1991R2568 — DE — 01.01.2015 — 027.001

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VERORDNUNG (EWG) Nr. 2568/91 DER KOMMISSION

vom 11. Juli 1991

über die Merkmale von Olivenölen und Oliventresterölen sowie die Verfahren zu ihrer Bestimmung







DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN — gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft, gestützt auf die Verordnung Nr. 136/66/EWG des Rates vom 22. September 1966 über die Errichtung einer gemeinsamen Marktorganisation für Fette ( 1 ), zuletzt geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 3577/90 ( 2 ), insbesondere auf Artikel 35a, in Erwägung nachstehender Gründe: in Erwägung nachstehender Gründe: Im Anhang der Verordnung Nr. 136/66/EWG sind die Bezeichnungen und Begriffsbestimmungen für Olivenöle und Oliventresteröle zur Vermarktung im innerstaatlichen und innergemeinschaftlichen Handel sowie im Handel mit Drittländern festgelegt. Unbeschadet der bereits geltenden einschlägigen Bestimmungen müssen zur Unterscheidung der Olivenölkategorien die entsprechenden chemisch-physikalischen Merkmale sowie die organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle festgelegt werden, damit Reinheit und Qualität der betreffenden Erzeugnisse gewährleistet sind. Die Merkmale der einzelnen Olivenöle müssen gemeinschaftsweit einheitlich bestimmt werden. Daher müssen gemeinschaftliche Verfahren für die chemische Analyse und die organoleptische Prüfung festgelegt werden. Allerdings sollten während einer Übergangszeit auch andere in den Mitgliedstaaten übliche Analyseverfahren zulässig sein, wobei jedoch vorzusehen ist, daß bei abweichenden Ergebnissen die nach dem gemeinschaftlichen Verfahren erzielten Ergebnisse gelten. Die Festlegung der chemisch-physikalischen Merkmale von Olivenölen und der Analyseverfahren erfordert eine Anpassung der Zusatzvorschriften zu Kapitel 15 der Kombinierten Nomenklatur. Zur Bewertung der organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle müssen Gruppen von ausgewählten und geschulten sensorischen Prüfern gebildet werden; dafür ist eine ausreichende Zeitspanne vorzusehen. Da einige Mitgliedstaaten solche Prüfergruppen nicht ohne weiteres zusammenstellen können, muß ihnen die Möglichkeit eingeräumt werden, die in anderen Mitgliedstaaten eingesetzten Prüfergruppen zu befassen. Damit das einwandfreie Funktionieren der für die Einfuhr von Oliventresteröl geltenden Abschöpfungsregelung gewährleistet ist, muß ein einheitliches Verfahren zur Bestimmung des Ölgehalts dieser Erzeugnisse vorgesehen werden. Um Nachteile für den Handel auszuschließen, sollte Olivenöl, das vor Inkrafttreten dieser Verordnung abgefüllt wurde, während einer bestimmten Zeit noch vermarktet werden dürfen. Die Verordnung (EWG) Nr. 1058/77 der Kommission ( 3 ), zuletzt geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 1858/88 ( 4 ), ist aufzuheben. Der Verwaltungsausschuß für Fette hat nicht innerhalb der ihm von seinem Vorsitzenden gesetzten Frist Stellung genommen — HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN:







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Artikel 1

(1) Native Olivenöle im Sinne von Nummer 1 Buchstaben a) und b) des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG sind Öle, deren Merkmale mit den in Anhang I Nummern 1 und 2 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.

(2) Lampantöl im Sinne von Nummer 1 Buchstabe c) des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Öl, dessen Merkmale mit den in Anhang I Nummer 3 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.

(3) Raffiniertes Olivenöl im Sinne von Nummer 2 des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit den in Anhang I Nummer 4 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.

(4) Olivenöl, bestehend aus raffiniertem und nativem Olivenöl, im Sinne von Nummer 3 des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Öl, dessen Merkmale mit den in Anhang I Nummer 5 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.

(5) Rohes Oliventresteröl im Sinne von Nummer 4 des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit den in Anhang I Nummer 6 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.

(6) Raffiniertes Oliventresteröl im Sinne der Nummer 5 des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit den in Anhang I Nummer 7 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.

(7) Oliventresteröl im Sinne von Nummer 6 des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit den in Anhang I Nummer 8 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.

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Artikel 2

(1) Die Merkmale der Öle gemäß Anhang I dieser Verordnung werden nach folgenden Analysenverfahren bestimmt:

a) freie Fettsäuren, berechnet in Prozent Ölsäure, nach dem Verfahren des Anhangs II;

b) Peroxidzahl nach dem Verfahren des Anhangs III;

c) Wachsgehalt nach dem Verfahren des Anhangs IV;

d) Zusammensetzung und Gehalt an Sterinen und Triterpen-Dialkoholen durch Kapillar-Gaschromatographie nach dem Verfahren des Anhangs V;

e) prozentualer Anteil an 2-Glycerinmonopalmitat nach dem Verfahren des Anhangs VII;

f) spektrophotometrische Analyse nach dem Verfahren des Anhangs IX;

g) Fettsäurezusammensetzung nach dem Verfahren der Anhänge XA und XB;

h) flüchtige halogenierte Lösungsmittel nach dem Verfahren des Anhangs XI;

i) Bestimmung der organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle nach dem Verfahren des Anhangs XII;

j) Stigmasterinnachweis nach dem Verfahren des Anhangs XVII;

k) Bestimmung der Zusammensetzung der Triglyceride mit ECN42 nach dem Verfahren des Anhangs XVIII;

l) Gehalt an aliphatischen Alkoholen nach dem Verfahren des Anhangs XIX;

m) Gehalt an Wachsen, Fettsäuremethylestern und Fettsäureethylestern nach dem Verfahren des Anhangs XX.

Zum Nachweis von pflanzlichen Fremdölen in Olivenölen wird das Analyseverfahren des Anhangs XXa angewendet.

(2) Die Prüfung der organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle durch die einzelstaatlichen Behörden oder ihre Vertreter wird von durch die Mitgliedstaaten zugelassenen Prüfergruppen vorgenommen.

Die organoleptischen Merkmale eines in Unterabsatz 1 genannten Olivenöls werden als mit der deklarierten Olivenölkategorie übereinstimmend angesehen, wenn eine von dem betreffenden Mitgliedstaat zugelassene Prüfergruppe die diesbezügliche Einstufung bestätigt.

Bestätigt die zugelassene Prüfergruppe die organoleptischen Merkmale der deklarierten Olivenölkategorie nicht, so fordern die einzelstaatlichen Behörden oder ihre Vertreter auf Antrag des Betroffenen zwei Gegenanalysen anderer zugelassener Prüfergruppen an, von denen mindestens eine von einer Prüfergruppe vorgenommen wird, die von dem betreffenden Erzeugermitgliedstaat zugelassen wurde. Die fraglichen Merkmale gelten als mit den deklarierten Merkmalen konform, wenn zwei Gegenanalysen die deklarierte Einstufung bestätigen. Im gegenteiligen Fall sind – unbeschadet der fälligen Sanktionen – die Kosten für die Gegenanalysen vom Betroffenen zu tragen.

(3) Bei der Überprüfung der Merkmale der in Absatz 1 genannten Öle durch die nationalen Behörden oder ihre Vertreter erfolgen die Probenahmen gemäß den internationalen Normen EN ISO 661 betreffend die Vorbereitung der Untersuchungsproben und EN ISO 5555 betreffend die Entnahme der Proben. Jedoch werden die Proben bei Partien, die aus Olivenöl in unmittelbaren Umschließungen bestehen, abweichend von Nummer 6.8 der Norm EN ISO 5555 gemäß den Bestimmungen von Anhang Ia dieser Verordnung entnommen. Bei unverpackten Ölen, bei denen die Probenahme nicht gemäß der Norm EN ISO 5555 durchgeführt werden kann, wird die Probe entsprechend den Anweisungen der zuständigen Behörde des Mitgliedstaats entnommen.

Unbeschadet der Bestimmungen der Norm EN ISO 5555 und des Kapitels 6 der Norm EN ISO 661 werden die Proben unverzüglich vor Licht und starker Hitze geschützt sowie spätestens am fünften Arbeitstag nach der Probenahme zur Analyse in das Laboratorium geschickt; ansonsten werden die Proben so aufbewahrt, dass sie während des Transports oder während der Lagerung vor dem Versand an das Laboratorium nicht verderben oder beschädigt werden.

(4) Bei der Überprüfung gemäß Absatz 3 erfolgen die Analysen bei verpackten Erzeugnissen gemäß den Anhängen II, III, IX, XII und XX sowie gegebenenfalls die in den einzelstaatlichen Rechtsvorschriften vorgesehenen Gegenanalysen vor Erreichen des Mindesthaltbarkeitsdatums. Bei unverpackten Ölen müssen die Proben spätestens im sechsten Monat nach der Probenahme analysiert werden.

Für die übrigen in dieser Verordnung vorgesehenen Analysen gelten keine Fristen.

Entsprechen die Analyseergebnisse nicht den Merkmalen der angemeldeten Kategorie Olivenöl bzw. Oliventresteröl, so wird der Beteiligte davon spätestens einen Monat vor Ablauf der in Unterabsatz 1 genannten Frist in Kenntnis gesetzt, es sei denn, die Probenahme ist weniger als zwei Monate vor dem Mindesthaltbarkeitsdatum erfolgt.

(5) Bei der nach einem der Verfahren in Absatz 1 Unterabsatz 1 vorgenommenen Bestimmung der Merkmale der Öle werden die Analyseergebnisse direkt mit den in dieser Verordnung vorgesehenen Grenzwerten verglichen.

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Artikel 2a

(1) Für die Zwecke dieses Artikels bedeutet „vermarktetes Olivenöl“ die Gesamtmenge an Olivenöl und Oliventresteröl eines Mitgliedstaats, die in dem Mitgliedstaat verbraucht oder aus diesem Mitgliedstaat ausgeführt wird.

(2) Die Mitgliedstaaten sorgen dafür, dass selektiv, auf der Grundlage einer Risikoanalyse und mit angemessener Häufigkeit Konformitätsprüfungen durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das vermarktete Olivenöl der angegebenen Kategorie entspricht.

(3) Die Kriterien zur Beurteilung des Risikos können Folgendes umfassen:

a) die Ölkategorie, den Erzeugungszeitraum, den Preis der Öle im Vergleich zu anderen Pflanzenölen, die Mischungs- und Verpackungsvorgänge, die Lagereinrichtungen und -bedingungen, das Ursprungsland, das Bestimmungsland, das Transportmittel oder den Umfang der Partie;

b) den Platz der Marktteilnehmer in der Vermarktungskette, Menge bzw. Wert der von ihnen vermarkteten Erzeugnisse, die Palette der von ihnen vermarkteten Ölkategorien, die Art des Unternehmens (Mühle, Lagerung, Raffination, Mischen, Verpacken oder Einzelhandelsverkauf);

c) Feststellungen bei vorangegangenen Kontrollen, einschließlich der Anzahl und Art der aufgedeckten Mängel, der marktüblichen Qualität der vermarkteten Öle, des Niveaus der verwendeten technischen Ausrüstung;

d) die Verlässlichkeit der Qualitätssicherungssysteme oder Eigenkontrollsysteme der Marktteilnehmer im Zusammenhang mit der Einhaltung der Vermarktungsnormen;

e) den Ort, an dem die Kontrolle durchgeführt wird, insbesondere, ob es sich um die Eingangszollstelle für das Gebiet der EU, die Ausgangszollstelle der EU oder den Ort handelt, an dem die Öle erzeugt, verpackt, verladen oder an den Endverbraucher verkauft werden;

f) jede andere Information, die auf ein Risiko der Nichtkonformität hinweisen könnte.

(4) Die Mitgliedstaaten legen Folgendes im Voraus fest:

a) die Kriterien für die Beurteilung des Risikos der Nichtkonformität der Partien;

b) auf der Grundlage einer Risikoanalyse für jede Risikokategorie die Mindestzahl der Marktteilnehmer oder Partien und/oder Mengen, die einer Konformitätsprüfung unterzogen werden.

Pro Jahr wird in den Mitgliedstaaten mindestens eine Konformitätsprüfung je Tausend Tonnen vermarktetes Olivenöl durchgeführt.

(5) Die Mitgliedstaaten prüfen die Konformität

a) entweder durch die Durchführung der in Anhang I aufgeführten Analysen in beliebiger Reihenfolge oder

b) nach der Reihenfolge des Anhangs Ib über den schematisierten Entscheidungsablauf, bis eine der in diesem Ablauf vorgesehenen Entscheidungen erreicht ist.

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▼M25

Artikel 3

Wird festgestellt, dass ein Olivenöl nicht der beschriebenen Kategorie entspricht, so verhängt der betreffende Mitgliedstaat unbeschadet etwaiger anderer Sanktionen wirksame, verhältnismäßige und abschreckende Maßnahmen, deren Umfang sich nach der Schwere der festgestellten Unregelmässigkeit richtet.

Lassen die Prüfungen bedeutende Unregelmäßigkeiten erkennen, so erhöhen die Mitgliedstaaten die Häufigkeit der Kontrollen in Bezug auf Vermarktungsschritt, Ölkategorie, Ursprung oder andere Kriterien.

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Artikel 4

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(1) Zur Beurteilung und Kontrolle der organoleptischen Merkmale durch die einzelstaatlichen Behörden oder ihre Vertreter können die Mitgliedstaaten Prüfergruppen zulassen.

Die Zulassungsbedingungen werden von den Mitgliedstaaten so festgelegt, dass insbesondere gewährleistet ist, dass

— die Bedingungen gemäß Anhang XII Nummer 4 erfüllt sind;

— der Leiter der Prüfergruppe in einem Institut und unter Bedingungen geschult wird, die vom Mitgliedstaat zu diesem Zweck anerkannt sind;

— die Zulassung von den Ergebnissen abhängig gemacht wird, die die Gruppe im Rahmen eines vom Mitgliedstaat jährlich festgelegten Kontrollprogramms erzielt.

Die Mitgliedstaaten teilen der Kommission die Liste der zugelassenen Prüfergruppen und die nach Maßgabe dieses Absatzes getroffenen Maßnahmen mit.

▼M5

(2) Ergeben sich in einem Mitgliedstaat Schwierigkeiten bei der Zulassung von Prüfergruppen, kann eine Prüfergruppe eingeschaltet werden, die in einem anderen Mitgliedstaat zugelassen ist.

(3) Jeder Mitgliedstaat erstellt ein Verzeichnis der von Organisationen des Berufsstands oder mehrerer Berufsstände unter den Bedingungen des Absatzes 1 eingeführten Prüfergruppen und achtet auf die Einhaltung dieser Bedingungen.

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Artikel 6

(1) Der Ölgehalt von Trester und anderen Rückständen der Olivenölextraktion (KN-Codes 2306 90 11 und 2306 90 19 ) wird nach dem Verfahren des Anhangs XV bestimmt.

(2) Der Ölgehalt gemäß Absatz 1 wird in Massenprozenten, bezogen auf die Trockenmasse, berechnet.

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Artikel 7

Es gelten die Gemeinschaftsvorschriften über die Anwesenheit von Kontaminanten.

Hinsichtlich des Gehalts an halogenierten Lösungsmitteln gelten für alle Kategorien von Olivenölen folgende Grenzwerte:

— Höchstgehalt an jedem festgestellten halogenierten Lösungsmittel 0,1 mg/kg

— Höchstgehalt der Summe der festgestellten halogenierten Lösungsmittel 0,2 mg/kg.

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Artikel 7a

Die natürlichen und juristischen Personen sowie die Vereinigungen von Personen, in deren Besitz sich zur Ausübung ihres Berufes oder zu gewerblichen Zwecken Olivenöl und Oliventresteröl von der Extraktion in der Mühle bis einschließlich zur Abfüllung befindet, sind verpflichtet, Ein- und Ausgangsbücher für jede Ölkategorie zu führen.

Die Mitgliedstaaten stellen sicher, dass die in Absatz 1 genannte Verpflichtung in vollem Umfang eingehalten wird.

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Artikel 8

(1) Die Mitgliedstaaten teilen der Kommission die Maßnahmen mit, die sie zur Durchführung dieser Verordnung getroffen haben. Sie unterrichten die Kommission auch über alle späteren diesbezüglichen Änderungen.

(2) Spätestens bis 31. Mai jedes Jahres übermitteln die Mitgliedstaaten der Kommission einen Bericht über die Durchführung dieser Verordnung im vorangegangenen Kalenderjahr. Der Bericht enthält mindestens die Ergebnisse der an Olivenölen durchgeführten Konformitätsprüfungen gemäß der Tabelle in Anhang XXI.

(3) Die in dieser Verordnung genannten Mitteilungen erfolgen nach der Verordnung (EG) Nr. 792/2009 der Kommission ( 5 ).

▼B

Artikel 9

Die Verordnung (EWG) Nr. 1058/77 wird aufgehoben.

Artikel 10

(1) Diese Verordnung tritt am dritten Tag nach ihrer Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften in Kraft.

Das Verfahren des Anhangs XII ist jedoch, außer wenn es sich um Interventionsmaßnahmen handelt, ab ►M1 1. November 1992 ◄ anwendbar.

▼M5

Diese Methode findet keine Anwendung auf native Olivenöle, die vor dem 1. November 1992 abgefüllt wurden.

▼B

(2) Diese Verordnung gilt nicht für Olivenöl und Oliventresteröl, das vor dem Tag des Inkrafttretens dieser Verordnung abgefüllt und bis zum 31. Oktober 1992 vermarktet wurde.

Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedem Mitgliedstaat.









ANHÄNGE

Inhalt







Anhang I: Merkmale von Olivenölen Anhang Ia: Probenahme bei olivenöl oder oliventresteröl, das in unmittelbaren verpackungseinheiten geliefert wird Anhang Ib: Schematisierter entscheidungsablauf für die prüfung der konformität einer olivenölprobe mit der deklarierten kategorie Anhang II: ►M21 Bestimmung der freien Fettsäuren, Kaltverfahren ◄ Anhang III: Bestimmung der Peroxidzahl Anhang IV: ►M6 Kapillargaschromatographische Bestimmung des Wachsgehalts ◄ Anhang V: Bestimmung der zusammensetzung und des gehalts an sterinen und triterpen-dialkoholen mit der kapillar - gaschromatographie Anhang VII: ►M21 Bestimmung des prozentualen Gehalts an 2-Glycerinmonopalmitat ◄ ▼M20 ————— ▼B Anhang IX: UV-spektrophotometrische Analyse Anhang XA: Gaschromatographische Analyse der Fettsäuremethylester Anhang XB: Vorbereitung der Fettsäuremethylester Anhang XI: Bestimmung des Gehalts an flüchtigen halogenierten Lösungsmitteln in Olivenöl Anhang XII: Verfahren des internationalen olivenölrates für die organoleptische prüfung von nativen olivenölen ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Anhang XV: Ölgehalt der Oliventrester Anhang XVI: Bestimmung der Iodzahl Anhang XVII: Bestimmung der Stigmastadiene in pflanzlichen Ölen Anhang XVIII: Bestimmung der differenz zwischen dem tatsächlichen und dem theoretischen gehalt an triglyceriden mit ECN 42 Anhang XIX: Bestimmung des Gehalts an aliphatischen Alkoholen angefügt ▼M23 Anhang XX: Verfahren für die Bestimmung des Gehalts an Wachsen, Fettsäuremethylestern und Fettsäureethylestern durch Kapillargaschromatographie ▼M26 Annex XXa: Methode zum nachweis von fremdölen in olivenölen ▼M25 Anhang XXI: Ergebnisse der durchgeführten Konformitätskontrollen von Olivenölen gemäß Artikel 8 Absatz 2

▼M26









ANHANG I

MERKMALE VON OLIVENÖLEN







Kategorie Fettsäureethylester (FAEE) mg/kg (*) Säure-gehalt (%) (*) Peroxid-zahl meq O2/kg (*) Wachse mg/kg (**) 2 Glycerin-monopalmitat (%) Stigmastadien mg/kg (1) ECN42- Differenz zwischen HPLC- Messwert und theoreti-scher Berech-nung (2) K232 (*) K268 oder K270 (*) Delta-K (*) Sensorische Prüfung Fehlermedian (Md) (*) Sensorische Prüfung Fruchtig-keitsmedian (Mf) (*) 1. Natives Olivenöl extra FAEEs ≤ 40 (Erntejahr 2013-2014) (3) FAEEs ≤ 35 (Erntejahr 2014-2015) FAEEs ≤ 30 (Erntejahre nach 2015) ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitin-säure ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 wenn Gesamtgehalt an Palmitin-säure > 14 % 2. Natives Olivenöl — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitin-säure ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 wenn Gesamtgehalt an Palmitin-säure > 14 % 3. Lampantöl — > 2,0 — (4) ≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitin-säure ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Md > 3,5 (5) — ≤ 1,1 wenn Gesamtgehalt an Palmitin-säure > 14 % 4. Raffiniertes Olivenöl — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitin-säure ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 wenn Gesamtgehalt an Palmitin-säure > 14 % 5. Olivenöl - bestehend aus raffinierten und nativen Olivenölen — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitin-säure ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 wenn Gesamtgehalt an Palmitin-säure > 14 % 6. Rohes Oliventresteröl — — — (6) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Raffiniertes Oliventresteröl — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Oliven-tresteröl — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Summe der mittels Kapillarsäule (nicht) abtrennbaren Isomere. (2) Das Olivenöl muss dem Verfahren des Anhangs XXa entsprechen. (3) Dieser Grenzwert gilt für ab dem 1. März 2014 erzeugte Olivenöle. (4) Öl mit einem Wachsgehalt zwischen 300 mg/kg und 350 mg/kg wird als Lampantöl eingestuft, wenn der Gesamtgehalt an aliphatischen Alkoholen höchstens 350 mg/kg oder der Gehalt an Erytrodiol und Uvaol höchstens 3,5 % beträgt. (5) Oder wenn der Fehlermedian größer als 3,5 ist oder der Fehlermedian höchstens 3,5 beträgt und der Fruchtigkeitsmedian gleich 0 ist. (6) Öl mit einem Wachsgehalt zwischen 300 mg/kg und 350 mg/kg wird als rohes Oliventresteröl eingestuft, wenn der Gesamtgehalt an aliphatischen Alkoholen höchstens 350 mg/kg oder der Gehalt an Erytrodiol und Uvaol über 3,5 % beträgt.







Kategorie Zusammensetzung der Fettsäuren (1) Summe trans-isomere Ölsäure (%) Summe trans- isomere Linol und Linolensäure (%) Zusammensetzung der Sterine Sterine insges. (mg/kg) Erythrodiol und Uvaol (%) (**) Myristinsäure (%) Linolensäure (%) Arach-ninsäure (%) Eicosen-säure (%) Behen-säure (%) Ligno-cerinsäure (%) Choleste-rin (%) Brassi-casterin (%) Campesterin (2) (%) Stigmasterin (%) App. β–Sitosterin (%) (3) Delta-7-Stigmastenol (2) (%) 1. Natives Olivenöl extra ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Natives Olivenöl ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Lampant-öl ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Raffinier-tes Olivenöl ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Olivenöl – bestehend aus raffinierten und nativen Olivenölen ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Rohes Oliven-tresteröl ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Raffinier-tes Oliven-tresteröl ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Oliven-tresteröl ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Gehalt an anderen Fettsäuren (%):Palmitinsäure: 7,50-20,00; Palmitoleinäure: 0,30-3,50; Heptadecansäure: ≤ 0,30; Heptadecensäure: ≤ 0,30; Stearinsäure: 0,50-5,00; Ölsäure: 55,00-83,00; Linolsäure: 3,50-21,00. (2) Siehe die Anlage zu diesem Anhang. (3) App β-Sitosterin: Delta-5,23-Stigmastadienol+Clerosterin+Beta-Sitosterin+Sitostanol+Delta-5-Avenasterin+Delta-5,24-Stigmastadienol. (4) Öl mit einem Wachsgehalt zwischen 300 mg/kg und 350 mg/kg wird als Lampantöl eingestuft, wenn der Gesamtgehalt an aliphatischen Alkoholen höchstens 350 mg/kg oder der Gehalt an Erytrodiol und Uvaol höchstens 3,5 % beträgt (5) Öl mit einem Wachsgehalt zwischen 300 mg/kg und 350 mg/kg wird als rohes Oliventresteröl eingestuft, wenn der Gesamtgehalt an aliphatischen Alkoholen über 350 mg/kg oder der Gehalt an Erytrodiol und Uvaol über 3,5 % beträgt.

Anmerkungen:

a) Die Analyseergebnisse müssen bis auf die gleiche Anzahl Dezimalstellen angegeben werden wie die für jedes Merkmal vorgesehenen Werte. Beträgt die nächstfolgende Dezimalstelle über 4, so ist die angegebene letzte Stelle hinter dem Komma aufzurunden.

b) Auch wenn nur ein einziges Merkmal nicht mit dem vorgesehenen Grenzwert übereinstimmt, muss das Öl einer anderen Kategorie zugeordnet werden oder als nicht seinen Reinheitskriterien entsprechend erklärt werden.

c) Die mit einem Sternchen (*) gekennzeichneten Ölqualitätsmerkmale bedeuten: - im Falle von Lampantöl, dass die betreffenden Grenzwerte nicht alle gleichzeitig erfüllt werden müssen; - im Falle nativer Olivenöle, dass die Nichterfüllung des Grenzwerts auch nur eines einzigen Merkmals eine Umstufung innerhalb der Kategorie der nativen Olivenöle zur Folge hat.

d) Die mit zwei Sternchen (**) gekennzeichneten Ölqualitätsmerkmale bedeuten im Fall der betreffenden Oliventresteröle, dass die jeweiligen Grenzwerte nicht alle gleichzeitig erfüllt werden müssen.









Anlage

Schematisierter entscheidungsablauf

Entscheidungsablauf Campesterin für native Olivenöle und native Olivenöle extra:

Die übrigen Parameter müssen die in dieser Verordnung festgelegten Grenzwerte einhalten.

Entscheidungsablauf Delta-7-stigmastenol für:

— Native Olivenöle extra und native Olivenöle —

Die übrigen Parameter müssen die in dieser Verordnung festgelegten Grenzwerte einhalten.

— Oliventresteröle (roh und raffiniert) —









ANHANG Ia

PROBENAHME BEI OLIVENÖL ODER OLIVENTRESTERÖL, DAS IN UNMITTELBAREN VERPACKUNGSEINHEITEN GELIEFERT WIRD

Diese Methode der Probenahme wird für Partien von Olivenöl oder Oliventresteröl angewendet, das in unmittelbare Verpackungseinheiten abgefüllt wurde. Je nachdem, ob der Inhalt der unmittelbaren Verpackung größer ist als 5 l oder nicht, kommen unterschiedliche Probenahmeverfahren zur Anwendung.

Eine „Partie“ besteht aus mehreren Verkaufseinheiten, die unter solchen Umständen hergestellt und aufgemacht wurden, dass das in jeder dieser Einheiten enthaltene Öl in Bezug auf alle analytischen Eigenschaften als homogen gilt. Die Vereinzelung einer Partie muss gemäß der Richtlinie 2011/91/EU des Europäischen Parlaments und des Rates ( 6 ) erfolgen.

„Teilprobe“ ist die Ölmenge, die in einer unmittelbaren Verpackungseinheit enthalten ist und von einer beliebigen Stelle der Partie entnommen wird.

1. ZUSAMMENSETZUNG EINER EINZELPROBE

1.1. Unmittelbare Verpackungseinheiten mit einem Inhalt von höchstens 5 l

Eine „Einzelprobe“ für unmittelbare Verpackungseinheiten mit einem Inhalt von höchstens 5 l ist die Anzahl der einer Partie entnommenen Teilproben gemäß Tabelle 1.







Tabelle 1 Die Mindestgröße einer Einzelprobe muss sich wie folgt zusammensetzen Verpackungseinheiten mit einem Inhalt von Die Einzelprobe besteht aus dem Öl von a) mindestens 1 l a) 1 unmittelbaren Verpackungseinheit; b) weniger als 1 l b) der Mindestanzahl Verpackungseinheiten, deren Gesamtinhalt mindestens 1,0 l beträgt

Die Anzahl der in Tabelle 1 genannten Verpackungseinheiten, die eine Einzelprobe darstellen, kann von jedem Mitgliedstaat nach seinen eigenen Erfordernissen erhöht werden (beispielsweise Durchführung der organoleptischen Prüfung durch ein anderes Labor als das Labor, das die chemischen Analysen, Gegenanalysen usw. durchgeführt hat).

1.2. Unmittelbare Verpackungseinheiten mit einem Inhalt von mehr als 5 l

Eine „Einzelprobe“ für unmittelbare Verpackungseinheiten mit einem Inhalt von mehr als 5 l ist ein repräsentativer Teil der Gesamtteilproben, der durch ein Reduktionsverfahren gemäß Tabelle 2 gewonnen wird. Die Einzelprobe muss sich aus verschiedenen Mustern zusammensetzen.

Ein „Muster“ einer Einzelprobe ist jede der Verpackungseinheiten, aus denen die Einzelprobe besteht.







Tabelle 2 Mindestanzahl der auszuwählenden Teilproben Anzahl der Verpackungseinheiten im Los Mindestanzahl der auszuwählenden Teilproben bis 10 1 von … 11 bis 150 2 von … 151 bis 500 3 von … 501 bis 1 500 4 von … 1 501 bis 2 500 5 > 2 500 je 1 000 Verpackungseinheiten 1 weitere Teilprobe

Um den Umfang der unmittelbaren Verpackungseinheiten für die Probenahme zu reduzieren, wird der Inhalt der Probenahmeteilproben zur Herstellung der Einzelprobe homogenisiert. Die Portionen der verschiedenen Teilproben werden unter Rühren so in einen gemeinsamen Behälter zur Homogenisierung gegeben, dass sie am besten vor Luft geschützt sind.

Der Inhalt der Einzelprobe ist in mehrere Verpackungen der Mindestkapazität von 1,0 l zu geben, von denen jede ein Muster der Einzelprobe darstellt.

Die Anzahl der Einzelproben kann von jedem Mitgliedstaat nach seinen eigenen Erfordernissen erhöht werden (beispielsweise Durchführung der organoleptischen Prüfung durch ein anderes Labor als das Labor, das die chemischen Analysen, Gegenanalysen usw. durchgeführt hat).

Jede Verpackung ist so zu befüllen, dass oben eine möglichst geringe Luftschicht vorhanden ist, und danach auf geeignete Weise zu verschließen und zu versiegeln, so dass das Produkt manipulationssicher ist.

Diese Muster sind zu kennzeichnen, so dass eine korrekte Identifizierung ermöglicht wird.

2. ANALYSEN UND ERGEBNISSE

2.1. Jede Einzelprobe wird gemäß Nummer 2.5 der Norm EN ISO 5555 in Laborproben unterteilt, die entsprechend der im schematisierten Entscheidungsablauf des Anhangs Ib ausgewiesenen Reihenfolge oder in einer anderen beliebigen Reihenfolge analysiert werden.

2.2. Stimmen alle Analyseergebnisse mit den Merkmalen der gemeldeten Olivenölkategorie überein, so wird die gesamte Partie als konform eingestuft. Stimmt ein einziges Analyseergebnis nicht mit den Merkmalen der gemeldeten Olivenölkategorie überein, so wird die gesamte Partie als nicht konform eingestuft.

3. ÜBERPRÜFUNG DER KATEGORIE DER PARTIE

3.1. Zur Überprüfung der Kategorie der Partie kann die zuständige Behörde die Anzahl der an verschiedenen Stellen der Partie entnommenen Einzelproben nach folgender Tabelle erhöhen:



Tabelle 3 Anzahl der Einzelproben in Abhängigkeit von der Partiegröße Größe der Partie (l) Anzahl der Einzelproben weniger als 7 500 2 von 7 500 bis weniger als 25 000 3 von 25 000 bis weniger als 75 000 4 von 75 000 bis weniger als 125 000 5 ab 125 000 6 + 1 je weitere 50 000 l Jede Teilprobe, die eine Einzelprobe darstellt, ist einer fortlaufenden Stelle in der Partie zu entnehmen; dabei ist der Ort jeder Einzelprobe zu notieren und eindeutig auszuweisen. Jede Einzelprobe ist nach den Verfahren unter den Nummern 1.1 und 1.2 herzustellen. Jede Einzelprobe wird anschließend den Analysen gemäß Artikel 2 Absatz 1 unterzogen.

3.2. Stimmen für mindestens eine Einzelprobe nicht alle Analyseergebnisse gemäß Artikel 2 Absatz 1 mit den Merkmalen der gemeldeten Olivenölkategorie überein, so wird die gesamte Partie als nicht konform eingestuft.









ANHANG Ib

SCHEMATISIERTER ENTSCHEIDUNGSABLAUF FÜR DIE PRÜFUNG DER KONFORMITÄT EINER OLIVENÖLPROBE MIT DER DEKLARIERTEN KATEGORIE

Schema 1

Schema 2

Schema 3









Anlage 1







Entsprechungen zwischen den Anhängen der vorliegenden Verordnung und den Analysen des Entscheidungsablaufs — Säuregehalt Anhang II Bestimmung des Gehalts an freien Fettsäuren, Kaltverfahren — Peroxidzahl Anhang III Bestimmung der Peroxidzahl — UV-Spektrometrie Anhang IX Spektrophotometrische Analyse — Bewertung der organoleptischen Eigenschaften Anhang XII Bewertung der organoleptischen Eigenschaften von nativem Olivenöl — Ethylester Anhang XX Verfahren für die Bestimmung des Gehalts an Wachsen, Fettsäuremethylestern und Fettsäureethylestern durch Kapillargaschromatographie — Stigmasta-3,5-dien Anhang XVII Methodik zur Bestimmung des Stigmastadiengehalts in pflanzlichen Ölen — trans-isomere Fettsäuren Anhang X A und Gaschromatographische Analyse der Fettsäuremethylester Anhang X B Herstellung der Fettsäuremethylester — Fettsäurenzusammensetzung Anhang X A und Gaschromatographische Analyse der Fettsäuremethylester Anhang X B Herstellung der Fettsäuremethylester — ΔECN42 Anhang XVIII Bestimmung der Triglycerid-Zusammensetzung mit ECN42 (Differenz zwischen dem tatsächlichen und dem theoretischen Triglycerid-Gehalt) — Zusammensetzung und Gesamtgehalt der Sterine — Erythrodiol und Uvaol Anhang V Bestimmung der Zusammensetzung und des Gehalts an Sterinen und Triterpen-Dialkoholen mit Kapillar- Gaschromatografie — Wachse Anhang IV Bestimmung des Gehalts an Wachsen mit Kapillar-Gaschromatografie — Aliphatische Alkohole Anhang XIX Bestimmung des Gehalts an aliphatischen Alkoholen mit Kapillar-Gaschromatografie — Gesättigte Fettsäuren in 2- Stellung Anhang VII Bestimmung des prozentualen Gehalts an 2-Glycerinmonopalmitat

▼B









ANHANG II

▼M21

BESTIMMUNG DER FREIEN FETTSÄUREN, KALTVERFAHREN

▼B

1. ANWENDUNGSBEREICH

Bestimmung der freien Fettsäuren in Olivenölen. Der Gehalt an freien Fettsäuren wird über den Gehalt an freien Säuren in konventioneller Weise berechnet.

1.1. Prinzip der Methode

Die Probe wird in einem geeigneten Lösungsmittelgemisch gelöst. Dann werden die vorhandenen freien Säuren mit einer ethanolischen Kaliumhydroxidlösung titriert.

1.2. Reagenzien

Alle Reagenzien müssen anerkannte Anaylsenqualität aufweisen; als Wasser ist destilliertes Wasser oder Wasser gleicher Reinheit zu verwenden.

1.2.1. Diethylether/Ethanol 95 %ig (V/V), Mischung 1:1. Vorsicht: Diethylether ist leicht brennbar und kann explosive Peroxide bilden. Es muß daher unter besonderen Vorsichtsmaßnahmen verwendet werden. Das Diethylether/Ethanol-Gemisch muß unmittelbar vor dem Gebrauch mit einer Kaliumhydroxidlösung (1.2.2) unter Zusatz von 0,3 ml Phenolphthaleinlösung (1.2.3) pro 100 ml Lösungsmittelgemisch neutralisiert werden. Anmerkung: Wenn Diethylether nicht benutzt werden kann, so kann auch eine Mischung aus Ethanol und Toluol verwandt werden. Eventuell kann auch Ethanol durch 2-Propanol ersetzt werden.

1.2.2. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung, 0,1 molar oder, falls erforderlich, 0,5 molar. Die genaue Konzentration der ethanolischen Kaliumhydroxidlösung muß bekannt sein und unmittelbar vor der Verwendung überprüft werden. Die Lösung sollte mindestens 5 Tage vorher hergestellt und in eine braune Flasche, die mit einem Gummistopfen verschlossen wird, dekantiert werden. Sie muß farblos oder nur schwach gefärbt sein. Anmerkung: Eine stabile farblose Kaliumhydroxidlösung kann wie folgt hergestellt werden: 1 000 ml Ethanol mit 8 g Kaliumhydroxid und 0,5 g Aluminiumspäne eine Stunde am Rückflußkühler kochen. Sofort destillieren. Die erforderliche Menge Kaliumhydroxid in dem destillierten Ethanol lösen und mehrere Tage stehen lassen. Die klare Lösung von dem ausgefallenen Karbonat abdekantieren. Die Lösung kann auch ohne Destillation wie folgt hergestellt werden: 1 000 ml Ethanol mit 4 ml Aluminiumbutylat mehrere Tage stehen lassen. Die überstehende Flüssigkeit abdekantieren und die erforderliche Menge Kaliumhydroxid darin lösen. Diese Lösung ist gebrauchsfertig.

1.2.3. Phenolphthalein, Lösung von 10 g/l in 95-96 %igem Ethanol oder Alkaliblau (bei sehr stark gefärbten Fetten), Lösung von 20 g/l in 95-96 %igem Ethanol.

1.3. Geräte

Übliche Laborgeräte u. a.:

1.3.1. Analysenwaage,

1.3.2. 250-ml-Erlenmeyerkolben,

1.3.3. 10-ml-Bürette mit 0,05-ml-Graduierung.

1.4. Verfahren

1.4.1. Die Bestimmung erfolgt mit der filtrierten Probe. Beträgt der Gesamtgehalt an Wasser und Verunreinigungen weniger als 1 %, so wird die Bestimmung mit der unfiltrierten Probe durchgeführt.

1.4.2. Probe Die Größe der Einwaage richtet sich nach dem zu erwartenden Gehalt an freien Fettsäuren (Angaben in der nachstehenden Tabelle).



Erwarteter Gehalt an freien Fettsäuren Einwaage (in g) Genauigkeit der Einwaage (in g) < 1 20 0,05 1—4 10 0,02 4—15 2,5 0,01 15—75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Die Probe in den Erlenmeyerkolben (1.3.2) einwiegen.

1.4.3. Durchführung der Bestimmung Die Probe (1.4.2) in 50 bis 150 ml der neutralisierten Diethylether/Ethanol-Mischung (1.2.1) lösen. Mit der 0,1 molaren Kaliumhydroxidlösung (1.2.2) (Anmerkung 2) unter Schütteln bis zum Umschlag des Indikators titrieren. (Die Rosafärbung des Phenolphthaleins muß mindestens 10 Sekunden anhalten.) Anmerkungen: 1. Die ethanolische Kaliumhydroxidlösung (1.2.2) kann durch eine wäßrige Kaliumhydroxid- oder Natriumhydroxidlösung ersetzt werden, wenn die zugeführte Wassermenge keine Phasentrennung bewirkt. 2. Werden zur Titration mehr als 10 ml der 0,1 molaren Kaliumhydroxidlösung benötigt, so ist eine 0,5 molare Lösung zu verwenden. 3. Wird die Lösung während der Titration trübe, so ist eine ausreichende Menge Lösungsmittelmischung (1.2.1) zuzufügen, bis die Lösung wieder klar ist.

1.5. Berechnung des Gehalts an freien Fettsäuren in % Ölsäure

Der Gehalt an freien Fettsäuren in Gewichtsprozent ist

Dabei sind:

▼C2

V = Verbrauch an Kaliumhydroxidlösung in ml,

▼B

c = genaue Konzentration der Kaliumhydroxidlösung in mol/l,

M = Molekulargewicht in g der Säure, die für die Berechnung zugrunde gelegt wird (= 282),

m = Probeneinwaage in g.

Als Ergebnis gilt das arithmetische Mittel ►M6 zweier Bestimmungen ◄ .









ANHANG III

BESTIMMUNG DER PEROXIDZAHL

1. ZWECK

Diese Norm beschreibt ein Verfahren für die Bestimmung der Peroxidzahl von Ölen und Fetten.

2. ANWENDUNGSBEREICH

Diese Norm gilt für tierische und pflanzliche Öle und Fette.

3. DEFINITION

Die Peroxidzahl ist die Gesamtmenge solcher Substanzen in der Probe, ausgedrückt in Milliäquivalenten aktiven Sauerstoffs pro kg, die unter den beschriebenen Arbeitsbedingungen Kaliumiodid oxidieren.

4. PRINZIP

Behandlung der in Essigsäure und Chloroform gelösten Probe mit einer Kaliumiodidlösung. Titration des freigesetzten Iods durch eine eingestellte Natriumthiosulfatlösung.

5. GERÄTE

Die Geräte müssen frei von reduzierenden oder oxidierenden Substanzen sein.

Anmerkung:

Schliffflächen nicht einfetten.

5.1. Mikrobechergläschen, 3 ml.

5.2. 250-ml-Schliffkolben mit Stopfen, die zuvor getrocknet und mit einem reinen, trockenen Inertgas (Stickstoff oder vorzugsweise Kohlendioxid) gefüllt wurden.

5.3. 25- oder 50-ml-Bürette, mit 0,1-ml-Graduierung.

6. REAGENZIEN

6.1. Chloroform, analytisch rein, durch Einleiten von reinem, trockenem Inertgas von Sauerstoff befreit.

6.2. Eisessig, analytisch rein, durch Einleiten von reinem, trockenem Inertgas von Sauerstoff befreit.

6.3. Kaliumiodid, gesättigte wäßrige Lösung, frisch zubereitet, frei von Iod und Iodaten.

6.4. Natriumthiosulfat, genau 0,01 oder 0,002 N wäßrige Lösung, unmittelbar vor der Verwendung eingestellt.

6.5. Stärkelösung, wäßrige Dispersion, von 10 g/l, aus natürlicher löslicher Stärke frisch hergestellt.

7. PROBE

Die Probe ist unter Lichtabschluß zu entnehmen und zu lagern und kühl in vollständig gefüllten Glasgefäßen, die mit Glas- oder Korkstopfen verschlossen sind, aufzubewahren.

8. VERFAHREN

Die Bestimmung soll bei diffusem Tageslicht oder künstlichem Licht durchgeführt werden. In ein Mikrobechergläschen (5.1) oder aber in einen Kolben (5.2) die Probemenge auf 0,001 g genau einwiegen, unter Berücksichtigung der erwarteten Peroxidzahl gemäß nachstehender Tabelle:







Erwartete Peroxidzahl (meq O2/kg) Probemenge (g) 0 bis 12 5,0 bis 2,0 12 bis 20 2,0 bis 1,2 20 bis 30 1,2 bis 0,8 30 bis 50 0,8 bis 0,5 50 bis 90 0,5 bis 0,3

Den Stopfen von dem Kolben (5.2) abnehmen und den Mikrobecher mit der Probemenge einführen. 10 ml Chloroform (6.1) hinzufügen. Die Probe schnell unter Rühren auflösen, 15 ml Essigsäure (6.2), dann 1 ml Kaliumiodidlösung (6.3) hinzufügen. Den Stopfen rasch einsetzen, eine Minute schütteln und genau fünf Minuten unter Lichtabschluß bei einer Temperatur von 15 bis 25 °C stehenlassen.

Etwa 75 ml destilliertes Wasser zugeben. Das freigesetzte Iod mit Natriumthiosulfatlösung (6.4) unter kräftigem Schütteln titrieren (0,002-N-Lösung für erwartete Werte unter 12 und 0,01-N-Lösung für erwartete Werte über 12). Stärkelösung (6.5) als Indikator verwenden.

Zwei Bestimmungen mit derselben Probe durchführen.

Zur gleichen Zeit einen Blindversuch durchführen. Übersteigt das Ergebnis des Blindversuchs 0,05 ml einer 0,01-N-Natriumthiosulfatlösung (6.4), so sind die unreinen Reagenzien zu ersetzen.

9. ABFASSUNG DER ERGEBNISSE

Die Peroxidzahl (P. V.), ausgedrückt in Milliäquivalenten aktiven Sauerstoffs pro kg, wird nach folgender Formel errechnet:

Dabei sind:

V = die Anzahl ml der eingestellten Natriumthiosulfatlösung (6.4), die für die Bestimmung verbraucht werden, korrigiert durch den entsprechenden Wert des Blindversuchs,

T = die genaue Normalität der Natriumthiosulfatlösung (6.4),

m = das Gewicht der Probe in g.

Als Ergebnis gilt das arithmetische Mittel der beiden so durchgeführten Bestimmungen.

▼M21









ANHANG IV

KAPILLARGASCHROMATOGRAFISCHE BESTIMMUNG DES WACHSGEHALTS

1. GEGENSTAND

Diese Arbeitsvorschrift beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des Wachsgehalts von Olivenölen. Die Wachse werden nach der Zahl der Kohlenstoffatome getrennt. Das Verfahren kann insbesondere zur Unterscheidung zwischen abgepresstem und extrahiertem Olivenöl (Oliventresteröl) verwendet werden.

2. PRINZIP

Das Fett wird mit einem geeigneten internen Standard versetzt und chromatografisch über eine Kieselgelsäule fraktioniert; die unter Versuchsbedingungen zuerst eluierte Fraktion (schwächerer Polarität als Triglyceride) wird gesammelt und sofort kapillargaschromatografisch analysiert.

3. GERÄTE

3.1. Erlenmeyerkolben, 25 ml

3.2. Glassäule für Gaschromatografie, Innendurchmesser 15,0 mm, Länge 30—40 cm, mit Hahn

3.3. Gaschromatograf, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen, mit Direkteinspritzung, bestehend aus: 3.3.1. Säulenofen mit Temperaturprogrammierung 3.3.2. Kalteinspritzsystem zur Direktaufgabe der Probe auf die Säule 3.3.3. Flammenionisationsdetektor mit Verstärker 3.3.4. Integrator mit Schreiber, mit Verstärker (3.3.3) zu koppeln, Ansprechzeit max. 1 Sekunde, variabler Papiervorschub. (Es können auch Informatiksysteme verwendet werden, bei denen die GC-Daten mittels PC erfasst werden.) 3.3.5. Glaskapillarsäule oder Fused-silica-Säule, Länge 8—12 m, Innendurchmesser 0,25—0,32 mm, Innenwand belegt mit Trennflüssigkeit, gleichmäßige Schichtdicke zwischen 0,10 und 0,30 μm. (Geeignete Trennflüssigkeiten vom Typ SE 52 oder SE 54 sind im Handel erhältlich.)

3.4. Mikroliterspritze, 10 μl, zur Direkteinspritzung in die Säule, mit gehärteter Nadel

3.5. Elektrorührwerk

3.6. Rotationsverdampfer

3.7. Muffelofen

3.8. Analysenwaage mit einer Messgenauigkeit von + 0,1 mg

3.9. Übliche Laborgeräte.

4. REAGENZIEN

4.1. Kieselgel mit einer Korngröße zwischen 60 und 200 μm Das Kieselgel wird im Muffelofen vier Stunden auf eine Temperatur von 500 °C erhitzt und nach dem Abkühlen mit 2 % Wasser, bezogen auf die betreffende Menge Kieselgel, versetzt. Durch gründliches Schütteln homogenisieren. Vor Gebrauch mindestens 12 Stunden im Dunkeln aufbewahren.

4.2. n-Hexan, zur Chromatografie

4.3. Ethylether, zur Chromatografie

4.4. n-Heptan, zur Chromatografie

4.5. Standardlösung aus Laurylarachidat 0,1 % (m/V) in Hexan (interner Standard) (Es kann auch Palmitylpalmitat oder Myristylstearat verwendet werden.) 4.5.1. Sudan 1 (1-Pheny-azo-2-naphthol)

4.6. Trägergas: Wasserstoff oder Helium, rein, zur Gaschromatografie

4.7. Hilfsgase — Wasserstoff, rein, zur Gaschromatografie — Luft, rein, zur Gaschromatografie

5. VERFAHREN

5.1. Vorbereiten der Chromatografiesäule

15 g Kieselgel (4.1) werden in n-Hexan (4.2) suspendiert und in die Säule (3.2) aufgegeben. Nach der Spontansedimentation wird die Phase mit einem Elektrorührwerk (3.5) nachbehandelt, um eine möglichst homogene Chromatografieschicht zu erzielen, und zur Entfernung etwa enthaltener Verunreinigungen wird mit 30 ml n-Hexan gespült. Genau 500 mg der Probe werden mithilfe der Waage (3.8) in den 25-ml-Erlenmeyerkolben (3.1) eingewogen und entsprechend dem vermuteten Wachsgehalt mit der geeigneten Menge interner Standardlösung (4.5) versetzt. So werden z. B. bei Olivenöl 0,1 mg Laurylarachidat und bei Oliventresteröl 0,25 bis 0,5 mg zugesetzt. Die derart gewonnene Probe wird unter Verwendung von je zwei Teilen 2 ml n-Hexan (4.2) in die Chromatografiesäule überführt.

Das Lösungsmittel bis zu einem Stand von 1 mm über der oberen Absorbensgrenzfläche ablaufen lassen und dann zur Entfernung der natürlich enthaltenen n-Alkane noch mit 70 ml n-Hexan spülen. Mit der chromatografischen Elution beginnen und 180 ml des n-Hexan/Ethylether-Gemischs, Verhältnis 99:1, bei einem Durchsatz von etwa 15 Tropfen/10 Sekunden auffangen. Die Elution der Probe ist bei einer Umgebungstemperatur von 22 ± 4 °C durchzuführen.

Anmerkungen:

— Das n-Hexan/Ethylethergemisch (99:1) muss jeden Tag frisch zubereitet werden.

— Für eine visuelle Kontrolle der Elution der Wachse können der gelösten Probe 100 μl Sudan (1 % im Elutionsmittel) zugesetzt werden. Die Retentionszeit des Farbstoffs liegt zwischen derjenigen der Wachse und derjenigen der Triglyceride. Wenn die Färbung das Ende der Säule erreicht, sind daher alle Wachse eluiert und die Elution kann beendet werden.

Die derart gewonnene Fraktion wird im Rotationsverdampfer (3.6) so lange getrocknet, bis das Lösungsmittel nahezu restlos verdampft ist, wobei die letzten 2 ml im schwachen Stickstoffstrom abgeblasen werden; der Trocknungsrückstand wird mit 2—4 ml n-Heptan versetzt.

5.2. Gaschromatografische Analyse

5.2.1. Vorarbeiten

Die Säule in den Gaschromatografen (3.3) einsetzen, wobei der Säulenanfang an das On-column-System und das Säulenende an den Detektor angeschlossen wird. Sodann ist der Gaschromatograf auf Dichtigkeit der Gasleitungen, Betriebsbereitschaft des Detektors und des Schreibers usw. zu überprüfen.

Wird die Säule zum ersten Mal verwendet, wird empfohlen, sie einzufahren. Einen schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromatografen einschalten und allmählich über einen Zeitraum von etwa 4 Stunden auf eine Temperatur von 350 °C aufheizen. Die Temperatur ist mindestens 2 Stunden konstant zu halten; sodann sind die Analysebedingungen einzustellen (Gasstrom, Zünden der Flamme, Anschluss an den elektronischen Schreiber (3.3.4), Temperatur des Säulenofens, des Detektors usw.). Anschließend das Signal mit einer Empfindlichkeit aufzeichnen, die mindestens doppelt so groß ist wie bei Durchführung der Analyse. Die Grundlinie muss linear verlaufen, ohne Peaks oder Drift.

Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluss der Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule hin.

5.2.2. Wahl der Arbeitsbedingungen

Anhaltspunkte für die Arbeitsbedingungen:

— Säulentemperatur: —



20 °C/Min. 5 °C/Min. 20 °C/Min. Ausgangstemperatur 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— Detektortemperatur: 350 °C

— Einspritzvolumen: 1 μl der n-Heptanlösung (2—4 ml)

— Trägergas: Helium oder Wasserstoff mit der für das gewählte Gas optimalen linearen Strömungsgeschwindigkeit (vgl. Anlage)

— Geräteempfindlichkeit, die den nachstehenden Bedingungen genügt:

Diese Bedingungen können je nach Beschaffenheit der Säule und des Gaschromatografen abgewandelt werden, damit eine Trennung aller Wachse und eine ausreichende Auflösung der Peaks (siehe Abbildung) erzielt werden. Die Retentionszeit des internen Standards C32 muss 18 ± 3 Minuten betragen, und der größte Wachspeak muss mindestens 60 % des Vollausschlags erreichen.

Die Parameter für die Peakintegration sind so zu wählen, dass für die in Betracht kommenden Peaks korrekte Werte erzielt werden.

Anmerkung:In Anbetracht der hohen Endtemperatur ist eine positive Drift von höchstens 10 % der Skala zulässig.

5.3. Durchführung der Analyse

Mit der 10-μl-Spritze 1 μl Probelösung aufziehen und dabei den Kolben der Spritze so weit einziehen, dass die Nadel leer ist. Die Nadel in das Einspritzsystem einführen, nach 1—2 Sekunden schnell einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam herausziehen.

Das Chromatogramm aufzeichnen, bis alle vorhandenen Wachse eluiert sind.

Die Grundlinie muss stets den vorgeschriebenen Anforderungen genügen.

5.4. Identifizierung der Peaks

Die Peaks werden anhand der Retentionszeiten durch Vergleich mit Wachsgemischen identifiziert, deren Retentionszeiten bekannt sind und die unter denselben Bedingungen analysiert wurden.

Die Abbildung zeigt ein Chromatogramm der Wachsfraktion eines nativen Olivenöls.

5.5. Quantitative Bestimmung

Die Peakflächen des internen Standards und der aliphatischen C40- bis C46-Ester werden mithilfe eines Integrators ermittelt.

Der Wachsgehalt jedes einzelnen Esters in mg/kg Fett wird nach folgender Formel berechnet:

Dabei ist:

Ax = jeweilige Ester-Peakfläche, in mm2

As = die Peakfläche des internen Standards, in mm2

ms = das Gewicht des zugegebenen internen Standards, in mg

m = Masse der zur Bestimmung entnommenen Probe in g.

6. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

Die Summe der Gehalte an den einzelnen Wachsen von C40 bis C46 wird in mg/kg Fett (ppm) angegeben.

AnmerkungDie mengenmäßig zu bestimmenden Bestandteile sind an den Peaks der Ester mit gerader Kohlenstoffzahl von C40 bis C46 abzulesen, wie als Beispiel im nachstehenden Chromatogramm der Wachse von Olivenöl dargestellt. Wenn der C46-Ester doppelt erscheint, ist zur Identifizierung die Wachsfraktion eines Oliventresteröls zu analysieren, bei dem der C46-Peak deutlich überwiegt und daher leicht zu erkennen ist.

Die Ergebnisse werden mit einer Dezimalstelle angegeben.

Abbildung

Chromatogramm der Wachsfraktion eines Olivenöls ( 7 )

Erläuterung:

I.S. = Laurylarachidat

1. = Diterpenester

2 + 2′ = C40-Ester

3 + 3′ = C42-Ester

4 + 4′ = C44-Ester

5. = C46-Ester

6. = Sterolester und Triterpenalkohole.









Anlage

Bestimmung der linearen Strömungsgeschwindigkeit

In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatografen werden 1—3 μl Methan (oder Propan) eingespritzt, und die Säulendurchlaufzeit des Gases wird vom Zeitpunkt des Einspritzens bis zum Peak-Austritt (tM) gemessen.

Die lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tM definiert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tM die gemessene Zeit in Sekunden.

▼M26









ANHANG V

BESTIMMUNG DER ZUSAMMENSETZUNG UND DES GEHALTS AN STERINEN UND TRITERPEN-DIALKOHOLEN MIT DER KAPILLAR - GASCHROMATOGRAPHIE

1. UMFANG UND ANWENDUNGSBEREICH

Diese Methode beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Sterinzusammensetzung und des Steringehalts sowie des Gehalts an Triterpen-Dialkoholen von Olivenölen und Oliventresterölen.

2. KURZBESCHREIBUNG

Das Öl wird mit α-Cholestanol als innerem Standard versetzt, mit ethanolischer Kaliumhydroxidlösung verseift und das Unverseifbare mit Ethylether extrahiert.

Die Sterin- und Triterpen-Dialkohol-Fraktion wird dünnschichtchromatographisch über basische Kieselgelplatten vom Unverseifbaren abgetrennt. Die aus dem Kieselgel isolierten Fraktionen werden in Trimethylsilylether überführt und anschließend mit Hilfe der Kapillar-Gaschromatographie untersucht.

3. GERÄTE UND HILFSMITTEL

Übliche Laboreinrichtung und insbesondere nachstehende Geräte:

3.1. Kolben, 250 ml, mit Rückflusskühler und Schliffstopfen,

3.2. Scheidetrichter, 500 ml,

3.3. Kolben, 250 ml,

3.4. komplette Apparatur für die Dünnschichtchromatographie mit Glasplatten 20 × 20 cm,

3.5. UV-Lampe, Wellenlänge 254 oder 366 nm,

3.6. Mikroliterspritzen, 100 und 500 μl,

3.7. Glasfiltertiegel mit Porenfilter G 3 (Porosität 15-40 μm), etwa 2 cm Durchmesser, 5 cm Höhe, geeignet für die Vakuumfiltration mit Schliffmuffe,

3.8. Vakuumflasche, 50 ml, mit Schliffmuffe, für Glasfiltertiegel (Nummer 3.7),

3.9. 10-ml-Röhrchen mit konischem Boden und dicht schließendem Glasstopfen,

3.10. Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen, mit Splitsystem, bestehend aus: 3.10.1. einem thermostatisierbaren Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte Temperatur mit einer Genauigkeit von ± 1 °C, 3.10.2. einem temperaturregelbaren Injektor mit Verdampfer aus persilanisiertem Glas und Splitsystem, 3.10.3. einem Flammenionisations-Detektor (FID), 3.10.4. einem Datenerfassungssystem, geeignet zur Verwendung mit dem FID (Nummer 3.10.3), manuell integrierbar,

3.11. Glaskapillarsäule oder Fused-silica-Säule, 20 bis 30 m Länge, 0,25 bis 0,32 mm Innendurchmesser, Innenwand belegt mit 5 % Diphenyl- / 95 % Dimethylpolysiloxan (SE-52 oder SE-54 stationäre Phase oder gleichwertig), gleichmäßige Schichtdicke zwischen 0,10 und 0,30 μm,

3.12. Mikroliterspritze für die Gaschromatographie, 10 μl, mit gehärteter Nadel, geeignet für Split-Injektion,

3.13. Calciumdichlorid-Exsikkator.

4. REAGENZIEN

4.1. Kaliumhydroxid (Titer mindestens 85 %),

4.2. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung etwa 2 N: 130 g Kaliumhydroxid (Nummer 4.1) in 200 ml destilliertem Wasser unter Kühlen lösen und mit Ethanol auf 1 Liter auffüllen (Nummer 4.10). Die Lösung ist in gut verschlossenen Braunglasflaschen maximal zwei Tage haltbar,

4.3. Ethylether, analysenrein,

4.4. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung etwa 0,2 N: 13 g Kaliumhydroxid (Nummer 4.1) werden in 20 ml destilliertem Wasser gelöst und mit Ethanol auf 1 Liter aufgefüllt (Nummer 4.10),

4.5. wasserfreies Natriumsulfat, analysenrein,

4.6. kieselgelbeschichtete Glasplatten (20 x 20 cm) ohne Fluoreszenzindikator, Schichtdicke 0,25 mm (gebrauchsfertig im Handel erhältlich),

4.7. Toluol für die Chromatographie,

4.8. Aceton für die Chromatographie,

4.9. n-Hexan für die Chromatographie,

4.10. Ethylether für die Chromatographie,

4.11. Ethanol, analyserein,

4.12. Ethylacetat, analyserein,

4.13. Referenzlösung für die Dünnschichtchromatographie: Cholesterin oder Phytosterole, und Erythrodiol-Lösung 5 % in Ethylacetat (Nummer 4.11),

4.14. 2′, 7′-Dichlorfluorescein, 0,2%ige ethanolische Lösung, leicht alkalisch durch Zusatz einiger Tropfen alkoholischer 2-N-Kaliumhydroxid- Lösung (Nummer 4.2),

4.15. wasserfreies Pyridin für die Chromatographie (Anmerkung 5).

4.16. Hexamethyldisilazan, analyserein,

4.17. Trimethylchlorosilan, analyserein,

4.18. Probelösung von Sterin-Trimethylsilylethern, unmittelbar vor Gebrauch ansetzen mit Sterinen und Erythrodiol aus Ölen, in denen sie enthalten sind,

4.19. α-Cholestanol, Reinheit mehr als 99 % (Reinheit mit GC-Analyse überprüfen),

4.20. α-Cholestanol-Lösung, interner Standard, 0,2 %ige Lösung (m/V) in Ethylacetat (Nummer 4.11).

4.21. Phenolphthalein-Lösung, 10 g/l in Ethanol (Nummer 4.10).

4.22. Trägergas: Wasserstoff oder Helium, rein, für die Gaschromatographie,

4.23. Hilfsgase: Wasserstoff, Helium, Stickstoff und Luft, rein, für die Gaschromatographie,

4.24. n-Hexan (Nummer 4.9)/Ethylether (Nummer 4.10)-Gemisch 65:35 (V/V),

4.25. Silanisierungsreagens, bestehend aus einem Gemisch aus Pyridin, Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan im Verhältnis 9:3:1 (V/V/V).

5. VERFAHREN

5.1. Herstellung des Unverseifbaren 5.1.1. Mit einer 500-μl-Mikroliterspritze (Nummer 3.6) so viel der α-Cholestanollösung (interner Standard) (Nummer 4.20) in einen 250-ml-Kolben (Nummer 3.1) geben, dass die Menge an Cholestanol etwa 10 % des Steringehalts der Probe entspricht. So werden z. B. für 5 g Olivenöl 500 μl der α-Cholestanollösung (Nummer 4.20) benötigt, für Oliventresteröl 1 500 μl. Im leichten Stickstoffstrom im warmen Wasserbad bis zur Trocknung abdampfen. Nach dem Abkühlen des Kolbens in den gleichen Kolben 5±0,01 g der trockenen und filtrierten Probe einwiegen. Anmerkung 1: Bei tierischen oder pflanzlichen Ölen und Fetten, die größere Mengen an Cholesterin enthalten, kann ein Peak mit einer ähnlichen Retentionszeit wie Cholestanol auftreten. In diesem Fall ist die Sterinfraktion einmal mit und einmal ohne internen Standard zu analysieren. 5.1.2. Die Probe bei aufgesetztem Rückflusskühler mit 50 ml 2-N-ethanolischer Kaliumhydroxidlösung (Nummer 4.2) und Bims versetzen, erhitzen und unter schwachem Sieden verseifen (wobei sich die Lösung klärt). Die Probe weitere 20 Minuten am Sieden halten und dann durch den Rückflusskühler mit 50 ml destilliertem Wasser versetzen, den Rückflusskühler entfernen und den Kolben auf etwa 30 °C abkühlen. 5.1.3. Den Kolbeninhalt quantitativ in einen 500-ml-Scheidetrichter (Nummer 3.2) überführen, wobei mehrfach mit destilliertem Wasser (50 ml) nachgespült wird. Die Probe mit etwa 80 ml Ethylether (Nummer 4.10) versetzen, etwa 60 Sekunden kräftig schütteln und den Druck durch Umdrehen des Scheidetrichters und Öffnen des Sperrhahns periodisch entlasten. Stehen lassen, bis die beiden Phasen vollständig getrennt sind (Anmerkung 2). Anschließend die Seifenlösung so vollständig wie möglich in einen anderen Scheidetrichter ablassen und dann die Wasser-Alkohol-Phase noch zweimal nach dem gleichen Verfahren mit 60-70 ml Ethylether extrahieren (Nummer 4.10). Anmerkung 2: Etwaige Emulsionen können mit Hilfe einer Waschflasche durch Zusatz kleiner Mengen Ethanol zerstört werden (Nummer 4.11). 5.1.4. Die drei Etherauszüge in einem Scheidetrichter mit 50 ml Wasser vereinigen. Weiter mit Wasser (50 ml) unter Zusatz eines Tropfens Phenolphthalein-Lösung (Nummer 4.21) waschen, bis das Waschwasser nicht mehr rosa gefärbt ist. Das Waschwasser ablassen und über wasserfreiem Natriumsulfat (Nummer 4.5) in einen zuvor gewogenen 250-ml-Kolben filtrieren. Scheidetrichter und Filter mit kleinen Mengen Ethylether nachspülen (Nummer 4.10). 5.1.5. Das Lösungsmittel durch Destillieren in einem Rotationsverdampfer bei 30 °C im Vakuum eindampfen. 5 ml Aceton hinzugeben und das flüchtige Lösungsmittel in einem leichten Luftzug vollständig entfernen. Den Rückstand bei 103 °C ± 2 °C im Trockenschrank 15 Minuten lang trocknen. Im Exsikkator abkühlen lassen und auf 0,1 mg genau wiegen.

5.2. Trennung der Sterin- und Triterpen-Dialkohol-Fraktion (Erythrodiol + Uvaol) 5.2.1. Herstellung der basischen Dünnschicht-Chromatographie-Platten Die Kieselgelplatten (Nummer 4.6) vollständig ca. 10 Sekunden lang in eine 0,2-N-ethanolische Alkalihydroxidlösung (Nummer 4.5) eintauchen, dann unter einem Abzug 2 Stunden trocknen lassen, anschließend noch 1 Stunde bei 100 °C im Trockenschrank. Die Platten aus den Trockenschrank nehmen und in einem Exsikkator über Calciumchlorid (Nummer 3.13) bis zum Gebrauch aufbewahren. (Derart behandelte Platten müssen innerhalb von 15 Tagen gebraucht werden.) Anmerkung 3: Bei Verwendung von alkalischen Kieselgelplatten zur Trennung der Sterinfraktion erübrigt sich die Behandlung der Unverseifbaren-Fraktion mit Aluminiumoxid. Auf diese Weise bleiben sämtliche sauren Verbindungen (Fettsäuren und andere) an der Startlinie. So erhält man eine saubere Trennung der Sterinzone von denen der aliphatischen Alkohole und Terpenalkohole. 5.2.2. Die Entwicklerkammer bis zu einer Höhe von etwa 1 cm mit einem Hexan/Ethylether-Gemisch (Nummer 4.24) (Anmerkung 4) beschicken. Die Kammer mit einem geeigneten Deckel verschließen und mindestens eine halbe Stunde an einem kühlen Ort stehen lassen, damit sich ein Gleichgewicht zwischen Flüssigkeit und Dampfphase einstellt. An der Innenwand der Kammer können Filterpapierstreifen befestigt werden, die in das Fließmittel eintauchen. Dadurch kann die Laufzeit um ein Drittel verkürzt und eine gleichmäßige Elution der Komponenten erzielt werden. Anmerkung 4: Das Gemisch ist jedes Mal frisch anzusetzen, damit die Wiederholbarkeit gewährleistet ist. Als alternatives Lösungsmittel kann n-Hexan/Ethylether 50:50 (V/V) verwandt werden. 5.2.3. Von einer 5%igen Lösung des Unverseifbaren (Nummer 5.1.5) in Ethylacetat mit einer 100-μl-Spritze 0,3 ml als dünnen, gleichmäßigen Strich 2 cm auf den unteren Rand (2 cm) der Dünnschichtplatte (Nummer 5.2.1) auftragen. In der Verlängerung der Startlinie werden 2-3 μl der Standardlösung (Nummer 4.13) aufgetragen, um die Sterin- und Triterpen-Dialkohol-Zone nach der Entwicklung zu identifizieren. 5.2.4. Die Platte in die nach Nummer 5.2.2 vorbereitete Entwicklerkammer stellen. Die Temperatur der Umgebung sollte 15-20 °C (Anmerkung 5) betragen. Die Kammer mit dem Deckel verschließen und die Platte so lange entwickeln, bis die Fließmittelfront bis 1 cm unter den oberen Plattenrand gestiegen ist. Dann die Platte aus der Entwicklerkammer nehmen und das Lösungsmittel in einem warmen Luftstrom abdampfen oder die Platte eine geraume Zeit unter dem Abzug liegen lassen. Anmerkung 5: Eine höhere Temperatur könnte die Separation verschlechtern. 5.2.5. Die Platte vorsichtig und gleichmäßig mit 2',7'-Dichlorfluoresceinlösung (Nummer 4.14) besprühen. Unter UV-Licht die Lage der Sterin- und Triterpen-Dialkohol-Zone mit Hilfe der Flecke der Standardlösung (Nummer 4.13) bestimmen und mit einem schwarzen Stift den fluoreszierenden Bereich markieren (siehe Dünnschichtplatte Abbildung 3). 5.2.6. Das in der markierten Zone liegende Kieselgel mit einem Metallspatel abkratzen, fein mahlen und in einen Glasfiltertiegel (Nummer 3.7) überführen. Mit 10 ml warmem Ethylacetat (Nummer 4.12) versetzen, mit Hilfe des Metallspatels gründlich vermischen und unter Vakuum filtrieren. Das Filtrat in der an dem Glasfiltertiegel angeschlossenen Vakuumflasche (Nummer 3.8) auffangen. Den Rückstand in der Flasche dreimal mit je 10 ml Ethylether (Nummer 4.3) waschen und das Filtrat wiederum in der Vakuumflasche auffangen. Das Filtrat bis auf ein Volumen von etwa 4-5 ml eindampfen und den Rest der Lösung in das zuvor gewogene 10-ml-Probenglas (Nummer 3.9) überführen. Durch vorsichtiges Erhitzen unter einem schwachen Stickstoffstrom bis zur Trocknung eindampfen. Mit einigen Tropfen Aceton (Nummer 4.8) versetzen, wieder bis zur Trocknung eindampfen. Der Rückstand in dem Probengläschen muss aus den Sterin- und Triterpen-Dialkohol-Fraktionen bestehen.

5.3. Herstellung der Trimethylsilylether (TMSE) 5.3.1. Dem Probengläschen mit der Sterin- und Terpenfraktion werden je Milligramm Sterin und Triterpen-Dialkohole 50 μl Silanisierungsreagenz (Nummer 4.25) zugesetzt, unter Ausschluss von Feuchtigkeit (Anmerkung 7). Anmerkung 6: Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich. Daneben gibt es auch andere Silanisierungsreagenzien, z. B. N,O-bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % Trimethylchlorsilan, das mit gleichen Teilen wasserfreiem Pyridin gemischt werden muss. Pyridin kann durch die gleiche Menge Acetonitril ersetzt werden. 5.3.2. Das Probengläschen verschließen und gründlich (nicht zu stark) schütteln, bis sich die Verbindungen vollständig gelöst haben. Die Probe mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und dann einige Minuten zentrifugieren. Die klare Lösung kann gaschromatographisch untersucht werden. Anmerkung 7: Die Beobachtung einer leichten Opaleszenz ist normal und bedeutet keine Anomalie. Die Bildung eines weißen Niederschlags oder der Eindruck einer Rosafärbung sind Anzeichen der Anwesenheit von Feuchtigkeit oder der Zersetzung des Reagens. In diesem Fall soll der Test wiederholt werden (nur bei Verwendung von Hexamethyldisilazan/Trimethylchlorosilan).

5.4. Gaschromatographische Analyse 5.4.1. Vorbereiten, Einfahren der Kapillarsäule 5.4.1.1. Die Säule (Nummer 3.11) in den Gaschromatographen einsetzen, wobei das Einlassteil an den Split-Injektor und das Auslassteil an den Detektor angeschlossen wird. Überprüfung des Gaschromatographen (Dichtigkeit der Gasleitungen, Betriebsbereitschaft des Detektors, des Trennsystems, des Schreibers usw.). 5.4.1.2. Wird die Säule zum ersten Mal verwendet, ist es ratsam, sie einzufahren: Einen schwachen Gasstrom durch die Säule selbst geben, den Gaschromatographen einschalten und allmählich auf eine Temperatur von mindestens 20 °C über der Arbeitstemperatur (Anmerkung 8) aufheizen. Diese Temperatur ist mindestens 2 Stunden konstant zu halten, und dann sind die Analysenbedingungen einzustellen (Gasstrom, Split, Zünden der Flamme, Rechensystemanschluss, Einstellen der Ofentemperatur, Injektor, Detektor). Dann eine Empfindlichkeit wählen, die mindestens doppelt so groß ist wie bei der Durchführung der Analyse. Die Grundlinie muss linear verlaufen, ohne Peaks oder Drift. Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluss der Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule hin. Anmerkung 8: Die Einfahrtemperatur muss in jedem Fall 20 °C unter der für die stationäre Phase angegebenen Maximaltemperatur liegen. 5.4.2. Wahl der Arbeitsbedingungen 5.4.2.1. Arbeitsbedingungen: — Säulentemperatur: 260 ± 5 °C; — Injektortemperatur: 280-300 °C; — Detektortemperatur: 280-300 °C; — Strömungsgeschwindigkeit: Helium 20–35 cm/s; Wasserstoff 30–50 cm/s; — Splitverhältnis: 1:50–1:100; — Geräteempfindlichkeit: das 4- bis 16fache der Mindestdämpfung; — Detektorempfindlichkeit: 1–2 mV f. s.; — Einspritzvolumen: 0,5-1 μl TMSE-Lösung. Diese Bedingungen können entsprechend den Charakteristiken der Säule und des Gaschromatographen derart geändert werden, dass die damit aufgezeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen erfüllen: — die Retentionszeit von ß-Sitosterin muss 20 ± 5 Minuten betragen; — der Campesterin-Peak muss bei Olivenöl (Durchschnittsgehalt 3 %) 20 ± 5 % des Skalenbereichs und bei Sojaöl (Durchschnittsgehalt 20 %) 80 ± 10 % des Skalenbereichs betragen; — alle enthaltenen Sterine müssen getrennt werden; die anderen Peaks müssen ebenfalls völlig aufgelöst sein, d. h. der Peakverlauf muss auf die Grundlinie zurückführen, bevor der nächste Peak beginnt; eine unvollständige Auflösung ist nur unter der Bedingung akzeptabel, dass der RRT-1,02-Peak (Sitostanol) mit Hilfe der Senkrechten quantitativ zu bestimmen ist. 5.4.3. Durchführung der Analyse 5.4.3.1. Mit der 10-μl-Mikroliterspritze 1 μl Hexan entnehmen, 0,5 μl Luft und anschließend 0,5–1 μl Probenlösung aufziehen; dabei den Kolben der Spritze so weit einziehen, dass die Nadel leer ist. Die Nadel in die Membran des Injektors einführen, nach 1–2 Sekunden schnell einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam herausziehen. Es kann auch ein automatischer Injektor verwendet werden. 5.4.3.2. Das Chromatogramm aufzeichnen, bis die TMSE der Triterpen-Dialkohole eluiert sind. Die Grundlinie muss stets den vorgeschriebenen Anforderungen (Nummer 5.4.1.2) genügen. 5.4.4. Identifizierung der Peaks Die einzelnen Peaks werden anhand der Retentionszeiten und durch Vergleich mit dem unter denselben Bedingungen analysierten Gemisch der Sterine und TMSE der Triterpen-Dialkohole bestimmt (siehe Anlage). Die Sterine und Triterpen-Dialkohole werden in folgender Reihenfolge eluiert: Cholesterin, Brassicasterin, Ergosterin, 24-Methylen-Cholesterin, Campesterin, Campestanol, Stigmasterin, Δ7-Campesterin, Δ5,23-Stigmastadienol, Clerosterin, ß-Sistosterin, Sitostanol, Δ5-Avenasterin, Δ5,24-Stigmastadienol, Δ7-Stigmastenol, Δ7-Avenasterin, Erythrodiol und Uvaol. In Tabelle 1 sind die Retentionszeiten relativ zu ß-Sitosterin für eine SE-52- und SE-54-Säule aufgeführt. Die Abbildungen 1 und 2 zeigen die typischen Chromatogramme einiger Öle. 5.4.5. Quantitative Bestimmung 5.4.5.1. Mit Hilfe des Rechensystems werden die Peak-Flächen von α-Cholestanol und der Sterine und Triterpen-Dialkohole berechnet. Dabei sind etwa auftretende Peaks von Verbindungen, die in Tabelle I nicht aufgeführt sind, nicht zu berücksichtigen (Ergosterin darf nicht berechnet werden). Der Responsefaktor von α-Cholestanol soll gleich 1 gesetzt werden. 5.4.5.2 Der Gehalt an den einzelnen Sterinen in mg/kg Fett wird nach folgender Formel berechnet: Darin bedeuten: Ax = Peakfläche des Sterins x in Computer-Counts, As = Peakfläche von α-Cholestanol in Computer-Counts, ms = zugesetzte Menge an α-Cholestanol in mg, m = Menge der für die Bestimmung entnommenen Probe in g.

6. ERGEBNISSE

6.1. Der Gehalt an den einzelnen Sterinen wird in mg/kg Öl angegeben, ihre Summe als „Gesamtsterine“. Die Zusammensetzung der einzelnen Sterine sowie des Erythrodiols und des Uvaols wird mit einer Dezimalstelle angegeben. Die Sterinzusammensetzung ist ohne Dezimalstelle anzugeben.

6.2. Der prozentuale Anteil jedes einzelnen Sterins errechnet sich aus dem Quotienten der Peakfläche des entsprechenden Peaks und der Summe der Peakflächen aller Sterine sowie des Erythrodiol und des Uvaols nach der Formel: Darin bedeuten: Ax = Peakfläche des Sterins x, ΣA = Summe der Peakfläche aller Sterine.

6.3. Apparentes β-Sitosterin: Δ5-23-Stigmastadienol + Clerosterin + β-Sitosterin + Sitostanol + Δ5-Avenasterin + Δ5-24-Stigmastadienol.

6.4. Der prozentuale Anteil der Erythrodiols und Uvaols errechnet sich nach der Formel: Darin bedeuten: ΣA = Gesamtfläche von Sterin in Computer-Counts; Er = Fläche des Erythrodiols in Computer-Counts; Uv = Fläche des Uvaols in Computer-Counts;









Anlage

Bestimmung der linearen Strömungsgeschwindigkeit

In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatographen werden 1 bis 3 μl Methan (oder Propan) eingespritzt und bis zum Peak-Austritt (tM) gemessen.

Die lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tM definiert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tM die gemessene Zeit in Sekunden.







Table 1 Relative Retentionszeit der Sterine Peak Identifizierung Relative Retentionszeit SE 54 SE 52 1 Cholesterin Δ-5-Cholesten-3ß-ol 0,67 0,63 2 Cholestanol 5α-Cholestan-3ß-ol 0,68 0,64 3 Brassicasterin [24S]-24-Methyl-Δ-5,22-Cholestadien-3ß-ol 0,73 0,71 * Ergosterin [24S] 24 Methy Δ5-7-22 Cholestatrien 3ß-ol 0,78 0,76 4 24-Methylen-Cholesterin 24-Methylen-Δ-5,24-Cholestadien-3ß-o1 0,82 0,80 5 Campesterin (24R)-24-Methyl-Δ-5-Cholesten-3ß-ol 0,83 0,81 6 Campestanol (24R)-24-Methyl-Cholestan-3ß-ol 0,85 0,82 7 Stigmasterin (24S)-24-Ethyl-Δ-5,22-Cholestadien-3ß-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-Campesterin (24R)-24-Methyl-Δ-7-Cholesten-3ß-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-Stigmastadienol (24R,S)-24-Ethyl-Δ-5,23-Cholestadien-3ß-ol 0,95 0,95 10 Clerosterin (24S)-24-Ethyl-Δ-5,25-Cholestadien-3ß-ol 0,96 0,96 11 ß-Sitosterin (24R)-24-Ethyl-Δ-5-Cholesten-3ß-ol 1,00 1,00 12 Sitostanol 24-Ethyl-Cholestan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-Avenasterin (24Z)-24-ethylidene-Δ-Cholesten-3ß-ol 1,03 1,03 14 Δ-5-24-Stigmastadienol (24R,S)-24-Ethyl-Δ-5,24-Cholestadien-3ß-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-Stigmastenol (24R,S)-24-Ethyl-Δ-7-Cholesten-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-Avenasterin (24Z)-24-Ethyliden-Δ-7-Cholesten-3ß-ol 1,16 1,16 17 Erythrodiol 5α Olean-12en-3ß28 diol 1,41 1,41 18 Uvaol Δ12-Ursen-3ß28 diol 1,52 1,52

Abbildung 1

Gaschromatogramm der Sterin- und Triterpen-Dialkohol-Fraktion von Lampantöl (mit dem internen Standard versetzt)

Abbildung 2

Gaschromatogramm der Sterin- und Triterpen-Dialkohol-Fraktion von raffiniertem Olivenöl (mit dem internen Standard versetzt)

Abbildung 3

Dünnschichtplatte Oliventresteröl mit dem Bereich, der zur Bestimmung der Sterine und Triterpen-Dialkohole abgekratzt werden muss

1 – Squalen

2 – Triterpen- und aliphatische Alkohole

3 – Sterine und triterpenische Dialkohole

4 – Beginn und freie Fettsäuren

▼M26 —————

▼M21









ANHANG VII

BESTIMMUNG DES PROZENTUALEN GEHALTS AN 2-GLYCERINMONOPALMITAT

1. GEGENSTAND UND ANWENDUNGSBEREICH

Diese Arbeitsvorschrift beschreibt das Analyseverfahren für die Bestimmung des prozentualen Gehalts an Palmitinsäure in 2-Stellung der Triglyceride mittels Bestimmung von 2-Glycerinmonopalmitat.

Die Methode eignet sich für bei Raumtemperatur (20 °C) flüssige pflanzliche Öle.

2. PRINZIP

Die vorbereitete Olivenölprobe wird der Wirkung der Pankreaslipase ausgesetzt. Die hierdurch bewirkte partielle und spezifische Hydrolyse an den Positionen 1 und 3 des Triglyceridmoleküls ergibt ein 2-Monoglycerid. Der prozentuale Gehalt an 2-Glycerinmonopalmitat in der Monoglyceridfraktion wird nach Silylierung durch Kapillargaschromatografie bestimmt.

3. GERÄTE UND LABORAUSSTATTUNG

3.1. Erlenmeyerkolben, 25 ml

3.2. Bechergläser, 100 ml, 250 ml und 300 ml

3.3. Glassäule für Chromatografie, 21—23 mm Innendurchmesser, 400 mm Länge, mit gläsernem Frittenboden und Hahn

3.4. Messkolben, 10, 50, 100 und 200 ml

3.5. Rundkolben, 100 ml und 250 ml

3.6. Rotationsverdampfer

3.7. Zentrifugengläser mit konischem Boden, 10 ml, mit Schliffstopfen

3.8. Zentrifuge für 10- und 100-ml-Gläser

3.9. Thermostat, einstellbar auf 40 °C mit einer Genauigkeit von ± 0,5 °C

3.10. Messpipetten, 1 ml und 2 ml

3.11. Injektionsspritze, 1 ml

3.12. Mikroliterspritze, 100 μl

3.13. Trichter, 1 000 ml

3.14. Kapillargaschromatograf mit „Cold-on-column“-Injektor zur Direkteinspritzung der Probe in die Säule und mit auf 1 °C genau einstellbarem Ofen

3.15. „Cold-on-column“-Injektor zur Direkteinspritzung der Probe in die Säule

3.16. Flammenionisationsdetektor und Elektrometer

3.17. Für das Elektrometer geeigneter Integrator mit Schreiber, Ansprechzeit max. 1 Sekunde, variabler Papiervorschub

3.18. Glaskapillarsäule oder Fused-silica-Säule, Länge 8—12 m, Innendurchmesser 0,25—0,32 mm, beschichtet mit Methylpolysiloxan oder Phenylmethylpolysiloxan 5 %, Schichtdicke 0,10—030 μm, verwendbar bis 370 °C

3.19. Mikroliterspritze, 10 μl, mit gehärteter Nadel, Länge mindestens 7,5 cm, für Direkteinspritzung.

4. REAGENZIEN

4.1. Kieselgel mit einer Korngröße zwischen 0,063 und 0,200 mm (70/280 mesh), hergestellt wie folgt: Kieselgel in eine Porzellanschale geben, im Trockenschrank 4 Stunden bei 160 °C trocknen, anschließend im Exsikkator auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Ein 5 % der Kieselgelmasse entsprechendes Volumen Wasser wie folgt zugeben: 152 g Kieselgel in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben einwiegen, 8 g destilliertes Wasser zugeben, den Kolben verschließen und leicht schütteln, bis eine gleichmäßige Verteilung des Wassers erreicht ist. Vor der Verwendung mindestens 12 Stunden ruhen lassen.

4.2. n-Hexan, zur Chromatografie

4.3. Isopropanol

4.4. Isopropanol, wässrige Lösung 1/1 (V/V)

4.5. Pankreaslipase: Die verwendete Lipase muss eine Aktivität zwischen 2,0 und 10 Lipaseeinheiten je mg haben (Pankreaslipasen mit einer Aktivität zwischen 2 und 10 Einheiten je mg Enzym sind im Handel erhältlich).

4.6. tris-Hydroxymethylaminomethan-Pufferlösung: 1 M wässrige Lösung durch Zusatz von konzentrierter HCl (1/1 V/V) auf pH 8 gebracht (durch Potenziometer überprüfen)

4.7. Natriumcholat, Enzymqualität, 0,1 %ige wässrige Lösung (diese Lösung ist innerhalb von 15 Tagen nach ihrer Herstellung zu verbrauchen)

4.8. Calciumchlorid, 22 %ige wässrige Lösung

4.9. Diethylether, zur Chromatografie

4.10. Elutionsmittel: Gemisch von n-Hexan/Diethylether (87/13) (V/V)

4.11. Natriumhydroxid, 12-Gew. %-Lösung

4.12. Phenolphthalein, 1 %ige Lösung in Ethanol

4.13. Trägergas: Wasserstoff oder Helium, zur Gaschromatografie

4.14. Hilfsgase: Wasserstoff, Reinheit mindestens 99 %, frei von Feuchtigkeit und organischen Stoffen, und Luft, gleicher Reinheitsgrad, zur Gaschromatografie

4.15. Silylierungsreagenz: Gemisch von Pyridin, Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan im Verhältnis 9/3/1 (V/V/V). (Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich. Daneben gibt es auch andere Silylierungsreagenzien, z. B. bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % Trimethylchlorsilan, das mit gleichen Teilen wasserfreiem Pyridin gemischt werden muss.)

4.16. Referenzproben: reine Monoglyceride oder Gemische von Monoglyceriden mit bekannter Zusammensetzung, die möglichst der Zusammensetzung der Probe ähnlich ist.

5. VERFAHREN

5.1. Vorbereiten der Probe

5.1.1. Öle mit einem Gehalt an freien Säuren unter 3 % brauchen vor der Säulenchromatografie mit Kieselgel nicht neutralisiert zu werden. Öle mit einem Gehalt an freien Säuren über 3 % sind gemäß Ziffer 5.1.1.1 zu neutralisieren. 5.1.1.1. 50 g Öl und 200 ml n-Hexan in den 1 000 -ml-Trichter (3.13) geben. 100 ml Isopropanol und so viel 12 %ige Natriumhydroxidlösung (4.11) hinzufügen, wie dem Gehalt des Öls an freien Fettsäuren, zuzüglich 5 %, entspricht. Eine Minute lang kräftig schütteln, 100 ml destilliertes Wasser zugeben, erneut schütteln und absetzen lassen. Nach dem Dekantieren die untere, die Seifen enthaltende Schicht sowie etwaige Zwischenschichten (Schleim, unlösliche Stoffe) entfernen. Die Hexanlösung des neutralisierten Öls mehrmals mit je 50—60 ml der Isopropanol/Wasserlösung (1/1 V/V) (4.4) waschen, bis die Rosafärbung des Phenolphthaleins verschwindet. Den größten Teil des Hexans unter Vakuum (z. B. im Rotationsverdampfer) abdestillieren. Das Öl in einen 100-ml-Rundkolben (3.5) überführen und bis zur vollständigen Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum trocknen. Nach diesem Verfahren muss der Säuregehalt des Öls unter 0,5 % liegen.

5.1.2. 1,0 g des wie beschrieben vorbereiteten Öls in einen 25-ml-Erlenmeyerkolben (3.1) geben und in 10 ml Elutionsmittel (4.10) lösen. Die Lösung vor der Kieselgelsäulenchromatografie mindestens 15 Minuten ruhen lassen. Wenn die Lösung trüb ist, sollte sie zentrifugiert werden, um optimale Chromatografiebedingungen zu schaffen. (Es können gebrauchsfertige SPE-Kartuschen (500 mg) verwendet werden).

5.1.3. Vorbereiten der Chromatografiesäule Etwa 30 ml Elutionsmittel (4.10) in die Säule (3.3) geben, einen Wattebausch mit Hilfe des Glasstabs bis auf den Grund der Säule schieben; dabei die Luft herausdrücken. In einem 100-ml-Becherglas 25 g Kieselgel (4.1) in etwa 80 ml Elutionsmittel suspendieren, dann mithilfe eines Trichters in die Säule geben. Zur restlosen Überführung des Kieselgels in die Säule ist das Becherglas mit dem Elutionsmittel (4.10) zu spülen. Hahn öffnen und soviel Elutionsmittel ablaufen lassen, bis der Elutionsmittelspiegel etwa 2 mm über dem Kieselgel liegt.

5.1.4. Säulenchromatografie In einen 25-ml-Erlenmeyerkolben (3.1) wird genau 1,0 g der gemäß Ziffer 5.1 vorbereiteten Probe eingewogen. Die Probe in 10 ml Elutionsmittel (4.10) auflösen und die Lösung in die gemäß Ziffer 5.1.3 vorbereitete Chromatografiesäule geben. Nicht umrühren. Hahn öffnen und die Probenlösung bis zur Kieselgelschicht ablaufen lassen. Mit 150 ml Elutionsmittel eluieren. Die Durchlaufgeschwindigkeit auf 2 ml/Min. einstellen (so dass 150 ml die Säule in 60 bis 70 Minuten durchströmen). Eluat in einem zuvor austarierten 250-ml-Rundkolben auffangen. Das Lösungsmittel unter Vakuum eindampfen und letzte Lösungsmittelspuren im Stickstoffstrom entfernen. Den Rundkolben wiegen und den Extrakt berechnen. (Bei Verwendung von gebrauchsfertigen Kieselgel-SPE-Kartuschen ist wie folgt vorzugehen: 1 ml der Lösung (5.1.2) in die mit 3 ml n-Hexan vorbereiteten Kartuschen geben. Nach der Perkolation der Lösung mit 4 ml h-Hexan/Diethylether 9:1 (V/V) eluieren. Das Eluat in einem 10-ml-Glas auffangen und im Stickstoffstrom bis zur Trockne eindampfen. Die Pankreaslipase (5.2) auf den Rückstand einwirken lassen. Es ist wichtig, die Fettsäurezusammensetzung vor und nach dem Durchlaufen der SPE-Kartusche zu überprüfen).

5.2. Hydrolyse durch Pankreaslipase

5.2.1. 0,1 g des gemäß Ziffer 5.1 zubereiteten Öls in ein Zentrifugenglas einwiegen. 2 ml Pufferlösung (4.6), 0,5 ml Natriumcholatlösung (4.7) und 0,2 ml Calciumchloridlösung zugeben und nach jeder Zugabe gut schütteln. Das Glas mit dem Schliffstopfen verschließen und bei 40 + 0,5 °C in den Thermostaten stellen.

5.2.2. 20 mg Lipase zugeben, vorsichtig schütteln (Befeuchten des Stopfens vermeiden) und das Glas genau 2 Minuten in den Thermostaten stellen. Herausnehmen, genau 1 Minute kräftig schütteln und abkühlen lassen.

5.2.3. 1 ml Diethylether zugeben, das Glas verschließen und kräftig schütteln, dann zentrifugieren und die Etherlösung mithilfe einer Mikroliterspritze in ein sauberes und trockenes Glas überführen.

5.3. Zubereitung der silylierten Derivate und Vorbereitung der Gaschromatografie

5.3.1. Mithilfe einer Mikroliterspritze 100 μl der Lösung (5.2.3.) in ein 10-ml-Zentrifugenglas mit konischem Boden geben.

5.3.2. Das Lösungsmittel im schwachen Stickstoffstrom austreiben, 200 μl Silylierungsreagenz (4.15) zugeben, das Glas verschließen und 20 Minuten ruhen lassen.

5.3.3. Nach 20 Minuten 1 bis 5 ml n-Hexan (je nach Chromatografiebedingungen) zugeben; die erhaltene Lösung ist bereit für die Gaschromatografie.

5.4. Gaschromatografie

Betriebsbedingungen:

— Injektortemperatur („On-column-Injektor“) unter dem Siedepunkt des Lösungsmittels (68 °C),

— Detektortemperatur: 350 °C,

— Säulentemperatur: Temperaturprogramm des Ofens: 1 Minute 60 °C, dann Erhöhung um 15 °C pro Minute bis auf 180 °C, dann um 5 °C pro Minute bis auf 340 °C, dann 13 Minuten 340 °C,

— Trägergas: Wasserstoff oder Helium, mit für die Auflösung gemäß Abbildung 1 geeigneter linearer Strömungsgeschwindigkeit. Die Retentionszeit des Triglycerids C54 muss 40 ± 5 Minuten betragen (siehe Abbildung 2). (Die hier vorgeschlagenen Arbeitsbedingungen sind Anhaltspunkte. Bei der Durchführung der Analyse sind sie so zu optimieren, dass die gewünschte Auflösung erzielt wird. Die Höhe des 2-Glycerinmonopalmitat-Peaks muss mindestens 10 % der Skala des Schreibers entsprechen.)

— Einspritzmenge: 0,5—1 μl der (5 ml) n-Hexanlösung (5.3.3).

5.4.1. Identifizierung der Peaks

Die einzelnen Monoglyceride werden auf der Grundlage der erhaltenen Retentionszeiten bestimmt, die mit den Retentionszeiten von unter den gleichen Bedingungen analysierten Standardmischungen von Monoglyceriden verglichen werden.

5.4.2. Quantitative Bestimmung

Die einzelnen Peakflächen werden mithilfe eines elektronischen Integrators berechnet.

6. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

Der prozentuale Gehalt an Glycerinmonopalmitat errechnet sich aus dem Quotienten der Peakfläche des entsprechenden Peaks und der Summe der Peakflächen aller Monoglyceride (vgl. Abbildung 2) nach folgender Formel:

Glycéryl monopalmitate (%):

(Glycéril monopalmitate = Glycerinmonopalmitat)

Dabei ist:

Ax = Peakfläche von Glycerinmonopalmitat

ΣA = Summe der Peakflächen aller Monoglyceride

Das Ergebnis wird mit einer Dezimalstelle angegeben.

7. ANALYSEBERICHT

Im Analysebericht ist Folgendes anzugeben:

— Verweis auf diese Methode,

— alle für die vollständige Identifizierung der Probe erforderlichen Angaben,

— Analyseergebnis,

— jede Abweichung von dieser Methode aufgrund einer Entscheidung der Beteiligten oder aus anderen Gründen,

— Angaben zum Labor, Analysedatum und Unterschrift der für die Analyse verantwortlichen Personen.

Abbildung 1

Chromatogramm der Produkte der Silylierungsreaktion, die durch Einwirkung der Lipase auf ein raffiniertes Olivenöl mit 20 %igem Zusatz an verestertem Öl (100 %) gewonnen wurden

Erläuterung: Acides gras libres = freie Fettsäuren; Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée = raffiniertes Olivenöl + 20 % verestertes Öl; 1-2 monopalmitoléine = 1-2 Monopalmitolein; 1-2 monopalmitine = 1-2 Monopalmitin; 1-2- monoC18 insat. = 1-2 MonoC18 unges.; Squalene = Squalen.

Abbildung 2

Chromatogramm von:

A) Olivenöl, nicht verestert; nach Lipase; nach Silylierung; unter diesen Bedingungen (Kapillarsäule 8—12 m) wird die Wachsfraktion gleichzeitig mit der Diglyceridfraktion oder kurze Zeit später eluiert. Nach der Lipase darf der Triglyceridgehalt 15 % nicht übersteigen. Erläuterung: 1 = Freie Fettsäuren 2 = Monoglyceride 3 = Diglyceride 4 = Triglyceride * = 2-Monopalmitin ** = Triglycerid C54

Chromatogramm von:

B) verestertem Öl nach Lipase; nach Silylierung; unter diesen Bedingungen (Kapillarsäule 8—12 m) wird die Wachsfraktion gleichzeitig mit der Diglyceridfraktion oder kurze Zeit später eluiert. Nach der Lipase darf der Triglyceridgehalt 15 % nicht übersteigen. Erläuterung: 1 = Freie Fettsäuren 2 = Monoglyceride 3 = Diglyceride 4 = Triglyceride * = 2-Monopalmitin ** = Triglycerid C54

8. ANMERKUNGEN

HERSTELLUNG DER LIPASE

Lipasen mit ausreichender Aktivität sind im Handel erhältlich. Sie können aber auch im Labor wie folgt hergestellt werden:

5 kg frisches Schweinepankreas auf 0 °C abkühlen. Das umhüllende feste Fett und die anhängenden Gewebe entfernen und Pankreas im Mixer zu einem flüssigen Brei zerkleinern. Diesen Brei 4 bis 6 Stunden mit 2,5 l wasserfreiem Aceton rühren, anschließend zentrifugieren. Den Rückstand noch dreimal mit dem gleichen Volumen Aceton, dann zweimal mit einer Mischung von Aceton und Diethylether 1:1 (V/V) und zweimal mit Diethylether extrahieren.

Den Rückstand 48 Stunden im Vakuum trocknen, bis ein stabiles Pulver entsteht, das vor Feuchtigkeit geschützt im Kühlschrank aufbewahrt werden sollte.

PRÜFUNG DER LIPASEAKTIVITÄT

Durch Rühren (10 Min.) eines Gemischs von 165 ml Gummiarabikumlösung (100 g/l), 15 g gemahlenem Eis und 20 ml neutralisiertem Olivenöl mit einem geeigneten Rührgerät eine Ölemulsion herstellen.

10 ml dieser Emulsion in ein 50-ml-Becherglas geben, anschließend 0,3 ml Natriumcholatlösung (0,2 g/ml) und 20 ml destilliertes Wasser hinzufügen.

Das Becherglas bei 37 °C in einen Thermostaten stellen; die Elektroden des pH-Meters und den Spiralrührer einsetzen.

Mit Hilfe einer Bürette tropfenweise 0,1 N Natriumhydroxidlösung hinzufügen bis zu einem pH-Wert von 8,3.

Eine ausreichende Menge der wässrigen Lipasesuspension (0,1 g/ml Lipase) hinzufügen. Sobald das pH-Meter 8,3 anzeigt, die Stoppuhr anstellen und Natriumhydroxidlösung so zutropfen lassen, dass der pH-Wert bei 8,3 gehalten wird. Das Volumen der pro Minute verbrauchten Lösung notieren.

Die Werte in ein Koordinatensystem eintragen, und zwar die Zeitablesungen als Abszisse und die Anzahl ml 0,1 N Alkalilösung zur Aufrechterhaltung eines konstanten pH-Werts als Ordinate. Dabei muss sich eine Gerade ergeben.

Die Lipaseaktivität, ausgedrückt als Lipaseeinheiten je mg, wird mit folgender Formel angegeben:

Dabei ist:

A die Aktivität in Lipaseeinheiten/mg

V die Anzahl der pro Minute verbrauchten Milliliter 0,1 N Natriumhydroxidlösung (berechnet aus der grafischen Darstellung)

N die Normalität der Natriumhydroxidlösung

m das Gewicht der Lipaseprobe in mg.

Die Lipaseeinheit wird als die Menge Enzym definiert, die 10 Mikroäquivalente Säure pro Minute freisetzt.

▼M20 —————

▼M25









ANHANG IX

UV-SPEKTROPHOTOMETRISCHE ANALYSE

VORWORT

Die spektrophotometrische Analyse im Ultraviolettlicht kann Angaben über die Qualität eines Fettes, seine Haltbarkeit und die infolge technologischer Verfahren eingetretenen Veränderungen erbringen.

Die Absorption bei den in dem Verfahren vorgesehenen Wellenlängen ist bedingt durch konjugierte Dien- und Trien-Systeme. Die Absorption als spezifische Extinktion E 1 % 1 cm angegeben (Extinktion einer 1%-igen Lösung des Fettes in dem vorgeschriebenen Lösungsmittel bei einer Schichtdicke von 1 cm). Sie wird üblicherweise als K bezeichnet (auch Extinktionskoeffizient genannt).

1. ANWENDUNGSBEREICH

Das Verfahren beschreibt die Durchführung der spektrophotometrischen Untersuchung von Olivenöl (wie in der Anlage beschrieben) im Ultraviolettlicht.

2. PRINZIP

Das zu untersuchende Fett wird in dem vorgeschriebenen Lösungsmittel gelöst und die Extinktion der Lösung bei den vorgeschriebenen Wellenlängen im Vergleich zum reinen Lösungsmittel bestimmt. Die spezifischen Extinktionen werden mit Hilfe der abgelesenen spektrophotometrischen Werte errechnet. Die spezifische Absorption bei 232 nm und 268 nm in Isooktan oder 232 nm und 270 nm in Cyclohexan bei einer Konzentration von 1 g/100 ml in einer 10-mm-Küvette wird errechnet.

3. GERÄTE

3.1. Spektrophotometer zur Messung der Extinktion im UV-Licht zwischen 220 und 360 nm mit der Möglichkeit, einzelne nanometrische Einheiten abzulesen. Es wird empfohlen, vor der Verwendung die Wellenlängen- und Absorptionsskalen des Spektrometers wie folgt zu überprüfen. 3.1.1. Wellenlängenskala: Zur Überprüfung der Wellenlängenskala kann ein holmiumoxidhaltiges optisches Glasfilter, welches deutlich getrennte Absorptionsbänder aufweist, als Referenzmaterial verwendet werden. Das Referenzmaterial dient der Überprüfung und Kalibrierung der Wellenlängenskala von Spektrophotometern im sichtbaren und UV-Wellenlängenbereich mit einer nominellen spektralen Bandbreite von 5 nm oder weniger. Das Holmiumglasfilter wird im Absorptionsmodus im Wellenlängenbereich von 640 bis 240 nm gegen eine Leerküvette gemessen. Für jede spektrale Bandbreite (0,10-0,25-0,50-1,00-1,50-2,00 und 3,00) wird eine Basislinienkorrektur mit einem leeren Küvettenhalter vorgenommen. Die Wellenlängen der Spektralbänder sind im Zertifikat des Referenzmaterials in ISO 3656 aufgeführt. 3.1.2. Absorptionsskala: Zur Überprüfung der Absorptionsskala kann ein Referenzmaterial verwendet werden, das aus vier Lösungen von Kaliumdichromat in Perchlorsäure in vier UV-Quarzküvetten besteht, um die Linearität und photometrische Genauigkeit im Ultraviolettlicht zu messen. Die mit Kaliumdichromat gefüllten Küvetten (40 mg/ml, 60 mg/ml, 80 mg/ml und 100 mg/ml) werden gegen eine mit Perchlorsäure gefüllte Küvette gemessen. Die Netto-Absoptionswerte sind im Zertifikat des Referenzmaterials in ISO 3656 aufgeführt.

3.2. Rechteckige Quarzküvetten mit Deckel und einer optischen Länge von 1 cm. Die Extinktionen der mit Wasser oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel gefüllten Küvetten dürfen nicht mehr als 0,01 Einheiten voneinander abweichen.

3.3. 25-ml-Messkolben.

3.4. Analysenwaage, Ablesegenauigkeit 0,0001 g.

4. REAGENZIEN

Alle Reagenzien müssen analysenrein sein, sofern nicht anders angegeben.

Lösungsmittel: Isooktan (2,2,4-Trimethylpentan) für die Messung bei 232 nm und 268 nm oder Cyclohexan für die Messung bei 232 nm und 270 nm, mit einer Absorption kleiner als 0,12 bei 232 nm und kleiner als 0,05 bei 250 nm gegen destilliertes Wasser, gemessen in 10-mm-Küvetten.

5. VERFAHREN

5.1. Die zu untersuchende Probe muss absolut homogen und frei von suspendierten Verunreinigungen sein. Die bei Raumtemperatur flüssigen Öle werden bei einer Temperatur von etwa 30 °C über Papier filtriert. Die festen Fette werden homogenisiert und bei einer Temperatur von nicht höchstens 10 °C über ihrem Schmelzpunkt filtriert.

5.2. Etwa 0,25 g der so vorbereiteten Probe in einen 25-ml-Messkolben einwiegen (auf 1 mg genau), mit dem vorgeschriebenen Lösungsmittel auffüllen und homogenisieren. Die so hergestellte Lösung muss absolut klar sein. Wenn die Lösung trüb ist oder Verunreinigungen enthält, muss schnell über Papier filtriert werden.

5.3. Mit der so hergestellten Lösung wird eine Küvette gefüllt und die Extinktion bei der entsprechenden Wellenlänge zwischen 232 und 276 nm gemessen, wobei das Lösungsmittel als Referenzlösung verwendet wird. Die abgelesenen Extinktionen müssen im Bereich von 0,1 bis 0,8 liegen; andernfalls müssen die Messungen unter Verwendung von entsprechend stärker konzentrierten oder verdünnten Lösungen wiederholt werden. ANMERKUNG: Es ist gegebenenfalls nicht notwendig, die Absorption über den gesamten Wellenlängenbereich zu messen.

6. ABFASSUNG DER ERGEBNISSE

6.1. Angegeben werden die bei den verschiedenen Wellenlängen bestimmten spezifischen Extinktionen (Extinktionskoeffizienten), die wie folgt zu berechnen sind: Dabei bedeuten: Κλ = die spezifische Extinktion (Extinktionskoeffizient) bei der Wellenlänge λ, Ελ = die bei der Wellenlänge λ gemessene Extinktion; c = die Konzentration der Lösung in g/100 ml; s = die Länge der Quarzküvetten in cm. Die Ergebnisse werden mit zwei Dezimalstellen angegeben.

6.2. Veränderung der spezifischen Extinktion (ΔΚ) Die spektrophotometrische Untersuchung von Olivenöl nach dem amtlichen Verfahren der Rechtsvorschriften der Union sieht auch die Bestimmung der Veränderung des Absolutwerts der spezifischen Extinktion (ΔΚ) gemäß folgender Formel vor: Dabei ist Km die spezifische Extinktion bei der Wellenlänge m, der Wellenlänge für die maximale Absorption je nach verwendetem Lösungsmittel: 270 für Cyclohexan und 268 für Isooktan.









Anhang I







MERKMALE VON OLIVENÖLEN Kategorie Fettsäuremethylester (FAME) und Fettsäureethylester (FAEE) Säuregehalt (%) (*) Peroxidzahl mEq 02/kg (*) Wachse mg/kg (**) 2-Gglycerinmonopalmitat (%) Stigmastadien mg/kg (1) ECN42- Differenz zwischen HPLC- Messwert und theoretischer Berechnung K232 (*) K270 (*) „K 270 or K 268 (5)“ Delta-K (*) (5) Sensorische Prüfung Fehlermedian (*) Sensorische Prüfung Fruchtigkeitsmedian (Mf) (*) 1. Natives Olivenöl extra Σ FAME + FAEE ≤75 mg/kg oder 75 mg/kg <Σ FAME + FAEE ≤150 mg/kg und (FAEE/FAME) ≤1,5 ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 if total palmitic acid % ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 1,0 if total palmitic acid % > 14 % 2. Natives Olivenöl — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 if total palmitic acid % ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 if total palmitic acid % > 14% 3. Lampantöl — > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 if total palmitic acid % ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 3,5 (2) — ≤ 1,1 if total palmitic acid % > 14% 4. Raffiniertes Olivenöl — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 if total palmitic acid % ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 if total palmitic acid % > 14% 5. Olivenöl bestehend aus raffinierten und nativen Olivenölen — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 if total palmitic acid % ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 if total palmitic acid % > 14% 6. Rohes Oliventresteröl — — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Raffiniertes Oliventresteröl — ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Oliventresteröl ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Summe der mittels Kapillarsäule (nicht) abtrennbaren Isomere. (2) Oder wenn der Fehlermedian höchstens 3,5 beträgt und der Fruchtigkeitsmedian gleich 0 ist. (3) Öl mit einem Wachsgehalt zwischen 300 mg/kg und 350 mg/kg wird als Lampantöl eingestuft, wenn der Gesamtgehalt an aliphatischen Alkoholen höchstens 350 mg/kg oder der Gehalt an Erytrodiol und Uvaol höchstens 3,5 % beträgt. (4) Öl miteinem Wachsgehalt zwischen 300 mg/kg und 350 mg/kg wird als rohes Oliventresteröl eingestuft, wenn der Gesamtgehalt an aliphatischen Alkoholen über 350 mg/kg und der Gehalt an Erytrodiol und Uvaol über 3,5 % beträgt. (5) K 270 bei Lösungsmittel Cyclohexan, K 268 bei Lösungsmittel Isooktan.

▼B









ANHANG XA

GASCHROMATOGRAPHISCHE ANALYSE DER FETTSÄUREMETHYLESTER

1. ANWENDUNGSBEREICH

Diese Norm enthält allgemeine Anweisungen zur Anwendung der Gaschromatographie mit gepackten Säulen oder mit Kapillarsäulen zur Bestimmung der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung einer Mischung von Fettsäuremethylestern, die nach dem in Anhang XB beschriebenen Verfahren hergestellt wurden.

Das Verfahren eignet sich nicht für polymerisierte Fettsäuren.

2. REAGENZIEN.

2.1. Trägergas

Inertgas (Stickstoff, Helium, Argon, Wasserstoff usw.), vollständig getrocknet und mit einem Sauerstoffgehalt unter 10 mg/kg.

Anmerkung 1:

Der ausschließlich in Kapillarsäulen als Trägergas verwendete Wasserstoff kann die Analysengeschwindigkeit verdoppeln, ist aber gefährlich. Sicherheitsvorrichtungen sind verfügbar.

2.2. Hilfsgase

2.2.1. Wasserstoff (Reinheit über 99,9 %), frei von organischen Verunreinigungen.

2.2.2. Luft oder Sauerstoff, frei von organischen Verunreinigungen.

2.3. Referenzstandard

Eine Mischung aus reinen Fettsäuremethylestern oder die Methylester eines Fetts mit bekannter Zusammensetzung, die möglichst der Zusammensetzung des zu analysierenden Fetts ähnlich sind.

Eine Oxidation der mehrfach ungesättigten Fettsäuren muß vermieden werden.

3. GERÄTE

Die vorliegenden Instruktionen gelten für die übliche Ausrüstung für die Gaschromatographie mit gepackter Säule oder Kapillarsäule und Flammenionisationsdetektor. Jedes Gerät, das die in 4.1.2 beschriebene Leistung und Trennung erbringt, ist geeignet.

3.1. Gaschromatograph

Der Gaschromatograph muß über folgende Bestandteile verfügen:

3.1.1. Einspritzsystem

Verwendet wird ein Einspritzsystem entweder in Verbindung

a) mit gepackten Säulen und möglichst geringem Totvolumen (es muß in diesem Fall auf Temperaturen erhitzt werden können, die um 20—50 °C über der Säulentemperatur liegen) oder

b) mit Kapillarsäulen. In diesem Fall muß das Einspritzsystem speziell für diese Säulen vorgesehen sein. Es kann das Split-System oder das System der splitlosen „On Column“-Injektion sein.

Anmerkung 2:

Sind Fettsäuren mit weniger als 16 Kohlenstoffatomen nicht vorhanden, so kann ein Injektor mit beweglicher Nadel verwendet werden.

3.1.2. Ofen

Der Ofen sollte so ausgelegt sein, daß die Säule auf mindestens 260 °C aufgeheizt und die Temperatur bei gepackten Säulen auf 1 °C und bei Kapillarsäulen auf 0,1 °C genau konstant gehalten werden kann. Letztere Bedingung ist vor allem dann wichtig, wenn eine „Fused Silica“-Säule verwendet wird.

In jedem Fall, besonders aber bei Fettsäuren mit weniger als 16 Kohlenstoffatomen, wird eine Heizung mit Temperaturprogramm empfohlen.

3.1.3. Gepackte Säule

3.1.3.1. Säule aus einem Material, das unempfindlich ist gegenüber den zu analysierenden Substanzen (z. B. Glas oder rostfreier Stahl). Größe der Säule: a) Länge: 1—3 m. Eine relativ kurze Säule sollte verwendet werden, wenn langkettige Fettsäuren (über C20) vorkommen. Bei der Analyse von Säuren mit 4 oder 6 Kohlenstoffatomen wird eine 2 m lange Säule empfohlen; b) Innendurchmesser: 2—4 mm. Anmerkung 3: Sind mehrfach ungesättigte Bestandteile mit mehr als drei Doppelbindungen vorhanden, so können sie in einer Säule aus rostfreiem Stahl zersetzt werden. Anmerkung 4: Es kann ein System mit zwei gepackten Säulen verwendet werden.

3.1.3.2. Füllung, bestehend aus folgenden Bestandteilen: a) Trägermaterial: Mit Säure gewaschenes und silanisiertes Kieselgur oder sonstiges geeignetes neutrales Trägermaterial mit einem engen Korngrößenbereich (Schwankungsbereich 25 μm innerhalb der Grenzwerte von 125 bis 200 μm), wobei die durchschnittliche Korngröße auf den Innendurchmesser der Säule abgestimmt wird. b) Stationäre Phase: Polare Flüssigkeit vom Typ Polyester (z. B. ►C2 Diethylenglykolpolysuccinat ◄ , Butandiolpolysuccinat, Ethylenglykolpolyadipat usw.), Cyanosilicone oder sonstige Flüssigkeiten, die die erforderliche chromatographische Trennung ermöglichen (siehe Ziffer 4). Die stationäre Phase sollte 5—20 % (m/m) der Füllung ausmachen. Für bestimmte Trennungen kann eine nichtpolare stationäre Phase verwendet werden.

3.1.3.3. Vorbereitung der Säule Nachdem die Säule vom Detektor getrennt worden ist, den Ofen allmählich auf 185 °C aufheizen und einen Inertgasstrom von 20—60 ml/min mindestens 16 Stunden bei 185 °C sowie weitere 2 Stunden bei 195 °C durch die frisch hergestellte Säule leiten.

3.1.4. Kapillarsäule

3.1.4.1. Kapillare aus einem Material, das nicht mit den zu analysierenden Stoffen reagiert (üblicherweise Glas oder „Fused Silica“). Der Innendurchmesser sollte zwischen 0,2 und 0,8 mm liegen. Die Innenflächen müssen vor dem Auftragen der stationären Phase einer geeigneten Behandlung unterzogen werden (beispielsweise Oberflächenvorbereitung, Desaktivierung). In den meisten Fällen ist eine Länge von 25 m ausreichend.

3.1.4.2. Die stationäre Phase ist üblicherweise vom Typ Polyglykol (Polyethylenglykol 20 000 ), Polyester (Butandiolpolysuccinat) oder polarem Polysiloxan (Cyanosilicon). Vernetzte (cross linked) Säulen sind geeignet. Anmerkung 5: Bei Verwendung von polaren Polysiloxanen können bei der Identifizierung und Trennung von Linolensäure und C20-Säuren Schwierigkeiten auftreten. Die Beschichtung sollte dünn, beispielsweise nur 0,1 bis 0,2 μm, sein.

3.1.4.3. Einbau und Vorbereitung der Säule Beim Einbau der Kapillarsäule müssen die üblichen Vorsichtsmaßnahmen, wie Anordnung der Säule im Ofen (Träger), Auswahl und Zusammenbau der Verbindungsstücke (Abdichtung), Ausrichten der Säulenenden in dem Einspritzsystem und im Detektor (Verringerung von Totvolumen), getroffen werden. Die Säule wird mit dem Trägergasstrom gespült (z. B. bei einer Säulenlänge von 25 m und einem Innendurchmesser von 0,3 mm mit 0,3 bar (30 kPa)). Zur Vorbereitung der Säule wird das Temperaturprogramm des Ofens auf 3 °C/min eingestellt und die Säule, ausgehend von der Raumtemperatur, auf eine Temperatur von 10 °C unter der Zersetzungsgrenze der stationären Phase erhitzt. Diese Ofentemperatur wird 1 Stunde beibehalten, bis die Grundlinie stabilisiert ist. Dann auf 180 °C zurückschalten und unter isothermen Bedingungen weiterarbeiten. Anmerkung 6: Entsprechend vorbehandelte Fertigsäulen können im Handel bezogen werden.

3.1.5. Der Detektor sollte auf eine höhere Temperatur als die Säulentemperatur erhitzt werden können.

3.2. Spritze

Die Spritze sollte eine maximale Kapazität von 10 μl und eine Graduierung in 0,1 μl haben.

3.3. Schreiber

Wird die von dem Schreiber aufgezeichnete Kurve zur Berechnung der Zusammensetzung der analysierten Mischung verwendet, so wird ein mit dem verwendeten Gerät kompatibler Schreiber von hoher Präzision benötigt. Der Schreiber sollte folgende Merkmale aufweisen:

a) Ansprechgeschwindigkeit unter 1,5 s, vorzugsweise 1 s (die Ansprechgeschwindigkeit ist die Zeit, die der Schreiber benötigt, um nach plötzlicher Auslösung eines Signals (100 %) von 0 % auf 90 % auszuschlagen);

b) Papierbreite mindestens 20 cm;

c) Vorschubgeschwindigkeit einstellbar zwischen 0,4 und 2,5 cm/min.

3.4. Integrator oder Rechner (fakultativ)

Eine schnelle und genaue Berechnung ist mit Hilfe eines elektronischen Integrators oder Rechners möglich, der eine lineare Reaktion bei angemessener Empfindlichkeit liefern soll. Dabei muß die Korrektur bei Abweichungen von der Grundlinie zufriedenstellend sein.

4. VERFAHREN

Die in 4.1 bis 4.3 beschriebenen Verfahren beziehen sich auf den Gebrauch eines Flammenionisationsdetektors.

Alternativ kann auch ein Gaschromatograph mit einem Katharometer-Detektor (der auf dem Prinzip der Änderungen der Wärmeleitfähigkeit beruht) verwendet werden. In diesem Fall müssen die Betriebsbedingungen entsprechend Ziffer 6 geändert werden.

4.1. Versuchsbedingungen

4.1.1. E