1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—1
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►B VERORDNUNG (EWG) Nr. 2568/91 DER KOMMISSION
vom 11. Juli 1991
über die Merkmale von Olivenölen und Oliventresterölen sowie die Verfahren zu ihrer Bestim-
mung
(ABl.L248vom5.9.1991,S.1)
Geändert durch:
Amtsblatt
Nr. Seite Datum
►M1Verordnung (EWG) Nr. 3682/91 der Kommission vom 17. Dezember
1991L349 36 18.12.1991
►M2Verordnung(EWG)Nr.1429/92derKommissionvom26.Mai1992 L150 17 2.6.1992
►M3Verordnung(EWG)Nr.1683/92derKommissionvom29.Juni1992 L176 27 30.6.1992
►M4Verordnung(EWG)Nr.1996/92derKommissionvom15.Juli1992 L199 18 18.7.1992
►M5Verordnung (EWG) Nr. 3288/92 der Kommission vom 12. November
1992L327 28 13.11.1992
►M6Verordnung(EWG)Nr.183/93derKommissionvom29.Januar1993 L22 58 30.1.1993
►M7geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 826/93 der Kommission
vom6.April1993L87 6 7.4.1993
►M8Verordnung(EWG)Nr.620/93derKommissionvom17.März1993 L66 29 18.3.1993
►M9Verordnung(EG)Nr.177/94derKommissionvom28.Januar1994 L24 33 29.1.1994
►M10Verordnung(EG)Nr.2632/94derKommissionvom28.Oktober1994 L280 43 29.10.1994
►M11Verordnung(EG)Nr.656/95derKommissionvom28.März1995 L69 1 29.3.1995
Berichtigt durch:
►C1Berichtigung, ABl.L347vom28.11.1992,S.69(2568/91)
►C2Berichtigung, ABl.L290vom6.10.1992,S.15(1429/92)
►C3Berichtigung, ABl.L176vom20.7.1993,S.26(183/93)
▼B
VERORDNUNG (EWG) Nr. 2568/91 DER KOMMISSION
vom 11. Juli 1991
über die Merkmale von Olivenölen und Oliventresterölen sowie die
Verfahren zu ihrer Bestimmung
DIEKOMMISSIONDEREUROPÄISCHENGEMEINSCHAFTEN—
gestütztaufdenVertragzurGründungderEuropäischenWirtschaftsge-
meinschaft,
gestützt auf die Verordnung Nr. 136/66/EWG des Rates vom 22.
September 1966 über die Errichtung einer gemeinsamen Marktorgani-sation für Fette(
1), zuletzt geändert durch die Verordnung (EWG)
Nr.3577/90(2),insbesondere aufArtikel35a,
inErwägungnachstehenderGründe:
Im Anhang der Verordnung Nr. 136/66/EWG sind die Bezeichnungen
und Begriffsbestimmungen für Olivenöle und Oliventresteröle zurVermarktung im innerstaatlichen und innergemeinschaftlichen Handelsowieim Handelmit Drittländern festgelegt.
Unbeschadet der bereits geltenden einschlägigen Bestimmungen
müssen zur Unterscheidung der Olivenölkategorien die entsprechendenchemisch-physikalischen Merkmale sowie die organoleptischen Merk-male nativer Olivenöle festgelegt werden, damit Reinheit und Qualitätderbetreffenden Erzeugnisse gewährleistet sind.
Die Merkmale der einzelnen Olivenöle müssen gemeinschaftsweit
einheitlich bestimmt werden. Daher müssen gemeinschaftlicheVerfahren für die chemische Analyse und die organoleptische Prüfungfestgelegtwerden.AllerdingssolltenwährendeinerÜbergangszeitauchandere in den Mitgliedstaaten übliche Analyseverfahren zulässig sein,
wobei jedoch vorzusehen ist, daß bei abweichenden Ergebnissen die
nachdemgemeinschaftlichen Verfahrenerzielten Ergebnissegelten.
DieFestlegungderchemisch-physikalischen MerkmalevonOlivenölen
und der Analyseverfahren erfordert eine Anpassung der Zusatzvor-schriften zuKapitel 15derKombinierten Nomenklatur.
Zur Bewertung der organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle
müssen Gruppen von ausgewählten und geschulten sensorischenPrüfern gebildet werden; dafüristeine ausreichende Zeitspanne vorzu-sehen. Da einige Mitgliedstaaten solche Prüfergruppen nicht ohneweiteres zusammenstellen können, muß ihnen die Möglichkeit einge-räumt werden, die in anderen Mitgliedstaaten eingesetzten
Prüfergruppenzubefassen.
Damit das einwandfreie Funktionieren der für die Einfuhr von Oliven-
tresteröl geltenden Abschöpfungsregelung gewährleistet ist, muß eineinheitliches Verfahren zur Bestimmung des Ölgehalts dieser Erzeug-nissevorgesehen werden.
Um Nachteile für den Handel auszuschließen, sollte Olivenöl, das vor
Inkrafttreten dieser Verordnung abgefüllt wurde, während einerbestimmten Zeit nochvermarktet werdendürfen.
Die Verordnung (EWG) Nr. 1058/77 der Kommission(
3), zuletzt
geändert durchdie Verordnung(EWG)Nr.1858/88(4),istaufzuheben.
Der Verwaltungsausschuß für Fette hat nicht innerhalb der ihm von
seinem Vorsitzenden gesetzten FristStellunggenommen —1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—2
(1) ABl.Nr.172vom30.9.1966,S.3025/66.
(2) ABl.Nr.L353vom17.12.1990,S.23.
(3) ABl.Nr.L128vom24.5.1977,S.6.
(4) ABl.Nr.L166vom1.7.1988,S.10.
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HATFOLGENDEVERORDNUNGERLASSEN:
Artikel 1
(1) NativeOlivenöleimSinnederNummer1Buchstabena),b)und
c) des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG sind Öle, derenMerkmale mit den in Anhang I Nummern 1, 2 und 3 dieser Verord-nunggenannten Merkmalen übereinstimmen.
(2) Natives Lampantöl im Sinne der Nummer 1 Buchstabe d) des
Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Öl, dessen Merkmalemit den in Anhang I Nummer 4 dieser Verordnung genannten Merk-malen übereinstimmen.
(3) Raffiniertes Olivenöl im Sinne der Nummer 2 des Anhangs der
VerordnungNr.136/66/EWGistOlivenöl,dessenMerkmalemitdeninAnhangINummer5dieserVerordnunggenanntenMerkmalenüberein-
stimmen.
(4) Olivenöl im Sinne der Nummer 3 des Anhangs der Verordnung
Nr. 136/66/EWG ist Öl, dessen Merkmale mit den in Anhang I
Nummer 6dieserVerordnunggenannten Merkmalen übereinstimmen.
(5) Rohes Oliventresteröl im Sinne der Nummer 4 des Anhangs der
VerordnungNr.136/66/EWGistOlivenöl,dessenMerkmalemitdenin
AnhangINummer7dieserVerordnunggenanntenMerkmalenüberein-stimmen.
(6) Raffiniertes Oliventresteröl im Sinne der Nummer 5 des
Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merk-male mit den in Anhang I Nummer 8 dieser Verordnung genanntenMerkmalen übereinstimmen.
(7) Oliventresteröl im Sinne der Nummer 6 des Anhangs der
Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit deninAnhangINummer9dieserVerordnunggenanntenMerkmalenüber-
einstimmen.
Artikel 2
(1) Die Merkmale der Öle gemäß Anhang I dieser Verordnung
werdennach folgenden Analysenverfahren bestimmt:
— freieFettsäuren, berechnet inProzentÖlsäure,nachdemVerfahren
desAnhangsII;
— Peroxidzahl nachdemVerfahrendesAnhangsIII;
— aliphatische Alkoholenach demVerfahrendesAnhangsIV;
— Sterinfraktion nachdemVerfahrendesAnhangsV;
— Erythrodiol nachdemVerfahrendesAnhangVI;
— gesättigte Fettsäuren in 2-Stellung der Triglyceride nach dem
VerfahrendesAnhangsVII;
— Trilinoleingehalt nach demVerfahrendesAnhangsVIII;
— spektrophotometrische Analyse nach dem Verfahren des Anhangs
IX;
— Fettsäurezusammensetzung nach dem Verfahren der Anhänge XA
undXB;
— flüchtige halogenierte Lösungsmittel nach dem Verfahren des
AnhangsXI;
— BestimmungderorganoleptischenMerkmalenativerOlivenölenach
demgemäßAbsatz2angewandten VerfahrendesAnhangsXII;
— Raffinationsnachweis nachdemVerfahrendesAnhangsXIII;
— Stigmasterinnachweis nachdemVerfahrendesAnhangsXVII.
(2) Die organoleptischen Merkmale werden ►
M3von einem mit
der sensorischen Analyse vertrauten Prüfer oder unter HinzuziehungvonSensorikern ◄nachdemimPrüfbogengemäßAnhangXIIvorge-
sehenen Verfahren bewertet. Stellt der Analytiker Abweichungenzwischen den von ihm erfaßten und den aufgrund der Produktbezeich-1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—3
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nung zu erwartenden organoleptischen Merkmalen fest, so muß er die
Probe von einer Gruppe von sensorischen Prüfern gemäß den Bestim-mungendesAnhangsXIIprüfenlassen.
Die Kontrollanalysen werden von der Gruppe nach denselben Bestim-
mungendurchgeführt.
Die Prüfergruppe bewertet die organoleptischen Eigenschaften im
Zusammenhang mit Interventionsmaßnahmen nach den Vorschriften
desAnhangsXII.
Artikel 3
Unbeschadet der Einführung der Analysenverfahren gemäß Artikel 2
dürfen die Mitgliedstaaten bis ►
M628. Februar 1993 ◄andere
erprobteundwissenschaftlichbegründeteVerfahrenverwenden,soweitder freie Verkehr mit den in Anwendung der Gemeinschaftsverfahren
als vorschriftsmäßig anerkannten Erzeugnissen nicht behindert wird.
Die betreffenden Mitgliedstaaten notifizieren der Kommission dieseanderen VerfahrenvorihrerVerwendung.
Führt eines dieser anderen Verfahren zu einem anderen Ergebnis als
das Gemeinschaftsverfahren, so gilt das nach dem Gemeinschaftsver-
fahrenerzielte Ergebnis.
Artikel 3a
Bei Meinungsverschiedenheiten in bezug auf die organoleptischen
Merkmale eines Olivenöls, das Gegenstand eines Handelsgeschäfts ist,
könnensichdiebetreffendenParteienaneinezugelassenePrüfergruppeihrerWahl wenden.
Artikel 3b
Werden Abweichungen zwischen den festgestellten und den aus der
Produktkennzeichnung zu erwartenden organoleptischen Merkmalen
festgestellt, so verhängt der betreffende Mitgliedstaat unbeschadetetwaiger anderer Sanktionen administrative finanzielle Sanktionen,deren Höhesich nach derSchwere der festgestellten Unregelmäßigkeitrichtet.
ZurBeurteilung derUnregelmäßigkeit wirddienatürliche Entwicklung
der Merkmale von unter normalen Bedingungen aufbewahrten Ölenberücksichtigt.
Die Mitgliedstaaten teilen der Kommission zu Beginn eines jeden
Halbjahres Anzahl und Art der festgestellten Unregelmäßigkeiten undder im Laufe des vorhergehenden Halbjahres verhängten Sanktionen
mit.
Artikel 4
(1) Zur Beurteilung der organoleptischen Merkmale bilden die
Mitgliedstaaten Prüfergruppen, die mit der amtlichen Kontrolle dieserMerkmale beauftragt sindund
— sich aus ausgewählten und gemäß den Regeln des in Anhang XII
beschriebenen Verfahrens geschulten sensorischen Prüfern zusam-mensetzen;
— die gemäß den Regeln des genannten Verfahrens erforderlichen
Einrichtungen und Hilfsmittel für die organoleptische Bewertungbesitzen;
— die spezifischen Begriffe fürdie sensorische PrüfungvonOlivenöl,
die Profilbeschreibung und die Bewertungstabelle verwenden, die
fürdiesesVerfahrenvorgesehen sind;
— sich verpflichten, bei regelmäßigen Kontrollen und Zusammen-
künften zur Harmonisierung der sensorischen Kriterien die aufGemeinschaftsebene und internationaler Ebene vorgesehenen orga-noleptischen Bewertungen vorzunehmen;1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—4
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— sichverpflichten, derKommissionjährlich sämtliche Angabenüber
Änderungen in der Zusammensetzung jeder Prüfergruppe und dieZahl der von ihr als zugelassener Prüfergruppe vorgenommenen
Bewertungen mitzuteilen.
Jeder Mitgliedstaat läßt die auf seinem Hoheitsgebiet gebildeten, die
oben beschriebenen Bedingungen erfüllenden Prüfergruppen zu. Er
bestimmt, welche dieser Prüfergruppen mit Revisionsanalysen beauf-
tragt werden.
Prüfergruppen, die in den Mitgliedstaaten vor dem 1. November 1992
gemäß den im Anhang XII vorgesehenen Regeln eingeführt wurden,
gelten alsimSinnediesesArtikelszugelassen.
Jeder Mitgliedstaat übermittelt der Kommission und den anderen
Mitgliedstaaten dasVerzeichnis derzugelassenen Prüfergruppen.
(2) Ergeben sich in einem Mitgliedstaat Schwierigkeiten bei der
Zulassung von Prüfergruppen, kann eine Prüfergruppe eingeschaltetwerden,dieineinem anderen Mitgliedstaat zugelassenist.
(3) Jeder Mitgliedstaat erstellt ein Verzeichnis der von Organisa-
tionen des Berufsstands oder mehrerer Berufsstände unter denBedingungen des Absatzes 1 eingeführten Prüfergruppen und achtetaufdie Einhaltung dieserBedingungen.
Artikel 5
Diezusätzlichen Anmerkungen 2,3und4desKapitels 15derKombi-
niertenNomenklaturimAnhangIderVerordnung(EWG)Nr.2658/87des Rates(
1) erhalten die Fassung des Wortlauts gemäß Anhang XIV
dieserVerordnung.
Artikel 6
(1) DerÖlgehaltvonTresterundanderenRückständenderOlivenö-
lextraktion (KN-Codes 23069011 und 23069019) wird nach dem
VerfahrendesAnhangsXVbestimmt.
(2) DerÖlgehaltgemäßAbsatz1wirdinMassenprozenten,bezogen
aufdie Trockenmasse, berechnet.
Artikel 7
Für andere als im Anhang XI aufgeführte unerwünschte Stoffe gelten
die entsprechenden Gemeinschaftsvorschriften.
Artikel 8
(1) DieMitgliedstaaten teilen derKommissiondie Maßnahmen mit,
die siezurDurchführungdieserVerordnunggetroffen haben.
(2) Die Mitgliedstaaten übermitteln der Kommission zu Beginn
jedes Halbjahres eine Zusammenstellung der analytischen Daten derimvorangegangenen Halbjahrdurchgeführten Bestimmungen.
Diese Ergebnisse werden vom Verwaltungsausschuß für Fette nach
dem Verfahren des Artikels 39 der Verordnung Nr. 136/66/EWGgeprüft.
Artikel 9
DieVerordnung(EWG)Nr.1058/77wirdaufgehoben.
Artikel 10
(1) Diese Verordnung tritt am dritten Tag nach ihrer Veröffentli-
chungim Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften inKraft.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—5
(1) ABl.Nr.L256vom7.9.1987,S.1.▼M6
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Das Verfahren des Anhangs XII ist jedoch, außer wenn es sich um
Interventionsmaßnahmen handelt, ab ►M11. November 1992 ◄
anwendbar.
Diese Methode findet keine Anwendung auf native Olivenöle, die vor
dem1.November 1992abgefüllt wurden.
(2) DieseVerordnunggiltnichtfürOlivenölundOliventresteröl,das
vor dem Tag des Inkrafttretens dieser Verordnung abgefüllt und biszum31.Oktober1992vermarktetwurde.
Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmit-
telbar injedem Mitgliedstaat.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—6
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ANHÄNGE
Inhalt
AnhangI: Merkmale vonOlivenölen …
AnhangII: Bestimmung derfreienFettsäuren…
AnhangIII: Bestimmung derPeroxidzahl …AnhangIV: ►
M6Kapillargaschromatographische Bestimmung des
Wachsgehalts ◄…
AnhangV: Bestimmung der Zusammensetzung und des Gehalts an
Sterinen mit derKapillar-Gaschromatographie …
AnhangVI: Bestimmung desErythrodiolsunddesUvaols…AnhangVII: Bestimmung vonFettsäurenin2-StellungderTriglyceride …
AnhangVIII: Bestimmung desTrilinoleingehalts …
AnhangIX: UV-spektrophotometrische Analyse…AnhangXA: Gaschromatographische AnalysederFettsäuremethylester …
AnhangXB: Vorbereitung derFettsäuremethylester …
AnhangXI: BestimmungdesGehaltsanflüchtigenhalogeniertenLösungs-
mitteln inOlivenöl …
AnhangXII: Organoleptische Prüfungvonnativem Olivenöl …
AnhangXIII: ►
M6Neutralisierung und Bleichung von Olivenöl im
Laboratorium ◄…
AnhangXIV: Zusätzliche Anmerkungen 2, 3 und 4 zu Kapitel 15 der
Kombinierten Nomenklatur
AnhangXV: Ölgehalt derOliventrester …
AnhangXVI: Bestimmung derIodzahl…
AnhangXVII: Bestimmung derStigmastadiene inpflanzlichen Ölen…1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—7
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ANHANG I
MERKMALE VON OLIVENÖLEN
KategorieGehalt an
freien
Fettsäure-
n%Peroxid-
zahl
meqO2/kgHalogen-
ierte
Lösungs-
mittel mg/
kg(1)Wachsem-
g/kgGesättigte
Fettsäure
in2-Stel-
lung
derTrigly-
ceride %Stigmasta-
diene(2)-
mg/kgErythrodi-
ol+Uvao-
l%Trilinolei-
n%Cholester-
in%Brassicas-
terin%Campeste-
rin%Stigmaste-
rin%Beta-
Sitosteri-
n(3)%Delta-7-
Stigmaste-
nol%Gesamtst-
erine mg/
kg
1. NativesOlivenöl
extra M1,0 M20 M0,20 M250 M1,3 M0,15 M4,5 M0,5 M0,5 M0,1 M4,0 <Camp. m93,0 M0,5 m1000
2. NativesOlivenöl M2,0 M20 M0,20 M250 M1,3 M0,15 M4,5 M0,5 M0,5 M0,1 M4,0 <Camp. m93,0 M0,5 m10003. Gewöhnliches
nativesOlivenöl M3,3 M20 M0,20 M250 M1,3 M0,15 M4,5 M0,5 M0,5 M0,1 M4,0 <Camp. m93,0 M0,5 m1000
4. Lampantöl m3,3 m20 m0,20 M350 M1,3 M0,50 M4,5 M0,5 M0,5 M0,1 M4,0 — m93,0 M0,5 m10005. Raffiniertes
Olivenöl M0,5 M5 M0,20 M350 M1,5 M4,5 M0,5 M0,5 M0,1 M4,0 <Camp. m93,0 M0,5 m1000
6. Olivenöl M1,5 M15 M0,20 M350 M1,5 M4,5 M0,5 M0,5 M0,1 M4,0 <Camp. m93,0 M0,5 m1000
7. RohesOliventre-
steröl m2,0 — — — M1,8 m12 M0,7 M0,5 M0,1 M4,0 — m93,0 M0,5 m2500
8. Raffiniertes
Oliventresteröl M0,5 M5 M0,20 — M2,0 m12 M0,6 M0,5 M0,1 M4,0 <Camp. m93,0 M0,5 m1800
9. Oliventresteröl M1,5 M15 M0,20 >350 M2,0 >4,5 M0,6 M0,5 M0,1 M4,0 <Camp. m93,0 M0,5 m1600
M=Höchstgehalt, m =Mindestgehalt.
(1) Höchstgehalt fürdieSumme allerVerbindungenbeiNachweismittels Elektroneneinfang+Detektor.
Fürjede einzelne VerbindungbeträgtderHöchstgehalt 0,10mg/kg.
(2) Summe dermittelsKapillarsäule (nicht) abspaltbarenIsomere.
(3) Summe ausDelta-5,23 +Stigmastadienol, Chlerosterol,Sitosterid, Sitostanol,Delta-5-AvenasteridundDelta-5,24-Stigmastadienol.
Anmerkung:
AuchwennnureineinzigesMerkmal nicht mitdem vorgeschriebenen Grenzwertübereinstimmt,mußdasÖleineranderen Klasssezugeordnetoderalsnich t seinenReinheitskriterien entsprechendbezeichnet werden.▼M111991R2568—DE—28.05.1995—012.001—8
KategorieGehalt an
Summe
trans-
Isomere
ÖlsäureSumme
trans-
Isomere
Linol und
Linolensäu-
re%K232K270K270nach
Behandlung
mitAlumi-
niumoxidDelta-KSensorische
Prüfung Myristinsäu-
re%Linolensäu-
re%Arachinsäu-
re%Eiconsensä-
ure%Behensäur-
e%Lignocerin-
säure%
1. NativesOlivenöl
extra M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,2 M0,2 M0,05 M0,05 M2,50 M0,20 M0,10 M0,01 m6,5
2. NativesOlivenöl M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,2 M0,2 M0,05 M0,05 M2,60 M0,25 M0,10 M0,01 m5,53. Gewöhnlichesnatives
Olivenöl M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,2 M0,2 M0,05 M0,05 M2,60 M0,25 M0,10 M0,01 m3,5
4. Lampantöl M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,2 M0,2 M0,10 M0,10 M3,70 M0,25 M0,11 — <3,55. Raffiniertes Olivenöl M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,2 M0,2 M0,20 M0,30 M3,40 M1,20 — M0,16 —6. Olivenöl M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,2 M0,2 M0,20 M0,30 M3,30 M1,00 — M0,13 —7. RohesOliventresteröl M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,3 M0,2 M0,20 M0,10 —————
8. Raffiniertes Oliven-
tresteröl M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,3 M0,2 M0,40 M0,35 M5,50 M2,50 — M0,25 —
9. Oliventresteröl M0,05 M0,9 M0,6 M0,4 M0,3 M0,2 M0,40 M0,35 M5,30 M2,00 — M0,20 —
M=Höchstgehalt, m =Mindestgehalt.
Anmekung:
WenK270denGrenzwertderentsprechendenKategorie überschreitet, mußzurFeststellungderReinheit K270nachBehandlungmitAluminiumoxidbestimmtwerden.▼M111991R2568—DE—28.05.1995—012.001—9
▼B
ANHANG II
BESTIMMUNG DER FREIEN FETTSÄUREN
1. ANWENDUNGSBEREICH
Bestimmung der freien Fettsäuren in Olivenölen. Der Gehalt an freien
Fettsäuren wird über den Gehalt an freien Säuren in konventioneller
Weiseberechnet.
1.1.Prinzipder Methode
Die Probe wird in einem geeigneten Lösungsmittelgemisch gelöst. Dann
werdendievorhandenenfreienSäurenmiteinerethanolischenKaliumhy-
droxidlösungtitriert.
1.2.Reagenzien
Alle Reagenzien müssen anerkannte Anaylsenqualität aufweisen; als
Wasser ist destilliertes Wasser oder Wasser gleicher Reinheit zu
verwenden.
1.2.1. Diethylether/Ethanol 95%ig(V/V),Mischung1:1.
Vorsicht:Diethylether ist leicht brennbar und kann explosive Peroxide
bilden. Es muß daher unter besonderen Vorsichtsmaßnahmen
verwendet werden.
Das Diethylether/Ethanol-Gemisch muß unmittelbar vor dem Gebrauch
mit einer Kaliumhydroxidlösung (1.2.2) unter Zusatz von 0,3 ml
Phenolphthaleinlösung(1.2.3)pro100mlLösungsmittelgemisch neutrali-
siertwerden.
Anmerkung: WennDiethylethernichtbenutztwerdenkann,sokannauch
eine Mischung aus Ethanol und Toluol verwandt werden.
Eventuell kann auch Ethanol durch 2-Propanol ersetzt
werden.
1.2.2. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung, 0,1 molar oder, falls erforderlich,
0,5molar.
Die genaue Konzentration der ethanolischen Kaliumhydroxidlösung muß
bekannt seinundunmittelbar vorderVerwendungüberprüftwerden.Die
Lösung sollte mindestens 5 Tage vorher hergestellt und in eine braune
Flasche, die mit einem Gummistopfen verschlossen wird, dekantiert
werden.Siemußfarblosodernurschwachgefärbtsein.
Anmerkung: Eine stabile farblose Kaliumhydroxidlösung kann wie folgt
hergestellt werden: 1000 ml Ethanol mit 8 g Kaliumhy-
droxid und 0,5 g Aluminiumspäne eine Stunde am
Rückflußkühlerkochen.Sofortdestillieren.Dieerforderliche
Menge Kaliumhydroxid in dem destillierten Ethanol lösen
und mehrere Tage stehen lassen. Die klare Lösung von
demausgefallenen Karbonatabdekantieren.
Die Lösung kann auch ohne Destillation wie folgt herge-
stellt werden: 1000ml Ethanol mit 4ml Aluminiumbutylat
mehrere Tage stehen lassen. Die überstehende Flüssigkeit
abdekantieren und die erforderliche Menge Kaliumhydroxid
darinlösen.DieseLösungistgebrauchsfertig.
1.2.3. Phenolphthalein, Lösungvon10 g/lin 95-96%igem Ethanol oderAlkali-
blau (bei sehr stark gefärbten Fetten), Lösungvon 20g/l in 95-96%igem
Ethanol.
1.3.Geräte
ÜblicheLaborgeräte u.a.:
1.3.1. Analysenwaage,1.3.2. 250-ml-Erlenmeyerkolben,
1.3.3. 10-ml-Bürette mit 0,05-ml-Graduierung.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—10
▼B
1.4.Verfahren
1.4.1. Die Bestimmung erfolgt mit der filtrierten Probe. Beträgt der Gesamtge-
halt an Wasser und Verunreinigungen weniger als 1 %, so wird die
Bestimmungmit derunfiltrierten Probedurchgeführt.
1.4.2. Probe
DieGrößederEinwaagerichtetsichnachdemzuerwartendenGehaltan
freienFettsäuren(Angabenindernachstehenden Tabelle).
Erwarteter Gehalt an
freien FettsäurenEinwaage
(ing)Genauigkeitder
Einwaage
(ing)
<1 20 0,05
1—4 10 0,024—15 2,5 0,01
15—75 0,5 0,001
>75 0,1 0,0002
DieProbeindenErlenmeyerkolben (1.3.2)einwiegen.
1.4.3. DurchführungderBestimmung
Die Probe (1.4.2) in 50 bis 150 ml der neutralisierten Diethylether/
Ethanol-Mischung (1.2.1) lösen. Mit der 0,1 molaren Kaliumhydroxidlö-
sung (1.2.2) (Anmerkung 2) unter Schütteln bis zum Umschlag des
Indikators titrieren. (Die Rosafärbung des Phenolphthaleins muß
mindestens10Sekundenanhalten.)
Anmerkungen: 1. Die ethanolische Kaliumhydroxidlösung (1.2.2) kann
durch eine wäßrige Kaliumhydroxid- oder Natriumhydro-
xidlösung ersetzt werden, wenn die zugeführte
WassermengekeinePhasentrennungbewirkt.
2. Werden zur Titration mehr als 10 ml der 0,1 molaren
Kaliumhydroxidlösung benötigt, so ist eine 0,5 molare
Lösungzuverwenden.
3. Wird die Lösung während der Titration trübe, so ist eine
ausreichendeMengeLösungsmittelmischung(1.2.1)zuzu-
fügen,bisdieLösungwieder klarist.
1.5.Berechnung des Gehalts an freien Fettsäuren in % Ölsäure
DerGehaltanfreienFettsäureninGewichtsprozent ist
V/C2c/C2M
1000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
Dabeisind:
V= V erbrauchanKaliumhydroxidlösunginml,
c = genaueKonzentration derKaliumhydroxidlösunginmol/l,
M = Molekulargewicht in g der Säure, die für die Berechnung
zugrundegelegt wird(=282),
m = Probeneinwaage ing.
Als Ergebnis gilt das arithmetische Mittel ►M6zweier
Bestimmungen ◄.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—11
▼C1
▼B
▼B
ANHANG III
BESTIMMUNG DER PEROXIDZAHL
1. ZWECK
Diese Norm beschreibt ein Verfahren für die Bestimmung der Peroxidzahl
vonÖlenundFetten.
2. ANWENDUNGSBEREICH
DieseNormgilt fürtierische undpflanzliche ÖleundFette.
3. DEFINITION
Die Peroxidzahl ist die Gesamtmenge solcher Substanzen in der Probe,
ausgedrückt in Milliäquivalenten aktiven Sauerstoffs pro kg, die unter den
beschriebenen ArbeitsbedingungenKaliumiodid oxidieren.
4. PRINZIP
Behandlung der in Essigsäure und Chloroform gelösten Probe mit einer
Kaliumiodidlösung. Titration des freigesetzten Iods durch eine eingestellte
Natriumthiosulfatlösung.
5. GERÄTE
Die Geräte müssen frei von reduzierenden oder oxidierenden Substanzen
sein.
Anmerkung: Schliffflächen nichteinfetten.
5.1. Mikrobechergläschen, 3ml.5.2. 250-ml-Schliffkolben mit Stopfen, die zuvor getrocknet und mit einem
reinen, trockenen Inertgas (Stickstoff oder vorzugsweise Kohlendioxid)
gefülltwurden.
5.3. 25-oder50-ml-Bürette, mit 0,1-ml-Graduierung.
6. REAGENZIEN
6.1. Chloroform, analytisch rein, durch Einleiten von reinem, trockenem
InertgasvonSauerstoffbefreit.
6.2. Eisessig, analytisch rein, durch Einleiten von reinem, trockenem Inertgas
vonSauerstoffbefreit.
6.3. Kaliumiodid, gesättigte wäßrigeLösung,frischzubereitet, freivonIodund
Iodaten.
6.4. Natriumthiosulfat, genau 0,01 oder 0,002 N wäßrige Lösung, unmittelbar
vorderVerwendungeingestellt.
6.5. Stärkelösung, wäßrige Dispersion, von 10 g/l, aus natürlicher löslicher
Stärkefrischhergestellt.
7. PROBE
DieProbeistunterLichtabschluß zuentnehmen undzulagernundkühlin
vollständig gefüllten Glasgefäßen, die mit Glas- oder Korkstopfen
verschlossensind,aufzubewahren.
8. VERFAHREN
Die Bestimmung soll bei diffusem Tageslicht oder künstlichem Licht
durchgeführt werden. In ein Mikrobechergläschen (5.1) oder aber in einen
Kolben(5.2)dieProbemengeauf0,001ggenaueinwiegen,unterBerücks-
ichtigung dererwarteten Peroxidzahl gemäßnachstehender Tabelle:1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—12
▼B
Erwartete Peroxidzahl
(meqO2/kg)Probemenge
(g)
0bis12 5,0bis2,0
12bis20 2,0bis1,220bis30 1,2bis0,830bis50 0,8bis0,5
50bis90 0,5bis0,3
Den Stopfen von dem Kolben (5.2) abnehmen und den Mikrobecher mit
der Probemenge einführen. 10 ml Chloroform (6.1) hinzufügen. Die Probe
schnell unter Rühren auflösen, 15 ml Essigsäure (6.2), dann 1 ml Kalium-
iodidlösung (6.3) hinzufügen. Den Stopfen rasch einsetzen, eine Minute
schüttelnundgenaufünfMinutenunterLichtabschlußbeieinerTemperatur
von15bis25ºCstehenlassen.
Etwa75mldestilliertesWasserzugeben.DasfreigesetzteIodmitNatrium-
thiosulfatlösung (6.4) unter kräftigem Schütteln titrieren (0,002-N-Lösung
für erwartete Werte unter 12 und 0,01-N-Lösung für erwartete Werte über
12).Stärkelösung(6.5)alsIndikatorverwenden.
ZweiBestimmungen mitderselben Probedurchführen.
Zurgleichen Zeit einenBlindversuchdurchführen.ÜbersteigtdasErgebnis
des Blindversuchs 0,05 ml einer 0,01-N-Natriumthiosulfatlösung (6.4), so
sinddieunreinenReagenzien zuersetzen.
9. ABFASSUNGDERERGEBNISSE
Die Peroxidzahl (P. V.), ausgedrückt in Milliäquivalenten aktiven Sauer-
stoffsprokg,wirdnachfolgender Formelerrechnet:
P:V:¼
V/C2T/C21000
m
Dabeisind:
V= die Anzahl ml der eingestellten Natriumthiosulfatlösung (6.4), die
fürdieBestimmungverbrauchtwerden,korrigiertdurchdenentspre-
chenden WertdesBlindversuchs,
T = diegenaueNormalität derNatriumthiosulfatlösung (6.4),
m = dasGewichtderProbeing.
Als Ergebnis gilt das arithmetische Mittel der beiden so durchgeführten
Bestimmungen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—13
▼M6
ANHANG IV
KAPILLARGASCHROMATOGRAPHISCHE BESTIMMUNG DES
WACHSGEHALTS
1. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Arbeitsvorschrift beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des
Wachsgehalts verschiedener Fette ►C3undÖle ◄unterVersuchsbe-
dingungen.
Dieses Verfahren kann insbesondere zur Unterscheidung zwischen
abgepreßtem und extrahiertem Olivenöl (Oliventresteröl) verwendet
werden.
2. KURZBESCHREIBUNG
Das Fett wird mit einem geeigneten internen Standard versetzt und
chromatographisch über eine Kieselgelsäule fraktioniert; die unter
Versuchsbedingungen zuerst eluierte Fraktion (schwächerer Polarität
als Triglyceride) wird rückgeführt und sofort kapillargaschromatogra-
phischanalysiert.
3. GERÄTEUNDHILFSMITTEL
3.1. 25-ml-Erlenmeyerkolben,
3.2. Chromatographiesäule aus Glas, Innendurchmesser 15,0 mm, Höhe 30
—40cm,
3.3. Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen,
mit Direkteinspritzung, umfassend:
3.3.1. thermostatregelbaren Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte
Temperatur mit einerGenauigkeit von±1ºC,
3.3.2. Kalteinspritzsystem fürdieDirektbeschickung derSäule,
3.3.3. Flammenionisationsdetektor mitKonversionsverstärker,
3.3.4. Integrator mit Schreiber, mit Konversionsverstärker (3.3.3) zu koppeln,
Ansprechzeitmax.1Sekunde,variabler Papiervorschub,
3.3.5. GlaskapillarsäuleoderFused-silica-Säule, ►C310—15m ◄,Innen-
durchmesser 0,25 — 0,32 mm, Innenwand belegt mit flüssigem SE-52
oder SE-54 oder gleichwertiger Phase; gleichmäßige Schichtdicke 0,10
—0,30 µm,
3.4. 10- µl-Mikroliterspritze mit gehärteter NadelfürDirekteinspritzung.
4. REAGENZIEN
4.1. Kieselgel 70—230mesh,Artikel 7754Merck. DasKieselgel wirdim
Muffelofen vier Stunden bei einer Temperatur von ►C3500oC
getrocknet ◄undnachdemAbkühlenmit2%Wasserversetzt.Durch
gründliches Schütteln homogenisieren. Vor Gebrauch mindestens 12
StundenimDunkelnaufbewahren.
4.2. n-HexanfürdieChromatographie,
4.3. Ethylether fürdieChromatographie,
4.4. n-HeptanfürdieChromatographie,
4.5. Standardlösung aus Laurylarachidat 0,1 % (m/v) in Hexan (interner
Standard),
4.6. Trägergas: Wasserstoff,rein,fürdieGaschromatographie,
4.7. Hilfsgase:
— Wasserstoff,rein,fürdieGaschromatographie;
— Luft, rein,fürdieGaschromatographie.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—14
▼M6
5. VERFAHREN
5.1. TrennenderWachsfraktion
5.1.1. Vorbereiten derChromatographiesäule
15 g Kieselgel werden mit 2 % Wasser versetzt, in wasserfreiem n-
HexansuspendiertundderSäuleaufgegeben.
Nach der Spontansedimentation wird die Phase mit einem Elektrorühr-
werk nachbehandelt, um eine möglichst homogene
Chromatographieschicht zu erzielen, und zur Entfernung etwa enthal-
tenerVerunreinigungen mit 30mln-Hexangespült.
5.1.2. Säulenchromatographische Analyse
►C3Genau 500 mg der Probe ◄werden in den 25-ml-Erlenmeyer-
kolben eingewogen und entsprechend dem vermuteten Wachsgehalt
mit der geeigneten Menge interner Standardlösung versetzt. So werden
bei Olivenöl 0,1 mg Laurylarachidat und bei Oliventresteröl 0,25 bis
0,5mgzugesetzt.
DiederartgewonneneProbewirdunterVerwendungvonjezweiTeilen
2m l►C3n-Hexan ◄in die gemäß 5.1.1 vorbereitete Chromatogra-
phiesäule übergeführt.
Das Lösungsmittel bis zu einem Stand von 1 mm über der oberen
Absorbensgrenzflächeablaufenlassen.AndieserStelleistmitderchro-
matographischen Eluierung zu beginnen: es sind 140 ml n-Hexan/
Ethylether-Gemisch (99:1) bei einem Durchsatz von etwa 15 Tropfen/
10Sekunden(2,1ml/min) aufzufangen.
Die derart gewonnene Fraktion wird im Rotationsverdampfer so lange
getrocknet, bis das Lösungsmittel nahezu restlos verdampft ist, wobei
die letzten 2 bis 3 ml im schwachen Stickstoffstrom ausgetrieben
werden; der Trocknungsrückstand wird ►C3mit 10 ml n-Heptan
versetzt. ◄
5.2. Gaschromatographische Analyse
5.2.1. Vorarbeiten, EinfahrenderSäule
5.2.1.1. Die Säule in den Gaschromatographen einsetzen, wobei ►C3der
Säulenanfang ◄andasOn-column-Systemund ►C3dasSäulenende ◄
andenDetektor angeschlossenwird.
Sodann ist der Gaschromatograph auf Dichtigkeit der Gasleitungen,
Betriebsbereitschaft des Detektors und des Schreibers usw. zu über-
prüfen.
5.2.1.2. WirddieSäuleerstmalsverwendet,istesratsam,sieeinzufahren.Einen
schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromatographen
einschalten und allmählich auf eine Temperatur von mindestens 20 ºC
überderArbeitstemperatur (Anmerkung)aufheizen. DieTemperatur ist
mindestens 2 Stunden konstant zu halten; sodann sind die Analysebe-
dingungen einzustellen (Gasstrom, Zünden der Flamme, Anschluß an
den elektronischen Schreiber, Säulenofentemperatur, Detektor usw.).
Anschließend ein Signal mit einer Empfindlichkeit aufzeichnen, die
mindestens doppelt so groß ist wie bei Durchführung der Analyse. Die
Grundliniemußlinear verlaufen, ohnePeaksoderDrifts.
Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluß der
Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule
hin.
Anmerkung: Die Einfahrtemperatur muß in jedem Fall mindestens 20
ºC►C3unter der für die verwendete Phase ◄vorgese-
henenHöchsttemperatur liegen.
5.2.2. WahlderArbeitsbedingungen
5.2.2.1. AnhaltspunktefürdieArbeitsbedingungen:
— Säulentemperatur: anfangs 80 ºC, dann stufenweise um 30 ºC pro
Minute bis auf 120 ºC ansteigend, anschließend programmierter
Temperaturanstieg um5ºCproMinutebisauf340ºC;
— Detektortemperatur: 350ºC,— Strömungsgeschwindigkeit des Trägergases: Wasserstoff 20 — 35
cm/s,
— Geräteempfindlichkeit: 4-bis16-fache derMindestdämpfung,— Detektorempfindlichkeit: 1—2mVf.s.,— Papiervorschub:30cm/Stunde,— Einspritzvolumen: 0,5bis1 µlLösung.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—15
▼M6
DieseBedingungen könnenentsprechend denKenndaten derSäuleund
des Gaschromatographen derart geändert werden, daß die damit aufge-
zeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen erfüllen: die
RetentionszeitdesinternenStandardsC32muß25Minuten±2Minuten
betragen, und ►C3der größte Wachspeak ◄muß 60 bis 100 % des
Vollausschlagserreichen.
5.2.2.2. DieParameterfürdiePeakintegrationsindsozuwählen,daßfürdiein
Betracht kommendenPeakskorrekte Werte erzielt werden.
5.2.3. DurchführungderAnalyse5.2.3.1. Mitder10- µl-Spritze1- µlProbelösungaufziehenunddabeidenKolben
der Spritze so weit einziehen, daß die Nadel leer ist. Die Nadel
►
C3in den Injektor einführen, ◄nach 1 bis 2 Sekunden schnell
einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam heraus-
ziehen.
5.2.3.2. DasChromatogramm aufzeichnen, bisalle vorhandenenWachseeluiert
sind.
Die Grundlinie muß stets den vorgeschriebenen Anforderungen
►C3 ◄(5.2.1.2)genügen.
5.2.4. Identifizierung derPeaks
Die Peakflächen werden anhand der Retentionszeiten durch Vergleich
mit Wachsgemischen identifiziert, deren Retentionszeiten bekannt sind
unddieunterdenselben Bedingungenanalysiert wurden.
Abbildung1zeigteinChromatogrammderWachsfraktioneinesnativen
Olivenöls.
5.2.5. Quantitative Bestimmung
5.2.5.1. Die Peakflächen des internen Standards und der aliphatischen C40- bis
C46-Esterwerdenmit HilfeeinesIntegratorsermittelt.
5.2.5.2. Der Wachsgehalt jedes einzelnen Esters in mg/kg Fett wird nach
folgenderFormel berechnet:
Ester(mg/kg)=Ax·ms·►M91000◄
As·m
Hierinbedeuten:
Ax= jeweilige Ester-Peakfläche,
As= Peakfläche vonLaurylarachidat,
ms= Massedeszugesetzten Laurylarachidats inmg,
m = MassederzurBestimmungentnommenen Probeing.
6. ERGEBNISSE
Die Gehalte an den einzelnen Wachsen sowie ihre Summe werden in
mg/kgFettangegeben.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—16
▼M6
ANLAGE
Bestimmung der Strömungsgeschwindigkeit des Gases
In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatographen werden 1 bis
3µl Methan (oder Propan) eingespritzt und die Säulendurchlaufzeit des Gases
vomZeitpunkt desEinspritzensbiszumPeak-Austritt(tM)gemessen.
Die Gasströmungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tMdefi-
niert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tMdie gemessene Zeit in
Sekunden.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—17
▼M61991R2568—DE—28.05.1995—012.001—18
▼B
ANHANG V
BESTIMMUNG DER ZUSAMMENSETZUNG UND DES GEHALTS AN
STERINEN MIT DER KAPILLAR — GASCHROMATOGRAPHIE
1. UMFANGUNDANWENDUNGSBEREICH
DieseMethodebeschreibt dasVerfahrenzurBestimmungderSterinzu-
sammensetzung unddesSteringehalts vonFetten.
2. KURZBESCHREIBUNG
DasFett wirdmit α-Cholestanol als innerem Standard versetzt und mit
ethanolischer Kaliumhydroxidlösung verseift. Die Sterinfraktion wird
aus dem Unverseifbaren dünnschicht-chromatographisch über basische
Kieselgelplatten abgetrennt.
Die aus dem Kieselgel isolierten Sterine werden in Trimethylsilylether
überführtundmit HilfederKapillar-Gaschromatographie untersucht.
3. GERÄTEUNDHILFSMITTEL
3.1. Kolben,250ml,mitRückflußkühler undSchliffstopfen,
3.2. Scheidetrichter, 500ml,
3.3. Kolben,250ml,3.4. komplette Apparatur für die Dünnschichtchromatographie mit Glas-
platten 20×20cm,
3.5. UV-Lampe,Wellenlänge 366oder254nm,
3.6. Mikroliterspritzen, 100und500µl,3.7. Glasfiltertiegel mit Porenfilter G 3 (Porosität 15—40 µm), etwa 2 cm
Durchmesser, 5 cm Höhe, mit geeignetem Anschlußstück für die
Vakuumfiltration undSchliffmuffe12/21,
3.8. Vakuumflasche, 50 ml, mit Schliffmuffe 12/21, für Glasfiltertiegel
(3.7),
3.9. 10-ml-RöhrchenmitkonischemBodenunddichtschließendemStopfen,3.10. Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen,
mit Splitsystem,bestehend aus:
3.10.1. einem thermostatisierbaren Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte
Temperatur mit einerGenauigkeit von±1ºC,
3.10.2. einer temperaturregelbaren Verdampfereinrichtung mit Verdampfer aus
persilanisiertem Glas,
3.10.3. einem Flammenionisations-Detektor mit Verstärker,
3.10.4. einem Integrator mit Schreiber,mit Verstärkerzukoppeln,
3.11. einer Kapillarsäule aus Glas oder fused silica, 20—30 m Länge,
0,25—0,32 mm Innendurchmesser, Innenwand belegt mit SE-52 oder
SE-54 oder einer gleichwertigen stationären Phase, Schichtdicke
0,10—0,30µm,
3.12. Mikroliterspritze für die Gaschromatographie, 10 µl, mit gehärteter
Nadel.
4. REAGENZIEN
4.1. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 2 N: 130 g Kaliumhydroxid
(Titer mindestens 85 %) in 200 ml destilliertem Wasser unter Kühlen
lösen und mit Ethanol auf 1 Liter auffüllen. Die Lösung ist in gut
verschlossenenBraunglasflaschen haltbar (Ethanol95%V/V),
4.2. Ethylether, analysenrein,
4.3. wasserfreiesNatriumsulfat, analysenrein,
4.4. kieselgelbeschichtete Glasplatten ohne Fluoreszenzindikator, Schicht-
dicke0,25mm(gebrauchsfertig imHandelerhältlich),
4.5. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 0,2 N: 13 g Kaliumhydroxid
werdenin20mldestilliertemWassergelöstundmitEthanolauf1Liter
aufgefüllt,1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—19
▼B
4.6. BenzolfürdieChromatographie (siehe5.2.2),
4.7. AcetonfürdieChromatographie (siehe5.2.2),
4.8. HexanfürdieChromatographie (siehe5.2.2),4.9. Ethylether fürdieChromatographie (siehe5.2.2),4.10. Chloroform,analysenrein,4.11. Referenzlösung für die Dünnschichtchromatographie: Cholesterin oder
Phytosterole, ►
M62%ige ◄LösunginChloroform,
4.12. 2 ′,7′-Dichlorfluorescein, 0,2%ige ethanolische Lösung, leicht alkalisch
durch Zusatz einiger Tropfen alkoholischer 2-N-Kaliumhydroxid-
Lösung,
4.13. wasserfreiesPyridinfürdieChromatographie,4.14. Hexamethyldisilazan,4.15. Trimethylchlorsilan,
4.16. Standardlösung von Sterin-Trimethylsilylethern unmittelbar vor
Gebrauch ansetzen mit reinen Sterinen oder Sterinmischungen aus
Ölen,indenensieenthalten sind,
4.17. α-Cholestanol, 0,2%ige Lösung (m/V) in Chloroform (interner
Standard),
4.18. Trägergas: WasserstoffoderHelium,rein,fürdieGaschromatographie,
4.19. Hilfsgase:WasserstoffundLuft,rein, fürdieGaschromatographie.
5. VERFAHREN5.1.Herstellung des Unverseifbaren
5.1.1. Mit einer 500-µl-Mikroliterspritze so viel der 0,2%igen α-Cholesta-
nollösunginChloroform (4.17)ineinen250-ml-Kolben geben,daßdie
Menge an Cholestanol etwa 10 % des Steringehalts des zur Analyse
verwandten aliquoten Teils der Probe entspricht. So werden z. B. für
5 g Olivenöl 500 µl der 0,2%igen α-Cholestanollösung benötigt,
1500 µl für ►
M6 ◄Oliventresteröl. Im Stickstoff-
strombiszurTrocknungabdampfen.IndengleichenKolbengenau5g
dertrockenen undfiltrierten Probeeinwiegen.
Bei►M6Ölen◄,diegrößereMengenanCholesterinenthalten,kann
ein Peak mit der gleichen Retentionszeit wie Cholestanol auftreten. In
diesem Fall ist die Sterinfraktion einmal mit und einmal ohne internen
Standard zu analysieren. ►M6Anstelle von Cholestanol kann auch
Betulinverwendet werden. ◄
5.1.2. Die Probe bei aufgesetztem Rückflußkühler mit 50 ml 2-N-ethanoli-
scher Kaliumhydroxidlösung versetzen, auf dem Wasserbad erhitzen
und unter kräftigem Schütteln und schwachem Sieden verseifen (wobei
sichdieLösungklärt).DieProbeweitere20MinutenamSiedenhalten
und dann durch den Rückflußkühler mit 50 ml destilliertem Wasser
versetzen, den Rückflußkühler entfernen und den Kolben auf etwa
30ºCabkühlen.
5.1.3. Den Kolbeninhalt quantitativ in einen 500-ml-Scheidetrichter über-
führen, wobei mehrfach mit insgesamt 50 ml destilliertem Wasser
nachgespült wird. Die Probe mit etwa 80 ml Ethylether versetzen, 30
Sekundenkräftigschütteln undabsetzen lassen(vgl.Hinweis1).
Die wäßrige Phase in einen anderen Scheidetrichter ablassen und dann
noch zweimal nach dem gleichen Verfahren mit 60—70 ml Ethylether
extrahieren.
Hinweis 1:Etwaige Emulsionen können mit Hilfe einer Waschflasche
durch Zusatz kleiner Mengen Ethyl- oder Methylalkohol
zerstörtwerden.
5.1.4. Die Etherauszüge in einem Scheidetrichter vereinigen und mehrmals
mit jeweils 50 ml destilliertem Wasser waschen, bis das Waschwasser
neutralreagiert.
Das Waschwasser ablassen, die Etherphase mit wasserfreiem Natrium-
sulfat trocknen, über wasserfreiem Natriumsulfat in einen zuvor
gewogenen 250-ml-Kolben filtrieren. Scheidetrichter und Filter mit
kleinenMengenEthylether nachspülen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—20
▼B
5.1.5. Den Ether bis auf wenige ml abdestillieren, den Rückstand unter
leichtemVakuumoderimStickstoffstromtrocknen,¼StundeimTrok-
kenschrank bei 100 ºC nachtrocknen, im Exsikkator abkühlen lassen
undwiegen.
5.2.Trennung der Sterinfraktion
5.2.1. HerstellungderbasischenPlatten
DieKieselgelplatten(4.4)vollständigca.10Sekundenlangineine0,2-
N-ethanolische Alkalihydroxidlösung (4.5) eintauchen, dann unter
einem Abzug 2 Stunden trocknen lassen, anschließend noch 1 Stunde
bei100ºCimTrockenschrank.
Die Platten aus dem Trockenschrank nehmen und in einem Exsikkator
über Calciumchlorid bis zum Gebrauch aufbewahren. (Derart behan-
delte Plattenmüsseninnerhalb von15Tagengebraucht werden.)
Hinweis 2:BeiVerwendungvonalkalischenKieselgelplattenzurTren-
nung der Sterinfraktion erübrigt sich die Behandlung des
Unverseifbaren mit Aluminiumoxid. Auf diese Weise
bleiben sämtliche sauren Verbindungen (Fettsäuren und
andere) an der Startlinie. So erhält man eine saubere Tren-
nung der Sterinzone von denen der aliphatischen Alkohole
undTerpenalkohole.
5.2.2. Die Entwicklerkammer bis zu einer Höhe von etwa 1 cm mit einem
Benzol/Aceton-Gemisch 95:5 (V/V) beschicken. Statt dessen kann
auch ein Hexan/Ethylether-Gemisch 65:35 (V/V) verwandt werden.
DieKammermiteinemgeeignetenDeckelverschließenundmindestens
einehalbeStundestehenlassen,damitsicheinGleichgewichtzwischen
Flüssigkeit und Dampfphase einstellt. An der Innenwand der Kammer
können Filterpapierstreifen befestigt werden, die in das Fließmittel
eintauchen. Dadurch kann die Laufzeit um ein Drittel verkürzt und
eine gleichmäßige ElutionderKomponentenerzielt werden.
Hinweis 3:Das Gemisch ist jedesmal frisch anzusetzen, damit die
Wiederholbarkeit gewährleistet ist.
5.2.3. Von einer 5%igen Lösung des Unverseifbaren (5.1.5) in Chloroform
mit einer 100-µl-Spritze 0,3 ml als durchgehenden, gleichmäßigen
Strich2cmvomunterenPlattenrandentferntaufdieDünnschichtplatte
(5.2.1) auftragen. In der Verlängerung der Startlinie werden am Rande
2—3 µl der Sterin-Standardlösung (4.11) aufgetragen, um die Sterin-
zonenachderEntwicklungzuidentifizieren.
5.2.4. DiePlatteindienach5.2.2vorbereitete Entwicklerkammer stellen.Die
TemperaturderUmgebungsollte15—20ºCbetragen.DieKammermit
dem Deckel verschließen und die Platte so lange entwickeln, bis die
Fließmittelfront bis 1 cm unter den oberen Plattenrand gestiegen ist.
Dann die Platte aus der Entwicklerkammer nehmen und das Lösungs-
mittel in einem warmen Luftstrom abdampfen oder die Platte eine
geraumeZeit unterdemAbzugliegen lassen.
5.2.5. Die Platte vorsichtig und gleichmäßig mit 2 ′,7′-Dichlorfluoresceinlö-
sung besprühen. Die Lage der Sterinzone mit Hilfe des Flecks der
Standardlösung bestimmen und mit einem schwarzen Stift den fluores-
zierenden Bereichmarkieren.
5.2.6. Das in der markierten Zone liegende Kieselgel mit einem Metallspatel
abkratzen, fein mahlen und in einen Glasfiltertiegel (3.7) überführen.
Mit 10 ml warmem Chloroform versetzen, mit Hilfe des Metallspatels
gründlich vermischen und unter Vakuum filtrieren. Das Filtrat in der
an dem Glasfiltertiegel angeschlossenen Vakuumflasche (3.8)
auffangen.
Den Rückstand im Glasfiltertiegel dreimal mit je 10 ml Ethylether
waschen und das Filtrat wiederum in der Vakuumflasche auffangen.
Das Filtrat bis auf ein Volumen von etwa 4—5 ml eindampfen und
den Rest der Lösung in das zuvor gewogene 10-ml-Probenglas (3.9)
überführen. Durch vorsichtiges Erhitzen unter einem schwachen Stick-
stoffstrom bis zur Trocknung eindampfen. Mit einigen Tropfen Aceton
versetzen, wieder bis zur Trocknung eindampfen, etwa 10 Minuten im
Trockenschrank auf 105 ºC erhitzen, anschließend im Exsikkator
abkühlenlassenundwiegen.
DerRückstandindemProbengläschen bestehtausderSterinfraktion.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—21
▼B
5.3.Herstellung der Trimethylsilylether (TMSE)
5.3.1. Dem Probengläschen mit der Sterinfraktion werden je Milligramm
Sterin 50 µl Silanisierungsreagenz, bestehend aus einem Gemisch aus
Pyridin, Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan im Verhältnis
9:3:1(V/V/V),zugesetzt(Hinweis4)unterAusschlußvonFeuchtigkeit
(Hinweis5).
Hinweis 4:Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich;
daneben gibt es auch andere Silanisierungsreagenzien, z.
B. N,O-bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % Trime-
thylchlorsilan, das mit gleichen Teilen wasserfreiem
Pyridingemischt werdenmuß.
5.3.2. Das Probengläschen verschließen und gründlich (nicht zu stark) schüt-
teln, bis sich die Sterine gelöst haben. Die Probe mindestens 15
Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und dann einige Minuten
zentrifugieren. DieklareLösungkanngaschromatographischuntersucht
werden.
Hinweis 5:Die Beobachtung einer leichten Opaleszenz ist normal und
bedeutet keine Störung. Die Bildung eines weißen Nieder-
schlags oder der Eindruck einer Rosafärbung sind
Anzeichen der Anwesenheit von Feuchtigkeit oder der
Zersetzung des Reagens. In diesem Fall soll der Test
wiederholt werden.
5.4.Gaschromatographische Analyse
5.4.1. Vorbereiten, EinfahrenderSäule5.4.1.1. Die Säule in den Gaschromatographen einsetzen, wobei das Einlaßteil
andenmitdemTrennsystemverbundenenVerdampferunddasAuslaß-
teil andenDetektor angeschlossenwird.
Überprüfung des Gaschromatographen (Dichtigkeit der Gasleitungen,
Betriebsbereitschaft des Detektors, des Trennsystems, des Schreibers
usw.).
5.4.1.2. WirddieSäulezumerstenmalverwendet,istesratsam,sieeinzufahren.
Einen schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromato-
graphen einschalten und allmählich auf eine Temperatur von
mindestens 20 ºC über der Arbeitstemperatur (Hinweis 6) aufheizen.
Diese Temperatur ist mindestens 2 Stunden konstant zu halten, und
dann sind die Analysenbedingungen einzustellen (Gasstrom, Split,
ZündenderFlamme,Schreiberanschluß,Einstellen derOfentemperatur,
Injektor, Detektor). Dann eine Empfindlichkeit wählen, die mindestens
doppelt so groß ist wie bei der Durchführung der Analyse. Die Grund-
linie mußlinear verlaufen, ohnePeaksoderDrift.
Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluß der
Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule
hin.
Hinweis 6:Die Einfahrtemperatur muß in jedem Fall 20 ºC unter der
für die stationäre Phase angegebenen Maximaltemperatur
liegen.
5.4.2. WahlderArbeitsbedingungen5.4.2.1. AnhaltspunktefürdieArbeitsbedingungen:
Säulentemperatur: 260ºC±5ºC,
Verdampfertemperatur: 280ºC,Detektortemperatur: 290ºC,Strömungsgeschwindigkeit: Helium 20—35 cm/s; Wasserstoff
30—50cm/s,
Splitverhältnis: 1:50—1:100,
Geräteempfindlichkeit: das4-bis16fache derMindestdämpfung,
Detektorempfindlichkeit: 1—2mVf.s.,Papiervorschub:30—60cm/Std.,Einspritzvolumen: 0,5—1µlTMSE-Lösung.Diese Bedingungen können entsprechend den Charakteristiken der
Säule und des Gaschromatographen derart geändert werden, daß die1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—22
▼B
damit aufgezeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen
erfüllen:
— dieRetentionszeit von β-Sitosterinmuß20±5Minutenbetragen;
— der Campesterin-Peak muß bei Olivenöl (Durchschnittsgehalt 3 %)
15 ± 5 % des Skalenbereichs und bei Sojaöl (Durchschnittsgehalt
20%)80±10%desSkalenbereichs betragen;
— alle enthaltenen Sterinemüssengetrennt werden; dieanderen Peaks
müssen ebenfalls völlig aufgelöst sein, d. h. der Peakverlauf muß
auf die Grundlinie zurückführen, bevor der nächste Peak beginnt;
eine unvollständige Auflösung ist nur unter der Bedingung akzep-
tabel, daßderRRT-1,02-Peakmit HilfederSenkrechten quantitativ
zubestimmen ist.
5.4.3. DurchführungderAnalyse
5.4.3.1. Mit der 10-µl-Mikroliterspritze 1 µl Hexan entnehmen, 0,5 µl Luft und
anschließend 0,5—1 µl Probenlösung aufziehen; dabei den Kolben der
Spritze so weit einziehen, daß die Nadel leer ist. Die Nadel in die
Membran des Injektors einführen, nach 1—2 Sekunden schnell
einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam heraus-
ziehen.
5.4.3.2. Das Chromatogramm aufzeichnen, bis alle Sterin-TMS-Ether eluiert
sind.
DieGrundliniemußstetsdenvorgeschriebenenAnforderungen(5.4.1.2)
genügen.
5.4.4. Identifizierung derPeaks
Die einzelnen Peaks werden anhand der Retentionszeiten und durch
Vergleich mit dem unter denselben Bedingungen analysierten TSME-
GemischderSterine bestimmt.
DieSterine werdeninfolgender Reihenfolge eluiert: Cholesterin, Bras-
sicasterin, 24-Methylen-Cholesterin, Campesterin, Campestanol,
Stigmasterin, ∆7-Campesterin, ∆5, 23-Stigmastadienol, Chlerosterin, β-
Sitosterin,Sitostanol, ∆5-Avenasterin, ∆5, 24-Stigmastadienol, ∆7-Stig-
mastenol, ∆7-Avenasterin.
In Tabelle I sind die Retentionszeiten relativ zu β-Sitosterin für eine
SE-52-undSE-54-Säuleaufgeführt.
Die Abbildungen 1 und 2 zeigen die typischen Chromatogramme
einigerÖle.
5.4.5. Quantitative Bestimmung
5.4.5.1. Mit Hilfe des Integrators werden die Peak-Flächen von α-Cholestanol
und der Sterine berechnet. Dabei sind etwa auftretende Peaks von
Substanzen, die inTabelle I nicht aufgeführt sind, nicht zu berücksich-
tigen. DerResponsefaktorvon ►C1α-Cholestanol ◄sollgleich 1,00
gesetztwerden.
5.4.5.2. Der Gehalt an den einzelnen Sterinen in mg/100 g Fett wird nach
folgenderFormel berechnet:
Sterinx=Ax·ms·100
As·m
Darinbedeuten:
Ax= Peakfläche desSterinsx ►M6 ◄,
As= Peakfläche von α-Cholestanol ►M6 ◄,
ms= zugesetzte Mengean α-Cholestanol inmg,
m = MengederfürdieBestimmungentnommenen Probeing.
6. ERGEBNISSE
6.1. Der Gehalt an den einzelnen Sterinen wirdin mg/100 g Öl angegeben,
ihreSummeals„Gesamtsterine“.
6.2. Der prozentuale Anteil jedes einzelnen Sterins errechnet sich aus dem
Quotienten der Peakfläche des entsprechenden Peaks und der Summe
derPeakflächen aller SterinenachderFormel
►C1%Sterinx= ◄Ax
ΣA.1001991R2568—DE—28.05.1995—012.001—23
▼B
Darinbedeuten:
Ax= Peakfläche desSterinsx,
ΣA = SummederPeakfläche aller Sterine.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—24
▼B
ANLAGE
Bestimmung der linearen Strömungsgeschwindigkeit
In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatographen werden 1 bis
3µlMethan(oderPropan)eingespritztundbiszumPeak-Austritt(tM)gemessen.
Die lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tMdefiniert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tMdie gemessene Zeit in
Sekunden.
Tabelle I
Relative Retentionszeit derSterine
Pe-
akIdentifizierungRelative Retentions-
zeit
SE54 SE52
1 Cholesterin ∆-5-Cholesten-3 β-ol 0,67 0,63
2 Cholestanol 5 α-Cholestan-3 β-ol 0,68 0,64
3 Brassicasterin [24S]-24-Methyl- ∆-5,22-cholestadien-3 β-ol 0,73 0,71
4 24-Methylen-Cholesterin 24-Methylen- ∆-5,24-cholestadien-3 β-ol 0,82 0,80
5 Campesterin [24R]-24-Methyl- ∆-5-cholesten-3 β-ol 0,83 0,81
6 Campestanol [24R]-24-Methyl-cholestan-3 β-ol 0,85 0,82
7 Stigmasterin [24R]-24-Ethyl- ∆-5,22-cholestadien-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆-7-Campesterol [24R]-24-Methyl- ∆-7-cholesten-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆-5,23-Stigmastadienol [24R,S]-24-Ethyl- ∆-5,23-cholestadien-3 β-ol 0,95 0,95
10 Chlerosterin [24S]-24-Ethyl- ∆-5,25-cholestadien-3 β-ol 0,96 0,96
11►C1B-Sitosterin ◄► C1[24R]-24-Ethyl- ∆-5-cholestan-3B-
ol◄1,00 1,00
12►C1Sitostanol ◄► C124-Ethyl-cholestan-3B-ol ◄ 1,02 1,02
13 ∆-5-Avenasterin [24Z]-24-Ethyliden- ∆-5-cholesten-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆-5,24-Stigmastadienol [24S,R]-24-Ethyl- ∆-5,24-cholestadien-3 β-ol 1,08 1,08
15 ∆-7-Stigmastenol [24S,R]-24-Ethyl- ∆-7,24-cholestadien-3 β-ol 1,12 1,12
16 ∆-7-Avenasterin [24Z]-24-Ethyliden- ∆-7-cholesten-3 β-ol 1,16 1,161991R2568—DE—28.05.1995—012.001—25
▼B
Abbildung 1
Gaschromatogramm der Sterinfraktion von rohem Oivenöl
1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—26
▼B
Abbildung 2
Gaschromatogramm der Sterinfraktion von raffiniertem Olivenöl
1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—27
▼B
ANHANG VI
BESTIMMUNG DES ERYTHRODIOLS UND DES UVAOLS
EINLEITUNG
Das (üblicherweise als Summe von Erythrodiol und Uvaol angegebene)
Erythrodiol ist ein Bestandteil des Unverseifbaren, das für verschiedene
Fette charakteristisch ist. Seine Konzentration ist in extrahierten
Olivenölen erheblich höher als in anderen Ölen (Olivenöl aus Pressung,
Traubenkernöl),indenenesauchvorkommt.DeshalbkanneszumNach-
weisfürdasVorhandenseinvonextrahiertem Olivenöldienen.
1. ZWECKUNDANWENDUNGSBEREICH
Die Methode beschreibt ein Verfahren für die Bestimmung des Erythro-
diolgehalts inFetten.
2. PRINZIPDERMETHODE
Das Fett wird mit einer ethanolischen Kaliumhydroxidlösung verseift,
danndasUnverseifbaremitEthyletherextrahiertundübereineAluminiu-
moxidsäulegereinigt.
DieFraktionierungdesUnverseifbarenwirddurchDünnschichtchromato-
graphie auf Kieselgelplatten durchgeführt, anschließend werden die
Zonen der Sterinfraktion und der Erythrodiolfraktion isoliert. Die von
derPlatteisolierten SterineunddasErythrodiol werdeninTrimethylsily-
lether überführt, dann wird die Mischung gaschromatographisch
untersucht. Das Ergebnis wird angegeben als Prozent Erythrodiol der
Gesamtmenge vonErythrodiol plusSterine.
3. GERÄTE
3.1. DieimAnhangV(Bestimmung desSteringehalts)beschriebenen Geräte.
4. REAGENZIEN
4.1. Die im Anhang V(Bestimmung des Steringehalts) vorgeschriebenen
Reagenzien.
4.2. Referenzlösung von0,5%Erythrodiol inChloroform.
5. VERFAHREN
5.1.Herstellung des Unverseifbaren
Es wird gemäß 5.1.2 des in Anhang Vbeschriebenen V erfahrens vorge-
gangen.
5.2.Abtrennung des Erythrodiols und der Sterine
5.2.1. Vergleiche 5.2.1inAnhangV.
5.2.2. Vergleiche 5.2.2inAnhangV.5.2.3. Eine 5%ige Lösung des Unverseifbaren in Chloroform herstellen. Mit
einer0,1-ml-Mikroliterspritze0,3mldieserLösungaufeineDünnschicht-
platte 1,5 cm vom unteren Plattenrand entfernt in einem möglichst
dünnen und gleichmäßigen Strich auftragen. An einem Ende der Platte
werden als Referenzsubstanzen einige Mikroliter der Lösungen von
CholesterinundErythrodiol aufgetragen.
5.2.4. Die Platte in die nach 5.2.2 vorbereitete Entwicklerkammer geben. Die
Raumtemperatur soll etwa 20 ºC betragen. Die Kammer sofort mit dem
Deckel verschließen und so lange entwickeln, bis die Lösungsmittelfront
1 cm unter dem oberen Plattenrand angekommen ist. Die Platte aus der
Entwicklerkammer nehmen und das Lösungsmittel in einem warmen
Luftstromabdampfen.
5.2.5. DiePlattegleichmäßigmitderalkoholischen2 ′,7′-Dichlorfluoresceinlö-
sung besprühen. Unter UV-Licht den Verlauf der Sterin- und
ErythrodiolzoneanHandderReferenzsubstanzenidentifizierenundetwas
außerhalb derfluoreszierenden Zonenmarkieren.
5.2.6. Die markierten Kieselgelzonen mit einem Metallspatel abkratzen. Das
von der Platte isolierte Material in ein 50-ml-Becherglas geben, 15 ml1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—28
▼B
warmes Chloroform zugeben, gut schütteln und in einen Glasfiltertiegel
füllen. Dreimal mit je 10 ml warmem Chloroform auswaschen und die
Filtrate in einem 100-ml-Rundkolben sammeln. Bis auf ein Volumen
von 4—5 ml eindampfen, in ein vorher gewogenes, konisches 10-ml-
Zentrifugenröhrchen geben, im warmen Stickstoffstrom trocknen und
anschließend wiegen.
5.3. HerstellungderTrimethylsilylether
NachdeminAnhangVunter5.3beschriebenen Verfahrenvorgehen.
5.4. Gaschromatographische Analyse
NachderBeschreibungunter5.4desvorgenanntenVerfahrensvorgehen.Die Bedingungen der gaschromatographischen Analyse müssen so
gewählt werden, daß nicht nur die TMS-Ether der Sterine, sondern auch
dieTMS-EthervonErythrodiol undUvaolgetrennt werden.
Nach dem Einspritzen das Schreiberpapier ablaufen lassen, bis alle
Sterine, Erythrodiol und Uvaol eluiert sind. Identifizieren der Peaks
(Erythrodiol und Uvaol haben im Vergleich zu β-Sitosterin relative
Retentionszeiten von etwa 1,45 und 1,55) und Berechnung der Flächen-
prozente, wiefürSterinebeschrieben.
6. ABFASSUNGDERERGEBNISSE
%Erythrodiol =A
1+A2
A1+A2+ΣASterine×100
Hierinbedeuten:
A1= FlächedesErythrodiolpeaks ►M6 ◄,
A2= FlächedesUvaolpeaks ►M6 ◄,
ΣASterine= Summe der vorhandenen Sterinpeaks
►M6 ◄.
DasErgebniswirdmiteinerDezimale nachdemKommaangegeben.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—29
▼B
ANHANG VII
BESTIMMUNG VON FETTSÄUREN IN 2-STELLUNG DER TRIGLYCE-
RIDE
1. ZWECK
DieseMethodebeschreibt einVerfahrenzurBestimmungderZusammen-
setzung des Teils der Fettsäuren eines Öles oder Fettes, die in 2-Stellung
(βoderinnereStellung)desGlycerinsverestert sind.
2. ANWENDUNGSBEREICH
DieseMethodegiltfürÖleundFettemiteinemSchmelzpunktunter45ºC,
bedingt durchdieBesonderheiten derWirkungsweisederPankreaslipase.
Sie ist nicht uneingeschränkt anwendbar auf Öle und Fette mit höheren
Anteilen an Fettsäuren mit zwölf oder weniger Kohlenstoffatomen
(Kokos- und Palmkernöl, Butterfett), hoch ungesättigten Fettsäuren (mit
mehr als vier Doppelbindungen), die zwanzig oder mehr Kohlenstoff-
atome enthalten (Fisch- und Seetieröle), oder Fettsäuren mit
sauerstoffhaltigen GruppenaußerderSäuregruppe.
3. PRINZIP
Wenn nötig, Neutralisierung von sauren Ölen und Fetten in einem
Lösungsmittel. Reinigung über eine Aluminiumoxidsäule. Teilhydrolyse
derTriglyceridedurchPankreaslipaseineinervorgegebenenZeit.Abtren-
nung der gebildeten Monoglyceride durch Dünnschichtchromatographie
und Umesterung dieser Monoglyceride mit Methanol. Die gewonnenen
Methylester werdengaschromatographisch analysiert.
4. GERÄTE
4.1. 100-ml-Rundkolben.4.2. 25-ml-Rundkolben mitSchliff.4.3. 1mlangesSteigrohrmitSchliffansatz fürdenKolben4.2.4.4. 250-ml-Kolben.4.5. 50-ml-Becherglas.4.6. 500-ml-Scheidetrichter.4.7. Glassäule für die Säulenchromatographie, 13 mm Innendurchmesser,
400mmLänge, mit Hahnundgläsernem Frittenboden.
4.8. 10-ml-Zentrifugenglas, mit Schliffstopfen.
4.9. 5-ml-Bürette, Graduierung0,05ml.4.10. 1-ml-Injektionsspritze, mit dünnerKanüle.4.11. Mikroliterspritze, zurAbgabevonTropfenvonjeweils 3—4µl.4.12. Beschichtungsgerät fürDünnschichtplatten.4.13. Glasplatten fürDünnschichtchromatographie, 20×20cm.4.14. Entwicklerkammer für die Dünnschichtchromatographie, mit Schliffrand,
für20×20cmPlatten.
4.15. SprüherfürdieDünnschichtchromatographie.4.16. Trockenschrank, einstellbar auf103±2ºC.
4.17. Thermostat, regulierbar zwischen30und45ºC±0,5ºC.
4.18. Rotationsverdampfer.4.19. Elektrisches Schüttel- und Vibriergerät zum kräftigen Schütteln des
Zentrifugenglases.
4.20. Ultraviolettlampe zurBetrachtung derDünnschichtplatten.
Und für die Kontrolle der Lipasetätigkeit:
4.21. EinpH-Meßgerät.
4.22. Propellerrührer.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—30
▼B
4.23. 5-ml-Bürette.
4.24. Stoppuhr.
Und für die eventuelle Zubereitung der Lipase:
4.25. Laborrührgerät zumZerkleinern undMischenheterogener Materialien.
5. REAGENZIEN
5.1. n-Hexan oder, falls nicht verfügbar, Petrolether (Kp. 30—50 ºC), für die
Chromatographie.
5.2. 2-PropanoloderEthanol 95%ig(V/V),analytisch rein.
5.3. 2-PropanoloderEthanol, 1:1wäßrigeLösung.5.4. Diethylether, peroxidfrei.
5.5. Aceton.
5.6. Ameisensäure,mindestens98%ig(m/m).5.7. Fließmittel:Mischungausn-Hexan(5.1),Diethylether(5.4)undAmeisen-
säure(5.6)imVerhältnisvon70:30:1(V/V/V).
5.8. Aktiviertes Aluminiumoxid für die Chromatographie, neutral, Aktivi-
tätsstufe Brockmann1.
5.9. Kieselgel, mitBindemittel fürdieDünnschichtchromatographie.5.10. Pancreaslipase mit ausreichender Aktivität (Anmerkungen1und2).
5.11. Natriumhydroxid, 120g/lwäßrigeLösung.
5.12. Salzsäure, 6N.5.13. Kalziumchlorid (CaCl
2),220g/lwäßrigeLösung.
5.14. Natriumcholat (Enzymqualität), 1g/lwäßrigeLösung.
5.15. Pufferlösung: 1 M wäßrige Lösung von tris-Hydroxymethylaminomethan
durchZusatzvonSalzsäure(5.12)aufpH8gebracht(durchPotentiometer
überprüfen).
5.16. Phenolphthalein, Lösungvon10g/lin95%igem(V/V)Ethanol.
5.17. 2′,7′-Dichlorfluorescein, Lösung von 2 g/l in 95 %igem (V/V) Ethanol,
schwach alkalisch durch Zusatz eines Tropfens 1-N-Natriumhydroxidlö-
sungpro100ml.
Und für die Kontrolle der Lipasetätigkeit:
5.18. Neutralisiertes Öl.5.19. Natriumhydroxid, 0,1Nwäßrigre Lösung.
5.20. Natriumcholat (Enzymqualität), wäßrigeLösungvon200g/l.
5.21. Gummiarabikum, wäßrigeLösungvon100g/l.
6. VORBEREITUNGDERPROBE
Liegt der Gehalt an freien Fettsäuren nach einer Bestimmung gemäß
Anhang II unter 3 %, so ist direkt über Aluminiumoxid, wie unter 6.2
beschrieben, zu reinigen. Weist die Probe einen Gehalt an freien Fett-
säuren von über 3% gemäß AnhangII auf, soist sie in Gegenwart eines
Lösungsmittels gemäß 6.1 mit Alkali zu neutralisieren und dann über
Aluminiumoxid gemäß 6.2zugeben.
6.1.Neutralisierung durch Alkali in Gegenwart eines Lösungsmittels
Etwa 10 g rohes Öl in einen Scheidetrichter (4.6) geben und 100 ml
Hexan (5.1), 50 ml 2-Propanol (5.2), einige Tropfen Phenolphthaleinlö-
sung (5.16) und so viel Natriumhydroxidlösung (5.11) hinzufügen, wie
dem Gehalt des Öls an freien Fettsäuren zuzüglich 0,3 % Überschuß
entspricht. Eine Minute lang kräftig schütteln, 50 ml destilliertes Wasser
zugeben,erneut schüttelnundabsetzen lassen.
Nach dem Absetzen die untere, die Seifen enthaltende Schicht sowie
etwaige Zwischenschichten (Schleim, unlösliche Stoffe) entfernen. Die
HexanlösungdesneutralisiertenÖlsmehrmalsmit25—30mlder2-Propa-
nollösung (5.3) waschen, bis die Rosafärbung des Phenolphthaleins
verschwindet.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—31
▼B
Den größten Teil des Hexans unter Vakuum im Rotationsverdampfer
(4.18)abdestillieren, dasÖlbei30—40ºCunterVakuumineinemStick-
stoffstromtrocknen,bisdasHexanvollständigentferntist.
6.2.Reinigung über Aluminiumoxid
Eine Suspension von 15 g aktiviertem Aluminiumoxid (5.8) in 50 ml
Hexan (5.1) herstellen und unter Rühren in die Chromatographiesäule
(4.7) gießen. Das Aluminiumoxid gleichmäßig absetzen lassen und
warten, bis das Lösungsmittel auf 1—2 mm über dem Absorptionsmittel
abgelaufen ist.AufdieSäulevorsichtigeine Lösungvon5gÖlin25ml
Hexan (5.1) gießen; die gesamte aus der Säule ablaufende Flüssigkeit in
einem Rundkolben(4.1)sammeln.
7. HERSTELLUNGDERDÜNNSCHICHTPLATTEN
Die Glasplatten (4.13) sorgfältig mit Ethanol, Petrolether und Aceton
reinigen, um jeden Fettrest zu beseitigen. In einen Erlenmeyerkolben
(4.4) 30 g Kieselgel (5.9) geben, 60 ml destilliertes Wasser hinzufügen,
verschließen und eine Minute kräftig schüttteln. Die Suspension sofort in
dasBeschichtungsgerät (4.12)geben undeine 0,25mmdicke Schicht auf
diePlattenauftragen.DiePlatten15MinutenanderLuftundeineStunde
im Trockenschrank (4.16) bei 103 ± 2 ºC trocknen. Die Platten vor
Verwendungineinem ExsikkatoraufRaumtemperatur abkühlen.
Fertigplatten sindimHandelerhältlich.
8. VERFAHREN8.1.Hydrolyse durch Pancreaslipase
IndasZentrifugenglas(4.8)etwa0,1gdervorbereitetenProbeeinwiegen;
handelt es sich um ein festes Fett, muß es in 0,2 ml Hexan (5.1), evtl.
unterschwachemErwärmen,gelöstwerden.
20 mg Lipase (5.10) und 2 ml der Pufferlösung (5.15) hinzufügen.
Sorgfältig und vorsichtig schütteln und dann 0,5 ml der Natriumcholatlö-
sung (5.14) und 0,2 ml der Kalziumchloridlösung (5.13) hinzufügen. Das
Glas mit dem Schliffstopfen verschließen, vorsichtig schütteln
(Befeuchten des Stopfens vermeiden), das Glas sofort bei 40 ± 0,5 ºC in
den Thermostaten (4.17) stellen und genau eine Minute mit der Hand
schütteln.
Das Glas aus dem Thermostaten nehmen und mit Hilfe des Vibriergeräts
(4.19)genau2Minutenlangkräftigschütteln.
Sofort in fließendem Wasser abkühlen; 1 ml Salzsäure (5.12) und 1 ml
Diethylether (5.4) hinzufügen. Verschließen und kräftig mit dem elektri-
schen Schüttelgerät schütteln. Stehen lassen und die organische Phase
mit Hilfe der Spritze (4.10), gegebenenfalls nach Zentrifugieren,
abnehmen.
8.2.Abtrennung der Monoglyceride durch Dünnschichtchromatographie
Den Extrakt mit der Mikroliterspritze (4.11) auf die Dünnschichtplatte
auftragen, und zwar 1,5 cm vom unteren Rand entfernt, als dünnen,
einheitlichen Strich. Die Platte in die gut gesättigte Entwicklerkammer
(4.14) stellen und mit dem Fließmittel (5.7) bei etwa 20 ºC bis 1 cm
vomoberenPlattenrand entfernt entwickeln.
DiePlatteanderLuftbeidergleichenTemperaturwieinderEntwickler-
kammer trocknen und mit 2 ′,7′-Dichlorfluoresceinlösung (5.17)
besprühen. Die Zone der Monoglyceride (Rf etwa 0,035) unter UV-Licht
(4.20)markieren.
8.3.Analyse der Monoglyceride durch Gaschromatographie
Die nach 8.2 erhaltene Kieselgelzone mit einem Spatel abkratzen
(vermeiden, daß auch die auf der Startlinie verbleibenden Bestandteile
mit erfaßtwerden)undindasMethylierungskölbchen (4.2)überführen.
DasgesammelteKieselgel,sowieesvorliegt,nachdemVerfahrengemäß
Anhang XB behandeln, die Monoglyceride in Methylester überführen,
danndieEstergaschromatographisch nachdemVerfahrengemäßAnhang
XAuntersuchen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—32
▼B
9. FORMULIERUNGDERERGEBNISSE
DieZusammensetzungderFettsäurenin2-StellungaufeineDezimalstelle
genauangeben (Anmerkung3).
10. ANMERKUNGEN
Anmerkung 1: PrüfungderLipasetätigkeit
Aus einem Gemisch von 165 ml Gummiarabikumlösung
(5.21), 15 g gemahlenem Eis und 20 ml neutralisiertem
Öl(5.18)miteinemgeeignetenRührgeräteineÖlemulsion
herstellen.
10 ml dieser Emulsion in ein Becherglas (4.5) geben,
anschließend0,3mlNatriumcholatlösung(5.20)und20ml
destilliertes Wasserhinzufügen.
Das Becherglas bei 37 ± 0,5 ºC (Anmerkung 4) in einen
Thermostaten stellen; die Elektroden eines pH-Meters
(4.21)undeinenSpiralrührer(4.22)einsetzen.
Mit Hilfe einer Bürette (4.23) tropfenweise Natriumhydro-
xidlösung (5.19) hinzufügen bis zu einem pH-Wert von
8,5.
Eine ausreichende Menge der wäßrigen Lipasesuspension
(siehe nachstehend) hinzufügen. Sobald das pH-Meter 8,3
anzeigt, die Stoppuhr anstellen (4.24) und Natriumhydro-
xidlösung (5.19) so zutropfen lassen, daß der pH-Wert bei
8,3 gehalten wird. Das Volumen der pro Minute
verbrauchten Alkalilösungnotieren.
Die Werte in ein Koordinatensystem eintragen, und zwar
dieZeitablesungen alsAbszisseunddieAnzahlmlAlkali-
lösung zur Konstanthaltung des pH-Werts als Ordinate.
Dabeimußsicheine Geradeergeben.
DievorstehenderwähnteLipasesuspensionisteineSuspen-
sion von eins zu Tausend in Wasser. Für jeden Versuch
soviel der Suspension verwenden, daß in 4 bis 5 Minuten
etwa 1 ml Alkalilösung verbraucht wird. Normalerweise
werdenetwa1—5mgLipasepulvergebraucht.DieLipase-
einheit wird als die Menge Enzym definiert, die 10
Mikroäquivalente Säure pro Minute freisetzt. Damit ergibt
sich die Aktivität A des verwendeten Pulvers, ausgedrückt
alsLipaseeinheiten inmg,anhandfolgender Formel:
A¼V/C210
m
Dabei entspricht Vder Anzahl der pro Minute
verbrauchten ml Natriumhydroxidlösung (5.19), berechnet
aus der graphischen Darstellung, m ist das Gewicht der
Lipaseprobe inmg.
Anmerkung 2: HerstellungderLipase
Lipasen mit ausreichender Lipasetätigkeit sind im Handel
erhältlich.SiekönnenaberauchimLaborwiefolgtherge-
stellt werden: 5 kg frisches Schweinepankreas auf 0 ºC
abkühlen; das umhüllende feste Fett und die anhängenden
Gewebe entfernen und im Mixer zerkleinern, bis ein flüs-
siger Brei ensteht. Diesen Brei mit dem Rührgerät (4.25)
4—6 Stunden mit 2,5 l wasserfreiem Aceton rühren,
anschließend zentrifugieren. Den Rückstand noch dreimal
mit dem gleichen Volumen Aceton, dann zweimal mit
einer Mischung von Aceton und Diethylether 1: 1 (V/V)
und zweimal mit Diethylether extrahieren. Den Rückstand
im Vakuum 48 Stunden lang trocknen, bis ein stabiles
Pulver entsteht, das im Kühlschrank aufbewahrt werden
sollte.
Anmerkung 3: In jedem Fall ist es ratsam, die Zusammensetzung der
Gesamtfettsäuren der gleichen Probezubestimmen, daein
VergleichmitdenFettsäurenin2-StellungbeiderInterpre-
tationderWerte vonNutzenist.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—33
▼B
Anmerkung 4: DieHydrolysentemperaturwirdauf37ºCeingestellt,wenn
ein flüssiges Öl verwendet wird. Sie wird jedoch für die
Untersuchungsproben auf 40 ºC festgelegt, um auch die
UntersuchungvonFettenmitSchmelzpunktenbiszu45ºC
zuermöglichen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—34
▼B
ANHANG VIII
BESTIMMUNG DES TRILINOLEINGEHALTS
1. ZWECK
DievorliegendeNormbeschreibteinVerfahrenzurTrennungundquantita-
tiven Bestimmung der Zusammensetzung von Triglyceriden in
Abhängigkeit von Molekulargewicht und Grad der Ungesättigtheit, ausge-
drücktin„äquivalenten Kohlenstoffzahlen“ (sieheAnmerkung1).
2. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Norm gilt für alle pflanzlichen Öle, die Triglyceride langkettiger
Fettsäuren enthalten. Das Verfahren eignet sich insbesondere zum Nach-
weis von kleinen Mengen linolsäurereicher halbtrocknender Öle in den
Ölen, die überwiegend Ölsäure als ungesättigte Fettsäure enthalten, wie z.
B.Olivenöl.
3. PRINZIP
Trennung der Triglyceride durch Umkehrphasenchromatographie in
Abhängigkeit von ihren äquivalenten Kohlenstoffzahlen und Auswertung
derChromatogramme.
4. GERÄTE
4.1. Flüssigchromatograph,dersoausgestattetist,daßdieTemperaturderSäule
übereinenThermostaten kontrolliert werdenkann.
4.2. Einspritzsystem mit einer10-µl-Probenschleife.
4.3. Detektor: Differentialrefraktometer. Im Bereich der höchsten Empfindlich-
keit sollten wenigstens 10−4Einheiten des Brechungsindexes erreicht
werden.
4.4. Säule: Säule aus rostfreiem Stahl von 250 mm Länge und 4,5 mm Durch-
messer, gefüllt mit Kieselgelpartikeln, die mit Oktadecylsilan belegt sind
(Durchmesser 5 µm). Die durchschnittliche Kohlenstoffbelegung sollte bei
etwa22—23%liegen (sieheAnmerkung2).
4.5. Schreiber und/oderIntegrator.
5. REAGENZIEN
DieReagenzienmüssenanalytischreinsein.DieFließmittelsolltenentgast
sein.SiekönnenmehrereMalewiederverwendetwerden,ohnedaßdadurch
dieTrennleistungen beeinflußt werden.
5.1. Chloroform.
5.2. Aceton.
5.3. Acetonitril.5.4. Fließmittel: Aceton/Acetonitril. Das Mischungsverhältnis ist so einzu-
stellen, daß damit die gewünschte Trennung erzielt wird. Man geht
zunächst voneinem Mischungsverhältnisvon1:1aus.
5.5. Lösungsmittel: Aceton oder eine Mischung von Aceton/Chloroform im
Verhältnis1:1.
5.6. Triglyceride als Referenzsubstanzen. Entweder mit Hilfe der im Handel
verfügbaren Triglyceride (Tripalmitin, Triolein usw.) ein Diagramm aus
den Retentionszeiten und den äquivalenten Kohlenstoffzahlen aufzeichnen
oder ein Referenzchromatogramm des Sojaöls verwenden (siehe Anmer-
kungen3und4sowieAbbildungen1und2).
6. VORBEREITUNGDERPROBEN
Von der zu analysierenden Probe wird eine 5 %ige Lösung hergestellt,
indem genau 0,5 g ± 0,001 g der Probe in einen 10-ml-Meßkolben einge-
wogenundmit demLösungsmittel (5.5)auf10mlaufgefüllt werden.
7. VERFAHREN
7.1. Das HPLC-Gerät in Betrieb setzen. Das Fließmittel (5.4) wird mit einer
Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 ml/min durch die Säule gepumpt, um
dasgesamteSystemzureinigen.Eswirdsolangegewartet,biseinestabile1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—35
▼B
Grundlinie erreicht ist. Anschließend werden 10 µl der gemäß Ziffer 6
hergestellten Probeeingespritzt.
8. BERECHNUNGUNDABFASSUNGDERERGEBNISSE
Es wird die Methode der inneren Standardisierung angewandt, d. h. man
geht davon aus, daß die Summe der Peakflächen, die den verschiedenen
Triglyceriden entsprechen, 100 % darstellen. Der relative prozentuale
AnteileinesjedenTriglycerids wirdberechnet nachderFormel
%Triglycerid =Peakfläche
SummederPeakflächen×100
DasErgebnisistaufeine StellenachdemKommaanzugeben.
Anmerkung 1: DieReihenfolgederElutionkanndurchdieBerechnungder
„äquivalenten Kohlenstoffzahlen“ (NCE) ermittelt werden.
Diesesindwiefolgtdefiniert:
NCE=NC−2n.DabeiistNCdieZahlderKohlenstoffatomeundndieZahl
derDoppelbindungen.
Wenn n
o,n1und n1ndie Zahlen der Doppelbindungen sind,
dievonderÖl-bzw.derLinol- undLinolensäure stammen,
so kann die äquivalente Kohlenstoffzahl berechnet werden
nachderFormel
NCE=NC−dono−d1n1−d1nn1n.
Die Koeffizienten do,d1und d1nkönnen mit Hilfe der
Triglyceride, die als Referenzsubstanzen benutzt wurden,
berechnet werden. Unter den in dieser Methode beschrie-
benenBedingungengilt etwafolgende Beziehung
NCE=NC−2,60no−2,35n1−2,17n1n.
Anmerkung 2: Beispiele: LichrosorbRP18(Merck)Art50333,
Lichrospher 100 CH-18 (Merck) Art 50377 oder
ähnliches Füllmaterial.
Anmerkung 3: Man kann ebenfalls mit mehreren Triglyceriden als Refe-
renzsubstanzen und mit Hilfe der korrigierten
Retentionszeit TR ′=T R−T RLösungsmitteldie Selektivität in
bezugaufTriolein wiefolgtberechnen:
α=TR′
TR′Olein
DiegraphischeDarstellungvonlog α=f(ZahlderDoppel-
bindungen) ermöglicht es, die Retention von allen
Triglyceriden zu bestimmen, die die Fettsäuren enthalten,
die in den als Referenzsubstanzen verwendeten Triglyce-ridenvorkommen(sieheAbbildung2).
Anmerkung 4: Die Trennfähigkeit der Säule muß eine klare Trennung des
Trilinolein-Peaks (LLL) auch von den Peaks der Triglyce-
ride ermöglichen, die eine nur wenig unterschiedliche
Retentionszeit besitzen.
Anmerkung 5: Rohes naturreines Olivenlampantöl und rohes Oliventre-
steröl müssen zur Erzielung einer sauberen Trennung des
Trilinoleinpeaks vom linken und rechten Nachbarpeak oder
von den Peaks etwaiger Verunreinigungen zunächst gemäß
folgendem Verfahrengereinigt werden:
200µl Öl werden unverdünnt auf eine Fest-Flüssig-Extrak-
tions-Kieselgelsäule (Type SEP PAK silica cartridge-waters
part.Nr.51900)aufgegeben.
Die Triglyzeride werden innerhalb von höchstens 20
Sekunden mit 20 ml wasserfreiem Hexan für die HPLC
eluiert.
DasEluatwirdimStickstoffstromabgeblasenundinIsopro-
panoloderAceton(5ml)gelöst.10bis20 µldavonwerden
der HPLC-Säule aufgegeben. Es ist darauf zu achten, daß
die Zusammensetzung der Fettsäuren vor und nach der1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—36
▼M11
▼M11
Reinigung gleich ist, wobei der Fehlergrenze des verwen-
detenAnalyseverfahrensRechnunggetragen wird.
Abbildung 1
Chromatogramm eines Sojaöls
Anmerkung: P=Palmitinsäure;St=Stearinsäure;O=Ölsäure;L=Linol-
säure;Ln=Linolensäure.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—37
▼B
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Abbildung 2
Graphische Darstellung von log αals Funktion von f (Zahl der Doppelbin-
dungen)
Anmerkung: La = Laurinsäure; My = Myristinsäure; P = Palmitinsäure; St
= Stearinsäure; O = Ölsäure; L = Linolsäure; Ln = Linolen-
säure.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—38
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ANHANG IX
UV-SPEKTROPHOTOMETRISCHE ANALYSE
EINLEITUNG
Die spektrophotometrische Untersuchung im Ultraviolettlicht kann
Angaben über die Qualität eines Fettes, seine Haltbarkeit und die infolge
technologischer Verfahreneingetretenen Veränderungenerbringen.
Die Absorption bei den in dem Verfahren vorgesehenen Wellenlängen ist
bedingt durch das Vorkommen konjugierter Dien- und Triensysteme. Die
AbsorptionwirdalsspezifischeExtinktionE1cm1%angegeben(Extinktion
einer 1 %igen Lösung des Fettes in dem vorgeschriebenen Lösungsmittel
bei einer Schichtdicke von 1cm). Sie wirdüblicherweise als Kbezeichnet
(auchExtinktionskoeffizient genannt).
1. ANWENDUNGSBEREICH
Das Verfahren beschreibt die Durchführung der spektrophotometrischen
UntersuchungvonFettenimUltraviolettlicht.
2. PRINZIP
Das zu untersuchende Fett wird in dem vorgeschriebenen Lösungsmittel
gelöst, anschließend wird die Extinktion der Lösung bei der vorgeschrie-
benen Wellenlänge im Vergleich zum reinen Lösungsmittel bestimmt. Die
spezifischen Extinktionen werden mit Hilfe der abgelesenen spektrophoto-
metrischen Werte errechnet.
3. GERÄTE
3.1. Spektrophotometer, geeignet zum Messen der Extinktionen im UV-Licht
zwischen220und360nmundmitderMöglichkeit,einzelnenanometrische
Einheiten ablesen zukönnen.
3.2. Rechteckige Quarzküvetten mit Deckel und einer optischen Länge von
1 cm. Die Extinktionen der mit Wasser oder einem geeigneten Lösungs-
mittel gefüllten Küvetten dürfen nicht mehr als 0,01 Einheiten
voneinander abweichen.
3.3. 25-ml-Meßkolben.
3.4. Chromatographiesäule mit einem oberen Teil von 270 mm Länge und 35
mm Durchmesser sowie einem unteren Teil von 270 mm Länge und 10
mmDurchmesser.
4. REAGENZIEN
4.1. — Isooktan(2,2,4-Trimethylpentan),spektrophotometrischrein:esmußim
Vergleich zu destilliertem Wasser eine Durchlässigkeit von mindestens
60%bei220nmundmindestens95%bei250nmhaben;oder
— Cyclohexan, spektrophotometrisch rein: esmußim Vergleich zu destil-
liertem Wasser eine Durchlässigkeit von mindestens 40 % bei 220 nm
undmindestens95%bei250nmhaben.
4.2. BasischesAluminiumoxidzurSäulenchromatographie,dasgemäßAnlage1
vorbereitet undgeprüftwurde.
4.3. n-Hexan,zurChromatographie.
5. VERFAHREN
5.1. Die zu untersuchende Probe muß absolut homogen und frei von suspen-
dierten Verunreinigungen sein. Die bei Raumtemperatur flüssigen Öle
werden bei einer Temperatur von etwa 30 ºC über Papier filtriert. Die
festenFettewerdenhomogenisiertundbeieinerTemperaturvonhöchstens
10ºCüberihremSchmelzpunktfiltriert.
5.2. Etwa 0,25 g der so vorbereiteten Probe in einen 25-ml-Meßkolben
einwiegen, mit dem vorgeschriebenen Lösungsmittel auffüllen und homo-1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—39
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
genisieren. Die so hergestellte Lösung muß absolut klar sein. Wenn die
Lösung trüb ist oder Verunreinigungen enthält, muß schnell über Papier
filtriert werden.
5.3. Mit der so hergestellten Lösung wird eine Küvette gefüllt und die Extink-
tion bei der entsprechenden Wellenlänge zwischen 232 und 276 nm
gemessen,wobeidasLösungsmittel alsReferenzlösung verwendetwird.
Die abgelesenen Extinktionen müssen im Bereich von 0,1 bis 0,8 liegen;
andernfalls müssen die Messungen unter Verwendung von entsprechend
stärkerkonzentrierten oderverdünntenLösungenwiederholt werden.
5.4. Wird eine Bestimmung der spezifischen Extinktion nach Behandlung mit
Aluminiumoxid verlangt, so ist wie folgt zu verfahren: 30 g basisches
Aluminiumoxid werden in einer Hexansuspension in die Säule gegeben.
Nach dem Absetzen des Adsorbens wird überschüssiges Hexan bis auf
1cmoberhalb derAluminiumoxidfüllung entfernt.
10 gFett, das wie unter 5.1beschrieben homogenisiert und filtriert wurde,
wird in 100 ml Hexan gelöst und die Lösung auf die Säule gegeben. Das
EluatwirdgesammeltunddasLösungsmittelimVakuumbeiTemperaturen
unter25ºCentfernt.
Mit dem so erhaltenen Fett wird sofort weiter verfahren wie unter 5.2
beschrieben.
6. ABFASSUNGDERERGEBNISSE
6.1. Angegeben werden die bei den verschiedenen Wellenlängen bestimmten
spezifischen Extinktionen (Extinktionskoeffizienten), die wie folgt zu
berechnen sind:
Kλ¼Eλ
c/C1s
Dabeibedeuten:
Kλ= die spezifische Extinktion (Extinktionskoeffizient) bei der
Wellenlängeλ,
Eλ= diebeiderWellenlänge λgemesseneExtinktion,
c = dieKonzentration derLösunging/100ml,
s = dieLänge derKüvetteincm.
DieErgebnissewerdenmit zweiDezimalstellen angegeben.
6.2. DiespektrophotometrischeUntersuchungvonOlivenölnachdemamtlichen
Verfahren der EWG-Verordnungen sieht die Bestimmung der spezifischen
Extinktion in einer Isooktanlösung bei den Wellenlängen 232 und 270 nm
sowiedieBestimmungvon ∆KgemäßfolgenderFormel vor:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
Dabei ist Kmdie spezifische Extinktion bei der Wellenlänge m, bei der im
Bereich von270nmdasMaximumderAbsorptionliegt.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—40
▼B
ANLAGE I
Vorbereitung des Aluminiumoxids und Prüfung seiner Aktivität
A.1.1. Vorbereitung des Aluminiumoxids
Das zuvor im Trockenschrank bei 380—400 ºC 3 Stunden lang getroc-
knete Aluminiumoxid in ein gut verschließbares Gefäß geben, je 100 g
Aluminiumoxid 5 ml destilliertes Wasser zugeben, das Gefäß rasch
verschließen, mehrfach schütteln und vor der Verwendung mindestens
12Stundenstehenlassen.
A.1.2. Überprüfung der Aktivität des Aluminiumoxids
Eine chromatographische Säule mit 30 g Aluminiumoxid füllen und
weiter wie unter 5.4 beschrieben verfahren. Über die Säule gibt man
eine Mischungbestehend aus
— 95%nativemOlivenölmiteinerspezifischenExtinktionbei268nm
vonwenigerals0,18und
— 5 % Erdnußöl, das bei der Raffination mit Bleicherde behandelt
wurde und eine spezifische Extinktion bei 268 nm von mindestens 4
aufweist.
Weist die Mischung nach dem Passieren der Säule eine spezifische
Extinktion bei 268nm vonmehrals0,11auf,soistdasAluminiumoxid
geeignet, anderenfalls istderWasserzusatzzuerhöhen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—41
▼B
ANLAGE II
Eichung des Spektrophotometers
A.2. Das Gerät muß regelmäßig (mindestens alle 6 Monate) im Hinblick auf
die Einstellung der Wellenlänge und die Genauigkeit der Anzeige über-
prüftwerden.
A.2.1. Die Überprüfung der Einstellung der Wellenlänge kann mit Hilfe einer
Quecksilberdampflampe odergeeigneter Filtererfolgen.
A.2.2. Zur Überprüfung der photoelektrischen Zelle und des Photomultipliers
wird wie folgt verfahren: 0,2 g reines Kaliumchromat für die Spektro-
photometrie einwiegen und in einer 0,05-N-Kaliumhydroxidlösung
lösen, dann in einen Meßkolben geben und auf 1000 ml auffüllen.
Anschließend genau 25ml der sohergestellten Lösungineinen 500-ml-
Meßkolben überführen und mit der gleichen Kaliumhydroxidlösung
auffüllen.DieExtinktiondersohergestelltenLösungbei275nmmessen
unddabeidieKaliumhydroxidlösungalsReferenzlösungverwenden.Die
miteiner1-cm-KüvettegemesseneExtinktionmuß0,2±0,005betragen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—42
▼B
ANHANG XA
GASCHROMATOGRAPHISCHE ANALYSE DER FETTSÄUREMETHY-
LESTER
1. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Norm enthält allgemeine Anweisungen zur Anwendung der
Gaschromatographie mit gepackten Säulen oder mit Kapillarsäulen zur
Bestimmungderqualitativen undquantitativen Zusammensetzung einer
Mischung von Fettsäuremethylestern, die nach dem in Anhang XB
beschriebenen Verfahrenhergestellt wurden.
DasVerfahreneignet sichnichtfürpolymerisierte Fettsäuren.
2. REAGENZIEN.2.1.Trägergas
Inertgas (Stickstoff, Helium, Argon, Wasserstoff usw.), vollständig
getrocknet undmit einem Sauerstoffgehalt unter10mg/kg.
Anmerkung 1: Der ausschließlich in Kapillarsäulen als Trägergas
verwendete Wasserstoff kann die Analysengeschwindig-
keit verdoppeln, ist aber gefährlich.
Sicherheitsvorrichtungen sindverfügbar.
2.2.Hilfsgase
2.2.1. Wasserstoff (Reinheit über 99,9 %), frei von organischen Verunreini-
gungen.
2.2.2. LuftoderSauerstoff,freivonorganischenVerunreinigungen.
2.3.Referenzstandard
Eine Mischung aus reinen Fettsäuremethylestern oder die Methylester
eines Fetts mit bekannter Zusammensetzung, die möglichst der Zusam-
mensetzung deszuanalysierenden Fettsähnlichsind.
Eine Oxidation der mehrfach ungesättigten Fettsäuren muß vermieden
werden.
3. GERÄTE
Die vorliegenden Instruktionen gelten für die übliche Ausrüstung für
die Gaschromatographie mit gepackter Säule oder Kapillarsäule und
Flammenionisationsdetektor. Jedes Gerät, das die in 4.1.2 beschriebene
LeistungundTrennungerbringt,istgeeignet.
3.1.Gaschromatograph
DerGaschromatographmußüberfolgende Bestandteile verfügen:
3.1.1. Einspritzsystem
VerwendetwirdeinEinspritzsystem entweder inVerbindung
a) mit gepackten Säulen und möglichst geringem Totvolumen (es muß
in diesem Fall auf Temperaturen erhitzt werden können, die um
20—50ºCüberderSäulentemperatur liegen)oder
b) mit Kapillarsäulen. In diesem Fall muß das Einspritzsystem speziell
fürdieseSäulenvorgesehensein.EskanndasSplit-Systemoderdas
Systemdersplitlosen„OnColumn“-Injektion sein.
Anmerkung 2: Sind Fettsäuren mit weniger als 16 Kohlenstoffatomen
nicht vorhanden, so kann ein Injektor mit beweglicher
Nadelverwendet werden.
3.1.2. Ofen
DerOfensolltesoausgelegtsein,daßdieSäuleaufmindestens260ºC
aufgeheizt und die Temperatur bei gepackten Säulen auf 1 ºC und bei
Kapillarsäulen auf 0,1 ºC genau konstant gehalten werden kann. Letz-
tere Bedingung ist vor allem dann wichtig, wenn eine „Fused Silica“-
Säuleverwendetwird.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—43
▼B
InjedemFall,besondersaberbeiFettsäurenmitwenigerals16Kohlen-
stoffatomen, wirdeine Heizungmit Temperaturprogramm empfohlen.
3.1.3. Gepackte Säule3.1.3.1. Säule aus einem Material, das unempfindlich ist gegenüber den zu
analysierenden Substanzen(z.B.GlasoderrostfreierStahl).
GrößederSäule:
a) Länge: 1—3 m. Eine relativ kurze Säule sollte verwendet werden,
wennlangkettigeFettsäuren(überC
20)vorkommen.BeiderAnalyse
von Säuren mit 4 oder 6 Kohlenstoffatomen wird eine 2 m lange
Säuleempfohlen;
b) Innendurchmesser: 2—4mm.
Anmerkung 3: Sind mehrfach ungesättigte Bestandteile mit mehr als
dreiDoppelbindungenvorhanden,sokönnensieineiner
SäuleausrostfreiemStahlzersetzt werden.
Anmerkung 4: Es kann ein System mit zwei gepackten Säulen
verwendetwerden.
3.1.3.2. Füllung,bestehend ausfolgenden Bestandteilen:
a)Trägermaterial: Mit Säure gewaschenes und silanisiertes Kieselgur
oder sonstiges geeignetes neutrales Trägermaterial mit einem engen
Korngrößenbereich (Schwankungsbereich 25 µm innerhalb der
Grenzwerte von 125 bis 200 µm), wobei die durchschnittliche
KorngrößeaufdenInnendurchmesserderSäuleabgestimmt wird.
b)Stationäre Phase: Polare Flüssigkeit vom Typ Polyester (z. B.
►C1Diethylenglykolpolysuccinat ◄,Butandiolpolysuccinat,Ethy-
lenglykolpolyadipat usw.), Cyanosilicone oder sonstige
Flüssigkeiten, die die erforderliche chromatographische Trennung
ermöglichen (siehe Ziffer 4). Die stationäre Phase sollte 5—20 %
(m/m) der Füllung ausmachen. Für bestimmte Trennungen kann
eine nichtpolare stationäre Phaseverwendet werden.
3.1.3.3. VorbereitungderSäule
Nachdem die Säule vom Detektor getrennt worden ist, den Ofen
allmählich auf 185 ºC aufheizen und einen Inertgasstrom von
20—60 ml/min mindestens 16 Stunden bei 185 ºC sowie weitere 2
Stundenbei195ºCdurchdiefrischhergestellte Säuleleiten.
3.1.4. Kapillarsäule3.1.4.1. Kapillare aus einem Material, das nicht mit den zu analysierenden
Stoffen reagiert (üblicherweise Glas oder „Fused Silica“). Der Innen-
durchmesser sollte zwischen 0,2 und 0,8 mm liegen. Die Innenflächen
müssen vor dem Auftragen der stationären Phase einer geeigneten
Behandlung unterzogen werden (beispielsweise Oberflächenvorberei-
tung, Desaktivierung). In den meisten Fällen ist eine Länge von 25 mausreichend.
3.1.4.2. Die stationäre Phase ist üblicherweise vom Typ Polyglykol (Polyethy-
lenglykol 20000), Polyester (Butandiolpolysuccinat) oder polarem
Polysiloxan (Cyanosilicon). Vernetzte (cross linked) Säulen sind
geeignet.
Anmerkung 5: Bei Verwendung von polaren Polysiloxanen können bei
der Identifizierung und Trennung von Linolensäure und
C
20-SäurenSchwierigkeiten auftreten.
DieBeschichtung solltedünn,beispielsweisenur0,1bis0,2µm,sein.
3.1.4.3. EinbauundVorbereitungderSäule
Beim Einbau der Kapillarsäule müssen die üblichen Vorsichtsmaß-
nahmen, wie Anordnung der Säule im Ofen (Träger), Auswahl und
Zusammenbau der Verbindungsstücke (Abdichtung), Ausrichten der
Säulenenden in dem Einspritzsystem und im Detektor (Verringerung
vonTotvolumen),getroffenwerden.DieSäulewirdmitdemTrägergas-
strom gespült (z. B. bei einer Säulenlänge von 25 m und einem
Innendurchmesservon0,3mmmit 0,3bar(30kPa)).
Zur Vorbereitung der Säule wird das Temperaturprogramm des Ofens
auf3ºC/mineingestellt unddieSäule,ausgehendvonderRaumtempe-
ratur, auf eine Temperatur von 10 ºC unter der Zersetzungsgrenze der
stationären Phase erhitzt. Diese Ofentemperatur wird 1 Stunde beibe-
halten, bis die Grundlinie stabilisiert ist. Dann auf 180 ºC
zurückschalten undunterisothermen Bedingungenweiterarbeiten.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—44
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Anmerkung 6: Entsprechend vorbehandelte Fertigsäulen können im
Handelbezogenwerden.
3.1.5. Der Detektor sollte auf eine höhere Temperatur als die Säulentempe-
raturerhitzt werdenkönnen.
3.2.Spritze
DieSpritzesollteeinemaximaleKapazitätvon10µlundeineGraduie-
rungin0,1µlhaben.
3.3.Schreiber
Wird dievondem Schreiber aufgezeichnete KurvezurBerechnung der
Zusammensetzung der analysierten Mischung verwendet, so wird ein
mit dem verwendeten Gerät kompatibler Schreiber von hoher Präzision
benötigt.DerSchreiber solltefolgendeMerkmale aufweisen:
a) Ansprechgeschwindigkeit unter 1,5 s, vorzugsweise 1 s (die
Ansprechgeschwindigkeit ist die Zeit, die der Schreiber benötigt,
um nach plötzlicher Auslösung eines Signals (100 %) von 0 % auf
90%auszuschlagen);
b) Papierbreite mindestens20cm;
c) Vorschubgeschwindigkeit einstellbar zwischen0,4und2,5cm/min.
3.4.Integrator oder Rechner (fakultativ)
EineschnelleundgenaueBerechnungistmitHilfeeineselektronischen
Integrators oder Rechners möglich, der eine lineare Reaktion bei ange-
messener Empfindlichkeit liefern soll. Dabei muß die Korrektur bei
AbweichungenvonderGrundliniezufriedenstellend sein.
4. VERFAHREN
Die in 4.1 bis 4.3 beschriebenen Verfahren beziehen sich auf den
GebraucheinesFlammenionisationsdetektors.
Alternativ kann auch ein Gaschromatograph mit einem Katharometer-
Detektor (der auf dem Prinzip der Änderungen der Wärmeleitfähigkeit
beruht) verwendet werden. In diesem Fall müssen die Betriebsbedin-
gungenentsprechendZiffer6geändert werden.
4.1.Versuchsbedingungen
4.1.1. Ermittlung der optimalen Betriebsbeding ungen
4.1.1.1. Gepackte Säule
Bei der Ermittlung der Versuchsbedingungen müssen folgende Varia-
blenberücksichtigt werden:
a) LängeundDurchmesserderSäule;
b) ArtundMengederstationären Phase;
c) Säulentemperatur;
d) Trägergasstrom;
e) erforderliche Trennleistung;
f) Größe der zu untersuchenden Probe, die so ausgewählt sein muß,
daßDetektorundElektrometer einelineare Anzeigeergeben;
g) Analysendauer.
ImallgemeinenführendieindenTabellen1und2genanntenWertezu
dem gewünschten Ergebnis, d. h. mindestens 2000 theoretische Böden
pro Meter Säulenlänge für Methylstearat und dessen Elution innerhalb
von15Minuten.
Sofern die Geräte es erlauben, sollte das Einspritzsystem etwa 200 ºC
undderDetektor mindestensgenausoheißwiedieSäulesein.
Im allgemeinen liegt das Verhältnis der Strömungsgeschwindigkeit des
Wasserstoffs für den Flammenionisationsdetektor und der des Träger-
gases zwischen 1:2 und 1:1 je nach Säulendurchmesser. Der
Sauerstoffstrombeträgtetwadas5-bis10-fachedesWasserstoffstroms.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—45
▼B
Tabelle 1
InnendurchmesserderSäuleinmm Trägergasstrominml/min
2 15bis25
3 20bis40
4 40bis60
Tabelle 2
Konzentration derstationären Phase
in %(m/m)SäulentemperaturinºC
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Kapillarsäule
Die Eigenschaften der Kapillarsäule, nämlich Leistungsfähigkeit und
Durchlässigkeit, bedingen, daß die Trennung der Bestandteile und die
Analysendauer weitgehend von der Strömungsgeschwindigkeit des
Trägergases in der Säule abhängen. Daher ist eine Optimierung der
Betriebsbedingungen durch Einwirkung auf deren Parameter (einfacher
ausgedrückt: auf den Druckverlust der Säule) notwendig, je nachdem,
obeinebessereTrennungodereineschnellereAnalysegewünschtwird.
4.1.2. Bestimmung der Zahl der theoretischen Böden (Leistungs-
fähigkeit)undderAuflösung(sieheAbbildung1)
DieAnalysewirdmiteinerMischungausetwagleichenTeilenMethyl-
stearat und Methyloleat (beispielsweise Methylestern der Kakaobutter)
durchgeführt.
Die Säulentemperatur und der Trägergasstrom sind so zu wählen, daß
das Maximum des Methylstearat-Peaks etwa 15 Minuten nach dem
Lösungsmittelpeak aufgezeichnet wird. Dabei muß eine ausreichende
Menge Methylestermischung verwendet werden, damit der Methyl-
stearat-Peak etwaDreiviertel desvollen Skalenanschlagserreicht.
Die Zahl der theoretischen Böden n wird nach folgender Formel
berechnet:
n¼16drIðÞ
ωIðÞ/C20/C21
2
DieAuflösungRwirdberechnet nachderFormel:
R¼2∆
ωIðÞþωIIðÞ
Dabeisind:
dr(I)= dieRetentioninMillimetern, vomStartdesChromato-
grammsbiszumMaximumdesMethylstearat-Peaks;
ω(I)+ω(II)= die Breite des Methylstearat- bzw. Methyloleat-Peaks
in Millimeters, gemessen zwischen den Schnittpunkten
derWendetangenten mit derGrundlinie;
∆ = die Entfernung zwischen den Maxima des Methyl-
stearat- unddesMethyloleat-Peaks inMillimetern.
DerAuflösungsindexIrwirdberechnet nachderFormel:
a
b
Dabeisind:
a = Höhedeskleinsten Peaks,gemessenvonderGrundlinie;1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—46
▼M2
▼C2
▼C2
b = Höhe des niedrigsten Punktes im Tal zwischen den beiden
angrenzenden Peaks,gemessenvonderGrundlinie.
Abbildung 1
Chromatogramm zurBestimmungderZahldertheoretischen Böden(Leistungs-
fähigkeit) undderAuflösung
DieBetriebsbedingungen sindsozuwählen,daßsichfürMethylstearat
wenigstens2000theoretischeBödenproMeterSäuleergebenundeine
Auflösungvonwenigstens1,25erreicht wird.
4.2.Zu untersuchende Probe
Mit Hilfe der Spritze (3.2) werden 0,1 bis 2 µl der nach Anhang XB
hergestellten Methylester auf die Säule gespritzt. Sind die Ester nicht
gelöst, so sind 100 mg/ml in chromatographisch reinem Heptan zu
lösenunddavonetwa0,1bis1µleinzuspritzen.
Müssen Bestandteile bestimmt werden, die lediglich in Spuren
vorkommen,sokanndieProbengrößegesteigertwerden(biszumZehn-
fachen).
4.3.Analyse
Im allgemeinen soll unter den in 4.1.1 beschriebenen Bedingungen
gearbeitet werden. Es kann jedoch mit einer niedrigeren Säulentempe-
ratur gearbeitet werden, wenn eine Bestimmung von Fettsäuren mit
wenigerals12Kohlenstoffatomenerforderlichist.BeiderBestimmung
vonFettsäurenmitmehrals20KohlenstoffatomenkanndieTemperatur
erhöht werden. In beiden Fällen kann auch mit Temperaturprogramm
gearbeitet werden. Beispiel: Enthält die Probe Fettsäuremethylester mit
weniger als 12 Kohlenstoffatomen, so wird die Probe bei 100 ºC (oder
bei50—60ºCfallsButtersäurevorkommt)eingespritztunddieTempe-
ratur sofort mit einer Anstiegsrate von 4—8 ºC/min bis zum Optimum
erhöht. In manchen Fällen können die beiden Verfahren kombiniert
werden.
Nach dem programmierten Aufheizen wird die Elution bei gleichblei-
bender Temperatur fortgesetzt, bis alle Bestandteile eluiert sind.
Verfügt das Gerät über keine programmierbare Heizung, so ist bei1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—47
▼B
▼B
zwei festliegenden Temperaturen zwischen 100 ºC und 195 ºC zu
arbeiten. Gegebenenfalls ist es ratsam, die Analyse mit zwei Phasen
von unterschiedlicher Polarität durchzuführen, um die Abwesenheit
von verdeckten Peaks beispielsweise bei gleichzeitigem Vorkommen
vonC18:3undC20:0oderC18:3undC18:2konjugiert,sicherzustellen.
4.4.Herstellung von Referenzchromatogrammen und Referenzkurven
Die Referenz-Standardmischung (2.3) wird unter den gleichen Arbeits-
bedingungenwiedieProbeanalysiertunddieRetentionszeitenoderdie
Retention der vorkommenden Fettsäuren bestimmt. Für jeden Grad der
Ungesättigtheit wird auf halblogarithmischem Papier eine graphische
Darstellung angefertigt, die den Logarithmus der Retentionszeit oder
der Retention als Funktion der Zahl der Kohlenstoffatome zeigt. Unter
isothermen Bedingungen müßten die graphischen Darstellungen der
geradzahligenSäurenmitdemgleichenGradderUngesättigtheitgerade
Linienergeben.DieGeradensolltenannähernd parallel verlaufen.
Es müssen Bedingungen vermieden werden, unter denen verdeckte
Peaks auftreten, d. h. Bedingungen, unter denen die Auflösung zugeringist,umzweiBestandteile zutrennen.
5. DARSTELLUNGDERERGEBNISSE
5.1.Qualitative Analyse
Die Methylester-Peaks der Probe werden aus der nach 4.4 erstellten
graphischenDarstellungidentifiziert, wennnötigdurchInterpolation.
5.2.Quantitative Analyse
5.2.1. Bestimmung der Zusammensetzung
Abgesehen von Ausnahmefällen wird die Methode der inneren Norma-
lisierung angewandt, d. h. man geht davon aus, daß alle Bestandteile
der Probe auf dem Chromatogramm erscheinen, so daß die Gesamtheit
derPeakflächen100%derBestandteiledarstellt(vollständige Elution).
Enthält dasGeräteinenIntegrator,sosinddessenDatenzuverwenden.
Andernfalls muß die Fläche unter jedem Peak durch Multiplikation der
PeakhöhemitderBreiteaufhalberHöhebestimmtwerden.Gegebenen-
falls sind auch die verschiedenen während der Aufzeichnung
verwendeten Abschwächungenzuberücksichtigen.
5.2.2. Berech nung
5.2.2.1. Allgemeiner Fall
Der Gehalt eines Bestandteils i (ausgedrückt in Massenprozent Methy-
lester) wirddurch Bestimmung des prozentualen Anteils derjeweiligen
PeakflächeimVerhältniszurSummeallerPeakflächenberechnet.Dazu
wirdfolgende Formelverwendet:
Ai
ΣA/C2100
Hierbeisind:
Ai= diePeakfläche, diedemBestandteil ientspricht,
ΣA = dieSummealler Peakflächen.
DasErgebnisistaufeine StellenachdemKommaanzugeben.
Anmerkung 7: In diesem allgemeinen Fall wird davon ausgegangen,
daß das auf relative Flächen bezogene Berechnungser-
gebnis den jeweiligen Massenprozenten entspricht. Für
die Fälle, in denen diese Annahme nicht zulässig ist,
siehe5.2.2.2.
5.2.2.2. AnwendungvonKorrekturfaktoren
In bestimmten Fällen, beispielsweise in Gegenwart von Fettsäuren mit
weniger als 8 Kohlenstoffatomen oder von Fettsäuren mit sekundären
Gruppen, bei Verwendung eines Wärmeleitfähigkeits-Detektors oder
wenn eine besonders hohe Genauigkeit erforderlich ist, sollten Korrek-
turfaktoren angewandt werden, um die prozentualen Peakflächen in
Massenprozente der Bestandteile umzurechnen. Die Korrekturfaktoren
werden mit Hilfe eines Chromatogramms bestimmt, das durch Analyse
einerReferenzmischungvonMethylesternbekannterZusammensetzung1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—48
▼B
unter den gleichen Bedingungen wie bei der Analyse der Probe erstellt
wurde.
Für diese Referenzmischung ergibt sich der prozentuale Massenanteil
desBestandteiles iausderFormel:
mi
Σm/C2100
Hierinsind:
mi= dieMassedesBestandteils inderReferenzmischung,
Σm = die Gesamtheit aller Massen der verschiedenen Bestandteile
derReferenzmischung.
AusdemChromatogrammderReferenzmischung(4.4)wirdderprozen-
tuale Anteil(Fläche/Fläche) desBestandteils iwiefolgtberechnet:
Ai
ΣA/C2100
Hierinsind:
Ai= diePeakfläche desBestandteiles i,
ΣA = dieSummealler Peakflächen.
DerKorrekturfaktor ergibtsichausderFormel
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Imallgemeinen werdendieKorrekturfaktoren aufKC16bezogen, sodaß
dierelativen Faktorennachfolgender Formelberechnet werden:
K0
i¼Ki
KC16
Der Gehalt der Probe an jedem Bestandteil i, ausgedrückt in Massen-
prozentMethylester, ist:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
DieErgebnissesindaufeine StellenachdemKommaanzugeben.
5.2.2.3. VerwendungeinesinnerenStandards
In bestimmten Fällen ist es erforderlich, einen inneren Standard zu
verwenden (beispielsweise, wenn nicht alle Fettsäuren quantitativ
bestimmt werden sollen, wie beim Vorkommen von Säuren mit 4 und
6 Kohlenstoffatomen neben Säuren mit 16 oder 18 Kohlenstoffatomen,
oder wenn die absolute Menge an Fettsäuren in der Probe bestimmt
werdensoll).DazuwerdenhäufigFettsäurenmit5,15oder17Kohlen-
stoffatomen verwendet.
Auch für den inneren Standard sollte der Korrekturfaktor bestimmt
werden(soferneinerverwendet wird).
DerAnteildesBestandteilsiinMassenprozent,ausgedrücktalsMethy-
lester,ergibtsichdannausderFormel:
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
Hierinist:
Ai= diePeakfläche desBestandteils i,
As= diePeakfläche desinnerenStandards,
K′i= derKorrekturfaktorfürdenBestandteil i(bezogen aufKC16),
K′s= der Korrekturfaktor für den inneren Standard (bezogen auf
KC16),
m = dieMassederzuuntersuchendenProbeinMilligramm,
ms= dieMassedesinneren StandardsinMilligramm.
DasErgebnisistaufeine StellenachdemKommaanzugeben.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—49
▼M2
6. SONDERFALL,BESTIMMUNGVONTRANS-ISOMEREN
Der Gehalt an trans-Isomeren in Fettsäuren mit 10-24 Kohlenstoff-
atomen kann durch Trennung der Methylester bestimmt werden, wobei
Kapillarsäulen mitbesondererPolarität verwendet werden.
6.1. Kapillarsäulen (fused silica) mit einem Innendurchmesser von 0,25 -
0,32 mm, einer Länge von 50 m und belegt mit einer Cyanopropylsili-
conschicht von0,1bis0,3µm(Typ SP2340,SP2380,CPSil88,Silar
10undähnlichen Typen).
6.2. Die Methylester werden nach dem im Anhang XB unter B beschrie-
benen Verfahren hergestellt. Fette mit einem Gehalt an freien
Fettsäuren von mehr als 3 % müssen nach dem im Anhang VII unter
Punkt6.1beschriebenen Verfahrenneutralisiert werden.
6.3. DieArbeitsbedingungen fürdieGaschromatographie sindwiefolgt:
— Säulentemperatur programmiert von 150-220 ºC (z. B. 15 Minuten
bei165ºC,danachAnstiegvon5ºC/Minute auf200ºC;
— Injektortemperatur: 250 ºC bei Verwendung eines Split-Systems
oder Anfangstemperatur der Säule bei Verwendung eines „on
column“-Systems;
— Detektortemperatur: 260ºC;
— Trägergasstrom: (Helium oderWasserstoff)1,2ml/min.
Abbildung 1
Musterchromatogramm einer kapillargaschromatographischen Bestimmung von
trans-Fettäuren
Die Einspritzmenge soll so bemessen sein, daß unter den gegebenen
Empfindlichkeitsbedingungen die Höhe des Peaks für Arachinsäureme-
thylester20%odermehrdesVollausschlagsbeträgt.
6.4. Die Identifizierung der verschiedenen Methylester erfolgt mit Hilfe der
Retentionszeiten, die mit denen eines Referenzgemisches verglichen
werden(vgl.2.3).
Die Ester der trans-Fettsäuren werden vor den entsprechenden cis-
Isomeren eluiert. In Abbildung 2 wird ein Beispiel eines entspre-
chendenChromatogramms gezeigt.
6.5. Die Leistungsfähigkeit der Säule, bestimmt nach Punkt 4.1.2, soll die
Trennung bestimmter kritischer Paare ermöglichen. So soll z. B. die
Gruppe der trans-Isomere der Ölsäuren von dem Peak der Ölsäure
getrennt werden (trans C18:1/cis C18:1), und zwar mit einem
Auflösungsindex,derüber2liegt.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—50
▼C2
▼C2
6.6. Der prozentuale Gehalt der verschiedenen trans-Fettsäuren wird
berechnet aus dem Verhältnis der entsprechenden Peakfläche zur
SummederFlächen aller vorkommendenPeaks.
Bestimmt werdendieprozentualen Gehaltenachstehender Fettsäuren:
— „trans“-Oktadecensäuren (T 18:1), im Anhang I dieser Verordnung
alsSummedertrans-IsomerederÖlsäurebezeichnet;
— „cis-trans“- und „trans-cis“-Oktadecadiensäure (CT/TC 18:2), im
Anhang I dieser Verordnung als Summe der trans-Isomere der
Linolsäure bezeichnet;
— „trans-cis-trans“-, „cis-cis-trans“-, „cis-trans-cis“-, „trans-cis-cis“-
Oktadecatriensäure[(TCT+CCT+CTC+TCC)18:3],imAnhang
I dieser Verordnung als Summe der trans-Isomere der Linolensäure
bezeichnet.
Anmerkung 8:
Im Hinblick auf die Besonderheiten dieser Methode sind die Ergebnisse mit
zweiDezimalstellen anzugeben.
►M27.◄SONDERFALL—VERWENDUNGEINESKATHAROMETER-
DETEKTORS (BASIERT AUF DEM PRINZIP DER ÄNDERUNG
DERWÄRMELEITFÄHIGKEIT)
Zur Bestimmung der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung
eines Gemisches von Fettsäuremethylestern kann auch ein Gaschroma-
tograph mit einem Detektor verwendet werden, der auf der Grundlage
von Änderungen der Wärmeleitfähigkeit (Katharometer) arbeitet. In
diesem Fall müssen die in den Ziffern 3 und 4 beschriebenen Arbeits-
bedingungengemäßderTabelle 3geändert werden.
Für die quantitative Analyse sind die in 5.2.2.2 beschriebenen Korrek-
turfaktoren anzuwenden.
Tabelle 3
Variable Daten/Arbeitsbedingungen
Säule Länge:2—4m
Innendurchmesser:4mm
Trägermaterial Korngrößezwischen160und
200µm
Konzentration derstationären
Phase15%(m/m)bis25%(m/m)
Trägergas Heliumoder,wennnicht
vorhanden,Wasserstoff,mit
möglichst geringemSauerstoffge-
halt
Hilfsgase Keine
Temperatur desEinspritzsystems 40—60ºChöheralsdiederSäule
Säulentemperatur 180—200ºC
Strömungsgeschwindigkeitdes
TrägergasesImallgemeinen zwischen60und
80ml/min
Mengedereingespritzten Probe Imallgemeinen zwischen0,5und
2µl
►M28.◄UNTERSUCHUNGSBERICHT
Im Untersuchungsbericht müssen das zur Herstellung der Methylester
angewandte Verfahren, das gaschromatograpische Verfahren und die
Ergebnisse genau angegeben werden. Darüber hinaus sindalle Arbeits-
bedingungen zu nennen, die einen Einfluß auf die Ergebnisse gehabt
haben können, auch wenn sie nicht in dieser Internationalen Norm
aufgeführt wurdenoderalsfakultativ gelten.
Der Untersuchungsbericht muß alle zur vollständigen Identifizierung
derProbenotwendigenInformationen enthalten.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—51
▼B
▼B
ANHANG XB
VORBEREITUNG DER FETTSÄUREMETHYLESTER GEMÄSS
ANHANG VI ABSCHNITTE I UND II DER VERORDNUNG (EWG)
Nr. 72/77 ODER GEMÄSS DEM NACHSTEHEND BESCHRIEBENEN
VERFAHREN
EINLEITUNG
Die Wahl der Methode ist abhängig von der Zusammensetzung der Fett-
säuren, vom Gehalt an freien Fettsäuren des zu untersuchenden Fettes und
vonderauszuführendengaschromatographischen Analyse.
InFragekommen
— für Fette mit Fettsäuren unter C12 nur Verfahren in geschlossenen
Ampullenodermit Dimethylsulfat,
— für Fette mit einem Gehalt an freien Fettsäuren von über 3 % nur
Verfahrenmit Methanol-Salzsäure oderDimethylsulfat,
— für gaschromatographische Bestimmungen von trans-Isomeren nur
Verfahrenmit Natriummethylat oderDimethylsulfat,
— das Verfahren mit Methanol-Hexan-Schwefelsäure muß angewandt
werden für die Herstellung von Methylestern aus kleinen Fettmengen
nachderendünnschichtchromatographischer Abtrennung.
Das Unverseifbare kann vernachlässigt werden, wenn es einen Gehalt von
3% nicht überschreitet; anderenfalls müssendie Methylester aus den Fett-
säurenhergestellt werden.
1. METHODEN
Im folgenden werden 5 Methoden für die Herstellung der Methylester aus
Fettenbeschrieben:
a) mitNatriummethylat,
b) mitNatriummethylat ineinerverschlossenenAmpulle,
c) mitMethanol-Salzsäure ineinerverschlossenenAmpulle,
d) mitDimethylsulfat,
e) mitMethanol-Hexan-Schwefelsäure.
Methode A
2. PRINZIPDERMETHODE
DaszuuntersuchendeFettwirdunterRückflußmitMethanolundNatrium-
methylat erhitzt. Die gewonnenen Methylester werden mit Ethylether
extrahiert.
3. GERÄTE
3.1. 100-ml-Kolben mit Rückflußkühler, oben mit einem Calciumchloridrohr
verschlossen,mit Schliffanschlüssen.
3.2. 50-ml-Meßzylinder.
3.3. 5-ml-Meßpipette, mit 0,1-ml-Graduierung.
3.4. 250-ml-Scheidetrichter.3.5. 200-ml-Kolben.
4. REAGENZIEN
4.1. WasserfreiesMethanol.4.2. Natriummethylat, etwa 1%ige Lösung in Methanol; Herstellung durch
Auflösen von 0,34 g metallischem Natrium in 100 ml wasserfreiem
Methanol.
4.3. Ethylether.
4.4. Natriumchlorid, 10%igeLösung.4.5. Petrolether, Kp40º—60ºC.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—52
▼B
5. VERFAHREN
5.1. In den 100-ml-Kolben 2 g des über Natriumsulfat getrockneten und
filtrierten Fettes einwiegen; 35 ml Methanol hinzufügen, den Kühler
aufsetzen undunterRückflußeinige Minutenkochenlassen.
5.2. Das Erwärmen unterbrechen, die Kühlung abstellen und schnell 3,5 ml
Natriummethylatlösung zugeben. Die Kühlung wieder anstellen und unter
Rückfluß mindestens 3 Stunden sieden lassen. Die Methylierung ist
beendet,wenndasgesamteFettinLösunggegangenistunddasReaktions-
gemisch beiRaumtemperatur klarbleibt.
5.3. AbkühlenlassenunddasReaktionsgemischineinen250-ml-Scheidetrichter
überführen,30—40mlEthylether,100mlWasserund5—6ml10%ige
Natriumchloridlösung zugeben. Schütteln und die Schichten absetzen
lassen. Die wäßrige Phase in einen zweiten Scheidetrichter ablassen und
erneut mit 25 ml Ethylether extrahieren. Die vereinigten Etherfraktionen
mit 50 ml Petrolether Kp 40 — 60ºC versetzen — dadurch erfolgt eine
Abtrennung von Wasser, das dann entfernt wird. Die Etherphase dreimal
mit je 10 — 15 ml Wasser waschen, über Natriumsulfat trocknen, durch
einFilterineinen200-ml-Kolbenfiltrieren.
DasLösungsmittelaufdemWasserbadabdestillierenunddenRückstandin
einem Stromvonreinem Stickstofftrocknen.
Methode B
2. PRINZIPDERMETHODE
Das zu untersuchende Fett wird mit einer methanolischen Natriummethy-
latlösung ineinerverschlossenenAmpulle bei85—90ºCumgesetzt.
3. GERÄTE
3.1. Dickwandige Glasampulle, ca. 5 ml Inhalt (Länge 40—45 mm, Durch-
messer14—16mm).
3.2. 1-ml-Meßpipette, mit 0,1-ml-Graduierung.
4. REAGENZIEN
4.1. Natriummethylat, 1,5%ige Lösung in Methanol, hergestellt durch Auflösen
von0,50gmetallischem Natrium in100mlwasserfreiem Methanol.
5. VERFAHREN
5.1. In die Ampulle 2 g des über Natriumsulfat getrockneten und filtrierten
Fettes einwiegen, 0,3 g (ca. 0,4 ml) Natriummethylatlösung hinzufügen
unddieAmpulleüberderFlamme zuschmelzen.
5.2. Die Ampulle zwei Stunden in ein Wasserbad von 85—90 ºC stellen und
vonZeitzuZeitschütteln.DasEndederVeresterunginderAmpullezeigt
sichdarin,daßderInhaltnachAbsetzendesGlycerinsunddesRückstands
derReagenzien klarwird.
5.3. AufRaumtemperatur abkühlen.DieAmpulle erstöffnen,wenndieMethy-
lester gebraucht werden. Sie brauchen für die Verwendung im
Gaschromatographen nichtweiterbehandelt zuwerden.
Methode C
2. PRINZIPDERMETHODE
DaszuuntersuchendeFettwirdmitMethanol-Salzsäureineinerverschlos-
senenAmpullebei100ºCumgesetzt.
3. GERÄTE
3.1. Dickwandige Glasampulle, ca. 5 ml Inhalt (Länge 40—45 mm, Durch-
messer14—16mm).
3.2. Geeichte Pipetten von1und2ml.
4. REAGENZIEN
4.1. 2%igemethanolischeSalzsäure.HerstellungmitgasförmigerSalzsäureund
wasserfreiemMethanol (Anmerkung1,MethodeE).
4.2. HexanfürdieGaschromatographie.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—53
▼B
5. VERFAHREN
5.1. In die Ampulle 2 g des über Natriumsulfat getrockneten und filtrierten
Fettes einwiegen, 2 ml der methanolischen Salzsäurelösung hinzufügen
unddieAmpulleüberderFlamme zuschmelzen.
5.2. DieAmpulle40MinutenineinWasserbadvon100ºCstellen.5.3. Unter fließendem Wasser abkühlen, öffnen, 2 ml destilliertes Wasser und
1mlHexanhinzufügen.Zentrifugieren unddieHexanphaseabnehmen,sie
istfertigzumGebrauch.
Methode D
2. PRINZIPDERMETHODE
Daszu untersuchende Fett wirdmit methanolischer Kaliumhydroxidlösung
verseift, dann mit Dimethylsulfat behandelt. Nach Zusatz von Salzsäure
erfolgt eine Abtrennung der Methylester. Durchanschließende Behandlung
mit Aluminiumoxid erhält mansehrreineMethylester.
3. GERÄTE
3.1. Reaktionsgefäß aus dickwandigem Glas, etwa 20 ml Inhalt, mit Schliff-
stopfen10/19undSicherheitshaken.
3.2. Rückflußkühler mit Schliff10/19.
3.3. Glasfiltertiegel G2,20mmDurchmesser.3.4. Glasröhrchen,etwa10mlInhalt, mitkonischemBoden.3.5. 1-und5-ml-Spritzen.
4. REAGENZIEN
4.1. Kaliumhydroxid, 10%igeLösunginMethanolfürdieGaschromatographie.
4.2. Indikator ausBromkresolgrün:0,05%igeLösunginMethanol.4.3. Dimethylsulfat (d=1,335bei15ºC).4.4. Konzentrierte Salzsäure, d = 1,19, Verdünnung 1:1 mit Methanol für die
Gaschromatographie.
4.5. Aluminiumoxid, standardisiert nach Brockmann, für die Adsorptionschro-
matographie.
5. VERFAHREN
5.1. Indas20mlfassendeReaktionsgefäßetwa2g(ungefähr2,2ml)desüber
Natriumsulfat getrockneten undfiltrierten Fettes einfüllen, 5mlKaliumhy-
droxidlösung und einige Siedesteinchen zugeben. Den Rückflußkühler
aufsetzen und auf kleiner Flamme 5 Minuten unter Schütteln erhitzen. Die
Verseifung ist vollständig, wenn die Lösung klar aussieht. Unter flie-
ßendem Wasserabkühlen unddenRückflußkühlerentfernen.
5.2. ZweiTropfenIndikatorlösungzugeben,dannlangsammiteinerSpritze1ml
Dimethylsulfat. Das Reaktionsgefäß fest verschließen und 2—3 Minuten
schütteln, während das untere Ende in ein siedendes Wasserbad getaucht
wird. Die Reaktion ist beendet, wenn der Indikator von blau nach gelb
umschlägt.UnterfließendemWasserabkühlen,öffnenund5mlmethanoli-
scheSalzsäurezugeben.
5.3. Einige Sekunden schütteln, das Gefäß schräg halten und durch leichtes
Klopfen das Absetzen der Methylester in Form einer öligen Masse
beschleunigen (Anmerkung A). Die Methylester mit Hilfe einer Spritze,
die bis auf den Boden des Gefäßes reicht, aufnehmen, so viel Aluminiu-
moxid zugeben, wie etwa ¼ des Volumens der Methylester entspricht,
schütteln unddurcheinPapierfilter filtrieren.
Anmerkung A: Sofern keine sofortige Abtrennung der Methylester erfolgt,
5mlWasserindasGefäßgebenundschütteln.
Methode E
2. PRINZIPDERMETHODE
Das zu untersuchende Fett wird unter Rückfluß mit einer Mischung aus
Methanol, Hexan und Schwefelsäure erhitzt. Die dabei entstehenden
Methylester werdenmit Petrolether extrahiert.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—54
▼B
3. GERÄTE
3.1. Reaktionsgefäß von etwa 20 ml Inhalt, mit Steigrohr von etwa 1 m Länge
undSchliffverschluß.
3.2. 5-ml-Pipette, graduiert.
3.3. 50-ml-Scheidetrichter.3.4. 10-und25-ml-Meßzylinder.3.5. Versuchsgefäß,15mlInhalt, mit konischemBoden.
4. REAGENZIEN
4.1. Methylierungsreagenz:wasserfreiesMethanol,HexanundSchwefelsäure(d
=1,84)imVerhältnis75:25:1(V/V/V)gemischt.
4.2. Petrolether, Kp.40—60ºC.
4.3. WasserfreiesNatriumsulfat.
5. VERFAHREN
5.1. In das 20-ml-Reaktionsgefäß das von einer Dünnschichtplatte gewonnene
Material einfüllen und5mlMethylierungsreagenz zufügen.
5.2. Den Rückflußkühler anschließen und im siedenden Wasserbad 30 Minuten
erhitzen (Anmerkung2).
5.3. Die Mischung quantitativ mit Hilfe von 10 ml destilliertem Wasser und
10mlPetrolether ineinen50-ml-Scheidetrichter überführen.Kräftigschüt-
teln, die Phasen absetzen lassen, die wäßrige Schicht ablaufen lassen und
die Petroletherschicht zweimal mit je 20 ml destilliertem Wasser waschen.
IndenScheidetrichtereinekleineMengewasserfreiesNatriumsulfatgeben,
schütteln, einige Minuten stehen lassen und abfiltrieren. Das Filtrat in das
15-ml-Gefäßmit konischemBodenfüllen.
DasLösungsmittelimWasserbadunterEinleitenvonStickstoffabdampfen.
Anmerkung 1: Kleinere Mengen gasförmiger Salzsäure können im Labor
leichthergestelltwerden,indemmanineinekäuflicheSalz-
säure ( ρ= 1,18) konzentrierte Schwefelsäure ( ρ= 1,84)
eintropfen läßt. Das freigesetzte Gas kann leicht getrocknet
werden, indem man es über konzentrierte Schwefelsäure
leitet. Salzsäure wird schnell von Methanol absorbiert,
deshalb müssen beim Lösen Vorkehrungen getroffen
werden, z. B. indem man das Gas umgekehrt durch einen
kleinenTrichterleitet,dessenRanddieOberflächederFlüs-
sigkeit berührt. Größere Mengen an methanolischer
Salzsäure lassen sich auf Vorrat herstellen, da die Lösung
indunklenGlasflaschenmit Glasstöpselhaltbarist.
Anmerkung 2: Zur Kontrolle des Siedevorgangs sollte man einen Glasstab
in das Reaktionsgefäß stellen und die Temperatur des
Wasserbadesnichtüber90ºCansteigen lassen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—55
▼B
ANHANG XI
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN FLÜCHTIGEN HALOGENIERTEN
LÖSUNGSMITTELN IN OLIVENÖL
1. PRINZIP
Gaschromatographische Headspace-Analyse.
2. GERÄTE
2.1. Gaschromatographmit Elektroneneinfangdetektor (ECD).
2.2. Headspace-Vorrichtung.2.3. GaschromatographischeGlassäulevon2mLängeund2mmDurchmesser.
StationärePhase:10%OV101odereinegleichwertige Phase,aufgezogen
auf mit Säure gewaschenem und silanisiertem Kieselgur mit einer
Korngrößevon80—100Mesh.
2.4. Träger- und Hilfsgas: Stickstoff für die Gaschromatographie, geeignet für
Elektroneneinfangdetektoren.
2.5. Glasfläschchen 10—15 ml, versehen mit einem Verschluß aus Aluminium
undTeflon, dereine Entnahme mit HilfeeinerSpritzeermöglicht.
2.6. Klemmen fürabsolutdichten Verschluß.
2.7. Spritzen 0,5bis2ml,zumEinspritzen vonGas.
3. REAGENZIEN
Standard: Flüchtige halogenierte Lösungsmittel miteinem fürdieGaschro-
matographie geeigneten Reinheitsgrad,
Pentanmit einem fürdieGaschromatographie geeigneten Reinheitsgrad.
4. ANALYSENVERFAHREN
4.1. Etwa 3 g Öl in ein Glasfläschchen (das nicht wieder verwendet werden
darf)genaueinwiegenunddasFläschchenmitdemVerschlußabsolutdicht
verschließen. DasFläschchenbei70ºCeine StundeineinenThermostaten
stellen. Mit Hilfe einer Spritze genau ein Volumen von 0,2 bis 0,5 ml aus
dem Dampfraum entnehmen und auf die Säule des Gaschromatographen
spritzen.DerGaschromatograph istwiefolgteinzustellen:
— Verdampfungstemperatur: 150ºC,
— Säulentemperatur: 70bis80ºC,— Detektortemperatur: 200bis250ºC.
Es können auch andere Temperaturen eingestellt werden, sofern dabei
gleichwertige Ergebnisseerziehlt werden.
4.2. Referenzlösungen:StandardlösungenmitunterschiedlichenKonzentrationen
von flüchtigen halogenierten Lösungsmitteln zwischen 0,05 und 1 mg/kg
herstellen unter Verwendung von Olivenöl, das frei von Lösungsmittel-
spuren ist. Falls erforderlich, werden die halogenierten Lösungsmittel mit
Pentanverdünnt.
4.3. Quantitative Auswertung. Das Verhältnis bilden zwischen den Peakflächen
oder den Peakhöhen der Probe und der Standardlösung, deren Konzentra-
tion der erwarteten Konzentration am nächsten liegt. Liegt der relative
Unterschied über 10 %, so muß die Analyse mit einer neuen Standar-
dlösung wiederholt werden, bis ihre Konzentration innerhalb des
obengenannten relativen Unterschieds liegt. Der Gehalt wird auf der Basis
desMittelwertseinzelner Einspritzungen ermittelt.
4.4. Abfassung der Ergebnisse. Die Ergebnisse werden in mg/kg (ppm) ange-
geben.DieNachweisgrenze desVerfahrensliegt bei0,01mg/kg.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—56
▼B
ANHANG XII
ORGANOLEPTISCHE PRÜFUNG VON NATIVEM OLIVENÖL
1. UMFANGUNDANWENDUNGSBEREICH
Diese Arbeitsvorschrift bestimmt die Kriterien zur Bewertung des
Flavours von nativem Olivenöl und beschreibt die dafür zu verwendende
Methodik.
2. KURZBESCHREIBUNG
Das beschriebene Verfahren gilt nur für die organoleptische Bewertung
und Einstufung von nativem Olivenöl für den direkten Genuß. Dabei
wirddasnativeOlivenölvoneinerGruppeausgewählterPrüfermitHilfe
eines Prüfbogens nach einer Bewertungstabelle gemäß den von ihm
hervorgerufenen Sinneseindrücken eingestuft.
3. SENSORISCHEPRÜFUNG:GRUNDBEGRIFFE
SieheKapitel„SensorischePrüfung:Grundbegriffe“.
4. SPEZIFISCHEBEGRIFFEFÜROLIVENÖL
4.1. Angenehme Sinneseindrücke, die durch folgende typische Qualitätsmerk-
male nativen Olivenölshervorgerufenwerden:
Fruchtig:InAromaundBukettangesunde,frischeunderntereifeFrüchte
erinnernd.
Nach reifen Früchten: Bezeichnung fürOlivenöl ausvollreifen Früchten,
allgemein mit schwachemBukettundsüßemAroma.
Nach grünen Früchten: Bezeichnung fürÖlausgrünenFrüchten.
4.2. Sinneseindrücke, die je nach Intensität als mehr oder weniger angenehm
empfunden werdenund die keine Fehlermerkmale bedeuten, aber die die
Harmonie derFruchtigkeit beeinflussen.
Apfelartig:FlavourvonanÄpfelerinnerndesOlivenöl.
Süß:Bezeichnung für den Wohlgeschmack von Olivenöl ohne aufdring-
liche Süßeundohnehervortretende Bitterkeit, AdstringenzundSchärfe.
Grasig:Bezeichnung für das typische, an frisch gemähtes Gras erin-
nerndeAromamancher Olivenöle.
Nach grünen Blätter (bitter): Bezeichnung für das von zu grünen Oliven
odervonmitvermahlenen BlätternundStengelnherrührendeFlavourvon
Olivenöl.
Bitter:Bezeichnung für den typischen Geschmack von Olivenöl grüner
oder grünlicher Oliven. Je nach Intensität als mehr oder weniger ange-
nehmempfunden.
Adstringierend: Bezeichnung fürdieAdstringenzmancher Olivenöle.
Scharf:Typische stechende Geschmacksempfindung bei Ölen, die zu
Beginn des Wirtschaftsjahres auszumeist grünenOliven erzeugt werden.
Sie entsteht, wenn Phenolverbindungen die über die ganze Mundhöhle
verteilten EndendesTrigeminusnervs reizen.
Mandelartig: Dieser Begriff bezeichnet zweierlei: einmal das typische
Flavour frischer Mandeln und zum zweiten das Flavour getrockneter,
gesunder Mandeln, das mit einem ranzigen Anklang verwechselt werden
kann. Im Kontakt mit Zunge und Gaumen als Abgang wahrnehmbar,
erinnert ansüßlicheOlivenöle mit verhaltenem Bukett.
Fad oder schal: FlavourvonOlivenölmitschwachausgeprägtenorgano-
leptischen Eigenschaften infolgedesVerlustsseinerAromastoffe.
Heuartig:Bezeichnung fürdastypische,anmehroderwenigertrockenes
Heuerinnernde Flavourmancher Olivenöle.
4.3. Sinneseindrücke, die stets — auch wenn sie kaum wahrnehmbar sind —
als unangenehm empfunden werden und ein organoleptisches Fehler-
merkmal bedeuten.
Espartoartig: Bezeichnung für das typische Flavour von Olivenöl aus
Oliven, die mit Hilfe neuer Espartograskörbe gepreßt wurden. Dieses1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—57
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Aroma kann in verschiedenen Nuancen auftreten, je nachdem, ob Körbe
ausgrünemodertrockenem Espartograsverwendetwurden.
Erdig:Bezeichnung für das typische Flavour von Olivenöl, das von
anhaftender Erde oder Schlamm ungewaschener Oliven herrührt. Dieses
FlavourkanninEinzelfällen vonmodrigen Anklängenbegleitet sein.
Alt:BezeichnungfürdastypischeFlavourvonzulangeinLagerbehältern
aufbewahrtem Olivenöl. Kann auch durch zu langes Aufbewahren in
Verpackungsbehältern auftreten.
Wurmstichig: Bezeichnung für das typische Flavour von Olivenöl aus
starkvonLarvenderOlivenfliege (Dacusoleae) befallenen Oliven.
Metallisch:An Metall erinnerndes Flavour. Typisch für Olivenöl, das
beim Vermahlen, Schlagen, Pressen oder Lagern unter unsachgerechten
Bedingungen zu lange mit Lebensmitteln oder Metalloberflächen in
Kontaktstand.
Muffig:Bezeichnung für das typische Flavour von Olivenöl mit erhebli-
chem Schimmel- und Hefepilzbefall infolge mehrtägiger feuchter
Lagerung.
Ranzig:Bezeichnung für das durch Autoxidation infolge des zu langen
Kontakts mit der Luft entstehende typische Flavour von Fetten und
Ölen.DiesesFlavouristunerwünschtundirreversibel.
Stichig („atrojado“): Bezeichnung für das typische Aroma von Öl aus
Oliven,diesichbereitsineinemfortgeschrittenenZustandderZersetzung
durchGärungbefanden.
Lakig:Bezeichnung für das Flavour von Olivenöl aus in Salzlake aufbe-
wahrtenOliven.
Tresterartig: Bezeichnung fürdastypische FlavourvonOliventrestern.
Seifig:Bezeichnung für ein Flavour, das einen schmierseifenartigen
Sinneseindruckvermittelt.
Fruchtwasserartig: Bezeichnung für das typische Flavour von Olivenöl,
das von mangelhaftem Dekantieren und zu langem Kontakt mit Frucht-
wasserherrührt.
Wein- oder Essigartig: Bezeichnung für das typische Flavour von an
Wein oder Essig erinnerndes Olivenöl, das vor allem durch die anomal
starkeBildungvonEssigsäure,Ethylacetat undEthanolverursacht wird.
Gurkenartig: Durch zu langes Lagern in luftdichten Behältnissen, insbe-
sondere in Dosen, hervorgerufenes Flavour von Olivenöl, das von 2,6-
Nonadienal herrührt.
Brandig oder erhitzt: BezeichnungfürdastypischeFlavourvonOlivenöl,
das durch übermäßige und/oder zu lange Erwärmung bei der Gewinnung
verursacht wird, insbesondere durch unsachgemäße warme Behandlung
beiderHerstellungderPaste.
Schlammig:Bezeichnung für das typische Aroma von Olivenöl, das aus
dekantiertem Ölschlamm aus unterirdischen Becken oder Behältern
gewonnenwurde.
Nach Preßmatten: Bezeichnung für das typische Flavour von Olivenöl,
das mit Hilfe von Preßmatten gewonnen wurde, die mit vergorenen
Rückständenverschmutzt werden.
Schmierölartig: Bezeichnung für den Geruch von Olivenöl aus einer
Ölmühle, deren Ausrüstung nicht sachgerecht von Benzin-, Fett- oder
Mineralölresten gereinigt wurde.
Roh:Bezeichnung für Olivenöl, das im Mund einen dickflüssigen
pastösenSinneseindruck hinterläßt.
5. PRÜFGLASFÜRÖLE
SieheKapitel„PrüfglasfürÖle“.
6. PRÜFRAUM
SieheKapitel„Leitlinien fürdieEinrichtung desPrüfraums“.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—58
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7. HILFSMITTEL
Jedem Prüfer sind in seiner Kabine die zur Erfüllung seiner Aufgabe
notwendigen Hilfsmittel zur Verfügung zu stellen. Diese Hilfsmittel
umfassen:
— Gläser(genormt)mitdenProben,dienacheinemZufallsschlüsselmit
einem Ziffernpaar oder einem Ziffern-Buchstaben-Paar gekenn-
zeichnet sind. Die Kennzeichnung ist mit einem unverwischbaren
undgeruchlosenStiftanzubringen;
— Uhrgläsermit identischer MarkierungzumAbdeckenderGläser;— Prüfbogen,vgl.Abbildung2,mit Ausfüllhinweisen;— BleistiftoderKugelschreiber;— Schälchen mitApfelstücken;— GlasWasservonRaumtemperatur.
8. VERFAHREN
Dieser Abschnitt regelt die Vorkenntnisse für die Durchführung der
sensorischen Prüfung von nativem Olivenöl; ferner dient er der Regle-
mentierung des Verhaltens und der Arbeitsweise der an der Prüfung
teilnehmenden Prüfer, die sowohl den allgemeinen als auch den beson-
deren Empfehlungen für das Verkosten von Olivenöl Rechnung zu
tragenhaben.
8.1.Aufgaben des Prüfungsleiters bzw. des Vorsitzenden der Gruppe
(bzw.desPanels)
Der Prüfungsleiter muß ausreichend vorgebildet sein und über die nötige
Sach- und Fachkunde für die zur Beurteilung anstehenden Olivenöle
verfügen.EristdieSchlüsselfigurderPrüfergruppeundträgtdieVerant-
wortung für Organisation und Ablauf der Prüfungsarbeit. Er lädt die
Prüfer rechtzeitig ein und klärt sie über die Durchführung der Prüfungen
auf,enthält sichaberjedwederMeinungsäußerungüberdieProben.
Er ist verantwortlich für das Vorhandensein der Hilfsmittel, deren pein-
liche Sauberkeit, die Vorbereitung und Verschlüsselung der Proben,
derenÜbergabeandiePrüfergemäßdergeeigneten Prüfungsfolgesowie
fürdasEinsammelnunddiestatistischeAuswertungderPrüfdaten,damit
gewährleistet ist, daß mit möglichst geringem Aufwandmöglichst zuver-
lässigeErgebnisseerzielt werden.
Die Arbeit desPrüfungsleiters erfordert sensorischesFeingefühl, Sorgfalt
beiderPrüfungsvorbereitung,strengsteOrdnunghinsichtlichihrerDurch-
führung sowie Geschick und Geduld bei der Planung und Durchführung
derPrüfungen.AufgabedesPrüfungsleitersistes,dieMitgliederzumoti-
vierenundbeiihnenInteresse,NeugierundWettbewerbsgeistzuwecken.
Er hat sich einer Meinungsäußerung zu enthalten und muß sicherstellen,
daß möglicherweise tonangebende Prüfer die anderen nicht beeinflussen.
IhmobliegenfernerSchulung,AuswahlundÜberwachungderPrüferauf
ihregeboteneEignung.
8.2.Prüfbedingungen
8.2.1. Probenumfang
JedesGlasmuß15mlÖlenthalten.
8.2.2. Temperatur der Probe
Die zur Prüfung anstehenden Proben sind im Glas auf einer Temperatur
von28ºC±2ºCzuhalten.DiegewählteTemperaturgestattetambesten
die Erfassung der organoleptischen Unterschiede bei Normaltemperatur,
wenn Öle als Zutaten verwendet werden. Bei tieferen oder höheren
Temperaturen kommen entweder die Aromastoffe kaum zur Entfaltung
oderaberesentfalten sichdiefürerhitzte Öletypischen Aromastoffe.
8.2.3. Prüfungszeiten
Die für das Verkosten von Olivenöl geeignetste Tageszeit ist der
Vormittag. Geruchs- und Geschmackssinn sind zu bestimmten Tages-
zeiten nachweislich besondersempfindlich.
So ist die Empfindlichkeit von Geruchs- und Geschmackssinn vor den
Mahlzeiten besondersgroßundgehtdanachzurück.
Übertreibung ist aber auch hier zu vermeiden, da Hungergefühle die
Prüferablenken,ihrUnterscheidungsvermögenbeeinträchtigenundinsbe-
sondereihrePräferenz-undAkzeptanzschwelle herabsetzen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—59
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9. PRÜFER
Die an der organoleptischen Prüfung von Speiseolivenöl als Prüfer teil-
nehmenden Personen sind zu schulen und entsprechend ihrer Eignung
zur Unterscheidung ähnlicher Proben auszuwählen, wobei zu berücksich-
tigen ist, ob und inwieweit ihre Urteilsfähigkeit im Zuge der Schulung
zunimmt (vgl.entsprechenden Absatz).
Zur Prüfung benötigt man 8 bis 12 Prüfer nebst einigen Reserveprüfern
zurDeckungvonAusfällen.
9.1.Allgemeine Verhaltensmaßregeln für Kandidaten und Prüfer
Diese Empfehlungen gelten für das Verhalten der Kandidaten und Prüfer
beiihrerArbeit.
WervomPrüfungsleiterzurTeilnahmeaneinerorganoleptischenPrüfung
aufgefordert wurde,mußzuderihmgenanntenUhrzeitzurTeilnahme in
derLageseinundhatdazufolgende Vorschriftenzubeachten:
9.1.1. Er stellt mindestens 30 Minuten vor der festgesetzten Uhrzeit das
Rauchenein.
9.1.2. Parfüm,KosmetikaoderSeife,derenGeruchbeiderPrüfungnochwahr-
nehmbar ist, darf nicht verwendet werden. Zum Händewaschen ist
unparfümierte oder schwachparfümierte Seife zu verwenden; dabei sind
die Hände so lange mit Wasser nachzuspülen und abzutrocknen, bis
jedweder Geruchbeseitigt ist.
9.1.3. DerPrüfermußbeiPrüfungsantrittseitmindestenseinerStundenüchtern
sein.
9.1.4. Wer an einer Unpäßlichkeit und insbesondere einer Beeinträchtigung des
Geruchs- oder Geschmacksempfindens oder an einer die Konzentrations-
fähigkeit beeinflußenden psychischen Belastung leidet, hat dies dem
Prüfungsleitermitzuteilen, damitdieserihnvonseinerAufgabeentbindet
oder aber die geeigneten Maßnahmen trifft, wobei auch eine mögliche
Abweichung von den Durchschnittswerten der übrigen Mitglieder der
Gruppezuberücksichtigen ist.
9.1.5. Der die vorstehenden Vorschriften erfüllende Prüfer sucht die ihm zuge-
wiesene Kabine auf; dies hat so leise und diskret wie möglich zu
geschehen.
9.1.6. Nachdem er darin Platz genommen hat, prüft er, ob alle erforderlichen
Hilfsmittel vorhanden und ordentlich vorbereitet sind und vergewissert
sich,obdieKennzeichnungdesGlasesmitderKennzeichnungdesdamit
abgedeckten Uhrglasesübereinstimmt.
9.1.7. ErliestdieHinweiseaufdemPrüfbogensorgfältigdurchundbeginnterst
dann mit der Prüfungder Proben, wenner sich über seine Aufgabe voll-
ends im klaren ist. Unklarheiten sind mit dem Prüfungsleiter unter vier
Augenzuklären.
9.1.8. Der Prüfer nimmt das Glas zur Hand, hält es dabei mit dem Uhrglas
bedeckt schräg undschwenktesdabei einmal ganz um,damit die Innen-
seitemöglichst ganzbenetzt wird.Erlüftet dasUhrglasundinhaliert das
Bukett der Probe in leichten, ruhigen und langen Zügen durch die Nase
so lange, bis er sich ein Urteil über die zur Prüfung anstehende Probe
gebildet hat. Das eigentliche Riechen darf nicht länger als 30 Sekunden
dauern. Gelangt er nach dieser Zeit nicht zu einem Urteil, legt er eine
kleine Pause ein und macht einen weiteren Versuch. Nach dem Riechen
prüft er das Flavour (Gesamtsinneseindruck aus Geruchs-, Geschmacks
und Tastempfindung). Dazu nippt er einen kleinen Schluck Öl von etwa
3 ml. Sehr wichtig ist, daß alle geschmacksempfindlichen Teile des
Mundes mit dem Öl benetzt werden, vom vorderen Teil des Mundes
und der Zungenspitze über die Ränder des Zungenrückens bis zum
Gaumen und zur Zungenwurzel, da die Grundgeschmacke süß, salzig,
sauer und bitter an verschiedenen Stellen der Zunge und des Gaumens
unterschiedlich starkwahrgenommen werden.
Es ist unbedingt darauf zu achten, daß genügend Olivenöl von der
Zungenspitze bis zum Gaumen und zur Kehle langsam verteilt wird,
wobei auf die Reihenfolge des Auftretens der Bitterkeit und der Schärfe
zuachten ist.AnderenfallskannesbeimanchenOlivenölen vorkommen,
daß beide Sinneseindrücke nicht wahrgenommen werden oder die Bitter-
keit vonderSchärfeverdeckt wird.
Durchkurzes,wiederholtesEinsaugenvonLuftdurchdenMundwirddie
Probein der gesamten Mundhöhleverteilt, sodaß die flüchtigen Aroma-
stoffeüberdenGaumenindieNasegelangen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—60
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Auch die Tastempfindungen sind zu erfassen; so müssen die Merkmale
Fließfähigkeit, Dickflüssigkeit, Schärfe oder Stechen erfaßt und je nach
denErfordernissen derProbequantifiziert werden.
9.1.9. Bei der organoleptischen Prüfung von nativem Olivenöl wird in jedem
Prüfgang eine einzige Probe bewertet, damit keine Kontrastwirkungen
durchdassofortigeVerkostenanderer auftreten.
Da es bei aufeinanderfolgenden Prüfgängen zu Ermüdungserscheinungen
oder zur Dämpfung der Sinneswahrnehmung durch die vorangehenden
Eindrücke kommt, sind die Ölreste des vorherigen Prüfgangs mit einem
geeigneten Mittel ausdemMundzuentfernen.
DazuempfiehltsicheinkleinesStückApfelvonetwa15g,dasnachdem
Kauen ausgespuckt werden kann; anschließend ist der Mund mit Wasser
von Zimmertemperatur zu spülen. Zwischen dem Ende eines Prüfgangs
unddemBeginndesnächsten müssenmindestens15Minutenvergehen.
9.2.Vorauswahl der Kandidaten
DerPrüfungsleiterführteineVorauswahlderKandidateninEinzelgesprä-
chen durch, um ihre Persönlichkeit und ihr Umfeld kennenzulernen. An
die physiologischen und psychologischen Voraussetzungen werden keine
sehr hohen Anforderungen gestellt, da jeder Gesunde diese Aufgabe
wahrnehmen kann. Alter, Geschlecht und bestimmte Gewohnheiten
(Rauchen)usw.bleibeninderBedeutunghinteranderenGesichtspunkten
wie Gesundheit, persönliches Interesse und Abkömmlichkeit für diese
Arbeitzurück.
Der Prüfungsleiter klärt den Kandidaten im einzelnen über die von ihm
wahrzunehmendeAufgabeaufundunterrichtet ihnüberdenZeitaufwand
dafür.AnschließendsammelterAnhaltspunktezurPrüfungdesInteresses
und der Motivation des Kandidaten sowie seiner tatsächlichen Abkömm-
lichkeit. Der folgende Fragebogen kann dabei als Grundlage verwendet
werden.
1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—61
▼B
Der Prüfungsleiter nimmt anhand dieser Daten eine Vorauswahl vor,
wobeierdieKandidaten aussondert,dieandieserArbeitwenigInteresse
zeigen, wenig Zeit aufbringen können oder nicht in der Lage sind, ihre
Vorstellungenzuartikulieren.
9.3.Bestimmung der „Durchschnittsschwelle der Gruppe“ für „typische
Merkmale“
Es werden vier Öle ausgewählt, welche die Merkmale „stichig“ („atro-
jado“), „weinartig“, „ranzig“ und „bitter“ jeweils typgerecht und so
deutlich wiemöglich verkörpern.
Mitaliquoten Mengenjedes Typsundeinem geeigneten Substratwerden
Verdünnungsreihen in Abstufungen um den Faktor 2 angesetzt, bis bei
den zwei oder drei letzten Verdünnungsstufen kein Unterschied gegen-
über dem Glas mit dem reinen Substrat mehr wahrnehmbar ist. Zwei
GläsermitdemreinenSubstratbildendenAbschlußderReihe.
DieReihewirdmitVerdünnungenhöhererKonzentrationbisauf8aufge-
stockt.
Es werden so viele Muster der verschiedenen Konzentrationen angesetzt,
daß jedem der Kandidaten für jedes Merkmal vollständige Verdünnungs-
reihenbereitgestellt werdenkönnen.
Zur Ermittlung der „Durchschnittsschwelle“ der Kandidaten sind jedem
von jeder Verdünnungsstufe ein Glas mit 15 ml der Verdünnung sowieein Glas mit 15 ml des reinen Substrats bereitzustellen. Der Kandidat
muß nach Durchführung der Prüfung angeben, ob sie identisch oder
verschieden voneinander sind.
DiegleichePrüfungwirdmitVerdünnungsreihenderverbleibendenPrüf-
merkmale durchgeführt.
Die Zahl der richtigen Antworten aller Kandidaten für die jeweilige
Verdünnungsstufewirdaufgezeichnet undalsProzentsatz derAnzahlder
durchgeführten Prüfungenangegeben.
In einem Koordinatensystem werden die Prozentsätze der richtigen
Antworten für die jeweilige Verdünnungsstufe auf der Ordinate und die
geprüften Verdünnungsstufen in ansteigender Reihenfolge auf der
Abszisseeingetragen.
Abbildung 1 zeigt ein praktisches Beispiel für diese Darstellung. Als
Wahrnehmungsschwelle gilt dieVerdünnungsstufe,fürdiezu75%rich-
tige Beurteilungen abgegeben wurden. Sie wird ermittelt durch
Extrapolation diesesPunktesvonderKurveaufdieAbszisse.
Diese Schwellenkonzentration, die je nach Intensität des Merkmals für
jedes geprüfte Olivenöl unterschiedlich ausfallen kann, dürfte für die
einzelnen Gruppen von Kandidaten ähnlich sein; sie ist unabhängig von
Gebräuchen, Gewohnheiten oder persönlicher Präferenz und infolge-
dessen ein gemeinsamer Bezugspunkt für jede Gruppe von
Durchschnittsmenschen,sodaßsiezurHarmonisierungderverschiedenen
Prüfergruppen hinsichtlich der Geruchs- und Geschmacksempfindlichkeit
verwendet werdenkann.
Anhand der ermittelten Schwellenkonzentration der Gruppe ist wie folgt
zuverfahren:
Es wird eine Verdünnungsreihe mit zunehmender und abnehmender
Konzentration in der Weise angesetzt, daß die Schwellenkonzentration
mit dem Platz 10 dieser Reihe zusammenfällt. Daraus ergibt sich folge-
richtig, daß die Verdünnungen 11 und 12 stärker verdünnt sind, so daß
sehr schwer festzustellen ist, daß sie Öl mit dem entsprechenden
Merkmal enthalten.
AusgehendvonderKonzentration C
10könnendieübrigen Verdünnungen
nachfolgenderFormelangesetzt werden:
C10·an
Darinbedeuten:a = KonstantefürdenVerdünnungsfaktor1,5,
n = Exponent mit einem Wertvon9bis−2.
Beispiel:Gegeben sei ein Schwellenwert für ranziges Olivenöl von 0,32. Mit C
10=0,32unda=1,5ergebensichfolgendeVerdünnungsstufen:1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—62
▼B
Probe 1 234567891 0 1 1 1 2
Konzentration 12,30 8,20 5,47 3,65 2,43 1,62 1,08 0,72 0,48 0,32 0,21 0,14
Durch Ansetzen von Verdünnungsreihen nach dieser Arbeitsvorschrift
anhand der nach diesem Berechnungsverfahren bestimmten Schwellen-
werte für die übrigen Merkmale erhält man für alle Laboratorien Skalen
mit gleicher Reizabstufung für jedes einzelne Merkmal, selbst wenn die
FehlerderverwendetenOlivenöleunterschiedlichstarkfestzustellensind.
9.4.Auswahl der Prüfer nach dem Verfahren der „Intensitätseinstufung“
Zur Auswahl sind zwei- bis dreimal so viele Kandidaten heranzuziehen,
wie zur Bildung der Prüfergruppe erforderlich sind, damit die mit der
höchsten Sinnenschärfe und dem größten Unterscheidungsvermögen
ausgewählt werden können. Die Prüfung sollte immer mit dem gleichen
Erzeugnis wie das später zu Prüfende durchgeführt werden (daher wird
immerOlivenöl verwendet).
Abbildung 1
Bei der Auswahl des Verfahrens ist unabhängig von seiner Leistungs-
fähigkeit auch seine Wirtschaftlichkeit hinsichtlich der Ölmenge, der
Anzahl der Proben und des Zeitaufwands zu berücksichtigen. Ein
Auswahlverfahren ist umso wirksamer, je besser es gelingt, das optimale
Niveau der folgenden drei abhängigen Variablen zu bestimmen: a)
„Kosten“ in Abhängigkeit von der Anzahl der Prüfungen, b) „Anteil“
dermöglicherweisegeeignetenKandidaten,diedurchZufallleiderausge-
sondert werden, und c) „Anzahl“ der ungeeigneten Kandidaten, die das
Glückhatten, dasAuswahlverfahrendennochzubestehen.
Für die Auswahl wird das Verfahren der „Intensitätseinstufungsprüfung“
(intensity rating test) gemäß den Normen ASTM (American Society for
Testing and Materials), STP (Special Technical Publication) Nr. 440, S.
53,verwendet,dasinfolgenden Punktenabgeändert wurde:
1. VerringerungderZahlderProbeninderPrüfreihe;1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—63
▼B
2. Erweiterung der Reizstoffpalette durch Aufnahme weiterer Geruchs-
undGeschmacksnotenfürdieAuswahl,umdenhäufigstenwahrnehm-
barenFehlernvonOlivenöl Rechnungzutragen;
3. Variation desKonzentrationsverhältnisses inderPrüfreiheund4. statistische AuswertungderErgebnisse.
Geräte und Hilfsmittel:— FlaschenoderKolben,1500ml,
— dunkelfarbige Prüfgläser,
— Reagenzgläser, 10ml,15ml,1000mlund1500ml.
Reagenzien:— Merck-Paraffin (Nr. 7.160, DAB 6, USP XX) oder geruch- und
geschmackloses Ölsubstrat (frisch raffiniertes Oliven- oder anderes
Öl)
— Olivenöle: stichig(„atrojado“), weinartig, ranzigundbitter.
9.4.1. Verfahren
Nach dem Ansetzen der Verdünnungen wird, ausgehend von 25 Kandi-
daten, mit dem Auswahlverfahren begonnen. Die Auswahl wird nach
dem nachstehend beschriebenen Verfahren für jede Geschmacksnote
durchgeführt.
1. Verdünnungsreihen mit 12 verschlüsselt gekennzeichneten Gläsern
(eine Reihe pro Kandidat) werden vorbereitet. In jedes Prüfglas
werden 15 ml Probe mit der nach der Formel C
10·anjeweils herge-
stellten Konzentration gegeben.
2. Nach dem Füllen werden die Gläser mit aufliegendem Uhrglasdeckel
mindestens eine Stunde vor Beginn der Prüfungen bei einer Tempe-
ratur von 20—22 ºC im Prüfungsraum stehen gelassen, um sie auf
Raumtemperatur zubringen.
3. Die12GläserwerdenvomPrüfungsleiterinabsteigender Reihenfolge
derKonzentrationen ineinerReiheaufgestellt.
Anschließend wird jeder Kandidat aufgefordert, die Prüfung einzeln
durchzuführen; dazusindihmfolgende Anweisungenzuerteilen:
9.4.2. Anweisungen für die Kandidaten
Die 12 vor dem Kandidaten aufgestellten Gläser enthalten jeweils
Verdünnungen der Reize „stichig“ („atrojado“), „weinartig“, „ranzig“
und„bitter“. Die Gläserunterscheiden sichhinsichtlich derIntensität des
Geruchs, wobei das mit dem stärksten Geruch ganz links steht und die
Konzentrationen stufenweise nach rechts abnehmen. Das ganz rechts
stehende Glas kann so wenig von dem Geruchsstoff enthalten, daß er
nichtmehrwahrnehmbarist.
Gehen Sie bitte wie folgt vor: Machen Sie sich mit den Gerüchen der
einzelnen GläserderReihevertraut.Beginnen Siedabeimit demGeruch
des rechten Glases (Nr. 12) und versuchen Sie, sich die Intensität des
Geruchszumerken.Sinnenermüdungistzuvermeiden.
Sobald Sie sich die Reihenfolge der Verdünnungsstufen gemerkt haben,
verlassenSiedenPrüfraum.
Anschließend nimmt der Prüfungsleiter ein Glas aus der Reihe heraus,
stellt es gleichauf mit dem ganz rechts stehenden und schließt die Lücke
durch Verschieben der übrigen Gläser. Sie betreten darauf wieder den
PrüfstandundsetzendiePrüfungfort.
DiePrüfungbestehtausfolgender Aufgabe:
Das herausgenommene Glas ist an seinen ursprünglichen Platz in der
Reihe zurückzustellen. Dazu kann beliebig oft ein Geruchsvergleich der
Gläser durchgeführt werden. Zu beachten ist, daß das Glas bei korrekter
Plazierung stärker als das unmittelbar rechts daneben stehende und
schwächeralsdasunmittelbarlinksdanebenstehenderiechenmuß.Diese
Prüfungwirdmit dreiweiteren Gläsernwiederholt.
Zur Erleichterung der Prüfung und der Abgabe der Antworten erhalten
die Kandidaten zusammen mit den vorstehenden Anweisungen folgendes
Formblatt.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—64
▼B
9.4.3. Ergebnisse
Der Übersichtlichkeit halber notiert der Prüfungsleiter die von den
einzelnen Kandidaten gemachten Angabenwiefolgt:
9.4.4. Statistische Auswertung der Antworten
ImvorliegendenFallsinddieanihrenursprünglichenPlatzzurückzustel-
lenden Gläser für alle Kandidaten gleich; nach den statistischen
BerechnungenfürdiesenFallmußessichdabeiumdiefolgendenGläser
mitdenfürdasjeweiligeMerkmalaufgeführtenSeriennummernhandeln:
Stichig
(„atrojado“) (St)Weinartig(W) Ranzig (R) Bitter (B)
GlasNr. GlasNr. GlasNr. GlasNr.
(10,5,7,2) (11,3,8,6) (7,4,10,2) (6,3,11,9)
Die der entsprechenden Position des Glases in der Reihe entsprechende
Nummer darf nicht variieren, da die statistischen Berechnungen für
diesenFall aufderWahrscheinlichkeit beruhen, mit derdieGläserdurch
Zufall anihrenrechten Platzzurückgestellt werden.
Damit die Kandidaten keine Informationen untereinander austauschen
können,hatderPrüfungsleiter folgendeRegelnzubeachten:
1. Es muß ausgeschlossen sein, daß die Kandidaten Informationen
austauschen können. Für jeden Kandidaten müssen unterschiedliche
Aufschriftenverwendet werden.
2. Esmußausgeschlossensein,daßdieKandidateninErfahrungbringen
können,welcheGläserherausgenommen wurden.
3. Jedem Kandidaten sind die Gläser mit den vorstehenden Nummern in
einem anderen Prüfungsgangzupräsentieren.
DieErgebnissejedesKandidaten werdenwiefolgtbenotet:
Die 12 Gläser mit den entsprechenden Verdünnungsstufen des Merkmals
iseieninabnehmenderReihenfolgeihrerKonzentrationmitei
1,ei
2,…ei
12bezeichnet (i = ein beliebiges der Merkmale stichig („atrojado“), wein-
artig,ranzig undbitter).
Esseienei
keinbeliebigesGlasundK ′dervondemKandidatengewählte
Platzdesbetreffenden GlasesinderReihe. DieWerte fürKundK ′sind
demnach ganzeZahlen zwischen1und12einschließlich undbezeichnen
den tatsächlichen und den vom Kandidaten gewählten Platz des betref-
fendenGlasesinderReihe.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—65
▼B
T (maximal zulässige Abweichung) sei ein vorab auf einen bestimmten
Betrag, in unserem Fall auf den Betrag 3, festgesetztes Kriterium, das
bei K′−K > T den automatischen Ausschluß des Kandidaten zur Folge
hat(1).
Ist dagegen K ′−K≤T, so wird der Kandidat allgemein nicht ausge-
schlossen, sondern kann weiter an der Prüfung teilnehmen, da er in der
Lage ist, das herausgenommene Glas an den richtigen Platz zurückzu-
stellen, zumindest aberanzweiunmittelbar benachbarte Plätze.
In diesem Fall ist die Note, die ein Kandidat erhält, der ein bestimmtes
Geschmacksmerkmal (Konzentration) beurteilt hat (z. B. stichig („atro-
jado“), gleich dem Quadrat aus der Differenz zwischen der richtigen
Stelle in der Reihenfolge der Gläser und der Stelle, an die der Kandidat
dasGlasgestellt hat
Phst=(K′−K)2
Da ein Kandidat anhand von vier Intensitätsstufen (Verdünnungsstufen)
jedes einzelnen Merkmals geprüft wird, bestimmt sich die Einzelbewer-
tungfürdasfolgendeMerkmal (z.B.„stichig“ („atrojado“)) wiefolgt:
ZSt=PSt
h+PSt
j+PSt
l+PSt
m
ZumbesserenVerständnisnachstehend einige Beispiele:
Beispiel 1:
Nehmen wir an, der Kandidat A habe die Fragen nach den vier Inten-
sitätsstufenderVersuchsreihedesMerkmals(i)wiefolgtbeantwortet:
Richtiger Platz des
GlasesinderReihe
(K)Gewählter Platz
(K′)Differenz zu demrichtigen Platz
(K′−K)
7 7 7−7=0
4 5 4−5=−1
10 6 10−6=4(1)
2 4 2−4=−2
(1) Dieser Kandidat scheidet aus, da er bei der Prüfungnur einen Wert von T > 3
erreicht hat.
Beispiel 2:
Nehmenwiran,derKandidat ordnetdieVerdünnungsstufeneinesMerk-
malswiefolgtzu:
Richtiger Platz des
GlasesinderReihe
(K)Gewählter Platz
(K′)Differenz zu demrichtigen Platz
(K′−K)
7 7 7−7=0
4 4 4−4=0
10 7 10−7=3
2 3 2−3=−1
Dieser Kandidat scheidet nicht aus. Er hat für dieses Auswahlmerkmal
folgendeBenotungerreicht:
Zi=O2+O2+32+(−1)2=10
Die Gesamtbewertung für die Auswahloder dasAusscheidendes Kandi-
daten aufgrund seiner Antworten zu den vier Auswahlmerkmalen
geschieht wiefolgt:1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—66
(1) Der Prüfungsleiter muß den Kandidaten unbedingt veranlassen, die Prüfung mit
Bedacht zu absolvieren,damit seinGeruchssinnnicht abstumpft.▼C1
▼B
▼B
PSt
h+PSt
j+PSt
i+PSt
m=ZSt
PW
h+PW
j+PW
i+PW
m=ZW
PR
h+PR
j+PR
i+PR
m=ZR
PB
h+PB
j+PB
i+PB
m=ZB
ZGesamt=ZSt…+ZB
Darinbedeutet:
St = stichig(„atrojado“),
W = weinartig,
R = ranzig,
B = bitter.
Es stellt sich nun die Frage, bis zu welchem Betrag von Z davon auszu-
gehen ist, daß der Kandidat über Sinnenschärfe, Geruchsgedächtnis und
Zuordnungsvermögen in dem Maße verfügt, wie es zur richtigen Beant-
wortung im Hinblick auf die vier Merkmale erforderlich ist. Z ist
definitionsgemäß nie negativ, und ein Betrag Z = 0 bedeutet, daß der
Kandidat alle 16 ihm präsentierten Verdünnungsstufen (vier für jedes
Merkmal) erkannt und richtig zugeordnet hat. Ist der Betrag von Z von
Null verschieden, so bedeutet dies, daß der Kandidat die Bereiche, zu
denen die ausgewählten Verdünnungen gehören, zwar erkannt hat, den
genauen Platz jedoch nicht feststellen konnte, da er über kein gutes
Unterscheidungsvermögen hinsichtlich der Verdünnungsreihe, die ihm
füreinodermehrere Merkmale präsentiert wurden,verfügt.
Esempfiehltsichdaher,einenkritischenWertZcfestzulegen,fürdenbei
ausschließlich zufälliger Platzbewertung durch den Kandidaten innerhalb
der von ihm zuvor erkannten Bereiche die Wahrscheinlichkeit eines
Gesamtwerts Z < Zcein hinreichend kleiner Wert αist, der vorher fest-
gelegt werden kann. Mit anderen Worten, die Wahrscheinlichkeit, daß
mit diesem Verfahren ein Prüfer ausgewählt wird, dessen Unterschei-
dungsvermögen für die bei der Auswahl herangezogenenen Merkmale
unzureichend ist,istkleinerals α.
Bei gegebenem α,das in unserem Fall auf 0,05 festgelegt wurde, ergibt
sich Zcaus der Wahrscheinlichkeitsverteilung der Variablen Z, die sich
ihrerseits ausdenWahrscheinlichkeitsverteilungen derVariablen Pergibt
(K′).
Ausderstatistischen BerechnungergibtsichfürZceinBetrag von34.
Nachdem der von jedem Kandidaten erreichte Wert Z feststeht, scheiden
all jeneKandidaten aus,dieeinenWertvonüber34erreicht haben.
Soerhalten dieKandidaten AundBfolgende Bewertungen:
Merkmal Kandidat A Kandidat B
Stichig(„atrojado“) (St) ZSt=10 ZSt=12
Weinartig (W) ZW=10 ZW=11
Ranzig(R) ZR=10 ZR=15
Bitter(B) ZB=4 ZB=0
Σ=34 Σ=38
Die Kandidaten A und B kommen auf jeweils 34 bzw. 38 Punkte;
demnach hat der Kandidat A die Prüfung bestanden, B dagegen nicht
und scheidet aus. Nachdem die Kandidaten mit über 34 Punkten ausge-
schieden sind, werden die übrigen in der Reihenfolge der von ihnen
erzielten Punkte in einer Eignungsliste aufgelistet und die zwölf besten
ausgewählt.
9.5.Schulung
DieSchulungverfolgthauptsächlich folgendeZiele:
a) DiePrüfersollenmitdenzahlreichen Geruchs-undGeschmacksnoten
vonnativem Olivenölvertraut gemachtwerden.
b) DiePrüfersollenmitdenspezifischensensorischenMethodenvertraut
gemachtwerden.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—67
▼B
c) Die Fähigkeit jedes einzelnen, die sensorischen Merkmale wahrzu-
nehmen, zu identifizieren und quantitativ zu bestimmen, soll geschult
werden.
d) Sinnenschärfe und Gedächtnis für die verschiedenen Merkmale sollen
verbessert werden, damit eine zuverlässige Beurteilung gewährleistet
ist.
EntsprechenddenMöglichkeitenderTeilnehmer sowiederUntersuchung
umfaßt die Schulung gewöhnlich eine Reihe von Prüfungsgängen, bei
denendiePrüferdieÖleeinzelnprüfenundanschließenddiedabeiange-
troffenen Schwierigkeiten gemeinsam mit demLeiter diskutieren unddie
Bewertungenerläutern,umKriterienundMeinungsbildungzuvereinheit-
lichen.
Der nach einer bestimmten Zahl von Prüfungsgängenerreichte Standder
Schulung wird anhand der Zunahme des Prozentsatzes richtiger Bewer-
tungen bei Unterscheidungsprüfungen oder anhand der Analyse der
Varianz der durchschnittlichen Einzelbewertungen der Gruppe bei
Skalenprüfungenermittelt.
Der praktische Nutzen dieser Schulung wurde eingehend erörtert; heute
giltsiealssehreffizientundsogaralsunverzichtbarzurErzielungzuver-
lässiger,richtiger sensorischerDaten.
9.6.Leistungskontrolle
Erfahrene Prüfer nehmen gewöhnlich regelmäßig an sensorischen
Prüfungen teil, die ihnen sehr viel abverlangen. Ihre Bewertungen sind
intechnischerundgewerblicherHinsichtoftvongroßerTragweite;dahermüssen sie sich nach ihrer Auswahl und Schulung Leistungskontrollen
unterziehen, damitdieVerläßlichkeit derErgebnissegewährleistet ist.
DahermüssendieanRoutineprüfungenteilnehmenden Prüferregelmäßig
inbestimmten AbständenihreLeistungsfähigkeit nachweisen.
10. VERFAHREN FÜR DIE BEWERTUNG DER ORGANOLEPTISCHEN
EIGENSCHAFTENVONNATIVEMOLIVENÖL
Nach Erfüllung der Bedingungen und Bereitstellung der erforderlichen
Mittel entsprechend den vorstehenden Normen sowie nach Auswahl der
Prüfergruppe unterzieht jeder Prüfer das ihm zur Prüfung bereitgestellte
Glas mit dem Prüfmuster einer Geruchs- und Geschmacksprüfung(
1);
dabei prüft er die olfaktorischen, gustatorischen, taktilen und kinästheti-
schen Merkmale anhand des in Abbildung 2 abgebildeten Prüfbogens, in
den er das Vorhandensein und die Intensität der Merkmale einträgt.
Alsdannbewertet erdieQualität desÖls.
10.1.Verwendung des Prüfbogens in Abbildung 2 (Flavourbeschreibung
und Qualitätsbewertung)
In der linken Hälfte des Bogens sind einige der typischsten sensorischen
Merkmale aufgeführt, die bei Olivenöl am häufigsten auftreten und für
sein Flavour kennzeichnend sind. Werden außer den aufgeführten Merk-
malenweitereMerkmalewahrgenommen,sosinddiesemitdemoderden
treffendsten Begriff(en) dafürinderRubrik„Andere“ zuvermerken.
DiewahrgenommenenMerkmalesindentsprechendihrerIntensitätdurch
Ankreuzen(+)desdafürvorgesehenenKästchensentsprechenddernach-
stehenden Bewertungstabelle zubewerten:
1 = kaumwahrnehmbar,
2 = schwach,
3 = mittel,
4 = stark,5 = extrem.
Die rechte Hälfte des Bogens enthält eine Neun-Punkte-Bewertungsta-
belle (9 = außergewöhnliche Qualität, 1 = ungenügend), anhand derer
derPrüfereineeinheitlicheGesamtbewertungderÖlmerkmalevornimmt.
Bei dieser Bewertung ist den guten Eigenschaften und den Fehlern, die
bereits in der linken Hälfte im einzelnen vermerkt wurden, Rechnung zu
tragen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—68
(1) Sofern er bei der Geruchsprobe ein extrem oder stark unangenehm vorschmeckendes
Merkmal feststellt, kann er ausnahmsweise darauf verzichten und dies auf dem Prüf-
bogenvermerken.
▼B
Die erste Spalte (Fehler) der Bewertungstabelle umfaßt fünf Rubriken,
wonach Olivenöle hauptsächlich aufgrund des völligen Fehlens oder des
mehr oder weniger ausgeprägten Auftretens von Flavourfehlern beurteilt
werden; da die Bewertungstabelle jedoch neun Punkte umfaßt, sind die
in der zweiten Spalte (Merkmale) aufgeführten Nuancen und Aspekte zu
berücksichtigen, die zu der Gesamtbewertung der Qualität entscheidend
beitragen.
10.2.Endgültige Bewertung
Der Prüfungsleiter sammelt die von den einzelnen Prüfern abgegebenen
Bewertungen ein und überprüft, ob die wahrgenommenen und die in der
„Profilbeschreibung“ vermerkten Merkmale und Intensitäten mit der in
der„Bewertungstabelle“ erteilten BewertunginEinklangstehen.
Bei deutlichen Abweichungen muß der Prüfungsleiter den Prüfer auffor-
dern,seinenBewertungsbogenzuüberprüfen.
Erforderlichenfalls mußderPrüferdieUntersuchungwiederholen.
Schließlich stellt der Prüfungsleiter die Bewertungen durch die Gesamt-
gruppe in einer Tabelle zusammen und berechnet das arithmetische
MittelunddieArtdesFehlers(desMittelwerts).
Wenn die Art des Fehlers größer ist als der Fehler der Methode, somuß
erdieUntersuchungdurchdiegesamteGruppewiederholen lassen.
Nur im Fall von Revisionsanalysen müssen die Untersuchungen so oft
wiederholtwerden,bisdreiBewertungenjeProbevorliegen.Dieendgül-
tige Bewertung ist der Mittelwert von drei Bewertungen, wobei das
ErgebnisaufeineDezimalstelle angegeben wird.
WennderMittelwertfürdieIntensitätvonbitterund/oderpikantüber2,5
liegt, so wird dem Öl die entsprechende Bewertung gegeben, wobei
zusätzlich angegeben wird,daßesbesondersbitter und/oderpikantist.
Abfassung der Ergebnisse: Der Prüfungsleiter bestimmt anhand des
Mittelwerts die Kategorie, in die die Probe entsprechend den in Anhang
I vorgesehenen Grenzwerten eingeordnet wird. Zu diesem Zweck
berücksichtigt er
— imWirtschaftsjahr 1992/93einenToleranzwert von+1,5,
— imWirtschaftsjahr 1993/94und1994/95einenToleranzwert von+1,— imWirtschaftsjahr 1995/96einenToleranzwert von+0,5,
wennderMittelwert mindestens5Punkteerreicht.
Im Fall von Olivenölen, die Gegenstand von Interventionsmaßnahmen
sind,wirdjedochkeinToleranzwert angewandt.
Die in den vorstehenden Absätzen genannten Toleranzwerte berücksich-
tigen den statistischen Unterschied zwischen dem Analyseergebnis und
dem vorgeschriebenen Grenzwert hinsichtlich Wiederholbarkeit und
Vergleichbarkeit.
WirdOlivenölindengenanntenWirtschaftsjahrenohneBerücksichtigung
der vorgesehenen Toleranzwerte klassifiziert, so kann auf der unmittel-
baren Umschließung des Erzeugnisses die organoleptische
Mindestbenotungangegebenwerden,diebiszumHaltbarkeitsdatumüber-
prüftwerdenkann.
DerPrüfungsleitergibtimUntersuchungsbericht nurdieKategorie an, in
die die Probe eingeordnet wird. Wird die Prüfung durch einen Prüfer
gemäß Artikel 2 Absatz 2 erster Unterabsatz durchgeführt, so bestimmt
dieserdieKategorie nachdemgleichenVerfahren.
Anmerkung: Die Proben sind bis zu ihrer Untersuchung verschlossen im
Kühlschrank aufzubewahren und sind jedesmal wieder dort
hinzubringen, bisdiedritte Untersuchungabgeschlossen ist.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—69
▼M10
▼M9
▼M5
▼B
▼M3
Abbildung 2
Natives Olivenöl
SENSORISCHE PRÜFUNG: GRUNDBEGRIFFE
1. UMFANGUNDANWENDUNGSBEREICH
Diese Norm enthält eine Zusammenstellung der bei der sensorischen
PrüfungzuverwendendenBegriffe undihrerDefinitionen.
2. BEGRIFFE2.1.Allgemeine Begriffe
Sensorische Prüfung (Substantiv):
Sinnenprüfungderorganoleptischen Eigenschaften.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—70
▼B
▼B
Wahrnehmung (Substantiv):
SinnlichesErfassenäußererGegenständeundVorkommnisse.Organoleptisch (Adjektiv)(Merkmal oderEigenschaft):
Bezeichnet Eigenschaften einesErzeugnisses,diemit HilfederSinnesor-
ganewahrgenommenwerdenkönnen.
Sachverständiger (Substantiv) (auf dem Gebiet der Prüfung der organo-
leptischen Eigenschaften):
Auf die sensorische Prüfung eines bestimmten Erzeugnisses speziali-
sierter Prüfer, der über Grundkenntnisse über dessen Herstellung und die
Marktpräferenzen verfügt.
Prüfer(Substantiv):
Ausgewählte und geschulte Person mit Unterscheidungsvermögen und
Sinnesschärfe zur sensorischen Prüfung der organoleptischen Eigen-
schafteneinesLebensmittels.
Prüfergruppe (Substantiv):
GruppevoneigensausgewähltenundgeschultenPrüfern,diezursensori-
schen Prüfung des Erzeugnisses unter kontrollierten Bedingungen
zusammentritt.
Empfindung(Substantiv):
Durch einen Sinnesreiz verursachtes subjektives Phänomen. Dieses
Phänomen ist hinsichtlich seiner Art, seiner Bewertung sowie seiner
Intensität subjektiv unterscheidbar und objektiv über das betreffende
Sinnesorganbeschreibbar.
Sinnenschärfe (Substantiv):
Fähigkeit der Sinnesorgane zur qualitativen und quantitativen Wahrneh-
mung eines schwach ausgeprägten Sinnesreizes oder von geringen
UnterschiedenzwischenSinnesreizen.
Verkostung(Substantiv):
Vorgang des Wahrnehmens, Prüfens und Beurteilens organoleptischer
Eigenschaften, insbesondere der olfaktorischen, gustatorischen, taktilen
undkinästhetischen Eigenschaften einesLebensmittels.
Akzeptanz(Substantiv):
Positive Reaktion eines einzelnen oder einer Gruppe, die ein Erzeugnis
aufgrundseinerorganoleptischen Eigenschaften auslöst.
Harmonie(Substantiv):
Eigenschaft eines Erzeugnisses, die eine angenehme Gesamtempfindung
verursacht. Diese Empfindung wird verursacht durch die Wahrnehmung
ihrer Einzelbestandteile in Form von olfaktorischen, gustatorischen,
taktilen und kinästhetischen Reizen, da die Einzelbestandteile in jeweils
geeigneten Konzentrationsverhältnissen vorliegen.
Anklang(Substantiv):
Tatbestand der bereitwilligen Aufnahme eines Erzeugnisses aufgrund
seiner organoleptischen Eigenschaften durch den einzelnen oder eine
Gruppe.
Unterscheidung (Substantiv):
Qualitative und/oder quantitative Unterscheidung zweier oder mehrerer
Reize.
Kompensation (Substantiv):
Ergebnis des Zusammenwirkens mehrerer Sinnesreize derart, daß ein
jederdavonschwächerwahrnehmbarist,alswennerallein vorläge.
Aussehen(Substantiv):
Mit den Augen wahrgenommenes Gesamtbild der organoleptischen
Eigenschaften: Größe,Form,Farbe, Erscheinungsbild, Trübheit, Klarheit,
Fließvermögen,SchaumundEfferveszenz.DieserBegriffistdemBegriff
Erscheinungsbild vorzuziehen.
Eigenschaft(Substantiv):
Wahrnehmbares Merkmal.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—71
▼B
2.2.Physiologische Begriffe
Reizstoff(Substantiv):
Physikalisch oder chemisch beschreibbarer Stoff, der eine spezifische
Reaktion derexternen oderinternen Sinnesrezeptoren hervorruft.
Geschmack(Substantiv)(Geschmackssinn):
Einer der Sinne, dessen Rezeptoren sich im Mund und insbesondere auf
der Zunge befinden und auf verschiedene gelöste Verbindungen
reagieren.
Gustatorisch (Adjektiv):
Bezeichnet die Eigenschaft eines Erzeugnisses zur Reizung des
Geschmackssinns und Hervorrufung einer oder mehrerer der vier Grund-
geschmacke: süß,salzig, sauerundbitter.
Rezeptor(Substantiv):
AufdieAufnahmevonReizenspezialisierterTeileinesSinnesorgans,der
in der Lage ist, Reize zu empfangen und an die Nervenzellen weiterzu-
leiten.
Anmerkung: Die Rezeptoren werden nach der Art der Energie, die den
entsprechenden Sinnesreiz auslösen, unterschieden (Licht,
Wärme, Schallusw.).
Geruch(Substantiv):
Funktion der Geruchsorgane hinsichtlich der Wahrnehmung und Unter-
scheidung von Molekülen, die in der Gasphase von außen mittelbar oder
unmittelbar durchdieNasemit ihminBerührungkommen.
Intensität(Substantiv):
StärkederEnergieeinerEigenschaft,dieoberhalbderSchwellemitHilfe
einerquantitativen Werteskala bestimmt werdenkann.
Anpassung(Substantiv):
Vorübergehende Änderung der Sinnesschärfe bei der Wahrnehmung von
sensorischen Reizstoffen als Ergebnis einer ständigen, wiederholten
Einwirkungeinesbestimmten odereinesdiesem ähnlichen Reizstoffs.
Hemmung(Substantiv):
AusbleibenderReaktioneinesSinnesorgansodereinesseinerTeileunter
der Einwirkung eines geeigneten Reizstoffs, dessen Intensität oberhalb
derSchwelle liegt.
Reaktion(Substantiv):
Wirkung, mit der die Sinneszellen auf einen oder mehrere Reize eines
bestimmten Sinnsreagieren.
Körper(Substantiv):
In der Mundhöhle wahrgenommene taktile Empfindung, die ein Gefühl
für die Dichte, Viskosität, Konsistenz oder Kompaktheit eines Erzeug-
nissesliefert.
Duftigkeit(Substantiv):
Frischer,weicherundmilder Geruch.Riechen(Verb)(Fähigkeit desGeruchssinns):
Fähigkeit derGeruchswahrnehmung.
Objektiv(Adjektiv):
a) Bezeichnung für die Vermittlung einer wirklichkeitsgetreuen und
überprüfbaren Darstellung eines Sachverhalts unter Vernachlässigung
menschlicher Faktoren(z.B.Vorlieben,Gewohnheiten,Affekte);
b) Bezeichnung für eine Technik, die es trotz der Verwendung sensori-
scher oder instrumentaler Verfahren erlaubt, selbstverursachte Fehler
zuvermeiden.
Anmerkung: Von der Verwendung des Begriffs instrumentell als
Synonymwirdabgeraten.
Subjektiv(Adjektiv):1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—72
▼B
Bezeichnung für die Vermittlung einer Wahrnehmung, die nicht allein
durch den Reizstoff hervorgerufen wird, sondern auch durch unser
DenkenundFühlen.
Kinästhetik:Gesamtheit der Empfindungen, die sich beim Pressen der Probe bei der
Bewegung in der Mundhöhle oder beim Pressen zwischen den Fingern
ergeben(Beispiel: Zerdrücken vonKäsezwischendenFingern).
Schwelle(Substantiv):
—absolute Schwelle
MindestmengeeinesReizstoffes,
— dieeine Empfindunghervorruft(Wahrnehmungsschwelle) oder
— bei der diese Empfindung identifiziert wird (Identifizierungs-
schwelle);
—Unterscheidungsschwelle
MindestmengeeinesReizstoffs,beidereinmerklicherUnterschiedin
derIntensität derEmpfindungen feststellbar ist;
—Oberschwelle
Höchststärke eines Reizstoffs, oberhalb derer eine Zunahme der
Stärkenichtmehrwahrgenommen wird;
—Präferenzschwelle
Mindestmenge eines Reizstoffs oder kritische supraliminare Konzen-
tration dieses Reizstoffs, die im Vergleich zu einem neutralenReizstoff angenehme bzw. unangenehme Empfindungen hervorruft,
z.B.beiderWahlzwischeneinerZuckerlösungundWasser.
Anmerkung: Es ist zu unterscheiden zwischen absoluter Präferenz-
schwelleundUnterscheidungspräferenzschwelle.
Subliminar(Adjektiv):
Unterhalb derabsoluten Schwelle.
Supraliminar (Adjektiv):
OberhalbderabsolutenSchwelle.Sinnenermüdung:
Besonderer Fall der Sinnengewöhnung, bei dem ein Rückgang der
Sinnesschärfezuverzeichnen ist.
Kompensation (Substantiv):
Ergebnis des Zusammenwirkens mehrerer Reizstoffe derart, daß jeder
schwächerwahrgenommenwird,alswenneralleine vorkäme.
Synergistisch (Adjektiv):
Ergebnis des Zusammenwirkens bestimmter Stoffe in der Weise, daß die
Intensität der durch ihre Mischung hervorgerufenen organoleptischen
Eigenschaften stärker ist als die Summe der einzeln wirkenden Kompo-
nenten.
Kontrastwirkung (Substantiv):
Steigerung der Reaktion auf die Unterschiede zweier gleichzeitig oder
nacheinander wirkenderReizstoffe. Gegenteil vonKonvergenzwirkung.
Konvergenzwirkung (Substantiv):
AbschwächungderReaktionaufdieUnterschiedegleichzeitig odernach-
einander wirkenderReizstoffe. Gegenteil vonKontrastwirkung.
2.3.Begriffe für organoleptische Eigenschaften
Sauer(Adjektiv):
a) Bezeichnung für den vorherrschenden Geschmack verdünnter
wässriger Lösungen der meisten Säuren (z. B. Zitronensäure, Milch-
säure,Traubensäure);
b) BezeichnungfürdieEigenschaftvonStoffen,imReinzustandoderals
GemischdiesenGrundgeschmackhervorzurufen.
Daszugehörige Substantivlautet: Azidität.
Säuerlich(Adjektiv):1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—73
▼B
BezeichnungfürdieGeruchs-undGeschmackswirkungvonvorallembei
der Fermentierung freiwerdenden Säuren sowie von Lebensmitteln, die
dieseEmpfindungenhervorrufen.
Einige Faktoren, die zu dieser Empfindung beitragen, stehen in Bezie-
hung zur Fermentierung, zum Beispiel die Milchsäure- oder
EssigsäurebildungeinesLebensmittels.
Bitter(Adjektiv):
a) BezeichnungfürdenvorherrschendenGeschmackverdünnterwäßriger
Lösungen von verschiedenen Stoffen wie Chinin, Koffein sowie
bestimmter Alkaloide;
b) BezeichnungfürdieEigenschaftvonStoffen,imReinzustandoderals
GemischdiesenGrundgeschmackhervorzurufen.
Daszugehörige Substantivlautet: Bitterkeit.
Salzig(Adjektiv):
a) Charakteristische Geschmacksempfindung, wie sie in typischer Weise
voneinerNatriumchloridlösung hervorgerufenwird;
b) BezeichnungfürdieEigenschaftvonStoffen,imReinzustandoderals
GemischdiesenGrundgeschmackhervorzurufen.
Daszugehörige Substantivlautet: Salzigkeit.Süß(Adjektiv):
a) Bezeichnung für den vorherrschenden Geschmack wäßriger Lösungen
verschiedener Stoffe,z.B.Saccharose;
b) BezeichnungfürdieEigenschaftvonStoffen,imReinzustandoderals
GemischdiesenGrundgeschmackhervorzurufen.
Daszugehörige Substantivlautet: Süße.
Adstringierend (Adjektiv):
a) Bezeichnung für eine komplexe Empfindung, wie sie von einer
verdünnten wäßrigen Lösung mancher Stoffe, z. B. von bestimmten
Tanninen(Kaki-oderSchlehentannin), hervorgerufen wird;
b) BezeichnungfürdieEigenschaftvonStoffen,imReinzustandoderals
GemischdieseEmpfindunghervorzurufen.
Daszugehörige Substantivlautet: Adstringenz.Flavour(Substantiv):
AlsFlavourbezeichnetmandendurchdasZusammenwirkenvonolfakto-
rischen, gustatorischen, taktilen und kinästhetischen Empfindungen
hervorgerufenen Gesamtsinneseindruck, der für ein Lebensmittel kenn-
zeichnend ist und als mehr oder weniger angenehm oder unangenehm
empfundenwird.
Geschmack(Substantiv):
a) Empfindung, die durch die von bestimmten löslichen Substanzen
hervorgerufeneReizung derGeschmackspapillen hervorgerufenwird;
b) Bezeichnung für die von solchen Stoffen hervorgerufene besondere
Empfindung.
Grundgeschmack (Substantiv):
a) Beim Einatmen bestimmter flüchtiger Stoffe über das Riechorgan
wahrgenommener Gesamtsinneseindruck;
b) Bezeichnung für die von solchen Stoffen hervorgerufene besondere
Empfindung.
Geruch(Substantiv):
a) Kombination von Empfindungen, die durch das Geruchsorgan wahr-
genommen werden beim Einziehen bestimmter flüchtiger Substanzen
durchdieNase;
b) Eigenschaft einer spezifischen Empfindung, die von den obenge-
nanntenSubstanzenherrührt.
Aroma(Substantiv):
a) Beim Verkosten eines Lebensmittels indirekt über das Riechorgan
wahrgenommene angenehme Empfindungen;1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—74
▼B
b) inderParfümeriesowieinderUmgangssprachewirdderBegriffauch
für dieselben direkt über die Nase wahrgenommenen Empfindungen
verwendet.
Nachgeschmack (Substantiv):
Von den zuerst wahrgenommenen Empfindungen abweichender Gesamt-
sinneseindruck, der sich einstellt, nachdem der Reizstoff den Mund
verlassenhat.
Aromatisch(Adjektiv):
a) Bezeichnung für den von manchen Stoffen im Reinzustand oder als
Gemisch beim Verkosten hervorgerufene, als Aroma bezeichnete
Empfindung;
b) Bezeichnung für Stoffe, die bei der Geruchsprüfung durch die Nase
eineduftige,frischeEmpfindunghervorrufen.
Textur(Substantiv):
Eigenschaften eines Erzeugnisses im festen oder rheologischen Zustand,
welche diemechanischen Rezeptoren insbesonderederMundregionbeim
Verkostenanregen können.
Hinweis:Mit diesem Begriff werden ausschließlich objektiv vorhandene
Eigenschaften bezeichnet, nicht aber hervorgerufene Empfin-
dungen, die mit allgemeinen Begriffen wie Konsistenz,
Faserigkeit, Geschmeidigkeit usw.bezeichnet werden.
Kauen:Vorgang, bei dem das Lebensmittel mit allen geschmacksempfindlichen
Teilen des Mundes in Berührung gebracht wird, damit die von ihm
hervorgerufenen Empfindungen im Mund wahrgenommen werden
können.
Hinweis:Dieses Glossar kann ergänzt werden unter Heranziehung der
Normen ISO 5492/I-Vund anderer V eröffentlichungen, wie
beispielsweise die von J. L. Magnen unter dem Titel „Les
Cahiers techniques du Centre National de Coordination des
Etudeset Recherches surlaNutrition etl'Alimentation“ usw.
PRÜFGLAS FÜR ÖLE
1. UMFANGUNDANWENDUNGSBEREICH
DieseVorschriftbeschreibtdieEigenschaftendesGlaseszurorganolepti-
schenPrüfungvonSpeiseölen(Geruch,Geschmack,Flavour).
Sie beschreibt ferner die Vorrichtung zum Anwärmen und Temperieren
aufdiefürdiesePrüfunggeeignete Temperatur.
2. BESCHREIBUNG
In Abbildung 1 ist ein Prüfglas mit den am besten für diesen Zweck
geeignetenMerkmalendargestellt; dieselassensichwiefolgtzusammen-
fassen:
a) höchstmögliche Standfestigkeit, um ein Umstoßen und Vergießen des
Inhaltszuverhindern;
b) Standfläche paßt in die Öffnungen des Anwärmblocks hinein, was
einegleichmäßige ErwärmungdesGlasbodensermöglicht;
c) eine Form, die am Boden am weitesten ist, so daß die flüchtigen
Bestandteile der Öle vollständig freigesetzt werden. Sie verengt sichim Mundbereich, so daß die gleichen Verbindungen konzentriert
werden, wodurch sichergestellt wird, daß sie durch die Nase besser
wahrgenommenundidentifiziert werdenkönnen;
d) dunkles Glas. Es verhindert, daß der Prüfer die Farbe des Öles
erkennt, dadurch voreingenommen wird und sich möglicherweise von
einerobjektiven Bestimmungablenken läßt.
2.1.Maße
DasinAbbildung1dargestellte GlashatfolgendeMaße:
— Gesamtvolumen …............................. 130ml±10ml,
— Gesamthöhe…................................. 60mm±1mm,— DurchmesserderKelchöffnung….............. 50mm±1mm,1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—75
▼B
— größterKelchdurchmesser …................... 70mm±1mm,
— DurchmesserdesKelchbodens…............... 35mm±1mm,
— Wandstärke …................................. 1,5mm±0,2mm,
— StärkedesGlasbodens… ....................... 5mm±1mm.
ZujedemGlasgehörteinUhrglasmiteinemum10mmgrößerenDurch-
messer als der der Kelchöffnung. Dieses Glas dient als Deckel, damit
nichtsvondemAromaverlorengehtundkeinStaubeindringen kann.
2.2.Fertigungsdaten
Das Glas muß aus resistentem, dunklem, blasen- und kratzerfreiem Glas
gefertigt sein,sodaßdieFarbedesInhaltsnichterkennbar ist.
DerGlasrandmußgleichmäßig, glatt undleicht umgebogensein.
Das Glas muß getempert sein, damit es den bei den Prüfungen auftre-
tendenTemperaturschwankungen standhält.
2.3.Vorschriften für den Gebrauch
Zur Reinigung der Gläser ist geruchsfreie Seife bzw. Spülmittel zu
verwenden und anschließend ausreichend mit Wasser nachzuspülen, um
jedwede Rückstände von Reinigungsmittel zu entfernen. Schließlich
werden sie mit destilliertem Wasser nachgespült, man läßt abtropfen und
trocknet sieineinem Trockenschrank.
Konzentrierte Säuren oder gar Chromsäuregemische dürfen nicht
verwendet werden.
Die Gläser sind bis zum Gebrauch im Trockenschrank oder in einem
SchrankzumSchutzgegenFremdgeruchaufzubewahren.
VorjederVerwendungistjedes GlasdurchRiechen aufFremdgeruch zu
prüfen. Bei der Versuchsvorbereitung sind die Kennzeichen eines jeden
Glases sowie das enthaltene Ölmuster sorgfältig aufzuzeichnen. Nur der
Prüfungsleiter darf wissen, welches Kennzeichen welcher Ölprobe
entspricht.
3. VORRICHTUNGZUMANWÄRMENDERPROBEN
Die organoleptische Prüfung der Proben muß bei einer bestimmten
Temperaturgeschehen,diebeiSpeiseölen28±2ºCbetragenmuß.Damit
diesgewährleistetist,mußsichinjederKabineinReichweitedesPrüfers
eine Anwärmvorrichtung gemäß Abbildung 2 befinden. Sie besteht aus
einem Aluminiumblock in einem thermostatisch gesteuerten Wasserbad
und gewährleistet eine gleichmäßige Temperatur. Dieser Block weist
eine Reihe von paßgenauen Vertiefungen für den Boden auf. Der Unter-
schied zwischen der Temperatur der Anwärmvorrichtung und dem Öl in
den Gläsern in den Vertiefungen der einzelnen Blöcke darf höchstens
±2ºCbetragen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—76
▼B
Abbildung 1 — Prüfglas
Maße(inmm)1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—77
▼B
Abbildung 2 — Vorrichtung zum Anwärmen der Proben
(Maße in mm)
LEITLINIEN FÜR DIE EINRICHTUNG EINES PRÜFRAUMS
1. EINLEITUNG
Der Prüfraum soll den an der sensorischen Prüfung teilnehmenden
Prüfern zweckmäßige, bequeme und genormte Arbeitsbedingungen
bieten, um ihnen die Arbeit zu erleichtern und die Wiederholbarkeit und
Vergleichbarkeit derErgebnissezugewährleisten.
2. UMFANGUNDANWENDUNGSBEREICH
Diese Vorschriften regeln die Grundvoraussetzungen für die Einrichtung
einesPrüfraums.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—78
▼B
3. ALLGEMEINESPEZIFIKATIONDEREINRICHTUNG
Der Raum muß ungeachtet seiner Fläche (3.1) folgenden Anforderungen
genügen:
Der Raum muß angenehm und gut ausgeleuchtet (3.2), aber neutral
gehalten sein. Daher empfiehlt sich ein beruhigender, glatter und heller
Wandanstrich zurSchaffungeinerentspannten Atmosphäre(1).
Der Raum muß leicht zu reinigen und darf keinen Geräuschquellen
ausgesetzt sein; daher ist er nach Möglichkeit mit einer Schallisolierung
zu versehen. Ferner darf er keinerlei Fremdgeruch ausgesetzt sein und
ist nach Möglichkeit mit einer geeigneten Lüftungsanlage auszurüsten.
Sofern die Umgebungstemperaturen es verlangen, ist der Prüfraum mit
einer Klimaanlage auszustatten, die eine konstante Temperatur von 20
bis22ºCgewährleistet.
3.1.Maße
Die Maße hängen stark von den Möglichkeiten der Laboratorien bzw.
Unternehmen ab. Allgemein muß der Raum zur Aufnahme von etwa 10
Kabinenundeinem BereichzurVorbereitungderProbenausreichen.
Je größer der Raum ist, desto besser ist es natürlich, da in diesem Fall
Nebenräume beispielsweisefürdieReinigungdesMaterials,dieHerrich-
tung von Speisen und das Zusammentreten „offener Prüfgruppen“
eingerichtet werdenkönnen.
3.2.Beleuchtung
Die allgemeine natürliche oder künstliche Beleuchtung (z. B. mit Tages-
licht-Röhrenleuchten) mußgleichmäßig, regelbarunddiffussein.
3.3.Lufttemperatur und -feuchtigkeit
Der Raum muß ständig angenehme Lufttemperatur und -feuchtigkeit
aufweisen. Es empfiehlt sich eine Temperatur von 20—22 ºC und eine
relative Luftfeuchtigkeit von 60 bis 70 %, sofern keine besonderen
Bedingungengelten.
4. BESCHREIBUNGDERKABINEN4.1.Allgemeine Merkmale
Die Kabinen sind nebeneinander angeordnet, gleich ausgestattet und
durch Trennwände so voneinander getrennt, daß die Prüfer beim Sitzen
keinen Kontakt zueinander haben. Sie können aus jedwedem geeigneten,
reinigungsfreundlichen und haltbaren Material gefertigt werden (z. B.
Holz, glasierte Sperrholzplatten, Walzplatten usw.). Bei VerwendungvonAnstrichenmüssendiesenachdemTrocknenvölliggeruchlossein.
Die in jeder Kabine aufgestellten Stühle müssen bequem und höhenver-
stellbarsein.
Außerdem muß jede Kabine über eine richtungs- und helligkeitsverstell-
bareEinzelbeleuchtung verfügen.
Jede Kabine sollte ferner über einen Schalter mit einer außerhalb der
Kabine gelegenen Lichtquelle verbunden sein, mit der der Prüfer dem
Betreuer diskret melden kann, daß er mit der Prüfung fertig ist, weitere
Proben wünscht, ein Hilfsmittel benötigt, eine Unregelmäßigkeit festge-
stellt hatodereine Information benötigt usw.
4.2.Maße
DieKabinenmüssengenügendPlatzbieten undbequem sein.
Allgemein sindfolgende Maßevorzusehen:Länge:0,75m(ohneSpülbecken),
0,85m(mitSpülbecken);
Tiefe:0,50m(Tisch),1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—79
(1) FarbeundBeleuchtung könnendie ErgebnissedersensorischenPrüfungbeeinflussen.
▼B
0,20m(Trennwandaufmaß);
Trennwandhöhe:
mindestens0,60mabTischhöhe;Tischhöhe:
0,75m.
4.3.Anordnung
DieTischplatte mußleicht zureinigen sein.EinTeil dieserTischplatte istfürein Spülbeckenmit fließendem Wasser
vorgesehen. Sofern dies nicht möglich sein sollte, ist dieser Bereich für
eine Schüssel,einenSpucknapfoderähnliches vorzusehen.
Falls die Proben während der Prüfung auf einer konstanten Temperatur
über oder unter der Raumtemperatur gehalten werden müssen, ist eine
geeignete Einrichtung dafürvorzusehen(Wasserbad,Heizplatte usw.).
In einer Höhe von etwa 1,10 Metern kann auch ein Regal angebracht
werden, um verschiedene Hilfsmittel (Gläser, kleine Geräte usw.)
abstellen zukönnen.
Sofern die Anordnung der Kabinen in dem Raum es erlaubt, sollte eine
Einrichtung für die Bereitstellung der Proben vorgesehen werden. Diese
könnte als Schiebefenster (Abbildung 1), Drehfenster mit vertikaler
Achsefür Standgläser (hohe Gläser) (Abbildung2) oder mit horizontaler
Achse für Probengefäße geringer Höhe (Abbildung 3) vorgesehen
werden. Es kommt lediglich darauf an, daß die Öffnung groß genug ist,
daßdieTabletts mitdenProbengefäßenhindurchpassen.
5. NEBENRÄUME
Sofern genügend Platz vorhanden ist, sind getrennte Räumlichkeiten für
die Vorbereitung der Proben (Versuchsküche für den Fall der Durchfüh-
rung von Prüfungen mit Speisen o. a.), Regale für das Abstellen der
Gläser oder Hilfsmittel sowie für Besprechungen vor oder nach den
Prüfungen vorzusehen. Diese Räumlichkeiten sind sauber zu halten und
dürfen keinesfalls so gelegen oder beschaffen sein, daß die Arbeit der
Prüfer im Prüfraum durch Gerüche, Geräusche oder Gespräche
beeinträchtigt werdenkann.
Abbildung4zeigt einBeispieleinesPrüfraumsmit Nebenräumen.
Hinweis:Bei den beschriebenen Verhältnissen handelt es sich um Ideal-
bedingungen; sollte es nicht möglich sein, eine vergleichbare
EinrichtungausschließlichfürdiesensorischePrüfungbereitzu-
stellen, könnten die Prüfungen in einem Raum durchgeführt
werden, der die beschriebenen Mindestbedingungen (Licht,
Temperatur, Schall-Isolierung, Gerüche) erfüllt und in dem
transportable Kabinen aus Faltelementen so aufgestellt werden,
daßzumindest diePrüfervoneinander getrennt sind.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—80
▼B
EINRICHTUNGDERKABINE
Abbildung 1
1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—81
▼B
DREHFENSTERMITVERTIKALERACHSE
Abbildung 2
1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—82
▼B
DREHFENSTERMITHORIZONTALERACHSE
Abbildung 3
1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—83
▼B
LABORFÜRDIESENSORISCHEPRÜFUNG
Abbildung 4 — Beispiel eines Prüfraums
1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—84
▼B
ANHANG XIII
NEUTRALISIERUNG UND BLEICHUNG VON OLIVENÖL IM LABO-
RATORIUM
1. NEUTRALISIEREN UND BLEICHEN DES OLIVENÖLS IM LABO-
RATORIUM
1.1.Neutralisieren des Öls
1.1.1. Geräte
— hohes300-ml-Becherglas,
— Laborzentrifuge mit 100-ml-Gläsern,— 250-ml-Becherglas,— 100-ml-Rundkolben,— 1-Liter-Scheidetrichter.
1.1.2. Reagenzien
— 12%igewäßrigeNatriumhydroxidlösung,
— 1%igeLösungvonPhenolphthalein inÄthylalkohol,— Hexan,analysenrein,— Isopropylalkohol,analysenrein.
1.1.3. Verfahren
a)Öle mit einem Gehalt an freien Fettsäuren, berechnet als Ölsäure, von
weniger als 30 %
Mangibt 50 g rohes Öl in ein hohes 300-ml-Becherglas und erwärmt
im Wasserbad auf 65 ºC. Unter langsamem Rühren gibt man — mit
einem Überschußvon 5%—soviel 12%ige Natriumhydroxidlösung
hinzu, wie dem Gehalt des Öls an freien Fettsäuren entspricht. Unter
Aufrechterhaltung der Temperatur von 65 ºC wird 5 Minuten weiter-
gerührt.
DasGanzewirdin100-ml-ZentrifugengläserüberführtunddieSeifen-
massedurchZentrifugieren abgetrennt.Dasdekantierte Ölwirdinein
250-ml-Becherglas gegeben und mit 50 bis 60 ml kochendem destil-
liertem Wasser gewaschen. Die wäßrige Phase wird mit Hilfe eines
Saughebers entfernt. Die Waschungen werden wiederholt, bis auch
SpurenvonSeifenrestenentferntsind(VerschwindenderRosafärbung
desPhenolphthaleins).
Zur Entfernung der geringen Restwassermengen wird das Öl zentri-
fugiert.
b)Öle mit einem Gehalt an freien Fettsäuren, berechnet als Ölsäure, von
mehr als 30 %
In einen 1-Liter-Scheidetrichter gibt man 50 g rohes Öl, 200 ml
Hexan, 100 ml Isopropylalkohol und — mit einem Überschuß von
0,3 % — so viel 12%ige Natriumhydroxidlösung, wie dem Gehalt
desÖlsanfreienFettsäurenentspricht.
Eine Minute lang kräftig rühren. 100 ml destilliertes Wasser hinzu-
geben, erneut rühren und stehen lassen. Nach der Phasentrennung
wird die untere seifenhaltige Schicht abgelassen. In vielen Fällen
bildet sich zwischen den beiden Phasen (ölhaltige obere und wäßrige
untere Schicht) eine Zwischenschicht, die Schleimstoffe und unlös-
liche Substanzenenthält unddieebenfallsentfernt werdenmuß.
Anschließend wird die Hexanlösung des neutralen Öls mit Portionen
von jeweils 50 bis 60 ml einer Lösung aus Isopropylalkohol und
destilliertem Wasser im Verhältnis 1:1 (Volumenteile) bis zum
Verschwinden der Rosafärbung des Phenolphthaleins gewaschen.
Darauf wird das Hexan durch Abdestillieren im Vakuum (z. B. mit
HilfeeinesRotationsverdampfers) vollständigentfernt.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—85
▼M6
▼B
▼B
1.2.Bleichen des neutralisierten Öls
1.2.1. Geräte
— 250-ml-Dreihalskolben mit Schliffansätzen für:
a) Thermometer mitUnterteilung in1ºCfürMessungenbis90ºC,
b mechanisches Rührwerk, 250 bis 300 Umdrehungen/min, geeignet
zumBetrieb imVakuum,
c) AnschlußfürdieVakuumpumpe;
— Vakuumpumpefür15bis30Millibar Endvakuum,mitManometer.
1.2.2. Verfahren
In den Dreihalskolben werden etwa 100 g neutralisiertes Öl eingewogen.
Thermometer und Rührwerk einführen, Vakuumpumpe anschließen und
auf 90 ºC unter Umrühren erwärmen; die Temperatur wird unter
ständigem Rühren so lange aufrechterhalten, bis das zu untersuchende
ÖlvollständigvomWasserbefreit ist(etwa30Minuten).
Danach wird das Vakuum unterbrochen und 2 bis 3 g aktivierte Blei-
cherdezugegeben.
Dann wird wieder ein Vakuum mit einem Druck von 15 bis 30 Millibar
hergestellt, wobei über eine Zeit von 30 Minuten die Temperatur auf
90 ºC und die Drehzahl des Rührwerks bei etwa 250 Umdrehungen/min
gehalten werden. Danach wird in einem thermostatisch regulierten Trok-
kenschrankwarmfiltriert (50—60ºC).1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—86
▼M6
ANHANG XIV
ZUSÄTZLICHE ANMERKUNGEN 2, 3 UND 4 ZU KAPITEL 15 DER
KOMBINIERTEN NOMENKLATUR
2. A. Als Olivenöl im Sinne der Positionen 1509 und 1510 gelten ausschließ-
lich die aus der Verarbeitung von Oliven gewonnen Öle, soweit deren
Sterin- und Fettsäurezusammensetzung den Werten der nachstehenden
Tabellen entsprechen:
TabelleI:Fettsäuregehalt in Prozent desGesamt-
fettsäuregehaltsTabelle II:Steringehalt inProzent desGesamtste-
ringehalts
Myristinsäure M0,1 Cholesterin M0,5
Linolensäure M0,9 Brassicasterin M0,2
Arachinsäure M0,7 Campesterin M4,0
Eicosensäure M0,5 Stigmasterin(1) <Campesterin
Behensäure M0,3 Beta-Sitosterin(2) m93,0
Lignocerinsäure M0,5 Delta-7-Stigmasterin M0,5
m = Mindestgehalt.
M = Höchstgehalt.
(1) Gilt weder für Lampantöle (Unterposition 15091010) noch für rohe Oliventresteröle (Unterposition
15100010).
►C3(2) Delta-5,23-Stigmastadienol + Chlerosterin + Beta-Sitosterin + Sitostanol + Delta-5-Avenasterin
+Delta-5,24-Stigmastadienol. ◄
Zu den Positionen 1509 und 1510gehören weder chemisch modifizierte
(insbesondere wiederveresterte) Öle noch Mischungen von Olivenöl mit
anderen Ölen. Die Anwesenheit von wiederverestertem Olivenöl oder
von anderen Ölen wird mit den Verfahren der Anhänge V, VII, XA
►C3undXBderVerordnung(EWG)Nr.2568/91nachgewiesen. ◄
B. Zur Unterposition 150910 gehören nur die in den nachstehenden
Abschnitten I und II definierten Olivenöle, die aus Oliven ausschließlich
durchmechanischeoderanderephysikalischeVerfahrenundunterBedin-
gungen, insbesondere Temperaturbedingungen, gewonnen wurden, die
nichtzurVerschlechterungderÖleführen,unddiekeineandereBehand-
lung erfahren haben als Waschen, Dekantieren, Zentrifugieren und
Filtrieren. Mit Lösungsmitteln gewonnene Olivenöle werden in die Posi-
tion1510eingereiht.
I. Als „Lampantöl“ im Sinne der ►C3Unterposition ◄15091010
gilteinOlivenöl,das—unabhängigvonseinemGehaltanfreienFett-
säuren—folgendeMerkmale aufweist:
a) Gehalt an ►M9Wachs ◄höchstens ►M9350◄mg/kg,
b) Gehalt anErythrodiol undUvaolhöchstens4,5%,
c) Gehalt an gesättigten Fettsäuren in 2-Stellung der Triglyceride
höchstens1,3%,
d) Summe der trans-Ölsäureisomeren kleiner als 0,10 % und Summe
der trans-Linolsäureisomeren und trans-Linolensäureisomeren
kleiner als ►C30,10% ◄,
und
e) einesodermehrerederfolgendenMerkmale:
1. Peroxidzahl größerals20meqaktiver Sauerstoff/kg,
2. Gesamtgehalt an flüchtigen halogenierten Lösungsmitteln
größer als 0,2 mg/kg oder Gehalt an einem einzigen davon
jeweils größerals0,1mg/kg,
3. Extinktionskoeffizient K270größer als 0,25 und nach Behand-
lung der Ölprobe mit aktiviertem Aluminiumoxid höchstens
0,11. Bestimmte Öle mit einem als Ölsäure berechneten Gehalt
an freien Fettsäuren von mehr als 3,3 g/100 g können nach
Behandlung mit aktiviertem Aluminiumoxid gemäß dem
Verfahren des Anhangs IX ►C3der Verordnung (EWG) Nr.
2568/91 ◄einen Extinktionskoeffizienten K270von über 0,10
aufweisen; in diesem Fall mußdie Ölprobenach dem Neutrali-
sieren und Bleichen im Labor gemäß dem Verfahren des1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—87
▼M6
AnhangsXIII ►C3dervorerwähntenVerordnung ◄folgende
Merkmale aufweisen:
— Extinktionskoeffizient K270höchstens1,20,
— Schwankung des Extinktionskoeffizienten (Delta K) im
Bereichvon270nmvonmehrals0,01undhöchstens0,16:
DeltaK=Km−0,5(Km−4+Km+4)
Km= bezeichnet den Extinktionskoeffi-
zienten für die im Bereich von 270
nm liegende Wellenlänge, die im
Maximum der Absorptionskurve
liegt,
Km−4undKm+4= bezeichnen die Extinktionskoeffi-
zienten füreine um4nm niedrigere
bzw.höhereWellenlänge alsKm;
4. sensorische Merkmale mit wahrnehmbaren unannehmbaren
Geschmacksfehlern, mit einem Bewertungsergebnis von
weniger als 3,5 gemäß Anhang XII ►C3der Verordnung
(EWG)Nr.2568/91 ◄.
II. Als „anderes nicht behandeltes Olivenöl“ im Sinne der Unterposition
15091090gilt Olivenöl,dasfolgende Merkmale aufweist:
a) GehaltanfreienFettsäuren,berechnetalsÖlsäure,höchstens3,3g/
100g,
b) Peroxidzahl höchstens20meqaktiver Sauerstoff/kg,
c) Gehalt an ►M9Wachs ◄höchstens ►M9250◄mg/kg,
d) Gehalt an flüchtigen halogenierten Lösungsmitteln insgesamt
höchstens0,2mg/kgbzw.einzeln jeweilshöchstens0,1mg/kg,
e) Extinktionskoeffizient K270höchstens 0,25 und nach Behandlung
mit aktiviertem Aluminiumoxid höchstens0,10,
f) Schwankung des Extinktionskoeffizienten (Delta K) im Bereich
von270nmhöchstens0,01,
g) sensorische Merkmale, auch mit wahrnehmbaren, jedoch noch
akzeptablen Geschmacksfehlern und einem Bewertungsergebnis
von mindestens 3,5 gemäß Anhang XII ►C3der Verordnung
(EWG)Nr.2568/91 ◄,
h) Gehalt anErythrodiol undUvaolhöchstens4,5%,
i) Gehalt an gesättigten Fettsäuren in 2-Stellung der Triglyceride
höchstens1,3%,
j) Summe der trans-Ölsäureisomere kleiner als 0,03 % und Summe
der trans-Linolensäure- und trans-Linolsäureisomere kleiner als
0,03%.
C. AlsÖlederUnterposition15099000gelten Olivenöle,diedurchBehan-
deln von Ölen der Unterpositionen 15091010 und/oder 15091090
gewonnen wurden, auch vermischt mit nativem Olivenöl, und die
folgendeMerkmale aufweisen:
a) Gehalt an freien Fettsäuren, berechnet als Ölsäure, höchstens 3,3 g/
100g,
b) Gehaltan ►M9Wachs ◄höchstens350mg/kg,
c) Extinktionskoeffizient K270vonhöchstens1,2,
d) Schwankung des Extinktionskoeffizienten ( ∆K) im Bereich von
270nmvonhöchstens0,16,
e) GehaltanErythrodiol undUvaolhöchstens4,5%,
f) Gehalt an gesättigten Fettsäuren in 2-Stellung der Triglyceride
höchstens1,5%,
g) Summe der trans-Ölsäureisomere kleiner als 0,20 % und Summe der
►C3trans-Linolsäureisometre ◄und trans-Linolensäureisomere
kleiner als0,30%.
D. Als„rohe Öle“imSinnederUnterposition15100010gelten Öle,insbe-
sondereOliventresteröle, diefolgende Merkmale aufweisen:
a) GehaltanfreienFettsäuren,berechnetalsÖlsäure,mindestens2g/100
g,
b) GehaltanErythrodiol undUvaolmindestens12%,1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—88
▼M9
▼M6
▼M6
c) Gehalt an gesättigten Fettsäuren in 2-Stellung der Triglyceride
höchstens1,8%,
d) Summe der trans-Ölsäureisomere weniger als 0,20 % und Summe der
trans-Linolsäure- undtrans-Linolensäureisomere wenigerals0,10%.
E. Als Öle der Unterposition 15100090 gelten Öle, die durch Behandeln
von Ölen der Unterposition 15100010 gewonnen wurden, auch
vermischt mit nativem Olivenöl, sowie diejenigen, die nicht die Merk-
male von Olivenölen gemäß den zusätzlichen Anmerkungen 2.B, 2.C
und 2.D aufweisen. Die Öle dieser Unterposition müssen einen Gehalt
an gesättigten Fettsäuren in 2-Stellung der Triglyceride von nicht mehr
als 2 % aufweisen, wobei die Summe der trans-Ölsäureisomere kleiner
als 0,40 % und die Summe der trans-Linolsäureisomere und trans-Lino-
lensäureisomere kleinerals0,35%seinmuß.
3. NichtzudenUnterpositionen15220031und15220039gehören:
a) RückständeausderVerarbeitungvonFettstoffen,dieÖlenthalten,dessen
Iodzahl, bestimmt nach dem Verfahren des Anhangs XVI ►C3der
Verordnung (EWG) Nr. 2568/91 ◄, kleiner als 70 oder größer als 100
ist;
b) Rückstände aus der Verarbeitung von Fettstoffen, die Öle mit einer
Iodzahl zwischen 70 und 100 enthalten, bei dem jedoch die gemäß
Anhang V ►C3der Verordnung (EWG) Nr. 2568/91 ◄bestimmte
Fläche des Peaks, der der Retentionszeit des Beta-Sitosterins
►C3(1)◄entspricht,kleineristals93%derGesamtflächederSterin-
peaks.
4. Für die Bestimmung der Merkmale der obengenannten Erzeugnisse sind die
in den Anhängen ►C3der Verordnung (EWG) Nr. 2568/91 ◄beschrie-
benenAnalyseverfahren anzuwenden.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—89
(1) Delta-5,23-Stigmastadienol + Chlerosterin + Beta-Sitosterin + Sitostanol + Delta-5-
Avenasterin +Delta-5,24-Stigmastadienol.
▼B
ANHANG XV
1. ÖLGEHALTDEROLIVENTRESTER
1.1.Geräte
— Geeigneter Extraktionsapparat mit 200-bis250-ml-Kolben,
— elektrisch beheiztes Bad(Sandbad,Wasserbadusw.)oderHeizplatte,— Analysenwaage,— Trockenschrank,eingestellt aufhöchstens80ºC,— elektrischer Trockenschrank mit Thermostat, eingestellt auf 103 ºC
± 2 ºC, der unter Einblasen von Luft oder unter vermindertem Druck
betrieben werdenkann,
— mechanischeMühle,leichtzureinigen,mitderdieTresterohneErwär-
mung und ohne merkliche Verringerung ihres Gehalts an Wasser und
Ölzerkleinert werdenkönnen,
— ExtraktionshülseundWatteoderFilterpapier,freivonmitHexanextra-
hierbaren Stoffen,
— Exsikkator,— Sieb,Maschendurchmesser1mm,— Siedesteinchen, zuvorgetrocknet.
1.2.Reagenzien
— technisches n-Hexan; Rückstand bei vollständiger Verdampfung unter
0,002g/100ml.
2. ARBEITSVORSCHRIFT2.1.Vorbereitung der Probe
Die Probe wird, wenn nötig, in der zuvor gut gereinigten mechanischen
Mühle so weit gemahlen, daß die Teilchen vollständig das Sieb passieren
können.
Etwa ein Zwanzigstel der Probe ist zur Reinigung der Mühle zu benutzen;
dieses Mahlgutist zuverwerfen. DerRest istfein zumahlen, dasMahlgut
aufzufangen, sorgfältig zumischenundunverzüglich zuanalysieren.
2.2.Untersuchungsprobe
Etwa 10 g der Probe werden nach dem Mahlen auf 0,01 g genau für die
Untersuchungabgewogen.
2.3.Vorbereitung der Extraktionshülse
Die Probe wird in die Hülse gegeben und diese mit einem Wattebausch
verschlossen. Bei Verwendung von Filterpapier wird das Mahlgut darineingeschlagen.
2.4.Vertrocknung
Wenn die Trester sehr feucht sind (Gehalt an Wasser und flüchtigen
Stoffen größer als 10 %), ist vorzutrocknen, wobei die gefüllte Hülse
(bzw. das Filterpapier) so lange wie nötig in den auf höchstens 80 ºC
geheizten Trockenschrank gestellt wird, um den Gehalt an Wasser und
flüchtigen Stoffenaufunter10%zusenken.
2.5.Vorbereitung des Kolbens
Der Kolben, der 1 bis 2 Siedesteinchen enthält und zuvor im Trocken-
schrank bei 103 ºC ± 2 ºC getrocknet und danach mindestens 1 Stunde
langimExsikkatorabgekühlt wurde,wirdauf1mggenaugewogen.
2.6.Erste Extraktion
DieHülse(bzw.dasFilterpapier)mitderProbewirdindenExtraktionsap-
parat gestellt, die benötigte Menge Hexan in den Kolben gegeben, der
Kolben an den Extraktionsapparat angeschlossen und das Ganze auf das
elektrischeHeizbadgestellt.DieHeizungistsoeinzustellen,daßderRück-
fluß mindestens 3 Tropfen in der Sekunde beträgt (mäßiges, nicht heftiges
Sieden).1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—90
▼B
Nach 4stündiger Extraktion läßt man abkühlen. Die Hülse wird aus dem
Extraktionsapparat genommen und in einen Luftstrom gestellt, um den
größtenTeil desLösungsmittels, mitdemsiedurchtränkt ist,zuentfernen.
2.7.Zweite Extraktion
Die Hülse wird in die Mikrokugelmühle entleert, und es wird so fein wie
möglich gemahlen. Das Mahlgut wird quantitativ in die Hülse zurückge-
gebenunddiesewiederindenExtraktionsapparat gestellt.
Es wird nochmals 2 Stunden extrahiert, wobei der die erste Extraktion
enthaltene Kolbenverwendetwird.
DieimExtraktionskolbenenthalteneLösungmußklarsein.Wennnicht,ist
sieüberFilterpapier zufiltrieren, wobeiderersteKolbenunddasFilterpa-
pier mehrmals mit Hexan gewaschen werden. Das Filtrat und die
Waschflüssigkeit werden in einem zweiten, zuvor getrockneten und auf
1mgabgewogenen Kolbenaufgefangen.
2.8.Entfernung des Lösungsmittels und Wiegen des Extrakts
Durch Destillieren auf dem elektrischen Heizbad wird der größte Teil des
Lösungsmittels entfernt. Die letzten Lösungsmittelspuren werden durch
20minütiges Erhitzen des Kolbens im Trockenschrank bei 103 ºC ± 2 ºC
beseitigt. Die Beseitigung der Lösungsmittelreste wird durch zeitweiliges
Einführen eines Luftstroms oder besser eines Inertgasstroms oder durch
Arbeiten untervermindertem Druckerleichtert.
Den Kolben läßt man wenigstens 1 Stunde im Exsikkator abkühlen und
wiegtihndannauf1mggenau.
Danach wird der Kolben erneut 10 Minuten unter den gleichen Bedin-
gungenerhitzt, imExsikkatorabgekühlt undgewogen.
Der Unterschied zwischen den Ergebnissen der zwei Wägungen darf
höchstens 10 mg betragen. Wenn nicht, ist erneut 10 Minuten zu erhitzen,
dann wieder abkühlen zu lassen und zu wiegen, bis der Gewichtsunter-
schied höchstens 10 mg beträgt. Das letzte Gewicht des Kolbens wird
notiert.
FürjedeUntersuchungwerdenmitdergleichenProbezweiBestimmungen
durchgeführt.
3. ERGEBNISSE
3.1.Berechnung und Formel
a) Der Extrakt des Rohprodukts läßt sich in Gewichtsprozenten durch
nachstehende Formelberechnen:
S=m1×100
m0
Dabeisind:
S = Gewichtsprozente desExtraktsdesRohprodukts,
m0= GewichtderUntersuchungsprobeing,
m1= GewichtdesExtraktsnachderTrocknunging.
AlsErgebnisistdasarithmetische MittelausdenbeidenBestimmungen
zunehmen,fallsdieBedingungenderWiederholbarkeit erfüllt sind.
DasErgebniswirdaufeine Dezimalstelle angegeben.
b) Der Extrakt, bezogen auf den Trockenstoff, läßt sich berechnen durch
dieFormel:
S×100
100−U=Extrakt in%Fett,bezogenaufdenTrockenstoff.
Dabeisind:
S = Gewichtsprozente desExtraktsdesRohprodukts(vgl.a)),
U = seinGehaltanWasserunfflüchtigen Stoffen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—91
▼B
3.2.Wiederholbarkeit
DieDifferenzzwischendenErgebnissenvonzweigleichzeitigoderschnell
nacheinander von ein und demselben Analytiker vorgenommenen Bestim-
mungendarfnichtmehrals0,2gHexan-Extrakt je100gProbebetragen.
Andernfalls ist die Analyse mit zwei weiteren Untersuchungsproben zu
wiederholen. Liegt die Differenz wieder über0,2g,soistalsErgebnisdas
arithmetische Mittel ausallen vierBestimmungen zunehmen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—92
▼B
ANHANG XVI
BESTIMMUNG DER IODZAHL
1. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Internationale Norm beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der
Iodzahl von tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen, nachfolgend als
„Fette“ bezeichnet.
2. DEFINITION
IndieserInternationalen Normgilt folgendeDefinition:
2.1. Iodzahl: Iodmenge, die unter den in dieser Internationalen Norm beschrie-
benenVersuchsbedingungenvonderProbeaufgenommen wird.
DieIodzahlwirdinGrammIodpro100gProbeangegeben.
3. PRINZIP
DiezuuntersuchendeProbewirdindemLösungsmittelgelöstundmitdem
Wijs-Reagensversetzt. Nacheinerbestimmten Zeit werdenKaliumiodidlö-
sung und Wasser zugegeben und das freigesetzte Iod mit einer
Natriumthiosulfatlösung titriert.
4. REAGENZIEN
AlleReagenzien müssenvonanerkannter analysenreiner Qualitätsein.
4.1. Kaliumiodidlösung, 100g/l,diekeinIodatoderfreiesIodenthält.4.2. Stärkelösung
5 g lösliche Stärke mit 30 ml Wasser mischen und in 1000 ml kochendes
Wassergeben;3Minutenkochenundabkühlenlassen.
4.3. Natriumthiosulfat, eingestellte Standardlösung c (Na
2S2O3·5 H2O) = 0,1
mol/l, höchstens7TagevorderVerwendungeingestellt.
4.4. Lösungsmittel, hergestellt durch Mischen gleicher Volumenteile Cyclo-
hexanundEssigsäure.
4.5. Wijs-Reagens, das Iodmonochlorid in Essigsäure enthält. Es soll das im
Handelerhältliche Wijs-Reagensverwendet werden.
Anmerkung: DasReagensenthält 9gICl3+9gIinEssigsäure.
5. GERÄTE
Übliche Laboreinrichtung undinsbesonderenachstehende Geräte:
5.1. Mikrobechergläschen, die sich für die zu untersuchende Probe und zum
Einführen indieKolben(5.2)eignen.
5.2. 500-ml-Erlenmeyerkolben mitSchliffstopfen,vollständigtrocken.
6. VORBEREITUNGDERANALYSEPROBE
Diehomogenisierte ProbewirdüberNatriumsulfat getrocknet undfiltriert.
7. VERFAHREN7.1.Probemenge
Die Menge der zu untersuchenden Probe hängt von der erwarteten Iodzahl
ab(Tabelle 1).1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—93
▼B
Tabelle 1
Erwartete Iodzahl Massederzuuntersuchenden Probe
wenigerals5 3,00g
5—20 1,00g
21—50 0,40g
51—100 0,20g
101—150 0,13g
151—200 0,10g
Die zu untersuchende Probe wird in einem Mikrobechergläschen (5.1) auf
0,1mggenaueingewogen.
7.2.Bestimmung
Die Probe wird in einen 500-ml-Kolben (5.2) gegeben und mit 20 ml
Lösungsmittel (4.5) versetzt, um das Fett zu lösen. Genau 25 ml Wijs-
Reagens (4.6) zugeben, den Kolben mit dem Stopfen verschließen,
schwenken und dunkel stellen. FürdasWijs-Reagens sollen keine Pipetten
verwendet werden,diemit demMundaufgezogen werdenmüssen.
Dann wird in ähnlicher Weise eine Blindprobe vorbereitet; die das
Lösemittel unddasReagens,nichtaberdieProbeenthält.
Bei Proben mit Iodzahlen unter 150 muß der Kolben 1 Stunde dunkel
gestellt werden; bei Iodzahlen über 150 sowie bei polymerisierten oder
starkoxidierten Erzeugnissensindes2Stunden.
Nach Ablauf dieser Zeit wird in jeden Kolben 20 ml Kaliumiodidlösung
(4.1)und150mlWassergegeben.
Nun mit der eingestellten Natriumthiosulfat-Standardlösung (4.3) titrieren,
bis die durch Iod bedingte Gelbfärbung kaum noch sichtbar ist. Einige
Tropfen Stärkelösung (4.2) zugeben und weiter titrieren, bis die Blau-
färbungunterstarkemSchütteln verschwindet.
Anmerkung: Eine potentiometrische Bestimmung des Endpunkts ist
zulässig.
7.3.Zahl der Bestimmungen
EswerdenzweiBestimmungen mitdergleichenProbedurchgeführt.
8. DARSTELLUNGDERERGEBNISSE
DieIodzahlwirdnachfolgenderGleichungberechnet:
12;69c V1/C0V2 ðÞ
m
Hierinbedeuten:
c = die genaue zahlenmäßige Angabe der Konzentration der verwen-
detenNatriumthiosulfat-Standardlösung (4.3)inmolproLiter;
V1= Volumen der für den Blindversuch verwendeten Natriumthiosulfat-
Standardlösung(4.3)inMillilitern;
V2= Volumen der zur Bestimmung verwendeten Natriumthiosulfat-
Standardlösung(4.3)inMillilitern;
m = MassederuntersuchtenProbe(7.1)inGramm.
Als Ergebnis ist das arithmetische Mittel der beiden Bestimmungen anzu-
geben.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—94
▼M11
ANHANG XVII
METHODE ZUR BESTIMMUNG VON STIGMASTADIENEN IN
PFLANZLICHEN ÖLEN
1. ZWECK
BestimmungvonStigmastadieneninpflanzlichenÖlen,diedieseKohlen-
wasserstoffe nur in geringer Konzentration enthalten, insbesondere in
nativenOlivenölen undrohemOliventresteröl.
2. ANWENDUNGSBEREICH
DasVerfahrenläßtsichaufallepflanzlichen Öleanwenden.DieBestim-
mungen sind allerdings nur zuverlässig bei einer Konzentration dieses
Kohlenwasserstoffs von 0,01 bis 4,0 mg/kg. Die Methode eignet sich
besonders zum Nachweis von raffinierten pflanzlichen Ölen (Olivenöl,
Oliventresteröl, Sonnenblumenöl, Palmöl usw.) in nativem Olivenöl, da
raffinierte ÖleimGegensatz zunativenÖlenStigmastadien enthalten.
3. PRINZIP
Isolierung der unverseifbaren Bestandteile. Abtrennung der Steroid-Frak-
tion durch Säulenchromatographie an Kieselgel und Analyse durch
Kapillargaschromatographie.
4. GERÄTE
4.1. 250-ml-Stehkolben, zurVerwendungmit Rückflußkühlergeeignet.4.2. 200-ml-Scheidetrichter.4.3. 100-ml-Rundkolben.
4.4. Rotationsverdampfer.
4.5. Chromatographiesäule aus Glas (innerer Durchmesser 1,5 bis 2,0 cm,
Länge 50 cm) mit Teflonhahn und Glaswattebausch oder Sinterglas-
scheibe am unteren Ende. Zur Vorbereitung der Kieselgelsäule mit
ChromatographiesäulebiszueinerHöhevonetwa5cmmitHexanfüllen
und dann eine Suspension von 15 g Kieselgel in 40 ml Hexan mit Hilfe
vonmehrerenAnteilen Hexaneinschlämmen undunterleichtem Klopfen
vollständig absetzen lassen. Anschließend wasserfreies Natriumsulfat bis
zu einer Höhe von rund 0,5 cm zugeben und das überschüssige Hexan
ablaufen lassen.
4.6. Gaschromatograph mit Flammenionisationsdetektor, Split- oder cold On-
column-Injektor undOfenmiteinerEinstellgenauigkeit von±1ºC.
4.7. Fused-Silica-Kapillarsäule für Gaschromatographie (0,25 oder 0,32 mm
Innendurchmesserund25mLänge),belegtmit5%Phenylmethylsilicon,
Filmdicke 0,25 µm.
Anmerkung 1:
Andere Säulen mit vergleichbarer oder geringerer Polarität können eben-
fallsverwendetwerden.
4.8. Aufzeichnungsgerät mit Integrator mit Möglichkeit der Integration
zwischenzweiMinima.
4.9. 5-10- µl-MikrospritzefürGaschromatographie mit festerNadel.
4.10. Pilzheizhaube oderHeizplatte.
5. REAGENZIEN
Alle Reagenzien müssen, sofern nicht anders angegeben, von Analyse-
qualität sein. Es ist destilliertes Wasser oder Wasser von mindestens
gleichem Reinheitsgrad zuverwenden.
5.1. HexanoderAlkanmischungmiteinemSiedebereichvon65-70ºC,destil-
liert ineinerRektifiziersäule.
Anmerkung 2:
Das Lösungsmittel muß zur Entfernung von Verunreinigungen destilliert
werden.
5.2. Ethanol, 6%ig(v/v).1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—95
▼M11
5.3. WasserfreiesNatriumsulfat.
5.4. Ethanolische Kalilauge, 10%igeLösung.10mlWasserzu50gKalium-
hydroxid geben, umrühren und die Mischung durch Zugabe von Ethanol
lösenundmit Ethanolauf500mlauffüllen.
Anmerkung 3:
Ethanolische Kalilauge wird beim Stehen braun. Sie sollte täglich frisch
zubereitet und in dunklen Glasflaschen gut verschlossen aufbewahrt
werden.
5.5. Kieselgel 60 für Säulenchromatographie, 70-230 mesh (Merck, Art. Nr.
7734o.ä.).
Anmerkung 4:
GewöhnlichkannKieselgeldirektausdemBehälterohneVorbehandlung
verwendet werden. Manche Kieselgelpartien weisen jedoch eine geringe
Aktivität auf, waszu unbefriedigenden chromatographischen Trennungen
führt. In solchen Fällen ist wie folgt vorzugehen: das Kieselgel durch
mindestens vierstündiges Erhitzen auf 550 ºC aktivieren, nach dem
Erhitzen in einen Exsikkator stellen und nach dem Abkühlen in einen
verschließbaren Kolben überführen; 2 % Wasser zugeben und schütteln,
biskeineKlumpenmehrsichtbar sindunddasPulverfreirieselt.
Kieselgelpartien, die Chromatogramme mit sich überlappenden Peaks
ergeben, sind wie oben beschrieben zu behandeln. Eine Alternative ist
dieVerwendungvonextrareinem Kieselgel 60(Merck,Art.Nr.7754).
5.6. Stammlösung (200 ppm) von Cholesta-3,5-dien (Sigma, 99 % rein) in
Hexan(10mgin50ml).
5.7. Standardlösung von Cholesta-3,5-dien in Hexan in einer Konzentration
von20ppm.Dazudieobengenannte Lösungverdünnen.
Anmerkung 5:
Bei Temperaturen unter 4 ºC halten sich die Lösungen 5.6 und 5.7
mindestensvierMonate lang.
5.8. Lösung aus n-Nonacosan in Hexan mit einer Konzentration von rund
100ppm.
5.9. Trägergas für die Gaschromatographie: Helium oder Wasserstoff
(99,9990%rein).
5.10. Brenngase für den Flammenionisationsdetektor: Wasserstoff (99,9990 %
rein)undgereinigte Luft.
6. VERFAHREN
6.1.Herstellung des Unverseifbaren:
6.1.1. 20 ± 0,1 g Öl in einen 250-ml-Kolben (4.1) einwiegen, 1 ml der Stand-
ardlösungvonCholesta-3,5-dien(20 µg)und75ml10%igeethanolische
Kalilauge zugeben, Rückflußkühler anschließen und 30 Minuten köcheln
lassen.DenKolbenmitderProbevonderHitzequellenehmenundleicht
abkühlen lassen (nicht vollständig abkühlen lassen, da die Probe sonst
festwird).100mlWasserzugebenunddieLösungmitHilfevon100ml
Hexan in einen Scheidetrichter (4.2) geben. Die Mischung 30 Sekunden
kräftigschütteln undzurPhasentrennungstehenlassen.
Anmerkung 6:
BeiBildungeinerEmulsion,dienichtgleichwiederverschwindet,kleine
MengenEthanol zugeben.
6.1.2. Die untere, wäßrige Phase in einen zweiten Scheidetrichter überführen
und wiederum mit 100 ml Hexan extrahieren. Die untere Phase erneut
ablaufen lassen und die Hexanextrakte zusammen in einem weiteren
Scheidetrichter dreimal mit je 100 ml einer Ethanol-Wassermischung (1:
1)waschen,bisdiesepH-neutralreagiert.
6.1.3. Die Hexanlösung durch wasserfreies Natriumsulfat (50 g) laufen lassen,
mit 20 ml Hexan waschen und in einem Rotationsverdampfer bei 30 ºC
imleichten Vakuumvollständigeindampfen.
6.2.Abtrennung der Steroid-Fraktion:
6.2.1. DenRückstandmitHilfevonzweiVolumenanteilenHexan(jeweils1ml)
auf die Trennsäule aufgeben und soweit einziehen lassen, bis sich die
Flüssigkeitsoberfläche bis über die Natriumsulfatschicht abgesenkt hat.
Dann die Elution mit Hexan mit einer Flußrate von 1 ml/Minute1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—96
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beginnen. Die ersten 25 bis 30 ml des Eluats verwerfen, die folgenden
40mlauffangen. DieseFraktionineinen100-ml-Rundkolben(4.3)über-
führen.
Anmerkung 7:
Die erste Fraktion enthält gesättigte Kohlenwasserstoffe (Abbildung 1a),
die zweite Steroide. Danach werden Squalen und verwandte Verbin-
dungen eluiert. Für eine gute Trennung zwischen den gesättigten
Kohlenwasserstoffen und den Steroiden müssen die Fraktionsvolumina
optimiertwerden.HierzuistdasVolumendererstenFraktionsozuregu-
lieren, daß bei der Analyse der zweiten Fraktion nur kleine Peaks für
gesättigte Kohlenwasserstoffe auftreten (siehe Abbildung 1c). Treten
keine solchen Peaks auf und hat der Standardpeak gleichzeitig nur eine
geringe Größe, soist das Volumen der ersten Fraktion zu reduzieren. Im
übrigen ist eine vollständige Trennung zwischen den Komponenten der
ersten und zweiten Fraktion nicht erforderlich, da während der GC-
AnalyseunterdeninPunkt6.3.1beschriebenen Arbeitsbedingungen eine
ÜberlappungderPeaksnichtvorkommt.EineOptimierungdesVolumens
der zweiten Fraktion ist in der Regel nicht notwendig, da sich die
weiteren Komponenten gut abtrennen lassen. Ein großer Peak mit einer
Retentionszeit von rund 1,5 Minuten unter dem des Standards ist jedoch
auf das Vorhandensein von Squalen zurückzuführen und zeigt eine
schlechte Trennungan.
6.2.2. Die zweite Fraktion im Rotationsverdampfer bei 30 ºC im leichten
Vakuum vollständig eindampfen und den Rückstand sofort in 0,2 ml
Hexan auflösen. Die Lösung bis zur Analyse im Kühlschrank aufbe-
wahren.
Anmerkung 8:
Die Rückstände 6.1.3 und 6.2.2 sollten nicht trocken und nicht bei
Zimmertemperatur aufbewahrt werden. Nach Gewinnung des Rückstands
sofortdasLösungsmittelzugebenunddieLösungimKühlschrankaufbe-
wahren.
6.3.Gaschromatographie
6.3.1. ArbeitsbedingungenfürSplit-Injektion:
— Injektortemperatur: 300ºC,
— Detektortemperatur: 320ºC,
— Integrator: (Die Parameter für die Integration sind so zu wählen, daß
die Peakflächen richtig beurteilt werden können. Empfohlen wird die
Integration zwischenzweiMinima),
— Empfindlichkeit: runddas16-fache derMindestdämpfung,
— Einspritzvolumen: 1 µmLösung,
— Temperaturprogramm:6Minutenisothermbei235ºC,dannmit2ºC/
minauf285ºC,
— Injektormit Stromteilventil (Splitverhältnis 1:15),
— Trägergasvordruck: ca.120kPaHelium oderWasserstoff.
Diese Bedingungen können entsprechend den Kenndaten des Chromato-
graphen und der Säule derart geändert werden, daß die damit
aufgezeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen erfüllen: Der
Peak des internen Standards muß innerhalb von 5 Minuten vor oder
nach der unter 6.3.2 genannten Zeit erscheinen und mindestens 80 %
Vollausschlagerreichen.
Das GC-System ist durch Einspritzen einer Mischung aus der Cholesta-
dien-Stammlösung (5.6) und der n-Nonacosan-Lösung (5.8) zu
überprüfen. Der Cholesta-3,5-dien-Peak muß vor dem n-Nonacosan-Peak
erscheinen (Abbildung 1c). Ist dies nicht der Fall, so kann die ursprüng-
liche Ofentemperatur verringert und/oder die GC-Säule durch eine
wenigerpolareSäuleersetzt werden.
6.3.2. Identifizierung derPeaks
Der Peak der internen Standards erscheint nach rund 19 Minuten, derje-
nige von Stigmastadienen nach einer relativen Retentionszeit von rund
1,29(Abbildung1b).DasStigmasta-3,5-dientrittzusammenmitgeringen
Mengen eines Isomers auf; beide ergeben normalerweise aber nur einenPeak.IstdieSäulejedochzupolar,oderhatsieeinegroßeTrennleistung,
kann das Isomer als kleiner Peak dicht vor dem des Stigmasta-3,5-dien
erscheinen (Abbildung2).Um sicherzugehen, daß dieStigmastadiene als
ein Peak eluiert werden, empfiehlt es sich, die Säule durch eine weniger
polareSäuleodereineSäulemitgrößeremInnendruchmesserzuersetzen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—97
▼M11
Anmerkung 9:
Ein Referenzchromatogramm für Stigmastadien erhält man durch die
Analyse eines raffinierten pflanzlichen Öls mit einer kleineren Probe.
Stigmastadiene rufen einen signifikanten, leicht identifizierbaren Peak
hervor.
6.3.3. Quantitative Analyse
DerGehaltanStigmastadienen wirdnachfolgender Formelberechnet:
mg/kgStigmastadienen =As/C2Mc
Ac/C2Mo
Hierinbedeuten: As= Peakfläche von Stigmastadienen (wenn der
Peak geteilt ist, Summe der Flächen beider
Isomere),
Ac= PeakflächedesinternenStandards(Cholesta-
dien),
Mc= Masse des zugesetzten Standards in Mikro-
gramm,
Mo= MassedeseingewogenenÖlsinGramm.
Nachweisgrenze: rund0,01mg/kg.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—98
▼M11
Abb. 1:
Gaschromatogramme von Olivenölproben, analysiert auf einer Fused-
Silica-Kapillarsäule(0,25mmInnendurchmesserund25mLänge),belegt
mit 5%Phenylmethylsilicon (Filmdicke 0,25 µm).
a) Erste Fraktion (30 ml) eines nativen Olivenöls, mit dem Standard
versetzt.
b) Zweite Fraktion (40 ml) eines Olivenöls mit 0,10 mg/kg Stigmasta-
dienen.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—99
▼M11
c) ZweiteFraktion(40ml)miteinemkleinenAnteildererstenFraktion.
Abb. 2:
Gaschromatogramm einer Probe raffinierten Olivenöls, analysiert auf
einer DB-5-Säule, auf dem das Isomer von Stigmasta-3,5-dien zu
erkennen ist.1991R2568—DE—28.05.1995—012.001—100