1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 1
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►B DRITTE RICHTLINIE DER KOMMISSION
vom 27. April 1972
zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futter-
mitteln
(72/199/EWG)
(ABl. L 123 vom 29.5.1972, S. 6)
Geändert durch:
Amtsblatt
Nr. Seite Datum
►M1Richtlinie 81/680/EWG der Kommission vom 30. Juli 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Richtlinie 84/4/EWG der Kommission vom 20. Dezember 1983 L 15 28 18.1.1984
►M3Richtlinie 93/28/EWG der Kommission vom 4. Juni 1993 L 179 8 22.7.1993
►M4Richtlinie 98/54/EG der Kommission vom 16. Juli 1998 L 208 49 24.7.1998
Berichtigt durch:
►C1Berichtigung, ABl. L 320 vom 27.11.1980, S. 43 (72/199/EWG)
▼B
DRITTE RICHTLINIE DER KOMMISSION
vom 27. April 1972
zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die
amtliche Untersuchung von Futtermitteln
(72/199/EWG)
DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN —
gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsge-
meinschaft,
gestützt auf die Richtlinie des Rates vom 20. Juli 1970 über die Einfüh-
rung gemeinschaftlicher Probenahmeverfahren und Analysemethodenfür die amtliche Untersuchung von Futtermitteln (
1), insbesondere auf
Artikel 2,
in Erwägung nachstehender Gründe:Die oben genannte Richtlinie bestimmt, daß die amtlichen Untersu-
chungen von Futtermitteln zur Feststellung, ob die auf Grund derRechts- oder Verwaltungsvorschriften festgelegten Anforderungenhinsichtlich Beschaffenheit und Zusammensetzung der Futtermittelerfüllt sind, nach gemeinschaftlichen Probenahmeverfahren und Analy-
semethoden durchgeführt werden.
Die Richtlinien Nr. 71/250/EWG und Nr. 71/393/EWG der Kommis-
sion vom 15. Juni 1971 (
2) und vom 18. November 1971 (3) haben
bereits eine Reihe von Analysemethoden festgelegt. Nach dem Stand
der seitdem durchgeführten Arbeiten ist es nunmehr geboten, eine dritteSerie von Analysemethoden festzulegen.
Die in dieser Richtlinie vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der
Stellungnahme des Ständigen Futtermittelausschusses —
HAT FOLGENDE RICHTLINIE ERLASSEN:
Artikel 1
Die Mitgliedstaaten schreiben vor, daß die Analysen für die amtliche
Untersuchung von Futtermitteln auf ihren Gehalt an Stärke, Rohprotein,durch Pepsin und Salzsäure lösbarem Rohprotein und an freiem undGesamtgossypol sowie auf die Pepsinaktivität nach den in Anlage I zu
dieser Richtlinie beschriebenen Methoden durchgeführt werden.
Artikel 2
Die Mitgliedstaaten schreiben vor, daß die Analysen für die amtliche
Untersuchung von Futtermitteln ►M4 ◄auf den Gehalt
der Futtermittel an ►M4 ◄Tylosin und Virginiamycin
nach den in Anlage II zu dieser Richtlinie beschriebenen Methodendurchgeführt werden.
Artikel 3
Die Mitgliedstaaten setzen spätestens zum 1. Juli 1973 die erforderli-
chen Rechts- oder Verwaltungsvorschriften in Kraft, um denBestimmungen dieser Richtlinie nachzukommen. Sie setzen dieKommission unverzüglich hiervon in Kenntnis.1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 2
(1) ABl. Nr. L 170 vom 3. 8. 1970, S. 2.
(2) ABl. Nr. L 155 vom 12. 7. 1971, S. 13.
(3) ABl. Nr. L 279 vom 20. 12. 1971, S. 7.▼M1
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Artikel 4
Diese Richtlinie ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet.1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 3
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ANLAGE I
1.BESTIMMUNG VON STÄRKE
— Polarimetrische Methode —
1.Zweck und Anwendungsbereich
Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehaltes an Stärke und ihrer
Abbauprodukte mit hohem Molekulargewicht in Futtermitteln, mit Ausnahme
derjenigen, die Schnitzel und Diffusionsschnitzel von Rüben, getrocknete
Rübenblätter und Köpfe, Kartoffelpülpe, Trockenhefe, inulinhaltige Erzeug-
nisse (z.B. Topinamburschnitzel und -mehl) oder Grieben enthalten.
2.Prinzip
Die Methode basiert auf einer doppelten Bestimmung. Bei der ersten Bestim-
mung wird die Probe mit verdünnter Salzsäure heiß behandelt. Nach Klärung
und Filtration wird die optische Drehung der Lösung polarimetrisch
gemessen.
Bei der zweiten Bestimmung wird die Probe mit Äthanol 40 v.H. extrahiert.
Nach Behandlung des Filtrats mit Salzsäure wird geklärt, filtriert und die
optische Drehung unter den gleichen Bedingungen wie bei der ersten Bestim-
mung gemessen.
Der Unterschied zwischen den beiden Messungen, multipliziert mit einem
bekannten Faktor, ergibt den Stärkegehalt der Probe.
3.Reagenzien
3.1 Salzsäure 25 v.H. (G/G), D: 1,126
3.2 Salzsäure 1,128 v.H. (G/V)
Die Konzentration muß durch Titration mit 0,1 N Natriumhydroxidlö-
sung in Gegenwart von Methylrot 0,1 v.H. (G/V) in Äthanol 94 v.H.
(V/V) geprüft werden. 10 ml = 30,94 ml 0,1 N NaOH.
3.3 Carrez-Lösung I: 21,9 g Zinkazetat Zn (CH3COO)2·2H2O und 3 g
Eisessig werden in Wasser gelöst und auf 100 ml mit Wasser aufgefüllt.
3.4 Carrez-Lösung II: 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat (II), K4[Fe(CN)6]
·3H2O werden in Wasser gelöst und auf 100 ml mit Wasser aufgefüllt.
3.5 Äthanol 40 v.H. (V/V), D: 0,948 bei 20º C.
4.Geräte
4.1 250-ml-Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen und Rückflußkühler
4.2 Polarimeter oder Saccharimeter
5.Ausführung
5.1Vorbereitung der Probe
Die Probe muß so fein gemahlen werden, daß sie vollständig durch ein
Rundlochsieb von 0,5 mm Lochdurchmesser hindurchgeht.
5.2Bestimmung der gesamten optischen Drehung (P oder S) (s. Bemerkung
7.1)
2,5 g der Probe werden auf 1 mg genau in einen 100-ml-Meßkolben
eingewogen und 25 ml Salzsäure (3.2) hinzugefügt. Der Kolben wird
geschüttelt, bis sich die Substanz gut verteilt hat; dann werden weitere
25 ml Salzsäure (3.2) hinzugegeben. Schließlich wird der Kolben in ein
Bad mit kochendem Wasser gestellt und während der ersten 3 Minuten
kräftig und regelmäßig umgeschüttelt, um die Bildung von Klumpen zu
verhindern. Die in dem Wasserbad enthaltene Wassermenge muß ausrei-
chen, um das Wasser auch dann noch im Sieden zu erhalten, wenn der
Kolben eingetaucht wird. Während des Schüttelns darf der Kolben nicht
aus dem Wasser herausgenommen werden. Nach genau 15 Minuten wird
der Kolben aus dem Wasserbad entfernt, 30 ml kaltes Wasser hinzuge-
fügt und unverzüglich bis auf 20º C abgekühlt.
Es werden 5 ml Carrez-Lösung I (3.3) hinzugefügt und 1 Minute
geschüttelt; anschließend werden 5 ml Carrez-Lösung II (3.4) hinzuge-
fügt und es wird nochmals 1 Minute geschüttelt. Dann wird zur Marke1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 4
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mit Wasser aufgefüllt, umgeschüttelt und filtriert. Wenn das Filtrat nicht
vollständig klar ist, was selten vorkommt, muß die Bestimmung mit
größeren Mengen Carrez-Lösungen I und II, z.B. 10 ml, wiederholt
werden.
Anschließend wird die optische Drehung der Lösung in einem 200-mm-
Rohr mit einem Polarimeter oder einem Saccharimeter gemessen.
5.3Bestimmung der optischen Drehung (P ′oder S ′) der in Äthanol 40 v.H.
löslichen Substanzen
5 g der Probe werden auf 1 mg genau in einen 100-ml-Meßkolben einge-
wogen und etwa 80 ml Äthanol (3.5) hinzugefügt (s. Bemerkung 7.2).
Anschließend wird der Kolben 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehen
gelassen und währenddessen sechsmal kräftig geschüttelt, damit sich die
Substanz gut mit dem Äthanol vermischt. Es wird mit Äthanol (3.5) zur
Marke aufgefüllt, umgeschüttelt und filtriert.
50 ml des Filtrats (= 2,5 g der Probe) werden in einen 250-ml-Erlen-
meyerkolben abpipettiert und 2,1 ml Salzsäure (3.1) hinzugefügt; der
Kolben wird kräftig geschüttelt, an einen Rückflußkühler angeschlossen
und in ein Bad mit siedendem Wasser gesetzt. Nach genau 15 Minuten
wird der Erlenmeyerkolben aus dem Wasserbad herausgenommen und
der Inhalt in einen 100-ml-Meßkolben mit einer kleinen Menge von
kaltem Wasser überspült; anschließend wird auf eine Temperatur von
20º C abgekühlt.
Darauf wird mit den Carrez-Lösungen I (3.3) und II (3.4) geklärt, mit
Wasser zur Marke aufgefüllt, umgeschüttelt und filtriert und die optische
Drehung gemessen, wie unter 5.2 zweiter und dritter Absatz beschrieben.
6.Berechnung der Ergebnisse
Der Gehalt an Stärke in Hundertteilen der Probe wird wie folgt berechnet:
6.1Polarimetrische Messungen
St¨arke /C0Prozent ¼2000 P /C0P0ðÞ
α½/C13820º
D
P = Gesamte optische Drehung in Kreisgraden.
Optische Drehung in Kreisgraden der in Äthanol 40 v.H.
löslichen Substanzen.
α½/C13820º
D= Spezifisches Drehungsvermögen der reinen Stärke.
Für diesen Faktor werden die nachstehenden Werte verein-
barungsgemäß angewendet:
+ 185,9º: Reisstärke,
+ 185,4º: Kartoffelstärke,
+ 184,6º: Maisstärke,
+ 182,7º: Weizenstärke,+ 181,5º: Gerstenstärke,+ 181,3º: Haferstärke,+ 184,0º: übrige Stärkearten sowie Stärkegemische bei
Mischfuttermitteln.
6.2Saccharimetrische Messungen
St¨arke /C0Prozent ¼
2000
α½/C13820º
D/C12N/C10;665 ðÞ S/C0S0ðÞ
100¼26;6N S /C0S0ðÞ
α½/C13820º
D
S = Gesamte optische Drehung in Saccharimeter-Graden.
S′= Optische Drehung in Saccharimeter-Graden der in Äthanol
40 v.H. löslichen Substanzen.
N = Gewicht an Saccharose in g, das in 100 ml Wasser bei einer
Schichtdicke von 200 mm eine optische Drehung von 100
Saccharimeter-Grad ergibt. Dieses Gewicht variiert wie folgt
nach Typ des Saccharimeters:
16,29 g bei den französischen Saccharimetern,1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 5
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26,00 g bei den deutschen Saccharimetern,
20,00 g bei den gemischten Saccharimetern,
α½/C13820º
D= Spezifisches Drehungsvermögen der reinen Stärke
(s. 6.1).
6.3Wiederholbarkeit
Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und
derselben Probe bei Gehalten von weniger als 40 v.H. Stärke 0,4 v.H.absolut, bei Gehalten von 40 v.H. und mehr 1 v.H. relativ nicht über-
schreiten.
7.Bemerkungen
7.1 Enthält die Probe mehr als 6 v.H. Carbonate, berechnet als Calciumcar-
bonat, so müssen diese vor der Bestimmung der gesamten optischen
Drehung durch Behandlung mit einer gerade notwendigen Menge
verdünnter Schwefelsäure zerstört werden.
7.2 Bei Erzeugnissen mit hohem Laktosegehalt, z.B. bei Molkenpulver,
Magermilchpulver, wird nach Zusatz von 80 ml Äthanol (3.5) wie folgt
verfahren:
Der Meßkolben wird mit einem Rückflußkühler versehen und während
30 Minuten in ein Wasserbad von 50º C getaucht. Nach Abkühlen wird
das Verfahren wie unter 5.3 beschrieben fortgeführt.
2.BESTIMMUNG VON ROHPROTEIN
1.Zweck und Anwendungsbereich
Diese Methode dient der Bestimmung des Rohproteingehalts von Futtermit-
teln anhand des nach Kjeldahl ermittelten Stickstoffgehalts.
2.Prinzip
Die Probe wird mit Schwefelsäure in Anwesenheit eines Katalysators aufge-
schlossen. Die saure Lösung wird mit Natronlauge alkalisiert. Das
freigesetzte Ammoniak wird in eine Vorlage überdestilliert, die eine
bestimmte Menge Schwefelsäure enthält, deren Überschuß mit einer Natron-
lauge-Standardlösung titriert wird.
3.Reagenzien
3.1 Kaliumsulfat.3.2 Katalysator: Kupfer(II)-oxid CuO oder Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat
CuSO
4·5 H2O.
3.3 Zink, gekörnt.3.4 Schwefelsäure, ρ
20= 1,84 g/ml.
3.5 Schwefelsäure, c (1/2 H2SO4) = 0,5 mol/l.
3.6 Schwefelsäure, c (1/2 H2SO4) = 0,1 mol/l.
3.7 Methylrot-Indikator: 300 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol ( σ
= 95 — 96 %) gelöst.
3.8 Natronlauge β= 40 g/100 ml (m/V: 40 %).
3.9 Natronlauge c = 0,25 mol/l.3.10 Natronlauge c = 0,1 mol/l.3.11 Bimsstein gekörnt, mit Salzsäure gewaschen und geglüht.3.12 Acetanilid (Schmp. = 114 ºC, N = 10,36 %).3.13 Saccharose (stickstofffrei).
4.Geräte
Aufschluß-, Destillations- und Titrationsapparat nach Kjeldahl.1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 6
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5.Ausführung
5.1Aufschluß
1 g der Probe wird auf 0,001 g genau eingewogen und in den Kolben des
Aufschlußapparats überführt. Es werden 15 g Kaliumsulfat (3.1), eine
geeignete Menge Katalysator (3.2) (0,3 bis 0,4 g Kupfer(II)-oxid oder
0,9 bis 1,2 g Kupfersulfat), 25 ml Schwefelsäure (3.4) und einige Bims-
steinkörnchen (3.11) zugesetzt, und der Kolbeninhalt wird gemischt. Der
Kolben wird, wenn notwendig, unter regelmäßigem Schwenken zunächst
mäßig erhitzt, bis die Substanz verkohlt ist und das Schäumen aufgehört
hat; sodann wird die Flüssigkeit stärker erhitzt und gleichmäßig am
Sieden gehalten. Bei korrekter Erhitzung kondensiert die siedende Säure
auf der Kolbenwand. Ein Überhitzen der Kolbenwände und Ansetzen
organischer Partikel ist zu vermeiden. Sobald die Lösung klar ist und
sich hellgrün färbt, wird sie noch weitere 2 Stunden am Sieden gehalten
und danach abkühlen gelassen.
5.2Destillation
Es wird vorsichtig soviel Wasser zugegeben, daß die Sulfate vollständig
gelöst werden. Man läßt abkühlen; sodann werden einige Zinkkörnchen
(3.3) zugesetzt.
In den Auffangkolben des Destillationsapparates werden je nach dem zu
erwartenden Stickstoffgehalt genau 25 ml Schwefelsäure (3.5 oder 3.6)
gebracht und einige Tropfen Methylrot-Indikator (3.7) hinzugefügt.
Der Aufschlußkolben wird mit dem Kühler des Destillationsapparats
verbunden und das Ende des Kühlers mindestens 1 cm tief in die Flüs-
sigkeit des Auffangkolbens gesenkt (siehe Bemerkung 8.3). Dann werden
100 ml Natronlauge (3.8) langsam in den Aufschlußkolben eingefüllt,
wobei kein Ammoniak entweichen darf (siehe Bemerkung 8.1).
Der Kolben wird solange erhitzt bis alles Ammoniak überdestilliert ist.
5.3Titration
Der Schwefelsäureüberschuß im Auffangkolben wird je nach Konzentra-
tion der verwendeten Schwefelsäure mit Natronlauge (3.9 oder 3.10) bis
zum Endpunkt titriert.
5.4Blindversuch
Zur Feststellung, ob die Reagenzien stickstofffrei sind, wird ein Blind-
versuch (Aufschluß, Destillation und Titration) mit 1 g Saccharose
(3.13) anstelle der Probe durchgeführt.
6.Berechnung der Ergebnisse
Der Rohproteingehalt errechnet sich nach folgender Formel:
V0/C0V1 ðÞ /C2 c/C20;014/C2100/C26;25
m
Hierin bedeuten:
V0= Volumen (ml) der bei der Titration des Blindversuchs (5.4)
verbrauchten Natronlauge (3.9 oder 3.10).
V1= Volumen (ml) der bei der Titration (5.3) verbrauchten Natronlauge
(3.9 oder 3.10).
c = Konzentration (mol/l) der Natronlauge (3.9 oder 3.10).
m = Masse der Probe in Gramm.
7.Zuverlässigkeit der Methode
7.1Wiederholbarkeit
Der Unterschied der Ergebnisse von zwei Parallelbestimmungen darf bei
ein und derselben Probe folgende Werte nicht überschreiten:
— 0,2 % absolut bei Gehalten von weniger als 20 % Rohprotein,
— 1,0 % relativ vom höheren Ergebnis bei Gehalten von 20 % bis 40 %
Rohprotein,
— 0,4 % absolut bei Gehalten von mehr als 40 % Rohprotein.1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 7
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7.2Richtigkeit
Die Analyse (Aufschluß, Destillation und Titration) wird mit 1,5 bis 2,0 g
Acetanilid (3.12) in Gegenwart von 1 g Saccharose (3.13) durchgeführt;
1 g Acetanilid verbraucht 14,80 ml Schwefelsäure (3.5). Die Wiederfin-
dung muß mindestens 99 % betragen.
8.Bemerkungen
8.1 Es können manuelle, halbautomatische oder automatische Geräte
verwendet werden. Bei Geräten, die ein Umfüllen zwischen Aufschluß
und Destillation erfordern, ist darauf zu achten, daß dies verlustlos
geschieht. Verfügt der Destillationsapparat nicht über einen Tropftrichter,
so erfolgt die Zugabe der Natronlauge unmittelbar vor dem Anschließen
des Kolbens an den Kühler; die Flüssigkeit ist in diesem Fall langsam an
den Kolbenwänden entlanglaufen zu lassen.
8.2 Kommt es während des Aufschlusses zur Verfestigung der Mischung, ist
mit der Bestimmung von vorn zu beginnen und eine größere als die
obengenannte Menge an Schwefelsäure (3.4) zu verwenden.
8.3 Bei stickstoffarmen Proben kann die in den Auffangkolben einzufüllende
Menge Schwefelsäure (3.6) gegebenenfalls auf 10 oder 15 ml verringert
und mit Wasser auf 25 ml aufgefüllt werden.
3.BESTIMMUNG DES DURCH PEPSIN UND SALZSÄURE LÖSBAREN
ROHPROTEINS
1.Zweck und Anwendungsbereich
Die Methode erlaubt die Bestimmung des durch Pepsin und Salzsäure
lösbaren Rohproteins unter definierten Bedingungen. Sie gilt für alle Futter-
mittel.
2.Prinzip
Die Probe wird 48 Stunden lang bei 40º C mit einer Pepsin-Salzsäure-Lösung
behandelt. Die Suspension wird filtriert und der Stickstoffgehalt des Filtrats
nach der für die Bestimmung von Rohprotein beschriebenen Methodebestimmt.
3.Reagenzien
3.1 Salzsäure, D: 1,1253.2 0,075 N Salzsäure3.3 Pepsin 2.0 E/mg. Die Aktivität ist definiert in der Vorschrift des Teils 4
dieser Anlage und hiernach zu kontrollieren.
3.4 Pepsinlösung ca. 0,02 v.H. (G/V) in Salzsäure (3.2), frisch zubereitet.
Aktivität 400 E/l
3.5 Antischaumemulsion (z.B. Silikon)3.6 Sämtliche unter Punkt 3 der Methode zur Bestimmung von Rohproteinen
aufgeführte Reagenzien
4.Geräte
4.1 Wasserbad oder Brutschrank, auf 40º C ± 1º C eingestellt4.2 Apparatur zum Aufschluß und zur Destillation nach Kjeldahl
5.Ausführung
5.1Lösen des Rohproteins (s. Bemerkung 7.2)
2 g der Probe werden auf 1 mg genau eingewogen und in einen 500-ml-
Meßkolben gebracht. Dann fügt man 450 ml Pepsinlösung (3.4), die
zuvor auf 40º C erwärmt wurden, hinzu und schüttelt um, um Klümp-
chenbildung zu verhindern. Es ist darauf zu achten, daß der pH-Wert
der Suspension unter 1,7 liegt. Der Kolben wird ins Wasserbad oder in
den Brutschrank (4.1) gestellt und dort 48 Stunden belassen. Nach 8, 24
und 32 Stunden ist er zu schütteln. Nach 48 Stunden werden 15 ml Salz-
säure (3.1) zugesetzt, auf 20º C abkühlen gelassen, mit Wasser zur
Marke aufgefüllt und filtriert.1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 8
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5.2Aufschluß
250 ml des Filtrats werden abgenommen und in den Kolben der
Aufschlußapparatur (4.2) gefüllt. Dann werden die zum Aufschluß
benötigten Reagenzien, wie in der Beschreibungder Methode zur Bestim-
mung des Rohproteins unter Punkt 5.1, zweiter Satz, angegeben,
hinzugefügt. Es wird gemischt und bis zum Sieden erhitzt. Falls sich
starker Schaum bildet, werden einige Tropfen Antischaumemulsion
(3.5) zugesetzt. Die Flüssigkeit wird im kräftigen Sieden gehalten, bis
das Wasser fast vollständig verdampft ist. Die letzten Wasserspuren
werden vorsichtig bei verringerter Hitze beseitigt. Wenn die Lösung
klar und farblos (bzw. hellgrün bei Verwendung eines kupferhaltigen
Katalysators) ist, wird das Sieden noch eine Stunde lang fortgesetzt;
dann läßt man abkühlen.
5.3Destillation und Titration
Es ist wie in der Methode zur Bestimmung von Rohproteinen unter 5.2
und 5.3 angegeben zu verfahren.
5.4Blindversuch
Ein Blindversuch wird unter Anwendung desselben Verfahrens ohne
Analysenprobe ausgeführt.
6.Berechnung der Ergebnisse
Das Volumen an Schwefelsäure, das im Blindversuch verbraucht wird, wird
von dem Verbrauch der Analysenprobe abgezogen. 1 ml 0,1 N Schwefelsäure
entspricht 1,4 mg Stickstoff.
Die erhaltene Stickstoffmenge wird mit dem Faktor 6,25 multipliziert. Das
Ergebnis wird in Hundertteilen der Probe ausgedrückt.
Wiederholbarkeit
Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und
derselben Probe
— bei Gehalten von weniger als 20 v.H. lösbarem Rohprotein 0,4 v.H.
absolut,
— bei Gehalten von 20 bis 40 v.H. lösbarem Rohprotein 2 v.H. relativ,
— bei Gehalten von mehr als 40 v.H. lösbarem Rohprotein 0,8 v.H. absolut
nicht überschreiten.
7.Bemerkungen
7.1 Die ermittelten Werte stehen in keinem unmittelbaren Zusammenhang
mit der Verdaulichkeit in vivo.
7.2 Futtermittel, deren Rohfettgehalt 10 v.H. übersteigt, sind durch Extrak-
tion mit Petroläther (Kp 40 — 60º C) zu entfetten.
4.BESTIMMUNG DER PEPSINAKTIVITÄT
1.Zweck und Anwendungsbereich
Die Methode dient zur Kontrolle der Aktivität des Pepsins, das zur Bestim-
mung des durch Pepsin und Salzsäure lösbaren Rohproteins verwendet wird.
2.Prinzip
Hämoglobin wird unter definierten Bedingungen mit Pepsin und verdünnter
Salzsäure behandelt. Der nicht hydrolysierte Anteil der Proteine wird mit
Trichloressigsäure gefällt. Das Filtrat wird mit Natriumhydroxidlösung und
mit Reagenz nach Folin-Ciocalteu versetzt. Die Extinktion dieser Lösung
wird bei 750 nm gemessen und die dieser Extinktion entsprechende Menge
Tyrosin einer Eichkurve entnommen.
Definition: Die Pepsin-Einheit (E) wird definiert als die Enzymmenge, die
unter den Bedingungen der Methode pro Minute soviel Hydroxyaryl-Verbin-
dungen freisetzt, daß deren Färbung mit Folin-Ciocalteu-Reagenz eine
Extinktion ergibt, die derjenigen von 1 µ Mol Tyrosin unter den gleichen
Bedingungen entspricht.
3.Reagenzien
3.1 0,2 N Salzsäure1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 9
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3.2 0,06 N Salzsäure
3.3 0,025 N Salzsäure
3.4 Trichloressigsäurelösung 5 v.H. (G/V)
3.5 0,5 N Natriumhydroxidlösung3.6 Reagenz nach Folin-Ciocalteu: 100 g Natriumwolframat (Na
2WO4·2H2O), 25 g Natriummolybdat (Na2MoO4·2H2O) und 700 ml Wasser
werden in einen 2-l-Rundkolben mit Schliffstopfen gegeben. Man fügt
50 ml Phosphorsäure (D: 1,71) und 100 ml konzentrierte Salzsäure (D:
1,19) hinzu, verbindet den Kolben mit einem Rückflußkühler, erhitzt
zum Sieden und hält die Lösung 10 Stunden lang im gelinden Sieden.
Nach dem Abkühlen entfernt man den Rückflußkühler, gibt 175 g
Lithiumsulfat (Li2SO4·2H2O), 50 ml Wasser und 1 ml Brom hinzu.
Anschließend kocht man 15 Minuten lang zur Entfernung des überschüs-
sigen Broms.
Nach Abkühlen überführt man die Lösung in einen 1-l-Meßkolben, füllt
mit Wasser auf, schüttelt um und filtriert. Das fertige Reagenz darf keine
grünliche Farbe aufweisen. Vor Gebrauch werden 1 Volumenteil
Reagenz mit 2 Volumenteilen Wasser verdünnt.
3.7 Hämoglobinlösung: Eine 354 mg Stickstoff (1) entsprechende Hämoglo-
binmenge (ca. 2 g), Proteasesubstrat nach Anson, wird eingewogen und
in einen 200-ml-Kolben mit Schliffstopfen gebracht. Man gibt einige ml
0,06 N Salzsäure (3.2) hinzu, schließt den Kolben an der Vakuumpumpe
an und schüttelt, bis das Hämoglobin vollständig gelöst ist. Man entfernt
das Vakuum und gibt unter Umschütteln die noch zu 100 ml fehlende
Menge Salzsäure (3.2) hinzu. Vor Gebrauch frisch herzustellen .
3.8 Tyrosin-Standardlösung: 181,2 mg Tyrosin werden in Salzsäure (3.1)
gelöst und zu 1 l mit derselben Säure aufgefüllt (Stammlösung). 20,0 ml
dieser Lösung werden entnommen und mit Salzsäure (3.1) auf 100 ml
verdünnt. 1 ml dieser Lösung enthält 0,2 µ Mol Tyrosin.
4.Geräte
4.1 Ultrathermostat, auf 25º C ± 0,1º C eingestellt
4.2 Spektralphotometer4.3 Chronometer, Genauigkeit: 1 sec.4.4 pH-Meßgerät
5.Ausführung
5.1Herstellung der Lösung (s. Bemerkung 7.1)
150 mg Pepsin werden in 100 ml Salzsäure (3.2) gelöst. Von dieser
Lösung werden 2 ml abpipettiert und in einem 50-ml-Meßkolben mit
Salzsäure (3.3) zur Marke aufgefüllt. Der mit dem pH-Meßgerät kontroll-
ierte pH-Wert sollte 1,6 ± 0,1 betragen. Der Kolben wird in den
Ultrathermostaten (4.1) gebracht.
5.2Hydrolyse
5,0 ml Hämoglobinlösung (3.7) werden in ein Reagenzglas pipettiert und
im Ultrathermostat (4.1) auf 25º C erwärmt. Dann gibt man 1,0 ml der
nach 5.1 erhaltenen Pepsinlösung zu, mischt durch etwa 10maliges Auf-
und Abbewegen eines am Ende verdickten Glasstabes und beläßt das
Reagenzglas, von der Zugabe der Pepsinlösung an gerechnet, genau 10
Minuten lang bei 25º C im Wasserbad (Zeit und Temperatur sind genau
einzuhalten). Nach Ablauf dieser Zeit fügt man 10,0 ml der zuvor auf
25º C gebrachten Trichloressigsäurelösung (3.4) hinzu, schüttelt um und
filtriert durch ein trockenes Filter.
5.3Entwicklung der Färbung und Messung der Extinktion
5,0 ml des Filtrats werden in einen 50-ml-Erlenmeyerkolben pipettiert,
mit 10,0 ml Natriumhydroxidlösung (3.5) versetzt, dann werden unter
stetigem Umschütteln 3,0 ml des verdünnten Reagenz nach Folin-
Ciocalteu (3.6) hinzugefügt. Nach 5 bis 10 Minuten wird die Extinktion1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 10
(1) Der Gehalt an Stickstoff wird nach der Halb-Mikrokjeldahlmethode bestimmt (theoreti-
scher Gehalt: 17,7 % N).
▼B
der Lösung in 1-cm-Küvetten bei 750 nm gegen Wasser photometrisch
bestimmt.
5.4Blindversuch
Zu jeder Bestimmung ist ein Blindversuch wie folgt durchzuführen:
5,0 ml Hämoglobinlösung (3.7) werden in ein Reagenzglas pipettiert und
im Ultrathermostaten (4.1) auf 25º C erwärmt. Dann gibt man 10,0 ml
der zuvor auf 25º C gebrachten Trichloressigsäurelösung (3.4) hinzu,
mischt und fügt anschließend 1,0 ml der nach 5.1 erhaltenen Pepsinlö-
sung hinzu. Man mischt mittels eines Glasstabes und beläßt das
Reagenzglas genau 10 Minuten lang bei 25º C im Wasserbad (4.1). Es
wird umgeschüttelt und filtriert. Dann wird das Verfahren wie unter 5.3
beschrieben fortgeführt.
5.5Eichkurve
In 50-ml-Erlenmeyerkolben werden 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 und 5,0 ml Tyrosin-
standardlösung (3.8) (entsprechend den Tyrosinmengen von 0,2, 0,4, 0,6,
0,8 und 1,0 µ Mol) gegeben. Die Reihe wird durch eine tyrosinfreie
Vergleichsprobe vervollständigt. Die einzelnen Ansätze werden mit Salz-
säure (3.1) auf 5,0 ml ergänzt. Weiter werden 10,0 ml
Natriumhydroxidlösung (3.5) und unter ständigem Schütteln 3,0 ml des
verdünnten Reagenz nach Folin-Ciocalteu (3.6) zugegeben. Die Extink-
tion wird gemäß 5.3, letzter Satz, gemessen. Die Eichkurve wird durch
Auftragen der zugesetzten Mengen Tyrosin gegen die Extinktion festge-
legt.
6.Berechnung der Ergebnisse
Man entnimmt der Eichkurve die Menge an Tyrosin in µ Mol, die der durch
den Blindwert korrigierten Extinktion der gefärbten Lösungen entspricht.
Die Aktivität des Pepsins in µ Mol Tyrosin pro mg und pro Minute bei 25º C
ist nach folgender Formel zu berechnen:
Einheiten pro mg E =mgðÞ ¼0;32 a
p
wobei:
a = aus der Eichkurve entnommene Tyrosinmenge in µ Mol,
p = Gewicht in mg der gemäß 5.2 zugesetzten Pepsinmenge.
7.Bemerkung
7.1 Die aufzulösende Menge an Pepsin ist so zu wählen, daß bei der photo-
metrischen Endmessung eine Extinktion von 0,35 ± 0,035 erreicht wird.
7.2 2 E/mg, bestimmt nach dieser Methode, entsprechen
3,64 m-Anson E/mg (µ Mol Tyrosin/mg · Min. bei 35,5º C) oder36400 handelsüblichen E/g (µ Mol Tyrosin/g · 10 Min. bei 35,5º C).
5.BESTIMMUNG VON FREIEM UND GESAMTGOSSYPOL
1.Zweck und Anwendungsbereich
Die Methode erlaubt die Bestimmung von freiem Gossypol, Gesamtgossypol
und chemisch nahe verwandter Substanzen in Samen, Mehl und Kuchen von
Baumwollsaat sowie in Mischfuttermitteln, die Erzeugnisse aus Baumwoll-
saat enthalten. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 20 ppm.
2.Prinzip
Gossypol wird in Gegenwart von 3-Amino-1-Propanol entweder mit einer
Isopropanol-Hexan-Mischung für die Bestimmung von freiem Gossypol oder
mit Dimethylformamid für die Bestimmung von Gesamtgossypol extrahiert
und mittels Anilin zu Gossypoldianilin umgesetzt, dessen Extinktion bei
440 nm gemessen wird.
3.Reagenzien
3.1 Isopropanol-Hexan-Mischung: 60 Volumenteile Isopropanol p.a. werden
mit 40 Volumenteilen n-Hexan gemischt.
3.2 Lösungsmittel A: In einen 1-l-Meßkolben werden ungefähr 500 ml
Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1), 2 ml 3-Amino-1-Propanol, 8 ml1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 11
▼B
Eisessig und 50 ml Wasser gefüllt und mit Isopropanol-Hexan-Mischung
(3.1) zur Marke aufgefüllt. Dieses Reagenz ist eine Woche lang haltbar.
3.3 Lösungsmittel B: In einen 100-ml-Meßkolben werden 2 ml 3-Amino-1-
Propanol und 10 ml Eisessig abpipettiert, auf Raumtemperatur abgekühlt
und mit N,N-Dimethylformamid zur Marke aufgefüllt. Dieses Reagenz
ist eine Woche lang haltbar.
3.4 Anilin p.a.: Wenn die Extinktion im Blindversuch 0,022 überschreitet , ist
das Anilin über Zinkstaub unter Verwerfung der ersten und letzten
10 v.H. Teile des Destillats zu destillieren. In einem braunen, geschlos-
senen Gefäß ist dieses Reagenz einige Monate im Kühlschrank haltbar.
3.5 Gossypol-Standardlösung A: In einem 250-ml-Meßkolben werden
27,9 mg Gossypol-Acetat mit Lösungsmittel A (3.2) gelöst und dann
damit zur Marke aufgefüllt. 50 ml dieser Lösung werden in einen 250-
ml-Meßkolben pipettiert und mit Lösungsmittel A (3.2) zur Marke aufge-
füllt. Die Konzentration dieser Lösung an Gossypol beträgt 0,02 mg/ml.
Vor Gebrauch läßt man 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehen.
3.6 Gossypol-Standardlösung B: In einem 50-ml-Meßkolben werden 27,9 mg
Gossypol-Acetat in Lösungsmittel B (3.3) gelöst und zur Marke aufge-
füllt. Die Konzentration dieser Lösung an Gossypol beträgt 0,5 mg/ml.
Die Standard-Gossypol-Lösungen sind vor Lichteinwirkung geschützt 24
Stunden lang haltbar.
4.Geräte
4.1 Mechanischer Schüttelapparat: ungefähr 35 U/min.4.2 Spektralphotometer.
5.Ausführung
5.1Einwaage
Die Größe der Einwaage richtet sich nach dem vermuteten Gehalt an
Gossypol in der Probe. Es ist vorteilhaft, mit einer geringen Einwaage
und einem relativ großen aliquoten Teil des Filtrats zu arbeiten, um
genügend Gossypol für eine genaue photometrische Messung zu erhalten.
Für die Bestimmung von freiem Gossypol in Samen, Mehl und Kuchen
von Baumwollsaat soll die Einwaage 1 g nicht überschreiten, während
sie bei Mischfuttermitteln 5 g erreichen kann. Ein aliquoter Teil des
Filtrats von 10 ml ist in den meisten Fällen anwendbar, er soll 50 bis
100 µg Gossypol enthalten. Für die Bestimmung von Gesamtgossypol
soll die Einwaage 0,5 bis 5 g betragen, so daß im aliquoten Teil des
Filtrats von 2 ml 40 bis 200 µg Gossypol enthalten sind.
Die Analyse ist bei einer Raumtemperatur nahe 20º C auszuführen.
5.2Bestimmung von freiem Gossypol
Die Einwaage wird in einen 250-ml-Kolben mit Schliffstopfen, dessen
Boden mit Glassplittern bedeckt ist, übergeführt, 50 ml des Lösungsmit-
tels A (3.2) werden hinzupipettiert, der Kolben wird verschlossen und 1
Stunde lang im Schüttelapparat bewegt. Dann wird durch ein trockenes
Filter filtriert und das Filtrat in einem kleinen Kolben mit Schliffstopfen
aufgefangen. Währen der Filtration wird der Trichter mit einem Uhrglas
bedeckt. Es werden gleich große aliquote Teile des Filtrats, die 50 bis
100 µg Gossypol enthalten, in zwei 25-ml-Meßkolben (A und B) pipet-
tiert, gegebenenfalls wird auf 10 ml mit Lösungsmittel A (3.2) ergänzt.
Dann wird der Inhalt des Kolbens (A) mit der Isopropanol-Hexan-
Mischung (3.1) zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung wird als Vergleichs-
lösung für die Messung der Probelösung verwendet.
Danach werden in zwei andere 25-ml-Meßkolben (C und D) 10 ml
Lösungsmittel A (3.2) pipettiert. Der Inhalt des Kolbens (C) wird mit
der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefüllt. Diese
Lösung wird als Vergleichslösung für die Messung der Blindprobelösung
verwendet.
Zu den Meßkolben (D) und (B) werden je 2 ml Anilin (3.4) hinzugefügt.
Es wird 30 Minuten lang auf einem Bad mit kochendem Wasser zur
Entwicklung der Färbung erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit
der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefüllt, geschüttelt
und 1 Stunde lang stehen gelassen.
Dann werden im Spektralphotometer bei 440 nm und in Glasküvetten
von 1 cm Dicke die Extinktion der Blindprobe (D) im Vergleich mit1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 12
▼B
der Vergleichslösung (C) und die Extinktion der Probelösung (B) im
Vergleich mit der Vergleichslösung (A) gemessen. Die Extinktion der
Blindprobelösung wird von der Extinktion der Probelösung abgezogen
(= korrigierte Extinktion). Aus dem erhaltenen Wert wird der Gehalt an
freiem Gossypol wie unter 6 angegeben berechnet.
5.3Bestimmung von Gesamtgossypol
Eine Einwaage, die 1 bis 5 mg Gossypol enthält, wird in einen 50-ml-
Meßkolben gegeben; dann werden 10 ml des Lösungsmittels B (3.3)
hinzugefügt. Gleichzeitig wird ein Blindversuch mit 10 ml des Lösungs-
mittels B (3.3) in einen anderen 50-ml-Meßkolben vorbereitet. Beide
Meßkolben werden 30 Minuten lang auf einem Bad mit kochendem
Wasser erhitzt, bei Raumtemperatur abkühlen gelassen und mit der
Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefüllt. Es wird
geschüttelt, 10 bis 15 Minuten stehen gelassen, dann filtriert und das
Filtrat in Kolben mit Schliffstopfen aufgefangen.
Es werden je 2 ml des Filtrats der Probe in zwei 25-ml-Meßkolben und
je 2 ml des Filtrats des Blindversuchs in zwei andere 25-ml-Meßkolben
pipettiert. Je ein Kolben jeder Serie wird auf 25 ml mit der Isopropanol-
Hexan-Mischung (3.1) aufgefüllt. Diese Lösungen werden als
Vergleichslösungen verwendet.
Zu den beiden anderen Meßkolben werden je 2 ml Anilin (3.4) hinzuge-
fügt. Dann wird 30 Minuten lang auf einem Bad mit kochendem Wasser
zur Entwicklung der Färbung erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, auf
25 ml mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) aufgefüllt, geschüttelt
und 1 Stunde lang stehen gelassen.
Die Extinktionen werden wie unter 5.2 für freies Gossypol angegeben
gemessen. Aus dem ermittelten Wert wird der Gehalt an Gesamtgosspyol
wie unter 6 angegeben berechnet.
6.Berechnung der Ergebnisse
Die Berechnung der Ergebnisse kann aus der spezifischen Extinktion (6.1)
oder unter Benutzung einer Eichkurve (6.2) vorgenommen werden.
6.1Aus der spezifischen Extinktion
Die spezifische Extinktion beträgt unter den angegebenen Bedingungen
für
freies Gossypol E1%
1c m¼625
Gesamtgossypol E1%
1c m¼600
Der Gehalt an freiem oder Gesamtgossypol der Probe beträgt:
E/C11250
E1%
1c m/C1p/C1a¼v:H:Gossypol
wobei:
E = korrigierte Extinktion, wie unter 5.2 bestimmt,
p = Einwaage in g,a = aliquoter Teil des Filtrats in ml.
6.2Mit Hilfe einer Eichkurve
6.2.1Freies Gossypol
Es werden 2 Reihen von je fünf 25-ml-Meßkolben vorbereitet. In
beide Reihen werden 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 und 10,0 ml der Gossypol-
Standardlösung A (3.5) pipettiert und das Volumen auf 10 ml mit
dem Lösungsmittel A (3.2) ergänzt. Jeder Reihe wird ein 25-ml-
Meßkolben beigegeben, der nur 10 ml des Lösungsmittels A (3.2)
enthält (Blindversuch). Die Kolben der ersten Reihe einschließlich
des Blindversuchs werden mit der Isopropanol-Hexan-Mischung
(3.1) auf 25 ml aufgefüllt (Vergleichsreihe).
Zu den Kolben der zweiten Reihe, einschließlich des Blindver-
suchs, werden je 2 ml Anilin (3.4) hinzugefügt. Dann wird 30
Minuten lang auf einem Bad mit kochendem Wasser zur Entwick-
lung der Färbung erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, zur1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 13
▼B
Marke mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) aufgefüllt,
geschüttelt und 1 Stunde lang stehen gelassen (Standardreihe).
Unter den unter 5.2 angegebenen Bedingungen wird die Extinktion
der Standardreihelösungen durch Vergleich mit den entspre-
chenden Lösungen der Vergleichsreihe gemessen. Die Eichkurve
wird graphisch dargestellt, indem die Extinktionswerte und Gossy-
polmengen (in µg) gegeneinander eingetragen werden.
6.2.2Gesamtgossypol
Es werden sechs 50-ml-Meßkolben vorbereitet. In den ersten
werden 10 ml des Lösungsmittels B (3.3) und in die übrigen je
2,0, 4,0, 6,0, 8,0 und 10,0 ml der Gossypolstandardlösung B (3.6)
pipettiert. Der Inhalt jedes Kolbens wird auf 10 ml mit dem
Lösungsmittel B (3.3) ergänzt, 30 Minuten lang auf einem Bad
mit kochendem Wasser erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt,
mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefüllt
und geschüttelt.
In zwei Reihen von sechs 25-ml-Meßkolben werden je 2,0 ml
dieser Lösung pipettiert. Die Kolben der ersten Reihe werden mit
der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) auf 25 ml aufgefüllt
(Vergleichsreihe).
In die Kolben der zweiten Reihe werden je 2 ml Anilin (3.4)
hinzugefügt. Dann werden sie 30 Minuten lang auf einem Bad
mit kochendem Wasser erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt,
mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefüllt,
geschüttelt und 1 Stunde lang stehen gelassen (Standardreihe).
Unter den unter 5.2 angegebenen Bedingungen wird die Extinktion
der Standardreihelösungen durch Vergleich mit den entspre-
chenden Lösungen der Vergleichsreihe gemessen. Die Eichkurve
wird graphisch dargestellt, indem die Extinktionswerte und Gossy-
polmengen (in µg) gegeneinander eingetragen werden.
6.3Wiederholbarkeit
Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und
derselben Probe bei Gehalten von
weniger als 500 ppm Gossypol 15 v.H. relativ,— 500 bis 750 ppm Gossypol 75 ppm absolut,
— 750 und mehr ppm Gossypol 10 v.H. relativ
nicht überschreiten.1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 14
▼B
ANLAGE II
4.BESTIMMUNG VON TYLOSIN
— durch Diffusion in Agarnährboden —
1.Zweck und Anwendungsbereich
Die Methode erlaubt die Bestimmung von Tylosin in Futtermitteln, Konzen-
trationen und Vormischungen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt
2 ppm.
2.Prinzip
Die Probe wird mit einer auf 80º C erwärmten Phosphatpufferlösung pH 8
behandelt und danach mit Methanol extrahiert. Nach Zentrifugieren wird der
Extrakt verdünnt und seine antibiotische Aktivität durch Messung der Diffu-
sion des Tylosins in einen mit Sarcina lutea beimpften Agarnährboden
bestimmt. Die Diffusion wird durch die entstehenden Hemmzonen mit dem
Testorganismus nachgewiesen. Der Durchmesser dieser Hemmzonen ist dem
Logarithmus der Konzentration direkt proportional.
3.Testorganismus: Sarcina lutea ATCC Nr. 9341
3.1Haltung der Stammkultur
Ein Agarschrägröhrchen aus dem Nährboden (4.1), auf pH 7,0 einge-
stellt, wird mit Sarcina lutea beimpft und über Nacht bei etwa 35º C
bebrütet. Danach wird die Kultur im Kühlschrank aufbewahrt und monat-
lich in Agarschrägröhrchen überimpft.
3.2Herstellung der Keimsuspension
Ein Agarschrägröhrchen (3.1) wird mit 2 bis 3 ml steriler, frisch herge-
stellter Kochsalzlösung (4.4) aufgenommen. Mit dieser Suspension wird
eine Rouxflasche, die 250 ml des Nährbodens (4.1) auf pH 7,0 enthält,
beimpft. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei 35º C werden
die Keime mit 25 ml physiologischer Kochsalzlösung (4.4) aufgen-
ommen und homogenisiert. Diese Suspension wird verdünnt, um eine
Lichtdurchlässigkeit bei 650 nm von etwa 75 v.H. zu erhalten. Diese
Suspension kann während einer Woche verwendet werden, wenn sie im
Kühlschrank aufbewahrt wird.
Durch Versuchsplatten mit dem Testnährboden (4.1) wird die Impfmenge
ermittelt, die möglichst große, aber noch scharfe Hemmzonen mit den
verschiedenen verwendeten Konzentrationen an Tylosin ergibt. Die
Beimpfung des Nährbodens muß zwischen 48 und 50º C erfolgen.
4.Nährboden und Reagenzien
4.1Testnährboden (1)
Glukose 1 g
Pepton, tryptisch verdaut 10 g
Fleischextrakt 1,5 g
Hefeextrakt 3 gAgar je nach Qualität 10 bis 20 g
Destilliertes Wasser ad 1000 ml
Für die Haltung der Stammkultur und Herstellung der Keimsuspension
auf pH 7,0. für die Bestimmung auf pH 8,0 einstellen.
4.2Phosphatpuffer, pH 8
Monokaliumphosphat KH
2PO4p.a. 0,523 g1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 15
(1) Jeder handelsübliche Nährboden entsprechender Zusammensetzung, der dieselben Erge-
bnisse erbringt, kann verwendet werden.▼M4
▼B
▼B
Dikaliumphosphat K2HPO4p.a. 16,730 g
Destilliertes Wasser ad 1000 ml
4.3Phosphatpuffer, pH 7
Monokaliumphosphat KH2PO4p.a. 5,5 g
Dikaliumphosphat K2HPO4p.a. 13,6 g
Destilliertes Wasser ad 1000 ml
4.4 Physiologische Kochsalzlösung, steril
4.5 Methanol, rein4.6 Methanol 40 v.H. (V/V)4.7 Gemisch von Phosphatpuffer (4.2) und Methanol, rein: 60/40 in Vol.4.8 Standardsubstanz: Tylosin von bekannter Aktivität.
5.Standardlösungen
Die Standardsubstanz (4.8) wird 3 Stunden lang bei 60º C im Vakuumtrok-
kenschrank bei 5 mm Quecksilber getrocknet. Eine Einwaage von 10 bis
50 mg wird mit 5 ml Methanol (4.5) in einem Meßkolben gelöst und dann
mit Phosphatpuffer pH 7 (4.3) verdünnt, um eine Konzentration an Tylosin-
base von 1000 µg/ml zu erhalten.
Aus dieser Stammlösung wird durch Verdünnung mit dem Gemisch (4.7)
eine Arbeitsstandardlösung S
8hergestellt, die 2 µg Tylosinbase/ml enthält.
Dann werden die nachstehenden Konzentrationen mit dem Gemisch (4.7)
durch aufeinanderfolgende Verdünnungen (1 + 1) hergestellt:
S41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Extraktion
Bei Konzentraten werden 10 g eingewogen, bei Vormischungen und Misch-
futtermitteln 20 g. Die Einwaage wird mit 60 ml auf 80º C erwärmtem
Phosphatpuffer pH 8 (4.2) versetzt und während 2 Minuten homogenisiert
(Küchenmaschine, Ultra-Turrax etc.).
Danach läßt man 10 Minuten stehen, versetzt mit 40 ml Methanol (4.5) und
homogenisiert erneut während 5 Minuten. Der Extrakt wird zentrifugiert und
ein aliquoter Teil mit dem Gemisch (4.7) verdünnt, um eine vermutete
Konzentration an Tylosin von 2 µg/ml (= U8) zu erhalten. Anschließend
werden die Konzentrationen U4,U2und U1mit dem Gemisch (4.7) durch
aufeinanderfolgende Verdünnungen (1 + 1) hergestellt.
Bei Gehalten unter 10 ppm wird der Extrakt bei 35º C zur Trockne auf einem
Rotationsverdampfer eingeengt und mit Methanol 40 v.H. (4.6) aufgen-
ommen.
7.Testverfahren
7.1Beimpfung desNährbodens
Der auf pH 8,0 eingestellte Testnährboden (4.1) wird mit der Keimsu-
spension (3.2) bei 48 bis 50º C beimpft.
7.2Herstellung der Platten
Der Test ist als Diffusionstest auf Platten mit je 4 Konzentrationsstufen
der Standardlösung (S8,S4,S2,S1) und des Extrakts (U8,U4,U2,U1) ange-
legt. Jede Platte erhält unbedingt alle 4 Konzentrationen des Standards
und der Probe.
Daher muß die Plattengröße so bemessen sein, daß mindestens 8 Löcher
in der Nährbodenschicht ausgestanzt werden können. Der Lochdurch-
messer beträgt 10 bis 13 mm. Die beimpfte Nährbodenmenge (7.1) soll
so berechnet sein, daß man eine gleichmäßige Schicht von ca. 2 mm
Höhe erhält. Der Test sollte vorzugsweise auf Platten durchgeführt1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 16
▼B
werden, die aus einer Glasscheibe mit einem darauf gelegten plange-
drehten Aluminium- oder Kunststoffring von 20 mm Höhe und 200 mm
Durchmesser hergestellt werden.
In die Löcher werden mit der Pipette genau abgemessene Mengen der
Antibiotikalösung, zwischen 0,10 und 0,15 ml je nach Durchmesser der
Löcher, gefüllt.
Für jede Probe muß mindestens jede Konzentration in 4facher Wiederho-
lung eingefüllt werden, so daß pro Ansatz für jede Probe 32 Hemmzonen
ausgewertet werden.
7.3Inkubation
Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 35 bis 37º C.
8.Auswertung
Der Durchmesser der Hemmzonen wird vorzugsweise durch Projektion
gemessen. Die Messungen werden auf Semilogarithmenpapier aufgetragen,
wobei der Logarithmus der Konzentration gegen den Durchmesser der
Hemmzonen angetragen wird. Für den Standard sowie für den Extrakt
werden die Geraden gezogen. In einem störungsfreien Test müssen die
beiden Geraden parallel sein.
Der Logarithmus der relativen Aktivität wird durch folgende Formel rein
rechnerisch ermittelt:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Tatsächliche Aktivität = angenommene Aktivität × relative Aktivität.
9.Wiederholbarkeit
Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und
derselben Probe 10 v.H. relativ nicht überschreiten.
5.BESTIMMUNG VON VIRGINIAMYCIN
— durch Diffusion in Agarnährboden —
1.Zweck und Anwendungsbereich
Die Methode dient zur Bestimmung von Virginiamycin in Futtermitteln und
Vormischungen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 2 mg/kg
(2 ppm) (1).
2.Prinzip
Die Probe wird mit einer methanolischen Tween-80-Lösung extrahiert. Der
Extrakt wird dekantiert oder zentrifugiert und verdünnt. Seine antibiotische
Aktivität wird durch Messung der Diffusion des Virginiamycin in einem mit
Micrococcusluteus beimpften Agarnährboden bestimmt. Die Diffusion wird
durch die entstehenden Hemmzonen des Testorganismus nachgewiesen. Der
Durchmesser dieser Hemmzonen wird für den Bereich der angewandten
Konzentrationen als dem Logarithmus der Konzentration an Antibiotikum
direkt proportional angesehen.
3.Testorganismus: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB
8553)
3.1.Haltung der Stammkultur
Agarschrägröhrchen mit Kulturnährboden (4.1) werden mit Micrococcus
luteusbeimpft und 24 Stunden lang bei 30 ºC bebrütet. Die Kultur wird
im Kühlschrank bei etwa 4 ºC aufbewahrt und alle zwei Wochen neu
überimpft.1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 17
(1) 1 mg Virginiamycin entspricht 1 000 „UK“-Einheiten.▼M2
▼M2
3.2.Herstellung der Bakteriensuspension (a)
Eine junge Kultur auf Agarschrägröhrchen (3.1) wird mit 2 bis 3 ml
Natriumchloridlösung (4.3) abgewaschen. Mit dieser Suspension wird
eine Rouxflasche, die 250 ml des Nährbodens (4.1) enthält, beimpft
und 18-20 Stunden lang bei 30 ºC bebrütet. Die Kultur wird in 25 ml
Natriumchloridlösung (4.3) aufgenommen und gemischt. Die Suspension
wird 1: 10 mit Natriumchloridlösung 4.3) verdünnt. Die Lichtdurch-
lässigkeit der Suspension soll bei 650 nm und 1 cm Schichtdichte
gegen Natriumchloridlösung (4.3) bei 75 v. H. liegen. Diese Suspension
kann eine Woche lang bei ungefähr 4 ºC aufbewahrt werden.
4.Nährboden und Reagenzien
4.1Kultur- und Testnährboden (b)
Fleischpepton 6,0 g,
Caseinpepton 4,0 g,
Hefeextrakt 3,0 g,
Fleischextrakt 1,5 g,
Glukose 1,0 g,
Agar 10,0 bis 20,0 g,
Wasser 1000 ml,
pH 6,5 (nach Sterilisation)
4.2.Phosphatpuffer, pH 6
Di-Kaliumhydrogenphosphat, K2HPO42,0 g,
Kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO48,0 g,
Wasser 1000 ml.
4.3. Natriumchloridlösung 0,8 v. H. (G/V): 8 g Natriumchlorid werden in
Wasser aufgelöst, auf 1000 ml verdünnt und sterilisiert.
4.4. Methanol.
4.5. Mischung des Phosphatpuffers (4.2)/Methanol (4.4): 80/20 (V/V).4.6. Methanolische Tween-80-Lösung 0,5 v. H. (G/V): 5 g Tween 80 werden
in Methanol (4.4) aufgelöst und auf 1 000 ml mit Methanol verdünnt.
4.7. Standardsubstanz: Virginiamycin mit bekannter Aktivität.
5.Standardlösungen
Eine genau abgewogene Menge der Standardsubstanz (4.7) wird in Methanol
(4.4) gelöst und verdünnt um eine Stammlösung zu erhalten, die 1000 µg
Virginiamycin je ml enthält.
In verschlossener Flasche bei 4 ºC aufbewahrt hält sich diese Lösung 5 Tage
lang.
Aus dieser Stammlösung werden durch aufeinanderfolgende Verdünnungen
mit der Mischung (4.5) folgende Lösungen hergestellt:
S
81 µg/ml,
S40,5 µg/ml,
S20,25 µg/ml,
S10,125 µg/ml.
6.Herstellung des Extrakts und der Testlösungen
6.1.Extraktion
6.1.1.Erzeugnisse mit einem Virginiamycingehalt bis zu 100 mg/kg
Eine Menge von 50,0 g der Probe wird abgewogen, mit 200 ml
der Lösung (4.6) versetzt und 30 Minuten geschüttelt. Nach dem
Absetzen oder Zentrifugieren werden 20 ml des Überstands
entnommen und in einem Vakuum-Rotationsverdampfer bei einer
Temperatur nicht höher als 40 ºC auf ca. 5 ml verdampft. Der1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 18
(a) Andere Methoden, die entsprechende Bakteriensuspensionen ergeben, können ange-
wendet werden.
(b) Jeder handelsübliche Nährboden entsprechend der Zusammensetzung, der dieselben
Ergebnisse erbringt, kann verwendet werden.
▼M2
Rückstand wird mit der Mischung (4.5) verdünnt, um einen
erwarteten Virginiamycingehalt von 1 µg/ml (= U8) zu erhalten.
6.1.2.Erzeugnisse mit einem Virginiamycingehalt über 100 mg/kg
Eine Menge von höchstens 10,0 g der Probe mit einem Virginia-
mycingehalt zwischen 1 und 50 mg wird abgewogen, mit 100 ml
der Lösung (4.6) versetzt und 30 Minuten lang geschüttelt. Nach
dem Absetzen oder Zentrifugieren wird der Überstand mit der
Mischung (4.5) verdünnt, um einen erwarteten Virginiamycinge-
halt von 1 µg/ml (= U8) zu erhalten.
6.2.Testlösungen
Von der Lösung U8werden die Lösungen U4(erwarteter Gehalt: 0,5 µg/
ml), U2(erwarteter Gehalt: 0,25 µg/ml) und U1(erwarteter Gehalt:
0,125 µg/ml) durch aufeinanderfolgende Verdünnung (1: 1) mit der
Mischung (4.5) hergestellt.
7.Testverfahren
7.1.Beimpfung desTes tnährbodens
Der Testnährboden (4.1) wird mit der Bakteriensuspension (3.2) bei
ungefähr 50 ºC beimpft. Bei Vorversuchen auf Platten mit dem Test-
nährboden (4.1) wird die Menge des Inokulums ermittelt, die möglichst
große und scharfe Hemmzonen mit den verschiedenen Virginiamycin-
Konzentrationen ergibt.
7.2.Herstellung der Platten
Der Test ist als Diffusionstest auf Platten mit je vier Konzentrations-
stufen der Standardlösung (S8,S4,S2,S1) und der Testlösung (U8,U4,
U2,U1) angelegt. Jede Platte erhält unbedingt alle vier Konzentrationen
des Standards und des Extrakts. Daher muß die Plattengröße so
bemessen sein, daß mindestens acht Löcher mit einem Durchmesser
von 10-13 mm und mindestens 30 mm zwischen den Lochzentren in
die Nährbodenschicht gestanzt werden können. Der Test sollte vorzugs-
weise auf Platten durchgeführt werden, die aus einer Glasscheibe mit
einem daraufgelegten plangedrehten Aluminium- oder Kunstoffring von
20 mm Höhe und 200 mm Durchmesser hergestellt werden. Auf die
Platten wird eine Menge des nach 7.1 beimpften Testnährbodens (4.1)
gegossen, so daß sich eine ca. 2 mm dicke Schicht ergibt (60 ml für
eine Platte von 200 mm Durchmesser). Nachdem die Schicht festge-
worden ist, werden die Löcher gestanzt und genau abgemessene
Mengen der Standard- und Testlösungen einpipettiert. (Zwischen 0,10
und 0,15 ml pro Loch, je nach Lochdurchmesser). Jede Konzentration
muß mindestens in vierfacher Wiederholung angewendet werden, so
daß für jeden Test 32 Hemmzonen ausgewertet werden.
7.3.Inkubation
Die Inkubation erfolgt während 16 bis 18 Stunden bei 30 ºC ± 2 ºC.
8.Auswertung
Der Durchmesser der Hemmzonen wird auf 0,1 mm genau gemessen. Für
jede Konzentration werden die Mittelwerte auf Semilogarithmenpapier aufge-
tragen, wobei der Logarithmus der Konzentrationen gegen den Durchmesser
der Hemmzonen eingetragen wird. Für die Standardlösung sowie für den
Extrakt werden die geeignetsten Geraden — wie beispielsweise nachstehend
berechnet — gezogen.
Der geeignetste Punkt für das niedrigste Niveau der Standardlösung (SL)
wird nach folgender Formel ermittelt:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Der geeignetste Punkt für das höchste Niveau der Standardlösung (SH) wird
nach folgender Formel ermittelt:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
101972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 19
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Genauso werden auch die geeignetsten Punkte für das niedrigste (UL) und
höchste Niveau (UH) des Extrakts ermittelt, indem in der obigen Formel —
anstelle von s1,s2,s4und s8—u1,u2,u4und u8eingesetzt werden.
Die ermittelten SL- und SH-Werte werden auf dasselbe Diagramm aufge-
tragen. Indem man die beiden Punkte miteinander verbindet, erhält man die
geeignetste Gerade für die Standardlösung. Ebenso wird mit den UL- und
UH-Werten verfahren, um die geeignetste Gerade für den Extrakt zu erhalten.
In Abwesenheit von Störfaktoren sollten die Geraden parallel sein. Die
Geraden können als parallel angesehen werden, wenn die Werte (SH-SL)
und (UH-UL) nicht mehr als 10 v. H. vom Mittelwert abweichen.
Falls die Geraden nicht parallel sind, kann man entweder u1und s1oder u8und s8ausschalten. Dann sind die Werte, SL, SH, UL und UH mit folgenden
Formeln zu ermitteln, um die geeignetste Gerade zu erhalten:
(a′)S L ¼5s1þ2s2/C0s4
6oder5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)S H ¼5s4þ2s2/C0s1
6oder5s8þ2s4/C0s2
6
Ebenso wird für UL und UH verfahren. Hier muß denselben Parallelitätsan-
forderungen entsprochen werden. Falls die Ergebnisse aus drei Niveaus
ermittelt wurden, sollte dies im Analyseprotokoll vermerkt werden.
Wenn die Geraden als parallel anzusehen sind wird der Logarithmus der rela-
tiven Aktivität (log. A) durch eine der folgenden Formeln ermittelt, je
nachdem, ob 3 oder 4 Niveaus für die Beurteilung der Parallelität verwendet
wurden.
Für 4 Niveaus
(c) log A ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Für 3 Niveaus
(d) log A ¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
oder
(d′) log A ¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Aktivität des Probenextrakts = Aktivität der jeweiligen Standardlösung × A:
(U8=S8×A )
Wenn die relative Aktivität außerhalb des Bereichs der Werte 0,5 bis 2,0
liegt, wird die Bestimmung bei entsprechender Anpassung der Extraktkon-
zentrationen, bzw. der Standardlösungen wiederholt. Falls die relative
Aktivität nicht in den Bereich der erforderlichen Werte gebracht werden
kann, ist das Ergebnis als annähernd anzusehen. Dies sollte im Analyseproto-
koll vermerkt werden.
Wenn die Geraden nicht als parallel anzusehen sind, wird die Bestimmung
wiederholt. Wenn noch keine Parallelität erreicht wurde, ist die Bestimmung
als unbefriedigend anzusehen.
Die Ergebnisse werden in Milligramm Virginiamycin je kg Futtermittel
ausgedrückt.
9.Wiederholbarkeit
Der Unterschied zwischen den Ergebnissen zweier Bestimmungen eines
Analytikers sollte bei ein- und derselben Probe bei Gehalten von
— bis zu 10 mg/kg — 2 mg/kg absolut,
— 10 — 25 mg/kg — 20 v. H. des höheren Resultats,— 25 — 50 mg/kg — 5 mg/kg absolut,— über 50 mg/kg — 10 v. H. des höheren Resultats
nicht überschreiten.1972L0199 — DE — 13.08.1998 — 004.001 — 20