1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 1
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►B ENTSCHEIDUNG DER KOMMISSION
vom 15. Juli 1994
über die Veterinärbedingungen und Veterinärbescheinigungen für die Einfuhr von Rindersperma
aus Drittländern
(94/577/EG)
(ABl. L 221 vom 26.8.1994, S. 26)
Geändert durch:
Amtsblatt
Nr. Seite Datum
►M1Entscheidung 1999/495/EG der Kommission vom 1. Juli 1999 L 192 56 24.7.1999
►M2Entscheidung 2004/52/EG der Kommission vom 9. Januar 2004 L 10 67 16.1.2004
▼B
ENTSCHEIDUNG DER KOMMISSION
vom 15. Juli 1994
über die Veterinärbedingungen und Veterinärbescheinigungen für
die Einfuhr von Rindersperma aus Drittländern
(94/577/EG)
DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN —
gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft,
gestützt auf die Richtlinie 88/407/EWG des Rates vom 14. Juni 1988
zur Festlegung der tierseuchenrechtlichen Anforderungen an den inner-gemeinschaftlichen Handelsverkehr mit Samen von Rindern und andessen Einfuhr (
1), zuletzt geändert durch die Richtlinie 93/60/
EWG (2), insbesondere auf die Artikel 10 und 11,
in Erwägung nachstehender Gründe:
Mit der Entscheidung 90/14/EWG der Kommission (3), zuletzt geändert
durch die Entscheidung 91/276/EWG (4), wurde die Liste der
Drittländer festgelegt, aus denen die Mitgliedstaaten die Einfuhr von
Rindersperma zulassen.
Aufgrund der Tiergesundheitslage in Israel wurden Einfuhren aus
diesem Land mit der Entscheidung 91/277/EWG der Kommission (5)
untersagt.
In den Entscheidungen 91/479/EWG (6), 91/549/EWG (7), 92/123/
EWG (8), 92/124/EWG (9), 92/125/EWG (10), 92/126/EWG (11), 92/127/
EWG (12), 92/128/EWG (13), 92/386/EWG (14), 92/387/EWG (15) und
92/445/EWG (16) der Kommission wurden die Tiergesundheitsanforde-
rungen und die Veterinärbescheinigung für die Einfuhr vonRindersperma aus den Vereinigten Staaten von Amerika, Kanada,
Polen, Finnland, Neuseeland, Österreich, der Schweiz, Schweden,
Ungarn, Norwegen und der Tschechoslowakei geregelt.
Die Richtlinie 93/60/EWG muß in den Mitgliedstaaten spätestens ab 1.
Juli 1994 angewandt werden. Sie ändert die Richtlinie 88/407/EWG,weshalb auch die obengenannten Drittlandentscheidungen geändert
werden müssen. Zur Vereinfachung und Verdeutlichung der gemein-
schaftlichen Rechtsvorschriften in diesem Bereich sind dieobengenannten Entscheidungen zusammenzufassen und die für jedeseinzelne Land geltenden Entscheidungen aufzuheben.
Nach dem Abkommen über den Europäischen Wirtschaftsraum sind für
Einfuhren von Rindersperma aus Österreich, Finnland, Norwegen undSchweden keine Veterinärbescheinigungen mehr erforderlich.
Nach Auffassung des Wissenschaftlichen Veterinärausschusses ist ein
zusätzlicher Test für die epizootische hämorrhagische Krankheit erfor-
derlich.
Nur in Kanada werden die Routinetests für diese Krankheit vor der
Samengewinnung lediglich alle sechs Monate durchgeführt. Daher ist1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 2
(1) ABl. Nr. L 194 vom 22. 7. 1988, S. 10.
(2) ABl. Nr. L 186 vom 28. 7. 1993, S. 28.
(3) ABl. Nr. L 8 vom 11. 1. 1990, S. 71.
(4) ABl. Nr. L 135 vom 30. 5. 1991, S. 58.
(5) ABl. Nr. L 135 vom 30. 5. 1991, S. 60.
(6) ABl. Nr. L 258 vom 16. 9. 1991, S. 1.
(7) ABl. Nr. L 298 vom 29. 10. 1991, S. 6.
(8) ABl. Nr. L 48 vom 22. 2. 1992, S. 1.
(9) ABl. Nr. L 48 vom 22. 2. 1992, S. 10.
(10) ABl. Nr. L 48 vom 22. 2. 1992, S. 19.
(11) ABl. Nr. L 48 vom 22. 2. 1992, S. 28.
(12) ABl. Nr. L 48 vom 22. 2. 1992, S. 37.
(13) ABl. Nr. L 48 vom 22. 2. 1992, S. 46.
(14) ABl. Nr. L 204 vom 21. 7. 1992, S. 13.
(15) ABl. Nr. L 204 vom 21. 7. 1992, S. 22.
(16) ABl. Nr. L 247 vom 27. 8. 1992, S. 1.
▼B
es angezeigt, eine Übergangszeit für die Anwendung dieser Entschei-
dung auf Kanada vorzusehen, damit den kanadischenVeterinärbehörden genügend Zeit bleibt, um diesen neuen Test in ihr
Routineprogramm aufzunehmen.
Darüber hinaus kann aufgrund der jüngsten Erkenntnisse über die
Epidemiologie der Blauzungenkrankheit nunmehr die Einfuhr vonRindersperma aus Australien zugelassen werden.
Offenbar ist die Tiergesundheitslage in den in der Liste aufgeführten
Drittländern gut und wird in bezug auf die Krankheiten, die durchSperma übertragen werden können, von einwandfrei strukturierten und
organisierten Veterinärdienststellen überwacht.
Die zuständigen Veterinärbehörden der betreffenden Drittländer haben
sich verpflichtet, die Kommission und die Mitgliedstaaten per Telexder Telefax binnen 24 Stunden nach Bestätigung des Auftretens einerder in Liste A des Internationalen Tierseuchenamts (Office Interna-tional d'Epizooties; OIE) genannten Krankheiten oder über jede
Änderung der jeweiligen Impfpolitik zu unterrichten bzw. die Kommis-
sion und die Mitgliedstaaten innerhalb einer angemessenen Frist überdas Auftreten einer der in Liste B des OIE genannten Krankheitenund über jede vorgeschlagene Änderung der Einfuhrvorschriften fürHaustiere bzw. deren Sperma oder Embryonen zu informieren.
Die zuständigen Veterinärbehörden der in der Liste aufgeführten
Drittländer haben sich verpflichtet, die Erteilung der in dieser Entschei-
dung vorgesehenen Bescheinigungen amtlich zu überwachen und dafür
zu sorgen, daß alle der Attestierung zugrundeliegenden Bescheini-gungen, Abweichungen und Laborergebnisse nach dem Versand desentsprechenden Spermas noch mindestens zwölf Monate amtlichverwahrt werden.
Sie haben sich ferner verpflichtet, Besamungsstationen für die Ausfuhr
von Rindersperma in die Gemeinschaft gemäß Artikel 9 der Richtlinie
88/407/EWG amtlich zuzulassen.
Die Tiergesundheitsanforderungen und die Veterinärbescheinigung sind
der Tiergesundheitslage des jeweiligen Drittlandes anzupassen.
Die in dieser Entscheidung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der
Stellungnahme des Ständigen Veterinärausschusses —
HAT FOLGENDE ENTSCHEIDUNG ERLASSEN:
Artikel 1
Die Mitgliedstaaten genehmigen die Einfuhr von Rindersperma nur,
wenn die Bedingungen der Bescheinigungen in Teil 1 der Anhänge A,B, C und D erfüllt sind und das Sperma aus den in Teil 2 der Anhänge
A, B, C und D aufgeführten Drittländern stammt.
Sie genehmigen bis 31. Dezember 1994 die Einfuhr von Rindersperma
aus Kanada, das gemäß der Entscheidung 91/549/EWG gewonnen undaufbereitet wurde.
Artikel 2
Die Entscheidungen 91/479/EWG, 92/123/EWG, 92/124/EWG, 92/125/
EWG, 92/126/EWG, 92/127/EWG, 92/128/EWG, 92/386/EWG, 92/387/EWG und 92/445/EWG werden aufgehoben.
Die Entscheidung 91/549/EWG wird ab 1. Januar 1995 aufgehoben.
Artikel 3
Die Bestimmungen gemäß Artikel 1 erster Absatz bezüglich Kanadas
gelten erst ab 1. Januar 1995.
Artikel 4
Diese Entscheidung ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet.1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 3
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ANHANG A
TEIL 1
TIERGESUNDHEITSBESCHEINIGUNG
für die Einfuhr von Rindersperma
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▼B
1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 5
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 6
▼M2
TEIL 2
Liste der Drittländer, die zur Verwendung der Tiergesundheitsbescheini-
gung nach dem Muster in Anhang A Teil I zugelassen sind
ISO-Code Land Anmerkung
CH Schweiz
NZ Neuseeland
RO RumänienCY Zypern (*)
CZ Tschechische Republik (*)
EE Estland (*)
HU Ungarn (*)
LT Litauen (*)
LV Lettland (*)
MT Malta (*)
PL Polen (*)
SI Slowenien (*)
SK Slowakei (*)
(*) Gilt nur bis zu dem Tag, an dem dieses Land Mitgliedstaat der Gemeinschaft wird.1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 7
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ANHANG B
TEIL 1
TIERGESUNDHEITSBESCHEINIGUNG
für die Einfuhr von Rindersperma aus den Vereinigten Staaten von Amerika
1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 8
▼B
1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 9
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 10
▼B
TEIL 2
Liste der Länder, die die Tiergesundheitsbescheinigung in Teil 1 dieses
Anhangs verwenden dürfen
VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 11
▼B
ANHANG C
TEIL 1
TIERGESUNDHEITSBESCHEINIGUNG
für die Einfuhr von Rindersperma
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▼B
1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 13
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 14
▼B
TEIL 2
Liste der Länder, die die Tiergesundheitsbescheinigung in Teil 1 dieses
Anhangs verwenden dürfen
KANADA ausgenommen das innerhalb folgender Linie gelegene Gebiet des
Okanagan-Tals in Britisch-Kolumbien: von dem auf der Grenzezwischen Kanada und den Vereinigten Staaten gelegenen Punkt
120º 15 ′Länge — 49º Breite nach Norden bis zu dem Punkt 119º
35′Länge 50º 30 ′Breite, dann nach Nordosten bis zu dem Punkt
119º Länge 50º 45 ′Breite und nach Süden bis zu dem auf der
Grenze zwischen Kanada und den Vereinigten Staaten gelegenen
Punkt 118º 15 ′Länge 49º Breite1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 15
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ANHANG D
TEIL 1
TIERGESUNDHEITSBESCHEINIGUNG
für die Einfuhr von Rindersperma
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►(1) (2)M11994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 18
▼B
TEIL 2
Liste der Länder, die die Tiergesundheitsbescheinigung in Teil 1 dieses
Anhangs verwenden dürfen
AUSTRALIEN1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 19
▼B
ANHANG E
Protokoll für einen Blocking- bzw. kompetitiven Enzym-Immuntest
(ELISA) unter Verwendung eines gruppenspezifischen monoklonalen Anti-
körpers zum Nachweis von BTV-Antikörpern
KOMPETITIVER ELISA ZUM BTV-ANTIKÖRPERNACHWEIS UNTER
VERWENDUNG DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS 3-17-A3
Mit diesem Test können Antikörper aller bekannten Serotypen des Blauzungen-
virus (BTV) nachgewiesen werden.
Testprinzip ist die Unterbrechung der Reaktion zwischen BTV-Antigen und
einem gruppenspezifischen monoklonalen Antikörper (3-17-A3) durch Zugabe
von Testserumverdünnungen. Antikörper gegen im Testserum vorhandenes
BTV blockieren die Reaktionsfähigkeit des monoklonalen Antikörpers (Mab)
und reduzieren nach Zusatz von Enzymsubstrat die voraussichtliche Farbenent-
wicklung.
MATERIALIEN UND REAGENZIEN
1. Flachgrundige Mikrotiterplatten.
2. Antigen: wie folgt zubereitet.3. Blocking-Puffer: 5 % (w/v) „Marvel“ Milchpulver, 0,1 % (v/v) Tween-20
(als Polyoxydethylensorbitonmonolauratsyrup) in phosphatgepufferter Koch-
salzlösung (PBS).
4. Monoklonaler Antikörper 3-17-A3 (als aufschwimmende Hybridom-Gewebe-
kultur), aufbewahrt bei − 20 ºC oder gefriergetrocknet, vor Verwendung mit
Blocking-Puffer 1:50 verdünnt und gegen das gruppenspezifische Polypeptid
p7 gerichtet.
5. Konjugat: Kaninchen-Anti-Maus-Globulin (absorbiert und eluiert), zu Meer-
rettichperoxidase konjugiert und bei 4 ºC im Dunkeln aufbewahrt.
6. Substrat und Chromogen: 0,2 g o-Phenylendiamin (OPD), aufgelöst in einer
Pufferlösung aus 2,553 g Zitronensäure und 4,574 g Dinatrium-Hydrogenor-
thophosphat und mit destilliertem Wasser auf 500 ml aufgefüllt, in 25 ml-
Aliquoten aufgeteilt und bei − 20 ºC im Dunkeln aufbewahrt, unter Zusatz
von 12 µl/25 ml Wasserstoffperoxyd (30 % w/v) unmittelbar vor der
Verwendung.
OPD VORSICHTIG HANDHABEN — GUMMIHANDSCHUHE TRAGEN
— MUTAGENVERDÄCHTIG.
7. 1 Mol Schwefelsäure: 26,6 ml Säure, zugegeben zu 473,4 ml destilliertem
Wasser.
VORSICHT — STETS SÄURE ZU WASSER, NIEMALS WASSER ZUR
SÄURE GEBEN.
8. Orbitalschüttler.
9. ELISA-Plattenableser (das Testergebnis kann visuell abgelesen werden).1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 20
▼B
TEST FORMAT
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TESTPROTOKOLL
Blindkontrolle
Reihe 1 (A - H) ist eine Blindkontrolle, bestehend aus BTV-Antigen und
Konjugat. Sie kann zur Nichtanzeige des ELISA-Lesers verwendet werden.
Mab-KontrolleReihe 2 (A - H) ist die monoklonale Antikörper-Kontrolle, bestehend aus BTV-
Antigen, monoklonalem Antikörper und Konjugat. Sie stellt eine Negativ-
Kontrolle dar. Der Mittelwert der optischen Dichte (OD) dieser Kontrollreihe
entspricht dem Hemmungswert von 0 %.
PositivkontrolleReihe 3 (A - H) ist die Positivkontrolle, bestehend aus BTV-Antigen, BTV-posi-
tiven Antiserumverdünnungen, Mab und Konjugat. Damit soll angezeigt werden,
daß der Test sachgerecht funktioniert, und ähnliche Hemmungsniveaus sollten
von Test zu Test erzielt werden.
TestserenIm Testformat (siehe oben) können 18 Seren, verdünnt 1:2, 1: 4, 1:8 und 1:16,
getestet werden. So läßt sich der Titer von Antikörpern in den Testseren in etwa
ermitteln. Die Verdünnungsreihe könnte bis zu Serumverdünnungsendpunkttitern
fortgesetzt werden. Alternativ könnten bei großangelegten serologischen Unter-
suchungen Seren einmal (1:4) oder zweimal (1:2 und 1:4) verdünnt im Rapid-
screening-Testverfahren getestet werden.
VERFAHRENSWEISE
1. BTV-Antigen zu vortitrierter Konzentration in PBS verdünnen, zusammenge-
ballte Viren durch akustisches Abscheiden kurz dispergieren (falls kein
akustischer Abscheider vorhanden, kräftig pipettieren) und 50 µl in alle
Mulden der ELISA-Platte geben. Zur Dispergierung des Antigens Platte
leicht antippen.
2. Bei 37 ºC 60 Minuten auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Platten dreimal
durch Ausschwemmen der Mulden mit nicht steriler PBS waschen und auf
Löschpapier abtropfen lassen.
3. 50 µl Blocking-Puffer in jede Mulde geben. Testseren und Positivserum in
die entsprechenden Mulden geben und über die Platte verteilt mit einer
Mehrfach-Pipette verdünnen. Die Seren auf keinen Fall in die Blindkontrolle
oder die Mab-Kontrolle geben.
4. Unmittelbar nach Zugabe der Testseren Mab im Blocking-Puffer (zu vorti-
trierter Verdünnung) verdünnen und 50 µl in alle Mulden, ausgenommen
der Blindkontrolle, geben.
5. Bei 37 ºC 60 Minuten auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Dreimal mit
PBS waschen und abtropfen lassen.
6. Kaninchen-Antimaus-Konzentrat in Blocking-Puffer 1:5000 verdünnen und
50µl in alle Mulden geben.
7. Bei 37 ºC 60 Minuten auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Dreimal mit
PBS waschen und abtropfen lassen.
8. OPD auftauen und unmittelbar vor der Verwendung 12 µl 30 %iges Wasser-
stoffperoxid zu je 25 ml OPD geben. 50 µl in alle Mulden geben. Farbe
ungefähr 10 Minuten lang entwickeln lassen und Reaktion mit 1 M Schwe-
felsäure (50 µl je Mulde) stoppen. Eine Färbung sollte sich in den Mab-
Kontrollmulden und in den Mulden mit Seren ohne BTV-Antikörper entwik-
keln.
9. Plattenergebnisse entweder visuell oder mittels eines spektralphotometrischen
Lesers ablesen und registrieren.
ERGEBNISANALYSE
Den OD-Mittelwert, der einem Hemmungswert von 0 % entspricht, anhand der
Mab-Kontrollen berechnen. Die OD-Werte der Testseren werden anhand
folgender Formel in Hemmungsprozentwerten ausgedrückt.
Hemmungsprozentwert ¼100/C0
OD in Anwesenheit des Testserums
OD in Abwesenheit des Testserums/C2100
Hemmungswerte von über 40 % bei einer Serumverdünnung von 1:4 gelten als
positiv. Visuelles Ablesen ist möglich, da eine 40 %ige Hemmung der niedrigste
Wert ist, der mit bloßem Auge problemlos erfaßbar ist.1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 22
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ZUBEREITUNG DES BTV-ELISA-ANTIGENS
1. 10 Roux konfluierende BHK-21-Zellen dreimal mit serumfreiem Zellzüch-
tungsmedium nach Eagle waschen und mit BTV-Serotyp 1 in
vorgenanntem Medium infizieren.
2. Bei 37 ºC inkubieren und täglich auf zytopathischen Effekt (cpe) prüfen.
3. Wird bei 80 bis 90 % der Zellschicht jedes Roux ein zytopathischer Effekt
verzeichnet, das Virus durch Losschütteln noch anhaftender Zellen vom
Glas ernten.
4. Die Zellen bis zur Pelletierung bei 2 000 bis 3 000 upm zentrifugieren.5. Die aufschwimmende Flüssigkeit abnehmen und die Zellen in ungefähr 30
ml PBS mit 1 % „Sarkosyl“ und 2 ml Phenolmethylsulphonylfluorid (Lysis-
Puffer) erneut suspendieren. Eine eventuelle Gelbildung kann durch Zugabe
von mehr Lysis-Puffer reduziert werden.
Anmerkung: Phenylmethylsulphonylfluorid ist schädlich — mit äußerster
Vorsicht handhaben.
6. Die Zellen in 60 Sekunden mit einem Ultraschallprüfkopf bei 30 Mikron
Amplitude trennen.
7. Bei 10000 upm 10 Minuten zentrifugieren.8. Die aufschwimmende Flüssigkeit bei + 4 ºC aufbewahren und das verblei-
bende Zellpellet in 10 bis 20 ml Lysis-Puffer erneut suspendieren.
9. Insgesamt dreimal akustisch abscheiden und klären; dabei die aufschwim-
mende Flüssigkeit jedes Arbeitsgangs aufbewahren.
10. Die aufschwimmenden Flüssigkeiten poolen und bei 24000 upm 120
Minuten bei 4 ºC über einem 5 ml-Kissen aus 40 % Sukrose (w/v in PBS)
unter Verwendung von 30 ml Beckmann-Zentrifugenröhrchen und eines SW
28 Rotors zentrifugieren.
11. Die aufschwimmende Flüssigkeit abnehmen, die Röhrchen gründlich leeren
und das Pellet durch akustische Abscheidung in PBS erneut suspendieren.
Das Antigen in Aliquoten bei 70 ºC aufbewahren.
TITRIERUNG DES BTV-ELISA-ANTIGENS
Das BTV-ELISA-Antigen wird anhand des indirekten ELISA titriert. Zweifache
Antigenverdünnungen werden gegenüber einer konstanten Verdünnung (1:50)
des monoklonalen Antikörpers 3-17-A3 titriert. Es gilt folgendes:
VERFAHRENSWEISE
1. BTV-Antigen in PBS über die Mikrotiterplatte verteilt in Zweifach-Verdün-
nungsreihen mit einer Mehrfach-Pipette verdünnen (50 µl/Mulde).
2. Eine Stunde bei 37 ºC auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
3. Platten dreimal mit PBS waschen.
4. 50 µl monoklonalen Antikörper 3-17-A3 (verdünnt 1:50) in jede Mulde der
Mikrotiterplatte geben.
5. Eine Stunde bei 37 ºC auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
6. Platten dreimal mit PBS waschen.7. 50 µl Kaninchen-Antimaus-Globulin, zu Meerrettichperoxidase konjugiert
und zu einer vortitrierten optimalen Konzentration verdünnt, in jede Mulde
der Mikrotiterplatte geben.
8. Eine Stunde bei 37 ºC auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
9. Substrat und Chromogen wie vorstehend beschrieben zugeben. Die Reaktion
nach 10 Minuten durch Zugabe von 1 Mol Schwefelsäure (50 µl/Mulde)
stoppen.
Beim kompetitiven ELISA muß der monoklonale Antikörper überschüssig sein.
Demnach wird eine Antigenverdünnung gewählt, die auf die Titrationskurve
fällt, die nach 10 Minuten ungefähr 0,8 OD ergibt.1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 23
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Protokoll für einen Agargel-Immunodiffusionstest zum Nachweis von Anti-
körpern der epizootischen hämorrhagischen Krankheit
Der Agargel-Immunodiffusionstest wird nach folgendem Protokoll durchgeführt:
MATERIALIEN UND REAGENZIEN
1. Antigen
Präzipitierendes Antigen wird in einer Zellkultur bereitet, die die schnelle
Vermehrung der entsprechenden Serotypen des Virus der epizootischen
hämorrhagischen Krankheit unterstützt. Es werden BHK- oder Vero-Zellen
empfohlen. Nach abgeschlossenem Viruswachstum ist Antigen in der
aufschwimmenden Flüssigkeit vorhanden, erfordert jedoch eine 50- bis
100fache Konzentration, um wirksam zu werden. Dazu kann jedes Standard-
Proteinkonzentrationsverfahren herangezogen werden. Viren im Antigen
können durch Zugabe von 0,3 % (v/v) Beta-Propiolactin inaktiviert werden.
2. Bekanntes positives Kontrollserum
Unter Verwendung des internationalen Referenzserums und des Antigens
wird ein nationales Standardserum hergestellt, für ein optimales Verhältnis
gegenüber dem internationalen Referenzserum standardisiert, gefriergetroc-
knet und als das bekannte Kontrollserum in jedem Test verwendet.
3. Testserum.
VERFAHREN
1. 1 % Agarose, bereitet in Borat oder Natriumbarbitalpuffer pH 8,5 bis 9,0, in
eine Petrischale gießen, so daß sich eine mindestens 3 mm tiefe Agarose-
Schicht ergibt.
2. Aus dem Agar ein Testmuster von sieben feuchtigkeitsfreien Mulden von 5
mm Durchmesser herausstanzen. Das Muster besteht aus einer zentralen
sowie sechs kreisförmig im Abstand von 3 mm darum herum angeordneten
Mulden:
3. Die zentrale Mulde mit Standardantigen, die peripheren Mulden 2, 4 und 6
mit dem positiven Kontrollserum, die peripheren Mulden 1, 3 und 5 mit den
Testseren füllen.
4. Die so vorbereitete Schale bis zu 72 Stunden bei Raumtemperatur in einer
geschlossenen feuchten Kammer inkubieren.
AUSLEGUNG
Ein Testserum ist positiv, wenn sich eine spezifische Präzipitationslinie mit dem
Antigen bildet, die mit der entsprechenden Linie des Kontrollserums völlig iden-
tisch ist. Ein Testserum ist negativ, wenn es mit dem Antigen keine spezifische
Linie bildet und die Linie des Kontrollserums nicht beugt. Die Petrischalen
sollten bei indirekter Beleuchtung gegen einen dunklen Hintergrund geprüft
werden.1994D0577 — DE — 19.01.2004 — 002.001 — 24