2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 1
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Gewähr übernehmen
►B ENTSCHEIDUNG DER KOMMISSION
►C1 vom 14. August 2002 ◄
zur Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG des Rates betreffend die Durchführung von Analyseme-
thoden und die Auswertung von Ergebnissen
(Bekannt gegeben unter Aktenzeichen K(2002) 3044)
(Text von Bedeutung für den EWR)
(2002/657/EG)
(ABl. L 221 vom 17.8.2002, S. 8)
Geändert durch:
Amtsblatt
Nr. Seite Datum
►M1Entscheidung 2003/181/EG der Kommission vom 13. März 2003 L 71 17 15.3.2003
Berichtigt durch:
►C1Berichtigung, ABl. L 239 vom 6.9.2002, S. 66 (2002/657/EG)
▼B
ENTSCHEIDUNG DER KOMMISSION
►C1 vom 14. August 2002 ◄
zur Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG des Rates betreffend die
Durchführung von Analysemethoden und die Auswertung von
Ergebnissen
(Bekannt gegeben unter Aktenzeichen K(2002) 3044)
(Text von Bedeutung für den EWR)
(2002/657/EG)
DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN —
gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft,
gestützt auf die Richtlinie 96/23/EG des Rates vom 29. April 1996 über
Maßnahmen zur Kontrolle bestimmter Stoffe und ihrer Rückstände inlebenden Tieren und tierischen Erzeugnissen und zur Aufhebung derRichtlinien 85/358/EWG und 86/469/EWG und der Entscheidungen
89/187/EWG und 91/664/EWG (
1), insbesondere auf Artikel 15 Absatz
1 Satz 2,
in Erwägung nachstehender Gründe:
(1)Das Vorhandensein von Rückständen in Erzeugnissen tierischen
Ursprungs ist ein Problem des Schutzes der öffentlichen Gesund-
heit.
(2)Die Entscheidung 98/179/EG der Kommission vom 23. Februar1998 zur Festlegung von Einzelheiten betreffend die amtlicheProbenahme für die Kontrolle bestimmter Stoffe und ihrerRückstände in lebenden Tieren und tierischen Erzeugnissen (
2)
sieht vor, dass die Analyse der Proben ausschließlich von Labo-
ratorien durchzuführen ist, die von der zuständigeneinzelstaatlichen Behörde für die amtliche Rückstandskontrollezugelassen worden sind.
(3)Es ist notwendig, die Qualität und die Vergleichbarkeit derAnalysenergebnisse sicherzustellen, die von den für die amtlicheRückstandskontrolle zugelassenen Laboratorien gewonnen
werden. Dies muss erreicht werden durch die Anwendung von
Qualitätssicherungssystemen und speziell durch die Anwendungvon Methoden, die nach allgemeinen Verfahren und Leistungs-kriterien validiert sind, sowie durch die Rückverfolgbarkeit aufallgemeine Normen oder gemeinschaftlich vereinbarte Normen.
(4)Gemäß der Richtlinie 93/99/EWG des Rates vom 29. Oktober
1993 über zusätzliche Maßnahmen betreffend die amtliche
Kontrolle von Nahrungsmitteln (3) und der Entscheidung 98/
179/EG müssen amtliche Kontrolllaboratorien ab Januar 2002gemäß ISO 17025 (1) akkreditiert sein. Gemäß der Entscheidung98/179/EG müssen zugelassene Laboratorien an einem interna-
tional anerkannten externen Programm zur Bewertung der
Qualitätskontrolle und zur Akkreditierung teilnehmen. Außerdemmüssen die zugelassenen Laboratorien ihre Kompetenz durchregelmäßige und erfolgreiche Teilnahme an entsprechendenEignungsprüfungen nachweisen, die von den einzelstaatlichenoder gemeinschaftlichen Referenzlaboratorien anerkannt oder
organisiert werden.
(5)Ein Netzwerk von gemeinschaftlichen Referenzlaboratorien,
einzelstaatlichen Referenzlaboratorien und einzelstaatlichenKontrolllaboratorien ist gemäß Richtlinie 96/23/EG tätig, umdie Koordination zu verbessern.
(6)Aufgrund von Fortschritten in der chemischen Analytik seit derVerabschiedung der Richtlinie 96/23/EG ist an die Stelle des2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 2
(1) ABl. L 125 vom 23.5.1996, S. 10.
(2) ABl. L 65 vom 5.3.1998, S. 31.
(3) ABl. L 290 vom 24.11.1993, S. 14.
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Konzepts der Routinemethoden und Referenzmethoden der
Kriterienansatz getreten, bei dem Leistungskriterien undVerfahren für die Validierung von Screening- und Bestätigungs-
methoden festgelegt werden.
(7)Es müssen gemeinsame Kriterien für die Auswertung der Tester-
gebnisse von amtlichen Kontrolllaboratorien bestimmt werden,um eine harmonisierte Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG
sicherzustellen.
(8)Es müssen nach und nach Mindestleistungsgrenzen (MRPL) von
Analysenmethoden für Stoffe festgelegt werden, für die keinzulässiger Grenzwert festgesetzt worden ist, und insbesonderefür diejenigen Stoffe, deren Anwendung in der Gemeinschaft
nicht zugelassen oder ausdrücklich verboten ist, um eine harmo-
nisierte Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG sicherzustellen.
(9)Die Entscheidung 90/515/EWG der Kommission vom 26.September 1990 zur Festlegung der Referenzmethoden zumNachweis von Schwermetall- und Arsenrückständen (
1), die
Entscheidung 93/256/EWG vom 14. April 1993 zur Festlegung
der Methoden zum Rückstandsnachweis von Stoffen mit hormo-naler bzw. thyreostatischer Wirkung (
2) und die Entscheidung 93/
257/EWG der Kommission vom 15. April 1993 zur Festlegungder Referenzmethoden und des Verzeichnisses der nationalenReferenzlaboratorien für Rückstandsuntersuchungen (
3), zuletzt
geändert durch die Entscheidung 98/536/EG (4), sind überprüft
worden, um dem wissenschaftlich-technischen Fortschritt Rech-nung zu tragen, haben sich in ihrem Geltungsbereich und ihrenBestimmungen als veraltet erwiesen und sollten demgemäß mitdieser Entscheidung aufgehoben werden.
(10)Damit Methoden für die Analyse von amtlichen Proben an dieBestimmungen dieser Entscheidung angepasst werden können,sollte ein Übergangszeitraum festgesetzt werden.
(11)Die in dieser Entscheidung vorgesehenen Maßnahmen entspre-chen der Stellungnahme des Ständigen Ausschusses für die
Lebensmittelkette und Tiergesundheit —
HAT FOLGENDE ENTSCHEIDUNG ERLASSEN:
Artikel 1
Gegenstand und Geltungsbereich
Diese Entscheidung legt Regeln für die Analysemethoden fest, die bei
der Analyse von amtlichen Proben, die gemäß Artikel 15 Absatz 1 Satz2 der Richtlinie 96/23/EWG entnommen werden, zu verwenden sindund bestimmt gemeinsame Kriterien für die Auswertung von Analyse-nergebnissen amtlicher Kontrolllaboratorien für solche Proben.
Diese Entscheidung gilt nicht für Stoffe, für die in anderen gemein-
schaftlichen Rechtsvorschriften speziellere Regelungen festgelegt
worden sind.
Artikel 2
Begriffsbestimmungen
Für diese Entscheidung gelten die Begriffsbestimmungen in der Rich-
tlinie 96/23/EG sowie im ►
M1Anhang I ◄dieser Entscheidung.2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 3
(1) ABl. L 286 vom 18.10.1990, S. 33.
(2) ABl. L 118 vom 14.5.1993, S. 64.
(3) ABl. L 118 vom 14.5.1993, S. 75.
(4) ABl. L 251 vom 11.9.1998, S. 39.
▼B
Artikel 3
Analysemethoden
Die Mitgliedstaaten stellen sicher, dass amtliche Proben, die gemäß der
Richtlinie 96/23/EG entnommen werden, mit Methoden analysiert
werden, die:
a) in Testvorschriften dokumentiert sind, vorzugsweise gemäß ISO 78-
2 (6);
b) Teil 2 des ►M1Anhangs I ◄dieser Entscheidung entsprechen;
c) gemäß den in Teil 3 des ►M1Anhangs I ◄beschriebenen
Verfahren validiert worden sind;
d) die geforderten Mindestleistungsgrenzen (MRPL) erfüllen, die
gemäß Artikel 4 festzusetzen sind.
Artikel 4
Geforderte Mindestleistungsgrenzen
Die Mitgliedstaaten stellen sicher, dass die Analysemethoden zur Fest-
stellung folgender Stoffe die in Anhang II aufgeführtenMindestleistungsgrenzen (MRPL) auf der Grundlage der in demgenannten Anhang aufgeführten Matrizes erfüllen:
a) Chloramphenicol,
b) Nitrofuranmetaboliten,
c) Medroxy-Progesteron-Acetat.
Artikel 5
Qualitätskontrolle
Die Mitgliedstaaten stellen die Qualität der Analysenergebnisse von
Proben sicher, die gemäß Richtlinie 96/23/EG entnommen wurden,insbesondere durch die Überwachung der Tests bzw. der Kalibrierungs-ergebnisse gemäß Kapitel 5.9 der ISO 17025 (1).
Artikel 6
Auswertung der Ergebnisse
(1) Das Ergebnis einer Analyse gilt als positiv, wenn die Entschei-
dungsgrenze der Bestätigungsmethode für den Analyten überschritten
ist.
(2) Wenn ein zulässiger Grenzwert für einen Stoff festgelegt worden
ist, ist die Entscheidungsgrenze die Konzentration, über der mit einerstatistischen Sicherheit von 1 - αfestgestellt werden kann, dass der
zulässige Grenzwert tatsächlich überschritten worden ist.
(3) Wenn kein zulässiger Grenzwert für einen Stoff festgelegt
worden ist, ist die Entscheidungsgrenze die niedrigste Konzentration,bei der eine Methode mit einer statistischen Sicherheit von 1 - αunter-
scheiden kann, ob der betreffende Analyt vorhanden ist.
(4) Bei Stoffen, die in Gruppe A des Anhangs I der Richtlinie 96/23/
EG aufgelistet sind, muss der α-Fehler kleiner oder gleich 1 % sein.
Bei allen anderen Stoffen muss der α-Fehler kleiner oder gleich 5 %
sein.
Artikel 7
Aufhebung
Die Entscheidungen 90/515/EWG, 93/256/EWG und 93/257/EWG
werden aufgehoben.2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 4
▼M1
▼B
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Artikel 8
Übergangsbestimmungen
Die Methoden zur Analyse von amtlichen Proben auf Stoffe in Gruppe
A des Anhangs I der Richtlinie 96/23/EG, welche die Kriterien
erfüllen, die in den Entscheidungen 90/515/EWG, 93/256/EWG und
93/257/EWG festgelegt sind, können noch für die Dauer von bis zuzwei Jahren nach Inkrafttreten dieser Entscheidung verwendet werden.Methoden, die gegenwärtig für Stoffe in Gruppe B des Anhangs I derRichtlinie 96/23/EG eingesetzt werden, müssen spätestens fünf Jahrenach dem Datum der Gültigkeit dieser Entscheidung den Festlegungen
in dieser Entscheidung entsprechen.
Artikel 9
Datum der Gültigkeit
Diese Entscheidung gilt ab 1. September 2002.
Artikel 10
Adressaten
Diese Entscheidung ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet.2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 5
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ANHANGI
LEISTUNGSKRITERIEN, SONSTIGE ANFORDERUNGEN UND
VERFAHREN FÜR ANALYSEMETHODEN
1.BEGRIFFSBESTIMMUNGEN
1.1. Genauigkeit ist der Grad der Übereinstimmung zwischen einem Tester-
gebnis und dem akzeptierten Referenzwert (2). Sie wird bestimmt,
indem Richtigkeit und Präzision ermittelt werden.
1.2. Alpha-Fehler ist die Wahrscheinlichkeit, dass die untersuchte Probe
negativ ist, obwohl eine positive Messung erhalten wurde („falsch posi-
tives Ergebnis“).
1.3. Ein Analyt ist der Stoff, der nachgewiesen, identifiziert und/oder quan-
tifiziert werden muss, sowie die während seiner Analyse auftretenden
Derivate.
1.4. Beta-Fehler ist die Wahrscheinlichkeit, dass die untersuchte Probe
tatsächlich positiv ist, obwohl eine negative Messung erhalten wurde
(„falsch negatives Ergebnis“).
1.5. Bias ist der Unterschied zwischen der Erwartung des Testergebnisses
und einem akzeptierten Referenzwert (2).
1.6. Ein Kalibrierstandard ist ein Hilfsmittel für Messungen, das die Menge
des interessierenden Stoffs in einer Weise darstellt, die seinen Wert mit
einer Referenzbasis in Beziehung setzt.
1.7. Zertifiziertes Referenzmaterial (CRM) ist ein Material, dem ein
bestimmter Analytgehalt zugeordnet worden ist.
1.8. Co-Chromatografie ist ein Verfahren, bei dem der Extrakt vor dem
(den) chromatografischen Schritt(en) in zwei Teile aufgeteilt wird. Der
eine Teil wird normal chromatografiert. Der zweite Teil wird mit dem
zu messenden Standardanalyten gemischt. Dieses Gemisch wird dann
ebenfalls chromatografiert. Die Menge an zugesetztem Standardanalyt
muss etwa gleich groß wie die geschätzte Menge des Analyten im
Extrakt sein. Diese Methode soll die Identifizierung eines Analyten
verbessern, wenn chromatografische Methoden verwendet werden,
besonders wenn kein geeigneter interner Standard verwendet werden
kann.
1.9. Bei einer Methodenvergleichsstudie wird dieselbe Probe mit derselben
Methode analysiert, um die Leistungsmerkmale der Methode zu
bestimmen. Die Studie umfasst zufällige Messabweichungen und die
systematische Abweichung (Bias) der beteiligten Laboratorien.
1.10. Eine Bestätigungsmethode ist eine Methode, die vollständige oder
ergänzende Daten liefert, um einen Stoff eindeutig zu identifizieren
und, falls erforderlich, in der interessierenden Konzentration zu quanti-
fizieren.
1.11. Die Entscheidungsgrenze (CC α)ist der Grenzwert, bei und über dem
mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von αbestimmt werden kann, dass
eine Probe positiv ist.
1.12. Das Nachweisvermögen (CC β)ist der kleinste Gehalt des Stoffs, der
mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von βin einer Probe nachgewiesen,
identifiziert und/oder quantifiziert werden kann. Im Fall von Stoffen,
für die kein zulässiger Grenzwert festgelegt worden ist, ist das Nach-
weisvermögen die niedrigste Konzentration, bei der eine Methode in
der Lage ist, tatsächlich verunreinigte Proben mit einer statistischen
Sicherheit von 1 - βnachzuweisen. Im Fall von Stoffen mit einem fest-
gelegten zulässigen Grenzwert bedeutet dies, dass das
Nachweisvermögen die Konzentration ist, bei der die Methode zulässige
Grenzkonzentrationen mit einer statistischen Sicherheit von 1 - βnach-
zuweisen vermag.
1.13. Dotiertes Probenmaterial ist eine Probe, die mit einer bekannten Menge
des nachzuweisenden Analyten angereichert ist.
1.14. Eine Laborvergleichsuntersuchung ist die Organisation, Durchführung
und Auswertung von Tests mit derselben Probe durch zwei oder mehr
Laboratorien unter Einhaltung vorgegebener Bedingungen zur Bestim-
mung der analytischen Leistungsfähigkeit. Je nach Zweck lässt sich
die Untersuchung als Methodenvergleichsstudie oder als Laboreignung-
sprüfung klassifizieren.2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 6
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1.15. Ein interner Standard (IS) ist ein nicht in der Probe enthaltener Stoff
mit chemisch-physikalischen Eigenschaften, die denen des zu identifi-
zierenden Analyten möglichst ähnlich sind, und der jeder Probe sowie
jedem Kalibrierstandard zugesetzt wird.
1.16. Eine Laborprobe ist eine zum Einsenden an ein Labor vorbereitete
Probe, die untersucht bzw. analysiert werden soll.
1.17. Die interessierende Konzentration ist die Konzentration des Stoffs oder
Analyten in einer Probe, die wesentlich ist, um die Einhaltung der
Rechtsvorschriften zu bestimmen.
1.18. Die geforderte Mindestleistungsgrenze (Minimum Required Perfor-
mance Limit, MRPL) ist der Mindestgehalt eines Analyten in einer
Probe, der mindestens nachgewiesen und bestätigt werden muss. Er
soll die analytische Leistungsfähigkeit von Methoden für Stoffe, für
die kein zulässiger Grenzwert festgelegt worden ist, harmonisieren.
1.19. Ein Leistungsmerkmal bezeichnet eine funktionelle Qualität, die einer
Analysemethode zugeschrieben werden kann. Dies kann zum Beispiel
die Spezifität, Genauigkeit, Richtigkeit, Präzision, Wiederholpräzision,
Reproduzierbarkeit, Wiederfindung, Nachweisvermögen oder Robust-
heit sein.
1.20. Leistungskriterien sind Anforderungen an ein Leistungsmerkmal, nach
denen beurteilt werden kann, ob die Analysemethode für den Zweck
geeignet ist und zuverlässige Ergebnisse liefert.
1.21. Ein zulässiger Grenzwert ist eine Rückstandshöchstmenge, eine maxi-
male Konzentration oder eine sonstige maximale Toleranz für Stoffe,
die an anderer Stelle in gemeinschaftlichen Rechtsvorschriften festge-
legt ist.
1.22. Präzision ist der Grad der Übereinstimmung zwischen unabhängigen
Testergebnissen, die unter festgesetzten (vorgegebenen) Bedingungen
erzielt werden. Das Präzisionsmaß wird normalerweise als Unpräzision
ausgedrückt und als Standardabweichung des Testergebnisses berechnet.
Eine geringere Präzision ist durch eine größere Standardabweichung
gekennzeichnet (2).
1.23. In einer Laboreignungsprüfung analysieren verschiedene Laboratorien
dieselbe Probe, wobei die Laboratorien ihre eigenen Methoden wählen
können, sofern diese Methoden unter Routinebedingungen eingesetzt
werden. Die Prüfung muss gemäß ISO-Leitfaden 43-1 (3) und 43-2 (4)
durchgeführt und kann zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit von
Methoden herangezogen werden.
1.24. Eine qualitative Methode ist eine Analysemethode, die eine Substanz
aufgrund ihrer chemischen, biologischen oder physikalischen Eigen-
schaften identifiziert.
1.25. Eine quantitative Methode ist eine Analysemethode, welche die Menge
bzw. den Massenanteil eines Stoffs als Zahlenwert in geeigneten
Einheiten bestimmt.
1.26. Eine Reagenzleerwertbestimmung ist die Durchführung des voll-
ständigen Analyseverfahrens ohne Verwendung der Analysenprobe
oder unter Verwendung der gleichen Menge eines geeigneten Lösungs-
mittels anstelle der Analysenprobe.
1.27. Die Wiederfindung ist der Prozentsatz der wahren Konzentration eines
Stoffs, der beim Analysenverfahren wieder gefunden wird. Sie wird bei
der Validierung bestimmt, wenn kein zertifiziertes Referenzmaterial zur
Verfügung steht.
1.28. Ein Referenzmaterial ist ein Material, dessen Eigenschaft(en) mit einer
validierten Methode bestätigt wurde(n), so dass es zur Kalibrierung
eines Gerätes oder zur Überprüfung einer Messmethode verwendet
werden kann.
1.29. Die Wiederholpräzision ist die Präzision unter Wiederholbedingungen
(2).
1.30. Wiederholbedingungen sind Bedingungen, unter denen voneinander
unabhängige Testergebnisse mit derselben Methode, identischem Test-
material, in demselben Labor, durch denselben Untersucher und mit
derselben Ausrüstung erzielt werden (2).
1.31. Die Reproduzierbarkeit (Vergleichspräzision) ist die Präzision unter
Reproduzierbarkeitsbedingungen (2) (4).
1.32. Reproduzierbarkeitsbedingungen sind Bedingungen, unter denen Tester-
gebnisse mit derselben Methode, identischem Testmaterial, in2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 7
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verschiedenen Laboratorien, durch verschiedene Untersucher und mit
unterschiedlicher Ausrüstung erzielt werden (2) (4).
1.33. Robustheit ist die Anfälligkeit einer Analysemethode gegenüber
Änderungen in den Versuchsbedingungen und kann ausgedrückt werden
als eine Liste der Probematerialien, Analyte, Lagerungsbedingungen,
Umgebungs- und/oder Probenvorbereitungsbedingungen, unter welchen
die Methode wie beschrieben oder mit vorgeschriebenen geringfügigen
Änderungen angewendet werden kann. Für alle Versuchsbedingungen,
die in der Praxis möglicherweise schwanken können (beispielsweise
Stabilität der Reagenzien, Zusammensetzung der Probe, pH-Werte,
Temperatur), ist anzugeben, welche Schwankungen das Analysener-
gebnis beeinflussen können.
1.34. Eine Probenleerwertbestimmung ist die Durchführung des vollständigen
Analyseverfahrens mit einer Analysenprobe, die den Analyten nicht
enthält.
1.35. Screeningmethoden sind Methoden, die zum Nachweis des Vorhandens-
eins eines Stoffs oder einer Klasse von Stoffen in der interessierenden
Konzentration verwendet werden. Diese Methoden ermöglichen einen
hohen Probendurchsatz und werden eingesetzt, um eine große Anzahl
von Proben auf mögliche positive Ergebnisse zu sichten. Sie sind
speziell dafür ausgelegt, falsch negative Ergebnisse zu vermeiden.
1.36. Eine laborinterne Validierungsstudie ist eine analytische Studie in
einem Laboratorium unter Verwendung einer Methode zur Analyse
desselben oder verschiedener Testmaterialien unter unterschiedlichen
Bedingungen und über begründete lange Zeiträume.
1.37. Die Spezifität ist die Fähigkeit einer Methode, zwischen dem geme-
ssenen Analyten und anderen Stoffen zu unterscheiden. Dieses
Merkmal hängt vor allem vom beschriebenen Messverfahren ab, kann
jedoch je nach Substanzklasse oder Matrix schwanken.
1.38. Die Standardaddition ist ein Verfahren, bei dem die Untersuchungs-
probe in zwei (oder mehr) Analysenproben aufgeteilt wird. Eine
Analysenprobe wird als solche analysiert, und den anderen Analysen-
proben werden vor der Analyse bekannte Mengen des
Standardanalyten zugesetzt. Die Menge des zugesetzten Standarda-
nalyten muss zwischen dem Zweifachen und dem Fünffachen der
geschätzten Menge des Analyten in der Probe liegen. Dieses Verfahren
dient dazu, den Gehalt eines Analyten in einer Probe unter Berücksich-
tigung der Wiederfindung des Analysenverfahrens zu bestimmen.
1.39. Ein Standardanalyt ist ein Analyt mit bekanntem und zertifiziertem
Gehalt und Reinheit, der bei einer Analyse als Referenz verwendet
wird.
1.40. Ein Stoff ist eine Substanz von bestimmter chemischer Struktur und
ihre Metabolite.
1.41. Die Analysenprobe ist die Menge an Probenmaterial, die von der Unter-
suchungsprobe genommen wird, mit der die Analyse oder Beobachtung
durchgeführt wird.
1.42. Eine Untersuchungsprobe ist eine aus der Laborprobe hergestellte
Probe, von der Analysenproben genommen werden.
1.43. Die Richtigkeit ist der Grad der Übereinstimmung zwischen dem aus
einer großen Serie von Testergebnissen ermittelten Mittelwert und
einem akzeptierten Referenzwert. Die Richtigkeit wird normalerweise
als systematische Abweichung (Bias) angegeben (2).
1.44. Einheiten sind die in ISO 31 (20) und in der Richtlinie 71/354/EWG
beschriebenen Einheiten (19).
1.45. Validierung ist die Bestätigung durch Untersuchung und die Erbringung
eines effektiven Nachweises, dass die jeweiligen Anforderungen eines
bestimmten Verwendungszwecks erfüllt sind (1).
1.46. Die laborinterne Reproduzierbarkeit ist die in ein und demselben Labor
unter festgesetzten (vorgegebenen) Bedingungen (betreffend z. B. die
Methode, Testmaterialien, Untersucher, Umgebung) über begründete
lange Zeiträume erzielte Präzision.
2.LEISTUNGSKRITERIEN UND SONSTIGE ANFORDERUNGEN FÜR
ANALYSEMETHODEN
Analysemethoden oder Kombinationen von Methoden, die im Folgenden nicht
beschrieben werden, dürfen nur dann für Screening- oder Bestätigungszwecke2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 8
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verwendet werden, wenn belegt werden kann, dass sie die einschlägigen Anfor-
derungen, die in dieser Entscheidung festgelegt werden, erfüllen.
2.1. ALLGEMEINE ANFORDERUNGEN
2.1.1.Probenhandhabung
Die Proben müssen so gewonnen, gehandhabt und aufbereitet werden,
dass die größtmögliche Aussicht auf einen Nachweis des Stoffs besteht.
Die Verfahren der Probenhandhabung müssen die Möglichkeit einer
versehentlichen Verunreinigung oder eines Analytverlusts ausschließen.
2.1.2.Testdurchführung
2.1.2.1.Wiederfindung
Bei der Analyse von Proben muss die Wiederfindung in jeder Proben-
charge bestimmt werden, wenn ein fester
Wiederfindungskorrekturfaktor verwendet wird. Wenn die Wiederfin-
dung innerhalb der vorgegebenen Grenzen liegt, kann der feste
Korrekturfaktor verwendet werden. Ansonsten muss der für die betref-
fende Charge ermittelte Wiederfindungsfaktor verwendet werden, es sei
denn der spezifische Wiederfindungsfaktor des Analyten in der Probe
ist anzuwenden. In diesem Fall muss das Standardadditionsverfahren
(siehe 3.5) oder ein interner Standard für die quantitative Bestimmung
eines Analyten in einer Probe verwendet werden.
2.1.2.2.Spezifität
Eine Methode muss in der Lage sein, unter den Versuchsbedingungen
zwischen dem Analyten und den anderen Stoffen zu unterscheiden.
Eine Schätzung, bis zu welchem Grad dies möglich ist, muss vorgelegt
werden. Es sind Strategien zur Vermeidung vorhersehbarer Störungen
durch andere Substanzen bei Verwendung des beschriebenen Verfah-
rens, z. B. Homologa, Analoga, Stoffwechselprodukte des
interessierenden Rückstands, zu ergreifen. Es ist überaus wichtig, dass
eventuelle Störungen durch Matrixbestandteile untersucht werden.
2.2. SCREENINGMETHODEN
Nur diejenigen Analyseverfahren, für die zurückverfolgbar belegt werden kann,
dass sie validiert sind und bei der interessierenden Konzentration eine falsch
negative Rate von < 5 % ( β-Fehler) aufweisen, dürfen für Screeningzwecke
gemäß der Richtlinie 96/23/EWG eingesetzt werden. Bei Verdacht auf ein posi-
tives Ergebnis muss dieses Ergebnis durch eine Bestätigungsmethode bestätigt
werden.
2.3. BESTÄTIGUNGSMETHODEN FÜR ORGANISCHE RÜCKSTÄNDE
UND KONTAMINANTEN
Bestätigungsmethoden für organische Rückstände oder Kontaminanten müssen
Aufschluss über die chemische Struktur des Analyten liefern. Folglich sind
Methoden, die sich ausschließlich auf die chromatografische Analyse ohne
zusätzlichen spektrometrischen Nachweis stützen, für sich allein nicht als
Bestätigungsmethoden geeignet. Wenn jedoch eine Technik allein nicht spezi-
fisch genug ist, muss die gewünschte Spezifität mit Analyseverfahren erreicht
werden, die aus einer geeigneten Kombination von Clean-up, chromatografi-
scher Trennung und spektrometrischer Detektion bestehen.
Die folgenden Methoden oder Methodenkombinationen gelten als geeignet für
die Identifizierung von organischen Rückständen oder Kontaminanten der ange-
gebenen Stoffgruppen:
Tabelle 1
Geeignete Bestätigungsmethoden für organische Rückstände oder Kontaminanten
MessverfahrenStoffe in Anhang I 96/
23/EGEinschränkungen
LC oder GC mit massen-
spektrometrischer Dete-
ktionGruppen A und B Nur nach chromatografischer Online- oder
Offline-Trennung
Nur wenn Full-Scan-Verfahren verwendet
werden oder mindestens 3 (Gruppe B) oder 4
(Gruppe A) Identifizierungspunkte bei
Verfahren verwendet werden, die nicht die
vollen Massenspektren aufzeichnen
LC oder GC mit IR-spek-
trometrischer DetektionGruppen A und B Spezifische Anforderungen an die Absorption
bei der IR-Spektrometrie müssen erfüllt sein2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 9
▼B
MessverfahrenStoffe in Anhang I 96/
23/EGEinschränkungen
LC-Full-Scan-DAD Gruppe B Spezifische Anforderungen an die Absorption
bei der UV-Spektrometrie müssen erfüllt sein
LC — Fluoreszenz Gruppe B Nur für Moleküle, die eine natürliche Fluores-
zenz zeigen, und Moleküle, die eine Fluores-
zenz nach Transformation oder
Derivatisierung zeigen
2D-TLC — Full-Scan-UV/
VISGruppe B Zweidimensionale HPTLC und Co-Chromato-
grafie sind obligatorisch
GC-Elektroneneinfangde-
tektionGruppe B Nur, wenn zwei Säulen mit unterschiedlicher
Polarität verwendet werden
LC-Immunogramm Gruppe B Nur, wenn mindestens zwei verschiedene
Chromatografiesysteme oder eine zweite unab-
hängige Nachweismethode verwendet werden
LC-UV/VIS (eine
Wellenlänge)Gruppe B Nur, wenn mindestens zwei verschiedene
Chromatografiesysteme oder eine zweite unab-
hängige Nachweismethode verwendet werden
2.3.1.Gemeinsame Leistungskriterien und Anforderungen
Bestätigungsmethoden sollen Aufschluss über die chemische Struktur
des Analyten geben. Wenn mehrere Verbindungen das gleiche Signal
liefern, kann die Methode nicht zwischen diesen Verbindungen unter-
scheiden. Methoden, die sich ausschließlich auf die Chromatografie
ohne zusätzlichen spektrometrischen Nachweis stützen, sind allein nicht
als Bestätigungsmethoden geeignet.
Bei Verwendung eines geeigneten internen Standards in einer Methode
muss dieser am Anfang des Extraktionsverfahrens der Analysenprobe
zugesetzt werden. Je nach Verfügbarkeit werden entweder stabile isoto-
penmarkierte Formen des Analyten, die besonders für die
massenspektrometrische Detektion geeignet sind, oder Verbindungen,
die mit dem Analyten strukturell verwandt sind, verwendet.
Wenn kein geeigneter interner Standard verwendet werden kann, muss
die Identifizierung des Analyten durch Co-Chromatografie bestätigt
werden. In diesem Fall darf nur ein Peak gewonnen werden, wobei die
verstärkte Peakhöhe (oder -fläche) der Menge des zugefügten Analyten
entspricht. Bei der Gaschromatografie (GC) oder Flüssigchromatografie
(LC) muss sich die Peakbreite bei der Hälfte der maximalen Höhe im
Bereich von 90-110 % der Originalbreite bewegen, und die Retentions-
zeiten müssen mit einer Toleranz von 5 % identisch sein. Bei
Dünnschichtchromatografie-(TLC-)Methoden muss sich nur der vermut-
lich durch den Analyten bedingte Fleck verstärken. Es darf kein neuer
Fleck erscheinen, und auch das Erscheinungsbild darf sich nicht verän-
dern.
Referenzmaterial oder dotiertes Material, das bekannte Analytmengen
an oder nahe der zulässigen Grenze oder der Entscheidungsgrenze
(positive Kontrollprobe) enthält, sowie negatives Kontrollmaterial und
Reagenzleerwerte sollten vorzugsweise während des gesamten Verfah-
rens parallel zu jeder Serie von Untersuchungsproben analysiert
werden. Die empfohlene Reihenfolge für die Injektion der Extrakte in
das Analysengerät ist: Reagenzleerwert, negative Kontrollprobe, zu
bestätigende Probe(n), erneute negative Kontrollprobe und schließlich
die positive Kontrollprobe. Abweichungen von dieser Reihenfolge
müssen begründet werden.
2.3.2.Zusätzliche Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für
quantitative Analysemethoden
2.3.2.1.Richtigkeit von quantitativen Methoden
Bei wiederholten Analysen eines zertifizierten Referenzmaterials gelten
folgende Richtbereiche für die Abweichung des experimentell
bestimmten wiederfindungskorrigierten mittleren Masseanteils vom
zertifizierten Wert:2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 10
▼B
Tabelle 2
Mindestwerte der Richtigkeit von quantitativen Methoden
Massenanteil Bereich
≤1µg/kg – 50 % bis + 20 %
>1 µg/kg bis 10 µg/kg – 30 % bis + 10 %
≥10µg/kg – 20 % bis + 10 %
Wenn keine solchen zertifizierten Referenzmaterialien zur Verfügung
stehen, ist die Bestimmung der Richtigkeit der Messungen durch
Wiederfindung von zugesetzten bekannten Mengen des Analyten (bzw.
der Analyte) zu einer Leerwertmatrix akzeptabel. Mit der mittleren
Wiederfindung korrigierte Daten sind nur dann akzeptabel, wenn sie
innerhalb der Bereiche in Tabelle 2 liegen.
2.3.2.2.Präzision von quantitativen Methoden
Bei wiederholter Analyse eines Referenzmaterials oder dotierten Mate-
rials darf der Variationskoeffizient (CV) zwischen Laboratorien unter
Reproduzierbarkeitsbedingungen den mit der Horwitz-Gleichung
berechneten Wert nicht überschreiten. Diese Gleichung lautet:
CV = 2(1 - 0,5 log C)
Dabei ist C der Massenanteil, ausgedrückt als Zehnerpotenz (Exponent)
(z. B. 1 mg/g = 10-3). Tabelle 3 zeigt Beispiele.
Tabelle 3
Beispiele für Reproduzierbarkeits-CVs für quantitative Methoden bei einem Bereich von
Massenanteilen des Analyten
Massenanteil Reproduzierbarkeits-CV (%)
1µg/kg (*)
10µg/kg (*)
100 µg/kg 23
1 000 µg/kg (1 mg/kg) 16
(*) Für Massenanteile von weniger als 100 µg/kg liefert die Horwitz-Gleichung inakzeptabel hohe Werte.
Deshalb müssen die Variationskoeffizienten (CVs) für Konzentrationen unter 100 µg/kg möglichst
klein sein.
Bei Analysen unter Wiederholbedingungen sollte der laborinterne
Variationskoeffizient typischerweise zwischen der Hälfte und zwei Drit-
teln der obigen Werte liegen. Bei Analysen unter laborinternen
Reproduzierbarkeitsbedingungen darf der laborinterne Variationskoeffi-
zient nicht größer als der Reproduzierbarkeits-CV sein.
Bei Stoffen mit einem festgelegten zulässigen Grenzwert muss die
Methode eine laborinterne Reproduzierbarkeit erreichen, die nicht
größer als der Reproduzierbarkeits-CV bei einer Konzentration von 0,5
× der zulässige Grenzwert ist.
2.3.3.Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für den massen-
spektrometrischen Nachweis
Massenspektrometrische Methoden kommen nur nach chromatografi-
scher Online- oder Offline-Trennung als Bestätigungsmethoden in
Betracht.
2.3.3.1.Chromatografische Trennung
Bei GC-MS-Verfahren muss die gaschromatografische Trennung mit
Kapillarsäulen durchgeführt werden. Bei LC-MS-Verfahren muss die
chromatografische Trennung mit geeigneten LC-Säulen durchgeführt
werden. In jedem Fall beträgt die akzeptable Mindestretentionszeit für
den untersuchten Analyten das Doppelte der Retentionszeit für das
Totvolumen der Säule. Die Retentionszeit (bzw. relative Retentionszeit)
des Analyten in der Analysenprobe muss derjenigen des Kalibrierstan-
dards innerhalb eines vorgegebenen Retentionszeitfensters entsprechen.
Das Retentionszeitfenster muss dem Auflösungsvermögen des Chroma-2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 11
▼B
tografiesystems entsprechen. Das Verhältnis der chromatografischen
Retentionszeit des Analyten zu der des internen Standards, d. h. die
relative Retentionszeit des Analyten, muss derjenigen der Kalibrierlö-
sung entsprechen, bei einer Toleranz von ± 0,5 % für die GC und ±
2,5 % für die LC.
2.3.3.2.Massenspektrometrischer Nachweis
Der massenspektrometrische Nachweis muss mit MS-Verfahren wie
beispielsweise der Aufzeichnung von vollen Massenspektren (Full
Scan) oder der Einzelmassenregistrierung (SIM) sowie MS-MSn-
Verfahren wie dem Selected Reaction Monitoring (SRM) oder anderen
geeigneten MS- oder MS-MSn-Verfahren in Kombination mit entspre-
chenden Ionisierungsarten durchgeführt werden. Bei der
hochauflösenden Massenspektrometrie (HRMS) muss die Auflösung
für den gesamten Massenbereich bei 10 % Tal typischerweise größer
als 10000 sein.
Full-Scan: Wenn die massenspektrometrische Bestimmung durch die
Aufzeichnung von vollständigen Spektren erfolgt, ist das Vorhanden-
sein aller gemessenen diagnostischen Ionen (Molekül-Ion,
charakteristische Addukte des Molekül-Ions, charakteristische Frag-
ment-Ionen und Isotopen-Ionen) mit einer relativen Intensität von mehr
als 10 % im Referenzspektrum des Kalibrierstandards obligatorisch.
SIM: Erfolgt die massenspektrometrische Bestimmung mittels Frag-
mentografie, muss das Molekül-Ion vorzugsweise eines der
ausgewählten diagnostischen Ionen sein (Molekül-Ion, charakteristische
Addukte des Molekül-Ions, charakteristische Fragment-Ionen und alle
ihre Isotopen-Ionen). Die gewählten diagnostischen Ionen sollten nicht
ausschließlich aus demselben Teil des Moleküls stammen. Das Signal-
Rausch-Verhältnis für jedes diagnostische Ion muss ≥3:1 sein.
Full-Scan und SIM: Die relativen Intensitäten der nachgewiesenen
Ionen, ausgedrückt in Prozent der Intensität des intensivsten Ions oder
Übergangs, müssen denjenigen des Kalibrierstandards entsprechen, und
zwar entweder aus Kalibrierstandardlösungen oder aus dotierten Proben
in vergleichbaren Konzentrationen, gemessen unter den gleichen Bedin-
gungen innerhalb der folgenden Toleranzen:
Tabelle 4
Zulässige Höchsttoleranzen für relative Ionenintensitäten bei einer Reihe von massen-
spektrometrischen Verfahren
Relative Intensität
(% des Basispeaks)EI-GC-MS
(relativ)CI-GC-MS, GC-MSn
LC-MS, LC-MSn
(relativ)
>5 0% ±1 0% ±2 0%
> 20 %-50 % ± 15 % ± 25 %
> 10 %-20 % ± 20 % ± 30 %
≤10 % ± 50 % ± 50 %
Auswertung von Massenspektren: Die relativen Intensitäten der
diagnostischen Ionen und/oder Vorläufer-/Produkt-Ionenpaare müssen
durch Vergleich von Spektren oder durch Integration der Signale der
Einzelmassen ermittelt werden. Wenn eine Hintergrundkorrektur ange-
wandt wird, muss diese gleichmäßig über die gesamte Probenserie
angewandt (siehe 2.3.1, Absatz 4) und eindeutig angegeben werden.
Full-Scan: Wenn vollständige Spektren in einer Einzelmassenspektro-
metrie aufgezeichnet werden, müssen mindestens vier Ionen mit einer
relativen Intensität von ≥10 % des Basispeaks vorhanden sein. Das
Molekül-Ion sollte eingeschlossen sein, wenn es im Referenzspektrum
mit einer relativen Intensität von ≥10 % vorhanden ist. Mindestens
vier Ionen müssen innerhalb der zulässigen Höchsttoleranzen für rela-
tive Ionenintensitäten liegen (Tabelle 5). Eine computergestützte
Bibliothekssuche kann durchgeführt werden. In diesem Fall muss dasErgebnis des Vergleichs der Massenspektren der Untersuchungsproben
mit dem der Kalibrierlösung einen kritischen Abgleichfaktor über-
schreiten. Dieser Faktor wird bei der Validierung für jeden Analyten
auf der Basis von Spektren bestimmt, für welche die unten beschrie-
benen Kriterien erfüllt sind. Schwankungen in den Spektren, die durch
die Probenmatrix und die Leistungsfähigkeit des Detektors verursacht
werden können, müssen überprüft werden.2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 12
▼B
SIM: Wenn Massenfragmente nicht mit Full-Scan-Verfahren gemessen
werden, muss ein System von Identifizierungspunkten zur Auswertung
der Daten verwendet werden. Zur Bestätigung von Stoffen in Gruppe
A des Anhangs I der Richtlinie 96/23/EG werden mindestens 4 Identi-
fizierungspunkte benötigt. Zur Bestätigung von Stoffen in Gruppe B
von Anhang I der Richtlinie 96/23/EG werden mindestens 3 Identifizie-
rungspunkte benötigt. Die folgende Tabelle zeigt die Anzahl der
Identifizierungspunkte, die jedes der massenspektrometrischen Basisver-
fahren liefern kann. Damit jedoch die für die Bestätigung erforderlichen
Identifizierungspunkte vergeben und die Summe der Identifizierungs-
punkte berechnet werden kann, müssen folgende Voraussetzungen
erfüllt sein:
a) Mindestens ein Ionenverhältnis muss gemessen werden und
b) alle relevanten gemessenen Ionenverhältnisse müssen die oben
beschriebenen Kriterien erfüllen und
c) maximal drei separate Verfahren können kombiniert werden, um die
Mindestanzahl an Identifizierungspunkten zu erhalten.
Tabelle 5
Zusammenhang zwischen einer Reihe von Massenfragment-Klassen und erzielten Identi-
fizierungspunkten
MS-Verfahren Erzielte Identifizierungspunkte pro Ion
Niedrig auflösende Massenspektrometrie(LR-MS)1,0
LR-MS
nVorläufer-Ion 1,0
LR-MSnÜbergangsprodukte 1,5
HRMS 2,0
HR- MSnVorläufer-Ion 2,0
HR-MSnÜbergangsprodukte 2,5
Anmerkungen:
(1) Jedes Ion kann nur einmal gezählt werden.
(2) Die GC-MS mit Elektronenstoßionisierung gilt als ein anderes Verfahren als die GC-MS mit chemi-
scher Ionisierung.
(3) Verschiedene Analyte können nur dann verwendet werden, um die Anzahl der Identifizierungspunkte
zu erhöhen, wenn die Derivate verschiedene Reagenzien verwenden.
(4) Wenn für Stoffe in Gruppe A des Anhangs I der Richtlinie 96/23/EG die folgenden Verfahren bei der
Analyse verwendet werden, können diese maximal einen Identifizierungspunkt liefern, sofern dieeinschlägigen Kriterien für diese Verfahren erfüllt sind: HPLC gekoppelt mit Full-Scan-Diodenarray-Spektralfotometrie (DAD), HPLC gekoppelt mit Fluoreszenzdetektion, HPLC gekoppelt mit einemImmunogramm oder zweidimensionale TLC gekoppelt mit spektrometrischem Nachweis.
(5) Übergangsprodukte schließen sowohl Tochter- als auch Enkeltochter-Produkte ein.
Tabelle 6
Beispiele für die Anzahl der Identifizierungspunkte für eine Reihe von Verfahren und
deren Kombinationen (n = ganze Zahl)
Verfahren Anzahl der Ionen Identifizierungspunkte
GC-MS (EI oder CI) N n
GC-MS (EI und CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4
GC-MS (EI oder CI) 2
Derivate2 (Derivat A) + 2 (Derivat
B)4
LC-MS N n
GC-MS-MS 1 Vorläufer und 2 Töchter 4
LC-MS-MS 1 Vorläufer und 2 Töchter 4GC-MS-MS 2 Vorläufer-Ionen mit je 1
Tochter5
LC-MS-MS 2 Vorläufer-Ionen mit je 1
Tochter5
LC-MS-MS-MS 1 Vorläufer, 1 Tochter und
2 Enkeltöchter5,5
HRMS N 2 n
GC-MS und LC-MS 2 + 2 42002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 13
▼B
Verfahren Anzahl der Ionen Identifizierungspunkte
GC-MS und HRMS 2 + 1 4
2.3.4.Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für die Chromato-
grafie gekoppelt mit Infrarotdetektion
Adäquate Peaks: Adäquate Peaks sind Absorptionsmaxima im Infra-
rotspektrum eines Kalibrierstandards, welche die folgenden
Anforderungen erfüllen.
2.3.4.1.Infrarotdetektion
Absorptionsmaximum: Muss im Wellenzahlbereich von 4000-
500 cm-1liegen.
Absorptionsintensität: Darf nicht kleiner sein als
a) ein spezifisches molares Absorptionsmaß von 40 bezogen auf das
Grundrauschen; oder
b) eine relative Absorption von 12,5 % der Absorption des intensivsten
Peaks im Bereich von 4 000-500 cm-1,
wenn beide bezogen auf Nullabsorption gemessen werden, und von 5 %
der Absorption des intensivsten Peaks im Bereich von 4 000-500 cm-1,
wenn beide bezogen auf ihr Grundrauschen gemessen werden.
Hinweis: Obwohl adäquate Peaks gemäß Buchstabe a) theoretisch
vorzuziehen wären, sind in der Praxis die Peaks entsprechend Buch-
stabe b) leichter zu bestimmen.
Es wird die Anzahl der Peaks im Infrarotspektrum des Analyten ermit-
telt, deren Frequenzen denen eines adäquaten Peaks im Spektrum des
Kalibrierstandards mit einer Toleranz von ± 1 cm-1entsprechen.
2.3.4.2.Auswertung von Infrarotspektren
Eine Absorption muss in allen Bereichen des Analytspektrums
auftreten, die einem adäquaten Peak im Referenzspektrum des Kali-
brierstandards entsprechen. Mindestens sechs adäquate Peaks im
Infrarotspektrum des Kalibrierstandards sind erforderlich. Wenn
weniger als sechs adäquate Peaks vorhanden sind (7), kann das betref-
fende Spektrum nicht als Referenzspektrum verwendet werden. Der
„Score“, d. h. der Anteil der adäquaten Peaks, der im Infrarotspektrum
des Analyten gefunden wird, muss mindestens 50 betragen. Wo eine
genaue Bestimmung des adäquaten Peaks nicht möglich ist, darf der
entsprechende Bereich des Analytspektrums das Vorhandensein eines
passenden Peaks nicht ausschließen. Das Verfahren ist nur für Absorp-
tions-Peaks im Probenspektrum anwendbar, deren Intensität mindestens
das Dreifache des Rauschens zwischen zwei Peaks beträgt.
2.3.5.Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für die Bestimmung
eines Analyten mittels LC mit anderen Detektionsverfahren
2.3.5.1.Chromatografische Trennung
Ein interner Standard muss verwendet werden, wenn ein für diesen
Zweck geeignetes Material zur Verfügung steht. Es muss vorzugsweise
ein verwandter Standard mit einer Retentionszeit nahe der des Analyten
sein. Der Analyt muss bei der Retentionszeit eluieren, die für den
entsprechenden Kalibrierstandard unter den gleichen Versuchsbedin-
gungen typisch ist. Die akzeptable Mindestretentionszeit für einen
Analyten muss das Zweifache der Retentionszeit des Totvolumens der
Säule betragen. Das Verhältnis der Retentionszeit des Analyten zu der
des internen Standards, d. h. die relative Retentionszeit des Analyten,
muss mit einer Toleranz von ± 2,5 % mit der des Kalibrierstandards in
der entsprechenden Matrix identisch sein.
2.3.5.2.Full-Scan-UV-Detektion
Die Leistungskriterien für LC-Methoden müssen erfüllt sein.
Die Absorptionsmaxima im Spektrum des Analyten müssen mit einer
Toleranz, die durch das Auflösungsvermögen des Detektionssystems
bestimmt wird, bei denselben Wellenlängen wie die des Kalibrierstan-
dards liegen. Bei der Dioden-Array-Detektion beträgt das
Auflösungsvermögen typischerweise ± 2 nm. Das Analytspektrum ober-
halb von 220 nm darf sich im Bereich mit einem relativen
Absorptionsvermögen von ≥10 % optisch nicht vom Spektrum des2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 14
▼B
Kalibrierstandards unterscheiden. Dieses Kriterium ist erfüllt, wenn zum
einen die gleichen Maxima vorliegen und zum anderen der Unterschied
zwischen den beiden Spektren an keinem Punkt mehr als 10 % des
Absorptionsvermögens des Kalibrierstandards beträgt. Wenn eine
computergestützte Bibliothekssuche und Anpassung durchgeführt wird,
muss das Ergebnis des Vergleichs der Spektren der Untersuchungs-
proben mit dem der Kalibrierlösung einen kritischen Abgleichfaktor
überschreiten. Dieser Faktor wird bei der Validierung für jeden
Analyten auf der Basis von Spektren bestimmt, für welche die oben
beschriebenen Kriterien erfüllt sind. Schwankungen in den Spektren,
die durch die Probenmatrix und die Leistungsfähigkeit des Detektors
verursacht werden können, müssen überprüft werden.
2.3.5.3.Leistungskriterien für die fluorometrische Detektion
Die Leistungskriterien für LC-Methoden müssen erfüllt sein.
Dies betrifft Moleküle, die eine natürliche Fluoreszenz aufweisen, und
Moleküle, die nach Transformation oder Derivatisierung eine Fluores-
zenz zeigen. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen müssen in
Verbindung mit den chromatografischen Bedingungen so gewählt
werden, dass das Auftreten von störenden Bestandteilen in Leerwertpro-
benextrakten auf ein Mindestmaß reduziert wird.
Das nächstgelegene Peakmaximum im Chromatogramm muss bei 10 %
der maximalen Höhe des Analytpeaks mindestens eine volle Peakbreite
vom festgestellten Peak des Analyten getrennt sein.
2.3.5.4.Leistungskriterien für die Bestimmung eines Analyten mit einem LC-
Immunogramm
Ein LC-Immunogramm ist für sich allein nicht als Bestätigungsmethode
geeignet.
Die einschlägigen Kriterien für LC-Methoden müssen erfüllt sein.
Die vorgegebenen Qualitätskontrollparameter, z. B. unspezifische
Bindung, relative Bindung der Kontrollproben und der Absorptionswert
der Leerwertbestimmung, müssen innerhalb der bei der Validierung des
Assays ermittelten Grenzwerte liegen.
Das Immunogramm muss durch mindestens fünf Fraktionen zustande
kommen.
Jede Fraktion muss kleiner als die Hälfte der Peakbreite sein.
Die Fraktion mit dem höchsten Gehalt des Analyten muss für die Test-
probe, die positive Kontrollprobe und den Standard die gleiche sein.
2.3.5.5.Bestimmung eines Analyten mittels LC mit UV/VIS-Detektion (eine
Wellenlänge)
Die LC mit UV/VIS-Detektion (eine Wellenlänge) ist für sich allein
nicht als Bestätigungsmethode geeignet.
Das nächstgelegene Peakmaximum im Chromatogramm muss bei 10 %
der maximalen Höhe des Analytpeaks mindestens eine volle Peakbreite
vom festgestellten Peak des Analyten getrennt sein.
2.3.6.Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für die Bestimmung
eines Analyten mittels 2D-TLC gekoppelt mit Full-Scan-UV/VIS-
spektrometrischer Detektion
Die zweidimensionale HPTLC und die Co-Chromatografie sind obliga-
torisch.
Die RF-Werte des Analyten müssen mit den RF-Werten der Standards
innerhalb einer Toleranz von ± 5 % übereinstimmen.
Das Erscheinungsbild des Analyten darf sich von dem des Standards
nicht unterscheiden.
Bei Flecken der gleichen Farbe muss das Zentrum des Flecks, der dem
Zentrum des Flecks des Analyten am nächsten liegt, von diesem
mindestens die Hälfte der Summe der Fleckdurchmesser entfernt sein.
Das Spektrum des Analyten darf sich, wie für die Full-Scan-UV/VIS-
Detektion beschrieben, in seinem Erscheinungsbild nicht vom Spektrum
des Standards unterscheiden.
Wenn eine computergestützte Bibliothekssuche und Anpassung durch-
geführt wird, muss das Ergebnis des Vergleichs der Spektren der
Untersuchungsproben mit dem der Kalibrierlösung einen kritischen
Abgleichfaktor überschreiten. Dieser Faktor wird bei der Validierung2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 15
▼B
für jeden Analyten auf der Basis von Spektren bestimmt, für welche die
oben beschriebenen Kriterien erfüllt sind. Schwankungen in den Spek-
tren, die durch die Probenmatrix und die Leistungsfähigkeit des
Detektors verursacht werden können, müssen überprüft werden.
2.3.7.Leistungskriterien und Anforderungen für die Bestimmung eines
Analyten mittels GC in Kombination mit der Elektroneneinfangde-
tektion (ECD)
Ein interner Standard muss verwendet werden, wenn ein für diesen
Zweck geeignetes Material zur Verfügung steht. Es muss vorzugsweise
ein verwandter Standard mit einer Retentionszeit nahe der des Analyten
sein. Der Analyt muss bei der Retentionszeit eluieren, die für den
entsprechenden Kalibrierstandard unter den gleichen Versuchsbedin-
gungen typisch ist. Die akzeptable Mindestretentionszeit für einen
Analyten muss das Zweifache der Retentionszeit des Totvolumens der
Säule betragen. Das Verhältnis der Retentionszeit des Analyten zu der
des internen Standards, d. h. die relative Retentionszeit des Analyten,
muss mit einer Toleranz von ± 0,5 % mit der des Kalibrierstandards in
der entsprechenden Matrix identisch sein. Das nächstgelegene Peakma-
ximum im Chromatogramm muss bei 10 % der maximalen Höhe des
Analytpeaks mindestens eine volle Peakbreite vom festgestellten Peak
des Analyten getrennt sein. Zusätzliche Informationen können durch
Co-Chromatografie gewonnen werden.
2.4. BESTÄTIGUNGSMETHODEN FÜR ELEMENTE
Bestätigungsanalysen für chemische Elemente müssen auf der eindeutigen Iden-
tifizierung und der genauen und präzisen Quantifizierung mit Hilfe von
chemisch-physikalischen Eigenschaften beruhen, die für das betreffende chemi-
sche Element in der interessierenden Konzentration einzigartig sind (z. B.
elementcharakteristische Wellenlänge der emittierten oder absorbierten Strah-
lung, Atommasse).
Die folgenden Methoden oder Methodenkombinationen gelten als geeignet für
die Identifizierung von chemischen Elementen:
Tabelle 7
Geeignete Bestätigungsmethoden für chemische Elemente
Verfahren Messparameter
Differentielle anodische Stripping-Pulsvoltamme-
trieElektrisches Signal
Atomabsorptionsspektrometrie
Flamme Absorptionswellenlänge
Hydriderzeugung Absorptionswellenlänge
Kaltdampf Absorptionswellenlänge
Elektrothermische Atomisierung (Graphit-
ofen)Absorptionswellenlänge
Atomemissionsspektrometrie
Induktiv gekoppeltes Plasma Emissionswellenlänge
Massenspektrometrie
Induktiv gekoppeltes Plasma Masse-Ladungs-Verhältnis
2.4.1.Gemeinsame Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für
Bestätigungsmethoden
Referenzmaterial oder dotiertes Material, das bekannte Analytmengen
an oder nahe der zulässigen Höchstmenge oder der Entscheidungs-
grenze (positive Kontrollprobe) enthält, sowie negatives
Kontrollmaterial und Reagenzleerwerte sollten vorzugsweise während
des gesamten Verfahrens parallel zu jeder Serie von Untersuchungs-
proben analysiert werden. Die empfohlene Reihenfolge für die
Injektion der Extrakte in das Analysengerät ist: Reagenzleerwert, nega-
tive Kontrollprobe, zu bestätigende Probe, negative Kontrollprobe und
schließlich die positive Kontrollprobe. Jede Abweichung von dieser
Reihenfolge muss begründet werden.
Im Allgemeinen muss bei den meisten Analyseverfahren die organische
Matrix vollständig aufgeschlossen werden, um vor der Bestimmung des
Analyten Lösungen zu erhalten. Dazu können Mikrowellen-Mineralisa-2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 16
▼B
tionsverfahren verwendet werden, die das Risiko eines Verlustes und/
oder einer Verunreinigung der interessierenden Analyte auf ein
Mindestmaß reduzieren. Dekontaminierte Teflongefäße von guter
Qualität müssen verwendet werden. Wenn andere Nass- oder Trocke-
naufschlussmethoden herangezogen werden, sollten dokumentierte
Belege vorliegen, die potentielle Analytverluste oder -verunreinigungen
ausschließen. Als Alternative zum Aufschluss können unter Umständen
Trennverfahren (beispielsweise die Extraktion) gewählt werden, um
Analyte von Matrixbestandteilen zu trennen und/oder Analyte zu
konzentrieren, bevor sie dem Analysengerät zugeführt werden.
Bei der Kalibrierung, sei es extern oder anhand der Methode der Stand-
ardaddition, ist sorgfältig darauf zu achten, dass der für die Analyse
festgelegte Arbeitsbereich nicht überschritten wird. Bei der externen
Kalibrierung müssen die Kalibrierstandards unbedingt in einer Lösung
hergestellt werden, die der Zusammensetzung der Probenlösung
möglichst genau entspricht. Eine Hintergrundkorrektur muss ebenfalls
angewandt werden, falls aufgrund der speziellen Gegebenheiten der
Analyse erforderlich.
2.4.2.Zusätzliche Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für
quantitative Analysemethoden
2.4.2.1.Richtigkeit von quantitativen Methoden
Bei wiederholten Analysen eines zertifizierten Referenzmaterials auf
Elemente darf die Abweichung des experimentell bestimmten mittleren
Gehalts vom zertifizierten Wert nicht außerhalb der Toleranzgrenze von
± 10 % liegen. Wenn keine solchen zertifizierten Referenzmaterialien
zur Verfügung stehen, ist die Bestimmung der Richtigkeit der
Messungen durch Wiederfindung von zugesetzten bekannten Mengen
des Elements zu den unbekannten Proben akzeptabel. Es ist darauf
hinzuweisen, dass das zugegebene Element nicht wie der Analyt in der
realen Matrix chemisch gebunden ist und dass deshalb die mit dieser
Methode erzielten Ergebnisse weniger valide als die mit zertifizierten
Referenzmaterialien gewonnenen Ergebnisse sind. Wiederfindungsdaten
sind nur dann akzeptabel, wenn sie innerhalb eines Toleranzbereichs
von ± 10 % um den Zielwert liegen.
2.4.2.2.Präzision von quantitativen Methoden
Bei wiederholter Analyse einer Probe unter laborinternen Reproduzier-
barkeitsbedingungen darf der laborinterne Variationskoeffizient (CV)
des Mittelwerts die folgenden Werte nicht überschreiten:
Tabelle 8
CVs für quantitative Methoden bei einer Reihe von Elementmassenanteilen
Massenanteil CV (%)
≥10µg/kg bis 100 µg/kg 20
> 100 µg/kg bis 1 000 µg/kg 15
≥1 000 µg/kg 10
2.4.3.Spezifische Anforderungen für die differenzielle anodische Strip-
ping-Pulsvoltammetrie (DPASV)
Vor einer DPASV-Bestimmung ist eine vollständige Zerstörung von
organischen Stoffen von größter Bedeutung. Im Voltammogramm
dürfen keine breiten Signale wegen des Vorhandenseins von organi-
schen Stoffen auftreten. Anorganische Matrixbestandteile können die
Peakhöhen bei der DPASV beeinflussen. Deshalb muss die Quantifizie-
rung mit der Methode der Standardaddition erfolgen. Beispiele von
typischen Voltammogrammen einer Probenlösung müssen der Methode
beigefügt werden.
2.4.4.Spezfische Anforderungen für die Atomabsorptionsspektrometrie
(AAS)
Dieses Verfahren ist grundsätzlich ein Einelementverfahren und erfor-
dert deshalb eine Optimierung der Analysenbedingungen in
Abhängigkeit von dem zu quantifizierenden Element. Die Ergebnisse
müssen nach Möglichkeit qualitativ und quantitativ anhand von alterna-
tiven Absorptionslinien kontrolliert werden (im Idealfall sollten zwei
verschiedene Linien gewählt werden). Kalibrierstandards müssen in
einer Lösungsmatrix hergestellt werden, die derjenigen der Proben-
messlösung möglichst genau entspricht (z. B. in der2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 17
▼B
Säurekonzentration oder der Zusammensetzung des Modifikators). Um
Leerwerte auf ein Mindestmaß zu reduzieren, müssen alle Reagenzien
von höchstmöglicher Reinheit sein. Je nach gewählter Methode der
Verdampfung bzw. Atomisierung der Probe lassen sich verschiedene
Arten der AAS unterscheiden.
2.4.4.1.Spezifische Anforderungen für die Flammen-AAS
Die empfohlenen Geräteeinstellungen müssen für jedes Element opti-
miert werden. Vor allem die Gaszusammensetzung und die
Fließgeschwindigkeiten müssen überprüft werden. Ein Kontinuum-
strahler-Korrektursystem muss verwendet werden, um Störungen durch
die Hintergrundabsorption zu vermeiden. Bei unbekannten Matrices
muss überprüft werden, ob eine Hintergrundkorrektur erforderlich ist.
2.4.4.2.Spezifische Anforderungen für die Graphitrohrofen-AAS
Eine Verunreinigung im Labor beeinflusst häufig die Genauigkeit bei
Analysen im Ultraspurenbereich im Graphitrohrofen. Deshalb sollten
hochreine Reagenzien, deionisiertes Wasser und inerte Kunststoffgeräte
zur Handhabung der Proben und Reagenzien verwendet werden. Die
empfohlenen Geräteeinstellungen müssen für jedes Element optimiert
werden. Vor allem die Vorbehandlungs- und Atomisierungsbedin-
gungen (Temperatur, Zeit) und die Matrixmodifikation müssen
überprüft werden.
Das Arbeiten unter isothermischen Atomisierungsbedingungen (z. B. im
quergeheizten Graphitrohrofen mit integrierter Lvov-Plattform (8))
verringert den Einfluss der Matrix auf die Atomisierung des Analyten.
In Verbindung mit der Matrixmodifikation und der Zeeman-Hinter-
grundkorrektur (9) ist eine Quantifizierung anhand einer Kalibrierkurve
möglich, die auf der Messung von wässrigen Standardlösungen basiert.
2.4.5.Spezifische Anforderungen für die Atomabsorptionsspektrometrie
mit Hydriderzeugung
Organische Verbindungen, die Elemente wie Arsen, Wismut, Germa-
nium, Blei, Antimon, Selen, Zinn und Tellur enthalten, können sehr
stabil sein und müssen oxidativ zerlegt werden, damit korrekte Erge-
bnisse für den Gesamtelementgehalt gewonnen werden. Deshalb wird
ein Mikrowellenaufschluss oder eine Hochdruckveraschung unter
starken oxidativen Bedingungen empfohlen. Dabei sollte äußerst
sorgfältig auf die vollständige und reproduzierbare Umwandlung der
Elemente in ihre entsprechenden Hydride geachtet werden.
Die Bildung von Arsenhydrid in Salzsäurelösung mit NaBH4hängt vom
Oxidationszustand von Arsen ab (As III: schnelle Bildung, As V:
längere Bildungszeit). Um eine Empfindlichkeitseinbuße bei der
Bestimmung von As V mit der Fließinjektionstechnik aufgrund der
kurzen Reaktionszeit in diesem System zu vermeiden, muss As V nach
der oxidativen Zerlegung zu As III reduziert werden. Hierfür sind Kali-
umiodid/Ascorbinsäure oder Cystein geeignet. Leerwert-, Kalibrier- und
Probenlösungen müssen in der gleichen Weise behandelt werden. Der
Einsatz eines Chargensystems ermöglicht die Bestimmung beider
Arsenspezies, ohne dass die Genauigkeit beeinträchtigt wird. Aufgrund
der verzögerten Bildung von As-V-Hydrid muss die Kalibrierung durch
Peakflächenintegration erfolgen. Die empfohlenen Geräteeinstellungen
müssen optimiert werden. Vor allem der Gasfluss, der das Hydrid in
den Atomisator befördert, muss überprüft werden.
2.4.6.Spezifische Anforderungen für die Kaltdampf-Atomabsorptions-
spektrometrie
Kaltdampf wird nur für die Bestimmung von Quecksilber verwendet.
Aufgrund von Verflüchtigungs- und Adsorptionsverlusten von elemen-
tarem Quecksilber ist während der gesamten Analyse besondere
Sorgfalt geboten. Eine Verunreinigung durch Reagenzien oder die
Umgebung muss sorgfältig vermieden werden.
Organische Verbindungen, die Quecksilber enthalten, müssen oxidativ
zerlegt werden, damit korrekte Ergebnisse für den Gesamtquecksilberg-
ehalt erzielt werden. Zur Zerlegung werden geschlossene Systeme mit
Mikrowellenaufschluss oder Hochdruckveraschung empfohlen. Beson-
dere Sorgfalt ist bei der Reinigung der Geräte geboten, die mit
Quecksilber in Kontakt kamen.
Der Einsatz der Fließinjektionstechnik ist von Vorteil. Bei niedrigeren
Entscheidungsgrenzen empfiehlt sich eine Adsorption von elementarem
Quecksilber an Gold-/Platinabsorber mit anschließender thermischer
Desorption. Ein Kontakt des Adsorbers oder der Küvette mit Feuchtig-
keit stört die Messung und muss deshalb vermieden werden.2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 18
▼B
2.4.7.Spezifische Anforderungen für die Atomemissionsspektrometrie mit
induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-AES)
Die Atomemissionsspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (10)
ist eine Multielementmethode zur gleichzeitigen Messung verschiedener
Elemente. Für die ICP-AES müssen die Proben zunächst aufgeschlossen
werden, um organische Matrices zu ersetzen. Hierfür müssen geschlos-
sene Systeme mit Mikrowellenaufschluss oder Hochdruckveraschung
verwendet werden. Für eine aussagefähige ICP-AES-Analyse spielen
die Gerätekalibrierung und die Element- bzw. Wellenlängenwahl eine
wesentliche Rolle. Bei der Gerätekalibrierung müssen im Fall von
linearen Kalibrierkurven normalerweise Kalibrierlösungen mit nur vier
Konzentrationen gemessen werden, weil ICP-AES-Kalibrierkurven im
Allgemeinen über vier bis sechs Konzentrationsgrößenordnungen linear
sind. Die Kalibrierung des ICP-AES-Systems sollte normalerweise mit
einem Multielementstandard durchgeführt werden, der in einer Lösung
hergestellt werden muss, welche die gleiche Säurekonzentration wie die
Messlösung enthält. Für die lineare Kurve müssen die Elementkonzen-
trationen überprüft werden.
Die Wahl der Wellenlängen zur Messung der Emission der Analyte
richtet sich nach den Konzentrationen der zu bestimmenden Analyte.
Wenn die Analytkonzentration außerhalb des Arbeitsbereichs einer
Emissionslinie liegt, muss eine andere Emissionslinie verwendet
werden. Zunächst muss die empfindlichste Emissionslinie (nicht
gestört) gewählt werden, dann eine weniger empfindliche Linie. Bei
Analysen an oder nahe der Nachweisgrenze ist die empfindlichste Linie
für den betreffenden Analyten normalerweise am besten geeignet. Spek-
trale Störungen und Hintergrundstörungen bereiten bei der ICP-AES die
größten Schwierigkeiten. Mögliche Störungen sind z. B. die einfache
Hintergrundverschiebung, die ansteigende Hintergrundverschiebung,
die direkte spektrale Überlappung und die komplexe Hintergrundver-
schiebung. Für jede dieser Störungen gibt es bestimmte Ursachen und
Abhilfemaßnahmen. Je nach den Matrices muss sowohl eine Korrektur
der Störungen als auch eine Optimierung der Betriebsparameter vorgen-
ommen werden. Einige Störungen lassen sich durch Verdünnung oder
Anpassung der Matrices vermeiden. Mit jeder Serie von Untersuchungs-
proben müssen Referenzmaterialien und dotierte Materialien mit
bekannten Analytmengen sowie Leerwertmaterial in der gleichen Weise
wie die Untersuchungsproben analysiert werden. Zur Prüfung auf eine
Drift muss der Standard z. B. nach 10 Proben überprüft werden. Alle
Reagenzien sowie das Plasmagas müssen von höchstmöglicher Reinheit
sein.
2.4.8.Spezifische Anforderungen für die Massenspektrometrie mit indu-
ktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) (11)
Die Bestimmung von Spurenelementen mit durchschnittlicher Atom-
masse, wie zum Beispiel Chrom, Kupfer und Nickel, kann starken
Störungen durch andere isobare und mehratomige Ionen unterliegen.
Diese lassen sich nur vermeiden, wenn ein Auflösungsvermögen von
mindestens 7 000-8000 gegeben ist. Schwierigkeiten bei den MS-
Verfahren sind die instrumentelle Drift, Matrixeffekte und Molekü-
lionen-Störungen (m/z<80). Zur Korrektur der instrumentellen Drift
und der Matrixeffekte ist eine mehrfache interne Standardisierung erfor-
derlich, die denselben Massenbereich wie die zu bestimmenden
Elemente abdeckt.
Vor den ICP-MS-Messungen ist eine vollständige Zersetzung von orga-
nischen Stoffen in den Proben erforderlich. Wie bei der AAS müssen
flüchtige Elemente wie z. B. Iod nach Aufschluss in geschlossenen
Gefäßen in einen stabilen Oxidationszustand überführt werden. Sehr
starke Störungen kommen durch Molekülion-Kombinationen von Argon
(Plasmagas), Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff und Sauerstoff
(Auflösungssäuren, Verunreinigungen des Plasmagases und mitge-
schleppte Luftgase) und der Probenmatrix zustande. Zur Vermeidung
von Störungen sind ein vollständiger Aufschluss, Hintergrundmes-
sungen, eine entsprechende Wahl von analytischen Massen, die
mitunter in geringerer Häufigkeit vorkommen (schlechtere Nachweis-
grenze), und von Auflösungssäuren, beispielsweise Salpetersäure,
erforderlich.
Für die zu bestimmenden Elemente sind Störungen durch entsprechende
Wahl von spezifischen analytischen Massen einschließlich der Bestäti-
gung von Isotopenverhältnissen auszuschließen. Das Geräteverhalten
unter Berücksichtigung von Fano-Faktoren muss für jede Messung mit
Hilfe von internen Standards überprüft werden.2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 19
▼B
3.VALIDIERUNG
Die Validierung muss nachweisen, dass die Analysemethode die für die
einschlägigen Leistungsmerkmale gültigen Kriterien erfüllt.
Unterschiedliche Kontrollzwecke erfordern verschiedene Kategorien von
Methoden. Aus der folgenden Tabelle geht hervor, welche Leistungsmerkmale
für welchen Methodentyp verifiziert werden müssen.
Tabelle 9
Klassifikation von Analysenmethoden nach den Leistungsmerkmalen, die bestimmt werden
müssen
Nachweis-
grenze
CCβEntschei-
dungs-
grenze
CCαRichtigkeit/
Wiederfin-
dungPräzisionSelekti-
vität/Spezi-
fitätAnwend-
barkeit/
Robustheit/
Stabilität
Qualtita-
tive
MethodenS+–––++
C++––++
Quantita-
tive
MethodenS+––+++
C++++++
S = Screeningmethoden; C = Bestätigungsmethoden; + = Bestimmung ist obligatorisch.
3.1. VALIDIERUNGSVERFAHREN
Dieses Kapitel enthält Beispiele für bzw. Verweise auf Validierungsverfahren
für Analysenmethoden. Andere Ansätze zum Nachweis, dass die Analysenme-
thode die Leistungskriterien für Leistungsmerkmale erfüllt, können verwendet
werden, sofern sie denselben Informationsgehalt liefern.
Die Validierung kann auch vorgenommen werden, indem eine Laborvergleich-
untersuchung gemäß Codex Alimentarius, ISO oder IUPAC (12) durchgeführt
wird, oder mit alternativen Methoden, wie zum Beispiel laborinternen Validie-
rungsstudien (13) (14). Dieses Kapitel konzentriert sich auf die laborinterne
Validierung mit einem modularen Ansatz. Dieser Ansatz umfasst:
1. eine Reihe von allgemeinen Leistungsmerkmalen, die vom verwendeten Vali-
dierungsmodell unabhängig sind, und
2. spezifischere modellabhängige Verfahren (siehe Tabelle 10).
Tabelle 10
Modellunabhängige und modellabhängige Leistungsparameter
Validierung
Modellunabhängige Leistungspara-
meterModellabhängige Leistungsparameter
Allgemeine Leistungsmerkmale
(3.1.1)Herkömmlicher Validierungs-
ansatz (3.1.2)Laborinterner Validierungsan-
satz (3.1.3)
Spezifität Wiederfindung Wiederfindung
Richtigkeit Wiederholpräzision Wiederholpräzision
Robustheit: geringfügige
ÄnderungenLaborinterne Reproduzierbar-
keitLaborinterne Reproduzierbarkeit
Stabilität Reproduzierbarkeit Reproduzierbarkeit
Entscheidungsgrenze (CC α)Entscheidungsgrenze (CC α)
Nachweisvermögen (CC β) Nachweisvermögen (CC β)
Kalibrierkurven Kalibrierkurve
Robustheit: größere
ÄnderungenRobustheit2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 20
▼B
3.1.1.Modellunabhängige Leistungsmerkmale
Unabhängig vom gewählten Validierungsansatz müssen die folgenden
Leistungsmerkmale bestimmt werden. Um den Arbeitsaufwand auf ein
Mindestmaß zu reduzieren, können die durchgeführten Untersuchungen
sorgfältig durchdacht und statistisch fundiert kombiniert werden, um
verschiedene Parameter zu bestimmen.
3.1.1.1.Spezifität
Für Analysemethoden ist das Unterscheidungsvermögen zwischen dem
Analyten und eng verwandten Stoffen (Isomeren, Metaboliten, Abbau-
produkten, endogenen Stoffen, Matrixbestandteilen usw.) wichtig. Zwei
Ansätze sind zur Prüfung auf Störungen notwendig.
Deshalb müssen potenziell störende Substanzen ausgewählt und geeig-
nete Leerwertproben analysiert werden, um das Vorhandensein
möglicher Störungen nachzuweisen und die Auswirkung dieser
Störungen abzuschätzen:
— eine Reihe von chemisch verwandten Verbindungen (Metabolite,
Derivate usw.) oder andere Substanzen auswählen, die möglicher-
weise zusammen mit der interessierenden Verbindung, die in den
Proben vorhanden sein kann, vorkommen;
— eine geeignete Anzahl an repräsentativen Leerwertproben (n ≥20)
analysieren und in dem interessierenden Bereich, in dem die Elution
des Zielanalyten zu erwarten ist, auf Störungen (Signale, Peaks,
Ionenspuren) untersuchen;
— zusätzlich müssen repräsentative Leerwertproben in einer entspre-
chenden Konzentration mit Substanzen, welche die Identifizierung
bzw. die Quantifizierung stören könnten, dotiert werden;
— nach der Analyse ist zu untersuchen, ob:
— das Vorhandensein zu einer falschen Identifizierung führen
kann,
— die Identifizierung des Zielanalyten durch das Vorhandensein
von einer oder mehreren Störungen beeinträchtigt wird oder
— die Quantifizierung nennenswert beeinflusst wird.
3.1.1.2.Richtigkeit
In diesem Abschnitt wird die Bestimmung der Richtigkeit (eine
Komponente der Genauigkeit) beschrieben. Die Richtigkeit kann nur
mit Hilfe eines zertifizierten Referenzmaterials (CRM) bestimmt
werden. Ein CRM muss verwendet werden, wenn es zur Verfügung
steht. Das Verfahren ist im Einzelnen in ISO 5725-4 beschrieben (5).
Im Folgenden ist ein Beispiel aufgeführt:
— 6 Bestimmungen des CRM gemäß der Testvorschrift für die
Methode analysieren;
— die Konzentration des Analyten in jeder der Bestimmungen ermit-
teln;
— den Mittelwert, die Standardabweichung und den Variationskoeffi-
zienten (%) für diese Konzentrationen berechnen;
— die Richtigkeit berechnen, indem die gemessene mittlere Konzentra-
tion durch den zertifizierten Wert (gemessen als Konzentration)
dividiert und mit 100 multipliziert und das Ergebnis als Prozentwert
angegeben wird.
Richtigkeit (%) = mittlere wiederfindungskorrigierte gemessene
Konzentration x 100/zertifizierter Wert.
Wenn kein CRM zur Verfügung steht, kann anstelle der Richtigkeit die
Wiederfindung bestimmt werden, wie unter 4.1.2.1 weiter unten
beschrieben.
3.1.1.3.Anwendbarkeit/Robustheit (kleinere Änderungen)
In solchen Studien werden gezielt geringfügige vertretbare Verände-
rungen durch das Labor vorgenommen und ihre Folgen beobachtet.
Vor den Untersuchungen müssen Faktoren der Probenvorbereitung, des
Clean-up und der Analyse bestimmt werden, welche die Messergebnisse
beeinflussen können. Solche Faktoren können der Analytiker, die
Quelle und das Alter der Reagenzien, Lösungsmittel, Standards und
Probenextrakte, die Heizrate, die Temperatur, der pH-Wert sowie viele
weitere Faktoren sein, die im Labor vorkommen können. Diese
Faktoren sollten in einer Größenordnung verändert werden, die den
normalerweise zwischen Laboratorien feststellbaren Abweichungen
entspricht.2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 21
▼B
— Mögliche Faktoren ermitteln, welche die Ergebnisse beeinflussen
können;
— jeden Faktor leicht variieren;— einen Robustheitstest nach der Methode von Youden durchführen
(15) (16). (Hier können auch andere zulässige Methoden verwendet
werden. Die Methode nach Youden beschränkt jedoch den erforder-
lichen Zeit- und Arbeitsaufwand auf ein Minimum.) Die Methode
nach Youden ist ein gebrochenes Faktormodell. Wechselwirkungen
zwischen den verschiedenen Faktoren können nicht festgestellt
werden;
— wenn sich herausstellt, dass ein Faktor die Messergebnisse wesent-
lich beeinflusst, sind weitere Untersuchungen durchzuführen, um die
Akzeptanzgrenzen dieses Faktors zu bestimmen;
— Faktoren, welche die Ergebnisse wesentlich beeinflussen, sollten in
der Methodenvorschrift deutlich angegeben werden.
Grundsätzlich sollte aber nicht eine Veränderung nach der anderen
untersucht werden, sondern es sollten mehrere Veränderungen gleich-
zeitig ins Spiel gebracht werden. So seien beispielsweise A, B, C, D,
E, F, G die Nennwerte für sieben verschiedene Faktoren, welche die
Ergebnisse beeinflussen könnten, wenn ihre Nennwerte leicht verändert
werden. Ihre alternativen Werte seien die entsprechenden Kleinbuch-
staben a, b, c, d, e, f und g. Dies ergibt 2
(7)oder 128 verschiedene
mögliche Kombinationen.
Es ist nun möglich, daraus acht Kombinationen auszuwählen, in denen
Groß- und Kleinbuchstaben ausgewogen verteilt sind (Tabelle 11). Acht
Bestimmungen müssen durchgeführt werden, die eine Kombination der
gewählten Faktoren (A-G) verwenden. Die Ergebnisse der Bestim-
mungen sind in Tabelle 11 als S-Z angegeben.
Tabelle 11
Versuchsanordnung für Robustheitsstudien (geringfügige Änderungen)
Faktorwert FBestimmungen
12345678
A / a AAAAa a a a
B / b BBbBBBbb
C / c CcCcCcCc
D / d DDddddDD
E/e E e E e e E e E
F / f FffFFffF
G/g G g g G g G G g
Ergebnis R S T U V W X Y Z
Berechnungen siehe Beispiele für Robustheitstests in Abschnitt 3.3.
3.1.1.4.Stabilität
Es ist beobachtet worden, dass eine unzureichende Stabilität des
Analyten oder von Matrixbestandteilen in der Probe während der Lage-
rung oder Analyse zu erheblichen Abweichungen im Analysenergebnis
führen kann. Des Weiteren sollte die Stabilität des Kalibrierstandards in
Lösung überprüft werden. Normalerweise ist die Analytstabilität unter
verschiedenen Lagerungsbedingungen gut charakterisiert. Die Überwa-
chung der Lagerungsbedingungen ist Bestandteil des normalen
Laborakkreditierungssystems. Wenn die Stabilität nicht bekannt ist,
kann sie entsprechend den folgenden Beispielen bestimmt werden.
Stabilität des Analyten in Lösung— Frische Stammlösungen des (der) Analyte(n) herstellen und gemäß
den Angaben in der Testvorschrift verdünnen, um genügend
Aliquots (z. B. 40) jeder gewählten Konzentration (im Bereich der
geforderten Mindestleistungsgrenze bei Stoffen, für die kein
zulässiger Grenzwert festgelegt worden ist, oder im Bereich des
zulässigen Grenzwerts bei anderen Stoffen) zu erhalten. Sowohl
Lösungen des für die Dotierung und in der endgültigen Analyselö-2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 22
▼B
sung verwendeten Analyten als auch sonstige interessierende
Lösungen (z. B. derivatisierte Standards) herstellen;
— den Analytgehalt in der frisch hergestellten Lösung gemäß der Test-
vorschrift messen;
— entsprechende Volumina in geeignete Behältnisse pipettieren, etiket-
tieren und nach folgendem Schema lagern:
Tabelle 12
Lagerungsschema für die Bestimmung der Analgtstabilität in Lösung
–2 0º C +4º C +2 0º C
Dunkel 10 Aliquots 10 Aliquots 10 Aliquots
Hell 10 Aliquots
— Als Lagerungszeiten können 1, 2, 3 und 4 Wochen gewählt werden
oder länger, falls erforderlich, z. B. bis die ersten Zerfallserschei-
nungen bei der Identifizierung bzw. Quantifizierung zu beobachten
sind. Die maximale Lagerungszeit und die optimalen Lagerungsbe-
dingungen müssen dokumentiert werden.
— Die Konzentration des (der) Analyte(n) in jedem Aliquot sollte
berechnet werden, indem die zum Zeitpunkt der Analyse frisch
hergestellte Lösung des Analyten als 100 % angenommen wird.
Restanalyt (%) = Cix 100/Cfrisch
Ci= Konzentration zum Zeitpunkt
Cfrisch= Konzentration der frischen Lösung
Stabilität des Analyten in Matrix— Nach Möglichkeit sollten eingesandte Proben verwendet werden.
Wenn kein eingesandtes Material verfügbar ist, sollte mit dem
Analyten dotierte Matrix verwendet werden.
— Wenn eingesandtes Material zur Verfügung steht, sollte die Konzen-
tration in diesem Material bestimmt werden, solange das Material
noch frisch ist. Die Konzentration in weiteren Aliquots des Mate-
rials könnte nach 1, 2, 4 und 20 Wochen bestimmt werden. Das
Gewebe sollte bei mindestens minus 20 ºC gelagert werden, falls
erforderlich, auch bei niedrigeren Temperaturen.
— Wenn kein eingesandtes Material verfügbar ist, sollte etwas Leer-
wertmaterial homogenisiert werden. Das Material in 5 Aliquots
aufteilen. Jedes Aliquot mit dem Analyten dotieren, der vorzugs-
weise in einer geringen Menge wässriger Lösung zubereitet werden
sollte. Ein Aliquot sofort analysieren. Die restlichen Aliquots bei
mindestens minus 20 ºC oder, falls erforderlich, auch bei niedri-
geren Temperaturen lagern und nach 1, 2, 4 und 20 Wochen
analysieren.
3.1.1.5.Kalibrierkurven
Wenn Kalibrierkurven zur Quantifizierung verwendet werden, gilt
Folgendes:
— Mindestens fünf Konzentrationsstufen (einschließlich null) sollten
zur Erstellung der Kurve verwendet werden.
— Der Messbereich der Kurve sollte beschrieben werden.
— Die mathematische Formel der Kurve und die Anpassungsgüte der
Daten an die Kurve sollten beschrieben werden.
— Akzeptanzbereiche für die Parameter der Kurve sollten beschrieben
werden.
Wenn eine serielle Kalibrierung auf der Basis einer Standardlösung
erforderlich ist, müssen zulässige Bereiche für die Parameter der Kali-
brierkurve, die von Serie zu Serie schwanken können, angegeben
werden.
3.1.2.Herkömmliche Validierungsverfahren
Für die Berechnung der Parameter gemäß den herkömmlichen
Methoden müssen mehrere Einzeluntersuchungen durchgeführt werden.
Jedes Leistungsmerkmal muss für jede größere Änderung bestimmt
werden (siehe unter Anwendbarkeit/Robustheit weiter oben). Bei
Multianalytmethoden können mehrere Analyte gleichzeitig analysiert
werden, sofern mögliche relevante Störungen zuvor ausgeschlossen
werden. Mehrere Leistungsmerkmale können auf ähnliche Weise
bestimmt werden. So empfiehlt es sich, zur Reduzierung des Aufwands2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 23
▼B
die Untersuchungen soweit wie möglich zu kombinieren (z. B. Wieder-
holpräzision und laborinterne Reproduzierbarkeit mit der Spezifität, die
Analyse von Leerwertproben zur Bestimmung der Entscheidungsgrenze
und die Prüfung auf Spezifität).
3.1.2.1.Wiederfindung
Wenn kein zertifiziertes Referenzmaterial (CRM) zur Verfügung steht,
muss die Wiederfindung durch Untersuchungen mit dotierter Leerwert-
matrix bestimmt werden, z. B. nach folgendem Plan:
— 18 Aliquots eines Leerwertmaterials nehmen und je 6 Aliquots auf
das 1-, 1,5- und 2fache der geforderten Mindestleistungsgrenze oder
das 0,5-, 1- und 1,5fache des zulässigen Grenzwerts dotieren;
— die Proben analysieren und die Konzentration in jeder Probe
berechnen;
— mit der unten angegebenen Gleichung die Wiederfindung für jede
Probe berechnen;
— die mittlere Wiederfindung und den Variationskoeffizienten (CV)
aus den 6 Ergebnissen jeder Konzentration berechnen;
— % Wiederfindung = 100 x gemessener Gehalt/Dotierung.
Diese herkömmliche Methode der Bestimmung der Wiederfindung ist
eine Variante der im Abschnitt 3.5 beschriebenen Standardadditionsme-
thode, wenn
— die Probe als Leerwertprobe und nicht als zu analysierende Probe
betrachtet wird,
— angenommen wird, dass Ausbeute (1) und Wiederfindung (2) für die
beiden Analysenproben vergleichbar sind,
— die Untersuchungsproben die gleichen Massen haben und die Analy-
senprobe die gleichen Volumina extrahiert,
— die Menge des Kalibrierstandards, der zur zweiten (dotierten)
Analysenprobe gegeben wird, xADD ist (xADD = ρA.VA),
— x1 der gemessene Wert für die Leerwertprobe und x2 der geme-
ssene Wert für die zweite (dotierte) Analysenprobe ist,
— dann gilt: % Wiederfindung = 100 (x2 - x1)/xADD.
Wenn eine der oben genannten Bedingungen nicht (oder vermutlich
nicht) herzustellen ist, muss das im Abschnitt 3.5 beschriebene voll-
ständige Verfahren zur Bestimmung der Wiederfindung mit der
Methode der Standardaddition durchgeführt werden.
3.1.2.2.Wiederholpräzision
— Einen Satz von Proben mit identischer Matrix, dotiert mit dem
Analyten zu Konzentrationen entsprechend dem 1-, 1,5- und
2fachen der geforderten Mindestleistungsgrenze oder dem 0,5-, 1-
und 1,5fachen des zulässigen Grenzwerts, herstellen.
— In jeder Konzentration sollte die Analyse mit mindestens sechs
Bestimmungen durchgeführt werden.
— Die Proben analysieren.
— Die in jeder Probe gefundene Konzentration berechnen.
— Die mittlere Konzentration, die Standardabweichung und den Varia-
tionskoeffizienten (%) der dotierten Proben ermitteln.
— Diese Schritte mindestens zwei weitere Male wiederholen.
— Die mittleren Konzentrationen und CVs der dotierten Proben
insgesamt berechnen.
3.1.2.3.Laborinterne Reproduzierbarkeit
— Einen Satz von Proben mit spezifiziertem Prüfmaterial (identische
oder verschiedene Matrices), dotiert mit dem(den) Analyten zu
Konzentrationen entsprechend dem 1-, 1,5- und 2fachen der gefor-
derten Mindestleistungsgrenze oder dem 0,5-, 1- und 1,5fachen des
zulässigen Grenzwerts, herstellen.
— In jeder Konzentration sollte die Analyse mit mindestens sechs
Bestimmungen durchgeführt werden.2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 24
(1) Ausbeute: der Massenanteil des in der Probe enthaltenen Analyten, der im Endextrakt
vorhanden ist.
(2) Wiederfindung (hier): der Massenanteil des der Probe zugesetzten Analyten, der im
Endextrakt vorhanden ist. Im weiteren Verlauf des Dokuments wird vorausgesetzt,dass Ausbeute und Wiederfindung gleich sind, weshalb nur der Begriff „Wiederfin-
dung“ verwendet wird.
▼B
— Diese Schritte mindestens zwei weitere Male möglichst mit anderen
Analytikern und anderen Umgebungsbedingungen, beispielsweise
anderen Chargen von Reagenzien, Lösungsmitteln usw., anderen
Raumtemperaturen, anderen Geräten usw., wiederholen.
— Die Proben analysieren.
— Die in jeder Probe gefundene Konzentration berechnen.
— Die mittlere Konzentration, die Standardabweichung und den Varia-
tionskoeffizienten (%) der dotierten Proben berechnen.
3.1.2.4.Reproduzierbarkeit
Wenn die Reproduzierbarkeit verifiziert werden muss, sollten die Labo-
ratorien an Methodenvergleichsstudien gemäß ISO 5725-2 teilnehmen
(5).
3.1.2.5.Entscheidungsgrenze (CC α)
Die Entscheidungsgrenze muss gemäß den Anforderungen für die Iden-
tifizierung oder die Identifizierung plus Quantifizierung, die unter
„Leistungskriterien und sonstige Anforderungen für Analysemethoden“
(Teil 2) definiert sind, festgelegt werden.
Im Fall von Stoffen, für die kein zulässiger Grenzwert festgelegt
worden ist, kann die Entscheidungsgrenze CC αwie folgt bestimmt
werden:
— Entweder durch das Verfahren der Kalibrierkurve gemäß ISO 11843
(17) (hier als kritischer Wert der Nettokonzentration des Analyten
bezeichnet). In diesem Fall muss Leerwertmaterial verwendet
werden, das in gleichmäßigen Schritten in der Konzentration der
geforderten Mindestleistungsgrenze und höheren Konzentrationen
dotiert ist. Die Proben analysieren. Nach der Identifizierung das
Signal gegen die zugesetzte Konzentration auftragen. Die entspre-
chende Konzentration am y-Abschnitt plus das 2,33fache der
Standardabweichung der laborinternen Reproduzierbarkeit des
Achsenabschnitts ist gleich der Entscheidungsgrenze. Dieses
Verfahren ist nur auf quantitative Bestimmungen anwendbar ( α
= 1 %).
— Oder durch Analysieren von mindestens 20 Leerwertproben pro
Matrix, um das Signal-Rausch-Verhältnis im Zeitfenster, in dem
der Analyt zu erwarten ist, zu berechnen. Das Dreifache des
Signal-Rausch-Verhältnisses kann als Entscheidungsgrenze
verwendet werden. Dieses Verfahren ist auf quantitative und quali-
tative Bestimmungen anwendbar.
Im Fall von Stoffen mit einem festgelegten zulässigen Grenzwert kann
die Entscheidungsgrenze CC αwie folgt bestimmt werden:
— Entweder durch das Verfahren der Kalibrierkurve gemäß ISO 11843
(17) (hier als kritischer Wert der Nettokonzentration des Analyten
bezeichnet). In diesem Fall muss Leerwertmaterial verwendet
werden, das in gleichmäßigen Schritten in Konzentrationen um den
zulässigen Grenzwert dotiert ist. Die Proben analysieren. Nach der
Identifizierung das Signal gegen die zugesetzte Konzentration
auftragen. Die entsprechende Konzentration am zulässigen Grenz-
wert plus das 1,64fache der Standardabweichung der laborinternen
Reproduzierbarkeit ist gleich der Entscheidungsgrenze ( α= 5 %);
— oder durch Analysieren von mindestens 20 Leerwertproben pro
Matrix, dotiert mit dem(den) Analyten in der Konzentration des
zulässigen Grenzwerts. Die Konzentration am zulässigen Grenzwert
plus das 1,64fache der entsprechenden Standardabweichung ist
gleich der Entscheidungsgrenze ( α= 5 %).
Siehe auch Artikel 5 und Abschnitt 3.2.
3.1.2.6.Nachweisvermögen (CC β)
Das Nachweisvermögen sollte gemäß den festgelegten Anforderungen
für das Screening, die Identifizierung oder die Identifizierung plus
Quantifizierung (siehe Teil 2) bestimmt werden.
Im Fall von Stoffen, für die kein zulässiger Grenzwert festgelegt
worden ist, kann das Nachweisvermögen CC βwie folgt bestimmt
werden:
— Durch das Verfahren der Kalibrierkurve gemäß ISO 11843 (17)
(hier als kleinster nachweisbarer Wert der Nettokonzentration des
Analyten bezeichnet). In diesem Fall muss Leerwertmaterial
verwendet werden, das in gleichmäßigen Schritten in der Konzentra-
tion der geforderten Mindestleistungsgrenze und niedrigeren
Konzentrationen dotiert ist. Die Proben analysieren. Nach der Iden-2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 25
▼B
tifizierung das Signal gegen die zugesetzte Konzentration auftragen.
Die entsprechende Konzentration an der Entscheidungsgrenze plus
das 1,64fache der Standardabweichung der laborinternen Reprodu-
zierbarkeit des mittleren gemessenen Gehalts an der
Entscheidungsgrenze ist gleich dem Nachweisvermögen ( β= 5 %).
— Durch Analysieren von mindestens 20 Leerwertproben pro Matrix,
dotiert mit dem(den) Analyten in der Konzentration der Entschei-
dungsgrenze. Die Proben analysieren und die Analyte
identifizieren. Der Wert der Entscheidungsgrenze plus das 1,64fache
der Standardabweichung der laborinternen Reproduzierbarkeit des
gemessenen Gehalts ist gleich dem Nachweisvermögen ( β= 5 %).
— Wenn keine quantitativen Ergebnisse vorliegen, kann das Nachweis-
vermögen durch Analysieren von Leerwertmaterial bestimmt
werden, das in der Konzentration der Entscheidungsgrenze und
höheren Konzentrationen dotiert ist. In diesem Fall ist die Konzen-
tration, bei der nur ≤5 % falsch negative Ergebnisse verbleiben,
gleich dem Nachweisvermögen der Methode. Deshalb müssen
mindestens 20 Analysen für mindestens eine Konzentrationsstufe
durchgeführt werden, um eine zuverlässige Basis für diese Bestim-
mung sicherzustellen.
Im Fall von Stoffen, für die ein zulässiger Grenzwert festgelegt worden
ist, kann das Nachweisvermögen CC βwie folgt bestimmt werden:
— Entweder durch das Verfahren der Kalibrierkurve gemäß ISO 11843
(17) (hier als kleinster nachweisbarer Wert der Nettokonzentration
des Analyten bezeichnet). In diesem Fall muss repräsentatives Leer-
wertmaterial verwendet werden, das in gleichmäßigen Schritten in
Konzentrationen um den zulässigen Grenzwert dotiert ist. Die
Proben analysieren und den (die) Analyte(n) identifizieren. Die
Standardabweichung des mittleren gemessenen Gehalts an der
Entscheidungsgrenze berechnen. Die entsprechende Konzentration
am Wert der Entscheidungsgrenze plus das 1,64fache der Standar-
dabweichung der laborinternen Reproduzierbarkeit ist gleich dem
Nachweisvermögen ( β= 5 %).
— Oder durch Analysieren von mindestens 20 Leerwertproben pro
Matrix, dotiert mit dem (den) Analyten in der Konzentration der
Entscheidungsgrenze. Der Wert der Entscheidungsgrenze plus das
1,64fache der entsprechenden Standardabweichung ist gleich dem
Nachweisvermögen ( β= 5 %).
Siehe auch Abschnitt 3.2.
3.1.2.7.Robustheit (größere Änderungen)
Die Analysenmethode sollte unter unterschiedlichen Versuchsbedin-
gungen, unter anderem zum Beispiel verschiedene Spezies,
verschiedene Matrices oder verschiedene Probennahmebedingungen,
geprüft werden. Die vorgenommenen Änderungen sollten wesentlich
sein. Die Bedeutung dieser Änderungen kann beispielsweise mit der
Methode von Youden beurteilt werden (15) (16). Jedes Leistungs-
merkmal sollte für alle größeren Änderungen bestimmt werden, die
nachweislich einen wesentlichen Einfluss auf die Leistungsfähigkeit
des Tests haben.
3.1.3.Validierung nach alternativen Modellen
Wenn alternative Validierungsverfahren praktiziert werden, müssen das
zugrunde liegende Modell und die Validierungsstrategie sowie die
jeweiligen Voraussetzungen, Annahmen und Formeln im Validierungs-
plan dargelegt oder zumindest muss auf die entsprechenden Quellen
verwiesen werden. Im Folgenden wird ein Beispiel für einen alterna-
tiven Validierungsansatz gegeben. Wenn z. B. das Modell der
laborinternen Validierung angewandt wird, werden die Leistungsmerk-
male so bestimmt, dass im Rahmen desselben Validierungsverfahrens
eine Validierung für größere Änderungen möglich ist. Hierzu muss ein
Versuchsplan für die Validierung erstellt werden.
3.1.3.1.Versuchsplan
Ein Versuchsplan muss erstellt werden, der die Anzahl der verschie-
denen Tierarten und der verschiedenen untersuchten Faktoren
berücksichtigt. Deshalb muss im ersten Schritt des Validierungsverfah-
rens geprüft werden, welche Probenpopulationen künftig im
Laboratorium analysiert werden, um die wichtigsten Tierarten und jene
Faktoren auswählen zu können, welche die Messergebnisse beeinflussen
können. Anschließend muss der Konzentrationsbereich zweckbezogen
entsprechend dem interessierenden Wert gewählt werden.2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 26
▼B
Beispiel:
— Mehrere Analyte können gleichzeitig mit der zu validierenden
Analysemethode untersucht werden.
— Zwei Varianten des Leitfaktors sind ermittelt worden (A und B).
Leitfaktoren bilden die Grundlage, auf der die Faktorausprägungen
kombiniert werden. Diese Leitfaktoren können Faktoren wie Tier-
arten oder die Matrix sein. Im vorliegenden Beispiel wurde der
Leitfaktor in zwei Ausprägungen variiert, d. h. zwei verschiedene
Tierarten (A und B) wurden untersucht. Im Allgemeinen ist es
möglich, die Leitfaktoren in mehr als zwei Ausprägungen zu
variieren, so dass sich nur die Anzahl der durchzuführenden
Analysen erhöht.
— Die gewählten Faktoren sind in zwei Ausprägungen zu variieren
(die als + oder - angegeben werden).
Tabelle 13
Beispiele für Faktoren, die für ein Validierungsverfahren als wichtig erachtet werden
Geschlecht des Tieres (Faktor 1)
Rasse (Faktor 2)
Transportbedingungen (Faktor 3)Lagerungsbedingungen (Faktor 4)
Frische der Probe (Faktor 5)
Mastbedingungen (Faktor 6)Verschiedene Analytiker mit unterschiedlicher Erfahrung (Faktor 7)
Tabelle 14
Möglicher Versuchsplan für das oben genannte Beispiel
Tierart Faktor 1 Faktor 2 Faktor 3 Faktor 4 Faktor 5 Faktor 6 Faktor 7Probe
Nr.
A ++++–+– 1
A+ + – – + – – 2
A +–+–––+ 3
A +––++++ 4
A– + + – + + + 5
A –+–+––+ 6
A ––+++–– 7
A –––––+– 8
B +++++–+ 9
B+ + – – – + + 1 0
B +–+–++–1 1B+ – – + – – – 1 2
B –++––––1 3
B –+–+++–1 4
B– – + + – + + 1 5
B ––––+–+ 1 6
Da jede Probe (jede Kombination von Faktorausprägungen) mit 4
verschiedenen Konzentrationen im Bereich des interessierenden Werts
dotiert und eine Leerwertprobe für jede Kombination analysiert werden
muss, sind 5 × 16 = 80 Analysen für die gesamte Validierungsstudie
durchzuführen.
Aus diesen 80 Messergebnissen können folgende Leistungsmerkmale
berechnet werden (13) (14).
Wiederfindung
— Wiederholpräzision pro Konzentrationsstufe (sir),2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 27
▼B
— laborinterne Reproduzierbarkeit pro Konzentrationsstufe (siR),
— Entscheidungsgrenze (CC α),
— Nachweisvermögen (CC β),
— Gütekurve ( β-Fehlerrate versus Konzentration, siehe Abschnitt
3.1.3.2),
— Robustheit gegenüber größeren Änderungen (die Robustheit gegen-
über geringfügigen Änderungen kann gemäß Abschnitt 3.1.1.3
bestimmt werden),
— 16 probenbezogene Kalibrierkurven,— 1 Gesamtkalibrierkurve,
— Vorhersageintervall der Gesamtkalibrierkurve,
— matrixinduzierte Abweichungen (smat),— laufinduzierte Abweichungen (srun),— Auswirkung der einzelnen Faktoren auf die Messergebnisse.
Diese Leistungsmerkmale erlauben die umfassende Bewertung des
Leistungsgrads der Methode, da nicht nur der Einfluss der einzelnen
Faktoren untersucht wird, sondern auch derjenige der einschlägigen
Kombinationen dieser Faktoren. Mit Hilfe dieses Versuchsdesigns
kann festgestellt werden, ob irgendeiner der gewählten Faktoren aus
der Gesamtkalibrierkurve ausgeschlossen werden muss, weil er wesent-
lich von den Standardabweichungen der anderen Faktoren abweicht.
3.1.3.2.Gütekurve
Die Gütekurve gibt Aufschluss über das Nachweisvermögen der
Methode innerhalb des gewählten Konzentrationsbereichs. Sie bezieht
sich auf die β-Fehlerwahrscheinlichkeit beim Einsatz der untersuchten
Methode. Die Gütekurve erlaubt die Berechnung des Nachweisver-
mögens für die jeweiligen Kategorien (Screening, Bestätigung) oder
Arten (qualitativ oder quantitativ) von Methoden für einen bestimmten
β-Fehler (z. B. 5 %).2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 28
▼B
Abbildung 1
Gütekurve
Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für die grafische Darstellung des Nach-
weisvermögens (CC β)einer Analysemethode. Für die betreffende
Methode besteht bei einer Konzentration von 0,50 µg/kg eine Restwahr-
scheinlichkeit von 5 %, dass eine falsche Entscheidung getroffen wird.
Bei einer Konzentration von 0,55 µg/kg nimmt die Wahrscheinlichkeit
einer falsch negativen Entscheidung auf 1 % ab.
3.1.3.3.Reproduzierbarkeit
Die Bestimmung der Reproduzierbarkeit einer Methode nach dem
Konzept der laborinternen Validierung erfordert die wiederholte Teil-
nahme an Laboreignungsprüfungen gemäß ISO-Leitfaden 43-1 (3) und
43-2 (4). Die Laboratorien können ihre Methoden selbst wählen, sofern
diese Methoden unter Routinebedingungen eingesetzt werden. Die
Standardabweichung des Laboratoriums kann zur Bewertung der Repro-
duzierbarkeit der Methode herangezogen werden.2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 29
▼B
3.2. GRAFISCHE DARSTELLUNG DER VERSCHIEDENEN ANALYTI-
SCHEN GRENZEN
Abbildung 2
Stoffe, für die kein zulässiger Grenzwert festgelegt worden ist
2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 30
▼B
Abbildung 3
Stoffe mit einem festgelegten zulässigen Grenzwert
2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 31
▼B
3.3. BERECHNUNGSBEISPIEL FÜR EINEN ROBUSTHEITSTEST
GEGENÜBER GERINGFÜGIGEN ÄNDERUNGEN NACH DEM
ANSATZ VON YOUDEN (16)
Vergleich der Mittelwerte (A)
AA=Σ(Ai)/4
AB=Σ(Bi)/4
AC=Σ(Ci)/4
AD=Σ(Di)/4
AE=Σ(Ei)/4
AF=Σ(Ei)/4
AG=Σ(Gi)/4
Aa=Σ(ai)/4
Ab=Σ(bi)/4
Ac=Σ(ci)/4
Ad=Σ(di)/4
Ae=Σ(ei)/4
Af=Σ(fi)/4
Ag=Σ(gi)/4Die Mittelwerte der Großbuchstaben (AAbis AG) mit den Mittelwerten ihrer
entsprechenden Kleinbuchstaben (AAbis Ag) vergleichen. Wenn ein Faktor
eine Auswirkung hat, ist der Unterschied wesentlich größer als die Unterschiede
der anderen Faktoren.
Eine robuste Methode sollte nicht durch Veränderungen beeinflusst werden, die
fast sicher zwischen Laboratorien zu beobachten sind.
Wenn kein auffallender Unterschied besteht, ist das reellste Maß des Zufallsfeh-
lers durch die sieben Unterschiede angegeben.
Unterschiede (Di) Unterschiedsquadrate (Di2)
Da=A–a= Σ(Ai)–Σ(ai)
Db=B–b= Σ(Bi)–Σ(bi)
Dc=C–c= Σ(Ci)–Σ(ci)
Dd=D–d= Σ(Di)–Σ(di)
De=E–e= Σ(Ei)–Σ(ei)
Df=F–f= Σ(Fi)–Σ(fi)
Dg=G–g= Σ(Gi)–Σ(gi)Da2= Wert a
Db2= Wert b
Dc2= Wert c
Dd2= Wert d
De2= Wert e
Df2= Wert f
Dg2= Wert g
Standardabweichung der Unterschiede Di(SDi):
Wenn SDiwesentlich größer als die Standardabweichung der unter laborinternen
Reproduzierbarkeitsbedingungen durchgeführten Methode (siehe oben) ist, so
steht von vornherein fest, dass alle Faktoren zusammen eine Auswirkung auf
das Ergebnis haben, auch wenn jeder einzelne Faktor keinen wesentlichen
Einfluss zeigt, und dass die Methode somit nicht robust genug gegenüber den
gewählten Veränderungen ist.
3.4. BERECHNUNGSBEISPIELE FÜR DAS LABORINTERNE VALIDIE-
RUNGSVERFAHREN
Beispiele und Berechnungen für das laborinterne Validierungsmodell, das im
Abschnitt 3.1.3, Validierung nach alternativen Modellen, beschrieben ist (13)
(14).
3.5. BEISPIELE FÜR DIE STANDARDADDITIONSMETHODE
Eine Untersuchungsprobe mit einem Gehalt T des Analyten wird in zwei Analy-
senproben 1 und 2 mit den Massen m1und m2geteilt. Die Analysenprobe 2 wird
mit einem Volumen VAeiner Lösung der Konzentration ρA des Analyten
dotiert. Zwei Extrakte der Analysenproben mit den Volumina V1und V2werden
nach den Extraktions- und Aufreinigungsschritten der Methode gewonnen. Die
Wiederfindung des Analyten soll rc sein. Beide Extrakte werden mit einer Mess-
methode mit der Empfindlichkeit b gemessen und liefern ein Analysenergebnis
von x1 bzw. x2.
Angenommen rc und b sind gleich für den Analyten in der nativen Probe und in
der dotierten Probe, dann lässt sich der Gehalt T wie folgt berechnen:
T=x1.V1.ρA.VA/(x2.V2.m1−x1.V1.m2)
Die Methode erlaubt die Bestimmung der Wiederfindung rc. Dabei wird, zusätz-
lich zum oben beschriebenen Test, ein Teil des Extrakts der Analysenprobe 12002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 32
▼B
(Volumen V3) mit einer bekannten Menge ρB.VBdes Analyten dotiert und analy-
siert. Das Analysenergebnis ist x3und die Wiederfindung ist:
rc = x2.V1.V2.ρB.VB/[x3.V1.V3(T.m2+ρA.VA)−x2.V2.T.m1(V3−VB)]
Außerdem kann die Empfindlichkeit b wie folgt berechnet werden:b= x
1.V1/rc.T.m1
Alle Anwendungsbedingungen und die Einzelheiten sind bereits beschrieben
worden (18).
4.VERWENDETE ABKÜRZUNGEN
AAS Atomabsorptionsspektrometrie
AES Atomemissionsspektrometrie
AOAC-I Association of Official Analytical Chemists INTERNATIONAL
B gebundene Fraktion (Immunoassays)
CI chemische Ionisierung
CRM zertifiziertes ReferenzmaterialCV Variationskoeffizient
2D zweidimensional
DAD Dioden-Array-DetektionDPASV differenzielle anodische Stripping-Pulsvoltammetrie
ECD Elektroneneinfangdetektion
EI ElektronenstoßionisierungGC Gaschromatografie
HPLC Hochleistungsflüssigchromatografie
HPTLC Hochleistungsdünnschichtchromatografie
HRMS hochauflösende Massenspektrometrie
ICP-AES Atomemissionsspektrometrie mit induktiv gekoppeltem PlasmaICP-MS Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma
IR infrarot
ISO International Standard OrganisationLC Flüssigchromatografie
LRMS niedrig auflösende Massenspektrometrie
MRPL geforderte Mindestleistungsgrenze
MS Massenspektrometrie
m/z Masse-Ladungs-VerhältnisRF Retentionsfaktor (TLC)
RSDL relative Standardabweichungen des Laboratoriums
SIM EinzelmassenregistrierungTLC Dünnschichtchromatografie
UV ultraviolettes Licht
VIS sichtbares Licht
5.LITERATUR
(1) ISO 17025: 1999 General requirement for the competence of calibration
and testing laboratories
(2) ISO 3534-1: 1993 Statistics — Vocabulary and symbols — Part 1:
Probability and general statistical terms
(3) ISO Guide 43-1:1997 Proficiency testing by interlaboratory compari-
sons — Part 1: Development and operation of proficiency testing
schemes
(4) ISO Guide 43-2:1997 Proficiency testing by interlaboratory compari-
sons — Part 2: Selection and use of proficiency testing schemes by
laboratory accreditation bodies
(5) ISO 5725:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results — Part 1: General principles and definitions; ISO
5725-2 Part 2: Basic method for the determination of repeatability and
reproducibility of a standard measurement method; Part 4: Basic2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 33
▼B
methods for the determination of the trueness of a standard measure-
ment method
(6) ISO 78-2:1999 Chemistry — Layouts for standards — Part 2: Methods
of chemical analysis
(7) W. G de Ruig and J. M Weseman „A new approach to confirmation by
infrared spectrometry“ J. Chemometrics 4 (1990) 61-77.
(8) See e.g. May, T. W., Brumbaugh, W.G., 1982, Matrix modifier and
L'vov platform for elimination of matrix interferences in the analysis
of fish tissues for lead by graphite furnace atomic absorption spectro-
metry: Analytical Chemistry 54(7):1032-1037 (90353)
(9) Applications of Zeeman Graphite Furnace Atomic Absorption Spectro-
metry in the Chemical Laboratory and in Toxicology, C. Minoia, S.
Caroli (Eds.), Pergamon Press (Oxford), 1992, pp. xxvi + 675
(10) Inductively Coupled Plasmas in Analytical Atomic Spectrometry, A.
Montaser, D. W. Golighty (Eds.), VCH Publishers, Inc. (New York),
1992
(11) Plasma Source Mass Spectrometry Developments and Applications, G.
Holland, S. D. Tanner (Eds.), The Royal Society of Chemistry, 1997,
pp. 329
(12) IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of
method-performance studies, Pure & Applied Chem, 67, 331
(13) Jülicher, B., Gowik, P. und Uhlig, S. (1998) Assessment of detection
methods in trace analysis by means of a statistically based in-house
validation concept. Analyst, 120, 173
(14) Gowik, P., Jülicher, B. und Uhlig, S. (1998) Multi-residue method for
non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high perfor-
mance liquid chromatography-photodiode-array detection. Method
description and comprehensive in-house validation. J. Chromatogr.,
716, 221
(15) OAC-I Peer Verified Methods, Policies and Procedures, 1993, AOAC
International, 2200 Wilson Blvd., Suite 400, Arlington, Virginia
22201-3301, USA
(16) W. J. Youden; Steiner, E. H.; „Statistical Manual of the AOAC–Asso-
ciation of Official Analytical Chemists“, AOAC-I, Washington DC:
1975, p. 35 ff
(17) ISO 11843: 1997 Capability of detection — Part 1: Terms and defini-
tions, Part 2: Methodology in the linear calibration case
(18) R. W. Stephany & L. A. van Ginkel: „Yield or recovery: a world of
difference“. Proceedings 8th Euro Food Chem, Vienna, Austria
September 18-20 (1995) Federation of European Chemical Societies,
Event 206. ISBN 3-900554-17X, page 2-9
(19) Council Directive 71/354/EEC of 18 October 1971 on the approxima-
tion of the laws of the Member States relating to units of measurement
Official Journal L 243, 29.10.1971, p. 29
(20) ISO 31-0:1992 Quantities and units — Part 0: General principles2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 34
▼M1
ANHANG II
Mindestleistungsgrenzen
Stoff und/oder Metabolit Matrix MRPL
Chloramphenicol Fleisch
Eier 0,3 µg/kg
Milch
Urin
Erzeugnisse der Aquakultur
Honig
Medroxy-Progesteron-Acetat Schweinenierenfett 1 µg/kg
Nitrofuranmetaboliten:
— Furazolidon Geflügelfleisch 1 µg/kg für alle
— Furaltadon Erzeugnisse der Aquakultur
— Nitrofurantoin
— Nitrofural2002D0657 — DE — 15.03.2003 — 001.001 — 35