1978L0633—DE—20.12.1983—002.001—1
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►B ACHTE RICHTLINIE DER KOMMISSION
vom 15. Juni 1978
zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futter-
mitteln
(78/633/EWG)
(ABl.L206vom29.7.1978,S.43)
Geändert durch:
Amtsblatt
Nr. Seite Datum
►M1Richtlinie 81/680/EWGderKommissionvom30.Juli1981 L246 32 29.8.1981
►M2Richtlinie 84/4/EWGderKommissionvom20.Dezember 1983 L15 28 18.1.1984
▼B
ACHTE RICHTLINIE DER KOMMISSION
vom 15. Juni 1978
zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die
amtliche Untersuchung von Futtermitteln
(78/633/EWG)
DIEKOMMISSIONDEREUROPÄISCHENGEMEINSCHAFTEN—
gestütztaufdenVertragzurGründungderEuropäischenWirtschaftsge-
meinschaft,
gestützt auf die Richtlinie 70/373/EWG des Rates vom 20. Juli 1970
über die Einführung gemeinschaftlicher Probenahmeverfahren undAnalysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln(
1),
zuletzt geändert durchdie Beitrittsakte, insbesondereaufArtikel 2,
inErwägungnachstehenderGründe:
Die obengenannte Richtlinie bestimmt, daß die amtlichen Untersu-
chungen von Futtermitteln zur Feststellung, ob die aufgrund derRechts- oder Verwaltungsvorschriften festgelegten Anforderungenhinsichtlich Beschaffenheit und Zusammensetzung der Futtermittel
erfüllt sind,nachgemeinschaftlichen Probenahmeverfahren undAnaly-
semethoden durchgeführtwerden.
Mit den Richtlinien der Kommission 71/250/EWG vom 15. Juni
1971(
2), 71/393/EWG vom 18. November 1971(3), 72/199/EWG vom
27. April 1972(4), 73/46/EWG vom 5. Dezember 1972(5), 74/203/
EWG vom 25. März 1974(6), 75/84/EWG vom 20. Dezember 1974(7)
und 76/372/EWG vom 1. März 1976(8) wurde bereits eine Reihe von
Analysemethoden festgelegt. Der Stand der seitdem durchgeführtenArbeiten ermöglicht es nunmehr, eine achte Reihe von Analyseme-thodenfestzulegen.
Die in dieser Richtlinie vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der
Stellungnahme desStändigenFuttermittelausschusses —
HATFOLGENDERICHTLINIEERLASSEN:
Artikel 1
(1) Die Mitgliedstaaten schreiben vor, daß die Analysen für die
amtliche Untersuchung von Futtermitteln auf ihren Gehalt an Zink-
Bacitracin, Flavophospholipol, Eisen, Kupfer, Mangan und Zink nach
denin derAnlage zudieser Richtlinie beschriebenen Methodendurch-geführt werden.
Artikel 2
Die Mitgliedstaaten setzen zum 1. Januar 1979 die erforderlichen
Rechts- oder Verwaltungsvorschriften in Kraft, um den Bestimmungen
dieserRichtlinienachzukommen.SiesetzendieKommissionunverzüg-lich hiervoninKenntnis.1978L0633—DE—20.12.1983—002.001—2
(1) ABl.Nr.L170vom3.8.1970,S.2.
(2) ABl.Nr.L155vom12.7.1971,S.13.
(3) ABl.Nr.L279vom20.12.1971,S.7.
(4) ABl.Nr.L123vom29.5.1972,S.6.
(5) ABl.Nr.L83vom30.3.1973,S.21.
(6) ABl.Nr.L108vom22.4.1974,S.7.
(7) ABl.Nr.L32vom5.2.1975,S.26.
(8) ABl.Nr.L102vom15.4.1976,S.8.▼M1
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Artikel 3
DieseRichtlinie istanalle Mitgliedstaaten gerichtet.1978L0633—DE—20.12.1983—002.001—3
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ANLAGE
1.BESTIMMUNG VON ZINK-BACITRACIN
—durchDiffusioninAgarnährboden—
1. ZWECKUNDANWENDUNGSBEREICH
Die Methode dient zur Bestimmung von Zink-Bacitracin in Futtermit-
teln und Vormischungen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit
beträgt5mg/kg(5ppm)(1).
2. PRINZIP
Die Probe wird bei pH 2 mit einer Mischung aus Methanol/Wasser/
Salzsäure unter Zusatz einer Natriumsulfidlösung extrahiert. Natrium-
sulfid wird zugefügt, um etwa vorhandene lösliche Kupfersalze, die
den Test stören würden, auszufällen. Der Extrakt wird erforderlichen-
falls auf pH 6,5 gebracht, konzentriert und verdünnt. Die antibiotische
Aktivität wird durch Messung der Diffusion des Zink-Bacitracin in
einem mit Micrococcus luteus (flavus) beimpften Agarnährboden
bestimmt. Die Diffusion wird durch die entstehenden Hemmzonen des
Testorganismus nachgewiesen. Der Durchmesser dieser Hemmzonen
wird für den Bereich der angewandten Konzentrationen als dem Loga-
rithmus der Konzentration an Antibiotikum direkt proportional
angesehen.
3. TESTORGANISMUS: MICROCOCCUS LUTEUS (FLAVUS) ATCC
10240
3.1.Haltung der Stammkultur
Agarschrägröhrchen mit Kulturnährboden (4.1) werden mit Micro-
coccus luteus (flavus) beimpft und 24Stundenlang bei 30ºCbebrütet.
Die Kultur wird im Kühlschrank bei etwa 4 ºC aufbewahrt und alle
zweiWochenneuüberimpft.
3.2.Herstellung der Bakteriensuspensionen (a)
Eine junge Kultur auf Agarschrägröhrchen (3.1) wird mit 2 bis 3 ml
Natriumchloridlösung (4.3) abgewaschen. Mit dieser Suspension wird
eine Rouxflasche, die 250 ml des Nährbodens (4.1) enthält, beimpft
und 18 bis 20 Stunden lang bei 30 ºC bebrütet. Die Kultur wird in
25mlNatriumchloridlösung (4.3)aufgenommen undgemischt.
Die Suspension wird 1: 10 mit Natriumchloridlösung (4.3) verdünnt.
Die Lichtdurchlässigkeit der Suspension soll bei 650 nm und 1 cm
Schichtdichte gegen Natriumchloridlösung (4.3) bei 75 v. H. liegen.
Diese Suspension kann eine Woche lang bei ungefähr 4 ºC aufbewahrt
werden.
4. NÄHRBÖDENUNDREAGENZIEN
4.1.Kulturnährböden (b)
Fleischpepton 6,0g,
Caseinpepton 4,0g,Hefeextrakt 3,0g,
Fleischextrakt 1,5g,
Glukose 1,0g,Agar 10,0bis20,0gWasser 1000ml,pH6,5—6,6(nachSterilisation)
4.2.Testnährböden (
b)
Trypton 10,0g,
Hefeextrakt 3,0g,
Fleischextrakt 1,5g,
Glukose 1,0g,Agar 10,0bis20,0g,1978L0633—DE—20.12.1983—002.001—4
(1) 1mgZink-Bacitracin entspricht 42internationalen Einheiten(IE).
(a) Andere Methoden, die entsprechende Bakteriensuspensionen ergeben, können ange-
wendet werden.
(b) JederhandelsüblicheNährbodenentsprechenderZusammensetzung,derdieselbenErge-
bnisseerbringt, kannverwendetwerden.▼M2
▼M2
Tween80 1ml,
Wasser 1000ml,
pH6,5(nachSterilisation)
4.3. Natriumchloridlösung 0,8 v. H. (G/V): 8 g Natriumchlorid werden in
Wasseraufgelöst,auf1000mlverdünntundsterilisiert.
4.4. MischungausMethanol/Wasser/Salzsäure (4.6):80:17,5:2,5(V/V/V).4.5.Phosphatpuffer, pH 6,5
Di-Kaliumhydrogenphosphat,K
2HPO422,15g,
Kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO427,85g,
Wasser 1000ml.
4.6. Salzsäure,d:1,18—1,19.4.7. Salzsäure,0,1M.4.8. Natronlauge, 1M.4.9. Natriumsulfid,ca.0,5MLösung.4.10 Bromkresol-Purpurlösung 0,04 v. H. (G/V): 0,1 g Bromkresol-Purpur
werden in 18,5 ml 0,01 M Natronlauge aufgelöst und mit Wasser auf
250mlaufgefüllt undgemischt.
4.11. Standardsubstanz:Zink-Bacitracin mitbekannter Aktivität (inIE).
5. STANDARDLÖSUNG
Eine Menge der Standardsubstanz (4.11), die 1050 IE (gemäß der
angegebenen Aktivität) entspricht, wird abgewogen, mit 5 ml 0,1 M
Salsäure versetzt und 15 Minuten stehengelassen. Dann werden 30 ml
Wasser hinzugefügt, der pH-Wert auf 4,5 mit Phosphatpuffer (4.5)
(ungefähr4ml)eingestellt,dieLösungmitWasserauf50mlaufgefüllt
undgutgemischt (1ml=21IE).
Aus dieser Lösung werden durch aufeinanderfolgende Verdünnungen
mit Phosphatpuffer(4.5)folgende Lösungenhergestellt:
S
80,42 IE/ml,
S40,21 IE/ml,
S20,105 IE/ml,
S10,0525 IE/ml.
6. HERSTELLUNGDESEXTRAKTSUNDDERTESTLÖSUNGEN
6.1.Extraktion
6.1.1.Vormischungen und mineralische Futtermittel
Eine Menge von 2,0 bis 5,0 g der Probe wird abgewogen und mit
29,0 ml der Mischung (4.4) und 1,0 ml Natriumsulfidlösung (4.9)versetzt undkurzgeschüttelt. Esistdaraufzuachten, daßderpH-Wert
bei 2 liegt. Die Mischung wird 10 Minuten lang geschüttelt und mit
30 ml des Phosphatpuffers (4.5) versetzt, dann erneut 15 Minuten
geschüttelt und zentrifugiert. Ein angemessener Anteil des Überstands
wirdentnommenundderpH-WertdurcheineZugabevon1MNatron-
lauge (4.8) mit einem pH-Meter oder mit Bromkresol-Purpurlösung
(4.10)alsIndikator auf6,5eingestellt.
Anschließend wird mit Phosphatpuffer (4.5) verdünnt, um einen erwar-
teten Zink-Bacitracingehalt von0,42IE/ml(=U
8)zuerhalten.
6.1.2.Eiweißkonzentrate
Eine Menge von 10,0 g der Probe wird abgewogen, mit 49,0 ml der
Mischung(4.4)und1,0mlNatriumsulfidlösung (4.9)versetzt undkurz
geschüttelt. Es ist darauf zu achten, daß der pH-Wert bei 2 liegt. Die
Mischung wird 10 Minuten lang geschüttelt. Dann werden 50 ml des
Phosphatpuffers(4.5)zugesetzt,15Minutenlanggeschütteltundzentri-
fugiert.Anschließendwirdeine angemesseneMengederüberstehenden
Lösung entnommen und der pH-Wert durch Zugabe von 1 M Natron-
lauge (4.8) mit einem pH-Meter oder mit Bromkresolpurpurlösung
(4.10) als Indikator auf 6,5 eingestellt. Die Mischung wird in einem
Vakuum-Rotationsverdampfer bei höchstens 35 ºC auf ungefähr die
Hälfteeingedampft.
Der Rückstand wird mit Phosphatpuffer (4.5) verdünnt, um einen
erwarteten Zink-Bacitracingehalt von0,42IE/ml (=U8)zuerhalten.1978L0633—DE—20.12.1983—002.001—5
▼M2
6.1.3.Sonstige Futtermittel
EineMengevon10,0g(20,0gfüreinenerwartetenZink-Bacitracinge-
halt von 5 mg/kg) der Probe wird abgewogen, mit einer Mischung aus
24,0 ml der Mischung (4.4) und 1,0 ml Natriumsulfidlösung (4.9)
versetzt und 10 Minuten lang homogenisiert. Anschließend werden
25 ml Phosphatpuffer (4.5) zugesetzt und 15 Minuten lang geschüttelt
und zentrifugiert. Von der überstehenden Lösung werden 20 ml
entnommen und der pH-Wert mit Hilfe einer 1 M Natronlauge (4.8)
mit einem pH-Meter oder mit Bromkresolpurpurlösung (4.10) als Indi-
kator auf 6,5 eingestellt. Die Mischung wird in einem Vakuum-
Rotationsverdampfer bei höchstens 35 ºC auf ungefähr 4 ml einge-
dampft. Der Rückstand wird mit Phosphatpuffer verdünnt (4.5), um
einen erwarteten Zink-Bacitracingehalt von 0,42 IE/ml (= U8)z u
erhalten.
6.2.Testlösungen
VonderLösungU8werdendieLösungenU4(erwarteterGehalt:0,21IE/
ml), U2(erwarteter Gehalt: 0,105 IE/ml) und U1(erwarteter Gehalt:
0,0525 IE/ml) durch aufeinanderfolgende Verdünnung (1: 1) mit Phos-
phatpuffer (4.5)hergestellt.
7. TESTVERFAHREN
7.1.Beimpfung des Nährbodens
Der Testnährboden (4.2) wird mit der Bakteriensuspension (3.2) bei
ungefähr 50 ºC beimpft. Bei Vorversuchen auf Platten mit dem Test-
nährboden (4.2) wird die Menge des Inokulums ermittelt, die
möglichst große,abernochscharfeHemmzonenmit denverschiedenen
Zink-Bacitracin-Konzentrationen ergibt.
7.2.Herstellung der Platten
Der Test ist als Diffusionstest auf Platten mit je vier Konzentrations-
stufenderStandardlösung(S8,S4,S2,S1)undderTestlösungen (U8,U4,
U2,U1)angelegt. JedePlatte erhält unbedingtalle vierKonzentrationen
des Standards und des Extrakts. Daher muß die Plattengröße so
bemessen sein, daß mindestens acht Löcher mit einem Durchmesser
von 10-13 mm und mindestens 30 mm zwischen den Lochzentren in
dieNährbodenschichtgestanztwerdenkönnen.DerTestsolltevorzugs-
weise auf Platten durchgeführt werden, die aus einer Glasscheibe mit
einem daraufgelegten plangedrehten Aluminium- oder Kunstoffring
von20mmHöheund200mmDurchmesserhergestellt werden.
Auf die Platten wird eine Menge des nach 7.1 beimpften Testnährbo-
dens (4.1) gegossen, so daß sich eine ca. 2 mm dicke Schicht ergibt
(60mlfüreinePlattevon200mmDurchmesser).NachdemdieSchicht
festgeworden ist, werden die Löcher gestanzt und genau abgemessene
Mengen der Standard- und Testlösungen einpipettiert. (Zwischen 0,10
und 0,15 ml pro Loch, je nach Lochdurchmesser). Jede Konzentration
muß mindestens in vierfacher Wiederholung angewendet werden, so
daßfürjedenTest32Hemmzonenausgewertet werden.
7.3.Inkubation
DieInkubationerfolgtwährend16bis18Stundenbei30ºC±2ºC.
8. AUSWERTUNG
Der Durchmesser der Hemmzonen wird auf 0,1 mm genau gemessen.
FürjedeKonzentrationwerdendieMittelwerteaufSemilogarithmenpa-
pier aufgetragen, wobei der Logarithmus der Konzentrationen gegen
den Durchmesser der Hemmzonen eingetragen wird. Für die Standar-
dlösung sowie für den Extrakt werden die geeignetsten Geraden —
wie beispielsweise nachstehend berechnet — gezogen. Der geeignetste
Punkt für das niedrigste Niveau der Standardlösung (SL) wird nach
folgenderFormel ermittelt:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Der geeignetste Punktfür das höchste Niveau der Standardlösung (SH)
wirdnachfolgenderFormel ermittelt:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
101978L0633—DE—20.12.1983—002.001—6
▼M2
Genauso werden uch die geeignetsten Punkte für das niedrigste (UL)
und höchste Niveau (UH) des Extrakts errmittelt, indem in der obigen
Formel — anstelle von s1,s2,s4und s8—u1,u2,u4und u8eingesetzt
werden.
Die ermittelten SL- und SH-Werte werden auf dasselbe Diagramm
aufgetragen.IndemmandiebeidenPunktemiteinanderverbindet,erhält
man die geeignetste Gerade für die Standardlösung. Ebenso wird mit
denUL-undUH-Werten verfahren,umdiegeeignetste Gerade fürden
Extraktzuerhalten.
In Abwesenheit von Störfaktoren sollten die Geraden parallel sein. Die
Geraden können als parallel angesehen werden, wenn die Werte (SH-
SL)und(UH-UL)nichtmehrals10v.H.vomMittelwert abweichen.
FallsdieGeradennichtparallelsind,kannmanentwederu1unds1oder
u8und s8ausschalten. Dann sind die Werte, SL, SH, UL und UH mit
folgendenFormelnzuermitteln,umdiegeeignetsteGeradezuerhalten:
(a′)SL=5s1þ2s2/C0s4
6oder5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)SH=5s4þ2s2/C0s1
6oder5s8þ2s4/C0s2
6
Ebenso wird für UL und UH verfahren. Auch hier gelten dieselben
Parallelitätsanforderungen.FallsdasErgebnisausdreiNiveausermittelt
wurde,solltediesimAnalyseprotokoll vermerkt werden.
Wenn die Geraden als parallel anzusehen sind wird der Logarithmus
derrelativenAktivität(logA)durcheinederfolgendenFormelnermit-
telt, je nachdem, ob 3 oder 4 Niveaus für die Beurteilung der
Parallelität verwendetwurden.
Für 4 Niveaus
(c) logA ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Für 3 Niveaus
(d) logA ¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C20;401
u4þs4/C0u1/C0s1
oder
(d′)logA ¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Tätigkeit des Probenextrakts = Aktivität der jeweiligen Standardlösung
×A:
(U8=S8×A)
Wenn die relative Aktivität außerhalb des Bereichs der Werte 0,5 bis
2,0 liegt, wird die Bestimmung bei entsprechender Anpassung der
Extraktkonzentrationen, bzw. der Standardlösungen wiederholt. Falls
die relative Aktivität nicht in den Bereich der erforderlichen Werte
gebracht werden kann, ist das Ergebnis als annähernd anzusehen. Dies
sollteimAnalyseprotokoll vermerkt werden.
Wenn die Geraden nicht als parallel anzusehen sind, wird die Bestim-
mung wiederholt. Wenn noch keine Parallelität erreicht wurde, ist die
Bestimmungalsunbefriedigend anzusehen.
Die Ergebnisse werden in Milligramm Zink-Bacitracin je kg Futter-
mittel ausgedrückt.
9. WIEDERHOLBARKEIT
DerUnterschiedzwischendenErgebnissenzweierBestimmungeneines
Analytikerssolltebeiein-undderselben ProbebeiGehaltenvon
— biszu10mg/kg—2mg/kgabsolut,
— 10—25mg/kg—20v.H.deshöheren Resultats,— 25—50mg/kg—5mg/kgabsolut,1978L0633—DE—20.12.1983—002.001—7
▼M2
— über50mg/kg—10v.H.deshöherenResultats
nichtüberschreiten.
2.BESTIMMUNG VON FLAVOPHOSPHOLIPOL — DURCH DIFFU-
SION IN AGARNÄHRBODEN
1. ZWECKUNDANWENDUNGSBEREICH
DieMethodeerlaubt dieBestimmung vonFlavophospholipol inFutter-
mitteln, Konzentraten und Vormischungen. Die untere Grenze der
Bestimmbarkeit beträgt 1mg/kg(1ppm).
2. PRINZIP
Die Probe wirdmit verdünntem Methanol durch Erhitzen am Rückfluß
extrahiert. Nach Zentrifugieren wird der Extrakt (falls erforderlich)
durchBehandlungmit Ionenaustauschern gereinigt undverdünnt. Seine
antibiotische Aktivität wird durch Messung der Diffusion des Flavo-
phospholipols in einem mit Staphylococcus aureus beimpften
Agarnährboden bestimmt. Die Diffusion wird durch die entstehenden
Hemmzonen mit dem Testorganismus nachgewiesen. Der Durchmesser
dieser Hemmzonen wird für den Bereich der angewandten Konzentra-
tionen als dem Logarithmus der Konzentration an Antibiotikum direkt
proportionalangesehen.
3. TESTORGANISMUS:STAPHYLOCOCCUSAUREUSATCC6538P
3.1.Haltung der Stammkultur
Agarschrägröhrchen mit Kulturnährboden (4.1) werden mit Staphylo-
coccus aureus beimpft und 24 Stunden bei 37º C bebrütet. Die Kultur
wird im Kühlschrank bei etwa 4º C aufbewahrt und jeden Monat neu
überimpft.
3.2.Herstellung der Keimsuspension (a)
VonderStammkultur(3.1)werden2Schrägröhrchenwöchentlichüber-
impft,24Stundenbei37ºCbebrütetundimKühlschrankbeietwa4ºC
aufbewahrt.
24 Stunden vor dem Test werden mit dieser Kultur 2 bis 4
Schrägröhrchen mit Kulturnährboden (4.1) beimpft und 16 bis 18
Stunden bei 37º C bebrütet. Dann werden die Keime mit Natriumchlo-
ridlösung (4.3) aufgenommen und die Suspension verdünnt, um eine
Lichtdurchlässigkeit bei 578 nm und 1 cm Schichtdicke gegen
Natriumchloridlösung (4.3)vonetwa40v.H.zuerhalten.
4. NÄHRBÖDENUNDREAGENZIEN
4.1.Kulturnährboden (b)
Fleischpepton 6,0g
Trypton 4,0g
Hefeextrakt 3,0g
Fleischextrakt 1,5gGlukose 1,0g
Agar 15,0g
Wasser 1000mlpH6,5(nachSterilisation)
4.2.Testnährboden
4.2.1.Basalschicht(
c)
Fleischpepton 6,0g
Hefeextrakt 3,0gFleischextrakt 1,5g
Agar 10,0g1978L0633—DE—20.12.1983—002.001—8
(a) Andere Methoden, die entsprechende Bakteriensuspensionen ergeben, können
verwendetwerden.
(b) JederhandelsüblicheNährbodenentsprechenderZusammensetzung,derdieselbenErge-
bnisseerbringt,kannverwendetwerden,z.B.OxoidAntibioticumMedium1(CM327)mitZusatz vonOxoidAgarNr.3(L 13).
(
c) JederhandelsüblicheNährbodenentsprechenderZusammensetzung,derdieselbenErge-
bnisseerbringt,kannverwendetwerden,z.B.OxoidAntibioticumMedium2(CM335)
mit Zusatz vonOxoidAgarNr.3(L13).▼B
▼B
Wasser 1000ml
pH6,5(nachSterilisation)
4.2.2.Keimschicht
Wie unter4.1mit Zusatzvon2,0gSilikon-Antischaum-Emulsion(a)
4.3. Natriumchloridlösung0,4v.H.(G/V):4gNatriumchlorid p.a.werden
in Wasser aufgelöst und auf 1000 ml verdünnt; die Lösung wird steri-
lisiert.
4.4. Methanol,rein
4.5. Methanol 50 v. H. (V/V): 500 ml Methanol (4.4) werden mit 500 ml
Wasserverdünnt
4.6. Methanol 80 v. H. (V/V): 800 ml Methanol (4.4) werden mit 200 ml
Wasserverdünnt
4.7. Tris(hydroxymethyl)-aminomethan p.a.4.8. Kaliumchlorid-Methanollösung 1,5v.H.(G/V):1,5gKaliumchlorid p.
a.werdenin20mlWasseraufgelöstundbis100mlmitMethanol(4.4)
aufgefüllt.
4.9. Kationenaustauscher: Dowex 50 WX 8, 20 bis 50 mesh, Na-Form
(ServaKat.Nr.41600)odergleichwertiges
4.10. Anionenaustauscher: Dowex 1×2, 50 bis 100 mesh, CI-Form (Serva
Kat.Nr.41010)odergleichwertiges
4.11. Glaswolle4.12. pH-Indikatorpapier (pH6,6bis8,1)
4.13. Ascorbinsäure
4.14. Standardsubstanz:Flavophospholipolvonbekannter Aktivität.
5. GERÄTE
5.1. Glasrohr für Chromatographie, Innendurchmesser: 9 mm, Länge: 150
bis 200 mm, mit einem Hahn am unteren engeren Ende und Schliff
(fürdenAnschlußdesTropftrichters 5.2)amoberenEnde
5.2. Tropftrichter mit Behälter vom250ml,HahnundSchliff
5.3. Erlenmeyerkolben, 250mlInhalt, mitSchliff5.4. Rückflußkühler mitSchliff.
6. STANDARDLÖSUNGEN
Eine genau abgewogene Menge der Standardsubstanz (4.14) wird in
50v.H.Methanol(4.5)aufgelöstundverdünnt,umeineStammlösung,
die100µgFlavophospholipolpromlenthält,zuerhalten.Inverschlos-
senenFlaschenundbei4ºCaufbewahrt,bleibtdieseLösung2Monate
langhaltbar.
Aus dieser Stammlösung werden durch aufeinanderfolgende Verdün-
nungenmit50v.H.Methanol (4.5)folgendeLösungenhergestellt:
S
80,2 µg/ml
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,025µg/ml.
7. HERSTELLUNGDESEXTRAKTS
7.1.Extraktion
7.1.1.Konzentrate, Vormischungen und Mineralfutter
EinerabgewogenenMengevon2,0bis5,0gderProbewerden150mg
Ascorbinsäure (4.13) zugesetzt und in einem Erlenmeyerkolben (5.3)
mit 150 ml 50 v. H. Methanol (4.5) gemischt. Der pH-Wert wird auf
8,1 bis 8,2 mit ca. 400 mg Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (4.7)
eingestelltundmitIndikatorpapier(4.12)kontrolliert.Nach15Minuten
wird der pH-Wert mit Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (4.7) erneut
auf 8,1 bis 8,2 eingestellt und die Mischung 10 Minuten am Rückfluß1978L0633—DE—20.12.1983—002.001—9
(a) z.B.SE2(WackerChemie GmbH,München).
▼B
(5.4) unter ständigem Rühren gekocht. Nach Abkühlen wird abzentri-
fugiertundderExaktdekantiert.
7.1.2.Sonstige Futtermittel
EineMengevon5,0bis30,0gderProbe,diemindestens30µgFlavo-
phospholipolenthält, wirdeingewogenundineinem Erlenmeyerkolben
(5.3) mit 150 ml 50 v. H. Methanol (4.5) gemischt. Der pH-Wert wird
auf8,1bis8,2mit ca.400mgTris(hydroxymethyl)-aminomethan (4.7)
eingestelltundmitIndikatorpapier(4.12)kontrolliert.Nach15Minuten
wird der pH-Wert mit Tris(thydroxymethyl)-aminomethan (4.7) erneut
auf 8,1 bis 8,2 eingestellt und die Mischung 10 Minuten am Rückfluß
(5.4) unter ständigem Rühren gekocht. Nach Abkühlen wird abzentri-
fugiertundderExtraktdekantiert.
7.2.Reinigung (bei Konzentraten, Vormischungen und Mineralfutter
nicht erforderlich)
110 ml des Extraktes werden mit 11 g Kationenaustauscher (4.9)
versetzt und eine Minute am Rückfluß (5.4) unter ständigem Rühren
gekocht.
Nach Abtrennung des Kationenaustauschers durch Zentrifugieren oder
Filtrieren werden 100 ml des Extraktes mit 150 ml Methanol (4.4)
versetzt und die Lösung 12 bis 15 Stunden bei 4 ºC aufbewahrt. Die
Abtrennung der Ausflockung erfolgt durch Filtration der gekühlten
Lösung.
AmunterenEndeeinesGlasrohrs(5.1)wirdeinGlaswollstopfen(4.11)
eingeführt, anschließend werden 5 ml des Anionenaustauschers (4.10)
in das Rohr gegossen und die Säule mit 100 ml 80 v. H. Methanol
(4.6) gewaschen. Mit Hilfe des Trichters (5.2) werden mindestens
100 ml des Filtrats, das 16 µg Flavophospholipol enthalten sollte
(200 ml für 30 g Futtermittelprobe mit 1 ppm) auf die Säule gegeben.
Falls erforderlich, wird das Filtrat vor Aufbringen auf die Säule mit
80v.H.Methanol(4.6)verdünnt,umeinenerwartetenFlavophospholi-
polgehalt von16µg/100ml zuerhalten. DieDurchflußgeschwindigkeit
wird auf ca. 2 ml/Minute eingestellt, der Durchlauf verworfen. Die
Säule wird dann mit 50 ml 80 v. H. Methanol (4.6) gewaschen und
derDurchlaufverworfen.
Das Flavophospholipol wird mit der Kaliumchlorid-Methanollösung
(4.8) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von ca. 2 ml/Minute eluiert.
50 ml des Eluats werden in einem Meßzylinder aufgefangen und mit
30 ml Wasser gemischt. Diese Lösung sollte 0,2 µg/ml (= U8) Flavo-
phospholipolenthalten.
7.3.Testlösungen
Falls erforderlich (d. h. wenn keine Reinigung vorgenommen wurde),
wird der in 7.1.1 erhaltene Extrakt mit 50 v. H. Methanol (4.5)
verdünnt, um einen erwarteten Flavophospholipolgehalt von 0,2 µg/ml
(=U8)zuerhalten.
VonderLösungU8werdendieLösungenU4(erwarteterGehalt:0,1µg/
ml), U2(erwarteter Gehalt: 0,05 µg/ml) und U1(erwarteter Gehalt:
0,025 µg/ml) durch aufeinanderfolgende Verdünnung (1+1) mit 50 v.
H.Methanol (4.5)hergestellt.
8. TESTVERFAHREN
8.1.Beimpfung des Nährbodens
Der Testnährboden (4.2.2) wird mit der Keimsuspension (3.2) bei ca.
50º C beimpft. Bei Vorversuchen auf Platten mit dem Testnährboden
(4.2.2) wird die Menge der Keimsuspension ermittelt, die möglichst
große, aber noch scharfe Hemmzonen mit den verschiedenen verwen-
deten Konzentrationen an Flavophospholipol ergibt (etwa 30 ml pro
Liter).
8.2.Herstellung der Platten
Der Test ist als Diffusionstest auf Platten mit je vier Konzentrations-
stufen der Standardlösung (S8,S4,S2,S1) und der Testlösung (U8,U4,
U2,U1)angelegt. JedePlatte erhält unbedingtalle vierKonzentrationen
des Standards und des Extrakts. Daher muß die Plattengröße so
bemessen sein, daß mindestens acht Löcher mit einem Durchmesser
von 10 bis 13 mm und mindestens 30 mmzwischen den Lochzentren
in die Nährbodenschicht gestanzt werden können. Der Test sollte
vorzugsweise auf Platten durchgeführt werden, die aus einer Glas-
scheibe mit einem darauf gelegten plangedrehten Aluminium- oder1978L0633—DE—20.12.1983—002.001—10
▼B
Kunststoffring von 20 mm Höhe und 200 mm Durchmesser hergestellt
werden.
AufdiePlattenwirdeineMengederBasalschicht(4.2.1)gegossen,daß
sich eine 1,5 mm dicke Schicht ergibt (45 ml für eine Platte von
200 mm Durchmesser). Nachdem die Schicht fest geworden ist, wird
mit einer Menge der Keimschicht (4.2.2) — beimpft wie unter 8.1 —
überschichtet, um eine Schicht von 1 mm zu erhalten (30 ml für eine
Platte von 200 mm Durchmesser). Nachdem auch diese Schicht fest
geworden ist, werden die Löcher gestanzt und genau abgemessene
Mengen der Standard- und Testlösungen einpipettiert (zwischen 0,10
und0,15mlproLoch,jenachLochdurchmesser).
Jede Konzentration muß mindestens in 4facher Wiederholung ange-
wendet werden, so daß für jeden Test 32 Hemmzonen ausgewertet
werden.
8.3.Inkubation
DieInkubationerfolgtwährend16bis18Stundenbei28bis30ºC.
9. AUSWERTUNG
Der Durchmesser der Hemmzonen wird auf 0,1 mm genau gemessen.
FürjedeKonzentrationwerdendieMittelwerteaufSemilogarithmenpa-
pier aufgetragen, wobei der Logarithmus der Konzentrationen gegen
den Durchmesser der Hemmzonen eingetragen wird. Für die Standar-
dlösung sowie für den Extrakt werden die geeignetsten Geraden —
wiebeispielsweise nachstehend berechnet —gezogen.
Der geeignetste Punkt für das niedrigste Niveau der Standardlösung
(SL)wirdnachfolgender Formelermittelt:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Der geeigneste Punkt für das höchste Niveau der Standardlösung (SH)
wirdnachfolgenderFormel ermittelt:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Genauso werden auch die geeignetsten Punkte für das niedrigste (UL)
und höchste Niveau (UH) des Extraktes ermittelt, indem in der obigen
Formel — anstelle von s1,s2,s4und s8—u1,u2,u4und u8eingesetzt
werden.
Die ermittelten SL- und SH-Werte werden auf dasselbe Diagramm
aufgetragen.IndemmandiebeidenPunktemiteinanderverbindet,erhält
man die geeignetste Gerade für die Standardlösung. Ebenso wird mit
denUL-undUH-Werten verfahren,umdiegeeignetste Gerade fürden
Extraktzuerhalten.
In Abwesenheit von Störfaktoren sollten die Geraden parallel sein. Die
Geraden können als parallel angesehen werden, wenn die Werte
(SH—SL) und (UH—UL) nicht mehr als 10 v. H. vom Mittelwert
abweichen.
FallsdieGeradennichtparallelsind,kannmanentwederu1unds1oder
u8und s8ausschalten. Dann sind die Werte SL, SH, UL und UH mit
folgendenFormelnzuermitteln,umdiegeeignetsteGeradezuerhalten:
(a′)S L¼5s1þ2s2/C0s4
6oder5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)SH¼5s4þ2s2/C0s1
6oder5s8þ2s4/C0s2
6
Ebenso wird für UL und UH verfahren. Mit diesen Alternativen soll
auch dieParallelität derGeraden überprüftwerden. Ergebnisse,die aus
dreiNiveausermitteltwurden,sollenindemAnalyseprotokollvermerkt
sein.
Wenn die Geraden als parallel anzusehen sind , wird der Logarithmus
derrelativenAktivität(log.A)durcheinederfolgendenFormelnermit-
telt:1978L0633—DE—20.12.1983—002.001—11
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Für 4 Niveaus
(c) log :A¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Für 3 Niveaus
(d) log :A¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
oder
(d′)log :A¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Tatsächliche Aktivität =angenommene Aktivität ×relative Aktivität.
Wenn die Geraden nicht als parallel anzusehen sind , wird die Bestim-
mungwiederholt. WennauchdannkeineParallelität erreicht wurde,ist
der Logarithmus der relativen Aktivität (log. A) mit der Formel (c) zu
ermitteln. Das erhaltene Ergebnis ist als angenähert anzusehen; dies
sollteimAnalysenprotokollvermerkt werden.
10. WIEDERHOLBARKEIT
DerUnterschiedzwischendenErgebnissenzweierBestimmungeneines
Analytikerssolltebeiein-undderselben ProbebeiGehaltenvon:
1bis2mg/kgFlavophospholipol0,5mg/kgabsolut,mehrals2bis10mg/kg25v.H.deshöherenResultats,
mehrals10bis25mg/kg20v.H.deshöherenResultats,
mehrals25bis50mg/kg5mg/kgabsolut,mehrals50mg/kg10v.H.deshöherenResultatsnichtüberschreiten.
3.BESTIMMUNG DER SPURENELEMENTE EISEN, KUPFER,
MANGAN UND ZINK
1. ZWECKUNDANWENDUNGSBEREICH
Die Methode erlaubt die Bestimmung der Spurenelemente Eisen,
Kupfer, Mangan und Zink in Futtermitteln. Die unteren Grenzen der
Bestimmbarkeit betragen:
Eisen(Fe): 20mg/kg
Kupfer(Cu): 10mg/kg
Mangan(Mn): 20mg/kgZink(Zn): 20mg/kg
2. PRINZIP
Die Probe wird nach Zerstörung eventuell vorhandener organischer
Substanz in Salzsäure gelöst. Die Elemente Eisen, Kupfer, Mangan
undZinkwerdennachentsprechender VerdünnungderAnalysenlösung
mittels Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt.
3. REAGENZIEN
Vorbemerkungen
Daszur Herstellung der Reagenzien undAnalysenlösungen verwendete
Wasser muß „frei“ von den zu bestimmenden Kationen sein. Hierfür
kann Wasser verwendet werden, das, entweder in einer Borsilikatglas-
oder Quarzapparatur zweifach destilliert oder durch doppelten Ionen-
austauschgereinigt wurde.
DiezurAnalyseverwendetenReagenzienmüssenmindestensvonp.a.-
Qualität sein. Die Abwesenheit des zu bestimmenden Elements wird
mittels eines Blindversuchs kontrolliert. Falls erforderlich, sind die
Reagenzien einerzusätzlichen Reinigungzuunterziehen.
Anstelle der nachfolgend beschriebenen Standardlösungen können auch
handelsübliche Standardlösungen verwendet werden, deren Reinheit
garantiert undvorVerwendungkontrolliert wurde.1978L0633—DE—20.12.1983—002.001—12
▼B
3.1. Salzsäurep.a.,d:1,19
3.2. Salzsäurep.a.,6N3.3. Salzsäurep.a.,0,5N3.4. Fluorwasserstoffsäure, 38 bis 40 %ig (v/v); Eisengehalt: weniger als
1mg/lGlührückstand(alsSulfat):weniger als10mg/l
3.5. Schwefelsäurep.a.,d:1,843.6. Wasserstoffperoxidp.a.,ca.100Vol.Sauerstoff(30%Gew.%)
3.7. Eisen-Standardlösung (1000 µg Fe/ml): 1 g Eisendraht p.a. wird in
200ml6NSalzsäure(3.2)gelöst,eswerden16mlWasserstoffperoxid
(3.6)zugegeben,dannwirdmit Wasserauf1laufgefüllt.
3.7.1. Eisen-Gebrauchsstandardlösung (100 µ g Fe/ml): Die Standardlösung
(3.7)wirdimVerhältnis1+9mit Wasserverdünnt.
3.8. Kupfer-Standardlösung (1000 µ g Cu/ml): 1 g Kupfer p.a. in Pulver-
form wird in 25 ml 6 N Salzsäure (3.2) gelöst, es werden 5 ml
Wasserstoffperoxid (3.6) zugegeben, dann wird mit Wasser auf 1 l
aufgefüllt.
3.8.1. Kupfer-Gebrauchsstandardlösung (10 µ g Cu/ml): Die Standardlösung
(3.8) wird im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt und anschließend
die entstehende Lösung wiederum im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser
verdünnt.
3.9. Mangan-Standardlösung(1000µgMn/ml): 1gManganp.a.inPulver-
form wird in 23 ml 6 N Salzsäure (3.2) gelöst, dann wird mit Wasser
auf1laufgefüllt.
3.9.1. Mangan-Gebrauchsstandardlösung (10 µ g Mn/ml): Die Standardlösung
(3.9) wird im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt und anschließend
die entstehende Lösung wiederum im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser
verdünnt.
3.10. Zink-Standardlösung (1000 µg Zn/ml): 1 g Zink p.a. in Streifen- oder
Plattenform wird in 25 ml 6 N Salzsäure (3.2) gelöst; dann wird mit
Wasserauf1laufgefüllt.
3.10.1. Zink-Gebrauchsstandardlösung (10 µ g Zn/ml): die Standardlösung
(3.10) wird im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt und die entste-
hendeLösungwiederum imVerhältnis1+9mit Wasserverdünnt.
3.11. Lanthanchloridlösung: Es werden 12 g Lanthanoxid in 150 ml Wasser
aufgelöst, 100 ml 6 N Salzsäure (3.2) zugegeben und mit Wasser auf
1laufgefüllt.
4. GERÄTE
4.1. MuffelofenmitRegelvorrichtung undTemperaturanzeige.4.2. GlasgerätemüssenausresistentemBorsilikatglassein.Empfohlenwird,
Glasgerätezubenutzen,dieausschließlichderBestimmungvonSpuren-
elementen vorbehalten bleiben.
4.3. Platin-undeventuell Quarzschalen.
4.4. Atomabsorptions-Spektrophotometer; das Gerät muß hinsichtlich seiner
Empfindlichkeit und Genauigkeit innerhalb des vorgesehenen Meßbe-
reichsdenMethodenanforderungen genügen.1978L0633—DE—20.12.1983—002.001—13
▼B
5. AUSFÜHRUNG
5.1.Proben mit organischen Bestandteilen
5.1.1.Veraschung und Herstellung der Analysenlösung (*)
(i) 5 bis 10 g der Probe (auf ± 0,2 mg genau abgewogen) werden in
eine Quarz- oder Platinschale (4.3) gegeben (siehe Hinweis (b))
und im Trockenschrank bei 105 ºC getrocknet; dann wird die
Schale in den kalten Muffelofen (4.1) verbracht. Der Ofen wird
geschlossen (siehe Hinweis (c)) und die Temperatur innerhalb ca.
90 Min. langsam auf 450 bis 475 ºC erhöht. Diese Temperatur
wird 4 bis 16 Stunden (z. B. über Nacht) aufrechterhalten, um
Kohleteilchen zu entfernen; dann wird der Ofen geöffnet und man
läßt abkühlen(sieheHinweis(d)).
Die Asche wird mit Wasser angefeuchtet und in ein 250-ml-
Becherglas überführt. Die Schale wird mit insgesamt etwa 5 ml
Salzsäure (3.1) ausgespült und letztere langsam und vorsichtig in
das Becherglas gegeben (durch CO2-Bildung eventuell stürmische
Reaktion). Unter Schüttelnwird Salzsäure (3.1) tropfenweise zuge-
geben bis die Schaumbildung aufhört. Die Salzsäure wird unter
gelegentlichem Umrühren mit einem Glasstab bis zur Trockne
abgedampft.
Man gibt dann zum Rückstand 15 ml 6 N Salzsäure (3.2) und
anschließend etwa 120 ml Wasser. Umgerührt wird mit dem Glas-
stab, der in dem Becherglas belassen wird; dieses wird mit einem
Uhrglas abgedeckt. Die Flüssigkeit wird zu schwachem Sieden
gebracht und dieses so lange aufrechterhalten, bis die Asche
vollständig gelöst ist. Dann wird durch ein aschefreies Filterpapier
filtriert und das Filtrat in einem 250-ml-Meßkolben aufgefangen.Man wäscht das Becherglas und den Filter mit 5 ml heißer 6 N
Salzsäure (3.2) und zweimal mit kochendem Wasser aus und füllt
den Meßkolben mit Wasser bis zur Marke auf (HCI-Konzentration
etwa0,5N).
(ii) Sollte der Filterrückstand schwarz aussehen (Kohlenstoff), so gibt
man ihn in die Veraschungsschale zurück und verascht abermals
bei 450º C bis 475º C. Diese Veraschung, die nur wenige Stunden
erfordert(etwa3bis5Std.)istbeendet,wenndieAscheweißoder
nahezuweißaussieht.DerRückstandwirdmitetwa2mlSalzsäure
(3.1) aufgenommen, zur Trockne eingedampft, und mit 5 ml 6 N
Salzsäure (3.2) versetzt. Nach dem Erwärmen wird die Lösung in
denMeßkolbenfiltriertunddiesermitWasserbiszurMarkeaufge-
füllt(HCl-Konzentration etwa0,5N).
Hinweise:
(a) Bei der Bestimmung von Spurenelementen ist unbedingt auf die
Gefahr von Verunreinigungen, insbesondere durch Zink, Kupfer
und Eisen zu achten. Deshalb müssen die bei der Probenvorberei-
tungbenutzten GerätefreivondiesenMetallen sein.
Um die Verunreinigungsrisiken einzuschränken, ist in staubfreier
Luft, mit absolut reinen Geräten und sorgfältig gewaschenen Glas-
geräten zu arbeiten. Die Zinkbestimmung ist für Verunreinigungen
durchGlasgeräte, Reagenzien, Staubusw.besondersempfindlich.
(b) Die Einwaage wird nach dem etwa zu erwartenden Gehalt des
Futtermittels an Spurenelementen unter Berücksichtigung der
Empfindlichkeit des verwendeten Spektrophotometers berechnet.
Bei Futtermitteln, die einen sehr niedrigen Gehalt an Spurenele-
menten aufweisen,kanneserforderlich sein,eine Probevon10bis
20geinzuwägenunddasVolumenderAnalysenlösungauf100ml
zubegrenzen.1978L0633—DE—20.12.1983—002.001—14
(*) Grünfutter (frisch oder getrocknet) kann größere Mengen pflanzlicher Kieselsäure
enthalten, welche Spurenelemente binden kann und daher entfernt werden muß. FürProben dieser Futtermittel muß also nach folgendem geändertem Verfahren vorge-gangen werden:Das Verfahren 5.1.1 (i) wird bis zur Filtration durchgeführt. Das den unlöslichen
Rückstand enthaltende Filterpapier wird zweimal mit kochendem Wasser ausgewa-
schen, in eine Platinschale (4.3) gegeben und im Muffelofen bei weniger als 550 ºCbis zum Vollständigen Verschwinden aller Kohleteilchen verascht. Nach demAbkühlen werden einige Tropfen Wasser, danach 10 bis 15 ml Fluorwasserstoffsäure(3.4) zugegeben und bei circa 150 ºC zur Trockne eingedampft. Verbleibt im Rück-
stand noch Kieselsäure, so wird diese erneut in einigen ml Fluorwasserstoffsäure
(3.4) gelöst und anschließend zur Trockne eingedampft. Dann werden 5 TropfenSchwefelsäufe (3.5) zugesetzt und so lange erhitzt, bis keine weißen Dämpfe mehrauftreten Nach Zugabe von 5 ml 6 N Salzsäure (3.2) und etwa 30 ml Wasser wirderhitzt, die Lösung in den 250-ml-Meßkolben filtriert und dieser mit Wasser bis zur
Markeaufgefüllt(HCI-Konzentration etwa0,5N).Manverfährt dannab5.1.3.
▼B
(c) Die Veraschung erfolgt im geschlossenen Muffelofen ohne
Einblasen vonLuftoderSauerstoff.
(d) Die vom Pyrometer angezeigte Temperatur darf 475ºC nicht über-
schreiten.
5.1.2.Spektrophotometrische Bestimmung
5.1.2.1. Herstellen derEichlösungen
Aus den Gebrauchsstandardlösungen 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 und 3.10.1
werden für jedes der zu bestimmenden Spurenelemente eine Reihe von
Eichlösungen hergestellt. Jede dieser Eichlösungen hat eine etwa0,5N
HCl-Konzentration und (im Falle von Eisen, Mangan und Zink) eine
Lanthanchlorid-Konzentration, die 0,1 % La (g/v) entspricht. Die
gewählten Spurenelementkonzentrationen müssen im Empfindlichkeits-
bereichdesverwendetenSpektrophotometersliegen.Dienachfolgenden
Tabellen zeigen als Beispiel die Zusammensetzung typischer Reihen
von Eichlösungen. Je nach Typ und Empfindlichkeit des verwendeten
Spektrophotometers kann es jedoch erforderlich sein, für die Eichlö-
sungeneineandere Konzentration zuwählen.
Eisen
µgFe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
mlGebrauchsstan-
dardlösung(3.7.1)
(1ml=100µgFe) 0 0,5 1 2 3 4 5
+ml6NHCl(3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml Lanthanchloridlösung (3.11) und mit Wasser auf 100 ml
auffüllen
Kupfer
µgCu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml
Gebrauchs-
standard-
Lösung
(3.8.1)
(1ml
=10µg
Cu)01 24681 0
+ml6N
HCL(3.2)88 88888
mit Wasserauf100mlauffüllen
Mangan
µgMn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
mlGebrauchsstan-
dardlösung(3.9.1)
(1ml=10µgMn) 0 1 2 4 6 8 10
+ml6NHCl(3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml Lanthanchoridlösung (3.11) und mit Wasser auf 100 ml
auffüllen
Zink
µgZn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
mlverdünnte
Standardlösung
(3.10.1)
(1ml=10µgZn) 0 0,5 1 2 4 6 8
+ml6NHCl(3.2) 7 7 7 7 7 7 71978L0633—DE—20.12.1983—002.001—15
▼B
µgZn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
+ 10 ml Lanthanchloridlösung (3.11) und mit Wasser auf 100 ml
auffüllen
5.1.2.2. Herstellen derMeßlösungen
FürdieKupferbestimmungkanndienach5.1.1hergestellteAnalysenlö-
sung in der Regel direkt verwendet werden. Gegebenenfalls wird ein
aliquoterTeildieserAnalysenlösungineinen100-ml-Meßkolbenpipet-
tiert und mit 0,5 N Salzsäure (3.3) zur Marke aufgefüllt, um ihre
Konzentration indenBereich derEichlösungenzubringen.
Für die Bestimmung der Elemente Eisen, Mangan und Zink wird ein
aliquoter Teil nach 5.1.1 hergestellten Analysenlösung in einen 100-
ml-Meßkolben pipettiert. Man gibt 10 ml Lanthanchloridlösung (3.11)
hinzu und füllt mit 0,5 N Salzsäure (3.3) zur Marke auf (siehe 8
„Bemerkung“).
5.1.2.3. Blindversuch
Es wird ein Blindversuch ausgeführt, der alle Verfahrensschritte
umfassen muß, nur daß das Probematerial selbst weggelassen wird.
DieEichlösung„0“ersetzt nichtdenBlindversuch.
5.1.2.4. MessungderAtomabsorption
Die Absorption der Eichlösungen und der zu analysierenden Lösungen
ist mit oxydierender Luft-Azetylenflamme bei folgenden Wellenlängen
zumessen:
Fe: 248,3nm
Cu: 324,8nm
Mn: 279,5nm
Zn: 213,8nm
JedeMessungistviermal auszuführen.
5.2.Mineralische Futtermittel
Enthält die Probe keine organischen Substanzen, so erübrigt sich eine
vorherige Veraschung. Man verfährt dann wie unter 5.1.1 (i) ab 2.
Absatz beschrieben. Ein Abrauchen mit Fluorwasserstoffsäure kann
entfallen.
6. BERECHNUNGDERERGEBNISSE
DieSpurenelement-KonzentrationinderAnalysenlösungwirdmitHilfe
einer Eichkurve berechnet und das Ergebnis in mg Spurenelement/kg
Probe(ppm)ausgedrückt.
7. WIEDERHOLBARKEIT
Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestim-
mungen eines Analytikers sollte an derselben Probe bei Gehalten an
dembetreffenden Spurenelement von:
— bis50mg/kg5mg/kgabsolut,
— mehrals50bis100mg/kg10%deshöherenResultats,— mehrals100bis200mg/kg10mg/kgabsolut,— mehrals200mg/kg5%deshöherenResultats
nichtüberschreiten.
8. BEMERKUNG
Die Anwesenheit größerer Mengen Phosphat kann bei der Bestimmung
vonEisen,ManganundZinkzuInterferenzenführen,diedurchZugabe
von Lanthanchloridlösung (3.11) beseitigt werden. Ist jedoch in der
Probe das Gewichtsverhältnis
CaþMg
Pgrößer als 2, so kann auf den
ZusatzvonLanthanchloridlösung verzichtet werden.1978L0633—DE—20.12.1983—002.001—16