1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—1
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►B VERORDNUNG (EWG) Nr. 2568/91 DER KOMMISSION
vom 11. Juli 1991
über die Merkmale von Olivenölen und Oliventresterölen sowie die Verfahren zu ihrer Bestim-
mung
(ABl.L248vom5.9.1991,S.1)
Geändert durch:
Amtsblatt
Nr. Seite Datum
►M1Verordnung (EWG) Nr. 3682/91 der Kommission vom 17. Dezember
1991L349 36 18.12.1991
►M2Verordnung(EWG)Nr.1429/92derKommissionvom26.Mai1992 L150 17 2.6.1992
►M3Verordnung(EWG)Nr.1683/92derKommissionvom29.Juni1992 L176 27 30.6.1992
►M4Verordnung(EWG)Nr.1996/92derKommissionvom15.Juli1992 L199 18 18.7.1992
►M5Verordnung (EWG) Nr. 3288/92 der Kommission vom 12. November
1992L327 28 13.11.1992
►M6Verordnung(EWG)Nr.183/93derKommissionvom29.Januar1993 L22 58 30.1.1993
►M7geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 826/93 der Kommission
vom6.April1993L87 6 7.4.1993
►M8Verordnung(EWG)Nr.620/93derKommissionvom17.März1993 L66 29 18.3.1993
►M9Verordnung(EG)Nr.177/94derKommissionvom28.Januar1994 L24 33 29.1.1994
►M10Verordnung(EG)Nr.2632/94derKommissionvom28.Oktober1994 L280 43 29.10.1994
►M11Verordnung(EG)Nr.656/95derKommissionvom28.März1995 L69 1 29.3.1995
►M12Verordnung(EG)Nr.2527/95derKommissionvom27.Oktober1995 L258 49 28.10.1995
►M13Verordnung(EG)Nr.2472/97derKommissionvom11.Dezember1997 L341 25 12.12.1997
►M14Verordnung(EG)Nr.282/98derKommissionvom3.Februar1998 L28 5 4.2.1998
►M15Verordnung(EG)Nr.2248/98derKommissionvom19.Oktober1998 L282 55 20.10.1998
►M16Verordnung(EG)Nr.379/1999derKommissionvom19.Februar1999 L46 15 20.2.1999
►M17Verordnung(EG)Nr.455/2001derKommissionvom6.März2001 L65 9 7.3.2001
►M18Verordnung(EG)Nr.2042/2001derKommissionvom18.Oktober2001 L276 8 19.10.2001
►M19Verordnung(EG)Nr.796/2002derKommissionvom6.Mai2002 L128 8 15.5.2002
Berichtigt durch:
►C1Berichtigung, ABl.L347vom28.11.1992,S.69(2568/91)
►C2Berichtigung, ABl.L290vom6.10.1992,S.15(1429/92)
►C3Berichtigung, ABl.L176vom20.7.1993,S.26(183/93)
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VERORDNUNG (EWG) Nr. 2568/91 DER KOMMISSION
vom 11. Juli 1991
über die Merkmale von Olivenölen und Oliventresterölen sowie die
Verfahren zu ihrer Bestimmung
DIEKOMMISSIONDEREUROPÄISCHENGEMEINSCHAFTEN—
gestütztaufdenVertragzurGründungderEuropäischenWirtschaftsge-
meinschaft,
gestützt auf die Verordnung Nr. 136/66/EWG des Rates vom 22.
September 1966 über die Errichtung einer gemeinsamen Marktorgani-sation für Fette(
1), zuletzt geändert durch die Verordnung (EWG)
Nr.3577/90(2),insbesondere aufArtikel35a,
inErwägungnachstehenderGründe:
Im Anhang der Verordnung Nr. 136/66/EWG sind die Bezeichnungen
und Begriffsbestimmungen für Olivenöle und Oliventresteröle zurVermarktung im innerstaatlichen und innergemeinschaftlichen Handelsowieim Handelmit Drittländern festgelegt.
Unbeschadet der bereits geltenden einschlägigen Bestimmungen
müssen zur Unterscheidung der Olivenölkategorien die entsprechendenchemisch-physikalischen Merkmale sowie die organoleptischen Merk-male nativer Olivenöle festgelegt werden, damit Reinheit und Qualitätderbetreffenden Erzeugnisse gewährleistet sind.
Die Merkmale der einzelnen Olivenöle müssen gemeinschaftsweit
einheitlich bestimmt werden. Daher müssen gemeinschaftlicheVerfahren für die chemische Analyse und die organoleptische Prüfungfestgelegtwerden.AllerdingssolltenwährendeinerÜbergangszeitauchandere in den Mitgliedstaaten übliche Analyseverfahren zulässig sein,
wobei jedoch vorzusehen ist, daß bei abweichenden Ergebnissen die
nachdemgemeinschaftlichen Verfahrenerzielten Ergebnissegelten.
DieFestlegungderchemisch-physikalischen MerkmalevonOlivenölen
und der Analyseverfahren erfordert eine Anpassung der Zusatzvor-schriften zuKapitel 15derKombinierten Nomenklatur.
Zur Bewertung der organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle
müssen Gruppen von ausgewählten und geschulten sensorischenPrüfern gebildet werden; dafüristeine ausreichende Zeitspanne vorzu-sehen. Da einige Mitgliedstaaten solche Prüfergruppen nicht ohneweiteres zusammenstellen können, muß ihnen die Möglichkeit einge-räumt werden, die in anderen Mitgliedstaaten eingesetzten
Prüfergruppenzubefassen.
Damit das einwandfreie Funktionieren der für die Einfuhr von Oliven-
tresteröl geltenden Abschöpfungsregelung gewährleistet ist, muß eineinheitliches Verfahren zur Bestimmung des Ölgehalts dieser Erzeug-nissevorgesehen werden.
Um Nachteile für den Handel auszuschließen, sollte Olivenöl, das vor
Inkrafttreten dieser Verordnung abgefüllt wurde, während einerbestimmten Zeit nochvermarktet werdendürfen.
Die Verordnung (EWG) Nr. 1058/77 der Kommission(
3), zuletzt
geändert durchdie Verordnung(EWG)Nr.1858/88(4),istaufzuheben.
Der Verwaltungsausschuß für Fette hat nicht innerhalb der ihm von
seinem Vorsitzenden gesetzten FristStellunggenommen —1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—2
(1) ABl.Nr.172vom30.9.1966,S.3025/66.
(2) ABl.Nr.L353vom17.12.1990,S.23.
(3) ABl.Nr.L128vom24.5.1977,S.6.
(4) ABl.Nr.L166vom1.7.1988,S.10.
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HATFOLGENDEVERORDNUNGERLASSEN:
Artikel 1
(1) NativeOlivenöleimSinnederNummer1Buchstabena),b)und
c) des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG sind Öle, derenMerkmale mit den in Anhang I Nummern 1, 2 und 3 dieser Verord-
nunggenannten Merkmalen übereinstimmen.
(2) Natives Lampantöl im Sinne der Nummer 1 Buchstabe d) des
Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Öl, dessen Merkmale
mit den in Anhang I Nummer 4 dieser Verordnung genannten Merk-malen übereinstimmen.
(3) Raffiniertes Olivenöl im Sinne der Nummer 2 des Anhangs der
VerordnungNr.136/66/EWGistOlivenöl,dessenMerkmalemitdeninAnhangINummer5dieserVerordnunggenanntenMerkmalenüberein-
stimmen.
(4) Olivenöl im Sinne der Nummer 3 des Anhangs der Verordnung
Nr. 136/66/EWG ist Öl, dessen Merkmale mit den in Anhang INummer 6dieserVerordnunggenannten Merkmalen übereinstimmen.
(5) Rohes Oliventresteröl im Sinne der Nummer 4 des Anhangs der
VerordnungNr.136/66/EWGistOlivenöl,dessenMerkmalemitdeninAnhangINummer7dieserVerordnunggenanntenMerkmalenüberein-stimmen.
(6) Raffiniertes Oliventresteröl im Sinne der Nummer 5 des
Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merk-
male mit den in Anhang I Nummer 8 dieser Verordnung genanntenMerkmalen übereinstimmen.
(7) Oliventresteröl im Sinne der Nummer 6 des Anhangs der
Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit deninAnhangINummer9dieserVerordnunggenanntenMerkmalenüber-einstimmen.
(8) Für die ►
M18Wirtschaftsjahre 1998/99 bis 2002/03 ◄gelten
jedoch auch als native Olivenöle im Sinne von Nummer 1 Buchstabena),b),c)oderd)desAnhangsderVerordnungNr.136/66/EWGnicht-abgefüllte Öleoderinunmittelbare Umschließungen eines Nettoinhaltsvon mindestens 100 kg abgefüllte Öle, die auschließlich aus Marokkostammen,derenMerkmaledenAngabengemäßAnhangINummern1,
2, 3 und 4 dieser Verordnung entsprechen und deren Linolengehalt
abweichend von den Bestimmungen der Absätze 1 und 2 höchstens1,0%beträgt.
Artikel 2
(1) Die Merkmale der Öle gemäß Anhang I dieser Verordnung
werdennach folgenden Analysenverfahren bestimmt:
— freieFettsäuren, berechnet inProzentÖlsäure,nachdemVerfahren
desAnhangsII;
— Peroxidzahl nachdemVerfahrendesAnhangsIII;
— Wachsgehalt nachdemVerfahrendesAnhangsIV;— Sterinfraktion nachdemVerfahrendesAnhangsV;
— Erythrodiol nachdemVerfahrendesAnhangVI;— gesättigte Fettsäuren in 2-Stellung der Triglyceride nach dem
VerfahrendesAnhangsVII;
— Trilinoleingehalt nach demVerfahrendesAnhangsVIII;
— spektrophotometrische Analyse nach dem Verfahren des Anhangs
IX;
— Fettsäurezusammensetzung nach dem Verfahren der Anhänge XA
undXB;1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—3
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— flüchtige halogenierte Lösungsmittel nach dem Verfahren des
AnhangsXI;
— BestimmungderorganoleptischenMerkmalenativerOlivenölenach
demgemäßAbsatz2angewandten VerfahrendesAnhangsXII;
— Raffinationsnachweis nachdemVerfahrendesAnhangsXIII;
— Stigmasterinnachweis nachdemVerfahrendesAnhangsXVII;— Bestimmung der Zusammensetzung der Triglyceride mit ECN42
nachdemVerfahrendesAnhangsXVIII;
— Gehalt an aliphatischen Alkoholen nach dem Verfahren des
AnhangsXIX.
(2) Die Prüfung der organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle
durch die einzelstaatlichen Behörden oder ihre Vertreter wird vondurchdieMitgliedstaaten zugelassenen Prüfergruppenvorgenommen.
Die organoleptischen Merkmale eines in Unterabsatz 1 genannten
Olivenöls werden als mit der deklarierten Olivenölkategorie überein-stimmend angesehen, wenn eine von dem betreffenden Mitgliedstaat
zugelassene Prüfergruppediediesbezügliche Einstufungbestätigt.
Bestätigt die zugelassene Prüfergruppe die organoleptischen Merkmale
der deklarierten Olivenölkategorie nicht, so fordern die einzelstaatli-chen Behörden oder ihre Vertreter auf Antrag des Betroffenen zweiGegenanalysen anderer zugelassener Prüfergruppen an, von denenmindestens eine von einer Prüfergruppe vorgenommen wird, die von
dem betreffenden Erzeugermitgliedstaat zugelassen wurde. Die fragli-
chen Merkmale gelten als mit den deklarierten Merkmalen konform,wenn zwei Gegenanalysen die deklarierte Einstufung bestätigen. Imgegenteiligen Fall sind — unbeschadet der fälligen Sanktionen — dieKostenfürdieGegenanalysen vomBetroffenen zutragen.
(3) Bei der Überprüfung der Merkmale der in Absatz 1 genannten
Öle durch die nationalen Behörden oder ihre Vertreter erfolgen die
Probenahmen gemäß den internationalen Normen EN ISO 661 betref-fend die Vorbereitung der Untersuchungsproben und EN ISO 5555betreffend die Entnahme der Proben. Jedoch werden die Proben beiPartien, die aus Olivenöl in unmittelbaren Umschließungen mit einemVolumen von höchstens 100 l bestehen, abweichend von Nummer 6.8
der Norm EN ISO 5555 gemäß den Bestimmungen von Anhang Ia
dieserVerordnungentnommen.
UnbeschadetderBestimmungenderNormENISO5555unddesKapi-
tels6derNormENISO661werdendieProbenunverzüglichvorLichtundstarker Hitzegeschützt sowie
— in den Monaten Oktober bis Mai spätestens am zehnten Arbeitstag
nachderProbenahmeund
— in den Monaten Juni bis September spätestens am fünften
ArbeitstagnachderProbenahme
zurAnalyseindasLaboratoriumgeschickt.
(4) Bei der Überprüfung gemäß Absatz 3 erfolgen die Analysen
gemäß den Anhängen II, III, IX und XII der Verordnung (EWG) Nr.2568/91 sowie gegebenenfalls die in den einzelstaatlichen Rechtsvor-schriften vorgesehenen Gegenanalysen vor Erreichen desMindesthaltbarkeitsdatums. Erfolgt die Probenahme mehr als vier
Monate vor dem Mindesthaltbarkeitsdatum, so müssen die Proben
spätestens im vierten Monat nach der Probenahme analysiert werden.Für die übrigen in der genannten Verordnung vorgesehenen Analysengelten keineFristen.
Entsprechen die Analyseergebnisse nicht den Merkmalen der angemel-
deten Kategorie Olivenöl bzw. Oliventresteröl, so wird der Beteiligtedavon spätestens einen Monat vor Ablauf der in Unterabsatz 11991R2568—DE—22.05.2002—019.001—4
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genannten Frist in Kenntnis gesetzt, es sei denn, die Probenahme ist
wenigeralseinen MonatvordemMindesthaltbarkeitsdatum erfolgt.
(5) Bei der nach einem der Verfahren in Absatz 1 vorgenommenen
Bestimmung der Merkmale der Öle werden die Analyseergebnissedirekt mit den in dieser Verordnung vorgesehenen Grenzwertenverglichen.
Artikel►M193◄
Werden Abweichungen zwischen den festgestellten und den aus der
Produktkennzeichnung zu erwartenden organoleptischen Merkmalenfestgestellt, so verhängt der betreffende Mitgliedstaat unbeschadetetwaiger anderer Sanktionen administrative finanzielle Sanktionen,deren Höhesich nach derSchwere der festgestellten Unregelmäßigkeitrichtet.
ZurBeurteilung derUnregelmäßigkeit wirddienatürliche Entwicklung
der Merkmale von unter normalen Bedingungen aufbewahrten Ölenberücksichtigt.
Die Mitgliedstaaten teilen der Kommission zu Beginn eines jeden
Halbjahres Anzahl und Art der festgestellten Unregelmäßigkeiten undder im Laufe des vorhergehenden Halbjahres verhängten Sanktionen
mit.
Artikel 4
(1) Zur Beurteilung und Kontrolle der organoleptischen Merkmale
durch die einzelstaatlichen Behörden oder ihre Vertreter können die
Mitgliedstaaten Prüfergruppenzulassen.
DieZulassungsbedingungenwerdenvondenMitgliedstaaten sofestge-
legt,dassinsbesonderegewährleistet ist,dass
— dieBedingungen gemäßAnhangXIINummer 4erfüllt sind;
— der Leiter der Prüfergruppe in einem Institut und unter Bedin-
gungen geschult wird, die vom Mitgliedstaat zu diesem Zweckanerkannt sind;
— dieZulassungvondenErgebnissenabhängiggemacht wird,diedie
Gruppe im Rahmen eines vom Mitgliedstaat jährlich festgelegtenKontrollprogramms erzielt.
Die Mitgliedstaaten teilen der Kommission die Liste der zugelassenen
Prüfergruppen und die nach Maßgabe dieses Absatzes getroffenenMaßnahmen mit.
(2) Ergeben sich in einem Mitgliedstaat Schwierigkeiten bei der
Zulassung von Prüfergruppen, kann eine Prüfergruppe eingeschaltet
werden,dieineinem anderen Mitgliedstaat zugelassenist.
(3) Jeder Mitgliedstaat erstellt ein Verzeichnis der von Organisa-
tionen des Berufsstands oder mehrerer Berufsstände unter den
Bedingungen des Absatzes 1 eingeführten Prüfergruppen und achtetaufdie Einhaltung dieserBedingungen.
Artikel 6
(1) DerÖlgehaltvonTresterundanderenRückständenderOlivenö-
lextraktion (KN-Codes 23069011 und 23069019) wird nach dem
VerfahrendesAnhangsXVbestimmt.
(2) DerÖlgehaltgemäßAbsatz1wirdinMassenprozenten,bezogen
aufdie Trockenmasse, berechnet.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—5
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Artikel 7
Für andere als im Anhang XI aufgeführte unerwünschte Stoffe gelten
die entsprechenden Gemeinschaftsvorschriften.
Artikel 8
(1) DieMitgliedstaaten teilen derKommissiondie Maßnahmen mit,
die siezurDurchführungdieserVerordnunggetroffen haben.
(2) Die Mitgliedstaaten übermitteln der Kommission zu Beginn
jedes Halbjahres eine Zusammenstellung der analytischen Daten der
imvorangegangenen Halbjahrdurchgeführten Bestimmungen.
Diese Ergebnisse werden vom Verwaltungsausschuß für Fette nach
dem Verfahren des Artikels 39 der Verordnung Nr. 136/66/EWGgeprüft.
Artikel 9
DieVerordnung(EWG)Nr.1058/77wirdaufgehoben.
Artikel 10
(1) Diese Verordnung tritt am dritten Tag nach ihrer Veröffentli-
chungim Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften inKraft.
Das Verfahren des Anhangs XII ist jedoch, außer wenn es sich um
Interventionsmaßnahmen handelt, ab ►
M11. November 1992 ◄
anwendbar.
Diese Methode findet keine Anwendung auf native Olivenöle, die vor
dem1.November 1992abgefüllt wurden.
(2) DieseVerordnunggiltnichtfürOlivenölundOliventresteröl,das
vor dem Tag des Inkrafttretens dieser Verordnung abgefüllt und biszum31.Oktober1992vermarktetwurde.
Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmit-
telbar injedem Mitgliedstaat.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—6
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ANHÄNGE
Inhalt
AnhangI: MerkmalevonOlivenölen …
AnhangIa: Entnahme von Proben bei Partien von Olivenöl oder Oliven-
tresteröl in unmittelbaren Umschließungen mit einem Inhalt
vonhöchstens100l…
AnhangII: BestimmungderfreienFettsäuren…
AnhangIII: BestimmungderPeroxidzahl …
AnhangIV: ►M6Kapillargaschromatographische Bestimmung des
Wachsgehalts ◄…
AnhangV: Bestimmung der Zusammensetzung und des Gehalts an
Sterinenmit derKapillar-Gaschromatographie …
AnhangVI: BestimmungdesErythrodiolsunddesUvaols…
AnhangVII: BestimmungvonFettsäurenin2-StellungderTriglyceride…
AnhangVIII: BestimmungdesTrilinoleingehalts …AnhangIX: UV-spektrophotometrischeAnalyse…
AnhangXA: Gaschromatographische AnalysederFettsäuremethylester …
AnhangXB: VorbereitungderFettsäuremethylester …AnhangXI: Bestimmung des Gehalts an flüchtigen halogenierten
LösungsmittelninOlivenöl…
AnhangXII: Organoleptische Prüfungvonnativem Olivenöl …AnhangXIII: ►
M6Neutralisierung und Bleichung von Olivenöl im
Laboratorium ◄…
AnhangXV: ÖlgehaltderOliventrester …
AnhangXVI: BestimmungderIodzahl…
AnhangXVII: BestimmungderStigmastadiene inpflanzlichen Ölen…AnhangXVIII: Bestimmung der Zusammensetzung der Triglyceride mit
ECN42…
AnhangXIX: Bestimmung des Gehalts an aliphatischen Alkoholen ange-
fügt…1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—7
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ANHANG I
MERKMALE VON OLIVENÖLEN
KategorieGehalt an
freien Fett-
säuren
(%)(*)Peroxidzahl
mEq02/
kg(*)Halogen-
ierte
Lösungs-
mittel
mg/kg(*)(1)Wachse
mg/kg(**)Gesättigte
Fettsäuren
in2-Stel-
lungder
Triglyceride
(%)Stigmasta-
diene
mg/kg(2)ECN42-
Differenz
zwischen
HPLC-
Meßwert
undtheore-
tischer
BerechnungK232(*) K270(*)K270nach
Behandlung
mitAlumi-
nium(3)Delta-K (*)Sensorische
Prüfung
Fehlerme-
dian
(Md)(*)Sensorische
Prüfung
Fruchtig-
keitsmedian
(Mf)(*)
1.NativesOlivenölextra ≤1,0 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,50 ≤0,20 ≤0,10 ≤0,01 Md=0 Mf>0
2.Natives Olivenöl ≤2,0 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,10 ≤0,01 Md ≤2,5 Mf>0
3. Gewöhnliches natives
Olivenöl≤3,3 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,10 ≤0,01 Md ≤6,0(4)—
4.Lampantöl >3,3 >20 >0,20 ≤300(5)≤1,3 ≤0,50 ≤0,3 ≤3,70 >0,25 ≤0,11 — Md>6 —
5.Raffiniertes Olivenöl ≤0,5 ≤5 ≤0,20 ≤350 ≤1,5 — ≤0,3 ≤3,40 ≤1,20 — ≤0,16 — —
6.Olivenöl ≤1,5 ≤15 ≤0,20 ≤350 ≤1,5 — ≤0,3 ≤3,30 ≤1,00 — ≤0,13 — —
7.RohesOliventresteröl >0,5(**) — — >350(6)≤1,8 — ≤0 , 6 ——————
8.RaffiniertesOliventre-
steröl≤0,5 ≤5 ≤0,20 >350 ≤2,0 — ≤0,5 ≤5,50 ≤2,50 — ≤0,25 — —
9.Oliventresteröl ≤1,5 ≤15 ≤0,20 >350 ≤2,0 — ≤0,5 ≤5,30 ≤2,00 — ≤0,20 — —
(1) Höchstgehalt fürdieSumme allerhalogenierten VerbindungenbeiNachweismittels Elektroneneinfang-Detektor.
Fürjede einzelne VerbindungbeträgtderHöchstgehalt 0,10mg/kg.
(2) Summe dermittelsKapillarsäule (nicht) abtrennbaren Isomere.
(3) ZurBestimmungdesVorhandenseins raffinierter ÖlemussderWert K270sofernerdenGrenzwertfürdie entsprechendeKategorie überschreitet, nachBehandlungmitAluminiumoxid bestimmt werden.
(4) Wenn derFruchtigkeitsmedian gleich 0ist,darfderFehlermedianhöchstens2,5betragen.
(5) Öl mit einem Wachsgehalt zwischen 300 und 350 mg/kg wird als Lampantöl eingestuft, wenn der Gesamtgehalt an aliphatischen Alkoholen höchstens 350 m g/kg oder der Gehalt an Erythrodiol und Uvaol höchstens 3,5 %
beträgt.
(6) ÖlmiteinemWachsgehaltzwischen300und350mg/kgwirdalsrohesOliventresteröleingestuft,wennderGesamtgehaltanaliphatischenAlkoholenüb er350mg/kgundderGehaltanErythrodiolundUvaolüber3,5%beträgt.▼M191991R2568—DE—22.05.2002—019.001—8
KategorieGehalt an
Summe
trans-
Isomere
Ölsäure
(%)Summe
trans-
Isomere
Linol-
undLino-
lensäure
(%)Chole-
sterin
(%)Brassica-
sterin
(%)Campe-
sterin
(%)Stigma-
sterin
(%)Beta-
Sitosterin
(%)(1)Delta-7-
Stigma-
sterin
(%)Sterine
insgesamt
(mg/kg)Erythro-
diolund
Uvaol
(%)(**)Myristin-
säure
(%)Linolen-
säure
(%)Arachin-
säure
(%)Eicosen-
säure
(%)Behensä-
ure
(%)Lignoce-
rinsäure
(%)
1. Natives Olivenöl
extra≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
2.Natives Olivenöl ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
3. Gewöhnliches
nativesOlivenöl≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
4.Lampantöl ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,10≤0,10 ≤0,5≤0,1≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥1000≤4,5(2)
5. Raffiniertes
Olivenöl≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
6.Olivenöl ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1000 ≤4,5
7. Rohes Oliventre-
steröl≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,20≤0,10 ≤0,5≤0,2≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥2500 >4,5(3)
8. Raffiniertes
Oliventresteröl≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1800 >4,5
9.Oliventresteröl ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 <Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1600 >4,5
(1) Summe ausDelta-5,23-Stigmastadienol, Clerosterin, Beta-Sitosterin, Sitostanol,Delta-5-Avenasterin undDelta-5,24-Stigmastadienol.
(2) Öl mit einem Wachsgehalt zwischen 300 und 350 mg/kg wird als Lampantöl eingestuft, wenn der Gesamtgehalt an aliphatischen Alkoholen höchstens 350 m g/kg oder der Gehalt an Erythrodiol und Uvaol höchstens 3,5 %
beträgt.
(3) ÖlmiteinemWachsgehaltzwischen300und350mg/kgwirdalsrohesOliventresteröleingestuft,wennderGesamtgehaltanaliphatischenAlkoholenüb er350mg/kgundderGehaltanErythrodiolundUvaolüber3,5%beträgt.
Anmerkungen:
a) DieAnalyseergebnissemüssenbisaufdiegleicheZahl vonStellen hinterdemKomma angegeben werden wiedie fürjedesMerkmal vorgesehenenWerte.
Beträgt die nächstfolgendeDezimalstelle über4,soistdieangegebeneletzte Stelle hinterdemKomma aufzurunden.
b) Auchwennnureineinziges Merkmal nicht mitdemvorgeschriebenenGrenzwert übereinstimmt,mussdasÖleiner anderen Kategorie zugeordnetoderal snicht seinen Reinheitskriterien entsprechenderklärt werden.
c) DiemitSterchen(*),gekennzeichneten Ölqualitätsmerkmale bedeuten.
— imFalle vonLampantöl, dassdiebetreffenden Grenzwerte (außer K232)nicht alle gleichzeitigerfüllt werden müssen;
— imFalle anderernativer Olivenöle, dassdieNichterfüllung desGrenzwertsauchnureineseinzigen Merkmals eineUmstufunginnerhalb derKategori en dernativenOlivenöle zurFolgehat.
d) Diemitzwei Sternchen (**)gekennzeichneten Merkmalebedeuten imFallderbetreffenden Oliventresteröle, dassdiejeweiligen Grenzwerte nicht allegleichzeitigerfüllt werden müssen.▼M191991R2568—DE—22.05.2002—019.001—9
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ANHANG Ia
Entnahme von Proben bei Partien von Olivenöl oder Oliventresteröl in
unmittelbaren Umschließungen mit einem Inhalt von höchstens 100 l
Diese Methode der Probenahme wird für Partien von Olivenöl oder Oliventre-
steröl von bis zu 125000 l angewendet, das in unmittelbare Umschließungen
mit einem Inhaltvonhöchstens100labgefüllt wurde.
Umfasst die betreffende Partie mehr als 125000 l, so wird sie in annähernd
gleich große Teilpartien von jeweils bis zu 125000 l unterteilt. Die Methode
wirddannaufjede dieserTeilpartien angewendet.
1. InhalteinerEinzelprobe
JedeEinzelprobe besteht:
a) bei unmittelbaren Umschließungen mit einem Inhalt von mindestens 6 l:
aus dem Öl aus einer unmittelbaren Umschließung, das auf mindestens
sechsBehältnisseà1laufgeteilt wird,wobei
— ein Behältnis für die Analysen gemäß den Anhängen II, III, IX und
XIIund
— einweiteresBehältnis fürdieübrigenAnalysenbestimmt istund
— die übrigen Behältnisse für eventuelle Gegenanalysen aufbewahrt
werden;
b) bei unmittelbaren Umschließungen mit einem Inhalt von mindestens 2 l
undweniger als6l: ausdem Ölaus vier unmittelbaren Umschließungen,
wobei
— eine unmittelbare Umschließung für die Analysen gemäß den
AnhängenII,III,IXundXIIund
— einDritteleinerweiterenunmittelbaren Umschließungfürdieübrigen
Analysenbestimmt sindund
— dasrestlicheÖlfüreventuelle Gegenanalysen aufbewahrt wird;
c) beiunmittelbarenUmschließungenmiteinemInhaltvonmindestens0,75l
undwenigerals2l:ausdemÖlaussechsunmittelbarenUmschließungen,
wobei
— eine unmittelbare Umschließung für die Analysen gemäß den
AnhängenII,III,IXundXIIund
— eineweitere fürdieübrigen Analysenbestimmt istund— dasrestlicheÖlfüreventuelle Gegenanalysen aufbewahrt wird;
d) bei unmittelbaren Umschließungen mit einem Inhalt von weniger als
0,75 l: aus dem Öl in der Mindestanzahl von Umschließungen, deren
Gesamtvolumen 4,5lübersteigt; dabeigiltfolgende Aufteilung:
— das Öl in der Mindestanzahl von Umschließungen, deren Gesamtvo-
lumen0,75lübersteigt, istfürdieAnalysengemäß denAnhängenII,
III,IXundXIIbestimmt,
— nocheinmaldiegleicheMengeistfürdieübrigenAnalysenbestimmt
und
— dasrestlicheÖlwirdfüreventuelle Gegenanalysen aufbewahrt.
2. ZahlderEinzelproben
Die Mindestanzahl der Einzelproben ist abhängig von der Größe der Partie
undentsprichtderfolgendenÜbersicht:
GrößederPartie (l)unter MindestanzahlderEinzelproben
7500 2
25000 3
75000 4
125000 5
Die unmittelbaren Umschließungen einer Einzelprobe müssen aus nebenein-
anderliegenden Stellen derPartiestammen.
In Zweifelsfällen erhöht der Mitgliedstaat die Zahl der zu entnehmenden
Einzelproben.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—10
▼M17
3. AnalysenundErgebnisse
Soweit möglich, muss das Öl bis zur Durchführung der Analysen in den
Originalbehältnissen aufbewahrt werden.
a) Jede Einzelprobe wird gemäß Nummer 2.5 der Norm EN ISO 5555 in
Laborprobenunterteilt, diefolgenden Analysenunterzogen werden:
— Bestimmung der freien Fettsäuren gemäß Artikel 2 Absatz 1 erster
Gedankenstrich,
— Bestimmung der Peroxidzahl gemäß Artikel 2 Absatz 1 zweiter
Gedankenstrich,
— spektrophotometrische Analyse gemäß Artikel 2 Absatz 1 achter
Gedankenstrich,
— Fettsäurezusammensetzung gemäß Artikel 2 Absatz 1 neunter Gedan-
kenstrich.
b) Stimmen für mindestens eine Einzelprobe derselben Partie nicht alle
Analyseergebnisse gemäß Buchstabe a)mit denMerkmalen derangemel-
deten Olivenölkategorie überein, so wird die gesamte Partie als nicht
konformeingestuft.
Sind bei jeder der Einzelproben derselben Partie alle Analyseergebnisse
gemäßBuchstabea)unterBerücksichtigungderMerkmalederWiederhol-
barkeit der betreffenden Methoden homogen und stimmen sie mit den
Merkmalen der gemeldeten Olivenölkategorie überein, so wird eine
Einzelprobe dervorgenanntenPartiedenübrigenAnalysenunterzogen.
c) Stimmt eines der Analyseergebnisse gemäß Buchstabe b) Unterabsatz 2
nicht mit den Merkmalen der gemeldeten Olivenölkategorie überein, so
wirddiegesamtePartiealsnichtkonformeingestuft.
Stimmen alle Analyseergebnisse gemäß Buchstabe b) Unterabsatz 2 mit
den Merkmalen der gemeldeten Olivenölkategorie überein, so wird die
gesamtePartie alskonformeingestuft.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—11
▼B
ANHANG II
BESTIMMUNG DER FREIEN FETTSÄUREN
1. ANWENDUNGSBEREICH
Bestimmung der freien Fettsäuren in Olivenölen. Der Gehalt an freien
Fettsäuren wird über den Gehalt an freien Säuren in konventioneller
Weiseberechnet.
1.1.Prinzipder Methode
Die Probe wird in einem geeigneten Lösungsmittelgemisch gelöst. Dann
werdendievorhandenenfreienSäurenmiteinerethanolischenKaliumhy-
droxidlösungtitriert.
1.2.Reagenzien
Alle Reagenzien müssen anerkannte Anaylsenqualität aufweisen; als
Wasser ist destilliertes Wasser oder Wasser gleicher Reinheit zu
verwenden.
1.2.1. Diethylether/Ethanol 95%ig(V/V),Mischung1:1.
Vorsicht:Diethylether ist leicht brennbar und kann explosive Peroxide
bilden. Es muß daher unter besonderen Vorsichtsmaßnahmen
verwendet werden.
Das Diethylether/Ethanol-Gemisch muß unmittelbar vor dem Gebrauch
mit einer Kaliumhydroxidlösung (1.2.2) unter Zusatz von 0,3 ml
Phenolphthaleinlösung(1.2.3)pro100mlLösungsmittelgemisch neutrali-
siertwerden.
Anmerkung: WennDiethylethernichtbenutztwerdenkann,sokannauch
eine Mischung aus Ethanol und Toluol verwandt werden.
Eventuell kann auch Ethanol durch 2-Propanol ersetzt
werden.
1.2.2. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung, 0,1 molar oder, falls erforderlich,
0,5molar.
Die genaue Konzentration der ethanolischen Kaliumhydroxidlösung muß
bekannt seinundunmittelbar vorderVerwendungüberprüftwerden.Die
Lösung sollte mindestens 5 Tage vorher hergestellt und in eine braune
Flasche, die mit einem Gummistopfen verschlossen wird, dekantiert
werden.Siemußfarblosodernurschwachgefärbtsein.
Anmerkung: Eine stabile farblose Kaliumhydroxidlösung kann wie folgt
hergestellt werden: 1000 ml Ethanol mit 8 g Kaliumhy-
droxid und 0,5 g Aluminiumspäne eine Stunde am
Rückflußkühlerkochen.Sofortdestillieren.Dieerforderliche
Menge Kaliumhydroxid in dem destillierten Ethanol lösen
und mehrere Tage stehen lassen. Die klare Lösung von
demausgefallenen Karbonatabdekantieren.
Die Lösung kann auch ohne Destillation wie folgt herge-
stellt werden: 1000ml Ethanol mit 4ml Aluminiumbutylat
mehrere Tage stehen lassen. Die überstehende Flüssigkeit
abdekantieren und die erforderliche Menge Kaliumhydroxid
darinlösen.DieseLösungistgebrauchsfertig.
1.2.3. Phenolphthalein, Lösungvon10 g/lin 95-96%igem Ethanol oderAlkali-
blau (bei sehr stark gefärbten Fetten), Lösungvon 20g/l in 95-96%igem
Ethanol.
1.3.Geräte
ÜblicheLaborgeräte u.a.:
1.3.1. Analysenwaage,1.3.2. 250-ml-Erlenmeyerkolben,
1.3.3. 10-ml-Bürette mit 0,05-ml-Graduierung.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—12
▼B
1.4.Verfahren
1.4.1. Die Bestimmung erfolgt mit der filtrierten Probe. Beträgt der Gesamtge-
halt an Wasser und Verunreinigungen weniger als 1 %, so wird die
Bestimmungmit derunfiltrierten Probedurchgeführt.
1.4.2. Probe
DieGrößederEinwaagerichtetsichnachdemzuerwartendenGehaltan
freienFettsäuren(Angabenindernachstehenden Tabelle).
Erwarteter Gehalt an
freien FettsäurenEinwaage
(ing)Genauigkeitder
Einwaage
(ing)
<1 20 0,05
1—4 10 0,024—15 2,5 0,01
15—75 0,5 0,001
>75 0,1 0,0002
DieProbeindenErlenmeyerkolben (1.3.2)einwiegen.
1.4.3. DurchführungderBestimmung
Die Probe (1.4.2) in 50 bis 150 ml der neutralisierten Diethylether/
Ethanol-Mischung (1.2.1) lösen. Mit der 0,1 molaren Kaliumhydroxidlö-
sung (1.2.2) (Anmerkung 2) unter Schütteln bis zum Umschlag des
Indikators titrieren. (Die Rosafärbung des Phenolphthaleins muß
mindestens10Sekundenanhalten.)
Anmerkungen: 1. Die ethanolische Kaliumhydroxidlösung (1.2.2) kann
durch eine wäßrige Kaliumhydroxid- oder Natriumhydro-
xidlösung ersetzt werden, wenn die zugeführte
WassermengekeinePhasentrennungbewirkt.
2. Werden zur Titration mehr als 10 ml der 0,1 molaren
Kaliumhydroxidlösung benötigt, so ist eine 0,5 molare
Lösungzuverwenden.
3. Wird die Lösung während der Titration trübe, so ist eine
ausreichendeMengeLösungsmittelmischung(1.2.1)zuzu-
fügen,bisdieLösungwieder klarist.
1.5.Berechnung des Gehalts an freien Fettsäuren in % Ölsäure
DerGehaltanfreienFettsäureninGewichtsprozent ist
V/C2c/C2M
1000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
Dabeisind:
V= V erbrauchanKaliumhydroxidlösunginml,
c = genaueKonzentration derKaliumhydroxidlösunginmol/l,
M = Molekulargewicht in g der Säure, die für die Berechnung
zugrundegelegt wird(=282),
m = Probeneinwaage ing.
Als Ergebnis gilt das arithmetische Mittel ►M6zweier
Bestimmungen ◄.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—13
▼C1
▼B
▼B
ANHANG III
BESTIMMUNG DER PEROXIDZAHL
1. ZWECK
Diese Norm beschreibt ein Verfahren für die Bestimmung der Peroxidzahl
vonÖlenundFetten.
2. ANWENDUNGSBEREICH
DieseNormgilt fürtierische undpflanzliche ÖleundFette.
3. DEFINITION
Die Peroxidzahl ist die Gesamtmenge solcher Substanzen in der Probe,
ausgedrückt in Milliäquivalenten aktiven Sauerstoffs pro kg, die unter den
beschriebenen ArbeitsbedingungenKaliumiodid oxidieren.
4. PRINZIP
Behandlung der in Essigsäure und Chloroform gelösten Probe mit einer
Kaliumiodidlösung. Titration des freigesetzten Iods durch eine eingestellte
Natriumthiosulfatlösung.
5. GERÄTE
Die Geräte müssen frei von reduzierenden oder oxidierenden Substanzen
sein.
Anmerkung: Schliffflächen nichteinfetten.
5.1. Mikrobechergläschen, 3ml.5.2. 250-ml-Schliffkolben mit Stopfen, die zuvor getrocknet und mit einem
reinen, trockenen Inertgas (Stickstoff oder vorzugsweise Kohlendioxid)
gefülltwurden.
5.3. 25-oder50-ml-Bürette, mit 0,1-ml-Graduierung.
6. REAGENZIEN
6.1. Chloroform, analytisch rein, durch Einleiten von reinem, trockenem
InertgasvonSauerstoffbefreit.
6.2. Eisessig, analytisch rein, durch Einleiten von reinem, trockenem Inertgas
vonSauerstoffbefreit.
6.3. Kaliumiodid, gesättigte wäßrigeLösung,frischzubereitet, freivonIodund
Iodaten.
6.4. Natriumthiosulfat, genau 0,01 oder 0,002 N wäßrige Lösung, unmittelbar
vorderVerwendungeingestellt.
6.5. Stärkelösung, wäßrige Dispersion, von 10 g/l, aus natürlicher löslicher
Stärkefrischhergestellt.
7. PROBE
DieProbeistunterLichtabschluß zuentnehmen undzulagernundkühlin
vollständig gefüllten Glasgefäßen, die mit Glas- oder Korkstopfen
verschlossensind,aufzubewahren.
8. VERFAHREN
Die Bestimmung soll bei diffusem Tageslicht oder künstlichem Licht
durchgeführt werden. In ein Mikrobechergläschen (5.1) oder aber in einen
Kolben(5.2)dieProbemengeauf0,001ggenaueinwiegen,unterBerücks-
ichtigung dererwarteten Peroxidzahl gemäßnachstehender Tabelle:1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—14
▼B
Erwartete Peroxidzahl
(meqO2/kg)Probemenge
(g)
0bis12 5,0bis2,0
12bis20 2,0bis1,220bis30 1,2bis0,830bis50 0,8bis0,5
50bis90 0,5bis0,3
Den Stopfen von dem Kolben (5.2) abnehmen und den Mikrobecher mit
der Probemenge einführen. 10 ml Chloroform (6.1) hinzufügen. Die Probe
schnell unter Rühren auflösen, 15 ml Essigsäure (6.2), dann 1 ml Kalium-
iodidlösung (6.3) hinzufügen. Den Stopfen rasch einsetzen, eine Minute
schüttelnundgenaufünfMinutenunterLichtabschlußbeieinerTemperatur
von15bis25ºCstehenlassen.
Etwa75mldestilliertesWasserzugeben.DasfreigesetzteIodmitNatrium-
thiosulfatlösung (6.4) unter kräftigem Schütteln titrieren (0,002-N-Lösung
für erwartete Werte unter 12 und 0,01-N-Lösung für erwartete Werte über
12).Stärkelösung(6.5)alsIndikatorverwenden.
ZweiBestimmungen mitderselben Probedurchführen.
Zurgleichen Zeit einenBlindversuchdurchführen.ÜbersteigtdasErgebnis
des Blindversuchs 0,05 ml einer 0,01-N-Natriumthiosulfatlösung (6.4), so
sinddieunreinenReagenzien zuersetzen.
9. ABFASSUNGDERERGEBNISSE
Die Peroxidzahl (P. V.), ausgedrückt in Milliäquivalenten aktiven Sauer-
stoffsprokg,wirdnachfolgender Formelerrechnet:
P:V:¼
V/C2T/C21000
m
Dabeisind:
V= die Anzahl ml der eingestellten Natriumthiosulfatlösung (6.4), die
fürdieBestimmungverbrauchtwerden,korrigiertdurchdenentspre-
chenden WertdesBlindversuchs,
T = diegenaueNormalität derNatriumthiosulfatlösung (6.4),
m = dasGewichtderProbeing.
Als Ergebnis gilt das arithmetische Mittel der beiden so durchgeführten
Bestimmungen.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—15
▼M6
ANHANG IV
KAPILLARGASCHROMATOGRAPHISCHE BESTIMMUNG DES
WACHSGEHALTS
1. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Arbeitsvorschrift beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des
Wachsgehalts verschiedener Fette ►C3undÖle ◄unterVersuchsbe-
dingungen.
Dieses Verfahren kann insbesondere zur Unterscheidung zwischen
abgepreßtem und extrahiertem Olivenöl (Oliventresteröl) verwendet
werden.
2. KURZBESCHREIBUNG
Das Fett wird mit einem geeigneten internen Standard versetzt und
chromatographisch über eine Kieselgelsäule fraktioniert; die unter
Versuchsbedingungen zuerst eluierte Fraktion (schwächerer Polarität
als Triglyceride) wird rückgeführt und sofort kapillargaschromatogra-
phischanalysiert.
3. GERÄTEUNDHILFSMITTEL
3.1. 25-ml-Erlenmeyerkolben,
3.2. Chromatographiesäule aus Glas, Innendurchmesser 15,0 mm, Höhe 30
—40cm,
3.3. Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen,
mit Direkteinspritzung, umfassend:
3.3.1. thermostatregelbaren Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte
Temperatur mit einerGenauigkeit von±1ºC,
3.3.2. Kalteinspritzsystem fürdieDirektbeschickung derSäule,
3.3.3. Flammenionisationsdetektor mitKonversionsverstärker,
3.3.4. Integrator mit Schreiber, mit Konversionsverstärker (3.3.3) zu koppeln,
Ansprechzeitmax.1Sekunde,variabler Papiervorschub,
3.3.5. GlaskapillarsäuleoderFused-silica-Säule, ►C310—15m ◄,Innen-
durchmesser 0,25 — 0,32 mm, Innenwand belegt mit flüssigem SE-52
oder SE-54 oder gleichwertiger Phase; gleichmäßige Schichtdicke 0,10
—0,30 µm,
3.4. 10- µl-Mikroliterspritze mit gehärteter NadelfürDirekteinspritzung.
4. REAGENZIEN
4.1. Kieselgel 70—230mesh,Artikel 7754Merck. DasKieselgel wirdim
Muffelofen vier Stunden bei einer Temperatur von ►C3500oC
getrocknet ◄undnachdemAbkühlenmit2%Wasserversetzt.Durch
gründliches Schütteln homogenisieren. Vor Gebrauch mindestens 12
StundenimDunkelnaufbewahren.
4.2. n-HexanfürdieChromatographie,
4.3. Ethylether fürdieChromatographie,
4.4. n-HeptanfürdieChromatographie,
4.5. Standardlösung aus Laurylarachidat 0,1 % (m/v) in Hexan (interner
Standard),
4.6. Trägergas: Wasserstoff,rein,fürdieGaschromatographie,
4.7. Hilfsgase:
— Wasserstoff,rein,fürdieGaschromatographie;
— Luft, rein,fürdieGaschromatographie.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—16
▼M6
5. VERFAHREN
5.1. TrennenderWachsfraktion
5.1.1. Vorbereiten derChromatographiesäule
15 g Kieselgel werden mit 2 % Wasser versetzt, in wasserfreiem n-
HexansuspendiertundderSäuleaufgegeben.
Nach der Spontansedimentation wird die Phase mit einem Elektrorühr-
werk nachbehandelt, um eine möglichst homogene
Chromatographieschicht zu erzielen, und zur Entfernung etwa enthal-
tenerVerunreinigungen mit 30mln-Hexangespült.
5.1.2. Säulenchromatographische Analyse
►C3Genau 500 mg der Probe ◄werden in den 25-ml-Erlenmeyer-
kolben eingewogen und entsprechend dem vermuteten Wachsgehalt
mit der geeigneten Menge interner Standardlösung versetzt. So werden
bei Olivenöl 0,1 mg Laurylarachidat und bei Oliventresteröl 0,25 bis
0,5mgzugesetzt.
DiederartgewonneneProbewirdunterVerwendungvonjezweiTeilen
2m l►C3n-Hexan ◄in die gemäß 5.1.1 vorbereitete Chromatogra-
phiesäule übergeführt.
Das Lösungsmittel bis zu einem Stand von 1 mm über der oberen
Absorbensgrenzflächeablaufenlassen.AndieserStelleistmitderchro-
matographischen Eluierung zu beginnen: es sind 140 ml n-Hexan/
Ethylether-Gemisch (99:1) bei einem Durchsatz von etwa 15 Tropfen/
10Sekunden(2,1ml/min) aufzufangen.
Die derart gewonnene Fraktion wird im Rotationsverdampfer so lange
getrocknet, bis das Lösungsmittel nahezu restlos verdampft ist, wobei
die letzten 2 bis 3 ml im schwachen Stickstoffstrom ausgetrieben
werden; der Trocknungsrückstand wird ►C3mit 10 ml n-Heptan
versetzt. ◄
5.2. Gaschromatographische Analyse
5.2.1. Vorarbeiten, EinfahrenderSäule
5.2.1.1. Die Säule in den Gaschromatographen einsetzen, wobei ►C3der
Säulenanfang ◄an das On-column-System und ►C3das
Säulenende ◄andenDetektor angeschlossenwird.
Sodann ist der Gaschromatograph auf Dichtigkeit der Gasleitungen,
Betriebsbereitschaft des Detektors und des Schreibers usw. zu über-
prüfen.
5.2.1.2. WirddieSäuleerstmalsverwendet,istesratsam,sieeinzufahren.Einen
schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromatographen
einschalten und allmählich auf eine Temperatur von mindestens 20 ºC
überderArbeitstemperatur (Anmerkung)aufheizen. DieTemperatur ist
mindestens 2 Stunden konstant zu halten; sodann sind die Analysebe-
dingungen einzustellen (Gasstrom, Zünden der Flamme, Anschluß an
den elektronischen Schreiber, Säulenofentemperatur, Detektor usw.).
Anschließend ein Signal mit einer Empfindlichkeit aufzeichnen, die
mindestens doppelt so groß ist wie bei Durchführung der Analyse. Die
Grundliniemußlinear verlaufen, ohnePeaksoderDrifts.
Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluß der
Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule
hin.
Anmerkung: Die Einfahrtemperatur muß in jedem Fall mindestens 20
ºC►C3unter der für die verwendete Phase ◄vorgese-
henenHöchsttemperatur liegen.
5.2.2. WahlderArbeitsbedingungen
5.2.2.1. AnhaltspunktefürdieArbeitsbedingungen:
— Säulentemperatur: anfangs 80 ºC, dann stufenweise um 30 ºC pro
Minute bis auf 120 ºC ansteigend, anschließend programmierter
Temperaturanstieg um5ºCproMinutebisauf340ºC;
— Detektortemperatur: 350ºC,— Strömungsgeschwindigkeit des Trägergases: Wasserstoff 20 — 35
cm/s,
— Geräteempfindlichkeit: 4-bis16-fache derMindestdämpfung,— Detektorempfindlichkeit: 1—2mVf.s.,— Papiervorschub:30cm/Stunde,— Einspritzvolumen: 0,5bis1 µlLösung.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—17
▼M6
DieseBedingungen könnenentsprechend denKenndaten derSäuleund
des Gaschromatographen derart geändert werden, daß die damit aufge-
zeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen erfüllen: die
RetentionszeitdesinternenStandardsC32muß25Minuten±2Minuten
betragen, und ►C3der größte Wachspeak ◄muß 60 bis 100 % des
Vollausschlagserreichen.
5.2.2.2. DieParameterfürdiePeakintegrationsindsozuwählen,daßfürdiein
Betracht kommendenPeakskorrekte Werte erzielt werden.
5.2.3. DurchführungderAnalyse5.2.3.1. Mitder10- µl-Spritze1- µlProbelösungaufziehenunddabeidenKolben
der Spritze so weit einziehen, daß die Nadel leer ist. Die Nadel
►
C3in den Injektor einführen, ◄nach 1 bis 2 Sekunden schnell
einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam heraus-
ziehen.
5.2.3.2. DasChromatogramm aufzeichnen, bisalle vorhandenenWachseeluiert
sind.
Die Grundlinie muß stets den vorgeschriebenen Anforderungen
►C3 ◄(5.2.1.2)genügen.
5.2.4. Identifizierung derPeaks
Die Peakflächen werden anhand der Retentionszeiten durch Vergleich
mit Wachsgemischen identifiziert, deren Retentionszeiten bekannt sind
unddieunterdenselben Bedingungenanalysiert wurden.
Abbildung1zeigteinChromatogrammderWachsfraktioneinesnativen
Olivenöls.
5.2.5. Quantitative Bestimmung
5.2.5.1. Die Peakflächen des internen Standards und der aliphatischen C40- bis
C46-Esterwerdenmit HilfeeinesIntegratorsermittelt.
5.2.5.2. Der Wachsgehalt jedes einzelnen Esters in mg/kg Fett wird nach
folgenderFormel berechnet:
Ester(mg/kg)=Ax·ms·►M91000◄
As·m
Hierinbedeuten:
Ax= jeweilige Ester-Peakfläche,
As= Peakfläche vonLaurylarachidat,
ms= Massedeszugesetzten Laurylarachidats inmg,
m = MassederzurBestimmungentnommenen Probeing.
6. ERGEBNISSE
Die Gehalte an den einzelnen Wachsen sowie ihre Summe werden in
mg/kgFettangegeben.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—18
▼M6
ANLAGE
Bestimmung der Strömungsgeschwindigkeit des Gases
In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatographen werden 1 bis
3µl Methan (oder Propan) eingespritzt und die Säulendurchlaufzeit des Gases
vomZeitpunkt desEinspritzensbiszumPeak-Austritt(tM)gemessen.
Die Gasströmungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tMdefi-
niert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tMdie gemessene Zeit in
Sekunden.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—19
▼M61991R2568—DE—22.05.2002—019.001—20
▼B
ANHANG V
BESTIMMUNG DER ZUSAMMENSETZUNG UND DES GEHALTS AN
STERINEN MIT DER KAPILLAR — GASCHROMATOGRAPHIE
1. UMFANGUNDANWENDUNGSBEREICH
DieseMethodebeschreibt dasVerfahrenzurBestimmungderSterinzu-
sammensetzung unddesSteringehalts vonFetten.
2. KURZBESCHREIBUNG
DasFett wirdmit α-Cholestanol als innerem Standard versetzt und mit
ethanolischer Kaliumhydroxidlösung verseift. Die Sterinfraktion wird
aus dem Unverseifbaren dünnschicht-chromatographisch über basische
Kieselgelplatten abgetrennt.
Die aus dem Kieselgel isolierten Sterine werden in Trimethylsilylether
überführtundmit HilfederKapillar-Gaschromatographie untersucht.
3. GERÄTEUNDHILFSMITTEL
3.1. Kolben,250ml,mitRückflußkühler undSchliffstopfen,
3.2. Scheidetrichter, 500ml,
3.3. Kolben,250ml,3.4. komplette Apparatur für die Dünnschichtchromatographie mit Glas-
platten 20×20cm,
3.5. UV-Lampe,Wellenlänge 366oder254nm,
3.6. Mikroliterspritzen, 100und500µl,3.7. Glasfiltertiegel mit Porenfilter G 3 (Porosität 15—40 µm), etwa 2 cm
Durchmesser, 5 cm Höhe, mit geeignetem Anschlußstück für die
Vakuumfiltration undSchliffmuffe12/21,
3.8. Vakuumflasche, 50 ml, mit Schliffmuffe 12/21, für Glasfiltertiegel
(3.7),
3.9. 10-ml-RöhrchenmitkonischemBodenunddichtschließendemStopfen,3.10. Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen,
mit Splitsystem,bestehend aus:
3.10.1. einem thermostatisierbaren Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte
Temperatur mit einerGenauigkeit von±1ºC,
3.10.2. einer temperaturregelbaren Verdampfereinrichtung mit Verdampfer aus
persilanisiertem Glas,
3.10.3. einem Flammenionisations-Detektor mit Verstärker,
3.10.4. einem Integrator mit Schreiber,mit Verstärkerzukoppeln,
3.11. einer Kapillarsäule aus Glas oder fused silica, 20—30 m Länge,
0,25—0,32 mm Innendurchmesser, Innenwand belegt mit SE-52 oder
SE-54 oder einer gleichwertigen stationären Phase, Schichtdicke
0,10—0,30µm,
3.12. Mikroliterspritze für die Gaschromatographie, 10 µl, mit gehärteter
Nadel.
4. REAGENZIEN
4.1. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 2 N: 130 g Kaliumhydroxid
(Titer mindestens 85 %) in 200 ml destilliertem Wasser unter Kühlen
lösen und mit Ethanol auf 1 Liter auffüllen. Die Lösung ist in gut
verschlossenenBraunglasflaschen haltbar (Ethanol95%V/V),
4.2. Ethylether, analysenrein,
4.3. wasserfreiesNatriumsulfat, analysenrein,
4.4. kieselgelbeschichtete Glasplatten ohne Fluoreszenzindikator, Schicht-
dicke0,25mm(gebrauchsfertig imHandelerhältlich),
4.5. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 0,2 N: 13 g Kaliumhydroxid
werdenin20mldestilliertemWassergelöstundmitEthanolauf1Liter
aufgefüllt,1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—21
▼B
4.6. BenzolfürdieChromatographie (siehe5.2.2),
4.7. AcetonfürdieChromatographie (siehe5.2.2),
4.8. HexanfürdieChromatographie (siehe5.2.2),4.9. Ethylether fürdieChromatographie (siehe5.2.2),4.10. Chloroform,analysenrein,4.11. Referenzlösung für die Dünnschichtchromatographie: Cholesterin oder
Phytosterole, ►
M62%ige ◄LösunginChloroform,
4.12. 2 ′,7′-Dichlorfluorescein, 0,2%ige ethanolische Lösung, leicht alkalisch
durch Zusatz einiger Tropfen alkoholischer 2-N-Kaliumhydroxid-
Lösung,
4.13. wasserfreiesPyridinfürdieChromatographie,4.14. Hexamethyldisilazan,4.15. Trimethylchlorsilan,
4.16. Standardlösung von Sterin-Trimethylsilylethern unmittelbar vor
Gebrauch ansetzen mit reinen Sterinen oder Sterinmischungen aus
Ölen,indenensieenthalten sind,
4.17. α-Cholestanol, 0,2%ige Lösung (m/V) in Chloroform (interner
Standard),
4.18. Trägergas: WasserstoffoderHelium,rein,fürdieGaschromatographie,
4.19. Hilfsgase:WasserstoffundLuft,rein, fürdieGaschromatographie.
5. VERFAHREN5.1.Herstellung des Unverseifbaren
5.1.1. Mit einer 500-µl-Mikroliterspritze so viel der 0,2%igen α-Cholesta-
nollösunginChloroform (4.17)ineinen250-ml-Kolben geben,daßdie
Menge an Cholestanol etwa 10 % des Steringehalts des zur Analyse
verwandten aliquoten Teils der Probe entspricht. So werden z. B. für
5 g Olivenöl 500 µl der 0,2%igen α-Cholestanollösung benötigt,
1500 µl für ►
M6 ◄Oliventresteröl. Im Stickstoff-
strombiszurTrocknungabdampfen.IndengleichenKolbengenau5g
dertrockenen undfiltrierten Probeeinwiegen.
Bei►M6Ölen◄,diegrößereMengenanCholesterinenthalten,kann
ein Peak mit der gleichen Retentionszeit wie Cholestanol auftreten. In
diesem Fall ist die Sterinfraktion einmal mit und einmal ohne internen
Standard zu analysieren. ►M6Anstelle von Cholestanol kann auch
Betulinverwendet werden. ◄
5.1.2. Die Probe bei aufgesetztem Rückflußkühler mit 50 ml 2-N-ethanoli-
scher Kaliumhydroxidlösung versetzen, auf dem Wasserbad erhitzen
und unter kräftigem Schütteln und schwachem Sieden verseifen (wobei
sichdieLösungklärt).DieProbeweitere20MinutenamSiedenhalten
und dann durch den Rückflußkühler mit 50 ml destilliertem Wasser
versetzen, den Rückflußkühler entfernen und den Kolben auf etwa
30ºCabkühlen.
5.1.3. Den Kolbeninhalt quantitativ in einen 500-ml-Scheidetrichter über-
führen, wobei mehrfach mit insgesamt 50 ml destilliertem Wasser
nachgespült wird. Die Probe mit etwa 80 ml Ethylether versetzen, 30
Sekundenkräftigschütteln undabsetzen lassen(vgl.Hinweis1).
Die wäßrige Phase in einen anderen Scheidetrichter ablassen und dann
noch zweimal nach dem gleichen Verfahren mit 60—70 ml Ethylether
extrahieren.
Hinweis 1:Etwaige Emulsionen können mit Hilfe einer Waschflasche
durch Zusatz kleiner Mengen Ethyl- oder Methylalkohol
zerstörtwerden.
5.1.4. Die Etherauszüge in einem Scheidetrichter vereinigen und mehrmals
mit jeweils 50 ml destilliertem Wasser waschen, bis das Waschwasser
neutralreagiert.
Das Waschwasser ablassen, die Etherphase mit wasserfreiem Natrium-
sulfat trocknen, über wasserfreiem Natriumsulfat in einen zuvor
gewogenen 250-ml-Kolben filtrieren. Scheidetrichter und Filter mit
kleinenMengenEthylether nachspülen.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—22
▼B
5.1.5. Den Ether bis auf wenige ml abdestillieren, den Rückstand unter
leichtemVakuumoderimStickstoffstromtrocknen,¼StundeimTrok-
kenschrank bei 100 ºC nachtrocknen, im Exsikkator abkühlen lassen
undwiegen.
5.2.Trennung der Sterinfraktion
5.2.1. HerstellungderbasischenPlatten
DieKieselgelplatten(4.4)vollständigca.10Sekundenlangineine0,2-
N-ethanolische Alkalihydroxidlösung (4.5) eintauchen, dann unter
einem Abzug 2 Stunden trocknen lassen, anschließend noch 1 Stunde
bei100ºCimTrockenschrank.
Die Platten aus dem Trockenschrank nehmen und in einem Exsikkator
über Calciumchlorid bis zum Gebrauch aufbewahren. (Derart behan-
delte Plattenmüsseninnerhalb von15Tagengebraucht werden.)
Hinweis 2:BeiVerwendungvonalkalischenKieselgelplattenzurTren-
nung der Sterinfraktion erübrigt sich die Behandlung des
Unverseifbaren mit Aluminiumoxid. Auf diese Weise
bleiben sämtliche sauren Verbindungen (Fettsäuren und
andere) an der Startlinie. So erhält man eine saubere Tren-
nung der Sterinzone von denen der aliphatischen Alkohole
undTerpenalkohole.
5.2.2. Die Entwicklerkammer bis zu einer Höhe von etwa 1 cm mit einem
Benzol/Aceton-Gemisch 95:5 (V/V) beschicken. Statt dessen kann
auch ein Hexan/Ethylether-Gemisch 65:35 (V/V) verwandt werden.
DieKammermiteinemgeeignetenDeckelverschließenundmindestens
einehalbeStundestehenlassen,damitsicheinGleichgewichtzwischen
Flüssigkeit und Dampfphase einstellt. An der Innenwand der Kammer
können Filterpapierstreifen befestigt werden, die in das Fließmittel
eintauchen. Dadurch kann die Laufzeit um ein Drittel verkürzt und
eine gleichmäßige ElutionderKomponentenerzielt werden.
Hinweis 3:Das Gemisch ist jedesmal frisch anzusetzen, damit die
Wiederholbarkeit gewährleistet ist.
5.2.3. Von einer 5%igen Lösung des Unverseifbaren (5.1.5) in Chloroform
mit einer 100-µl-Spritze 0,3 ml als durchgehenden, gleichmäßigen
Strich2cmvomunterenPlattenrandentferntaufdieDünnschichtplatte
(5.2.1) auftragen. In der Verlängerung der Startlinie werden am Rande
2—3 µl der Sterin-Standardlösung (4.11) aufgetragen, um die Sterin-
zonenachderEntwicklungzuidentifizieren.
5.2.4. DiePlatteindienach5.2.2vorbereitete Entwicklerkammer stellen.Die
TemperaturderUmgebungsollte15—20ºCbetragen.DieKammermit
dem Deckel verschließen und die Platte so lange entwickeln, bis die
Fließmittelfront bis 1 cm unter den oberen Plattenrand gestiegen ist.
Dann die Platte aus der Entwicklerkammer nehmen und das Lösungs-
mittel in einem warmen Luftstrom abdampfen oder die Platte eine
geraumeZeit unterdemAbzugliegen lassen.
5.2.5. Die Platte vorsichtig und gleichmäßig mit 2 ′,7′-Dichlorfluoresceinlö-
sung besprühen. Die Lage der Sterinzone mit Hilfe des Flecks der
Standardlösung bestimmen und mit einem schwarzen Stift den fluores-
zierenden Bereichmarkieren.
5.2.6. Das in der markierten Zone liegende Kieselgel mit einem Metallspatel
abkratzen, fein mahlen und in einen Glasfiltertiegel (3.7) überführen.
Mit 10 ml warmem Chloroform versetzen, mit Hilfe des Metallspatels
gründlich vermischen und unter Vakuum filtrieren. Das Filtrat in der
an dem Glasfiltertiegel angeschlossenen Vakuumflasche (3.8)
auffangen.
Den Rückstand im Glasfiltertiegel dreimal mit je 10 ml Ethylether
waschen und das Filtrat wiederum in der Vakuumflasche auffangen.
Das Filtrat bis auf ein Volumen von etwa 4—5 ml eindampfen und
den Rest der Lösung in das zuvor gewogene 10-ml-Probenglas (3.9)
überführen. Durch vorsichtiges Erhitzen unter einem schwachen Stick-
stoffstrom bis zur Trocknung eindampfen. Mit einigen Tropfen Aceton
versetzen, wieder bis zur Trocknung eindampfen, etwa 10 Minuten im
Trockenschrank auf 105 ºC erhitzen, anschließend im Exsikkator
abkühlenlassenundwiegen.
DerRückstandindemProbengläschen bestehtausderSterinfraktion.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—23
▼B
5.3.Herstellung der Trimethylsilylether (TMSE)
5.3.1. Dem Probengläschen mit der Sterinfraktion werden je Milligramm
Sterin 50 µl Silanisierungsreagenz, bestehend aus einem Gemisch aus
Pyridin, Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan im Verhältnis
9:3:1(V/V/V),zugesetzt(Hinweis4)unterAusschlußvonFeuchtigkeit
(Hinweis5).
Hinweis 4:Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich;
daneben gibt es auch andere Silanisierungsreagenzien, z.
B. N,O-bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % Trime-
thylchlorsilan, das mit gleichen Teilen wasserfreiem
Pyridingemischt werdenmuß.
5.3.2. Das Probengläschen verschließen und gründlich (nicht zu stark) schüt-
teln, bis sich die Sterine gelöst haben. Die Probe mindestens 15
Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und dann einige Minuten
zentrifugieren. DieklareLösungkanngaschromatographischuntersucht
werden.
Hinweis 5:Die Beobachtung einer leichten Opaleszenz ist normal und
bedeutet keine Störung. Die Bildung eines weißen Nieder-
schlags oder der Eindruck einer Rosafärbung sind
Anzeichen der Anwesenheit von Feuchtigkeit oder der
Zersetzung des Reagens. In diesem Fall soll der Test
wiederholt werden.
5.4.Gaschromatographische Analyse
5.4.1. Vorbereiten, EinfahrenderSäule5.4.1.1. Die Säule in den Gaschromatographen einsetzen, wobei das Einlaßteil
andenmitdemTrennsystemverbundenenVerdampferunddasAuslaß-
teil andenDetektor angeschlossenwird.
Überprüfung des Gaschromatographen (Dichtigkeit der Gasleitungen,
Betriebsbereitschaft des Detektors, des Trennsystems, des Schreibers
usw.).
5.4.1.2. WirddieSäulezumerstenmalverwendet,istesratsam,sieeinzufahren.
Einen schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromato-
graphen einschalten und allmählich auf eine Temperatur von
mindestens 20 ºC über der Arbeitstemperatur (Hinweis 6) aufheizen.
Diese Temperatur ist mindestens 2 Stunden konstant zu halten, und
dann sind die Analysenbedingungen einzustellen (Gasstrom, Split,
ZündenderFlamme,Schreiberanschluß,Einstellen derOfentemperatur,
Injektor, Detektor). Dann eine Empfindlichkeit wählen, die mindestens
doppelt so groß ist wie bei der Durchführung der Analyse. Die Grund-
linie mußlinear verlaufen, ohnePeaksoderDrift.
Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluß der
Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule
hin.
Hinweis 6:Die Einfahrtemperatur muß in jedem Fall 20 ºC unter der
für die stationäre Phase angegebenen Maximaltemperatur
liegen.
5.4.2. WahlderArbeitsbedingungen5.4.2.1. AnhaltspunktefürdieArbeitsbedingungen:
Säulentemperatur: 260ºC±5ºC,
Verdampfertemperatur: 280ºC,Detektortemperatur: 290ºC,Strömungsgeschwindigkeit: Helium 20—35 cm/s; Wasserstoff
30—50cm/s,
Splitverhältnis: 1:50—1:100,
Geräteempfindlichkeit: das4-bis16fache derMindestdämpfung,
Detektorempfindlichkeit: 1—2mVf.s.,Papiervorschub:30—60cm/Std.,Einspritzvolumen: 0,5—1µlTMSE-Lösung.Diese Bedingungen können entsprechend den Charakteristiken der
Säule und des Gaschromatographen derart geändert werden, daß die1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—24
▼B
damit aufgezeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen
erfüllen:
— dieRetentionszeit von β-Sitosterinmuß20±5Minutenbetragen;
— der Campesterin-Peak muß bei Olivenöl (Durchschnittsgehalt 3 %)
15 ± 5 % des Skalenbereichs und bei Sojaöl (Durchschnittsgehalt
20%)80±10%desSkalenbereichs betragen;
— alle enthaltenen Sterinemüssengetrennt werden; dieanderen Peaks
müssen ebenfalls völlig aufgelöst sein, d. h. der Peakverlauf muß
auf die Grundlinie zurückführen, bevor der nächste Peak beginnt;
eine unvollständige Auflösung ist nur unter der Bedingung akzep-
tabel, daßderRRT-1,02-Peakmit HilfederSenkrechten quantitativ
zubestimmen ist.
5.4.3. DurchführungderAnalyse
5.4.3.1. Mit der 10-µl-Mikroliterspritze 1 µl Hexan entnehmen, 0,5 µl Luft und
anschließend 0,5—1 µl Probenlösung aufziehen; dabei den Kolben der
Spritze so weit einziehen, daß die Nadel leer ist. Die Nadel in die
Membran des Injektors einführen, nach 1—2 Sekunden schnell
einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam heraus-
ziehen.
5.4.3.2. Das Chromatogramm aufzeichnen, bis alle Sterin-TMS-Ether eluiert
sind.
DieGrundliniemußstetsdenvorgeschriebenenAnforderungen(5.4.1.2)
genügen.
5.4.4. Identifizierung derPeaks
Die einzelnen Peaks werden anhand der Retentionszeiten und durch
Vergleich mit dem unter denselben Bedingungen analysierten TSME-
GemischderSterine bestimmt.
DieSterine werdeninfolgender Reihenfolge eluiert: Cholesterin, Bras-
sicasterin, 24-Methylen-Cholesterin, Campesterin, Campestanol,
Stigmasterin, ∆7-Campesterin, ∆5, 23-Stigmastadienol, Chlerosterin, β-
Sitosterin,Sitostanol, ∆5-Avenasterin, ∆5, 24-Stigmastadienol, ∆7-Stig-
mastenol, ∆7-Avenasterin.
In Tabelle I sind die Retentionszeiten relativ zu β-Sitosterin für eine
SE-52-undSE-54-Säuleaufgeführt.
Die Abbildungen 1 und 2 zeigen die typischen Chromatogramme
einigerÖle.
5.4.5. Quantitative Bestimmung
5.4.5.1. Mit Hilfe des Integrators werden die Peak-Flächen von α-Cholestanol
und der Sterine berechnet. Dabei sind etwa auftretende Peaks von
Substanzen, die inTabelle I nicht aufgeführt sind, nicht zu berücksich-
tigen. DerResponsefaktorvon ►C1α-Cholestanol ◄sollgleich 1,00
gesetztwerden.
5.4.5.2. Der Gehalt an den einzelnen Sterinen in mg/100 g Fett wird nach
folgenderFormel berechnet:
Sterinx=Ax·ms·100
As·m
Darinbedeuten:
Ax= Peakfläche desSterinsx ►M6 ◄,
As= Peakfläche von α-Cholestanol ►M6 ◄,
ms= zugesetzte Mengean α-Cholestanol inmg,
m = MengederfürdieBestimmungentnommenen Probeing.
6. ERGEBNISSE
6.1. Der Gehalt an den einzelnen Sterinen wirdin mg/100 g Öl angegeben,
ihreSummeals„Gesamtsterine“.
6.2. Der prozentuale Anteil jedes einzelnen Sterins errechnet sich aus dem
Quotienten der Peakfläche des entsprechenden Peaks und der Summe
derPeakflächen aller SterinenachderFormel
►C1%Sterinx= ◄Ax
ΣA.1001991R2568—DE—22.05.2002—019.001—25
▼B
Darinbedeuten:
Ax= Peakfläche desSterinsx,
ΣA = SummederPeakfläche aller Sterine.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—26
▼B
ANLAGE
Bestimmung der linearen Strömungsgeschwindigkeit
In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatographen werden 1 bis
3µlMethan(oderPropan)eingespritztundbiszumPeak-Austritt(tM)gemessen.
Die lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tMdefiniert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tMdie gemessene Zeit in
Sekunden.
Tabelle I
Relative Retentionszeit derSterine
Pe-
akIdentifizierungRelative Retentions-
zeit
SE54 SE52
1 Cholesterin ∆-5-Cholesten-3 β-ol 0,67 0,63
2 Cholestanol 5 α-Cholestan-3 β-ol 0,68 0,64
3 Brassicasterin [24S]-24-Methyl- ∆-5,22-cholestadien-3 β-ol 0,73 0,71
4 24-Methylen-Cholesterin 24-Methylen- ∆-5,24-cholestadien-3 β-ol 0,82 0,80
5 Campesterin [24R]-24-Methyl- ∆-5-cholesten-3 β-ol 0,83 0,81
6 Campestanol [24R]-24-Methyl-cholestan-3 β-ol 0,85 0,82
7 Stigmasterin [24R]-24-Ethyl- ∆-5,22-cholestadien-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆-7-Campesterol [24R]-24-Methyl- ∆-7-cholesten-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆-5,23-Stigmastadienol [24R,S]-24-Ethyl- ∆-5,23-cholestadien-3 β-ol 0,95 0,95
10 Chlerosterin [24S]-24-Ethyl- ∆-5,25-cholestadien-3 β-ol 0,96 0,96
11►C1B-Sitosterin ◄► C1[24R]-24-Ethyl- ∆-5-cholestan-3B-
ol◄1,00 1,00
12►C1Sitostanol ◄► C124-Ethyl-cholestan-3B-ol ◄ 1,02 1,02
13 ∆-5-Avenasterin [24Z]-24-Ethyliden- ∆-5-cholesten-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆-5,24-Stigmastadienol [24S,R]-24-Ethyl- ∆-5,24-cholestadien-3 β-ol 1,08 1,08
15 ∆-7-Stigmastenol [24S,R]-24-Ethyl- ∆-7,24-cholestadien-3 β-ol 1,12 1,12
16 ∆-7-Avenasterin [24Z]-24-Ethyliden- ∆-7-cholesten-3 β-ol 1,16 1,161991R2568—DE—22.05.2002—019.001—27
▼B
Abbildung 1
Gaschromatogramm der Sterinfraktion von rohem Oivenöl
1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—28
▼B
Abbildung 2
Gaschromatogramm der Sterinfraktion von raffiniertem Olivenöl
1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—29
▼B
ANHANG VI
BESTIMMUNG DES ERYTHRODIOLS UND DES UVAOLS
EINLEITUNG
Das (üblicherweise als Summe von Erythrodiol und Uvaol angegebene)
Erythrodiol ist ein Bestandteil des Unverseifbaren, das für verschiedene
Fette charakteristisch ist. Seine Konzentration ist in extrahierten
Olivenölen erheblich höher als in anderen Ölen (Olivenöl aus Pressung,
Traubenkernöl),indenenesauchvorkommt.DeshalbkanneszumNach-
weisfürdasVorhandenseinvonextrahiertem Olivenöldienen.
1. ZWECKUNDANWENDUNGSBEREICH
Die Methode beschreibt ein Verfahren für die Bestimmung des Erythro-
diolgehalts inFetten.
2. PRINZIPDERMETHODE
Das Fett wird mit einer ethanolischen Kaliumhydroxidlösung verseift,
danndasUnverseifbaremitEthyletherextrahiertundübereineAluminiu-
moxidsäulegereinigt.
DieFraktionierungdesUnverseifbarenwirddurchDünnschichtchromato-
graphie auf Kieselgelplatten durchgeführt, anschließend werden die
Zonen der Sterinfraktion und der Erythrodiolfraktion isoliert. Die von
derPlatteisolierten SterineunddasErythrodiol werdeninTrimethylsily-
lether überführt, dann wird die Mischung gaschromatographisch
untersucht. Das Ergebnis wird angegeben als Prozent Erythrodiol der
Gesamtmenge vonErythrodiol plusSterine.
3. GERÄTE
3.1. DieimAnhangV(Bestimmung desSteringehalts)beschriebenen Geräte.
4. REAGENZIEN
4.1. Die im Anhang V(Bestimmung des Steringehalts) vorgeschriebenen
Reagenzien.
4.2. Referenzlösung von0,5%Erythrodiol inChloroform.
5. VERFAHREN
5.1.Herstellung des Unverseifbaren
Es wird gemäß 5.1.2 des in Anhang Vbeschriebenen V erfahrens vorge-
gangen.
5.2.Abtrennung des Erythrodiols und der Sterine
5.2.1. Vergleiche 5.2.1inAnhangV.
5.2.2. Vergleiche 5.2.2inAnhangV.5.2.3. Eine 5%ige Lösung des Unverseifbaren in Chloroform herstellen. Mit
einer0,1-ml-Mikroliterspritze0,3mldieserLösungaufeineDünnschicht-
platte 1,5 cm vom unteren Plattenrand entfernt in einem möglichst
dünnen und gleichmäßigen Strich auftragen. An einem Ende der Platte
werden als Referenzsubstanzen einige Mikroliter der Lösungen von
CholesterinundErythrodiol aufgetragen.
5.2.4. Die Platte in die nach 5.2.2 vorbereitete Entwicklerkammer geben. Die
Raumtemperatur soll etwa 20 ºC betragen. Die Kammer sofort mit dem
Deckel verschließen und so lange entwickeln, bis die Lösungsmittelfront
1 cm unter dem oberen Plattenrand angekommen ist. Die Platte aus der
Entwicklerkammer nehmen und das Lösungsmittel in einem warmen
Luftstromabdampfen.
5.2.5. DiePlattegleichmäßigmitderalkoholischen2 ′,7′-Dichlorfluoresceinlö-
sung besprühen. Unter UV-Licht den Verlauf der Sterin- und
ErythrodiolzoneanHandderReferenzsubstanzenidentifizierenundetwas
außerhalb derfluoreszierenden Zonenmarkieren.
5.2.6. Die markierten Kieselgelzonen mit einem Metallspatel abkratzen. Das
von der Platte isolierte Material in ein 50-ml-Becherglas geben, 15 ml1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—30
▼B
warmes Chloroform zugeben, gut schütteln und in einen Glasfiltertiegel
füllen. Dreimal mit je 10 ml warmem Chloroform auswaschen und die
Filtrate in einem 100-ml-Rundkolben sammeln. Bis auf ein Volumen
von 4—5 ml eindampfen, in ein vorher gewogenes, konisches 10-ml-
Zentrifugenröhrchen geben, im warmen Stickstoffstrom trocknen und
anschließend wiegen.
5.3. HerstellungderTrimethylsilylether
NachdeminAnhangVunter5.3beschriebenen Verfahrenvorgehen.
5.4. Gaschromatographische Analyse
NachderBeschreibungunter5.4desvorgenanntenVerfahrensvorgehen.Die Bedingungen der gaschromatographischen Analyse müssen so
gewählt werden, daß nicht nur die TMS-Ether der Sterine, sondern auch
dieTMS-EthervonErythrodiol undUvaolgetrennt werden.
Nach dem Einspritzen das Schreiberpapier ablaufen lassen, bis alle
Sterine, Erythrodiol und Uvaol eluiert sind. Identifizieren der Peaks
(Erythrodiol und Uvaol haben im Vergleich zu β-Sitosterin relative
Retentionszeiten von etwa 1,45 und 1,55) und Berechnung der Flächen-
prozente, wiefürSterinebeschrieben.
6. ABFASSUNGDERERGEBNISSE
%Erythrodiol =A
1+A2
A1+A2+ΣASterine×100
Hierinbedeuten:
A1= FlächedesErythrodiolpeaks ►M6 ◄,
A2= FlächedesUvaolpeaks ►M6 ◄,
ΣASterine= Summe der vorhandenen Sterinpeaks
►M6 ◄.
DasErgebniswirdmiteinerDezimale nachdemKommaangegeben.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—31
▼B
ANHANG VII
BESTIMMUNG VON FETTSÄUREN IN 2-STELLUNG DER TRIGLYCE-
RIDE
1. ZWECK
DieseMethodebeschreibt einVerfahrenzurBestimmungderZusammen-
setzung des Teils der Fettsäuren eines Öles oder Fettes, die in 2-Stellung
(βoderinnereStellung)desGlycerinsverestert sind.
2. ANWENDUNGSBEREICH
DieseMethodegiltfürÖleundFettemiteinemSchmelzpunktunter45ºC,
bedingt durchdieBesonderheiten derWirkungsweisederPankreaslipase.
Sie ist nicht uneingeschränkt anwendbar auf Öle und Fette mit höheren
Anteilen an Fettsäuren mit zwölf oder weniger Kohlenstoffatomen
(Kokos- und Palmkernöl, Butterfett), hoch ungesättigten Fettsäuren (mit
mehr als vier Doppelbindungen), die zwanzig oder mehr Kohlenstoff-
atome enthalten (Fisch- und Seetieröle), oder Fettsäuren mit
sauerstoffhaltigen GruppenaußerderSäuregruppe.
3. PRINZIP
Wenn nötig, Neutralisierung von sauren Ölen und Fetten in einem
Lösungsmittel. Reinigung über eine Aluminiumoxidsäule. Teilhydrolyse
derTriglyceridedurchPankreaslipaseineinervorgegebenenZeit.Abtren-
nung der gebildeten Monoglyceride durch Dünnschichtchromatographie
und Umesterung dieser Monoglyceride mit Methanol. Die gewonnenen
Methylester werdengaschromatographisch analysiert.
4. GERÄTE
4.1. 100-ml-Rundkolben.4.2. 25-ml-Rundkolben mitSchliff.4.3. 1mlangesSteigrohrmitSchliffansatz fürdenKolben4.2.4.4. 250-ml-Kolben.4.5. 50-ml-Becherglas.4.6. 500-ml-Scheidetrichter.4.7. Glassäule für die Säulenchromatographie, 13 mm Innendurchmesser,
400mmLänge, mit Hahnundgläsernem Frittenboden.
4.8. 10-ml-Zentrifugenglas, mit Schliffstopfen.
4.9. 5-ml-Bürette, Graduierung0,05ml.4.10. 1-ml-Injektionsspritze, mit dünnerKanüle.4.11. Mikroliterspritze, zurAbgabevonTropfenvonjeweils 3—4µl.4.12. Beschichtungsgerät fürDünnschichtplatten.4.13. Glasplatten fürDünnschichtchromatographie, 20×20cm.4.14. Entwicklerkammer für die Dünnschichtchromatographie, mit Schliffrand,
für20×20cmPlatten.
4.15. SprüherfürdieDünnschichtchromatographie.4.16. Trockenschrank, einstellbar auf103±2ºC.
4.17. Thermostat, regulierbar zwischen30und45ºC±0,5ºC.
4.18. Rotationsverdampfer.4.19. Elektrisches Schüttel- und Vibriergerät zum kräftigen Schütteln des
Zentrifugenglases.
4.20. Ultraviolettlampe zurBetrachtung derDünnschichtplatten.
Und für die Kontrolle der Lipasetätigkeit:
4.21. EinpH-Meßgerät.
4.22. Propellerrührer.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—32
▼B
4.23. 5-ml-Bürette.
4.24. Stoppuhr.
Und für die eventuelle Zubereitung der Lipase:
4.25. Laborrührgerät zumZerkleinern undMischenheterogener Materialien.
5. REAGENZIEN
5.1. n-Hexan oder, falls nicht verfügbar, Petrolether (Kp. 30—50 ºC), für die
Chromatographie.
5.2. 2-PropanoloderEthanol 95%ig(V/V),analytisch rein.
5.3. 2-PropanoloderEthanol, 1:1wäßrigeLösung.5.4. Diethylether, peroxidfrei.
5.5. Aceton.
5.6. Ameisensäure,mindestens98%ig(m/m).5.7. Fließmittel:Mischungausn-Hexan(5.1),Diethylether(5.4)undAmeisen-
säure(5.6)imVerhältnisvon70:30:1(V/V/V).
5.8. Aktiviertes Aluminiumoxid für die Chromatographie, neutral, Aktivi-
tätsstufe Brockmann1.
5.9. Kieselgel, mitBindemittel fürdieDünnschichtchromatographie.5.10. Pancreaslipase mit ausreichender Aktivität (Anmerkungen1und2).
5.11. Natriumhydroxid, 120g/lwäßrigeLösung.
5.12. Salzsäure, 6N.5.13. Kalziumchlorid (CaCl
2),220g/lwäßrigeLösung.
5.14. Natriumcholat (Enzymqualität), 1g/lwäßrigeLösung.
5.15. Pufferlösung: 1 M wäßrige Lösung von tris-Hydroxymethylaminomethan
durchZusatzvonSalzsäure(5.12)aufpH8gebracht(durchPotentiometer
überprüfen).
5.16. Phenolphthalein, Lösungvon10g/lin95%igem(V/V)Ethanol.
5.17. 2′,7′-Dichlorfluorescein, Lösung von 2 g/l in 95 %igem (V/V) Ethanol,
schwach alkalisch durch Zusatz eines Tropfens 1-N-Natriumhydroxidlö-
sungpro100ml.
Und für die Kontrolle der Lipasetätigkeit:
5.18. Neutralisiertes Öl.5.19. Natriumhydroxid, 0,1Nwäßrigre Lösung.
5.20. Natriumcholat (Enzymqualität), wäßrigeLösungvon200g/l.
5.21. Gummiarabikum, wäßrigeLösungvon100g/l.
6. VORBEREITUNGDERPROBE
Liegt der Gehalt an freien Fettsäuren nach einer Bestimmung gemäß
Anhang II unter 3 %, so ist direkt über Aluminiumoxid, wie unter 6.2
beschrieben, zu reinigen. Weist die Probe einen Gehalt an freien Fett-
säuren von über 3% gemäß AnhangII auf, soist sie in Gegenwart eines
Lösungsmittels gemäß 6.1 mit Alkali zu neutralisieren und dann über
Aluminiumoxid gemäß 6.2zugeben.
6.1.Neutralisierung durch Alkali in Gegenwart eines Lösungsmittels
Etwa 10 g rohes Öl in einen Scheidetrichter (4.6) geben und 100 ml
Hexan (5.1), 50 ml 2-Propanol (5.2), einige Tropfen Phenolphthaleinlö-
sung (5.16) und so viel Natriumhydroxidlösung (5.11) hinzufügen, wie
dem Gehalt des Öls an freien Fettsäuren zuzüglich 0,3 % Überschuß
entspricht. Eine Minute lang kräftig schütteln, 50 ml destilliertes Wasser
zugeben,erneut schüttelnundabsetzen lassen.
Nach dem Absetzen die untere, die Seifen enthaltende Schicht sowie
etwaige Zwischenschichten (Schleim, unlösliche Stoffe) entfernen. Die
HexanlösungdesneutralisiertenÖlsmehrmalsmit25—30mlder2-Propa-
nollösung (5.3) waschen, bis die Rosafärbung des Phenolphthaleins
verschwindet.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—33
▼B
Den größten Teil des Hexans unter Vakuum im Rotationsverdampfer
(4.18)abdestillieren, dasÖlbei30—40ºCunterVakuumineinemStick-
stoffstromtrocknen,bisdasHexanvollständigentferntist.
6.2.Reinigung über Aluminiumoxid
Eine Suspension von 15 g aktiviertem Aluminiumoxid (5.8) in 50 ml
Hexan (5.1) herstellen und unter Rühren in die Chromatographiesäule
(4.7) gießen. Das Aluminiumoxid gleichmäßig absetzen lassen und
warten, bis das Lösungsmittel auf 1—2 mm über dem Absorptionsmittel
abgelaufen ist.AufdieSäulevorsichtigeine Lösungvon5gÖlin25ml
Hexan (5.1) gießen; die gesamte aus der Säule ablaufende Flüssigkeit in
einem Rundkolben(4.1)sammeln.
7. HERSTELLUNGDERDÜNNSCHICHTPLATTEN
Die Glasplatten (4.13) sorgfältig mit Ethanol, Petrolether und Aceton
reinigen, um jeden Fettrest zu beseitigen. In einen Erlenmeyerkolben
(4.4) 30 g Kieselgel (5.9) geben, 60 ml destilliertes Wasser hinzufügen,
verschließen und eine Minute kräftig schüttteln. Die Suspension sofort in
dasBeschichtungsgerät (4.12)geben undeine 0,25mmdicke Schicht auf
diePlattenauftragen.DiePlatten15MinutenanderLuftundeineStunde
im Trockenschrank (4.16) bei 103 ± 2 ºC trocknen. Die Platten vor
Verwendungineinem ExsikkatoraufRaumtemperatur abkühlen.
Fertigplatten sindimHandelerhältlich.
8. VERFAHREN8.1.Hydrolyse durch Pancreaslipase
IndasZentrifugenglas(4.8)etwa0,1gdervorbereitetenProbeeinwiegen;
handelt es sich um ein festes Fett, muß es in 0,2 ml Hexan (5.1), evtl.
unterschwachemErwärmen,gelöstwerden.
20 mg Lipase (5.10) und 2 ml der Pufferlösung (5.15) hinzufügen.
Sorgfältig und vorsichtig schütteln und dann 0,5 ml der Natriumcholatlö-
sung (5.14) und 0,2 ml der Kalziumchloridlösung (5.13) hinzufügen. Das
Glas mit dem Schliffstopfen verschließen, vorsichtig schütteln
(Befeuchten des Stopfens vermeiden), das Glas sofort bei 40 ± 0,5 ºC in
den Thermostaten (4.17) stellen und genau eine Minute mit der Hand
schütteln.
Das Glas aus dem Thermostaten nehmen und mit Hilfe des Vibriergeräts
(4.19)genau2Minutenlangkräftigschütteln.
Sofort in fließendem Wasser abkühlen; 1 ml Salzsäure (5.12) und 1 ml
Diethylether (5.4) hinzufügen. Verschließen und kräftig mit dem elektri-
schen Schüttelgerät schütteln. Stehen lassen und die organische Phase
mit Hilfe der Spritze (4.10), gegebenenfalls nach Zentrifugieren,
abnehmen.
8.2.Abtrennung der Monoglyceride durch Dünnschichtchromatographie
Den Extrakt mit der Mikroliterspritze (4.11) auf die Dünnschichtplatte
auftragen, und zwar 1,5 cm vom unteren Rand entfernt, als dünnen,
einheitlichen Strich. Die Platte in die gut gesättigte Entwicklerkammer
(4.14) stellen und mit dem Fließmittel (5.7) bei etwa 20 ºC bis 1 cm
vomoberenPlattenrand entfernt entwickeln.
DiePlatteanderLuftbeidergleichenTemperaturwieinderEntwickler-
kammer trocknen und mit 2 ′,7′-Dichlorfluoresceinlösung (5.17)
besprühen. Die Zone der Monoglyceride (Rf etwa 0,035) unter UV-Licht
(4.20)markieren.
8.3.Analyse der Monoglyceride durch Gaschromatographie
Die nach 8.2 erhaltene Kieselgelzone mit einem Spatel abkratzen
(vermeiden, daß auch die auf der Startlinie verbleibenden Bestandteile
mit erfaßtwerden)undindasMethylierungskölbchen (4.2)überführen.
DasgesammelteKieselgel,sowieesvorliegt,nachdemVerfahrengemäß
Anhang XB behandeln, die Monoglyceride in Methylester überführen,
danndieEstergaschromatographisch nachdemVerfahrengemäßAnhang
XAuntersuchen.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—34
▼B
9. FORMULIERUNGDERERGEBNISSE
DieZusammensetzungderFettsäurenin2-StellungaufeineDezimalstelle
genauangeben (Anmerkung3).
10. ANMERKUNGEN
Anmerkung 1: PrüfungderLipasetätigkeit
Aus einem Gemisch von 165 ml Gummiarabikumlösung
(5.21), 15 g gemahlenem Eis und 20 ml neutralisiertem
Öl(5.18)miteinemgeeignetenRührgeräteineÖlemulsion
herstellen.
10 ml dieser Emulsion in ein Becherglas (4.5) geben,
anschließend0,3mlNatriumcholatlösung(5.20)und20ml
destilliertes Wasserhinzufügen.
Das Becherglas bei 37 ± 0,5 ºC (Anmerkung 4) in einen
Thermostaten stellen; die Elektroden eines pH-Meters
(4.21)undeinenSpiralrührer(4.22)einsetzen.
Mit Hilfe einer Bürette (4.23) tropfenweise Natriumhydro-
xidlösung (5.19) hinzufügen bis zu einem pH-Wert von
8,5.
Eine ausreichende Menge der wäßrigen Lipasesuspension
(siehe nachstehend) hinzufügen. Sobald das pH-Meter 8,3
anzeigt, die Stoppuhr anstellen (4.24) und Natriumhydro-
xidlösung (5.19) so zutropfen lassen, daß der pH-Wert bei
8,3 gehalten wird. Das Volumen der pro Minute
verbrauchten Alkalilösungnotieren.
Die Werte in ein Koordinatensystem eintragen, und zwar
dieZeitablesungen alsAbszisseunddieAnzahlmlAlkali-
lösung zur Konstanthaltung des pH-Werts als Ordinate.
Dabeimußsicheine Geradeergeben.
DievorstehenderwähnteLipasesuspensionisteineSuspen-
sion von eins zu Tausend in Wasser. Für jeden Versuch
soviel der Suspension verwenden, daß in 4 bis 5 Minuten
etwa 1 ml Alkalilösung verbraucht wird. Normalerweise
werdenetwa1—5mgLipasepulvergebraucht.DieLipase-
einheit wird als die Menge Enzym definiert, die 10
Mikroäquivalente Säure pro Minute freisetzt. Damit ergibt
sich die Aktivität A des verwendeten Pulvers, ausgedrückt
alsLipaseeinheiten inmg,anhandfolgender Formel:
A¼V/C210
m
Dabei entspricht Vder Anzahl der pro Minute
verbrauchten ml Natriumhydroxidlösung (5.19), berechnet
aus der graphischen Darstellung, m ist das Gewicht der
Lipaseprobe inmg.
Anmerkung 2: HerstellungderLipase
Lipasen mit ausreichender Lipasetätigkeit sind im Handel
erhältlich.SiekönnenaberauchimLaborwiefolgtherge-
stellt werden: 5 kg frisches Schweinepankreas auf 0 ºC
abkühlen; das umhüllende feste Fett und die anhängenden
Gewebe entfernen und im Mixer zerkleinern, bis ein flüs-
siger Brei ensteht. Diesen Brei mit dem Rührgerät (4.25)
4—6 Stunden mit 2,5 l wasserfreiem Aceton rühren,
anschließend zentrifugieren. Den Rückstand noch dreimal
mit dem gleichen Volumen Aceton, dann zweimal mit
einer Mischung von Aceton und Diethylether 1: 1 (V/V)
und zweimal mit Diethylether extrahieren. Den Rückstand
im Vakuum 48 Stunden lang trocknen, bis ein stabiles
Pulver entsteht, das im Kühlschrank aufbewahrt werden
sollte.
Anmerkung 3: In jedem Fall ist es ratsam, die Zusammensetzung der
Gesamtfettsäuren der gleichen Probezubestimmen, daein
VergleichmitdenFettsäurenin2-StellungbeiderInterpre-
tationderWerte vonNutzenist.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—35
▼B
Anmerkung 4: DieHydrolysentemperaturwirdauf37ºCeingestellt,wenn
ein flüssiges Öl verwendet wird. Sie wird jedoch für die
Untersuchungsproben auf 40 ºC festgelegt, um auch die
UntersuchungvonFettenmitSchmelzpunktenbiszu45ºC
zuermöglichen.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—36
▼B
ANHANG VIII
BESTIMMUNG DES TRILINOLEINGEHALTS
1. ZWECK
DievorliegendeNormbeschreibteinVerfahrenzurTrennungundquantita-
tiven Bestimmung der Zusammensetzung von Triglyceriden in
Abhängigkeit von Molekulargewicht und Grad der Ungesättigtheit, ausge-
drücktin„äquivalenten Kohlenstoffzahlen“ (sieheAnmerkung1).
2. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Norm gilt für alle pflanzlichen Öle, die Triglyceride langkettiger
Fettsäuren enthalten. Das Verfahren eignet sich insbesondere zum Nach-
weis von kleinen Mengen linolsäurereicher halbtrocknender Öle in den
Ölen, die überwiegend Ölsäure als ungesättigte Fettsäure enthalten, wie z.
B.Olivenöl.
3. PRINZIP
Trennung der Triglyceride durch Umkehrphasenchromatographie in
Abhängigkeit von ihren äquivalenten Kohlenstoffzahlen und Auswertung
derChromatogramme.
4. GERÄTE
4.1. Flüssigchromatograph,dersoausgestattetist,daßdieTemperaturderSäule
übereinenThermostaten kontrolliert werdenkann.
4.2. Einspritzsystem mit einer10-µl-Probenschleife.
4.3. Detektor: Differentialrefraktometer. Im Bereich der höchsten Empfindlich-
keit sollten wenigstens 10−4Einheiten des Brechungsindexes erreicht
werden.
4.4. Säule: Säule aus rostfreiem Stahl von 250 mm Länge und 4,5 mm Durch-
messer, gefüllt mit Kieselgelpartikeln, die mit Oktadecylsilan belegt sind
(Durchmesser 5 µm). Die durchschnittliche Kohlenstoffbelegung sollte bei
etwa22—23%liegen (sieheAnmerkung2).
4.5. Schreiber und/oderIntegrator.
5. REAGENZIEN
DieReagenzienmüssenanalytischreinsein.DieFließmittelsolltenentgast
sein.SiekönnenmehrereMalewiederverwendetwerden,ohnedaßdadurch
dieTrennleistungen beeinflußt werden.
5.1. Chloroform.
5.2. Aceton.
5.3. Acetonitril.5.4. Fließmittel: Aceton/Acetonitril. Das Mischungsverhältnis ist so einzu-
stellen, daß damit die gewünschte Trennung erzielt wird. Man geht
zunächst voneinem Mischungsverhältnisvon1:1aus.
5.5. Lösungsmittel: Aceton oder eine Mischung von Aceton/Chloroform im
Verhältnis1:1.
5.6. Triglyceride als Referenzsubstanzen. Entweder mit Hilfe der im Handel
verfügbaren Triglyceride (Tripalmitin, Triolein usw.) ein Diagramm aus
den Retentionszeiten und den äquivalenten Kohlenstoffzahlen aufzeichnen
oder ein Referenzchromatogramm des Sojaöls verwenden (siehe Anmer-
kungen3und4sowieAbbildungen1und2).
6. VORBEREITUNGDERPROBEN
Von der zu analysierenden Probe wird eine 5 %ige Lösung hergestellt,
indem genau 0,5 g ± 0,001 g der Probe in einen 10-ml-Meßkolben einge-
wogenundmit demLösungsmittel (5.5)auf10mlaufgefüllt werden.
7. VERFAHREN
7.1. Das HPLC-Gerät in Betrieb setzen. Das Fließmittel (5.4) wird mit einer
Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 ml/min durch die Säule gepumpt, um
dasgesamteSystemzureinigen.Eswirdsolangegewartet,biseinestabile1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—37
▼B
Grundlinie erreicht ist. Anschließend werden 10 µl der gemäß Ziffer 6
hergestellten Probeeingespritzt.
8. BERECHNUNGUNDABFASSUNGDERERGEBNISSE
Es wird die Methode der inneren Standardisierung angewandt, d. h. man
geht davon aus, daß die Summe der Peakflächen, die den verschiedenen
Triglyceriden entsprechen, 100 % darstellen. Der relative prozentuale
AnteileinesjedenTriglycerids wirdberechnet nachderFormel
%Triglycerid =Peakfläche
SummederPeakflächen×100
DasErgebnisistaufeine StellenachdemKommaanzugeben.
Anmerkung 1: DieReihenfolgederElutionkanndurchdieBerechnungder
„äquivalenten Kohlenstoffzahlen“ (NCE) ermittelt werden.
Diesesindwiefolgtdefiniert:
NCE=NC−2n.DabeiistNCdieZahlderKohlenstoffatomeundndieZahl
derDoppelbindungen.
Wenn n
o,n1und n1ndie Zahlen der Doppelbindungen sind,
dievonderÖl-bzw.derLinol- undLinolensäure stammen,
so kann die äquivalente Kohlenstoffzahl berechnet werden
nachderFormel
NCE=NC−dono−d1n1−d1nn1n.
Die Koeffizienten do,d1und d1nkönnen mit Hilfe der
Triglyceride, die als Referenzsubstanzen benutzt wurden,
berechnet werden. Unter den in dieser Methode beschrie-
benenBedingungengilt etwafolgende Beziehung
NCE=NC−2,60no−2,35n1−2,17n1n.
Anmerkung 2: Beispiele: LichrosorbRP18(Merck)Art50333,
Lichrospher 100 CH-18 (Merck) Art 50377 oder
ähnliches Füllmaterial.
Anmerkung 3: Man kann ebenfalls mit mehreren Triglyceriden als Refe-
renzsubstanzen und mit Hilfe der korrigierten
Retentionszeit TR ′=T R−T RLösungsmitteldie Selektivität in
bezugaufTriolein wiefolgtberechnen:
α=TR′
TR′Olein
DiegraphischeDarstellungvonlog α=f(ZahlderDoppel-
bindungen) ermöglicht es, die Retention von allen
Triglyceriden zu bestimmen, die die Fettsäuren enthalten,
die in den als Referenzsubstanzen verwendeten Triglyce-ridenvorkommen(sieheAbbildung2).
Anmerkung 4: Die Trennfähigkeit der Säule muß eine klare Trennung des
Trilinolein-Peaks (LLL) auch von den Peaks der Triglyce-
ride ermöglichen, die eine nur wenig unterschiedliche
Retentionszeit besitzen.
Anmerkung 5: Rohes naturreines Olivenlampantöl und rohes Oliventre-
steröl müssen zur Erzielung einer sauberen Trennung des
Trilinoleinpeaks vom linken und rechten Nachbarpeak oder
von den Peaks etwaiger Verunreinigungen zunächst gemäß
folgendem Verfahrengereinigt werden:
200µl Öl werden unverdünnt auf eine Fest-Flüssig-Extrak-
tions-Kieselgelsäule (Type SEP PAK silica cartridge-waters
part.Nr.51900)aufgegeben.
Die Triglyzeride werden innerhalb von höchstens 20
Sekunden mit 20 ml wasserfreiem Hexan für die HPLC
eluiert.
DasEluatwirdimStickstoffstromabgeblasenundinIsopro-
panoloderAceton(5ml)gelöst.10bis20 µldavonwerden
der HPLC-Säule aufgegeben. Es ist darauf zu achten, daß
die Zusammensetzung der Fettsäuren vor und nach der1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—38
▼M11
▼M11
Reinigung gleich ist, wobei der Fehlergrenze des verwen-
detenAnalyseverfahrensRechnunggetragen wird.
Abbildung 1
Chromatogramm eines Sojaöls
Anmerkung: P=Palmitinsäure;St=Stearinsäure;O=Ölsäure;L=Linol-
säure;Ln=Linolensäure.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—39
▼B
▼B
Abbildung 2
Graphische Darstellung von log αals Funktion von f (Zahl der Doppelbin-
dungen)
Anmerkung: La = Laurinsäure; My = Myristinsäure; P = Palmitinsäure; St
= Stearinsäure; O = Ölsäure; L = Linolsäure; Ln = Linolen-
säure.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—40
▼B
ANHANG IX
UV-SPEKTROPHOTOMETRISCHE ANALYSE
EINLEITUNG
Die spektrophotometrische Untersuchung im Ultraviolettlicht kann
Angaben über die Qualität eines Fettes, seine Haltbarkeit und die infolge
technologischer Verfahreneingetretenen Veränderungenerbringen.
Die Absorption bei den in dem Verfahren vorgesehenen Wellenlängen ist
bedingt durch das Vorkommen konjugierter Dien- und Triensysteme. Die
AbsorptionwirdalsspezifischeExtinktionE1cm1%angegeben(Extinktion
einer 1 %igen Lösung des Fettes in dem vorgeschriebenen Lösungsmittel
bei einer Schichtdicke von 1cm). Sie wirdüblicherweise als Kbezeichnet
(auchExtinktionskoeffizient genannt).
1. ANWENDUNGSBEREICH
Das Verfahren beschreibt die Durchführung der spektrophotometrischen
UntersuchungvonFettenimUltraviolettlicht.
2. PRINZIP
Das zu untersuchende Fett wird in dem vorgeschriebenen Lösungsmittel
gelöst, anschließend wird die Extinktion der Lösung bei der vorgeschrie-
benen Wellenlänge im Vergleich zum reinen Lösungsmittel bestimmt. Die
spezifischen Extinktionen werden mit Hilfe der abgelesenen spektrophoto-
metrischen Werte errechnet.
3. GERÄTE
3.1. Spektrophotometer, geeignet zum Messen der Extinktionen im UV-Licht
zwischen220und360nmundmitderMöglichkeit,einzelnenanometrische
Einheiten ablesen zukönnen.
3.2. Rechteckige Quarzküvetten mit Deckel und einer optischen Länge von
1 cm. Die Extinktionen der mit Wasser oder einem geeigneten Lösungs-
mittel gefüllten Küvetten dürfen nicht mehr als 0,01 Einheiten
voneinander abweichen.
3.3. 25-ml-Meßkolben.
3.4. Chromatographiesäule mit einem oberen Teil von 270 mm Länge und 35
mm Durchmesser sowie einem unteren Teil von 270 mm Länge und 10
mmDurchmesser.
4. REAGENZIEN
4.1. — Isooktan(2,2,4-Trimethylpentan),spektrophotometrischrein:esmußim
Vergleich zu destilliertem Wasser eine Durchlässigkeit von mindestens
60%bei220nmundmindestens95%bei250nmhaben;oder
— Cyclohexan, spektrophotometrisch rein: esmußim Vergleich zu destil-
liertem Wasser eine Durchlässigkeit von mindestens 40 % bei 220 nm
undmindestens95%bei250nmhaben.
4.2. BasischesAluminiumoxidzurSäulenchromatographie,dasgemäßAnlage1
vorbereitet undgeprüftwurde.
4.3. n-Hexan,zurChromatographie.
5. VERFAHREN
5.1. Die zu untersuchende Probe muß absolut homogen und frei von suspen-
dierten Verunreinigungen sein. Die bei Raumtemperatur flüssigen Öle
werden bei einer Temperatur von etwa 30 ºC über Papier filtriert. Die
festenFettewerdenhomogenisiertundbeieinerTemperaturvonhöchstens
10ºCüberihremSchmelzpunktfiltriert.
5.2. Etwa 0,25 g der so vorbereiteten Probe in einen 25-ml-Meßkolben
einwiegen, mit dem vorgeschriebenen Lösungsmittel auffüllen und homo-1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—41
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
genisieren. Die so hergestellte Lösung muß absolut klar sein. Wenn die
Lösung trüb ist oder Verunreinigungen enthält, muß schnell über Papier
filtriert werden.
5.3. Mit der so hergestellten Lösung wird eine Küvette gefüllt und die Extink-
tion bei der entsprechenden Wellenlänge zwischen 232 und 276 nm
gemessen,wobeidasLösungsmittel alsReferenzlösung verwendetwird.
Die abgelesenen Extinktionen müssen im Bereich von 0,1 bis 0,8 liegen;
andernfalls müssen die Messungen unter Verwendung von entsprechend
stärkerkonzentrierten oderverdünntenLösungenwiederholt werden.
5.4. Wird eine Bestimmung der spezifischen Extinktion nach Behandlung mit
Aluminiumoxid verlangt, so ist wie folgt zu verfahren: 30 g basisches
Aluminiumoxid werden in einer Hexansuspension in die Säule gegeben.
Nach dem Absetzen des Adsorbens wird überschüssiges Hexan bis auf
1cmoberhalb derAluminiumoxidfüllung entfernt.
10 gFett, das wie unter 5.1beschrieben homogenisiert und filtriert wurde,
wird in 100 ml Hexan gelöst und die Lösung auf die Säule gegeben. Das
EluatwirdgesammeltunddasLösungsmittelimVakuumbeiTemperaturen
unter25ºCentfernt.
Mit dem so erhaltenen Fett wird sofort weiter verfahren wie unter 5.2
beschrieben.
6. ABFASSUNGDERERGEBNISSE
6.1. Angegeben werden die bei den verschiedenen Wellenlängen bestimmten
spezifischen Extinktionen (Extinktionskoeffizienten), die wie folgt zu
berechnen sind:
Kλ¼Eλ
c/C1s
Dabeibedeuten:
Kλ= die spezifische Extinktion (Extinktionskoeffizient) bei der
Wellenlängeλ,
Eλ= diebeiderWellenlänge λgemesseneExtinktion,
c = dieKonzentration derLösunging/100ml,
s = dieLänge derKüvetteincm.
DieErgebnissewerdenmit zweiDezimalstellen angegeben.
6.2. DiespektrophotometrischeUntersuchungvonOlivenölnachdemamtlichen
Verfahren der EWG-Verordnungen sieht die Bestimmung der spezifischen
Extinktion in einer Isooktanlösung bei den Wellenlängen 232 und 270 nm
sowiedieBestimmungvon ∆KgemäßfolgenderFormel vor:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
Dabei ist Kmdie spezifische Extinktion bei der Wellenlänge m, bei der im
Bereich von270nmdasMaximumderAbsorptionliegt.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—42
▼B
ANLAGE I
Vorbereitung des Aluminiumoxids und Prüfung seiner Aktivität
A.1.1. Vorbereitung des Aluminiumoxids
Das zuvor im Trockenschrank bei 380—400 ºC 3 Stunden lang getroc-
knete Aluminiumoxid in ein gut verschließbares Gefäß geben, je 100 g
Aluminiumoxid 5 ml destilliertes Wasser zugeben, das Gefäß rasch
verschließen, mehrfach schütteln und vor der Verwendung mindestens
12Stundenstehenlassen.
A.1.2. Überprüfung der Aktivität des Aluminiumoxids
Eine chromatographische Säule mit 30 g Aluminiumoxid füllen und
weiter wie unter 5.4 beschrieben verfahren. Über die Säule gibt man
eine Mischungbestehend aus
— 95%nativemOlivenölmiteinerspezifischenExtinktionbei268nm
vonwenigerals0,18und
— 5 % Erdnußöl, das bei der Raffination mit Bleicherde behandelt
wurde und eine spezifische Extinktion bei 268 nm von mindestens 4
aufweist.
Weist die Mischung nach dem Passieren der Säule eine spezifische
Extinktion bei 268nm vonmehrals0,11auf,soistdasAluminiumoxid
geeignet, anderenfalls istderWasserzusatzzuerhöhen.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—43
▼B
ANLAGE II
Eichung des Spektrophotometers
A.2. Das Gerät muß regelmäßig (mindestens alle 6 Monate) im Hinblick auf
die Einstellung der Wellenlänge und die Genauigkeit der Anzeige über-
prüftwerden.
A.2.1. Die Überprüfung der Einstellung der Wellenlänge kann mit Hilfe einer
Quecksilberdampflampe odergeeigneter Filtererfolgen.
A.2.2. Zur Überprüfung der photoelektrischen Zelle und des Photomultipliers
wird wie folgt verfahren: 0,2 g reines Kaliumchromat für die Spektro-
photometrie einwiegen und in einer 0,05-N-Kaliumhydroxidlösung
lösen, dann in einen Meßkolben geben und auf 1000 ml auffüllen.
Anschließend genau 25ml der sohergestellten Lösungineinen 500-ml-
Meßkolben überführen und mit der gleichen Kaliumhydroxidlösung
auffüllen.DieExtinktiondersohergestelltenLösungbei275nmmessen
unddabeidieKaliumhydroxidlösungalsReferenzlösungverwenden.Die
miteiner1-cm-KüvettegemesseneExtinktionmuß0,2±0,005betragen.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—44
▼B
ANHANG XA
GASCHROMATOGRAPHISCHE ANALYSE DER FETTSÄUREMETHY-
LESTER
1. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Norm enthält allgemeine Anweisungen zur Anwendung der
Gaschromatographie mit gepackten Säulen oder mit Kapillarsäulen zur
Bestimmungderqualitativen undquantitativen Zusammensetzung einer
Mischung von Fettsäuremethylestern, die nach dem in Anhang XB
beschriebenen Verfahrenhergestellt wurden.
DasVerfahreneignet sichnichtfürpolymerisierte Fettsäuren.
2. REAGENZIEN.2.1.Trägergas
Inertgas (Stickstoff, Helium, Argon, Wasserstoff usw.), vollständig
getrocknet undmit einem Sauerstoffgehalt unter10mg/kg.
Anmerkung 1: Der ausschließlich in Kapillarsäulen als Trägergas
verwendete Wasserstoff kann die Analysengeschwindig-
keit verdoppeln, ist aber gefährlich.
Sicherheitsvorrichtungen sindverfügbar.
2.2.Hilfsgase
2.2.1. Wasserstoff (Reinheit über 99,9 %), frei von organischen Verunreini-
gungen.
2.2.2. LuftoderSauerstoff,freivonorganischenVerunreinigungen.
2.3.Referenzstandard
Eine Mischung aus reinen Fettsäuremethylestern oder die Methylester
eines Fetts mit bekannter Zusammensetzung, die möglichst der Zusam-
mensetzung deszuanalysierenden Fettsähnlichsind.
Eine Oxidation der mehrfach ungesättigten Fettsäuren muß vermieden
werden.
3. GERÄTE
Die vorliegenden Instruktionen gelten für die übliche Ausrüstung für
die Gaschromatographie mit gepackter Säule oder Kapillarsäule und
Flammenionisationsdetektor. Jedes Gerät, das die in 4.1.2 beschriebene
LeistungundTrennungerbringt,istgeeignet.
3.1.Gaschromatograph
DerGaschromatographmußüberfolgende Bestandteile verfügen:
3.1.1. Einspritzsystem
VerwendetwirdeinEinspritzsystem entweder inVerbindung
a) mit gepackten Säulen und möglichst geringem Totvolumen (es muß
in diesem Fall auf Temperaturen erhitzt werden können, die um
20—50ºCüberderSäulentemperatur liegen)oder
b) mit Kapillarsäulen. In diesem Fall muß das Einspritzsystem speziell
fürdieseSäulenvorgesehensein.EskanndasSplit-Systemoderdas
Systemdersplitlosen„OnColumn“-Injektion sein.
Anmerkung 2: Sind Fettsäuren mit weniger als 16 Kohlenstoffatomen
nicht vorhanden, so kann ein Injektor mit beweglicher
Nadelverwendet werden.
3.1.2. Ofen
DerOfensolltesoausgelegtsein,daßdieSäuleaufmindestens260ºC
aufgeheizt und die Temperatur bei gepackten Säulen auf 1 ºC und bei
Kapillarsäulen auf 0,1 ºC genau konstant gehalten werden kann. Letz-
tere Bedingung ist vor allem dann wichtig, wenn eine „Fused Silica“-
Säuleverwendetwird.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—45
▼B
InjedemFall,besondersaberbeiFettsäurenmitwenigerals16Kohlen-
stoffatomen, wirdeine Heizungmit Temperaturprogramm empfohlen.
3.1.3. Gepackte Säule3.1.3.1. Säule aus einem Material, das unempfindlich ist gegenüber den zu
analysierenden Substanzen(z.B.GlasoderrostfreierStahl).
GrößederSäule:
a) Länge: 1—3 m. Eine relativ kurze Säule sollte verwendet werden,
wennlangkettigeFettsäuren(überC
20)vorkommen.BeiderAnalyse
von Säuren mit 4 oder 6 Kohlenstoffatomen wird eine 2 m lange
Säuleempfohlen;
b) Innendurchmesser: 2—4mm.
Anmerkung 3: Sind mehrfach ungesättigte Bestandteile mit mehr als
dreiDoppelbindungenvorhanden,sokönnensieineiner
SäuleausrostfreiemStahlzersetzt werden.
Anmerkung 4: Es kann ein System mit zwei gepackten Säulen
verwendetwerden.
3.1.3.2. Füllung,bestehend ausfolgenden Bestandteilen:
a)Trägermaterial: Mit Säure gewaschenes und silanisiertes Kieselgur
oder sonstiges geeignetes neutrales Trägermaterial mit einem engen
Korngrößenbereich (Schwankungsbereich 25 µm innerhalb der
Grenzwerte von 125 bis 200 µm), wobei die durchschnittliche
KorngrößeaufdenInnendurchmesserderSäuleabgestimmt wird.
b)Stationäre Phase: Polare Flüssigkeit vom Typ Polyester (z. B.
►C1Diethylenglykolpolysuccinat ◄,Butandiolpolysuccinat,Ethy-
lenglykolpolyadipat usw.), Cyanosilicone oder sonstige
Flüssigkeiten, die die erforderliche chromatographische Trennung
ermöglichen (siehe Ziffer 4). Die stationäre Phase sollte 5—20 %
(m/m) der Füllung ausmachen. Für bestimmte Trennungen kann
eine nichtpolare stationäre Phaseverwendet werden.
3.1.3.3. VorbereitungderSäule
Nachdem die Säule vom Detektor getrennt worden ist, den Ofen
allmählich auf 185 ºC aufheizen und einen Inertgasstrom von
20—60 ml/min mindestens 16 Stunden bei 185 ºC sowie weitere 2
Stundenbei195ºCdurchdiefrischhergestellte Säuleleiten.
3.1.4. Kapillarsäule3.1.4.1. Kapillare aus einem Material, das nicht mit den zu analysierenden
Stoffen reagiert (üblicherweise Glas oder „Fused Silica“). Der Innen-
durchmesser sollte zwischen 0,2 und 0,8 mm liegen. Die Innenflächen
müssen vor dem Auftragen der stationären Phase einer geeigneten
Behandlung unterzogen werden (beispielsweise Oberflächenvorberei-
tung, Desaktivierung). In den meisten Fällen ist eine Länge von 25 mausreichend.
3.1.4.2. Die stationäre Phase ist üblicherweise vom Typ Polyglykol (Polyethy-
lenglykol 20000), Polyester (Butandiolpolysuccinat) oder polarem
Polysiloxan (Cyanosilicon). Vernetzte (cross linked) Säulen sind
geeignet.
Anmerkung 5: Bei Verwendung von polaren Polysiloxanen können bei
der Identifizierung und Trennung von Linolensäure und
C
20-SäurenSchwierigkeiten auftreten.
DieBeschichtung solltedünn,beispielsweisenur0,1bis0,2µm,sein.
3.1.4.3. EinbauundVorbereitungderSäule
Beim Einbau der Kapillarsäule müssen die üblichen Vorsichtsmaß-
nahmen, wie Anordnung der Säule im Ofen (Träger), Auswahl und
Zusammenbau der Verbindungsstücke (Abdichtung), Ausrichten der
Säulenenden in dem Einspritzsystem und im Detektor (Verringerung
vonTotvolumen),getroffenwerden.DieSäulewirdmitdemTrägergas-
strom gespült (z. B. bei einer Säulenlänge von 25 m und einem
Innendurchmesservon0,3mmmit 0,3bar(30kPa)).
Zur Vorbereitung der Säule wird das Temperaturprogramm des Ofens
auf3ºC/mineingestellt unddieSäule,ausgehendvonderRaumtempe-
ratur, auf eine Temperatur von 10 ºC unter der Zersetzungsgrenze der
stationären Phase erhitzt. Diese Ofentemperatur wird 1 Stunde beibe-
halten, bis die Grundlinie stabilisiert ist. Dann auf 180 ºC
zurückschalten undunterisothermen Bedingungenweiterarbeiten.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—46
▼B
Anmerkung 6: Entsprechend vorbehandelte Fertigsäulen können im
Handelbezogenwerden.
3.1.5. Der Detektor sollte auf eine höhere Temperatur als die Säulentempe-
raturerhitzt werdenkönnen.
3.2.Spritze
DieSpritzesollteeinemaximaleKapazitätvon10µlundeineGraduie-
rungin0,1µlhaben.
3.3.Schreiber
Wird dievondem Schreiber aufgezeichnete KurvezurBerechnung der
Zusammensetzung der analysierten Mischung verwendet, so wird ein
mit dem verwendeten Gerät kompatibler Schreiber von hoher Präzision
benötigt.DerSchreiber solltefolgendeMerkmale aufweisen:
a) Ansprechgeschwindigkeit unter 1,5 s, vorzugsweise 1 s (die
Ansprechgeschwindigkeit ist die Zeit, die der Schreiber benötigt,
um nach plötzlicher Auslösung eines Signals (100 %) von 0 % auf
90%auszuschlagen);
b) Papierbreite mindestens20cm;
c) Vorschubgeschwindigkeit einstellbar zwischen0,4und2,5cm/min.
3.4.Integrator oder Rechner (fakultativ)
EineschnelleundgenaueBerechnungistmitHilfeeineselektronischen
Integrators oder Rechners möglich, der eine lineare Reaktion bei ange-
messener Empfindlichkeit liefern soll. Dabei muß die Korrektur bei
AbweichungenvonderGrundliniezufriedenstellend sein.
4. VERFAHREN
Die in 4.1 bis 4.3 beschriebenen Verfahren beziehen sich auf den
GebraucheinesFlammenionisationsdetektors.
Alternativ kann auch ein Gaschromatograph mit einem Katharometer-
Detektor (der auf dem Prinzip der Änderungen der Wärmeleitfähigkeit
beruht) verwendet werden. In diesem Fall müssen die Betriebsbedin-
gungenentsprechendZiffer6geändert werden.
4.1.Versuchsbedingungen
4.1.1. Ermittlung der optimalen Betriebsbeding ungen
4.1.1.1. Gepackte Säule
Bei der Ermittlung der Versuchsbedingungen müssen folgende Varia-
blenberücksichtigt werden:
a) LängeundDurchmesserderSäule;
b) ArtundMengederstationären Phase;
c) Säulentemperatur;
d) Trägergasstrom;
e) erforderliche Trennleistung;
f) Größe der zu untersuchenden Probe, die so ausgewählt sein muß,
daßDetektorundElektrometer einelineare Anzeigeergeben;
g) Analysendauer.
ImallgemeinenführendieindenTabellen1und2genanntenWertezu
dem gewünschten Ergebnis, d. h. mindestens 2000 theoretische Böden
pro Meter Säulenlänge für Methylstearat und dessen Elution innerhalb
von15Minuten.
Sofern die Geräte es erlauben, sollte das Einspritzsystem etwa 200 ºC
undderDetektor mindestensgenausoheißwiedieSäulesein.
Im allgemeinen liegt das Verhältnis der Strömungsgeschwindigkeit des
Wasserstoffs für den Flammenionisationsdetektor und der des Träger-
gases zwischen 1:2 und 1:1 je nach Säulendurchmesser. Der
Sauerstoffstrombeträgtetwadas5-bis10-fachedesWasserstoffstroms.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—47
▼B
Tabelle 1
InnendurchmesserderSäuleinmm Trägergasstrominml/min
2 15bis25
3 20bis40
4 40bis60
Tabelle 2
Konzentration derstationären Phase
in %(m/m)SäulentemperaturinºC
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Kapillarsäule
Die Eigenschaften der Kapillarsäule, nämlich Leistungsfähigkeit und
Durchlässigkeit, bedingen, daß die Trennung der Bestandteile und die
Analysendauer weitgehend von der Strömungsgeschwindigkeit des
Trägergases in der Säule abhängen. Daher ist eine Optimierung der
Betriebsbedingungen durch Einwirkung auf deren Parameter (einfacher
ausgedrückt: auf den Druckverlust der Säule) notwendig, je nachdem,
obeinebessereTrennungodereineschnellereAnalysegewünschtwird.
4.1.2. Bestimmung der Zahl der theoretischen Böden (Leistungs-
fähigkeit)undderAuflösung(sieheAbbildung1)
DieAnalysewirdmiteinerMischungausetwagleichenTeilenMethyl-
stearat und Methyloleat (beispielsweise Methylestern der Kakaobutter)
durchgeführt.
Die Säulentemperatur und der Trägergasstrom sind so zu wählen, daß
das Maximum des Methylstearat-Peaks etwa 15 Minuten nach dem
Lösungsmittelpeak aufgezeichnet wird. Dabei muß eine ausreichende
Menge Methylestermischung verwendet werden, damit der Methyl-
stearat-Peak etwaDreiviertel desvollen Skalenanschlagserreicht.
Die Zahl der theoretischen Böden n wird nach folgender Formel
berechnet:
n¼16drIðÞ
ωIðÞ/C20/C21
2
DieAuflösungRwirdberechnet nachderFormel:
R¼2∆
ωIðÞþωIIðÞ
Dabeisind:
dr(I)= dieRetentioninMillimetern, vomStartdesChromato-
grammsbiszumMaximumdesMethylstearat-Peaks;
ω(I)+ω(II)= die Breite des Methylstearat- bzw. Methyloleat-Peaks
in Millimeters, gemessen zwischen den Schnittpunkten
derWendetangenten mit derGrundlinie;
∆ = die Entfernung zwischen den Maxima des Methyl-
stearat- unddesMethyloleat-Peaks inMillimetern.
DerAuflösungsindexIrwirdberechnet nachderFormel:
a
b
Dabeisind:
a = Höhedeskleinsten Peaks,gemessenvonderGrundlinie;1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—48
▼M2
▼C2
▼C2
b = Höhe des niedrigsten Punktes im Tal zwischen den beiden
angrenzenden Peaks,gemessenvonderGrundlinie.
Abbildung 1
Chromatogramm zurBestimmungderZahldertheoretischen Böden(Leistungs-
fähigkeit) undderAuflösung
DieBetriebsbedingungen sindsozuwählen,daßsichfürMethylstearat
wenigstens2000theoretischeBödenproMeterSäuleergebenundeine
Auflösungvonwenigstens1,25erreicht wird.
4.2.Zu untersuchende Probe
Mit Hilfe der Spritze (3.2) werden 0,1 bis 2 µl der nach Anhang XB
hergestellten Methylester auf die Säule gespritzt. Sind die Ester nicht
gelöst, so sind 100 mg/ml in chromatographisch reinem Heptan zu
lösenunddavonetwa0,1bis1µleinzuspritzen.
Müssen Bestandteile bestimmt werden, die lediglich in Spuren
vorkommen,sokanndieProbengrößegesteigertwerden(biszumZehn-
fachen).
4.3.Analyse
Im allgemeinen soll unter den in 4.1.1 beschriebenen Bedingungen
gearbeitet werden. Es kann jedoch mit einer niedrigeren Säulentempe-
ratur gearbeitet werden, wenn eine Bestimmung von Fettsäuren mit
wenigerals12Kohlenstoffatomenerforderlichist.BeiderBestimmung
vonFettsäurenmitmehrals20KohlenstoffatomenkanndieTemperatur
erhöht werden. In beiden Fällen kann auch mit Temperaturprogramm
gearbeitet werden. Beispiel: Enthält die Probe Fettsäuremethylester mit
weniger als 12 Kohlenstoffatomen, so wird die Probe bei 100 ºC (oder
bei50—60ºCfallsButtersäurevorkommt)eingespritztunddieTempe-
ratur sofort mit einer Anstiegsrate von 4—8 ºC/min bis zum Optimum
erhöht. In manchen Fällen können die beiden Verfahren kombiniert
werden.
Nach dem programmierten Aufheizen wird die Elution bei gleichblei-
bender Temperatur fortgesetzt, bis alle Bestandteile eluiert sind.
Verfügt das Gerät über keine programmierbare Heizung, so ist bei1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—49
▼B
▼B
zwei festliegenden Temperaturen zwischen 100 ºC und 195 ºC zu
arbeiten. Gegebenenfalls ist es ratsam, die Analyse mit zwei Phasen
von unterschiedlicher Polarität durchzuführen, um die Abwesenheit
von verdeckten Peaks beispielsweise bei gleichzeitigem Vorkommen
vonC18:3undC20:0oderC18:3undC18:2konjugiert,sicherzustellen.
4.4.Herstellung von Referenzchromatogrammen und Referenzkurven
Die Referenz-Standardmischung (2.3) wird unter den gleichen Arbeits-
bedingungenwiedieProbeanalysiertunddieRetentionszeitenoderdie
Retention der vorkommenden Fettsäuren bestimmt. Für jeden Grad der
Ungesättigtheit wird auf halblogarithmischem Papier eine graphische
Darstellung angefertigt, die den Logarithmus der Retentionszeit oder
der Retention als Funktion der Zahl der Kohlenstoffatome zeigt. Unter
isothermen Bedingungen müßten die graphischen Darstellungen der
geradzahligenSäurenmitdemgleichenGradderUngesättigtheitgerade
Linienergeben.DieGeradensolltenannähernd parallel verlaufen.
Es müssen Bedingungen vermieden werden, unter denen verdeckte
Peaks auftreten, d. h. Bedingungen, unter denen die Auflösung zugeringist,umzweiBestandteile zutrennen.
5. DARSTELLUNGDERERGEBNISSE
5.1.Qualitative Analyse
Die Methylester-Peaks der Probe werden aus der nach 4.4 erstellten
graphischenDarstellungidentifiziert, wennnötigdurchInterpolation.
5.2.Quantitative Analyse
5.2.1. Bestimmung der Zusammensetzung
Abgesehen von Ausnahmefällen wird die Methode der inneren Norma-
lisierung angewandt, d. h. man geht davon aus, daß alle Bestandteile
der Probe auf dem Chromatogramm erscheinen, so daß die Gesamtheit
derPeakflächen100%derBestandteiledarstellt(vollständige Elution).
Enthält dasGeräteinenIntegrator,sosinddessenDatenzuverwenden.
Andernfalls muß die Fläche unter jedem Peak durch Multiplikation der
PeakhöhemitderBreiteaufhalberHöhebestimmtwerden.Gegebenen-
falls sind auch die verschiedenen während der Aufzeichnung
verwendeten Abschwächungenzuberücksichtigen.
5.2.2. Berech nung
5.2.2.1. Allgemeiner Fall
Der Gehalt eines Bestandteils i (ausgedrückt in Massenprozent Methy-
lester) wirddurch Bestimmung des prozentualen Anteils derjeweiligen
PeakflächeimVerhältniszurSummeallerPeakflächenberechnet.Dazu
wirdfolgende Formelverwendet:
Ai
ΣA/C2100
Hierbeisind:
Ai= diePeakfläche, diedemBestandteil ientspricht,
ΣA = dieSummealler Peakflächen.
DasErgebnisistaufeine StellenachdemKommaanzugeben.
Anmerkung 7: In diesem allgemeinen Fall wird davon ausgegangen,
daß das auf relative Flächen bezogene Berechnungser-
gebnis den jeweiligen Massenprozenten entspricht. Für
die Fälle, in denen diese Annahme nicht zulässig ist,
siehe5.2.2.2.
5.2.2.2. AnwendungvonKorrekturfaktoren
In bestimmten Fällen, beispielsweise in Gegenwart von Fettsäuren mit
weniger als 8 Kohlenstoffatomen oder von Fettsäuren mit sekundären
Gruppen, bei Verwendung eines Wärmeleitfähigkeits-Detektors oder
wenn eine besonders hohe Genauigkeit erforderlich ist, sollten Korrek-
turfaktoren angewandt werden, um die prozentualen Peakflächen in
Massenprozente der Bestandteile umzurechnen. Die Korrekturfaktoren
werden mit Hilfe eines Chromatogramms bestimmt, das durch Analyse
einerReferenzmischungvonMethylesternbekannterZusammensetzung1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—50
▼B
unter den gleichen Bedingungen wie bei der Analyse der Probe erstellt
wurde.
Für diese Referenzmischung ergibt sich der prozentuale Massenanteil
desBestandteiles iausderFormel:
mi
Σm/C2100
Hierinsind:
mi= dieMassedesBestandteils inderReferenzmischung,
Σm = die Gesamtheit aller Massen der verschiedenen Bestandteile
derReferenzmischung.
AusdemChromatogrammderReferenzmischung(4.4)wirdderprozen-
tuale Anteil(Fläche/Fläche) desBestandteils iwiefolgtberechnet:
Ai
ΣA/C2100
Hierinsind:
Ai= diePeakfläche desBestandteiles i,
ΣA = dieSummealler Peakflächen.
DerKorrekturfaktor ergibtsichausderFormel
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Imallgemeinen werdendieKorrekturfaktoren aufKC16bezogen, sodaß
dierelativen Faktorennachfolgender Formelberechnet werden:
K0
i¼Ki
KC16
Der Gehalt der Probe an jedem Bestandteil i, ausgedrückt in Massen-
prozentMethylester, ist:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
DieErgebnissesindaufeine StellenachdemKommaanzugeben.
5.2.2.3. VerwendungeinesinnerenStandards
In bestimmten Fällen ist es erforderlich, einen inneren Standard zu
verwenden (beispielsweise, wenn nicht alle Fettsäuren quantitativ
bestimmt werden sollen, wie beim Vorkommen von Säuren mit 4 und
6 Kohlenstoffatomen neben Säuren mit 16 oder 18 Kohlenstoffatomen,
oder wenn die absolute Menge an Fettsäuren in der Probe bestimmt
werdensoll).DazuwerdenhäufigFettsäurenmit5,15oder17Kohlen-
stoffatomen verwendet.
Auch für den inneren Standard sollte der Korrekturfaktor bestimmt
werden(soferneinerverwendet wird).
DerAnteildesBestandteilsiinMassenprozent,ausgedrücktalsMethy-
lester,ergibtsichdannausderFormel:
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
Hierinist:
Ai= diePeakfläche desBestandteils i,
As= diePeakfläche desinnerenStandards,
K′i= derKorrekturfaktorfürdenBestandteil i(bezogen aufKC16),
K′s= der Korrekturfaktor für den inneren Standard (bezogen auf
KC16),
m = dieMassederzuuntersuchendenProbeinMilligramm,
ms= dieMassedesinneren StandardsinMilligramm.
DasErgebnisistaufeine StellenachdemKommaanzugeben.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—51
▼M2
6. SONDERFALL,BESTIMMUNGVONTRANS-ISOMEREN
Der Gehalt an trans-Isomeren in Fettsäuren mit 10-24 Kohlenstoff-
atomen kann durch Trennung der Methylester bestimmt werden, wobei
Kapillarsäulen mitbesondererPolarität verwendet werden.
6.1. Kapillarsäulen (fused silica) mit einem Innendurchmesser von 0,25 -
0,32 mm, einer Länge von 50 m und belegt mit einer Cyanopropylsili-
conschicht von0,1bis0,3µm(Typ SP2340,SP2380,CPSil88,Silar
10undähnlichen Typen).
6.2. Die Methylester werden nach dem im Anhang XB unter B beschrie-
benen Verfahren hergestellt. Fette mit einem Gehalt an freien
Fettsäuren von mehr als 3 % müssen nach dem im Anhang VII unter
Punkt6.1beschriebenen Verfahrenneutralisiert werden.
6.3. DieArbeitsbedingungen fürdieGaschromatographie sindwiefolgt:
— Säulentemperatur programmiert von 150-220 ºC (z. B. 15 Minuten
bei165ºC,danachAnstiegvon5ºC/Minute auf200ºC;
— Injektortemperatur: 250 ºC bei Verwendung eines Split-Systems
oder Anfangstemperatur der Säule bei Verwendung eines „on
column“-Systems;
— Detektortemperatur: 260ºC;
— Trägergasstrom: (Helium oderWasserstoff)1,2ml/min.
Abbildung 1
Musterchromatogramm einer kapillargaschromatographischen Bestim-
mung von trans-Fettäuren
Die Einspritzmenge soll so bemessen sein, daß unter den gegebenen
Empfindlichkeitsbedingungen die Höhe des Peaks für Arachinsäureme-
thylester20%odermehrdesVollausschlagsbeträgt.
6.4. Die Identifizierung der verschiedenen Methylester erfolgt mit Hilfe der
Retentionszeiten, die mit denen eines Referenzgemisches verglichen
werden(vgl.2.3).
Die Ester der trans-Fettsäuren werden vor den entsprechenden cis-
Isomeren eluiert. In Abbildung 2 wird ein Beispiel eines entspre-
chendenChromatogramms gezeigt.
6.5. Die Leistungsfähigkeit der Säule, bestimmt nach Punkt 4.1.2, soll die
Trennung bestimmter kritischer Paare ermöglichen. So soll z. B. die
Gruppe der trans-Isomere der Ölsäuren von dem Peak der Ölsäure
getrennt werden (trans C18:1/cis C18:1), und zwar mit einem
Auflösungsindex,derüber2liegt.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—52
▼C2
▼C2
6.6. Der prozentuale Gehalt der verschiedenen trans-Fettsäuren wird
berechnet aus dem Verhältnis der entsprechenden Peakfläche zur
SummederFlächen aller vorkommendenPeaks.
Bestimmt werdendieprozentualen Gehaltenachstehender Fettsäuren:
— „trans“-Oktadecensäuren (T 18:1), im Anhang I dieser Verordnung
alsSummedertrans-IsomerederÖlsäurebezeichnet;
— „cis-trans“- und „trans-cis“-Oktadecadiensäure (CT/TC 18:2), im
Anhang I dieser Verordnung als Summe der trans-Isomere der
Linolsäure bezeichnet;
— „trans-cis-trans“-, „cis-cis-trans“-, „cis-trans-cis“-, „trans-cis-cis“-
Oktadecatriensäure[(TCT+CCT+CTC+TCC)18:3],imAnhang
I dieser Verordnung als Summe der trans-Isomere der Linolensäure
bezeichnet.
Anmerkung 8: Im Hinblick auf die Besonderheiten dieser Methode
sind die Ergebnisse mit zwei Dezimalstellen anzu-
geben.
►M27.◄SONDERFALL—VERWENDUNGEINESKATHAROMETER-
DETEKTORS (BASIERT AUF DEM PRINZIP DER ÄNDERUNG
DERWÄRMELEITFÄHIGKEIT)
Zur Bestimmung der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung
eines Gemisches von Fettsäuremethylestern kann auch ein Gaschroma-
tograph mit einem Detektor verwendet werden, der auf der Grundlage
von Änderungen der Wärmeleitfähigkeit (Katharometer) arbeitet. In
diesem Fall müssen die in den Ziffern 3 und 4 beschriebenen Arbeits-
bedingungengemäßderTabelle 3geändert werden.
Für die quantitative Analyse sind die in 5.2.2.2 beschriebenen Korrek-
turfaktoren anzuwenden.
Tabelle 3
Variable Daten/Arbeitsbedingungen
Säule Länge:2—4m
Innendurchmesser:4mm
Trägermaterial Korngrößezwischen160und
200µm
Konzentration derstationären
Phase15%(m/m)bis25%(m/m)
Trägergas Heliumoder,wennnicht
vorhanden,Wasserstoff,mit
möglichst geringemSauerstoffge-
halt
Hilfsgase Keine
Temperatur desEinspritzsystems 40—60ºChöheralsdiederSäule
Säulentemperatur 180—200ºC
Strömungsgeschwindigkeitdes
TrägergasesImallgemeinen zwischen60und
80ml/min
Mengedereingespritzten Probe Imallgemeinen zwischen0,5und
2µl
►M28.◄UNTERSUCHUNGSBERICHT
Im Untersuchungsbericht müssen das zur Herstellung der Methylester
angewandte Verfahren, das gaschromatograpische Verfahren und die
Ergebnisse genau angegeben werden. Darüber hinaus sindalle Arbeits-
bedingungen zu nennen, die einen Einfluß auf die Ergebnisse gehabt
haben können, auch wenn sie nicht in dieser Internationalen Norm
aufgeführt wurdenoderalsfakultativ gelten.
Der Untersuchungsbericht muß alle zur vollständigen Identifizierung
derProbenotwendigenInformationen enthalten.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—53
▼B
▼M19
ANHANG X B
ZUBEREITUNG DER FETTSÄUREMETHYLESTER VON OLIVENÖL
UND OLIVENTRESTERÖL
Zur Zubereitung der Fettsäuremethylester von Olivenöl und Oliventresteröl
werdendiezweifolgenden Methodenempfohlen:
MethodeA: Umesterungmit kalter methanolischer Kaliumhydroxidlösung;
MethodeB: Methylierung durch Erhitzen mit methanolischer Natriummethy-
latlösungundnachfolgender VeresterunginsauremMedium.
DieWahlderMethodehängtvondemzubestimmenden Analyseparameter und
derbetreffenden Ölkategorie ab:
a) Bestimmung der Differenz zwischen dem tatsächlichen und dem theoreti-
schenTriglycerid-Gehalt beiECN42( ∆ECN42):
— DieMethodeAwirdbeiÖlprobenaller Kategorien nachReinigungüber
eine Kieselgelsäule angewandt.
b) BestimmungderZusammensetzung derFettsäuren:
— Die Methode A wird bei Ölproben folgender Kategorien direkt ange-
wandt:
— native Olivenöle mit einem Gehalt anfreienFettsäurenunter3,3%,
— raffiniertes Olivenöl,
— Olivenöl(MischungvonnativemOlivenölundraffiniertemOlivenöl),
— raffiniertes Oliventresteröl,
— Oliventresteröl (Mischung von nativem Olivenöl und raffiniertem
Oliventresteröl);
— die Methode B wird bei Ölproben folgender Kategorien direkt ange-
wandt:
— nativesOlivenöl mit einem GehaltanfreienFettsäurenüber3,3%,
— rohesOliventresteröl.
c) BestimmungderFettsäurenvontrans-Isomeren:
— Die Methode A wird bei Ölproben folgender Kategorien direkt ange-
wandt:
— native Olivenöle mit einem Gehalt anfreienFettsäurenunter3,3%,
— raffiniertes Olivenöl,— Olivenöl(MischungvonnativemOlivenölundraffiniertemOlivenöl);
— raffiniertes Oliventresteröl,
— Oliventresteröl (Mischung von nativem Olivenöl und raffiniertem
Oliventresteröl);
— die Methode A wird bei Ölproben folgender Kategorien nach Reinigung
übereine Kieselgelsäule angewandt:
— nativesOlivenöl mit einem GehaltanfreienFettsäurenüber3,3%,
— rohesOliventresteröl.
REINIGUNGDERÖLPROBEN
Die Ölproben werden nötigenfalls über eine Kieselgelsäule mit einem Hexan-
Diethylether-Gemisch (87:13 v/v) als Elutionslösung nach der Methode IUPAC
2.507gereinigt.
Als alternatives Verfahren ist die Festphasenextraktion an Kieselgelkartuschen
möglich. In einen Elutionsapparat unter Vakuum eine Kieselgelkartusche (1 g,
6 ml) geben und mit 6 ml Hexan waschen. Das Vakuum unterbrechen, damit
die Säule nicht austrocknet. In die Säule eine Lösung von etwa 0,12 g Öl in
0,5 ml Hexan geben und das Vakuum wieder herstellen, bis die Lösung in das
Kieselgeleingedrungenist,dannmit10mlHexan/Diethylether(87:13v/v)unter
Vakuumeluieren. Dasgesamte Eluat homogenisieren undinzweigleiche Teile
teilen. Einen Teil an einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck bei
Zimmertemperatur bis zur Trockne abrotieren. Den Rückstand in 1 ml Heptan
lösen. Die Lösung ist nun zur gaschromatographischen Analyse der Fettsäuren
bereit. Zur Analyse der Triglyceride mit HPLC gegebenenfalls den übrigen
Teil einrotieren unddenRückstandin1mlAcetonlösen.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—54
▼M19
METHODENZURZUBEREITUNGDERFETTSÄUREMETHYLESTER
1.Methode A: Umesterung mit kalter methanolischer Kaliumhydroxidlö-
sung
1.1.Anwendung
Diese schnelle Methode wird bei Olivenöl und Oliventresteröl mit
einem Gehalt an freien Fettsäuren unter 3,3 % angewandt. Die freien
FettsäurenwerdendurchdasKaliumhydroxidnichtverestert.DieEthy-
lesterderFettsäurenwerdenlangsamerumgeestertalsdieGlyceridester
undmöglicherweise nurteilweise methyliert.
1.2.Prinzip
Die Methylester bilden sich durch Umesterung in einer methanolischen
Kaliumhydroxidlösung als Zwischenprodukte vor der Verseifung
(Nummer 5 der Methode ISO 5509:2000 und der Methode IUPAC
2.301).
1.3.Reagenzien
Methanolmit höchstens0,5%(m/m)Wassergehalt,HeptanfürdieChromatographie,Kaliumhydroxid, ca. 2 N methanolische Lösung: 11,2 g Kaliumhy-
droxidin100mlMethanol lösen.
1.4.Geräte
5-ml-Reaktionsgefäße mit Schraubverschluss/PTFE-Dichtung,graduierte oderautomatische Pipetten,2und0,2ml.
1.5.Verfahren
In ein 5-ml-Reaktionsgefäß mit Schraubverschluss etwa 0,1 g Ölprobe
einwiegen, 2 ml Heptan zufügen und schütteln. 0,2 ml der 2 N metha-
nolischen Kaliumhydroxidlösung zugeben, fest verschließen und 30
Sekunden kräftig schütteln. Absetzen lassen, bis sich der obere Teil
der Lösung geklärt hat. Die obere Phase (mit den Methylestern) abde-
kantieren. Die Heptanlösung ist bereit zur Injektion in den
Chromatographen.Eswirdempfohlen,dieLösungbiszurchromatogra-
phischen Analyse im Kühlschrank und nicht länger als 12 Stunden
aufzubewahren.
2.Methode B: Methylierung durch Erhitzen mit methanolischer Natriu-
methylatlösung und nachfolgender Veresterung in saurem Medium
2.1.Anwendung
DieseMethodewirdbeiOlivenölundOliventresteröl miteinem Gehalt
anfreienFettsäurenüber3,3%angewandt.
2.2.Prinzip
Neutralisierung der freien Fettsäuren und alkalische Methanolyse der
Glyceride mit nachfolgender Veresterung der Fettsäuren in saurem
Medium(Nummer4.2derMethodeIUPAC2.301).
2.3.Reagenzien
— Heptan fürdieChromatographie,
— Methanol mit höchstens0,05%(m/m)Wassergehalt,— Natriummethylat, 0,2 N methanolische Lösung: 5 g Natrium in
1000mlMethanollösen(kannauskäuflichenLösungenhergestellt
werden),
— Phenolphtalein, 0,2%igemethanolische Lösung,
— Schwefelsäure,1NinmethanolischerLösung:3ml96%igeSchwe-
felsäure in100mlMethanolgeben,
— gesättigte Natriumchloridlösung inWasser.
2.4.Geräte
— 50-ml-Stehkolben, langerengerHalsmitSchliff,1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—55
▼M19
— Rückflusskühler, Mantellänge 1 m mit Schliff, passend zum Steh-
kolben,
— Siedesteine/-perlen,
— Glastrichter.
2.5.Verfahren
Ineinen50-ml-Stehkolben mit Schliff0,25gÖlprobegeben.MitHilfe
einesTrichters10mlder0,2NmethanolischenNatriummethylatlösung
und Siedeperlen hinzufügen. Den Rückflusskühler anbringen, schütteln
und zum Sieden bringen. Die Lösungmuss nach etwa 10 Minuten klar
werden,dieReaktionistpraktischnach15Minutenabgeschlossen.Den
KolbenvonderWärmequelle nehmen,dieBeendigungdesRückflusses
abwarten, den Kühler abnehmen und zwei Tropfen Phenolphtaleinlö-
sung zugeben. Einige ml 1N Schwefelsäure in die Lösung geben, bis
sie farblos wird, und dann nochmals 1 ml zufügen. Den Kühler
anschließen und erneut zum Sieden bringen. Nach etwa 20 Minuten
denKolbenvonderWärmequellenehmenundunterfließendemWasser
abkühlen. Den Kühler abnehmen, 20 ml gesättigte Natriumchloridlö-
sung zugeben und schütteln. 5 ml Heptan zufügen, den Kolben
verschließen und15Sekundenkräftigschütteln.
Bis zur vollständigen Trennung der beiden Phasen absetzen lassen.
Nochmals einen Teil der gesättigten Natriumchloridlösung zugeben,
bis die wässrige Phase den unteren Rand des Kolbenhalses erreicht.
Die obere Schicht, die sich im Hals des Kolbens befindet, enthält die
Methylester. Die Lösung ist bereit zum Einspritzen in den Gaschroma-
tographen.
Vorsicht: Die Methylierung mit Methode B unter eingeschaltetem
Abzugdurchführen!
2.6.Alternativen zur Methylierung nach Methode B
2.6.1. Methode C
2.6.1.1. Prinzip
Das zu analysierende Fett wird mit methanolischer Salzsäurelösung in
einerverschlossenenAmpulle bei100ºCumgesetzt.
2.6.1.2. Geräte
— Dickwandige Glasampulle mit ca. 5 ml Inhalt (Länge 40-45 mm,
Durchmesser14-16mm),
— 1-und2-ml-Messpipetten.
2.6.1.3. Reagenzien
Salzsäurelösung in 2 % Methanol, aus gasförmiger Salzsäure und
wasserfreiemMethanol hergestellt (Anmerkung1),
HexanfürdieChromatografie.
Anmerkung 1: Dazu können käufliche Salzsäure-Methanollösungen
verwendetwerden.ImLaborlasensichkleinereMengen
gasförmigr Salzsäure leicht herstellen, indem man in
eine käufliche Salzsäure (p = 1,18) etwas konzentrierte
Schwefelsäure(p=1,84)eintropfen lässt.Dadiefreige-
setzte Salzsäure sehr schnell vom Methanol absorbiert
wird, sind beim Lösen die nötigen Vorkehrungen zu
treffen(z.B.indemmandasGasumgekehrtdurcheinen
kleinen Trichter einleitet, dessen Rand die Oberfläche
des Methanols berührt). Größere Mengen Salzsäure-Methanollösung lassen sich auf Vorrat herstellen, da sie
in dunklen Glasflaschen mit Glasstöpsel haltbar ist.
DiesesReagenzkannauchdurchLösungvonAcethylch-
loridinwasserfreiem Methanolhergestellt werden.
2.6.1.4. Verfahren
— In die Ampulle 0,2 g der über Natriumsulfat getrockneten und
filtrierten Ölprobe geben, 2 ml der Salzsäure-Methanollösung
zufügen unddieAmpulle schließen.
— DieAmpulle40MinutenineinWasserbadvon100ºCtauchen.
— Unter fließendem Wasser abkühlen, öffnen, 2 ml destilliertes
Wasserund1mlHexanzugeben.
— Zentrifugieren unddiegebrauchsfertige Hexanphaseabnehmen.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—56
▼M19
2.6.2. Methode D
2.6.2.1. Prinzip
DaszuanalysierendeFettwirdunterRückflussmiteinemGemischaus
Methanol, Hexan und Schwefelsäure erhitzt. Die dabei entstehenden
Methylester werdenmit Petrolether extrahiert.
2.6.2.2. Geräte
— Reaktionsgefäß, ca. 20 ml Inhalt, Rückflusskühler von ca. 1 m
Länge mitSchliff,
— 5-ml-Messpipette,
— 50-ml-Scheidetrichter,
— 10-und25-ml-Messbecher,— 15-ml-Reaktionsgefäß mitkonischemBoden.
2.6.2.3. Reagenzien
— Methylierungsreagenz: wasserfreies Methanol, Hexan und Schwe-
felsäure (p=1,84)imVerhältnis75:25:1(v/v/v),
— Petrolether, 40-60ºC,
— wasserfreiesNatriumsulfat.
2.6.2.4. Verfahren
In das 20-ml-Reaktionsgefäß 0,1 g Ölprobe geben und 5 ml Methylie-
rungsreagenzzufügen.
Rückflusskühler anbringen und im siedenden Wasserbad 30 Minuten
erhitzen (Anmerkung2).
Die Mischung quantitativ mit 10 ml destilliertem Wasser und 10 ml
Petrolether in einen 50-ml-Scheidetrichter umfüllen. Kräftig schütteln
und die Phasen absetzen lassen. Die wässrige Schicht ablaufen lassen
und die Petroletherschicht zweimal mit je 20 ml destilliertem Wasser
waschen. In den Scheidetrichter eine kleine Menge wasserfreies
Natriumsulfat geben, schütteln, einige Minuten stehen lassen und
filtrieren. Das Filtrat in das 15-ml-Reaktionsgefäß mit konischem
Bodengeben.
Das Lösungsmittel im Wasserbad unter Einleiten von Stickstoff
abdampfen.
Anmerkung 2: Zur Kontrolle des Siedevorgangs einen Glasstab in das
Reaktionsgefäß stellen und die Temperatur nicht über
90ºCansteigen lassen.
3.Präzisionsparameter
DiestatistischeAuswertungderPräzisionderMethodenAundBwurde
vomInternationalenOlivenölratinseinerMethodeCOI/T.20/Dok.Nr.24
veröffentlicht.
EMPFEHLUNGEN ZUR GASCHROMATOGRAPHISCHEN ANALYSE DER
FETTSÄUREESTERVONOLIVENÖLUNDOLIVENTRESTERÖL
1.Verfahren
DiegaschromatographischeAnalysederFettsäureesterinHeptanerfolgt
nach der Norm ISO 5508 mit einer Kapillarsäule (Länge 50 m, Innen-
durchmesser 0,25 oder 0,32 mm), beschichtet mit einer
Cyanopropylsilikonphase, die zur Bestimmung der trans-Isomere von
Fettsäurenangegeben ist(COI/T.20/Dok.Nr.17).
Schaubild1zeigt dastypische chromatographische Profileines Oliven-
tresteröls mit Fettsäuremethyl- und -ethylestern sowie trans-Isomeren
vonMethylestern.
2.Berechnungen
2.1. Bei der Berechnung der Fettsäurezusammensetzung und ∆ECN42
werdenalle folgendenFettsäurenberücksichtigt:
Myristinsäure(C14:0);
Palmititinsäure (C16:0), Summe der den Methyl- und Ethylestern
entsprechenden Peakflächen;
Palmitoleinsäure (C16:1), Summe der den ω9- und ω7-Isomeren der
Methylester entsprechenden Peakflächen;1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—57
▼M19
Heptadecansäure/Margarinsäure (C17:0);
Heptadecensäure (C17:1);Stearinsäure (C18:0);Ölsäure (C18:1), Summe der den ω9- und ω7-Isomeren der Methyle-
ster, den Ethylestern und den trans-Isomeren der Methylester
entsprechenden Peakflächen;
Linolsäure (C18:2), Summe der den Methyl- und Ethylestern und den
trans-IsomerenderMethylester entsprechenden Peakflächen;
Arachinsäure(C20:0);
Linolensäure (C18:3).SummederPeakflächen derMethylester undder
trans-IsomerederMethylester;
Eïcosensäure(C20:1);
Behensäure(C22:0);Lignocerinsäure (C24:0).BeiderBerechnungderGesamtflächebleibtdasSqualenunberücksich-
tigt.
2.2. ZurBerechnungvontrans-C18:1wirdderdenMethylesterndieserFett-
säureentsprechendePeakherangezogen.FürdieSumme[trans-C18:2+
trans-C18:3] werden alle den trans-Isomeren dieser beiden Fettsäuren
entsprechenden Peaks addiert. Die Gesamtfläche berechnet sich aus
allen unter2.1genannten Peaks(s.COI/T.20/Dok.Nr.17).
Der Prozentsatz der einzelnen Fettsäuren wird nach folgender Formel
berechnet:% X=(Fläche X×100)/(Gesamtfläche)
Schaubild 1: Gaschromatogramm eines Oliventresteröls nach der Methode derKaltmethylierung. Die Peaks entsprechen den Methylestern, soweit nichts
anderesangegeben ist.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—58
▼B
ANHANG XI
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN FLÜCHTIGEN HALOGENIERTEN
LÖSUNGSMITTELN IN OLIVENÖL
1. PRINZIP
Gaschromatographische Headspace-Analyse.
2. GERÄTE
2.1. Gaschromatographmit Elektroneneinfangdetektor (ECD).
2.2. Headspace-Vorrichtung.2.3. GaschromatographischeGlassäulevon2mLängeund2mmDurchmesser.
StationärePhase:10%OV101odereinegleichwertige Phase,aufgezogen
auf mit Säure gewaschenem und silanisiertem Kieselgur mit einer
Korngrößevon80—100Mesh.
2.4. Träger- und Hilfsgas: Stickstoff für die Gaschromatographie, geeignet für
Elektroneneinfangdetektoren.
2.5. Glasfläschchen 10—15 ml, versehen mit einem Verschluß aus Aluminium
undTeflon, dereine Entnahme mit HilfeeinerSpritzeermöglicht.
2.6. Klemmen fürabsolutdichten Verschluß.
2.7. Spritzen 0,5bis2ml,zumEinspritzen vonGas.
3. REAGENZIEN
Standard: Flüchtige halogenierte Lösungsmittel miteinem fürdieGaschro-
matographie geeigneten Reinheitsgrad,
Pentanmit einem fürdieGaschromatographie geeigneten Reinheitsgrad.
4. ANALYSENVERFAHREN
4.1. Etwa 3 g Öl in ein Glasfläschchen (das nicht wieder verwendet werden
darf)genaueinwiegenunddasFläschchenmitdemVerschlußabsolutdicht
verschließen. DasFläschchenbei70ºCeine StundeineinenThermostaten
stellen. Mit Hilfe einer Spritze genau ein Volumen von 0,2 bis 0,5 ml aus
dem Dampfraum entnehmen und auf die Säule des Gaschromatographen
spritzen.DerGaschromatograph istwiefolgteinzustellen:
— Verdampfungstemperatur: 150ºC,
— Säulentemperatur: 70bis80ºC,— Detektortemperatur: 200bis250ºC.
Es können auch andere Temperaturen eingestellt werden, sofern dabei
gleichwertige Ergebnisseerziehlt werden.
4.2. Referenzlösungen:StandardlösungenmitunterschiedlichenKonzentrationen
von flüchtigen halogenierten Lösungsmitteln zwischen 0,05 und 1 mg/kg
herstellen unter Verwendung von Olivenöl, das frei von Lösungsmittel-
spuren ist. Falls erforderlich, werden die halogenierten Lösungsmittel mit
Pentanverdünnt.
4.3. Quantitative Auswertung. Das Verhältnis bilden zwischen den Peakflächen
oder den Peakhöhen der Probe und der Standardlösung, deren Konzentra-
tion der erwarteten Konzentration am nächsten liegt. Liegt der relative
Unterschied über 10 %, so muß die Analyse mit einer neuen Standar-
dlösung wiederholt werden, bis ihre Konzentration innerhalb des
obengenannten relativen Unterschieds liegt. Der Gehalt wird auf der Basis
desMittelwertseinzelner Einspritzungen ermittelt.
4.4. Abfassung der Ergebnisse. Die Ergebnisse werden in mg/kg (ppm) ange-
geben.DieNachweisgrenze desVerfahrensliegt bei0,01mg/kg.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—59
▼M19
ANHANG XII
ORGANOLEPTISCHE PRÜFUNG VON NATIVEN OLIVENÖLEN
1. GEGENSTANDUNDANWENDUNGSBEREICH
Diese Verfahrensvorschrift dient der Festlegung der Kriterien für die
Bewertung der organoleptischen Merkmale von nativen Olivenölen im
Sinne von Nummer 1 des Anhangs der Verordnung 136/66/EWG und
beschreibt dieMethodefürihrediesbezügliche Einstufung.
Die Verfahrensvorschrift gilt nur für die Einstufung nativer Olivenöle
entsprechend ihrer Fruchtigkeit und dem Umfang der Mängel, wie sie von
einer Gruppe ausgewählter und geschulter Prüfer gemäß Nummer 4
bestimmt werden.
2. ALLGEMEINES
Für die allgemeinen Grundbegriffe, den Prüfraum, die grundlegende
Verfahrensweise und das Prüfglas wird empfohlen, sich an die entspre-
chenden VorgabendesInternationalen Olivenölrates zuhalten.
3. SPEZIFISCHEBEGRIFFE
3.1.Positive Attribute
Fruchtig: Gesamtheit der je Olivensorte und Merkmale eines Öls unmit-
telbar oder retronasal wahrgenommenen Geruchsempfindungen aus
gesundenundfrischen,grünenoderreifenFrüchten.
Bitter:typischerGeschmackvonÖlausgrünenodergrünlichen Oliven.
Scharf: taktil empfundenes Prickeln, typisch für Öle, die zu Beginn des
WirtschaftsjahreshauptsächlichausnochgrünenOlivengewonnenwerden.
3.2.Negative Attribute
Stichig: typisches Flavour bei Öl aus Oliven, die sich in einem Zustand
fortgeschrittener anaeroberGärungbefinden.
Modrig-feucht : typisches Flavour bei Öl aus Oliven mit Schimmel- und
Hefepilzbefall wegen mehrtägiger Lagerung der Früchte unter feuchten
Bedingungen.
Schlammig: typisches Flavour bei Öl, das mit Dekantier-„Schlämmen“ in
BeckenundFässerninKontaktwar.
Wein- oder essigartig : typisches Flavour bei bestimmten Ölen, an Wein
oder Essig erinnernd und in erster Linie bedingt durch einen Gärungspro-
zessderOliven,beidemEssigsäure,Ethylacetat undEthanolentstehen.
Metallisch: an Metall erinnerndes Flavour, typisch für Öl, das beim
Vermahlen, Schlagen, Pressen oder Lagern lange mit Metallflächen in
Kontaktstand.
Ranzig:Flavourvonoxidierten Ölen.
Brandig oder erhitzt : typisches Flavour bei Ölen aufgrund einer über-
mäßigen und/oder zu langen Erwärmung bei der Gewinnung und
insbesondere durch unsachgemäße Wärmebehandlung bei Herstellung der
Paste.
Heuartig-holzig :typischesFlavourbeibestimmtenÖlen,dasvontrockenen
Olivenherrührt.
Roh: Bezeichnung für Öl, das im Mund einen dickflüssigen, pastösen
Sinneseindruck hinterlässt.
Schmierölartig : Flavour bei Ölen, das an Dieseltreibstoff, Fett oder Mine-
ralölerinnert.
Fruchtwasserartig : Flavour bei Ölen, das von längerem Kontakt mit
Fruchtwasserherrührt.
Lakig:FlavourbeiÖlenausOliven,dieinSalzlake aufbewahrt wurden.
Espartograsartig : typisches Flavour bei Ölen aus Oliven, die mit Hilfe
neuer Espartograskörbe gepresst wurden. Dieses Aroma kann in verschie-
denen Nuancen auftreten, je nachdem, ob Körbe aus grünem oder
trockenem Espartograsverwendet wurden.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—60
▼M19
Erdig: Flavour bei Ölen, das von anhaftender Erde oder Schlamm unge-
waschenerOlivenherrührt.
Wurmstichig: Flavour bei Ölen aus Oliven mit starkem Befall von Larven
derOlivenfliege (Bactrocera Oleae)
Gurkenartig: Flavour bei Ölen, das von zu langem Lagern in luftdichten
Behältnissen, insbesondere Weißblechdosen, und dem dadurch entste-
henden2,6-Nonadienalherrührt.
4. PRÜFERGRUPPE
DiePrüfergruppewirdvomMitgliedstaat benanntundsetztsichauseinem
Prüfungsleiter und acht bis zwölf sensorischen Prüfern zusammen. Für das
Wirtschaftsjahr 2001/02 darf die Zahl der Prüfer jedoch weniger als acht
betragen.
Der Prüfungsleiter muss über eine solide Ausbildungsgrundlage und über
Sach- und Fachkenntnisse auf dem Gebiet der verschiedenen Öltypen
verfügen.EristverantwortlichfürdieGruppe,ihreOrganisationundTätig-
keit, die Vorbereitung, Verschlüsselung und Aufmachung der Proben für
diePrüfersowiefürdieErfassungundstatistische AuswertungderDaten.
Der Prüfungsleiter wählt die Prüfer aus, überwacht ihre Schulung und
kontrolliertihrePrüfungsleistungumsicherzustellen,dassihreUrteilsfähig-
keit erhalten bleibt.
Die für die organoleptische Bewertung von Olivenöl zuständigen sensori-
schen Prüfer werden nach ihrer Eignung ausgewählt und geschult,
ähnliche Proben voneinander zu unterscheiden und so dem Leitfaden des
Internationalen Olivenölrates für die Auswahl, Schulung und Kontrolle
qualifizierter sensorischerPrüfervonnativem Olivenölzuentsprechen.
DiePrüfergruppenmüssensichverpflichten,andenaufnationaler,gemein-
schaftlicher oder internationaler Ebene vorgesehenen organoleptischen
Bewertungen zur regelmäßigen Kontrolle und zur Harmonisierung der
Wahrnehmungskriterien teilzunehmen. Sie sind weiter verpflichtet, dem
betreffenden Mitgliedstaat jährlich alle Auskünfte über ihre Zusammenset-
zung und die Zahl der in ihrer Funktion als zugelassene Prüfergruppe
durchgeführten Bewertungenmitzuteilen.
5. VERFAHREN FÜR DIE ORGANOLEPTISCHE BEWERTUNG UND
EINSTUFUNGVONOLIVENÖL
5.1.Verwendung der Profilbeschreibung durch den Prüfer
Die zu verwendende Profilbeschreibung ist in Anlage A dieser Verfahren-
svorschriftfestgelegt.
Jeder zur Prüfergruppe gehörende Prüfer muss das im Prüfglas befindliche
Öl zunächst riechen und dann verkosten(1), um einen Gesamtsinnesein-
druck aus Geruchs-, Geschmacks-, taktilen und kinästhetischen
Empfindungen gewinnen und analysieren zu können. Die Intensität der
Wahrnehmung jedes negativen und positiven Attributs ist in der Profilbe-
schreibungeinzutragen.
Werden negative Attribute wahrgenommen, die nichtinderProfilbeschrei-
bung vermerkt sind, so sind diese unter Verwendung der Begriffe gemäß
Nummer 3.2 dieser Verfahrensvorschrift, mit denen sie am zutreffendsten
beschrieben werden,inderSpalte„Sonstige“anzugeben.
5.2.Verwendung der Angaben durch den Prüfungsleiter
Der Prüfungsleiter sammelt die ausgefüllten Profilbeschreibungen der
einzelnen Prüfer, um die zugeteilten Intensitäten zu überprüfen; bei Fest-
stellung einer Anomalie fordert erdenPrüferauf,seineProfilbeschreibung
zuüberarbeiten unddenPrüfversucherforderlichenfalls zuwiederholen.
Der Prüfungsleiter kann die Angaben der einzelnen Prüfer nach der
Methode zur statistischen Berechnung des Medians gemäß Anlage B in
einer elektronischen Datenbank erfassen. Die Daten für eine Probe werden
anhand einer Matrix aus10Spalten, die jeweils den10sensorischenAttri-
buten entsprechen, und n Zeilen erfasst, die n Prüfern der Prüfergruppe
entsprechen.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—61
(1) DerPrüferkannvomVerkostenabsehen,wennereinigeausgeprägtenegativeAttribute
feststellt; ervermerkt dieseaußergewöhnlichenUmstände inderProfilbeschreibung.
▼M19
Wird in der Spalte „Sonstige“ von mindestens 50 % der Prüfer ein nega-
tives Attribut eingetragen, so muss der Prüfungsleiter den Median dieses
Attributsberechnen unddieentsprechende Einstufungvornehmen.
Im Falle von Analysen im Rahmen von Konformitätskontrollen oder
Gegengutachten muss der Prüfungsleiter die organoleptische Bewertung
desÖlsimAbstandvonmindestens einem Tagdreimal vornehmen lassen;
der Median der Attribute wird anhand der Gesamtangaben der Profilbe-
schreibungderdreiVersucheberechnet.
5.3.Einstufung der Öle
Das Öl wird entsprechend dem Median der festgestellten Mängel und dem
Median des Attributs „fruchtig“ unter den nachstehenden Bezeichnungen
eingestuft. Unter Median der Mängel wirdder Median des am intensivsten
wahrgenommenen negativen Attributs verstanden. Der Wert des robusten
Variationskoeffizienten für dieses negative Attribut darf höchstens 20 %
betragen.
a)Natives Olivenöl extra : der Median der Mängel ist 0 und der Median
desAttributs„fruchtig“ istgrößerals0.
b)Natives Olivenöl :derMedianderMängelistgrößerals0undkleinerals
odergleich2,5undderMediandesAttributs„fruchtig“istgrößerals0.
c)Gewöhnliches natives Olivenöl : der Median der Mängel ist größer als
2,5 und kleiner als oder gleich 6,0 oder der Median der Mängel ist
kleiner als oder gleich 2,5 und der Median des Attributs „fruchtig“ ist
gleich 0.
d)Natives Lampantöl :derMedianderMängelistgrößerals6,0.
Ab 1. November 2003 werden die Kategorien c) und d) jedoch durch
folgende Kategorieersetzt:
c)Lampantöl: der Median der Mängel ist größer als 2,5 oder der Median
der Mängel ist kleiner oder gleich 2,5 und der Median des Attributs
„fruchtig“ istgleich 0.
5.4.Sonderfälle
Liegt derMedian füreinanderes positivesAttributals„fruchtig“ über5,0,
sovermerkt derPrüfungsleiterdiesaufderAnalysebescheinigung desÖls.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—62
▼M19
ANLAGE A
1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—63
▼M19
ANLAGE B
METHODE ZUR BERECHNUNG DES MEDIANS UND DER VERTRAU-
ENSINTERVALLE
Median
DerMedianistdiereelleZahlXm,gekennzeichnetdurchdieTatsache,dassdie
Wahrscheinlichkeit (P), dass die Werte der Verteilung (X) unter dieser Zahl
(Xm) liegen, geringer oder gleich 0,5 ist und dass gleichzeitig die Wahrschein-
lichkeit (P), dass die Werte der Verteilung (X) unter dieser Zahl (Xm) liegen
oder ihr entsprechen, höher oder gleich 0,5 ist. Nach einer anderen Definition
ist der Median das 50. Perzentil einer Zahlenverteilung in steigender Reihen-
folge. Mit anderen Worten, der Median entspricht bei einer ungeraden Zahl
von Werten in nach ihrer Größe geordneten Folge dem zentralen Wert und bei
einer gerader Zahl von Werten dem Durchschnittswert der beiden zentralen
Werte.
Robuste Standardabweichung
Umeinenzuverlässigen Schätzwert fürdieVariabilität zuerhalten, diesichum
den Median bildet, ist der Schätzwert der robusten Standardabweichung nach
Stuart und Kendall heranzuziehen. Die Formel der asymptotischen Standardab-
weichung S hängt ab von N und IQR. N ist die Zahl der Beobachtungen und
IQRderQuartilabstand, d.h.derrobusteSchätzwert derVariabilität derbetref-
fenden Angaben (der Quartilabstand umfasst genau 50 % der Fälle einer
beliebigen Wahrscheinlichkeitsverteilung). Zur Berechnung des Quartilabstands
wird die Dimension der Abweichung zwischen dem 75. und 25. Perzentil
berechnet.
IQR=75.Perzentil-25.PerzentilDas Perzentil ist der Wert Xpc, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass die
Wahrscheinlichkeit (P), dass die Werte der Verteilung (X) unter Xpc liegen,
niedriger alseinbestimmtes Hunderstelistoderihmentspricht unddassgleich-
zeitig die Wahrscheinlichkeit (P), dass die Werte der Verteilung niedriger als
Xpcsindoderihm entsprechen, höheralsdasgenannte Hunderstelistoderihm
entspricht. Das Hundertstel gibt die Fraktion der in Frage kommenden Vertei-
lungan.ImFalldesMediansentsprichtsie50/100.
Mit anderen Worten, das Perzentil ist der Verteilungswert, der einembestimmten Bereich entspricht, der unter Zugrundelegung der Verteilungs- oder
Dichtekurve bestimmt wird. Beispiel: das 25. Perzentil ist der Verteilungswert,
dereinem Bereichvon0,25oder25/100entspricht.
Robuster Variationskoeffizient in %
Der CVR ist eine reine Zahl, d. h. ein Wert ohne Dimension, die den Prozent-
satz der Variabilität der analysierten Zahlenreihe gemessen am Median Me
angibt; daher ist dieser Koeffizient zur Überprüfung der Zuverlässigkeit der
Mitglieder derPrüfergruppebesondersgeeignet.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—64
▼M19
Vertrauensintervalle bei 95 % für den Median
Das Vertrauensintervall (I.C.) von 95 % (der Wert des Fehlers erster Art
entspricht 0,05 bzw. 5 %) ist das Intervall, in dem der Median, ausgehend von
der Hypothese, dass sich der Versuch unendliche Male wiederholen ließe,
schwanken könnte. In der Praxis gibt dieses Intervall das Variabilitätsintervall
des Versuchs unter den vorgesehenen operationellen Bedingungen an, in der
Annahme, dass der Versuch mehrmals wiederholt werden könnte. Das Intervall
ist,wiederCVR,nützlichzurBewertungderZuverlässigkeit desVersuchs.
I. C. Sup. = Me + (c.S)I. C. Inf. = Me - (c.S)wobei c, bei einem Vertrauensin-
tervall von0,95,einem Wertvon1,96entspricht.
Die Einstufung erfolgt durch Vergleich der Medianwerte mit den gemäß
Nummer 5.3 der Verfahrensvorschrift bestimmten Bezugsintervallen. Eine
entsprechendeComputer-SoftwaregestatteteinevisuelleEinstufungintabellari-
scherodergrafischer Form.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—65
▼B
ANHANG XIII
NEUTRALISIERUNG UND BLEICHUNG VON OLIVENÖL IM LABO-
RATORIUM
1. NEUTRALISIEREN UND BLEICHEN DES OLIVENÖLS IM LABO-
RATORIUM
1.1.Neutralisieren des Öls
1.1.1. Geräte
— hohes300-ml-Becherglas,
— Laborzentrifuge mit 100-ml-Gläsern,— 250-ml-Becherglas,— 100-ml-Rundkolben,— 1-Liter-Scheidetrichter.
1.1.2. Reagenzien
— 12%igewäßrigeNatriumhydroxidlösung,
— 1%igeLösungvonPhenolphthalein inÄthylalkohol,— Hexan,analysenrein,— Isopropylalkohol,analysenrein.
1.1.3. Verfahren
a)Öle mit einem Gehalt an freien Fettsäuren, berechnet als Ölsäure, von
weniger als 30 %
Mangibt 50 g rohes Öl in ein hohes 300-ml-Becherglas und erwärmt
im Wasserbad auf 65 ºC. Unter langsamem Rühren gibt man — mit
einem Überschußvon 5%—soviel 12%ige Natriumhydroxidlösung
hinzu, wie dem Gehalt des Öls an freien Fettsäuren entspricht. Unter
Aufrechterhaltung der Temperatur von 65 ºC wird 5 Minuten weiter-
gerührt.
DasGanzewirdin100-ml-ZentrifugengläserüberführtunddieSeifen-
massedurchZentrifugieren abgetrennt.Dasdekantierte Ölwirdinein
250-ml-Becherglas gegeben und mit 50 bis 60 ml kochendem destil-
liertem Wasser gewaschen. Die wäßrige Phase wird mit Hilfe eines
Saughebers entfernt. Die Waschungen werden wiederholt, bis auch
SpurenvonSeifenrestenentferntsind(VerschwindenderRosafärbung
desPhenolphthaleins).
Zur Entfernung der geringen Restwassermengen wird das Öl zentri-
fugiert.
b)Öle mit einem Gehalt an freien Fettsäuren, berechnet als Ölsäure, von
mehr als 30 %
In einen 1-Liter-Scheidetrichter gibt man 50 g rohes Öl, 200 ml
Hexan, 100 ml Isopropylalkohol und — mit einem Überschuß von
0,3 % — so viel 12%ige Natriumhydroxidlösung, wie dem Gehalt
desÖlsanfreienFettsäurenentspricht.
Eine Minute lang kräftig rühren. 100 ml destilliertes Wasser hinzu-
geben, erneut rühren und stehen lassen. Nach der Phasentrennung
wird die untere seifenhaltige Schicht abgelassen. In vielen Fällen
bildet sich zwischen den beiden Phasen (ölhaltige obere und wäßrige
untere Schicht) eine Zwischenschicht, die Schleimstoffe und unlös-
liche Substanzenenthält unddieebenfallsentfernt werdenmuß.
Anschließend wird die Hexanlösung des neutralen Öls mit Portionen
von jeweils 50 bis 60 ml einer Lösung aus Isopropylalkohol und
destilliertem Wasser im Verhältnis 1:1 (Volumenteile) bis zum
Verschwinden der Rosafärbung des Phenolphthaleins gewaschen.
Darauf wird das Hexan durch Abdestillieren im Vakuum (z. B. mit
HilfeeinesRotationsverdampfers) vollständigentfernt.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—66
▼M6
▼B
▼B
1.2.Bleichen des neutralisierten Öls
1.2.1. Geräte
— 250-ml-Dreihalskolben mit Schliffansätzen für:
a) Thermometer mitUnterteilung in1ºCfürMessungenbis90ºC,
b mechanisches Rührwerk, 250 bis 300 Umdrehungen/min, geeignet
zumBetrieb imVakuum,
c) AnschlußfürdieVakuumpumpe;
— Vakuumpumpefür15bis30Millibar Endvakuum,mitManometer.
1.2.2. Verfahren
In den Dreihalskolben werden etwa 100 g neutralisiertes Öl eingewogen.
Thermometer und Rührwerk einführen, Vakuumpumpe anschließen und
auf 90 ºC unter Umrühren erwärmen; die Temperatur wird unter
ständigem Rühren so lange aufrechterhalten, bis das zu untersuchende
ÖlvollständigvomWasserbefreit ist(etwa30Minuten).
Danach wird das Vakuum unterbrochen und 2 bis 3 g aktivierte Blei-
cherdezugegeben.
Dann wird wieder ein Vakuum mit einem Druck von 15 bis 30 Millibar
hergestellt, wobei über eine Zeit von 30 Minuten die Temperatur auf
90 ºC und die Drehzahl des Rührwerks bei etwa 250 Umdrehungen/min
gehalten werden. Danach wird in einem thermostatisch regulierten Trok-
kenschrankwarmfiltriert (50—60ºC).1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—67
▼M19
▼B
ANHANG XV
1. ÖLGEHALTDEROLIVENTRESTER
1.1.Geräte
— Geeigneter Extraktionsapparat mit 200-bis250-ml-Kolben,
— elektrisch beheiztes Bad(Sandbad,Wasserbadusw.)oderHeizplatte,— Analysenwaage,— Trockenschrank,eingestellt aufhöchstens80ºC,— elektrischer Trockenschrank mit Thermostat, eingestellt auf 103 ºC
± 2 ºC, der unter Einblasen von Luft oder unter vermindertem Druck
betrieben werdenkann,
— mechanischeMühle,leichtzureinigen,mitderdieTresterohneErwär-
mung und ohne merkliche Verringerung ihres Gehalts an Wasser und
Ölzerkleinert werdenkönnen,
— ExtraktionshülseundWatteoderFilterpapier,freivonmitHexanextra-
hierbaren Stoffen,
— Exsikkator,— Sieb,Maschendurchmesser1mm,— Siedesteinchen, zuvorgetrocknet.
1.2.Reagenzien
— technisches n-Hexan; Rückstand bei vollständiger Verdampfung unter
0,002g/100ml.
2. ARBEITSVORSCHRIFT2.1.Vorbereitung der Probe
Die Probe wird, wenn nötig, in der zuvor gut gereinigten mechanischen
Mühle so weit gemahlen, daß die Teilchen vollständig das Sieb passieren
können.
Etwa ein Zwanzigstel der Probe ist zur Reinigung der Mühle zu benutzen;
dieses Mahlgutist zuverwerfen. DerRest istfein zumahlen, dasMahlgut
aufzufangen, sorgfältig zumischenundunverzüglich zuanalysieren.
2.2.Untersuchungsprobe
Etwa 10 g der Probe werden nach dem Mahlen auf 0,01 g genau für die
Untersuchungabgewogen.
2.3.Vorbereitung der Extraktionshülse
Die Probe wird in die Hülse gegeben und diese mit einem Wattebausch
verschlossen. Bei Verwendung von Filterpapier wird das Mahlgut darineingeschlagen.
2.4.Vertrocknung
Wenn die Trester sehr feucht sind (Gehalt an Wasser und flüchtigen
Stoffen größer als 10 %), ist vorzutrocknen, wobei die gefüllte Hülse
(bzw. das Filterpapier) so lange wie nötig in den auf höchstens 80 ºC
geheizten Trockenschrank gestellt wird, um den Gehalt an Wasser und
flüchtigen Stoffenaufunter10%zusenken.
2.5.Vorbereitung des Kolbens
Der Kolben, der 1 bis 2 Siedesteinchen enthält und zuvor im Trocken-
schrank bei 103 ºC ± 2 ºC getrocknet und danach mindestens 1 Stunde
langimExsikkatorabgekühlt wurde,wirdauf1mggenaugewogen.
2.6.Erste Extraktion
DieHülse(bzw.dasFilterpapier)mitderProbewirdindenExtraktionsap-
parat gestellt, die benötigte Menge Hexan in den Kolben gegeben, der
Kolben an den Extraktionsapparat angeschlossen und das Ganze auf das
elektrischeHeizbadgestellt.DieHeizungistsoeinzustellen,daßderRück-
fluß mindestens 3 Tropfen in der Sekunde beträgt (mäßiges, nicht heftiges
Sieden).1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—68
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Nach 4stündiger Extraktion läßt man abkühlen. Die Hülse wird aus dem
Extraktionsapparat genommen und in einen Luftstrom gestellt, um den
größtenTeil desLösungsmittels, mitdemsiedurchtränkt ist,zuentfernen.
2.7.Zweite Extraktion
Die Hülse wird in die Mikrokugelmühle entleert, und es wird so fein wie
möglich gemahlen. Das Mahlgut wird quantitativ in die Hülse zurückge-
gebenunddiesewiederindenExtraktionsapparat gestellt.
Es wird nochmals 2 Stunden extrahiert, wobei der die erste Extraktion
enthaltene Kolbenverwendetwird.
DieimExtraktionskolbenenthalteneLösungmußklarsein.Wennnicht,ist
sieüberFilterpapier zufiltrieren, wobeiderersteKolbenunddasFilterpa-
pier mehrmals mit Hexan gewaschen werden. Das Filtrat und die
Waschflüssigkeit werden in einem zweiten, zuvor getrockneten und auf
1mgabgewogenen Kolbenaufgefangen.
2.8.Entfernung des Lösungsmittels und Wiegen des Extrakts
Durch Destillieren auf dem elektrischen Heizbad wird der größte Teil des
Lösungsmittels entfernt. Die letzten Lösungsmittelspuren werden durch
20minütiges Erhitzen des Kolbens im Trockenschrank bei 103 ºC ± 2 ºC
beseitigt. Die Beseitigung der Lösungsmittelreste wird durch zeitweiliges
Einführen eines Luftstroms oder besser eines Inertgasstroms oder durch
Arbeiten untervermindertem Druckerleichtert.
Den Kolben läßt man wenigstens 1 Stunde im Exsikkator abkühlen und
wiegtihndannauf1mggenau.
Danach wird der Kolben erneut 10 Minuten unter den gleichen Bedin-
gungenerhitzt, imExsikkatorabgekühlt undgewogen.
Der Unterschied zwischen den Ergebnissen der zwei Wägungen darf
höchstens 10 mg betragen. Wenn nicht, ist erneut 10 Minuten zu erhitzen,
dann wieder abkühlen zu lassen und zu wiegen, bis der Gewichtsunter-
schied höchstens 10 mg beträgt. Das letzte Gewicht des Kolbens wird
notiert.
FürjedeUntersuchungwerdenmitdergleichenProbezweiBestimmungen
durchgeführt.
3. ERGEBNISSE
3.1.Berechnung und Formel
a) Der Extrakt des Rohprodukts läßt sich in Gewichtsprozenten durch
nachstehende Formelberechnen:
S=m1×100
m0
Dabeisind:
S = Gewichtsprozente desExtraktsdesRohprodukts,
m0= GewichtderUntersuchungsprobeing,
m1= GewichtdesExtraktsnachderTrocknunging.
AlsErgebnisistdasarithmetische MittelausdenbeidenBestimmungen
zunehmen,fallsdieBedingungenderWiederholbarkeit erfüllt sind.
DasErgebniswirdaufeine Dezimalstelle angegeben.
b) Der Extrakt, bezogen auf den Trockenstoff, läßt sich berechnen durch
dieFormel:
S×100
100−U=Extrakt in%Fett,bezogenaufdenTrockenstoff.
Dabeisind:
S = Gewichtsprozente desExtraktsdesRohprodukts(vgl.a)),
U = seinGehaltanWasserunfflüchtigen Stoffen.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—69
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3.2.Wiederholbarkeit
DieDifferenzzwischendenErgebnissenvonzweigleichzeitigoderschnell
nacheinander von ein und demselben Analytiker vorgenommenen Bestim-
mungendarfnichtmehrals0,2gHexan-Extrakt je100gProbebetragen.
Andernfalls ist die Analyse mit zwei weiteren Untersuchungsproben zu
wiederholen. Liegt die Differenz wieder über0,2g,soistalsErgebnisdas
arithmetische Mittel ausallen vierBestimmungen zunehmen.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—70
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ANHANG XVI
BESTIMMUNG DER IODZAHL
1. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Internationale Norm beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der
Iodzahl von tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen, nachfolgend als
„Fette“ bezeichnet.
2. DEFINITION
IndieserInternationalen Normgilt folgendeDefinition:
2.1. Iodzahl: Iodmenge, die unter den in dieser Internationalen Norm beschrie-
benenVersuchsbedingungenvonderProbeaufgenommen wird.
DieIodzahlwirdinGrammIodpro100gProbeangegeben.
3. PRINZIP
DiezuuntersuchendeProbewirdindemLösungsmittelgelöstundmitdem
Wijs-Reagensversetzt. Nacheinerbestimmten Zeit werdenKaliumiodidlö-
sung und Wasser zugegeben und das freigesetzte Iod mit einer
Natriumthiosulfatlösung titriert.
4. REAGENZIEN
AlleReagenzien müssenvonanerkannter analysenreiner Qualitätsein.
4.1. Kaliumiodidlösung, 100g/l,diekeinIodatoderfreiesIodenthält.4.2. Stärkelösung
5 g lösliche Stärke mit 30 ml Wasser mischen und in 1000 ml kochendes
Wassergeben;3Minutenkochenundabkühlenlassen.
4.3. Natriumthiosulfat, eingestellte Standardlösung c (Na
2S2O3·5 H2O) = 0,1
mol/l, höchstens7TagevorderVerwendungeingestellt.
4.4. Lösungsmittel, hergestellt durch Mischen gleicher Volumenteile Cyclo-
hexanundEssigsäure.
4.5. Wijs-Reagens, das Iodmonochlorid in Essigsäure enthält. Es soll das im
Handelerhältliche Wijs-Reagensverwendet werden.
Anmerkung: DasReagensenthält 9gICl3+9gIinEssigsäure.
5. GERÄTE
Übliche Laboreinrichtung undinsbesonderenachstehende Geräte:
5.1. Mikrobechergläschen, die sich für die zu untersuchende Probe und zum
Einführen indieKolben(5.2)eignen.
5.2. 500-ml-Erlenmeyerkolben mitSchliffstopfen,vollständigtrocken.
6. VORBEREITUNGDERANALYSEPROBE
Diehomogenisierte ProbewirdüberNatriumsulfat getrocknet undfiltriert.
7. VERFAHREN7.1.Probemenge
Die Menge der zu untersuchenden Probe hängt von der erwarteten Iodzahl
ab(Tabelle 1).1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—71
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Tabelle 1
Erwartete Iodzahl Massederzuuntersuchenden Probe
wenigerals5 3,00g
5—20 1,00g
21—50 0,40g
51—100 0,20g
101—150 0,13g
151—200 0,10g
Die zu untersuchende Probe wird in einem Mikrobechergläschen (5.1) auf
0,1mggenaueingewogen.
7.2.Bestimmung
Die Probe wird in einen 500-ml-Kolben (5.2) gegeben und mit 20 ml
Lösungsmittel (4.5) versetzt, um das Fett zu lösen. Genau 25 ml Wijs-
Reagens (4.6) zugeben, den Kolben mit dem Stopfen verschließen,
schwenken und dunkel stellen. FürdasWijs-Reagens sollen keine Pipetten
verwendet werden,diemit demMundaufgezogen werdenmüssen.
Dann wird in ähnlicher Weise eine Blindprobe vorbereitet; die das
Lösemittel unddasReagens,nichtaberdieProbeenthält.
Bei Proben mit Iodzahlen unter 150 muß der Kolben 1 Stunde dunkel
gestellt werden; bei Iodzahlen über 150 sowie bei polymerisierten oder
starkoxidierten Erzeugnissensindes2Stunden.
Nach Ablauf dieser Zeit wird in jeden Kolben 20 ml Kaliumiodidlösung
(4.1)und150mlWassergegeben.
Nun mit der eingestellten Natriumthiosulfat-Standardlösung (4.3) titrieren,
bis die durch Iod bedingte Gelbfärbung kaum noch sichtbar ist. Einige
Tropfen Stärkelösung (4.2) zugeben und weiter titrieren, bis die Blau-
färbungunterstarkemSchütteln verschwindet.
Anmerkung: Eine potentiometrische Bestimmung des Endpunkts ist
zulässig.
7.3.Zahl der Bestimmungen
EswerdenzweiBestimmungen mitdergleichenProbedurchgeführt.
8. DARSTELLUNGDERERGEBNISSE
DieIodzahlwirdnachfolgenderGleichungberechnet:
12;69c V1/C0V2 ðÞ
m
Hierinbedeuten:
c = die genaue zahlenmäßige Angabe der Konzentration der verwen-
detenNatriumthiosulfat-Standardlösung (4.3)inmolproLiter;
V1= Volumen der für den Blindversuch verwendeten Natriumthiosulfat-
Standardlösung(4.3)inMillilitern;
V2= Volumen der zur Bestimmung verwendeten Natriumthiosulfat-
Standardlösung(4.3)inMillilitern;
m = MassederuntersuchtenProbe(7.1)inGramm.
Als Ergebnis ist das arithmetische Mittel der beiden Bestimmungen anzu-
geben.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—72
▼M11
ANHANG XVII
METHODE ZUR BESTIMMUNG VON STIGMASTADIENEN IN
PFLANZLICHEN ÖLEN
1. ZWECK
BestimmungvonStigmastadieneninpflanzlichenÖlen,diedieseKohlen-
wasserstoffe nur in geringer Konzentration enthalten, insbesondere in
nativenOlivenölen undrohemOliventresteröl.
2. ANWENDUNGSBEREICH
DasVerfahrenläßtsichaufallepflanzlichen Öleanwenden.DieBestim-
mungen sind allerdings nur zuverlässig bei einer Konzentration dieses
Kohlenwasserstoffs von 0,01 bis 4,0 mg/kg. Die Methode eignet sich
besonders zum Nachweis von raffinierten pflanzlichen Ölen (Olivenöl,
Oliventresteröl, Sonnenblumenöl, Palmöl usw.) in nativem Olivenöl, da
raffinierte ÖleimGegensatz zunativenÖlenStigmastadien enthalten.
3. PRINZIP
Isolierung der unverseifbaren Bestandteile. Abtrennung der Steroid-Frak-
tion durch Säulenchromatographie an Kieselgel und Analyse durch
Kapillargaschromatographie.
4. GERÄTE
4.1. 250-ml-Stehkolben, zurVerwendungmit Rückflußkühlergeeignet.4.2. 200-ml-Scheidetrichter.4.3. 100-ml-Rundkolben.
4.4. Rotationsverdampfer.
4.5. Chromatographiesäule aus Glas (innerer Durchmesser 1,5 bis 2,0 cm,
Länge 50 cm) mit Teflonhahn und Glaswattebausch oder Sinterglas-
scheibe am unteren Ende. Zur Vorbereitung der Kieselgelsäule mit
ChromatographiesäulebiszueinerHöhevonetwa5cmmitHexanfüllen
und dann eine Suspension von 15 g Kieselgel in 40 ml Hexan mit Hilfe
vonmehrerenAnteilen Hexaneinschlämmen undunterleichtem Klopfen
vollständig absetzen lassen. Anschließend wasserfreies Natriumsulfat bis
zu einer Höhe von rund 0,5 cm zugeben und das überschüssige Hexan
ablaufen lassen.
4.6. Gaschromatograph mit Flammenionisationsdetektor, Split- oder cold On-
column-Injektor undOfenmiteinerEinstellgenauigkeit von±1ºC.
4.7. Fused-Silica-Kapillarsäule für Gaschromatographie (0,25 oder 0,32 mm
Innendurchmesserund25mLänge),belegtmit5%Phenylmethylsilicon,
Filmdicke 0,25 µm.
Anmerkung 1:
Andere Säulen mit vergleichbarer oder geringerer Polarität können eben-
fallsverwendetwerden.
4.8. Aufzeichnungsgerät mit Integrator mit Möglichkeit der Integration
zwischenzweiMinima.
4.9. 5-10- µl-MikrospritzefürGaschromatographie mit festerNadel.
4.10. Pilzheizhaube oderHeizplatte.
5. REAGENZIEN
Alle Reagenzien müssen, sofern nicht anders angegeben, von Analyse-
qualität sein. Es ist destilliertes Wasser oder Wasser von mindestens
gleichem Reinheitsgrad zuverwenden.
5.1. HexanoderAlkanmischungmiteinemSiedebereichvon65-70ºC,destil-
liert ineinerRektifiziersäule.
Anmerkung 2:
Das Lösungsmittel muß zur Entfernung von Verunreinigungen destilliert
werden.
5.2. Ethanol, 6%ig(v/v).1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—73
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5.3. WasserfreiesNatriumsulfat.
5.4. Ethanolische Kalilauge, 10%igeLösung.10mlWasserzu50gKalium-
hydroxid geben, umrühren und die Mischung durch Zugabe von Ethanol
lösenundmit Ethanolauf500mlauffüllen.
Anmerkung 3:
Ethanolische Kalilauge wird beim Stehen braun. Sie sollte täglich frisch
zubereitet und in dunklen Glasflaschen gut verschlossen aufbewahrt
werden.
5.5. Kieselgel 60 für Säulenchromatographie, 70-230 mesh (Merck, Art. Nr.
7734o.ä.).
Anmerkung 4:
GewöhnlichkannKieselgeldirektausdemBehälterohneVorbehandlung
verwendet werden. Manche Kieselgelpartien weisen jedoch eine geringe
Aktivität auf, waszu unbefriedigenden chromatographischen Trennungen
führt. In solchen Fällen ist wie folgt vorzugehen: das Kieselgel durch
mindestens vierstündiges Erhitzen auf 550 ºC aktivieren, nach dem
Erhitzen in einen Exsikkator stellen und nach dem Abkühlen in einen
verschließbaren Kolben überführen; 2 % Wasser zugeben und schütteln,
biskeineKlumpenmehrsichtbar sindunddasPulverfreirieselt.
Kieselgelpartien, die Chromatogramme mit sich überlappenden Peaks
ergeben, sind wie oben beschrieben zu behandeln. Eine Alternative ist
dieVerwendungvonextrareinem Kieselgel 60(Merck,Art.Nr.7754).
5.6. Stammlösung (200 ppm) von Cholesta-3,5-dien (Sigma, 99 % rein) in
Hexan(10mgin50ml).
5.7. Standardlösung von Cholesta-3,5-dien in Hexan in einer Konzentration
von20ppm.Dazudieobengenannte Lösungverdünnen.
Anmerkung 5:
Bei Temperaturen unter 4 ºC halten sich die Lösungen 5.6 und 5.7
mindestensvierMonate lang.
5.8. Lösung aus n-Nonacosan in Hexan mit einer Konzentration von rund
100ppm.
5.9. Trägergas für die Gaschromatographie: Helium oder Wasserstoff
(99,9990%rein).
5.10. Brenngase für den Flammenionisationsdetektor: Wasserstoff (99,9990 %
rein)undgereinigte Luft.
6. VERFAHREN
6.1.Herstellung des Unverseifbaren:
6.1.1. 20 ± 0,1 g Öl in einen 250-ml-Kolben (4.1) einwiegen, 1 ml der Stand-
ardlösungvonCholesta-3,5-dien(20 µg)und75ml10%igeethanolische
Kalilauge zugeben, Rückflußkühler anschließen und 30 Minuten köcheln
lassen.DenKolbenmitderProbevonderHitzequellenehmenundleicht
abkühlen lassen (nicht vollständig abkühlen lassen, da die Probe sonst
festwird).100mlWasserzugebenunddieLösungmitHilfevon100ml
Hexan in einen Scheidetrichter (4.2) geben. Die Mischung 30 Sekunden
kräftigschütteln undzurPhasentrennungstehenlassen.
Anmerkung 6:
BeiBildungeinerEmulsion,dienichtgleichwiederverschwindet,kleine
MengenEthanol zugeben.
6.1.2. Die untere, wäßrige Phase in einen zweiten Scheidetrichter überführen
und wiederum mit 100 ml Hexan extrahieren. Die untere Phase erneut
ablaufen lassen und die Hexanextrakte zusammen in einem weiteren
Scheidetrichter dreimal mit je 100 ml einer Ethanol-Wassermischung (1:
1)waschen,bisdiesepH-neutralreagiert.
6.1.3. Die Hexanlösung durch wasserfreies Natriumsulfat (50 g) laufen lassen,
mit 20 ml Hexan waschen und in einem Rotationsverdampfer bei 30 ºC
imleichten Vakuumvollständigeindampfen.
6.2.Abtrennung der Steroid-Fraktion:
6.2.1. DenRückstandmitHilfevonzweiVolumenanteilenHexan(jeweils1ml)
auf die Trennsäule aufgeben und soweit einziehen lassen, bis sich die
Flüssigkeitsoberfläche bis über die Natriumsulfatschicht abgesenkt hat.
Dann die Elution mit Hexan mit einer Flußrate von 1 ml/Minute1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—74
▼M11
beginnen. Die ersten 25 bis 30 ml des Eluats verwerfen, die folgenden
40mlauffangen. DieseFraktionineinen100-ml-Rundkolben(4.3)über-
führen.
Anmerkung 7:
Die erste Fraktion enthält gesättigte Kohlenwasserstoffe (Abbildung 1a),
die zweite Steroide. Danach werden Squalen und verwandte Verbin-
dungen eluiert. Für eine gute Trennung zwischen den gesättigten
Kohlenwasserstoffen und den Steroiden müssen die Fraktionsvolumina
optimiertwerden.HierzuistdasVolumendererstenFraktionsozuregu-
lieren, daß bei der Analyse der zweiten Fraktion nur kleine Peaks für
gesättigte Kohlenwasserstoffe auftreten (siehe Abbildung 1c). Treten
keine solchen Peaks auf und hat der Standardpeak gleichzeitig nur eine
geringe Größe, soist das Volumen der ersten Fraktion zu reduzieren. Im
übrigen ist eine vollständige Trennung zwischen den Komponenten der
ersten und zweiten Fraktion nicht erforderlich, da während der GC-
AnalyseunterdeninPunkt6.3.1beschriebenen Arbeitsbedingungen eine
ÜberlappungderPeaksnichtvorkommt.EineOptimierungdesVolumens
der zweiten Fraktion ist in der Regel nicht notwendig, da sich die
weiteren Komponenten gut abtrennen lassen. Ein großer Peak mit einer
Retentionszeit von rund 1,5 Minuten unter dem des Standards ist jedoch
auf das Vorhandensein von Squalen zurückzuführen und zeigt eine
schlechte Trennungan.
6.2.2. Die zweite Fraktion im Rotationsverdampfer bei 30 ºC im leichten
Vakuum vollständig eindampfen und den Rückstand sofort in 0,2 ml
Hexan auflösen. Die Lösung bis zur Analyse im Kühlschrank aufbe-
wahren.
Anmerkung 8:
Die Rückstände 6.1.3 und 6.2.2 sollten nicht trocken und nicht bei
Zimmertemperatur aufbewahrt werden. Nach Gewinnung des Rückstands
sofortdasLösungsmittelzugebenunddieLösungimKühlschrankaufbe-
wahren.
6.3.Gaschromatographie
6.3.1. ArbeitsbedingungenfürSplit-Injektion:
— Injektortemperatur: 300ºC,
— Detektortemperatur: 320ºC,
— Integrator: (Die Parameter für die Integration sind so zu wählen, daß
die Peakflächen richtig beurteilt werden können. Empfohlen wird die
Integration zwischenzweiMinima),
— Empfindlichkeit: runddas16-fache derMindestdämpfung,
— Einspritzvolumen: 1 µmLösung,
— Temperaturprogramm:6Minutenisothermbei235ºC,dannmit2ºC/
minauf285ºC,
— Injektormit Stromteilventil (Splitverhältnis 1:15),
— Trägergasvordruck: ca.120kPaHelium oderWasserstoff.
Diese Bedingungen können entsprechend den Kenndaten des Chromato-
graphen und der Säule derart geändert werden, daß die damit
aufgezeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen erfüllen: Der
Peak des internen Standards muß innerhalb von 5 Minuten vor oder
nach der unter 6.3.2 genannten Zeit erscheinen und mindestens 80 %
Vollausschlagerreichen.
Das GC-System ist durch Einspritzen einer Mischung aus der Cholesta-
dien-Stammlösung (5.6) und der n-Nonacosan-Lösung (5.8) zu
überprüfen. Der Cholesta-3,5-dien-Peak muß vor dem n-Nonacosan-Peak
erscheinen (Abbildung 1c). Ist dies nicht der Fall, so kann die ursprüng-
liche Ofentemperatur verringert und/oder die GC-Säule durch eine
wenigerpolareSäuleersetzt werden.
6.3.2. Identifizierung derPeaks
Der Peak der internen Standards erscheint nach rund 19 Minuten, derje-
nige von Stigmastadienen nach einer relativen Retentionszeit von rund
1,29(Abbildung1b).DasStigmasta-3,5-dientrittzusammenmitgeringen
Mengen eines Isomers auf; beide ergeben normalerweise aber nur einenPeak.IstdieSäulejedochzupolar,oderhatsieeinegroßeTrennleistung,
kann das Isomer als kleiner Peak dicht vor dem des Stigmasta-3,5-dien
erscheinen (Abbildung2).Um sicherzugehen, daß dieStigmastadiene als
ein Peak eluiert werden, empfiehlt es sich, die Säule durch eine weniger
polareSäuleodereineSäulemitgrößeremInnendruchmesserzuersetzen.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—75
▼M11
Anmerkung 9:
Ein Referenzchromatogramm für Stigmastadien erhält man durch die
Analyse eines raffinierten pflanzlichen Öls mit einer kleineren Probe.
Stigmastadiene rufen einen signifikanten, leicht identifizierbaren Peak
hervor.
6.3.3. Quantitative Analyse
DerGehaltanStigmastadienen wirdnachfolgender Formelberechnet:
mg/kgStigmastadienen =As/C2Mc
Ac/C2Mo
Hierinbedeuten: As= Peakfläche von Stigmastadienen (wenn der
Peak geteilt ist, Summe der Flächen beider
Isomere),
Ac= PeakflächedesinternenStandards(Cholesta-
dien),
Mc= Masse des zugesetzten Standards in Mikro-
gramm,
Mo= MassedeseingewogenenÖlsinGramm.
Nachweisgrenze: rund0,01mg/kg.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—76
▼M11
Abb. 1:
Gaschromatogramme von Olivenölproben, analysiert auf einer Fused-
Silica-Kapillarsäule(0,25mmInnendurchmesserund25mLänge),belegt
mit 5%Phenylmethylsilicon (Filmdicke 0,25 µm).
a) Erste Fraktion (30 ml) eines nativen Olivenöls, mit dem Standard
versetzt.
b) Zweite Fraktion (40 ml) eines Olivenöls mit 0,10 mg/kg Stigmasta-
dienen.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—77
▼M11
c) ZweiteFraktion(40ml)miteinemkleinenAnteildererstenFraktion.
Abb. 2:
Gaschromatogramm einer Probe raffinierten Olivenöls, analysiert auf
einer DB-5-Säule, auf dem das Isomer von Stigmasta-3,5-dien zu
erkennen ist.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—78
▼M13
ANHANG XVIII
BESTIMMUNG DER ZUSAMMENSETZUNG DER TRIGLYCERIDE
MIT ECN42 (DIFFERENZ ZWISCHEN HPLC-DATEN UND THEORETI-
SCHEM GEHALT)
1.Zweck
Bestimmung der Zusammensetzung der in Olivenöl enthaltenen Trigly-
ceride (TAG) hinsichtlich ihrer äquivalenten Kohlenstoffzahl (ECN)
anhand der Unterschiede zwischen den Analyseergebnissen der Hoch-
leistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und dem auf der
Grundlage der Fettsäurezusammensetzung berechneten theoretischen
Gehalt.
2.Anwendungsbereich
Diese Norm ist anwendbar auf Olivenöle. Das Verfahren dient dem
Nachweis kleiner Mengen von (linolsäurereichen) Saatölen in
Olivenölen aller Kategorien.
3.Prinzip
Der mit Hilfe der HPLC-Analyse bestimmte Gehalt an Triglyceriden
mit ECN42 und der (auf der Grundlage der gaschromatographisch
bestimmten Fettsäurezusammensetzung berechnete) theoretische Gehalt
an Triglyceriden mit ECN42 stimmen bei reinen Ölen bis zu einem
gewissen Grad überein. Unterschiede, die über den in der Verordnung
für jeden Typ angegebenen Werten liegen, deuten darauf hin, daß das
ÖlSaatölenthält.
4.Verfahren
DieMethodefürdieBerechnungdestheoretischenGehaltsanTriglyce-
riden mit ECN42 und der Differenz zwischen diesem und den HPLC-
Daten besteht im wesentlichen aus dem Vergleich von Analysedaten,
die mit Hilfe anderer Methoden gewonnen wurden. Drei Verfahren-
sstufen sind zu unterscheiden: Bestimmung der Fettsäurezusammenset-
zung durch Kapillarsäulengaschromatographie, Berechnung der
theoretischen Zusammensetzung der Triglyceride mit ECN42 und
HPLC-BestimmungderTriglyceride mit ECN42.
4.1.Geräte
4.1.1. 250-ml-und500-ml-Rundkolben.4.1.2. 100-ml-Bechergläser.4.1.3. Chromatographiesäule aus Glas, 21 mm innerer Durchmesser, 450 mm
Länge, mitHahnundNormschliffhülle amoberenEnde.
4.1.4. Scheidetrichter 250 ml Inhalt, mit Normschliffkern am unteren Ende,
geeignet zumVerbindenmit demoberenEndederSäule.
4.1.5. Glasstab,600mmLänge.4.1.6. Glastrichter, 80mmDurchmesser.4.1.7. 50-ml-Meßkolben.4.1.8. 20-ml-Meßkolben.4.1.9. Rotationsverdampfer.4.1.10. Hochleistungsflüssigchromatograph mit Säulenofen zur Regelung der
Säulentemperatur.
4.1.11. Einspritzsystem mit10- µl-Probenschleife.
4.1.12. Detektor: Differentialrefraktometer. Im Bereich der höchsten Empfind-
lichkeit sollten wenigstens 10
−4Einheiten des Brechungsindex erreicht
werden.
4.1.13. Säule: Säule aus rostfreiem Stahl, 250 mm Länge und 4,5 mm Innen-
durchmesser, gefüllt mit Kieselgel (5 µm Partikelgröße) mit einer
durchschnittlichen Kohlenstoffbelegung von 22—23 % in Form von
Octodecylsilan (Anmerkung2).
4.1.14. Schreiberund/oderIntegrator.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—79
▼M13
4.2.Reagenzien
DieReagenzien müssenanalysenrein sein.
Die Fließmittel müssen entgast sein. Sie können mehrere Male wieder-
verwendet werden, ohne daß dadurch die Trennleistungen beeinflußt
werden.
4.2.1. Petrolether (40—60ºC)fürdieChromatographie.4.2.2. Diethylether, peroxidfrei, frischdestilliert.4.2.3. ElutionsmittelfürdieSäulenchromatographie:MischungausPetrolether
undDiethylether imVerhältnis87/13(v/v).
4.2.4. Kieselgel, 70—230 mesh, TypE Merck 7734, standardisiert auf einem
Wassergehalt von5%(w/w).
4.2.5. Glaswatte.
4.2.6. Aceton.
4.2.7. Acetonitril.4.2.8. HPLC-Fließmittel: Acetonitril + Aceton (Das Mischungsverhältnis ist
so einzustellen, daß damit die gewünschte Trennung erzielt wird; man
beginntmit einem Mischungsverhältnisvon1:1).
4.2.9. Lösungsmittel: Aceton.4.2.10. Als Referenztriglyceride können handelsübliche Triglyceride (Tripal-
mitin, Triolein usw.) verwendet werden, wobei ein Diagramm aus den
Retentionszeiten unddenäquivalenten Kohlenstoffzahlen aufgezeichnet
wird, oder es werden Referenzchromatogramme von Sojaöl, einer
Mischung von Sojaöl/Olivenöl (30:70) und reinem Olivenöl erstellt
(sieheAnmerkungen3und4undAbbildungen1,2,3und4).
4.3.Vorbereitung der Proben
DaeinigestörendeSubstanzenzufalschenpositivenErgebnissenführen
können,mußdieProbeimmernachderIUPAC-Methode2.507,diefür
die Bestimmung polarer Stoffe in oxidierten Ölen verwendet wird,
gereinigt werden.
4.3.1. Vorbereitung der Chromatographiesäule
Etwa 30 ml Fließmittel (4.2.3) in die Säule (4.1.3) geben, Glaswatte-
bausch (4.2.5) einführen und mit Hilfe des Glasstabs (4.1.5) bis auf
denGrundderSäuleschieben.
In einem 100-ml-Becherglas 25 g Kieselgel (4.2.4) in 80 ml Elutions-
mittel (4.2.3) suspendieren, dann mit Hilfe eines Glastrichters (4.1.6)
indieSäulegeben.
Zur restlosen Überführung des Kieselgels in die Säule ist das Becher-
glasmit demElutionsmittel zuspülenunddie Spülflüssigkeitebenfalls
indieSäulezugeben.
HahnöffnenundsovielFließmittel ablaufenlassen,bisderFließmittel-
spiegeletwa1cmüberdemKieselgel liegt.
4.3.2. Säulenchromatographie
Ineinem50-ml-Meßkolben(4.1.7)werdenauf0,001ggenau2,5±0,1g
filtriertes, homogenisiertes und erforderlichenfalls entwässertes Öleingewogen. Die Einwaage wird in etwa 20 ml Elutionsmittel (4.2.3)
gelöst; erforderlichenfalls leicht erwärmen, damit sich das Öl besser
löst. Auf Raumtemperatur erkalten lassen und mit Elutionsmittel
auffüllen.
Mit Hilfe einer Meßpipette werden 20 ml der Lösung in die gemäß
4.3.1 vorbereitete Säule gegeben; Hahn öffnen und das Elutionsmittel
biszurKieselgelschicht ablaufenlassen.
Mit Hilfe von 150 ml Elutionsmittel (4.2.3) bei einer Durchlaufge-
schwindigkeit vonetwa 2ml/Minute eluieren, sodaß150ml dieSäule
in60bis70Minutendurchströmen.
Eluat in einem zuvor im Ofen austarierten und genau gewogenen 250-
ml-Rundkolben (4.1.1) auffangen. Lösungsmittel unter Unterdruck
(Rotavapor) entfernen und Rückstand wägen, der zur Herstellung der
LösungfürdieHPLC-AnalyseundfürdieBereitungderMethylesterzu-
bereitung verwendetwird.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—80
▼M13
Nach Durchlaufen der Säule muß im Fall von nativem Olivenöl extra,
nativem Olivenöl, gewöhnlichem nativem Olivenöl, raffiniertem
Olivenöl und Olivenöl die Probe zu 90 %, im Fall von Lampantöl und
Tresteröl mindestenszu80%zurückgewonnenwerden.
4.4.HPLC-Analyse
4.4.1. Vorbereitung der Proben für die Chromatographieanalyse
Von der zu analysierenden Probe wird eine 5 %ige Lösung hergestellt,
indem 0,5 g ± 0,001 g der Probe in einen 10-ml-Meßkolben einge-
wogenundmitdemLösungsmittel(4.2.9)auf10mlaufgefülltwerden.
4.4.2. Verfahren
Das HPLC-Gerät in Betrieb setzen. Das Fließmittel (4.2.8) mit einer
Strömungsgeschwindigkeitvon1,5ml/MinutedurchdieSäulepumpen,
um das gesamte System zu spülen. Sobald eine stabile Basislinie erre-
icht ist,werden10 µldergemäß4.3hergestellten Probeneingespritzt.
4.4.3. Berech nungundAbfassungderErgebnisse
Es wird vorausgesetzt, daß die Summe der Peakflächen aller Triglyce-
ridemitECN42bisECN52100%entspricht(Flächenprozentmethode).
Der relative Anteil eines jeden Triglycerids berechnet sich nach
folgenderFormel:
%Triglycerid =Peakfläche ×100/SummederPeakflächen.Die Ergebnisse sind auf mindestens zwei Stellen nach dem Komma
anzugeben.
Anmerkung 1: DieReihenfolge derElutionkanndurchBerechnungder
äquivalenten Kohlenstoffzahlen (ECN) bestimmt werden, die häufig
durch die Beziehung ECN = CN − 2n definiert sind. Hierbei ist CN
die Zahl der Kohlenstoffatome und n die Zahl der Doppelbindungen.
Durch Berücksichtigung des Ursprungs der Doppelbindungen kann sie
noch genauer bestimmt werden. Wenn n
o,nlund nlndie Zahlen der
Doppelbindungen sind, die der Öl-, Linol- bzw. Linolensäure zuge-
ordnet sind, so kann die äquivalente Kohlenstoffzahl nach folgender
Formelberechnet werden:
ECN=CN−dono−dlnl−dlnnln
Die Koeffizienten do,dlund dlnkönnen mit Hilfe der Referenztriglyce-
ride berechnet werden. Unter den in dieser Methode beschriebenen
Bedingungengilt näherungsweisefolgende Beziehung:
ECN=CN−(2,60no)−(2,35nl)−(2,15nln)
Anmerkung 2: Beispiele: LiChrosorbRP18(MerckArt50333),
LiChrospher 100 CH18 (Merck Art 50377)
odergleichwertiges Material.
Anmerkung 3: MitHilfeverschiedenerTriglyceridekanndieAuflösung
fürTrioleinunterVerwendungderreduziertenRetentionszeitRT'=RT−
RTLösungsmittel wiefolgtberechnet werden:
α=RT'/RTriolein
Der Graph von log αgegen f (Zahl der Doppelbindungen) ermöglicht
es,die Retentionswerte aller Triglyceride zu bestimmen, die Fettsäuren
enthalten, die in den Referenztriglyceriden vorkommen (siehe Abbil-
dung2).
Anmerkung 4: Die Trennfähigkeit der Säule muß eine klare Trennung
des Trilinolein-Peaks von den Peaks der Triglyceride mit wenig unter-
schiedlicher Retentionszeit ermöglichen. Die Elution wird bis zum
ECN52-Peakdurchgeführt.
Anmerkung 5: Eine korrekte Bestimmung der Flächen aller für die
Bestimmung interessierenden Peaks wird dadurch sichergestellt, daß
der zweite Peak mit ECN50 50 % des Vollausschlags des Rekorders
erreicht.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—81
▼M13
4.5.Berechnung der Triglyceridzusammensetzung (Mol %) anhand der
GLC-Daten (Flächen %)
4.5.1. Bestimmung der Fettsäurezusammensetzung
Die Fettsäurezusammensetzung wird nach dem EG-Verfahren gemäß
Anhang X A der Verordnung (EWG) Nr. 2568/91 unter Verwendung
einer Kapillarsäule gaschromatographisch bestimmt. Die Fettsäureme-
thylester werden gemäß Anhang X B der genannten Verordnung
vorbereitet (Reaktion mit Natriummethylat inMethanollösung).
4.5.2. Berech nungsrelevanteFettsäuren
Die Triglyceride werden nach ihrer äquivalenten Kohlenstoffzahl
(ECN) unter Berücksichtigung folgender ECN/Fettsäureäquivalenzen
zusammengefaßt. Nur Fettsäuren mit 16 und 18 Kohlenstoffatomen
werdenberücksichtigt, danursiebeiOlivenöl vonBedeutungsind.
Fettsäure (FS) AbkürzungMolekularge-
wicht(MG)ECN
Palmitinsäure P 256,4 16
Palmitoleinsäure Po 254,4 14Stearinsäure S 284,5 18Ölsäure O 282,5 16Linolsäure L 280,4 14Linolensäure Ln 278,4 12
4.5.3. Umrech nung der prozentualen Fläche in Mol für alle Fett-
säuren
MolP ¼
%Fl¨acheP
MGPMolS ¼%Fl¨acheS
MGSMolPo ¼%Fl¨achePo
MGPo/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(1)
MolO ¼
%Fl¨acheO
MGOMolL ¼%Fl¨acheL
MGLMolLn ¼%Fl¨acheLn
MGLn
4.5.4. Normalisierung der Fettsäuren auf 100 %
Mol%P 1 ;2;3 ðÞ ¼MolP /C3100
Mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(2)Mol%S 1 ;2;3 ðÞ ¼
MolS /C3100
Mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Mol%Po 1 ;2;3 ðÞ ¼MolPo /C3100
Mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Mol%O 1 ;2;3 ðÞ ¼MolO /C3100
Mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Mol%L 1 ;2;3 ðÞ ¼MolL /C3100
Mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Mol%Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼MolLn /C3100
Mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Als Ergebnis erhält man den prozentualen Anteil jeder Fettsäure in
Molprozentin(1,2,3-)PositionenderTAG.
Anschließend wird die Summe der gesättigten Fettsäuren P und S
(SFA) sowie der ungesättigten Fettsäuren Po, O, L und Ln (UFA)
berechnet:
Mol%SFA=Mol%P+Mol%S/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(3)Mol%UFA=100−Mol%SFA1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—82
▼M13
4.5.5. Berech nung der Fettsäurezusammensetzung in 2- und 1,3-
StellungderTAG
Die Fettsäuren werden wie folgt in drei Gruppen eingeteilt: zwei
gleiche Gruppen für 1- und 3-Stellung und eine Gruppe für 2-Stellung,
wobeiunterschiedlicheKoeffizientenfürgesättigte(PundS)undunge-
sättigte Fettsäuren(Po,O,LundLn)verwendetwerden.
4.5.5.1. Gesättigte Fettsäurenin2-Stellung(P(2)undS(2))
Mol%P(2)=Mol%P(1,2,3)*0,06/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(4)Mol%S(2)=Mol%S(1,2,3)*0,06
4.5.5.2. Ungesättigte Fettsäurenin2-Stellung(Po(2),O(2),L(2)undLn(2))
Mol%Po 2 ðÞ ¼Mol%Po 1 ;2;3 ðÞ
Mol%UFA/C3100/C0Mol%P 2 ðÞ /C0Mol%S 2 ðÞ ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(5)Mol%O 2 ðÞ ¼
Mol%O 1 ;2;3 ðÞ
Mol%UFA/C3100/C0Mol%P 2 ðÞ /C0Mol%S 2 ðÞ ðÞ
Mol%L 2 ðÞ ¼Mol%L 1 ;2;3 ðÞ
Mol%UFA/C3100/C0Mol%P 2 ðÞ /C0Mol%S 2 ðÞ ðÞ
Mol%Ln 2 ðÞ ¼Mol%Ln 1 ;2;3 ðÞ
Mol%UFA/C3100/C0Mol%P 2 ðÞ /C0Mol%S 2 ðÞ ðÞ
4.5.5.3. Fettsäuren in 1,3-Stellung (P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) und
Ln(1,3))
Mol%P 1 ;3ðÞ ¼Mol%P 1 ;2;3 ðÞ /C0Mol%P 2 ðÞ
2þMol%P 1 ;2;3 ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(6)Mol%S 1 ;3ðÞ ¼
Mol%S 1 ;2;3 ðÞ /C0Mol%S 2 ðÞ
2þMol%S 1 ;2;3 ðÞ
Mol%Po 1 ;3ðÞ ¼Mol%Po 1 ;2;3 ðÞ /C0Mol%Po 2 ðÞ
2þMol%Po 1 ;2;3 ðÞ
Mol%O 1 ;3ðÞ ¼Mol%O 1 ;2;3 ðÞ /C0Mol%O 2 ðÞ
2þMol%O 1 ;2;3 ðÞ
Mol%L 1 ;3ðÞ ¼Mol%L 1 ;2;3 ðÞ /C0Mol%L 2 ðÞ
2þMol%L 1 ;2;3 ðÞ
Mol%Ln 1 ;3ðÞ ¼Mol%Ln 1 ;2;3 ðÞ /C0Mol%Ln 2 ðÞ
2þMol%Ln 1 ;2;3 ðÞ
4.5.6. Berech nungderTriglyceride(TAG)
4.5.6.1. TAGmit einerFettsäure(AAA,hierLLL, PoPoPo)
Mol%AAA ¼Mol%A 1 ;3ðÞ /C3Mol%A 2 ðÞ/C3Mol%A 1 ;3ðÞ
10000(7)
4.5.6.2. TAGmit zweiFettsäuren(AAB,hierPoPoL,PoLL)
Mol%AAB ¼Mol%A 1 ;3ðÞ /C3Mol%A 2 ðÞ/C3Mol%B 1 ;3ðÞ /C32
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(8)
Mol%ABA ¼
Mol%A 1 ;3ðÞ /C3Mol%B 2 ðÞ/C3Mol%A 1 ;3ðÞ
100001991R2568—DE—22.05.2002—019.001—83
▼M13
4.5.6.3. TAG mit drei verschiedenen Fettsäuren (ABC, hier OLLn, PLLn,
PoOLn,PPoLn)
Mol%ABC ¼Mol%A 1 ;3ðÞ /C3Mol%B 2 ðÞ/C3Mol%C 1 ;3ðÞ /C32
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(9) Mol%BCA ¼
Mol%B 1 ;3ðÞ /C3Mol%C 2 ðÞ/C3Mol%A 1 ;3ðÞ /C32
10000
Mol%CAB ¼Mol%C 1 ;3ðÞ /C3Mol%A 2 ðÞ/C3Mol%B 1 ;3ðÞ /C32
10000
4.5.6.4. ECN42-haltige Triglyceride
Die folgenden Triglyceride mit ECN42 werden nach den Formeln 7, 8
und9inderReihenfolge derbeiderHPLCerwartetenElution(norma-
lerweisenurdreiPeaks)berechnet.
LLLPoLLunddasPositionsisomerLPoLOLLnunddiePositionsisomereOLnLundLnOLPoPoLunddasPositionsisomerPoLPoPoOLnunddiePositionsisomereOPoLnundOLnPoPLLnunddiePositionsisomereLLnPundLnPLPoPoPoSLnLnunddasPositionsisomerLnSLnPPoLnunddiePositionsisomerePLnPoundPoPLnDie Triglyceride mit ECN42 ergeben sich aus der Summe der neun
Triacylglyceride einschließlich ihrer Positionsisomere. Die Ergebnisse
sindaufmindestenszweiStellennachdemKommaanzugeben.
5.Auswertung der Ergebnisse
Der rechnerisch bestimmte theoretische Gehalt und der durch die
HPLC-Analyse bestimmte Gehalt werden verglichen. Liegt die Diffe-
renz zwischen HPLC-Daten und theoretischen Daten über den in der
Verordnung für die jeweilige Ölkategorie angegebenen Werten, so
enthält dieProbeSaatöl.
Anmerkung: Die Ergebnisse sind auf eine Stelle nach dem Komma
anzugeben.
6.Beispiel(Die Zahlen beziehen sich auf die betreffenden Textab-
schnitte des Verfahrens)
4.5.1. Berech nung der Molprozente der Fettsäuren aus den GLC-
Daten(Flächenprozente)
DieGaschromatographie ergibtfolgende Fettsäurezusammensetzung:
FS
MGP
256,4S
284,5Po
254,4O
282,5L
280,4Ln
278,4
%Fläche 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
4.5.3. Umrech nung der prozentualen Fläche in Mol für alle Fett-
säuren
MolP ¼10
256 ;4¼0;03900MolP Vgl.Formel(1)
MolS ¼3
284 ;5¼0;01054MolS Vgl.Formel(1)1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—84
▼M13
MolPo ¼1
254 ;4¼0;00393MolPo Vgl.Formel(1)
MolO ¼75
282 ;5¼0;26549MolO Vgl.Formel(1)
MolL ¼10
280 ;4¼0;03566MolL Vgl.Formel(1)
MolLn ¼1
278 ;4¼0;003594MolLn Vgl.Formel(1)
Insgesamt =0,35822MolTAG
4.5.4. Normalisierung der Fettsäuren auf 100 %
Mol%P 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03900MolP /C3100
0;35822Mol¼10;888% Vgl.Formel(2)
Mol%S 1 ;2;3 ðÞ ¼0;01054MolS /C3100
0;35822Mol¼2;944% Vgl.Formel(2)
Mol%Po 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00393MolPo /C3100
0;35822Mol¼1;097% Vgl.Formel(2)
Mol%O 1 ;2;3 ðÞ ¼0;26549MolO /C3100
0;35822Mol¼74;113% Vgl.Formel(2)
Mol%L 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03566MolL /C3100
0;35822Mol¼9;956% Vgl.Formel(2)
Mol%Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00359MolLn /C3100
0;35822Mol¼1;003% Vgl.Formel(2)
Mol%insgesamt =100,0%
Summe der gesättigten und ungesättigten Fettsäuren in 1,2,3-Stellung
derTAG
Mol%SFA=10,888%+2,944%=13,831% Vgl.Formel(3)
Mol%UFA=100,000%−13,831%=86,169% Vgl.Formel(3)
4.5.5. Berech nung der Zusammensetzung der Fettsäuren in 2- und
1,3-StellungderTAG
4.5.5.1. Gesättigte Fettsäurenin2-Stellung(P(2)undS(2))
Mol%P(2)=10,888%*0,06=0,653%Mol Vgl.Formel(4)
Mol%S(2)=2,944%*0,06=0,177%Mol Vgl.Formel(4)
4.5.5.2. Ungesättigte Fettsäuren in 1,3-Stellung (Po(1,3), O(1,3), L(1,3) und
Ln(1,3))
Mol%Po 2 ðÞ ¼1;097%
86;169%/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;263%Mol Vgl.Formel
(5)
Mol%O 2 ðÞ ¼74;113%
86;169%/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 85;295%Mol Vgl.Formel
(5)
Mol%L 2 ðÞ ¼9;956%
86;169%/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 11;458%Mol Vgl.Formel
(5)
Mol%Ln 2 ðÞ ¼1;003%
86;169%/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;154%Mol Vgl.Formel
(5)1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—85
▼M13
4.5.5.3. Fettsäuren in 1,3-Stellung (P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) und
Ln(1,3))
Mol%P 1 ;3ðÞ ¼10;888/C00;659
210;888¼16;005%Mol Vgl.Formel(6)
Mol%S 1 ;3ðÞ ¼2;944/C00;177
22;944¼4;327%Mol Vgl.Formel(6)
Mol%Po 1 ;3ðÞ ¼1;097/C01;263
21;097¼1;015%Mol Vgl.Formel(6)
Mol%O 1 ;3ðÞ ¼74;113/C085;295
274;113¼68;522%Mol Vgl.Formel(6)
Mol%L 1 ;3ðÞ ¼9;956/C011;458
29;956¼9;205%Mol Vgl.Formel(6)
Mol%Ln 1 ;3ðÞ ¼1;003/C01;154
21;003¼0;927%Mol Vgl.Formel(6)
4.5.6. Berech nungderTriglyceride(TAG)
Anhand der berechneten Zusammensetzung der Fettsäuren in sn-2-und
sn-1,3-Stellung(vgl.oben)
FSin 1,3-Stellung 2-Stellung
P 16,005% 0,653%
S 4,327% 0,177%
Po 1,015% 1,263%
O 68,522% 85,295%L 9,205% 11,458%Ln 0,927% 1,154%
Insgesamt 100,0% 100,0%
werdenfolgendeTriglyceride rechnerisch bestimmt:
LLL
PoPoPo
PoLLmit 1Positionsisomer
SLnLnmit1PositionsisomerPoPoLmit 1PositionsisomerPPoLnmit 2Positionsisomeren
OLLnmit2Positionsisomeren
PLLnmit 2PositionsisomerenPoOLnmit 2Positionsisomeren
4.5.6.1. TAGmit einerFettsäure(LLL, PoPoPo) Vgl.Formel(7)
Mol%LLL ¼
9;205% /C311;458% /C39;205%
10000=0,09708MolLLL
Mol%PoPoPo ¼1;015% /C31;263% /C31;015%
10000=0,00013MolPoPoPo
4.5.6.2. TAGmit zweiFettsäuren(PoLL,SLnLn,PoPoL) Vgl.Formel(8)
Mol%PoLL þLLPo ¼1;015% /C311;458% /C39;205% /C32
10000=0,021411991R2568—DE—22.05.2002—019.001—86
▼M13
Mol%LPoL ¼9;205% /C31;263% /C39;205%
10000 =0,01070
0,03211MolPoLL
Mol%SLnLn þLnLnS ¼4;327% /C31;154% /C30;927% /C32
10000=0,00093
Mol%LnSLn ¼0;927% /C30;177% /C30;927%
10000=0,00002
0,00095MolSLnLn
Mol%PoPoL þLPoPo ¼1;015% /C31;263% /C39;205% /C32
10000=0,00236
Mol%PoLPo ¼1;015% /C311;458% /C31;015%
10000=0,00118
0,00354MolPoPoL
4.5.6.3. TAGmit dreiverschiedenen Fettsäuren(PoPLn,OLLn,PLLn,PoOLn)
Vgl.Formel(9)
Mol%PPoLn ¼16;005% /C31;263% /C30;927% /C32
10000=0,00375
Mol%LnPPo ¼0;927% /C30;653% /C31;015% /C32
10000=0,00012
Mol%PoLnP ¼1;015% /C31;154% /C316;005% /C32
10000=0,00375
0,00762MolPPoLn
Mol%OLLn ¼68;522% /C311;458% /C30;927% /C32
10000=0,14577
Mol%LnOL ¼0;927% /C385;295% /C39;205% /C32
10000=0,14577
Mol%LLnO ¼9;205% /C31;154% /C368;522% /C32
10000=0,14577
0,43671MolOLLn
Mol%PLLn ¼16;005% /C311;458% /C30;927% /C32
10000=0,03400
Mol%LnPL ¼0;927% /C30;653% /C39;205% /C32
10000=0,00111
Mol%LLnP ¼9;205% /C31;154% /C316;005% /C32
10000=0,03400
0,06911MolPLLn
Mol%PoOLn ¼1;015% /C385;295% /C30;927% /C32
10000=0,01605
Mol%LnPoO ¼0;927% /C31;263% /C368;522% /C32
10000=0,01605
Mol%OLnPo ¼68;522% /C31;154% /C31;015% /C32
10000=0,01605
0,04815MolPoOLn
ECN42=0,69540MolTAG1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—87
▼M14
Abbildung 1: Graphische Darstellung von log αalsFunktion von f
(Zahl der Doppelbindungen)
Anmerkung: La=Laurinsäure;My=Myristinsäure;P=Palmitinsäure;
St = Stearinsäure; O = Ölsäure; L = Linolsäure; Ln =
Linolensäure.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—88
▼M14
Abbildung 2: Sojaöl
Abbildung 3: Sojaöl/Olivenöl 30/70
1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—89
▼M14
Abbildung 4: Olivenöl
1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—90
▼M19
ANHANG XIX
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN ALIPHATISCHEN ALKOHOLEN
MIT DER KAPILLAR-GASCHROMATOGRAPHIE
1. ANWENDUNGSBEREICH
DieMethodebeschreibteinVerfahrenzurBestimmungderZusammen-
setzungunddesGehaltsanaliphatischen Alkoholen.
2. PRINZIPDERMETHODE
DasFettwirdmit1-EicosanolalsinternemStandardversetzt, mitetha-
nolischer Kaliumhydroxidlösung verseift und das Unverseifbare mit
Ethylether extrahiert. Die Alkoholfraktion wird dünnschichtchromato-
graphisch über basische Kieselgelplatten vom Unverseifbaren
abgetrennt.DieausdemKieselgelisoliertenAlkoholewerdeninTrime-
thylsilylether überführt und mit Hilfe der Kapillar-Gaschromatographie
untersucht.
3. GERÄTE
3.1. Kolben,250ml,mitRückflusskühlerundSchliffstopfen,3.2. 500-ml-Scheidetrichter,
3.3. Kolben,250ml,
3.4. komplette Apparatur für die Dünnschichtchromatographie mit Glas-
platten 20×20cm,
3.5. UV-Lampe,Wellenlänge 366oder254nm,
3.6. Mikroliterspritzen, 100und500 µl,
3.7. Glasfiltertiegel mit Porenfilter G 3 (Porosität 15-40 µm), etwa 2 cm
Durchmesser, 5 cm Höhe, mit geeignetem Anschlussstück für die
Vakuumfiltration undSchliffmuffe12/21,
3.8. Vakuumflasche, 50 ml, mit Schliffmuffe 12/21, für Glasfiltertiegel
(3.7),
3.9. 10ml-RöhrchenmitkonischemBodenunddichtschließendemStopfen,
3.10. Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen,
mit Splitsystem,bestehend aus:
3.10.1. thermostatisierbarem Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte
Temperatur mit einerGenauigkeit von±1ºC,
3.10.2. temperaturregelbarer Injektionseinrichtung mit Verdampfer aus persila-
nisiertem Glas,
3.10.3. Flammenionisations-Detektor mitVerstärker,3.10.4. Integrator mit Schreiber, an Verstärker zu koppeln, Reaktionszeit
maximal 1Sekunde,variabler Papiervorschub,
3.11. KapillarsäuleausGlasoderfusedsilica,20-30mLänge,0,25-0,32mm
Innendurchmesser, Innenwand belegt mit SE-52 oder SE-54 oder einer
gleichwertigen stationären Phase,Schichtdicke 0,10-0,30 µm,
3.12. Mikroliterspritze für die Gaschromatographie, 10 µl, mit gehärteter
Nadel,
3.13. Präzisionswaagemit einerEmpfindlichkeit von1mg(Anzeigegenauig-
keit 0,1mg).
4. REAGENZIEN
4.1. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 2 N: 130 g Kaliumhydroxid
(Titer mindestens 85 %) in 200 ml destilliertem Wasser unter Kühlen
lösen und mit Ethanol auf 1 Liter auffüllen. Die Lösung ist in gut
verschlossenenbraunenGlasflaschenaufzubewahren.
4.2. Ethylether, analysenrein,
4.3. wasserfreiesNatriumsulfat, analysenrein,
4.4. kieselgelbeschichtete Glasplatten ohne Fluoreszenzindikator, Schicht-
dicke0,25mm(gebrauchsfertig imHandelerhältlich),1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—91
▼M19
4.5. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 0,2 N: 13 g Kaliumhydroxid in
20mldestilliertem Wasserlösenundmit Ethanolauf1lauffüllen,
4.6. BenzolfürdieChromatographie (siehe5.2.2),4.7. AcetonfürdieChromatographie (siehe5.2.2),4.8. HexanfürdieChromatographie (siehe5.2.2),4.9. Ethylether fürdieChromatographie (siehe5.2.2),4.10. Chloroform,analysenrein,4.11. Referenzlösung für die Dünnschichtchromatographie: Cholesterin oder
Phytosterole,5%igeLösunginChloroform,
4.12. 2',7'-Dichlorfluorescein, 0,2%ige ethanolische Lösung, leicht alkalisch
durch Zusatz einiger Tropfen alkoholischer 2-N-Kaliumhydroxid-
Lösung,
4.13. wasserfreiesPyridinfürdieChromatographie,4.14. Hexamethyldisilazan,4.15. Trimethylchlorsilan,4.16. Standardlösung der Trimethylsilylether der aliphatischen Alkohole von
C
20bis C28, unmittelbar vor Gebrauch ansetzen aus einer Mischung der
reinenAlkohole,
4.17. 1-Eicosanol, 0,1%igeLösung(m/V)inChloroform(internerStandard),4.18. Trägergas: WasserstoffoderHelium,rein,fürdieGaschromatographie,4.19. Hilfsgase:Stickstoff,rein, fürdieGaschromatographie.
5. VERFAHREN
5.1.Herstellung des Unverseifbaren
5.1.1. Miteiner500-Mikroliterspritzesovielvonder0,1%igen1-Eicosanollö-
sung in Chloroform (4.17) in den 250-ml-Kolben geben, dass die
Menge an 1-Eicosanol etwa 10 % des Gehalts an aliphatischen Alko-
holen des zur Analyse verwandten aliquoten Teils der Probe
entspricht. So werden z. B. für 5 g Olivenöl 250 µl und für Oliventre-
steröl1500 µlder0,1%igen1-Eicosanollösungbenötigt.
Die Probe im Stickstoffstrom bis zur Trockne eindampfen. In den
gleichen Kolben genau 5 g der trockenen und filtrierten Probe
einwiegen.
5.1.2. Die Probe bei aufgesetztem Rückflusskühler mit 50 ml 2-N-Ethanol-
Kaliumhydroxidlösung versetzen, auf dem Wasserbad erhitzen und
unter kräftigem Schütteln und schwachem Sieden verseifen (wobei die
Lösungklarwird).DieProbeweitere20MinutenamSiedenhaltenund
dann durch den Rückflusskühler mit 50 ml destilliertem Wasser
versetzen; Rückflusskühler entfernen und den Kolben auf etwa 30 ºC
abkühlen.
5.1.3. Den Kolbeninhalt quantitativ in einen 500-ml-Scheidetrichter über-
führen, wobei mehrfach mit insgesamt etwa 50 ml destilliertem
Wasser nachgespült wird. Die Probe mit etwa 80 ml Ethylether
versetzen, 30 Sekunden kräftig schütteln und absetzen lassen (Anmer-
kung1).
DiewässrigePhaseineinen anderenScheidetrichter ablassenunddann
nochzweimalnachdemgleichenVerfahrenmitjeweils60-70mlEthy-
lether extrahieren.
Anmerkung 1: Etwaige Emulsionen können mit Hilfe einer Waschfla-
sche durch Zusatz kleiner Mengen Ethylalkohol oder
Methylalkoholzerstört werden.
5.1.4. Die Etherauszüge in einem Scheidetrichter vereinigen und mehrmals
mit jeweils 50 ml destilliertem Wasser waschen, bis das Waschwasser
neutralreagiert.
Das Waschwasser ablassen, die Etherphase mit wasserfreiem Natrium-
sulfat trocknen und über wasserfreiem Natriumsulfat in einen zuvor
gewogenen 250-ml-Kolben filtrieren. Scheidetrichter und Filter mit
kleinenMengenEthylether nachspülen.
5.1.5. Den Ether bis auf wenige Milliliter abdestillieren, den Rückstand unter
leichtemVakuumoderimStickstoffstromtrocknen,etwa1/4Stundeim1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—92
▼M19
Trockenschrank bei 100 ºC nachtrocknen, im Exsikkator abkühlen
lassenundwiegen.
5.2.Abtrennen der Alkoholfraktion
5.2.1. HerstellungderbasischenPlatten:DieKieselgelplatten(4.4)vollständig
ca.10Sekundenlangineineethanolische0,2-N-Kaliumhydroxidlösung
(4.5) eintauchen, dann unter einem Abzug 2 Stunden trocknen lassen,
anschließend noch für 1 Stunde bei 100 ºC in den Trockenschrank
gestellt.
Die Platten aus den Trockenschrank nehmen und in einem Exsikkator
über Calciumchlorid bis zum Gebrauch aufbewahren. (Derart behan-
delte Plattenmüsseninnerhalb von15Tagengebraucht werden.)
Anmerkung 2: Bei Verwendung von basischen Kieselgelplatten zur
Abtrennung der Alkoholfraktion erübrigt sich die
Behandlung des Unverseifbaren mit Aluminiumoxid.
AufdieseWeisebleibensämtlichesaurenVerbindungen
(Fettsäuren und andere) an der Startlinie. So erhält man
einesaubereTrennungderZonederaliphatischen Alko-
holeundTerpenalkohole vondenSterinen.
5.2.2. Die Entwicklerkammer bis zu einer Höhe von etwa 1 cm mit einem
Hexan/Ethylether-Gemisch 65:35(V/V)beschicken(*).
DieKammermiteinemgeeignetenDeckelverschließenundmindestens
einehalbeStundestehenlassen,damitsicheinGleichgewichtzwischen
Flüssigkeit und Dampfphase einstellt. An der Innenwand der Kammer
können Filterpapierstreifen befestigt werden, die in das Fließmittel
eintauchen. Dadurch kann die Laufzeit um ein Drittel verkürzt und
eine gleichmäßige ElutionderKomponentenerzielt werden.
Anmerkung 3: Um gut reproduzierbare Trennungen zu erzielen, ist das
Gemischjedesmal frischanzusetzen.
5.2.3. Von einer 5%igen Lösung des Unverseifbaren (5.1.5) in Chloroform
mit einer 100- µl-Spritze 0,3 ml als durchgehenden, gleichmäßigen
Strich2cmvomunterenPlattenrandentferntaufdieDünnschichtplatte
(5.2.1) auftragen. In der Verlängerung der Startlinie werden am Rande
2-3µl der Standardlösung der aliphatischen Alkohole (4.11) aufge-
tragen, um die Alkoholzone nach der Entwicklung identifizieren zu
können.
5.2.4. DiePlatteindienach5.2.2vorbereitete Entwicklerkammer stellen.Die
Temperatur der Umgebung sollte 15-20 ºC betragen. Die Kammer mit
dem Deckel verschließen und die Platte so lange entwickeln, bis die
Fließmittelfront bis1cmunterdenoberenPlattenrand gestiegen ist.
Dann die Platte aus der Entwicklerkammer nehmen und das Lösungs-
mittel in einem warmen Luftstrom abdampfen oder die Platte eine
geraumeZeit unterdemAbzugtrocknenlassen.
5.2.5. DiePlattevorsichtigundgleichmäßigmit2',7'-Dichlorfluoresceinlösung
besprühen.DieLagederZonederaliphatischenAlkoholemitHilfedes
Flecks der Referenzlösung bestimmen. Die Zone der aliphatischen
Alkohole und die Zone der unmittelbar darüber liegenden Terpenalko-
holewerdenmit einem schwarzenStiftumrandet.
Anmerkung 4: Da unter den Bedingungen dieses Verfahrens die
Terpenalkohole beträchtliche Mengen an aliphatischen
Alkoholen enthalten, müssen beide Zonen zusammen
erfasstwerden.
5.2.6. Das in der markierten Zone liegende Kieselgel mit einem Metallspatel
abkratzen, fein mahlen und in einen Glasfiltertiegel (3.7) überführen.
Mit 10 ml warmem Chloroform versetzen, mit Hilfe des Metallspatels
gründlich vermischen und unter Vakuum filtrieren. Das Filtrat in der
andenGlasfiltertiegelangeschlossenenVakuumflasche(3.8)auffangen.
Den Rückstand im Glasfiltertiegel dreimal mit je 10 ml Ethylether
waschen und das Filtrat wiederum in der Vakuumflasche auffangen.
Das Filtrat bis auf ein Volumen von etwa 4-5 ml eindampfen und den
Rest der Lösung in das zuvor gewogene 10-ml-Probenglas (3.9) über-
führen. Durch vorsichtiges Erhitzen unter einem schwachen
Stickstoffstrom bis zur Trockne eindampfen. Mit einigen Tropfen
Acetonversetzen,wiederbiszurTrockneeindampfen,etwa10Minuten1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—93
(*) Insbesondere in diesem Fall istzursauberen Trennung derZonen einBenzol/Aceton-
Gemisch 95:5 (V/V)alsElutionsmittel zuverwenden.
▼M19
im Trockenschrank auf 105 ºC erhitzen, anschließend im Exsikkator
abkühlenlassenundwiegen.
DerRückstandindemProbengläschenenthältdieFraktionderaliphati-
schenAlkohole.
5.3.Herstellung der Trimethylsilylether (TMSE)
5.3.1. Dem Probengläschen mit der Fraktion der aliphatischen Alkohole je
Milligramm aliphatischem Alkohol 50 µl Silanisierungsreagenz, beste-
hend aus einem Gemisch aus Pyridin, Hexamethyldisilazan und
Trimethylchlorsilan im Verhältnis 9:3:1 (V/V/V) (Anmerkung 5)
zusetzen. Dabei darf es nicht zur Aufnahme von Wasser kommen
(Anmerkung6).
Anmerkung 5: Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich;
daneben gibt es auch andere Silanisierungsreagenzien,
wie z. B. N,O-bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 %
Trimethylchlorsilan, das mit gleichen Teilen wasser-
freiem Pyridingemischt werdenmuss.
Anmerkung 6: Die Beobachtung einer leichten Opaleszenz ist normal
und bedeutet keine Störung. Die Bildung eines weißen
NiederschlagsoderderEindruck einerRosafärbungsind
Anzeichen der Anwesenheit von Feuchtigkeit oder der
Zersetzung des Reagens. In diesem Fall ist der Test zu
wiederholen.
5.3.2. Das Probengläschen verschließen und gründlich, nicht zu stark schüt-
teln, bis sich die aliphatischen Alkohole gelöst haben. Die Probe
mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und dann
einige Minuten zentrifugieren. Die klare Lösung kann gaschromatogra-
phischuntersuchtwerden.
5.4.Gaschromatographische Analyse
5.4.1. Vorbereiten, EinfahrenderSäule
5.4.1.1. Die Säule in den Gaschromatographen einsetzen, wobei das Einlassteil
an den mit dem Trennsystem verbundenen Injektor und das Auslassteil
andenDetektorangeschlossenwird.ÜberprüfungdesGaschromatogra-phen auf Dichtigkeit der Gasleitungen, Betriebsbereitschaft des
Detektors,desTrennsystems,desSchreibersusw.
5.4.1.2. WirddieSäulezumerstenmalverwendet,istesratsam,sieeinzufahren.
Einen schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromato-
graphen einschalten und allmählich auf eine Temperatur von
mindestens20ºCüberderArbeitstemperatur(Anmerkung7)aufheizen.
Diese Temperatur mindestens 2 Stunden konstant halten und dann die
Analysenbedingungen einstellen (Gasstrom, Split, Zünden der Flamme,
Schreiberanschluss,Ofentemperatur, Injektor,Detektor). Eine Empfind-
lichkeit wählen, die mindestens doppelt so groß ist wie bei der
Durchführung der Analyse. Die Grundlinie musslinear verlaufen, ohne
Peaks oder Drift. Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten
Anschluss der Säule, eine positive deutet auf mangelhaftes Einfahren
derSäulehin.
Anmerkung 7: Die Einfahrtemperatur muss in jedem Fall 20 ºC unter
der für die stationäre Phase angegebenen Maximaltem-
peraturliegen.
5.4.2. WahlderArbeitsbedingungen
5.4.2.1. AnhaltspunktefürdieArbeitsbedingungen:
— Säulentemperatur: anfangs isotherm 8 Minuten bei 180 ºC, dann
stufenweise um 5 ºC pro Minute bis auf 260 ºC ansteigend,
anschließend 15Minutenbei260ºC,
— Verdampfertemperatur: 280ºC,
— Detektortemperatur: 290ºC
— Strömungsgeschwindigkeit des Trägergases: Helium 20-35 cm/s;
Wasserstoff30-50cm/s,
— Splitverhältnis: 1:50—1:100,
— Geräteempfindlichkeit: das4-bis16fache derMindestdämpfung,
— Detektorempfindlichkeit: 1-2mVf.s.,
— Papiervorschub:30-60cm/Std.
— Einspritzvolumen: 0,5-1 µlTMSE-Lösung.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—94
▼M19
DieseBedingungen könnenentsprechend denKenndaten derSäuleund
desGaschromatographen derartgeändert werden,dassdiedamit aufge-
zeichneten Chromatogramme folgendeBedingungen erfüllen:
— DieRetentionszeitdesC26-Alkoholsmuss18±5Minutenbetragen;
— der Peak des C22-Alkohols muss bei Olivenöl 80 ± 20 % und bei
Samenölen 40±20%dergesamten Skalaerreichen.
5.4.2.2. Zur Überprüfung der vorstehenden Bedingungen werden wiederholt
Proben von TMSE-Alkohol-Gemischen eingespritzt und die Arbeitsbe-
dingungenoptimiert.
5.4.2.3. Die Parameter für die Peak-Integration sind so zu wählen, dass für die
inBetracht kommendenPeakskorrekteWerte erzielt werden.
5.4.3. DurchführungderAnalyse
5.4.3.1. Mitder10- µl-Mikroliterspritze 1 µlHexanentnehmen, 0,5 µlLuftund
anschließend 0,5-1 µl Probenlösung aufziehen; dabei den Kolben der
Spritze so weit einziehen, dass die Nadel leer ist. Die Nadel in die
Membran des Injektors einführen, nach 1-2 Sekunden schnell
einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam heraus-
ziehen.
5.4.3.2. Das Chromatogramm aufzeichnen, bis alle vorhandenen aliphatischen
Alkohole eluiert sind. Die Grundlinie muss stets den vorgeschriebenen
Anforderungen(5.4.1.2)genügen.
5.4.4. Identifizierung derPeaks
Die einzelnen Peaks werden anhand der Retentionszeiten und durch
Vergleich mit dem unter denselben Bedingungen analysierten TSME-
Gemischderaliphatischen Alkoholeidentifiziert.
Abbildung 1 zeigt ein Chromatogramm der Alkoholfraktion eines
nativenOlivenöls.
5.4.5. Quantitative Bestimmung
5.4.5.1. Die Peakflächen von 1-Eicosanol und der aliphatischen Alkohole C22,
C24,C26undC28werdenmit HilfeeinesIntegratorsermittelt.
5.4.5.2. Der Gehalt an den einzelnen aliphatischen Alkoholen in mg/1000 g
Fettwirdnachfolgender Formelberechnet:
Hierinbedeuten:
Ax = Peakfläche desAlkoholsx,
As= Peakfläche von1-Eicosanol,
ms= zugesetzte Menge1-Eicosanol inmg,
m = MengederfürdieBestimmungentnommenen Probeing.
6. DARSTELLUNGDERERGEBNISSE
Der Gehalt an den einzelnen aliphatischen Alkoholen wird in mg/
1000gFettangegeben undzum„Gesamtgehalt analiphatischen Alko-
holen“addiert.1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—95
▼M19
ANLAGE
Bestimmung der linearen Strömungsgeschwindigkeit
In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatographen werden 1 bis
3µl Methan (oder Propan) eingespritzt und die von dem Gas benötigte Durch-
laufzeit durch die Säule vom Zeitpunkt des Einspritzens bis zum Peak-Austritt
(tM)gemessen.
Die lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tMdefiniert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tMdie gemessene Zeit in
Sekunden.
Abbildung1—Chromatogramm derAlkoholfraktioneinesnativen Olivenöls
1 = Eicosanol
2 = Docosanol
3 = Tricosanol
4 = Tetracosanol5 = Pentacosanol6 = Hexacosanol
7 = Heptacosanol
8 = Octacosanol1991R2568—DE—22.05.2002—019.001—96