungen in Kontrollkulturen Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 728
 
Dabei gilt:  
Populationsverdopplung = [log (Zellzahl nach Behandlung ÷ Anfängliche Zell ­
zahl)] ÷ log 2  
4. Somit zeigt ein RICC oder eine RPD von 53 % eine Zytotoxizität/Zytostase 
von 47 % an.  
5. Bei Verwendung eines Proliferationsindex (PI) kann die Zytotoxizität durch 
das Zählen aller Klone bewertet werden, die aus 1 Zelle (cl1), 2 Zellen (cl2), 3 
bis 4 Zellen (cl4) sowie 5 bis 8 Zellen (cl8) bestehen.  
PI ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. Der PI wurde als aussagefähiger und zuverlässiger Parameter für Zytotoxi ­
zität auch bei Zelllinien verwendet, die  in situ  ohne cytoB kultiviert wurden (25) 
(26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 729
 
Anlage 3  
Zur Leistungsbewertung empfohlene Referenzsubstanzen  ( 1 ) 
Kategorie Substanz CAS-Nr. EG-Nr.:  
1. Klastogene, die ohne Stoffwechsel-Aktivierung wirken 
Zytosin-Arabinosid 147-94-4 205-705-9 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
2. Klastogene, die eine Stoffwechsel-Aktivierung erfordern 
Benzo(a)pyren 50-32-8 200-028-5 
Zyklophosphamid 50-18-0 200-015-4 
3. Aneugene 
Colchicin 64-86-8 200-598-5 Vinblastin 143-67-9 205-606-0 
4. Negative Substanzen 
Di(2-ethylhexyl)phthalat 117-81-7 204-211-0 
Nalidixinsäure 389-08-2 206-864-7 Pyren 129-00-0 204-927-3 Natriumchlorid 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Die Referenzsubstanzen sind die zur Verwendung empfohlenen Chemikalien. Der Ersatz oder die Hinzufügung bestimmter Stoffe zu 
der Liste der Referenzsubstanzen ist möglich, wenn ihre Wirkung bekannt ist, wenn sie Mikrokerne mittels derselben Wirkmecha ­
nismen induzieren und wenn sie sich als relevant für die Chemikalien erweisen, die mit dem MNvit-Verfahren geprüft werden. Je 
nach Verwendungszweck könnte die Begründung eine Validierungsstudie enthalten, die entweder auf einer breiten Auswahl an 
Substanzen beruht oder sich auf ein engeres Spektrum auf der Grundlage der chemischen Klasse der Prüfsubstanz oder des 
untersuchten Schädigungsmechanismus konzentriert.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 730
 
B.50.  HAUTSENSIBILISIERUNG: LOKALER LYMPHKNOTENTEST: DA  
EINLEITUNG  
1. Die OECD-Leitlinien für die Prüfung von Chemikalien und die 
EU-Prüfmethoden werden regelmäßig überarbeitet, um dem wissenschaftli ­
chen Fortschritt, sich ändernden Rechtsvorgaben und Belangen des Tierschut ­
zes gerecht zu werden. Die ursprüngliche Prüfmethode (B.42) zur Bestimmung 
der Hautsensibilisierung bei der Maus, der Lokale Lymphknotentest (Local 
Lymph Node Assay bzw. LLNA; OECD-Prüfrichtlinie 429) wurde inzwischen überarbeitet (1). Verschiedene Veröffentlichungen (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) gehen genauer auf die Validierung des LLNA und auf die mit ihm verbunde ­
nen wissenschaftlichen Arbeiten ein. Bei dem LLNA wird zur Messung der 
Lymphozytenproliferation radioisotopisches Thymidin oder Jod verwendet. Der Test hat daher Beschränkungen, wenn der Erwerb, die Verwendung oder die Entsorgung radioaktiver Materialien mit Problemen verbunden sind. 
Bei dem LLNA: DA (entwickelt von Daicel Chemical Industries, Ltd.) handelt 
es sich um eine nicht-radioaktive Modifikation des LLNA, die den Gehalt an Adenosintriphosphat (ATP) mittels Biolumineszenz als Indikator für die Lym ­
phozytenproliferation bestimmt. Die Prüfmethode LLNA: DA wurde durch ein 
internationales Gremium für Sachverständigengutachten (peer review) vali ­
diert, geprüft und zur Identifizierung sensibilisierender und nicht sensibilisie ­
render Chemikalien mit einigen Beschränkungen als geeignet befunden (10) (11) (12) (13). Diese Prüfmethode wurde zur Bewertung des Hautsensibilisie ­
rungspotenzials von Chemikalien (Stoffen und Gemischen) bei Tieren ent ­
wickelt. Kapitel B.6 dieses Anhangs und OECD-Prüfrichtlinie 406 stützen sich auf Meerschweinchen-Tests, insbesondere den Meerschweinchen-Maximierungstest und den Bühler-Test (14). Der LLNA 
(Kapitel B.42 dieses Anhangs; OECD-Prüfrichtlinie 429) und die beiden 
nicht-radioaktiven Modifikationen, LLNA: DA (Kapitel B.50 dieses Anhangs; OECD-Prüfrichtlinie 442 A) und LLNA: BrdU-ELISA (Kapitel B.51 dieses Anhangs; OECD-Prüfrichtlinie 442 B) haben insofern Vorteile gegenüber den 
Meerschweinchen-Tests in B.6 und OECD-Prüfrichtlinie 406 (14), als sie 
einen verringerten und gezielteren Einsatz von Versuchstieren ermöglichen.
 
2. Ebenso wie im LLNA wird bei dem LLNA: DA die Induktionsphase der 
Hautsensibilisierung untersucht. Der Test liefert quantitative Daten für die Bewertung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen. Durch den möglichen Nach ­
weis von hautsensibilisierenden Stoffen ohne die Verwendung radioaktiver 
Markierungen für die DNA können die berufliche Exposition gegenüber Radioaktivität und Entsorgungsprobleme vermieden werden. Dies wiederum ermöglicht eine verstärkte Verwendung von Mäusen zur Bestimmung haut ­
sensibilisierender Stoffe und somit eine geringere Verwendung von Meer ­
schweinchen zur Bewertung des hautsensibilisierenden Potenzials (B.6; OECD-Prüfrichtlinie 406) (14).
 
BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
3. Die verwendeten Begriffsbestimmungen sind in Anlage 1 aufgeführt.  
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN UND BEGRENZUNGEN  
4. Der LLNA: DA ist eine modifizierte LLNA-Methode zum Nachweis von 
Chemikalien mit potenziell hautsensibilisierenden Eigenschaften, mit be ­
stimmten Beschränkungen. Dies bedeutet nicht notwendigerweise, dass der LLNA: DA zwingend in jedem Fall anstelle des LLNA oder der Meerschweinchen-Tests (B.6; OECD-Prüfrichtlinie) (14) eingesetzt werden 
muss. Vielmehr erweist sich der Test als gleichermaßen wertvoll und kann 
als Alternative gewählt werden, bei der im Allgemeinen keine weitere Be ­
stätigung von positiven oder negativen Ergebnissen erforderlich ist. (10) (11). Das Prüflabor sollte vor der Durchführung der Studie alle verfügbaren 
Informationen über die Prüfsubstanz auswerten und berücksichtigen. Zu 
diesen Informationen zählen die Identität und die chemische Struktur der
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Prüfsubstanz, ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften, die Ergebnisse 
aller sonstigen  in vitro - oder  in vivo -Toxizitätsprüfungen der Prüfsubstanz 
sowie toxikologische Daten zu strukturell verwandten Chemikalien. Diese Informationen sind zu berücksichtigen, um die Eignung des LLNA: DA für die jeweilige Prüfsubstanz festzustellen (bestimmte Arten chemischer Stoffe 
sind mit dem LLNA: DA nicht kompatibel [siehe Absatz 5]) und die Fest ­
legung der Dosis zu erleichtern.
 
5. Beim LLNA: DA handelt es sich um eine  in vivo -Methode. Das bedeutet, 
dass die kontaktsensibilisierenden Eigenschaften weiterhin an Tieren bewer ­
tet werden. Der Test erlaubt es jedoch, im Vergleich zu den Meerschweinchen-Tests (B.6; OECD-Prüfrichtlinie 406) die Anzahl der für 
diesen Zweck benötigten Tiere zu reduzieren (14). Zudem ist der LLNA: 
DA eine wesentlich verfeinerte Methode im Hinblick auf die Verwendung der Tiere (weniger Schmerzen und Leiden) bei den Tests zur Kontraktsen ­
sibilisierung, da es beim LLNA: DA, anders als bei B.6 und 
OECD-Prüfrichtlinie 406, nicht erforderlich ist, provozierte Überempfind ­
lichkeitsreaktionen der Haut auszulösen. Trotz der Vorteile, die der LLNA: DA gegenüber B.6 und OECD-Prüfrichtlinie 406 (14) aufweist, ist er mit gewissen Einschränkungen behaftet, die die Anwendung von B.6 oder von 
OECD-Prüfrichtlinie 406 erforderlich machen können (z. B. die Prüfung 
bestimmter Metalle, falsch positive Ergebnisse bei bestimmten hautreizenden Stoffen [wie etwa bei tensidähnlichen Chemikalien] (6) (1 und Kapitel B.42 in diesem Anhang), oder die Löslichkeit der Prüfsubstanz). Zudem können 
chemische Klassen oder Substanzen mit Funktionsgruppen, die erwiesener ­
maßen als potenzielle Störfaktoren wirken können (16), den Einsatz von Meerschweinchen-Tests erforderlich machen (B.6; OECD-Prüfrichtlinie 406) (14)). Beschränkungen, die für den LLNA festgestellt wurden (1, 
und Kapitel B.42 dieses Anhangs), empfehlen sich auch für den LLNA: 
DA (10). Zudem könnte die Verwendung des LLNA: DA ungeeignet sein für die Prüfung von Substanzen mit Auswirkungen auf das ATP-Niveau (z. B. Substanzen, die als ATP-Hemmer wirken) oder Substanzen, die die ge ­
naue Messung der intrazellulären ATP-Messung beeinträchtigen (z. B. Vor ­
handensein ATP abbauender Enzyme, Vorhandensein extrazellulären ATPs im Lymphknoten). Abgesehen von diesen bekannten Beschränkungen dürfte der LLNA: DA für die Prüfung aller Substanzen geeignet sein, sofern mit 
diesen Substanzen keine Eigenschaften verbunden sind, die die Genauigkeit 
des LLNA: DA beeinträchtigen könnten. Außerdem sollte die Möglichkeit positiver Grenzergebnisse in Betracht gezogen werden, wenn für den Stimulationsindex (SI) Werte zwischen 1,8 und 2,5 ermittelt werden (siehe 
Absätze 31-32). Dies beruht auf der Validierungs-Datenbasis von 44 Sub ­
stanzen mit einem SI ≥ 1,8 (siehe Absatz 6), bei denen der LLNA: DA alle 
32 LLNA-Sensibilisatoren richtig identifizierte, jedoch drei von 12 LLNA-Nichtsensibilisatoren mit SI-Werten zwischen 1,8 und 2,5 (d. h. 
positive Grenzwerte) (10) nicht korrekt identifizierte. Da allerdings derselbe 
Datensatz für die Einstellung der SI-Werte und die Berechnung der prädik ­
tiven Eigenschaften des Tests verwendet wurde, könnten die festgestellten 
Ergebnisse auch eine Überbewertung der tatsächlichen prädiktiven Eigen ­
schaften sein.
 
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
6. Der LLNA: DA beruht auf dem Prinzip, dass sensibilisierende Stoffe eine 
Lymphozytenproliferation in den drainierenden Lymphknoten an der Stelle der Applikation des chemischen Stoffes induzieren. Diese Proliferation ver ­
läuft proportional zur Dosis und zur Wirksamkeit des applizierten Allergens 
und bietet sich als einfache Möglichkeit an, eine quantitative Messung der 
Sensibilisierung zu erhalten. Die Proliferation wird gemessen, indem man die mittlere Proliferation jeder Prüfgruppe mit der mittleren Proliferation der mit Vehikel behandelten Kontrollgruppe (VK) vergleicht. Das Verhältnis der 
mittleren Proliferation in jeder Behandlungsgruppe zu dem in der gleich ­
zeitigen Vehikelkontrollgruppe, auch als SI bezeichnet, wird
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festgelegt und sollte ≥ 1,8 betragen, ehe eine weitere Bewertung einer Prüf ­
substanz als potenzieller Hautsensibilisator erfolgt. Die hier beschriebenen 
Methoden beruhen auf der Messung des ATP-Gehalts durch Biolumineszenz (die bekanntermaßen mit der Anzahl lebender Zellen korreliert) (17), um einen erhöhten Anteil proliferierender Zellen in den drainierenden aurikulä ­
ren Lymphknoten nachzuweisen (18) (19). Die Biolumineszenz-Methode 
stützt sich auf das Enzym Luciferase, um die Bildung von Licht aus ATP und Luciferin mittels der folgenden Reaktion zu katalysieren:
 
ATP + Luciferin  + O 2
 Oxyluciferin  + AMP  + PP  i + CO  2 + Light  
Die emittierte Lichtintensität steht in linearer Beziehung zur 
ATP-Konzentration und wird mit einem Luminometer gemessen. Bei dem Luciferin-Luciferase-Test handelt es sich um eine sensible Methode zur ATP-Quantifizierung, die in einer breiten Palette von Anwendungen zum 
Einsatz kommt (20).
 
BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
Auswahl von Versuchstierarten  
7. Für diesen Test ist die Maus die Spezies der Wahl. Validierungsstudien für 
den LLNA: DA wurden ausschließlich mit dem CBA/J-Stamm durchgeführt, 
der daher als bevorzugter Stamm gilt (12) (13). Es werden junge erwachsene weibliche Mäuse verwendet, die weder geworfen haben noch trächtig sind. Bei Versuchsbeginn sollten die Tiere 8-12 Wochen alt sein, die Gewichts ­
unterschiede minimal sein und 20 % des mittleren Gewichts nicht überstei ­
gen. Alternativ können Tests an anderen Stämmen und männlichen Tieren erfolgen, wenn anhand von hinlänglich großen Datenangaben nachgewiesen werden kann, dass keine signifikanten stamm- und/oder geschlechtsspezi ­
fischen Unterschiede in der Reaktion auf den LLNA: DA bestehen.
 
Haltungs- und Fütterungsbedingungen  
8. Mäuse sollten in Gruppen gehalten werden (21), wenn nicht angemessene 
wissenschaftliche Begründungen eine Einzelhaltung nahelegen. Die Tem ­
peratur im Versuchsraum sollte 22 ± 3 °C betragen. Obwohl die relative 
Luftfeuchtigkeit mindestens 30 % betragen und zu anderen Zeiten als wäh ­
rend der Reinigung vorzugsweise nicht über 70 % liegen soll, ist ein Wert von 50-60 % anzustreben. Die Beleuchtung sollte künstlich sein und die 
Hell- und Dunkelphasen sollten sich im Abstand von 12 Stunden abwech ­
seln. An die Versuchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert wer ­
den, und eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung ist zu gewährleisten.
 
Vorbereitung der Tiere  
9. Die Tiere werden nach Zufallskriterien ausgewählt, zur individuellen Iden ­
tifizierung markiert (aber nicht am Ohr) und vor Beginn der Dosierung für 
einen Zeitraum von mindestens 5 Tagen in ihren Käfigen an die Laborbe ­
dingungen gewöhnt. Vor Behandlungsbeginn werden alle Tiere untersucht, 
um sicherzustellen, dass keine sichtbaren Hautverletzungen bestehen.  
Vorbereitung der Dosierlösungen  
10. Feste Chemikalien sollten vor der Applikation in ein Mäuseohr in Lösungs ­
mitteln/Vehikeln gelöst oder suspendiert und ggf. verdünnt werden. Flüssige Chemikalien können direkt appliziert oder zuvor verdünnt werden. Unlösli ­
che Chemikalien, wie sie in der Regel in Medizinprodukten vorliegen, soll ­
ten vor der Applikation in ein Mäuseohr in einem geeigneten Lösungsmittel einer übertrieben starken Extraktion unterzogen werden, um alle extrahier ­
baren Inhaltsstoffe vor der Prüfung sichtbar zu machen. Die Prüfsubstanzen 
sollten täglich zubereitet werden, es sei denn, die Stabilität der Substanz bei 
Lagerung wird nachgewiesen.
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Überprüfung der Zuverlässigkeit:  
11. Anhand von positiven Kontrollchemikalien (PC) wird die ordnungsgemäße 
Leistung des Tests nachgewiesen. Hierzu ist eine angemessene und reproduzier ­
bare Empfindlichkeit der Reaktion auf eine sensibilisierende Prüfsubstanz er ­
forderlich, wobei die Reaktionsstärke gut charakterisiert ist. Es wird die Ein ­
beziehung einer gleichzeitigen Positivkontrolle empfohlen, da diese die Fähig ­
keit des Labors belegt, jeden Test erfolgreich durchzuführen und eine Bewertung 
der Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Labors er ­
möglicht. Einige Regulierungsbehörden schreiben eine Positivkontrolle für jede Studie vor. Daher wird Anwendern empfohlen, vor Durchführung des LLNA: 
DA die zuständigen Behörden zu Rate zu ziehen. Dementsprechend wird die 
routinemäßige Verwendung einer gleichzeitigen Positivkontrolle angeregt, um die Notwendigkeit zusätzlicher Tierversuche zur Erfüllung von Anforderungen zu vermeiden, die aus der Verwendung einer nur periodischen Positivkontrolle 
resultieren könnten (siehe Absatz 12). Die Positivkontrolle sollte eine positive 
Reaktion auf den LLNA: DA bei einem Expositionsniveau hervorrufen, das einen Anstieg des Stimulationsindex (SI ≥ 1,8 im Vergleich zur Negativkontroll ­
gruppe, NK) bewirkt. Die positive Kontrolldosis soll so gewählt werden, dass sie 
keine übermäßige Hautreizung oder systemische Toxizität verursacht und die 
Induktion reproduzierbar, aber nicht exzessiv ist (z. B. ein SI > 10 würde als exzessiv gelten). Bevorzugte positive Kontrollstoffe sind 25 % Hexylcinnami ­
naldehyd (Chemical Abstracts Service [CAS]-Nr. 101-86-0) und 25 % Eugenol 
(CAS-Nummer 97-53-0) in Aceton: Olivenöl (4:1, v/v). Unter bestimmten Um ­
ständen können in ausreichend begründeten Fällen andere Kontrollsubstanzen eingesetzt werden, die den genannten Kriterien entsprechen.
 
12. Obwohl die Einbeziehung einer gleichzeitigen Positivkontrollgruppe emp ­
fohlen wird, können in gewissen Situationen periodische Prüfungen (d. h. in Abständen ≤ 6 Monaten) der Positivkontrolle für Laboratorien ausreichen, 
die den LLNA: DA regelmäßig (d. h. mindestens einmal pro Monat) durch ­
führen und über eine etablierte historische Kontrolldatenbasis verfügen, die 
die Fähigkeit des Labors bestätigt, reproduzierbare und genaue Ergebnisse mit Positivkontrollen zu erzielen. Eine angemessene Beherrschung des LLNA: DA kann erfolgreich nachgewiesen werden, indem durchgehend 
positive Ergebnisse mit den positiven Kontrollchemikalien in mindestens 
10 unabhängigen Prüfungen erzielt werden, die innerhalb eines angemesse ­
nen Zeitraums (d. h. in weniger als einem Jahr) durchgeführt wurden.
 
13. Eine gleichzeitige Positivkontrollgruppe sollte immer einbezogen werden, 
wenn Verfahrensänderungen im LLNA: DA auftreten (z. B. Wechsel des geschulten Personals, Änderung der Materialien bei den Prüfmethoden und/ oder der Reagenzien, Änderung der Ausrüstung, Änderung der Herkunft der 
Versuchstiere). Solche Änderungen sollten in Laborberichten dokumentiert 
werden. Ferner ist der Einfluss dieser Änderungen auf die Aussagefähigkeit der zuvor eingerichteten historischen Datenbank zu bedenken. Dabei sollte die Notwendigkeit überdacht werden, eine neue historische Datenbank ein ­
zurichten, um die gleichbleibende Qualität der positiven Kontrollergebnisse 
zu dokumentieren.
 
14. Die Prüfer sollten sich der Tatsache bewusst sein, dass die Entscheidung, 
eine PC-Studie periodisch statt gleichzeitig durchzuführen, Auswirkungen 
auf die Aussagefähigkeit und Akzeptanz negativer Studienergebnisse haben 
kann, die ohne gleichzeitige Positivkontrolle im Zeitraum zwischen den einzelnen periodischen PC-Studien auftreten können. Wenn zum Beispiel ein falsch negatives Ergebnis in der periodischen PC-Studie auftritt, können 
negative Ergebnisse für die Prüfsubstanz, die in dem Zeitraum zwischen der 
letzten akzeptablen periodischen PC-Studie und der inakzeptablen periodi ­
schen PC-Studie aufgetreten waren, in Frage gestellt werden. Die Auswir ­
kungen solcher Ergebnisse sollten sorgfältig bedacht werden, wenn entschie ­
den wird, ob gleichzeitige oder nur periodische PC-Studien durchgeführt 
werden sollen. Auch ist die Verwendung einer geringeren Anzahl an Ver ­
suchstieren bei der gleichzeitigen Positivkontroll-Gruppe zu bedenken, wenn dies wissenschaftlich zu begründen ist und wenn das Labor auf der Grund ­
lage laborspezifischer historischer Daten nachweist, dass eine geringere An ­
zahl an Mäusen ausreicht (22).
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15. Obwohl eine positive Kontrollchemikalie in einem Vehikel getestet werden 
sollte, das bekanntermaßen eine gleichbleibende Reaktion auslöst (z. B. 
Aceton: Olivenöl; 4:1, v/v), können in bestimmten Rechtssituationen außer ­
dem Prüfungen in einem Nichtstandard-Vehikel (klinisch/chemisch relevante Formulierung) erforderlich sein (23). Wenn die gleichzeitige Positivkontrolle 
in einem anderen Vehikel als der Prüfsubstanz getestet wird, sollte eine 
gesonderte Vehikelkontrolle für die gleichzeitige PC einbezogen werden.
 
16. In Fällen, in denen Prüfsubstanzen einer bestimmten chemischen Klasse 
oder eine Reihe von Reaktionen bewertet werden, können Referenzsubstan ­
zen nützlich sein, um nachzuweisen, dass die Prüfmethode zur Feststellung des Hautsensibilisierungspotenzials dieser Art von Prüfsubstanzen ordnungs ­
gemäß funktioniert. Geeignete Referenzsubstanzen sollten die folgenden 
Eigenschaften haben:
 
— strukturelle und funktionale Ähnlichkeit mit der Klasse der getesteten 
Prüfsubstanz;  
— bekannte physikalische/chemische Eigenschaften;  
— zugrunde liegende Daten aus dem LLNA: DA;  
— zugrunde liegende Daten aus anderen Tiermodellen und/oder von Men ­
schen.  
TESTVERFAHREN  
Anzahl der Versuchstiere und Dosierungen  
17. Mindestens vier Tiere pro Dosisgruppe mit jeweils mindestens drei Konzen ­
trationen der Prüfsubstanz werden benötigt; zusätzlich braucht man eine 
Negativkontrollgruppe, die nur mit dem Vehikel für die Prüfsubstanz be ­
handelt wird, sowie eine Positivkontrolle (gleichzeitig oder jüngeren Da ­
tums, auf der Grundlage der Laborvorschriften in den relevanten Abschnit ­
ten 11-15). Tests mit Mehrfachdosen der PC sollten in Erwägung gezogen werden, insbesondere wenn die Positivkontrolle intermittierend getestet wird. Bis auf die Verabreichung der Prüfsubstanz sind die Tiere der Kon ­
trollgruppen ebenso zu behandeln wie die Tiere der Behandlungsgruppen.
 
18. Die Auswahl der Dosis und des Vehikels soll anhand der Empfehlungen in 
(2) und (24) erfolgen. Für aufeinanderfolgende Dosierungen werden norma ­
lerweise geeignete abgestufte Konzentrationen gewählt, wie z. B. 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % usw. Die Auswahl der Kon ­
zentrationsfolge sollte angemessen wissenschaftlich begründet werden. Alle 
vorhandenen toxikologischen Angaben (z. B. über die akute Toxizität und 
Hautreizung) sowie strukturelle und physiochemische Angaben zu der je ­
weiligen Prüfsubstanz (und/oder strukturverwandten Substanzen) sollten bei der Festlegung von drei aufeinander folgenden Konzentrationen berücksich ­
tigt werden, so dass bei der Höchstkonzentration einerseits die Exposition 
maximiert und andererseits eine systemische Toxizität und/oder eine über ­
mäßige lokale Hautreizung ausgeschlossen werden (24) (25). Mangels sol ­
cher Informationen kann ein anfänglicher Dosisfindungstest erforderlich sein 
(siehe Absätze 21-24).
 
19. Das Vehikel sollte das Testergebnis nicht beeinflussen oder beeinträchtigen 
und sollte so gewählt werden, dass die Löslichkeit zur Erzielung einer 
möglichst hohen Konzentration maximiert und gleichzeitig eine für das Applizieren der Prüfsubstanz geeignete Lösung/Suspension hergestellt wer ­
den kann. Empfohlene Vehikel sind Aceton: Olivenöl (4:1, v/v),  N,N -Di­
methylformamid, Methylethylketon, Propylenglykol und Dimethylsulphoxid 
(6), wobei mit hinreichender wissenschaftlicher Begründung auch andere Vehikel verwendet werden können. Unter bestimmten Umständen muss ein klinisch relevantes Lösungsmittel oder die handelsübliche Zubereitung, 
in der die Prüfsubstanz vermarktet wird, als zusätzliche Kontrolle genutzt 
werden. Besondere Sorgfalt sollte darauf verwendet werden, zu gewährleis ­
ten, dass in das Vehikelsystem durch die Verwendung geeigneter Lösungs ­
vermittler (z. B. 1 % Pluronic
 ® L92) hydrophile Stoffe eingearbeitet werden, 
die die Haut befeuchten und nicht sofort ablaufen. Folglich sind vollständig 
wässrige Vehikel zu vermeiden.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 735
 
20. Die Bearbeitung von Lymphknoten einzelner Mäuse ermöglicht die Bewer ­
tung der Variabilität von Tieren sowie einen statistischen Vergleich zwi ­
schen der Prüfsubstanz und Messungen an der Vehikelkontrollgruppe (siehe Absatz 33). Die Möglichkeit, die Anzahl der Mäuse in der Positivkontroll ­
gruppe zu verringern, ist nur realistisch, wenn Einzeltierdaten erhoben wer ­
den (22). Außerdem verlangen einige Regulierungsbehörden die Erhebung 
von Daten einzelner Tiere. Die regelmäßige Erhebung von Einzeltierdaten stellt im Hinblick auf den Tierschutz einen Vorteil dar, indem Doppeltests vermieden werden. Diese wären notwendig, wenn die ursprünglich gemein ­
sam gesammelten Ergebnisse für die Prüfsubstanz (z. B. über gepoolte 
Daten) später von Regulierungsbehörden mit anderen Vorschriften (z. B. Einzeltierdaten) geprüft würden.
 
Dosisfindungstest  
21. Wenn über die höchst mögliche Dosierung keine Informationen vorliegen 
(siehe Absatz 18), sollte ein Dosisfindungstest durchgeführt werden, um die geeignete Dosierung für den LLNA: DA festzulegen. Der Dosisfindungstest soll eine Orientierung bei der Auswahl der höchst möglichen Dosisstufe für 
die Hauptuntersuchung des LLNA: DA in Fällen liefern, in denen keine 
Informationen über Konzentrationen vorliegen, die zur systemischen Toxi ­
zität (siehe Absatz 24) und/oder zu übermäßiger Hautreizung führen (siehe Absatz 23). Die höchsten geprüften Dosisstufen sollten 100 % der Prüfsub ­
stanz bei Flüssigkeiten bzw. die höchst möglichen Konzentrationen bei Fest ­
stoffen oder Suspensionen sein.
 
22. Der Dosisfindungstest wird unter Bedingungen durchgeführt, die denen der 
Hauptstudie des LLNA: DA genau entsprechen. Allerdings gibt es hier 
keine Bewertung der Lymphknotenproliferation und es können weniger Tiere pro Dosisgruppe eingesetzt werden. Es werden ein oder zwei Tiere pro Dosisgruppe empfohlen. Alle Mäuse werden täglich auf klinische Zei ­
chen für systemische Toxizität oder lokale Reizungen an der Applikations ­
stelle untersucht. Das Körpergewicht wird vor dem Test und vor dem Ab ­
schluss (Tag 8) protokolliert. Beide Ohren jeder Maus werden auf Anzei ­
chen für Erytheme untersucht und mit Hilfe von Tabelle 1 bewertet (25). 
Die Ohrdicke wird mit Hilfe eines Ohrdickenmessgeräts (z. B. digitaler 
Mikrometer oder Peacock Dickenmessuhr) an Tag 1 vor der Dosierung, Tag 3 (ca. 48 Stunden nach der ersten Dosis), Tag 7 (24 Stunden vor Abschluss) und Tag 8 bestimmt. Zusätzlich kann an Tag 8 die Ohrdicke 
durch die Gewichtsbestimmung von Ohrstanzproben ermittelt werden. Dies 
sollte nach der tierschutzgerechten Tötung der Tiere erfolgen. Eine über ­
mäßige lokale Hautreizung wird durch eine Erythem-Punktzahl von ≥ 3 
und/oder eine Zunahme der Ohrdicke ≥ 25 % an jedem beliebigen Messtag 
angezeigt (26) (27). Als höchste Dosis für die Hauptuntersuchung des 
LLNA: DA wird die nächst niedrigere Dosis in der Konzentrationsreihe des Dosisfindungstests gewählt (siehe Absatz 18), die keine systemische Toxizität und/oder übermäßige lokale Hautreizung verursacht.
 
Tabelle 1  
Erythem-Klassifizierung  
Beobachtung Punktzahl  
Kein Erythem 0 
Sehr leichtes Erythem (kaum wahrnehmbar) 1 Klar abgegrenztes Erythem 2
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Beobachtung Punktzahl  
Mäßiges bis ausgeprägtes Erythem 3 
Schweres Erythem (dunkelrot) bis hin zur Schorfbildung, so dass eine 
Bewertung nicht möglich ist 4 
23. Zusätzlich zu einer Zunahme der Ohrdicke um 25 % (26) (27) wurde ein 
statistisch signifikanter Anstieg der Ohrdicke bei den behandelten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen zugrunde gelegt, um Reizstoffe in dem LLNA zu identifizieren (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Obwohl ein 
statistisch signifikanter Anstieg auch bei einer Ohrdicke von weniger als 
25 % auftreten kann, konnte kein spezifischer Zusammenhang mit einer übermäßigen Hautreizung festgestellt werden (30) (31) (32) (33) (34).
 
24. Die folgenden klinischen Beobachtungen können, sofern sie Bestandteil 
einer Gesamtbewertung sind, auf systemische Toxizität hinweisen (35) und somit die höchst mögliche Dosisstufe für die Hauptuntersuchung des 
LLNA: DA anzeigen: Änderungen der Funktionen des Nervensystems 
(z. B. Piloerektion, Ataxie, Tremor und Krämpfe); Verhaltensänderungen 
(z. B. Aggressivität, Änderungen bei der Fellpflege, auffallende Änderung 
des Aktivitätsniveaus); Änderungen des Atemmusters ( d. h. Änderung der 
Häufigkeit und Intensität des Atmens wie Dyspnoe, Keuchen, rasselnder 
Atem) sowie Änderungen der Futter- und Wasseraufnahme. Zusätzlich soll ­
ten Anzeichen von Lethargie und/oder Teilnahmslosigkeit sowie alle kli ­
nischen Anzeichen für mehr als leichte oder momentane Schmerzen und 
Qual, eine Gewichtsreduktion > 5 % zwischen Tag 1 und Tag 8 sowie 
die Sterblichkeit in der Bewertung berücksichtigt werden. Moribunde Tiere oder Tiere, die Anzeichen starker und andauernder Qualen zeigen, sollten tierschutzgerecht getötet werden (36).
 
Versuchsplan der Hauptuntersuchung  
25. Der Versuchsplan des Tests ist wie folgt:  
— Tag 1:  Jedes Tier wird einzeln gekennzeichnet und das Gewicht sowie 
jede klinische Beobachtung protokolliert. Es wird 1 % 
Natriumlaurylsulfat (NLS) in wässriger Lösung auf die Rückseite jedes 
Ohrs aufgetragen. Dies erfolgt mit vier bis fünf Strichen einer in die NLS-Lösung getauchten Bürste, so dass die gesamte Rückseite jedes Ohrs bedeckt ist. Eine Stunde nach der NLS-Behandlung werden 25 
μL der Prüfsubstanz in der jeweiligen Verdünnung, des Vehikels allein 
oder der PK (gleichzeitig oder jüngeren Datums) gemäß den Laborvor ­
schriften in den relevanten Abschnitten 11-15) auf die Rückseite jedes Ohrs appliziert.
 
— Tage 2, 3 und 7:  Die an Tag 1 erfolgte Vorbehandlung mit 1 % NLS 
wässriger Lösung und die Applikation der Prüfsubstanz werden wiederholt.  
— Tage 4, 5 und 6:  Keine Behandlung.  
— Tag 8:  Das Gewicht jedes Tiers sowie jede klinische Beobachtung 
werden protokolliert. Ca. 24 bis 30 Stunden nach Beginn der Applika ­
tion an Tag 7 werden die Tiere tierschutzgerecht getötet. Die drainie ­
renden aurikulären Lymphknoten jedes Mäuseohrs werden entfernt und separat (für jedes Tier einzeln) in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) gegeben. Einzelheiten und Diagramme der 
Lymphknotenidentifikation und -entfernung sind unter Referenz (22) 
aufgeführt. Zur weiteren Kontrolle der lokalen Hautreaktion in der Hauptuntersuchung können zusätzliche Parameter wie die Auswertung des Ohr-Erythems oder Ohrdickemessungen (mittels eines Dickenmess ­
geräts oder durch die Gewichtsbestimmung von Ohrstanzproben bei der 
Nekropsie) in das Untersuchungsprotokoll aufgenommen werden.
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Vorbereitung der Zellsuspensionen  
26. Für jede Maus wird eine Einzelzellsuspension der beidseitig entnommenen 
Lymphknotenzellen (LNC) erstellt, indem die Lymphknoten zwischen zwei 
Glasträger geklemmt werden und leichter Druck ausgeübt wird, um die Knoten zu zerquetschen. Nach der Vergewisserung, dass das Gewebe sich dünnflächig verteilt hat, können die beiden Träger voneinander gelöst wer ­
den. Das Gewebe auf beiden Trägern wird in PBS gelöst, indem jeder 
Träger im Winkel über die Petrischale gehalten wird und mit PBS gespült wird, während gleichzeitig das Gewebe mit einem Zellschaber von dem Träger abgeschabt wird. Die Lymphknoten bei Tieren der Negativkontroll ­
gruppe sind klein; daher ist Vorsicht geboten, um eine ungewollte Beein ­
flussung der SI-Werte zu vermeiden. Für das Spülen beider Träger sollte ein Gesamtvolumen von 1 mL PBS verwendet werden. Die Lymphknoten-Lösung in der Petrischale sollte mit dem Zellschaber leicht 
homogenisiert werden. Anschließend wird mit einer Mikropipette ein 20 μL 
Aliquot der Lymphknotenlösung entnommen (Achtung: nicht die für das Auge sichtbare Membran entnehmen) und mit 1,98 mL PBS gemischt, sodass sich eine Probe von 2 mL ergibt. Darauf wird eine zweite Probe 
von 2 mL mittels desselben Verfahrens zubereitet, sodass für jedes Tier zwei 
Proben vorliegen.
 
Bestimmung der Zellproliferation (Messung des ATP-Gehalts der Lympho ­
zyten)  
27. Erhöhungen des ATP-Gehalts in den Lymphknoten werden mittels der 
Luciferin-/Luciferase-Methode mit einem ATP-Mess-Kit bestimmt, das die Biolumineszenz in Relativen Lumineszenz-Einheiten (Relative Lumines ­
cence Units; RLU) misst. Die Testzeit zwischen dem Zeitpunkt der Tiertö ­
tung bis zur Messung des ATP-Gehalts für jedes einzelne Tier sollte gleich 
bleiben und bei bis zu ca. 30 Minuten liegen, da davon ausgegangen wird, dass der ATP-Gehalt nach der Tiertötung allmählich abnimmt (12). Folglich sollten die verschiedenen Verfahrensschritte ab der Entnahme der aurikulä ­
ren Lymphknoten bis zur ATP-Messung nach einem vorher festgelegten 
Zeitplan, der für jedes Tier gleich ist, innerhalb von 20 Minuten abgeschlos ­
sen werden. Die ATP-Lumineszenz sollte in jeder Probe von 2 mL gemes ­
sen werden, so dass für jedes Tier zwei ATP-Messungen vorliegen. An ­
schließend wird die mittlere ATP-Lumineszenz bestimmt und in den folgen ­
den Berechnungen verwendet (siehe Absatz 30).
 
BEOBACHTUNGEN  
Klinische Beobachtungen  
28. Jede Maus sollte mindestens einmal täglich sorgfältig auf klinische Zeichen, 
d. h. lokale Reizung an der Applikationsstelle, oder auf systemische Toxi ­
zität untersucht werden. Alle Beobachtungen werden systematisch in Einzel ­
protokollen dokumentiert, die für jedes Tier geführt werden. Die Über ­
wachungspläne sollten Kriterien beinhalten, anhand derer Mäuse mit syste ­
mischer Toxizität, übermäßiger lokaler Hautreizung oder Hautätzung schnell zu Zwecken der schmerzlosen Tötung identifiziert werden können (36).
 
Körpergewicht  
29. In Abschnitt 25 wurde bereits ausgeführt, dass das Körpergewicht der ein ­
zelnen Tiere zu Versuchsbeginn und zum Zeitpunkt der tierschutzgerechten Tötung der Tiere laut Versuchsplan festgestellt werden soll.
 
BERECHNUNG DER ERGEBNISSE  
30. Die Ergebnisse für jede Behandlungsgruppe werden als mittlerer 
Stimulationsindex (SI) angegeben. Den SI erhält man durch Teilen der mitt ­
leren RLU pro Maus innerhalb jeder Prüfgruppe und der Positivkontroll ­
gruppe durch die mittleren RLU pro Maus für die Lösungsmittel-/Vehikel ­
kontrollgruppe. Der durchschnittliche SI beträgt demnach für die mit Vehi ­
kel behandelten Kontrollen 1.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 738
 
31. In dem Entscheidungsprozess gilt ein Ergebnis als positiv, wenn SI ≥ 1,8 ist 
(10). Die Stärke der Dosis-Wirkung, die statistische Signifikanz und die 
gleichbleibende Qualität der Lösungsmittel-/Vehikel-Reaktion sowie der Re ­
aktion der Positivkontrolle können aber auch benutzt werden, um festzule ­
gen, ob ein Grenzergebnis (d. h. SI-Wert zwischen 1,8 und 2,5) als positiv 
bezeichnet werden soll (2) (3) (37).  
32. Bei einer positiven Grenzwertreaktion mit einem SI zwischen 1,8 und 2,5 
können Anwender zusätzliche Informationen berücksichtigen, wie z. B. die Dosis-Wirkungs-Beziehung, das Vorliegen einer systemischen Toxizität oder 
übermäßigen Hautreizung, sowie gegebenenfalls die statistische Signifikanz 
zusammen mit den SI-Werten, um zu bestätigen, dass die Ergebnisse positiv sind (10). Zu beachten sind ferner die verschiedenen Eigenschaften der Prüfsubstanz, wobei es unter anderem zu klären gilt, ob ein struktureller 
Zusammenhang mit bekannten Hautsensibilisatoren besteht, ob sie eine 
übermäßige lokale Hautreizung bei der Maus hervorruft und wie die fest ­
gestellte Art der Reaktion bezüglich der Dosis ist. Diese und weitere As ­
pekte werden an anderer Stelle ausführlich erörtert (4).
 
33. Werden die Daten für jede einzelne Maus erhoben, kann eine statistische 
Analyse zu Vorhandensein und Grad des Dosis-Wirkungs-Verhältnisses in den Daten durchgeführt werden. Jede statistische Auswertung könnte eine Bewertung der Dosis-Wirkungs-Beziehung sowie geeignete 
Testgruppen-Vergleiche beinhalten (z. B. Gruppe mit paarweiser Dosierung 
vs. gleichzeitige Lösungsmittel-/Vehikelkontrollgruppen). Die statistischen Analysen könnten z. B. die lineare Regression, den Williams-Test zur Be ­
wertung von Dosis-Wirkungs-Trends oder den Dunnett-Test für paarweise 
Vergleiche beinhalten. Bei der Auswahl einer geeigneten Methode für die 
statistische Analyse sollte sich der Prüfer möglicher ungleicher Varianzen und anderer damit zusammenhängender Probleme stets bewusst sein, denn diese erfordern unter Umständen eine Datentransformation oder ein 
nicht-parametrisches statistisches Verfahren. Auf jeden Fall muss der Prüfer 
unter Umständen SI-Berechnungen und statistische Analysen mit und ohne bestimmte Datenpunkte (manchmal als „Ausreißer“ bezeichnet) vornehmen.
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Daten  
34. Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Sie sollten die 
RLU-Einzelwerte, die mittleren RLU-Gruppenwerte pro Tier, die damit ver ­
bundene Fehlervariable (z. B. SD, SEM) und den mittleren SI für jede Dosisgruppe, verglichen mit der gleichzeitigen Lösungsmittel-/Vehikelkon ­
trollgruppe angeben.
 
Prüfbericht  
35. Der Testbericht sollte folgende Angaben enthalten:  
Prüf- und Kontrollsubstanzen:  
— Angaben zur Identität (z. B. CAS-Nummer und EG-Nummer, falls vor ­
handen; Bezugsquelle; Reinheit; bekannte Verunreinigungen; Chargen ­
nummer);  
— physikalische Beschaffenheit und physikalisch-chemische Eigenschaften 
(z. B. Flüchtigkeit, Stabilität, Löslichkeit);  
— bei Mischungen Zusammensetzung und relative Anteile der Bestandteile 
in Prozent;  
Lösungsmittel/Vehikel:  
— Angaben zur Identität (Reinheit, Konzentration, gegebenenfalls verwen ­
dete Mengen);  
— Begründung für die Wahl des Vehikels;  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 739
 
Versuchstiere:  
— Herkunft der CBA-Mäuse;  
— mikrobiologischer Status der Tiere, soweit bekannt;  
— Anzahl und Alter der Tiere;  
— Herkunft der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.;  
Prüfbedingungen:  
— Herkunft, Chargennummer und Daten des Herstellers zur Qualitätssiche ­
rung/Qualitätskontrolle für das ATP-Kit;  
— Angaben zur Vorbereitung und Applikation der Prüfsubstanz;  
— Begründung der gewählten Dosierung (mit Ergebnissen des eventuell 
durchgeführten Dosisfindungstests);  
— verwendete Konzentrationen des Vehikels und der Prüfsubstanz sowie 
Gesamtmenge der applizierten Prüfsubstanz;  
— Angaben über Futter- und Wasserqualität (einschließlich Art/Herkunft 
des Futters, Wasserquelle);  
— nähere Angaben zum Behandlungs- und Stichprobenentnahmeplan;  
— Methoden zur Bestimmung der Toxizität;  
— Kriterien zur Einstufung der Studien als positiv oder negativ;  
— Einzelheiten zu eventuellen Protokollabweichungen und eine Erklärung 
dazu, wie sich diese Abweichung auf Prüfdesign und Ergebnisse aus ­
wirkt.  
Überprüfung der Zuverlässigkeit:  
— Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse der letzten Überprüfung 
der Zuverlässigkeit mit Angaben zu verwendeten Prüfsubstanzen, Kon ­
zentration und Vehikel;  
— gleichzeitige und/oder historische PC und gleichzeitige Daten der Nega ­
tivkontrolle (Lösungsmittel/Vehikel) für das Prüflabor;  
— wenn keine gleichzeitige PC eingeschlossen war, Datum und Laborbe ­
richt über die jüngste periodische PC sowie ein Bericht mit ausführ ­
lichen Angaben über die historischen positiven Kontrolldaten des Labors 
mit Angabe der Gründe, warum keine gleichzeitige PC durchgeführt 
wurde;  
Ergebnisse:  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Beginn der Prüfung und zum Zeitpunkt 
der Tötung laut Versuchsplan, sowie mittlere und zugehörige Fehler ­
variable (z. B. SD, SEM) für jede Behandlungsgruppe;  
— Beginn und zeitlicher Verlauf der toxischen Erscheinungen für jedes 
Tier, einschließlich gegebenenfalls Hautreizungen an der Stelle der Ver ­
abreichung;  
— Zeitpunkt der Tötung und Zeitpunkt der ATP-Messungen für jedes Tier;  
— Tabelle der RLU-Werte für jede Maus und der SI-Werte für jede Dosis ­
gruppe;  
— mittlere verbundene Fehlervariable (z. B. SD, SEM) für RLU/Maus für 
jede Behandlungsgruppe sowie die Ergebnisse der Ausreißer-Analyse für 
jede Behandlungsgruppe;  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 740
 
— berechneter SI und geeignete Messung der Variabilität, welche die Va ­
riabilität der Tiere sowohl in der Behandlungsgruppe als auch in der 
Kontrollgruppe berücksichtigt;  
— Dosis-Wirkungs-Beziehung;  
— gegebenenfalls statistische Analysen.  
Diskussion der Ergebnisse:  
— Kurze Kommentierung der Ergebnisse, der Dosis-Wirkungs-Beziehung 
und gegebenenfalls der statistischen Analysen mit Schlussfolgerungen 
zur Frage, ob die Prüfsubstanz als Hautsensibilisator eingestuft werden 
soll. 
LITERATUR  
(1) OECD (2010),  Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test Guideline 
No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Abrufbar 
unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem, Toxicol ., 34, 999-1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem, Toxicol ., 34, 985-997.
 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food Chem. 
Toxicol. , 36, 327-333.  
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins.  Toxicol ., 146, 49-59.
 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: 
The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Abrufbar unter: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 258-273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. 34 , 274-286.
 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM eva ­
luation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 249-257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradio ­
active local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National 
Institute of Environmental Health Sciences. Abrufbar unter: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 741
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Up ­
dated validation status of new versions and applications of the murine local 
lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Abrufbar unter: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf].
 
(12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characteri ­
zation and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint. J. Pharmacol. Toxicol. Meth. , 58, 
1-10.
 
(13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, 
T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph 
node assay based on adenosine triphosphate measurement.  J. Pharmacol. 
Toxicol. Meth. , 58, 11-26.
 
(14) OECD (1992),  Skin Sensitisation , Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/ 
env/testguidelines]  
(15) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol ., 46, 1896-1904.
 
(16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing dis ­
cordant sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. Phar ­
macol ., 55, 90-96.
 
(17) Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.  J. 
Immunol. Meth ., 160, 81-88.  
(18) Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP.  
J. Immunol. Meth ., 72, 127-132.  
(19) Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Deve ­
lopment of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacte ­
rial cell number from a mixed population.  Biomat. , 24, 27-34.  
(20) Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of bio ­
mass, enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol ., 305, 346-370.  
(21) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press.  
(22) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine 
Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Abrufbar unter: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/ 
LLNAPerfStds.pdf]
 
(23) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol ., 238, 71-89.  
(24) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol ., 93, 13-31.  
(25) OECD (2002),  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Abrufbar unter: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 742
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances.  Toxicologist , 96, 235.  
(27) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environ ­
mental Health Sciences. Abrufbar unter: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ 
immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol ., 21, 195-206.
 
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  To­
xicol. Appl. Pharmacol. , 153, 83-94.
 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals.  Toxicol. Meth. , 8, 245-256.  
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods.  Drug Chem. Toxicol ., 22, 491-506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alter ­
native endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 
212, 60-68.
 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721-728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023-1028.  
(35) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Abrufbar unter: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm]
 
(36) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. 
Toxicol. Environ. Health , 53 563-79.  
(38) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 743
 
Anlage 1  
BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Genauigkeit:  Der Grad an Übereinstimmung zwischen Testergebnissen und ak ­
zeptierten Referenzwerten. Die Genauigkeit ist ein Maß der Leistung der Prüf ­
methode und ein Aspekt der Relevanz. Der Begriff wird oft im Sinne von 
„Übereinstimmung“ verwendet und bezeichnet den Anteil der korrekten Ergeb ­
nisse einer Prüfmethode (38).  
Vergleichssubstanz:  Eine sensibilisierende oder nicht sensibilisierende Substanz, 
die als Standard zu Vergleichszwecken für eine Prüfsubstanz verwendet wird. 
Eine Vergleichssubstanz sollte die folgenden Eigenschaften haben: i) gleichblei ­
bende und verlässliche Quelle(n); ii) strukturelle und funktionelle Ähnlichkeit mit der Klasse der zu prüfenden Stoffe; iii) bekannte physikalisch-chemische Eigen ­
schaften; iv) unterstützende Daten zu bekannten Effekten und v) bekannte Wirk ­
samkeit im Bereich der erwünschten Reaktion.
 
Falsch negativ:  Eine Substanz, die durch eine Prüfmethode fälschlich als negativ 
oder nicht wirksam charakterisiert wird, obwohl sie in Wirklichkeit positiv bzw. wirksam ist.
 
Falsch positiv:  Eine Substanz, die durch eine Prüfmethode fälschlich als positiv 
oder wirksam charakterisiert wird, obwohl sie in Wirklichkeit negativ bzw. nicht 
wirksam ist.  
Gefahr:  Potenzial eines schädlichen Effekts für Gesundheit oder Umwelt. Die 
schädliche Wirkung manifestiert sich nur, wenn es zu einem ausreichenden Ex ­
positionsniveau kommt.  
Inter-Labor-Reproduzierbarkeit:  Das Ausmaß, in dem unterschiedliche qualifi ­
zierte Laboratorien, die dasselbe Protokoll verwenden und dieselben Prüfsubstan ­
zen testen, qualitativ und quantitativ vergleichbare Ergebnisse erzielen können. Die Inter-Labor-Reproduzierbarkeit wird während der Prävalidierungs- und Vali ­
dierungsverfahren ermittelt und zeigt das Maß an, in dem ein Test erfolgreich 
zwischen Laboratorien übertragen werden kann. Im englischen Sprachgebrauch spricht man in diesem Zusammenhang auch von „Between-laboratory reproduci ­
bility“ (38).
 
Intra-Labor-Reproduzierbarkeit:  Das Ausmaß, in dem qualifizierte Personen in ­
nerhalb desselben Labors, die dasselbe spezifische Protokoll zu unterschiedlichen Zeiten verwenden, erfolgreich dieselben Ergebnisse replizieren können. In diesem Zusammenhang spricht man auch von laborinterner Reproduzierbarkeit (38).
 
Ausreißer:  Ein Ausreißer ist ein Messwert, der sich beträchtlich von anderen 
Werten in einem zufällig ausgewählten Muster in einer Population unterscheidet.  
Qualitätssicherung:  Ein Managementprozess, mittels dessen die Einhaltung von 
Laborprüfnormen, Anforderungen und Aufzeichnungsverfahren, sowie die Ge ­
nauigkeit des Datentransfers durch Individuen bewertet wird, die von den tes ­
tenden Personen unabhängig sind.  
Zuverlässigkeit:  Maß der Verlässlichkeit der Reproduzierbarkeit der Prüfmethode 
innerhalb von und zwischen Laboratorien in einem bestimmten Zeitintervall bei einheitlichem Protokoll. Sie wird durch Berechnung der Intra- und Interlabor-Reproduzierbarkeit bewertet (38).
 
Hautsensibilisierung:  Ein immunologischer Prozess, der auftritt, wenn ein emp ­
findliches Individuum oberflächlich einem induzierenden chemischen Allergen 
ausgesetzt ist, das eine kutane Immunreaktion auslöst, die zur Entwicklung einer Kontaktsensibilisierung führen kann.
 
Stimulationsindex (SI):  Ein Wert, der zur Bewertung des Hautsensibilisierungspoten ­
zials einer Prüfsubstanz berechnet wird. Der SI ist das Verhältnis der Proliferation in 
behandelten Gruppen zu dem der gleichzeitigen Vehikelkontrollgruppe.  
Prüfsubstanz (auch Prüfchemikalie):  Jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit 
dieser Prüfmethode getestet wird.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 744
 
B.51.  HAUTSENSIBILISIERUNG: LOKALER LYMPHKNOTENTEST: 
BRDU-ELISA  
EINLEITUNG  
1. Die OECD-Leitlinien für die Prüfung von Chemikalien und die 
EU-Prüfmethoden werden regelmäßig überarbeitet, um dem wissenschaftli ­
chen Fortschritt, sich ändernden Rechtsvorgaben und Belangen des Tier ­
schutzes gerecht zu werden. Die ursprüngliche Prüfmethode (B.42) zur 
Bestimmung der Hautsensibilisierung bei der Maus, der Lokale Lymphkno ­
tentest (Local Lymph Node Assay bzw. LLNA; OECD-Prüfrichtlinie 429) wurde inzwischen überarbeitet (1, und Kapitel B.42 in diesem Anhang). 
Verschiedene Veröffentlichungen (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) gehen ge ­
nauer auf die Validierung des LLNA und auf die mit ihm verbundenen wissenschaftlichen Arbeiten ein. Bei dem LLNA wird zur Messung der Lymphozytenproliferation radioisotopisches Thymidin oder Jod verwendet. 
Der Test hat daher Beschränkungen, wenn der Erwerb, die Verwendung 
oder die Entsorgung radioaktiver Materialien mit Problemen verbunden sind. Die Prüfmethode LLNA: BrdU-ELISA [Enzymgebundener Immuno ­
assay] ist eine nicht-radioaktive Modifikation der LLNA-Prüfmethode, bei 
der nicht radioaktiv gekennzeichnetes 5-Bromo-2-deoxyuridin (BrdU) (Che ­
mical Abstracts Service [CAS-] Nr. 59-14-3) in einem ELISA-basierten Testsystem zur Messung der Lymphozytenproliferation zum Einsatz kommt. Die Prüfmethode LLNA: BrdU-ELISA wurde durch ein internationales 
wissenschaftliches Gremium für Sachverständigengutachten (peer review) 
validiert, geprüft und zur Identifizierung sensibilisierender und nicht sensi ­
bilisierender Chemikalien mit einigen Beschränkungen als geeignet befun ­
den (10) (11) (12). Diese Prüfmethode wurde zur Bewertung des Hautsen ­
sibilisierungspotenzials von Chemikalien (Stoffen und Gemischen) bei Tie ­
ren entwickelt. Kapitel B.6 dieses Anhangs und OECD-Prüfrichtlinie 406 stützen sich auf Meerschweinchen-Tests, insbesondere den Meerschweinchen-Maximierungstest und den Bühler-Test (13). Der LLNA 
(Kapitel B.42 dieses Anhangs; OECD-Prüfrichtlinie 429) und die beiden 
nicht-radioaktiven Modifikationen, LLNA: BrdU-ELISA (Kapitel B.51 die ­
ses Anhangs; OECD-Prüfrichtlinie 442 B) und LLNA: DA (Kapitel B.50 dieses Anhangs; OECD-Prüfrichtlinie 442 A) haben insofern Vorteile ge ­
genüber den Meerschweinchen-Tests in B.6 und OECD-Prüfrichtlinie 
406 (13), als sie einen verringerten und gezielteren Einsatz von Versuchs ­
tieren ermöglichen.
 
2. Ähnlich wie der LLNA untersucht der LLNA: BrdU-ELISA die Induktions ­
phase der Hautsensibilisierung, und der Test liefert quantitative Daten für die Bewertung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen. Durch den möglichen 
Nachweis von hautsensibilisierenden Stoffen ohne die Verwendung radio ­
aktiver Markierungen für die DNA können die berufliche Exposition gegen ­
über Radioaktivität und Entsorgungsprobleme vermieden werden. Dies wie ­
derum ermöglicht eine verstärkte Verwendung von Mäusen zur Bestim ­
mung hautsensibilisierender Stoffe und somit eine geringere Verwendung 
von Meerschweinchen zur Bewertung des hautsensibilisierenden Potenzials (B.6; OECD-Prüfrichtlinie 406) (13).
 
BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
3. Die verwendeten Begriffsbestimmungen sind in Anlage 1 aufgeführt.  
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN UND BEGRENZUNGEN  
4. Die Prüfmethode LLNA: BrdU-ELISA ist eine modifizierte LLNA-Methode 
zum Nachweis von Chemikalien mit potenziell hautsensibilisierenden Ei ­
genschaften, mit bestimmten Beschränkungen. Dies bedeutet nicht notwen ­
digerweise, dass der LLNA: BrdU-ELISA zwingend in jedem Fall anstelle 
des LLNA oder der Meerschweinchen-Tests (B.6; OECD-Prüfrichtlinie 406) (13) eingesetzt werden muss. Vielmehr erweist sich der Test als gleicher ­
maßen wertvoll und kann als Alternative gewählt werden, bei der im All ­
gemeinen keine weitere Bestätigung von positiven wie auch negativen Er ­
gebnissen erforderlich ist (10) (11). Das Prüflabor sollte vor der
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Durchführung der Studie alle verfügbaren Informationen über die Prüfsub ­
stanz auswerten und berücksichtigen. Zu diesen Informationen zählen die 
Identität und die chemische Struktur der Prüfsubstanz, ihre physikalisch- chemischen Eigenschaften, die Ergebnisse aller sonstigen  in vitro - oder  in 
vivo-Toxizitätsprüfungen der Prüfsubstanz sowie toxikologische Daten zu 
strukturell verwandten Chemikalien. Dies gilt es zu berücksichtigen, um 
die Eignung des LLNA: BrdU-ELISA für die jeweilige Prüfsubstanz fest ­
zustellen (bestimmte Arten chemischer Stoffe sind mit dem LLNA: BrdU-ELISA nicht kompatibel [siehe Absatz 5]) und die Festlegung der 
Dosis zu erleichtern.
 
5. Die Prüfmethode LLNA: BrdU-ELISA ist eine  in vivo -Methode. Das be ­
deutet, dass die kontaktsensibilisierenden Eigenschaften weiterhin an Tieren bewertet werden. Der Test erlaubt es jedoch, im Vergleich zu den 
Meerschweinchen-Tests (B.6; OECD-Prüfrichtlinie 406) die Anzahl der 
für diesen Zweck benötigten Tiere zu reduzieren (13). Ferner stellt der LLNA: BrdU-ELISA eine substanzielle Verfeinerung in der Behandlung von Versuchstieren bei Tests auf allergische Kontaktsensibilisierung dar, 
da anders als B.6 und OECD-Prüfrichtlinie 406 der LLNA: BrdU-ELISA 
keine Auslösung von provozierten Überempfindlichkeitsreaktionen der Haut erfordert. Außerdem erfordert der LLNA: BrdU-ELISA, anders als der Meerschweinchen-Maximierungstest, keinen Einsatz von Adjuvanzien (Ka ­
pitel B.6 dieses Anhangs, 13). Damit verringert der LLNA: BrdU-ELISA 
das Leiden der Tiere. Trotz der Vorteile des LLNA: BrdU-ELISA gegen ­
über B.6 und OECD-Prüfrichtlinie 406 (13) ist er mit gewissen Einschrän ­
kungen behaftet, die die Anwendung von B.6 oder von OECD-Prüfrichtlinie 
406 erforderlich machen können ( z. B.  die Prüfung bestimmter Metalle, 
falsch positive Ergebnisse bei bestimmten hautreizenden Stoffen [wie etwa bei tensidähnlichen Chemikalien] (6) (1 und Kapitel B.42 in diesem Anhang), oder die Löslichkeit der Prüfsubstanz). Zudem können chemische 
Klassen oder Substanzen mit Funktionsgruppen, die erwiesenermaßen als 
potenzielle Störfaktoren wirken können (15), den Einsatz von Meerschweinchen-Tests erforderlich machen (B.6; OECD-Prüfrichtlinie 406 (13)). Beschränkungen, die für den LLNA festgestellt wurden (1 und 
Kapitel B.42 dieses Anhangs), empfehlen sich auch für den LLNA: 
BrdU-ELISA (10). Abgesehen von diesen bekannten Beschränkungen dürfte der LLNA: BrdU-ELISA für die Prüfung aller Chemikalien geeignet sein, sofern mit diesen Chemikalien keine Eigenschaften verbunden sind, die die 
Genauigkeit des LLNA: BrdU-ELISA beeinträchtigen könnten. Außerdem 
sollte die Möglichkeit positiver Grenzergebnisse in Betracht gezogen wer ­
den, wenn für den Stimulationsindex (SI) Werte zwischen 1,6 und 1,9 ermittelt werden (siehe Absätze 31-32). Dies beruht auf der 
Validierungs-Datenbasis von 43 Substanzen mit einem SI ≥ 1,6 (siehe Ab ­
satz 6), bei denen der LLNA: BrdU-ELISA alle 32 LLNA-Sensibilisatoren richtig identifizierte, jedoch zwei von 11 LLNA-Nichtsensibilisatoren mit SI-Werten zwischen 1,6 und 1,9 ( d. h.  positive Grenzwerte) nicht korrekt 
identifizierte (10). Da allerdings derselbe Datensatz für die Einstellung der 
SI-Werte und die Berechnung der prädiktiven Eigenschaften des Tests ver ­
wendet wurde, könnten die festgestellten Ergebnisse auch eine Überbewer ­
tung der tatsächlichen prädiktiven Eigenschaften sein.
 
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
6. Der LLNA: BrdU-ELISA beruht auf dem Prinzip, dass sensibilisierende 
Stoffe eine Lymphozytenproliferation in den drainierenden Lymphknoten an der Stelle der Applikation des chemischen Stoffes induzieren. Diese 
Proliferation verläuft proportional zur Dosis und zur Wirksamkeit des ap ­
plizierten Allergens und bietet sich als einfache Möglichkeit an, eine quan ­
titative Messung der Sensibilisierung zu erhalten. Die Proliferation wird gemessen, indem man die mittlere Proliferation jeder Prüfgruppe mit der 
mittleren Proliferation der mit Vehikel behandelten Kontrollgruppe ver ­
gleicht. Das Verhältnis der mittleren Proliferation in jeder Behandlungs ­
gruppe zu dem in der gleichzeitigen Vehikelkontrollgruppe, auch als SI bezeichnet, wird festgelegt und sollte ≥ 1,6 betragen, ehe eine weitere 
Bewertung einer Prüfsubstanz als potenzieller Hautsensibilisator erfolgt. 
Die hier beschriebenen Methoden beruhen auf der Messung des
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BrdU-Gehalts zur Anzeige einer erhöhten Anzahl proliferierender Zellen in 
den drainierenden aurikulären Lymphknoten. BrdU ist eine Nachbildung 
von Thymidin und wird ähnlich in die DNA proliferierender Zellen inte ­
griert. Die Integration von BrdU wird durch ELISA mittels eines für BrdU spezifischen Antikörpers gemessen, der auch mit Peroxidase markiert wird. 
Bei Hinzufügung des Substrats reagiert die Peroxidase mit diesem und es 
entsteht ein gefärbtes Produkt, das mittels eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts auf ein bestimmtes Absorptionsmaß gemessen wird.
 
BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
Auswahl von Versuchstierarten  
7. Für diesen Test ist die Maus die Spezies der Wahl. Validierungsstudien für 
den LLNA: BrdU-ELISA wurden ausschließlich mit dem CBA/JN-Stamm 
durchgeführt, der daher als bevorzugter Stamm gilt (10) (12). Es werden 
junge erwachsene weibliche Mäuse verwendet, die weder geworfen haben noch trächtig sind. Bei Versuchsbeginn sollten die Tiere 8-12 Wochen alt sein, die Gewichtsunterschiede minimal sein und 20 % des mittleren Ge ­
wichts nicht übersteigen. Alternativ können Tests an anderen Stämmen und 
männlichen Tieren erfolgen, wenn anhand von hinlänglich großen Daten ­
angaben nachgewiesen werden kann, dass keine signifikanten stamm- und/ oder geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Reaktion auf den LLNA: 
BrdU-ELISA bestehen.
 
Haltungs- und Fütterungsbedingungen  
8. Mäuse sollten in Gruppen gehalten werden (16), wenn nicht angemessene 
wissenschaftliche Begründungen eine Einzelhaltung nahelegen. Die Tem ­
peratur im Versuchsraum sollte 22 ± 3 °C betragen. Obwohl die relative Luftfeuchtigkeit mindestens 30 % betragen und zu anderen Zeiten als wäh ­
rend der Reinigung vorzugsweise nicht über 70 % liegen soll, ist ein Wert 
von 50-60 % anzustreben. Die Beleuchtung sollte künstlich sein und die Hell- und Dunkelphasen sollten sich im Abstand von 12 Stunden abwech ­
seln. An die Versuchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert wer ­
den, und eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung ist zu gewährleisten.
 
Vorbereitung der Tiere  
9. Die Tiere werden nach Zufallskriterien ausgewählt, zur individuellen Iden ­
tifizierung markiert (aber nicht am Ohr) und vor Beginn der Dosierung für einen Zeitraum von mindestens 5 Tagen in ihren Käfigen an die Laborbe ­
dingungen gewöhnt. Vor Behandlungsbeginn werden alle Tiere untersucht, 
um sicherzustellen, dass keine sichtbaren Hautverletzungen bestehen.
 
Vorbereitung der Dosierlösungen  
10. Feste Chemikalien sollten vor der Applikation in ein Mäuseohr in Lösungs ­
mitteln/Vehikeln gelöst oder suspendiert und ggf. verdünnt werden. Flüssige Chemikalien können direkt appliziert oder zuvor verdünnt werden. Unlös ­
liche Chemikalien, wie sie in der Regel in Medizinprodukten vorliegen, 
sollten vor der Applikation in ein Mäuseohr in einem geeigneten Lösungs ­
mittel einer übertrieben starken Extraktion unterzogen werden, um alle ex ­
trahierbaren Inhaltsstoffe vor der Prüfung sichtbar zu machen. Die Prüfsub ­
stanzen sollten täglich zubereitet werden, es sei denn, die Stabilität der 
Substanz bei Lagerung wird nachgewiesen.
 
Überprüfung der Zuverlässigkeit:  
11. Anhand von positiven Kontrollchemikalien (PC) wird die ordnungsgemäße 
Leistung des Tests nachgewiesen. Hierzu ist eine angemessene und repro ­
duzierbare Empfindlichkeit der Reaktion auf eine sensibilisierende Prüfsub ­
stanz erforderlich, wobei die Reaktionsstärke gut charakterisiert ist. Es wird 
die Einbeziehung einer gleichzeitigen Positivkontrolle empfohlen, da diese 
die Fähigkeit des Labors belegt, jeden Test erfolgreich durchzuführen und eine Bewertung der Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit zwischen ver ­
schiedenen Labors ermöglicht. Einige Regulierungsbehörden schreiben auch 
eine Positivkontrolle für jede Studie vor. Daher wird Anwendern empfoh ­
len, vor Durchführung des LLNA: BrdU-ELISA die zuständigen Behörden
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zu Rate zu ziehen. Dementsprechend wird die routinemäßige Verwendung 
einer gleichzeitigen Positivkontrolle angeregt, um die Notwendigkeit zusätz ­
licher Tierversuche zur Erfüllung von Anforderungen zu vermeiden, die aus der Verwendung einer nur periodischen Positivkontrolle resultieren könnten (siehe Absatz 12). Die Positivkontrolle sollte eine positive Reaktion auf den 
LLNA: BrdU-ELISA bei einem Expositionsniveau hervorrufen, das einen 
Anstieg des Stimulationsindex (SI ≥ 1,6 im Vergleich zur Negativkontroll ­
gruppe, NK) bewirkt. Die positive Kontrolldosis soll so gewählt werden, dass sie keine übermäßige Hautreizung oder systemische Toxizität ver ­
ursacht und die Induktion reproduzierbar, aber nicht exzessiv ist ( z. B.  
ein SI > 14 würde als exzessiv gelten). Bevorzugte positive Kontrollstoffe sind 25 % Hexylcinnaminaldehyd (CAS-Nr. 101-86-0) und 25 % Eugenol (CAS-Nr. 97-53-0) in Aceton: Olivenöl (4:1, v/v). Unter bestimmten Um ­
ständen können in ausreichend begründeten Fällen andere Kontrollsubstan ­
zen eingesetzt werden, die den genannten Kriterien entsprechen.
 
12. Obwohl die Einbeziehung einer gleichzeitigen Positivkontrollgruppe emp ­
fohlen wird, können in gewissen Situationen periodische Prüfungen ( d. h. in 
Abständen ≤ 6 Monaten) der Positivkontrolle für Laboratorien ausreichen, 
die denen der LLNA: BrdU-ELISA regelmäßig ( d. h. mindestens einmal pro 
Monat) durchgeführt wird und die über eine etablierte historische Kontroll ­
datenbasis verfügen, die die Fähigkeit des Labors bestätigt, reproduzierbare und genaue Ergebnisse mit Positivkontrollen zu erzielen. Eine angemessene 
Beherrschung des LLNA: BrdU-ELISA kann erfolgreich nachgewiesen wer ­
den, indem durchgehend positive Ergebnisse mit den positiven Kontroll ­
chemikalien in mindestens 10 unabhängigen Prüfungen erzielt werden, die innerhalb eines angemessenen Zeitraums ( d. h.  in weniger als einem Jahr) 
durchgeführt wurden.
 
13. Eine gleichzeitige Positivkontrollgruppe sollte immer einbezogen werden, 
wenn Verfahrensänderungen im LLNA: BrdU-ELISA auftreten ( z. B. Wech­
sel des geschulten Personals, Änderung der Materialien bei den Prüfmetho ­
den und/oder der Reagenzien, Änderung der Ausrüstung, Änderung der 
Herkunft der Versuchstiere). Solche Änderungen sollten in Laborberichten dokumentiert werden. Ferner ist der Einfluss dieser Änderungen auf die Aussagefähigkeit der zuvor eingerichteten historischen Datenbank zu beden ­
ken. Dabei sollte die Notwendigkeit überdacht werden, eine neue histori ­
sche Datenbank einzurichten, um die gleichbleibende Qualität der positiven Kontrollergebnisse zu dokumentieren.
 
14. Die Prüfer sollten sich der Tatsache bewusst sein, dass die Entscheidung, 
eine PC-Studie periodisch statt gleichzeitig durchzuführen, Auswirkungen 
auf die Aussagefähigkeit und Akzeptanz negativer Studienergebnisse haben kann, die ohne gleichzeitige Positivkontrolle im Zeitraum zwischen den einzelnen periodischen PC-Studien auftreten können. Wenn zum Beispiel 
ein falsch negatives Ergebnis in der periodischen PC-Studie auftritt, können 
negative Ergebnisse für die Prüfsubstanz, die in dem Zeitraum zwischen der letzten akzeptablen periodischen PC-Studie und der inakzeptablen periodi ­
schen PC-Studie aufgetreten waren, in Frage gestellt werden. Die Auswir ­
kungen solcher Ergebnisse sollten sorgfältig bedacht werden, wenn ent ­
schieden wird, ob gleichzeitige oder nur periodische PC-Studien durch ­
geführt werden sollen. Auch ist die Verwendung einer geringeren Anzahl an Versuchstieren bei der gleichzeitigen Positivkontrollgruppe zu bedenken, 
wenn dies wissenschaftlich zu begründen ist und wenn das Labor auf der 
Grundlage laborspezifischer historischer Daten demonstriert, dass eine ge ­
ringere Anzahl an Mäusen ausreicht (17).
 
15. Obwohl eine positive Kontrollchemikalie in dem Vehikel geprüft werden 
sollte, von dem bekannt ist, dass es eine gleichbleibende Reaktion hervor ­
ruft ( z. B.  Aceton: Olivenöl; 4:1, v/v), können in bestimmten Rechtssitua ­
tionen auch Prüfungen in einem Nichtstandard-Vehikel (klinisch/chemisch relevante Formulierung) erforderlich sein (18). Wenn die gleichzeitige Po ­
sitivkontrolle in einem anderen Vehikel als der Prüfsubstanz getestet wird, 
sollte eine gesonderte Vehikelkontrolle für die gleichzeitige PC einbezogen 
werden.
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16. In Fällen, in denen Prüfsubstanzen einer bestimmten chemischen Klasse 
oder eine Reihe von Reaktionen bewertet werden, können Referenzsubstan ­
zen nützlich sein, um nachzuweisen, dass die Prüfmethode zur Feststellung des Hautsensibilisierungspotenzials dieser Art von Substanzen ordnungs ­
gemäß funktioniert. Geeignete Referenzsubstanzen sollten die folgenden 
Eigenschaften haben:
 
— strukturelle und funktionale Ähnlichkeit mit der Klasse der getesteten 
Prüfsubstanz;  
— bekannte physikalische/chemische Eigenschaften;  
— zugrunde liegende Daten aus dem BrdU-ELISA;  
— zugrunde liegende Daten aus anderen Tiermodellen und/oder von Men ­
schen.  
TESTVERFAHREN  
Anzahl der Versuchstiere und Dosierungen  
17. Mindestens vier Tiere pro Dosisgruppe mit jeweils mindestens drei Kon ­
zentrationen der Prüfsubstanz werden benötigt; zusätzlich braucht man eine Negativkontrollgruppe, die nur mit dem Vehikel für die Prüfsubstanz be ­
handelt wird, sowie eine Positivkontrolle (gleichzeitig oder jüngeren Da ­
tums, auf der Grundlage der Laborvorschriften in den relevanten Abschnit ­
ten 11-15). Tests mit Mehrfachdosen der PC sollten in Erwägung gezogen 
werden, insbesondere wenn die Positivkontrolle intermittierend getestet 
wird. Bis auf die Verabreichung der Prüfsubstanz sind die Tiere der Kon ­
trollgruppen ebenso zu behandeln wie die Tiere der Behandlungsgruppen.
 
18. Die Auswahl von Dosierung und Vehikel sollte auf den Empfehlungen in 
den Referenzen 2 und 19 beruhen. Für aufeinanderfolgende Dosierungen werden normalerweise geeignete abgestufte Konzentrationen gewählt, wie z. B. 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % usw. Die Auswahl 
der Konzentrationsfolge sollte angemessen wissenschaftlich begründet wer ­
den. Alle vorhandenen toxikologischen Angaben ( z. B.  über die akute To ­
xizität und Hautreizung) sowie strukturelle und physiochemische Angaben zu der jeweiligen Prüfsubstanz (und/oder strukturverwandten Substanzen) 
sollten bei der Festlegung von drei aufeinander folgenden Konzentrationen 
berücksichtigt werden, so dass bei der Höchstkonzentration einerseits die Exposition maximiert und andererseits eine systemische Toxizität und/oder eine übermäßige lokale Hautreizung ausgeschlossen werden (19) (20 und 
Kapitel B.4 dieses Anhangs). Mangels solcher Informationen kann ein an ­
fänglicher Dosisfindungstest erforderlich sein (siehe Absätze 21-24).
 
19. Das Vehikel sollte das Testergebnis nicht beeinflussen oder beeinträchtigen 
und sollte so gewählt werden, dass die Löslichkeit zur Erzielung einer 
möglichst hohen Konzentration maximiert und gleichzeitig eine für das Applizieren der Prüfsubstanz geeignete Lösung/Suspension hergestellt wer ­
den kann. Empfohlene Vehikel sind Aceton: Olivenöl (4:1, v/v),  N,N -Di­
methylformamid, Methylethylketon, Propylenglykol und Dimethylsulphoxid 
(6), wobei mit hinreichender wissenschaftlicher Begründung auch andere Vehikel verwendet werden können. Unter bestimmten Umständen muss ein klinisch relevantes Lösungsmittel oder die handelsübliche Zubereitung, 
in der die Prüfsubstanz vermarktet wird, als zusätzliche Kontrolle genutzt 
werden. Besondere Sorgfalt sollte darauf verwendet werden, zu gewährleis ­
ten, dass in das Vehikelsystem durch die Verwendung geeigneter Lösungs ­
vermittler ( z. B. 1 % Pluronic
 ® L92) hydrophile Stoffe eingearbeitet werden, 
die die Haut befeuchten und nicht sofort ablaufen. Folglich sind vollständig 
wässrige Vehikel zu vermeiden.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 749
 
20. Die Arbeit an Lymphknoten einzelner Mäuse ermöglicht die Bewertung der 
Variabilität von Tieren sowie einen statistischen Vergleich zwischen der 
Prüfsubstanz und Messungen an der Vehikelkontrollgruppe (siehe Absatz 33). Die Möglichkeit, die Anzahl der Mäuse in der Positivkontrollgruppe zu verringern, ist nur realistisch, wenn Einzeltierdaten erhoben werden (17). 
Außerdem verlangen einige Regulierungsbehörden die Erhebung von Daten 
einzelner Tiere. Die regelmäßige Erhebung von Einzeltierdaten stellt im Hinblick auf den Tierschutz einen Vorteil dar, indem Doppeltests vermieden werden. Diese wären notwendig, wenn die ursprünglich gemeinsam gesam ­
melten Ergebnisse für die Prüfsubstanz ( z. B.  über gepoolte Daten) später 
von Regulierungsbehörden mit anderen Vorschriften ( z. B.  Einzeltierdaten) 
geprüft würden.
 
Dosisfindungstest  
21. Wenn über die höchst mögliche Dosierung keine Informationen vorliegen 
(siehe Absatz 18), sollte ein Dosisfindungstest durchgeführt werden, um die geeignete Dosierung für den LLNA: BrdU-ELISA festzulegen. Der Dosis ­
findungstest soll eine Orientierung bei der Auswahl der höchst möglichen 
Dosisstufe für die Hauptuntersuchung des LLNA: BrdU-ELISA geben, 
wenn keine Informationen darüber vorliegen, welche Konzentration syste ­
mische Toxizität (siehe Absatz 24) und/oder übermäßige lokale Hautreizung (siehe Absatz 23) verursacht. Die höchste geprüfte Dosisstufe sollte eine 
Konzentration von 100 % der Prüfsubstanz bei Flüssigkeiten bzw. die 
höchst mögliche Konzentration bei Feststoffen oder Suspensionen sein.
 
22. Der Dosisfindungstest wird unter Bedingungen durchgeführt, die denen der 
Hauptstudie des LLNA: BrdU-ELISA genau entsprechen. Allerdings gibt es 
hier keine Bewertung der Lymphknotenproliferation und es können weniger Tiere pro Dosisgruppe eingesetzt werden. Es werden ein oder zwei Tiere pro Dosisgruppe empfohlen. Alle Mäuse werden täglich auf klinische Zei ­
chen für systemische Toxizität oder lokale Reizungen an der Applikations ­
stelle untersucht. Das Körpergewicht wird vor dem Test und vor dem Ab ­
schluss (Tag 6) protokolliert. Beide Ohren jeder Maus werden auf Anzei ­
chen für Erytheme untersucht und mit Hilfe von Tabelle 1 (20 und Kapitel 
B.4 dieses Anhangs) bewertet. Die Ohrdicke wird mit Hilfe eines Ohr ­
dickenmessgeräts ( z. B. digitaler Mikrometer oder Peacock Dickenmessuhr) 
an Tag 1 vor der Dosierung, Tag 3 (ca. 48 Stunden nach der ersten Dosis) und Tag 6 bestimmt. Zusätzlich kann an Tag 6 die Ohrdicke durch die 
Gewichtsbestimmung von Ohrstanzproben ermittelt werden. Dies sollte 
nach der tierschutzgerechten Tötung der Tiere erfolgen. Eine übermäßige lokale Hautreizung wird durch eine Erythem-Punktzahl von ≥ 3 und/oder 
eine Zunahme der Ohrdicke ≥ 25 % an jedem beliebigen Messtag angezeigt 
(21) (22). Als höchste Dosis für die Hauptuntersuchung des LLNA: 
BrdU-ELISA wird die nächst niedrigere Dosis in der Konzentrationsreihe des Dosisfindungstests gewählt (siehe Absatz 18), die keine systemische Toxizität und/oder übermäßige lokale Hautreizung verursacht.
 
Tabelle 1  
Erythem-Klassifizierung  
Beobachtung Punktzahl  
Kein Erythem 0 
Sehr leichtes Erythem (kaum wahrnehmbar) 1 Klar abgegrenztes Erythem 2
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Beobachtung Punktzahl  
Mäßiges bis ausgeprägtes Erythem 3 
Schweres Erythem (dunkelrot) bis hin zur Schorfbildung, so 
dass eine Bewertung nicht möglich ist 4 
23. Zusätzlich zu einer Zunahme der Ohrdicke um 25 % (21) (22) wurde ein 
statistisch signifikanter Anstieg der Ohrdicke bei den behandelten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen zugrundelegt, um Reizstoffe in dem LLNA zu identifizieren (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Obwohl ein 
statistisch signifikanter Anstieg auch bei einer Ohrdicke von weniger als 
25 % auftreten kann, konnte kein spezifischer Zusammenhang mit einer übermäßigen Hautreizung festgestellt werden (25) (26) (27) (28) (29).
 
24. Die folgenden klinischen Beobachtungen können, sofern sie Bestandteil 
einer Gesamtbewertung sind, auf systemische Toxizität hinweisen (30) 
und somit die höchst mögliche Dosisstufe für die Hauptuntersuchung des LLNA: BrdU-ELISA anzeigen: Änderungen der Funktionen des Nerven ­
systems ( z. B. Piloerektion, Ataxie, Tremor und Krämpfe); Verhaltensände ­
rungen ( z. B.  Aggressivität, Änderungen bei der Fellpflege, auffallende 
Änderung des Aktivitätsniveaus); Änderungen des Atemmusters ( d. h.  Än­
derung der Häufigkeit und Intensität des Atmens wie Dyspnoe, Keuchen, rasselnder Atem) sowie Änderungen der Futter- und Wasseraufnahme. Zu ­
sätzlich sollten Anzeichen von Lethargie und/oder Teilnahmslosigkeit sowie 
alle klinischen Anzeichen für mehr als leichte oder momentane Schmerzen und Qual, eine Gewichtsreduktion von > 5 % zwischen Tag 1 und Tag 6 und die Sterblichkeit in der Bewertung berücksichtigt werden. Moribunde 
Tiere oder Tiere, die Anzeichen starker und andauernder Qualen zeigen, 
sollten tierschutzgerecht getötet werden (31).
 
Versuchsplan der Hauptuntersuchung  
25. Der Versuchsplan des Tests ist wie folgt:  
— Tag 1:  Jedes Tier wird einzeln gekennzeichnet und das Gewicht sowie 
jede klinische Beobachtung protokolliert. Es werden 25 μL der Prüf ­
substanz in der jeweiligen Verdünnung, des Vehikels allein oder der Positivkontrolle (gleichzeitig oder jüngeren Datums) gemäß den Labor ­
vorschriften in den relevanten Abschnitten 11-15) auf die Rückseite 
jedes Ohrs appliziert.
 
— Tage 2 und 3:  Die am Tag 1 durchgeführte Applikationsprozedur wird 
wiederholt.  
— Tag 4:  Keine Behandlung.  
— Tag 5:  Es werden 0,5 mL (5 mg/Maus) BrdU-Lösung (10 mg/mL) in 
die Bauchhöhle gespritzt.  
— Tag 6:  Das Gewicht jedes Tiers sowie jede klinische Beobachtung 
werden protokolliert. Ca. 24 Stunden (24 h) nach der BrdU-Injektion 
werden die Tiere tierschutzgerecht getötet. Die drainierenden aurikulä ­
ren Lymphknoten jedes Mäuseohrs werden entfernt und separat (für jedes Tier einzeln) in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) gege ­
ben. Einzelheiten und Diagramme der Lymphknotenidentifikation und 
-entfernung sind unter Referenz (17) aufgeführt. Zur weiteren Kontrolle 
der lokalen Hautreaktion in der Hauptuntersuchung können zusätzliche Parameter wie die Auswertung des Ohr-Erythems oder Ohrdickemes ­
sungen (mittels eines Dickenmessgeräts oder durch die Gewichtsbestim ­
mung von Ohrstanzproben bei der Nekropsie) in das Untersuchungs ­
protokoll aufgenommen werden.
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Vorbereitung der Zellsuspensionen  
26. Für jede Maus wird aus den paarweise entnommenen 
Lymphknotenzellen (LNC) durch vorsichtigen mechanischen Aufschluss 
in einem Edelstahlfilter mit einer Maschenweite von 200 Mikron oder mit ­
tels einer anderen geeigneten Technik ( z. B.  Verwendung eines wegwerf ­
baren Kunststoff-Stößels zum Zerkleinern der Lymphknoten, die anschlie ­
ßend durch ein #70 Nylon-Gewebe passiert werden) eine Einzelzellsuspen ­
sion hergestellt. Das Verfahren zur Zubereitung der Lymphknotensuspen ­
sion ist für diesen Test von entscheidender Bedeutung. Deshalb sollte jeder Prüfer diese Technik im Voraus gut beherrschen erlernen. Die Lymphkno ­
ten bei Tieren der Negativkontrollgruppe sind klein; daher ist Vorsicht 
geboten, um eine ungewollte Beeinflussung der SI-Werte zu vermeiden. In jedem Fall sollte das Zielvolumen der LNC-Lösung an ein vorgegebenes Optimalvolumen (ca. 15 mL) angepasst werden. Das Optimalvolumen be ­
ruht auf der Erzielung eines mittleren Absorptionsmaßes der Negativkon ­
trollgruppe zwischen 0,1 und 0,2.
 
Bestimmung der Zellproliferation (Messung des BrdU-Gehalts in der DNA 
der Lymphozyten)  
27. Die Messung des BrdU erfolgt im ELISA mit einem im Handel erhältlichen 
Mess-Kit ( z. B.  Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland, 
Katalog-Nr. 11 647 229 001). Darauf werden kurz 100 μL der 
Lymphknoten-Suspension in die Vertiefungen einer flachgrundigen Mikro ­
platte in dreifacher Ausfertigung gegeben. Nach der Fixierung und Dena ­
turierung der Lymphknoten-Suspension werden in jede Vertiefung 
Anti-BrdU-Antikörper gegeben und zur Reaktion gebracht. Die 
Anti-BrdU-Antikörper werden anschließend durch Spülen entfernt. Die Sub ­
stratlösung wird hinzugefügt und kann Chromogen erzeugen. Anschließend wird das Absorptionsmaß bei 370 nm mit einer Referenzwellenlänge von 
492 nm gemessen. In allen Fällen sollten die Prüfbedingungen des Tests 
optimiert werden (siehe Absatz 26).
 
BEOBACHTUNGEN  
Klinische Beobachtungen  
28. Jede Maus sollte mindestens einmal täglich sorgfältig auf klinische Zeichen, 
d. h. lokale Reizung an der Applikationsstelle, oder auf systemische Toxi ­
zität untersucht werden. Alle Beobachtungen werden systematisch in Einzel ­
protokollen dokumentiert, die für jedes Tier geführt werden. Die Über ­
wachungspläne sollten Kriterien beinhalten, anhand derer Mäuse mit syste ­
mischer Toxizität, übermäßiger lokaler Hautreizung oder Hautätzung schnell 
zu Zwecken der schmerzlosen Tötung identifiziert werden können (31).  
Körpergewicht  
29. In Abschnitt 25 wurde bereits ausgeführt, dass das Körpergewicht der ein ­
zelnen Tiere zu Versuchsbeginn und zum Zeitpunkt der tierschutzgerechten 
Tötung der Tiere laut Versuchsplan festgestellt werden soll.  
BERECHNUNG DER ERGEBNISSE  
30. Die Ergebnisse für jede Behandlungsgruppe werden als mittlerer 
Stimulationsindex (SI) angegeben. Den SI erhält man durch Teilen des mittleren BrdU-Markierungsindex pro Maus innerhalb jeder Prüfgruppe und der Positiv ­
kontrollgruppe durch den mittleren BrdU-Markierungsindex pro Maus für die 
Lösungsmittel/Vehikelkontrollgruppe. Der durchschnittliche SI beträgt dem ­
nach für die mit Vehikel behandelten Kontrollen 1.
 
Der BrdU-Markierungsindex ist definiert als:  
BrdU-Markierungsindex = (ABS  em — ABS blank  em ) — (ABS  ref — ABS 
blank  ref ) 
Dabei gilt: em = Emissionswellenlänge und ref = Referenzwellenlänge.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 752
 
31. In dem Entscheidungsprozess gilt ein Ergebnis als positiv, wenn SI ≥ 1,6 ist 
(10). Die Stärke der Dosis-Wirkung, die statistische Signifikanz und die 
gleichbleibende Qualität der Lösungsmittel-/Vehikel-Reaktion sowie der Re ­
aktion der Positivkontrolle können aber auch benutzt werden, um festzule ­
gen, ob ein Grenzergebnis ( d. h.  SI-Wert zwischen 1,6 und 1,9) als positiv 
bezeichnet werden soll (3) (6) (32).  
32. Bei einer positiven Grenzwertreaktion mit einem SI zwischen 1,6 und 1,9 
können Anwender zusätzliche Informationen berücksichtigen, wie z. B. die Dosis-Wirkungs-Beziehung, das Vorliegen einer systemischen Toxizität 
oder übermäßigen Hautreizung, sowie gegebenenfalls die statistische Sig ­
nifikanz zusammen mit den SI-Werten, um zu bestätigen, dass die Ergeb ­
nisse positiv sind (10). Zu beachten sind ferner die verschiedenen Eigen ­
schaften der Prüfsubstanz, wobei es unter anderem zu klären gilt, ob ein 
struktureller Zusammenhang mit bekannten Hautsensibilisatoren besteht, ob 
sie eine übermäßige lokale Hautreizung bei der Maus hervorruft und wie die festgestellte Art der Dosis-Wirkungs-Beziehung ist. Diese und weitere As ­
pekte werden an anderer Stelle ausführlich erörtert (4).
 
33. Werden die Daten für jede einzelne Maus erhoben, kann eine statistische 
Analyse zu Vorhandensein und Grad des Dosis-Wirkungs-Verhältnisses in den Daten durchgeführt werden. Jede statistische Auswertung könnte eine Bewertung der Dosis-Wirkungs-Beziehung sowie geeignete 
Testgruppen-Vergleiche beinhalten ( z. B.  Gruppe mit paarweiser Dosierung 
vs. gleichzeitige Lösungsmittel-/Vehikelkontrollgruppen). Die statistischen Analysen könnten z. B. die lineare Regression, den Williams-Test zur Be ­
wertung von Dosis-Wirkungs-Trends oder den Dunnett-Test für paarweise 
Vergleiche beinhalten. Bei der Auswahl einer geeigneten Methode für die 
statistische Analyse sollte sich der Prüfer möglicher ungleicher Varianzen und anderer damit zusammenhängender Probleme stets bewusst sein, denn diese erfordern unter Umständen eine Datentransformation oder ein 
nicht-parametrisches statistisches Verfahren. Auf jeden Fall muss der Prüfer 
unter Umständen SI-Berechnungen und statistische Analysen mit und ohne bestimmte Datenpunkte (manchmal als „Ausreißer“ bezeichnet) vornehmen.
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Daten  
34. Die Daten sind in tabellarischer Form zusammenzufassen. Sie sollten die 
BrdU-Index-Werte pro Tier, den mittleren BrdU-Markierungsindex pro Tier für jede Gruppe, die damit verbundene Fehlervariable ( z. B. SD, SEM) und 
den mittleren SI für jede Dosisgruppe, verglichen mit der gleichzeitigen 
Lösungsmittel-/Vehikelkontrollgruppe angeben.
 
Prüfbericht  
35. Der Testbericht sollte folgende Angaben enthalten:  
Prüf- und Kontrollsubstanzen:  
— Angaben zur Identität ( z. B. CAS-Nummer und EG-Nummer, falls vor ­
handen; Bezugsquelle; Reinheit; bekannte Verunreinigungen; Chargen ­
nummer);  
— physikalische Beschaffenheit und physikalisch-chemische Eigenschaften 
(z. B.  Flüchtigkeit, Stabilität, Löslichkeit);  
— bei Mischungen Zusammensetzung und relative Anteile der Bestandteile 
in Prozent;  
Lösungsmittel/Vehikel:  
— Angaben zur Identität (Reinheit, Konzentration, gegebenenfalls verwen ­
dete Mengen);  
— Begründung für die Wahl des Vehikels;  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 753
 
Versuchstiere:  
— Herkunft der CBA-Mäuse;  
— mikrobiologischer Status der Tiere, soweit bekannt;  
— Anzahl und Alter der Tiere;  
— Herkunft der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.;  
Prüfbedingungen:  
— Herkunft, Chargennummer und Angaben des Herstellers zu Qualitäts ­
sicherung/Qualitätskontrolle (Antikörperempfindlichkeit und -spezifizität sowie Nachweisgrenze) für das ELISA-Kit;
 
— Angaben zur Vorbereitung und Applikation der Prüfsubstanz;  
— Begründung der gewählten Dosierung (mit Ergebnissen des eventuell 
durchgeführten Dosisfindungstests);  
— verwendete Konzentrationen des Vehikels und der Prüfsubstanz sowie 
Gesamtmenge der applizierten Prüfsubstanz;  
— Angaben über Futter- und Wasserqualität (einschließlich Art/Herkunft 
des Futters, Wasserquelle);  
— nähere Angaben zum Behandlungs- und Stichprobenentnahmeplan;  
— Methoden zur Bestimmung der Toxizität;  
— Kriterien zur Einstufung der Studien als positiv oder negativ;  
— Einzelheiten zu eventuellen Protokollabweichungen und eine Erklärung 
dazu, wie sich diese Abweichung auf Prüfdesign und Ergebnisse aus ­
wirkt.  
Überprüfung der Zuverlässigkeit:  
— Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse der letzten Überprüfung 
der Zuverlässigkeit mit Angaben zu verwendeten Prüfsubstanzen, Kon ­
zentration und Vehikel;  
— gleichzeitige und/oder historische PC und gleichzeitige Daten der Ne ­
gativkontrolle (Lösungsmittel/Vehikel) für das Prüflabor;  
— wenn keine gleichzeitige PC eingeschlossen war, Datum und Laborbe ­
richt über die jüngste periodische PC sowie ein Bericht mit ausführ ­
lichen Angaben über die historischen positiven Kontrolldaten des La ­
bors mit Angabe der Gründe, warum keine gleichzeitige PC durch ­
geführt wurde;  
Ergebnisse:  
— Gewicht der einzelnen Tiere bei Beginn der Prüfung und zum Zeitpunkt 
der tierschutzgerechten Tötung laut Versuchsplan, sowie mittlere und 
zugehörige Fehlervariable ( z. B. SD, SEM) für jede Behandlungsgruppe;  
— Beginn und zeitlicher Verlauf der toxischen Erscheinungen für jedes 
Tier, einschließlich gegebenenfalls Hautreizungen an der Stelle der Ver ­
abreichung;  
— Tabelle der BrdU-Markierungsindizes für jede Maus und der SI-Werte 
für jede Dosis-Behandlungsgruppe;  
— mittlere zugehörige Fehlervariable ( z. B.  SD, SEM) für den 
BrdU-Markierungsindex/Maus für jede Behandlungsgruppe sowie die 
Ergebnisse der Ausreißer-Analyse für jede Behandlungsgruppe;  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 754
 
— berechneter SI und geeignete Messung der Variabilität, welche die Va ­
riabilität der Tiere sowohl in der Behandlungsgruppe als auch in der 
Kontrollgruppe berücksichtigt;  
— Dosis-Wirkungs-Beziehung;  
— gegebenenfalls statistische Analysen.  
Diskussion der Ergebnisse:  
— Kurze Kommentierung der Ergebnisse, der Dosis-Wirkungs-Beziehung 
und gegebenenfalls der statistischen Analysen mit Schlussfolgerungen zur Frage, ob die Prüfsubstanz als Hautsensibilisator eingestuft werden soll.
 
LITERATUR  
(1) OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guide ­
line No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Abruf ­
bar unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin 
sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985-997.  
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-33.
 
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: 
employment of a regression method that includes determination of uncer ­
tainty margins. Toxicol., 146, 49-59.  
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: 
The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Abrufbar unter: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258-273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. 
Pharmacol., 34(3), 274-286.
 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM eva ­
luation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249-257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradio ­
active local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552A/B. Research Triangle Park, 
NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Abrufbar unter: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 755
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Up ­
dated validation status of new versions and applications of the murine local 
lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Abrufbar unter: [http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf]
 
(12) Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129-134.
 
(13) OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/ 
env/testguidelines]  
(14) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
 
(15) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing dis ­
cordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Phar ­
macol., 55, 90-96.
 
(16) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
 
(17) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Abrufbar unter: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds. pdf]
 
(18) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89.  
(19) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13- 31.
 
(20) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Abrufbar unter: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(21) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.
 
(22) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background 
Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environ ­
mental Health Sciences. Abrufbar unter: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
 
(23) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195-206.  
(24) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. To ­
xicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.
 
(25) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 756
 
(26) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506.  
(27) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of 
alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. 
Toxicol., 212, 60-68.
 
(28) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.  
(29) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 
1023-1028.  
(30) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Abrufbar unter: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ Tox_workshop.htm].
 
(31) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(32) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563-79.
 
(33) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Abrufbar unter: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 757
 
Anlage 1  
BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Genauigkeit:  Der Grad an Übereinstimmung zwischen Testergebnissen und ak ­
zeptierten Referenzwerten. Die Genauigkeit ist ein Maß der Leistung der Prüf ­
methode und ein Aspekt der Relevanz. Der Begriff wird oft im Sinne von 
„Übereinstimmung“ verwendet und bezeichnet den Anteil der korrekten Ergeb ­
nisse einer Prüfmethode (33).  
Vergleichssubstanz:  Eine sensibilisierende oder nicht sensibilisierende Substanz, 
die als Standard zu Vergleichszwecken für eine Prüfsubstanz verwendet wird. 
Geeignete Vergleichssubstanzen sollten die folgenden Eigenschaften haben: (i) 
gleichbleibende und verlässliche Quelle(n); (ii) strukturelle und funktionelle Ähn ­
lichkeit mit der Klasse der zu prüfenden Stoffe; (iii) bekannte physikalisch-chemische Eigenschaften; (iv) unterstützende Daten zu bekannten 
Effekten und (v) bekannte Wirksamkeit im Bereich der erwünschten Reaktion.
 
Falsch negativ:  Eine Prüfsubstanz, die durch eine Prüfmethode fälschlich als 
negativ oder nicht wirksam charakterisiert wird, obwohl sie in Wirklichkeit po ­
sitiv bzw. wirksam ist (33).  
Falsch positiv:  Eine Prüfsubstanz, die durch eine Prüfmethode fälschlich als 
positiv oder wirksam charakterisiert wird, obwohl sie in Wirklichkeit negativ 
bzw. nicht wirksam ist (33).  
Gefahr:  Potenzial eines schädlichen Effekts für Gesundheit oder Umwelt. Die 
schädliche Wirkung manifestiert sich nur, wenn es zu einem ausreichenden Ex ­
positionsniveau kommt.  
Inter-Labor-Reproduzierbarkeit:  Das Ausmaß, in dem unterschiedliche qualifi ­
zierte Laboratorien, die dasselbe Protokoll verwenden und dieselben Prüfsubstanz testen, qualitativ und quantitativ vergleichbare Ergebnisse erzielen können. Die Inter-Labor-Reproduzierbarkeit wird während der Prävalidierungs- und Validie ­
rungsverfahren ermittelt und zeigt das Maß an, in dem ein Test erfolgreich 
zwischen Laboratorien übertragen werden kann. Im englischen Sprachgebrauch spricht man in diesem Zusammenhang auch von „Between-laboratory reproduci ­
bility“ (33).
 
Intra-Labor-Reproduzierbarkeit:  Das Ausmaß, in dem qualifizierte Personen in ­
nerhalb desselben Labors, die dasselbe spezifische Protokoll zu unterschiedlichen Zeiten verwenden, erfolgreich dieselben Ergebnisse replizieren können. In diesem Zusammenhang spricht man auch von laborinterner Reproduzierbarkeit (33).
 
Ausreißer:  Ein Ausreißer ist ein Messwert, der sich beträchtlich von anderen 
Werten in einem zufällig ausgewählten Muster in einer Population unterscheidet.  
Qualitätssicherung:  Ein Managementprozess, mittels dessen die Einhaltung von 
Laborprüfnormen, Anforderungen und Aufzeichnungsverfahren, sowie die Ge ­
nauigkeit des Datentransfers durch Individuen bewertet wird, die von den tes ­
tenden Personen unabhängig sind.  
Zuverlässigkeit:  Maß der Verlässlichkeit der Reproduzierbarkeit der Prüfmethode 
innerhalb von und zwischen Laboratorien in einem bestimmten Zeitintervall bei einheitlichem Protokoll. Sie wird durch Berechnung der Intra- und Interlabor-Reproduzierbarkeit bewertet (33).
 
Hautsensibilisierung:  Ein immunologischer Prozess, der auftritt, wenn ein emp ­
findliches Individuum oberflächlich einem induzierenden chemischen Allergen 
ausgesetzt ist, das eine kutane Immunreaktion auslöst, die zur Entwicklung einer Kontaktsensibilisierung führen kann.
 
Stimulationsindex (SI):  Ein Wert, der zur Bewertung des Hautsensibilisierungspoten ­
zials einer Prüfsubstanz berechnet wird. Der SI ist das Verhältnis der Proliferation in 
behandelten Gruppen zu dem der gleichzeitigen Vehikelkontrollgruppe.  
Prüfsubstanz (auch Prüfchemikalie):  Jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit 
dieser Prüfmethode getestet wird.  ▼M3 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 758
 
B.52  AKUTE INHALATIONSTOXIZITÄT — AKUT-TOXISCHE 
KLASSENMETHODE  
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 436 (2009). Die 
erste Methode zur Prüfung auf akute Inhalationstoxizität TG 403 wurde 
1981 angenommen und seitdem überarbeitet (siehe Kapitel B.2 dieses An ­
hangs (1)). Nach der Annahme der überarbeiteten akut-toxischen Klassenmethode (ATK) mit oraler Verabreichung (Kapitel B.1 tris dieses Anhangs) (5) wurde es für angebracht gehalten, eine akut-toxische Klassen ­
methode mit Inhalation (2) (3) (4) zu entwickeln. Eine retrospektive Leis ­
tungsbewertung der ATK-Methode zur Prüfung auf akute Inhalationstoxizi ­
tät hat gezeigt, dass die Methode für Zwecke der Einstufung und Kenn ­
zeichnung geeignet ist (6). Bei der ATK-Inhalationsprüfmethode kann die 
Toxizität der Prüfsubstanz mithilfe aufeinander folgender Stufen festgelegter 
Zielkonzentrationen eingestuft werden. Der wichtigste Endpunkt ist Letalität, aber Tiere, bei denen starke Schmerzen oder schweres Leiden festgestellt werden, oder Tiere, deren Tod bevorsteht, sollten zur Minimierung ihres 
Leidens tierschutzgerecht getötet werden. Hinweise zu humanen Endpunkten 
sind im OECD Guidance Document No. 19 (7) zu finden.
 
2. Das Guidance Document No. 39 on Acute Inhalation Toxicity Testing (GD 
39 (8)) enthält Hinweise zur Durchführung und Auswertung dieser Prüf ­
methode.  
3. Die im Zusammenhang mit dieser Prüfmethode verwendeten Begriffe wer ­
den in Anlage 1 und im GD 39 (8) definiert.  
4. Die Prüfmethode gibt Aufschluss über die gefährlichen Eigenschaften der 
Prüfsubstanz und ermöglicht ihre Einstufung gemäß der Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 zur Einstufung chemischer Stoffe mit akut toxischer Wirkung (9). Falls Punktschätzungen von LC
 50 -Werten oder Analysen der 
Konzentrations-Wirkungs-Beziehung erforderlich sind, ist Kapitel B.2 dieses 
Anhangs (1) die geeignete Prüfmethode. Weitere Hinweise zur Wahl der Prüfmethode sind im GD 39 (8) zu finden. Diese Prüfmethode ist nicht 
speziell für die Prüfung von Spezialmaterialien wie schwer löslichen isome ­
trischen oder Fasermaterialien oder hergestellten Nanomaterialien bestimmt.
 
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN  
5. Bevor Versuche nach dieser Prüfmethode in Betracht gezogen werden, sollte 
das Prüflabor alle verfügbaren Informationen über die Prüfsubstanz, ein ­
schließlich bereits vorliegender Studien, deren Ergebnisse darauf hindeuten, 
dass auf weitere Versuche verzichtet werden kann, auswerten, damit mög ­
lichst wenig Tiere verwendet werden. Für die Auswahl der in Bezug auf Art, Stamm und Geschlecht am besten geeigneten Tiere sowie der geeig ­
neten Expositionsart und Prüfkonzentrationen sollten u. a. Informationen wie 
die Identität, die chemische Struktur und die physikalisch-chemischen Ei ­
genschaften der Prüfsubstanz, Ergebnisse jeglicher  In-vitro - oder  In-vivo - 
Toxizitätsprüfungen, vorgesehene Verwendungen und die Möglichkeit der 
Exposition des Menschen, (Q)SAR-Daten und toxikologische Daten über 
strukturverwandte Substanzen herangezogen werden. Konzentrationen, die wegen ätzender (
 1 ) oder stark reizender Wirkungen voraussichtlich starke 
Schmerzen und Qualen verursachen, sollten mit dieser Prüfmethode nicht 
geprüft werden [siehe GD 39 (8)].  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 759  
( 1 ) Die Bewertung der Ätzwirkung könnte auf dem Urteil von Experten beispielsweise 
anhand folgender Belege beruhen: Erfahrungswerte bei Mensch und Tier, vorliegende 
(In-vitro-)Daten, z. B. Kapitel B.40 (10), B.40.bis (11) dieses Anhangs oder OECD TG 
435 (12), pH-Werte sowie Informationen über ähnliche Substanzen und andere sachdien ­
liche Daten.
 PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
6. Das Prinzip der Prüfung besteht darin, in einem schrittweisen Verfahren 
genügend Informationen über die akute Toxizität der Prüfsubstanz nach Inhalation über einen Expositionszeitraum von 4 Stunden zu gewinnen, 
damit sie eingestuft werden kann. Für spezifische Regulierungszwecke 
sind andere Expositionszeiten möglich. Bei jeder der festgelegten Konzen ­
trationsstufen werden je drei Tiere beider Geschlechter geprüft. Je nach Mortalität und/oder moribundem Zustand der Tiere können zwei Stufen 
ausreichen, um eine Beurteilung der akuten Toxizität der Prüfsubstanz zu 
ermöglichen. Gibt es Anhaltspunkte dafür, dass ein Geschlecht empfindli ­
cher reagiert als das andere, kann die Prüfung mit dem empfindlicheren 
Geschlecht allein fortgesetzt werden. Das Ergebnis einer Stufe bestimmt 
die jeweils folgende Stufe:
 
a) keine weitere Prüfung erforderlich,  
b) Prüfung von drei Tieren je Geschlecht oder  
c) Prüfung von sechs Tieren des empfindlicheren Geschlechts, d. h. die 
Schätzungen der Untergrenze der Toxizitätsklasse sollte unabhängig vom Geschlecht auf sechs Tieren je Prüfkonzentrationsgruppe basieren.
 
7. Moribunde Tiere oder Tiere, die offensichtlich unter Schmerzen leiden oder 
Anzeichen von schwerem und anhaltendem Leiden zeigen, sollten auf tier ­
schutzgerechte Weise getötet werden und sind bei der Auswertung der Test ­
ergebnisse auf die gleiche Weise zu werten wie während des Tests gestor ­
bene Tiere. Kriterien für die Entscheidung, moribunde oder schwer leidende Tiere zu töten, sowie Hinweise zur Erkennung des absehbaren oder bevor ­
stehenden Todes sind Gegenstand des OECD Guidance Document No. 19 
on Humane Endpoints (7).
 
BESCHREIBUNG DER METHODE  
Auswahl von Versuchstierarten  
8. Es sollten junge, gesunde, adulte Tiere aus üblicherweise eingesetzten La ­
borstämmen verwendet werden. Bevorzugtes Versuchstier ist die Ratte; wer ­
den andere Tierarten eingesetzt, ist dies zu begründen.  
Vorbereitung der Tiere  
9. Die weiblichen Tiere dürfen weder bereits geworfen haben noch momentan 
trächtig sein. Am Tag der Exposition sollten die jungen, adulten Tiere 8 bis 12 Wochen alt sein; ihr Körpergewicht sollte innerhalb von ± 20 % des mittleren Gewichts für jedes Geschlecht aller zuvor exponierten Tiere des ­
selben Alters liegen. Die Tiere werden nach Zufallskriterien ausgewählt, zur 
individuellen Identifizierung markiert und vor Beginn der Prüfung für einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen in ihren Käfigen an die Laborbedin ­
gungen gewöhnt. Die Tiere sollten auch für einen kurzen Zeitraum vor der 
Prüfung an die Versuchsapparatur gewöhnt werden, da dies den Stress durch 
die Umsetzung in eine neue Umgebung verringert.
 
Tierhaltung  
10. Die Temperatur in dem Raum, in dem die Versuchstiere gehalten werden, 
sollte 22 ± 3 °C betragen. Die relative Luftfeuchtigkeit sollte im Idealfall im 
Bereich zwischen 30 und 70 % liegen; bei Verwendung von Wasser als 
Vehikel könnte dies jedoch unmöglich sein. Die Tiere sollten vor und nach den Expositionen im Allgemeinen nach Geschlecht und Konzentration in Käfigen gruppiert werden, wobei aber die Anzahl der Tiere pro Käfig 
noch eine genaue Beobachtung der einzelnen Tiere ermöglichen muss und 
Verluste aufgrund von Kannibalismus oder Kämpfen minimiert werden soll ­
ten. Wenn die Tiere der Prüfsubstanz nur mit der Nase ausgesetzt werden sollen, müssen sie möglicherweise an die Restrainer gewöhnt werden. Die 
Restrainer sollten die Tiere weder körperlich noch in Bezug auf Wärme oder 
Fixierung übermäßig beeinträchtigen. Die Fixierung kann physiologische
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 760
 
Endpunkte wie Körpertemperatur (Hyperthermie) und/oder das Atemminu ­
tenvolumen beeinflussen. Wenn generische Daten zeigen, dass keine der ­
artigen Veränderungen in nennenswertem Ausmaß vorkommen, ist eine Eingewöhnung an die Restrainer nicht erforderlich. Bei der Ganzkörper ­
exposition gegen ein Aerosol sollten die Tiere während der Exposition 
einzeln untergebracht sein, damit sie die Prüfsubstanz nicht durch das Fell 
ihrer Käfiggenossen filtriert einatmen. Außer während der Exposition kann herkömmliches und zertifiziertes Labortierfutter verwendet werden bei un ­
eingeschränkter Versorgung mit Trinkwasser. Die Beleuchtung sollte künst ­
lich sein und die Hell- und Dunkelphasen sollten sich im Abstand von 12 
Stunden abwechseln.
 
Inhalationskammern  
11. Bei der Auswahl einer Inhalationskammer sind die Art der Prüfsubstanz und 
das Ziel der Prüfung zu berücksichtigen. Das bevorzugte Verfahren ist die 
„Nose-only“-Exposition (dieser Begriff umfasst „nur Kopf“, „nur Nase“ 
oder „nur Schnauze“). Für die Untersuchung von Flüssigkeits- oder Fest ­
stoffaerosolen und für Dämpfe, die zu Aerosolen kondensieren können, wird im Allgemeinen die „Nose-only“-Exposition bevorzugt. Besondere Ziele der 
Untersuchung können möglicherweise mit einer Ganzkörperexposition bes ­
ser erreicht werden, doch dies sollte im Prüfbericht begründet werden. Um bei Verwendung einer Ganzkörperkammer die Stabilität der Atmosphäre sicherzustellen, sollte das Gesamtvolumen der Versuchstiere 5 % des Volu ­
mens der Kammer nicht übersteigen. Die Grundzüge der „Nose-only“- und 
der Ganzkörperexposition sowie ihre jeweiligen Vor- und Nachteile sind im GD 39 (8) beschrieben.
 
EXPOSITIONSBEDINGUNGEN  
Verabreichung der Konzentrationen  
12. Es wird eine feste Expositionsdauer von 4 Stunden — ohne die zur Errei ­
chung des Gleichgewicht erforderliche Zeit — empfohlen. Um spezifische 
Erfordernisse zu erfüllen, sind auch andere Expositionszeiten möglich; diese 
sind jedoch im Prüfbericht zu begründen [siehe GD 39 (8)]. Bei Ganzkör ­
perexpositionen sollten die Tiere einzeln untergebracht sein, um eine Auf ­
nahme der Prüfsubstanz durch das Putzen von Käfiggenossen zu verhindern. 
Während der Exposition sollte kein Futter verabreicht werden. Wasser kann 
während einer Ganzkörperexposition jederzeit angeboten werden.  
13. Die Tiere werden der Prüfsubstanz in Form von Gas, Dampf, Aerosol oder 
einer Kombination dieser Formen ausgesetzt. Der zu prüfende Aggregat ­
zustand hängt von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsub ­
stanz, der gewählten Konzentration und/oder der physikalischen Form ab, in der die Prüfsubstanz bei der Handhabung und Verwendung am wahrschein ­
lichsten vorliegt. Hygroskopische und chemisch reaktive Prüfsubstanzen 
sollten bei geringer Luftfeuchtigkeit geprüft werden. Dabei ist darauf zu achten, dass keine explosionsfähigen Konzentrationen erzeugt werden.
 
Partikelgrößenverteilung  
14. Bei allen Aerosolen und bei Dämpfen, die zu Aerosolen kondensieren kön ­
nen, sollte die Partikelgröße bestimmt werden. Damit alle relevanten Regio ­
nen der Atemwege der Prüfsubstanz ausgesetzt werden, werden mittlere aerodynamische Massendurchmesser (Mass Median Aerodynamic Diameter — MMAD) von 1 bis 4 μm mit einer geometrischen Standardabweichung 
(σ
 g ) von 1,5 bis 3,0 empfohlen (8) (13) (14). Wenngleich nach Möglichkeit 
versucht werden sollte, diese Werte zu erreichen, ist Fachwissen erforder ­
lich, falls sie nicht erzielt werden können. Metalldämpfe können z. B. unter diesen Werten liegen, und geladene Partikel, Fasern und hygroskopische 
Stoffe (die sich in der feuchten Umgebung der Atemwege ausdehnen) kön ­
nen diese Werte überschreiten.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 761
 
Vorbereitung der Prüfsubstanz in einem Vehikel  
15. Um die gewünschte Konzentration und Partikelgröße der Prüfsubstanz in der 
Atmosphäre herzustellen, kann ein Vehikel verwendet werden. Hierbei ist in der Regel Wasser zu bevorzugen. Partikel können durch mechanische Pro ­
zesse auf die erforderliche Größenverteilung gebracht werden. Dabei ist 
darauf zu achten, dass die Prüfsubstanz nicht zersetzt oder verändert wird. Wenn angenommen wird, dass die Zusammensetzung der Prüfsubstanz durch mechanische Prozesse verändert wurde (z. B. hohe Temperatur auf ­
grund von Reibung durch übermäßiges Mahlen), sollte die Zusammenset ­
zung der Prüfsubstanz analytisch überprüft werden. Es ist darauf zu achten, dass die Prüfsubstanz nicht kontaminiert wird. Nicht brüchige Granulate, die 
speziell so formuliert sind, dass sie nicht eingeatmet werden können, brau ­
chen nicht geprüft zu werden. Mit einem Abriebtest sollte nachgewiesen werden, dass beim Umgang mit dem Granulat keine lungengängigen Par ­
tikel entstehen. Entstehen bei einem Abriebtest lungengängige Partikel, so 
sollte eine Inhalationstoxizitätsprüfung durchgeführt werden.
 
Kontrolltiere  
16. Eine negative Kontrollgruppe (Luft) ist nicht erforderlich. Wenn zur Erzeu ­
gung der Prüfatmosphäre ein anderes Vehikel als Wasser verwendet wird, 
sollte nur dann eine Vehikelkontrollgruppe verwendet werden, wenn keine historischen Daten über Inhalationstoxizität vorliegen. Ergibt eine Toxizitäts ­
studie einer in einem Vehikel formulierten Prüfsubstanz, dass keine Toxizi ­
tät vorliegt, ist das Vehikel folglich in der geprüften Konzentration nicht toxisch. Daher ist keine Vehikelkontrolle erforderlich.
 
ÜBERWACHUNG DER EXPOSITIONSBEDINGUNGEN  
Luftstrom in der Inhalationskammer  
17. Der Luftstrom durch die Kammer sollte während jeder Exposition sorgfältig 
geregelt, kontinuierlich überwacht und mindestens stündlich protokolliert werden. Die Überwachung der Konzentration (oder Stabilität) der Prüfatmo ­
sphäre ist eine integrale Messung aller dynamischen Parameter und gibt 
indirekt die Möglichkeit, alle relevanten dynamischen Parameter der Erzeu ­
gung der Prüfatmosphäre zu messen. Es sollte besonders darauf geachtet werden, das erneute Einatmen in „Nose-only“-Expositionskammern zu ver ­
meiden, wenn die Luftströmung durch das Expositionssystem nicht aus ­
reicht, um eine dynamische Strömung der Prüfsubstanzatmosphäre zu errei ­
chen. Es gibt festgelegte Methoden, mit denen nachgewiesen werden kann, dass es unter den gewählten Bedingungen nicht zu erneutem Einatmen kommt (8) (15). Die Sauerstoffkonzentration sollte mindestens 19 % betra ­
gen, und die Kohlendioxidkonzentration sollte 1 % nicht überschreiten. Gibt 
es Grund zu der Annahme, dass diese Werte nicht eingehalten werden können, sind die Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen zu messen.
 
Temperatur und relative Luftfeuchtigkeit in der Inhalationskammer  
18. Die Temperatur in der Inhalationskammer sollte 22 ± 3 °C betragen. Sowohl 
bei der „Nose-only“- als auch bei der Ganzkörperexposition sollte die rela ­
tive Luftfeuchtigkeit im Atembereich der Tiere mindestens dreimal für Zeit ­
räume von bis zu 4 Stunden und für kürzere Zeiträume stündlich überwacht und dokumentiert werden. Die relative Luftfeuchtigkeit sollte im Idealfall zwischen 30 und 70 % liegen, was jedoch möglicherweise nicht erreichbar 
ist (z. B. bei der Prüfung von wasserbasierten Mischungen) oder wegen 
chemischer Interferenz mit der Prüfmethode nicht gemessen werden kann.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 762
 
Prüfsubstanz: nominale Konzentration  
19. Die nominale Konzentration in der Expositionskammer sollte möglichst be ­
rechnet und protokolliert werden. Die nominale Konzentration ist die Masse der erzeugten Prüfsubstanz dividiert durch das Gesamtvolumen der durch 
das Kammersystem geleiteten Luft. Sie wird nicht zur Beschreibung der 
Exposition der Tiere verwendet; vielmehr gibt ein Vergleich der nominalen Konzentration und der tatsächlichen Konzentration Aufschluss über die Ef ­
fizienz des Prüfsystems bei der Erzeugung der Prüfkonzentration, und kann 
daher für die Aufdeckung von Problemen bei dieser Erzeugung verwendet 
werden.
 
Prüfsubstanz: tatsächliche Konzentration  
20. Die tatsächliche Konzentration ist die Konzentration der Prüfsubstanz im 
Atembereich der Tiere in einer Inhalationskammer. Die tatsächlichen Kon ­
zentrationen können entweder durch spezifische Methoden (z. B. direkte 
Probenahme, adsorptive Methoden oder chemische Reaktionsverfahren mit anschließender analytischer Charakterisierung) oder durch unspezifische Me ­
thoden wie Gravimetrie bestimmt werden. Die gravimetrische Methode ist 
lediglich für Aerosole mit nur einem Bestandteil in Pulverform oder Aero ­
sole von Flüssigkeiten mit geringer Flüchtigkeit akzeptabel und sollte sich auf geeignete, vor der Studie zu erstellende und für die Prüfsubstanz spezi ­
fische Beschreibungen stützen. Die Konzentration von Aerosolen mit meh ­
reren Bestandteilen in Pulverform kann ebenfalls gravimetrisch bestimmt werden. Hierzu muss jedoch mit Analysedaten belegt werden, dass die Schwebstoffe eine ähnliche Zusammensetzung haben wie das Ausgangs ­
material. Liegen diese Angaben nicht vor, muss die Prüfsubstanz (im Ideal ­
fall im Schwebezustand) möglicherweise im Verlauf der Studie in regel ­
mäßigen Abständen neu analysiert werden. Bei aerosolisierten Agenzien, die verdunsten oder sublimieren können, sollte gezeigt werden, dass alle 
Phasen von der gewählten Methode erfasst wurden. Im Prüfbericht sollten 
die Zielkonzentration sowie die nominale und die tatsächliche Konzentration angegeben werden, aber nur die tatsächlichen Konzentrationen werden für statistische Analysen zur Berechnung letaler Konzentrationswerte verwendet.
 
21. Es sollte möglichst eine Partie der Prüfsubstanz verwendet werden; die 
Probe sollte unter Bedingungen aufbewahrt werden, die ihre Reinheit, Ho ­
mogenität und Stabilität gewährleisten. Die Prüfsubstanz sollte vor Beginn 
der Studie mit Angaben zur Reinheit und, falls technisch machbar, zur 
Identität sowie zu Mengen identifizierter Schadstoffe und Verunreinigungen beschrieben werden. Hierzu können unter anderem die folgenden Daten verwendet werden: Retentionszeit und relative Peakfläche, durch Massen ­
spektrometrie oder Gaschromatographie bestimmtes Molekulargewicht oder 
andere Werte. Das Prüflabor ist zwar nicht für die Identität der Probe ver ­
antwortlich, doch es kann ratsam sein, dass es die Beschreibung des Auf ­
traggebers zumindest in gewissen Grenzen (z. B. Farbe, physikalische Be ­
schaffenheit usw.) überprüft.
 
22. Die Expositionsatmosphäre ist so konstant wie möglich zu halten und je 
nach Analysemethode kontinuierlich und/oder intermittierend zu über ­
wachen. Bei der intermittierenden Probenahme sollten in einer vierstündigen 
Studie mindestens zweimal Proben der Atmosphäre in der Kammer genom ­
men werden. Ist dies wegen begrenzter Luftdurchflussraten oder niedriger Konzentrationen nicht möglich, kann während der gesamten Expositionszeit 
eine einzige Probe genommen werden. Weichen die einzelnen Proben stark 
voneinander ab, sollten bei den nächsten geprüften Konzentrationen vier Proben je Exposition gezogen werden. Die einzelnen Proben der Konzen ­
tration in der Kammer sollten bei Gasen und Dämpfen nicht mehr als 
± 10 % und bei Flüssig- oder Feststoffaerosolen nicht mehr als ± 20 % 
von der mittleren Kammerkonzentration abweichen. Die Zeit bis zum Errei ­
chen eines Gleichgewichts in der Kammer (t
 95 ) ist zu berechnen und zu 
dokumentieren. Die Expositionsdauer erstreckt sich über den Zeitraum, in 
dem die Prüfsubstanz erzeugt wird; dazu gehört die zur Erreichung von t  95 
erforderliche Zeit. GD 39 (8) enthält Hinweise zur Einschätzung von t  95 . ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 763
 
23. Bei sehr komplexen Mischungen aus Dämpfen/Gasen und Aerosolen (z. B. 
Verbrennungsatmosphären und Prüfsubstanzen, die aus hierzu bestimmten 
Endverbraucherprodukten/-geräten gesprüht werden) kann sich jede Phase in einer Inhalationskammer anders verhalten, so dass mindestens eine Indika ­
torsubstanz (Analyt), normalerweise der wichtigste Wirkstoff in der Mi ­
schung, von jeder Phase (Dampf/Gas und Aerosol) ausgewählt werden soll ­
te. Wenn die Prüfsubstanz eine Mischung ist, sollte die Analysekonzentra ­
tion für die gesamte Mischung und nicht nur für den Wirkstoff oder den Bestandteil (Analyt) dokumentiert werden. Weitere Informationen zu tat ­
sächlichen Konzentrationen sind im GD 39 (8) zu finden.
 
Prüfsubstanz: Partikelgrößenverteilung  
24. Die Partikelgrößenverteilung von Aerosolen sollte während jeder 4-stündi ­
gen Exposition mindestens zweimal mit einem Kaskaden-Impaktor oder 
einem anderen Messgerät wie einem APS bestimmt werden. Kann nach ­
gewiesen werden, dass die mit einem Kaskaden-Impaktor und einem alter ­
nativen Messgerät erzielten Ergebnisse gleichwertig sind, so kann das alter ­
native Instrument während der gesamten Studie verwendet werden. Parallel 
zum Hauptinstrument ist ein zweites Gerät wie ein Gravimetriefilter oder 
eine Gaswaschflasche zu verwenden, um den Abscheidegrad des Haupt ­
instruments zu bestätigen. Die durch die Partikelgrößenanalyse bestimmte 
Massenkonzentration sollte innerhalb vertretbarer Grenzen um die durch die 
Filteranalyse bestimmte Massenkonzentration liegen [siehe DG 39 (8)]. Wenn die Gleichwertigkeit zu Beginn der Studie nachgewiesen werden kann, kann auf weitere bestätigende Messungen verzichtet werden. Aus 
Tierschutzgründen sollten Vorkehrungen getroffen werden, um unklare Da ­
ten zu minimieren, die dazu führen könnten, dass eine Exposition wiederholt werden muss. Wenn die Möglichkeit besteht, dass Dampfkondensation zur Bildung eines Aerosols führen kann, oder wenn in einer Dampfatmosphäre 
mit dem Potenzial für gemischte Phasen Partikel nachgewiesen werden, 
sollte eine Partikelgrößenbestimmung für Dämpfe vorgenommen werden (siehe Nummer 14).
 
VERFAHREN  
Hauptversuch  
25. Für jede Stufe werden drei Tiere je Geschlecht oder sechs Tiere des emp ­
findlicheren Geschlechts verwendet. Wenn für eine „Nose-only“-Exposition 
andere Nagetierarten als Ratten verwendet werden, kann die maximale Ex ­
positionsdauer angepasst werden, um artenspezifisches Leiden zu minimie ­
ren. Die als Startdosis zu verwendende Konzentrationsstufe wird aus vier 
festen Dosiswerten gewählt; dabei sollte die Stufe gewählt werden, bei der 
die Wahrscheinlichkeit, dass sie bei einigen der behandelten Tiere Toxizität hervorruft, am größten ist. Die Prüfschemata für Gase, Dämpfe und Aero ­
sole (Anlagen 2, 3 und 4) veranschaulichen die Prüfung mit den Berück ­
sichtigungsgrenzwerten der GHS-Kategorien 1-4 (9) für Gase (100, 500, 
2 500, 20 000 ppm/4 Std.) (Anlage 2), für Dämpfe (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 Std.) (Anlage 3) und für Aerosole (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4 Std.) (Anlage 4). Kategorie 5, die in der Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 (9) nicht umgesetzt 
ist, bezieht sich auf Konzentrationen über den jeweiligen Grenzkonzentra ­
tionen. Für jede Startkonzentration gilt das entsprechende Prüfschema. Der Verlauf des Prüfverfahrens folgt je nach Anzahl der tierschutzgerecht getö ­
teten oder gestorbenen Versuchstiere den angegebenen Pfeilen, bis eine 
Einstufung vorgenommen werden kann.
 
26. Der Zeitabstand zwischen den einzelnen Expositionsgruppen richtet sich 
nach dem Einsetzen, der Dauer und dem Schweregrad der toxischen Zei ­
chen. Die Tiere sollten erst dann der nächsten Konzentrationsstufe aus ­
gesetzt werden, wenn mit angemessener Gewissheit vom Überleben der 
zuvor getesteten Tiere ausgegangen werden kann. Es wird empfohlen, zwi ­
schen den Versuchen mit den einzelnen Konzentrationsstufen einen Abstand von drei bis vier Tagen einzuhalten, damit eine verzögerte Toxizität fest ­
gestellt werden kann. Dieser Zeitabstand kann nach Bedarf angepasst wer ­
den, wenn z. B. die beobachteten Reaktionen keine Schlussfolgerungen 
zulassen.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 764
 
Limit-Test  
27. Der Limit-Test wird verwendet, wenn bekannt oder zu erwarten ist, dass die 
Prüfsubstanz praktisch nicht toxisch ist, d. h. nur über der regulatorisch festgelegten Grenzkonzentration eine toxische Wirkung hervorruft. Informa ­
tionen über die Toxizität der Prüfsubstanz können aus Kenntnissen über 
ähnliche geprüfte Stoffe oder ähnliche Mischungen gewonnen werden, wo ­
bei Art und prozentualer Anteil der Komponenten zu berücksichtigen sind, deren toxikologische Relevanz bekannt ist. In den Fällen, in denen nur 
wenige oder keine Informationen über die Toxizität der Prüfsubstanz vor ­
liegen oder in denen von einer Toxizität der Prüfsubstanz ausgegangen wird, sollte der Hauptversuch durchgeführt werden [weitere Hinweise sind GD 39 
(8) zu entnehmen].
 
28. Bei der normalen Vorgehensweise werden je drei Tiere beider Geschlechter 
oder sechs Tiere des empfindlicheren Geschlechts Konzentrationen von 20 000 ppm im Fall von Gasen, 20 mg/l im Fall von Dämpfen und 5 
mg/l im Fall von Stäuben/Nebel ausgesetzt. Wenn diese Konzentrationen 
erreicht werden, dienen sie als Limit-Test für diese Prüfmethode. Bei der Prüfung von Aerosolen sollte das Hauptziel darin bestehen, eine lungengän ­
gige Partikelgröße (d. h. ein MMAD von 1-4 μm) zu erreichen. Dies ist bei 
den meisten Prüfsubstanzen bei einer Konzentration von 2 mg/l der Fall. 
Aerosole sollten nur dann bei mehr als 2 mg/l geprüft werden, wenn eine lungengängige Partikelgröße erreicht werden kann [siehe GD 39 (8)]. In Übereinstimmung mit dem GHS (16) wird aus Tierschutzgründen von Prü ­
fungen über einer Grenzkonzentration abgeraten. Prüfungen in der 
GHS-Kategorie 5 (16), die in der Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 (9) nicht umgesetzt ist, sollten nur dann in Betracht gezogen werden, wenn es sehr wahrscheinlich ist, dass die Ergebnisse einer solchen Prüfung von unmittel ­
barer Relevanz für den Schutz der menschlichen Gesundheit sind. Im Stu ­
dienbericht ist eine Begründung anzugeben. Bei potenziell explosiven Prüf ­
substanzen ist darauf zu achten, dass keine explosionsfördernden Bedingun ­
gen geschaffen werden. Um eine unnötige Verwendung von Versuchstieren 
zu vermeiden und sicherzustellen, dass die Kammerbedingungen für einen Limit-Test erreicht werden können, sollte vor dem Limit-Test ein Pro ­
bedurchlauf ohne Tiere vorgenommen werden.
 
BEOBACHTUNGEN  
29. Die Tiere sollten während der Exposition häufig auf klinische Zeichen be ­
obachtet werden. Nach der Exposition sollten klinische Beobachtungen min ­
destens zweimal am Tag der Exposition oder, falls es aufgrund der Reaktion der Tiere auf die Behandlung angezeigt erscheint, häufiger und danach für einen Zeitraum von insgesamt 14 Tagen mindestens einmal täglich vor ­
genommen werden. Die Länge des Beobachtungszeitraums ist nicht fest ­
gelegt; sie sollte nach Art und Zeitpunkt des Einsetzens klinischer Zeichen und der Länge der Erholungsphase bestimmt werden. Der Zeitpunkt, zu dem die Toxizitätszeichen auftreten und wieder abklingen, ist von Bedeutung, 
insbesondere dann, wenn Anzeichen für ein verzögertes Auftreten von To ­
xizitätszeichen erkennbar sind. Sämtliche Beobachtungen werden systema ­
tisch in Einzelprotokollen dokumentiert, die für jedes Tier geführt werden. Tiere, bei denen ein moribunder Zustand festgestellt wird, sowie Tiere, die 
starke Schmerzen haben oder anhaltende Anzeichen von schwerem Leiden 
zeigen, sollten aus Tierschutzgründen getötet werden. Bei den Untersuchun ­
gen auf klinische Toxizitätszeichen ist darauf zu achten, dass ein anfänglich schlechtes Aussehen und vorübergehende Atemveränderungen, die auf das 
Expositionsverfahren zurückzuführen sind, nicht mit behandlungsbedingten 
Wirkungen verwechselt werden. Die im Humane Endpoints Guidance Do ­
cument (7) zusammengefassten Prinzipien und Kriterien sind zu berücksich ­
tigen. Wenn Tiere aus Tierschutzgründen getötet werden oder ihr Tod fest ­
gestellt wird, sollte der Todeszeitpunkt so genau wie möglich registriert 
werden.
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30. Bei den Beobachtungen ist auf Veränderungen von Haut, Fell, Augen und 
Schleimhäuten sowie Atmung, Kreislauf, autonomes und zentrales Nerven ­
system, Somatomotorik und Verhaltensmuster zu achten. Soweit möglich, ist auf Differenzierungen zwischen lokalen und systemischen Wirkungen zu achten. Besonderes Augenmerk ist auf Tremor, Konvulsionen, Salivation, 
Diarrhö, Lethargie, Schlaf und Koma zu richten. Die Messung der Rektal ­
temperatur kann zusätzliche Belege für mit der Behandlung oder Unterbrin ­
gung zusammenhängende Reflex-Bradypnoe oder Hypo-/Hyperthermie lie ­
fern.
 
Körpergewicht  
31. Das Körpergewicht der einzelnen Tiere sollte einmal während der Einge ­
wöhnungszeit, am Tag der Exposition vor der Exposition (Tag 0) und 
mindestens an den Tagen 1, 3 und 7 (und danach wöchentlich) sowie zum Zeitpunkt des Todes oder der Tötung, falls später als Tag 1, dokumen ­
tiert werden. Das Körpergewicht gilt als kritischer Indikator für Toxizität; 
Tiere, die gegenüber ihrem Gewicht vor der Prüfung eine dauerhafte Ab ­
nahme um ≥ 20 % aufweisen, sollten sorgfältig überwacht werden. Die 
überlebenden Tiere werden gewogen und am Ende der Post-Expositions ­
phase auf tierschutzgerechte Weise getötet.
 
Pathologie  
32. Alle Versuchstiere (einschließlich der Tiere, die während des Tests sterben 
oder aus Tierschutzgründen getötet und aus der Studie genommen werden) sind auf makroskopische Veränderungen zu untersuchen. Kann die Nekrop ­
sie nicht unmittelbar nach Auffinden eines toten Tieres erfolgen, sollte der 
Körper auf eine Temperatur gekühlt (nicht eingefroren) werden, die tief 
genug ist, um die Autolyse zu minimieren. Die Nekropsie ist baldmöglichst, in der Regel innerhalb von einem oder zwei Tagen durchzuführen. Alle makroskopischen Veränderungen sollten für jedes Tier protokolliert werden, 
wobei besonders auf Veränderungen der Atemwege zu achten ist.
 
33. Es kann in Betracht gezogen werden, von vorneherein zusätzliche Unter ­
suchungen in die Studienauslegung aufzunehmen, die die Aussagekraft der 
Studie erhöhen, z. B. die Messung des Lungengewichts überlebender Ratten 
und/oder den Nachweis einer Reizwirkung durch mikroskopische Unter ­
suchung der Atemwege. Untersucht werden können auch diejenigen Organe, die bei 24 Stunden oder länger überlebenden Tieren makroskopische Be ­
funde aufweisen, sowie Organe, die bekanntermaßen oder vermutlich be ­
troffen sind. Eine mikroskopische Untersuchung des gesamten Atemtrakts kann nützliche Informationen über Prüfsubstanzen liefern, die mit Wasser reagieren, z. B. Säuren und hygroskopische Prüfsubstanzen.
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Daten  
34. Das Körpergewicht der einzelnen Tiere und Sektionsbefunde sollten ange ­
geben werden. Die Daten der klinischen Beobachtung sollten in tabellari ­
scher Form zusammengefasst werden. Daraus müssen für jede Prüfgruppe 
die Anzahl der verwendeten Tiere, die Anzahl der Tiere mit spezifischen Toxizitätszeichen, die Anzahl der Tiere, die während der Prüfung tot auf ­
gefunden oder vorzeitig getötet wurden, der Todeszeitpunkt der einzelnen 
Tiere, eine Beschreibung und der zeitliche Verlauf der toxischen Wirkungen 
und deren Reversibilität sowie die Sektionsbefunde ersichtlich sein.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 766
 
Prüfbericht  
35. Der Prüfbericht sollte, soweit zutreffend, die folgenden Informationen ent ­
halten:  
Versuchstiere und Tierhaltung  
— Beschreibung der Haltungsbedingungen mit Angaben zu Anzahl (oder 
Veränderung der Anzahl) der Tiere je Käfig, Einstreu, Umgebungstem ­
peratur und relativer Luftfeuchtigkeit, Photoperiode und Futter,  
— Art/Stamm und Begründung für die Verwendung einer anderen Art als 
der Ratte,  
— Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere,  
— Randomisierungsmethode,  
— Angaben über Futter- und Wasserqualität (einschließlich Art/Herkunft 
des Futters, Wasserquelle),  
— Beschreibung etwaiger Vorbereitung vor der Prüfung, einschließlich Er ­
nährung, Quarantäne und Behandlung von Krankheiten.  
Prüfsubstanz  
— physikalische Beschaffenheit, Reinheit und, wenn maßgeblich, 
physikalisch-chemische Eigenschaften (einschließlich Isomerisierung),  
— Angaben zur Identifikation und CAS-Nummer (Chemical Abstract Ser ­
vices), falls bekannt.  
Vehikel  
— Begründung für die Verwendung eines Vehikels sowie für die Wahl des 
Vehikels (falls nicht Wasser),  
— historische oder parallel erzeugte Daten, die belegen, dass das Vehikel 
keinen Einfluss auf das Ergebnis der Studie hat.  
Inhalationskammer  
— Beschreibung der Inhalationskammer mit Angabe von Abmessungen und 
Volumen,  
— Herkunft und Beschreibung der für die Exposition der Tiere sowie für 
die Erzeugung der Atmosphäre verwendeten Ausrüstung,  
— Ausrüstung für die Messung von Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Partikel ­
größe und tatsächlicher Konzentration,  
— Herkunft der Luft, Behandlung der eingeleiteten/entzogenen Luft sowie 
Klimatisierungssystem,  
— für die Kalibrierung der Ausrüstung verwendete Methoden, um eine 
homogene Prüfatmosphäre sicherzustellen,  
— Druckunterschied (positiv oder negativ),  
— Expositions-Öffnungen je Kammer („Nose-only“-Exposition); Anord ­
nung der Tiere im System (Ganzkörper),  
— zeitliche Homogenität/Stabilität der Prüfatmosphäre,  
— Lage von Temperatur- und Feuchtigkeitssensoren und Ort der Pro ­
benahme der Prüfatmosphäre in der Kammer,  
— Luftdurchflussraten, Luftdurchflussrate/Expositions-Öffnung („Nose-on ­
ly“-Exposition) oder Anzahl der Tiere je Kammer (Ganzkörperexpositi ­
on), 
— Angaben zur Ausrüstung für die Messung des Sauerstoff- und Kohlen ­
dioxidgehalts, falls zutreffend,  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 767
 
— bis zum Erreichen des Gleichgewichts in der Inhalationskammer benö ­
tigte Zeit (t  95 ), 
— Zahl der Volumenänderungen pro Stunde,  
— Messgeräte (falls zutreffend).  
Expositionsdaten  
— Begründung für die Wahl der Zielkonzentration in der Hauptstudie,  
— nominale Konzentrationen (Gesamtmasse der in die Inhalationskammer 
eingeleiteten Prüfsubstanz dividiert durch das Volumen der durch die Kammer geleiteten Luft),
 
— im Atembereich der Tiere ermittelte tatsächliche Konzentrationen der 
Prüfsubstanz; bei Prüfgemischen mit heterogenen physikalischen Formen (Gase, Dämpfe, Aerosole) kann jede Form getrennt analysiert werden,
 
— alle Luftkonzentrationen sollten in Masseneinheiten angegeben werden 
(z. B. mg/l, mg/m  3 usw.), Volumeneinheiten können in Klammern eben ­
falls angegeben werden (z. B. ppm, ppb),  
— Partikelgrößenverteilung, mittlerer aerodynamischer 
Massendurchmesser (MMAD) und geometrische Standardabweichung 
(σg), einschließlich der Berechnungsmethoden. Einzelne Partikelgrößen ­
analysen sind zu protokollieren.  
Prüfbedingungen  
— Angaben zur Vorbereitung der Prüfsubstanz, einschließlich Angaben zu 
den Verfahren zur Reduzierung der Partikelgröße von Feststoffen oder 
zur Herstellung von Lösungen der Prüfsubstanz. Wenn die Zusammen ­
setzung der Prüfsubstanz durch mechanische Prozesse verändert worden sein kann, sind die Ergebnisse der Analysen zur Überprüfung der Zu ­
sammensetzung der Prüfsubstanz beizufügen.
 
— Eine Beschreibung (möglichst mit Diagramm) der Ausrüstung, die zur 
Erzeugung der Prüfatmosphäre und zur Exposition der Tiere gegen die 
Prüfatmosphäre verwendet wurde.  
— Angaben zur verwendeten chemischen Analysemethode und zur Validie ­
rung der Methode (einschließlich der Effizienz der Wiederfindung der 
Prüfsubstanz im Medium).  
— Begründung für die Wahl der Prüfkonzentrationen.  
Ergebnisse  
— tabellarische Darstellung von Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Luft ­
strom in der Kammer,  
— tabellarische Darstellung von Daten zur nominalen und tatsächlichen 
Konzentration in der Kammer,  
— tabellarische Darstellung der Partikelgrößendaten einschließlich Daten 
zur analytischen Probenahme, Partikelgrößenverteilung und Berechnung des MMAD und der σ
 g , 
— tabellarische Erfassung der erhobenen Daten und der Konzentration für 
jedes einzelne Tier (d. h. Tiere, die Anzeichen für Toxizität zeigen, einschließlich Mortalität sowie Art, Schweregrad und Dauer der Wirkun ­
gen),
 
— Körpergewicht der einzelnen Tiere, erfasst an Prüfungstagen, Datum und 
Zeitpunkt des Todes, falls vor geplanter Tötung, zeitlicher Verlauf des 
Einsetzens von Toxizitätsanzeichen sowie Angabe, ob diese reversibel 
waren, für jedes einzelne Tier,  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 768
 
— Sektionsbefunde und histopathologische Ergebnisse für jedes einzelne 
Tier, falls vorhanden,  
— GHS-Kategorieeinstufung und LC  50 -Berücksichtigungsgrenzwert.  
Diskussion und Auswertung der Ergebnisse  
— Besondere Aufmerksamkeit sollte der Beschreibung der Methoden gel ­
ten, die verwendet wurden, um die Kriterien dieser Prüfmethode zu erfüllen, z. B. die Grenzkonzentration oder die Partikelgröße.
 
— Die Lungengängigkeit von Partikeln vor dem Hintergrund der Gesamt ­
befunde sollte behandelt werden, insbesondere, wenn die Partikelgrößen ­
kriterien nicht erfüllt werden konnten.  
— Die Kohärenz der Methoden zur Bestimmung der nominalen und der 
tatsächlichen Konzentration sowie die Beziehung der tatsächlichen Kon ­
zentration zur nominalen Konzentration sind in die Gesamtbewertung der Studie aufzunehmen.
 
— Die wahrscheinliche Todesursache und die vorherrschende Wirkungs ­
weise (systemisch oder lokal) sollten behandelt werden.  
— Falls Tiere, die unter Schmerzen litten oder Zeichen für schweres und 
anhaltendes Leiden aufwiesen, auf tierschutzgerechte Weise getötet wer ­
den mussten, ist eine Erklärung auf der Grundlage der Kriterien im OECD Guidance Document on Humane Endpoints (7) zu geben.
 
LITERATUR:  
1. Kapitel B.2 dieses Anhangs, Akute Inhalationstoxizität.  
2. Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and 
Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric 
Evaluations for the Globally Harmonized Classification System.  Arch. Toxi ­
col. 77: 243-254.  
3. Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations.  Arch. Toxicol.  
71: 537-549.  
4. Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to 
LD/LC  50 Tests.  ALTEX  1: 129-134.  
5. Kapitel B.1.tris dieses Anhangs, Akute orale Toxizität — Akut toxische 
Klassenmethode.  
6. OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft 
TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 105, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/ testguidelines]
 
7. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No. 19. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/ testguidelines]
 
8. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  
9. Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 des Europäischen Parlaments und des Rates 
vom 16. Dezember 2008 über die Einstufung, Kennzeichnung und Ver ­
packung von Stoffen und Gemischen, zur Änderung und Aufhebung der 
Richtlinien 67/548/EWG und 1999/45/EG und zur Änderung der 
Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 (ABl. L 353 vom 31.12.2008, S. 1).  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 769
 
10. Kapitel B.40 dieses Anhangs,  In-vitro -Prüfung auf hautätzende Wirkung: 
TER-Test (transcutaneous electrical resistance test).  
11. Kapitel B.40.bis dieses Anhangs,  In-vitro -Prüfung auf hautätzende Wirkung: 
Test mit menschlichem Hautmodell.  
12. OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Abrufbar unter: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
13. Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2  nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  
14. SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, So ­
ciety of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests.  Fund. Appl. Toxicol.  18: 321-327.
 
15. Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160- 
167 
16. UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and 
Geneva. Abrufbar unter: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ 
ghs_welcome_e.html]  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 770
 
Anlage 1  
DEFINITION  
Prüfsubstanz:  jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode 
getestet wird.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 771
 
Anlage 2  
Verfahrensweise für jede Startkonzentration von Gasen (ppm/4 Std.)  
Allgemeine Hinweise (  1 ) 
Die Prüfschemata in dieser Anlage geben für jede Startkonzentration die jeweils 
zu beachtende Vorgehensweise an.  
Anlage 2a: Startkonzentration 100 ppm  
Anlage 2b: Startkonzentration 500 ppm  
Anlage 2c: Startkonzentration 2 500 ppm  
Anlage 2d: Startkonzentration 20 000 ppm  
Der Testverlauf folgt je nach Anzahl der tierschutzgerecht getöteten oder gestor ­
benen Versuchstiere den angegebenen Pfeilen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 772  
( 1 ) In den folgenden Tabellen wird auf das GHS (Global Harmonisiertes System zur Ein ­
stufung und Kennzeichnung von Chemikalien verwiesen. Die entsprechende Rechtsvor ­
schrift in der EU ist die Verordnung (EG) Nr. 1272/2008. Im Fall der akuten Inhalations ­
toxizität wird die Kategorie 5 in der Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 (9) nicht umge ­
setzt.
 Anlage 2a  
Akute Inhalationstoxizität:  
Prüfverfahren mit einer Ausgangskonzentration von 100 ppm/4 Std. für 
Gase
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 773
 
Anlage 2b  
Akute Inhalationstoxizität:  
Prüfverfahren mit einer Ausgangskonzentration von 500 ppm/4 Std. für 
Gase
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 774
 
Anlage 2c  
Akute Inhalationstoxizität:  
Prüfverfahren mit einer Ausgangskonzentration von 2 500 ppm/4 Std. für 
Gase
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 775
 
Anlage 2d  
Akute Inhalationstoxizität:  
Prüfverfahren mit einer Ausgangskonzentration von 20 000 ppm/4 Std. für Gase
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 776
 
Anlage 3  
Verfahrensweise für jede Startkonzentration von Dämpfen (mg/l/4 Std.)  
Allgemeine Hinweise (  1 ) 
Die Prüfschemata in dieser Anlage geben für jede Startkonzentration die jeweils 
zu beachtende Vorgehensweise an.  
Anlage 3a: Startkonzentration 0,5 mg/l  
Anlage 3b: Startkonzentration 2,0 mg/l  
Anlage 3c: Startkonzentration 10 mg/l  
Anlage 3d: Startkonzentration 20 mg/l  
Der Testverlauf folgt je nach Anzahl der tierschutzgerecht getöteten oder gestor ­
benen Versuchstiere den angegebenen Pfeilen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 777  
( 1 ) In den folgenden Tabellen wird auf das GHS (Global Harmonisiertes System zur Ein ­
stufung und Kennzeichnung von Chemikalien verwiesen. Die entsprechende Rechtsvor ­
schrift in der EU ist die Verordnung (EG) Nr. 1272/2008. Im Fall der akuten Inhalations ­
toxizität wird die Kategorie 5 in der Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 (9) nicht umge ­
setzt.
 Anlage 3a  
Akute Inhalationstoxizität:  
Prüfverfahren mit einer Ausgangskonzentration von 0,5 mg/l/4 Std. für Dämpfe
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 778
 
Anhang 3b  
Akute Inhalationstoxizität:  
Prüfverfahren mit einer Ausgangskonzentration von 2 mg/l/4 Std. für Dämpfe
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 779
 
Anlage 3c  
Akute Inhalationstoxizität:  
Prüfverfahren mit e iner Ausgangskonzentration von 10 mg/l/4 Std. für Dämpfe
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 780
 
Anlage 3d  
Akute Inhalationstoxizität:  
Prüfverfahren mit einer Ausgangskonzentration von 20 mg/l/4 Std. für Dämpfe
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 781
 
Anlage 4  
Verfahrensweise für jede Startkonzentration von Aerosolen (mg/l/4 Std.)  
Allgemeine Hinweise (  1 ) 
Die Prüfschemata in dieser Anlage geben für jede Startkonzentration die jeweils 
zu beachtende Vorgehensweise an.  
Anlage 4a: Startkonzentration 0,05 mg/l  
Anlage 4b: Startkonzentration 0,5 mg/l  
Anlage 4c: Startkonzentration 1 mg/l  
Anlage 4d: Startkonzentration 5 mg/l  
Der Testverlauf folgt je nach Anzahl der tierschutzgerecht getöteten oder gestor ­
benen Versuchstiere den angegebenen Pfeilen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 782  
( 1 ) In den folgenden Tabellen wird auf das GHS (Global Harmonisiertes System zur Ein ­
stufung und Kennzeichnung von Chemikalien verwiesen. Die entsprechende Rechtsvor ­
schrift in der EU ist die Verordnung (EG) Nr. 1272/2008. Im Fall der akuten Inhalations ­
toxizität wird die Kategorie 5 in der Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 (9) nicht umge ­
setzt.
 Anlage 4a  
Akute Inhalationstoxizität:  
Prüfverfahren mit einer Ausgangskonzentration von 0.05 mg/l/4 Std. für 
Dämpfe
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 783
 
Anlage 4b  
Akute Inhalationstoxizität:  
Prüfverfahren mit einer Ausgangskonzentration von 0,5 mg/l/4Std. für 
Aerosole
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 784
 
Anlage 4c  
Akute Inhalationstoxizität:  
Prüfverfahren mit einer Ausgangskonzentration von 1 mg/l/4 Std. für 
Aerosole
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 785
 
Anlage 4d  
Akute Inhalationstoxizität:  
Prüfverfahren mit einer Ausgangskonzentration von 5 mg/l/4 Std. für 
Aerosole
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 786
 
TEIL C: METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER ÖKOTOXIZITÄT  
INHALTSVERZEICHNIS 
C.1. AKUTE TOXIZITÄT FÜR FISCHE 
C.2. DAPHNIA -SP.-TEST AUF AKUTE SCHWIMMUNFÄHIGKEIT 
C.3. SÜSSWASSERALGEN UND CYANOBAKTERIEN: WACHS ­
TUMSINHIBITIONSTEST 
C.4. BIOLOGISCHE ABBAUBARKEIT — BESTIMMUNG DER 
„LEICHTEN“ BIOLOGISCHEN ABBAUBARKEIT 
TEIL I. ALLGEMEINES 
TEIL II. DOC-DIE-AWAY–TEST — ABNAHME VON GELÖSTEM 
ORGANISCHEM KOHLENSTOFF (DOC) (Methode C.4-A) 
TEIL III. MODIFIZIERTER OECD-SCREENING-TEST (Methode C.4-B) 
TEIL IV. CO  2 -ENTWICKLUNGSTEST (Methode C.4-C) 
TEIL V. MANOMETRISCHER RESPIRATIONSTEST (Methode C.4-D) TEIL VI. GESCHLOSSENER FLASCHENTEST (Methode C.4-E) 
TEIL VII. MITI-TEST (Methode C.4-F) 
C.5. ABBAUBARKEIT — BIOCHEMISCHER SAUERSTOFF ­
BEDARF 
C.6. ABBAUBARKEIT — CHEMISCHER SAUERSTOFFBEDARF C.7. ABBAUBARKEIT — ABIOTISCHER ABBAU: HYDROLYSE 
IN ABHÄNGIGKEIT VOM pH-WERT 
C.8. TOXIZITÄT FÜR REGENWÜRMER 
C.9. BIOLOGISCHE ABBAUBARKEIT — ZAHN-WELLENS-TEST 
C.10. SIMULATION DER AEROBEN ABWASSERBEHANDLUNG: 
C.10-A: BELEBTSCHLAMM — C.10-B: BIOFILME 
C.11. BIOLOGISCHE ABBAUBARKEIT — BELEBTSCHLAMM: 
PRÜFUNG DER ATMUNGSHEMMUNG 
C.12. BIOLOGISCHE ABBAUBARKEIT — MODIFIZIERTER SCAS- 
TEST 
C.13. BIOKONZENTRATION: DURCHFLUSS-FISCHTEST 
C.14. WACHSTUMSTEST AN JUNGFISCHEN 
C.15. FISCHE, KURZFRISTIGE TOXIZITÄTSPRÜFUNG AN EM ­
BRYONEN UND JUNGFISCHEN MIT DOTTERSACK 
C.16. HONIGBIENEN — AKUTE ORALE TOXIZITÄTSPRÜFUNG 
C.17. HONIGBIENEN — AKUTE KONTAKTTOXIZITÄTSPRÜ ­
FUNG 
C.18. ADSORPTION/DESORPTION NACH EINER SCHÜTTEL ­
METHODE
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 787
 
C.19. SCHÄTZUNG DES ADSORPTIONSKOEFFIZIENTEN (K  oc ) IM 
BODEN UND IN KLÄRSCHLAMM MITTELS DER HOCH ­
DRUCK- FLÜSSIGCHROMATOGRAFIE (HPLC) 
C.20.  DAPHNIA-MAGNA -REPRODUKTIONSTEST 
C.21. BODENMIKROORGANISMEN: STICKSTOFFTRANSFORMA ­
TIONSTEST 
C.22. BODENMIKROORGANISMEN: KOHLENSTOFFTRANSFOR ­
MATIONSTEST 
C.23. AEROBE UND ANAEROBE TRANSFORMATION IM BODEN 
C.24. AEROBE UND ANAEROBE TRANSFORMATION IN WAS ­
SER-SEDIMENT-SYSTEMEN 
C.25. AEROBE MINERALISATION IN OBERFLÄCHENWASSER — 
SIMULATIONSTEST ZUR BIOLOGISCHEN ABBAUBAR ­
KEIT 
C.26.  LEMNA  SP. — WACHSTUMSINHIBITIONSTEST  
▼M4 
C.27. CHIRONOMIDEN-TOXIZITÄTSTEST IN SEDIMENT-WAS ­
SER-SYSTEMEN MIT GESPIKTEM SEDIMENT 
C.28. CHIRONOMIDEN-TOXIZITÄTSTEST IN SEDIMENT-WAS ­
SER-SYSTEMEN MIT GESPIKTEM WASSER 
C.29. LEICHTE BIOLOGISCHE ABBAUBARKEIT — BESTIM ­
MUNG VON CO  2 IN GESCHLOSSENEN FLASCHEN (HEAD ­
SPACE-TEST) 
C.30. BIOAKKUMULATION IN TERRESTRISCHEN OLIGOCHAE ­
TEN ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 788
 
C.1. AKUTE TOXIZITÄT FÜR FISCHE  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Mit diesem Test soll die akute letale Toxizität einer Substanz für 
Fische in Süßwasser bestimmt werden. So weit wie möglich sollten 
Angaben über die Wasserlöslichkeit, den Dampfdruck, die chemische Stabilität, die Dissoziationskonstanten und die biologische Abbaubar ­
keit der Substanz vorhanden sein, um die Auswahl der am besten 
geeigneten Prüfmethode (statisch, semistatisch oder im Durchfluss) 
zur Sicherstellung ausreichend konstanter Konzentrationen der Prüf ­
substanz während des gesamten Prüfzeitraums zu erleichtern.
 
Weitere Angaben (z. B. Strukturformel, Reinheitsgrad, Art und Pro ­
zentanteil signifikanter Verunreinigungen, Vorhandensein und 
Menge von Zusätzen, sowie der n-Oktanol/Wasser-Verteilungskoef ­
fizient) sind sowohl bei der Planung der Prüfung als auch bei der Interpretation der Prüfergebnisse zu berücksichtigen.
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Unter akuter Toxizität wird die deutlich erkennbare schädigende 
Wirkung verstanden, die in einem Organismus innerhalb kurzer Zeit (Tage) durch Einwirkung (Exposition) eines Stoffes hervorgeru ­
fen wird. In der vorliegenden Prüfung wird die akute Toxizität als 
die mittlere letale Konzentration (LC
 50 ) ausgedrückt; das ist die 
Konzentration im Wasser, die 50 % einer Prüfgruppe von Fischen innerhalb einer anzugebenden ununterbrochenen Einwirkungsdauer 
tötet.
 
Alle Konzentrationen der Prüfsubstanz sind in Gewicht/Volumen 
(mg/l) anzugeben. Sie können auch als Gewichtsanteile (mg/kg) an ­
gegeben werden.  
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Eine Referenzsubstanz kann geprüft werden, um nachzuweisen, dass 
sich die Reaktion des Prüfsystems unter den Bedingungen der Prü ­
feinrichtung nicht wesentlich geändert hat.  
Referenzsubstanzen sind für diesen Test noch nicht festgelegt.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Es kann ein Limit-Test mit 100 mg.l  -1 durchgeführt werden, um 
nachzuweisen, dass die LC  50 über dieser Konzentration liegt.  
Die Fische werden der dem Wasser zugesetzten Prüfsubstanz für 
einen Zeitraum von 96 Stunden verschiedenen Konzentrationen aus ­
gesetzt. Die Mortalitäten werden mindestens alle 24 Stunden erfasst; soweit möglich, werden bei jeder Beobachtung auch die Konzentra ­
tionen berechnet, die 50 % der Fische töten (LC
 50 ). 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Die Qualitätskriterien gelten für den Limit-Test wie auch für das 
vollständige Prüfverfahren.  
Die Mortalität darf bei den Kontroll-Prüfsystemen am Ende der Prü ­
fung 10 % (bzw. einen Fisch, wenn weniger als 10 verwendet wer ­
den) nicht überschreiten.  
Die Sauerstoffkonzentration muss über die gesamte Prüfdauer mehr 
als 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungswerts betragen:  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 789
 
Die Konzentrationen der Prüfsubstanz sollen über den gesamten 
Prüfzeitraum bei bis zu 80 % der Anfangskonzentrationen gehalten 
werden.  
Bei Substanzen, die im Prüfmedium leicht löslich sind und stabile 
Lösungen ergeben, d. h. Lösungen, die sich nicht in signifikantem 
Maße verflüchtigen oder nicht in einem solchen Maße abgebaut, hydrolisiert oder adsorbiert werden, kann die Anfangskonzentration als der nominalen Konzentration gleichwertig angesehen werden. Es 
ist nachzuweisen, dass die Konzentrationen über den gesamten Prüf ­
zeitraum aufrechterhalten und die Qualitätskriterien erfüllt worden sind.
 
Bei Substanzen, die  
i) im Prüfmedium schwer löslich sind oder  
ii) stabile Emulsionen oder Dispersionen bilden können oder  
iii) in wässrigen Lösungen nicht stabil sind,  
soll die Anfangskonzentration diejenige Konzentration sein, die bei 
Prüfbeginn in der Lösung (oder, wenn dies aus technischen Gründen 
nicht möglich ist, in der Wassersäule) gemessen worden ist. Die 
Konzentration soll nach einer Zeit der Äquilibrierung, jedoch vor Einbringen der Prüforganismen, bestimmt werden.
 
In all diesen Fällen müssen weitere Messungen im Verlauf der Prü ­
fung durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass die Expositions ­
konzentrationen tatsächlich erreicht und die Qualitätskriterien erfüllt 
worden sind.  
Der pH-Wert darf nicht um mehr als eine Einheit schwanken.  
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
Für die Durchführung der Prüfung aufgrund der vorliegenden Me ­
thode sind drei Verfahren möglich:  
Statisches Verfahren  
Toxizitätsprüfung, wobei das Prüfmedium während der Prüfdauer 
nicht erneuert wird.  
Semistatisches Verfahren  
Das Prüfmedium wird regelmäßig nach einem längeren Zeitraum 
(z. B. 24 Stunden) vollständig ausgewechselt.  
Durchflussverfahren  
Das Prüfmedium wird ständig erneuert, wobei die Prüfsubstanz mit 
dem Wasser für die Erneuerung des Prüfmediums eingebracht wird.  
1.6.1.  Reagenzien  
1.6.1.1.  Lösungen der Prüfsubstanzen  
Die Stammansätze in den erforderlichen Konzentrationen werden 
durch Lösung der Prüfsubstanz in deionisiertem Wasser oder Wasser 
entsprechend 1.6.1.2 hergestellt.  
Die gewählten Prüfkonzentrationen werden durch Verdünnung des 
Stammansatzes zubereitet. Bei hohen Konzentrationen kann die Prüf ­
substanz unmittelbar im Verdünnungswasser gelöst werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 790
 
Die Substanzen sollen im Allgemeinen nur bis zur Löslichkeits ­
grenze geprüft werden. Bei einigen Substanzen (z. B. bei solchen 
mit geringer Wasserlöslichkeit oder hohem P  ow oder solchen, die im 
Wasser eher eine stabile Dispersion als eine echte Lösung bilden), kann es angezeigt sein, eine Prüfkonzentration zu verwenden, die 
oberhalb der Löslichkeitsgrenze der Substanz liegt, um sicherzustel ­
len, dass die höchste lösliche/stabile Konzentration erreicht worden ist. Wichtig ist jedoch, dass diese Konzentration das Prüfsystem nicht auf sonstige Weise stört (z. B. durch Bildung eines Substanz ­
films auf der Wasseroberfläche, durch den die Anreicherung des 
Wassers mit Sauerstoff verhindert wird).
 
Durch Ultraschalldispersion, Verwendung organischer Lösungsmittel 
und emulgierender oder dispergierender Mittel können Stammansätze von Prüfsubstanzen mit geringer Wasserlöslichkeit hergestellt oder deren Dispersion im Prüfmedium gefördert werden. Werden derartige 
Hilfsstoffe verwendet, müssen alle Prüfkonzentrationen die gleiche 
Menge des Hilfsstoffes enthalten, und zusätzliche Kontroll-Fische müssen derselben Konzentration an Hilfsstoffen ausgesetzt werden, wie sie in der Prüfreihe verwendet wurde. Die Konzentration der ­
artiger Hilfsstoffe sollte niedrig gehalten werden, in keinem Fall 
jedoch 100 mg.l
 -1 im Prüfmedium überschreiten.  
Die Prüfung ist ohne eine Einstellung des pH-Wertes durchzuführen. 
Gibt es Anzeichen für eine deutliche Änderung des pH-Wertes, wird empfohlen, die Prüfung mit einer pH-Wert-Einstellung zu wieder ­
holen und die Ergebnisse entsprechend zu protokollieren. In diesem 
Fall ist der pH-Wert des Stammansatzes auf den pH-Wert des Ver ­
dünnungswassers einzustellen, falls nicht bestimmte Gründe dagegen sprechen. Hierzu sind möglichst HCl und NaOH zu verwenden. Die pH-Wert-Einstellung muss so erfolgen, dass sich die Konzentration 
der Prüfsubstanz im Stammansatz nicht wesentlich ändert. Sollte sich 
durch die Einstellung eine chemische Reaktion oder eine physika ­
lische Ausfüllung der Prüfsubstanz ergeben, so muss diese Beobach ­
tung im Prüfbericht protokolliert werden.
 
1.6.1.2.  Hälterungs- und Verdünnungswasser  
Verwendet werden kann Leitungswasser (Trinkwasser) (nicht verunrei ­
nigt durch potenziell schädliche Konzentrationen an Chlor, Schwer ­
metallen oder anderen Substanzen), einwandfreies natürliches Wasser 
oder zubereitetes Wasser (siehe Anlage 1). Am besten geeignet sind Wasserqualitäten mit einer Gesamthärte zwischen 10 und 250 mg.l
 -1 
(bezogen auf CaCO  3 ) und einem pH-Wert zwischen 6,0 und 8,5.  
1.6.2.  Geräte  
Alle Geräte müssen aus chemisch inertem Material bestehen:  
— Einrichtungen zur automatischen Verdünnung (für das Durch ­
fluss-Verfahren),  
— Sauerstoffmessgerät,  
— Gerät zur Bestimmung der Wasserhärte,  
— geeignetes Gerät zur Temperaturmessung,  
— pH-Messgerät.  
1.6.3.  Prüforganismen  
Die Fische müssen in guter gesundheitlicher Verfassung sein und 
dürfen keine offensichtlichen Missbildungen aufweisen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 791
 
Es wird empfohlen, die verwendeten Arten nach so wichtigen prak ­
tischen Kriterien wie ihrer Verfügbarkeit im ganzen Jahr, ihrer pro ­
blemlosen Hälterung, ihrer Eignung für Prüfzwecke, ihrer relativen Empfindlichkeit gegenüber Chemikalien sowie anderen ökonomisch, biologisch oder ökologisch bedeutsamen Faktoren auszuwählen. Au ­
ßerdem sollten bei der Auswahl der Fischarten die Notwendigkeit 
der Vergleichbarkeit der erhaltenen Daten und die bestehende inter ­
nationale Harmonisierung (vgl. (1)) berücksichtigt werden.
 
Eine Liste der für die Prüfung empfohlenen Fischarten ist in Anlage 
2 enthalten; bevorzugt verwendet werden Zebrabärblinge und Regen ­
bogenforelle.  
1.6.3.1.  Hälterung  
Die Fische sollten möglichst aus einer einzigen Charge bei etwa 
gleicher Länge und gleichem Alter stammen. Sie müssen mindestens 12 Tage unter folgenden Bedingungen gehältert werden:
 
Besatz  
Entsprechend dem Verfahren (Umwälzanlage oder Durchfluss) und 
der Fischart.  
Wasser  
Siehe 1.6.1.2.  
Beleuchtung  
12 bis 16 Stunden Beleuchtungsdauer täglich.  
Konzentration an gelöstem Sauerstoff  
Mindestens 80 % des Luftsauerstoff-Sättigungswerts.  
Fütterung  
Dreimal wöchentlich oder täglich, Aussetzung der Fütterung 24 
Stunden vor Beginn der Fütterung.  
1.6.3.2.  Mortalität  
Nach einer Eingewöhnungszeit von 48 Stunden wird die Mortalität 
unter Anwendung folgender Kriterien erfasst:  
— bei mehr als 10 % der Population in sieben Tagen:  
Die Charge ist nicht verwendbar für den Test;  
— zwischen 5 und 10 % der Population:  
Die Hälterungszeit ist weitere sieben Tage fortzusetzen.  
Treten keine weiteren Sterbefälle auf, ist die Charge für die 
Prüfung verwendbar, ansonsten nicht;  
— bei 5 % und weniger der Population:  
Die Charge ist für die Prüfung verwendbar.  
1.6.4.  Anpassung  
Alle Fische sind für eine Mindestdauer von sieben Tagen vor ihrem 
Einsatz in der Prüfung in Wasser derselben Qualität und bei der 
gleichen Temperatur einzusetzen, wie es in der Prüfung verwendet 
wird. ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 792
 
1.6.5.  Durchführung der Prüfung  
Ein Vorversuch kann der eigentlichen Prüfung vorangehen. Dieser 
Vorversuch liefert Informationen über den in der eigentlichen Prü ­
fung zu verwendenden Konzentrationsbereich.  
Zusätzlich zu den Konzentrationen der Prüfsubstanz sind eine Kon ­
trolle ohne die Prüfsubstanz und ggf. eine Kontrolle mit dem Hilfs ­
stoff einzusetzen.  
In Abhängigkeit von den physikalischen und chemischen Eigen ­
schaften der Prüfsubstanz ist zur Erfüllung der Qualitätskriterien 
eine Prüfung in einem statischen, semistatischen oder Durchfluss- 
Verfahren auszuwählen.  
Die Fische werden der Prüfsubstanz, wie im Folgenden beschrieben, 
ausgesetzt:  
— Dauer: 96 Stunden;  
— Anzahl der Tiere: mindestens 7 je Konzentration;  
— Behälter: geeignetes Fassungsvermögen im Verhältnis zum emp ­
fohlenen Besatz;  
— Besatz: Als Höchstbesatz werden im statischen und semistati ­
schen Verfahren 1,0 g.l  -1 empfohlen; im Durchfluss-Verfahren 
ist ein höherer Besatz möglich;  
— Prüfkonzentration: mindestens fünf Konzentrationen, die sich 
durch einen konstanten Faktor unterscheiden, der 2,2 nicht über ­
schreiten darf, und die den Bereich von 0 % bis 100 % Mortalität so weit wie möglich umfassen;
 
— Wasser: siehe 1.6.1.2;  
— Beleuchtung: 12 bis 16 Stunden Beleuchtungsdauer täglich;  
— Temperatur: entsprechend der Fischart (Anlage 2), jedoch inner ­
halb ± 1  o C bei jeder einzelnen Prüfung;  
— Konzentration an gelöstem Sauerstoff: nicht unter 60 % des Luft ­
sauerstoff-Sättigungswerts bei der gewählten Temperatur;  
— Fütterung: keine.  
Die Fische werden nach den ersten 2 bis 4 Stunden und mindestens 
alle 24 Stunden beobachtet. Ein Fisch gilt als tot, wenn bei Berüh ­
rung des Schwanzansatzes keine Reaktion erfolgt und wenn keine 
Atembewegungen erkennbar sind. Tote Fische sind, sobald sie be ­
merkt werden, zu entfernen und entsprechend zu protokollieren. Für den Prüfbericht sind außerdem weitere sichtbare Veränderungen zu 
erfassen (z. B. Gleichgewichtsverlust, Änderungen des Schwimmver ­
haltens, der Atmung, der Pigmentierung usw.).
 
Messungen des pH-Wertes, des Gehalts an gelöstem Sauerstoff und 
der Temperatur müssen täglich erfolgen.  
Limit-Test  
Unter Verwendung der bei diesem Prüfverfahren beschriebenen Me ­
thoden kann ein Limit-Test mit 100 mg.l  -1 durchgeführt werden, um 
nachzuweisen, dass die LC  50 über dieser Konzentration liegt.  
Wenn die Substanz so beschaffen ist, dass eine Konzentration von 
100 mg/l im Prüfwasser nicht erreicht werden kann, ist der Limit- Test mit einer Konzentration durchzuführen, die der Löslichkeit der Substanz (oder der höchsten Konzentration, die eine stabile Disper ­
sion bildet) im verwendeten Medium entspricht (vgl. auch 
Abschnitt 1.6.1.1).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 793
 
Im Limit-Test sollten 7 bis 10 Fische untersucht und die gleiche 
Anzahl als Kontrollen verwendet werden. (Nach dem Binomischen 
Lehrsatz liegt bei Verwendung von 10 Fischen mit Null-Mortalität die Wahrscheinlichkeit bei 99,9 %, dass die LC
 50 höher ist als die im 
Limit-Test verwendete Konzentration. Bei 7, 8 oder 9 Fischen ergibt 
eine Null-Mortalität eine Wahrscheinlichkeit von mindestens 99 %, 
dass die LC  50 höher ist als die verwendete Konzentration.)  
Bei Vorliegen von Sterbefällen ist das vollständige Verfahren an ­
zuwenden. Wenn subletale Wirkungen beobachtet werden, sind diese zu protokollieren.
 
2. DATEN UND AUSWERTUNG  
Die Mortalität wird für jeden Zeitraum, in dem Beobachtungen pro ­
tokolliert wurden (24, 48, 72 und 96 Stunden), für jede empfohlene 
Expositionsdauer auf Wahrscheinlichkeits-(Probit-)papier (mit loga ­
rithmischer Einteilung) gegen die Konzentration aufgetragen.  
Soweit möglich, sollten die LC  50 und der jeweilige Vertrauens ­
bereich (p = 0,05) für jeden Beobachtungszeitraum nach Standard ­
verfahren ermittelt werden. Diese Werte sind auf eine oder höchstens 
zwei signifikante Stelle(n) zu runden (Beispiele für das Runden auf zwei Stellen: 170 für 173,5; 0,13 für 0,127; 1,2 für 1,21).
 
Sollte der Verlauf der Konzentrations-Wirkungs-Kurve für eine Be ­
rechnung der LC  50 zu steil sein, so reicht eine grafische Abschätzung 
dieses Wertes.  
Ergeben zwei unmittelbar aufeinander folgende Konzentrationen, die 
sich durch den Faktor 2,2 unterscheiden, nur 0 % und 100 % Mor ­
talität, so werden diese beiden Werte zur Angabe des Bereichs, in 
den die LC  50 fällt, herangezogen.  
Wird beobachtet, dass die Stabilität oder Homogenität der Prüfsub ­
stanz nicht aufrechterhalten werden kann, so ist dies im Prüfbericht mitzuteilen und bei der Interpretation der Ergebnisse entsprechend zu berücksichtigen.
 
3. ABSCHLUSSBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— Angaben über die verwendeten Fische (wissenschaftlicher Name, 
Stamm, Züchter oder Bezugsquelle, Vorbehandlungen, Größe 
und Anzahl der einzelnen Prüfkonzentrationen);  
— Herkunft des Verdünnungswassers und wichtige chemische Ei ­
genschaften (pH-Wert, Härte, Temperatur);  
— Bei Substanzen mit geringer Wasserlöslichkeit: Angabe der Me ­
thode zur Herstellung des Stammansatzes und der Prüflösungen;  
— Konzentration aller Hilfsstoffe;  
— Liste der verwendeten Konzentrationen sowie alle vorhandenen 
Informationen über die Stabilität der Prüfsubstanz in der Prüf ­
lösung bei den verwendeten Konzentrationen;  
— bei Durchführung chemischer Analysen: Angabe der verwende ­
ten Methoden und der Ergebnisse;  
— ggf. Ergebnisse des Limit-Tests;  
— Gründe für die Auswahl und Einzelheiten der Durchführung der 
Prüfung (z. B. statisch, semistatisch, Dosierungsrate, Durchfluss ­
rate, ob belüftet, Fischbesatz usw.);  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 794
 
— Beschreibung der Prüfgeräte;  
— Beleuchtungsverhältnisse;  
— Konzentrationen des gelösten Sauerstoffs, pH-Werte, Temperatu ­
ren in den Prüflösungen alle 24 Stunden;  
— Nachweis, dass die Qualitätskriterien erfüllt sind;  
— Tabelle der kumulativen Mortalität bei jeder Konzentration und 
bei der Kontrolle (ggf. auch bei der Kontrolle mit dem Hilfsstoff) 
zu den empfohlenen Beobachtungszeitpunkten;  
— grafische Darstellung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve am 
Ende der Prüfung;  
— wenn möglich, die LC  50 -Werte für jeden empfohlenen Beobach ­
tungszeitpunkt (möglichst mit 95 % Vertrauensbereich);  
— verwendete statistische Verfahren zur Bestimmung der LC  50 - 
Werte;  
— bei Verwendung einer Referenzsubstanz: Angabe der Ergebnisse;  
— höchste eingesetzte Prüfkonzentrationen ohne Mortalität im Prüf ­
zeitraum;  
— niedrigste eingesetzte Prüfkonzentration mit 100 % Mortalität im 
Prüfzeitraum.  
4. LITERATUR  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final and Updates.  
(2) AFNOR — Determination of the acute toxicity of a substance 
to Brachydanio rerio  — Static and Flow Through methods — 
NFT 90-303 June 1985.  
(3) AFNOR — Determination of the acute toxicity of a substance 
to Salmo gairdneri  — Static and Flow Through methods — 
NFT 90-305 June 1985.  
(4) ISO 7364/1,/2 and/3 — Water Quality — Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish ( Bra­
chydanio rerio  Hamilton-Buchanan —  Teleostei, Cyprinidae ). 
Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow- 
through method.  
(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungs ­
methoden — Part II 1974.  
(6) DIN-Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und 
L (15).  
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.  
(8) NEN 6506 — Water — Bepaling van de akute toxiciteit met 
behulp van  Poecilia reticulata , 1980.  
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxi ­
city tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The 
Commitee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organ ­
isms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.  
(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory, Office of Research and Development, 
EPA-600/4-78-012, January 1978.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 795
 
(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979.  
(12) Standard methods for the examination of water and wastewa ­
ter, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.  
(13) Commission of the European Communities, Inter-Laboratory 
test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC study D.8368, 
22 March 1979.
 
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R., Ökotoxikologie, Grund ­
lagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltche ­
mikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.  
(15) Lichtfield, J, T. and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Phare, Exp. Therap., 1949, vol. 96,99.
 
(16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U. K., 1978.  
(17) Sprague, J. B. Measurement of pullutant toxicity to fish. I 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3,793-821.
 
(18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, 
vol. 4, 3-32.  
(19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC4  50 . In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelinck). American Society for Testing and Materials. 
ASTM STP 634,1977, 65-84.
 
(20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and An ­
drews, R. W. A Computer program for calculating an LC  50 . 
US EPA.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 796
 
Anlage 1  
Zubereitetes Wasser  
Beispiel für ein geeignetes Verdünnungswasser  
Alle Chemikalien müssen analysenrein sein.  
Das Wasser muss einwandfreies destilliertes oder deionisiertes Wasser mit einer 
Leitfähigkeit von weniger als 5 μScm  -1 sein. 
Die für die Destillation von Wasser verwendete Apparatur darf keine Kupferteile 
enthalten.  
Stammlösungen  
CaCl  2 · 2H  2 O (Calciumchlorid-Dihydrat) 
in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 Liter auffüllen 11,76 g 
MgSO  4 · 7H  2 O (Magnesiumsulfat-Heptahydrat) 
in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 Liter auffüllen 4,93 g 
NaHCO  3 (Natriumhydrogencarbonat) 
in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 Liter auffüllen 2,59 g 
KCl (Kaliumchlorid) 
in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 Liter auffüllen 0,23 g  
Zubereitetes Verdünnungswasser  
Je 25 ml der vier Stammlösungen mischen und mit Wasser auf 1 Liter auffüllen.  
So lange belüften, bis die Konzentration an gelöstem Sauerstoff dem Luftsauer ­
stoff-Sättigungswert entspricht.  
Der pH-Wert muss 7,8 ± 0,2 betragen.  
Falls erforderlich, ist der pH-Wert mit NaOH (Natronlauge) oder HCl (Salzsäure) 
einzustellen.  
Dieses Verdünnungswasser lässt man 12 Stunden stehen; eine weitere Belüftung 
ist nicht erforderlich.  
Die Summe der Ca- und Mg-Ionen in dieser Lösung beträgt 2,5 mmol.l  -1 . Das 
Verhältnis der Ca- zu den Mg-Ionen beträgt 4:1 und das der Na- zu den K-Ionen 
10:1. Die Gesamtalkalinität dieser Lösung liegt bei 0,8 mmol.l  -1 . 
Eine abweichende Zubereitung des Verdünnungswassers darf die Zusammenset ­
zung oder die Eigenschaften des Wassers nicht verändern.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 797
 
Anlage 2  
Für die Prüfung empfohlene Fischarten  
Empfohlene Art Empfohlener 
Bereich der 
Prüftemperatur (  o C) Empfohlene 
Gesamtlänge der 
Fische (cm)  
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamilton-Buchanan) Zebrabärbling 20 bis 24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprini ­
dae) (Rafinesque) Amerikanische Elnitze 20 bis 24 5,0 ± 2,0  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae ) 
(Linnaeus 1758) Karpfen 20 bis 24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliiae) 
Cyprinodontidae  (Tomminck et Schlegel 
1850) Japanischer Reisfisch 20 bis 24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae ) 
(Peters 1859) Guppy 20 bis 24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Cen ­
trarchidae ) (Rafinesque Linnaeus 1758) 
Blauer Sonnenbarsch 20 bis 24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Sal ­
monidae ) (Walbaum 1988) Regenbogen ­
forelle 12 bis 17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae ) 
(Linnaeus 1758) Goldorfe 20 bis 24 6,0 ± 2,0  
Beschaffung  
Die oben aufgeführten Fischarten lassen sich leicht züchten und/oder sind das 
ganze Jahr über weitgehend verfügbar. Sie lassen sich in Fischzuchtbetrieben 
oder in Prüfeinrichtungen unter Bedingungen züchten und aufziehen, die eine Kontrolle über Krankheiten und Parasiten erlauben, so dass sie für eine Prüfung gesund und von bekannter Herkunft sind. Diese Fischarten sind in vielen Teilen 
der Welt erhältlich.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 798
 
Anlage 3  
Beispiel für eine Konzentrations-Mortalitätskurve  
Beispiel für die Bestimmung der LC  50 auf Wahrscheinlichkeitspapier
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 799
 
C.2. DAPHNIA- Sp.-TEST AUF AKUTE SCHWIMMUNFÄHIGKEIT  
1. METHODE  
Diese Methode für die Untersuchung auf akute Schwimmunfähigkeit 
entspricht OECD TG 202 (2004).  
1.1. EINLEITUNG  
Durch diese Methode wird ein akuter Toxizitätstest beschrieben, mit 
dem die Wirkung von Chemikalien auf Daphnien bewertet wird. 
Soweit möglich, wurden bestehende Testmethoden herangezogen (1) (2) (3).
 
1.2. DEFINITIONEN  
Im Rahmen der vorliegenden Testmethode werden folgende Defini ­
tionen verwendet:  
EC 50 : die geschätzte Konzentration, bei der 50 % der Daphnien 
innerhalb einer festgelegten Expositionszeit schwimmunfähig wer ­
den. Wird eine abweichende Definition verwendet, ist dies zusam ­
men mit der Quelle im Bericht anzugeben.  
Schwimmunfähigkeit:  Tiere, die nicht innerhalb von 15 Sekunden 
nach vorsichtigem Umrühren des Testgefäßes schwimmen können, 
gelten als schwimmunfähig (auch wenn sie noch ihre Antennen be ­
wegen können).  
1.3. PRINZIP DER TESTMETHODE  
Junge Daphnien, die zu Beginn des Tests weniger als 24 Stunden alt 
sind, werden 48 Stunden lang der Testsubstanz bei unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt. Die Schwimmunfähigkeit wird nach 24 Stunden und 48 Stunden aufgezeichnet und mit Kontrollwerten ver ­
glichen. Die Ergebnisse werden zur Berechnung der nach 48 Stunden 
herrschenden EC
 50 analysiert (siehe Definition in 1.2). Die Ermitt ­
lung der EC  50 nach 24 Stunden ist freigestellt.  
1.4. INFORMATIONEN ZUR TESTSUBSTANZ  
Wasserlöslichkeit und Dampfdruck der Testsubstanz müssen bekannt 
sein, und es muss eine zuverlässige Analysenmethode zur Quantifi ­
zierung der Substanz in den Testlösungen zur Verfügung stehen, mit 
der der festgestellte Rückgewinnungsgrad und die Bestimmungs ­
grenze angegeben werden können. Zu den zweckmäßigen Angaben zählen Strukturformel, Reinheit der Substanz, Stabilität in Wasser 
oder Licht, P
 ow und die Ergebnisse eines Tests auf leichte biologi ­
sche Abbaubarkeit (siehe Methode C.4).  
Hinweis : Richtlinien für Tests an Substanzen, deren Test aufgrund 
ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften schwierig ist, sind in (4) enthalten.
 
1.5. REFERENZSUBSTANZEN  
Die Referenzsubstanz kann auf EC  50 getestet werden, um auf diese 
Weise die Zuverlässigkeit der Testbedingungen zu gewährleisten. 
Hierfür wird die Verwendung von Giftstoffen empfohlen, die in internationalen Ringtests (1) (5) verwendet werden (
 1 ). Test(s) mit 
einer Referenzsubstanz sind möglichst monatlich, mindestens aber 
zweimal jährlich durchzuführen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 800  
( 1 ) Nach den Ergebnissen dieser laborübergreifenden Tests und einem technischen Korrigen ­
dum zu ISO 6341 liegt der EC  50 — 24 h von Kaliumdichromat (K  2 Cr 2 O 7 ) in einem 
Bereich zwischen 0,6 mg/l und 1,7 mg/l.
 1.6. QUALITÄTSKRITERIEN  
Die Tests sind gültig, wenn die folgenden Durchführungskriterien 
eingehalten werden:  
— In den Kontrollen — einschließlich der Kontrolle, die das Löse ­
mittel enthält — dürfen nicht mehr als 10 % der Daphnien schwimmunfähig geworden sein;
 
— die Konzentration des gelösten Sauerstoffs muss in den Kontroll- 
und Testgefäßen bei Testende > 3 mg/l sein.  
Hinweis : Beim ersten Kriterium dürfen nicht mehr als 10 % der dem 
Kontrolltest unterzogenen Daphnien Schwimmunfähigkeit oder sons ­
tige Anzeichen von Erkrankungen oder Stress zeigen, z. B. Verfär ­
bungen oder ungewöhnliches Verhalten wie Einschluss an der Was ­
seroberfläche.  
1.7. BESCHREIBUNG DER TESTMETHODE  
1.7.1.  Geräte  
Die Testgefäße und sonstigen Geräte, die mit den Testlösungen in 
Kontakt kommen, müssen vollständig aus Glas oder einem anderen 
chemisch inerten Material bestehen. Als Testgefäße werden norma ­
lerweise Reagenzgläser oder Bechergläser verwendet; diese müssen vor jeder Verwendung nach den üblichen Laborverfahren gereinigt werden. Die Testgefäße sind locker abzudecken, um Wasserverlust 
durch Verdunstung zu verringern und Staubeintritt in die Lösungen 
zu verhindern. Flüchtige Substanzen sind in vollständig gefüllten, geschlossenen Behältern zu testen, die ausreichend groß sein müssen, so dass verhindert wird, dass durch Sauerstoffmangel eine drosselnde 
Wirkung eintritt oder der Sauerstoffgehalt zu gering wird (siehe 
Abschnitt 1.6 und ersten Absatz von Abschnitt 1.8.3).
 
Zusätzlich werden einige oder alle der folgenden Geräte verwendet: 
Sauerstoffmessgerät (mit Mikroelektrode oder anderen geeigneten 
Vorrichtungen für die Messung von gelöstem Sauerstoff in Proben mit geringem Probengehalt), pH-Messgerät, geeignete Geräte für die Temperaturregelung, Geräte für die Ermittlung des Gesamtgehalts an 
organischen Kohlenstoffverbindungen (TOC), Geräte für die Ermitt ­
lung des chemischen Sauerstoffbedarfs (COD) und Geräte für die Härtebestimmung usw.
 
1.7.2.  Testorganismen  
Daphnia magna  Straus ist die vorzugsweise verwendete Art; aller ­
dings können auch andere Arten der  Daphnia  für diese Tests ver ­
wendet werden (z. B.  Daphnia pulex).  Zu Beginn des Tests müssen 
die Tiere weniger als 24 Stunden alt sein; zur Begrenzung von Variabilitäten wird dringend empfohlen, keine Daphnien aus der 
ersten Nachkommenschaft einer Brut zu verwenden. Die Tiere müs ­
sen aus einem gesunden Bestand stammen (d. h., sie dürfen keine Anzeichen von Stress aufweisen, z. B. hohe Mortalität, Vorhanden ­
sein von männlichen Tieren und Ephippien, verzögerte Produktion 
der ersten Brut, Verfärbungen an den Tieren usw.). Alle für einen 
bestimmten Test verwendeten Organismen müssen aus Kulturen stammen, die aus dem gleichen Daphnienbestand entnommen wur ­
den. Die Elterntiere müssen unter Kulturbedingungen (Licht, Tem ­
peratur, Medium) gehalten werden, die den Testbedingungen ähneln. 
Wird für den Test der Daphnien ein anderes Kulturmedium verwen ­
det als bei den routinemäßigen Daphnienkulturen, sollte dem Test eine Eingewöhnungsphase als Vortest vorausgehen. Hierzu sind die 
Zuchtdaphnien vor Testbeginn mindestens 48 Stunden lang bei Test ­
temperatur in Verdünnungswasser zu halten.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 801
 
1.7.3.  Halte- und Verdünnungswasser  
Natürliches Wasser (Oberflächen- oder Grundwasser), zubereitetes 
Wasser oder entchlortes Leitungswasser sind als Halte- und Verdün ­
nungswasser zulässig, wenn die Daphnien hierin während der Zucht-, 
Akklimatisations- und Testphase ohne Stressanzeichen überleben. 
Alle Wassersorten, die den chemischen Eigenschaften von zugelas ­
senem Verdünnungswasser gemäß Anlage 1 entsprechen, sind als Testwasser geeignet. Das Wasser muss während der gesamten Test ­
dauer eine gleich bleibende Qualität aufweisen. Zubereitetes Wasser 
kann durch Zugabe bestimmter Mengen von analysenreinen Reagen ­
zien zu entionisiertem oder destilliertem Wasser hergestellt werden. 
Beispiele für zubereitetes Wasser sind in (1), (6) und in Anlage 2 
enthalten. Dabei ist zu beachten, dass Medien, die bekannte Chelat ­
bildner enthalten, z. B. die Medien M4 und M7 aus Anlage 2, für Tests an metallhaltigen Substanzen zu vermeiden sind. Der pH-Wert 
muss sich in einem Bereich zwischen 6 und 9 bewegen. Eine Härte 
zwischen 140 und 250 mg/l (wie CaCO
 3 ) wird für  Daphnia Magna  
empfohlen, für andere  Daphnia- Arten ist ggf. auch eine geringere 
Härte geeignet. Das Verdünnungswasser kann vor Verwendung für 
den Test belüftet werden, bis die Konzentration an gelöstem Sauer ­
stoff die Sättigungsgrenze erreicht hat.  
Wird natürliches Wasser verwendet, sind die Qualitätsparameter 
mindestens zweimal jährlich bzw. immer dann zu messen, wenn der Verdacht besteht, dass sich diese Eigenschaften erheblich ver ­
ändert haben (siehe vorigen Abschnitt und Anlage 1). Außerdem 
ist eine Messung auf Schwermetalle (z. B. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) durchzuführen. Wird entchlortes Leitungswasser verwendet, empfiehlt sich eine tägliche Chloranalyse. Wird Verdünnungswas ­
ser aus einer Oberflächenwasser- oder Grundwasserquelle verwen ­
det, sind Leitfähigkeit und der Gesamtgehalt an organischen Koh ­
lenstoffverbindungen (TOC) oder der chemische Sauerstoffbedarf 
(COD) zu messen.
 
1.7.4.  Testlösungen  
Die Testlösungen in der festgelegten Konzentration werden norma ­
lerweise durch Verdünnung des Stammansatzes hergestellt. Der Stammansatz ist vorzugsweise durch Lösung der Testsubstanz im Verdünnungswasser herzustellen. Die Verwendung von Lösemitteln, 
Emulgatoren oder Dispergiermitteln sollte möglichst vermieden wer ­
den. Allerdings sind derartige Verbindungen in bestimmten Fällen zur Herstellung eines ausreichend konzentrierten Stammansatzes er ­
forderlich. Richtlinien für geeignete Lösemittel, Emulgatoren und 
Dispergiermittel sind in (4) nachzulesen. Grundsätzlich darf die Test ­
substanz in den Testlösungen die Löslichkeitsgrenze im Verdün ­
nungswasser nicht überschreiten.
 
Der Test ist ohne Korrektur des pH-Werts durchzuführen. Bleibt der 
pH-Wert nicht im Bereich zwischen 6 und 9, ist ein zweiter Test 
durchzuführen, bei dem der pH-Wert des Stammansatzes auf den 
pH-Wert des Verdünnungswassers vor Zugabe der Testsubstanz kor ­
rigiert wird. Die pH-Korrektur muss so erfolgen, dass sich die Kon ­
zentration des Stammansatzes nicht nennenswert verändert und keine 
chemische Reaktion oder Ausfällung der Testsubstanz eintritt. Vor ­
zugsweise sollten HCl und NaOH verwendet werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 802
 
1.8. DURCHFÜHRUNG DES TESTS  
1.8.1.  Expositionsbedingungen  
1.8.1.1.  Testgruppen und Kontrollen  
Die Testgefäße werden mit Verdünnungswasser und Lösungen der 
Testsubstanz in geeigneten Volumenanteilen gefüllt. Das Luft-Was ­
ser-Volumenverhältnis im Gefäß muss bei den Test- und Kontroll ­
gruppen identisch sein. Anschließend werden die Daphnien in die Testgefäße eingelegt. Für jede Testkonzentration und für die Kon ­
trollen sind mindestens 20 Tiere zu verwenden, die vorzugsweise in 
vier Gruppen mit je fünf Tieren aufgeteilt werden sollten. Je Tier sind mindestens 2 ml der Testlösung bereitzustellen (d. h. ein Volu ­
men von 10 ml für fünf Daphnien je Testgefäß). Der Test ist mit 
einem semistatischen Erneuerungs- oder Durchflusssystem durch ­
zuführen, wenn die Konzentration der Testsubstanz nicht stabil ist.
 
Zusätzlich zu den Behandlungsreihen sind eine Kontrollreihe mit 
Verdünnungswasser sowie — sofern relevant — eine Kontrollreihe, 
die das Solubilisierungsmittel enthält, durchzuführen.  
1.8.1.2.  Testkonzentrationen  
Zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs für den endgültigen Test 
kann ein Vortest durchgeführt werden, sofern nicht Angaben zur Toxizität der Testsubstanz vorliegen. Hierzu werden die Daphnien 
einer Reihe von weit auseinander liegenden Konzentrationen der 
Testsubstanz ausgesetzt. Jeder Testkonzentration werden fünf Daph ­
nien über einen Zeitraum von 48 Stunden oder weniger ausgesetzt; wiederholte Gleichtests sind nicht notwendig. Die Expositionsdauer 
kann verkürzt werden (z. B. auf 24 Stunden oder weniger), wenn 
über eine kürzere Zeitdauer geeignete Daten für den Vortest ermittelt werden können.
 
Es sind mindestens fünf Testkonzentrationen zu verwenden. Sie sind 
in einer geometrischen Reihe mit einem Separierungsfaktor anzuord ­
nen, der einen Wert von 2,2 möglichst nicht überschreiten sollte. Werden weniger als fünf Konzentrationen verwendet, ist eine Be ­
gründung vorzulegen. Die höchste getestete Konzentration sollte vor ­
zugsweise eine 100 %ige Schwimmunfähigkeit ergeben, die nied ­
rigste getestete Konzentration sollte vorzugsweise keine wahrnehm ­
bare Wirkung zeigen.
 
1.8.1.3.  Inkubationsbedingungen  
Die Temperatur muss im Bereich zwischen 18  o C und 22  o C liegen; 
für jeden Einzeltest ist die Temperatur auf ± 1  o C konstant zu halten. 
Es wird ein Zyklus mit 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkel ­
phase empfohlen. Völlige Dunkelheit ist ebenfalls zulässig, vor allem bei unter Lichteinwirkung instabilen Testsubstanzen.
 
Die Testgefäße dürfen während des Tests nicht belüftet werden. Der 
Test wird ohne pH-Korrektur durchgeführt. Die Daphnien dürfen 
während des Tests nicht gefüttert werden.  
1.8.1.4.  Testdauer  
Die Testdauer beträgt 48 Stunden.  
1.8.2.  Beobachtungen  
Jedes Testgefäß ist 24 und 48 Stunden nach Testbeginn auf 
schwimmunfähige Daphnien zu kontrollieren (siehe Definitionen in 1.2). Neben der festgestellten Schwimmunfähigkeit sind etwaige 
Verhaltensauffälligkeiten oder äußerliche Veränderungen im Bericht 
anzugeben.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 803
 
1.8.3.  Analysemessungen  
Der gelöste Sauerstoff und der pH-Wert sind zu Beginn und Ende 
des Tests in den Kontrollen und in der höchsten Konzentration der Testsubstanz zu messen. Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs 
in den Kontrollen muss dem Validitätskriterium entsprechen (siehe 
1.6). Der pH-Wert darf in einem einzigen Test normalerweise nicht um mehr als 1,5 Einheiten variieren. Die Temperatur wird normaler ­
weise in Kontrollgefäßen oder in Umgebungsluft gemessen und ist 
vorzugsweise durchgehend während des gesamten Tests bzw. zumin ­
dest zu Anfang und Ende des Tests aufzuzeichnen.
 
Die Konzentration der Testsubstanz ist mindestens bei der höchsten 
und niedrigsten Testkonzentration und zu Beginn und Ende des Tests 
zu messen (4). Es wird empfohlen, bei den Ergebnissen die gemes ­
senen Konzentrationen zugrunde zu legen. Lässt sich aber nachwei ­
sen, dass die Konzentration der Testsubstanz während des gesamten Tests in zufriedenstellender Weise innerhalb von ± 20 % der nomi ­
nellen oder gemessenen Anfangskonzentration gehalten wurde, kön ­
nen bei den Ergebnissen die nominellen oder gemessenen Anfangs ­
werte zugrunde gelegt werden.
 
1.9. LIMIT-TEST  
Anhand der in dieser Testmethode beschriebenen Verfahren kann ein 
Limit-Test mit 100 mg/l der Testsubstanz oder bis zum Erreichen der Löslichkeitsgrenze (je nachdem, welcher Wert niedriger ist) durch ­
geführt werden, um nachzuweisen, dass die EC
 50 über dieser Kon ­
zentration liegt. Der Limit-Test ist an 20 Daphnien (die vorzugsweise in vier Gruppen zu je fünf Tieren aufgeteilt werden sollten) und einer gleichen Anzahl Tiere in den Kontrollgruppen durchzuführen. Wird 
eine Schwimmunfähigkeit festgestellt, ist eine umfassende Unter ­
suchung durchzuführen. Etwaige beobachtete anormale Verhaltens ­
weisen sind aufzuzeichnen.
 
2. DATEN  
Die Daten sind in Tabellenform zusammenzufassen, wobei für jede 
der Behandlung unterzogenen Gruppe und Kontrollgruppe die Zahl 
der verwendeten Daphnien und die bei jeder Beobachtung fest ­
gestellte Schwimmunfähigkeit angegeben werden. Der prozentuale Anteil der nach 24 Stunden bzw. 48 Stunden schwimmunfähig ge ­
wordenen Tiere wird anhand der Testkonzentrationen grafisch dar ­
gestellt. Die Daten werden durch geeignete statistische Verfahren 
(z. B. Probitanalyse) analysiert, mit denen die Steigung der Kurven und die EC
 50 mit einer Vertrauensgrenze von 95 % berechnet wer ­
den kann (p = 0,05) (7) (8).  
Können die Standardmethoden für die Berechnung der EC  50 nicht 
auf die ermittelten Daten angewandt werden, sind die höchste Kon ­
zentration, bei der keine Schwimmunfähigkeit eintritt, und die nied ­
rigste Konzentration, die zu 100 %iger Schwimmunfähigkeit führt, als Näherungswerte für die EC
 50 (die das geometrische Mittel dieser 
beiden Konzentrationen ausdrückt) zugrunde zu legen.  
3. BERICHTER ATTUNG  
3.1. TESTBERICHT  
Der Testbericht muss folgende Angaben enthalten:  
Testsubstanz  
— physikalische Beschaffenheit und relevante physikalisch-che ­
mische Eigenschaften,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 804
 
— chemische Kenndaten (einschließlich Angabe der Reinheit).  
Getestete Art  
— Herkunft und Art der  Daphnia,  Züchter (sofern bekannt) und 
Kulturbedingungen (einschließlich Herkunft, Art und Menge der Nahrung, Häufigkeit der Fütterung).
 
Testbedingungen  
— Beschreibung der Testgefäße: Art der Gefäße, Volumen der Lö ­
sung, Zahl der Daphnien je Testgefäß, Zahl der Testgefäße (wie ­
derholte Gleichtests) je Konzentration,  
— Verfahren zur Herstellung des Stammansatzes und der Testlösun ­
gen einschließlich der verwendeten Lösemittel oder Dispergier ­
mittel, verwendete Konzentrationen,  
— Details zum Verdünnungswasser: Herkunft und Kenndaten für 
die Wasserqualität (pH-Wert, Härte, Ca/Mg-Verhältnis, Na/K- Verhältnis, Alkalinität, Leitfähigkeit usw.), Zusammensetzung des zubereiteten Wassers (sofern diese Wassersorte verwendet 
wird),
 
— Inkubationsbedingungen: Temperatur, Lichtstärke und -dauer, ge ­
löster Sauerstoff, pH-Wert usw.  
Ergebnisse  
— Zahl und prozentualer Anteil der Daphnien, die schwimmunfähig 
wurden oder anderweitige negative Wirkungen zeigen (ein ­
schließlich Verhaltensauffälligkeiten), in den Kontrollen sowie in den einzelnen behandelten Gruppen zu den jeweiligen Be ­
obachtungszeitpunkten; ferner eine Beschreibung der Art der be ­
obachteten Wirkungen,
 
— Ergebnisse und Datum des mit der Referenzsubstanz (sofern vor ­
handen) durchgeführten Tests,  
— nominale Testkonzentrationen und Ergebnis sämtlicher Analysen 
für die Ermittlung der Konzentration der Testsubstanz in den Testgefäßen; der Rückgewinnungsgrad der Methode und die Be ­
stimmungsgrenze sind ebenfalls im Bericht anzugeben,
 
— sämtliche während des Tests durchgeführten physikalisch-che ­
mischen Messungen von Temperatur, pH-Wert und gelöstem Sauerstoff,
 
— Schwimmunfähigkeitswert EC  50 nach 48 h mit Vertrauensinter ­
vallen und grafischen Darstellungen des für die Berechnung ver ­
wendeten Modells, Steigung der Dosis-Wirkungs-Kurven und des Standardfehlers, statistische Verfahren zur Ermittlung von 
EC
 50 (diese Größen sind, sofern sie gemessen wurden, auch 
für die Schwimmunfähigkeit nach 24 h anzugeben),  
— Erläuterung etwaiger Abweichungen von der Testmethode sowie 
der Angabe, ob die Abweichung sich auf die Testergebnisse 
ausgewirkt hat.  
4. LITERATURHINWEISE  
(1) ISO 6341 (1996). Water quality — Determination of the inhi ­
bition of the mobility of  Daphnia magna  Straus (Cladocera, 
Crustacea) — Acute toxicity test (Wasserbeschaffenheit — Be ­
stimmung der Wirkung von Wasserinhaltsstoffen auf die Bewe ­
gungsfähigkeit von  Daphnia magna  Straus (Cladocera, 
Crustacea) — Akuter Toxizitätstest). Third edition, 1996.  
(2) EPA OPPTS 850.1010 (1996). Ecological Effects Test Guideli ­
nes — Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
daphnids.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 805
 
(3) Environment Canada (1996). Biological test method. Acute Le ­
thality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/11. Environment 
Canada, Ottawa, Ontario, Canada.  
(4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 
23. Paris 2000.
 
(5) Kommission der Europäischen Gemeinschaften. Study D8369 
(1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to  Daph­
nia (Laborübergreifendes Testprogramm zur Untersuchung der 
Ökotoxizität einer chemischen Substanz für  Daphnia).
 
(6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998.  
(7) Stephan, C.E (1977). Methods for calculating an LC  50 . In Aqua ­
tic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and 
J.L. Hamelink). ASTM STP 634 — American Society for Tes ­
ting and Materials, 65-84.  
(8) Finney, D.J (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3rd 
ed. London. Griffin/Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 806
 
Anlage 1  
CHEMISCHE EIGENSCHAFTEN EINER GEEIGNETEN ZUSAMMEN ­
SETZUNG VON VERDÜNNUNGSWASSER  
Substanz Konzentration  
Partikel < 20 mg/l 
Gesamtgehalt an organischen Kohlenstoffen < 2 mg/l 
Nicht ionisierter Ammoniak < 1 μg/l 
Chlorüberschuss < 10 μg/l 
Gesamtgehalt an phosphororganischen Pestiziden < 50 ng/l Gesamtgehalt an phosphororganischen Pestiziden plus po ­
lychlorierten Biphenylen < 50 ng/l 
Gesamtgehalt an organischem Chlor < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 807
 
Anlage 2  
BEISPIELE FÜR GEEIGNETES ZUBEREITETES TESTWASSER  
ISO-Testwasser (1)  
Stammansatz (Einzelsubstanz) Zur Herstellung von 
zubereitetem Wasser werden 
auf 1 Liter Wasser folgende 
Mengen des Stammansatzes 
zugesetzt (*) Substanz 1 Liter Wasser zugesetzte 
Menge (*)  
Kalziumchlorid 
CaCl  2 ·2H 2 O 11,76 g 25 ml 
Magnesiumsulfat 
MgSO  4 ·7H 2 O 4,93 g 25 ml 
Natriumbicarbonat 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Kaliumchlorid 
KCl 0,23 g 25 ml  
(*) Wasser in der erforderlichen Reinheit, d. h. entionisiert, destilliert oder einer Umkehr ­
osmose unterzogen, Leitfähigkeit möglichst nicht über 10 μS/cm  -1 . 
Elendt M7- und M4-Medium  
Gewöhnung an die Medien Elendt M4 und M7  
In verschiedenen Labors sind Schwierigkeiten bei der direkten Umsetzung von 
Daphnien in die Medien M4 und M7 aufgetreten. Als erfolgreich erwies sich jedoch eine schrittweise Eingewöhnung, d. h. beim Wechsel aus dem eigenen Medium in 30 %iges Elendt-Medium, dann in 60 %iges Elendt-Medium und 
schließlich in ein 100 %iges Elendt-Medium. Die erforderliche Eingewöhnungs ­
zeit kann bis zu einem Monat betragen.
 
Herstellung  
Spurenelemente  
Gesonderte Stammansätze (I) einzelner Spurenelemente werden zuerst in Wasser 
geeigneter Reinheit (d. h. entionisiert, destilliert oder aus Umkehrosmose) her ­
gestellt. Aus diesen unterschiedlichen Stammansätzen (I) wird ein zweiter allei ­
niger Stammansatz (II) hergestellt, der sämtliche Spurenelemente (kombinierte 
Lösung) enthält, d. h.:  
Stammansatz/Stammansätze I 
(Einzelsubstanz) In Wasser zugesetzte 
Menge (mg/l) Konzentration (im 
Verhältnis zu M4) Zur Herstellung des kombinierten Stammansatzes 
II ist die folgende Menge Stammansatz I zu 
Wasser zuzusetzen (ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000-fach 1,0 0,25 
MnCl  2 ·4H 2 O 7 210 20 000-fach 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000-fach 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 808
 
Stammansatz/Stammansätze I 
(Einzelsubstanz) In Wasser zugesetzte 
Menge (mg/l) Konzentration (im 
Verhältnis zu M4) Zur Herstellung des kombinierten Stammansatzes 
II ist die folgende Menge Stammansatz I zu 
Wasser zuzusetzen (ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000-fach 1,0 0,25 
SrCl  2 ·6H 2 O 3 040 20 000-fach 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000-fach 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4 ·2H 2 O 1 230 20 000-fach 1,0 0,25 
CuCl  2 ·2H 2 O 335 20 000-fach 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000-fach 1,0 1,0 
CoCl  2 ·6H 2 O 200 20 000-fach 1,0 1,0 
KI 65 20 000-fach 1,0 1,0 
Na 2 SeO  3 43,8 20 000-fach 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000-fach 1,0 1,0 
Na 2 EDTA·2H 2 O 5 000 2 000-fach — — 
FeSO  4 ·7H 2 O 1 991 2 000-fach — — 
Na 2 -EDTA- und FeSO  4 -Lösungen werden einzeln hergestellt, zusammengegossen und sofort im Autoklav behandelt. 
Dies ergibt: 
2 l Fe-EDTA-Lösung 1 000-fach 20,0 5,0  
Medien M4 und M7  
Die Medien M4 und M7 werden unter Verwendung des Stammansatzes II und 
der folgenden Makronährstoffe und Vitamine hergestellt:  
Dem Wasser zugesetzte 
Menge (mg/l) Konzentration (bezogen 
auf Medium M4) Menge an Stammansatz II, die für die Zubereitung 
des Mediums zugesetzt wird (ml/l) 
M4 M7  
Stammansatz II (kom ­
binierte Spurenelemente) 20-fach 50 50 
Makronährstoff-Stamm ­
ansätze (Einzelsubstanz) 
CaCl  2 ·2H 2 O 293 800 1 000-fach 1,0 1,0 
MgSO  4 ·7H 2 O 246 600 2 000-fach 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000-fach 0,1 0,1 
NaHCO  3 64 800 1 000-fach 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 ·9H 2 O 50 000 5 000-fach 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000-fach 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000-fach 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000-fach 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 809
 
Dem Wasser zugesetzte 
Menge (mg/l) Konzentration (bezogen 
auf Medium M4) Menge an Stammansatz II, die für die Zubereitung 
des Mediums zugesetzt wird (ml/l) 
M4 M7  
Kombinierter Vitamin ­
stamm — 10 000-fach 0,1 0,1 
Der kombinierte Vitamin-Stammansatz wird durch Zugabe der 3 Vitamine gemäß untenstehender Übersicht zu 1 Liter 
Wasser hergestellt: 
Thiaminhydrochlorid 750 10 000-fach 
Cyanocobalamin (B  12 ) 10 10 000-fach 
Biotin 7,5 10 000-fach  
Der kombinierte Vitamin-Stammansatz wird in kleinen Portionen tiefgefroren 
aufbewahrt. Die Vitamine werden den Medien kurz vor der Verwendung zuge ­
setzt.  
Hinweis : Um ein Ausfällen der Salze bei der Herstellung der vollständigen 
Medien zu vermeiden, sind die Portionen der Stammansätze zu ca. 500 bis 800 ml entionisiertem Wasser zuzugeben und anschließend auf 1 Liter aufzufüllen.
 
Hinweis : Die erste Veröffentlichung zum Medium M4 ist zu finden bei Elendt, 
B. P (1990): Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructual ap ­
proach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 
154, 25-33.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 810
 
C.3. SÜSSWASSERALGEN UND CYANOBAKTERIEN: WACHS ­
TUMSINHIBITIONSTEST  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht der Prüfrichtlinie OECD TG 
201 (2006) (1).  
1.1. EINLEITUNG  
Die Prüfmethoden werden regelmäßig unter Berücksichtigung des 
wissenschaftlichen Fortschritts überarbeitet und aktualisiert. Prüfmethode C.3 musste unter Einbeziehung weiterer Arten und un ­
ter Berücksichtigung der Anforderungen an die Risikobewertung und 
Klassifizierung chemischer Stoffe überarbeitet werden. Die Über ­
arbeitung wurde auf der Grundlage umfassender praktischer Erfah ­
rungen sowie des wissenschaftlichen Fortschritts im Zusammenhang 
mit Untersuchungen zur Algentoxizität und der weit reichenden An ­
wendung entsprechender Rechtsvorschriften seit Annahme der ur ­
sprünglichen Fassung vorgenommen.
 
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Im Zusammenhang mit dieser Prüfmethode werden die folgenden 
Begriffsbestimmungen zugrunde gelegt und folgende Abkürzungen 
verwendet:  
Biomasse : Trockengewicht lebenden Materials einer Population be ­
zogen auf ein vorgegebenes Volumen (z. B. mg Algen/Liter Testlö ­
sung); gewöhnlich wird „Biomasse“ definiert als Masse; in Verbin ­
dung mit dieser Prüfung wird der Begriff allerdings zur Bezeichnung 
einer Masse pro Volumen verwendet. Typischerweise werden Surro ­
gate für die betreffende Biomasse (z. B. Zellgehalt oder Fluoreszenz) gemessen; entsprechend bezieht sich der Begriff „Biomasse“ auch auf diese Surrogatparameter.
 
Variationskoeffizient : ein dimensionsloses Maß für die Veränder ­
lichkeit eines Parameters; definiert als Verhältnis der Standardabwei ­
chung vom Mittelwert; der Variationskoeffizient kann auch als Pro ­
zentwert ausgedrückt werden. Der mittlere Variationskoeffizient der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate sollte bei Wieder ­
holungs-Kontrollkulturen wie folgt berechnet werden:
 
1. Der Variationskoeffizient in Prozent (VK %) der durchschnitt ­
lichen spezifischen Wachstumsrate ist aus den täglichen bzw. abschnittsbezogenen Wachstumsraten der entsprechenden Wieder ­
holungen zu beziehen.
 
2. Aufgrund des Mittelwertes aller in Punkt 1 berechneten Werte ist der 
mittlere Variationskoeffizient der täglichen/abschnittsbezogenen 
Wachstumsraten der Kulturen in den Wiederholungen zu bestimmen.  
EC x : Konzentration der Prüfsubstanz aufgelöst im Prüfmedium, bei 
der das Wachstum des Testorganismus binnen einer bestimmten Ex ­
positionsdauer (die ausdrücklich anzugeben ist, wenn die Expositi ­
onsdauer nicht mit der vollständigen oder gewöhnlichen Dauer der 
Prüfung übereinstimmt) um x % (z. B. 50 %) abnimmt; um eindeutig anzugeben, ob ein EC-Wert aus der Wachstumsrate (growth rate) oder aus dem Zellertrag (yield) abgeleitet wurde, werden die Kurz ­
bezeichnungen „E
 r C“ und „E  y C“ verwendet.  
Nährmedium : gesamtes synthetisches Kulturmedium, in dem die zu 
prüfenden Algen wachsen, wenn sie der Prüfsubstanz ausgesetzt werden; die Prüfsubstanz wird im Allgemeinen im Prüfmedium auf ­
gelöst.
 
Wachstumsrate (durchschnittliche spezifische Wachstumsrate) : 
logarithmische Zunahme der Biomasse während der Expositions ­
dauer.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 811
 
Niedrigste Konzentration mit beobachteter Wirkung (LOEC) : 
niedrigste geprüfte Konzentration, bei der beobachtet wurde, dass 
die Substanz binnen einer bestimmten Expositionsdauer gegenüber der Kontrollprobe eine statistisch signifikante Wachstumsreduzierung bewirkt (bei p < 0,05); allerdings müssen sämtliche Testkonzentra ­
tionen über der LOEC schädliche Folgen haben, die mindestens den 
bei der LOEC beobachteten schädlichen Folgen gleichwertig sind. Wenn diese beiden Bedingungen nicht erfüllt werden können, ist umfassend darzulegen, warum die LOEC (und entsprechend die NO ­
EC) gewählt wurde.
 
Höchste geprüfte Konzentration ohne beobachtete schädliche 
Wirkung (NOEC) : Testkonzentration unmittelbar unterhalb der 
LOEC.  
Reaktionsvariable : Variable für die geschätzte Toxizität, abgeleitet 
aus beliebigen gemessenen Parametern zur Beschreibung der Bio ­
masse durch verschiedene Berechnungsmethoden; bei dieser Me ­
thode sind Wachstumsrate und Zellertrag Reaktionsvariablen, die 
aus der direkten Messung der Biomasse oder einer Messung eines der genannten Surrogate abgeleitet werden.
 
Spezifische Wachstumsrate : Reaktionsvariable, die sich aus dem 
Quotienten der Differenz der natürlichen Logarithmen eines be ­
obachteten Parameters (bei dieser Prüfmethode die Biomasse) und dem betreffenden Zeitraum ergibt.
 
Zellertrag : Wert einer Messvariable am Ende der Expositionsdauer 
abzüglich des Wertes der Messvariablen zu Beginn der Expositions ­
dauer als Maß für die Zunahme der Biomasse während der Prüfung.  
1.3. ANWENDBARKEIT DER PRÜFMETHODE  
Diese Prüfmethode ist am einfachsten bei wasserlöslichen Substan ­
zen anzuwenden, die unter den Prüfbedingungen voraussichtlich im 
Wasser gelöst bleiben. Zum Prüfen von flüchtigen, stark adsorbie ­
renden, farbigen und schlecht in Wasser löslichen Substanzen sowie von Substanzen, die sich auf die Verfügbarkeit von Nährstoffen oder 
Mineralien im Prüfmedium auswirken können, sind am beschriebe ­
nen Verfahren unter Umständen gewisse Änderungen vorzunehmen (z. B. die Herstellung eines geschlossenen Systems oder eine beson ­
dere Vorbereitung der Prüfgefäße). Hinweise zu verschiedenen Än ­
derungen sind den Quellen (2), (3) und (4) zu entnehmen.
 
1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Mit dieser Prüfung sollen die Auswirkungen einer Substanz auf das 
Wachstum von Süßwassermikroalgen und/oder Cyanobakterien be ­
stimmt werden. Exponentiell wachsende Testorganismen werden 
über einen Zeitraum von im Allgemeinen 72 Stunden in Batch-Kul ­
turen der Prüfsubstanz ausgesetzt. Trotz der verhältnismäßig kurzen Testdauer können die Auswirkungen über mehrere Generationen be ­
urteilt werden.
 
Die Systemreaktion besteht in der Verringerung des Wachstums ei ­
ner Reihe von Algenkulturen (Versuchseinheiten), die einer Prüfsub ­
stanz in unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt wurden. Diese 
Reaktion wird dann in Abhängigkeit von der Expositionskonzentra ­
tion gegenüber dem durchschnittlichen Wachstum in zur Wieder ­
holung verwendeten Kontrollkulturen bewertet, die der betreffenden Substanz nicht ausgesetzt waren. Um die Systemreaktion auf toxi ­
sche Auswirkungen (optimale Empfindlichkeit) umfassend beschrei ­
ben zu können, wird ein unbegrenztes exponentielles Wachstum der Kulturen bei hinreichender Ernährung und kontinuierlicher Beleuch ­
tung über einen ausreichenden Zeitraum ermöglicht, damit anschlie ­
ßend die Verringerung der spezifischen Wachstumsrate gemessen 
werden kann.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 812
 
Wachstum und Wachstumshemmung werden durch zeitabhängige 
Messung der Biomasse der Algen bestimmt. Die Biomasse der Algen 
wird als Trockengewicht pro Volumen ausgedrückt (z. B. in mg Algen/Liter Testlösung). Das Trockengewicht ist jedoch schwer zu messen; daher werden Surrogatparameter verwendet. Häufigster Sur ­
rogatparameter ist der Zellgehalt. Weitere Surrogatparameter sind das 
Zellvolumen, die Fluoreszenz, die optische Dichte usw. Ein Faktor für die Umrechnung zwischen dem gemessenen Surrogatparameter und der Biomasse sollte bekannt sein.
 
Der Endpunkt des Tests ist die Wachstumshemmung, ausgedrückt 
als logarithmische Zunahme der Biomasse (durchschnittliche spezi ­
fische Wachstumsrate) während der Expositionsdauer. Aus den in einer Reihe von Testlösungen erfassten durchschnittlichen spezi ­
fischen Wachstumsraten wird die Konzentration bestimmt, bei der 
sich eine spezifizierte Hemmung der Wachstumsrate von x % 
(z. B. 50 %) ergibt; diese Konzentration wird als E
 r C x bezeichnet 
(z. B. E  r C 50 ). 
Bei der Anwendung dieser Methode im Rahmen des Gemeinschafts ­
rechts sollte die Ergebnisberechnung aus den im nachfolgenden 
Abschnitt 2.2 dargelegten Gründen auf einer durchschnittlichen spe ­
zifischen Wachstumsrate basieren. Bei dieser Prüfmethode wird als weitere Reaktionsvariable der Zellertrag verwendet; diese Variable kann erforderlich sein, damit in manchen Ländern bestimmte maß ­
gebliche Rechtsvorschriften erfüllt werden. Der Zellertrag wird de ­
finiert als Biomasse am Ende der Expositionsdauer abzüglich der Biomasse zu Beginn der Expositionsdauer. Aus dem in einer Reihe von Testlösungen erfassten Zellertrag wird die Konzentration berech ­
net, bei der sich eine spezifizierte Hemmung des Zellertrags 
(z. B. um 50 %) ergibt; diese Konzentration wird als E
 y C x angege­
ben (z. B. E  y C 50 ). 
Außerdem können die niedrigste Konzentration mit beobachteter 
Wirkung (LOEC) und die höchste geprüfte Konzentration ohne be ­
obachtete schädliche Wirkung (NOEC) statistisch bestimmt werden.  
1.5. INFORMATIONEN ZUR PRÜFSUBSTANZ  
Informationen zur Prüfsubstanz, die bei der Bestimmung der Prüfbe ­
dingungen hilfreich sein könnten, sind z. B. die Strukturformel, die Reinheit, die Lichtbeständigkeit, die Beständigkeit unter den Prüfbe ­
dingungen, das Lichtabsorptionsverhalten, pKa und die Ergebnisse 
von Transformationsstudien (u. a. die Ergebnisse von Studien zur 
biologischen Abbaubarkeit in Wasser).
 
Die Wasserlöslichkeit, der Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient 
(P ow ) und der Dampfdruck der Prüfsubstanz sollten bekannt sein, 
eine validierte Methode zur Quantifizierung der Substanz in den 
Testlösungen mit bekannten Wiederfindungsraten und mit bekannter 
Nachweisgrenze sollte verfügbar sein.  
1.6. REFERENZSUBSTANZ  
Um das Prüfverfahren zu testen, können Referenzsubstanzen wie 
z. B. das im internationalen Ringtest (4) verwendete 3,5-Dichlorphe ­
nol geprüft werden. Für Grünalgen kann auch Kaliumdichromat als 
Referenzsubstanz verwendet werden. Nach Möglichkeit sollten Re ­
ferenzsubstanzen mindestens zweimal jährlich getestet werden.  
1.7. VALIDITÄT DES TESTS  
Damit ein Test als gültig gewertet werden kann, sollten die folgen ­
den Kriterien erfüllt sein:  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 813
 
— Die Biomasse der Kontrollkulturen sollte binnen der 72-stündi ­
gen-Testdauer exponentiell um einen Faktor von mindestens 16 
gewachsen sein. Dieses Wachstum entspricht einer spezifischen Wachstumsrate von 0,92 d
 –1 . Bei den am häufigsten verwendeten 
Arten ist die Wachstumsrate im Allgemeinen erheblich größer 
(siehe Anlage 1). Dieses Kriterium wird unter Umständen nicht 
erfüllt, wenn Arten verwendet werden, die langsamer wachsen als die in Anlage 1 genannten Arten. In diesem Fall sollte die Testdauer so verlängert werden, dass ein mindestens 16faches 
Wachstum der Kontrollkulturen gewährleistet ist; dabei muss 
das Wachstum während der gesamten Testdauer exponentiell er ­
folgen. Die Testdauer kann bis auf eine Mindestdauer von 48 Stunden verkürzt werden, damit während des Tests ein unbe ­
grenztes exponentielles Wachstum aufrechterhalten 
wird; Voraussetzung ist jedoch, dass ein Multiplikationsfaktor von mindestens 16 erreicht wird.
 
— Der mittlere Variationskoeffizient der abschnittsbezogenen spezi ­
fischen Wachstumsraten (Tage 0-1, 1-2 und 2-3 bei 72-stündigen 
Tests) der Kontrollkulturen (siehe Abschnitt 1.2 Absatz „Varia ­
tionskoeffizient“) darf maximal 35 % betragen. Zur Berechnung der abschnittsbezogenen spezifischen Wachstumsrate sind die Hinweise in Abschnitt 2.2.1 Absatz 2 zu beachten. Dieses Kri ­
terium gilt für den mittleren Variationskoeffizienten, der für zur 
Wiederholung verwendete Kontrollkulturen berechnet wurde.
 
— Der Variationskoeffizient der durchschnittlichen spezifischen 
Wachstumsraten während der gesamten Testdauer darf bei den 
zur Wiederholung verwendeten Kontrollkulturen in Tests mit  
Pseudokirchneriella subcapitata  und  Desmodesmus subspicatus  
höchstens 7 % betragen. Bei weniger häufig in Tests verwende ­
ten Arten sollte der Wert höchstens 10 % betragen.  
1.8. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.8.1.  Apparatur  
Testgefäße und sonstige Apparaturen, die mit den Testlösungen in 
Berührung kommen, sollten vollständig aus Glas oder einem sons ­
tigen chemisch inerten Material bestehen. Die Komponenten sollten gründlich gespült werden, um sicherzustellen, dass keine organischen 
oder anorganischen Verunreinigungen das Algenwachstum oder die 
Zusammensetzung der Testlösungen beeinträchtigen können.
 
Als Prüfgefäße kommen im Allgemeinen Glaskolben mit Abmessun ­
gen in Betracht, die während des Tests ein hinreichendes Kulturvo ­
lumen und einen hinreichenden CO  2 -Transfer aus der Umgebungsluft 
gewährleisten (siehe Abschnitt 1.8.9 Absatz 2). Das Flüssigkeitsvolu ­
men muss für analytische Bestimmungen hinreichend sein (siehe Abschnitt 1.8.11 Absatz 5).
 
Außerdem werden unter Umständen die folgenden Geräte benötigt:  
— Kulturapparatur: Empfohlen werden ein Schrank oder eine Kam ­
mer, in dem bzw. in der die gewählte Inkubationstemperatur mit einer Toleranz von ± 2 °C aufrechterhalten werden kann.
 
— Lichtmessgeräte: Bei den Tests ist die Methode zur Messung der 
Lichtintensität zu protokollieren; insbesondere ist der für den 
Messwert maßgebliche Messkopftyp (Sensor) anzugeben. Die 
Messungen sollten vorzugsweise mit einem kugelförmigen (4 π)-Messkopf (der unmittelbar reagiert und Licht aus allen 
Winkeln über und unter der Messebene reflektiert) oder mit ei ­
nem (2 π)-Messkopf gemessen werden (der auf Licht aus belie ­
bigen Winkeln oberhalb der Geräteebene reagiert).
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 814
 
— Apparatur zur Bestimmung der Biomasse der Algen: Der Zell ­
gehalt als am häufigsten verwendeter Surrogatparameter für die 
Biomasse von Algen kann mit einem elektronischen Teilchenzäh ­
ler, mit einem Mikroskop mit Zählkammer und mit einem Durch ­
flusszytometer ermittelt werden. Weitere Surrogate für Biomas ­
sen können mit einem Durchflusszytometer, einem Fluorimeter, 
einem Spektrophotometer oder einem Farbmessgerät gemessen werden. Ein Umrechnungsfaktor, mit dem der Zellgehalt zum Trockengewicht in Beziehung gesetzt wird, kann Berechnungen 
erleichtern. Um mit einem Spektrophotometer verwertbare Mes ­
sungen bei geringen Biomassekonzentrationen durchführen zu können, müssen unter Umständen Küvetten mit einem Strahlen ­
gang von mindestens 4 cm verwendet werden.
 
1.8.2.  Testorganismen  
Für die Tests können mehrere Arten frei treibender Mikroalgen und 
Cyanobakterien verwendet werden. Die in Anlage 1 genannten Stämme haben sich für das in dieser Prüfmethode beschriebene Test ­
verfahren als geeignet erwiesen.
 
Wenn sonstige Arten verwendet werden, sollte der betreffende 
Stamm und/oder Ursprung angegeben werden. Außerdem ist sicher ­
zustellen, dass das exponentielle Wachstum der ausgewählten Tes ­
talgen während der gesamten Testdauer unter den jeweiligen Bedin ­
gungen aufrechterhalten werden kann.  
1.8.3.  Nährmedium  
Als Nährmedien werden wahlweise das OECD-Medium und das 
AAP-Medium empfohlen. Die Zusammensetzungen dieser Medien 
sind Anlage 2 zu entnehmen. Beide Medien haben unterschiedliche 
pH-Ausgangswerte und unterschiedliche Pufferkapazitäten (zur Re ­
gulierung des pH-Anstiegs). Daher können die Testergebnisse je 
nach verwendetem Medium unterschiedlich ausfallen; dies gilt ins ­
besondere für die Prüfung ionisierender Substanzen.  
Für bestimmte Zwecke muss unter Umständen das Nährmedium 
modifiziert werden (z. B. für die Prüfung von Metallen und Chelat ­
bildnern oder für Prüfungen bei unterschiedlichen pH-Werten). Die 
Verwendung modifizierter Nährmedien ist im Einzelnen zu erläutern und zu begründen (3)(4).
 
1.8.4.  Biomasse-Ausgangskonzentration  
Die Ausgangsbiomasse der Prüfkulturen muss bei allen Prüfkulturen 
identisch und so gering sein, dass während der Inkubationsdauer ein exponentielles Wachstum erzielt werden kann, ohne eine Erschöp ­
fung des Nährmediums befürchten zu müssen. Die Ausgangsbio ­
masse sollte höchstens 0,5 mg/l Trockengewicht betragen. Folgende 
Ausgangs-Zellkonzentrationen werden empfohlen:  
Pseudokirchneriella subcapitata:  5 × 10
 3 -10 4 Zellen/ml  
Desmodesmus subspicatus  2-5 × 10  3 Zellen/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 Zellen/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 Zellen/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 -10 5 Zellen/ml  
1.8.5.  Konzentrationen der Prüfsubstanz  
Der Konzentrationsbereich, in dem wahrscheinlich Auswirkungen 
auftreten, kann aufgrund von Tests zur Bestimmung des Konzentra ­
tionsbereichs ermittelt werden. Für den definitiven Test sollten min ­
destens fünf Konzentrationen in einer geometrischen Reihe mit ei ­
nem Faktor von höchstens 3,2 ausgewählt werden. Bei Prüfsubstan ­
zen mit einer flacheren Konzentrations-Reaktionskurve kann ein hö ­
herer Faktor gerechtfertigt sein. Die Konzentrationsreihen sollten 
vorzugsweise einen Bereich abdecken, in dem das Algenwachstum 
um 5-75 % gehemmt wird.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 815
 
1.8.6.  Wiederholungen und Kontrollen  
Das Prüfprotokoll sollte für jede Testkonzentration drei Wieder ­
holungen vorsehen. Wenn die NOEC nicht bestimmt werden muss, kann das Prüfprotokoll dahingehend geändert werden, dass die An ­
zahl der Konzentrationen erhöht und die Anzahl der Wiederholungen 
verringert wird. Es müssen mindestens drei Kontrollwiederholungen durchgeführt werden, im Idealfall die doppelte Anzahl der Wieder ­
holungen für jede Testkonzentration.
 
Für analytische Bestimmungen der Prüfsubstanzkonzentrationen 
kann eine eigene Reihe von Testlösungen hergestellt werden (siehe 
Abschnitt 1.8.11 Absätze 4 und 6).  
Wenn zur Auflösung der Prüfsubstanz ein Lösungsmittel verwendet 
wird, sind in das Prüfprotokoll weitere Kontrollen mit dem Lösungs ­
mittel in der Konzentration einzubeziehen, die auch in den Prüfkul ­
turen verwendet wird.  
1.8.7.  Herstellung der Impfkultur  
Um eine Anpassung der Testalgen an die Testbedingungen zu er ­
möglichen und um sicherzustellen, dass sich die Algen in der Phase 
des exponentiellen Wachstums befinden, wenn sie zur Impfung der Testlösungen verwendet werden, wird 2-4 Tage vor Testbeginn im Prüfmedium eine Impfkultur hergestellt. Die Algenbiomasse sollte so 
angepasst werden, dass ein exponentielles Wachstum der Impfkultur 
bis zum Testbeginn erfolgen kann. Die Impfkultur ist unter den gleichen Bedingungen wie die Prüfkulturen zu inkubieren. Die Zu ­
nahme der Biomasse der Impfkultur ist zu messen, um sicherzustel ­
len, dass das Wachstum unter den gegebenen Kulturbedingungen für 
den jeweiligen Teststamm im normalen Bereich liegt. In Anlage 3 wird ein Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung einer Algenkultur beschrieben. Um gleichzeitige Zellteilungen während des Tests zu 
vermeiden, kann unter Umständen ein zweiter Schritt zur Vermeh ­
rung der Impfkultur erforderlich sein.
 
1.8.8.  Herstellung der Testlösungen  
Alle Testlösungen müssen das Nährmedium und die Ausgangsbio ­
masse der Testalgen in denselben Konzentrationen enthalten. Die 
Testlösungen in den ausgewählten Konzentrationen werden gewöhn ­
lich durch Mischen einer Stammlösung der Prüfsubstanz mit dem Nährmedium und der Impfkultur hergestellt. Stammlösungen werden 
im Allgemeinen durch Auflösung der betreffenden Substanz im Prüf ­
medium hergestellt.
 
Wenn Substanzen mit geringer Wasserlöslichkeit zum Prüfmedium 
hinzugegeben werden sollen, können Lösungsmittel (z. B. Aceton, 
t-Butyl-Alkohol und Dimethylformamid) als Träger verwendet werden (2)(3). Die Lösungsmittelkonzentration sollte höchstens 100 μl/l betragen, und für alle Kulturen der Testreihen (einschließ ­
lich der Kontrollkulturen) sollte die gleiche Konzentration verwendet 
werden.
 
1.8.9.  Inkubation  
Die Testgefäße sind mit luftdurchlässigen Stopfen zu versehen. An ­
schließend werden die Gefäße geschüttelt und in die Kulturapparatur 
gebracht. Während des Tests müssen die Algen suspendiert bleiben, und der CO
 2 -Transfer muss erleichtert werden. Dazu sollten die 
Gefäße ständig geschüttelt oder umgerührt werden. Die Temperatur 
der Kulturen sollte bei einer Toleranz von ± 2 °C ständig auf 21 
bis 24 °C geregelt werden. Bei anderen als den in Anlage 1 genann ­
ten Arten (z. B. bei tropischen Arten) sind unter Umständen höhere Temperaturen angemessen, wenn die Validitätskriterien erfüllt sind. 
Es wird empfohlen, die Kolben zufällig verteilt und täglich neu in 
den Inkubator einzusetzen.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 816
 
Der pH-Wert des Kontrollmediums darf während des Tests höchs ­
tens um 1,5 Einheiten ansteigen. Bei Metallen und Verbindungen, 
die bei pH-Werten etwa im Bereich der im Test verwendeten pH- Werte teilweise ionisieren, muss die pH-Verschiebung möglicher ­
weise begrenzt werden, um reproduzierbare und gut definierte Ergeb ­
nisse zu erhalten. Eine Verschiebung des pH-Werts um < 0,5 ist 
technisch möglich und kann hervorgerufen werden, um einen an ­
gemessenen CO
 2 -Transfer aus der Umgebungsluft in die Testlösung 
zu erzielen (z. B. durch stärkeres Schütteln). Eine weitere Möglich ­
keit besteht in der Verringerung des CO  2 -Bedarfs durch Verringe ­
rung der Ausgangsbiomasse oder in einer Verkürzung der Testdauer.  
Die Oberfläche, auf der die Kulturen inkubiert werden, sollte kon ­
tinuierlich und gleichförmig fluoreszierend beleuchtet werden (z. B. 
mit den Lichtfarben kaltweiß („cool-white“) oder Tageslicht („day ­
light“). Algen- und Cyanobakterienstämme stellen unterschiedliche Anforderungen an die Lichtverhältnisse. Die Lichtintensität sollte entsprechend den verwendeten Testorganismen gewählt werden. 
Bei den empfohlenen Grünalgenarten ist die Lichtintensität auf der 
Höhe der Testlösungen im Bereich 60-120 μE · m
 –2 · s –1 zu wählen 
(bei Messung im photosynthetisch wirksamen Spektralbereich von 400-700 nm mit einem geeigneten Rezeptor). Einige Arten, ins ­
besondere  Anabaena flos-aquae , wachsen bei geringeren Lichtinten ­
sitäten und können durch größere Lichtintensitäten beschädigt wer ­
den. Bei diesen Arten sollte die durchschnittliche Lichtintensität im Bereich 40-60 μE · m
 –2 · s –1 liegen. (Bei in Lux kalibrierten Licht ­
messgeräten entspricht der Bereich 4 440-8 880 lx für die Lichtfarbe 
„cool-white“ etwa der empfohlenen Lichtintensität von 60- 120 μE · m
 –2 · s –1 ) Die Lichtintensität darf um höchstens ± 15 % 
von der durchschnittlichen Lichtintensität über dem Inkubations ­
bereich abweichen.  
1.8.10.  Testdauer  
Im Allgemeinen dauert der Test 72 Stunden. Allerdings sind auch 
kürzere oder längere Testzeiten möglich, sofern alle in Abschnitt 1.7 genannten Validitätskriterien eingehalten werden.
 
1.8.11.  Messungen und analytische Bestimmungen  
Die Algenbiomasse in den einzelnen Kolben wird während der Test ­
dauer mindestens einmal täglich überprüft. Wenn die Messungen an 
kleinen Volumina vorgenommen werden, die aus der Testlösung pipettiert wurden, sollten die betreffenden Volumina nicht ersetzt werden.
 
Die Biomasse wird durch manuelle Zählung der Zellen unter dem Mi ­
kroskop oder mit einem elektronischen Teilchenzähler (Einstellung auf Zellgehalt und/oder Biovolumen) ermittelt. Alternative Verfahren wie z. B. die Messung mit einem Durchflusszytometer, in vitro und/oder 
in vivo durchgeführte Chlrorophyll-Fluoreszenzmessungen (6)(7), oder 
Messungen der optischen Dichte kommen in Betracht, wenn in dem für den jeweiligen Test maßgeblichen Biomassebereich eine befriedigende Korrelation mit der Biomasse nachgewiesen werden kann.
 
Der pH-Wert der Lösungen wird am Anfang und am Ende des Tests 
gemessen.  
Wenn ein Analyseverfahren zur Bestimmung der Prüfsubstanz im 
maßgeblichen Konzentrationsbereich verfügbar ist, sollten die Test ­
lösungen analysiert werden, um die Ausgangskonzentrationen und 
die Aufrechterhaltung der Expositionskonzentrationen während der 
Tests zu prüfen bzw. sicherzustellen.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 817
 
Die Analyse der Prüfsubstanzkonzentration am Anfang und am Ende 
des Tests bei einer niedrigen und einer hohen Testkonzentration 
sowie bei einer Konzentration im zu erwartenden EC  50 -Bereich 
kann hinreichend sein, wenn anzunehmen ist, dass die Expositions ­
konzentrationen während des Tests um weniger als 20 % von den 
Nennwerten abweichen. Wenn die Konzentrationen eher nicht im 
Bereich von 80-120 % der Nennkonzentrationen bleiben werden, wird die Analyse sämtlicher Testkonzentrationen am Anfang und am Ende der Tests empfohlen. Bei flüchtigen, instabilen oder stark 
adsorbierenden Prüfsubstanzen werden während der Expositions ­
dauer weitere Probenahmen zur Durchführung von Analysen in Ab ­
ständen von jeweils 24 Stunden empfohlen, um den Verlust der Prüfsubstanz besser bestimmen zu können. Bei diesen Substanzen 
werden zusätzliche Wiederholungen benötigt. In jedem Fall müssen 
die Prüfsubstanzkonzentrationen für alle Testkonzentrationen bei den Wiederholungen jeweils nur in einem Gefäß (bzw. in dem Gesamt ­
inhalt aller Gefäße einer Wiederholung) bestimmt werden.
 
Ausdrücklich für die Analyse von Expositionskonzentrationen wäh ­
rend der Testdauer hergestellte Prüfmedien sollten auf die gleiche Weise behandelt werden, wie die für die Tests verwendeten Medien, 
d. h. die Medien sollten mit Algen geimpft und unter identischen 
Bedingungen inkubiert werden. Wenn eine Analyse der gelösten Prüfsubstanz erforderlich ist, müssen die Algen unter Umständen vom Medium getrennt werden. Die Trennung sollte vorzugsweise 
durch Zentrifugierung mit niedriger Beschleunigungskraft erfolgen, 
die eben noch hinreichend für die Ausfällung der Algen ist.
 
Wenn nachgewiesen wird, dass die Konzentration der Prüfsubstanz 
während der gesamten Testdauer in befriedigender Weise im Bereich 
von ± 20 % der Nennkonzentration oder der gemessenen Ausgangs ­
konzentration aufrechterhalten werden konnte, können die Ergebnisse auch ausgehend von den Nennwerten bzw. von den gemessenen 
Ausgangswerten analysiert werden. Wenn die Abweichung von der 
Nennkonzentration oder von der gemessenen Ausgangskonzentration mehr als ± 20 % beträgt, sollte bei der Analyse der Ergebnisse von der geometrischen mittleren Konzentration während der Expositions ­
dauer oder von Modellen ausgegangen werden, welche den Rück ­
gang der Prüfsubstanzkonzentration beschreiben (3)(8).
 
Der Test zur Hemmung des Algenwachstum ist ein dynamischeres 
Prüfsystem als die meisten sonstigen aquatischen Toxizitätstests mit kürzerer Testdauer. Entsprechend sind die tatsächlichen Expositions ­
konzentrationen unter Umständen schwer zu bestimmen; dies gilt 
besonders für adsorbierende Substanzen, die bei niedrigen Konzen ­
trationen getestet werden. In diesen Fällen bedeutet das Verschwin ­
den der Substanz aus der Lösung infolge der Adsorption in die zunehmende Algenbiomasse nicht, dass das Testsystem die Substanz 
„verliert“. Bei der Analyse des Testergebnisses sollte geprüft werden, 
ob ein Rückgang der Prüfsubstanzkonzentration im Laufe des Tests mit einer Abnahme der Wachstumshemmung einhergeht. Wenn dies der Fall ist, kann der Einsatz eines geeigneten Modells zur Beschrei ­
bung des Rückgangs der Prüfsubstanzkonzentration (8) in Betracht 
gezogen werden. Ansonsten ist es unter Umständen nicht angemes ­
sen, bei der Analyse der Ergebnisse von den Ausgangskonzentratio ­
nen (Nennkonzentrationen oder gemessenen Konzentrationen) aus ­
zugehen.
 
1.8.12.  Sonstige Beobachtungen  
Durch Beobachtung unter dem Mikroskop sollte sichergestellt wer ­
den, dass die Impfkultur normal und gesund wirkt; außerdem können unter dem Mikroskop am Ende des Tests gegebenenfalls Auffällig ­
keiten an den Algen festgestellt werden (die z. B. auf die Einwirkung 
der Prüfsubstanz zurückzuführen sein könnten).
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 818
 
1.8.13.  Limit-Test  
Unter gewissen Umständen, z. B. wenn ein vorläufiger Test darauf 
hindeutet, dass die Prüfsubstanz bei Konzentrationen bis zu 100 mg · l
 –1 bzw. bis zur Löslichkeitsgrenze im Prüfmedium (maßgeblich ist die 
jeweils niedrigere Konzentration) keine toxische Wirkung hat, kann ein 
Limit-Test durchgeführt werden, in dem die Reaktionen einer Kontroll ­
gruppe und einer Behandlungsgruppe (100 mg · l  –1 bzw. eine mit der 
Löslichkeitsgrenze identische Konzentration) verglichen werden. Es 
wird nachdrücklich empfohlen, diese Tests durch Analysen der Exposi ­
tionskonzentration zu verifizieren. Alle oben beschriebenen Testbedin ­
gungen und Validitätskriterien gelten für Limit-Tests; allerdings sollten 
mindestens sechs Wiederholungen mit behandelten Proben durchgeführt 
werden. Die Reaktionsvariablen der Kontrollgruppe und der Behand ­
lungsgruppe können mit einem statistischen Test zum Vergleich der Mittelwerte analysiert werden (z. B. mit einem Student-Test). Wenn 
die Varianzen der beiden Gruppen nicht übereinstimmen, sollte ein für 
nicht identische Varianzen angepasster t-Test (Student-Test) durch ­
geführt werden.
 
1.8.14.  Änderung für stark kolorierte Substanzen  
Die Bestrahlung (Lichtintensität) sollte im obersten Ende des bei dieser 
Testmethode vorgeschriebenen Bereichs liegen: 120 μE m  –2 s –1 oder 
höher.  
Der Strahlengang sollte durch eine Verringerung des Volumens der 
Testlösungen (im Bereich von 5-25 ml) verkürzt werden.  
Es sollte (z. B. durch mäßiges Schütteln) für ausreichende Bewegung 
gesorgt werden, um zu gewährleisten, dass die Algen häufig einer 
hohen Bestrahlung an der Oberfläche der Kultur exponiert sind.  
2. DATEN  
2.1. GRAFISCHE DARSTELLUNG DER WACHSTUMSKURVEN  
Die in den Prüfgefäßen enthaltene Biomasse kann in Einheiten des 
für die Messung verwendeten Surrogatparameters ausgedrückt wer ­
den (z. B. als Zellgehalt oder Fluoreszenz).  
Die geschätzte Biomassekonzentration der Prüfkulturen und der Kon ­
trollkulturen ist zusammen mit den mindestens zu jeder vollen Stunde zu erfassenden Konzentrationen des Prüfmaterials und den 
Messzeitpunkten in Tabellen zusammenzustellen und für die Erstel ­
lung von Wachstumskurven zu verwenden. In diesem ersten Stadium können sowohl die logarithmischen Skalen als auch die linearen Skalen hilfreich sein; während der Testdauer sind jedoch die loga ­
rithmischen Skalen vorgeschrieben, die im Allgemeinen eine bessere 
Darstellung von Abweichungen der Wachstumsstrukturen ermögli ­
chen. Bei exponentiellem Wachstum ergibt sich bezogen auf eine logarithmische Skala eine Gerade; die Steigung der Gerade gibt Auf ­
schluss über die jeweilige Wachstumsrate.
 
Anhand der Darstellungen ist sicherzustellen, dass die Kontrollkul ­
turen während der gesamten Testdauer tatsächlich mit der erwarteten Geschwindigkeit exponentiell wachsen. Alle Datenpunkte sowie die Darstellungen sind kritisch zu überprüfen, und Ausgangsdaten und 
Verfahren sind auf mögliche Fehler zu kontrollieren. Insbesondere 
sind alle Datenpunkte zu prüfen, die aufgrund eines systematischen Fehlers abzuweichen scheinen. Wenn Verfahrensfehler zweifelsfrei festgestellt und/oder als sehr wahrscheinlich betrachtet werden kön ­
nen, wird der betreffende Datenpunkt als Ausreißer gekennzeichnet 
und nicht in die anschließende statistische Analyse einbezogen. (Eine Algenkonzentration von null in einem der beiden bzw. der drei für die Wiederholungen verwendeten Gefäße kann darauf hindeuten, 
dass das Gefäß nicht ordnungsgemäß geimpft oder nicht angemessen 
gereinigt wurde.) Die Gründe für den Ausschluss eines als Ausreißer eingestuften Datenpunkts sind im Prüfbericht genau anzugeben. Als Begründungen werden ausschließlich (selten) Verfahrensfehler, nicht 
aber einfach ungenaue Messungen anerkannt. Statistische Verfahren 
zur Bestimmung von Ausreißern sind bei dieser Art von Problemen von begrenztem Nutzen und können die Beurteilung durch Fachleute nicht ersetzen. Ausreißer (die als solche gekennzeichnet wurden) 
sollten vorzugsweise in den Datenpunkten verbleiben, die später in 
grafischen oder tabellarischen Darstellungen verwendet werden.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 819
 
2.2. REAKTIONSVARIABLEN  
Mit der Prüfung sollen die Auswirkungen der Prüfsubstanz auf das 
Algenwachstum bestimmt werden. Diese Prüfmethode beschreibt zwei Reaktionsvariablen, da in den Mitgliedsländern unterschiedliche Präferenzen und rechtliche Anforderungen bestehen. Damit die Test ­
ergebnisse in allen Mitgliedsländern anerkannt werden können, soll ­
ten die Auswirkungen mit Hilfe der beiden im Folgenden beschrie ­
benen Reaktionsvariablen a) und b) beurteilt werden.
 
a) Durchschnittliche spezifische Wachstumsrate: Diese Reaktions ­
variable wird ausgehend von der täglichen logarithmischen Zu ­
nahme der Biomasse während der Testdauer berechnet.  
b) Zellertrag: Diese Reaktionsvariable ergibt sich aus der Biomasse 
am Ende des Tests abzüglich der Biomasse bei Beginn des Tests.  
Bei der Anwendung dieser Methode im Rahmen des Gemeinschafts ­
rechts sollte die Ergebnisberechnung aus den nachfolgend dargeleg ­
ten Gründen auf einer durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate 
basieren. Es wird darauf hingewiesen, dass die mit diesen beiden Reaktionsvariablen berechneten Toxizitätswerte nicht vergleichbar sind; der entsprechende Unterschied muss bei der Verwendung der 
Testergebnisse berücksichtigt werden. Die mit der durchschnittlichen 
spezifischen Wachstumsrate (E
 r C x ) berechneten Werte für EC  x wer­
den im Allgemeinen höher sein als die anhand des Zellertrags (E  y C x ) 
ermittelten Werte, wenn die für diese Testmethode vorgesehenen 
Bedingungen eingehalten werden; dies ist auf die unterschiedliche mathematische Grundlage der beiden Berechnungsverfahren zurück ­
zuführen. Die auftretenden Unterschiede sollten jedoch nicht als An ­
zeichen für eine unterschiedliche Empfindlichkeit der beiden Reakti ­
onsvariablen betrachtet werden; beide Werte sind einfach mathema ­
tisch verschieden. beide Werte sind einfach mathematisch verschie ­
den. Das Konzept der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate 
beruht auf dem im Allgemeinen exponentiellen Verlauf des Algen ­
wachstums bei nicht begrenzten Kulturen, bei denen die Toxizität aufgrund der Auswirkungen auf die Wachstumsrate geschätzt wird, ohne jedoch von der absoluten Höhe der jeweiligen Wachstumsrate 
der Kontrollprobe, von der Steigung der Konzentrations-Reaktions ­
kurve oder von der Testdauer abhängig zu sein. Auf der Reaktions ­
variable Zellertrag beruhende Ergebnisse hingegen hängen von allen übrigen genannten Variablen ab. E
 y C x ist von der spezifischen 
Wachstumsrate der in den einzelnen Tests verwendeten Algenarten 
sowie von der maximalen spezifischen Wachstumsrate abhängig, die je nach Art sowie sogar zwischen den einzelnen Algenstämmen unterschiedlich sein kann. Diese Reaktionsvariable sollte nicht ver ­
wendet werden, um die Empfindlichkeit von Algenarten oder auch 
nur verschiedener Algenstämme gegenüber Giftstoffen zu verglei ­
chen. Die Verwendung der durchschnittlichen spezifischen Wachs ­
tumsrate zur Schätzung der Toxizität wird in der Wissenschaft be ­
vorzugt; bei dieser Prüfmethode werden jedoch auch Toxizitätsschät ­
zungen aufgrund des Zellertrags berücksichtigt, um den derzeitigen rechtlichen Anforderungen einiger Länder Rechnung zu tragen.
 
2.2.1.  Durchschnittliche Wachstumsrate  
Die durchschnittliche spezifische Wachstumsrate in einem bestimm ­
ten Zeitraum wird mit Hilfe der folgenden Formel als logarithmische Zunahme der Biomasse für die Gefäße mit den verschiedenen Kon ­
trollproben und mit den behandelten Proben berechnet:
 
μ iÄj ¼ lnX j – lnX i 
t j – t i ðday  – 1 Þ 
wobei  
μ i-j : durchschnittliche spezifische Wachstumsrate zwischen Zeit ­
punkt  i und Zeitpunkt  j; 
X i : Biomasse zum Zeitpunkt  i; 
X j : Biomasse zum Zeitpunkt  j. ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 820
 
Für jede Behandlungsgruppe und für jede Kontrollgruppe sind die 
mittlere Wachstumsrate sowie die Varianzschätzungen zu berechnen.  
Die durchschnittliche spezifische Wachstumsrate wird über die ge ­
samte Testdauer (im Allgemeinen Tage 0-3) berechnet; dabei ist eher als ein gemessener Ausgangswert die geimpfte Nennbiomasse als 
Ausgangswert anzunehmen, da mit diesem Wert gewöhnlich eine 
höhere Genauigkeit erzielt wird. Wenn die zur Messung der Bio ­
masse verwendete Ausrüstung eine hinreichend genaue Bestimmung der Biomasse mit dem geringen Inokulum zulässt (z. B. ein Durch ­
flusszytometer), kann die gemessene Konzentration der Ausgangs ­
biomasse angenommen werden. Außerdem ist während der gesamten Testdauer (Tage 0-1, 1-2 und 2-3) die abschnittsbezogene Wachs ­
tumsrate als tägliche spezifische Wachstumsrate zu ermitteln und zu 
prüfen, ob das Wachstum der Kontrollgruppe konstant bleibt (siehe 
Gültigkeitskriterien, Abschnitt 1.7). Eine spezifische Wachstumsrate, die an einem bestimmten Tag signifikant niedriger ist als die durch ­
schnittliche spezifische Gesamtwachstumsrate, kann Anzeichen für 
eine „Lag“-Phase sein. Bei den Kontrollkulturen kann eine „Lag“- 
Phase minimiert und praktisch ausgeschlossen werden, wenn die Vorkultur in geeigneter Weise vermehrt wird; bei den behandelten Kulturen hingegen kann eine „Lag“-Phase Anzeichen für eine Erho ­
lung nach anfänglicher toxischer Belastung oder Anzeichen für eine 
geringere Belastung infolge eines Verlustes der Prüfsubstanz (u. a. durch Sorption in die Algenbiomasse) nach der anfänglichen Be ­
handlung sein. Entsprechend kann die abschnittsbezogene Wachs ­
tumsrate bewertet werden, um die Auswirkungen der Prüfsubstanz während der Expositionsdauer zu beurteilen. Erhebliche Unterschiede zwischen der abschnittsbezogenen Wachstumsrate und der durch ­
schnittlichen Wachstumsrate deuten auf Abweichungen vom kon ­
stanten exponentiellen Wachstum hin und erfordern eine genaue Überprüfung der Wachstumskurven.
 
Die prozentuale Hemmung der Wachstumsrate der einzelnen Wieder ­
holungen mit behandelten Proben ist mit folgender Formel zu be ­
rechnen:  
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100  
wobei  
%I r : Hemmung der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate 
in Prozent;  
μ C : mittlere durchschnittliche spezifische Wachstumsrate ( μ) der 
Kontrollgruppe;  
μ T : durchschnittliche spezifische Wachstumsrate der Wieder ­
holung mit einer behandelten Probe.  
Wenn die Testlösungen mit Lösungsmitteln hergestellt werden, soll ­
ten eher die Kontrolllösungen mit dem Lösungsmittel als die Kon ­
trolllösungen ohne das Lösungsmittel zur Berechnung der prozentua ­
len Hemmung verwendet werden.  
2.2.2.  Zellertrag  
Der Zellertrag wird für alle Gefäße mit Kontrolllösungen und be ­
handelten Lösungen als Biomasse bei Ende des Tests abzüglich der 
Biomasse am Anfang des Tests berechnet. Für die Testkonzentratio ­
nen und für die Kontrolllösungen ist jeweils ein mittlerer Zellertrag zu berechnen; die Varianzen sind jeweils zu schätzen. Die prozen ­
tuale Hemmung des Zellertrags (%I
 y ) kann für die Wiederholungen 
mit behandelten Proben wie folgt berechnet werden:  
%I y ¼ ðY C – Y T Þ 
Y C Ü 100 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 821
 
wobei  
% I  y : prozentuale Hemmung des Zellertrags;  
Y C : mittlerer Zellertrag der Kontrollgruppe;  
Y T : Zellertrag der Wiederholung mit einer behandelten Probe.  
2.3. GRAFISCHE DARSTELLUNG DER KONZENTRATIONS-RE ­
AKTIONSKURVE  
Die prozentuale Hemmung ist bezogen auf den Logarithmus der 
Prüfsubstanzkonzentration grafisch darzustellen und sorgfältig zu überprüfen; dabei sind alle Datenpunkte zu verwerfen, die in der ersten Phase als Ausreißer identifiziert wurden. Die Datenpunkte 
sind nach visueller oder rechnergestützter Interpolation zu einer 
gleichmäßigen Kurve zu verbinden, um einen ersten Eindruck von der Beziehung zwischen den verschiedenen Konzentrationen und Reaktionen zu erhalten. Anschließend ist mit einer differenzierteren 
Methode (vorzugsweise mit einer rechnergestützten statistischen Me ­
thode) fortzufahren. Abhängig von der beabsichtigten Verwendung der Daten, der Qualität (Genauigkeit) und dem Umfang der Daten sowie von der Verfügbarkeit von Werkzeugen zur Analyse der Daten 
kann (gelegentlich durchaus berechtigt) entschieden werden, die Da ­
tenanalyse in diesem Stadium zu beenden und einfach die wesentli ­
chen Werte für EC
 50 und EC  10 (und/oder EC  20 ) aus der nach visu ­
eller Interpolation erstellten Kurve abzulesen (siehe auch folgender 
Abschnitt zu stimulierenden Auswirkungen). Die folgenden Gründe 
können dafür sprechen, von der Verwendung einer statistischen Me ­
thode abzusehen:  
— Die Daten sind nicht geeignet, durch rechnergestützte Methoden 
zuverlässigere Ergebnisse zu ermitteln als durch die Beurteilung 
von Fachleuten. In diesen Fällen werden mit manchen Computer- Programmen unter Umständen keinerlei zuverlässige Ergebnisse erzielt (Wiederholungen stimmen nicht überein usw.).
 
— Stimulierende Wachstumsreaktionen können mit verfügbaren 
Computer-Programmen nicht in angemessener Weise verarbeitet werden (siehe folgender Abschnitt).
 
2.4. STATISTISCHE VERFAHREN  
Ziel ist die Ermittlung einer quantitativen Konzentrations-Reaktions ­
beziehung durch Regressionsanalyse. Im Anschluss an eine lineari ­
sierte Transformation der Reaktionsdaten (z. B. in Einheiten nach dem Probit-, Logit- oder Weibull-Modell) (9) kann eine gewichtete lineare Regression vorgenommen werden; nicht-lineare Regressions ­
verfahren, mit denen die unvermeidlichen Unregelmäßigkeiten der 
Daten und Abweichungen von gleichförmigen Verteilungen besser verarbeitet werden können, werden jedoch bevorzugt. Gegen null bzw. gegen die vollständige Hemmung können diese Unregelmäßig ­
keiten durch die Transformation vergrößert werden und die Analyse 
beeinträchtigen (9). Es wird darauf hingewiesen, dass Standard-Ana ­
lysmethoden mit Probit-, Logit- oder Weibull-Transformationen für quantitative Daten (z. B. Mortalität oder Überlebensraten) vorgese ­
hen sind und zur Verwendung in Verbindung mit Wachstums- oder 
Biomassedaten entsprechend modifiziert werden müssen. Spezifische Verfahren zur Bestimmung von EC
 x -Werten aus kontinuierlichen 
Daten sind den Quellen (10)(11) and (12) zu entnehmen. In 
Anlage 4 wird der Einsatz nicht-linearer Regressionsanalysen näher 
erläutert.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 822
 
Für jede zu analysierende Reaktionsvariable sind aufgrund der Kon ­
zentrations-Reaktionsbeziehung Punktschätzungen für die EC  x -Werte 
zu ermitteln. Nach Möglichkeit sollten für jede Schätzung die 95%- Konfidenzintervalle bestimmt werden. Die Qualität der Übereinstim ­
mung der Reaktionsdaten mit dem Regressionsmodell sollte grafisch 
oder statistisch bewertet werden. Die Regressionsanalyse sollte mit 
den Reaktionen der einzelnen Wiederholungen (und nicht mit den Mittelwerten der Behandlungsgruppe) durchgeführt werden. Wenn eine nicht-lineare Kurvenanpassung jedoch schwierig oder wegen 
zu großer Streuung der Daten nicht möglich ist, kann die Regression 
auch bezogen auf die Mittelwerte der Gruppe vorgenommen werden, um so auf einfache Weise die Auswirkungen erwarteter Ausreißer zu reduzieren. Wenn von dieser Möglichkeit Gebrauch gemacht wird, 
sollte dies im Prüfbericht als Abweichung vom normalen Verfahren 
vermerkt und darauf hingewiesen werden, dass mit Kurvenanpassun ­
gen der einzelnen Wiederholungen kein befriedigendes Ergebnis er ­
zielt wurde.
 
Schätzwerte für EC  50 und für die Konfidenzintervalle können auch 
durch lineare Interpolation mit einem Bootstrapping-Algorithmus (13) 
erzielt werden, wenn die verfügbaren Regressionsmodelle/-methoden für die betreffenden Daten nicht geeignet sind.
 
Um die LOEC und entsprechend die NOEC zu schätzen sowie um 
die Auswirkungen der Prüfsubstanzen auf die Wachstumsrate zu 
ermitteln, müssen die Mittelwerte der behandelten Proben mit Vari ­
anzanalyseverfahren (ANOVA) verglichen werden. Der Mittelwert der einzelnen Konzentrationen ist dann mit einer geeigneten Methode zur Durchführung von Mehrfachvergleichen bzw. zur Durchführung 
von Trendtests mit dem Mittelwert der Kontrollgruppe zu verglei ­
chen. Dunnett- und Williams-Tests können hilfreich sein (14)(15) ­
(16)(17)(18). Die ANOVA-Annahme der Varianzhomogenität muss einer Überprüfung unterzogen werden. Die entsprechende Bewertung 
kann anhand einer grafischen Darstellung oder aufgrund eines for ­
malen Tests vorgenommen werden (18). Geeignet sind Levene- und Bartlett-Tests. Wenn die Annahme der Varianzhomogenität nicht erfüllt ist, kann gelegentlich eine Korrektur durch logarithmische 
Datentransformation erfolgen. Bei außerordentlicher Varianzhetero ­
genität, die durch Transformation nicht korrigiert werden kann, soll ­
ten Analysen durch Methoden wie z. B. Jonckheere-Trendtests (Step ­
down) erwogen werden. Weitere Hinweise zur Bestimmung von 
NOEC-Werten sind Quelle (12) zu entnehmen.
 
Aufgrund neuer Forschungsergebnisse wird empfohlen, das Konzept 
der NOEC aufzugeben und durch Punktschätzungen von EC  x -Werten 
zu ersetzen, die durch Regression ermittelt wurden. Für diesen Al ­
gentest wurde noch kein geeigneter Wert für x definiert. Ein Bereich 
von 10 bis 20 % scheint geeignet (abhängig von der auswählten Reaktionsvariable); vorzugsweise sollten sowohl EC
 10 als auch 
EC 20 protokolliert werden.  
2.5. WACHSTUMSSTIMULATION  
Gelegentlich wird bei niedrigen Konzentrationen eine Wachstumssti ­
mulation (negative Hemmung) beobachtet. Diese Wachstumsstimula ­
tion kann entweder auf eine Hormesis („toxische Stimulation“) oder 
darauf zurückzuführen sein, dass im verwendeten Minimalmedium mit dem zu prüfenden Material zusätzliche stimulierende Wachs ­
tumsfaktoren zum Tragen kommen. Die Zugabe anorganischer Nähr ­
stoffe sollte keinerlei unmittelbare Auswirkungen haben, weil das 
Prüfmedium während der gesamten Testdauer ohnehin überschüssige Nährstoffe enthalten sollte. Eine Stimulation mit niedriger Dosierung kann bei Berechnungen von EC
 50 gewöhnlich übergangen werden, 
wenn die Stimulation nicht ungewöhnlich stark ist. Bei ungewöhn ­
lich starker Stimulation oder wenn ein EC  x -Wert für einen niedrigen 
x-Wert berechnet werden soll, sind möglicherweise jedoch besondere Verfahrensweisen erforderlich. Die Löschung von Stimulationsreak ­
tionen aus der Datenanalyse sollte nach Möglichkeit vermieden wer ­
den, und wenn die verfügbare Software zur Kurvenanpassung nicht in der Lage ist, geringere Stimulationen zu verarbeiten, kann eine lineare Interpolation mit einem Bootstrapping-Algorithmus vor ­
genommen werden. Bei ungewöhnlich starker Stimulation kann der 
Einsatz eines Hormesis-Modells erwogen werden (19).
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 823
 
2.6. NICHT TOXISCHE WACHSTUMSHEMMUNG  
Licht absorbierende Testmaterialien können zu einer Verringerung 
der Wachstumsrate führen, weil die Abdunklung den Anteil des ver ­
fügbaren Lichts verringert. Diese physikalischen Auswirkungen soll ­
ten durch geeignete Modifikation der Testbedingungen von toxischen 
Auswirkungen unterschieden und getrennt protokolliert werden. Ent ­
sprechende Hinweise sind den Quellen (2) und (3) zu entnehmen.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten:  
Prüfsubstanz:  
— physikalische Beschaffenheit und maßgebliche physikalisch-che ­
mische Merkmale einschließlich der Wasserlöslichkeitsgrenze;  
— chemische Kenndaten einschließlich der Reinheit.  
Im Test verwendete Art:  
— Stamm, Lieferant oder Herkunft und Kulturbedingungen.  
Prüfbedingungen:  
— Datum des Testbeginns und Dauer des Tests;  
— Beschreibung des Prüfprotokolls: Prüfgefäße, Kulturvolumina, 
Biomassedichte am Beginn des Tests;  
— Zusammensetzung des Mediums;  
— Testkonzentrationen und Wiederholungen (z. B. Anzahl der Wie ­
derholungen, Anzahl der Testkonzentrationen und verwendete geometrische Progression);
 
— Beschreibung der Herstellung der Testlösungen, einschließlich 
Verwendung von Lösungsmitteln usw.;  
— Kulturapparatur;  
— Lichtintensität und Qualität (Herkunft, Homogenität);  
— Temperatur;  
— getestete Konzentrationen: nominale Testkonzentrationen sowie 
alle Ergebnisse der Analysen zur Bestimmung der Konzentration 
der Prüfsubstanz in den Prüfgefäßen; außerdem sollten die mit 
der Methode erzielte Wiederfindungsrate und die Quantifizie ­
rungsgrenze der Testmatrix angegeben werden;  
— sämtliche Abweichungen von dieser Prüfmethode;  
— Methode zur Bestimmung der Biomasse und Anzeichen für eine 
Korrelation zwischen dem gemessenen Parameter und dem Tro ­
ckengewicht;  
Ergebnisse:  
— pH-Werte am Beginn und am Ende des Tests bei allen Behand ­
lungen;  
— Biomasse der einzelnen Kolben an allen Messpunkten und Me ­
thode zur Messung der Biomasse;  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 824
 
— Wachstumskurven (grafische Darstellung der Biomasse in einem 
bestimmten Zeitraum);  
— berechnete Reaktionsvariablen für alle behandelten Wiederholun ­
gen mit Mittelwerten und dem Variationskoeffizienten für Wie ­
derholungen;  
— grafische Darstellung der Beziehung zwischen Konzentration und 
Wirkung;  
— Schätzungen der Toxizität für die Reaktionsvariablen (z. B. EC  50 , 
EC 10 , EC  20 ) sowie entsprechende Konfidenzintervalle; wenn be ­
rechnet, sind die LOEC und die NOEC sowie die zur jeweiligen 
Berechnung verwendeten statistischen Methoden anzugeben;  
— bei Durchführung von Varianzanalysen (ANOVA) der Umfang 
der nachzuweisenden Auswirkungen (z. B. geringster signifikan ­
ter Unterschied);  
— jegliche in behandelten Proben festgestellte Wachstumssti ­
mulation;  
— alle sonstigen beobachteten Auswirkungen (z. B. morphologische 
Änderungen der Algen);  
— Diskussion der Ergebnisse einschließlich aller Auswirkungen auf 
das Testergebnis, die auf Abweichungen von dieser Prüfmethode zurückzuführen sind.
 
4. LITERATUR  
1. OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test.  
2. ISO 1998: Water quality — Guidance for algal growth inhibition 
tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442.
 
3. OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and 
Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23.  
4. ISO 1998: Water quality — Sampling — Part 16: General Gui ­
dance for Biotesting. ISO 5667-16.  
5. ISO 1993: Water quality — Algal growth inhibition test. ISO 
8692.  
6. Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro 
fluorescence method for biomass measurements in algal growth 
inhibition tests. Water Research 31, S. 2525-2531.  
7. Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. In vivo fluorescence determina ­
tions of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22,5 (1977), S. 919-925.
 
8. Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. 
(2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal bio ­
assay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, S. 2073-2079.  
9. Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. 
Technol. 19, S. 713-718.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 825
 
10. Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. 
Environ. Toxicol. Chem. 11, S. 157-167.  
11. Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11, S. 1485-1494.
 
12. OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
13. Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN.  
14. Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc. 50, S. 1096-1121.  
15. Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with 
a control. Biometrics 20: 482-491.  
16. Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, S. 103-117.  
17. Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, S. 510-531.  
18. Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York.  
19. Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research 29, S. 93-96.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 826
 
Anlage 1  
Stämme, die sich für den Test als geeignet erwiesen haben  
Grünalgen  
— Pseudokirchneriella subcapitata  (früher auch als  Selenastrum capricornutum  
bezeichnet), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG  
— Desmodesmus subspicatus  (früher auch als  Scenedesmus subspicatus  bezeich­
net) 86.81 SAG  
Kieselalgen  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Cyanobakterien  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A  
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Herkunft der Stämme  
Die empfohlenen Stämme sind als artenreine Algenkulturen aus folgenden 
Sammlungen verfügbar (in alphabetischer Reihenfolge):  
ATCC: American Type Culture Collection  
10801 University Boulevard  
Manassas, Virginia 20110-2209  
USA  
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa  
Institute of Freshwater Ecology,  
Windermere Laboratory  
Far Sawrey, Amblerside  
Cumbria  
LA22 0LP  
UK 
SAG: Sammlung Algenkulturen  
Pflanzenphysiologisches Institut  
Universität Göttingen  
Nikolausberger Weg 18  
3400 Göttingen  
DEUTSCHLAND  
UTEX Culture Collection of Algae  
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology  
School of Biological Sciences  
the University of Texas at Austin  
Austin, Texas 78712  
USA ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 827
 
Aussehen und Merkmale der empfohlenen Arten  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Aussehen Gekrümmte 
und gedrehte 
einzelne Zel ­
len Oval, meist 
einzelne Zel ­
len Stäbchen Ketten ovaler 
Zellen Stäbchen 
Größe (L × B) μm 8-14 × 2-3 7-15 × 3-12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Zellvolumen ( μm3/Zelle) 40-60 (  1 ) 60-80 (  1 ) 40-50 (  1 ) 30-40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Zelltrockengewicht (mg/Zelle) 2-3 × 10  –8 3-4 × 10  –8 3-4 × 10  –8 1-2 × 10  –8 2-3 × 10  –9 
Wachstumsrate (  3 ) (Tag  –1 ) 1,5-1,7 1,2-1,5 1,4 1,1-1,4 2,0-2,4  
( 1 ) Gemessen mit einem elektronischen Teilchenzähler. 
( 2 ) Aus der Größe berechnet. 
( 3 ) Am häufigsten beobachtete Wachstumsrate im OECD-Medium bei einer Lichtintensität von ca. 70 μE · m  –2 · s –1 und einer 
Temperatur von 21 °C.  
Spezifische Empfehlungen zur Kultivierung und zur Handhabung der für 
den Test empfohlenen Arten  
Pseudokirchneriella subcapitata  und  Desmodesmus subspicatus  
Diese Grünalgen sind in unterschiedlichen Kulturmedien im Allgemeinen leicht 
zu kultivieren. Informationen zu geeigneten Medien sind von den Stellen zu beziehen, welche die Sammlungen unterhalten. Die Zellen kommen im Allgemei ­
nen einzeln vor; mit einem elektronischen Teilchenzähler oder unter einem Mi ­
kroskop kann die Zelldichte problemlos bestimmt werden.
 
Anabaena flos-aquae  
Für Stammkulturen können verschiedene Nährmedien verwendet werden. Ins ­
besondere muss vermieden werden, dass die Batch-Kultur bei der Erneuerung das Stadium des exponentiellen Wachstums überschreitet; eine Rückgewinnung wäre ansonsten schwierig.
 
Anabaena flos-aquae  bildet Ansammlungen verschachtelter Zellketten. Die Größe 
dieser Ansammlungen kann je nach Kulturbedingungen unterschiedlich sein. Unter Umständen müssen diese Ansammlungen getrennt werden, wenn die Bio ­
masse unter dem Mikroskop bzw. mit einem elektronischen Teilchenzähler be ­
stimmt werden soll.
 
Zum Trennen der Ketten mit dem Ziel, Schwankungen der Zählergebnisse zu 
verringern, können Teilproben einer Ultraschallbehandlung unterzogen werden. 
Eine unnötig lange Ultraschallbehandlung zum Trennen der Ketten in kürzere 
Stücke kann die Zellen zerstören. Intensität und Dauer der Ultraschallbehandlung müssen bei allen Behandlungen identisch sein.
 
Mit dem Hämozytometer sind hinreichend Zellen zu zählen (mindestens 400), 
um auftretende Schwankungen korrigieren zu können und die Zuverlässigkeit der mikroskopischen Dichtebestimmungen zu erhöhen.
 
Zur Bestimmung des Gesamtvolumens der Anabaena-Zellen nach dem Trennen 
der Zellketten durch vorsichtige Ultraschallbehandlung kann ein elektronischer 
Teilchenzähler verwendet werden. Die Ultraschallenergie ist so anzupassen, dass die Zellen nicht beschädigt werden.
 
Mit einem Wirbelmischer oder durch ein ähnliches geeignetes Verfahren ist 
sicherzustellen, dass die zur Impfung der Prüfgefäße verwendete Algensuspen ­
sion gut durchgemischt und homogen beschaffen ist.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 828
 
Die Prüfgefäße sind auf einen Schütteltisch (mit kreisförmiger oder gerader 
Schüttelbewegung) zu bringen, der mit etwa 150 Umdrehungen pro Minute 
bewegt wird. Alternativ kann bei  Anabaena  die Verklumpungstendenz auch 
durch intermittierendes Schütteln verringert werden. Wenn eine Verklumpung auftritt, ist darauf zu achten, dass repräsentative Proben für Messungen der 
Biomasse vorliegen. Unter Umständen müssen die Gefäße vor der Probenahme 
heftig geschüttelt werden, um die Algenklumpen aufzulösen.
 
Synechococcus leopoliensis  
Für Stammkulturen können verschiedene Nährmedien verwendet werden. Infor ­
mationen zu geeigneten Medien sind von den Stellen zu beziehen, welche die 
Sammlungen unterhalten.  
Synechococcus leopoliensis  wächst in einzelnen stäbchenförmigen Zellen. Die 
Zellen sind sehr klein; dies erschwert Messungen der Biomasse durch Zählungen 
unter dem Mikroskop. Elektronische Teilchenzähler, die für die Zählung von 
Teilchen mit einer Größe von bis zu etwa 1 μm ausgelegt sind, können hilfreich 
sein. In-vitro-Fluoreszenzmessungen kommen ebenfalls in Betracht.  
Navicula pelliculosa  
Für Stammkulturen können verschiedene Nährmedien verwendet werden. Infor ­
mationen zu geeigneten Medien sind von den Stellen zu beziehen, welche die Sammlungen unterhalten. Das Medium muss Silikat enthalten.
 
Navicula pelliculosa kann unter bestimmten Wachstumsbedingungen Ansamm ­
lungen bilden. Wegen der Bildung von Lipiden neigen die Algenzellen gelegent ­
lich zur Akkumulierung im Oberflächenfilm. In diesem Fall sind besondere Ver ­
fahrensweisen erforderlich, wenn repräsentative Teilproben zur Bestimmung der Biomasse genommen werden sollen. Unter Umständen ist ein heftiges Schütteln z. B. mit einem Wirbelmischer erforderlich.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 829
 
Anlage 2  
Nährmedien  
Für die Tests kann eines der beiden folgenden Nährmedien verwendet werden:  
OECD-Medium: Originalmedium gemäß OECD TG 201 sowie gemäß ISO 8692  
US. EPA-Medium AAP, auch gemäß ASTM.  
Bei der Herstellung dieser Medien sollten chemische Stoffe in Reagenzien- oder 
Analysequalität und entionisiertes Wasser verwendet werden.  
Zusammensetzung des AAP-Mediums (US. EPA) und des Mediums gemäß OECD TG 201:  
Bestandteil EPA OECD 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 .2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) Das Molverhältnis von EDTA zu Eisen ist geringfügig größer als eins. Daher kann das Eisen nicht ausfällen, 
und die Chelatbildung von Schwermetallionen wird minimiert.  
Im Test mit der Kieselalge Navicula pelliculosa sind beide Medien mit 
Na 2 SiO  3 · 9H  2 0 aufzufüllen, bis eine Konzentration von 1,4 mg Si/l erreicht ist.  
Der pH-Wert des Mediums wird ermittelt, wenn sich das Carbonatsystem des 
Mediums und der Partialdruck des CO  2 in der Umgebungsluft im Gleichgewicht 
befinden. Die ungefähre Beziehung zwischen dem pH-Wert bei 25 °C und der molaren Bicarbonat-Konzentration lässt sich mit folgender Formel berechnen:
 
PH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 830
 
Bei 15 mg NaHCO  3 pH eq = 7,5 (U.S. EPA-Medium) und 50 mg NaHCO  3 /l, 
pH eq = 8,1 (OECD-Medium).  
Stoffliche Zusammensetzung des Prüfmediums  
Element EPA OECD 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Herstellung des OECD-Mediums  
Nährstoff Konzentration in der Stammlösung 
Stammlösung 1: Makronährstoffe  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Stammlösung 2: Eisen  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
Stammlösung 3: Spurenelemente  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Stammlösung 4: Bicarbonat  
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 
Die Stammlösungen sind durch Membranfiltration (mittlerer Porendurchmesser 
0,2 μm) oder durch Autoklavieren (120 °C, 15 min) zu sterilisieren. Anschlie ­
ßend werden die Lösungen bei einer Temperatur von 4 °C dunkel gelagert.  
Die Stammlösungen 2 und 4 dürfen nicht autoklaviert werden, sondern sind 
durch Membranfiltration zu sterilisieren.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 831
 
Zum Herstellen des Nährmediums wird eine geeignete Menge der Stammlösun ­
gen 1-4 wie folgt zu Wasser hinzugegeben:  
Zu 500 ml sterilisiertem Wasser werden folgende Mengen hinzugegeben:  
— 10 ml Stammlösung 1  
— 1 ml Stammlösung 2  
— 1 ml Stammlösung 3  
— 1 ml Stammlösung 4  
Anschließend wird sterilisiertes Wasser bis zu einem Volumen von 1 000 ml 
hinzugegeben.  
Danach muss hinreichend Zeit zur Herstellung eines Gleichgewichts zwischen 
dem Medium und dem CO  2 -Gehalt der Umgebungsluft belassen werden; wenn 
erforderlich, ist das Nährmedium einige Stunden mit steriler gefilterter Luft zu 
sprudeln.  
Herstellung des AAP-Mediums  
A1.1. Von den Stammlösungen aus A1.2.1–A1.2.7 ist jeweils 1 ml zu etwa 
900 ml entionisiertem oder destilliertem Wasser hinzuzugeben; an ­
schließend wird die Flüssigkeit bis zu einem Volumen von 1 l auf ­
gefüllt.  
A1.2. Stammlösungen mit Makronährstoffen werden hergestellt, indem die 
folgenden Stoffmengen jeweils zu 500 ml entionisiertem oder destil ­
liertem Wasser hinzugegeben werden. Die Reagenzien A1.2.1, A1.2.2, 
A1.2.3 und A1.2.4 können zu einer einzigen Stammlösung kombiniert 
werden.  
A1.2.1.  NaNO  3 — 12,750 g.  
A1.2.2.  MgCL  2 · 6H 2 O — 6,082 g.  
A1.2.3.  CaCl  2 · 2H 2 O — 2,205 g.  
A1.2.4.  Micronutrient Stock Solution  — (siehe A1.3).  
A1.2.5.  MgSO  4 ·7H  2 O — 7,350 g.  
A1.2.6.  K  2 HPO  4 — 0,522 g.  
A1.2.7.  NaHCO  3 — 7,500 g.  
A1.2.8.  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O — Siehe Hinweis A1.1.  
Hinweis A1.1 : Ausschließlich für im Test eingesetzte Kieselalgen-Arten 
zu verwenden; kann unmittelbar (202,4 mg) hinzugegeben oder mittel ­
bar durch Auffüllen mit einer Stammlösung bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 20 mg/l Si im Medium hinzugegeben werden.
 
A1.3. Die Mikronährstoff-Lösung wird hergestellt, indem folgende Mengen 
in 500 ml entionisiertem oder destilliertem Wasser aufgelöst werden:  
A1.3.1.  H  3 BO 3 — 92,760 mg.  
A1.3.2.  MnCl  2 ·4H  2 O — 207,690 mg.  
A1.3.3.  ZnCl  2 — 1,635 mg.  
A1.3.4.  FeCl  3 ·6H  2 O — 79,880 mg.  
A1.3.5.  CoCl  2 ·6H  2 O — 0,714 mg.  
A1.3.6.  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O — 3,630 mg.  
A1.3.7.  CuCl  2 ·2H  2 O — 0,006 mg.  
A1.3.8.  Na  2 EDTA·2H  2 O — 150,000 mg.  
[Dinatrium(ethylendinitril)tetraacetat]  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 832
 
A1.3.9.  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O — 0,005 mg Siehe Hinweis A1.2.  
Hinweis A1.2 : Darf ausschließlich im Medium für Stammkulturen mit 
Kieselalgen-Arten verwendet werden.  
A1.4. Der pH-Wert ist auf 7,5 ± 0,1 einzustellen (mit 0,1 N oder 1,0 N 
NaOH oder HCl).  
A1.5. Wenn ein Teilchenzähler verwendet werden soll, wird das Medium 
durch einen 0,22- μm-Membranfilter in ein steriles Gefäß gefiltert; an ­
sonsten erfolgt die Filtration in ein steriles Gefäß durch einen 0,45- μm- 
Filter.  
A1.6. Das Medium ist bis zur Verwendung bei einer Temperatur von etwa 
4 °C dunkel zu lagern.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 833
 
Anlage 3  
Beispiel eines Verfahrens zur Kultivierung der Algen  
Allgemeine Bemerkungen  
Durch die Kultivierung nach dem folgenden Verfahren sollen Algenkulturen für 
Toxizitätsprüfungen hergestellt werden.  
Um sicherzustellen, dass die Algenkulturen nicht mit Bakterien verunreinigt sind, 
sind geeignete Methoden zu verwenden. Wenngleich u. U. axenische Kulturen 
erwünscht sein mögen, sind doch Algenkulturen mit einer einzigen Alge herzu ­
stellen und zu verwenden.  
Sämtliche Schritte sind unter sterilen Bedingungen auszuführen, um Verunrei ­
nigungen mit Bakterien und anderen Algen zu vermeiden.  
Ausrüstung und Materialien  
Siehe Prüfmethode: Apparatur.  
Verfahren zur Herstellung von Algenkulturen  
Herstellung der Nährlösungen (Medien)  
Alle Nährsalze des Mediums werden als konzentrierte Stammlösungen hergestellt 
und dunkel und kühl gelagert. Diese Lösungen werden durch Filtration oder durch Autoklavieren hergestellt.
 
Das Medium wird durch Zugabe der jeweils erforderlichen Menge der Stamm ­
lösung zu sterilem destilliertem Wasser hergestellt; dabei ist darauf zu achten, 
dass keine Verunreinigungen entstehen können. Bei festen Medien ist 0,8 % Agar hinzuzugeben.
 
Stammkultur  
Die Stammkulturen bestehen aus kleinen Algenkulturen, die regelmäßig in fri ­
sche Medien übertragen werden und als Ausgangs-Prüfmaterial fungieren. Wenn die Kulturen nicht regelmäßig verwendet werden, sind die Kulturen auf Agar ­
röhrchen (Slopes) abzustreichen. Diese werden anschließend mindestens einmal 
alle zwei Monate in frische Medien gebracht.
 
Die Stammkulturen werden in konischen Kolben mit dem jeweils geeigneten 
Medium kultiviert (Volumen etwa 100 ml). Wenn die Algen bei 20 °C unter ständiger Beleuchtung inkubiert werden, ist eine wöchentliche Überimpfung er ­
forderlich.
 
Dabei ist von der „alten“ Kultur mit sterilen Pipetten so viel in einen Kolben mit 
frischem Medium zu geben, dass bei schnell wachsenden Arten die Ausgangs ­
konzentration etwa 100 mal geringer ist als die Konzentration der alten Kultur.  
Die Wachstumsrate einer Art kann anhand der Wachstumskurve bestimmt wer ­
den. Wenn diese bekannt ist, kann die Dichte geschätzt werden, bei der die 
Kultur in das neue Medium gegeben werden sollte. Die Dichteschätzung muss 
erfolgen, bevor die betreffende Kultur in die Absterbephase gelangt.  
Vorkultur  
Mit der Vorkultur sollen Algen zur Impfung der Prüfkulturen hergestellt werden. 
Die Vorkultur wird unter den Prüfbedingungen inkubiert und noch während der 
Phase des exponentiellen Wachstums verwendet (in der Regel nach einer Inku ­
bationsdauer von 2 bis 4 Tagen). Algenkulturen mit deformierten oder anomalen Zellen sind zu verwerfen.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 834
 
Anlage 4  
Datenanalyse durch nicht-lineare Regression  
Allgemeine Bemerkungen  
In den Algentests und in sonstigen Tests zur Ermittlung des mikrobiologischen 
Wachstums — des Wachstums einer Biomasse — stellt die Reaktion naturgemäß 
eine kontinuierliche oder metrische Variable dar: eine Prozessrate, wenn von 
einer Wachstumsrate ausgegangen wird, und ein zeitbezogenes Integral, wenn die Biomasse zugrunde gelegt wird. Beide Parameter werden auf die entspre ­
chende mittlere Reaktion von zur Wiederholung verwendeten nicht behandelten 
Kontrollproben bezogen, die am stärksten auf die jeweils gegebenen Bedingun ­
gen reagieren; bei Algentests sind Licht und Temperatur die Hauptfaktoren. Das System kann verteilt oder homogen sein, und die Biomasse kann als kontinuier ­
licher Parameter betrachtet werden; einzelne Zellen brauchen nicht berücksichtigt 
zu werden. Die Varianzverteilung des Reaktionstyps dieser Systeme hängt aus ­
schließlich von den Versuchsbedingungen ab (die in der Regel durch logarith ­
misch-normale oder normale Fehlerverteilungen gekennzeichnet sind). In dieser Hinsicht besteht ein Unterschied gegenüber typischen Reaktionen in Bioassays 
mit quantitativen Daten, bei denen die Toleranz (typischerweise mit binomischer 
Verteilung) der einzelnen Organismen häufig als maßgebliche Varianzkom ­
ponente betrachtet wird. Die Kontrollreaktionen liegen hier bei Null oder im Bereich des Hintergrundwerts.
 
Im einfachsten Fall nimmt die normalisierte oder relative Reaktion r gleichmäßig 
von 1 (Hemmung Null) bis 0 (vollständige Hemmung) ab. Sämtliche Reaktionen sind mit einem Fehler verbunden, und offensichtlich negative Hemmungen kön ­
nen rechnerisch ausschließlich das Ergebnis zufälliger Fehler sein.
 
Regressionsanalyse  
Modelle  
Durch eine Regressionsanalyse soll die Konzentrations-Reaktionskurve als ma ­
thematische Regressionsfunktion Y = f (C) bzw. häufiger als F (Z) beschrieben 
werden; dabei ist Z = log C. Umgekehrt ermöglicht C = f  –1 (Y) die Berechnung 
von EC  x -Werten einschließlich EC  50 , EC  10 und EC  20 sowie der jeweiligen 95- 
%-Konfidenzintervalle. Verschiedene einfache mathematische Funktionen haben 
sich als geeignet zur Beschreibung von Konzentrations-Reaktionsbeziehungen in 
Tests zur Ermittlung der Hemmung des Algenwachstums erwiesen. Zu diesen Formeln zählen die logistische Gleichung, die nicht symmetrische Weibull-Ver ­
teilung und die logarithmische Normalverteilung als Sigma-Kurven, bei denen 
sich jeweils ein asymptotischer Verlauf gegen eins bei C → 0 bzw. gegen Null 
bei C → unendlich ergibt.
 
Der Einsatz kontinuierlicher Schwellenwert-Funktionsmodelle (z. B. des Koo ­
ijman-Modells der „Hemmung des Populationswachstums“ (Kooijman u. a. 
1996) wurde kürzlich als Alternative zu asymptotischen Modellen vorgeschlagen. Dieses Modell geht davon aus, dass bei Konzentrationen unter einem bestimmten Schwellenwert EC0+ keine Auswirkungen mehr gegeben sind; dieser Schwellen ­
wert wird mit Hilfe einer einfachen kontinuierlichen Funktion mit undifferenzier ­
tem Ausgangspunkt durch Extrapolation der Reaktions-Konzentrationsbeziehung so geschätzt, dass die Konzentrationsachse geschnitten wird.
 
Die Analyse kann in einer einfachen Minimierung der Restquadratsummen (bei 
Annahme einer konstanten Varianz) oder der gewichteten Quadrate (bei Aus ­
gleich einer Varianzheterogenität) bestehen.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 835
 
Verfahren  
Das Verfahren kann wie folgt beschrieben werden: Eine geeignete Funktions ­
gleichung Y = f (C) wird gewählt und durch nicht-lineare Regression an die Daten angepasst. Vorzugsweise sind die Messungen der einzelnen Kolben und nicht die Mittelwerte der Wiederholungen zu verwenden, um möglichst viele 
Informationen aus den Daten zu gewinnen. Bei einer hohen Varianz haben prak ­
tische Erfahrungen hingegen gezeigt, dass die Mittelwerte der Wiederholungen eine sicherere mathematische Schätzung ermöglichen, die weniger von systema ­
tischen Fehlern bei den Daten als von den einzelnen ermittelten Datenpunkten 
abhängt.
 
Die angepasste Kurve und die gemessenen Daten werden grafisch dargestellt; 
anschließend ist zu prüfen, ob die Kurve in angemessener Weise angepasst wurde. Eine Analyse der Restwerte könnte für diesen Zweck besonders hilf ­
reich sein. Wenn die gewählte Funktionsbeziehung zur Anpassung der Kon ­
zentrations-Reaktionskurve die Kurve nicht vollständig beschreibt oder einen 
wesentlichen Teil der Kurve wie z. B. die Reaktion bei niedrigen Konzen ­
trationen nicht gut beschreibt, ist eine andere Option zur Kurvenanpassung zu wählen (z. B. eine nicht symmetrische Kurve wie etwa die Weibull-Funktion 
anstelle einer symmetrischen Kurve). Negative Hemmungen können z. B. in 
Verbindung mit der logarithmischen Normalverteilung problematisch sein und ebenfalls den Einsatz einer alternativen Regressionsfunktion erfordern. Es wird nicht empfohlen, diesen negativen Werten einen Wert von Null oder einen 
kleinen positiven Wert zuzuweisen, weil ansonsten die Fehlerverteilung beein ­
trächtigt werden könnte. Angemessen sind unter Umständen getrennte Kurven ­
anpassungen für bestimmte Bereiche der Kurve (z. B. für den Bereich mit der niedrigen Hemmung, wenn EC
 low x  -Werte geschätzt werden sollen). Aus der 
angepassten Formel sind (mit der Umkehrfunktion C = f  –1 (Y)) charakteristi ­
sche Schätzwerte für EC  x zu ermitteln und mindestens für EC  50 sowie für 
einen oder zwei Werte von EC  low x zu protokollieren. Praktische Erfahrungen 
haben gezeigt, dass die Genauigkeit der Algentests im Allgemeinen eine an ­
gemessen exakte Schätzung der Konzentration bei einer Hemmung von etwa 
10 % ermöglicht, wenn hinreichende Datenpunkte verfügbar sind (sofern nicht eine Unregelmäßigkeit in Form einer Stimulation auch bei niedrigen Konzen ­
trationen gegeben ist). Die Genauigkeit einer EC
 20 -Schätzung ist häufig be ­
trächtlich größer als die Genauigkeit geschätzter EC  10 -Werte, weil die EC  20 - 
Werte gewöhnlich im annähernd linearen Bereich der zentralen Konzentrations- Reaktionskurve vorgenommen werden. Gelegentlich ist die Beurteilung von 
EC
 10 -Werten wegen der Wachstumsstimulation problematisch. Werte für 
EC 10 sind also im Allgemeinen mit hinreichender Genauigkeit zu erhalten; 
in jedem Fall empfiehlt sich jedoch, auch die EC  20 -Werte zu erfassen.  
Gewichtungsfaktoren  
Die Versuchsvarianz ist nicht grundsätzlich konstant und beinhaltet typischer ­
weise eine proportionale Komponente; daher wird vorzugsweise regelmäßig auch eine gewichtete Regression vorgenommen. Die Gewichtungsfaktoren für diese Analysen werden im Allgemeinen als umgekehrt proportional zur Varianz 
angenommen:
 
W i = 1/Var(r  i ) 
Viele Regressionsprogramme beinhalten die Option zur Durchführung gewichte ­
ter Regressionsanalysen mit Gewichtungsfaktoren, die aus einer Tabelle aus ­
gewählt werden können. Die Normalisierung der Gewichtungsfaktoren kann auf bequeme Weise erfolgen, indem die Gewichtungsfaktoren so mit n/ ∑ w
 i 
(n = Anzahl der Datenpunkte) multipliziert werden, dass sich die Summe 
1 ergibt.  
Normalisierung der Reaktionen  
Die Normalisierung durch die mittlere Kontrollreaktion bringt einige grundsätz ­
liche Probleme mit sich und bedingt eine eher komplizierte Varianzstruktur. Mit 
der Division der Reaktionen durch die mittlere Kontrollreaktion zur Ermittlung der prozentualen Hemmung wird ein weiterer Fehler eingeführt, der auf den in den Mittelwerten der Kontrollen enthaltenen Fehler zurückzuführen ist. Wenn 
dieser Fehler nicht vernachlässigbar gering ist, sind Gewichtungsfaktoren in Ver ­
bindung mit der Regression und mit den Konfidenzintervallen bezogen auf die Kovarianz der Kontrollen zu korrigieren (17). Eine hohe Genauigkeit der ge ­
schätzten Mittelwerte der Kontrollreaktionen ist wichtig, um die Gesamtvarianz 
der relativen Reaktion zu minimieren. Diese Varianz lässt sich wie folgt 
beschreiben.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 836
 
(Dabei steht das tiefgestellte i für die Konzentration i und die tiefgestellte 0 für 
die Kontrollen.)  
Y i = relative Reaktion = r  i /r 0 = 1 – I = f (C  i ) 
bei gegebener Varianz:  
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) (∂Y i /∂ r i ) 2 · Var(r  i ) + (∂ Y i /∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ) 
entsprechend gilt  
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 und (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
bei normal verteilten Daten und m  i und m  0 Wiederholungen:  
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
für die Gesamtvarianz der relativen Reaktion Y  i gilt somit:  
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
Der Fehler im Mittelwert der Kontrollen ist umgekehrt proportional zur Qua ­
dratwurzel der Anzahl der durchschnittlichen Kontrollwiederholungen; gelegent ­
lich ist die Einbeziehung historischer Daten gerechtfertigt, um den Fehler auf diese Weise erheblich zu reduzieren. Ein alternatives Verfahren besteht darin, die Daten nicht zu normalisieren und die absoluten Reaktionen einschließlich der 
Daten der Kontrollreaktionen nicht anzupassen, sondern den Kontroll-Reaktions ­
wert als zusätzlichen Parameter einzuführen, der durch nicht-lineare Regression anzupassen ist. In Verbindung mit einer normalen Regressionsgleichung mit zwei Parametern erfordert diese Methode die Anpassung von drei Parametern; daher 
sind mehr Datenpunkte erforderlich als bei der nicht-linearen Regression von 
Daten, die mit einer vordefinierten Kontrollreaktion normalisiert werden.
 
Umkehrung der Konfidenzintervalle  
Die Berechnung nicht-linearer Konfidenzintervalle durch Schätzung mit der Um ­
kehrfunktion gestaltet sich eher komplex und ist in den üblichen statistischen 
Computer-Programmen als reguläre Option nicht enthalten. Ungefähre Kon ­
fidenzintervalle können mit Standardprogrammen zur Berechnung nicht-linearer Regressionen durch Neu-Parametrisierung ermittelt werden (Bruce und Versteeg, 
1992); dabei wird die mathematische Formel mit den angestrebten Punktschät ­
zungen (z. B. EC
 10 und EC  50 ) als zu schätzenden Parametern neu entwickelt. 
Vorausgesetzt wird I = f ( α, β, Konzentration. Die Definitionsbeziehungen f 
(α, β, EC  10 ) = 0,1 und f ( α, β, EC  50 ) = 0,5 werden verwendet, um f ( α, β, 
Konzentration) durch eine äquivalente Funktion g (EC  10 , EC  50 , Konzentration) 
zu ersetzen.  
Für eine direktere Berechnung (Andersen u. a. 1998) kann die ursprüngliche 
Formel verwendet und eine Taylor-Expansion um die Mittelwerte für r  i und r  0 
angenommen werden.  
In letzter Zeit werden zunehmend auch Methoden mit Bootstrapping-Algorithmen 
verwendet. Diese Methoden beruhen auf Schätzungen einer empirischen Varianz ­
verteilung ausgehend von den gemessenen Daten und von häufigen Stichproben unter Einsatz eines Zufalls-Nummerngenerators.
 
Literatur  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. Water Research 30, S. 1625-1632.  
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem. 11, S. 1485-1494.  
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics 3, S. 405-420.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 837
 
C.4. BIOLOGISCHE ABBAUBARKEIT — BESTIMMUNG DER 
„LEICHTEN“ BIOLOGISCHEN ABBAUBARKEIT  
TEIL I.  ALLGEMEINES  
I.1. EINLEITUNG  
Es werden sechs Prüfverfahren als „Screening“-Untersuchungen zur 
leichten biologischen Abbaubarkeit von chemischen Substanzen in einem aeroben wässrigen Medium beschrieben:
 
a) DOC-Die-Away-Test — Abnahme von gelöstem organischem 
Kohlenstoff (DOC) (  1 ) (Methode C.4-A);  
b) modifizierter OECD-Screening-Test — Abnahme von gelöstem 
organischem Kohlenstoff (Methode C.4-B);  
c) CO  2 -Entwicklungstest (modifizierter Sturm-Test) (Methode C.4-C);  
d) manometrischer Respirationstest (Methode C.4-D);  
e) geschlossener Flaschentest (Methode C.4-E);  
f) MITI-Test (Ministry of International Trade and Industry — Ja ­
pan) (Methode C.4-F).  
Teil I der Methode enthält allgemeine Überlegungen sowie Anmer ­
kungen, die für alle sechs Prüfverfahren gelten. Spezielle Ausführun ­
gen zu den einzelnen Prüfverfahren werden in den Teilen II bis VII 
gemacht. Die Anlagen enthalten Definitionen, Formeln und Über ­
sichtsmaterial.  
Ein im Jahr 1988 im Bereich der OECD-Länder durchgeführter 
Ring-Test hat ergeben, dass mit den Prüfverfahren übereinstimmende 
Ergebnisse erzielt werden. Dennoch wird im Einzelfall, je nach den physikalischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, das eine oder das andere Verfahren vorzuziehen sein.
 
I.2. AUSWAHL DES GEEIGNETEN VERFAHRENS  
Um das geeignetste Verfahren auszuwählen, sind Angaben über die 
Löslichkeit, den Dampfdruck und die Adsorption der chemischen 
Substanz erforderlich. Zur Berechnung der theoretischen Werte und/ 
oder zur Kontrolle der gemessenen Parameter (z. B. ThSB, ThCO  2 , 
DOC, TOC, CSB — siehe Anlagen 1 und 2) müssen chemische Struktur oder Formel bekannt sein.
 
Prüfsubstanzen, die mindestens 100 mg/l wasserlöslich sind, können 
mit jedem beliebigen der genannten Verfahren geprüft werden, so ­
fern sie nicht flüchtig und nicht adsorbierend sind. Geeignete Ver ­
fahren für schwer wasserlösliche, flüchtige oder adsorbierende che ­
mische Substanzen sind in Tabelle 1 angegeben. Der Umgang mit schwer wasserlöslichen und flüchtigen Substanzen ist in Anlage 3 
beschrieben. Mäßig flüchtige Substanzen lassen sich nach dem DOC- 
Die-Away-Test prüfen, wenn die Prüfgefäße (die mit einem geeig ­
neten Stopfen verschlossen sein müssen) über ausreichenden Gas ­
raum verfügen. In diesem Fall ist hier eine abiotische Kontrolle 
vorzusehen, um mögliche physikalische Verluste zu berücksichtigen.
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( 1 ) DOC = dissolved organic carbon.
 Tabelle 1  
Anwendbarkeit der Prüfverfahren  
Verfahren Analysenmethode Eignung für folgende Substanzen: 
löslich flüchtig adsorbierend  
DOC-Die-Away-Test Gelöster organischer Kohl ­
stoff — — +/– 
Modifizierter OECD-Scree ­
ning-Test Gelöster organischer Kohl ­
stoff — — +/– 
CO 2 -Entwicklungstest Respirationstest: CO  2 -Ent­
wicklung + — + 
Manometrischer Respirati ­
onstest Manometrische Messung: 
Sauerstoffverbrauch + +/– + 
Geschlossener Flaschentest Respirationstest: Sauerstoff ­
verbrauch +/– + + 
MITI-Test Respirationstest: Sauerstoff ­
verbrauch + +/– +  
Zur Interpretation der erzielten Ergebnisse sind Angaben zur Rein ­
heit oder zu den relativen Anteilen der Hauptbestandteile der Prüf ­
substanz erforderlich, insbesondere wenn es sich um niedrige oder 
marginale Werte handelt.  
Angaben zur Bakterientoxizität der Prüfsubstanz (Anlage 4) können 
bei der Wahl geeigneter Prüfkonzentrationen zweckdienlich und bei 
der richtigen Interpretation geringer biologischer Abbauwerte wichtig 
sein. 
I.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Zur Überprüfung des Verfahrens werden Referenzsubstanzen getes ­
tet, die die Kriterien für eine leichte biologische Abbaubarkeit erfül ­
len; dazu wird ein geeignetes Prüfgefäß parallel zur normalen Prü ­
freihe mitgeführt.  
Geeignete Chemikalien sind Anilin (frisch destilliert), Natriumacetat 
und Natriumbenzoat. Diese Referenzsubstanzen werden bei diesen Verfahren durchweg abgebaut, auch wenn kein Inokulum hinzuge ­
fügt wird.
 
Es ist vorgeschlagen worden, dass eine Referenzsubstanz gesucht 
werden sollte, die biologisch leicht abgebaut wird, aber die Zugabe 
eines Inokulums erfordert. Als eine solche Substanz wurde Kalium ­
hydrogenphthalat vorgeschlagen, doch steht ein entsprechender Nachweis noch aus, bevor es als Referenzsubstanz akzeptiert werden 
kann.
 
Bei den Respirationstests können stickstoffhaltige Verbindungen die 
Sauerstoffaufnahme infolge Nitrifikation beeinflussen (siehe Anlagen 
2 und 5).  
I.4. PRINZIP DER METHODE  
Eine Lösung oder Suspension der Prüfsubstanz in einem minerali ­
schen Medium wird unter aeroben Bedingungen im Dunkeln oder 
bei diffuser Beleuchtung angeimpft und bebrütet. Die DOC-Menge in der Prüflösung, die aus dem Inokulum stammt, muss im Vergleich zu der DOC-Menge aus der Prüfsubstanz so gering wie möglich sein. 
Die endogene Aktivität des Inokulums wird durch Mitfuhren paral ­
leler Blindproben mit Inokulum aber ohne Prüfsubstanz in der Lö ­
sung berücksichtigt, obwohl die endogene Aktivität der Zellen in Gegenwart der Substanz nicht genau dieselbe sein wird wie in der 
endogenen Kontrolle. Eine Referenzsubstanz wird parallel dazu ein ­
gesetzt, um den Verlauf der Vorgänge zu kontrollieren.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 839
 
Im Allgemeinen wird der Abbau durch Bestimmung von Parametern 
(z. B. DOC-Abnahme, CO  2 -Erzeugung und Sauerstoffaufnahme) er ­
mittelt; entsprechende Messungen werden in ausreichenden Abstän ­
den vorgenommen, um Beginn und Ende des Bioabbaus zu identi ­
fizieren. Automatische Respirometer gestatten eine fortlaufende Mes ­
sung. Mitunter wird der DOC-Wert zusätzlich zu einem weiteren 
Parameter gemessen, im Allgemeinen aber nur zu Beginn und am Ende des Tests. Zur Beurteilung des Primärabbaus der Prüfsubstanz und zur Bestimmung der Konzentration eventueller Abbauprodukte 
können auch spezifische Analysen durchgeführt werden. (Beim MI ­
TI-Test sind diese obligatorisch).
 
Normalerweise beträgt die Testdauer 28 Tage. Die Tests können 
jedoch auch vorzeitig abgebrochen werden, wenn die biologische Abbaukurve über mindestens drei Messungen ein Plateau erreicht 
hat. Eine Verlängerung der Tests über 28 Tage hinaus ist ebenfalls 
möglich, wenn aus der Kurve zu ersehen ist, dass der biologische Abbau eingesetzt hat, das Plateau aber am 28. Tag noch nicht er ­
reicht ist.
 
I.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
I.5.1.  Reproduzierbarkeit  
Wegen der Spezifität des biologischen Abbaus und der als Inokula 
verwendeten Bakterienmischpopulationen sind die Messungen min ­
destens in doppelten Ansätzen durchzuführen.  
Es ist allgemein bekannt, dass die Unterschiede zwischen Doppel ­
messungen umso kleiner sind, je größer die Konzentration der dem Prüfmedium anfänglich hinzugefügten Mikroorganismen war. Ring ­
tests haben auch gezeigt, dass zwischen den in verschiedenen Prü ­
feinrichtungen erzielten Ergebnissen große Unterschiede bestehen können, doch wird normalerweise eine gute Übereinstimmung er ­
reicht, wenn biologisch leicht abbaubare Substanzen verwendet 
werden.
 
I.5.2.  Gültigkeit des Versuchs  
Ein Versuch wird dann als gültig angesehen, wenn die Extremwerte 
der Wiederholungsmessungen für die Abnahme der Prüfsubstanz nicht mehr als 20 % voneinander abweichen, am Plateau, Testende oder am Ende des 10-Tage-Fensters, und wenn der prozentuale Ab ­
bau der Referenzsubstanz das Plateau für leichte biologische Abbau ­
barkeit innerhalb von 14 Tagen erreicht hat. Ist eine der beiden Bedingungen nicht erfüllt, sollte der Versuch wiederholt werden. Auf Grund der Stringenz der Methoden bedeuten niedrige Ergebnisse 
nicht unbedingt, dass die Prüfsubstanz unter Umweltbedingungen 
biologisch nicht abbaubar ist, sondern zeigt nur, dass weitere Unter ­
suchungen erforderlich sind, um einen biologischen Abbau nach ­
zuweisen.
 
Wenn in einem Toxizitätstest mit Prüf- und Referenzsubstanz inner ­
halb von 14 Tagen weniger als 35 % Abbau (auf DOC-Basis) bzw. 
weniger als 25 % (auf der Basis des ThSB oder ThCO  2 ) erzielt 
wurde, kann von einer Hemmwirkung der Prüfsubstanz ausgegangen werden (vgl. auch Anlage 4). Die Versuchsreihe sollte in diesem Fall 
wiederholt werden, wenn möglich unter Verwendung einer geringe ­
ren Konzentration der Prüfsubstanz und/oder einer höheren Konzen ­
tration des Inokulums, jedoch nicht mehr als 30 mg Feststoffe pro Liter.
 
I.6. ALLGEMEINE VERFAHREN UND VORBEREITUNGEN  
Die allgemeinen Prüfbedingungen sind in Tabelle 2 zusammenge ­
fasst. Geräte und weitere Versuchsbedingungen speziell zu den Ein ­
zeltests werden gesondert in den entsprechenden Kapiteln zu den 
einzelnen Prüfverfahren angegeben.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 840
 
Tabelle 2  
Prüfbedingungen  
Prüfverfahren DOC-Die- 
Away-Test CO 2 Entwick­
lungstest Manometr. Re ­
spirationstest Mod. OECD- 
Screening-Test Geschlossener 
Flaschentest MITI-(I)-Test  
in mg/l 100 2-10 100 
mg DOC/l 10-40 10-20 10-40 
ThSB/l 50-100 5-10 
Konzentration 
des Inoku ­
lums (in Zel ­
len/l, unge ­
fährer Wert) höchstens 30 mg/l SF 
oder höchstens 100 ml Kläranlagenablauf 
pro 1 
(10 7 -10 8 ) 0,5 ml Klär ­
anlagenab ­
lauf pro 1 
(10 5 ) bis zu 5 ml 
Kläranlagen ­
ablauf pro 1 
(10 4 -10 6 ) 30 mg/l SF 
(10 7 -10 8 ) 
Konzentration 
der Elemente im mineral. Medium (in 
mg/l): 
P 116 11,6 29 N 1,3 0,13 1,3 Na 86 8,6 17,2 K 122 12,2 36,5 Mg 2,2 2,2 6,6 Ca 9,9 9,9 29,7 Fe 0,05 - 0,1 0,05 - 0,1 0,15 
pH 7,4 ± 0,2 nach Mög ­
lichkeit 7,0 
Temperatur 22 ± 2
 o C 25 ± 1  o C 
DOC = gelöster organischer Kohlenstoff 
(Dissolved Organic Carbon). ThSB = Theoretischer 
Sauerstoffbedarf. SF = suspendierte Fest ­
stoffe.  
I.6.1.  Verdünnungswasser  
Deionisiertes oder destilliertes Wasser, frei von toxischen Substanzen 
(z. B. Cu  ++ -Ionen) in hemmenden Konzentrationen, wird verwendet. 
Es darf nicht mehr als 10 % des von der Prüfsubstanz eingebrachten organischen Kohlenstoffs enthalten. Die hohe Reinheit des Prüfwas ­
sers ist zur Vermeidung hoher Blindwerte erforderlich. Eine Kon ­
tamination kann sich aus inhärenten Verunreinigungen sowie aus 
dem Ionenaustauscherharz und Materialien aus Bakterien und Algen ergeben. Für jede Versuchsreihe ist nur eine Charge Wasser zu ver ­
wenden, die vorher durch DOC-Analyse zu prüfen ist. Diese Prüfung 
ist nicht nötig im Closed-Bottle-Test, aber der Sauerstoffverbrauch des Wassers muss gering sein.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 841
 
I.6.2.  Stammlösungen von mineralischen Bestandteilen  
Zur Herstellung der Prüflösungen werden Stammlösungen mit geeig ­
neten Konzentrationen an mineralischen Bestandteilen angesetzt. Für den DOC-Die-Away-Test, den modifizierten OECD-Screening-Test, 
den CO
 2 -Enwicklungstest, den manometrischen Respirationstest und 
den geschlossenen Flaschentest können folgende Stammlösungen (mit unterschiedlichen Verdünnungsfaktoren) verwendet werden.
 
Die Verdünnungsfaktoren und — beim MITI-Test — die spezielle 
Vorbereitung des mineralischen Mediums werden jeweils in den ent ­
sprechenden Kapiteln zu den einzelnen Versuchen angegeben.  
Stammlösungen:  
Die folgenden Stammlösungen sind unter Verwendung von Reagen ­
zien des Reinheitsgrades „zur Analyse“ (p. a.) anzusetzen: 
a) Kaliumdihydrogenorthophosphat, KH  2 PO 4 8,50 g 
Dikaliummonohydrogenorthophosphat, K  2 HPO  4 21,75 g 
Dinatriummonohydrogenorthophosphat-Dihydrat, 
Na 2 HPO  4 ·2H 2 O 33,40 g 
Ammoniumchlorid, NH  4 Cl 0,50 g 
in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefüllt; der pH- 
Wert der Lösung sollte 7,4 betragen. 
b) Calciumchlorid, wasserfrei, CaCl  2 27,50 g 
oder Calciumchlorid-Dihydrat, CaCl  2 ·2H 2 O 36,40 g 
in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefüllt 
c) Magnesiumsulfat-Heptahydrat, MgSO  4 ·7H 2 O 22,50 g 
in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefüllt 
d) Eisen(III)chlorid-Hexahydrat, FeCl  3 ·6H 2 O 0,25 g 
in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefüllt  
Anmerkung : Damit diese Lösung nicht unmittelbar vor Gebrauch 
zubereitet werden muss, ist 1 Tropfen konzentriertes HCl oder 
0,4 g Dinatriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pro Liter zuzufügen.
 
I.6.3.  Stammlösungen der Chemikalien  
Liegt die Löslichkeit über 1 g/l, sind je nach Notwendigkeit 1-10 g 
der Prüf- oder Referenzsubstanz in deionisiertem Wasser zu lösen 
und auf 1 l aufzufüllen. Ansonsten sind die Stammlösungen im 
mineralischen Medium anzusetzen, oder die Prüfsubstanz wird direkt dem mineralischen Medium zugegeben. Die Vorgehensweise für schwerlösliche Substanzen ist in Anlage 3 angegeben; beim MITI- 
Test (Methode C.4-F) jedoch sind weder Lösungsmittel noch Emul ­
gatoren zu verwenden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 842
 
I.6.4.  Inokula  
Das Inokulum kann aus verschiedenen Quellen gewonnen werden: 
aus Belebtschlamm, aus Kläranlagenablauf (nicht chloriert), aus Oberflächenwasser, aus Böden oder aus mehreren dieser Quellen 
zugleich. Bei den Methoden DOC-Die-Away-Test, CO
 2 -Entwick­
lungstest oder manometrischer Respirationstest, sollte der Belebt ­
schlamm, falls dieser verwendet wird, einer Klärgroß- oder -labor ­
anlage entstammen, die hauptsächlich häusliche Abwässer reinigt. 
Bei Inokula aus anderen Quellen sind stärker streuende Ergebnisse 
festgestellt worden. Beim modifizierten OECD-Screening-Test und beim geschlossenen Flaschentest ist ein stärker verdünntes Inokulum 
ohne Schlammflocken erforderlich, vorzugsweise aus dem Ablauf 
einer kommunalen Kläranlage oder einer Laboranlage für häusliche Abwässer. Beim MITI-Test wird das Inokulum aus einer Kombina ­
tion verschiedener Quellen gewonnen — siehe Beschreibung im ent ­
sprechenden Kapitel.
 
I.6.4.1.  Inokulum aus Belebtschlamm  
Eine Belebtschlammprobe ist dem Belüftungstank einer Kläranlage 
oder einer Laboranlage, die hauptsächlich häusliche Abwässer rei ­
nigt, frisch zu entnehmen. Falls erforderlich, sind grobe Partikel durch Filtration durch ein feinmaschiges Sieb zu entfernen; danach 
ist der Schlamm aerob zu halten.
 
Eine andere Möglichkeit besteht darin, den Schlamm nach Abtren ­
nung grober Partikel absitzen zu lassen oder zu zentrifugieren (z. B. 
10 Min. bei 1 100 g). Der Überstand wird verworfen und der 
Schlamm kann im mineralischen Medium gewaschen werden. Der konzentrierte Schlamm wird in einem mineralischen Medium sus ­
pendiert, um eine Konzentration von 3-5 g suspendierte Feststoffe 
pro Liter zu erhalten. Anschließend wird bis zur Verwendung 
belüftet.
 
Der Schlamm sollte von einer gut arbeitenden konventionellen An ­
lage genommen werden. Wenn Schlamm aus einer Abwasserklär ­
anlage verwendet werden muss, der vermutlich Substanzen mit hem ­
mender Wirkung enthält, ist er zu waschen. Dazu lässt man den resuspendierten Schlamm nach gründlichem Durchmischen absitzen oder zentrifugiert ihn, verwirft anschließend den Überstand und sus ­
pendiert den gewaschenen Schlamm in einem weiteren Volumen 
mineralischen Mediums erneut. Diese Schritte sind so lange zu wiederholen, bis der Schlamm als frei von übermäßigem Substrat oder Hemmsubstanz angesehen wird.
 
Nach vollständiger Resuspension oder bei unbehandeltem Schlamm 
ist unmittelbar vor Gebrauch das Trockengewicht der suspendierten Feststoffe zu bestimmen.
 
Eine weitere Möglichkeit besteht in der Homogenisierung von Be ­
lebtschlamm (3-5 g suspendierte Feststoffe pro Liter). Dazu wird der Schlamm 2 Min. bei mittlerer Geschwindigkeit in einer mecha ­
nischen Mischvorrichtung durchmischt. Danach lässt man den durch ­
mischten Schlamm 30 Min., wenn erforderlich länger, absitzen und 
dekantiert die als Inokulum verwendete Flüssigkeit mit einer Ge ­
schwindigkeit von 10 ml pro Liter mineralischen Mediums.
 
I.6.4.2.  Andere Quellen für das Inokulum  
Dieses lässt sich aus dem Ablauf einer Kläranlage oder einer Labor ­
anlage für überwiegend häusliche Abwässer gewinnen. Dazu ist eine 
frische Probe zu entnehmen und während des Transports aerob zu 
halten. Zum Absetzen wird die Probe eine Stunde stehen gelassen oder durch einen grobporigen Papierfilter filtrier μt und der dekan ­
tierte Ablauf (bzw. das Filtrat) bis zum Gebrauch aerob gehalten. Bis 
zu 100 ml diesen Inokulumtyps kann pro Liter Medium verwendet 
werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 843
 
Als weitere Inokulumquelle dient Oberflächenwasser. In diesem Fall 
ist von einem geeigneten Oberflächenwasser (z. B. Fluss, See) eine 
Probe zu entnehmen und diese bis zum Gebrauch aerob zu halten. Falls erforderlich, wird das Inokulum durch Filtration oder Zentrifu ­
gieren konzentriert.
 
I.6.5.  Vorbereitung der Inokula  
Die Inokula können an die Versuchsbedingungen, nicht aber an die 
Prüfsubstanz adaptiert werden. Die entsprechende Konditionierung 
besteht in der Belüftung des Belebtschlamms im mineralischen Me ­
dium oder des Kläranlagenablaufs über eine Dauer von 5-7 Tagen bei der Prüftemperatur. Die Konditionierung verbessert mitunter die Präzision der Prüfmethoden durch eine Absenkung der Blindwerte. 
Eine Vorbereitung des MITI-Inokulums wird als nicht erforderlich 
angesehen.
 
I.6.6.  Abiotische Kontrollen  
Sofern erforderlich, sollte der mögliche abiotische Abbau der Prüf ­
substanz durch Bestimmung der DOC-Abnahme, der Sauerstoffauf ­
nahme oder der Kohlendioxidentwicklung in sterilen Kontrollen 
ohne Inokulum geprüft werden. Die Sterilisierung ist durch Mem ­
branfiltration (0,2 - 0,45 μm) oder durch Hinzufügen von einer ge ­
eigneten toxischen Substanz in entsprechender Konzentration vor ­
zunehmen. Wenn Membranfiltration verwendet wird, muss die Pro ­
benahme aseptisch erfolgen, um sterile Bedingungen zu wahren. 
Unter der Voraussetzung, dass die Adsorption der Prüfsubstanz nicht von vornherein ausgeschlossen werden kann, müssen Prüfungen auf der Grundlage der Messung von DOC-Abnahme, insbesondere bei 
Belebtschlamm-Inokula, eine abiotische Kontrolle beinhalten, die 
beimpft und vergiftet wurde.
 
I.6.7.  Anzahl der Flaschen  
Die Anzahl der Flaschen in einem typischen Ansatz wird in den 
Kapiteln zu jedem Test beschrieben.  
Die folgenden Flaschen sollten verwendet werden:  
— Prüfsuspension: enthält Prüfsubstanz und Inokulum  
— Inokulum-Blindwert: enthält nur Inokulum  
— Verfahrenskontrolle: enthält Referenzsubstanz und Inokulum  
— Abiotische Sterilkontrolle: steril, enthält nur Prüfsubstanz (siehe 
I.6.6)  
— Adsorptionskontrolle: enthält Prüfsubstanz, Inokulum und Steri ­
lisierungsmittel  
— Toxizitätskontrolle: enthält Prüfsubstanz, Referenzsubstanz und 
Inokulum  
Die Bestimmung der Prüfsuspension und des Inokulum-Blindwerts 
muss unbedingt parallel durchgeführt werden. Die Bestimmungen der anderen Flaschen sollten ebenfalls parallel durchgeführt werden.
 
Dies ist eventuell nicht immer möglich. Es sollte sichergestellt sein, 
dass ausreichend Proben genommen oder Ablesungen vorgenommen 
werden, um die prozentuale Abnahme innerhalb des auszuwertenden 
„10-Tage-Fensters“ zu beurteilen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 844
 
I.7. DATEN UND AUSWERTUNG  
Zur Berechnung von D  t (prozentualer Abbau) werden die Mittelwerte 
der Wiederholungsmessung der Summenparameter in beiden Prüfge ­
fäßen und im Inokulum-Blindversuch verwendet. Die Formeln sind 
nachstehend in den jeweiligen Kapiteln angegeben. Der Verlauf des 
Abbaus wird grafisch dargestellt, und das 10-Tage-Fenster markiert. Die am Ende des 10-Tage-Fensters erreichte prozentuale Abnahme und der bei Erreichen des Plateaus bzw. bei Testende (je nach dem 
konkreten Fall) erzielte Wert sind zu berechnen und anzugeben.
 
In den respirometrischen Tests können stickstoffhaltige Substanzen 
den Sauerstoffverbrauch infolge Nitrifikation beeinträchtigen (vgl. Anlagen 2 und 5).
 
I.7.1.  Messung des Abbaus mittels DOC-Bestimmung  
Der prozentuale Abbau (D  t ) sollte für die Flaschen mit Prüfsubstanz 
zu jeder Probenahme-Zeit getrennt berechnet werden, wobei Mittel ­
werte der beiden DOC-Messungen verwendet werden, um die Vali ­
dität der Prüfungen beurteilen zu können (siehe I.5.2). Er wird wie 
folgt berechnet:  
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Í Î 
Ü 100  
Hierin bedeuten:  
D t = prozentualer Abbau zum Zeitpunkt t  
C o = mittlere DOC-Anfangskonzentration im angeimpften Kul ­
turmedium mit der Prüfsubstanz (mg DOC/l)  
C t = mittlere DOC-Konzentration im angeimpften Kulturmedium 
mit der Prüfsubstanz zum Zeitpunkt t (mg DOC/l)  
C bo = mittlere DOC-Anfangskonzentration des Blindwerts im an ­
geimpften mineralischen Medium (mg DOC/l)  
C bt = mittlere DOC-Konzentration des Blindwerts im angeimpf ­
ten mineralischen Medium zum Zeitpunkt t (mg DOC/l)  
Sämtliche Konzentrationen werden experimentell bestimmt.  
I.7.2.  Messung des Abbaus mittels spezifischer Analytik  
Liegen Daten aus einer spezifischen Analyse vor, ist der biologische 
Primärabbau wie folgt zu berechnen:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Hierin bedeuten:  
D t = prozentualer Abbau zum Zeitpunkt t, in der Regel nach 28 
Tagen  
S a = Restmenge an Prüfsubstanz im angeimpften Medium bei 
Versuchsende (mg)  
S b = Restmenge an Prüfsubstanz im Blindversuch mit Wasser/ 
Medium, zu dem nur die Prüfsubstanz hinzugefügt 
wurde (mg)  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 845
 
I.7.3.  Abiotischer Abbau  
Bei abiotischer Sterilkontrolle wird der prozentuale abiotische Abbau 
wie folgt berechnet:  
% abiotischer Abbau  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
wobei:  
C s ( o ) = DOC-Konzentration in Sterilkontrolle am Tag 0  
C s ( t ) = DOC-Konzentration in Sterilkontrolle am Tag t  
I.8. ABSCHLUSSBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— Prüf- und Referenzsubstanz und deren jeweiligen Reinheitsgrad;  
— Versuchsbedingungen;  
— Inokulum: Beschaffenheit und Herkunft, Konzentration und evtl. 
Vorbehandlung (Konditionierung);  
— Anteil und Beschaffenheit der in den Abwässern enthaltenen 
Industrie-Abwässer (soweit bekannt);  
— Versuchsdauer und -temperatur;  
— bei schwerlöslichen Prüfsubstanzen: vorgenommene Behandlung;  
— angewendetes Prüfverfahren; sämtliche Abweichungen hiervon 
sind wissenschaftlich zu begründen;  
— Datenblatt;  
— möglicherweise beobachtete Hemmwirkungen;  
— ein möglicherweise beobachteter abiotischer Abbau;  
— Daten aus spezifischer Analyse (falls vorhanden);  
— Analysenwerte bezüglich Zwischenprodukte, wenn vorhanden;  
— die Kurve des prozentualen Abbaus, aufgetragen gegen die Zeit, 
für Prüf- und Referenzsubstanz; die „lag“-Phase, die Abbaupha ­
se, das 10-Tage-Fenster und die Steigung sind klar anzugeben (Anlage 1). Wenn der Test mit den Validitätskriterien überein ­
stimmt, sollte der Mittelwert der Abbauprozente der Flaschen mit 
Prüfsubstanz für die Auftragung verwendet werden;
 
— der prozentuale Abbau nach dem 10-Tage-Fenster sowie auf dem 
Plateau oder zu Versuchsende.  
TEIL II:  DOC-DIE-AWAY-TEST — ABNAHME VON 
GELÖSTEM ORGANISCHEM KOHLENSTOFF 
(DOC)  (Methode C.4-A)  
II.1. PRINZIP DER METHODE  
Ein definiertes Volumen des angeimpften mineralischen Mediums 
mit einer bekannten Konzentration der Prüfsubstanz (10-40 mg DOC/l) als einziger nomineller Quelle organischen Kohlenstoffs 
wird im Dunkeln oder bei diffuser Beleuchtung bei 22 ± 2
 o C be­
lüftet.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 846
 
Der Abbau wird mittels DOC-Analyse über einen Zeitraum von 28 
Tagen in kurzen Zeitabständen verfolgt. Der Grad des biologischen 
Abbaus wird durch die Abnahme der DOC-Konzentration (nach Be ­
rücksichtigung des Inokulum-Blindwerts) in % der Ausgangskonzen ­
tration berechnet. Der Grad des biologischen Primärabbaus lässt sich 
aus der ergänzenden chemischen Analyse errechnen, die zu Beginn 
und am Ende der Inkubation vorgenommen wird.  
II.2. BESCHREIBUNG DER METHODE  
II.2.1.  Geräte  
a) Konische Flaschen, z. B. 250 ml bis 2 l, je nach dem für die 
DOC-Analyse benötigten Volumen  
b) Schüttelmaschine zur Aufnahme der konischen Flaschen, die ent ­
weder mit einem Thermostaten ausgestattet oder in einem klima ­
tisierten Raum aufgestellt ist und so ausgelegt sein muss, dass aerobe Bedingungen in allen Flaschen aufrechterhalten werden
 
c) Filtrationsgerät mit geeigneten Membranen  
d) DOC-Analysator  
e) Gerät zur Bestimmung von gelöstem Sauerstoff  
f) Zentrifuge  
II.2.2.  Ansatz des mineralischen Mediums  
Zubereitung der Stammlösung siehe I.6.2.  
10 ml Lösung (a) mit 800 ml Verdünnungswasser mischen, 1 ml der 
Lösungen (b) bis (d) hinzugeben und mit Verdünnungswasser auf 1 l auffüllen.
 
II.2.3.  Ansatz und Vorbereitung des Inokulums  
Das Inokulum kann aus verschiedenen Quellen gewonnen werden: 
aus Belebtschlamm, aus Kläranlagenablauf, aus Oberflächenwasser, 
aus Böden oder aus mehreren dieser Quellen zugleich.  
Vgl. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 und I.6.5.  
II.2.4.  Ansatz der Flaschen  
Beispiel: Jeweils 800 ml des mineralischen Mediums werden in ko ­
nische 2-l-Flaschen gegeben, dazu wird in jeweils separate Ansätzen 
ein ausreichendes Volumen Stammlösung der Prüf- und der Refe ­
renzsubstanz gegeben, um ein DOC-Äquivalent von 10-40 mg/l zu erhalten. Der pH-Wert sollte überprüft und wenn nötig auf 7,4 einge ­
stellt werden. Die Flaschen werden mit Belebtschlamm oder einem 
Inokulum anderer Herkunft (vgl. I.6.4) beimpft, um eine Endkonzen ­
tration nicht über 30 mg suspendierter Feststoffe pro Liter zu erhal ­
ten. Daneben werden Inokulum-Kontrollen im mineralischen Me ­
dium ohne Prüf- oder Referenzsubstanz angesetzt.
 
Falls erforderlich, ist ein Gefäß zur Kontrolle der möglichen Hemm ­
wirkung der Prüfsubstanz zu verwenden; dazu ist eine Lösung mit vergleichbaren Konzentrationen sowohl der Prüf- als auch der Refe ­
renzsubstanz im mineralischen Medium anzuimpfen.
 
Falls erforderlich, ist eine weitere, sterile Flasche anzusetzen, um zu 
prüfen, ob die Prüfsubstanz abiotisch abgebaut wird; dazu ist eine 
nicht angeimpfte Lösung dieser Substanz zu verwenden (vgl. I.6.6).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 847
 
Wenn vermutet werden muss, dass die Prüfsubstanz signifikant am 
Glas oder am Schlamm usw. adsorbiert wird, ist eine Vorprüfung 
vorzunehmen, mit der das Ausmaß der Adsorption und damit die Eignung des Versuchs für die Prüfsubstanz bestimmt werden (vgl. Tabelle 1). Ansetzen einer Flasche mit Prüfsubstanz, Inokulum und 
Sterilisiermittel.
 
Alle Flaschen mit dem mineralischen Medium auf 1 l auffüllen, 
mischen und anschließend von jeder Flasche eine Probe zwecks Bestimmung der DOC-Ausgangskonzentration entnehmen (vgl. An ­
lage 2.4). Öffnungen der Flaschen so abdecken, z. B. mit Alumini ­
umfolie, dass ein freier Luftaustausch zwischen der Flasche und der Umgebungsluft möglich bleibt. Danach die Flaschen in die Schüttel ­
maschine stellen und mit dem Versuch beginnen.
 
II.2.5.  Anzahl der Flaschen in einem typischen Durchgang  
Flaschen 1 und 2: Prüfsuspension  
Flaschen 3 und 4: Inokulum-Blindwert  
Flasche 5: Verfahrenskontrolle  
Empfohlen und falls notwendig:  
Flasche 6: abiotische Sterilkontrolle  
Flasche 7: Adsorptionskontrolle  
Flasche 8: Toxizitätskontrolle  
Vgl. I.6.7.  
II.2.6.  Durchführung der Prüfung  
Während des Versuchs sind die DOC-Konzentrationen in jeder Fla ­
sche in bestimmten Zeitabständen doppelt zu bestimmen, und zwar so häufig, dass der Beginn des 10-Tage-Fensters und die prozentuale Abnahme am Ende des 10-Tage-Fensters bestimmt werden können. 
Dabei ist pro Messung nur die Mindestmenge an Prüfsuspension zu 
entnehmen.
 
Vor der Probeentnahme sind die Verdampfungsverluste aus den Fla ­
schen, falls erforderlich, durch Zufügen von Verdünnungswasser aus ­
zugleichen (I.6.1). Der Versuchsansatz ist vor Entnahme einer Probe 
gründlich zu durchmischen, wobei sicherzustellen ist, dass an den Wän ­
den der Flaschen anhaftendes Material vor der Probenahme gelöst oder suspendiert wird. Unmittelbar nach der Probenahme ist zu filtrieren 
(Membranfilter) oder zu zentrifugieren (vgl. Anlage 2.4). Die filtrierten 
oder zentrifugierten Proben sind noch am selben Tag zu analysieren; ansonsten können sie bei 2-4
 o C für maximal 48 h bzw. bei unter — 
18 o C über einen längeren Zeitraum aufbewahrt werden.  
II.3. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT  
II.3.1.  Auswertung der Ergebnisse  
Der prozentuale Abbau zum Zeitpunkt t ist entsprechend I.7.1 (DOC- 
Bestimmung) sowie wahlweise entsprechend I.7.2 (spezifische Ana ­
lyse) zu berechnen.  
Sämtliche Ergebnisse sind auf den dafür vorgesehenen Datenblättern 
zu protokollieren.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 848
 
II.3.2.  Gültigkeit der Ergebnisse  
Vgl. I.5.2.  
II.3.3.  Abschlussbericht  
Vgl. I.8.  
II.4. DATENBLATT  
Nachstehend ein Beispiel eines Datenblattes.  
DOC-DIE-AWAY-TEST  
1. LABOR  
2. DATUM BEI VERSUCHSBEGINN  
3. PRÜFSUSBSTANZ  
Name:  
Konzentration der Stammlösung: ... mg/l auf Substanz bezogen  
Anfangskonzentration im Medium, t  0 : ... mg/l auf Substanz be ­
zogen  
4. INOKULUM  
Herkunft: ...  
Vorgenommene Behandlung: ...  
Vorbereitung/Konditionierung (soweit zutreffend): ...  
Konzentration der suspendierten Feststoffe im Reaktions ­
gemisch: ... mg/l  
5. KOHLENSTOFFBESTIMMUNGEN  
Kohlenstoffanalysator: ...  
Flasche Nr. DOC nach n Tagen (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Testsubstanz plus 
Inokulum 
1 a 1 
a 2 
a, Mittelwert 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, Mittelwert 
C b(t) ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 849
 
Flasche Nr. DOC nach n Tagen (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Inokulum-Blind ­
versuch ohne Testsubstanz 3 c
 1 
c 2 
c, Mittelwert C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, Mittelwert 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. AUSWERTUNG DER ROHDATEN  
Flasche Nr. % Abbau nach n Tagen 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Mittel (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) Bei erheblichem Unterschied sollten D  1 und D  2 nicht gemittelt werden.  
Anmerkung : Für die Referenz und die Toxizitätskontrolle können 
ähnliche Formblätter verwendet werden.  
7. ABIOTISCHE KONTROLLE  (wahlweise)  
Zeit (Tage) 
0 t  
DOC-Konzentration (mg/l) in Sterilkontrolle C s(o) C s(t) 
% abiotischer Abbau  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPEZIFISCHE ANALYSE  (wahlweise)  
Bei Versuchsende verbliebene 
Menge an Prüfsubstanz (mg/l) % Primärabbau  
Sterilkontrolle S  b ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 850
 
Bei Versuchsende verbliebene 
Menge an Prüfsubstanz (mg/l) % Primärabbau  
Beimpftes Prüfmedium S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
TEIL III.  MODIFIZIERTER OECD-SCREENING-TEST  (Me­
thode C.4-B)  
III.1. PRINZIP DER METHODE  
Ein definiertes Volumen des mineralischen Mediums mit einer be ­
kannten Konzentration der Prüfsubstanz (10-40 mg/l DOC) als ein ­
ziger nomineller Quelle organischen.Kohlenstoffs wird mit 0,5 ml 
Kläranlagenablauf pro Liter Medium angeimpft und im Dunkeln oder bei diffuser Beleuchtung bei 22 ± 2
 o C belüftet.  
Der Abbau wird mittels DOC-Analyse über einen Zeitraum von 28 
Tagen in kurzen Zeitabständen verfolgt. Der Grad des biologischen Abbaus wird durch die Abnahme der DOC-Konzentration (nach Be ­
rücksichtigung des Inokulum-Blindwerts) in % der Ausgangskonzen ­
tration berechnet. Der Grad des biologischen Primärabbaus lässt sich 
auch aus der ergänzenden chemischen Analyse errechnen, die zu Beginn und am Ende der Inkubation vorgenommen wird.
 
III.2. BESCHREIBUNG DER METHODE  
III.2.1. Geräte  
a) Konische Flaschen, z. B. 250 ml bis 2 1, je nach dem für die 
DOC-Analyse benötigten Volumen  
b) Schüttelmaschine zur Aufnahme der konischen Flaschen, die ent ­
weder mit einem Thermostaten ausgestattet oder in einem klima ­
tisierten Raum aufgestellt ist und so ausgelegt sein muss, dass 
aerobe Bedingungen in allen Flaschen aufrechterhalten werden  
c) Filtrationsgerät mit geeigneten Membranen  
d) DOC-Analysator  
e) Gerät zur Bestimmung von gelöstem Sauerstoff  
f) Zentrifuge  
III.2.2.  Ansatz des mineralischen Mediums  
Zubereitung der Stammlösung siehe I.6.2.  
10 ml Lösung (a) mit 800 ml Verdünnungswasser mischen, 1 ml der 
Lösungen (b) bis (d) hinzugeben und mit Verdünnungswasser auf 1 l 
auffüllen.  
Bei diesem Verfahren werden nur 0,5 ml Kläranlagenablauf pro Liter 
als Inokulum verwendet, so dass das Medium möglicherweise mit Spurenelementen und Wachstumsfaktoren angereichert werden muss. 
Zu diesem Zweck wird von den folgenden Lösungen jeweils 1 ml 
pro Liter endgültigem Medium zugefügt.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 851
 
Lösung der Spurenelemente: 
Mangansulfat-Tetrahydrat, MnSO  4 ·4H 2 O 39,9 mg 
Borsäure, H  3 BO 3 57,2 mg 
Zinksulfat-Heptahydrat, ZnSO  4 ·7H 2 O 42,8 mg 
Ammoniumheptamolybdat, (NH  4 ) 6 ·Mo 7 O 24 34,7 mg 
Fe-Chelat (FeCl  3 Ethylendiamintetraessigsäure) 100,0 mg 
in Verdünnungswasser gelöst und auf 1 000 ml auf ­
gefüllt. 
Vitaminlösung: 
Hefeextrakt 15,0 mg  
in 100 ml Wasser gelöst und durch Membranfilter mit 0,2 μm Poren­
größe steril filtriert bzw. frisch zubereitet.  
III.2.3.  Ansatz und Vorbereitung des Inokulums  
Das Inokulum ist von Abläufen einer Kläranlage oder Anlage im 
Labormaßstab, denen vorwiegend häusliche Abwässer zugeführt wer ­
den, zu entnehmen. Vgl. I.6.4.2 und I.6.5.  
0,5 ml pro Liter mineralisches Medium sind zu verwenden.  
III.2.4.  Ansatz der Flaschen  
Beispiel: Jeweils 800 ml mineralischen Mediums werden in konische 2- 
l-Flaschen gegeben, dazu wird in jeweils separaten Ansätzen ein aus ­
reichendes Volumen Stammlösung der Prüf- und der Referenzsubstanz 
gegeben, um ein DOC-Äquivalent von 10-40 mg/l zu erhalten. Der pH- 
Wert sollte überprüft und wenn nötig auf 7,4 eingestellt werden. Die Flaschen werden mit 0,5 ml Kläranlagenablauf pro Liter beimpft (vgl. I.6.4.2). Daneben werden Inokulum-Kontrollen im mineralischen Me ­
dium ohne Prüf- oder Referenzsubstanz angesetzt.
 
Falls erforderlich, ist ein Gefäß zur Kontrolle der möglichen Hemm ­
wirkung der Prüfsubstanz zu verwenden; dazu ist eine Lösung mit vergleichbaren Konzentrationen sowohl der Prüf- als auch der Refe ­
renzsubstanz im mineralischen Medium anzuimpfen.
 
Falls erforderlich, ist eine weitere, sterile Flasche anzusetzen, um zu 
prüfen, ob die Prüfsubstanz abiotisch abgebaut wird; dazu ist eine 
nicht angeimpfte Lösung dieser Substanz zu verwenden (vgl. I.6.6).  
Wenn vermutet werden muss, dass die Prüfsubstanz signifikant am 
Glas oder am Schlamm usw. adsorbiert wird, ist eine Vorprüfung 
vorzunehmen, mit der das Ausmaß der Adsorption und damit die 
Eignung des Versuchs für die Prüfsubstanz bestimmt werden (vgl. Tabelle 1). Ansetzen einer Flasche mit Prüfsubstanz, Inokulum und Sterilisiermittel.
 
Alle Flaschen mit dem mineralischen Medium auf 1 l auffüllen, 
mischen, und anschließend von jeder Flasche eine Probe zwecks 
Bestimmung der DOC-Ausgangskonzentration entnehmen (vgl. An ­
lage 2.4). Öffnungen der Flaschen so abdecken, z. B. mit Alumini ­
umfolie, dass ein freier Luftaustausch zwischen der Flasche und der 
Umgebungsluft möglich bleibt. Danach die Flaschen in die Schüttel ­
maschine stellen und mit dem Versuch beginnen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 852
 
III.2.5.  Anzahl der Flaschen in einem typischen Durchgang  
Flaschen 1 und 2: Prüfsuspension  
Flaschen 3 und 4: Inokulum-Blindwert  
Flasche 5: Verfahrenskontrolle  
Empfohlen und falls notwendig:  
Flasche 6: abiotische Sterilkontrolle  
Flasche 7: Adsorptionskontrolle  
Flasche 8: Toxizitätskontrolle  
Vgl. I.6.7.  
III.2.6.  Durchführung der Prüfung  
Während des Versuchs sind die DOC-Konzentrationen in jeder Flasche 
in bestimmten Zeitabständen doppelt zu bestimmen, und zwar so häufig, dass der Beginn des 10-Tage-Fensters und die prozentuale Abnahme am 
Ende des 10-Tage-Fensters bestimmt werden können. Dabei ist pro 
Messung nur die Mindestmenge an Prüfsuspension zu entnehmen.
 
Vor der Probeentnahme sind die Verdampfungsverluste aus den Fla ­
schen, falls erforderlich, durch Zufügen von Verdünnungswasser aus ­
zugleichen (I.6.1.). Der Versuchsansatz ist vor Entnahme einer Probe 
gründlich zu durchmischen, wobei sicherzustellen ist, dass an den Wän ­
den der Flaschen anhaftendes Material vor der Probenahme gelöst oder suspendiert wird. Unmittelbar nach der Probenahme ist zu filtrieren 
(Membranfilter) oder zu zentrifugieren (vgl. Anlage 2.4). Die filtrierten 
oder zentrifugierten Proben sind noch am selben Tag zu analysieren; ansonsten können sie bei 2-4
 o C für maximal 48 h bzw. bei unter — 
18 o C über einen längeren Zeitraum aufbewahrt werden.  
III.3. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT  
III.3.1.  Auswertung der Ergebnisse  
Der prozentuale Abbau zum Zeitpunkt t ist entsprechend I.7.1 (DOC- 
Bestimmung) sowie wahlweise entsprechend I.7.2. (spezifische Ana ­
lyse) zu berechnen.  
Sämtliche Ergebnisse sind auf den dafür vorgesehenen Datenblättern 
zu protokollieren.  
III.3.2. Gültigkeit der Ergebnisse  
Vgl. I.5.2.  
III.3.3. Prüfbericht  
Vgl. I.8.  
III.4. DATENBLATT  
Nachstehend ein Beispiel eines Datenblattes.  
MODIFIZIERTER OECD-SCREENING-TEST  
1. LABOR  
2. DATUM BEI VERSUCHSBEGINN  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 853
 
3. PRÜFSUSBSTANZ  
Name: …  
Konzentration der Stammlösung: ... mg/l auf Substanz bezogen  
Anfangskonzentration im Medium, t  0 : ... mg/l auf Substanz be ­
zogen  
4. INOKULUM  
Herkunft: ...  
Vorgenommene Behandlung: ...  
Vorbereitung/Konditionierung (soweit zutreffend): ...  
Konzentration der suspendierten Feststoffe im Reaktions ­
gemisch: ... mg/l  
5. KOHLENSTOFFBESTIMMUNGEN  
Kohlenstoffanalysator: ...  
Flasche Nr. DOC nach n Tagen (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Testsubstanz plus 
Inokulum 
1 a 1 
a 2 
a, Mittelwert 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, Mittelwert 
C b(t) 
Inokulum-Blind ­
versuch ohne Testsubstanz 3 c
 1 
c 2 
c, Mittelwert C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, Mittelwert 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. AUSWERTUNG DER ROHDATEN  
Flasche Nr. % Abbau nach n Tagen 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 854
 
Flasche Nr. % Abbau nach n Tagen 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Mittel (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) Bei erheblichem Unterschied sollten D  1 und D  2 nicht gemittelt werden.  
Anmerkung : Für die Referenz und die Toxizitätskontrolle können 
ähnliche Formblätter verwendet werden.  
7. ABIOTISCHE KONTROLLE  (wahlweise)  
Zeit (Tage) 
0 t  
DOC-Konzentration (mg/l) in Sterilkontrolle C s(o) C s(t) 
% abiotischer Abbau  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. SPEZIFISCHE ANALYSE  (wahlweise)  
Bei Versuchsende verbliebene 
Menge an Prüfsubstanz (mg/l) % Primärabbau  
Sterilkontrolle S  b 
Beimpftes Prüfmedium S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
TEIL IV. CO  2 -ENTWICKLUNGSTEST (Methode C.4-C)  
IV.1. PRINZIP DER METHODE  
Ein definiertes Volumen des angeimpften mineralischen Mediums 
mit einer bekannten Konzentration der Prüfsubstanz (10-20 mg/l 
DOC oder TOC) als einziger nomineller Quelle organischen Kohlen ­
stoffs wird durch Einleiten von kohlendioxidfreier Luft bei gesteu ­
erter Geschwindigkeit im Dunkeln oder bei diffusem Licht belüftet. 
Der Abbau wird über einen Zeitraum von 28 Tagen durch Bestim ­
mung des erzeugten Kohlendioxids verfolgt, das in Bariumhydroxid oder Natronlauge gebunden und durch Titration des restlichen Hydroxids/der restlichen Lauge oder als anorganischer Kohlenstoff 
bestimmt wird. Die Menge des aus der Prüfsubstanz freigesetzten 
Kohlendioxids wird (nach Berücksichtigung der Menge aus dem Inokulum-Blindversuch) in % ThCO
 2 angegeben. Der Grad des bio ­
logischen Abbaus lässt sich auch aus der ergänzenden DOC-Analyse 
errechnen, die zu Beginn und am Ende der Inkubation vorgenommen 
wird. ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 855
 
IV.2. BESCHREIBUNG DER METHODE  
IV.2.1.  Geräte  
a) Konische Flaschen, 2 bis 5 l, jeweils mit einem Belüftungsrohr, 
das nahezu auf den Boden der Flasche reicht, und mit einem 
Auslass  
b) Magnetrührer (bei der Prüfung schwer löslicher Substanzen  
c) Gaswaschflaschen  
d) Einrichtung zur Steuerung und Messung des Luftstromes  
e) Gerät zur Kohlendioxidwäsche zwecks Gewinnung von Luft, die frei 
von Kohlendioxid ist; alternativ dazu kann ein Gemisch aus 
CO 2 -freiem Sauerstoff und CO  2 -freiem Stickstoff im richtigen Ver ­
hältnis aus Gasflaschen verwendet werden (20 % O  2 : 80 % N  2 ) 
f) Einrichtung zur Kohlendioxidbestimmung, entweder durch Titra ­
tion oder Analyse des anorganischen Kohlenstoffs  
g) Membranfiltrationsgerät (wahlweise)  
h) DOC-Analysator (wahlweise)  
IV.2.2.  Ansatz des mineralischen Mediums  
Zubereitung der Stammlösungen siehe I.6.2.  
10 ml Lösung (a) mit 800 ml Verdünnungswasser mischen, 1 ml der 
Lösungen (b) bis (d) hinzugeben und mit Verdünnungswasser auf 1 l 
auffüllen.  
IV.2.3.  Ansatz und Vorbereitung des Inokulums  
Das Inokulum kann aus verschiedenen Quellen gewonnen werden: 
aus Belebtschlamm, aus Kläranlagenablauf, aus Oberflächenwasser, 
aus Böden oder aus mehreren dieser Quellen zugleich.  
Vgl. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 und I.6.5.  
IV.2.4.  Ansatz der Flaschen  
Die folgenden Mengen- und Gewichtsangaben sind als Beispiel für 
5-Liter-Flaschen mit 3 l Suspension zu verstehen. Werden Flaschen 
mit geringerem Volumen verwendet, sind die Angaben entsprechend zu ändern. Es muss allerdings sichergestellt sein, dass das gebildete Kohlendioxid exakt gemessen werden kann.
 
In jede 5-l-Flasche werden 2 400 ml mineralisches Medium gegeben. 
Dazu wird eine geeignete Menge des vorbereiteten Belebtschlamms 
hinzugefügt (vgl. I.6.4.1 und I.6.5), um schließlich in den 3 l beimpf ­
ter Mischung eine Konzentration an suspendierten Feststoffen von nicht mehr als 30 mg/l zu erhalten. Alternativ dazu kann der vor ­
bereitete Belebtschlamm zunächst im mineralischen Medium ver ­
dünnt werden zu einer Suspension von 500-1 000 mg/l. Danach wird dem Inhalt der 5-l-Flasche eine aliquote Menge hinzugegeben, um so eine Konzentration von 30 mg/l zu erhalten. Dieses letztere 
Verfahren sichert eine höhere Präzision. Es kann auch Inokulum 
anderer Herkunft verwendet werden (vgl. I.6.4.2).
 
Diese angeimpften Mischungen sind über Nacht mit CO  2 -freier Luft 
zu belüften, um das System von Kohlendioxid zu reinigen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 856
 
Die Prüf- und die Referenzsubstanz sind getrennt als Stammlösungen 
bekannten Volumens in die Gefäße des Parallelansatzes zu geben, 
um so Substanzkonzentrationen von 10 bis 20 mg/l DOC oder TOC zu erhalten; einige Gefäße sind ohne Zugabe von Substanz als Ino ­
kulum-Kontrollen mitzuführen. Schwerlösliche Prüfsubstanzen sind 
auf Gewichts- oder Volumenbasis direkt in die Gefäße zu geben 
oder gemäß Anlage 3 zu behandeln.
 
Falls erforderlich, ist ein Gefäß zur Kontrolle der möglichen Hemm ­
wirkung der Prüfsubstanz zu verwenden; dazu ist sowohl die Prüf- 
als auch die Referenzsubstanz in derselben Konzentration zuzugeben wie in den anderen Gefäßen.
 
Falls erforderlich, ist eine weitere, sterile Flasche anzusetzen, um zu 
prüfen, ob die Prüfsubstanz abiotisch abgebaut wird; dazu ist eine nicht angeimpfte Lösung dieser Substanz zu verwenden (vgl. I.6.6). Sterilisierung durch Zugabe einer toxischen Substanz in geeigneter 
Konzentration.
 
Die Suspensionen in allen Flaschen sind durch Zugabe des zuvor mit 
CO 2 -freier Luft belüfteten mineralischen Mediums aufzufüllen. 
Wahlweise können Proben zur DOC-Analyse (vgl. Anlage 2.4) und/ ­
oder zur spezifischen Analyse entnommen werden. Die Absorptions ­
flaschen sind mit den Gasauslässen der Flaschen zu verbinden.  
Bei Verwendung von Bariumhydroxid sind an jede 5-l-Flasche drei 
Absorptionsflaschen, jeweils gefüllt mit 100 ml Bariumhydroxidlö ­
sung 0,0125 M, in Serie anzuschließen. Die Lösung muss frei von 
ausgefälltem Sulfat und Karbonat sein; die Konzentration der Lösung 
ist unmittelbar vor Gebrauch zu bestimmen. Bei Verwendung von Natronlauge sind zwei Absorptionsfallen anzuschließen, wobei die zweite als Kontrolle dafür dient, ob das gesamte Kohlendioxid in 
der ersten Falle absorbiert wurde. Geeignet sind hierfür Absorptions ­
flaschen, die mit Serumflaschenverschlüssen versehen sind. In jede Flasche sind 200 ml Natronlauge 0,05 M zu geben; diese Menge ist ausreichend, um das gesamte bei vollständigem Abbau der Prüfsub ­
stanz entstehende Kohlendioxid zu absorbieren. Auch nach frischer 
Zubereitung enthält die Natronlauge Spuren von Karbonaten, die durch Subtraktion des im Blindwert enthaltenen Karbonats berück ­
sichtigt werden.
 
IV.2.5.  Anzahl der Flaschen in einem typischen Durchgang  
Flaschen 1 und 2: Prüfsuspension  
Flaschen 3 und 4: Inokulum-Blindwert  
Flasche 5: Verfahrenskontrolle.  
Empfohlen und falls notwendig:  
Flasche 6: abiotische Sterilkontrolle  
Flasche 7: Toxizitätskontrolle  
Vgl. auch I.6.7.  
IV.2.6.  Durchführung der Prüfung  
Bei Versuchsbeginn wird CO  2 -freie Luft (Geschwindigkeit: 30- 
100 ml/min) in die Gefäße mit den Suspensionen geleitet. Zur Be ­
stimmung der CO  2 -Entwicklung sind regelmäßig Proben des Kohlen ­
dioxid-Absorbers zu entnehmen. Es wird empfohlen, diese Messun ­
gen in den ersten zehn Tagen alle zwei oder drei, danach bis zum 
28. Tag alle fünf Tage vorzunehmen, um das 10-Tage-Fenster zu 
ermitteln.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 857
 
Am 28. Tag werden Proben (wahlweise) zwecks DOC- und/oder 
spezifischer Analyse entnommen, der pH-Wert der Suspensionen 
gemessen und jeder Flasche 1 ml konzentrierte Salzsäure zugesetzt; die Flaschen sind über Nacht zu belüften, um das in den Prüfsus ­
pensionen vorhandene Kohlendioxid auszutreiben. Am 29. Tag ist 
die letzte Bestimmung der Kohlendioxidentwicklung vorzunehmen.
 
An den Tagen, an denen CO  2 -Messungen vorgenommen werden, ist 
die dem Testgefäß am nächsten stehende Bariumhydroxid-Absorpti ­
onsflasche abzutrennen und die Hydroxidlösung mit HCl 0,05 M 
unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator zu titrieren. 
Die verbleibenden Absorptionsflaschen rücken jeweils um einen Platz auf, und eine neue Absorptionsflasche mit 100 ml frischem Bariumhydroxid 0,0125 M wird an das Ende der Serie hinzugefügt. 
Die Titrationen sind je nach Bedarf vorzunehmen, z. B. wenn in der 
ersten Falle deutliche Niederschläge auftreten, d. h., bevor ein Nie ­
derschlag in der zweiten Falle sichtbar wird, zumindest aber einmal pro Woche. Alternativ kann man — bei Verwendung von NaOH als 
Absorber — mit einer Spritze eine kleine Probe Natronlauge (je nach 
verwendetem Kohlenstoffanalysator) aus der dem Testgefäß am nächsten stehenden Absorptionsflasche entnehmen und diese zur Be ­
stimmung der Kohlenstoffentwicklung direkt in den IC-Teil des 
Kohlenstoffanalysators einspritzen.
 
Der Inhalt der zweiten Absorptionsfalle ist nur am Versuchsende zu 
analysieren, um eine mögliche Kohlendioxidübertragung zu berück ­
sichtigen.  
IV.3. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT  
IV.3.1.  Auswertung der Ergebnisse  
Die in einem Absorber gebundene Menge CO  2 ergibt sich nach 
Titration:  
mg CO  2 = (100 × C  B — 0,5 × V × C  A ) × 44  
Hierin bedeuten:  
V = zur Titration der 100 ml im Absorber verbrauchtes Volumen 
HCl (ml)  
C B = Konzentration der Bariumhydroxidlösung (M)  
C A = Konzentration der Salzsäurelösung (M)  
Wenn C  B 0,0125 M und C  A 0,05 M sind, beträgt das zur Titration 
von 100 ml Bariumhydroxid verbrauchte Volumen 50 ml, während sich die Menge an CO
 2 wie folgt ergibt:  
0; 05 
2 Ü 44 Ü ml HCI titrierte ¼ 1; 1 Ü ml HCI  
Der Faktor zur Umrechnung des titrierten HO-Volumens in mg CO  2 
beträgt demnach 1,1.  
Die Mengen des aus dem Inokulum allein und aus Inokulum plus 
Prüfsubstanz freigesetzten CO  2 sind unter Verwendung der entspre ­
chenden Titrationswerte zu berechnen; aus der Differenz ergibt sich die Menge des aus der Prüfsubstanz allein freigesetzten CO
 2 . 
Ergibt z. B. das Inokulum allein einen Titrationswert vom 48 ml, 
Inokulum plus Prüfsubstanz einen Wert von 45 ml, so betragen  
CO 2 aus dem Inokulum = 1,1 × (50-48) = 2,2 mg,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 858
 
CO 2 aus Inokulum plus Prüfsubstanz = 1,1 × (50-45) = 5,5 mg;  
d. h., die Menge des aus der Prüfsubstanz allein freigesetzten CO  2 
liegt bei 3,3 mg.  
Der prozentuale biologische Abbau berechnet sich wie folgt:  
% Abbau ¼ mg freigesetztes CO  2 Ü 100 
ThCO  2 Ü mg zugegebene Prüfsubstanz  
oder 
% Abbau ¼ mg freigesetztes CO  2 Ü 100 
mg im Versuch zugegebener TOC  Ü 3; 67 
wobei 3,67 der Umrechnungsfaktor (44/12) von Kohlenstoff in Koh ­
lendioxid ist.  
Der prozentuale Abbau für jeden beliebigen Zeitabschnitt kann durch 
Addition der prozentualen ThCO  2 -Werte ermittelt werden, die für 
jeden einzelnen Tag bis zum Zeitpunkt der Messung berechnet wor ­
den sind.  
Bei Verwendung von Adsorptionsgefäßen mit Natronlauge ist die 
freigesetzte Kohlendioxidmenge, angegeben als IC (mg), durch Mul ­
tiplikation der IC-Konzentration im Absorber mit dem Volumen des 
verwendeten Absorbers zu berechnen.  
Der prozentuale biologische Abbau berechnet sich wie folgt:  
% ThCO  2 ¼ mg IC aus dem Prüfgefäß  Ä mg IC des Blindwertes 
mg als Prüfsubstanz hinzugefügter TOC  Ü 100 
Die DOC-Abnahme wird (wahlweise) entsprechend den Angaben 
unter Abschnitt I.7 berechnet. Die erhaltenen Werte werden zusam ­
men mit allen anderen Ergebnissen auf den vorliegenden Datenblät ­
tern protokolliert.  
IV.3.2.  Validität der Ergebnisse  
Der IC-Gehalt der Prüfsuspension im mineralischen Medium zu Ver ­
suchsbeginn darf nicht mehr als 5 % des TC-Werts betragen, und die 
gesamte CO  2 -Entwicklung des Inokulum-Blindwerts zu Versuchs ­
ende sollte normalerweise 40 mg/l Medium nicht überschreiten. Bei Werten über 70 mg CO
 2 pro Liter sollten die Daten und das 
Versuchsverfahren kritisch überprüft werden.  
Vgl. auch I.5.2.  
IV.3.3.  Abschlussbericht  
Vgl. I.8.  
IV.4. DATENBLATT  
Nachstehend ein Beispiel eines Datenblattes.  
KOHLENDIOXIDENTWICKLUNGSTEST  
1. LABOR  
2. DATUM BEI VERSUCHSBEGINN  
3. PRÜFSUBSTANZ  
Name: …  
Konzentration der Stammlösung: ... mg/l auf Substanz bezogen  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 859
 
Anfangskonzentration im Medium: ... mg/l auf Substanz 
bezogen  
In die Flasche gegebene Gesamtmenge an C (TC): ... mg C  
ThCO  2 : ... mg CO  2 
4. INOKULUM  
Herkunft: ...  
Vorgenommene Behandlung: ...  
Vorbereitung/Konditionierung (soweit zutreffend): ...  
Konzentration der suspendierten Feststoffe im Reaktions ­
gemisch: ... mg/l  
5. KOHLENDIOXIDENTWICKLUNG UND ABBAUBAR ­
KEIT  
Methode: Ba(OH)  2 /NaOH/Sonstige ...  
Zeit 
(Tag) Freigesetztes CO  2 
Test (mg) Freigesetztes CO  2 
Blindversuch (mg) Freigesetztes CO  2 ku­
mulativ (mg) 
(Test — Blindversuch) % ThCO  2 
kumulativ  CO  2 
ThCO  2 Ü 100 
1 
2 Mittelwert 3 
4 Mittelwert 1 2 1 2 Mittelwert  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Anmerkung : Für die Referenzsubstanz sowie für die Toxizitätskon ­
trolle können ähnliche Formblätter verwendet werden.  
6. KOHLENSTOFFANALYSE  (wahlweise)  
Kohlenstoffanalysator: ...  
Zeit (Tag) Blindversuch mg/l Prüfsubstanz mg/l  
0 C  b(o) C o 
28 (*) C  b(t) C t 
(*) oder am Ende der Inkubation.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 860
 
% DOC Abnahme  ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
C o Ä C bðoÞ Î 
Ü 100 
7. ABIOTISCHER ABBAU  (wahlweise) 
% abiotischer Abbau  ¼ CO  2 Ä Bildung Sterilkontrolle nach 28 Tagen  ðmgÞ 
ThCO  2 ðmgÞ Ü 100 
TEIL V:  MANOMETRISCHER RESPIRATIONSTEST  (Me­
thode C.4-D)  
V.l. PRINZIP DER METHODE  
Ein definiertes Volumen des angeimpften mineralischen Mediums 
mit einer bekannten Konzentration der Prüfsubstanz (100 mg/l), die einem ThSB von mindestens 50-100 mg/l entsprechen als einziger 
nomineller Quelle organischen Kohlenstoffs, wird in einer geschlos ­
senen Flasche bei konstanter Temperatur (± 1
 o C oder genauer) bis 
zu 28 Tage gerührt. Der Sauerstoffverbrauch wird entweder durch Messung der (elektrolytisch erzeugten) Sauerstoffmenge bestimmt, 
die erforderlich ist, um in der Respirometerflasche ein konstantes 
Gasvolumen aufrechtzuerhalten, oder aus der Änderung des Volu ­
mens oder Drucks im Gerät (bzw. einer Kombination beider Para ­
meter). Das entstandene Kohlendioxid wird in einer Lösung von 
Kaliumhydroxid oder einem anderen geeigneten Absorptionsmittel 
absorbiert. Die Menge des von der Prüfsubstanz aufgenommenen Sauerstoffs wird (nach Berücksichtigung des entsprechenden Wertes in dem parallel mitgeführten Inokulum-Blindversuch) als prozentua ­
ler Anteil des ThSB oder CSB angegeben. Wahlweise lässt sich 
Totalabbau durch DOC-Analyse, primärer biologischer Abbau auch aus einer ergänzenden spezifischen Analyse errechnen, die zu Beginn und am Ende der Inkubation vorgenommen wird.
 
V.2. BESCHREIBUNG DER METHODE  
V.2.1.  Geräte  
a) geeignetes Respirationsmessgerät  
b) Thermostat mit einer Temperaturkonstanz von ± 1  o C oder ge ­
nauer  
c) Membranfiltrationsgerät (wahlweise)  
d) Kohlenstoffanalysator (wahlweise)  
V.2.2.  Ansatz des mineralischen Mediums  
Zubereitung der Stammlösungen siehe I.6.2.  
10 ml Lösung (a) mit 800 ml Verdünnungswasser mischen, 1 ml der 
Lösungen (b) bis (d) hinzugeben und mit Verdünnungswasser auf 1 l auffüllen.
 
V.2.3.  Ansatz und Vorbereitung des Inokulums  
Das Inokulum kann aus verschiedenen Quellen gewonnen werden: 
aus Belebtschlamm, aus Kläranlagenablauf, aus Oberflächenwasser, 
aus Böden oder aus mehreren dieser Quellen zugleich.  
Vgl. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 und I.6.5.  
V.2.4.  Ansatz der Flaschen  
Lösungen der Prüf- und Referenzsubstanz sind aus den Stammlösun ­
gen in getrennten Ansätzen in einer Konzentration von normaler ­
weise 100 mg/l Substanz entsprechend einem ThSB von mindestens 
50-100 mg/l zuzubereiten.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 861
 
Der ThSB ist auf der Grundlage der Bildung von Ammoniumsalzen 
zu berechnen, sofern nicht eine Nitrifikation zu erwarten ist, bei der 
die Berechnung auf der Grundlage einer Nitratbildung vorzunehmen ist (siehe Anlage 2.2).
 
Die pH-Werte sind zu bestimmen und, falls erforderlich, auf 
7,4 ± 0,2 einzustellen.  
Schwerlösliche Substanzen sollten zu einem späteren Zeitpunkt hin ­
zugegeben werden (siehe unten).  
Wenn die Toxizität der Prüfsubstanz bestimmt werden soll, ist eine 
weitere Lösung in mineralischem Medium anzusetzen, die sowohl die Prüf- als auch die Referenzsubstanz enthält, und zwar in densel ­
ben Konzentrationen wie bei den Einzelansätzen.
 
Soweit die Messung der physikalisch-chemischen Sauerstoffauf ­
nahme erforderlich ist, ist eine durch Zugabe einer geeigneten toxi ­
schen Substanz sterilisierte Lösung mit der Prüfsubstanz, entspre ­
chend einem ThSB von normalerweise 100 mg/l, anzusetzen (vgl. I.6.6).
 
Die erforderliche Menge der Lösungen der Prüf- und der Referenz ­
substanz wird jeweils auf zwei Flaschen verteilt. Daneben sind wei ­
tere Flaschen nur mit dem mineralischen Medium (für die Inokulum- 
Kontrollen) und, falls erforderlich, mit der gemischten 
Prüf-/Referenzlösung und mit der sterilen Lösung anzusetzen.  
Handelt es sich um eine schwerlösliche Prüfsubstanz, wird diese 
gewichts- oder volumenbezogen zu diesem Zeitpunkt direkt in die 
Gefäße gegeben oder nach Anlage 3 behandelt. In die CO  2 -Absorp­
tionsflaschen sind Kaliumhydroxid, Natronkalk-Pellets oder ein an ­
deres Absorptionsmittel zu geben.  
V.2.5.  Anzahl der Flaschen in einem typischen Durchgang  
Flaschen 1 und 2: Prüfsuspension  
Flaschen 3 und 4: Inokulum-Blindwert  
Flasche 5: Verfahrenskontrolle  
Empfohlen und falls notwendig:  
Flasche 6: Sterilkontrolle  
Flasche 7: Toxizitätskontrolle  
Vgl. I.6.7.  
V.2.6.  Durchführung der Prüfung  
Nachdem die Gefäße die gewünschte Temperatur erreicht haben, 
werden sie mit vorbereitetem Belebtschlamm oder einem Inokulum anderer Herkunft in einer Konzentration von nicht mehr als 30 mg 
suspendierter Feststoffe pro Liter beimpft. Danach wird die Ver ­
suchsanordnung zusammengestellt, das Rührgerät angestellt, auf Luftabschluss geprüft und mit der Messung der Sauerstoffaufnahme begonnen. Bis auf die notwendigen Ablesungen sowie täglichen 
Kontrollen der richtigen Temperatur und des erforderlichen angemes ­
senen Rührens ist gewöhnlich kein weiterer Aufwand notwendig.
 
Die Sauerstoffaufnahme ist aus den in regelmäßigen und kurzen 
Abständen abgelesenen Messwerten zu berechnen; dabei sind die 
vom Gerätehersteller angegebenen Methoden zu verwenden. Am Ende der Inkubation, normalerweise nach 28 Tagen, sind die pH- Werte der Flascheninhalte zu messen, insbesondere wenn die Sauer ­
stoffaufnahme niedrig ist bzw. über dem ThSB
 NH4 liegt (für stick ­
stoffhaltige Verbindungen).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 862
 
Falls erforderlich, sind den Respirometerflaschen am Anfang und am 
Ende Proben zur DOC-Analyse oder zur spezifischen Analyse zu ent ­
nehmen (vgl. Anlage 2.4). Bei der ersten Probenahme ist sicherzustellen, dass das Volumen der in der Flasche verbleibenden Prüfsuspension bekannt ist. Im Falle der Sauerstoffaufnahme einer stickstoffhaltigen 
Prüfsubstanz, ist die Zunahme der Nitrit- und Nitratkonzentration über 
einen Zeitraum von 28 Tagen zu bestimmen und der Sauerstoffverbrauch infolge Nitrifikation zu berücksichtigen (Anlage 5).
 
V.3. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT  
V.3.1.  Auswertung der Ergebnisse  
Die Sauerstoffaufnahme (mg) der Prüfsubstanz nach einer vorgege ­
benen Zeit (korrigiert um die Sauerstoffaufnahme der Inokulum- 
Blindkontrolle nach der gleichen Zeit) ist durch das Gewicht der verwendeten Prüfsubstanz zu dividieren. Dadurch erhält man den BSB, ausgedrückt als mg Sauerstoff pro mg Prüfsubstanz:
 
BSB ¼ ðmg O  2 – Aufn : der Prüfsubst : – mg O  2 – Aufn : der Blindkontr :Þ 
ðmg Prüfsubst : in der FlascheÞ 
= mg O  2 pro mg Prüfsubstanz  
Der prozentuale biologische Abbau ist zu berechnen entweder nach:  
% biolog : Abbau ¼ % ThSB ¼ BSB ðmg O  2=mg SubstanzÞ 
ThSB ðmg O  2 SubstanzÞ Ü 100 
oder nach:  
% CSB ¼ BSB ðmg O  2=mg SubstanzÞ 
CSB ðmg O  2 SubstanzÞ Ü 100 
Dabei ist anzumerken, dass diese beiden Verfahren nicht notwendi ­
gerweise denselben Wert ergeben; vorzugsweise sollte das erstere Verfahren angewendet werden.
 
Bei stickstoffhaltigen Prüfsubstanzen ist, je nachdem, ob eine Nitri ­
fikation zu erwarten ist oder nicht, der entsprechende ThSB-Wert (NH
 4 oder NO  3 ) zu verwenden (Anlage 2.2). Bei auftretender, je ­
doch unvollständiger Nitrifikation, ist aus den Veränderungen der 
Nitrit- und Nitratkonzentration ein Korrekturfaktor für den durch 
die Nitrifikation verbrauchten Sauerstoff zu berechnen (Anlage 5).  
Wenn wahlweise Bestimmungen des organischen Kohlenstoffs und/ ­
oder einer Einzelsubstanz vorgenommen werden, ist der prozentuale 
Abbau entsprechend I.7 zu berechnen.  
Sämtliche Ergebnisse sind auf den beigefügten Datenblättern zu pro ­
tokollieren.  
V.3.2.  Gültigkeit der Ergebnisse  
Die Sauerstoffaufnahme des Inokulum-Blindwerts liegt normaler ­
weise bei 20-30 mg/l O  2 und sollte nach 28 Tagen nicht größer 
sein als 60 mg/l. Bei Werten über 60 mg/l sollten die Daten und 
Versuchsdurchführung kritisch überprüft werden. Wenn der pH-Wert außerhalb des Bereichs 6-8,5 liegt und der Sauerstoffverbrauch durch die Prüfsubstanz unter 60 % beträgt, ist der Test mit einer geringeren 
Konzentration der Prüfsubstanz zu wiederholen.
 
Vgl. auch I.5.2.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 863
 
V.3.3.  Abschlussbericht  
Vgl. I.8.  
V.4. DATENBLATT  
Nachstehend ein Beispiel eines Datenblatts.  
MANOMETRISCHER RESPIRATIONSTEST  
1. LABOR  
2. DATUM BEI VERSUCHSBEGINN  
3. PRÜFSUBSTANZ  
Name:  
Konzentration der Stammlösung: ... mg/l  
Anfangskonzentration im Medium, C  o : ... mg/l  
Volumen in der Prüfflasche (V): ... ml  
ThSB/CSB: ... mg O  2 /mg Prüfsubstanz (NH  4 , NO  3 ) 
4. INOKULUM  
Herkunft: ...  
Vorgenommene Behandlung: ...  
Vorbereitung/Konditionierung (soweit zutreffend): ...  
Konzentration der suspendierten Feststoffe im Reaktions ­
gemisch: ... mg/l  
5. SAUERSTOFFAUFNAHME: BIOLOGISCHE ABBAU ­
BARKEIT  
Zeit (Tage) 
0 7 14 21 28  
O 2 -Aufnahme 
(mg) Prüfsub ­
stanz 1 
2 
a, Mittelwert 
O 2 -Aufnahme 
(mg) Blindwert 3 
4 
b, Mittelwert 
Korrigierter 
BSD (mg) (a 1 - b m ) 
(a 2 - b m ) 
BSB pro mg 
Prüfsubstanz ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 864
 
Zeit (Tage) 
0 7 14 21 28  
% Abbau  
BOD 
ThOD Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
Mittelwert (*)  
V = Volumen des Mediums in der Prüfflasche. 
(*) Bei erheblichem Unterschied sollten D  1 und D  2 nicht gemittelt werden.  
Anmerkung : Für die Referenzsubstanz sowie Toxizitätskontrolle kön ­
nen ähnliche Formblätter verwendet werden.  
6. KORREKTUR INFOLGE NITRIFIKATION  (vgl. Anlage 5)  
Tag 0 28 Differenz  
(i) Nitratkonzentration (mg N/l) (N) 
(ii) Sauerstoffäquivalent (4,57 × N × V) (mg) — — (iii) Nitritkonzentration (mg N/l) (N) (iv) Sauerstoffäquivalent (3,43 × N × V) (mg) — — (ii + iv) Gesamtsauerstoffäquivalent — —
 
7. KOHLENSTOFFANALYSE  (wahlweise)  
Kohlenstoffanalysator: ...  
Zeit (Tag) Blindversuch mg/l Prüfsubstanz mg/l  
0 C  b(o) C o 
28 (*) C  b(t) C t 
(*) oder am Ende der Inkubation.  
% DOC Abnahme  ¼ 1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Í Î 
Ü 100 
8. SPEZIFISCHE ANALYSE  (wahlweise)  
S b = Konzentration der Prüfsubstanz in der physikalisch-che ­
mischen (steril-)Kontrolle nach 28 Tagen  
S a = Konzentration in der angeimpften Flasche nach 28 Tagen  
% biologischer Primärabbau  ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
9. ABIOTISCHER ABBAU  (wahlweise)  
a = Sauerstoffverbrauch in sterilen Flaschen nach 28 Tagen (mg)  
Sauerstoffverbrauch pro mg Prüfsubstanz  ¼ a Ü 100 
C o V ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 865
 
(vgl. Abschnitte 1 und 3)  
% abiotischer Abbau  ¼ a Ü 100 
C o V Ü ThSB  
TEIL VI:  GESCHLOSSENER FLASCHENTEST  (Methode 
C.4-E)  
VI.1. PRINZIP DER METHODE  
Die Lösung der Prüfsubstanz im mineralischen Medium, normaler ­
weise in einer Konzentration von 2-5 mg/l, wird mit einer relativ kleinen Anzahl Mikroorganismen einer gemischten Population beimpft und in vollständig gefüllten, verschlossenen Flaschen im 
Dunkeln bei konstanter Temperatur gehalten. Der Abbau wird 28 
Tage lang mittels Analyse des gelösten Sauerstoffs verfolgt. Die von der Prüfsubstanz verbrauchte Sauerstoffmenge, korrigiert um die Aufnahme im parallelen Inokulum-Blindversuch, wird als Pro ­
zent des ThSB oder CSB angegeben.
 
VI.2. BESCHREIBUNG DER METHODE  
VI.2.1.  Geräte  
a) BSB-Flaschen mit Glasstopfen, z. B. 250-300 ml;  
b) Wasserbad oder Inkubator, in dem die Flaschen im Dunkeln bei 
konstanter Temperatur (± 1  o C oder genauer) gehalten werden;  
c) große Glasflaschen (2-5 l) zur Vorbereitung der Medien und zum 
Füllen der BSB-Flaschen;  
d) Sauerstoffelektrode und -messgerät bzw. Ausrüstung und Reagen ­
zien zur Winkler-Titration.  
VI.2.2.  Ansatz des mineralischen Mediums  
Zubereitung der Stammlösungen siehe I.6.2.  
1 ml der Lösungen (a) bis (d) zusammengeben und mit Verdün ­
nungswasser auf 1 l auffüllen.  
VI.2.3.  Ansatz des Inokulums  
Das Inokulum ist normalerweise von Abläufen einer Kläranlage oder 
Anlagen im Labormaßstab, denen vorwiegend häusliche Abwässer zugeleitet werden, zu entnehmen. Alternativ kann ein Inokulum aus Oberflächengewässern verwendet werden. Die Verwendung sollte 
üblicherweise ein Tropfen (0,05 ml) bis 5 ml Filtrat pro Liter Me ­
dium betragen; Versuche können erforderlich werden, um das geeig ­
nete Volumen für den jeweiligen Ablauf zu ermitteln. (Vgl. I.6.4.2 und I.6.5).
 
VI.2.4.  Ansatz der Flaschen  
Das mineralische Medium ist über mindestens 20 min intensiv zu 
belüften. Jede Prüfreihe ist mit mineralischem Medium aus derselben 
Charge durchzuführen. Im Allgemeinen ist das Medium nach 20 h 
Stehen bei der Prüftemperatur gebrauchsfertig. Für Kontrollzwecke ist die Konzentration des gelösten Sauerstoffs zu bestimmen; der Wert sollte bei 20
 o C etwa 9 mg/l betragen. Alle Transfer- und 
Fülloperationen mit luftgesättigtem Medium sind blasenfrei aus ­
zuführen, z. B. durch Verwendung von Ansaughebern.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 866
 
Gruppen von Flaschen zur gleichzeitigen BSB-Bestimmung der Prüf- 
und Referenzsubstanz werden in parallelen Versuchsreihen angesetzt. 
Eine ausreichende Anzahl von BSB-Flaschen — einschließlich der für die Inokulum-Blindversuche — ist so aufzustellen, dass zu den gewünschten Zeitpunkten, z. B. nach 0, 7, 14, 21 und 28 Tagen, 
mindestens Doppelmessungen des Sauerstoffverbrauchs vorgenom ­
men werden können. Wenn das 10-Tage-Fenster erkannt werden soll, können mehr Flaschen erforderlich sein.
 
Die großen Flaschen werden zu etwa einem Drittel ihres Volumens 
mit vollständig belüftetem mineralischem Medium gefüllt. Danach 
wird so viel an Stammlösungen der Prüf- sowie der Referenzsub ­
stanz in getrennte Flaschen gegeben, dass die Endkonzentration der Substanzen im Normalfall nicht größer als 10 mg/l ist. Der Blind ­
kontrolle werden in einer anderen großen Flasche keine chemischen 
Substanzen hinzugesetzt.
 
Um sicherzustellen, dass die Aktivität des Inokulums nicht einge ­
schränkt wird, darf die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in den BSB-Flaschen nicht unter 0,5 mg/l fallen. Dies beschränkt die Kon ­
zentration der Prüfsubstanz auf etwa 2 mg/l. Für schwer abbaubare 
Substanzen und solche mit einem geringen ThSB können jedoch 5- 
10 mg/l verwendet werden. In einigen Fällen kann es ratsam sein, parallele Versuchsreihen mit der Prüfsubstanz in zwei verschiedenen 
Konzentrationen, z. B. 2 und 5 mg/l, anzusetzen. Normalerweise ist 
der ThSB auf der Grundlage der Bildung von Ammoniumsalzen zu berechnen; wenn aber eine Nitrifikation erwartet oder vorausgesetzt werden kann, muss die Berechnung auf der Basis der Nitratbildung 
erfolgen (ThSB
 NO3 : siehe Anlage 2.2). Bei auftretender, jedoch un ­
vollständiger Nitrifikation muss eine Korrektur erfolgen, die die Ver ­
änderungen der analytisch ermittelten Nitrit- und Nitratkonzentration berücksichtigt (Anlage 5).
 
Wenn die Toxizität der Prüfsubstanz bestimmt werden soll (z. B. im 
Falle einer zuvor ermittelten geringen biologischen Abbaubarkeit), ist 
eine zusätzliche Reihe Flaschen notwendig.  
Eine weitere große Flasche ist mit belüftetem mineralischem Me ­
dium (etwa bis zu einem Drittel ihres Volumens) mit Prüf- und Referenzsubstanz zusammen anzusetzen, in Endkonzentrationen wie 
normalerweise in den anderen großen Flaschen.
 
Die Lösungen in den großen Flaschen sind mit dem Ablauf aus einer 
Kläranlage (ein Tropfen oder etwa 0,05 ml auf 5 ml/l) oder mit einem Inokulum anderer Herkunft, z. B. Flusswasser, zu beimpfen 
(vgl. I.6.4.2). Schließlich werden die Lösungen mit Hilfe eines 
Schlauches, der bis zum Boden der Flasche reicht, mit belüftetem mineralischem Medium aufgefüllt, um eine ausreichende Durch ­
mischung zu gewährleisten.
 
VI.2.5.  Anzahl der Flaschen in einem typischen Ansatz  
In einem typischen Ansatz werden folgende Flaschen benötigt:  
— mindestens 10 Flaschen mit Prüfsubstanz und Inokulum (Prüf ­
suspension),  
— mindestens 10 Flaschen nur mit Inokulum (Inokulum-Blindwert),  
— mindestens 10 Flaschen mit Referenzsubstanz und Inokulum 
(Verfahrenskontrolle),  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 867
 
— sowie, falls erforderlich, 6 Flaschen mit der Prüf-, der Referenz ­
substanz und dem Inokulum (Toxizitätskontrolle). Um jedoch 
sicherzustellen, das 10-Tage-Fenster zu erkennen, ist etwa die doppelte Anzahl Flaschen erforderlich.
 
VI.2.6. Durchführung der Prüfung  
Jede zubereitete Lösung wird sofort mit einem Schlauch aus dem 
unteren Viertel (nicht vom Flaschenboden) der entsprechenden gro ­
ßen Flasche auf die jeweilige Gruppe von BSB-Flaschen verteilt, bis 
alle BSB-Flaschen vollständig gefüllt sind. Danach wird leicht an die 
Flaschen geklopft, um mögliche Luftblasen zu entfernen. Die Fla ­
schen zum Zeitpunkt 0 werden sofort nach dem Winkler- oder dem Elektrodenverfahren auf gelösten Sauerstoff analysiert. Der Inhalt der 
Flaschen kann zwecks späterer Analyse durch Zugabe von Mangan- 
(II)-sulfat und Natronlauge (dem ersten Winkler-Reagens) konser ­
viert werden. Die sorgfältig mit einem Stopfen verschlossenen Fla ­
schen, die den fixierten Sauerstoff als braunes Mangan-(III)-oxihy ­
drat enthalten, sind im Dunkeln bei 10-20
 o C nicht länger als 24 h 
aufzubewahren, bevor mit dem Winkler- Verfahren fortgefahren wird. Die verbleibenden parallelen Flaschen werden mit einem Stop ­
fen versehen, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luftblasen in 
den Flaschen eingeschlossen werden, und bei 20
 o C im Dunkeln 
inkubiert. Neben jeder Versuchsreihe führt man eine vollständige Parallelreihe zur Bestimmung des Inokulum-Blindwerts mit. Wäh ­
rend der 28-tägigen Inkubation sind in bestimmten Zeitabständen 
(mindestens einmal wöchentlich) mindestens zwei Flaschen pro Serie zwecks Untersuchung auf gelösten Sauerstoff zu entnehmen.
 
Die wöchentlichen Proben gestatten die Bewertung der prozentualen 
Abnahme in einem 14-Tage-Fenster, während die Probenahme alle 
3-4 Tage die Bestimmung des 10-Tage-Fensters ermöglichen soll, 
wofür jedoch etwa die doppelte Anzahl von Flaschen erforderlich ist.  
Bei stickstoffhaltigen Prüfsubstanzen sind Korrekturen für die Sauer ­
stoffaufnahme infolge Nitrifikation vorzunehmen. Dazu ist die O  2 - 
Elektrodenmethode zur Bestimmung der Konzentration von gelöstem 
Sauerstoff zu verwenden und anschließend zwecks Nitrit- und Nitrat ­
analyse eine Probe aus der BSB-Flasche zu entnehmen. Aus der Zunahme der Nitrit- und Nitratkonzentration ist der Sauerstoffver ­
brauch zu berechnen (siehe Anlage 5).
 
VI.3. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT  
VI.3.1.  Auswertung der Ergebnisse  
Zuerst ist der BSB nach jedem Zeitabschnitt zu berechnen; dazu ist 
die O  2 -Eigenzehrung (mg O  2 /l) des Inokulum-Blindansatzes von dem 
Wert des Prüfansatzes zu subtrahieren. Diese korrigierte Zehrung ist durch die Konzentration (mg/l) der Prüfsubstanz zu dividieren, um so 
den spezifischen BSB, ausgedrückt als mg Sauerstoff pro mg Prüf ­
substanz, zu erhalten. Die prozentuale biologische Abbaubarkeit wird dann durch Dividieren des spezifischen BSB durch den spezifischen ThSB (bestimmt entsprechend Anlage 2.2) oder CSB (bestimmt 
durch Analyse, vgl. Anlage 2.3) wie folgt berechnet:
 
BSB ¼ ðmg O  2 Ä Aufn : Prüfsubst : Ä mg O  2 Ä Aufn : BlindkontrolleÞ 
ðmg Prüfsubst : in der FlascheÞ ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 868
 
= mg O  2 pro mg Prüfsubstanz  
% Abbau ¼ BSB ðmg O  2=mg PrüfsubstanzÞ 
ThSB ðmg O  2=mg PrüfsubstanzÞ Ü 100 
oder 
% Abbau ¼ BSB ðmg O  2=mg PrüfsubstanzÞ 
CSB ðmg O  2=mg PrüfsubstanzÞ Ü 100 
Dabei ist anzumerken, dass diese beiden Verfahren nicht notwendi ­
gerweise denselben Wert ergeben; vorzugsweise sollte das erste Ver ­
fahren verwendet werden.  
Bei stickstoffhaltigen Prüfsubstanzen ist, je nachdem, ob eine Nitri ­
fikation zu erwarten ist oder nicht (Anlage 2.2), der entsprechende 
ThSB-Wert (NH  4 oder NO  3 ) zu verwenden. Bei stattfindender, je ­
doch unvollständiger Nitrifikation ist aus den Veränderungen der Nitrit- und Nitratkonzentration ein Korrekturfaktor für den durch die Nitrifikation verbrauchten Sauerstoff zu berechnen (Anlage 5).
 
VI.3.2.  Gültigkeit der Ergebnisse  
Bei der Impfzehrkontrolle sollte der Sauerstoffverbrauch nach 28 
Tagen 1,5 mg gelösten Sauerstoff pro Liter nicht überschreiten. 
Bei höheren Werten ist eine Überprüfung der Versuchsdurchführung 
vorzunehmen. Die in den Prüfflaschen verbleibende Sauerstoffkon ­
zentration darf zu keinem Zeitpunkt 0,5 mg/l unterschreiten. Solch niedrige Sauerstoffkonzentrationen sind nur gültig, wenn das zur 
Bestimmung des gelösten Sauerstoffs verwendete Verfahren in der 
Lage ist, solche Konzentrationen genau zu messen.
 
Vgl. auch I.5.2.  
VI.3.3.  Abschlussbericht  
Vgl. I.8.  
VI.4. DATENBLATT  
Nachstehend ein Beispiel eines Datenblatts  
GESCHLOSSENER FLASCHENTEST  
1. LABOR  
2. DATUM BEI VERSUCHSBEGINN  
3. PRÜFSUBSTANZ  
Name:  
Konzentration der Stammlösung: ... mg/l  
Anfangskonzentration in der Flasche: ... mg/l  
ThSB bzw. CSB: ... mg O  2 /mg Prüfsubstanz  
4. INOKULUM  
Herkunft: ...  
Vorgenommene Behandlung: ...  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 869
 
Vorbereitung/Konditionierung (falls zutreffend): ...  
Konzentration im Reaktionsgemisch: ... ml/l  
5. DO-BESTIMMUNG  
Methode: Winkler- oder Elektrodenverfahren  
Flaschenanalysen  
Inkubationszeit (d) DO (mg/l) 
0 n  1 n 2 
Blindwert (ohne 
Prüfsubstanz) 1 C  1 
2 C  2 
Mittelwert 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Prüfsubstanz 1 a  1 
2 a  2 
Mittelwert 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Anmerkung : Für die Referenzsubstanz sowie Toxizitätskontrolle kön ­
nen ähnliche Formblätter verwendet werden.  
6. KORREKTUR INFOLGE NITRIFIKATION  (vgl. Anlage 5)  
Inkubationszeit (d) 0 n  1 n 2 n 3 
(i) Nitratkonzentration (mg N/l) 
(ii) Änderung der Nitratkonzentration (mg N/l) — (iii) Sauerstoffäquivalent (mg/l) — (iv) Nitritkonzentration (mg N/l) (v) Änderung der Nitritkonzentration (mg N/l) — (vi) Sauerstoffäquivalent (mg/l) — (iii + vi) Sauerstoffäquivalent insges. (mg/l) —
 
7. DO-ZEHRUNG: % ABBAU  
Zehrung nach n Tagen (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
FLASCHE 1: (m  to - m  tx — (m  bo - m  bx ) 
FLASCHE 2: (m  to - m  tx ) — (m  bo - m  bx ) ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 870
 
Zehrung nach n Tagen (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
FLASCHE 1: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
conc : of test Ü ThOD chemical 
FLASCHE 2: 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
conc : of test Ü ThOD chemical 
ðäÞ D 1 Ä D 2 
2 
(*) Nicht mitteln bei starker Abweichung der Parallelansätze.  
m t0 = Wert in der Prüfflasche zur Zeit 0  
m tx = Wert in der Prüfflasche zur Zeit x  
m bo = Mittelwert Blindansatz zur Zeit 0  
m bx = Mittelwert Blindansatz zur Zeit x  
Außerdem ist die Korrektur infolge Nitrifikation aus iii + iv in 
Abschnitt 6 vorzunehmen.  
8. DO-ZEHRUNG IM INOKULUM-BLINDANSATZ  
Sauerstoffverbrauch im Blindversuch: (m  bo - m  b28 ) mg/l. Dieser 
Verbrauch ist wichtig für die Gültigkeit des Tests. Er sollte unter 1,5 mg/l liegen.
 
TEIL VII:  MITI-TEST  (Methode C.4-F)  
VII.1. PRINZIP DER METHODE  
Das Prinzip der Methode besteht in der automatischen Messung der 
Sauerstoffaufnahme durch eine gerührte Lösung oder Suspension der 
Prüfsubstanz in einem mit speziell gezüchteten, nicht adaptierten Mikroorganismen angeimpften mineralischen Medium; die Messung erfolgt über einen Zeitraum von 28 Tagen in einem abgedunkelten, 
geschlossenen Respirationsmessgerät bei 25 ± 1
 o C. Das entstehende 
Kohlendioxid wird durch Natronkalk absorbiert. Die biologische Ab ­
baubarkeit wird als prozentuale Sauerstoffaufnahme (nach Berück ­
sichtigung der Aufnahme aus dem Blindansatz) auf der Grundlage 
der theoretischen Aufnahme (ThSB) angegeben. Zusätzlich wird der 
Grad des biologischen Primärabbaus aus der ergänzenden spezi ­
fischen Analyse errechnet, die zu Beginn und am Ende der Inkuba ­
tion vorgenommen wird, wahlweise auch durch DOC-Analyse.  
VII.2. BESCHREIBUNG DER METHODE  
VII.2.1.  Geräte  
a) Automatisches elektrolytisches BSB-Messgerät oder Respiro ­
meter, normalerweise ausgestattet mit 6 Flaschen zu je 300 ml 
mit Bechern für das CO  2 -Absorbens;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 871
 
b) Klimakammer und/oder Wasserbad mit 25  o C ± 1  o C oder ge ­
nauer;  
c) Membranfiltrationsgerät (wahlweise);  
d) Kohlenstoffanalysator (wahlweise).  
VII.2.2.  Ansatz des mineralischen Mediums  
Die folgenden Stammlösungen sind unter Verwendung von Reagen ­
zien des Reinheitsgrades zur Analyse (p. a.) und Wasser (I.6.1) an ­
zusetzen: 
a) Kaliumdihydrogenorthophosphat, KH  2 PO 4 8,50 g 
Dikaliummonohydrogenorthophosphat, K  2 HPO  4 21,75 g 
Dinatriummonohydrogenorthophosphat-Dodecahy ­
drat, Na  2 HPO  4 .12 H  2 O 44,60 g 
Ammoniumchlorid, NH  4 Cl 1,70 g 
in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefüllt; der pH-Wert der Lösung sollte 7,2 betragen, 
b) Magnesiumsulfat-Heptahydrat, MgSO
 4 .7 H  2 O 22,50 g 
in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefüllt. 
c) Calciumchlorid, wasserfrei, CaCl  2 27,50 g 
in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefüllt. 
d) Eisen(III)chlorid-Hexahydrat, FeCl  3 .6 H  2 O 0,25 g 
in Wasser gelöst und auf 1 l aufgefüllt.  
Je 3 ml der Lösungen a, b, c, d zusammengeben und auf 1 l auf ­
füllen.  
VII.2.3.  Ansatz des Inokulums  
Es sind frische Proben an mindestens zehn Orten zu entnehmen, 
vorzugsweise aus Gebieten, in denen eine Vielzahl chemischer Sub ­
stanzen verwendet und eingetragen werden. An solchen Orten wie 
kommunalen Kläranlagen, Industriekläranlagen, Flüssen, Seen oder 
dem Meer sind 1-l-Proben Belebtschlamm, Oberboden, Wasser usw. zu entnehmen und gründlich zu durchmischen. Nach Entfernen auf ­
schwimmender Stoffe wird die Probe stehen gelassen und der Über ­
stand mit Natronlauge oder Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 7 
± 1 eingestellt.
 
Ein geeignetes Volumen des abfiltrierten Überstands wird in ein 
Belebtschlammgefäß gefüllt und etwa 23 1/2 h belüftet. Eine halbe Stunde nach Abschalten der Belüftung wird etwa ein Drittel des gesamten Überstands entnommen und das gleiche Volumen einer 
Lösung (pH 7), aus jeweils 0,1 % Glukose, Pepton und Kaliumortho ­
phosphat, dem abgesetzten Material hinzugefügt und weiterbelüftet. Diese Schritte sind täglich zu wiederholen. Die Belebtschlammanlage ist unter Beachtung folgender Kriterien ordnungsgemäß zu betreiben: 
Der Überstand sollte klar sein und einen pH-Wert von 7 ± 1 auf ­
weisen, die Temperatur sollte 25 ± 2
 o C betragen, der Schlamm 
sollte sich gut absetzen, die Anlage sollte ausreichend belüftet wer ­
den, um die Mischung jederzeit aerob zu halten, es sollten Protozoa 
vorhanden sein, und die Aktivität des Schlamms sollte mindestens 
alle 3 Monate mit einer Referenzsubstanz überprüft werden. Vor Verwendung einer Schlammprobe als Inokulum muss die Anlage mindestens einen Monat, aber nicht länger als 4 Monate in Betrieb 
gewesen sein. Danach sind in regelmäßigen Abständen, alle 3 Mo ­
nate, Proben an mindestens 10 Orten zu entnehmen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 872
 
Um frischen und alten Belebtschlamm bei gleicher Aktivität zu hal ­
ten, wird der filtrierte Überstand des alten, bereits in der Prüfung 
verwendeten Belebtschlamms mit einem gleichen Teil Überstands ­
filtrat einer frisch gewonnenen Mischung von zehn Orten gemischt. Die Gesamtmischung wird wie beschrieben weitergezüchtet. Als Ino ­
kulum sind Schlammproben erst 18-24 h nach Beschickung der An ­
lage zu verwenden.
 
VII.2.4.  Ansatz der Flaschen  
Es sind folgende sechs Flaschen anzusetzen:  
Nr. 1: 100 mg/l Prüfsubstanz in Verdünnungswasser  
Nr. 2, 3 und 4: 100 mg/l Prüfsubstanz in mineralischem Medium  
Nr. 5: 100 mg/l Referenzsubstanz (z. B. Anilin) in mineralischem 
Medium  
Nr. 6: nur mineralisches Medium  
Schwerlösliche Prüfsubstanzen werden gewichts- oder volumenbezo ­
gen direkt in die Flasche gegeben oder entsprechend Anlage 3 be ­
handelt (mit der Abweichung, dass weder Lösungsmittel noch Emul ­
gatoren verwendet werden dürfen). Das CO  2 -Absorbens wird allen 
Flaschen in die dafür vorgesehenen Behälter gegeben und der pH- Wert in den Flaschen Nr. 2, 3 und 4 auf 7,0 eingestellt.
 
VII.2.5.  Durchführung der Prüfung  
Die Flaschen Nr. 2, 3 und 4 (Prüfsuspensionen), Nr. 5 (Aktivitäts ­
prüfung) und Nr. 6 (Inokulum-Blindversuch) werden mit einer ge ­
ringen Menge Inokulum angeimpft, um eine Konzentration an sus ­
pendierten Feststoffen von 30 mg/l zu erhalten. Flasche Nr. 1, die als 
abiotische Kontrolle dient, erhält kein Inokulum. Anschließend ist die Versuchsanordnung aufzubauen, auf Luftabschluss zu prüfen, die Rührgeräte anzustellen und mit der Messung der Sauerstoffauf ­
nahme im Dunkeln zu beginnen. Es sind tägliche Kontrollen der 
Temperatur, des Rührgeräts und des coulometrischen Registriergeräts für die Sauerstoffaufnahme vorzunehmen und eventuelle Farbände ­
rungen des Flascheninhalts zu protokollieren. Die Sauerstoffauf ­
nahme für die sechs Flaschen ist direkt mit Hilfe eines geeigneten 
Geräts, zum Beispiel am Sechsfachschreiber abzulesen, der eine BSB-Kurve erzeugt. Am Ende der Inkubation, normalerweise nach 28 Tagen, sind die pH-Werte der Flascheninhalte zu messen und die 
Konzentration der restlichen Prüfsubstanz sowie möglicher Abbau ­
produkte und, im Falle wasserlöslicher Stoffe, die DOC-Konzentra ­
tion zu bestimmen (Anlage 2.4). Besondere Vorsicht ist bei flüchti ­
gen Substanzen geboten. Ist eine Nitrifikation zu erwarten, sind — 
wenn möglich — Nitrat- und Nitritkonzentration zu bestimmen.
 
VII.3. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT  
VII.3.1.  Auswertung der Ergebnisse  
Die Sauerstoffaufnahme (mg) durch die Prüfsubstanz nach einer vor ­
gegebenen Zeit (korrigiert um die Sauerstoffaufnahme der Inokulum- 
Blindkontrolle nach der gleichen Zeit) ist durch die Menge der ver ­
wendeten Prüfsubstanz zu dividieren. Dadurch erhält man den BSB, angegeben als mg Sauerstoff pro mg Prüfsubstanz:
 
BSB ¼ ðmg O  2 Ä Aufn : Prüfsubst : Ä mg O  2 Ä Aufn : BlindkontrolleÞ 
ðmg Prüfsubst : in der FlascheÞ 
= mg O  2 pro mg Prüfsubstanz  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 873
 
Der prozentuale biologische Abbau ist dann wie folgt zu berechnen:  
% biolog : Abbau ¼ % ThSB ¼ BSB ðmg O  2=mg PrüfsubstanzÞ 
ThSB ðmg O  2=mg PrüfsubstanzÞ Ü 100 
Bei Mischungen ist der ThSB aus der Elementanalyse — wie für 
einfache Verbindungen — zu berechnen. Der zu verwendende 
ThSB-Wert (ThSB  NH4 oder ThSB  NO3 ) richtet sich danach, ob keine 
oder eine vollständige Nitrifikation stattgefunden hat (Anlage 2.2). Bei auftretender, jedoch unvollständiger Nitrifikation, ist ein Korrek ­
turfaktor für den durch die Nitrifikation verbrauchten Sauerstoff aus 
den Änderungen der Nitrit- und Nitratkonzentration zu berechnen 
(Anlage 5).
 
Der prozentuale biologische Primärabbau wird aus dem Verlust an 
spezifischer (Ausgangs-)Substanz ermittelt (vgl. I.7.2).  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 %  
Wird in Flasche Nr. 1 bei der Bestimmung des physikalisch-che ­
mischen Abbaus ein Verlust an Prüfsubstanz festgestellt, so ist dies zu protokollieren und die Konzentration der Prüfsubstanz (S
 b ) nach 
28 Tagen in dieser Flasche zur Berechnung des prozentualen biolo ­
gischen Abbaus zu verwenden.  
Wenn DOC-Bestimmungen vorgenommen werden (wahlweise), dann 
ist der prozentuale biologische Endabbau entsprechend I.7.1. aus  
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Í Î 
Ü 100 %  
zu berechnen. Wird in Flasche Nr. 1 bei der Bestimmung des phy ­
sikalisch-chemisch bedingten Abbaus eine Abnahme an DOC fest ­
gestellt, so ist die DOC-Konzentration in dieser Flasche zur Berech ­
nung des prozentualen biologischen Abbaus zu verwenden.  
Sämtliche Ergebnisse sind auf den beigefügten Datenblättern zu pro ­
tokollieren.  
VII.3.2.  Gültigkeit der Ergebnisse  
Die Sauerstoffaufnahme in dem Inokulum-Blindansatz liegt norma ­
lerweise bei 20-30 mg/l O  2 und sollte nach 28 Tagen einen Wert von 
60 mg/l nicht überschreiten. Bei Werten über 60 mg/l sollten die Daten und die Versuchsdurchführung kritisch überprüft werden. Liegt der pH-Wert außerhalb des Bereichs 6-8,5 und der Sauerstoff ­
verbrauch durch die Prüfsubstanz unter 60 %, ist der Test mit einer 
geringeren Konzentration an Prüfsubstanz zu wiederholen.
 
Vgl. auch I.5.2.  
Wenn der aus dem Sauerstoffverbrauch berechnete prozentuale Ab ­
bau des Anilins nach 7 Tagen nicht mehr als 40 % und nach 14 
Tagen nicht mehr als 65 % beträgt, wird der Test als ungültig be ­
trachtet.  
VII.3.3.  Abschlussbericht  
Vgl. I.8.  
VII.4. DATENBLATT  
Nachstehend ein Beispiel eines Datenblatts  
MITI-(I)-TEST  
1. LABOR  
2. DATUM BEI VERSUCHSBEGINN  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 874
 
3. PRÜFSUBSTANZ  
Name:  
Konzentration der Stammlösung: ... mg/l auf Substanz bezogen  
Anfangskonzentration im Medium, C  o : ... mg/l auf Substanz 
bezogen  
Volumen des Reaktionsgemisches, V: ... ml  
ThSB: ... mg O  2 /l 
4. INOKULUM  
Entnahmeorte: 
1) … 6) … 
2) … 7) … 
3) … 8) … 
4) … 9) … 5) … 10) …
 
Konzentration der suspendierten Feststoffe im Belebtschlamm 
nach Akklimatisierung mit synthetischen Abwässern = ... mg/l  
Menge Belebtschlamm pro Liter im Versuchsansatz = ... ml  
Konzentration des Schlamms im Versuchsansatz = ... mg/l  
5. SAUERSTOFFAUFNAHME: BIOLOGISCHE ABBAU ­
BARKEIT  
Verwendeter respirometertyp:  
Zeit (Tage) 
0 7 14 21 28  
Aufnahme (mg) 
Prüfsubstanz a 1 
a 2 
a 3 
O 2 Aufnahne (mg) 
Blindwert b 
Korrigierte O  2 - 
Aufnahne (mg) (a 1 - b) 
(a 2 - b) 
(a 3 - b) 
BSB pro mg 
Prüfsubstanz ða Ä bÞ 
C o V Flasche 1 
Flasche 2 Flasche 3 
% Abbau
 
BOD 
ThOD Ü 100 1 
2 
3 
Mittelwert (*)  
(*) Bei erheblichem Unterschied sollten die Parallelansätze nicht gemittelt werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 875
 
Anmerkung : Für die Referenzsubstanz sowie Toxizitätskontrolle kön ­
nen ähnliche Formblätter verwendet werden.  
6. KOHLENSTOFFANALYSE  (wahlweise) : 
Kohlenstoffanalysator: ...  
Flasche DOC 
%DOC-Abnahme Mittelwert 
Gemessener Korrigierter  
Wasser + Prüfsubstanz a — — 
Schlamm + Prüfsubstanz b  1 b 1 - c 
Schlamm + Prüfsubstanz b  2 b 2 - c 
Schlamm + Prüfsubstanz b  3 b 3 - c 
Blindkontrolle c — — —  
% DOC Abnahme:  a 1 Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100 
7. DATEN AUS DER SPEZIFISCHEN ANALYSE  
Restliche Menge an Prüfsubstanz zu 
Versuchsende % Abbau  
Blindversuch mit Wasser S  b 
Angeimpftes Medium S a1 
S a2 
S a3 
% Abbau ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Der prozentuale Abbau ist für die Flaschen a1, a2 bzw. a3 zu 
berechnen  
8. ANMERKUNGEN  
Nach Möglichkeit ist die BSB-Zeit-Kurve beizufügen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 876
 
Anlage 1  
ABKÜRZUNGEN UND DEFINITIONEN  
DO: Gelöster Sauerstoff (Dissolved Oxygen) (mg/l) — Konzentration des in 
einer wässrigen Probe gelösten Sauerstoffs.  
BSB: Biochemischer Sauerstoffbedarf (g) — von den Mikroorganismen beim 
Abbau einer Prüfsubstanz verbrauchte Sauerstoffmenge; auch angege ­
ben als g Sauerstoffaufnahme pro g Prüfsubstanz (vgl. Methode C.5).  
CSB: Chemischer Sauerstoffbedarf (g) — bei der Oxidation einer Prüfsub ­
stanz mit heißem, saurem Dichromat verbrauchte Sauerstoffmenge; Maß 
für die vorhandene Menge an oxidierbarer Substanz; auch angegeben 
als g Sauerstoffverbrauch pro g Prüfsubstanz (vgl. Methode C.6).  
DOC: Gelöster organischer Kohlenstoff (Dissolved Organic Carbon) — 
Menge an organischem Kohlenstoff, die in der Lösung vorliegt oder 
ein Filter mit 0,45 um Porengröße passiert bzw. nach 15 Minuten Zen ­
trifugieren bei 40 000 m/s  –2 (± 4 000 g) im Überstand verbleibt.  
ThSB: Theoretischer Sauerstoffbedarf (mg) — Gesamtmenge an Sauerstoff, die 
zur vollständigen Oxidation einer Substanz erforderlich ist; wird aus der 
Summenformel berechnet (siehe Anlage 2.2); auch angegeben als mg 
Sauerstoffbedarf pro mg Prüfsubstanz.  
ThCO  2 : Theoretisches Kohlendioxid (mg) — Kohlendioxidmenge, die sich rech ­
nerisch aus dem bekannten oder gemessenen Kohlenstoffgehalt der 
Prüfsubstanz bei vollständiger Mineralisation ergibt; auch angegeben 
als mg Kohlendioxidentwicklung pro mg Prüfsubstanz.  
TOC: Gesamter organischer Kohlenstoff (Total Organic Carbon) einer Probe 
— Summe des organischen Kohlenstoffs in Lösung und in Suspension.  
IC: Anorganischer Kohlenstoff (Inorganic Carbon).  
TC: Gesamtkohlenstoff (Total Carbon) — Summe des in einer Probe ent ­
haltenen organischen und anorganischen Kohlenstoffs.  
Biologischer Primärabbau:  
durch biologische Prozesse in der chemischen Struktur einer Substanz herbei ­
geführte Veränderung, die zum Verlust spezifischer Eigenschaften dieser Sub ­
stanz führt.  
Biologischer Gesamtabbau (aerob):  
der nach vollständiger Umsetzung durch Mikroorganismen erreichte Abbaugrad 
der Prüfsubstanz unter Erzeugung von Kohlendioxid, Wasser, Mineralsalzen und neuen mikrobiellen Zellbestandteilen (Biomasse).
 
biologisch leicht abbaubar:  
ein willkürlich festgelegter Begriff für eine Kategorie von chemischen Substan ­
zen, die bestimmte Screening-Tests auf vollständige biologische Abbaubarkeit durchlaufen haben; diese Tests sind so stringent, dass angenommen wird, dass 
diese Substanzen im aquatischen Milieu unter aeroben Bedingungen schnell und 
vollständig biologisch abgebaut werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 877
 
potenziell biologisch abbaubar:  
ein Begriff für eine Kategorie von chemischen Substanzen, deren biologische 
Abbaubarkeit (primär oder vollständig) eindeutig in einem beliebigen, anerkann ­
ten Test auf biologische Abbaubarkeit nachgewiesen worden ist.  
in einer Kläranlage abbaubar:  
Eigenschaft chemischer Substanzen, im Verlauf der biologischen Abwasser ­
behandlung entfernt zu werden, ohne dass der normale Betrieb der Klärprozesse negativ beeinträchtigt wird. Im Allgemeinen sind biologisch leicht abbaubare Substanzen in einer Kläranlage abbaubar, nicht aber alle potenziell abbaubaren 
Substanzen. Hier können auch abiotische Prozesse stattfinden.
 
Lag-Phase  
in einem Abbaubarkeitstest die Zeit zwischen der Animpfung und dem Zeitpunkt, 
zu dem der prozentuale Abbau mindestens 10 % erreicht hat. Die Lag-Phase ist 
häufig sehr variabel und schwer reproduzierbar.  
Abbauzeit  
Zeit vom Ende der Lag-Phase bis zu dem Zeitpunkt, zu dem 90 % des maxi ­
malen Abbauwerts erreicht sind.  
10- Tage-Fenster  
der 10-Tage-Abschnitt, der unmittelbar auf das Erreichen von 10 % Abbau folgt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 878
 
Anlage 2  
BERECHNUNG UND BESTIMMUNG GEEIGNETER SUMMENPARA ­
METER  
Je nach der gewählten Methode werden bestimmte Summenparameter benötigt. 
Nachfolgend wird die Ableitung dieser Werte beschrieben. Die Verwendung 
dieser Parameter wird bei den einzelnen Methoden angegeben.  
1. Kohlenstoffgehalt  
Der Kohlenstoffgehalt wird aus der bekannten Elementzusammensetzung 
berechnet oder durch Elementanalyse der Prüfsubstanz bestimmt.  
2. Theoretischer Sauerstoffbedarf (ThSB)  
Der Theoretische Sauerstoffbedarf (ThSB) kann berechnet werden, wenn 
die Summenformel bekannt ist oder durch Elementaranalyse bestimmt wird. Für die Substanz
 
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
beträgt sie ohne Nitrifikation  
ThSB  NH4 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW mg=mg 
bzw. mit Nitrifikation  
ThSB  NO3 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW mg=mg 
3. Chemischer Sauerstoffbedarf (CSB)  
Der Chemische Sauerstoffbedarf (CSB) wird nach Methode C.6 bestimmt.  
4. Gelöster organischer Kohlenstoff (DOC)  
Gelöster organischer Kohlenstoff (DOC) ist per definitionem der organische 
Kohlenstoff, der bei Filtration einer chemischen Substanz oder Gemischs in 
Wasser durch ein Filter mit 0,45 m Porengröße in dieser verbleibt.  
Dazu werden Proben aus den Prüfgefäßen entnommen und sofort im Filtra ­
tionsgerät unter Verwendung eines geeigneten Membranfilters filtriert. Die 
ersten 20 ml (diese Menge kann bei Verwendung kleiner Filter verringert 
werden) des Filtrats werden verworfen. 10-20 ml oder — bei Injektion — weniger (je nach der für den Kohlenstoffanalysator benötigten Menge) wer ­
den für die Kohlenstoffanalyse zurückbehalten. Die DOC-Konzentration wird 
mit Hilfe eines organischen Kohlenstoffanalysators bestimmt, der eine genaue 
Messung einer Kohlenstoffkonzentration von 10 % oder weniger der im Ver ­
such verwendeten DOC-Ausgangs-Konzentration ermöglichen muss.
 
Filtrierte Proben, die am selben Arbeitstag nicht mehr analysiert werden 
können, können 48 h im Kühlschrank bei 2-4  o C bzw. über längere Zeit ­
räume bei Temperaturen unter - 18  o C aufbewahrt werden.  
Anmerkungen:  
Membranfilter  sind häufig mit oberflächenaktiven Substanzen versehen, die 
ihnen hydrophile Eigenschaften verleihen. Daher kann der Filter bis zu mehre ­
ren mg löslichen organischen Kohlenstoff enthalten, der die Bestimmung der 
biologischen Abbaubarkeit beeinträchtigt. Um die oberflächenaktiven Substan ­
zen sowie andere lösliche organische Verbindungen aus den Filtern zu entfer ­
nen, werden diese 3 × jeweils 1 Stunde in deionisiertem Wasser gekocht. Danach können die Filter eine Woche in Wasser aufbewahrt werden. Bei Ver ­
wendung von Einwegfilterpatronen ist jede einzelne darauf zu überprüfen, dass 
sie keinen löslichen organischen Kohlenstoff freisetzt.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 879
 
Bestimmte Membranfilter haben die Eigenschaft, die Prüfsubstanz zu ad ­
sorbieren. Es wird daher empfohlen, die Filter in dieser Hinsicht zu über ­
prüfen.  
Anstelle der Filtration kann zur Differenzierung von TOC und DOC eine 
15-minütige  Zentrifugation  bei 40 000 m/s  -2 (4 000 g) vorgenommen wor ­
den. Allerdings ist dieses Verfahren bei einer Ausgangskonzentration 
< 10 mg/l DOC nicht zuverlässig, da entweder nicht alle Bakterien beseitigt 
werden oder aber der Kohlenstoff als Bestandteil des Bakterienplasmas erneut gelöst wird.
 
LITERATUR  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed, Am. Publ. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen De ­
mand, 1965, 65.  
— Wagner, R. Von Wasser, 1976, Vol. 46, 139.  
— DIN-Entwurf 38 409 Teil 41 — Deutsches Einheitsverfahren zur Was ­
ser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- 
und Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des chemischen Sauer ­
stoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuss Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e. V.
 
— Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble com ­
pounds. Chemosphere, 1984, Vol. 13 (1), 169.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 880
 
Anlage 3  
BEWERTUNG DER BIOLOGISCHEN ABBAUBARKEIT VON 
SCHWERLÖSLICHEN SUBSTANZEN  
Bei Bioabbaubarkeitstests mit schwerlöslichen Substanzen ist folgenden Aspek ­
ten besondere Aufmerksamkeit zu schenken.  
Während homogene Flüssigkeiten selten Probleme bei der Probenahme bereiten, 
wird empfohlen, Feststoffe durch geeignete Mittel zu homogenisieren, um so 
durch Inhomogenität bedingte Fehler zu vermeiden. Besondere Vorsicht ist ge ­
boten, wenn repräsentative Proben von nur wenigen mg von Mischungen bzw. Substanzen, die reich an Verunreinigungen sind, benötigt werden.
 
Während der Prüfungen können verschiedene Bewegungsvorgänge angewandt 
werden. Dabei sollte darauf geachtet werden, dass nur so viel bewegt wird, 
um die Substanz gut zu verteilen, und dass ein Überhitzen, übermäßige Schaum ­
bildung sowie übermäßige Scherkräfte vermieden werden.  
Ein Emulgator, der der Substanz eine stabile Dispersion verleiht, kann verwendet 
werden. Dieser sollte allerdings nicht bakterientoxisch sein und darf unter den 
Bedingungen des Versuchs einem biologischen Abbau nicht unterliegen oder Schaum bilden.
 
Dieselben Kriterien wie für Emulgatoren gelten für Lösungsmittel.  
Es wird davon abgeraten, für feste Prüfsubstanzen feste Trägerstoffe zu verwen ­
den; für ölige Substanzen können diese allerdings geeignet sein.  
Wenn Hilfsstoffe, wie z. B. Emulgatoren, Lösungsmittel und Trägerstoffe, ver ­
wendet werden, ist ein Blindversuch mit dem Hilfsstoff mitzuführen.  
Zur Prüfung der biologischen Abbaubarkeit von schwerlöslichen Substanzen 
kann jeder der drei respirometrischen Tests — CO  2 , BSB, MITI — eingesetzt 
werden.  
LITERATUR  
— de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, Vol. 16, 833.  
— Gerike, P. The Biodegradabilicy testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, Vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 881
 
Anlage 4  
BEURTEILUNG DER BIOLOGISCHEN ABBAUBARKEIT VON 
CHEMISCHEN SUBSTANZEN, BEI DENEN VERDACHT AUF 
TOXIZITÄT GEGENÜBER DEM INOKULUM BESTEHT  
Wenn eine Prüfsubstanz auf leichte biologische Abbaubarkeit getestet wird und 
biologisch nicht abbaubar scheint, wird folgendes Verfahren empfohlen, um 
zwischen Hemmung und stoffbedingter Nichtabbaubarkeit zu unterscheiden (Reynolds et al., 1987).
 
Für die Toxizitätsprüfung und den Test auf biologische Abbaubarkeit sind ähn ­
liche oder gleiche Inokula zu verwenden.  
Zur Bewertung der Toxizität von Prüfsubstanzen, die auf leichte biologische 
Abbaubarkeit getestet werden, erscheint die Anwendung einer oder einer Kom ­
bination der folgenden Methoden geeignet: Belebtschlamm: Prüfung der At ­
mungshemmung — Richtlinie 88/302/EWG, BSB und/oder Wachstumshem ­
mung.  
Um eine toxizitätsbedingte Hemmung zu vermeiden, wird empfohlen, dass die 
bei den Tests auf leichte biologische Abbaubarkeit verwendeten Prüfsubstanz ­
konzentrationen unter 1/10 der EC  50 -Werte (oder unter den EC  20 -Werten) aus 
dem Toxizitätsversuch liegen. Bei Verbindungen, deren EC  50 -Wert über 300 mg/l 
liegt, sind toxische Wirkungen bei Prüfungen auf leichte biologische Abbaubar ­
keit unwahrscheinlich.  
Bei EC  50 -Werten unter 20 mg/l sind bei den nachfolgenden Tests ernste Pro ­
bleme zu erwarten. Es müssen niedrige Prüfkonzentrationen verwendet werden, die allerdings die Anwendung des stringenten und empfindlichen Geschlossenen 
Flaschentests bzw. die Verwendung von
 14 C-markiertem Material erforderlich 
machen. Alternativ dazu kann ein akklimatisiertes Inokulum die Verwendung höherer Prüfkonzentrationen erlauben. Im letzteren Falle geht das spezifische Kriterium der leichten biologischen Abbaubarkeit jedoch verloren.
 
LITERATUR  
Reynolds, L. et al. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, Vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 882
 
Anlage 5  
BERÜCKSICHTIGUNG DER SAUERSTOFFAUFNAHME INFOLGE 
NITRIFIKATION  
Bei Prüfsubstanzen, die keinen Stickstoff enthalten, sind Fehler, die durch Nicht ­
berücksichtigung der Nitrifikation bei der Bewertung der biologischen Abbaubar ­
keit anhand der Sauerstoffaufnahme entstehen, von marginaler Bedeutung (nicht 
größer als 5 %), selbst wenn die Oxidation des Ammonium-N im Medium zwischen dem Prüf- und dem Blindansatz gelegentlich schwankt. Bei stickstoff ­
haltigen Prüfsubstanzen kann es jedoch zu schweren Fehlern kommen.
 
Bei auftretender, jedoch unvollständiger Nitrifikation kann die Sauerstoffauf ­
nahme durch das Reaktionsgemisch um den Sauerstoffverbrauch durch Oxidation 
von Ammonium zu Nitrit und Nitrat korrigiert werden, wenn die Konzentrations ­
änderungen von Nitrit und Nitrat während der Inkubation bestimmt und durch folgende Gleichungen berücksichtigt werden: 
2 NH
 4 Cl + 3 O  2 = 2 HNO  2 + 2 HCl + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
insgesamt: 2 NH
 4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  2 O (3)  
Aus Gleichung (1) ergibt sich, dass die Sauerstoffaufnahme zur Oxidation von 
28 g Stickstoff [Bestandteil von Ammoniumchlorid (NH  4 Cl)] zu Nitrit 96 g 
beträgt; dies entspricht einem Faktor von 3,43 (96/28). Auf die gleiche Weise 
ergibt sich aus Gleichung (3) für die Oxidation von 28 g Stickstoff zu Nitrat eine 
Sauerstoffaufnahme von 128 g; dies entspricht einem Faktor von 4,57 (128/28).  
Da es sich hier um aufeinander folgende Reaktionen handelt, die auf verschie ­
dene Bakterienarten zurückzuführen sind, kann die Nitritkonzentration zu- oder 
abnehmen; im letzteren Falle würde eine äquivalente Nitratkonzentration gebildet. 
Der bei der Nitratbildung verbrauchte Sauerstoff beträgt daher 4,57, multipliziert mit der Konzentrationszunahme des Nitrats, wohingegen der bei der Nitritbildung verbrauchte Sauerstoff 3,43 beträgt, multipliziert mit der Konzentrationszunahme 
des Nitrits. Bei einer Nitritabnahme beträgt der Sauerstoffverlust - 3,43, multi ­
pliziert mit der Abnahme der Konzentration.
 
Das heißt: 
der bei der Nitratbildung verbrauchte O  2 = 4,57 × Zunahme in 
N-Nitratkonzentration (4) 
und 
der bei der Nitritbildung verbrauchte O  2 = 3,43 × Zunahme in 
N-Nitritkonzentration (5) 
und 
O 2 -Verlust bei der Nitritabnahme = Abnahme der N-Nitritkon ­
zentration × - 3,43 (6) 
so dass 
O 2 -Aufnahme infolge Nitrifikation = ± 3,43 × Änderung der N- 
Nitritkonzentration + 4,57 × Zunahme der N-Nitratkonzentration (7) 
und infolgedessen 
O 2 -Aufnahme durch Oxidation von C = festgestellte Gesamtauf ­
nahme — Aufnahme infolge Nitrifikation (8). 
Wenn andererseits nur der gesamte oxidierte N bestimmt wird, kann für die 
Sauerstoffaufnahme infolge Nitrifikation in erster Näherung ein Wert von 4,57 
× Zunahme an oxidiertem N angenommen werden.  
Der korrigierte Wert für den Sauerstoffverbrauch infolge Oxidation von C wird 
dann mit dem ThSB  NH4 , berechnet nach Anlage 2, verglichen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 883
 
C.5. ABBAUBARKEIT — BIOCHEMISCHER SAUERSTOFF ­
BEDARF  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Zweck des Verfahrens ist die Messung des biochemischen Sauer ­
stoffbedarfs (BSB) fester oder flüssiger organischer Substanzen.  
Die mit diesem Verfahren erzielbaren Prüfergebnisse gelten in erster 
Linie für wasserlösliche Substanzen; flüchtige und in Wasser schwer 
lösliche Verbindungen können zumindest grundsätzlich auch mit 
diesem Verfahren geprüft werden.  
Die Methode ist nur für solche organischen Substanzen anwendbar, 
die bei den im Test verwendeten Konzentrationen keine bakterien ­
hemmende Wirkung haben. Ist eine Substanz bei der Prüfkonzen ­
tration nicht löslich, so sind gegebenenfalls besondere Verfahren wie Ultraschalldispersion anzuwenden, um eine ausreichende Dispersion der Prüfsubstanz sicherzustellen.
 
Angaben zur Toxizität der Prüfsubstanz können bei der Interpretation 
niedriger Ergebnisse und bei der Auswahl der geeigneten Testkon ­
zentrationen von Nutzen sein.  
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Der biochemische Sauerstoffbedarf (BSB) wird definiert als die 
Menge an gelöstem Sauerstoff, die zur biochemischen Oxidation 
einer bestimmten Menge einer gelösten Substanz unter den vor ­
geschriebenen Bedingungen notwendig ist.  
Die Ergebnisse werden dargestellt als g biochemischer Sauerstoff ­
bedarf (BSB) pro g Prüfsubstanz.  
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Es wird empfohlen, eine geeignete Referenzsubstanz zur Überprü ­
fung der Inokulumaktivität zu verwenden.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Eine vorher bestimmte Menge der Prüfsubstanz wird in einem ge ­
eigneten sauerstoffreichen Medium gelöst oder dispergiert und an ­
schließend mit einem Inokulum angeimpft sowie bei einer konstan ­
ten Umgebungstemperatur im Dunkeln inkubiert.  
Der BSB wird aus der Differenz des Gehalts an gelöstem Sauerstoff 
vor Beginn und nach Ende des Tests bestimmt. Die Testdauer muss mindestens 5 Tage, darf jedoch nicht mehr als 28 Tage betragen.
 
Parallel zu diesem Test ist ein Blindversuch ohne die Prüfsubstanz 
durchzuführen.  
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Die BSB-Bestimmung kann nicht als valide Bestimmung der biolo ­
gischen Abbaubarkeit eines Stoffes angesehen werden. Dieser Test ist nur als „Screening“-Test zu betrachten.
 
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
Je nach Prüfverfahren wird eine Lösung oder Dispersion der Prüf ­
substanz in einer geeigneten Konzentration vorbereitet. Dann wird 
der BSB nach einem geeigneten national oder international standar ­
disierten Verfahren ermittelt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 884
 
2. DATEN UND AUSWERTUNG  
Der in der Lösung enthaltene BSB wird entsprechend dem gewählten 
Standardverfahren berechnet und in g Sauerstoffbedarf/g Prüfsub ­
stanz umgerechnet.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
Die angewandte Methode ist anzugeben.  
Als biochemischer Sauerstoffbedarf ist der Mittelwert von mindes ­
tens drei gültigen Messergebnissen anzugeben.  
Alle für die Interpretation der Ergebnisse wichtigen Informationen 
und Bemerkungen sind anzugeben, insbesondere hinsichtlich Ver ­
unreinigungen, Aggregatzustand, toxischer Wirkungen und inhären ­
ter Zusammensetzung der Prüfsubstanz, die die Ergebnisse beein ­
flussen können.  
Wird ein Zusatz zur Hemmung der biologischen Nitrifikation ver ­
wendet, muss dies angegeben werden.  
4. LITERATUR  
Verzeichnis der standardisierten Verfahren, z. B.  
NF T 90-103: Determination of the Biochemical Oxygen Demand.  
NBN 407: Biochemical Oxygen Demand.  
NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemisch zuurstofverbruik 
(BZV).  
The Determination of Biochemical Oxygen Demand (Methods for 
the examination of Water and Associated Materials, HMSO, London).
 
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after 
n days.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 885
 
C.6. ABBAUBARKEIT — CHEMISCHER SAUERSTOFFBEDARF  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Zweck des Verfahrens ist die Messung des chemischen Sauerstoff ­
bedarfs (CSB) fester oder flüssiger organischer Stoffe unter bestimm ­
ten standardisierten Laborbedingungen.  
Zur Durchführung dieses Tests sowie zur Interpretation der Test ­
ergebnisse sind Angaben über die chemische Formel der Prüfsub ­
stanz von Nutzen (z. B. der Gehalt an Halogensalzen, Eisensalze organischer Substanzen oder chlorierten Kohlenwasserstoffen).
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Der chemische Sauerstoffbedarf ist ein Maß für die Oxidierbarkeit 
einer Substanz, ausgedrückt als diejenige Sauerstoffmenge eines oxi ­
dierenden Reagenzmittels, die eine Prüfsubstanz unter definierten 
Laborbedingungen verbraucht.  
Das Testergebnis wird in g chemischer Sauerstoffverbrauch/g Prüf ­
substanz angegeben.  
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Referenzsubstanzen müssen nicht immer bei der Prüfung neuer 
Stoffe eingesetzt werden. Sie sollten jedoch von Zeit zu Zeit primär 
zur Eichung der Messmethode benutzt werden, um auf diese Weise eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse, die mit anderen Methoden erzielt wurden, zu ermöglichen.
 
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Eine vorher bestimmte Menge in Wasser gelöster oder dispergierter 
Substanz wird mit Kaliumdichromat in einem starken Schwefelsäu ­
remedium in Gegenwart von Silbersulfat als Katalysator unter Rück ­
fluss über zwei Stunden lang oxidiert. Das restliche Dichromat wird durch Titration mit standardisiertem Ammoniumeisen(II)sulfat be ­
stimmt.
 
Im Falle chlorhaltiger Substanzen wird zur Vermeidung von Störun ­
gen durch Chloride Quecksilbersulfat (*) zugefügt.  
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Wegen der willkürlichen Art des Nachweises ist der chemische Sau ­
erstoffbedarf ein „Oxidierbarkeitsindikator“ und wird als solcher als praktischer Parameter zur Messung des Gehalts an organischer Sub ­
stanz verwendet.
 
Chloride können das Testergebnis verfälschen. Anorganische Reduk ­
tions- oder Oxidationsmittel können die Bestimmung des chemischen 
Sauerstoffbedarfs ebenfalls stören.  
Einige zyklische Verbindungen und zahlreiche flüchtige Substanzen 
(z. B. niedere Fettsäuren) werden in diesem Test nicht vollständig oxidiert.
 
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
Zuerst wird eine Lösung oder eine Dispersion der Testsubstanz her ­
gestellt, um einen CSB zwischen 250 und 600 mg/l zu erzielen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 886  
(*) Nach der Verwendung sollten Quecksilbersalz enthaltende Lösungen zur Vermeidung 
des Eintrags von Quecksilber in die Umwelt behandelt werden.
 Bemerkung:  
Im Falle schwerlöslicher oder nicht dispergierbarer Substanzen kann 
eine bestimmte Menge pulverförmiger oder flüssiger Prüfsubstanz 
entsprechend einem CSB von 5 mg abgewogen werden und in die Versuchsgefäße mit Wasser gegeben werden.
 
Der chemische Sauerstoffbedarf (CSB) wird häufig und besonders 
bei schwerlöslichen Substanzen vorzugsweise mit Hilfe einer Vari ­
ante des Verfahrens bestimmt, d. h. in einem geschlossenen System 
mit Druckausgleich (H. Kelkenberg, 1975). Mit diesem modifizier ­
tem Verfahren können Substanzen, die mit dem herkömmlichen Ver ­
fahren nur schwer zu bestimmen sind — wie z. B. Essigsäure —, in 
vielen Fällen erfolgreich quantifiziert werden. Diese Methode versagt 
jedoch im Fall von Pyridin. Wird die Kaliumdichromatkonzentration, wie in (1) vorgeschrieben, auf 0,25 N (0,0416 M) erhöht, wird die Direkteinwaage von 5-10 mg Substanz erleichtert, was für die CSB- 
Bestimmung schwer wasserlöslicher Substanzen wichtig ist (2).
 
Ansonsten kann der CSB nach jedem geeigneten nationalen oder 
internationalen standardisierten Verfahren bestimmt werden.  
2. DATEN UND AUSWERTUNG  
Der in den Versuchsflaschen auftretende CSB-Wert wird mit Hilfe 
der jeweils gewählten standardisierten Methode berechnet und in g 
chemischen Sauerstoffbedarfs pro g Testsubstanz ausgedrückt.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
Die verwendete Referenzmethode ist anzugeben.  
Der chemische Sauerstoffbedarf sollte aus mindestens drei Messwer ­
ten gemittelt werden. Der Bericht sollte alle für die Interpretation der Messergebnisse relevanten Informationen und Bemerkungen enthal ­
ten, die die Testergebnisse beeinflussen könnten, z. B. Verunrei ­
nigungen der Prüfsubstanz, physikalischer Zustand und die Zusam ­
mensetzung der Substanz (falls bekannt).
 
Die Verwendung von Quecksilbersulfat zur Verminderung von Stö ­
rungen durch Chlorid muss erwähnt werden.  
4. LITERATUR  
(1) Kelkenberg, H. Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146.  
(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13,169.  
Liste der standardisierten Verfahren, z. B.:  
NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen de ­
mand.  
ISBN 0 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters.  
NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.  
DS 217 — water analysis Determination of the chemical 
oxygen demand.  
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen de ­
mand (COD) within the range above 15 mg per litre.  
NEN 3235 5.3 Bepaling von het chemisch zuurstofverbruik.  
ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichro ­
mate methods.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 887
 
C.7. ABBAUBARKEIT — ABIOTISCHER ABBAU: HYDROLYSE IN 
ABHÄNGIGKEIT VOM pH-WERT  
1. METHODE  
Diese Testmethode entspricht OECD TG 111 (2004).  
1.1. EINLEITUNG  
Chemikalien können auf unterschiedlichen Wegen in Oberflächenge ­
wässer gelangen, z. B. durch direkte Applikation, Sprühmittelabtrift, Ablauf, Entwässerung, Abfallentsorgung, Industrie-, Haushalts- oder 
Landwirtschaftsabwässer oder über atmosphärische Deposition, und 
können in diesen Gewässern durch chemische (z. B. Hydrolysere ­
aktionen, Oxidation), fotochemische und/oder mikrobielle Prozesse umgewandelt werden. In der vorliegenden Richtlinie wird eine La ­
bortestmethode zur Beurteilung der abiotischen hydrolytischen Um ­
wandlung von Chemikalien in Wassersystemen bei pH-Werten beschrieben, wie sie normalerweise in der Umwelt vorkommen (pH 4-9); diese Richtlinie stützt sich auf bestehende Richtlinien (1) 
(2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
Durch diese Tests soll i) die Hydrolysegeschwindigkeit der Testsub ­
stanz in Abhängigkeit vom pH-Wert und ii) die Beschaffenheit bzw. 
Art sowie die Geschwindigkeit der Entstehung und des Rückgangs 
von Hydrolyseprodukten ermittelt werden, denen die Organismen ausgesetzt sein können. Derartige Studien sind für Chemikalien er ­
forderlich, die direkt dem Wasser zugesetzt werden oder voraussicht ­
lich durch die sonstigen oben beschriebenen Wege in die Umwelt 
gelangen.
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Siehe Anlage 2.  
1.3. ANWENDUNGSBEREICH DER TESTMETHODE  
Die Testmethode ist generell auf (markierte oder unmarkierte) che ­
mische Substanzen anwendbar, für die eine Analysemethode mit 
ausreichender Genauigkeit und Empfindlichkeit zur Verfügung steht. Sie kann Anwendung finden für leicht flüchtige und nichtflüchtige Verbindungen mit ausreichender Wasserlöslichkeit. Der Test darf 
dagegen an Chemikalien, die in Wasser hochgradig flüchtig sind 
(z. B. Fumiganzien, organische Lösungsmittel) und daher unter den Versuchsbedingungen dieses Tests nicht in Lösung gehalten werden können, nicht durchgeführt werden. Die Durchführung des Tests an 
Substanzen, die in Wasser nur minimal löslich sind, ist möglicher ­
weise nur erschwert möglich (8).
 
1.4. PRINZIP DER TESTMETHODE  
Sterile wässrige Pufferlösungen mit unterschiedlichen pH-Werten 
(pH 4, 7 und 9) werden mit der Testsubstanz behandelt und im 
Dunkeln unter kontrollierten Laborbedingungen (bei konstanter Tem ­
peratur) inkubiert. Nach entsprechenden Zeitintervallen werden die Pufferlösungen auf die Testsubstanz und Hydrolyseprodukte ana ­
lysiert. Bei Verwendung einer markierten Testsubstanz (z. B. mit
 
14 C) lässt sich die Stoffbilanz leichter erstellen.  
Diese Testmethode ist als mehrstufiges Konzept angelegt (siehe Dar ­
stellung und Erläuterung in Anlage 1). Die einzelnen Stufen des 
Tests werden durch die Ergebnisse der jeweils vorherigen Stufe ge ­
startet.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 888
 
1.5. INFORMATIONEN ZUR TESTSUBSTANZ  
Für die Messung der Hydrolysegeschwindigkeit können markierte 
oder nicht markierte Testsubstanzen verwendet werden. Normaler ­
weise sollte vorzugsweise markiertes Material zur Messung der Hy ­
drolysewege und zur Ermittlung der Stoffbilanz verwendet werden; 
in bestimmten Sonderfällen ist eine Markierung allerdings nicht un ­
bedingt notwendig. Die Markierung mit  14 C wird empfohlen, andere 
Isotope wie  13 C, 15 N oder  3 H sind jedoch ggf. ebenfalls geeignet. 
Die Markierung ist — soweit möglich — im stabilsten Teil des 
Moleküls anzuordnen. Enthält die Testsubstanz beispielsweise einen Ring, muss die Markierung auf dem Ring erfolgen; enthält die Test ­
substanz zwei oder mehr Ringe, sind evtl. separate Untersuchungen 
zum Verhalten der einzelnen markierten Ringe und zur Ermittlung geeigneter Informationen zur Bildung von Hydrolyseprodukten not ­
wendig. Die Testsubstanz muss eine Reinheit von mindestens 95 % 
aufweisen.
 
Vor der Durchführung von Hydrolysetests müssen folgende Informa ­
tionen zur Testsubstanz vorliegen:  
a) Löslichkeit in Wasser (Testmethode A.6),  
b) Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln,  
c) Dampfdruck (Testmethode A.4) und/oder Konstante des Henry ­
schen Gesetzes,  
d) Verteilungskoeffizient n-Oktanol/Wasser (Testmethode A.8);  
e) Dissoziationskonstante (pK  a ) (OECD-Richtlinie 112) (9);  
f) direkte und indirekte Fototransformationsgeschwindigkeit in Was ­
ser (soweit relevant).  
Es müssen Analysemethoden für die Quantifizierung der Testsub ­
stanz sowie — sofern relevant — für die Identifizierung und Quan ­
tifizierung der Hydrolyseprodukte in wässrigen Lösungen zur Ver ­
fügung stehen (siehe auch Abschnitt 1.7.2).  
1.6. REFERENZSUBSTANZEN  
Soweit möglich, sollten Referenzsubstanzen zur Identifizierung und 
Quantifizierung von Hydrolyseprodukten durch Spektroskopie- und Chromatografieverfahren oder andere ausreichend genaue Methoden 
verwendet werden.
 
1.7. QUALITÄTSKRITERIEN  
1.7.1.  Wiederfindungsrate  
Die Analyse von mindestens zwei Pufferlösungen oder deren Extrak ­
ten unmittelbar nach der Zugabe der Testsubstanz gibt einen ersten 
Hinweis auf die Wiederholbarkeit der Analysemethode und die 
gleichmäßige Verteilung der Testsubstanz bei der Applikation der Testsubstanz. Die Wiederfindungsraten für spätere Versuchsphasen ergeben sich aus den jeweiligen Massenbilanzen (bei Verwendung 
markierter Substanzen). Die Wiederfindungsraten müssen bei mar ­
kierten und unmarkierten Chemikalien zwischen 90 % und 110 % liegen (7). Falls es sich als technisch schwierig erweist, diese Wie ­
derfindungsrate zu erreichen, ist bei unmarkierten Chemikalien eine 
Wiederfindungsrate von 70 % zulässig, allerdings ist dies entspre ­
chend zu begründen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 889
 
1.7.2.  Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit der Analysemethoden  
Die Wiederholbarkeit der Analysemethode(n), die zur späteren Quan ­
tifizierung der Testsubstanz und der Hydrolyseprodukte verwendet werden, kann durch eine parallele Analyse derselben Pufferlösungen 
(oder ihrer Extrakte) überprüft werden, nachdem sich ausreichende 
Mengen an Hydrolyseprodukten für die Quantifizierung gebildet ha ­
ben.
 
Die Analysemethode muss eine ausreichende Empfindlichkeit auf ­
weisen, mit der die Quantifizierung der Konzentrationen der Testsubstanz bis auf 10 % der Anfangskonzentration oder weniger 
möglich ist. Sofern relevant, müssen die Analysemethoden außerdem 
eine ausreichende Empfindlichkeit für die Quantifizierung von Hy ­
drolyseprodukten aufweisen, die 10 % der (zu einem beliebigen Zeit ­
punkt während der Studie) eingebrachten Konzentration oder mehr 
oder aber 25 % oder weniger der Spitzenkonzentration darstellt.
 
1.7.3.  Konfidenzintervalle für Kinetikdaten der Hydrolyse  
Die Konfidenzintervalle sind für sämtliche Regressionskoeffizienten, 
Geschwindigkeitskonstanten, Halbwertszeiten und sonstigen kineti ­
schen Parameter rechnerisch zu ermitteln und darzustellen (z. B. DT
 50 ). 
1.8. BESCHREIBUNG DER TESTMETHODE  
1.8.1.  Geräte und Apparatur  
Die Untersuchung ist in Glasgefäßen (z. B. Reagenzgläser, kleine 
Kolben) unter abgedunkelten und sterilen Bedingungen (sofern er ­
forderlich) durchzuführen, sofern nicht bereits vorliegende Informa ­
tionen (wie der n-Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient) darauf hin ­
deuten, dass die Testsubstanz möglicherweise am Glas anhaftet. In diesen Fällen sollte die Verwendung alternativer Materialien (wie 
Teflon) geprüft werden. Mitunter lässt sich das Problem der Anhaf ­
tung an Glas auch durch eine oder mehrere der folgenden Methoden mildern:
 
— Bestimmung der Masse der am Glas sorbierten Testsubstanz und 
Hydrolyseprodukte,  
— Verwendung eines Ultraschallbades,  
— Waschen sämtlicher Glasartikel mit Lösungsmittel bei jedem Pro ­
benahmeintervall,  
— Verwendung formulierter Produkte,  
— Verwendung einer größeren Menge an Zusatzlösungsmittel für 
die Zugabe der Testsubstanz zum System; wird ein Zusatz ­
lösungsmittel verwendet, sollte dieses so beschaffen sein, dass es keine Hydrolysierung der Testsubstanz verursacht.
 
Normalerweise werden temperaturgeregelte Wasserbad-Schüttelvor ­
richtungen oder thermostatgeregelte Inkubatoren für die Inkubation der verschiedenen Testlösungen benötigt.
 
Außerdem werden Standard-Laborgeräte benötigt, insbesondere fol ­
gende Geräte:  
— pH-Messgerät,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 890
 
— Analyseinstrumente wie GC-, HPLC-, TLC-Geräte einschließlich 
der entsprechenden Detektionssysteme zur Analyse radioaktiv 
markierter und unmarkierter Substanzen oder für die inverse Iso ­
topenverdünnungsmethode,  
— Instrumente zu Identifikationszwecken (z. B. MS, GC-MS, 
HPLC-MS, NMR usw.),  
— Flüssigkeits-Szintillationszähler,  
— Trenntrichter für Flüssig-Flüssig-Extraktionen,  
— Instrumentierung für die Konzentration von Lösungen und Ex ­
trakten (z. B. Rotationsverdampfer),  
— Temperaturregelungsvorrichtung (z. B. Wasserbad).  
Zu den chemischen Reagenzien gehören unter anderem:  
— organische Lösungsmittel (analysenrein) wie Hexan, Dichlor ­
methan usw.,  
— Szintillationsflüssigkeit,  
— Pufferlösungen (Details siehe Abschnitt 1.8.3).  
Sämtliche Glasgeräte sowie das analysenreine Wasser und die Puff ­
erlösungen, die in den Hydrolysetests verwendet werden, sind zu sterilisieren.
 
1.8.2.  Applikation der Testsubstanz  
Die Testsubstanz ist als wässrige Lösung in die verschiedenen Puff ­
erlösungen einzugeben (siehe Anlage 3). Soweit zur Herstellung 
einer ausreichenden Auflösung erforderlich, ist die Verwendung ge ­
ringer Mengen wassermischbarer Lösungsmittel (wie Acetonitril, Aceton, Ethanol) für die Applikation und Verteilung der Testsub ­
stanz zulässig, allerdings darf dies normalerweise 1 % v/v nicht 
überschreiten. Falls eine höhere Lösungsmittelkonzentration erwogen 
wird (beispielsweise bei schlecht löslichen Testsubstanzen), ist dies nur zulässig, wenn nachgewiesen werden kann, dass das Lösungs ­
mittel die Hydrolyse der Testsubstanzen nicht beeinflusst.
 
Die Verwendung formulierter Produkte wird nicht grundsätzlich 
empfohlen, da nicht ausgeschlossen werden kann, dass die Bestand ­
teile der Formulierung den Hydrolysevorgang beeinflussen. Bei schlecht wasserlöslichen Testsubstanzen oder Substanzen, die an Glas anhaften (siehe Abschnitt 1.8.1), bietet sich jedoch die Ver ­
wendung formulierter Substanzen als geeignete Alternative an.
 
Die Testsubstanz ist in einer einzigen Konzentration zu verwenden; 
diese darf 0,01 M oder die Hälfte der Sättigungskonzentration nicht 
überschreiten (siehe Anlage 1).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 891
 
1.8.3.  Pufferlösungen  
Der Hydrolyseversuch wird bei drei pH-Werten durchgeführt: 4, 7 
und 9. Hierzu sind Pufferlösungen unter Verwendung von analysen ­
reinen Chemikalien und Wasser vorzubereiten. Geeignete Beispiele 
für Puffersysteme sind in Anlage 3 dargestellt. Dabei ist darauf zu 
achten, dass das verwendete Puffersystem die Hydrolysegeschwin ­
digkeit beeinflussen kann; werden entsprechende Erscheinungen fest ­
gestellt, ist eine andere Pufferlösung zu verwenden (  1 ). 
Der pH-Wert der einzelnen Pufferlösungen ist mit einem kalibrierten 
pH-Messgerät mit einer Messgenauigkeit von mindestens 0,1 bei der 
Solltemperatur zu kontrollieren.  
1.8.4.  Testbedingungen  
1.8.4.1.  Testtemperatur  
Die Hydrolyseversuche sind bei konstanter Temperatur durchzufüh ­
ren. Zur Extrapolation ist es wichtig, die Temperatur auf mindestens 
± 0,5  o C zu halten.  
Ist das Hydrolyseverhalten der Testsubstanz unbekannt, ist ein vor ­
bereitender Test (Stufe 1) bei einer Temperatur von 50  o C durch­
zuführen. Kinetische Tests auf höherer Stufe sind bei mindestens drei Temperaturen (die auch den Test bei 50
 o C einschließen) durch ­
zuführen, sofern die Testsubstanz sich — wie bei den Tests auf Stufe 
1 ermittelt — bei Hydrolyse stabil verhält. Es wird ein Temperatur ­
bereich von 10-70  o C empfohlen (wobei möglichst mindestens eine 
der Temperaturen unter 25  o C liegen sollte), der sowohl die für die 
Berichterstellung zugrunde gelegte Temperatur von 25  o C als auch 
die meisten der in der Praxis vorkommenden Temperaturen umfasst.  
1.8.4.2.  Licht und Sauerstoff  
Alle Hydrolyseversuche sind mit geeigneten Methoden durchzufüh ­
ren, mit denen fotolytische Effekte vermieden werden können. Durch 
geeignete Maßnahmen ist außerdem eine Sauerstoffbildung (z. B. 
durch 5-minütiges Einblasen von Helium, Stickstoff oder Argon vor der Zubereitung der Lösung) zu vermeiden.
 
1.8.4.3.  Testdauer  
Der Vortest ist über einen Zeitraum von 5 Tagen durchzuführen, die 
Tests auf höherer Stufe sind durchzuführen, bis eine 90 %ige Hy ­
drolyse der Testsubstanz erreicht ist oder ein Zeitraum von 30 Tagen abgelaufen sind (je nachdem, welcher Zeitpunkt zuerst erreicht ist).
 
1.8.5.  Durchführung des Tests  
1.8.5.1.  Vortest (Stufe 1)  
Der Vortest wird bei 50 ± 0,5  o C und pH-Werten von 4,0, 7,0 und 
9,0 durchgeführt. Wird nach 5 Tagen eine Hydrolyse von weniger 
als 10 % festgestellt (t  0,525 o C > 1 Jahr), gilt die Testsubstanz als 
hydrolytisch stabil, und es sind normalerweise keine weiteren Tests erforderlich. Ist bekannt, dass die Substanz bei umwelttechnisch re ­
levanten Temperaturen instabil ist, braucht kein Vortest durchgeführt 
zu werden. Die Analysemethode muss so präzise und empfindlich 
sein, dass eine Reduktion der ursprünglichen Konzentration um 10 % festgestellt werden kann.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 892  
( 1 ) Mabey und Mill empfehlen die Verwendung von Borat- oder Acetatpuffern statt Phos ­
phat (11).
 1.8.5.2.  Hydrolyse instabiler Substanzen (Stufe 2)  
Der (fortgeschrittene) Test auf höherer Stufe ist bei den pH-Werten 
durchzuführen, bei denen gemäß den Vorgaben des oben beschrie ­
benen Vortests eine Instabilität der Testsubstanz festgestellt wurde. 
Die Pufferlösungen der Testsubstanzen sind durch Thermostatrege ­
lung auf den gewählten Temperaturen zu halten. Zur Durchführung der Tests auf Reaktionen erster Ordnung ist jede Reaktionslösung in zeitlichen Intervallen zu analysieren, die so angesetzt sein müssen, 
dass sich mindestens sechs zwischen 10 % und 90 % Hydrolyse der 
Testsubstanz normal verteilte Bezugspunkte ergeben. Die einzelnen Proben der wiederholten Gleichtests (eine Mindestanzahl von Dop ­
pelproben, die in separaten Reaktionsgefäßen enthalten sind) sind zu 
entfernen und der Inhalt ist bei jedem der mindestens sechs Pro ­
benahmepunkte zu analysieren (für mindestens zwölf Wieder ­
holungs-Bezugspunkte). Die Verwendung einer einzigen Sammelpro ­
be, aus der bei jedem Probenahmeintervall einzelne Probenanteile der 
Testlösung entnommen werden, gilt als unzureichend, da damit keine Analyse der Datenvariabilität möglich ist und Probleme durch Kon ­
taminierung der Testlösung auftreten können. Tests zum Nachweis 
der Sterilität sind am Ende des höherrangigen Tests durchzuführen 
(z. B. bei 90 % Hydrolyse bzw. 30 Tage). Wird allerdings keine Zersetzung (d. h. Transformation) festgestellt, sind keine weiteren Sterilitätstests notwendig.
 
1.8.5.3.  Feststellung der Hydrolyseprodukte (Stufe 3)  
Umfangreichere Hydrolyseprodukte, zumindest jene, die > 10 % der 
eingebrachten Dosis entsprechen, sind durch entsprechende Analyse ­
methoden festzustellen.  
1.8.5.4.  Zusätzliche Tests  
Bei hydrolytisch instabilen Testsubstanzen sind evtl. weitere Tests 
bei anderen pH-Werten als 4, 7 und 9 erforderlich. So ist für phy ­
siologische Zwecke möglicherweise ein Test unter saureren Bedin ­
gungen (z. B. pH-Wert 1,2) bei einer einzigen physiologisch rele ­
vanten Temperatur (37  o C) notwendig.  
2. DATEN  
Die Mengen der Testsubstanz und der Hydrolyseprodukte sind — 
soweit relevant — als Prozentsatz der eingebrachten Anfangskonzen ­
tration sowie in mg/l für jedes Probenahmeintervall und für jeden 
pH-Wert und jede Testtemperatur anzugeben. Darüber hinaus ist eine Stoffbilanz als Prozentanteil der eingebrachten Anfangskonzentration anzugeben, wenn eine markierte Testsubstanz verwendet wurde.
 
In den Bericht ist eine grafische Darstellung der log-transformierten 
Daten der Testsubstanzkonzentrationen im zeitlichen Verlauf auf ­
zunehmen. Umfangreichere Hydrolyseprodukte, zumindest jene, die ≥ 10 % der eingebrachten Dosis repräsentieren, sind anzugeben und 
ihre log-transformierten Konzentrationen sind in gleicher Weise wie 
die Muttersubstanz grafisch darzustellen, so dass sich eine Darstel ­
lung der Bildungs- und Verfallgeschwindigkeiten ergibt.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 893
 
2.1. AUFBEREITUNG DER ERGEBNISSE  
Eine genauere Bestimmung der Halbwertszeiten oder DT  50 -Werte 
dürfte mithilfe geeigneter kinetischer Modellberechnungen möglich sein. Die Halbwertszeit und/oder die DT
 50 -Werte (einschließlich der 
Vertrauensgrenzen) sind für jeden pH-Wert und jede Temperatur 
zusammen mit einer Beschreibung des verwendeten Modells, der kinetischen Ordnung und des Bestimmungskoeffizienten (r2) in den Bericht aufzunehmen. Erforderlichenfalls sind die Berechnungen 
auch für die Hydrolyseprodukte zu übernehmen.
 
Dabei sind A  i und B  i Regressionskonstanten des Abschnitts bzw. der 
Steigung der Geraden der besten Anpassung, die aus einem linear 
regressiven ln k  i zur Reziproken der Absoluttemperatur in Kelvin (T) 
generiert wurden. Mithilfe der Arrhenius-Beziehungen für  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i¼H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
Bei Geschwindigkeitsuntersuchungen, die bei unterschiedlichen Tem ­
peraturen durchgeführt werden, sind die Hydrolyse-Geschwindigkeits ­
konstanten pseudo-erster Ordnung (k  obs ) in Abhängigkeit von der Tem ­
peratur zu beschreiben. Die Berechnung muss sich dabei auf die Tren ­
nung von k  obs in Geschwindigkeitskonstanten für säurekatalysierte, neu ­
trale und basenkatalysierte Hydrolyse (k  H , k neutral  bzw. k  OH ) sowie auf 
die Arrhenius-Gleichung stützen: säure-, neutral und basenkatalysierte Hydrolyse können Geschwindigkeitskonstanten pseudo-erster Ordnung und somit die Halbwertszeiten für andere Temperaturen berechnet wer ­
den, bei denen die direkte experimentelle Ermittlung einer Geschwindig ­
keitskonstante nicht praktikabel ist (10).
 
2.2. EVALUIERUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Die meisten Hydrolysereaktionen folgen scheinbaren Reaktions ­
geschwindigkeiten erster Ordnung; die Halbwertszeiten sind daher 
von der Konzentration unabhängig (siehe Gleichung 4 in 
Anlage 2). Auf diese Weise können normalerweise Laborergebnisse, die bei 10–
 2 bis 10–  3 M ermittelt wurden, auf Umgebungsbedingun ­
gen (≤ 10–  6 M) angewandt werden (10). Von Mabey und Mill 
wurden verschiedene Beispiele genauer Übereinstimmung zwischen 
Hydrolysegeschwindigkeiten dargestellt, die für unterschiedliche Chemikalien in reinem und natürlichem Wasser gemessen wurden (11), sofern pH-Wert und Temperatur gemessen wurden.
 
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. TESTBERICHT  
Der Testbericht muss mindestens folgende Informationen enthalten:  
Testsubstanz:  
— Common name, chemischer Name, CAS-Nummer, Strukturfor ­
mel (zur Angabe der Lage der Markierung bei Verwendung ra ­
dioaktiv markierten Materials) und relevante physikalisch-che ­
mische Eigenschaften (siehe Abschnitt 1.5),  
— Reinheit (Verunreinigungen) der Testsubstanz,  
— Reinheit der Markierung von markierten Chemikalien und molare 
Aktivität (soweit relevant).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 894
 
— Pufferlösungen:  
— Datum und Einzelheiten der Zubereitung,  
— verwendete Puffersubstanzen und Wasser,  
— Molarität und pH-Wert der Pufferlösungen.  
Testbedingungen:  
— Durchführungsdatum der Studien,  
— Menge der eingebrachten Testsubstanz,  
— Methode und Lösungsmittel (Art und Menge), die für die Ein ­
bringung der Testsubstanz verwendet wurden,  
— Volumen der inkubierten gepufferten Testsubstanzlösungen,  
— Beschreibung des verwendeten Inkubationssystems,  
— pH-Wert und Temperatur während der Studie,  
— Probenahmezeiten,  
— Extraktionsverfahren,  
— Verfahren zur Quantifizierung und Identifizierung der Testsub ­
stanz und ihrer Hydrolyseprodukte in den Pufferlösungen,  
— Zahl der Wiederholungen.  
Ergebnisse:  
— Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit der verwendeten Analyse ­
methoden,  
— Wiederfindungsraten (Prozentwerte für eine gültige Studie sind in 
Abschnitt 1.7.1 angegeben),  
— Wiederholungsdaten und -mittel in Tabellenform,  
— Stoffbilanz während und am Ende der Untersuchung (wenn mar ­
kierte Testsubstanzen verwendet werden),  
— Ergebnisse des Vortests,  
— Diskussion und Interpretation der Ergebnisse,  
— sämtliche ursprünglichen Daten und Abbildungen.  
Die folgenden Angaben werden nur zur Bestimmung der Hydrolyse ­
geschwindigkeit benötigt:  
— zeitabhängige grafische Darstellung der Konzentrationen der 
Testsubstanzen und — soweit relevant — der Hydrolyseprodukte 
für die einzelnen pH-Werte und für jede Temperatur,  
— Tabellen der Ergebnisse der Arrhenius-Gleichung für die Tem ­
peraturen 20  o C/25  o C mit pH-Werten, Geschwindigkeitskonstan ­
ten [h  -1 oder Tag  -1 ], Halbwertszeiten oder DT  50 , Temperaturen 
( o C) einschließlich der Vertrauensgrenzen und der Korrelations ­
koeffizienten (r2) oder vergleichbarer Informationen,  
— vorgeschlagener Hydrolyseweg.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 895
 
4. LITERATUR  
(1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Gui ­
deline for Testing of Chemicals Nr. 111, angenommen am 12. Mai 1981.
 
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25  o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
(3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(4) Europäische Union (EU) (1995). Richtlinie 95/36/EG der 
Kommission zur Änderung der Richtlinie 91/414/EWG des Rates über das Inverkehrbringen von Pflanzenschutzmitteln. 
Anhang V: Verbleib und Verhalten in der Umwelt.
 
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (Niederlän ­
dische Kommission für die Eintragung von Pestiziden) (1991). Application for registration of a pesticide. Section G: Beha ­
viour of the product and its metabolites in soil, water and air 
(Antrag auf Eintragung eines Pestizids — Teil G. Verhalten 
des Produkts und seiner Stoffwechselprodukte im Boden, in Wasser und in der Luft).
 
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (Okto ­
ber 1980).  
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental 
Health and Safety Publications Series on Testing and Assess ­
ment Nr. 23.  
(9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Tes ­
ting of Chemicals.  
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14
 th Annual Meeting of the Society of 
Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, Novem ­
ber 1993).  
(11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis 
of organic compounds in water under environmental conditi ­
ons. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-415.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 896
 
Anlage 1  
Mehrstufiger Hydrolyse-Testablauf
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 897
 
Anlage 2  
Definitionen und Einheiten  
Es sind grundsätzlich  SI-Einheiten  (der  Standard-International-Organisation)  
zu verwenden.  
Testsubstanz:  Eine beliebige Substanz (Mutterverbindung oder die entsprechen ­
den Umwandlungsprodukte).  
Umwandlungsprodukte:  Alle Substanzen, die aus biotischen oder abiotischen 
Umwandlungsreaktionen der Testsubstanz entstehen.  
Hydrolyseprodukte:  Alle Substanzen, die aus hydrolytischen Umwandlungs ­
reaktionen der Testsubstanz entstehen.  
Hydrolyse  bezeichnet die Reaktion einer Testsubstanz RX mit Wasser, die sich 
durch den Austausch der Gruppe X mit OH im Reaktionszentrum darstellen lässt: 
RX + HOH → ROH + HX [1]  
Die Geschwindigkeit, mit der die Konzentration von RX in diesem vereinfachten 
Prozess sinkt, wird wie folgt angegeben: 
Geschwindigkeit = k [H  2 O] [RX] Reaktion zweiter Ordnung 
oder 
Geschwindigkeit = k [RX] Reaktion erster Ordnung  
Dies ist vom geschwindigkeitsbestimmenden Schritt abhängig. Da Wasser gegen ­
über der Testsubstanz in erheblichem Überschuss vorhanden ist, wird dieser 
Reaktionstyp gewöhnlich als Reaktion pseudo-erster Ordnung beschrieben, in 
der die ermittelte Geschwindigkeitskonstante durch die Beziehung 
k obs = k [H  2 O] [2]  
ausgedrückt wird und aus der folgenden Formel ermittelt werden kann (*):  
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
Dabei sind:  
t = Zeit  
und C  o , C t = Konzentrationen von RX zum Zeitpunkt 0 und t.  
Die Einheiten dieser Konstanten weisen die Dimension (Zeit)  –1 auf; die Halb ­
wertszeit der Reaktion (Zeitdauer für die Reaktion von 50 % RX) wird aus ­
gedrückt durch:  
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Halbwertszeit:  (t 0,5 ) bezeichnet die Zeitdauer für eine 50 %ige Hydrolyse einer 
Testsubstanz, wenn die Reaktion durch Kinetik erster Ordnung beschrieben wer ­
den kann: Sie ist von der Konzentration unabhängig.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 898  
(*) Lässt die grafische Darstellung der logarithmisch umgewandelten Daten über der Zeit 
keine lineare Funktion erkennen (gleich einer Reaktionsgeschwindigkeit erster Ordnung 
gesetzt), eignet sich Gleichung [3] nicht für die Ermittlung der Hydrolyse-Geschwindig ­
keitskonstante der Testverbindung.
 DT 50 (Disappearance Time 50 bzw. Abbauzeit 50):  Die Zeitdauer, innerhalb 
deren die Konzentration der Testsubstanz um 50 % reduziert wird; sie differiert 
von der Halbwertszeit t  0,5 , wenn die Reaktion nicht nach einer Kinetik erster 
Ordnung verläuft.  
Schätzung von k bei unterschiedlichen Temperaturen  
Wenn die Geschwindigkeitskonstanten für zwei Temperaturen bekannt sind, kön ­
nen die Geschwindigkeitskonstanten bei anderen Temperaturen nach der Arrheni ­
us-Gleichung berechnet werden:  
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T oder ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Eine grafische Darstellung von ln k in Abhängigkeit von 1/T ergibt eine Gerade 
mit einer Steigung von –E/R  
Dabei ist:  
k = Geschwindigkeitskonstante, bei unterschiedlichen Temperaturen gemessen  
E = Aktivierungsenergie (kJ/mol)  
T = Absoluttemperatur (K)  
R = Gaskonstante (8,314 J/mol.K)  
Die Aktivierungsenergie wurde durch Regressionsanalyse oder durch die fol ­
gende Gleichung berechnet:  
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Í Î  
Dabei ist: T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 899
 
Anlage 3  
Puffersysteme  
A. CLARK AND LUBS:  
Puffergemische von CLARK and LUBS  (*) 
Zusammensetzung pH  
0,2 N HCl UND 0,2 N KCl BEI 20  o C 
47,5 ml HCl + 25 ml KCl dil. auf 100 ml 1,0 
32,25 ml HCl + 25 ml KCl dil. auf 100 ml 1,2 
20,75 ml HCl + 25 ml KCl dil. auf 100 ml 1,4 13,15 ml HCl + 25 ml KCl dil. auf 100 ml 1,6 
8,3 ml HCl + 25 ml KCl dil. auf 100 ml 1,8 
5,3 ml, HCl + 25 ml KCl dil. auf 100 ml 2,0 
3,35 ml HCl + 25 ml KCl dil. auf 100 ml 2,2  
0,1 M Kaliumhydrogenphthalat + 0,1 N HCl bei 20
 o C 
46,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 2,2 39,60 ml 0,1 N HCl + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 2,4 
32,95 ml 0,1 N HCl + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 2,6 
26,42 ml 0,1 N HCl + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 2,8 20,32 ml 0,1 N HCl + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 3,0 14,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 3,2 
9,90 ml 0,1 N HCl + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 3,4 5,97 ml 0,1 N HCl + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 3,6 2,63 ml 0,1 N HCl + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 3,8  
0,1 M Kaliumhydrogenphthalat + 0,1 N NaOH bei 20
 o C 
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 4,0 3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 4,2 
7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 4,4 
12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 4,6 17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 4,8
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 900  
(*) Die in diesen Tabellen aufgeführten pH-Werte wurden ausgehend von den Potenzialmessungen unter Ver ­
wendung der Sörensen'schen Standardgleichungen (1909) errechnet. Die entsprechenden pH-Werte liegen um 
0,04 Einheiten über den Werten in dieser Tabelle.
 Zusammensetzung pH  
23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 5,0 
29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 5,2 35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 5,4 39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 5,6 43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 5,8 45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Hydrogenphthalat auf 100 ml 6,0
 
Puffergemische von CLARK and LUBS (Forts.) 
0,1 M Monokaliumphosphat + 0,1 N NaOH bei 20  o C 
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Phosphat auf 100 ml 6,0 8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Phosphat auf 100 ml 6,2 
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Phosphat auf 100 ml 6,4 17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Phosphat auf 100 ml 6,6 23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Phosphat auf 100 ml 6,8 29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Phosphat auf 100 ml 7,0 35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Phosphat auf 100 ml 7,2 
39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Phosphat auf 100 ml 7,4 
42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Phosphat auf 100 ml 7,6 45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Phosphat auf 100 ml 7,8 46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Phosphat auf 100 ml 8,0  
0,1 M H
 3 BO  3 in 0,1 M KCl + 0,1 N NaOH bei 20  o C 
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Borsäure auf 100 ml 7,8 3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Borsäure auf 100 ml 8,0 5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Borsäure auf 100 ml 8,2 
8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Borsäure auf 100 ml 8,4 
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Borsäure auf 100 ml 8,6 16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Borsäure auf 100 ml 8,8 21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Borsäure auf 100 ml 9,0 26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Borsäure auf 100 ml 9,2
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 901
 
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Borsäure auf 100 ml 9,4 
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Borsäure auf 100 ml 9,6 
40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Borsäure auf 100 ml 9,8 
43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Borsäure auf 100 ml 10,0  
B. KOLTHOFF UND VLEESCHHOUWER:  
Zitratpuffer von KOLTHOFF und VLEESCHHOUWER  (*) 
Zusammensetzung pH  
0,1 M Monokaliumzitrat und 0,1 N HCl bei 18  o C (*) 
49,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml Zitrat auf 100 ml 2,2 43,4 ml 0,1 N HCl + 50 ml Zitrat auf 100 ml 2,4 36,8 ml 0,1 N HCl + 50 ml Zitrat auf 100 ml 2,6 30,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml Zitrat auf 100 ml 2,8 23,6 ml 0,1 N HCl + 50 ml Zitrat auf 100 ml 3,0 
17,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml Zitrat auf 100 ml 3,2 
10,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml Zitrat auf 100 ml 3,4 
4,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml Zitrat auf 100 ml 3,6  
0,1 M Monokaliumzitrat und 0,1 N NaOH bei 18
 o C (*) 
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Zitrat auf 100 ml 3,8 9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Zitrat auf 100 ml 4,0 
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Zitrat auf 100 ml 4,2 23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Zitrat auf 100 ml 4,4 31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Zitrat auf 100 ml 4,6 
39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Zitrat auf 100 ml 4,8 
46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Zitrat auf 100 ml 5,0 54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Zitrat auf 100 ml 5,2 61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Zitrat auf 100 ml 5,4 68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Zitrat auf 100 ml 5,6 74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Zitrat auf 100 ml 5,8 81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml Zitrat auf 100 ml 6,0
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 902  
(*) Zur Vermeidung von Pilzbildung ist ein kleiner Kristall Thymol oder einer ähnlichen Substanz zuzusetzen.
 C. SÖRENSEN:  
Boratgemische von sörenseN  
Zusammensetzung Sörensen 
18 o C Walbum, pH bei 
ml Borax ml HCl/NaOH 10  o C 40  o C 70  o C 
0,05 M Borax + 0,1 NHCl  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 
6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 
9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
0,05 M Borax + 0,1 N NaOH  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
Phosphatgemische von SÖRENSEN  
Zusammensetzung pH  
0,0667 M Monokaliumphosphat + 0,0667 M Dinatriumphosphat bei 20  o C 
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 903
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 904
 
C.8. TOXIZITÄT FÜR REGENWÜRMER  
PRÜFUNG IN KÜNSTLICHEM BODEN  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Bei dieser Laborprüfung wird die Prüfsubstanz einem künstlichen 
Boden zugesetzt; in diesem Boden werden die Würmer 14 Tage lang gehalten. Nach 14 Tagen (wahlweise nach 7 Tagen) wird die tödliche Wirkung der Substanz auf die Regenwürmer überprüft. Die ­
ser Test ist eine Methode zur relativ schnellen Überprüfung der 
Wirkung von Chemikalien auf Regenwürmer bei Aufnahme über die Haut und die Nahrung.
 
1.2. DEFINITION UND MESSGRÖSSE  
LC 50 : Die Konzentration einer Substanz, durch die 50 % der Ver ­
suchstiere während der Versuchszeit getötet werden.  
1.3. REFERENZSUBSTANZ  
Mit einer Referenzsubstanz wird regelmäßig überprüft, dass sich die 
Empfindlichkeit des Prüfsystems nicht wesentlich geändert hat.  
Als Referenzsubstanz wird Chloracetamid p. a. empfohlen.  
1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Der Boden ist ein sehr variables Medium; daher wird bei dieser 
Prüfung ein sorgfältig definierter künstlicher Lehmboden verwendet. 
Adulte Regenwürmer der Art  Eisenia foetida  (siehe Anmerkung in 
der Anlage) werden in einem definierten künstlichen Boden gehalten, der mit verschiedenen Konzentrationen der Prüfsubstanz behandelt wird. 14 Tage (wahlweise 7 Tage) nach Prüfbeginn wird der Gefäß ­
inhalt in einer flachen Schale ausgebreitet. Die bei der jeweiligen 
Konzentration überlebenden Regenwürmer werden gezählt.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Die Prüfmethode muss hinsichtlich Prüfsubstanz und Prüforganismus 
so reproduzierbar wie möglich sein. Die Mortalität in den Kontrollen 
darf am Ende der Prüfung 10 % nicht überschreiten oder aber die 
Prüfung ist ungültig.  
1.6. BESCHREIBUNG DES PRÜFVERFAHRENS  
1.6.1.  Material  
1.6.1.1. P r ü f s u b s t r a t  
Ein definierter künstlicher Boden wird als Grundprüfsubstrat einge ­
setzt.  
a) Grundsubstrat (in Prozent des Trockengewichts)  
— 10 % Sphagnumtorf (so nahe wie möglich bei pH 5,5 bis 6,0; 
ohne sichtbare Pflanzenreste und fein gemahlen);  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 905
 
— 20 % Kaolinitkreide mit vorzugsweise mehr als 50 % 
Kaolinit;  
— etwa 69 % Industriequarzsand (überwiegend feiner Sand mit 
mehr als 50 % 0,05 bis 0,2 mm großen Teilchen). Wenn die Prüfsubstanz in Wasser ungenügend dispergierbar ist, werden 
10 g pro Prüfgefäß aufbewahrt, die später mit der Prüfsub ­
stanz gemischt werden;
 
— etwa 1 % Kalziumcarbonat (CaCO  1 ), in Pulverform, chemisch 
rein, zur Einstellung des pH-Werts auf 6,0 ± 0,5.  
b) Prüfsubstrat  
Das Prüfsubstrat enthält das Grundsubstrat, die Prüfsubstanz und 
deionisiertes Wasser.  
Der Wassergehalt beträgt etwa 25 bis 42 % des Trockengewichts 
des Grundsubstrats. Der Wassergehalt des Substrats wird be ­
stimmt, indem eine Probe bei 105  o C bis zur Gewichtskonstanz 
getrocknet wird. Es ist eine wichtige Voraussetzung, dass der künstliche Boden durchnässt ist, aber kein Wasser darauf steht. Um eine gleichmäßige Verteilung der Prüfsubstanz im Substrat zu 
erzielen, muss sorgfältig gemischt werden. Es muss im Prüfbe ­
richt angegeben werden, wie die Prüfsubstanz in das Substrat eingebracht wird.
 
c) Kontrollsubstrat  
Das Kontrollsubstrat enthält das Grundsubstrat und Wasser. Wird 
ein Trägerstoff verwendet, so muss eine zusätzliche Kontrolle die gleiche Menge an Trägerstoff enthalten.
 
1.6.1.2. P r ü f g e f ä ß e  
Glasgefäße mit perforierten Kunststoffdeckeln, -platten oder -folien 
von ca. 1 Liter Inhalt werden mit einer Menge an feuchtem Prüf- oder Kontrollsubstrat gefüllt, die 500 g Trockengewicht des Substrats 
entspricht.
 
1.6.2.  Prüfbedingungen  
Die Gefäße werden in Klimakammern bei einer Temperatur von 
20 o C ± 2  o C und Dauerlicht gehalten. Die Lichtintensität beträgt 
400 bis 800 Lux.  
Die Versuchszeit beträgt 14 Tage, aber die Mortalität kann wahl ­
weise 7 Tage nach Versuchsbeginn bewertet werden.  
1.6.3.  Prüfverfahren  
P r ü f k o n z e n t r a t i o n  
Die Konzentrationen der Prüfsubstanz werden als Gewicht der Sub ­
stanz pro Trockengewicht des Grundsubstrats (mg/kg) ausgedrückt.  
V o r v e r s u c h  
In einer Vorprüfung wird der Konzentrationsbereich bestimmt, in 
dem 0 bis 100 % Mortalität auftritt. Der Vorversuch liefert Informa ­
tionen zu dem in der Hauptprüfung zu verwendenden Konzentrati ­
onsbereich.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 906
 
Die Prüfsubstanz sollte bei folgenden Konzentrationen getestet wer ­
den: 1 000; 100; 10; 1; 0,1 mg Substanz/kg Prüfsubstrat (Trocken ­
gewicht).  
Wird eine vollständige Hauptprüfung durchgeführt, reichen 1 Prüf ­
ansatz pro Konzentration und 1 pro unbehandelte Kontrolle mit je 10 
Würmern für die Vorprüfung aus.  
H a u p t p r ü f u n g  
Die Ergebnisse des Vorversuchs werden eingesetzt, um mindestens 5 
Konzentrationen in einer geometrischen Reihe zu wählen, die den Bereich von 0 bis 100 % Mortalität umfassen, und die sich durch 
einen konstanten Faktor unterscheiden, der 1,8 nicht überschreitet.
 
Über diese Konzentrationsreihe sollten sich der LC  50 -Wert und sein 
Vertrauensbereich so genau wie möglich bestimmen lassen.  
In der Hauptprüfung werden mindestens 4 Prüfansätze pro Konzen ­
tration und 4 unbehandelte Kontrollen mit je 10 Würmern eingesetzt. 
Die Ergebnisse dieser Parallelansätze werden als Mittelwert und 
Standardabweichung angegeben.  
Ergeben zwei aufeinander folgende Konzentrationen, die sich um 
den Faktor 1,8 unterscheiden, 0 und 100 % Mortalität, so reichen diese beiden Werte aus, um den Bereich anzugeben, in dem der LC
 50 -Wert liegt.  
M i s c h u n g d e s G r u n d p r ü f s u b s t r a t s u n d d e r P r ü f ­
s u b s t a n z  
Das Prüfsubstrat sollte möglichst immer ohne andere Trägerstoffe als 
Wasser angesetzt werden. Unmittelbar vor Prüfbeginn wird die in deionisiertem Wasser oder einem anderen Lösungsmittel emulgierte oder dispergierte Prüfsubstanz mit dem Grundprüfsubstrat gemischt 
oder aber sie wird mit einem feinen chromatografischen Sprüher oder 
etwas Ähnlichem gleichmäßig aufgesprüht.
 
Wenn die Prüfsubstanz wasserunlöslich ist, wird sie in dem kleinst ­
möglichen Volumen eines geeigneten organischen Lösungsmittels (z. B. Hexan, Aceton oder Chloroform) gelöst. Um die Prüfsubstanz zu lösen, zu dispergieren oder zu emulgieren, dürfen nur leicht 
flüchtige Lösungsmittel verwendet werden. Das Prüfsubstrat muss 
vor Gebrauch belüftet werden. Verdunstetes Wasser muss ersetzt werden. Die Kontrolle muss die gleiche Menge jeden Trägerstoffes enthalten.
 
Ist die Prüfsubstanz in organischen Lösungsmitteln nicht löslich, 
dispergierbar oder emulgierbar, werden 10 g eines Gemischs von fein gemahlenem Quarzsand und der zur Behandlung von 500 g 
künstlichem Boden (Trockengewicht) benötigten Menge an Prüfsub ­
stanz mit 490 g Prüfsubstrat (Trockengewicht) gemischt.
 
Für jeden Prüfansatz wird feuchtes Prüfsubstrat in einer Menge, die 
500 g Trockengewicht entspricht, in die einzelnen Glasgefäße gefüllt. Je 10 Würmer, die 24 Stunden lang zur Gewöhnung in einem ent ­
sprechend feuchten Grundsubstrat gehalten, dann schnell gewaschen 
und mit Filterpapier abgetupft wurden, werden auf das Prüfsubstrat 
gesetzt.
 
Um ein Austrocknen des Substrats zu vermeiden, werden die Gefäße 
mit perforierten Kunststoffdeckeln, -platten oder -folien zugedeckt 
und 14 Tage lang unter Versuchsbedingungen belassen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 907
 
Die Auswertung wird 14 Tage (und wahlweise 7 Tage) nach Prüf ­
beginn durchgeführt. Das Substrat wird auf einer  
Platte aus Glas oder rostfreiem Stahl ausgebreitet. Die Würmer wer ­
den untersucht und die Überlebenden gezählt. Regenwürmer gelten als tot, wenn sie nicht auf einen leichten mechanischen Reiz am Vorderende reagieren.
 
Anschließend an eine Untersuchung nach 7 Tagen wird das Substrat 
wieder in das Prüfgefäß eingefüllt und die überlebenden Regenwür ­
mer werden wieder auf dasselbe Prüfsubstrat gesetzt.  
1.6.4.  Prüforganismen  
Als Prüforganismen werden adulte  Eisenia foetida  (siehe Anlage) 
(mindestens 2 Monate alt mit Clitellum) von 300 bis 600 mg Feucht ­
gewicht eingesetzt (zur Anzucht siehe Anlage).  
2. DATEN  
2.1. VERARBEITUNG UND AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE  
Die Konzentrationen der Prüfsubstanz werden zusammen mit dem 
jeweils entsprechenden Prozentsatz an toten Regenwürmern angegeben.
 
Wenn die Daten es zulassen, lassen sich der LC  50 -Wert und der 
Vertrauensbereich (p = 0,05) nach Standardmethoden bestimmen 
(Litchfield und Wilcoxon, 1949, oder entsprechende Methode). Die LC
 50 wird in mg Prüfsubstanz pro kg Trockengewicht des Prüfsub ­
strats angegeben.  
Ist die Konzentrationskurve zu steil, um eine Berechnung der LC  50 
zuzulassen, dann genüge es, den Wert aufgrund der grafischen Dar ­
stellung abzuschätzen.  
Ergeben 2 aufeinander folgende Konzentrationen, die sich um den 
Faktor 1,8 unterscheiden, 0 und 100 % Mortalität, so reichen diese 
beiden Werte aus, um den Bereich anzugeben, in dem die LC  50 liegt.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— die Feststellung, dass die Prüfung in Übereinstimmung mit den 
oben genannten Qualitätskriterien durchgeführt wurde;  
— welche Prüfung durchgeführt wurde (Vorprüfung und/oder 
Hauptprüfung);  
— die genaue Beschreibung der Prüfbedingungen oder die Feststel ­
lung, dass die Prüfung entsprechend der angegebenen Methode durchgeführt wurde; jede Abweichung muss angegeben werden;
 
— die genaue Beschreibung, wie die Prüfsubstanz in das Grundprüf ­
substrat eingebracht wurde;  
— Angaben zu den Prüforganismen (Art, Alter, Durchschnitts ­
gewicht und Gewichtsbereich, Haltungs- und Anzuchtmethoden, 
Herkunft);  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 908
 
— das zur Bestimmung der LC  50 angewendete Verfahren;  
— die Prüfergebnisse einschließlich aller verwendeten Daten;  
— die Beschreibung der beobachteten Symptome oder Veränderun ­
gen im Verhalten der Versuchstiere;  
— die Mortalität in den Kontrollen;  
— die LC  50 oder die höchste geprüfte Konzentration ohne Mortalität 
und die niedrigste geprüfte Konzentration mit einer Mortalität von 100 % 14 Tage (wahlweise 7 Tage) nach Prüfbeginn;
 
— das Auftragen der Konzentrations-Wirkungs-Kurve;  
— die Ergebnisse, die mit der Referenzsubstanz erzielt wurden, ent ­
weder in Verbindung mit der vorliegenden Prüfung oder aus vorherigen Qualitätskontrollversuchen.
 
4. LITERATUR  
(1) OECD, Paris, 1981,  Test Guideline 207,  Beschluss des Rates 
C(81) 30 final.  
(2) Edwards, C. A. and Lofty, J. R., 1977,  Biology of Earthworms.  
Chapman and Hall, London, 331.  
(3) Bauche, M. B., 1972,  Lombriciens de France, Ecologie et 
Systematique,  Institut National de la Recherche Agronomique, 
671 S. .  
(4) Litchfield.J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of eva ­
luating dose-effect experiments. J.  Pharm. Exp. Therap.,  1949, 
Band 96, 99.  
(5) Commission of the European Communities,  Development of a 
standardized Laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms,  Report EUR 8714 EN, 
1983.
 
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Toxizitäts ­
test am Regenwurm  Eisenia foetida  in künstlichem Boden“, in: 
Rudolph/Boje:  ökotoxikologie,  ecomed, Landsberg, 1986.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 909
 
Anlage  
Anzucht und Haltung der Würmer vor der Prüfung  
Zur Anzucht werden 30 bis 50 adulte Würmer 14 Tage lang in einem Brutkasten 
mit frischem Substrat gehalten. Diese Tiere können für weitere Anzuchten ver ­
wendet werden. Die aus den Kokons geschlüpften Würmer werden für die Prü ­
fung eingesetzt, wenn sie geschlechtsreif sind (nach 2 bis 3 Monaten bei den 
vorgeschriebenen Bedingungen).  
Anzucht und Haltungsbedingungen  
Klimakammer:: 20  o C ± 2  o C vorzugsweise mit Dauerlicht (400 bis 800 Lux).  
Brutkasten:: Geeignete flache Behälter von 10 bis 20 Liter Inhalt.  
Substrat::  Eisenia foetida  kann in verschiedenen tierischen Exkrementen 
angezogen werden. Es wird empfohlen, ein Gemisch von 50 Vol. % Torf und 50 Vol. % Kuh- oder Pferdedung zu verwenden. Der pH-Wert sollte bei 6 bis 7 liegen (er wird 
mit Kalziumcarbonat eingestellt); die Ionenleitfähigkeit sollte 
niedrig sein (weniger als 6 mmhos oder 0,5 % Salzkonzentra ­
tion). 
Das Substrat sollte feucht, aber nicht zu nass sein.
 
Neben der oben angegebenen Methode können auch andere 
bewährte Verfahren eingesetzt werden.  
Anmerkung: Eisenia foetida  gibt es in 2 Rassen, die von einigen Taxonomen als 
2 verschiedene Arten bezeichnet werden (Bouche, 1972). Morphologisch sind sie 
ähnlich, doch zeigt  Eisenia foetida foetida  typische Querstreifen oder Bänder auf 
den Segmenten, während  Eisenia foetida andrei  diese nicht aufweist und fleckig 
rötlich gefärbt ist. Es sollte möglichst  Eisenia foetida andrei  verwendet werden. 
Andere Arten können eingesetzt werden, wenn das nötige Verfahren zur Ver ­
fügung steht.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 910
 
C.9. BIOLOGISCHE ABBAUBARKEIT  
ZAHN-WELLENS-TEST  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Zweck des Verfahrens ist die Prüfung der potenziellen vollständigen 
biologischen Abbaubarkeit wasserlöslicher, nichtflüchtiger organi ­
scher Stoffe, indem diese in einem statischen Test relativ hohen Konzentrationen von Mikroorganismen ausgesetzt werden.
 
Eine physikalisch-chemische Adsorption an suspendierte Feststoffe 
kann auftreten und muss ggf. bei der Interpretation der Ergebnisse 
berücksichtigt werden (siehe 3.2).  
Die Prüfsubstanzen werden in Konzentrationen verwendet, die DOC- 
Werten von 50 bis 400 mg/l oder CSB-Werten von 100 bis 1 000 
mg/l entsprechen (DOC = Dissolved Organic Carbon, gelöster orga ­
nischer Kohlenstoff; CSB = Chemischer Sauerstoffbedarf). Diese verhältnismäßig hohen Konzentrationen ermöglichen zuverlässige Analysen, Verbindungen mit toxischen Eigenschaften können den 
Abbauprozess verzögern oder hemmen.
 
Bei diesem Verfahren wird die Konzentration des gelösten organi ­
schen Kohlenstoffs oder der chemische Sauerstoffbedarf zur Beur ­
teilung der vollständigen biologischen Abbaubarkeit der Prüfsubstanz 
benutzt.  
Werden gleichzeitig spezifische Analysemethoden angewandt, kann 
die biologische Primär-Abbaubarkeit des Stoffes beurteilt werden 
(Abnahme der chemischen Ausgangsstruktur).  
Mit diesem Verfahren können nur organische Stoffe geprüft werden, 
die bei der verwendeten Konzentration  
— unter den Testbedingungen wasserlöslich sind,  
— unter den Testbedingungen einen unbedeutenden Dampfdruck 
haben,  
— die Bakterien nicht hemmen,  
— im Testsystem nur beschränkt adsorbiert werden,  
— nicht durch Schäumen aus der Testlösung verloren gehen.  
Angaben über die relativen Anteile der wichtigsten Komponenten 
der Prüfsubstanz sind zur Interpretation der erzielten Ergebnisse ins ­
besondere dann nützlich, wenn niedrige oder marginale Abbauwerte 
erhalten werden.  
Informationen über die Toxizität des Stoffes gegenüber Mikroorga ­
nismen sind zur Interpretation niedriger Abbauwerte sowie zur Wahl 
der geeigneten Prüfkonzentration ebenfalls nützlich.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 911
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Der nach Ablauf des Tests erzielte Abbaugrad wird als „Biologische 
Abbaubarkeit im Zahn-Wellens-Test“ angegeben:  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100 
D T = Abbau ( %) zur Zeit T,  
C A = DOC(oder CSB)-Werte des Prüfansatzes 3 Stunden nach 
Beginn des Tests (mg/l),  
C T = DOC(oder CSB)-Werte des Prüfansatzes zur Zeit der Pro ­
benahme (mg/l),  
C B = DOC(oder CSB)-Werte des Blindansatzes zur Zeit der Pro ­
benahme (mg/l),  
C BA = DOC(oder CSB)-Werte des Blindansatzes 3 Stunden nach 
Beginn des Tests (mg/l).  
Der Abbaugrad wird auf ganze Prozentzahlen gerundet.  
Als prozentualer Abbau wird der Prozentsatz der DOC-(oder CSB)- 
Verminderung der Prüfsubstanz angegeben.  
Die Differenz zwischen dem nach 3 Stunden gemessenen und dem 
berechneten oder vorzugsweise gemessenen Anfangswert stellt eine 
nützliche Information über die Eliminierung des Stoffes dar (siehe 3.2 „Interpretation der Ergebnisse“).
 
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Bei der Untersuchung neuer Stoffe können in einigen Fällen Refe ­
renzsubstanzen nützlich sein; spezifische Substanzen können jedoch nicht empfohlen werden.
 
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Belebtschlamm, mineralische Nährstoffe und die Prüfsubstanz als 
einzige Kohlenstoffquelle werden in wässriger Lösung in ein Glas ­
gefäß von 1 bis 4 Liter Volumen mit Rührwerk und Belüftungsvor ­
richtung gegeben. Die Suspension wird bei 20 bis 25  o C bei diffu ­
sem Licht oder in einem dunklen Raum bis zu 28 Tage gerührt und belüftet. Der Abbau wird verfolgt, indem die DOC-(oder CSB- 
)Werte der Lösung nach Filtration täglich oder in anderen geeigneten 
Zeitabständen gemessen werden. Das Verhältnis zwischen dem zur Zeit der Probenahme eliminierten DOC- (oder CSB-)Wert und dem 3 Stunden nach Beginn des Tests gemessenen Wert wird als Prozent ­
satz des biologischen Abbaus angegeben und dient als Maß des 
Abbaugrades zum betreffenden Zeitpunkt. Das Ergebnis wird jeweils gegen die Zeit grafisch aufgetragen und der biologische Abbau als Kurve dargestellt.
 
Wird ein spezifisches Analyseverfahren angewandt, so können Än ­
derungen in der Konzentration der Ausgangsverbindung, die infolge 
des biologischen Abbaus auftreten, gemessen werden (Biologischer 
Primärabbau).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 912
 
1.5. QU ALITÄTSKRITERIEN  
In einem Ringversuch ergab sich eine befriedigende Reproduzierbar ­
keit des Tests.  
Die Empfindlichkeit des Verfahrens ist weitgehend abhängig von der 
Variabilität des Blindansatzes und in geringem Ausmaß von der Genauigkeit der Bestimmung des gelösten organischen Kohlenstoffs 
sowie der Konzentration der Prüfsubstanz in der Kultursuspension.
 
1.6. PRÜFVERFAHREN  
1.6.1.  Vorbereitung  
1.6.1.1. R e a g e n z i e n  
Wasser: Trinkwasser mit einem Gehalt an organischem Kohlenstoff 
< 5 mg/l. Die Konzentration der Kalzium- und Magnesiumionen darf insgesamt 2,7 mMol/l nicht übersteigen; sonst ist eine ausreichende Verdünnung mit deionisiertem oder destilliertem Wasser erforderlich. 
Schwefelsäure, p. a.: 50 g/l 
Natriumhydroxidlösung, p. a.: 40 g/l 
Mineralische Nährlösung: in 1 Liter deionisiertem Was ­
ser ist Folgendes zu lösen: 
Ammoniumchlorid, NH
 4 Cl, p. a.: 38,5 g 
Natriumdihydrogenphospat, NaH  2 PO 2 .2H  2 O 2 p. a.: 33,4 g 
Kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO4, p. a.: 8,5 g Dikaliummonohydrogenphosphat, K
 2 HPO  4 , p. a.: 21,75 g.  
Dieser Ansatz dient sowohl als Nähr- als auch als Pufferlösung.  
1.6.1.2. G e r ä t e  
Glasgefäße mit 1 bis 4 Liter Volumen (z. B. zylindrische Gefäße).  
Rührwerk mit Rührelement aus Glas oder Metall an einem geeig ­
neten Stiel (das Rührelement sollte sich 5 bis 10 cm über dem Boden des Gefäßes bewegen). Auch ein magnetisches Rührwerk mit einem 7 bis 10 cm langen Magnetstab kann benutzt werden.
 
Glasrohr von 2 bis 4 mm Innendurchmesser zur Belüftung. Die 
Rohröffnung sollte sich rund 1 cm über dem Boden des Gefäßes befinden.
 
Zentrifuge (rd. 3 550 g).  
pH-Messgerät.  
Gerät zur Messung des gelösten Sauerstoffs.  
Papierfilter.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 913
 
Membranfiltrationsgerät.  
Membranfilter, Porengröße 0,45 μm. Die Membranfilter dürfen we ­
der Kohlenstoff freisetzen noch während der Filtration absorbieren.  
Analysegerät zur Bestimmung des Gehalts an organischem Kohlen ­
stoff und Ausrüstung zur Bestimmung des chemischen Sauerstoff ­
bedarfs.  
1.6.1.3. V o r b e r e i t u n g d e s I n o k u l u m s  
Belebtschlamm aus einer biologischen Kläranlage wird gewaschen, 
indem er mit Wasser (der vorgeschriebenen Qualität) wiederholt zen ­
trifugiert oder sedimentiert wird.  
Der Belebtschlamm muss in einem geeigneten Zustand sein. Er ist in 
einer einwandfrei arbeitenden Kläranlage erhältlich. Um möglichst viele Bakterienarten oder Stämme zu erhalten, sollten evtl. Inokula aus verschiedenen Quellen gemischt werden (z. B. Schlamm aus 
verschiedenen Kläranlagen, Bodenextrakte, Flusswasser usw.). Das 
Gemisch ist nach obiger Beschreibung zu behandeln.
 
Zur Prüfung der Aktivität des Belebtschlamms siehe „Funktionskon ­
trolle“ (unter 1.6.2).  
1.6.1.4. Z u b e r e i t u n g d e r T e s t l ö s u n g e n  
In das Testgefäß sind 500 ml Wasser, 2,5 ml/l mineralische Nähr ­
lösung und Belebtschlamm in einer Menge von 0,2 bis 1,0 g/l Tro ­
ckenmasse im Endgemisch zu geben. Man gebe genügend Stamm ­
lösung der Prüfsubstanz hinzu, um eine DOC-Konzentration von 
50 bis 400 mg/l in der Kultursuspension zu erhalten. Die entspre ­
chenden CSB-Werte sind 100 bis 1 000 mg/l. Dann wird mit Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 1 bis 4 Liter aufgefüllt. Das zu wählende Gesamtvolumen ist abhängig von der Anzahl Pro ­
ben für die DOC- oder CSB-Bestimmungen und vom für das Ana ­
lyseverfahren benötigten Probevolumen.
 
In der Regel sind 2 Liter ausreichend. Gleichzeitig mit jeder Testse ­
rie ist zumindest eine Kontrolle durchzuführen; der Kontrollansatz (Blindprobe) hierfür enthält nur Belebtschlamm und Mineralnähr ­
lösung und wird mit Wasser auf das gleiche Volumen wie die Prüf ­
ansätze aufgefüllt.
 
1.6.2.  Durchführung der Prüfung  
Die Kulturgefäße werden bei diffusem Licht oder in einer Dunkel ­
kammer bei 20 bis 25  o C inkubiert und mit Hilfe eines magnetischen 
Rührwerks oder eines Schraubenpropellers gerührt. Die Belüftung erfolgt mit Druckluft, die — falls erforderlich — mit einem Watte ­
filter oder einer Waschflasche zu reinigen ist. Es ist dafür zu sorgen, 
dass sich der Schlamm nicht absetzt und die Sauerstoffkonzentration 
nicht unter 2 mg/l sinkt.
 
Der pH-Wert ist in regelmäßigen Abständen zu prüfen (z. B. täglich) 
und ggf. auf 7 bis 8 einzustellen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 914
 
Verdunstungsverluste werden vor jeder Probenahme mit deionisier ­
tem oder destilliertem Wasser ausgeglichen. Hierfür ist es zweck ­
mäßig, das Flüssigkeitsniveau am Gefäß vor Beginn des Tests zu markieren. Nach jeder Probenahme wird bei ausgeschalteter Belüf ­
tung und Rührung eine neue Marke angebracht. Die ersten Proben 
werden jeweils drei Stunden nach Beginn des Tests entnommen, um 
die Absorption der Prüfsubstanz an den Belebtschlamm zu ermitteln.
 
Die Elimination der Prüfsubstanz wird verfolgt, indem täglich oder 
in anderen regelmäßigen Zeitabständen die DOC- oder CSB-Werte 
bestimmt werden. Die Proben aus dem Prüfansatz und die Blind ­
proben werden durch ein sorgfältig gewaschenes Papierfilter filtriert. 
Die ersten 5 ml des Filtrats sind zu verwerfen. Schwer zu filtrierende 
Suspensionen können zuvor durch Zentrifugation (10 Minuten) vor ­
gereinigt werden. Die DOC- und DSB-Bestimmungen werden min ­
destens doppelt ausgeführt. Die Ansätze werden bis zu 28 Tage 
inkubiert.  
Anmerkung:  Proben, die nach dieser Behandlung noch trüb sind, 
werden durch Membranfilter filtriert. Die Membranfilter dürfen keine 
organischen Stoffe freisetzen oder adsorbieren.  
F u n k t i o n s k o n t r o l l e d e s B e l e b t s c h l a m m s  
Parallel zu jeder Testserie ist ein Ansatz mit einer Substanz, deren 
Abbauverhalten bekannt ist, zu prüfen, um die Abbau-Kapazität des 
Belebtschlamms zu kontrollieren. Diäthylenglykol hat sich hierfür als 
zweckmäßig erwiesen.  
A d a p t a t i o n  
Werden Analysen in relativ kurzen Zeitabständen (z. B. täglich) 
durchgeführt, so lässt sich die Adaptation aufgrund der Abbaukurve klar erkennen (siehe Abbildung 2). Der Test sollte deshalb nicht 
unmittelbar vor einem Wochenende begonnen werden.
 
Erfolgt die Adaptation am Ende der normalen Testdauer, so kann der 
Test bis zum vollständigen Abbau der Prüfsubstanz verlängert werden.  
Anmerkung:  Ist eine eingehendere Kenntnis über das Verhalten des 
adaptierten Belebtschlamms erforderlich, so wird dieser nach folgen ­
dem Verfahren ein weiteres Mal mit der gleichen Prüfsubstanz in ­
kubiert:  
Rührwerk und Belüftung werden ausgeschaltet, damit sich der Be ­
lebtschlamm absetzen kann. Die überstehende Flüssigkeit wird ent ­
fernt, man füllt mit Wasser (Testqualität) auf 2 Liter auf, rührt 15 
Minuten lang und lässt den Schlamm absetzen. Die überstehende Flüssigkeit wird wiederum entfernt und der Test mit dem verblei ­
benden Schlamm und der gleichen Prüfsubstanz wie oben unter 
1.6.1.4 und 1.6.2 beschrieben wiederholt. Der Belebtschlamm kann 
auch durch Zentrifugieren anstatt durch Absetzen gewonnen werden.
 
Der adaptierte Schlamm kann mit frischem Belebtschlamm gemischt 
werden, so dass wiederum 0,2 bis 1 g Trockengewicht pro Liter in 
der Kultursuspension erreicht werden,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 915
 
V o r b e r e i t u n g f ü r d i e A n a l y s e  
Die Proben werden in der Regel durch ein sorgfältig gewaschenes 
Papierfilter filtriert (zum Waschen verwende man entionisiertes Wasser).
 
Trübe Proben werden durch Membranfilter (0,45 μm) filtriert.  
Die DOC-Konzentration wird in Probefiltraten (die ersten 5 ml wer ­
den verworfen) mit dem TOG-Messgerät doppelt bestimmt. Kann das Filtrat nicht am gleichen Tag analysiert werden, so muss es bis zum nächsten Tag im Kühlschrank aufbewahrt werden. Von 
längeren Lagerungen wird abgeraten.
 
Die CSB-Konzentration der Probefiltrate wird nach dem in der Li ­
teraturangabe (  2 ) beschriebenen Verfahren bestimmt.  
2. DATEN UND AUSWERTUNG  
Die DOC- und CSB-Konzentrationen werden in den Proben, wie 
oben in 1.6.2 beschrieben, mindestens doppelt bestimmt. Der Abbau 
zum Zeitpunkt T wird nach der unter 1.2 oben angegebenen Formel mit den Definitionen berechnet.
 
Der Abbaugrad wird auf ganze Prozentzahlen aufgerundet. Der nach 
Ablauf des Tests erreichte Abbau wird als „Biologische Abbaubar ­
keit im Zahn-Wellens-Test“ angegeben.  
Anmerkung:  Wird vor Ablauf der Testzeit ein vollständiger Abbau 
erreicht und dieses Ergebnis in einer zweiten Analyse am nächsten 
Tag bestätigt, so kann die Prüfung beendet werden.  
3. SCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— Substanzkonzentration zu Beginn des Tests;  
— sämtliche Informationen und experimentellen Ergebnisse, die mit 
der Prüfsubstanz, ggf. der Referenzsubstanz sowie der Blind ­
probe erhalten wurden;  
— Substanzkonzentration nach drei Stunden;  
— Abbau-Kurve mit Beschreibung;  
— Datum und Ort der Entnahme der Organismen, Stand der Adap ­
tation, verwendete Konzentration usw.;  
— wissenschaftliche Gründe für jedwede Änderungen des Testver ­
fahrens.  
3.2. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Eine fortschreitende Abnahme des DOC (CSB) innerhalb von Tagen 
oder Wochen weist auf einen biologischen Abbau des Teststoffes 
hin. ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 916
 
Eine physikalisch-chemische Adsorption kann jedoch in manchen 
Fällen auch eine Rolle spielen; ein Hinweis darauf besteht, wenn 
während der ersten drei Stunden eine vollständige oder teilweise DOC-(CSB-)Abnahme festgestellt wird und der Unterschied zwi ­
schen der überstehenden Flüssigkeit in den Proben aus dem Kontroll ­
gefäß und dem Testgefäß unerwartet niedrig ist.
 
Soll zwischen vollständigem (oder teilweisem) biologischem Abbau 
und Adsorption unterschieden werden, sind weitere Tests erforder ­
lich. Hierfür bieten sich mehrere Möglichkeiten an; am besten ver ­
wendet man jedoch überstehende Kultursuspension aus dem Prüf ­
ansatz als Inokulum in einem Grundstufen-Test (vorzugsweise in 
einem respirometrischen Test).  
Prüfsubstanzen, die eine weitgehende, nicht durch Adsorption be ­
dingte Abnahme des DOC-(CSB)Gehalts in diesem Test aufweisen, sind als potenziell biologisch abbaubar zu betrachten. Eine partielle 
nichtadsorptive Abnahme weist darauf hin, dass der Stoff zumindest 
teilweise biologisch abbaubar ist.
 
Erfolgt keine oder nur eine geringe DOC-(CSB-)Abnahme, kann dies 
möglicherweise auf einer Hemmung der Mikroorganismen durch den 
zu prüfenden Stoff beruhen. Eine Hemmung kann sich auch durch 
Auflösung und Verlust des Schlammes sowie einer Trübung der überstehenden Kultursuspension zeigen. In solchen Fällen ist die Prüfung mit einer niedrigeren Konzentration des zu prüfenden Stof ­
fes zu wiederholen.
 
Durch spezifische Analysemethoden oder den Einsatz  14 C-markierter 
Prüfsubstanzen lässt sich evtl. eine höhere Empfindlichkeit erreichen. Wird
 14 C-markierte Prüfsubstanz verwendet, lässt sich durch Nach ­
weis des entstehenden  14 CO 2 bestätigen, dass ein biologischer Abbau 
stattgefunden hat.  
Werden die Ergebnisse auch in Form des biologischen Primär-Ab ­
baus angegeben, so sollten, wenn möglich, Angaben über die Ver ­
änderungen der chemischen Struktur gemacht werden, die die man ­
gelnde Wiederauffindung der Ausgangssubstanz begründen.  
Die Eignung der Analysemethode sowie die damit bestimmten Werte 
im Nährmedium ohne Zusatz der Prüfsubstanz müssen angegeben werden.
 
4. LITERATUR  
(1) OECD Paris, 1981,  Test Guideline 302 B,  Beschluss des Rates 
C(81) 30 final.  
(2) Anhang V C.9 Abbaubarkeit: Chemischer Sauerstoffbedarf. 
Richtlinie 84/449/EWG der Kommission (ABl. L 251 vom 
19.9.1984, S. 1).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 917
 
Anlage  
BEISPIEL EINER AUSWERTUNG 
Organische Verbindung: 4-Äthoxybenzoesäure 
Theoretische Testkonzentration: 600 mg/l Theoretischer DOC-Gehalt: 390 mg/l 
Impfgut (Inokulum): Kläranlage ... 
Konzentration: 1 Gramm Trockensubstanz/l Stand der Adaptation: nicht adaptiert Analyse: DOC-Bestimmung 
Probemenge: 3 ml 
Kontrollsubstanz: Diäthylenglykol Toxizität der Verbindung: keine toxische Wirkung unter 1 000 mg/l 
Angewandter Test: Gärröhrentest
 
Zeit Kontrollsubstanz Prüfsubstanz 
Blindansatz 
DOC (  1 ) 
mg/l DOC (  1 ) 
mg/l Netto DOC 
mg/l Abbau 
% DOC (  1 ) 
mg/l Netto DOC 
mg/l Abbau 
% 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 Std. 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 
1 Tag 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 
2 Tage 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 Tage 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 6 Tage 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 7 Tage 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 8 Tagt 7,8 142,5 134,7 55 ' 58,9 51,1 87 9 Tage 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 Tage (
 1 ) 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99  
( 1 ) Mittelwerte aus dreifacher Bestimmung.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 918
 
Abbildung 1  
Beispiele von Abbau-Kurven
  
Abbildung 2  
Beispiel für eine Adaptation des Schlammes
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 919
 
C.10.  SIMULATION DER AEROBEN ABWASSERBEHANDLUNG: C.10- 
A: BELEBTSCHLAMM — C.10-B: BIOFILME  
C.10-A: Belebtschlamm  
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD  Test Guideline  (TG) 303 (2001). In 
den 1950er Jahren wurde erkannt, dass die neu auf dem Markt eingeführten Tenside in Kläranlagen und Flüssen exzessive Schaumbildung verursachten. Sie wurden bei der aeroben Behandlung nicht vollständig abgebaut und 
behinderten in einigen Fällen auch den Abbau anderer organischer Substan ­
zen. Im Rahmen zahlreicher Untersuchungen wurde sodann geprüft, wie Tenside aus Abwässern entfernt werden könnten und ob neue industriell hergestellte chemische Stoffe für die Abwasserbehandlung geeignet sind. 
Dazu wurden Modellanlagen verwendet, die für die beiden wichtigsten Ar ­
ten der aeroben biologischen Abwasserbehandlung (Belebtschlamm- und Tropfkörperverfahren) repräsentativ sind. Es wäre unpraktisch und sehr kost ­
spielig gewesen, jede neu auf dem Markt eingeführte chemische Substanz 
auf kommunale Klärwerke zu verteilen und diese zu überwachen, selbst auf lokaler Basis.
 
AUSGANGSÜBERLEGUNGEN  
Belebtschlammanlagen  
2. Es wurden Belebtschlamm-Modellanlagen in Größenordnungen von 300 ml 
bis ca. 2 000 ml Fassungsvermögen beschrieben. Einige dieser Modellanla ­
gen gewährleisteten realitätsnahe Bedingungen mit Absetztanks und Schläm ­
men, die in den Belüftungstank zurückgepumpt wurden, während andere ohne Absetzvorrichtungen betrieben wurden, siehe z. B.  Swisher  (1). Die 
Größe der Apparatur ist stets ein Kompromiss: Sie muss einerseits groß 
genug sein, um einen reibungslosen mechanischen Ablauf und Probenahmen in einem Umfang zu gewährleisten, der den Betrieb der Ablage nicht beein ­
trächtigt, darf jedoch andererseits nicht so groß sein, dass sie zu viel Platz 
und Materialien in Anspruch nimmt.
 
3. Zwei Apparaturen, die häufig eingesetzt wurden und sich bewährt haben, 
sind die Modellanlage vom Typ  Husmann (2)  und der Poröse Topf ( Porous 
Pot) (3)(4), die als erste für die Untersuchung von Tensiden verwendet 
wurden; beide Modelle werden in diesem Kapitel näher beschrieben. 
Auch andere Modellanlagen, z. B.  Eckenfelder  (5), wurden mit Erfolg einge ­
setzt. Aufgrund des mit diesem Simulationstest verbundenen relativ hohen Kosten- und Arbeitsaufwands wurde parallel dazu die Möglichkeit einfache ­
rer und kostengünstigerer Screeningtests untersucht, die zurzeit in Kapitel 
C.4 (A-F) dieses Anhangs (6) beschrieben sind. Die Erfahrung mit zahlrei ­
chen Tensiden und anderen chemischen Substanzen hat gezeigt, dass sich Stoffe mit positiven („ pass“) Ergebnissen im Screeningtest (auf leichte bio ­
logische Abbaubarkeit) auch im Simulationstest zersetzten. Einige der Stoffe 
mit negativen ( „fail“ ) Ergebnissen im Screeningtest reagierten positiv 
(„pass“) im Test auf potenzielle (inhärente) Bioabbaubarkeit (Kapitel C.12 
(7) und C.19 (8) dieses Anhangs), doch nur wenige Substanzen dieser letzten Gruppe zersetzten sich im Simulationstest, während Stoffe mit nega ­
tiven Ergebnissen im Test auf inhärente Abbaubarkeit im Simulationstest 
nicht abgebaut wurden (9)(10)(11).
 
4. Für bestimmte Zwecke reichen Simulationstests, die stets unter denselben 
Prozessbedingungen durchgeführt werden, aus; die Ergebnisse dieser Tests werden als prozentuale Abnahme der Prüfsubstanz oder des gelösten orga ­
nischen Kohlenstoffs ( Dissolved Organic Carbon , DOC) ausgedrückt. Unter 
der vorliegenden Prüfmethode wird ein solcher Test beschrieben. Im Gegen ­
satz zur vorherigen Version dieses Kapitels, die nur einen einzigen Appara ­
turtypus beschrieb, bei dem die Behandlung synthetischer Abwässer in ge ­
koppelten Anlagen nach der relativ simplen Methode des Überschuss ­
schlammabzugs erfolgte, bietet diese aktuelle Version Variationsmöglichkei ­
ten, d. h. es werden Alternativen für Apparaturtyp, Betriebsmodus,
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 920
 
Abwässer und Überschussschlammabzug beschrieben. Der vorliegende Text 
lehnt sich eng an die ISO-Norm 11733 (12) an, die im Zuge der Ausarbei ­
tung des Textes eingehend geprüft wurde, obgleich die Methode keinem Ringtest unterzogen wurde.
 
5. Für andere Zwecke muss die Konzentration der Prüfsubstanz im Ablauf 
genauer bekannt sein, und zur Bestimmung dieser Konzentration ist eine umfassendere Methode erforderlich. Beispielsweise muss die Schlamm ­
abzugsrate im Tagesverlauf und während der gesamten Prüfungsdauer prä ­
ziser kontrolliert werden, und die Modellanlagen müssen bei verschiedenen 
Abzugsraten betrieben werden. Damit die Methode in jeder Hinsicht um ­
fassend ist, sollten die Tests auch unter zwei oder drei verschiedenen Tem ­
peraturbedingungen durchgeführt werden: Eine derartige Methode wird von  
Birch (13)  (14) beschrieben und ist in Anlage 6 zusammengefasst. Der 
aktuelle Wissensstand reicht jedoch nicht aus, um entscheiden zu können, welches der kinetischen Modelle zur Bestimmung der biologischen Abbau ­
barkeit chemischer Substanzen bei der Abwasserbehandlung und im Wasser ­
milieu im Allgemeinen geeignet ist. Die Anwendung der Monod-Kinetik 
(siehe Beispielfall in Anlage 6) ist auf chemische Substanzen begrenzt, die in Konzentrationen von 1 mg/l oder mehr präsent sind, wenngleich auch die Meinung vertreten wird, dass selbst dies zu beweisen ist. Tests 
bei Konzentrationen, die die Konzentrationen in Abwässern akkurater wider ­
spiegeln, sind in Anlage 7 beschrieben, werden jedoch, ebenso wie die Tests in Anhang 6, nicht als eigenständige Prüfmethoden geführt, sondern ledig ­
lich in den Anlagen genannt.
 
Filtration  
6. Sehr viel weniger Arbeit wurde in Modell-Tropfkörper investiert, vielleicht, 
weil sie aufwändiger und weniger kompakt sind als Modell-Belebtschlamm ­
anlagen.  Gerike et al  entwickelten Tropfkörperanlagen und betrieben sie im 
Koppelmodus (15). Die Filter waren relativ groß (2 m hoch mit einem Fassungsvermögen von 60 l) und für jeden einzelnen waren 2 l/Std. Ab ­
wasser erforderlich.  Baumann et al  (16) simulierten Tropfkörper, indem 1 m 
lange Röhren (mit 14 mm Innendurchmesser) mit zuvor für 30 Minuten in 
Belebtschlammkonzentrat getränkten Polyester-Vliesstreifen ausgekleidet wurden. Die Prüfsubstanz wurde als einzige C-Quelle in einer Mineralsalz ­
lösung in die vertikal angeordnete Röhre gegeben, und die biologische 
Abbaubarkeit wurde durch Messung des DOC im Ablauf und des CO
 2 im 
austretenden Gas bestimmt.  
7. Biofilter wurden auf andere Weise simuliert (15): Die Innenwandungen von 
Drehrohren, in einem kleinen Neigungswinkel zur Horizontalen angeordnet, 
wurden mit Abwasser (ungefähr 250 ml/Std.) mit und ohne Zusatz von Prüfsubstanz beaufschlagt, und die gesammelten Abläufe wurden auf DOC und/oder die betreffende Prüfsubstanz analysiert.
 
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
8. Dieses Verfahren ist ausgelegt, um die Elimination und den Primär- und/ 
oder den vollständigen biologischen Abbau wasserlöslicher organischer Sub ­
stanzen durch aerobe Mikroorganismen in einem das Belebtschlammverfah ­
ren simulierenden kontinuierlich betriebenen Prüfsystem bestimmt werden. 
Ein leicht biologisch abbaubares organisches Medium und die organische 
Prüfsubstanz dienen als C-Quellen und Energiequellen für die Mikroorga ­
nismen.  
9. Zwei kontinuierlich betriebene Prüfsysteme (Belebtschlamm- oder  Porous- 
Pot-Anlagen) werden unter identischen Bedingungen, die je nach Prüfungs ­
zweck festgelegt werden, parallel betrieben. In der Regel betragen die mitt ­
lere hydraulische Verweilzeit 6 Stunden und das mittlere Schlammalter 
(Schlammverweilzeit) 6 bis 10 Tage. Überschussschlamm wird nach einer 
von zwei Methoden abgezogen, und der Zulauf (organisches Medium) von ausschließlich einer der beiden Prüfanlagen wird mit Prüfsubstanz einer Konzentration von üblicherweise 10 mg/l DOC bis 20 mg/l DOC beschickt. 
Die zweite Anlage fungiert als Kontrollanlage zur Bestimmung der biologi ­
schen Abbaubarkeit des organischen Mediums.
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10. Anhand häufig gezogener Ablaufproben werden durch spezifische Analyse 
der DOC (vorzugsweise) oder der chemische Sauerstoffbedarf (CSB) sowie 
die Prüfsubstanzkonzentration (soweit erforderlich) im Ablauf der mit der Prüfsubstanz beschickten Anlage bestimmt. Es wird davon ausgegangen, dass die Differenz zwischen den DOC- oder CSB-Konzentrationen in den 
Abläufen der Prüf- und der Kontrollanlage auf die Prüfsubstanz oder ihre 
organischen Stoffwechselprodukte zurückzuführen ist. Um die Elimination der Prüfsubstanz zu ermitteln, wird diese Differenz mit der durch die zu ­
geführte Prüfsubstanz bedingten DOC- oder CSB-Konzentration im Zulauf 
verglichen.
 
11. In der Regel lässt sich biologische Abbaubarkeit durch sorgfältige Prüfung 
der Konzentrations-Zeit-Kurve der Elimination von der Bioadsorption unter ­
scheiden; dies kann gewöhnlich durch einen Test auf leichte biologische Abbaubarkeit, bei dem ein akklimatisiertes Inokulum aus der mit der Prüf ­
substanz beaufschlagten Anlage zum Einsatz kommt, bestätigt werden.
 
ANGABEN ZUR PRÜFSUBSTANZ  
12. Die Reinheits-, Wasserlöslichkeits-, Flüchtigkeits- und Adsorptionsmerkmale 
der Prüfsubstanz sollten bekannt sein, um eine akkurate Ergebnisauswertung 
zu ermöglichen. Normalerweise können flüchtige und nicht lösliche che ­
mische Substanzen nur getestet werden, wenn besondere Vorsichtsmaßnah ­
men getroffen werden (siehe Anlage 5). Auch die chemische Struktur oder 
zumindest die empirische Formel sollten bekannt sein, um theoretische 
Werte berechnen und/oder gemessene Parameterwerte (z. B. für den theo ­
retischen Sauerstoffbedarf ( Theoretical Oxygen Demand , ThOD), den gelös ­
ten organischen Kohlenstoff ( Dissolved organic carbon , DOC) und den 
chemischen Sauerstoffbedarf (CSB)) überprüfen zu können.  
13. Informationen über die Toxizität der Prüfsubstanz für Mikroorganismen 
(siehe Anlage 4 können für die Wahl geeigneter Testkonzentrationen zweck ­
dienlich und für die korrekte Auswertung niedriger Abbaubarkeitswerte aus ­
schlaggebend sein.  
NEGATIVE/POSITIVE TESTERGEBNISSE (PASS/FAIL)  
14. Bei der ersten Anwendung dieses Simulationstests (Bestätigungstest) zur 
Bestimmung der primären Bioabbaubarkeit von Tensiden müssen über 
80 % der betreffenden chemischen Substanz abgebaut werden, bevor das 
Tensid in den Verkehr gebracht werden kann. Werden diese 80 % nicht erreicht, kann der vorliegende Simulationstest (Bestätigungstest) durch ­
geführt werden, und das Tensid darf nur in den Verkehr gebracht werden, 
wenn über 90 % der betreffenden chemischen Substanz abgebaut wurden. 
Im Allgemeinen stellt sich die  Pass-/Fail -Frage bei chemischen Substanzen 
nicht, und der Wert der prozentualen Abnahme kann zur approximativen Berechnung der wahrscheinlichen Umweltkonzentration einer chemischen 
Substanz verwendet werden, die zur Analyse der von chemischen Substan ­
zen ausgehenden Gefahren erforderlich ist. Testergebnisse folgen in der Regel dem Schema „Alles oder Nichts“. Einige Untersuchungen reiner Che ­
mikalien haben in mehr als drei Viertel aller Fälle eine prozentuale 
DOC-Abnahme von > 90 % und bei über 90 % der Substanzen, die sich 
als in signifikantem Maße biologisch abbaubar erwiesen haben, von > 80 % ergeben.
 
15. Relativ wenige chemische Substanzen (z. B. Tenside) sind in den für diese 
Prüfung verwendeten Konzentrationen (ungefähr 10 mg C/l) in Abwässern 
vorhanden. Einige Substanzen manifestieren in diesen Konzentrationen mög ­
licherweise eine Hemmwirkung, bei anderen kann die Abnahmegeschwin ­
digkeit bei niedrigen Konzentrationen unterschiedlich sein. Die Zersetzung könnte mit modifizierten Methoden, bei denen die Prüfsubstanz realitäts ­
näher in niedrigen Konzentrationen verwendet wird, akkurater bewertet 
und die so erhobenen Daten könnten zur Berechnung von kinetischen Kon ­
stanten verwendet werden. Die hierzu erforderlichen Versuchstechniken sind jedoch noch nicht umfassend validiert, und auch die kinetischen Modelle zur 
Beschreibung der beim biologischen Abbau stattfindenden Reaktionen lie ­
gen noch nicht fest (siehe Anlage 7).
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REFERENZSUBSTANZEN  
16. Um sicherzustellen, dass das Testverfahren korrekt durchgeführt wird, ist es 
sinnvoll, gelegentlich parallel zur Untersuchung der Prüfsubstanz auch an ­
dere Substanzen zu analysieren, deren Verhalten bekannt ist. Dazu zählen 
Adipinsäure, 2-Phenylphenol, 1-Naphthol, Diphensäure, 1- Naphthoesäure 
usw. (9)(10)(11).  
REPRODUZIERBARKEIT VON TESTERGEBNISSEN  
17. Es gibt wesentlich weniger Studienberichte über Simulationstests als über 
Tests auf leichte Bioabbaubarkeit. Die Reproduzierbarkeit der Testergeb ­
nisse zwischen (Simultan-)Replikaten ist gut (10 % bis 15 %) bei Prüfsub ­
stanzen, die zu mindestens 80 % abgebaut werden, bei weniger gut abge ­
bauten Substanzen ist die Schwankungsbreite jedoch größer. Bei bestimmten 
grenzwertigen Substanzen wurden innerhalb des neunwöchigen Prüfungs ­
zeitraums mitunter auch weit auseinanderliegende Ergebnisse (z. B. 10 %, 90 %) verzeichnet.
 
18. Bei den mit den beiden Apparaturtypen erzielten Ergebnissen zeigten sich 
nur geringe Unterschiede, einige chemische Substanzen wurden in Haus ­
haltsabwasser jedoch umfassender und konsistenter abgebaut als in synthe ­
tischem Abwasser (OECD).  
BESCHREIBUNG DES PRÜFVERFAHRENS  
Geräte  
Prüfsystem  
19. Das Prüfsystem für eine Prüfsubstanz umfasst eine Prüfanlage und eine 
Kontrollanlage; werden jedoch nur spezifische Analysen durchgeführt (pri ­
märe Bioabbaubarkeit), ist nur eine Prüfanlage erforderlich. Eine Kontroll ­
anlage kann für mehrere Prüfanlagen verwendet werden, die entweder mit 
derselben oder mit unterschiedlichen Prüfsubstanzen beschickt werden. Bei 
gekoppelten Anlagen (Anlage 3) muss jede Prüfanlage über eine separate Kontrollanlage verfügen. Beim Prüfsystem kann es sich entweder um eine Belebtschlamm-Modellanlage vom Typ  Husmann  (Anlage 1, Abbildung 1) 
oder um eine  Porous-Pot -Anlage (Anlage 1, Abbildung 2) handeln. In 
beiden Fällen sind ausreichend große Vorrats-/Sammelgefäße für die Zu- bzw. Abläufe erforderlich, ebenso wie Pumpen zur Dosierung des Zustroms (entweder mit Prüfsubstanzlösung gemischt oder separat).
 
20. Jede Belebtschlammanlage besteht aus einem Belüftungsgefäß (Belebung) 
mit einem bekannten Fassungsvermögen von ca. 3 Liter Belebtschlamm und 
einem Absetzgefäß (Nachklärung) eines Fassungsvermögens von ungefähr 1,5 Litern; durch Regelung der Höhe des Absetzgefäßes können die Füll ­
mengen bis zu einem bestimmten Grad geändert werden. Gefäße anderer 
Größen sind zulässig, wenn vergleichbare hydraulische Frachten eingehalten 
werden. Ist es nicht möglich, die Temperatur im Prüfraum im gewünschten Bereich zu halten, wird die Verwendung von wasserummantelten Gefäßen (temperiertes Wasser) empfohlen. Für die kontinuierliche oder intermittente 
Rückführung von Belebtschlamm aus dem Absetzgefäß ins Belüftungsgefäß 
wird eine Druckluft- oder Dosierpumpe verwendet.
 
21. Das  Porous-Pot -System besteht aus einem porösen inneren Zylinder mit 
konischem Boden, der in einem geringfügig größeren, aus undurchlässigem Kunststoff bestehenden formgleichen Gefäß fixiert ist. Als Material für das 
poröse Gefäß ist poröses Polyethylen einer Porengröße von maximal 90 μm 
und 2 mm Dicke geeignet. Der Schlamm wird durch die Filtrierwirkung der porösen Wand vom behandelten organischen Medium abgetrennt. Der Ab ­
lauf sammelt sich in dem ringförmigen Bereich, von dem aus er in das 
Sammelgefäß überfließt. Da kein Absetzen erfolgt, gibt es auch keine 
Schlammrückführung. Das gesamte System kann in einem thermostatisch kontrollierten Wasserbad montiert werden. Poröse Töpfe können in den Anfangsstadien verstopfen und überlaufen. In diesem Fall wird die poröse 
Auskleidung erneuert; dazu wird zunächst der Schlamm aus dem Topf in 
einen sauberen Eimer abgeschlaucht und die verstopfte Innenauskleidung
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wird entfernt. Der undurchlässige äußere Zylinder wird ausgewischt, eine 
saubere Auskleidung wird eingesetzt und der Schlamm wird in den Topf 
zurückgeführt. Außerdem werden alle an den Rändern der verstopfen Innen ­
auskleidung anhaftenden Schlammreste sorgfältig abgeschabt und ebenfalls zurück in den Topf transferiert. Verstopfte Töpfe werden zunächst mit ei ­
nem feinen Wasserstrahl gesäubert, um Schlammreste zu entfernen; an ­
schließend wird das Gerät zunächst in verdünnte Natriumhypochlorit-Lö ­
sung, dann in Wasser gesetzt und gründlich mit Wasser abgespült.
 
22. Die Belüftung des Schlamms in den Belüftungsgefäßen beider Systeme 
erfordert geeignete Verfahren, z. B. gesinterte Würfel (Sprudelsteine) und Druckluft. Die Luft muss bei Bedarf gesäubert werden, indem sie durch einen geeigneten Filter geleitet und gewaschen wird. Das System muss 
ausreichend belüftet werden, um aerobe Bedingungen zu gewährleisten 
und die Schlammflocken während des Prüfungsvorgangs in ständiger Sus ­
pension zu halten.
 
Filtrationsgerät oder Zentrifuge  
23. Gerät zur Filtration von Proben mit Membranfiltern einer geeigneten Poren ­
weite (Nennöffnungsdurchmesser 0,45 μm), die lösliche organische Substan ­
zen adsorbieren und ein Minimum an organischem Kohlenstoff freisetzen. Bei Verwendung von Filtern, die organischen Kohlenstoff freisetzen, sind 
die Filter sorgfältig mit heißem Wasser zu waschen, um den Kohlenstoff zu 
entfernen. Alternativ kann eine Zentrifuge einer Kapazität von 40 000 m/s
 2 
verwendet werden.  
Analysegerät  
24. Apparatur zur Bestimmung folgender Größen:  
— DOC (gelöster organischer Kohlenstoff) und TOC (gesamter organischer 
Kohlenstoff) oder CSB (chemischer Sauerstoffbedarf);  
— bestimmte chemische Substanz, soweit erforderlich;  
— suspendierte Feststoffe, pH-Wert, Sauerstoffkonzentration im Wasser;  
— Temperatur, Azidität und Alkalinität;  
— Ammonium, Nitrit und Nitrat, wenn der Test unter nitrifizierenden Be ­
dingungen durchgeführt wird.  
Wasser  
25. Leitungswasser (Trinkwasser) mit einem DOC-Gehalt von weniger als 3 
mg/l. Soweit nicht bereits bekannt, die Alkalinität bestimmen.  
26. Deionisiertes Wasser mit einem DOC-Gehalt von weniger als 2 mg/l DOC.  
Organisches Medium  
27. Als organisches Medium kommt synthetisches Abwasser, Haushaltsabwasser 
oder eine Mischung aus beiden Abwasserarten in Frage. Es hat sich gezeigt 
(11)(14), dass die alleinige Verwendung von Haushaltsabwasser oft zu einer 
höheren prozentualem DOC-Abnahme führt und selbst die Abnahme und den biologischen Abbau bestimmter chemischer Substanzen fördert, die bei Verwendung von synthetischem Abwasser (OECD) nicht abgebaut werden. 
Außerdem wirkt die konstante oder intermittente Zugabe von Haushalts ­
abwasser auf den Belebtschlamm, einschließlich der entscheidenden Absetz ­
fähigkeit, häufig stabilisierend. Die Verwendung von Haushaltsabwasser wird demnach empfohlen. Bei jeder neuen Charge von organischem Me ­
dium die DOC- oder die CSB-Konzentration messen. Die Azidität oder 
Alkalinität des organischen Mediums sollte bekannt sein. Das organische Medium kann die Zugabe einer geeigneten Pufferlösung (Natriumhydrogen ­
carbonat oder Kaliumdihydrogenphosphat) erfordern, wenn die Azidität oder 
Alkalinität gering ist, um während des Tests einen pH-Wert von etwa 7,5 
± 0,5 im Belüftungsgefäß zu gewährleisten. Wie viel Pufferlösung zuzuge ­
ben ist und wann, muss auf Fallbasis entschieden werden. Werden kontinu ­
ierlich oder intermittent Abwassermischungen verwendet, muss der 
DOC-Wert (oder der CSB-Wert) der Mischung möglichst konstant gehalten 
werden, z. B. durch Verdünnung mit Wasser.
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Synthetisches Abwasser  
28. In jedem Liter Leitungswasser Folgendes auflösen: 160 mg Pepton; 110 mg 
Fleischextrakt; 30 mg Harnstoff; 28 mg wasserfreies Dikaliumhydrogen- 
phosphat (K  2 HPO  4 ); 7 mg Natriumchlorid (NaCl); 4 mg Calciumchlorid- 
Dihydrat (CaCl  2 .2H  2 O); 2 mg Magnesiumsulfat-Heptahydrat 
(Mg  2 SO 4 .7H  2 0). Dieses synthetische Abwasser (OECD) hat Beispielcharak ­
ter und ergibt eine mittlere DOC-Konzentration im Zulauf von etwa 100 
mg/l. Alternativ können andere Zusammensetzungen mit ähnlicher DOC-Konzentration verwendet werden, die realitätsnäher sind. Ist ein we ­
niger konzentrierter Zulauf erforderlich, das synthetische Abwasser mit Lei ­
tungswasser verdünnen, beispielsweise im Verhältnis 1:1, um eine Konzen ­
tration von ungefähr 50 mg/l zu erhalten. Ein derart verdünnter Zulauf fördert das Wachstum nitrifizierender Organismen, und diese Modifikation sollte vorgenommen werden, wenn die Simulation nitrifizierender Kläranla ­
gen untersucht werden soll. Dieses synthetische Abwasser kann aus destil ­
liertem Wasser in konzentrierter Form hergestellt und bis zu einer Woche bei ungefähr 1 °C gelagert werden. Bei Bedarf mit Leitungswasser verdün ­
nen. (Dieses Medium ist eher ungeeignet, weil die Stickstoffkonzentration 
sehr hoch und der Kohlenstoffgehalt relativ niedrig ist; es gibt jedoch keine 
besseren Empfehlungen, außer Hinzufügung von mehr Phosphat als Puffer und zusätzlichem Pepton).
 
Haushaltsabwasser  
29. Es sollte frisch abgesetztes Abwasser verwendet werden, das täglich von 
einer vorwiegend Haushaltsabwässer behandelnden Kläranlage bezogen wird. Es sollte vor der Vorklärung aus der Ablaufrinne des Vorklärbeckens 
oder aus dem Beschickungswasser der Belebtschlammanlage gezogen wer ­
den und weitgehend frei von Grobstoffen sein. Das Abwasser kann nach mehrtägiger, jedoch höchstens siebentägiger Lagerung bei 4 °C verwendet werden, sofern erwiesen ist, dass der gelöste organische Kohlenstoff (DOC) 
(oder der chemische Sauerstoffbedarf, CSB) während der Lagerung nicht 
wesentlich (d. h. um weniger als 20 %) abgenommen hat. Um Störungen des Systems zu vermeiden, sollte der DOC (oder der CSB) jedes neuen Ansatzes vor dessen Verwendung auf einen geeigneten konstanten Wert 
eingestellt werden, z. B. durch Verdünnung mit Leitungswasser.
 
Belebtschlamm  
30. Zur Beimpfung Belebtschlamm aus dem Belüftungsbecken einer ordnungs ­
gemäß betriebenen Kläranlage oder einer Labor-Belebtschlammanlage ent ­
nehmen, die vorwiegend Haushaltsabwässer behandeln.  
Stammlösungen der Prüfsubstanz  
31. Für angemessen lösliche chemische Substanzen in geeigneten Konzentratio ­
nen (z. B. 1 bis 5 g/l) in entionisiertem Wasser oder in einer mineralischen 
Kulturlösung aus synthetischem Abwasser Stammlösungen ansetzen (für 
nicht lösliche und flüchtige Chemikalien siehe Anlage 5). Den DOC- und den TOC-Wert der Stammlösung bestimmen und die Messungen bei jeder neuen Charge wiederholen. Bei einer Differenz zwischen DOC und TOC 
von mehr als 20 % die Wasserlöslichkeit der Prüfsubstanz überprüfen. Den 
DOC oder die durch spezifische Analyse der Stammlösung gemessene Kon ­
zentration der Prüfsubstanz mit dem Nennwert vergleichen, um festzustellen, ob die Wiederfindungsrate ausreicht (in der Regel kann mit > 90 % gerech ­
net werden). Vor allem bei Dispersionen ist festzustellen, ob der DOC als 
Analyseparameter verwendet werden kann oder nicht oder ob nur ein prüf ­
substanzspezifisches Analyseverfahren angewendet werden kann. Bei Dis ­
persionen müssen die Proben zentrifugiert werden. Für jede neue Charge 
den DOC, den CSB bzw. die Prüfsubstanz durch spezifische Analyse mes ­
sen.
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32. Den pH-Wert der Stammlösung bestimmen. Extremwerte zeigen an, dass die 
Zugabe der chemischen Substanz den pH-Wert des Belebtschlamms im 
Prüfsystem beeinflussen kann. In diesem Fall die Stammlösung mit kleinen Mengen anorganischer Säure oder Base neutralisieren, um einen pH-Wert von 7 ± 0,5 zu erhalten, wobei eine Ausfällung der Prüfsubstanz zu ver ­
meiden ist.
 
PRÜFVERFAHREN  
33. Das beschriebene Verfahren betrifft Belebtschlammanlagen; es muss für das  
Porous-Pot -System in bestimmten Punkten angepasst werden.  
Vorbereitung des Inokulums  
34. Das Prüfsystem zu Testbeginn entweder mit Belebtschlamm oder mit einem 
Inokulum animpfen, das eine geringe Konzentration an Mikroorganismen 
enthält. Das Inokulum bis zu seiner Verwendung (innerhalb von 24 Stun ­
den) bei Raumtemperatur unter aeroben Bedingungen aufbewahren. Im ers ­
ten Fall (Verwendung von Belebtschlamm) aus dem Belüftungsbecken einer 
ordnungsgemäß betriebenen biologischen Kläranlage oder einer Laborklär ­
anlage, die vorwiegend mit Haushaltsabwasser betrieben wird, eine Schlammprobe ziehen. Sollen nitrifizierende Bedingungen simuliert werden, den Schlamm aus einer nitrifizierenden Kläranlage beziehen. Die Konzen ­
tration der suspendierten Feststoffe bestimmen und den Schlamm bei Bedarf 
durch Absetzen eindicken, so dass dem Prüfsystem nur eine minimale Schlammmenge zugeführt werden muss. Die Anfangskonzentration der Tro ­
ckensubstanz sollte ungefähr 2,5 g/l betragen.
 
35. Im zweiten Fall (Inokulum) 2 bis 10 ml/l Ablauf aus einer biologischen 
Kläranlage für Haushaltsabwässer verwenden. Um möglichst viele unter ­
schiedliche Bakterienarten zu erhalten, kann es sinnvoll sein, auch Inokula 
aus diversen anderen Quellen wie Oberflächenwasser zuzuführen. In diesem Fall wird sich der Belebtschlamm im Prüfsystem entwickeln und vermehren.
 
Zudosierung des organischen Mediums  
36. Zulauf- und Ablaufbehälter und Schlauchleitungen aus den Zulauf- und zu 
den Ablaufgefäßen vor und während des Tests gründlich reinigen, um Mi ­
krobenbewuchs zu entfernen. Die Prüfsysteme in einem temperaturkontrol ­
lierten Raum (übliche Temperaturspanne: 20-25 °C) montieren oder wasser ­
ummantelte Testgefäße verwenden. Eine ausreichende Menge des benötigten 
organischen Mediums (Nummern 27-29) zubereiten. Zunächst Belüftungs- und Absetzungsgefäß (Separator) mit organischem Medium füllen und Ino ­
kulum zusetzen (Nummern 34, 35). Die Belüftung so einstellen, dass der 
Schlamm unter aeroben Bedingungen dauerhaft suspendiert ist; anschließend 
Zulaufdosierung und Schlammrückführung einleiten. Organisches Medium aus den Vorrats- in die Belüftungsgefäße (Nummern 20, 21) der Prüf- und der Kontrollanlage zudosieren, und die jeweiligen Abläufe in entsprechen ­
den Sammelgefäßen auffangen. Um die normale hydraulische Verweilzeit 
von 6 Std. zu erreichen, organisches Medium in einem Volumen von 0,5 l/Std. zupumpen. Zur Bestätigung durch Messung des Volumenrückgangs in den Vorratsgefäßen die zudosierte Tagesmenge an organischem Medium 
ermitteln. Zur Bestimmung der Effekte der intermittenten Freisetzung von 
chemischen Substanzen und der Stoßbelastung ( shock loading ) des Systems 
mit diesen Substanzen wären andere Dosierungsmodi erforderlich.
 
37. Soll das vorbereitete organische Medium für länger als einen Tag verwendet 
werden, muss es auf ungefähr 4 °C gekühlt oder auf andere Weise haltbar gemacht werden, um Mikrobenwachstum und biologischen Abbau außerhalb der Prüfanlagen zu vermeiden (Nummer 29). Werden synthetische Abwässer 
verwendet, kann eine konzentrierte Stammlösung (z. B. das Zehnfache der 
normalen Konzentration; Nummer 28) vorbereitet und bei etwa 4 °C gela ­
gert werden. Diese Stammlösung kann vor ihrer Verwendung mit einer entsprechenden Menge Leitungswasser gründlich durchgemischt oder — 
alternativ — direkt zugepumpt werden, während die entsprechende Menge 
Leitungswasser separat zugepumpt wird.
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Zudosierung der Prüfsubstanz  
38. Eine geeignete Menge Stammlösung der Prüfsubstanz (Nummer 31) in das 
Vorratsgefäß des Zulaufs geben oder mittels einer separaten Dosierpumpe direkt in das Belüftungsgefäß pumpen. Die normale mittlere Testkonzentra ­
tion im Zulauf sollte 10 bis 20 mg/l DOC betragen, wobei die Höchstkon ­
zentration von 50 mg/l nicht überschritten werden sollte. Ist die Wasser ­
löslichkeit der Prüfsubstanz gering oder ist mit toxischen Effekten zu rech ­
nen, ist die Konzentration auf 5 mg/l DOC oder auch weniger zu reduzieren, 
allerdings nur, wenn eine geeignete spezifische Analysemethode verfügbar 
ist und angewendet wird (schlecht wasserlösliche dispergierte Prüfsubstan ­
zen können nach besonderen Dosiermethoden zugesetzt werden; siehe An ­
lage 5).
 
39. Die Prüfsubstanz zusetzen, sobald sich das System stabilisiert und der ge ­
löste organische Kohlenstoff (DOC) im organischen Medium weitgehend 
(um etwa 80 %) abgenommen hat. Es muss sichergestellt werden, dass 
alle Anlagen mit gleicher Wirksamkeit funktionieren, bevor die Prüfsubstanz zugesetzt wird; ist dies nicht der Fall, ist es in der Regel sinnvoll, die einzelnen Schlämme zu mischen und die einzelnen Anlagen erneut mit 
identischen Schlammmengen zu beschicken. Wird ein Inokulum aus (etwa) 
2,5 g/l (Trockengewicht) Belebtschlamm verwendet, so kann die Prüfsub ­
stanz ab Testbeginn zugesetzt werden, denn die direkte Zugabe steigender Mengen von Testbeginn an hat den Vorteil, dass der Belebtschlamm mög ­
licherweise besser an die Prüfsubstanz adaptiert wird. Wie immer die Prüf ­
substanz zugegeben wird, empfiehlt es sich, die Dosierrate und/oder die Mengen in den Vorratsgefäßen regelmäßig zu messen.
 
Handhabung von Belebtschlamm  
40. Je nach Qualität und Konzentration des organischen Mediums, Betriebs ­
bedingungen, Art der vorhandenen Mikroorganismen und Einfluss der Prüf ­
substanz und unabhängig vom verwendeten Inokulum stabilisiert sich die Konzentration der Belebtschlamm-Feststoffe während der Prüfung in der 
Regel im Bereich von 1 bis 3 g/l (Trockengewicht).
 
41. Entweder die in den Belüftungsgefäßen suspendierten Feststoffe mindestens 
wöchentlich bestimmen, wobei der Überschussschlamm verworfen wird, um 
die Konzentration zwischen 1 und 3 g/l (Trockengewicht) zu halten, oder das mittlere Schlammalter auf einem konstanten Wert (gewöhnlich innerhalb einer Bandbreite von 6 bis 10 Tagen) halten. Wird beispielsweise eine 
Schlammverweilzeit ( sludge retention time , SRT) von 8 Tagen gewählt, 
sollte täglich 1/8 der im Belüftungsgefäß befindlichen Belebtschlammmenge abgezogen und verworfen werden. Dieser Vorgang ist täglich oder, vorzugs ­
weise, mithilfe einer intermittent arbeitenden automatischen Pumpe zu wie ­
derholen. Das Halten der Konzentration suspendierter Feststoffe auf einem 
konstanten Wert oder innerhalb einer engen Bandbreite garantiert keine konstante Schlammverweilzeit; letztere ist die Betriebsvariable, die den Wert der Prüfsubstanzkonzentration im Ablauf bestimmt.
 
42. Während der gesamten Prüfungsdauer zumindest täglich den an den Wänden 
des Belüftungs- und des Absetzungsgefäßes (Separator) anhaftenden 
Schlamm entfernen und resuspendieren. Alle Röhren und Schlauchleitungen 
regelmäßig kontrollieren und reinigen, um einen Bewuchs mit Biofilm zu vermeiden. Abgesetzten Schlamm aus dem Absetzungsgefäß (Separator) in das Belüftungsgefäß zurückführen, vorzugsweise durch intermittentes Pum ­
pen. Beim  Porous-Pot -System gibt es keine Schlammrückführung; es ist 
jedoch sicherzustellen, dass saubere Innentöpfe eingesetzt werden, bevor das Gefäßvolumen signifikant ansteigt (Nummer 21).
 
43. Bei  Husmann -Anlagen kann es vorkommen, dass sich der Schlamm schlecht 
absetzt und verlorengeht. Diese Mängel können in Prüf- und Kontrollanla ­
gen mit einer oder mehreren der nachstehend angeführten Maßnahmen zeit ­
gleich behoben werden:  
— Regelmäßige, z. B. wöchentliche Zuführung von frischem Schlamm oder 
Flockungsmittel (z. B. je Gefäß 2 ml einer 50 g/l-FeCl  3 -Lösung), wobei 
jedoch sicherzustellen ist, dass es nicht zu einer Reaktion oder Präzipi ­
tation der Prüfsubstanz mit FeCl  3 kommt;  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 927
 
— Ersetzung der Druckluftpumpe durch eine Peristaltikpumpe, um einen 
dem zuzuführenden Zulauf in etwa entsprechenden Schlammrücklauf 
und die Entwicklung eines anaeroben Milieus im abgesetzten Schlamm zu ermöglichen (die Geometrie der Druckluftpumpe begrenzt den Min ­
destdurchfluss des Rücklaufschlamms auf ungefähr das 12-fache der 
Zulaufmenge);
 
— intermittentes Zupumpen von Schlamm aus dem Absetzungsgefäß 
(Separator) in das Belüftungsgefäß (z. B. für 5 Minuten alle 2,5 Std, um statt 1 Liter/Std. 1,5 Liter/Std. zurückzuführen);
 
— Verwendung eines nichttoxischen schwach konzentrierten Anti ­
schaummittels (z. B. Silikonöl) zur Vermeidung von Verlusten durch Schaumbildung;
 
— kurze Luftschockstöße durch den Schlamm im Absetzungsgefäß (Se ­
parator) (z. B. stündlich 10 Sekunden);  
— Intervalldosierung des organischen Medium in das Belüftungsgefäß 
(z. B. stündlich für jeweils 3 bis 10 Minuten).  
Probenahme und Analytik  
44. Konzentration an gelöstem Sauerstoff, Temperatur und pH-Wert des Belebt ­
schlamms in den Belüftungsgefäßen in regelmäßigen Zeitabständen messen. 
Dabei ist sicherzustellen, dass stets ausreichend Sauerstoff vorhanden ist (> 
2 mg/l) und die Temperatur innerhalb der erforderlichen Spanne (normaler ­
weise zwischen 20 und 25 °C) liegt. Durch Zudosierung von kleinen Men ­
gen einer anorganischen Base oder Säure ins Belüftungsgefäß oder in den 
Zulauf oder durch Erhöhung der Pufferkapazität des organischen Mediums 
(siehe Nummer 27) den pH-Wert auf 7,5 ± 0,5 konstant halten. Kommt es zur Nitrifikation, entsteht Säure, d. h. bei Oxidation von 1 mg N wird das Äquivalent von ungefähr 7 mg CO
 3 – erzeugt. Die Häufigkeit der Messung 
richtet sich nach dem Messparameter und der Systemstabilität und kann 
zwischen täglich und wöchentlich variieren.  
45. Den DOC- bzw. den CSB-Wert in den Kontroll- und Prüfgefäßzuläufen 
messen. Die Konzentration der Prüfsubstanz im Zulauf der Prüfanlage durch 
spezifische Analyse messen oder anhand der Konzentration in der Stamm ­
lösung (Nummer 31), der verwendeten Menge und der der Prüfanlage zu ­
dosierten Abwassermenge schätzen. Es empfiehlt sich, die Konzentration der Prüfsubstanz zu berechnen, um die Streuung der Konzentrationsdaten zu 
verringern.
 
46. Aus (z. B. über 24 Stunden) gesammeltem Ablauf geeignete Proben ziehen 
und durch eine Membran einer Porengröße von 0,45 μm filtern oder bei 
40 000 m/s  2 für ungefähr 15 Min. zentrifugieren. Erweist sich das Filtern als 
schwierig, sollte zentrifugiert werden. Der DOC- bzw. der CSB-Wert sollte 
mindestens doppelt bestimmt werden, um die vollständige Bioabbaubarkeit zu ermitteln; die primäre Bioabbaubarkeit erforderlichenfalls durch eine prüfsubstanzspezifische Analyse messen.
 
47. Die Verwendung des CSB-Wertes kann bei geringen Konzentrationen zu 
analytischen Problemen führen und wird daher nur empfohlen, wenn eine ausreichend hohe Prüfkonzentration (etwa 30 mg/l) verwendet wird. Bei stark adsorbierenden chemischen Substanzen sollte nach einem prüfsub ­
stanzspezifischen Analyseverfahren auch die Menge der adsorbierten che ­
mischen Substanz im Schlamm gemessen werden.
 
48. Die Probenahmehäufigkeit richtet sich nach der voraussichtlichen Prüfungs ­
dauer. Empfohlen werden Probenahmen dreimal wöchentlich. Sobald die 
Anlagen ordnungsgemäß funktionieren, sollten nach der Beschickung mit 
Prüfsubstanz bis zum Erreichen eines Gleichgewichtszustands ( steady state ) 
1 bis maximal 6 Wochen vorgesehen werden. In der Plateau-Phase (Num ­
mer 59), die in der Regel 3 Wochen anhält, sollten wenn möglich mindes ­
tens 15 gültige Werte ermittelt werden, um das Prüfungsergebnis auswerten 
zu können. Die Prüfung kann abgeschlossen werden, wenn ein ausreichen ­
der Eliminationsgrad erreicht ist (z. B. > 90 %) und die genannten 15 Werte aus Analysen, die drei Wochen lang an jedem Wochentag durchgeführt 
wurden, vorliegen. Faustregel: Nach Zugabe der Prüfsubstanz sollte eine 
Prüfungsdauer von 12 Wochen nicht überschritten werden.
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49. Nitrifiziert der Schlamm und sollen die Auswirkungen der Prüfsubstanz auf 
die Nitrifikation untersucht werden, sind Proben aus dem Ablauf der Prüf- 
und der Kontrollanlage mindestens einmal wöchentlich auf Ammonium und/ oder Nitrit sowie Nitrat zu untersuchen.
 
50. Alle Analysen sollten zügig durchgeführt werden; dies gilt vor allem für 
Stickstoffbestimmungen. Müssen Analysen aufgeschoben werden, sind die 
Proben bei etwa 4 °C in randvollen, dicht verschlossenen Flaschen dunkel zu lagern. Müssen Proben für länger als 48 Stunden gelagert werden, sind sie durch Tiefgefrieren, Ansäuern (z. B. mit 10 ml/l einer 400 g/l-Lösung 
Schwefelsäure) oder Zugabe einer geeigneten toxischen Substanz (z. B. 20 
ml/l einer 10 g/l-Lösung Quecksilber-(II)-Chlorid) haltbar zu machen. Dabei ist sicherzustellen, dass die angewandte Konservierungsmethode die Ana ­
lyseergebnisse nicht beeinträchtigt.
 
Koppeln von Prüfanlagen  
51. Bei Anlagenkopplung (Anlage 3) täglich dieselbe Menge Belebtschlamm 
(150 ml — 1 500 ml für Belüftungsgefäße eines Fassungsvermögens von 
3 Litern Liquorkultur) zwischen den Belüftungsgefäßen der Prüf- und der Kontrollanlage austauschen. Lagert sich die Prüfsubstanz stark an den Schlamm an, nur den Überstand der Absetzungsgefäße (Separatoren) aus ­
tauschen. In beiden Fällen wird Berechnung der Prüfungsergebnisse einen 
Berichtigungsfaktor anwenden (Nummer 55).
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Auswertung der Ergebnisse  
52. Den Prozentsatz der Elimination der Prüfsubstanz, basierend auf der DOC- 
bzw. der CSB-Messung, in den vorgegebenen Zeitabständen nach folgender Gleichung berechnen:
 
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
Dabei sind:  
D t = der DOC- bzw. CSB-Eliminationsgrad (in %) zum Zeitpunkt t  
C s = der DOC- bzw. CSB-Wert der Prüfsubstanz im Zulauf, vorzugsweise 
anhand der Stammlösung geschätzt (mg/l)  
E = der gemessene DOC- oder CSB-Wert im Ablauf der Prüfanlage zum 
Zeitpunkt t (mg/l)  
E o = der gemessene DOC- oder CSB-Wert im Ablauf der Kontrollanlage 
zum Zeitpunkt t (mg/l)  
53. Der Grad der Elimination des organischen Mediums in der Kontrollanlage, 
basierend auf der DOC- bzw. der CSB-Messung, ist eine nützliche Größe für die Beurteilung der Bioabbauaktivität des Belebtschlamms während des 
Prüfung. Die prozentuale Elimination nach folgender Gleichung berechnen:
 
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
Dabei sind:  
D B = der DOC- bzw. CSB-Eliminationsgrad (in %) des organischen Me ­
diums in der Kontrollanlage zum Zeitpunkt t  
C M = der DOC- bzw. CSB-Wert des organischen Mediums im Zulauf der 
Kontrollanlage (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 929
 
Wahlweise kann der Prozentsatz der Elimination des durch das organische 
Medium PLUS die Prüfsubstanz bedingten DOC- bzw. CSB-Wertes nach 
folgender Gleichung berechnet werden:  
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
Dabei sind:  
D T = der Eliminationsgrad des DOC bzw. des CSB (in %) im Gesamt ­
zulauf (organisches Medium PLUS Prüfsubstanz) der Prüfanlage  
C T = der DOC bzw. CSB im Gesamtzulauf (organisches Medium PLUS 
Prüfsubstanz) der Prüfanlage oder anhand von Stammlösungen be ­
rechneter DOC bzw. CSB (mg/l)  
54. Die Abnahme der Prüfsubstanz, soweit nach einer spezifischen Analyse ­
methode gemessen, in den vorgegebenen Zeitabständen nach folgender Glei ­
chung berechnen:  
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
Dabei sind:  
D ST = der Primäreliminationsgrad (in %) der Prüfsubstanz zum Zeitpunkt t  
S i = die gemessene oder geschätzte Konzentration der Prüfsubstanz im 
Zulauf der Prüfanlage (mg/l)  
S e = die gemessene Konzentration der Prüfsubstanz im Ablauf der Prüf ­
anlage zum Zeitpunkt t (mg/l)  
55. Bei gekoppelten Anlagen die durch den Schlammaustausch bedingte Ver ­
dünnung der Prüfsubstanz im Belüftungsgefäß durch einen Berichtigungs ­
faktor kompensieren (siehe Anlage 3). Bei einer mittleren hydraulischen 
Verweilzeit von 6 Stunden und einem Austausch der Hälfte der Belebt ­
schlammmenge im Belüftungsgefäß müssen die täglich berechneten Elimi ­
nationswerte (D  t , Nummer 52) berichtigt werden, um anhand der nachste ­
henden Gleichung den realen Eliminationsgrad „D  tc “ der Prüfsubstanz zu 
ermitteln:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Angabe der Prüfergebnisse  
56. Die prozentuale Elimination D  t (oder D  tc ) und D  st , soweit dieser Wert vor ­
liegt, gegen die Zeit auftragen (siehe Anlage 2). Aus der Eliminationskurve 
der Prüfsubstanz ( per se  oder als DOC-Wert) lassen sich bestimmte Schlüsse 
über den Abnahmeprozess ziehen.  
Adsorption  
57. Manifestiert sich bei der Prüfsubstanz bereits zu Beginn des Tests eine 
starke DOC-Elimination, so wird die Prüfsubstanz wahrscheinlich durch 
Adsorption an die Belebtschlammfeststoffe eliminiert. Dies kann durch Be ­
stimmung der adsorbierten Prüfsubstanz anhand eines substanzspezifischen Analysenverfahrens nachgewiesen werden. Die DOC-Elimination adsorpti ­
onsfähiger chemischer Substanzen bleibt erfahrungsgemäß nicht während 
der gesamten Prüfung hoch; sie ist eher zu Beginn der Prüfung hoch und fällt dann allmählich auf ein stabiles Niveau. Könnte die adsorptionsfähige Prüfsubstanz jedoch auf die eine oder andere Weise eine Akklimatisation der 
Mikrobenpopulation herbeiführen, würde die DOC-Elimination der Prüfsub ­
stanz anschließend zunehmen und einen hohen Plateauwert erreichen.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 930
 
Latenzphase (Lag-Phase)  
58. Wie bei statischen Screeningtests durchlaufen viele Prüfsubstanzen eine 
Latenzphase, bevor sie vollständig biologisch abgebaut werden. In dieser  
Lag-Phase akklimatisieren bzw. adaptieren sich die Zersetzungsbakterien, 
ohne dass die Prüfsubstanz in nennenswertem Maße abnimmt; erst nach dieser Phase setzt das Bakterienwachstum ein. Die Phase endet und die 
Abbauphase gilt als begonnen, wenn etwa 10 % der anfänglichen Menge 
Prüfsubstanz abgebaut sind (nach der Adsorption, falls es dazu kommt). Die  
Lag-Phase ist oft sehr variabel und schwer reproduzierbar.
 
Plateauphase  
59. Die Plateauphase einer Eliminationskurve im kontinuierlichen Test ist de ­
finiert als die Phase, in der maximale Zersetzung stattfindet. Sie sollte mindestens 3 Wochen dauern, in denen etwa 15 gültige Messwerte ermittelt 
werden.
 
Mittlerer Eliminationsgrad der Prüfsubstanz  
60. Diesen Mittelwert anhand der Eliminationswerte (D  t ) der Prüfsubstanz in der 
Plateauphase berechnen. Auf die nächste ganze Zahl (1 %) gerundet, ent ­
spricht dieser gerundete Wert dem Eliminationsgrad der Prüfsubstanz. Fer ­
ner wird empfohlen, das 95 %-Konfidenzniveau für den Mittelwert zu be ­
rechnen.  
Elimination des organischen Mediums  
61. Die prozentuale Elimination des organischen Mediums in der Kontrollanlage 
(D B ), basierend auf dem DOC- bzw. CSB-Wert, gegen die Zeit auftragen. 
Dabei ist der mittlere Eliminationsgrad auf dieselbe Weise anzugeben wie für die Prüfsubstanz (Nummer 60).
 
Hinweis auf den biologischen Abbau  
62. Adsorbiert die Prüfsubstanz nicht signifikant an den Belebtschlamm und hat 
die Eliminationskurve die typische Form einer Bioabbaukurve mit Latenz-, 
Abbau- und Plateauphasen (Nummern 58, 59), so kann die gemessene Eli ­
mination mit Sicherheit dem biologischen Abbau zugeschrieben werden. War die Abnahme im Anfangsstadium hoch, kann der Simulationstest nicht zwischen biologischen und abiotischen Eliminationsprozessen differenzieren. 
In derartigen Fällen und in anderen Fällen, in denen Zweifel am biologi ­
schen Abbau bestehen (z. B. wenn die Prüfsubstanz ausgast ( stripping )), die 
Adsorption der Prüfsubstanzen untersuchen, oder anhand von Parametern, die biologische Prozesse genau angeben, zusätzliche statische Bioabbaubar ­
keitstests durchführen. Zu derartigen Tests zählen die Sauerstoffaufnahme ­
methoden (Kapitel C.4 (D, E, F) dieses Anhangs (6)) oder Kohlendioxid-Entwicklungstests (Kapitel C.4 C dieses Anhangs (6)) oder die ISO- Headspace -Methode (18), bei der ein zuvor exponiertes Inokulum 
aus dem Simulationstest verwendet wird. Wurden sowohl die 
DOC-Abnahme als auch die Prüfsubstanzabnahme gemessen, zeigen große Unterschiede (d. h. wenn erstere geringer ist als letztere) zwischen den Abnahmeprozentwerten die Präsenz intermediärer organischer Produkte in 
den Abläufen an, die möglicherweise schwerer abzubauen sind als die Aus ­
gangssubstanz.
 
Gültigkeit der Prüfergebnisse  
63. Die Bestimmung des Eliminationsgrades des organischen Mediums (Num ­
mer 53) in der Kontrollanlage liefert Informationen über das normale Ab ­
bauverhalten des Inokulums. Der Test kann als gültig angesehen werden, wenn der Grad der DOC- bzw. der CSB-Elimination in der (den) Kontroll ­
anlage(n) nach zwei Wochen > 80 % beträgt und nichts Ungewöhnliches 
festgestellt wurde.
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64. Wurde eine leicht biologisch abbaubare (Referenz-)Substanz verwendet, 
sollte der Abbaubarkeitsgrad (D  t , Nummer 52) > 90 % betragen.  
65. Wurde der Test unter nitrifizierenden Bedingungen durchgeführt, sollte die 
mittlere Konzentration in den Abläufen < 1 mg/l Ammonium-N und < 2 
mg/l Nitrit-N betragen.  
66. Sind diese Kriterien (Nummern 63-65) nicht erfüllt, müssen der Test mit 
einem Inokulum aus anderer Quelle wiederholt, eine Referenzsubstanz ge ­
testet und alle Testverfahren überprüft werden.  
Prüfbericht  
67. Der Prüfbericht muss Folgendes umfassen:  
Prüfsubstanz:  
— Kenndaten;  
— physikalischer Zustand und, soweit relevant, physikalisch-chemische Ei ­
genschaften.  
Prüfbedingungen:  
— Art des Prüfsystems; etwaige Änderungen bei Prüfungen nicht löslicher 
und flüchtiger chemischer Substanzen;  
— Art des organischen Mediums;  
— Anteil (und Art) der Industrieabwässer im kommunalen Abwasser, so ­
weit bekannt;  
— Inokulum, Art und Probenahmestelle(n), Konzentration und etwaige 
Vorbehandlung;  
— Prüfsubstanz-Stammlösung: DOC- und TOC-Gehalt; bei Suspension: Art 
der Aufbereitung; verwendete Testkonzentration; falls außerhalb der 
Bandbreite von 10-20 mg/l DOC: Begründung; Zugabemethode; Datum der ersten Zugabe; etwaige Änderungen;
 
— mittleres Schlammalter und mittlere hydraulische Verweilzeit; Methode 
des Überschussschlammabzugs; Methoden zur Verminderung der Bil ­
dung von Blähschlamm, von Schlammverlusten usw.;  
— angewandte Analysetechniken;  
— Testtemperatur;  
— Eigenschaften wie Blähschlammbildung, Schlammvolumenindex ( Sludge 
Volume Index , SVI), suspendierte Stoffe im Ablauf ( Mixed Liquor Sus ­
pended Solids , MLSS);  
— etwaige Abweichungen von Standardverfahren und etwaige Umstände, 
die die Testergebnisse möglicherweise beeinträchtigt haben.  
Prüfergebnisse:  
— alle Messdaten (DOC, CSB, spezifische Analysen, pH-Wert, Tempera ­
tur, Sauerstoffkonzentration, suspendierte Feststoffe, N-Chemikalien, so ­
weit relevant;  
— alle Berechnungswerte für D  t (oder D  tc ), D  B , D St in tabellarischer Form 
und als Eliminationskurven;  
— Aussagen zu Latenz- und Plateau-Phasen, Prüfungsdauer, Eliminations ­
grad der Prüfsubstanz und des organischen Mediums in der Kontroll ­
anlage sowie statistische Informationen und Angaben zur Bioabbaubar ­
keit und Gültigkeit des Tests;  
— Diskussion der Ergebnisse.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 932
 
LITERATUR:  
1. Swisher RD (1987). „ Surfactant Biodegradation “, 2. Ausgabe. Marcel Dek ­
ker Inc. New York, S. 1085 ff.  
2. Deutsche Bundesregierung (1962). Verordnung über die Abbaubarkeit von 
Detergenzien in Wasch- und Reinigungsmitteln. Bundesgesetzblatt, Teil I, 
Nr. 49: 698-706.  
3. Painter HA and King EF (1978a).  WRc porous-pot method for assessing 
biodegradability . Technischer Bericht Nr. 70, Water Research Centre, Med ­
menham, Vereinigtes Königreich.  
4. Painter HA and King EF (1978b).  The effect of phosphate and temperature 
on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants . Wat. 
Res. 12: 909-915.  
5. Eckenfelder, W.W (19) US EPA.  
6. Kapitel C.4 dieses Anhangs, Bestimmung der „leichten“ biologischen Ab ­
baubarkeit.  
7. Kapitel C.12 dieses Anhangs, Biologische Abbaubarkeit — Modifizierter 
SCAS-Test.  
8. Kapitel C.19 dieses Anhangs, Schätzung des Adsorptionskoeffizienten (K  OC ) 
im Boden und in Klärschlamm mittels der Hochdruck- Flüssigchromatografie (HPLC).
 
9. Gerike P and Fischer WK (1979).  A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests . Ecotox. Env. Saf. 3: 
157-173.  
10. Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II  Additional results and conclu ­
sions . Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55.  
11. Painter HA and Bealing D (1989).  Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test , S. 113-138, In: Laboratory tests for simu ­
lation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
 
12. ISO 11733 (1995; überarbeitet 2004). Bestimmung der Elimination und der 
biologischen Abbaubarkeit organischer Verbindungen in einem wässrigen 
Medium — Belebtschlamm-Simulationstest.  
13. Birch RR (1982).  The biodegradability of alcohol ethoxylates . XIII Jornado 
Com. Espanol. Deterg.: 33-48.  
14. Birch RR (1984).  Biodegradation of noniomic surfactants . J.A.O.C, S. 61 
(2): 340-343.  
15. Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980).  Biodegradability determi ­
nations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test . 
Wat.Res. 14: 753-758.  
16. Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF — Z. Umwelt ­
chem. Ökotox. 10: 214-220.  
17. Her Majesty’s Stationery Office (1982).  Assessment of biodegradability. Me ­
thods for the examination of waters and associated materials , S. 91-98 ISBN 
011 751661 9.  
18. ISO 14593 (1998). Wasserbeschaffenheit — Bestimmung der vollständigen 
biologischen Abbaubarkeit organischer Substanzen im wässrigen Medium — 
Verfahren mittels Bestimmung des anorganischen Kohlenstoffs in geschlos ­
senen Flaschen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 933
 
Anlage 1  
Abbildung 1  
Apparatur zur Bestimmung der biologischen Abbaubarkeit  
Husmann -Anlage
  
A. Vorratsgefäß  
B. Dosierpumpe  
C. Belüftungsgefäß (3 l-Volumen)  
D. Absetzungsgefäß  E. Druckluftpumpe  
F. Sammelgefäß  
G. Fritte  
H. Luftmengenmesser  
Abbildung 2  
Apparatur zur Bestimmung der biologischen Abbaubarkeit  
„Porous-Pot“ -Anlage
  
A. Vorratsgefäß  
B. Dosierpumpe  
C. Poröses Belüftungsgefäß  
D. Undurchlässiges Außengefäß  E. Sammelgefäß  
F. Diffusor  
G. Luftmengenmesser  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 934
 
Abbildung 3  
Einzelheiten des 3-Liter-„ Porous-Pot “-Belüftungsgefäßes
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 935
 
Anlage 2  
Beispiel einer Eliminationskurve
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 936
 
Anlage 3  
[ZUR INFORMATION]  
KOPPELN VON PRÜFANLAGEN  
Um die Mikrobenpopulationen in Schlämmen in einer Prüfanlage, die mit Ab ­
wasser PLUS Prüfsubstanz beschickt wird, und in einer Kontrollanlage, die nur 
mit Abwasser beaufschlagt wird, zu egalisieren, wurde der Schlamm täglich ausgetauscht (1). Der Vorgang wurde als „koppeln“ bezeichnet und die Methode ist als Anlagenkopplung bekannt. Die Kopplung wurde ursprünglich mit  Hus­
mann -Belebtschlammanlagen, anschließend aber auch mit  Porous-Pot -Anlagen 
durchgeführt (2)(3). Es wurden keine signifikanten Ergebnisunterschiede zwi ­
schen nicht gekoppelten und gekoppelten Anlagen, ob  Husmann - oder  Porous- 
Pot-Anlagen, festgestellt, so dass der Zeit- und Arbeitsaufwand für das Koppeln 
der Anlagen mit keinerlei Vorteil verbunden ist.
 
Beim Schlammaustausch kann der Eindruck einer beträchtlichen Prüfsubstanz ­
abnahme entstehen, da ein Teil der Substanz übertragen wird und die Prüfsub ­
stanzkonzentrationen in den Abläufen der Prüf- und der Kontrollanlagen mehr 
oder weniger gleich sind. Folglich müssen Berichtigungsfaktoren angewendet 
werden, die von der ausgetauschten Fraktion und der mittleren hydraulischen Verweilzeit abhängen. Weitere Einzelheiten zur Berechnung wurden veröffent ­
licht (1).
 
Der berichtigte DOC- bzw. CSB-Eliminationsgrad wird nach der folgenden all ­
gemeingültigen Formel berechnet:  
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ % 
Dabei sind:  
D tc = der berichtigte DOC- bzw. CSB-Eliminationsgrad (in %)  
D t = die bestimmte DOC- bzw. CSB-Abnahme Eliminationsgrad (in %)  
a = die ausgetauschte Fraktion des Volumens der Belebtschlammanlagen  
r = die mittlere hydraulische Verweilzeit (in Std.)  
Wird beispielsweise die Hälfte des Volumens des Belüftungsgefäßes ausgetauscht 
(a = 0,5) und beträgt die mittlere hydraulische Verweilzeit 6 Stunden, so ist die 
Korrekturformel  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
LITERATUR  
1. Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975).  Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test . I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.
 
2. Painter HA, Bealing DJ (1989).  Experience and Data from the OECD Acti ­
vated Sludge Simulation Test , S. 113-138. In: Laboratory Tests for Simulation 
of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
 
3. Painter HA, King EF (1978).  Water Research Centre Porous Pot Method for 
Assessing Biodegradability . Technischer Bericht TR70, Water Research Cen ­
tre, Stevenage, Vereinigtes Königreich.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 937
 
Anlage 4  
BEURTEILUNG DER BELEBTSCHLAMM-INHIBITION  
Hemmung durch Prüfsubstanzen  
1. Es kann vorkommen, dass eine chemische Substanz (oder ein Abwasser) im 
Simulationstest nicht abgebaut wird bzw. nicht abnimmt und sogar eine hem ­
mende (inhibierende) Wirkung auf die Schlammmikroorganismen entfaltet. 
Andere chemische Substanzen werden in niedrigen Konzentrationen biolo ­
gisch abgebaut, wirken jedoch in höheren Konzentrationen inhibierend (Hor ­
mesis). Inhibitionseffekte wurden möglicherweise in einem früheren Stadium 
festgestellt oder lassen sich im Toxizitätstest bestimmen, bei dem ein Inoku ­
lum verwendet wird, das dem im Simulationstest verwendeten Inokulum ähn ­
lich oder identisch ist (1). Zu derartigen Methoden zählen die Prüfung der Atmungshemmung (Kapitel C.11 dieses Anhangs (2) und ISO 8192(3)) oder 
die Bestimmung der Hemmwirkung der Wasserbestandteile auf das Wachstum 
der Belebtschlamm-Mikroorganismen (ISO 15522 (4)).
 
2. Im Simulationstest manifestiert sich eine Hemmung dadurch, dass die Diffe ­
renz zwischen dem DOC-Gehalt (bzw. dem CSB) des Prüfgefäßablaufs und dem des Kontrollgefäßablaufs größer ist als der mit der Prüfsubstanz zuge ­
führte DOC. Anders ausgedrückt, die prozentuale Abnahme des DOC (und 
des biochemischen Sauerstoffbedarfs (BSB), des chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB), und/oder von NH
 + 4 ) des organischen Kulturmedi ­
ums ist geringer, wenn bei Prüfsubstanz zugeführt wird. In diesem Fall sollte 
der Test mit einer geringeren Prüfsubstanzkonzentration so lange wiederholt 
werden, bis ein Niveau erreicht ist, bei dem kein Hemmungseffekt mehr auftritt, wobei die Konzentration u. U. so weit verringert werden sollte, bis die Prüfsubstanz biologisch abgebaut ist. Hat die Prüfsubstanz (oder das Ab ­
wasser) jedoch in allen getesteten Konzentrationen eine nachteilige Wirkung 
auf den Prozess, so deutet dies darauf hin, dass die chemische Substanz nur schwer und möglicherweise überhaupt nicht biologisch abbaubar ist; es könnte jedoch sinnvoll sein, den Test mit Belebtschlamm aus einer anderen Quelle zu 
wiederholen und/oder den Schlamm schrittweise zu akklimatisieren.
 
3. Umgekehrt sollte die Konzentration der Prüfsubstanz erhöht werden, wenn 
diese bereits im ersten Simulationsversuch biologisch abgebaut wird und er ­
mittelt werden muss, ob die chemische Substanz einen Inhibitionseffekt ent ­
falten könnte.  
4. Bei der Bestimmung von Hemmungsgraden sollte nicht außer Acht gelassen 
werden, dass sich Belebtschlammpopulationen verändern können und dass die 
Mikroorganismen mit der Zeit möglicherweise eine Toleranz gegenüber hem ­
menden Substanzen entwickeln.  
5. Berechnung des Hemmungsgrades:  
Die gesamten prozentualen Abnahmen (R  o ) von BSB, DOC, CSB usw. kön ­
nen für die Prüf- und die Kontrollanlage nach folgender Gleichung berechnet 
werden:  
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
Dabei sind:  
I = die Zulaufkonzentration von BSB, DOC, CSB usw. in Prüf- oder Kon ­
trollgefäßen (mg/l)  
E = die entsprechende Ablaufkonzentrationen (mg/l).  
I und E müssen aufgrund des auf die Prüfsubstanz in den Prüfanlagen zurück ­
zuführenden DOC korrigiert werden, um korrekt berechnete Hemmungspro ­
zentsätze zu gewährleisten.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 938
 
Der auf die Prüfsubstanz zurückzuführende Hemmungsgrad kann nach folgen ­
der Gleichung berechnet werden:  
% Hemmungsprozentsatz  ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
Dabei sind:  
R c = die prozentuale Abnahme in den Kontrollgefäßen  
R t = die prozentuale Abnahme in den Prüfgefäßen  
LITERATUR  
1. Reynolds L  et al . (1987).  Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability . Chemosphere 16: 2259.  
2. Kapitel C.11 dieses Anhangs, Biologische Abbaubarkeit — Belebtschlamm: 
Prüfung der Atmungshemmung.  
3. ISO 8192 (2007) Wasserbeschaffenheit — Bestimmung der Hemmung des 
Sauerstoffverbrauchs von Belebtschlamm nach Kohlenstoff- und Ammonium-Oxidation.
 
4. ISO 15522 (1999) Wasserbeschaffenheit — Bestimmung der Hemmwirkung 
der Wasserbestandteile auf das Wachstum der Belebtschlamm-Mikroorganis ­
men. ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 939
 
Anlage 5  
Schwer wasserlösliche Prüfsubstanzen — flüchtige chemische Substanzen  
Schwer wasserlösliche chemische Substanzen  
Es wurden offensichtlich nur wenige Berichte über die Verwendung schwer 
wasserlöslicher oder nicht wasserlöslicher chemischer Substanzen in Tests zur 
Simulation der Abwasserbehandlung veröffentlicht (1)(2)(3).  
Es existiert keine einfache Methode zur Dispergierung der Prüfsubstanz, die für 
alle nicht wasserlöslichen chemischen Substanzen geeignet wäre. Zwei der vier in 
ISO 10634 (4) beschriebenen Verfahren scheinen sich zur Dispergierung von 
Prüfsubstanzen für die Simulationstestung zu eignen; sie sehen den Einsatz von Emulgatoren und/oder Ultraschallenergie vor. Die resultierende Dispersion 
sollte mindestens 24 Stunden lang stabil sein. Hinreichend stabilisierte Disper ­
sionen in einem konstant gerührten Behälter (Nummer 38) werden anschließend, separat vom Haushalts- oder synthetischen Abwasser, in das Belüftungsgefäß dosiert.
 
Soweit die Dispersionen stabil sind, wird untersucht, wie die Prüfsubstanz in 
dispergierter Form bestimmt werden kann. Da der DOC-Gehalt in diesem Fall wahrscheinlich ungeeignet ist, sollte eine spezifische Analysemethode für die 
Prüfsubstanz entwickelt werden, die sich für Abflüsse, Feststoffe in Abflüssen 
und Belebtschlämme gleichermaßen eignet. Danach sollte der Verbleib der Prüf ­
substanz im simulierten Belebtschlammprozess (Flüssig- und Festphasen) be ­
stimmt werden. Auf diese Weise wird eine ‚Massenbilanz‘ erstellt, anhand deren 
festgestellt werden könnte, ob die Prüfsubstanz biologisch abgebaut wurde. Dies 
würde jedoch nur die primäre Bioabbaubarkeit betreffen. Vollständige Bioabbau ­
barkeit sollte in einem respirometrischen Test auf leichte biologische Abbaubar ­
keit (Kapitel C.4 dieses Anhangs (5) C, F oder D) nachgewiesen werden, bei 
dem als Inokulum Schlamm eingesetzt wird, der der Prüfsubstanz im Simulati ­
onstest ausgesetzt war.
 
Flüchtige chemische Substanzen  
Die Verwendung flüchtiger chemischer Substanzen in Tests zur Simulation der 
Abwasserbehandlung ist umstritten und problematisch. Wie schon bei schwer 
wasserlöslichen Prüfsubstanzen scheint es kaum veröffentlichte Berichte über 
Simulationstests zu geben, bei denen flüchtige chemische Substanzen zum Ein ­
satz kamen. Ein konventionelles Rührwerk wird durch Abdichten der Belüftungs- und Absetzgefäße, Messung und Kontrollmessung des Luftflusses mittels Luft ­
flussmessern und Passieren des austretendes Gases durch Filter zum Auffangen 
flüchtiger organischer Stoffe umgerüstet. In einigen Fällen wird eine Vakuum ­
pumpe verwendet, um das austretende Gas durch eine Kühlfalle oder ein  Purge- 
&-Trap -System für gaschromatographische Analysen mit Tenax- und 
Silikagel-Filtern zu führen. Die im Filter festgehaltene Prüfsubstanz kann ana ­
lytisiert werden.
 
Der Test wird in zwei Phasen durchgeführt. Die Anlagen werden zunächst ohne 
Schlamm betrieben; synthetisches Abwasser PLUS Prüfsubstanz werden jedoch in das Belüftungsgefäß gepumpt. Es werden Zulauf- und Ablaufproben sowie Proben des austretenden Gases gezogen und einige Tage lang auf Präsenz von 
Prüfsubstanz analysiert. Aus den so erhobenen Daten kann der Prozentsatz (R
 vs ) 
der aus dem System gelösten und entfernten (gestrippten) Prüfsubstanz errechnet werden.
 
Anschließend wird unter denselben Betriebsbedingungen wie bei der  Stripping - 
Studie der normale biologische Test (mit Schlamm) durchgeführt. DOC bzw. CSB werden ebenfalls gemessen, um sicherzustellen, dass die Anlagen ordnungs ­
gemäß funktionieren. In der ersten Testphase wird die Prüfsubstanz im Zulauf, 
im Ablauf und in austretenden Gas sporadisch analysiert; nach der Akklimatisa ­
tion werden diese Analysen häufiger durchgeführt. Auch hier können anhand der Daten im Gleichgewichtszustand ( steady state ) die aus allen (physikalischen und 
biologischen) Abbauprozessen resultierende prozentuale Abnahme der Prüfsub ­
stanz in der Flüssigphase (R
 T ) sowie der aus dem System gestrippte Anteil (R  V ) 
berechnet werden.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 940
 
Berechnung:  
a) Beim nicht biologischen Test kann der Prozentsatz (R  VP ) der aus dem System 
gestrippten Prüfsubstanz nach folgender Gleichung berechnet werden:  
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
Dabei sind:  
R VP = die prozentuale Abnahme der Prüfsubstanz aufgrund von Verflüchti ­
gung,  
S VP = die im Filter aufgefangene Prüfsubstanz, angegeben als äquivalente 
Konzentration in der Flüssigphase (mg/l),  
S IP = die Konzentration der Prüfsubstanz im Zulauf (mg/l).  
b) Beim biologischen Test kann der Prozentsatz (R  V ) der aus dem System ge ­
strippten Prüfsubstanz nach folgender Gleichung berechnet werden:  
R V ¼ S V 
S I · 100 
Dabei sind:  
R V = die prozentuale Abnahme der Prüfsubstanz aufgrund von Verflüchti ­
gung im biologischen Test,  
S V = die im biologischen Test im Filter aufgefangene Prüfsubstanz, ange ­
geben als äquivalente Konzentration im flüssigen Zulauf (mg/l),  
S I = die Konzentration der Prüfsubstanz im Zulauf (mg/l).  
c) Beim biologischen Test kann die aus allen Abbauprozessen resultierende pro ­
zentuale Abnahme der Prüfsubstanz (R  T ) nach folgender Gleichung berechnet 
werden:  
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
Dabei ist:  
S E = die Konzentration der Prüfsubstanz im (flüssigen) Ablauf (mg/l).  
d) Die prozentuale Abnahme der Prüfsubstanz aufgrund des biologischen Ab ­
baus PLUS Adsorption (R  BA ) kann somit nach folgender Gleichung berechnet 
werden:  
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Es sollten separate Tests durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob die 
Prüfsubstanz adsorbiert wurde; wenn ja, kann eine weitere Korrektur vor ­
genommen werden.  
e) Ein Vergleich zwischen dem Anteil der Prüfsubstanz, der aus dem biologischen 
Prüfsystem gestrippt wurde (R  v ), und dem Anteil, der aus dem nicht biologi ­
schen Prüfsystem gestrippt wurde (R  vp ), ergibt den Gesamteffekt der biologi ­
schen Behandlung auf die Emission der Prüfsubstanz in die Atmosphäre.  
Beispiel:  Benzol  
Schlammverweilzeit = 4 Tage  
Synthetisches Abwasser; Verweilzeit = 8 Stunden  
S IP = S  I = 150 mg/l  
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l  
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 941
 
Daher:  
R VP = 100 %, R  V = 15 %  
R T = 100 % und R  BA = 85 %.  
Es wurde davon ausgegangen, dass sich Benzol nicht an den Schlamm an ­
lagert.  
LITERATUR  
1. Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970).  Biological degradation of tertiary butyl 
alcohol . Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854.  
2. Pitter P, Chudoba J (1990).  Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment . CRC Press. Boston, USA.  
3. Stover EL, Kincannon DF (1983).  Biological treatability of specific organic 
compounds found in chemical industry waste waters . J. Wat. Pollut. Control 
Fed. 55: 97.  
4. ISO 10634 (1995) Wasserbeschaffenheit — Anleitung für die Vorbereitung 
und Behandlung von in Wasser schwer löslichen organischen Verbindungen für die nachfolgende Bestimmung ihrer biologischen Abbaubarkeit in einem 
wässrigen Medium.
 
5. Kapitel C.4 dieses Anhangs, Bestimmung der ‚leichten‘ biologischen Abbau ­
barkeit.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 942
 
Anlage 6  
Auswirkungen der Schlammverweilzeit auf die Behandlungsfähigkeit 
chemischer Substanzen  
EINLEITUNG  
1. Die im Haupttext beschriebene Methode dient der Feststellung, ob die ge ­
testeten Substanzen (in der Regel Stoffe, die bekanntermaßen inhärent, aber 
nicht leicht biologisch abbaubar sind) innerhalb der für Kläranlagen gelten ­
den Grenzen biologisch abgebaut werden können. Die Ergebnisse werden als prozentuale Abnahme und prozentualer biologischer Abbau angegeben. 
Die Betriebsbedingungen der Belebtschlammanlagen und die Wahl des Zu ­
laufs lassen relativ breit gefächerte Prüfsubstanzkonzentrationen im Ablauf zu. Tests werden nur an Schlammfeststoffen in einer einzigen nominalen Konzentration oder bei einer einzigen nominalen Schlammverweilzeit 
(sludge retention time , SRT) durchgeführt, und die beschriebenen Verfahren 
für den Überschussschlammabzug können dazu führen, dass der SRT-Wert während des Tests sowohl von einem Tag zum anderen als auch während eines Tages beträchtlich variiert.
 
2. Bei dieser Variante (1)(2) wird die Schlammverweilzeit (wie dies auch bei 
Anlagen größeren Maßstabs der Fall ist) während jedes 24-Stunden-Zeit ­
raums innerhalb sehr viel engerer Grenzen kontrolliert, wodurch sich eine konstantere Konzentration in den Abläufen ergibt. Es wird die Verwendung 
von Haushaltsabwasser empfohlen, da diese Abwasserart konsistentere und 
höhere Abnahmeprozentwerte ergibt. Darüber hinaus werden die Effekte verschiedener SRT-Werte untersucht, und in einer weiterreichenden Studie können die Effekte verschiedener Temperaturen auf die Ablaufkonzentration 
bestimmt werden.
 
3. Es besteht bisher kein allgemeines Einvernehmen darüber, welche kineti ­
schen Modelle zugrunde liegen, wenn chemische Stoffe unter Abwasser ­
behandlungsbedingungen biologisch abgebaut werden. Auf die erhobenen Daten wurde das Monod-Modell (zur Vorhersage der Wachstumsgeschwin ­
digkeit von Bakterien in Abhängigkeit von der Konzentration der Substrate) 
gewählt (1)(2), da die Methode nur zur Anwendung auf in großen Mengen produzierte chemische Substanzen bestimmt war, die in Abwasser in Kon ­
zentrationen von über 1 mg/l vorkommen. Die Gültigkeit des vereinfachten 
Modells und die aufgestellten Annahmen wurden anhand einer Reihe von 
Alkoholethoxylaten von unterschiedlicher primärer Bioabbaubarkeit be ­
stimmt (2)(3).
 
Anmerkung:  Da sich diese Variante eng an den Wortlaut der vorliegenden 
Prüfmethode (C.10-A) anlehnt, werden im Folgenden nur die 
Punkte beschrieben, bei denen Abweichungen bestehen.  
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
4. Porous-Pot -Belebtschlammanlagen, die zur Erleichterung des (fast) kontinu ­
ierlichen Abzugs von Kultursuspension konzipiert wurden und eine sehr präzise Kontrolle der Schlammverweilzeit (SRT, oder θ
 s ) gestatten, werden 
mit verschiedenen Schlammverweilzeiten und — fakultativ — bei verschie ­
denen Temperaturen als nicht gekoppelte Anlagen betrieben. Die Verweil ­
zeit beträgt in der Regel 2 bis 10 Tage, und die Temperaturen liegen zwischen 5 und 20 °C. (Vorzugsweise häusliches) Abwasser und eine Lö ­
sung der Prüfsubstanz werden in Anteilen, die die erforderliche Schlamm ­
verweilzeit (3 bis 6 Stunden) und die erforderliche Prüfsubstanzkonzentra ­
tion im Zulauf gewährleisten, separat in die Anlagen zudosiert. Zu Ver ­
gleichszwecken werden zeitgleich Kontrollanlagen ohne Prüfsubstanz betrie ­
ben.
 
5. Es können andere Apparaturtypen verwendet werden, doch muss in diesem 
Fall unbedingt sichergestellt werden, dass eine gute Kontrolle der Schlamm ­
verweilzeit gewährleistet ist. So muss bei der Verwendung von Anlagen mit Klärkasten möglicherweise in Kauf genommen werden, dass Feststoffe über den Anlagenablauf verloren gehen. Ferner sollten besondere Vorkehrungen 
getroffen werden, um Fehler aufgrund von Schwankungen der Schlamm ­
menge im Klärkasten zu vermeiden.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 943
 
6. Die Anlagen werden unter allen gewählten Testbedingungen betrieben, und 
sobald Stabilität erreicht wurde, werden über einen Zeitraum von ungefähr 
drei Wochen die durchschnittlichen  Steady-State -Konzentrationen der Prüf ­
substanz in den Abläufen und — fakultativ — die DOC-Werte bestimmt. Zusätzlich zur Bestimmung der prozentualen Abnahme der Prüfsubstanz und 
der fakultativen Bestimmung des DOC-Wertes wird das Verhältnis zwischen 
Betriebsbedingungen und Prüfsubstanzkonzentration im Ablauf grafisch dar ­
gestellt. Auf diese Weise können kinetische Konstanten berechnet und die Bedingungen vorausgesagt werden, unter denen die Prüfsubstanz behandelt 
werden kann.
 
ANGABEN ZUR PRÜFSUBSTANZ  
7. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummern 12 und 13.  
NEGATIVE/POSITIVE TESTERGEBNISSE (PASS/FAIL)  
8. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummern 14 und 15.  
REFERENZSUBSTANZ  
9. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummer 16.  
REPRODUZIERBARKEIT VON TESTERGEBNISSEN  
10. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummern 17 und 18.  
BESCHREIBUNG DER METHODE  
Apparatur  
11. Als Anlage ist das modifizierte  Porous-Pot -System geeignet (siehe Anlage 
6.1). Das System besteht aus einem Innengefäß (oder Einsatz) aus porösem 
Polypropylen mit einer Dicke von 3,2 mm und einer Porengröße von un ­
gefähr 90 μm; das Anschlussstück ist stumpfgeschweißt (dadurch wird die 
Anlage robuster als das unter Nummer 21 dieses Kapitels C.10 A beschrie ­
bene System). Das Innengefäß wird in ein größeres Außengefäß aus un ­
durchlässigem Polyethylen eingesetzt, welches aus zwei Teilen besteht — einer runden Basisplatte mit ausgestanzten Lochöffnungen für zwei Luft ­
leitungen und eine Schlammabzugleitung und einem aufschraubbaren Zylin ­
der mit einem derart angeordneten Ausfluss, dass das Volumen im Topf 
stets auf 3 Liter gehalten werden kann. Eine der Luftleitungen ist mit einem Lüftungsstein versehen, die andere ist an einem Ende offen und im Topf im rechten Winkel zum Stein angeordnet. Das System erzeugt genügend Tur ­
bulenz, um den Inhalt des Topfes vollständig durchzumischen und Konzen ­
trationen an gelöstem Sauerstoff von über 2 mg/l zu gewährleisten.
 
12. Die Anlagen in angemessener Zahl entweder im Wasserbad oder in konstant 
temperierten Räumen unter kontrollierten Temperaturbedingungen zwischen 5 und 20 °C (± 1 °C) betreiben. Um die Prüfsubstanzlösung und den abge ­
setzten Schlamm in den vorgeschriebenen Raten (0-1,0 ml/Min bzw. 0-25 
ml/Min) in die Belüftungsgefäße zu dosieren, sind Pumpen erforderlich; eine dritte Pumpe zieht den Überschussschlamm aus den Belüftungsgefäßen ab. Die erforderliche sehr langsame Fließgeschwindigkeit des Überschuss ­
schlamms wird erreicht, indem eine Pumpe auf höhere Geschwindigkeit 
eingestellt und mithilfe einer Zeitschaltuhr intermittent, d. h. 10 Sekunden pro Minute, betrieben wird, wobei eine Pumpenleistung von 3 ml/Min eine Abzugrate von 0,5 ml/Min ergibt.
 
Filtrationsgerät oder Zentrifuge  
13. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummer 23.  
Analysegerät  
14. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummer 24.  
Wasser  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 944
 
15. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummern 25 and 26.  
Organisches Medium  
16. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummer 27.  
Synthetisches Abwasser  
17. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummer 28.  
Haushaltsabwasser  
18. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummer 29.  
Belebtschlamm  
19. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummer 30.  
Stammlösungen der Prüfsubstanz  
20. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummern 31 und 32.  
PRÜFVERFAHREN  
Aufbereitung des Inokulums  
21. Es gelten nur die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummer 34. — Es ist 
Belebtschlamm zu verwenden (ungefähr 2,5 g/l).  
Anzahl Prüfanlagen  
22. Für einen einfachen Test, d. h. einen Test zur Messung der prozentualen 
Abnahme, ist nur eine einzige Schlammverweilzeit (SRT) erforderlich; um jedoch die zur Berechnung vorläufiger kinetischer Konstanten erforderlichen Daten erheben zu können, werden 4 oder 5 SRT-Werte benötigt. In der 
Regel werden Verweilzeiten zwischen 2 und 10 Tagen gewählt. In der 
Praxis bietet es sich an, einen Test mit 4 oder 5 Verweilzeiten gleichzeitig bei ein und derselben Temperatur durchzuführen; bei ausgedehnten Studien werden dieselben SRT-Werte (oder u. U. eine unterschiedliche Wertespan ­
ne) und andere Temperaturen (5 bis 20 °C) verwendet. Zur Bestimmung der 
primären Bioabbaubarkeit (Hauptverwendungszweck) wird in der Regel nur eine Anlage je Bedingungsszenario benötigt. Zur Bestimmung der vollstän ­
digen Bioabbaubarkeit ist jedoch für jedes Bedingungsszenario eine Kon ­
trollanlage erforderlich, die mit Abwasser, jedoch nicht mit Prüfsubstanz 
beschickt wird. Kann davon ausgegangen werden, dass im verwendeten Abwasser Prüfsubstanz präsent ist, müssten auch bei der Bestimmung der primären Bioabbaubarkeit Kontrollanlagen verwendet und die Berechnungen 
entsprechend korrigiert werden.
 
Zudosierung des organischen Mediums und der Prüfsubstanz  
23. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummern 36 bis 39; es 
wird jedoch darauf hingewiesen, dass die Prüfsubstanzlösung separat zu ­
dosiert wird und dass verschiedene Schlammabzugsraten verwendet werden. 
Die Fließgeschwindigkeiten der Zuläufe, der Abläufe und des abgezogenen 
Überschussschlamms häufig, z. B. zweimal täglich, überprüfen und bei Bedarf auf ± 10 % justieren. Treten bei Verwendung von Haushaltsabwasser 
Probleme mit den Analysemethoden auf, sollte der Test mit synthetischem 
Abwasser durchgeführt werden, wobei jedoch sicherzustellen ist, dass un ­
terschiedliche Medien vergleichbare kinetische Daten liefern.
 
Handhabung von Belebtschlammanlagen  
24. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummern 40 bis 43, die 
Schlammverweilzeit (SRT) sollte jedoch nur durch „konstanten“ Schlamm ­
abzug reguliert werden.  
Probnahme und Analyse  
25. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummern 44 bis 50, außer 
dass die Konzentration der Prüfsubstanz bestimmt werden  muss  und der 
DOC-Wert bestimmt werden  kann ; CSB-Werte sollten nicht verwendet wer ­
den. ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 945
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Auswertung der Ergebnisse  
26. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummern 52 bis 54.  
Darstellung der Prüfergebnisse  
27. Es gelten die Bestimmungen von Kapitel C.10 A Nummern 56 bis 62.  
Berechnung kinetischer Konstanten  
28. Es ist realistischer, die mittlere  Steady-State -Konzentration der Prüfsubstanz 
im Ablauf anzugeben und zu beschreiben, wie sich diese unter unterschied ­
lichen Anlagenbetriebsbedingungen verändert, als die prozentuale primäre 
Biobaubarkeit anzuführen. Dies kann mithilfe von Gleichung (6) in Anlage 
6.2 erfolgen, mit der Werte für K  S , μ m und θ SC , die kritische Schlamm ­
verweilzeit, berechnet werden können.  
(Alternativ können mit einem einfachen Rechnerprogramm Näherungswerte 
für K  S und μ m bestimmt werden, um die mithilfe von Gleichung 2 (Anlage 
6.2) errechnete theoretische Kurve den erzielten Testwerten anzupassen. 
Auch wenn keine der Lösungen die einzige richtige sein wird, lässt sich 
dennoch ein verhältnismäßig akkurater Näherungswert für K  S und μ m be­
stimmen.)  
Variabilität von Ergebnissen  
29. Es ist durchaus gängig, dass für kinetische Parameter bestimmter chemischer 
Substanzen unterschiedliche Werte erzielt werden. Es wird davon ausgegan ­
gen, dass sowohl die Bedingungen, unter denen sich der Schlamm vermehrt 
hat, als auch die Testbedingungen (wie unter Nummer 5 und für andere Tests beschrieben) großen Einfluss auf die Prüfergebnisse haben. Ein Aspekt dieser Variabilität wurde von  Grady et al  (4) erörtert, die vorschlugen, die 
Begriffe „existierend“ ( extant ) und „intrinsisch“ ( intrinsic ) auf die beiden die 
Grenzen des physiologischen Zustands einer Kultur repräsentierenden Ex ­
tremzustände anzuwenden, die während eines kinetischen Versuchs erreicht werden können. Darf sich der Zustand während des Tests nicht verändern, 
so spiegeln die Werte der kinetischen Parameter die Bedingungen des Mi ­
lieus wider, aus dem die Mikroorganismen entnommen wurden; diese Werte gelten als „existierend“, d. h. gegenwärtig vorhanden. Am anderen Ende, d. h. wenn die Testbedingungen die vollständige Entwicklung des 
protein-synthetisierenden Systems und somit eine größtmögliche Wachs ­
tumsrate gestatten, gelten die erzielten kinetischen Parameter als „intrin ­
sisch“ und werden nur von der Art des Substrats und den Arten von Bak ­
terien in der Kultur beeinflusst. Als Faustregel gilt, dass  Existenz -Werte 
erzielt werden, wenn das Verhältnis von Substratkonzentration zu kompeten ­
ten (d. h. auf den Abbau spezialisierten) Mikroorganismen (S
 o /X o ) gering, z. 
B. auf 0,025, gehalten wird, während intrinsische Werte anfallen, wenn dieses Verhältnis größer ist und ein Wert von mindestens 20 vorliegt. In 
beiden Fällen sollte S
 o dem relevanten Wert von Ks — der Halbsättigungs ­
konstante — entsprechen oder darüber liegen.  
30. Die Variabilität und andere Aspekte der Bioabbaugeschwindigkeit waren 
Gegenstand eines kürzlich stattgefundenen SETAC-Workshops (5). Solche (bereits vorliegenden oder geplanten) Studien dürften einen genaueren Ein ­
blick in die in Kläranlagen ablaufenden kinetischen Prozesse geben und 
somit eine bessere Auswertung existierender Daten ermöglichen, aber 
auch Anregungen für eine zweckdienlichere Auslegung künftiger Prüf ­
methoden geben.
 
LITERATUR:  
1. Birch RR (1982).  The biodegradability of alcohol ethoxylates . XIII Jornado 
Com. Espanol Deterg.: 33-48.  
2. Birch RR (1984).  Biodegradation of nonionic surfactants . J.A.O.C.S., 61(2): 
340-343.  
3. Birch RR (1991).  Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage 
treatment . J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 946
 
4. Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996).  Variability in kinetic para ­
meter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology . 
Wat. Res., 30 (3): 742-748.  
5. Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making  (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Herausgeber: Hales SG, 
Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6. September 1996. SETAC- 
Europe, Brüssel.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 947
 
Anlage 6.1  
„Porous Pot“ mit SRT-Kontrolle
  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 948
 
Anlage 6.2  
Berechnung von kinetischen Konstanten  
1. In der Annahme, dass das mathematische Modell der Monod-Kinetik gilt, 
und ausgehend von einer Massenbilanz aus aktiven Feststoffen und Substrat 
im gesamten Belebtschlammsystem (1) können die folgenden Werte für den Gleichgewichtszustand ( steady state ) berechnet werden:
 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
oder 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
Dabei sind:  
S 1 = die Konzentration des Substrats im Ablauf, (mg/l)  
K S = die Halbsättigungskonstante, d. h. die Konzentration, bei der μ = 
μ m /2 (mg/l)  
μ = die spezifische Wachstumsrate (d  –1 ) 
μ m = der Höchstwert von μ m (d 1 ) 
K d = die spezifische Zerfallsrate aktiver Feststoffe (d  –1 ) 
θ S = die mittlere Schlammverweilzeit, SRT (d)  
Die Prüfung dieser Gleichung führt zu folgenden Schlussfolgerungen:  
i) Die Ablaufkonzentration ist unabhängig von der Zulaufkonzentration 
(S 0 ); folglich verändert sich der Prozentsatz des biologischen Abbaus 
mit der Zulaufkonzentration S  0 . 
ii) Der einzige S  1 beeinflussende kontrollierbare Parameter der Anlage ist 
die Schlammverweilzeit θ S . 
iii) Jeder Zulaufkonzentration S  0 entspricht eine kritische Schlammverweil ­
zeit, so dass:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
Dabei ist:  
θ SC = die kritische Schlammverweilzeit, unterhalb der kompetente (d. 
h. auf den Abbau spezialisierte) Mikroorganismen aus der An ­
lage ausgewaschen werden.  
iv) Da die anderen Parameter in Gleichung (2) die Wachstumskinetik be ­
treffen, ist davon auszugehen, dass die Temperatur den Substratgehalt 
des Ablaufs und das kritische Schlammalter beeinflusst, d. h. die für einen bestimmten Behandlungsgrad erforderliche Schlammverweilzeit würde bei abnehmender Temperatur zunehmen.
 
2. Ausgehend von einer Massenbilanz von Feststoffen im  Porous-Pot -System 
und in der Annahme, dass die Feststoffkonzentration im Anlagenablauf, X  2 , 
im Vergleich zur Feststoffkonzentration im Belüftungsgefäß, X  1 , gering ist, 
die Schlammverweilzeit wie folgt berechnen:  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 949
 
und 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
Dabei sind:  
V = das Volumen des Belüftungsgefäßes (l)  
X 1 = die Feststoffkonzentration im Belüftungsgefäß (mg/l)  
X 2 = die Feststoffkonzentration im Ablauf (mg/l)  
Q 0 = die Zuflussrate (l/d)  
Q 1 = die Schlammabzugsrate (l/d)  
Folglich kann die Schlammverweilzeit (jeder vorab eingestellte Wert) durch 
Kontrolle der Schlammabzugsrate, Q  1 , kontrolliert werden.  
Schlussfolgerungen  
3. Hauptzweck dieses Tests ist es demnach, die Vorhersage der Ablaufkonzen ­
tration und somit der Prüfsubstanzmengen in den Vorflutern zu ermöglichen.  
4. Durch Auftragen von S  1 gegen θ S lässt sich die kritische Schlammverweil ­
zeit, θ SC , in manchen Fällen vorhersagen; siehe beispielsweise Kurve 3 in 
Abbildung 1. Ist dies nicht möglich, kann θ SC (zusammen mit Näherungs ­
werten für μ m und K  S ) berechnet werden durch Auftragen von S  1 gegen 
S 1 •θ S . 
Die Umstellung von Gleichung (1) ergibt  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Ist K  d klein, wird 1 + θ s K d ~ 1 und [5] wird zu  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Die grafischen Punkte sollten demnach eine Gerade (siehe Abbildung 2) mit 
Steigung 1/ μ m und Schnittpunkt K  S /μ m ergeben; ferner gilt θ S ~ 1/μ m . ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 950
 
Abbildung 1  
Drei Temperaturen; fünf Schlammverweilzeiten (SRT)
  
Abbildung 2  
Regressionsgerade SRT — S  1 vs S  1 bei Temperatur T = 5 °C
  
Legende:  
Ablaufkonzentration:  
Kurve:  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 951
 
Anlage 7  
TESTS BEI NIEDRIGEN ( μg/l) KONZENTRATIONSBEREICHEN  
1. Zahlreiche chemische Substanzen sind im Wassermilieu, auch in Abwässern, 
normalerweise in sehr niedrigen Konzentrationen ( μg/l) vorhanden. In derart 
kleinen Mengen sind sie als primäre Vermehrungssubstrate eher nicht ge ­
eignet, sondern werden vielmehr als vermehrungsunfähige Sekundärsub ­
strate zur gleichen Zeit wie diverse natürlich vorkommende kohlenstoffhal ­
tige Substanzen biologisch abgebaut. Das in Anlage 6 beschriebene Modell 
ist für den Abbau derartiger chemischer Stoffe folglich nicht geeignet. Viele andere Modelle könnten jedoch angewendet werden, und unter den in Ab ­
wasserbehandlungssystemen vorherrschenden Bedingungen in vielen Fällen 
zeitgleich. Zur Klärung dieser Frage ist jedoch noch größerer Forschungs ­
aufwand erforderlich.
 
2. Bis dahin kann das im Haupttext beschriebene Verfahren (Kapitel C.10 A) 
angewendet werden, allerdings nur zur Bestimmung der primären Bioabbau ­
barkeit mittels angemessen geringer Konzentrationen (< 100 μg/l) und nach 
einem validierten Analyseverfahren. Die prozentuale biologische Abbaubar ­
keit kann berechnet werden (siehe Nummer 54 der Prüfmethode), sofern abiotische Prozesse (Adsorption, Flüchtigkeit usw.) berücksichtigt werden. 
Als Beispiel kann die Studie von  Nyholm et al.  (1)(2) angeführt werden, bei 
der die Prüfanlage im 4-Stunden-Takt mit Prüfsubstanz beschickt wurde (Fill-and-Draw -Methode). Für fünf chemische Stoffe, mit denen syntheti ­
sches Abwasser im Verhältnis 5 zu 100 μg/l beimpft wurde, wurden Kon ­
stanten pseudo-erster Ordnung berichtet. (Für vollständige Bioabbaubarkeit 
können
 14 C-markierte Prüfsubstanzen verwendet werden. Da hierfür bislang 
keine allgemein anerkannten Verfahren vorliegen, geht eine Beschreibung dieser Methode über den Geltungsbereich der vorliegenden Prüfmethode 
hinaus, wenngleich eine für ISO 14592 (3) vorgeschlagene Methode Leit ­
linien für die Verwendung
 14 C-markierter chemischer Stoffe enthält.)  
SCAS-Test  
3. Später wurde ein einfacherer Zwei-Phasen-Test vorgeschlagen (4)(5)(6); auf 
die halbkontinuierliche Belebtschlamm-(SCAS)-Methode folgen kinetische Schnelltests an Proben aus den SCAS-Anlagen. Beim SCAS-System sind 
(im Gegensatz zur ursprünglichen C.12-Prüfmethode) die Überschuss ­
schlamm-Abzugsraten bekannt, und die Anlage wird mit modifiziertem syn ­
thetischen Abwasser (OECD) oder Haushaltsabwasser beschickt. Das syn ­
thetische Abwasser wurde (wegen veränderlichem pH-Wert und unzuläng ­
licher Schlammsedimentation) durch Zugabe von Phosphatpuffer, Hefeex ­
trakt, Eisen-(III)-Chlorid und Spurenelementsalzen modifiziert, und sein CSB wurde durch Erhöhung der Pepton- und Fleischextraktkonzentration auf etwa 750 mg/l angehoben. Die Anlagen wurden im 24-Stunden-Zyklus 
betrieben, d. h. Belüftung für 23 Stunden, Überschussschlammabzug, Sedi ­
mentation, Entfernung des Überstands (über den Ablauf) mit anschließender Zuführung von synthetischem Abwasser PLUS Prüfsubstanz in Höhe von bis zu 100 μg/l (d. h. in ungefähr derselben Konzentration wie beim 
Schnelltest). Einmal wöchentlich wurden 10 % des gesamten Schlamms 
durch frischen Schlamm ersetzt, um eine ausgewogene Mikrobenpopulation zu gewährleisten.
 
4. Die anfängliche Konzentration der Prüfsubstanz und die Konzentration am 
Ende der Belüftungsphase werden gemessen, und der Test wird fortgesetzt, 
bis eine konstante Abnahme der Prüfsubstanz erreicht ist; dies kann eine Woche bis mehrere Monate dauern.
 
Schnelltest  
5. Ein Schnelltest (z. B. ein 8-Stunden-Test) wird durchgeführt, um die Kon ­
stante der Abbaukinetik (pseudo-)erster Ordnung zu bestimmen, die über die Geschwindigkeit der Zersetzung der Prüfsubstanz in Belebtschlamm aus 
bekannten, jedoch unterschiedlichen Quellen und Werdegängen Aufschluss 
gibt. Während eines Akklimatisationsversuchs (Nummern 3, 4) werden ins ­
besondere aus den SCAS-Reaktoren Schlammproben gezogen, und zwar am Ende einer Belüftungsphase, wenn die Konzentration des organischen Sub ­
strats gering ist. Zum Vergleich kann Schlamm auch aus einer parallel 
laufenden SCAS-Anlage entnommen werden, die nicht mit Prüfsubstanz
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 952
 
beschickt wurde. Gemische aus Schlamm und Prüfsubstanz, die in zwei oder 
mehr Konzentrationen zwischen 1 μg/l und 50 μg/l zugeführt wird, werden 
ohne Zugabe von synthetischem Abwasser oder einem anderen organischen Substrat belüftet. Die Restprüfsubstanz in der Lösung wird während eines Zeitraums von maximal 24 Stunden je nach Abbaubarkeit der chemischen 
Substanz in regelmäßigen Zeitabständen, z. B. stündlich, bestimmt. Vor den 
entsprechenden Analysen werden die Proben zentrifugiert.
 
Berechnungen  
6. Zur Berechnung der prozentualen Abnahme der Prüfsubstanz werden Daten 
aus den SCAS-Anlagen verwendet (Nummer 54). Außerdem kann mittels 
folgender Gleichung eine Konstante der Durchschnittsgeschwindigkeit, K  1 , 
(normiert für die Konzentration suspendierter Feststoffe) berechnet werden:  
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
Dabei sind:  
t = der Belüftungszeitraum (23 Stunden)  
C e = die Konzentration am Ende des Belüftungszeitraums ( μg/l) 
C i = die Konzentration zu Beginn des Belüftungszeitraums ( μg/l) 
SS = die Konzentration von Belebtschlammfeststoffen (g/l)  
7. Beim Schnelltest wird die logarithmische Konzentration der Restprüfsub ­
stanz (in %) gegenüber der Zeit grafisch dargestellt, und die Steigung des 
ersten Teils (10-50 % Zersetzung) der Kurve entspricht K  1 , der Konstanten 
(pseudo-)erster Ordnung. Für die Konzentration der Schlammfeststoffe wird die Konstante durch Division der Steigung durch die Konzentration der 
Schlammfeststoffe normiert. Das mitgeteilte Ergebnis muss auch Einzelhei ­
ten über die anfänglichen Konzentrationen der Prüfsubstanz und suspendier ­
ter Feststoffe, über die Schlammverweilzeit, Eintrag und Quelle des 
Schlamms und über eine (etwaige) Präexposition gegenüber der Prüfsub ­
stanz enthalten.
 
Variabilität der Ergebnisse  
8. Die Variabilität und andere Aspekte der Bioabbaugeschwindigkeit waren 
Gegenstand eines kürzlich stattgefundenen SETAC-Workshops (7). Solche 
(bereits vorliegenden oder geplanten) Studien dürften einen genaueren Ein ­
blick in die in Kläranlagen ablaufenden kinetischen Prozesse geben und somit eine bessere Auswertung existierender Daten ermöglichen, aber auch Anregungen für eine zweckdienlichere Auslegung künftiger Prüf ­
methoden enthalten.
 
LITERATUR  
1. Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and 
Schultz B (1992).  Removal of micropollutants in laboratory activated sludge 
reactors. Biodegradability . Wat. Res. 26: 339-353.  
(2) Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993).  
Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors 
under various operating conditions: Sorption . Wat. Res. 27: 1505-1510.  
(3) ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Wasserbeschaffenheit — 
Bestimmung der aeroben biologischen Abbaubarkeit organischer Verbindun ­
gen in geringen Konzentrationen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 953
 
(4) Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996).  
Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in acti ­
vated sludge waste water treatment plants using short-term batch experi ­
ments and μg/l range spiked concentrations.  Chemosphere 33 (5): 851-864.  
(5) Berg UT and Nyholm N (1996).  Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and stan ­
dard (ppm range) chemical concentrations . Chemosphere 33 (4): 711-735.  
(6) Danish Environmental Protection Agency. (1996).  Activated sludge biodegra ­
dability simulation test . Umweltprojekt, Nr. 337. Nyholm, N. Berg, UT. 
Ingerslev, F. Ministerium für Umwelt und Energie, Kopenhagen.  
(7) Biodegradation kinetics:  Generation and use of data for regulatory decision 
making  (1997). Workshop in Port Sunlight, VK. Verlag: Hales, SG. Feitjel, 
T. King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4.-6. September 1996. SETAC- Europe, Brüssel.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 954
 
C.10-B: Biofilme  
EINLEITUNG  
1. Simulationstests werden normalerweise an chemischen Substanzen vor ­
genommen, die sich im Screeningtest als nicht leicht abbaubar erwiesen 
haben (Kapitel C.4 (A-F) dieses Anhangs (9)), deren potenzielle (oder in ­
härente) biologische Abbaubarkeit jedoch im Test nachgewiesen wurde. In Ausnahmefällen werden Simulationstests auch an Substanzen vorgenommen, zu denen mehr Informationen benötigt werden (vor allem wenn sie in gro ­
ßen Mengen vorkommen), wobei in der Regel das Belebtschlammverfahren 
angewandt wird (C.10-A). In bestimmten Fällen sind jedoch spezifische Informationen über das Abbauverhalten einer chemischen Substanz bei bio ­
logischer Abwasserbehandlung (durch Biofilmreaktoren wie z. B. Tropfkör ­
per, Tauchkörper, Fließbettreaktoren) erforderlich. Zu diesem Zweck wurden 
diverse Apparaturen entwickelt.
 
2. Gerike  et al . (1) verwendeten große pilotmaßstäbliche Tropfkörper als ge ­
koppelte Anlagen. Diese Filter nahmen viel Platz in Anspruch und erfor ­
derten verhältnismäßig große Mengen an Abwasser oder synthetischem Ab ­
wasser. Truesdale  et al . (2) beschrieben kleinere Filter (eines Durchmessers 
von 6 Fuß × 6 Zoll), denen ein tensidfreies natürliches Abwasser zugeführt 
wurde; allerdings erforderten auch diese Filter immer noch große Wasser ­
mengen. Es dauerte 14 Wochen, bis sich ein „reifer“ Biofilm entwickelte, und bis zur Akklimatisierung waren nach der Beschickung mit dem Prüf ­
tensid noch weitere 4-8 Wochen erforderlich.
 
3. Baumann  et al.  (3) entwickelten einen viel kleineren Filter, bei dem 
Polyester-„Vlies“ verwendet wurde, das zuvor als inerte Aufwuchsfläche (Substratum ) für den Biofilm in Belebtschlamm getränkt wurde. Die Prüf ­
substanz wurde als die einzige C-Quelle verwendet, und die biologische 
Abbaubarkeit wurde durch Messung des gelösten organischen Kohlenstoffs 
(dissolved organic carbon , DOC) im Zu- und Ablauf und anhand des CO
 2 - 
Gehalts des austretenden Gases bestimmt.  
4. Gloyna  et al.  (4), die Erfinder des Drehrohrreaktors, verfolgten einen ganz 
anderen Ansatz. Auf der Innenfläche des Drehrohres wurde ein Biofilm gebildet, indem die betreffende Fläche über die Stirnseite des in einem kleinem Winkel zur Horizontalen angeordneten Rohres mit Zulaufwasser 
überströmt wurde. Der Reaktor wurde zur Bestimmung der biologischen 
Abbaubarkeit von Tensiden (5), aber auch zur Untersuchung der optimalen Dicke der Biofilmschicht und der Diffusion durch den Film (6) verwendet. Gloyna  et al.  entwickelten den Reaktor weiter, auch durch Modifizierung, 
um den CO
 2 -Gehalt des austretenden Gases bestimmen zu können.  
5. Der Drehrohrreaktor wurde vom  Standing Committee of Analysts  (Vereinig ­
tes Königreich) als Standardmethode für die Bestimmung sowohl der bio ­
logischen Abbaubarkeit chemischer Substanzen (7) als auch der Reinigungs ­
fähigkeit und Toxizität von Abwässern (8) anerkannt. Die hier beschriebene Methode hat den Vorteil, dass sie einfach, kompakt und reproduzierbar ist und relativ kleine Mengen an organischem Medium benötigt werden.
 
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
6. Die Innenfläche eines langsam rotierenden geneigten Rohres wird mit syn ­
thetischem Abwasser oder Haushaltsabwasser und Prüfsubstanz (dazuge ­
mischt oder separat) überströmt. Auf dieser Innenfläche bildet sich eine Schicht von Mikroorganismen, die denen auf Biofiltermedien vergleichbar sind. Die Prozessbedingungen des Reaktors werden so gewählt, dass eine 
angemessene Eliminierung der organischen Substanzen und, falls nötig, eine 
Ammonium-Oxidation erfolgt.
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7. Ausfluss aus dem Rohrablauf wird gesammelt und abgesetzt und/oder ge ­
filtert, bevor der DOC- und/oder der Prüfsubstanzgehalt nach einer spezi ­
fischen Methode analysiert wird. Zeitgleich werden zu Vergleichszwecken unter denselben Bedingungen Kontrollanlagen ohne Prüfsubstanz betrieben. Dabei wird angenommen, dass die Differenz zwischen den 
DOC-Konzentrationen im Ablauf der Prüf- und der Kontrollanlage durch 
die Prüfsubstanz und ihre organischen Stoffwechselprodukte bedingt ist. Zur Berechnung der Elimination der Prüfsubstanz wird diese Differenz mit der Konzentration der zugeführten Prüfsubstanz (als DOC) verglichen.
 
8. Der biologische Abbau lässt sich in der Regel durch sorgfältige Prüfung der 
Eliminations-Zeit-Kurve von der Bioadsorption differenzieren. Dies kann gewöhnlich durch einen Test auf leichte Bioabbaubarkeit (Sauerstoffauf ­
nahme oder Kohlendioxidproduktion) bestätigt werden, bei dem ein akkli ­
matisiertes Inokulum verwendet wird, das am Ende des Tests aus den mit der Prüfsubstanz beschickten Reaktoren entnommen wird.
 
ANGABEN ZUR PRÜFSUBSTANZ  
9. Reinheit, Wasserlöslichkeit und Flüchtigkeit sowie die Adsorptionsmerk ­
male der Prüfsubstanz sollten bekannt sein, um eine akkurate Ergebnisaus ­
wertung zu ermöglichen.  
10. Normalerweise können flüchtige oder schwer lösliche chemische Substanzen 
nicht getestet werden, es sei denn, es werden besondere Vorsichtsmaßnah ­
men getroffen (siehe Kapitel C.10-A, Anlage 5). Die chemische Struktur oder zumindest die empirische Formel sollten ebenfalls bekannt sein, um theoretische Werte berechnen und/oder gemessene Parameterwerte, z. B. für 
den theoretischen Sauerstoffbedarf (ThOD) oder den DOC, überprüfen zu 
können.
 
11. Angaben zur Toxizität der Prüfsubstanz für Mikroorganismen (siehe Kapitel 
C.10-A, Anlage 4) können für die Wahl geeigneter Testkonzentrationen 
zweckdienlich und für die korrekte Auswertung niedriger Bioabbaubarkeits ­
werte ausschlaggebend sein.  
NEGATIVE/POSITIVE TESTERGEBNISSE (PASS/FAIL)  
12. Ursprünglich musste die primäre Bioabbaubarkeit von Tensiden mindestens 
80 % betragen, bevor die Substanz in den Verkehr gebracht werden konnte. 
Wird der Wert von 80 % nicht erreicht, kann der vorliegende Simulations-(Bestätigungs-)Test durchgeführt werden, und das Tensid darf nur in den Verkehr gebracht werden, wenn über 90 % der betreffenden 
Substanz abgebaut wurden. Im Allgemeinen stellt sich die  Pass-/Fail -Frage 
bei chemischen Substanzen nicht, und der Wert der prozentualen Abnahme kann zur approximativen Berechnung der wahrscheinlichen Umweltkonzen ­
tration einer chemischen Substanz verwendet werden, die zur Analyse der 
von chemischen Substanzen ausgehenden Gefahren erforderlich ist. Einige 
Untersuchungen reiner Chemikalien haben in mehr als drei Viertel aller Fälle eine prozentuale DOC-Abnahme von > 90 % und bei über 90 % der Substanzen, die sich in nennenswerten Maße als biologisch abbaubar 
erwiesen haben, von > 80 % ergeben.
 
REFERENZSUBSTANZEN  
13. Um sicherzustellen, dass das Testverfahren korrekt durchgeführt wird, ist es 
sinnvoll, gelegentlich Referenzsubstanzen zu testen, deren Verhalten be ­
kannt ist. Zu derartigen Substanzen zählen Adipinsäure, 2-Phenylphenol, 
1-Naphthol, Diphensäure und 1-Naphthoesäure.  
REPRODUZIERBARKEIT VON TESTERGEBNISSEN  
14. Die relative Standardabweichung lag nach Feststellung eines britischen La ­
bors bei den Tests selbst bei 3,5 % und zwischen Tests bei 5 % (7).  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 956
 
BESCHREIBUNG DES PRÜFVERFAHRENS  
Apparatur  
Drehrohrreaktoren  
15. Die Apparatur (siehe Anlage 8, Abbildungen 1 und 2) besteht aus einer 
Reihe von jeweils 30,5 cm langen Acrylrohren mit jeweils 5 cm Innen ­
durchmesser, die innerhalb eines metallenen Stützkastens auf Gummirollen 
angeordnet sind. Jedes Rohr hat einen ca. 0,5 cm tiefen Flansch, damit es 
fest auf den Rädern aufsitzt, eine mit grober Stahlwolle aufgeraute Innen ­
fläche und am Stirnende (Zufuhrende) einen 0,5 cm tiefen inneren Rand ­
abschluss, um ein Überlaufen der Flüssigkeit zu vermeiden. Die Rohre sind 
in einem Winkel von ungefähr einem Grad zur Horizontalen angeordnet, 
um, wenn das Testmedium dem sauberen Rohr zugeführt wird, die erfor ­
derliche Kontaktzeit zu gewährleisten. Die Gummirollen werden mithilfe eines Motors mit Geschwindigkeitssteuerung langsam gedreht. Da die Ap ­
paratur in einem Raum mit konstanten Temperaturbedingungen aufgestellt 
wird, ist Temperaturkontrolle gewährleistet.
 
16. Indem jeder Rohrreaktor in ein geringfügig größeres, gedeckeltes Rohr ge ­
setzt und sichergestellt wird, dass die Anschlüsse gasdicht sind, könnte austretendes CO
 2 in einer alkalischen Lösung aufgefangen und anschließend 
gemessen werden (6).  
17. Für jedes Rohr wird in einem 20 l-Vorratsgefäß (A) (siehe Abbildung 2) ein 
24-Stunden-Vorrat an organischem Medium, gegebenenfalls mit Prüfsub ­
stanz versetzt, bereitgehalten. Bei Bedarf kann die Prüfsubstanz separat 
dosiert zugeführt werden. Am unteren Ende jedes Vorratsgefäßes befindet 
sich ein Ausguss, der mit einen geeigneten Schlauch, z. B. aus Silikonkaut ­
schuk, über eine Peristaltikpumpe (B) an ein Glas- oder Acryl-Überfüh ­
rungsrohr angeschlossen ist, das an der Stirnseite des geneigten Rohrreaktors 
2-4 cm tief in das Rohr eingeführt wird (C). Der Abfluss wird am unteren 
Ende des Rohres in einem Sammelgefäß aufgefangen (D). Er wird vor der Analyse abgesetzt oder gefiltert.
 
Filtrationsgerät — Zentrifuge  
18. Gerät zur Filtration von Proben mit Membranfiltern einer geeigneten Poren ­
weite (Nennöffnungsdurchmesser 0,45 μm), die lösliche organische Substan ­
zen adsorbieren bzw. ein Minimum an organischem Kohlenstoff freisetzen. Bei Verwendung von Kohlenstoff freisetzenden Filtern sind diese sorgfältig mit heißem Wasser zu waschen, um austretenden organischen Kohlenstoff 
zu entfernen. Alternativ kann eine Zentrifuge einer Kapazität von 40 000 
m/s
 2 verwendet werden.  
19. Analysegerät zur Bestimmung folgender Größen:  
— DOC/TOC (gesamter organischer Kohlenstoff) oder CSB (chemischer 
Sauerstoffbedarf);  
— bestimmte chemische Substanz (mittels HPLC, GC usw.), soweit erfor ­
derlich;  
— pH-Wert, Temperatur, Azidität und Alkalinität;  
— Ammonium, Nitrit und Nitrat, wenn die Tests unter nitrifizierenden 
Bedingungen durchgeführt werden.  
Wasser  
20. Leitungswasser (Trinkwasser) mit einem DOC-Gehalt von weniger als 3 
mg/l.  
21. Destilliertes oder deionisiertes Wasser mit einem DOC-Gehalt von weniger 
als 2 mg/l.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 957
 
Organisches Medium  
22. Als organisches Medium kommt synthetisches Abwasser, Haushaltsabwasser 
oder eine Mischung aus beiden Abwasserarten in Frage. Es hat sich gezeigt, 
dass die alleinige Verwendung von Haushaltsabwasser (in Belebtschlamm ­
anlagen) oft zu einer höheren prozentualen DOC-Abnahme führt und selbst den biologischen Abbau bestimmter chemischer Substanzen fördert, die bei 
Verwendung von synthetischem Abwasser (OECD) nicht abgebaut werden. 
Die Verwendung von Haushaltsabwasser wird demnach empfohlen. Bei jeder neuen Charge von organischem Medium wird die DOC- (oder die CSB-)Konzentration gemessen. Die Azidität oder Alkalinität des organi ­
schen Mediums sollte bekannt sein. Das Medium kann die Zugabe einer 
geeigneten Pufferlösung (Natriumhydrogencarbonat oder Kalium(di)hydro ­
gen-phosphat) erfordern, wenn die Azidität oder Alkalinität gering ist, um während des Tests einen pH-Wert von etwa 7,5 ± 0,5 im Reaktor zu ge ­
währleisten. Wie viel Pufferlösung zuzugeben ist und wann, muss auf Fall ­
basis entschieden werden.
 
Synthetisches Abwasser  
23. In jedem Liter Leitungswasser wird Folgendes aufgelöst: 160 mg Pepton; 
110 mg Fleischextrakt; 30 mg Harnstoff; 28 mg wasserfreies Dikaliumhy ­
drogenphosphat (K  2 HPO  4 ); 7 mg Natriumchlorid (NaCl); 4 mg Calcium ­
chlorid-Dihydrat (CaCl  2 .2H  2 O); 2 mg Magnesiumsulfat-Heptahydrat 
(Mg  2 SO 4 .7H  2 0). Dieses synthetische Abwasser (OECD) hat Beispielcharak ­
ter und ergibt eine mittlere DOC-Konzentration im Zulauf von etwa 100 
mg/l. Alternativ können andere Zusammensetzungen mit ähnlichen DOC-Konzentrationen verwendet werden, die realitätsnäher sind. Dieses synthetische Abwasser kann aus destilliertem Wasser in konzentrierter 
Form hergestellt und bis zu einer Woche bei ungefähr 1 °C gelagert werden. 
Bei Bedarf wird es mit Leitungswasser verdünnt. (Dieses Medium ist eher ungeeignet, weil die Stickstoffkonzentration sehr hoch und der Kohlenstoff ­
gehalt relativ niedrig ist; es gibt jedoch keine besseren Empfehlungen, außer 
dass mehr Phosphat (als Puffer) sowie zusätzliches Pepton hinzugefügt 
werden könnten).
 
Haushaltsabwasser  
24. Es sollte frisch abgesetztes Abwasser verwendet werden, das täglich von 
einem vorwiegend Haushaltsabwässer reinigenden Klärwerk bezogen wird. 
Es sollte aus der Ablaufrinne des Vorklärbeckens oder aus dem Beschi ­
ckungswasser der Belebtschlammanlage gezogen werden und weitgehend frei von Grobstoffen sein. Das Abwasser kann nach mehrtägiger Lagerung 
bei 4 °C verwendet werden, sofern erwiesen ist, dass der gelöste organische 
Kohlenstoff (DOC) (oder der chemische Sauerstoffbedarf, CSB) während der Lagerung nicht wesentlich (d. h. um weniger als 20 %) abgenommen hat. Um Störungen des Systems zu minimieren, sollte der DOC-(oder der 
CSB-) Wert jedes neuen Ansatzes vor dessen Verwendung auf einen geeig ­
neten konstanten Wert eingestellt werden, z. B. durch Verdünnung mit Leitungswasser.
 
Schmiermittel  
25. Zum Schmieren der Peristaltikpumpenrollen kann Glyzerin oder Olivenöl 
verwendet werden: Beide Schmiermittel sind für Silikonkautschukschläuche geeignet.
 
Stammlösungen der Prüfsubstanz  
26. Für angemessen lösliche chemische Substanzen werden in geeigneten Kon ­
zentrationen (z. B. 1 bis 5 g/l) in entionisiertem Wasser oder in einer mineralischen Kulturlösung aus synthetischem Abwasser Stammlösungen angesetzt. Für nicht lösliche chemische Substanzen siehe Kapitel C.10-A, 
Anlage 5. Diese Methode ist für flüchtige Substanzen ohne Modifizierung 
der Drehrohrreaktoren (Nummer 16) nicht geeignet. Der DOC- und der TOC-Gehalt der Stammlösung werden bestimmt und die Messungen für jede neue Charge wiederholt. Bei einer Differenz zwischen DOC und 
TOC von mehr als 20 % wird die Wasserlöslichkeit der Prüfsubstanz 
überprüft. Der DOC oder die durch spezifische Analyse der Stammlösung
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gemessene Konzentration der Prüfsubstanz wird mit dem Nennwert vergli ­
chen, um festzustellen, ob die Wiederfindungsrate ausreicht (in der Regel 
kann mit > 90 % gerechnet werden). Vor allem bei Dispersionen ist fest ­
zustellen, ob der DOC-Wert als Analyseparameter verwendet werden kann oder nicht oder ob nur ein prüfsubstanzspezifisches Analyseverfahren ange ­
wendet werden kann. Bei Dispersionen müssen die Proben zentrifugiert 
werden. Bei jeder neuen Charge werden der DOC-Wert, der CSB-Wert bzw. die Prüfsubstanz durch spezifische Analyse gemessen.
 
27. Der pH-Wert der Stammlösung wird bestimmt. Extremwerte zeigen an, dass 
die Zugabe der chemischen Substanz den pH-Wert des Belebtschlamms im Prüfsystem beeinflussen kann. In diesem Fall wird die Stammlösung mit 
kleinen Mengen anorganischer Säure oder Base Trägerstoff neutralisiert, um 
einen pH-Wert von 7 ± 0,5 zu erhalten, wobei eine Ausfällung der Prüf ­
substanz zu vermeiden ist.
 
PRÜFVERFAHREN  
Vorbereitung des organischen Mediums für die Zudosierung  
28. Alle Zulauf- und Ablaufgefäße und die Schlauchleitungen aus den Zulauf- 
und zu den Ablaufgefäßen sind vor und während des Tests gründlich zu 
säubern, um Mikrobenbewuchs zu entfernen.  
29. Aus den Feststoffen oder aus der konzentrierten Stammlösung wird durch 
Verdünnen mit einer angemessenen Menge Leitungswasser täglich frisches 
synthetisches Abwasser (Nummer 23) vorbereitet. Die erforderliche Menge wird in einem Zylinder dosiert und in ein sauberes Vorratsgefäß gegeben. Bei Bedarf wird dem synthetischen Abwasser vor der Verdünnung auch die 
Stammlösung der Prüfsubstanz oder der Referenzsubstanz in vorgegebener 
Menge zugesetzt. Wenn dies praktischer oder zur Vermeidung von Prüf ­
substanzverlusten notwendig ist, wird in einem separaten Gefäß eine ver ­
dünnte Lösung der Prüfsubstanz gesondert vorbereitet und dem geneigten 
Rohrreaktor über eine andere Dosierpumpe zugeführt.
 
30. Alternativ (und vorzugsweise) wird abgesetztes Haushaltsabwasser (Num ­
mer 24) verwendet, das möglichst täglich frisch bezogen wird.  
Betrieb der Drehrohrreaktoren  
31. Zur Bewertung einer einzelnen Prüfsubstanz sind zwei identische Rohrreak ­
toren erforderlich, die in einem Raum mit konstanten Temperaturbedingun ­
gen von 22 ± 2 °C montiert werden.  
32. Die Peristaltikpumpen werden so eingestellt, dass stündlich 250 ± 25 ml 
organisches Medium (ohne Prüfsubstanz) in die geneigten Rohre dosiert 
werden, die bei 18 ± 2 rpm rotieren. Die Pumpenrohre werden vor Beginn 
und regelmäßig während des Tests geschmiert (Nummer 25), um einen reibungslosen Prozessablauf und eine möglichst lange Lebensdauer der 
Rohrinstallation zu gewährleisten.
 
33. Der Neigungswinkel der Rohre zur Horizontalen wird so eingestellt, dass 
eine Verweilzeit des Zuflusses im sauberen Rohr von 125 ± 12,5 Sekunden 
gewährleistet ist. Die Verweilzeit wird durch Versetzung des Zuflusses mit 
einem nichtbiologischen Markierungsstoff (z. B. NaCl, inerter Farbstoff) geschätzt: Dabei gilt die Zeit, bis die Höchstkonzentration im Abfluss er ­
reicht ist, als mittlere Verweilzeit (ist Biofilm in maximaler Menge vor ­
handen, kann sich die Verweilzeit auf bis zu 30 Minuten erhöhen).
 
34. Diese Raten, Geschwindigkeiten und Zeiten haben sich für angemessene 
DOC- (bzw. CBS-)Abnahmeraten (> 80 %) und die Nitrifikation von Ab ­
flüssen bewährt. Die Fließgeschwindigkeit sollte geändert werden, wenn die Abnahme unzulänglich ist oder die Leistung einer bestimmten Kläranlage simuliert werden soll. In letzterem Fall sollte die Zudosierung des organi ­
schen Mediums so lange justiert werden, bis die Leistung des Reaktors der 
Kläranlagenleistung entspricht.
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Animpfung  
35. Bei Verwendung von synthetischem Abwasser reicht zur Anregung des 
Wachstums der Mikroorganismen möglicherweise eine aerogene Inokulation aus; andernfalls wird dem Zufluss drei Tage lang 1 ml/l abgesetztes Ab ­
wasser zugegeben.
 
Messungen  
36. In regelmäßigen Abständen wird kontrolliert, ob die Dosiermengen und die 
Rotationsgeschwindigkeiten innerhalb der vorgegebenen Grenzen liegen. 
Darüber hinaus wird der pH-Wert des Abflusses gemessen, vor allem, 
wenn mit Nitrifikation gerechnet werden muss.  
Probenahme und Analyse  
37. Methode, Schema und Häufigkeit der Probenahmen richten sich nach der 
Zweckbestimmung des Tests. Es werden beispielsweise Momentproben 
(snap/grab samples ) des Zu- und Ablaufs gezogen, oder die Proben werden 
über einen längeren, z. B. drei- bis sechsstündigen, Zeitraum entnommen. In der ersten Phase (in der noch keine Prüfsubstanz zugegeben wurde) werden zweimal wöchentlich Proben gezogen. Diese werden entweder durch eine 
Membran gefiltert oder bei etwa 40 000 m/sec
 2 für ungefähr 15 Minuten 
zentrifugiert (Nummer 18). Möglicherweise müssen die Proben vor der Membranfiltration sedimentiert und/oder grob gefiltert werden. Der DOC-Wert (bzw. der CSB-Wert) wird mindestens doppelt bestimmt, ebenso 
wie erforderlichenfalls der BSB-, Ammonium- und Nitrit-/Nitratwert.
 
38. Alle Analysen sollten nach dem Ziehen und Vorbereiten der Proben so bald 
wie möglich durchgeführt werden. Müssen Analysen zeitlich verschoben 
werden, sind die Proben in randvollen, fest verschlossenen Flaschen bei ungefähr 4 °C dunkel zu lagern. Müssen die Proben für länger als 48 Stunden gelagert werden, sollten sie durch Tiefgefrieren, Ansäuern oder 
Zugabe einer geeigneten toxischen Substanz (z. B. 20 ml/l einer 10 g/l- 
Lösung Quecksilber(II)-Chlorid) haltbar gemacht werden. Dabei ist sicher ­
zustellen, dass die Konservierungsmethode die Analyseergebnisse nicht be ­
einträchtigt.
 
Vorlaufphase (Running-in period)  
39. In dieser Phase, die in der Regel etwa zwei Wochen dauert, sechs Wochen 
jedoch nicht überschreiten sollte, entwickelt sich auf der Grenzfläche ein Biofilm optimaler Dicke. Der DOC- (bzw. der CSB-)Wert nimmt weiter ab (Nummer 44) und erreicht einen Plateauwert. Ist in beiden Rohren ein ver ­
gleichbarer Plateauwert erreicht, wird ein Rohr ausgewählt, das für die 
restliche Prüfungsdauer, während der die Leistungen beider Rohre konsistent bleiben sollten, als Kontrollanlage fungiert.
 
Zugabe der Prüfsubstanz  
40. In dieser Phase wird der zweite Reaktor in vorgegebener Konzentration (in 
der Regel 10-20 mg C/l) mit Prüfsubstanz beschickt. Der Kontrollanlage wird weiterhin nur organisches Medium zugeführt.
 
Akklimatisierungsphase  
41. Der DOC-Wert (bzw. der CSB-Wert) wird weiterhin zweimal wöchentlich 
bestimmt; wenn die primäre Bioabbaubarkeit bestimmt werden muss, wird 
durch spezifische Analyse auch die Prüfsubstanzkonzentration gemessen. Zur Akklimatisierung sollten nach Erstzugabe der Prüfsubstanz eine bis sechs Wochen (unter besonderen Umständen auch länger) eingeplant wer ­
den. Sobald die prozentuale Abnahme (Nummern 43-45) ihren Höchststand 
erreicht hat, werden während der Plateauphase über einen Zeitraum von ungefähr drei Wochen 12-15 gültige Werte ermittelt, um die mittlere Ab ­
nahmerate zu bestimmen. Der Test gilt als abgeschlossen, wenn ein aus ­
reichend hoher Eliminationsgrad erreicht ist. Der Test sollte nach Erstzugabe 
der Prüfsubstanz nicht länger als zwölf Wochen dauern.
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Bewuchsablösungen (Sloughing)  
42. In relativ regelmäßigen Zeitabständen lösen sich plötzlich ganze Teile über ­
schüssigen Films von den Rohren ab ( Sloughing ). Um sicherzustellen, dass 
die Vergleichbarkeit der Ergebnisse nicht beeinträchtigt wird, sollten die 
Tests mindestens zwei vollständige Wachstums- und  Sloughing -Zyklen er ­
fassen.  
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Auswertung der Ergebnisse  
43. Die prozentuale Abnahme (Elimination) der Prüfsubstanz, basierend auf der 
DOC- bzw. der CSB-Messung, wird in den vorgegebenen Zeitabständen 
nach folgender Gleichung berechnet:  
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
Dabei sind:  
D t = der Prozentsatz der Abnahme des DOC- bzw. des CSB-Wertes zum 
Zeitpunkt t  
Cs = die DOC- bzw. CSB-Konzentration der Prüfsubstanz im Zulauf, vor ­
zugsweise anhand der Stammlösung geschätzt (mg/l)  
E = der gemessene DOC- oder CSB-Wert im Ablauf der Prüfanlage zum 
Zeitpunkt t (mg/l)  
Eo = der gemessene DOC- oder CSB-Wert im Ablauf der Kontrollanlage 
zum Zeitpunkt t (mg/l)  
Die Berechnung sollte für die Referenzsubstanz, sofern getestet, wiederholt 
werden.  
Leistung des Kontrollreaktors  
44. Der Grad der Elimination des organischen Mediums in den Kontrollreakto ­
ren, bezogen auf den DOC- bzw. den CSB-Wert, ist eine nützliche Größe für die Bestimmung der biologischen Abbauaktivität des Biofilms während der Prüfung. Die prozentuale Elimination wird nach folgender Gleichung 
berechnet:
 
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
Dabei ist:  
Cm = DOC- bzw. CSB-Wert des organischen Mediums im Zulauf der 
Kontrollanlage (mg/l)  
45. Die Abnahme (D  ST ) der Prüfsubstanz wird, soweit nach einer spezifischen 
Analysemethode gemessen, in den vorgegebenen Zeitabständen nach folgen ­
der Gleichung berechnet:  
DST ¼ 100 ð1 Ä Se=SiÞ % 
Dabei sind:  
Si = die gemessene oder vorzugsweise geschätzte Konzentration der Prüf ­
substanz im Zulauf der Prüfanlage (mg/l)  
Se = die gemessene Konzentration der Prüfsubstanz im Ablauf der Prüf ­
anlage zum Zeitpunkt t (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 961
 
Ergibt die Analysemethode bei unverändertem Abwasser einen positiven 
Wert (S  c mg/l), wird die prozentuale Abnahme (D  SC ) nach folgender Glei ­
chung berechnet:  
DSC ¼ 100 ðSi Ä Se þ ScÞ=ðSi þ ScÞ % 
Darstellung der Prüfergebnisse  
46. Die prozentuale Elimination D  t und D  ST (oder D  sc ), soweit dieser Wert 
vorliegt, wird gegen die Zeit aufgetragen (siehe Kapitel C.10-A, Anlage 2). Die (auf die nächste ganze Zahl gerundete) mittlere Abweichung und 
die Standardabweichung der in der Plateauphase ermittelten 12-15 Werte für 
D
 T (und für D  ST , falls dieser Wert vorliegt) entsprechen der prozentualen 
Abnahme der Prüfsubstanz. Vom Verlauf der Eliminationskurve lassen sich 
bestimmte Schlüsse über die Abnahmeprozesse ziehen.  
Adsorption  
47. Manifestiert sich zu Prüfungsbeginn bei der Prüfsubstanz eine starke 
DOC-Elimination, wird die Prüfsubstanz wahrscheinlich durch Anlagerung (Adsorption) an den Biofilm eliminiert. Dieser Vorgang kann möglicher ­
weise durch Bestimmung der Prüfsubstanz nachgewiesen werden, die an 
Feststoffen, die sich vom Film abgelöst haben, angelagert ist. Die DOC-Elimination adsorptionsfähiger chemischer Substanzen bleibt erfah ­
rungsgemäß nicht während der gesamten Prüfung hoch; in der Regel ist 
sie zu Beginn der Prüfung hoch und fällt dann allmählich auf ein stabiles 
Niveau. Könnte die adsorptionsfähige Prüfsubstanz jedoch auf die eine oder andere Weise eine Akklimatisation der Mikrobenpopulation herbeiführen, würde die DOC-Elimination der Prüfsubstanz in der Folge ansteigen und 
einen hohen Plateauwert erreichen.
 
Latenzphase (Lag-Phase)  
48. Wie bei statischen Screeningtests müssen viele Prüfsubstanzen eine Latenz ­
phase durchlaufen, bevor sie vollständig biologisch abgebaut werden. In 
dieser  Lag -Phase akklimatisieren (bzw. adaptieren) sich die betreffenden 
Bakterien, ohne dass in nennenswertem Maße Prüfsubstanz abgebaut wird; erst nach dieser Phase setzt das Bakterienwachstum ein. Die Phase endet und die Abbauphase gilt als begonnen, wenn etwa 10 % der anfänglichen 
Prüfsubstanzmenge abgebaut sind (nach der Adsorption, falls es dazu 
kommt). Die  Lag -Phase ist oft sehr variabel und schwer reproduzierbar.
 
Plateauphase  
49. Die Plateau-Phase einer Eliminationskurve im kontinuierlichen Test ist de ­
finiert als die Phase, in der maximale Zersetzung stattfindet. Sie sollte 
mindestens 3 Wochen dauern, in denen etwa 12-15 gültige Messwerte er ­
mittelt werden.  
Mittlerer Eliminationsgrad der Prüfsubstanz  
50. Dieser Mittelwert wird anhand der Eliminationswerte D  t (und D  st , falls 
dieser Wert vorliegt) der Prüfsubstanz in der Plateauphase berechnet. Auf 
die nächste ganze Zahl (1 %) gerundet entspricht dieser Wert dem Elimina ­
tionsgrad der Prüfsubstanz. Ferner wird empfohlen, das 95 %-Konfidenz ­
niveau für den Mittelwert zu berechnen. Auf dieselbe Weise wird der mitt ­
lere Eliminationsgrad (D  B ) des organischen Mediums im Kontrollgefäß be ­
rechnet.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 962
 
Hinweis auf den biologischen Abbau  
51. Lagert sich die Prüfsubstanz nicht in nennenswertem Umfang an den Bio ­
film an und hat die Eliminationskurve die typische Form einer Bioabbau ­
kurve mit Latenz-, Abbau- und Plateauphasen (Nummern 48, 49), so kann 
die gemessene Elimination mit Sicherheit dem biologischen Abbau zu ­
geschrieben werden. War die Abnahme im Anfangsstadium hoch, kann der Simulationstest nicht zwischen biologischen und abiotischen Eliminati ­
onsprozessen differenzieren. In derartigen Fällen und in anderen Fällen, in 
denen Zweifel am biologischen Abbau bestehen (z. B. wenn die Prüfsub ­
stanz ausgegast wird ( stripping )), wird die Adsorption der Prüfsubstanz an 
Biofilmproben untersucht, oder anhand von Parametern, die biologische 
Prozesse genau angeben, werden zusätzliche statische Bioabbaubarkeitstests 
(Screeningtests) durchgeführt. Zu derartigen Tests zählen die Sauerstoffauf ­
nahmemethoden (Kapitel C.4 (D, E und F) dieses Anhangs) (9) oder Kohlendioxid-Entwicklungstests (Kapitel C.4-C dieses Anhangs oder die 
ISO- Headspace -Methode (10), wobei als Inokulum zuvor exponierter Bio ­
film aus dem entsprechenden Reaktor verwendet wird.
 
52. Wurden sowohl die DOC-Abnahme als auch die Prüfsubstanzabnahme ge ­
messen, deuten große Unterschiede (d. h. wenn erstere geringer ist als 
letztere) zwischen den Abnahmeprozentsätzen auf die Präsenz intermediärer organischer Produkte in den Abläufen hin, die möglicherweise schwerer abzubauen sind und untersucht werden sollten.
 
Gültigkeit der Prüfergebnisse  
53. Der Test kann als gültig angesehen werden, wenn der Grad der 
DOC-Elimination (bzw. der CSB-Elimination) in den Kontrollanlagen nach zwei Wochen Betrieb > 80 % beträgt und nichts Ungewöhnliches festgestellt wurde.
 
54. Wurde eine leicht biologisch abbaubare (Referenz-)Substanz getestet, sollten 
der Abbaubarkeitsgrad > 90 % und die Differenz zwischen Duplikatwerten nicht mehr als 5 % betragen. Sind diese beiden Kriterien nicht erfüllt, soll ­
ten die Testverfahren überprüft werden, und/oder es sollte Haushaltsabwas ­
ser aus einer anderen Quelle bezogen werden.
 
55. Gleichermaßen sollten Differenzen zwischen Abbaubarkeitswerten aus eine 
Prüfsubstanz behandelnden Duplikatanlagen (sofern verwendet) nicht mehr als 5 % betragen. Wenn dieses Kriterium nicht erfüllt ist, die Abnahmewerte jedoch hoch sind, sollten die Analysen für weitere drei Wochen fortgesetzt 
werden. Sind die Abnahmewerte gering, müssen die Hemmwirkungen der 
Prüfsubstanz, soweit sie nicht bekannt sind, untersucht werden, und der Test muss mit einer niedrigeren Prüfsubstanzkonzentration wiederholt werden, sofern dies möglich ist.
 
Prüfbericht  
56. Der Prüfbericht muss Folgendes umfassen:  
Prüfsubstanz:  
— Kenndaten;  
— physikalischer Zustand und, soweit relevant, physikalisch-chemische Ei ­
genschaften.  
Prüfbedingungen:  
— etwaige Modifikationen des Prüfsystems, vor allem bei Prüfungen nicht 
löslicher und flüchtiger chemischer Substanzen;  
— Art des organischen Mediums;  
— Anteil (und Art) der Industrieabwässer im kommunalen Abwasser, so ­
weit bekannt;  
— Animpfungsmethode;  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 963
 
— Prüfsubstanz-Stammlösung: DOC- und TOC-Gehalt; bei Suspension: Art 
der Zubereitung; verwendete Testkonzentration; falls außerhalb der 
Bandbreite von 10-20 mg/l DOC: Begründung; Zugabemethode; Datum der ersten Zugabe; etwaige Änderungen der Konzentration;
 
— mittlere hydraulische Verweilzeit (ohne Wachstum); Rotationsgeschwin ­
digkeit des Rohres; ungefährer Neigungswinkel (wenn möglich);  
— Angaben zur Bewuchsablösung ( Sloughing ); Dauer und Intensität;  
— Testtemperatur und Temperaturspanne;  
— angewandte Analysetechniken.  
Prüfergebnisse:  
— alle Messdaten (DOC, CSB, spezifische Analysen, pH-Wert, Tempera ­
tur, N-Chemikalien, soweit relevant);  
— alle Berechnungswerte für D  t (oder D  tc ), D  B , D S in tabellarischer Form 
und als Eliminationskurven;  
— Aussagen zu Latenz- und Plateau-Phasen, Prüfungsdauer, Eliminations ­
grad der Prüfsubstanz, der Referenzsubstanz (falls getestet) und des organischen Mediums (in der Kontrollanlage) sowie statistische Infor ­
mationen und Angaben zur Bioabbaubarkeit und zur Gültigkeit des 
Tests;
 
— Diskussion der Ergebnisse.  
LITERATUR:  
1. Gerike  P, Fischer W, Holtmann W (1980).  Biodegradability determinations 
in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test . Wat. 
Res. 14: 753-758.  
2. Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959).  Removal of synthetic deter ­
gents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable 
material .Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444.  
3. Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF — Z. Umwelt ­
chem. Ökotox. 10: 214-220.  
4. Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952).  Rotary tubes as experimental 
trickling filters . Sewage ind. Waste 24: 1355-1357.  
5. Kumke GW, Renn CE (1966).  LAS removal across an institutional trickling 
filter . JAOCS 43: 92-94.  
6. Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966).  Biological oxidation of sewage by 
films of micro-organisms . Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881.  
7. Her Majesty’s Stationery Office (1982).  Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability , 1981, Lon ­
don. 
8. Her Majesty’s Stationery Office (1984).  Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes , 1982, London.
 
9. Kapitel C.4 dieses Anhangs, Bestimmung der „leichten“ biologischen Ab ­
baubarkeit, A-F.  
10. ISO 14593 (1998). Wasserbeschaffenheit — Bestimmung der vollständigen 
biologischen Abbaubarkeit organischer Substanzen im wässrigen Medium — 
Verfahren mittels Bestimmung des anorganischen Kohlenstoffs in geschlos ­
senen Flaschen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 964
 
Anlage 8  
Abbildung 1  
Drehrohre
  
Legende:  
Draufsicht:  
Draufsicht A/B:  
Antriebsrollen:  
Umlenkrollen:  
Antriebsmotor:  
Umsetzungsgetriebe:  
Innenflansch:  
Neigungsmechanismus:  
Kegelradgetriebe:  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 965
 
Abbildung 2  
Fließdiagramm
  
A: Zulaufgefäß  
B: Peristaltikpumpe  
C: Drehrohr  
D: Ablaufsammelgefäß  
BEGRIFFSBESTIMMUNGEN:  
a Prüfsubstanz:  jede nach dieser Prüfmethode getestete Substanz oder Mischung.  
b Chemische Substanzen:  „Es wird darauf hingewiesen, dass der Begriff ‚che ­
mische Substanz‘ in den UNCED-Übereinkommen und Folgedokumenten im Allgemeinen Substanzen, Produkte, Gemische, Aufbereitungen oder jeden ande ­
ren Begriff einschließt, der in bestehenden Systemen möglicherweise zur Be ­
schreibung des Prüfgegenstands verwendet wird.“
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 966
 
C.11.  BIOLOGISCHE  
ABBAUBARKEIT BELEBTSCHLAMM: PRÜFUNG DER 
ATMUNGSHEMMUNG  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Die beschriebene Methode dient zur Bestimmung der Auswirkungen 
einer Prüfsubstanz auf Mikroorganismen durch Messen der Sauer ­
stoffzehrung. Die Prüfung erfolgt unter festgelegten Bedingungen bei 
unterschiedlichen Konzentrationen der Prüfsubstanz.  
Zweck dieser Methode ist die Schaffung eines schnellen Auswahl ­
verfahrens, mit dem sich Substanzen feststellen lassen, die sich un ­
günstig auf Kläranlagen mit aeroben Mikroorganismen auswirken, sowie die Angabe geeigneter, nicht hemmender Konzentrationen von Prüfsubstanzen, die bei Prüfungen der biologischen Abbaubar ­
keit eingesetzt werden können.
 
Ein Vorversuch kann der eigentlichen Prüfung vorausgehen. Er lie ­
fert Informationen über den in der eigentlichen Prüfung zu verwen ­
denden Konzentrationsbereich.  
Die Versuchsdurchführung schließt zwei Kontrollen ohne Prüfsub ­
stanzen ein, von denen die eine zu Beginn und die andere am Ende der Prüfreihen durchgeführt wird. Jede Belebtschlammprobe ist au ­
ßerdem mit Hilfe einer Referenzsubstanz zu überprüfen.
 
Dieses Verfahren ist am einfachsten bei Substanzen anzuwenden, die 
aufgrund ihrer Wasserlöslichkeit und geringen Flüchtigkeit voraus ­
sichtlich im Wasser verbleiben.  
Für Substanzen mit begrenzter Löslichkeit im Prüfmedium kann der 
EC 50 -Wert möglicherweise nicht bestimmt werden.  
Wenn die Prüfsubstanz eine Entkoppelung der oxidativen Phospho ­
rylierung bewirkt, können die auf der Sauerstoffaufnahme beruhen ­
den Ergebnisse zu falschen Schlussfolgerungen führen.  
Zur Durchführung der Prüfung sind folgende Informationen von 
Nutzen:  
— Wasserlöslichkeit,  
— Dampfdruck,  
— Strukturformel,  
— Reinheit der Prüfsubstanz.  
Empfehlung:  
Belebtschlamm kann pathogene Organismen enthalten und ist daher 
mit Vorsicht zu handhaben.  
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Als Sauerstoffzehrung wird der Sauerstoffverbrauch der im Belebt ­
schlamm enthaltenen Mikroorganismen bezeichnet. Diese Zehrung 
wird im Allgemeinen in mg O  2 je mg Schlamm und Stunde aus ­
gedrückt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 967
 
Zur Berechnung der Hemmwirkung einer Prüfsubstanz bei einer be ­
stimmten Konzentration wird die Sauerstoffzehrung als Prozentsatz 
der Sauerstoffzehrung der gemittelten Werte der beiden Kontroll- Zehrungen ausgedrückt:
 
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Í Î  
Ü 100 ¼ Hemmung in Prozent  
Hierbei sind:  
R s = Sauerstoffzehrung bei der geprüften Konzentration der Prüf ­
substanz,  
R C1 = Sauerstoffzehrung der Kontrolle 1,  
R C2 = Sauerstoffzehrung der Kontrolle 2.  
Bei diesem Verfahren ist die EC  50 die Konzentration der Prüfsub ­
stanz, bei der die Sauerstoffzehrung 50 % der in der Kontrolle unter gleichen Bedingungen erreichten Zehrung ausmacht.
 
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Es wird empfohlen, 3,5-Dichlorphenol, das als Hemmstoff bekannt 
ist, als Referenzsubstanz zu verwenden und bei jeder einzelnen Be ­
lebtschlammprobe hiermit die EC  10 zu prüfen, um eine anomale 
Empfindlichkeit des Schlammes festzustellen.  
1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Die Sauerstoffzehrung eines Belebtschlamms, der mit einer genorm ­
ten Menge synthetischen Abwassers beschickt wurde, wird nach Kontaktzeiten von 30 Minuten und/oder 3 Stunden gemessen. 
Ebenso wird die Sauerstoffzehrung desselben Belebtschlamms, dem 
jedoch unterschiedliche Konzentrationen der Prüfsubstanz zugesetzt wurden, gemessen. Die Hemmwirkung der Prüfsubstanz bei einer bestimmten Konzentration wird als Prozentsatz der durchschnitt ­
lichen Sauerstoffzehrung von zwei Kontrollen ausgedrückt. Aus Be ­
stimmungen bei verschiedenen Konzentrationen wird die EC
 50 er­
rechnet.  
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Die Prüfergebnisse sind gültig, sofern:  
— die Sauerstoffzehrungen der beiden Kontrollen sich um höchstens 
15 % voneinander unterscheiden;  
— der EC  50 -Wert (30 Minuten und/oder 3 Stunden) von 3,5-Di ­
chlorphenol im zulässigen Bereich von 5 bis 30 mg/l liegt.  
1.6. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.6.1.  Reagenzien  
1.6.1.1. L ö s u n g e n d e r P r ü f s u b s t a n z  
Die Lösungen der Prüfsubstanz werden aus einem Stammansatz zu 
Beginn jeder Untersuchung frisch zubereitet. Für das unten empfoh ­
lene Verfahren ist eine Konzentration von 0,5 g/l im Stammansatz 
geeignet,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 968
 
1.6.1.2. L ö s u n g d e r K o n t r o l l s u b s t a n z  
Eine 3,5-Dichlorphenol-Lösung kann z. B. wie folgt zubereitet wer ­
den: 0,5 g 3,5-Dichlorphenol in 10 ml 1 M NaOH auflösen, mit destilliertem Wasser auf etwa 30 ml verdünnen, umrühren und 
gleichzeitig 0,5 M H
 2 SO 4 bis zum Beginn der Ausfällung zugeben 
— hierzu sind etwa 8 ml erforderlich — und schließlich die Mi ­
schung mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen. Der pH-Wert sollte dann etwa 7-8 betragen.
 
1.6.1.3. S y n t h e t i s c h e s A b w a s s e r  
Synthetisches Abwasser wird durch Auflösen folgender Stoffmengen 
in einem Liter Wasser hergestellt:  
— 16 g Pepton,  
— 11g Fleischextrakt,  
— 3 g Harnstoff,  
— 0,7 g NaCl,  
— 0,4 g CaCl  2 .2H  2 O, 
— 0,2 g MgSO  4 .7H  2 O, 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
Anmerkung 1:  Dieses synthetische Abwasser hat die hundertfache 
Konzentration des im technischen Bericht der OECD vom 11. Juni 
1976„Vorgeschlagenes Verfahren zur Bestimmung der biologischen 
Abbaubarkeit von Tensiden in synthetischen Detergenzien“ beschrie ­
benen Abwassers und enthält außerdem Dikaliumhydrogenphosphat,  
Anmerkung 2:  Wenn das vorbereitete synthetische Abwasser nicht 
sofort benutzt wird, wird es im Dunkeln bei 4  o C unter Bedingungen, 
die keine Veränderung seiner Zusammensetzung verursachen, für 
nicht länger als eine Woche aufbewahrt. Das synthetische Abwasser 
kann auch vor der Lagerung sterilisiert werden, oder Pepton und Fleischextrakt können kurz vor dem Versuchsansatz zugegeben wer ­
den. Es wird vor Gebrauch gründlich gemischt und der pH-Wert 
eingestellt.
 
1.6.2.  Geräte  
Messanlage: Die Form der Anlage ist nicht entscheidend. Es darf 
jedoch kein Luftraum in der gefüllten Messflasche sein, und die 
Sauerstoffelektrode muss genau in deren Hals passen.  
Ergänzend zur normalen Laboratoriumsausrüstung sind insbesondere 
folgende Geräte erforderlich:  
— Messanlage  
— Belüftungseinrichtung  
— pH-Elektrode  
— O  2 -Elektrode.  
1.6.3.  Vorbereitung des Inokulums  
Als Inokulum für die Prüfung wird Belebtschlamm aus einer vor ­
wiegend kommunalen Kläranlage verwendet.  
Falls notwendig, können grobe Teilchen daraus durch kurzzeitiges 
Absetzen, z. B. für 15 Minuten, und Dekantieren der oberen Schicht 
abgetrennt werden. Alternativ kann der Schlamm durch kurzzeitiges 
Mischen — einige Sekunden — mit einem Hochleistungsrührer ho ­
mogenisiert werden. Zusätzlich sollte bei Verdacht auf Anwesenheit von Hemmstoffen der Schlamm mit Trinkwasser oder einer isoto ­
nischen Lösung gewaschen werden. Der Überstand wird nach Zen ­
trifugation dekantiert. (Dieser Vorgang wird dreifach wiederholt.)
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 969
 
Eine kleine Menge des Schlammes wird gewogen und getrocknet. 
Daraus kann die Menge feuchten Schlammes berechnet werden, die 
in Wasser suspendiert werden muss, um einen Schlammgehalt zwi ­
schen 2 und 4 g/l einzustellen. Dies ergibt einen Schlammgehalt zwischen 0,8 und 1,6 g/l im Kulturmedium, wenn die unten vor ­
geschlagene Verfahrensweise befolgt wird.
 
Kann der Schlamm nicht am Tag der Entnahme verwendet werden, 
gibt man 50 ml synthetischen Abwassers zu jedem Liter des wie 
oben beschrieben zubereiteten Belebtschlamms hinzu. Diese Mi ­
schung wird dann bis zur Verwendung am nächsten Tag sowie während des Versuchs bei 20 ± 2
 o C belüftet. Vor der Verwendung 
wird der pH-Wert der Mischung geprüft und — falls erforderlich — 
mit Hilfe einer Natriumbikarbonatlösung auf einen pH-Wert von 6,0 bis 8,0 abgepuffert.
 
Die in der Flüssigkeit suspendierten Feststoffe sind nach dem im 
vorhergehenden Abschnitt beschriebenen Verfahren zu bestimmen.  
Muss die gleiche Schlammprobe an aufeinander folgenden Tagen 
(höchstens 4 Tage) verwendet werden, gibt man weitere 50 ml syn ­
thetischen Abwassers pro Liter Schlamm am Ende jedes Arbeitstages 
hinzu.  
1.6.4.  Durchführung der Prüfung  
Kontaktzeit/Dauer: 30 Minuten und/oder 3 Stunden unter 
ständiger Belüftung 
Wasser: Trinkwasser (entchlort, falls erforder ­
lich) 
Luftversorgung: saubere, ölfreie Luft. Luftstrom: 0,5 bis 
1 Liter/Minute 
Messanlage: Gefäß mit flachem Boden, beispiels ­
weise eine BSB-Flasche 
Sauerstoffmessgerät: geeignete Sauerstoffelektrode mit An ­
zeige 
Nährlösung: synthetisches Abwasser (siehe oben) Prüfsubstanz: die Prüflösung wird zu Beginn der Prü ­
fung frisch zubereitet 
Referenzsubstanz: beispielsweise 3,5-Dichlorphenol (min ­
destens 3 Konzentrationen) 
Kontrollen: beimpfter Ansatz ohne Prüfsubstanz 
Temperatur: 20 ± 2
 o C. 
Für eine dreistündige Kontaktzeit kann folgendes Versuchsverfahren 
sowohl für die Prüf- als auch für die Referenzsubstanz angewandt werden:
 
Es werden mehrere Gefäße (beispielsweise 1-Liter-Bechergläser) ver ­
wendet.  
Es sind mindestens 5 Konzentrationen, die sich durch einen kon ­
stanten Faktor (möglichst nicht über 3,2) unterscheiden, zu verwen ­
den. 
Zum Zeitpunkt „0“ werden 16 ml des synthetischen Abwassers mit 
Wasser auf 300 ml aufgefüllt. Dann werden 200 ml des Inokulums 
zugesetzt und die Gesamtmischung (500 ml) in das erste Gefäß 
gegeben (erste Kontrolle C  1 ). ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 970
 
Die Versuchsgefäße sollten kontinuierlich belüftet werden, so dass 
sichergestellt ist, dass die Konzentration an gelöstem Sauerstoff 2,5 
mg/l nicht unterschreitet und dass unmittelbar vor Messung der Sau ­
erstoffzehrung die Sauerstoffkonzentration mindestens 6,5 mg/l be ­
trägt.  
Zum Zeitpunkt „15 Minuten“ (15 Minuten sind ein willkürliches, 
jedoch geeignetes Intervall) wird der oben beschriebene Vorgang wiederholt. Diesmal werden jedoch 100 ml der Prüfsubstanz-Stamm ­
lösung zu den 16 ml synthetischen Abwassers zugegeben und an ­
schließend mir Wasser auf 300 ml aufgefüllt. Dann wird das Inoku ­
lum zugesetzt und das Volumen auf 500 ml aufgefüllt. Diese Mi ­
schung wird in das zweite Gefäß gegeben und wie oben beschrieben belüftet. Dieser Vorgang wird in Abständen von 15 Minuten mit 
unterschiedlichen Mengen der Prüfsubstanz-Stammlösung wieder ­
holt, um eine Reihe von Gefäßen mit unterschiedlichen Konzentra ­
tionen der Prüfsubstanz zu erhalten. Schließlich wird eine zweite Kontrolle hergestellt (C
 2 ). 
Nach drei Stunden wird der pH-Wert gemessen, dann eine gut ge ­
mischte Probe des Inhalts des ersten Gefäßes in die Messanlage gegeben und die Sauerstoffzehrung über einen Zeitraum von höchs ­
tens 10 Minuten gemessen.
 
Diese Zehrungsmessung wird mit den Inhalten der einzelnen Gefäße 
in Intervallen von 15 Minuten durchgeführt, so dass die Kontaktzeit in jedem Gefäß drei Stunden beträgt.
 
Die Referenzsubstanz wird bei jeder Probe des Inokulums auf die 
gleiche Weise geprüft.  
Ein geändertes Verfahren (beispielsweise mit mehr als einem Sauer ­
stoffmessgerät) ist erforderlich, falls die Messungen nach 30 Minuten 
Kontaktzeit durchgeführt werden sollen.  
Ist eine Messung des chemischen Sauerstoffbedarfs erforderlich, wer ­
den weitere Gefäße mit Prüfsubstanz, synthetischem Abwasser und Wasser, jedoch ohne Belebtschlamm, vorbereitet. Der Sauerstoff ­
bedarf wird nach einer Belüftungszeit von 30 Minuten und/oder 
drei Stunden Kontaktzeit gemessen und aufgezeichnet.
 
2. DATEN UND AUSWERTUNG  
Die Sauerstoffzehrung wird aus der Aufzeichnung des Messschrei ­
bers zwischen etwa 6,5 mg O  2 /l und 2,5 mg O  2 /l oder, bei niedriger 
Sauerstoffzehrung, über einen Zeitraum von 10 Minuten gemessen 
und als mg O  2 /l· h berechnet.  
Der Teil der Zehrungskurve, bei dem die Zehrung gemessen wird, 
sollte linear sein.  
Sofern die Sauerstoffzehrungen der beiden Kontrollen mehr als 15 % 
voneinander abweichen oder der EC  50 -Wert (30 Minuten und/oder 3 
Stunden) der Referenzsubstanz nicht im gültigen Bereich liegt (5 bis 30 mg/l für 3,5-Dichlorphenol), ist die Prüfung ungültig und muss 
wiederholt werden.
 
Der Prozentsatz der Hemmung wird für jede Prüfkonzentration wie 
oben beschrieben berechnet, auf normalem Logarithmenpapier (oder Wahrscheinlichkeitspapier) gegen die Konzentration aufgetragen und 
der EC
 50 -Wert hieraus ermittelt. 95 %-Vertrauensbereiche der EC  50 - 
Werte werden nach Standardverfahren ermittelt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 971
 
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— Prüfsubstanz: chemische Kenndaten;  
— Prüfsystem: Herkunft, Konzentration sowie sämtliche Vor ­
behandlungen des Belebtschlamms.  
— Prüfbedingungen:  
— pH der Kulturlösung vor der Zehrungsmessung;  
— Temperatur bei der Prüfung;  
— Dauer der Prüfung;  
— Referenzsubstanz und ihr gemessener EC  50 -Wert;  
— abiotische Sauerstoffzehrung (sofern diese auftritt).  
— Ergebnisse  
— sämtliche gemessenen Werte;  
— Hemmkurve und Verfahren zur Berechnung des EC  50 -Wer­
tes; 
— EC  50 -Wert und — falls möglich — EC  20 - und EC  80 -Werte 
mit 95 %-Vertrauensbereichen;  
— sämtliche Beobachtungen sowie Abweichungen von diesem 
Prüfverfahren, die möglicherweise das Ergebnis beeinflusst 
haben.  
3.2. INTERPRETATION DER WERTE  
Der EC  50 -Wert sollte vornehmlich nur als Hinweis auf die mögliche 
Toxizität der Prüfsubstanz, entweder gegenüber dem Belebtschlamm bei der Abwasserbehandlung oder gegenüber Abwasser-Mikroorga ­
nismen, angesehen werden, da die in der Umwelt stattfindenden 
komplexen Wechselwirkungen bei einer Laboratoriumsprüfung nicht 
vollständig simuliert werden können. Weiterhin können nitrifikati ­
onshemmende Substanzen atypische Hemmkurven verursachen. Sol ­
che Kurven sollten deshalb mit Vorsicht interpretiert werden.
 
4. LITERATUR  
(1) International Standard ISO 8192 — 1986  
(2) Broecker, B. and Zahn, R., W ater Research  11, 1977, 165.  
(3) Brown D., Hitz, H. R. and Schaefer, L.,  Chemosphere  10, 245 
(1981).  
(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs 
Manufacturing Industries) R ecommended Method No. 103,  also 
Described by  
(5) Robra, B.,  Wasser/Abwasser  117, (1976), 80.  
(6) Schefer, W.,  Textilveredlung 6,  (1977), 247.  
(7) OECDE, Paris, 1981,  Test Guideline  209, Beschluss des Rates 
C(81)30 endg.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 972
 
C.12  BIOLOGISCHE  
ABBAUBARKEIT MODIFIZIERTER SCAS-TEST  
1. METHODE  
1.1. EINLEITUNG  
Zweck des Verfahrens ist die Prüfung der potenziellen vollständigen 
biologischen Abbaubarkeit von wasserlöslichen, nichtflüchtigen or ­
ganischen Stoffen, die längere Zeit relativ hohen Konzentrationen von Mikroorganismen ausgesetzt werden. Durch tägliche Zugabe 
von Abwasser als Nährlösung werden die Mikroorganismen während 
der Versuchszeit am Leben erhalten. An Wochenenden kann das Abwasser bei 4
 o C aufbewahrt werden. Wahlweise kann auch das 
„synthetische“ Abwasser des OECD-Bestätigungstests verwendet 
werden.  
Tritt eine physikalisch-chemische Adsorption der Prüfsubstanz an die 
suspendierten Feststoffe auf, muss dies bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden (siehe Randziffer 3.2).
 
Wegen der langen Verweilzeit der flüssigen Phase in der Belüftungs ­
einheit (36 Stunden) und der zwischenzeitlichen Zugabe von Nähr ­
stoffen simuliert der Test nicht die in einer Kläranlage üblichen Bedingungen. Die für verschiedene Prüfsubstanzen vorliegenden Er ­
gebnisse weisen darauf hin, dass das biologische Abbaupotenzial des 
Tests hoch ist.
 
Die Testbedingungen sind für die Selektion und/oder Adaptation von 
Mikroorganismen, die die Prüfsubstanzen abzubauen vermögen, äu ­
ßerst günstig, (Dieses Verfahren kann auch zur Herstellung akklima ­
tisierten Impfguts für andere Prüfungen angewandt werden.)  
Bei dieser Methode wird die Konzentration des gelösten organischen 
Kohlenstoffs (DOC) als Maß zur Beurteilung der vollständigen bio ­
logischen Abbaubarkeit der Prüfsubstanz benutzt. Der Gehalt an 
gelöstem organischem Kohlenstoff ist vorzugsweise nach Ansäue ­
rung und Strippen und  nicht  als Differenz zwischen Gesamtkohlen ­
stoffgehalt und anorganischem Kohlenstoff zu bestimmen.  
Werden gleichzeitig spezifische Analysen durchgeführt, kann der 
Primärabbau (Verschwinden der chemischen Ausgangsstruktur) des Stoffes beurteilt werden.
 
Mit diesem Verfahren können nur organische Stoffe geprüft werden, 
die bei der verwendeten Konzentration  
— in Wasser löslich sind (mindestens 20 mg DOC/L);  
— einen niederen Dampfdruck aufweisen;  
— die Bakterien nicht hemmen;  
— innerhalb des Prüfsystems nicht nennenswert adsorbieren;  
— nicht durch Schäumen aus der Testlösung verloren gehen.  
Der organische Kohlenstoffgehalt der Prüfsubstanz ist zu bestimmen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 973
 
Informationen über die relativen Anteile der Hauptkomponenten der 
Prüfsubstanz sind für die Interpretation der Ergebnisse insbesondere 
dann nützlich, wenn niedrige oder marginale Abbau-Werte erhalten werden.
 
Informationen über die Toxizität des Stoffes gegenüber Mikroorga ­
nismen sind zur Interpretation niedriger Abbauwerte sowie zur Aus ­
wahl geeigneter Prüfkonzentrationen nützlich.  
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
C T = Konzentration der Prüfsubstanz, bestimmt als zu Beginn der 
Belüftungszeit vorhandener oder hinzugegebener organischer Kohlenstoff (mg/L);
 
C t = Konzentration des organischen Kohlenstoffs in der nach Be ­
lüftung und anschließender Sedimentation überstehenden Flüs ­
sigkeit in der Prüfeinheit (mg/L);  
C c = Konzentration des gelösten organischen Kohlenstoffs in der 
nach Belüftung und anschließender Sedimentation überstehen ­
den Flüssigkeit der Kontrolleinheit (mg/L).  
Der biologische Abbau wird in dieser Vorschrift als Abnahme des 
Gehalts an organischem Kohlenstoff definiert. Er lässt sich wie folgt 
darstellen:  
1. als prozentuale Abnahme D  da der täglich hinzugegebenen Stoff ­
menge:  
D da ¼ C T Ä ðC T Ä C c Þ 
C T Ü 100 [1]  
D da = Abbau/Tägliche Zugabe.  
2. Als prozentuale Abnahme D  ssd der zu Beginn eines jeden Tages 
im Testsystem vorhandenen Stoffmenge: 
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100 [2(a)] 
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100 [2(b)]  
D ssd = Abbau/Stoff zu Beginn des Tages.  
Die Indizes i und (i + 1) beziehen sich auf den Tag der Messung.  
Gleichung [2a] wird empfohlen, wenn der DOC-Gehalt der ent ­
nommenen Kultursuspension täglichen Schwankungen unterwor ­
fen ist, während Gleichung [2b] benutzt werden kann, wenn der 
DOC-Gehalt von Tag zu Tag relativ konstant bleibt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 974
 
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Bei der Untersuchung neuer Stoffe können in einigen Fällen Refe ­
renzsubstanzen nützlich sein; jedoch können keine spezifischen Sub ­
stanzen empfohlen werden,  
In Anlage 1 werden Daten von mehreren Verbindungen, die in Ring ­
versuchen geprüft worden sind, angegeben. Mit ihnen kann gelegent ­
lich eine Kalibrierung der Methode vorgenommen sowie ein Ver ­
gleich mit Ergebnissen, die mit anderen Methoden erhalten wurden, 
durchgeführt werden.  
1.4. PRINZIP DER METHODE  
Belebtschlamm aus einer Kläranlage wird in eine Belüftungseinheit, 
die halbkontinuierlich betrieben wird (Semi-Continuous Activated Sludge unit, SCAS-Einheit), gegeben. Die Prüfsubstanz sowie häus ­
liches Abwasser werden zugesetzt und das Gemisch 23 Stunden lang 
belüftet. Danach lässt man den Schlamm absetzen und nimmt die überstehende Flüssigkeit ab.
 
Der im Kulturgefäß verbleibende Schlamm wird sodann mit einer 
weiteren aliquoten Menge der Prüfsubstanz sowie mit Abwasser ge ­
mischt und das Verfahren wird wiederholt.  
Der biologische Abbau wird durch Bestimmung des DOC-Gehalts 
nach Sedimentation des Schlammes in der überstehenden Flüssigkeit 
ermittelt. Dieser Wert wird mit dem entsprechenden der Kontroll ­
einheit verglichen.  
Wird ein spezifisches Analyseverfahren angewandt, so können Ver ­
änderungen in der Konzentration der Ausgangsverbindung, die in ­
folge des biologischen Abbaus (Primär-Abbau) auftreten, gemessen werden.
 
1.5. QUALITÄTSKRITERIEN  
Die Reproduzierbarkeit dieses Verfahrens, das auf der Messung der 
DOC-Abnahme beruht, ist noch nicht überprüft worden. (Ist der 
biologische Primär-Abbau zu ermitteln, so können sehr präzise Daten 
für Stoffe erhalten werden, die weitgehend abgebaut werden.)  
Die Empfindlichkeit des Verfahrens ist weitgehend von den Schwan ­
kungen des Kontrollwerts und in geringerem Ausmaß von der Ge ­
nauigkeit der Bestimmung des gelösten organischen Kohlenstoffs 
und der Konzentration der Prüfsubstanz in der Kultursuspension zu Beginn der einzelnen Zyklen abhängig.
 
1.6. PRÜFVERFAHREN  
1.6.1.  Vorbereitung  
Eine ausreichende Zahl von sauberen Kulturgefäßen (wahlweise 
kann auch die ursprüngliche SCAS-Einheit, die ein Volumen von 1,5 l fasst, angewandt werden) und Belüftungsrohren für jede Prüf ­
substanz sowie die Kontrolle werden zusammengesetzt. Die den 
Prüfeinheiten zugeführte Druckluft muss, durch ein Wattefilter gerei ­
nigt, frei von organischem Kohlenstoff sein und zur Verminderung der Evaporationsverluste zuvor mit Wasser gesättigt werden.
 
Eine Mischprobe mit 1 bis 4 g suspendierten Feststoffen/l wird einer 
Belebtschlammanlage, in der vorwiegend häusliche Abwässer behan ­
delt werden, entnommen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 975
 
Für jede Belüftungseinheit sind rund 150 ml Belebtschlamm erfor ­
derlich.  
Stammlösungen der Prüfsubstanz werden in destilliertem Wasser zu ­
bereitet; normalerweise ist eine Konzentration von 400 mg organi ­
schem Kohlenstoff/l erforderlich, um eine Konzentration der Prüf ­
substanz von 20 mg Kohlenstoff/l zu Beginn jedes Belüftungszyklus, wenn kein biologischer Abbau erfolgt, einzustellen.
 
Höhere Konzentrationen sind zulässig, wenn die Toxizität gegenüber 
den Mikroorganismen dies erlaubt. Der Gehalt der Stammlösungen 
an organischem Kohlenstoff wird gemessen.  
1.6.2.  Prüfbedingungen  
Der Test ist bei einer Temperatur von 20 bis 25  o C durchzuführen.  
Es wird eine hohe Konzentration aerober Mikroorganismen verwen ­
det (1 bis 4 g/l suspendierte Feststoffe); die effektive Verweilzeit im 
Kulturgefäß beträgt 36 Stunden. Die kohlenstoffhaltigen Substanzen im zugesetzten Abwasser werden in der Regel innerhalb der ersten acht Stunden nach Beginn eines jeden Belüftungszyklus weitest ­
gehend oxydiert. Danach atmet der Schlamm endogen; während die ­
ser Zeit ist die Prüfsubstanz das einzig verfügbare Substrat, wenn sie nicht ebenfalls sofort abgebaut worden ist. Diese Rahmenbedingun ­
gen schaffen, zusammen mit der täglichen Wiederbeimpfung bei 
Verwendung von häuslichem Abwasser als Nährmedium, sowohl 
für die Akklimatisierung als auch für einen weitgehenden biologi ­
schen Abbau sehr günstige Voraussetzungen.
 
1.6.3.  Durchführung der Prüfung  
Eine gemischte Belebtschlammprobe wird einer geeigneten kom ­
munalen Kläranlage, die vorwiegend häusliche Abwässer behandelt, oder einer Laboratoriumsanlage entnommen und bis zur Verwendung 
im Laboratorium unter aeroben Bedingungen gehalten. In jede Prüf- 
und Kontrolleinheit werden 150 ml (werden die Original-SCAS-Prü ­
feinheiten verwendet, so sind die angegebenen Volumina zu ver ­
zehnfachen) der Belebtschlamm-Suspension gegeben und dann be ­
lüftet. Nach 23 Stunden wird die Belüftung ausgeschaltet und man 
lässt den Schlamm 45 Minuten absetzen. Dann werden die Ablaufs ­
tutzen der einzelnen Gefäße geöffnet und aus jedem 100 ml der überstehenden Flüssigkeit entnommen. Von einer unmittelbar vor 
Gebrauch gezogenen Probe häuslicher Abwasser, aus dem die grö ­
beren Partikel nach Sedimentation entfernt wurden, werden je 100 ml zu dem in den Belüftungseinheiten verbliebenen Schlamm gegeben. Sodann wird wieder belüftet. In dieser Phase werden keine Prüfsub ­
stanzen zugesetzt. In die Einheiten wird so oft häusliches Abwasser 
gegeben, bis nach dem Absetzen des Schlamms eine klare überste ­
hende Flüssigkeit erhalten wird. Dies dauert in der Regel bis zu zwei Wochen; in dieser Zeit nähert sich der gelöste organische Kohlen ­
stoff in der überstehenden Schicht nach Abschluss der Belüftungs ­
zyklen einem konstanten Wert.
 
Am Ende dieser Phase werden die einzelnen abgesetzten Schlämme 
gemischt und jeweils 50 ml des daraus erhaltenen Mischschlammes wiederum in die einzelnen Einheiten gegeben.
 
95 ml abgesetztes Abwasser und  5 ml Wasser werden in den Kon ­
trollansatz und 95 ml des abgesetzten Abwassers und 5 ml der Prüf ­
substanz-Stammlösung (400 mg/l) werden in jede Prüfeinheit gege ­
ben. Dann wird wieder für 23 Stunden belüftet. Danach lässt man den Schlamm 45 Minuten absetzen, worauf die überstehende Schicht 
abgenommen und auf den Gehalt an organischem Kohlenstoff unter ­
sucht wird.
 
Das oben beschriebene Füll- und Entnahmeverfahren wird während 
der Testdauer täglich wiederholt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 976
 
Vor dem Absetzen müssen eventuell die Wände der Einheiten gerei ­
nigt werden, um eine Anhaftung von Feststoffen oberhalb des Flüs ­
sigkeitsniveaus zu verhindern. Für jede Einheit sind getrennte Scha ­
ber oder Bürsten zu verwenden, um eine gegenseitige Kontamination zu vermeiden.
 
Im Idealfall wird der Gehalt an gelöstem organischen Kohlenstoff in 
der überstehenden Kultursuspension täglich bestimmt; weniger häu ­
fige Analysen sind jedoch zulässig. Vor der Analyse werden die 
Suspensionen durch gewaschene Membranfilter von 0,45 μm filtriert 
oder zentrifugiert. Membranfilter sind geeignet, wenn sichergestellt ist, dass sie weder Kohlenstoff freisetzen noch Stoffe bei der Fil ­
tration adsorbieren. Die Temperatur der Probe darf bei der Zentrifu ­
gation 40
 o C nicht übersteigen.  
Die Dauer der Prüfung ist für gering oder nicht biologisch abbaubare 
Verbindungen unbestimmt; nach bisherigen Erfahrungen sollte sie mindestens 12, höchstens jedoch 26 Wochen betragen.
 
2. DATEN UND AUSWERTUNG  
Die Gehalte an gelöstem organischen Kohlenstoff in den nach der 
Sedimentation überstehenden Kultursuspensionen der Prüf- und Kon ­
trolleinheiten werden gegen die Zeit grafisch aufgetragen.  
Nach Abschluss des biologischen Abbaus sollten sich die Werte der 
Prüfansätze demjenigen des Kontrollansatzes nähern. Bleibt die Dif ­
ferenz zwischen diesen beiden Werten während drei aufeinander 
folgender Messungen konstant, so werden noch so viele Messungen vorgenommen, wie es zur statistischen Auswertung der Daten erfor ­
derlich ist, und der prozentuale biologische Abbau der zu prüfenden 
Substanz wird berechnet (D
 da oder D  ssd, siehe 1.2).  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:  
— sämtliche Informationen über die Art des Abwassers, den Typ 
der benutzten Belüftungseinheit und die mit dem zu prüfenden 
Stoff, der Kontrolle sowie gegebenenfalls mit der Referenzsub ­
stanz erhaltenen Versuchsergebnisse;  
— Temperatur;  
— Abbaukurve mit Beschreibung der Berechnungsweise (siehe 1.2);  
— Datum und Ort der Entnahme des Belebtschlamms und des Ab ­
wassers;  
— Stand der Adaptation, Konzentration usw.;  
— wissenschaftliche Gründe für jedwede Änderung des Prüfverfah ­
rens;  
— Unterschrift und Datum.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 977
 
3.2. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Da der mit diesem Verfahren zu prüfende Stoff biologisch nicht 
leicht abbaubar ist, wird jede ausschließlich auf biologischen Abbau zurückzuführende Abnahme des DOC-Gehalts in der Regel über 
Tage oder Wochen nur langsam erfolgen. Ausgenommen sind die 
Fälle, in denen eine plötzliche Akklimatisierung eintritt, erkennbar an einer raschen DOC-Abnahme.
 
Eine physikalisch-chemische Adsorption kann jedoch oftmals eine 
wichtige Rolle spielen; dies ist daran erkenntlich, dass der zugesetzte 
gelöste organische Kohlenstoff von Anfang an vollständig oder teil ­
weise verschwindet. Die danach auftretenden Effekte sind von Fak ­
toren wie dem Adsorptionsgrad und der Konzentration der suspen ­
dierten Partikel in der den Belüftungseinheiten entnommenen Sus ­
pension abhängig. Die Differenz zwischen den DOC-Konzentratio ­
nen in der Kontrolle und dem Prüfansatz nimmt zunächst in der Regel von geringen Anfangswerten fortschreitend zu und bleibt 
dann während der restlichen Versuchszeit konstant, sofern keine 
Akklimatisierung erfolgt.
 
Soll zwischen vollständigem (oder teilweisem) biologischem Abbau 
und Adsorption unterschieden werden, sind weitere Tests erforder ­
lich. Hierfür bieten sich mehrere Möglichkeiten an; am besten ver ­
wendet man jedoch den Belebtschlamm aus der Prüfeinheit oder die 
nach Sedimentation daraus erhaltene Kultursuspension als Inokulum in einem Grundstufen-Test (vorzugsweise respirometrisch).
 
Prüfsubstanzen, die eine weitgehende, nicht durch Adsorption be ­
dingte Abnahme des DOC-Gehalts in diesem Test aufweisen, sind 
als potenziell biologisch abbaubar zu betrachten. Eine partielle nich ­
tadsorptive Abnahme weist darauf hin, dass der Stoff zumindest teilweise biologisch abbaubar ist.
 
Erfolgt keine oder nur eine geringe Abnahme des gelösten organi ­
schen Kohlenstoffs, kann dies möglicherweise auf einer Hemmung 
der Mikroorganismen durch den zu prüfenden Stoff beruhen. Diese kann sich auch durch Auflösung und Verlust des Schlammes sowie einer Trübung der überstehenden Kultursuspension zeigen. In sol ­
chen Fällen ist die Prüfung mit einer niedrigeren Konzentration 
des zu prüfenden Stoffes zu wiederholen.
 
Durch spezifische Analysemethoden oder den Einsatz  14 C-markierter 
Prüfsubstanzen lässt sich eventuell eine höhere Empfindlichkeit er ­
reichen. Wird  14 C-markierte Prüfsubstanz verwendet, lässt sich durch 
Nachweis des entstehenden  l4 CO 2 bestätigen, dass ein biologischer 
Abbau stattgefunden hat.  
Werden die Ergebnisse auch in Form des biologischen Primär-Ab ­
baus angegeben, so sollten, wenn möglich, Angaben über die Ver ­
änderungen der chemischen Struktur gemacht werden, die die man ­
gelnde Wiederauffindung der Ausgangssubstanz begründen.  
Die Validierung der Analysemethode sowie die damit bestimmten 
Werte im Nährmedium ohne Zusatz der Prüfsubstanz müssen ange ­
geben werden.  
4. LITERATUR  
(1) OECD, Paris, 1981,  Test Guideline 302 A,  Beschluss des Rates 
C(81)30 endg.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 978
 
Anlage 1  
SCAS-Test: Beispiel der Ergebniseingabe  
Substanz C T 
(mg/l) C t — C  c 
(mg/l) Prozent biologi ­
scher Abbau 
D da Testdauer 
(Tage)  
4-Acetylaminobenzolsulfonat 17,2 2,0 85 40 
Tetrapropylenbenzolsulfonat 17,3 8,4 51,4 40 4-Nitrophenol 16,9 0,8 95,3 40 
Diethylenglykol 16,5 0,2 98,8 40 
Anilin 16,9 1,7 95,9 40 Cyclopentantetracarboxylat 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 979
 
Anlage 2  
Beispiel der Testapparatur  
Abbildung 1
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 980
 
C.13.  BIOKONZENTRATION: DURCHFLUSS-FISCHTEST  
1. METHODE  
Diese Biokonzentrationsmethode entspricht der OECD TG 305 
(1996).  
1.1. EINLEITUNG  
Die Methode beschreibt ein Verfahren zur Charakterisierung des 
Potenzials verschiedener Substanzen zur Biokonzentration in Fischen 
unter Durchflussbedingungen. Obwohl Durchflusstests generell stark 
zu bevorzugen sind, sind — unter der Voraussetzung, dass die Va ­
liditätskriterien erfüllt werden — auch semistatische Methoden zu ­
lässig.  
Die Methode gibt genügend Einzelheiten für die Durchführung des 
Tests vor, räumt gleichzeitig jedoch auch ausreichend Spielraum zur 
Anpassung des Versuchsaufbaus an die jeweiligen Laborgegebenhei ­
ten und zur Änderung der Eigenschaften der Prüfsubstanzen ein. Sie wird am effizientesten für stabile organische Chemikalien mit log 
P
 ow -Werten zwischen 1,5 und 6,0 (1) eingesetzt, kann aber auch 
noch für superlipophile Substanzen (mit log P  ow > 6,0) verwendet 
werden. Der vorläufig geschätzte Wert des Biokonzentrationsfaktors (BCF), manchmal auch als K
 B bezeichnet, für solche superlipophilen 
Substanzen wird voraussichtlich höher sein als der aufgrund von 
Laborversuchen erwartete steady-state-Biokonzentrationsfaktor (BCF
 SS ). Schätzwerte des Biokonzentrationsfaktors für organische 
Chemikalien mit log P  ow -Werten von bis zu ca. 9,0 können anhand 
der Gleichung von Bintein et al. (2) ermittelt werden. Zu den Pa ­
rametern, die das Biokonzentrationspotenzial charakterisieren, gehö ­
ren die Aufnahmekonstante (k  1 ), die Ausscheidungskonstante (k  2 ) 
sowie der BCF  SS . 
Radioaktiv markierte Prüfsubstanzen können die Analyse von Was ­
ser- und Fischproben erleichtern und für die Entscheidung, ob die 
Abbauprodukte identifiziert und quantifiziert werden sollten, heran ­
gezogen werden. Wenn die gesamten radioaktiven Rückstände ge ­
messen werden (z. B. durch Verbrennung oder Solubilisierung von Gewebe), basiert der BCF auf der Ausgangsverbindung, auf allen 
zurückbehaltenen Stoffwechselprodukten sowie dem assimilierten 
Kohlenstoff. Der BCF, der auf der Grundlage der gesamten radio ­
aktiven Rückstände ermittelt wird, kann daher nicht direkt mit einem 
BCF verglichen werden, der allein aus der spezifischen chemischen 
Analyse der Ausgangsverbindung abgeleitet wurde.
 
In Untersuchungen mit radioaktiven Markierungen können Aufarbei ­
tungsschritte zur Bestimmung des BCF auf der Grundlage der Aus ­
gangsverbindung herangezogen werden; ferner können die Haupt ­
stoffwechselprodukte charakterisiert werden, falls dies für notwendig 
erachtet wird. Auch ist es aufgrund der Analyse und Identifizierung 
der Rückstände in den Geweben möglich, Untersuchungen des Fischstoffwechsels mit Biokonzentrationsuntersuchungen zu kom ­
binieren.
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Biokonzentration/Bioakkumulation  bezeichnet den Anstieg der Kon ­
zentration der Prüfsubstanz in oder auf einem Organismus (oder 
bestimmten Gewebeteilen davon) im Verhältnis zur Konzentration 
der Prüfsubstanz im umgebenden Medium.  
Der Biokonzentrationsfaktor  (BCF oder K  B ) bezeichnet zu jeder Zeit 
während der Aufnahmephase dieses Akkumulationstests das Verhält ­
nis der gegebenen Konzentration der Prüfsubstanz in/auf den Fischen oder bestimmten Gewebeteilen davon (C
 f in μg/g (ppm)) zur Kon ­
zentration der Chemikalie im umgebenden Medium (C  w in μg/ml 
(ppm)).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 981
 
Der steady-state-Biokonzentrationsfaktor  (BCF  SS oder K  B ) ändert 
sich über einen längeren Zeitraum nicht wesentlich; die Konzentra ­
tion der Prüfsubstanz im umgebenden Medium ist während dieser Zeit konstant.
 
Ein Plateau  oder der  steady-state  (Fließgleichgewicht) in der gra ­
fischen Darstellung der gegen die Zeit aufgetragenen Prüfsubstanz in Fisch (C
 f ) ist erreicht, wenn die Kurve parallel zur Zeitachse verläuft 
und wenn drei aufeinander folgende C  f -Analysen, die auf Proben 
durchgeführt werden, die im Abstand von mindestens zwei Tagen 
genommen wurden, um nicht mehr als ± 20 % voneinander abwei ­
chen, bzw. wenn es keine bedeutenden Unterschiede zwischen den drei Probenahmephasen gibt. Werden gepoolte Proben analysiert, 
sind mindestens vier aufeinander folgende Analysen erforderlich. 
Für Prüfsubstanzen, die nur langsam aufgenommen werden, ist ein zeitlicher Abstand zwischen den Probenahmen von sieben Tagen geeigneter.
 
Biokonzentrationsfaktoren,  die direkt aus den kinetischen Geschwin ­
digkeitskonstanten (k  1 /k 2 berechnet werden, werden als kinetische 
Konzentrationsfaktoren BCF  k bezeichnet.  
Der Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient  (P ow ) bezeichnet das Ver ­
hältnis der Löslichkeit einer Chemikalie in n-Oktanol und Wasser im Gleichgewicht (Methode A.8), auch als K
 ow bezeichnet. Aus dem 
Logarithmus P  ow kann auf das Potenzial einer Chemikalie zur Bio ­
konzentration in aquatischen Organismen geschlossen werden.  
Die Expositions- oder Aufnahmephase  bezeichnet die Zeit, während 
der die Fische der Prüfchemikalie ausgesetzt sind.  
Die Aufnahmekonstante  (k 1 ) ist der numerische Wert, der die Ge ­
schwindigkeit des Anstiegs in der Konzentration der Prüfsubstanz 
in/auf den Versuchsfischen (oder bestimmten Gewebeteilen davon) bezeichnet, während die Fische gegenüber dieser Chemikalie expo ­
niert sind (k
 1 wird in Tag  -1 angegeben).  
Die Post-Expositions- oder Ausscheidungsphase  bezeichnet die Zeit 
nach der Umsetzung der Versuchsfische aus dem Medium, das die Prüfsubstanz enthalt, in ein Medium ohne diese Substanz, während 
der der Abbau (oder der Nettoverlust) der Substanz in den Versuchs ­
fischen (oder bestimmten Gewebeteilen davon) untersucht wird.
 
Die Ausscheidungskonstante  (k 2 ) ist der numerische Wert, der die Ge ­
schwindigkeit der Konzentrationsabnahme der Prüfsubstanz in den 
Versuchsfischen (oder bestimmten Gewebeteilen davon) definiert, die der Umsetzung der Versuchsfische aus einem Medium, das die Prüf ­
substanz enthält, in ein Medium ohne diese Substanz (k, wird in Tag
 -1 
angegeben) folgt.  
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Der Test besteht aus zwei Phasen: der Expositions-/Aufnahmephase 
und der Post-Expositions-/Ausscheidungsphase. Während der Auf ­
nahmephase werden verschiedene Fischgruppen einer Spezies min ­
destens zwei Konzentrationen der Prüfsubstanz ausgesetzt. Anschlie ­
ßend werden sie für die Ausscheidungsphase in ein Medium ohne die Prüfsubstanz eingesetzt. Eine Ausscheidungsphase ist immer er ­
forderlich, es sei denn, die Aufnahme der Substanz während der 
Aufnahmephase war unbedeutend (der BCF beträgt z. B. weniger 
als 10). Die Konzentration der Prüfsubstanz in/auf den Fischen (oder bestimmten Gewebeteilen davon) wird in beiden Phasen des Tests beobachtet. Zusätzlich zu den beiden Testkonzentrationen wird eine 
Kontrollgruppe von Fischen unter — abgesehen von der fehlenden 
Prüfsubstanz — gleichen Bedingungen gehalten, um eventuelle schä ­
digende Wirkungen, die während des Biokonzentrationstests be ­
obachtet werden, mit einer entsprechenden Kontrollgruppe verglei ­
chen zu können und um Backgroundkonzentrationen der Prüfsub ­
stanz zu erhalten.
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Die Aufnahmephase dauert 28 Tage, sofern nicht schon zu einem 
früheren Zeitpunkt ein Gleichgewicht erreicht wird. Die Dauer der 
Aufnahmephase und die Zeit bis zur Einstellung des Fließgleichge ­
wichts kann anhand der Gleichung in Anlage 3 abgeleitet werden. Die Ausscheidungsperiode beginnt dann mit der Umsetzung der Fi ­
sche in ein anderes, sauberes Testgefäß, das ein bis auf die Prüf ­
substanz identisches Medium enthält. Wenn möglich, sollte der Bio ­
konzentrationsfaktor nicht nur als Verhältnis (BCF
 SS ) der Konzen ­
tration in den Fischen (C  f ) und im Wasser (C  w ) bei offensichtlichem 
Fließgleichgewicht berechnet werden, sondern auch als kinetischer 
Biokonzentrationsfaktor BCF  k , d. h. als Verhältnis der Aufnahme- 
(k l ) und Ausscheidungskonstanten (k  2 ) unter Annahme einer Kinetik 
erster Ordnung. Wenn die Messdaten offensichtlich nicht einer Ki ­
netik erster Ordnung folgen, sollten komplexere Modelle verwendet 
werden (Anlage 5).  
Wird innerhalb von 28 Tagen kein Fließgleichgewicht erreicht, sollte 
die Aufnahmephase so lange verlängert werden, bis sich ein Fließ ­
gleichgewicht einstellt, oder bis zu 60 Tage; danach beginnt die 
Ausscheidungsphase.  
Die Aufnahmekonstante, die Ausscheidungskonstante (oder Konstan ­
ten, wenn komplexere Modelle verwendet werden), der Biokonzen ­
trationsfaktor und, wenn möglich, die Konfidenzgrenzen eines jeden 
dieser Parameter werden anhand des Modells berechnet, das die gemessenen Konzentrationen der Prüfsubstanz in den Fischen und im Wasser am besten beschreibt.
 
Der BCF wird als Funktion des gesamten Nassgewichts der Fische 
ausgedrückt. Für gewisse Zwecke können jedoch auch bestimmte Gewebeteile oder Organe (z. B. Muskeln, Leber) verwendet werden, sofern die Fische groß genug sind, oder die Fische können in essbare 
(Filet) und nichtessbare (Viszera) Fraktionen unterteilt werden. Da 
bei vielen organischen Substanzen eine eindeutige Beziehung zwi ­
schen dem Biokonzentrationspotenzial und der Lipophilie besteht, gibt es auch eine entsprechende Beziehung zwischen dem Lipid ­
gehalt der Versuchsfische und der beobachteten Biokonzentration 
der Substanzen. Um dadurch bedingte Abweichungen in den Test ­
ergebnissen für hochlipophile Substanzen (d. h. mit log P
 ow > 3) auf 
ein Minimum zu beschränken, sollte die Biokonzentration nicht nur 
im Verhältnis zum gesamten Körpergewicht, sondern auch zum Li ­
pidgehalt ausgedrückt werden.  
Der Lipidgehalt sollte nach Möglichkeit anhand desselben biologi ­
schen Materials bestimmt werden, das auch für die Bestimmung der 
Konzentration der Prüfsubstanz verwendet wird.  
1.4. ANGABEN ZUR PRÜFSUBSTANZ  
Vor der Durchführung des Biokonzentrationstests sollten folgende 
Angaben über die Prüfsubstanz vorliegen:  
— a) Wasserlöslichkeit  
— b) Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient P  ow (auch als K  ow be­
zeichnet, ermittelt durch ein HPLC-Verfahren in A.8)  
— c) Hydrolyse  
— d) Phototransformation in Wasser, bestimmt unter direkter oder 
simulierter Sonneneinstrahlung sowie unter den Bestrahlungs ­
bedingungen des Biokonzentrationstests (3)  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 983
 
— e) Oberflächenspannung (d. h. für Substanzen, bei denen der log 
P ow nicht ermittelt werden kann)  
— f) Dampfdruck  
— g) leichte biologische Abbaubarkeit (gegebenenfalls).  
Ferner müssen Informationen hinsichtlich der toxischen Wirkung auf 
die Fischspezies, die im Test verwendet werden, vorliegen — vor ­
zugsweise der asymptotische LC  50 -Wert (d. h. zeitunabhängig). Eine 
entsprechende Analysemethode von bekannter Zuverlässigkeit, Ge ­
nauigkeit und Empfindlichkeit muss für die Quantifizierung der Prüf ­
substanz in den Testlösungen und im biologischen Material verfüg ­
bar sein sowie auch Einzelheiten zur Probenvorbereitung und -auf ­
bewahrung. Ebenso sollten die analytischen Nachweisgrenzen der 
Prüfsubstanz im Wasser sowie in den Fischgeweben bekannt sein. 
Wenn eine  14 C-markierte Prüfsubstanz verwendet wird, sollte der 
prozentuale Anteil der mit Verunreinigungen einhergehenden Radio ­
aktivität bekannt sein.  
1.5. VALIDITÄT DES TESTS  
Ein Test wird als valid betrachtet, wenn folgende Bedingungen er ­
füllt sind:  
— Die Temperaturschwankung beträgt weniger als ± 2  o C; 
— die Konzentration an gelöstem Sauerstoff liegt nicht unter einer 
Sättigung von 60 %;  
— die Konzentration der Prüfsubstanz in den Kammern liegt zwi ­
schen ± 20 % der während der Aufnahmephase gemessenen Durchschnittswerte;
 
— Mortalität oder andere schädigende Wirkungen/Krankheiten bei 
den Kontroll- und Versuchsfischen betragen am Ende des Tests weniger als 10 %; wenn sich der Test über mehrere Wochen oder 
Monate erstreckt, sollten Mortalität oder andere schädigende Wir ­
kungen bei beiden Fischgruppen weniger als 5 % pro Monat betragen und 30 % insgesamt nicht überschreiten.
 
1.6. REFERENZVERBINDUNGEN  
Die Verwendung von Referenzverbindungen mit bekanntem Biokon ­
zentrationspotenzial ist für eine Überprüfung des Versuchsverlaufs gegebenenfalls sinnvoll. Bisher können jedoch noch keine bestimm ­
ten Substanzen empfohlen werden.
 
1.7. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.7.1.  Apparatur  
Die Verwendung von Materialien, die sich auflösen können, die sorbie ­
ren oder auslaugen können bzw. schädigende Auswirkungen auf die 
Fische haben können, sollte für alle verwendeten Teile sorgfältigst ver ­
mieden werden. Es können rechteckige oder zylindrische Standardbehäl ­
ter aus chemisch inertem Material, die ein dem Besatz entsprechendes Fassungsvermögen haben, verwendet werden. Die Verwendung von 
Rohren aus Weichkunststoff sollte auf ein Minimum beschränkt sein. 
Rohre aus Teflon ®, Edelstahl und oder Glas sind zu bevorzugen. Die Erfahrung hat gezeigt, dass bei Substanzen mit hohen Adsorptionskoef ­
fizienten, wie z. B. synthetischen Pyrethroiden, die Verwendung von 
silanisiertem Glas nötig sein kann. In solchen Fällen muss die Anlage 
nach der Benutzung entsorgt werden.
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1.7.2.  Wasser  
Allgemein wird für den Test natürliches Wasser verwendet, das aus 
einer unverschmutzten Quelle von gleichbleibend guter Qualität ge ­
wonnen wird. Das Verdünnungswasser muss von einer Qualität sein, 
die ein Überleben der gewählten Fischspezies für die Dauer der 
Akklimatisations- und Testperiode ermöglicht, ohne dass sie ein ab ­
normes Erscheinungsbild oder Verhalten zeigen. Im Idealfall sollte nachgewiesen werden, dass die Testspezies im Verdünnungswasser 
(z. B. in einer Laborkultur oder in einem Lebenszyklus-Toxizitäts ­
test) überleben, wachsen und sich vermehren können. Über das Was ­
ser sollten zumindest Angaben bezüglich pH-Wert, Härte, Gesamt ­
feststoffgehalt, gesamten organischen Kohlenstoff vorliegen sowie 
nach Möglichkeit auch bezüglich Ammonium, Nitrit und Alkalität bzw. — für die Meerwasserspezies — bezüglich der Salinität. Die Parameter, die für einen optimalen Schutz der Fische wichtig sind, 
sind hinreichend bekannt, doch werden in Anlage 1 für eine Reihe 
von Parametern die empfohlenen Höchstkonzentrationen für Süß- und Meerestestwasser genannt.
 
Während der Testdauer sollte das Wasser von gleichbleibender Qua ­
lität sein. Der pH-Wert sollte zwischen 6,0 und 8,5 liegen, doch während eines bestimmten Tests sollte er um nicht mehr als ± 0,5 
pH-Einheiten schwanken. Um sicherzugehen, dass das Verdünnungs ­
wasser das Testergebnis nicht übermäßig stark beeinflusst (beispiels ­
weise durch die Komplexierung der Prüfsubstanz) oder schädigende Wirkungen auf den Fischbestand hat, sollten in gewissen Abständen 
Proben zur Analyse entnommen werden. Wenn bekannt ist, dass das 
Verdünnungswasser qualitativ relativ konstant ist, sollte beispiels ­
weise alle drei Monate der Gehalt an Schwermetallen (z. B. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), an Hauptanionen und -kationen (z. B. Ca, 
Mg, Na, K, Cl, SO
 4 ), Pestiziden (z. B. der Gesamtgehalt an phos ­
phororganischen und chlororganischen Pestiziden), der TOC und die Schwebstoffe bestimmt werden. Wenn sich die Wasserqualität über mindestens ein Jahr als konstant erwiesen hat, können die Unter ­
suchungen weniger häufig und in größeren Zeitabständen (z. B. 
alle sechs Monate) erfolgen.
 
Der natürliche Partikelgehalt sowie der gesamte organische Kohlen ­
stoff (TOC) des Verdünnungswassers sollte möglichst niedrig sein, um die Adsorption der Prüfsubstanz an organischen Substanzen zu 
vermeiden, wodurch deren Bioverfügbarkeit (4) reduziert werden 
könnte. Der maximal zulässige Wert beträgt 5 mg/l für Partikel (Tro ­
ckensubstanz, die nicht durch ein Filter von 0,45 μm geht) und 
2 mg/l für den gesamten organischen Kohlenstoff (siehe Anlage 
1). Gegebenenfalls sollte das Wasser vor der Verwendung gefiltert 
werden. Der Beitrag zum organischen Kohlenstoffgehalt im Wasser durch die Versuchsfische (Ausscheidungen) und Nahrungsreste sollte so gering wie möglich sein. Während der gesamten Testdauer sollte 
die Konzentration des organischen Kohlenstoffs im Testbehältnis die 
Konzentration des organischen Kohlenstoffs aus der Prüfsubstanz und dem Lösungsmittel, falls verwendet, um nicht mehr als 10 mg/l (± 20 %) überschreiten.
 
1.7.3.  Testlösungen  
Eine Stammlösung der Prüfsubstanz wird in entsprechender Konzen ­
tration vorbereitet. Die Stammlösung sollte vorzugsweise durch ein ­
faches Mischen oder Einrühren der Prüfsubstanz in das Verdün ­
nungswasser vorbereitet werden. Die Verwendung von Lösungs- oder Dispergiermitteln (Lösungsvermittlern) wird nicht empfohlen, auch wenn dies in einigen Fällen nötig sein sollte, um eine entspre ­
chend konzentrierte Stammlösung herzustellen. Lösungsmittel, die 
verwendet werden können, sind Ethanol, Methanol, Ethylenglykol- Monomethylether, Ethylenglykol-Dimethylether, Dimethylformamid und Triethylenglykol. Dispergiermittel, die verwendet werden kön ­
nen, sind Cremophor RH40, Tween 80, Methylzellulose 0,01 % und 
HCO-40. Bei der Verwendung biologisch leicht abbaubarer Stoffe ist Vorsicht geboten, da diese im Durchflusstest Probleme im Hinblick auf das Bakterienwachstum verursachen können. Die Prüfsubstanz 
kann radioaktiv markiert und sollte von höchster Reinheit sein (vor ­
zugsweise > 98 %).
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Bei Durchflusstests ist ein System erforderlich, das kontinuierlich 
eine Stammlösung der Prüfsubstanz abzieht und verdünnt (z. B. Do ­
sierpumpe, Proportionalverdünner, Sättigungsvorrichtung), um die Testkonzentrationen den Testkammern zuzuführen. Ein Austausch von mindestens fünf Rauminhalten durch jede der Testkammern 
pro Tag ist zulässig. Das Durchflussverfahren ist zu bevorzugen; 
wenn dieses nicht eingesetzt werden kann (wenn z. B. schädigende Wirkungen auf die Testorganismen zu erwarten sind), kann ein se ­
mistatisches Verfahren verwendet werden, unter der Voraussetzung, 
dass die Validitätskriterien erfüllt sind. Die Durchflussgeschwindig ­
keit der Stammlösungen und des Verdünnungswassers sollten 48 Stunden vor dem Test und während des Testverlaufs mindestens einmal pro Tag geprüft werden. Im Rahmen dieser Prüfung wird 
die Durchflussgeschwindigkeit durch jede der Testkammern be ­
stimmt und sichergestellt, dass sie innerhalb oder zwischen den Kammern um nicht mehr als 20 % abweicht.
 
1.7.4.  Auswahl der Spezies  
Wichtig für die Auswahl der Spezies ist, dass sie leicht und in ent ­
sprechender Größe verfügbar sind und problemlos im Labor gehalten 
werden können. Andere Kriterien zur Auswahl der Fischspezies sind 
u. a. ihr Freizeitwert, ihre kommerzielle und ökologische Bedeutung sowie eine vergleichbare Empfindlichkeit, ein erfolgreicher Einsatz in früheren Tests usw.
 
Die empfohlenen Testspezies werden in Anlage 2 aufgeführt. Es 
können auch andere Spezies verwendet werden, doch müssen die Testverfahren dann u. U. angepasst werden, um die entsprechenden Testbedingungen zu schaffen. Die Gründe für die Auswahl der Spe ­
zies und der Versuchsmethode sollten in diesem Fall genau doku ­
mentiert werden.
 
1.7.5.  Haltung der Fische  
Eine Stammpopulation von Fischen wird mindestens zwei Wochen 
lang im Wasser bei Testtemperatur akklimatisiert und mit entspre ­
chender Nahrung, die später auch während des Tests verwendet wird, 
gefüttert.  
Nach einer 48stündigen Eingewöhnungsphase wird die Mortalität 
festgehalten, wobei folgende Kriterien gelten:  
— Mortalität größer als 10 % der Population in sieben Tagen: Aus ­
tausch des gesamten Besatzes;  
— Mortalität zwischen 5 und 10 % der Population in sieben Tagen: 
weitere sieben Tage Akklimatisation;  
— Mortalität weniger als 5 % der Population in sieben Tagen: An ­
nahme des gesamten Besatzes — wenn die Mortalität innerhalb 
der folgenden sieben Tage bei mehr als 5 % liegt: Austausch des 
gesamten Besatzes.  
Stellen Sie sicher, dass die für den Test verwendeten Fische keine 
sichtbaren Erkrankungen oder Abnormitäten aufweisen. Entfernen Sie alle kranken Fische. Die Fische sollten zwei Wochen vor dem 
Test oder während des Tests nicht wegen irgendwelcher Erkrankun ­
gen behandelt werden.
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1.8. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG  
1.8.1.  Vorversuch  
Es kann sehr sinnvoll sein, einen Vorversuch durchzuführen, um die 
Bedingungen für den endgültigen Versuch zu optimieren, z. B. Wahl 
der Prüfsubstanzkonzentration(en), Dauer der Aufnahme- und Aus ­
scheidungsphase.  
1.8.2.  Expositionsbedingungen  
1.8.2.1. D a u e r d e r A u f n a h m e p h a s e  
Eine Vorhersage der Dauer der Aufnahmephase kann aus praktischen 
Erfahrungen (z. B. aus einer früheren Untersuchung oder anhand 
einer Chemikalie vergleichbarer Akkumulation) oder aus bestimmten empirischen Beziehungen abgeleitet werden, wozu entweder die Kenntnis der Wasserlöslichkeit oder des Oktanol-Wasser-Vertei ­
lungskoeffizienten der Prüfsubstanz (siehe Anlage 3) herangezogen 
wird.
 
Die Aufnahmephase sollte 28 Tage dauern, sofern nicht nachweislich 
bereits zu einem früheren Zeitpunkt ein Gleichgewicht erzielt wurde. 
Stellt sich innerhalb von 28 Tagen kein Fließgleichgewicht ein, so 
sollte die Aufnahmephase entsprechend verlängert und weitere Mes ­
sungen vorgenommen werden, bis das Fließgleichgewicht erreicht ist, höchstens jedoch 60 Tage.
 
1.8.2.2. D a u e r d e r A u s s c h e i d u n g s p h a s e  
In der Regel reicht die Hälfte der Dauer der Aufnahmephase aus, um 
eine relevante Reduzierung (z. B.  95 %) der Körperbelastung durch 
die Substanz (zur Erläuterung dieser Schätzung siehe Anlage 3) fest ­
zustellen. Sollte die Zeit, die für eine 95 %ige Ausscheidung benötigt wird, jedoch unangemessen lang und damit nicht praktikabel sein 
(wenn sie beispielsweise die normale Dauer der Aufnahmephase 
um mehr als das Doppelte überschreitet, d. h. mehr als 56 Tage beträgt), kann die Phase entsprechend verkürzt werden (d. h. bis die Konzentration der Prüfsubstanz weniger als 10 % der Fließ ­
gleichgewichtskonzentration beträgt). Bei Substanzen mit komplexe ­
ren Aufnahme- und Ausscheidungsmustern, als sie durch ein Ein ­
kompartiment-Fischmodell dargestellt werden können (bei einer Ki ­
netik erster Ordnung), sollten jedoch längere Ausscheidungsphasen 
zur Bestimmung der Ausscheidungskonstanten geplant werden. Die 
Dauer kann jedoch durch die Zeit vorgegeben sein, in der die Kon ­
zentration der Prüfsubstanz in den Fischen oberhalb der analytischen Nachweisgrenze liegt.
 
1.8.2.3. A n z a h l d e r V e r s u c h s f i s c h e  
Die Zahl der Fische pro Testkonzentration sollte so gewählt werden, 
dass bei jeder Probenahme mindestens vier Fische pro Probe zur Verfügung stehen. Wird eine stärkere statistische Aussagekraft ge ­
fordert, ist eine größere Anzahl von Fischen pro Probe notwendig.
 
Wenn ausgewachsene Fische verwendet werden, muss dokumentiert 
sein, ob es sich um männliche oder weibliche Tiere handelt bzw. ob 
beide Geschlechter für den Versuch eingesetzt werden. Werden beide Geschlechter verwendet, sollten die unterschiedlichen Lipidgehalte der Geschlechter vor Beginn der Exposition als nicht signifikant 
dokumentiert werden; ein Pooling aller männlichen und aller weib ­
lichen Fische kann u. U. erforderlich sein.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 987
 
Für jeden Test werden Fische mit vergleichbarem Gewicht gewählt, 
so dass die kleinsten nicht weniger als zwei Drittel des Gewichts der 
größten Tiere haben. Alle sollten derselben Altersgruppe angehören und dieselbe Herkunft haben. Da Gewicht und Alter eines Fisches häufig einen bedeutenden Einfluss auf die BCF-Werte (1) zu haben 
scheinen, werden diese Angaben sorgfältig dokumentiert. Das Wie ­
gen einer Teilprobe der Fischpopulation vor der Durchführung des Tests wird empfohlen, damit das Durchschnittsgewicht geschätzt werden kann.
 
1.8.2.4. B e s a t z  
Es wird ein hohes Wasser-Fisch-Verhältnis gewählt, damit die C  w - 
Reduzierung, die durch den Einsatz der Fische zu Beginn des Tests 
verursacht wird, minimiert und eine Abnahme der Konzentration an gelöstem Sauerstoff vermieden werden kann. Wichtig ist, dass die Besatzrate der jeweils verwendeten Testspezies angepasst ist. In der 
Regel wird auf jeden Fall eine Besatzrate von 0,1-1,0 g Fisch (Nass ­
gewicht) pro Liter Wasser pro Tag empfohlen. Höhere Besatzraten können gewählt werden, wenn nachgewiesen werden kann, dass die geforderte Konzentration der Prüfsubstanz innerhalb der Grenze von 
± 20 % gehalten werden kann und dass die Konzentration an gelös ­
tem Sauerstoff eine Sättigung von 60 % nicht unterschreitet.
 
Durch die Wahl der geeigneten Besatzrate wird dem normalen Ha ­
bitat der Fischspezies Rechnung getragen. Beispielsweise erfordern in der benthischen Zone lebende Fische bei gleicher Wassermenge u. 
U. eine größere Bodenfläche im Aquarium als pelagische Fischspe ­
zies.
 
1.8.2.5. F ü t t e r u n g  
Während der Akklimatisations- und der Testphase werden die Fische 
mit einem geeigneten Futter von bekanntem Lipid- und Gesamtpro ­
teingehalt in dem Maße gefüttert, dass sie gesund bleiben und das 
Körpergewicht erhalten wird. Die Fische werden während der ge ­
samten Dauer der Akklimatisations- und Testphase täglich mit einer Futtermenge von ca. 1 bis 2 % ihres Körpergewichts pro Tag gefüt ­
tert; auf diese Weise wird bei den meisten Fischspezies die Lipid ­
konzentration während des Tests auf einem relativ konstanten Niveau 
gehalten. Die Futtermenge sollte in regelmäßigen Abständen, zum Beispiel einmal pro Woche, neu berechnet werden, damit Körper ­
gewicht und Lipidgehalt konsistent gehalten werden. Für diese Be ­
rechnung sollte das Gewicht der Fische in den einzelnen Testkam ­
mern anhand des Gewichts der Fische geschätzt werden, die der Kammer zuletzt als Probe entnommen wurden. Wiegen Sie nicht das Gewicht der in der Kammer verbliebenen Fische.
 
Nicht gefressenes Futter und Exkremente werden täglich aus den 
Testkammern entfernt, und zwar kurz nach der Fütterung (30 Minuten bis 1 Stunde). Die Kammern werden während der gesamten Testdauer so sauber wie möglich gehalten, damit die Konzentration 
organischer Stoffe so gering wie möglich gehalten wird, da das Vor ­
handensein organischen Kohlenstoffs die Bioverfügbarkeit der Prüf ­
substanz (1) u. U. beeinträchtigen kann.
 
Da viele Futtersorten aus Fischmehl gewonnen werden, sollte das 
Futter auf die Prüfsubstanz untersucht werden. Eine Untersuchung 
des Futters auf Pestizide und Schwermetalle ist ebenfalls wünschens ­
wert. ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 988
 
1.8.2.6. L i c h t u n d T e m p e r a t u r  
Die Photoperiode beträgt in der Regel 12 bis 16 Stunden, und die 
Temperatur (± 2  o C) sollte den Testspezies (siehe Anlage 2) ange ­
passt sein. Art und Eigenschaften der Beleuchtung sollten bekannt 
sein. Eine mögliche Phototransformation der Prüfsubstanz unter den 
Bestrahlungsbedingungen der Untersuchung sollte berücksichtigt werden. Die Beleuchtung sollte so gewählt werden, dass eine Ex ­
position der Fische gegenüber unnatürlichen Photoprodukten vermie ­
den wird. In einigen Fällen mag die Verwendung eines Filters an ­
gebracht sein, um UV-Strahlungen unter 290 mm herauszufiltern.
 
1.8.2.7. T e s t k o n z e n t r a t i o n e n  
Die Fische werden unter Durchflussbedingungen mindestens zwei Kon ­
zentrationen der Prüfsubstanz in Wasser ausgesetzt. Normalerweise wer ­
den höhere (oder höchste) Konzentrationen der Prüfsubstanz gewählt, 
die ca. 1 % ihres akuten asymptotischen LC  50 -Wertes entsprechen und 
mindestens zehnmal höher sind als die durch das angewandte analytische Verfahren vorgegebene Nachweisgrenze in Wasser.
 
Die höchste Testkonzentration kann auch ermittelt werden, indem der 
akute 96h-LC  50 -Wert durch ein geeignetes Akut-chronisch-Verhältnis 
dividiert wird (bei einigen Chemikalien kann der Quotient zwischen 3 
und 100 liegen). Wenn möglich, wählen Sie die andere(n) Konzentrati ­
on(en) so, dass sie sich von der vorherigen um den Faktor zehn unter ­
scheidet. Sollte das aufgrund des Kriteriums eines LC  50 -Wertes von 1 % 
und der analytischen Grenze nicht möglich sein, sollte ein niedrigerer 
Faktor als zehn gewählt bzw. die Verwendung einer  14 C-markierten 
Prüfsubstanz erwogen werden. Keine Konzentration sollte oberhalb der Löslichkeit der Prüfsubstanz liegen.
 
Wird ein Lösungsvermittler verwendet, so sollte dessen Konzentra ­
tion nicht mehr als 0,1 ml/l betragen und in allen Versuchsbehält ­
nissen identisch sein. Sein Beitrag (zusammen mit dem der Prüfsub ­
stanz) zum Gesamtgehalt an organischem Kohlenstoff im Testwasser sollte bekannt sein. Die Verwendung solcher Stoffe sollte allerdings 
unter allen Umständen vermieden werden.
 
1.8.2.8. K o n t r o l l e n  
Zusätzlich zur Versuchsreihe sollte eine Verdünnungswasserkontrolle 
bzw. gegebenenfalls auch eine Kontrolle mit dem Lösungsvermittler 
vorgenommen werden, unter der Voraussetzung, dass keine Auswir ­
kungen dieses Stoffs auf die Fische festgestellt wurden. Falls nicht, sollten beide Kontrollen durchgeführt werden.
 
1.8.3.  Häufigkeit der Wasserqualitätsmessungen  
Während des Tests sollten der gelöste Sauerstoff, der TOC, der pH- 
Wert und die Temperatur in allen Behältnissen gemessen werden. 
Die Gesamthärte und gegebenenfalls die Salinität sollten in den Kon ­
trolllösungen und in einem Behältnis mit höherer (oder höchster) Konzentration gemessen werden. Der gelöste Sauerstoff und gegebe ­
nenfalls die Salinität sollten mindestens dreimal — zu Beginn, un ­
gefähr in der Mitte und am Ende der Aufnahmeperiode — sowie 
regelmäßig einmal pro Woche in der Ausscheidungsperiode gemes ­
sen werden. Der TOC sollte zu Beginn des Tests (24 bzw. 48 Std. vor Beginn der Aufnahmephase) vor dem Einsatz der Fische und 
sowohl während der Aufnahme- als auch der Ausscheidungsphase 
mindestens einmal pro Woche gemessen werden. Die Temperatur sollte täglich gemessen werden; der pH-Wert wird zu Beginn und am Ende jeder Testperiode, die Härte einmal pro Test festgestellt. 
Die Temperatur sollte in mindestens einem Gefäß möglichst kon ­
tinuierlich überprüft werden.
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1.8.4.  Probenahme und Analyse der Fisch- und Wasserproben  
1.8.4.1. F i s c h - u n d W a s s e r p r o b e n a h m e p l a n  
Vor dem Einsatz der Fische sowie während der Aufnahme- und der 
Ausscheidungsphase wird den Testkammern Wasser zur Bestimmung 
der Prüfsubstanzkonzentration entnommen. Wasserproben sollten 
mindestens so häufig entnommen werden wie die Fischproben, und zwar vor der Fütterung. Während der Aufnahmephase werden die Konzentrationen der Prüfsubstanz bestimmt, um die Übereinstim ­
mung mit den Validitätskriterien zu überprüfen.
 
Während der Aufnahmephase werden mindestens fünf Fischproben 
entnommen sowie mindestens vier während der Ausscheidungsphase. Da es sich in manchen Fällen als schwierig erweisen wird, anhand 
dieser Probenzahl eine einigermaßen genaue Schätzung des BCF 
vorzunehmen — insbesondere wenn es sich um keine reine Aus ­
scheidungskinetik erster Ordnung handelt —, kann es ratsam sein, in beiden Perioden größere Proben zu nehmen (siehe Anlage 4). Die 
zusätzlichen Proben werden aufbewahrt und nur dann analysiert, 
wenn sich die Ergebnisse des ersten Untersuchungszyklus für die Berechnung eines BCF-Werts der gewünschten Genauigkeit als un ­
zureichend erweisen.
 
Ein Beispiel für einen denkbaren Probenahmeplan wird in Anlage 4 
gegeben. Andere Pläne können leicht anhand anderer angenommener 
P ow -Werte errechnet werden, um die Expositionszeit für eine Auf ­
nahme von  95 % zu berechnen.  
Die Probenahme wird während der Aufnahmephase fortgesetzt, bis 
ein Fließgleichgewicht erreicht ist, höchstens aber 28 Tage. Stellt 
sich nach 28 Tagen immer noch kein Fließgleichgewicht ein, wird 
die Probenahme bis zur Erreichung des Fließgleichgewichts oder aber höchstens 60 Tage fortgesetzt. Vor Beginn der Ausscheidungs ­
phase werden die Fische in saubere Behältnisse umgesetzt.
 
1.8.4.2 P r o b e n a h m e u n d P r o b e n v o r b e r e i t u n g  
Wasserproben für die Analyse werden z. B. durch Absaugen mittels 
einer inerten Rohrleitung an einem zentralen Punkt der Testkammer 
gezogen. Da der nicht bioverfügbare Teil der Prüfsubstanz offensichtlich 
weder durch Filtration noch durch Zentrifugation von dem bioverfüg ­
baren getrennt werden kann (das gilt insbesondere für superlipophile Chemikalien, d. h. Chemikalien mit einem log P
 ow > 5) (1) (5), können 
die Proben diesen Verfahren nicht unterzogen werden.  
Stattdessen müssen entsprechende Vorkehrungen getroffen werden, 
um die Behältnisse so sauber wie möglich zu halten, und der Ge ­
samtgehalt an organischem Kohlenstoff sollte sowohl während der Aufnahme- als auch während der Ausscheidungsphase kontrolliert 
werden.
 
Bei jeder Probenahme wird eine angemessene Zahl von Fischen (in 
der Regel mindestens vier) den Testkammern entnommen. Die Fisch ­
proben sollten schnell mit Wasser gespült, „trockengetupft“ und un ­
verzüglich auf eine geeignete, möglichst humane Weise getötet und 
dann gewogen werden.  
Die Analyse der Fisch- und Wasserproben sollte vorzugsweise direkt 
nach der Probenahme erfolgen, damit ein Abbau oder sonstige Ver ­
luste vermieden werden und die ungefähre Aufnahme- und Ausschei ­
dungsgeschwindigkeit ermittelt werden können, während der Test 
fortgesetzt wird. Eine unverzügliche Analyse verhindert auch, dass 
ein Plateau zu spät erkannt wird.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 990
 
Kann keine sofortige Analyse vorgenommen werden, werden die 
Proben auf geeignete Weise aufbewahrt. Angaben über die für die 
betreffende Prüfsubstanz geeignete Aufbewahrungsmethode — bei ­
spielsweise Tiefkühlung, Lagerung bei 4  o C, Dauer der Aufbewah ­
rung, Extraktion usw. — werden vor Beginn der Untersuchung ein ­
geholt.  
1.8.4.3. Q u a l i t ä t d e r A n a l y s e m e t h o d e  
Da das gesamte Verfahren im Wesentlichen von der Zuverlässigkeit, 
Genauigkeit und Empfindlichkeit der für die Prüfsubstanz verwende ­
ten Analysemethoden abhängt, muss in Versuchen überprüft werden, 
ob die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der chemischen Analyse sowie die Wiederfindung der Prüfsubstanz aus Wasser und Fischen für die betreffende Methode geeignet sind. Ferner muss darauf ge ­
achtet werden, dass die Prüfsubstanz im verwendeten Verdünnungs ­
wasser nicht nachweisbar ist.
 
Gegebenenfalls müssen die durch den Test ermittelten C  w - und C  f - 
Werte um die Wiederauffindung und Background-Werte der Kon ­
trollen berichtigt werden. Die Fisch- und Wasserproben werden stets so behandelt, dass Verunreinigungen und Verluste (z. B. infolge von 
Adsorption durch das Probenahmegerät) minimiert werden.
 
1.8.4.4. A n a l y s e d e r F i s c h p r o b e n  
Werden für den Test radioaktiv markierte Stoffe verwendet, können 
die Proben entweder auf ihre gesamte radioaktive Markierung ana ­
lysiert (d. h. Ausgangsverbindung und Metaboliten) oder aber gerei ­
nigt werden, so dass die Ausgangsverbindung separat untersucht werden kann. Ebenso können die Hauptmetaboliten im Fließgleich ­
gewicht oder gegen Ende der Aufnahmephase bestimmt werden, je 
nachdem, was eher eintritt. Wenn der BCF im Verhältnis zu den gesamten radioaktiv markierten Rückständen ≥ 1 000 % beträgt, ist 
es u. U. ratsam — und bei gewissen Chemikalien wie Pestiziden 
unbedingt empfehlenswert — die Abbauprodukte zu identifizieren 
und zu quantifizieren, die ≥ 10 % des Gesamtrückstands in Fisch ­
geweben im Fließgleichgewicht ausmachen. Wenn die Abbauproduk ­
te, die ≥ 10 % des gesamten radioaktiv markierten Rückstands in den 
Fischgeweben ausmachen, identifiziert und quantifiziert werden, 
dann sollten auch die Abbauprodukte im Testwasser identifiziert und quantifiziert werden.
 
Die Konzentration der Prüfsubstanz sollte in der Regel für jeden 
gewogenen Fisch einzeln bestimmt werden. Ist dies nicht möglich, ist bei jeder Probenahme ein Pooling der Proben zulässig, doch wird 
durch das Pooling die Zahl der statistischen Verfahren eingeschränkt, 
die auf die Daten anwendbar sind. Sollte auf ein spezielles statisti ­
sches Verfahren bzw. eine bestimmte statistische Aussagekraft Wert gelegt werden, dann muss im Test (6) (7) eine Zahl von Fischen 
eingesetzt werden, die dem Pooling und der gewünschten Aussage ­
kraft Genüge leistet.
 
Der BCF sollte sowohl im Verhältnis zum gesamten Nassgewicht als 
auch (bei hochlipophilen Substanzen) im Verhältnis zum Lipidgehalt ausgedrückt werden. Der Lipidgehalt der Fische wird möglichst bei jeder Probenahme bestimmt. Zur Bestimmung des Lipidgehalts soll ­
ten geeignete Methoden (siehe Literaturhinweise 8 und 2 zu Anlage 
3) verwendet werden, wobei ein Chloroform/Methanol-Extraktions ­
verfahren als Standardmethode empfohlen wird (9). Die verschiede ­
nen Methoden führen zu unterschiedlichen Werten (10); daher ist es 
wichtig, Einzelheiten über die verwendete Methode anzugeben. Die 
Lipidanalyse sollte möglichst an dem Extrakt vorgenommen werden, das für die Untersuchung der Prüfsubstanz hergestellt wurde, da die Lipide häufig erst aus dem Extrakt entfernt werden müssen, bevor 
dieses chromatografisch analysiert werden kann. Der Lipidgehalt der 
Fische (in mg/kg Nassgewicht) sollte am Ende des Versuchs um nicht mehr als ± 25 % von dem zu Beginn ermittelten Wert abwei ­
chen. Der Anteil fester Bestandteile im Gewebe sollte ebenfalls do ­
kumentiert werden, um eine Umrechnung der Lipidkonzentration 
vom Nass- zum Trockengewicht zu ermöglichen.
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2. DATEN  
2.1. BEHANDLUNG DER ERGEBNISSE  
Die Aufnahmekurve der Prüfsubstanz ergibt sich, indem ihre Kon ­
zentration in/auf den Fischen (oder bestimmten Gewebeteilen) in der 
Aufnahmephase gegen die Zeit auf einer arithmetischen Skala auf ­
getragen wird. Wenn die Kurve ein Plateau erreicht hat, d. h. nahezu asymptotisch zur Zeitachse ist, wird der steady-state BCF
 ss errechnet 
anhand:  
C f als Fließgleichgewicht  ðDurchschnittÞ 
C w als Fließgleichgewicht  ðDurchschnittÞ 
Wird kein Fließgleichgewicht erzielt, ist es für eine Bewertung der 
Gefährdung u. U. möglich, einen einigermaßen genauen BCF  SS an­
hand eines „Fließgleichgewichts“ von 80 % (1,6/k  2 ) oder 95 % 
(3,0/k  2 ) zu berechnen.  
Ebenso wird der Konzentrationsfaktor (BCF  k ) als Quotient k  1 /k 2 (der 
beiden kinetischen Konstanten erster Ordnung) ermittelt. Die Aus ­
scheidungskonstante (k  2 ) wird in der Regel aus der Ausscheidungs ­
kurve abgeleitet (d. h. einer grafischen Darstellung der Abnahme der Prüfsubstanzkonzentration in den Fischen mit der Zeit). Die Auf ­
nahmekonstante (k
 1 ) wird dann anhand des gegebenen Wertes k  2 
und einem C  1 -Wert berechnet, der sich aus der Aufnahmekurve ab ­
leitet (siehe auch Anlage 5). Die bevorzugte Methode zur Berech ­
nung des BCF  k und der Geschwindigkeitskonstanten k  1 und k  2 ist 
eine computergestützte nichtlineare Parameterschätzung (11). An ­
sonsten können grafische Methoden zur Berechnung von k  1 und k  2 
verwendet werden. Wenn die Ausscheidungskurve offensichtlich 
nicht erster Ordnung ist, sollten komplexere Modelle herangezogen werden (siehe Literaturhinweise zu Anlage 3) und der Rat eines 
Biostatistikers eingeholt werden.
 
2.2. ERGEBNISBEWERTUNG  
Ergebnisse, bei denen die gemessenen Konzentrationen der Testlö ­
sungen nahe der Nachweisgrenze des Analyseverfahrens liegen, soll ­
ten mit Vorsicht interpretiert werden.  
Klar abgegrenzte Aufnahme- und Ausscheidungskurven weisen auf 
eine gute Qualität der Biokonzentrationsdaten hin. Die Schwankun ­
gen der Aufnahme-/Ausscheidungskonstanten sollten bei den beiden 
Testkonzentrationen weniger als 20 % betragen. Werden erhebliche 
Unterschiede bei den Aufnahme-Ausscheidungsgeschwindigkeiten zwischen den beiden eingesetzten Testkonzentrationen beobachtet, sollten diese dokumentiert und mögliche Erklärungen gesucht wer ­
den. Bei einem guten Versuchsaufbau nähert sich die Konfidenz ­
grenze der BCF im Allgemeinen ± 20 %.
 
3. ABSCHLUSSBERICHT  
Der Testbericht muss folgende Angaben enthalten:  
3.1. PRÜFSUBSTANZ  
— physikalischer Zustand und gegebenenfalls physikalisch-che ­
mische Eigenschaften  
— chemische Identifizierungsdaten (einschließlich des organischen 
Kohlenstoffgehalts, falls angemessen)  
— bei radioaktiv markierten Substanzen, die genaue Position des 
markierten Atoms (der Atome) und der prozentuale Anteil der 
auf Verunreinigungen zurückzuführenden Radioaktivität.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 992
 
3.2. TESTSPEZIES  
— wissenschaftlicher Name, Stamm, Herkunft, eventuelle Vor ­
behandlungen, Akklimatisation, Alter, Größenbereich usw.  
3.3. PRÜFBEDINGUNGEN  
— verwendetes Prüfverfahren (z. B. Durchflussverfahren, semistati ­
sches Verfahren)  
— Art und Eigenschatten der verwendeten Beleuchtung und Phot ­
operiode(n)  
— Versuchsaufbau (z. B. Zahl und Größe der Testkammern, Was ­
servolumen-Austauschrate, Zahl der Versuchswiederholungen, Zahl der Fische pro Versuchswiederholung, Zahl der Testkonzen ­
trationen, Dauer der Aufnahme- und Ausscheidungsphase, Häu ­
figkeit der Entnahme von Fisch- und Wasserproben)
 
— Vorbereitung der Stammlösungen und Erneuerungshäufigkeit 
(falls verwendet, müssen Angaben zum Lösungsvermittler, seiner Konzentration und seinem Beitrag zum organischen Kohlenstoff ­
gehalt des Testwassers gemacht werden)
 
— die nominellen Testkonzentrationen, der Durchschnitt der gemes ­
senen Werte sowie deren Standardabweichungen in den Testbe ­
hältnissen sowie das Verfahren, durch das diese ermittelt wurden  
— Quelle des Verdünnungswassers, Beschreibung aller Vorbehand ­
lungen, Ergebnisse aller Nachweise, dass die Versuchsfische in 
dem Wasser überleben können, sowie Wassereigenschaften: pH- Wert, Härte, Temperatur, Konzentration des gelösten Sauerstoffs, Restchlor (falls gemessen), TOC, suspendierte Feststoffe, Salini ­
tät des Testmediums (gegebenenfalls) sowie die Ergebnisse aller 
anderen durchgeführten Messungen
 
— Wasserqualität innerhalb der Testbehältnisse, pH-Wert, Härte, 
TOC, Temperatur und Konzentration des gelösten Sauerstoffs  
— ausführliche Angaben zur Fütterung (z. B. Art des Futters, Her ­
kunft, Zusammensetzung — zumindest der Lipid- und Protein ­
gehalt — Fütterungsmenge und Häufigkeit)  
— Angaben zur Behandlung der Fisch- und Wasserproben, ein ­
schließlich aller Einzelheiten über Vorbereitung, Lagerung, Ex ­
traktion und Analyseverfahren (und -genauigkeit) in bezug auf 
die Prüfsubstanz und den Lipidgehalt (falls gemessen).  
3.4 ERGEBNISSE  
— Ergebnisse aller durchgeführten Voruntersuchungen  
— Mortalität der Kontrollfische und der Fische in den einzelnen 
Expositionskammern sowie jegliches beobachtetes anormales Verhalten
 
— der Lipidgehalt der Fische (falls in der Prüfung ermittelt)  
— Kurven (einschließlich aller gemessenen Daten) der Aufnahme 
und der Ausscheidung der Prüfchemikalie durch die Fische, die 
Zeit bis zur Einstellung des Fließgleichgewichts  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 993
 
— C  f und C  w (gegebenenfalls mit Standardabweichung und Abwei ­
chungsbereich) für alle Probenahmen (wobei C  f in μg/g Nass­
gewicht (ppm) des Ganzkörpers oder bestimmter Gewebeteile, z. B. Lipid und C
 w in μg/ml (ppm), ausgedrückt wird). Auch 
die C  w -Werte für die Kontrollreihe (Background) sollten doku ­
mentiert werden  
— der steady-state Biokonzentrationsfaktor (BCF  SS ) und/oder der 
kinetische Konzentrationsfaktor (BCF  k ) sowie gegebenenfalls 
die 95 %-Konfidenzgrenzen für die Aufnahme- und Ausschei ­
dungskonstanten (alle ausgedrückt im Verhältnis zum Ganzkör ­
per und zum Gesamtlipidgehalt (falls gemessen) des Tieres oder 
bestimmter Gewebeteile), die Konfidenzgrenzen und die Stan ­
dardabweichung (sowie verfügbar) sowie Berechnungs-/ Datenanalyseverfahren für jede Konzentration der verwendeten 
Prüfsubstanz
 
— wenn radioaktiv markierte Substanzen verwendet werden bzw. 
wenn es erforderlich ist, muss die Akkumulation aller nachgewie ­
senen Metaboliten angegeben werden  
— alle Besonderheiten im Zusammenhang mit dem Test, alle Ab ­
weichungen von den genannten Verfahren sowie alle weiteren 
relevanten Informationen.  
Ergebnisse der Art „bis zur Nachweisgrenze nicht nachweisbar“ soll ­
ten durch die Entwicklung von Vortestverfahren und einen entspre ­
chenden Versuchsaufbau vermieden werden, da diese nicht für die 
Berechnung der Geschwindigkeitskonstanten herangezogen werden 
können.  
4. LITERATURHINWEISE  
(1) Connell D.W. (1988). Biouccumulation behaviour of persistent 
chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. To ­
xicol. 102, 117-156.  
(2) Bintein S., Devillers J. and Karelier W. (1993). Nonlinear 
dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water par ­
tition coefficient. SAR und QSAR in Environmental Research, 1, 29-390.
 
(3) OECD, Paris (1996). Direct Phototransformation of Chemicals 
in Water. Environmental Health and Safety Guidance Docu ­
ment Series on Testing and Assessment of Chemicals. Nr. 3.  
(4) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: Comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM tes ­
ting methods; influence of particulate organic matter to the 
bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.  
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Ini ­
tiative Technical Support Doc. for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.
 
(6) US FDA, (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide 
analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 
20852, July 1975.  
(7) US EPA (1974). Section 5. A (1) Analysis of Human Adipose 
Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Envi ­
ronmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Research Triangle 
Park, N.C. 27711.  
(8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic invironment: degradation, toxicity, bioaccumulation“ Ch. 2.3, 
Part II. Government Publishing Office, the Hague, The Nether ­
lands.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 994
 
(9) Gardner et al, (1995) Limn. & Oceanogr. 30, 1099-1105.  
(10) Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. 
(1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising 
pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, 1431- 1436.
 
(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the 
flow-through method-Ring Test Programme, 1984- 
1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and 
N. Nyholm.  
(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988) Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater 
Bivalve Molluscs.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 995
 
Anlage 1  
Chemische Eigenschaften eines geeigneten Verdünnungswassers  
Substanz Grenzkonzentration  
1 Partikelstoffe 5 mg/l 
2 Gesamter organischer Kohlenstoff 2 mg/l 3 Nichtionisiertes Ammoniak 1 μg/l 
4 Restchlor 10 μg/l 
5 Gesamte phosphororganische Pestizide 50 ng/l 6 Gesamte chlororganische Pestizide sowie polychlorierte 
Biphenyle 50 ng/l 
7 Gesamter organischer Chlorgehalt 25 ng/l 
8 Aluminium 1 μg/l 
9 Arsen 1 μg/l 
10 Chrom 1 μg/l 
11 Kobalt 1 μg/l 
12 Kupfer 1 μg/l 
13 Eisen 1 μg/l 
14 Blei 1 μg/l 
15 Nickel 1 μg/l 
16 Zink 1 μg/l 
17 Cadmium 100 ng/l 18 Quecksilber 100 ng/l 19 Silber 100 ng/l
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 996
 
Anlage 2  
Für den Test empfohlene Fischspezies  
Empfohlene Spezies Empfohlener 
Bereich der 
Testtemperatur (  o C) Empfohlene 
Gesamtlänge der 
Versuchstiere 
(cm) 
1 Danio rerio (  1 ) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton- 
Buchanan) Zebrabärbling 20-25 3,0 ± 0,5 
2 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) 
(Rafinesque) Dickkopf-Elritye 20-25 5,0 ± 2,0 
3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linna ­
eus) Karpfen 20-25 5,0 ± 3,0 
4 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck 
und Schlegel) Japanischer Reisfisch 20-25 4,0 ± 1,0 
5 Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) 
Guppy 20-25 3,0 ± 1,0 
6 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) 
(Rafinesque) Blauer Sonnenbarsch 20-25 5,0 ± 2,0 
7 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) 
(Walbaum) Regenbogenforelle 13-17 8,0 ± 4,0 
8 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) 
(Linnaeus) Dreistachliger Stichling 18-20 3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A, Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B, Vol. 252, p. 231.  
In verschiedenen Ländern wurden unterschiedliche Ästuarine- und Meeresspezies verwendet, bei ­
spielsweise: 
Umberfisch Leiostomus xanthurus 
Edelsteinkärpfling Cyprinodon variegatus 
Gezeiten-Ährenfisch Menidia beryllina 
Juwelflussbarsch Cymatogaster aggregata Englische Seezunge Parophrys vetulus 
Geweihgroppe Leptocottus armatus 
Dreistachliger Stichling Gasterosteus aculeatus Sägebarsch Dicentracus labrax Ukelei Alburnus alburnus
 
Zusammenstellung  
Die in obenstehender Tabelle aufgeführten Süßwasserfische sind leicht zu züchten oder stehen 
größtenteils ganzjährig zur Verfügung, wohingegen die Verfügbarkeit der Ästuarinen- und Mee ­
resspezies teilweise auf bestimmte Länder beschränkt ist. Sie können entweder in Teichwirtschaften 
oder im Labor unter krankheits- und parasitenkontrollierten Bedingungen gezüchtet und aufgezogen werden, so dass man gesunde Versuchstiere hat, deren Abstammung bekannt ist. Diese Fische sind in vielen Teilen der Welt verfügbar.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 997
 
Anlage 3  
Vorhersage der Dauer der Aufnahme- und der Abbauphase  
1. Vorhersage der Dauer der Aufnahmephase  
Vor der Durchführung des Tests kann ein geschätzter Wert k  2 und damit 
ein prozentualer Teil der für die Erreichung des Fließgleichgewichts benö ­
tigten Zeit aus den empirischen Beziehungen zwischen k  2 und dem n- 
Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten (P  ow ) bzw. zwischen k  2 und der 
Wasserlöslichkeit (s) abgeleitet werden.  
So lässt sich k  2 (Tag  –1 ) beispielsweise anhand folgender empirischer Be ­
ziehung (1) schätzen: 
log 10 k 2 = - 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47 (r  2 = 0,95) (Gleichung 1)  
Für weitere Beziehungen siehe Literaturhinweise (2).  
Ist der Verteilungskoeffizient (P  ow ) nicht bekannt, kann dieser (3) anhand 
der bekannten Wasserlöslichkeit (s) der Substanz geschätzt werden: 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) (Gleichung 2)  
wobei  
s = Löslichkeit (Mol/l) : (n = 36)  
Diese Beziehungen gelten nur für Chemikalien mit log P  ow -Werten zwi ­
schen 2 und 6,5 (4).  
Die Zeit bis zur Einstellung eines gewissen Prozentsatzes des Fließgleich ­
gewichts kann — durch Anwendung des Schätzwertes k  2 — aus der all ­
gemeinen kinetischen Gleichung, die die Aufnahme und die Ausscheidung 
(Kinetik erster Ordnung) beschreibt, abgeleitet werden:  
dC f 
dt ¼ k 1 · C w Ä k 2 · C f 
oder, wenn C  w konstant ist:  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ (Gleichung 3)  
Bei Annäherung an das Fließgleichgewicht (t → ∞) kann Gleichung 3 
reduziert werden (5) (6) zu:  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w oder C f /C w = k  1 /k 2 = BCF  
Damit stellt (k  1 /k 2 ) · C w eine Annäherung an die Konzentration in den 
Fischen im „Fließgleichgewicht“ (C  f, s ) dar.  
Gleichung 3 kann umgeformt werden in:  
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ oder  C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t (Gleichung 4)  
Bei Anwendung von Gleichung 4 kann die Zeit bis zur Herstellung eines 
gewissen Gleichgewichtsprozentsatzes vorhergesagt werden, wenn k  2 zuvor 
anhand der Gleichungen 1 oder 2 geschätzt wurde.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 998
 
Als Richtschnur gilt, dass die statistisch optimale Dauer der Aufnahme ­
phase für die Ableitung statistisch brauchbarer Daten (BCF  k ) die Zeit ist, 
die benötigt wird, bis die gegen die lineare Zeit aufgetragene Logarithmus ­
kurve der Prüfsubstanzkonzentration in den Fischen ihren Mittelpunkt bzw. 1,6/k
 2 oder ein 80 %iges Fließgleichgewicht, jedoch nicht mehr als 3,0/k  2 
oder 95 %iges Fließgleichgewicht (7) erreicht.  
Die Zeit zur Herstellung eines 50 %igen Fließgleichgewichts entspricht 
(Gleichung 4):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 oder t 80 ¼ 1; 6 
k 2 (Gleichung 5)  
Dementsprechend gilt für ein 95 %iges Fließgleichgewicht:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 (Gleichung 6)  
Demnach wäre beispielsweise die Dauer der Aufnahmephase (ap) für eine 
Prüfsubstanz mit log P  ow = 4 (unter Anwendung der Gleichungen 1, 5, 6): 
log 10 k 2 = - 0,414 . (4) + 1,47 k  2 = 0,652 Tage  -1 
ap (80 %) = 1,6/0,652, d. h. 2,45 Tage (59 Stunden)  
oder ap (95 %) = 3.0/0,652, d. h. 4,60 Tage (110 Stunden).  
Für eine Prüfsubstanz mit s = 10  -5 Mol/l (log(s) = - 5,0) wäre die Dauer der 
ap (unter Anwendung der Gleichungen 1, 2, 5, 6) entsprechend:  
log 10 (P ow ) = - 0,862 . (– 5,0) + 0,710 = 5,02  
log 10 k, = - 0,414 . (5,02) + 1,47  
k 2 = 0,246 Tage  –1 
ap (80 %) = 1,6/0,246, d. h. 6,5 Tage (156 Stunden)  
oder ap (95 %) = 3,0/0,246, d. h. 12,2 Tage (293 Stunden)  
Alternativ kann der Ausdruck:  
t eq = 6,54 . 10  -3 P ow + 55,31 (Stunden)  
zur Berechnung der Zeit bis zur Herstellung des effektiven Fließgleichge ­
wichts verwendet werden (4).  
2. Vorhersage der Dauer der Ausscheidungsphase  
Die Vorhersage der Zeit, die für die Reduzierung der Körperbelastung auf 
einen gewissen Prozentsatz der ursprünglichen Konzentration benötigt 
wird, kann auch aus der allgemeinen kinetischen Gleichung erster Ord ­
nung über die Aufnahme und die Ausscheidung (1) (8) abgeleitet werden.  
Für die Ausscheidungsphase wird C  w als Null angenommen. Die Glei ­
chung kann reduziert werden zu:  
dC f 
dt ¼ Ä k 2 C f oder C f ¼ C f;o · e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 999
 
wobei  C f, o die Konzentration zu Beginn der Ausscheidungsperiode be ­
zeichnet. Eine 50 %ige Ausscheidung wird dann erreicht bei (t  50 ): 
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 oder t 50 ¼ 0; 693 
k 2 
Dementsprechend wird eine 95 %ige Ausscheidung erreicht bei:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Bei einer 80 %igen Aufnahme in der ersten Periode (1,6/ k 2 ) und einem 
95 %igen Verlust in der Ausscheidungsphase (3,0/ k 2 ) wird die Ausschei ­
dungsphase ungefähr doppelt so lange wie die Aufnahmephase dauern.  
Es ist jedoch wichtig festzuhalten, dass die Schätzungen auf der Annahme 
beruhen, dass die Aufnahme- und Ausscheidungsmuster einer Kinetik ers ­
ter Ordnung folgen. Wenn es sich jedoch offensichtlich nicht um eine Kinetik erster Ordnung handelt, müssen komplexere Modelle verwendet werden (z. B. Literaturhinweis (1)).
 
Literaturhinweise  (zu Anlage 3)  
(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (15S2) Alternative modeis for describing 
the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, 309-320.
 
(2) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCF’s 
derived from OECD and ASTM testing methods; influence of par ­
ticulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Qua ­
lity Institute.  
(3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982) Partitioning of organic 
compounds in octanol-water Systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), 
4-10.  
(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988) Influence of partition coef ­
ficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), 701-707.
 
(5) Branson D.R.. Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975) 
Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), 785-792.  
(6) Ernst W. (1985) Accumulation in Aquatic Organisms. In: Appraisal of 
tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4, 243- 
255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N.Y.
 
(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff 
M.W. (1977) Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. 
Eng. 55, 614-622.
 
(8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980) Toxicokinetics in Fish: 
Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, 3-19.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1000
 
Anlage 4  
Theoretisches Beispiel für einen Probenahmeplan für Biokonzentrationstests bei Substanzen mit log P  ow = 4 
Probenahme Fische Probenahmezeitplan 
Anzahl der Wasserproben Anzahl der Fische pro 
Probe Erforderliche Mindest ­
häufigkeit (Tage) Zusätzliche Probenahmen  
Aufnahmephase -1 
0 2 (*) 
2 Zugabe von 45-80 Fi ­
schen 
1. 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
2. 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
3. 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
4. 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
5. 4,7 2 6 
Ausscheidungsphase Umsetzung der Fische 
in Wasser ohne die 
Prüfchemikalie 
6. 5,0 5,3 4 
(4) 
7. 5,9 7,0 4 
(4) 
8. 9,3 11,2 4 
(4) 
9. 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Probewasser nachdem mindestens 3 „Kammer-Inhalte“ geliefert wurden. 
Die Werte in Klammern bezeichnen die Anzahl der Proben (Wasser, Fisch), die bei einer zusätzlichen Probenahme genommen werden 
müssen.  
Anm. : Der in Vortests ermittelte Schätzwert von k  2 für einen log P  ow gleich 4,0 beträgt 0,652 Tage  –1 . Die Gesamtdauer des Versuchs 
wird auf 3 × ap = 3 × 4,6 Tage, d. h. 14 Tage festgelegt. Zur Schätzung von „ap“ siehe Anlage 3.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1001
 
Anlage 5  
Modelldiskriminierung  
Man geht davon aus, dass die meisten Biokonzentrationsdaten durch ein ein ­
faches Zwei-Kompartiment-/Zwei-Parameter-Modell „einigermaßen“ gut dar ­
gestellt werden, wie aus der geradlinigen Kurve ersichtlich ist, die sich den 
Punkten für die Konzentrationen in den Fischen während der Ausscheidungs ­
phase annähert, wenn diese auf semilogarithmischem Papier aufgetragen werden. (Wenn diese Punkte nicht durch eine geradlinige Kurve beschrieben werden können, sollten komplexere Modelle verwendet werden, siehe z. B. Spa ­
cie und Hamelink, Literaturhinweis 1 in Anlage 3).
 
Grafische Methode zur Bestimmung der Ausscheidungskonstanten k  2 
Tragen Sie die in den einzelnen Fischproben festgestellten Prüfsubstanzkonzen ­
trationen gegen die Probenahmezeit auf semilogarithmischem Papier ab. Die Neigung dieser Linie bezeichnet k
 2 . 
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Beachten Sie, dass Abweichungen von einer geraden Linie auf ein komplexeres 
Ausscheidungsmuster als eine Kinetik erster Ordnung hindeuten können. Für eine 
Auswertung von Ausscheidungsvorgängen, die nicht einer Kinetik erster Ord ­
nung entspricht, kann eine grafische Methode gewählt werden.  
Grafische Methode zur Bestimmung der Aufnahmekonstanten k  1 
Bei gegebenem K  2 wird k  1 wie folgt berechnet:  
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ (Gleichung 1)  
Der Wert C  f wird vom Mittelpunkt der glatten Aufnahmekurve abgelesen, die 
entsteht, wenn die log Konzentration gegen die Zeit (auf einer arithmetischen 
Skala) aufgetragen wird.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1002
 
Computergestütztes Verfahren zur Berechnung der Aufnahme- und 
Ausscheidungskonstanten  
Für die Berechnung des Biokonzentrationsfaktors sowie der Geschwindigkeits ­
konstanten k  1 und k  2 wird der Einsatz computergestützter, nichtlinearer Verfah ­
ren zur Parameterschätzung bevorzugt. Diese Programme bestimmen die Werte 
k 1 und k  2 basierend auf einem gegebenen Satz von über die Zeit ermittelten 
Konzentrationsdaten und dem Modell:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü 1 Ä e Äk 2 t Ê Ì  
0 < t < t  c (Gleichung 2)  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü e Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Ê Ì  
t > t  c (Gleichung 3)  
wobei t  c die Zeit am Ende der Aufnahmephase bezeichnet.  
Durch diesen Ansatz wird die Standardabweichung von k  1 und k  2 geschätzt.  
Da k  2 zumeist anhand der Ausscheidungskurve mit relativ hoher Genauigkeit 
geschätzt werden kann und weil es eine starke Korrelation zwischen den beiden Parametern k
 1 und k  2 gibt, wenn sie gleichzeitig geschätzt werden, kann es u. U. 
ratsam sein, k  2 zunächst lediglich anhand der Ausscheidungsdaten abzuleiten und 
anschließend k  1 anhand der Aufnahmedaten mittels nichtlinearer Regression zu 
berechnen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1003
 
C.14.  WACHSTUMSTEST AN JUNGFISCHEN  
1. METHODE  
Diese Methode für einen Wachstumstest zur Toxizitätsbestimmung 
entspricht der OECD TG 215 (2000).  
1.1. EINLEITUNG  
Anhand dieses Tests sollen die Auswirkungen einer lang anhaltenden 
Chemikalienexposition auf das Wachstum von Jungfischen bewertet 
werden. Er beruht auf einer Methode, bei der die Auswirkungen von 
Chemikalien auf das Wachstum junger Regenbogenforellen (Oncor ­
hynchus mykiss) unter Durchflussbedingungen bewertet werden. Sie wurde in der Europäischen Union entwickelt und einem Ringtest 
unterzogen (1) (2). Auch andere gut dokumentierte Spezies sind 
dafür geeignet. So liegen beispielsweise Erfahrungen mit Wachs ­
tumstests an Zebrabärblingen (Danio rerio) (2) (3) (4) und Reiskär ­
pflingen (Medaka,  Oryzias latipes)  vor (5) (6) (7).
 
Siehe auch Allgemeine Einführung Teil C.  
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Lowest Observed Effect Concentration — LOEC  (niedrigste Kon ­
zentration mit beobachteter Wirkung): die geringste getestete Kon ­
zentration einer Prüfsubstanz, bei der verglichen mit den Kontrollen eine signifikante Wirkung der Substanz zu beobachten ist (bei p 
< 0,05). Jedoch müssen alle Testkonzentrationen, die die LOEC 
übersteigen, verglichen mit dieser eine ebenso große oder größere Schadwirkung haben.
 
No Observed Effect Concentration — NOEC ( Konzentration ohne 
beobachtete Wirkung): die Testkonzentration unmittelbar unterhalb der LOEC.
 
EC X : Bei dieser Testmethode ist dies die Konzentration der Prüf ­
substanz, die verglichen mit den Kontrollen eine Veränderung von x % in der Wachstumsrate der Fische hervorruft.
 
Besatzrate:  Feuchtgewicht der Fische pro Volumen Wasser.  
Besatzdichte:  Zahl der Fische je Volumenteil Wasser.  
Individuelle spezifische Wachstumsrate des Fisches:  Wachstums ­
rate eines Individuums auf der Grundlage seines Ausgangsgewichts.  
Durchschnittliche spezifische Wachstumsrate je Behältnis:  mitt­
lere Wachstumsrate des Besatzes eines Prüfgefäßes bei einer be ­
stimmten Konzentration.  
Pseudo-spezifische Wachstumsrate:  Wachstumsrate eines einzelnen 
Fisches im Vergleich zum mittleren Ausgangsgewicht des Besatzes 
eines Prüfgefäßes.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1004
 
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Jungfische in der Phase exponentiellen Wachstums werden nach dem 
Wiegen in Testkammern eingebracht und einer Reihe subletaler Kon ­
zentrationen der in Wasser gelösten Prüfsubstanz ausgesetzt; dies 
geschieht vorzugsweise unter Durchflussbedingungen oder, sollte 
dies nicht möglich sein, unter geeigneten semistatischen Bedingun ­
gen (statisch mit Erneuerung). Die Testdauer beträgt 28 Tage. Die Fische werden täglich gefüttert. Die Futterration richtet sich nach 
dem Ausgangsgewicht der Fische und wird gegebenenfalls nach 14 
Tagen neu berechnet. Am Ende der Prüfung werden die Fische erneut gewogen. Die Auswirkungen auf die Wachstumsraten werden 
anhand eines Regressionsmodells analysiert, um diejenige Konzen ­
tration zu ermitteln, die eine Veränderung der Wachstumsrate von x % hervorruft, d. h. EC
 X (z. B. EC  10 , EC  20 oder EC  30 ). Wahlweise 
können die Daten mit denen von Kontrollgruppen verglichen wer ­
den, um die LOEC (niedrigste Konzentration mit beobachteter Wir ­
kung) und damit die NOEC (Konzentration ohne beobachtete Wir ­
kung) zu bestimmen.  
1.4. ANGABEN ZUR PRÜFSUBSTANZ  
Es müssen die Ergebnisse einer Untersuchung der akuten Toxizität 
(siehe Prüfmethode C.1) vorliegen, die vorzugsweise mit der für diesen Test ausgewählten Spezies durchgeführt wurde. Damit sind Wasserlöslichkeit und Dampfdruck der Prüfsubstanz bekannt, und es 
steht eine zuverlässige Analysemethode zur Quantifizierung der Sub ­
stanz in den Testlösungen mit bekannter und dokumentierter Genau ­
igkeit und bekannter Nachweisgrenze zur Verfügung.
 
Weitere nützliche Informationen sind die Strukturformel, der Rein ­
heitsgrad der Substanz, die Wasser- und Lichtbeständigkeit, pK  a , P ow 
und die Ergebnisse einer Prüfung auf leichte biologische Abbaubar ­
keit (siehe Prüfmethode C.4).  
1.5. VALID1TÄT DES TESTS  
Damit der Test gültig ist, müssen folgende Bedingungen gegeben 
sein:  
— Am Ende der Prüfung darf die Mortalität bei der (den) Kontroll ­
gruppe(n) 10 % nicht überschreiten.  
— Das mittlere Gewicht der Fische in der (den) Kontrollgruppe(n) 
muss in einem solchen Maß zugenommen haben, dass die für signifikant erachtete Mindestveränderung der Wachstumsrate 
nachgewiesen werden kann. Ein Ringtest (2) hat ergeben, dass 
bei Regenbogenforellen das mittlere Gewicht der Fische in den Kontrollgruppen im Laufe von 28 Tagen um mindestens die Hälfte (d. h. 50 %) des mittleren Ausgangsgewichts zugenommen 
haben muss. Beispiel: 1 g/Fisch (= 100 %), Abschlussgewicht 
nach 28 Tagen: > 1,5 g/Fisch (> 150 %).
 
— Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff muss für die gesamte 
Dauer des Tests mindestens 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungs ­
werts betragen.  
— Für die Dauer des Tests dürfen sich die Wassertemperaturen im 
Vergleich zwischen den Testkammern zu keiner Zeit um mehr als ± 1
 o C unterscheiden und innerhalb des für die Testspezies 
festgelegten Temperaturbereichs um höchstens 2  o C schwanken 
(Anlage 1).  
1.6. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.6.1.  Apparatur  
Normale Laborgeräte, darunter insbesondere folgende:  
— a) Sauerstoff- und pH-Messgerät;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1005
 
— b) Geräte zur Bestimmung von Wasserhärte und -alkalität;  
— c) geeignete Geräte zur Temperaturregelung und vorzugsweise 
zur fortlaufenden Überwachung;  
— d) Behältnisse aus chemisch inertem Material und mit einem dem 
empfohlenen Besatz und der Besatzdichte entsprechenden Fas ­
sungsvermögen (siehe Abschnitt 1.8.5 und Anlage 1);  
— e) Waage mit ausreichender Genauigkeit (d. h. auf ± 0,5 % ge ­
nau).  
1.6.2.  Wasser  
Als Testwasser eignet sich jedes Wasser, in dem ein ausreichend 
langes Überleben und ein ausreichendes Wachstum der Testspezies 
möglich sind. Es muss für die Dauer des Tests von gleichbleibend 
guter Qualität sein. Der pH-Wert des Wassers soll zwischen 6,0 und 8,5 liegen, jedoch während eines bestimmten Tests um nicht mehr als ± 0,5 pH-Einheiten schwanken. Es wird eine Härte von mehr als 
140 mg/l (als CaCO
 3 ) empfohlen. Um sicherzugehen, dass das Ver ­
dünnungswasser das Testergebnis nicht übermäßig stark beeinflusst (beispielsweise durch Komplexierung der Prüfsubstanz), sind in ge ­
wissen Abständen Proben zur Analyse zu entnehmen. Wenn bekannt 
ist, dass das Verdünnungswasser eine relativ konstante Qualität auf ­
weist, sind beispielsweise alle drei Monate der Gehalt an Schwer ­
metallen (z. B. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd und Ni), an Hauptanionen und -kationen (z. B. Ca, Mg, Na, K, Cl und SO
 4 ), Pestiziden (z. B. 
Gesamtgehalt an phosphororganischen und chlororganischen Pestizi ­
den), der gesamte organische Kohlenstoff und die Schwebstoffe zu bestimmen. Wenn sich die Wasserqualität über mindestens ein Jahr als konstant erwiesen hat, können die Untersuchungen weniger häu ­
fig und in größeren Zeitabständen (z. B. alle sechs Monate) erfolgen. 
Einige chemische Eigenschaften eines geeigneten Verdünnungswas ­
sers sind in Anlage 2 genannt.
 
1.6.3.  Testlösungen  
Die Testlösungen mit den ausgewählten Konzentrationen werden 
durch Verdünnung einer Stammlösung hergestellt.  
Die Stammlösung sollte vorzugsweise durch einfaches Mischen oder 
Einrühren der Prüfsubstanz in das Verdünnungswasser mit mecha ­
nischen Mitteln (Rührwerk oder Ultraschall) hergestellt werden. Zur 
Herstellung einer geeigneten konzentrierten Stammlösung können Sättigungssäulen (Löslichkeitssäulen) verwendet werden.
 
Zur Herstellung einer Stammlösung mit geeigneter Konzentration 
kann in einigen Fällen die Verwendung von Lösungs- oder Disper ­
giermitteln (Lösungsvermittlern) erforderlich sein. Geeignete Lö ­
sungsmittel sind beispielsweise Aceton, Ethanol, Methanol, Di ­
methylsulfoxid, Dimethylformamid und Triethylenglykol. Geeignete 
Dispergiermittel sind beispielsweise Cremophor RH40, Tween 80, Methylcellulose 0,01 % und HCO-40. Bei der Verwendung von biologisch leicht abbaubaren Stoffen (z. B. Aceton) und/oder leicht ­
flüchtigen Stoffen ist Vorsicht geboten, da diese im Durchflusstest 
Probleme im Hinblick auf das Bakterienwachstum verursachen kön ­
nen. Wird ein Lösungsvermittler verwendet, so darf er keine signifi ­
kanten Auswirkungen auf das Fischwachstum und keine erkennbaren 
nachteiligen Auswirkungen auf die Jungfische haben, was durch eine 
nur mit Lösungsmittel vorgenommene Kontrolle nachzuweisen ist.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1006
 
Bei Durchflusstests ist ein System erforderlich, das kontinuierlich 
eine Stammlösung der Prüfsubstanz verdünnt (z. B. Dosierpumpe, 
Proportionalverdünner, Sättigungsvorrichtung), um die Testkonzen ­
trationen den Testkammern zuzuführen. Die Durchflussgeschwindig ­
keiten der Stammlösungen und des Verdünnungswassers sind wäh ­
rend des Testverlaufs in bestimmten Abständen, vorzugsweise täg ­
lich, zu prüfen und sollten während der gesamten Testdauer um nicht mehr als 10 % schwanken. Ein Ringtest (2) hat ergeben, dass es bei Regenbogenforellen vertretbar ist, wenn während des Testverlaufs 6 
Liter Wasser/g Fisch/Tag ausgetauscht werden (siehe 1.8.2.2).
 
Bei semistatischen (Erneuerungs-)Tests hängt die Häufigkeit der Er ­
neuerung des Mediums von der Stabilität der Prüfsubstanz ab, doch 
wird eine tägliche Erneuerung des Wassers empfohlen. Hat sich bei vorherigen Stabilitätstests (siehe 1.4) gezeigt, dass die Konzentration der Prüfsubstanz während des Erneuerungszeitraums nicht stabil ist 
(d. h. nicht in einem Bereich von 80-120 % des Nominalwerts liegt 
oder auf weniger als 80 % der gemessenen Ausgangskonzentration abfällt), so ist die Verwendung eines Durchflusstests in Erwägung zu ziehen.
 
1.6.4.  Auswahl der Spezies  
Empfohlen wird für diesen Test die Regenbogenforelle  (Oncorhyn ­
chus mykiss),  da beim Ringtest mit dieser Spezies die meisten Er ­
fahrungen gesammelt wurden (1) (3). Es kommen auch andere gut 
dokumentierte Spezies in Frage, wobei jedoch das Testverfahren möglicherweise abgewandelt werden muss, um geeignete Testbedin ­
gungen zu schaffen. Beispielsweise liegen auch Erfahrungen mit dem 
Zebrabärbling  (Danio rerio ) (4)(5) und dem Reiskärpfling (Medaka,  
Oryzias latipes ) (6) (7) (8) vor. Die Gründe für die Auswahl der 
Spezies und der Versuchsmethode sind in diesem Fall genau zu dokumentieren.
 
1.6.5.  Haltung der Fische  
Die Versuchsfische sind aus einer Population eines einzelnen Stam ­
mes — vorzugsweise vom selben Laich — auszuwählen, die im 
Hinblick auf Wasserqualität und Beleuchtung vor dem Test mindes ­
tens zwei Wochen lang unter ähnlichen Bedingungen gehalten wur ­
de, wie sie beim Test verwendet werden. Sie werden während der gesamten Dauer der Haltung und während des Tests mit einer Fut ­
termenge von mindestens 2 %, vorzugsweise aber 4 %, ihres Kör ­
pergewichts gefüttert.
 
Nach einer 48-stündigen Eingewöhnungsphase wird die Mortalität 
festgehalten, wobei folgende Kriterien gelten:  
— Mortalität größer als 10 % der Population in sieben Tagen: Aus ­
tausch aller Fische;  
— Mortalität zwischen 5 und 10 % der Population in sieben Tagen: 
weitere sieben Tage Akklimatisation; wenn die Mortalität inner ­
halb der folgenden sieben Tage bei mehr als 5 % liegt: Aus ­
tausch des gesamten Besatzes;  
— Mortalität weniger als 5 % der Population in sieben Tagen: Ver ­
wendung aller Fische für den Test.  
Die Fische sollen zwei Wochen vor dem Test und während des Tests 
nicht wegen irgendwelcher Erkrankungen behandelt werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1007
 
1.7. VERSUCHSAUFBAU  
Unter „Versuchsaufbau“ sind die gewählte Anzahl und der Abstand 
der Testkonzentrationen, die Anzahl der Prüfgefäße je Konzentration und die Anzahl der Fische je Gefäß zu verstehen. Nach Möglichkeit 
sollte die Auswahl der Versuchsanordnung anhand folgender Krite ­
rien erfolgen:
 
— a) Ziel der Studie;  
— b) vorgesehene Methode der statistischen Analyse;  
— c) Verfügbarkeit und Kosten der experimentellen Ressourcen.  
In der Erklärung zur Zielsetzung ist nach Möglichkeit die statistische 
Trennschärfe anzugeben, mit der ein Unterschied bestimmter Grö ­
ßenordnung (z. B. in der Wachstumsrate) nachgewiesen werden soll; 
wahlweise kann die Genauigkeit angegeben werden, mit der EC  X 
(z. B. x = 10, 20 oder 30, vorzugsweise nicht unter 10) ermittelt 
werden soll. Ohne diese ist keine feste Angabe zum Umfang der 
Studie nicht möglich.  
Es ist zu beachten, dass ein Versuchsaufbau, der für eine bestimmte 
Methode der statistischen Analyse optimal ist (d. h. die bestmögliche Nutzung der Ressourcen gestattet), dies nicht unbedingt auch für eine andere Methode sein muss. Daher wird für die Ermittlung der 
LOEC/NOEC nicht derselbe Aufbau empfohlen wie für die Regres ­
sionsanalyse.
 
Aus Gründen, die von Stephan und Rogers (9) erörtert werden, ist in 
den meisten Fällen die Regressionsanalyse der Varianzanalyse vor ­
zuziehen. Falls jedoch kein geeignetes Regressionsmodell zur Ver ­
fügung steht (r  2 < 0,9), ist die NOEC/LOEC zu verwenden.  
1.7.1.  Versuchsaufbau für die Regressionsanalyse  
Bei der Planung eines Tests, der mittels Regressionsanalyse aus ­
gewertet werden soll, ist Folgendes zu beachten:  
— a) Die im Test verwendeten Konzentrationen müssen in jedem 
Falle die Wirkungskonzentration (z. B. EC  10,20,30  ) und den Kon ­
zentrationsbereich, in dem die Wirkung der Prüfsubstanz von 
Interesse ist, einschließen. Bei der Bestimmung von Wirkungs ­
konzentrationen wird die größte Genauigkeit dann erzielt, wenn die Wirkungskonzentration in der Mitte des Bereichs der getes ­
teten Konzentrationen liegt. Ein Vorversuch kann die Auswahl 
geeigneter Testkonzentrationen erleichtern.
 
— b) Im Interesse einer zufrieden stellenden statistischen Modellie ­
rung sind bei dem Test mindestens ein Kontrollansatz und fünf weitere Gefäße mit unterschiedlichen Konzentrationen zu ver ­
wenden. Gegebenenfalls ist bei Verwendung eines Lösungsver ­
mittlers zusätzlich zur Testreihe ein Kontrollansatz mitzuführen, 
der den Lösungsvermittler in der höchsten eingesetzten Konzen ­
tration enthält (siehe 1.8.3 und 1.8.4).
 
— c) Es kann eine geeignete geometrische Reihe oder logarith ­
mische Reihe (10) (siehe Anlage 3) verwendet werden. Ein lo ­
garithmischer Abstand zwischen den Testkonzentrationen ist zu 
bevorzugen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1008
 
— d) Stehen mehr als sechs Prüfgefäße zur Verfügung, so sind die 
überzähligen Gefäße entweder für Paralleltests zu verwenden 
oder so über den Konzentrationsbereich zu verteilen, dass sich der Abstand zwischen den Konzentrationen verringert. Beide Maßnahmen sind gleichermaßen zu empfehlen.
 
1.7.2.  Versuchsaufbau für die Bestimmung der NOEC/LOEC mittels 
Varianzanalyse  
Vorzugsweise sollten bei allen Konzentrationen Parallelansätze vor ­
handen sein, und die statistische Analyse sollte für die einzelnen Prüfgefäße vorgenommen werden (11). Ohne Parallelansätze ist es 
nicht möglich, die Variabilität zwischen den Prüfgefäßen über das 
auf die einzelnen Fische zurückzuführende Maß hinaus zu berück ­
sichtigen. Bei einer Untersuchung (12) wurde jedoch die Erfahrung gemacht, dass die Variabilität zwischen den Gefäßen im Vergleich 
zur Variabilität innerhalb der Prüfgefäße (d. h. zwischen den Fi ­
schen) sehr gering war. Daher besteht eine durchaus vertretbare Al ­
ternative darin, eine statistische Analyse für die einzelnen Fische vorzunehmen.
 
In der Regel werden mindestens fünf Testkonzentrationen in einer 
geometrischen Reihe verwendet, wobei der Faktor vorzugsweise nicht größer als 3,2 ist.
 
Wird der Test mit Parallelansätzen durchgeführt, so gilt im Allgemei ­
nen, dass die Zahl der zur Kontrolle verwendeten Parallelgefäße und damit die Zahl der Fische jeweils doppelt so groß sein soll wie bei den einzelnen Testkonzentrationen, bei denen die Zahl wiederum 
jeweils gleich sein soll (13) (14) (15). Werden dagegen keine Paral ­
lelgefäße verwendet, so soll die Zahl der Fische in der jeweiligen Kontrollgruppe mit der Zahl der Fische in der jeweiligen Testkon ­
zentration übereinstimmen.
 
Wenn die Varianzanalyse für die Prüfgefäße und nicht auf die ein ­
zelnen Fische bezogen durchgeführt werden soll (wobei Letzteres entweder eine Markierung der einzelnen Fische oder die Verwen ­
dung „pseudo“-spezifischer Wachstumsraten voraussetzen würde 
(siehe 2.1.2)), müssen so viele Prüfgefäße für Paralleltests vorhanden sein, dass die Standardabweichung der „Gefäße innerhalb der einzel ­
nen Konzentrationen“ bestimmt werden kann. Dies bedeutet, dass die 
Freiheitsgrade für Fehler in der Varianzanalyse mindestens 5 (11) 
betragen sollten. Bei alleiniger Replikation der Kontrollen besteht die Gefahr einer Beeinflussung der Fehlervariabilität, da sie zusammen mit dem mittleren Wert der fraglichen Wachstumsrate ansteigen 
kann. Da die Wachstumsrate aller Wahrscheinlichkeit nach mit stei ­
gender Konzentration abnimmt, hat dies zur Folge, dass die Varia ­
bilität zu hoch eingeschätzt wird.
 
1.8. VERFAHREN  
1.8.1.  Auswahl und Wiegen der Versuchsfische  
Zu Beginn des Tests kommt es darauf an, die Unterschiede im 
Gewicht der Fische möglichst gering zu halten. In Anlage 1 werden geeignete Größenbereiche für die einzelnen Spezies angegeben, de ­
ren Verwendung in diesem Test empfohlen wird. Beim gesamten im 
Test verwendeten Fischbesatz sollen die Unterschiede im Gewicht 
der einzelnen Fische am Anfang des Tests möglichst nicht mehr als ± 10 % des arithmetischen Mittels betragen und in keinem Falle 25 % übersteigen. Es wird empfohlen, vor dem Test zwecks Bestim ­
mung des mittleren Gewichts eine Teilstichprobe von Fischen zu 
wiegen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1009
 
Die Fütterung der Stammpopulation ist in den 24 Stunden vor dem 
Test auszusetzen Anschließend erfolgt eine Zufallsauswahl der Fi ­
sche. Unter Verwendung eines allgemeinen Anästhetikums (z. B. einer wässrigen Lösung von 100 mg/l Tricainmethansulphonat (MS 222), die durch Zugabe von zwei Teilen Natriumhydrogencarbonat 
pro Teil MS 222 neutralisiert wird), werden die (trockengetupften) 
Fische einzeln gewogen, um das Feuchtgewicht mit der in Anlage 1 angegebenen Genauigkeit zu ermitteln. Diejenigen Fische, deren Ge ­
wicht innerhalb des ausgewählten Bereichs liegt, sind verwendbar 
und werden willkürlich auf die Testbehältnisse aufgeteilt. Das Ge ­
samtfeuchtgewicht der Fische in jedem Testbehältnis ist festzuhalten. Die Verwendung eines Anästhetikums und die Handhabung der Fi ­
sche (darunter das Trockentupfen und Wiegen) können bei den Jung ­
fischen Stress und Verletzungen hervorrufen, was insbesondere für 
kleinwüchsige Spezies gilt. Daher sind die Jungfische mit äußerster Vorsicht zu behandeln, um eine Belastung und Verletzung der Ver ­
suchstiere zu vermeiden.
 
Am 28. Tag des Tests werden die Fische erneut gewogen (siehe 
1.8.6). Wird jedoch eine neuerliche Berechnung der Futterration 
für notwendig erachtet, können die Fische am 14. Tag des Tests erneut gewogen werden (siehe 1.8.2.3). Es können auch andere Me ­
thoden wie beispielsweise die fotografische Längenmessung verwen ­
det werden, um Größenänderungen bei den Fischen zu ermitteln, auf 
deren Grundlage die Futterrationen angepasst werden.
 
1.8.2.  Expositionsbedingungen  
1.8.2.1.  Dauer  
Die Testdauer beträgt 28 Tage.  
1.8.2.2.  Besatzrate und Besatzdichte  
Wichtig ist, dass die Besatzrate und Besatzdichte der jeweils ver ­
wendeten Testspezies angepasst sind (siehe Anlage 1). Die bei einer 
zu hohen Besatzdichte entstehende Enge ruft Stress hervor, der eine 
Verringerung der Wachstumsrate und unter Umständen Erkrankun ­
gen zur Folge haben kann. Eine zu niedrige Besatzdichte kann Aus ­
löser für Revierverhalten sein, wodurch ebenfalls das Wachstum 
beeinträchtigt werden kann. In jedem Falle sollte die Besatzrate so 
niedrig sein, dass ohne Belüftung eine Konzentration an gelöstem Sauerstoff von mindestens 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungswerts aufrechterhalten werden kann. Ein Ringtest (3) hat ergeben, dass bei 
Regenbogenforellen eine Besatzrate von 16 Forellen von 3-5 g auf 
jeweils 40 Liter vertretbar ist. Es wird empfohlen, für die Dauer des Tests 6 l Wasser/g Fisch/Tag auszutauschen.
 
1.8.2.3.  Fütterung  
Die Fische sind mit geeignetem Futter (Anlage 1) in einer Menge zu 
füttern, die eine annehmbare Wachstumsrate ermöglicht. Das Wachs ­
tum von Mikroorganismen sowie Wassertrübungen sind sorgfältig zu 
vermeiden. Bei Regenbogenforellen dürfte dies mit einer täglichen Futterration von 4 % des Körpergewichts zu erreichen sein (3) (16) (17) (18). Die Tagesration kann in zwei gleiche Teile aufgeteilt und 
den Fischen in zwei Fütterungen pro Tag im Abstand von mindes ­
tens fünf Stunden verabreicht werden. Die Ration richtet sich nach dem jeweiligen Gesamt-Ausgangsgewicht der Fische in den einzel ­
nen Testbehältnissen. Werden die Fische am 14. Tag erneut gewo ­
gen, so erfolgt die Neuberechnung der Ration zu diesem Zeitpunkt. 
Die Fütterung ist 24 Stunden vor dem Wiegen auszusetzen.
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Nicht gefressenes Futter und Exkremente werden täglich vom Boden 
der Prüfgefäße sorgfältig abgesaugt.  
1.8.2.4.  Licht und Temperatur  
Fotoperiode und Wassertemperatur sind der Testspezies anzupassen 
(Anlage 1).  
1.8.3.  Testkonzentrationen  
Normalerweise werden unabhängig vom Testaufbau fünf Konzentra ­
tionen der Prüfsubstanz benötigt (siehe 1.7.2). Eine vorherige Be ­
stimmung der Toxizität der Prüfsubstanz (z. B. durch Akuttests und/ ­
oder einen Vorversuch zur Ermittlung eines geeigneten Konzentrati ­
onsbereichs) erleichtert die Auswahl der Testkonzentrationen. Wer ­
den weniger als fünf Konzentrationen verwendet, so ist dies zu begründen. Die höchste getestete Konzentration darf die Löslich ­
keitsgrenze der Substanz in Wasser nicht überschreiten.
 
Wird ein Lösungsvermittler verwendet, so soll dessen Konzentration 
nicht mehr als 0,1 ml/l betragen und vorzugsweise in allen Testbe ­
hältnissen identisch sein (siehe 1.6.3). Die Verwendung solcher 
Stoffe sollte allerdings möglichst vermieden werden.  
1.8.4.  Kontrollen  
Die Zahl der mit Verdünnungswasser vorgenommenen Kontrollen ist 
vom Testaufbau abhängig (siehe 1.7-1.7.2). Bei Verwendung eines Lösungsvermittlers sind mit diesem ebenso viele Kontrollen durch ­
zuführen wie mit dem Verdünnungswasser.
 
1.8.5.  Häufigkeit der analytischen Bestimmungen und Messungen  
Für die Dauer des Tests werden die Konzentrationen der Prüfsub ­
stanz in regelmäßigen Abständen bestimmt (siehe unten).  
Beim Durchflusstest sind die Durchflussgeschwindigkeiten des Ver ­
dünnungswassers und der Stammlösungen des Giftstoffs in regel ­
mäßigen Abständen — vorzugsweise täglich — zu überprüfen und dürfen während der gesamten Testdauer um höchstens 10 % schwan ­
ken. Ist damit zu rechnen, dass die Konzentrationen der Prüfsubstanz 
um höchstens ± 20 % des Nominalwerts schwanken (d. h. im Be ­
reich von 80-120 % liegen; siehe 1.6.2 und 1.6.3), so wird emp ­
fohlen, mindestens die höchste und die niedrigste Testkonzentration 
zu Beginn des Tests und danach in wöchentlichen Abständen zu analysieren. Ist bei einem Test (aufgrund der Stabilitätsdaten der Prüfsubstanz) nicht damit zu rechnen, dass die Konzentration der 
Prüfsubstanz um höchstens ± 20 % des Nominalwertes schwankt, 
müssen sämtliche Testkonzentrationen analysiert werden, wobei die ­
selbe Vorgehensweise anzuwenden ist.
 
Ist bei einem semistatischen (Erneuerungs-)Test damit zu rechnen, 
dass die Konzentration der Prüfsubstanz um höchstens ± 20 % des Nominalwerts schwankt, so wird empfohlen, mindestens die höchste und die niedrigste Testkonzentration zu Beginn der Studie sofort 
nach der Zubereitung und unmittelbar vor der Erneuerung sowie 
anschließend wöchentlich zu analysieren. Ist bei einem Test nicht damit zu rechnen, dass die Konzentration der Prüfsubstanz um höchstens ± 20 % des Nominalwerts schwankt, müssen sämtliche 
Testkonzentrationen analysiert werden, wobei dieselbe Vorgehens ­
weise anzuwenden ist wie bei den stabileren Substanzen.
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Es wird empfohlen, bei der Berechnung der Ergebnisse von den 
gemessenen Konzentrationen auszugehen. Liegen jedoch Nachweise 
dafür vor, dass die Konzentration der gelösten Prüfsubstanz für die Dauer des gesamten Tests in zufrieden stellender Weise in einem Bereich von + 20 % des Nominalwertes oder der gemessenen Aus ­
gangskonzentration gehalten wurde, kann vom Nennwert oder vom 
gemessenen Wert ausgegangen werden.
 
Es kann erforderlich sein, die Proben zu filtrieren (z. B. unter Ver ­
wendung einer Porengröße von 0,45 μm) oder zu zentrifugieren. Das 
empfohlene Verfahren ist die Zentrifugation. Allerdings ist auch die 
Filtration zulässig, sofern es nicht zur Adsorption des Testmaterials 
am Filter kommt.  
Während des Tests sind in allen Testbehältnissen der gelöste Sauer ­
stoff, der pH-Wert und die Temperatur zu messen. In den Kontroll ­
gefäßen und einem Prüfgefäß mit der höchsten Konzentration sind 
die Gesamthärte, -alkalität und -salinität (falls zutreffend) zu messen. Der gelöste Sauerstoff und die Salinität (falls zutreffend) sind min ­
destens dreimal zu messen (zu Beginn, in der Mitte und am Ende des 
Tests). Bei semistatischen Tests wird empfohlen, den gelösten Sauer ­
stoff häufiger zu messen, vorzugsweise vor und nach jedem Wasser ­
austausch, mindestens aber einmal wöchentlich. Der pH-Wert ist beim semistatischen Test zu Beginn und Ende jedes Wasseraus ­
tauschs und beim Durchflusstest mindestens wöchentlich zu messen. 
Härte und Alkalität sind bei jedem Test je einmal zu messen. Die Temperatur sollte vorzugsweise in mindestens einem Testgefäß fort ­
laufend überwacht werden.
 
1.8.6.  Anmerkungen  
Gewicht: Am Ende des Tests sind alle überlebenden Fische zur Ermitt ­
lung des Feuchtgewichts (trockengetupft) entweder als Gruppe je Test ­
gefäß oder einzeln zu wiegen. Das Wiegen der Tiere je Testgefäß ist zu bevorzugen, da das individuelle Wiegen eine vorherige individuelle Kennzeichnung der Fische erfordern würde. Werden die Fische einzeln 
gewogen, um ihre individuellen spezifischen Wachstumsraten zu ermit ­
teln, so sollte die Kennzeichnungsmethode die Tiere möglichst wenig belasten (eventuell kommen Alternativen zum Gefrierbrand in Frage, z. B. die Verwendung von dünner farbiger Angelschnur).
 
Für die Dauer des Tests sind die Fische täglich zu untersuchen und 
jegliche äußerliche Abnormitäten (wie Blutungen, Verfärbungen) und 
abnorme Verhaltensweisen aufzuzeichnen. Die Mortalität ist fest ­
zuhalten, und tote Fische sind so schnell wie möglich zu entfernen. Tote Fische werden nicht ersetzt, da die Besatzrate und Besatzdichte 
so gewählt sind, dass Änderungen in der Zahl der Fische je Prüfge ­
fäß keine Auswirkungen auf das Wachstum haben. Es ist jedoch eine Anpassung der Futtermenge erforderlich.
 
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
2.1. BEHANDLUNG DER ERGEBNISSE  
Es wird die Mitwirkung eines Statistikers bei der Festlegung des 
Testaufbaus wie auch bei der Analyse der Testergebnisse empfohlen, 
da die Versuchsanordnungen bei dieser Testmethode stark variieren können, so beispielsweise was die Zahl der Testkammern, der Test ­
konzentrationen, der Fische usw. anbelangt. In Anbetracht der ver ­
schiedenen Möglichkeiten des Testaufbaus wird hier auf eine kon ­
krete Anleitung zum statistischen Verfahren verzichtet.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1012
 
Für Testgefäße, in denen die Mortalität 10 % übersteigt, werden 
keine Wachstumsraten berechnet. Dennoch sind die Mortalitätsraten 
für sämtliche Testkonzentrationen anzugeben.  
Das Grundkonzept bei sämtlichen Analysemethoden ist die Ermitt ­
lung der spezifischen Wachstumsrate r zwischen Zeitpunkt t  1 und 
Zeitpunkt t  2 . Diese kann in Abhängigkeit davon, ob die Fische ein ­
zeln gekennzeichnet sind oder ob ein Durchschnittswert je Prüfgefäß errechnet werden muss, unterschiedlich definiert werden.
 
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
wobei  
r 1 = individuelle spezifische Wachstumsrate des Fisches  
r 2 = durchschnittliche spezifische Wachstumsrate je Gefäß  
r 3 = „pseudo“-spezifische Wachstumsrate  
w 1 , w 2 = Gewicht eines bestimmten Fisches zum Zeitpunkt t  1 
bzw. t  2 
log e w 1 = Logarithmus des Gewichts eines einzelnen Fisches am 
Anfang des Untersuchungszeitraums  
log e w 2 = Logarithmus des Gewichts eines einzelnen Fisches am 
Ende des Untersuchungszeitraums  
log e W 1 = Durchschnitt der Logarithmen der Werte w  1 für die 
Fische im Gefäß am Anfang des Untersuchungszeit ­
raums  
log e W 2 = Durchschnitt der Logarithmen der Werte w  2 für die 
Fische im Gefäß am Ende des Untersuchungszeitraums  
t 1 , t 2 = Zeitpunkt (Tage) am Anfang und Ende des Unter ­
suchungszeitraumes  
r 1 , r 2 , r 3 kann für den Zeitraum von 0-28 Tagen und gegebenenfalls 
(d. h. wenn am 14. Tag eine Messung erfolgt) für die Zeiträume von 0-14 und 14-28 Tagen berechnet werden.
 
2.1.1.  Analyse der Ergebnisse mittels Regression (Konzentrations-Wir ­
kungs-Modell)  
Diese Analysemethode stellt eine geeignete mathematische Bezie ­
hung zwischen der spezifischen Wachstumsrate und der Konzentra ­
tion her und ermöglicht damit die Bestimmung von „EC  X “, d. h. 
eines beliebigen gewünschten EC-Wertes. Bei Verwendung dieser Methode ist die Berechnung von r für den einzelnen Fisch (r
 1 ) nicht 
notwendig, vielmehr kann bei der Analyse vom Durchschnitt je Ge ­
fäß (r  2 ) ausgegangen werden. Letztere Methode wird bevorzugt. Im 
Falle sehr kleiner Spezies ist sie auch besser geeignet.  
Zur Untersuchung der Beziehung zwischen Konzentration und Wir ­
kung werden die durchschnittlichen spezifischen Wachstumsraten je 
Gefäß (r  2 ) grafisch als Funktion der Konzentration dargestellt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1013
 
Für die Darstellung der Beziehung zwischen r  2 und Konzentration ist 
ein geeignetes Modell zu wählen, und die Auswahl ist angemessen 
zu begründen.  
Ist die Zahl der überlebenden Fische in den einzelnen Prüfgefäß 
unterschiedlich, ist das Verfahren der Modellanpassung, ob einfach 
oder nichtlinear, zwecks Berücksichtigung der ungleichen Gruppen ­
größen zu gewichten.  
Die Methode der Modellanpassung muss beispielsweise eine Schät ­
zung der EC  20 und ihrer Streuung (entweder Standardfehler oder 
Vertrauensintervall) ermöglichen. Die Abbildung des angepassten Modells ist im Verhältnis zu den Daten zu zeigen, um die Eignung der Anpassung zu verdeutlichen (9) (19) (20) (21).
 
2.1.2.  Analyse der Ergebnisse zur Bestimmung der LOEC  
Waren bei dem Test auf allen Konzentrationsstufen Parallelgefäße 
vorhanden, so kann die LOEC mittels Varianzanalyse der durch ­
schnittlichen spezifischen Wachstumsrate je Gefäß bestimmt werden (siehe 2.1), wonach der Durchschnitt r bei jeder Konzentration an ­
hand einer geeigneten Methode (z. B. Dunnett-Test oder Williams- 
Test (13) (14) (15) (22)) mit dem Durchschnitt r der Kontrollgruppen verglichen wird, um die geringste Konzentration zu ermitteln, bei der der Unterschied mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,05 signifikant 
ist. Sind die Voraussetzungen für eine parametrische Methode nicht 
gegeben (durch Nichtnormalverteilung (z. B. Shapiro-Wilk-Test) oder heterogene Varianzen (Bartlett-Test)), so sollte vor der Varian ­
zanalyse zwecks Homogenisierung der Varianzen eine Transforma ­
tion der Daten erfolgen oder aber eine gewichtete Varianzanalyse 
durchgeführt werden.
 
Waren nicht bei jeder Konzentration Parallelgefäße vorhanden, ist 
eine von den einzelnen Gefäßen ausgehende Varianzanalyse unemp ­
findlich oder nicht möglich. In diesem Falle besteht eine annehmbare Kompromisslösung darin, bei der Varianzanalyse die „pseudo“-spezi ­
fische Wachstumsrate r
 3 für die einzelnen Fische zu verwenden.  
Der Durchschnitt r  3 für die einzelnen Testkonzentrationen kann dann 
mit dem Durchschnitt r  3 für die Kontrollgruppen verglichen werden. 
Anschließend wird die LOEC wie oben ermittelt. Zu beachten ist, dass es bei dieser Methode nicht möglich ist, die Variabilität zwi ­
schen den Prüfgefäßen über das auf die einzelnen Fische zurück ­
zuführende Maß hinaus zu berücksichtigen oder sich in dieser Hin ­
sicht abzusichern. Es wurde jedoch die Erfahrung gemacht (9), dass die Variabilität zwischen den Gefäßen im Vergleich zur Variabilität 
innerhalb der Gefäße (d. h. zwischen den Fischen) sehr gering war. 
Werden keine einzelnen Fische in die Analyse einbezogen, so ist die verwendete Methode zur Ermittlung von Ausreißern anzugeben und zu begründen.
 
2.2. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Die Ergebnisse sind mit Vorsicht zu interpretieren, wenn die gemes ­
senen Substanzkonzentrationen in den Testlösungen nahe an der Nachweisgrenze des Analyseverfahrens liegen bzw. wenn bei semis ­
tatischen Tests die Konzentration der Prüfsubstanz in der Zeit zwi ­
schen der Zubereitung und der Erneuerung abnimmt.
 
2.3. TESTBERICHT  
Der Testbericht muss folgende Angaben enthalten:  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1014
 
2.3.1.  Prüfsubstanz:  
— physikalischer Zustand und relevante physikalisch-chemische Ei ­
genschaften;  
— chemische Kenndaten einschließlich Reinheitsgrad und gegebe ­
nenfalls Analyseverfahren zur Quantifizierung der Prüfsubstanz.  
2.3.2.  Testspezies:  
— wissenschaftliche Bezeichnung (nach Möglichkeit):  
— Stamm, Größe, Herkunft, eventuelle Vorbehandlungen usw.  
2.3.3.  Prüfbedingungen:  
— verwendetes Prüfverfahren (z. B. semistatisch/Erneuerung. 
Durchflussverfahren, Besatz. Besatzdichte usw.);  
— Versuchsaufbau (z. B. Zahl der Testgefäße, der Testkonzentratio ­
nen und der Parallelansätze, Zahl der Fische pro Gefäß);  
— Methode der Zubereitung der Stammlösungen und Erneuerungs ­
häufigkeit (falls verwendet, müssen Angaben zum Lösungsver ­
mittler und seiner Konzentration gemacht werden);  
— die nominellen Testkonzentrationen, der Durchschnitt der gemes ­
senen Werte und deren Standardabweichungen in den Testgefä ­
ßen sowie das Verfahren, durch das diese ermittelt wurden; Nachweise dafür, dass sich die Messungen auf die Konzentratio ­
nen der Prüfsubstanz in echter Lösung beziehen;
 
— Eigenschaften des Verdünnungswassers: pH-Wert, Härte, Alkali ­
tät, Temperatur, Konzentration des gelösten Sauerstoffs, Rest ­
chlor (falls gemessen), gesamter organischer Kohlenstoff, suspen ­
dierte Feststoffe, Salinität des Testmediums (falls gemessen) so ­
wie alle sonstigen durchgeführten Messungen;  
— Wasserqualität innerhalb der Testgefäße: pH-Wert, Härte, Tem ­
peratur und Konzentration des gelösten Sauerstoffs;  
— ausführliche Angaben zur Fütterung (z. B. Art des Futters, Her ­
kunft, Fütterungsmenge und -häufigkeit).  
2.3.4.  Ergebnisse:  
— Nachweis dafür, dass die Kontrollgruppen die Validitätskriterien 
für das Überleben erfüllen, sowie Daten zur Mortalität bei allen 
Testkonzentrationen;  
— verwendete statistische Analysemethoden, statistische Angaben 
auf der Basis von Parallelgefäßen oder ein zelnen Fischen, Auf ­
bereitung der Daten und Begründung der verwendeten Methoden;  
— tabellarische Angaben zum individuellen und durchschnittlichen 
Gewicht der Fische an den Tagen 0, 14 (falls gemessen) und 28, Werte für durchschnittliche spezifische Wachstumsraten je Gefäß oder (gegebenenfalls) pseudo-spezifische Wachstumsraten für 
den Zeitraum 0-28 Tage bzw. 0-14 und 14-28 Tage;
 
— Ergebnisse der statistischen Analyse (d. h. Regressionsanalyse 
oder Varianzanalyse), vorzugsweise in tabellarischer und gra ­
fischer Form, sowie LOEC (p = 0,05) und NOEC oder nach 
Möglichkeit EC  X , gegebenenfalls mit Standardfehlern;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1015
 
— festgestellte ungewöhnliche Reaktionen der Fische und erkenn ­
bare Auswirkungen der Prüfsubstanz.  
3. LITERATUR  
(1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. 
WRc Report No PRD 1388-M/2.  
(2) Meyer, A., Bierman, C. H. and Orti, G. (1993). The phyloge ­
netic position of the zebrafish  (Danio rerio ), a model System 
in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.
 
(3) Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring 
Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of 
the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
 
(4) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, 1855-1870.  
(5) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., 
Munk R., Scholz N. and Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4- 
dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish  (Bra­
chydanio rerio ): results of a comparative laboratory study. 
Ecotox. Environ. Safety, 21, 157-164.  
(6) Yamamoto, Tokio. (197 5). Series of stock cultures in biolo ­
gical field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.
 
(7) Holcombe. G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leo ­
nard, E. N. and Johnson. R. D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka ( Oryzias 
latipes ). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, 287-297.
 
(8) Benoit. D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). 
Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese 
medaka ( Oryzias latipes ). Ecological Research Series 
EPA-600/3-91-063. US Environmental Protection Agency. Du ­
luth, Minnesota.  
(9) Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposi ­
um, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 328- 338.
 
(10) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or Atlantic salmon). Conservation and Protection, 
Ontario, Report EPS l/RM/28, 81 S.
 
(11) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.  
(12) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts 
on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10- 
12 December 1991.
 
(13) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. 
Assoc, 50, 1096-1121.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1016
 
(14) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482-491.  
(15) Williams D. A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117.
 
(16) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A 
technique using sequential feedings of different coloured food 
to determine food intake by individual rainbow trout,  Oncor­
hynchus mykiss:  effect of feeding level. Aquaculture 120, 123- 
133. 
(17) Quinton J. C. and Blake R. W. (1990). The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response 
in rainbow trout,  Oncorhynchus mykiss.  Journal of Fish Biolo ­
gy, 37, 33-41.  
(18) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, 
Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 S.  
(19) Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.
 
(20) DeGraeve G. M., Cooney J. M., Pollock T. L, Reichenbach J. 
H., Dean, Marcus M. D. and McIntyre D. O. (1989). Precision 
of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (Ame ­
rican Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power 
Research Institute, Palo Alto, CA.
 
(21) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chro ­
nic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment 
Center. Sept. 1988. 12 S.
 
(22) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, 510-531.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1017
 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1018
 ▼B 
Anlage 1  
FÜR DIE PRÜFUNG EMPFOHLENE FISCHSPEZIES UND GEEIGNETE PRÜFBEDINGUNGEN  
Spezies Empfohlener 
Testtemperaturbereich 
( o C) Fotoperiode 
(Stunden) Empfohlener 
Bereich für das 
erforderliche 
Ausgangsgewicht 
der Fische Messgenauigkeit 
(g) Besatzrate 
(g/l) Besatzdichte 
(pro Liter) Futter Testdauer 
(Tage)  
Empfohlene Spezies  
Oncorhynchus mykiss  
Regenbogenforelle 12,5-16,0 12-16 1-5 Auf 100 mg ge ­
nau 1,2-2,0 4 Marken-Trockenfutter für Sal ­
monidenbrut > 28  
Sonstige gut dokumentierte 
Spezies  
Danio rerio  
Zebrabärbling 21-25 12-16 0,050-0,100 Auf 1 mg genau 0,2-1,0 5-10 Lebendfutter ( Brachionus Arte ­
mia) > 28  
Oryzias latipes  
Reiskärpfling (Medaka) 21-25 12-16 0,050-0,100 Auf 1 mg genau 0,2-1,0 5-20 Lebendfutter ( Brachionus Arte ­
mia) > 28
Anlage 2  
EINIGE CHEMISCHE EIGENSCHAFTEN VON GEEIGNETEM 
VERDÜNNUNGSWASSER  
Substanz Konzentrationen  
Schwebstoffe < 20 mg/l 
Gesamter organischer Kohlenstoff < 2 mg/l 
Nichtionisiertes Ammoniak < 1 μg/l 
Restchlorgehalt < 10 μg/l 
Gesamtgehalt an phosphororganischen Pestiziden < 50 ng/l Gesamtgehalt an chlororganischen Pestiziden und poly ­
chlorierten Biphenylen < 50 ng/l 
Gesamtgehalt an organischem Chlor < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1019
 
Anlage 3  
Logarithmische Reihe geeigneter Konzentrationen für den Toxizitätstest (9)  
Spalte (Anzahl der Konzentrationen zwischen 100 und 10 oder zwischen 10 und 1) (  1 ) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 
10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 
1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 
1,0 1,8 
1,3 1,0
 
( 1 ) Es können fünf (oder mehr) aufeinander folgende Konzentrationen aus einer Spalte gewählt werden. Die Mittelpunkte zwischen 
den Konzentrationen in Spalte (x) sind Spalte (2x + 1) zu entnehmen. Die aufgeführten Konzentrationen können Volumen- oder 
Gewichtsprozent (mg/l oder μg/l) darstellen. Die Werte können gegebenenfalls mit jeder beliebigen Zehnerpotenz multipliziert bzw. 
durch sie dividiert werden. Spalte 1 kann verwendet werden, wenn erhebliche Unsicherheit hinsichtlich des Toxititätsgrads beste ht. ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1020
 
C.15.  FISCHE, KURZFRISTIGE TOXIZITÄTSPRÜFUNG AN 
EMBRYONEN UND JUNGFISCHEN MIT DOTTERSACK  
1. METHODE  
Diese Methode zur kurzfristigen Toxizitätsprüfung entspricht der 
OECD TG 212 (1998).  
1.1. EINLEITUNG  
Diese kurzfristige Toxizitätsprüfung an Fischembryonen und Jung ­
fischen mit Dottersack stellt eine kurzfristige Prüfung dar, bei der die 
Entwicklungsstadien vom frisch befruchteten Ei bis zum Ende des 
Dottersackstadiums exponiert werden. Bei der Prüfung an Fischem ­
bryonen und Jungfischen mit Dottersack erfolgt keine Fütterung, daher sollte die Prüfung abgeschlossen sein, solange sich die Larven 
noch aus dem Dottersack ernähren.
 
Die Prüfung soll zur Ermittlung der letalen und — in gewissem 
Umfang — auch der subletalen Auswirkungen von Chemikalien 
auf die spezifischen Entwicklungsstadien und geprüften Fischarten 
dienen. Sie soll insofern nützliche Informationen liefern, als sie a) eine Brücke zwischen letalen und subletalen Prüfungen schlagen, b) als Screening-Test für eine Durchführung des vollständigen Early- 
Life-Stage-Tests oder für einen chronischen Toxizitätstest verwendet 
und c) für die Prüfung von Fischarten herangezogen werden könnte, bei denen die Zuchtverfahren noch nicht hinreichend weit entwickelt sind, um die Zeit der Umstellung von der endogenen auf die exogene 
Fütterung abzudecken.
 
Nicht vergessen werden sollte, dass nur Prüfungen, die alle Entwick ­
lungsstadien von Fischen umfassen, im Allgemeinen eine korrekte 
Schätzung der chronischen Toxizität von Chemikalien für Fische 
ermöglichen und dass eine verkürzte Exposition in Bezug auf Ent ­
wicklungsstadien unter Umständen zu einer Herabsetzung der Emp ­
findlichkeit und damit zu einer Unterschätzung der chronischen To ­
xizität führen kann. Es wird daher erwartet, dass die Empfindlichkeit 
bei der Prüfung an Fischembryonen und Jungfischen mit Dottersack geringer als in einer vollständigen Prüfung des frühen Entwicklungs ­
stadiums ist, insbesondere bei Chemikalien mit einer hohen Lipophi ­
lizität (log P
 ow > 4) und Chemikalien mit einer spezifischen toxi ­
schen Wirkungsweise. Kleinere Unterschiede in der Empfindlichkeit zwischen zwei Tests dürften allerdings bei Chemikalien mit einer unspezifischen narkotischen Wirkungsweise (1) zu erwarten sein.
 
Vor der Veröffentlichung dieser Prüfung lagen die meisten Erfahrun ­
gen mit Fischembryonen und Dottersackjungfischen des Süßwasser ­
fischs  Danio rerio  Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae — all ­
gemeinsprachlicher Name: Zebrabärbling) vor. Detailliertere Anga ­
ben zur Versuchsdurchführung bei dieser Fischart finden sich daher in Anlage 1. Dadurch wird die Verwendung von anderen Fischarten, mit denen ebenfalls Erfahrungen vorliegen (Tabellen 1A und 1B), 
nicht ausgeschlossen.
 
1.2. DEFINITIONEN  
Lowest Observed Effect Concentration (LOEC):  Dies ist die nied ­
rigste geprüfte Konzentration einer Prüfsubstanz, bei der sich im 
Vergleich zu der Kontrolle eine signifikante Wirkung beobachten 
lässt (bei p < 0,05). Alle Prüfkonzentrationen oberhalb der LOEC müssen jedoch eine schädigende Wirkung haben, die gleich den bei der LOEC beobachteten Wirkungen oder größer als diese ist.
 
No Observed Effect Concentration (NOEC):  Dies ist die Prüfkon ­
zentration unmittelbar unterhalb der LOEC.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1021
 
1.3. PRINZIP DER METHODE  
Die Fischembryonen und Jungfische mit Dottersack werden einem 
Bereich von Konzentrationen der in Wasser gelösten Prüfsubstanz ausgesetzt. Im Rahmen des Protokolls kann zwischen einem semis ­
tatischen und einem Durchflussverfahren gewählt werden. Die Ent ­
scheidung über das Verfahren hängt dabei von der Art der Prüfsub ­
stanz ab. Die Prüfung beginnt damit, dass befruchtete Eier in die Prüfkammern gesetzt werden, und sie endet, kurz bevor der Dotter ­
sack von Larven in einer der Prüfkammern vollständig aufgezehrt ist 
beziehungsweise bevor die Tiere in den Kontrollen zu verhungern anfangen. Letale und subletale Auswirkungen werden bewertet und 
mit Kontrollwerten zur Bestimmung der niedrigsten beobachteten 
Wirkkonzentration (LOEC) und damit auch der höchsten Konzen ­
tration ohne Wirkung (NOEC) verglichen. Alternativ können sie auch mit Hilfe eines Regressionsmodells analysiert werden, um die 
Konzentrationen zu schätzen, die zu einer Wirkung mit einem be ­
stimmten prozentualen Anteil führen würden (d. h. LC/ECx, wobei x für den prozentualen Anteil, der von der Wirkung betroffen ist, steht).
 
1.4. INFORMATIONEN ÜBER DIE PRÜFSUBSTANZ  
Ergebnisse einer akuten Toxizitätsprüfung (siehe Methode C.1), die 
möglichst an der für diese Prüfung gewählten Fischart durchgeführt 
wurde, sollten zur Verfügung stehen. Die Ergebnisse können bei der Auswahl eines geeigneten Bereichs an Prüfkonzentrationen bei der Prüfung in den frühen Entwicklungsstadien hilfreich sein. Die Was ­
serlöslichkeit (einschließlich Löslichkeit im Prüfwasser) und der 
Dampfdruck der Prüfsubstanz sollten bekannt sein. Ein zuverlässiges analytisches Verfahren für die Quantifizierung der Substanz in den Prüflösungen mit bekannter und protokollierter Genauigkeit und 
Nachweisgrenze sollte verfügbar sein.
 
Zu den Informationen über die Prüfsubstanz, die bei der Festlegung 
der Prüfbedingungen von Nutzen sein können, gehören die Struktur ­
formel, die Reinheit der Substanz, die Lichtstabilität, die Stabilität 
unter den Versuchsbedingungen, pKa, P  ow und die Ergebnisse einer 
Prüfung zur leichten biologischen Abbaubarkeit (siehe Methode C.4).  
1.5. VALIDITÄTSKRITERIEN  
Damit die Validität einer Prüfung gegeben ist, gelten die folgenden 
Bedingungen:  
— Die gesamte Überlebensrate von befruchteten Eiern in den Kon ­
trollen und, soweit zutreffend, in den Gefäßen, in denen sich 
ausschließlich Lösemittel befindet, muss größer oder gleich den in den Anlagen 2 und 3 definierten Grenzwerten sein.
 
— Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff muss während der 
gesamten Prüfung zwischen 60 und 100 % des Luftsauerstoff- 
Sättigungswertes liegen.  
— Die Wassertemperatur darf zwischen den Prüfkammern oder zwi ­
schen aufeinander folgenden Tagen zu keiner Zeit während der Prüfung um mehr als ± 1,5
 o C schwanken und sollte innerhalb 
der für die geprüfte Fischart festgelegten Temperaturbereiche lie ­
gen (Anlagen 2 und 3).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1022
 
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.6.1.  Prüfkammern  
Verwendet werden können beliebige Gefäße aus Glas oder einem 
anderen chemisch inerten Werkstoff. Die Abmessungen der Gefäße 
sollten der Besatzrate entsprechend groß genug sein (siehe 1.7.1.2). 
Es wird empfohlen, die Prüfkammern nach dem Zufallsprinzip in dem Prüfbereich anzuordnen. Einem randomisierten Blockkonzept, bei dem jede Behandlung in jedem Block vorhanden ist, ist der 
Vorzug vor einem vollständig randomisierten Konzept zu geben, 
wenn systemische Wirkungen in der Prüfeinrichtung vorhanden sind, die durch die Blockbildung kontrolliert werden können. Der Block ­
bildung sollte, sofern sie zum Tragen kommt, bei der anschließenden 
Datenauswertung Rechnung getragen werden. Die Prüfkammern sind vor ungewollten Störungen zu schützen.
 
1.6.2.  Auswahl der Fischarten  
Empfohlene Fischarten werden in Tabelle 1A genannt. Dies schließt 
die Verwendung anderer Fischarten (Beispiele hierzu finden sich in Tabelle 1B) zwar nicht aus, doch ist das Prüfverfahren unter Um ­
ständen anzupassen, um geeignete Prüfbedingungen zu schaffen. In 
diesem Fall sollten die Beweggründe für die Auswahl der Fischart und das Versuchsverfahren protokolliert werden.
 
1.6.3.  Haltung der Zuchtfische  
Nähere Angaben, wie man die Zuchtfische unter zufriedenstellenden 
Bedingungen hält, lassen sich in der OECD TG 210 (  1 ) und in den 
Literaturhinweisen (2) (3) (4) (5) (6) finden.  
1.6.4.  Handhabung von Embryonen und Larven  
Embryonen und Larven können innerhalb des Hauptgefäßes in klei ­
neren Behältern exponiert werden, die mit Siebseiten oder -enden versehen sind, damit die Prüflösung durch das Gefäß hindurchfließen kann. Einen wirbelfreien Durchfluss durch diese kleinen Gefäße 
kann man dadurch herbeiführen, dass man diese an einen Arm auf ­
hängt, der das Gefäß auf- und abbewegt, dabei jedoch die Organis ­
men immer mit der Prüflösung bedeckt hält; ebenfalls verwendet werden kann ein Siphonspülsystem. Befruchtete Eier von Salmonid ­
fischen können auf Einschüben oder Gittern gehältert werden, deren 
Öffnungen groß genug sind, so dass die Larven nach dem Schlüpfen hindurch fallen können. Pasteurpipetten eignen sich, um die Embryo ­
nen und Larven in den semistatischen Prüfungen mit vollständigem 
täglichem Wechsel des Prüfmediums zu entfernen (siehe 1.6.6).
 
Werden Eierbehälter, Gitter oder Siebe verwendet, um die Eier inner ­
halb des Hauptprüfgefäßes zu halten, sollten diese Rückhaltevorrich ­
tungen nach dem Schlüpfen der Larven entfernt werden (  1 ); Siebe 
sollten nur bleiben, um die Fische an der Flucht zu hindern. Sofern 
die Larven umgesetzt werden müssen, sollten sie nicht der Luft 
ausgesetzt werden, und es sollten keine Netze verwendet werden, um Fische aus Eierbehältern herauszuholen (derartige Vorsicht ist 
bei weniger anfälligen Arten wie beispielsweise Karpfen gegebenen ­
falls nicht erforderlich). Der Zeitpunkt für diese Umsetzung ist von Art zu Art unterschiedlich, und ein Umsetzen ist auch nicht immer erforderlich. Für das semistatische Verfahren können Bechergläser 
oder flache Behälter verwendet werden, die bei Bedarf mit einem 
leicht über dem Boden des Becherglases erhöhten Sieb versehen sind. Ist das Fassungsvermögen dieser Behälter für die Besatzanfor ­
derungen (siehe 1.7.1.2) ausreichend, brauchen die Embryonen oder 
Larven gegebenenfalls nicht umgesetzt zu werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1023  
( 1 ) OECD. Paris, 1992, Test Guideline 210, Fish. Early-life Stage Toxicity Test.
 1.6.5.  Wasser  
Jedes Wasser, das die chemischen Eigenschaften eines annehmbaren 
Verdünnungswassers entsprechend der Auflistung in Anlage 4 erfüllt und bei dem die zu prüfende Fischart eine Kontrollüberlebensrate 
aufweist, die zumindest so gut wie in den Anlagen 2 und 3 beschrie ­
ben ist, kommt als Prüfwasser in Frage. Das Wasser sollte während des Prüfzeitraums von gleich bleibender Qualität sein. Der pH-Wert sollte in einem Bereich von ± 0,5 pH-Einheiten bleiben. Um sicher ­
zustellen, dass das Verdünnungswasser das Prüfergebnis nicht über ­
mäßig beeinflusst (beispielsweise durch Komplexbildung mit der Prüfsubstanz) oder sich nachteilig auf die Leistung des Zucht ­
bestands auswirkt, sollten in Abständen Proben zur Analyse entnom ­
men werden. Messungen von Schwermetallen (z. B. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd und Ni), größeren Anionen und Kationen (z. B. Ca, Mg, Na, K, Cl und SO
 4 ), Pestiziden (z. B. gesamte phosphororganische und 
gesamte chlororganische Pestizide), des gesamten organischen Koh ­
lenstoffs (TOC) und der Schwebstoffe sollten beispielsweise alle 3 Monate ermittelt werden, wenn bekanntermaßen ein Verdünnungs ­
wasser von relativ gleich bleibender Qualität vorliegt. Hat sich die 
Wasserqualität über einen Zeitraum von mindestens einem Jahr als 
relativ konstant erwiesen, können Bestimmungen seltener durch ­
geführt und die Abstände verlängert werden (z. B. alle 6 Monate).
 
1.6.6.  Prüflösungen  
Prüflösungen der gewählten Konzentrationen werden durch Verdün ­
nung eines Stammansatzes hergestellt.  
Der Stammansatz sollte möglichst durch einfaches Mischen oder 
Hin- und Herbewegen der Prüfsubstanz in dem Verdünnungswasser auf mechanischem Wege hergestellt werden (z. B. Rühren und Ultra ­
schalldispersion). Sättigungskolonnen (Löslichkeitskolonnen) können 
verwendet werden, um einen Stammansatz von geeigneter Konzen ­
tration zu erzielen. Soweit möglich, sollte der Einsatz von Löse- oder Dispersionsmitteln (Lösungsmittel) vermieden werden; allerdings 
können derartige Verbindungen in einigen Fällen erforderlich sein, 
um einen Stammansatz von geeigneter Konzentration herzustellen. Beispiele für geeignete Lösemittel sind Aceton, Ethanol, Methanol, Dimethylformamid und Triethylenglycol. Beispiele für geeignete 
Dispersionsmittel sind Cremophor RH40, Tween 80, Methylcellulose 
0,01 % und HCO-40. Vorsicht ist bei leicht biologisch abbaubaren (z. B. Aceton) und/oder hochflüchtigen Stoffen geboten, da diese Probleme mit einer Anreicherung von Bakterien in Durchflussprü ­
fungen bereiten können. Wird ein Löslichkeitshilfsmittel verwendet, 
darf dieses weder eine signifikante Auswirkung auf das Überleben noch erkennbare negative Auswirkungen auf frühe Entwicklungspha ­
sen haben, was durch eine Kontrolle, bei der nur das Lösemittel 
verwendet wird, nachgewiesen wird. Es sollten jedoch alle Anstren ­
gungen unternommen werden, um den Einsatz derartiger Stoffe zu vermeiden.
 
Bei dem semistatischen Verfahren können zwei verschiedene Ver ­
fahren zur Erneuerung des Prüfmediums eingesetzt werden; entweder 
i) werden neue Prüflösungen in sauberen Gefäßen hergestellt und überlebende Eier und Larven vorsichtig zusammen mit einer kleinen Menge der alten Lösung in die neuen Behälter umgesetzt, wobei eine 
Exposition gegenüber Luft vermieden wird, oder ii) die Prüforganis ­
men bleiben in den Gefäßen, während ein Teil (mindestens drei Viertel) des Prüfwassers ausgetauscht wird. Die Häufigkeit der Er ­
neuerung des Prüfmediums hängt zwar von der Stabilität der Prüf ­
substanz ab, jedoch wird ein täglicher Austausch des Wassers emp ­
fohlen. Wenn aus vorausgehenden Stabilitätsprüfungen (siehe 1.4) bekannt ist, dass die Konzentration der Prüfsubstanz während des Zeitraums, in dem das Prüfmedium gewechselt wird, nicht stabil 
ist (d. h., außerhalb des Bereichs von 80 bis 120 % der nominalen 
Konzentration oder Unterschreitung von 80 % der gemessenen an ­
fänglichen Konzentration), sollte der Einsatz einer Durchflussprüfung in Erwägung gezogen werden. In jedem Fall sollte darauf geachtet 
werden, dass während des Wasserwechsels Stress für die Larven 
vermieden wird.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1024
 
Bei Durchflussprüfungen ist ein System erforderlich, das einen 
Stammansatz der Prüfsubstanz kontinuierlich abgibt und verdünnt 
(z. B. Dosierpumpe, Proportionalverdünnungsvorrichtung, Sättiger ­
system), um den Prüfkammern eine Reihe von Konzentrationen zu ­
zuführen. Die Durchsatzraten der Stammansätze und des Verdün ­
nungswassers sollten in Abständen, möglichst einmal pro Tag, über ­
prüft werden und während der gesamten Prüfung um nicht mehr als 10 % schwanken. Eine Durchsatzrate, die zumindest dem fünffachen Kammervolumen in 24 Stunden entspricht, hat sich als geeignet 
erwiesen (2).
 
1.7. VORGEHENSWEISE  
Nützliche Informationen über die Durchführung von Toxizitätsprü ­
fungen an Fischembryonen und Jungtieren mit Dottersack finden 
sich in der Fachliteratur, einige Beispiele hierfür sind im Abschnitt Literaturhinweise dieses Texts enthalten (7) (8) (9).
 
1.7.1.  Expositionsbedingungen  
1.7.1.1.  Dauer  
Die Prüfung sollte möglichst innerhalb von 30 Minuten nach der 
Befruchtung der Eier beginnen. Die Embryonen werden vor oder so bald wie möglich nach Beginn des Stadiums der Blastulaschei ­
ben-Spaltung und auf jeden Fall vor Einsetzen des Gastrula-Stadiums 
in die Prüflösung eingetaucht. Bei Eiern von kommerziellen Liefe ­
ranten ist es unter Umständen nicht möglich, die Prüfung unmittelbar nach der Befruchtung zu beginnen. Da die Empfindlichkeit der Prü ­
fung durch einen verzögerten Prüfbeginn gravierend beeinflusst wer ­
den kann, sollte die Prüfung innerhalb von 8 Stunden nach der Befruchtung eingeleitet werden. Da die Larven während des Exposi ­
tionszeitraums nicht gefüttert werden, sollte die Prüfung, kurz bevor 
der Dottersack von Larven in einer der Prüfkammern vollständig aufgezehrt ist beziehungsweise bevor in den Kontrollen Tiere zu verhungern anfangen, beendet sein. Die Dauer hängt dabei von der 
verwendeten Art ab. Einige Empfehlungen zur Dauer finden sich in 
den Anlagen 2 und 3.
 
1.7.1.2.  Besatz  
Die Anzahl an befruchteten Eiern bei Beginn der Prüfung sollte zur 
Erfüllung von statistischen Anforderungen hinreichend groß sein. Die 
Eier sollten nach dem Zufallsprinzip auf die Behandlungen verteilt wer ­
den, und mindestens 30 befruchtete Eier sollten, zu gleichen Teilen (oder 
so gleich wie möglich, da es bei Einsatz von einigen Arten schwierig sein 
kann, gleiche Chargen zu bekommen) auf mindestens drei parallele Prüfkammern aufgeteilt, je Konzentration verwendet werden. Die Be ­
satzrate (Biomasse je Volumen an Prüflösung) sollte gering genug sein, 
dass eine Konzentration an gelöstem Sauerstoff von mindestens 60 % 
des Luftsauerstoff-Sättigungswerts ohne Belüftung aufrechterhalten wer ­
den kann. Bei Durchflussprüfungen wurde eine Besatzrate von nicht mehr als 0,5 g/l je 24 Stunden und nicht mehr als 5 g/l Lösung zu jeder 
Zeit empfohlen (2).
 
1.7.1.3.  Licht und Temperatur  
Die Belichtungsdauer und die Prüfwassertemperatur sollten für die 
geprüfte Fischart angemessen sein (Anlagen 2 und 3). Zur Über ­
wachung der Temperatur kann die Verwendung eines weiteren Prüf ­
gefäßes angebracht sein.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1025
 
1.7.2.  Prüfkonzentrationen  
Im Normalfall sind fünf Konzentrationen der Prüfsubstanz, die sich 
durch einen konstanten Faktor von nicht mehr als 3,2 voneinander unterscheiden, erforderlich. Die Kurve, in der die LC
 50 gegen den 
Expositionszeitraum in der akuten Prüfung aufgetragen ist, sollte bei 
der Auswahl des Bereichs an Prüfkonzentrationen berücksichtigt werden. Die Verwendung von weniger als fünf Konzentrationen, beispielsweise in Limit-Tests, und ein engerer Konzentrationsbereich 
können unter gewissen Umständen angebracht sein. Werden weniger 
als fünf Konzentrationen verwendet, sollte dies begründet werden. Konzentrationen der Substanz, die höher als die LC
 50 über 96 Stun ­
den beziehungsweise 100 mg/l sind, je nachdem, welcher Wert der 
niedrigere ist, brauchen nicht geprüft zu werden. Substanzen sollten nicht oberhalb ihrer Löslichkeitsgrenze im Prüfwasser geprüft werden.
 
Wird ein Lösungsmittel bei der Herstellung der Prüflösungen ver ­
wendet (siehe 1.6.6), sollte dessen Endkonzentration in den Prüfge ­
fäßen nicht mehr als 0,1 ml/l betragen und in allen Prüfgefäßen 
gleich sein.  
1.7.3.  Kontrollen  
Eine Kontrolle mit Verdünnungswasser (mit der entsprechenden An ­
zahl von Wiederholungen) und ebenfalls, soweit relevant, eine Kon ­
trolle mit dem Lösungsmittel (mit der entsprechenden Anzahl von Wiederholungen) sollten zusätzlich zu der Testreihe durchgeführt werden.
 
1.7.4.  Häufigkeit von analytischen Bestimmungen und Messungen  
Während der Prüfung werden die Konzentrationen der Prüfsubstanz 
in regelmäßigen Abständen bestimmt.  
Bei semistatischen Prüfungen, bei denen erwartet wird, dass die 
Konzentration der Prüfsubstanz innerhalb von ± 20 % der Nominal ­
konzentration konstant bleibt (d. h. innerhalb des Bereichs von 80 bis 120 %; siehe 1.4 und 1.6.6), wird empfohlen, dass zumindest die höchste und die niedrigste Prüfkonzentration analysiert werden, 
wenn diese frisch hergestellt ist und unmittelbar vor dem Austausch, 
und zwar zu mindestens drei gleichmäßig über die Prüfung verteilten Zeitpunkten (d. h., Analysen sollten anhand einer Probe derselben Lösung erfolgen — wenn diese frisch hergestellt ist und beim Aus ­
tausch).
 
Bei Prüfungen, bei denen nicht damit zu rechnen ist, dass die Kon ­
zentration der Prüfsubstanz innerhalb von ± 20 % der Nominalkon ­
zentration (d. h., der Grundlage von Stabilitätsdaten der Substanz) konstant bleibt, ist es notwendig, alle Prüfkonzentrationen, frisch 
hergestellt und beim Austausch, zu analysieren, jedoch unter glei ­
chen Verhältnissen (d. h. bei mindestens drei Gelegenheiten, die gleichmäßig über die Prüfung verteilt sind). Die Bestimmung von Konzentrationen der Prüfsubstanz vor dem Austausch braucht nur an 
einem Wiederholungsgefäß bei jeder Prüfkonzentration durchgeführt 
zu werden. Konzentrationen sollten im Abstand von nicht mehr als 7 Tagen bestimmt werden. Es wird empfohlen, dass Ergebnisse dabei auf gemessenen Konzentrationen basieren. Kann jedoch nachgewie ­
sen werden, dass die Konzentration der Prüfsubstanz während der 
gesamten Prüfung zufriedenstellend innerhalb von ± 20 % der no ­
minalen Konzentration oder gemessenen Anfangskonzentration ge ­
halten wurde, dann können Ergebnisse auf nominalen oder gemes ­
senen Anfangswerten basieren.
 
Bei Durchflussprüfungen ist ein ähnliches Probenahmeverfahren, wie 
für semistatische Prüfungen beschrieben, angebracht (die Messung 
der „alten“ Lösungen gilt in diesem Falle jedoch nicht). Dauert die Prüfung allerdings länger als 7 Tage, ist es unter Umständen ratsam, die Anzahl an Probenahmen in der ersten Woche zu erhöhen (d. h. 
drei Messreihen), um sicherzugehen, dass die Prüfkonzentrationen 
stabil bleiben.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1026
 
Proben müssen gegebenenfalls zentrifugiert oder gefiltert werden 
(z. B. mit einer Porengröße von 0,45 μm). Da jedoch weder die 
Zentrifugation noch die Filtration stets den nicht bioverfügbaren Teil der Prüfsubstanz von dem bioverfügbaren Teil trennt, brauchen die Proben diesen Behandlungen nicht unterzogen zu werden.
 
Während der Prüfung sollten in allen Prüfgefäßen der gelöste Sauer ­
stoff, der pH-Wert und die Temperatur gemessen werden. Die Ge ­
samthärte und der Salzgehalt (soweit relevant) sollten in den Kon ­
trollen und einem Gefäß mit der höchsten Konzentration gemessen werden. Der gelöste Sauerstoff und der Salzgehalt (soweit relevant) 
sollten mindestens dreimal (zu Beginn, in der Mitte und am Ende der 
Prüfung) gemessen werden. Bei semistatischen Prüfungen wird emp ­
fohlen, den gelösten Sauerstoff häufiger zu messen, möglichst vor und nach jedem Wasseraustausch, oder zumindest einmal pro Wo ­
che. Der pH-Wert sollte zu Beginn und am Ende eines jeden Wasser ­
wechsels bei semistatischen Prüfungen und mindestens einmal pro Woche bei Durchflussprüfungen gemessen werden. Die Härte sollte jeweils einmal pro Prüfung gemessen werden. Die Temperatur sollte 
einmal pro Tag gemessen und zumindest in einem Prüfgefäß kon ­
tinuierlich überwacht werden.
 
1.7.5.  Beobachtungen  
1.7.5.1.  Stadium der Embryonalenwicklung  
Das Embryonalstadium (d. h. Gastrula-Stadium) zu Beginn der Ex ­
position gegenüber der Prüfsubstanz sollte so genau wie möglich überprüft werden. Dies kann mit Hilfe einer repräsentativen Probe 
von Eiern, die in geeigneter Form aufbewahrt und gereinigt wurden, 
erfolgen. Zur Beschreibung und Darstellung von Embryonalstadien kann auch die Fachliteratur herangezogen werden (2) (5) (10) (11).
 
1.7.5.2.  Schlüpfen und Überleben  
Beobachtungen zum Schlüpfen und Überleben sollten zumindest ein ­
mal pro Tag erfolgen, und die jeweiligen Zahlen sollten protokolliert 
werden. Zu Beginn der Prüfung können häufigere Beobachtungen 
(z. B. alle 30 Minuten in den ersten 3 Stunden) wünschenswert sein, da in einigen Fällen Überlebenszeiten aussagefähiger sein können als nur die Anzahl von Todesfällen (z. B. bei akuten toxischen Wirkun ­
gen). Sobald tote Embryonen und Larven festgestellt werden, sollten 
diese unmittelbar entfernt werden, da sie sich rasch zersetzen können. Äußerste Sorgfalt sollte bei der Entfernung von einzelnen toten Individuen aufgewendet werden, um benachbarte Eier/Larven 
nicht zu stoßen oder körperlich zu beschädigen, da diese äußerst zart 
und empfindlich sind. Je nach Entwicklungsstadium gelten unter ­
schiedliche Kriterien zur Bestimmung des Todes:
 
— bei Eiern:  insbesondere in den frühen Stadien ein deutlich er ­
kennbarer Verlust an Lichtdurchlässigkeit und eine Veränderung 
der Färbung, hervorgerufen durch Gerinnung und/oder Ausfäl ­
lung von Eiweiß, was zu einem weiß-opaken Aussehen führt;  
— bei Embryonen:  fehlende Körperbewegung und/oder fehlender 
Herzschlag und/oder opake Verfärbung bei Arten, bei denen die Embryonen im Normalfall durchsichtig sind;
 
— bei Larven:  Bewegungslosigkeit und/oder fehlende Atmung 
und/oder fehlender Herzschlag und/oder weiß-opake Färbung 
des zentralen Nervensystems und/oder mangelnde Reaktion auf 
mechanische Reize.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1027
 
1.7.5.3.  Abnormes Aussehen  
Die Anzahl der Larven, die eine abnorme Körperform und/oder Pig ­
mentierung aufweisen, und das Stadium der Dottersackaufzehrung sollten in angemessenen Abständen in Abhängigkeit der Dauer der 
Prüfung und der Art der beschriebenen Abnormität protokolliert wer ­
den. Zu beachten ist, dass abnorme Embryonen und Larven auch von Natur aus auftreten und bei einigen Arten in der Größenordnung von mehreren Prozent bei der/den Kontrolle(n) liegen können. Abnorme 
Tiere sollten aus den Prüfgefäßen nur dann entfernt werden, wenn 
sie tot sind.
 
1.7.5.4.  Abnormes Verhalten  
Abnormitäten, z. B. Hyperventilation, unkoordiniertes Schwimmen 
und atypische Ruhe, sollten in angemessenen Abständen in Abhän ­
gigkeit der Dauer der Prüfung protokolliert werden. Auch wenn sich 
diese Auswirkungen nur schwer quantifizieren lassen, können sie, 
sofern sie beobachtet werden, bei der Interpretation von Mortalitäts ­
daten helfen, d. h., Informationen über die toxische Wirkungsweise der Substanz liefern,
 
1.7.5.5.  Länge  
Am Ende der Prüfung wird eine Messung der Einzellängen empfoh ­
len; dabei kann die Standard-, die Gabelungs- oder die Gesamtlänge 
verwendet werden. Kommt es jedoch zu Schwanzflossenfäule oder Flossenerosion, sollten Standardlängen herangezogen werden. Im Allgemeinen sollte in einer ordentlich durchgeführten Prüfung der 
Variationskoeffizient für die Länge unter den Wiederholungen in 
den Kontrollen 20 % sein.
 
1.7.5.6.  Gewicht  
Am Ende der Prüfung können die einzelnen Gewichte bestimmt 
werden; dabei sollten möglichst Trockengewichte (24 Stunden bei 60
 o C) vor Nassgewichten (trocken getupft) gemessen werden. Im 
Allgemeinen sollte in einer ordentlich durchgeführten Prüfung der 
Variationskoeffizient für das Gewicht unter den Wiederholungen in den Kontrollen < 20 % sein.
 
Diese Beobachtungen führen zu einigen oder allen der folgenden 
Daten, die zur statistischen Auswertung zur Verfügung stehen:  
— kumulative Mortalität;  
— Anzahl von gesunden Larven am Ende der Prüfung;  
— Zeit des Schlüpfbeginns und des Schlüpfendes (d. h. 90 % 
Schlüpfen in jeder Wiederholung);  
— Anzahl von Larven, die jeden Tag schlüpfen;  
— Länge (und Gewicht) der am Ende der Prüfung überlebenden 
Tiere;  
— Anzahl an Larven, die deformiert sind oder ein abnormes Aus ­
sehen aufweisen;  
— Anzahl von Larven, die abnormes Verhalten zeigen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1028
 
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
2.1. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE  
Es wird empfohlen, einen Statistiker sowohl an der Auslegung als 
auch an der Auswertung der Prüfung zu beteiligen, da die Methode 
eine beträchtliche Bandbreite im Versuchskonzept zulässt, beispiels ­
weise bei der Anzahl an Prüfkammern, der Anzahl an Prüfkonzen ­
trationen, der Ausgangszahl an befruchteten Eiern und der gemesse ­
nen Parameter. In Anbetracht der für die Auslegung der Prüfung zur 
Verfügung stehenden Möglichkeiten wird an dieser Stelle keine kon ­
krete Orientierung zu den statistischen Verfahren gegeben.  
Sind LOEC/NOEC-Werte zu bestimmen, wird die Notwendigkeit 
bestehen, Streuungen innerhalb jeder Wiederholungsreihe durch eine Varianzanalyse (ANOVA) oder Kontingenztabellenverfahren 
zu analysieren. Für einen Mehrfachvergleich zwischen den Ergeb ­
nissen bei den einzelnen Konzentrationen und den Ergebnissen der Kontrollen ist möglicherweise die Dunnet’sche Methode von Nutzen (12) (13). Weitere hilfreiche Beispiele sind ebenfalls verfügbar (14) 
(15). Der Umfang der Wirkung, der mit ANOVA oder anderen Ver ­
fahren nachweisbar ist, (d. h. die Aussagefähigkeit der Prüfung) sollte berechnet und protokolliert werden. Zu beachten ist, dass sich nicht alle in 1.7.5.6 aufgeführten Beobachtungen für eine sta ­
tistische Auswertung mittels einer ANOVA eignen. Die kumulative 
Mortalität und die Anzahl an gesunden Larven am Ende der Prüfung könnten beispielsweise mit Hilfe von Probit-Methoden analysiert werden.
 
Sind LC/EC  x -Werte zu bestimmen, sollte(n) (eine) geeignete Kur ­
ve(n) wie beispielsweise die logistische Kurve an die Daten von 
Interesse mittels eines statistischen Verfahrens wie der Methode 
der kleinsten Quadrate oder der nichtlinearen kleinsten Quadrate angepasst werden. Die Kurve(n) sollte(n) so parametriert werden, dass die LC/EC
 X von Interesse und deren Standardfehler direkt abge ­
schätzt werden können. Dies wird die Berechnung des Vertrauens ­
bereichs rund um die LC/EC  X deutlich erleichtern. Soweit keine 
guten Gründe dafür vorliegen, anderen Vertrauensbereichen den Vor ­
zug zu geben, sollte der zweiseitige 95 % Vertrauensbereich ange ­
geben werden. Das Anpassungsverfahren sollte möglichst einen Weg 
bieten, um die Signifikanz der mangelnden Anpassung zu bewerten. Für die Anpassung von Kurven können grafische Methoden einge ­
setzt werden. Für alle in 1.7.5.6 aufgeführten Beobachtungen kommt 
eine Regressionsanalyse in Frage.
 
2.2. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Die Ergebnisse sollten mit Vorsicht interpretiert werden, wenn ge ­
messene toxische Konzentrationen in Prüflösungen in der Nähe der 
Nachweisgrenze des analytischen Verfahrens liegen. Die Interpreta ­
tion von Ergebnissen für Konzentrationen oberhalb der Wasserlös ­
lichkeit der Substanz sollte ebenfalls mit Vorsicht erfolgen.  
2.3. ABSCHLUSSBERICHT  
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:  
2.3.1.  Prüfsubstanz  
— Physikalische Beschaffenheit und relevante physikalisch-che ­
mische Eigenschaften;  
— Daten zur chemischen Identifizierung, einschließlich Reinheits ­
grad und analytisches Verfahren zur Quantifizierung der Prüfsub ­
stanz, soweit zutreffend.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1029
 
2.3.2.  Geprüfte Fischart  
— Wissenschaftlicher Name, Stamm. Anzahl an Elternfischen (d. h., 
wie viele Weibchen wurden für die erforderlichen Zahlen an Eiern in der Prüfung verwendet), Herkunft und Art der Samm ­
lung der befruchteten Eier sowie anschließende Handhabung.
 
2.3.3.  Prüfbedingungen  
— Zum Einsatz kommendes Prüfverfahren (z. B. semistatisches oder 
Durchflussverfahren, Zeitraum von der Befruchtung bis zum Be ­
ginn der Prüfung, Besatz usw.);  
— Belichtungszeit(en);  
— Auslegung der Prüfung (z. B. Anzahl der Prüfkammern und 
Wiederholungen, Anzahl an Embryonen je Wiederholung);  
— Methode zur Herstellung von Stammansätzen und Häufigkeit der 
Erneuerung (sollte ein Lösungsmittel verwendet werden, sind dieses Mittel und dessen Konzentration anzugeben);
 
— die nominalen Prüfkonzentrationen, die Messwerte, deren Mittel ­
werte und deren Standardabweichungen in den Prüfbehältern so ­
wie das Verfahren, nach dem diese erzielt wurden, und, sofern 
die Prüfsubstanz in Wasser bei Konzentrationen unterhalb der Prüfkonzentrationen löslich ist; es sollte der Nachweis geführt werden, dass sich die Messungen auf die Konzentrationen der 
Prüfsubstanz in der Lösung beziehen;
 
— Eigenschaften des Verdünnungswassers: pH-Wert, Härte, Tem ­
peratur, gelöste Sauerstoffkonzentration, Restchlorgehalt (soweit 
gemessen), gesamter organischer Kohlenstoff (TOC), Schweb ­
stoffe, Salzgehalt des Prüfmediums (soweit gemessen) und even ­
tuelle andere vorgenommene Messungen;  
— Wasserqualität innerhalb der Prüfgefäße: pH-Wert, Härte, Tem ­
peratur und gelöste Sauerstoffkonzentration.  
2.3.4.  Ergebnisse  
— Ergebnisse von eventuellen vorhergehenden Untersuchungen zur 
Stabilität der Prüfsubstanz;  
— Nachweis, dass die Kontrollen den allgemeinen Standard bezüg ­
lich der Annehmbarkeit der Überlebensraten für die geprüfte Fischart erfüllen (Anlagen 2 und 3);
 
— Daten zu Mortalität/Überleben im Embryo- und Larvenstadium 
sowie Gesamtmortalität/-überleben;  
— Tage bis zum Schlüpfen und Anzahl geschlüpfter Tiere;  
— Angaben zur Länge (und zum Gewicht);  
— Vorkommen und Beschreibung morphologischer Abnormitäten, 
soweit zutreffend;  
— Vorkommen und Beschreibung von Auswirkungen auf das Ver ­
halten, soweit zutreffend;  
— statistische Auswertung und Datenaufbereitung;  
— bei Tests, in denen zur Auswertung die ANOVA zum Einsatz 
kommt, die geringste Dosiskonzentration, bei der eine Wirkung 
beobachtet wird (LOEC). bei p = 0,05 und die höchste Dosis ­
konzentration, bei der keine Wirkung beobachtet wird (NOEC), für jede bewertete Reaktion, einschließlich einer Beschreibung 
der herangezogenen statistischen Verfahren und eine Angabe 
zum Umfang der Wirkung, die ermittelt werden konnte;
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1030
 
— bei Tests, die unter Zuhilfenahme von Regressionsverfahren aus ­
gewertet werden, die LC/EC  X und Vertrauensbereiche sowie ein 
Graf des angepassten Modells, das für deren Berechnung benutzt wurde;
 
— Erklärung für eine eventuelle Abweichung von dieser 
Prüfmethode.  
3. LITERATURHINWEISE  
(1) Kristensen P. (1990) Evaluation of the Sensitivity of Short 
Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 June 1990.
 
(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life- 
Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 S.
 
(3) Brauhn J. L. and Schoettger R. A. (1975). Acquisition and 
Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, 
Channel Catfish and Bluegills. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
 
(4) Brungs W. A. and Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures, 128, Ecological Re ­
search Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.  
(5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish  
(Brachydanio rerio)  in Fisheries Research. A Literature Re ­
view. J. Biol. 10, 121-173.  
(6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish,  Brachy­
danio rerio  (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, 328-330.  
(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander 
B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval To ­
xicity Test with Zebrafish  (Brachydanio rerio)  Using Chro ­
mium and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and 
Chemistry, 6, 61-71.  
(8) Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short- 
term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Esti ­
mating Chronic Values for Single Compounds and Complex 
Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, 807- 821.
 
(9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986). Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Com ­
pounds. 111. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri).  J. Aquatic Toxicology, 9, 129-145.
 
(10) Kirchen R. V. and W. R. West (1969). Teleostean Develop ­
ment. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply 
Company.  
(11) Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. 
Its care and Development. Carolina Biological Supply Compa ­
ny, North Carolina. 36 S.  
(12) Dunnett C. W. (195 5). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, 1096-1121.
 
(13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, 482-491.  
(14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J.G. (1980). Sta ­
tistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Procee ­
dings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Phi ­
ladelphia.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1031
 
(15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early 
Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, 321-334.  
(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or 
Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992. 81 S.
 
(17) Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish,  Brachydanio 
rerio.  Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 
21, 126-134.  
(18) Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phylogene ­
tic position of the Zebrafish  (Danio rerio).  a model System in 
developmental biology — an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 
231-236.
 
(19) Ghillebaert F., Chaillou C, Deschamps F. and Roubaud P. 
(1995). Toxic Effects, at Three pH Levels. of Two Reference 
Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and En ­
vironmental Safety 32, 19-28.  
(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Meda ­
ka, Oryzias latipes.  EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, 
EPA, Duluth.  
(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.
 
(22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. 0., Poccocic T. 
L, Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. (1991). 
Validity in the Performance of the seven-day Fathead minnow  
(Pimephales promelas)  larval survival and growth test: an in ­
tra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, 1189- 1203.
 
(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing 
and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estua ­
rine and Marine fish.  
(24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New develop ­
mental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 S.
 
(25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: 
W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, 1-58.
 
Tabelle 1A  
Für die Prüfung empfohlene Fischarten  
Süßwasserfische  
Oncorhynchus mykiss  
Regenbogenforelle (9) (16)  
Danio rerio  
Zebrabärbling (7) (17) (18)  
Cyprinus caprio  
Gemeiner Karpfen (8) (19)  
Oryzias latipes  
Japankärpfling/Medaka (20) (21)  
Pimephales 
promelas  Dickkopfelritze (8) (22)  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1032
 
Tabelle 1B  
Beispiele für andere hinreichend dokumentierte Arten, die ebenfalls verwendet wurden  
Süßwasserfische Salzwasserfische  
Carassius auratus  
Goldfisch (8)  Menidia peninsulae  
Gezeiten-Ährenfisch (23) (24) (25)  
Lepomis macrochirus  
Blauer Sonnenbarsch (8)  Clupea 
harengus  Hering (24) (25)  
Gadus 
morhua  Kabeljau (24) (25)  
Cyprinodon 
variegatus  Edelsteinkärpfling (23) (24) (25)  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1033
 
Anlage 1  
ANLEITUNG ZUR DURCHFÜHRUNG EINER TOXIZITÄTSPRÜFUNG 
AN EMBRYONEN UND JUNGTIEREN MIT DOTTERSACK DES 
ZEBRABÄRBLINGS ( BRACHYDANIO RERIO ) 
EINFÜHRUNG  
Der Zebrabärbling stammt von der Koromandelküste in Indien, wo er in schnell 
fließenden Strömen lebt. Er ist ein verbreiteter Aquarienfisch und gehört zur Familie der Karpfen; Informationen über seine Pflege und Kultur sind in Stan ­
dardnachschlagewerken über tropische Fische zu finden. Die Biologie und die 
Verwendung des Zebrabärblings in der Fischforschung wurden von Laale (1) 
besprochen.
 
Nur in seltenen Fällen erreicht der Fisch eine Länge von mehr als 45 mm. Sein 
Körper ist zylindrisch geformt mit 7 bis 9 dunkelblauen, waagerecht verlaufenden 
silbernen Streifen. Diese Streifen reichen bis in die Schwanz- und Afterflossen. 
Der Rücken ist olivgrün gefärbt. Männchen sind schlanker als Weibchen. Bei Weibchen ist die silberne Färbung stärker ausgeprägt, und ihr Bauch ist gebläht, 
vor allem vor dem Laichen.
 
Erwachsene Fische können große Schwankungen von Temperatur, pH-Wert und 
Härte vertragen. Um jedoch gesunde Fische zu erhalten, die Eier von guter Qualität produzieren, sollte für optimale Bedingungen gesorgt werden.
 
Beim Laichen verfolgt und begattet das Männchen das Weibchen, und im Aus ­
stoßen werden die Eier befruchtet. Die Eier, die transparent sind und keinen klebrigen Stoff enthalten, fallen auf den Grund, wo sie von den Eltern aufgefres ­
sen werden können. Das Laichen wird durch Licht beeinflusst. Bei entsprechen ­
dem Morgenlicht laichen die Fische im Allgemeinen in den ersten Stunden nach Tagesanbruch.
 
Ein Weibchen kann im Abstand von einer Woche Chargen von mehreren Hun ­
dert Eiern produzieren.  
BEDINGUNGEN FÜR ELTERNFISCHE, FORTPFLANZUNG UND FRÜHE 
ENTWICKLUNGSSTADIEN  
Eine geeignete Anzahl von gesunden Fischen auswählen und mindestens 2 Wo ­
chen vor dem beabsichtigten Laichen in geeignetem Wasser (z. B. Anlage 4) halten. Man sollte die Fischgruppe zumindest einmal brüten lassen, bevor sie die 
für die Prüfung zu verwendende Charge an Eiern produzieren. Die Fischdichte 
sollte in diesem Zeitraum 1 Gramm Fische je Liter nicht übersteigen. Durch einen regelmäßigen Wechsel des Wassers oder den Einsatz von Reinigungssys ­
temen lässt sich eine höhere Dichte erreichen. Die Temperatur in den Hälterungs ­
behältern sollte bei 25 ± 2
 o C gehalten werden. Den Fischen sollte abwechs ­
lungsreiche Nahrung geboten werden, die beispielsweise aus entsprechendem handelsüblichem Trockenfutter, lebenden frischgeschlüpften Arthemien, Chirono ­
miden, Daphnien oder weißen Würmern (Enchytraeiden) bestehen kann.
 
Im Folgenden werden zwei Verfahren in groben Zügen beschrieben, die in der 
Praxis eine ausreichende Charge von gesunden befruchteten Eiern für eine durch ­
zuführende Prüfung ergeben haben:  
i) 8 Weibchen und 16 Männchen werden in einen Behälter mit 50 Litern Ver ­
dünnungswasser gesetzt, der vor direktem Licht geschützt und nach Möglich ­
keit mindestens 48 Stunden lang ungestört gelassen wird. Auf den Boden des 
Aquariums wird am Nachmittag des Tages, bevor die Prüfung beginnt, eine 
Laichschale gesetzt. Die Laichschale besteht aus einem Rahmen (aus Plexi ­
glas oder einem anderen geeigneten Material) und ist 5 bis 7 cm hoch; am oberen Ende ist ein grobes Netz mit einer Maschenweite von 2 bis 5 mm 
befestigt, unten auf dem Boden ein feines Netz mit einer Maschenweite von 
10 bis 30 μm. An dem groben Netz des Rahmens wird eine Reihe von 
„Laichbäumen“, die aus ungedrehtem Nylonfaden bestehen, befestigt. Nach ­
dem die Fische 12 Stunden lang im Dunkeln gelassen wurden, wird ein 
schwaches Licht eingeschaltet, welches das Laichen in Gang setzen wird. 
2 bis 4 Stunden nach dem Laichen wird die Laichschale entfernt, und die Eier werden eingesammelt. Die Laichschale hindert die Fische daran, die Eier aufzufressen, und ermöglicht gleichzeitig ein einfaches Einsammeln der Eier. 
Die Fischgruppe sollte zumindest einmal vor dem Laich, von dem Eier für die 
Prüfung verwendet werden, gelaicht haben.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1034
 
ii) 5 bis 10 Männchen und Weibchen werden mindestens 2 Wochen vor dem 
beabsichtigten Laichen einzeln gehalten. Nach 5 bis 10 Tagen sind die Bäu ­
che der Weibchen gebläht und ihre Genitalpapillen sichtbar. Männliche Fische besitzen keine Papillen. Das Laichen erfolgt in Laichbehältern, die mit einem eingeschobenen Gitterboden ausgerüstet sind (wie oben). Der Behälter wird 
mit Verdünnungswasser gefüllt, so dass das Wasser 5 bis 10 cm über dem 
Gitter steht. Am Tag vor dem beabsichtigten Laichen werden 1 Weibchen und 2 Männchen in den Behälter gesetzt. Die Wassertemperatur wird schrittweise 1 Grad über die Eingewöhnungstemperatur erhöht. Das Licht wird aus ­
geschaltet, und der Behälter wird so ungestört wie möglich gelassen. Am 
Morgen wird ein schwaches Licht eingeschaltet, welches das Laichen in Gang setzen wird. Nach 2 bis 4 Stunden werden die Fische entfernt und die Eier eingesammelt. Werden größere Chargen von Eiern benötigt, als 
von einem Weibchen gewonnen werden können, kann eine hinreichende An ­
zahl von Laichbehältern parallel aufgestellt werden. Dadurch, dass man den Reproduktionserfolg der einzelnen Weibchen vor der Prüfung festhält (Größe der Charge und Qualität), können die Weibchen mit dem höchsten Repro ­
duktionserfolg für die Zucht ausgewählt werden.
 
Die Eier sollten mit Hilfe von Glasröhrchen (mit einem Innendurchmesser von 
nicht weniger als 4 mm), die mit einem flexiblen Saugkolben ausgestattet sind, in 
die Prüfgefäße umgesetzt werden. Dabei sollte die Menge Wasser, die zusammen 
mit den Eiern umgelagert wird, so gering wie möglich sein. Die Eier sind schwerer als Wasser und sinken aus dem Röhrchen. Vorsicht ist geboten, damit die Eier (und Larven) nicht mit Luft in Berührung kommen. Es sollte eine 
mikroskopische Untersuchung von einer oder mehreren Proben von der/den 
Charge(n) durchgeführt werden, um sicherzugehen, dass in den ersten Entwick ­
lungsstadien keine Unregelmäßigkeiten vorliegen. Eine Desinfektion der Eier ist nicht zulässig.
 
Die Mortalitätsrate der Eier ist in den ersten 24 Stunden nach der Befruchtung 
am höchsten. In dieser Zeit ist häufig eine Mortalität von 5 bis 40 % zu be ­
obachten. Infolge einer erfolglosen Befruchtung oder aufgrund von Entwick ­
lungsfehlern kommt es zur Degeneration von Eiern. Die Qualität der Eiercharge scheint dabei vom Fischweibchen abzuhängen: Einige Weibchen produzieren gleich bleibend Eier von guter Qualität, andere tun das niemals. Auch die Ent ­
wicklungs- und Schlüpfrate ist von Charge zu Charge unterschiedlich. Erfolg ­
reich befruchtete Eier und Dottersacklarven überleben gut, normalerweise in einer Größenordnung von mehr als 90 %. Bei einer Temperatur von 25
 o C schlüpfen 
die Eier 3 bis 5 Tage nach der Befruchtung, und der Dottersack ist etwa 13 Tage 
nach der Befruchtung aufgezehrt.  
Die Embryonalentwicklung wurde von Hisaoka und Battle (2) gut bestimmt. 
Aufgrund der Transparenz der Eier und der Larven nach dem Schlüpfen kann 
die Entwicklung der Fische verfolgt werden, und vorhandene Missbildungen lassen sich beobachten. Etwa 4 Stunden nach dem Laichen können unbefruchtete Eier von befruchteten unterschieden werden (3). Zu dieser Untersuchung werden 
Eier und Larven in Prüfgefäße mit geringem Fassungsvermögen gesetzt und unter 
dem Mikroskop untersucht.
 
Die für die frühen Entwicklungsstufen geltenden Prüfbedingungen sind in Anlage 
2 aufgeführt. Optimal als pH-Wert und Härte für das Verdünnungswasser sind 
7,8 beziehungsweise 250 mg CaCO  3 /l. 
BERECHNUNGEN UND STATISTIK  
Vorgeschlagen wird eine zweistufige Vorgehensweise. In einem ersten Schritt 
werden Daten zu Mortalität, abnormer Entwicklung und Schlüpfzeit statistisch ausgewertet. Dann wird bei denjenigen Konzentrationen, bei denen keine nega ­
tiven Auswirkungen auf einen dieser Parameter festgestellt wurden, die Körper ­
länge statistisch bewertet. Diese Vorgehensweise ist ratsam, da der toxische Stoff kleinere Fisch selektiv töten, die Schlüpfzeit verlängern und grobe Missbildungen hervorrufen und somit zu einseitigen Längenmessungen führen kann. Außerdem 
soll in etwa die gleiche Anzahl von Fischen für jede Behandlung vermessen 
werden, um die Validität der Prüfstatistik sicherzustellen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1035
 
BESTIMMUNG DER LC  50 UND EC  50 
Der prozentuale Anteil an überlebenden Eiern und Larven wird berechnet und 
um die Mortalität in den Kontrollen nach der Abbottschen Formel korrigiert (4):  
P ¼ 100 Ä C Ä P 0 
C Ü 100 Í Î  
Dabei gilt:  
P = korrigierter prozentualer Anteil an überlebenden Eiern und Larven  
P' = beobachteter prozentualer Anteil an überlebenden Eiern und Larven in der 
Prüfkonzentration  
C = prozentualer Anteil an überlebenden Eiern und Larven in der Kontrolle  
Soweit möglich, wird die LC  50 am Ende der Prüfung mittels einer geeigneten 
Methode bestimmt.  
Wird die Berücksichtigung von morphologischen Abnormitäten in der EC  50 -Sta­
tistik gewünscht, finden sich dazu bei Stephan (5) entsprechende Hinweise.  
SCHÄTZUNG DER LOEC UND NOEC  
Eine Zielsetzung, die mit der Prüfung an Eiern und Jungfischen im Dottersack ver ­
folgt wird, besteht darin, die Konzentrationen, die nicht wirkungslos sind, mit der Kontrolle zu vergleichen, das heißt, die LOEC zu bestimmen. Aus diesem Grunde 
sollten Mehrfachvergleichsverfahren zum Einsatz kommen (6) (7) (8) (9) (10).
 
LITERATURHINWEISE  
(1) Laale H. \V. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish  (Brachydanio 
rerio)  in Fisheries Research. A Literature Review). Fish Biol. 10, 121-173.  
(2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the 
Zebrafish  Brachydanio rerio ( Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 S.  
(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling  
(Brachyidanio rerio  Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 
2, 173-181.  
(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, 1-333.  
(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society 
for Testing and Materials, 69-81,
 
(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.  
(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Con ­
trol. Biometrics, 20, 482-491.  
(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Bio ­
metrics, 27, 103-117.  
(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a 
Zero Dose Control. Biometrics 28, 519-531.  
(10) Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1036
 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1037
 ▼B 
Anlage 2  
PRÜFBEDINGUNGEN, DAUER UND ÜBERLEBENSKRITERIEN FÜR EMPFOHLENE FISCHARTEN  
Fischart Temperatur 
( o C) Salzgehalt 
(0/00) Belichtungs ­
dauer 
(Std.) Dauer der Stadien 
(Tage) 
Typische Dauer der Prüfung Überlebensrate in der Kontrolle 
(min.- %) 
Embryonen Jungfische mit 
Dottersack Schlüpferfolg Nach dem 
Schlüpfen  
SÜSSWASSERFISCHE  
Brachydanio rerio  
Zebrabärbling 25 ± 1 — 12-16 3-5 8-10 So bald wie möglich nach der Befruchtung 
(frühes Gastrula-Stadium) bis 5 Tage nach dem Schlüpfen (8-10 Tage) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
Regenbogenforelle 10 ± 1 (
 1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  a ) 30-35 25-30 So bald wie möglich nach der Befruchtung 
(frühes Gastrula-Stadium) bis 20 Tage nach 
dem Schlüpfen (50-55 Tage) 66 70  
C.yprinus carpio  
Gemeiner Karpfen 21-25 — 12-16 5 > 4 So bald wie möglich nach der Befruchtung 
(frühes Gastrula-Stadium) bis 4 Tage nach dem Schlüpfen (8-9 Tage) 80 75  
Oryzias latipes  
Japankärpfling/Medaka 24 ± 1 (
 1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12-16 8-11 4-8 So bald wie möglich nach der Befruchtung 
(frühes Gastrula-Stadium) bis 5 Tage nach 
dem Schlüpfen (13-16 Tage) 80 80  
Pimephales promelas  
Fettköpfige Elritze 25 ± 2 — 16 4-5 5 So bald wie möglich nach der Befruchtung 
(frühes Gastrula-Stadium) bis 4 Tage nach 
dem Schlüpfen (8-9 Tage) 60 70  
( 1 ) Für Embryonen. 
( 2 ) Für Larven. 
( a ) Dunkelheit für Embryonen und Larven bis eine Woche nach dem Schlüpfen, außer diese werden kontrolliert. Dann gedämpfte Beleuc htung während der gesamten Prüfung.
 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1038
 ▼B 
Anlage 3  
Prüfbedingungen, Dauer und Überlebenskriterien für andere hinreichend dokumentierte Fischarten  
Fischart Temperatur (  o C) Salzgehalt (0/00) Belichtungsdauer 
(Std.) Dauer der Stadien (Tage) 
Typische Dauer der Prüfung an Embryonen und 
Jungfischen mit Dottersack Überlebensrate in der Kontrolle 
(min.- %) 
Embryonen Jungfische mit 
Dottersack Schlüpferfolg Nach dem 
Schlüpfen  
SÜSSWASSERFISCHE  
Carassius auratus  
Goldfisch 24 ± 1 — — 3-4 > 4 So bald wie möglich nach der Befruchtung 
(frühes Gastrula-Stadium) bis 4 Tage nach 
dem Schlüpfen (7 Tage) — 80  
Leopomis macrochirus  
Blauer Sonnenbarsch 21 ± 1 — 16 3 > 4 So bald wie möglich nach der Befruchtung 
(frühes Gastrula-Stadium) bis 4 Tage nach dem Schlüpfen (7 Tage) — 75 
SALZWASSERFISCHE  
Menidia peninsulae  
Gezeiten-Ährenfisch 22-25 15-22 12 1,5 10 So bald wie möglich nach der Befruchtung 
(frühes Gastrula-Stadium) bis 5 Tage nach 
dem Schlüpfen (6-7 Tage) 80 60  
Clupea harengus  
Hering 10 ± 1 8-15 12 20-25 3-5 So bald wie möglich nach der Befruchtung 
(frühes Gastrula-Stadium) bis 3 Tage nach 
dem Schlüpfen (23-27 Tage) 60 80  
Gadus morhua  
Kabeljau 5 ± 1 5-30 12 14-16 3-5 So bald wie möglich nach der Befruchtung 
(frühes Gastrula-Stadium) bis 3 Tage nach dem Schlüpfen (18 Tage) 60 80  
Cyprinodon variegatus  
Edelsteinkärpfling 25 ± 1 15-30 12 — — So bald wie möglich nach der Befruchtung 
(frühes Gastrula-Stadium) bis 4-7 Tage 
nach dem Schlüpfen (28 Tage) > 75 80
Anlage 4  
VERSCHIEDENE CHEMISCHE EIGENSCHAFTEN EINES ANNEHM ­
BAREN VERDÜNNUNGSWASSERS  
Substanz Konzentrationen  
Partikelgehalt < 20 mg/l 
Gesamter organischer Kohlenstoff (TOC) < 2 mg/l 
Nichtionisierter Ammoniak < 1 μg/l 
Restchlor < 10 μg/l 
Gesamte phosphororganische Pestizide < 50 ng/l Gesamte chlororganische Pestizide plus polychlorierte 
Biphenyle < 50 ng/l 
Gesamtes organisches Chlor < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1039
 
C.16.  HONIGBIENEN — AKUTE ORALE TOXIZITÄTSPRÜFUNG  
1. METHODE  
Diese Methode zur Prüfung der akuten Toxizität entspricht der 
OECD TG 213 (1998).  
1.1. EINLEITUNG  
Diese Toxizitätsprüfung ist ein Laborverfahren, mit dem die akute 
orale Toxizität von Pflanzenschutzmitteln und anderen Chemikalien 
für erwachsene Arbeitshonigbienen bewertet werden soll.  
Bei der Bewertung und Beurteilung der toxischen Merkmale von 
Substanzen ist unter Umständen die Bestimmung der akuten oralen Toxizität bei Bienen erforderlich, beispielsweise wenn die Wahr ­
scheinlichkeit einer Exposition von Bienen gegenüber einer bestimm ­
ten Chemikalie besteht. Die akute orale Toxizitätsprüfung wird 
durchgeführt, um die spezifische Toxizität von Pestiziden und ande ­
ren Chemikalien für Bienen zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Prüfung sollten herangezogen werden, um festzulegen, ob weiterer 
Beurteilungsbedarf besteht. Diese Methode kann insbesondere in 
schrittweise aufgebauten Programmen zur Bewertung der Gefahren von Pflanzenschutzmitteln für Bienen verwendet werden, die auf einem sequenziellen Übergang von Labortoxizitätsprüfungen auf 
Halbfreiland- und Freilandversuche beruhen (1). Pestizide können 
dabei als Wirkstoffe oder als formulierte Produkte geprüft werden.
 
Zur Überprüfung der Empfindlichkeit der Bienen und der Genau ­
igkeit des Prüfverfahrens sollte ein toxischer Standard verwendet werden.
 
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Akute orale Toxizität:  Dies sind die negativen Wirkungen, die 
innerhalb eines Zeitraums von maximal 96 Stunden bei einer oralen 
Verabreichung einer einfachen Dosis der Prüfsubstanz auftreten.  
Dosis:  Dies ist die aufgenommene Menge an Prüfsubstanz. Die Do ­
sis wird als Masse ( μg) Prüfsubstanz je Prüftier ausgedrückt ( μg/­
Biene). Die tatsächliche Dosis für jede einzelne Biene kann zwar nicht berechnet werden, da die Bienen gemeinsam gefüttert werden, 
es lässt sich jedoch eine durchschnittliche Dosis abschätzen (ins ­
gesamt aufgenommene Prüfsubstanz/Anzahl der Testbienen in einem Käfig).
 
Orale LD  50 (mittlere letale Dosis):  Dies ist die statistisch abge ­
leitete einfache Dosis einer Substanz, die bei oraler Verabreichung bei 50 % der Tiere zum Tod führen kann. Der LD
 50 -Wert wird in μg 
Prüfsubstanz je Biene angegeben. Bei Pflanzenschutzmitteln kann 
die Prüfsubstanz entweder als Wirkstoff oder als formuliertes Pro ­
dukt mit einem oder mehreren Wirkstoffen vorliegen.  
Mortalität:  Ein Tier wird als tot protokolliert, wenn es absolut unbe ­
weglich ist.  
1.3. PRINZIP DER METHODE  
Erwachsene Arbeitshonigbienen ( Apis mellifera ) werden einem Be ­
reich von Dosen der in einer Zuckerlösung dispergierten Prüfsub ­
stanz ausgesetzt. Die Bienen werden dann mit derselben Lösung, 
jedoch ohne die Prüfsubstanz, gefüttert. Die Mortalität wird täglich im Verlauf von zumindest 48 Stunden protokolliert und mit Kontroll ­
werten verglichen. Wenn die Mortalitätsrate in der Zeit zwischen 24 
Stunden und 48 Stunden zunimmt, während die Kontrollmortalität 
auf einem akzeptierten Stand bleibt, d. h. < 10 %, ist es angebracht, die Dauer der Prüfung auf maximal 96 Stunden zu verlängern. Die Ergebnisse werden ausgewertet, um die LD
 50 für 24 Stunden und 48 
Stunden und, sofern die Untersuchung verlängert wurde, für 72 Stun ­
den und 96 Stunden zu berechnen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1040
 
1.4. VALIDITÄTSKRITERIEN  
Damit die Validität einer Prüfung gegeben ist, gelten die folgenden 
Bedingungen:  
— Die durchschnittliche Mortalität darf bei der gesamten Anzahl an 
Kontrollen 10 % am Ende der Prüfung nicht übersteigen;  
— die LD  50 der toxischen Bezugsnormale entspricht dem festgeleg ­
ten Bereich.  
1.5. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.5.1.  Sammlung der Bienen  
Es sollten junge erwachsene Arbeiterinnen derselben Rasse verwen ­
det werden, d. h. Bienen gleichen Alters, gleichen Ernährungs ­
zustands usw. Die Bienen sollten aus angemessen gefütterten, gesun ­
den, möglichst krankheitsfreien Völkern mit Königin stammen, deren 
Vorgeschichte und physiologischer Zustand bekannt ist. Sie könnten am Morgen der Verwendung oder am Abend vor der Prüfung ge ­
sammelt und bis zum nächsten Tag unter Prüfbedingungen gehalten 
werden. Bienen, die von Rähmchen ohne Brut gesammelt werden, 
sind geeignet. Eine Sammlung im frühen Frühjahr oder Spätherbst sollte vermieden werden, da die Bienen in dieser Zeit eine veränderte 
Physiologie aufweisen. Müssen Prüfungen im frühen Frühjahr oder 
Spätherbst durchgeführt werden, können Bienen in einem Brut ­
schrank zum Schlüpfen gebracht und eine Woche lang mit „Bienen ­
brot“ (aus der Wabe gesammelte Pollen) und Zuckerlösung aufgezo ­
gen werden. Bienen, die mit chemischen Substanzen behandelt wur ­
den, wie z. B. Antibiotika, Anti-Varroa-Produkten usw., sollten nach dem Ende der letzten Behandlung 4 Wochen nicht für Toxizitäts ­
prüfungen eingesetzt werden.
 
1.5.2.  Unterbringungs- und Fütterungsbedingungen  
Verwendet werden einfach zu säubernde und gut belüftete Käfige. 
Dabei kann jedes geeignete Material verwendet werden, beispiels ­
weise Edelstahl-, Drahtgitter-, Kunststoff- oder Einwegholzkäfige usw. Es sollten möglichst Gruppen von jeweils 10 Bienen pro Käfig 
zum Einsatz kommen. Die Größe der Prüfkäfige sollte der Anzahl 
der Bienen entsprechen, d. h. angemessenen Platz bieten.
 
Die Bienen sollten im Dunkeln in einem Versuchsraum mit einer 
Temperatur von 25  o C ± 2  o C gehalten werden. Die relative Feuchte, 
die im Normalfall zwischen 50 und 70 % liegt, sollte während der 
gesamten Prüfung gemessen und protokolliert werden. Alle Tätig ­
keiten, einschließlich Behandlung und Beobachtungen, können bei (Tages-)Licht durchgeführt werden. Als Futter wird eine Zuckerlö ­
sung in Wasser mit einer endgültigen Konzentration von 500 g/l 
(50 % Gew./Vol.) verwendet. Nach Verabreichung der Prüfdosen sollte das Futter nach Belieben dargeboten werden. Das Fütterungs ­
system sollte die Möglichkeit bieten, die Futteraufnahme für jeden 
Käfig zu protokollieren (siehe 1.6.3.1). Es kann ein Glasröhrchen 
(circa 50 mm lang und 10 mm breit und am offenen Ende auf einen Durchmesser von etwa 2 mm verjüngt) verwendet werden.
 
1.5.3.  Vorbereitung der Bienen  
Die gesammelten Bienen werden nach dem Zufallsprinzip auf die 
Prüfkäfige verteilt, die ebenfalls zufällig in dem Versuchsraum an ­
geordnet sind.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1041
 
Vor Beginn der Prüfung kann man die Bienen bis zu 2 Stunden 
hungern lassen. Es wird empfohlen, den Bienen vor der Behandlung 
die Nahrung zu entziehen, damit der Darminhalt zu Beginn der Prüfung bei allen Bienen gleich ist. Im Sterben liegende Bienen sollten ausgesondert und vor Beginn der Prüfung durch gesunde 
Bienen ersetzt werden.
 
1.5.4.  Herstellung der Dosen  
Sofern es sich bei der Prüfsubstanz um eine mit Wasser mischbare 
Verbindung handelt, kann diese direkt in einer 50 %igen Zuckerlö ­
sung dispergiert werden. Bei technischen Produkten und Substanzen mit geringer Wasserlöslichkeit können Trägersubstanzen wie organi ­
sche Lösemittel, Emulgatoren oder Dispersionsmittel mit geringer 
Bienentoxizität verwendet werden (z. B. Aceton, Dimethylformamid, 
Dimethylsulfoxid). Die Konzentration des Trägers hängt dabei von der Löslichkeit der Prüfsubstanz ab und sollte für alle geprüften Konzentrationen gleich sein. Im Allgemeinen ist eine Konzentration 
der Trägersubstanz von 1 % angemessen und sollte nicht überschrit ­
ten werden.
 
Es sollten entsprechende Kontrolllösungen hergestellt werden, d. h., 
wird ein Löse- oder Dispersionsmittel zur Lösung der Prüfsubstanz benutzt, sollten zwei getrennte Kontrollgruppen verwendet werden, und zwar eine Lösung in Wasser und eine Zuckerlösung mit dem 
Lösemittel/Träger in der Konzentration, die auch in den Dosierlösun ­
gen vorliegt.
 
1.6. VORGEHENSWEISE  
1.6.1.  Prüf- und Kontrollgruppen  
Die Anzahl an geprüften Dosen und Wiederholungen sollte die sta ­
tistischen Anforderungen für eine Bestimmung der LD  50 mit einem 
95 %igen Vertrauensbereich erfüllen. Im Normalfall sind für die 
Prüfung fünf Dosen in einer geometrischen Reihe, die sich um einen Faktor von nicht mehr als 2,2 unterscheiden und den Bereich für die LD
 50 , abdecken, erforderlich. Der Verdünnungsfaktor und die An ­
zahl an Konzentrationen für die Dosierung müssen jedoch im Ver ­
hältnis zur Steigung der Toxizitätskurve (Dosis im Verhältnis zu Mortalität) unter Berücksichtigung der für die Auswertung der Er ­
gebnisse herangezogenen statistischen Methode bestimmt werden. 
Mit Hilfe einer Vorprüfung zur Bestimmung des Konzentrations ­
bereichs lassen sich die angemessenen Konzentrationen für die Do ­
sierung auswählen.
 
Mindestens drei Wiederholungsprüfgruppen von jeweils 10 Bienen 
sollten jeder Prüfkonzentrationsdosis ausgesetzt werden. Zusätzlich zu den Prüfreihen sollten mindestens drei Kontrollgruppen von je ­
weils 10 Bienen zum Einsatz kommen. Kontrollgruppen sollten auch 
für die verwendeten Lösemittel/Trägersubstanzen einbezogen werden (siehe 1.5.4).
 
1.6.2.  Toxischer Standard  
In die Prüfreihen ist ein toxischer Standard aufzunehmen. Zumindest 
drei Dosen sollten ausgewählt werden, die den erwarteten LD  50 -Wert 
abdecken. Für jede Prüfdosis sollten mindestens drei Wiederholungs ­
käfige mit jeweils 10 Bienen verwendet werden Der bevorzugte 
toxische Standard ist Dimethoat; für diesen Stoff liegt die nach ­
gewiesene orale LD  50 für 24 Stunden im Bereich von 0,10 bis 
0,35 μg Wirkstoff/Biene (2). Andere toxische Standards wären je ­
doch annehmbar, soweit hinreichende Daten zur Überprüfung der 
erwarteten Dosisreaktion vorgelegt werden können (z. B. Parathion).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1042
 
1.6.3.  Exposition  
1.6.3.1.  Verabreichung der Dosen  
Jeder Prüfgruppe von Bienen müssen 100 bis 200 μl einer 50 %igen 
Zuckerlösung in Wasser mit der Prüfsubstanz in der entsprechenden 
Konzentration verabreicht werden. Bei Produkten mit geringer Lös ­
lichkeit, niedriger Toxizität oder geringer Konzentration in der Re ­
zeptur ist ein größeres Volumen erforderlich, da dann größere An ­
teile an Zuckerlösung verwendet werden müssen. Die Menge an 
aufgenommener Nahrung je Gruppe ist festzuhalten. Nach dem Ver ­
zehr (im Allgemeinen innerhalb von 3-4 Stunden) muss die Fütte ­
rungsvorrichtung aus dem Käfig entfernt und durch eine Vorrich ­
tung, die ausschließlich Zuckerlösung enthält, ersetzt werden. Die 
Zuckerlösung wird dann nach Belieben dargeboten. Bei einigen Ver ­
bindungen kann bei höheren Konzentrationen die Ablehnung der Prüfdosis dazu führen, dass nur wenig oder gar kein Futter auf ­
genommen wird. Nach maximal 6 Stunden sollte das bis dahin un ­
verbrauchte behandelte Futter durch eine reine Zuckerlösung ersetzt werden. Die Menge an aufgenommenem behandeltem Futter muss gemessen werden (z. B. Messung von Volumen/Gewicht des noch 
verbleibenden behandelten Futters).
 
1.6.3.2.  Dauer  
Die Dauer der Prüfung sollte vorzugsweise 48 Stunden ab dem Zeit ­
punkt, zu dem die Prüflösung durch die Zuckerlösung allein ersetzt wurde, betragen. Steigt die Mortalität nach den ersten 24 Stunden 
weiterhin um mehr als 10 % an, sollte die Prüfdauer auf maximal 96 
Stunden verlängert werden, sofern die Kontrollmortalität nicht über 10 % hinausgeht.
 
1.6.4.  Beobachtungen  
Die Mortalität wird 4 Stunden nach Beginn der Prüfung und dann 
nach 24 Stunden und 48 Stunden protokolliert (d. h. nach Verabrei ­
chung der Dosis). Ist ein verlängerter Beobachtungszeitraum erfor ­
derlich, sollten weitere Bewertungen im Abstand von 24 Stunden bis maximal 96 Stunden vorgenommen werden, sofern die Kontrollmor ­
talität 10 % nicht übersteigt.
 
Die Menge an aufgenommenem Futter pro Gruppe muss gemessen 
werden. Ein Vergleich zwischen den Anteilen an verzehrtem behan ­
deltem und unbehandeltem Futter innerhalb der vorgegebenen 6 
Stunden kann Aufschluss über die Genießbarkeit des behandelten 
Futters geben.  
Alle anormalen Verhaltensweisen während des Prüfzeitraums müssen 
protokolliert werden.  
1.6.5.  Limit-Test  
in einigen Fällen (z. B. wenn man erwartet, dass die Prüfsubstanz 
eine geringe Toxizität besitzt) kann ein Limit-Test mit 100 μg 
Wirkstoff/Biene durchgeführt werden, um nachzuweisen, dass die LD
 50 höher als dieser Wert ist. Dabei sollte das gleiche Verfahren 
zum Einsatz kommen, einschließlich drei Wiederholungsprüfgruppen 
für die Prüfdosis, die betreffenden Kontrollen, die Messung der Menge an verzehrtem behandeltem Futter und die Verwendung des toxischen Standards. Sofern Mortalitäten auftreten, sollte eine voll ­
ständige Untersuchung durchgeführt werden. Eventuell beobachtete 
subletale Wirkungen (siehe 1.6.4) müssen dokumentiert werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1043
 
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
2.1. DATEN  
Daten sollten in tabellarischer Form zusammengefasst werden, wobei 
für jede Behandlungsgruppe sowie für die Kontrollgruppe und die 
Gruppe mit dem toxischen Standard die Anzahl an eingesetzten Bie ­
nen, die Mortalität für jede Beobachtungszeit und die Anzahl an Bienen mit beeinträchtigtem Verhalten auszuweisen sind. Die Mor ­
talitätsdaten sind mit angemessenen statistischen Verfahren zu ana ­
lysieren (z. B. Probit-Analyse, gleitender Durchschnitt, binomiale 
Wahrscheinlichkeit) (3) (4). Die Dosis-Reaktions-Kurven sind für jede empfohlene Beobachtungszeit darzustellen, und die Steigungen 
der Kurven und die mittleren letalen Dosen (LD
 50 ) sind mit einem 
95 % Vertrauensbereich zu berechnen. Korrekturen an der Kontroll ­
mortalität könnten mit Hilfe der Abbott’schen Korrektur vorgenom ­
men werden (4) (5). Sofern das behandelte Futter nicht vollständig 
verzehrt wurde, sollte die Prüfsubstanzdosis, die von jeder Gruppe 
aufgenommen wurde, ermittelt werden. Die LD  50 sollte in μg Prüf­
substanz je Biene angegeben werden.  
2.2. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:  
2.2.1.  Prüfsubstanz  
— Physikalische Beschaffenheit und relevante physikalisch-che ­
mische Eigenschaften (z. B. Stabilität in Wasser, Dampfdruck);  
— Daten zur chemischen Identifikation, einschließlich Strukturfor ­
mel, Reinheit (d. h., für Pflanzenschutzmittel die Identität und Konzentration des/der Wirkstoffs(e).
 
2.2.2.  Geprüfte Bienenart  
— Wissenschaftlicher Name, Rasse, ungefähres Alter (in Wochen), 
Sammlungsverfahren, Datum der Sammlung;  
— Angaben über die Völker, die für die Sammlung der Prüfbienen 
eingesetzt wurden, einschließlich Gesundheitszustand, eventuelle 
Krankheiten von erwachsenen Bienen, eventuelle Vorbehandlun ­
gen usw.  
2.2.3.  Prüfbedingungen  
— Temperatur und relative Feuchte des Versuchsraums;  
— Unterbringungsbedingungen einschließlich Art, Größe und Mate ­
rial der Käfige;  
— Verfahren für die Herstellung der Stamm- und Prüflösungen (so ­
fern ein Lösemittel verwendet wird, müssen dieses Mittel und seine Konzentration angegeben werden);
 
— Versuchsanlage, z. B. Anzahl und eingesetzte Prüfkonzentratio ­
nen, Anzahl an Kontrollen; für jede Prüfkonzentration und Kon ­
trolle Anzahl an Wiederholungskäfigen und Anzahl an Bienen pro Käfig;
 
— Datum der Prüfung.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1044
 
2.2.4.  Ergebnisse  
— Ergebnisse von eventuellen Vorversuchen zur Ermittlung des 
Konzentrationsbereichs;  
— Rohdaten: Mortalität bei jeder geprüften Dosis zu jeder Beobach ­
tungszeit;  
— Darstellung der Dosisreaktionskurven am Ende der Prüfung;  
— LD  50 -Werte mit 95 %igem Vertrauensbereich für jede empfoh ­
lene Beobachtungszeit, jede Prüfsubstanz und den toxischen Standard;
 
— zur Bestimmung der LD  50 herangezogene statistische Verfahren;  
— Mortalität in Kontrollen;  
— sonstige beobachtete oder gemessene biologische Wirkungen, 
z. B. abnormes Verhalten der Bienen (einschließlich Ablehnung der Prüfdosis), Anteil an verzehrtem Futter in behandelten und unbehandelten Gruppen;
 
— eventuelle Abweichungen von den hier beschriebenen Prüfver ­
fahren und sonstige relevante Informationen.  
3. LITERATURHINWEISE  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products — Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, 151-165. March 1993.
 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees ( Apis mellifera  L.) 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, 119-125.  
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Ex ­
per. Ther., 96, 99-113.  
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. jour. Econ. Entomol., 18, 265-267.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1045
 
C.17.  HONIGBIENEN — AKUTE KONTAKTTOXIZITÄTSPRÜFUNG  
1. METHODE  
Diese Methode zur Prüfung der akuten Toxizität entspricht der 
OECD TG 214 (1998).  
1.1. EINLEITUNG  
Diese Toxizitätsprüfung ist ein Laborverfahren, mit dem die akute 
Kontakttoxizität von Pflanzenschutzmitteln und anderen Chemikalien für erwachsene Arbeitshonigbienen bewertet werden soll.
 
Bei der Bewertung und Beurteilung der toxischen Merkmale von 
Substanzen ist unter Umständen die Bestimmung der akuten Kon ­
takttoxizität bei Bienen erforderlich, beispielsweise wenn die Wahr ­
scheinlichkeit einer Exposition von Bienen gegenüber einer bestimm ­
ten Chemikalie besteht. Die akute Kontakttoxizitätsprüfung wird durchgeführt, um die spezifische Toxizität von Pestiziden und ande ­
ren Chemikalien für Bienen zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser 
Prüfung sollten herangezogen werden, um festzulegen, ob weiterer 
Beurteilungsbedarf besteht. Diese Methode kann insbesondere in schrittweise aufgebauten Programmen zur Bewertung der Gefahren von Pflanzenschutzmittel für Bienen verwendet werden, die auf ei ­
nem sequenziellen Übergang von Labortoxizitätsprüfungen auf Halb ­
freiland- und Freilandversuche beruhen (1). Pestizide können dabei als Wirkstoffe oder als formulierte Produkte geprüft werden.
 
Zur Überprüfung der Empfindlichkeit der Bienen und der Genau ­
igkeit des Prüfverfahrens sollte ein toxischer Standard verwendet werden.
 
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Akute Kontakttoxizität:  Dies sind die negativen Wirkungen, die 
innerhalb eines Zeitraums von maximal 96 Stunden bei einer topi ­
kalen Verabreichung einer einzelnen Dosis der Prüfsubstanz auftre ­
ten. 
Dosis:  Dies ist die aufgebrachte Menge an Prüfsubstanz. Die Dosis 
wird als Menge ( μg) Prüfsubstanz je Prüftier angegeben ( μg/Biene).  
Kontakt-LD  50 (mittlere letale Dosis):  Dies ist die statistisch abge ­
leitete einzelne Dosis einer Substanz, die bei Verabreichung durch Kontakt bei 50 % der Tiere zum Tod führen kann. Der LD
 50 -Wert 
wird in μg Prüfsubstanz je Biene angegeben. Bei Pestiziden können 
die Pflanzenschutzmittel entweder als Wirkstoff oder als formuliertes 
Produkt mit einem oder mehreren Wirkstoffen vorliegen.  
Mortalität:  Ein Tier wird als tot protokolliert, wenn es absolut unbe ­
weglich ist.  
1.3. PRINZIP DER METHODE  
Erwachsene Arbeitshonigbienen ( Apis mellifera ) werden einem Be ­
reich von Dosen der in einem entsprechenden Träger gelösten Prüf ­
substanz durch direktes Aufbringen auf den Thorax (Tröpfchen) aus ­
gesetzt. Die Dauer der Prüfung beträgt 48 Stunden. Wenn die Mor ­
talitätsrate in der Zeit zwischen 24 Stunden und 48 Stunden zu ­
nimmt, während die Kontrollmortalität auf einem akzeptierten Stand 
bleibt, d. h. < 10 %, ist es angebracht, die Dauer der Prüfung auf 
maximal 96 Stunden zu verlängern. Die Mortalität wird täglich pro ­
tokolliert und mit Kontrollwerten verglichen. Die Ergebnisse werden ausgewertet, um die LD
 50 für 24 Stunden und 48 Stunden und, 
sofern die Untersuchung verlängert wurde, für 72 Stunden und 96 
Stunden zu berechnen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1046
 
1.4. VALIDITÄTSKRITERIEN  
Damit die Validität einer Prüfung gegeben ist, gelten die folgenden 
Bedingungen:  
— Die durchschnittliche Mortalität darf bei der gesamten Anzahl an 
Kontrollen 10 % am Ende der Prüfung nicht übersteigen;  
— die LD  50 des toxischen Standards entspricht dem festgelegten 
Bereich.  
1.5. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.5.1.  Sammlung der Bienen  
Es sollten junge erwachsene Arbeiterinnen verwendet werden, d. h. Bie ­
nen gleichen Alters, gleichen Ernährungszustands, gleicher Rasse usw. 
Die Bienen sollten aus angemessen gefütterten, gesunden, möglichst 
krankheitsfreien Völkern mit Königin stammen, deren Vorgeschichte und physiologischer Zustand bekannt ist. Sie könnten am Morgen der 
Verwendung oder am Abend vor der Prüfung gesammelt und bis zum 
nächsten Tag unter Prüfbedingungen gehalten werden. Bienen, die von Rähmchen ohne Brut gesammelt werden, sind geeignet. Eine Sammlung im frühen Frühjahr oder Spätherbst sollte vermieden werden, da die 
Bienen in dieser Zeit eine veränderte Physiologie aufweisen. Müssen 
Prüfungen im frühen Frühjahr oder Spätherbst durchgeführt werden, können Bienen in einem Brutschrank zum Schlüpfen gebracht und eine Woche lang mit „Bienenbrot“ (aus der Wabe gesammelte Pollen) 
und Zuckerlösung aufgezogen werden. Bienen, die mit chemischen Sub ­
stanzen behandelt wurden wie z. B. Antibiotika, Anti-Varroa-Produkten usw., sollten nach dem Ende der letzten Behandlung 4 Wochen nicht für Toxizitätsprüfungen eingesetzt werden.
 
1.5.2.  Unterbringungs- und Fütterungsbedingungen  
Verwendet werden einfach zu säubernde und gut belüftete Käfige. 
Dabei kann jedes geeignete Material benutzt werden, beispielsweise 
Edelstahl-, Drahtgitter-, Kunststoff- oder Einwegholzkäfige usw. Die 
Größe der Prüfkäfige sollte der Anzahl der Bienen entsprechen, d. h. angemessenen Platz bieten. Es sollten möglichst Gruppen von je ­
weils 10 Bienen pro Käfig zum Einsatz kommen.
 
Die Bienen sollten im Dunkeln in einem Versuchsraum mit einer Tem ­
peratur von 25 ± 2  o C gehalten werden. Die relative Feuchte, die im 
Normalfall zwischen 50 und 70 % liegt, sollte während der gesamten Prüfung gemessen und protokolliert werden. Alle Tätigkeiten, ein ­
schließlich Behandlung und Beobachtungen, können bei (Tages-)Licht 
durchgeführt werden. Als Futter sollte eine Zuckerlösung in Wasser mit einer endgültigen Konzentration von 500 g/l (50 % Gew./Vol.) verwendet und nach Belieben während der Prüfdauer mit Hilfe einer 
Bienenfütterungsvorrichtung dargeboten werden. Dies kann ein Glas ­
röhrchen (circa 50 mm lang und 10 mm breit und am offenen Ende auf einen Durchmesser von etwa 2 mm verjüngt) sein.
 
1.5.3.  Vorbereitung der Bienen  
Die gesammelten Bienen können mit Kohlendioxid oder Stickstoff zum 
Aufbringen der Prüfsubstanz betäubt werden. Dabei sollten die Menge 
an Betäubungsmittel und dessen Einwirkungszeit so gering wie möglich gehalten werden. Im Sterben liegende Bienen sollten ausgesondert und vor Beginn der Prüfung durch gesunde Bienen ersetzt werden.
 
1.5.4.  Herstellung der Dosen  
Die Prüfsubstanz ist als Lösung in einer Trägersubstanz aufzubrin ­
gen, d. h. einem organischen Lösemittel oder einer Wasserlösung mit 
einem Benetzungsmittel. Als organisches Lösemittel wird Aceton bevorzugt, aber auch andere organische Lösemittel mit geringer Bie ­
nentoxizität können verwendet werden (z. B. Dimethylformamid, 
Dimethylsulfoxid). Bei in Wasser dispergierten formulierten Produk ­
ten und hochpolaren organischen Substanzen, die in organischen Trägerlösemitteln nicht löslich sind, lassen sich die Lösungen unter Umständen einfacher auftragen, wenn sie in einer schwachen Lösung 
eines handelsüblichen Benetzungsmittels hergestellt werden (z. B. 
Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1047
 
Es sollten entsprechende Kontrolllösungen hergestellt werden, d. h., 
wird ein Löse- oder Dispersionsmittel zur Lösung der Prüfsubstanz 
benutzt, sollten zwei getrennte Kontrollgruppen verwendet werden, und zwar eine, die mit Wasser, und eine, die mit dem Löse-/ ­
Dispersionsmittel behandelt ist.
 
1.6. VORGEHENSWEISE  
1.6.1.  Prüf- und Kontrollgruppen  
Die Anzahl an geprüften Dosen und Wiederholungen sollte die sta ­
tistischen Anforderungen für eine Bestimmung der LD  50 mit einem 
95 %igen Vertrauensbereich erfüllen. Im Normalfall sind für die Prüfung fünf Dosen in einer geometrischen Reihe, die sich um einen Faktor von nicht mehr als 2,2 unterscheiden und den Bereich für die 
LD
 50 , abdecken, erforderlich. Die Anzahl an Dosen muss jedoch im 
Verhältnis zur Steigung der Toxizitätskurve (Dosis im Verhältnis zu Mortalität) unter Berücksichtigung der für die Auswertung der Er ­
gebnisse herangezogenen statistischen Methode bestimmt werden. 
Mit Hilfe einer Vorprüfung zur Bestimmung des Konzentrations ­
bereichs lassen sich die angemessenen Dosen auswählen.
 
Mindestens drei Wiederholungsprüfgruppen von jeweils 10 Bienen 
sollten jeder Prüfkonzentrationsdosis ausgesetzt werden.  
Zusätzlich zu den Prüfreihen sollten mindestens drei Kontrollgruppen 
von jeweils 10 Bienen zum Einsatz kommen. Wird ein organisches 
Lösemittel oder ein Benetzungsmittel verwendet, müssen drei zusätz ­
liche Kontrollgruppen mit jeweils 10 Bienen für das Löse- oder Benetzungsmittel mit einbezogen werden.
 
1.6.2.  Toxischer Standard  
In die Prüfreihen ist ein toxischer Standard aufzunehmen. Zumindest 
drei Dosen sollten ausgewählt werden, die den erwarteten LD  50 -Wert 
abdecken. Für jede Prüfdosis sollten mindestens drei Wiederholungs ­
käfige mit jeweils 10 Bienen verwendet werden. Der bevorzugte toxische Standard ist Dimethoat: Für diesen Stoff liegt die nach ­
gewiesene Kontakt-LD
 50 für 24 Stunden im Bereich von 0,10 bis 
0,30 μg Wirkstoff/Biene (2). Andere toxische Standards wären je ­
doch annehmbar, soweit hinreichende Daten zur Überprüfung der erwarteten Dosisreaktion vorgelegt werden können (z. B. Parathion).
 
1.6.3.  Exposition  
1.6.3.1.  Verabreichung der Dosen  
Bei den betäubten Bienen erfolgt jeweils einzeln eine topikale Auf ­
bringung. Die Bienen werden nach dem Zufallsprinzip den verschie ­
denen Prüfdosen und Kontrollen zugeordnet. Ein Volumen von 1 μl 
Lösung mit der Prüfsubstanz in der geeigneten Konzentration wird 
mit einem Mikroapplikator auf die Dorsalseite des Thorax einer 
jeden Biene aufgetragen. Sofern begründet, können andere Volumina verwendet werden. Nach dem Auftragen werden die Bienen auf die Prüfkäfige verteilt und mit den Zuckerlösungen versorgt.
 
1.6.3.2.  Dauer  
Die Dauer der Prüfung sollte vorzugsweise 48 Stunden betragen. 
Steigt die Mortalität zwischen 24 und 48 Stunden um mehr als 
10 % an, sollte die Prüfdauer auf maximal 96 Stunden verlängert 
werden, sofern die Kontrollmortalität nicht über 10 % hinausgeht.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1048
 
1.6.4.  Beobachtungen  
Die Mortalität wird 4 Stunden nach der Dosierung und dann nach 24 
Stunden und 48 Stunden protokolliert. Ist ein verlängerter Beobach ­
tungszeitraum erforderlich, sollten weitere Bewertungen im Abstand 
von 24 Stunden bis maximal 96 Stunden vorgenommen werden, 
sofern die Kontrollmortalität 10 % nicht übersteigt.  
Alle anormalen Verhaltensweisen während des Prüfzeitraums müssen 
protokolliert werden.  
1.6.5.  Limit-Test  
In einigen Fällen (z. B. wenn man erwartet, dass die Prüfsubstanz 
eine geringe Toxizität besitzt) kann ein Limit-Test mit 100 μg 
Wirkstoff/Biene durchgeführt werden, um nachzuweisen, dass die LD
 50 höher als dieser Wert ist. Dabei sollte das gleiche Verfahren 
zum Einsatz kommen, einschließlich drei Wiederholungsprüfgruppen 
für die Prüfdosis, die betreffenden Kontrollen und die Verwendung 
des toxischen Standards. Sofern Mortalitäten auftreten, sollte eine vollständige Untersuchung durchgeführt werden. Eventuell beobach ­
tete subletale Wirkungen (siehe 1.6.4) sind zu dokumentieren.
 
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
2.1. DATEN  
Daten sollten in tabellarischer Form zusammengefasst werden, wobei 
für jede Behandlungsgruppe sowie für die Kontrollgruppe und die Gruppe mit dem toxischen Standard die Anzahl an eingesetzten Bie ­
nen, die Mortalität für jede Beobachtungszeit und die Anzahl an 
Bienen mit beeinträchtigtem Verhalten auszuweisen sind. Die Mor ­
talitätsdaten sind mit angemessenen statistischen Verfahren zu ana ­
lysieren (z. B. Probit-Analyse, gleitender Durchschnitt, binomiale Wahrscheinlichkeit) (3) (4). Die Dosisreaktionskurven sind für jede 
empfohlene Beobachtungszeit (d. h. 24 und 48 Stunden sowie, so ­
weit zutreffend, 72 und 96 Stunden) darzustellen, und die Steigungen der Kurven und die mittleren letalen Dosen (LD
 50 ) sind mit einem 
95 % Vertrauensbereich zu berechnen. Korrekturen um die Kontroll ­
mortalität könnten mit Hilfe der Abbott’schen Korrektur vorgenom ­
men werden (4) (5). Die LD  50 sollte in μg Prüfsubstanz je Biene 
angegeben werden.  
2.2. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:  
2.2.1.  Prüfsubstanz  
— Physikalische Beschaffenheit und relevante physikalisch-che ­
mische Eigenschaften (z. B. Stabilität in Wasser, Dampfdruck);  
— Daten zur chemischen Identifikation, einschließlich Strukturfor ­
mel, Reinheit (d. h. für Pflanzenschutzmittel die Identität und 
Konzentration des bzw. der Wirkstoffe).  
2.2.2.  Geprüfte Bienenart  
— Wissenschaftlicher Name, Rasse, ungefähres Alter (in Wochen), 
Sammlungsverfahren, Datum der Sammlung:  
— Angaben über die Völker, die für die Sammlung der Prüfbienen 
eingesetzt wurden, einschließlich Gesundheitszustand, eventuelle 
Krankheiten von erwachsenen Bienen, eventuelle Vorbehandlun ­
gen usw.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1049
 
2.2.3.  Prüfbedingungen  
— Temperatur und relative Feuchte des Versuchsraums;  
— Unterbringungsbedingungen einschließlich Art, Größe und Mate ­
rial der Käfige;  
— Verfahren für die Verabreichung der Prüfsubstanz, z. B. verwen ­
dete Trägerlösung, aufgebrachtes Prüflösungsvolumen, verwende ­
tes Betäubungsmittel;  
— Versuchsanlage, z. B. Anzahl und eingesetzte Prüfdosen, Anzahl 
an Kontrollen; für jede Prüfdosis und Kontrolle Anzahl an Wie ­
derholungskäfigen und Anzahl an Bienen pro Käfig;  
— Datum der Prüfung.  
2.2.4.  Ergebnisse  
— Ergebnisse von eventuellen Vorversuchen zur Ermittlung des 
Konzentrationsbereichs;  
— Rohdaten: Mortalität bei jeder geprüften Konzentration zu jeder 
Beobachtungszeit;  
— Darstellung der Dosisreaktionskurven am Ende der Prüfung;  
— LD  50 -Werte mit 95 %igem Vertrauensbereich für jede empfoh ­
lene Beobachtungszeit, jede Prüfsubstanz und den toxischen 
Standard;  
— zur Bestimmung der LD  50 herangezogene statistische Verfahren;  
— Mortalität in Kontrollen;  
— sonstige beobachtete oder gemessene biologische Wirkungen und 
eventuelle abnorme Reaktionen der Bienen;  
— eventuelle Abweichungen von den hier beschriebenen Prüfver ­
fahren und sonstige relevante Informationen.  
3. LITERATURHINWEISE  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products — Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, 151-165. March 1993.
 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees ( Apis mellifera  L.), 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research 22, 119-125.
 
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Ex ­
per. Ther., 96, 99-113.  
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for Computing the effective ­
ness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, 265-267.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1050
 
C.18.  ADSORPTION/DESORPTION NACH EINER SCHÜTTEL ­
METHODE  
1. METHODE  
Diese Methode ist ein Verfahren im Format der Prüfrichtlinie OECD 
TG 106 zur Bestimmung von Bodenadsorption bzw. -desorption 
nach einer Schüttelmethode (Batch Equilibrium Method) (2000).  
1.1. EINLEITUNG  
Die Methode stützt sich auf einen Ringtest und einen Workshop zur 
Bodenauswahl für die Entwicklung eines Adsorptionstests (1) (2) (3) 
(4) sowie auf einzelstaatliche Leitlinien (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11).  
Anhand von Adsorptions-/Desorptionsuntersuchungen lassen sich 
wesentliche Informationen über die Mobilität von Chemikalien und 
deren Verteilung in den Boden-, Wasser- und Luftkompartimenten der Biosphäre gewinnen (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Diese Informationen können bei der Vorhersage bzw. Abschät ­
zung beispielsweise der Verfügbarkeit einer Chemikalie für den Ab ­
bau (22) (23), die Umwandlung und die Aufnahme durch Organis ­
men (24), Auswaschung durch das Bodenprofil (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28), Volatilität aus dem Boden (21) (29) (30), ober ­
flächliches Abfließen in natürliche Gewässer (18) (31) (32) heran ­
gezogen werden. Adsorptionsdaten eignen sich für Vergleichs- und Modellierungszwecke (19) (33) (34) (35).
 
Die Verteilung einer Chemikalie zwischen der Boden- und Wasser ­
phase ist ein komplexer Prozess und von einer Reihe unterschiedli ­
cher Faktoren abhängig: der chemischen Beschaffenheit der Substanz (12) (36) (37) (38) (39) (40), den Merkmalen des Bodens (4) (12) 
(13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) sowie klima ­
tischen Faktoren wie Niederschlag, Temperatur, Sonnenlicht und Wind. Folglich ist es nicht möglich, die zahlreichen Phänomene und Mechanismen, die am Prozess der Adsorption einer Chemikalie 
durch den Boden beteiligt sind, vollständig durch ein vereinfachtes 
Labormodell wie die vorliegende Methode zu definieren. Doch auch wenn dieser Versuch nicht alle in der Umwelt möglichen Fälle be ­
rücksichtigen kann, liefert er doch ausreichende Informationen zur 
Umweltrelevanz der Adsorption einer Chemikalie.
 
Siehe auch Allgemeine Einleitung.  
1.2. ANWENDUNGSBEREICH  
Das Verfahren dient der Abschätzung des Adsorptions-/ ­
Desorptionsverhaltens einer Substanz an Böden. Das Ziel besteht 
darin, einen Sorptionswert zu erhalten, der zur Prognose der Ver ­
teilung unter den verschiedensten Umweltbedingungen benutzt wer ­
den kann; zu diesem Zweck werden für eine Chemikalie an verschie ­
denen Böden Gleichgewichtsadsorptionskoeffizienten als Funktion 
von Bodenmerkmalen (z. B. organischer Kohlenstoffgehalt, Ton ­
gehalt sowie Bodentextur und pH-Wert) bestimmt. Um die Inter ­
aktionen einer bestimmten Substanz mit natürlich vorkommenden 
Böden weitestmöglich zu erfassen, sind unterschiedliche Bodentypen 
zu verwenden.  
Bei dieser Methode steht Adsorption für den Prozess des Anlagerns 
einer Chemikalie an Bodenoberflächen; es erfolgt keine Unterschei ­
dung zwischen unterschiedlichen Adsorptionsprozessen (physika ­
lische und chemische Adsorption) und solchen Prozessen wie ober ­
flächenkatalysierter Abbau, Volumenadsorption oder chemische Re ­
aktion. Nicht berücksichtigt ist die Adsorption an von den Böden 
erzeugte kolloide Partikel (Durchmesser < 0,2 μm). ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1051
 
Folgenden Bodenparametern wird in Bezug auf die Adsorption der 
größte Stellenwert beigemessen: dem organischen Kohlenstoffgehalt 
(3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) (44) (45) (46) (47) (48), dem Ton ­
gehalt und der Bodentextur (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) sowie für ionisierbare Verbindungen dem pH-Wert (3) (4) (42). 
Weitere Bodenparameter, die einen Einfluss auf die Adsorption-De ­
sorption einer Substanz haben, sind die effektiven Kationenaus ­
tauschkapazität (KAK
 eff ), der Gehalt an amorphen Eisen- und Alu ­
miniumoxiden, insbesondere für vulkanische und tropische Böden 
(4), wie auch die spezifische Oberfläche (49).  
Der Test ist dafür ausgelegt, die Adsorption einer Chemikalie an 
unterschiedliche Bodentypen mit einer Reihe unterschiedlicher orga ­
nischer Kohlenstoffgehalte, Tongehalte und Bodentexturen sowie pH-Werte zu bewerten. Er besteht aus drei Stufen:
 
Stufe 1 : Voruntersuchung zur Bestimmung  
— des Boden-Lösungs-Verhältnisses;  
— der Gleichgewichtszeit für die Adsorption und der bei 
Gleichgewicht adsorbierten Menge an Testsubstanz;  
— der Adsorption der Testsubstanz an der Oberfläche der 
Testgefäße und der Stabilität der Testsubstanz während des Testzeitraums.
 
Stufe 2 : Screening-Test: Bei fünf verschiedenen Bodentypen wird 
die Adsorption anhand der Adsorptionskinetik bei einer 
einzigen Konzentration und mittels Bestimmung des Ver ­
teilungskoeffizienten K  d . und K  oc untersucht.  
Stufe 3:  Bestimmung von Freundlich-Adsorptionsisothermen zur Er ­
mittlung des Einflusses der Konzentration auf die Adsorp ­
tion an Böden.  
Untersuchung der Desorption mit Hilfe von 
Desorptionskinetik/Freundlich-Desorptionsisothermen (An ­
lage 1).  
1.3. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN UND EINHEITEN  
Symbol Begriffsbestimmung Einheit  
A t i Adsorptionsanteil zur Zeit t  i % 
A eq Adsorptionsanteil bei Adsorptionsgleichgewicht %  
m s ads ðt i Þ Masse der zur Zeit t  i am Boden adsorbierten Testsubstanz μg 
m s ads ðΔt i Þ Masse der während des Zeitintervalls Δt i am Boden ad ­
sorbierten Testsubstanz μg 
m s ads ðeqÞ Masse der bei Adsorptionsgleichgewicht am Boden ad ­
sorbierten Testsubstanz μg 
m 0 Masse der Testsubstanz im Reagenzglas am Beginn des 
Adsorptionstests μg 
m m ads ðt i Þ Masse der Testsubstanz, gemessen in einer Aliquote ( v a A ) 
zum Zeitpunkt t  j μg 
m aq ads ðeqÞ Masse der Substanz in der Lösung bei Adsorptionsgleich ­
gewicht μg 
m Boden  = m  soil = Menge der Bodenphase, ausgedrückt als Boden- 
Trockenmasse g ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1052
 
Symbol Begriffsbestimmung Einheit  
C st Massenkonzentration der Vorratslösung der Substanz μg cm  -3 
C 0 Ausgangsmassenkonzentration der Testlösung in Kontakt 
mit dem Boden μg cm  -3 
C aq ads ðt i Þ Massenkonzentration der Substanz in der wässrigen Phase 
zur Zeit t  i wenn die Analyse durchgeführt ist μg cm  -3 
C s ads ðeqÞ Gehalt der bei Adsorptionsgleichgewicht am Boden ad ­
sorbierten Substanz μg g -1 
C aq ads ðeqÞ Massenkonzentration der Substanz in der wässrigen Phase 
bei Adsorptionsgleichgewicht μg cm  -3 
V 0 Anfangsvolumen der wässrigen Phase in Kontakt mit dem 
Boden während des Adsorptionstests cm 3 
v a A Volumen der Aliquote, in der die Testsubstanz gemessen 
wird cm 3 
K d Verteilungskoeffizient für die Adsorption cm  3 g -1 
K oc Auf organischen Kohlenstoff normierter Adsorptionskoef ­
fizient cm 3 g -1 
K om Auf organisches Material normierter Verteilungskoeffizient cm  3 g -1 
K F ads Freundlich-Adsorptionskoeffizient μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
l/n Freundlich-Exponent  
D t i Desorptionsanteil zum Zeitpunkt t  i % 
D Δt i Desorptionsanteil im Zeitintervall Δt j % 
K des Scheindesorptionskoeffizient cm  3 g -1 
K F ads Freundlich-Desorptionskoeffizient μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
m aq ads ðt i Þ Masse der aus Boden während der Zeit t  i desorbierten 
Testsubstanz μg 
m m ads ðΔt i Þ Masse der aus Boden während des Zeitintervalls Δt j de­
sorbierten Testsubstanz μg 
m m ads ðeqÞ Analytisch bestimmte Masse Substanz in der wässrigen 
Phase bei Desorptionsgleichgewicht μg 
m aq ads ðeqÞ Gesamtmasse der bei Desorptionsgleichgewicht desorbier ­
ten Testsubstanz μg 
m s ads ðΔt i Þ Masse der nach dem Zeitintervall Δt i am Boden adsorbiert 
bleibenden Substanz μg 
m aq A Masse der nach Adsorptionsgleichgewichtseinstellung in ­
folge unvollständigen Volumenaustauschs verbliebenen 
Substanz μg 
C s ads ðeqÞ Gehalt der bei Desorptionsgleichgewicht am Boden ad ­
sorbiert bleibenden Testsubstanz μg g -1 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1053
 
Symbol Begriffsbestimmung Einheit  
C aq ads ðeqÞ Massenkonzentration der Testsubstanz in der wässrigen 
Phase bei Desorptionsgleichgewicht μg cm  -3 
V T Gesamtvolumen der wässrigen Phase in Kontakt mit dem 
Boden während des nach der Aliquotenbeprobungs ­
methode durchgeführten Desorptionskinetikversuchs cm 3 
V R Volumen des nach Einstellung des Adsorptionsgleichge ­
wichts aus dem Glas abgenommenen und durch das glei ­
che Volumen einer 0,01 M CaCl  2 -Lösung ersetzten Über ­
stands cm 3 
v a D Volumen der während des nach der Aliquotenbepro ­
bungsmethode durchgeführten Desorptionskinetikversuchs ab der Zeit (i) als Probe zu Analysezwecken abgenom ­
menen Aliquote cm
 3 
V r r Volumen der im Desorptionskinetikversuch (Gesamt ­
beprobungsmethode) aus dem Glas (i) zur Messung der 
Testsubstanz abgenommenen Lösung cm 3 
V r F Volumen der bei Desorptionsgleichgewicht aus dem Glas 
zur Messung der Testsubstanz abgenommenen Lösung cm 3 
MB Massenbilanz %  
m E Gesamtmasse der aus Boden und von Wänden des Test ­
gefäßes in zwei Schritten extrahierten Testsubstanz μg 
V rec Volumen des nach Adsorptionsgleichgewicht erhaltenen 
Überstands cm 3 
P ow Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient 
pKa Dissoziationskonstante 
S w Wasserlöslichkeit g l  -1 
1.4. PRINZIP DER TESTMETHODE  
Bodenproben mit bekanntem Trockengewicht, die vorab in 0,01 M 
CaCl  2 in ein Gleichgewicht gebracht worden sind, werden bei be ­
kannten Konzentrationen von 0,01 M CaCl  2 mit bekannten Volu ­
mina von Lösungen der Testsubstanz, die nicht markiert oder radio ­
aktiv markiert ist, versetzt. Das Gemisch wird für eine angemessene 
Zeit geschüttelt. Anschließend werden die Bodensuspensionen mit ­
tels Zentrifugieren und, falls gewünscht, Filtrieren getrennt, und die wässrige Phase wird analysiert. Die Menge der an der Bodenprobe 
adsorbierten Testsubstanz wird berechnet als die Differenz zwischen 
der Anfangsmenge der Testsubstanz in Lösung und der bei Beendi ­
gung des Versuchs verbleibenden Menge (indirekte Methode).
 
Wahlweise kann die Menge der adsorbierten Testsubstanz auch un ­
mittelbar durch eine Bodenanalyse bestimmt werden (direkte Metho ­
de). Diese Vorgehensweise, die eine schrittweise Bodenextraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel umfasst, empfiehlt sich in Fäl ­
len, bei denen eine präzise Bestimmung der Differenz in der Lö ­
sungskonzentration der Substanz nicht möglich ist. Als Beispiele 
seien folgende Sachverhalte genannt: Adsorption der Testsubstanz an der Oberfläche der Testgefäße, Instabilität der Testsubstanz im Zeitrahmen des Versuchs, nur geringe Konzentrationsveränderung in 
der Lösung infolge einer schwachen Adsorption sowie starke Ad ­
sorption mit dem Ergebnis einer niedrigen Konzentration, die nicht genau bestimmt werden kann. Kommt eine radioaktiv markierte Sub ­
stanz zum Einsatz, könnte die Bodenextraktion durch Analyse der 
Bodenphase mittels Verbrennung und Flüssigszintillationszählung 
umgangen werden. Die Flüssigszintillationszählung ist jedoch eine unspezifische Technik, die keine Unterscheidung zwischen Aus ­
gangs- und Umwandlungsprodukten erlaubt. Daher sollte sie nur 
dann Anwendung finden, wenn die Testchemikalie für die Dauer 
der Untersuchung stabil ist.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1054
 
1.5. ANGABEN ZUR TESTSUBSTANZ  
Die chemischen Reagenzien sollten Analysenreinheit aufweisen. 
Empfohlen wird die Verwendung nicht markierter Testsubstanzen mit bekannter Zusammensetzung und von vorzugsweise mindestens 
95 %iger Reinheit bzw. radioaktiv markierter Testsubstanzen mit 
bekannter Zusammensetzung und von radioaktiver Reinheit. Bei Markierungssubstanzen mit kurzer Halbwertzeit sollten Zerfallskor ­
rekturen angewendet werden.
 
Vor der Durchführung einer Adsorptions-/Desorptionsprüfung sollten 
in Bezug auf die Testsubstanz folgende Angaben vorliegen:  
a) Wasserlöslichkeit (A.6);  
b) Dampfdruck (A.4) und/oder Henry-Konstante;  
c) abiotischer Abbau: Hydrolyse als Funktion des pH (C.7);  
d) Verteilungskoeffizient (A.8);  
e) leichte biologische Abbaubarkeit (C.4) bzw. aerobe und anaerobe 
Umwandlung im Boden;  
f) pKa von ionisierbaren Substanzen;  
g) Direktfotolyse in Wasser (d. h. UV-Vis-Absorptionsspektrum in 
Wasser, Quantenausbeute) und fotochemischer Abbau an Boden.  
1.6. ANWENDBARKEIT DES TESTS  
Der Test ist anwendbar auf chemische Substanzen, für die eine ana ­
lytische Methode mit hinreichender Genauigkeit zur Verfügung steht. 
Ein wichtiger Kennwert, der die Verlässlichkeit der Ergebnisse be ­
einflussen kann, und zwar besonders bei der indirekten Methode, ist die Stabilität der Testsubstanz innerhalb des Zeitrahmens des Tests. 
Daher ist die Stabilität in jedem Falle in einer Voruntersuchung zu 
überprüfen. Wird im Zeitrahmen des Tests eine Umwandlung be ­
obachtet, so empfiehlt es sich, dass die Hauptuntersuchung durch Analysen sowohl der Bodenphase als auch der wässrigen Phase 
durchgeführt wird.
 
Schwierigkeiten könnten sich bei der Ausführung dieses Tests bei Test ­
substanzen mit geringer Wasserlöslichkeit ergeben (S  w < 10  -4 g l -1 ), 
desgleichen bei hoch dosierten Substanzen, da die Konzentration in der wässrigen Phase analytisch nicht mit ausreichender Genauigkeit 
messbar ist. In diesen Fällen sind zusätzliche Schritte notwendig. In 
den entsprechenden Abschnitten der vorliegenden Dokumentation sind Hinweise dafür zu finden, wie sich diese Probleme lösen lassen.
 
Bei der Prüfung flüchtiger Substanzen ist dafür Sorge zu tragen, dass 
Verluste während der Behandlung vermieden werden.  
1.7. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.7.1.  Geräte und chemische Reagenzien  
Standardlaborausstattung, insbesondere Folgendes:  
a) Reagenzgläser oder Gefäße zur Versuchsdurchführung. Vor allem 
müssen diese Reagenzgläser oder Gefäße  
— genau in die Zentrifuge passen, um Handhabungs- und Um ­
setzfehler weitestgehend auszuschließen;  
— aus inertem Material bestehen, damit es möglichst nicht zur 
Adsorption der Testsubstanz an der Oberfläche kommt;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1055
 
b) Schüttelwerk: Überkopfschüttler oder gleichwertige Vorrichtung; 
der Schüttler sollte den Boden während des Schüttelns in Sus ­
pension halten;  
c) Zentrifuge: vorzugsweise Hochleistungsgerät, z. B. mit Zentrifu ­
galkräften > 3 000 g, temperaturgeregelt, fähig zur Abtrennung von Partikeln mit einem Durchmesser über 0,2 μm aus wässriger 
Lösung. Die Behälter sollten während des Rührens und Zentrifu ­
gierens abgedeckt sein, um Volatilitäts- und Wasserverluste zu vermeiden; um einer Adsorption daran möglichst vorzubeugen, sollte auf inaktivierte Abdeckungen, beispielsweise teflon ­
beschichtete Schraubkappen, zurückgegriffen werden;
 
d) fakultativ: Filtriervorrichtung; sterile Einweg-Filter mit einer Po ­
rosität von 0,2 μm. Mit besonderer Umsicht ist bei der Auswahl 
des Filtermaterials vorzugehen, um jegliche Verluste der Testsub ­
stanz daran zu vermeiden; bei schwerlöslichen Testsubstanzen 
wird empfohlen, kein organisches Filtermaterial zu verwenden;  
e) analytische Instrumente, mit denen die Konzentration der Test ­
chemikalie gemessen werden kann;  
f) Laborofen, mit dem sich eine Temperatur von 103  o C bis 110  o C 
halten lässt.  
1.7.2.  Charakterisierung und Auswahl von Böden  
Die Charakterisierung der Böden sollte anhand von drei Parametern 
erfolgen, die als weitgehend verantwortlich für das Adsorptionsver ­
mögen betrachtet werden: der organische Kohlenstoffgehalt, der Ton ­
gehalt und die Bodentextur sowie der pH-Wert. Wie bereits erwähnt (siehe unter „Anwendungsbereich“), können sich auch andere physi ­
kalisch-chemische Eigenschaften des Bodens auf die Adsorption/ ­
Desorption einer bestimmten Substanz auswirken und sollten daher 
in solchen Fällen berücksichtigt werden.
 
Die für eine Bodencharakterisierung verwendeten Methoden sind 
von großer Bedeutung und können einen erheblichen Einfluss auf die Ergebnisse ausüben. Aus diesem Grund empfiehlt es sich, den 
Boden-pH-Wert in einer Lösung von 0,01 M CaCl
 2 (der im Adsorp ­
tions-/Desorptionstest verwendeten Lösung) gemäß der entsprechen ­
den ISO-Methode (ISO-10390-1) zu messen. Weiterhin wird emp ­
fohlen, die übrigen relevanten Bodenmerkmale nach Standardverfah ­
ren zu bestimmen (z. B. ISO Handbook of soil analysis). Diese 
Vorgehensweise gestattet es, die Analyse von Sorptionsdaten anhand international einheitlicher Bodenparameter vorzunehmen. Einige An ­
leitungen zu vorhandenen Standardverfahren der Bodenanalyse und 
-Charakterisierung sind den Literaturangaben zu entnehmen (50) (51) 
(52). Zur Kalibrierung von Bodentestmethoden wird die Verwendung von Referenzböden empfohlen.
 
Eine Anleitung zur Auswahl von Böden für Adsorptions-/ ­
Desorptionsversuche ist in Tabelle 1 zu finden. Mit den sieben aus ­
gewählten Böden werden Bodentypen erfasst, die in gemäßigten 
geografischen Zonen anzutreffen sind. Bei ionisierbaren Testsubstan ­
zen sollten die gewählten Böden einen großen pH-Bereich abdecken, damit die Adsorption der Substanz in deren ionisierter und nichtio ­
nisierter Form bewertet werden kann. Im Abschnitt 1.9 „Durchfüh ­
rung des Tests“ ist angegeben, wie viele unterschiedliche Böden in den einzelnen Phasen des Tests zu verwenden sind.
 
Werden andere Bodentypen bevorzugt, so sollten diese nach densel ­
ben Parametern charakterisiert werden und eine ähnliche Spannbreite 
an Merkmalen wie die in Tabelle 1 beschriebenen aufweisen, auch 
wenn sie den Kriterien nicht exakt entsprechen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1056
 
Tabelle 1  
Anleitung zur Auswahl von Bodenproben zur Adsorption/Desorption  
Bodentyp pH-Bereich (in 0,01 M 
CaCl  2 ) Organischer Kohlen ­
stoffgehalt ( %) Tongehalt ( %) Bodentextur (  1 ) 
1 4,5-5,5 1,0-2,0 65-80 Ton 
2 > 7,5 3,5-5,0 20-40 Toniger Lehm 
3 5,5-7,0 1,5-3,0 15-25 Schluffiger Lehm 4 4,0-5,5 3,0-4,0 15-30 Lehm 5 < 4,0-6,0 (
 2 ) < 0,5-1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10-15 (  2 ) Lehmiger Sand 
6 >7,0 < 0,5-1,0 (  2 ) ( 3 ) 40-65 Toniger Lehm/Ton 
7 < 4,5 > 10 < 10 Sand/lehmiger Sand  
( 1 ) Gemäß FAO und dem US-amerikanischen System (85). 
( 2 ) Die Werte der jeweiligen Variablen sollten vorzugsweise in dem angegebenen Bereich liegen. Sollten jedoch Schwie ­
rigkeiten bei der Suche nach geeignetem Bodenmaterial auftreten, sind auch Werte unterhalb des angezeigten Mi ­
nimums zulässig. 
( 3 ) Böden mit einem organischen Kohlenstoffgehalt unter 0,3 % können die Korrelation zwischen organischem Gehalt 
und Adsorption stören. Daher ist es ratsam, Böden mit einem organischer. Kohlenstoffgehalt von mindestens 0,3 % 
einzusetzen.  
1.7.3.  Sammlung und Lagerung von Bodenproben  
1.7.3.1.  Sammlung  
Es werden keine speziellen Probenahmetechniken oder -hilfsmittel 
empfohlen. Das Probenahmeverfahren richtet sich nach dem Zweck 
der Untersuchung (53) (54) (55) (56) (57) (58).  
Folgendes ist zu beachten:  
a) Es sind ausführliche Informationen über die Geschichte des Feld ­
standorts erforderlich, so zum Ort, zum Bewuchs, zu Behandlun ­
gen mit Pestiziden und/oder Düngemitteln, zu biologischen An ­
lagerungen oder zu unfallbedingten Verschmutzungen. Im Hin ­
blick auf die Beschreibung des Probenahmestandorts sind die Empfehlungen der ISO-Norm zur Entnahme von Bodenproben 
(ISO 10381-6) einzuhalten.
 
b) Der Probenahmestandort ist mittels UTM (Universale Transver ­
sale Mercator-Projektion/European Horizontal Datum) oder geo ­
grafischen Koordinaten zu definieren. Daraus könnte für die Zu ­
kunft die Möglichkeit erwachsen, einen bestimmten Boden erneut zu sammeln oder Boden nach verschiedenen Klassifizierungssys ­
temen zu definieren, die in unterschiedlichen Ländern benutzt 
werden. Außerdem sollte A-Horizont nur bis zu einer Maximal ­
tiefe von 20 cm gesammelt werden. Vor allem der Boden Nr. 7 sollte in die Probenahme einbezogen werden, wenn ein Teil des 
Bodens O
 h -Horizont ist.  
Die Bodenproben sollten mit Hilfe von Behältern und unter Tempera ­
turbedingungen transportiert werden, die gewährleisten, dass die ur ­
sprünglichen Bodeneigenschaften nicht wesentlich verändert werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1057
 
1.7.3.2.  Lagerung  
Bevorzugt wird die Verwendung feldfrischer Böden. Nur wenn dies 
nicht möglich ist, sollte Boden bei Umgebungstemperatur gelagert und lufttrocken aufbewahrt werden. Eine Begrenzung der Lagerzeit 
wird nicht empfohlen, doch sollten Böden, die länger als drei Jahre 
gelagert wurden, vor ihrer Verwendung erneut auf ihren organischen Kohlenstoffgehalt, pH-Wert und KAK analysiert werden.
 
1.7.3.3.  Handhabung und Vorbereitung von Bodenproben auf den Test  
Die Böden werden bei Umgebungstemperatur (vorzugsweise zwi ­
schen 20 und 25  o C) luftgetrocknet. Die Auflockerung sollte mit 
minimalem Kraftaufwand erfolgen, so dass die ursprüngliche Textur 
des Bodens möglichst wenig verändert wird. Die Böden werden auf eine Partikelgröße < 2 mm gesiebt. Im Hinblick auf den Siebvorgang sollten die Empfehlungen der ISO-Norm zur Probenahme eingehal ­
ten werden (ISO 10381-6). Empfohlen wird eine sorgfältige Homo ­
genisierung, da dies die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erhöht. Der Feuchtegehalt jedes Bodens wird an drei Aliquoten mit Erwär ­
mung auf 105
 o C bestimmt, bis keine signifikante Gewichtsverände ­
rung mehr zu verzeichnen ist (ca. 12 Stunden). Bei allen Berech ­
nungen bezieht sich die Bodenmasse auf die Ofentrockenmasse, d. h. das um den Feuchtegehalt korrigierte Bodengewicht.
 
1.7.4.  Vorbereitung der Testsubstanz zur Anwendung auf Boden  
Die Testsubstanz wird in einer Lösung von 0,01 M CaCl  2 in des­
tilliertem oder entionisiertem Wasser gelöst. Die CaCl  2 -Lösung dient 
als wässrige Lösungsmittelphase zur Verbesserung der Zentrifugation 
und Minimierung des Kationenaustauschs. Die Konzentration der Vorratslösung sollte die Nachweisgrenze der verwendeten analyti ­
schen Methode vorzugsweise um den Faktor 3 übersteigen. Diese 
Schwelle gewährleistet genaue Messungen in Bezug auf die diesem 
Verfahren zugrunde liegende Methodik. Darüber hinaus sollte die Konzentration der Vorratslösung die Wasserlöslichkeit der Testsub ­
stanz unterschreiten.
 
Die Vorratslösung sollte am besten unmittelbar vor Anwendung auf 
die Bodenproben zubereitet sowie verschlossen und vor Licht ge ­
schützt bei 4  o C aufbewahrt werden. Die Lagerzeit richtet sich 
nach der Stabilität der Testsubstanz und ihrer Konzentration in der 
Lösung.  
Lediglich bei schwerlöslichen Substanzen (S  w < 10  -4 g l -1 ) könnte 
unter Umständen ein geeignetes Solubilisierungsmittel notwendig sein, wenn sich die Testsubstanz nur schwer auflösen lässt. Ein solches Solubilisierungsmittel sollte a) mit Wasser mischbar sein, 
beispielsweise Methanol oder Acetonitril, b) in einer Konzentration 
von höchstens 1 % des Gesamtvolumens der Vorratslösung und darunter in der Lösung der Testsubstanz, die in Kontakt mit dem Boden kommt (vorzugsweise unter 0,1 %), enthalten sein und c) kein 
oberflächenaktiver Stoff sein oder solvolytische Reaktionen mit der 
Testchemikalie durchlaufen. Die Verwendung eines Solubilisierungs ­
mittels sollte im Datenbericht festgehalten und begründet werden.
 
Eine andere Alternative bei schwerlöslichen Substanzen besteht da ­
rin, die Testsubstanz durch Untermischen in ein Testsystem zu ge ­
ben: Die Testsubstanz wird in einem organischen Lösungsmittel ge ­
löst, von dem eine Aliquote zu dem System von Boden und 0,01 M CaCl
 2 -Lösung in destilliertem oder entionisiertem Wasser gegeben 
wird. Der Gehalt an organischem Lösungsmittel in der wässrigen 
Phase sollte so niedrig wie möglich gehalten werden und im Regel ­
fall 0,1 % nicht übersteigen. Beim Untermischen aus einer organi ­
schen Lösung kann das Problem der Volumen-Nichtreproduzierbar ­
keit auftreten. Dadurch kann sich ein zusätzlicher Fehler ergeben, da 
die Konzentrationen von Testsubstanz und Hilfslösungsmittel nicht 
in allen Tests gleich hoch ausfallen dürften.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1058
 
1.8. VORAUSSETZUNGEN FÜR DIE DURCHFÜHRUNG DES AD ­
SORPTIONS-/DESORPTIONSTESTS  
1.8.1.  Analysenmethode  
Zu den wichtigsten Parametern, die die Genauigkeit von Sorptions ­
messungen beeinflussen können, zählen die Genauigkeit der Ana ­
lysenmethode bei der Untersuchung der Lösungs- und adsorbierten Phasen, die Stabilität und Reinheit der Testsubstanz, das Einstellen des Sorptionsgleichgewichts, das Ausmaß der Lösungskonzentrati ­
onsveränderung, das Boden-Lösungs-Verhältnis sowie Veränderun ­
gen in der Bodenstruktur während des Gleichgewichtseinstellungs ­
prozesses (35) (59-62). Einige Beispiele betreffend die Genauigkeits ­
problematik sind in Anlage 2 dargestellt.
 
Die Zuverlässigkeit der verwendeten Analysenmethode muss bei 
dem Konzentrationsbereich überprüft werden, der vermutlich wäh ­
rend des Tests auftreten wird. Es sollte im Ermessen des Experimen ­
tators liegen, eine geeignete Methode mit angemessener Genauigkeit, 
Präzision, Reproduzierbarkeit, Gewinnungsraten und hinreichenden Nachweisgrenzen zu entwickeln. Eine Anleitung für die Durchfüh ­
rung eines solchen Tests vermittelt der nachstehende Versuch.
 
Ein angemessenes Volumen 0,01 M CaCl  2 , z. B. 100 cm  3 , wird mit 
einer Masse Boden, z. B. 20 g, hoher Adsorptionsfähigkeit, d. h. mit hohem organischen Kohlenstoff- und Tongehalt 4 Stunden geschüt ­
telt. Diese Massen und Volumen können je nach Analysenanforde ­
rung variieren, doch ist ein Boden-Lösungs-Verhältnis von 1:5 ein geeigneter Ausgangswert. Das Gemisch wird zentrifugiert, und die wässrige Phase kann filtriert werden. Diese wird dann mit einem 
bestimmten Volumen der Testsubstanz-Vorratslösung versetzt, so 
dass eine Nennkonzentration innerhalb des für den Testverlauf wahr ­
scheinlichen Konzentrationsbereichs erreicht wird. Dieses Volumen sollte 10 % des Endvolumens der wässrigen Phase nicht überschrei ­
ten, um den Charakter der Lösung vor Einstellung des Gleichge ­
wichts so wenig wie möglich zu verändern. Die Lösung wird ana ­
lysiert.
 
Es ist ein Leerdurchlauf, bestehend aus dem System Boden + CaCl  2 - 
Lösung (ohne Testsubstanz), anzusetzen, um unerwünschte Pseudo ­
ergebnisse in der Analysenmethode und durch den Boden hervor ­
gerufene Matrixeffekte zu entdecken.  
Zu den für Sorptionsmessungen geeigneten analytischen Methoden 
gehören die Gas-Flüssigkeits-Chromatografie (GLC), Hochleistungs- Flüssigchromatografie (HPLC), Spektrometrie (z. B. GC/ ­
Massenspektrometrie, HPLC/Massenspektrometrie) und Flüssigszin ­
tillationszählung (für radioaktiv markierte Substanzen). Unabhängig 
von der verwendeten Analysenmethode gelten Gewinnungsraten zwi ­
schen 90 und 110 % des Nennwerts als angemessen. Um eine De ­
tektion und Evaluierung nach erfolgter Verteilung zu ermöglichen, 
sollten die Nachweisgrenzen der Analysenmethode die Nennkonzen ­
tration mindestens um den Faktor 2 unterschreiten.
 
Die Merkmale und Nachweisgrenzen der zur Ausführung von Ad ­
sorptionsuntersuchungen verfügbaren Analysenmethode spielen eine 
wichtige Rolle bei der Festlegung der Testbedingungen und der 
Durchführung des Tests insgesamt. Die vorliegende Methode stützt sich auf eine allgemeinere experimentelle Vorgehensweise und gibt Empfehlungen und Anleitung für alternative Lösungswege, die ge ­
wählt werden können, wenn sich Einschränkungen aufgrund der 
analytischen Methode und der Laborausstattung ergeben.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1059
 
1.8.2.  Auswahl optimaler Boden-Lösungs-Verhältnisse  
Die Auswahl geeigneter Boden-Lösungs-Verhältnisse für Sorptions ­
untersuchungen richtet sich nach dem Verteilungskoeffizienten K  d 
und dem gewünschten relativen Adsorptionsgrad. Die Veränderung 
der Konzentration der Substanz in der Lösung bestimmt die statisti ­
sche Genauigkeit der Messung auf der Grundlage der Form der Adsorptionsgleichung und der Grenze der analytischen Methodik bei der Bestimmung der Konzentration der Chemikalie in Lösung. 
Daher ist es in der Praxis generell von Nutzen, einige wenige feste 
Verhältnisse anzusetzen, bei denen der adsorbierte Anteil oberhalb 20 % und vorzugsweise >50 % liegt (62). Gleichzeitig ist darauf zu 
achten, dass die Konzentration der Testsubstanz in der wässrigen 
Phase so hoch ist, dass sie eine genaue Messung erlaubt. Dies ist insbesondere im Fall hoher Adsorptionsanteile von Bedeutung.
 
Ein passender Ansatz für die Wahl geeigneter Boden-Wasser-Ver ­
hältnisse basiert auf einer Schätzung des K  d -Werts entweder mittels 
Voruntersuchungen oder durch etablierte Abschätzungsverfahren 
(Anlage 3). Die Wahl eines geeigneten Verhältnisses kann auf der Basis einer grafischen Darstellung des Boden-Lösungs-Verhältnisses in Abhängigkeit von K
 d für festgelegte Adsorptionsanteile erfolgen 
(Abbildung 1). Bei dieser Darstellung wird angenommen, dass die 
Adsorptionsgleichung linear ist (  1 ). Die anwendbare Beziehung wird 
durch Umstellung der Gleichung (4) des K  d in Form der 
Gleichung (1) erhalten:  
V 0 
m soil ¼ Í 
m 0 
m s ads ðeqÞ Ä 1 Î 
K d (1) 
oder in ihrer logarithmischen Form unter der Annahme, dass 
R = m  soil=V 0 und A  eq %=100 = :  m s ads ðeqÞ 
m 0 
logR ¼ Ä logK  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # (2)
 
Abbildung 1:  Beziehung zwischen Boden-Lösungs-Verhältnissen 
und K  d bei verschiedenen Anteilen adsorbierter Testsubstanz  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1060  
( 1 ) C s ads ðeqÞ ¼ K d · C aq ads ðeqÞ:
 Abbildung 1 zeigt für unterschiedliche Adsorptionsebenen erforder ­
liche Boden-Lösungs-Verhältnisse als Funktion von K  d . Beispiels ­
weise würde es bei einem Verhältnis Boden:Lösung von 1:5 und einem K
 d von 20 zu einer annähernd 80 %igen Adsorption kommen. 
Um bei identischem K  d eine 50 %ige Adsorption zu erzielen, ist ein 
Verhältnis von 1:25 anzusetzen. Mit diesem flexiblen Ansatz kann 
der Untersucher das für die Versuchsanforderungen jeweils geeignete Boden-Lösungs-Verhältnis wählen.
 
Größere Schwierigkeiten bestehen in Bereichen, in denen die Che ­
mikalie stark oder sehr geringfügig adsorbiert wird. Bei geringer Adsorption empfiehlt sich ein Boden-Lösungs-Verhältnis von 1:1, wenngleich bei einigen ausgeprägt organischen Bodentypen unter 
Umständen niedrigere Verhältnisse erforderlich sind, um einen 
Schlamm zu erhalten. Mit Sorgfalt ist bei der analytischen Methodik zur Messung geringfügiger Veränderungen der Lösungskonzentration vorzugehen, da andernfalls die Adsorptionsmessung ungenau aus ­
fällt. Demgegenüber ist bei sehr hohen Verteilungskoeffizienten K
 d 
ein Boden-Lösungs-Verhältnis von bis zu 1:100 möglich, damit eine 
signifikante Menge der Chemikalie in Lösung bleibt. In jedem Fall ist auf ein gründliches Durchmischen zu achten. Ferner ist für die 
Gleichgewichtseinstellung im System eine ausreichende Zeitspanne 
einzuplanen. Ein alternativer Ansatz besteht darin, den K
 d -Wert an­
hand von Abschätzungstechniken vorherzubestimmen, die zum Bei ­
spiel auf P  ow -Werten fußen (Anlage 3). Diese Vorgehensweise 
könnte sich insbesondere bei geringfügig adsorbierten/polaren Che ­
mikalien mit P  ow < 20 und für lipophile/stark sorbierende Chemika ­
lien mit P  ow > 10  4 als sinnvoll erweisen.  
1.9. DURCHFÜHRUNG DES TESTS  
1.9.1.  Testbedingungen  
Sämtliche Versuche werden bei Umgebungstemperatur und, falls 
möglich, bei einer konstanten Temperatur zwischen 20 und 25  o C 
durchgeführt.  
Beim Zentrifugieren sollten Partikel aus der Lösung abgetrennt wer ­
den, die größer als 0,2 μm sind. Dieser Wert steht für die kleinsten 
Partikel, die als Feststoffpartikel eingestuft werden, und stellt den 
Grenzwert zwischen Feststoff- und Kolloidpartikeln dar. In Anlage 4 ist eine Anleitung zur Bestimmung der Zentrifugierbedingungen zu finden.
 
Ist mit den Zentrifugiervorrichtungen die Entfernung von Partikeln 
> 0,2 μm nicht zu gewährleisten, könnte auf eine Kombination von 
Zentrifugation und Filtration mit 0,2- μm-Filtern zurückgegriffen wer ­
den. Diese Filter sollten aus einem entsprechenden inerten Material 
bestehen, um jegliche Verluste der Testsubstanz daran zu vermeiden. In jedem Fall sollte nachgewiesen sein, dass es während des Abfil ­
trierens nicht zu Verlusten der Testsubstanz kommt.
 
1.9.2.  Stufe 1 — Voruntersuchung  
Der Zweck der Durchführung einer Voruntersuchung ist bereits im 
Abschnitt „Anwendungsbereich“ erläutert worden. Eine Anleitung zur Ansetzung eines solchen Tests wird anhand des nachfolgend 
vorgeschlagenen Versuchs gegeben.
 
1.9.2.1.  Auswahl optimaler Boden-Lösungs-Verhältnisse  
Zum Einsatz kommen zwei Bodentypen und drei Boden-Lösungs- 
Verhältnisse (sechs Versuche). Ein Bodentyp besitzt einen hohen 
organischen Kohlenstoffgehalt und einen niedrigen Tongehalt, der 
andere einen niedrigen organischen Kohlenstoffgehalt und einen ho ­
hen Tongehalt. Folgende Verhältnisse werden vorgeschlagen:  
— 50 g Boden und 50 cm  3 wässrige Lösung der Testsubstanz (Ver ­
hältnis 1:1);  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1061
 
— 10 g Boden und 50 cm  3 wässrige Lösung der Testsubstanz (Ver ­
hältnis 1:5);  
— 2 g Boden und 50 cm  3 wässrige Lösung der Testsubstanz (Ver ­
hältnis 1:25).  
Die Mindestmenge Boden zur Ausführung des Versuchs richtet sich 
nach den Laboreinrichtungen und der Leistungsfähigkeit der verwen ­
deten analytischen Methoden. Es empfiehlt sich jedoch, mindestens 1 g, vorzugsweise 2 g, einzusetzen, um verlässliche Testergebnisse 
zu erzielen.
 
Eine Kontrollprobe mit lediglich der Testsubstanz in 0,01 M CaCl  2 - 
Lösung (kein Boden) wird exakt den gleichen Schritten wie die Testsysteme unterzogen, um die Stabilität der Testsubstanz in 
CaCl
 2 -Lösung und ihre mögliche Adsorption an den Oberflächen 
der Testgefäße zu prüfen.  
Ein Leerdurchlauf je Boden mit der gleichen Menge Boden und 
einem Gesamtvolumen von 50 cm  3 0,01 M CaCl  2 -Lösung (ohne 
Testsubstanz) wird dem gleichen Testverfahren unterzogen. Dies dient während der Analyse als Leerkontrolle zum Nachweis stören ­
der Substanzen oder kontaminierter Böden.
 
Sämtliche Versuche, eingeschlossen Kontroll- und Leerversuche, 
sollten mindestens doppelt durchgeführt werden. Die Gesamtzahl der Proben, die für den Test vorbereitet werden sollten, kann mit 
Bezug auf die zugrunde liegende Methodik berechnet werden.
 
Für Vor- und Hauptuntersuchung werden in der Regel die gleichen 
Methoden angewendet. Ausnahmen werden, falls relevant, angege ­
ben. 
Die lufttrockenen Proben werden durch Schütteln mit einem Min ­
destvolumen von 45 cm  3 0,01 M CaCl  2 über Nacht (12 Stunden) vor 
dem Versuchstag ins Gleichgewicht gebracht. Anschließend wird mit 
einem bestimmten Volumen der Vorratslösung der Testsubstanz auf 
das Endvolumen von 50 cm  3 aufgefüllt. Das zugesetzte Volumen der 
Vorratslösung sollte a) 10 % des Endvolumens von 50 cm  3 der 
wässrigen Phase nicht überschreiten, um den Charakter der Lösung 
vor Einstellung des Gleichgewichts möglichst wenig zu verändern; 
und b) vorzugsweise in einer Anfangskonzentration der in Kontakt mit dem Boden befindlichen Testsubstanz (C
 0 ) resultieren, die die 
Nachweisgrenze der analytischen Methode mindestens um den Fak ­
tor 2 überschreitet — diese Schwelle gewährleistet auch bei einer 
starken Adsorption genaue Messungen (> 90 %) sowie später die Bestimmung der Adsorptionsisothermen. Die Anfangskonzentration der Substanz (C
 0 ) sollte möglichst nicht höher sein als die Hälfte 
ihrer Löslichkeitsgrenze.  
Nachstehend wird ein Beispiel für die Art und Weise der Berech ­
nung der Konzentration der Vorratslösung (C  st ) beschrieben. An ­
genommen wird eine Nachweisgrenze von 0,01 μg cm  -3 und 
90 %ige Adsorption. Daher sollte die Anfangskonzentration der Test ­
substanz in Kontakt mit dem Boden vorzugsweise 1 μg cm  -3 betra­
gen (zwei Größenordnungen über der Nachweisgrenze). Unter der 
Voraussetzung, dass das empfohlene Höchstvolumen der Vorrats ­
lösung zugesetzt wird, d. h. 5 bis 45 cm  3 0,01 M CaCl  2 -Gleichge ­
wichtseinstellungslösung (= 10 % der Vorratslösung zum Gesamt ­
volumen der wässrigen Phase von 50 cm  3 ), sollte die Konzentration 
der Vorratslösung 10 μg cm  -3 betragen, d. h., die Nachweisgrenze 
der analytischen Methode um den Faktor 3 überschreiten.  
Der pH-Wert der wässrigen Phase sollte vor und nach Kontakt mit 
dem Boden gemessen werden, da er im gesamten Adsorptionspro ­
zess eine wichtige Rolle spielt, insbesondere für ionisierbare Sub ­
stanzen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1062
 
Das Gemisch wird bis zum Erreichen des Adsorptionsgleichgewichts 
geschüttelt. Die Gleichgewichtszeit in Böden ist, da abhängig von 
der Chemikalie und vom Boden, stark schwankend. In der Regel ist ein Zeitraum von 24 Stunden ausreichend (77). In der Vorunter ­
suchung mit sequenzieller Beprobung ist ein Vermischen über einen 
Zeitraum von 48 Stunden empfehlenswert (zum Beispiel 4, 8, 24, 48 
Stunden). Die Analysenzeiten sollten jedoch unter Berücksichtigung des Arbeitsplans im Labor flexibel angesetzt werden.
 
Für die Analyse der Testsubstanz in der wässrigen Lösung bestehen 
zwei Möglichkeiten: a) die Gesamtbeprobungsmethode und b) die 
Aliquotenbeprobungsmethode. Es sei besonders darauf hingewiesen, 
dass die Gesamtbeprobung zwar in der Versuchsdurchführung zeit ­
aufwendiger, die mathematische Aufbereitung der Ergebnisse jedoch einfacher ist (Anlage 5). Allerdings liegt die Entscheidung für die 
jeweilige Methodik beim Experimentator, der auch die verfügbaren 
Laboreinrichtungen und -mittel in Rechnung zu stellen hat.
 
a) Gesamtbeprobungsmethode: Proben mit dem gleichen Boden-Lö ­
sungs-Verhältnis werden vorbereitet, und war so viele, wie Zeit ­
intervalle zur Untersuchung der Adsorptionskinetik vorgesehen 
sind. Nach Zentrifugation und, falls gewünscht, Filtration wird die wässrige Phase möglichst vollständig erhalten und nach bei ­
spielsweise 4 Stunden gemessen. Bei der zweiten Probe erfolgt 
die Messung nach 8 Stunden, bei der dritten nach 24 Stunden 
usw.
 
b) Aliquotenbeprobungsmethode: Für jedes Boden-Lösungs-Verhält ­
nis wird lediglich eine Duplikatprobe vorbereitet. Bei festgelegten Zeitintervallen wird das Gemisch zur Trennung der Phasen zen ­
trifugiert. Eine kleine Aliquote der wässrigen Phase wird sofort 
auf die Testsubstanz analysiert. Anschließend wird der Versuch mit dem ursprünglichen Gemisch fortgesetzt. Folgt auf die Zen ­
trifugation Filtration, so sollte das Labor für die Zentrifugation 
kleiner wässriger Aliquoten ausgestattet sein. Es empfiehlt sich, 
dass das Gesamtvolumen der abgenommenen Aliquoten nicht höher ist als 1 % des Gesamtvolumens der Lösung, damit sich das Boden-Lösungs-Verhältnis nicht signifikant ändert und die 
Masse des zur Adsorption verfügbaren gelösten Stoffs während 
des Tests nicht abnimmt.
 
Der Adsorptionsanteil wird zu jedem Zeitpunkt ( A t i ) auf der Basis 
der nominellen Anfangskonzentration und der gemessenen Konzen ­
tration zur Probenahmezeit (t  i ), korrigiert um den Leerwert, berech ­
net. Grafische Darstellungen von  A t i in Abhängigkeit von der Zeit 
(Abbildung 1 Anlage 5) werden erzeugt, um das Erreichen des Gleichgewichtsplateaus abzuschätzen (
 1 ). Der K  d -Wert bei Gleichge ­
wicht wird ebenfalls berechnet. Ausgehend von diesem K  d -Wert 
werden aus Abbildung 1 geeignete Boden-Lösungs-Verhältnisse so ausgewählt, dass der Adsorptionsanteil über 20 % und vorzugsweise >50 % liegt (61). Alle anwendbaren Gleichungen und Grundsätze 
sind im Abschnitt „Daten und Abschlussbericht“ sowie in Anlage 5 
aufgeführt.
 
1.9.2.2.  Bestimmung der Zeit zur Einstellung des Adsorptionsgleichgewichts 
und der bei Gleichgewicht adsorbierten Menge Testsubstanz  
Wie bereits erwähnt, gestatten grafische Darstellungen von  A t i bzw. 
C aq ads in Abhängigkeit von der Zeit eine Abschätzung des Erreichens 
des Adsorptionsgleichgewichts und der bei Gleichgewicht adsorbier ­
ten Menge Testsubstanz. Beispiele für solche grafischen Darstellun ­
gen werden in den Abbildungen 1 und 2 gezeigt. Die Gleichge ­
wichtseinstellungszeit ist die Zeit, die das System benötigt, um ein 
Plateau zu erreichen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1063  
( 1 ) Einträge der Konzentration der Testsubstanz in der wässrigen Phase (  C aq ads Ê Ì  
) in Ab­
hängigkeit von der Zeit könnten ferner zur Abschätzung des Erreichens des Gleichge ­
wichtsplateaus verwendet werden (siehe Abbildung 2 in Anlage 5).
 Wird bei einem speziellen Boden kein Plateau, sondern ein kontinu ­
ierlicher Anstieg festgestellt, so können dafür Faktoren wie Bioabbau 
oder langsame Diffusion verantwortlich sein. Ein Bioabbau lässt sich nachweisen, indem das Experiment mit einer sterilisierten Probe des Bodens wiederholt wird. Wird kein Plateau erreicht, sollte der Ex ­
perimentator nach anderen Phänomenen suchen, die bei seinen spezi ­
fischen Untersuchungen beteiligt sein könnten. Zu diesem Zweck könnten entsprechende Modifizierungen an den Versuchsbedingun ­
gen (Temperatur, Schüttelzeiten, Boden-Lösungs-Verhältnisse) vor ­
genommen werden. Die Entscheidung darüber, ob das Testverfahren 
fortgesetzt werden soll, auch wenn es möglicherweise nicht gelingt, ein Gleichgewicht zu erreichen, liegt im Ermessen des Experimen ­
tators.
 
1.9.2.3.  Adsorption an der Oberfläche des Testgefäßes und Stabilität der 
Testsubstanz  
Einige Informationen zur Adsorption der Testsubstanz an der Ober ­
fläche von Testgefäßen und zu ihrer Stabilität lassen sich aus der 
Analyse der Kontrollproben ableiten. Wird ein Verfall außerhalb der Standardabweichung der analytischen Methode beobachtet, könnten ein abiotischer Abbau und/oder eine Adsorption an der Oberfläche 
des Testgefäßes beteiligt sein. Eine Unterscheidung zwischen diesen 
beiden Phänomenen kann getroffen werden, indem die Wände des Gefäßes mit einem bekannten Volumen eines geeigneten Lösungs ­
mittels gründlich gewaschen werden und die Waschlösung auf die 
Testsubstanz analysiert wird. Ist keine Adsorption an der Oberfläche 
des Testgefäßes zu beobachten, demonstriert der Verfall eine abioti ­
sche Instabilität der Testsubstanz. Wird Adsorption festgestellt, macht sich ein Wechsel des Materials des Testgefäßes erforderlich. 
Die aus diesem Experiment gewonnenen Daten zur Adsorption an 
der Oberfläche der Testgefäße können jedoch nicht direkt auf ein Boden-Lösungs-Experiment extrapoliert werden. Die Anwesenheit von Boden wird sich auf diese Adsorption auswirken.
 
Zusätzliche Angaben zur Stabilität der Testsubstanz lassen sich durch 
Bestimmung der Stamm-Massenbilanz im Zeitablauf ableiten. Dabei 
werden die wässrige Phase, Extrakte von Boden und Testgefäßwän ­
den auf die Testsubstanz analysiert. Die Differenz zwischen der Masse der zugesetzten Testchemikalie und der Summe der Massen 
der Testchemikalie in der wässrigen Phase, Extrakte von Boden und 
Testgefäßwänden ist gleich der abgebauten und/oder verdunsteten und/oder nicht extrahierten Masse. Zur Durchführung einer Massen ­
bilanzbestimmung sollte das Adsorptionsgleichgewicht innerhalb der 
Versuchszeit erreicht worden sein.
 
Die Bestimmung der Massenbilanz erfolgt an beiden Böden sowie 
für ein Boden-Lösungs-Verhältnis je Boden, das einen Verfall ober ­
halb 20 % und vorzugsweise > 50 % bei Gleichgewicht ergibt. Wenn das Experiment zur Verhältnisfindung mit der Analyse der letzten 
Probe der wässrigen Phase nach 48 Stunden abgeschlossen ist, wer ­
den die Phasen mittels Zentrifugation und, falls gewünscht, Filtration getrennt. Die wässrige Phase wird so weitgehend wie möglich auf ­
gefangen, und der Boden wird mit einem Extraktionslösungsmittel 
(Extraktionskoeffizient mindestens 95 %) versetzt, um die Testsub ­
stanz zu extrahieren. Empfehlenswert sind wenigstens zwei aufeinan ­
der folgende Extraktionen. Die Menge Testsubstanz in den Boden- und Testgefäßextrakten wird bestimmt und die Massenbilanz berech ­
net (Gleichung 10, „Daten und Abschlussbericht“). Fällt sie niedriger 
aus als 90 %, gilt die Testsubstanz als im Zeitrahmen des Tests instabil. Dennoch könnten die Untersuchungen weiter fortgesetzt werden, wobei dann die Instabilität der Testsubstanz zu berücksich ­
tigen wäre. Für diesen Fall empfiehlt es sich, beide Phasen in der 
Hauptuntersuchung zu analysieren.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1064
 
1.9.3.  Stufe 2 — Adsorptionskinetik bei einer Konzentration der Testsub ­
stanz  
Zum Einsatz kommen fünf aus Tabelle 1 ausgewählte Böden. Hier ­
bei wäre es von Vorteil, gegebenenfalls einige oder sämtliche Böden, 
die bei der Voruntersuchung verwendet wurden, einzubeziehen. In 
einem solchen Fall muss Stufe 2 für die in der Voruntersuchung benutzten Böden nicht wiederholt werden.
 
Die Zeit zur Einstellung des Gleichgewichts, das Boden-Lösungs- 
Verhältnis, das Gewicht der Bodenprobe, das Volumen der wäss ­
rigen Phase in Kontakt mit dem Boden und die Konzentration der 
Testsubstanz in der Lösung werden auf der Basis der Ergebnisse aus 
den Voruntersuchungen ausgewählt. Analysen sollten vorzugsweise nach etwa 2, 4, 6, 8 (eventuell auch 10) und 24 Stunden Kontaktzeit erfolgen. Die Rührzeit könnte auf maximal 48 Stunden ausgedehnt 
werden, sollte eine Chemikalie im Zusammenhang mit den Resulta ­
ten der Verhältnisfindung eine längere Zeit bis zum Erreichen des Gleichgewichts benötigen. Die Analysenzeiten könnten jedoch flexi ­
bel angesetzt werden.
 
Jedes Experiment (ein Boden und eine Lösung) wird mindestens 
doppelt ausgeführt, um die Varianz der Resultate abschätzen zu 
können. Bei jedem Versuch wird eine Leerprobe untersucht. Sie besteht aus dem Boden und 0,01 M CaCl
 2 -Lösung ohne Testsub ­
stanz und ist hinsichtlich Gewicht und Volumen mit den Versuchs ­
proben identisch. Zu Absicherung gegen unerwartete Ergebnisse 
wird eine Kontrollprobe mit lediglich der Testsubstanz in 0,01 M CaCl
 2 -Lösung (ohne Boden) dem gleichen Testverfahren unterzogen.  
Der Adsorptionsanteil wird zu jedem Zeitpunkt  A t i und/oder Zeit ­
intervall  A Δt i (gemäß den Erfordernissen) berechnet und in Abhän ­
gigkeit von der Zeit grafisch aufgetragen. Ebenfalls berechnet wer ­
den der Verteilungskoeffizient K  d bei Gleichgewicht sowie der auf 
organischen Kohlenstoff normierte Adsorptionskoeffizient K  oc (für 
nichtpolare organische Chemikalien).  
Ergebnisse des Adsorptionskinetiktests:  
Der lineare K  d -Wert ist im Allgemeinen zur Beschreibung des Sorp ­
tionsverhaltens in Boden hinreichend genau (35) (78) und ist ein 
Ausdruck für die inhärente Mobilität von Chemikalien in Boden. Beispielsweise gelten Chemikalien mit K
 d ≤ 1 cm  3 g -1 in der Regel 
als qualitativ mobil. In ähnlicher Weise haben MacCall et al. (16) 
eine Mobilitätssystematik auf der Basis von K  oc -Werten aufgestellt. 
Ferner gibt es Auswaschsystematiken auf der Grundlage einer Be ­
ziehung zwischen K  oc und DT-50 (  1 ) (32) (79).  
Fehleranalysenuntersuchungen (61) zufolge können K  d -Werte unter ­
halb 0,3 cm  3 g -1 zudem nicht genau anhand eines Rückgangs der 
Konzentration in der wässrigen Phase abgeschätzt werden, und zwar 
auch dann nicht, wenn das (aus Sicht der Genauigkeit) günstigste Boden-Lösungs-Verhältnis, nämlich 1:1, angewendet wird. In diesem Fall ist eine Analyse beider Phasen, d. h. von Boden und Lösung, 
angeraten.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1065  
( 1 ) DT-50: Abbauzeit für 50 % der Testsubstanz.
 Angesichts der vorstehenden Feststellungen empfiehlt es sich, die 
Untersuchung des Adsorptionsverhaltens einer Chemikalie in Boden 
und ihres Mobilitätspotenzials fortzusetzen, indem für diese Systeme die Adsorptionsisothermen nach Freundlich bestimmt werden, bei denen eine exakte Bestimmung von K
 d nach dem dieser Testmethode 
zugrunde liegenden Versuchsprotokoll möglich ist. Eine genaue Be ­
stimmung ist möglich, sofern der aus der Multiplikation von K  d mit 
dem Boden-Lösungs-Verhältnis resultierende Wert größer ist als 0,3, wenn die Messungen auf einem Konzentrationsrückgang in der wäss ­
rigen Phase beruhen (indirekte Methode), bzw. größer ist als 0,1, 
wenn beide Phasen analysiert werden (direkte Methode) (61).
 
1.9.4.  Stufe 3 — Adsorptionsisothermen und Desorptionskinetik/ ­
Desorptionsisothermen  
1.9.4.1. A d s o r p t i o n s i s o t h e r m e n  
Zum Einsatz kommen fünf Substanzen, mit denen vorzugsweise 
zwei Größenordnungen abgedeckt werden. Bei der Auswahl dieser 
Konzentrationen sollten die Wasserlöslichkeit und die resultierenden 
wässrigen Gleichgewichtskonzentrationen Berücksichtigung finden. Das Boden-Lösungs-Verhältnis je Boden sollte während des Verlaufs der Untersuchung nicht verändert werden. Der Adsorptionstest wird 
wie vorstehend beschrieben durchgeführt, mit dem einzigen Unter ­
schied, dass die wässrige Phase nur einmal zu der Zeit analysiert wird, die notwendig ist, um ein Gleichgewicht — wie zuvor in Stufe 2 — bestimmt zu erreichen. Die Gleichgewichtskonzentrationen in 
der Lösung werden bestimmt, und die adsorbierte Menge wird an ­
hand des Verfalls der Testsubstanz in der Lösung oder nach der direkten Methode berechnet. Die je Einheit Bodenmasse adsorbierte Menge wird grafisch als Funktion der Gleichgewichtskonzentration 
der Testsubstanz aufgetragen (siehe Abschnitt „Daten und Ab ­
schlussbericht“).
 
Ergebnisse aus dem Adsorptionsisothermenexperiment:  
Von den bisher vorgeschlagenen mathematischen Adsorptionsmodel ­
len ist die Freundlich-Isotherme das zur Beschreibung von Adsorp ­
tionsprozessen am häufigsten verwendete Modell. Nähere Einzelhei ­
ten zur Interpretation und Bedeutung von Adsorptionsmodellen sind 
in den Literaturangaben zu finden (41) (45) (80) (81) (82).  
Anmerkung : Es sei darauf hingewiesen, dass ein Vergleich von K  F 
(Freundlich-Adsorptionskoeffizient)-Werten für unterschiedliche Sub ­
stanzen nur möglich ist, wenn diese K  F -Werte in den gleichen Ein ­
heiten ausgedrückt werden (83).  
1.9.4.2. D e s o r p t i o n s k i n e t i k  
Der Zweck dieses Experiments besteht darin, zu untersuchen, ob die 
Adsorption einer Chemikalie an einem Boden reversibel oder irre ­
versibel ist. Diese Information ist insofern von Bedeutung, als auch der Desorptionsprozess eine wichtige Rolle im Verhalten einer Che ­
mikalie in Feldboden spielt. Darüber hinaus sind Desorptionsdaten 
nützliche Eingangsdaten für die Computermodellierung von Aus ­
waschungen und aufgelöster Abflusssimulation. Wird eine Desorpti ­
onsuntersuchung gewünscht, so empfiehlt es sich, die nachfolgend 
beschriebene Studie an jedem System auszuführen, bei dem im vor ­
hergehenden Experiment zur Adsorptionskinetik eine genaue Bestim ­
mung von K
 d möglich war.  
Ähnlich wie bei der Adsorptionskinetikuntersuchung bestehen auch 
hier zwei Möglichkeiten zur Fortführung des Desorptionskinetik ­
experiments: a) die Gesamtbeprobungsmethode und b) die Aliquo ­
tenbeprobungsmethode. Die Wahl der zugrunde liegenden Methodik 
liegt im Ermessen des Experimentators, der dabei auch die verfüg ­
baren Laboreinrichtungen und -mittel in Rechnung stellen muss.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1066
 
a) Gesamtbeprobungsmethode: Für jeden Boden, der zur Fortfüh ­
rung der Desorptionsstudie ausgewählt wurde, werden so viele 
Proben mit dem gleichen Boden-Lösungs-Verhältnis vorbereitet, wie Zeitintervalle zur Untersuchung der Desorptionskinetik vor ­
gesehen sind. Vorzugsweise sollten die gleichen Zeitintervalle 
wie beim Adsorptionskinetikversuch Anwendung finden, doch 
kann die Gesamtzeit auch ausgedehnt werden, falls dies zum Erreichen des Desorptionsgleichgewichts im System erforderlich ist. Bei jedem Versuch (ein Boden, eine Lösung) wird eine Leer ­
probe untersucht. Diese besteht aus dem Boden und 0,01 M 
CaCl
 2 -Lösung, ohne Testsubstanz, und ist hinsichtlich Gewicht 
und Volumen mit denen des Experiments identisch. Als Kontroll ­
probe wird die Testsubstanz in 0,01 M CaCl  2 -Lösung (ohne Bo ­
den) dem gleichen Testverfahren unterzogen. Alle Gemische des 
Bodens mit der Lösung werden bis zum Erreichen des Adsorpti ­
onsgleichgewichts geschüttelt (wie zuvor in Stufe 2 bestimmt). Anschließend werden die Phasen mittels Zentrifugieren getrennt 
und die wässrigen Phasen so weit wie möglich abgenommen. Für 
das abgenommene Volumen Lösung wird mit einem gleichen Volumen 0,01 M CaCl
 2 ohne Testsubstanz aufgefüllt, und die 
neuen Gemische werden wieder geschüttelt. Die wässrige Phase 
des ersten Glases wird möglichst vollständig aufgefangen und 
nach beispielsweise 2 Stunden gemessen, die des zweiten Glases nach 4 Stunden, die des dritten nach 6 Stunden usw., bis das Desorptionsgleichgewicht eingestellt ist.
 
b) Aliquotenbeprobungsmethode: Nach dem Adsorptionskinetikver ­
such wird das Gemisch zentrifugiert und die wässrige Phase so 
weit wie möglich abgenommen. Für das abgenommene Lösungs ­
volumen wird mit einem gleichen Volumen 0,01 M CaCl  2 ohne 
Testsubstanz aufgefüllt. Das neue Gemisch wird bis zur Einstel ­
lung des Desorptionsgleichgewichts geschüttelt. Während dieses 
Zeitraums wird das Gemisch in festgelegten Zeitintervallen zur Trennung der Phasen zentrifugiert. Eine kleine Aliquote der wäss ­
rigen Phase wird sofort auf die Testsubstanz analysiert. Anschlie ­
ßend läuft der Versuch mit dem ursprünglichen Gemisch weiter. 
Das Volumen jeder einzelnen Aliquote sollte geringer sein als 1 % des Gesamtvolumens. Zur Aufrechterhaltung des Verhältnis ­
ses Boden/Lösung wird in das Gemisch die gleiche Menge fri ­
scher 0,01-M-CaCl
 2 -Lösung gegeben. Das Schütteln wird bis 
zum darauf folgenden Zeitintervall fortgesetzt.  
Der Desorptionsanteil wird zu jedem Zeitpunkt ( ðD t i Þ) und/oder Zeit ­
intervall (ðD Δt i Þ) (je nach den Untersuchungserfordernissen) berech ­
net und grafisch in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen. Der 
Desorptionskoeffizient von K  des bei Gleichgewicht wird ebenfalls 
berechnet. Alle anwendbaren Gleichungen sind im Abschnitt „Daten und Abschlussbericht“ sowie in Anlage 5 aufgeführt.
 
Ergebnisse aus dem Desorptionskinetikversuch:  
Gemeinsame grafische Darstellung des Anteils an Desorption  D t i und Adsorption  A  t i in Abhängigkeit von der Zeit erlauben eine 
Abschätzung der Reversibilität des Adsorptionsvorgangs. Wird das 
Desorptionsgleichgewicht erreicht, auch wenn dies erst nach dem 
Zweifachen der Zeit für das Adsorptionsgleichgewicht der Fall ist, und liegt die Gesamtdesorption bei über 75 % der adsorbierten 
Menge, so gilt die Adsorption als reversibel.
 
1.9.4.3. D e s o r p t i o n s i s o t h e r m e n  
Desorptionsisothermen nach Freundlich werden an den Böden be ­
stimmt, die im Experiment zu den Adsorptionsisothermen verwendet wurde. Der Desorptionstest wird wie im Abschnitt „Desorptionskine ­
tik“ beschrieben durchgeführt, mit dem einzigen Unterschied, dass 
die wässrige Phase nur einmal, und zwar bei Desorptionsgleichge ­
wicht, analysiert wird. Es wird die Menge der desorbierten Testsub ­
stanz berechnet. Der Gehalt von am Boden adsorbiert bleibender Testsubstanz wird als Funktion der Gleichgewichtskonzentration 
der Testsubstanz in Lösung aufgetragen (siehe Abschnitt „Daten 
und Abschlussbericht“ sowie Anlage 5).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1067
 
2. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT  
Die Zusammenstellung der Analysendaten erfolgt in Tabellenform 
(siehe Anlage 6). Es werden einzelne Messungen und errechnete Mittelwerte angegeben. Von Adsorptionsisothermen werden gra ­
fische Darstellungen vorgelegt. Die Berechnungen werden wie nach ­
folgend beschrieben durchgeführt.
 
Für die Zwecke des Tests wird davon ausgegangen, dass das Ge ­
wicht von 1 cm  3 wässriger Lösung 1 g beträgt. Das Boden-Lösungs- 
Verhältnis kann in den Darstellungen mit den Einheiten w/w bzw. 
w/vol ausgedrückt werden.  
2.1. ADSORPTION  
Die Adsorption ( A t i ) wird als der Anteil von unter den Testbedin ­
gungen am Boden adsorbierter Substanz bezogen auf die zu Beginn 
des Tests vorhandene Menge definiert. Ist die Testsubstanz stabil und adsorbiert nicht signifikant an der Behälterwand, so wird
 A t i zu 
jedem Zeitpunkt t  i nach folgender Gleichung berechnet:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 ð%Þ (3) 
Hierin bedeuten:  
A t i = Adsorptionsanteil zum Zeitpunkt t  i ( %) 
m s ads ðt i Þ = Masse der am Boden zur Zeit t  i adsorbierten Testsub ­
stanz (μg) 
m 0 = Masse der Testsubstanz im Reagenzglas zu Beginn des 
Tests (μg) 
Detaillierte Angaben zur Vorgehensweise bei der Berechnung des 
Adsorptionsanteils  A t i für die Gesamtbeprobungs- und die Aliquo ­
tenbeprobungsmethode enthält Anlage 5.  
Der Verteilungskoeffizient K  d ist der Quotient aus dem Gehalt der 
Substanz in der Bodenphase und der Massenkonzentration der Sub ­
stanz in der wässrigen Lösung unter den Testbedingungen, wenn das Adsorptionsgleichgewicht erreicht wird.
 
K d ¼ C s ads ðeqÞ 
C aq ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
Hierin bedeuten:  
C s ads ðeqÞ = Gehalt der am Boden bei Adsorptionsgleich ­
gewicht adsorbierten Substanz ( μg g  -1 ) 
C aq ads ðeqÞ = Massenkonzentration der Substanz in der 
wässrigen Phase bei Adsorptionsgleichgewicht (μg cm
 -3 ). (Diese Konzentration wird ana ­
lytisch unter Berücksichtigung der durch die 
Leerversuche erhaltenen Werte bestimmt.)  
m s ads ðeqÞ = Masse der am Boden bei Adsorptionsgleichge ­
wicht adsorbierten Substanz ( μg) 
m aq ads ðeqÞ = Masse der Substanz in der Lösung bei Adsorp ­
tionsgleichgewicht ( μg) 
m Boden  = m  soil = Menge der Bodenphase, ausgedrückt in Tro ­
ckenmasse Boden (g)  
V 0 = Ausgangsvolumen der wässrigen Phase in 
Kontakt mit dem Boden (cm  3 ) 
Die Beziehung zwischen A  eq und K  d wird wie folgt dargestellt:  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1068
 
Hierin bedeutet:  
A eq = Adsorptionsanteil bei Adsorptionsgleichgewicht ( %).  
Der auf organischen Kohlenstoff normierte Adsorptionskoeffizient 
K oc setzt den Verteilungskoeffizienten K  d in Beziehung zum Gehalt 
an organischem Kohlenstoff in der Bodenprobe:  
K oc ¼ K d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
Hierin bedeutet:  
% oc = Anteil an organischem Kohlenstoff in der Bodenprobe 
(g g  -1 ). 
Der K  oc -Koeffizient steht für einen einzigen Wert, der die Verteilung 
hauptsächlich von nichtpolaren organischen Chemikalien zwischen organischem Kohlenstoff im Boden oder Sediment und Wasser cha ­
rakterisiert. Die Adsorption dieser Chemikalien wird in Korrelation 
zum organischen Gehalt des sorbierenden Feststoffs gesetzt (7). Folglich sind K
 oc -Werte abhängig von den spezifischen Eigenschaf ­
ten der Huminfraktionen, die hinsichtlich der Sorptionskapazität auf ­
grund von Unterschieden in Herkunft, Entstehung usw. erheblich voneinander abweichen.
 
2.1.1.  Adsorptionsisothermen  
Die Freundlich-Adsorptionsisothermen-Gleichung setzt die Menge 
der adsorbierten Testsubstanz in Beziehung zur Konzentration der Testsubstanz in Lösung bei Gleichgewicht (Gleichung 8).
 
Die Daten werden wie unter dem Punkt „Adsorption“ beschrieben 
behandelt, und für jedes Reagenzglas wird der Gehalt der nach dem Adsorptionstest am Boden adsorbierten Testsubstanz (
C s ads ðeqÞ, an 
anderer Stelle als x/m bezeichnet) berechnet. Es wird angenommen, 
dass ein Gleichgewicht eingestellt worden ist und dass  C s ads ðeqÞ für 
den Gleichgewichtswert steht:  
C s ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m soil ¼ ½C 0 Ä C aq ads ðeqÞâ: V 0 
m soil (μg g  -1 ) (7) 
Die Freundlich’sche Adsorptionsgleichung lautet wie folgt (8):  
C s ads ðeqÞ ¼ K F ads Ö C aq ads ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
bzw. in der linearen Form:  
logC  s ads ðeqÞ ¼ logK  F ads þ 1=n·logC  aq ads ðeqÞ (9) 
Hierin bedeuten:  
K F ads = Freundlich-Adsorptionskoeffizient; seine Dimension 
ist cm  3 g -1 , jedoch nur wenn l/n = 1; in allen anderen 
Fällen wird die Neigung l/n in die Dimension von  K F ads 
(μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 ) eingeführt:  
n = Regressionskonstante; l/n liegt im Allgemeinen im Be ­
reich von 0,7 bis 1,0 und zeigt an, dass Sorptionsdaten oft leicht nichtlinear sind.
 
Die Gleichungen 8 und 9 werden grafisch aufgetragen, und die 
Werte von  K  F ads und l/n werden mittels Regressionsanalyse nach 
der Gleichung 9 berechnet. Der Korrelationskoeffizient r  2 der log- 
Gleichung wird ebenfalls berechnet. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel 
für solche grafischen Darstellungen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1069
 
Abbildung 2:  Freundlich-Adsorptionskurve, normal und linearisiert  
2.1.2.  Massenbilanz  
Die Massenbilanz (MB) wird definiert als der Anteil der Substanz, 
der nach einem Adsorptionstest gegenüber der nominalen Substanz ­
menge am Beginn des Tests analytisch erhalten werden kann.  
Die Behandlung von Daten hängt davon ab, inwieweit das Lösungs ­
mittel vollständig mit Wasser mischbar ist. Im Fall eines wasser ­
mischbaren Lösungsmittels kann die unter Punkt „Desorption“ be ­
schriebene Behandlung von Daten angewendet werden, um die durch Lösungsmittelextraktion rückgewonnene Substanzmenge zu bestim ­
men. Ist das Lösungsmittel nicht so gut mit Wasser mischbar, muss 
die Bestimmung der erhaltenen Menge erfolgen.
 
Die Massenbilanz MB wird für die Adsorption wie folgt berechnet: 
Es wird angenommen, dass der Term (m  E ) der Summe der Massen 
der Testchemikalien entspricht, die mit einem organischen Lösungs ­
mittel aus dem Boden und von den Oberflächen des Testgefäßes extrahiert wurden:
 
MB ¼ V rec ·C aq ads ðeqÞ þ m  E Ê Ì  
·100 
V 0 ·C 0 ð%Þ (10) 
Hierin bedeuten:  
MB = Massenbilanz ( %)  
m E = Gesamtmasse von aus dem Boden und von Wänden des 
Testgefäßes in zwei Schritten extrahierter Testsubstanz (μg)
 
C 0 = Anfangsmassenkonzentration der Testlösung in Kontakt 
mit dem Boden ( μg cm  -3 ) 
V rec = Volumen des nach dem Adsorptionsgleichgewicht erhalte ­
nen Überstandes (cm  -3 ). 
2.2. DESORPTION  
Die Desorption (D) wird als Anteil der unter Testbedingungen de ­
sorbierten Testsubstanz bezogen auf die Menge der zuvor adsorbier ­
ten Substanz definiert:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ ·100ð%Þ (11) 
Hierin bedeuten:  
D t i = Desorptionsanteil zum Zeitpunkt t  i ( %) ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1070
 
m aq des ðt i Þ = Masse der aus Boden zum Zeitpunkt t  i desorbierten 
Testsubstanz ( μg) 
m s ads ðeqÞ = Masse der bei Adsorptionsgleichgewicht an Boden ad ­
sorbierten Testsubstanz ( μg) 
Detaillierte Angaben zur Vorgehensweise bei der Berechnung des 
Desorptionsanteils  D 
t i für die Gesamtbeprobungs- und die Aliquo ­
tenbeprobungsmethode enthält Anlage 5.  
Der Scheindesorptionskoeffizient (K  des ) ist unter den Testbedingun ­
gen der Quotient aus dem Gehalt der in der Bodenphase verbleiben ­
den Substanz und der Massenkonzentration der in der wässrigen 
Lösung desorbierten Substanz bei Erreichen des Desorptionsgleich ­
gewichts:  
K des ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ V T 
m aq des ðeqÞ m  soil (cm  3 g -1 ) (12) 
Hierin bedeuten:  
K des = Desorptionskoeffizient (cm  3 g- 1 ) 
m aq des ðeqÞ = Gesamtmasse der bei Desorptionsgleichgewicht aus 
Boden desorbierten Testsubstanz ( μg) 
V T = Gesamtvolumen der wässrigen Phase in Kontakt mit 
dem Boden während des Desorptionskinetiktests (cm
 3 ). 
Eine Anleitung zur Berechnung von  m aq des ðeqÞ wird in Anlage 5 im 
Abschnitt „Desorption“ gegeben.  
Hinweis : 
Wurde der vorausgehende Adsorptionstest nach der Gesamtbepro ­
bungsmethode durchgeführt, so gilt: Das Volumen V  T in der Glei ­
chung 12 ist gleich V  0 . 
2.2.1.  Desorptionsisothermen  
Die Freundlich-Desorptionsisothermen-Gleichung setzt den Gehalt 
der am Boden adsorbiert bleibenden Testsubstanz in Beziehung zur Konzentration der Testsubstanz in Lösung bei Desorptionsgleichge ­
wicht (Gleichung 16).
 
Für jedes Reagenzglas wird der Gehalt der an Boden bei Desorpti ­
onsgleichgewicht adsorbiert bleibenden Substanz wie folgt berech ­
net: 
C s des ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m soil (μg g  -1 ) (13) 
m aq des ðeqÞ wird definiert als:  
m aq des ðeqÞ ¼ m m des ðeqÞ· V 0 
V r F Ä m aq A (μg) (14) 
Hierin bedeuten:  
C s des ðeqÞ = Gehalt der bei Desorptionsgleichgewicht am Boden 
adsorbiert bleibenden Testsubstanz ( μg g  -1 ) 
m m des ðeqÞ = analytisch bestimmte Masse Substanz in der wäss ­
rigen Phase bei Desorptionsgleichgewicht ( μg) ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1071
 
m aq A = Masse der nach Adsorptionsgleichgewichtseinstellung 
infolge unvollständigen Volumenaustauschs verblie ­
benen Testsubstanz ( μg) 
m aq des ðeqÞ = Masse der Substanz in der Lösung bei Adsorptions ­
gleichgewicht ( μg) 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ· V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (15) 
V r F = Volumen der aus dem Glas zur Messung der Testsubstanz 
bei Desorptionsgleichgewicht abgenommenen Lösung (cm  3 ) 
V R = Volumen des nach Einstellung des Adsorptionsgleichge ­
wichts aus dem Glas abgenommenen und durch das gleiche Volumen einer 0,01-M-CaCl
 2 -Lösung ersetzten Überstandes 
(cm  3 ) 
Die Desorptionsgleichung nach Freundlich lautet wie folgt (16):  
C s des ðeqÞ ¼ K F des ·C aq des ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (16) 
bzw. in der linearen Form:  
logC  s des ðeqÞ ¼ logK  F des þ 1=n·logC  aq des ðeqÞ (17) 
Hierin bedeuten:  
K F des = Freundlich-Desorptionskoeffizient  
n = Regressionskonstante  
C aq des ðeqÞ = Massenkonzentration der Substanz in der wässrigen 
Phase bei Desorptionsgleichgewicht ( μg cm  -3 ) 
Die Gleichungen 16 und 17 können grafisch aufgetragen werden, 
und die Werte von  K F des und l/n werden mittels Regressionsanalyse 
nach der Gleichung 17 berechnet.  
Hinweis : 
Ist der Freundlich-Adsorptions- bzw. Desorptionsexponent l/n gleich 
1, so wird die Freundlich-Adsorptions- bzw. Desorptionsbindungs ­
konstante ( K F ads und K F des ) gleich der Adsorptions- bzw. der Desorp ­
tionsgleichgewichtskonstante (K  d bzw. K  des ) sein, und die Kurven 
von C  s in Abhängigkeit von C  aq werden linear verlaufen. Sind die 
Exponenten nicht gleich 1, so verlaufen die Kurven C  s in Abhängig ­
keit von C  aq nicht linear, und die Adsorptions- und die Desorptions ­
konstante werden entlang der Isothermen variieren.  
2.2.2.  Testbericht  
Der Testbericht sollte folgende Angaben enthalten:  
— vollständige Angaben zu den verwendeten Bodenproben, darun ­
ter: 
— geografische Angaben zum Standort (Breite, Länge),  
— Datum der Probenahme,  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1072
 
— Einsatzstruktur (z. B. landwirtschaftlich genutzter Boden, Forst 
usw.),  
— Probenahmetiefe,  
— Sand-/Schluff-/Tongehalt,  
— pH-Werte (in 0,01 M CaCl  2 ), 
— organischer Kohlenstoffgehalt,  
— organischer Substanzgehalt,  
— Stickstoffgehalt,  
— C/N-Verhältnis,  
— Kationenaustauschkapazität (mmol/kg),  
— sämtliche Informationen zur Sammlung und Lagerung von Bo ­
denproben,  
— gegebenenfalls alle für die Interpretation der Adsorption/ ­
Desorption der Testsubstanz relevanten Informationen,  
— Angaben zu den für die Bestimmung der einzelnen Parameter 
verwendeten Methoden;  
— Informationen zur Testsubstanz, wenn erforderlich;  
— Temperatur der Experimente;  
— Zentrifugierbedingungen;  
— zur Analyse der Testsubstanz herangezogenes analytisches Ver ­
fahren;  
— Begründung der eventuellen Verwendung eines Solubilisierungs ­
mittels bei der Herstellung der Vorratslösung der Testsubstanz;  
— Erläuterung zu Korrekturen an den Berechnungen, falls relevant;  
— Daten gemäß Formular (Anlage 6) und grafische Darstellungen;  
— sämtliche Informationen und Beobachtungen, die für die Aus ­
legung der Testergebnisse hilfreich sind.  
3. LITERATURANGABEN  
(1) Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02 045, Part II.
 
(2) Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L. (1987). Selection of Re ­
presentative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02 
045, Part I.  
(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection. Treatment, Characterisation. Special Publication 
No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.
 
(4) OECD Test Guidelines Programme. Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Solls/Sediments, Belgirate, Italy, 18- 20 January 1995 (June 1995).
 
(5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines. Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, 
Series 16 3-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1073
 
(6) US Environment Protection Agency: Prevention. Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 
835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/ Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048. April 1996.
 
(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for De ­
termining a Sorption Constant (K  oc ) for an Organic Chemical 
in Soil and Sediments.  
(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Gui ­
delines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.  
(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
 
(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially dan ­
gerous to health or especially harmful to the environment.  
(11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Pro ­
tection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany.
 
(12) Calvet R. (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and 
the prediction of the mobilities of pesticides in soils“, in Me ­
thodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
 
(13) Calvet R. (1980), „Adsorption-Desorption Phenomena“ in In ­
teractions between herbicides and the soil. (R.J. Hance ed.), Academic Press, London, 83-122.
 
(14) Hasset J. J. and Banwart W.L. (1989), „The sorption of non ­
polar organics by soils and sediments“ in Reactions and Mo ­
vement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, 31-44.
 
(15) Van Genuchten M. Th., Davidson J. M. and Wierenga P. J. 
(1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations for 
the prediction of pesticide movement through porous media“. 
Soil Sci. Soc. Am. Proc., Vol. 38(1), 29-35.  
(16) McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L. and Dishburger 
H. J. (1981), „Measurement of sorption coefficients of organic 
chemicals and their use, in environmental fate analysis“, in 
Test Protocols for Environmental Fate and Movement of To ­
xicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washing ­
ton DC.  
(17) Lambert S. M., Porter P. E. and Schieferrstein R. H., (1965), 
„Movement and sorption of chemicals applied to the soil“. Weeds, 1 3, 185-190.
 
(18) Rhodes R. C, Belasco I. J., and Pease H. L, (1970) „Determi ­
nation of mobility and adsorption of agrochemicals in soils“. 
J.Agric.Food Chem., 18, 524-528.  
(19) Russell M. H. (1995), „Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil“ in Environmental Behavior of Agro ­
chemicals (ed. T. R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley 
& Sons Ltd.  
(20) Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. 
W. and Holland P. T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides“, IU ­
PAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, 901- 
932.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1074
 
(21) Guth J. A., Burkhard N. and D. O. Eberle (1976), „Experi ­
mental models for studying the persistence of pesticides in 
soils“. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 137-157, BCPC, Surrey, UK.
 
(22) Furminge C. G. L and Osgerby J. M. (1967), „Persistence of 
herbicides in soil“. J. Sci. Fd Agric, 18, 269-273.  
(23) Burkhard N. and Guth J. A. (1981), „Chemical hydrolysis of 
2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-l,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption“. Pestic. 
Sci. 12, 45-52.
 
(24) Guth J. A., Gerber H. R. and Schlaepfer T. (1977), „Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological avai ­
lability of soil-applied pesticides“. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, 961-971.
 
(25) Osgerby J. M. (1973), „Process affecting herbicide action in 
soil“. Pestic. Sci., 4, 247-258.  
(26) Guth J. A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Böden“. Schr. Reihe Ver. Wass.-Bo ­
den-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, 143-154.  
(27) Hamaker J. W. (1975), „The interpretation of soil leaching 
experiments“, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), 135-172. Plenum Press, NY.
 
(28) Helling C. S. (1971), „Pesticide mobility in soils“. Soil Sci. 
Soc. Amer. Proc, 35, 732-210.  
(29) Hamaker J. W. (1972), „Diffusion and volatilization“ in Or ­
ganic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J. 
W. Hamaker eds), Vol. I, 49-143.  
(30) Burkhard N. and Guth J. A. (1981), „Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system“. Pestic. Sci. 12, 37-44.
 
(31) Cohen S. Z., Creeger S. M, Carsel R.F. and Enfield C.G. 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC.
 
(32) Gustafson D. I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide leachability“. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), 339-357.
 
(33) Leistra M. and Dekkers W. A. (1976), „Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils“. J. of Soil 
Sci., 28, 340-350.  
(34) Bromilov R. H. and Leistra M. (1980), „Measured and simu ­
lated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils“. Pest. Sci., 11, 389-395.
 
(35) Green R. E. and Karickoff S. W., (1990), „Sorption estimates 
for modeling“, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. h.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series no. 2, 80-101.
 
(36) Lambert S. M. (1967), „Functional relationship between sorp ­
tion in soil and chemical structure“. J. Agri. Food Chem., 15, 
572-576.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1075
 
(37) Hance R. J. (1969), „An empirical relationship between che ­
mical structure and the sorption of some herbicides by soils“.). 
Agri. Food Chem., 17, 667-668.  
(38) Briggs G. G. (1969), „Molecular structure of herbicides and 
their sorption by soils“. Nature, 223, 1288.  
(39) Briggs G. G. (1981). „Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the pa ­
rachor“. J. Agric. Food Chem., 29, 1050-1059.  
(40) Sabljic A. (1984), „Predictions of the nature and strength of 
soil sorption of organic polutance by molecular topology“. J. 
Agric. Food Chem., 32, 243-246.  
(41) Bailey G. W. and White J. L. (1970), „Factors influencing the 
adsorption, desorption and movement of pesticides in soil“. Residue Rev., 32, 29-92.
 
(42) Bailey G. W., J. L. White and Y. Rothberg. (1968), „Adsorp ­
tion of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate“. Soil Sci. Soc. Amer. 
Proc. 32, 222-234.
 
(43) Karickhoff S. W. (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. Chemosphere 10, 833-846.
 
(44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B. (1989), „Soil Sorption 
of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners“. Environ. Toxi ­
col. Safety 21, 1-17.  
(45) Hamaker J. W. and Thompson J. M. (1972), „Adsorption in 
organic chemicals“ in Organic Chemicals in the Soil Environ ­
ment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, 49-143.
 
(46) Deli J. and Warren G. F., 1971, „Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils“. Weed Sci. 19, 67-69.  
(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M. and Santelmann, 
(1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils“. Weed Science, Vol. 23, 454-457.
 
(48) Haues M. H. B., Stacey M. and Thompson J. M. (1968), 
„Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparati ­
ons“ in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, 75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
 
(49) Pionke H. B. and Deangelis R. J. (1980), „Methods for dis ­
tributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase“, CREAMS, in A Field Scale Model for 
Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Manage ­
ment Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentati ­
on, USDA Conservation Research report.
 
(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality — Ge ­
neral aspects: chemical and physical methods of analysis; bio ­
logical methods of analysis. First Edition (1994).  
(51) Scheffer F. and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde. F. 
Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.  
(52) Black, Evans D. D., White J. L, Ensminger L. E. and Clark F. 
E., eds., „Methods of Soil Analysis“, Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1076
 
(53) 1SO/DIS 10381-1 Soil Quality — Sampling — Pan 1: Gui ­
dance on the design of sampling programmes.  
(54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality — Sampling — Part 2: Gui ­
dance on sampling techniques.  
(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality — Sampling — Part 3: Gui ­
dance on safety of sampling.  
(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality — Sampling — Part 4: Gui ­
dance on the investigation of natural and cultivated soils.  
(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality — Sampling — Part 5: Gui ­
dance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.
 
(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality — Sampling — Part 6: Gui ­
dance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
(59) Green R. E. and Yamane V. K. (1970), „Precision in pesticide 
adsorption measurements“. Soil Sci. Am. Proc, 34, 353-354.  
(60) Grover R. and Hance R. J. (1970), „Effect of ratio of soil to 
water on adsorption of linuron and atrazine“. Soil Sci., 109- 138.
 
(61) Boesten, J. J. T. I, „Influence of soil/liquid ratio on the expe ­
rimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system“. 
Pest. Sci. 1990, 30, 31-41.  
(62) Boesten, J. J. T. I. „Influence of soil/liquid ratio on the expe ­
rimental error of sorption coefficients in relation to OECD 
guideline 106“. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulator)' aspects, Brussels, 26-29. April 1994.
 
(63) Bastide J., Cantier J. M. et Coste C. (1980), „Comportement 
de substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique“. Weed Res. 21, 227-231.
 
(64) Brown D. S. and Flagg E. W. (1981), „Empirical prediction of 
organic pollutants sorption in natural sediments“. J. Envi ­
ron.Qual, 10(3), 382-386.  
(65) Chiou C. T., Porter P. E., and Schmedding D. W., (1983), 
„Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water“. Environ. Sci. Technol., 17(4), 227-231.
 
(66) Gerstl Z., and Mingelgrin U. (1984), „Sorption of organic sub ­
stances by soils and sediments“. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), 297-312.
 
(67) Vowles P. D. and Mantoura R. F. C. (1987), „Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons“. Chemosphere, 16(1), 109-116.
 
(68) Lyman W. J. , Reehl W. F. and Rosenblatt D. H. (1990). 
Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environ ­
mental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical 
Society, Washington DC.  
(69) Keniga E. E., and Goring, C. A. I. (1980). „Relationship bet ­
ween water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota“ in Aquatic Toxi ­
cology (eds J.G. Eaton, et al.), 78-115, ASTM STP 707, Phi ­
ladelphia.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1077
 
(70) Chiou C. T., Peters L. J., and Freed V. H., (1979), „A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic com ­
pounds“. Science, Vol. 206, 831-832.  
(71) Hassett J. J., Banwart W. I., Wood S. G. and Means J. C. 
(1981), „Sorption of/-Naphtol: implications concerning the li ­
mits of hydrophobic sorption“. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, 38-42.  
(72) Karickhoff S. W. (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. 
Chemosphere, Vol. 10(8), 833-846.  
(73) Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbi ­
cides et insecticides par le sol. Relation solubilite-reactivité“. 
Revue de l'Agric, 34 (4), 319-322.  
(74) Müller M., Kördel W. (1996), „Comparison of screening me ­
thods for the determination/estimation of adsorption coeffi ­
cients on soil“. Chemosphere, 32(12), 2493-2504.  
(75) Kördel W., Kotthoff G., Müller M. (1995). „HPLC — scree ­
ning method for the determination of the adsorption coefficient 
on soil — results of a ring test“. Chemosphere 30 (7), 1373- 1384.
 
(76) Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC — screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil — comparison of different stationary phases“. Che ­
mosphere 27 (12), 2341-2352.  
(77) Hance, R. J. (1967), „The Speed of Attainment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides“. Weed Re ­
search, Vol. 7, 29-36.  
(78) Koskinen W. C and Harper S. S. (1990), „The retention pro ­
cesses: mechanisms“ in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. h.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
 
(79) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F. and Enfield C. G. 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from 
agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide Was ­
tes, 297-325, ACS Symp. Ser, 259, American Chemical Socie ­
ty, Washington DC.  
(80) Giles C. H. (1970), „Interpretation and use of Sorption iso ­
therms“ in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograf No. 37, 14-32.
 
(81) Giles C. H., McEwan J. H., Nakhwa S.N. and Smith D. 
(1960), „Studies in adsorption: XI. A System of classification 
of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of 
adsorption mechanisms and in measurements of pesticides sur ­
face areas of soils“. J. Chem. Soc, 3973-93.  
(82) Calvet R., Terce M. and Arvien J. C. (1980), „Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caracteristiques 
générales de l'adsorption“. Ann. Agron. 31, 239-251.  
(83) Bedbur E. (1996), Anomalies in the Freundlich equation', Proc. 
COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.
 
(84) Guth, J. A., (1985), „Adsorption/desorption“, in Joint International 
Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Envi ­
ronmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.  
(85) Soil Texture Classification (US and FAO Systems): Weed Sci ­
ence, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26, 
305 (1962).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1078
 
Anlage 1  
Testplan
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1079
 
Anlage 2  
EINFLUSS DER GENAUIGKEIT DER ANALYSENMETHODE UND 
DER KONZENTRATIONSVERÄNDERUNG AUF DIE GENAUIGKEIT 
VON ADSORPTIONSERGEBNISSEN  
Wie die nachstehende Tabelle (84) verdeutlicht, führt dann, wenn die Differenz 
zwischen der Anfangsmasse (m  0 = 110 μg) und der Gleichgewichtsmasse 
(m aq ads ðeqÞ) der Testsubstanz sehr gering ist, eine Abweichung von 5 % bei der 
Messung der Gleichgewichtskonzentration zu einer Abweichung von 50 % bei der Berechnung des Gehalts der an Boden adsorbierten Substanz (
m s ads ðeqÞ) und 
von 52,4 % bei der Berechnung von K  d . 
Menge des Bodens m  Boden  = 10 g 
Volumen der Lösung V  0 = 100 cm  3 
m aq ads ðeqÞ 
(μg) C aq ads ðeqÞ 
(μg cm  -3 ) R m s ads ðeqÞä 
(μg) C s ads ðeqÞä 
(μg g 1 ) R‡ K  d * R‡  
FÜR A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg oder 
C 0 ¼ 1 100 μg=cm3 
100 1,000 wahrer 
Wert 10 1,00 wahrer 
Wert 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
FÜR A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg oder 
C 0 ¼ 1 100 μg=cm3 50,0 0,500 wahrer 
Wert 6,00 6,00 wahrer 
Wert 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 1,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
FÜR A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg oder 
C 0 ¼ 1 100 μg=cm3 1,100 0,011 wahrer 
Wert 108,9 10,89 wahrer 
Wert 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 9 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %  
Hierin bedeuten: 
äm s ads ðeqÞ = m 0 Ä m aq ads ðeqÞ; C s ads ðeqÞ ¼ h 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ i 
V 0 
m soil: Kd ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ V 0 
m soil 
m s ads ðeqÞ = Masse der Testsubstanz in der Bodenphase bei Gleichgewicht, μg; 
m aq ads ðeqÞ = Masse der Testsubstanz in der wässrigen Phase bei Gleichgewicht, μg; 
C s ads ðeqÞ = Gehalt der Testsubstanz in der Bodenphase bei Gleichgewicht, μg g  -1 ; 
C aq ads ðeqÞ = Massenkonzentration der Testsubstanz in der wässrigen Phase bei Gleichgewicht, μg cm  -3 ; 
R = Analysenfehler bei der Bestimmung der  m aq ads ðeqÞ; 
R‡ = rechnerische Abweichung als Folge des Analysenfehlers R.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1080
 
Anlage 3  
ABSCHÄTZUNGSVERFAHREN FÜR K  d 
1. Abschätzungsverfahren gestatten eine Vorhersage von K  d ausgehend von 
Korrelationen mit beispielsweise P  ow -Werten (12) (39) (63-68), Wasserlös ­
lichkeitsdaten (12) (19) (21) (39) (68-73) oder Polaritätsdaten, die mittels 
Anwendung von HPLC auf die entgegengesetzte Phase erhalten wurden 
(74-76). Wie aus den Tabellen 1 und 2 hervorgeht, ist der K  oc bzw. K  om 
der nach diesen Gleichungen berechnete und dann — indirekt — der K  d 
aus den Gleichungen:  
K oc ¼ K d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Das Konzept dieser Korrelationen stützt sich auf zwei Annahmen: (1) Der 
größte Einfluss auf die Adsorption einer Substanz geht von den organi ­
schen Substanzen des Bodens aus, und (2) die beteiligten Wechselbezie ­
hungen verlaufen überwiegend nichtpolar. Daraus folgt, dass diese Korre ­
lationen (1) nicht oder nur in gewissem Umfang auf polare Substanzen 
anwendbar sind und (2) nicht anwendbar sind, wenn der organische Sub ­
stanzgehalt des Bodens sehr klein ist (12). Darüber hinaus sind zwar zu ­
frieden stellende Korrelationen zwischen P  ow und Adsorption (19) fest ­
gestellt worden, doch für die Beziehung zwischen der Wasserlöslichkeit 
und dem Umfang der Adsorption ist dies nicht der Fall (19) (21): in diesem 
Punkt kommen die Studien zu äußerst widersprüchlichen Aussagen.  
3. Beispielhafte Korrelationen zwischen dem Adsorptionskoeffizienten und 
dem Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten sowie die Wasserlöslichkeit sind in Tabelle 1 bzw. 2 aufgeführt.
 
Tabelle 1.  
Beispielhafte Korrelationen zwischen dem Adsorptionsverteilungskoeffizienten und dem Oktanol-Wasser- 
Verteilungskoeffizienten; weitere Beispiele siehe (12) (68).  
Substanzen Korrelationen Verfasser  
Substituierte Harnstoffe log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Aromatische chlorierte Sub ­
stanzen log K  oc = - 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou  et al . (198 3) (6 5) 
Verschiedene Pestizide log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl und Mingelgrin (1984) (66) 
Aromatische Kohlenwasser ­
stoffe log K  oc = - 2,53 + 1,15 log P  ow Vowles und Mantoura (1987) (67)  
Tabelle 2.  
Beispielhafte Korrelationen zwischen dem Adsorptionsverteilungskoeffizienten und der Wasserlöslichkeit: 
weitere Beispiele siehe (68) (69).  
Verbindungen Korrelationen Verfasser  
Verschiedene Pestizide log K  om = 3,8 - 0,561 log S  w Gerstl und Mingelgrin (1984) (66) 
Aliphatische, aromatische 
chlorierte Substanzen log K  om = (4,040 +/- 0,038) - (0,557 
+/- 0,012) log S  w Chiou  et al . (1979) (70) 
a-Naphtol log K  oc = 4,273 - 0,686 log S  w Hasset et al. (1981) (71) 
Cyclische, aliphatische aro ­
matische Substanzen log K  oc = - 1,405 - 0,921 log S  w - 
0,00953 (mp–25) Karickhoff (1981) (72) 
Verschiedene Verbindungen log K  om = 2,75 - 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1081
 
Anlage 4  
BERECHNUNGEN ZUR FESTLEGUNG DER ZENTRIFUGATIONS ­
BEDINGUNGEN  
1. Die Zentrifugationszeit ergibt sich nach der folgenden Formel, wobei ku ­
gelförmige Partikel angenommen werden:  
t ¼ 9 
2 η 
ω 2 rp 2 ρ s Ä ρ aq Ä Ö " #  
lnðR b=R t Þ (1) 
Zur Vereinfachung sind alle Parameter in Nicht-SI-Einheiten beschrieben 
(g, cm).  
Hierin bedeuten:  
ω = die Drehzahl (= 2 π Upm/60), rad s  –1 ; 
rpm = Umdrehungen pro Minute;  
η = Viskosität der Lösung, g s  –1 cm –1 ; 
r p = Partikelradius, cm;  
ρ s = Lösungsdichte, g cm  -3 ; 
ρ aq = solution density, g cm  -3 ; 
R t = Abstand vom Zentrum des Zentrifugenrotors zum oberen Ende 
der Lösung im Zentrifugenglas, cm;  
R b = Abstand vom Zentrum des Zentrifugenrotors zum unteren Ende 
des Zentrifugenglases, cm;  
R b -R t = Länge des Boden-Lösungs-Gemischs im Zentrifugenrohr  
In der Praxis wird zur Gewährleistung einer vollständigen Trennung übli ­
cherweise das Doppelte der berechneten Zeiten angesetzt.  
2. Die Gleichung 1 kann noch weiter vereinfacht werden, wenn man die 
Viskosität ( η) und die Dichte ( ρ aq ) der Lösung gleich der Viskosität und 
der Dichte von Wasser bei 25  o C setzt. Daraus folgt η = 8,95 × 10  –3 g 
s –1 cm –1 und ρ aq = 1,0 g.cm  –3 . 
Daraus ergibt sich die Zentrifugationszeit nach folgender Gleichung (2):  
t ¼ 3:7 
rpmð Þ  2 · r p 2 ρ s Ä 1ð Þ  ln Rb 
Rt (2) 
3. Aus Gleichung 2 wird ersichtlich, dass für die Festlegung der Zentrifuga ­
tionsbedingungen, d. h. Zeit (t) und Geschwindigkeit (Upm), zwei Parame ­
ter von Bedeutung sind, um die Abtrennung von Partikeln mit einer be ­
stimmten Größe zu erreichen (in unserem Fall 0,1 um Radius); (1) die Dichte des Bodens und (2) die Länge des Gemischs im Zentrifugenglas (R
 b –R t ), d. h. der Abstand, den ein Bodenpartikel vom oberen Ende der 
Lösung zum unteren Ende des Glases abdeckt; offenkundig hängt bei ei ­
nem feststehenden Volumen die Länge des Gemischs im Glas vom Quadrat des Radius des Glases ab.
 
4. in Abb. 1 sind verschiedene Zentrifugationszeiten (t) in Abhängigkeit von 
der Zentrifugiergeschwindigkeit (Upm) für unterschiedliche Bodendichten (ρ
 s ) (Abb. 1a) und unterschiedliche Längen des Gemischs in den Zentrifu ­
gengläsern (Abb. 2a) dargestellt. Aus Abb. 1a geht der klare Einfluss der 
Bodendichte hervor. So beträgt die Zentrifugationszeit bei einer herkömm ­
lichen Zentrifugation von 3 000 Upm für 1,2 g cm  3 Bodendichte annähernd 
240 min, bei 2,0 g cm  3 hingegen nur 50 min. Ebenso lässt sich an Abb. 1b 
ablesen, dass die Zentrifugationszeit für eine Länge des Gemischs von 
10 cm etwa 50 min beträgt, bei einer Länge von 1 cm dagegen nur 7 min. In jedem Fall kommt es darauf an, ein optimales Verhältnis zwi ­
schen Zentrifugation, die die kleinstmögliche Länge erfordert, und einer 
einfachen Handhabung für den Experimentator bei der Abtrennung der 
Phase nach der Zentrifugation zu finden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1082
 
5. Darüber hinaus muss bei der Festlegung der Versuchsbedingungen für die 
Trennung von Boden/Lösung-Phasen vor allem das mögliche Vorhanden ­
sein einer dritten „Pseudophase“, der Kolloide, in Betracht gezogen werden. Diese Partikel, deren Größe unter 0,2 μm liegt, können einen erheblichen 
Einfluss auf den gesamten Adsorptionsmechanismus einer Substanz in einer 
Bodensuspension ausüben. Wird die Zentrifugation wie vorstehend be ­
schrieben durchgeführt, verbleiben Kolloide in der wässrigen Phase und werden gemeinsam mit der wässrigen Phase analysiert. Dadurch gehen die Informationen über ihren Einfluss verloren.
 
Verfügt das ausführende Labor über Ultrazentrifugier- oder Ultrafiltrierein ­
richtungen, könnte die Adsorption/Desorption einer Substanz in Boden 
eingehender untersucht werden, z. B. die Adsorption der Substanz an den Kolloiden. In diesem Fall sollte eine Ultrazentrifugation von 60 000 Upm/ ­
min bzw. eine Ultrafiltration mit einer Filterporosität von 100 000 Dalton 
zur Anwendung kommen, um die drei Phasen Boden, Kolloide und Lösung 
zu trennen. Das Testprotokoll sollte ebenfalls entsprechend modifiziert wer ­
den, damit alle drei Phasen einer Substanzanalyse unterzogen werden.
 
Abb. 1a.
  
Variationen der Zentrifugationszeit (t) in Abhängigkeit von der Zentrifu ­
giergeschwindigkeit (Upm) für unterschiedliche Bodendichten ( ρ s ). R  t = 
10 cm, R  b –R t = 10 cm, η = 8,95 × 10  –3 g s  –1 cm –1 und ρ aq = 
1,0 g cm  –3 und 25  o C. 
Abb. 1b.
  
Variationen der Zentrifugationszeit (t) in Abhängigkeit von der Zentrifugier ­
geschwindigkeit (Upm) für unterschiedliche Längen des Gemischs im Zentri ­
fugenglas (R  b –R t ) = L; R  t = 10 cm, η = 8,95 × 10  –3 g s –1 cm –1 , ρ aq = 
1,0 g cm  –3 at 25  o C und ρ s = 2,0 g cm  –3 . ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1083
 
Anlage 5  
BERECHNUNG VON ADSORPTION A ( %) UND DESORPTION D ( %)  
Die Zeitplanung des Ablaufs sieht wie folgt aus:
  
Für alle Berechnungen wird angenommen, dass die Testsubstanz stabil ist und 
nicht signifikant an den Behälterwänden adsorbiert.  
ADSORPTION A (A %)  
a) Gesamtbeprobungsmethode  
Der Adsorptionsanteil wird für jedes Reagenzglas (i) zu jedem Zeitpunkt 
(t i ) nach folgender Gleichung berechnet:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1) 
Die Tenne dieser Gleichung lassen sich wie folgt berechnen: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2) 
m s ads ðt i Þ ¼ m 0 Ä C aq ads ðt i Þ · V 0 (μg) (3) 
Hierin bedeuten:  
A t i = Adsorptionsanteil ( %) zum Zeitpunkt t  i ; 
m s ads ðt i Þ = Masse der Testsubstanz an Boden zum Zeitpunkt  t i , an dem 
die Analyse durchgeführt wird ( μg); 
m 0 = Masse Testsubstanz im Reagenzglas zu Beginn des Tests 
(μg): 
C 0 = Anfangsmassenkonzentration der Testlösung in Kontakt mit 
dem Boden ( μg cm  –3 ): ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1084
 
C aq ads ðt i Þ = Massenkonzentration der Substanz in der wässrigen Phase zur 
Zeit t  i , zu der die Analyse durchgeführt wird ( μg cm  –3 ); diese 
Konzentration wird analytisch unter Berücksichtigung der an ­
hand der Leerproben gewonnenen Werte bestimmt.  
V 0 = Anfangsvolumen der Testlösung in Kontakt mit dem 
Boden (cm  3 ). 
Die Werte des Adsorptionsanteils  A t i bzw. C aq ads ðt i Þ werden grafisch in 
Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen, und die Zeit, nach der das Sorpti ­
onsgleichgewicht erreicht ist, wird bestimmt. Beispiele für solche gra ­
fischen Darstellungen sind die Abb. 1 und 2.
  
Abb. 1.  
Grafische Darstellung eines Adsorptionsgleichgewichts
  
Abb. 2.  
Massenkonzentration der Testsubstanz in der wässrigen Phase (C  aq ) in 
Abhängigkeit von der Zeit  
(1) Gleichungen sowohl auf die direkte als auch auf die indirekte Methode 
anwendbar. Alle anderen Gleichungen gelten nur für die indirekte Methode.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1085
 
b) Aliquotenbeprobungsmethode  
Bei den folgenden Gleichungen wird in Rechnung gestellt, dass die Ad ­
sorptionsprozedur durch Messungen der Testsubstanz in kleinen Aliquoten der wässrigen Phase in bestimmten Zeitintervallen ausgeführt wird.
 
— Während jedes Zeitintervalls wird die Menge der am Boden adsorbier ­
ten Substanz wie folgt berechnet:  
— für das erste Zeitintervall Δt i = t i - t 0 
m s ads ðΔt 1 Þ ¼ m 0 Ä m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î (4) 
— für das zweite Zeitintervall Δt 2 = t 2 - t 1 
m s ads ðΔt 2 Þ ¼ m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
Ä m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î (5) 
— für das dritte Zeitintervall Δt 3 = t 3 - t 2 
m s ads ðΔt 3 Þ ¼ m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt 3 Þ · Í 
V 0 Ä 2 · v a A 
v a A Î (6) 
— für das n  te Zeitintervall Δt n = t n - t n-1 
m s ads ðΔt n Þ ¼ m m ads ðt nÄ1 Þ · Í 
V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt n Þ · V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v a A Ê Ì  
v a A 0 
@ 1 
A (7) 
— Der Adsorptionsanteil in jedem Zeitintervall,  A Δt i wird nach folgender 
Gleichung berechnet:  
A Δt i ¼ m s ads ðΔt i Þ 
m 0 · 100 ð%Þ (8) 
wohingegen der Adsorptionsanteil ( ðA t i Þ) zu einem Zeitpunkt t  i nach 
folgender Gleichung erhalten wird:  
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) 
Die Werte der Adsorption  A t i bzw. A Δt i (in Bezug auf die Anforde ­
rungen der Untersuchung) werden grafisch in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen, und die Zeit, nach der das Sorptionsgleichgewicht 
eingestellt ist, wird bestimmt.
 
— Nach der Gleichgewichtszeit t  eq : 
— ist die Masse der am Boden adsorbierten Testsubstanz:  
m s ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10) ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1086
 
— ist die Masse der Testsubstanz in der Lösung:  
m aq ads ðeqÞ ¼ m 0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) 
— und ist der Adsorptionsanteil bei Gleichgewicht:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (12) 
Die vorstehend verwendeten Parameter werden wie folgt definiert:  
m s ads ðΔt 1 Þ; m s ads ðΔt 2 Þ; :::; m s ads ðΔt n Þ = Masse der am Boden während der 
Zeitintervalle Δt 1 , Δt 2 , ..., Δt n ad­
sorbierten Substanz ( μg); 
m m ads ðt 1 Þ; m m ads ðt 2 Þ; :::; m n ads ðt n Þ = Masse der in einer Aliquote  v a A 
zu den Zeitpunkten t  1 , t 2 , ..., t  n 
gemessenen Substanz ( μg); 
m s ads ðeqÞ = Masse der am Boden bei Adsorp ­
tionsgleichgewicht adsorbierten 
Substanz ( μg); 
m aq ads ðeqÞ = Masse der Substanz in der Lösung 
bei Adsorptionsgleichgewicht ( μg): 
v a A = Volumen der Aliquote, in der die 
Testsubstanz gemessen wird (cm  3 ); 
A Δt i = Adsorptionsanteil bei Adsorptions ­
gleichgewicht ( %).  
A eq = entsprechender Adsorptionsanteil 
in einem Zeitintervall Δt i ( %);  
(1) Gleichungen sowohl auf die direkte als auch auf die indirekte Methode 
anwendbar. Alle anderen Gleichungen gelten nur für die indirekte Methode.  
DESORPTION D ( %)  
Als die Zeit t  0 , bei der das Desorptionskinetikexperiment beginnt, gilt der Augen ­
blick, in dem das höchste erhaltene Volumen der Testsubstanzlösung (nach Ein ­
stellen des Adsorptionsgleichgewichts) durch ein identisches Volumen 0,01 M 
CaCl  2 -Lösung ersetzt wird.  
a) Gesamtbeprobungsmethode  
Zu einem Zeitpunkt t  i wird die Masse der Testsubstanz in der wässrigen 
Phase gemessen, die aus dem Glas i (  V  i 
r Ê Ì  
) abgenommen wurde, und die 
desorbierte Masse wird nach folgender Gleichung berechnet:  
m aq des ðt i Þ ¼ m m des ðt i Þ · Í 
V 0 
v r i Î 
Ä m aq A (13) 
ei Desorptionsgleichgewicht ist t  i = t eq und folglich ist  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ 
Die Masse der während eines Zeitintervalls ( Δt i ) desorbierten Testsubstanz 
wird durch folgende Gleichung erhalten:  
m aq des ðΔt i Þ ¼ m aq des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m aq des ðjÞ (14) 
Die Berechnung des Desorptionsanteils erfolgt:  
zu einem Zeitpunkt t  i aus der Gleichung:  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1087
 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
und während eines Zeitintervalls ( Δt i ) aus der Gleichung:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
Hierin bedeuten:  
D t i = Desorptionsanteil zu einem Zeitpunkt t  i ( %);  
D Δt i = Desorptionsanteil entsprechend einem Zeitintervall Δt i ( %);  
m aq des ðt 1 Þ = Masse der zu einem Zeitpunkt t  i desorbierten Testsubstanz 
(μg); 
m aq des ðΔt 1 Þ = Masse der während eines Zeitintervalls Δt i desorbierten 
Testsubstanz ( μg): 
m m des ðt i Þ = Masse der zu einem Zeitpunkt t  i in einem Lösungsvolumen  
V r i analytisch gemessenen Testsubstanz, die zur Analyse 
abgenommen wird ( μg); 
m aq A = Masse der nach Adsorptionsgleichgewichtseinstellung in ­
folge unvollständigen Volumenaustauschs verbleibenden Testsubstanz ( μg);
 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (17) 
m aq ads ðeqÞ = Masse der Testsubstanz in der Lösung bei Adsorptions ­
gleichgewicht ( μg); 
V R = Volumen des nach Erreichen des Adsorptionsgleichge ­
wichts aus dem Glas abgenommenen und durch ein iden ­
tisches Volumen 0,01 M CaCl  2 -Lösung ersetzten Überstan ­
des (cm  3 ); 
V r i = Volumen der im Desorptionskinetikversuch aus dem 
Glas (i) zur Messung der Testsubstanz abgenommenen Lösung (cm
 3 ). 
Die Desorptionswerte  D t i bzw.  D Δt i (gemäß den Anforderungen der Unter ­
suchung) werden grafisch in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen, und 
die Zeit, nach der das Desorptionsgleichgewicht erreicht wird, wird be ­
stimmt.  
b) Aliquotenbeprobungsmethode  
Bei den nachstehenden Gleichungen wird in Rechnung gestellt, dass die 
zuvor ausgeführte Adsorptionsprozedur mittels Messung der Testsubstanz 
in kleinen Aliquoten  v  a A Ê Ì  
der wässrigen Phase (Aliquotenbeprobungs ­
methode siehe 1.9 „Durchführung des Tests“) ausgeführt wurde. Es wird angenommen, dass a) das Volumen des aus dem Glas nach dem Adsorp ­
tionskinetikversuch abgenommenen Überstands durch ein identisches Vo ­
lumen 0,01 M CaCl
 2 -Lösung (V  R ) ersetzt wurde, und dass b) das Gesamt ­
volumen der wässrigen Phase in Kontakt mit dem Boden (V  T ) während des 
Desorptionskinetikversuchs konstant bleibt und nach folgender Gleichung erhalten wird:
 
V T ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1088
 
Zu einem Zeitpunkt t  i : 
— Die Masse der Testsubstanz wird in einer kleinen Aliquote  v  a D Ê Ì  
ge­
messen, und die desorbierte Masse wird nach folgender Gleichung be ­
rechnet:  
m aq des ðt i Þ ¼ m m des ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m aq A · V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— Bei Desorptionsgleichgewicht ist t  i = t eq und folglich ist  m aq des ðt i Þ = 
m aq des ðeqÞ. 
— Der Desorptionsanteil  D t i wird nach folgender Gleichung berechnet:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
In einem Zeitintervall ( Δt i ): 
Während jedes Zeitintervalls wird die Menge der desorbierten Substanz wie 
folgt berechnet:  
— für das erste Zeitintervall Δt 1 = t 1 -t 0 
m aq des ðΔt 1 Þ ¼ m m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m aq A and m  s des ðt 1 Þ ¼ m s aq ðeqÞ Ä m aq des ðΔt 1 Þ (21) 
— für das zweite Zeitintervall Δt 2 = t 2 -t 1 
m aq des ðΔt 2 Þ ¼ m m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m aq des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m aq A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A und 
m s des ðt 2 Þ ¼ m s ads ðeqÞ Ä m  aq des ðΔt 1 Þ þ m aq des ðΔt 2 Þ h i  (22) 
— für das n  th Zeitintervall Δt n = t n -t n-1 
m aq des ðΔt n Þ ¼ Ï 
m m des ðt n Þ · V T 
v a D Í Î 
Ä m aq A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m aq des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
und 
m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m aq des ðΔt i Þ (23) 
Abschließend wird der Desorptionsanteil für jedes Zeitintervall,  D Δt i , nach 
folgender Gleichung berechnet:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
wobei der Desorptionsanteil  D  t i zu einem Zeitpunkt t  i durch folgende 
Gleichung erhalten wird:  
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i m aq des ðjÞ 
m s ads ðeqÞ · 100 ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1089
 
abei werden die vorstehend eingesetzten Parameter wie folgt definiert:  
m s des ðΔt 1 Þ, m s des ðΔt 2 Þ,... , m s des ðΔt n Þ = Masse der nach den Zeitinterval ­
len Δt i , Δt 2 , …, Δt n am Boden 
adsorbiert bleibenden Substanz (μg);
 
m aq des ðΔt 1 Þ, m aq des ðΔt 2 Þ,... , m aq des ðΔt n Þ = Masse der während der Zeitinter ­
valle Δt 1 Δt 2 , ... bzw. Δt n desor­
bierten Substanz ( μg); 
m m des ðt 1 Þ, m m des ðt 2 Þ,... , m m des ðt n Þ = Masse der in einer Aliquote 
(ðv D 
a Þ zu den Zeitpunkten t  1 , t 2 , 
... bzw. t  n , gemessenen Substanz 
(μg); 
V T = Gesamtvolumen der wässrigen 
Phase in Kontakt mit dem Boden während des nach der Aliquoten ­
beprobungsmethode durchgeführ ­
ten Desorptionskinetikversuchs (cm
 3 ); 
m A 
aq = Masse der nach Adsorptions ­
gleichgewichtseinstellung infolge 
unvollständigen Volumenaus ­
tauschs verbliebenen Testsub ­
stanz (μg); 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m
 ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = Volumen des aus dem Glas nach 
Einstellen des Adsorptionsgleich ­
gewichts abgenommenen und 
durch das identische Volumen 
0,01 M CaCl  2 -Lösung ersetzten 
Überstands (cm  3 ); 
v D 
a = Volumen der während des nach 
der Aliquotenbeprobungsmethode 
durchgeführten Desorptionskine ­
tikversuchs als Probe zu Ana ­
lysenzwecken aus dem Glas ab ­
genommenen Aliquote (i) (cm  3 ); 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1090
 
Anlage 6  
ADSORPTION-DESORPTION IN BÖDEN: DATENBERICHTSFORMULARE  
Getestete Substanz:  
Getesteter Boden:  
Trockenmassegehalt des Bodens (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . %  
Temperatur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Eignung der Analysenmethode  
Bodeneinwaage g 
Boden: Trockenmasse g 
Volumen CaCl  2 -Lösung cm  3 
Nennkonzentration fertige Lösung μg cm–  3 
Analysenkonzentration fertige Lösung μg cm–  3 
Prinzip der zugrunde liegenden Analysenmethode:  
Kalibrierung der Analysenmethode:  
Getestete Substanz:  
Getesteter Boden:  
Trockenmassegehalt des Bodens (105  o C, 12h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Zugrundeliegende Analysenmethodik: Indirekt  □ Gesamt  □ Aliquoten  □ 
Direkt □ 
Adsorptionstest: Testproben  
Symbol Einheiten Gleichgewichts ­
einstellungszeit Gleichgewichts ­
einstellungszeit Gleichgewichts ­
einstellungszeit Gleichgewichts ­
einstellungszeit  
Glas Nr. 
Bodeneinwaage — g Boden: Trockenmasse m
 Boden  g 
Wasservolumen in Bodenein ­
waage (rechnerisch) V ws cm 3 
Volumen 0,01 M CaCl  2 -Lösung 
zur Gleichgewichtseinstellung 
des Bodens cm 3 
Volumen Vorratslösung cm  3 
Gesamtvolumen wässrige Phase 
in Kontakt mit Boden V 0 cm 3 
Anfangskonzentration Testlö ­
sung C 0 μg cm  -3 
Masse Testsubstanz bei Beginn 
des Tests m 0 μg ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1091
 
Symbol Einheiten Gleichgewichts ­
einstellungszeit Gleichgewichts ­
einstellungszeit Gleichgewichts ­
einstellungszeit Gleichgewichts ­
einstellungszeit  
Nach Schütteln und Zentrifugieren  
INDIREKTE METHODE 
Gesamtbeprobungsmethode 
Konzentration Testsubstanz 
wässrige Phase, Leerkorrektur berücksichtigt
 C aq ads ðt i Þ μg cm  -3 
Aliquotenbeprobungsmethode 
Gemessene Masse Testsubstanz 
in der Aliquote V  a A m m ads ðt i Þ μg 
DIREKTMETHODE 
Masse der an Boden adsorbier ­
ten Testsubstanz  m s ads ðt i Þ μg 
Adsorptionsberechnung 
Adsorption  A  t i % 
A Δt i % 
Mittel 
Adsorptionskoeffizient K  d cm 3 g– 1 
Mittel 
Adsorptionskoeffizient K  oc cm 3 g– 1 
Mittel  
Getestete Substanz:  
Getesteter Boden:  
Trockenmassegehalt des Bodens (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . %  
Temperatur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adsorptionstest: Leer- und Kontrollwerte  
Symbol Einheiten Leerwert Leerwert Kontrollwert  
Glas Nr. 
Bodeneinwaage g 0 0 Wassermenge in Bodenein ­
waage (rechnerisch) cm
 3 — — 
Volumen zugesetzter 0,01 M 
CaCl  2 -Lösung cm 3 
Volumen der zugesetzten Vor ­
ratslösung der Testsubstanz cm 3 0 0 
Gesamtvolumen wässriger Phase 
(rechnerisch) cm 3 — —  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1092
 
Symbol Einheiten Leerwert Leerwert Kontrollwert  
Anfangskonzentration der Test ­
substanz in wässriger Phase μg cm–  3 
Nach Schütteln und Zentrifugieren  
Konzentration in wässriger 
Phase μg cm–  3 
Hinweis: Falls erforderlich, können weitere Spalten angefügt werden.  
Getestete Substanz:  
Getesteter Boden:  
Trockenmassegehalt des Bodens (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . %  
Temperatur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Massenbilanz  
Symbol Einheiten  
Glas Nr. 
Bodeneinwaage — g Boden: Trockenmasse m
 Boden  g 
Wasservolumen in Bodeneinwaage 
(rechnerisch) V ws ml 
Volumen 0,01 M CaCl  2 -Lösung zur 
Gleichgewichtseinstellung des Bodens ml 
Volumen der Vorratslösung cm  3 
Gesamtvolumen wässrige Phase in Kon ­
takt mit Boden v 0 cm 3 
Anfangskonzentration der Testlösung C  0 μg cm–  3 
Gleichgewichtseinstellungszeit — h  
Nach Schütteln und Zentrifugieren  
Testsubstanz wässrige Phase bei Ad ­
sorptionsgleichgewicht, Leerkorrektur 
berücksichtigt C aq ads ðeqÞ μg cm–  3 
Gleichgewichtseinstellungszeit t  eq h 
Erste Verdünnung mit Lösungsmittel 
Abgenommenes Volumen wässrige 
Phase V rec cm 3 
Zugesetztes Volumen Lösungsmittel ΔV cm  3 
Erste Extraktion mit Lösungsmittel 
Signalanalysiert in Lösungsmittel S  E1 var. 
Konzentration Testsubstanz in Lösungs ­
mittel C E1 μg cm–  3 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1093
 
Symbol Einheiten  
Masse der aus Boden und von Gefäß ­
wänden extrahierten Substanz m E1 μg 
Zweite Verdünnung mit Lösungsmittel 
Abgenommenes Volumen Lösungsmittel ΔV S cm 3 
Zugesetztes Volumen Lösungsmittel ΔV' cm  3 
Zweite Extraktion mit Lösungsmittel 
Signal analysiert in Lösungsmittelphase S  E2 var. 
Konzentration Testsubstanz in Lösungs ­
mittel C E2 μg cm–  3 
Masse der aus Boden und von Gefäß ­
wänden extrahierten Substanz m E2 μg 
Gesamtmasse Testsubstanz extrahiert in 
zwei Schritten m E μg 
Massenbilanz MB %  
Getestete Substanz:  
Getesteter Boden:  
Trockenmassegehalt des Bodens (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . %  
Temperatur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adsorptionsisothermen  
Symbol Einheiten  
Glas Nr. 
Bodeneinwaage — g 
Boden: Trockenmasse E g 
Wasservolumen in Bodenein ­
waage (rechnerisch) V WS cm 3 
Volumen 0,01 M CaCl  2 -Lösung 
zur Gleichgewichtseinstellung 
des Bodens cm 3 
Volumen zugesetzter Vorrats ­
lösung cm 3 
Gesamtvolumen wässrige Phase 
in Kontakt mit Boden (rech ­
nerisch) V 0 cm 3 
Konzentration Lösung C  0 μg cm  -3 
Gleichgewichtseinstellungszeit — h  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1094
 
Symbol Einheiten  
Nach Schütteln und Zentrifugieren  
Konzentration Substanz wäss ­
rige Phase, Leerkorrektur be ­
rücksichtigt C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Temperatur  o C 
Adsorbierte Masse je Einheit 
Boden  C s ads ðeqÞ μg g  -1 
Regressionsanalyse:  
Wert von: K  F ads : 
Wert von l/n:  
Regressionskoeffizient r  2 : 
Getestete Substanz:  
Getesteter Boden:  
Trockenmassegehalt des Bodens (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . %  
Teperatur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Zugrunde liegende Analysenmethodik: Indirekt  □ Gesamt  □ Aliquoten  □ 
Desorptionstest  
Symbol Einheiten Zeitinter­
vall Zeitinter­
vall Zeitinter­
vall Zeitinter­
vall 
Glas Nr. aus dem Adsorptionsschritt 
Masse von an Boden bei Adsorptions ­
gleichgewicht adsorbierter Substanz  m s ads ðeqÞ μg 
Abgenommenes Volumen wässrige Pha ­
se, ersetzt durch 0,01 M CaCl  2 V R cm 3 
Gesamtvolumen wässrige 
Phase in Kontakt mit Bo ­
den GM V  0 cm 3 
AM V  T cm 3 
Masse der nach Adsorptionsgleichge ­
wichtseinstellung infolge unvollständigen 
Volumenaustauschs verbliebenen Test ­
substanz  m aq A μg 
Desorptionskinetik  
Gemessene Masse von aus Boden zur 
Zeit t  i desorbierter Substanz  m m ads ðt i Þ μg 
Volumen der abgenom ­
menen Lösung aus dem Glas (i) zur Messung der 
Testsubstanz GM V
 f i cm 3 
AM v  a D cm 3 
Masse der aus Boden zur Zeit t  i desor­
bierten Substanz (rechnerisch)  m aq ads ðt i Þ μg 
Masse der aus Boden im Zeitintervall Δt i 
desorbierten Substanz (rechnerisch)  m aq ads ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1095
 
Symbol Einheiten Zeitinter­
vall Zeitinter­
vall Zeitinter­
vall Zeitinter­
vall 
Desorptionsanteil  
Desorption zur Zeit t  i D ti % 
Desortion im Zeitintervall Δt i D Δt i % 
Scheindesorptionskoeffizient K  des 
GM: Gesamtbeprobungsmethode  
AM: Aliquotenbeprobungsmethode  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1096
 
C.19.  SCHÄTZUNG DES ADSORPTIONSKOEFFIZIENTEN (K  oc ) IM 
BODEN UND IN KLÄRSCHLAMM MITTELS DER 
HOCHDRUCK-FLÜSSIGCHROMATOGRAFIE (HPLC)  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht der OECD TG121 (2000).  
1.1. EINLEITUNG  
Das Sorptionsverhalten von Stoffen in Böden oder Klärschlämmen 
kann anhand von Parametern beschrieben werden, die experimentell mittels der Testmethode C.18 bestimmt werden. Ein wichtiger Para ­
meter ist der Adsorptionskoeffizient, der als das Verhältnis zwischen 
der Konzentration des Stoffs im Boden/Klärschlamm und der Kon ­
zentration des Stoffs in der wässrigen Phase im Adsorptionsgleich ­
gewicht definiert wird. Der aufgrund des Gehalts des Bodens an 
organischem Kohlenstoff genormte Adsorptionskoeffizient, K
 oc , ist 
ein nützlicher Indikator für die Fähigkeit eines chemischen Stoffs zur Bindung an organischen Stoff im Boden oder Klärschlamm und gestattet Vergleiche zwischen unterschiedlichen Chemikalien. 
Dieser Parameter kann durch Korrelation mit der Wasserlöslichkeit 
und dem Verteilungskoeffizienten n-Oktanol/Wasser geschätzt wer ­
den (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
Die in diesem Test beschriebene Versuchsmethode wendet für die 
Schätzung des Adsorptionskoeffizienten K  oc im Boden und in Klär ­
schlamm die HPLC an (8). Die Schätzwerte sind verlässlicher als die 
der QSAR-Berechnungen (9). Als Schätzmethode kann sie die in der Testmethode C.18 verwendeten  Batch equilibrium -Experimente nicht 
vollständig ersetzen. Jedoch kann der geschätzte K
 oc für die Auswahl 
geeigneter Testparameter für Adsorptions-/Desorptionsstudien gemäß 
der Testmethode C.18 durch Berechnung von K  d (Verteilungskoef ­
fizient) oder K  f (Adsorptionskoeffizient nach Freundlich) nach der 
Gleichung 3 (siehe 1.2) nützlich sein.  
1.2. DEFINITIONEN  
K d : Der Verteilungskoeffizient Feststoff/Wasser wird als das Ver ­
hältnis der Gleichgewichtskonzentrationen C einer gelösten Testsub ­
stanz in einem zweiphasigen System, das aus einem Sorptionsmittel (Boden oder Klärschlamm) und einer wässrigen Phase besteht, de ­
finiert; er ist eine reine Zahl, wenn Konzentrationen in beiden Phasen 
in Gewicht/Gewicht ausgedrückt sind. Wird die Konzentration in der wässrigen Phase in Gewicht/Volumen ausgedrückt, sind die Einhei ­
ten ml· g
 –1 . K d kann je nach den Eigenschaften des Sorptionsmittels 
unterschiedlich und auch konzentrationsabhängig sein.  
K d ¼ C Boden 
C aq oder  C Klärschlamm  
C aq (1) 
dabei ist:  
C Boden  = Konzentration der Testsubstanz im Boden im 
Gleichgewichtszustand ( μg· g –1 ) 
C Klärschlamm  = Konzentration der Testsubstanz im Klärschlamm 
im Gleichgewichtszustand ( μg· g –1 ) 
C aq = Konzentration der Testsubstanz in der wässrigen 
Phase im Gleichgewichtszustand ( μg· g  –1 , 
μg· ml  –1 ). ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1097
 
K f : Der Adsorptionskoeffizient nach Freundlich wird definiert als die 
Konzentration der Testsubstanz im Boden oder im Klärschlamm 
(x/m), wenn die Gleichgewichtskonzentration C  aq in der wässrigen 
Phase gleich eins ist; er wird in μg· g –1 Sorptionsmittel ausgedrückt. 
Sein Wert kann je nach den Eigenschaften des Sorptionsmittels un ­
terschiedlich sein.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n ·logC  aq (2) 
dabei ist:  
x/m = die im Gleichgewichtszustand an eine Menge Sorptionsmit ­
tel m (g) adsorbierte Menge der Testsubstanz x ( μg) 
l/n = Neigung der Adsorptionsisotherme nach Freundlich  
C aq = Konzentration der Testsubstanz in wässriger Phase im 
Gleichgewichtszustand ( μg ml  –1 ) 
At C aq ¼ 1; logK  f ¼ log x 
m 
K oc : ist der aufgrund des organischen Kohlenstoffgehalts (f  oc ) eines 
Sorptionsmittels genormte Verteilungskoeffizient (K  d ) oder Adsorp ­
tionskoffizient nach Freundlich (K  f ); dieser Koeffizient ist insbeson ­
dere für nicht ionisierte Chemikalien ein ziemlich genauer Indikator für den Grad der Adsorption eines Stoffes an das Sorptionsmittel und 
ermöglicht Vergleiche zwischen verschiedenen Chemikalien. Je nach 
den Messgrößen von K
 d und K  f kann K  oc eine reine Zahl sein oder 
in ml g  –1 oder μg g  –1 organische Stoffe ausgedrückt werden.  
Koc ¼ Kd 
foc ðdimensionlos oder ml ·g Ä1 Þoder Kf 
foc ðμg·g Ä1 Þ (3) 
Das Verhältnis zwischen K  oc und K  d ist nicht immer linear, daher 
können K  oc -Werte auch je nach Bodentyp variieren, doch ist ihre 
Variabilität im Vergleich zu den K  d - oder K  f -Werten viel geringer.  
Der Adsorptionskoeffizient (K  oc ) wird von dem Kapazitätsfaktor (k') 
mittels einer Eichkurve log k'/log K  oc der ausgewählten Referenz ­
verbindungen hergeleitet.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
dabei ist:  
t R = HPLC-Retentionszeit der Test- und Referenzsubstanz (Minu ­
ten) 
t 0 = HPLC-Totzeit (Minuten) (siehe Abschnitt 1.8.2).  
POW : Der Verteilungskoeffizient Oktanol/Wasser wird definiert als 
das Verhältnis der Konzentrationen gelöster Stoffe in n-Oktanol und 
Wasser; er ist eine reine Zahl.  
Pow ¼ Coctanol 
Caq ð¼KowÞ (5) 
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Die Strukturformel, die Reinheit und die Dissoziationskonstante (so ­
fern zutreffend) sollten vor Anwendung der Methode bekannt sein. Informationen über die Löslichkeit in Wasser und organischen Löse ­
mitteln, über den Trennungskoeffizienten Oktanol/Wasser und über 
Hydrolyse-Merkmale sind nützlich.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1098
 
Um die gemessenen HPLC-Retentionsdaten einer Testsubstanz mit 
ihrem Adsorptionskoeffizienten K  oc zu korrelieren, muss eine Eich ­
kurve log K  oc /log k' erstellt werden. Mindestens sechs Referenz ­
punkte sollten verwendet werden, davon zumindest einer über und einer unter dem erwarteten Wert der Testsubstanz. Die Genauigkeit 
der Methode wird erheblich verbessert, wenn Referenzsubstanzen 
verwendet werden, die von der Struktur her mit der Testsubstanz verwandt sind. Liegen derartige Daten nicht vor, muss der Anwender die geeigneten Eichsubstanzen selbst auswählen. In diesem Fall 
sollte eine allgemeinere Reihe von strukturell heterogenen Stoffen 
gewählt werden. Empfohlene Referenzsubstanzen und ihre K
 oc - 
Werte sind in den Tabellen 1 und 3 der Anlage aufgelistet. Die Wahl anderer Eichsubstanzen ist zu begründen.
 
1.4. PRINZIP DER TESTMETHODE  
Die HPLC wird auf Analysesäulen durchgeführt, die mit im Handel 
erhältlicher Cyanopropyl-Festphase mit lipophilen und polaren An ­
teilen gefüllt sind. Ferner wird eine gemäßigt polare stationäre Phase auf der Grundlage einer Silica-Matrix verwendet: 
— O — Si — CH
 2 — CH  2 — CH  2 — CN 
Silica nicht-polarer Spacer polarer Anteil  
Das Prinzip der Testmethode ist ähnlich wie bei der Testmethode 
A.8 (Verteilungskoeffizient, HPLC-Methode). Während die Testsub ­
stanz die Säule mit der mobilen Phase passiert, steht die Testsubstanz zu der stationären Phase in einer Wechselwirkung. Durch die Tren ­
nung zwischen der mobilen und der stationären Phase wird die Test ­
substanz verzögert. Die Ambivalenz der stationären Phase mit pola ­
ren und nicht polaren Verbindungsstellen ermöglicht eine ähnliche 
Wechselwirkung zwischen polaren und nicht polaren Gruppen eines 
Moleküls wie bei organischen Stoffen in Boden- oder Klärschlamm- Matrizen. Dies ermöglicht die Feststellung des Verhältnisses zwi ­
schen der Retentionszeit auf der Säule und dem Koeffizienten der 
Adsorption durch organischen Stoff.
 
Der pH-Wert hat insbesondere bei polaren Substanzen einen signifi ­
kanten Einfluss auf das Sorptionsverhalten. Bei landwirtschaftlichen Böden oder Behältern von Klärschlammbehandlungsanlagen schwankt der pH-Wert normalerweise zwischen 5,5 und 7,5. Für 
ionisierbare Stoffe sind zwei Tests mit sowohl ionisierten als auch 
nicht ionisierten Formen in geeigneten Pufferlösungen durchzufüh ­
ren, jedoch nur in Fällen, in denen zumindest 10 % der Testverbin ­
dung bei pH-Werten zwischen 5,5 und 7,5 dissoziiert vorliegen.
 
Da die Bewertung ausschließlich aufgrund der Relation zwischen der 
Retention in der HPLC-Säule und dem Adsorptionskoeffizienten er ­
folgt, ist keine quantitative Analysemethode, sondern nur eine Be ­
stimmung der Retentionszeit erforderlich. Sofern eine Reihe geeig ­
neter Referenzsubstanzen zur Verfügung stehen und die Versuche 
unter Standardbedingungen durchgeführt werden können, bietet die 
Methode einen schnellen und wirksamen Weg zur Schätzung des Adsorptionskoeffizienten K
 oc . 
1.5. ANWENDBARKEIT DES TESTS  
Die HPLC-Methode ist auf (markierte oder nicht markierte) Che ­
mikalien anwendbar, für die ein geeignetes Detektionssystem (z. B. 
Spektrofotometer, Radioaktivitätsanzeiger) zur Verfügung steht und 
die für die Dauer des Tests stabil genug sind. Die Methode kann insbesondere für Chemikalien brauchbar sein, deren Untersuchung in anderen Versuchssystemen schwierig ist (d. h. flüchtige Stoffe; Stof ­
fe, die in Wasser in einer analytisch messbaren Konzentration nicht 
löslich sind; Stoffe mit einer starken Affinität gegenüber der Ober ­
fläche von Inkubationssystemen). Die Methode kann auf Mischungen angewendet werden, die nicht aufgelöste Elutionsbänder ergeben. In 
einem solchen Fall sind die Ober- und Untergrenzen der log K
 oc - 
Werte der Verbindungen der Testmischung anzugeben.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1099
 
Zwar können Unreinheiten zuweilen zu Problemen bei der Interpre ­
tation der HPLC-Ergebnisse führen, doch sind sie von geringerer 
Bedeutung, solange die Testsubstanz auf analytischem Wege identi ­
fiziert und von den Unreinheiten getrennt werden kann.  
Die Methode ist mit den in Tabelle 1 der Anlage aufgelisteten Stof ­
fen validiert worden und wurde auch auf verschiedene andere Che ­
mikalien angewandt, die zu den folgenden Chemikalienklassen ge ­
hören:  
— aromatische Amine (z. B. Trifluralin, 4-Chloroanilin, 3,5-Dini ­
troanilin, 4-Methylanilin, N-Methylanilin, 1-Naphthylamin;  
— aromatische Carbonsäureester (z. B. Benzoesäuremethylester, 
3,5-Dinitrobenzoesäureethylester);  
— aromatische Kohlenwasserstoffe (z. B. Toluol, Xylol, Ethylben ­
zol, Nitrobenzol);  
— Aryloxyphenoxypropionsäureester (z. B. Diclofop-methyl, Feno ­
xaprop-ethyl, Fenoxaprop-P-ethyl);  
— Benzimidazol- und Imidazol-Fungizide (z. B. Carbendazim, Fu ­
beridazol, Triazoxid);  
— Carbonsäureamide (z. B. 2-Chlorbenzamid, N,N-Dimethylben ­
zamid, 3,5-Dinitrobenzamid, N-Methylbenzamid, 2-Nitrobenzam ­
id, 3-Nitrobenzamid);  
— Chlorkohlenwasserstoffe (z. B. Endosulfan, DDT, Hexachlorben ­
zol, Quintozen, 1,2,3-Trichlorbenzol);  
— phosphororganische Insektizide (z. B. Azinphos-methyl, Disulfo ­
ton, Fenamiphos. Isofenphos, Pyrazophos, Sulprofos, Triazo ­
phos);  
— Phenole (z. B. Phenol, 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol, Penta ­
chlorphenol, 2,4,6-Trichlorphenol, 1-Naphthol):  
— Phenylharnstoffderivative (z. B. Isoproturon, Monolinuron, Pen ­
cycuron);  
— Pigmentfarbstoffe (z. B. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct 
Red 81);  
— polyaromatische Kohlenwasserstoffe (z. B. Acenaphthen, Naph ­
thalin);  
— 1,3,5-Triazin-Herbizide (z. B. Prometryn, Propazin, Simazin, Ter ­
butryn);  
— Triazolderivate (z. B. Tebuconazol, Triadimefon, Tradimenol, 
Triapenthenol).  
Die Methode ist nicht auf Stoffe anwendbar, die entweder mit dem 
Eluenten oder der stationären Phase reagieren. Ferner ist sie nicht auf 
Stoffe anwendbar, die in einer spezifischen Wechselwirkung mit anorganischen Verbindungen stehen (z. B. Bildung von Clusterkom ­
plexen mit Tonmineralien). Es ist möglich, dass sich die Methode 
nicht für oberflächenaktive Stoffe, anorganische Verbindungen und 
gemäßigt oder stark organische Säuren und Basen eignet. Log K
 oc - 
Werte im Bereich 1,5 bis 5,0 können bestimmt werden. Ionisierbare Stoffe müssen mittels einer gepufferten mobilen Phase gemessen 
werden, doch ist darauf zu achten, dass eine Präzipitation von Puffer ­
komponenten oder der Testsubstanz vermieden wird.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1100
 
1.6. QUALITÄTSKRITERIEN  
1.6.1.  Genauigkeit  
Normalerweise kann der Adsorptionskoeffizient einer Testsubstanz 
auf +/– 0,5 log. Einheiten des Werts geschätzt werden, der nach 
der Batch equilibrium -Methode (siehe Tabelle 1 der Anlage) be ­
stimmt wird. Größere Genauigkeit kann erzielt werden, wenn die verwendeten Referenzsubstanzen von der Struktur her mit der Test ­
substanz verwandt sind.
 
1.6.2.  Wiederholbarkeit  
Die Bestimmungen müssen mindestens doppelt durchgeführt werden. 
Die von Einzelmessungen hergeleiteten log K  oc -Werte müssen inner ­
halb von 0,25 log. Einheiten liegen.  
1.6.3.  Reproduzierbarkeit  
Die bisher mit der Methode gewonnenen Erfahrungen sprechen für 
ihre Validität. Eine Prüfung der HPLC-Methode, bei der 48 Stoffe 
(zumeist Pestizide) verwendet wurden, für die verlässliche Daten über K
 oc in Böden vorlagen, ergab einen Korrelationskoeffizienten 
von = 0,95 (10) (11).  
Ein Ringversuch mit 11 teilnehmenden Laboratorien wurde durch ­
geführt, um die Methode zu verbessern und zu validieren (12). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 der Anlage enthalten.
 
1.7. BESCHREIBUNG DER TESTMETHODE  
1.7.1.  Vorbereitende Schätzung des Adsorptionskoeffizienten  
Der Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient P  ow (= K  ow ) und in be ­
stimmtem Maße die Wasserlöslichkeit können als Indikatoren für den Adsorptionsgrad, insbesondere für nicht ionisierte Stoffe, dienen und können somit zur Bereichsfindung verwendet werden. Für verschie ­
dene Gruppen von Chemikalien wurden eine Reihe nützlicher Kor ­
relationen veröffentlicht (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
1.7.2.  Geräte  
Erforderlich ist ein Flüssigchromatograf, der mit einer impulsfreien 
Pumpe und einem geeigneten Detektor ausgerüstet ist. Es wird emp ­
fohlen, ein Injektionsventil mit einer Injektionsschleife zu verwen ­
den. Ferner ist ein im Handel erhältliches chemisch gebundenes Cyanpropylharz auf Silica-Basis (z. B. Hypersil und Zorbax CN) zu verwenden. Eine Vorsäule mit demselben Material kann zwischen 
dem Injektionssystem und der Analysesäule platziert werden. Säulen 
unterschiedlicher Lieferanten können hinsichtlich der Trennwirkung sehr unterschiedlich sein. Als Richtschnur müssen folgende Kapazi ­
tätsfaktoren k' erzielt werden: log k' > 0,0 für log K
 oc = 3,0 und log 
k' > 0,4 für log K  oc = 2,0 bei Verwendung von Methanol/Wasser 
55/45 % als mobile Phase.  
1.7.3.  Mobile Phasen  
Von den verschiedenen mobilen Phasen, die getestet wurden, werden 
folgende zwei empfohlen:  
— Methanol/Wasser (55/45 % v/v)  
— Methanol/0,01M Citratpuffer pH 6,0 (55/45 % v/v)  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1101
 
Zur Herstellung der Eluierflüssigkeit sind Methanol von HPLC-Qua ­
lität und destilliertes Wasser oder Citratpuffer zu verwenden. Das 
Gemisch wird vor der Verwendung entgast. Es empfiehlt sich, eine isokratische Elution anzuwenden. Wenn das Methanol-Wasser-Ge ­
misch nicht geeignet ist, können andere Gemische aus organischen 
Lösemitteln und Wasser, z. B. Ethanol-Wasser- oder Acetonitril- 
Wasser-Gemische versucht werden. Für ionisierende Verbindungen wird die Verwendung einer Pufferlösung zur pH-Stabilisierung emp ­
fohlen. Es ist darauf zu achten, dass Salzniederschlag/ ­
Salzpräzipitation und eine Säulenverschlechterung vermieden wer ­
den, die bei einigen organische Phase-Puffer-Gemischen auftreten können.
 
Es dürfen keine Zusätze wie Ionenpaar-Reagenzien verwendet wer ­
den, weil sie die Sorptionseigenschaften der stationären Phase beein ­
trächtigen können. Derartige Veränderungen der stationären Phase 
können irreversibel sein. Aus diesem Grunde ist es unbedingt erfor ­
derlich, dass Versuche, bei denen Zusätze verwendet werden, an getrennten Säulen durchgeführt werden.
 
1.7.4.  Gelöste Stoffe  
Test- und Referenzsubstanzen sollten in der mobilen Phase gelöst 
werden.  
1.8. DURCHFÜHRUNG DES TESTS  
1.8.1.  Testbedingungen  
Die Temperatur während der Messungen ist aufzuzeichnen. Für das 
Säulenkompartiment wird eine Temperaturregelung sehr empfohlen, um konstante Bedingungen während der Eichung und Schätzung sowie der Messung der Testsubstanz zu gewährleisten.
 
1.8.2.  Bestimmung der Totzeit t  o 
Für die Bestimmung der Totzeit t  o können zwei unterschiedliche 
Methoden angewendet werden (siehe auch 1.2).  
1.8.2.1.  Bestimmung der Totzeit t  o durch eine homologe Reihe  
Es hat sich herausgestellt, dass dieses Verfahren verlässliche und 
standardisierte t  o -Werte ergibt. Für weitere Einzelheiten siehe Test ­
methode A.8: Verteilungskoeffizient (n-Oktanol/Wasser), HPLC-Me ­
thode.  
1.8.2.2.  Bestimmung der Totzeit t  o durch inerte Stoffe, bei denen keine Re ­
tention durch die Säule auftritt  
Diese Technik basiert auf der Injektion von Formamid-, Harnstoff- 
oder Natriumnitratlösungen. Die Messungen sollten zumindest dop ­
pelt ausgeführt werden.  
1.8.3.  Bestimmung der Retentionszeiten t  R 
Referenzsubstanzen sind gemäß der Beschreibung in 1.3 auszuwäh ­
len. Sie können zur Bestimmung ihrer Retentionszeiten als gemisch ­
ter Standard injiziert werden, sofern bestätigt worden ist, dass die 
Retentionszeiten der einzelnen Referenzstandards nicht durch das 
Vorhandensein der anderen Referenzstandards beeinflusst werden. Die Eichung muss in regelmäßigen Abständen mindestens zweimal täglich erfolgen, um unerwarteten Veränderungen in der Leistung der 
Säule Rechnung zu tragen. Die Injektionen sind vorzugsweise vor 
und nach den Injektionen der Testsubstanz durchzuführen, um sicher zu sein, dass die Retentionszeiten unverändert sind. Die Testsubstan ­
zen werden getrennt in möglichst kleinen Dosen injiziert (um ein 
Überladen der Säule zu vermeiden), dann werden ihre Retentions ­
zeiten bestimmt.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1102
 
Um die Verlässlichkeit der Messung zu erhöhen, sind sie zumindest 
doppelt durchzuführen. Die von Einzelmessungen hergeleiteten log 
K oc -Werte müssen im Bereich von 0,25 log. Einheiten liegen.  
1.8.4.  Bewertung  
Die Kapazitätsfaktoren k' werden aus der Totzeit t  o und den Reten ­
tionszeiten t  R der gewählten Testsubstanzen nach der Formel 4 (siehe 
1.2) berechnet. Die log k'-Daten der Referenzsubstanzen werden 
daraufhin gegen ihre in den Tabellen 1 und 3 der Anlage genannten 
log K  oc -Werte aus den  Batch equilibrium -Experimenten aufgetragen. 
Mit Hilfe dieser Kurve wird der log k'-Wert einer Testsubstanz zur Bestimmung ihres log K
 oc -Wertes verwendet. Wenn die tatsächlichen 
Werte zeigen, dass der log K  oc der Testsubstanz außerhalb des Eich ­
bereichs liegt, ist der Test unter Verwendung anderer geeigneterer Referenzsubstanzen zu wiederholen.
 
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Der Bericht muss folgende Informationen enthalten:  
— Identität, Reinheit und gegebenenfalls pK  a -Werte von Test- und 
Referenzsubstanzen;  
— Beschreibung der Apparatur und der Betriebsbedingungen, z. B. 
Typ und Abmessung der Analysesäule (sowie Vorsäule), Detek ­
tionsvorrichtung, mobile Phase (Verhältnis zwischen Bestandtei ­
len und pH-Wert), Temperaturbereich während der Messungen;  
— Totzeit und die für ihre Bestimmung angewandte Methode;  
— Mengen der in die Säule eingebrachten Test- und Referenzsub ­
stanzen;  
— Retentionszeiten der für die Eichung verwendeten Referenzver ­
bindungen;  
— Einzelheiten der angepassten Regressionslinie (log k'/log K  oc ) 
und grafische Darstellung der Regressionslinie;  
— durchschnittliche Retentionsdaten und geschätzter log K  oc -Wert 
der Testverbindung;  
— Chromatogramme.  
3. LITERATURHINWEISE  
(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). 
Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, McGraw-Hill, New York.
 
(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the ad ­
sorption coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 
17, 1 67.  
(3) G. G. Briggs (1981), Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the pa ­
rachor. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.  
(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, pp. 227-231.
 
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substan ­
ces by soils and Sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, pp. 
297-312.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1103
 
(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic com ­
pounds, Science, 106, pp. 831-832.  
(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of Sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural Sediments and soils. Chemosphere, 10, pp. 833-846.
 
(8) W. Kordel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of 
the HPLC-screening method for the determination of the ad ­
sorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), pp. 121-128.
 
(9) M. Mueller, W. Kordel (1996). Comparison of screening me ­
thods for the estimation of adsorption coefficients on soil. 
Chemosphere, 32(12), pp. 2493-2504.  
(10) W. Kordel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening me ­
thod for the determination of the adsorption coefficient in soil- comparison of different stationry phases, Chemosphere, 27(12), 
pp. 2341-2352.
 
(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of non ­
polar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD 
Guideline 106, Chemosphere, 22, pp. 285-304.
 
(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995), HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1104
 
Anlage  
Tabelle 1  
Vergleich von K  oc -Werten für Böden und Klärschlämme, und mittels der HPLC-Screeningmethode  ( 1 ) ( 2 ) 
berechneten Werten  
Stoffe CAS-Nr. Log K  oc 
Klär­
schlamm Log K  oc 
HPLC Δ Log K  oc 
Böden Log K  oc 
HPLC Δ 
Atrazin 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linuron 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fenthion 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monuron 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Phenanthren 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 Benzoesäurephenylester 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 Benzamid 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 4-Nitrobenzamid 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 Acetanilid 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 Anilin 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-Dichloranilin 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kordel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121-128. 
( 2 ) W. Kordel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), 107-119  
Tabelle 2  
Ergebnisse eines Ringversuchs (11 teilnehmende Laboratorien) zur Verbesserung und Validierung der HPLC- 
Methode  ( 1 ) 
Stoff CAS-Nr. Log K oc K oc Log K  oc 
(OECD 106) (HPLC Methode)  
Atrazin 1912-24-9 1,81 78 ± 16 1,89 
Monuron 150-68-5 1,99 100 ± 8 2,00 Triapenthenol 77608-88-3 2,37 292 ± 58 2,47 Linuron 330-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 Fenthion 55-38-9 3,31 2062 ± 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff. J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
results of a ring test. Chemosphere. 30(7), 1373-1384.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1105
 
Tabelle 3  
Empfohlene Referenzsubstanzen für die HPLC-Screeningmethode auf der Grundlage von Bodenadsorptionsdaten  
Referenzsubstanz CAS-Nr. Durchschn. log 
K oc -Werte vom 
Chargen-Gleich ­
gewicht Anzahl K  oc 
Daten Log S.D. Quelle  
Acetanilid 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Phenol 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-Nitrobenzamid 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N, N-Dimethylbenzamid 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-Methylbenzamid 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Methylbenzoat 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrazin 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
Isoproturon 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-Nitrobenzamid 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Anilin 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-Dinitrobenzamid 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Carbendazim 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triazoxid 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triazophos 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linuron 330-55-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naphthalin 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfan-diol 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
Methiocarb 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Acid Yellow 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-Trichlorobenzen 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
γ-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fenthion 55-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Direct Red 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pyrazophos 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
α-Endosulfan 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Diclofop-methyl 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
Phenanthren 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Basic Blue 41 (mix) 26850-47-5 
12270-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 1 — (  b ) 
( a ) W. Kördel. J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D 
Report No 106 01044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen. W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, 285-304. 
( c ) Von der Industrie vorgelegte Daten.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1106
 
C.20.  DAPHNIA MAGNA , REPRODUKTIONSTEST  
1. METHODE  
Diese Methode zur Prüfung der Reproduktionstoxizität entspricht der 
OECD TG 211 (1998).  
1.1. EINLEITUNG  
Die primäre Zielsetzung der Prüfung besteht darin, die Wirkung von 
Chemikalien auf die Reproduktionsleistung der Daphnia magna zu bestimmen.
 
1.2. DEFINITIONEN UND EINHEITEN  
Elterntiere : Dies sind diejenigen weiblichen Daphnien, die zu Be ­
ginn der Prüfung vorhanden sind und deren Reproduktionsleistung in 
der Prüfung untersucht werden soll.  
Nachkommen : Dies sind die jungen Daphnien, die von den Eltern ­
tieren im Verlauf der Prüfung produziert werden.  
Lowest Observed Effect Concentration (LOEC) : Dies ist die nied ­
rigste geprüfte Dosiskonzentration, bei der sich eine statistisch sig ­
nifikante Wirkung auf die Reproduktion und die Mortalität der El ­
terntiere (bei p < 0,05) im Vergleich zu der Kontrolle innerhalb eines 
angegebenen Expositionszeitraums beobachten lässt. Alle Prüfkon ­
zentrationen oberhalb der LOEC müssen jedoch eine schädigende Wirkung haben, die gleich den bei der LOEC beobachteten Wirkun ­
gen oder größer als diese ist. Können diese beiden Bedingungen 
nicht erfüllt werden, muss ausführlich erklärt werden, wie die LOEC (und damit auch die NOEC) ausgewählt wurde.
 
No Observed Effect Concentration (NOEC) : Dies ist die Prüfkon ­
zentration unmittelbar unterhalb der LOEC, bei der im Vergleich zu 
der Kontrolle innerhalb eines angegebenen Expositionszeitraums keine statistisch signifikante Wirkung (p < 0,05) vorliegt.
 
EC x : Dies ist die Konzentration der in Wasser gelösten Prüfsubstanz, 
die zu einer Verringerung der Reproduktion der Daphnia magna um x Prozent innerhalb eines angegebenen Expositionszeitraums führt.
 
Immanente Wachstumsrate : Dies ist ein Maß für das Wachstum 
der Population, welches die Reproduktionsleistung und die altersspe ­
zifische Mortalität mit einbezieht (20) (21) (22). In stabilen Popula ­
tionen ist die immanente Wachstumsrate gleich null. Bei wachsenden Populationen ist sie positiv, und bei schrumpfenden Populationen ist 
sie negativ. Letztere kann eindeutig keine Erhaltung der Art ermög ­
lichen und führt schließlich zum Aussterben.
 
Nachweisgrenze : Dies ist die niedrigste Konzentration, die nach ­
gewiesen, aber nicht quantifiziert werden kann.  
Bestimmungsgrenze : Dies ist die niedrigste Konzentration, die 
quantitativ gemessen werden kann.  
Mortalität : Ein Tier wird als tot protokolliert, wenn es unbeweglich 
ist, d. h., wenn es nicht schwimmen kann oder sich keine Bewegun ­
gen von Anhängseln oder Postabdomen innerhalb von 15 Sekunden nach vorsichtigem Hin- und Herbewegen des Prüfbehälters beobach ­
ten lassen. (Wird eine andere Definition herangezogen, muss diese 
zusammen mit dem dazugehörigen Literaturhinweis angegeben 
werden.)
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1107
 
1.3. PRINZIP DER METHODE  
Junge weibliche Daphnien (die Elterntiere), die zu Beginn der Prüfung 
weniger als 24 Stunden alt sind, werden der dem Wasser in verschie ­
denen Konzentrationen zugesetzten Prüfsubstanz ausgesetzt. Die 
Dauer der Prüfung beträgt 21 Tage. Am Ende der Prüfung wird die 
gesamte Anzahl an lebenden Nachkommen, die von den am Ende der Prüfung noch lebenden Elterntieren produziert wurden, bewertet. Dies bedeutet, dass Jungtiere, die von erwachsenen Tieren, welche im Ver ­
lauf der Prüfung sterben, produziert werden, aus den Berechnungen 
ausgeschlossen werden. Die Reproduktionsleistung von Elterntieren kann auch auf andere Art und Weise angegeben werden (z. B. Anzahl 
an lebenden Nachkommen, die je Tier und Tag ab dem ersten Tag, an 
dem Nachkommen festgestellt wurden, produziert werden), diese An ­
gaben sollten jedoch zusätzlich zu der Gesamtanzahl an Jungtieren, bezogen auf die am Ende der Prüfung noch lebenden Elterntiere, pro ­
tokolliert werden. Die Reproduktionsleistung der Tiere, die der Prüf ­
substanz ausgesetzt wurden, wird mit der Leistung der Kontrolle(n) verglichen, um die niedrigste Wirkkonzentration (LOEC) und damit auch die höchste Konzentration ohne Wirkung (NOEC) zu bestimmen. 
Zusätzlich sind die Daten so weit wie möglich mit Hilfe eines Regres ­
sionsmodells zu analysieren, um die Konzentration zu schätzen, die zu einer x %igen Verringerung der Reproduktionsleistung führen würde (d. h. EC
 50 . EC  20 oder EC  10 ). 
Das Überleben der Elterntiere und die Zeit bis zur Produktion der 
ersten Brut müssen ebenfalls berichtet werden. Andere sich auf die 
jeweilige Substanz beziehende Wirkungen auf Parameter wie das Wachstum (z. B. die Länge) und eine mögliche immanente Wachs ­
tumsrate können ebenfalls untersucht werden.
 
1.4. ANGABEN ZUR PRÜFSUBSTANZ  
Ergebnisse einer akuten Toxizitätsprüfung (siehe Methode C.2, Teil 1), 
die an  Daphnia magna  durchgeführt wurde, sollten zur Verfügung 
stehen. Das Ergebnis kann bei der Auswahl eines geeigneten Bereichs an Prüfkonzentrationen in den Reproduktionsprüfungen von Nutzen sein. Die Wasserlöslichkeit und der Dampfdruck der Prüfsubstanz soll ­
ten bekannt sein, und ein zuverlässiges analytisches Verfahren für die 
Quantifizierung der Prüfsubstanz in den Prüflösungen mit dokumen ­
tierter Restitutionsgüte und Nachweisgrenze sollte vorhanden sein.
 
Zu den Informationen über die Prüfsubstanz, die bei der Festlegung 
der Prüfbedingungen von Nutzen sein können, gehören die Struktur ­
formel, die Reinheit der Substanz, die Lichtstabilität, die Stabilität unter den Versuchsbedingungen, pKa, P
 ow und die Ergebnisse einer 
Prüfung zur leichten biologischen Abbaubarkeit (siehe Methode C.4).  
1.5. VALIDITÄTSKRITERIEN  
Damit die Validität einer Prüfung gegeben ist, sollten die folgenden 
Leistungskriterien in der/den Kontrolle(n) erfüllt werden:  
— Die Mortalität der Elterntiere (weibliche  Daphnien)  darf am Ende 
der Prüfung 20 % nicht übersteigen;  
— Die mittlere Anzahl an lebenden Nachkommen, die pro am Ende 
der Prüfung noch lebendem Elterntier produziert wurden, ist ≥ 60.
 
1.6. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.6.1.  Prüfanordnung  
Prüfgefäße und andere Geräte, die mit den Prüflösungen in Berüh ­
rung kommen, sollten ganz aus Glas oder einem anderen chemisch 
inerten Werkstoff bestehen. Normalerweise handelt es sich bei den Prüfgefäßen um Glaskolben.
 
Zusätzlich werden einige oder alle der folgenden Geräte erforderlich 
sein:  
— Sauerstoffmessgerät (mit einer Mikroelektrode oder einem ande ­
ren geeigneten Gerät zur Messung von gelöstem Sauerstoff in 
Proben von geringem Volumen);  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1108
 
— geeignetes Gerät zur Regelung der Temperatur;  
— pH-Messgerät;  
— Gerät zur Bestimmung der Wasserhärte;  
— Gerät zur Bestimmung der gesamten organischen Kohlenstoff ­
konzentration (TOC) von Wasser oder Gerät zur Bestimmung des chemischen Sauerstoffbedarfs (COD);
 
— geeignetes Gerät zur Regelung der Beleuchtungsverhältnisse und 
zur Messung der Lichtstärke.  
1.6.2.  Prüforganismen  
In der Prüfung soll die Art Daphnia magna Straus verwendet werden. 
Andere Daphnien-Arten können zum Einsatz kommen, sofern sie die 
Validitätskriterien, soweit zutreffend, erfüllen (die Validitätskriterien 
hinsichtlich der Reproduktionsleistung in den Kontrollen sollten für die Daphnien-Art relevant sein). Werden andere Daphnien-Arten ver ­
wendet, müssen diese eindeutig identifiziert werden, außerdem ist 
ihre Verwendung zu begründen.
 
Der Klon sollte möglichst durch eine Genotypbestimmung identifi ­
ziert worden sein. Untersuchungen (1) haben gezeigt, dass die Re ­
produktionsleistung von Klon A (der aus dem IRCHA in Frankreich stammt) (3) das Validitätskriterium eines Mittelwerts von ≥ 60 Nach­
kommen je überlebendem Elterntier gleich bleibend erfüllt, wenn die 
Kultur unter den in dieser Methode beschriebenen Bedingungen er ­
folgt. Andere Klone sind jedoch annehmbar, sofern nachgewiesen ist, dass die Daphnien-Kultur die Validitätskriterien für eine Prüfung 
erfüllt.
 
Zu Beginn der Prüfung sollten die Tiere weniger als 24 Stunden alt 
sein, und sie dürfen nicht zur ersten Nachkommenschaft einer Brut 
gehören. Sie sollten aus einem gesunden Bestand stammen (d. h., keine Anzeichen von Stress aufweisen, beispielsweise eine hohe 
Mortalität, das Vorhandensein von männlichen Tieren oder Ephip ­
pien, verzögerte Produktion der ersten Brut, verfärbte Tiere usw.). Die Zuchttiere müssen unter ähnlichen Kulturbedingungen (Licht, Temperatur, Medium, Fütterung und Tiere je Volumeinheit) gehalten 
werden wie die Tiere, die in der Prüfung verwendet werden. Wird 
bei der Prüfung ein anderes Kulturmedium für die Daphnien ver ­
wendet als bei der routinemäßigen Daphnien-Kultur, empfiehlt sich eine Eingewöhnungszeit vor der Prüfung, die im Normalfall etwa 3 
Wochen dauert (d. h. eine Generation), um Stress für die Elterntiere 
zu vermeiden.
 
1.6.3.  Prüfmedium  
In dieser Prüfung wird der Einsatz eines vollständig definierten Me ­
diums empfohlen. Dadurch kann die Verwendung von Additiven (z. B. Seetang, Bodenextrakt, usw.), die sich nur schwer charakteri ­
sieren lassen, vermieden werden, und es bestehen größere Chancen 
auf eine Standardisierung unter den Prüfeinrichtungen. Die Medien 
Elendt M4 (4) und M7 (siehe Anlage 1) haben sich für diesen Zweck als geeignet erwiesen. Allerdings sind andere Medien (z. B. (5) (6)) annehmbar, sofern nachgewiesen ist, dass die Leistung der Daph ­
nien-Kultur die Validitätskriterien für die Prüfung erfüllt.
 
Werden Medien verwendet, die undefinierte Additive enthalten, soll ­
ten diese Additive klar und deutlich spezifiziert werden, und es 
sollten in dem Prüfbericht Angaben zur Zusammensetzung enthalten sein, insbesondere im Hinblick auf den Kohlenstoffgehalt, da dies zu der gebotenen Nahrung beitragen kann. Empfohlen wird, dass der 
gesamte organische Kohlenstoff (TOC) und/oder der chemische Sau ­
erstoffbedarf (COD) des Stammansatzes des organischen Additivs bestimmt und eine Schätzung des sich daraus ergebenden Beitrags zu dem TOC/COD in dem Prüfmedium vorgenommen wird. Die 
Empfehlung lautet, dass die TOC-Anteile in dem Medium (d. h. 
vor dem Zusatz von Algen) unter 2 mg/l liegen sollten (7).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1109
 
Enthalten die Prüfsubstanzen Metalle, ist es wichtig, anzuerkennen, 
dass die Eigenschaften des Prüfmediums (z. B. Härte, Chelatbil ­
dungsvermögen) Einfluss auf die Toxizität der Prüfsubstanz haben können. Aus diesem Grunde sollte möglichst ein umfassend definier ­
tes Prüfmedium verwendet werden. Gegenwärtig sind jedoch die 
einzigen umfassend definierten Medien, die bekanntermaßen für 
die Langzeitkultur von Daphnia magna geeignet sind, Elendt M4 und M7. Beide Medien enthalten den Chelatbildner EDTA. Unter ­
suchungen haben gezeigt (2), dass die „scheinbare Toxizität“ von 
Cadmium im Allgemeinen niedriger ist, wenn die Reproduktionsprü ­
fung in den Medien M4 und M7 durchgeführt wird, als in Medien, die kein EDTA enthalten. M4 und M7 werden aus diesem Grunde nicht für Prüfsubstanzen empfohlen, die Metalle enthalten, und an ­
dere Medien, die bekannte Chelatbildner enthalten, sollten ebenfalls 
vermieden werden. Bei Substanzen, die Metall enthalten, kann die Verwendung eines alternativen Mediums ratsam sein, beispielsweise rekonstituiertes hartes Süßwasser (7) nach ASTM, das kein EDTA 
enthält und dem Seetangextrakt zugesetzt wurde (8). Diese Kom ­
bination von rekonstituiertem hartem Süßwasser nach ASTM und Seetangextrakt ist ebenfalls für die Langzeitkultur und Prüfung von Daphnia magna (2) geeignet, auch wenn sie aufgrund der organi ­
schen Komponente in dem zugesetzten Seetangextrakt immer noch 
eine geringfügige chelatbildende Wirkung ausübt.
 
Zu Beginn und im Verlauf der Prüfung sollte die gelöste Sauerstoff ­
konzentration über 3 mg/l liegen. Der pH-Wert sollte sich im Bereich von 6 bis 9 befinden und in jedem einzelnen Test um nicht mehr als 
1,5 Einheiten schwanken. Eine Härte von mehr als 140 mg/l (als 
CaCO
 3 ) wird empfohlen. Bei Prüfungen mit diesem und höheren 
Werten wurde eine Reproduktionsleistung im Einklang mit den Va ­
liditätskriterien (9) (10) nachgewiesen.  
1.6.4.  Prüflösungen  
Prüflösungen der gewählten Konzentrationen werden im Allgemei ­
nen durch Verdünnung eines Stammansatzes hergestellt. Stamm ­
ansätze sollten möglichst durch Auflösung der Substanz im Prüfme ­
dium hergestellt werden.  
In einigen Fällen kann zwar der Einsatz von organischen Löse- oder 
Dispersionsmitteln erforderlich sein, um einen Stammansatz von ge ­
eigneter Konzentration zu erzielen, jedoch sollten alle Anstrengungen 
unternommen werden, um die Verwendung derartiger Stoffe zu ver ­
meiden. Beispiele für geeignete Lösemittel sind Aceton, Ethanol, Methanol, Dimethylformamid und Triethylenglycol. Beispiele für ge ­
eignete Dispersionsmittel sind Cremophor RH40, Methylcellulose 
0,01 % und HCO-40. In jedem Fall sollte die Prüfsubstanz in den 
Prüflösungen die Löslichkeitsgrenze im Prüfmedium nicht über ­
schreiten.
 
Lösemittel werden zur Herstellung eines Stammansatzes verwendet, 
der genau in Wasser dosiert werden kann. Bei der empfohlenen 
Lösemittelkonzentration in dem endgültigen Prüfmedium (d. h. ≤ 
0,1 ml/l) sind die oben genannten Lösemittel nicht toxisch und füh ­
ren nicht zu einer höheren Wasserlöslichkeit einer Substanz.  
Dispersionsmittel können bei einer genauen Dosierung und Disper ­
sion helfen. Bei der empfohlenen Konzentration in dem endgültigen Prüfmedium ( ≤ 0,1 ml/l) sind die oben genannten Dispersionsmittel 
nicht toxisch und führen nicht zu einer höheren Wasserlöslichkeit 
einer Substanz.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1110
 
1.7. AUSLEGUNG DER PRÜFUNG  
Die Behandlungen sollten den Prüfgefäßen zugeordnet werden, und 
die gesamte anschließende Handhabung der Prüfgefäße sollte nach dem Zufallsprinzip erfolgen. Ist dies nicht der Fall, kann dies zu 
einer einseitigen Ausrichtung führen, die als Konzentrationswirkung 
ausgelegt werden könnte. Insbesondere wenn mit Versuchseinheiten in einer Behandlungs- oder Konzentrationsreihenfolge umgegangen wird, könnten verschiedene zeitabhängige Auswirkungen wie bei ­
spielsweise die Müdigkeit des Prüfers oder andere Fehler zu größe ­
ren Wirkungen bei den höheren Konzentrationen führen. Außerdem sollte eine Blockbildung für die Prüfung in Erwägung gezogen wer ­
den, wenn die Prüfergebnisse wahrscheinlich durch eine anfängliche 
oder umweltbezogene Bedingung der Prüfung wie der Position in der Prüfeinrichtung beeinflusst werden.
 
1.8. DURCHFÜHRUNG DER PRÜFUNG  
1.8.1.  Expositionsbedingungen  
1.8.1.1.  Dauer  
Die Dauer der Prüfung beträgt 21 Tage.  
1.8.1.2.  Besatz  
Die Elterntiere werden jeweils einzeln in einem Prüfgefäß mit 50 bis 
100 ml Prüfmedium in jedem Gefäß gehalten.  
Mitunter können größere Volumina erforderlich sein, um die Anfor ­
derungen des für die Bestimmung der Prüfsubstanzkonzentration zum Einsatz kommenden analytischen Verfahrens zu erfüllen, auch wenn ein Poolen von Wiederholungen für die chemische Analyse 
ebenfalls zulässig ist. Werden größere Volumina als 100 ml verwen ­
det, muss unter Umständen die den Daphnien verabreichte Ration erhöht werden, um ein entsprechendes Nahrungsangebot und die Einhaltung der Validitätskriterien sicherzustellen. Bei Durchflussprü ­
fungen können aus technischen Gründen alternative Konzepte in 
Erwägung gezogen werden (z. B. vier Gruppen von jeweils zehn Tieren in einem größeren Prüfvolumen), dann sollten allerdings Än ­
derungen an der Auslegung der Prüfung protokolliert werden.
 
1.8.1.3.  Anzahl an Tieren  
Bei semistatischen Prüfungen werden mindestens 10 Tiere einzeln 
bei jeder Prüfkonzentration und mindestens 10 Tiere einzeln in den 
Kontrollreihen gehalten.  
Bei Durchflussprüfungen haben sich 40 Tiere, die in vier Gruppen 
von jeweils 10 Tieren bei jeder Prüfkonzentration aufgeteilt werden, 
als geeignet erwiesen (1). Eine geringere Anzahl an Prüforganismen kann verwendet werden, und mindestens 20 Tiere je Konzentration, die in zwei oder mehr Wiederholungen mit einer gleichen Anzahl 
von Tieren aufgeteilt werden (z. B. vier Wiederholungen mit jeweils 
fünf Daphnien), werden empfohlen. Zu beachten ist, dass es bei Prüfungen, bei denen die Tiere in Gruppen gehalten werden, nicht möglich sein wird, die Reproduktionsleistung als Gesamtanzahl an 
lebenden Nachkommen pro am Ende der Prüfung noch lebendem 
Elterntier darzustellen, wenn Elterntiere sterben. In diesen Fällen sollte die Reproduktionsleistung als „Gesamtanzahl an lebenden Nachkommen pro zu Beginn der Prüfung vorhandenem Elterntier“ 
angegeben werden.
 
1.8.1.4.  Fütterung  
Bei semistatischen Prüfungen sollte die Fütterung möglichst täglich, 
zumindest jedoch dreimal pro Woche erfolgen (d. h. entsprechend 
dem Wechsel des Prüfmediums). Abweichungen hiervon (z. B. bei 
Durchflussprüfungen) sollten protokolliert werden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1111
 
Während der Prüfung sollte die Nahrung der Elterntiere möglichst 
aus lebenden Algenzellen von einer oder mehreren der folgenden 
Arten bestehen: Chlorella sp, Selenastrum capricornutum (jetzt Pseu ­
dokirchneriella subcapitata (11)) und Scenedesmus subspicatus. Die angebotene Nahrung sollte auf der Menge an organischem Kohlen ­
stoff (C) beruhen, die jedem Elterntier zur Verfügung gestellt wird. 
Untersuchungen (12) haben gezeigt, dass bei Daphnia magna Ratio ­
nen zwischen 0,1 und 0,2 mg C/Daphnie/Tag hinreichend sind, um die zur Erfüllung der Validitätskriterien der Prüfung erforderliche 
Anzahl an Nachkommen zu erzielen. Die Ration kann entweder 
aus einer gleich bleibenden Gabe während des gesamten Prüfzeit ­
raums bestehen, oder es kann, sofern gewünscht, am Anfang eine geringere Menge dargeboten werden, die dann im Verlauf der Prü ­
fung erhöht wird, um dem Wachstum der Elterntiere Rechnung zu 
tragen. In diesem Falle sollte die Ration zu allen Zeiten nach wie vor innerhalb des empfohlenen Bereichs von 0,1 bis 0,2 mg C/Daphnie/ ­
Tag bleiben.
 
Kommen zur Bestimmung der erforderlichen Futterration Ersatzgrö ­
ßen zum Einsatz, beispielsweise die Anzahl an Algenzellen oder die 
Lichtextinktion (aus Gründen der Zweckmäßigkeit, weil die Messung des Kohlenstoffgehalts zeitaufwendig ist), muss jede Prüfeinrichtung ihr eigenes Nomogramm erstellen, in dem die Ersatzgröße in Bezug 
zum Kohlenstoffgehalt der Algenkultur gesetzt wird (Anleitung zur 
Erstellung von Nomogrammen siehe Anlage 2). Nomogramme soll ­
ten zumindest einmal pro Jahr oder häufiger überprüft werden, wenn 
sich die Bedingungen für die Algenkultur geändert haben. Dabei hat 
sich die Lichtextinktion als eine bessere Ersatzgröße für den Kohlen ­
stoffgehalt als die Zellenanzahl erwiesen (13).
 
Den Daphnien sollte eine konzentrierte Algensuspension gefüttert 
werden, um das Volumen des Algenkulturmediums, das in die Prüf ­
gefäße gelangt, auf ein Mindestmaß zu beschränken. Die Konzen ­
tration der Algen lässt sich durch Zentrifugieren mit anschließender Resuspension in destilliertem Wasser, entionsiertem Wasser oder Daphnien-Kulturmedium erreichen.
 
1.5.1.5.  Licht  
16 Stunden Licht mit einer Stärke von nicht mehr als 15 bis 20 · μE 
m –2 s– 1 . 
1.8.1.6.  Temperatur  
Die Temperatur der Prüfmedien sollte innerhalb eines Bereichs von 
18 bis 22  o C liegen. Allerdings sollte die Temperatur bei jeder 
einzelnen Prüfung nach Möglichkeit um nicht mehr als 2  o C inner­
halb dieser Grenzwerte schwanken (z. B. 18 bis 20, 19 bis 21 oder 
20 bis 22  o C). Zur Überwachung der Temperatur kann die Verwen ­
dung eines zusätzlichen Prüfgefäßes angebracht sein.  
1.8.1.7.  Belüftung  
Die Prüfgefäße dürfen während der Prüfung nicht belüftet werden.  
1.8.2.  Prüfkonzentration  
Im Normalfall sollten mindestens fünf Prüfkonzentrationen verwen ­
det werden, die in einer geometrischen Reihe angeordnet sind und sich um einen Faktor von möglichst nicht mehr als 3,2 voneinander 
unterscheiden, und es sollte die angemessene Anzahl an Wieder ­
holungen für jede Prüfkonzentration eingesetzt werden (siehe 1.8.1.3). Werden weniger als fünf Konzentrationen verwendet, sollte eine Begründung dafür angegeben werden. Substanzen sollten nicht 
oberhalb ihrer Löslichkeitsgrenze im dem Prüfmedium getestet 
werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1112
 
Bei der Festlegung des Bereichs von Konzentrationen sollte Folgen ­
des bedacht werden:  
i) Wenn das Ziel die Ermittlung der LOEC/NOEC ist, muss die 
niedrigste Prüfkonzentration so niedrig sein, dass die Fruchtbar ­
keit bei dieser Konzentration nicht signifikant niedriger als in der Kontrolle ist. Ist dies nicht der Fall, muss die Prüfung mit einer 
geringeren niedrigsten Konzentration wiederholt werden.
 
ii) Wenn das Ziel die Bestimmung der LOEC/NOEC ist, muss die 
höchste Prüfkonzentration so hoch sein, dass die Fruchtbarkeit bei dieser Konzentration signifikant niedriger als in der Kontrolle ist. Ist dies nicht der Fall, muss die Prüfung mit einer höheren 
höchsten Konzentration wiederholt werden.
 
iii) Wenn die EC  x für Wirkungen auf die Reproduktion geschätzt 
wird, ist es ratsam, hinreichende Konzentrationen zur Bestim ­
mung der EC  x mit einem angemessenen Vertrauensbereich zu 
verwenden. Wenn die EC  50 für Wirkungen auf die Reproduktion 
geschätzt wird, ist es ratsam, dass die höchste Prüfkonzentration 
höher als diese EC  50 ist. Andernfalls ist es zwar immer noch 
möglich, die EC  50 zu schätzen, der Vertrauensbereich für die 
EC 50 ist jedoch sehr weit, und es ist vielleicht nicht möglich, 
die Angemessenheit des angepassten Modells zufrieden stellend zu bewerten.
 
iv) Der Prüfkonzentrationsbereich sollte möglichst keine Konzentra ­
tion beinhalten, die eine statistisch signifikante Wirkung auf das 
Überleben von erwachsenen Tieren hat, da dies die Art der Prü ­
fung von einer einfachen Reproduktionsprüfung in eine kom ­
binierte Reproduktions- und Mortalitätsprüfung verwandeln wür ­
de, für die eine deutlich komplexere statistische Auswertung er ­
forderlich ist.  
Wenn die Toxizität der Prüfsubstanz im Vorfeld bekannt ist (z. B. 
aus einer akuten Toxizitätsprüfung und/oder aus Voruntersuchungen zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs), dürfte dies bei der Aus ­
wahl geeigneter Prüfkonzentrationen helfen.
 
Wird ein Löse- oder Dispersionsmittel zur Herstellung der Prüflösun ­
gen verwendet (siehe Abschnitt 1.6.4), sollte dessen Endkonzentra ­
tion in den Prüfgefäßen 0,1 ml/l nicht übersteigen und in allen Prüfgefäßen gleich sein.
 
1.8.3.  Kontrollen  
Eine Kontrollreihe mit dem Prüfmedium und, sofern zutreffend, auch 
eine Kontrollreihe mit dem Löse- oder Dispersionsmittel sollten zu ­
sätzlich zu den Testreihen durchgeführt werden. Werden Löse- oder 
Dispersionsmittel verwendet, sollte deren Konzentration gleich den Konzentrationen in den Gefäßen mit der Prüfsubstanz sein. Die ent ­
sprechende Anzahl an Wiederholungen sollte zum Einsatz kommen 
(siehe 1.8.1.3).
 
Im Allgemeinen sollte in einer ordentlich durchgeführten Prüfung der 
Variationskoeffizient rund um die mittlere Anzahl an lebenden Nach ­
kommen, die pro Elterntier in der/den Kontrolle(n) produziert wer ­
den, ≤ 25 % sein, und dies sollte bei Prüfkonzepten mit einzeln 
gehaltenen Tieren protokolliert werden.  
1.8.4.  Erneuerung des Prüfmediums  
Die Häufigkeit, mit der das Prüfmedium erneuert wird, hängt von der 
Stabilität der Prüfsubstanz ab. Jedoch sollte es zumindest dreimal pro Woche ausgetauscht werden. Wenn aus vorhergehenden Stabilitäts ­
prüfungen (siehe 1.4) bekannt ist, dass die Konzentration der Prüf ­
substanz während des maximalen Erneuerungszeitraums (d. h. 3 Ta ­
ge) nicht stabil ist (d. h. außerhalb des Bereichs von 80 bis 120 % der nominalen Konzentration oder Unterschreitung von 80 % der gemessenen anfänglichen Konzentration), sollte ein häufigerer Wech ­
sel des Prüfmediums oder der Einsatz einer Durchflussprüfung in 
Erwägung gezogen werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1113
 
Wird das Medium in semistatischen Prüfungen erneuert, wird eine 
zweite Reihe von Prüfgefäßen vorbereitet, in die die Elterntiere bei ­
spielsweise mit einer Glaspipette von geeignetem Durchmesser um ­
gesetzt werden. Dabei sollte die Menge an Prüfmedium, die zusam ­
men mit den  Daphnien  umgesetzt wird, so gering wie möglich sein.  
1.8.5.  Beobachtungen  
Die Ergebnisse der Beobachtungen während der Prüfung sollten auf 
Datenblättern (siehe Beispiele in Anlage 3 und 4) protokolliert wer ­
den. Sind andere Messungen erforderlich (siehe 1.3 und 1.8.8), sind 
gegebenenfalls weitere Beobachtungen vonnöten.  
1.8.6.  Nachkommen  
Die Nachkommen, die von jedem Elterntier produziert werden, soll ­
ten vom Auftreten der ersten Brut an möglichst täglich entfernt und 
gezählt werden, um zu verhindern, dass diese die für die erwachse ­
nen Tiere bestimmte Nahrung verbrauchen. Für diese Methode braucht zwar nur die Anzahl an lebenden Nachkommen gezählt zu werden, vorhandene unreife Eier oder tote Nachkommen sollten je ­
doch ebenfalls festgehalten werden.
 
1.8.7.  Mortalität  
Sterbefälle unter den Elterntieren sollten möglichst täglich protokol ­
liert werden; sie sollten zumindest zu den gleichen Zeiten wie die 
Nachkommen gezählt werden.  
1.8.8.  Sonstige Parameter  
Auch wenn dieses Verfahren in der Hauptsache zur Bewertung der 
Wirkungen auf die Reproduktion dienen soll, besteht die Möglich ­
keit, dass auch andere Auswirkungen in hinreichendem Maße für 
eine statistische Auswertung quantifiziert werden können. Besonders wünschenswert sind dabei Wachstumsmessungen, denn sie liefern Informationen über mögliche subletale Wirkungen, die unter Um ­
ständen nützlicher als die Reproduktionsmessung alleine sind; emp ­
fohlen wird die Vermessung der Länge der Elterntiere (d. h. die Körperlänge ohne Afterstachel) am Ende der Prüfung. Weitere Pa ­
rameter, die sich messen oder berechnen lassen, sind unter anderem 
die Zeit bis zur Produktion der ersten Brut (und folgender Bruten), Anzahl und Umfang der Bruten je Tier, Anzahl an unreifen Eiern, Vorhandensein von männlichen Tieren oder Ephippien und die im ­
manente Populationswachstumsrate.
 
1.8.9.  Häufigkeit von analytischen Bestimmungen und Messungen  
Die Sauerstoffkonzentration, die Temperatur, die Härte und pH- 
Werte sollten zumindest einmal pro Woche gemessen werden, und 
zwar in frischen und alten Medien, in der/den Kontrolle(n) und in 
der höchsten Konzentration der Prüfsubstanz.  
Während der Prüfung werden die Konzentrationen der Prüfsubstanz 
in regelmäßigen Abständen bestimmt.  
Bei semistatischen Prüfungen, bei denen erwartet wird, dass die 
Konzentration der Prüfsubstanz innerhalb von ± 20 % der Nominal ­
konzentration konstant bleibt (d. h. innerhalb des Bereichs von 80 bis 120 % — siehe Abschnitt 1.4 und 1.8.4), wird empfohlen, dass zumindest die höchste und die niedrigste Prüfkonzentration, 
frisch hergestellt und zum Zeitpunkt des Austauschs, einmal während 
der ersten Woche der Prüfung analysiert werden (d. h. Analysen sollten anhand einer Probe derselben Lösung erfolgen — wenn diese frisch hergestellt ist und beim Austausch). Diese Bestimmungen 
sollten anschließend zumindest in wöchentlichen Abständen wieder ­
holt werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1114
 
Bei Prüfungen, bei denen nicht damit zu rechnen ist, dass die Kon ­
zentration der Prüfsubstanz innerhalb von ± 20 % der Nominalkon ­
zentration konstant bleibt, ist es notwendig, alle Prüfkonzentrationen, frisch hergestellt und beim Austausch, zu analysieren. Bei denjenigen Prüfungen jedoch, bei denen die gemessene Anfangskonzentration 
der Prüfsubstanz zwar nicht innerhalb von ± 20 % der nominalen 
Konzentration stabil bleibt, bei der jedoch hinreichend nachgewiesen werden kann, dass die Anfangskonzentrationen reproduzierbar und stabil sind (d. h. innerhalb des Bereichs von 80 bis 120 % der 
Anfangskonzentrationen), könnten die chemischen Bestimmungen 
in Woche 2 und 3 der Prüfung auf die höchste und die niedrigste Konzentration reduziert werden. In allen Fällen braucht die Bestim ­
mung der Prüfsubstanzkonzentrationen vor der Erneuerung des Prüf ­
mediums nur an einem Wiederholungsgefäß bei jeder Prüfkonzen ­
tration vorgenommen zu werden.
 
Bei einer Durchflussprüfung ist ein ähnliches Probenahmeverfahren 
wie für semistatische Prüfungen beschrieben angebracht (die Mes ­
sung der „alten“ Lösungen gilt in diesem Fall jedoch nicht). Es kann 
allerdings ratsam sein, die Anzahl an Probenahmen in der ersten 
Woche zu erhöhen (z. B. drei Messreihen), um sicherzugehen, dass die Prüfkonzentrationen stabil bleiben. Bei diesen Prüfarten sollte die Durchsatzrate des Verdünnungsmittels und der Prüfsub ­
stanz täglich überprüft werden.
 
Ist nachgewiesen, dass die Konzentration der geprüften Substanz 
während der gesamten Prüfung zufrieden stellend innerhalb von ± 20 % der Nominalkonzentration oder der gemessenen Anfangskon ­
zentration bleibt, können die Ergebnisse auf nominalen oder gemes ­
senen Anfangswerten beruhen. Wenn die Abweichung von der no ­
minalen oder gemessenen Anfangskonzentration größer als ± 20 % ist, sollten die Ergebnisse als zeitgewichtetes Mittel dargestellt wer ­
den (siehe Anlage 5).
 
2. DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
2.1. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE  
Mit dieser Prüfung soll die Wirkung der Prüfsubstanz auf die Ge ­
samtanzahl an lebenden Nachkommen, die pro am Ende der Prüfung noch lebendem Elterntier produziert wurden, bestimmt werden. Da ­
bei sollte die Gesamtanzahl an Nachkommen je Elterntier für jedes 
Prüfgefäß (d. h. für jede Wiederholung) berechnet werden. Wenn in 
einer Wiederholung das Elterntier während der Prüfung stirbt oder sich als Männchen herausstellt, dann wird die Wiederholung von der Analyse ausgeschlossen. Die Analyse beruht dann auf einer verrin ­
gerten Anzahl von Wiederholungen.
 
Zur Schätzung der LOEC und damit auch der NOEC für Wirkungen 
der Chemikalie auf die Reproduktionsleistung müssen die mittlere Reproduktionsleistung unter den Wiederholungen für jede Konzen ­
tration und die gepoolte Reststandardabweichung berechnet werden; 
dies kann durch eine Varianzanalyse (ANOVA) erfolgen. Der Mittel ­
wert für jede Konzentration muss dann mit Hilfe einer angemessenen Mehrfachvergleichsmethode mit dem Kontrollmittelwert verglichen werden. Von Nutzen können dabei Dunnett’sche oder Williams’sche 
Tests sein (14) (15) (16) (17). Überprüft werden muss, ob die ANO ­
VA-Voraussetzung der Homogenität der Varianz zutreffend ist. Es wird empfohlen, dies eher grafisch als durch eine formale Signifi ­
kanzprüfung zu ermitteln (18); eine geeignete Alternative besteht in 
der Durchführung eines Bartlett’schen Tests. Gilt diese Annahme 
nicht, sollte überlegt werden, die Daten zur Homogenisierung von Varianzen vor der Durchführung der ANOVA zu transformieren oder eine gewichtete ANOVA durchzuführen. Der Umfang der mit der 
ANOVA nachweisbaren Wirkung (d. h. die geringste signifikante 
Differenz) sollte berechnet und protokolliert werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1115
 
Zur Schätzung der Konzentration, die eine 50 %ige Verringerung der 
Reproduktionsleistung verursachen würde (d. h. die EC  50 ), sollte 
eine geeignete Kurve wie beispielsweise die logistische Kurve an die Daten unter Einsatz eines statistischen Verfahrens wie der Me ­
thode der kleinsten Quadrate angepasst werden. Die Kurve könnte so 
parametriert werden, dass die EC
 50 und deren Standardfehler direkt 
abgeschätzt werden können. Dies würde die Berechnung des Ver ­
trauensbereichs für die EC  50 deutlich erleichtern. Soweit keine guten 
Gründe dafür vorliegen, anderen Vertrauensbereichen den Vorzug zu 
geben, sollte der zweiseitige 95 %-Vertrauensbereich angegeben wer ­
den. Das Anpassungsverfahren sollte möglichst einen Weg bieten, um die Signifikanz der mangelnden Anpassung zu bewerten. Dies kann grafisch erfolgen oder indem man die Restsumme der Quadrate 
in „mangelnde Anpassung“ und „reine Fehlerkomponenten“ unter ­
teilt und eine Signifikanzprüfung für die mangelnde Anpassung durchführt. Da Behandlungen, die zu einer höheren Fruchtbarkeit führen, wahrscheinlich eine größere Varianz in der Anzahl an pro ­
duzierten Jungtieren aufweisen als Behandlungen, die eine niedrige 
Fruchtbarkeit ergeben, sollte eine Gewichtung der beobachteten Werte in Erwägung gezogen werden, um den unterschiedlichen Va ­
rianzen in den verschiedenen Behandlungsgruppen Rechnung zu tra ­
gen (Hintergrundinformationen siehe Literaturhinweis 18).
 
Bei der Analyse der Daten aus dem endgültigen Ringversuch (2) wurde 
eine logistische Kurve anhand des folgenden Modells angepasst, auch wenn andere geeignete Modelle herangezogen werden können:
 
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
Dabei gilt:  
Y = Gesamtanzahl an Jungtieren pro Elterntier, das am Ende der 
Prüfung noch lebt (für jedes Gefäß berechnet)  
x = Konzentration der Substanz  
c = Erwartete Anzahl an Jungtieren bei x = 0  
x 0 = EC  50 in der Population  
b = Steigungsparameter.  
Dieses Modell kommt wahrscheinlich für eine große Anzahl von 
Situationen in Frage, es wird jedoch Prüfungen geben, bei denen es nicht angemessen ist. Wie oben angeregt, sollte die Validität des Modells überprüft werden. In einigen Fällen kann auch ein Hor ­
mesis-Modell, bei dem niedrige Konzentrationen zu größeren Wir ­
kungen führen, angebracht sein (19).
 
Andere Wirkkonzentrationen wie die EC  10 oder EC  20 können eben ­
falls geschätzt werden, auch wenn vielleicht besser eine andere Pa ­
rametrierung für das Modell als bei der Schätzung der EC  50 zu ver­
wenden ist.  
2.2. ABSCHLUSSBERICHT  
Der Prüfbericht muss die folgenden Angaben enthalten:  
2.2.1.  Prüfsubstanz  
— Physikalische Beschaffenheit und relevante physikalisch-che ­
mische Eigenschaften;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1116
 
— Daten zur chemischen Identität, einschließlich Reinheit.  
2.2.2.  Geprüfte Daphnienart  
— Der Klon (ob er einer Gentypisierung unterzogen wurde), der 
Lieferant oder die Bezugsquelle (sofern bekannt) und die zum Einsatz kommenden Kulturbedingungen. Wird eine andere Art 
als Daphnia magna eingesetzt, sollte dies protokolliert und be ­
gründet werden.
 
2.2.3.  Prüfbedingungen  
— Zum Einsatz kommendes Prüfverfahren (z. B. semistatisches oder 
Durchflussverfahren, Volumen, Besatz mit Anzahl Daphnien pro Liter);
 
— Belichtungsdauer und Lichtstärke;  
— Auslegung der Prüfung (z. B. Anzahl an Wiederholungen, An ­
zahl an Elterntieren je Wiederholung);  
— nähere Angaben zum verwendeten Kulturmedium:  
— sofern verwendet, zugesetztes organisches Material, einschließ ­
lich Zusammensetzung, Herkunft, Herstellungsverfahren, TOC/ ­
COD der Stammansätze, Schätzung des sich daraus ergebenden TOC/COD im Prüfmedium;
 
— detaillierte Informationen über die Fütterung, einschließlich 
Menge (in mg C/Daphnie/Tag) und Plan (z. B. Art von Futter ­
mittel(n), einschließlich spezifischer Name (Art) bei Algen und, 
sofern bekannt, der Stamm, die Kulturbedingungen);  
— Art der Herstellung von Stammansätzen und Häufigkeit der Er ­
neuerung (sofern verwendet, müssen das Löse- oder Dispersions ­
mittel und dessen Konzentration angegeben werden).  
2.2.4.  Ergebnisse  
— Ergebnisse von eventuellen vorhergehenden Untersuchungen zur 
Stabilität der Prüfsubstanz;  
— die nominalen Prüfkonzentrationen und die Ergebnisse aller Ana ­
lysen zur Bestimmung der Konzentration der Prüfsubstanz in den Prüfgefäßen (siehe Beispieldatenblätter in Anlage 4); die Resti ­
tutionsgüte der Methode und die Bestimmungsgrenze sollten 
ebenfalls protokolliert werden;
 
— Wasserqualität innerhalb der Prüfgefäße (d. h. pH-Wert, Tem ­
peratur und gelöste Sauerstoffkonzentration sowie TOC und/oder 
COD und Härte, soweit zutreffend) (siehe Beispieldatenblatt in Anlage 3);
 
— die gesamte Aufzeichnung der lebenden Nachkommen für jedes 
Elterntier (siehe Beispieldatenblatt in Anlage 3);  
— die Anzahl an Todesfällen unter den Elterntieren und der Tag, an 
dem diese eingetreten sind (siehe Beispieldatenblatt in Anlage 3);  
— der Variationskoeffizient für die Kontrollfruchtbarkeit (anhand 
der Gesamtanzahl von lebenden Nachkommen je Elterntier, das am Ende der Prüfung noch lebt);
 
— Darstellung der Gesamtanzahl an lebenden Nachkommen je El ­
terntier (für jede Wiederholung), das am Ende der Prüfung noch 
lebt, im Verhältnis zur Prüfkonzentration der Prüfsubstanz;  
— die Lowest Observed Effect Concentration (LOEC) für die Re ­
produktion, einschließlich einer Beschreibung der eingesetzten 
statistischen Verfahren und einer Angabe zum Umfang der Wir ­
kung, die nachgewiesen werden konnte, und die No Observed Effect Concentration (NOEC) für die Reproduktion; soweit zu ­
treffend, sollten die LOEC/NOEC für die Mortalität der Eltern ­
tiere ebenfalls protokolliert werden;
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1117
 
— soweit zutreffend, die EC  x für die Reproduktion und die Ver ­
trauensbereiche und ein Diagramm für das angepasste Modell, 
das für deren Berechnung herangezogen wurde, die Steigung der Dosisreaktionskurve und deren Standardfehler;
 
— andere beobachtete biologische Wirkungen oder Messungen: alle 
anderen biologischen Wirkungen dokumentieren, die beobachtet oder gemessen wurden (z. B. Wachstum von Elterntieren), ein ­
schließlich einer angemessenen Begründung;
 
— eine Erklärung für eine eventuelle Abweichung von der Prüf ­
methode.  
3. LITERATURHINWEISE  
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna  Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 
20-21 March 1993.  
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series 
on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring 
Test of the Daphnia  magna  Reproduction Test Paris. 1997.  
(3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C., Soares A. M. V. M. and 
Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity 
to acute toxic stress using clones of  Daphnia magna  Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, pp. 257-265.  
(4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia magna  
Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33.  
(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Or ­
ganisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
 
(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as Standard medium for culturing Daphnia  magna.  Bull. 
Environ. Contam. Toxicol., 47, pp. 775-782.  
(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 pp.
 
(8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley 
M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of  
Daphnia magna  Straus for use in ecotoxicological tests; pro ­
blems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Con ­
ference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H. Løkke, H. 
Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), pp. 144-148.  
(9) Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Repro ­
ducibility of a life-cycle toxicity test with  Daphnia magna.  
Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, pp. 1-8.  
(10) Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), pp. 185-196.
 
(11) Korshikov (1990).  Pseudokirchneriella subcapitata  Hindak, F- 
1990. Biologice Prace, 36, 209.  
(12) Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a Stan ­
dard Daphnia  juvenile production test. Environmental Toxico ­
logy and Chemistry, 12, pp. 2053-2058.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1118
 
(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three commonly 
used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, pp. 459-466.
 
(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, pp. 1096-1121.  
(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero 
dose control. Biometrics 27, pp. 103-117.  
(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, pp. 510-531.  
(18) Draper N, R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is Stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29. pp. 93-96.  
(20) Wilson E. O. and Bossen, W. H. (1971). A Primer of Popu ­
lation Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.  
(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, pp. 
5 32.  
(22) Meyer J. S. . Ingersoll C. G., McDonald L. L. and Boyce M. 
S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, pp. 1156-1166.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1119
 
Anlage 1  
HERSTELLUNG DER VOLLSTÄNDIG DEFINIERTEN MEDIEN 
ELENDT M7 UND M4  
Gewöhnung an die Medien Elendt M7 und M4  
Einige Prüfeinrichtungen haben Schwierigkeiten,  Daphnien  direkt in die Medien 
M4 (1) und M7 umzusetzen. Erfolg wurde jedoch mit einer schrittweisen Einge ­
wöhnung erzielt, d. h. dem Wechsel von dem eigenen Medium in 30 %iges Elendt, dann in 60 %iges Elendt und dann in 100 %iges Elendt. Die Einge ­
wöhnungszeiten können dabei durchaus einen Monat betragen.
 
HERSTELLUNG  
Spurenelemente  
Zunächst werden gesonderte Stammansätze (I) einzelner Spurenelemente in Was ­
ser mit geeignetem Reinheitsgrad, z. B. entionisiertes oder destilliertes Wasser 
oder Wasser aus umgekehrter Osmose, hergestellt. Aus diesen unterschiedlichen 
Stammansätzen (I) wird ein zweiter alleiniger Stammansatz (II) hergestellt, der alle Spurenelemente enthält (kombinierte Lösung), d. h.:
 
Stammansätze I 
(einzelne Substanz) Wasser zugesetzte 
Menge 
(mg/l) Konzentration (in 
Verhältnis zum 
Medium M4) 
(x-fach) Zur Herstellung des kombinierten 
Stammansatzes II zu Wasser die 
folgende Menge an Stammansatz I 
zugeben 
(ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 * 4 H  2 0 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 SrCl
 2 * 6 H  2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4 * 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2 H  2 0 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 * 6 H  2 0 200 20 000 1,0 1,0 
Kl 65 20 000 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA * 2 H  2 O 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 * H  2 O 1 991 2 000 — — 
Sowohl die Na  2 EDTA- als auch die FeSO  4 -Lösung werden einzeln hergestellt, zusammengegossen und sofort im 
Autoklaven behandelt. Dies ergibt: 
21 Fe-EDTA-Lösung 1 000 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1120
 
Medien M4 und M7  
Die Medien M4 und M7 werden anhand des Stammansatzes II, der Makronähr ­
stoffe und Vitamine wie folgt hergestellt:  
Wasser zugesetzte 
Menge 
(mg/l) Konzentration (im 
Verhältnis zum 
Medium M4) 
(x-fach) Zur Herstellung des Mediums zugesetzte 
Menge an Stammansatz 
(ml/l) 
M4 M7  
Stammansatz II kombinierte Spurenelemente 20 50 50 
Makronährstoff-Stammansätze (einzelne Substanz) CaCl
 2 * 2 H  2 O 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7 H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KC1 58 000 10 000 0,1 0,1 
NaHCO  3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 * 9 H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Kombinierter Vitaminstammansatz — 10 000 0,1 0,1 
Der kombinierte Vitaminstammansatz wird hergestellt, indem man die 3 Vitamine einem Liter Wasser zusetzt, wie im 
Folgenden angegeben: 
Thiaminhydrochlorid 750 10 000 — — 
Cyanocobalamine (B  12 ) 10 10 000 — — 
Biotine 7,5 10 000 — —  
Der kombinierte Vitaminstammansatz wird in kleinen Portionen tiefgefroren aufbewahrt. Vitamine werden den Medien kurz vor der 
Verwendung zugesetzt. 
Hinweise Um die Ausfällung von Salzen bei der Herstellung der vollständigen Medien zu vermeiden, die Portionen von Stammansätze n 
in etwa 500 bis 800 ml Wasser entionisiertes Wasser geben und dann auf 1 Liter auffüllen. 
Erstmals in einer Publikation erwähnt wird das Medium M4 bei Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, 25-3 3.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1121
 
Anlage 2  
ANALYSE DES GESAMTEN ORGANISCHEN KOHLENSTOFFS (TOC) 
UND ERSTELLUNG VON NOMOGRAMMEN FÜR DEN TOC-GEHALT 
VON ALGENFUTTER  
Bekanntermaßen wird der Kohlenstoffgehalt des Algenfutters normalerweise 
nicht direkt gemessen, sondern aus Korrelationen (d. h. Nomogrammen) mit 
Ersatzgrößen wie der Algenzeilenzahl oder der Lichtextinktion abgeleitet.  
Der TOC sollte eher durch Oxidation bei hoher Temperatur als durch UV- oder 
Persulfatmethoden gemessen werden (siehe hierzu auch: The Instrumental De ­
termination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related De ­
terminands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).  
Für die Erstellung von Nomogrammen sollten die Algen durch Zentrifugierung 
von dem Wachstumsmedium getrennt werden, gefolgt von einer Resuspension in destilliertem Wasser. Den Ersatzparameter und die TOC-Konzentration in jeder Probe in einer Dreifachwiederholung messen. Es sollten Blindproben des des ­
tillierten Wassers analysiert und die TOC-Konzentration von der TOC-Konzen ­
tration in der Algenprobe abgeleitet werden.
 
Nomogramme sollten über den geforderten Bereich von Kohlenstoffkonzentratio ­
nen linear verlaufen. Beispiele hierzu finden sich weiter unten.  
Hinweis: Diese Beispiele sollten nicht für Umrechnungen herangezogen werden; 
wichtig ist, dass die Prüfeinrichtungen ihre eigenen Nomogramme erstellen.
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1122
 
▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1123
 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1124
 ▼B 
Anlage 3  
BEISPIELDATENBLATT ZUR PROTOKOLLIERUNG DER ERNEUERUNG DES PRÜFMEDIUMS, VON PHYSIKALISCH-CHEMISCHEN ÜBERWACHUNGSDATEN, DER 
FÜTTERUNG, DAPHNIEN-REPRODUKTION UND MORTALITÄT VON ERWACHSENEN TIEREN  
Versuch Nr. Ausgangsdaten: Klon: Medium: Futterart: Prüfsubstanz: Nominale Konz.: 
Tag 0 I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Mediumerneuerung 
ankreuzen) 
pH-Wert (  1 ) neu 
alt 
O 2 mg/l (  1 ) neu 
alt 
Temp. (  o C) (  1 ) neu 
alt 
Geb. Futter (ankreu ­
zen) 
Anz. leb. 
Nachkommen (  2 ) Gesamt 
Gefäß 1 
2 
3 4 
5
 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1125
 ▼B 
Versuch Nr. Ausgangsdaten: Klon: Medium: Futterart: Prüfsubstanz: Nominale Konz.: 
Tag 0 I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 
9 
10 
Gesamt 
Kumulative Mortalität bei 
erwachs. Tieren (
 3 ) 
( 1 ) Angeben, welches Gefäß für den Versuch verwendet wurde. 
( 2 ) Unreife Bruten als „AB“ in dem betreffenden Kästchen protokollieren. 
( 3 ) Die Mortalität von erwachsenen Tieren als „M“ in dem betreffenden Kästchen protokollieren.
 Anlage 4  
BEISPIELDATENBLATT ZUR PROTOKOLLIERUNG VON ERGEBNISSEN DER CHEMISCHEN 
ANALYSE  
a) Gemessene Konzentrationen  
Nominale Konz. Woche 1 Probe Woche 2 Probe Woche 3 Probe 
Frisch Alt Frisch Alt Frisch Alt  
b) Gemessene Konzentrationen in Prozent der Nominalkonzentrationen  
Nominale Konz. Woche 1 Probe Woche 2 Probe Woche 3 Probe 
Frisch Alt Frisch Alt Frisch Alt  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1126
 
Anlage 5  
BERECHNUNG EINES ZEITGEWICHTETEN MITTELS  
Zeitgewichtetes Mittel  
In Anbetracht der Tatsache, dass sich die Konzentration der Prüfsubstanz während 
des Zeitraums zwischen den Erneuerungen des Prüfmediums verringern kann, muss 
überlegt werden, welche Konzentration als für den Konzentrationsbereich, dem die 
Elterndaphnien ausgesetzt werden, repräsentativ ausgewählt werden sollte. Die Aus ­
wahl sollte dabei sowohl auf biologischen als auch auf statistischen Erwägungen beruhen. Wenn man beispielsweise davon ausgeht, dass die Reproduktion am stärks ­
ten durch die zur Anwendung kommende Spitzenkonzentration beeinflusst wird, 
dann sollte die maximale Konzentration herangezogen werden. Wenn jedoch die kumulierte oder längerfristige Wirkung der toxischen Substanz für wichtiger gehalten wird, dann hat eine Durchschnittskonzentration eine größere Relevanz. In diesem Fall 
besteht ein geeigneter anzusetzender Durchschnittswert aus der zeitgewichteten mitt ­
leren Konzentration, da hierbei die Streubreite der Augenblickskonzentration im Laufe der Zeit berücksichtigt wird.
 
Bild 1:  
Beispiel für ein zeitgewichtetes Mittel
  
Bild 1 zeigt ein Beispiel für eine (vereinfachte) Prüfung, die 7 Tage dauert und 
bei der an Tag 0, 2 und 4 das Prüfmedium erneuert wird.  
Die dünne Zickzacklinie stellt die Konzentration zu jedem Zeitpunkt dar. 
Es wird angenommen, dass der Rückgang der Konzentration einem expo ­
nentiellen Zerfallsprozess folgt.  
Die 6 eingezeichneten Punkte stellen die beobachteten Konzentrationen dar, 
die am Anfang und am Ende eines jeden Erneuerungszeitraums gemessen 
wurden.  
Die dicke durchgezogene Linie gibt die Lage des zeitgewichteten Mittels an.  
Das zeitgewichtete Mittel wird so berechnet, dass die Fläche unterhalb des zeit ­
gewichteten Mittels gleich der Fläche unterhalb der Konzentrationskurve ist. Die 
Berechnung für das oben genannte Beispiel wird in Tabelle 1 dargestellt.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1127
 
Table 1:  
Berechnung des zeitgewichteten Mittels  
Erneuerung Nr. Tage Konz0 Konz1 Ln (Konz0) Ln (Konz1) Fläche  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Gesamtanzahl Tage: 7 Gesamtfläche 50,091 
Zeitgew. 
Mittel 7,156
 
„Tage“ steht für die Anzahl von Tagen des Erneuerungszeitraums.  
„Konz0“ ist die gemessene Konzentration zu Beginn eines jeden Erneuerungszeitraums.  
„Konz1“ ist die gemessene Konzentration am Ende eines jeden Erneuerungszeitraums.  
„Ln(Konz0)“ ist der natürliche Logarithmus von Konz0.  
„Ln(Konz1)“ ist der natürliche Logarithmus von Konz1.  
„Fläche“ ist die Fläche unter der exponentiellen Kurve für jeden Erneuerungszeitraum. Sie 
wird wie folgt berechnet:  
Fläche ¼ Konz0 Ä Konz 1 
LnðKonz0Þ Ä LnðKonz 1Þ Ü Tage  
Das zeitgewichtete Mittel (zeitgew. Mittel) ist gleich der „Gesamtfläche“ dividiert 
durch die „Gesamtanzahl Tage“.  
Natürlich müsste die Tabelle für die Daphnien-Reproduktionsprüfung auf einen 
Zeitraum von 21 Tagen erweitert werden.  
Klar ist, dass, wenn Beobachtungen nur am Anfang und am Ende eines jeden 
Erneuerungszeitraums erfolgen, nicht bestätigt werden kann, ob der Zerfallspro ­
zess tatsächlich exponentiell verläuft. Eine andere Kurve würde zu einer anderen 
Berechnung für die „Fläche“ führen. Jedoch ist ein exponentieller Zerfallsprozess durchaus plausibel und wahrscheinlich die beste Kurve, die bei Fehlen anderer Informationen zu verwenden ist.
 
Vorsicht ist allerdings geboten, wenn in der chemischen Analyse am Ende des 
Erneuerungszeitraums keine Substanz gefunden wird. Sofern keine Möglichkeit 
besteht, abzuschätzen, wie schnell die Substanz aus der Lösung verschwunden ist, ist es unmöglich, eine realistische Fläche unter der Kurve zu erhalten, und 
damit auch unmöglich, ein vernünftiges zeitgewichtetes Mittel zu bestimmen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1128
 
C.21.  BODENMIKROORGANISMEN: STICKSTOFFTRANSFORMA ­
TIONSSTEST  
1. METHODE  
Diese Testmethode entspricht der Prüfrichtlinie OECD TG 216 
(2000).  
1.1. EINLEITUNG  
Diese Testmethode beschreibt eine Labormethode zur Untersuchung 
der Langzeitauswirkungen von Chemikalien auf die Stickstofftrans ­
formationsaktivität von Bodenmikroorganismen nach einmaliger Ex ­
position. Der Test beruht im Wesentlichen auf den Empfehlungen 
der Pflanzenschutzorganisation für Europa und den Mittelmeerraum (1), doch auch andere Richtlinien wurden berücksichtigt, wie die der 
deutschen Biologischen Bundesanstalt (2), der US-amerikanischen 
Environmental Protection Agency (3), SETAC (4) und von der In ­
ternationalen Organisation für Normung (5). Auf einem OECD- Workshop zur Boden-/Sedimentauswahl, der 1995 im italienischen 
Belgirate stattfand (6), wurden die bei diesem Test zu verwendende 
Anzahl und Art von Böden vereinbart. Die Empfehlungen zur Ent ­
nahme, Behandlung und Lagerung von Bodenproben basieren auf einer ISO-Anleitung (7) und auf Empfehlungen des Belgirate-Work ­
shops. Bei der Be- und Auswertung toxischer Eigenschaften von 
Testsubstanzen kann eine Bestimmung der Auswirkungen auf die mikrobielle Aktivität des Bodens erforderlich sein, z. B. wenn Daten zu möglichen Nebenwirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf die 
Mikroflora des Bodens benötigt werden oder wenn eine Exposition 
von Bodenmikroorganismen gegenüber anderen Chemikalien als Pflanzenschutzmitteln erwartet wird. Der Stickstofftransformations ­
test wird durchgeführt, um den Einfluss derartiger Chemikalien auf 
die Bodenmikroflora zu ermitteln. Bei der Prüfung von Agroche ­
mikalien (z. B. Pflanzenschutzmittel, Düngemittel, Forstchemika ­
lien), werden sowohl Stickstoff- als auch Kohlenstofftransformations ­
tests durchgeführt. Bei anderen Substanzen als Agrochemikalien ge ­
nügt der Stickstofftransformationstest. Liegen jedoch die EC
 50 -Werte 
des Stickstofftransformationstests bei diesen Chemikalien im Be ­
reich, der für käufliche Nitrifikationshemmstoffe (z. B. Nitrapyrin) ermittelt wurde, kann ein Kohlenstofftransformationstest durch ­
geführt werden, um weitere Informationen zu gewinnen,
 
Boden besteht sowohl aus lebenden als auch aus nichtlebenden 
Komponenten, die in komplexen und heterogenen Gemischen vor ­
kommen. Beim Abbau organischen Materials und seiner Transfor ­
mation in fruchtbaren Böden spielen Mikroorganismen eine wichtige Rolle, wobei viele Arten für unterschiedliche Aspekte der Boden ­
fruchtbarkeit verantwortlich sind. Jede langfristige Störung dieser 
biochemischen Prozesse kann sich potenziell auf den Nährstoffkreis ­
lauf auswirken und dadurch wiederum die Bodenfruchtbarkeit beein ­
flussen. Die Transformation von Kohlenstoff und Stickstoff erfolgt in allen fruchtbaren Böden. Die Transformationspfade sind im Wesent ­
lichen gleich, auch wenn je nach Boden unterschiedliche mikrobielle 
Populationen für diese Prozesse verantwortlich sind.
 
Mit der hier beschriebenen Testmethode können durch einen Stoff 
hervorgerufene langfristige nachteilige Auswirkungen auf den Pro ­
zess der Stickstofftransformation in aeroben Oberböden bestimmt 
werden. Darüber hinaus ermöglicht die Testmethode die Abschät ­
zung der Auswirkungen von Substanzen auf die Kohlenstoff ­
umwandlung durch die Bodenmikroflora. Die Nitratbildung findet 
nach dem Zerfall der Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen statt. Werden 
also bei behandelten und Kontrollböden gleiche Nitratbildungsraten festgestellt, sind höchstwahrscheinlich die wichtigsten Kohlenstoff ­
abbauwege intakt und funktionstüchtig. Das für den Test gewählte 
Substrat (pulverisiertes Luzernemehl) besitzt ein günstiges Kohlen ­
stoff-Stickstoff-Verhältnis (in der Regel zwischen 12:1 und 16:1). Deshalb wird der Kohlenstoffmangel während des Tests verringert, und sollten mikrobielle Populationen durch eine Chemikalie geschä ­
digt werden, könnten sie sich innerhalb von 100 Tagen wieder er ­
holen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1129
 
Die Tests, auf deren Grundlage diese Testmethode entwickelt wurde, 
waren in erster Linie für Substanzen ausgelegt, bei denen die in den 
Boden gelangende Menge vorherbestimmt werden kann. Dies ist z. B. bei Pflanzenschutzmitteln der Fall, bei denen die Applikations ­
rate auf dem Feld bekannt ist. Bei Agrochemikalien genügt es, zwei 
Konzentrationen zu testen, die für die erwartete oder vorhergesagte 
Applikationsmenge relevant sind. Agrochemikalien können als Wirk ­
stoffe (a.i.) oder als formulierte Handelsprodukte getestet werden. Der Test ist jedoch nicht auf Agrochemikalien begrenzt. Durch Ver ­
änderung sowohl der Mengen der auf den Boden aufgebrachten Test ­
substanz als auch der Art und Weise, wie die Daten ausgewertet werden, kann der Test auch für Chemikalien angewendet werden, bei denen nicht bekannt ist, in welcher Menge sie in den Boden 
gelangen. Somit werden bei anderen Substanzen als Agrochemika ­
lien die Wirkungen einer Reihe von Konzentrationen auf die Stick ­
stoffumwandlung bestimmt. Die Daten dieser Tests werden verwen ­
det, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu erstellen und EC
 x -Werte zu 
berechnen, wobei x als die Wirkung in % definiert ist.  
1.2. DEFINITIONEN  
Stickstofftransformation: der Endabbau stickstoffhaltiger organischer 
Substanz durch Mikroorganismen über die Schritte Ammonifikation 
und Nitrifikation zum entsprechenden anorganischen Endprodukt Ni ­
trat. 
EC x (Effektkonzentration): diejenige Konzentration der Testsubstanz 
im Boden, die die Umwandlung von Stickstoff in Nitrat zu x % hemmt.
 
EC 50 (Medianwert der Effektkonzentration): diejenige Konzentration 
der Testsubstanz im Boden, die die Transformation von Stickstoff in Nitrat zu 50 Prozent (50 %) hemmt.
 
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Keine.  
1.4. PRINZIP DER TESTMETHODE  
Gesiebter Boden wird mit pulverisiertem Pflanzenmehl angereichert 
und entweder mit der Testsubstanz behandelt oder unbehandelt 
(Kontrollprobe) belassen. Werden Agrochemikalien geprüft, wird eine Mindestanzahl von zwei Testkonzentrationen empfohlen, die im Verhältnis zur höchsten auf dem Feld erwarteten Konzentration 
gewählt werden sollten. Nach 0, 7, 14 und 28 Tagen Inkubation 
werden Proben behandelter und unbehandelter Böden mit einem ge ­
eigneten Lösungsmittel extrahiert, und die Nitratmengen in den Ex ­
trakten bestimmt. Die Nitratbildungsrate in behandelten Proben wird 
mit der in den Kontrollproben verglichen, und es wird die prozen ­
tuale Abweichung der behandelten Proben von den Kontrollproben berechnet. Alle Versuche laufen über mindestens 28 Tage. Sind die Differenzen zwischen behandelten und unbehandelten Böden am 
28. Tag gleich oder größer als 25 %, werden die Messungen bis 
zur Höchstdauer von 100 Tagen fortgesetzt. Werden andere Sub ­
stanzen als Agrochemikalien geprüft, wird die Testsubstanz in einer Reihe von Konzentrationen Proben des Bodens zugesetzt, und nach 
28 Tagen Inkubation werden die Mengen des gebildeten Nitrats in 
behandelten Proben und in Kontrollproben gemessen. Die Ergebnisse aus Versuchen mit mehreren unterschiedlichen Konzentrationen wer ­
den mit Hilfe eines Regressionsmodells analysiert, und die EC
 x - 
Werte berechnet (d. h. EC  50 , EC  25 und/oder EC  10 ). Siehe Definitio ­
nen. 
1.5. VALIDITÄT DES TESTS  
Auswertungen von Testergebnissen mit Agrochemikalien beruhen 
auf vergleichsweise kleinen Differenzen (d. h. Mittelwert ± 25 %) 
zwischen Nitratkonzentrationen in Kontrollproben und behandelten Bodenproben, so dass große Schwankungen bei den Kontrollproben zu falschen Ergebnissen führen können. Daher sollte die Schwan ­
kungsbreite zwischen Replikatkontrollproben weniger als ± 15 % 
betragen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1130
 
1.6. BESCHREIBUNG DER TESTMETHODE  
1.6.1.  Geräte  
Es werden Testgefäße aus chemisch inertem Material verwendet. Ihr 
Fassungsvermögen sollte sich nach dem gewählten Inkubationsver ­
fahren der Böden richten, d. h. für die Inkubation von Sammelpro ­
ben oder einer Reihe einzelner Bodenproben (siehe 1.7.1.2). Wäh ­
rend des Tests ist darauf zu achten, dass sowohl der Wasserverlust möglichst gering gehalten wird als auch ein Gasaustausch stattfinden 
kann (so könnten die Testbehälter z. B. mit perforierter Polyethylen ­
folie abgedeckt werden). Beim Testen flüchtiger Substanzen sind abdichtbare und gasdichte Behälter zu verwenden. Diese sollten in 
ihrer Größe so bemessen sein, dass sie etwa zu einem Viertel ihres 
Volumens mit der Bodenprobe gefüllt sind.
 
Verwendet werden Standardlaborgeräte, darunter folgende:  
— Schüttelvorrichtung: mechanischer Schüttler oder gleichwertiges 
Gerät;  
— Zentrifuge (3 000 g) oder Filtriervorrichtung (mit nitratfreiem 
Filterpapier);  
— Messgerät mit geeigneter Empfindlichkeit und Reproduzierbar ­
keit für die Nitratanalyse.  
1.6.2.  Auswahl und Anzahl der Röden  
Es wird ein einziger Boden verwendet. Empfohlen wird Boden mit 
folgenden Eigenschaften:  
— Sandgehalt: mindestens 50 % und höchstens 75 %;  
— pH: 5,5-7,5;  
— organischer Kohlenstoffgehalt: 0,5-1,5 %;  
— es ist die mikrobielle Biomasse zu bestimmen (8) (9), und ihr 
Kohlenstoffgehalt sollte mindestens 1 % des gesamten organi ­
schen Kohlenstoffs des Bodens betragen.  
Meist stellt ein Boden mit diesen Eigenschaften den „worst case“ 
dar, da seine Adsorption minimal und die Verfügbarkeit der Test ­
chemikalie für die Mikroflora maximal ist. Demnach sind in aller 
Regel keine Tests mit anderen Böden notwendig. Unter bestimmten Umständen jedoch, wenn z. B. der erwartete hauptsächliche Einsatz der Testsubstanz auf bestimmten Böden wie sauren Waldböden statt ­
findet, oder bei elektrostatisch aufgeladenen Chemikalien kann es 
erforderlich sein, einen zusätzlichen Boden zu verwenden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1131
 
1.6.3.  Entnahme und Lagerung von Bodenproben  
1.6.3.1.  Entnahme  
Es sind ausführliche Informationen über die Vorgeschichte des Feld ­
standorts erforderlich, von dem der Testboden entnommen wird. Diese 
Angaben beinhalten unter anderem die genaue Lage, den Bewuchs, die 
Behandlung mit Pflanzenschutzmitteln sowie mit organischen und an ­
organischen Düngemitteln, Zugaben biologischen Materials oder unbe ­
absichtigte Kontaminationen. Der für die Bodenentnahme gewählte 
Standort muss über einen längeren Zeitraum hinweg nutzbar sein. Ge ­
eignet sind Dauerweiden, Felder mit einjährigen Getreidekulturen (aus ­
genommen Mais) oder dicht gesäten Gründüngungspflanzen. Der ge ­
wählte Probenahmestandort sollte mindestens ein Jahr vor der Pro ­
benahme nicht mit Pflanzenschutzmitteln behandelt worden sein. Ferner sollten mindestens sechs Monate vorher keine organischen Düngemittel ausgebracht worden sein. Die Verwendung von Mineraldünger ist nur 
zulässig, wenn dies für die Kultur erforderlich ist, und die Entnahme der 
Bodenproben sollte frühestens drei Monate nach Ausbringung des Dün ­
gemittels erfolgen. Zu vermeiden ist die Verwendung von Boden, der mit Düngemitteln mit bekannter biozider Wirkung (z. B. Kalkstickstoff) 
behandelt wurde.
 
Die Probenahme während oder unmittelbar nach längeren (mehr als 
30 Tage) Dürre- oder Überschwemmungsperioden sollte vermieden 
werden. Bei gepflügten Böden sind die Proben aus einer Tiefe von 
0 bis 20 cm zu entnehmen. Bei Grünland (Weiden) oder anderen Böden, die über längere Zeiträume (mindestens eine Vegetationsperi ­
ode) nicht gepflügt werden, kann die maximale Tiefe der Pro ­
benahme geringfügig über 20 cm liegen (z. B. bei bis zu 25 cm).
 
Die Bodenproben sollten in Behältern und unter Temperaturbedin ­
gungen transportiert werden, die sicherstellen, dass die ursprüng ­
lichen Bodeneigenschaften nicht wesentlich verändert werden.  
1.6.3.2.  Lagerung  
Bevorzugt wird die Verwendung feldfrischer Böden. Lässt sich die 
Lagerung im Labor nicht vermeiden, sollten die Böden im Dunkeln bei 4 ± 2
 o C höchstens drei Monate gelagert werden. Während der 
Lagerung der Böden müssen aerobe Bedingungen sichergestellt sein. 
Werden Böden von Flächen entnommen, die über mindestens drei Monate im Jahr gefroren sind, kann eine Lagerung für sechs Monate bei — 18
 o C bis — 22  o C in Betracht gezogen werden. Vor jedem 
Versuch ist die mikrobielle Biomasse der gelagerten Böden zu be ­
stimmen, und der Kohlenstoffgehalt in der Biomasse sollte mindes ­
tens 1 % des gesamten organischen Kohlenstoffs des Bodens befra ­
gen (siehe 1.6.2).  
1.6.4.  Handhabung und Vorbereitung des Bodens für den Test  
1.6.4.1.  Vorinkubation  
Falls der Boden gelagert wurde (siehe 1.6.3.2), wird eine Vorinku ­
bation über eine Zeitdauer von  2 bis 28 Tagen empfohlen. Die Tem ­
peratur und der Feuchtegehalt des Bodens während der Vorinkuba ­
tion sollten den Testbedingungen möglichst entsprechen (siehe 
1.6.4.2 und 1.7.1.3).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1132
 
1.6.4.2.  Physikalisch-chemische Eigenschaften  
Der Boden wird manuell von großen Gegenständen befreit (z. B. 
Steine, Pflanzenteile usw.) und im feuchten Zustand ohne übermäßi ­
ges Austrocknen auf eine Partikelgröße von kleiner als oder gleich 
2 mm gesiebt. Der Feuchtegehalt der Bodenprobe sollte mit destil ­
liertem oder entionisiertem Wasser auf einen Wert zwischen 40 % und 60 % der maximalen Wasserhaltekapazität eingestellt werden.
 
1.6.4.3.  Anreicherung mit organischem Substrat  
Der Boden ist mit einem geeigneten organischen Substrat anzurei ­
chern, z. B. pulverisiertem Luzernegrüngrasmehl (Hauptbestandteil:  
Medicago sativa)  mit einem C:N-Verhältnis zwischen 12:1 und 
16:1. Empfohlen wird ein Luzerne-Boden-Verhältnis von 5 g Lu ­
zerne je kg Boden (Trockengewicht).  
1.6.5.  Vorbereitung der Testsubstanz zur Applikation auf den Boden  
Üblicherweise wird die Testsubstanz unter Verwendung eines Trä ­
gers zugegeben. Bei diesem Träger kann es sich um Wasser (bei wasserlöslichen Substanzen) oder einen inerten Feststoff wie feiner Quarzsand (Partikelgröße: 0,1-0,5 mm) handeln. Andere flüssige Trä ­
ger als Wasser (z. B. organische Lösungsmittel wie Aceton oder 
Chloroform) sind zu vermeiden, da sie die Mikroflora schädigen können. Wird Sand als Träger benutzt, kann er mit der in einem 
geeigneten Lösungsmittel aufgelösten oder suspendierten Testsub ­
stanz überzogen werden. In diesen Fallen sollte das Lösungsmittel vor dem Mischen mit dem Boden durch Verdampfen entfernt wer ­
den. Zur optimalen Verteilung der Testsubstanz im Boden wird ein 
Verhältnis von 10 g Sand je kg Boden (Trockengewicht) empfohlen. 
Die Kontrollproben werden nur mit einer äquivalenten Menge Was ­
ser und/oder Quarzsand behandelt.
 
Beim Testen flüchtiger Chemikalien sind Verluste während der Be ­
handlung so weit wie möglich zu vermeiden, und es ist nach Mög ­
lichkeit für eine homogene Verteilung im Boden zu sorgen (z. B. indem die Testsubstanz an verschiedenen Stellen in den Boden inji ­
ziert wird).
 
1.6.6.  Testkonzentrationen  
Werden Agrochemikalien geprüft, sind mindestens zwei Konzentra ­
tionen zu verwenden. Die niedrigere Konzentration sollte mindestens der maximalen Menge entsprechen, die unter praxisüblichen Bedin ­
gungen voraussichtlich in den Boden gelangt, während die höhere 
Konzentration ein Mehrfaches der niedrigeren Konzentration sein 
sollte. Die Konzentrationen der dem Boden zugegebenen Testsub ­
stanz werden unter der Annahme einer gleichmäßigen Einarbeitung bis zu einer Tiefe von 5 cm und einer Bodenrohdichte 
von 1,5 berechnet. Bei Agrochemikalien, die direkt auf den Boden 
ausgebracht werden, oder bei Chemikalien, bei denen die den Boden erreichende Menge vorhersagbar ist, werden als Testkonzentrationen die höchste vorhergesagte Umweltkonzentration (PEC) und das Fünf ­
fache dieser Konzentration empfohlen. Substanzen, die voraussicht ­
lich mehrmals in einer Kulturperiode auf den Boden ausgebracht werden, sollten in Konzentrationen getestet werden, die sich durch die Multiplikation der PEC mit der höchsten erwarteten Anzahl der 
Anwendungen ergeben. Allerdings sollte die obere getestete Konzen ­
tration das Zehnfache der höchsten einfachen Applikationsrate nicht übersteigen. Werden andere Substanzen als Agrochemikalien geprüft, wird eine geometrische Reihe von mindestens fünf Konzentrationen 
verwendet. Die getesteten Konzentrationen sollten den zur Bestim ­
mung der EC
 x -Werte notwendigen Bereich abdecken.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1133
 
1.7. DURCHFÜHRUNG DES TESTS  
1.7.1.  Expositionsbedingungen  
1.7.1.1.  Behandlung und Kontrolle  
Werden Agrochemikalien geprüft, wird der Boden in drei Teile glei ­
chen Gewichts aufgeteilt. Zwei Teile werden mit dem produkthalti ­
gen Träger vermischt, und der dritte wird mit dem Träger ohne das Produkt vermischt (Kontrollprobe). Sowohl für die behandelten als auch die unbehandelten Böden wird eine Mindestanzahl von drei 
Replikaten empfohlen. Werden andere Substanzen als Agrochemika ­
lien geprüft, wird der Boden in sechs Teile gleichen Gewichts auf ­
geteilt. Fünf dieser Proben werden mit dem die Testsubstanz ent ­
haltenden Träger vermischt, und die sechste wird mit dem Träger 
ohne die Chemikalie vermischt. Sowohl für die behandelten Proben als auch für die Kontrollproben werden drei Replikate empfohlen. Es ist auf eine homogene Verteilung der Testsubstanz in den behandel ­
ten Bodenproben zu achten. Während des Mischens ist eine Ver ­
dichtung oder Verklumpung des Bodens zu vermeiden.
 
1.7.1.2.  Inkubation von Bodenproben  
Die Inkubation der Bodenproben kann auf zwei Wegen durchgeführt 
werden: als Sammelproben von jedem behandelten und unbehandel ­
ten Boden oder als Reihe von einzelnen, gleich großen Teilproben von jedem behandelten und unbehandelten Boden. Bei flüchtigen Substanzen sollte der Test jedoch nur mit einer Reihe einzelner Teil ­
proben durchgeführt werden. Bei der Inkubation von Böden als 
Sammelproben werden große Mengen von jedem behandelten und unbehandelten Boden vorbereitet und während des Tests je nach Notwendigkeit zu analysierende Teilproben entnommen. Die zu Be ­
ginn für jede Behandlung und Kontrolle vorbereitete Menge ist ab ­
hängig von der Größe der Teilproben, der Anzahl der zur Analyse verwendeten Replikate und der höchsten erwarteten Anzahl von Pro ­
benahmen. Vor der Entnahme von Teilproben sind die inkubierten 
Sammelproben gründlich zu mischen. Bei der Bodeninkubation als 
Reihe einzelne Bodenproben wird jeder behandelte und unbehandelte Sammelboden in die benötigte Anzahl von Teilproben aufgeteilt, und diese Teilproben werden je nach Notwendigkeit verwendet. Für Un ­
tersuchungen mit mehr als zwei Probenahmezeitpunkten sind genü ­
gend Teilproben herzustellen, um alle Replikate und Probenahme ­
zeiten zu berücksichtigen. Mindestens drei Replikatproben des Test ­
bodens sollten unter aeroben Bedingungen inkubiert werden (siehe 
1.7.1.1). Bei allen Tests sind geeignete Behälter mit ausreichendem 
Headspace zu verwenden, um das Entstehen anaerober Bedingungen zu vermeiden. Werden flüchtige Substanzen geprüft, ist der Test nur mit einer Reihe einzelner Teilproben durchzuführen,
 
1.7.1.3.  Testbedingungen und -dauer  
Der Test wird im Dunkeln bei Raumtemperatur (20 ± 2  o C) durch­
geführt. Der Feuchtegehalt der Bodenproben ist im Testverlauf bei 
40-60 % (± 5 %) der maximalen Wasserhaltekapazität des Bodens zu 
halten (siehe 1.6.4.2). Destilliertes bzw. entionisiertes Wasser kann nach Bedarf zugegeben werden.
 
Die Mindestdauer der Tests beträgt 28 Tage. Bei Agrochemikalien 
werden die Nitratbildungsraten in den behandelten Proben mit denen in den Kontrollproben verglichen. Weichen diese am 28. Tag um mehr als 25 % voneinander ab, wird der Test bis zum Erreichen 
einer Differenz von gleich oder weniger als 25 % bzw. für die 
Höchstdauer von 100 Tagen fortgesetzt, je nachdem, was kürzer ist. Werden andere Substanzen als Agrochemikalien geprüft, wird der Test nach 28 Tagen beendet. Am 28. Tag werden die Nitratmen ­
gen in den behandelten Proben und in den Kontrollproben bestimmt 
und die EC
 x -Werte berechnet.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1134
 
1.7.2.  Probenahme und Analyse von Böden  
1.7.2.1.  Probenahmeintervalle  
Bei der Prüfung von Agrochemikalien werden Bodenproben am Tag 
0, 7, 14 und 28 auf Nitrat analysiert. Ist eine Testverlängerung er ­
forderlich, sind weitere Messungen vom 28. Tag an im Abstand von 
jeweils 14 Tagen vorzunehmen.  
Bei der Prüfung von anderen Substanzen als Agrochemikalien wer ­
den mindestens fünf Testkonzentrationen verwendet und Bodenpro ­
ben am Beginn (Tag 0) und am Ende der Expositionszeit (28 Tage) 
auf Nitrat analysiert. Gegebenenfalls kann eine Zwischenmessung, z. B. am 7. Tag, eingefügt werden. Die am 28. Tag erhaltenen Daten werden zur Bestimmung des EC
 x -Werts der Chemikalie benutzt. 
Falls gewünscht, können die Daten der Kontrollproben vom Tag 0 
im Bericht zur Angabe der Ausgangsmenge von Nitrat im Boden verwendet werden,
 
1.7.2.2.  Analyse von Bodenproben  
Die Menge des in jeder behandelten Probe und in jedem Kontroll ­
replikat gebildeten Nitrats wird zu jedem Probenahmezeitpunkt be ­
stimmt. Nitrat wird aus dem Boden durch Schütteln der Proben mit 
einem geeigneten Extraktionsmittel, z. B. einer 0,1 M Kaliumchlo ­
ridlösung, extrahiert. Empfohlen wird ein Verhältnis von 5 ml KCl- Lösung je Gramm Trockengewichtsäquivalent Boden. Um die Ex ­
traktion zu optimieren, sind die den Boden und die Extraktions ­
lösung enthaltenden Behälter höchstens zur Hälfte zu füllen. Die Gemische werden bei 150 U/min 60 Minuten geschüttelt. Die Ge ­
mische werden zentrifugiert oder filtriert, und die Flüssigphasen wer ­
den auf Nitrat analysiert. Partikelfreie Flüssigextrakte können vor der 
Analyse bis zu sechs Monate bei — 20 ± 5
 o C aufbewahrt werden.  
2. DATEN  
2.1. AUFBEREITUNG DER ERGEBNISSE  
Werden Agrochemikalien geprüft, ist die in jeder Replikatboden ­
probe gebildete Nitratmenge aufzuzeichnen, und die Mittelwerte aller Replikate sind in tabellarischer Form darzustellen. Die Stickstoff ­
transformationsraten sind mittels geeigneter und allgemein anerkann ­
ter statistischer Methoden (z. B. F-Test, 5 % Signifikanzniveau) zu berechnen. Die Mengen von gebildetem Nitrat werden in mg Nitrat/ ­
kg Trockengewicht Boden/Tag ausgedrückt. Die Nitratbildungsrate 
jeder Behandlung wird mit der in der Kontrollprobe verglichen, und es wird die prozentuale Abweichung von der Kontrollprobe berechnet.
 
Werden andere Substanzen als Agrochemikalien geprüft, wird die in 
jedem Replikat gebildete Nitratmenge bestimmt und zur Abschät ­
zung der EC  x -Werte eins Dosis-Wirkungs-Kurve erstellt. Die in 
den behandelten Proben nach 28 Tagen gefundenen Nitratmengen (d. h. mg Nitrat/kg Trockengewicht Boden) werden mit den in der 
Kontrollprobe gefundenen verglichen. Auf der Basis dieser Daten 
werden die Inhibitionswerte, ausgedrückt in %, für jede Testkonzen ­
tration berechnet. Diese Prozentangaben werden über der Konzen ­
tration aufgetragen, und mit Hilfe statistischer Verfahren werden die 
EC
 x -Werte berechnet. Mittels Standardverfahren werden ferner Ver ­
trauensbereiche (p = 0,95) für die errechneten EC  x -Werte ermittelt 
(10) (11) (12).  
Unter Umständen tragen Testsubstanzen, die große Mengen Stick ­
stoff enthalten, zur Bildung von Nitrat während des Tests bei. Wer ­
den diese Substanzen in einer hohen Konzentration getestet (z. B. 
Chemikalien, bei denen von einer wiederholten Anwendung aus ­
zugehen ist), sind in den Test entsprechende Kontrollproben auf ­
zunehmen (d. h. Boden plus Testsubstanz, jedoch ohne Pflanzen ­
mehl). Daten aus diesen Kontrollproben sind bei den EC  x -Berech­
nungen zu berücksichtigen.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1135
 
2.2. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Ist bei der Auswertung der Testergebnisse von Agrochemikalien die 
Differenz der Nitratbildungsraten zwischen der niedrigen Behandlung (d. h. der höchsten erwarteten Konzentration) und den Kontrollpro ­
ben zu jedem Probenahmezeitpunkt nach dem 28. Tag gleich oder 
geringer als 25 %, dann ist das Mittel so zu bewerten, dass es keinen langfristigen Einfluss auf die Stickstofftransformation in Böden hat. Für die Auswertung der Testergebnisse von anderen Chemikalien als 
Agrochemikalien werden die EC
 50 -, EC  25 - und/oder EC  10 -Werte he ­
rangezogen.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
Der Testbericht muss folgende Informationen enthalten:  
Vollständige Angaben zu den verwendeten Böden, darunter:  
— geografische Angaben zum Standort (Breitengrad, Längengrad);  
— Informationen über die Geschichte des Feldstandorts (d. h. Be ­
wuchs, Behandlungen mit Pflanzenschutzmitteln und Düngemit ­
teln, unbeabsichtigte Kontaminationen usw.);  
— Nutzungsstruktur (z. B. landwirtschaftlich genutzter Boden, Forst 
usw.);  
— Probenahmetiefe (cm);  
— Sand-/Schluff-/Tongehalt ( % Trockengewicht);  
— pH (in Wasser);  
— organischer Kohlenstoffgehalt ( % Trockengewicht);  
— Stickstoffgehalt ( % Trockengewicht);  
— Ausgangswert der Nitratkonzentration (mg Nitrat/kg Trockenge ­
wicht);  
— Kationenaustauschkapazität (mmol/kg);  
— mikrobielle Biomasse als Anteil (in %) am gesamten organischen 
Kohlenstoff;  
— Angaben zu den für die Bestimmung der einzelnen Parameter 
verwendeten Methoden;  
— alle Angaben zur Entnahme und Lagerung der Bodenproben;  
— ggf. Einzelheiten zur Vorinkubation des Bodens.  
Testsubstanz:  
— physikalischer Zustand und falls relevant physikalisch-chemische 
Eigenschaften;  
— chemische Kenndaten, falls relevant mit Strukturformel, Reinheit 
(d. h. bei Pflanzenschutzmitteln der Wirkstoffanteil in %), Stick ­
stoffgehalt.  
Substrat:  
— Herkunft des Substrats;  
— Zusammensetzung (d. h. Luzernemehl, Luzernegrüngrasmehl);  
— Kohlenstoff-, Stickstoffgehalt ( % Trockengewicht);  
— Siebmaschenweite (mm).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1136
 
Testbedingungen:  
— genaue Angaben zur Anreicherung des Bodens mit organischem 
Substrat;  
— Anzahl der verwendeten Konzentrationen der Testchemikalie und 
ggf. Begründung für die gewählten Konzentrationen;  
— genaue Angaben zur Applikation der Testsubstanz auf den Bo ­
den; 
— Inkubationstemperatur;  
— Feuchtegehalt des Bodens zu Beginn und während des Tests;  
— das zur Bodeninkubation verwendete Verfahren (d. h. als Sam ­
melproben oder als Reihe einzelner Teilproben);  
— Anzahl der Replikate;  
— Anzahl der Probenahmezeitpunkte;  
— das zur Nitratextraktion aus dem Boden verwendete Verfahren;  
Ergebnisse:  
— zur Nitratanalyse verwendete analytische Verfahren und Geräte;  
— Daten in tabellarischer Form, einschließlich Einzel- und Mittel ­
werte der Nitratbestimmungen;  
— Abweichung zwischen den Replikaten behandelter Proben und 
Kontrollproben;  
— Erläuterungen zu den Korrekturen an den Berechnungen, falls 
relevant;  
— die Abweichung (in %) der Nitratbildungsraten zu jedem Pro ­
benahmezeitpunkt bzw. ggf. der EC  50 -Wert mit 95 %-Vertrau ­
ensgrenze, weitere EC  x (d. h. EC  25 oder EC  10 ) mit Vertrauens ­
intervallen und eine Grafik der Dosis-Wirkungs-Kurve;  
— statistische Aufbereitung der Ergebnisse;  
— sämtliche Informationen und Beobachtungen, die für die Inter ­
pretation der Testergebnisse hilfreich sind.  
4. LITERATURANGABEN  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16,1994.  
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1-1 (2. Ausgabe, 1990).  
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Gui ­
delines; Proposed rule. 28. September 1987.  
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Brüssel.  
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality — Determination of Ni ­
trogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influ ­
ence of Chemicals on these Processes. Technical Committee 
ISO/TC 190/SC 4:  Soil Quality Biological Methods.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1137
 
(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Se ­
lection of Soils/Sediments, Belgirate, Italien,18.-20. Januar 
1995.  
(7) ISO 10381-6 (1993). Bodenbeschaffenheit — Probenahme — 
Teil 6: Anleitung zur Probenahme, Behandlung und Lagerung von Boden für die Bestimmung aerober mikrobieller Prozesse 
unter Laborbedingungen.
 
(8) ISO 14240-1 (1997). Bodenbeschaffenheit — Bestimmung der 
mikrobiellen Biomasse von Böden — Teil 1: Substratinduzier ­
tes Respirationsverfahren.  
(9) ISO 14240-2 (1997). Bodenbeschaffenheit — Bestimmung der 
mikrobiellen Biomasse von Böden — Teil 2: Fumigations-Ex ­
traktionsverfahren.  
(10) Litchfield, J.T. und Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper, Ther., 96, 99-113.
 
(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New York.  
(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1138
 
C.22.  BODENMIKROORGANISMEN: KOHLENSTOFFTRANSFOR ­
MATIONSTEST  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht der Prüfrichtlinie OECD TG 217 (2000).  
1.1. EINLEITUNG  
Diese Testmethode beschreibt eine Labormethode zur Untersuchung 
der potenziellen Langzeitauswirkungen einer einmaligen Exposition 
gegenüber Pflanzenschutzmitteln und etwaigen anderen Chemikalien auf die Kohlenstofftransformationsaktivität von Bodenmikroorganis ­
men. Der Test beruht im Wesentlichen auf den Empfehlungen der 
Pflanzenschutzorganisation für Europa und den Mittelmeerraum (1), 
doch auch andere Richtlinien wurden berücksichtigt, wie die der deutschen Biologischen Bundesanstalt (2), der US-amerikanischen Environmental Protection Agency (3) und SETAC (4). Auf einem 
OECD-Workshop zur Boden-/Sedimentauswahl, der 1995 im italie ­
nischen Belgirate stattfand (5), wurden die bei diesem Test zu ver ­
wendende Anzahl und Art von Böden vereinbart. Die Empfehlungen zur Entnahme, Behandlung und Lagerung von Bodenproben basieren 
auf einer ISO-Anleitung (6) und auf Empfehlungen des Belgirate- 
Workshops.
 
Bei der Be- und Auswertung toxischer Eigenschaften von Testsub ­
stanzen kann eine Bestimmung der Auswirkungen auf die mikro ­
bielle Aktivität des Bodens erforderlich sein, z. B., wenn Daten zu 
möglichen Nebenwirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf die Mi ­
kroflora des Bodens benötigt werden oder wenn eine Exposition von Bodenmikroorganismen gegenüber anderen Chemikalien als Pflan ­
zenschutzmitteln erwartet wird. Der Kohlenstofftransformationstest 
wird durchgeführt, um den Einfluss derartiger Chemikalien auf die Bodenmikroflora zu ermitteln. Bei der Prüfung von Agrochemikalien (z. B. Pflanzenschutzmittel, Düngemittel, Forstchemikalien) werden 
sowohl Kohlenstoff- als auch Stickstofftransformationstests durch ­
geführt. Bei anderen Substanzen als Agrochemikalien genügt der Stickstofftransformationstest. Liegen jedoch die EC
 50 -Werte des 
Stickstofftransformationstests bei diesen Chemikalien im Bereich, 
der für käufliche Nitrifikationshemmstoffe (z. B. Nitrapyrin) ermittelt 
wurde, kann ein Kohlenstofftransformationstest durchgeführt werden, um weitere Informationen zu gewinnen,
 
Boden besteht sowohl aus lebenden als auch aus nichtlebenden 
Komponenten, die in komplexen und heterogenen Gemischen vor ­
kommen. Beim Abbau organischen Materials und seiner Transfor ­
mation in fruchtbaren Böden spielen Mikroorganismen eine wichtige Rolle, wobei viele Arten für unterschiedliche Aspekte der Boden ­
fruchtbarkeit verantwortlich sind. Jede langfristige Störung dieser 
biochemischen Prozesse kann sich potenziell auf den Nährstoffkreis ­
lauf auswirken und dadurch wiederum die Bodenfruchtbarkeit beein ­
flussen. Die Transformation von Kohlenstoff und Stickstoff erfolgt in allen fruchtbaren Böden. Die Transformationspfade sind im Wesent ­
lichen gleich, auch wenn je nach Boden unterschiedliche mikrobielle 
Populationen für diese Prozesse verantwortlich sind.
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Mit der hier beschriebenen Testmethode können durch einen Stoff 
hervorgerufene langfristige nachteilige Auswirkungen auf den Pro ­
zess der Kohlenstofftransformation in aeroben Oberböden bestimmt werden. Der Test reagiert empfindlich auf Veränderungen in Größe und Aktivität der mikrobiellen Populationen, die für die Kohlenstoff ­
transformation verantwortlich sind, da diese Populationen sowohl 
einem chemischen Stress als auch einem Kohlenstoffmangel aus ­
gesetzt werden. Verwendet wird ein an organischem Material armer Sandboden. Dieser Boden wird mit der Testsubstanz behandelt und 
unter Bedingungen inkubiert, die einen schnellen mikrobiellen Stoff ­
wechsel ermöglichen. Unter diesen Bedingungen werden Quellen von leicht verfügbarem Kohlenstoff im Boden rasch aufgebraucht. Dies verursacht einen Kohlenstoffmangel, der nicht nur mikrobielle 
Zellen tötet, sondern auch eine Keimruhe und/oder Sporenbildung 
induziert. Läuft der Test über mehr als 28 Tage, kann die Summe dieser Reaktionen in den Kontrollproben (unbehandelter Boden) als progressiver Verlust an stoffwechselaktiver mikrobieller Biomasse 
gemessen werden (7). Wird die Biomasse in kohlenstoffgestresstem 
Boden unter den Versuchsbedingungen von der Anwesenheit einer Chemikalie beeinflusst, kehrt sie möglicherweise nicht auf das Ni ­
veau in den Kontrollproben zurück. Folglich halten zu einem belie ­
bigen Zeitpunkt während des Versuchs durch die Testsubstanz ver ­
ursachte Störungen häufig bis zum Ende des Tests an.
 
Die Tests, auf deren Grundlage diese Testmethode entwickelt wurde, 
waren in erster Linie für Substanzen ausgelegt, bei denen die in den Boden gelangende Menge vorherbestimmt werden kann. Dies ist 
z. B. bei Pflanzenschutzmitteln der Fall, bei denen die Applikations ­
menge auf dem Feld bekannt ist. Bei Agrochemikalien genügt es, zwei Konzentrationen zu testen, die für die erwartete oder vorherge ­
sagte Applikationsmenge relevant sind. Agrochemikalien können als 
Wirkstoffe (a.i.) oder als formulierte Handelsprodukte getestet wer ­
den. Der Test ist jedoch nicht auf Chemikalien mit vorhersagbaren Umweltkonzentrationen begrenzt. Durch Veränderung sowohl der 
Mengen der auf den Boden ausgebrachten Testsubstanz als auch 
der Art und Weise, wie die Daten ausgewertet werden, kann der Test auch für Chemikalien angewendet werden, bei denen nicht bekannt ist, in welcher Menge sie in den Boden gelangen. Somit 
werden bei anderen Substanzen als Agrochemikalien die Wirkungen 
einer Reihe von Konzentrationen auf die Kohlenstofftransformation bestimmt. Die Daten von diesen Tests werden verwendet, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu erstellen und EC
 x -Werte zu berechnen, 
wobei x als die Wirkung in % definiert ist.  
1.2. DEFINITIONEN  
Kohlenstofftransformation : der Abbau organischen Materials durch 
Mikroorganismen zum anorganischen Endprodukt Kohlendioxid.  
EC x (Effektkonzentration) : diejenige Konzentration der Testsub ­
stanz im Boden, die die Transformation von Kohlenstoff in Kohlen ­
dioxid zu x % hemmt.  
EC 50 (Medianwert der Effektkonzentration) : diejenige Konzentra ­
tion der Testsubstanz im Boden, die die Transformation von Kohlen ­
stoff in Kohlendioxid zu 50 % hemmt.  
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Keine.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1140
 
1.4. PRINZIP DER TESTMETHODE  
Gesiebter Boden wird entweder mit der Testsubstanz behandelt oder 
unbehandelt (Kontrollprobe) belassen. Werden Agrochemikalien ge ­
prüft, wird eine Mindestanzahl von zwei Testkonzentrationen emp ­
fohlen, die im Verhältnis zur höchsten auf dem Feld erwarteten 
Konzentration gewählt werden sollten. Nach 0, 7, 14 und 28 Tagen Inkubation werden Proben behandelter und unbehandelter Böden mit Glucose gemischt, und die Glucose-induzierten Respirationsraten 
werden 12 Stunden hintereinander gemessen. Respirationsraten wer ­
den als freigesetztes Kohlendioxid (mg Kohlendioxid/kg Trockenboden/h) oder verbrauchter Sauerstoff (mg Sauerstoff/kg 
Boden/h) ausgedrückt. Die mittlere Respirationsrate in behandelten 
Bodenproben wird mit der in der Kontrollprobe verglichen, und es wird die prozentuale Abweichung der behandelten Proben von den Kontrollproben berechnet. Alle Tests laufen mindestens 28 Tage. 
Sind die Differenzen zwischen behandelten und unbehandelten Bö ­
den am 28. Tag gleich oder größer als 25 %, werden die Messungen in Abständen von 14 Tagen für die Höchstdauer von 100 Tagen fortgesetzt. Werden andere Substanzen als Agrochemikalien geprüft, 
wird die Testsubstanz in einer Reihe von Konzentrationen Boden ­
proben zugesetzt, und nach 28 Tagen werden die Glucose-induzier ­
ten Respirationsraten (d. h. das Mittel der Mengen an gebildetem Kohlendioxid oder verbrauchtem Sauerstoff) gemessen. Die Ergeb ­
nisse aus Versuchen mit einer Reihe von Konzentrationen werden 
mit Hilfe eines Regressionsmodells analysiert, und die EC,-Werte werden berechnet (d. h. EC
 50 , EC  25 und/oder EC  10 ). Siehe Defini ­
tionen.  
1.5. VALIDITÄT DES TESTS  
Auswertungen von Testergebnissen mit Agrochemikalien beruhen 
auf vergleichsweise kleinen Differenzen (d. h. Mittelwert ± 25 %) 
zwischen dem freigesetzten Kohlendioxid oder dem verbrauchten 
Sauerstoff in (bzw. durch) Kontrollproben und behandelte(n) Boden ­
proben, so dass große Schwankungen bei den Kontrollproben zu falschen Ergebnissen führen können. Daher sollte die Abweichung 
zwischen Replikatkontrollproben weniger als ± 15 % betragen.
 
1.6. BESCHREIBUNG DER TESTMETHODE  
1.6.1.  Geräte  
Es werden Testgefäße aus chemisch inertem Material verwendet. Ihr 
Fassungsvermögen sollte sich nach dem gewählten Inkubationsver ­
fahren der Böden richten, d. h. für die Inkubation von Sammelpro ­
ben oder einer Reihe einzelner Bodenproben (siehe 1.7.1.2). Wäh ­
rend des Tests ist darauf zu achten, dass sowohl der Wasserverlust möglichst gering gehalten wird als auch ein Gasaustausch stattfinden kann (so könnten die Testbehälter z. B. mit perforierter Polyethylen ­
folie abgedeckt werden). Beim Testen flüchtiger Substanzen sind 
abdichtbare und gasdichte Behälter zu verwenden. Diese sollten in ihrer Größe so bemessen sein, dass sie zu etwa einem Viertel ihres Volumens mit der Bodenprobe gefüllt sind.
 
Zur Bestimmung der Glucose-induzierten Respiration werden Inku ­
bationssysteme sowie Geräte für die Messung der Kohlendioxidbil ­
dung bzw. des Sauerstoffverbrauchs benötigt. Beispiele für derartige 
Systeme sind in der Literatur zu finden (8) (9) (10) (11).  
1.6.2.  Auswahl und Anzahl der Böden  
Es wird ein einziger Boden verwendet. Empfohlen wird Boden mit 
folgenden Eigenschaften:  
— Sandgehalt: mindestens 50 % und höchstens 75 %;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1141
 
— pH: 5,5-7,5;  
— organischer Kohlenstoffgehalt: 0,5-1,5 %;  
— es ist die mikrobielle Biomasse zu bestimmen (12) (13), und ihr 
Kohlenstoffgehalt sollte mindestens 1 % des gesamten organi ­
schen Kohlenstoffs des Bodens betragen.  
Meist stellt ein Boden mit diesen Eigenschaften den „worst case“ 
dar, da seine Adsorption minimal und die Verfügbarkeit der Test ­
chemikalie für die Mikroflora maximal ist. Demnach sind in aller 
Regel keine Tests mit anderen Böden notwendig, Unter bestimmten Umstanden jedoch, wenn z. B. der erwartete hauptsächliche Einsatz der Testsubstanz auf bestimmten Böden wie sauren Waldböden statt ­
findet, oder bei elektrostatisch aufgeladenen Chemikalien kann es 
erforderlich sein, einen zusätzlichen Boden zu verwenden.
 
1.6.3.  Entnahme und Lagerung von Bodenproben  
1.6.3.1.  Entnahme  
Es sind ausführliche Informationen über die Vorgeschichte des Feld ­
standorts erforderlich, von dem der Testboden entnommen wird. Diese Angaben beinhalten unter anderem die genaue Lage, den Bewuchs, die Behandlung mit Pflanzenschutzmitteln sowie mit organischen und an ­
organischen Düngemitteln, Zusätze biologischer Materialien oder unbe ­
absichtigte Kontaminationen. Der für die Bodenentnahme gewählte Standort muss über einen längeren Zeitraum hinweg nutzbar sein. Ge ­
eignet sind Dauerweiden, Felder mit einjährigen Getreidekulturen (aus ­
genommen Mais) oder dicht gesäten Gründüngungspflanzen. Der ge ­
wählte Probenahmestandort sollte mindestens ein Jahr vor der Pro ­
benahme nicht mit Pflanzenschutzmitteln behandelt worden sein. Ferner 
sollten mindestens sechs Monate vorher keine organischen Düngemittel 
ausgebracht worden sein. Die Verwendung von Mineraldünger ist nur zulässig, wenn dies für die Kultur erforderlich ist, und die Entnahme der Bodenproben sollte frühestens drei Monate nach Ausbringung des Dün ­
gemittels erfolgen. Zu vermeiden ist die Verwendung von Boden, der 
mit Düngemitteln mit bekannter biozider Wirkung (z. B. Kalkstickstoff) behandelt wurde.
 
Die Probenahme während oder nach längeren (mehr als 30 Tage) 
Dürre- oder Überschwemmungsperioden sollte vermieden werden. Bei gepflügten Böden sind die Proben aus einer Tiefe von 0 bis 
20 cm zu entnehmen. Bei Grünland (Weiden) oder anderen Böden, 
die über längere Zeiträume (mindestens eine Vegetationsperiode) nicht gepflügt werden, kann die maximale Tiefe der Probenahme geringfügig über 20 cm liegen (z. B. bei bis zu 25 cm). Die Boden ­
proben sollten in Behältern und unter Temperaturbedingungen trans ­
portiert werden, die sicherstellen, dass die ursprünglichen Boden ­
eigenschaften nicht wesentlich verändert werden.
 
1.6.3.2.  Lagerung  
Bevorzugt wird die Verwendung feldfrischer Böden. Lässt sich die 
Lagerung im Labor nicht vermeiden, sollten die Böden im Dunkeln bei 4 ± 2
 o C höchstens drei Monate gelagert werden. Während der 
Lagerung der Böden müssen aerobe Bedingungen sichergestellt sein, 
Werden Böden von Flächen entnommen, die über mindestens drei 
Monate im Jahr gefroren sind, kann eine Lagerung für sechs Monate bei — 18
 o C in Betracht gezogen werden. Vor jedem Versuch ist die 
mikrobielle Biomasse der gelagerten Böden zu bestimmen, und der 
Kohlenstoffgehalt in der Biomasse sollte mindestens 1 % des ge ­
samten organischen Kohlenstoffs des Bodens betragen (siehe 1.6.2).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1142
 
1.6.4.  Handhabung und Vorbereitung des Bodens für den Test  
1.6.4.1.  Vorinkubation  
Falls der Boden gelagert wurde (siehe 1.6.4.2 und 1.7.1.3), wird eine 
Vorinkubation über eine Zeitdauer von 2 bis 28 Tagen empfohlen. 
Die Temperatur und der Feuchtegehalt des Bodens während der 
Vorinkubation sollten den Testbedingungen möglichst entsprechen (siehe 1.6.4.2 und 1.7.1.3).
 
1.6.4.2.  Physikalisch-chemische Eigenschaften  
Der Boden wird manuell von großen Gegenständen befreit (z. B. 
Steine, Pflanzenteile usw.) und im feuchten Zustand ohne übermäßi ­
ges Austrocknen auf eine Partikelgröße von ≤ 2 mm gesiebt. Der 
Feuchtegehalt der Bodenprobe sollte mit destilliertem oder entioni ­
siertem Wasser auf einen Wert zwischen 40 % und 60 % der maxi ­
malen Wasserhaltekapazität eingestellt werden.  
1.6.5.  Vorbereitung der Testsubstanz zur Applikation auf den Boden  
Üblicherweise wird die Testsubstanz unter Verwendung eines Trä ­
gers zugegeben. Bei diesem Träger kann es sich um Wasser (bei 
wasserlöslichen Substanzen) oder einen inerten Feststoff wie feinen 
Quarzsand (Partikelgröße: 0,1-0,5 mm) handeln. Andere flüssige Trä ­
ger als Wasser (z. B. organische Lösungsmittel wie Aceton oder Chloroform) sind zu vermeiden, da sie die Mikroflora schädigen 
können. Wird Sand als Träger benutzt, kann er mit der in einem 
geeigneten Lösungsmittel aufgelösten oder suspendierten Testsub ­
stanz überzogen werden, In diesen Fällen sollte das Lösungsmittel vor dem Mischen mit dem Boden durch Verdampfen entfernt wer ­
den. Zur optimalen Verteilung der Testsubstanz im Boden wird ein 
Verhältnis von 10 g Sand je kg Boden (Trockengewicht) empfohlen. Die Kontrollproben werden nur mit einer äquivalenten Menge Was ­
ser und/oder Quarzsand behandelt.
 
Beim Testen flüchtiger Chemikalien sind Verluste während der Be ­
handlung so weit wie möglich zu vermeiden, und es ist nach Mög ­
lichkeit für eine homogene Verteilung im Boden zu sorgen (z. B., indem die Testsubstanz an verschiedenen Stellen in den Boden inji ­
ziert wird).
 
1.6.6.  Testkonzentrationen  
Werden Pflanzenschutzmittel oder andere Chemikalien mit vorher ­
sagbaren Umweltkonzentrationen geprüft, sind mindestens zwei Kon ­
zentrationen zu verwenden. Die niedrigere Konzentration sollte min ­
destens der maximalen Menge entsprechen, die unter praxisüblichen Bedingungen voraussichtlich in den Boden gelangt, während die höhere Konzentration ein Mehrfaches der niedrigeren Konzentration 
sein sollte. Die Konzentrationen der dem Boden zugegebenen Test ­
substanz werden unter der Annahme einer gleichmäßigen Einarbeitung bis zu einer Tiefe von 5 cm und einer Bodenrohdichte von 1,5 berechnet. Bei Agrochemikalien, die direkt auf den Boden 
ausgebracht werden, oder bei Chemikalien, bei denen die den Boden 
erreichende Menge vorhersagbar ist, werden als Testkonzentrationen die höchste vorhergesagte Umweltkonzentration (PEC) und das 5- fache dieser Konzentration empfohlen. Substanzen, die voraussicht ­
lich mehrmals in einer Kulturperiode auf den Boden ausgebracht 
werden, sollten in Konzentrationen getestet werden, die sich durch die Multiplikation der PEC mit der höchsten erwarteten Anzahl der Anwendungen ergeben. Allerdings sollte die obere getestete Konzen ­
tration das 10-fache der höchsten einfachen Applikationsrate nicht 
übersteigen.
 
Werden andere Substanzen als Agrochemikalien geprüft, wird eine 
geometrische Reihe von mindestens fünf Konzentrationen verwendet. 
Die getesteten Konzentrationen sollten den zur Bestimmung der EC  x - 
Werte notwendigen Bereich abdecken.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1143
 
1.7. DURCHFÜHRUNG DES TESTS  
1.7.1.  Expositionsbedingungen  
1.7.1.1.  Behandlung und Kontrolle  
Werden Agrochemikalien geprüft, wird der Boden in drei Teile glei ­
chen Gewichts aufgeteilt. Zwei Teile werden mit dem produkthalti ­
gen Träger gemischt, und der dritte wird mit dem Träger ohne das Produkt vermischt (Kontrollprobe). Sowohl für die behandelten als auch die unbehandelten Böden wird eine Mindestanzahl von drei 
Replikaten empfohlen. Werden andere Substanzen als Agrochemika ­
lien geprüft, wird der Boden in sechs Teile gleichen Gewichts auf ­
geteilt. Fünf dieser Proben werden mit dem die Testsubstanz ent ­
haltenden Träger vermischt, und die sechste wird mit dem Träger 
ohne die Chemikalie vermischt. Sowohl für die behandelten Proben als auch für die Kontrollproben werden drei Replikate empfohlen. Es ist auf eine homogene Verteilung der Testsubstanz in den behandel ­
ten Bodenproben zu achten. Während des Mischens ist eine Ver ­
dichtung oder Verklumpung des Bodens zu vermeiden.
 
1.7.1.2.  Inkubation von Bodenproben  
Die Inkubation der Bodenproben kann auf zwei Wegen durchgeführt 
werden: als Sammelproben von jedem behandelten und unbehandel ­
ten Boden oder als Reihe von einzelnen, gleich großen Teilproben 
von jedem behandelten und unbehandelten Boden. Bei flüchtigen 
Substanzen sollte der Test jedoch nur mit einer Reihe einzelner Teil ­
proben durchgeführt werden. Bei der Inkubation von Böden als Sammelproben werden große Mengen von jedem behandelten und 
unbehandelten Boden vorbereitet und während des Tests je nach 
Notwendigkeit zu analysierende Teilproben entnommen. Die zu Be ­
ginn für jede Behandlung und Kontrolle vorbereitete Menge ist ab ­
hängig von der Größe der Teilproben, der Anzahl der zur Analyse 
verwendeten Replikate und der höchsten erwarteten Anzahl von Pro ­
benahmen. Vor der Entnahme von Teilproben sind die inkubierten Sammelproben gründlich zu mischen. Bei der Bodeninkubation als Reihe einzelner Bodenproben wird jeder behandelte und unbehan ­
delte Sammelboden in die benötigte Anzahl von Teilproben auf ­
geteilt, und diese Teilproben werden je nach Notwendigkeit verwen ­
det. Für Untersuchungen mit mehr als zwei Probenahmezeitpunkten 
sind genügend Teilproben herzustellen, um alle Replikate und Pro ­
benahmezeiten zu berücksichtigen. Mindestens drei Replikatproben des Testbodens sollten unter aeroben Bedingungen inkubiert werden (siehe 1.7.1.1). Bei allen Tests sind geeignete Behälter mit ausrei ­
chendem Headspace zu verwenden, um das Entstehen anaerober 
Bedingungen zu vermeiden. Werden flüchtige Substanzen geprüft, ist der Test nur mit einer Reihe einzelner Teilproben durchzuführen.
 
1.7.1.3.  Testbedingungen und -dauer  
Der Test wird im Dunkeln bei Raumtemperatur (20 ± 2  o C) durch­
geführt. Der Feuchtegehalt der Bodenproben ist im Testverlauf bei 
40-60 % (+ 5 %) der maximalen Wasserhaltekapazität des Bodens zu 
halten (siehe 1.6.4.2). Destilliertes bzw. entionisiertes Wasser kann nach Bedarf zugegeben werden.
 
Die Mindestdauer der Tests beträgt 28 Tage. Bei Agrochemikalien 
werden die Mengen an freigesetztem Kohlenstoff bzw. verbrauchtem 
Sauerstoff in den behandelten Proben mit denen in den Kontroll ­
proben verglichen. Weichen diese am 28. Tag um mehr als 25 % voneinander ab, wird der Test bis zum Erreichen einer Differenz von 
gleich oder weniger als 25 % bzw. für die Höchstdauer von 100 
Tagen fortgesetzt, je nachdem, was kürzer ist. Werden andere Sub ­
stanzen als Agrochemikalien geprüft, wird der Test nach 28 Tagen beendet. Am 28. Tag werden die Mengen an freigesetztem Kohlen ­
dioxid bzw. verbrauchtem Sauerstoff in den behandelten Proben und 
in den Kontrollproben bestimmt und die EC
 x -Werte berechnet.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1144
 
1.7.2.  Probenahme und Analyse von Böden  
1.7.2.1.  Probenahmeintervalle  
Bei der Prüfung von Agrochemikalien werden Bodenproben am Tag 
0, 7, 14 und 28 auf Glucose-induzierte Respirationsraten analysiert. 
Ist eine Testverlängerung erforderlich, sind weitere Messungen vom 
28. Tag an im Abstand von jeweils 14 Tagen vorzunehmen.  
Bei der Prüfung von anderen Substanzen als Agrochemikalien wer ­
den mindestens fünf Testkonzentrationen verwendet und Bodenpro ­
ben am Beginn (Tag 0) und am Ende der Expositionszeit (28 Tage) 
auf die Glucose-induzierte Respiration analysiert. Gegebenenfalls 
kann eine Zwischenmessung, z. B. am 7. Tag, eingefügt werden. Die am 28. Tag erhaltenen Daten werden zur Bestimmung des EC
 x -Werts der Chemikalie benutzt. Falls gewünscht, können die 
Daten der Kontrollproben vom Tag 0 zur Abschätzung der Aus ­
gangsmengen der stoffwechselaktiven mikrobiellen Biomasse im Bo ­
den herangezogen werden (12).  
1.7.2.2.  Messung von Glucose-induzierten Respirationsraten  
Die Glucose-induzierte Respirationsrate in jeder behandelten Probe 
und in jedem Kontrollreplikat wird zu jedem Probenahmezeilpunkt bestimmt. Die Bodenproben werden mit einer Menge Glucose ver ­
mischt, die groß genug ist, um unverzüglich einen maximalen At ­
mungswert zu erreichen. Die zum Erreichen eines maximalen At ­
mungswerts in einem bestimmten Boden notwendige Glucosemenge kann in einem Vorversuch mit einer Reihe von Glucosekonzentra ­
tionen bestimmt werden (14). Bei sandigen Böden mit einem orga ­
nischen Kohlenstoffgehalt von 0,5-1,5 % sind jedoch üblicherweise 2 000 mg bis 4 000 mg Glucose je kg Boden (Trockengewicht) ausreichend. Die Glucose kann mit sauberem Quarzsand pulverisiert 
werden (10 g Sand/kg Trockengewicht Boden) und mit dem Boden 
homogen vermischt werden.
 
Die mit Glucose angereicherten Bodenproben werden in einem ge ­
eigneten Gerät inkubiert, mit dem die Respirationsraten bei 20 ± 2
 o C entweder laufend, stündlich oder in 2-Stunden-Intervallen ge ­
messen werden können (siehe 1.6.1). Das freigesetzte Kohlendioxid 
bzw. der verbrauchte Sauerstoff werden 12 Stunden lang gemessen, und die Messungen sollten so früh wie möglich beginnen, d. h. innerhalb von 1 bis 2 Stunden nach der Glucosezugabe. Die Gesamt ­
mengen des in den 12 Stunden freigesetzten Kohlendioxids bzw. 
verbrauchten Sauerstoffs werden gemessen und die minieren Respi ­
rationsraten bestimmt.
 
2. DATEN  
2.1. AUFBEREITUNG DER ERGEBNISSE  
Werden Agrochemikalien geprüft, ist für jedes Replikat die Menge 
des jeweils freigesetzten Kohlendioxids bzw. verbrauchten Sauer ­
stoffs aufzuzeichnen, und die Mittelwerte aller Replikate sind in 
tabellarischer Form darzustellen. Die Ergebnisse sind mittels geeig ­
neter und allgemein anerkannter statistischer Methoden (z. B. F-Test, 5 % Signifikanzniveau) zu bewerten, Die Glucose-induzierten Respi ­
rationsraten werden in mg Kohlendioxid/kg Trockengewicht Boden/h 
bzw. mg Sauerstoff/Trockengewicht Boden/h ausgedrückt. Die mitt ­
lere Kohlendioxidbildungsrate bzw. die mittlere Sauerstoffver ­
brauchsrate jeder Behandlung wird mit der in der Kontrollprobe ver ­
glichen, und es wird die prozentuale Abweichung von der Kontroll ­
probe berechnet.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1145
 
Werden andere Substanzen als Agrochemikalien geprüft, wird die 
Menge an freigesetztem Kohlendioxid bzw. an verbrauchtem Sauer ­
stoff für jedes Replikat bestimmt, und zur Abschätzung der EC  x - 
Werte eine Dosis-Wirkungs-Kurve erstellt. Die in den behandelten Proben nach 28 Tagen gefundenen Glucose-induzierten Respirations ­
raten (d. h. mg Kohlendioxid/kg Trockengewicht Boden/h bzw. mg 
Sauerstoff/Trockengewicht Boden/h) werden mit den in der Kontroll ­
probe gefundenen verglichen. Auf der Basis dieser Daten werden die Inhibitionswerte, ausgedrückt in %, für jede Testkonzentration be ­
rechnet. Diese Prozentangaben werden über der Konzentration auf ­
getragen, und dann werden mit Hilfe statistischer Verfahren die EC,- Werte berechnet. Mittels Standard verfahren werden femer Vertrau ­
ensbereiche (p = 0,95) für die errechneten EC,-Werte ermittelt (15) 
(16) (17).
 
2.2. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Ist bei der Auswertung der Testergebnisse von Agrochemikalien die 
Differenz der Respirationsraten zwischen der niedrigen Behandlung (d. h. der höchsten erwarteten Konzentration) und den Kontrollpro ­
ben zu jedem Probenahmezeitpunkt nach dem 28. Tag ≤ 25 %, dann 
ist das Produkt so zu bewerten, dass es keinen langfristigen Einfluss auf die Kohlenstofftransformation in Böden hat. Für die Auswertung der Testergebnisse von anderen Chemikalien als Agrochemikalien 
werden die EC
 50 -, EC  25 - und/oder EC  10 -Werte herangezogen.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
TESTBERICHT  
Der Testbericht muss folgende Informationen enthalten:  
Vollständige Angaben zu den verwendetentBöden, darunter:  
— geografische Angaben zum Standort (Breitengrad, Längengrad);  
— Informationen über die Vorgeschichte des Feldstandorts (d. h. 
Bewuchs, Behandlungen mit Pflanzenschutzmitteln und Dünge ­
mitteln, unbeabsichtigte Kontaminationen usw.)  
— Nutzungsstruktur (z. B. landwirtschaftlich genutzter Boden, Forst 
usw.);  
— Probenahmetiefe (cm);  
— Sand-/Schluff-/Tongehalt ( % Trockengewicht);  
— pH (in Wasser);  
— organischer Kohlenstoffgehalt ( % Trockengewicht);  
— Stickstoffgehalt ( %Trockengewicht);  
— Kationenaustauschkapazilät (mmol/kg);  
— Ausgangswert der mikrobiellen Biomasse als Anteil (in %) am 
gesamten organischen Kohlenstoff;  
— Angaben zu den für die Bestimmung der einzelner Parameter 
verwendeten Methoden;  
— alle Angaben zur Entnahme und Lagerung der Bodenproben;  
— ggf. Einzelheiten zur Vorinkubation des Bodens.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1146
 
Testsubstanz:  
— physikalischer Zustand und, falls relevant, physikalisch-che ­
mische Eigenschaften;  
— chemische Kenndaten, falls relevant mit Strukturformel, Reinheit 
(d. h. bei Pflanzenschutzmitteln der Wirkstoffanteil in %), Stick ­
stoffgehalt.  
Testbedingungen:  
— genaue Angaben zur Anreicherung des Bodens mit organischem 
Substrat;  
— Anzahl der verwendeten Konzentrationen der Testchemikalie und 
ggf. Begründung für die gewählten Konzentrationen;  
— genaue Angaben zur Applikation der Testsubstanz auf den Boden;  
— Inkubationstemperatur;  
— Feuchtegehalt des Bodens zu Beginn und während des Tests;  
— das zur Bodeninkubation verwendete Verfahren (d. h. als Sam ­
melproben oder als Reihe einzelner Teilproben);  
— Anzahl der Replikate;  
— Anzahl der Probenahmezeitpunkte.  
Ergebnisse:  
— zur Messung der Respirationsraten verwendete Verfahren und 
Geräte;  
— Daten in tabellarischer Form, einschließlich Einzel- und Mittel ­
werte der Kohlendioxid- bzw. Sauerstoffmengen;  
— Abweichung zwischen den Replikaten behandelter Proben und 
Kontrollproben;  
— Erläuterungen zu den Korrekturen an den Berechnungen, falls 
relevant;  
— die Abweichung (in %) der Glucose-induzierten Respirations ­
raten zu jedem Probenahmezeitpunkt bzw. ggf. der EC  50 -Wert 
mit 95 % Vertrauens bereich, weitere EC  x (d. h. EC  25 oder EC  10 ) 
mit Vertrauensbereichen und eine grafische Darstellung der Do ­
sis-Wirkungs-Kurve;  
— ggf. statistische Aufbereitung der Ergebnisse;  
— sämtliche Informationen und Beobachtungen, die für die Inter ­
pretation der Testergebnisse hilfreich sind.  
4. LITERATURANGABEN  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soll Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.  
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2. Ausgabe, 1990).
 
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Gui ­
delines; Proposed rule. 28. September 1987.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1147
 
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Brüssel.  
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Se ­
lection of Soils/Sediments, Belgirate, Italien, 18-20. Januar 1995.
 
(6) ISO 10381-6 (1993). Bodenbeschaffenheit — Probenahme — 
Teil 6: Anleitung zur Probenahme, Behandlung und Lagerung 
von Boden für die Bestimmung aerober mikrobieller Prozesse unter Laborbedingungen.
 
(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soit Microflo ­
ra“. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3, 45-60.  
(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil 
Analysis — Part 2: Chemical and Microbiological Properties“. Agronomy Monograph N
 o 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and 
D.R. Keeney. 41, 831-871.  
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality — Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.  
(10) ISO 14239 (1997E). Bodenbeschaffenheil — Laboratoriumsin ­
kubationssysteme zur Messung der Mineralisierung von orga ­
nischen Chemikalien im Boden bei aeroben Bedingungen.  
(11) Heinemeyer, O., Insam, H., Kaiser, E.A. and Walenzik, G. 
(1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116, 77-81.
 
(12) ISO 14240-1 (1997). Bodenbeschaffenheit — Bestimmung der 
mikrobiellen Biomasse von Böden — Teil 1: Substratinduzier ­
tes Respirationsverfahren.  
(13) ISO 14240-2 (1997). Bodenbeschaffenheit — Bestimmung der 
mikrobiellen Biomasse von Böden — Teil 2: Fumigations-Ex ­
traktionsverfahren.  
(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluss von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden gegenüber Pflanzen ­
schutzmitteln, dargestellt am Beispiel eines Herbizids. (Influ ­
ence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect 
of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example), Nachrichtenblatt Deutscher Pflanzenschutzdienst, Braunschweig, 38, 113-120.
 
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, 99-113.  
(16) Finney, D.J. (1971), Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New York.  
(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1148
 
C.23.  AEROBE UND ANAEROBE TRANSFORMATION IM BODEN  
1. METHODE  
Diese Testmethode entspricht der Prüfrichtlinie OECD TG 307 
(2002)  
1.1. EINLEITUNG  
Die Testmethode basiert auf bestehenden Richtlinien (1) (2) (3) (4) 
(5) (6) (7) (8) (9). Das in dieser Testmethode beschriebene Verfahren soll eine Evaluierung der aeroben und anaeroben Transformations ­
prozesse von Chemikalien im Boden ermöglichen. Die Tests sind so 
konzipiert, dass i) die Transformationsrate der Testsubstanz und ii) 
die Art der Transformationsprodukte sowie Bildungs- und Abbaura ­
ten bestimmt werden. So können die Konzentrationen von Chemika ­
lien bzw. deren Transformationsprodukten, denen Pflanzen und Bo ­
denorganismen ausgesetzt sein können, errechnet werden. Solche 
Untersuchungen sind für Chemikalien erforderlich, die direkt auf den Boden ausgebracht werden bzw. bei denen die Möglichkeit be ­
steht, dass sie in den terrestrischen Bereich gelangen. Die Ergebnisse 
solcher Laboruntersuchungen können auch dazu genutzt werden, Probenahme- und Analysevorschriften für gleich gelagerte Feldstu ­
dien zu entwickeln.
 
Im Allgemeinen sind aerobe und anaerobe Untersuchungen mit einer 
Bodenart für die Untersuchung der Transformationspfade im Boden ausreichend (8) (10) (11). Die Transformationsraten sollten mit min ­
destens drei zusätzlichen Böden bestimmt werden (8) (10).
 
Auf einem OECD-Workshop zur Boden-/Sedimentauswahl, der 1995 
im italienischen Belgirate stattfand (10), wurden insbesondere die Anzahl und Arten der in diesem Test zu verwendenden Böden ver ­
einbart. Die im Test verwendeten Böden sollten repräsentativ für die 
im Freiland bei Chemikalieneinsatz bzw. -eintrag exponierten Boden sein. So sollten etwa Chemikalien, die möglicherweise in subtropischem bis tropischem Klima freigesetzt werden, mit Ferra ­
solen oder Nitosolen (FAO-System) getestet werden. Des Weiteren 
gab der Workshop basierend auf der ISO-Anleitung (15) Empfeh ­
lungen zur Entnahme, Handhabung und Lagerung von Bodenproben. Die Verwendung von Reisböden ist in dieser Methode ebenfalls 
berücksichtigt.
 
1.2. DEFINITIONEN  
Testsubstanz : jede Substanz, ob Ausgangssubstanz oder relevante 
Transformationsprodukte.  
Transformationsprodukte : alle Substanzen, die durch biotische 
oder abiotische Transformationsreaktionen der Testsubstanz entste ­
hen, einschließlich CO  2 und Reaktionsprodukte in gebundenen 
Rückständen.  
Gebundene Rückstände : „Gebundene Rückstände“ sind Verbindun ­
gen in Boden, Pflanzen oder Tieren, die nach einer Extraktion in der Matrix in Form der Ausgangssubstanz oder deren Metaboliten/ ­
Transformationsprodukte(n) verbleiben. Die Extraktionsmethode 
darf die Verbindungen selbst oder die Matrixstruktur nicht wesent ­
lich verändern. Durch matrixverändernde Extraktionsmethoden und hochentwickelte Analysenvertahren kann die Art der Bindung zum Teil geklärt werden. Bislang werden z. B. kovalente Ionen- und 
Sorptionsbindungen sowie Einschlüsse auf diese Weise nachgewie ­
sen. In aller Regel bedeutet die Bildung von gebundenen Rückstän ­
den eine deutliche Verminderung der Bioverfügbarkeit (12) (modifi ­
ziert nach IUPAC 1984 (13)).
 
Aerobe Transformation : in Gegenwart von molekularem Sauerstoff 
ablaufende Reaktionen (14).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1149
 
Anaerobe Transformation : unter Ausschluss von molekularem Sau ­
erstoff ablaufende Reaktionen (14).  
Boden : ein Gemisch mineralischer und organisch-chemischer Be ­
standteile, wobei Letztere Verbindungen mit hohem Kohlenstoff- und Stickstoffgehalt sowie einem hohen Molekulargewicht enthalten und mit kleinen (zumeist Mikro-)Organismen belebt sind. Boden 
kann in zwei Zustandsformen bearbeitet werden:
 
a) ungestört, wie er sich im Laufe der Zeitentwickelt hat, mit der 
charakteristischer Horizontabfolge der verschiedenen Bodentypen;  
b) gestört, wie er in der Regel auf landwirtschaftlich genutzten Flä ­
chen vorzufinden ist oder wie er vorkommt, wenn Proben durch 
Graben entnommen und in der beschriebenen Testmethode ver ­
wendet werden (14).  
Mineralisation : vollständiger Abbau einer organischen Verbindung 
zu CO  2 und H  2 O unter aeroben Bedingungen und zu CH  4 , CO  2 und 
H 2 O unter anaeroben Bedingungen. Im Zusammenhang mit dieser 
Testmethode, bei der eine  14 C-markierte Verbindung verwendet wird, 
bedeutet Mineralisation einen extensiven Abbau, wobei ein markier ­
tes Kohlenstoffatom unter Freisetzung der entsprechenden Menge  
14 CO 2 oxidiert wird (14).  
Halbwertszeit t  0,5 : die für die 50 %ige Transformation einer Test ­
substanz ermittelte Zeit, wenn die Transformation mittels Kinetik erster Ordnung beschrieben werden kann; sie ist konzentrationsunab ­
hängig.
 
Abbauzeit DT  50 : Zeitspanne, in der sich die Konzentration der Test ­
substanz um 50 % reduziert hat; sie unterscheidet sich von der 
Halbwertszeit t  0,5 , wenn die Transformation nicht nach der Kinetik 
erster Ordnung erfolgt.  
Abbauzeit DT  75 : Zeitspanne, in der sich die Testsubstanzkonzentra ­
tion um 75 % reduziert hat.  
Abbauzeit DT  90 : Zeitspanne, in der sich die Testsubstanzkonzentra ­
tion um 90 % reduziert hat.  
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Referenzsubstanzen sollten zur Charakterisierung und/oder zur Iden ­
tifizierung von Transformationsprodukten mittels spektroskopischer 
und chromatografischer Verfahren verwendet werden.  
1.4. ANWENDBARKEIT DES TESTS  
Die Methode ist auf sämtliche chemischen Substanzen (nicht mar ­
kiert oder radioaktiv markiert) anwendbar, für die ein Analysenver ­
fahren mit hinreichender Genauigkeit und Empfindlichkeit zur Ver ­
fügung steht. Sie ist anwendbar auf schwach flüchtige, nichtflüchti ­
ge, wasserlösliche oder wasserunlösliche Verbindungen, Bei Che ­
mikalien, die aus Böden hochflüchtig sind (z. B. Begasungsmittel oder organische Lösungsmittel) und somit unter den Testbedingun ­
gen dieses Tests nicht im Boden gehalten werden können, sollte der 
Test nicht angewendet werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1150
 
1.5. INFORMATIONEN ZUR TESTSUBSTANZ  
Zur Messung der Transformationsrate kann nicht markierte oder 
markierte Testsubstanz verwendet werden. Markiertes Material ist zur Untersuchung des Umwandlungswegs und zur Aufstellung einer 
Massenbilanz notwendig. Empfohlen wird die
 14 C-Markierung, doch 
auch der Einsatz anderer Isotope wie  13 C, 15 N, 3 H oder  32 P kann 
sinnvoll sein. Die Markierung sollte möglichst im stabilsten Teil, bzw, in den stabilsten Teilen des Moleküls positioniert sein (
 1 ). 
Der Reinheitsgrad der Testsubstanz sollte mindestens 95 % betragen.  
Vor der Durchführung eines Tests zur aeroben und anaeroben Trans ­
formation im Boden sollten folgende Informationen zur Testsubstanz vorliegen:
 
a) Wasserlöslichkeit (Methode A.6);  
b) Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln;  
c) Dampfdruck (Methode A.4) und Henry-Konstante;  
d) n-Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient (Methode A.8);  
e) chemische Stabilität im Dunkeln (Hydrolyse) (Methode C.7);  
f) pK  a , wenn ein Molekül zur Protonierung oder Deprotonierung 
neigt (OECD Guideline 112) (16).  
Außerdem können Angaben zur Toxizität der Testsubstanz gegen ­
über Bodenmikroorganismen sinnvoll sein (Testmethoden C.21 und 
C.22) (16).  
Es sollten Analysenmethoden (einschließlich Extraktions- und Rei ­
nigungsverfahren) zur Identifizierung und Quantifizierung der Test ­
substanz sowie ihrer Transformationsprodukte verfügbar sein.  
1.6. PRINZIP DER TESTMETHODE  
Den Bodenproben wird die Testsubstanz zugefügt, und die Proben 
werden im Dunkeln in einem Biometergefäß oder einem Durchfluss ­
system unter kontrollierten Laborbedingungen (bei konstanter Tem ­
peratur und Bodenfeuchtigkeit) inkubiert. Nach entsprechenden Zeit ­
intervallen werden die Bodenproben extrahiert und auf die Aus ­
gangssubstanz und Transformationsprodukte analysiert. Außerdem werden flüchtige Produkte mit Hilfe geeigneter Absorptionsvorrich ­
tungen für die Analyse gesammelt. Mittels
 14 C-markiertem Material 
können die verschiedenen Mineralisationsraten von Testsubstanzen durch Auffangen von entstandenem
 14 CO 2 gemessen werden, und 
es kann eine Massenbilanz, einschließlich der Bildung von boden ­
gebundenen Rückständen, aufgestellt werden.  
1.7. QUALITÄTSKRITERIEN  
1.7.1.  Wiederfindungsraten  
Die Extraktion und Analyse von mindestens zwei parallel angesetz ­
ten Bodenproben unmittelbar nach Zugabe der Testsubstanz geben einen ersten Hinweis auf die Wiederholbarkeit der Analysenmethode 
und die gleichmäßige Verteilung der Testsubstanz bei der Applika ­
tion. Die Wiederfindungsraten für spätere Testphasen ergeben sich aus den jeweiligen Massenbilanzen. Die Wiederfindungsraten sollten im Bereich von 90-110 % für markierte Chemikalien (8) und von 70- 
110 % für nicht markierte Chemikalien (3) liegen.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1151  
( 1 ) Wenn beispielsweise die Testsubstanz einen Ring enthält, muss sich die Markierung auf 
diesem Ring befinden; enthält die Testsubstanz zwei oder mehr Ringe, können geson ­
derte Untersuchungen erforderlich sein, um den Verbleib jedes markierten Ringes zu 
erfassen und sachgerechte Informationen zur Bildung von Transformationsprodukten zu 
gewinnen.
 1.7.2.  Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit der Analysenmethode  
Die Wiederholbarkeit der Analysenmethode (ausgenommen die Effi ­
zienz der Extraktion im Anfangsstadium) zur Quantifizierung der Testsubstanz und der Transformationsprodukte kann durch eine pa ­
rallele Analyse desselben Extrakts einer Bodenprobe, die hinreichend 
lange zur Bildung von Transformationsprodukten inkubiert wurde, überprüft werden.
 
Die Nachweisgrenze („limit of detection; LOD“) der Analysen ­
methode für die Testsubstanz und für die Transformationsprodukte 
sollte mindestens 0,01 mg · kg  -1 Boden (als Testsubstanz) oder — 
falls dieser Wert niedriger ist — 1 % der Applikationskonzentration betragen. Die Quantifizierungsgrenze („limit of quantification; LOQ“) sollte ebenfalls spezifiziert werden.
 
1.7.3.  Genauigkeit der Transformationsdaten  
Geeignete Informationen über die Zuverlässigkeit der Transformati ­
onskurve lassen sich mittels Regressionsanalyse aus denTestsub ­
stanzkonzentrationen in Abhängigkeit von der Zeit gewinnen, die 
auch die Berechnung des Vertrauensbereichs für Halbwertszeiten (im Falle einer Kinetik pseudo-erster Ordnung) bzw. DT
 50 -Werte 
und ggf. für DT  75 - und DT  90 -Werte ermöglicht.  
1.8. BESCHREIBUNG DER TESTMETHODE  
1.8.1.  Geräte und chemische Reagenzien  
Inkubationssysteme bestehen aus statischen geschlossenen Systemen 
oder geeigneten Durchflusssystemen (7) (17). Beispiele für eine ge ­
eignete Durchfluss-Bodeninkubationsapparatur und ein Biometerge ­
fäß sind in den Abbildungen 1 bzw. 2 dargestellt. Beide Arten von Inkubationssystemen haben Vorteile und Einschränkungen (7) (17).
 
Erforderlich ist die Standardlaborausstattung, insbesondere 
Folgendes:  
— Analysengeräte, z. B. GLC-, HPLC-, TLC-Ausstattung, ein ­
schließlich geeigneter Detektionssysteme für die Analyse radio ­
aktiv markierter oder nicht markierter Substanzen oder für die 
inverse Isotopenverdünnungsmethode;  
— Geräte für Identifizierungszwecke (z. B. MS, GC-MS, HPLC 
MS, NMR);  
— Flüssigkeitsszintillationszähler;  
— Oxidiser für die Verbrennung von radioaktivem Material;  
— Zentrifuge;  
— Extraktionsgerät (z. B. Zentrifugengläser für die Kaltextraktion 
und ein Soxhlet-Apparat für die kontinuierliche Extraktion unter 
Rückfluss);  
— Instrumente zum Einengen von Lösungen und Extrakten (z. B. 
Rotationsverdampfer);  
— Wasserbad;  
— mechanische Mischvorrichtung (z. B. Knetmaschine, Rotations ­
mischer).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1152
 
Einzusetzende chemische Reagenzien sind z. B.:  
— NaOH, analysenrein, 2 mol · dm  -3 , oder eine andere geeignete 
Base (z. B. KOH, Ethanolamin);  
— H  2 SO 4 , analysenrein, 0,05 mol · dm  -3 ; 
— Ethylenglykol, analysenrein;  
— feste Absorptionsmittel wie Natronkalk und Polyurethanstopfen;  
— organische Lösungsmittel, analysenrein, wie Aceton, Methanol 
usw.;  
— Szintillationsflüssigkeit.  
1.8.2.  Applikation der Testsubstanz  
Für die Zugabe zum Boden und die Verteilung darin kann die Test ­
substanz in Wasser (entionisiert oder destilliert) oder — falls not ­
wendig — in möglichst geringen Mengen Aceton oder anderen or ­
ganischen Lösungsmitteln (6) gelöst werden, in denen die Testsub ­
stanz hinreichend löslich und stabil ist. Die gewählte Lösungsmittel ­
menge sollte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Aktivität 
der Bodenmikroorganismen haben (siehe Abschnitte 1.5, 1.9.2 und 1.9.3). Die Verwendung von Lösungsmitteln, die die Aktivität der Bodenmikroorganismen hemmen, wie etwa Chloroform, Dichlor ­
methan oder andere halogenierte Lösungsmittel, ist zu vermeiden.
 
Die Testsubstanz kann auch als Feststoff zugegeben werden, z. B. in 
Quarzsand (6) eingemischt oder in einer kleinen Teilprobe des Test ­
bodens, die zuvor luftgetrocknet und sterilisiert wurde. Wird die 
Testsubstanz unter Verwendung eines Lösungsmittels zugegeben, 
muss das Lösungsmittel verdampfen können, bevor die Teilprobe der ursprünglichen nicht sterilen Bodenprobe zugesetzt wird.
 
Bei gebräuchlichen Chemikalien, deren Eintrag in den Boden haupt ­
sächlich über Klärschlamm/Anwendung in der Landwirtschaft er ­
folgt, sollte die Testsubstanz zuerst dem Schlamm zugesetzt werden, der dann in die Bodenprobe eingebracht wird (siehe 1.9.2 und 1.9.3).
 
Die Verwendung von formulierten Handelsprodukten wird nicht rou ­
tinemäßig empfohlen. Sie kann jedoch z. B. bei schlecht löslichen 
Testsubstanzen eine geeignete Alternative sein.  
1.8.3.  Böden  
1.8.3.1.  Bodenauswahl  
Zur Bestimmung der Transformationswege kann ein repräsentativer 
Boden verwendet werden; empfohlen werden sandiger Lehm oder 
schluffiger Lehm oder Lehm oder lehmiger Sand (gemäß FAO und 
USDA-Klassifikation (18)) mit einem pH-Wert von 5,5-8,0, einem organischen Kohlenstoffgehalt von 0,5-2,5 % und einer mikrobiellen Biomasse von mindestens 1 % des gesamten organischen Kohlen ­
stoffs (10).
 
Zur Untersuchung der Transformationsraten sollten mindestens drei 
zusätzliche Böden verwendet werden, die einen Bereich aller rele ­
vanten Böden repräsentieren. Die Böden sollten sich hinsichtlich des 
organischen Kohlenstoffgehalts, des pH-Werts, des Tongehalts und 
der mikrobiellen Biomasse voneinander unterscheiden (10).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1153
 
Alle Böden sollten mindestens hinsichtlich folgender Eigenschaften 
charakterisiert werden: Textur ( % Sand, % Schluff, % Ton) (gemäß 
FAO und der USDA-Klassifikation (18)), pH-Wert, Kationenaus ­
tauschkapazität, organischer Kohlenstoffgehalt, Bodendichte, Wasserrückhalteeigenschaft (
 1 ) und mikrobielle Biomasse (nur für 
aerobe Untersuchungen), Zusätzliche Informationen über Boden ­
eigenschaften können für die Interpretation der Ergebnisse von Nut ­
zen sein. Zur Bestimmung der Bodeneigenschaften können die in den Literaturangaben (19) (20) (21) (22) (23) empfohlenen Methoden 
herangezogen werden. Die mikrobielle Biomasse sollte mit Hilfe der 
substratinduzierten Respirationsmethode (SIR) (25) (26) oder alter ­
nativer Verfahren (20) bestimmt werden.
 
1.8.3.2.  Probenahme, Handhabung und Lagerung von Böden  
Es sind ausführliche Informationen über die Geschichte des Feld ­
standorts erforderlich, von dem der Testboden entnommen wird. 
Die Angaben betreffen unter anderem die genaue Lage, den Be ­
wuchs, Behandlungen mit Chemikalien sowie mit organischen und anorganischen Düngemitteln, Zusätze biologischer Materialien oder anderer Verunreinigungen. Böden, die in den vorhergehenden 4 Jah ­
ren mit der Testsubstanz oder ihren Struktur-Analoga behandelt wor ­
den sind, sollten nicht für die Transformationsuntersuchungen ver ­
wendet werden (10) (15).
 
Der Boden sollte feldfrisch entnommen werden (aus dem A-Horizont 
oder bis zu einer Tiefe von maximal 20 cm) und einen Bodenwasser ­
gehalt aufweisen, der das Sieben ermöglicht. Bei Böden, die nicht von Reisfeldern stammen, sollte die Probenahme während oder un ­
mittelbar nach längeren (> 30 Tage) Dürre-, Frost- oder Über ­
schwemmungsperioden vermieden werden (14). Die Proben sollten so transportiert werden, dass der Bodenwassergehalt möglichst un ­
verändert bleibt, und sie sollten unter freiem Luftzutritt dunkel auf ­
bewahrt werden. Im Allgemeinen ist ein locker verschlossener Poly ­
ethylenbeutel geeignet.
 
Der Boden sollte so schnell wie möglich nach der Probenahme be ­
arbeitet werden. Vegetationsreste, größere Bodentiere und Steine 
sollten entfernt werden, bevor der Boden durch ein Sieb mit 2 mm 
Maschenweite gegeben wird, um kleine Steine, Bodentiere und Pflanzenteile zu entfernen. Ein übermäßiges Austrocknen und Zer ­
kleinern des Bodens vor dem Sieben ist zu vermeiden (15).
 
Wenn die Probenahme auf dem Feld im Winter schwierig ist (Boden 
gefroren oder schneebedeckt), kann auf Boden zurückgegriffen wer ­
den, der im Gewächshaus unter einer Pflanzenabdeckung (Gras oder Gras-Klee-Mischung) gelagert wurde. Untersuchungen mit feldfri ­
schen Böden werden in jedem Fall bevorzugt, doch wenn der ent ­
nommene und bearbeitete Boden vor Beginn der Untersuchungen gelagert werden muss, dann unter angemessenen Bedingungen und nur für eine begrenzte Dauer (höchstens drei Monate bei 4 ± 2
 o C), 
um die rnikrobielle Aktivität zu erhalten (  2 ). Ausführliche Anweisun ­
gen zur Probenahme, Handhabung und Lagerung von Böden für Untersuchungen der Biotransformation sind zu finden in (8) (10) (15) (26) (27).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1154  
( 1 ) Die Wasserrückhalteeigenschaft eines Bodens lässt sich als Feldkapazität, als Wasser ­
haltekapazität oder als Wassersaugspannung (pF) messen. Erläuterungen siehe Anlage 
1. Im Testbericht ist festzuhalten, ob die Wasserrückhalteeigenschaft und die Boden ­
dichte von Böden bei ungestörten Feldproben oder gestörten (bearbeiteten) Proben er ­
mittelt wurden. 
( 2 ) Aktuelle Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass Böden aus den gemäßigten Kli ­
mazonen bei — 20  o C sogar mehr als drei Monate gelagert werden können (28) (29), 
ohne dass die mikrobielle Aktivität wesentlich zurückgeht.
 Bevor der bearbeitete Boden für diesen Test verwendet wird, sollte 
er vorinkubiert werden, um das Keimen und Entfernen von Samen 
zu ermöglichen und im Anschluss an den Wechsel von den Pro ­
benahme- oder Lagerungsbedingungen zu den Inkubationsbedingun ­
gen wieder ein Gleichgewicht des Mikrobenstoffwechsels herzustel ­
len. Im Allgemeinen ist eine Vorinkubationsdauer von 2 bis 28 
Tagen unter annähernder Einhaltung der Temperatur- und Feuchtig ­
keitsbedingungen des eigentlichen Tests ausreichend (15). Lagerung und Vorinkubation sollten zusammengenommen nicht länger als drei 
Monate dauern.
 
1.9. DURCHFÜHRUNG DES TESTS  
1.9.1.  Testbedingungen  
1.9.1.1.  Testtemperatur  
Während der gesamten Testdauer sollten die Böden im Dunkeln bei 
einer konstanten Temperatur inkubiert werden, die für die klimati ­
schen Bedingungen, unter denen der Einsatz bzw. die Freisetzung 
erfolgt. repräsentativ ist. Für alle Testsubstanzen, die in gemäßigten 
Klimazonen in den Boden gelangen können, wird eine Temperatur von 20 ± 2
 o C empfohlen. Die Temperatur sollte überwacht werden.  
Bei Chemikalien, die in kälteren Klimazonen angewandt bzw. einge ­
tragen werden (z. B. in nördlichen Ländern oder während des 
Herbstes/Winters), sollten zusätzlich Bodenproben bei einer niedrige ­
ren Temperatur inkubiert werden(z. B. 10 ± 2  o C). 
1.9.1.2.  Feuchtegehalt  
Bei Transformationstests unter aeroben Bedingungen sollte der 
Feuchtegehalt (  1 ) des Bodens auf einen pF Wert von 2,0 bis 2,5 
eingestellt und bei diesem Wert gehalten werden(3). Der Feuchte ­
gehalt des Bodens wird als Masse Wasser pro Masse Boden (Tro ­
ckengewicht) ausgedrückt und sollte regelmäßig kontrolliert werden 
(z. B. alle zwei Wochen), indem die Inkubationsgefäße gewogen und Wasserverluste ersetzt werden (vorzugsweise mit sterilfiltriertem Lei ­
tungswasser). Es ist darauf zu achten, dass während der Zugabe von 
Feuchtigkeit Verluste von Testsubstanz und/oder Transformations ­
produkten durch Verflüchtigung und/oder ggf. fotochemischen Ab ­
bau möglichst verhindert oder minimiert werden.
 
Für Transformationstests unter anaeroben und Reisanbaubedingun ­
gen wird der Boden durch Überflutung mit Wasser gesättigt.  
1.9.1.3.  Aerobe Inkubationsbedingungen  
Bei Durchflusssystemen werden aerobe Bedingungen durch diskon ­
tinuierliches Spülen oder kontinuierliches Belüften mit befeuchteter 
Luft aufrechterhalten. In Biometergefäßen wird der ständige Aus ­
tausch von Luft durch Diffusion ermöglicht.  
1.9.1.4.  Sterile aerobe Bedingungen  
Um Informationen über die Relevanz der abiotischen Transformation 
einer Testsubstanz zu gewinnen, können Bodenproben sterilisiert (zu Sterilisationsverfahren vgl. (16) und (29)), mit einer sterilen Test ­
substanz behandelt (z. B. Zugabe der Lösung durch ein Sterilfilter) 
und mit steriler befeuchteter Luft, wie in 1.9.1.3 beschrieben, belüftet werden. Bei Reisböden sollten Boden und Wasser sterilisiert und die Inkubation wie in 1.9.1.6 beschrieben durchgeführt werden.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1155  
( 1 ) Der Boden sollte weder zu feucht noch zu trocken sein, um eine adäquate Belüftung und 
Ernährung der Bodenmikroflora zu gewährleisten. Für ein optimales Wachstum der 
Bodenmikroorganismen wird ein Feuchtegehalt von 40-60 % der Wasserhaltekapazität 
(WHK) und von 0,1-0,33 bar empfohlen (6). Der letztere Bereich entspricht einem pF- 
Bereich von 2,0-2,5. Typische Feuchtegehalte verschiedener Bodenarten sind in Anlage 2 
aufgeführt.
 1.9.1.5.  Anaerobe Inkubationsbedingungen  
Zum Erreichen und Aufrechterhalten anaerober Bedingungen wird 
der mit der Testsubstanz behandelte und unter aerober Bedingungen für 30 Tage bzw. eine Halbwertszeit oder DT
 50 (je nachdem, was 
kürzer ist) inkubierte Boden mit Wasser überflutet (Wassersäule 1- 
3 cm), und das Inkubationssystem wird mit einem inerten Gas (z. B. Stickstoff oder Argon) gespült (
 1 ). Das Testsystem muss Messungen 
z. B. des pH-Werts, der Sauerstoffkonzentration und des Redox ­
potenzials ermöglichen und Absorptionsfallen für flüchtige Reakti ­
onsprodukte beinhalten. Das Biometersystem muss geschlossen sein, um den Zutritt von Luft durch Diffusion zu vermeiden.
 
1.9.1.6.  Inkubation unter Reisfeldbedingungen  
Zur Untersuchung der Transformation in Reisfeldböden wird der 
Boden mit einer Wassersäule von etwa 1-5 cm Höhe überflutet 
und die Testsubstanz in die Wasserphase appliziert (9). Es wird eine Bodentiefe von mindestens 5 cm empfohlen. Das System wird mit Luft wie unter aeroben Bedingungen belüftet. Der pH-Wert, die 
Sauerstoffkonzentration und das Redoxpotenzial der Wassersäule 
sollten überwacht und aufgezeichnet werden. Vor der Aufnahme der Transformationsuntersuchungen ist eine Vorinkubationsdauer von mindestens zwei Wochen erforderlich (siehe 1.8.3.2).
 
1.9.1.7.  Testdauer  
Die Untersuchungen zu Geschwindigkeit und Transformationsverlauf 
sollten nicht länger als 120 Tage dauern (  2 ) (3) (6) (8), da danach in 
einem künstlichen Laborsystem, isoliert von natürlichen Revitalisie ­
rungsprozessen, eine Abnahme der mikrobiellen Aktivität im Boden mit der Zeit zu erwarten wäre. Falls es für die Charakterisierung des 
Testsubstanzabbaus sowie der Bildung und des Abbaus der Trans ­
formationsprodukte erforderlich ist, können die Untersuchungen über längere Zeiträume fortgesetzt werden (z. B. 6 oder 12 Monate) (8). Längere Inkubationszeiten sollten im Testbericht begründet und 
durch Biomassemessungen im Verlauf und am Ende dieser Zeit ­
räume begleitet werden.
 
1.9.2.  Durchführung des Tests  
In jedes Inkubationsgefäß werden etwa 50 bis 200 g Boden (Bezugs ­
basis Trockengewicht) gegeben (siehe Abbildungen 1 und 2 in An ­
lage 3), und der Boden wird nach einem der in 1.8.2 beschriebenen 
Verfahren mit der Testsubstanz behandelt. Werden organische Lö ­
sungsmittel für die Applikation der Testsubstanz verwendet, sollten sie durch Verdampfen aus dem Boden entfernt werden. Anschließend 
wird der Boden mit einem Spatel und/oder durch Schütteln des 
Gefäßes gründlich durchmischt. Wird die Untersuchung unter Reis ­
feldbedingungen durchgeführt, sollten Boden und Wasser nach Ap ­
plikation der Testsubstanz gründlich gemischt werden. Zur Überprü ­
fung der gleichmäßigen Verteilung sollten kleine Aliquoten (z. B. 
1 g) des behandelten Bodens auf die Testsubstanzgehalte analysiert werden. Angaben zu einem alternativen Verfahren siehe unten.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1156  
( 1 ) Wie ein von der EU gefördertes Forschungsprojekt gezeigt hat, herrschen in Oberböden 
und selbst in Böden aus Tiefenschichten aerobe Bedingungen vor (K. Takagi et al. 
(1992). Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal varia ­
tion in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17.-21. August 1992, Sigtuna, Schweden). Anae ­
robe Bedingungen kommen nur gelegentlich bei Überschwemmungen von Böden nach 
schweren Niederschlägen oder bei der Herstellung von Anbaubedingungen auf Reisfel ­
dern vor. 
(
 2 ) Aerobe Untersuchungen können weit vor Ablauf von 120 Tagen beendet werden, wenn 
zu diesem Zeitpunkt der Abbauweg eindeutig identifiziert wurde und die vollständige 
Mineralisation erreicht worden ist. Beendet werden kann der Test nach 120 Tagen oder 
wenn mindestens 90 % der Testsubstanz umgewandelt sind, jedoch nur, wenn sich 
mindestens 5 % CO  2 gebildet haben.
 Die Testkonzentration sollte der höchsten Anwendungsrate eines 
Pflanzenschutzmittels laut den Empfehlungen in der Gebrauchsanlei ­
tung und einer gleichmäßigen Einarbeitung in eine geeignete Tiefe im Feld (z. B. bis zu einer Tiefe von 10 cm (
 1 ) in den Boden) 
entsprechen. So beträgt z. B. bei Chemikalien, die auf die Blätter 
oder den Boden ohne Einarbeitung ausgebracht werden, die geeig ­
nete Tiefe für die Berechnung der in jedes Gefäß zu gebenden Che ­
mikalie 2,5 cm. Bei in den Boden eingearbeiteten Chemikalien ist die geeignete Tiefe die in der Gebrauchsanleitung genannte Einarbei ­
tungstiefe. Für Chemikalien im Allgemeinen sollte die Applikations ­
rate basierend auf dem Haupteintragspfad gewählt werden. Wenn z. B. der Eintrag in den Boden hauptsächlich über Klärschlamm erfolgt, sollte die Chemikalie im Schlamm so dosiert werden, dass 
ihre Konzentration im Verhältnis zu der erwarteten Schlammkonzen ­
tration steht, und der dem Boden zugegebene Schlamm sollte im Verhältnis zum üblichen Schlammeintrag in landwirtschaftlich ge ­
nutzte Böden stehen. Ist diese Konzentration nicht hoch genug, um 
die wichtigsten Transformationsprodukte nachzuweisen, kann eine 
Inkubation gesonderter Bodenproben mit höheren Mengen hilfreich sein, doch sollten zu hohe Mengen, die die Funktionen der Boden ­
mikroorganismen beeinflussen, vermieden werden (siehe 1.5 und 
1.8.2).
 
Alternativ kann eine größere Charge (d. h. 1 bis 2 kg) Boden mit der 
Testsubstanz behandelt werden; dieser Ansatz wird in einem geeig ­
neten Mischgerät sorgfältig gemischt und anschließend in kleinen Teilen von 50 bis 200 g in die Inkubationsgefäße gegeben (z. B. 
unter Verwendung von Probenteilern). Zur Überprüfung der gleich ­
mäßigen Verteilung sollten kleine Aliquoten (z. B. 1 g) des behan ­
delten Bodens auf die Testsubstanzgehalte analysiert werden. Ein solches Verfahren wird bevorzugt, da es eine gleichmäßigere Ver ­
teilung der Testsubstanz im Boden ermöglicht.
 
Zusätzlich zu den mit Testsubstanz behandelten Proben werden un ­
behandelte Bodenproben unter den gleichen Bedingungen (aerob) inkubiert. Diese Proben werden zur Messung der Biomasse im Ver ­
lauf und am Ende der Untersuchungen herangezogen.
 
Wird die Testsubstanz mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels/ 
mehrerer organischer Lösungsmittel gelöst auf den Boden auf ­
gebracht, werden mit der gleichen Menge des Lösungsmittels/der Lösungsmittel behandelte Bodenproben unter den gleichen Bedin ­
gungen (aerob) inkubiert, wie die mit der Testsubstanz behandelten 
Proben. Diese Proben werden zur Biomassemessung zu Testbeginn, während des Tests und zu Testende herangezogen, um die Wirkun ­
gen des Lösungsmittels/der Lösungsmittel auf die mikrobielle Bio ­
masse zu prüfen.
 
Die den behandelten Boden enthaltenden Gefäße werden entweder 
an das in Abbildung 1 dargestellte Durchflusssystem angeschlossen oder mit der in Abbildung 2 gezeigten Absorptionskolonne ver ­
schlossen (siehe Anlage 3).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1157  
( 1 ) Die Berechnung der Ausgangskonzentration eines Standorts beruht auf folgender Glei ­
chung: 
C Boden ½mg=kg soil â ¼ A½kg=haâ·10 6 ½mg=kgâ 
l½mâ·10 4 ½m 2=haâ·d½kg soil=m 3 â 
C Boden  = C  soil = Ausgangskonzentration im Boden (mg ·kg-1); kgsoil = kgBoden 
A = Aufwandrate (kg · ha -1 ); l = Dicke der Bodenschicht am Feldstandort (m); d = Boden ­
dichte des trockenen Bodens (kg · m -3 ). 
Als Faustregel gilt, dass eine Aufwandrate von 1 kg · ha -1 in einer Bodenkonzentration von ca. 
1 mg· kg -1 in einer 10-cm-Schicht resultiert (ausgehend von einer Bodendichte von 1 g · cm  -3 ).
 1.9.3.  Probenahme und Messung  
Parallel-Inkubationsgefäße werden in entsprechenden Zeitintervallen 
entnommen und die Bodenproben mit geeigneten Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität extrahiert und auf die Testsubstanz und/ ­
oder Transformationsprodukte analysiert. Bei einer gut konzipierten 
Untersuchung ist eine ausreichende Zahl von Gefäßen vorgesehen, so dass zu jedem Probenahmetermin zwei Gefäße entnommen wer ­
den. Zudem werden in verschiedenen Zeitintervallen (7-Tage-Inter ­
valle während des ersten Monats und 17-Tage-Intervalle nach einem 
Monat) Absorptionslösungen bzw. feste Absorptionsmittel im Ver ­
lauf und am Ende der Inkubation jeder Bodenprobe entfernt und auf 
flüchtige Produkte analysiert. Abgesehen von einer unmittelbar nach 
der Applikation (0-Tage-Probe) genommenen Bodenprobe sollten mindestens 5 zusätzliche Probenahmetermine vorgesehen sein. Die Zeitintervalle sollten derart ausgewählt werden, dass ein Abbau ­
schema für die Testsubstanz und ein Bitdungs- und Abbauschema 
für die Transformationsprodukte erstellt werden können (z. B. 0, 1, 3, 7 Tage; 2, 3 Wochen; 1, 2, 3 Monate usw.).
 
Wird eine  14 C-markierte Testsubstanz verwendet, wird die nicht ex ­
trahierbare Radioaktivität durch Verbrennung quantifiziert, und für jedes Probenahmeintervall wird eine Massenbilanz berechnet.
 
Im Falle einer anaeroben Inkubation sowie einer Inkubation unter 
Reisfeldbedingungen werden die Boden- und Wasserphasen gemein ­
sam auf die Testsubstanz und Transformationsprodukte analysiert oder vor der Extraktion und Analyse durch Filtrieren oder Zentrifu ­
gieren abgetrennt.
 
1.9.4.  Fakultative Tests  
Aerobe, nichtsterile Untersuchungen bei zusätzlichen Temperaturen 
und Bodenfeuchten können sinnvoll sein, wenn es darum geht, den Einfluss von Temperatur und Bodenfeuchte auf die Transformations ­
geschwindigkeit einer Testsubstanz und/oder ihrer Transformations ­
produkte im Boden abzuschätzen.
 
Eine weitere Charakterisierung von nicht extrahierbarer Radioaktivi ­
tät kann z. B. mittels überkritischer Flüssigextraktion versucht wer ­
den. 
2. DATEN  
2.1. AUFBEREITUNG DER ERGEBNISSE  
Die Konzentrationen der Testsubstanz, Transformationsprodukte, 
flüchtigen Substanzen (nur in %) und nicht extrahierbaren Substan ­
zen sollten in % der applizierten Ausgangskonzentration und ggf. in mg· kg
 -1 Boden (Bezugsbasis Trockengewicht) für jedes Probenah ­
meintervall angegeben werden. Eine Massenbilanz in Prozent, bezo ­
gen auf die Ausgangskonzentration, sollte für jedes Probenahme ­
intervall erstellt werden. Eine grafische Darstellung der Testsubstanz ­
konzentrationen in Abhängigkeit von der Zeit wird eine Einschät ­
zung der Transformationshalbwertszeit bzw. der DT  50 ermöglichen. 
Die Haupttransformationsprodukte sollten identifiziert und ihre Kon ­
zentrationen ebenfalls über der Zeit aufgetragen werden, um die jeweilige Geschwindigkeit ihrer Bildung und ihres Abbaus aufzuzei ­
gen. Ein Haupttransformationsprodukt ist jedes Reaktionsprodukt, 
das zu irgendeinem Zeitpunkt des Tests mit einer Konzentration ≥ 10 % der Applikationskonzentration vorliegt.
 
Die aufgefangenen flüchtigen Produkte geben Hinweise auf das 
Flüchtigkeitspotenzial einer Testsubstanz und ihrer Transformations ­
produkte im Boden.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1158
 
Eine genauere Bestimmung der Halbwertszeiten bzw. DT  50 -Werte 
und ggf. DT  75 - und DT  90 -Werte sollte durch die Anwendung geeig ­
neter Kinetik-Modellberechnungen möglich sein. Die Halbwertszei ­
ten und DT  50 -Werte sollten zusammen mit der Beschreibung des 
verwendeten Modells, der Kinetikordnung und des Determinations ­
koeffizienten (r  2 ) angegeben werden. Bevorzugt wird die Kinetik 
erster Ordnung, sofern nicht r  2 < 0,7. Ggf. sollten die Berechnungen 
auch bei den Haupttransformationsprodukten angewendet werden. Beispiele für zweckmäßige Modelle sind in den Literaturangaben 
(31) bis (35) beschrieben.
 
Wurden Untersuchungen bei verschiedenen Temperaturen durch ­
geführt, sollten die Transformationsraten in Abhängigkeit von der 
Temperatur innerhalb des eingesetzten experimentellen Temperatur ­
bereichs dargestellt werden, und zwar unter Verwendung der Arr ­
henius-Gleichung, in der Form:  
k ¼ A·e ÄB=T oder lnk ¼ 1nA Ä B 
T , 
wobei ln A und B Regressionskonstanten aus dem Achsenabschnitt 
bzw. der Steigung einer Ausgleichsgeraden sind, die durch lineare Regression von ln k gegen 1/T erzeugt wird. k ist die Geschwindig ­
keitskonstante bei der Temperatur T und T ist die Temperatur in 
Kelvin ist. Es ist auf den begrenzten Temperaturbereich zu achten, in dem die Arrhenius-Gleichung gültig ist, wenn die Transformation auf mikrobieller Aktivität beruht.
 
2.2. EVALUIERUNG UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE  
Obwohl die Untersuchungen in einem künstlichen Laborsystem statt ­
finden, lassen die Ergebnisse doch eine Einschätzung der Transfor ­
mationsrate der Testsubstanz und auch der Bildungs- und Abbaurate 
der Transformationsprodukte unter Feldbedingungen zu (36) (37).  
Eine Untersuchung der Transformationswege einer Testsubstanz ver ­
mittelt Erkenntnisse über die Art und Weise wie die Substanz im 
Boden in ihrer Struktur durch chemische und mikrobielle Reaktion 
verändert wird.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
TESTBERICHT  
Der Testbericht muss folgende Angaben enthalten:  
Testsubstanz:  
— Common Name (Handelsname von Pflanzenschutzmitteln), sys ­
tematischer chemischer Name, CAS-Nummer, Strukturformel (bei Verwendung radioaktiv markierter Chemikalien Angabe 
des Markierungsorts) und relevante physikalisch-chemische Ei ­
genschaften (siehe 1.5);
 
— Reinheit (Verunreinigungen) der Testsubstanz;  
— für markierte Chemikalien: radiochemische Reinheit und spezi ­
fische Aktivität (falls zutreffend).  
Referenzsubstanzen:  
— Systematischer chemischer Name und Struktur der Referenzsub ­
stanzen, die zur Charakterisierung und/oder Identifizierung von 
Transformationsprodukten verwendet werden.  
Testböden:  
— Angaben zum Probenahmeort;  
— Datum und Verfahren der Probenahme;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1159
 
— Bodeneigenschaften, z. B. pH-Wert, organischer Kohlenstoff ­
gehalt, Textur ( % Sand, % Schluff, % Ton), Kationenaustausch ­
kapazität, Bodendichte, Wasserrückhalteeigenschaft und mikro ­
bielle Biomasse;  
— ggf. Lagerungsdauer und -bedingungen.  
Testbedingungen:  
— Angabe aller Kalenderdaten in Zusammenhang mit der Test ­
durchführung;  
— Applikationsmenge der Testsubstanz;  
— verwendete Lösungsmittel und Art der Testsubstanzapplikation;  
— Bodengewicht zu Testbeginn und zu jedem Probenahmetermin, 
der Analytik einschließt;  
— Beschreibung des verwendeten Inkubationssystems;  
— Luftdurchflussrate (nur für Durchflusssysteme);  
— Versuchstemperatur;  
— Bodenfeuchtegehalt während der Inkubation;  
— mikrobielle Biomasse zu Beginn, im Verlauf und am Ende der 
aeroben Untersuchungen;  
— pH-Wert, Sauerstoffkonzentration und Redoxpotenzial zu Be ­
ginn, im Verlauf und am Ende der anaeroben Untersuchungen und der Untersuchungen unter Reisfeldbedingungen;
 
— Extraktionsverfahren;  
— Quantifizierungs- und Identifizierungsverfahren für die Testsub ­
stanz und die Haupttransformationsprodukte im Boden und in 
den Absorptionsmitteln;  
— Anzahl der Replikate und der Kontrollansätze.  
Ergebnisse:  
— Ergebnis der Bestimmung der mikrobiellen Aktivität;  
— Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit der herangezogenen Ana ­
lysenmethoden;  
— Wiederfindungsraten (Werte in % für eine valide Untersuchung 
sind in 1.7.1 angegeben);  
— tabellarische Darstellung der Ergebnisse in % der applizierten 
Ausgangskonzentration und ggf. in mg · kg  -1 Boden (bezogen 
auf Trockengewicht);  
— Massenbilanz während und am Ende der Untersuchungen;  
— Charakterisierung nicht extrahierbarer (gebundener) Radioaktivi ­
tät bzw. Rückstände im Boden;  
— Quantifizierung von freigesetztem CO  2 und anderer flüchtiger 
Verbindungen;  
— grafische Darstellungen von Bodenkonzentrationen in Abhängig ­
keit von der Zeit für die Testsubstanz und ggf. für die Haupt ­
transformationsprodukte;  
— Halbwertszeit oder DT  50 , DT  75 und DT  90 für die Testsubstanz 
und ggf. für die  
— Haupttransformationsprodukte einschließlich Vertrauensberei ­
chen;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1160
 
— Einschätzung der abiotischen Abbaurate unter sterilen 
Bedingungen;  
— Beurteilung der Transformationskinetik für die Testsubstanz und 
ggf. für die Haupttransformationsprodukte;  
— Angabe von Transformationspfaden (falls möglich);  
— Diskussion und Interpretation der Ergebnisse;  
— Rohdaten (d. h. Chromatogramme der einzelnen Proben, Berech ­
nungen der Transformationsraten sowie Methoden zur Identifi ­
zierung von Transformationsprodukten).  
4. LITERATURANGABEN  
(1) US-Environmental Protection Agency (1982). Pesticide As ­
sessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmen ­
tal Fate.  
(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fa ­
te. Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(3) Europäische Union (EU) (1995). Richtlinie 95/36/EG der 
Kommission vom 14. Juli 1995 zur Änderung der Richtlinie 91/414/EWG über das Inverkehrbringen von Pflanzenschutz ­
mitteln. Anhang II, Teil A, und Anhang III, Teil A: Verbleib 
und Verhalten in der Umwelt.
 
(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Ap ­
plication for registration of a pesticide. Section G: Behaviour 
of Ehe product and its metabolites in soil, water and air.  
(5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflan ­
zenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutz ­
mitteln im Boden — Abbau, Umwandlung und Metabolismus.  
(6) IS0/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Gutdance on laboratory 
tests for biodegradation of organic chemicals in soil — Part 1: Aerobic conditions.
 
(7) ISO 14239 (1997). Bodenbeschaffenheit — Laboratoriumsin ­
kubationssysteme zur Bestimmung der Mineralisierung von organischen Chemikalien im Boden unter aeroben Bedingun ­
gen.
 
(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(9) MAFF — Japan 2000 — Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil — Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).
 
(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Se ­
lection of Soils/Sediments. Belgirate, Italien, 18-20 January 1995.
 
(11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Inter ­
actions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.
 
(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley — VCH 
(1998).  
(13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
(14) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(angenommen am 12. Mai 1981).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1161
 
(15) ISO 10381-6 (1993). Bodenbeschaffenheit — Probenahme — 
Teil 6: Anleitung zur Probenahme, Behandlung und Lagerung 
von Boden für die Bestimmung aerober mikrobieller Prozesse unter Laborbedingungen.
 
(16) Anhang V zur Richtlinie 67/548/EWG  
(17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemis ­
try. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol I, 85-114.
 
(18) Soil Texture Classification (US and FAO Systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) und Soil Sci. Soc. Amer. Proc, 26:305 (1962).
 
(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mi ­
neralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 
2nd Edition.  
(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Mi ­
crobiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. 
Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.  
(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality 
— General aspects; chemical and physical methods of ana ­
lysis; biological methods of analysis. First Edition.  
(22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologi ­
schen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologi ­
schen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  
(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.  
(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological me ­
thod for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol, Biochem. 10, 215-221.
 
(25) ISO 14240-1 und 2 (1997). Bodenbeschaffenheit — Bestim ­
mung der mikrobiellen Biomasse von Böden — Teil 1: Sub ­
stratinduziertes Respirationsverfahren. Teil  2: Fumigations-Ex ­
traktionsverfahren.  
(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for 
pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. 
L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60.  
(27) Kalo, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transforma ­
tion in the environment: Aerobic and bio- transformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16
 th 
Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105-120.  
(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology 
and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).  
(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl Svensson K., 
Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and 
cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SE ­
TAC-Europe).
 
(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of 
ethylene oxide on soil microbial content and some chemical 
characteristics. Plant and Soil 102, 197-200.  
(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und 
Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat 
im Boden. Zeitschrift Pflanzenkrankheiten — Pflanzenschutz, 
Sonderheft VII, 141-146.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1162
 
(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical mo ­
delling to the soil persistence and accumulation of pesticides. 
Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Her ­
bicides, 181-199.  
(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, 
R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In 
„Environmental Dynamics of Pesticides“. R. Haque and 
V.H. Freed, Eds., 135-172.  
(34) Timme, G. Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical Interpre ­
tation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz — Nachrichten 
Bayer 39, 188-204.  
(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical Interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pes ­
ticide residues. I. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer 33, 
47-60.  
(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dis ­
sipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032-1041.
 
(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In: 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), Academic Press, 83-122.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1163
 
Anlage 1  
WASSERSPANNUNG, FELDKAPAZITÄT (FK) UND WASSERHALTEKAPAZITÄT 
(WHK)  ( 1 ) 
Höhe der Wassersäule 
(cm) pF (  a ) bar (  b ) Bemerkungen  
10 7 7 10  4 Trockener Boden 
1,6 · 10 4 4,2 16 Welkepunkt 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6· 10 2 2,8 0,6 
3,3 · 10 2 2,5 0,33 (  c ) 
Bereich der 
Feldkapazität (  d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 WHK (Näherungswert) 
1 0 0,001 wassergesättigter Boden
 
( a ) pF = dekadischer Logarithmus der Wasserspannung (in cm Wassersäule). 
( b ) 1 bar = 10  5 Pa. 
( c ) Entspricht einem angenäherten Wassergehalt von 10 % in Sand, 35 % in Lehm und 45 % in Ton. 
( d ) Die Feldkapazität (FK) ist nicht konstant, sondern schwankt je nach Bodentyp zwischen pF 1,5 und 2,5.  
Die Wasserspannung (Saugspannung)  wird in cm Wassersäule oder in bar gemessen. Aufgrund des 
großen Saugspannungsbereichs wird sie einfach als pF-Wert angegeben, der dem Logarithmus der 
in cm Wassersäule angegebenen Wasserspannung entspricht.  
Die Feldkapazität (Speicherfeuchte)  wird definiert als die Wassermenge, die ein natürlicher Boden 
nach längeren Niederschlägen oder nach ausreichender Bewässerung zwei Tage gegen die Gravi ­
tation speichern kann. Sie wird in ungestörtem Boden in situ im Feld bestimmt. Daher ist die Messung nicht auf gestörte Laborbodenproben anwendbar. In gestörtem Boden bestimmte FK- 
Werte können erhebliche systematische Varianzen aufweisen.
 
Die Wasserhaltekapazität (WHK)  wird im Labor für ungestörten und gestörten Boden durch Sät ­
tigung einer Bodensäule mit Wasser durch Kapillaraufstieg bestimmt Sie ist besonders für gestörte Böden nützlich und kann bis zu 30 % größer sein als die Feldkapazität (1). Sie ist im Test auch 
leichter zu bestimmen als verlässliche FK-Werte.
 
Anmerkungen  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1164
 
Anlage 2  
BODENFEUCHTEGEHALT (in g Wasser je 100 g Boden TG  ( 1 )) VERSCHIEDENER 
BODENARTEN AUS UNTERSCHIEDLICHEN LÄNDERN  
Bodenfeuchtegehalt bei 
Bodenart Land 
WHK (  1 ) pF = 1,8 pF = 2,5  
Sand Deutschland 28,7 8,8 3,9 
Lehmiger Sand Deutschland 50,4 17,9 12,1 
Lehmiger Sand Schweiz 44,0 35,3 9,2 
Schluffiger Lehm Schweiz 72,8 56,6 28,4 Toniger Lehm Brasilien 69,7 38,4 27,3 Toniger Lehm Japan 74,4 57,8 31,4 Sandiger Lehm Japan 82,4 59,2 36,0 Schluffiger Lehm USA 47,2 33,2 18,8 Sandiger Lehm USA 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Wasserhaltekapazität.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1165  
( 1 ) TG: Trockengewicht.
 Anlage 3  
Abbildung 1  
Beispiel eines Durchflussapparats für die Untersuchung der Transformation von Chemikalien 
im Boden  ( 1 ) ( 2 )
 
Abbildung 2  
Beispiel eines Biometergefäßes für die Untersuchung der Transformation von Chemikalien im 
Boden  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1166  
( 1 ) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), Academic Press, 123-157. 
( 2 ) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide 
Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons, Vol I, 85-114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von 
Diallat im Boden. Zeitschrift Pflanzenkrankheiten — Pflanzenschutz, Sonderheft VII, 141-146.
 C.24.  AEROBE UND ANAEROBE TRANSFORMATION IN WASSER- 
SEDIMENT-SYSTEMEN  
1. METHODE  
Diese Testmethode entspricht der Prüfrichtlinie OECD TG 308 
(2002).  
1.1. EINLEITUNG  
Chemikalien gelangen in flache oder tiefe Oberflächengewässer auf fol ­
genden Wegen: direkte Applikation, Sprühmittelabdrift, Ablauf, Ent ­
wässerung, Abfallentsorgung, Industrie-, Haushalts- oder Landwirt ­
schaftsabwässer und über atmosphärische Ablagerung. Die Testmethode 
beschreibt eine Labormethode zur Beurteilung der aeroben und anaer ­
oben Transformation von organischen Chemikalien in Wasser-Sedi ­
ment-Systemen. Sie basiert auf bestehenden Richtlinien (1) (2) (3) (4) (5) (6). Auf einem OECD-Workshop zur Boden/Sedimentauswahl, der 
1995 im italienischen Belgirate stattfand (7), wurden insbesondere die 
Anzahl und Arten der bei diesem Test zu verwendenden Sedimente vereinbart. Des Weiteren gab der Workshop Empfehlungen zur Entnah ­
me, Handhabung und Lagerung von Sedimentproben basierend auf den 
ISO-Hinweisen (8). Derartige Untersuchungen sind bei Chemikalien 
erforderlich, bei denen davon auszugehen ist, dass sie unmittelbar in Wasser angewandt werden oder auf den oben aufgeführten Eintragspfa ­
den in den aquatischen Bereich gelangen.
 
Die Bedingungen in natürlichen Wasser-Sediment-Systemen sind in 
der oberen Wasserphase häufig aerob. Die Oberflächenschicht des Sediments kann entweder aerob oder anaerob sein, während die tieferen Sedimentschichten in der Regel anaerob sind. Um sämtli ­
chen Möglichkeiten Rechnung zu tragen, werden in diesem Doku ­
ment sowohl aerobe als auch anaerobe Tests beschrieben. Der aerobe Test simuliert eine aerobe Wassersäule über einer aeroben Sedim ­
entschicht, die mit einem anaeroben Gradienten unterschichtet ist. 
Der anaerobe Test simuliert ein vollständig anaerobes Wasser-Sedi ­
ment-System. Deuten die Umstände darauf hin, dass es notwendig ist, von diesen Empfehlungen deutlich abzuweichen, indem z. B. intakte Sedimentkerne oder Sedimente verwendet werden, die mög ­
licherweise gegenüber der Testsubstanz exponiert waren, können 
andere, zu diesem Zweck verfügbare Methoden zur Anwendung kommen (9).
 
1.2. DEFINITIONEN  
In jedem Falle ist das Internationale Einheitensystem (SI-System) 
anzuwenden.  
Testsubstanz:  jede Substanz, ob Ausgangsverbindung oder relevante 
Transformationsprodukte.  
Transformationsprodukte:  alle Substanzen, die das Ergebnis von 
biotischen oder abiotischen Transformationsreaktionen der Testsub ­
stanz sind, einschließlich CO  2 und Reaktionsprodukte in gebundenen 
Rückständen.  
Gebundene Rückstände:  Verbindungen in Böden, Pflanzen oder 
Tieren, die nach einer Extraktion in der Matrix in Form der Aus ­
gangssubstanz oder deren Metaboliten verbleiben. Die Extraktions ­
methode darf die Verbindungen selbst oder die Matrix Struktur nicht wesentlich verändern. Die Art der Bindung kann zum Teil durch 
matrixverändernde Extraktionsmethoden und hochentwickelte Ana ­
lysenverfahren geklärt werden. Bislang werden z. B. kovalente Io ­
nen- und Sorptionsbindungen sowie Einschlüsse auf diese Weise nachgewiesen. In aller Regel bedeutet die Bildung von gebundenen 
Rückständen eine deutliche Verminderung der Bioverfügbarkeit (10) 
(modifiziert nach IUPAC 1984 (11)).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1167
 
Aerobe Transformation  (oxidierend): in Gegenwart von molekula ­
rem Sauerstoff ablaufende Reaktionen (12).  
Anaerobe Transformation  (reduzierend): unter Ausschluss von mo ­
lekularem Sauerstoff ablaufende Reaktionen (12).  
Natürliche Gewässer:  Oberflächengewässer, die aus Teichen, Flüs ­
sen, Strömen usw. stammen.  
Sediment:  ein Gemisch mineralischer und organisch-chemischer Be ­
standteile. Letztere enthalten Verbindungen mit hohem Kohlenstoff- 
und Stickstoffgehalt und mit hoher Molekularmasse. Das Sediment 
lagert sich in natürlichen Gewässern ab und bildet eine Grenzfläche zu diesem Wasser.
 
Mineralisation:  vollständiger Abbau einer organischen Verbindung 
zu CO  2 und H  2 O unter aeroben Bedingungen, und zu CH  4 , CO  2 und 
H 2 O unter anaeroben Bedingungen. Im Zusammenhang mit dieser 
Testmethode, bei der eine radioaktiv markierte Verbindung verwen ­
det wird, bedeutet Mineralisation einen extensiven Abbau eines Mo ­
leküls, wobei ein markiertes Kohlenstoffatom unter Freisetzung der 
entsprechenden Menge  14 CO 2 bzw.  14 CH 4 quantitativ oxidiert oder 
reduziert wird.  
Halbwertszeit t  0,5 : die für die 50 %ige Transformation einer Test ­
substanz ermittelte Zeit, wenn die Transformation mittels Kinetik 
erster Ordnung beschrieben werden kann; sie ist unabhängig von 
der Ausgangskonzentration.  
Abbauzeit DT  50 : Zeitspanne, in der sich die Ausgangskonzentration 
der Testsubstanz um 50 % reduziert hat.  
Abbauzeit DT  75 : Zeitspanne, in der sich die Ausgangskonzentration 
der Testsubstanz um 75 % reduziert hat.  
Abbauzeit DT  90 : Zeitspanne, in der sich die Ausgangskonzentration 
der Testsubstanz um 90 % reduziert hat.  
1.3. REFERENZSUBSTANZEN  
Referenzsubstanzen sollten zur Identifizierung und Quantifizierung 
von Transformationsprodukten mittels spektroskopischer und chro ­
matografischer Verfahren verwendet werden.  
1.4. INFORMATIONEN ZUR TESTSUBSTANZ  
Zur Messung der Transformationsrate kann eine nicht markierte oder 
markierte Testsubstanz verwendet werden, jedoch werden markierte 
Substanzen bevorzugt. Markierte Substanzen sind notwendig zur Un ­
tersuchung des Transformationsweges und zur Aufstellung einer Massenbilanz. Empfohlen wird die
 14 C-Markierung, doch auch der 
Einsatz anderer Isotope wie  13 C, 15 N, 3 H oder  32 P kann sinnvoll 
sein. Die Markierung sollte möglichst im stabilsten Teil/in den sta ­
bilsten Teilen des Moleküls positioniert sein (  1 ). Die chemische und/ ­
oder radiochemische Reinheit der Testsubstanz sollte mindestens 95 % betragen.
 
Vor der Durchführung eines Tests sollten folgende Informationen zur 
Testsubstanz vorliegen:  
a) Wasserlöslichkeit (Methode A.6);  
b) Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln;  
c) Dampfdruck (Methode A.4) und Henry-Konstante;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1168  
( 1 ) Wenn beispielsweise die Testsubstanz einen Ring enthält, muss sich die Markierung auf 
diesem Ring befinden; enthält die Testsubstanz zwei oder mehr Ringe, können geson ­
derte Untersuchungen erforderlich sein, um den Verbleib jedes markierten Rings zu 
erfassen und sachgerechte Informationen zur Bildung von Transformationsprodukten zu 
gewinnen.
 d) n-Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient (Methode A.8);  
e) Adsorptionskoeffizient (K  d , K F oder K  oc ) (Methode C.18);  
f) Hydrolyse (Methode C.7);  
g) Dissoziationskonstante (pK  a ) (OECD Guideline 112) (13);  
h) chemische Struktur der Testsubstanz und Ort der Isotopenmarkie ­
rung(en), falls zutreffend.  
Hinweis:  Die Temperatur, bei der diese Messungen vorgenommen 
werden, sollte angegeben werden.  
Sinnvoll können u. a. auch folgende Angaben sein: Toxizität der 
Testsubstanz gegenüber Mikroorganismen, Daten zur leichten und/ ­
oder potenziellen biologischen Abbaubarkeil sowie Daten zur aer ­
oben und anaeroben Transformation im Boden.  
Analysenmethoden (einschließlich Extraktions- und Reinigungsver ­
fahren) zur Identifizierung und Quantifizierung der Testsubstanz und ihrer Transformationsprodukte in Wasser und Sediment sollten 
verfügbar sein (siehe 1.7.2).
 
1.5. PRINZIP DER TESTMETHODE  
Bei der hier beschriebenen Methode werden ein aerobes und ein 
anaerobes Wassersediment verwendet (siehe Anlage 1), das folgende 
Untersuchungen erlaubt:  
i) Messung der Transformationsrate der Testsubstanz in einem 
Wasser-Sediment-System,  
ii) Messung der Transformationsrate der Testsubstanz im Sediment,  
iii) Messung der Mineralisationsrate der Testsubstanz und/oder ihrer 
Transformationsprodukte (bei Verwendung einer  14 C-markierten 
Testsubstanz),  
iv) Identifizierung und Quantifizierung von Transformationsproduk ­
ten in Wasser- und Sedimentphasen einschließlich einer Massen ­
bilanz (bei Verwendung einer markierten Testsubstanz),  
v) Messung der Verteilung der Testsubstanz und ihrer Transforma ­
tionsprodukte auf die beiden Phasen während einer Inkubation im Dunkeln (um z. B. Algenblüten zu vermeiden) bei konstanter Temperatur. Halbwertszeiten, DT
 50 -, DT  75 - und DT  90 -Werte 
werden bestimmt, wenn es die entsprechenden Daten hergeben, 
sollten jedoch nicht weit über den Versuchszeitraum hinaus ex ­
trapoliert werden (siehe 1.2).  
Sowohl für die aerobe als auch für die anaerobe Untersuchung sind 
jeweils mindestens zwei Sedimente sowie die dazugehörigen Wasser ­
phasen erforderlich (7). In bestimmten Fällen sollten jedoch mehr als 
zwei Sedimente verwendet werden, z. B. bei Chemikalien, die in 
Binnengewässern und/oder in Meeresgewässern vorkommen können.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1169
 
1.6. ANWENDBARKEIT DES TESTS  
Die Methode ist allgemein anwendbar auf chemische Substanzen 
(nicht markiert oder markiert), für die ein Analysenverfahren mit hinreichender Genauigkeit und Empfindlichkeit zur Verfügung steht. 
Es ist anwendbar auf schwach flüchtige, nichtflüchtige, wasserlösli ­
che oder schlecht wasserlösliche Verbindungen. Der Test sollte nicht angewendet werden bei Chemikalien, die aus Wasser stark flüchtig sind (z. B. Begasungsmittel oder organische Lösungsmittel) und so ­
mit unter den Versuchsbedingungen dieses Tests nicht im Wasser 
und/oder Sediment gehalten werden können.
 
Bisher wird diese Methode zur Untersuchung der Transformation 
von Chemikalien in Binnengewässern und Sedimenten genutzt, 
aber im Prinzip ist sie auch für Ästuar-/Meeressysteme anwendbar. Sie ist nicht geeignet zur Simulation von Bedingungen in strömen ­
dem Wasser (z. B. Flüssen) oder auf hoher See.
 
1.7. QUALITÄTSKRITERIEN  
1.7.1.  Wiederfindungsraten  
Die Extraktion und Analyse von mindestens jeweils zwei parallel 
angesetzten Wasser- und Sedimentproben unmittelbar nach Zugabe der Testsubstanz geben einen ersten Hinweis auf die Wiederholbar ­
keit der Analysenmethode und die gleichmäßige Verteilung der Test ­
substanz bei der Applikation. Die Wiederfindungsraten für spätere Versuchsphasen ergeben sich aus den jeweiligen Massenbilanzen (bei Verwendung markierter Substanzen). Die Wiederfindungsraten 
sollten im Bereich von 90-110 % für markierte Chemikalien (6) und 
von 70-110 % für nicht markierte Chemikalien liegen.
 
1.7.2.  Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit der Analysenmethode  
Die Wiederholbarkeit der Analysenmethode (ausgenommen die Effi ­
zienz der Extraktion im Anfangsstadium) zur Quantifizierung der Testsubstanz und der Transformationsprodukte kann durch eine pa ­
rallele Analyse desselben Extrakts der Wasser- bzw. der Sediment ­
proben, die hinreichend lange zur Bildung von Transformationspro ­
dukten inkubiert wurden, überprüft werden.
 
Die Nachweisgrenze („limit of detection — LOD“) der Analysen ­
methode für die Testsubstanz und für die Transformationsprodukte sollte mindestens 0,01 mg · kg
 -1 in Wasser oder Sediment (als Test ­
substanz) oder — falls dieser Wert niedriger ist — 1 % der in ein 
Testsystem applizierten. Ausgangsmenge betragen. Die Quantifizie ­
rungsgrenze („limit of quantification — LOQ“) sollte ebenfalls spe ­
zifiziert werden.  
1.7.3.  Genauigkeit der Transformationsdaten  
Geeignete Informationen über die Zuverlässigkeit der Transformati ­
onskurve lassen sich mittels einer Regressionsanalyse aus den Test ­
substanzkonzentrationen in Abhängigkeit von der Zeit gewinnen, die auch die Berechnung des Vertrauensbereiche für Halbwertszeiten (im Falle einer Kinetik pseudo-erster Ordnung) bzw. DT
 50 -Werte und 
ggf. für DT  75 und DT  90 -Werte ermöglicht.  
1.8. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.8.1.  Testsystem und Geräte  
Die Untersuchung sollte in Glasgefäßen (z. B. Flaschen oder Zen ­
trifugengläsern) durchgeführt werden, sofern nicht bereits vorlie ­
gende Informationen (wie der n-Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffi ­
zient, Sorptionsdaten usw.) darauf hindeuten, dass die Testsubstanz 
möglicherweise an Glas anhaftet. In diesem Fall kann es erforderlich sein, andere Materialien (wie Teflon) in Betracht zu ziehen. Wenn bekannt ist, dass die Testsubstanz an Glas anhaftet, könnte eine 
Lösung darin bestehen, eine oder mehrere der folgenden Methoden 
anzuwenden:
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1170
 
— Bestimmung der Masse der am Glas sorbierten Testsubstanz und 
Transformationsprodukte,  
— obligatorische Spülung aller Glasgegenstände mit einem Lö ­
sungsmittel zu Testende,  
— Verwendung formulierter Handelsprodukte (siehe auch 1.9.2),  
— Verwendung einer größeren Menge eines Hilfslösungsmittels für 
die Zugabe der Testsubstanz in das System; das eingesetzte 
Hilfslösungsmittel sollte die Testsubstanz nicht durch Solvolyse 
aufspalten,  
Beispiele für typische Testgeräte, d. h. Durchfluss- und Biometersyste ­
me, sind in Anlage 2 bzw. 3 dargestellt (14). Weitere geeignete Inkuba ­
tionssysteme sind in der Literaturangabe (15) beschrieben. Die Anord ­
nung der Versuchsgeräte sollte den Austausch von Luft oder Stickstoff und das Auffangen flüchtiger Produkte ermöglichen. Die Geräte müssen so bemessen sein, dass sie den Anforderungen des Tests entsprechen 
(siehe 1.9.1), Die Belüftung kann entweder durch schonendes Durch ­
perlen oder durch das Leiten von Luft oder Stickstoff über die Wasser ­
oberfläche erfolgen. In letzterem Fall kann ein vorsichtiges Umrühren 
des Wassers von oben angeraten sein, um eine bessere Verteilung des 
Sauerstoffs bzw. Stickstoffs im Wasser zu erreichen. CO
 2 -freie Luft 
sollte nicht verwendet werden, da dies zu einem Anstieg des pH-Werts des Wassers führen kann. In jedem Falle ist eine Störung des Sediments 
nicht wünschenswert und sollte weitestgehend vermieden werden. 
Schwach flüchtige Chemikalien sollten in einem Biometersystem unter vorsichtigem Rühren der Wasseroberfläche getestet werden. Ebenfalls können geschlossene Gefäße mit einer Gasphase aus atmosphärischer 
Luft oder Stickstoff sowie mit innen befindlichen Röhrchen zum Auf ­
fangen flüchtiger Produkte verwendet werden (16). Beim aeroben Test ist ein regelmäßiger Austausch der Gasphase im oberen Teil des Gefäßes erforderlich, um den Sauerstoffverbrauch durch die Biomasse auszuglei ­
chen.
 
Geeignete Abscheider für das Sammeln flüchtiger Transformations ­
produkte sind u. a. Kaliumhydroxid- oder Natriumhydroxidlösungen (1 mol· dm
 -3 ) für Kohlendioxid (  1 ) und Ethylenglykol, Ethanolamin 
oder 2 %iges Paraffin in Xylol für organische Verbindungen. Flüch ­
tige Verbindungen wie Methan, die unter anaeroben Bedingungen entstehen, können z. B. mittels Molekularsieben aufgefangen wer ­
den. Solche flüchtigen Verbindungen können z. B. zu CO
 2 verbrannt 
werden, indem das Gas bei einer Temperatur von 900  o C durch eine 
CuO enthaltende Quarzröhre geführt und das gebildete CO  2 in einem 
Abscheider mit Alkali aufgefangen wird (17).  
Erforderlich ist eine Laborausstattung für die chemische Analyse der 
Testsubstanz und von Transformationsprodukten (z. B. Gas-Flüssig ­
chromatografie (GLC), Hochleistungsflüssigchromatografie (HPLC), Dünnschichtchromatografie (TLC), Massenspektroskopie (MS), Gas ­
chromatografie-Massenspektroskopie (GC-MS), Flüssigchromatogra ­
fie-Massenspektrometrie (LC-MS), kernmagnetische Resonanz (NMR) u. a.), sowie ggf. Detektionssysteme für radioaktiv markierte oder nicht markierte Chemikalien. Bei Verwendung radioaktiv mar ­
kierter Substanzen werden darüber hinaus ein Flüssigkeitsszintillati ­
onszähler und ein Oxidationsmittel (für die Verbrennung von Sedi ­
mentproben vor der Analyse auf Radioaktivität) benötigt.
 
Weitere Standardlaborgeräte für physikalisch-chemische und biologi ­
sche Bestimmungen (siehe Tabelle 1 in Abschnitt 1.8.2.2), Glasgegen ­
stände, Chemikalien und Reagenzien sind je nach Bedarf erforderlich;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1171  
( 1 ) Da diese basischen Absorptionslösungen auch das Kohlendioxid aus der Belüftungsluft 
und das bei den aeroben Versuchen durch die Atmung gebildete Kohlendioxid absor ­
bieren können, müssen sie in regelmäßigen Zeitabständen ausgewechselt werden, um ihre 
Sättigung und damit einen Verlust ihres Absorptionsvermögens zu verhindern.
 1.8.2.  Auswahl und Anzahl von Wassersedimenten  
Die Probenahmestellen sollten entsprechend dem Zweck des Tests je 
nach gegebener Situation gewählt werden. Bei der Auswahl der Pro ­
benahmestellen ist die Vorgeschichte möglicher landwirtschaftlicher, 
industrieller oder häuslicher Einträge in das Einzugsgebiet und die 
Oberläufe zu berücksichtigen. Es sollten nur Sedimente verwendet werden, die in den 4 vorhergehenden Jahren nicht mit der Testsub ­
stanz oder ihren Struktur-Analoga verunreinigt worden sind.
 
1.8.2.1.  Sedimentauswahl  
Für die aeroben Tests werden üblicherweise zwei Sedimente ver ­
wendet (7). Die beiden ausgewählten Sedimente sollten sich hinsicht ­
lich ihres organischen Kohlenstoffgehalts und ihrer Textur voneinan ­
der unterscheiden. Ein Sediment sollte einen hohen organischen 
Kohlenstoffgehalt (2,5-7,5 %) aufweisen und feinkörnig sein, das andere Sediment sollte einen niedrigen organischen Kohlenstoff ­
gehalt (0,5-2,5 %) haben und grobkörnig sein. Der Unterschied zwi ­
schen den organischen Kohlenstoffgehalten sollte im Regelfall min ­
destens 2 % betragen. „Feinkörnigkeit“ wird definiert als ein [Ton und Schluff] (
 1 ) -Gehalt von > 50 %, und „Grobkörnigkeit“ wird 
definiert als ein [Ton und Schluff]-Gehalt von < 50 %, Die Differenz 
zwischen den [Ton und Schluff]-Gehalten beider Sedimente sollte in 
aller Regel mindestens 20 % betragen. In Fällen, in denen eine Chemikalie auch in Meerwasser gelangen kann, sollte mindestens eines der Wasser-Sediment-Systeme marinen Ursprungs sein.
 
Für die strikt anaerobe Untersuchung sollten Proben von zwei Sedi ­
menten (einschließlich des jeweils dazugehörigen Wassers) aus den 
anaeroben Bereichen der Oberflächenwasserkörper genommen wer ­
den (7). Handhabung und Transport von Sediment- und Wasserpha ­
sen sollten vorsichtig unter Ausschluss von Sauerstoff erfolgen.  
Für die Auswahl von Sedimenten können noch andere Parameter von 
Bedeutung sein und sollten je nach Ausgangslage berücksichtigt werden. So wäre z. B. der pH-Bereich von Sedimenten wichtig für die Unter ­
suchung von Chemikalien, bei denen die Transformation und/oder Sorp ­
tion pH-abhängig sein könnte. Die pH-Abhängigkeit der Sorption kann 
im pK
 a -Wert der Testsubstanz zum Ausdruck kommen.  
1.8.2.2.  Charakterisierung von Wasser-Sediment-Proben  
In der folgenden Tabelle sind die wichtigsten Parameter, die für 
Wasser und Sediment zu messen und zu protokollieren sind (unter 
Verweis auf die verwendete Methode), sowie die Testphase, in der 
diese Parameter zu bestimmen sind, aufgeführt. Informationen über die Methoden zur Bestimmung dieser Parameter sind in der Literatur 
(18) (19) (20) (21) zu finden.
 
Unter Umständen sind je nach Ausgangslage noch weitere Parameter 
zu messen und zu protokollieren (z. B. für Süßwasser: Partikel, 
Alkalinität, Harte, Leitfähigkeit, NO  3 /PO  4 (Verhältnis und Einzel ­
werte); für Sedimente: Kationenaustauschkapazität, Wasserhaltekapa ­
zität, Carbonat, Gesamtstickstoff und -phosphor; und für Meeressys ­
teme: Salzgehalt). Zur Messung der Redoxbedingungen, insbeson ­
dere im Hinblick auf die anaerobe Transformation, kann auch eine 
Analyse von Sedimenten und Wasser auf Nitrat, Sulfat, bioverfüg ­
bares Eisen und evtl. andere Elektronenakzeptoren sinnvoll sein.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1172  
( 1 ) [Ton und Schluff] ist die mineralische Fraktion des Sediments mit einer Partikelgröße 
von < 50 μm.
 Messung von Parametern zur Charakterisierung von Wasser-Sediment-Proben (7) (22) (23)  
Parameter Phase des Testverfahrens 
Feld pro­
benahme Handha­
bung Beginn der 
Akklimati ­
sierung Testbeginn Laufender 
Test Testende  
Wasser  
Herkunft/Quelle × 
Temperatur × 
pH-Wert × × × × × 
TOC × × × 
O 2 -Konzentration (  * ) × × × × × 
Redoxpotenzial (  * ) × × × ×  
Sediment  
Herkunft/Quelle × 
Tiefe der Schicht × 
pH-Wert × × × × × 
Korngrößenverteilung × 
TOC × × × × 
Mikrobielle Biomasse (*) × × × 
Redoxpotenzial (**) Beobach ­
tung 
(Farbe/ 
Geruch) × × × ×  
(*) Aktuelle Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass Messungen der Sauerstoffkonzentrationen im Wasser und der 
Redoxpotenziale für das Wachstum und die Entwicklung von mikrobiellen Populationen in Oberflächengewässern 
weder einen mechanistischen noch einen prognostischen Wert besitzen (24) (25). Zur Interpretation und Beurteilung 
der aeroben biologischen Transformationsraten und -pfade besser geeignete Hilfsmittel sind möglicherweise die Bestimmung des biochemischen Sauerstoffbedarfs (BSB) (bei der Feldprobenahme sowie zu Testbeginn und –ende) 
und die Konzentrationsbestimmung der Mikro-/Makronährstoffe Ca
 2+ , Mg  2+ und Mn  2+ (zu Testbeginn und -ende) in 
Wasser sowie die Messung des Gesamt-N und Gesamt-P in Sedimenten (bei der Feldprobenahme und zu Testende). 
(**) Die Methode der mikrobiellen Respirationsrate (26), die Fumigationsmethode (27) oder die Bestimmung der Le ­
bendkeimzahl (z. B. Bakterien, Aktinomyceten, Pilze und Gesamtzahl der Kolonien) für aerobe Untersuchungen; 
Methanogeneserate bei anaeroben Untersuchungen.  
1.8.3.  Probenahme, Handhabung und Lagerung  
1.8.3.1.  Probenahme  
Für die Entnahme von Sedimentproben sollte der Entwurf der ISO- 
Hinweise zur Probenahme von Sedimenten (8) herangezogen wer ­
den. Sedimentproben sollten von der gesamten oberen, 5 bis 10 cm starken Sedimentschicht genommen werden. Am selben Standort und 
zum selben Zeitpunkt sollte das dazugehörige Wasser entnommen 
werden. Für die anaerobe Studie sollte die Probenahme und der Transport des Sediments und des dazugehörigen Wassers unter Aus ­
schluss von Sauerstoff erfolgen (28) (siehe 1.8.2.1). Einige Pro ­
benahmegeräte sind in der Literatur beschrieben (8) (23).
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1173
 
1.8.3.2.  Handhabung  
Das Sediment wird durch Filtration vom Wasser getrennt und dann 
mit überschüssigem Standortwasser, das anschließend verworfen wird, durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 2 mm feucht 
gesiebt. Dann werden bekannte Mengen Sediment und Wasser im 
gewünschten Verhältnis (siehe 1.9.1) in Inkubationsgefäßen ver ­
mischt und für die Akklimatisierung vorbereitet (siehe 1.8.4). Bei der anaeroben Studie sind alle Schritte unter Ausschluss von Sauer ­
stoff durchzuführen (29) (30) (31) (32) (33).
 
1.8.3.3.  Lagerung  
In jedem Falle wird die Verwendung frischer Sediment- und Wasser ­
proben empfohlen; ist jedoch eine Lagerung erforderlich, sollten 
Sediment und Wasser wie zuvor beschrieben gesiebt und zusammen gelagert werden, und zwar mit einem Wasserüberstand (6 10 cm Wassersäule), im Dunkeln, bei 4 ± 2
 o C 4 und für einen Zeitraum 
von höchstens vier Wochen (7) (8) (23). Für aerobe Untersuchungen 
vorgesehene Proben sollten bei freiem Luftzutritt gelagert werden (z. B. in offenen Behältern), die für anaerobe Untersuchungen vor ­
gesehenen Proben hingegen unter Ausschluss von Sauerstoff. Wäh ­
rend des Transports and der Lagerung dürfen Sediment und Wasser 
nicht gefrieren und das Sediment darf nicht austrocknen.
 
1.8.4.  Vorbereitung der Sediment-/Wasserproben für den Test  
Der Testsubstanzzugabe sollte eine Akklimatisierungsperiode voran ­
gehen, während der sich jede Sediment-/Wasserprobe in dem im 
Haupttest zu verwendenden Inkubationsgefäß befindet. Die Bedin ­
gungen der Akklimatisierungsperiode müssen exakt denen der Inku ­
bation beim Haupttest entsprechen (siehe 1.9.1). Die Akklimatisie ­
rungsperiode ist die Zeit, die benötigt wird, um eine hinreichende 
Stabilität des Systems zu erreichen, die sich am pH-Wert, an der Sauerstoffkonzentration im Wasser, am Redoxpotenzial des Sedi ­
ments und Wassers sowie an der makroskopischen Phasentrennung 
ablesen lässt. Die Akklimatisierungsperiode beträgt in aller Regel ein bis zwei Wochen und sollte vier Wochen nicht überschreiten. Die Ergebnisse der während dieser Zeit durchgeführten Bestimmun ­
gen sind zu protokollieren.
 
1.9. DURCHFÜHRUNG DES TESTS  
1.9.1.  Testbedingungen  
Der Test sollte im Inkubationsgefäß (siehe 1.8.1) mit einem Wasser- 
Sediment-Volumenverhältnis zwischen 3:1 und 4:1 und einer Sedim ­
entschicht von 2,5 cm (± 0,5 cm) durchgeführt werden (  1 ). Eine 
Mindestmenge von 50 g Sediment (Trockengewicht) pro Inkubati ­
onsgefäß wird empfohlen.  
Der Test sollte im Dunkeln bei einer konstanten Temperatur im 
Bereich von 10 bis 30  o C durchgeführt werden. Angemessen ist 
eine Temperatur von (20 ± 2)  o C. Falls notwendig, kann zusätzlich 
eine niedrigere Temperatur (im Allgemeinen 10  o C) gewählt werden, 
als Einzelfallentscheidung in Abhängigkeit von den zu ermittelnden Testergebnissen. Die Inkubationstemperatur sollte überwacht und 
protokolliert werden.
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( 1 ) Aktuelle Studien haben gezeigt, dass eine Lagerung bei 4  o C zu einer Verminderung des 
organischen Kohlenstoffgehalts des Sediments führen kann, was unter Umständen einen 
Rückgang der mikrobiellen Aktivität zur Folge hat (34).
 1.9.2.  Behandlung und Applikation der Testsubstanz  
Es wird eine Testkonzentration der Chemikalie verwendet (  1 ). Für 
Pflanzenschutzmittel, die direkt auf den Wasserkörper appliziert wer ­
den, sollte die auf dem Etikett angegebene Höchstdosierung als ma ­
ximale Applikationsrate, die bezogen auf die Wasseroberfläche des 
Testgefäßes errechnet wird, eingesetzt werden. In allen anderen Fäl ­
len sollte die einzusetzende Konzentration auf Berechnungen aus Umweltemissionen basieren. Es ist darauf zu achten, dass eine aus ­
reichende Testsubstanzkonzentration appliziert wird, um den Trans ­
formationspfad und die Bildung und den Rückgang der Transforma ­
tionsprodukte erfassen zu können. Es kann erforderlich sein, höhere 
Dosen zu applizieren (z. B. das 10-fache), wenn z. B. die Testsub ­
stanzkonzentration zu Testbeginn dicht an der Nachweisgrenze liegt und/oder wenn die Haupttransformationsprodukte nicht ohne wei ­
teres nachgewiesen werden können, obwohl ihr Anteil 10 % der 
Applikationsrate der Testsubstanz ausmacht. Werden höhere Test ­
konzentrationen verwendet, sollten diese allerdings keine erhebliche Beeinträchtigung der mikrobiellen Aktivität des Wasser-Sediment- Systems bewirken. Um eine konstante Testsubstanzkonzentration in 
verschieden großen Gefäßen zu erreichen, kann eine Anpassung der 
applizierten Substanzmenge als sinnvoll angesehen werden, basie ­
rend auf der Höhe der Wassersäule im Gefäß im Verhältnis zur Höhe der Wassersäule am Probenahmestandort (die mit 100 cm an ­
genommen wird, doch auch andere Höhen sind möglich). Siehe die 
Beispielrechnung in Anlage 4.
 
Idealerweise sollte die Testsubstanz als wässrige Lösung in die Was ­
serphase des Testsystems gegeben werden. Falls es sich nicht ver ­
meiden lässt, ist der Einsatz geringer Mengen von mit Wasser misch ­
baren Lösungsmitteln (wie Aceton oder Ethanol) für die Applikation 
und Verteilung der Testsubstanz zulässig, sollte jedoch l % v/v nicht 
überschreiten und die mikrobielle Aktivität des Testsystems nicht beeinträchtigen. Die Herstellung der wässrigen Lösung der Testsub ­
stanz ist mit Sorgfalt vorzunehmen — zur Sicherstellung einer voll ­
ständigen Homogenität können die Verwendung von Generatorsäu ­
len und das Mischen vor Testbeginn sinnvoll sein. Nach Zugabe der wässrigen Lösung in das Testsystem wird ein vorsichtiges Mischen 
der Wasserphase empfohlen, wobei das Sediment so wenig wie mög ­
lich gestört werden sollte.
 
Die Verwendung von formulierten Handelsprodukten wird routine ­
mäßig nicht empfohlen, da die Formulierungsbestandteile die Ver ­
teilung der Testsubstanz und/oder der Transformationsprodukte zwi ­
schen der Wasser- und der Sedimentphase beeinflussen können. Bei 
schlecht wasserlöslichen Testsubstanzen kann der Einsatz von for ­
mulierten Handelsprodukten jedoch eine geeignete Alternative dar ­
stellen.  
Die Anzahl der Inkubationsgefäße richtet sich nach der Anzahl der 
Probenahmezeitpunkte (siehe 1.9.3). Es sollte eine ausreichende 
Anzahl von Testansätzen vorgesehen werden, so dass zwei Ansätze 
zu jedem Probenahmezeitpunkt ausgewertet werden können. Wer ­
den Kontrollansätze für die verschiedenen Wasser-Sediment-Sys ­
teme eingesetzt, sollten sie nicht mit der Testsubstanz behandelt 
werden. Die Kontrollansätze können zur Bestimmung der mikro ­
biellen Biomasse des Sediments und der Gesamtmenge an orga ­
nisch gebundenem Kohlenstoff des Wassers und Sedimentes zu Testende herangezogen werden. Zwei der Kontrollansätze (d. h. 
ein Kontrollansatz pro Wassersedimentansatz) können zur Über ­
wachung der erforderlichen Parameter im Sediment und im Wasser während der Akklimatisierungsphase genutzt werden (siehe Tabelle in Abschnitt 1.8.2.2). Es sind zwei zusätzliche Kontrollansätze für 
den Fall vorzusehen, dass die Testsubstanz mittels eines Lösungs ­
mittels appliziert wird, um Beeinträchtigungen der mikrobiellen Aktivität des Testsystems zu erfassen.
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( 1 ) Ein Test mit einer zweiten Konzentrationsstufe kann bei Chemikalien von Nutzen sein, 
die auf verschiedenen Eintragspfaden in Oberflächengewässer gelangen und somit sig ­
nifikant unterschiedliche Konzentrationen aufweisen, sofern die niedrigere Konzentration 
mit hinreichender Genauigkeit analytisch bestimmt werden kann.
 1.9.3.  Testdauer und Probenahme  
Der Versuch sollte im Normalfall nicht länger als 100 Tage dauern 
(6), sollte jedoch so lange fortgesetzt werden, bis der Abbauweg und das Wasser-/Sedimentverteilungsmuster ermittelt sind bzw. der Ver ­
lust der Testsubstanz durch Transformation und/oder Verflüchtigung 
90 % erreicht hat. Die Anzahl der Probenahmezeitpunkte sollte min ­
destens sechs (einschließlich des Nullzeitpunkts) betragen, wobei fakultativ eine Voruntersuchung (siehe 1.9.4) durchgeführt werden 
kann, um ein geeignetes Probenahmeschema und die optimale Test ­
dauer zu ermitteln, sofern nicht genügend Daten zur Testsubstanz aus früheren Untersuchungen vorliegen. Bei hydrophoben Testsubstan ­
zen können zusätzliche Probenahmen während der Anfangsphase 
der Untersuchung erforderlich sein, um die Verteilungsrate zwischen der Wasser-/Sedimentphase zu bestimmen.
 
Zu entsprechenden Probenahmezeitpunkten werden komplette Inkuba ­
tionsgefäße (im Replikat) zur Analyse entnommen. Das Sediment und das darüber liegende Wasser werden getrennt analysiert (
 1 ). Das Ober ­
flächenwasser sollte vorsichtig entnommen werden, um das Sediment 
so wenig wie möglich zu stören. Die Extraktion und Charakterisierung 
der Testsubstanz und der Transformationsprodukte sollte nach geeig ­
neten Analysenverfahren erfolgen. Substanzen, die sich unter Umstän ­
den am Inkubationsgefäß oder an den Verbindungsleitungen, die zum 
Auffangen flüchtiger Verbindungen dienen, angelagert haben, sollten 
vorsichtig abgelöst und gesammelt werden.  
1.9.4.  Fakultative Voruntersuchung  
Können Dauer und Probenahmeschema nicht auf der Grundlage an ­
derer relevanter Untersuchungen zur Testsubstanz abgeschätzt wer ­
den, kann fakultativ eine Voruntersuchung als sinnvoll angesehen werden, die unter den gleichen Testbedingungen durchzuführen ist, wie sie für den endgültigen Hauptversuch geplant sind. Die relevan ­
ten Versuchsbedingungen und Ergebnisse aus der Voruntersuchung, 
falls sie durchgeführt wurde, sollten in Kurzform protokolliert wer ­
den.
 
1.9.5.  Messungen und Analyse  
Die Konzentration der Testsubstanz und der Transformationspro ­
dukte ist zu jedem Probenahmezeitpunkt im Wasser und im Sedi ­
ment zu messen und zu protokollieren (als Konzentrationsangabe und als prozentualer Anteil der Applikationsmenge). Allgemein 
sollten Transformationsprodukte, die ≥ 10 % der applizierten Ra ­
dioaktivität im gesamten Wasser-Sediment-System zu irgendeinem Probenahmezeitpunkt aufweisen, identifiziert werden, sofern nicht hinreichende Gründe dagegen sprechen. Ebenfalls für eine Identi ­
fizierung in Betracht gezogen werden sollten Transformationspro ­
dukte, deren Konzentrationen während des Tests kontinuierlich steigen, da dies ein Hinweis auf Persistenz ist, auch wenn ihre Konzentrationen die oben genannten Grenzen nicht überschreiten. 
Dieses Vorgehen sollte im Einzelfall erwogen und im Abschluss ­
bericht begründet werden.
 
Zu jedem Probenahmezeitpunkt sollten die Ergebnisse aus den Ab ­
scheidesystemen für Gase/flüchtige Verbindungen (CO  2 und andere, 
d. h. flüchtige organische Verbindungen) protokolliert werden. Die Mineralisationsraten sind zu protokollieren. Nicht extrahierbare (ge ­
bundene) Rückstände im Sediment sind zu jedem Probenahmezeit ­
punkt zu protokollieren.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1176  
( 1 ) Falls es ohne weiteres zu einer schnellen Reoxidation anaerober Transformationsprodukte 
kommen kann, sollten während der Probenahme und Analyse anaerobe Bedingungen 
sichergestellt werden.
 2. DATEN  
2.1. AUFBEREITUNG DER ERGEBNISSE  
Die Gesamtmassenbilanz bzw. die Wiederfindungsrate (siehe 1.7.1) 
der zugegebenen Radioaktivität ist zu jedem Probenahmezeitpunkt zu 
berechnen. Die Ergebnisse sind als Anteile (in %) der applizierten 
Radioaktivität zu protokollieren. Die Verteilung der Radioaktivität im Wasser und Sediment sollte als Konzentration und prozentualer Anteil zu jedem Probenahmezeitpunkt protokolliert werden.
 
Die Halbwertszeit, DT  50 - und ggf. DT  75 - und DT  90 -Werte der Test ­
substanz sollten zusammen mit ihren Vertrauensbereichen berechnet 
werden (siehe 1.7.3). Informationen zur Verlustrate der Testsubstanz ­
konzentration im Wasser und im Sediment lassen sich mittels geeig ­
neter Berechnungsprogramme gewinnen. Dazu können gehören: die 
Anwendung einer Kinetik nach pseudo-erster Ordnung, empirische Kurvenanpassungsverfahren unter Anwendung grafischer oder nume ­
rischer Lösungen sowie komplexere Berechnungen z. B. unter An ­
wendung von Einzel- oder Mehrkompartimentmodellen. Weitere Ein ­
zelheiten sind in der relevanten Literatur zu finden (35) (36) (37).
 
Alle Ansätze haben Stärken und Schwächen und weisen hinsichtlich 
ihrer Komplexität erhebliche Unterschiede auf. Die Annahme einer Kinetik erster Ordnung kann eine zu starke Vereinfachung der Ab ­
bau- und Verteilungsprozesse bedeuten, ergibt jedoch — falls mög ­
lich — einen Wert (die Geschwindigkeitskonstante oder Halbwerts ­
zeit), der leicht zu verstehen und für Simulationsmodellierungen und Berechnungen von Umweltkonzentrationen relevant ist. Empirische 
Ansätze oder lineare Transformationen können bessere Anpassungen 
von Kurven an Daten und damit eine optimalere Abschätzung von Halbwertszeiten, DT
 50 - und ggf. DT  75 - und DT  90 -Werten ermögli ­
chen. Allerdings ist der Nutzen dieser abgeleiteten Konstanten be ­
grenzt. Mit Kompartimentmodellen lassen sich eine Reihe nützlicher 
Konstanten berechnen, die wichtig für die Risikoabschätzung sind und die die Abbaugeschwindigkeit in den verschiedenen Kompar ­
timenten sowie die Verteilung der Chemikalie beschreiben. Sie soll ­
ten ferner zur Ermittlung der Geschwindigkeitskonstanten für die 
Bildung und den Abbau von Haupttransformationsprodukten heran ­
gezogen werden. In allen Fällen muss die Auswahl der Methode begründet werden, und der Versuchsleiter sollte die Güte der An ­
passung grafisch und/oder statistisch nachweisen.
 
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. TESTBERICHT  
Der Testbericht muss folgende Angaben enthalten:  
Testsubstanz:  
— Common Name (Handelsname von Pflanzenschutzmitteln), sys ­
tematischer chemischer Name, CAS-Nummer, Strukturformel (bei Verwendung radioaktiv markierter Chemikalien mit Angabe des Markierungsorts) und relevante physikalisch-chemische Ei ­
genschaften;
 
— Reinheit (Verunreinigungen) der Testsubstanz;  
— radiochemische Reinheit der markierten Chemikalie und molare 
Aktivität (falls zutreffend).  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1177
 
Referenzsubstanzen:  
— Systematischer chemischer Name und Struktur von Referenzsub ­
stanzen, die zur Charakterisierung und/oder zur Identifizierung 
von Transformationsprodukten verwendet werden.  
Testsedimente und -wasser:  
— Ort und Beschreibung der Probenahmestelle(n) für das Wasser ­
sediment, einschließlich etwaiger früherer Kontaminationen;  
— alle Informationen zur Probenahme, (ggf.) Lagerung und Akkli ­
matisierung von Wasser-Sediment-Systemen;  
— Eigenschaften der Wasser-Sediment-Proben gemäß der Tabelle in 
Abschnitt 1.8.2.2.  
Testbedingungen:  
— Verwendetes Testsystem (z. B. Durchflusssystem, Biometersys ­
tem, Art der Belüftung, Rührmethode, Wasservolumen, Sedi ­
mentmasse, Höhe der Wasser- und der Sedimentschicht, Abmes ­
sungen der Testgefäße usw.);  
— Applikation der Testsubstanz in das Testsystem: verwendete 
Testkonzentration, Anzahl der Replikat- und Kontrollproben, 
Art der Applikation der Testsubstanz (z. B. Verwendung eines 
Lösungsmittels, falls zutreffend) usw.;  
— Inkubationstemperatur;  
— Probenahmezeitpunkte;  
— Extraktionsmethoden und -effizienz sowie Analysenmethoden 
und Nachweisgrenzen;  
— Verfahren für die Charakterisierung/Identifizierung von Transfor ­
mationsprodukten;  
— Abweichungen vor der Testvorschrift oder den Testbedingungen 
während der Untersuchung.  
Ergebnisse:  
— Rohdaten-Zahlenwerte repräsentativer Analysen (sämtliche Roh ­
daten sind im GLP-Archiv zu speichern);  
— Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit der herangezogenen Ana ­
lysenverfahren;  
— Wiederfindungsraten (prozentuale Werte für eine valide Studie 
sind in 1.7.1 angegeben);  
— tabellarische Darstellung der Ergebnisse, ausgedrückt in % der 
applizierten Menge und in mg · kg -1 im Wasser, im Sediment und 
im Gesamtsystem (nur in %) für die Testsubstanz und ggf. für 
Transformationsprodukte und nicht extrahierbare Radioaktivität;  
— Massenbilanz während und am Ende der Untersuchungen;  
— grafische Darstellung der Transformation in den Wasser- und 
Sedimentfraktionen sowie im Gesamtsystem (einschließlich Mi ­
neralisation);  
— Mineralisationsraten;  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1178
 
— Halbwertszeit, DT  50 - sowie ggf. DT  75 - und DT  90 -Werte für die 
Testsubstanz und ggf. Haupttransformationsprodukte einschließ ­
lich der Vertrauensbereiche im Wasser, Sediment und im Ge ­
samtsystem;  
— Beurteilung der Transformationskinetik der Testsubstanz und ggf. 
der Haupttransformationsprodukte;  
— Vorschlag für einen Transformationspfad, falls möglich;  
— Diskussion der Ergebnisse.  
4. LITERATURANGABEN  
(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability 
and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.
 
(2) Commission for registration of pesticides: Application for re ­
gistration of a pesticide, (1991). Part G. Behaviour of the pro ­
duct and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 
(a). The Netherlands.  
(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992), Preliminary gui ­
deline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in 
natural sediment/water systems. Ref No SC 9046, United- Kingdom.
 
(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) — Anaerobic and aerobic. Canada, 35-37.
 
(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Che ­
mistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anaerobic 
aquatic metabolism.  
(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr 
Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.  
(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
 
(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality — Sampling — Part 
12: Guidance on sampling of bottom sediments.  
(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 
712-C-9B-O8O.  
(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).  
(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem, 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  
(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Tes ­
ting of Chemicals.  
(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC Pests and Diseases, 3B 4, 149 158.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1179
 
(15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry 
(D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.
 
(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocu ­
lation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic 
aromatic hydrocarbons in soil Environ. Toxicol. Chem. 16, 631-637.
 
(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Sludies with  14 C-la­
belled model surfactants. Water Research 21, 661-667.  
(18) Black, CA. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Mo ­
nograph No 9. American Society of Agronomy, Madison.  
(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water 
and Wastewater (17 edition). American Public Health Associa ­
tion, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.
 
(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. 
Longman.  
(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential mea ­
surements. Anal. Chemistry 44, 1038-1039.  
(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on tes ­
ting procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests“, 3-4 July 1991.
 
(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for. freshwater and ma ­
rine environments. From the Workshop On Sediment.Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10. November 1993. Eds.: I.R. Hill, 
P. Matthiessen and F. Heimbach.
 
(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide bio ­
transformation in surface waters: multivariate analyses of en ­
vironmental factors at field sites. Water Research 31, 2858- 
2868,  
(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in 
nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329-338.  
(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations under  in-situ  conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197-203.
 
(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method.  
(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sedi ­
ment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13-21.  
(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850-857.
 
(30) Birch, R.R., Biver, C, Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, 
U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527-1550.
 
(31) Pagga, U. and Beimbom, D.B. (1993). Anaerobic biodegrada ­
tion tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499-1509.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1180
 
(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A baten test for asses ­
sing the mineralisation of  l4 C-radiolabelled compounds under 
realistic anaerobic conditions, Environ. Sci. Technol. 30, 3597- 3603,
 
(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic che ­
micals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 
712-C-98-090.  
(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sedi ­
ment characteristics and drying sediment on sorption coeffi ­
cients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. To ­
xicol. 58, 961-968.  
(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical Inter ­
pretation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues II. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer, 39, 187-203.
 
(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues I. Pflanzenschutz — Nachrichten Bayer, 33, 47- 60.
 
(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
Systems. Brighton Crop Protection Conference — Pest and Diseases, 1349-1354.
 ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1181
 
Anlage 1  
ANLEITUNG ZU DEN AEROBEN UND DEN ANAEROBEN 
TESTSYSTEMEN  
Aerobes Testsystem  
Das in dieser Testmethode beschriebene aerobe Testsystem besteht aus einer 
aeroben Wassersäule (typische Sauerstoffkonzentrationen im Bereich von 7 bis 
10 mg· l -1 ) und einer Sedimentschicht, die an der Oberfläche aerob und unter der 
Oberfläche anaerob ist. (Typische mittlere Redoxpotenziale (E  h ) der anaeroben 
Sedimentzone liegen im Bereich von - 80 bis - 190 mV.) In jedem Inkubations ­
gefäß wird angefeuchtete Luft über die Wasseroberfläche geführt, um im oberen 
Teil des Gefäßes eine ausreichende Menge Sauerstoff zu gewährleisten.  
Anaerobes Testsystem  
Das Testverfahren des anaeroben Testsystems gleicht im Wesentlichen dem für 
das aerobe System beschriebenen, mit dem Unterschied, dass in jedem Inkuba ­
tionsgefäß angefeuchteter Stickstoff über die Wasseroberfläche geführt wird, um eine ausreichende Stickstoffmenge im oberen Gefäßteil zu gewährleisten. Sedi ­
ment und Wasser werden als anaerob betrachtet, wenn das Redoxpotenzial (E
 h ) 
niedriger ist als - 100 mV.  
Im anaeroben Test beruht die Beurteilung der Mineralisation auf der Messung 
des gebildeten Kohlendioxids und Methans.  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1182
 
Anlage 2  
BEISPIEL EINES DURCHFLUSSSYSTEMS
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1183
 
Anlage 3  
BEISPIEL EINES BIOMETERSYSTEMS
  ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1184
 
Anlage 4  
BEISPIELRECHNUNG FÜR DIE APPLIKATIONSDOSIS IN 
TESTGEFÄSSEN  
Zylinderinnendurchmesser: = 8 cm 
Höhe der Wassersäule ohne Sediment: = 12 cm Oberfläche: 3,142 × 4
 2 = 50,3 cm  2 
Applikationsrate: 500 g Testsubstanz/ha ent ­
spricht 5 
μg/cm  2 Gesamtmenge ( μg): 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Bezug der Gesamtmenge auf eine Wassersäu ­
lenhöhe von 100 cm: 
12 × 251,5 ÷ 100 = 30,18 μg 
Volumen der Wassersäule: 50,3 × 12 = 603 ml 
Konzentration in Wasser: 30,18 ÷ 603 = 0,050 μg/ml oder 50 μg/l ▼B 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1185
 
C.25.  AEROBE MINERALISATION IN OBERFLÄCHENWASSER — 
SIMULATIONSTEST ZUR BIOLOGISCHEN ABBAUBARKEIT  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht der Prüfrichtlinie OECD TG 
309 (2004) (1).  
1.1. EINLEITUNG  
Mit diesem Test sollen der zeitliche Verlauf des biologischen Ab ­
baus einer niedrig konzentrierten Prüfsubstanz in aerobem natürli ­
chem Wasser gemessen und die Beobachtungen als kinetische Ge ­
schwindigkeit quantifiziert werden. Dieser Simulationstest besteht 
aus einem im Labor durchgeführten Schüttelkolben-Batch-Test, in 
dem die Rate des aeroben biologischen Abbaus organischer Substan ­
zen in Proben natürlichen Oberflächenwassers (Süßwasser, Brack ­
wasser oder Meerwasser) ermittelt wird. Der Test beruht auf ISO/ ­
DIS 14592-1 (2) und beinhaltet außerdem Elemente der Prüfmetho ­
den C.23 und C.24 (3)(4). Bei langer Testdauer wird anstelle der Batch-Untersuchung ein semikontinuierlicher Test durchgeführt, um den Abbau der Testorganismen zu verhindern. Das Hauptziel des 
Simulationstests besteht in der Mineralisation der Prüfsubstanz in 
Oberflächenwasser; aufgrund der Mineralisation wird dann die Ab ­
baukinetik beschrieben. Ein fakultatives untergeordnetes Ziel des Tests besteht in der Ermittlung von Informationen zum primären 
Abbau und zur Bildung wesentlicher Transformationsprodukte. Die 
Bestimmung der Transformationsprodukte sowie nach Möglichkeit die Quantifizierung der jeweiligen Konzentrationen sind besonders 
wichtig bei Substanzen, die sehr langsam mineralisiert werden (z. B. 
wenn die Halbwertszeiten für den Abbau sämtlicher
 14 C-Rückstände 
mehr als 60 Tage betragen). Zur Bestimmung und Quantifizierung wichtiger Transformationsprodukte sollten aus analytischen Gründen 
die Prüfsubstanzen im Allgemeinen in höheren Konzentrationen 
(z. B. > 100 μg/l) verwendet werden.
 
Niedrige Konzentrationen sind in diesem Test Konzentrationen (z. B. 
von weniger als 1 μg/l auf 100 μg/l), die so gering sind, dass sicher ­
gestellt ist, dass die Kinetik des biologischen Abbaus im Test die in der natürlichen Umgebung zu erwartende Kinetik widerspiegelt. Ge ­
genüber der Gesamtmasse an biologisch abbaubaren Kohlenstoffsub ­
straten, die in im Test verwendetem natürlichem Wasser vorkommen, fungiert die niedrig konzentrierte Prüfsubstanz als untergeordnetes Substrat. Dies bedeutet, dass die zu erwartende Kinetik des biologi ­
schen Abbaus als Kinetik erster Ordnung einzustufen ist (Kinetik 
„ohne Wachstum“) und dass die Prüfsubstanz durch „Cometabolis ­
mus“ abgebaut werden kann. Eine Kinetik erster Ordnung impliziert, dass die Abbaurate (mg/l/Tag) proportional zur im Laufe der Zeit 
abnehmenden Substratkonzentration ist. Bei echter Kinetik erster 
Ordnung ist die Konstante der spezifischen Abbaurate (k) unabhän ­
gig von der Dauer und von der Konzentration. Die Konstante k ändert sich also während eines Versuchs nicht nennenswert, und 
wesentliche Änderungen treten auch nach Konzentrationssteigerun ­
gen von einem Versuch zum nächsten nicht auf. Per Definition ent ­
spricht die Konstante der spezifischen Abbaurate der relativen Kon ­
zentrationsänderung pro Zeiteinheit: k = (1/C) · (dC/dt). Unter den 
vorgegebenen Bedingungen ist im Allgemeinen eine Kinetik erster 
Ordnung zu erwarten; unter gewissen Bedingungen kann jedoch auch eine sonstige Kinetik gegeben sein. Abweichungen von der Kinetik erster Ordnung können z. B. festzustellen sein, wenn die 
Geschwindigkeit der biologischen Transformation stärker durch ein 
Massentransfer-Phänomen wie z. B. die Diffusionsrate als durch die Geschwindigkeit der biologischen Reaktion begrenzt wird. Die Daten können jedoch nahezu immer durch eine Pseudo-Kinetik erster Ord ­
nung beschrieben werden, wobei eine konzentrationsabhängige Kon ­
stante für die Abbaurate angenommen wird.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1186
 
Informationen zur biologischen Abbaubarkeit der Prüfsubstanz bei 
höheren Konzentrationen (z. B. aufgrund von Standard-Screening- 
Tests) sowie Informationen zur abiotischen Abbaubarkeit, zu Trans ­
formationsprodukten und zu maßgeblichen physikalisch-chemischen Merkmalen sollten vor dem Test verfügbar sein, um den Versuch 
planen und die Ergebnisse auswerten zu können. Die Verwendung 
von mit
 14 C-markierten Prüfsubstanzen und die Bestimmung der 
Phasenverteilung von  14 C am Ende des Tests ermöglichen die Be ­
stimmung der biologischen Endabbaubarkeit. Bei nicht markierten 
Prüfsubstanzen kann der biologische Endabbau nur geschätzt wer ­
den, wenn eine höhere Konzentration getestet wird und alle wesent ­
lichen Transformationsprodukte bekannt sind.  
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Primärer biologischer Abbau : Strukturänderung (Transformation) 
einer chemischen Substanz durch Mikroorganismen infolge des Ver ­
lusts der chemischen Identität.  
Funktionaler biologischer Abbau : Strukturänderung (Transformati ­
on) einer chemischen Substanz durch Mikroorganismen infolge des Verlusts eines spezifischen Merkmals.
 
Aerober biologischer Endabbau : Zersetzung einer chemischen 
Substanz durch Mikroorganismen unter Sauerstoffeinwirkung in 
Kohlendioxid und Wasser sowie in Mineralsalze sonstiger vorhande ­
ner Elemente (Mineralisation) und Erzeugung neuer Biomasse und organischer mikrobiologischer Biosyntheseprodukte.
 
Mineralisation : Zersetzung einer chemischen Substanz oder eines 
organischen Materials durch Mikroorganismen unter Sauerstoffein ­
wirkung in Kohlendioxid und Wasser sowie in Mineralsalze sons ­
tiger vorhandener Elemente.  
„Lag“-Phase : Zeitraum vom Beginn eines Tests bis zur Anpassung 
der abbauenden Mikroorganismen und bis der biologische Abbau 
einer chemischen Substanz oder eines organischen Materials einen 
nachweisbaren Umfang angenommen hat (z. B. 10 % des maximalen theoretischen biologischen Abbaus bzw. je nach Genauigkeit des Messverfahrens auch weniger).
 
Maximaler Umfang des biologischen Abbaus : In Prozent erfasster 
Umfang des biologischen Abbaus einer chemischen Substanz oder 
eines organischen Materials in einem Test, über den hinaus während des Tests kein weiterer biologischer Abbau mehr erfolgt.
 
Primärsubstrat : Zusammenstellung natürlichen Kohlenstoffs und 
natürlicher Energiequellen, in der eine mikrobiologische Biomasse 
wachsen und kultiviert werden kann.  
Sekundärsubstrat : Niedrig konzentrierte Substratkomponente, durch 
deren Abbau den maßgeblichen Mikroorganismen im Vergleich zur Kohlenstoff- und Energieversorgung infolge des Abbaus der wesent ­
lichen Substratkomponenten (Primärsubstrate) nur unerhebliche Men ­
gen an Kohlenstoff und Energie zugeführt werden.
 
Konstante der Abbaurate : Konstante der Abbaukinetik erster Ord ­
nung k (d  –1 ); diese Konstante gibt Aufschluss über die Geschwindig ­
keit von Abbauprozessen; bei Batch-Versuchen wird k aufgrund des 
anfänglichen Abschnitts der Abbaukurve geschätzt, die am Ende der 
„Lag“-Phase ermittelt wird.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1187
 
Halbwertszeit, t  1/2 (d): Parameter zur Beschreibung der Geschwin ­
digkeit einer Reaktion erster Ordnung; Zeitabstand, der einem Kon ­
zentrationsrückgang um den Faktor 2 entspricht. Der Zusammenhang zwischen der Halbwertszeit und der Konstante der Abbaurate lässt sich mit der Formel t
 1/2 = ln2/k beschreiben.  
Abbauzeit, DT  50 (d): Parameter zur Quantifizierung des Ergebnisses 
von Tests zur Ermittlung der biologischen Abbaubarkeit; Zeitinter ­
vall einschließlich der „Lag“-Phase, in dem ein biologischer Abbau von 50 % erreicht wird.
 
Nachweisgrenze (LOD = Limit of Detection) und Quantifizie ­
rungsgrenze (LOQ = Limit of Quantification) : Als Nachweis ­
grenze (LOD) wird die Konzentration einer Substanz bezeichnet, 
unter der die Substanz nicht mehr von analytischen Artefakten un ­
terschieden werden kann. Als Quantifizierungsgrenze (LOQ) gilt die Konzentration einer Substanz, unter der die Konzentrationen nicht 
mehr mit annehmbarer Genauigkeit bestimmt werden kann.
 
Gelöster organischer Kohlenstoff (DOC = Dissolved organic Car ­
bon) : Der Anteil des in einer Wasserprobe enthaltenen organischen 
Kohlenstoffs, der nicht durch die spezifizierte Phasentrennung ent ­
fernt werden kann (etwa durch 15-minütiges Zentrifugieren mit 
40 000 ms  –2 oder durch Membranfiltration mit einer Porengröße 
von 0,2 μm-0,45 μm). 
TOA (Total organic  14 C Activity) : 14 C-Gesamtaktivität von orga ­
nischem Kohlenstoff  
DOA (Dissolved organic  14 C Activity) : 14 C-Aktivität von gelöstem 
organischem Kohlenstoff  
POA (Particulate organic  14 C Activity) : 14 C-Aktivität von als Fest ­
stoff vorliegendem organischem Kohlenstoff  
1.3. ANWENDBARKEIT DER PRÜFMETHODE  
Dieser Simulationstest ist bei nicht flüchtigen oder leicht flüchtigen 
organischen Substanzen durchzuführen, die bei niedrigen Konzentra ­
tionen getestet werden. Bei Verwendung von zur Atmosphäre offe ­
nen Kolben (z. B. nur mit einem Wattepropf verschlossen) können 
Substanzen mit Henry-Konstanten von unter etwa 1 Pa · m  3 /mol (ca. 
10 –5 atm · m  3 /mol) in der Praxis als nicht flüchtig betrachtet werden. 
Mit geschlossenen Kolben mit einem gewissen Luftraum können leicht flüchtige Substanzen (mit Henry-Konstanten < 100 Pa · m
 3 /mol 
bzw. < 10  –3 atm · m  3 /mol) verlustfrei getestet werden. Bei mit  14 C 
markierten Substanzen können Verluste auftreten, wenn beim Ab ­
trennen des CO  2 nicht die erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen ge ­
troffen werden. In diesen Fällen muss unter Umständen CO  2 in 
einem internen Absorber mit Alkali gebunden oder ein externes 
CO 2 -Absorbersystem verwendet werden (direkte  14 CO 2 -Bestimmung, 
wie in Anhang 3 beschrieben). Damit die Kinetik des biologischen Abbaus bestimmt werden kann, muss die Konzentration der Prüf ­
substanz unter der Wasserlöslichkeit der Prüfsubstanz liegen. Es 
wird jedoch darauf hingewiesen, dass die in der Fachliteratur ge ­
nannten Werte für die Wasserlöslichkeit erheblich höher sein können als die Löslichkeit der Prüfsubstanz in natürlichen Gewässern. Fa ­
kultativ kann die Löslichkeit von Prüfsubstanzen mit besonders 
schlechter Wasserlöslichkeit auch unter Verwendung von Material aus den zu prüfenden natürlichen Gewässern bestimmt werden.
 
Die Methode kann zur Simulierung des biologischen Abbaus in von 
groben Partikeln freiem Oberflächenwasser („pelagischer Test“) oder 
in trübem Oberflächenwasser z. B. an einem Wasser-/Sediment- 
Übergang („Test mit suspendierten Sedimenten“) eingesetzt werden.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1188
 
1.4. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Der Test wird als Batch-Test durchgeführt, indem die Prüfsubstanz 
entweder ausschließlich mit Oberflächenwasser („pelagischer Test“) oder in mit suspendierten Feststoffen/Sedimenten mit 0,01 bis 1 g/l 
Trockengewicht aufbereitetem Oberflächenwasser („Test mit suspen ­
dierten Sedimenten“) inkubiert wird, um ein Wasservolumen mit suspendierten Feststoffen oder neu suspendierten Sedimenten zu si ­
mulieren. Die Konzentration der suspendierten Feststoffe/Sedimente 
im unteren Bereich dieses Intervalls ist typisch für die meisten Ober ­
flächengewässer. Die Testkolben werden im Dunkeln bei Umge ­
bungstemperatur unter Schütteln bei aeroben Bedingungen inkubiert. 
Die Prüfsubstanz sollte in mindestens zwei Konzentrationen verwen ­
det werden, um die Abbaukinetik zu bestimmen. Die Konzentratio ­
nen sollten sich um den Faktor 5 bis 10 voneinander unterscheiden und den in der Umwelt zu erwartenden Konzentrationsbereich ab ­
decken. Die maximale Konzentration der Prüfsubstanz sollte höchs ­
tens 100 μg/l betragen; maximale Testkonzentrationen unter 10 μg/l 
sind jedoch zu bevorzugen, um sicherzustellen, dass beim biologi ­
schen Abbau eine Kinetik erster Ordnung gegeben ist. Die niedrigste 
Konzentration sollte höchstens 10 μg/l betragen; niedrigste Konzen ­
trationen von 1-2 μg/l oder von weniger als 1 μg/l sind zu bevor ­
zugen. Im Allgemeinen kann eine angemessene Analyse derart nied ­
riger Konzentrationen mit handelsüblichen mit
 14 C markierten Sub ­
stanzen durchgeführt werden. Aus analysetechnischen Gründen kann 
die Konzentration der Prüfsubstanz häufig nicht mit der erforderli ­
chen Genauigkeit gemessen werden, wenn die Prüfsubstanz in einer Konzentration von ≤ 100 μg/l vorliegt (siehe Abschnitt 1.7.2 
Absatz 2). Höhere Konzentrationen der Prüfsubstanz (> 100 μg/l 
und gelegentlich > 1 mg/l) können zur Bestimmung und zur Quan ­
tifizierung wichtigerer Transformationsprodukte sowie dann verwen ­
det werden, wenn ein spezifisches Analyseverfahren mit niedriger 
Nachweisgrenze nicht verfügbar ist. Wenn hohe Konzentrationen 
einer Prüfsubstanz getestet werden sollen, können die Ergebnisse unter Umständen nicht zur Schätzung der Konstante des Abbaus erster Ordnung und zur Schätzung der Halbwertszeit verwendet wer ­
den, weil der Abbau wahrscheinlich nicht der Kinetik erster Ordnung 
folgt.
 
Nach dem Abbau werden in geeigneten Zeitabständen entweder die  
14 C-Restwerte oder die Restkonzentration der Prüfsubstanz gemes ­
sen, wenn eine spezifische chemische Analyse erfolgt. Die  14 C-Mar­
kierung der stabilsten Molekülbereiche gewährleistet, dass die Ge ­
samtmineralisation bestimmt wird; erfolgt die Markierung mit  14 C 
bei weniger stabilen Molekülbereichen oder werden spezifische Ana ­
lyseverfahren eingesetzt, kann nur der primäre biologische Abbau ermittelt werden. Der stabilste Bereich beinhaltet jedoch nicht 
zwangsläufig den funktionsrelevanten Teil des Moleküls (der einem 
spezifischen Merkmal wie z. B. der Toxizität oder der Bioakkumu ­
lation zugeordnet werden kann). In diesem Fall ist unter Umständen die Verwendung einer im funktionsrelevanten Teil mit
 14 C markier ­
ten Prüfsubstanz angemessen, wenn die Aufhebung eines spezi ­
fischen Merkmals überwacht werden soll.  
1.5. INFORMATIONEN ZUR PRÜFSUBSTANZ  
Für diesen Test können sowohl radioaktiv markierte als auch nicht 
markierte Prüfsubstanzen verwendet werden. Die Markierung mit  
14 C wird empfohlen; markiert werden sollten im Allgemeinen die 
stabilsten Bereiche der jeweiligen Moleküle (siehe auch 
Abschnitt 1.4). Bei Substanzen mit mehreren aromatischen Ringen 
sollte vorzugsweise mindestens ein Kohlenstoffmolekül pro Ring mit  
14 C markiert werden. Außerdem sollte vorzugsweise mindestens ein 
Kohlenstoffmolekül auf beiden Seiten leicht abbaubarer Brücken mit  
14 C markiert werden. Die chemische und/oder radiochemische Rein ­
heit der Prüfsubstanz sollte > 95 % sein. Bei radioaktiv markierten Substanzen ist eine spezifische Aktivität von mindestens ca. 50 μCi/­
mg (1,85 MBq) zu bevorzugen, um die
 14 C-Messungen in Tests mit 
niedrigen Ausgangskonzentrationen zu erleichtern. Zu den Prüfsub ­
stanzen sollten folgende Informationen verfügbar sein:  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1189
 
— Löslichkeit in Wasser (Methode A.6);  
— Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln (mit Lösungsmitteln 
behandelte Substanzen oder Substanzen mit geringer Wasserlös ­
lichkeit),  
— Dissoziationskonstante (pKa), wenn die betreffende Substanz zur 
Protonierung oder Deprotonierung neigt (OECD TG 112) (5);  
— Dampfdruck (Methode A.4] und Henry-Konstante;  
— chemische Stabilität in Wasser und im Dunkeln (Hydrolyse) 
(Methode C.7).  
Wenn Substanzen mit geringer Wasserlöslichkeit in Meerwasser ge ­
testet werden, kann die Kenntnis der Aussalzungskonstante (oder 
„Setschenow-Konstante“) K  s von Vorteil sein; diese Konstante 
wird mit folgender Formel definiert: log (S/S’) = K  s C m ; dabei 
stehen S und S’ für die Löslichkeit der Substanz in Süßwasser 
bzw. in Meerwasser und C  m für die molare Salzkonzentration.  
Wenn der Test als „Test mit suspendierten Sedimenten“ durchgeführt 
wird, sollten auch die folgenden Informationen vorliegen:  
— n-Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient (Methode A.8);  
— Adsorptionskoeffizient (Methode C.18);  
Außerdem können die folgenden Informationen hilfreich sein:  
— Umweltkonzentration (wenn bekannt oder geschätzt);  
— Toxizität der Prüfsubstanz für Mikroorganismen (Methode C.11);  
— leichte und/oder inhärente biologische Abbaubarkeit 
(Methoden C.4 A-F, C.12, C.9, OECD TG 302 (5));  
— aerobe bzw. anaerobe biologische Abbaubarkeit im Boden sowie 
Studien zur Sediment-/Wasser-Transformation (Methoden C.23, C.24).
 
1.6. REFERENZSUBSTANZ  
Als Referenzsubstanz sollte eine unter aeroben Bedingungen im All ­
gemeinen leicht abzubauende Substanz (z. B. Anilin oder Natrium ­
benzoat) verwendet werden. Gewöhnlich werden Anilin und Na ­
triumbenzoat in weniger als zwei Wochen.abgebaut. Mit den Refe ­
renzsubstanzen soll sichergestellt werden, dass die mikrobiologische 
Aktivität des Testwassers in einem bestimmten Rahmen liegt, d. h. 
dass das Wasser eine aktive mikrobiologische Population enthält.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1190
 
1.7. QUALITÄTSKRITERIEN  
1.7.1.  Wiederfindungsraten  
Unmittelbar nach der Zugabe der Prüfsubstanz sollte durch Messun ­
gen der  14 C-Aktivität bzw. — bei nicht markierten Substanzen — 
durch chemische Analysen in jeweils mindestens zwei Proben je ­
weils die Ausgangs-Testkonzentration geprüft werden. Die entspre ­
chenden Messungen geben Aufschluss über die Anwendbarkeit und über die Wiederholbarkeit der Analysemethode sowie über die Ho ­
mogenität der Verteilung der Prüfsubstanz. Im Allgemeinen wird in 
den anschließenden Datenanalysen eher die gemessene
 14 C-Aus­
gangsaktivität oder die Prüfsubstanzkonzentration gemessen als die 
Nennkonzentration, da bei den Messungen der  14 C-Ausgangsaktivität 
oder der Prüfsubstanzkonzentration die auftretenden Sorptions- und Dosierungsfehler kompensiert werden. Bei mit
 14 C markierten Prüf ­
substanzen wird der Umfang der Wiederfindung am Ende des Ver ­
suchs als Massenbilanz angegeben (siehe Abschnitt 1.8.9.4 letzter 
Absatz). Im Idealfall sollte die Massenbilanz bei radioaktiver Mar ­
kierung im Bereich 90 % bis 110 % liegen; die erforderliche Ana ­
lysegenauigkeit sollte bei nicht markierten Prüfsubstanzen durch eine 
anfängliche Wiederfindung von 70 % bis 110 % gegeben sein. Diese 
Bereiche sollten jedoch als Idealbereiche betrachtet und nicht als Kriterien für die Annehmbarkeit eines Tests angenommen werden. Die Analysegenauigkeit kann für die Prüfsubstanz auch bei einer 
niedrigeren Konzentration als der Ausgangskonzentration sowie für 
wichtigere Transformationsprodukte bestimmt werden.
 
1.7.2.  Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit der Analysemethode  
Die Wiederholbarkeit der zur Quantifizierung der Prüfsubstanz sowie 
ggf. der Transformationsprodukte eingesetzten Analysemethode (ein ­
schließlich der Methoden zur Überprüfung der Wirksamkeit der Ers ­
textraktion) sollte durch fünf Wiederholungsanalysen der einzelnen Extrakte des Oberflächenwassers geprüft werden.
 
Die Nachweisgrenze (LOD) der zur Analyse der Prüfsubstanz und 
der Transformationsprodukte verwendeten Methode sollte nach Mög ­
lichkeit bei mindestens 1 % der in das Testsystem eingebrachten Ausgangsmenge liegen. Die Quantifizierungsgrenze (LOQ) sollte kleiner oder gleich 10 % der verwendeten Konzentration sein. Die 
chemischen Analysen vieler organischer Substanzen und der jewei ­
ligen Transformationsprodukte setzen häufig voraus, dass die Prüf ­
substanz in verhältnismäßig hohen Konzentrationen (d. h. > 100 μg/l) 
eingebracht wird.
 
1.8. BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
1.8.1.  Apparatur  
Der Test kann in konischen oder zylindrischen Kolben mit geeig ­
netem Fassungsvermögen (z. B. 0,5 oder 1,0 l) durchgeführt werden, 
die mit Silikon- oder Gummistopfen verschlossen sind; alternativ 
können auch Serumflaschen mit CO  2 -dichten Deckeln (z. B. mit 
Butylkautschuk-Septum) verwendet werden. Eine weitere Möglich ­
keit besteht in der Durchführung der Tests mit mehreren Kolben und 
in der Entnahme des gesamten Inhalts von jeweils mindestens zwei 
Kolben je Probenintervall (siehe Abschnitt 1.8.9.1 letzter Absatz). Für nicht flüchtige Prüfsubstanzen, die nicht radioaktiv markiert wur ­
den, sind gasdichte Stopfen oder Deckel nicht erforderlich. Lose 
Wattepfropfen, die eine Verunreinigung aus der Luft verhindern, 
können verwendet werden (siehe Abschnitt 1.8.9.1 Absatz 2). Leicht flüchtige Substanzen sollten in einem Biometersystem unter leichten Rühren der Wasseroberfläche getestet werden. Um sicherzustellen, 
dass keine Verunreinigung durch Bakterien erfolgt, können die Ge ­
fäße auch durch Erwärmen oder durch Autoklavieren vor der Ver ­
wendung sterilisiert werden. Außerdem wird die folgende Standard- Laborausrüstung verwendet:
 
— ein Schütteltisch oder Magnetrührer zum kontinuierlichen Rühren 
der Testkolben;  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1191
 
— eine Zentrifuge;  
— ein pH-Messgerät;  
— ein Trübungsmesser für nephelometrische Trübungsmessungen;  
— ein Ofen oder eine Mikrowelle zur Bestimmung der Trockenge ­
wichte;  
— Geräte zur Membranfiltration;  
— ein Autoklav oder ein Ofen zur Sterilisierung der Glasgeräte 
durch Erwärmen;  
— Instrumente zur Handhabung von mit  14 C markierten Substanzen;  
— Geräte zur Quantifizierung der  14 C-Aktivität der Proben aus 
CO 2 -Abscheidelösungen sowie ggf. aus Sedimentproben;  
— Analysegeräte zur Bestimmung der Prüfsubstanz (und der Refe ­
renzsubstanz), wenn spezifische chemische Analysen (z. B. mit 
einem Gaschromatographien oder durch HPLC) vorgenommen werden.
 
1.8.2.  Stammlösungen der Prüfsubstanz  
Zur Herstellung von Stammlösungen der Prüfsubstanzen und der 
Referenzsubstanzen wird entionisiertes Wasser verwendet (siehe 
Abschnitt 1.8.7 Absatz 1). Das entionisierte Wasser sollte frei von 
Substanzen sein, die auf Mikroorganismen toxisch wirken könnten; außerdem sollte der Anteil an gelöstem organischem Kohlenstoff (DOC) höchstens 1 mg/l betragen (6).
 
1.8.3.  Entnahme und Transport von Oberflächenwasser  
Die Stellen, an denen das Oberflächenwasser entnommen wird, soll ­
ten grundsätzlich abhängig vom Zweck des jeweiligen Tests aus ­
gewählt werden. Bei der Auswahl von Entnahmestellen sind mögli ­
che Einträge aus Landwirtschaft, Industrie und Haushalten zu be ­
rücksichtigen. Wenn bekannt ist, dass eine aquatische Umgebung 
in den letzten vier Jahren mit der Prüfsubstanz oder mit analog auf ­
gebauten Substanzen verunreinigt wurde, sollte dort nur dann Wasser für die Tests entnommen werden, wenn ausdrücklich die Abbauraten an bereits belasteten Stellen untersucht werden sollen. An der Ent ­
nahmestelle sollten der pH-Wert und die Temperatur des Wassers 
gemessen werden. Die Tiefe, in der das Wasser entnommen wurde, sowie das Aussehen der Wasserproben (z. B. Farbe und Trübung) sollten ebenfalls protokolliert werden (siehe Abschnitt 3). Die Sauer ­
stoffkonzentration und/oder das Redoxpotenzial in Wasser und in der 
Sedimentoberfläche sollten gemessen werden, um die aerobe Qualität der Proben nachzuweisen, wenn diese nicht aufgrund des Aussehens oder bereits vorliegender Erfahrungen mit der Entnahmestelle offen ­
sichtlich bzw. bekannt sind. Das Oberflächenwasser sollte in einem 
gründlich gespülten Behälter transportiert werden. Während des Transports sollte die Probentemperatur die Testtemperatur nicht er ­
heblich überschreiten. Bei einer Transportdauer von mehr als 2- 
3 Stunden wird eine Kühlung auf 4 °C empfohlen. Die Wasserprobe 
darf nicht gefroren sein.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1192
 
1.8.4.  Lagerung und Vorbereitung des Oberflächenwassers  
Der Test sollte vorzugsweise binnen eines Tages nach der Pro ­
benahme begonnen werden. Die ggf. erforderliche Lagerung des Wassers sollte auf ein Minimum beschränkt werden; Lagerzeiten 
von mehr als vier Wochen sind unter keinen Umständen annehmbar. 
Die Wasserprobe sollte bis zur Verwendung bei einer Temperatur von 4 °C aufbewahrt werden. Vor der Verwendung sollten grobe Teilchen entfernt werden (z. B. durch Filtration durch einen Nylon ­
filter mit einer Maschenweite von 100 μm oder mit einem groben 
Papierfilter oder durch Ausfällung).
 
1.8.5.  Vorbereitung von mit Sedimenten aufbereitetem Wasser (fakul ­
tativ)  
Für den Test mit dem suspendierten Sediment wird ein Oberflächen ­
sediment zu den Kolben mit dem wie in Abschnitt 1.8.4 beschrieben zur Abtrennung grober Teilchen gefilterten natürlichen Wasser hin ­
zugegeben, um eine Suspension herzustellen; die Konzentration der 
suspendierten Feststoffe sollte zwischen 0,01 und 1 g/l betragen. Das Oberflächensediment sollte aus der Stelle stammen, aus der auch die Wasserprobe genommen wurde. Abhängig von der jeweiligen aqua ­
tischen Umgebung kann das Oberflächensediment entweder durch 
einen hohen Anteil an organischem Kohlenstoff (2,5-7,5 %) und durch eine feine Textur oder durch einen geringen Anteil an orga ­
nischem Kohlenstoff (0,5-2,5 %) und eine grobe Textur gekenn ­
zeichnet sein (3). Das Oberflächensediment kann wie folgt hergestellt 
werden: Mit einem durchsichtigen Kunststoffröhrchen werden meh ­
rere Sedimentkerne gezogen; unmittelbar nach der Probenahme wer ­
den anschließend die oberen aeroben Schichten abgeschnitten (von 
der Oberfläche bis zu einer Tiefe von maximal 5 mm) und zusam ­
mengegeben. Die so hergestellte Sedimentprobe sollte in einem Be ­
hälter mit großem Luftraum transportiert werden, um die aerobe 
Umgebung des Sediments aufrechtzuerhalten. (Bei einer Transport ­
dauer von mehr als 2-3 Stunden ist das Sediment auf 4 °C zu kühlen.) Die Sedimentprobe sollte dann im für den Test zu verwen ­
denden Wasser im Verhältnis 1:10 suspendiert und bis zur Verwen ­
dung belüftet bei einer Temperatur von 4 °C gelagert werden. Die 
ggf. erforderliche Lagerung des Sediments sollte auf ein Minimum beschränkt werden; Lagerzeiten von mehr als vier Wochen sind unter keinen Umständen annehmbar.
 
1.8.6.  Semikontinuierliches Verfahren (fakultativ)  
Eine längere Inkubation (über mehrere Monate) kann erforderlich 
sein, wenn ein erheblicher Abbau der Prüfsubstanz erst nach einer langen Verzögerung messbar ist. Wenn die Notwendigkeit einer län ­
geren Inkubation aus früheren Tests einer Substanz bekannt ist, kann 
der Test mit einem semikontinuierlichen Verfahren begonnen wer ­
den, bei dem regelmäßig ein Teil des im Test verwendeten Wassers 
bzw. der Suspension erneuert wird (siehe Anhang 2). Alternativ kann 
auch der normale Batch-Test zu einem semikontinuierlichen Test abgewandelt werden, wenn binnen einer Testdauer von etwa 60 Tagen im Batch-Test (siehe Abschnitt 1.8.8.3 Absatz 2) kein 
Abbau der Prüfsubstanz festgestellt wurde.
 
1.8.7.  Zugabe der Prüfsubstanz (bzw. der Referenzsubstanz)  
Bei Substanzen mit hoher Wasserlöslichkeit (> 1 mg/l) und geringer 
Flüchtigkeit (Henry-Konstanten < 1 Pa · m  3 /mol oder 
< 10  –5 atm · m  3 /mol) kann eine Stammlösung in entionisiertem 
Wasser hergestellt werden (siehe Abschnitt 1.8.2); die jeweils erfor ­
derliche Menge der Stammlösung wird zu den Prüfgefäßen hinzuge ­
geben, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist. Das Volumen 
einer hinzugefügten Stammlösung sollte auf das geringstmögliche 
Maß begrenzt werden (möglichst < 10 % des endgültigen Flüssig ­
keitsvolumens). Ein weiteres Verfahren besteht in der Auflösung der Prüfsubstanz in einem größeren Volumen des im Test verwendeten 
Wassers; diese Möglichkeit kommt als Alternative zur Verwendung 
organischer Lösungsmittel in Betracht.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1193
 
Wenn zwingend erforderlich, sollten Stammlösungen nicht flüchtiger 
Substanzen mit geringer Wasserlöslichkeit unter Einsatz eines flüchti ­
gen organischen Lösungsmittels hergestellt werden; die Menge des zum Testsystem hinzugegebenen Lösungsmittels sollte jedoch maxi ­
mal 1 % (v/v) betragen und die mikrobiologische Aktivität nicht beein ­
trächtigen. Außerdem sollte das Lösungsmittel keine Auswirkungen 
auf die Stabilität der Prüfsubstanz im Wasser haben. Das Lösungsmittel sollte bis zu einem äußerst geringen Volumen so weit abgetrennt wer ­
den, dass die DOC-Konzentration des im Test verwendeten Wassers 
bzw. der verwendeten Suspension nicht erheblich erhöht wird. Dies 
sollte durch eine substanzspezifische Analyse bzw. nach Möglichkeit durch eine DOC-Analyse sichergestellt werden (6). Dabei ist sorgfältig darauf zu achten, dass die Menge des übertragenen Lösungsmittels auf 
das absolut erforderliche Minimum begrenzt wird; außerdem muss 
gewährleistet sein, dass sich die vorhandene Prüfsubstanz im Endvo ­
lumen des im Test verwendeten Wassers auflösen kann. Für die Ein ­
bringung der Prüfsubstanz in die Prüfgefäße können auch andere Ver ­
fahren verwendet werden (siehe Quellen (7) und (8)). Wenn zur Ein ­
bringung der Prüfsubstanz ein organisches Lösungsmittel verwendet wird, sollten Lösungsmittelkontrollen mit dem im Test verwendeten Wasser (ohne weitere Zusätze) sowie das im Test verwendete Wasser 
unter Zugabe einer Referenzsubstanz in ähnlicher Weise wie die ak ­
tiven Prüfgefäße behandelt werden, zu denen die Prüfsubstanz in einem Trägerlösungsmittel hinzugegeben wurde. Mit den Lösungsmittelkon ­
troollen sollen anhand des Abbaus der Referenzsubstanz mögliche 
Beeinträchtigungen der mikrobiologischen Population durch das Lö ­
sungsmittel untersucht werden.
 
1.8.8.  Prüfbedingungen  
1.8.8.1.  Testtemperatur  
Die Inkubation sollte (vorzugsweise) im Dunkeln oder bei diffuser 
Beleuchtung und kontrollierter Temperatur (± 2 °C) erfolgen; dies kann die in der betreffenden Außenumgebung gegebene Temperatur 
oder eine Standardtemperatur von 20-25 °C sein. Die in der Außen ­
umgebung gegebene Temperatur kann entweder die tatsächliche Pro ­
bentemperatur zum Zeitpunkt der Probenahme oder eine durch ­
schnittliche Temperatur in der Außenumgebung der Entnahmestelle 
sein.
 
1.8.8.2.  Vermischung  
Durch Vermischung unter kontinuierlichem Schütteln oder Rühren 
muss sichergestellt werden, dass die Teilchen und Mikroorganismen 
suspendiert bleiben. Außerdem begünstigt die ständige Mischung den 
Sauerstoffeintrag aus dem Luftraum über der Flüssigkeit und somit die Aufrechterhaltung angemessener aerober Bedingungen. Dazu 
können die Kolben auf einen Schütteltisch (mit einer Frequenz von 
etwa 100 Umdrehungen pro Minute) gebracht oder mit einem Mag ­
netrührer gerührt werden: Die Proben sind in einem kontinuierlichen Prozess zu schütteln. Das Schütteln oder Rühren muss möglichst 
vorsichtig erfolgen; trotzdem muss eine homogene Suspension auf ­
rechterhalten werden.
 
1.8.8.3.  Testdauer  
Die Testdauer sollte im Allgemeinen höchstens 60 Tage betragen, 
wenn nicht das semikontinuierliche Verfahren unter regelmäßiger 
Erneuerung der Testsuspension eingesetzt wird (siehe Abschnitt 1.8.6 und Anhang 2). Die Testdauer des Batch-Tests kann jedoch auf maximal 90 Tage ausgedehnt werden, wenn binnen 
der ersten 60 Tage der Abbau der Prüfsubstanz begonnen hat. Der 
Abbau wird in geeigneten Zeitabständen aufgrund der
 14 C-Restakti ­
vität oder der gebildeten  14 CO 2 -Menge (siehe Abschnitt 1.8.9.4) 
und/oder durch chemische Analyse (Abschnitt 1.8.9.5) überwacht. 
Die Inkubationsdauer muss so lange sein, dass der Abbauprozess 
bewertet werden kann. Der Abbau sollte vorzugsweise in einem Umfang von über 50 % erfolgt sein; bei langsam abbauenden Sub ­
stanzen muss der Umfang des Abbaus hinreichend sein (im All ­
gemeinen mehr als 20 %), um die Schätzung einer Konstante der 
kinetischen Abbaurate zu ermöglichen.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1194
 
Der pH-Wert und die Sauerstoffkonzentration des Testsystems sind 
regelmäßig zu messen, wenn nicht aus ähnlichen Tests mit Wasser- 
und Sedimentproben, die aus derselben Stelle entnommen wurden, Erfahrungen vorliegen und diese Messungen daher nicht mehr er ­
forderlich sind. Unter gewissen Bedingungen kann der Metabolismus 
von Primärsubstraten in stark erhöhten Konzentrationen im Wasser 
bzw. im Sediment dazu führen, dass so viel CO
 2 entwickelt und so 
viel Sauerstoff abgebaut wird, dass sich die Versuchsbedingungen während der Testdauer erheblich ändern.
 
1.8.9.  Verfahren  
1.8.9.1.  Vorbereitung der Kolben für den pelagischen Test  
Ein geeignetes Volumen des im Test zu verwendenden Wassers wird 
in die Testkolben gebracht; die Kolben sind bis zu etwa einem 
Drittel zu füllen. Eine Füllmenge von etwa 100 ml darf nicht unter ­
schritten werden. Auch wenn mehrere Kolben verwendet werden (um ggf. auch den gesamten Inhalt eines Kolbens prüfen zu können), beträgt das Volumen des zu verwendenden Wassers etwa 100 ml, da 
sich zu geringe Probenvolumina auf die Dauer der „Lag“-Phase aus ­
wirken könnten. Die Prüfsubstanz wird aus einer Stammlösung hin ­
zugegeben, wie in den Abschnitten 1.8.2 und 1.8.7 beschrieben. Die Prüfsubstanz sollte in mindestens zwei Konzentrationen verwendet 
werden, die sich mindestens um den Faktor 5 bis 10 unterscheiden; 
anhand dieser Konzentrationen sollte die Abbaukinetik bestimmt und die Konstante der kinetischen Abbaurate ermittelt werden. Die bei ­
den ausgewählten Konzentrationen sollten unter 100 μg/l liegen und 
sich vorzugsweise im Bereich < 1-10 μg/l bewegen.
 
Die Kolben sind mit für Luft und für CO  2 undurchlässigen Stopfen 
oder Deckeln zu verschließen. Bei nicht flüchtigen und nicht mit  14 C 
markierten Prüfchemikalien können lose Wattepropfen zum Schutz vor Verunreinigungen aus der Luft verwendet werden (siehe Abschnitt 1.8.1), wenn alle wichtigeren Abbauprodukte bekannter ­
maßen nicht flüchtig sind und wenn die CO
 2 -Konzentration indirekt 
bestimmt wird (siehe Anhang 3).  
Die Kolben werden bei der jeweils ausgewählten Temperatur inku ­
biert (siehe Abschnitt 1.8.8.1). Proben zur chemischen Analyse oder für
 14 C-Messungen sind am Anfang des Tests zu entnehmen (d. h. 
noch vor Beginn des biologischen Abbaus; siehe Abschnitt 1.7.1); 
anschließend folgen während der Testdauer weitere Probenahmen in 
geeigneten Zeitabständen. Die Probenahme kann entweder durch Entnahme von Teilproben (z. B. 5-ml-Aliquoten) aus den einzelnen Wiederholungen oder durch Entnahme jeweils des gesamten Inhalts 
eines Kolbens bei der Probenahme erfolgen. Die Mineralisation der 
Prüfsubstanz kann wahlweise direkt oder indirekt bestimmt werden (siehe Anhang 3). In der Regel werden während der Abbauphase (d. h. nach Ende der „Lag“-Phase) mindestens fünf Probenahmestel ­
len benötigt, um die Konstante der Abbaurate zuverlässig bestimmen 
zu können, wenn nicht bei rasch abbaubaren Substanzen begründet werden kann, dass drei Probenahmestellen hinreichend sind. Bei Substanzen, die nicht schnell abgebaut werden, können leicht weitere 
Messungen während der Abbauphase vorgenommen werden; daher 
sollten mehr Datenpunkte zur Bestimmung von k verwendet werden. Ein bestimmter zeitlicher Rahmen für die Probenahme kann nicht vorgegeben werden, da sich der biologische Abbau von Fall zu 
Fall unterschiedlich vollzieht; bei langsamem Abbau wird allerdings 
empfohlen, wöchentlich eine Probe zu entnehmen. Wenn die Prüf ­
substanz rasch abbaubar ist, sollten Proben während der ersten drei Tage einmal täglich und anschließend jeden zweiten oder dritten Tag 
entnommen werden. Unter gewissen Umständen (z. B. bei sehr rasch 
hydrolysierenden Substanzen) müssen Proben unter Umständen stündlich genommen werden. Eine Vorstudie vor Durchführung des eigentlichen Tests wird empfohlen, um die geeigneten Intervalle für 
die Probenahme zu bestimmen. Wenn Proben für weitere spezifische 
Analysen verfügbar sein müssen, sollten mehr Proben entnommen und dann am Ende des Versuchs in rückläufiger Reihenfolge (d. h. die letzten Proben zuerst) die zu analysierenden Proben ausgewählt 
werden. (Hinweise zur Stabilität der Proben während der Lagerung 
sind Abschnitt 1.8.9.5 Absatz 2 zu entnehmen.).
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1195
 
1.8.9.2.  Anzahl der Kolben und Proben  
Testkolben werden in folgendem Umfang benötigt:  
— Testkolben; mindestens jeweils zwei Kolben für jede Konzentra ­
tion der Prüfsubstanz (vorzugsweise mindestens 3) bzw. mehrere 
Testkolben pro Konzentration, wenn jeweils der gesamte Kolben ­
inhalt als Probe genommen werden soll (Kurzbezeichnung F  T ); 
— Testkolben für die Berechnung der Massenbilanz; jeweils min ­
destens zwei Kolben pro Testkonzentration (Kurzbezeichnung F
 M ); 
— Testkolben für die unbehandelte Blindprobe (ohne Prüfsubstanz); 
mindestens ein Blindproben-Testkolben ausschließlich mit dem im Test verwendeten Wasser (Kurzbezeichnung F
 B ); 
— Testkolben für die Referenzkontrolle; zwei Kolben mit der Re ­
ferenzsubstanz (z. B. Anilin oder Natriumbenzoat in einer Kon ­
zentration von 10 μg/l) (Kurzbezeichnung F  C ); mit der Referenz ­
kontrolle soll sichergestellt werden, dass eine gewisse mikrobio ­
logische Mindestaktivität gegeben ist. Wenn ohne Weiteres prak ­
tikabel, kann eine radioaktiv markierte Referenzsubstanz verwen ­
det werden. Diese Möglichkeit kommt auch in Betracht, wenn 
der Abbau der Prüfsubstanz durch chemische Analysen über ­
wacht werden soll);  
— Testkolben für die sterile Kontrolllösung; ein oder zwei Kolben 
mit im Test verwendetem sterilisiertem Wasser zur Untersuchung 
eines möglichen abiotischen Abbaus oder sonstiger nicht biolo ­
gischer Abtrennungen der Prüfsubstanz (Kurzbezeichnung F  S ); 
die biologische Aktivität kann durch Autoklavieren (121 °C; 
20 min) des im Test verwendeten Wassers oder durch Zugabe 
eines Giftstoffs (z. B. Natriumazid (NaN  3 ) in einer Konzentration 
von 10-20 g/l, Quecksilberchlorid (HgCl  2 ) in einer Konzentration 
von 100 mg/l oder Formalin in einer Konzentration von 100 mg/l) 
oder durch Gammabestrahlung beendet werden. HgCl  2 sollte als 
Sonderabfall entsorgt werden. Bei Wasser mit starker Segment ­
zugabe sind sterile Bedingungen schwer herzustellen; in diesem Fall wird mehrfaches Autoklavieren (z. B. dreimal) empfohlen. 
Dabei ist allerdings zu beachten, dass sich das Sorptionsverhalten 
durch Autoklavieren ändern kann.
 
— Testkolben für die Lösungsmittelkontrolllösungen mit dem im 
Test zu verwendenden Wasser und mit dem zu verwendenden 
Wasser in Verbindung mit der Referenzsubstanz; jeweils zwei Kolben, die mit der gleichen Lösungsmittelmenge behandelt und demselben Verfahren unterzogen wurden, wie die Kolben 
mit der Prüfsubstanz; mit diesen Lösungen sollen aufgrund des 
Abbaus der Referenzsubstanz mögliche Beeinträchtigungen durch das Lösungsmittel bestimmt werden.
 
Bei der Gestaltung des Prüfprotokolls sollte die relative Bedeutung 
häufigerer Wiederholungen bei einer höheren Anzahl an Probenah ­
men berücksichtigt werden. Die genaue Anzahl der erforderlichen Kolben hängt von der jeweiligen Methode zur Messung des Abbaus 
ab (siehe Abschnitt 1.8.9.1 Absatz 3 und Abschnitt 1.8.9.4 sowie 
Anhang 3).
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Aus allen Testkolben sollten bei der Probenahme jeweils zwei Teil ­
proben (z. B. 5-ml-Aliquoten) genommen werden. Wenn mehrere 
Kolben eingesetzt werden, um den gesamten Inhalt eines Kolbens als Probe verwenden zu können, sollten mindestens zwei Kolben pro Probenahme entnommen werden (siehe Abschnitt 1.8.9.1 Absatz 1).
 
1.8.9.3.  Vorbereitung der Kolben für Tests mit suspendierten Sedimenten 
(fakultativ)  
Die erforderliche Menge des im Test zu verwendenden Wassers und 
das ggf. erforderliche Sediment werden zum Prüfgefäß hinzugegeben (siehe Abschnitt 1.8.5). Die Vorbereitung der Kolben für Tests mit suspendierten Sedimenten unterscheidet sich nicht von der Vorberei ­
tung für den pelagischen Test (siehe Abschnitte 1.8.9.1 und 1.8.9.2). 
Vorzugsweise sind Serumflaschen oder ähnlich geformte Kolben zu verwenden. Die geschlossenen Kolben werden horizontal auf eine Schüttelvorrichtung gesetzt. Offene Kolben zur Untersuchung von 
nicht mit
 14 C markierten und nicht flüchtigen Substanzen müssen 
selbstverständlich aufrecht eingesetzt werden. In diesem Fall werden ein Magnetrührer sowie der Einsatz von glasbeschichteten Mag ­
netrührstäben empfohlen. Wenn erforderlich, sind die Flaschen zu 
belüften, um die erforderlichen aeroben Bedingungen herzustellen.
 
1.8.9.4.  Radiochemische Bestimmungen  
Die entstandene  14 CO 2 -Menge wird indirekt und direkt gemessen 
(siehe Anhang 3). Indirekt wird der  14 CO 2 -Anteil aufgrund der Dif ­
ferenz zwischen der anfänglichen  14 C-Aktivität des im Test verwen ­
deten Wassers bzw. der verwendeten Suspension und der gesamten 
Restaktivität zum Zeitpunkt der Probenahme bestimmt, nachdem die Probe auf einen pH-Wert von 2-3 angesäuert und das enthaltene CO
 2 
abgetrennt wurde. Auf diese Weise wird anorganischer Kohlenstoff 
entfernt, und die Restaktivität ergibt sich aus dem gemessenen orga ­
nischen Material. Die indirekte  14 CO 2 -Bestimmung kommt nicht in 
Betracht, wenn während der Transformation der Prüfsubstanz wich ­
tigere flüchtige Transformationsprodukte entstehen (siehe Anhang 3). 
Nach Möglichkeit sollte die  14 CO 2 -Bildung direkt gemessen werden; 
die Messung sollte bei der Probenahme für mindestens einen Test ­
kolben erfolgen. So können die Massenbilanz und der biologische Abbau überprüft werden; diese Vorgehensweise beschränkt sich al ­
lerdings auf Tests mit verschlossenen Kolben.
 
Wenn das entstandene  14 CO 2 während des Tests direkt gemessen 
wird, sollten bei Beginn des Tests mehrere Kolben für diesen Zweck vorgesehen werden. Die direkte
 14 CO 2 -Bestimmung wird empfohlen, 
wenn während der Transformation der Prüfsubstanz wichtigere flüch ­
tige Transformationsprodukte entstehen. Bei jeder Messung werden die zusätzlichen Testkolben auf einen pH-Wert von 2-3 angesäuert, und das
 14 CO 2 wird in einem internen oder externen Absorber ge ­
bunden (siehe Anhang 3).  
Fakultativ können auch die Konzentrationen von mit  14 C markierten 
Prüfsubstanzen sowie von wichtigeren Transformationsprodukten durch Radiochromatographie (z. B. Dünnschichtchromatographie, 
RAD-TLC) oder HPLC unter radiochemischem Nachweis bestimmt 
werden.
 
Die Phasenverteilung der verbliebenen Radioaktivität (siehe 
Anhang 1) und die verbliebene Prüfsubstanz sowie die noch 
vorhandenen Transformationsprodukte können ebenfalls bestimmt 
werden.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1197
 
Am Ende des Tests sollte die Massenbilanz durch direkte  14 CO 2 - 
Messung mit eigenen Testkolben bestimmt werden, aus denen wäh ­
rend des Tests die benötigten Proben entnommen werden.  
1.8.9.5.  Spezifische chemische Analyse  
Wenn eine empfindliche spezifische Analysemethode verfügbar ist, 
kann der primäre biologische Abbau statt durch radioaktive Markie ­
rung auch aufgrund einer Messung der gesamten Restkonzentration der Prüfsubstanz ermittelt werden. Wird eine radioaktiv markierte Prüfsubstanz eingesetzt (um die Gesamtmineralisation zu messen), 
können spezifische chemische Analysen parallel durchgeführt wer ­
den, um weitere hilfreiche Informationen zu erhalten und das Ver ­
fahren bewerten zu können. Ferner können spezifische chemische Analysen zur Messung der beim Abbau der Prüfsubstanz gebildeten 
Transformationsprodukte eingesetzt werden; dies wird für Substan ­
zen empfohlen, bei denen die Mineralisation mit Halbwertszeiten von über 60 Tagen erfolgt ist. Die Konzentration der Prüfsubstanz und die Transformationsprodukte sollten jeweils bei der Probenahme 
gemessen und protokolliert werden (als Konzentration und als Pro ­
zentanteil). Im Allgemeinen sollten die Transformationsprodukte be ­
stimmt werden, die bei ≥ 10 % der verwendeten Konzentration je ­
weils bei der Probenahme nachgewiesen werden; ansonsten ist in 
angemessener Weise zu begründen, warum die Transformationspro ­
dukte nicht bestimmt wurden. Transformationsprodukte, deren Kon ­
zentration während der Studie kontinuierlich ansteigt, sollten eben ­
falls bestimmt werden, selbst wenn die jeweiligen Konzentrationen 
den genannten Höchstwert nicht überschreiten, da aus diesen Trans ­
formationsprodukten auf eine Persistenz geschlossen werden könnte. Analysen der Transformationsprodukte in sterilen Kontrolllösungen sollten in Erwägung gezogen werden, wenn eine rasche abiotische 
Transformation der Prüfsubstanz (z. B. durch Hydrolyse) für möglich 
gehalten wird. Die Notwendigkeit einer Quantifizierung und Bestim ­
mung von Transformationsprodukten sollte im Einzelfall geprüft werden; die entsprechenden Begründungen sind zu protokollieren. 
Extraktionen unter Verwendung organischer Lösungsmittel sollten 
gemäß den Anweisungen zum betreffenden Analyseverfahren durch ­
geführt werden.
 
Alle Proben sollten bei 2 bis 4 °C luftdicht gelagert werden, wenn 
die Analyse binnen 24 Stunden (vorzugsweise) durchgeführt wird. Für eine längere Lagerung sollten die Proben auf Temperaturen unter 
– 18 °C gefroren oder chemisch konserviert werden. Eine Ansäue ­
rung zur Konservierung der Proben wird nicht empfohlen, da an ­
gesäuerte Proben unter Umständen instabil sind. Wenn die Proben nicht binnen 24 Stunden analysiert und länger gelagert werden, sollte 
eine Untersuchung zur Stabilität unter Lagerungsbedingungen durch ­
geführt werden, um die Stabilität der maßgeblichen Chemikalien bei einer Temperatur von – 18 °C oder bei sonstiger Konservierung der Chemikalien nachzuweisen. Erfolgt die Analyse unter Extraktion mit 
einem Lösungsmittel oder durch Festphasenextraktion (SPE), sollte 
die Extraktion unmittelbar nach der Probenahme oder nach maximal 24-stündiger Lagerung der gekühlten Probe vorgenommen werden:
 
Je nach Empfindlichkeit der Analysemethode können größere Pro ­
benvolumina erforderlich sein als in Abschnitt 1.8.1 genannt. Der Test kann auf bequeme Weise mit Testvolumina von einem Liter in Kolben mit einem Volumen von 2-3 Litern durchgeführt werden, 
aus denen dann Proben mit einem Volumen von etwa 100 ml ent ­
nommen werden.
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2. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT  
2.1. BEHANDLUNG DER ERGEBNISSE  
2.1.1.  Grafische Darstellung der Daten  
Die Zeitpunkte der Probenahme sind jeweils auf volle Stunden zu 
runden (sofern die betreffenden Substanzen nicht binnen Minuten 
oder weniger Stunden abgebaut werden); eine Rundung auf Tage ist nicht zulässig. Die geschätzte Restaktivität der Prüfsubstanzen (mit
 14 C markierte Substanzen) bzw. die Restkonzentration (nicht 
markierte Substanzen) ist bezogen auf den zeitlichen Verlauf sowohl 
linear als auch semilogarithmisch darzustellen (siehe Abbildungen 1a und 1b). Wenn ein Abbau erfolgt ist, sind die Ergebnisse der 
Kolben F
 T mit den Ergebnissen der Kolben F  S zu vergleichen. 
Wenn die Mittelwerte der Ergebnisse der Kolben mit der Prüfsubstanz (F
 T ) und der sterilen Kolben (F  S ) um weniger als 
10 % voneinander abweichen, kann davon ausgegangen werden, 
dass der festgestellte Abbau vorwiegend abiotisch erfolgt. Wird in 
den Kolben F  S ein geringerer Abbau beobachtet, können die Zahlen 
verwendet werden, um die bei den Kolben F  T ermittelten Werte zu 
korrigieren (durch Subtraktion) und entsprechend den Umfang des 
biologischen Abbaus zu schätzen. Wenn fakultative Analysen der 
wichtigeren Transformationsprodukte vorgenommen werden, sollten ergänzend zur grafischen Darstellung des Abbaus der Prüfsubstanz auch die Entstehung und der Abbau dieser Transformationsprodukte 
grafisch dargestellt werden.
 
Die Dauer der „Lag“-Phase t  L wird aufgrund der Abbaukurve (se ­
milogarithmische Darstellung) durch Extrapolierung des linearen Ab ­
schnitts bis zum Abbau null oder alternativ durch Bestimmung der 
Zeit bis zu einem Abbau von etwa 10 % geschätzt (siehe 
Abbildungen 1a und 1b). Aus der semilogarithmischen Darstellung sind die Konstante der Rate erster Ordnung (k) sowie die betreffende Standardabweichung durch lineare Regression der ln (
 14 C-Restakti ­
vität oder Prüfsubstanzkonzentration) bezogen auf den zeitlichen 
Verlauf zu schätzen. Insbesondere bei  14 C-Messungen sind aus ­
schließlich Daten aus dem anfänglichen linearen Bereich der Kurve im Anschluss an die beendete „Lag“-Phase zu verwenden; dabei 
sollten vorzugsweise eher einige wenige repräsentative Daten als 
umfangreichere, aber unsicherere Daten ausgewählt werden. Unsi ­
cherheitsfaktoren sind unter anderem auch die der empfohlenen di ­
rekten Messung der
 14 C-Restaktivität inhärenten Fehler (siehe fol ­
gende Erläuterungen). Unter Umständen kann die Berechnung von 
zwei unterschiedlichen Konstanten für die Abbaurate erforderlich sein, wenn der Abbau in zwei Phasen erfolgt. In diesem Fall werden zwei getrennte Phasen der Abbaukurve definiert. Für die Kolben mit 
den einzelnen Wiederholungen sollten die Konstante der 
Abbaurate (k) und die Halbwertszeit (t
 ½ = ln2/k) berechnet werden, 
wenn aus einem Kolben mehrere Teilproben entnommen werden; alternativ können die Durchschnittswerte verwendet werden, wenn 
jeweils der vollständige Inhalt eines Kolbens als Probe entnommen 
wird (siehe Abschnitt 1.8.9.2 letzter Absatz). Beim erstgenannten Verfahren sollten die Konstante der Abbaurate und die Halbwertszeit für alle Kolben mit den einzelnen Wiederholungen sowie ein Durch ­
schnittswert mit einer Standardabweichung protokolliert werden. Bei 
hohen Prüfsubstanzkonzentrationen kann die Abbaukurve beträcht ­
lich von einer Gerade abweichen (semilogarithmische Darstellung), und die Kinetik erster Ordnung ist unter Umständen nicht gültig. Die 
Definition einer Halbwertszeit wäre daher nicht sinnvoll. Für einen 
begrenzten Datenbereich kann jedoch die Pseudo-Kinetik erster Ord ­
nung angenommen und die Halbwertszeit des Abbaus DT
 50 (Dauer 
bis zu einem Abbau von 50 %) geschätzt werden. Dabei ist jedoch 
zu berücksichtigen, dass der zeitliche Verlauf des Abbaus über den 
ausgewählten Datenbereich hinaus nicht mit DT  50 prognostiziert wer ­
den kann, da dieser Parameter ausschließlich einen vorgegebenen Datensatz beschreibt. Analyse-Tools zur einfacheren statistischen Be ­
rechnung und zur Kurvenanpassung sind allgemein zugänglich; der 
Einsatz dieser Software wird empfohlen.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1199
 
Wenn spezifische chemische Analysen durchgeführt werden, sind die 
Konstanten der Abbaurate und die Halbwertszeiten des primären 
Abbaus wie oben beschrieben für die Gesamtmineralisation zu schät ­
zen. Gelegentlich können Datenpunkte aus der gesamten Abbauphase verwendet werden, wenn der Prozess durch den primären Abbau 
eingeschränkt wird. (Im Gegensatz zu Messungen der
 14 C-Aktivität 
werden diese Messungen direkt durchgeführt.)  
Wenn mit  14 C markierte Substanzen verwendet werden, sollte eine 
Massenbilanz ausgedrückt als Prozentanteil der eingesetzten 
Ausgangskonzentration zumindest am Ende des Tests protokolliert werden.
 
2.1.2.  Restaktivität  
Beim biologischen Abbau des mit  14 C markierten Anteils einer or ­
ganischen Substanz wird das  14 C größtenteils in  14 CO 2 umgewan ­
delt; ein weiterer Anteil des  14 C wird beim Wachstum der Biomasse 
und/oder bei der Synthese extrazellulärer Metaboliten verbraucht. 
Entsprechend wird der Kohlenstoff auch bei biologischem „End ­
abbau“ einer Substanz nicht zu 100 % in  14 CO 2 umgewandelt. Das 
in den durch Biosynthese gebildeten Produkten enthaltene  14 C wird 
anschließend infolge „sekundärer Mineralisation“ langsam als  14 CO 2 
freigesetzt. Aus diesen Gründen weisen grafische Darstellungen der 
organischen  14 C-Restaktivität (gemessen nach der Abtrennung des 
CO 2 ) oder des erzeugten  14 CO 2 bezogen auf den zeitlichen Verlauf 
auch nach Abschluss des Abbaus noch „Tailings“ auf. Dies er ­
schwert die Auswertung der Daten unter kinetischen Gesichtspunk ­
ten; daher sollte im Allgemeinen nur der erste Abschnitt der Kurve (nach dem Ende der „Lag“-Phase und vor Erreichen eines Abbaus 
von etwa 50 %) für die Schätzung der Abbaurate-Konstante berück ­
sichtigt werden. Beim Abbau der Prüfsubstanz ist die gesamte
 14 C- 
Restaktivität immer höher als die  14 C-Aktivität in Verbindung mit 
der verbliebenen noch unveränderten Prüfsubstanz. Wird die Prüf ­
substanz durch eine Reaktion erster Ordnung abgebaut und erfolgt 
eine Mineralisation einer konstanten Fraktion α in CO  2 , beträgt die 
anfängliche Steigung der  14 C-Abbaukurve (Gesamtanteil an organi ­
schem  14 C bezogen auf den zeitlichen Verlauf) das αfache der Stei ­
gung der entsprechenden Kurve der Prüfsubstanzkonzentration (bzw. 
genauer gesagt des mit  14 C markierten Anteils der Prüfsubstanz). Die 
Konstante der Abbaurate wird ausgehend von unkorrigierten Mes ­
sungen der  14 C-Gesamtaktivität daher eher mit einem Sicherheits ­
zuschlag berechnet. Verfahren zum Schätzen der Prüfsubstanzkon ­
zentrationen aus der gemessenen radiochemischen Aktivität aufgrund verschiedener vereinfachender Annahmen wurden in der Literatur beschrieben (2)(9)(10)(11). Diese Verfahren sind bei rasch abbauba ­
ren Substanzen am leichtesten anzuwenden.
 
2.2. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE  
Wenn festgestellt wird, dass k unabhängig von der hinzugegebenen 
Konzentration ist (d. h. wenn die berechnete Konstante k bei unter ­
schiedlichen Konzentrationen der Prüfsubstanz etwa gleich ist), kann 
angenommen werden, dass die Konstante des Abbaus erster Ordnung repräsentativ für die betreffenden Testbedingungen sowie für die Wasserprobe und die Testtemperatur ist. In welchem Umfang die 
Ergebnisse verallgemeinert oder auf andere Systeme extrapoliert wer ­
den können, ist von Fachleuten zu beurteilen. Wenn eine hohe Prüf ­
substanzkonzentration eingesetzt wird und der Abbau daher nicht nach der Kinetik erster Ordnung verläuft, können die Daten nicht 
zur direkten Schätzung einer Rate für den Abbau erster Ordnung 
oder einer entsprechenden Halbwertszeit verwendet werden. Aus ei ­
nem Test mit einer hohen Prüfsubstanzkonzentration abgeleitete Da ­
ten können jedoch trotzdem für eine Schätzung des Umfangs der 
Gesamtmineralisation und/oder für den Nachweis und die Quantifi ­
zierung von Transformationsprodukten geeignet sein.
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Wenn statt des biologischen Abbaus die Raten sonstiger Verlustpro ­
zesse bekannt sind (z. B. Hydrolyse- oder Verflüchtigungsdaten), 
können diese Daten von der im Test festgestellten Nettoverlustrate abgezogen werden, um die Rate des biologischen Abbaus zu schät ­
zen. Hydrolysedaten können z. B. aus sterilen Kontrollen oder 
aus Paralleltests mit höheren Prüfsubstanzkonzentrationen ermittelt 
werden.
 
Die indirekte und die direkte Bestimmung von  14 CO 2 
(Abschnitt 1.8.9.4 und Anhang 3) kommt ausschließlich für die 
Messung des Umfangs der Mineralisation der Prüfsubstanz in CO  2 
in Betracht. Die Analyse der Konzentrationen von mit  14 C markier ­
ten Prüfsubstanzen und der Bildung wichtigerer Transformationspro ­
dukte kann durch Radiochromatographie (RAD-TLC) oder HPLC 
erfolgen (Abschnitt 1.8.9.4 Absatz 3). Voraussetzung für eine direkte 
Schätzung der Halbwertszeit ist, dass keine wichtigeren Transforma ­
tionsprodukte (definiert als ≥ 10 % der eingesetzten Menge der Prüf ­
substanz) enthalten sind. Wenn wichtigere Transformationsprodukte 
in einem größeren Umfang als im vorstehenden Satz genannt vor ­
kommen, ist eine detaillierte Auswertung der Daten vorzunehmen. Die detaillierte Auswertung kann Testwiederholungen und/oder Be ­
stimmungen der Transformationsprodukte beinhalten (siehe 
Abschnitt 1.8.9.5 Absatz 1), wenn das Verhalten der Transformati ­
onsprodukte nicht aufgrund von Erfahrungswerten (z. B. Informatio ­
nen zu den Abbauwegen) mit angemessener Zuverlässigkeit beurteilt werden kann. Da das Verhältnis des in der Prüfsubstanz enthaltenen 
und in CO
 2 umgewandelten Kohlenstoffs nicht immer gleich ist 
(weitgehend von der Konzentration der Prüfsubstanz und sonstiger vorhandener Substrate sowie von den Testbedingungen und den je ­
weiligen Mikroorganismen abhängig), lässt dieser Test (im Gegen ­
satz zu einem DOC-Die-Away-Test) eine direkte Schätzung des bio ­
logischen Endabbaus nicht zu; das Ergebnis ist jedoch ähnlich dem Ergebnis einer Respirometer-Untersuchung. Der Umfang der Minera ­
lisation wird entsprechend kleiner oder gleich dem Mindestumfang 
des biologischen Endabbaus sein. Um ein umfassenderes Bild vom 
biologischen Endabbau (Mineralisation und Aufnahme in die vor ­
handene Biomasse) zu erhalten, sollte am Ende des Tests die Phasen ­
verteilung des
 14 C analysiert werden (siehe Anhang 1). Das in den 
vorhandenen Feststoffen enthaltene  14 C beinhaltet das in die Bakte ­
rienmasse aufgenommene  14 C sowie das in organische Partikel sor ­
bierte  14 C. 
2.3. VALIDITÄT DES TESTS  
Wenn die Referenzsubstanz binnen des erwarteten Zeitraums nicht 
abgebaut wird (bei Anilin und Natriumbenzoat gewöhnlich unter 
zwei Wochen), ist die Validität des Tests zu bezweifeln und weiter zu überprüfen; alternativ kann der Test auch mit einer frischen Was ­
serprobe wiederholt werden. Bei einem ISO-Ringtest der Methode, 
an dem sieben europäische Labors beteiligt waren, lagen die ange ­
passten Abbaurate-Konstanten zwischen 0,3 und 1,7 d
 –1 bei durch ­
schnittlich 0,8 d  –1 , einer Temperatur von 20 °C und einer Standard ­
abweichung von ± 0,4 d  –1 (t ½ = 0,9 Tage). Typisch waren „Lag“- 
Phasen von 1 bis 7 Tagen. Für das untersuchte Wasser wurde eine 
bakterielle Biomasse von 10  3 — 10  4 KBE (koloniebildenden Ein ­
heiten) pro ml protokolliert. Die Abbauraten in nährstoffreichen mit ­
teleuropäischen Gewässern waren höher als in nordischen oligotro ­
phen Gewässern; dies könnte auf die unterschiedlichen Trophie ­
zustände oder auf eine vorherige Belastung mit chemischen Stoffen zurückzuführen sein.
 
Die Gesamtwiederfindung (Massenbilanz) am Ende des Versuchs 
sollte zwischen 90 % und 110 % bei radioaktiv markierten Sub ­
stanzen liegen; bei nicht radioaktiv markierten Substanzen sollte die anfängliche Rückgewinnung am Anfang des Versuchs zwischen 70 % und 110 % betragen. Die angegebenen Bereiche sind als Ideal ­
bereiche zu verstehen und sollten nicht als Kriterien für die Annehm ­
barkeit eines Tests betrachtet werden.
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3. PRÜFBERICHT  
Der Typ der Studie (z. B. pelagischer Test oder Test mit suspendier ­
tem Sediment) ist im Prüfbericht klar anzugeben; außerdem enthält der Bericht mindestens folgende Informationen:
 
Prüfsubstanz und Referenzsubstanz(en):  
— Common Names (allgemeine Bezeichnungen 
und Handelsnamen), systematische chemische Namen (möglichst 
IUPAC- und/oder CAS-Bezeichnungen), CAS-Nummern, Struk ­
turformeln (bei Einsatz radioaktiv markierter Substanzen zur Be ­
schreibung der Position des  14 C) sowie maßgebliche physika ­
lisch-chemische Merkmale der Prüfsubstanz und der Referenz ­
substanz (siehe Abschnitte 1.5 und 1.6),  
— systematische chemische Namen, CAS-Nummern, Strukturfor ­
meln (bei Verwendung radioaktiv markierter Substanzen zur Be ­
schreibung der Position des  14 C) sowie maßgebliche physika ­
lisch-chemische Merkmale der Prüfsubstanz und der Referenz ­
substanz, die als Standards für den Nachweis und die Quantifi ­
zierung von Transformationsprodukten angenommen werden,  
— Reinheit (Verunreinigungen) der Prüfsubstanzen und der Refe ­
renzsubstanzen,  
— radiochemische Reinheit markierter Chemikalien und (ggf.) spe ­
zifische Aktivität.  
Oberflächenwasser:  
Für Wasserproben sind mindestens die folgenden Informationen an ­
zugeben:  
— Standort und Beschreibung der Entnahmestelle möglichst ein ­
schließlich Informationen über frühere Verunreinigungen,  
— Datum und Zeitpunkt der Probenahme,  
— Nährstoffe (N gesamt; Ammonium, Nitrit, Nitrat, P gesamt; ge ­
löstes Orthophosphat),  
— Tiefe der Probenahme,  
— Aussehen der Probe (z. B. Farbe und Trübung),  
— DOC und TOC,  
— BOD,  
— Temperatur und pH-Wert an der Entnahmestelle zum Zeitpunkt 
der Probenahme,  
— Sauerstoff- oder Redoxpotenzial (erforderlich nur dann, wenn die 
aerobe Qualität nicht offensichtlich ist),  
— Salzgehalt oder Leitfähigkeit (bei Meer- und Brackwasser),  
— suspendierte Feststoffe (bei trüben Proben),  
— nach Möglichkeit sonstige maßgebliche Informationen über die 
Entnahmestelle zum Zeitpunkt der Probenahme (z. B. aktuelle oder frühere Daten zur Fließgeschwindigkeit von Flüssen oder Meeresströmungen, in der Nähe befindliche Abwassereinleitun ­
gen und Typ der Abwässer, Witterungsbedingungen vor dem 
Zeitpunkt der Probenahme),
 
fakultativ:  
— mikrobiologische Biomasse (z. B. AODC (Acridine Orange Di ­
rect Count oder KBE (koloniebildende Einheiten)),  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1202
 
— anorganischer Kohlenstoff,  
— Chlorophyll-a-Konzentration als spezifisches Maß für die Algen ­
biomasse.  
Bei Tests mit suspendierten Sedimenten sollten außerdem die folgen ­
den Informationen zu den Sedimenten angegeben werden:  
— Tiefe der Sedimententnahm,  
— Aussehen des Sediments (farbig, schlammig, schluffig oder san ­
dig), 
— Textur (z. B. % grober Sand, feiner Sand, Schluff und Ton),  
— Trockengewicht in g/l der suspendierten Feststoffe, TOC-Kon ­
zentration oder Gewichtsverlust nach Entzündung als Maß für 
den Anteil an organischem Material,  
— pH-Wert,  
— Sauerstoff- oder Redoxpotenial (erforderlich nur dann, wenn die 
aerobe Qualität nicht offensichtlich ist).  
Testbedingungen:  
— Zeitabstand zwischen Probenahme und Verwendung im Labor ­
test; Dauer der Probenlagerung und Vorbereitung der Proben; Zeitpunkte der Durchführung der Tests,
 
— Menge der verwendeten Prüfsubstanz, Testkonzentration und Re ­
ferenzsubstanz,  
— Methode zur Einbringung der Prüfsubstanz einschließlich ggf. 
verwendeter Lösungsmittel,  
— Volumen des verwendeten Oberflächenwassers und (wenn ver ­
wendet) der Sedimente sowie jeweils zur Analyse entnommenes Probenvolumen,
 
— Beschreibung des eingesetzten Testsystems,  
wenn der Test nicht im Dunkeln durchgeführt werden muss, Infor ­
mationen zur Qualität des „diffusen Lichts“;  
— Informationen zu den Methoden zur Herstellung steriler Kontrol ­
len (z. B. Temperatur, Dauer und Anzahl der Autoklavierungen),  
— Inkubationstemperatur,  
— Informationen zu Analyseverfahren und Methoden für radioche ­
mische Messungen sowie zur Prüfung der Massenbilanz und für Messungen der Phasenverteilung (wenn durchgeführt),
 
— Anzahl der Wiederholungen.  
Ergebnisse:  
— Wiederfindung in Prozent (siehe Abschnitt 1.7.1),  
— Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit der Analysemethoden ein ­
schließlich der Nachweisgrenze (LOD) und der Quantifizierungs ­
grenze (LOQ) (siehe Abschnitt 1.7.2),  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1203
 
— Darstellung aller gemessenen Daten (einschließlich der Zeit ­
punkte der Probenahmen) sowie der berechneten Werte in Ta ­
bellen und entsprechenden Abbaukurven; für jede Testkonzentra ­
tion und für jeden Kolben mit einer Wiederholungslösung sind für die logarithmische Darstellung der lineare Korrelationskoeffi ­
zient der Steigung sowie die geschätzte „Lag“-Phase und eine 
Konstante für die Pseudo-Rate erster Ordnung (wenn möglich) und die entsprechende Abbauzeit (bzw. die Halbwertszeit t
 50 ) 
anzugeben,  
— die entsprechenden Werte sind als Durchschnittswerte der in den 
einzelnen Wiederholungen festgestellten Ergebnisse zu protokol ­
lieren (z. B. Dauer der „Lag“-Phase, Konstante der Abbaurate 
und Abbauzeit (bzw. t  50 ), 
— das System ist aufgrund der Beschaffenheit der Abbaukurve so ­
wie unter Berücksichtigung der möglichen Auswirkungen der 
Testkonzentration als angepasst oder als nicht angepasst zu be ­
werten,  
— Ergebnisse der Endmassenbilanz und Ergebnisse der Messungen 
zur Bestimmung der Phasenverteilungen (wenn vorhanden);  
— Anteil des mineralisierten  14 C sowie — bei spezifischen Ana ­
lysen — Endumfang des primären Abbaus,  
— (ggf.) Nachweis, Molkonzentration und Prozentanteil zugegebe ­
ner wichtigerer Transformationsprodukte (siehe Abschnitt 1.8.9.5 Absatz 1),
 
— (ggf.) angenommener Transformationsweg,  
— Diskussion der Ergebnisse.  
4. LITERATUR  
1. OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water 
— Simulation Biodegradation Test.  
2. ISO/DIS 14592-1 (1999) Water quality — Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations — Part 1: Shake flask batch test with surface water or surface water/sediment suspensions.
 
3. Prüfmethode C.23. Aerobic and anaerobic transformation in soil.  
4. Prüfmethode C.24. Aerobic and anaerobic transformation in 
aquatic sediments.  
5. OECD (1993). Leitlinien für die Prüfung von Chemikalien 
OECD, Paris.  
6. ISO 8245 (1999). Water quality — Guidelines on the determi ­
nation of total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon (DOC).
 
7. ISO 10634 (1995). Water quality — Guidance for the prepara ­
tion and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an 
aqueous medium.
 
8. OECD-Entwurf (2000). Guidance Document on aquatic toxicity 
testing of difficult substances and mixtures. Environmental He ­
alth and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. 
No 22.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1204
 
9. Simkins, S. und Alexander, M. (1984). Models for mineraliza ­
tion kinetics with the variables of substrate concentration and 
population density. Appl. Environ. Microbiol. 47, S. 394-401.  
10. Ingerslev, F. und N. Nyholm. (2000). Shake-flask test for de ­
termination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at 
low concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Envi ­
ron. Saf. 45, S. 274-283.  
11. ISO/CD 14592-1 (1999). Ring test report: Water Quality — 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 — report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface water/ ­
sediment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1205
 
Anhang 1  
Phasenverteilung  14 C 
Um das Verfahren zu überprüfen, sollten die Routinemessungen der  14 C-Gesamt ­
aktivität von organischem Kohlenstoff (TOA) um Massenbilanzmessungen unter direkter Bestimmung des entwickelten
 14 CO 2 nach Bindung in einem Absorber 
ergänzt werden (siehe Anhang 3). Eine positive  14 CO 2 -Bildung ist an sich schon 
als direkter Nachweis für einen biologischen Abbau zu betrachten (im Gegensatz zum abiotischen Abbau oder zu sonstigen Verlustprozessen wie z. B. Verflüch ­
tigung oder Sorption). Weitere hilfreiche Informationen zur Beschreibung des 
biologischen Abbauverhaltens sind aus Messungen der TOA-Verteilung zwischen 
dem gelösten Stadium (
 14 C-Aktivität von gelöstem organischem Kohlenstoff, 
DOA) und dem Partikelstadium (  14 C-Aktivität von als Feststoff vorliegendem 
organischem Kohlenstoff, POA) nach Abtrennung der Feststoffe durch Membran ­
filtration oder Zentrifugierung zu entnehmen. Die POA besteht aus der in der 
mikrobiologischen Biomasse und auf sonstigen Feststoffen sorbierten Prüfsub ­
stanz sowie dem in der Prüfsubstanz enthaltenen Kohlenstoff, der zur Synthese neuen Zellmaterials verwendet und dadurch in die Feststoff-Biomasse aufgenom ­
men wurde. Die Bildung gelösten organischen
 14 C-Materials kann als DOA am 
Ende des biologischen Abbaus (Plateau der Abbau-/Zeit-Kurve) geschätzt wer ­
den. 
Die Phasenverteilung des  14 C-Restanteils, der auf den ausgewählten Proben nach 
Filtration auf einem Membranfilter (etwa aus Polycarbonat) mit einer Porengröße 
von 0,22 μm oder 0,45 μm verblieben ist, wird geschätzt. Wenn die Sorption der 
Prüfsubstanz auf dem Filter nicht vernachlässigbar gering ist (vor der Durch ­
führung des Versuchs festzustellen), kann anstelle der Filtration eine Zentrifugie ­
rung mit hoher Geschwindigkeit (2 000 g; 10 min) erfolgen.  
Anschließend ist das Filtrat bzw. das Zentrifugat wie in Anhang 3 für ungefilterte 
Proben beschrieben zu behandeln. Membranfilter sind in einer geeigneten Szin ­
tillationsflüssigkeit zu lösen; die Zählung erfolgt dann in der üblichen Weise; im Allgemeinen werden Korrekturen der jeweiligen Querempfindlichkeit unter An ­
wendung eines externen Standardverhältnisverfahrens vorgenommen; alternativ 
kann auch ein Oxydationsmittel verwendet werden. Wenn eine Zentrifugierung erforderlich ist, muss das aus der Partikelfraktion gebildete Pellet in 1-2 ml destilliertem Wasser aufgelöst und in ein Szintillationsfläschchen gegeben wer ­
den. Anschließend werden zwei Spülungen mit 1 ml destilliertem Wasser vor ­
genommen und das Spülwasser in das Fläschchen gebracht. Wenn erforderlich, kann die Suspension zur Flüssigkeitsszintillationszählung in ein Gel eingebettet werden.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1206
 
Anhang 2  
Semikontinuierliches Verfahren  
Eine Inkubation über maximal mehrere Monate kann erforderlich sein, um einen 
hinreichenden Abbau von persistenten Substanzen zu erzielen. Die Testdauer sollte im Allgemeinen höchstens 60 Tage betragen, wenn die Merkmale der 
ursprünglichen Wasserprobe nicht auch nach einer Erneuerung der Testsuspen ­
sion unverändert erhalten bleiben. Hat allerdings binnen der ersten 60 Tage der Abbau der Prüfsubstanz noch immer nicht begonnen, kann die Testdauer auf maximal 90 Tage ohne Erneuerung der Testsuspension ausgedehnt werden.
 
Während der Inkubation über längere Zeiträume kann die Diversität des mikro ­
biologischen Materials durch verschiedene Verlustprozesse sowie durch den 
möglichen Verbrauch wesentlicher Nährstoffe und primärer Kohlenstoffsubstrate aus der Wasserprobe reduziert werden. Daher wird empfohlen, mit einem semi ­
kontinuierlichen Test in angemessener Weise die Abbaurate langsam abbauender 
Substanzen zu bestimmen. Der Test sollte mit dem semikontinuierlichen Ver ­
fahren begonnen werden, wenn erfahrungsgemäß eine Inkubationsdauer von drei Monaten erforderlich ist, um die Substanz zu 20 % abzubauen. Alternativ kann der normale Batch-Test in einen seminkontinuierlichen Test abgewandelt werden, 
wenn während der Prüfung im Batch-Test binnen etwa 60 Tagen kein Abbau der 
Prüfsubstanz erfolgt ist. Das semikontinuierliche Verfahren kann ausgesetzt und der Test als Batch-Test fortgesetzt werden, wenn ein erheblicher Abbau ver ­
zeichnet wurde (z. B. > 20 %).
 
Beim semikontinuierlichen Test wird alle zwei Wochen etwa ein Drittel des 
Volumens der Testsuspension durch frisch entnommenes Wasser ersetzt, zu dem die Prüfsubstanz in der Ausgangskonzentration hinzugegeben wurde: Sedi ­
mentmaterial wird ebenso in der Ausgangskonzentration (zwischen 0,01 und 1 g/l) 
zum zur Erneuerung zu verwendenden Wasser hinzugegeben, wenn der fakulta ­
tive Test mit dem suspendierten Sediment durchgeführt wird. Bei der Durch ­
führung des Tests mit den suspendierten Sedimentpartikeln muss gewährleistet sein, dass auch während der Erneuerung des Wassers ein System mit vollstän ­
diger Suspension besteht und dass die Verweildauer für Feststoffe und Wasser 
gleich ist; ansonsten kann die erwünschte Ähnlichkeit mit einem homogenen wässerigen System ohne feste Phasen beeinträchtigt werden kann. Aus diesen Gründen wird für das semikontinuierliche Verfahren eine Ausgangskonzentration 
der suspendierten Sedimente im unteren Segment des vorgegebenen Konzentra ­
tionsbereichs bevorzugt.
 
Die vorgesehene Zugabe der Prüfsubstanz setzt voraus, dass die Ausgangskon ­
zentration der Prüfsubstanz nicht durch eine teilweise Erneuerung der Testsus ­
pension überschritten und entsprechend — wie häufig bei hohen Prüfsubstanz ­
konzentrationen festzustellen — eine Anpassung vermieden wird. Da das Ver ­
fahren sowohl eine Neubeimpfung als auch einen Ausgleich für abgebaute Nähr ­
stoffe und Primärsubstrate beinhaltet, wird die ursprüngliche mikrobiologische Diversität wiederhergestellt, und die Testdauer kann theoretisch unendlich aus ­
gedehnt werden. Beim semikontinuierlichen Verfahren ist darauf zu achten, dass 
die Restkonzentration der Prüfsubstanz unter Berücksichtigung der jeweiligen Mengen der hinzugegebenen und der entnommenen Prüfsubstanz korrigiert wird. Die Gesamtkonzentration und die Konzentration der gelösten Prüfsubstanz sind 
für Verbindungen mit schwachem Sorptionsverhalten beliebig austauschbar. Die 
Sorption ist unter den vorgegebenen Bedingungen (0,1-1 g Feststoffe/l) bei Sub ­
stanzen mit log Kow < 3 (für neutrale, lipophile Verbindungen) unerheblich 
(< 5 %). Dies wird aus dem folgenden Berechnungsbeispiel deutlich: 0,1 g/l 
Feststoffe entsprechen etwa 10 mg Kohlenstoff pro Liter (Kohlenstofffraktion, f
 C = 0,01). Wenn angenommen wird, dass  
Log K  ow (der Prüfsubstanz) = 3,  
K oc = 0,42 × K  ow und 
der Verteilungskoeffizient K  d = f C × K  oc ist, 
beträgt die gelöste Fraktion der Gesamtkonzentration (C-Wasser (C  w )/C- 
Gesamt (C  t ): 
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 × 0,1 × 
10 –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1207
 
Anhang 3  
Bestimmung des  14 CO  2 -Anteils  
Indirekte  14 CO  2 -Bestimmung  
Bei Routinemessungen ist die indirekte Methode im Allgemeinen am wenigsten 
zeitaufwändig und am präzisesten, wenn die Prüfsubstanz nicht flüchtig ist und 
wenn aus der Prüfsubstanz keine flüchtigen Transformationsprodukte gebildet 
werden. Dazu sind einfach ungefilterte Proben (z. B. 5 ml in Szintillationsfläschchen) zu geben. Für die Tests geeignet ist eine anfängliche Probenaktivität von 5 000 dpm-10 000 dpm (80-170 Bq); die änfängliche Akti ­
vität sollte mindestens etwa 1 000 dpm betragen. Das CO
 2 sollte nach dem 
Ansäuern auf einen pH-Wert von 2-3 mit 1-2 Tropfen konzentriertem H  3 PO 4 
oder HCl erfolgen. Die CO  2 -Abtrennung kann durch Sprudeln mit Luft über 
etwa ½-1 Stunde erfolgen. Alternativ können die Fläschchen auch 1-2 Stunden 
heftig geschüttelt werden (z. B. auf einem Mikroplatten-Schüttler) oder vorsich ­
tiger über Nacht geschüttelt werden. Die Wirksamkeit der CO  2 -Abtrennung ist zu 
überprüfen (durch Verlängerung der Belüftung oder der Dauer des Schüttelns). Anschließend sollte eine zur Zählung wässeriger Proben geeignete geeignete 
Szintillationsflüssigkeit hinzugegeben, die Probe in einem Wirbelmischer homo ­
genisiert und die Radioaktivität mit einem Flüssigkeitsszintillationszähler be ­
stimmt werden; dabei ist die in den Blindproben festgestellte Hintergrundaktivität (F
 B ) abzuziehen. Wenn das im Test verwendete Wasser stark gefärbt ist oder 
hohe Feststoffkonzentrationen enthält, weisen die Proben im Allgemeinen eine 
einheitliche Querempfindlichkeit auf; in diesem Fall sind Querempfindlichkeits ­
korrekturen mit einem externen Standard hinreichend. Ist das im Test verwendete Wasser stark gefärbt, müssen die Querempfindlichkeitskorrekturen unter Umstän ­
den durch Zugabe eines internen Standards vorgenommen werden. Bei hoher 
Feststoffkonzentration kann unter Umständen keine homogene Lösung bzw. kein homogenes Gel hergestellt werden, oder die Proben. weisen sehr unter ­
schiedliche Querempfindlichkeiten auf. In diesem Fall kann die im Folgenden 
beschriebene Methode zum Zählen von Testschlämmen verwendet werden. Wenn 
der Test mit einem suspendierten Sediment durchgeführt wird, sollte die
 14 CO 2 - 
Messung indirekt durch Entnahme einer homogenen 10-ml-Probe des im Test verwendeten Wassers bzw. der im Test verwendeten Suspension und anschlie ­
ßende Trennung der Phasen durch Zentrifugieren bei geeigneter Geschwindigkeit 
(z. B. 40 000 m/s
 2 , 15 min) erfolgen. Danach sollte die wässerige Phase wie oben 
beschrieben behandelt werden. Die  14 C-Aktivität von als Feststoff vorliegendem 
organischem Kohlenstoff (POA) sollte durch erneute Suspendierung des Sedi ­
ments in einer kleinen Menge destillierten Wassers, Einbringung in Szintillations ­
fläschchen und Zugabe einer Szintillationsflüssigkeit zur Bildung eines Gels ermittelt werden. (Für diesen Zweck geeignete Szintillationsflüssigkeiten sind verfügbar.) Je nach Beschaffenheit der Feststoffe (z. B. Anteil an organischem 
Material) kann die Probe unter Umständen über Nacht mit einem Gewebelöser 
verarbeitet und dann in einem Wirbelmischer homogenisiert werden, bevor die Szintillationsflüssigkeit hinzugegeben wird. Alternativ kann die POA durch Ver ­
brennung des überschüssigen Sauerstoffs mit einem Oxydationsmittel bestimmt 
werden. Beim Zählen sollten grundsätzlich interne Standards einbezogen werden; 
unter Umständen müssen Querempfindlichkeitskorrekturen unter Zugabe eines internen Standards zu den einzelnen Proben vorgenommen werden.
 
Direkte  14 CO  2 -Bestimmung  
Wenn das entstandene  14 CO 2 direkt gemessen werden soll, sind bei Beginn des 
Tests zusätzliche Kolben vorzubereiten. Bei der Probenahme wird jeweils der gesamte Inhalt der Kolben entnommen. Die Kolben werden auf einen pH-Wert 
von 2-3 angesäuert und das
 14 CO 2 in einem internen (bereits bei Beginn des 
Tests in die Testkolben gebrachten) Absorber oder einem externen Absorber gebunden. Als Absorptionsmedium kann wahlweise Alkali (z. B. 1 N NaOH- Lösung oder ein NaOH-Pellet), Ethanolamin oder ein im Handel erhältlicher 
Absorber auf Ethanolaminbasis verwendet werden. Für direkte Messungen des
 
14 CO 2 -Gehalts sollten die Kolben z. B. mit Butylkautschuk-Septen verschlossen 
werden.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1208
 
Abbildung 1a  
Beispiel einer arithmetischen Darstellung der Daten (Restaktivität/Zeit)
  
Abbildung 1b  
Beispiel einer semilogarithmischen Darstellung der Daten (ln Restaktivität/Zeit)
  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1209
 
C.26.  LEMNA  SP. — WACHSTUMSINHIBITIONSTEST  
1. METHODE  
Diese Methode entspricht der Prüfrichtlinie OECD TG 
221 (2006) (1). Unter den Behörden der EU bestand breiter Konsens 
darüber, dass der  Lemna -Test bei stark kolorierten Substanzen eine 
geeignete Alternative zur Prüfung an einer Alge ist (2)(3).  
1.1. EINLEITUNG  
Mit dieser Prüfmethode soll die Toxizität von Substanzen für Süß ­
wasserpflanzen der Gattung  Lemna  (Wasserlinse) beurteilt werden. 
Die Methode beruht auf bestehenden Leitlinien (4)(5)(6)(7)(8)(9), sieht aber Änderungen der entsprechenden Methoden vor, die neue ­
ren Forschungsergebnissen und Anhörungen bezüglich einer Reihe 
wesentlicher Aspekte Rechnung tragen. Die vorgeschlagene Methode wurde durch einen internationalen Ringtest validiert (10).
 
Diese Prüfmethode beschreibt Toxizitätstests mit  Lemna gibba  und  
Lemna minor , die beide umfassend untersucht wurden und Gegen ­
stand der genannten Standards waren. Die Taxonomie von  Lemna  
spp. ist schwierig; problematisch sind die zahlreichen Phänotypen. 
Bei Lemna  kann die Reaktion auf Giftstoffe zu genetischer Varia ­
bilität führen; zurzeit sind jedoch keine hinreichenden Daten zu den Ursachen dieser Variabilität verfügbar, welche die Empfehlung eines 
spezifischen Klons für diese Prüfmethode rechtfertigen würden. Es 
wird darauf hingewiesen, dass der Test nicht axenisch durchgeführt wird; in verschiedenen Stadien während der Durchführung des Tests wird jedoch mit geeigneten Maßnahmen versucht, Verunreinigungen 
durch andere Organismen auf ein Minimum zu begrenzen.
 
Die Durchführung von Tests sowohl unter Erneuerung der Testlö ­
sung (semistatische Tests und Durchflusstests) als auch ohne Erneue ­
rung der Testlösung (statische Tests) wird detailliert beschrieben. Abhängig von den Zielsetzungen der Tests sowie von rechtlichen Anforderungen wird empfohlen, den Einsatz von semistatischen Me ­
thoden sowie von Durchflussmethoden zu prüfen (z. B. für Substan ­
zen, die durch Verflüchtigung, Photodegradation, Ausfällung oder biologischen Abbau rasch verloren gehen). Weitere Informationen sind Quelle (11) zu entnehmen.
 
1.2. BEGRIFFSBESTIMMUNGEN  
Im Zusammenhang mit dieser Prüfmethode werden die folgenden 
Begriffsbestimmungen zugrunde gelegt und folgende Abkürzungen verwendet:
 
Biomasse : Trockengewicht des in einer Population enthaltenen le ­
benden Materials; bei diesem Test werden typischerweise Surrogate für die betreffende Biomasse (z. B. Frondzahl oder Frondfläche) 
gemessen; entsprechend bezieht sich der Begriff „Biomasse“ auch 
auf diese Surrogatparameter.
 
Chlorose : Gelbfärbung des Blattmaterials.  
KIon : ein Organismus oder eine Zelle, der bzw. die durch ge ­
schlechtslose Reproduktion aus einem einzelnen Organismus gewon ­
nen wurde; aus jeweils demselben Klon gewonnene Organismen sind 
entsprechend genetisch identisch.  
Kolonie : Gesamtheit der miteinander verbundenen Mutter- und 
Tochter-Fronds (gewöhnlich 2 bis 4); gelegentlich auch als Pflanze 
bezeichnet.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1210
 
EC x : Konzentration der im Prüfmedium aufgelösten Prüfsubstanz, 
bei der sich binnen einer festgelegten Expositionsdauer eine Redu ­
zierung des Wachstums von  Lemna  um x % (z. B. 50 %) ergibt. (Die 
Expositionsdauer ist ausdrücklich zu nennen, wenn die Dauer von der vollständigen oder normalen Testdauer abweicht.) Um einen von 
der Wachstumsrate oder vom Zellertrag abweichenden EC-Wert ein ­
deutig zu kennzeichnen, wird die Bezeichnung „E
 r C“ für die Wachs ­
tumsrate und „E  y C“ für den Zellertrag jeweils gefolgt von der ver ­
wendeten Messvariablen (z. B. E  r C (Frondzahl)) verwendet.  
Durchflusstest : ein Test, bei dem die Testlösungen kontinuierlich 
ersetzt werden.  
Frond : eine separate/einzelne „blattartige“ Struktur einer Wasserlin ­
sen-Pflanze; kleinste reproduktionsfähige Einheit (d. h. einzelner Or ­
ganismus).  
Aufwölbungen : Fronds mit einer Wölbung oder Schwellung.  
Wachstum : Zunahme der Messvariablen, z. B. Frondzahl, Trocken ­
gewicht, Feuchtgewicht oder Frondfläche während der Testdauer.  
Wachstumsrate (durchschnittliche spezifische Wachstumsrate) : 
logarithmische Zunahme der Biomasse während der Expositionsdauer.
 
Niedrigste Konzentration mit beobachteter Wirkung (LOEC) : 
niedrigste geprüfte Konzentration, bei der beobachtet wurde, dass 
die Substanz binnen einer bestimmten Expositionsdauer gegenüber der Kontrollprobe eine statistisch signifikante Wachstumsreduzierung bewirkt (bei p < 0,05); allerdings müssen sämtliche Testkonzentra ­
tionen über der LOEC schädliche Folgen haben, die mindestens den 
bei der LOEC beobachteten schädlichen Folgen gleichwertig sind. Wenn diese beiden Bedingungen nicht erfüllt werden können, ist umfassend darzulegen, warum die LOEC (und entsprechend die 
NOEC) gewählt wurde.
 
Messvariablen : alle Variablentypen, die gemessen werden, um mit 
mindestens einer Reaktionsvariablen den Endpunkt des Tests zu be ­
schreiben; Messvariablen bei dieser Methode sind Frondzahl, Frond ­
fläche, Frischgewicht und Trockengewicht.  
Monokultur : Kultur mit einer Pflanzenart.  
Nekrose : totes (d. h. weißes oder mit Wasser durchfeuchtetes) Blatt ­
material.  
Höchste geprüfte Konzentration ohne beobachtete schädliche 
Wirkung (NOEC) : Testkonzentration unmittelbar unterhalb der 
LOEC.  
Phänotyp : zu beobachtende Merkmale eines Organismus, die durch 
Interaktion der Gene dieses Organismus mit seiner Umgebung be ­
stimmt werden.  
Reaktionsvariablen : Variablen für die geschätzte Toxizität, abge ­
leitet aus beliebigen gemessenen Variablen zur Beschreibung der 
Biomasse durch verschiedene Berechnungsmethoden; bei dieser Me ­
thode sind die Wachstumsraten und der Zellertrag Reaktionsvaria ­
blen, die aus Messvariablen wie z. B. Frondzahl, Frondfläche, 
Frischgewicht oder Trockengewicht abgeleitet werden.  
Semistatischer (Erneuerungs-)Test : Test, bei dem die Testlösung 
während der Testdauer regelmäßig oder in bestimmten Intervallen ersetzt wird.
 
Statischer Test : Testmethode, bei der die Testlösung während der 
Testdauer nicht erneuert wird.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1211
 
Endpunkt des Tests : beschreibt den allgemeinen Faktor, der bezo ­
gen auf die Kontrolle als Testziel durch die Prüfchemikalie verändert 
wird; bei dieser Methode wird als Endpunkt des Tests die Wachs ­
tumshemmung angenommen; diese kann durch verschiedene Reakti ­
onsvariablen ausgedrückt werden, die jeweils auf mindestens einer 
Messvariablen beruhen.  
Prüfmedium : gesamtes synthetisches Nährmedium, in dem die zu 
prüfenden Pflanzen wachsen, wenn sie der Prüfsubstanz ausgesetzt werden; die Prüfsubstanz wird im Allgemeinen im Prüfmedium auf ­
gelöst.
 
Zellertrag : Wert einer Messvariablen zur Beschreibung der Bio ­
masse am Ende der Expositionsdauer abzüglich der Messvariablen am Anfang der Expositionsdauer.
 
1.3. PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
Exponentiell wachsende Pflanzenkulturen der Gattung  Lemna  wer­
den über einen Zeitraum von sieben Tagen als Monokulturen in unterschiedlichen Konzentrationen der Prüfsubstanz kultiviert. Ziel des Tests ist die Quantifizierung von durch die Substanz bedingten 
Auswirkungen auf das Pflanzenwachstum während dieses Zeitraums, 
ausgehend von Bewertungen der ausgewählten Messvariablen. Die Frondzahl ist die primäre Messvariable. Mindestens eine weitere Messvariable (gesamte Frondfläche, Trockengewicht oder Frisch ­
gewicht) wird ebenfalls gemessen, da sich einige Substanzen erheb ­
lich stärker als die Frondzahlen auf die Messvariablen auswirken können. Um die substanzabhängigen Auswirkungen zu quantifizie ­
ren, wird das Wachstum der Testlösungen mit dem Wachstum der 
Kontrolllösungen verglichen, bei dem eine spezifizierte Wachstums ­
hemmung von x % (z. B. 50 %) festgestellt wird, die dann als EC
 x 
(z. B. EC  50 ) anzugeben ist.  
Der Endpunkt des Tests ist die Wachstumshemmung ausgedrückt als 
logarithmische Zunahme der Messvariablen (durchschnittliche spezi ­
fische Wachstumsrate) während der Expositionsdauer. Aus den in einer Reihe von Testlösungen erfassten durchschnittlichen spezi ­
fischen Wachstumsraten wird die Konzentration bestimmt, bei der 
sich eine spezifizierte Hemmung der Wachstumsrate von x % (z. B. 
50 %) ergibt; diese Konzentration wird als E
 r C x bezeichnet (z. B. 
E r C 50 ). 
Bei dieser Prüfmethode wird als weitere Reaktionsvariable der Zel ­
lertrag verwendet; diese Variable kann erforderlich sein, damit in 
manchen Ländern bestimmte maßgebliche Rechtsvorschriften erfüllt werden. Die Variable ergibt sich aus den Messvariablen am Ende der 
Expositionsdauer abzüglich der Messvariablen am Beginn der Ex ­
positionsdauer. Aus dem in einer Reihe von Testlösungen ermittelten Zellertrag werden die Konzentrationen berechnet, bei denen sich eine festgelegte Zellertrag-Hemmung von x % (z. B. 50 %) ergibt; diese 
Konzentration wird als E
 y C x bezeichnet (z. B. E  y C 50 ). 
Außerdem können die niedrigste Konzentration mit beobachteter 
Wirkung (LOEC) und die höchste geprüfte Konzentration ohne be ­
obachtete schädliche Wirkung (NOEC) statistisch bestimmt werden.  
1.4. INFORMATIONEN ZUR PRÜFSUBSTANZ  
Eine Analysemethode mit geeigneter Empfindlichkeit für die Quan ­
tifizierung der im Prüfmedium enthaltenen Substanz sollte verfügbar 
sein. ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1212
 
Zur Festlegung der Testbedingungen hilfreiche Informationen zur 
Prüfsubstanz sind die Strukturformel, die Wasserlöslichkeit, die Sta ­
bilität in Wasser, die Lichtbeständigkeit, pK  a , K ow , der Dampfdruck 
und die biologische Abbaubarkeit. Aus der Wasserlöslichkeit und dem Dampfdruck kann die Henry-Konstante berechnet werden, aus 
der zu entnehmen ist, ob während der Testdauer erhebliche Verluste 
der Prüfsubstanz zu erwarten sind. Die Konstante gibt Aufschluss darüber, ob bestimmte Maßnahmen zur Überwachung dieser Verluste durchgeführt werden sollten. Wenn Informationen zur Löslichkeit 
und zur Stabilität der Prüfsubstanz nicht zuverlässig sind, sollten 
die Substanzen unter den Testbedingungen (d. h. Nährmedium, Tem ­
peratur und Beleuchtung) untersucht werden.
 
Wenn der Steuerung des pH-Wertes des Prüfmediums besondere 
Bedeutung zukommt (z. B. beim Testen von Metallen oder sonstigen hydrolytisch instabilen Substanzen), wird die Zugabe einer Pufferlö ­
sung zum Nährmedium empfohlen (siehe Abschnitt 1.7.4 Absatz 1). 
Weitere Hinweise zu Prüfsubstanzen mit physikalisch-chemischen Merkmalen, welche die Durchführung des Tests erschweren, sind Quelle (11) zu entnehmen.
 
1.5. REFERENZSUBSTANZ  
Um das Prüfverfahren zu testen, können Referenzsubstanzen wie 
z. B. das im internationalen Ringtest (10) verwendete 3,5-Dichlorp ­
henol geprüft werden. Die Prüfsubstanzen sollten mindestens zwei ­
mal jährlich bzw., wenn die Tests seltener durchgeführt werden, gleichzeitig mit der Bestimmung der Toxizität der Prüfsubstanzen getestet werden.
 
1.6. VALIDITÄT DES TESTS  
Die Tests sind nur dann gültig, wenn die Zeit bis zur Verdopplung 
der Frondzahl der Kontrolle weniger als 2,5 Tage (60 h) und damit 
etwa einer Erhöhung um das Siebenfache binnen sieben Tagen bei 
einer durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate von 0,275 d  –1 
entspricht. Für die Medien und Testbedingungen gemäß dieser Me ­
thode kann dieses Kriterium mit dem Prüfprotokoll des statischen 
Tests (8) erfüllt werden. Außerdem wird angenommen, dass dieses 
Kriterium auch bei den Bedingungen des semistatischen Tests und des Durchflusstests erfüllt wird. Wie die Verdopplungszeit zu be ­
rechnen ist, wird in Abschnitt 2.1 beschrieben.
 
1.7. BESCHREIBUNG DER METHODE  
1.7.1.  Apparatur  
Sämtliche Geräte, die mit dem Prüfmedium in Berührung kommen, 
sollten aus Glas oder einem sonstigen chemisch inerten Material 
bestehen. Die zur Kultivierung und für die Tests verwendeten Glas ­
geräte sollten steril sein und von chemischen Verunreinigungen be ­
freit werden, die in das Prüfmedium gelangen könnten. Die Prüfge ­
fäße sollten so groß sein, dass die Fronds der verschiedenen Kolo ­
nien in den Kontrollgefäßen wachsen können, ohne sich am Ende der Testdauer zu überlagern. Dass die Wurzeln gegebenenfalls den Boden der Prüfgefäße berühren, ist unerheblich; in jedem Fall ist 
jedoch eine Mindesttiefe von 20 mm und ein Mindestvolumen von 
100 ml pro Prüfgefäß zu empfehlen. Die Art der Prüfgefäße ist nicht entscheidend, sofern diese Anforderungen erfüllt sind. Bewährt ha ­
ben sich Bechergläser, Kristallisierungsschalen und Petrischalen mit 
geeigneten Abmessungen. Die Prüfgefäße werden abgedeckt, um die 
Verdampfung und zufällige Verunreinigungen zu minimieren und trotzdem den erforderlichen Luftaustausch zu ermöglichen. Die Prüf ­
gefäße und insbesondere die verwendeten Abdeckungen dürfen keine 
Schatten erzeugen und keine Änderungen des Lichtspektrums 
bewirken.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1213
 
Kulturen und Prüfgefäße sollten nicht zusammen gelagert werden. 
Um diese Anforderung zu erfüllen, werden am besten getrennte 
Wachstumskammern bzw. getrennte Inkubatoren oder Räume ver ­
wendet. Beleuchtung und Temperatur müssen kontrolliert werden können, und für Beleuchtung und Temperatur müssen gleichblei ­
bende Werte aufrechterhalten werden können (siehe Abschnitt 1.7.8).
 
1.7.2.  Testorganismus  
Für diesen Test wird entweder  Lemna gibba  oder  Lemna minor  
verwendet. In Anlage 1 sind Kurzbeschreibungen von in Toxizitäts ­
tests verwendeten Wasserlinsenarten zusammengestellt. Das Pflan ­
zenmaterial kann aus einer Kultursammlung oder aus einem anderen 
Labor bezogen oder aus der Natur entnommen werden. Bei Ent ­
nahme aus der Natur sollten die Pflanzen mindestens acht Wochen vor der Verwendung in dem Medium kultiviert werden, das auch für die Tests verwendet wird. Orte in der freien Natur, aus denen die 
Ausgangskulturen entnommen werden, dürfen keinen offensicht ­
lichen Quellen von Verunreinigungen ausgesetzt sein. Wenn die Kulturen aus einem anderen Labor oder aus einer Kultursammlung bezogen werden, sollten sie ebenfalls mindestens drei Wochen unter 
ähnlichen Bedingungen kultiviert werden. Angegeben werden sollten 
auch die Herkunft des Pflanzenmaterials, der Arten und des Klons (wenn bekannt), die für die Tests verwendet werden.
 
Für die Tests sollten Monokulturen verwendet werden, die keine 
sichtbaren Verunreinigungen durch andere Organismen als Algen 
und Protozoen aufweisen. Gesunde Pflanzen der Art  L. minor  be­
stehen aus Kolonien mit zwei bis fünf Fronds; gesunde  L. gibba - 
Kolonien können bis zu sieben Fronds umfassen.  
Qualität und Einheitlichkeit der für die Tests verwendeten Pflanzen 
haben erhebliche Auswirkungen auf das Ergebnis der Tests; entspre ­
chend sorgfältig sollten die Pflanzen ausgewählt werden. Nach Mög ­
lichkeit sollten junge, rasch wachsende Pflanzen ohne sichtbare Lä ­
sionen oder Verfärbungen (Chlorose) verwendet werden. Hochwer ­
tige Kulturen weisen einen hohen Anteil an Kolonien mit mindestens zwei Fronds auf. Zahlreiche einzelne Fronds deuten auf Umwelt ­
stress hin (z. B. auf Nährstoffmangel); Pflanzenmaterial aus diesen 
Kulturen sollte für die Tests nicht verwendet werden.
 
1.7.3.  Kultivierung  
Um den Kultivierungsaufwand zu reduzieren (z. B. wenn über einen 
bestimmten Zeitraum keine Tests mit  Lemna  vorgesehen sind), kön ­
nen die Kulturen bei verringerter Beleuchtung und niedrigerer Tem ­
peratur (4-10 °C) gelagert werden. Nähere Informationen zur Kulti ­
vierung sind Anlage 2 zu entnehmen. Bei offensichtlichen Anzeichen für Verunreinigungen durch Algen oder sonstige Organismen muss eine Oberflächensterilisation einer Teilprobe der  Lemna -Fronds vor ­
genommen werden und anschließend eine Übertragung in ein fri ­
sches Medium erfolgen (siehe Anhang 2). In diesem Fall sollte die verbleibende verunreinigte Kultur verworfen werden.
 
Mindestens sieben Tage vor Durchführung der Tests wird eine hin ­
reichende Anzahl an Kolonien keimfrei in ein frisches steriles Me ­
dium gebracht und 7-10 Tage bei Testbedingungen kultiviert.  
1.7.4.  Prüfmedium  
Für Lemna minor  und  Lemna gibba  werden jeweils die im Folgen ­
den genannten Medien empfohlen. Wenn angenommen wird, dass das Medium mit der Prüfsubstanz reagieren und die Toxizitätswir ­
kung beeinflussen könnte, ist sorgfältig zu prüfen, ob eine pH-Puff ­
erlösung zum Prüfmedium gegeben werden sollte (beim  L. minor - 
Medium MOPS (4-Morpholinpropan-Sulfonsäure, CAS-Nr: 1132-61- 2; EINECS-Nr: 214-478-5) und beim  L. gibba -Medium NaHCO
 3 ). 
Das Steinberg-Medium (12) ist ebenfalls annehmbar, wenn die Va ­
liditätskriterien erfüllt werden.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1214
 
Zur Kultivierung von  L. minor  und für Tests mit  L. minor  wird eine 
Modifizierung des SIS- Lemna -Nährmediums (SIS = schwedisches 
Standardmedium) empfohlen. Die Zusammensetzung dieses Medi ­
ums ist Anlage 3 zu entnehmen.  
Zur Kultivierung von  L. gibba  und für Tests mit  L. gibba  wird das 
Nährmedium 20X — AAP (siehe Anlage 3) empfohlen.  
Das in Anlage 3 beschriebene Steinberg-Medium ist für  L. minor  
ebenfalls geeignet, kann aber auch für  L. gibba  verwendet werden, 
wenn die Validitätskriterien erfüllt sind.  
1.7.5.  Testlösungen  
Die Testlösungen werden gewöhnlich durch Verdünnung einer 
Stammlösung hergestellt. Zum Herstellen von Stammlösungen der Prüfsubstanz wird die Substanz im Allgemeinen im Nährmedium gelöst.
 
Die höchste getestete Konzentration der Prüfsubstanz sollte in der 
Regel die Wasserlöslichkeit der Substanz bei den jeweiligen Testbe ­
dingungen nicht überschreiten. Allerdings wird darauf hingewiesen, dass Lemna  spp. auf der Oberfläche treiben und Substanzen aus ­
gesetzt werden könnten, die sich am Übergang zwischen Wasser 
und Umgebungsluft sammeln (z. B. schlecht wasserlösliche oder 
hydrophobe Substanzen oder oberflächenaktive Wirkstoffe). Unter diesen Umständen besteht eine Belastung durch nicht in der Lösung enthaltene Materialien, und die Testkonzentrationen können je nach 
den Merkmalen der Prüfsubstanz die Wasserlöslichkeit überschreiten. 
Bei Prüfsubstanzen mit geringerer Wasserlöslichkeit muss unter Um ­
ständen mit einem organischen Lösungsmittel oder einem Dispergier ­
mittel eine konzentrierte Stammlösung oder eine Dispersion der Sub ­
stanz hergestellt werden, damit leichter die exakten Mengen der 
Prüfsubstanz zum Prüfmedium hinzugegeben werden können und damit die Dispergierung und die Auflösung der Substanz begünstigt 
wird. Es sollte unbedingt versucht werden, die Verwendung dieser 
Materialien zu vermeiden. Infolge der Verwendung unterstützender Lösungsmittel oder Dispergiermittel sollte keine Phytotoxizität ent ­
stehen. Häufig verwendete Lösungsmittel, die bei Konzentrationen 
bis zu 100 μl·l
 –1 keine phototoxische Wirkung haben, sind z. B. 
Aceton und Dimethylformamid. Wenn ein Lösungsmittel oder ein Dispergiermittel verwendet wird, sollte die Endkonzentration pro ­
tokolliert und auf ein Minimum ( ≤ 100 μl·l
 –1 ) beschränkt werden; 
alle behandelten Proben und die Kontrollproben sollten das Lösungs ­
mittel bzw. das Dispergiermittel in derselben Konzentration enthal ­
ten. Weitere Informationen zur Verwendung von Dispergiermitteln sind Quelle (11) zu entnehmen.
 
1.7.6.  Test- und Kontrollgruppen  
Die vorherige Kenntnis der Toxizität der Prüfsubstanz für  Lemna  
(z. B. aufgrund eines Tests zur Bereichsermittlung) erleichtert die 
Auswahl geeigneter Testkonzentrationen. Beim definitiven Toxizi ­
tätstest sollten in der Regel mindestens fünf Testkonzentrationen in geometrischen Reihen angeordnet sein. Der Trennfaktor zwischen den Testkonzentrationen sollte höchstens 3,2 betragen; bei flachen 
Konzentrations-Reaktionskurven kommen jedoch auch höhere Werte 
in Betracht. Die Verwendung von weniger als fünf Konzentrationen sollte begründet werden. Für jede Testkonzentration sollten mindes ­
tens drei Wiederholungen verwendet werden.
 
Beim Festlegen des Testkonzentrationsbereichs (zur Bereichsermitt ­
lung und/oder für den definitiven Toxizitätstest) sind folgende 
Punkte zu berücksichtigen:  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1215
 
— Um ein angemessenes Konfidenzintervall sicherzustellen, sollten 
bei der Bestimmung eines EC  x -Wertes die Testkonzentrationen 
so gewählt werden, dass der EC  x -Wert abgedeckt ist. Bei der 
Schätzung von EC  50 beispielsweise sollte die höchste Testkon ­
zentration größer als EC  50 sein. Wenn der EC  50 -Wert außerhalb 
des Testkonzentrationsbereichs liegt, sind die entsprechenden 
Konfidenzintervalle groß, und eine angemessene Bewertung der statistischen Eignung des Modells ist unter Umständen nicht möglich.
 
— Wenn die LOEC oder die NOEC bestimmt werden sollen, sollte 
die niedrigste Testkonzentration so gering sein, dass das Wachs ­
tum nicht signifikant kleiner als das Wachstum der Kontroll ­
gruppe ist. Außerdem sollte die höchste Testkonzentration so 
hoch sein, dass das Wachstum signifikant geringer ist als das Wachstum der Kontrollgruppe. Ansonsten muss der Test mit einem anderen Konzentrationsbereich wiederholt werden (wenn 
die höchste Konzentration nicht an der Löslichkeitsgrenze bzw. 
bei der höchstens erforderlichen Grenzkonzentration [z. B. 100 mg · l
 –1 ) liegt].  
Die Tests sollten jeweils Kontrollen beinhalten, bei denen dasselbe 
Nährmedium, dieselbe Anzahl an Fronds und Kolonien und die gleichen Umgebungsbedingungen und Verfahren wie in den Prüfge ­
fäßen gegeben sind und nur die Prüfsubstanz fehlt. Wenn ein zu ­
sätzliches Lösungsmittel oder Dispergiermittel verwendet wird, sollte 
eine zusätzliche Kontrollbehandlung mit dem Lösungsmittel/ ­
Dispergiermittel erfolgen, das in derselben Konzentration wie in den Gefäßen mit der Prüfsubstanz vorliegt. Die Anzahl der Kontroll ­
gefäße zur Durchführung von Wiederholungen (sowie ggf. der Lö ­
sungsmittelgefäße) sollte mindestens identisch mit der Anzahl der für die verschiedenen Testkonzentrationen verwendeten Gefäße sein; im Idealfall sollten sogar doppelt so viele Gefäße verwendet werden.
 
Wenn die NOEC nicht bestimmt werden muss, kann das Prüfpro ­
tokoll geändert werden, indem die Anzahl der Konzentrationen er ­
höht und die Anzahl der Wiederholungen verringert wird. Zur Kon ­
trolle sollten mindestens drei Wiederholungen durchgeführt werden.  
1.7.7.  Exposition  
Kolonien mit zwei bis vier sichtbaren Fronds werden unter keim ­
freien Bedingungen aus der Impfkultur übertragen und zufällig den Prüfgefäßen zugewiesen. Die Prüfgefäße sollten jeweils insgesamt 
neun bis zwölf Fronds enthalten. Die Anzahl der Fronds und Kolo ­
nien sollte in allen Prüfgefäßen jeweils identisch sein. Erfahrungen mit dieser Methode sowie Daten aus Ringtests haben gezeigt, dass drei Wiederholungen pro Behandlung und pro Wiederholung anfäng ­
lich neun bis zwölf Fronds hinreichend sind, um Unterschiede hin ­
sichtlich der Wachstumshemmungen in der Größenordnung von ca. 4 bis 7 % aufgrund der Wachstumsrate (pro Zellertrag 10 bis 15 % 
berechnet) zwischen den Behandlungen feststellen zu können (10).
 
Die Prüfgefäße müssen randomisiert im Inkubator angeordnet wer ­
den, um die Auswirkungen räumlich unterschiedlicher Lichtintensi ­
täten und Temperaturen zu minimieren. Außerdem sind eine block ­
weise Anordnung oder ein zufälliges Einsetzen der Gefäße während 
der Durchführung der Messungen (oder noch häufiger) erforderlich.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1216
 
Wenn aufgrund eines vorläufigen Stabilitätstests anzunehmen ist, 
dass die Prüfsubstanzkonzentration während der Testdauer (7 Tage) 
nicht aufrechterhalten werden kann (d. h. wenn die gemessene Kon ­
zentration unter 80 % der gemessenen Ausgangskonzentration fällt), wird ein semistatischer Test empfohlen. In diesem Fall sollten die 
Kolonien während der Testdauer mindestens zweimal (z. B. an den 
Tagen 3 und 5) frisch hergestellten Test- und Kontrolllösungen aus ­
gesetzt werden. Wie häufig die Lösungen dem frischen Medium ausgesetzt werden, hängt von der Stabilität der Prüfsubstanz ab. 
Bei sehr instabilen oder flüchtigen Substanzen ist unter Umständen 
eine häufigere Exposition erforderlich, um die Konzentrationen an ­
nähernd konstant zu halten. Unter gewissen Umständen kann auch die Durchführung eines Durchflusstests erforderlich sein (11)(13).
 
Das Expositionsszenario beim Besprühen wird in dieser Prüfmethode 
nicht berücksichtigt; diesbezüglich wird auf Quelle (14) verwiesen.  
1.7.8.  Inkubationsbedingungen  
Durch kontinuierliche fluoreszierende Beleuchtung mit warmem oder 
kaltweißem Licht sollte eine Lichtintensität hergestellt werden, die 
bei Messung unter photosynthetisch aktiver Strahlung (400-700 nm) an Punkten jeweils in demselben Abstand von der Lichtquelle wie die Lemna -Fronds im Bereich 85-135 μE·m
 –2 · s –1 (entsprechend 
etwa 6 500-10 000 lx) liegt. Abweichungen von der gewählten Licht ­
intensität dürfen im Testbereich höchstens ± 15 % betragen. Dabei ist zu beachten, dass die Messwerte von der Methode zur Feststel ­
lung und zur Messung der Lichtintensität (insbesondere vom Sensor ­
typ) abhängen. Kugelförmige Sensoren (die auf Licht aus allen Win ­
keln über und unter der Messebene reagieren) sowie „Kosinus“-Sen ­
soren (die auf Licht aus allen Winkeln über der Messebene anspre ­
chen) sind gegenüber unidirektionalen Sensoren zu bevorzugen, da 
diese Sensoren bei Mehrpunkt-Lichtquellen des hier beschriebenen 
Typs höhere Messwerte ergeben.
 
Die Temperatur der Prüfgefäße sollte 24 ± 2 °C betragen. Der pH- 
Wert des Kontrollmediums darf während des Tests höchstens um 
1,5 Einheiten ansteigen. Auch bei Abweichungen von mehr als 1,5 Einheiten sind Testergebnisse jedoch dann nicht ungültig, wenn nachgewiesen werden kann, dass die Validitätskriterien erfüllt 
sind. Erhöhte Sorgfalt ist bei der Beurteilung von Verschiebungen 
des pH-Wertes in Sonderfällen geboten (z. B. beim Testen instabiler Substanzen oder beim Testen von Metallen). Weitere Informationen in diesem Zusammenhang sind Quelle (11) zu entnehmen.
 
1.7.9.  Dauer  
Der Test wird sieben Tage nach Einbringung der Pflanzen in die 
Prüfgefäße beendet.  
1.7.10.  Messungen und analytische Bestimmungen  
Bei Beginn des Tests wird die Anzahl der in den Prüfgefäßen ent ­
haltenen Fronds ermittelt und protokolliert; zu zählen sind alle he ­
rausragenden, deutlich erkennbaren Fronds. Die Anzahl der normal oder anomal aussehenden Fronds ist bei Beginn des Tests, alle drei 
Tage während der Expositionsdauer (d. h. binnen des Zeitraums von 
sieben Tagen mindestens zweimal) und am Ende des Tests zu bestimmen. Änderungen in der Entwicklung der Pflanzen (z. B. Än ­
derungen der Größe oder des Aussehens der Fronds, Anzeichen für 
eine Nekrose, Chlorose oder Aufwölbungen, das Aufbrechen von 
Kolonien oder der Verlust der Schwimmfähigkeit sowie Veränderun ­
gen der Wurzellänge oder der sonstigen Beschaffenheit der Wurzeln) sind zu protokollieren. Wesentliche Merkmale des Prüfmediums 
(z. B. Vorliegen nicht gelösten Materials oder Algenwachstum im 
Prüfgefäß) sollten ebenfalls verzeichnet werden.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1217
 
Ergänzend zur Ermittlung der Frondzahl während des Tests sind 
auch die Auswirkungen der Prüfsubstanz auf eine (oder mehrere) 
der folgenden Messvariablen zu bewerten:  
i) Gesamtfläche der Fronds,  
ii) Trockengewicht,  
iii) Frischgewicht.  
Die Gesamtfläche der Fronds hat den Vorteil, dass sie für jedes 
einzelne Prüfgefäß und für jedes einzelne Kontrollgefäß jeweils bei 
Beginn des Tests, während der Durchführung des Tests und am Ende des Tests bestimmt werden kann. Das Trockengewicht und das Frischgewicht sollten bei Beginn des Tests an einer Probe der Impf ­
kultur ermittelt werden, die typisch für das bei Beginn des Tests 
verwendete Material ist; eine weitere Feststellung sollte am Ende des Tests anhand des Pflanzenmaterials jeweils aus den Prüfgefäßen und aus den Kontrollgefäßen erfolgen. Wenn die Frondfläche nicht 
gemessen wird, sollte eher das Trockengewicht als das Frischgewicht 
ermittelt werden.
 
Die Gesamtfläche der Fronds, das Trockengewicht und das Frisch ­
gewicht können wie folgt bestimmt werden:  
i) Gesamtfläche der Fronds : Die Gesamtfläche der Fronds aller 
Kolonien kann durch Bildanalyse ermittelt werden. Eine Silhou ­
ette des Prüfgefäßes und der Pflanzen kann mit einer Video ­
kamera erfasst werden; dazu wird das Gefäß auf einen Leucht ­
kasten gebracht und das dort aufgenommene Bild anschließend 
digitalisiert. Durch die Kalibrierung mit flachen Verläufen be ­
kannter Flächen kann dann die Gesamtfläche der Fronds im Prüfgefäß bestimmt werden. Dabei ist darauf zu achten, dass Störungen durch den Rand des Prüfgefäßes ausgeschlossen wer ­
den. Ein alternatives, aber aufwändigeres Verfahren besteht da ­
rin, dass Prüfgefäße und Pflanzen fotokopiert und die entspre ­
chenden Silhouetten der Kolonien ausgeschnitten werden; an ­
schließend wird die jeweilige Fläche mit einem Blattflächen- 
Analysator oder mit Millimeterpapier bestimmt. Geeignet sind 
unter Umständen aber auch andere Verfahren (z. B. die Ermitt ­
lung des Papiergewicht-Verhältnisses zwischen der Fläche der Kolonie-Silhouette und der Fläche der jeweils zugrunde gelegten 
Einheit).
 
ii) Trockengewicht : Alle Kolonien werden jeweils aus den Prüfge ­
fäßen entnommen und mit destilliertem oder entionisiertem Was ­
ser gespült. Durch anschließendes Ablöschen wird überschüssi ­
ges Wasser entfernt; danach werden die Proben bei 60 °C auf ein konstantes Gewicht getrocknet. Wurzelreste sollten einbezogen 
werden. Das Trockengewicht sollte mit einer Genauigkeit von 
mindestens 0,1 mg angegeben werden.
 
iii) Frischgewicht : Alle Kolonien werden in zuvor gewogene Röhr ­
chen aus Polystyrol (oder einem sonstigen inerten Material) mit 
feinen Löchern (1 mm) im gerundeten Boden eingebracht. An ­
schließend werden die Röhrchen bei Raumtemperatur 10 Minuten mit 3 000 Umdrehungen/min. zentrifugiert. Die 
Röhrchen mit den nun getrockneten Kolonien werden nun 
noch einmal gewogen; danach wird das Frischgewicht durch Subtraktion des Gewichts der leeren Röhrchen bestimmt.
 
1.7.10.1.  Häufigkeit der Messungen und der analytischen Bestimmungen  
Bei statischen Tests sollte jeweils bei Beginn des Tests und am Ende 
des Tests der pH-Wert der behandelten Lösungen gemessen werden. Bei semistatischen Tests sollte für alle Batches der „frischen“ Test ­
lösung jeweils vor den Erneuerungen der pH-Wert ermittelt werden; 
außerdem sollte der pH-Wert der „verbrauchten“ Lösungen bestimmt 
werden.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1218
 
Die Lichtintensität sollte in der Wachstumskammer, im Inkubator 
oder im jeweiligen Raum in dem Abstand von der Lichtquelle ge ­
messen werden, der auch für die  Lemna -Fronds gegeben ist. Wäh ­
rend des Tests sollte mindestens eine Messung vorgenommen wer ­
den. Die Temperatur des Mediums in einem Surrogatgefäß, das Be ­
dingungen ausgesetzt wird, die in der Wachstumskammer bzw. im 
Inkubator oder im jeweiligen Raum gegeben sind, sollte mindestens täglich protokolliert werden.
 
Während des Tests wird die Konzentration der Prüfsubstanz in ge ­
eigneten Intervallen bestimmt. Bei statischen Tests ist die Konzen ­
tration mindestens bei Beginn des Tests und am Ende des Tests zu 
ermitteln.  
Bei semistatischen Tests, bei denen davon ausgegangen wird, dass 
die Konzentration der Prüfsubstanz nicht im Bereich von 20 % der 
Nennkonzentration aufrechterhalten werden kann, müssen alle frisch hergestellten Testlösungen sowie alle Lösungen jeweils nach einer Erneuerung analysiert werden (siehe Abschnitt 1.7.7 Absatz 3). Bei 
Tests, bei denen die gemessene Ausgangskonzentration der Prüfsub ­
stanz zwar nicht im Bereich von 20 % der Nennkonzentration liegt, bei denen jedoch hinreichend nachgewiesen werden kann, dass die Ausgangskonzentrationen wiederholbar und stabil sind (d. h. dass die 
Konzentrationen im Bereich von 80-120 % der Ausgangskonzentra ­
tion liegen), sind chemische Bestimmungen nur bei der höchsten und bei der niedrigsten Konzentration erforderlich. In jedem Fall brau ­
chen die Prüfsubstanzkonzentrationen für alle Testkonzentrationen 
vor der Erneuerung jeweils nur bei einer einzigen Wiederholung (bzw. bei Gefäßen mit zusammengefassten Wiederholungen jeweils bei nur einem Gefäß) erneut bestimmt zu werden.
 
Bei Durchflusstests ist ähnlich zu verfahren, wie bei den semistati ­
schen Tests, d. h. Analysen sind jeweils bei Beginn des Tests, wäh ­
rend des Tests und am Ende des Tests durchzuführen; Messungen 
der „verbrauchten“ Lösungen sind jedoch nicht erforderlich. Bei diesem Testtyp sollten der Durchfluss des Verdünnungsmittels und der Prüfsubstanz-Stammlösung täglich geprüft werden.
 
Wenn nachgewiesen wird, dass die Konzentration der Prüfsubstanz 
während der gesamten Testdauer in befriedigender Weise im Bereich 
von 20 % der Nennkonzentration oder der gemessenen Ausgangs ­
konzentration aufrechterhalten werden konnte, können die Ergebnisse auch ausgehend von den Nennwerten bzw. von den gemessenen Ausgangswerten durchgeführt werden. Beträgt die Abweichung von 
der Nennkonzentration oder von der gemessenen Ausgangskonzen ­
tration mehr als 20 %, sollte bei der Analyse der Ergebnisse von der geometrischen mittleren Konzentration während der Expositions ­
dauer oder von Modellen ausgegangen werden, die den Rückgang 
der Prüfsubstanzkonzentration beschreiben (11).
 
1.7.11.  Limit-Test  
Unter gewissen Umständen, z. B. wenn ein vorläufiger Test darauf 
hindeutet, dass die Prüfsubstanz bei Konzentrationen bis zu 
100 mg · l  –1 bzw. bis zur Löslichkeitsgrenze im Prüfmedium (maß ­
geblich ist die jeweils niedrigere Konzentration) keine toxische Wir ­
kung hat, kann ein Limit-Test durchgeführt werden, in dem die 
Reaktionen einer Kontrollgruppe und einer Behandlungsgruppe 
(100 mg · l  –1 bzw. eine mit der Löslichkeitsgrenze identische Kon ­
zentration) verglichen werden. Es wird nachdrücklich empfohlen, diese Tests durch Analysen der Expositionskonzentration zu verifi ­
zieren. Alle oben beschriebenen Testbedingungen und Validitätskri ­
terien beziehen sich auf einen Limit-Test; allerdings sollte die An ­
zahl der behandelten Wiederholungen mindestens doppelt so hoch sein. Das Wachstum der Kontrollgruppe und der Behandlungsgruppe 
kann mit einem statistischen Test zum Vergleich der Mittelwerte 
analysiert werden (z. B. mit einem Student-Test).
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1219
 
2. DATEN UND ABSCHLUSSBERICHT  
2.1. VERDOPPLUNGSZEIT  
Um die Dauer bis zur Verdopplung der Frondzahl (T  d ) zu bestimmen 
und um sicherzustellen, dass dieses Validitätskriterium von der Stu ­
die erfüllt wird (siehe Abschnitt 1.6), ist mit den Daten der Kontroll ­
gefäße die folgende Gleichung zu berechnen:  
T d = ln 2/μ 
Dabei steht μ für die durchschnittliche spezifische Wachstumsrate, 
die bestimmt wurde, wie in Abschnitt 2.2.1 in Absatz 2 beschrieben.  
2.2. REAKTIONSVARIABLEN  
Mit der Prüfung sollen die Auswirkungen der Prüfsubstanz auf das 
vegetative Wachstum von  Lemna  bestimmt werden. Diese Prüf ­
methode beschreibt zwei Reaktionsvariablen, da in den Mitglieds ­
ländern unterschiedliche Präferenzen und rechtliche Anforderungen bestehen. Damit die Testergebnisse in allen Mitgliedsländern an ­
erkannt werden können, sollten die Auswirkungen mit Hilfe der 
beiden im Folgenden beschriebenen Reaktionsvariablen a) und b) 
beurteilt werden.
 
a) Durchschnittliche spezifische Wachstumsrate: Diese Reaktions ­
variable wird aufgrund von Veränderungen der Frondzahlen-Lo ­
garithmen sowie ausgehend von den Veränderungen der Logarith ­
men sonstiger Messparameter der Kontrollen und der einzelnen Behandlungsgruppen (gesamte Frondfläche, Trockengewicht oder Frischgewicht) während eines bestimmten Zeitraums (jeweils pro 
Tag ausgedrückt) berechnet. Gelegentlich wird diese Wachstums ­
rate auch als relative Wachstumsrate bezeichnet (15).
 
b) Zellertrag: Diese Reaktionsvariable wird ausgehend von Änderun ­
gen der Frondzahl sowie aufgrund von Änderungen anderer Messparameter der Kontrollen und der einzelnen Behandlungs ­
gruppen (gesamte Frondfläche, Trockengewicht oder Frisch ­
gewicht) bis zum Ende der Testdauer berechnet.
 
Es wird darauf hingewiesen, dass die mit diesen beiden Reaktions ­
variablen berechneten Toxizitätswerte nicht vergleichbar sind; der 
entsprechende Unterschied muss bei der Verwendung der Testergeb ­
nisse berücksichtigt werden. Die mit der durchschnittlichen spezi ­
fischen Wachstumsrate (E  r C x ) berechneten Werte für EC  x werden 
im Allgemeinen höher sein als die anhand des Zellertrags (E  y C x ) 
ermittelten Werte, wenn die für diese Testmethode vorgesehenen 
Bedingungen eingehalten werden; dies ist auf die unterschiedliche mathematische Grundlage der beiden Berechnungsverfahren zurück ­
zuführen. Die auftretenden Unterschiede sollten jedoch nicht als An ­
zeichen für eine unterschiedliche Empfindlichkeit der beiden Reakti ­
onsvariablen betrachtet werden; beide Werte sind einfach mathema ­
tisch verschieden. Das Konzept der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate beruht auf dem im Allgemeinen exponentiellen Ver ­
lauf des Wasserlinsenwachstums bei nicht beschränkten Kulturen, bei 
denen die Toxizität aufgrund der Auswirkungen auf die Wachstums ­
rate geschätzt wird, ohne jedoch von der absoluten Höhe der jewei ­
ligen Wachstumsrate der Kontrollprobe, von der Steigung der Kon ­
zentrations-Reaktionskurve oder von der Testdauer abhängig zu sein. 
Auf der Reaktionsvariable Zellertrag beruhende Ergebnisse hingegen hängen von allen übrigen genannten Variablen ab. E
 y C x ist von der 
spezifischen Wachstumsrate der in den einzelnen Tests verwendeten 
Wasserlinsenarten sowie von der maximalen spezifischen Wachs ­
tumsrate abhängig, die je nach Art sowie sogar zwischen den ein ­
zelnen Klonen unterschiedlich sein kann. Diese Reaktionsvariable sollte nicht verwendet werden, um die Empfindlichkeit von Algen ­
arten oder auch nur verschiedener Klone gegenüber Giftstoffen zu 
vergleichen. Die Verwendung der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate zur Schätzung der Toxizität wird in der Wissenschaft bevorzugt; bei dieser Prüfmethode werden jedoch auch Toxizitäts ­
schätzungen aufgrund des Zellertrags berücksichtigt, um den derzei ­
tigen rechtlichen Anforderungen einiger Länder Rechnung zu tragen.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1220
 
Toxizitätsschätzungen sollten auf der Frondzahl sowie auf einer wei ­
teren Messvariablen (gesamte Frondfläche, Trockengewicht oder 
Frischgewicht) beruhen, da sich manche Substanzen erheblich stärker auf andere Messvariablen auswirken können als die Frondzahl. Diese Auswirkungen würden nicht festgestellt, wenn ausschließlich die 
Frondzahl berechnet würde.
 
Die Anzahl der Fronds sowie alle sonstigen protokollierten Mess ­
variablen (gesamte Frondfläche, Trockengewicht oder Frischgewicht) 
werden zusammen mit den Konzentrationen der Prüfsubstanz für 
jede Messung tabellarisch zusammengestellt. Anschließende Daten ­
analysen z. B. zur Schätzung von LOEC-, NOEC- oder EC  x -Werten 
sollten auf den Werten der einzelnen Wiederholungen, nicht aber auf 
berechneten Mittelwerten der einzelnen Behandlungsgruppen beru ­
hen. 
2.2.1.  Durchschnittliche spezifische Wachstumsrate  
Die durchschnittliche spezifische Wachstumsrate in einem bestimm ­
ten Zeitraum wird als logarithmische Zunahme der Wachstumsvaria ­
blen (d. h. der Frondzahl und einer sonstigen Messvariablen (ge ­
samte Frondfläche, Trockengewicht oder Frischgewicht)) mit der nachstehenden Formel für die einzelnen Wiederholungen der Kon ­
trolllösungen und der behandelten Lösungen berechnet.
 
μ iÄj ¼ lnðN j Þ – lnðN i Þ 
t 
wobei  
— μ i-j : durchschnittliche spezifische Wachstumsrate vom 
Zeitpunkt i bis zum Zeitpunkt j  
— N  i : Messvariable im Prüfgefäß bzw. im Kontrollgefäß zum 
Zeitpunkt i  
— N  j : Messvariable im Prüfgefäß bzw. im Kontrollgefäß zum 
Zeitpunkt j  
— t: Zeitraum vom Zeitpunkt i bis zum Zeitpunkt j  
Für jede Behandlungsgruppe und für jede Kontrollgruppe sind die 
mittlere Wachstumsrate sowie die Varianzschätzungen zu berechnen.  
Die durchschnittliche spezifische Wachstumsrate sollte für die ge ­
samte Testdauer berechnet werden. (In der vorstehenden Formel be ­
zeichnet „i“ den Beginn des Tests und der Zeitpunkt „j“ das Ende des Tests.) Für alle Konzentrationen der Testlösungen und der Kon ­
trolllösungen sind ein Mittelwert für die durchschnittliche spezifische 
Wachstumsrate zu berechnen und die entsprechenden Varianzschät ­
zungen vorzunehmen. Außerdem sollte die abschnittsbezogene Wachstumsrate bestimmt werden, um die Auswirkungen der Prüf ­
substanz während der Expositionsdauer beurteilen zu können (z. B. 
durch Prüfung der logarithmisch transformierten Wachstumskurven). Erhebliche Unterschiede zwischen der abschnittsbezogenen Wachs ­
tumsrate und der durchschnittlichen Wachstumsrate deuten auf Ab ­
weichungen vom konstanten exponentiellen Wachstum hin und er ­
fordern eine genaue Überprüfung der Wachstumskurven. In diesem Fall würde ein vorsichtigerer Ansatz in einem Vergleich der spezi ­
fischen Wachstumsraten der behandelten Kulturen während der 
Dauer der maximalen Hemmung mit den spezifischen Wachstums ­
raten der Kontrolllösungen im selben Zeitraum bestehen.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1221
 
Die Hemmung der Wachstumsrate in Prozent (I  r ) kann anschließend 
für jede Testkonzentration (Behandlungsgruppe) nach der folgenden 
Formel berechnet werden:  
%I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100 
wobei  
— % I  r : Hemmung der durchschnittlichen spezifischen Wachs ­
tumsrate in Prozent  
— μ C : Mittelwert für μ der Kontrollgruppe  
— μ T : Mittelwert für μ der Behandlungsgruppe  
2.2.2.  Zellertrag  
Die Auswirkungen auf den Zellertrag werden ausgehend von zwei 
Messvariablen, d. h. der Frondzahl und einer sonstigen Messvaria ­
blen (der gesamten Frondfläche, dem Trockengewicht oder dem Frischgewicht) der jeweiligen Prüfgefäße am Anfang und am Ende des Tests bestimmt. Für das Trockengewicht und das Frischgewicht 
wird die Ausgangsbiomasse ausgehend von einer Frond-Probe aus 
dem betreffenden Batch bestimmt, aus der die Prüfgefäße geimpft wurden (siehe Abschnitt 1.7.3 Absatz 2). Für die Testkonzentratio ­
nen und für die Kontrolllösungen ist jeweils ein mittlerer Zellertrag 
zu berechnen; die Varianzen sind jeweils zu schätzen. Die prozen ­
tuale Hemmung des Zellertrags (% I
 y ) kann für die Behandlungs ­
gruppen wie folgt berechnet werden:  
%I y ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100 
wobei  
— % I  y : Verringerung des Zellertrags in Prozent,  
— b  C : Biomasse am Ende des Tests abzüglich der Biomasse 
der Kontrollgruppe am Anfang des Tests,  
— b  T : Biomasse am Ende des Tests abzüglich der Biomasse 
der Behandlungsgruppe am Anfang des Tests.  
2.2.3.  Darstellung der Konzentrations-Reaktionskurven  
Die Konzentrations-Reaktionskurven der mittleren Hemmung der 
Reaktionsvariablen in Prozent (I  r bzw. I  y berechnet gemäß der An ­
weisung im letzten Absatz in Abschnitt 2.2.1 bzw. gemäß der An ­
weisung in Abschnitt 2.2.2) und die logarithmische Konzentration 
der Prüfsubstanz sollten grafisch dargestellt werden.  
2.2.4.  Schätzung von EC  x 
Schätzungen der EC  x -Werte (z. B. EC  50 ) sollten sowohl auf der 
durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate (E  r C x ) als auch auf 
dem Zellertrag (E  y C x ) beruhen, und beide Werte sollten ihrerseits 
von der Frondzahl und von einer weiteren Messvariablen (gesamte Frondfläche, Trockengewicht oder Frischgewicht) ausgehen, weil sich manche Prüfsubstanzen in besonderer Weise auf die Frondzahl 
und sonstige Messvariablen auswirken. Die gewünschten Toxizitäts ­
parameter bestehen entsprechend aus vier EC
 x -Werten für alle be ­
rechneten Hemmkonzentrationen x: E  r C x (Frondzahl), E  r C x (gesamte 
Frondfläche, Trockengewicht oder Frischgewicht), E  y C x (Frondzahl), 
und E  y C x (gesamte Frondfläche, Trockengewicht oder Frisch ­
gewicht).  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1222
 
2.3. STATISTISCHE VERFAHREN  
Ziel ist die Ermittlung einer quantitativen Konzentrations-Reaktions ­
beziehung durch Regressionsanalyse. Im Anschluss an eine lineari ­
sierte Transformation der Reaktionsdaten (z. B. in Einheiten nach 
dem Probit-, Logit- oder Weibull-Modell) (16) kann eine gewichtete 
lineare Regression vorgenommen werden; nicht-lineare Regressions ­
verfahren, mit denen die unvermeidlichen Unregelmäßigkeiten der Daten und Abweichungen von gleichförmigen Verteilungen besser 
verarbeitet werden können, werden jedoch bevorzugt. Gegen null 
bzw. gegen die vollständige Hemmung können diese Unregelmäßig ­
keiten durch die Transformation vergrößert werden und die Analyse 
beeinträchtigen (16). Es wird darauf hingewiesen, dass Standard- 
Analysmethoden mit Probit-, Logit- oder Weibull-Transformationen für quantitative Daten (z. B. Mortalität oder Überlebensraten) vor ­
gesehen sind und zur Verwendung in Verbindung mit Wachstums- 
oder Zellertragsdaten entsprechend modifiziert werden müssen. Spe ­
zifische Verfahren zur Bestimmung von EC
 x -Werten aus kontinuier ­
lichen Daten sind den Quellen (17), (18) und (19) zu entnehmen.  
Für jede zu analysierende Reaktionsvariable sind aufgrund der Kon ­
zentrations-Reaktionsbeziehung Punktschätzungen für die EC  x -Werte 
zu ermitteln. Nach Möglichkeit sollten für jede Schätzung die 95%- Konfidenzintervalle bestimmt werden. Die Qualität der Übereinstim ­
mung der Reaktionsdaten mit dem Regressionsmodell sollte grafisch 
oder statistisch bewertet werden. Die Regressionsanalyse sollte mit den Reaktionen der einzelnen Wiederholungen (und nicht mit den Mittelwerten der Behandlungsgruppe) durchgeführt werden.
 
Schätzwerte für EC  50 und für die Konfidenzintervalle können auch 
durch lineare Interpolation mit einem Bootstrapping- Algorithmus (20) erzielt werden, wenn die verfügbaren 
Regressionsmodelle/-methoden für die betreffenden Daten nicht ge ­
eignet sind.
 
Für eine Schätzung der LOEC und entsprechend auch der NOEC 
müssen die Mittelwerte der behandelten Lösungen durch Varianzana ­
lyseverfahren (ANOVA) verglichen werden. Der Mittelwert der ein ­
zelnen Konzentrationen ist dann mit einer geeigneten Methode zur 
Durchführung von Mehrfachvergleichen bzw. zur Durchführung von 
Trendtests mit dem Mittelwert der Kontrollgruppe zu vergleichen. Dunnett- und Williams-Tests können hilfreich sein (21)(22)(23)(24). Die ANOVA-Annahme der Varianzhomogenität muss einer Über ­
prüfung unterzogen werden. Die entsprechende Bewertung kann an ­
hand einer grafischen Darstellung oder aufgrund eines formalen Tests vorgenommen werden (25). Geeignet sind Levene- und Bart ­
lett-Tests. Wenn die Annahme der Varianzhomogenität nicht erfüllt 
ist, kann gelegentlich eine Korrektur durch logarithmische Daten ­
transformation erfolgen. Bei außerordentlicher Varianzheterogenität, die durch Transformation nicht korrigiert werden kann, sollten Ana ­
lysen durch Methoden wie z. B. Jonckheere-Trendtests (Stepdown) 
erwogen werden. Weitere Hinweise zur Bestimmung von NOEC- 
Werten sind Quelle (19) zu entnehmen.
 
Aufgrund neuer Forschungsergebnisse wird empfohlen, das Konzept 
der NOEC aufzugeben und durch Punktschätzungen von EC  x -Werten 
zu ersetzen, die durch Regression ermittelt wurden. Für diesen  Lem­
na-Test wurde noch kein geeigneter Wert für x definiert. Ein Bereich 
von 10 bis 20 % scheint jedoch geeignet (abhängig von der aus ­
wählten Reaktionsvariablen); vorzugsweise sollten sowohl EC  10 als 
auch EC  20 protokolliert werden.  
3. ABSCHLUSSBERICHT  
3.1. PRÜFBERICHT  
Der Prüfbericht muss folgende Informationen enthalten:  
Prüfsubstanz:  
— physikalische Beschaffenheit und physikalisch-chemische Merk ­
male einschließlich der Wasserlöslichkeitsgrenze,  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1223
 
— chemische Kenndaten (z. B. CAS-Nummer) einschließlich der 
Reinheit.  
Im Test verwendete Art:  
— wissenschaftliche Bezeichnung, Klon (wenn bekannt) und Her ­
kunft.  
Prüfbedingungen:  
— verwendetes Testverfahren (statisch, semistatisch oder Durch ­
fluss),  
— Datum des Testbeginns und Dauer des Tests,  
— Prüfmedium,  
— Beschreibung des Prüfprotokolls: Prüfgefäße und Abdeckungen, 
Lösungsvolumina, Anzahl der Kolonien und Fronds pro Prüfge ­
fäß am Anfang des Tests,  
— Testkonzentrationen (Nennkonzentrationen bzw. gemessene Kon ­
zentrationen) und Anzahl der Wiederholungen pro Konzentration,  
— Methoden zur Herstellung von Stamm- und Testlösungen ein ­
schließlich der Verwendung von Lösungsmitteln und Dispergier ­
mitteln,  
— Temperatur während des Tests,  
— Lichtquelle, Lichtintensität und Homogenität des Lichts,  
— pH-Werte der Prüfmedien und der Kontrollmedien,  
— Prüfsubstanzkonzentrationen und Analysemethode mit geeigneten 
Daten zur Qualitätsbewertung (Validierungsstudien, Standard ­
abweichungen oder Konfidenzintervalle der Analysen),  
— Methoden zur Bestimmung der Frondzahl und sonstiger Mess ­
variablen (z. B. Trockengewicht, Frischgewicht oder Frondflä ­
che),  
— sämtliche Abweichungen von dieser Prüfmethode.  
Ergebnisse:  
— Ausgangsdaten: Anzahl der Fronds und sonstige Messvariablen 
der einzelnen Prüfgefäße und der Kontrollgefäße jeweils bei einer Beobachtung und Analyse,
 
— Mittelwerte und Standardabweichungen der einzelnen Messvaria ­
blen,  
— Wachstumskurven bei den verschiedenen Konzentrationen (mög ­
lichst mit logarithmisch transformierter Messvariable, siehe Abschnitt 2.2.1 Absatz 2),
 
— Verdopplungszeit/Wachstumsrate in der Kontrolllösung bezogen 
auf die Frondzahl,  
— berechnete Reaktionsvariablen für alle behandelten Wiederholun ­
gen mit Mittelwerten und dem Variationskoeffizienten für Wie ­
derholungen,  
— grafische Darstellung der Beziehung zwischen Konzentration und 
Wirkung,  
— Schätzungen der Endpunkte der Toxizität für die verschiedenen 
Reaktionsvariablen (z. B. EC  50 , EC  10 und EC  20 ) und entspre ­
chende Konfidenzintervalle; wenn berechnet, sind die LOEC 
und/oder die NOEC sowie die zur jeweiligen Berechnung ver ­
wendeten statistischen Methoden anzugeben,  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1224
 
— bei Durchführung von Varianzanalysen (ANOVA) der Umfang 
der nachzuweisenden Auswirkungen (z. B. geringster signifikan ­
ter Unterschied),  
— jegliche in behandelten Proben festgestellte Wachst ­
umsstimulation,  
— alle offensichtlichen Anzeichen einer Phytotoxizität sowie Be ­
obachtungen an den Testlösungen,  
— Diskussion der Ergebnisse einschließlich aller Auswirkungen auf 
das Testergebnis, die auf Abweichungen von dieser Prüfmethode 
zurückzuführen sind.  
4. LITERATUR  
1. OECD TG 221 (2006)  Lemna  Sp. Growth Inhibition Test.  
2. Die Nutzung von  Lemna -Studien für kolorierte Substanzen ist in 
Abschnitt 13.5.3 des EU-Handbuchs für Entscheidungen/ 
Beschlüsse vom Juli 2006 ausgeführt: http://ecb.jrc.ec.europa.eu/ 
new-chemicals.  
3. Guidance on information requirements and chemical safety as ­
sessment — Kapitel R.7b: Endpoint specific guidance; 
Tabelle 7.8.3: Summary of difficult substance testing issues, 
verfügbar unter  
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/ 
information_requirements_en.htm?time=1234958685#A  
4. ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reap ­
proved 1998). S. 733-742. Annual Book of ASTM Standards, 
Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotech ­
nology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.  
5. USEPA — United States Environmental Protection Agency. 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  
Lemna  spp., „Public draft“. EPA 712-C-96-156. 8pp.  
6. AFNOR — Association Française de Normalisation. (1996). XP 
T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de  
Lemna minor . 10pp.  
7. SSI — Swedish Standards Institute. (1995). Water quality — 
Determination of growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duck­
weed. SS 02 82 13. 15 S. (Schwedisch).  
8. Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Ma ­
crophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37-120 S.  
9. Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Eva ­
luation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.
 
10. Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD  Lemna  
Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft 
OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.
 
11. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental He ­
alth and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
 
12. ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) — Duckweed Growth Inhibition Test.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1225
 
13. Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor L .). Environmental Research Labora ­
tory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3-77 108. September 1977.
 
14. Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bio ­
assays with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of sprayed 
and dissolved glyphosate. Hydrobiologia 118/119, S. 353-359.  
15. Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the as ­
sessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxico ­
logy and Chemistry 12, S. 481-483.  
16. Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. 
Technol. 19, S. 713-718.  
17. Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, S. 157-167.
 
18. Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, S. 1485-1494.
 
19. OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
20. Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, MN.  
21. Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc. 50, S. 1096-1121.  
22. Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with 
a control. Biometrics, 20, 482-491.  
23. Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, S. 103-117.  
24. Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, S. 510-531.  
25. Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research 29, S. 93-96.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1226
 
Anlage 1  
Beschreibung Lemna spp.  
Die gemeinsprachlich als Wasserlinse ( Lemna  spp.) bezeichnete Wasserpflanze zählt 
zur Familie der  Lemnaceae , die weltweit in vier Gattungen mit verschiedenen Arten 
vorkommt. Das jeweilige Aussehen und die Taxonomie wurden umfassend 
dokumentiert (1)(2).  Lemna gibba  und L. minor  sind für gemäßigte Regionen typische 
Arten; diese Arten werden häufig in Toxizitätstests verwendet. Beide Arten besitzen einen treibenden oder auch untergetauchten Stängel (Frond); von der Mitte der Un ­
terseite der Fronds geht jeweils eine Wurzel aus.  Lemna  spp. bilden selten Blüten aus; 
die Pflanzen vermehren sich durch Austrieb neuer Fronds (3). Im Vergleich zu älteren 
Pflanzen sind jüngere Pflanzen eher blasser, besitzen kürzere Wurzeln und bestehen aus zwei bis drei Fronds unterschiedlicher Größe. Dank der geringen Größe, des einfachen Aufbaus, der geschlechtslosen Reproduktion und der kurzen Generations ­
dauer ist  Lemna  für Labortests in besonderer Weise geeignet (4)(5).
 
Da von unterschiedlichen Empfindlichkeiten der verschiedenen Arten auszugehen 
ist, sind ausschließlich Vergleiche der Empfindlichkeit jeweils einer einzigen Art annehmbar.
 
Beispiele für Lemna-Arten, die in Tests verwendet wurden: Artenreferenz  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, 
Stockholm University.  
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna  major as a 
function of intensity and duration of light. J. phys. Chem. 29, S. 935-941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft“. 
EPA 712-C-96-156. 8pp.  
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Dé ­
termination de l'inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10 S.  
Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of growth 
inhibition (7-d)  Lemna minor , duckweed. SS 02 82 13. 15 S. (Schwedisch).  
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). S. 733-742.  
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft“. EPA 
712-C-96-156. 8 S.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 10, S. 1959-1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf. 5, S. 87-96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assess ­
ment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem. 12, S. 481-483.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1227
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol. 19, 
S. 2102-2111.  
Bezugsquellen für Lemna-Arten  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria  
Department of Botany, University of Toronto  
Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2  
Tel: +1-416-978-3641  
Telefax:+1-416-978-5878  
E-Mail: jacreman@botany.utoronto.ca  
http://www.botany.utoronto.ca/utcc  
North Carolina State University  
Forestry Dept  
Duckweed Culture Collection  
Campus Box 8002  
Raleigh, NC 27695-8002  
United States  
Telefon 001 (919) 515-7572  
astomp@unity.ncsu.edu  
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University  
SE -106 91 Stockholm  
Schweden  
Tel: +46 8 674 7240  
+46 8 674 7636  
Umweltbundesamt (UBA)  
FG III 3.4  
Schichauweg 58  
12307 Berlin  
Deutschland  
E-Mail: Lemna@uba.de  
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm  
Literatur  
1. Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the 
descriptive and experimental literature. The Botanical Review 27 S. 221-287.  
2. Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland.  
3. Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human uti ­
lization of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82-991150-0-0. The Agri ­
cultural Research Council of Norway, University of Oslo.  
4. Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B 11, S. 1-14.  
5. Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52, S. 7-22.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1228
 
Anlage 2  
Haltung der Stammkultur  
Die Stammkulturen können über längere Zeiträume bei niedrigeren Temperaturen 
(4-10 °C) gebrauchsfähig gelagert werden. Das  Lemna -Nährmedium kann iden ­
tisch mit dem für die Tests verwendeten Nährmedium sein; für Stammkulturen 
können jedoch auch andere nährstoffreiche Medien verwendet werden.  
Regelmäßig wird eine gewisse Anzahl junger, hellgrüner Pflanzen entnommen 
und mit einem keimfreien Verfahren in neue Kulturgefäße mit einem frischen Medium gebracht. Unter den hier empfohlenen kühleren Bedingungen können in Intervallen von bis zu drei Monaten Teilkulturen hergestellt werden.
 
In den Prüfungen sollten chemische reine (mit Säure gereinigte) und sterile 
gläserne Kulturgefäße verwendet werden; die Handhabung sollte keimfrei erfol ­
gen. Bei einer Verunreinigung der Stammkultur (z. B. durch Algen oder Pilze) sind entsprechende Schritte zur Entfernung der verunreinigenden Organismen erforderlich. Algen und die meisten sonstigen verunreinigenden Organismen kön ­
nen durch eine Oberflächensterilisation entfernt werden. Von dem verunreinigten 
Pflanzenmaterial wird eine Probe genommen; von dem Material werden die Wurzeln abgeschnitten. Anschließend wird das Material heftig in sauberem Was ­
ser geschüttelt und dann 30 Sekunden bis 5 Minuten in eine 0,5%ige 
Natriumhypochloridlösung (v/v) getaucht. Danach wird das Pflanzenmaterial mit sterilem Wasser gespült und in mehreren Schritten in Kulturgefäße jeweils mit frischem Nährmedium gebracht. Bei dieser Behandlung werden viele Fronds 
sterben, besonders bei längerer Expositionsdauer; einige der überlebenden Fronds 
sollten jedoch frei von Verunreinigungen sein. Diese Fronds können dann zur Impfung neuer Kulturen verwendet werden.
 ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1229
 
Anlage 3  
Medien  
Für L. minor  und  L. gibba  werden unterschiedliche Nährmedien empfohlen. Für  
L. minor  sollte ein modifiziertes schwedisches Standardmedium (SIS) verwendet 
werden; für  L. gibba  ist das Medium 20X AAP zu empfehlen. Die Zusammenset ­
zungen beider Medien werden im Folgenden beschrieben. Bei der Herstellung 
dieser Medien sollten chemische Stoffe in Reagenzien- oder Analysequalität und entionisiertes Wasser verwendet werden.
 
Schwedisches Standard- Lemna -Nährmedium (SIS)  
— Die Stammlösungen I-V werden durch Autoklavieren (120 °C, 15 Minuten) 
oder durch Membranfiltration (Porengröße ca. 0,2 μm) sterilisiert.  
— Die Stammlösung VI (sowie optional Stammlösung VII) ist ausschließlich 
durch Membranfiltration zu sterilisieren; diese Lösungen sollten nicht auto ­
klaviert werden.  
— Sterile Stammlösungen sollten kühl und dunkel gelagert werden. Die Stamm ­
lösungen I-V sollten nach sechs Monaten entsorgt werden; die 
Stammlösung VI (sowie optional Stammlösung VII) kann einen Monat gela ­
gert werden.  
Stammlösung 
Nr. Substanz Konzentration in 
der Stammlösung 
(g· l  –1 ) Konzentration im 
hergestellten Me ­
dium (mg·l  –1 ) Hergestelltes Medium 
Element Konzentration 
(mg·l  –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 
0,010 1,00 
0,20 
0,010 
0,050 0,0050 
0,010 B 
Mn 
Mo 
Zn Cu 
Co 0,17 
0,056 
0,0040 
0,011 0,0013 
0,0020 
VI FeCl
 3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (Puffer) 490 490 — —  
— Um einen Liter SIS-Medium herzustellen, werden die folgenden Inhaltsstoffe 
zu 900 ml entionisiertem Wasser hinzugegeben:  
— 10 ml Stammlösung I  
— 5 ml Stammlösung II  
— 5 ml Stammlösung III  
— 5 ml Stammlösung IV  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1230
 
— 1 ml Stammlösung V  
— 5 ml Stammlösung VI  
— 1 ml Stammlösung VII (optional)  
Hinweis:  Bei bestimmten Prüfsubstanzen kann eine weitere Stammlösung VII (MOPS- 
Pufferlösung) erforderlich sein (siehe Abschnitt 1.4 letzter Absatz).  
— Der pH-Wert wird wahlweise mit 0,1 oder 1 mol HCl oder NaOH auf 6,5 
± 0,2 eingestellt; durch Hinzugabe von entionisiertem Wasser wird ein Vo ­
lumen von einem Liter hergestellt.  
Nährmedium 20X AAP  
Die Stammlösungen werden in sterilem destilliertem oder entionisiertem Wasser 
hergestellt.  
Sterile Stammlösungen sollten kühl und dunkel gelagert werden. Unter diesen 
Bedingungen beträgt die Lagerfähigkeit der Stammlösungen mindestens 6-8 Wo ­
chen.  
Für das Medium 20X AAP werden fünf Stamm-Nährlösungen (A1, A2, A3, B 
und C) hergestellt; dabei sind chemische Stoffe mit Reagenzienqualität zu ver ­
wenden. Jeweils 20 ml der Stamm-Nährlösungen werden zu etwa 850 ml entio ­
nisiertem Wasser hinzugegeben, um das Nährmedium herzustellen. Der pH-Wert 
wird wahlweise mit 0,1 oder 1 mol HCl oder NaOH auf 7,5 ± 0,1 eingestellt; 
durch Hinzugabe von entionisiertem Wasser wird ein Volumen von einem Liter hergestellt. Anschließend wird das Medium durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von (etwa) 0,2 μm in einen sterilen Behälter gefiltert.
 
Das für die Prüfung vorgesehene Nährmedium sollte 1-2 Tage vor der Verwen ­
dung hergestellt werden, damit sich der pH-Wert stabilisieren kann. Der pH-Wert des Nährmediums sollte vor der Verwendung geprüft und ggf. durch Zugabe von 0,1 oder 1 M NaOH oder HCl wie oben beschrieben korrigiert werden.
 
Stammlösung 
Nr. Substanz Konzentration in 
der Stammlösung 
(g·l –1 ) (*) Konzentration im 
hergestellten Me ­
dium (mg·l  –1 ) (*) Hergestelltes Medium 
Element Konzentration 
(mg·l  –1 ) (*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24.04 
A2 MgSO
 4 ·7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 ·3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4;3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 0,19 
0,42 
0,16 
0,30 3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 
3,2 
6,0 66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn 
Fe 
— Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 
0,66 
— 31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) Wenn nicht anders angegeben.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1231
 
Fußnote: Die theoretisch geeignete Bicarbonat-Endkonzentration (bei der eine nennenswerte 
Anpassung des pH-Werts nicht erforderlich ist) liegt bei 15 mg/l (und nicht bei 
300 mg/l). Trotzdem wird das Medium 20X-AAP — auch im Ringtest dieser Methode — in einer Konzentration von 300 mg/l verwendet. (I. Sims, P. White ­
house and R. Lacey. (1999) The OECD  Lemna  Growth Inhibition Test. Develop ­
ment and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report 
EMA 003. WRc plc — Environment Agency.
 
STEINBERG-Medium (nach ISO 20079)  
Konzentrationen und Stammlösungen  
— Das modifizierte Steinberg-Medium ist in ISO 20079 nur für  Lemna minor  
vorgesehen (da dort ausschließlich  Lemna minor  zugelassen wird); in Tests 
wurden gute Ergebnisse aber auch mit  Lemna gibba  erzielt.  
— Bei der Herstellung des Mediums sollten chemische Stoffe in Reagenzien- 
oder Analysequalität und entionisiertes Wasser verwendet werden.  
— Das Nährmedium ist aus Stammlösungen oder aus dem 10fach konzentrierten 
Medium herzustellen, damit ohne Ausfällungen eine größtmögliche Konzen ­
tration des Mediums erzielt werden kann.  
Tabelle 1  
STEINBERG-Medium mit stabilisiertem pH-Wert (modifiziert nach Altenburger)  
Substanz Nährmedium  
Makroelemente  Molmasse mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Mikroelemente  Molmasse μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
EDTA-Dinatrium-Dihydrat 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1232
 
Tabelle 2  
Stammlösungen (Makroelemente)  
1. Makroelemente (50fach konzentriert)  g/l  
Stammlösung 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Stammlösung 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Stammlösung 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Tabelle 3  
Stammlösungen (Mikroelemente)  
2. Mikroelemente (1 000fach konzentriert)  mg/l  
Stammlösung 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Stammlösung 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Stammlösung 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Stammlösung 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Stammlösung 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00 
EDTA-Dinatrium-Dihydrat 1 500,00  
— Die Stammlösungen 2 und 3 sowie getrennt auch die Stammlösungen 4 bis 7 
können zusammengefasst werden. (Dabei sind die jeweils erforderlichen Kon ­
zentrationen zu berücksichtigen.)  
— Um die Lagerfähigkeit zu verlängern, sind die Stammlösungen 20 Minuten 
bei 121 °C zu autoklavieren oder einer Sterilfiltration (Porengröße 0,2 μm) zu 
unterziehen. Für die Stammlösung 8 wird eine Sterilfiltration (0,2 μm) nach­
drücklich empfohlen.  
Herstellung der Endkonzentration des STEINBERG-Mediums (modifiziert)  
— 20 ml der Stammlösungen 1, 2 und 3 (siehe Tabelle 2) sind etwa 900 ml 
entionisiertes Wasser zuzugeben, um eine Ausfällung zu vermeiden.  
— 1,0 ml der Stammlösungen 4, 5, 6, 7 und 8 werden hinzugegeben (siehe 
Tabelle 3).  
— Der pH-Wert sollte auf 5,5 ± 0,2 eingestellt werden (durch Zugabe eines 
minimalen Volumens einer NaOH- oder HCl-Lösung).  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1233
 
— Anschließend sind die Lösungen mit Wasser auf ein Volumen von 1 000 ml 
aufzufüllen.  
— Wenn die Stammlösungen sterilisiert werden und geeignetes Wasser verwen ­
det wird, ist eine weitere Sterilisierung nicht mehr erforderlich. Wird das endgültige Medium sterilisiert, sollte die Stammlösung 8 nach dem Autokla ­
vieren (20 Minuten bei 121 °C) hinzugegeben werden.
 
Herstellung des 10fach konzentrierten STEINBERG-Mediums (modifiziert) 
zur Zwischenlagerung  
— 20 ml der Stammlösungen 1, 2 und 3 (siehe Tabelle 2) sind etwa 30 ml 
entionisiertes Wasser zuzugeben, um eine Ausfällung zu vermeiden.  
— 1,0 ml der Stammlösungen 4, 5, 6, 7 und 8 werden hinzugegeben (siehe 
Tabelle 3). Anschließend sind die Lösungen mit Wasser auf ein Volumen 
von 100 ml aufzufüllen.  
— Wenn die Stammlösungen sterilisiert werden und geeignetes Wasser verwen ­
det wird, ist eine weitere Sterilisierung nicht mehr erforderlich. Wird das 
endgültige Medium sterilisiert, sollte die Stammlösung 8 nach dem Autokla ­
vieren (20 Minuten bei 121 °C) hinzugegeben werden.  
— Der pH-Wert des Mediums sollte in der Endkonzentration 5,5 ± 0,2 betragen.  ▼M1 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1234
 
C.27  CHIRONOMIDEN-TOXIZITÄTSTEST IN SEDIMENT-WASSER- 
SYSTEMEN MIT GESPIKTEM SEDIMENT  
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 218 (2004). Sie 
dient der Bewertung der Wirkung einer Langzeitexposition gegenüber Che ­
mikalien auf die sedimentbewohnenden Larven von  Chironomus  sp., einem 
in Frischwasser lebenden Zweiflügler. Die Methode basiert auf bestehenden Protokollen für Toxizitätstests mit  Chironomus riparius  und  Chironomus 
tentans , die in Europa (1)(2)(3) und Nordamerika (4)(5)(6)(7)(8) entwickelt 
und Ringtests (1)(6)(9) unterzogen wurden. Auch andere gut dokumentierte 
Chironomid-Arten wie  Chironomus yoshimatsui  (10)(11) sind geeignet.
 
2. Bei dem für diese Prüfmethode verwendeten Expositionsszenario wird das 
Sediment mit der Prüfsubstanz gespikt. Die Wahl des Szenarios hängt vom jeweiligen Testziel ab. Durch Dotieren (Spiken) des Sediments soll die Akkumulation von persistenten Chemikalien im Sediment simuliert werden. 
Dieser Vorgang erfolgt in einem Sediment-Wasser-System.
 
3. In der Regel haben die an sedimentbewohnenden Organismen zu testenden 
Substanzen eine lange Verweildauer in diesem Kompartiment. Sedimentbe ­
wohner können über verschiedene Wege exponiert werden. Die relative Bedeutung der einzelnen Expositionspfade und die Geschwindigkeit, mit der diese jeweils zu den gesamten toxischen Wirkungen beitragen, hängen 
von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der betreffenden Substanz 
ab. Für stark adsorbierende Substanzen (z. B. log K
 ow > 5) oder für kovalent 
an das Sediment gebundene Substanzen kann die Aufnahme von Schad ­
stoffen über die Nahrung einen wichtigen Expositionspfad darstellen. Die 
Toxizität hoch lipophiler Substanzen sollte nicht unterschätzt werden, wes ­
halb gegebenenfalls vor Applikation der Prüfsubstanz dem Sediment Futter hinzugegeben werden sollte. Um alle potenziellen Expositionspfade zu be ­
rücksichtigen, liegt der Schwerpunkt bei dieser Prüfmethode auf der Lang ­
zeitexposition. Die Testdauer beträgt 20 bis 28 Tage für  C. riparius  und C. 
yoshimatsui  und 28 bis 65 Tage für  C. tentans . Falls aus einem besonderen 
Grund, z. B. zur Untersuchung der Wirkungen von instabilen Chemikalien, Kurzzeitdaten benötigt werden, können nach dem 10. Versuchstag zusätzli ­
che Replikate entnommen werden.
 
4. Als Endpunkte werden die Gesamtzahl der geschlüpften Imagines und die 
Emergenzzeit gemessen. Falls zusätzlich Kurzzeitdaten benötigt werden, sollten die Messungen der Überlebensrate und des Wachstums der Larven erst nach dem 10. Tag gegebenenfalls anhand zusätzlicher Replikate vor ­
genommen werden.
 
5. Es wird empfohlen, formuliertes Sediment zu verwenden, da es gegenüber 
natürlichen Sedimenten mehrere Vorteile hat:  
— Die Variabilität zwischen den Versuchen ist nicht so groß, da formu ­
liertes Sediment eine reproduzierbare „standardisierte Matrix“ ergibt und 
es nicht erforderlich ist, Quellen für unkontaminiertes, sauberes Sedi ­
ment ausfindig zu machen;  
— es kann jederzeit mit den Versuchen begonnen werden, ohne durch 
jahreszeitliche Schwankungen gestört zu werden und ohne dass eine Vorbehandlung zur Defaunierung des Sediments erforderlich wäre; die 
Verwendung von formuliertem Sediment reduziert auch die Kosten, die 
bei Feldprobenahmen ausreichender Sedimentmengen für Routineprü ­
fungen anfallen;
 
— die Verwendung formulierter Sedimente ermöglicht Toxizitätsvergleiche 
und die entsprechende Einstufung der Substanzen.  
6. Die verwendeten Begriffe sind in Anlage 1 definiert.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1235
 
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
7. Chironomidlarven des 1. Larvenstadiums (L1-Larven) werden gegenüber der 
Prüfsubstanz in verschiedenen Konzentrationen in Sediment-Wasser-Syste ­
men exponiert. Das Sediment wird mit der Prüfsubstanz dotiert (gespikt); 
anschließend werden L1-Larven in Bechergläser mit stabilisierten Sediment- 
und Wasserkonzentrationen eingesetzt. Zum Versuchsende werden Emer ­
genz und Entwicklungsrate der Chironomiden bestimmt. Sofern erforderlich, können (gegebenenfalls anhand zusätzlicher Replikate) nach 10 Tagen Mes ­
sungen der Überlebensrate und des Gewichts der Larven vorgenommen 
werden. Analysiert werden diese Daten entweder anhand eines Regressions ­
modells, um die Konzentration zu ermitteln, die zu einer ×-%igen Verrin ­
gerung der Emergenz-, Überlebens- oder Wachstumsrate der Larven führt (z. 
B. EC
 15 , EC  50 usw.), oder anhand statistischer Hypothesentests zur Bestim ­
mung von NOEC/LOEC-Werten. Hierzu sind die Wirkungswerte anhand statistischer Tests mit Kontrollwerten zu vergleichen.
 
ANGABEN ZUR PRÜFSUBSTANZ  
8. Wasserlöslichkeit und Dampfdruck der Prüfsubstanz, ihre gemessene oder 
berechnete Verteilung im Sediment sowie ihre Stabilität im Wasser und im Sediment sollten bekannt sein. Ein zuverlässiges Analyseverfahren für die Quantifizierung der Prüfsubstanz im Überstandswasser, Porenwasser und 
Sediment mit bekannter und dokumentierter Genauigkeit und Nachweis ­
grenze sollte vorhanden sein. Weitere nützliche Informationen sind die Strukturformel und der Reinheitsgrad der Prüfsubstanz sowie das chemische Schicksal der Prüfsubstanz (z. B. Verlustrate, abiotischer und biotischer 
Abbau usw.). Weitere Hinweise zu Prüfsubstanzen mit 
physikalisch-chemischen Merkmalen, welche die Durchführung des Tests erschweren, sind Quelle (12) zu entnehmen.
 
REFERENZSUBSTANZEN  
9. Referenzsubstanzen können regelmäßig getestet werden, um auf diese Weise 
die Zuverlässigkeit des Prüfprotokolls und der Prüfbedingungen zu gewähr ­
leisten. Beispiele von Referenzgiftstoffen, die erfolgreich in Ringtests und Validierungsstudien verwendet werden: Lindan, Trifluralin, Pentachlorphe ­
nol, Cadmiumchlorid und Kaliumchlorid (1)(2)(5)(6)(13).
 
GÜLTIGKEIT DER ERGEBNISSE  
10. Der Test ist gültig, wenn folgende Bedingungen erfüllt sind:  
— Die Emergenz in den Kontrollen muss am Ende des Tests mindestens 
70 % betragen. (1)(6);  
— erste Imagines von  C. riparius  und C. yoshimatsui  sollten zwischen dem 
12. und dem 23. Tag nach dem Einsetzen der Tiere in die Prüfgefäße 
schlüpfen; für  C. tentans  sind 20 bis 65 Tage erforderlich;  
— zum Versuchsende sind der pH-Wert und die Konzentration an gelöstem 
Sauerstoff zu messen. Der Sauerstoffgehalt sollte mindestens 60 % des 
Luftsauerstoff-Sättigungswertes betragen und der pH-Wert des Über ­
standswassers sollte in allen Prüfgefäßen zwischen 6 und 9 liegen;  
— die Wassertemperatur sollte nicht mehr als ±1,0 °C schwanken; sie kann 
mit Hilfe einer Klimakammer kontrolliert werden, wobei in diesem Fall 
die Raumtemperatur in angemessenen Zeitabständen zu bestimmen ist.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1236
 
BESCHREIBUNG DER METHODE  
Prüfgefäße  
11. Der Versuch wird in 600-ml-Glasbechergläsern mit einem Durchmesser von 
8 cm durchgeführt. Andere Gefäße sind ebenfalls geeignet, sofern sie eine entsprechende Höhe von Überstandswasser und Sediment fassen. Die Sedi ­
mentoberfläche sollte 2 bis 3 cm
 2 pro Larve bieten. Das Verhältnis zwischen 
Sedimentschicht und Überstandswasser sollte 1:4 betragen. Die Prüfgefäße 
und sonstigen Geräte, die mit dem Prüfsystem in Kontakt kommen, müssen vollständig aus Glas oder einem anderen chemisch inerten Material (z. B. Teflon) bestehen.
 
Wahl der Testspezies  
12. Als Testspezies sollte bevorzugt  Chironomus riparius  eingesetzt werden.  
Chironomus tentans  ist ebenfalls geeignet, lässt sich aber schwieriger hand ­
haben und erfordert eine längere Prüfdauer. Auch  Chironomus yohimatsui  
kann verwendet werden. Einzelheiten zu den Anzuchtverfahren für  Chiro­
nomus riparius  sind in Anlage 2 enthalten. Informationen zu den Anzucht ­
bedingungen sind auch für andere Arten ( Chironomus tentans  (4) und  Chi­
ronomus yoshimatsui  (11)) verfügbar. Die Identität der Spezies ist vor der 
Prüfung zu bestätigen, allerdings ist dies nicht vor jedem Test erforderlich, 
wenn die Organismen aus laboreigener Zucht stammen.  
Sediment  
13. Vorzugsweise ist formuliertes Sediment (so genanntes rekonstituiertes, 
künstliches oder synthetisches Sediment) zu verwenden. Wenn jedoch na ­
türliches Sediment verwendet wird, so ist es zu charakterisieren (zumindest 
pH-Wert und Gehalt an organischem Kohlenstoff; die Bestimmung sonstiger 
Parameter wie C/N-Verhältnis und Granulometrie wird ebenfalls empfoh ­
len). Auch sollte es frei von Verunreinigungen sowie Konkurrenten und Fressfeinden der Chironomiden sein. Ferner wird empfohlen, natürliches 
Sediment vor seiner Verwendung in einem Chironomiden-Toxizitätstest 
für sieben Tage unter denselben Bedingungen, wie sie im anschließenden Test herrschen, zu konditionieren. Für diesen Test wird auf der Grundlage der in der Prüfmethode C.8 (14) verwendeten Kunsterde folgendes formu ­
liertes Sediment empfohlen (1)(15)(16):
 
a) 4-5 % (bezogen auf die Trockenmasse) Torf: so nahe wie möglich bei 
pH 5,5 bis 6,0; wichtig: Torf in Pulverform, feingemahlen (Partikelgröße 
≤ 1 mm) und nur luftgetrocknet, verwenden;  
b) 20 % (bezogen auf die Trockenmasse) Kaolin-Ton (Kaolingehalt vor ­
zugsweise über 30 %);  
c) 75-76 % (bezogen auf die Trockenmasse) Quarzsand (hauptsächlich 
Feinsand, der zu mehr als 50 % eine Korngröße von 50 bis 200 μm 
aufweist);  
d) der Feuchtegehalt der fertigen Mischung wird durch die Zugabe von 
entionisiertem Wasser auf einen Wert zwischen 30 % und 50 % einge ­
stellt;  
e) durch die Zugabe von chemisch reinem Calciumcarbonat (CaCO  3 ) wird 
die fertige Mischung des Sediments auf einen pH-Wert von 7,0 ± 0,5 eingestellt. Der Gehalt der fertigen Mischung an organischem Kohlen ­
stoff sollte 2 % (± 0,5 %) betragen und ist durch Zugabe geeigneter 
Mengen Torf und Sand (siehe Buchstaben a und c) zu gewährleisten.
 
14. Die Herkunft von Torf, Kaolin-Ton und Sand sollte bekannt sein. Es sollte 
kontrolliert werden, dass die Bestandteile des Sediments nicht chemisch verunreinigt sind (z. B. durch Schwermetalle, chlororganische Verbindun ­
gen, phosphororganische Verbindungen usw.). Ein Beispiel für die Herstel ­
lung des formulierten Sediments ist in Anlage 3 beschrieben. Die Bestand ­
teile können auch in trockenem Zustand gemischt werden, sofern nach ­
gewiesen ist, dass es nach Zugabe des Überstandswassers nicht zu einer 
Auftrennung der Sedimentbestandteile kommt (z. B. schwimmende Torfpar ­
tikel) und dass der Torf oder das Sediment ausreichend konditioniert ist.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1237
 
Wasser  
15. Alle Wassersorten, die den chemischen Eigenschaften von zugelassenem 
Verdünnungswasser gemäß den Anlagen 2 und 4 entsprechen, sind als Test ­
wasser geeignet. Natürliches Wasser (Oberflächen- oder Grundwasser), re ­
konstituiertes Wasser (siehe Anlage 2) oder entchlortes Leitungswasser sind 
als Hälterungs- und Verdünnungswasser zulässig, wenn die Chironomiden hierin während der Zucht- und Testphase ohne Stressanzeichen überleben. Zu Testbeginn sollte der pH-Wert des Testwassers zwischen 6 und 9 liegen 
und die Gesamthärte des Wassers sollte nicht mehr als 400 mg/l (in CaCO
 3 ) 
betragen. Wird jedoch ein Ionenaustausch zwischen den Härteionen und der Prüfsubstanz vermutet, ist Wasser geringerer Härte zu verwenden (und somit 
in diesem Fall das Elendt-Medium M4 zu vermeiden). Das Wasser muss 
über die gesamte Testdauer von gleichbleibender Qualität sein. Die Quali ­
tätsparameter des Wassers gemäß Anlage 4 sind mindestens zweimal jähr ­
lich bzw. immer dann zu messen, wenn der Verdacht besteht, dass sie sich 
erheblich verändert haben.
 
Stammlösungen — Gespikte Sedimente  
16. Die gespikten Sedimente der gewünschten Konzentration werden in der 
Regel zubereitet, indem eine Lösung der Prüfsubstanz direkt in das Sedi ­
ment gegeben wird. Eine Stammlösung der in entionisiertem Wasser gelös ­
ten Prüfsubstanz wird mit Hilfe eines Walzwerks oder Futtermischers oder per Hand mit dem formulierten Sediment gemischt. Wenn die Prüfsubstanz im Wasser schwer löslich ist, kann sie in dem kleinstmöglichen Volumen 
eines geeigneten organischen Lösungsmittels (z. B. Hexan, Aceton oder 
Chloroform) gelöst werden. Diese Lösung wird anschließend mit 10 g fei ­
nem Quarzsand je Prüfgefäß gemischt. Nach vollständigem Abdampfen des 
Lösungsmittels aus dem Sand wird dieser mit einer geeigneten Menge Se ­
diment pro Prüfgefäß gemischt. Um die Prüfsubstanz zu lösen, zu disper ­
gieren oder zu emulgieren, dürfen nur sich leicht verflüchtigende Lösungs ­
mittel verwendet werden. Bei der Zubereitung des Sediments ist die in der 
Mischung von Prüfsubstanz und Sand enthaltene Sandmenge zu berücksich ­
tigen (d. h. das Sediment sollte mit weniger Sand zubereitet werden). Es ist darauf zu achten, dass die Prüfsubstanz mit dem Sediment gut durchmischt wird, damit sie in dem Sediment homogen verteilt ist. Gegebenenfalls kön ­
nen Teilproben analysiert werden, um den Homogenitätsgrad zu bestimmen.
 
VERSUCHSAUFBAU  
17. Unter „Versuchsaufbau“ sind die gewählte Anzahl und der Abstand der 
Testkonzentrationen, die Anzahl der Prüfgefäße je Konzentration und die 
Anzahl der Larven je Gefäß zu verstehen. Beschrieben werden die Ver ­
fahren für die Bestimmung der EC-Werte und der NOEC-Werte und für die Durchführung eines Limit-Tests.
 
Versuchsaufbau für die Regressionsanalyse  
18. Die im Test verwendeten Konzentrationen müssen in jedem Fall die Wir ­
kungskonzentration (z. B. EC  15 , EC  50 ) und den Konzentrationsbereich, in 
dem die Wirkung der Prüfsubstanz von Interesse ist, einschließen. Bei der 
Bestimmung von Wirkungskonzentrationen (EC  x ) wird in der Regel eine 
größere Genauigkeit und insbesondere Validität erzielt, wenn die Wirkungs ­
konzentration im Bereich der getesten Konzentrationen liegt. Extrapolierun ­
gen weit unter der niedrigsten positiven Konzentration oder über der höchs ­
ten Konzentration sind zu vermeiden. Ein Vorversuch kann die Auswahl der 
zu verwendenden Konzentrationsspanne erleichtern (siehe Nummer 27).  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1238
 
19. Für die Bestimmung von EC  x sollten mindestens fünf Konzentrationen und 
drei Replikate jeder Konzentration getestet werden. Im Interesse einer an ­
gemessenen Modellierung ist es in jedem Fall ratsam, eine hinreichende Anzahl an Konzentrationen zu testen. Die Konzentrationen sollten sich um einen Faktor von nicht mehr als 2 unterscheiden (außer bei einer schwa ­
chen Steigung der Dosis-Wirkungs-Kurve). Die Anzahl der Replikate pro 
Behandlung kann reduziert werden, wenn die Anzahl der Prüfkonzentratio ­
nen mit unterschiedlicher Wirkung erhöht wird. Eine höhere Anzahl an Replikaten oder eine Verkürzung der Intervalle zwischen den Prüfkonzen ­
trationen führt tendenziell zu engeren Konfidenzintervallen für den Test. Zur 
Bestimmung der Überlebensrate und des Wachstums der Larven nach 10 Tagen sind zusätzliche Replikate erforderlich.
 
Versuchsaufbau für die Bestimmung von NOEC/LOEC-Werten  
20. Zur Bestimmung von LOEC- oder NOEC-Werten sollten fünf Prüfkonzen ­
trationen mit mindestens vier Replikaten pro Konzentration verwendet wer ­
den, wobei sich die Konzentrationen um einen Faktor von nicht mehr als 2 unterscheiden sollten. Es sollten so viele Replikate verwendet werden, dass sich im Hinblick auf eine angemessene statistische Aussagekraft bei einem 
Signifikanzniveau von 5 % (p = 0,05) eine Differenz von 20 % zur Kon ­
trollkonzentration nachweisen lässt. Für die Entwicklungsrate eignen sich in der Regel Varianzanalysen (ANOVA) wie der Dunnett-Test und der Williams-Test (17)(18)(19)(20). Für die Schlupfrate kann der 
Cochran-Armitage-Test, der Exakte Test nach Fisher (mit 
Bonferroni-Korrektur) oder der Mantel-Haenszel-Test herangezogen werden.
 
Limit-Test  
21. Falls der Vorversuch keine Wirkungen zeigt, kann ein Limit-Test (mit je 
einer Prüfkonzentration und einer Kontrolle) durchgeführt werden. Der 
Limit-Test wird mit einer Konzentration durchgeführt, die hoch genug ist, dass Entscheidungsträger jegliche möglichen toxischen Wirkungen der Prüf ­
substanz ausschließen können; dabei wird das Limit auf einen Konzentrati ­
onswert festgesetzt, der unter realen Bedingungen nicht erreicht werden 
dürfte. Empfohlen wird eine Konzentration von 1 000 mg/kg (Trockenge ­
wicht). In der Regel sind jeweils mindestens sechs Replikate pro Behand ­
lung und pro Kontrolle erforderlich. Es ist nachzuweisen, dass die statisti ­
sche Aussagekraft ausreicht, um bei einem Signifikanzniveau von 5 % (p = 
0,05) eine Differenz von 20 % zur Kontrollkonzentration festzustellen. Für metrische Merkmale (Entwicklungsrate und Gewicht) ist der t-Test eine geeignete statistische Methode, sofern die Daten die Bedingungen für diesen 
Test (Normalverteilung, Varianzhomogenität) erfüllen. Sind diese Bedingun ­
gen nicht erfüllt, so kann ein t-Test für ungleiche Varianzen oder ein nicht-parametrischer Test wie der Wilcoxon-Mann-Whithey-Test verwendet werden. Für die Schlupfrate eignet sich der Exakte Test nach Fisher.
 
PRÜFVERFAHREN  
Expositionsbedingungen  
Zubereitung des Sediment-Wasser-Systems mit gespiktem Sediment  
22. Für die Applikation der Prüfsubstanz wird das in der Prüfmethode C.8: 
Toxizität für Regenwürmer‘ beschriebene Spiking-Verfahren empfohlen 
(14). Gespiktes Sediment wird in die Prüfgefäße gefüllt und anschließend mit Wasser überschichtet, bis ein Verhältnis von Sediment zu Wasser von 1:4 erreicht ist (siehe Nummern 11 und 15). Die Sedimentschicht sollte 1,5 
bis 3 cm dick sein. Um zu verhindern, dass es während der Zugabe von 
Prüfwasser in die Wassersäule zu einer Auftrennung der Sedimentbestand ­
teile und einer Resuspension der feinen Partikel kommt, kann das Sediment beim Einfüllen des Wassers mit einer Plastikschale abgedeckt werden, die 
anschließend sofort entfernt wird. Andere Hilfsmittel sind ebenfalls geeignet.
 
23. Die Prüfgefäße sollten abgedeckt werden (z. B. mit Glasplatten). Etwaige 
Verdunstungsverluste im Laufe des Versuchs sind auszugleichen, und zwar 
mit destilliertem oder entionisiertem Wasser, um Salzfreiheit zu gewährleis ­
ten. ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1239
 
Stabilisierung  
24. Nach Fertigstellung des gespikten Sediments mit dem überschichteten Was ­
ser ist abzuwarten, bis sich die Prüfsubstanz zwischen Wasserphase und Sediment verteilt hat (3)(4)(6)(13). Dies sollte bevorzugt unter denselben 
Temperatur- und Belüftungsbedingungen wie im Versuch erfolgen. Die er ­
forderliche Zeit für die Einstellung des Gleichgewichts hängt vom Sediment und der Chemikalie ab. In einigen Fällen reichen ein paar Stunden oder Tage, in selten Fällen können sogar mehrere Wochen (4 bis 5 Wochen) 
erforderlich sein. Es sollte nicht abgewartet werden, bis die Gleichgewichts ­
einstellung abgeschlossen ist, da es in dieser Zeit bei vielen Chemikalien zu Abbauprozessen kommen kann, aber eine Wartezeit von 48 Std. wird emp ­
fohlen. Am Ende dieser Gleichgewichtseinstellungszeit wird die Konzentra ­
tion der Prüfsubstanz im Überstandswasser, Porenwasser und Sediment ge ­
messen, zumindest die Höchstkonzentration und eine niedrigere Konzentra ­
tion (siehe Nummer 38). Diese analytischen Bestimmungen der Prüfsubstanz 
ermöglichen es, die Massenbilanz zu berechnen und die Ergebnisse auf der 
Grundlage der gemessenen Konzentrationen darzustellen.
 
Einsetzen der Testorganismen  
25. Vier bis fünf Tage vor dem Einsetzen der Testorganismen in die Prüfgefäße 
werden Eigelege aus der Zucht entnommen und in kleinen Gefäßen in das Kulturmedium eingesetzt. Es kann „altes“ Medium aus den Stammkulturen oder frisch zubereitetes Medium verwendet werden. In letzterem Fall wird 
eine geringe Futtermenge, z. B. Grünalgen und/oder einige Tropfen des 
Filtrats einer Suspension aus fein zerkleinerten Fischfutterflocken, zum Kul ­
turmedium hinzugegeben (siehe Anlage 2). Es sollten nur frische Eigelege verwendet werden. Normalerweise beginnen die Larven einige Tage nach 
dem Einsetzen der Eier zu schlüpfen ( Chironomus riparius : 2 bis 3 Tage bei 
20 °C,  Chironomus tentans  und  Chironomus yoshimatsui : 1 bis 4 Tage bei 
23 °C bzw. 25 °C) und durchlaufen während ihres Wachstums vier Stadien von jeweils 4 bis 8 Tagen. Für den Versuch sollten Larven des ersten 
Larvenstadiums (L1) (2 bis 3 Tage oder 1 bis 4 Tage nach dem Schlüpfen) 
verwendet werden. Das Larvenstadium kann anhand der Kopfkapselbreite bestimmt werden (6).
 
26. Jeweils 20 L1-Larven werden nach dem Zufallsprinzip mit einer stumpfen 
Pipette in die einzelnen Prüfgefäße eingesetzt, die das gespikte Sediment 
und das Wasser enthalten. Während des Einsetzens der Larven in das Prüf ­
gefäß und der folgenden 24 Std. (siehe Nummern 25 und 32) wird die Belüftung gestoppt. Je nach Versuchsaufbau (siehe Nummern 19 und 20) 
werden pro Konzentration mindestens 60 Larven zur Bestimmung der 
EC-Punktschätzung und mindestens 80 Larven zur Bestimmung der NOEC-Werte verwendet.
 
Prüfkonzentrationen  
27. Zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs für den endgültigen Test kann 
ein Vorversuch hilfreich sein. Hierzu wird eine Reihe von weit auseinander liegenden Konzentrationen der Prüfsubstanz verwendet. Um dieselbe Be ­
siedlungsdichte der Oberfläche durch die Chironomiden wie im eigentlichen 
Versuch zu reproduzieren, werden die Chironomiden jeder Konzentration der Prüfsubstanz über einen Zeitraum ausgesetzt, mit dem sich die geeig ­
neten Prüfkonzentrationen ermitteln lassen; Replikate sind nicht erforderlich.
 
28. Die Prüfkonzentrationen für den endgültigen Test werden auf der Grundlage 
der Ergebnisse des Vorversuchs festgelegt. Es sollten mindestens fünf Kon ­
zentrationen (siehe Nummern 18 bis 20) ausgewählt und verwendet werden.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1240
 
Kontrollgefäße  
29. In den Versuch sind Kontrollgefäße mit unbehandeltem Sediment und einer 
ausreichenden Anzahl von Replikaten einzubeziehen (siehe Nummern 19 und 20). Wurde die Prüfsubstanz mit Hilfe eines Lösungsmittel appliziert 
(siehe Nummer 16), so ist ein Kontrollgefäß hinzuzufügen, dessen Sediment 
das Lösungsmittel enthält.
 
Prüfsystem  
30. Es werden statische Prüfsysteme verwendet. Semi-statische oder Durchfluss ­
systeme, bei denen das Überstandswasser in bestimmten Intervallen bzw. 
kontinuierlich ersetzt wird, können in Ausnahmefällen verwendet werden, z. B. wenn die Spezifikationen zur Wasserqualität für den Testorganismus 
nicht mehr geeignet sind oder sich auf das chemische Gleichgewicht aus ­
wirken (z. B. wenn die Konzentration an gelöstem Sauerstoff zu stark abnimmt, die Konzentration der Ausscheidungen zu stark zunimmt oder aus dem Sediment ausgewaschene Mineralien den pH-Wert und/oder die 
Wasserhärte beeinflussen). Allerdings reichen andere Methoden zur Verbes ­
serung der Qualität des Überstandswassers wie die Belüftung aus und sollten bevorzugt angewendet werden.
 
Futter  
31. Die Larven sollten täglich, mindestens jedoch dreimal pro Woche gefüttert 
werden. Für jüngere Larven scheinen in den ersten 10 Tagen 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg für  C. yoshimatui ) Fischfutter (in Wasser suspendiertes oder 
fein zerkleinertes Futter, z. B. TetraMin oder TetraPhyll; Einzelheiten siehe 
Anlage 2) pro Larve und Tag angemessen. Ältere Larven benötigen etwas 
mehr Nahrung: Für den Rest des Versuchs dürften 0,5-1 mg Futter pro Larve und Tag ausreichen. Bei Pilzbesatz oder Absterben von Kontrollorga ­
nismen wird die Futterration für alle behandelten Organismen und Kontroll ­
organismen reduziert. Lässt sich die Pilzentwicklung nicht stoppen, muss 
der Versuch wiederholt werden. Bei Versuchen mit stark adsorbierenden Substanzen (z. B. log K
 ow > 5) oder kovalent an das Sediment gebundenen 
Substanzen kann dem formulierten Sediment die für das Überleben und 
natürliche Wachstum der Organismen erforderliche Futtermenge vor der 
Stabilisierungsphase hinzugefügt werden. In diesem Fall wird das Fischfutter durch pflanzliches Material ersetzt, z. B. durch Zugabe von 0,5 % (Tro ­
ckengewicht) feingeriebene Blätter z. B. von Brennnessel ( Urtica dioica ), 
Maulbeere ( Morus alba ), Weiß-Klee ( Trifolium repens ) oder Spinat ( Spina­
cia oleracea ) oder von sonstigem pflanzlichen Material ( Cerophyl  oder 
Alphacellulose).
 
Inkubationsbedingungen  
32. Das Überstandswasser in den Prüfgefäßen wird vorzugsweise 24 Std. nach 
dem Einsetzen der Larven über den gesamten Versuchszeitraum moderat belüftet (Es ist darauf zu achten, dass die Konzentration an gelöstem Sauer ­
stoff nicht unter 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungswertes fällt). Für die 
Belüftung (eine oder mehrere Blasen/sek.) wird eine Glaspasteurpipette 2- 
3 cm über der Sedimentschicht angebracht. Bei flüchtigen Prüfsubstanzen ist gegebenenfalls von einer Belüftung des Sediment-Wasser-Systems abzuse ­
hen.
 
33. Der Test wird bei einer konstanten Raumtemperatur von 20 °C (± 2 °C) 
durchgeführt. Für  C. tentans  und  C. yoshimatui  wird eine Temperatur von 
23 °C bzw. 25 °C (± 2 °C) empfohlen. Die Photoperiode beträgt 16 Std. 
und die Beleuchtungsstärke 500 bis 1 000 lux.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1241
 
Expositionsdauer  
34. Die Exposition beginnt mit dem Einsetzen der Larven in die Gefäße mit 
dem gespikten Sediment und in die Kontrollgefäße. Die maximale Exposi ­
tionsdauer beträgt 28 Tage für  C. riparius  und C. yoshimatsui  und 65 Tage 
für C. tentans . Falls die Mücken früher schlüpfen, kann der Versuch frü ­
hestens fünf Tage nach dem Schlüpfen der letzten Kontrollimago beendet werden.
 
Beobachtungen  
Emergenz  
35. Es werden die Entwicklungsdauer und die Anzahl der vollständig geschlüpf ­
ten männlichen und weiblichen Mücken bestimmt. Männchen sind leicht an den gefiederten Antennen zu erkennen.
 
36. Die Prüfgefäß sollten dreimal wöchentlich visuell auf Verhaltensänderungen 
(z. B. Verlassen des Sediments, ungewöhnliches Schwimmverhalten) gegen ­
über den Kontrollgefäßen überprüft werden. Während der Schlupfzeit müs ­
sen täglich die geschlüpften Tiere gezählt werden. Geschlecht und Anzahl der vollständig geschlüpften Mücken sind täglich festzuhalten. Danach wer ­
den die geschlüpften Mücken aus den Prüfgefäßen entfernt. Vor dem Ver ­
suchsende abgelegte Eigelege sind im Protokoll zu vermerken und anschlie ­
ßend zu entfernen, um zu verhindern, dass erneut Larven in das Sediment gelangen. Die Anzahl der sichtbaren Puppen, die nicht geschlüpft sind, wird 
ebenfalls protokolliert. Anweisungen zur Messung der Emergenz sind An ­
lage 5 zu entnehmen.
 
Wachstum und Überleben  
37. Müssen Daten zum Überleben und Wachstum der Larven nach 10 Tagen 
ermittelt werden, so sollten bereits ab Versuchsbeginn zusätzliche Prüfge ­
fäße hinzugefügt werden, die dann später verwendet werden können. Das Sediment aus diesen zusätzlichen Gefäßen wird durch ein 250- μm-Sieb 
gesiebt, um die Larven auszusieben. Kriterien zur Bestimmung des Todes 
sind Bewegungslosigkeit oder mangelnde Reaktion auf mechanische Reize. Nicht wiedergefundene Larven sollten auch zu den Todesfällen gerechnet werden (Larven, die zu Versuchsbeginn gestorben sind, wurden möglicher ­
weise durch Mikroben zersetzt). Nachdem das (aschefreie) Trockengewicht 
der überlebenden Larven pro Prüfgefäß bestimmt wurde, wird das mittlere Trockengewicht der einzelnen Larven pro Prüfgefäß berechnet. Es ist nütz ­
lich festzustellen, zu welchem Larvenstadium die überlebenden Larven ge ­
hören, was anhand der Kopfkapselbreite der einzelnen Larven bestimmt 
werden kann.
 
Analysemessungen  
Konzentration der Prüfsubstanz  
38. Vor Versuchsbeginn (d. h. vor dem Einsetzen der Larven) werden aus 
mindestens einem Gefäß pro Behandlung Sedimentproben für die analyti ­
sche Bestimmung der Konzentration der Prüfsubstanz im Sediment entnom ­
men. Es wird empfohlen, zu Beginn (siehe Nummer 24) und am Ende des Versuchs Proben des Überstandswassers, des Porenwassers und des Sedi ­
ments zumindest in der Höchstkonzentration und einer niedrigeren Konzen ­
tration zu analysieren. Diese Bestimmung der Konzentration der Prüfsub ­
stanz gibt Aufschluss über das Verhalten/die Verteilung der Prüfsubstanz im Wasser-Sediment-System.
 
39. Falls Zwischenmessungen (z. B. am 7. Tag) vorgenommen werden und für 
die Analyse größere Proben erforderlich sind, die nicht aus den Prüfgefäßen 
entnommen werden können, ohne das Testsystem zu beeinflussen, sollten Analysemessungen an Proben aus zusätzlichen Prüfgefäßen vorgenommen werden, die derselben Behandlung (einschließlich Präsenz von Testorganis ­
men) unterzogen, aber nicht für biologische Beobachtungen verwendet wur ­
den.
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40. Eine 30-minütige Zentrifugation bei z. B. 10 000 g und 4 °C wird empfoh ­
len, um das Interstitialwasser abzutrennen. Bei Prüfsubstanzen, die nach ­
weislich nicht an Filtern anlagern, kann auch filtriert werden. Bei zu kleinen Proben kann es passieren, dass sich die Konzentrationen im Porenwasser nicht analysieren lassen.
 
Physikalisch-chemische Parameter  
41. pH-Wert und Temperatur der Prüfgefäße sind auf geeignete Weise zu mes ­
sen (siehe Nummer 10). Zu Beginn und am Ende des Versuchs sind Härte 
und Ammonium-Gehalt in den Kontrollgefäßen und in einem Prüfgefäß zu 
bestimmen.  
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Auswertung der Ergebnisse  
42. Ziel dieses Versuchs ist, die Wirkung der Prüfsubstanz auf die Entwick ­
lungsrate und die Gesamtanzahl der vollständig geschlüpften männlichen und weiblichen Mücken bzw. im Falle des 10-Tage-Versuchs die Wirkun ­
gen auf Überleben und Gewicht der Larven zu bestimmen. Gibt es keinerlei 
Hinweise auf eine unterschiedliche Empfindlichkeit der Geschlechter, wer ­
den die Ergebnisse für Männchen und Weibchen für die statistischen Ana ­
lysen gepoolt. Unterschiedliche Empfindlichkeiten der Geschlechter können statistisch z. B. anhand eines Tafeltests mit χ
 2 -r × 2 bewertet werden. Er ­
forderlichenfalls sind nach 10 Tagen Daten zur Überlebensrate der Larven 
und zum mittleren Trockengewicht der einzelnen Larven pro Prüfgefäß zu ermitteln.
 
43. Die nach Trockengewicht ausgedrückten Effektkonzentrationen sind mög ­
lichst auf der Grundlage der zu Testbeginn gemessenen Sedimentkonzen ­
trationen (siehe Nummer 38) zu berechnen.  
44. Für eine Punktschätzung von EC  50 oder einem anderen EC  x können die pro 
Gefäß erstellten Statistiken als echte Replikate dienen. Bei der Berechnung 
eines Konfidenzintervalls für einen beliebigen EC  x -Wert ist die Variabilität 
zwischen den Gefäßen zu berücksichtigen oder nachzuweisen, dass diese Variabilität so klein ist, dass sie übergangen werden kann. Wird das Modell nach der Methode der geringsten Abweichungsquadrate angepasst, so sollten 
die pro Gefäß erstellten Statistiken transformiert werden, um die Varianz ­
homogenität zu verbessern. Allerdings werden die EC
 x -Werte berechnet, 
nachdem die Ergebnisse auf den ursprünglichen Wert rücktransformiert wur ­
den. 
45. Wenn die statistische Analyse darauf abzielt, NOEC/LOEC-Werte anhand 
von Hypothesentests zu bestimmen, so ist die Variabilität zwischen den Prüfgefäßen zu berücksichtigen, z. B. mit Hilfe einer geschachtelten (nested) Varianzanalyse (ANOVA). Alternativ können in den Fällen, in denen von 
den herkömmlichen ANOVA-Annahmen abgewichen wird, robustere Tests 
(21) angewendet werden.
 
Schlupfrate  
46. Schlupfraten sind quantale Daten und können anhand des 
Cochran-Armitage-Tests im Step-Down-Verfahren analysiert werden, wenn eine monotone Dosis-Antwort erwartet wird und die Schlupfdaten dieser Erwartung entsprechen. Andernfalls können ein Exakter Test nach Fisher 
oder ein Mantel-Haenszel-Test mit Bonferroni-Holm-angepassten p-Werten 
verwendet werden. Ist die Variabilität zwischen den Replikaten mit dersel ­
ben Konzentration nachweislich größer als eine Binomialverteilung ergeben würde (häufig als „extra-binomiale“ Variation bezeichnet), so sollte ein 
robusterer Test (Cochran-Armitage-Test oder Exakter Test nach Fisher), 
wie in (21) vorgeschlagen, angewendet werden.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1243
 
Die Summe geschlüpfter Mücken (ne) je Prüfgefäß wird bestimmt und 
durch die Anzahl der eingesetzten Larven (na) dividiert:  
ER ¼ n e 
n a 
Dabei sind:  
ER = Schlupfrate  
n e = Anzahl der geschlüpften Mücken je Prüfgefäß  
n a = Anzahl der eingesetzten Larven je Prüfgefäß  
47. Eine alternative Methode, die sich bei größeren Proben im Falle einer 
extra-binomialen Varianz eher eignet, besteht darin, die Schlupfrate als kon ­
tinuierliche Antwort zu behandeln und Methoden wie den Williams-Test anzuwenden, wenn eine monotone Dosis-Antwort erwartet wird und die Schlupfraten dies bestätigen. Der Dunnett’s-Test eignet sich für den Fall, 
dass die Monotonie nicht anhält. Als große Probe gilt hier eine Probe, bei 
der die Anzahl der geschlüpften Mücken und die Anzahl der nicht ge ­
schlüpften Mücken jeweils mehr als fünf pro Replikat(gefäß) beträgt.
 
48. Für die Anwendung von ANOVA-Methoden sollten die ER-Werte zunächst 
einer arcsin-Wurzel-Transformation oder Freeman-Tukey-Transformation 
unterzogen werden, um annähernd normal verteilte Daten und Homogenität 
der Varianzen zu erreichen. Bei der Verwendung von absoluten Frequenzen können auch der Cochran-Armitage-, der Exakte Test nach Fisher (mit Bonferroni-Korrektur) oder der Mantel-Haenszel-Test angewendet werden. 
Bei der arcsin-Wurzel-Transformation wird die Umkehrfunktion des Sinus 
(sin
 –1 ) der Wurzel von ER berechnet.  
49. Für Schlupfraten werden die EC  x -Werte mittels Regressionsanalyse (oder z. 
B. mit der Probit- (22), Logit-, Weibull-Methode, geeigneter kommerzieller Software usw.) berechnet. Versagt die Regressionsanalyse (z. B. bei weniger 
als zwei Teilantworten), so werden andere nicht-parametrische Methoden 
wie die Berechnung des gleitenden Durchschnitts oder eine einfache Inter ­
polation angewendet.
 
Entwicklungsrate  
50. Die mittlere Entwicklungszeit repräsentiert die mittlere Zeitspanne zwischen 
dem Einsetzen der Larven (Tag 0 des Versuchs) und dem Schlupf der in die Prüfgefäße eingesetzten Mückenkohorten. (Für die Berechnung der reellen 
Entwicklungszeit ist das Alter der Larven beim Einsetzen in die Prüfgefäße 
zu berücksichtigen). Die Entwicklungsrate ist der Reziprokwert der Entwick ­
lungszeit (Einheit: 1/Tag) und repräsentiert den Teil der Larven, die sich pro Tag entwickeln. Für die Bewertung der Sedimenttoxizität ist die Entwick ­
lungsrate zu bevorzugen, da sie im Vergleich zur Entwicklungszeit eine 
geringere Varianz aufweist und ihre Werte homogener sind und näher an der Normalverteilung liegen. Aus diesem Grund eignen sich parametrische Verfahren mit großer Teststärke eher für die Entwicklungsrate als für die 
Entwicklungszeit. Wird die Entwicklungsrate als kontinuierliche Antwort 
behandelt, so können die EC
 x -Werte mittels Regressionsanalyse geschätzt 
werden (z. B. (23), (24)).  
51. Für folgende statistische Tests gilt die Anzahl der am Kontrolltag × be ­
obachteten Mücken als die Anzahl der Mücken, die in der Mitte des Zeit ­
intervalls zwischen dem Tag x und dem Tag x-l geschlüpft sind (l = Länge des Kontrollintervalls, gewöhnlich 1 Tag). Die mittlere Entwicklungsrate je Prüfgefäß berechnet sich folgendermaßen:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1244
 
Dabei sind: 
ðxÞ: mittlere Entwicklungsrate je Prüfgefäß  
i: Index des Kontrollintervalls  
m: maximale Anzahl der Kontrollintervalle  
ƒ i : Anzahl der Mücken, die im Kontrollintervall i geschlüpft sind  
n e : Gesamtzahl der geschlüpften Mücken bei Versuchsende (=  P ƒ i ) 
x i : Entwicklungsrate der geschlüpften Mücken im Intervall i  
x i ¼ 1 Í 
Tag  i Ä 1 i 
2 Î 
Dabei sind:  
Tag  i : Kontrolltag (Tage seit der Applikation)  
l i : Länge des Kontrollintervalls i (Tage, in der Regel 1 Tag)  
Prüfbericht  
52. Der Prüfbericht muss mindestens folgende Angaben enthalten:  
Prüfsubstanz:  
— physikalischer Zustand und relevante physikalisch-chemische Eigen ­
schaften (Wasserlöslichkeit, Dampfdruck, Verteilungskoeffizient im Bo ­
den (oder — falls verfügbar — im Sediment), Stabilität im Wasser 
usw.);  
— chemische Kenndaten (Common name, chemische Bezeichnung, Struk ­
turformel, CAS-Nummer usw.) einschließlich Reinheitsgrad und Ana ­
lyseverfahren zur Quantifizierung der Prüfsubstanz.  
Testspezies:  
— eingesetzte Testtiere: Art, wissenschaftlicher Name, Bezugsquelle der 
Testorganismen und Zuchtbedingungen;  
— Informationen über die Handhabung der Eigelege und Larven;  
— Alter der Tiere beim Einsetzen in die Prüfgefäße.  
Prüfbedingungen:  
— verwendetes Sediment, d. h. natürliches oder formuliertes Sediment;  
— für natürliches Sediment: Ort und Beschreibung der Probenahmestelle(n) 
für das Sediment, möglichst einschließlich etwaiger früherer Kontamina ­
tionen; Merkmale: pH-Wert, Gehalt an organischem Kohlenstoff, C/N- Verhältnis und gegebenenfalls Granulometrie;
 
— Zubereitung des formulierten Sediments: Zutaten und Merkmale (Gehalt 
an organischem Kohlenstoff, pH-Wert, Feuchte usw. zu Versuchs ­
beginn);  
— Zubereitung des Prüfwassers (falls rekonstituiertes Wasser verwendet 
wird) und Merkmale des Wassers (Sauerstoffgehalt, pH-Wert, Leitfähig ­
keit, Härte usw. zu Testbeginn);  
— Tiefe des Sediments und des Überstandswassers;  
— Volumen des Überstandswassers und des Porenwassers; Gewicht des 
feuchten Sediments mit und ohne Porenwasser;  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1245
 
— Prüfgefäße (Material und Größe);  
— Verfahren für das Spiken des Sediments: verwendete Prüfkonzentratio ­
nen, Anzahl der Replikate und gegebenenfalls Verwendung von Lö ­
sungsmitteln;  
— Phase der Gleichgewichtseinstellung des Sediment-Wasser-Systems: 
Dauer und Bedingungen;  
— Inkubationsbedingungen: Temperatur, Lichtzyklus und Beleuchtungsstär ­
ke, Belüftung (Häufigkeit und Intensität);  
— genaue Angaben zur Fütterung, einschließlich Art des Futters, Präpara ­
tion des Futters, Futtermenge und Fütterungsregime.  
Ergebnisse:  
— die nominellen Prüfkonzentrationen, die gemessenen Prüfkonzentratio ­
nen und die Ergebnisse sämtlicher Analysen zur Bestimmung der Kon ­
zentration der Prüfsubstanz im Prüfgefäß;  
— Qualität des Wassers in den Prüfgefäßen, d. h. pH-Wert, Temperatur, 
Gehalt an gelöstem Kohlenstoff, Härte und Ammonium;  
— gegebenenfalls Ausgleich von Verdunstungsverlusten;  
— Anzahl der geschlüpften männlichen und weiblichen Mücken pro Gefäß 
und Tag;  
— Anzahl der Larven pro Gefäß, die sich nicht zu Mücken entwickelt 
haben;  
— mittleres Trockengewicht der einzelnen Larven pro Gefäß und gegebe ­
nenfalls pro Larvenstadium;  
— prozentuale Emergenzrate pro Replikat und Prüfkonzentration (männ ­
liche und weibliche Mücken gepoolt);  
— mittlere Entwicklungsrate der vollentwickelten Mücken pro Replikat und 
Behandlungsrate (männliche und weibliche Mücken gepoolt);  
— Schätzung der toxischen Endpunkte, z. B. EC  x (und dazugehörige Kon ­
fidenzintervalle), NOEC- und/oder LOEC-Werte und die zu ihrer Be ­
stimmung verwendeten statistischen Methoden;  
— Diskussion der Ergebnisse, einschließlich der Auswirkungen etwaiger 
Abweichungen von dieser Prüfmethode auf die Prüfergebnisse.  
LITERATUR:  
1. BBA (1995): Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Develop ­
ment and validation of a new test system. Herausgeber: M. Streloke und H. Köpp. Berlin 1995.
 
2. Fleming R.  et al.  (1994): Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Abschlussbericht an die Europäische Kommission. Bericht Nr.: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
 
3. SETAC (1993): Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bio ­
assays for Freshwater and Marine Environments. Aus dem WOSTA-Workshop in den Niederlanden.
 
4. ASTM International/E1706-00 (2002): Test Method for Measuring the To ­
xicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, S. 1125-1241. In: ASTM International 2002 Annual Book of Standards. 
Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; 
Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
 
5. Environment Canada (1997): Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. Dezember 1997.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1246
 
6. US-EPA (2000): Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Zweite 
Ausgabe. EPA 600/R-99/064. März 2000. Überarbeitung der ersten Ausgabe vom Juni 1994.
 
7. US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
8. US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
9. Milani D., Day K.E., McLeay D.J. and Kirby R.S. (1996): Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxi ­
city using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chiro­
nomus riparius).  Technischer Bericht. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada.
 
10. Sugaya Y. (1997): Intra-specific variations of the susceptibility of insectici ­
des in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.  
11. Kawai K. (1986): Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47-57.  
12. OECD (2000): Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publicati ­
ons, Series on Testing and Assessment No. 23.  
13. Environment Canada (1995): Guidance Document on Measurement of Toxi ­
city Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxi ­
cant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.  
14. Prüfmethode C.8 dieses Anhangs: Toxizität für Regenwürmer.  
15. Suedel B.C. and Rodgers J.H. (1994): Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163-1175.  
16. Naylor C. and Rodrigues C. (1995): Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291- 3303.
 
17. Dunnett C.W. (1964): A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121.  
18. Dunnett C.W. (1964): New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics, 20: 482-491.  
19. Williams D.A. (1971): A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 
103-117.  
20. Williams D.A. (1972): The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics, 28: 510-531.  
21. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992): A simple method for the analysis of 
clustered binary data. Biometrics 48: 577-585.  
22. Christensen E.R. (1984): Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.  
23. Bruce and Versteeg (1992): A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494.  
24. Slob W. (2002): Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1247
 
Anlage 1  
DEFINITIONEN  
Für diese Prüfmethode gelten folgende Definitionen:  
Formuliertes Sediment  oder rekonstitutiertes, künstliches oder synthetisches Se ­
diment: ein Gemisch aus Stoffen, mit denen die Bestandteile eines natürlichen Sediments nachgeahmt werden sollen.
 
Überstandswasser:  das auf das Sediment im Prüfgefäß aufgebrachte Wasser.  
Interstitialwasser  oder Porenwasser: das Wasser in den Zwischenräumen zwi ­
schen Sediment- und Bodenpartikeln.  
Gespiktes Sediment:  Sediment, dem Prüfsubstanz hinzugefügt wurde.  
Prüfsubstanz:  jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode 
getestet wird.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1248
 
Anlage 2  
Empfehlungen für die Anzucht von  Chironomus riparius  
1. Für die Anzucht von  Chironomus -Larven können Kristallisierschalen oder 
größere Behälter verwendet werden. Auf dem Boden des Behälters wird eine 5 bis 10 mm dicke Schicht feiner Quarzsand aufgetragen. Kieselguhr (z. B. Merck, Art 8117) hat sich ebenfalls als Substrat bewährt (eine dünnere 
Schicht von nur ein paar Millimetern ist ausreichend). Anschließend wird 
mit geeignetem Wasser auf mehrere Zentimeter Höhe aufgefüllt. Soweit erforderlich ist bei Verdunstungsverlusten Wasser nachzufüllen, um ein Aus ­
trocknen zu verhindern. Nötigenfalls kann das Wasser ausgetauscht werden. 
Leicht belüften. Die Larvenzuchtgefäße sind in geeignete Käfige zu setzen, 
um zu verhindern, dass die schlüpfenden Imagines entweichen. Der Käfig muss groß genug sein (Mindestgröße ca. 30 × 30 × 30 cm), damit die geschlüpften Imagines schwärmen können, da es andernfalls nicht zur Paa ­
rung kommt.
 
2. Die Käfige sind bei Raumtemperatur oder in einer Klimakammer bei 20 
± 2 °C und einer Licht-/Dunkelphase von 16:8 Std. (Lichtintensität ca. 1 000 
lux) zu halten. Eine relative Luftfeuchte von weniger als 60 % soll offen ­
sichtlich die Vermehrung verhindern.  
Verdünnungswasser  
3. Es kann jedes natürliche oder synthetische Wasser verwendet werden. Im 
Allgemeinen wird Brunnenwasser, entchlortes Leitungswasser und künst ­
liches Medium (z. B. Elendt-Medium „M4“ oder „M7“, siehe unten) ver ­
wendet. Das Wasser muss vor Verwendung belüftet werden. Soweit erfor ­
derlich kann das Anzuchtwasser durch vorsichtiges Abgießen oder Absau ­
gen des gebrauchten Wassers aus den Prüfgefäßen erneuert werden; dabei ist darauf zu achten, dass die Wohnröhren der Larven nicht zerstört werden.
 
Fütterung der Larven  
4. Chironomus -Larven sollten mit ca. 250 mg Fischfutterflocken (TetraMin®, 
TetraPhyll® oder einer anderen entsprechenden Fischfuttermarke) pro Gefäß und Tag gefüttert werden. Hierzu kann trockengemahlenes Pulver oder eine Suspension in Wasser (1,0 g Futterflocken, mit 20 ml Verdünnungswasser 
zu einer homogenen Masse gemischt) verwendet werden. Diese Zubereitung 
kann in Portionen von 5 ml pro Gefäß und pro Tag verfüttert werden (vor Gebrauch schütteln). Ältere Larven können etwas mehr Futter erhalten.
 
5. Das Futter ist an die Wasserqualität anzupassen. Bei Trübung des Kultur ­
mediums ist die Futterration zu reduzieren. Die Futterzugaben sind sorgfältig 
zu notieren. Zu wenig Futter kann dazu führen, dass die Larven in die Wassersäule abwandern, während zu viel Futter die mikrobielle Aktivität 
verstärkt und die Sauerstoffkonzentrationen verringert. In beiden Fällen 
kann es zu einer Verlangsamung des Wachstums der Organismen kommen.
 
6. Wenn neue Kulturgefäße angesetzt werden, können auch einige Grünalgen ­
zellen (z. B.  Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris ) hinzugefügt wer ­
den. 
Fütterung der geschlüpften Imagines  
7. Einige Experimentatoren empfehlen, als Futter für die geschlüpften Imagines 
ein mit gesättigter Zuckerlösung getränktes Wattepad zu verwenden.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1249
 
Emergenz  
8. Nach ca. 13 bis 15 Tagen bei einer Temperatur von 20 ± 2 °C beginnen die 
Imagines in den Larvenzuchtgefäßen zu schlüpfen. Männchen sind leicht an den gefiederten Antennen zu erkennen.
 
Eigelege  
9. Sobald sich Imagines in den Zuchtkäfigen befinden, sind alle Larvenzucht ­
gefäße dreimal wöchentlich auf gallertartige Eigelege zu kontrollieren. Diese sind vorsichtig zu entfernen und in eine kleine Schale mit einer Probe Anzuchtwasser umzusetzen. Mit den Eigelegen werden neue Kulturen an ­
gesetzt (z. B. 2 bis 4 Eigelege pro Gefäß) oder Toxizitätstests durchgeführt.
 
10. Nach 2 bis 3 Tagen sollten L1-Larven schlüpfen.  
Ansetzen neuer Kulturen  
11. Sobald die Zucht etabliert ist, sollte es möglich sein, je nach Prüfungsanfor ­
derungen wöchentlich oder weniger häufig frische Kulturen anzusetzen und die älteren Prüfgefäße nach dem Schlüpfen der Imagines zu entfernen. Auf 
diese Weise ist es möglich, mit nur geringem Aufwand ständig über Ima ­
gines zu verfügen.
 
Zubereitung der Prüflösungen M4 und M7  
12. Das Medium M4 wurde von Elendt (1990) beschrieben. Das Medium M7 
wird wie das Medium M4 zubereitet, mit Ausnahme der in Tabelle 1 an ­
gegebenen Substanzen, deren Konzentration bei M7 viermal niedriger ist als 
bei M4. Eine Veröffentlichung zum Medium M7 wird derzeit ausgearbeitet (Elendt, persönliche Mitteilung). Die Prüflösungen nicht nach den Anwei ­
sungen von Elendt und Bias (1990) zubereiten, da die für die Zubereitung 
der Stammlösungen angegebenen Konzentrationen von NaSiO
 3 5 H  2 O, Na­
NO  3 , KH  2 PO 4 und K  2 HPO  4 nicht geeignet sind.  
Herstellung des M7-Mediums  
13. Zunächst wird jede Stammlösung (I) einzeln zubereitet; diese Stammlösun ­
gen werden anschließend zu einer kombinierten Stammlösung (II) zusammengegossen (I) (siehe Tabelle 1). 50 ml der kombinierten 
Stammlösung (II) und die in Tabelle 2 angegebenen jeweiligen Mengen 
der Makronährstoffe werden zur Herstellung des M7-Mediums mit entioni ­
siertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt. Durch Zugabe von drei Vitaminen gemäß Tabelle 3 zu entionisiertem Wasser wird eine kombinierte 
Vitamin-Stammlösung hergestellt, von der 0,1 ml vor der Verwendung 
dem fertigen M7-Medium zugesetzt werden. (Die Vitaminstammlösung wird in kleinen Portionen tiefgefroren aufbewahrt). Das Medium wird be ­
lüftet und stabilisiert.
 
LITERATUR  
BBA (1995): Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Herausgeber: M. Streloke und H. Köpp. 
Berlin 1995.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1250
 
Tabelle 1  
Stammlösungen der Spurenelemente für das M4- und das M7-Medium  
Stammlösungen (I) Menge (mg), die 
mit entionisier ­
tem Wasser auf 1 
Liter aufgefüllt 
wird Zur Herstellung der kombinierten 
Stammlösung (II): Folgende Mengen 
(ml) der Stammlösungen (I) mischen und mit entionisiertem Wasser auf 1 
Liter auffüllen Endkonzentrationen der 
Prüflösungen (mg/l) 
M4 M7 M4 M7
 
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Diese Stoffe sind in M4 und M7 unterschiedlich dosiert (siehe oben). 
( 2 ) Diese Lösungen werden einzeln hergestellt, zusammengegossen und sofort autoklaviert.  
Tabelle 2  
Makronährstoff-Stammlösungen für das M4- und das M7-Medium  
Menge (mg), die mit 
entionisiertem Wasser 
auf 1 Liter aufgefüllt 
wird Zur Herstellung des M4- 
und des M7-Mediums zu ­
gesetzte Menge an Makro ­
nährstoff-Stammlösungen 
(ml/l) Endkonzentrationen 
der Prüflösungen M4 
und M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1251
 
Tabelle 3  
Vitamin-Stammlösung für das M4- und das M7-Medium. Aus den drei Vitaminlösungen wird 
eine einzige Vitamin-Stammlösung hergestellt.  
Menge (mg), die mit 
entionisiertem Wasser 
auf 1 Liter aufgefüllt 
wird Zur Herstellung des M4- und 
des M7-Mediums zugesetzte 
Menge an 
Vitamin-Stammlösung 
(ml/l) Endkonzentrationen der 
Prüflösungen M4 und 
M7 
(mg/l)  
Thiaminhydrochlorid 750 0,1 0,075 
Cyanocobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075
 
LITERATUR  
Elendt B.P. (1990): Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25-33.  
Elendt B.P. & W.-R. Bias (1990): Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1252
 
Anlage 3  
ZUBEREITUNG DES FORMULIERTEN SEDIMENTS  
Zusammensetzung des Sediments  
Das formulierte Sediment sollte die folgende Zusammensetzung haben:  
Bestandteil Charakterisierung % des Trockengewichts 
des Sediments  
Torf Sphagnum-Torf, so nahe wie 
möglich bei pH 5,5 bis 6,0, 
ohne sichtbare Pflanzenreste, 
fein gemahlen (Partikelgröße ≤ 1 mm) und luftgetrocknet 4 - 5 
Quarzsand Korngröße: > 50 % der Par ­
tikel sollten Größen zwischen 50 und 200 μm aufweisen 75 - 76 
Kaolin-Ton Kaolinit-Gehalt ≥ 30 % 20 
Organischer Kohlenstoff Eingestellt durch Zugabe von 
Torf und Sand 2 (± 0,5) 
Calciumcarbonat CaCO
 3 , pulverisiert, che ­
misch rein 0,05 - 0,1 
Wasser Leitfähigkeit ≤ 10 μS/cm 30 - 50  
Zubereitung  
Der Torf wird luftgetrocknet und zu feinem Pulver zermahlen. Die erforderliche 
Menge an Torfpulver wird mit Hilfe eines Hochleistungshomogenisators in en ­
tionisiertem Wasser suspendiert und durch Zugabe von CaCO  3 auf einen 
pH-Wert von 5,5 ± 0,5 eingestellt. Diese Suspension wird bei 20 ± 2 °C für 
mindestens zwei Tage unter sanftem Rühren konditioniert, um den pH-Wert zu stabilisieren und eine Etablierung der mikrobiellen Fauna zu ermöglichen. Der pH-Wert wird erneut bestimmt und sollte bei 6,0 ± 0,5 liegen. Nun werden die 
übrigen Komponenten (Sand und Kaolin-Ton) sowie entionisiertes Wasser zur 
Torf-Wasser-Suspension hinzugegeben und zu einem homogenen Sediment ver ­
mischt, dessen Wassergehalt 30 bis 50 % des Trockengewichts des Sediments betragen sollte. Der pH-Wert der fertigen Mischung wird erneut gemessen und 
erforderlichenfalls mit CaCO
 3 auf 6,5 bis 7,5 eingestellt. Sedimentproben neh ­
men, um das Trockengewicht und den Gehalt an organischem Kohlenstoff zu bestimmen. Es wird empfohlen, das formulierte Sediment vor dem Einsatz in einem Chironomiden-Toxizitätstest für sieben Tage unter denselben Bedingun ­
gen, wie sie im anschließenden Test herrschen, zu konditionieren.
 
Lagerung  
Die trockenen Bestandteile für die Zubereitung des künstlichen Sediments kön ­
nen an einem trockenen und kühlen Ort bei Raumtemperatur gelagert werden. 
Das formulierte (feuchte) Sediment darf vor seiner Verwendung im Prüfversuch nicht gelagert werden. Es ist unmittelbar nach Ablauf der siebentägigen Kon ­
ditionierung, mit der die Zubereitung abschließt, zu verwenden.
 
LITERATUR  
Kapitel C.8 dieses Anhangs: Toxizität für Regenwürmer.  
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998): 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tu ­
bificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1253
 
Anlage 4  
Chemische Eigenschaften eines geeigneten Verdünnungswassers  
Substanz Konzentration  
Partikel < 20 mg/l 
Gesamtgehalt an organischen Kohlenstoffen < 2 mg/l Nichtionisiertes Ammonium < 1 μg/l 
Härte in CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Restchlor < 10 μg/l 
Gesamtgehalt an phosphororganischen Pestiziden < 50 ng/l Gesamtgehalt an chlororganischen Pestiziden plus po ­
lychlorierten Biphenylen < 50 ng/l 
Gesamtgehalt an organischem Chlor < 25 ng/l
 
(*) Wird jedoch ein Ionenaustausch zwischen den Härteionen und der Prüfsubstanz ver ­
mutet, ist Wasser geringerer Härte zu verwenden (und somit ist in diesem Fall das 
Elendt-Medium M4 zu vermeiden).  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1254
 
Anlage 5  
Empfehlungen für die Beobachtung des Schlüpfens der Chironomidenlarven  
Die Bechergläser werden ab dem 20. Tag bis zum Versuchsende mit Emergenz ­
fallen abgedeckt. Nachstehend ist ein Beispiel für eine derartige Falle abgebildet:
  
A: Nylongaze  
B: umgedrehte Plastikschalen  
C: Becherglas ohne Ausguss  D: abgedeckte Öffnungen für den Wasseraustausch  
E: Wasser  
F: Sediment  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1255
 
C. 28  CHIRONOMIDEN-TOXIZITÄTSTEST IN SEDIMENT-WASSER- 
SYSTEMEN MIT GESPIKTEM WASSER  
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 219 (2004). Sie 
dient der Bewertung der Wirkung einer Langzeitexposition gegenüber Che ­
mikalien auf die sedimentbewohnenden Larven von  Chironomus  sp., einem 
in Frischwasser lebenden Zweiflügler. Die Methode basiert hauptsächlich auf der BBA-Richtlinie, bei der die Exposition anhand eines 
Sediment-Wasser-Testsystems mit Kunsterde und Wassersäule vorgenom ­
men wird (1). Sie berücksichtigt auch die bestehenden Protokolle für Toxi ­
zitätstests mit  Chironomus riparius  und  Chironomus tentans , die in Europa 
und Nordamerika (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) entwickelt und Ringtests (1)(6)(9) 
unterzogen wurden. Auch andere gut dokumentierte Chironomid-Arten wie  
Chironomus yoshimatsui  (10)(11) sind geeignet.
 
2. Bei dem für diese Prüfmethode verwendeten Expositionsszenario wird das 
Wasser mit der Prüfsubstanz gespikt. Die Wahl des Szenarios hängt vom jeweiligen Testziel ab. Durch Dotieren (Spiken) der Wassersäule sollen Sprühverluste beim Aufbringen von Pestiziden simuliert und die Anfangs ­
spitzen der Konzentrationen im Porenwasser erfasst werden. Die Methode 
eignet sich auch für andere Expositionsarten (einschließlich Austritt von Chemikalien), ausgenommen für Akkumulationsvorgänge, die länger dauern als der Test.
 
3. In der Regel haben die an sedimentbewohnenden Organismen zu testenden 
Substanzen eine lange Verweildauer in diesem Kompartiment. Sedimentbe ­
wohner können über verschiedene Wege exponiert werden. Die relative 
Bedeutung der einzelnen Expositionspfade und die Geschwindigkeit, mit der diese jeweils zu den gesamten toxischen Wirkungen beitragen, hängen von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der betreffenden Substanz 
ab. Für stark adsorbierende Substanzen (z. B. log K
 ow > 5) oder für kovalent 
an das Sediment gebundene Substanzen kann die Aufnahme von Schad ­
stoffen über die Nahrung einen wichtigen Expositionspfad darstellen. Die 
Toxizität hoch lipophiler Substanzen sollte nicht unterschätzt werden, wes ­
halb gegebenenfalls vor Applikation der Prüfsubstanz dem Sediment Futter hinzugegeben werden sollte. Um alle potenziellen Expositionspfade zu be ­
rücksichtigen, liegt der Schwerpunkt bei dieser Prüfmethode auf der Lang ­
zeitexposition. Die Testdauer beträgt 20 bis 28 Tage für  C. riparius  und C. 
yoshimatsui  und 28 bis 65 Tage für  C. tentans . Falls aus einem besonderen 
Grund, z. B. zur Untersuchung der Wirkungen von instabilen Chemikalien, Kurzzeitdaten benötigt werden, können nach dem 10. Versuchstag zusätzli ­
che Replikate entnommen werden.
 
4. Als Endpunkte werden die Gesamtzahl der geschlüpften Imagines und die 
Emergenzzeit gemessen. Falls zusätzlich Kurzzeitdaten benötigt werden, 
sollten die Messungen der Überlebensrate und des Wachstums der Larven erst nach dem 10. Tag gegebenenfalls anhand zusätzlicher Replikate vor ­
genommen werden.
 
5. Es wird empfohlen, formuliertes Sediment zu verwenden, da es gegenüber 
natürlichen Sedimenten mehrere Vorteile hat:  
— Die Variabilität zwischen den Versuchen ist nicht so groß, da formu ­
liertes Sediment eine reproduzierbare „standardisierte Matrix“ ergibt und 
es nicht erforderlich ist, Quellen für unkontaminiertes, sauberes Sedi ­
ment ausfindig zu machen;  
— es kann jederzeit mit den Versuchen begonnen werden, ohne durch 
jahreszeitliche Schwankungen gestört zu werden und ohne dass eine Vorbehandlung zur Defaunierung des Sediments erforderlich wäre; die Verwendung von formuliertem Sediment reduziert auch die Kosten, die 
bei Feldprobenahmen ausreichender Sedimentmengen für Routineprü ­
fungen anfallen;
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1256
 
— die Verwendung formulierter Sedimente ermöglicht Toxizitätsvergleiche 
und die entsprechende Einstufung der Substanzen: Versuche mit natür ­
lichen und künstlichen Sedimenten haben vergleichbare Toxizitätsdaten für mehrere Chemikalien ergeben (2).
 
6. Die verwendeten Begriffe sind in Anlage 1 definiert.  
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
7. Chironomidlarven des 1. Larvenstadiums (L1-Larven) werden gegenüber der 
Prüfsubstanz in verschiedenen Konzentrationen in Sediment-Wasser-Syste ­
men exponiert. Der Versuch beginnt mit dem Einsetzen von L1-Larven in die Bechergäser mit dem Sediment-Wasser-System und dem Dotieren (Spiken) des Wassers mit der Prüfsubstanz. Zum Versuchsende werden 
Emergenz und Entwicklungsrate der Chironomiden bestimmt. Sofern erfor ­
derlich, können (gegebenenfalls anhand zusätzlicher Replikate) nach 10 Ta ­
gen Messungen der Überlebensrate und des Gewichts der Larven vorgenom ­
men werden. Analysiert werden diese Daten entweder anhand eines Regres ­
sionsmodells, um die Konzentration zu ermitteln, die zu einer ×-%igen Ver ­
ringerung der Emergenz-, Überlebens- oder Wachstumsrate der Larven führt (z. B. EC
 15 , EC  50 usw.), oder anhand statistischer Hypothesentests zur Be ­
stimmung von NOEC/LOEC-Werten. Hierzu sind die Wirkungswerte an ­
hand statistischer Tests mit Kontrollwerten zu vergleichen.  
ANGABEN ZUR PRÜFSUBSTANZ  
8. Wasserlöslichkeit und Dampfdruck der Prüfsubstanz, ihre gemessene oder 
berechnete Verteilung im Sediment sowie ihre Stabilität im Wasser und im 
Sediment sollten bekannt sein. Ein zuverlässiges analytisches Verfahren für die Quantifizierung der Prüfsubstanz im Überstandswasser, Porenwasser und Sediment mit bekannter und dokumentierter Genauigkeit und Nachweis ­
grenze sollte vorhanden sein. Weitere nützliche Informationen sind die 
Strukturformel und der Reinheitsgrad der Prüfsubstanz sowie das chemische Schicksal der Prüfsubstanz (z. B. Verlustrate, abiotischer und biotischer Abbau usw.). Weitere Hinweise zu Prüfsubstanzen mit 
physikalisch-chemischen Merkmalen, welche die Durchführung des Tests 
erschweren, sind Quelle (12) zu entnehmen.
 
REFERENZSUBSTANZEN  
9. Referenzsubstanzen können regelmäßig getestet werden, um auf diese Weise 
die Zuverlässigkeit des Prüfprotokolls und der Prüfbedingungen zu gewähr ­
leisten. Beispiele von Referenzgiftstoffen, die erfolgreich in Ringtests und Validierungsstudien verwendet werden: Lindan, Trifluralin, Pentachlorphe ­
nol, Cadmiumchlorid und Kaliumchlorid (1)(2)(5)(6)(13).
 
GÜLTIGKEIT DER ERGEBNISSE  
10. Der Test ist gültig, wenn folgende Bedingungen erfüllt sind:  
— Die Emergenz in den Kontrollen muss am Ende des Tests mindestens 
70 % betragen. (1)(6);  
— erste Imagines von  C. riparius  und C. yoshimatsui  sollten zwischen dem 
12. und dem 23. Tag nach dem Einsetzen der Tiere in die Prüfgefäße schlüpfen; für  C. tentans  sind 20 bis 65 Tage erforderlich;
 
— zum Versuchsende sind der pH-Wert und die Konzentration an gelöstem 
Sauerstoff zu messen. Der Sauerstoffgehalt sollte mindestens 60 % des 
Luftsauerstoff-Sättigungswertes betragen und der pH-Wert des Über ­
standswassers sollte in allen Prüfgefäßen zwischen 6 und 9 liegen;  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1257
 
— die Wassertemperatur sollte nicht mehr als ± 1,0 °C schwanken; sie 
kann mit Hilfe einer Klimakammer kontrolliert werden, wobei in diesem 
Fall die Raumtemperatur in angemessenen Zeitabständen zu bestimmen ist.
 
BESCHREIBUNG DER METHODE  
Prüfgefäße  
11. Der Versuch wird in 600-ml-Glasbechergläsern mit einem Durchmesser von 
8 cm durchgeführt. Andere Gefäße sind ebenfalls geeignet, sofern sie eine 
entsprechende Höhe von Überstandswasser und Sediment fassen. Die Sedi ­
mentoberfläche sollte 2 bis 3 cm  2 pro Larve bieten. Das Verhältnis zwischen 
Sedimentschicht und Überstandswasser sollte 1:4 betragen. Die Prüfgefäße und sonstigen Geräte, die mit dem Prüfsystem in Kontakt kommen, müssen 
vollständig aus Glas oder einem anderen chemisch inerten Material (z. B. 
Teflon) bestehen.
 
Wahl der Testspezies  
12. Als Testspezies sollte bevorzugt  Chironomus riparius  eingesetzt werden.  
Chironomus tentans  ist ebenfalls geeignet, lässt sich aber schwieriger hand ­
haben und erfordert eine längere Prüfdauer. Auch  Chironomus yohimatsui  
kann verwendet werden. Einzelheiten zu den Anzuchtverfahren für  Chiro­
nomus riparius  sind in Anlage 2 enthalten. Informationen zu den Anzucht ­
bedingungen sind auch für andere Arten ( Chironomus tentans  (4) und  Chi­
ronomus yoshimatsui  (11)) verfügbar. Die Identität der Spezies ist vor der 
Prüfung zu bestätigen, allerdings ist dies nicht vor jedem Test erforderlich, wenn die Organismen aus laboreigener Zucht stammen.
 
Sediment  
13. Vorzugsweise ist formuliertes Sediment (so genanntes rekonstituiertes, 
künstliches oder synthetisches Sediment) zu verwenden. Wenn jedoch na ­
türliches Sediment verwendet wird, so ist es zu charakterisieren (zumindest 
pH-Wert und Gehalt an organischem Kohlenstoff; die Bestimmung sonstiger 
Parameter wie C/N-Verhältnis und Granulometrie wird ebenfalls empfoh ­
len). Auch sollte es frei von Verunreinigungen sowie Konkurrenten und Fressfeinden der Chironomiden sein. Ferner wird empfohlen, natürliches 
Sediment vor seiner Verwendung in einem Chironomiden-Toxizitätstest 
für sieben Tage unter denselben Bedingungen, wie sie im anschließenden Test herrschen, zu konditionieren. Für diesen Test wird auf der Grundlage der in der Prüfmethode C.8 (14) verwendeten Kunsterde folgendes formu ­
liertes Sediment empfohlen (1)(15)(16):
 
a) 4-5 % (bezogen auf die Trockenmasse) Torf: so nahe wie möglich bei 
pH 5,5 bis 6,0; wichtig: Torf in Pulverform, feingemahlen (Partikelgröße 
≤ 1 mm) und nur luftgetrocknet, verwenden;  
b) 20 % (bezogen auf die Trockenmasse) Kaolin-Ton (Kaolingehalt vor ­
zugsweise über 30 %);  
c) 75-76 % (bezogen auf die Trockenmasse) Quarzsand (hauptsächlich 
Feinsand, der zu mehr als 50 % eine Korngröße von 50 bis 200 μm 
aufweist;  
d) der Feuchtegehalt der fertigen Mischung wird durch die Zugabe von 
entionisiertem Wasser auf einen Wert zwischen 30 % und 50 % einge ­
stellt;  
e) durch die Zugabe von chemisch reinem Calciumcarbonat (CaCO  3 ) wird 
die fertige Mischung des Sediments auf einen pH-Wert von 7,0 ± 0,5 
eingestellt.  
f) der Gehalt der fertigen Mischung an organischem Kohlenstoff sollte 2 % 
(± 0,5 %) betragen und ist durch Zugabe geeignete Mengen Torf und 
Sand (siehe Buchstaben a und c) zu gewährleisten.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1258
 
14. Die Herkunft von Torf, Kaolin-Ton und Sand sollte bekannt sein. Es sollte 
kontrolliert werden, dass die Bestandteile des Sediments nicht chemisch 
verunreinigt sind (z. B. durch Schwermetalle, chlororganische Verbindun ­
gen, phosphororganische Verbindungen usw.). Ein Beispiel für die Herstel ­
lung des formulierten Sediments ist in Anlage 3 beschrieben. Die Bestand ­
teile können auch in trockenem Zustand gemischt werden, sofern nach ­
gewiesen ist, dass es nach Zugabe des Überstandswassers nicht zu einer Auftrennung der Sedimentbestandteile kommt (z. B. schwimmende Torfpar ­
tikel) und dass der Torf oder das Sediment ausreichend konditioniert ist.
 
Wasser  
15. Alle Wassersorten, die den chemischen Eigenschaften von zugelassenem 
Verdünnungswasser gemäß den Anlagen 2 und 4 entsprechen, sind als Test ­
wasser geeignet. Natürliches Wasser (Oberflächen- oder Grundwasser), re ­
konstituiertes Wasser (siehe Anlage 2) oder entchlortes Leitungswasser sind 
als Hälterungs- und Verdünnungswasser zulässig, wenn die Chironomiden 
hierin während der Zucht- und Testphase ohne Stressanzeichen überleben. Zu Testbeginn sollte der pH-Wert des Testwassers zwischen 6 und 9 liegen und die Gesamthärte des Wassers sollte nicht mehr als 400 mg/l (in CaCO
 3 ) 
betragen. Wird jedoch ein Ionenaustausch zwischen den Härteionen und der 
Prüfsubstanz vermutet, ist Wasser geringerer Härte zu verwenden (und somit in diesem Fall das Elendt-Medium M4 zu vermeiden). Das Wasser muss über die gesamte Testdauer von gleichbleibender Qualität sein. Die Quali ­
tätsparameter des Wassers gemäß Anlage 4 sind mindestens zweimal jähr ­
lich bzw. immer dann zu messen, wenn der Verdacht besteht, dass sie sich erheblich verändert haben.
 
Stammlösungen — Gespiktes Wasser  
16. Die Testkonzentrationen werden auf der Grundlage der Konzentrationen in 
der Wassersäule, d. h. im Überstandswasser, berechnet. Die Prüflösungen 
werden in der Regel durch Verdünnung einer Stammlösung in den ge ­
wünschten Konzentrationen zubereitet. Stammlösungen sollten möglichst 
durch Auflösung der Substanz im Prüfmedium hergestellt werden. In einigen 
Fällen kann der Einsatz von Lösungs- oder Dispersionsmitteln erforderlich sein, um eine Stammlösung von geeigneter Konzentration zu erzielen. Ge ­
eignete Lösungsmittel sind beispielsweise Aceton, Ethanol, Methanol, 
Ethylenglykol-Monomethylether, Ethylenglykol-Dimethylether, Dimethylfor ­
mamid und Triethylenglykol. Geeignete Dispersionsmittel sind beispiels ­
weise Cremophor RH40, Tween 80, Methylzellulose 0,01 % und HCO-40. Die Konzentration des Lösungsvermittlers in dem endgültigen Prüfmedium 
sollte auf ein Mindestmaß (d.h. ≤ 0,1 ml/l) beschränkt und bei allen Behand ­
lungen gleich sein. Wird ein Lösungsvermittler verwendet, so darf er keine signifikanten Auswirkungen auf das Überleben und keine erkennbaren nach ­
teiligen Auswirkungen auf die Chironomiden-Larven haben, was durch eine 
nur mit Lösungsmittel vorgenommene Kontrolle nachzuweisen ist. Es soll ­
ten jedoch alle Anstrengungen unternommen werden, um den Einsatz der ­
artiger Stoffe zu vermeiden.
 
VERSUCHSAUFBAU  
17. Unter „Versuchsaufbau“ sind die gewählte Anzahl und der Abstand der 
Testkonzentrationen, die Anzahl der Prüfgefäße je Konzentration und die 
Anzahl der Larven je Gefäß zu verstehen. Beschrieben werden die Ver ­
fahren für die Bestimmung der EC-Werte und der NOEC-Werte und für die Durchführung eines Limit-Tests. Regressionsanalysen sind Hypothesen ­
test vorzuziehen.
 
Versuchsaufbau für die Regressionsanalyse  
18. Die im Test verwendeten Konzentrationen müssen in jedem Fall die Wir ­
kungskonzentration (z. B. EC  15 , EC  50 ) und den Konzentrationsbereich, in 
dem die Wirkung der Prüfsubstanz von Interesse ist, einschließen. Bei der 
Bestimmung von Wirkungskonzentrationen (EC  x ) wird in der Regel eine 
größere Genauigkeit und insbesondere Validität erzielt, wenn die  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1259
 
Wirkungskonzentration im Bereich der getesten Konzentrationen liegt. Ex ­
trapolierungen weit unter der niedrigsten positiven Konzentration oder über 
der höchsten Konzentration sind zu vermeiden. Ein Vorversuch kann die Auswahl der zu verwendenden Konzentrationsspanne erleichtern (siehe Nummer 27).
 
19. Für die Bestimmung von EC  x sollten mindestens fünf Konzentrationen und 
drei Replikate jeder Konzentration getestet werden. Im Interesse einer an ­
gemessenen Modellierung ist es in jedem Fall ratsam, eine hinreichende Anzahl an Konzentrationen zu testen. Die Konzentrationen sollten sich 
um einen Faktor von nicht mehr als 2 unterscheiden (außer bei einer schwa ­
chen Steigung der Dosis-Wirkungs-Kurve). Die Anzahl der Replikate pro Behandlung kann reduziert werden, wenn die Anzahl der Prüfkonzentratio ­
nen mit unterschiedlicher Wirkung erhöht wird. Eine höhere Anzahl an 
Replikaten oder eine Verkürzung der Intervalle zwischen den Prüfkonzen ­
trationen führt tendenziell zu engeren Konfidenzintervallen für den Test. Zur Bestimmung der Überlebensrate und des Wachstums der Larven nach 10 Tagen sind zusätzliche Replikate erforderlich.
 
Versuchsaufbau für die Bestimmung von NOEC/LOEC-Werten  
20. Zur Bestimmung von LOEC- oder NOEC-Werten sollten fünf Prüfkonzen ­
trationen mit mindestens vier Replikaten pro Konzentration verwendet wer ­
den, wobei sich die Konzentrationen um einen Faktor von nicht mehr als 2 unterscheiden sollten. Es sollten so viele Replikate verwendet werden, dass 
sich im Hinblick auf eine angemessene statistische Aussagekraft bei einem 
Signifikanzniveau von 5 % (p = 0,05) eine Differenz von 20 % zur Kon ­
trollkonzentration nachweisen lässt. Für die Entwicklungsrate eignen sich in der Regel Varianzanalysen (ANOVA) wie der Dunnett-Test und der 
Williams-Test (17)(18)(19)(20). Für die Schlupfrate kann der 
Cochran-Armitage-Test, der Exakte Test nach Fisher (mit Bonferroni-Korrektur) oder der Mantel-Haenszel-Test herangezogen werden.
 
Limit-Test  
21. Falls der Vorversuch keine Wirkungen zeigt, kann ein Limit-Test (mit einer 
Prüfkonzentration und einer Kontrolle) durchgeführt werden. Mit dem 
Limit-Test soll nachgewiesen werden, dass der toxische Wert der Prüfsub ­
stanz über der getesteten Limitkonzentration liegt. Für diese Prüfmethode kann keine Konzentration empfohlen werden; dies bleibt den Regulierungs ­
behörden überlassen. In der Regel sind jeweils mindestens sechs Replikate 
pro Behandlung und Kontrolle erforderlich. Es ist nachzuweisen, dass die 
statistische Aussagekraft ausreicht, um bei einem Signifikanzniveau von 5 % (p = 0,05) eine Differenz von 20 % zur Kontrollkonzentration festzustellen. Für metrische Merkmale (Entwicklungsrate und Gewicht) ist der t-Test eine 
geeignete statistische Methode, sofern die Daten die Bedingungen für diesen 
Test (Normalverteilung, Varianzhomogenität) erfüllen. Sind diese Bedingun ­
gen nicht erfüllt, so kann ein t-Test für ungleiche Varianzen oder ein nicht-parametrischer Test wie der Wilcoxon-Mann-Whithey-Test verwendet 
werden. Für die Schlupfrate eignet sich der Exakte Test nach Fisher.
 
PRÜFVERFAHREN  
Expositionsbedingungen  
Zubereitung des Wasser-Sediment-Systems mit gespiktem Wasser  
22. In die Prüfgefäße wird formuliertes Sediment (siehe Nummern 13 und 14 
sowie Anlage 3) in ausreichender Menge gegebenen, um eine mindestens 
1,5 cm dicke Schicht zu erhalten, die anschließend mit 6 cm Wasser (siehe 
Nummer 15) überschichtet wird. Das Verhältnis von Sediment zu Wasser sollte nicht mehr als 1:4 und die Sedimenthöhe nicht mehr als 3 cm betra ­
gen. Das Sediment-Wasser-System sollte vor dem Einsetzen der Testorga ­
nismen für 7 Tage moderat belüftet werden (siehe Nummer 14 und Anlage 
3). Um zu verhindern, dass es während der Zugabe von Prüfwasser in die Wassersäule zu einer Auftrennung der Sedimentbestandteile und einer Re ­
suspension der feinen Partikel kommt, kann das Sediment beim Einfüllen 
des Wassers mit einer Plastikschale abgedeckt werden, die anschließend 
sofort entfernt wird. Andere Hilfsmittel sind ebenfalls geeignet.
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23. Die Prüfgefäße sollten abgedeckt werden (z. B. mit Glasplatten). Etwaige 
Verdunstungsverluste im Laufe des Versuchs sind auszugleichen, und zwar 
mit destilliertem oder entionisiertem Wasser, um Salzfreiheit zu gewährleis ­
ten. 
Einsetzen der Testorganismen  
24. Vier bis fünf Tage vor dem Einsetzen der Testorganismen in die Prüfgefäße 
werden Eigelege aus der Zucht entnommen und in kleinen Gefäßen in das Kulturmedium eingesetzt. Es kann „altes“ Medium aus den Stammkulturen oder frisch zubereitetes Medium verwendet werden. In letzterem Fall wird 
eine geringe Futtermenge, z. B. Grünalgen und/oder einige Tropfen des 
Filtrats einer Suspension aus fein zerkleinerten Fischfutterflocken, zum Kul ­
turmedium hinzugegeben (siehe Anlage 2). Es sollten nur frische Eigelege verwendet werden. Normalerweise beginnen die Larven einige Tage nach 
dem Einsetzen der Eier zu schlüpfen ( Chironomus riparius : 2 bis 3 Tage bei 
20 °C,  Chironomus tentans  und  Chironomus yoshimatsui : 1 bis 4 Tage bei 
23 °C bzw. 25 °C) und durchlaufen während ihres Wachstums vier Stadien von jeweils 4 bis 8 Tagen. Für den Versuch sollten Larven des ersten 
Larvenstadiums (L1) (2 bis 3 Tage oder 1 bis 4 Tage nach dem Schlüpfen) 
verwendet werden. Das Larvenstadium kann anhand der Kopfkapselbreite bestimmt werden (6).
 
25. Jeweils 20 L1-Larven werden nach dem Zufallsprinzip mit einer stumpfen 
Pipette in die einzelnen Prüfgefäße eingesetzt, die das gespikte Sediment 
und Wasser enthalten. Während des Einsetzens der Larven in das Prüfgefäß 
und der folgenden 24 Std. (siehe Nummern 24 und 32) wird die Belüftung gestoppt. Je nach Versuchsaufbau (siehe Nummern 19 und 20) werden pro Konzentration mindestens 60 Larven zur Bestimmung der 
EC-Punktschätzung und mindestens 80 Larven zur Bestimmung der 
NOEC-Werte verwendet.
 
26. 24 Std. nach dem Einsetzen der Larven wird die Prüfsubstanz in die Wasser ­
säule gespikt, und es wird erneut leicht belüftet. Kleine Mengen der Prüf ­
substanz werden mit Hilfe einer Pipette unterhalb der Oberfläche der Was ­
sersäule injiziert. Anschließend sollte das Überstandswasser vorsichtig ge ­
mischt werden, um das Sediment nicht aufzuwirbeln.  
Prüfkonzentrationen  
27. Zur Ermittlung des Konzentrationsbereichs für den endgültigen Test kann 
ein Vorversuch hilfreich sein. Hierzu wird eine Reihe von weit auseinander 
liegenden Konzentrationen der Prüfsubstanz verwendet. Um dieselbe Be ­
siedlungsdichte der Oberfläche durch die Chironomiden wie im eigentlichen Versuch zu reproduzieren, werden die Chironomiden jeder Konzentration 
der Prüfsubstanz über einen Zeitraum ausgesetzt, mit dem sich die geeig ­
neten Prüfkonzentrationen ermitteln lassen; Replikate sind nicht erforderlich.
 
28. Die Prüfkonzentrationen für den endgültigen Test werden auf der Grundlage 
der Ergebnisse des Vorversuchs festgelegt. Es sollten mindestens fünf Kon ­
zentrationen (siehe Nummern 18 bis 20) ausgewählt und verwendet werden.  
Kontrollgefäße  
29. In den Versuch sind Kontrollgefäße mit unbehandeltem Sediment und einer 
ausreichenden Anzahl von Replikaten einzubeziehen (siehe Nummern 19 und 20). Wurde die Prüfsubstanz mit Hilfe eines Lösungsmittel appliziert 
(siehe Nummer 16), so ist ein Kontrollgefäß hinzuzufügen, dessen Sediment 
das Lösungsmittel enthält.
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Prüfsystem  
30. Es werden statische Prüfsysteme verwendet. Semi-statische oder Durchfluss ­
systeme, bei denen das Überstandswasser in bestimmten Intervallen bzw. kontinuierlich ersetzt wird, können in Ausnahmefällen verwendet werden, z. 
B. wenn die Spezifikationen zur Wasserqualität für den Testorganismus 
nicht mehr geeignet sind oder sich auf das chemische Gleichgewicht aus ­
wirken (z. B. wenn die Konzentration an gelöstem Sauerstoff zu stark abnimmt, die Konzentration der Ausscheidungen zu stark zunimmt oder 
aus dem Sediment ausgewaschene Mineralien den pH-Wert und/oder die 
Wasserhärte beeinflussen). Allerdings reichen andere Methoden zur Verbes ­
serung der Qualität des Überstandswassers wie die Belüftung aus und sollten 
bevorzugt angewendet werden.
 
Futter  
31. Die Larven sollten täglich, mindestens jedoch dreimal pro Woche gefüttert 
werden. Für jüngere Larven scheinen in den ersten 10 Tagen 0,25-0,5 mg 
(0,35-0,5 mg für  C. yoshimatui ) Fischfutter (in Wasser suspendiertes oder 
fein zerkleinertes Futter, z. B. TetraMin oder TetraPhyll; Einzelheiten siehe Anlage 2) pro Larve und Tag angemessen. Ältere Larven benötigen etwas 
mehr Nahrung: Für den Rest des Versuchs dürften 0,5-1 mg Futter pro 
Larve und Tag ausreichen. Bei Pilzbesatz oder Absterben von Kontrollorga ­
nismen wird die Futterration für alle behandelten Organismen und Kontroll ­
organismen reduziert. Lässt sich die Pilzentwicklung nicht stoppen, muss 
der Versuch wiederholt werden. Bei Versuchen mit stark adsorbierenden 
Substanzen (z. B. log K
 ow > 5) oder kovalent an das Sediment gebundenen 
Substanzen kann dem formulierten Sediment die für das Überleben und natürliche Wachstum der Organismen erforderliche Futtermenge vor der 
Stabilisierungsphase hinzugefügt werden. In diesem Fall wird das Fischfutter 
durch pflanzliches Material ersetzt, z. B. durch Zugabe von 0,5 % (Tro ­
ckengewicht) feingeriebene Blätter z. B. von Brennnessel ( Urtica dioica ), 
Maulbeere ( Morus alba ), Weiß-Klee ( Trifolium repens ) oder Spinat ( Spina­
cia oleracea ) oder von sonstigem pflanzlichen Material ( Cerophyl  oder 
Alphacellulose).
 
Inkubationsbedingungen  
32. Das Überstandswasser in den Prüfgefäßen wird vorzugsweise 24 Std. nach 
dem Einsetzen der Larven über den gesamten Versuchszeitraum moderat belüftet (Es ist darauf zu achten, dass die Konzentration an gelöstem Sauer ­
stoff nicht unter 60 % des Luftsauerstoff-Sättigungswertes fällt). Für die 
Belüftung (eine oder mehrere Blasen/sek.) wird eine Glaspasteurpipette 2 
bis 3 cm über der Sedimentschicht angebracht. Bei flüchtigen Prüfsubstan ­
zen ist gegebenenfalls von einer Belüftung des Sediment-Wasser-Systems abzusehen.
 
33. Der Test wird bei einer konstanten Raumtemperatur von 20 °C (± 2 °C) 
durchgeführt. Für  C. tentans  und  C. yoshimatsui  wird eine Temperatur von 
23 °C bzw. 25 °C (± 2 °C) empfohlen. Die Photoperiode beträgt 16 Std. und die Beleuchtungsstärke 500 bis 1 000 lux.
 
Expositionsdauer  
34. Die Exposition beginnt mit dem Einsetzen der Larven in die Gefäße mit 
dem gespikten Wasser und in die Kontrollgefäße. Die maximale Expositi ­
onsdauer beträgt 28 Tage für  C. riparius  und C yoshimatsui  und 65 Tage für  
C. tentans . Falls die Mücken früher schlüpfen, kann der Versuch frühestens 
fünf Tage nach dem Schlüpfen der letzten Kontrollimago beendet werden.  
BEOBACHTUNGEN  
Emergenz  
35. Es werden die Entwicklungsdauer und die Anzahl der vollständig geschlüpf ­
ten männlichen und weiblichen Mücken bestimmt. Männchen sind leicht an 
den gefiederten Antennen zu erkennen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1262
 
36. Die Prüfgefäß sollten dreimal wöchentlich visuell auf Verhaltensänderungen 
(z. B. Verlassen des Sediments, ungewöhnliches Schwimmverhalten) gegen ­
über den Kontrollgefäßen überprüft werden. Während der Schlupfzeit müs ­
sen täglich die geschlüpften Tiere gezählt werden. Geschlecht und Anzahl der vollständig geschlüpften Mücken sind täglich festzuhalten. Danach wer ­
den die geschlüpften Mücken aus den Prüfgefäßen entfernt. Vor dem Ver ­
suchsende abgelegte Eigelege sind im Protokoll zu vermerken und anschlie ­
ßend zu entfernen, um zu verhindern, dass erneut Larven in das Sediment gelangen. Die Anzahl der sichtbaren Puppen, die nicht geschlüpft sind, wird 
ebenfalls protokolliert. Anweisungen zur Messung der Emergenz sind An ­
lage 5 zu entnehmen.
 
Wachstum und Überleben  
37. Müssen Daten zum Überleben und Wachstum der Larven nach 10 Tagen 
ermittelt werden, so sollten bereits ab Versuchsbeginn zusätzliche Prüfge ­
fäße hinzugefügt werden, die dann später verwendet werden können. Das Sediment aus diesen zusätzlichen Gefäßen wird durch ein 250- μm-Sieb 
gesiebt, um die Larven auszusieben. Kriterien zur Bestimmung des Todes 
sind Bewegungslosigkeit oder mangelnde Reaktion auf mechanische Reize. Nicht wiedergefundene Larven sollten auch zu den Todesfällen gerechnet werden (Larven, die zu Versuchsbeginn gestorben sind, wurden möglicher ­
weise durch Mikroben zersetzt). Nachdem das (aschefreie) Trockengewicht 
der überlebenden Larven pro Prüfgefäß bestimmt wurde, wird das mittlere Trockengewicht der einzelnen Larven pro Prüfgefäß berechnet. Es ist nütz ­
lich festzustellen, zu welchem Larvenstadium die überlebenden Larven ge ­
hören, was anhand der Kopfkapselbreite der einzelnen Larven bestimmt 
werden kann.
 
Analysemessungen  
Konzentration der Prüfsubstanz  
38. Es wird unbedingt empfohlen, zu Beginn (vorzugsweise 1 Stunde nach 
Applikation der Prüfsubstanz) und am Ende des Versuchs Proben des Über ­
standswassers, des Porenwassers und des Sediments zumindest in der Höchstkonzentration und einer niedrigeren Konzentration zu analysieren. 
Diese Bestimmung der Konzentration der Prüfsubstanz gibt Aufschluss 
über das Verhalten/die Verteilung der Prüfsubstanz im Wasser-Sediment- System. Die Entnahme von Sedimentproben zu Versuchsbeginn kann das Prüfsystem beeinflussen (Entfernen von Testlarven), so dass zusätzliche 
Prüfgefäße vorzusehen sind, um die Analysemessungen zu Beginn und ge ­
gebenenfalls während des Versuchs (siehe Nummer 39) vorzunehmen. Es ist nicht unbedingt notwendig, das Sediment zu analysieren, wenn die Vertei ­
lung der Prüfsubstanz zwischen Wasser und Sediment eindeutig in einer 
unter vergleichbaren Bedingungen durchgeführten Wasser/Sediment-Studie 
bestimmt wurde (z. B. Sediment-Wasser-Verhältnis, Applikationsart, Gehalt an organischem Kohlenstoff im Sediment).
 
39. Falls Zwischenmessungen (z. B. am 7. Tag) vorgenommen werden und für 
die Analyse größere Proben erforderlich sind, die nicht aus den Prüfgefäßen 
entnommen werden können, ohne das Testsystem zu beeinflussen, sollten die Analysemessungen an Proben aus zusätzlichen Prüfgefäßen vorgenom ­
men werden, die derselben Behandlung (einschließlich Präsenz von Test ­
organismen) unterzogen, aber nicht für biologische Beobachtungen verwen ­
det wurden.
 
40. Eine 30-minütige Zentrifugation bei z. B. 10 000 g und 4 °C wird empfoh ­
len, um das Interstitialwasser abzutrennen. Bei Prüfsubstanzen, die nach ­
weislich nicht an Filtern anlagern, kann auch filtriert werden. Bei zu kleinen 
Proben kann es passieren, dass sich die Konzentrationen im Porenwasser 
nicht analysieren lassen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1263
 
Physikalisch-chemische Parameter  
41. pH-Wert, Gehalt an gelöstem Sauerstoff im Prüfwasser und Temperatur der 
Prüfgefäße sind auf geeignete Weise zu messen (siehe Nummer 10). Zu Beginn und am Ende des Versuchs sind Härte und Ammonium-Gehalt in 
den Kontrollgefäßen und in einem Prüfgefäß in der Höchstkonzentration zu 
bestimmen.
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Auswertung der Ergebnisse  
42. Ziel dieses Versuchs ist, die Wirkung der Prüfsubstanz auf die Entwick ­
lungsrate und die Gesamtanzahl der vollständig geschlüpften männlichen 
und weiblichen Mücken bzw. im Falle des 10-Tage-Versuchs die Wirkun ­
gen auf Überleben und Gewicht der Larven zu bestimmen. Gibt es keinerlei Hinweise auf eine unterschiedliche Empfindlichkeit der Geschlechter, wer ­
den die Ergebnisse für Männchen und Weibchen für die statistischen Ana ­
lysen gepoolt. Unterschiedliche Empfindlichkeiten der Geschlechter können 
statistisch z. B. anhand eines Tafeltests mit χ
 2 -r × 2 bewertet werden. Er ­
forderlichenfalls sind nach 10 Tagen Daten zur Überlebensrate der Larven 
und zum mittleren Trockengewicht der einzelnen Larven pro Prüfgefäß zu 
ermitteln.  
43. Die als Konzentration im Überstandswasser ausgedrückten Effektkonzentra ­
tionen sind möglichst auf der Grundlage der zu Testbeginn gemessenen Konzentrationen (siehe Nummer 38) zu berechnen.
 
44. Für eine Punktschätzung von EC  50 oder einem anderen EC  x können die pro 
Gefäß erstellten Statistiken als echte Replikate dienen. Bei der Berechnung eines Konfidenzintervalls für einen beliebigen EC
 x -Wert ist die Variabilität 
zwischen den Gefäßen zu berücksichtigen oder nachzuweisen, dass diese 
Variabilität so klein ist, dass sie übergangen werden kann. Wird das Modell nach der Methode der geringsten Abweichungsquadrate angepasst, so sollten die pro Gefäß erstellten Statistiken transformiert werden, um die Varianz ­
homogenität zu verbessern. Allerdings werden die EC
 x -Werte berechnet, 
nachdem die Ergebnisse auf den ursprünglichen Wert rücktransformiert wur ­
den. 
45. Wenn die statistische Analyse darauf abzielt, NOEC/LOEC-Werte anhand 
von Hypothesentests zu bestimmen, so ist die Variabilität zwischen den 
Prüfgefäßen zu berücksichtigen, z. B. mit Hilfe einer geschachtelten (nested) 
Varianzanalyse (ANOVA). Alternativ können in den Fällen, in denen von den herkömmlichen ANOVA-Annahmen abgewichen wird, robustere Tests (21) angewendet werden.
 
Schlupfrate  
46. Schlupfraten sind quantale Daten und können anhand des 
Cochran-Armitage-Tests im Step-Down-Verfahren analysiert werden, wenn eine monotone Dosis-Antwort erwartet wird und die Schlupfdaten dieser 
Erwartung entsprechen. Andernfalls können ein Exakter Test nach Fisher 
oder ein Mantel-Haenszel-Test mit Bonferroni-Holm-angepassten p-Werten verwendet werden. Ist die Variabilität zwischen den Replikaten mit dersel ­
ben Konzentration nachweislich größer als eine Binomialverteilung ergeben 
würde (häufig als „extra-binomiale“ Variation bezeichnet), so sollte ein 
robusterer Test (Cochran-Armitage-Test oder Exakter Test nach Fisher), wie in (21) vorgeschlagen, angewendet werden.
 
47. Die Summe geschlüpfter Mücken (ne) je Prüfgefäß wird bestimmt und 
durch die Anzahl der eingesetzten Larven (na) dividiert:  
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1264
 
Dabei sind:  
ER = Schlupfrate  
n e = Anzahl der geschlüpften Mücken je Prüfgefäß  
n a = Anzahl der eingesetzten Larven je Prüfgefäß  
48. Eine alternative Methode, die sich bei größeren Proben im Falle einer 
extra-binomialen Varianz eher eignet, besteht darin, die Schlupfrate als kon ­
tinuierliche Antwort zu behandeln und Methoden wie den Williams-Test 
anzuwenden, wenn eine monotone Dosis-Antwort erwartet wird und die Schlupfraten dies bestätigen. Der Dunnett’s-Test eignet sich für den Fall, dass die Monotonie nicht anhält. Als große Probe gilt hier eine Probe, bei 
der die Anzahl der geschlüpften Mücken und die Anzahl der nicht ge ­
schlüpften Mücken jeweils mehr als fünf pro Replikat(gefäß) beträgt.
 
49. Für die Anwendung von ANOVA-Methoden sollten die ER-Werte zunächst 
einer arcsin-Wurzel-Transformation oder Freeman-Tukey-Transformation unterzogen werden, um annähernd normal verteilte Daten und Homogenität 
der Varianzen zu erreichen. Bei der Verwendung von absoluten Frequenzen 
können auch der Cochran-Armitage-, der Exakte Test nach Fisher (mit Bonferroni-Korrektur) oder der Mantel-Haenszel-Test angewendet werden. Bei der arcsin-Wurzel-Transformation wird die Umkehrfunktion des Sinus 
(sin
 –1 ) der Wurzel von ER berechnet.  
50. Für Schlupfraten werden die EC  x -Werte mittels Regressionsanalyse (oder z. 
B. mit der Probit- (22), Logit-, Weibull-Methode, geeigneter kommerzieller Software usw.) berechnet. Versagt die Regressionsanalyse (z. B. bei weniger als zwei Teilantworten), so werden andere nicht-parametrische Methoden 
wie die Berechnung des gleitenden Durchschnitts oder eine einfache Inter ­
polation angewendet.
 
Entwicklungsrate  
51. Die mittlere Entwicklungszeit repräsentiert die mittlere Zeitspanne zwischen 
dem Einsetzen der Larven (Tag 0 des Versuchs) und dem Schlupf der in die 
Prüfgefäße eingesetzten Mückenkohorten. (Für die Berechnung der reellen Entwicklungszeit ist das Alter der Larven beim Einsetzen in die Prüfgefäße 
zu berücksichtigen). Die Entwicklungsrate ist der Reziprokwert der Entwick ­
lungszeit (Einheit: 1/Tag) und repräsentiert den Teil der Larven, die sich pro Tag entwickeln. Für die Bewertung der Sedimenttoxizität ist die Entwick ­
lungsrate zu bevorzugen, da sie im Vergleich zur Entwicklungszeit eine 
geringere Varianz aufweist und ihre Werte homogener sind und näher an 
der Normalverteilung liegen. Aus diesem Grund eignen sich parametrische Verfahren mit großer Teststärke eher für die Entwicklungsrate als für die Entwicklungszeit. Wird die Entwicklungsrate als kontinuierliche Antwort 
behandelt, so können die EC
 x -Werte mittels Regressionsanalyse geschätzt 
werden (z. B. (23), (24)).  
52. Für folgende statistische Tests gilt die Anzahl der am Kontrolltag × be ­
obachteten Mücken als die Anzahl der Mücken, die in der Mitte des Zeit ­
intervalls zwischen dem Tag x und dem Tag x - l geschlüpft sind (l = Länge 
des Kontrollintervalls, gewöhnlich 1 Tag). Die mittlere Entwicklungsrate je 
Prüfgefäß berechnet sich folgendermaßen:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
Dabei sind:  
(x): mittlere Entwicklungsrate je Prüfgefäß  
i: Index des Kontrollintervalls  
m: maximale Anzahl der Kontrollintervalle  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1265
 
ƒ i : Anzahl der Mücken, die im Kontrollintervall i geschlüpft sind  
n e : Gesamtzahl der geschlüpften Mücken bei Versuchsende (=  P ƒ i ) 
x i : Entwicklungsrate der geschlüpften Mücken im Intervall i  
x i ¼ 1= Í 
Tag  i Ä l i 
2 Î 
Dabei sind:  
Tag  i : Kontrolltag (Tage seit der Applikation)  
l i : Länge des Kontrollintervalls i (Tage, in der Regel 1 Tag)  
Prüfbericht  
53. Der Prüfbericht muss mindestens folgende Angaben enthalten:  
Prüfsubstanz:  
— physikalischer Zustand und relevante physikalisch-chemische Eigen ­
schaften (Wasserlöslichkeit, Dampfdruck, Verteilungskoeffizient im Bo ­
den (oder — falls verfügbar — im Sediment), Stabilität im Wasser 
usw.);  
— chemische Kenndaten (Common name, chemische Bezeichnung, Struk ­
turformel, CAS-Nummer usw.) einschließlich Reinheitsgrad und Ana ­
lyseverfahren zur Quantifizierung der Prüfsubstanz.  
Testspezies:  
— eingesetzte Testtiere: Art, wissenschaftlicher Name, Bezugsquelle der 
Testorganismen und Zuchtbedingungen;  
— Informationen über die Handhabung der Eigelege und Larven;  
— Alter der Tiere beim Einsetzen in die Prüfgefäße.  
Prüfbedingungen:  
— verwendetes Sediment, d. h. natürliches oder formuliertes Sediment;  
— für natürliches Sediment: Ort und Beschreibung der Probenahmestelle(n) 
für das Sediment, möglichst einschließlich etwaiger früherer Kontamina ­
tionen; Merkmale: pH-Wert, Gehalt an organischem Kohlenstoff, C/N- 
Verhältnis und gegebenenfalls Granulometrie;  
— Zubereitung des formulierten Sediments: Zutaten und Merkmale (Gehalt 
an organischem Kohlenstoff, pH-Wert, Feuchte usw. zu Versuchs ­
beginn);  
— Zubereitung des Prüfwassers (falls rekonstituiertes Wasser verwendet 
wird) und Merkmale des Wassers (Sauerstoffgehalt, pH-Wert, Leitfähig ­
keit, Härte usw. zum Testbeginn);  
— Höhe des Sediments und des Überstandswassers;  
— Volumen des Überstandswassers und des Porenwassers; Gewicht des 
feuchten Sediments mit und ohne Porenwassers;  
— Prüfgefäße (Material und Größe);  
— Methode für die Zubereitung der Stammlösungen und Prüfkonzentratio ­
nen; ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1266
 
— Applikation der Prüfsubstanz: verwendete Prüfkonzentrationen, Anzahl 
der Replikate und gegebenenfalls Verwendung von Lösungsmitteln;  
— Inkubationsbedingungen: Temperatur, Lichtzyklus und Beleuchtungsstär ­
ke, Belüftung (Häufigkeit und Intensität);  
— genaue Angaben zur Fütterung, einschließlich Art des Futters, Präpara ­
tion des Futters, Futtermenge und Fütterungsregime.  
Ergebnisse:  
— die nominellen Prüfkonzentrationen, die gemessenen Prüfkonzentratio ­
nen und die Ergebnisse sämtlicher Analysen zur Bestimmung der Kon ­
zentration der Prüfsubstanz im Prüfgefäß;  
— Qualität des Wassers in den Prüfgefäßen, d. h. pH-Wert, Temperatur, 
Gehalt an gelöstem Kohlenstoff, Härte und Ammonium;  
— gegebenenfalls Ausgleich von Verdunstungsverlusten;  
— Anzahl der geschlüpften männlichen und weiblichen Mücken pro Gefäß 
und pro Tag;  
— Anzahl der Larven pro Gefäß, die sich nicht zu Mücken entwickelt 
haben;  
— mittleres Trockengewicht der einzelnen Larven pro Gefäß und gegebe ­
nenfalls pro Larvenstadium;  
— prozentuale Emergenzrate pro Replikat und Testkonzentration (männ ­
liche und weibliche Mücken gepoolt);  
— mittlere Entwicklungsrate von voll entwickelten Mücken pro Replikat 
und Behandlungsrate (männliche und weibliche Mücken gepoolt);  
— Schätzung der toxischen Endpunkte, z. B. EC  x (und dazugehörige Kon ­
fidenzintervalle), NOEC- und/oder LOEC-Werte und die zu ihrer Be ­
stimmung verwendeten statistischen Methoden;  
— Diskussion der Ergebnisse, einschließlich der Auswirkungen etwaiger 
Abweichungen von dieser Prüfmethode auf die Prüfergebnisse.  
LITERATUR:  
1. BBA (1995): Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Develop ­
ment and validation of a new test system. Herausgeber: M. Streloke und H. 
Köpp. Berlin 1995.  
2. Fleming R.  et al.  (1994): Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Abschlussbericht an die Europäische Kommission. Bericht Nr.: 
EC 3738. August 1994. WRc, UK.  
3. SETAC (1993): Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bio ­
assays for Freshwater and Marine Environments. Aus dem WOSTA-Workshop in den Niederlanden.
 
4. ASTM International/E1706-00 (2002): Test Method for Measuring the To ­
xicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, 
S. 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. 
Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
 
5. Environment Canada (1997): Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. Dezember 1997.  
6. US-EPA (2000): Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Zweite 
Ausgabe. EPA 600/R-99/064. März 2000. Überarbeitung der ersten Ausgabe 
vom Juni 1994.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1267
 
7. US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
8. US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
9. Milani D., Day K.E., McLeay D.J., Kirby R.S. (1996): Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxi ­
city using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chiro­
nomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada.
 
10. Sugaya Y. (1997): Intra-specific variations of the susceptibility of insectici ­
des in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.  
11. Kawai K. (1986): Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47-57.  
12. OECD (2000): Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publicati ­
ons, Series on Testing and Assessment No. 23.  
13. Environment Canada (1995): Guidance Document on Measurement of Toxi ­
city Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxi ­
cant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.  
14. Kapitel C.8 dieses Anhangs: Toxizität für Regenwürmer,  
15. Suedel B.C. and Rodgers J.H. (1994): Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163-1175.  
16. Naylor C. and Rodrigues C. (1995): Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291- 3303.
 
17. Dunnett C.W. (1964): A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121.  
18. Dunnett C.W. (1964): New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics 20: 482-491.  
19. Williams D.A. (1971): A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 
103-117.  
20. Williams D.A. (1972): The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics 28: 510-531.  
21. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992): A simple method for the analysis of 
clustered binary data. Biometrics 48:577-585.  
22. Christensen E.R. (1984): Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.  
23. Bruce and Versteeg (1992): A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494.  
24. Slob W: (2002): Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1268
 
Anlage 1  
DEFINITIONEN  
Für diese Prüfmethode gelten folgende Definitionen:  
Formuliertes Sediment  oder rekonstitutiertes, künstliches oder synthetisches Se ­
diment: ein Gemisch aus Stoffen, mit denen die physikalischen Bestandteile eines natürlichen Sediments nachgeahmt werden sollen.
 
Überstandswasser:  das auf das Sediment im Prüfgefäß aufgebrachte Wasser.  
Interstitialwasser  oder Porenwasser: das Wasser in den Zwischenräumen zwi ­
schen Sediment- und Bodenpartikeln.  
Gespiktes Wasser:  Wasser, dem Prüfsubstanz hinzugefügt wurde.  
Prüfsubstanz:  jeder Stoff oder jedes Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode 
getestet wird.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1269
 
Anlage 2  
Empfehlungen für die Anzucht von  Chironomus riparius  
1. Für die Anzucht von  Chironomus -Larven können Kristallisierschalen oder 
größere Behälter verwendet werden. Auf dem Boden des Behälters wird eine 5 bis 10 mm dicke Schicht feiner Quarzsand aufgetragen. Kieselguhr (z. B. Merck, Art 8117) hat sich ebenfalls als Substrat bewährt (eine dünnere 
Schicht von nur ein paar Millimetern ist ausreichend). Anschließend wird 
mit geeignetem Wasser auf mehrere Zentimeter Höhe aufgefüllt. Soweit erforderlich ist bei Verdunstungsverlusten Wasser nachzufüllen, um ein Aus ­
trocknen zu verhindern. Nötigenfalls kann das Wasser ausgetauscht werden. 
Leicht belüften. Die Larvenzuchtgefäße sind in geeignete Käfige zu setzen, 
um zu verhindern, dass die schlüpfenden Imagines entweichen. Der Käfig muss groß genug sein (Mindestgröße ca. 30 x 30 x 30 cm), damit die geschlüpften Imagines schwärmen können, da es andernfalls nicht zur Paa ­
rung kommt.
 
2. Die Käfige sind bei Raumtemperatur oder in einer Klimakammer bei 20 
± 2 °C und einer Licht-/Dunkelphase von 16:8 Std. (Lichtintensität ca. 1 000 
lux) zu halten. Eine relative Luftfeuchte von weniger als 60 % soll offen ­
sichtlich die Vermehrung verhindern.  
Verdünnungswasser  
3. Es kann jedes natürliche oder synthetische Wasser verwendet werden. Im 
Allgemeinen wird Brunnenwasser, entchlortes Leitungswasser und künst ­
liches Medium (z. B. Elendt-Medium „M4“ oder „M7“, siehe unten) ver ­
wendet. Das Wasser muss vor Verwendung belüftet werden. Soweit erfor ­
derlich kann das Anzuchtwasser durch vorsichtiges Abgießen oder Absau ­
gen des gebrauchten Wassers aus den Prüfgefäßen erneuert werden; dabei ist darauf zu achten, dass die Wohnröhren der Larven nicht zerstört werden.
 
Fütterung der Larven  
4. Chironomus -Larven sollten mit ca. 250 mg Fischfutterflocken (TetraMin®, 
TetraPhyll® oder einer anderen entsprechenden Fischfuttermarke) pro Gefäß und Tag gefüttert werden. Hierzu kann trockengemahlenes Pulver oder eine Suspension in Wasser (1,0 g Futterflocken mit 20 ml Verdünnungswasser zu 
einer homogenen Masse gemischt) verwendet werden. Diese Zubereitung 
kann in Portionen von 5 ml pro Gefäß und pro Tag verfüttert werden (vor Gebrauch schütteln). Ältere Larven können etwas mehr Futter erhalten.
 
5. Das Futter ist an die Wasserqualität anzupassen. Bei Trübung des Kultur ­
mediums ist die Futterration zu reduzieren. Die Futterzugaben sind sorgfältig 
zu notieren. Zu wenig Futter kann dazu führen, dass die Larven in die Wassersäule abwandern, während zu viel Futter die mikrobielle Aktivität 
verstärkt und die Sauerstoffkonzentrationen verringert. In beiden Fällen 
kann es zu einer Verlangsamung des Wachstums der Organismen kommen.
 
6. Wenn neue Kulturgefäße angesetzt werden, können auch einige Grünalgen ­
zellen (z. B.  Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris ) hinzugefügt wer ­
den. 
Fütterung der geschlüpften Imagines  
7. Einige Experimentatoren empfehlen, als Futter für die geschlüpften Imagines 
ein mit gesättigter Zuckerlösung getränktes Wattepad zu verwenden.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1270
 
Emergenz  
8. Nach ca. 13 bis 15 Tagen bei einer Temperatur von 20 ± 2 °C beginnen die 
Imagines in den Larvenzuchtgefäßen zu schlüpfen. Männchen sind leicht an den gefiederten Antennen zu erkennen.
 
Eiergelege  
9. Sobald sich Imagines in den Zuchtkäfigen befinden, sind alle Larvenzucht ­
gefäße dreimal wöchentlich auf gallertartige Eigelege zu kontrollieren. Diese sind vorsichtig zu entfernen und in eine kleine Schale mit einer Probe Anzuchtwasser umzusetzen. Mit den Eigelegen werden neue Kulturen an ­
gesetzt (z. B. 2 bis 4 Eigelege pro Gefäß) oder Toxizitätstests durchgeführt.
 
10. Nach 2 bis 3 Tagen sollten L1-Larven schlüpfen.  
Ansetzen neuer Kulturen  
11. Sobald die Zucht etabliert ist, sollte es möglich sein, je nach Prüfungsanfor ­
derungen wöchentlich oder weniger häufig frische Kulturen anzusetzen und 
die älteren Prüfgefäße nach dem Schlüpfen der Imagines zu entfernen. Auf diese Weise ist es möglich, mit nur geringem Aufwand ständig über Ima ­
gines zu verfügen.
 
Zubereitung der Prüflösungen M4 und M7  
12. Das Medium M4 wurde von Elendt (1990) beschrieben. Das Medium M7 
wird wie das Medium M4 zubereitet, mit Ausnahme der in Tabelle 1 an ­
gegebenen Substanzen, deren Konzentration bei M7 viermal niedriger ist als bei M4. Eine Veröffentlichung zum Medium M7 wird derzeit ausgearbeitet 
(Elendt, persönliche Mitteilung). Die Prüflösungen nicht nach den Anwei ­
sungen von Elendt und Bias (1990) zubereiten, da die für die Zubereitung der Stammlösungen angegebenen Konzentrationen von NaSiO
 3 5 H  2 O, Na­
NO  3 , KH  2 PO 4 und K  2 HPO  4 nicht geeignet sind.  
Herstellung des M7-Mediums  
13. Zunächst wird jede Stammlösung (I) einzeln zubereitet; diese Stammlösun ­
gen werden anschließend zu einer kombinierten Stammlösung (II) 
zusammengegossen (I) (siehe Tabelle 1). 50 ml der kombinierten Stammlösung (II) und die in Tabelle 2 angegebenen jeweiligen Mengen der Makronährstoffe werden zur Herstellung des M7-Mediums mit entioni ­
siertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt. Durch Zugabe von drei Vitaminen 
gemäß Tabelle 3 zu entionisiertem Wasser wird eine kombinierte Vitamin-Stammlösung hergestellt, von der 0,1 ml vor der Verwendung dem fertigen M7-Medium zugesetzt werden. (Die Vitaminstammlösung 
wird in kleinen Portionen tiefgefroren aufbewahrt). Das Medium wird be ­
lüftet und stabilisiert.
 
Tabelle 1  
Stammlösungen der Spurenelemente für das M4- und das M7-Medium  
Stammlösungen (I) Menge (mg), die 
mit entionisier ­
tem Wasser auf 1 
Liter aufgefüllt 
wird Zur Herstellung der kombinierten 
Stammlösung (II): Folgende Mengen 
(ml) der Stammlösungen (I) mischen 
und mit entionisiertem Wasser auf 1 
Liter auffüllen Endkonzentrationen der 
Prüflösungen (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 • 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1271
 
Stammlösungen (I) Menge (mg), die 
mit entionisier ­
tem Wasser auf 1 
Liter aufgefüllt 
wird Zur Herstellung der kombinierten 
Stammlösung (II): Folgende Mengen 
(ml) der Stammlösungen (I) mischen 
und mit entionisiertem Wasser auf 1 
Liter auffüllen Endkonzentrationen der 
Prüflösungen (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 • 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 • 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 • 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 • 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na2EDTA • 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO4 • 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Diese Stoffe sind in M4 und M7 unterschiedlich dosiert (siehe oben). 
( 2 ) Diese Lösungen werden einzeln hergestellt, zusammengegossen und sofort autoklaviert.  
Tabelle 2  
Makronährstoff-Stammlösung für das M4- und das M7-Medium  
Menge (mg), die mit 
entionisiertem Wasser 
auf 1 Liter aufgefüllt 
wird Zur Herstellung des M4- 
und des m7-Mediums zu ­
gesetzte Menge an Makro ­
nährstoff-Stammlösungen 
(ml/l) Endkonzentrationen 
der Prüflösungen M4 
und M7 
(mg/l)  
CaCl  2 • 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 • 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 • 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1272
 
Tabelle 3  
Vitamin-Stammlösung für das M4- und das M7-Medium  
Aus den drei Vitaminlösungen wird eine einzige Vitamin-Stammlösung hergestellt.  
Menge (mg), die mit 
entionisiertem Wasser 
auf 1 Liter aufgefüllt 
wird Zur Herstellung des M4- und 
des M7-Mediums zugesetzte 
Menge an 
Vitamin-Stammlösung 
(ml/l) Endkonzentrationen der 
Prüflösungen M4 und 
M7 
(mg/l)  
Thiaminhydrochlorid 750 0,1 0,075 
Cyanocobalamin (B  12 ) 10 0,1 0,0010 
Biotin 7,5 0,1 0,00075  
LITERATUR  
BBA (1995): Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development 
and validation of a new test system. Herausgegeben von M. Streloke und 
H.Köpp. Berlin 1995.  
Elendt B.P. (1990): Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25-33.  
Elendt B.P. and Bias W.-R. (1990): Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization 
of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1273
 
Anlage 3  
ZUBEREITUNG DES FORMULIERTEN SEDIMENTS  
Zusammensetzung des Sediments  
Das formulierte Sediment sollte die folgende Zusammensetzung haben:  
Bestandteil Charakterisierung % des Trockengewichts 
des Sediments  
Torf Sphagnum-Torf, so nahe wie 
möglich bei pH 5,5 bis 6,0, ohne sichtbare Pflanzenreste, fein gemahlen (Partikelgröße 
≤ 1 mm) und luftgetrocknet 4-5 
Quarzsand Korngröße: > 50 % der Par ­
tikel sollten Größen zwischen 
50 und 200 μm aufweisen 75-76 
Kaolin-Ton Kaolinit-Gehalt ≥ 30 % 20 
Organischer Kohlenstoff Eingestellt durch Zugabe von 
Torf und Sand 2 (± 0,5) 
Calciumcarbonat CaCO
 3 , pulverisiert, che ­
misch rein 0,05 - 0,1 
Wasser Leitfähigkeit ≤ 10 μS/cm 30 - 50  
Zubereitung  
Der Torf wird luftgetrocknet und zu feinem Pulver zermahlen. Die erforderliche 
Menge an Torfpulver wird mit Hilfe eines Hochleistungshomogenisators in en ­
tionisiertem Wasser suspendiert und durch Zugabe von CaCO  3 auf einen 
pH-Wert von 5,5 ± 0,5 eingestellt. Diese Suspension wird bei 20 ± 2 °C für mindestens zwei Tage unter sanftem Rühren konditioniert, um den pH-Wert zu 
stabilisieren und eine Etablierung der mikrobiellen Fauna zu ermöglichen. Der 
pH-Wert wird erneut bestimmt und sollte bei 6,0 ± 0,5 liegen. Nun werden die übrigen Komponenten (Sand und Kaolin-Ton) sowie entionisiertes Wasser zur Torf-Wasser-Suspension hinzugegeben und zu einem homogenen Sediment ver ­
mischt, dessen Wassergehalt 30 bis 50 % des Trockengewichts des Sediments 
betragen sollte. Der pH-Wert der fertigen Mischung wird erneut gemessen und erforderlichenfalls mit CaCO
 3 auf 6,5 bis 7,5 eingestellt. Sedimentproben neh ­
men, um das Trockengewicht und den Gehalt an organischem Kohlenstoff zu 
bestimmen. Es wird empfohlen, das formulierte Sediment vor dem Einsatz in 
einem Chironomiden-Toxizitätstest für sieben Tage unter denselben Bedingun ­
gen, wie sie im anschließenden Test herrschen, zu konditionieren.  
Lagerung  
Die trockenen Bestandteile für die Zubereitung des künstlichen Sediments kön ­
nen an einem trockenen und kühlen Ort bei Raumtemperatur gelagert werden. 
Das formulierte (feuchte) Sediment darf vor seiner Verwendung im Prüfversuch nicht gelagert werden. Es ist unmittelbar nach Ablauf der siebentägigen Kon ­
ditionierung, mit der die Zubereitung abschließt, zu verwenden.
 
LITERATUR:  
Kapitel C.8 dieses Anhangs: Toxizität für Regenwürmer.  
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998): 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tu ­
bificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. 
Safety 39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1274
 
Anlage 4  
Chemische Eigenschaften eines geeigneten Verdünnungswassers  
Substanz Konzentration  
Partikel < 20 mg/l 
Gesamtgehalt an organischen Kohlenstoffen < 2 mg/l Nichtionisiertes Ammonium < 1 μg/l 
Härte in CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Restchlor < 10 μg/l 
Gesamtgehalt an phosphororganischen Pestiziden < 50 ng/l Gesamtgehalt an chlororganischen Pestiziden plus po ­
lychlorierten Biphenylen < 50 ng/l 
Gesamtgehalt an organischem Chlor < 25 ng/l
 
(*) Wird jedoch ein Ionenaustausch zwischen den Härteionen und der Prüfsubstanz ver ­
mutet, ist Wasser geringerer Härte zu verwenden (und somit ist in diesem Fall das 
Elendt-Medium M4 zu vermeiden).  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1275
 
Anlage 5  
Empfehlungen für die Beobachtung des Schlüpfens der Chironomidenlarven  
Die Bechergläser werden ab dem 20. Tag bis zum Versuchsende mit Emergenz ­
fallen abgedeckt. Nachstehend ist ein Beispiel für eine derartige Falle abgebildet:
  
A: Nylongaze  
B: umgedrehte Plastikschalen  
C: Becherglas ohne Ausguss  D: abgedeckte Öffnungen für den Wasseraus ­
tausch  
E: Wasser  
F: Sediment  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1276
 
C.29  LEICHTE BIOLOGISCHE ABBAUBARKEIT — BESTIMMUNG 
VON CO  2 IN GESCHLOSSENEN FLASCHEN (HEADSPACE-TEST)  
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 310 (2006). Sie 
beschreibt ein Screening-Verfahren zur Bestimmung der leichten biologi ­
schen Abbaubarkeit von chemischen Substanzen und liefert ähnliche Infor ­
mationen wie die sechs Prüfmethoden (A bis F), die in Kapitel C.4 dieses Anhangs beschrieben sind. Daher kann eine chemische Substanz, die im 
Rahmen dieser Prüfmethode positive Ergebnisse zeigt, als leicht biologisch 
abbaubar und somit auch als unter Umweltbedingungen rasch zersetzbar angesehen werden.
 
2. Die anerkannte Methode zur Bestimmung der CO  2 -Entwicklung (1), die auf 
dem ursprünglichen Sturm-Test (2) zur Bestimmung der biologischen Ab ­
baubarkeit von organischen Substanzen durch Erfassung des durch die mi ­
krobielle Aktivität erzeugten Kohlendioxids basiert, ist in der Regel die erste Wahl für die Prüfung von im Wasser schwer löslichen Substanzen sowie 
von stark adsorbierenden Substanzen. Sie wird auch für lösliche (aber nicht 
flüchtige) Substanzen herangezogen, da die Kohlenstoffentwicklung von vielen als der einzige eindeutige Beweis für mikrobielle Aktivität angesehen wird. Eine Abnahme des gelösten organischen Kohlenstoffs (DOC) kann 
durch physikalisch-chemische Prozesse (Adsorption, Verflüchtigung, Aus ­
fällung, Hydrolyse) sowie durch mikrobielle Aktivität und zahlreiche nicht ­
biologische Reaktionen, die Sauerstoff verbrauchen, erreicht werden. Es ist selten, dass CO
 2 auf abiotische Weise aus organischen Substanzen entsteht. 
Beim ursprünglichen und modifizierten Sturm-Test (1)(2) wird CO  2 aus der 
Flüssigphase entfernt und durch  Sparging  (d. h. Durchblasen von behandel ­
ter Luft durch das flüssige Medium zur Entfernung des CO  2 ) in die Ad ­
sorptionsgefäße geleitet, während bei der Version von Larson (3)(4) das 
CO 2 aus dem Reaktionsgefäß in die Adsorptionsgefäße übergeleitet wird, 
indem CO  2 -freie Luft durch den Luftraum ( Headspace ) geblasen und dabei 
das Prüfgefäß kontinuierlich geschüttelt wird. Nur in der geänderten Version 
von Larson wird das Reaktionsgefäß geschüttelt; dagegen wird Rühren in 
der ISO-Norm 9439 (5) und in der ursprünglichen amerikanischen Version (6) ausschließlich für unlösliche Substanzen vorgeschrieben, wobei beide Versionen  Sparging  anstelle des  Headspace -Austausches vorsehen. In einer 
anderen offiziellen amerikanischen EPA-Methode (7), die auf der 
Gledhill-Methode (8) basiert, wird das Reaktionsgefäß geschüttelt und at ­
mosphärisch verschlossen. Das gebildete CO
 2 wird direkt aus der Gasphase 
in einem Alkali-Abscheider aufgefangen, wie bei den klassischen Warburg/ 
Barcroft-Respirometer-Kolben.  
3. Es hat sich jedoch bei der Anwendung des modifizierten Standard-Sturm- 
Tests auf eine Reihe von chemischen Substanzen gezeigt, dass anorgani ­
scher Kohlenstoff (IC) sich im Medium akkumuliert (9). Der Abbau von 20 
mg C/l Anilin ergab eine IC-Konzentration von 8 mg/l. Dies bedeutet, dass 
die Ansammlung von CO  2 im Alkali-Abscheider kein wahrheitsgetreues 
Bild der CO  2 -Menge liefert, die zwischenzeitlich während des Abbaus auf 
mikrobielle Weise erzeugt wird. Folglich wird die Auflage, wonach für die 
Einstufung einer Prüfsubstanz als „biologisch leicht abbaubar“ > 60 % der 
theoretisch maximalen Menge an CO  2 (ThCO  2 ) innerhalb eines „10-Tage- 
Fensters“ (der 10-Tage-Abschnitt, der unmittelbar auf das Erreichen von 10 % Abbau folgt) erreicht sein muss, für einige Substanzen nicht erreicht, 
die bei Zugrundelegung der DOC-Abnahme in dieser Kategorie eingestuft 
worden wären.
 
4. Ist der Abbaugrad niedriger als erwartet, so hat möglicherweise eine Akku ­
mulation des IC in der Prüflösung stattgefunden. In diesem Fall kann die 
biologische Abbaubarkeit nach anderen Verfahren zur Bestimmung der 
„leichten“ biologischen Abbaubarkeit bewertet werden.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1277
 
5. Andere Nachteile der Sturm-Methode (umständlich, zeitaufwändig, anfäl ­
liger für Versuchsfehler und nicht geeignet für flüchtige Substanzen) waren 
früher bereits der Anlass dafür, anstelle des Gasdurchflusssystems nach einer anderen Technik mit geschlossenen Gefäßen als der von Gledhill zu suchen (10)(11). Boatman et al (12) haben frühere Methoden überprüft und sich für 
ein System mit geschlossenem Luftraum entschieden, bei dem CO
 2 am Ende 
der Inkubation durch Ansäuerung des Mediums in den  Headspace  freige­
setzt wird. Das CO  2 wurde mittels Gaschromatografie (GC)/IC-Analyse in 
automatisch aus dem  Headspace  entnommenen Proben gemessen, wobei der 
gelöste anorganische Kohlenstoff (DIC) in der Flüssigphase jedoch nicht 
berücksichtigt wurde. Auch waren die verwendeten Gefäße sehr klein (20 ml) und fassten nicht mehr als 10 ml des Mediums, was sich als problema ­
tisch erwies, z. B. wenn zwangsläufig nur sehr kleine Mengen unlöslicher 
Prüfsubstanz hinzugefügt wurden. Auch kann es sein, dass das inokulierte 
Medium nicht genügend oder keine Mikroorganismen enthält, durch die die Prüfsubstanzen abgebaut werden konnten.
 
6. Diese Probleme wurden durch die unabhängigen Studien von Struijs und 
Stoltenkamp (13) und von Birch und Fletcher (14) überwunden, wobei 
letztere sich von ihren Erfahrungen mit den in Prüfmethoden für die anae ­
robe biologische Abbaubarkeit verwendeten Geräten hatten inspirieren las ­
sen (15). Bei der erstgenannten Methode (13) wird das CO  2 im Headspace  
nach Ansäuerung und Herstellung eines Gleichgewichtszustands bestimmt, 
während bei letztgenannter Methode (14) der DIC sowohl in der Gasphase als auch in der Flüssigphase ohne Behandlung bestimmt wird; über 90 % des gebildeten IC befanden sich in der Flüssigphase. Gegenüber dem 
Sturm-Test hatten beide Methoden den Vorteil, dass das Prüfsystem kom ­
pakter und leichter zu handhaben war, flüchtige Substanzen getestet werden können und dem Risiko einer Verzögerung bei der Bestimmung des gebil ­
deten CO
 2 zuvorgekommen wird.  
7. Diese beiden Konzepte wurden in der ISO-Norm für den CO  2 -Headspace - 
Test (16) miteinander kombiniert, die einem Ringtest unterzogen wurde (17) und die Grundlage für die vorliegende Prüfmethode bildet. Die beiden Kon ­
zepte wurden auch in der amerikanischen EPA-Methode (18) angewendet. 
Es wurden zwei Methoden für die CO
 2 -Bestimmung empfohlen: Bestim ­
mung des CO  2 im Headspace  nach Ansäuerung (13) und Bestimmung 
des IC in der Flüssigphase nach Zugabe von überschüssigem Alkali. Letz ­
tere Methode wurde von Peterson während des CONCAWE-Ringtests (19) 
dieser modifizierten  Headspace -Methode eingeführt, um die inhärente bio ­
logische Abbaubarkeit zu bestimmen. Die Änderungen, die im Rahmen der Revision 1992 (20) der in Kapitel C.4 dieses Anhangs beschriebenen Prüf ­
methoden für die „leichte“ biologische Abbaubarkeit vorgenommen wurden, 
sind in die vorliegende Prüfmethode einbezogen worden, so dass die Be ­
dingungen (Medium, Dauer usw.) im Übrigen die gleichen sind wie bei dem überarbeiteten Sturm-Test (20). Birch und Fletcher (14) haben nachgewie ­
sen, dass die mit dieser  Headspace -Prüfmethode erzielten Ergebnisse den im 
OECD-Ringtest (21) der überarbeiteten Prüfmethoden mit denselben Che ­
mikalien erzielten Ergebnisse sehr ähnlich sind.
 
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
8. Die Prüfsubstanz (in der Regel 20 mg/l Kohlenstoff) wird als einzige 
Kohlenstoff- und Energiequelle zu einem Mineralsalz-Puffermedium gege ­
ben, das mit einer Mischpopulation von Mikroorganismen beimpft wurde. 
Der Versuch wird in geschlossenen Gefäßen mit einem Luftraum ( Head­
space ) durchgeführt, der als Sauerstoffreservoir für den aeroben Abbau 
dient. Die aus dem vollständigen aeroben biologischen Abbau der Prüfsub ­
stanz resultierende CO  2 -Entwicklung wird bestimmt, indem der in den Prüf ­
flaschen gebildete überschüssige IC mit dem in den Blindwertgefäßen, die 
nur das Inokulum enthalten, verglichen wird. Der Abbaugrad wird als Pro ­
zentwert der theoretischen maximalen Menge an anorganischem Kohlenstoff (ThIC) ausgedrückt, die wiederum aus der ursprünglich zugegebenen Menge 
an Prüfsubstanz (als organischer Kohlenstoff) berechnet wird.
 
9. Die DOC-Abnahme und/oder der Primärabbau der Prüfsubstanz können 
ebenfalls bestimmt werden (20).  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1278
 
ANGABEN ZUR PRÜFSUBSTANZ  
10. Der Gehalt an organischem Kohlenstoff (Massenanteil) der Prüfsubstanz 
muss bekannt sein, sei es aufgrund ihrer chemischen Struktur oder durch Messung, damit der prozentuale Abbau berechnet werden kann. Bei flüch ­
tigen Prüfsubstanzen ist eine gemessene oder berechnete Henry-Konstante 
für die Bestimmung eines angemessenen Verhältnisses von  Headspace  zu 
Flüssigkeit hilfreich. Angaben über die Toxizität der Prüfsubstanz gegenüber Mikroorganismen sind wichtig für die Auswahl einer geeigneten Prüfkon ­
zentration und die Auslegung der Ergebnisse bei geringem Abbau: Es wird 
empfohlen, eine Hemmkontrolle vorzusehen, außer wenn bekannt ist, dass die Prüfsubstanz mikrobielle Aktivitäten nicht hemmt (siehe Nummer 24).
 
ANWENDUNGSBEREICH DER METHODE  
11. Diese Methode ist auf wasserlösliche und wasserunlösliche Substanzen an ­
wendbar, allerdings ist für eine gute Dispersion der Prüfsubstanz zu sorgen. Bei Anwendung des empfohlenen Verhältnisses von  Headspace  zu Flüssig ­
keit von 1:2 können flüchtige Substanzen mit einer Henry-Konstante von bis 
zu 50 Pa.m
 3 .mol  –1 getestet werden, da der Anteil der Prüfsubstanz im  Head­
space  höchstens 1 % beträgt (13). Ein kleineres  Headspace -Volumen kann 
für die Testung von Prüfsubstanzen mit höherer Flüchtigkeit verwendet 
werden, allerdings kann ihre Bioverfügbarkeit begrenzt sein, insbesondere 
wenn es sich um in Wasser schwer lösliche Substanzen handelt. Es ist jedoch sicherzustellen, dass das Verhältnis von  Headspace  zu Flüssigkeit 
und die Konzentration der Prüfsubstanz so bemessen sind, dass ein ausrei ­
chendes Volumen an Sauerstoff vorhanden ist, um einen vollständigen aer ­
oben biologischen Abbau zu ermöglichen (Eine hohe Konzentration an Prüf ­
substanz und ein kleines  Headspace -Volumen sollten z. B. vermieden wer ­
den). Leitlinien hierzu sind in (13)(23) zu finden.
 
REFERENZSUBSTANZEN  
12. Zur Kontrolle des Prüfverfahrens sollte parallel eine Referenzsubstanz ge ­
testet werden, deren biologische Abbaubarkeit bekannt ist. Zu diesem 
Zweck können Anilin, Natriumbenzoat oder Ethylenglykol bei der Testung 
von wasserlöslichen Substanzen und Octan-1-ol für schwer lösliche Prüf ­
substanzen verwendet werden (13). Der biologische Abbau dieser Substan ­
zen muss nach 14 Tagen > 60 % des ThIC erreichen.  
REPRODUZIERBARKEIT  
13. Der ISO-Ringtest der Prüfmethode (17), der unter den empfohlenen Bedin ­
gungen, einschließlich einer Prüfkonzentration von 20 mg/l Kohlenstoff, durchgeführt wurde, brachte folgende Ergebnisse:
 
Prüfsubstanz Mittelwert des pro ­
zentualen biologi ­
schen Abbaus 
(28d) Variationskoeffi ­
zient 
(%) Anzahl der Labo ­
ratorien  
Anilin 90 16 17 
Octan-1-ol 85 12 14  
Bei der Verwendung von Anilin war die Variabilität innerhalb desselben 
Tests (Reproduzierbarkeit) mit einem Variationskoeffizienten von maximal 5 % bei nahezu allen Testdurchläufen niedrig. In den beiden Fällen, in denen die Reproduzierbarkeit schlechter war, war die größere Variabilität 
wahrscheinlich der hohen IC-Produktion in den Blindwertansätzen zu ­
zuschreiben. Bei Octan-1-ol war die Reproduzierbarkeit schlechter, wobei die Variabilität jedoch in 79 % der Testdurchläufe weniger als 10 % betrug. Diese größere Variabilität innerhalb desselben Tests könnte auf Dosierfeh ­
lern beruhen, da ein kleines Volumen (3 bis 4 μl) Ocant-1-ol in die ge ­
schlossenen Prüfflaschen injiziert werden musste. Geringere Prüfsubstanz ­
konzentrationen würden höhere Variationskoeffizienten ergeben, insbeson ­
dere Konzentrationen von weniger als 10 mg/l Kohlenstoff. Dieses Problem 
lässt sich zum Teil dadurch beheben, dass die Konzentration des gesamten 
anorganischen Kohlenstoffs (TIC) im Inokulum reduziert wird.
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14. In einem EU-Ringtest (24) von fünf Tensiden in einer Konzentration von 10 
mg/l Kohlenstoff wurden folgende Ergebnisse erzielt:  
Prüfsubstanz Mittelwert des pro ­
zentualen biologi ­
schen Abbaus 
(28d) Variationskoef ­
fizient 
(%) Anzahl der La ­
boratorien  
Tetrapropylen 
benzolsulfonat 17 45 10 
Di-iso-Octylsulfosucci ­
nat 
(anionisch) 72 22 9 
Hexadecyl-tri ­
methyl (*)- ammoni ­
umchlorid 
(kationisch) 75 13 10 
Iso-Nonylphenol-(Et ­
hoxylat)  9 
(nichtionisch) 41 32 10 
Cocoamidopropyl- 
Dimethylhydroxy- Sulfobetain (amphoter) 60 23 11
 
(*) SiO  2 wurde zur Neutralisierung der Toxizität hinzugefügt.  
Die Ergebnisse zeigen, dass die Variabilität in der Regel bei den weniger 
gut abgebauten Tensiden höher war. Die Variabilität innerhalb desselben Tests betrug in über 90 % der Fälle weniger als 15 % und lag maximal 
bei 30 bis 40 %.
 
Anmerkung : Die meisten Tenside bestehen nicht nur aus einer Molekülart, 
sondern sind Mischungen aus Isomeren, Homologen usw., die nach verschiedenen lag-Phasen und mit unterschiedlicher kine ­
tischer Geschwindigkeit abbauen. Dies führt zu „verwischten“, 
abgeschwächten Kurven, so dass der Grenzwert von 60 % 
möglicherweise nicht innerhalb des „10-Tage-Fensters“ erreicht wird, selbst wenn jede einzelne Molekülart gesondert getestet den Wert von > 60 % innerhalb von 10 Tagen erreichen wür ­
de. Dies ist auch bei anderen komplexen Mischungen zu be ­
obachten.
 
BESCHREIBUNG DER PRÜFMETHODE  
Geräte  
15. Übliche Laborausrüstung und folgende Geräte:  
a) Glasserumflaschen, mit Butylgummisepten und Aluminiumkrampen ver ­
schließbar. Empfohlen wird eine Größe von 125 ml bei einem Flaschen ­
volumen von ca. 160 ml (In diesem Fall muss das Volumen der einzel ­
nen Flaschen 160 ± 1 ml betragen). Kleinere Gefäße können verwendet werden, wenn die Ergebnisse den Bedingungen unter den Nummern 66 
und 67 entsprechen;
 
b) Kohlenstoffanalysator oder sonstiges Gerät zur Bestimmung des anorga ­
nischen Kohlenstoffs (z. B. Gaschromatograph);  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1280
 
c) Präzisionsspritzen für Gas- und Flüssigproben;  
d) Orbitalschüttler in temperaturkontrollierter Umgebung;  
e) Vorrichtung für die Zufuhr von CO  2 -freier Luft — Hierzu kann Luft 
über Natronkalkgranulat oder durch eine Gasmischung aus 80 % N  2 
und 20 % 0  2 geleitet werden (optional) (siehe Nummer 28);  
f) Filtrationsvorrichtung mit Membranfilter (Porenweite zwischen 0,20 μm 
und 0,45 μm) (optional);  
g) Analysator zur Bestimmung des organischen Kohlenstoffs (optional).  
Reagenzien  
16. Nur Reagenzien des Reinheitsgrades „zur Analyse“ verwenden.  
Wasser  
17. Wasser, destilliert oder entionisiert, mit weniger als 1 mg/l an gesamtem 
organischem Kohlenstoff. Dies entspricht ≤ 5 % des durch die empfohlene 
Prüfsubstanzdosis bedingten ursprünglichen Gehalts an organischem Koh ­
lenstoff.  
Stammlösungen für das Mineralsalzmedium  
18. Die Stammlösungen und das Mineralsalzmedium sind mit denen der 
ISO-Norm 14593 (16) und der C.4-Prüfmethoden zur Bestimmung der „leichten“ biologischen Abbaubarkeit (20) vergleichbar. Höhere Konzentra ­
tionen an Ammoniumchlorid (2,0 g/l anstelle von 0,5 g/l) sollten nur in ganz 
besonderen Ausnahmefällen erforderlich sein, z. B. bei einer Prüfsubstanz ­
konzentration von > 40 mg/l Kohlenstoff. Stammlösungen sind gekühlt zu lagern und werden nach sechs Monaten oder bei festgestellten Niederschlä ­
gen oder mikrobiellem Wachstum früher verworfen. Folgende Stammlösun ­
gen zubereiten:
 
a) Kaliumdihydrogenorthophosphat (KH  2 PO 4 ) 8,50 g  
Dikaliummonohydrogenorthophosphat (K  2 HPO  4 ) 21,75 g  
Dinatriummonohydrogenorthophosphat-Dihydrat (Na  2 HPO  4 ·2H 2 O) 33,40 g  
Ammoniumchlorid (NH  4 Cl) 0,50 g  
In Wasser lösen und auf 1 Liter auffüllen. Der pH-Wert der Lösung 
sollte bei 7,4 (± 0,2) liegen. Wenn dies nicht der Fall ist, eine neue Lösung herstellen.
 
b) Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl  2 ·2H 2 O) 36,40 g  
In Wasser lösen und auf 1 Liter auffüllen.  
c) Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO  4 ·7H 2 O) 22,50 g  
In Wasser lösen und auf 1 Liter auffüllen.  
d) Eisen(III)chlorid-Hexahydrat (FeCl  3 ·6H 2 0) 0,25 g  
In Wasser lösen und auf 1 Liter auffüllen und einen Tropfen 
HCl-Konzentrat hinzufügen.  
Zubereitung des mineralischen Mediums  
19. 10 ml Lösung (a) mit 800 ml Wasser (Nummer 17) mischen, je 1 ml der 
Lösungen b), c) und d) hinzugeben und mit Wasser auf 1 Liter auffüllen (Nummer 17).
 
Andere Reagenzien  
20. Konzentrierte Orthophosphorsäure (H  3 PO 4 ) (> 85 % Masse pro Volumen).  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1281
 
Natriumhydroxid-Lösung 7M  
21. 280 g Natriumhydroxid (NaOH) in 1 Liter Wasser (Nummer 17) lösen. Die 
Konzentration an gelöstem anorganischem Kohlenstoff (DIC) bestimmen und diesen Wert bei der Berechnung des Testergebnisses berücksichtigen 
(siehe Nummern 55 und 61), insbesondere im Hinblick auf das Validitäts ­
kriterium unter Nummer 66 b). Eine frische Lösung zubereiten, wenn die DIC-Konzentration zu hoch ist.
 
Prüfsubstanz  
22. Bei ausreichend wasserlöslichen Prüfsubstanzen eine Stammlösung in Was ­
ser (Nummer 17) oder im Testmedium (Nummer 19) herstellen. Die Kon ­
zentration sollte möglichst 100-mal größer sein als die im Versuch verwen ­
dete endgültige Konzentration. Es kann erforderlich sein, den pH-Wert ein ­
zustellen. Ein ausreichendes Volumen der Stammlösung zum mineralischen 
Medium geben, um eine TOC-Konzentration zwischen 2 und 40 mg/l Koh ­
lenstoff, vorzugsweise jedoch 20 mg/l Kohlenstoff zu erhalten. Bei gerin ­
geren Konzentrationen kann es sein, dass sich die Genauigkeit verschlech ­
tert. Lösliche und nicht lösliche flüssige Substanzen können direkt mit Hilfe 
von Präzisionsspritzen in die Gefäße gegeben werden. Für schwer oder nicht lösliche Prüfsubstanzen kann eine besondere Behandlung erforderlich sein (25). Folgende Techniken stehen zur Wahl:
 
a) Direkteinwaage;  
b) Ultraschalldispersion vor Zugabe der Prüfsubstanz;  
c) Dispersion mit Hilfe eines Emulgiermittels; vor Zugabe des Mittels ist 
festzustellen, ob es sich hemmend oder stimulierend auf die mikrobielle Aktivität auswirkt;
 
d) Adsorption von flüssigen Prüfsubstanzen oder einer mit einem geeig ­
neten Lösungsmittel hergestellten Lösung an ein inertes Medium oder inertes Trägermaterial (z. B. Glasfaserfilter) mit anschließender Verdamp ­
fung des Lösungsmittels (sofern eines verwendet wurde) und Direktein ­
waage;
 
e) Zugabe eines bekanntes Volumens einer Lösung der Prüfsubstanz in 
einem leicht flüchtigen Lösungsmittel in ein leeres Prüfgefäß mit an ­
schließender Verdampfung des Lösungsmittels.  
Bei den für die Techniken c), d) und e) verwendeten Vermittlern und 
Lösungsmitteln ist zu testen, ob sie sich stimulierend oder hemmend auf 
die mikrobielle Aktivität auswirken (siehe Nummer 42 b).)  
Referenzsubstanz  
23. Eine Stammlösung der (löslichen) Referenzsubstanz in Wasser (Nummer 17) 
in einer Konzentration zubereiten, die möglichst 100-mal größer ist als die 
im Versuch zu verwendende endgültige Konzentration (20 mg/l Kohlen ­
stoff).  
Hemmkontrolle  
24. Es kommt häufig vor, dass unter den Bedingungen, die für die Beurteilung 
des leichten biologischen Abbaus zugrunde gelegt werden, kein signifikanter 
Abbau der Prüfsubstanzen festzustellen ist. Eine mögliche Ursache ist, dass 
sich die Prüfsubstanz in der Konzentration, in der sie im Test aufgetragen wird, hemmend auf das Inokulum auswirkt. Eine Hemmkontrolle kann in den Versuchsaufbau einbezogen werden, um (rückblickend) eine Hemmung 
als mögliche Ursache oder beitragenden Faktor leichter ausmachen zu kön ­
nen. Die Hemmkontrolle kann auch dazu dienen, derartige Interferenzen auszuschließen und nachzuweisen, dass der nicht stattgefundene oder schwa ­
che Abbau ausschließlich auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass die 
Mikroorganismen die Prüfsubstanz unter den Prüfbedingungen nicht angrei ­
fen. Um Informationen über die Toxizität der Prüfsubstanz gegenüber (aer ­
oben) Mikroorganismen zu erhalten, eine Lösung aus Prüfsubstanz und Referenzsubstanz (Nummer 19) im Prüfmedium herstellen, dabei für beide 
Substanzen jeweils dieselbe Konzentration wie die im Versuch zugefügte 
Konzentration verwendeten (siehe Nummern 22 und 23).
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1282
 
Inokulum  
25. Das Inokulum kann aus verschiedenen Quellen gewonnen werden: aus Be ­
lebtschlamm, aus Kläranlagenablauf (nicht chloriert), aus Oberflächenwas ­
ser, aus Böden oder aus mehreren dieser Quellen zugleich (20). Die Abbau ­
aktivität der Quelle sollte mit Hilfe einer Referenzsubstanz überprüft wer ­
den. Ungeachtet der Quelle sollten vorexponierte Mikroorganismen nicht eingesetzt werden, wenn das Verfahren als Test für leichte biologische Abbaubarkeit verwendet werden soll.
 
Warnung: Belebtschlamm, Abwasser und Kläranlagenablauf können patho ­
gene Organismen enthalten und sind daher mit Vorsicht zu hand ­
haben.  
26. Das für das Inokulum optimale Volumen ist erfahrungsgemäß das Volumen, 
das 
— ausreicht, um eine genügende Abbauaktivität zu ermöglichen;  
— die Referenzsubstanz zum vorgesehenen Prozentgrad abbaut (siehe 
Nummer 66);  
— zwischen 10  2 und 10  5 koloniebildende Einheiten je ml Endgemisch 
ergibt;  
— üblicherweise 4 mg/l suspendierte Stoffe aus Belebtschlamm im Endge ­
misch ergibt (höhere Konzentrationen bis zu 30 mg/l sind möglich, können aber zu einem deutlichen Anstieg der CO
 2 -Produktion in den 
Blindwerten führen (26));  
— eine Menge von weniger als 10 % der ursprünglichen Konzentrationen 
an organischem Kohlenstoff der zugegebenen Prüfsubstanz liefert;  
— in der Regel 1-10 ml Inokulum für 1 Liter Testlösung beträgt.  
Belebtschlamm  
27. Eine Belebtschlammprobe ist dem Belebungsbecken einer Kläranlage oder 
dem Belüftungsgefäß einer Laborkläranlage, die hauptsächlich kommunale Abwässer behandeln, frisch zu entnehmen. Falls erforderlich, sind grobe Partikel durch ein feinmaschiges Sieb (z. B. mit 1 mm
 2 Siebmaschengröße) 
auszusieben; danach ist der Schlamm bis zur Verwendung aerob zu halten.  
28. Eine andere Möglichkeit besteht darin, den Schlamm nach Abtrennung gro ­
ber Partikel absitzen zu lassen oder zu zentrifugieren (z. B. 10 Min. bei 
1 100 g). Der Überstand wird verworfen und der Schlamm kann im mi ­
neralischen Medium gewaschen werden. Der konzentrierte Schlamm wird in einem mineralischen Medium suspendiert, um eine Konzentration von 3 bis 5 g suspendierte Feststoffe pro Liter zu erhalten. Anschließend wird bis zur 
Verwendung belüftet.
 
29. Der Schlamm sollte von einer gut arbeitenden konventionellen Anlage ge ­
nommen werden. Wenn Schlamm aus einer Abwasserkläranlage verwendet 
werden muss, der vermutlich Substanzen mit hemmender Wirkung enthält, 
ist er zu waschen. Dazu lässt man den resuspendierten Schlamm nach gründlichem Durchmischen absitzen oder zentrifugiert ihn, verwirft anschlie ­
ßend den Überstand und suspendiert den gewaschenen Schlamm in einem 
weiteren Volumen mineralischen Mediums erneut. Diese Schritte sind so 
lange zu wiederholen, bis der Schlamm als frei von übermäßigem Substrat oder Hemmsubstanz angesehen wird.
 
30. Nach vollständiger Resuspension oder bei unbehandeltem Schlamm ist un ­
mittelbar vor Gebrauch das Trockengewicht der suspendierten Feststoffe zu bestimmen.
 
31. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Homogenisierung von Belebt ­
schlamm (3 bis 5 g suspendierte Feststoffe pro Liter). Dazu wird der 
Schlamm 2 Min. bei mittlerer Geschwindigkeit in einer mechanischen Mischvorrichtung durchmischt. Danach lässt man den durchmischten Schlamm 30 Min., wenn erforderlich länger, absitzen und dekantiert die 
als Inokulum zu verwendende Flüssigkeit im Verhältnis von 10 mg pro 
Liter mineralischen Mediums.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1283
 
32. Eine weitere Reduzierung der CO  2 -Entwicklung in den Blindwertansätzen 
kann erreicht werden, indem der Schlamm über Nacht mit CO  2 -freier Luft 
belüftet wird. Als Inokulumkonzentration in diesem Versuch 4 mg/l Belebt ­
schlammfeststoffe verwenden (13).  
Sekundärabwasserablauf  
33. Alternativ kann das Inokulum aus dem Sekundärablauf einer Kläranlage 
oder einer Laborkläranlage entnommen werden, in der vor allem kommunale Abwässer behandelt werden. Die Probe aerob halten und am Tag der Pro ­
benahme verwenden oder, falls erforderlich, eine Vorkonditionierung vor ­
nehmen. Die Ablaufprobe filtrieren, um grobe Partikel zu entfernen, und den 
pH-Wert messen.
 
34. Zu Reduzierung des IC-Gehalts das Filtrat mit CO  2 -freier Luft (Nummer 15- 
e) 1 Std. lang belüften; dabei den pH-Wert durch Zudosieren von Ortho ­
phosphorsäure (Nummer 20) bei 6,5 halten. Danach den pH-Wert mit Na ­
triumhydroxid (Nummer 21) wieder auf den Ausgangswert einstellen, die 
Probe 1 Std. absitzen lassen und ein geeignetes Volumen aus dem Über ­
stand zur Beimpfung verwenden. Dieses  Sparging -Verfahren verringert den 
IC-Gehalt des Inokulums. Wenn z. B. das Maximum des empfohlenen 
Testvolumens von 100 ml filtrierten Ablaufs je Liter als Inokulum eingesetzt 
wird, dann liegt die Menge des in den Prüfgefäßen für die Blindkontrolle gebildeten IC im Bereich 0,4 mg/l bis 1,3 mg/l (14), was 2 bis 6,5 % des Kohlenstoffs der Prüfsubstanz bei 20 mg C/l und 4 bis 13 % bei 10 mg C/l 
entspricht.
 
Oberflächengewässer  
35. Aus einem geeigneten Oberflächengewässer eine Probe entnehmen, die un ­
ter aeroben Bedingungen zu halten und am Tag der Probenahme zu ver ­
wenden ist. Falls erforderlich ist die Probe durch Filtration oder Zentrifuga ­
tion zu konzentrieren. Das für die einzelnen Prüfgefäße zu verwendende Inokulumvolumen muss die Kriterien von Nummer 26 erfüllen.
 
Böden  
36. Aus einem geeigneten Boden in einer Tiefe von bis zu 20 cm unter der 
Oberfläche eine Probe entnehmen. Steine, pflanzliche Reste und Invertebra ­
ten sollten aus der Bodenprobe entfernt werden, bevor diese durch ein 2- 
mm-Sieb passiert wird (falls die Probe zu feucht ist, um unmittelbar gesiebt zu werden, kann sie zum Teil luftgetrocknet werden, um das Sieben zu erleichtern). Die Probe ist unter aeroben Bedingungen zu halten und am 
Tag der Probenahme zu verwenden. (Wird die Probe in einem schwarzen, 
locker verschlossenen Polyethylenbeutel transportiert, so kann sie bis zu einem Monat lang bei 2 bis 4 °C gelagert werden).
 
Vorbereitung der Inokula  
37. Die Inokula können an die Versuchsbedingungen, nicht aber an die Prüf ­
substanz adaptiert werden. Durch die Vorkonditionierung lässt sich die CO  2 - 
Entwicklung im Blindwert reduzieren. Zur Vorkonditionierung wird der 
Belebtschlamm, nachdem er im Prüfmedium auf 30 mg/l verdünnt wurde, 
über eine Dauer von fünf bis sieben Tagen bei Prüftemperatur mit feuchter CO
 2 -freier Luft belüftet.  
PRÜFVERFAHREN  
Anzahl der Flaschen  
38. Die Anzahl der benötigten Prüfgefäße (Nummer 15-a) hängt von der Häu ­
figkeit der Analysen und der Testdauer ab.  
39. Es wird empfohlen, die Flaschen dreifach zu analysieren, und zwar in aus ­
reichenden Zeitabständen, um das 10-Tage-Fenster erkennen zu können. Es werden ebenfalls mindestens fünf Prüfflaschen (Nummer 15-a) der Ver ­
suchsreihen a), b) und c) (siehe Nummer 42) am Versuchsende analysiert, 
um für den Mittelwert des prozentualen biologischen Abbaus Konfidenz ­
intervalle von 95 % berechnen zu können.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1284
 
Inokulum  
40. Als Inokulum wird Belebtschlamm mit einer Konzentration an trockenen 
Feststoffen von 4 mg/l verwendet. Unmittelbar vor Gebrauch eine ausrei ­
chende Menge Inokulum zubereiten, indem z. B. 2 ml auf geeignete Weise 
behandelter Belebtschlamm (Nummern 27 bis 32) in einer Konzentration 
von 2 000 mg/l zu 1 Liter Mineralsalzmedium (Nummer 19) hinzugegeben wird. Bei der Verwendung von Abwasser bis zu 100 ml Abwasser (Nummer 33) zu 900 ml Mineralsalzmedium (Nummer 19) hinzugeben und mit dem 
Medium auf 1 Liter auffüllen.
 
Ansatz der Flaschen  
41. Portionen des Inokulums so auf die Replikatgefäße verteilen, dass das Ver ­
hältnis von  Headspace  zu Flüssigkeit 1:2 beträgt (z. B. 107 ml in Flaschen 
mit einem Fassungsvermögen von 160 ml geben). Es kann auch ein anderes Verhältnis verwendet werden, doch ist dabei die Warnung unter Nummer 11 
zu beachten. Unabhängig von der Art des verwendeten Inokulums ist darauf 
zu achten, dass dieses gründlich gemischt wird, um zu gewährleisten, dass es gleichmäßig auf die Prüfflaschen verteilt ist.
 
42. Die Flaschenreihen (Nummer 15a) werden wie folgt vorbereitet:  
a) Prüfgefäße (F  T bezeichnet) mit der Prüfsubstanz;  
b) Prüfgefäße (F  B bezeichnet) für den Blindwert, nur mit Prüfmedium und 
Inokulum; alle für die Applikation der Prüfsubstanz in die Prüfgefäße verwendeten Chemikalien, Lösungsmittel, Vermittler oder Glasfaserfilter sind ebenfalls hinzuzufügen;
 
c) Prüfgefäße (F  C bezeichnet) mit der Referenzsubstanz zur Kontrolle des 
Verfahrens;  
d) falls erforderlich, Prüfgefäße (F  I bezeichnet) zur Prüfung einer möglichen 
Hemmwirkung der Prüfsubstanz; die Gefäße enthalten die Prüfsubstanz und die Referenzsubstanz in jeweils derselben Konzentration (Nummer 
24) wie die Flaschen F
 T bzw. F  C ; 
e) Prüfgefäße (F  S bezeichnet) zur Prüfung eines möglichen abiotischen Ab ­
baus; wie unter a) plus 50 mg/l HgCl  2 oder auf andere Weise sterilisiert 
(z. B. durch Autoklavieren).  
43. Wasserlösliche Prüfsubstanzen und Referenzsubstanzen werden als wässrige 
Lösungen (Nummern 22, 23 und 24) hinzugefügt, um eine Konzentration 
von 10 bis 20 mg C/l zu erhalten.  
44. Nicht wasserlösliche Prüfsubstanzen und nicht wasserlösliche Referenzsub ­
stanzen werden je nach Art der Prüfsubstanz auf verschiedene Weise in die 
Flaschen gegeben (siehe Nummer 22a-e), und zwar abhängig von der Me ­
thode zur Behandlung der Prüfsubstanz entweder vor oder nach der Zugabe des Inokulums. Wird eines der unter Nummer 22a-e beschriebenen Ver ­
fahren angewendet, so sind die Flaschen F
 B für den Blindwert (Nummer 
42b) genauso zu behandeln, nur dass sie weder die Prüfsubstanz noch die 
Referenzsubstanz enthalten.  
45. Flüchtige Prüfsubstanzen mit Hilfe einer Mikrospritze in die verschlossenen 
Gefäße (Nummer 47) injizieren. Die Dosis berechnet sich aus dem injizier ­
ten Volumen und der Dichte der Prüfsubstanz.  
46. Die Prüfgefäße erforderlichenfalls mit Wasser auffüllen, bis in allen Gefäßen 
dasselbe Flüssigkeitsvolumen erreicht ist. Sicherstellen, dass das Verhältnis  
Headspace  zu Flüssigkeit (in der Regel 1:2) und die Konzentration der 
Prüfsubstanz so bemessen sind, dass ein ausreichendes Volumen an Sauer ­
stoff im  Headspace  vorhanden ist, um einen vollständigen biologischen 
Abbau zu ermöglichen.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1285
 
47. Alle Gefäße dann dicht verschließen, z. B. mit Butylgummisepten und 
Aluminiumkrampen. Flüchtige Prüfsubstanzen sind in dieser Phase hinzuzu ­
fügen (Nummer 45). Wenn die Abnahme der DOC-Konzentration in der Prüflösung bestimmt und die ursprüngliche IC-Konzentration zum Zeitpunkt Null (sterile Kontrollen, Nummer 42e) oder sonstige Parameter bestimmt 
werden sollen, wird eine entsprechende Probe aus dem Prüfgefäß entnom ­
men. Das Prüfgefäß wird dann samt Inhalt verworfen.
 
48. Die verschlossenen Flaschen auf einen Orbitalschüttler stellen (Nummer 
15d); dabei darauf achten, dass die Schüttelgeschwindigkeit ausreicht, um 
eine gute Durchmischung der Flascheninhalte zu erreichen (z. B. 150 bis 
200 rpm); im Dunkeln bei 20 °C ± 1 °C inkubieren.  
Probenahme  
49. Das Probenahmeschema richtet sich nach der lag-Phase und der kinetischen 
Geschwindigkeit des biologischen Abbaus der Prüfsubstanz. Die Flaschen werden am Tag der Probenahme für Analysen entnommen. Dies ist min ­
destens einmal in der Woche erforderlich, kann aber auch öfters (z. B. 
zweimal pro Woche) erforderlich sein, um eine vollständige Abbaukurve zu erhalten. Die benötigte Anzahl Replikatgefäße der Versuchsreihen F
 T , 
F B und F  C und, falls erforderlich, F  I und F  S vom Laborschüttler nehmen 
(siehe Nummer 42). Der Test dauert üblicherweise 28 Tage. Er kann vor ­
zeitig beendet werden, wenn die Abbaukurve zeigt, dass die Plateau-Phase vor dem 28. Tag erreicht wurde. Proben aus den für den 28 Tag des Test für Analysen bestimmten Flaschen entnehmen und die Ergebnisse zur Berech ­
nung der Konfidenzgrenzen oder des Variationskoeffizienten des prozentua ­
len biologischen Abbaus verwenden. Die für die Hemmkontrollen und für die Kontrolle des abiotischen Abbau bestimmten Flaschen brauchen nicht so häufig beprobt zu werden wie die anderen Flaschen; Probenahmen am 1. 
und am 28. Tag reichen aus.
 
Analyse des anorganischen Kohlenstoffs (IC)  
50. Das in den Flaschen gebildete CO  2 durch Messung der Zunahme der Kon ­
zentration an anorganischem Kohlenstoff (IC) während der Inkubation be ­
stimmen. Zur Bestimmung des während des Tests gebildeten IC werden die 
beiden nachstehend beschriebenen Verfahren empfohlen. Da die Verfahren 
geringfügig unterschiedliche Ergebnisse liefern können, darf in einem Test ­
lauf nur eines davon verwendet werden.  
51. Methode a) wird empfohlen, falls damit zu rechnen ist, dass das Medium 
Reste z. B. von Galsfilterpapier und/oder nicht löslicher Prüfsubstanz ent ­
hält. Für diese Analyse kann ein Gaschromatograph verwendet werden, falls kein Kohlenstoffanalysator zur Verfügung steht. Es ist wichtig, dass die Flaschen (fast) Prüftemperatur haben, wenn das Gas im  Headspace  ana­
lysiert wird. Methode b) ist möglicherweise einfacher für Labors, die zur 
IC-Bestimmung Kohlenstoffanalysatoren verwenden. Es ist wichtig, dass die für die Umsetzung von CO
 2 zu Carbonat verwendete Natriumhydroxidlö ­
sung (Nummer 21) entweder frisch zubereitet wird oder ihr IC-Gehalt be ­
kannt ist, damit dieser Wert bei der Berechnung der Testergebnisse berück ­
sichtigt werden kann (siehe Nummer 66-b.)  
Verfahren a): Ansäuerung auf pH < 3  
52. Vor jeder Versuchsreihe wird der Kohlenstoffanalysator mit einem geeig ­
neten Standard (z. B. 1 % w/w CO  2 in N  2 ) kalibriert. Konzentrierte Ortho ­
phosphorsäure (Nummer 20) (z. B. 1 ml je 107 ml Prüfmedium hinzufügen) 
wird durch das Septum jedes Prüfgefäßes injiziert, um den pH-Wert des 
Mediums auf < 3 zu senken. Die Flaschen zurück auf den Laborschüttler stellen. Nach 1 Std. Schütteln bei Prüftemperatur die Flaschen wieder vom Laborschüttler herunternehmen, Gasportionen (z. B. 1 ml) aus dem  Head­
space  der einzelnen Flaschen entnehmen und in den IC-Analysator injizie ­
ren. Die gemessenen IC-Konzentrationen werden in mg C/l notiert.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1286
 
53. Das Prinzip dieses Verfahrens besteht darin, dass nach Ansäuerung auf pH 
< 3 und Einstellung des Gleichgewichts bei einer Temperatur von 20 °C die 
Gleichgewichtskonstante für die Verteilung des CO  2 zwischen der flüssigen 
und der gasförmigen Phase in den Prüfgefäßen bei 1,0 liegt, wenn nach Konzentration gemessen wird (13). Dies ist für das Prüfsystem mindestens 
einmal wie folgt zu überprüfen:
 
Flaschen mit 5 und 10 mg/l anorganischem Kohlenstoff ansetzen; hierzu 
eine Lösung von wasserfreiem Natriumcarbonat (Na  2 CO 3 ) in CO  2 -freies 
Wasser geben, das wie folgt hergestellt wurde: Ansäuern von Wasser auf pH 6,5 mit konzentrierter Orthophosphorsäure (Nummer 20), Begasen über 
Nacht mit CO
 2 -freier Luft und Neutralisierung des pH mit Alkali. Sicher ­
stellen, dass das Verhältnis  Headspace -Volumen zu Flüssigkeitsvolumen 
dem der Testansätze (z. B. 1:2) entspricht. Ansäuern und Einstellen des Gleichgewichts wie unter Nummer 52 beschrieben; IC-Konzentrationen im  
Headspace  und in der Flüssigphase bestimmen. Prüfen, ob beide Konzen ­
trationen innerhalb des Versuchfehlers denselben Wert liefern. Wenn nicht, sollte der Experimentator seine Verfahren überprüfen. Diese Kontrolle der IC-Verteilung zwischen flüssiger und gasförmiger Phase braucht nicht bei 
jedem Test durchgeführt werden; sie könnte auch während des Kalibrierens 
erfolgen.
 
54. Wenn die DOC-Abnahme zu bestimmen ist (nur bei wasserlöslichen Prüf ­
substanzen), sollten die Proben aus der Flüssigphase separater Flaschen (ohne Ansäuerung) entnommen, membranfiltriert und in den 
DOC-Analysator injiziert werden. Diese Flaschen können erforderlichenfalls 
auch für andere Analysen zur Bestimmung des Primärabbaus verwendet werden.
 
Verfahren b): Umsetzung von CO  2 zu Carbonat  
55. Vor jeder Versuchsreihe wird der Kohlenstoffanalysator mit einem geeig ­
neten Standard (z. B. eine Lösung von Natriumhydrogencarbonat (NaHCO  3 ) 
in CO  2 -freiem Wasser (siehe Nummer 53) in Konzentrationen von 0 mg/l 
bis 20 mg/l) kalibriert. Dann Natriumhydroxid-Lösung (7M, Nummer 21) (z. 
B. 1 ml zu 107 ml Medium) durch das Septum in jede für die Probenahme 
bestimmte Flasche injizieren und die Flaschen 1 Std. bei Prüftemperatur schütteln. Für alle an einem bestimmten Tag verworfenen Flaschen wird dieselbe NaOH-Lösung verwendet, allerdings nicht unbedingt bei allen Pro ­
benahmen, die im Laufe des Versuchs durchgeführt werden. Werden abso ­
lute Werte des IC-Gehalts in den Blindwertansätzen für jede Probenahme benötigt, so ist der IC-Gehalt der NaOH-Lösung bei jeder Verwendung der Lösung zu bestimmen. Die Gefäße vom Laborschüttler nehmen und den 
Inhalt absetzen lassen. Aus der Flüssigphase der einzelnen Prüfgefäße mit 
Hilfe einer Spritze ein geeignetes Volumen (z. B. 50 μl bis 1 000 μl) 
entnehmen. Die Proben in den IC-Analysator injizieren und die 
IC-Konzentrationen aufzeichnen. Darauf achten, dass der eingesetzte Ana ­
lysator für die bei diesem Verfahren anfallenden alkalischen Proben ent ­
sprechend ausgerüstet ist.
 
56. Das Prinzip dieses Verfahrens beruht auf der Tatsache, dass nach Zugabe 
von Alkali und Schütteln die Konzentration an IC im  Headspace  vernach­
lässigbar klein ist. Dies ist für das Prüfsystem mindestens einmal zu über ­
prüfen. Hierzu IC-Standards verwenden, Alkali zugeben, stabilisieren und 
sodann die IC-Konzentration sowohl im  Headspace  als auch in den Flüssig ­
phasen bestimmen (siehe Nummer 53). Die Konzentration im  Headspace  
sollte nahe an Null liegen. Es ist nicht erforderlich, diese praktisch voll ­
ständige CO  2 -Adsorption bei jedem Versuch zu überprüfen.  
57. Wenn die DOC-Abnahme zu bestimmen ist (nur bei wasserlöslichen Prüf ­
substanzen), sollten die Proben aus der Flüssigphase separater Flaschen (ohne Alkali-Zusatz) entnommen, membranfiltriert und in den DOC-Analysator injiziert werden. Diese Flaschen können erforderlichenfalls 
auch für anderen Analysen zur Bestimmung des Primärabbaus verwendet 
werden.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1287
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Berechnung der Ergebnisse  
58. Es wird angenommen, dass bei vollständiger Mineralisierung der Prüfsub ­
stanz zu CO  2 die theoretische Menge an anorganischem Kohlenstoff (ThIC) 
nach Abzug des Blindwerts der Menge an gesamtem organischem Kohlenstoff (TOC) entspricht, die zu Beginn des Tests in die Prüfgefäße 
gegeben wurde:
 
ThIC ¼ TOC  
Der gesamte (mg) anorganische Kohlenstoff (TIC) in den Prüfgefäßen ist: 
TIC ¼ ðmg C in der Flüssigphase  þ mg C im  HeadspaceÞ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ Gleichung [1]  
Dabei sind:  
V L = das Volumen der Flüssigkeit im Prüfgefäß (in Liter);  
C L = die IC-Konzentration in der Flüssigphase in Milligramm Kohlenstoff 
je Liter Flüssigkeit (mg/l);  
V H = das Volumen des  Headspaces  (in Liter);  
C H = die IC-Konzentration im  Headspace  in Milligramm Kohlenstoff je 
Liter Gas (mg/l).  
Die Berechnung des TIC für die beiden Analyseverfahren, die bei diesem 
Test verwendet werden, wird unter den Nummern 60 und 61 beschrieben. 
Der prozentuale biologische Abbau ( % D ) wird in beiden Fällen mit Hilfe 
folgender Gleichung berechnet: 
%D ¼ ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 Gleichung [2]  
Dabei sind:  
TIC  t = der TIC im Prüfgefäß zur Zeit t in Milligramm (mg);  
TIC  b = der mittlere TIC im Blindwert zur Zeit t in Milligramm (mg);  
TOC = der TOC, der am Testbeginn in das Prüfgefäß gegeben wurde, in 
Milligramm (mg).  
Der Abbaugrad (% D) der Prüfsubstanz (F  T ), der Referenzsubstanz (F  C ) 
und, sofern dies vorgesehen ist, der Hemmkontrolle (F  I ) wird aus dem 
jeweiligen produzierten TIC für jeden Probenahmezeitpunkt berechnet.  
59. Wenn während des Versuchs der TIC-Gehalt in den sterilen Kontrollen (F  S ) 
deutlich angestiegen ist, kann darauf geschlossen werden, dass ein abioti ­
scher Abbau der Prüfsubstanz stattgefunden hat, was bei der Berechnung von D in Gleichung [2] zu berücksichtigen ist.
 
Ansäuerung auf pH < 3  
60. Nach Ansäuerung auf pH < 3 und Einstellung des Gleichgewichts kommt es 
zu einem Ausgleich zwischen der TIC-Konzentration in der Flüssigphase 
und der TIC-Konzentration in der Gasphase. Daher muss in diesem Fall nur 
die IC-Konzentration in der Gasphase bestimmt werden. Somit ist nach Gleichung [1]
 TIC ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , wobei V  B das Volumen 
der Serumflasche ist.  
Umsetzung von CO  2 zu Carbonat  
61. Bei diesem Verfahren werden die Berechnungen wie in Gleichung [1] be ­
schrieben durchgeführt; der vernachlässigbar kleine IC-Gehalt in der Gas ­
phase wird jedoch ignoriert, so dass  V H Ü C H ¼ 0, und  TIC ¼ V L Ü C L ist. ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1288
 
Angabe der Ergebnisse  
62. Eine Abbaukurve durch Auftragen der prozentualen Abbaugrade (D) gegen 
die Inkubationszeit erstellen und, wenn möglich, lag-Phase, Abbauphase, 10-Tage-Fenster und Plateau-Phase (die Phase, in der der maximale Abbau ­
grad erreicht ist und die Abbaukurve abnimmt) kennzeichnen. Wenn in den 
parallelen F
 T –Prüfgefäßen vergleichbare Ergebnisse (< 20 % Differenz) er ­
zielt wurden, die Abbaukurve mit den Mittelwerten erstellen (siehe Anlage 2, Schaubild 1); andernfalls Abbaukurven für jedes Prüfgefäß erstellen. Den 
Mittelwert des prozentualen Abbaus in der Plateau-Phase bestimmen oder 
den höchsten Abbauwert verwenden (z. B. wenn die Abbaukurve in der Plateau-Phase abnimmt), wobei jedoch in letzterem Fall zu ermitteln ist, 
dass es sich dabei nicht um einen Ausreißer handelt. Diesen maximalen 
biologischen Abbauwert als „Abbaugrad der Prüfsubstanz“ im Prüfbericht angeben. Wenn die Anzahl der Prüfgefäße nicht ausreichte, um eine Plateau-Phase zu erstellen, werden die gemessenen Daten des letzten Prüf ­
tags verwendet und daraus ein Mittelwert gebildet. Mit letzterem Wert, der 
den Durchschnitt aus fünf Replikaten darstellt, wird die Genauigkeit ange ­
geben, mit der der prozentuale Abbau ermittelt wurde. Im Prüfbericht ist ebenfalls der am Ende des 10-Tage-Fensters erzielte Wert anzugeben.
 
63. Auf dieselbe Weise Abbaukurven für die Referenzsubstanz F  C und, sofern 
angesetzt, Kurven der abiotischen Eliminationskontrolle F  S und der Hemm ­
kontrolle F  I erstellen.  
64. Die Mengen an TIC, die in den Blindkontrollen (F  B ) und, sofern im Ver ­
such enthalten, in den Gefäßen F  S (abiotische Kontrolle) gebildet wurden, 
angeben.  
65. D für die F  I -Gefäße auf der Grundlage des erwarteten theoretischen 
IC-Ertrags, der nur aus der Referenzsubstanz der Mischung stammt, berech ­
nen. Ist am 28. Tag [(D  FC ( 1 ) — D  FI ( 2 ))/D  FC ] × 100 > 25 %, so kann 
angenommen werden, dass die Aktivität des Inokulums durch die Prüfsub ­
stanz gehemmt wurde, was ein Grund für die unter den Prüfbedingungen erzielten niedrigen D
 FT –Werte sein kann. In diesem Fall kann der Versuch 
mit einer niedrigeren Prüfkonzentration wiederholt werden, wobei der DIC 
im Inokulum und der TIC in den Blindkontrollen möglichst reduziert wer ­
den sollte, da sich andernfalls durch die niedrigere Konzentration die Ge ­
nauigkeit des Verfahrens verschlechtert. Alternativ kann ein anderes Inoku ­
lum verwendet werden. Wenn in den Gefäßen F  S (abiotische Kontrolle) eine 
deutliche TIC-Zunahme (> 10 %) festgestellt wird, ist dies ein Hinweis auf 
mögliche abiotische Abbauprozesse.  
Gültigkeit der Ergebnisse  
66. Der Test ist gültig, wenn  
a) der mittlere prozentuale Abbaugrad der Referenzsubstanz in den Prüfge ­
fäßen F  C am 14. Tag der Inkubation > 60 % ist; und  
b) die mittlere Menge an produziertem TIC in den Blindwertansätzen F  B am 
Ende des Tests > 3 mg/l Kohlenstoff beträgt.  
Werden diese Grenzwerte nicht erreicht, so sollte der Versuch mit einem 
Inokulum aus einer anderen Quelle wiederholt werden und/oder die ange ­
wandten Verfahren sollten überarbeitet werden. Bereitet z. B. die starke 
IC-Produktion in den Blindwertansätzen Schwierigkeiten, so ist das unter den Nummern 27 bis 32 beschriebene Verfahren anzuwenden.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1289  
( 1 ) Der prozentuale Abbau in den Gefäßen F  C mit der Referenzsubstanz. 
( 2 ) Der prozentuale Abbau in den Gefäßen F  I .
 67. Erreicht die Prüfsubstanz nicht 60 % des ThIC und wurde nachgewiesen, 
dass sie keine Hemmwirkung (Nummer 65) hat, so kann der Versuch mit 
einem höher konzentrierten Inokulum (bis zu 30 mg/l Belebtschlamm und 100 ml Ablauf/l) oder mit Inokuli aus anderen Quellen wiederholt werden; dies gilt insbesondere, wenn der Abbaugrad 20 bis 60 % beträgt.
 
Auswertung der Ergebnisse  
68. Erreicht eine Prüfsubstanz bei diesem Versuch innerhalb des 10-Tage-Fens ­
ters einen Abbaugrad von > 60 % des ThIC, so ist dies ein Nachweis dafür, dass sie unter aeroben Bedingungen leicht abbaubar ist.
 
69. Wurde der Grenzwert von 60 % des ThIC nicht erreicht, so wird der 
pH-Wert des Mediums in den Flaschen gemessen, die nicht angesäuert oder alkalisiert wurden; ein Wert von weniger als 6,5 könnte darauf hin ­
weisen, dass eine Nitrifikation stattgefunden hat. In diesem Fall den Versuch 
mit einer höher konzentrierten Pufferlösung wiederholen.
 
Prüfbericht  
70. Eine Tabelle mit dem prozentualen Abbau (D) jeder Prüfsubstanz (F  T ), 
Referenzkontrolle (F  C ) und, sofern diese durchgeführt wurde, Hemmkon ­
trolle (F  I ) für jeden Probenahmetag erstellen. Werden vergleichbare Ergeb ­
nisse für die Replikatgefäße erzielt, so wird der durchschnittliche prozen ­
tuale Abbau (D) als Funktion der Zeit in einer Kurve dargestellt. Die Menge an TIC in den Blindkontrollen (F
 B ) und in den sterilen Kontrollen (F  S ) 
sowie den DOC und/oder sonstige Analyten und ihren prozentualen Abbau 
angeben.  
71. Den mittleren Abbaugrad (prozentualen Abbau) D während der 
Plateau-Phase oder den maximalen Abbaugrad (wenn die Abbaukurve in 
der Abbauphase abnimmt) bestimmen und als „Abbaugrad der Prüfsub ­
stanz“ angeben. In letzterem Fall ist sicherzustellen, dass es sich bei dem Maximalwert nicht um einen Ausreißer handelt.
 
72. Der Prüfbericht muss folgende Angaben enthalten:  
Prüfsubstanz:  
— gebräuchliche Bezeichnung, chemische Bezeichnung, CAS-Nummer, 
Strukturformel und relevante physikalisch-chemische Eigenschaften;  
— Reinheit (Verunreinigungen) der Prüfsubstanz.  
Prüfbedingungen:  
— Hinweis auf diese Prüfmethode;  
— Beschreibung des verwendeten Prüfsystems (z. B. Volumen des Prüfge ­
fäßes, Verhältnis  Headspace  zu Flüssigphase, Rührmethode usw.);  
— Applikation der Prüf- und Referenzsubstanz auf das Prüfsystem: ver ­
wendete Prüfkonzentration und Anteil an Kohlenstoff, der jeder Prüf ­
flasche hinzugegeben wurde; etwaige Verwendung von Lösungsmitteln;  
— Angaben zum Inokulum, evtl. Vorbehandlung und Vorkonditionierung;  
— Inkubationstemperatur;  
— Validierung des Prinzips der IC-Analyse;  
— wesentliche Merkmale des verwendeten Kohlenstoffanalysators (und an ­
derer verwendeter Analysemethoden);  
— Anzahl der Replikate.  
Ergebnisse:  
— Rohdaten und berechnete Werte der biologischen Abbaubarkeit in Ta ­
bellenform;  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1290
 
— die Kurve des prozentualen Abbaus, aufgetragen gegen die Zeit, für 
Prüf- und Referenzsubstanz; Angabe von lag-Phase, Abbauphase, 10- 
Tage-Fenster und Steigung;  
— prozentualer Abbau auf dem Plateau, zum Versuchsende und nach dem 
10-Tage-Fenster;  
— Angabe von Gründen, falls die Prüfergebnisse verworfen werden;  
— weitere Faktoren, die für das Prüfverfahren von Bedeutung waren;  
— Diskussion der Ergebnisse.  
LITERATUR:  
1. Kapitel C.4 dieses Anhangs, Biologische Abbaubarkeit — Bestimmung der 
„leichten“ biologischen Abbaubarkeit: CO  2 -Entwicklungstest (Methode C.4-C).  
2. Sturm R.N. (1973): Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test 
for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A.,Oil Chem Soc. 50: 159- 
167. 
3. Larson R.J. (1979): Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161.  
4. Larson R.J., Hansmann M.A. and Bookland E.A. (1996): Carbon dioxide 
recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210.
 
5. ISO 9439 (1990; überarbeitet 1999): (Sturm). Wasserbeschaffenheit — Be ­
stimmung der vollständigen aeroben biologischen Abbaubarkeit organischer Stoffe im wäßrigen Medium — Verfahren mit Kohlenstoffdioxid-Messung.
 
6. US EPA (1996): Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic 
Substances Washington, DC.  
7. US EPA (1996): Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and To ­
xic Substances Washington, DC.  
8. Gledhill W.E. (1975): Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929.  
9. Weytjens D., Van Ginneken I. and Painter H.A. (1994): The recovery of 
carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812.
 
10. Ennis D.M. and Kramer A. (1975): A rapid microtechnique for testing 
biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185.  
11. Ennis D.M., Kramer A., Jameson C.W., Mazzoccki P.H. and Bailey P.H. 
(1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53.  
12. Boatman R.J., Cunningham S.L. and Ziegler D.A. (1986): A method for 
measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233-243.
 
13. Struijs J. and Stoltenkamp J. (1990): Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211.
 
14. Birch R.R. and Fletcher R.J. (1991): The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 
23: 507-524.  
15. Birch R.R., Biver C., Campagna R., Gledhill W.E., Pagga U., Steber J., 
Reust H., and Bontinck W.J. (1989): Screening of chemicals for anaerobic 
biodegradation. Chemosphere 19: 1527-1550.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1291
 
16. ISO 14593, (1999) Wasserbeschaffenheit — Bestimmung der vollständigen 
biologischen Abbaubarkeit organischer Substanzen im wässrigen Medium — 
Verfahren mittels Bestimmung des anorganischen Kohlenstoffs in geschlos ­
senen Flaschen (C0  2 -Headspace -Test).  
17. Battersby N.S. (1997): The ISO headspace C0  2 biodegradation test, Che ­
mosphere 34: 1813-1822.  
18. US EPA (1996): Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel 
carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Sub ­
stance, Washington, DC.  
19. Battersby N.S., Ciccognani D., Evans M.R., King D., Painter H.A., Peterson 
D.R. and Starkey M. (1999). An „inherent“ biodegradability test for oil 
products: description and results of an international ring test. Chemosphere 
38: 3219-3235.  
20. Kapitel C.4 dieses Anhangs, Biologische Abbaubarkeit — Bestimmung der 
„leichten“ biologischen Abbaubarkeit.  
21. OECD (1988): OECD Ring-test of methods for determining ready biodegra ­
dability: Bericht des Vorsitzenden (M. Hashimoto; MITI) und Abschluss ­
bericht (M. Kitano und M. Takatsuki; CITI). Paris.  
22. Kapitel C.11 dieses Anhangs, Biologische Abbaubarkeit — Belebtschlamm: 
Prüfung der Atmungshemmung.  
23. Struijs J., Stoltenkamp-Wouterse M.J. and Dekkers A.L.M. (1995): A ratio ­
nale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. 
Biodegradation 6: 319-327.  
24. EU (1999): Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Bericht EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.
 
25. ISO 10634 (1996) Wasserbeschaffenheit — Anleitung für die Vorbereitung 
und Behandlung von in Wasser schwer löslichen organischen Verbindungen 
für die nachfolgende Bestimmung ihrer biologischen Abbaubarkeit in einem wäßrigen Medium.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1292
 
Anlage 1  
ABKÜRZUNGEN UND DEFINITIONEN  
IC: anorganischer Kohlenstoff.  
ThCO  2 : theoretisches Kohlendioxid (mg) — Kohlendioxidmenge, die sich rech ­
nerisch aus dem bekannten oder gemessenen Kohlenstoffgehalt der Prüfsubstanz bei vollständiger Mineralisation ergibt; auch angegeben als mg Kohlendioxident ­
wicklung pro mg Prüfsubstanz.
 
DOC:  gelöster organischer Kohlenstoff — Menge an organischem Kohlenstoff, 
die in der Lösung vorliegt oder einen Filter mit 0,45 μm Porengröße passiert 
bzw. nach 15 Minuten Zentrifugieren bei 40 000 m/s  –2 (± 4 000 g) im Überstand 
verbleibt.  
DIC:  gelöster anorganischer Kohlenstoff  
ThIC:  Theoretische Menge an anorganischem Kohlenstoff  
TIC:  Gesamter anorganischer Kohlenstoff  
Biologisch leicht abbaubar:  ein willkürlich festgelegter Begriff für eine Kate ­
gorie von chemischen Substanzen, die bestimmte Screening-Tests auf vollstän ­
dige biologische Abbaubarkeit durchlaufen haben; diese Tests sind so stringent, 
dass angenommen wird, dass diese Substanzen im aquatischen Milieu unter aer ­
oben Bedingungen schnell und vollständig biologisch abgebaut werden.  
10-Tage-Fenster:  der 10-Tage-Abschnitt, der unmittelbar auf das Erreichen von 
10 % Abbau folgt.  
Inhärente biologische Abbaubarkeit:  Begriff für eine Kategorie von Substan ­
zen, deren biologische Abbaubarkeit (primär oder vollständig) eindeutig in einem 
beliebigen Test auf biologische Abbaubarkeit nachgewiesen worden ist.  
Vollständiger aerober biologischer Abbau:  Abbaugrad der Prüfsubstanz, der 
nach vollständiger Zerlegung der Substanz durch Mikroorganismen zur Bildung von Kohlendioxid, Wasser, Mineralsalzen und neuen mikrobiellen Zellbestand ­
teilen (Biomasse) führt.
 
Mineralisation:  vollständiger Abbau einer organischen Verbindung zu CO  2 und 
H 2 O unter aeroben Bedingungen und zu CH  4 , CO  2 und H  2 O unter anaeroben 
Bedingungen.  
Lag-Phase:  Zeitspanne zwischen dem Beginn eines Tests und dem Zeitpunkt, an 
dem die Akklimatisation und/oder Adaptation der abbauenden Mikroorganismen 
erreicht ist und der biologische Abbau einer Prüfsubstanz oder eines rein orga ­
nischen Materials einen nachweisbaren Umfang angenommen hat (z. B. 10 % des maximalen theoretischen biologischen Abbaus bzw. je nach Genauigkeit des 
Messverfahrens auch weniger).
 
Abbauphase:  Zeitspanne zwischen dem Ende der lag-Phase und dem Erreichen 
von 90 % des maximalen Abbaugrades.  
Plateau-Phase:  die Phase, in der der maximale Abbaugrad erreicht ist und die 
Abbaukurve abnimmt.  
Prüfsubstanz:  Jede Substanz oder jedes Gemisch, die/das mit dieser Prüf ­
methode getestet wird.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1293
 
Anlage 2  
Beispiel einer Abbaukurve  
Abbildung 1  
Bioabbau von Octan-1-ol im CO  2 -Headspace -Test
  
Glossar  
Abbaugrad  
Abbauphase  
maximaler biologischer Abbaugrad  
Plateau-Phase  
10-Tage-Fenster  
Testdauer (Tage)  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1294
 
C. 30  BIOAKKUMULATION IN TERRESTRISCHEN OLIGOCHAETEN  
EINLEITUNG  
1. Diese Prüfmethode entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 317 (2010). Zur 
Untersuchung des Verbleibs von Schadstoffen in der Umwelt liegen die 
Methode zur Bestimmung der „Biokonzentration: Durchfluss-Fischtest“ (Ka ­
pitel C.13 dieses Anhangs (49)) und die Methode zur Bestimmung der „Bioakkumulation in sedimentbewohnenden benthischen Oligochaeten“ (53) vor, die 1996 bzw. 2008 veröffentlicht wurden. Jedoch sind Rück ­
schlüsse aus Daten über die aquatische Bioakkumulation auf die Reaktionen 
von Bodenorganismen wie Regenwürmern schwierig, wenn nicht gar un ­
möglich. Modellberechnungen auf der Grundlage der Lipophilie einer Prüf ­
substanz, z. B. (14) und (37), werden derzeit zur Beurteilung der Bioakku ­
mulation von chemischen Substanzen im Boden, wie z. B. im technischen 
Leitfaden der EU (Technical Guidance Document) (19), verwendet. Auf die Notwendigkeit einer kompartimentspezifischen Prüfmethode wurde bereits eingegangen, z. B. (55). Eine solche Methode ist vor allem für die Abschät ­
zung der Sekundärvergiftung ( secondary poisoning ) in der terrestrischen 
Nahrungskette von Bedeutung (4). Mehrere nationale Prüfmethoden befas ­
sen sich mit der Bioakkumulation in anderen Organismen als Fischen, z. B. (2) und (72). So wurde eine Methode zur Bestimmung der Bioakkumulation 
aus kontaminierten Böden in Regenwürmern ( Eisenia fetida , Savigny) und 
Topfwürmern von der  American Society for Testing and Materials  ent­
wickelt (3). Eine international anerkannte Methode zur Bestimmung der Bioakkumulation in dotiertem Boden wird die Risikoanalyse für Chemika ­
lien in terrestrischen Ökosystemen verbessern, z. B. (25) und (29).
 
2. Bodenfressende Invertebraten sind bodengebundenen chemischen Substan ­
zen ausgesetzt. Unter diesen Tieren spielen terrestrische Oligochaeten eine 
wichtige Rolle für die Bodenstruktur und die Bodenfunktionen (15) (20). Terrestrische Oligochaeten leben im Boden und zum Teil an der Boden ­
oberfläche (insbesondere in der Streuschicht); ihrer Biomasse nach sind sie 
häufig die am stärksten vertretene Art (54). Durch Bioturbation des Bodens 
und als Beutetiere können diese Tiere einen erheblichen Einfluss auf die Bioverfügbarkeit von chemischen Substanzen für andere Organismen wie Invertebraten (z. B. Raubmilben und Käfer; z. B. (64)) oder räuberische 
Vertebraten (z. B. Füchse und Möwen) (18) (62) haben. In Anlage 5 sind 
einige Arten von terrestrischen Oligochaeten beschrieben, die derzeit in ökotoxikologischen Untersuchungen verwendet werden.
 
3. Die ASTM-Richtlinie „Standard Guide for Conducting Laboratory Soil To ­
xicity or Bioaccumulation Tests with the Lumbricid Earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid Potworm  Enchytraeus albidus “ (3) enthält zahl ­
reiche wesentliche und nützliche Angaben für die Durchführung der vor ­
liegenden Prüfmethode zur Bestimmung der Bioakkumulation im Boden. Weitere Dokumente, auf die in dieser Prüfmethode verwiesen wird, sind Kapitel C.13 dieses Anhangs „Biokonzentration: Durchfluss-Fischtest“ 
(49) und die OECD-Prüfrichtlinie (TG) 315 „Bioakkumulation in sediment ­
bewohnenden benthischen Oligochaeten“ (53). Praktische Erfahrungen mit der Untersuchung der Bioakkumulation im Boden und Veröffentlichungen 
aus der Literatur z. B. (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) 
(78) (79) sind ebenfalls wichtige Informationsquellen für diese Prüfmethode.
 
4. Diese Prüfmethode wird am geeignetsten für stabile, neutrale organische 
Substanzen eingesetzt, die Tendenz haben, am Boden zu adsorbieren. Sie kann auch für die Testung der Bioakkumulation stabiler metallorganischer Verbindungen, die an den Boden gebunden sind, herangezogen werden. 
Ebenso eignet sie sich für Metalle und sonstige Spurenelemente.
 
VORAUSSETZUNGEN  
5. Untersuchungen zur Bestimmung der Bioakkumulation einer chemischen 
Substanz in terrestrischen Oligochaeten wurden mit Schwermetallen (siehe z. B. (63)) und persistenten, organischen Stoffen mit log K
 ow –Werten zwi ­
schen 3,0 und 6,0 durchgeführt, z. B. (40). Solche Tests können auch ver ­
wendet werden für  
— chemische Substanzen mit einem log K  ow -Wert von > 6,0 (superhydro ­
phobe chemischen Substanzen);  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1295
 
— chemische Substanzen, die zu einer Kategorie von organischen Che ­
mikalien gehören, von denen bekannt ist, dass sie ein Potenzial zur 
Bioakkumulation in lebenden Organismen haben, z. B. oberflächenaktive Stoffe oder Stoffe mit hohem Adsorptionsvermögen;
 
— chemische Substanzen mit Struktureigenschaften, die auf ein Bioakku ­
mulationspotenzial hinweisen, z. B. Analoga von chemischen Substan ­
zen mit bekanntem Bioakkumulationspotenzial, und  
— Metalle.  
6. Vor Beginn der Studie müssen bestimmte Informationen zur Prüfsubstanz 
wie Common name, chemische Bezeichnung (vorzugsweise IUPAC-Name), Strukturformel, CAS-Nummer, Reinheitsgrad, Sicherheitshinweise, an ­
gemessene Lagerungsbedingungen und Analysemethoden vorliegen. Darü ­
ber hinaus sollten folgende Angaben bekannt sein:
 
a) Wasserlöslichkeit;  
b) Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizient, K  ow ; 
c) Boden-Wasser-Verteilungskoeffizient, ausgedrückt als K  oc ; 
d) Dampfdruck;  
e) Abbaubarkeit (z. B. im Boden, Wasser);  
f) bekannte Metaboliten.  
7. Es können sowohl radioaktiv markierte als auch nicht radioaktiv markierte 
Prüfsubstanzen verwendet werden. Zur Erleichterung der Analyse wird je ­
doch die Verwendung von radioaktiv markierten Prüfsubstanzen empfohlen. 
Diese Wahl wird von den Nachweisgrenzen oder der Notwendigkeit abhän ­
gen, Ausgangssubstanzen und Metaboliten zu messen. Wird eine radioaktiv markierte Prüfsubstanz verwendet und werden die gesamten radioaktiven Rückstände bestimmt, so ist es wichtig, dass die radioaktiv markierten 
Rückstände sowohl im Boden als auch in den Testorganismen nach dem 
prozentualen Anteil der Ausgangsprüfsubstanz und der markierten Nichtaus ­
gangssubstanz gekennzeichnet sind, z. B. in Proben, die im  steady state  oder 
am Ende der Aufnahmephase genommen wurden, so dass ein 
Bioakkumulationsfaktor (BAF) für die Ausgangsprüfsubstanz und für die betreffenden Bodenmetaboliten (siehe Nummer 50) berechnet werden kann. Möglicherweise muss die hier beschriebene Methode angepasst werden, z. 
B. um über eine ausreichende Biomasse für die Messung von nicht radio ­
aktiv markierten organischen Prüfsubstanzen oder Metallen zu verfügen. Werden die gesamten radioaktiven Rückstände (durch Flüssigszintillations ­
zählung nach Extrahieren, Verbrennung oder Gewebeauflösung) bestimmt, 
so basiert der Bioakkumulationsfaktor auf der Ausgangsprüfsubstanz und 
den Metaboliten. Die Berechnung des BAF sollte sich vorzugsweise auf die Konzentration der Ausgangsprüfsubstanz in den Organismen und auf die gesamten radioaktiven Rückstände stützen. Anschließend wird der 
nach dem Lipidgehalt der Würmer und dem Gehalt des Bodens an organi ­
schem Kohlenstoff normalisierte Biota-Boden-Akkumulationsfaktor (BSAF) anhand des BAF berechnet, um die Ergebnisse aus verschiedenen Bioakku ­
mulationstests vergleichen zu können.
 
8. Die Toxizität der Prüfsubstanz gegenüber der Testspezies sollte bekannt 
sein, z. B. eine Effektkonzentration (EC  x ) oder letale Konzentration (LC  x ) 
für die Dauer der Aufnahmephase (z. B. (19)). Die ausgewählte Konzen ­
tration der Prüfsubstanz sollte möglichst ca. 1 % ihres akuten asymptoti ­
schen LC  50 -Wertes entsprechen und mindestens zehnmal höher sein als die 
durch das angewandte analytische Verfahren vorgegebene Nachweisgrenze im Boden. Soweit verfügbar sollten bevorzugt Toxizitätswerte aus Langzeit ­
studien über subletale Endpunkte (51) (52) herangezogen werden. Sind 
solche Daten nicht verfügbar, kann ein akuter Toxizitätstest nützliche Infor ­
mationen liefern (siehe z. B. (23)).
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9. Eine geeignete Analysemethode von bekannter Zuverlässigkeit, Genauigkeit 
und Empfindlichkeit sollte für die Quantifizierung der Prüfsubstanz in den 
Testlösungen, im Boden und im biologischen Material verfügbar sein ebenso wie Einzelheiten zur Probenvorbereitung und -aufbewahrung und Sicherheitsdatenblätter. Auch die analytischen Nachweisgrenzen der Prüf ­
substanz im Boden und Wurmgewebe sollten bekannt sein. Wenn eine
 
14 C-markierte Prüfsubstanz verwendet wird, sollten die spezifische Radio ­
aktivität (d. h. Bq mol-1) und der prozentuale Anteil der mit Verunreinigun ­
gen einhergehenden Radioaktivität bekannt sein. Zur Erleichterung der Ana ­
lyse sollte die spezifische Radioaktivität der Prüfsubstanz hoch genug sein; 
auch sollten die Prüfkonzentrationen keine toxischen Effekte verursachen.  
10. Der Versuch kann mit Kunsterde oder mit natürlichem Boden durchgeführt 
werden. Die Merkmale des verwendeten Bodens, z. B. Herkunft des Bodens 
oder seiner Bestandteile, pH-Wert, Gehalt an organischem Kohlenstoff, Korngrößenverteilung (Anteil an Sand, Schluff und Lehm) und Wasserhaltekapazität (WHC) sollten vor Testbeginn bekannt sein (3) (48).
 
PRINZIP DER PRÜFMETHODE  
11. Zu den charakteristischen Parametern der Bioakkumulation einer Prüfsub ­
stanz gehören der Bioakkumulationsfaktor (BAF), die Aufnahmekonstante (k
 s ) und die Eliminationskonstante (k  e ). Definitionen dieser Parameter sind 
in Anlage 1 enthalten.  
12. Der Test besteht aus zwei Phasen: der Aufnahme-/Expositionsphase und der 
Eliminations-/Post-Expositionsphase. Während der Aufnahmephase werden 
Replikatgruppen von Würmern gegenüber dem mit der Prüfsubstanz dotier ­
ten Boden exponiert. Neben diesen Testtieren werden Gruppen von Kon ­
trollwürmern unter identischen Bedingungen, jedoch ohne Prüfsubstanz ge ­
halten. Das Trockengewicht und der Lipidgehalt der Prüforganismen werden 
bestimmt. Hierzu können Würmer der Kontrollgruppe verwendet werden. Analytische Hintergrundwerte (Blindwerte) können durch die Analyse von Proben der Kontrollwürmer und -böden ermittelt werden. Für die Elimina ­
tionsphase werden die Würmer in einen Boden ohne Prüfsubstanz umge ­
setzt. Eine Eliminationsphase ist immer erforderlich, es sei denn, während der Expositionsphase wurden nur vernachlässigbare Mengen Prüfsubstanz aufgenommen. Sie liefert Informationen über die Geschwindigkeit, mit der 
die Prüfsubstanz durch die Testorganismen ausgeschieden wird (z. B. (27)). 
Wurde während der Aufnahmephase kein  steady state  erreicht, so sollte sich 
die Bestimmung der kinetischen Parameter — kinetischer Bioakkumulati ­
onsfaktor BAFk, Aufnahme- und Eliminationskonstante(n) — vorzugsweise 
auf die gleichzeitige Anpassung der Ergebnisse der Aufnahmephase und der 
Eliminationsphase stützen. Die Konzentration der Prüfsubstanz in/an den Würmern wird während der beiden Phasen durchgehend überwacht.
 
13. Während der Aufnahmephase werden über einen Zeitraum von 14 Tagen 
(Enchytraeen) bzw. 21 Tagen (Regenwürmer) Messungen vorgenommen, bis der steady state  erreicht ist (11) (12) (67). Der  steady state  tritt ein, wenn 
die Kurve der gegen die Zeit aufgetragenen Konzentration im Wurm parallel 
zur Zeitachse verläuft und wenn drei aufeinander folgende Konzentrations ­
analysen, die an Proben durchgeführt werden, die im Abstand von mindes ­
tens zwei Tagen genommen wurden, auf Basis von statistischen Vergleichen 
(z. B. Varianzanalyse, Regressionsanalyse) um nicht mehr als ± 20 % von ­
einander abweichen.
 
14. In der Eliminationsphase werden die Testorganismen in Gefäße umgesetzt, 
die das gleiche Substrat aber keine Prüfsubstanz enthalten. Während der 
Eliminationsphase werden über einen Zeitraum von 14 Tagen (Enchytraeen) bzw. 21 Tagen (Regenwürmer) Messungen genommen, es sei denn, bei einer früheren analytischen Messung wurde eine 90 %ige Abnahme der 
Prüfsubstanzrückstände in den Würmern festgestellt. Die Konzentration 
der Prüfsubstanz in den Würmern am Ende der Eliminationsphase wird
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als nicht eliminierte Rückstände im Bericht verzeichnet. Der  steady-state - 
Bioakkumulationsfaktor (BAF  ss ) wird möglichst auf zweierlei Weise berech ­
net: zum einen als Verhältnis der Konzentration in den Würmern (C  a ) zur 
Konzentration im Boden (C  s ) bei sichtbarem  steady state  und zum anderen 
als ein kinetischer Bioakkumulationsfaktor, BAF  K , d. h. als Verhältnis der 
Aufnahmekonstante im Boden (k  s ) zur Eliminationskonstanten (k  e ) (Defini­
tionen siehe in Anlage 1), wobei von einer Kinetik 1. Ordnung ausgegangen wird (Berechnungen siehe in Anlage 2). Ist eine Kinetik 1. Ordnung ein ­
deutig nicht anwendbar, so sind andere Modellgleichungen zu verwenden.
 
15. Die Aufnahmekonstante, die Eliminationskonstante (oder Konstanten, wenn 
andere Modelle verwendet werden), der kinetische Bioakkumulationsfaktor 
(BAF  K ) und, wenn möglich, die Konfidenzgrenzen eines jeden dieser Pa ­
rameter werden anhand computergestützter Modellgleichungen berechnet (Anleitungen siehe Anlage 2). Die Anpassungsgüte eines Modells lässt sich z. B. anhand des Korrelationskoeffizienten oder Bestimmungskoeffi ­
zienten (Koeffizienten nahe an 1 deuten auf eine gute Anpassung hin) 
oder anhand der Chi-Quadrat-Verteilung feststellen. Auch kann die Größe des Standardfehlers oder die Konfidenzgrenze um die geschätzten Parameter einen Hinweis auf die Anpassungsgüte des Modells geben.
 
16. Zur Verringerung der Variabilität der Testergebnisse für Prüfsubstanzen mit 
hoher Lipophilie sollten die Bioakkumulationsfaktoren im Verhältnis zum Lipidgehalt und zum Gehalt an organischem Kohlenstoff (kg organischer 
Kohlenstoff im Boden (OC) kg-1 Lipidgehalt der Würmer) ausgedrückt 
werden. Dieses Konzept stützt sich auf die Tatsache, dass bei bestimmten Chemikalienklassen ein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem Bioakku ­
mulationspotenzial und der Lipophilie besteht, wie dies für Fische eindeutig 
festgestellt wurde (47). Es besteht ein Zusammenhang zwischen dem Lipid ­
gehalt der Fische und der Bioakkumulation solcher Substanzen. Für ben ­
thische Organismen wurden ähnliche Korrelationen festgestellt, z. B. (30) 
(44). Auch für terrestrische Oligochaeten wurde diese Korrelation nach ­
gewiesen, z. B. (5) (6) (7) (14). Wenn genügen Wurmgewebe zur Ver ­
fügung steht, kann der Lipidgehalt der Testtiere mit demselben biologischen Material bestimmt werden, das für die Bestimmung der Prüfsubstanzkon ­
zentration verwendet wurde. Als Alternative können Kontrolltiere zur Be ­
stimmung des Lipidgehalts verwendet werden.
 
GÜLTIGKEIT DES TESTS  
17. Der Test ist gültig, wenn sowohl die Kontrollgruppen als auch die Test ­
gruppen folgende Kriterien erfüllen:  
— Am Ende des Tests beträgt die Gesamtmortalität während der 
Aufnahme- und der Eliminationsphase höchstens 10 % (Regenwürmer) 
oder 20 % (Enchytraeen) der Gesamtanzahl der eingesetzten Würmer.  
— Für  Eisenia fetida  und  Eisenia andrei  beträgt der mittlere Masseverlust 
am Ende der Aufnahmephase und am Ende der Eliminationsphase nicht 
mehr als 20 % des anfänglichen Frischgewichts zu Beginn jeder Phase.  
BESCHREIBUNG DER METHODE  
Testspezies  
18. Für Bioakkumulationstests werden mehrere Arten von terrestrischen Oligo ­
chaeten empfohlen. In Anlage 5 sind die am häufigsten verwendeten Arten beschrieben:  Eisenia fetida  und Eisenia andrei  (Lumbricidae) sowie  Enchyt­
raeus albidus , Enchytraeus crypticus  und  Enchytraeus luxuriosus  (Enchyt­
raeidae).
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Apparatur  
19. Die Verwendung von Materialien, die sich auflösen können, die Prüfsub ­
stanz absorbieren oder andere chemischen Substanzen auslaugen bzw. schä ­
digende Auswirkungen auf die Testtiere haben können, sollte für alle ver ­
wendeten Teile sorgfältigst vermieden werden. Es können rechteckige oder 
zylindrische Standardbehälter aus chemisch inertem Material, die ein dem Besatz (Anzahl der Testwürmer) entsprechendes Fassungsvermögen haben, verwendet werden. Geräte, die mit dem Prüfmedium in Berührung kommen, 
können aus rostfreiem Stahl, Kunststoff oder Glas sein. Die Gefäße sind so 
abzudecken, dass die Tiere nicht entweichen können, aber für eine ausrei ­
chende Luftzufuhr gesorgt ist. Bei Substanzen mit hohen Adsorptionskoef ­
fizienten, wie z. B. synthetischen Pyrethroiden, kann die Verwendung von 
silanisiertem Glas nötig sein. In solchen Fällen muss die Apparatur/Anlage nach der Benutzung entsorgt werden (49). Das Entweichen radioaktiv mar ­
kierter Prüfsubstanzen und flüchtiger Substanzen ist zu vermeiden. Hierzu 
Abscheider (z. B. Gaswaschflaschen aus Glas) mit geeigneten Adsorbersub ­
stanzen verwenden, um etwaige Rückstände, die aus den Prüfgefäßen ver ­
dampfen könnten, aufzufangen.
 
Boden  
20. Die Qualität des Prüfbodens sollte so beschaffen sein, dass die Prüforganis ­
men während der Akklimatisierungs- und Testphasen überleben und sich möglichst vermehren können, ohne ein abnormales Aussehen oder Verhalten zu zeigen. Die Würmer sollten sich in den Boden eingraben.
 
21. Als Substrat für die Versuche wird die in Kapitel C.8 dieses Anhangs (48) 
beschriebene Kunsterde empfohlen. Anlage 4 enthält eine Beschreibung der 
Zubereitung dieser Kunsterde und Empfehlungen für ihre Lagerung: Luft ­
getrockneter künstlicher Boden kann bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur gelagert werden.
 
22. Natürliche Böden von nicht unkontaminierten Standorten können jedoch 
auch als Prüf- und/oder Anzuchtsubstrat dienen. Zur Charakterisierung 
von natürlichen Böden sind zumindest Herkunft (Sammelstelle), pH-Wert, 
Gehalt an organischem Kohlenstoff, Korngrößenverteilung (Anteil an Sand, Schluff und Lehm), maximale Wasserhaltekapazität (WHC
 max ) und prozen ­
tualer Wassergehalt anzugeben (3). Eine vor Gebrauch durchgeführte Ana ­
lyse des Bodens oder seiner Bestandteile auf Mikroschadstoffe dürfte nütz ­
liche Informationen liefern. Wird Feldboden von landwirtschaftlichen Nutz ­
flächen verwendet, so darf der Boden vor der Probenahme mindestens ein Jahr lang nicht mit Pflanzenschutzmitteln behandelt oder mit Dung von 
behandelten Tieren und sechs Monate lang nicht mit organischen Dünge ­
mitteln gedüngt worden sein (50). Verfahren für die Handhabung von na ­
türlichen Böden vor ihrer Verwendung in ökotoxikologischen Labortests mit Oligochaeten sind in (3) beschrieben. Natürliche Böden sollten im Labor so 
kurz wie möglich gelagert werden.
 
Applikation der Prüfsubstanz  
23. Die Prüfsubstanz wird in den Boden eingemischt. Dabei sind die 
physikalisch-chemischen Eigenschaften der jeweiligen Substanz zu berück ­
sichtigen. Wasserlösliche Prüfsubstanzen sind vollständig in Wasser zu lö ­
sen, bevor sie mit dem Boden vermischt werden. Als Dotierungsverfahren für im Wasser schwer lösliche Prüfsubstanzen wird empfohlen, einen oder mehrere Bestandteile des (künstlichen) Bodens mit der Prüfsubstanz zu 
beschichten. So kann z. B. der Quarzsand (oder ein Teil davon) mit einer 
Lösung der Prüfsubstanz in einem geeigneten organischen Lösungsmittel durchtränkt werden; das Lösungsmittel wird anschließend durch Trocknen abgedampft. Die beschichtete Quarzsandfraktion wird sodann mit dem be ­
feuchteten Boden vermischt. Wesentlicher Vorteil dieses Verfahrens ist, dass 
kein Lösungsmittel in den Boden gelangt. Bei natürlichem Boden kann die
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Prüfsubstanz, wie bei der Kunsterde beschrieben, durch Dotieren eines luft ­
getrockneten Teils des Bodens oder durch Einrühren der Prüfsubstanz in den 
feuchten Boden mit anschließendem Abdampfen im Falle der Verwendung eines Lösungsmittels hinzugefügt werden. Im Allgemeinen ist soweit wie möglich zu vermeiden, dass feuchter Boden mit den Lösungsmitteln in 
Berührung kommt. Folgendes ist zu bedenken (3):
 
— Wird ein anderes Lösungsmittel als Wasser verwendet, so sollte dieses 
mit Wasser mischbar sein und/oder vollständig eliminiert werden können 
(z. B. durch Abdampfen), so dass nur die Prüfsubstanz im Boden zu ­
rückbleibt.  
— Wird eine Kontrolle mit Lösungsmittel verwendet, so sind keine Nega ­
tivkontrollen erforderlich. Die Lösungsmittelkontrolle sollte die höchste Konzentration des in den Boden gegebenen Lösungsmittels enthalten, und das verwendete Lösungsmittel sollte aus derselben Partie stammen, 
die für die Zubereitung der Stammlösung verwendet wurde. Hauptkrite ­
rien für die Wahl des geeigneten Lösungsvermittlers sollten die Toxizität und Flüchtigkeit des Lösungsmittels und die Löslichkeit der Prüfsub ­
stanz in dem gewählten Lösungsmittel sein.
 
24. Ist die Prüfsubstanz in Wasser und in organischen Lösungsmitteln nur 
schwer löslich, können mit Hilfe eines Mörsers pro Prüfgefäß 2,0 bis 2,5 g 
fein gemahlener Quarzsand mit der Menge Prüfsubstanz vermischt werden, 
die erforderlich ist, um die gewünschte Prüfkonzentration zu erhalten. Diese Mischung aus Quarzsand und Prüfsubstanz wird zum angefeuchteten Boden hinzugegeben und mit einer entsprechenden Menge entionisierten Wassers 
gründlich gemischt, um den gewünschten Feuchtegehalt zu erhalten. Die 
endgültige Mischung wird auf die Prüfgefäße verteilt. Das Verfahren wird für jede Prüfkonzentration wiederholt, und zusätzlich wird eine geeignete Kontrollgruppe mit 2,0 bis 2,5 g fein gemahlenem Quarzsand pro Prüfgefäß 
angesetzt.
 
25. Die Konzentration der Prüfsubstanz im Boden ist nach dem Dotieren zu 
bestimmen. Bevor die Testorganismen eingesetzt werden, ist die homogene 
Verteilung der Prüfsubstanz im Boden zu überprüfen. Das Dotierungsver ­
fahren und die Gründe für die Wahl des Verfahrens werden im Protokoll erfasst (24).
 
26. Die Einstellung des Gleichgewichts zwischen Boden und Porenwasserphase 
sollte idealerweise noch vor dem Einsetzen der Organismen stattfinden; 
hierzu wird ein Zeitraum von 4 Tagen bei 20 °C empfohlen. Für viele im 
Wasser schwer lösliche organische Substanzen kann es Tage oder Monate dauern, bis zwischen den adsorbierten und gelösten Fraktionen ein echtes Gleichgewicht erreicht ist. Je nach Zweck der Studie, z. B. wenn die Um ­
weltbedingungen simuliert werden sollen, kann der dotierte Boden über 
längere Zeit „gealtert“ werden (z. B. 3 Wochen bei 20 °C für Metalle) (22).
 
Anzucht der Testorganismen  
27. Die Würmer sind vorzugsweise in dauerhafter Laborkultur zu halten. Leit ­
linien für die Anzucht von  Eisenia fetida  und  Eisenia andrei  sowie von 
Enchytraeen-Arten unter Laborbedingungen sind in Anlage 5 enthalten 
(siehe auch (48) (51) (52)).  
28. Die im Test verwendeten Würmer sollten frei von sichtbaren Erkrankungen, 
Abnormalitäten und Parasiten sein.  
PRÜFVERFAHREN  
29. Die Testorganismen werden während der Aufnahmephase gegenüber der 
Prüfsubstanz exponiert: Die Aufnahmephase sollte 14 Tage (Enchytraeen) 
oder 21 Tage (Regenwürmer) dauern, bis nachgewiesen wird, dass ein  
steady state  erreicht ist.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1300
 
30. Für die Eliminationsphase werden die Würmer in einen prüfsubstanzfreien 
Boden umgesetzt. Die erste Probe sollte 4 bis 24 Std. nach Beginn der 
Eliminationsphase genommen werden. Anlage 3 enthält Beispiele von Pro ­
benahmeplänen für eine Aufnahmephase und eine Eliminationsphase von jeweils 21 Tagen.
 
Testorganismen  
31. Bei vielen Arten der terrestrischen Enchytraeen ist das Einzelgewicht sehr 
niedrig (z. B. 5 bis 10 mg Feuchtgewicht je Individuum  Enchytraeus albidus  
und weniger für  Enchytraeus crypticus  und  Enchytraeus luxuriosus ). Um 
Gewichtsbestimmungen und chemische Analysen vorzunehmen, kann es erforderlich sein, die Würmer der Replikatgefäße zu poolen (d. h. alle 
Würmer eines Replikatgefäßes werden verwendet, um ein analytisches 
Messergebnis für das Gewebe zu erhalten). 20 einzelne Enchytraeen werden in jedes Replikatgefäß gegeben, und es werden mindestens drei Replikate verwendet. Bei Prüfsubstanzen mit einer hohen analytischen Nachweis ­
grenze sind möglicherweise mehr Würmer erforderlich. Für Testspezies 
mit höherem Einzelgewicht ( Eisenia fetida  und  Eisenia andrei ) können 
Replikatgefäße mit nur einem Individuum verwendet werden.
 
32. Die jeweils für einen Versuch verwendeten Würmer sollten ein ähnliches 
Gewicht haben (z. B.  Eisenia fetida  und Eisenia andrei  sollten jeweils 250 
bis 600 mg wiegen). Enchytraeen (z. B.  Enchytraeus albidus ) sollten ca. 
1 cm lang sein. Alle für einen bestimmten Versuch verwendeten Würmer 
sollten aus derselben Quelle stammen und adulte Tiere mit einem Clitellum 
sein (siehe Anlage 5). Da sich Gewicht und Alter der Tiere auf die BAF-Werte auswirken können (z. B. aufgrund des unterschiedlichen Lipid ­
gehalts und/oder des Vorhandenseins von Eiern), sollten diese Parameter 
sorgfältig aufgezeichnet und bei der Auswertung der Ergebnisse berücksich ­
tigt werden. Darüber hinaus kann es während der Exposition zur Ablage von Kokons kommen, was sich auch auf die BAF-Werte auswirken wird. Es wird empfohlen, eine Teilprobe der Testwürmer vor dem Test zu wiegen, 
um das mittlere Feucht- und Trockengewicht zu schätzen.
 
33. Um die Abnahme der Prüfsubstanzkonzentration im Boden während der 
Aufnahmephase möglichst gering zu halten, ist ein hohes Boden-Wurm- Verhältnis vorzusehen. Für  Eisenia fetida  und  Eisenia andrei  wird eine 
Mindestmenge von 50 g Trockengewicht (TG) Boden je Wurm und für 
Enchytraeen eine Mindestmenge von 10 bis 20 g (TG) Boden je Prüfgefäß empfohlen. Die Bodenschicht in den Prüfgefäßen sollte 2 bis 3 cm (Enchyt ­
raeen) bzw. 4 bis 5 cm (Regenwürmer) dick sein.
 
34. Die für einen Versuch benötigten Würmer werden aus der Kultur entnom ­
men (z. B. Enchytraeen mit einer Juwelierpinzette). Adulte Tiere werden zur Akklimatisierung in einen unbehandelten Prüfboden umgesetzt und gefüttert 
(siehe Nummer 36). Weichen die Prüfbedingungen von den Anzuchtbedin ­
gungen ab, dürfte eine Akklimatisierungsphase von 24 bis 72 Std. ausrei ­
chen, damit die Würmer sich an die Prüfbedingungen gewöhnen können. Nach der Akklimatisierung werden die Regenwürmer zum Spülen in Glas ­
schalen (z. B. Petrischalen) mit sauberem Wasser umgesetzt und anschlie ­
ßend gewogen, bevor sie in den Prüfboden gegeben werden. Vor dem Wiegen ist das an den Würmern anhaftende Wasser durch leichtes Abtupfen am Rand der Schale oder durch vorsichtiges Trockentupfen mit einem leicht 
angefeuchteten Papiertuch zu entfernen.
 
35. Das Eingrabungsverhalten der Testorganismen ist zu beobachten und auf ­
zuzeichnen. Bei Tests mit Regenwürmern graben sich die Tiere (Kontroll- und Testgruppe) in der Regel innerhalb von ein paar Stunden in den Boden 
ein; dies sollte spätestens 24 Std. nach dem Einsetzen der Würmer in die 
Prüfgefäße überprüft werden. Graben sich die Regenwürmer nicht in den
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Boden ein (z. B. über 10 % während mehr als der Hälfte der Aufnahme ­
phase), so deutet dies darauf hin, dass die Prüfbedingungen nicht angemes ­
sen oder die Testorganismen nicht gesund sind. In diesem Fall muss der Test gestoppt und wiederholt werden. Enchytraeen leben hauptsächlich im Porenwasser des Bodens, und häufig kommt ihr Integument nur zum Teil 
mit dem umgebenden Substrat in Kontakt; es wird davon ausgegangen, dass 
grabende und nichtgrabende Enchytraeen in gleichem Maße exponiert sind, und ein Nichteingraben der Enchytraeen erfordert nicht unbedingt eine Wie ­
derholung des Tests.
 
Fütterung  
36. Wenn ein Boden mit niedrigem Gesamtgehalt an organischem Kohlenstoff 
verwendet wird, dann sollte gefüttert werden. Bei der Verwendung von 
Kunsterde wird ein wöchentlicher Fütterrhythmus empfohlen (d. h. die Wür ­
mer werden einmal pro Woche gefüttert). Für Regenwürmer werden wö ­
chentlich 7 mg getrockneter Dung pro g Boden (TG) und für Enchytraeen wöchentlich 2 bis 2,5 mg gemahlene Haferflocken pro g Boden (TG) emp ­
fohlen (11). Die erste Futterration sollte mit dem Boden unmittelbar vor dem 
Einsetzen der Testorganismen vermischt werden. Es sollte möglichst die ­
selbe Art Futter wie für die Aufzucht (siehe Anlage 5) verwendet werden.
 
Licht und Temperatur  
37. Die Tests sind bei einem geregelten Licht-Dunkel-Zyklus von 16 zu 8 Std., 
bei einer Lichtstärke von vorzugsweise 400 bis 800 lx im Bereich der Prüfgefäße (3) durchzuführen. Die Prüftemperatur sollte während des ge ­
samten Test 20 ± 2 °C betragen.
 
Prüfkonzentrationen  
38. Es wird eine einzige Konzentration verwendet. Situationen, in denen zusätz ­
liche Konzentration(en) erforderlich ist/sind, müssen begründet werden. 
Liegt die Toxizität (EC  x ) der Prüfsubstanz nahe an der analytischen Nach ­
weisgrenze, wird empfohlen, radioaktiv markierte Prüfsubstanzen mit hoher 
spezifischer Radioaktivität zu verwenden. Für Metalle sollte die Konzentra ­
tion über den Hintergrundwerten in Gewebe und Boden liegen.  
Replikate  
39. Für die kinetischen Messungen (Aufnahme- und Eliminationsphase) sind pro 
Messpunkt mindestens drei behandelte Replikatgefäße vorzusehen. Die Ge ­
samtzahl der vorbereiteten Replikate muss ausreichen, um alle Messpunkte während der Aufnahme- und Eliminationsphase abzudecken.
 
40. Für die biologischen Beobachtungen und Messungen (z. B. Verhältnis 
Trocken- und Feuchtgewicht, Lipidgehalt) und für die Analyse der Hinter ­
grundkonzentrationen in den Würmern und im Boden sind mindestens 12 Replikatgefäße einer Negativkontrolle (jeweils vier Probenahmen zu Beginn und am Ende der Aufnahmephase und vier Probenahmen am Ende der 
Eliminationsphase) bereitzustellen, wenn kein anderes Lösungsmittel als 
Wasser verwendet wird. Wurde für die Applikation der Prüfsubstanz ein Lösungsvermittler verwendet, muss neben den behandelten Replikaten eine Lösungsmittelkontrolle (jeweils vier Replikatgefäße sind zu Beginn und am 
Ende der Aufnahmephase sowie vier am Ende der Eliminationsphase zu 
beproben) durchgeführt werden, für die mit Ausnahme der Prüfsubstanz alle Bestandteile zu verwenden sind. In diesem Fall können auch vier zu ­
sätzliche Replikatgefäße einer Negativkontrolle (kein Lösungsmittel) für 
eine fakultative Probenahme am Ende der Aufnahmephase vorgesehen wer ­
den. Diese Replikate können biologisch mit der Lösungsmittelkontrolle ver ­
glichen werden, um Informationen über einen möglichen Einfluss des Lö ­
sungsmittels auf den Testorganismus zu erhalten. Es wird empfohlen, eine 
ausreichende Anzahl an Replikatgefäßen (z. B. 8) als zusätzliche Reserve für 
Test- und Kontrollgruppen anzusetzen.
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Häufigkeit der Bodenqualitätsmessungen  
41. Zu Beginn und am Ende der Aufnahmephase und der Eliminationsphase 
werden der pH-Wert und der Feuchtegehalt des Bodens sowie (kontinuier ­
lich) die Temperatur in der Prüfkammer bestimmt. Einmal pro Woche sollte 
der Feuchtegehalt des Bodens durch Wiegen der Prüfgefäße und Vergleich 
ihres Gewichts zum Zeitpunkt der Kontrolle mit ihrem Gewicht zu Test ­
beginn überprüft werden. Wasserverluste sollten durch Zugabe von entioni ­
siertem Wasser ausgeglichen werden.  
Probenahme und Analyse der Wurm- und Bodenproben  
42. Anlage 3 enthält ein Beispiel eines Probenahmeplans für die Testung der 
Bioakkumulation mit Regenwürmern und Enchytraeen.  
43. Vor dem Einsetzen der Würmer sowie während der Aufnahmephase und der 
Eliminationsphase wird den Prüfgefäßen Boden zur Bestimmung der Prüf ­
substanzkonzentration entnommen. Während des Tests werden die Konzen ­
trationen der Prüfsubstanz in den Würmern und im Boden bestimmt. In der Regel werden die Gesamtkonzentrationen im Boden gemessen. Es können 
auch die Konzentrationen im Porenwasser bestimmt werden; in diesem Fall 
sind vor Beginn der Studie eine Begründung für diesen Entschluss und geeignete Methoden anzugeben, die ebenfalls in den Bericht aufgenommen werden.
 
44. Während der Aufnahmephase und der Eliminationsphase werden jeweils 
mindestens sechs Mal Proben entnommen. Ist eine Prüfsubstanz nachweis ­
lich stabil, so kann die Zahl der Bodenproben reduziert werden. Es wird 
empfohlen, zu Beginn und am Ende der Aufnahmephase mindestens drei 
Replikate zu analysieren. Weicht die am Ende der Aufnahmephase be ­
stimmte Konzentration im Boden um mehr als 30 % von der Ausgangs ­
konzentration ab, so sollten die zu anderen Zeitpunkten genommenen Bo ­
denproben ebenfalls analysiert werden.  
45. Die Würmer eines bestimmten Replikatgefäßes werden an jedem Messzeit ­
punkt aus dem Boden entnommen (z. B. indem der Boden des Replikats auf 
eine flache Schale verteilt wird und die Würmer mit einer abgerundeten 
Juwelierpinzette ausgelesen werden) und anschließend kurz in einer flachen Schale aus Glas oder Stahl mit Wasser gespült. Anhaftendes Wasser ent ­
fernen (siehe Nummer 34). Die Würmer vorsichtig in ein vorgewogenes 
Gefäß geben und sofort samt Darminhalt wiegen.
 
46. Die Regenwürmer ( Eisenia  sp.) sollten dann über Nach ihren Darm ent ­
leeren, z. B. auf einem angefeuchteten Filterpapier in einer abgedeckten 
Petrischale (siehe Nummer 34). Nach der Darmentleerung ist das Gewicht 
der Würmer zu bestimmen, um die eventuelle Abnahme der Biomasse wäh ­
rend des Tests zu beurteilen (siehe Validitätskriterien unter Nummer 17). Wiegen und Gewebsanalyse der Enchytraeen erfolgen ohne vorherige Darm ­
entleerung, da dies aus technischer Sicht angesichts der geringen Größe 
dieser Würmer schwierig ist. Nachdem das Endgewicht bestimmt wurde, werden die Würmer anhand der am besten geeigneten Methode sofort abge ­
tötet (z. B. mit Flüssigstickstoff oder durch Einfrieren bei Temperaturen 
unter –18 °C).
 
47. Während der Eliminationsphase ersetzen die Würmer kontaminierten Darm ­
inhalt durch sauberen Boden. Dies bedeutet, dass bei unmittelbar vor der 
Eliminationsphase entnommenen Proben von Würmern, die ihren Darm 
nicht entleert haben (in diesem Fall Enchytraeen), der Darm verunreinigten Boden enthält. Bei aquatischen Oligochaeten wird davon ausgegangen, dass nach den ersten 4 bis 24 Std. der Eliminationsphase der Großteil des ver ­
unreinigten Darminhalts durch sauberes Sediment ersetzt wurde, z. B. (46). 
In Studien über die Akkumulation von radioaktiv markiertem Cadmium und Zink wurden vergleichbare Feststellungen für Regenwürmer gemeldet (78). Bei Enchytraeen mit Darminhalt kann die Konzentration dieser ersten Probe 
der Eliminationsphase als die Konzentration im Gewebe nach Darmentlee ­
rung angesehen werden. Um der Verdünnung der Prüfsubstanzkonzentration durch unkontaminierten Boden während der Eliminationsphase Rechnung zu tragen, kann das Gewicht des Darminhalts auf Basis des Verhältnisses Nass ­
gewicht/Aschegewicht des Wurms oder des Verhältnisses Trockengewicht/ 
Aschegewicht des Wurms geschätzt werden.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1303
 
48. Die Analyse der Boden- und Wurmproben sollte vorzugsweise direkt nach 
der Probenahme (d. h. innerhalb von 1 bis 2 Tagen) erfolgen, um einen 
Abbau oder sonstige Verluste zu vermeiden; es wird empfohlen, die unge ­
fähren Aufnahme- und Eliminationsraten zu ermitteln, während der Versuch fortgesetzt wird. Verzögert sich die Analyse, so sind die Proben auf geeig ­
nete Weise zu lagern, z. B. durch Tiefgefrieren ( ≤ –18 °C).
 
49. Es sollte überprüft werden, ob die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der 
chemischen Analyse sowie die Wiederfindung der Prüfsubstanz aus Boden- und Wurmproben für die betreffende Methode geeignet sind; die Effizienz der Extraktion, die Nachweisgrenze („limit of detection; LOD“) und die 
Quantifizierungsgrenze („limit of quantification; LOQ“) sollten im Bericht 
erfasst werden. Auch ist zu kontrollieren, ob die Prüfsubstanz in den Kon ­
trollgefäßen nicht in Konzentrationen feststellbar ist, die über der Hinter ­
grundkonzentration liegen. Wenn die Konzentration der Prüfsubstanz im 
Testorganismus Ca für die Kontrollwürmer > 0 ist, sollte dies bei der Be ­
rechnung der kinetischen Parameter berücksichtigt werden (siehe Anlage 2). Alle Proben sollten während des Tests stets so behandelt werden, dass Verunreinigungen und Verluste (z. B. infolge von Adsorption der Prüfsub ­
stanz durch das Probenahmegerät) auf ein Mindestmaß beschränkt werden.
 
50. Werden radioaktiv markierte Prüfsubstanzen verwendet, so können Aus ­
gangssubstanz und Metaboliten analysiert werden. Eine Quantifizierung der Ausgangsprüfsubstanz und der Metaboliten im  steady state  oder am 
Ende der Aufnahmephase liefert wichtige Informationen. Die Proben sollten 
dann „gereinigt“ werden, damit die Ausgangsprüfsubstanz separat quantifi ­
ziert werden kann. Wenn einzelne Metaboliten mehr als 10 % der gesamten Radioaktivität in den analysierten Proben ausmachen, sollten diese Metabo ­
liten identifiziert werden.
 
51. Die Gesamtwiederfindungsrate und die Wiederfindung der Prüfsubstanz in 
Würmern, Boden und gegebenenfalls Abscheidern mit Adsorbersubstanzen, die eingesetzt wurden, um verdampfende Prüfsubstanz aufzufangen, müssen registriert und im Protokoll erfasst werden.
 
52. Für Enchytraeen, die kleiner sind als Regenwürmer, ist es zulässig, die 
beprobten Individuen aus einem bestimmten Prüfgefäß zu poolen. Verringert 
sich durch das Pooling die Zahl der Replikate, so wird hierdurch die Zahl der statistischen Verfahren eingeschränkt, die auf die Daten anwendbar sind. Wird auf ein spezielles statistisches Verfahren bzw. eine bestimmte statisti ­
sche Aussagekraft Wert gelegt, so muss der Test unter Berücksichtigung des 
Pooling, des Verfahrens und der gewünschten Aussagekraft eine angemes ­
sene Anzahl an Replikatgefäßen umfassen.
 
53. Der BAF sollte sowohl im Verhältnis zum gesamten Trockengewicht als 
auch, falls erforderlich (bei hochlipophilen Substanzen) im Verhältnis zum 
Lipidgehalt ausgedrückt werden. Zur Bestimmung des Lipidgehalts sollten 
geeignete Methoden verwendet werden (zu diesem Zweck sollten einige bestehende Methoden — z. B. (31) (58) — angepasst werden). Bei diesen Methoden wird ein Chloroform/Methanol-Extraktionsverfahren eingesetzt. 
Um die Verwendung von gechlorten Lösungsmitteln zu vermeiden, sollte 
jedoch eine angepasste Version der Methode von Bligh and Dyer (9), wie in (17) beschrieben, verwendet werden. Da die verschiedenen Methoden mög ­
licherweise zu unterschiedlichen Werten führen, ist es wichtig, Einzelheiten 
über die verwendete Methode anzugeben. Wenn möglich, d. h. wenn genü ­
gend Wurmgewebe verfügbar ist, sollte die Lipidanalyse idealerweise an derselben Probe oder demselben Extrakt vorgenommen werden, das für die Analyse der Prüfsubstanz verwendet wurde, da die Lipide häufig erst 
aus dem Extrakt entfernt werden müssen, bevor dieses chromatografisch 
analysiert werden kann (49). Als Alternative können die Kontrolltiere ver ­
wendet werden, um den Lipidgehalt zu bestimmen, der dann herangezogen werden kann, um die BAF-Werte zu normalisieren. Mit letztgenanntem 
Konzept lässt sich die Verunreinigung der Geräte durch die Prüfsubstanz 
reduzieren.
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1304
 
DATEN UND BERICHTERSTATTUNG  
Auswertung der Ergebnisse  
54. Die Aufnahmekurve der Prüfsubstanz ergibt sich, indem ihre Konzentration 
in/auf den Würmern in der Aufnahmephase gegen die Zeit auf einer arith ­
metischen Skala aufgetragen wird. Wenn die Kurve ein Plateau oder den  
steady state  (siehe Definitionen in Anlage 1) erreicht hat, wird der  steady- 
state -Bioakkumulationsfaktor BAF  ss wie folgt errechnet:  
C a bei steady state oder am Ende der Aufnahmephase  ðDurchschnittÞ 
C s bei steady state oder am Ende der Aufnahmephase  ðDurchschnittÞ 
Dabei sind:  
C a = die Konzentration der Prüfsubstanz im Testorganismus  
C s = die Konzentration der Prüfsubstanz im Boden  
55. Wird kein  steady state  erreicht, sollte der auf den Konstanten basierende 
BAF  K anstelle des BAF  ss wie nachstehend beschrieben bestimmt werden:  
— Bestimmung des Akkumulationsfaktors (BAF  K ) als Quotient k  s /k e . 
— Aufnahme- und Eliminationskonstante möglichst gleichzeitig berechnen 
(siehe Gleichung 11 in Anlage 2)  
— Die Eliminationskonstante (k  e ) wird in der Regel aus der Eliminations ­
kurve abgeleitet (d. h. einer graphischen Darstellung der Prüfsubstanz ­
konzentration in den Würmern während der Eliminationsphase). Die Aufnahmekonstante k
 s wird dann anhand des gegebenen Wertes k  e 
und einem C  a -Wert berechnet, der sich aus der Aufnahmekurve ableitet. 
Siehe Beschreibung dieser Methoden in Anlage 2. Die bevorzugte Me ­
thode zur Berechnung des BAF  K und der Konstanten k  s und k  e ist eine 
computergestützte nichtlineare Parameterschätzung. Wenn die Ausschei ­
dungskurve offensichtlich nicht erster Ordnung ist, sollten komplexere 
Modelle herangezogen werden.  
Prüfbericht  
56. Der Prüfbericht sollte folgende Angaben enthalten:  
Prüfsubstanz:  
— Etwaige verfügbare Angaben zur akuten oder chronischen Toxizität (z. 
B. EC  x , LC  x, NOEC) der Prüfsubstanz gegenüber bodenbewohnenden 
Oligochaeten;  
— Reinheit, physikalischer Zustand und gegebenenfalls 
physikalisch-chemische Eigenschaften, z. B. log K  ow , Wasserlöslichkeit;  
— chemische Kenndaten; Herkunft der Prüfsubstanz, Bezeichnung und 
Konzentration der verwendeten Lösungsmittel;  
— bei radioaktiv markierten Prüfsubstanzen: die genaue Position des mar ­
kierten Atoms (der Atome), die spezifische Radioaktivität und die radio ­
chemische Reinheit.  
Testspezies:  
— wissenschaftlicher Name, Stamm, Bezugsquelle, eventuelle Vorbehand ­
lungen, Akklimatisation, Alter, Größenbereich usw.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1305
 
Prüfbedingungen:  
— angewandtes Prüfverfahren;  
— Art und Eigenschaften der verwendeten Beleuchtung und Photoperio ­
de(n);  
— Versuchsaufbau (z. B. Anzahl und Größe der Prüfgefäße, Bodenmasse 
und Füllhöhe der Bodenschicht, Anzahl der Replikate, Anzahl der Wür ­
mer pro Replikat, Anzahl der Prüfkonzentrationen, Dauer der Aufnahme- und Eliminationsphase, Häufigkeit der Probenahmen);
 
— Begründung für die Wahl des Materials der Prüfgefäße;  
— Methode für die Vorbereitung des Prüfgegenstands und Applikations ­
methode sowie Begründung der Wahl einer bestimmten Methode;  
— die nominellen Prüfkonzentrationen, der Durchschnitt der gemessenen 
Werte sowie deren Standardabweichungen in den Prüfgefäßen sowie 
das Verfahren, durch das diese Werte ermittelt wurden;  
— Quelle der Bestandteile des künstliches Bodens oder — wenn ein na ­
türliches Medium verwendet wird — Herkunft des Bodens, Beschrei ­
bung etwaiger Vorbehandlungen, Ergebnisse der Kontrollen (Über ­
lebensrate, Entwicklung der Biomasse, Reproduktion), Bodenmerkmale 
(pH-Wert, Gesamtgehalt an organischem Kohlenstoff, Korngrößenvertei ­
lung (Anteil an Sand, Schluff und Lehm), WHC  max , Wassergehalt zu 
Beginn und am Ende des Versuchs und sonstige vorgenommene Mes ­
sungen);  
— Angaben zur Behandlung der Boden- und Wurmproben, einschließlich 
aller Einzelheiten über Vorbereitung, Lagerung, Dotierungsverfahren, Extraktion, und zu Analyseverfahren (und -genauigkeit) in Bezug auf 
die Prüfsubstanz in Würmern und Boden sowie zum Lipidgehalt (falls 
gemessen) und Wiederauffindungsraten des Prüfgegenstands.
 
Ergebnisse:  
— Mortalität der Kontrollwürmer und der Würmer in den einzelnen Prüf ­
gefäßen sowie jegliches beobachtetes anormales Verhalten (z. B. Ver ­
meidung des Bodens, fehlende Reproduktion bei einem Bioakkumulati ­
onstest mit Enchytraeen);  
— Verhältnis zwischen Trockengewicht und Frischgewicht im Boden und 
in den Testorganismen (nützlich für die Normalisierung);  
— das Feuchtgewicht der Würmer bei jeder Probenahme; für Regenwürmer 
das Feuchtgewicht zu Beginn des Versuchs und bei jeder Probenahme 
vor und nach der Darmentleerung;  
— der Lipidgehalt der Testorganismen (falls in der Prüfung ermittelt);  
— Kurven der Aufnahme- und Eliminationskinetiken der Prüfsubstanz in 
den Würmern und die Zeit bis zur Einstellung des  steady state ; 
— C  a und C  s (gegebenenfalls mit Standardabweichung und Abweichungs ­
bereich) für alle Probenahmen (wobei C  a in g kg  –1 Feucht- und Tro ­
ckengewicht des Ganzkörpers und C  s in g kg  –1 Feucht- und Trockenge ­
wicht des Bodens ausgedrückt wird). Wird der Biota-Boden- 
Akkumulationsfaktor (BSAF) benötigt (z. B. für den Vergleich der Er ­
gebnisse von zwei oder mehreren Tests, die mit Tieren mit unterschied ­
lichem Lipidgehalt durchgeführt wurden), so können C  a zusätzlich als g 
kg –1 Lipidgehalt des Organismus und C  s als g kg  –1 organischer 
Kohlenstoff (OC) des Bodens ausgedrückt werden;  
— BAF (ausgedrückt in kg Boden ·kg –1 Wurm), Boden-Aufnahmekonstante 
k s (ausgedrückt in g Boden kg  –1 Wurm d  –1 ) und Eliminationskonstante 
k e (ausgedrückt in d  –1 ); BSAF (ausgedrückt in kg Boden organischer 
Kohlenstoff kg  –1 Lipidgehalt des Wurms) kann zusätzlich angegeben 
werden;  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1306
 
— falls gemessen: Gehalt an Ausgangssubstanz, Metaboliten und gebunde ­
nen Rückständen (d. h. Gehalt an Prüfsubstanz, die sich nicht mit ge ­
wöhnlichen Extraktionsmethoden extrahieren lässt) im Boden und in den Testtieren;
 
— Methoden zur statistischen Datenanalyse.  
Auswertung der Ergebnisse:  
— Übereinstimmung der Ergebnisse mit den Validitätskriterien gemäß in 
Nummer 17;  
— unerwartete oder ungewöhnliche Ergebnisse, z. B. unvollständige Elimi ­
nation der Prüfsubstanz durch die Testtiere.  
LITERATUR:  
1. Amorim M. (2000): Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane ( γ-HCH) 
in the Enchytraeid  Enchytraeus albidus . Master thesis, Universidade de 
Coimbra.  
2. ASTM (2000): Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American So ­
ciety for Testing and Materials, E 1688-00a.  
3. ASTM International (2004): Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus.  ASTM Interna ­
tional, E1676-04: 26 ff.  
4. Beek B., Boehling S., Bruckmann U., Franke C., Joehncke U., Studinger G. 
(2000): The assessment of bioaccumulation. In: Hutzinger, O. (editor), The 
Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): 
Bioaccumulation — New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235-276.
 
5. Belfroid A., Sikkenk M., Seinen W., Van Gestel C., Hermens J. (1994): The 
toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia andrei ): 
Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem., 13: 93-99.  
6. Belfroid A., Van Wezel A., Sikkenk M., Van Gestel C., Seinen W. & 
Hermens J. (1993): The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earth ­
worms ( Eisenia andrei ): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety, 25: 
154-165.  
7. Belfroid A., Meiling J., Drenth H., Hermens J., Seinen W., Van Gestel C. 
(1995): Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms ( Eisenia 
andrei ). Ecotox. Environ. Safety 31: 185-191.  
8. Bell A.W. (1958): The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus.  Ann. Mus. Novitat. 1902: 1-13.  
9. Bligh E.G. and Dyer W.J. (1959): A rapid method of total lipid extraction 
and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911-917.  
10. Bouche M. (1972): Lombriciens de France. Écologie et Systématique. INRA, 
Annales de Zoologie-Écologie animale, Paris, 671 p.  
11. Bruns E., Egeler Ph., Moser T., Römbke J., Scheffczyk A., Spörlein P. 
(2001a): Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Bericht an das Umweltbundesamt Berlin, 
FuE-Nr.: 298 64 416.
 
12. Bruns E., Egeler Ph., Römbke J., Scheffczyk A., Spörlein P. (2001b): Bio ­
accumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  Enchyt­
raeus luxuriosus  and Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligochaeta, An ­
nelida). Hydrobiologia 463: 185-196.  
13. Conder J.M. and Lanno R.P. (2003): Lethal critical body residues as mea ­
sures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  Eisenia 
fetida.  J. Soils Sediments 3: 13-20.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1307
 
14. Connell D.W. and Markwell R.D. (1990): Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System. Chemosphere 20: 91-100.  
15. Didden W.A.M. (1993): Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 
37: 2-29.  
16. Didden W.A.M. (2003): Oligochaeta. In: Bioindicators and Biomonitors. 
Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science 
Ltd., Niederlande, S. 555-576.  
17. De Boer J., Smedes F., Wells D., Allan A. (1999): Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. 
Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU-Programm für Normung, Mess- und Prüfverfahren.
 
18. Dietrich D.R., Schmid P., Zweifel U., Schlatter C., Jenni-Eiermann S., Bach ­
mann H., Bühler U., Zbinden N. (1995): Mortality of birds of prey following 
field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Con ­
tam. Toxicol. 29: 140-145.  
19. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates 
vom 18. Dezember 2006 zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Be ­
schränkung chemischer Stoffe (REACH), zur Schaffung einer Europäischen Chemikalienagentur, zur Änderung der Richtlinie 1999/45/EG und zur Auf ­
hebung der Verordnung (EWG) Nr. 793/93 des Rates, der Verordnung (EG) 
Nr. 1488/94 der Kommission, der Richtlinie 76/769/EWG des Rates sowie der Richtlinien 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/EG und 2000/21/EG der Kommission; ABl. L 396 vom 30.12.2006, S. 1.
 
20. Edwards C.A. and Bohlen P.J. (1996): Biology and Ecology of Earthworms. 
Third Edition, Chapman & Hall, London, S. 426 ff.  
21. OECD (2008), „Bioakkumulation in sedimentbewohnenden benthischen Oli ­
gochaeten“, Prüfrichtlinie Nr. 315, Guidelines for the Testing of Chemicals, 
OECD, Paris.  
22. Egeler Ph., Gilberg D., Scheffczyk A., Moser Th. and Römbke J. (2009): 
Validierung einer Methode zur Messung der Bioakkumulation in terrestri ­
schen Organismen mittels eines internationalen Ringtests. Bericht an das 
Umweltbundesamt Dessau-Rosslau, FuE-Nr.: 204 67 458: S. 149 ff. Abruf ­
bar unter folgender Adresse: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/ 
42552727.pdf.  
23. Elmegaard N. and Jagers op Akkerhuis G.A.J.M. (2000): Safety factors in 
pesticide risk assessment. Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technischer Be ­
richt 325: S. 57 ff.
 
24. Environment Canada (1995): Guidance document on measurement of toxi ­
city test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. 
Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.  
25. EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195-208.
 
26. Franke C. (1996): How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment? Chemosphere 32: 1897-1905.  
27. Franke C., Studinger G., Berger G., Böhling S., Bruckmann U., 
Cohors-Fresenborg D., Jöhncke U. (1994): The assessment of bioaccumula ­
tion. Chemosphere 29: 1501-1514.  
28. Füll C. (1996): Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexa ­
chlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Di ­
chlorprop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, Lumbrici ­
dae). Dissertation University Mainz, 156 ff.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1308
 
29. Füll C., Schulte C., Kula C. (2003): Bewertung der Auswirkungen von 
Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF — Z. Umweltchem, Öko ­
tox. 15: 78-84.  
30. Gabric A.J., Connell D.W., Bell P.R.F. (1990): A kinetic model for biocon ­
centration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225- 1231.
 
31. Gardner W.S., Frez W.A., Cichocki E.A., Parrish C.C. (1985): Micro ­
methods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 
30: 1099-1105.  
32. Hawker D.W. and Connell D.W. (1988): Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707.
 
33. Hund-Rinke K. and Wiechering H. (2000): Earthworm avoidance test for soil 
assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sedi ­
ments 1: 15-20.  
34. Hund-Rinke K., Römbke J., Riepert F., Achazi R. (2000): Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxiko ­
logische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisen ­
traeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59-81.  
35. ISO 11268-2 (1998) Bodenbeschaffenheit — Wirkungen von Schadstoffen 
auf Regenwürmer ( Eisenia fetida ). Teil 2: Bestimmung der Wirkung auf die 
Reproduktionsleistung.  
36. Jaenike J. (1982): „ Eisenia foetida “ is two biological species. Megadrilogica 
4: 6-8.  
37. Jager T. (1998): Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080-2090.
 
38. Jager T., Sanchez P.A., Muijs B., van der Welde E., Posthuma L (2000): 
Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia andrei  (Oli­
gochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953-961.  
39. Jager T., Baerselman R., Dijkman E., De Groot A.C., Hogendoorn E.A., 
DeJong A., Kruitbosch J.A.W., Peijnenburg W.J.G.M. (2003a): Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia andrei , Oligo­
chaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. 
Chem. 22: 767-775.
 
40. Jager T., Fleuren R.L.J., Hoogendoorn E., de Korte G. (2003b): Elucidating 
the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  Eisenia 
andrei  (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399-3404.  
41. Janssen M.P.M., Bruins A., De Vries T.H., Van Straalen N.M. (1991): 
Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. En ­
viron. Contam. Toxicol. 20: 305-312.  
42. Kasprzak K. (1982): Review of enchytraeid community structure and 
function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217-232.  
43. Khalil A.M. (1990): Aufnahme und Metabolismus von  14 C-Hexachlorbenzol 
und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation Universität 
München, S. 137 ff.  
44. Landrum P.F. (1989): Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aro ­
matic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod  Pontoporeia hoyi.  
Environ. Sci. Toxicol. 23: 588-595.  
45. Marinussen M.P.J.C., Van der Zee S.E.A.T.M., De Haan F.A. (1997): Cu 
accumulation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions compared 
with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17-26.  
46. Mount D.R., Dawson T.D., Burkhard L.P. (1999): Implications of gut pur ­
ging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment 
with Lumbriculus variegates.  Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244-1249.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1309
 
47. Nendza M. (1991): QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations. In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumula ­
tion in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
 
48. Kapitel C.8 dieses Anhangs; Toxizität für Regenwürmer.  
49. Kapitel C.13 dieses Anhangs; Biokonzentration: Durchfluss-Fischtest.  
50. Kapitel C.21 dieses Anhangs; Bodenmikroorganismen: Stickstofftransforma ­
tionstest.  
51. OECD (2004a), Reproduktionstest mit Enchytraeen, Prüfrichtlinie Nr. 220, 
Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris.  
52. OECD (2004b) Reproduktionstest mit Regenwürmern ( Eisenia fetida /Eisenia 
andrei ), Prüfrichtlinie Nr. 222, Guidelines for the Testing of Chemicals, 
OECD, Paris.  
53. OECD (2008), „Bioakkumulation in sedimentbewohnenden benthischen Oli ­
gochaeten“, Prüfrichtlinie Nr. 315, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris.
 
54. Petersen H. and Luxton M. (1982): A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388.  
55. Phillips D.J.H. (1993): Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology 
Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378-396.  
56. Pflugmacher J. (1992): Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Ko ­
effzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77-81.  
57. Posthuma L., Weltje L., Anton-Sanchez F.A. (1996): Joint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  Eisenia 
fetida.  RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.  
58. Randall R.C., Lee II H., Ozretich R.J., Lake J.L., Pruell R.J. (1991): Eva ­
luation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431-1436.
 
59. Römbke J., Egele, P., Füll C. (1998): Literaturstudie über Bioakkumulations ­
tests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.  
60. Römbke J. and Moser Th. (1999): Organisation and performance of an 
international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: S. 373 ff.
 
61. Römbke J., Riepert F., Achazi R. (2000): Enchytraeen als Testorganismen. 
In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & 
Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105-129.  
62. Romijn C.A.F.M., Luttik R., Van De Meent D., Slooff W.,Canton J.H. 
(1993): Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, 
Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107-127.
 
63. Sample B.E., Suter D.W., Beauchamp J.J., Efroymson R.A. (1999): 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110-2120.
 
64. Schlosser H-J. and Riepert F. (1992): Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413-433.
 
65. Schmelz R. and Collado R. (1999):  Enchytraeus luxuriosus  sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 
57: 93–100.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1310
 
66. Sims R.W. and Gerard B.M. (1985): Earthworms, In: Kermack, D.M. & 
Barnes, R.S.K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 
31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.  
67. Sousa J.P., Loureiro S., Pieper S., Frost M., Kratz W., Nogueira A.J.A., 
Soares A.M.V.M. (2000): Soil and plant diet exposure routes and toxicoki ­
netics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 
2557–2563.  
68. Spacie A. and Hamelink J.L. (1982): Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320.  
69. Stephenson G.L., Kaushik A., Kaushik N.K., Solomon K.R., Steele T., 
Scroggins R.P. (1998): Use of an avoidance-response test to assess the 
toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm 
ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, Pensacola, 67-81.
 
70. Sterenborg I., Vork N.A., Verkade S.K., Van Gestel C.A.M., Van Straalen 
N.M. (2003): Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding 
and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta.  Environ. 
Toxicol. Chemistry 22: 1167-1171.  
71. UBA (Umweltbundesamt) (1991): Bioakkumulation — Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.  
72. US EPA (2000): Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of 
sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edi ­
tion, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000.
 
73. Van Brummelen T.C. and Van Straalen N.M. (1996): Uptake and elimination 
of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber.  Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 31: 277-285.  
74. Van Gestel C.A.M. (1992): The influence of soil characteristics on the 
toxicity of chemicals for earthworms; a review. In: Ecotoxicology of Earth ­
worms (Ed. Becker H., Edwards P.J., Greig-Smith P.W. & Heimbach F.). 
Intercept Press, Andover (GB).  
75. Van Gestel C.A.M. and Ma W.-C. (1990): An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Che ­
mosphere 21: 1023-1033.  
76. Van Straalen N.M., Donker M.H., Vijver M.G., van Gestel C.A.M. (2005): 
Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil inver ­
tebrates. Environmental Pollution 136: 409-417.  
77. Venter J.M. and Reinecke A.J. (1988): The life-cycle of the compost-worm  
Eisenia fetida  (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161-165.  
78. Vijver M.G., Vink J.P.M., Jager T., Wolterbeek H.T., van Straalen N.M., 
van Gestel C.A.M. (2005): Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn 
and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contaminated flood ­
plain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851.  
79. Widianarko B. and Van Straalen N.M. (1996): Toxicokinetics-based survival 
analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 
15: 402–406.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1311
 
Anlage 1  
DEFINITIONEN  
Bioakkumulation  ist die Konzentrationszunahme (Anreicherung) der Prüfsub ­
stanz in oder an einem Organismus gegenüber der Prüfsubstanzkonzentration 
im umgebenden Medium. Bioakkumulation setzt sich aus Biokonzentrations- und Biomagnifikationsvorgängen (siehe unten) zusammen.
 
Biokonzentration  ist die Konzentrationszunahme (Anreicherung) der Prüfsub ­
stanz in oder an einem Organismus gegenüber der Prüfsubstanzkonzentration 
im umgebenden Medium, die ausschließlich aus der Aufnahme der Substanz aus dem umgebenden Medium (z. B. über die Körperoberfläche und durch die ingestive Aufnahme des Bodens) resultiert.
 
Biomagnifikation  ist die Konzentrationszunahme (Anreicherung) der Prüfsub ­
stanz in oder an einem Organismus, die hauptsächlich aus der Aufnahme der 
Prüfsubstanz über kontaminiertes Futter oder kontaminierte Beute resultiert, be ­
zogen auf die Prüfsubstanzkonzentration im Futter bzw. in der Beute. Biomag ­
nifikation kann zum Transfer oder zur Bioakkumulation der Prüfsubstanz in 
Nahrungsketten oder -netzen führen.  
Die Elimination  einer Prüfsubstanz ist die Ausscheidung der angereicherten 
Prüfsubstanz aus dem Prüforganismus durch aktive oder passive Prozesse, die unabhängig von An- oder Abwesenheit der Prüfsubstanz im umgebenden Me ­
dium erfolgt.
 
Der Bioakkumulationsfaktor  (BAF) zu jedem beliebigen Zeitpunkt während der 
Aufnahmephase dieses Bioakkumulationstests ist der Quotient aus der Konzen ­
tration der Prüfsubstanz in/an dem Prüforganismus (C  a in g kg  -1 Trockengewicht 
Wurm) und der Konzentration der Prüfsubstanz im umgebenden Medium (C  s 
in g kg  -1 Trockengewicht Boden); der BAF wird in kg Boden ·kg -1 Wurm aus ­
gedrückt.  
Der steady-state -Bioakkumulationsfaktor  (BAF  ss ), der den BAF im  steady state  
bezeichnet, ändert sich über einen längeren Zeitraum nicht wesentlich; die Kon ­
zentration der Prüfsubstanz im umgebenden Medium (C  s ausgedrückt als g kg  -1 
Trockengewicht des Bodens) ist während dieser Zeit konstant.  
Bioakkumulationsfaktoren , die sich direkt anhand des Verhältnisses der 
Substrat-Aufnahmekonstanten zur Eliminationskonstanten (k  s und k  e , siehe un ­
ten) berechnen lassen, werden als kinetischer Bioakkumulationsfaktor (BAF  K ) 
bezeichnet.  
Der Biota-Boden-Akkumulationsfaktor  (BSAF) ist der Quotient aus der auf 
den Lipidgehalt normierten Prüfsubstanzkonzentration in/an dem Testorganismus (C
 a in g kg  -1 Lipidgehalt des Organismus) und der auf den organischen Kohlen ­
stoffgehalt normierten Prüfsubstanzkonzentration im Boden im  steady state  (C  s 
in g kg  -1 organischen Kohlenstoff des Bodens); der BSAF wird in kg organischer 
Kohlenstoff ·kg -1 Lipid ausgedrückt.  
Ein Plateau  oder  steady state  ist definiert als das Gleichgewicht zwischen den 
während der Aufnahmephase simultan auftretenden Aufnahme- und Eliminations ­
vorgängen. Der  steady state  in der grafischen Darstellung des gegen die Zeit 
aufgetragenen BAF ist erreicht, wenn die Kurve parallel zur Zeitachse verläuft 
und wenn drei aufeinander folgende BAF-Analysen, die an Proben durchgeführt werden, die im Abstand von mindestens zwei Tagen genommen wurden, um 
nicht mehr als ± 20 % voneinander abweichen, bzw. wenn es keine statistisch 
bedeutenden Unterschiede zwischen den drei Probenahmephasen gibt. Für Prüf ­
substanzen, die nur langsam aufgenommen werden, ist ein zeitlicher Abstand zwischen den Probenahmen von sieben Tagen geeigneter (49).
 
Der Koeffizient für die Verteilung organischer Kohlenstoff/Wasser  (K  oc ) be­
zeichnet das Verhältnis der Gleichgewichtskonzentration Substanz im/am organi ­
schen Kohlenstoffanteil im Boden zu derjenigen im Wasser.  
Der Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizient  (K  ow ) bezeichnet das Verhältnis 
zwischen der Konzentration einer Substanz in n-Oktanol und ihrer Konzentration in Wasser im Gleichgewicht, auch als P
 ow -Wert ausgedrückt. Der Logarithmus 
von K  ow (log K  ow ) gilt als Maß für das Potenzial einer Substanz, von aquatischen 
Organismen angereichert zu werden.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1312
 
Die Aufnahme- oder Expositionsphase  ist der Zeitraum, in dem die Prüforga ­
nismen der Prüfsubstanz ausgesetzt sind.  
Die Substrat-Aufnahmekonstante  (k s ) ist der numerische Wert, der die Ge ­
schwindigkeitsrate der Zunahme der Prüfsubstanzkonzentration im/am Testorga ­
nismus bei Anreicherung der Substanz aus dem Boden definiert. k  s wird in g 
Boden kg  -1 Wurm d  -1 ausgedrückt.  
Die Eliminationsphase  ist der Zeitraum, in dem nach Umsetzung der Testorga ­
nismen von kontaminiertem Medium in prüfsubstanzfreies Medium die Ausschei ­
dung (oder der Nettoverlust) der Prüfsubstanz durch die Testorganismen be ­
obachtet wird.  
Die Eliminationskonstante  (k e ) ist der numerische Wert, der die Geschwindig ­
keit der Konzentrationsabnahme der Prüfsubstanz in/an dem Testorganismus nach 
Umsetzung der Testorganismen aus einem mit Prüfsubstanz belasteten Medium in prüfsubstanzfreies Medium definiert; k
 e wird in Tag  -1 (d -1 ) angegeben.  
Prüfsubstanz:  jede Substanz oder jedes Gemisch, die/das mit dieser Prüfmethode 
getestet wird.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1313
 
Anlage 2  
Berechnung der Aufnahme- und Eliminationsparameter  
Hauptendpunkt eines Bioakkumulationstests ist der Bioakkumulationsfaktor 
(BAF). Zur Berechnung des gemessenen BAF bildet man den Quotienten aus 
der Konzentration der Prüfsubstanz im Testorganismus (C  a ) und der Konzentra ­
tion im Substrat (C  s ) im steady state . Wurde der  steady state  während der Auf ­
nahmephase nicht erreicht, so wird anhand der Konstanten der kinetische Bio ­
akkumulationsfaktor (BAF  K ) anstelle des  steady-state -Bioakkumulationsfaktors 
BAFss berechnet.  
Für die Berechnung des kinetischen Bioakkumulationsfaktors (BAF  K ), der 
Substrat-Aufnahmekonstanten (k  s ) und der Eliminationskonstanten (k  e ) werden 
in der Regel computergestützte, nichtlineare Verfahren zur Parameterschätzung 
eingesetzt, z. B. basierend auf den in (68) beschriebenen Modellen. Diese Pro ­
gramme bestimmen die Werte BAF  K , k s und k  e basierend auf einem gegebenen 
Satz von über die Zeit ermittelten Konzentrationsdaten und den Modellgleichun ­
gen: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [Gleichung 1]  
oder 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [Gleichung 2]  
Dabei sind:  
C a = Konzentration der chemischen Substanz in den Würmern [g kg-1 Feucht- 
oder Trockengewicht]  
k s = Aufnahmekonstante im Gewebe [g Boden kg-1 Wurm d-1]  
C s = Konzentration der chemischen Substanz im Boden [g kg-1 Feucht- oder 
Trockengewicht]  
k e = Eliminationskonstante [d-1]  
t c = Zeit am Ende der Aufnahmephase.  
Wenn die Hintergrundkonzentration in den nichtexponierten Würmern z. B. am 
Tag 0 deutlich von Null abweicht (was z. B. bei Metallen der Fall sein kann), so wird diese Hintergrundkonzentration (C
 a,0 ) in den Gleichungen wie folgt berück ­
sichtigt: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [Gleichung 3]  
und 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [Gleichung 4]  
Wird im Verlauf der Aufnahmephase eine deutliche Abnahme der Prüfsubstanz ­
konzentration im Boden beobachtet, so können folgende Modellgleichungen ver ­
wendet werden (z. B. (67) (79)): 
C s ¼ C 0 ðe –k 0 t Þ [Gleichung 5]  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1314
 
Dabei sind:  
C s = Konzentration der Substanz im Boden [g kg-1 Feucht- oder Trockenge ­
wicht]  
k 0 = Boden-Abbaukonstante [d-1]  
C 0 = anfängliche Konzentration der chemischen Substanz im Boden [gkg-1 
Feucht- oder Trockengewicht] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [Gleichung 6] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [Gleichung 7]  
Dabei sind:  
C a = Konzentration der chemischen Substanz in Würmern [g kg-1 Feucht- oder 
Trockengewicht]  
k s = Aufnahmekonstante im Gewebe [g soil kg-1 of worm d-1]  
k 0 = Boden-Abbaukonstante [d-1]  
k e = Eliminationskonstante [d-1]  
t c = Zeit am Ende der Aufnahmephase.  
Wird ein  steady state  während der Aufnahmephase erreicht (d. h. t = ∞), kann 
Gleichung 1  
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [Gleichung 1]  
umgeformt werden zu  
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
oder 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [Gleichung 8]  
Damit stellt k  s /k e x C  s eine Annäherung an die Konzentration der Prüfsubstanz 
im Wurmgewebe im  steady state  (C a,ss ) dar.  
Der Biota-Boden-Akkumulationsfaktor (BSAF) lässt sich wie folgt berechnen:  
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [Gleichung 9]  
wobei f  oc die Fraktion des organischen Kohlenstoffs im Boden und f  lip die 
Fraktion des Lipidgehalts der Würmer ist, beide vorzugsweise an Proben, die aus dem Versuch stammen, und jeweils nach Trocken- oder Feuchtgewicht be ­
stimmt.
 
Zur Modellierung der Eliminationskinetik/Eliminationsverläufe können die Daten 
aus der Eliminationsphase herangezogen und die folgende Modellgleichung und 
ein computergestütztes, nichtlineares Verfahren zur Parameterschätzung angewen ­
det werden. Weisen die gegen die Zeit aufgetragenen Messwerte auf eine kon ­
stante exponentielle Abnahme der Prüfsubstanzkonzentration in den Tieren hin, 
so lässt sich der Eliminationsverlauf mit einem Ein-Kompartiment-Modell (Glei ­
chung 9) beschreiben.  
C a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [Gleichung 10]  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1315
 
Die Elimination kann zuweilen biphasisch verlaufen, mit einer raschen Abnahme 
von C  a in den Anfangsphasen und einem langsameren Verlust an Prüfsubstanz in 
den letzten Phasen der Elimination, z. B. (27) (68). Erklären lassen sich die beiden Phasen mit der Annahme, dass es im Organismus zwei verschiedene Kompartimente gibt, aus denen die Prüfsubstanz mit unterschiedlichen Geschwin ­
digkeiten eliminiert wird. Für diese Fälle wird auf die einschlägige Literatur 
verwiesen, z. B. (38) (39) (40) (78).
 
Anhand der obigen Modellgleichungen können die Kinetikparameter (k  s und k  e ) 
auch in einem Durchlauf berechnet werden, indem die Kinetikmodellgleichung 1. Ordnung auf alle Daten aus der Aufnahme- und der Eliminationsphase gleich ­
zeitig angewendet wird. Für die Beschreibung einer Methode, die eine solche 
kombinierte Berechnung der Aufnahme- und Eliminationskonstanten ermöglicht, wird auf (41), (73) und (70) verwiesen. 
C
 a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[Gleichung 11]  
Anmerkung:  Bei gleichzeitiger Schätzung der Aufnahme- und Eliminationspara ­
meter anhand der kombinierten Aufnahme- und Eliminationsdaten 
ist„m“ in Gleichung 11 ein Deskriptor, mit dem das Computerpro ­
gramm die Teilterme der Gleichung den Datensätzen der jeweiligen Phase zuordnen und die Schätzung korrekt durchführen kann (m = 
1 für die Aufnahmephase; m = 2 für die Eliminationsphase).
 
Diese Modellgleichungen sind jedoch mit Vorsicht anzuwenden, insbesondere 
wenn sich während des Versuchs die Bioverfügbarkeit der Prüfsubstanz ändert oder (biologischer) Abbau stattfindet (siehe z. B. (79)).
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1316
 
Anlage 3  
PROBENAHMEPLAN FÜR DIE TESTUNG DER BIOAKKUMULATION IM 
BODEN —BEISPIELE  
Regenwurmtest  
a) Aufnahmephase mit 8 Messpunkten für die Kinetikberechnung  
Tag Arbeitsschritte  
– 6 Konditionieren des zubereiteten Bodens für 48 Std.; 
– 4 Dotieren der Bodenfraktion mit der Lösung der Prüfsubstanz, 
Abdampfen von Lösungsmitteln; Mischen der Bodenbestandteile; Befüllen der Prüfgefäße mit dem Boden; Equilibrieren bei Prüf ­
bedingungen für 4 Tage (3 Wochen bei metalldotierten Böden); 
– 3 bis – 1 Entnahme der Testorganismen aus der Anzuchtkultur zwecks 
Akklimatisierung; Zubereitung und Befeuchtung der Boden ­
bestandteile; 
0 Bestimmung von Temperatur und pH-Wert des Bodens; Ent ­
nahme von Bodenproben aus den behandelten Prüfgefäßen und 
den Kontrollgefäßen mit Lösungsmittel zur Bestimmung der Prüfsubstanzkonzentration; Zugabe der Futterration; Wiegen und Verteilen der Würmer auf die Prüfgefäße nach dem Zufallsprin ­
zip; Reservieren einer ausreichenden Anzahl von Teilproben von 
Würmern zur Bestimmung von analytischen Hintergrundwerten, Feucht- und Trockengewicht sowie Lipidgehalt; Wiegen sämtli ­
cher Prüfgefäße zur Kontrolle der Bodenfeuchte; Kontrolle der 
Luftzufuhr bei Verwendung eines geschlossenen Prüfsystems; 
1 Kontrolle der Luftzufuhr, Aufzeichnung von Wurmverhalten und 
Temperatur; Entnahme von Boden- und Wurmproben zur Be ­
stimmung der Prüfsubstanzkonzentration; 
2 wie Tag 1; 
3 Kontrolle von Luftzufuhr, Wurmverhalten und Temperatur; 4 wie Tag 1; 
5-6 wie Tag 3; 
7 wie Tag 1; Zugabe der Futterration; Kontrolle der Bodenfeuchte 
durch Rückwägung der Prüfgefäße und Ausgleichen der Ver ­
dunstungsverluste; 
8-9 wie Tag 3; 
10 wie Tag 1; 
11-13 wie Tag 3; 
14 wie Tag 1; Zugabe der Futterration; Kontrolle der Bodenfeuchte 
durch Rückwägung der Prüfgefäße und Ausgleichen der Ver ­
dunstungsverluste; 
15-16 wie Tag 3; 
17 wie Tag 1; 
18-20 wie Tag 3;
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1317
 
Tag Arbeitsschritte  
21 wie Tag 1; Bestimmung von Temperatur und pH-Wert des Bo ­
dens; Kontrolle der Bodenfeuchte durch Rückwägung der Prüf ­
gefäße; Ende der Aufnahmephase; Umsetzen der Würmer aus den verbleibenden exponierten Replikaten in Gefäße mit saube ­
rem Boden für die Eliminationsphase (ohne Entleerung des 
Darminhalts); Entnahme von Boden- und Wurmproben aus den 
Kontrollgefäßen mit Lösungsmittel. 
Die Arbeitsschritte vor der Exponierung (Equilibrierungsphase) 
sind unter Berücksichtigung der Eigenschaften der Prüfsubstanz 
zu programmieren. 
Die für Tag 3 beschriebenen Arbeitsschritte sind täglich durch ­
zuführen (mindestens an den Arbeitstagen).
 
b) Eliminationsphase  
Tag Arbeitsschritte  
– 6 Zubereitung und Befeuchtung der Bodenbestandteile; Konditio ­
nieren des zubereiteten Bodens für 48 Std.; 
– 4 Mischen der Bodenbestandteile; Befüllen der Prüfgefäße mit dem 
Boden; Inkubation bei Prüfbedingungen für 4 Tage; 
0 (Ende der Auf ­
nahmephase) Bestimmung von Temperatur und pH-Wert des Bodens; Wiegen 
und Verteilen der Würmer auf die Prüfgefäße nach dem Zufalls ­
prinzip; Zugabe der Futterration; Umsetzen der Würmer aus den 
verbleibenden exponierten Replikaten in Gefäße mit sauberem Boden; Entnahme von Boden- und Wurmproben nach 4 bis 6 Std. zur Bestimmung der Prüfsubstanzkonzentration; 
1 Kontrolle der Luftzufuhr, Aufzeichnung von Wurmverhalten und 
Temperatur; Entnahme von Boden- und Wurmproben zur Be ­
stimmung der Prüfsubstanzkonzentration; 
2 wie Tag 1; 
3 Kontrolle von Luftzufuhr, Wurmverhalten und Temperatur; 
4 wie Tag 1; 
5-6 wie Tag 3; 
7 wie Tag 1; Zugabe der Futterration; Kontrolle der Bodenfeuchte 
durch Rückwägung der Prüfgefäße und Ausgleichen der Ver ­
dunstungsverluste; 
8-9 wie Tag 3; 
10 wie Tag 1; 
11-13 wie Tag 3; 
14 wie Tag 1; Zugabe der Futterration; Kontrolle der Bodenfeuchte 
durch Rückwägung der Prüfgefäße und Ausgleichen der Ver ­
dunstungsverluste; 
15-16 wie Tag 3; 
17 wie Tag 1;
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1318
 
Tag Arbeitsschritte  
18-20 wie Tag 3; 
21 wie Tag 1; Bestimmung von Temperatur und pH-Wert des Bo ­
dens; Kontrolle der Bodenfeuchte durch Rückwägung der Prüf ­
gefäße; Entnahme von Boden- und Wurmproben aus den Kon ­
trollgefäßen mit Lösungsmittel. 
Der Boden wird vor Beginn der Eliminationsphase auf dieselbe 
Weise zubereitet wie vor der Aufnahmephase. 
Die für Tag 3 beschriebenen Arbeitsschritte sind täglich durch ­
zuführen (mindestens an den Arbeitstagen).  
Enchyträentest  
a) AUfnahmephase mit 8 Messpunkten für die Kinetikberechnung  
Tag Arbeitsschritte  
– 6 Konditionieren des zubereiteten Bodens für 48 h; 
– 4 Dotieren der Bodenfraktion mit der Lösung der Prüfsubstanz, 
Abdampfen von Lösungsmitteln; Mischen der Bodenbestandteile; Befüllen der Prüfgefäße mit dem Boden; Equiliben bei Prüfbe ­
dingungen für 4 Tage (3 Wochen bei metalldotierten Böden); 
– 3 bis – 1 Entnahme der Testorganismen aus der Anzuchtkultur zwecks 
Akklimatisierung; Zubereitung und Befeuchtung der Boden ­
bestandteile; 
0 Bestimmung von Temperatur und pH-Wert des Bodens; Ent ­
nahme von Bodenproben aus den behandelten Prüfgefäßen und den Kontrollgefäßen mit Lösungsmittel zur Bestimmung der Prüfsubstanzkonzentration; Zugabe der Futterration in den Bo ­
den; Wiegen und Verteilen der Würmer auf die Prüfgefäße 
nach dem Zufallsprinzip; Reservieren einer ausreichenden Anzahl von Teilproben von Würmern zur Bestimmung von analytischen 
Hintergrundwerten, Feucht- und Trockengewicht sowie Lipid ­
gehalt; Wiegen sämtlicher Prüfgefäße zur Kontrolle der Boden ­
feuchte; Kontrolle der Luftzufuhr bei Verwendung eines ge ­
schlossenen Prüfsystems; 
1 Kontrolle von Luftzufuhr, Wurmverhalten und Temperatur; Ent ­
nahme von Boden- und Wurmproben zur Bestimmung der Prüf ­
substanzkonzentration; 
2 wie Tag 1; 
3 Kontrolle von Luftzufuhr, Wurmverhalten und Temperatur; 
4 wie Tag 1; 
5-6 wie Tag 3; 
7 wie Tag 1; Zugabe der Futterration in den Boden; Kontrolle der 
Bodenfeuchte durch Rückwägung der Prüfgefäße und Ausglei ­
chen der Verdunstungsverluste; 
9 wie Tag 1; 
10 wie Tag 3;
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1319
 
Tag Arbeitsschritte  
11 wie Tag 1; 
12-13 wie Tag 3; 
14 wie Tag 1; Zugabe der Futterration in den Boden; Bestimmung 
von Temperatur und pH-Wert des Bodens; Kontrolle der Boden ­
feuchte durch Rückwägung der Prüfgefäße; Ende der Aufnahme ­
phase; Umsetzen der Würmer aus den verbleibenden exponierten 
Replikaten in Gefäße mit sauberem Boden für die Eliminations ­
phase (ohne Entleerung des Darminhalts); Entnahme von Boden- und Wurmproben aus den Kontrollgefäßen mit Lösungsmittel. 
Die Arbeitsschritte vor der Exponierung (Equilibrierungsphase) 
sind unter Berücksichtigung der Eigenschaften der Prüfsubstanz 
zu programmieren. 
Die für Tag 3 beschriebenen Arbeitsschritte sind täglich durch ­
zuführen (mindestens an den Arbeitstagen).
 ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1320
 
Anlage 4  
Kunsterde — Empfehlungen für die Zubereitung und Lagerung  
Da natürlicher Boden aus einer bestimmten Quelle möglicherweise nicht das 
ganze Jahr über verfügbar ist und vorhandene Bodenorganismen sowie Mikro ­
schadstoffe den Test beeinflussen können, wird für diesen Test künstliches Sub ­
strat, die Kunsterde gemäß Kapitel C.8 dieses Anhangs (Toxizität für Regenwür ­
mer) (48), empfohlen. In dieser Kunsterde können mehrere Testspezies über ­
leben, heranwachsen und sich vermehren, und eine maximale Standardisierung 
sowie Vergleichbarkeit der Test- und Kulturbedingungen sowohl laborintern als auch zwischen verschiedenen Labors sind gewährleistet.
 
Bodenbestanteile 
Torf: 10 % Sphagnum-Torf, gemäß OECD-Richtlinie 
Nr. 207 (48); 
Quarzsand: 70 % Industriequarzsand (luftgetrocknet); Korn ­
größe: > 50 % der Partikel sollten Größen zwischen 50 und 200 μm aufweisen, aber 
alle Partikel sollten nicht größer als 2 mm 
sein; 
Kaolin-Ton: 20 % Kaolinitgehalt: ≥ 30 %; 
Calciumcarbonat: ≤ 1 % CaCO
 3 , pulverisiert, chemisch rein.  
Es ist ebenfalls möglich, den Gehalt der Kunsterde an organischem Kohlenstoff 
zu reduzieren, z. B. indem der Torfgehalt auf 4 bis 5 % bezogen auf das Tro ­
ckengewicht des Bodens verringert und der Sandanteil entsprechend erhöht wird. Durch eine solche Reduzierung des Gehalts an organischem Kohlenstoff kann die 
Bindung der Prüfsubstanz an den Boden (organischen Kohlenstoff) verringert 
werden und die Bioverfügbarkeit der Prüfsubstanz für die Würmer zunehmen (74). Es wurde nachgewiesen, dass  Enchytraeus albidus  und  Eisenia fetida  den 
Validitätskriterien hinsichtlich der Vermehrung bei Versuchen mit Feldböden mit 
geringerem Gehalt an organischem Kohlenstoff (z. B. 2,7 % (33), (61)) genügen, 
und es ist auch erwiesen, dass diese Ergebnisse auch mit Kunsterde mit 5 %igem Torfgehalt erzielt werden können.
 
Zubereitung  
Die trockenen Bodenbestandteile werden ca. eine Woche vor Prüfbeginn gründ ­
lich durchmischt (z. B. in einem großen Labormischer). Diese Mischung sollte 
mindestens 48 Std. vor Auftragen der Prüfsubstanz zur Einstellung/Stabilisierung des Säuregehalts mit entionisiertem Wasser befeuchtet werden. Der pH-Wert wird bestimmt, indem man den Boden im Verhältnis 1:5 mit 1 M KCl-Lösung 
mischt. Den pH-Wert des Bodens gegebenenfalls durch Zugabe einer ausreichen ­
den Menge von CaCO
 3 auf 6,0 ± 0,5 einstellen oder eine neue Bodenpartie 
zubereiten.  
Die maximale Wasserhaltekapazität (WHC) der Kunsterde wird nach der 
ISO-Norm 11268-2 bestimmt (35). Mindesten zwei Tage vor Testbeginn die trockene Kunsterde mit genug entionisiertem oder rekonsituiertem Wasser be ­
feuchten, bis ungefähr 50 % des endgültigen Wassergehalts, der 40 bis 60 % 
der maximalen Wasserhaltekapazität (WHC) betragen sollte, erreicht sind. Zu Testbeginn wird der angefeuchtete Boden in so viele Portionen, wie Prüfkonzen ­
trationen und Kontrollen für den Test benötigt werden, aufgeteilt und der Feuch ­
tegehalt wird mit der Lösung der Prüfsubstanz und/oder entionisiertem oder 
rekonstituiertem Wasser auf 40 bis 60 % des WHC
 max eingestellt. Der Feuchte ­
gehalt wird zu Beginn und am Ende des Tests (bei 105 °C) bestimmt. Er sollte optimal auf die Bedürfnisse der Spezies abgestimmt sein. (Der Feuchtegehalt 
kann auch überprüft werden, indem der Boden vorsichtig zusammengedrückt 
wird, bis kleine Wassertropfen zwischen den Finger auftauchen).
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Lagerung  
Die trockenen Bestandteile der Kunsterde können bis zu ihrem Gebrauch bei 
Raumtemperatur gelagert werden. Der vorbereitete, angefeuchtete Boden kann bis zu drei Tage vor dem Dotieren an einem kühlen Ort gelagert werden. Ver ­
dunstungsverluste sind möglichst gering zu halten. Der Boden ist unmittelbar 
nach dem Auftragen der Prüfsubstanz zu gebrauchen, außer es liegen Informa ­
tionen darüber vor, dass der betreffende Boden gelagert werden kann, ohne dass hierdurch die Toxizität und Bioverfügbarkeit der Prüfsubstanz beeinflusst wer ­
den. In diesem Fall können Proben des dotierten Bodens bis zur Analyse unter 
den für die betreffende Prüfsubstanz empfohlenen Bedingungen gelagert werden.
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Anlage 5  
Als Testspezies für die Bestimmung der Bioakkumulation aus dem Boden 
empfohlene Arten terrestrischer Oligochaeten  
Regenwürmer  
Die empfohlene Testspezies  Eisenia fetida  (Savigny 1826) gehört zur Familie der 
Regenwürmer (Lumbricidae). Seit 1972 wird sie in zwei Unterarten ( Eisenia 
fetida  und  Eisenia andrei  aufgeteilt (10)). Laut Jaenike (36) handelt es sich 
jedoch um zwei gesonderte Arten.  Eisenia fetida  ist leicht an den glänzenden 
gelben Streifen zwischen den Segmenten erkennbar, während  Eisenia andrei  eine 
einheitlich dunkelrote Färbung aufweist. Die ursprüngliche Heimat dieser Arten 
liegt wahrscheinlich in der Gegend des Schwarzen Meers; inzwischen sind sie weltweit verbreitet und kommen vor allem in anthropogen beeinflussten Habita ­
ten wie Komposthaufen vor. Beide lassen sich sowohl für Ökotoxikologietests als 
auch für Bioakkumulationstests verwenden.
 
Eisenia fetida  und Eisenia andrei  sind im Handel erhältlich, z. B. als Fischköder. 
Ihr Reproduktionszyklus ist im Vergleich zu anderen Lumbriciden relativ kurz. Bei Raumtemperatur erreichen sie nach ca. 2-3 Monaten Geschlechtsreife. Ihr Temperaturoptimum liegt bei ca. 20-24 °C. Sie bevorzugen ein relativ feuchtes 
Substrat mit neutralem pH und hohem Gehalt an organischem Material. Da diese 
Arten seit ca. 25 Jahren weitgehend in standardisierten Ökotoxikologietests ver ­
wendet werden, ist das Verfahren für ihre Anzucht wohlbekannt (48) (77).
 
Beide Arten können in vielfältigen tierischen Exkrementen angezogen werden. In 
der ISO-Norm (35) wird als Anzuchtsmedium eine 50:50-Mischung von Pferde- oder Rinderdung und Torf empfohlen. Das Medium sollte einen pH-Wert von 
etwa 6 bis 7 (eingestellt mit Calciumcarbonat) sowie eine niedrige Ionenleitfähig ­
keit (weniger als 6 mS/cm oder weniger als 0,5 % Salzkonzentration) haben und sollte nicht übermäßig mit Ammonium oder tierischem Urin verunreinigt sein. Es 
kann auch handelsübliche zusatzfreie Gartenerde, OECD-Kunsterde (48) oder 
eine Mischung aus beiden zu gleichen Teilen verwendet werden. Das Substrat sollte feucht, jedoch nicht zu nass sein. Zur Anzucht eignen sich Kästen mit einem Fassungsvermögen von 10 Liter bis 50 Liter.
 
Zur Gewinnung von Würmern gleichen Alters und gleicher Größe (Masse) ist es 
am besten, die Kultur mit Kokons zu beginnen. Hierzu werden adulte Würmer 
zur Kokonablage in einen Anzuchtkasten mit frischem Substrat gesetzt. Die 
praktische Erfahrung hat gezeigt, dass eine Besatzdichte von ca. 100 adulten Würmern pro kg Substrat (Feuchtgewicht) gute Reproduktionsraten ergibt. Nach 28 Tagen werden die adulten Tiere entfernt. Die aus diesen Kokons ge ­
schlüpften Würmer werden nach Erreichen der Geschlechtsreife nach mindestens 
zwei Monaten, spätestens jedoch nach 12 Monaten für Tests verwendet.
 
Die Würmer der oben beschriebenen Arten können als gesund betrachtet werden, 
wenn sie sich durch das Substrat bewegen, nicht versuchen, das Substrat zu verlassen und sich regelmäßig reproduzieren. Substratmangel wird durch eine 
sehr langsame Bewegung der Würmer angezeigt und dadurch, dass sie ein gelbes 
hinteres Ende (im Fall von  Eisenia fetida ) aufweisen. In diesem Fall ist/sind die 
Bereitstellung von frischem Substrat und/oder die Reduzierung der Besatzdichte je Kasten zu empfehlen.
 
Zusätzlich ausgewähltes Referenzmaterial  
Gerard B.M. (1964): Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. London, 6: 1-58.  
Graff O. (1953): Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch. 7: 1-81.  
Römbke J., Egeler P., Füll C. (1997): Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 
909, 86 S.  
Rundgren S. (1977): Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. 
Oikos 28: 49-55.  
Satchell J.E. (1955): Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 
180-201.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1323
 
Sims R.W. and Gerard B.M. (1985): A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. 
London 31: 1-171.  
Tomlin A.D. (1984): The earthworm bait market in North America. In: Earth ­
worm Ecology — from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & 
Hall, London. 331-338 pp.  
Enchytraeen  
Als Testspezies wird  Enchytraeus albidus  Henle 1837 (Weißer Topfwurm) emp ­
fohlen. Mit einer Länge von bis zu 15 mm ist  Enchytraeus albidus  einer der 
größten Vertreter der zu den Ringelwürmern gehörenden Oligochaetenfamilie 
Enchytraeidae und ist ubiquitär (8) verbreitet.  Enchytraeus albidus  ist in marinen, 
limnischen und terrestrischen Habitaten zu finden, hauptsächlich in faulendem 
organischem Material (Seetang, Kompost), aber, wenn auch seltener, ebenso in 
Wiesen (42). Diese breite ökologische Toleranz und einige morphologische Va ­
riationen weisen darauf hin, dass es möglicherweise mehrere Unterarten dieser Art gibt.
 
Enchytraeus albidus  ist im Handel erhältlich, z. B. als Fischfutter. Es ist zu 
prüfen, ob andere, für gewöhnlich kleinere Arten in der Kultur präsent sind (60). 
Ist dies der Fall, sind alle Würmer in einer Petrischale mit Wasser zu waschen. 
Große adulte Exemplare von  Enchytraeus albidus  werden dann (mittels Stereo ­
mikroskop) für eine neue Kultur aussortiert. Alle anderen Würmer werden ver ­
worfen. Der Reproduktionszyklus ist kurz, da die Tiere ihre Geschlechtsreife 
zwischen 33 Tagen (bei 18 °C) und 74 Tagen (bei 12 °C) erreichen. Für die 
Versuche sollten ausschließlich Wurmkulturen verwendet werden, die mindestens fünf Wochen lang (eine Generation) problemlos im Labor gehalten wurden.
 
Andere Arten der Gattung  Enchytraeus  sind ebenfalls geeignet, insbesondere  
Enchytraeus luxuriosus . Diese in (65) neu beschriebene Art ist ein echter Bo ­
denbewohner. Werden andere  Enchytraeus -Arten verwendet, so sind diese ein ­
deutig zu identifizieren und die Gründe für die Wahl der Art zu protokollieren.  
Die Art  Enchytraeus crypticus  (Westheide & Graefe 1992) gehört zur selben 
Gruppe wie  Enchytraeus luxuriosus . Ihr Vorkommen im Freiland konnte nicht 
sicher nachgewiesen werden, da die Art bisher nur im Zusammenhang mit Wurmzuchten und Komposthaufen beschrieben wurde (Römbke 2003). Ihre ur ­
sprünglichen ökologischen Ansprüche sind daher nicht bekannt. Jüngste Labor ­
studien mit Freilandböden haben jedoch bestätigt, dass sich diese Art durch eine 
breite Toleranz gegenüber Bodeneigenschaften wie pH-Wert ud Bodentextur auszeichnet (Jänsch et al. 2005). In jüngster Zeit wird die Art wegen der Ein ­
fachheit ihrer Zucht und Testung häufig für ökotoxikologische Studien verwendet 
(z. B. Kuperman et al. 2003). Die Tiere sind jedoch klein (3-12 mm; im Durch ­
schnitt 7 mm) (Westheide & Müller 1996) und daher nicht so leicht handhabbar wie Enchytraeus albidus . Bei Verwendung dieser Art anstelle von  Enchytraeus 
albidus  können, müssen aber nicht unbedingt kleinere Prüfgefäße eingesetzt 
werden. Darüber hinaus ist zu berücksichtigen, dass sich diese Art mit einer 
Generationszeit von weniger als 20 Tagen bei 20 ± 2 °C (Achazi et al. 1999) sehr schnell und bei höheren Temperaturen sogar noch schneller vermehrt.
 
Enchytraeen der Art  Enchytraeus albidus  (sowie andere  Enchytraeus -Arten kön ­
nen in großen Kunststoffschalen (z. B. 30 × 60 ×10 cm bzw. 20 × 12 × 8 cm für Kulturen kleinerer Wurmarten) gezüchtet werden, die mit einer Mischung aus 
Kunsterde und im Handel erhältlicher zusatzfreier Gartenerde gefüllt sind. Kom ­
postmaterial ist zu vermeiden, da dieses toxische Substanzen wie Schwermetalle enthalten kann. Vor Gebrauch sollte das Zuchtsubstrat durch dreimaliges Tief ­
gefrieren defauniert werden. Reine Kunsterde kann ebenfalls verwendet werden, 
doch könnte die Reproduktionsgeschwindigkeit geringer sein als bei der Ver ­
wendung von Mischsubstraten. Der pH-Wert des Substrats sollte bei 6,0 ± 0,5 liegen. Die Zucht erfolgt in einem Inkubator bei 15 ± 2 °C im Dauerdunkel. In jedem Fall sind Temperaturen von über 23 °C zu vermeiden. Der künstliche/ 
natürliche Boden sollte feucht, jedoch nicht nass sein. Bei leichtem Zusammen ­
drücken des Bodens (Faustprobe) sollten nur kleine Wassertropfen austreten. Auf jeden Fall ist die Sauerstoffversorgung sicherzustellen (z. B. muss bei Verwen ­
dung eines Deckels dieser so perforiert sein, dass ein ausreichender Luftaustausch 
gewährleistet ist). Die Anzuchterde sollte einmal wöchentlich durch vorsichtiges 
Mischen belüftet werden.
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Die Würmer sollten mindestens einmal wöchentlich ad libitum mit Haferflocken 
gefüttert werden, die in eine Vertiefung auf der Bodenoberfläche gegeben und 
mit Erde abgedeckt werden. Bleiben von der letzten Fütterung Futterreste im Behälter, so ist die Futterzugabe entsprechend anzupassen. Bei Pilzbesatz auf den Futterresten sind diese durch eine neue Menge Haferflocken zu ersetzen. 
Zur Stimulierung der Reproduktion kann den Haferflocken alle zwei Wochen 
mit Vitaminen angereichertes Proteinpulver zugesetzt werden. Nach drei Monaten werden die Tiere in eine frisch angesetzte Kultur oder Zuchtsubstrat umgesetzt. Die Haferflocken sind in geschlossenen Gefäßen zu lagern und sollten vor Ge ­
brauch autoklaviert oder erhitzt werden, um den Befall mit Mehlmotten (z. B.  
Glyzyphagus  sp., Astigmata, Acarina) oder Raubmilben (z. B.  Hypoaspis (Cos ­
molaelaps) miles , Gamasida, Acarina) zu vermeiden. Das desinfizierte Futter 
wird gemahlen, so dass es sich leicht auf die Bodenoberfläche streuen lässt. 
Als weitere Futterquellen kommen Bäckerhefe oder TetraMin
 ® -Fischfutter in 
Betracht.  
In der Regel sind die Anzuchtbedingungen ausreichend, wenn die Würmer nicht 
versuchen, das Substrat zu verlassen, sich schnell durch den Boden bewegen, eine glänzende Hautoberfläche ohne anhaftende Bodenpartikel aufweisen und 
weißlich gefärbt sind und wenn Würmer verschiedener Altersgruppen vorhanden 
sind. Die Würmer können als gesund betrachtet werden, wenn sie sich regel ­
mäßig reproduzieren.
 
Zusätzlich ausgewähltes Referenzmaterial  
Achazi R.K., Fröhlich E., Henneken M., Pilz C. (1999): The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). 
Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126.
 
Jänsch S., Amorim M.J.B., Römbke J. (2005): Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Re ­
views 13: 51-83.  
Kuperman R.G., Checkai R.T., Simini M., Phillips C.T., Kolakowski J.E., Kur ­
nas C.W., Sunahara G.I. (2003): Survival and reproduction of  Enchytraeus cryp ­
ticus  (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the 
nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656.  
Römbke J. (2003): Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. 
Pedobiologia 47: 607-616.  
Westheide W. and Graefe U. (1992): Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488.  
Westheide W. and Müller M.C. (1996). Cinematographic documentation of en ­
chytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267.  ▼M4 2008R0440 — DE — 22.03.2014 — 004.001 — 1325