1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 1
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►B VERORDNUNG (EWG) Nr. 2568/91 DER KOMMISSION
vom 11. Juli 1991
über die Merkmale von Olivenölen und Oliventresterölen sowie die Verfahren zu ihrer Bestim-
mung
(ABl. L 248 vom 5.9.1991, S. 1)
Geändert durch:
Amtsblatt
Nr. Seite Datum
►M1Verordnung (EWG) Nr. 3682/91 der Kommission vom 17. Dezember
1991L 349 36 18.12.1991
►M2Verordnung (EWG) Nr. 1429/92 der Kommission vom 26. Mai 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3Verordnung (EWG) Nr. 1683/92 der Kommission vom 29. Juni 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4Verordnung (EWG) Nr. 1996/92 der Kommission vom 15. Juli 1992 L 199 18 18.7.1992
►M5Verordnung (EWG) Nr. 3288/92 der Kommission vom 12. November
1992L 327 28 13.11.1992
►M6Verordnung (EWG) Nr. 183/93 der Kommission vom 29. Januar 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 826/93 der Kommission
vom 6. April 1993L 87 6 7.4.1993
►M8Verordnung (EWG) Nr. 620/93 der Kommission vom 17. März 1993 L 66 29 18.3.1993
►M9Verordnung (EG) Nr. 177/94 der Kommission vom 28. Januar 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10Verordnung (EG) Nr. 2632/94 der Kommission vom 28. Oktober 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11Verordnung (EG) Nr. 656/95 der Kommission vom 28. März 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12Verordnung (EG) Nr. 2527/95 der Kommission vom 27. Oktober 1995 L 258 49 28.10.1995
►M13Verordnung (EG) Nr. 2472/97 der Kommission vom 11. Dezember 1997 L 341 25 12.12.1997
►M14Verordnung (EG) Nr. 282/98 der Kommission vom 3. Februar 1998 L 28 5 4.2.1998
►M15Verordnung (EG) Nr. 2248/98 der Kommission vom 19. Oktober 1998 L 282 55 20.10.1998
►M16Verordnung (EG) Nr. 379/1999 der Kommission vom 19. Februar 1999 L 46 15 20.2.1999
►M17Verordnung (EG) Nr. 455/2001 der Kommission vom 6. März 2001 L 65 9 7.3.2001
►M18Verordnung (EG) Nr. 2042/2001 der Kommission vom 18. Oktober 2001 L 276 8 19.10.2001
►M19Verordnung (EG) Nr. 796/2002 der Kommission vom 6. Mai 2002 L 128 8 15.5.2002
►M20Verordnung (EG) Nr. 1989/2003 der Kommission vom 6. November
2003L 295 57 13.11.2003
Berichtigt durch:
►C1Berichtigung, ABl. L 347 vom 28.11.1992, S. 69 (2568/91)
►C2Berichtigung, ABl. L 290 vom 6.10.1992, S. 15 (1429/92)
►C3Berichtigung, ABl. L 176 vom 20.7.1993, S. 26 (183/93)
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VERORDNUNG (EWG) Nr. 2568/91 DER KOMMISSION
vom 11. Juli 1991
über die Merkmale von Olivenölen und Oliventresterölen sowie die
Verfahren zu ihrer Bestimmung
DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN —
gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsge-
meinschaft,
gestützt auf die Verordnung Nr. 136/66/EWG des Rates vom 22.
September 1966 über die Errichtung einer gemeinsamen Marktorgani-sation für Fette (
1), zuletzt geändert durch die Verordnung (EWG)
Nr. 3577/90 (2), insbesondere auf Artikel 35a,
in Erwägung nachstehender Gründe:
Im Anhang der Verordnung Nr. 136/66/EWG sind die Bezeichnungen
und Begriffsbestimmungen für Olivenöle und Oliventresteröle zurVermarktung im innerstaatlichen und innergemeinschaftlichen Handelsowie im Handel mit Drittländern festgelegt.
Unbeschadet der bereits geltenden einschlägigen Bestimmungen
müssen zur Unterscheidung der Olivenölkategorien die entsprechendenchemisch-physikalischen Merkmale sowie die organoleptischen Merk-male nativer Olivenöle festgelegt werden, damit Reinheit und Qualitätder betreffenden Erzeugnisse gewährleistet sind.
Die Merkmale der einzelnen Olivenöle müssen gemeinschaftsweit
einheitlich bestimmt werden. Daher müssen gemeinschaftlicheVerfahren für die chemische Analyse und die organoleptische Prüfungfestgelegt werden. Allerdings sollten während einer Übergangszeit auchandere in den Mitgliedstaaten übliche Analyseverfahren zulässig sein,
wobei jedoch vorzusehen ist, daß bei abweichenden Ergebnissen die
nach dem gemeinschaftlichen Verfahren erzielten Ergebnisse gelten.
Die Festlegung der chemisch-physikalischen Merkmale von Olivenölen
und der Analyseverfahren erfordert eine Anpassung der Zusatzvor-schriften zu Kapitel 15 der Kombinierten Nomenklatur.
Zur Bewertung der organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle
müssen Gruppen von ausgewählten und geschulten sensorischenPrüfern gebildet werden; dafür ist eine ausreichende Zeitspanne vorzu-sehen. Da einige Mitgliedstaaten solche Prüfergruppen nicht ohneweiteres zusammenstellen können, muß ihnen die Möglichkeit einge-räumt werden, die in anderen Mitgliedstaaten eingesetzten
Prüfergruppen zu befassen.
Damit das einwandfreie Funktionieren der für die Einfuhr von Oliven-
tresteröl geltenden Abschöpfungsregelung gewährleistet ist, muß eineinheitliches Verfahren zur Bestimmung des Ölgehalts dieser Erzeug-nisse vorgesehen werden.
Um Nachteile für den Handel auszuschließen, sollte Olivenöl, das vor
Inkrafttreten dieser Verordnung abgefüllt wurde, während einerbestimmten Zeit noch vermarktet werden dürfen.
Die Verordnung (EWG) Nr. 1058/77 der Kommission (
3), zuletzt
geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 1858/88 (4), ist aufzuheben.
Der Verwaltungsausschuß für Fette hat nicht innerhalb der ihm von
seinem Vorsitzenden gesetzten Frist Stellung genommen —1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 2
(1) ABl. Nr. 172 vom 30. 9. 1966, S. 3025/66.
(2) ABl. Nr. L 353 vom 17. 12. 1990, S. 23.
(3) ABl. Nr. L 128 vom 24. 5. 1977, S. 6.
(4) ABl. Nr. L 166 vom 1. 7. 1988, S. 10.
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HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN:
Artikel 1
(1) Native Olivenöle im Sinne von Nummer 1 Buchstaben a) und b)
des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG sind Öle, deren Merk-
male mit den in Anhang I Nummern 1 und 2 dieser Verordnunggenannten Merkmalen übereinstimmen.
(2) Lampantöl im Sinne von Nummer 1 Buchstabe c) des Anhangs
der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Öl, dessen Merkmale mit den in
Anhang I Nummer 3 dieser Verordnung genannten Merkmalen überein-stimmen.
(3) Raffiniertes Olivenöl im Sinne von Nummer 2 des Anhangs der
Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit den in
Anhang I Nummer 4 dieser Verordnung genannten Merkmalen überein-stimmen.
(4) Olivenöl, bestehend aus raffiniertem und nativem Olivenöl, im
Sinne von Nummer 3 des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG
ist Öl, dessen Merkmale mit den in Anhang I Nummer 5 dieser Verord-nung genannten Merkmalen übereinstimmen.
(5) Rohes Oliventresteröl im Sinne von Nummer 4 des Anhangs der
Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit den in
Anhang I Nummer 6 dieser Verordnung genannten Merkmalen überein-stimmen.
(6) Raffiniertes Oliventresteröl im Sinne der Nummer 5 des
Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merk-
male mit den in Anhang I Nummer 7 dieser Verordnung genannten
Merkmalen übereinstimmen.
(7) Oliventresteröl im Sinne von Nummer 6 des Anhangs der
Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit den
in Anhang I Nummer 8 dieser Verordnung genannten Merkmalen über-
einstimmen.
Artikel 2
(1) Die Merkmale der Öle gemäß Anhang I dieser Verordnung
werden nach folgenden Analysenverfahren bestimmt:
— freie Fettsäuren, berechnet in Prozent Ölsäure, nach dem Verfahren
des Anhangs II;
— Peroxidzahl nach dem Verfahren des Anhangs III;
— Wachsgehalt nach dem Verfahren des Anhangs IV;
— Sterinfraktion nach dem Verfahren des Anhangs V;
— Erythrodiol nach dem Verfahren des Anhang VI;
— gesättigte Fettsäuren in 2-Stellung der Triglyceride nach dem
Verfahren des Anhangs VII;
— spektrophotometrische Analyse nach dem Verfahren des Anhangs
IX;
— Fettsäurezusammensetzung nach dem Verfahren der Anhänge XA
und XB;
— flüchtige halogenierte Lösungsmittel nach dem Verfahren des
Anhangs XI;
— Bestimmung der organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle nach
dem gemäß Absatz 2 angewandten Verfahren des Anhangs XII;1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 3
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— Stigmasterinnachweis nach dem Verfahren des Anhangs XVII;
— Bestimmung der Zusammensetzung der Triglyceride mit ECN42
nach dem Verfahren des Anhangs XVIII;
— Gehalt an aliphatischen Alkoholen nach dem Verfahren des
Anhangs XIX.
(2) Die Prüfung der organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle
durch die einzelstaatlichen Behörden oder ihre Vertreter wird vondurch die Mitgliedstaaten zugelassenen Prüfergruppen vorgenommen.
Die organoleptischen Merkmale eines in Unterabsatz 1 genannten
Olivenöls werden als mit der deklarierten Olivenölkategorie überein-stimmend angesehen, wenn eine von dem betreffenden Mitgliedstaat
zugelassene Prüfergruppe die diesbezügliche Einstufung bestätigt.
Bestätigt die zugelassene Prüfergruppe die organoleptischen Merkmale
der deklarierten Olivenölkategorie nicht, so fordern die einzelstaatli-chen Behörden oder ihre Vertreter auf Antrag des Betroffenen zweiGegenanalysen anderer zugelassener Prüfergruppen an, von denenmindestens eine von einer Prüfergruppe vorgenommen wird, die vondem betreffenden Erzeugermitgliedstaat zugelassen wurde. Die fragli-
chen Merkmale gelten als mit den deklarierten Merkmalen konform,
wenn zwei Gegenanalysen die deklarierte Einstufung bestätigen. Imgegenteiligen Fall sind — unbeschadet der fälligen Sanktionen — dieKosten für die Gegenanalysen vom Betroffenen zu tragen.
(3) Bei der Überprüfung der Merkmale der in Absatz 1 genannten
Öle durch die nationalen Behörden oder ihre Vertreter erfolgen dieProbenahmen gemäß den internationalen Normen EN ISO 661 betref-
fend die Vorbereitung der Untersuchungsproben und EN ISO 5555
betreffend die Entnahme der Proben. Jedoch werden die Proben beiPartien, die aus Olivenöl in unmittelbaren Umschließungen mit einemVolumen von höchstens 100 l bestehen, abweichend von Nummer 6.8der Norm EN ISO 5555 gemäß den Bestimmungen von Anhang Ia
dieser Verordnung entnommen.
Unbeschadet der Bestimmungen der Norm EN ISO 5555 und des Kapi-
tels 6 der Norm EN ISO 661 werden die Proben unverzüglich vor Lichtund starker Hitze geschützt sowie
— in den Monaten Oktober bis Mai spätestens am zehnten Arbeitstag
nach der Probenahme und
— in den Monaten Juni bis September spätestens am fünften
Arbeitstag nach der Probenahme
zur Analysein das Laboratorium ge schickt.
(4)►
M20Bei der Überprüfung gemäß Absatz 3 erfolgen die
Analysen gemäß den Anhängen II, III, IX, X und XII sowie gegeben-enfalls die in den einzelstaatlichen Rechtsvorschriften vorgesehenen
Gegenanalysen vor Erreichen des Mindesthaltbarkeitsdatums. Erfolgt
die Probenahme mehr als vier Monate vor dem Mindesthaltbarkeits-datum, so müssen die Proben spätestens im vierten Monat nach derProbenahme analysiert werden. Für die übrigen in der genanntenVerordnung vorgesehenen Analysen gelten keine Fristen. ◄
Entsprechen die Analyseergebnisse nicht den Merkmalen der angemel-
deten Kategorie Olivenöl bzw. Oliventresteröl, so wird der Beteiligte
davon spätestens einen Monat vor Ablauf der in Unterabsatz 1
genannten Frist in Kenntnis gesetzt, es sei denn, die Probenahme istweniger als einen Monat vor dem Mindesthaltbarkeitsdatum erfolgt.
(5) Bei der nach einem der Verfahren in Absatz 1 vorgenommenen
Bestimmung der Merkmale der Öle werden die Analyseergebnissedirekt mit den in dieser Verordnung vorgesehenen Grenzwertenverglichen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 4
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Artikel 2a
Die Prüfung der Konformität einer Probe von Oliven- oder Oliventre-
steröl mit der gemeldeten Kategorie durch die nationalen Behördenoder deren Vertreter kann folgendermaßen erfolgen:
a) entweder durch die Durchführung der in Anhang I aufgeführten
Analysen in beliebiger Reihenfolge
b) oder nach der Reihenfolge des Anhangs Ib über den schematisierten
Entscheidungsablauf, bis eine der in diesem Ablauf vorgesehenenEntscheidungen erreicht ist.
Artikel►M193◄
Werden Abweichungen zwischen den festgestellten und den aus der
Produktkennzeichnung zu erwartenden organoleptischen Merkmalen
festgestellt, so verhängt der betreffende Mitgliedstaat unbeschadet
etwaiger anderer Sanktionen administrative finanzielle Sanktionen,deren Höhe sich nach der Schwere der festgestellten Unregelmäßigkeitrichtet.
Zur Beurteilung der Unregelmäßigkeit wird die natürliche Entwicklung
der Merkmale von unter normalen Bedingungen aufbewahrten Ölenberücksichtigt.
Die Mitgliedstaaten teilen der Kommission zu Beginn eines jeden
Halbjahres Anzahl und Art der festgestellten Unregelmäßigkeiten und
der im Laufe des vorhergehenden Halbjahres verhängten Sanktionen
mit.
Artikel 4
(1) Zur Beurteilung und Kontrolle der organoleptischen Merkmale
durch die einzelstaatlichen Behörden oder ihre Vertreter können die
Mitgliedstaaten Prüfergruppen zulassen.
Die Zulassungsbedingungen werden von den Mitgliedstaaten so festge-
legt, dass insbesondere gewährleistet ist, dass
— die Bedingungen gemäß Anhang XII Nummer 4 erfüllt sind;
— der Leiter der Prüfergruppe in einem Institut und unter Bedin-
gungen geschult wird, die vom Mitgliedstaat zu diesem Zweck
anerkannt sind;
— die Zulassung von den Ergebnissen abhängig gemacht wird, die die
Gruppe im Rahmen eines vom Mitgliedstaat jährlich festgelegten
Kontrollprogramms erzielt.
Die Mitgliedstaaten teilen der Kommission die Liste der zugelassenen
Prüfergruppen und die nach Maßgabe dieses Absatzes getroffenenMaßnahmen mit.
(2) Ergeben sich in einem Mitgliedstaat Schwierigkeiten bei der
Zulassung von Prüfergruppen, kann eine Prüfergruppe eingeschaltetwerden, die in einem anderen Mitgliedstaat zugelassen ist.
(3) Jeder Mitgliedstaat erstellt ein Verzeichnis der von Organisa-
tionen des Berufsstands oder mehrerer Berufsstände unter denBedingungen des Absatzes 1 eingeführten Prüfergruppen und achtetauf die Einhaltung dieser Bedingungen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 5
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Artikel 6
(1) Der Ölgehalt von Trester und anderen Rückständen der Olivenö-
lextraktion (KN-Codes 2306 90 11 und 2306 90 19) wird nach dem
Verfahren des Anhangs XV bestimmt.
(2) Der Ölgehalt gemäß Absatz 1 wird in Massenprozenten, bezogen
auf die Trockenmasse, berechnet.
Artikel 7
Es gelten die Gemeinschaftsvorschriften über die Anwesenheit von
Kontaminanten.
Hinsichtlich des Gehalts an halogenierten Lösungsmitteln gelten für
alle Kategorien von Olivenölen folgende Grenzwerte:
— Höchstgehalt an jedem festgestellten halogenierten Lösungsmittel
0,1 mg/kg
— Höchstgehalt der Summe der festgestellten halogenierten Lösungs-
mittel 0,2 mg/kg.
Artikel 8
(1) Die Mitgliedstaaten teilen der Kommission die Maßnahmen mit,
die sie zur Durchführung dieser Verordnung getroffen haben.
(2) Die Mitgliedstaaten übermitteln der Kommission zu Beginn
jedes Halbjahres eine Zusammenstellung der analytischen Daten derim vorangegangenen Halbjahr durchgeführten Bestimmungen.
Diese Ergebnisse werden vom Verwaltungsausschuß für Fette nach
dem Verfahren des Artikels 39 der Verordnung Nr. 136/66/EWG
geprüft.
Artikel 9
Die Verordnung (EWG) Nr. 1058/77 wird aufgehoben.
Artikel 10
(1) Diese Verordnung tritt am dritten Tag nach ihrer Veröffentli-
chung im Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften in Kraft.
Das Verfahren des Anhangs XII ist jedoch, außer wenn es sich um
Interventionsmaßnahmen handelt, ab ►
M11. November 1992 ◄
anwendbar.
Diese Methode findet keine Anwendung auf native Olivenöle, die vor
dem 1. November 1992 abgefüllt wurden.
(2) Diese Verordnung gilt nicht für Olivenöl und Oliventresteröl, das
vor dem Tag des Inkrafttretens dieser Verordnung abgefüllt und biszum 31. Oktober 1992 vermarktet wurde.
Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmit-
telbar in jedem Mitgliedstaat.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 6
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ANHÄNGE
Inhalt
Anhang I: Merkmale von Olivenölen
Anhang Ia: Entnahme von Proben bei Partien von Olivenöl oder Oliven-
tresteröl in unmittelbaren Umschließungen mit einem Inhalt
von höchstens 100 l
Anhang Ib: Schematisierter Entscheidungsverlauf
Anhang II: Bestimmung der freien Fettsäuren
Anhang III: Bestimmung der Peroxidzahl
Anhang IV: ►M6Kapillargaschromatographische Bestimmung des
Wachsgehalts ◄
Anhang V: Bestimmung der Zusammensetzung und des Gehalts an
Sterinen mit der Kapillar-Gaschromatographie
Anhang VI: Bestimmung des Erythrodiols und des Uvaols
Anhang VII: Bestimmung von Fettsäuren in 2-Stellung der Triglyceride
Anhang IX: UV-spektrophotometrische AnalyseAnhang XA: Gaschromatographische Analyse der Fettsäuremethylester
Anhang XB: Vorbereitung der Fettsäuremethylester
Anhang XI: Bestimmung des Gehalts an flüchtigen halogenierten
Lösungsmitteln in Olivenöl
Anhang XII: Organoleptische Prüfung von nativem Olivenöl
Anhang XV: Ölgehalt der OliventresterAnhang XVI: Bestimmung der Iodzahl
Anhang XVII: Bestimmung der Stigmastadiene in pflanzlichen Ölen
Anhang XVIII: Bestimmung der Zusammensetzung der Triglyceride mit
ECN42
Anhang XIX: Bestimmung des Gehalts an aliphatischen Alkoholen ange-
fügt1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 7
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ANHANG I
MERKMALE VON OLIVENÖLEN
KategorieSäuregehalt
(%)
(*)Peroxidzahl
meq O2/kg
(*)Wachsemg/kg
(**)Gesättigte
Fettsäuren in
2-Stellung der
Triglyceride
(%)Stigmastadien
mg/kg (1)ECN42-Diffe-
renz zwischen
HPLC-Mess-
wert und theo-
retischer
BerechnungK232(*) K270(*) Delta-K (*)Sensorische
Prüfung
Fehlermedian
(Md) (*)Sensorische
Prüfung
Fruchtigkeits-
median (Mf)
(*)
1. Natives Olivenöl extra ≤0,8 ≤20 ≤250 ≤1,5 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,50 ≤0,22 ≤0,01 Md = 0 Mf > 0
2. Natives Olivenöl ≤2,0 ≤20 ≤250 ≤1,5 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,01 Md ≤2,5 Mf > 0
3. Lampantöl > 2,0 — ≤300 (3) ≤1,5 ≤0,50 ≤0,3 — — — Md > 2,5 (2)—
4. Raffiniertes Olivenöl ≤0,3 ≤5 ≤350 ≤1,8 — ≤0,3 — ≤1,10 ≤0,16 — —
5. Olivenöl — bestehend
aus raffinierten und
nativen Olivenölen ≤1,0 ≤15 ≤350 ≤1,8 — ≤0,3 — ≤0,90 ≤0,15 — —
6. Rohes Oliventresteröl — — > 350 (4) ≤2,2 — ≤0,6 — — — — —
7. Raffiniertes Oliventre-
steröl ≤0,3 ≤5 > 350 ≤2,2 — ≤0,5 — ≤2,00 ≤0,20 — —
8. Oliventresteröl ≤1,0 ≤15 > 350 ≤2,2 — ≤0,5 — ≤1,70 ≤0,18 — —
(1) Summe der mittels Kapillarsäule (nicht) abtrennbaren Isomere.
(2) Oder wenn der Fehlermedian höchstens 2,5 beträgt und der Fruchtigkeitsmedian gleich 0 ist.
(3) Öl mit einem Wachsgehalt zwischen 300 mg/kg und 350 mg/kg wird als Lampantöl eingestuft, wenn der Gesamtgehalt an aliphatischen Alkoholen höchsten s 350 mg/kg oder der Gehalt an Erytrodiol und Uvaol höchstens 3,5
beträgt.
(4) Öl mit einem Wachsgehalt zwischen 300 mg/kg und 350 mg/kg wird als rohes Olivenresteröl eingestuft, wenn der Gesamtgehalt an aliphatischen Alkohol en über 350 mg/kg oder der Gehalt an Erytrodiol und Uvaol über3,5
beträgt.▼M201991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 8
KategorieGehalt an Fettsäuren (1)Summe
trans-
Isomere
Fett-
säuren
(%)Summe
trans-
Isomere
Linol-
und Lino-
lensäure
(%)Zusammensetzung der Sterine
Sterine
insgesamt
(mg/kg)Erythro-
diol und
Uvaol
(%) (**)Myristin-
säure
(%)Linolen-
säure
(%)Arachin-
säure
(%)Eicosen-
säure
(%)Behensä-
ure
(%)Lignoce-
rinsäure
(%)Chole-
sterin
(%)Brassica-
sterin
(%)Cam
pesterin
(%)Stigma-
sterin
(%)Beta-
Sitosterin
(%) (2)Delta-7-
Stigma-
sterin
(%)
1. Natives Olivenöl
extra ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
2. Natives Olivenöl ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
3. Lampantöl ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,10≤0,10 ≤0,5≤0,1≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥1 000≤4,5 (3)
4. Raffiniertes
Olivenöl ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
5. Olivenöl —
bestehend aus
raffinierten und
nativen
Olivenölen ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
6. Rohes Oliventre-
steröl ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,20≤0,10 ≤0,5≤0,2≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥2 500 > 4,5 (4)
7. Raffiniertes
Oliventresteröl ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 800 > 4,5
8. Oliventresteröl ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 600 > 4,5
(1) Gehalt an anderen Fettsäuren (%): Palmititinsäure: 7,5-20,0; Palmitoleinsäure: 0,3-3,5; Heptadecansäure: ≤0,3; Heptadecensäure: ≤0,3; Stearinsäure: 0,5-5,0; Ölsäure 55,0-83,0; Linolsäure: 3,5-21,0.
(2) Summe aus Delta-5-23-Stigmastadienol, Clerosterin, Beta-Sitosterin, Sitostanol, Delta-5-Avenasterin und Delta-5-24-Stigmastadienol.
(3) Öl mit einem Wachsgehalt zwischen 300 und 350 mg/kg wird als Lampantöl eingestuft, wenn der Gesamtgehalt an aliphatischen Alkoholen höchstens 350 m g/kg oder der Gehalt an Erytrodiol und Uvaol höchstens 3,5 % beträgt.
(4) Öl mit einem Wachsgehalt zwischen 300 und 350 mg/kg wird als rohes Oliventresteröl eingestuft, wenn der Gesamtgehalt an aliphatischen Alkoholen üb er 350 mg/kg und der Gehalt an Erytrodiol und Uvaol über 3,5 % beträgt.
Anmerkungen:
a) Die Analyseergebnisse müssen bis auf die gleiche Anzahl von Dezimalstellen angegeben werden wie die für jedes Merkmal vorgesehenen Werte. Beträg t die nächstfolgende Dezimalstelle über 4, so ist die angegebene letzte
Stelle hinter dem Komma aufzurunden.
b) Auch wenn nur ein einziges Merkmal nicht mit dem vorgesehenen Grenzwert übereinstimmt, muss das Öl einer anderen Kategorie zugeordnet oder als nic ht seinen Reinheitskriterien entsprechend erklärt werden.
c) Die mit einem Sternchen (*) gekennzeichneten Ölqualitätsmerkmale bedeuten
— im Falle von Lampantöl, dass die betreffenden Grenzwerte nicht alle gleichzeitig erfüllt werden müssen;
— im Falle nativer Olivenöle, dass die Nichterfüllung des Grenzwerts auch nur eines einzigen Merkmals eine Umstufung innerhalb der Kategorien der na tiven Olivenöle zur Folge hat.
d) Die mit zwei Sternchen (**) gekennzeichneten Merkmale bedeuten im Fall der betreffenden Oliventresteröle, dass die jeweiligen Grenzwerte nicht alle gleichzeitig erfüllt werden müssen.▼M201991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 9
▼M20
ANHANG Ia
Probenahme bei Olivenöl oder Oliventresteröl, das in unmittelbaren
Verpackungseinheiten mit einem Inhalt von höchstens 100 l geliefert wird
Diese Methode der Probenahme wird für Lieferungen von Olivenöl oder Oliven-
tresteröl von bis zu 125 000 l angewendet, das in unmittelbare
Verpackungseinheiten mit einem Inhalt von höchstens 100 l abgefüllt wurde.
Umfasst die Lieferung mehr als 125 000 l, so wird sie in gleich große Partien
von jeweils bis zu 125 000 l unterteilt. Umfasst die Lieferung weniger als
125 000 l, so stellt sie eine Partie dar. Die Methode wird dann auf jede Partie
angewendet.
Abhängig von der Größe der Partie wird die Mindestanzahl der Einzelproben
festgesetzt, die der Übersicht in Nummer 1 entspricht.
Die Bedeutung der Einzelprobe hängt von der Größe der unmittelbaren
Verpackungseinheiten gemäß der Übersicht in Nummer 2.1 ab.
Die Begriffe „Lieferung“, „Einzelprobe“ und „Laborprobe“ entsprechen der
Definition in der Norm EN ISO 5555.
Eine „Partie“ besteht aus mehreren Verkaufseinheiten, die unter solchen
Umständen hergestellt und aufgemacht wurden, dass das in jeder dieser
Einheiten enthaltene Öl in Bezug auf alle analytischen Eigenschaften als
homogen gilt.
1. ANZAHL DER EINZELPROBEN
Die Mindestanzahl der Einzelproben ist abhängig von der Größe der Partie
und entspricht der folgenden Übersicht:
Größe der Partie (l) unter Mindestanzahl der Einzelproben
7 500 2
25 000 3
75 000 4
125 000 5
Die unmittelbaren Verpackungseinheiten einer Einzelprobe müssen aus
nebeneinanderliegenden Stellen der Partie stammen.
In Zweifelsfällen erhöht der Mitgliedstaat die Zahl der zu entnehmenden
Einzelproben.
2. ZUSAMMENSETZUNG EINER EINZELPROBE
2.1Jede Einzelprobe besteht
bei unmittelbaren Verpackungseinheiten
mit einem Inhalt von:aus dem Öl von:
a) mindestens 5 l a) 3 unmittelbaren Verpackungsein-
heiten
b) mindestens 3 l und weniger als
5lb) 3 unmittelbaren Verpackungsein-
heiten
c) mindestens 2 l und weniger als
3lc) 3 unmittelbaren Verpackungsein-
heiten
d) mindestens 1 l und weniger als
2ld) 6 unmittelbaren Verpackungsein-
heiten
e) mindestens 0,75 l und weniger
als 1 le) 6 unmittelbaren Verpackungsein-
heiten
f) weniger als 0,75 l f) der dreifachen Ölmenge der
Mindestanzahl Verpackungsein-
heiten, deren Gesamtinhalt 5 l
übersteigt1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 10
▼M20
2.2Die Einzelproben müssen bis zum Zeitpunkt der Analyse in den unmit-
telbaren Verpackungseinheiten verbleiben. Das Öl der Einzelproben
wird anschließend gegebenenfalls in drei Laborproben aufgeteilt, um
Folgendes durchzuführen:
a) die Analysen gemäß den Anhängen II, III, IX und X,
b) dieAnalysege mäß Anhang XII und
c) die übrigen Analysen.
2.3Die Verpackungseinheiten, die eine Einzelprobe bilden, werden gemäß
den in den einzelstaatlichen Rechtsvorschriften vorgesehenen Kontroll-
verfahren aufgeteilt.
3. ANALYSEN UND ERGEBNISSE
a) Jede der in Nummer 1 genannten Einzelproben wird gemäß Nummer 2.5
der Norm EN ISO 5555 in Laborproben unterteilt, die folgenden
Analysen unterzogen werden:
— Bestimmung der freien Fettsäuren gemäß Artikel 2 Absatz 1 erster
Gedankenstrich,
— Bestimmung der Peroxidzahl gemäß Artikel 2 Absatz 1 zweiter
Gedankenstrich,
— spektrophotometrische Analyse gemäß Artikel 2 Absatz 1 achter
Gedankenstrich,
— Fettsäurezusammensetzung gemäß Artikel 2 Absatz 1 neunter Gedan-
kenstrich.
b) Stimmen für mindestens eine Einzelprobe derselben Partie nicht alle
Analyseergebnisse gemäß Buchstabe a) mit den Merkmalen der gemel-
deten Olivenölkategorie überein, so wird die gesamte Partie als nicht
konform eingestuft.
Sind bei jeder der Einzelproben derselben Partie die Analyseergebnisse
gemäß Buchstabe a) unter Berücksichtigung der Merkmale der Wieder-
holbarkeit der betreffenden Methoden nicht alle homogen, so wird die
gesamte Partie als nicht homogen eingestuft und jede Einzelprobe muss
den übrigen vorgeschriebenen Analysen unterzogen werden. Ist das
Gegenteil der Fall, so wird nur eine Einzelprobe der vorgenannten Partie
den übrigen vorgeschriebenen Analysen unterzogen.
c) Stimmt eines der Analyseergebnisse gemäß Buchstabe b) Unterabsatz 2
nicht mit den Merkmalen der gemeldeten Olivenölkategorie überein, so
wird die gesamte Partie als nicht konform eingestuft.
Stimmen alle Analyseergebnisse gemäß Buchstabe b) Unterabsatz 2 mit
den Merkmalen der gemeldeten Olivenölkategorie überein, so wird die
gesamte Partie als konform eingestuft.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 11
▼M20
ANHANG Ib
SCHEMATISIERTER ENTSCHEIDUNGSABLAUF FÜR DIE PRÜFUNG
DER KONFORMITÄT EINER OLIVENÖLPROBE MIT DER DEKLA-
RIERTEN KATEGORIE
Die Konformität von Olivenöl bzw. Oliventresteröl mit der deklarierten Kate-
gorie kann wie folgt geprüft werden:
a) Prüfung der Erfüllung der in Anhang I genannten Eigenschaften durch Vorn-
ahme der hierfür vorgesehenen Analysen in beliebiger Reihenfolge oder
b) Vornahme der im Entscheidungsablauf vorgesehenen Analysen in der ange-
gebenen Reihenfolge, bis eine der in diesem Ablauf vorgesehenen
Entscheidungen erreicht ist.
Unabhängig davon sind die zur Prüfung der Übereinstimmung mit den Gemein-
schaftsnormen erforderlichen Analysen hinsichtlich etwaiger Kontaminanten
oder halogenierter Lösungsmittel durchzuführen.
Der Entscheidungsablauf gilt für alle Olivenöl- und Oliventresterölkategorien
und besteht aus von 1 bis 11 nummerierten Schemata, die entsprechend der
deklarierten Kategorie in der Reihenfolge des Übersichtschemas anzuwenden
sind.
Erläuterung für das Übersichtsschema und die Schemata 1 bis 11:
— Die Doppellinie (=) weist auf den nächsten Schritt hin, der durchzuführen
ist, wenn die Bedingungen des vorherigen Rechtecksymbols erfüllt wurden
(positives Ergebnis). Die gepunktete Linie (…) verweist auf die weitere
Vorgehensweise bei negativem Ergebnis.
— Die Bezeichnungen der Rechtecksymbole der Schemata 1 bis 11 verweisen
auf die Analysen der vorliegenden Verordnung. Die Entsprechungen sind in
Anlage 1 des vorliegenden Anhangs wiedergegeben.
— Die Buchstaben in den Kreissymbolen (negative Ergebnisse) der Schemata 1
bis 11 verweisen auf die Anmerkungen in Anlage 2 des vorliegenden
Anhangs. Sie bedeuten nicht automatisch, dass weitere Analysen durchge-
führt werden müssen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 12
▼M20
Übersichtsschema1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 13

▼M20
Schema 11991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 14

▼M20
Schema 21991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 15

▼M20
Schema 31991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 16

▼M20
Schema 41991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 17

▼M20
Schema 51991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 18

▼M20
Schema 61991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 19

▼M20
Schema 71991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 20

▼M20
Schema 81991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 21

▼M20
Schema 91991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 22

▼M20
Schema 101991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 23

▼M20
Schema 111991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 24

▼M20
Anlage 1
Entsprechungen zwischen den Anhängen der vorliegenden Verordnung und den Analysen des
Entscheidungsablaufs
— Säuregehalt: Anhang II Bestimmung des Gehalts an freien
Fettsäuren
— Peroxidzahl: Anhang III Bestimmung der Peroxidzahl
— UV-Spektrometrie: Anhang IX Peroxidzahl— Bewertung der organoleptischen
Eigenschaften:Anhang XII Bewertung der organoleptischen
Eigenschaften von nativem Olivenöl
— Stigmasta-3,5-dien: Anhang XVII Methodik zur Bestimmung des Stig-
mastadiengehalts in pflanzlichen
Ölen
— trans-Isomere Fettsäuren: Anhang Xa und Gaschromatografische Analyse der
Fettsäuremethylester
Anhang Xb Herstellung der Fettsäuremethylester
— Fettsäurenzusammensetzung: Anhang Xa und Gaschromatografische Analyse der
Fettsäuremethylester
Anhang Xb Herstellung der Fettsäuremethylester
—∆ECN42: Anhang XVIII Bestimmung der Triglycerid-Zusam-
mensetzung mit ECN42 (Differenz
zwischen dem tatsächlichen und dem
theoretischen Triglycerid-Gehalt)
— Zusammensetzung und Gesamt-
gehalt der Sterine:Anhang V Bestimmung der Zusammensetzung
und des Gehalts an Sterinen mit
Kapillar-Gaschromatografie
— Erythrodiol und Uvaol: Anhang VI Bestimmung des Erythrodiol- und
Uvaolgehalts
— Wachse: Anhang IV Bestimmung des Gehalts an Wachsen
mit Kapillar-Gaschromatografie
— Aliphatische Alkohole: Anhang XIX Bestimmung des Gehalts an aliphati-
schen Alkoholen mit Kapillar-
Gaschromatografie
— Gesättigte Fettsäuren in 2-Stel-
lung:Anhang VII Bestimmung der gesättigten Fett-
säuren in 2-Stellung der Triglyceride1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 25
▼M20
Anlage 2
Schema 1
a) Siehe natives Olivenöl oder Lampantöl (Qualitätskriterien Schema 2 bzw.
Qualitäts- und Reinheitskriterien Schema 4)
b) Siehe Lampantöl (Qualitäts- und Reinheitskriterien Schema 4)
Schema 2
a) Siehe Lampantöl (Qualitäts- und Reinheitskriterien Schema 4)
b) Siehe natives Olivenöl extra (Qualitätskriterien Schema 1)
Schema 3
a) Enthält raffiniertes Öl (Olivenöl oder andere Öle)
b) Enthält Oliventresteröl
Schema 4
a) Siehe natives Olivenöl extra und natives Olivenöl (Qualitätskriterien Schema
1 und Schema 2)
b) Enthält raffiniertes Öl (Olivenöl oder andere Öle)
c) Enthält Oliventresteröl
d) Enthält veresterte Öle
Schema 7
a) Enthält Oliventresteröl
b) Enthält veresterte Öle
Schema 8
a) Enthält raffiniertes Öl (Olivenöl oder andere Öle)
b) Siehe Lampantöl (Qualitäts- und Reinheitskriterien Schema 4)
c) Enthält veresterte Öle
Schema 11
a) Enthält veresterte Öle1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 26
▼B
ANHANG II
BESTIMMUNG DER FREIEN FETTSÄUREN
1. ANWENDUNGSBEREICH
Bestimmung der freien Fettsäuren in Olivenölen. Der Gehalt an freien
Fettsäuren wird über den Gehalt an freien Säuren in konventioneller
Weise berechnet.
1.1.Prinzipder Methode
Die Probe wird in einem geeigneten Lösungsmittelgemisch gelöst. Dann
werden die vorhandenen freien Säuren mit einer ethanolischen Kaliumhy-
droxidlösung titriert.
1.2.Reagenzien
Alle Reagenzien müssen anerkannte Anaylsenqualität aufweisen; als
Wasser ist destilliertes Wasser oder Wasser gleicher Reinheit zu
verwenden.
1.2.1. Diethylether/Ethanol 95%ig (V/V), Mischung 1:1.
Vorsicht: Diethylether ist leicht brennbar und kann explosive Peroxide
bilden. Es muß daher unter besonderen Vorsichtsmaßnahmen
verwendet werden.
Das Diethylether/Ethanol-Gemisch muß unmittelbar vor dem Gebrauch
mit einer Kaliumhydroxidlösung (1.2.2) unter Zusatz von 0,3 ml
Phenolphthaleinlösung (1.2.3) pro 100 ml Lösungsmittelgemisch neutrali-
siert werden.
Anmerkung: Wenn Diethylether nicht benutzt werden kann, so kann auch
eine Mischung aus Ethanol und Toluol verwandt werden.
Eventuell kann auch Ethanol durch 2-Propanol ersetzt
werden.
1.2.2. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung, 0,1 molar oder, falls erforderlich,
0,5 molar.
Die genaue Konzentration der ethanolischen Kaliumhydroxidlösung muß
bekannt sein und unmittelbar vor der Verwendung überprüft werden. Die
Lösung sollte mindestens 5 Tage vorher hergestellt und in eine braune
Flasche, die mit einem Gummistopfen verschlossen wird, dekantiert
werden. Sie muß farblos oder nur schwach gefärbt sein.
Anmerkung: EinestabilefarbloseKaliumhydroxidlösung kann wiefolgt
hergestellt werden: 1 000 ml Ethanol mit 8 g Kaliumhy-
droxid und 0,5 g Aluminiumspänee ineStundeam
Rückflußkühler kochen. Sofort destillieren. Die erforderliche
Menge Kaliumhydroxid in dem destillierten Ethanol lösen
und mehrere Tage stehen lassen. Die klare Lösung von
dem ausgefallenen Karbonat abdekantieren.
Die Lösung kann auch ohne Destillation wie folgt herge-
stellt werden: 1 000 ml Ethanol mit 4 ml Aluminiumbutylat
mehrere Tage stehen lassen. Die überstehende Flüssigkeit
abdekantieren und die erforderliche Menge Kaliumhydroxid
darin lösen. Diese Lösung ist gebrauchsfertig.
1.2.3. Phenolphthalein, Lösung von 10 g/l in 95-96%igem Ethanol oder Alkali-
blau (bei sehr stark gefärbten Fetten), Lösung von 20 g/l in 95-96%igem
Ethanol.
1.3.Geräte
ÜblicheLaborge räteu. a.:
1.3.1. Analysenwaage,1.3.2. 250-ml-Erlenmeyerkolben,
1.3.3. 10-ml-Bürette mit 0,05-ml-Graduierung.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 27
▼B
1.4.Verfahren
1.4.1. Die Bestimmung erfolgt mit der filtrierten Probe. Beträgt der Gesamtge-
halt an Wasser und Verunreinigungen weniger als 1 %, so wird die
Bestimmung mit der unfiltrierten Probe durchgeführt.
1.4.2. Probe
Die Größe der Einwaage richtet sich nach dem zu erwartenden Gehalt an
freien Fettsäuren (Angaben in der nachstehenden Tabelle).
Erwarteter Gehalt an
freien FettsäurenEinwaage
(in g)Genauigkeit der
Einwaage
(in g)
< 1 20 0,05
1—4 10 0,02
4—15 2,5 0,01
15—75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Die Probe in den Erlenmeyerkolben (1.3.2) einwiegen.
1.4.3. Durchführung der Bestimmung
Die Probe (1.4.2) in 50 bis 150 ml der neutralisierten Diethylether/
Ethanol-Mischung (1.2.1) lösen. Mit der 0,1 molaren Kaliumhydroxidlö-
sung (1.2.2) (Anmerkung 2) unter Schütteln bis zum Umschlag des
Indikators titrieren. (Die Rosafärbung des Phenolphthaleins muß
mindestens 10 Sekunden anhalten.)
Anmerkungen: 1. Diee thanolischeKaliumhydroxidlösung (1.2.2) kann
durch eine wäßrige Kaliumhydroxid- oder Natriumhy-
droxidlösung ersetzt werden, wenn die zugeführte
Wassermenge keine Phasentrennung bewirkt.
2. Werden zur Titration mehr als 10 ml der 0,1 molaren
Kaliumhydroxidlösung benötigt, so ist eine 0,5 molareLösung zu verwenden.
3. Wird die Lösung während der Titration trübe, so ist
eine ausreichende Menge Lösungsmittelmischung
(1.2.1) zuzufügen, bis die Lösung wieder klar ist.
1.5.Berechnung des Gehalts an freien Fettsäuren in % Ölsäure
Der Gehalt an freien Fettsäuren in Gewichtsprozent ist
V/C2c/C2M
1000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
Dabei sind:
V = Verbrauch an Kaliumhydroxidlösung in ml,
c = genaue Konzentration der Kaliumhydroxidlösung in mol/l,
M = Molekulargewicht in g der Säure, die für die Berechnung
zugrunde gelegt wird (= 282),
m = Probeneinwaage in g.
Als Ergebnis gilt das arithmetische Mittel ►M6zweier
Bestimmungen ◄.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 28
▼C1
▼B
▼B
ANHANG III
BESTIMMUNG DER PEROXIDZAHL
1. ZWECK
Diese Norm beschreibt ein Verfahren für die Bestimmung der Peroxidzahl
von Ölen und Fetten.
2. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Norm gilt für tierische und pflanzliche Öle und Fette.
3. DEFINITION
Die Peroxidzahl ist die Gesamtmenge solcher Substanzen in der Probe,
ausgedrückt in Milliäquivalenten aktiven Sauerstoffs pro kg, die unter den
beschriebenen Arbeitsbedingungen Kaliumiodid oxidieren.
4. PRINZIP
Behandlung der in Essigsäure und Chloroform gelösten Probe mit einer
Kaliumiodidlösung. Titration des freigesetzten Iods durch eine eingestellte
Natriumthiosulfatlösung.
5. GERÄTE
Die Geräte müssen frei von reduzierenden oder oxidierenden Substanzen
sein.
Anmerkung: Schliffflächen nicht einfetten.
5.1. Mikrobechergläschen, 3 ml.5.2. 250-ml-Schliffkolben mit Stopfen, die zuvor getrocknet und mit einem
reinen, trockenen Inertgas (Stickstoff oder vorzugsweise Kohlendioxid)
gefüllt wurden.
5.3. 25- oder 50-ml-Bürette, mit 0,1-ml-Graduierung.
6. REAGENZIEN
6.1. Chloroform, analytisch rein, durch Einleiten von reinem, trockenem
Inertgas von Sauerstoff befreit.
6.2. Eisessig, analytisch rein, durch Einleiten von reinem, trockenem Inertgas
von Sauerstoff befreit.
6.3. Kaliumiodid, gesättigte wäßrige Lösung, frisch zubereitet, frei von Iod und
Iodaten.
6.4. Natriumthiosulfat, genau 0,01 oder 0,002 N wäßrige Lösung, unmittelbar
vor der Verwendung eingestellt.
6.5. Stärkelösung, wäßrige Dispersion, von 10 g/l, aus natürlicher löslicher
Stärke frisch hergestellt.
7. PROBE
Die Probe ist unter Lichtabschluß zu entnehmen und zu lagern und kühl in
vollständig gefüllten Glasgefäßen, die mit Glas- oder Korkstopfen
verschlossen sind, aufzubewahren.
8. VERFAHREN
Die Bestimmung soll bei diffusem Tageslicht oder künstlichem Licht
durchgeführt werden. In ein Mikrobechergläschen (5.1) oder aber in einen
Kolben (5.2) die Probemenge auf 0,001 g genau einwiegen, unter Berücks-
ichtigung der erwarteten Peroxidzahl gemäß nachstehender Tabelle:1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 29
▼B
Erwartete Peroxidzahl
(meq O2/kg)Probemenge
(g)
0 bis 12 5,0 bis 2,0
12 bis 20 2,0 bis 1,2
20 bis 30 1,2 bis 0,8
30 bis 50 0,8 bis 0,5
50 bis 90 0,5 bis 0,3
Den Stopfen von dem Kolben (5.2) abnehmen und den Mikrobecher mit
der Probemenge einführen. 10 ml Chloroform (6.1) hinzufügen. Die Probe
schnell unter Rühren auflösen, 15 ml Essigsäure (6.2), dann 1 ml Kalium-
iodidlösung (6.3) hinzufügen. Den Stopfen rasch einsetzen, eine Minute
schütteln und genau fünf Minuten unter Lichtabschluß bei einer Temperatur
von 15 bis 25 ºC stehenlassen.
Etwa 75 ml destilliertes Wasser zugeben. Das freigesetzte Iod mit Natrium-
thiosulfatlösung (6.4) unter kräftigem Schütteln titrieren (0,002-N-Lösung
für erwartete Werte unter 12 und 0,01-N-Lösung für erwartete Werte über
12). Stärkelösung (6.5) als Indikator verwenden.
Zwei Bestimmungen mit derselben Probe durchführen.
Zur gleichen Zeit einen Blindversuch durchführen. Übersteigt das Ergebnis
des Blindversuchs 0,05 ml einer 0,01-N-Natriumthiosulfatlösung (6.4), so
sind die unreinen Reagenzien zu ersetzen.
9. ABFASSUNG DER ERGEBNISSE
Die Peroxidzahl (P. V.), ausgedrückt in Milliäquivalenten aktiven Sauer-
stoffs pro kg, wird nach folgender Formel errechnet:
P:V:¼V/C2T/C21000
m
Dabei sind:
V = die Anzahl ml der eingestellten Natriumthiosulfatlösung (6.4), die
für die Bestimmung verbraucht werden, korrigiert durch den entspre-
chenden Wert des Blindversuchs,
T = die genaue Normalität der Natriumthiosulfatlösung (6.4),
m = das Gewicht der Probe in g.
Als Ergebnis gilt das arithmetische Mittel der beiden so durchgeführten
Bestimmungen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 30
▼M6
ANHANG IV
KAPILLARGASCHROMATOGRAPHISCHE BESTIMMUNG DES
WACHSGEHALTS
1. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Arbeitsvorschrift beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des
Wachsgehalts verschiedener Fette ►C3und Öle ◄unter Versuchsbe-
dingungen.
Dieses Verfahren kann insbesondere zur Unterscheidung zwischen
abgepreßtem und extrahiertem Olivenöl (Oliventresteröl) verwendet
werden.
2. KURZBESCHREIBUNG
Das Fett wird mit einem geeigneten internen Standard versetzt und
chromatographisch über eine Kieselgelsäule fraktioniert; die unter
Versuchsbedingungen zuerst eluierte Fraktion (schwächerer Polarität
als Triglyceride) wird rückgeführt und sofort kapillargaschromatogra-
phisch analysiert.
3. GERÄTE UND HILFSMITTEL
3.1. 25-ml-Erlenmeyerkolben,
3.2. Chromatographiesäule aus Glas, Innendurchmesser 15,0 mm, Höhe 30
—4 0c m ,
3.3. Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen,
mit Direkteinspritzung, umfassend:
3.3.1. thermostatregelbaren Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte
Temperatur mit einer Genauigkeit von ± 1 ºC,
3.3.2. Kalteinspritzsystem für die Direktbeschickung der Säule,
3.3.3. Flammenionisationsdetektor mit Konversionsverstärker,
3.3.4. Integrator mit Schreiber, mit Konversionsverstärker (3.3.3) zu koppeln,
Ansprechzeit max. 1 Sekunde, variabler Papiervorschub,
3.3.5. Glaskapillarsäule oder Fused-silica-Säule, ►C310 — 15 m ◄, Innen-
durchmesser 0,25 — 0,32 mm, Innenwand belegt mit flüssigem SE-52
oder SE-54 oder gleichwertiger Phase; gleichmäßige Schichtdicke 0,10
— 0,30 µm,
3.4. 10- µl-Mikroliterspritze mit gehärteter Nadel für Direkteinspritzung.
4. REAGENZIEN
4.1. Kieselgel 70 — 230 mesh, Artikel 7754 Merck. Das Kieselgel wird im
Muffelofen vier Stunden bei einer Temperatur von ►C3500oC
getrocknet ◄und nach dem Abkühlen mit 2 % Wasser versetzt. Durch
gründliches Schütteln homogenisieren. Vor Gebrauch mindestens 12
Stunden im Dunkeln aufbewahren.
4.2. n-Hexan für die Chromatographie,
4.3. Ethylether für die Chromatographie,
4.4. n-Heptan für die Chromatographie,
4.5. Standardlösung aus Laurylarachidat 0,1 % (m/v) in Hexan (interner
Standard),
4.6. Trägergas: Wasserstoff, rein, für die Gaschromatographie,
4.7. Hilfsgase:
— Wasserstoff, rein, für die Gaschromatographie;
— Luft, rein, für die Gaschromatographie.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 31
▼M6
5. VERFAHREN
5.1. Trennen der Wachsfraktion
5.1.1. Vorbereiten der Chromatographiesäule
15 g Kieselgel werden mit 2 % Wasser versetzt, in wasserfreiem n-
Hexan suspendiert und der Säule aufgegeben.
Nach der Spontansedimentation wird die Phase mit einem Elektrorühr-
werk nachbehandelt, um eine möglichst homogene
Chromatographieschicht zu erzielen, und zur Entfernung etwa enthal-
tener Verunreinigungen mit 30 ml n-Hexan gespült.
5.1.2. Säulenchromatographische Analyse
►C3Genau 500 mg der Probe ◄werden in den 25-ml-Erlenmeyer-
kolben eingewogen und entsprechend dem vermuteten Wachsgehalt
mit der geeigneten Menge interner Standardlösung versetzt. So werden
bei Olivenöl 0,1 mg Laurylarachidat und bei Oliventresteröl 0,25 bis
0,5 mg zugesetzt.
Die derart gewonnene Probe wird unter Verwendung von je zwei Teilen
2m l►C3n-Hexan ◄in die gemäß 5.1.1 vorbereitete Chromatogra-
phiesäule übergeführt.
Das Lösungsmittel bis zu einem Stand von 1 mm über der oberen
Absorbensgrenzfläche ablaufen lassen. An dieser Stelle ist mit der chro-
matographischen Eluierung zu beginnen: es sind 140 ml n-Hexan/
Ethylether-Gemisch (99:1) bei einem Durchsatz von etwa 15 Tropfen/
10 Sekunden (2,1 ml/min) aufzufangen.
Die derart gewonnene Fraktion wird im Rotationsverdampfer so lange
getrocknet, bis das Lösungsmittel nahezu restlos verdampft ist, wobei
die letzten 2 bis 3 ml im schwachen Stickstoffstrom ausgetrieben
werden; der Trocknungsrückstand wird ►C3mit 10 ml n-Heptan
versetzt. ◄
5.2. GaschromatographischeAnalyse
5.2.1. Vorarbeiten, Einfahren der Säule
5.2.1.1. Die Säule in den Gaschromatographen einsetzen, wobei ►C3der
Säulenanfang ◄an das On-column-System und ►C3das
Säulenende ◄an den Detektor angeschlossen wird.
Sodann ist der Gaschromatograph auf Dichtigkeit der Gasleitungen,
Betriebsbereitschaft des Detektors und des Schreibers usw. zu über-
prüfen.
5.2.1.2. Wird die Säule erstmals verwendet, ist es ratsam, sie einzufahren. Einen
schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromatographen
einschalten und allmählich auf eine Temperatur von mindestens 20 ºC
über der Arbeitstemperatur (Anmerkung) aufheizen. Die Temperatur ist
mindestens 2 Stunden konstant zu halten; sodann sind die Analysebe-
dingungen einzustellen (Gasstrom, Zünden der Flamme, Anschluß an
den elektronischen Schreiber, Säulenofentemperatur, Detektor usw.).
Anschließend ein Signal mit einer Empfindlichkeit aufzeichnen, die
mindestens doppelt so groß ist wie bei Durchführung der Analyse. Die
Grundlinie muß linear verlaufen, ohne Peaks oder Drifts.
Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluß der
Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule
hin.
Anmerkung: Die Einfahrtemperatur muß in jedem Fall mindestens 20
ºC►C3unter der für die verwendete Phase ◄vorgese-
henen Höchsttemperatur liegen.
5.2.2. Wahl der Arbeitsbedingungen
5.2.2.1. Anhaltspunkte für die Arbeitsbedingungen:
— Säulentemperatur: anfangs 80 ºC, dann stufenweise um 30 ºC pro
Minute bis auf 120 ºC ansteigend, anschließend programmierter
Temperaturanstieg um 5 ºC pro Minute bis auf 340 ºC;
— Detektortemperatur: 350 ºC,— Strömungsgeschwindigkeit des Trägergases: Wasserstoff 20 — 35
cm/s,
— Geräteempfindlichkeit: 4- bis 16-fache der Mindestdämpfung,— Detektorempfindlichkeit: 1 — 2 mV f.s.,— Papiervorschub: 30 cm/Stunde,— Einspritzvolumen: 0,5 bis 1 µl Lösung.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 32
▼M6
Diese Bedingungen können entsprechend den Kenndaten der Säule und
des Gaschromatographen derart geändert werden, daß die damit aufge-
zeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen erfüllen: die
Retentionszeit des internen Standards C32muß 25 Minuten ± 2 Minuten
betragen, und ►C3der größte Wachspeak ◄muß 60 bis 100 % des
Vollausschlags erreichen.
5.2.2.2. Die Parameter für die Peakintegration sind so zu wählen, daß für die in
Betracht kommenden Peaks korrekte Werte erzielt werden.
5.2.3. Durchführung der Analyse5.2.3.1. Mit der 10- µl-Spritze1- µl Probelösung aufziehen und dabei den Kolben
der Spritze so weit einziehen, daß die Nadel leer ist. Die Nadel
►
C3in den Injektor einführen, ◄nach 1 bis 2 Sekunden schnell
einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam heraus-
ziehen.
5.2.3.2. Das Chromatogramm aufzeichnen, bis alle vorhandenen Wachse eluiert
sind.
Die Grundlinie muß stets den vorgeschriebenen Anforderungen
►C3 ◄(5.2.1.2) genügen.
5.2.4. Identifizierung der Peaks
Die Peakflächen werden anhand der Retentionszeiten durch Vergleich
mit Wachsgemischen identifiziert, deren Retentionszeiten bekannt sind
und die unter denselben Bedingungen analysiert wurden.
Abbildung 1 zeigt ein Chromatogramm der Wachsfraktion eines nativen
Olivenöls.
5.2.5. QuantitativeBe stimmung
5.2.5.1. Die Peakflächen des internen Standards und der aliphatischen C40- bis
C46-Ester werden mit Hilfe eines Integrators ermittelt.
5.2.5.2. Der Wachsgehalt jedes einzelnen Esters in mg/kg Fett wird nach
folgender Formel berechnet:
Ester (mg/kg) =Ax·ms·►M91 000◄
As·m
Hierin bedeuten:
Ax= jeweilige Ester-Peakfläche,
As= Peakfläche von Laurylarachidat,
ms= Masse des zugesetzten Laurylarachidats in mg,
m = Masse der zur Bestimmung entnommenen Probe in g.
6. ERGEBNISSE
Die Gehalte an den einzelnen Wachsen sowie ihre Summe werden in
mg/kg Fett angegeben.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 33
▼M6
ANLAGE
Bestimmung der Strömungsgeschwindigkeit des Gases
In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatographen werden 1 bis
3µl Methan (oder Propan) eingespritzt und die Säulendurchlaufzeit des Gases
vom Zeitpunkt des Einspritzens bis zum Peak-Austritt (tM) gemessen.
Die Gasströmungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tMdefi-
niert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tMdie gemessene Zeit in
Sekunden.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 34
▼M61991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 35
▼B
ANHANG V
BESTIMMUNG DER ZUSAMMENSETZUNG UND DES GEHALTS AN
STERINEN MIT DER KAPILLAR — GASCHROMATOGRAPHIE
1. UMFANG UND ANWENDUNGSBEREICH
Diese Methode beschreibt das Verfahren zur Bestimmung der Sterinzu-
sammensetzung und des Steringehalts von Fetten.
2. KURZBESCHREIBUNG
Das Fett wird mit α-Cholestanol als innerem Standard versetzt und mit
ethanolischer Kaliumhydroxidlösung verseift. Die Sterinfraktion wird
aus dem Unverseifbaren dünnschicht-chromatographisch über basische
Kieselgelplatten abgetrennt.
Die aus dem Kieselgel isolierten Sterine werden in Trimethylsilylether
überführt und mit Hilfe der Kapillar-Gaschromatographie untersucht.
3. GERÄTE UND HILFSMITTEL
3.1. Kolben, 250 ml, mit Rückflußkühler und Schliffstopfen,
3.2. Scheidetrichter, 500 ml,
3.3. Kolben, 250 ml,3.4. komplette Apparatur für die Dünnschichtchromatographie mit Glas-
platten 20 × 20 cm,
3.5. UV-Lampe, Wellenlänge 366 oder 254 nm,
3.6. Mikroliterspritzen, 100 und 500 µl,3.7. Glasfiltertiegel mit Porenfilter G 3 (Porosität 15—40 µm), etwa 2 cm
Durchmesser, 5 cm Höhe, mit geeignetem Anschlußstück für die
Vakuumfiltration und Schliffmuffe12/21,
3.8. Vakuumflasche, 50 ml, mit Schliffmuffe 12/21, für Glasfiltertiegel
(3.7),
3.9. 10-ml-Röhrchen mit konischem Boden und dicht schließendem Stopfen,3.10. Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen,
mit Splitsystem, bestehend aus:
3.10.1. einem thermostatisierbaren Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte
Temperatur mit einer Genauigkeit von ± 1 ºC,
3.10.2. einer temperaturregelbaren Verdampfereinrichtung mit Verdampfer aus
persilanisiertem Glas,
3.10.3. einem Flammenionisations-Detektor mit Verstärker,
3.10.4. einem Integrator mit Schreiber, mit Verstärker zu koppeln,
3.11. einer Kapillarsäule aus Glas oder fused silica, 20—30 m Länge,
0,25—0,32 mm Innendurchmesser, Innenwand belegt mit SE-52 oder
SE-54 oder einer gleichwertigen stationären Phase, Schichtdicke
0,10—0,30 µm,
3.12. Mikroliterspritze für die Gaschromatographie, 10 µl, mit gehärteter
Nadel.
4. REAGENZIEN
4.1. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 2 N: 130 g Kaliumhydroxid
(Titer mindestens 85 %) in 200 ml destilliertem Wasser unter Kühlen
lösen und mit Ethanol auf 1 Liter auffüllen. Die Lösung ist in gut
verschlossenen Braunglasflaschen haltbar (Ethanol 95 % V/V),
4.2. Ethylether, analysenrein,
4.3. wasserfreies Natriumsulfat, analysenrein,
4.4. kieselgelbeschichtete Glasplatten ohne Fluoreszenzindikator, Schicht-
dicke 0,25 mm (gebrauchsfertig im Handel erhältlich),
4.5. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 0,2 N: 13 g Kaliumhydroxid
werden in 20 ml destilliertem Wasser gelöst und mit Ethanol auf 1 Liter
aufgefüllt,1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 36
▼B
4.6. Benzol für die Chromatographie (siehe 5.2.2),
4.7. Aceton für die Chromatographie (siehe 5.2.2),
4.8. Hexan für die Chromatographie (siehe 5.2.2),4.9. Ethylether für die Chromatographie (siehe 5.2.2),4.10. Chloroform, analysenrein,4.11. Referenzlösung für die Dünnschichtchromatographie: Cholesterin oder
Phytosterole, ►
M62 %ige ◄Lösung in Chloroform,
4.12. 2 ′,7′-Dichlorfluorescein, 0,2%ige ethanolische Lösung, leicht alkalisch
durch Zusatz einiger Tropfen alkoholischer 2-N-Kaliumhydroxid-
Lösung,
4.13. wasserfreies Pyridin für die Chromatographie,4.14. Hexamethyldisilazan,4.15. Trimethylchlorsilan,
4.16. Standardlösung von Sterin-Trimethylsilylethern unmittelbar vor
Gebrauch ansetzen mit reinen Sterinen oder Sterinmischungen aus
Ölen, in denen sie enthalten sind,
4.17. α-Cholestanol, 0,2%ige Lösung (m/V) in Chloroform (interner
Standard),
4.18. Trägergas: Wasserstoff oder Helium, rein, für die Gaschromatographie,
4.19. Hilfsgase: Wasserstoff und Luft, rein, für die Gaschromatographie.
5. VERFAHREN5.1.Herstellung des Unverseifbaren
5.1.1. Mit einer 500-µl-Mikroliterspritze so viel der 0,2%igen α-Cholesta-
nollösung in Chloroform (4.17) in einen 250-ml-Kolben geben, daß die
Menge an Cholestanol etwa 10 % des Steringehalts des zur Analyse
verwandten aliquoten Teils der Probe entspricht. So werden z. B. für
5 g Olivenöl 500 µl der 0,2%igen α-Cholestanollösung benötigt,
1 500 µl für ►
M6 ◄Oliventresteröl. Im Stickstoff-
strom bis zur Trocknung abdampfen. In den gleichen Kolben genau 5 g
der trockenen und filtrierten Probe einwiegen.
Bei►M6Ölen◄, die größere Mengen an Cholesterin enthalten, kann
ein Peak mit der gleichen Retentionszeit wie Cholestanol auftreten. In
diesem Fall ist die Sterinfraktion einmal mit und einmal ohne internen
Standard zu analysieren. ►M6Anstelle von Cholestanol kann auch
Betulin verwendet werden. ◄
5.1.2. Die Probe bei aufgesetztem Rückflußkühler mit 50 ml 2-N-ethanoli-
scher Kaliumhydroxidlösung versetzen, auf dem Wasserbad erhitzen
und unter kräftigem Schütteln und schwachem Sieden verseifen (wobei
sich die Lösung klärt). Die Probe weitere 20 Minuten am Sieden halten
und dann durch den Rückflußkühler mit 50 ml destilliertem Wasser
versetzen, den Rückflußkühler entfernen und den Kolben auf etwa
30 ºC abkühlen.
5.1.3. Den Kolbeninhalt quantitativ in einen 500-ml-Scheidetrichter über-
führen, wobei mehrfach mit insgesamt 50 ml destilliertem Wasser
nachgespült wird. Die Probe mit etwa 80 ml Ethylether versetzen, 30
Sekunden kräftig schütteln und absetzen lassen (vgl. Hinweis 1).
Die wäßrige Phase in einen anderen Scheidetrichter ablassen und dann
noch zweimal nach dem gleichen Verfahren mit 60—70 ml Ethylether
extrahieren.
Hinweis 1: Etwaige Emulsionen können mit Hilfe einer Waschflasche
durch Zusatz kleiner Mengen Ethyl- oder Methylalkohol
zerstört werden.
5.1.4. Die Etherauszüge in einem Scheidetrichter vereinigen und mehrmals
mit jeweils 50 ml destilliertem Wasser waschen, bis das Waschwasser
neutral reagiert.
Das Waschwasser ablassen, die Etherphase mit wasserfreiem Natrium-
sulfat trocknen, über wasserfreiem Natriumsulfat in einen zuvor
gewogenen 250-ml-Kolben filtrieren. Scheidetrichter und Filter mit
kleinen Mengen Ethylether nachspülen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 37
▼B
5.1.5. Den Ether bis auf wenige ml abdestillieren, den Rückstand unter
leichtem Vakuum oder im Stickstoffstrom trocknen, ¼ Stunde im Trok-
kenschrank bei 100 ºC nachtrocknen, im Exsikkator abkühlen lassen
und wiegen.
5.2.Trennung der Sterinfraktion
5.2.1. Herstellung der basischen Platten
Die Kieselgelplatten (4.4) vollständig ca. 10 Sekunden lang in eine 0,2-
N-ethanolische Alkalihydroxidlösung (4.5) eintauchen, dann unter
einem Abzug 2 Stunden trocknen lassen, anschließend noch 1 Stunde
bei 100 ºC im Trockenschrank.
Die Platten aus dem Trockenschrank nehmen und in einem Exsikkator
über Calciumchlorid bis zum Gebrauch aufbewahren. (Derart behan-
delte Platten müssen innerhalb von 15 Tagen gebraucht werden.)
Hinweis 2: Bei Verwendung von alkalischen Kieselgelplatten zur Tren-
nung der Sterinfraktion erübrigt sich die Behandlung des
Unverseifbaren mit Aluminiumoxid. Auf diese Weise
bleiben sämtliche sauren Verbindungen (Fettsäuren und
andere) an der Startlinie. So erhält man eine saubere Tren-
nung der Sterinzone von denen der aliphatischen Alkohole
und Terpenalkohole.
5.2.2. Die Entwicklerkammer bis zu einer Höhe von etwa 1 cm mit einem
Benzol/Aceton-Gemisch 95:5 (V/V) beschicken. Statt dessen kann
auch ein Hexan/Ethylether-Gemisch 65:35 (V/V) verwandt werden.
Die Kammer mit einem geeigneten Deckel verschließen und mindestens
eine halbe Stunde stehen lassen, damit sich ein Gleichgewicht zwischen
Flüssigkeit und Dampfphase einstellt. An der Innenwand der Kammer
können Filterpapierstreifen befestigt werden, die in das Fließmittel
eintauchen. Dadurch kann die Laufzeit um ein Drittel verkürzt und
eine gleichmäßige Elution der Komponenten erzielt werden.
Hinweis 3: Das Gemisch ist jedesmal frisch anzusetzen, damit die
Wiederholbarkeit gewährleistet ist.
5.2.3. Von einer 5%igen Lösung des Unverseifbaren (5.1.5) in Chloroform
mit einer 100-µl-Spritze 0,3 ml als durchgehenden, gleichmäßigen
Strich 2 cm vom unteren Plattenrand entfernt auf die Dünnschichtplatte
(5.2.1) auftragen. In der Verlängerung der Startlinie werden am Rande
2—3 µl der Sterin-Standardlösung (4.11) aufgetragen, um die Sterin-
zone nach der Entwicklung zu identifizieren.
5.2.4. Die Platte in die nach 5.2.2 vorbereitete Entwicklerkammer stellen. Die
Temperatur der Umgebung sollte 15—20 ºC betragen. Die Kammer mit
dem Deckel verschließen und die Platte so lange entwickeln, bis die
Fließmittelfront bis 1 cm unter den oberen Plattenrand gestiegen ist.
Dann die Platte aus der Entwicklerkammer nehmen und das Lösungs-
mittel in einem warmen Luftstrom abdampfen oder die Platte eine
geraume Zeit unter dem Abzug liegen lassen.
5.2.5. DiePlattevorsichtig und gle ichmäßig mit 2 ′,7′-Dichlorfluoresceinlö-
sung besprühen. Die Lage der Sterinzone mit Hilfe des Flecks der
Standardlösung bestimmen und mit einem schwarzen Stift den fluores-
zierenden Bereich markieren.
5.2.6. Das in der markierten Zone liegende Kieselgel mit einem Metallspatel
abkratzen, fein mahlen und in einen Glasfiltertiegel (3.7) überführen.
Mit 10 ml warmem Chloroform versetzen, mit Hilfe des Metallspatels
gründlich vermischen und unter Vakuum filtrieren. Das Filtrat in der
an dem Glasfiltertiegel angeschlossenen Vakuumflasche (3.8)
auffangen.
Den Rückstand im Glasfiltertiegel dreimal mit je 10 ml Ethylether
waschen und das Filtrat wiederum in der Vakuumflasche auffangen.
Das Filtrat bis auf ein Volumen von etwa 4—5 ml eindampfen und
den Rest der Lösung in das zuvor gewogene 10-ml-Probenglas (3.9)
überführen. Durch vorsichtiges Erhitzen unter einem schwachen Stick-
stoffstrom bis zur Trocknung eindampfen. Mit einigen Tropfen Aceton
versetzen, wieder bis zur Trocknung eindampfen, etwa 10 Minuten im
Trockenschrank auf 105 ºC erhitzen, anschließend im Exsikkator
abkühlen lassen und wiegen.
Der Rückstand in dem Probengläschen besteht aus der Sterinfraktion.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 38
▼B
5.3.Herstellung der Trimethylsilylether (TMSE)
5.3.1. Dem Probengläschen mit der Sterinfraktion werden je Milligramm
Sterin 50 µl Silanisierungsreagenz, bestehend aus einem Gemisch aus
Pyridin, Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan im Verhältnis
9:3:1 (V/V/V), zugesetzt (Hinweis 4) unter Ausschluß von Feuchtigkeit
(Hinweis 5).
Hinweis 4: Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich;
daneben gibt es auch andere Silanisierungsreagenzien, z.
B. N,O-bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % Trime-
thylchlorsilan, das mit gleichen Teilen wasserfreiem
Pyridin gemischt werden muß.
5.3.2. Das Probengläschen verschließen und gründlich (nicht zu stark) schüt-
teln, bis sich die Sterine gelöst haben. Die Probe mindestens 15
Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und dann einige Minuten
zentrifugieren. Die klare Lösung kann gaschromatographisch untersucht
werden.
Hinweis 5: Die Beobachtung einer leichten Opaleszenz ist normal und
bedeutet keine Störung. Die Bildung eines weißen Nieder-
schlags oder der Eindruck einer Rosafärbung sind
Anzeichen der Anwesenheit von Feuchtigkeit oder der
Zersetzung des Reagens. In diesem Fall soll der Test
wiederholt werden.
5.4.Gaschromatographische Analyse
5.4.1. Vorbereiten, Einfahren der Säule5.4.1.1. Die Säule in den Gaschromatographen einsetzen, wobei das Einlaßteil
an den mit dem Trennsystem verbundenen Verdampfer und das Auslaß-
teil an den Detektor angeschlossen wird.
Überprüfung des Gaschromatographen (Dichtigkeit der Gasleitungen,
Betriebsbereitschaft des Detektors, des Trennsystems, des Schreibers
usw.).
5.4.1.2. Wird die Säule zum erstenmal verwendet, ist es ratsam, sie einzufahren.
Einen schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromato-
graphen einschalten und allmählich auf eine Temperatur von
mindestens 20 ºC über der Arbeitstemperatur (Hinweis 6) aufheizen.
Diese Temperatur ist mindestens 2 Stunden konstant zu halten, und
dann sind die Analysenbedingungen einzustellen (Gasstrom, Split,
Zünden der Flamme, Schreiberanschluß, Einstellen der Ofentemperatur,
Injektor, Detektor). Dann eine Empfindlichkeit wählen, die mindestens
doppelt so groß ist wie bei der Durchführung der Analyse. Die Grund-
linie muß linear verlaufen, ohne Peaks oder Drift.
Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluß der
Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule
hin.
Hinweis 6: Die Einfahrtemperatur muß in jedem Fall 20 ºC unter der
für die stationäre Phase angegebenen Maximaltemperatur
liegen.
5.4.2. Wahl der Arbeitsbedingungen5.4.2.1. Anhaltspunkte für die Arbeitsbedingungen:
Säulentemperatur: 260 ºC ± 5 ºC,
Verdampfertemperatur: 280 ºC,Detektortemperatur: 290 ºC,Strömungsgeschwindigkeit: Helium 20—35 cm/s; Wasserstoff
30—50 cm/s,
Splitverhältnis: 1:50—1:100,
Geräteempfindlichkeit: das 4- bis 16fache der Mindestdämpfung,
Detektorempfindlichkeit: 1—2 mV f. s.,Papiervorschub: 30—60 cm/Std.,Einspritzvolumen: 0,5—1 µl TMSE-Lösung.Diese Bedingungen können entsprechend den Charakteristiken der
Säule und des Gaschromatographen derart geändert werden, daß die1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 39
▼B
damit aufgezeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen
erfüllen:
— die Retentionszeit von β-Sitosterin muß 20 ± 5 Minuten betragen;
— der Campesterin-Peak muß bei Olivenöl (Durchschnittsgehalt 3 %)
15 ± 5 % des Skalenbereichs und bei Sojaöl (Durchschnittsgehalt
20 %) 80 ± 10 % des Skalenbereichs betragen;
— alle enthaltenen Sterine müssen getrennt werden; die anderen Peaks
müssen ebenfalls völlig aufgelöst sein, d. h. der Peakverlauf muß
auf die Grundlinie zurückführen, bevor der nächste Peak beginnt;
eine unvollständige Auflösung ist nur unter der Bedingung akzep-
tabel, daß der RRT-1,02-Peak mit Hilfe der Senkrechten quantitativ
zu bestimmen ist.
5.4.3. Durchführung der Analyse
5.4.3.1. Mit der 10-µl-Mikroliterspritze 1 µl Hexan entnehmen, 0,5 µl Luft und
anschließend 0,5—1 µl Probenlösung aufziehen; dabei den Kolben der
Spritze so weit einziehen, daß die Nadel leer ist. Die Nadel in die
Membran des Injektors einführen, nach 1—2 Sekunden schnell
einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam heraus-
ziehen.
5.4.3.2. Das Chromatogramm aufzeichnen, bis alle Sterin-TMS-Ether eluiert
sind.
Die Grundlinie muß stets den vorgeschriebenen Anforderungen (5.4.1.2)
genügen.
5.4.4. Identifizierung der Peaks
Die einzelnen Peaks werden anhand der Retentionszeiten und durch
Vergleich mit dem unter denselben Bedingungen analysierten TSME-
Gemisch der Sterine bestimmt.
Die Sterine werden in folgender Reihenfolge eluiert: Cholesterin, Bras-
sicasterin, 24-Methylen-Cholesterin, Campesterin, Campestanol,
Stigmasterin, ∆7-Campesterin, ∆5, 23-Stigmastadienol, Chlerosterin, β-
Sitosterin, Sitostanol, ∆5-Avenasterin, ∆5, 24-Stigmastadienol, ∆7-Stig-
mastenol, ∆7-Avenasterin.
In Tabelle I sind die Retentionszeiten relativ zu β-Sitosterin für eine
SE-52- und SE-54-Säuleaufge führt.
Die Abbildungen 1 und 2 zeigen die typischen Chromatogramme
einiger Öle.
5.4.5. QuantitativeBe stimmung
5.4.5.1. Mit Hilfe des Integrators werden die Peak-Flächen von α-Cholestanol
und der Sterine berechnet. Dabei sind etwa auftretende Peaks von
Substanzen, die in Tabelle I nicht aufgeführt sind, nicht zu berücksich-
tigen. Der Responsefaktor von ►C1α-Cholestanol ◄soll gleich 1,00
gesetzt werden.
5.4.5.2. Der Gehalt an den einzelnen Sterinen in mg/100 g Fett wird nach
folgender Formel berechnet:
Sterin x =Ax·ms· 100
As·m
Darin bedeuten:
Ax= Peakfläche des Sterins x ►M6 ◄,
As= Peakfläche von α-Cholestanol ►M6 ◄,
ms= zugesetzte Menge an α-Cholestanol in mg,
m = Menge der für die Bestimmung entnommenen Probe in g.
6. ERGEBNISSE
6.1. Der Gehalt an den einzelnen Sterinen wird in mg/100 g Öl angegeben,
ihre Summe als „Gesamtsterine“.
6.2. Der prozentuale Anteil jedes einzelnen Sterins errechnet sich aus dem
Quotienten der Peakfläche des entsprechenden Peaks und der Summe
der Peakflächen aller Sterine nach der Formel
►C1% Sterin x = ◄Ax
ΣA. 1001991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 40
▼B
Darin bedeuten:
Ax= Peakfläche des Sterins x,
ΣA = Summe der Peakfläche aller Sterine.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 41
▼B
ANLAGE
Bestimmung der linearen Strömungsgeschwindigkeit
In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatographen werden 1 bis
3 µl Methan (oder Propan) eingespritzt und bis zum Peak-Austritt (tM) gemessen.
Die lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tMdefiniert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tMdie gemessene Zeit in
Sekunden.
Tabelle I
Relative Retentionszeit der Sterine
Peak IdentifizierungRelative Retentions-
zeit
SE 54 SE 52
1 Cholesterin ∆-5-Cholesten-3 β-ol 0,67 0,63
2 Cholestanol 5 α-Cholestan-3 β-ol 0,68 0,64
3 Brassicasterin [24S]-24-Methyl- ∆-5,22-cholestadien-3 β-
ol0,73 0,71
4 24-Methylen-Cholesterin 24-Methylen- ∆-5,24-cholestadien-3 β-ol 0,82 0,80
5 Campesterin [24R]-24-Methyl- ∆-5-cholesten-3 β-ol 0,83 0,81
6 Campestanol [24R]-24-Methyl-cholestan-3 β-ol 0,85 0,82
7 Stigmasterin [24R]-24-Ethyl- ∆-5,22-cholestadien-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆-7-Campesterol [24R]-24-Methyl- ∆-7-cholesten-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆-5,23-Stigmastadienol [24R,S]-24-Ethyl- ∆-5,23-cholestadien-3 β-
ol0,95 0,95
10 Chlerosterin [24S]-24-Ethyl- ∆-5,25-cholestadien-3 β-ol 0,96 0,96
11 ►C1B-Sitosterin ◄► C1[24R]-24-Ethyl- ∆-5-cholesten-3B-
ol◄1,00 1,00
12 ►C1Sitostanol ◄► C124-Ethyl-cholestan-3B-ol ◄ 1,02 1,02
13 ∆-5-Avenasterin [24Z]-24-Ethyliden- ∆-5-cholesten-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆-5,24-Stigmastadienol [24S,R]-24-Ethyl- ∆-5,24-cholestadien-3 β-
ol1,08 1,08
15 ∆-7-Stigmastenol [24S,R]-24-Ethyl- ∆-7,24-cholestadien-3 β-
ol1,12 1,12
16 ∆-7-Avenasterin [24Z]-24-Ethyliden- ∆-7-cholesten-3 β-ol 1,16 1,161991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 42
▼B
Abbildung 1
Gaschromatogramm der Sterinfraktion von rohem Oivenöl
1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 43
▼B
Abbildung 2
Gaschromatogramm der Sterinfraktion von raffiniertem Olivenöl
1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 44
▼B
ANHANG VI
BESTIMMUNG DES ERYTHRODIOLS UND DES UVAOLS
EINLEITUNG
Das (üblicherweise als Summe von Erythrodiol und Uvaol angegebene)
Erythrodiol ist ein Bestandteil des Unverseifbaren, das für verschiedene
Fette charakteristisch ist. Seine Konzentration ist in extrahierten
Olivenölen erheblich höher als in anderen Ölen (Olivenöl aus Pressung,
Traubenkernöl), in denen es auch vorkommt. Deshalb kann es zum Nach-
weis für das Vorhandensein von extrahiertem Olivenöl dienen.
1. ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH
Die Methode beschreibt ein Verfahren für die Bestimmung des Erythro-
diolgehalts in Fetten.
2. PRINZIP DER METHODE
Das Fett wird mit einer ethanolischen Kaliumhydroxidlösung verseift,
dann das Unverseifbare mit Ethylether extrahiert und über eine Aluminiu-
moxidsäule gereinigt.
Die Fraktionierung des Unverseifbaren wird durch Dünnschichtchromato-
graphie auf Kieselgelplatten durchgeführt, anschließend werden die
Zonen der Sterinfraktion und der Erythrodiolfraktion isoliert. Die von
der Platte isolierten Sterine und das Erythrodiol werden in Trimethylsily-
lether überführt, dann wird die Mischung gaschromatographisch
untersucht. Das Ergebnis wird angegeben als Prozent Erythrodiol der
Gesamtmenge von Erythrodiol plus Sterine.
3. GERÄTE
3.1. Die im Anhang V (Bestimmung des Steringehalts) beschriebenen Geräte.
4. REAGENZIEN
4.1. Die im Anhang V (Bestimmung des Steringehalts) vorgeschriebenen
Reagenzien.
4.2. Referenzlösung von 0,5 % Erythrodiol in Chloroform.
5. VERFAHREN
5.1.Herstellung des Unverseifbaren
Es wird gemäß 5.1.2 des in Anhang V beschriebenen Verfahrens vorge-
gangen.
5.2.Abtrennung des Erythrodiols und der Sterine
5.2.1. Vergleiche 5.2.1 in Anhang V.
5.2.2. Vergleiche 5.2.2 in Anhang V.5.2.3. Eine 5%ige Lösung des Unverseifbaren in Chloroform herstellen. Mit
einer 0,1-ml-Mikroliterspritze 0,3 ml dieser Lösung auf eine Dünnschicht-
platte 1,5 cm vom unteren Plattenrand entfernt in einem möglichst
dünnen und gleichmäßigen Strich auftragen. An einem Ende der Platte
werden als Referenzsubstanzen einige Mikroliter der Lösungen von
Cholesterin und Erythrodiol aufgetragen.
5.2.4. Die Platte in die nach 5.2.2 vorbereitete Entwicklerkammer geben. Die
Raumtemperatur soll etwa 20 ºC betragen. Die Kammer sofort mit dem
Deckel verschließen und so lange entwickeln, bis die Lösungsmittelfront
1 cm unter dem oberen Plattenrand angekommen ist. Die Platte aus der
Entwicklerkammer nehmen und das Lösungsmittel in einem warmen
Luftstrom abdampfen.
5.2.5. Die Platte gleichmäßig mit der alkoholischen 2 ′,7′-Dichlorfluoresceinlö-
sung besprühen. Unter UV-Licht den Verlauf der Sterin- und
Erythrodiolzone an Hand der Referenzsubstanzen identifizieren und etwas
außerhalb der fluoreszierenden Zonen markieren.
5.2.6. Die markierten Kieselgelzonen mit einem Metallspatel abkratzen. Das
von der Platte isolierte Material in ein 50-ml-Becherglas geben, 15 ml1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 45
▼B
warmes Chloroform zugeben, gut schütteln und in einen Glasfiltertiegel
füllen. Dreimal mit je 10 ml warmem Chloroform auswaschen und die
Filtrate in einem 100-ml-Rundkolben sammeln. Bis auf ein Volumen
von 4—5 ml eindampfen, in ein vorher gewogenes, konisches 10-ml-
Zentrifugenröhrchen geben, im warmen Stickstoffstrom trocknen und
anschließend wiegen.
5.3. Herstellung der Trimethylsilylether
Nach dem in Anhang V unter 5.3 beschriebenen Verfahren vorgehen.
5.4. GaschromatographischeAnalyse
Nach der Beschreibung unter 5.4 des vorgenannten Verfahrens vorgehen.Die Bedingungen der gaschromatographischen Analyse müssen so
gewählt werden, daß nicht nur die TMS-Ether der Sterine, sondern auch
die TMS-Ether von Erythrodiol und Uvaol getrennt werden.
Nach dem Einspritzen das Schreiberpapier ablaufen lassen, bis alle
Sterine, Erythrodiol und Uvaol eluiert sind. Identifizieren der Peaks
(Erythrodiol und Uvaol haben im Vergleich zu β-Sitosterin relative
Retentionszeiten von etwa 1,45 und 1,55) und Berechnung der Flächen-
prozente, wie für Sterine beschrieben.
6. ABFASSUNG DER ERGEBNISSE
% Erythrodiol =A
1+A2
A1+A2+ΣASterine× 100
Hierin bedeuten:
A1= Fläche des Erythrodiolpeaks ►M6 ◄,
A2= Fläche des Uvaolpeaks ►M6 ◄,
ΣASterine= Summe der vorhandenen Sterinpeaks
►M6 ◄.
Das Ergebnis wird mit einer Dezimale nach dem Komma angegeben.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 46
▼B
ANHANG VII
BESTIMMUNG VON FETTSÄUREN IN 2-STELLUNG DER TRIGLYCE-
RIDE
1. ZWECK
Diese Methode beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammen-
setzung des Teils der Fettsäuren eines Öles oder Fettes, die in 2-Stellung
(βoder innere Stellung) des Glycerins verestert sind.
2. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Methode gilt für Öle und Fette mit einem Schmelzpunkt unter 45 ºC,
bedingt durch die Besonderheiten der Wirkungsweise der Pankreaslipase.
Sie ist nicht uneingeschränkt anwendbar auf Öle und Fette mit höheren
Anteilen an Fettsäuren mit zwölf oder weniger Kohlenstoffatomen
(Kokos- und Palmkernöl, Butterfett), hoch ungesättigten Fettsäuren (mit
mehr als vier Doppelbindungen), die zwanzig oder mehr Kohlenstoff-
atome enthalten (Fisch- und Seetieröle), oder Fettsäuren mit
sauerstoffhaltigen Gruppen außer der Säuregruppe.
3. PRINZIP
Wenn nötig, Neutralisierung von sauren Ölen und Fetten in einem
Lösungsmittel. Reinigung über eine Aluminiumoxidsäule. Teilhydrolyse
der Triglyceride durch Pankreaslipase in einer vorgegebenen Zeit. Abtren-
nung der gebildeten Monoglyceride durch Dünnschichtchromatographie
und Umesterung dieser Monoglyceride mit Methanol. Die gewonnenen
Methylester werden gaschromatographisch analysiert.
4. GERÄTE
4.1. 100-ml-Rundkolben.4.2. 25-ml-Rundkolben mit Schliff.4.3. 1 m langes Steigrohr mit Schliffansatz für den Kolben 4.2.4.4. 250-ml-Kolben.4.5. 50-ml-Becherglas.4.6. 500-ml-Scheidetrichter.4.7. Glassäule für die Säulenchromatographie, 13 mm Innendurchmesser,
400 mm Länge, mit Hahn und gläsernem Frittenboden.
4.8. 10-ml-Zentrifugenglas, mit Schliffstopfen.
4.9. 5-ml-Bürette, Graduierung 0,05 ml.4.10. 1-ml-Injektionsspritze, mit dünner Kanüle.4.11. Mikroliterspritze, zur Abgabe von Tropfen von jeweils 3—4 µl.4.12. Beschichtungsgerät für Dünnschichtplatten.4.13. Glasplatten für Dünnschichtchromatographie, 20 × 20 cm.4.14. Entwicklerkammer für die Dünnschichtchromatographie, mit Schliffrand,
für 20 × 20 cm Platten.
4.15. Sprüher für die Dünnschichtchromatographie.4.16. Trockenschrank, einstellbar auf 103 ± 2 ºC.
4.17. Thermostat, regulierbar zwischen 30 und 45 ºC ± 0,5 ºC.
4.18. Rotationsverdampfer.4.19. Elektrisches Schüttel- und Vibriergerät zum kräftigen Schütteln des
Zentrifugenglases.
4.20. Ultraviolettlampe zur Betrachtung der Dünnschichtplatten.
Und für die Kontrolle der Lipasetätigkeit:
4.21. Ein pH-Meßgerät.
4.22. Propellerrührer.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 47
▼B
4.23. 5-ml-Bürette.
4.24. Stoppuhr.
Und für die eventuelle Zubereitung der Lipase:
4.25. Laborrührgerät zum Zerkleinern und Mischen heterogener Materialien.
5. REAGENZIEN
5.1. n-Hexan oder, falls nicht verfügbar, Petrolether (Kp. 30—50 ºC), für die
Chromatographie.
5.2. 2-Propanol oder Ethanol 95 %ig (V/V), analytisch rein.
5.3. 2-Propanol oder Ethanol, 1:1 wäßrige Lösung.5.4. Diethylether, peroxidfrei.
5.5. Aceton.
5.6. Ameisensäure, mindestens 98 %ig (m/m).5.7. Fließmittel: Mischung aus n-Hexan (5.1), Diethylether (5.4) und Ameisen-
säure(5.6) im Ve rhältnis von 70:30:1 (V/V/V).
5.8. Aktiviertes Aluminiumoxid für die Chromatographie, neutral, Aktivi-
tätsstufeBrockmann 1.
5.9. Kieselgel, mit Bindemittel für die Dünnschichtchromatographie.5.10. Pancreaslipase mit ausreichender Aktivität (Anmerkungen 1 und 2).
5.11. Natriumhydroxid, 120 g/l wäßrigeLösung.
5.12. Salzsäure, 6 N.5.13. Kalziumchlorid (CaCl
2), 220 g/l wäßrigeLösung.
5.14. Natriumcholat (Enzymqualität), 1 g/l wäßrigeLösung.
5.15. Pufferlösung: 1 M wäßrige Lösung von tris-Hydroxymethylaminomethan
durch Zusatz von Salzsäure (5.12) auf pH 8 gebracht (durch Potentiometer
überprüfen).
5.16. Phenolphthalein, Lösung von 10 g/l in 95 %igem (V/V) Ethanol.
5.17. 2′,7′-Dichlorfluorescein, Lösung von 2 g/l in 95 %igem (V/V) Ethanol,
schwach alkalisch durch Zusatz eines Tropfens 1-N-Natriumhydroxidlö-
sung pro 100 ml.
Und für die Kontrolle der Lipasetätigkeit:
5.18. Neutralisiertes Öl.5.19. Natriumhydroxid, 0,1 N wäßrigreLösung.
5.20. Natriumcholat (Enzymqualität), wäßrigeLösung von 200 g/l.
5.21. Gummiarabikum, wäßrigeLösung von 100 g/l.
6. VORBEREITUNG DER PROBE
Liegt der Gehalt an freien Fettsäuren nach einer Bestimmung gemäß
Anhang II unter 3 %, so ist direkt über Aluminiumoxid, wie unter 6.2
beschrieben, zu reinigen. Weist die Probe einen Gehalt an freien Fett-
säuren von über 3 % gemäß Anhang II auf, so ist sie in Gegenwart eines
Lösungsmittels gemäß 6.1 mit Alkali zu neutralisieren und dann über
Aluminiumoxid gemäß 6.2 zu geben.
6.1.Neutralisierung durch Alkali in Gegenwart eines Lösungsmittels
Etwa 10 g rohes Öl in einen Scheidetrichter (4.6) geben und 100 ml
Hexan (5.1), 50 ml 2-Propanol (5.2), einige Tropfen Phenolphthaleinlö-
sung (5.16) und so viel Natriumhydroxidlösung (5.11) hinzufügen, wie
dem Gehalt des Öls an freien Fettsäuren zuzüglich 0,3 % Überschuß
entspricht. Eine Minute lang kräftig schütteln, 50 ml destilliertes Wasser
zugeben, erneut schütteln und absetzen lassen.
Nach dem Absetzen die untere, die Seifen enthaltende Schicht sowie
etwaige Zwischenschichten (Schleim, unlösliche Stoffe) entfernen. Die
Hexanlösung des neutralisierten Öls mehrmals mit 25—30 ml der 2-
Propanollösung (5.3) waschen, bis die Rosafärbung des Phenolphthaleins
verschwindet.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 48
▼B
Den größten Teil des Hexans unter Vakuum im Rotationsverdampfer
(4.18) abdestillieren, das Öl bei 30—40 ºC unter Vakuum in einem Stick-
stoffstrom trocknen, bis das Hexan vollständig entfernt ist.
6.2.Reinigung über Aluminiumoxid
Eine Suspension von 15 g aktiviertem Aluminiumoxid (5.8) in 50 ml
Hexan (5.1) herstellen und unter Rühren in die Chromatographiesäule
(4.7) gießen. Das Aluminiumoxid gleichmäßig absetzen lassen und
warten, bis das Lösungsmittel auf 1—2 mm über dem Absorptionsmittel
abgelaufen ist. Auf die Säule vorsichtig eine Lösung von 5 g Öl in 25 ml
Hexan (5.1) gießen; die gesamte aus der Säule ablaufende Flüssigkeit in
einem Rundkolben (4.1) sammeln.
7. HERSTELLUNG DER DÜNNSCHICHTPLATTEN
Die Glasplatten (4.13) sorgfältig mit Ethanol, Petrolether und Aceton
reinigen, um jeden Fettrest zu beseitigen. In einen Erlenmeyerkolben
(4.4) 30 g Kieselgel (5.9) geben, 60 ml destilliertes Wasser hinzufügen,
verschließen und eine Minute kräftig schüttteln. Die Suspension sofort in
das Beschichtungsgerät (4.12) geben und eine 0,25 mm dicke Schicht auf
die Platten auftragen. Die Platten 15 Minuten an der Luft und eine Stunde
im Trockenschrank (4.16) bei 103 ± 2 ºC trocknen. Die Platten vor
Verwendung in einem Exsikkator auf Raumtemperatur abkühlen.
Fertigplatten sind im Handel erhältlich.
8. VERFAHREN8.1.Hydrolyse durch Pancreaslipase
In das Zentrifugenglas (4.8) etwa 0,1 g der vorbereiteten Probe einwiegen;
handelt es sich um ein festes Fett, muß es in 0,2 ml Hexan (5.1), evtl.
unter schwachem Erwärmen, gelöst werden.
20 mg Lipase (5.10) und 2 ml der Pufferlösung (5.15) hinzufügen.
Sorgfältig und vorsichtig schütteln und dann 0,5 ml der Natriumcholatlö-
sung (5.14) und 0,2 ml der Kalziumchloridlösung (5.13) hinzufügen. Das
Glas mit dem Schliffstopfen verschließen, vorsichtig schütteln
(Befeuchten des Stopfens vermeiden), das Glas sofort bei 40 ± 0,5 ºC in
den Thermostaten (4.17) stellen und genau eine Minute mit der Hand
schütteln.
Das Glas aus dem Thermostaten nehmen und mit Hilfe des Vibriergeräts
(4.19) genau 2 Minuten lang kräftig schütteln.
Sofort in fließendem Wasser abkühlen; 1 ml Salzsäure (5.12) und 1 ml
Diethylether (5.4) hinzufügen. Verschließen und kräftig mit dem elektri-
schen Schüttelgerät schütteln. Stehen lassen und die organische Phase
mit Hilfe der Spritze (4.10), gegebenenfalls nach Zentrifugieren,
abnehmen.
8.2.Abtrennung der Monoglyceride durch Dünnschichtchromatographie
Den Extrakt mit der Mikroliterspritze (4.11) auf die Dünnschichtplatte
auftragen, und zwar 1,5 cm vom unteren Rand entfernt, als dünnen,
einheitlichen Strich. Die Platte in die gut gesättigte Entwicklerkammer
(4.14) stellen und mit dem Fließmittel (5.7) bei etwa 20 ºC bis 1 cm
vom oberen Plattenrand entfernt entwickeln.
Die Platte an der Luft bei der gleichen Temperatur wie in der Entwickler-
kammer trocknen und mit 2 ′,7′-Dichlorfluoresceinlösung (5.17)
besprühen. Die Zone der Monoglyceride (Rf etwa 0,035) unter UV-Licht
(4.20) markieren.
8.3.Analyse der Monoglyceride durch Gaschromatographie
Die nach 8.2 erhaltene Kieselgelzone mit einem Spatel abkratzen
(vermeiden, daß auch die auf der Startlinie verbleibenden Bestandteile
mit erfaßt werden) und in das Methylierungskölbchen (4.2) überführen.
Das gesammelte Kieselgel, so wie es vorliegt, nach dem Verfahren gemäß
Anhang XB behandeln, die Monoglyceride in Methylester überführen,
dann die Ester gaschromatographisch nach dem Verfahren gemäß Anhang
XA untersuchen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 49
▼B
9. FORMULIERUNG DER ERGEBNISSE
Die Zusammensetzung der Fettsäuren in 2-Stellung auf eine Dezimalstelle
genau angeben (Anmerkung 3).
10. ANMERKUNGEN
Anmerkung 1: Prüfung der Lipasetätigkeit
Aus einem Gemisch von 165 ml Gummiarabikumlösung
(5.21), 15 g gemahlenem Eis und 20 ml neutralisiertem
Öl (5.18) mit einem geeigneten Rührgerät eine Ölemulsion
herstellen.
10 ml dieser Emulsion in ein Becherglas (4.5) geben,
anschließend 0,3 ml Natriumcholatlösung (5.20) und 20 ml
destilliertes Wasser hinzufügen.
Das Becherglas bei 37 ± 0,5 ºC (Anmerkung 4) in einen
Thermostaten stellen; die Elektroden eines pH-Meters
(4.21) und einen Spiralrührer (4.22) einsetzen.
Mit Hilfe einer Bürette (4.23) tropfenweise Natriumhydro-
xidlösung (5.19) hinzufügen bis zu einem pH-Wert von
8,5.
Eine ausreichende Menge der wäßrigen Lipasesuspension
(siehe nachstehend) hinzufügen. Sobald das pH-Meter 8,3
anzeigt, die Stoppuhr anstellen (4.24) und Natriumhydro-
xidlösung (5.19) so zutropfen lassen, daß der pH-Wert bei
8,3 gehalten wird. Das Volumen der pro Minute
verbrauchten Alkalilösung notieren.
Die Werte in ein Koordinatensystem eintragen, und zwar
die Zeitablesungen als Abszisse und die Anzahl ml Alkali-
lösung zur Konstanthaltung des pH-Werts als Ordinate.
Dabei muß sich eine Gerade ergeben.
Die vorstehend erwähnte Lipasesuspension ist eine Suspen-
sion von eins zu Tausend in Wasser. Für jeden Versuch
soviel der Suspension verwenden, daß in 4 bis 5 Minuten
etwa 1 ml Alkalilösung verbraucht wird. Normalerweise
werden etwa 1—5 mg Lipasepulver gebraucht. Die Lipase-
einheit wird als die Menge Enzym definiert, die 10
Mikroäquivalente Säure pro Minute freisetzt. Damit ergibt
sich die Aktivität A des verwendeten Pulvers, ausgedrückt
als Lipaseeinheiten in mg, anhand folgender Formel:
A¼V/C210
m
Dabei entspricht V der Anzahl der pro Minute
verbrauchten ml Natriumhydroxidlösung (5.19), berechnet
aus der graphischen Darstellung, m ist das Gewicht der
Lipaseprobe in mg.
Anmerkung 2: Herstellung der Lipase
Lipasen mit ausreichender Lipasetätigkeit sind im Handel
erhältlich. Sie können aber auch im Labor wie folgt herge-
stellt werden: 5 kg frisches Schweinepankreas auf 0 ºC
abkühlen; das umhüllende feste Fett und die anhängenden
Gewebe entfernen und im Mixer zerkleinern, bis ein flüs-
siger Brei ensteht. Diesen Brei mit dem Rührgerät (4.25)
4—6 Stunden mit 2,5 l wasserfreiem Aceton rühren,
anschließend zentrifugieren. Den Rückstand noch dreimal
mit dem gleichen Volumen Aceton, dann zweimal miteiner Mischung von Aceton und Diethylether 1: 1 (V/V)
und zweimal mit Diethylether extrahieren. Den Rückstand
im Vakuum 48 Stunden lang trocknen, bis ein stabiles
Pulver entsteht, das im Kühlschrank aufbewahrt werden
sollte.
Anmerkung 3: In jedem Fall ist es ratsam, die Zusammensetzung der
Gesamtfettsäuren der gleichen Probe zu bestimmen, da ein
Vergleich mit den Fettsäuren in 2-Stellung bei der Interpre-
tation der Werte von Nutzen ist.
Anmerkung 4: Die Hydrolysentemperatur wird auf 37 ºC eingestellt, wenn
ein flüssiges Öl verwendet wird. Sie wird jedoch für die1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 50
▼B
Untersuchungsproben auf 40 ºC festgelegt, um auch die
Untersuchung von Fetten mit Schmelzpunkten bis zu 45 ºC
zu ermöglichen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 51
▼M20
▼B
ANHANG IX
UV-SPEKTROPHOTOMETRISCHE ANALYSE
EINLEITUNG
Die spektrophotometrische Untersuchung im Ultraviolettlicht kann
Angaben über die Qualität eines Fettes, seine Haltbarkeit und die infolge
technologischer Verfahren eingetretenen Veränderungen erbringen.
Die Absorption bei den in dem Verfahren vorgesehenen Wellenlängen ist
bedingt durch das Vorkommen konjugierter Dien- und Triensysteme. Die
Absorption wird als spezifische Extinktion E1cm1 % angegeben (Extinktion
einer 1 %igen Lösung des Fettes in dem vorgeschriebenen Lösungsmittel
bei einer Schichtdicke von 1 cm). Sie wird üblicherweise als K bezeichnet
(auch Extinktionskoeffizient genannt).
1. ANWENDUNGSBEREICH
Das Verfahren beschreibt die Durchführung der spektrophotometrischen
Untersuchung von Fetten im Ultraviolettlicht.
2. PRINZIP
Das zu untersuchende Fett wird in dem vorgeschriebenen Lösungsmittel
gelöst, anschließend wird die Extinktion der Lösung bei der vorgeschrie-
benen Wellenlänge im Vergleich zum reinen Lösungsmittel bestimmt. Die
spezifischen Extinktionen werden mit Hilfe der abgelesenen spektrophoto-
metrischen Werte errechnet.
3. GERÄTE
3.1. Spektrophotometer, geeignet zum Messen der Extinktionen im UV-Licht
zwischen 220 und 360 nm und mit der Möglichkeit, einzelne nanometrische
Einheiten ablesen zu können.
3.2. Rechteckige Quarzküvetten mit Deckel und einer optischen Länge von
1 cm. Die Extinktionen der mit Wasser oder einem geeigneten Lösungs-
mittel gefüllten Küvetten dürfen nicht mehr als 0,01 Einheiten
voneinander abweichen.
3.3. 25-ml-Meßkolben.
3.4. Chromatographiesäule mit einem oberen Teil von 270 mm Länge und 35
mm Durchmesser sowie einem unteren Teil von 270 mm Länge und 10
mm Durchmesser.
4. REAGENZIEN
4.1. — Isooktan (2,2,4-Trimethylpentan), spektrophotometrisch rein: es muß im
Vergleich zu destilliertem Wasser eine Durchlässigkeit von mindestens
60 % bei 220 nm und mindestens 95 % bei 250 nm haben; oder
— Cyclohexan, spektrophotometrisch rein: es muß im Vergleich zu destil-
liertem Wasser eine Durchlässigkeit von mindestens 40 % bei 220 nm
und mindestens 95 % bei 250 nm haben.
4.2. Basisches Aluminiumoxid zur Säulenchromatographie, das gemäß Anlage 1
vorbereitet und geprüft wurde.
4.3. n-Hexan, zur Chromatographie.
5. VERFAHREN
5.1. Die zu untersuchende Probe muß absolut homogen und frei von suspen-
dierten Verunreinigungen sein. Die bei Raumtemperatur flüssigen Öle
werden bei einer Temperatur von etwa 30 ºC über Papier filtriert. Die
festen Fette werden homogenisiert und bei einer Temperatur von höchstens
10 ºC über ihrem Schmelzpunkt filtriert.
5.2. Etwa 0,25 g der so vorbereiteten Probe in einen 25-ml-Meßkolben
einwiegen, mit dem vorgeschriebenen Lösungsmittel auffüllen und homo-1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 52
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
genisieren. Die so hergestellte Lösung muß absolut klar sein. Wenn die
Lösung trüb ist oder Verunreinigungen enthält, muß schnell über Papier
filtriert werden.
5.3. Mit der so hergestellten Lösung wird eine Küvette gefüllt und die Extink-
tion bei der entsprechenden Wellenlänge zwischen 232 und 276 nm
gemessen, wobei das Lösungsmittel als Referenzlösung verwendet wird.
Die abgelesenen Extinktionen müssen im Bereich von 0,1 bis 0,8 liegen;
andernfalls müssen die Messungen unter Verwendung von entsprechend
stärker konzentrierten oder verdünnten Lösungen wiederholt werden.
5.4. Wird eine Bestimmung der spezifischen Extinktion nach Behandlung mit
Aluminiumoxid verlangt, so ist wie folgt zu verfahren: 30 g basisches
Aluminiumoxid werden in einer Hexansuspension in die Säule gegeben.
Nach dem Absetzen des Adsorbens wird überschüssiges Hexan bis auf
1 cm oberhalb der Aluminiumoxidfüllung entfernt.
10 g Fett, das wie unter 5.1 beschrieben homogenisiert und filtriert wurde,
wird in 100 ml Hexan gelöst und die Lösung auf die Säule gegeben. Das
Eluat wird gesammelt und das Lösungsmittel im Vakuum bei Temperaturen
unter 25 ºC entfernt.
Mit dem so erhaltenen Fett wird sofort weiter verfahren wie unter 5.2
beschrieben.
6. ABFASSUNG DER ERGEBNISSE
6.1. Angegeben werden die bei den verschiedenen Wellenlängen bestimmten
spezifischen Extinktionen (Extinktionskoeffizienten), die wie folgt zu
berechnen sind:
Kλ¼Eλ
c/C1s
Dabei bedeuten:
Kλ= die spezifische Extinktion (Extinktionskoeffizient) bei der
Wellenlängeλ,
Eλ= die bei der Wellenlänge λgemessene Extinktion,
c = die Konzentration der Lösung in g/100 ml,
s = die Länge der Küvette in cm.
Die Ergebnisse werden mit zwei Dezimalstellen angegeben.
6.2. Die spektrophotometrische Untersuchung von Olivenöl nach dem amtlichen
Verfahren der EWG-Verordnungen sieht die Bestimmung der spezifischen
Extinktion in einer Isooktanlösung bei den Wellenlängen 232 und 270 nm
sowiedieBe stimmung von ∆K gemäß folgender Formel vor:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
Dabei ist Kmdie spezifische Extinktion bei der Wellenlänge m, bei der im
Bereich von 270 nm das Maximum der Absorption liegt.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 53
▼B
ANLAGE I
Vorbereitung des Aluminiumoxids und Prüfung seiner Aktivität
A.1.1. Vorbereitung des Aluminiumoxids
Das zuvor im Trockenschrank bei 380—400 ºC 3 Stunden lang getroc-
knete Aluminiumoxid in ein gut verschließbares Gefäß geben, je 100 g
Aluminiumoxid 5 ml destilliertes Wasser zugeben, das Gefäß rasch
verschließen, mehrfach schütteln und vor der Verwendung mindestens
12 Stunden stehen lassen.
A.1.2. Überprüfung der Aktivität des Aluminiumoxids
EinechromatographischeSäulemit 30 g Aluminiumoxid fülle n und
weiter wie unter 5.4 beschrieben verfahren. Über die Säule gibt man
eine Mischung bestehend aus
— 95 % nativem Olivenöl mit einer spezifischen Extinktion bei 268 nm
von weniger als 0,18 und
— 5 % Erdnußöl, das bei der Raffination mit Bleicherde behandelt
wurde und eine spezifische Extinktion bei 268 nm von mindestens 4
aufweist.
Weist die Mischung nach dem Passieren der Säule eine spezifische
Extinktion bei 268 nm von mehr als 0,11 auf, so ist das Aluminiumoxid
geeignet, anderenfalls ist der Wasserzusatz zu erhöhen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 54
▼B
ANLAGE II
Eichung des Spektrophotometers
A.2. Das Gerät muß regelmäßig (mindestens alle 6 Monate) im Hinblick auf
die Einstellung der Wellenlänge und die Genauigkeit der Anzeige über-
prüft werden.
A.2.1. Die Überprüfung der Einstellung der Wellenlänge kann mit Hilfe einer
Quecksilberdampflampe oder geeigneter Filter erfolgen.
A.2.2. Zur Überprüfung der photoelektrischen Zelle und des Photomultipliers
wird wie folgt verfahren: 0,2 g reines Kaliumchromat für die Spektro-
photometrie einwiegen und in einer 0,05-N-Kaliumhydroxidlösung
lösen, dann in einen Meßkolben geben und auf 1 000 ml auffüllen.
Anschließend genau 25 ml der so hergestellten Lösung in einen 500-ml-
Meßkolben überführen und mit der gleichen Kaliumhydroxidlösung
auffüllen. Die Extinktion der so hergestellten Lösung bei 275 nm messen
und dabei die Kaliumhydroxidlösung als Referenzlösung verwenden. Die
mit einer 1-cm-Küvette gemessene Extinktion muß 0,2 ± 0,005 betragen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 55
▼B
ANHANG XA
GASCHROMATOGRAPHISCHE ANALYSE DER FETTSÄUREMETHY-
LESTER
1. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Norm enthält allgemeine Anweisungen zur Anwendung der
Gaschromatographie mit gepackten Säulen oder mit Kapillarsäulen zur
Bestimmung der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung einer
Mischung von Fettsäuremethylestern, die nach dem in Anhang XB
beschriebenen Verfahren hergestellt wurden.
Das Verfahren eignet sich nicht für polymerisierte Fettsäuren.
2. REAGENZIEN.2.1.Trägergas
Inertgas (Stickstoff, Helium, Argon, Wasserstoff usw.), vollständig
getrocknet und mit einem Sauerstoffgehalt unter 10 mg/kg.
Anmerkung 1: Der ausschließlich in Kapillarsäulen als Trägergas
verwendete Wasserstoff kann die Analysengeschwindig-
keit verdoppeln, ist aber gefährlich.
Sicherheitsvorrichtungen sind verfügbar.
2.2.Hilfsgase
2.2.1. Wasserstoff (Reinheit über 99,9 %), frei von organischen Verunreini-
gungen.
2.2.2. Luft oder Sauerstoff, frei von organischen Verunreinigungen.
2.3.Referenzstandard
Eine Mischung aus reinen Fettsäuremethylestern oder die Methylester
eines Fetts mit bekannter Zusammensetzung, die möglichst der Zusam-
mensetzung des zu analysierenden Fetts ähnlich sind.
Eine Oxidation der mehrfach ungesättigten Fettsäuren muß vermieden
werden.
3. GERÄTE
Die vorliegenden Instruktionen gelten für die übliche Ausrüstung für
die Gaschromatographie mit gepackter Säule oder Kapillarsäule und
Flammenionisationsdetektor. Jedes Gerät, das die in 4.1.2 beschriebene
Leistung und Trennung erbringt, ist geeignet.
3.1.Gaschromatograph
Der Gaschromatograph muß über folgende Bestandteile verfügen:
3.1.1. Einspritzsystem
Verwendet wird ein Einspritzsystem entweder in Verbindung
a) mit gepackten Säulen und möglichst geringem Totvolumen (es muß
in diesem Fall auf Temperaturen erhitzt werden können, die um
20—50 ºC über der Säulentemperatur liegen) oder
b) mit Kapillarsäulen. In diesem Fall muß das Einspritzsystem speziell
für diese Säulen vorgesehen sein. Es kann das Split-System oder das
System der splitlosen „On Column“-Injektion sein.
Anmerkung 2: Sind Fettsäuren mit weniger als 16 Kohlenstoffatomen
nicht vorhanden, so kann ein Injektor mit beweglicher
Nadel verwendet werden.
3.1.2. Ofen
Der Ofen sollte so ausgelegt sein, daß die Säule auf mindestens 260 ºC
aufgeheizt und die Temperatur bei gepackten Säulen auf 1 ºC und bei
Kapillarsäulen auf 0,1 ºC genau konstant gehalten werden kann. Letz-
tere Bedingung ist vor allem dann wichtig, wenn eine „Fused Silica“-
Säule verwendet wird.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 56
▼B
In jedem Fall, besonders aber bei Fettsäuren mit weniger als 16 Kohlen-
stoffatomen, wird eine Heizung mit Temperaturprogramm empfohlen.
3.1.3. Gepackte Säule3.1.3.1. Säule aus einem Material, das unempfindlich ist gegenüber den zu
analysierenden Substanzen (z. B. Glas oder rostfreier Stahl).
Größe der Säule:
a) Länge: 1—3 m. Eine relativ kurze Säule sollte verwendet werden,
wenn langkettige Fettsäuren (über C
20) vorkommen. Bei der Analyse
von Säuren mit 4 oder 6 Kohlenstoffatomen wird eine 2 m lange
Säule empfohlen;
b) Innendurchmesser: 2—4 mm.
Anmerkung 3: Sind mehrfach ungesättigte Bestandteile mit mehr als
drei Doppelbindungen vorhanden, so können sie in einer
Säule aus rostfreiem Stahl zersetzt werden.
Anmerkung 4: Es kann ein System mit zwei gepackten Säulen
verwendet werden.
3.1.3.2. Füllung, bestehend aus folgenden Bestandteilen:
a)Trägermaterial: Mit Säure gewaschenes und silanisiertes Kieselgur
oder sonstiges geeignetes neutrales Trägermaterial mit einem engen
Korngrößenbereich (Schwankungsbereich 25 µm innerhalb der
Grenzwerte von 125 bis 200 µm), wobei die durchschnittliche
Korngröße auf den Innendurchmesser der Säule abgestimmt wird.
b)Stationäre Phase: Polare Flüssigkeit vom Typ Polyester (z. B.
►C1Diethylenglykolpolysuccinat ◄, Butandiolpolysuccinat, Ethy-
lenglykolpolyadipat usw.), Cyanosilicone oder sonstige
Flüssigkeiten, die die erforderliche chromatographische Trennung
ermöglichen (siehe Ziffer 4). Die stationäre Phase sollte 5—20 %
(m/m) der Füllung ausmachen. Für bestimmte Trennungen kann
eine nichtpolare stationäre Phase verwendet werden.
3.1.3.3. Vorbereitung der Säule
Nachdem die Säule vom Detektor getrennt worden ist, den Ofen
allmählich auf 185 ºC aufheizen und einen Inertgasstrom von
20—60 ml/min mindestens 16 Stunden bei 185 ºC sowie weitere 2
Stunden bei 195 ºC durch die frisch hergestellte Säule leiten.
3.1.4. Kapillarsäule3.1.4.1. Kapillare aus einem Material, das nicht mit den zu analysierenden
Stoffen reagiert (üblicherweise Glas oder „Fused Silica“). Der Innen-
durchmesser sollte zwischen 0,2 und 0,8 mm liegen. Die Innenflächen
müssen vor dem Auftragen der stationären Phase einer geeigneten
Behandlung unterzogen werden (beispielsweise Oberflächenvorberei-
tung, Desaktivierung). In den meisten Fällen ist eine Länge von 25 mausreichend.
3.1.4.2. Die stationäre Phase ist üblicherweise vom Typ Polyglykol (Polyethy-
lenglykol 20 000), Polyester (Butandiolpolysuccinat) oder polarem
Polysiloxan (Cyanosilicon). Vernetzte (cross linked) Säulen sind
geeignet.
Anmerkung 5: Bei Verwendung von polaren Polysiloxanen können bei
der Identifizierung und Trennung von Linolensäure und
C
20-Säuren Schwierigkeiten auftreten.
Die Beschichtung sollte dünn, beispielsweise nur 0,1 bis 0,2 µm, sein.
3.1.4.3. Einbau und Vorbereitung der Säule
Beim Einbau der Kapillarsäule müssen die üblichen Vorsichtsmaß-
nahmen, wie Anordnung der Säule im Ofen (Träger), Auswahl und
Zusammenbau der Verbindungsstücke (Abdichtung), Ausrichten der
Säulenenden in dem Einspritzsystem und im Detektor (Verringerung
von Totvolumen), getroffen werden. Die Säule wird mit dem Trägergas-
strom gespült (z. B. bei einer Säulenlänge von 25 m und einem
Innendurchmesser von 0,3 mm mit 0,3 bar (30 kPa)).
Zur Vorbereitung der Säule wird das Temperaturprogramm des Ofens
auf 3 ºC/min eingestellt und die Säule, ausgehend von der Raumtempe-
ratur, auf eine Temperatur von 10 ºC unter der Zersetzungsgrenze der
stationären Phase erhitzt. Diese Ofentemperatur wird 1 Stunde beibe-
halten, bis die Grundlinie stabilisiert ist. Dann auf 180 ºC
zurückschalten und unter isothermen Bedingungen weiterarbeiten.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 57
▼B
Anmerkung 6: Entsprechend vorbehandelte Fertigsäulen können im
Handel bezogen werden.
3.1.5. Der Detektor sollte auf eine höhere Temperatur als die Säulentempe-
ratur erhitzt werden können.
3.2.Spritze
Die Spritze sollte eine maximale Kapazität von 10 µl und eine Graduie-
rung in 0,1 µl haben.
3.3.Schreiber
Wird die von dem Schreiber aufgezeichnete Kurve zur Berechnung der
Zusammensetzung der analysierten Mischung verwendet, so wird ein
mit dem verwendeten Gerät kompatibler Schreiber von hoher Präzision
benötigt. Der Schreiber sollte folgende Merkmale aufweisen:
a) Ansprechgeschwindigkeit unter 1,5 s, vorzugsweise 1 s (die
Ansprechgeschwindigkeit ist die Zeit, die der Schreiber benötigt,
um nach plötzlicher Auslösung eines Signals (100 %) von 0 % auf
90 % auszuschlagen);
b) Papierbreite mindestens 20 cm;
c) Vorschubgeschwindigkeit einstellbar zwischen 0,4 und 2,5 cm/min.
3.4.Integrator oder Rechner (fakultativ)
Eine schnelle und genaue Berechnung ist mit Hilfe eines elektronischen
Integrators oder Rechners möglich, der eine lineare Reaktion bei ange-
messener Empfindlichkeit liefern soll. Dabei muß die Korrektur bei
Abweichungen von der Grundlinie zufriedenstellend sein.
4. VERFAHREN
Die in 4.1 bis 4.3 beschriebenen Verfahren beziehen sich auf den
Gebrauch eines Flammenionisationsdetektors.
Alternativ kann auch ein Gaschromatograph mit einem Katharometer-
Detektor (der auf dem Prinzip der Änderungen der Wärmeleitfähigkeit
beruht) verwendet werden. In diesem Fall müssen die Betriebsbedin-
gungen entsprechend Ziffer 6 geändert werden.
4.1.Versuchsbedingungen
4.1.1. Ermittlung der optimalen Betriebsbeding ungen
4.1.1.1. Gepackte Säule
Bei der Ermittlung der Versuchsbedingungen müssen folgende Varia-
blen berücksichtigt werden:
a) Länge und Durchmesser der Säule;
b) Art und Menge der stationären Phase;
c) Säulentemperatur;
d) Trägergasstrom;
e) erforderliche Trennleistung;
f) Größe der zu untersuchenden Probe, die so ausgewählt sein muß,
daß Detektor und Elektrometer eine lineare Anzeige ergeben;
g) Analysendauer.
Im allgemeinen führen die in den Tabellen 1 und 2 genannten Werte zu
dem gewünschten Ergebnis, d. h. mindestens 2 000 theoretische Böden
pro Meter Säulenlänge für Methylstearat und dessen Elution innerhalb
von 15 Minuten.
Sofern die Geräte es erlauben, sollte das Einspritzsystem etwa 200 ºC
und der Detektor mindestens genauso heiß wie die Säule sein.
Im allgemeinen liegt das Verhältnis der Strömungsgeschwindigkeit des
Wasserstoffs für den Flammenionisationsdetektor und der des Träger-
gases zwischen 1:2 und 1:1 je nach Säulendurchmesser. Der
Sauerstoffstrom beträgt etwa das 5- bis 10-fache des Wasserstoffstroms.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 58
▼B
Tabelle 1
Innendurchmesser der Säule in mm Trägergasstrom in ml/min
2 15 bis 25
3 20 bis 40
4 40 bis 60
Tabelle 2
Konzentration der stationären Phase
in % (m/m)Säulentemperatur in ºC
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Kapillarsäule
Die Eigenschaften der Kapillarsäule, nämlich Leistungsfähigkeit und
Durchlässigkeit, bedingen, daß die Trennung der Bestandteile und die
Analysendauer weitgehend von der Strömungsgeschwindigkeit des
Trägergases in der Säule abhängen. Daher ist eine Optimierung der
Betriebsbedingungen durch Einwirkung auf deren Parameter (einfacher
ausgedrückt: auf den Druckverlust der Säule) notwendig, je nachdem,
ob eine bessere Trennung oder eine schnellere Analyse gewünscht wird.
4.1.2. Bestimmung der Zahl der theoretischen Böden (Leistungs-
fähigkeit) und der Auflösung (siehe Abbildung 1)
Die Analyse wird mit einer Mischung aus etwa gleichen Teilen Methyl-
stearat und Methyloleat (beispielsweise Methylestern der Kakaobutter)
durchgeführt.
Die Säulentemperatur und der Trägergasstrom sind so zu wählen, daß
das Maximum des Methylstearat-Peaks etwa 15 Minuten nach dem
Lösungsmittelpeak aufgezeichnet wird. Dabei muß eine ausreichende
Menge Methylestermischung verwendet werden, damit der Methyl-
stearat-Peak etwa Dreiviertel des vollen Skalenanschlags erreicht.
Die Zahl der theoretischen Böden n wird nach folgender Formel
berechnet:
n¼16drIðÞ
ωIðÞ/C20/C21
2
Die Auflösung R wird berechnet nach der Formel:
R¼2∆
ωIðÞþωIIðÞ
Dabei sind:
dr(I)= die Retention in Millimetern, vom Start des Chromato-
gramms bis zum Maximum des Methylstearat-Peaks;
ω(I)+ω(II)= die Breite des Methylstearat- bzw. Methyloleat-Peaks
in Millimeters, gemessen zwischen den Schnittpunkten
der Wendetangenten mit der Grundlinie;
∆ = die Entfernung zwischen den Maxima des Methyl-
stearat- und des Methyloleat-Peaks in Millimetern.
Der Auflösungsindex Ir wird berechnet nach der Formel:1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 59
▼M2
▼C2
▼C2
a
b
Dabei sind:
a = Höhe des kleinsten Peaks, gemessen von der Grundlinie;
b = Höhe des niedrigsten Punktes im Tal zwischen den beiden
angrenzenden Peaks, gemessen von der Grundlinie.
Abbildung 1
Chromatogramm zur Bestimmung der Zahl der theoretischen Böden (Leistungs-
fähigkeit) und der Auflösung
Die Betriebsbedingungen sind so zu wählen, daß sich für Methylstearat
wenigstens 2 000 theoretische Böden pro Meter Säule ergeben und eine
Auflösung von wenigstens 1,25 erreicht wird.
4.2.Zu untersuchende Probe
Mit Hilfe der Spritze (3.2) werden 0,1 bis 2 µl der nach Anhang XB
hergestellten Methylester auf die Säule gespritzt. Sind die Ester nicht
gelöst, so sind 100 mg/ml in chromatographisch reinem Heptan zu
lösen und davon etwa 0,1 bis 1 µl einzuspritzen.
Müssen Bestandteile bestimmt werden, die lediglich in Spuren
vorkommen, so kann die Probengröße gesteigert werden (bis zum Zehn-
fachen).
4.3.Analyse
Im allgemeinen soll unter den in 4.1.1 beschriebenen Bedingungen
gearbeitet werden. Es kann jedoch mit einer niedrigeren Säulentempe-
ratur gearbeitet werden, wenn eine Bestimmung von Fettsäuren mit
weniger als 12 Kohlenstoffatomen erforderlich ist. Bei der Bestimmung
von Fettsäuren mit mehr als 20 Kohlenstoffatomen kann die Temperatur
erhöht werden. In beiden Fällen kann auch mit Temperaturprogramm
gearbeitet werden. Beispiel: Enthält die Probe Fettsäuremethylester mit
weniger als 12 Kohlenstoffatomen, so wird die Probe bei 100 ºC (oder1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 60
▼B
▼B
bei 50—60 ºC falls Buttersäure vorkommt) eingespritzt und die Tempe-
ratur sofort mit einer Anstiegsrate von 4—8 ºC/min bis zum Optimum
erhöht. In manchen Fällen können die beiden Verfahren kombiniert
werden.
Nach dem programmierten Aufheizen wird die Elution bei gleichblei-
bender Temperatur fortgesetzt, bis alle Bestandteile eluiert sind.
Verfügt das Gerät über keine programmierbare Heizung, so ist bei
zwei festliegenden Temperaturen zwischen 100 ºC und 195 ºC zu
arbeiten. Gegebenenfalls ist es ratsam, die Analyse mit zwei Phasen
von unterschiedlicher Polarität durchzuführen, um die Abwesenheit
von verdeckten Peaks beispielsweise bei gleichzeitigem Vorkommen
von C18:3und C20:0oder C18:3und C18:2konjugiert, sicherzustellen.
4.4.Herstellung von Referenzchromatogrammen und Referenzkurven
Die Referenz-Standardmischung (2.3) wird unter den gleichen Arbeits-
bedingungen wie die Probe analysiert und die Retentionszeiten oder die
Retention der vorkommenden Fettsäuren bestimmt. Für jeden Grad der
Ungesättigtheit wird auf halblogarithmischem Papier eine graphische
Darstellung angefertigt, die den Logarithmus der Retentionszeit oder
der Retention als Funktion der Zahl der Kohlenstoffatome zeigt. Unter
isothermen Bedingungen müßten die graphischen Darstellungen der
geradzahligen Säuren mit dem gleichen Grad der Ungesättigtheit gerade
Linien ergeben. Die Geraden sollten annähernd parallel verlaufen.
Es müssen Bedingungen vermieden werden, unter denen verdeckte
Peaks auftreten, d. h. Bedingungen, unter denen die Auflösung zu
gering ist, um zwei Bestandteile zu trennen.
5. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE
5.1.Qualitative Analyse
Die Methylester-Peaks der Probe werden aus der nach 4.4 erstellten
graphischen Darstellung identifiziert, wenn nötig durch Interpolation.
5.2.Quantitative Analyse
5.2.1. Bestimmung der Zusammensetzung
Abgesehen von Ausnahmefällen wird die Methode der inneren Norma-
lisierung angewandt, d. h. man geht davon aus, daß alle Bestandteile
der Probe auf dem Chromatogramm erscheinen, so daß die Gesamtheit
der Peakflächen 100 % der Bestandteile darstellt (vollständige Elution).
Enthält das Gerät einen Integrator, so sind dessen Daten zu verwenden.
Andernfalls muß die Fläche unter jedem Peak durch Multiplikation der
Peakhöhe mit der Breite auf halber Höhe bestimmt werden. Gegebenen-
falls sind auch die verschiedenen während der Aufzeichnung
verwendeten Abschwächungen zu berücksichtigen.
5.2.2. Berech nung
5.2.2.1. Allgemeiner Fall
Der Gehalt eines Bestandteils i (ausgedrückt in Massenprozent Methy-
lester) wird durch Bestimmung des prozentualen Anteils der jeweiligen
Peakfläche im Verhältnis zur Summe aller Peakflächen berechnet. Dazu
wird folgende Formel verwendet:
Ai
ΣA/C2100
Hierbei sind:
Ai= die Peakfläche, die dem Bestandteil i entspricht,
ΣA = die Summe aller Peakflächen.
Das Ergebnis ist auf eine Stelle nach dem Komma anzugeben.
Anmerkung 7: In diesem allgemeinen Fall wird davon ausgegangen,
daß das auf relative Flächen bezogene Berechnungser-
gebnis den jeweiligen Massenprozenten entspricht. Für
die Fälle, in denen diese Annahme nicht zulässig ist,
siehe 5.2.2.2.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 61
▼B
5.2.2.2. Anwendung von Korrekturfaktoren
In bestimmten Fällen, beispielsweise in Gegenwart von Fettsäuren mit
weniger als 8 Kohlenstoffatomen oder von Fettsäuren mit sekundären
Gruppen, bei Verwendung eines Wärmeleitfähigkeits-Detektors oder
wenn eine besonders hohe Genauigkeit erforderlich ist, sollten Korrek-
turfaktoren angewandt werden, um die prozentualen Peakflächen in
Massenprozente der Bestandteile umzurechnen. Die Korrekturfaktoren
werden mit Hilfe eines Chromatogramms bestimmt, das durch Analyse
einer Referenzmischung von Methylestern bekannter Zusammensetzung
unter den gleichen Bedingungen wie bei der Analyse der Probe erstellt
wurde.
Für diese Referenzmischung ergibt sich der prozentuale Massenanteil
des Bestandteiles i aus der Formel:
mi
Σm/C2100
Hierin sind:
mi= die Masse des Bestandteils in der Referenzmischung,
Σm = die Gesamtheit aller Massen der verschiedenen Bestandteile
der Referenzmischung.
Aus dem Chromatogramm der Referenzmischung (4.4) wird der prozen-
tuale Anteil (Fläche/Fläche) des Bestandteils i wie folgt berechnet:
Ai
ΣA/C2100
Hierin sind:
Ai= die Peakfläche des Bestandteiles i,
ΣA = die Summe aller Peakflächen.
Der Korrekturfaktor ergibt sich aus der Formel
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Im allgemeinen werden die Korrekturfaktoren auf KC16bezogen, so daß
die relativen Faktoren nach folgender Formel berechnet werden:
K0
i¼Ki
KC16
Der Gehalt der Probe an jedem Bestandteil i, ausgedrückt in Massen-
prozent Methylester, ist:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Die Ergebnisse sind auf eine Stelle nach dem Komma anzugeben.
5.2.2.3. Verwendung eines inneren Standards
In bestimmten Fällen ist es erforderlich, einen inneren Standard zu
verwenden (beispielsweise, wenn nicht alle Fettsäuren quantitativ
bestimmt werden sollen, wie beim Vorkommen von Säuren mit 4 und
6 Kohlenstoffatomen neben Säuren mit 16 oder 18 Kohlenstoffatomen,
oder wenn die absolute Menge an Fettsäuren in der Probe bestimmt
werden soll). Dazu werden häufig Fettsäuren mit 5, 15 oder 17 Kohlen-
stoffatomen verwendet.
Auch für den inneren Standard sollte der Korrekturfaktor bestimmt
werden (sofern einer verwendet wird).
Der Anteil des Bestandteils i in Massenprozent, ausgedrückt als Methy-
lester, ergibt sich dann aus der Formel:
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C21001991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 62
▼B
Hierin ist:
Ai= die Peakfläche des Bestandteils i,
As= die Peakfläche des inneren Standards,
K′i= der Korrekturfaktor für den Bestandteil i (bezogen auf KC16),
K′s= der Korrekturfaktor für den inneren Standard (bezogen auf
KC16),
m = die Masse der zu untersuchenden Probe in Milligramm,
ms= die Masse des inneren Standards in Milligramm.
Das Ergebnis ist auf eine Stelle nach dem Komma anzugeben.
6. SONDERFALL, BESTIMMUNG VON TRANS-ISOMEREN
Der Gehalt an trans-Isomeren in Fettsäuren mit 10-24 Kohlenstoff-
atomen kann durch Trennung der Methylester bestimmt werden, wobei
Kapillarsäulen mit besonderer Polarität verwendet werden.
6.1. Kapillarsäulen (fused silica) mit einem Innendurchmesser von 0,25 -
0,32 mm, einer Länge von 50 m und belegt mit einer Cyanopropylsili-
conschicht von 0,1 bis 0,3µm (Typ SP 2340, SP 2380, CP Sil 88, Silar
10 und ähnlichen Typen).
6.2. Die Methylester werden nach dem im Anhang XB unter B beschrie-
benen Verfahren hergestellt. Fette mit einem Gehalt an freien
Fettsäuren von mehr als 3 % müssen nach dem im Anhang VII unter
Punkt 6.1 beschriebenen Verfahren neutralisiert werden.
6.3. Die Arbeitsbedingungen für die Gaschromatographie sind wie folgt:
— Säulentemperatur programmiert von 150-220 ºC (z. B. 15 Minuten
bei 165 ºC, danach Anstieg von 5 ºC/Minute auf 200 ºC;
— Injektortemperatur: 250 ºC bei Verwendung eines Split-Systems
oder Anfangstemperatur der Säule bei Verwendung eines „on
column“-Systems;
— Detektortemperatur: 260 ºC;— Trägergasstrom: (Helium oder Wasserstoff) 1,2 ml/min.
Abbildung 1
Musterchromatogramm einer kapillargaschromatographischen Bestim-
mung von trans-Fettäuren
Die Einspritzmenge soll so bemessen sein, daß unter den gegebenen
Empfindlichkeitsbedingungen die Höhe des Peaks für Arachinsäureme-
thylester 20 % oder mehr des Vollausschlags beträgt.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 63
▼M2
▼C2
▼C2
6.4. Die Identifizierung der verschiedenen Methylester erfolgt mit Hilfe der
Retentionszeiten, die mit denen eines Referenzgemisches verglichen
werden (vgl. 2.3).
Die Ester der trans-Fettsäuren werden vor den entsprechenden cis-
Isomeren eluiert. In Abbildung 2 wird ein Beispiel eines entspre-
chenden Chromatogramms gezeigt.
6.5. Die Leistungsfähigkeit der Säule, bestimmt nach Punkt 4.1.2, soll die
Trennung bestimmter kritischer Paare ermöglichen. So soll z. B. die
Gruppe der trans-Isomere der Ölsäuren von dem Peak der Ölsäure
getrennt werden (trans C18:1/cis C18:1), und zwar mit einem
Auflösungsindex, der über 2 liegt.
6.6. Der prozentuale Gehalt der verschiedenen trans-Fettsäuren wird
berechnet aus dem Verhältnis der entsprechenden Peakfläche zur
Summe der Flächen aller vorkommenden Peaks.
Bestimmt werden die prozentualen Gehalte nachstehender Fettsäuren:
— „trans“-Oktadecensäuren (T 18:1), im Anhang I dieser Verordnung
als Summe der trans-Isomere der Ölsäure bezeichnet;
— „cis-trans“- und „trans-cis“-Oktadecadiensäure (CT/TC 18:2), im
Anhang I dieser Verordnung als Summe der trans-Isomere der
Linolsäure bezeichnet;
— „trans-cis-trans“-, „cis-cis-trans“-, „cis-trans-cis“-, „trans-cis-cis“-
Oktadecatriensäure [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18:3], im Anhang
I dieser Verordnung als Summe der trans-Isomere der Linolensäure
bezeichnet.
Anmerkung 8: Im Hinblick auf die Besonderheiten dieser Methode sind
die Ergebnisse mit zwei Dezimalstellen anzugeben.
►M2►C27.◄◄SONDERFALL — VERWENDUNG EINES KATHA-
ROMETER-DETEKTORS (BASIERT AUF DEM PRINZIP DER
ÄNDERUNG DER WÄRMELEITFÄHIGKEIT)
Zur Bestimmung der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung
eines Gemisches von Fettsäuremethylestern kann auch ein Gaschroma-
tograph mit einem Detektor verwendet werden, der auf der Grundlage
von Änderungen der Wärmeleitfähigkeit (Katharometer) arbeitet. In
diesem Fall müssen die in den Ziffern 3 und 4 beschriebenen Arbeits-
bedingungen gemäß der Tabelle 3 geändert werden.
Für die quantitative Analyse sind die in 5.2.2.2 beschriebenen Korrek-
turfaktoren anzuwenden.
Tabelle 3
Variable Daten/Arbeitsbedingungen
SäuleLänge : 2—4 m
Innendurchmesser: 4 mm
Trägermaterial Korngröße zwischen 160 und
200 µm
Konzentration der stationären
Phase15 % (m/m) bis 25 % (m/m)
Trägergas Helium oder, wenn nicht
vorhanden, Wasserstoff, mit
möglichst geringem Sauerstoffge-
halt
HilfsgaseKe ine
Temperatur des Einspritzsystems 40—60 ºC höher als die der Säule
Säulentemperatur 180—200 ºC
Strömungsgeschwindigkeit des
TrägergasesIm allgemeinen zwischen 60 und
80 ml/min
Menge der eingespritzten Probe Im allgemeinen zwischen 0,5 und
2µ l1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 64
▼B
▼B
►M2►C28.◄◄UNTERSUCHUNGSBERICHT
Im Untersuchungsbericht müssen das zur Herstellung der Methylester
angewandte Verfahren, das gaschromatograpische Verfahren und die
Ergebnisse genau angegeben werden. Darüber hinaus sind alle Arbeits-
bedingungen zu nennen, die einen Einfluß auf die Ergebnisse gehabt
haben können, auch wenn sie nicht in dieser Internationalen Norm
aufgeführt wurden oder als fakultativ gelten.
Der Untersuchungsbericht muß alle zur vollständigen Identifizierung
der Probe notwendigen Informationen enthalten.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 65
▼M19
ANHANG X B
ZUBEREITUNG DER FETTSÄUREMETHYLESTER VON OLIVENÖL
UND OLIVENTRESTERÖL
Zur Zubereitung der Fettsäuremethylester von Olivenöl und Oliventresteröl
werden die zwei folgenden Methoden empfohlen:
Methode A: Umesterung mit kalter methanolischer Kaliumhydroxidlösung;
Methode B: Methylierung durch Erhitzen mit methanolischer Natriummethy-
latlösung und nachfolgender Veresterung in saurem Medium.
Die Wahl der Methode hängt von dem zu bestimmenden Analyseparameter und
der betreffenden Ölkategorie ab:
a) Bestimmung der Differenz zwischen dem tatsächlichen und dem theoreti-
schen Triglycerid-Gehalt bei ECN42 ( ∆ECN42):
— Die Methode A wird bei Ölproben aller Kategorien nach Reinigung über
eine Kieselgelsäule angewandt.
b) Bestimmung der Zusammensetzung der Fettsäuren:
— Die Methode A wird bei Ölproben folgender Kategorien direkt ange-
wandt:
— native Olivenöle mit einem Gehalt an freien Fettsäuren unter 3,3 %,
— raffiniertes Olivenöl,
— Olivenöl (Mischung von nativem Olivenöl und raffiniertem Olivenöl),
— raffiniertes Oliventresteröl,
— Oliventresteröl (Mischung von nativem Olivenöl und raffiniertem
Oliventresteröl);
— die Methode B wird bei Ölproben folgender Kategorien direkt ange-
wandt:
— natives Olivenöl mit einem Gehalt an freien Fettsäuren über 3,3 %,
— rohes Oliventresteröl.
c) Bestimmung der Fettsäuren von trans-Isomeren:
— Die Methode A wird bei Ölproben folgender Kategorien direkt ange-
wandt:
— native Olivenöle mit einem Gehalt an freien Fettsäuren unter 3,3 %,
— raffiniertes Olivenöl,— Olivenöl (Mischung von nativem Olivenöl und raffiniertem Olivenöl);
— raffiniertes Oliventresteröl,
— Oliventresteröl (Mischung von nativem Olivenöl und raffiniertem
Oliventresteröl);
— die Methode A wird bei Ölproben folgender Kategorien nach Reinigung
über eine Kieselgelsäule angewandt:
— natives Olivenöl mit einem Gehalt an freien Fettsäuren über 3,3 %,
— rohes Oliventresteröl.
REINIGUNG DER ÖLPROBEN
Die Ölproben werden nötigenfalls über eine Kieselgelsäule mit einem Hexan-
Diethylether-Gemisch (87:13 v/v) als Elutionslösung nach der Methode IUPAC
2.507 gereinigt.
Als alternatives Verfahren ist die Festphasenextraktion an Kieselgelkartuschen
möglich. In einen Elutionsapparat unter Vakuum eine Kieselgelkartusche (1 g,
6 ml) geben und mit 6 ml Hexan waschen. Das Vakuum unterbrechen, damit
die Säule nicht austrocknet. In die Säule eine Lösung von etwa 0,12 g Öl in
0,5 ml Hexan geben und das Vakuum wieder herstellen, bis die Lösung in das
Kieselgel eingedrungen ist, dann mit 10 ml Hexan/Diethylether (87:13 v/v) unter
Vakuum eluieren. Das gesamte Eluat homogenisieren und in zwei gleiche Teile
teilen. Einen Teil an einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck bei
Zimmertemperatur bis zur Trockne abrotieren. Den Rückstand in 1 ml Heptan
lösen. Die Lösung ist nun zur gaschromatographischen Analyse der Fettsäuren
bereit. Zur Analyse der Triglyceride mit HPLC gegebenenfalls den übrigen
Teil einrotieren und den Rückstand in 1 ml Aceton lösen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 66
▼M19
METHODEN ZUR ZUBEREITUNG DER FETTSÄUREMETHYLESTER
1.Methode A: Umesterung mit kalter methanolischer Kaliumhydroxidlö-
sung
1.1.Anwendung
Diese schnelle Methode wird bei Olivenöl und Oliventresteröl mit
einem Gehalt an freien Fettsäuren unter 3,3 % angewandt. Die freien
Fettsäuren werden durch das Kaliumhydroxid nicht verestert. Die Ethy-
lester der Fettsäuren werden langsamer umgeestert als die Glyceridester
und möglicherweise nur teilweise methyliert.
1.2.Prinzip
Die Methylester bilden sich durch Umesterung in einer methanolischen
Kaliumhydroxidlösung als Zwischenprodukte vor der Verseifung
(Nummer 5 der Methode ISO 5509:2000 und der Methode IUPAC
2.301).
1.3.Reagenzien
Methanol mit höchstens 0,5 % (m/m) Wassergehalt,Heptan für die Chromatographie,Kaliumhydroxid, ca. 2 N methanolische Lösung: 11,2 g Kaliumhy-
droxid in 100 ml Methanol lösen.
1.4.Geräte
5-ml-Reaktionsgefäße mit Schraubverschluss/PTFE-Dichtung,graduierte oder automatische Pipetten, 2 und 0,2 ml.
1.5.Verfahren
In ein 5-ml-Reaktionsgefäß mit Schraubverschluss etwa 0,1 g Ölprobe
einwiegen, 2 ml Heptan zufügen und schütteln. 0,2 ml der 2 N metha-
nolischen Kaliumhydroxidlösung zugeben, fest verschließen und 30
Sekunden kräftig schütteln. Absetzen lassen, bis sich der obere Teil
der Lösung geklärt hat. Die obere Phase (mit den Methylestern) abde-
kantieren. Die Heptanlösung ist bereit zur Injektion in den
Chromatographen. Es wird empfohlen, die Lösung bis zur chromatogra-
phischen Analyse im Kühlschrank und nicht länger als 12 Stunden
aufzubewahren.
2.Methode B: Methylierung durch Erhitzen mit methanolischer Natriu-
methylatlösung und nachfolgender Veresterung in saurem Medium
2.1.Anwendung
Diese Methode wird bei Olivenöl und Oliventresteröl mit einem Gehalt
an freien Fettsäuren über 3,3 % angewandt.
2.2.Prinzip
Neutralisierung der freien Fettsäuren und alkalische Methanolyse der
Glyceride mit nachfolgender Veresterung der Fettsäuren in saurem
Medium (Nummer 4.2 der Methode IUPAC 2.301).
2.3.Reagenzien
— Heptan für die Chromatographie,
— Methanol mit höchstens 0,05 % (m/m) Wassergehalt,— Natriummethylat, 0,2 N methanolische Lösung: 5 g Natrium in
1 000 ml Methanol lösen (kann aus käuflichen Lösungen hergestellt
werden),
— Phenolphtalein, 0,2%ige methanolische Lösung,
— Schwefelsäure, 1 N in methanolischer Lösung: 3 ml 96%ige Schwe-
felsäure in 100 ml Methanol geben,
— gesättigte Natriumchloridlösung in Wasser.
2.4.Geräte
— 50-ml-Stehkolben, langer enger Hals mit Schliff,1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 67
▼M19
— Rückflusskühler, Mantellänge 1 m mit Schliff, passend zum Steh-
kolben,
— Siedesteine/-perlen,
— Glastrichter.
2.5.Verfahren
In einen 50-ml-Stehkolben mit Schliff 0,25 g Ölprobe geben. Mit Hilfe
eines Trichters 10 ml der 0,2 N methanolischen Natriummethylatlösung
und Siedeperlen hinzufügen. Den Rückflusskühler anbringen, schütteln
und zum Sieden bringen. Die Lösung muss nach etwa 10 Minuten klar
werden, die Reaktion ist praktisch nach 15 Minuten abgeschlossen. Den
Kolben von der Wärmequelle nehmen, die Beendigung des Rückflusses
abwarten, den Kühler abnehmen und zwei Tropfen Phenolphtaleinlö-
sung zugeben. Einige ml 1N Schwefelsäure in die Lösung geben, bis
sie farblos wird, und dann nochmals 1 ml zufügen. Den Kühler
anschließen und erneut zum Sieden bringen. Nach etwa 20 Minuten
den Kolben von der Wärmequelle nehmen und unter fließendem Wasser
abkühlen. Den Kühler abnehmen, 20 ml gesättigte Natriumchloridlö-
sung zugeben und schütteln. 5 ml Heptan zufügen, den Kolben
verschließen und 15 Sekunden kräftig schütteln.
Bis zur vollständigen Trennung der beiden Phasen absetzen lassen.
Nochmals einen Teil der gesättigten Natriumchloridlösung zugeben,
bis die wässrige Phase den unteren Rand des Kolbenhalses erreicht.
Die obere Schicht, die sich im Hals des Kolbens befindet, enthält die
Methylester. Die Lösung ist bereit zum Einspritzen in den Gaschroma-
tographen.
Vorsicht: Die Methylierung mit Methode B unter eingeschaltetem
Abzug durchführen!
2.6.Alternativen zur Methylierung nach Methode B
2.6.1. Methode C
2.6.1.1. Prinzip
Das zu analysierende Fett wird mit methanolischer Salzsäurelösung in
einer verschlossenen Ampulle bei 100 ºC umgesetzt.
2.6.1.2. Geräte
— DickwandigeGlasampullemit ca. 5 ml Inhalt (Länge40-45 mm,
Durchmesser 14-16 mm),
— 1- und 2-ml-Messpipetten.
2.6.1.3. Reagenzien
Salzsäurelösung in 2 % Methanol, aus gasförmiger Salzsäure und
wasserfreiem Methanol hergestellt (Anmerkung 1),
Hexan für die Chromatografie.
Anmerkung 1: Dazu können käufliche Salzsäure-Methanollösungen
verwendet werden. Im Labor lasen sich kleinere Mengen
gasförmigr Salzsäure leicht herstellen, indem man in
eine käufliche Salzsäure (p = 1,18) etwas konzentrierte
Schwefelsäure (p = 1,84) eintropfen lässt. Da die freige-
setzte Salzsäure sehr schnell vom Methanol absorbiert
wird, sind beim Lösen die nötigen Vorkehrungen zu
treffen (z. B. indem man das Gas umgekehrt durch einen
kleinen Trichter einleitet, dessen Rand die Oberfläche
des Methanols berührt). Größere Mengen Salzsäure-Methanollösung lassen sich auf Vorrat herstellen, da sie
in dunklen Glasflaschen mit Glasstöpsel haltbar ist.
Dieses Reagenz kann auch durch Lösung von Acethylch-
lorid in wasserfreiem Methanol hergestellt werden.
2.6.1.4. Verfahren
— In die Ampulle 0,2 g der über Natriumsulfat getrockneten und
filtrierten Ölprobe geben, 2 ml der Salzsäure-Methanollösung
zufügen und die Ampulle schließen.
— Die Ampulle 40 Minuten in ein Wasserbad von 100 ºC tauchen.
— Unter fließendem Wasser abkühlen, öffnen, 2 ml destilliertes
Wasser und 1 ml Hexan zugeben.
— Zentrifugieren und die gebrauchsfertige Hexanphase abnehmen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 68
▼M19
2.6.2. Methode D
2.6.2.1. Prinzip
Das zu analysierende Fett wird unter Rückfluss mit einem Gemisch aus
Methanol, Hexan und Schwefelsäure erhitzt. Die dabei entstehenden
Methylester werden mit Petrolether extrahiert.
2.6.2.2. Geräte
— Reaktionsgefäß, ca. 20 ml Inhalt, Rückflusskühler von ca. 1 m
Längemit Schliff,
— 5-ml-Messpipette,
— 50-ml-Scheidetrichter,
— 10- und 25-ml-Messbecher,— 15-ml-Reaktionsgefäß mit konischem Boden.
2.6.2.3. Reagenzien
— Methylierungsreagenz: wasserfreies Methanol, Hexan und Schwe-
felsäure (p=1,84) im Verhältnis 75:25:1 (v/v/v),
— Petrolether, 40-60 ºC,
— wasserfreies Natriumsulfat.
2.6.2.4. Verfahren
In das 20-ml-Reaktionsgefäß 0,1 g Ölprobe geben und 5 ml Methylie-
rungsreagenz zufügen.
Rückflusskühler anbringen und im siedenden Wasserbad 30 Minuten
erhitzen (Anmerkung 2).
Die Mischung quantitativ mit 10 ml destilliertem Wasser und 10 ml
Petrolether in einen 50-ml-Scheidetrichter umfüllen. Kräftig schütteln
und die Phasen absetzen lassen. Die wässrige Schicht ablaufen lassen
und die Petroletherschicht zweimal mit je 20 ml destilliertem Wasser
waschen. In den Scheidetrichter eine kleine Menge wasserfreies
Natriumsulfat geben, schütteln, einige Minuten stehen lassen und
filtrieren. Das Filtrat in das 15-ml-Reaktionsgefäß mit konischem
Boden geben.
Das Lösungsmittel im Wasserbad unter Einleiten von Stickstoff
abdampfen.
Anmerkung 2: Zur Kontrolle des Siedevorgangs einen Glasstab in das
Reaktionsgefäß stellen und die Temperatur nicht über
90 ºC ansteigen lassen.
3.Präzisionsparameter
Die statistische Auswertung der Präzision der Methoden A und B wurde
vom Internationalen Olivenölrat in seiner Methode COI/T.20/Dok.Nr.24
veröffentlicht.
EMPFEHLUNGEN ZUR GASCHROMATOGRAPHISCHEN ANALYSE DER
FETTSÄUREESTER VON OLIVENÖL UND OLIVENTRESTERÖL
1.Verfahren
Die gaschromatographische Analyse der Fettsäureester in Heptan erfolgt
nach der Norm ISO 5508 mit einer Kapillarsäule (Länge 50 m, Innen-
durchmesser 0,25 oder 0,32 mm), beschichtet mit einer
Cyanopropylsilikonphase, die zur Bestimmung der trans-Isomere von
Fettsäuren angegeben ist (COI/T.20/Dok.Nr.17).
Schaubild 1 zeigt das typische chromatographische Profil eines Oliven-
tresteröls mit Fettsäuremethyl- und -ethylestern sowie trans-Isomeren
von Methylestern.
2.Berechnungen
2.1. Bei der Berechnung der Fettsäurezusammensetzung und ∆ECN42
werden alle folgenden Fettsäuren berücksichtigt:
Myristinsäure(C14:0);
Palmititinsäure (C16:0), Summe der den Methyl- und Ethylestern
entsprechenden Peakflächen;
Palmitoleinsäure (C16:1), Summe der den ω9- und ω7-Isomeren der
Methylester entsprechenden Peakflächen;1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 69
▼M19
Heptadecansäure/Margarinsäure (C17:0);
Heptadecensäure (C17:1);Stearinsäure (C18:0);Ölsäure (C18:1), Summe der den ω9- und ω7-Isomeren der Methyle-
ster, den Ethylestern und den trans-Isomeren der Methylester
entsprechenden Peakflächen;
Linolsäure (C18:2), Summe der den Methyl- und Ethylestern und den
trans-Isomeren der Methylester entsprechenden Peakflächen;
Arachinsäure(C20:0);
Linolensäure (C18:3). Summe der Peakflächen der Methylester und der
trans-Isomere der Methylester;
Eïcosensäure (C20:1);
Behensäure (C22:0);Lignocerinsäure (C24:0).Bei der Berechnung der Gesamtfläche bleibt das Squalen unberücksich-
tigt.
2.2. Zur Berechnung von trans-C18:1 wird der den Methylestern dieser Fett-
säure entsprechende Peak herangezogen. Für die Summe [trans-C18:2 +
trans-C18:3] werden alle den trans-Isomeren dieser beiden Fettsäuren
entsprechenden Peaks addiert. Die Gesamtfläche berechnet sich aus
allen unter 2.1 genannten Peaks (s. COI/T.20/Dok.Nr.17).
Der Prozentsatz der einzelnen Fettsäuren wird nach folgender Formel
berechnet:
% X = (Fläche X × 100)/(Gesamtfläche)
Schaubild 1: Gaschromatogramm eines Oliventresteröls nach der Methode der
Kaltmethylierung. Die Peaks entsprechen den Methylestern, soweit nichts
anderes angegeben ist.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 70
▼B
ANHANG XI
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN FLÜCHTIGEN HALOGENIERTEN
LÖSUNGSMITTELN IN OLIVENÖL
1. PRINZIP
Gaschromatographische Headspace-Analyse.
2. GERÄTE
2.1. Gaschromatograph mit Elektroneneinfangdetektor (ECD).
2.2. Headspace-Vorrichtung.2.3. Gaschromatographische Glassäule von 2 m Länge und 2 mm Durchmesser.
Stationäre Phase: 10 % OV 101 oder eine gleichwertige Phase, aufgezogen
auf mit Säure gewaschenem und silanisiertem Kieselgur mit einer
Korngrößevon 80—100 Me sh.
2.4. Träger- und Hilfsgas: Stickstoff für die Gaschromatographie, geeignet für
Elektroneneinfangdetektoren.
2.5. Glasfläschchen 10—15 ml, versehen mit einem Verschluß aus Aluminium
und Teflon, der eine Entnahme mit Hilfe einer Spritze ermöglicht.
2.6. Klemmen für absolut dichten Verschluß.
2.7. Spritzen 0,5 bis 2 ml, zum Einspritzen von Gas.
3. REAGENZIEN
Standard: Flüchtige halogenierte Lösungsmittel mit einem für die Gaschro-
matographie geeigneten Reinheitsgrad,
Pentan mit einem für die Gaschromatographie geeigneten Reinheitsgrad.
4. ANALYSENVERFAHREN
4.1. Etwa 3 g Öl in ein Glasfläschchen (das nicht wieder verwendet werden
darf) genau einwiegen und das Fläschchen mit dem Verschluß absolut dicht
verschließen. Das Fläschchen bei 70 ºC eine Stunde in einen Thermostaten
stellen. Mit Hilfe einer Spritze genau ein Volumen von 0,2 bis 0,5 ml aus
dem Dampfraum entnehmen und auf die Säule des Gaschromatographen
spritzen. Der Gaschromatograph ist wie folgt einzustellen:
— Verdampfungstemperatur: 150 ºC,
— Säulentemperatur: 70 bis 80 ºC,— Detektortemperatur: 200 bis 250 ºC.
Es können auch andere Temperaturen eingestellt werden, sofern dabei
gleichwertige Ergebnisse erziehlt werden.
4.2. Referenzlösungen: Standardlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen
von flüchtigen halogenierten Lösungsmitteln zwischen 0,05 und 1 mg/kg
herstellen unter Verwendung von Olivenöl, das frei von Lösungsmittel-
spuren ist. Falls erforderlich, werden die halogenierten Lösungsmittel mit
Pentan verdünnt.
4.3. Quantitative Auswertung. Das Verhältnis bilden zwischen den Peakflächen
oder den Peakhöhen der Probe und der Standardlösung, deren Konzentra-
tion der erwarteten Konzentration am nächsten liegt. Liegt der relative
Unterschied über 10 %, so muß die Analyse mit einer neuen Standar-
dlösung wiederholt werden, bis ihre Konzentration innerhalb des
obengenannten relativen Unterschieds liegt. Der Gehalt wird auf der Basis
des Mittelwerts einzelner Einspritzungen ermittelt.
4.4. Abfassung der Ergebnisse. Die Ergebnisse werden in mg/kg (ppm) ange-
geben. Die Nachweisgrenze des Verfahrens liegt bei 0,01 mg/kg.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 71
▼M19
ANHANG XII
ORGANOLEPTISCHE PRÜFUNG VON NATIVEN OLIVENÖLEN
1. GEGENSTAND UND ANWENDUNGSBEREICH
Diese Verfahrensvorschrift dient der Festlegung der Kriterien für die
Bewertung der organoleptischen Merkmale von nativen Olivenölen im
Sinne von Nummer 1 des Anhangs der Verordnung 136/66/EWG und
beschreibt die Methode für ihre diesbezügliche Einstufung.
Die Verfahrensvorschrift gilt nur für die Einstufung nativer Olivenöle
entsprechend ihrer Fruchtigkeit und dem Umfang der Mängel, wie sie von
einer Gruppe ausgewählter und geschulter Prüfer gemäß Nummer 4
bestimmt werden.
2. ALLGEMEINES
Für die allgemeinen Grundbegriffe, den Prüfraum, die grundlegende
Verfahrensweise und das Prüfglas wird empfohlen, sich an die entspre-
chenden Vorgaben des Internationalen Olivenölrates zu halten.
3. SPEZIFISCHE BEGRIFFE
3.1.Positive Attribute
Fruchtig : Gesamtheit der je Olivensorte und Merkmale eines Öls unmit-
telbar oder retronasal wahrgenommenen Geruchsempfindungen aus
gesunden und frischen, grünen oder reifen Früchten.
Bitter: typischer Geschmack von Öl aus grünen oder grünlichen Oliven.
Scharf: taktil empfundenes Prickeln, typisch für Öle, die zu Beginn des
Wirtschaftsjahres hauptsächlich aus noch grünen Oliven gewonnen werden.
3.2.Negative Attribute
Stichig: typisches Flavour bei Öl aus Oliven, die sich in einem Zustand
fortgeschrittener anaerober Gärung befinden.
Modrig-feucht : typisches Flavour bei Öl aus Oliven mit Schimmel- und
Hefepilzbefall wegen mehrtägiger Lagerung der Früchte unter feuchten
Bedingungen.
Schlammig : typisches Flavour bei Öl, das mit Dekantier-„Schlämmen“ in
Becken und Fässern in Kontakt war.
Wein- oder essigartig : typisches Flavour bei bestimmten Ölen, an Wein
oder Essig erinnernd und in erster Linie bedingt durch einen Gärungspro-
zess der Oliven, bei dem Essigsäure, Ethylacetat und Ethanol entstehen.
Metallisch : an Metall erinnerndes Flavour, typisch für Öl, das beim
Vermahlen, Schlagen, Pressen oder Lagern lange mit Metallflächen in
Kontakt stand.
Ranzig: Flavour von oxidierten Ölen.
Brandig oder erhitzt : typisches Flavour bei Ölen aufgrund einer über-
mäßigen und/oder zu langen Erwärmung bei der Gewinnung und
insbesondere durch unsachgemäße Wärmebehandlung bei Herstellung der
Paste.
Heuartig-holzig : typisches Flavour bei bestimmten Ölen, das von trockenen
Oliven herrührt.
Roh: Bezeichnung für Öl, das im Mund einen dickflüssigen, pastösen
Sinneseindruck hinterlässt.
Schmierölartig : Flavour bei Ölen, das an Dieseltreibstoff, Fett oder Mine-
ralöl erinnert.
Fruchtwasserartig : Flavour bei Ölen, das von längerem Kontakt mit
Fruchtwasser herrührt.
Lakig: Flavour bei Ölen aus Oliven, die in Salzlake aufbewahrt wurden.
Espartograsartig : typisches Flavour bei Ölen aus Oliven, die mit Hilfe
neuer Espartograskörbe gepresst wurden. Dieses Aroma kann in verschie-
denen Nuancen auftreten, je nachdem, ob Körbe aus grünem oder
trockenem Espartogras verwendet wurden.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 72
▼M19
Erdig: Flavour bei Ölen, das von anhaftender Erde oder Schlamm unge-
waschener Oliven herrührt.
Wurmstichig : Flavour bei Ölen aus Oliven mit starkem Befall von Larven
der Olivenfliege (Bactrocera Oleae)
Gurkenartig : Flavour bei Ölen, das von zu langem Lagern in luftdichten
Behältnissen, insbesondere Weißblechdosen, und dem dadurch entste-
henden 2,6-Nonadienal herrührt.
4. PRÜFERGRUPPE
Die Prüfergruppe wird vom Mitgliedstaat benannt und setzt sich aus einem
Prüfungsleiter und acht bis zwölf sensorischen Prüfern zusammen. Für das
Wirtschaftsjahr 2001/02 darf die Zahl der Prüfer jedoch weniger als acht
betragen.
Der Prüfungsleiter muss über eine solide Ausbildungsgrundlage und über
Sach- und Fachkenntnisse auf dem Gebiet der verschiedenen Öltypen
verfügen. Er ist verantwortlich für die Gruppe, ihre Organisation und Tätig-
keit, die Vorbereitung, Verschlüsselung und Aufmachung der Proben für
die Prüfer sowie für die Erfassung und statistische Auswertung der Daten.
Der Prüfungsleiter wählt die Prüfer aus, überwacht ihre Schulung und
kontrolliert ihre Prüfungsleistung um sicherzustellen, dass ihre Urteilsfähig-
keit erhalten bleibt.
Die für die organoleptische Bewertung von Olivenöl zuständigen sensori-
schen Prüfer werden nach ihrer Eignung ausgewählt und geschult,
ähnliche Proben voneinander zu unterscheiden und so dem Leitfaden des
Internationalen Olivenölrates für die Auswahl, Schulung und Kontrolle
qualifizierter sensorischer Prüfer von nativem Olivenöl zu entsprechen.
Die Prüfergruppen müssen sich verpflichten, an den auf nationaler, gemein-
schaftlicher oder internationaler Ebene vorgesehenen organoleptischen
Bewertungen zur regelmäßigen Kontrolle und zur Harmonisierung der
Wahrnehmungskriterien teilzunehmen. Sie sind weiter verpflichtet, dem
betreffenden Mitgliedstaat jährlich alle Auskünfte über ihre Zusammenset-
zung und die Zahl der in ihrer Funktion als zugelassene Prüfergruppe
durchgeführten Bewertungen mitzuteilen.
5. VERFAHREN FÜR DIE ORGANOLEPTISCHE BEWERTUNG UND
EINSTUFUNG VON OLIVENÖL
5.1.Verwendung der Profilbeschreibung durch den Prüfer
Die zu verwendende Profilbeschreibung ist in Anlage A dieser Verfahren-
svorschrift festgelegt.
Jeder zur Prüfergruppe gehörende Prüfer muss das im Prüfglas befindliche
Öl zunächst riechen und dann verkosten (1), um einen Gesamtsinnesein-
druck aus Geruchs-, Geschmacks-, taktilen und kinästhetischen
Empfindungen gewinnen und analysieren zu können. Die Intensität der
Wahrnehmung jedes negativen und positiven Attributs ist in der Profilbe-
schreibung einzutragen.
Werden negative Attribute wahrgenommen, die nicht in der Profilbeschrei-
bung vermerkt sind, so sind diese unter Verwendung der Begriffe gemäß
Nummer 3.2 dieser Verfahrensvorschrift, mit denen sie am zutreffendsten
beschrieben werden, in der Spalte „Sonstige“ anzugeben.
5.2.Verwendung der Angaben durch den Prüfungsleiter
Der Prüfungsleiter sammelt die ausgefüllten Profilbeschreibungen der
einzelnen Prüfer, um die zugeteilten Intensitäten zu überprüfen; bei Fest-
stellung einer Anomalie fordert er den Prüfer auf, seine Profilbeschreibung
zu überarbeiten und den Prüfversuch erforderlichenfalls zu wiederholen.
Der Prüfungsleiter kann die Angaben der einzelnen Prüfer nach der
Methode zur statistischen Berechnung des Medians gemäß Anlage B in
einer elektronischen Datenbank erfassen. Die Daten für eine Probe werden
anhand einer Matrix aus 10 Spalten, die jeweils den 10 sensorischen Attri-
buten entsprechen, und n Zeilen erfasst, die n Prüfern der Prüfergruppe
entsprechen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 73
(1) Der Prüfer kann vom Verkosten absehen, wenn er einige ausgeprägte negative Attribute
feststellt; er vermerkt diese außergewöhnlichen Umstände in der Profilbeschreibung.
▼M19
Wird in der Spalte „Sonstige“ von mindestens 50 % der Prüfer ein nega-
tives Attribut eingetragen, so muss der Prüfungsleiter den Median dieses
Attributs berechnen und die entsprechende Einstufung vornehmen.
Im Falle von Analysen im Rahmen von Konformitätskontrollen oder
Gegengutachten muss der Prüfungsleiter die organoleptische Bewertung
des Öls im Abstand von mindestens einem Tag dreimal vornehmen lassen;
der Median der Attribute wird anhand der Gesamtangaben der Profilbe-
schreibung der drei Versuche berechnet.
5.3.Einstufung der Öle
Das Öl wird entsprechend dem Median der festgestellten Mängel und dem
Median des Attributs „fruchtig“ unter den nachstehenden Bezeichnungen
eingestuft. Unter Median der Mängel wird der Median des am intensivsten
wahrgenommenen negativen Attributs verstanden. Der Wert des robusten
Variationskoeffizienten für dieses negative Attribut darf höchstens 20 %
betragen.
a)Natives Olivenöl extra : der Median der Mängel ist 0 und der Median
des Attributs „fruchtig“ ist größer als 0.
b)Natives Olivenöl : der Median der Mängel ist größer als 0 und kleiner als
oder gleich 2,5 und der Median des Attributs „fruchtig“ ist größer als 0.
c)Gewöhnliches natives Olivenöl : der Median der Mängel ist größer als
2,5 und kleiner als oder gleich 6,0 oder der Median der Mängel ist
kleiner als oder gleich 2,5 und der Median des Attributs „fruchtig“ ist
gleich 0.
d)Natives Lampantöl : der Median der Mängel ist größer als 6,0.
Ab 1. November 2003 werden die Kategorien c) und d) jedoch durch
folgende Kategorie ersetzt:
c)Lampantöl : der Median der Mängel ist größer als 2,5 oder der Median
der Mängel ist kleiner oder gleich 2,5 und der Median des Attributs
„fruchtig“ ist gleich 0.
5.4.Sonderfälle
Liegt der Median für ein anderes positives Attribut als „fruchtig“ über 5,0,
so vermerkt der Prüfungsleiter dies auf der Analysebescheinigung des Öls.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 74
▼M19
ANLAGE A
1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 75
▼M19
ANLAGE B
METHODE ZUR BERECHNUNG DES MEDIANS UND DER VERTRAUEN-
SINTERVALLE
Median
Der Median ist die reelle Zahl Xm, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass die
Wahrscheinlichkeit (P), dass die Werte der Verteilung (X) unter dieser Zahl
(Xm) liegen, geringer oder gleich 0,5 ist und dass gleichzeitig die Wahrschein-
lichkeit (P), dass die Werte der Verteilung (X) unter dieser Zahl (Xm) liegen
oder ihr entsprechen, höher oder gleich 0,5 ist. Nach einer anderen Definition
ist der Median das 50. Perzentil einer Zahlenverteilung in steigender Reihen-
folge. Mit anderen Worten, der Median entspricht bei einer ungeraden Zahl
von Werten in nach ihrer Größe geordneten Folge dem zentralen Wert und bei
einer gerader Zahl von Werten dem Durchschnittswert der beiden zentralen
Werte.
Robuste Standardabweichung
Um einen zuverlässigen Schätzwert für die Variabilität zu erhalten, die sich um
den Median bildet, ist der Schätzwert der robusten Standardabweichung nach
Stuart und Kendall heranzuziehen. Die Formel der asymptotischen Standardab-
weichung S hängt ab von N und IQR. N ist die Zahl der Beobachtungen und
IQR der Quartilabstand, d. h. der robuste Schätzwert der Variabilität der betref-
fenden Angaben (der Quartilabstand umfasst genau 50 % der Fälle einer
beliebigen Wahrscheinlichkeitsverteilung). Zur Berechnung des Quartilabstands
wird die Dimension der Abweichung zwischen dem 75. und 25. Perzentil
berechnet.
IQR= 75. Perzentil - 25. Perzentil
Das Perzentil ist der Wert Xpc, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass die
Wahrscheinlichkeit (P), dass die Werte der Verteilung (X) unter Xpc liegen,
niedriger als ein bestimmtes Hunderstel ist oder ihm entspricht und dass gleich-
zeitig die Wahrscheinlichkeit (P), dass die Werte der Verteilung niedriger als
Xpc sind oder ihm entsprechen, höher als das genannte Hunderstel ist oder ihm
entspricht. Das Hundertstel gibt die Fraktion der in Frage kommenden Vertei-
lung an. Im Fall des Medians entspricht sie 50/100.
Mit anderen Worten, das Perzentil ist der Verteilungswert, der einembestimmten Bereich entspricht, der unter Zugrundelegung der Verteilungs- oder
Dichtekurve bestimmt wird. Beispiel: das 25. Perzentil ist der Verteilungswert,
der einem Bereich von 0,25 oder 25/100 entspricht.
Robuster Variationskoeffizient in %
Der CVR ist eine reine Zahl, d. h. ein Wert ohne Dimension, die den Prozent-
satz der Variabilität der analysierten Zahlenreihe gemessen am Median Me1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 76
▼M19
angibt; daher ist dieser Koeffizient zur Überprüfung der Zuverlässigkeit der
Mitglieder der Prüfergruppe besonders geeignet.
Vertrauensintervalle bei 95 % für den Median
Das Vertrauensintervall (I.C.) von 95 % (der Wert des Fehlers erster Art
entspricht 0,05 bzw. 5 %) ist das Intervall, in dem der Median, ausgehend von
der Hypothese, dass sich der Versuch unendliche Male wiederholen ließe,
schwanken könnte. In der Praxis gibt dieses Intervall das Variabilitätsintervall
des Versuchs unter den vorgesehenen operationellen Bedingungen an, in der
Annahme, dass der Versuch mehrmals wiederholt werden könnte. Das Intervall
ist, wie der CVR, nützlich zur Bewertung der Zuverlässigkeit des Versuchs.
I. C. Sup. = Me+ (c.S)
I. C. Inf. = Me- (c.S)
wobei c, bei einem Vertrauensintervall von 0,95, einem Wert von 1,96
entspricht.
Die Einstufung erfolgt durch Vergleich der Medianwerte mit den gemäß
Nummer 5.3 der Verfahrensvorschrift bestimmten Bezugsintervallen. Eine
entsprechende Computer-Software gestattet eine visuelle Einstufung in tabellari-
scher oder grafischer Form.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 77
▼M20
▼M19
▼B
ANHANG XV
1. ÖLGEHALT DER OLIVENTRESTER
1.1.Geräte
— Geeigneter Extraktionsapparat mit 200- bis 250-ml-Kolben,
— elektrisch beheiztes Bad (Sandbad, Wasserbad usw.) oder Heizplatte,— Analysenwaage,— Trockenschrank, eingestellt auf höchstens 80 ºC,— elektrischer Trockenschrank mit Thermostat, eingestellt auf 103 ºC
± 2 ºC, der unter Einblasen von Luft oder unter vermindertem Druck
betrieben werden kann,
— mechanische Mühle, leicht zu reinigen, mit der die Trester ohne Erwär-
mung und ohne merkliche Verringerung ihres Gehalts an Wasser und
Öl zerkleinert werden können,
— Extraktionshülse und Watte oder Filterpapier, frei von mit Hexan extra-
hierbaren Stoffen,
— Exsikkator,— Sieb, Maschendurchmesser 1 mm,— Siedesteinchen, zuvor getrocknet.
1.2.Reagenzien
— technisches n-Hexan; Rückstand bei vollständiger Verdampfung unter
0,002 g/100 ml.
2. ARBEITSVORSCHRIFT2.1.Vorbereitung der Probe
Die Probe wird, wenn nötig, in der zuvor gut gereinigten mechanischen
Mühle so weit gemahlen, daß die Teilchen vollständig das Sieb passieren
können.
Etwa ein Zwanzigstel der Probe ist zur Reinigung der Mühle zu benutzen;
dieses Mahlgut ist zu verwerfen. Der Rest ist fein zu mahlen, das Mahlgut
aufzufangen, sorgfältig zu mischen und unverzüglich zu analysieren.
2.2.Untersuchungsprobe
Etwa 10 g der Probe werden nach dem Mahlen auf 0,01 g genau für die
Untersuchung abgewogen.
2.3.Vorbereitung der Extraktionshülse
Die Probe wird in die Hülse gegeben und diese mit einem Wattebausch
verschlossen. Bei Verwendung von Filterpapier wird das Mahlgut darineingeschlagen.
2.4.Vertrocknung
Wenn die Trester sehr feucht sind (Gehalt an Wasser und flüchtigen
Stoffen größer als 10 %), ist vorzutrocknen, wobei die gefüllte Hülse
(bzw. das Filterpapier) so lange wie nötig in den auf höchstens 80 ºC
geheizten Trockenschrank gestellt wird, um den Gehalt an Wasser und
flüchtigen Stoffen auf unter 10 % zu senken.
2.5.Vorbereitung des Kolbens
Der Kolben, der 1 bis 2 Siedesteinchen enthält und zuvor im Trocken-
schrank bei 103 ºC ± 2 ºC getrocknet und danach mindestens 1 Stunde
lang im Exsikkator abgekühlt wurde, wird auf 1 mg genau gewogen.
2.6.Erste Extraktion
Die Hülse (bzw. das Filterpapier) mit der Probe wird in den Extraktionsap-
parat gestellt, die benötigte Menge Hexan in den Kolben gegeben, der
Kolben an den Extraktionsapparat angeschlossen und das Ganze auf das
elektrische Heizbad gestellt. Die Heizung ist so einzustellen, daß der Rück-
fluß mindestens 3 Tropfen in der Sekunde beträgt (mäßiges, nicht heftiges
Sieden).1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 78
▼B
Nach 4stündiger Extraktion läßt man abkühlen. Die Hülse wird aus dem
Extraktionsapparat genommen und in einen Luftstrom gestellt, um den
größten Teil des Lösungsmittels, mit dem sie durchtränkt ist, zu entfernen.
2.7.Zweite Extraktion
Die Hülse wird in die Mikrokugelmühle entleert, und es wird so fein wie
möglich gemahlen. Das Mahlgut wird quantitativ in die Hülse zurückge-
geben und diese wieder in den Extraktionsapparat gestellt.
Es wird nochmals 2 Stunden extrahiert, wobei der die erste Extraktion
enthaltene Kolben verwendet wird.
Die im Extraktionskolben enthaltene Lösung muß klar sein. Wenn nicht, ist
sie über Filterpapier zu filtrieren, wobei der erste Kolben und das Filterpa-
pier mehrmals mit Hexan gewaschen werden. Das Filtrat und die
Waschflüssigkeit werden in einem zweiten, zuvor getrockneten und auf
1 mg abgewogenen Kolben aufgefangen.
2.8.Entfernung des Lösungsmittels und Wiegen des Extrakts
Durch Destillieren auf dem elektrischen Heizbad wird der größte Teil des
Lösungsmittels entfernt. Die letzten Lösungsmittelspuren werden durch
20minütiges Erhitzen des Kolbens im Trockenschrank bei 103 ºC ± 2 ºC
beseitigt. Die Beseitigung der Lösungsmittelreste wird durch zeitweiliges
Einführen eines Luftstroms oder besser eines Inertgasstroms oder durch
Arbeiten unter vermindertem Druck erleichtert.
Den Kolben läßt man wenigstens 1 Stunde im Exsikkator abkühlen und
wiegt ihn dann auf 1 mg genau.
Danach wird der Kolben erneut 10 Minuten unter den gleichen Bedin-
gungen erhitzt, im Exsikkator abgekühlt und gewogen.
Der Unterschied zwischen den Ergebnissen der zwei Wägungen darf
höchstens 10 mg betragen. Wenn nicht, ist erneut 10 Minuten zu erhitzen,
dann wieder abkühlen zu lassen und zu wiegen, bis der Gewichtsunter-
schied höchstens 10 mg beträgt. Das letzte Gewicht des Kolbens wird
notiert.
Für jede Untersuchung werden mit der gleichen Probe zwei Bestimmungen
durchgeführt.
3. ERGEBNISSE
3.1.Berechnung und Formel
a) Der Extrakt des Rohprodukts läßt sich in Gewichtsprozenten durch
nachstehende Formel berechnen:
S=m1×100
m0Dabei sind:
S = Gewichtsprozente des Extrakts des Rohprodukts,
m0= Gewicht der Untersuchungsprobe in g,
m1= Gewicht des Extrakts nach der Trocknung in g.
Als Ergebnis ist das arithmetische Mittel aus den beiden Bestimmungen
zu nehmen, falls die Bedingungen der Wiederholbarkeit erfüllt sind.
Das Ergebnis wird auf eine Dezimalstelle angegeben.
b) Der Extrakt, bezogen auf den Trockenstoff, läßt sich berechnen durch
dieForme l:
S×100
100 − U= Extrakt in % Fett, bezogen auf den Trockenstoff.
Dabei sind:
S = Gewichtsprozente des Extrakts des Rohprodukts (vgl. a)),
U = sein Gehalt an Wasser unf flüchtigen Stoffen.
3.2.Wiederholbarkeit
Die Differenz zwischen den Ergebnissen von zwei gleichzeitig oder schnell
nacheinander von ein und demselben Analytiker vorgenommenen Bestim-
mungen darf nicht mehr als 0,2 g Hexan-Extrakt je 100 g Probe betragen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 79
▼B
Andernfalls ist die Analyse mit zwei weiteren Untersuchungsproben zu
wiederholen. Liegt die Differenz wieder über 0,2 g, so ist als Ergebnis das
arithmetische Mittel aus allen vier Bestimmungen zu nehmen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 80
▼B
ANHANG XVI
BESTIMMUNG DER IODZAHL
1. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Internationale Norm beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der
Iodzahl von tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen, nachfolgend als
„Fette“ bezeichnet.
2. DEFINITION
In dieser Internationalen Norm gilt folgende Definition:
2.1. Iodzahl: Iodmenge, die unter den in dieser Internationalen Norm beschrie-
benen Versuchsbedingungen von der Probe aufgenommen wird.
Die Iodzahl wird in Gramm Iod pro 100 g Probe angegeben.
3. PRINZIP
Die zu untersuchende Probe wird in dem Lösungsmittel gelöst und mit dem
Wijs-Reagens versetzt. Nach einer bestimmten Zeit werden Kaliumiodidlö-
sung und Wasser zugegeben und das freigesetzte Iod mit einer
Natriumthiosulfatlösung titriert.
4. REAGENZIEN
Alle Reagenzien müssen von anerkannter analysenreiner Qualität sein.
4.1. Kaliumiodidlösung, 100 g/l, die kein Iodat oder freies Iod enthält.4.2. Stärkelösung
5 g lösliche Stärke mit 30 ml Wasser mischen und in 1 000 ml kochendes
Wasser geben; 3 Minuten kochen und abkühlen lassen.
4.3. Natriumthiosulfat, eingestellte Standardlösung c (Na
2S2O3·5 H2O) = 0,1
mol/l, höchstens 7 Tage vor der Verwendung eingestellt.
4.4. Lösungsmittel, hergestellt durch Mischen gleicher Volumenteile Cyclo-
hexan und Essigsäure.
4.5. Wijs-Reagens, das Iodmonochlorid in Essigsäure enthält. Es soll das im
Handel erhältliche Wijs-Reagens verwendet werden.
Anmerkung: Das Reagens enthält 9 g ICl3+ 9 g I in Essigsäure.
5. GERÄTE
Übliche Laboreinrichtung und insbesondere nachstehende Geräte:
5.1. Mikrobechergläschen, die sich für die zu untersuchende Probe und zum
Einführen in die Kolben (5.2) eignen.
5.2. 500-ml-Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen, vollständig trocken.
6. VORBEREITUNG DER ANALYSEPROBE
Die homogenisierte Probe wird über Natriumsulfat getrocknet und filtriert.
7. VERFAHREN
7.1.Probemenge
Die Menge der zu untersuchenden Probe hängt von der erwarteten Iodzahl
ab (Tabelle 1).
Tabelle 1
Erwartete Iodzahl Masse der zu untersuchenden Probe
weniger als 5 3,00 g
5— 20 1,00 g
21— 50 0,40 g
51—100 0,20 g1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 81
▼B
Erwartete Iodzahl Masse der zu untersuchenden Probe
101—150 0,13 g
151—200 0,10 g
Die zu untersuchende Probe wird in einem Mikrobechergläschen (5.1) auf
0,1 mg genau eingewogen.
7.2.Bestimmung
Die Probe wird in einen 500-ml-Kolben (5.2) gegeben und mit 20 ml
Lösungsmittel (4.5) versetzt, um das Fett zu lösen. Genau 25 ml Wijs-
Reagens (4.6) zugeben, den Kolben mit dem Stopfen verschließen,
schwenken und dunkel stellen. Für das Wijs-Reagens sollen keine Pipetten
verwendet werden, die mit dem Mund aufgezogen werden müssen.
Dann wird in ähnlicher Weise eine Blindprobe vorbereitet; die das
Lösemittel und das Reagens, nicht aber die Probe enthält.
Bei Proben mit Iodzahlen unter 150 muß der Kolben 1 Stunde dunkel
gestellt werden; bei Iodzahlen über 150 sowie bei polymerisierten oder
stark oxidierten Erzeugnissen sind es 2 Stunden.
Nach Ablauf dieser Zeit wird in jeden Kolben 20 ml Kaliumiodidlösung
(4.1) und 150 ml Wasser gegeben.
Nun mit der eingestellten Natriumthiosulfat-Standardlösung (4.3) titrieren,
bis die durch Iod bedingte Gelbfärbung kaum noch sichtbar ist. Einige
Tropfen Stärkelösung (4.2) zugeben und weiter titrieren, bis die Blau-
färbung unter starkem Schütteln verschwindet.
Anmerkung: Eine potentiometrische Bestimmung des Endpunkts ist
zulässig.
7.3.Zahl der Bestimmungen
Es werden zwei Bestimmungen mit der gleichen Probe durchgeführt.
8. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE
Die Iodzahl wird nach folgender Gleichung berechnet:
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
m
Hierin bedeuten:
c = die genaue zahlenmäßige Angabe der Konzentration der verwen-
deten Natriumthiosulfat-Standardlösung (4.3) in mol pro Liter;
V1= Volumen der für den Blindversuch verwendeten Natriumthiosulfat-
Standardlösung (4.3) in Millilitern;
V2= Volumen der zur Bestimmung verwendeten Natriumthiosulfat-
Standardlösung (4.3) in Millilitern;
m = Masse der untersuchten Probe (7.1) in Gramm.
Als Ergebnis ist das arithmetische Mittel der beiden Bestimmungen anzu-
geben.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 82
▼M11
ANHANG XVII
METHODE ZUR BESTIMMUNG VON STIGMASTADIENEN IN
PFLANZLICHEN ÖLEN
1. ZWECK
Bestimmung von Stigmastadienen in pflanzlichen Ölen, die diese Kohlen-
wasserstoffe nur in geringer Konzentration enthalten, insbesondere in
nativen Olivenölen und rohem Oliventresteröl.
2. ANWENDUNGSBEREICH
Das Verfahren läßt sich auf alle pflanzlichen Öle anwenden. Die Bestim-
mungen sind allerdings nur zuverlässig bei einer Konzentration dieses
Kohlenwasserstoffs von 0,01 bis 4,0 mg/kg. Die Methode eignet sich
besonders zum Nachweis von raffinierten pflanzlichen Ölen (Olivenöl,
Oliventresteröl, Sonnenblumenöl, Palmöl usw.) in nativem Olivenöl, da
raffinierte Öle im Gegensatz zu nativen Ölen Stigmastadien enthalten.
3. PRINZIP
Isolierung der unverseifbaren Bestandteile. Abtrennung der Steroid-Frak-
tion durch Säulenchromatographie an Kieselgel und Analyse durch
Kapillargaschromatographie.
4. GERÄTE
4.1. 250-ml-Stehkolben, zur Verwendung mit Rückflußkühler geeignet.4.2. 200-ml-Scheidetrichter.4.3. 100-ml-Rundkolben.
4.4. Rotationsverdampfer.
4.5. Chromatographiesäule aus Glas (innerer Durchmesser 1,5 bis 2,0 cm,
Länge 50 cm) mit Teflonhahn und Glaswattebausch oder Sinterglas-
scheibe am unteren Ende. Zur Vorbereitung der Kieselgelsäule mit
Chromatographiesäule bis zu einer Höhe von etwa 5 cm mit Hexan füllen
und dann eine Suspension von 15 g Kieselgel in 40 ml Hexan mit Hilfe
von mehreren Anteilen Hexan einschlämmen und unter leichtem Klopfen
vollständig absetzen lassen. Anschließend wasserfreies Natriumsulfat bis
zu einer Höhe von rund 0,5 cm zugeben und das überschüssige Hexan
ablaufen lassen.
4.6. Gaschromatograph mit Flammenionisationsdetektor, Split- oder cold On-
column-Injektor und Ofen mit einer Einstellgenauigkeit von ± 1 ºC.
4.7. Fused-Silica-Kapillarsäule für Gaschromatographie (0,25 oder 0,32 mm
Innendurchmesser und 25 m Länge), belegt mit 5 % Phenylmethylsilicon,
Filmdicke0,25 µm.
Anmerkung 1:
Andere Säulen mit vergleichbarer oder geringerer Polarität können eben-
falls verwendet werden.
4.8. Aufzeichnungsgerät mit Integrator mit Möglichkeit der Integration
zwischen zwei Minima.
4.9. 5-10- µl-Mikrospritze für Gaschromatographie mit fester Nadel.
4.10. Pilzheizhaube oder Heizplatte.
5. REAGENZIEN
Alle Reagenzien müssen, sofern nicht anders angegeben, von Analyse-
qualität sein. Es ist destilliertes Wasser oder Wasser von mindestens
gleichem Reinheitsgrad zu verwenden.
5.1. Hexan oder Alkanmischung mit einem Siedebereich von 65-70 ºC, destil-
liert in einer Rektifiziersäule.
Anmerkung 2:
Das Lösungsmittel muß zur Entfernung von Verunreinigungen destilliert
werden.
5.2. Ethanol, 6%ig (v/v).1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 83
▼M11
5.3. Wasserfreies Natriumsulfat.
5.4. Ethanolische Kalilauge, 10 %ige Lösung. 10 ml Wasser zu 50 g Kalium-
hydroxid geben, umrühren und die Mischung durch Zugabe von Ethanol
lösen und mit Ethanol auf 500 ml auffüllen.
Anmerkung 3:
Ethanolische Kalilauge wird beim Stehen braun. Sie sollte täglich frisch
zubereitet und in dunklen Glasflaschen gut verschlossen aufbewahrt
werden.
5.5. Kieselgel 60 für Säulenchromatographie, 70-230 mesh (Merck, Art. Nr.
7734 o. ä.).
Anmerkung 4:
Gewöhnlich kann Kieselgel direkt aus dem Behälter ohne Vorbehandlung
verwendet werden. Manche Kieselgelpartien weisen jedoch eine geringe
Aktivität auf, was zu unbefriedigenden chromatographischen Trennungen
führt. In solchen Fällen ist wie folgt vorzugehen: das Kieselgel durch
mindestens vierstündiges Erhitzen auf 550 ºC aktivieren, nach dem
Erhitzen in einen Exsikkator stellen und nach dem Abkühlen in einen
verschließbaren Kolben überführen; 2 % Wasser zugeben und schütteln,
bis keine Klumpen mehr sichtbar sind und das Pulver frei rieselt.
Kieselgelpartien, die Chromatogramme mit sich überlappenden Peaks
ergeben, sind wie oben beschrieben zu behandeln. Eine Alternative ist
die Verwendung von extrareinem Kieselgel 60 (Merck, Art. Nr. 7754).
5.6. Stammlösung (200 ppm) von Cholesta-3,5-dien (Sigma, 99 % rein) in
Hexan (10 mg in 50 ml).
5.7. Standardlösung von Cholesta-3,5-dien in Hexan in einer Konzentration
von 20 ppm. Dazu die obengenannte Lösung verdünnen.
Anmerkung 5:
Bei Temperaturen unter 4 ºC halten sich die Lösungen 5.6 und 5.7
mindestens vier Monate lang.
5.8. Lösung aus n-Nonacosan in Hexan mit einer Konzentration von rund
100 ppm.
5.9. Trägergas für die Gaschromatographie: Helium oder Wasserstoff
(99,9990 % rein).
5.10. Brenngase für den Flammenionisationsdetektor: Wasserstoff (99,9990 %
rein) und gereinigte Luft.
6. VERFAHREN
6.1.Herstellung des Unverseifbaren:
6.1.1. 20 ± 0,1 g Öl in einen 250-ml-Kolben (4.1) einwiegen, 1 ml der Stand-
ardlösung von Cholesta-3,5-dien (20 µg) und 75 ml 10 %igee thanolische
Kalilauge zugeben, Rückflußkühler anschließen und 30 Minuten köcheln
lassen. Den Kolben mit der Probe von der Hitzequelle nehmen und leicht
abkühlen lassen (nicht vollständig abkühlen lassen, da die Probe sonst
fest wird). 100 ml Wasser zugeben und die Lösung mit Hilfe von 100 ml
Hexan in einen Scheidetrichter (4.2) geben. Die Mischung 30 Sekunden
kräftig schütteln und zur Phasentrennung stehen lassen.
Anmerkung 6:
Bei Bildung einer Emulsion, die nicht gleich wieder verschwindet, kleine
Mengen Ethanol zugeben.
6.1.2. Die untere, wäßrige Phase in einen zweiten Scheidetrichter überführen
und wiederum mit 100 ml Hexan extrahieren. Die untere Phase erneut
ablaufen lassen und die Hexanextrakte zusammen in einem weiteren
Scheidetrichter dreimal mit je 100 ml einer Ethanol-Wassermischung (1:
1) waschen, bis diese pH-neutral reagiert.
6.1.3. Die Hexanlösung durch wasserfreies Natriumsulfat (50 g) laufen lassen,
mit 20 ml Hexan waschen und in einem Rotationsverdampfer bei 30 ºC
im leichten Vakuum vollständig eindampfen.
6.2.Abtrennung der Steroid-Fraktion:
6.2.1. Den Rückstand mit Hilfe von zwei Volumenanteilen Hexan (jeweils 1 ml)
auf die Trennsäule aufgeben und soweit einziehen lassen, bis sich die
Flüssigkeitsoberfläche bis über die Natriumsulfatschicht abgesenkt hat.
Dann die Elution mit Hexan mit einer Flußrate von 1 ml/Minute1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 84
▼M11
beginnen. Die ersten 25 bis 30 ml des Eluats verwerfen, die folgenden
40 ml auffangen. Diese Fraktion in einen 100-ml-Rundkolben (4.3) über-
führen.
Anmerkung 7:
Die erste Fraktion enthält gesättigte Kohlenwasserstoffe (Abbildung 1a),
die zweite Steroide. Danach werden Squalen und verwandte Verbin-
dungen eluiert. Für eine gute Trennung zwischen den gesättigten
Kohlenwasserstoffen und den Steroiden müssen die Fraktionsvolumina
optimiert werden. Hierzu ist das Volumen der ersten Fraktion so zu regu-
lieren, daß bei der Analyse der zweiten Fraktion nur kleine Peaks für
gesättigte Kohlenwasserstoffe auftreten (siehe Abbildung 1c). Treten
keine solchen Peaks auf und hat der Standardpeak gleichzeitig nur eine
geringe Größe, so ist das Volumen der ersten Fraktion zu reduzieren. Im
übrigen ist eine vollständige Trennung zwischen den Komponenten der
ersten und zweiten Fraktion nicht erforderlich, da während der GC-
Analyse unter den in Punkt 6.3.1 beschriebenen Arbeitsbedingungen eine
Überlappung der Peaks nicht vorkommt. Eine Optimierung des Volumens
der zweiten Fraktion ist in der Regel nicht notwendig, da sich die
weiteren Komponenten gut abtrennen lassen. Ein großer Peak mit einer
Retentionszeit von rund 1,5 Minuten unter dem des Standards ist jedoch
auf das Vorhandensein von Squalen zurückzuführen und zeigt eine
schlechte Trennung an.
6.2.2. Die zweite Fraktion im Rotationsverdampfer bei 30 ºC im leichten
Vakuum vollständig eindampfen und den Rückstand sofort in 0,2 ml
Hexan auflösen. Die Lösung bis zur Analyse im Kühlschrank aufbe-
wahren.
Anmerkung 8:
Die Rückstände 6.1.3 und 6.2.2 sollten nicht trocken und nicht bei
Zimmertemperatur aufbewahrt werden. Nach Gewinnung des Rückstands
sofort das Lösungsmittel zugeben und die Lösung im Kühlschrank aufbe-
wahren.
6.3.Gaschromatographie
6.3.1. Arbeitsbedingungen für Split-Injektion:
— Injektortemperatur: 300 ºC,
— Detektortemperatur: 320 ºC,
— Integrator: (Die Parameter für die Integration sind so zu wählen, daß
die Peakflächen richtig beurteilt werden können. Empfohlen wird die
Integration zwischen zwei Minima),
— Empfindlichkeit: rund das 16-fache der Mindestdämpfung,
— Einspritzvolumen: 1 µm Lösung,
— Temperaturprogramm: 6 Minuten isotherm bei 235 ºC, dann mit 2 ºC/
min auf 285 ºC,
— Injektor mit Stromteilventil (Splitverhältnis 1: 15),
— Trägergasvordruck: ca. 120 kPa Helium oder Wasserstoff.
Diese Bedingungen können entsprechend den Kenndaten des Chromato-
graphen und der Säule derart geändert werden, daß die damit
aufgezeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen erfüllen: Der
Peak des internen Standards muß innerhalb von 5 Minuten vor oder
nach der unter 6.3.2 genannten Zeit erscheinen und mindestens 80 %
Vollausschlag erreichen.
Das GC-System ist durch Einspritzen einer Mischung aus der Cholesta-
dien-Stammlösung (5.6) und der n-Nonacosan-Lösung (5.8) zu
überprüfen. Der Cholesta-3,5-dien-Peak muß vor dem n-Nonacosan-Peak
erscheinen (Abbildung 1c). Ist dies nicht der Fall, so kann die ursprüng-
liche Ofentemperatur verringert und/oder die GC-Säule durch eine
weniger polare Säule ersetzt werden.
6.3.2. Identifizierung der Peaks
Der Peak der internen Standards erscheint nach rund 19 Minuten, derje-
nige von Stigmastadienen nach einer relativen Retentionszeit von rund
1,29 (Abbildung 1b). Das Stigmasta-3,5-dien tritt zusammen mit geringen
Mengen eines Isomers auf; beide ergeben normalerweise aber nur einenPeak. Ist die Säule jedoch zu polar, oder hat sie eine große Trennleistung,
kann das Isomer als kleiner Peak dicht vor dem des Stigmasta-3,5-dien
erscheinen (Abbildung 2). Um sicherzugehen, daß die Stigmastadiene als
ein Peak eluiert werden, empfiehlt es sich, die Säule durch eine weniger
polare Säule oder eine Säule mit größerem Innendruchmesser zu ersetzen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 85
▼M11
Anmerkung 9:
Ein Referenzchromatogramm für Stigmastadien erhält man durch die
Analyse eines raffinierten pflanzlichen Öls mit einer kleineren Probe.
Stigmastadiene rufen einen signifikanten, leicht identifizierbaren Peak
hervor.
6.3.3. QuantitativeAnalyse
Der Gehalt an Stigmastadienen wird nach folgender Formel berechnet:
mg/kg Stigmastadienen =As/C2Mc
Ac/C2Mo
Hierin bedeuten: As= Peakfläche von Stigmastadienen (wenn der
Peak geteilt ist, Summe der Flächen beider
Isomere),
Ac= Peakfläche des internen Standards (Cholesta-
dien),
Mc= Masse des zugesetzten Standards in Mikro-
gramm,
Mo= Masse des eingewogenen Öls in Gramm.
Nachweisgrenze: rund 0,01 mg/kg.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 86
▼M11
Abb. 1:
Gaschromatogramme von Olivenölproben, analysiert auf einer Fused-
Silica-Kapillarsäule (0,25 mm Innendurchmesser und 25 m Länge), belegt
mit 5 % Phenylmethylsilicon (Filmdicke 0,25 µm).
a) Erste Fraktion (30 ml) eines nativen Olivenöls, mit dem Standard
versetzt.
b) Zweite Fraktion (40 ml) eines Olivenöls mit 0,10 mg/kg Stigmasta-
dienen.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 87
▼M11
c) Zweite Fraktion (40 ml) mit einem kleinen Anteil der ersten Fraktion.
Abb. 2:
Gaschromatogramm einer Probe raffinierten Olivenöls, analysiert auf
einer DB-5-Säule, auf dem das Isomer von Stigmasta-3,5-dien zu
erkennen ist.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 88
▼M13
ANHANG XVIII
BESTIMMUNG DER ZUSAMMENSETZUNG DER TRIGLYCERIDE
MIT ECN42 (DIFFERENZ ZWISCHEN HPLC-DATEN UND THEORETI-
SCHEM GEHALT)
1.Zweck
Bestimmung der Zusammensetzung der in Olivenöl enthaltenen Trigly-
ceride (TAG) hinsichtlich ihrer äquivalenten Kohlenstoffzahl (ECN)
anhand der Unterschiede zwischen den Analyseergebnissen der Hoch-
leistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und dem auf der
Grundlage der Fettsäurezusammensetzung berechneten theoretischen
Gehalt.
2.Anwendungsbereich
Diese Norm ist anwendbar auf Olivenöle. Das Verfahren dient dem
Nachweis kleiner Mengen von (linolsäurereichen) Saatölen in
Olivenölen aller Kategorien.
3.Prinzip
Der mit Hilfe der HPLC-Analyse bestimmte Gehalt an Triglyceriden
mit ECN42 und der (auf der Grundlage der gaschromatographisch
bestimmten Fettsäurezusammensetzung berechnete) theoretische Gehalt
an Triglyceriden mit ECN42 stimmen bei reinen Ölen bis zu einem
gewissen Grad überein. Unterschiede, die über den in der Verordnung
für jeden Typ angegebenen Werten liegen, deuten darauf hin, daß das
Öl Saatöl enthält.
4.Verfahren
Die Methode für die Berechnung des theoretischen Gehalts an Triglyce-
riden mit ECN42 und der Differenz zwischen diesem und den HPLC-
Daten besteht im wesentlichen aus dem Vergleich von Analysedaten,
die mit Hilfe anderer Methoden gewonnen wurden. Drei Verfahren-
sstufen sind zu unterscheiden: Bestimmung der
Fettsäurezusammensetzung durch Kapillarsäulengaschromatographie,
Berechnung der theoretischen Zusammensetzung der Triglyceride mit
ECN42 und HPLC-Bestimmung der Triglyceride mit ECN42.
4.1.Geräte
4.1.1. 250-ml- und 500-ml-Rundkolben.4.1.2. 100-ml-Bechergläser.4.1.3. Chromatographiesäule aus Glas, 21 mm innerer Durchmesser, 450 mm
Länge, mit Hahn und Normschliffhülle am oberen Ende.
4.1.4. Scheidetrichter 250 ml Inhalt, mit Normschliffkern am unteren Ende,
geeignet zum Verbinden mit dem oberen Ende der Säule.
4.1.5. Glasstab, 600 mm Länge.4.1.6. Glastrichter, 80 mm Durchmesser.4.1.7. 50-ml-Meßkolben.4.1.8. 20-ml-Meßkolben.4.1.9. Rotationsverdampfer.4.1.10. Hochleistungsflüssigchromatograph mit Säulenofen zur Regelung der
Säulentemperatur.
4.1.11. Einspritzsystem mit 10- µl-Probenschleife.
4.1.12. Detektor: Differentialrefraktometer. Im Bereich der höchsten Empfind-
lichkeit sollten wenigstens 10
−4Einheiten des Brechungsindex erreicht
werden.
4.1.13. Säule: Säule aus rostfreiem Stahl, 250 mm Länge und 4,5 mm Innen-
durchmesser, gefüllt mit Kieselgel (5 µm Partikelgröße) mit einer
durchschnittlichen Kohlenstoffbelegung von 22—23 % in Form von
Octodecylsilan (Anmerkung 2).
4.1.14. Schreiber und/oder Integrator.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 89
▼M13
4.2.Reagenzien
Die Reagenzien müssen analysenrein sein.
Die Fließmittel müssen entgast sein. Sie können mehrere Male wieder-
verwendet werden, ohne daß dadurch die Trennleistungen beeinflußt
werden.
4.2.1. Petrolether (40—60 ºC) für die Chromatographie.4.2.2. Diethylether, peroxidfrei, frisch destilliert.4.2.3. Elutionsmittel für die Säulenchromatographie: Mischung aus Petrolether
und Diethylether im Verhältnis 87/13 (v/v).
4.2.4. Kieselgel, 70—230 mesh, TypE Merck 7734, standardisiert auf einem
Wassergehalt von 5 % (w/w).
4.2.5. Glaswatte.
4.2.6. Aceton.
4.2.7. Acetonitril.4.2.8. HPLC-Fließmittel: Acetonitril + Aceton (Das Mischungsverhältnis ist
so einzustellen, daß damit die gewünschte Trennung erzielt wird; man
beginnt mit einem Mischungsverhältnis von 1:1).
4.2.9. Lösungsmittel: Aceton.4.2.10. Als Referenztriglyceride können handelsübliche Triglyceride (Tripal-
mitin, Triolein usw.) verwendet werden, wobei ein Diagramm aus den
Retentionszeiten und den äquivalenten Kohlenstoffzahlen aufgezeichnet
wird, oder es werden Referenzchromatogramme von Sojaöl, einer
Mischung von Sojaöl/Olivenöl (30:70) und reinem Olivenöl erstellt
(siehe Anmerkungen 3 und 4 und Abbildungen 1, 2, 3 und 4).
4.3.Vorbereitung der Proben
Da einige störende Substanzen zu falschen positiven Ergebnissen führen
können, muß die Probe immer nach der IUPAC-Methode 2.507, die für
die Bestimmung polarer Stoffe in oxidierten Ölen verwendet wird,
gereinigt werden.
4.3.1. Vorbereitung der Chromatographiesäule
Etwa 30 ml Fließmittel (4.2.3) in die Säule (4.1.3) geben, Glaswatte-
bausch (4.2.5) einführen und mit Hilfe des Glasstabs (4.1.5) bis auf
den Grund der Säule schieben.
In einem 100-ml-Becherglas 25 g Kieselgel (4.2.4) in 80 ml Elutions-
mittel (4.2.3) suspendieren, dann mit Hilfe eines Glastrichters (4.1.6)
in die Säule geben.
Zur restlosen Überführung des Kieselgels in die Säule ist das Becher-
glas mit dem Elutionsmittel zu spülen und die Spülflüssigkeit ebenfalls
in die Säule zu geben.
Hahn öffnen und soviel Fließmittel ablaufen lassen, bis der Fließmittel-
spiegel etwa 1 cm über dem Kieselgel liegt.
4.3.2. Säulenchromatographie
In einem 50-ml-Meßkolben (4.1.7) werden auf 0,001 g genau 2,5 ± 0,1 g
filtriertes, homogenisiertes und erforderlichenfalls entwässertes Öleingewogen. Die Einwaage wird in etwa 20 ml Elutionsmittel (4.2.3)
gelöst; erforderlichenfalls leicht erwärmen, damit sich das Öl besser
löst. Auf Raumtemperatur erkalten lassen und mit Elutionsmittel
auffüllen.
Mit Hilfe einer Meßpipette werden 20 ml der Lösung in die gemäß
4.3.1 vorbereitete Säule gegeben; Hahn öffnen und das Elutionsmittel
bis zur Kieselgelschicht ablaufen lassen.
Mit Hilfe von 150 ml Elutionsmittel (4.2.3) bei einer Durchlaufge-
schwindigkeit von etwa 2 ml/Minute eluieren, so daß 150 ml die Säule
in 60 bis 70 Minuten durchströmen.
Eluat in einem zuvor im Ofen austarierten und genau gewogenen 250-
ml-Rundkolben (4.1.1) auffangen. Lösungsmittel unter Unterdruck
(Rotavapor) entfernen und Rückstand wägen, der zur Herstellung der
Lösung für die HPLC-Analyse und für die Bereitung der Methylesterzu-
bereitung verwendet wird.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 90
▼M13
Nach Durchlaufen der Säule muß im Fall von nativem Olivenöl extra,
nativem Olivenöl, gewöhnlichem nativem Olivenöl, raffiniertem
Olivenöl und Olivenöl die Probe zu 90 %, im Fall von Lampantöl und
Tresteröl mindestens zu 80 % zurückgewonnen werden.
4.4.HPLC-Analyse
4.4.1. Vorbereitung der Proben für die Chromatographieanalyse
Von der zu analysierenden Probe wird eine 5 %ige Lösung hergestellt,
indem 0,5 g ± 0,001 g der Probe in einen 10-ml-Meßkolben einge-
wogen und mit dem Lösungsmittel (4.2.9) auf 10 ml aufgefüllt werden.
4.4.2. Verfahren
Das HPLC-Gerät in Betrieb setzen. Das Fließmittel (4.2.8) mit einer
Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute durch die Säule pumpen,
um das gesamte System zu spülen. Sobald eine stabile Basislinie erre-
icht ist, werden 10 µl der gemäß 4.3 hergestellten Proben eingespritzt.
4.4.3. Berech nung und Abfassung der Ergebnisse
Es wird vorausgesetzt, daß die Summe der Peakflächen aller Triglyce-
ride mit ECN42 bis ECN52 100 % entspricht (Flächenprozentmethode).
Der relative Anteil eines jeden Triglycerids berechnet sich nach
folgender Formel:
% Triglycerid = Peakfläche × 100/Summe der Peakflächen.
Die Ergebnisse sind auf mindestens zwei Stellen nach dem Komma
anzugeben.
Anmerkung 1: Die Reihenfolge der Elution kann durch Berechnung
der äquivalenten Kohlenstoffzahlen (ECN) bestimmt werden, die häufig
durch die Beziehung ECN = CN − 2n definiert sind. Hierbei ist CN die
Zahl der Kohlenstoffatome und n die Zahl der Doppelbindungen. Durch
Berücksichtigung des Ursprungs der Doppelbindungen kann sie noch
genauer bestimmt werden. Wenn no,nlund nlndie Zahlen der Doppel-
bindungen sind, die der Öl-, Linol- bzw. Linolensäure zugeordnet sind,
so kann die äquivalente Kohlenstoffzahl nach folgender Formel
berechnet werden:
ECN = CN − dono−dlnl−dlnnln
Die Koeffizienten do,dlund dlnkönnen mit Hilfe der Referenztriglyce-
ride berechnet werden. Unter den in dieser Methode beschriebenen
Bedingungen gilt näherungsweise folgende Beziehung:
ECN = CN − (2,60 no) − (2,35 nl) − (2,15 nln)
Anmerkung 2: Beispiele: LiChrosorb RP18 (Merck Art 50333),
LiChrospher 100 CH18 (Merck Art 50377)
oder gleichwertiges Material.
Anmerkung 3: Mit Hilfe verschiedener Triglyceride kann die Auflösung
für Triolein unter Verwendung der reduzierten Retentionszeit
RT' = RT − RT Lösungsmittel wie folgt berechnet werden:
α= RT' / RTriolein
Der Graph von log αgegen f (Zahl der Doppelbindungen) ermöglicht
es, die Retentionswerte aller Triglyceride zu bestimmen, die Fettsäuren
enthalten, die in den Referenztriglyceriden vorkommen (siehe Abbil-
dung 2).
Anmerkung 4: Die Trennfähigkeit der Säule muß eine klare Trennung
des Trilinolein-Peaks von den Peaks der Triglyceride mit wenig unter-
schiedlicher Retentionszeit ermöglichen. Die Elution wird bis zum
ECN52-Peak durchgeführt.
Anmerkung 5: Eine korrekte Bestimmung der Flächen aller für die
Bestimmung interessierenden Peaks wird dadurch sichergestellt, daß
der zweite Peak mit ECN50 50 % des Vollausschlags des Rekorders
erreicht.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 91
▼M13
4.5.Berechnung der Triglyceridzusammensetzung (Mol %) anhand der
GLC-Daten (Flächen %)
4.5.1. Bestimmung der Fettsäurezusammensetzung
Die Fettsäurezusammensetzung wird nach dem EG-Verfahren gemäß
Anhang X A der Verordnung (EWG) Nr. 2568/91 unter Verwendung
einer Kapillarsäule gaschromatographisch bestimmt. Die Fettsäureme-
thylester werden gemäß Anhang X B der genannten Verordnung
vorbereitet (Reaktion mit Natriummethylat in Methanollösung).
4.5.2. Berech nungsrelevante Fettsäuren
Die Triglyceride werden nach ihrer äquivalenten Kohlenstoffzahl
(ECN) unter Berücksichtigung folgender ECN/Fettsäureäquivalenzen
zusammengefaßt. Nur Fettsäuren mit 16 und 18 Kohlenstoffatomen
werden berücksichtigt, da nur sie bei Olivenöl von Bedeutung sind.
Fettsäure (FS) AbkürzungMolekularge-
wicht (MG)ECN
PalmitinsäureP 256,4 16
Palmitoleinsäure Po 254,4 14Stearinsäure S 284,5 18ÖlsäureO 282,5 16LinolsäureL 280,4 14Linolensäure Ln 278,4 12
4.5.3. Umrech nung der prozentualen Fläche in Mol für alle Fett-
säuren
Mol P ¼
%F l ¨acheP
MG PMol S ¼%F l ¨acheS
MG SMol Po ¼%F l ¨achePo
MG Po/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(1)
Mol O ¼
%F l ¨acheO
MG OMol L ¼%F l ¨acheL
MG LMol Ln ¼%F l ¨acheLn
MG Ln
4.5.4. Normalisierung der Fettsäuren auf 100 %
Mol % P 1 ;2;3 ðÞ ¼Mol P /C3100
Mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(2)Mol % S 1 ;2;3 ðÞ ¼
Mol S /C3100
Mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Mol % Po 1 ;2;3 ðÞ ¼Mol Po /C3100
Mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Mol % O 1 ;2;3 ðÞ ¼Mol O /C3100
Mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Mol % L 1 ;2;3 ðÞ ¼Mol L /C3100
Mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼Mol Ln /C3100
Mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Als Ergebnis erhält man den prozentualen Anteil jeder Fettsäure in
Molprozent in (1,2,3-) Positionen der TAG.
Anschließend wird die Summe der gesättigten Fettsäuren P und S
(SFA) sowie der ungesättigten Fettsäuren Po, O, L und Ln (UFA)
berechnet:
Mol % SFA = Mol % P + Mol % S/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(3)Mol % UFA = 100 − Mol % SFA1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 92
▼M13
4.5.5. Berech nung der Fettsäurezusammensetzung in 2- und 1,3-
Stellung der TAG
Die Fettsäuren werden wie folgt in drei Gruppen eingeteilt: zwei
gleiche Gruppen für 1- und 3-Stellung und eine Gruppe für 2-Stellung,
wobei unterschiedliche Koeffizienten für gesättigte (P und S) und unge-
sättigte Fettsäuren (Po, O, L und Ln) verwendet werden.
4.5.5.1. Gesättigte Fettsäuren in 2-Stellung (P(2) und S(2))
Mol % P(2) = Mol % P (1,2,3) * 0,06/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(4)Mol % S(2) = Mol % S (1,2,3) * 0,06
4.5.5.2. Ungesättigte Fettsäuren in 2-Stellung (Po(2), O(2), L(2) und Ln(2))
Mol % Po 2 ðÞ ¼Mol % Po 1 ;2;3 ðÞ
Mol % UFA/C3100/C0Mol % P 2 ðÞ /C0Mol % S 2 ðÞ ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(5)Mol % O 2 ðÞ ¼
Mol % O 1 ;2;3 ðÞ
Mol % UFA/C3100/C0Mol % P 2 ðÞ /C0Mol % S 2 ðÞ ðÞ
Mol % L 2 ðÞ ¼Mol % L 1 ;2;3 ðÞ
Mol % UFA/C3100/C0Mol % P 2 ðÞ /C0Mol % S 2 ðÞ ðÞ
Mol % Ln 2 ðÞ ¼Mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ
Mol % UFA/C3100/C0Mol % P 2 ðÞ /C0Mol % S 2 ðÞ ðÞ
4.5.5.3. Fettsäuren in 1,3-Stellung (P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) und
Ln(1,3))
Mol % P 1 ;3ðÞ ¼Mol % P 1 ;2;3 ðÞ /C0 Mol % P 2 ðÞ
2þMol % P 1 ;2;3 ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(6)Mol % S 1 ;3ðÞ ¼
Mol % S 1 ;2;3 ðÞ /C0 Mol % S 2 ðÞ
2þMol % S 1 ;2;3 ðÞ
Mol % Po 1 ;3ðÞ ¼Mol % Po 1 ;2;3 ðÞ /C0 Mol % Po 2 ðÞ
2þMol % Po 1 ;2;3 ðÞ
Mol % O 1 ;3ðÞ ¼Mol % O 1 ;2;3 ðÞ /C0 Mol % O 2 ðÞ
2þMol % O 1 ;2;3 ðÞ
Mol % L 1 ;3ðÞ ¼Mol % L 1 ;2;3 ðÞ /C0Mol % L 2 ðÞ
2þMol % L 1 ;2;3 ðÞ
Mol % Ln 1 ;3ðÞ ¼Mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ /C0 Mol % Ln 2 ðÞ
2þMol % Ln 1 ;2;3 ðÞ
4.5.6. Berech nung der Triglyceride (TAG)
4.5.6.1. TAG mit einer Fettsäure (AAA, hier LLL, PoPoPo)
Mol % AAA ¼Mol % A 1 ;3ðÞ /C3 Mol % A 2 ðÞ/C3Mol % A 1 ;3ðÞ
10000(7)
4.5.6.2. TAG mit zwei Fettsäuren (AAB, hier PoPoL, PoLL)
Mol % AAB ¼Mol % A 1 ;3ðÞ /C3 Mol % A 2 ðÞ/C3Mol % B 1 ;3ðÞ /C3 2
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(8)
Mol % ABA ¼
Mol % A 1 ;3ðÞ /C3 Mol % B 2 ðÞ/C3Mol % A 1 ;3ðÞ
100001991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 93
▼M13
4.5.6.3. TAG mit drei verschiedenen Fettsäuren (ABC, hier OLLn, PLLn,
PoOLn,PPoLn)
Mol % ABC ¼Mol % A 1 ;3ðÞ /C3 Mol % B 2 ðÞ/C3Mol % C 1 ;3ðÞ /C3 2
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(9) Mol % BCA ¼
Mol % B 1 ;3ðÞ /C3 Mol % C 2 ðÞ/C3Mol % A 1 ;3ðÞ /C3 2
10000
Mol % CAB ¼Mol % C 1 ;3ðÞ /C3 Mol % A 2 ðÞ/C3Mol % B 1 ;3ðÞ /C3 2
10000
4.5.6.4. ECN42-haltigeTriglyce ride
Die folgenden Triglyceride mit ECN42 werden nach den Formeln 7, 8
und 9 in der Reihenfolge der bei der HPLC erwarteten Elution (norma-
lerweise nur drei Peaks) berechnet.
LLLPoLL und das Positionsisomer LPoLOLLn und diePositionsisome reOLnL und LnOLPoPoL und das Positionsisomer PoLPoPoOLn und diePositionsisome reOPoLn und OLnPoPLLn und diePositionsisome reLLnP und LnPLPoPoPoSLnLn und das Positionsisomer LnSLnPPoLn und diePositionsisome rePLnPo und PoPLnDie Triglyceride mit ECN42 ergeben sich aus der Summe der neun
Triacylglyceride einschließlich ihrer Positionsisomere. Die Ergebnisse
sind auf mindestens zwei Stellen nach dem Komma anzugeben.
5.Auswertung der Ergebnisse
Der rechnerisch bestimmte theoretische Gehalt und der durch die
HPLC-Analyse bestimmte Gehalt werden verglichen. Liegt die Diffe-
renz zwischen HPLC-Daten und theoretischen Daten über den in der
Verordnung für die jeweilige Ölkategorie angegebenen Werten, so
enthält die Probe Saatöl.
Anmerkung: Die Ergebnisse sind auf eine Stelle nach dem Komma
anzugeben.
6.Beispiel (Die Zahlen beziehen sich auf die betreffenden Textabschnitte
des Verfahrens)
4.5.1. Berech nung der Molprozente der Fettsäuren aus den GLC-
Daten (Flächenprozente)
Die Gaschromatographie ergibt folgende Fettsäurezusammensetzung:
FS
MGP
256,4S
284,5Po
254,4O
282,5L
280,4Ln
278,4
% Fläche10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
4.5.3. Umrech nung der prozentualen Fläche in Mol für alle Fett-
säuren
Mol P ¼10
256 ;4¼0;03900 Mol P Vgl. Formel (1)
Mol S ¼3
284 ;5¼0;01054 Mol S Vgl. Formel (1)1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 94
▼M13
Mol Po ¼1
254 ;4¼0;00393 Mol Po Vgl. Formel (1)
Mol O ¼75
282 ;5¼0;26549 Mol O Vgl. Formel (1)
Mol L ¼10
280 ;4¼0;03566 Mol L Vgl. Formel (1)
Mol Ln ¼1
278 ;4¼0;003594 Mol Ln Vgl. Formel (1)
Insgesamt = 0,35822 Mol TAG
4.5.4. Normalisierung der Fettsäuren auf 100 %
Mol % P 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03900 Mol P /C3100
0;35822 Mol¼10;888 % Vgl. Formel (2)
Mol % S 1 ;2;3 ðÞ ¼0;01054 Mol S /C3100
0;35822 Mol¼2;944 % Vgl. Formel (2)
Mol % Po 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00393 Mol Po /C3100
0;35822 Mol¼1;097 % Vgl. Formel (2)
Mol % O 1 ;2;3 ðÞ ¼0;26549 Mol O /C3100
0;35822 Mol¼74;113 % Vgl. Formel (2)
Mol % L 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03566 Mol L /C3100
0;35822 Mol¼9;956 % Vgl. Formel (2)
Mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00359 Mol Ln /C3100
0;35822 Mol¼1;003 % Vgl. Formel (2)
Mol % insgesamt = 100,0 %
Summe der gesättigten und ungesättigten Fettsäuren in 1,2,3-Stellung
der TAG
Mol % SFA = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % Vgl. Formel (3)
Mol % UFA = 100,000 % − 13,831 % = 86,169 % Vgl. Formel (3)
4.5.5. Berech nung der Zusammensetzung der Fettsäuren in 2- und
1,3-Stellung der TAG
4.5.5.1. Gesättigte Fettsäuren in 2-Stellung (P(2) und S(2))
Mol % P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 % Mol Vgl. Formel (4)
Mol % S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 % Mol Vgl. Formel (4)
4.5.5.2. Ungesättigte Fettsäuren in 1,3-Stellung (Po(1,3), O(1,3), L(1,3) und
Ln(1,3))
Mol % Po 2 ðÞ ¼1;097 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;263 % Mol Vgl. Formel (5)
Mol % O 2 ðÞ ¼74;113 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 85;295 % Mol Vgl. Formel (5)
Mol % L 2 ðÞ¼9;956 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼11;458 % Mol Vgl. Formel (5)
Mol % Ln 2 ðÞ ¼1;003 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;154 % Mol Vgl. Formel (5)
4.5.5.3. Fettsäuren in 1,3-Stellung (P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) und
Ln(1,3))
Mol % P 1 ;3ðÞ ¼10;888/C00;659
210;888¼16;005 % Mol Vgl. Formel (6)1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 95
▼M13
Mol % S 1 ;3ðÞ ¼2;944/C00;177
22;944¼4;327 % Mol Vgl. Formel (6)
Mol % Po 1 ;3ðÞ ¼1;097/C01;263
21;097¼1;015 % Mol Vgl. Formel (6)
Mol % O 1 ;3ðÞ ¼74;113/C085;295
274;113¼68;522 % Mol Vgl. Formel (6)
Mol % L 1 ;3ðÞ ¼9;956/C011;458
29;956¼9;205 % Mol Vgl. Formel (6)
Mol % Ln 1 ;3ðÞ ¼1;003/C01;154
21;003¼0;927 % Mol Vgl. Formel (6)
4.5.6. Berech nung der Triglyceride (TAG)
Anhand der berechneten Zusammensetzung der Fettsäuren in sn-2- und
sn-1,3-Stellung (vgl. oben)
FS in 1,3-Stellung 2-Stellung
P 16,005 % 0,653 %
S 4,327 % 0,177 %
Po 1,015 % 1,263 %
O 68,522 % 85,295 %L 9,205 % 11,458 %Ln 0,927 % 1,154 %
Insgesamt 100,0 % 100,0 %
werden folgende Triglyceride rechnerisch bestimmt:
LLL
PoPoPoPoLL mit 1 Positionsisomer
SLnLn mit 1 Positionsisomer
PoPoL mit 1 PositionsisomerPPoLn mit 2 PositionsisomerenOLLn mit 2 Positionsisomeren
PLLn mit 2 Positionsisomeren
PoOLn mit 2 Positionsisomeren
4.5.6.1. TAG mit einer Fettsäure (LLL, PoPoPo) Vgl. Formel (7)
Mol % LLL ¼
9;205 % /C311;458 % /C39;205 %
10000= 0,09708 Mol LLL
Mol % PoPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C31;015 %
10000= 0,00013 Mol PoPoPo
4.5.6.2. TAG mit zwei Fettsäuren (PoLL, SLnLn, PoPoL) Vgl. Formel (8)
Mol % PoLL þLLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C39;205 % /C32
10000= 0,02141
Mol % LPoL ¼9;205 % /C31;263 % /C39;205 %
10000= 0,01070
0,03211 Mol PoLL
Mol % SLnLn þLnLnS ¼4;327 % /C31;154 % /C30;927 % /C32
10000= 0,000931991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 96
▼M13
Mol % LnSLn ¼0;927 % /C30;177 % /C30;927 %
10000 = 0,00002
0,00095 Mol SLnLn
Mol % PoPoL þLPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C39;205 % /C32
10000= 0,00236
Mol % PoLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C31;015 %
10000= 0,00118
0,00354 Mol PoPoL
4.5.6.3. TAG mit drei verschiedenen Fettsäuren (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn)
Vgl. Formel (9)
Mol % PPoLn ¼16;005 % /C31;263 % /C30;927 % /C32
10000= 0,00375
Mol % LnPPo ¼0;927 % /C30;653 % /C31;015 % /C32
10000= 0,00012
Mol % PoLnP ¼1;015 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10000= 0,00375
0,00762 Mol PPoLn
Mol % OLLn ¼68;522 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10000= 0,14577
Mol % LnOL ¼0;927 % /C385;295 % /C39;205 % /C32
10000= 0,14577
Mol % LLnO ¼9;205 % /C31;154 % /C368;522 % /C32
10000= 0,14577
0,43671 Mol OLLn
Mol % PLLn ¼16;005 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10000= 0,03400
Mol % LnPL ¼0;927 % /C30;653 % /C39;205 % /C32
10000= 0,00111
Mol % LLnP ¼9;205 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10000= 0,03400
0,06911 Mol PLLn
Mol % PoOLn ¼1;015 % /C385;295 % /C30;927 % /C32
10000= 0,01605
Mol % LnPoO ¼0;927 % /C31;263 % /C368;522 % /C32
10000= 0,01605
Mol % OLnPo ¼68;522 % /C31;154 % /C31;015 % /C32
10000= 0,01605
0,04815 Mol PoOLn
ECN42 = 0,69540 Mol TAG1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 97
▼M14
Abbildung 1: Graphische Darstellung von log αalsFunktion von f
(Zahl der Doppelbindungen)
Anmerkung: La = Laurinsäure; My = Myristinsäure; P = Palmitinsäure;
St = Stearinsäure; O = Ölsäure; L = Linolsäure; Ln =
Linolensäure.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 98
▼M14
Abbildung 2: Sojaöl
Abbildung 3: Sojaöl/Olivenöl 30/70
1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 99
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Abbildung 4: Olivenöl
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ANHANG XIX
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN ALIPHATISCHEN ALKOHOLEN
MIT DER KAPILLAR-GASCHROMATOGRAPHIE
1. ANWENDUNGSBEREICH
Die Methode beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammen-
setzung und des Gehalts an aliphatischen Alkoholen.
2. PRINZIP DER METHODE
Das Fett wird mit 1-Eicosanol als internem Standard versetzt, mit etha-
nolischer Kaliumhydroxidlösung verseift und das Unverseifbare mit
Ethylether extrahiert. Die Alkoholfraktion wird dünnschichtchromato-
graphisch über basische Kieselgelplatten vom Unverseifbaren
abgetrennt. Die aus dem Kieselgel isolierten Alkohole werden in Trime-
thylsilylether überführt und mit Hilfe der Kapillar-Gaschromatographie
untersucht.
3. GERÄTE
3.1. Kolben, 250 ml, mit Rückflusskühler und Schliffstopfen,3.2. 500-ml-Scheidetrichter,3.3. Kolben, 250 ml,3.4. komplette Apparatur für die Dünnschichtchromatographie mit Glas-
platten 20 × 20 cm,
3.5. UV-Lampe, Wellenlänge 366 oder 254 nm,3.6. Mikroliterspritzen, 100 und 500 µl,
3.7. Glasfiltertiegel mit Porenfilter G 3 (Porosität 15-40 µm), etwa 2 cm
Durchmesser, 5 cm Höhe, mit geeignetem Anschlussstück für die
Vakuumfiltration und Schliffmuffe12/21,
3.8. Vakuumflasche, 50 ml, mit Schliffmuffe 12/21, für Glasfiltertiegel
(3.7),
3.9. 10 ml-Röhrchen mit konischem Boden und dicht schließendem Stopfen,3.10. Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen,
mit Splitsystem, bestehend aus:
3.10.1. thermostatisierbarem Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte
Temperatur mit einer Genauigkeit von ± 1 ºC,
3.10.2. temperaturregelbarer Injektionseinrichtung mit Verdampfer aus persila-
nisiertem Glas,
3.10.3. Flammenionisations-Detektor mit Verstärker,
3.10.4. Integrator mit Schreiber, an Verstärker zu koppeln, Reaktionszeit
maximal 1 Sekunde, variabler Papiervorschub,
3.11. Kapillarsäule aus Glas oder fused silica, 20-30 m Länge, 0,25-0,32 mm
Innendurchmesser, Innenwand belegt mit SE-52 oder SE-54 oder einer
gleichwertigen stationären Phase, Schichtdicke 0,10-0,30 µm,
3.12. Mikroliterspritze für die Gaschromatographie, 10 µl, mit gehärteter
Nadel,
3.13. Präzisionswaage mit einer Empfindlichkeit von 1 mg (Anzeigegenauig-
keit 0,1 mg).
4. REAGENZIEN
4.1. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 2 N: 130 g Kaliumhydroxid
(Titer mindestens 85 %) in 200 ml destilliertem Wasser unter Kühlen
lösen und mit Ethanol auf 1 Liter auffüllen. Die Lösung ist in gut
verschlossenen braunen Glasflaschen aufzubewahren.
4.2. Ethylether, analysenrein,4.3. wasserfreies Natriumsulfat, analysenrein,4.4. kieselgelbeschichtete Glasplatten ohne Fluoreszenzindikator, Schicht-
dicke 0,25 mm (gebrauchsfertig im Handel erhältlich),1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 101
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4.5. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 0,2 N: 13 g Kaliumhydroxid in
20 ml destilliertem Wasser lösen und mit Ethanol auf 1 l auffüllen,
4.6. Benzol für die Chromatographie (siehe 5.2.2),4.7. Aceton für die Chromatographie (siehe 5.2.2),4.8. Hexan für die Chromatographie (siehe 5.2.2),4.9. Ethylether für die Chromatographie (siehe 5.2.2),4.10. Chloroform, analysenrein,4.11. Referenzlösung für die Dünnschichtchromatographie: Cholesterin oder
Phytosterole, 5%ige Lösung in Chloroform,
4.12. 2',7'-Dichlorfluorescein, 0,2%ige ethanolische Lösung, leicht alkalisch
durch Zusatz einiger Tropfen alkoholischer 2-N-Kaliumhydroxid-
Lösung,
4.13. wasserfreies Pyridin für die Chromatographie,4.14. Hexamethyldisilazan,4.15. Trimethylchlorsilan,4.16. Standardlösung der Trimethylsilylether der aliphatischen Alkohole von
C
20bis C28, unmittelbar vor Gebrauch ansetzen aus einer Mischung der
reinen Alkohole,
4.17. 1-Eicosanol, 0,1%ige Lösung (m/V) in Chloroform (interner Standard),4.18. Trägergas: Wasserstoff oder Helium, rein, für die Gaschromatographie,4.19. Hilfsgase: Stickstoff, rein, für die Gaschromatographie.
5. VERFAHREN
5.1.Herstellung des Unverseifbaren
5.1.1. Mit einer 500-Mikroliterspritze so viel von der 0,1%igen 1-Eicosanollö-
sung in Chloroform (4.17) in den 250-ml-Kolben geben, dass die
Menge an 1-Eicosanol etwa 10 % des Gehalts an aliphatischen Alko-
holen des zur Analyse verwandten aliquoten Teils der Probe
entspricht. So werden z. B. für 5 g Olivenöl 250 µl und für Oliventre-
steröl 1 500 µl der 0,1%igen 1-Eicosanollösung benötigt.
Die Probe im Stickstoffstrom bis zur Trockne eindampfen. In den
gleichen Kolben genau 5 g der trockenen und filtrierten Probe
einwiegen.
5.1.2. Die Probe bei aufgesetztem Rückflusskühler mit 50 ml 2-N-Ethanol-
Kaliumhydroxidlösung versetzen, auf dem Wasserbad erhitzen und
unter kräftigem Schütteln und schwachem Sieden verseifen (wobei die
Lösung klar wird). Die Probe weitere 20 Minuten am Sieden halten und
dann durch den Rückflusskühler mit 50 ml destilliertem Wasser
versetzen; Rückflusskühler entfernen und den Kolben auf etwa 30 ºC
abkühlen.
5.1.3. Den Kolbeninhalt quantitativ in einen 500-ml-Scheidetrichter über-
führen, wobei mehrfach mit insgesamt etwa 50 ml destilliertem
Wasser nachgespült wird. Die Probe mit etwa 80 ml Ethylether
versetzen, 30 Sekunden kräftig schütteln und absetzen lassen (Anmer-
kung 1).
Die wässrige Phase in einen anderen Scheidetrichter ablassen und dann
noch zweimal nach dem gleichen Verfahren mit jeweils 60-70 ml Ethy-
lether extrahieren.
Anmerkung 1: Etwaige Emulsionen können mit Hilfe einer Waschfla-
sche durch Zusatz kleiner Mengen Ethylalkohol oder
Methylalkohol zerstört werden.
5.1.4. Die Etherauszüge in einem Scheidetrichter vereinigen und mehrmals
mit jeweils 50 ml destilliertem Wasser waschen, bis das Waschwasser
neutral reagiert.
Das Waschwasser ablassen, die Etherphase mit wasserfreiem Natrium-
sulfat trocknen und über wasserfreiem Natriumsulfat in einen zuvor
gewogenen 250-ml-Kolben filtrieren. Scheidetrichter und Filter mit
kleinen Mengen Ethylether nachspülen.
5.1.5. Den Ether bis auf wenige Milliliter abdestillieren, den Rückstand unter
leichtem Vakuum oder im Stickstoffstrom trocknen, etwa 1/4 Stunde im1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 102
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Trockenschrank bei 100 ºC nachtrocknen, im Exsikkator abkühlen
lassen und wiegen.
5.2.Abtrennen der Alkoholfraktion
5.2.1. Herstellung der basischen Platten: Die Kieselgelplatten (4.4) vollständig
ca. 10 Sekunden lang in eine ethanolische 0,2-N-Kaliumhydroxidlösung
(4.5) eintauchen, dann unter einem Abzug 2 Stunden trocknen lassen,
anschließend noch für 1 Stunde bei 100 ºC in den Trockenschrank
gestellt.
Die Platten aus den Trockenschrank nehmen und in einem Exsikkator
über Calciumchlorid bis zum Gebrauch aufbewahren. (Derart behan-
delte Platten müssen innerhalb von 15 Tagen gebraucht werden.)
Anmerkung 2: Bei Verwendung von basischen Kieselgelplatten zur
Abtrennung der Alkoholfraktion erübrigt sich die
Behandlung des Unverseifbaren mit Aluminiumoxid.
Auf diese Weise bleiben sämtliche sauren Verbindungen
(Fettsäuren und andere) an der Startlinie. So erhält man
eine saubere Trennung der Zone der aliphatischen Alko-
hole und Terpenalkohole von den Sterinen.
5.2.2. Die Entwicklerkammer bis zu einer Höhe von etwa 1 cm mit einem
Hexan/Ethylether-Gemisch 65:35 (V/V) beschicken (*).
Die Kammer mit einem geeigneten Deckel verschließen und mindestens
eine halbe Stunde stehen lassen, damit sich ein Gleichgewicht zwischen
Flüssigkeit und Dampfphase einstellt. An der Innenwand der Kammer
können Filterpapierstreifen befestigt werden, die in das Fließmittel
eintauchen. Dadurch kann die Laufzeit um ein Drittel verkürzt und
eine gleichmäßige Elution der Komponenten erzielt werden.
Anmerkung 3: Um gut reproduzierbare Trennungen zu erzielen, ist das
Gemisch jedesmal frisch anzusetzen.
5.2.3. Von einer 5%igen Lösung des Unverseifbaren (5.1.5) in Chloroform
mit einer 100- µl-Spritze 0,3 ml als durchgehenden, gleichmäßigen
Strich 2 cm vom unteren Plattenrand entfernt auf die Dünnschichtplatte
(5.2.1) auftragen. In der Verlängerung der Startlinie werden am Rande
2-3µl der Standardlösung der aliphatischen Alkohole (4.11) aufge-
tragen, um die Alkoholzone nach der Entwicklung identifizieren zu
können.
5.2.4. Die Platte in die nach 5.2.2 vorbereitete Entwicklerkammer stellen. Die
Temperatur der Umgebung sollte 15-20 ºC betragen. Die Kammer mit
dem Deckel verschließen und die Platte so lange entwickeln, bis die
Fließmittelfront bis 1 cm unter den oberen Plattenrand gestiegen ist.
Dann die Platte aus der Entwicklerkammer nehmen und das Lösungs-
mittel in einem warmen Luftstrom abdampfen oder die Platte eine
geraume Zeit unter dem Abzug trocknen lassen.
5.2.5. Die Platte vorsichtig und gleichmäßig mit 2',7'-Dichlorfluoresceinlösung
besprühen. Die Lage der Zone der aliphatischen Alkohole mit Hilfe des
Flecks der Referenzlösung bestimmen. Die Zone der aliphatischen
Alkohole und die Zone der unmittelbar darüber liegenden Terpenalko-
hole werden mit einem schwarzen Stift umrandet.
Anmerkung 4: Da unter den Bedingungen dieses Verfahrens die
Terpenalkohole beträchtliche Mengen an aliphatischen
Alkoholen enthalten, müssen beide Zonen zusammen
erfasst werden.
5.2.6. Das in der markierten Zone liegende Kieselgel mit einem Metallspatel
abkratzen, fein mahlen und in einen Glasfiltertiegel (3.7) überführen.
Mit 10 ml warmem Chloroform versetzen, mit Hilfe des Metallspatels
gründlich vermischen und unter Vakuum filtrieren. Das Filtrat in der
an den Glasfiltertiegel angeschlossenen Vakuumflasche (3.8) auffangen.
Den Rückstand im Glasfiltertiegel dreimal mit je 10 ml Ethylether
waschen und das Filtrat wiederum in der Vakuumflasche auffangen.
Das Filtrat bis auf ein Volumen von etwa 4-5 ml eindampfen und den
Rest der Lösung in das zuvor gewogene 10-ml-Probenglas (3.9) über-
führen. Durch vorsichtiges Erhitzen unter einem schwachen
Stickstoffstrom bis zur Trockne eindampfen. Mit einigen Tropfen
Aceton versetzen, wieder bis zur Trockne eindampfen, etwa 10 Minuten1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 103
(*) Insbesondere in diesem Fall ist zur sauberen Trennung der Zonen ein Benzol/Aceton-
Gemisch 95:5 (V/V) als Elutionsmittel zu verwenden.
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im Trockenschrank auf 105 ºC erhitzen, anschließend im Exsikkator
abkühlen lassen und wiegen.
Der Rückstand in dem Probengläschen enthält die Fraktion der aliphati-
schen Alkohole.
5.3.Herstellung der Trimethylsilylether (TMSE)
5.3.1. Dem Probengläschen mit der Fraktion der aliphatischen Alkohole je
Milligramm aliphatischem Alkohol 50 µl Silanisierungsreagenz, beste-
hend aus einem Gemisch aus Pyridin, Hexamethyldisilazan und
Trimethylchlorsilan im Verhältnis 9:3:1 (V/V/V) (Anmerkung 5)
zusetzen. Dabei darf es nicht zur Aufnahme von Wasser kommen
(Anmerkung 6).
Anmerkung 5: Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich;
daneben gibt es auch andere Silanisierungsreagenzien,
wie z. B. N,O-bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 %
Trimethylchlorsilan, das mit gleichen Teilen wasser-
freiem Pyridin gemischt werden muss.
Anmerkung 6: Die Beobachtung einer leichten Opaleszenz ist normal
und bedeutet keine Störung. Die Bildung eines weißen
Niederschlags oder der Eindruck einer Rosafärbung sind
Anzeichen der Anwesenheit von Feuchtigkeit oder der
Zersetzung des Reagens. In diesem Fall ist der Test zu
wiederholen.
5.3.2. Das Probengläschen verschließen und gründlich, nicht zu stark schüt-
teln, bis sich die aliphatischen Alkohole gelöst haben. Die Probe
mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und dann
einige Minuten zentrifugieren. Die klare Lösung kann gaschromatogra-
phisch untersucht werden.
5.4.Gaschromatographische Analyse
5.4.1. Vorbereiten, Einfahren der Säule
5.4.1.1. Die Säule in den Gaschromatographen einsetzen, wobei das Einlassteil
an den mit dem Trennsystem verbundenen Injektor und das Auslassteil
an den Detektor angeschlossen wird. Überprüfung des Gaschromatogra-phen auf Dichtigkeit der Gasleitungen, Betriebsbereitschaft des
Detektors, des Trennsystems, des Schreibers usw.
5.4.1.2. Wird die Säule zum erstenmal verwendet, ist es ratsam, sie einzufahren.
Einen schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromato-
graphen einschalten und allmählich auf eine Temperatur von
mindestens 20 ºC über der Arbeitstemperatur (Anmerkung 7) aufheizen.
Diese Temperatur mindestens 2 Stunden konstant halten und dann die
Analysenbedingungen einstellen (Gasstrom, Split, Zünden der Flamme,
Schreiberanschluss, Ofentemperatur, Injektor, Detektor). Eine Empfind-
lichkeit wählen, die mindestens doppelt so groß ist wie bei der
Durchführung der Analyse. Die Grundlinie muss linear verlaufen, ohne
Peaks oder Drift. Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten
Anschluss der Säule, eine positive deutet auf mangelhaftes Einfahren
der Säule hin.
Anmerkung 7: Die Einfahrtemperatur muss in jedem Fall 20 ºC unter
der für die stationäre Phase angegebenen Maximaltem-
peratur liegen.
5.4.2. Wahl der Arbeitsbedingungen
5.4.2.1. Anhaltspunkte für die Arbeitsbedingungen:
— Säulentemperatur: anfangs isotherm 8 Minuten bei 180 ºC, dann
stufenweise um 5 ºC pro Minute bis auf 260 ºC ansteigend,
anschließend 15 Minuten bei 260 ºC,
— Verdampfertemperatur: 280 ºC,
— Detektortemperatur: 290 ºC
— Strömungsgeschwindigkeit des Trägergases: Helium 20-35 cm/s;
Wasserstoff 30-50 cm/s,
— Splitverhältnis: 1:50 — 1:100,
— Geräteempfindlichkeit: das 4- bis 16fache der Mindestdämpfung,
— Detektorempfindlichkeit: 1-2 mV f. s.,
— Papiervorschub: 30-60 cm/Std.
— Einspritzvolumen: 0,5-1 µl TMSE-Lösung.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 104
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Diese Bedingungen können entsprechend den Kenndaten der Säule und
des Gaschromatographen derart geändert werden, dass die damit aufge-
zeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen erfüllen:
— Die Retentionszeit des C26-Alkohols muss 18 ± 5 Minuten betragen;
— der Peak des C22-Alkohols muss bei Olivenöl 80 ± 20 % und bei
Samenölen 40 ± 20 % der gesamten Skala erreichen.
5.4.2.2. Zur Überprüfung der vorstehenden Bedingungen werden wiederholt
Proben von TMSE-Alkohol-Gemischen eingespritzt und die Arbeitsbe-
dingungen optimiert.
5.4.2.3. Die Parameter für die Peak-Integration sind so zu wählen, dass für die
in Betracht kommenden Peaks korrekte Werte erzielt werden.
5.4.3. Durchführung der Analyse
5.4.3.1. Mit der 10- µl-Mikroliterspritze 1 µl Hexan entnehmen, 0,5 µl Luft und
anschließend 0,5-1 µl Probenlösung aufziehen; dabei den Kolben der
Spritze so weit einziehen, dass die Nadel leer ist. Die Nadel in die
Membran des Injektors einführen, nach 1-2 Sekunden schnell
einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam heraus-
ziehen.
5.4.3.2. Das Chromatogramm aufzeichnen, bis alle vorhandenen aliphatischen
Alkohole eluiert sind. Die Grundlinie muss stets den vorgeschriebenen
Anforderungen (5.4.1.2) genügen.
5.4.4. Identifizierung der Peaks
Die einzelnen Peaks werden anhand der Retentionszeiten und durch
Vergleich mit dem unter denselben Bedingungen analysierten TSME-
Gemisch der aliphatischen Alkohole identifiziert.
Abbildung 1 zeigt ein Chromatogramm der Alkoholfraktion eines
nativen Olivenöls.
5.4.5. QuantitativeBe stimmung
5.4.5.1. Die Peakflächen von 1-Eicosanol und der aliphatischen Alkohole C22,
C24,C26und C28werden mit Hilfe eines Integrators ermittelt.
5.4.5.2. Der Gehalt an den einzelnen aliphatischen Alkoholen in mg/1 000 g
Fett wird nach folgender Formel berechnet:
Hierin bedeuten:
Ax = Peakfläche des Alkohols x,
As= Peakfläche von 1-Eicosanol,
ms= zugesetzte Menge 1-Eicosanol in mg,
m = Menge der für die Bestimmung entnommenen Probe in g.
6. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE
Der Gehalt an den einzelnen aliphatischen Alkoholen wird in mg/
1 000 g Fett angegeben und zum „Gesamtgehalt an aliphatischen Alko-
holen“ addiert.1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 105
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ANLAGE
Bestimmung der linearen Strömungsgeschwindigkeit
In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatographen werden 1 bis
3µl Methan (oder Propan) eingespritzt und die von dem Gas benötigte Durch-
laufzeit durch die Säule vom Zeitpunkt des Einspritzens bis zum Peak-Austritt
(tM) gemessen.
Die lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tMdefiniert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tMdie gemessene Zeit in
Sekunden.
Abbildung 1 — Chromatogramm der Alkoholfraktion eines nativen Olivenöls
1 = Eicosanol
2 = Docosanol
3 = Tricosanol
4 = Tetracosanol5 = Pentacosanol6 = Hexacosanol
7 = Heptacosanol
8 = Octacosanol1991R2568 — DE — 01.11.2003 — 020.001 — 106