1976L0372—DE—19.08.1981—001.001—1
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►B SIEBTE RICHTLINIE DER KOMMISSION
vom 1. März 1976
zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futter-
mitteln
(76/372/EWG)
(ABl.L102vom15.4.1976,S.8)
Geändert durch:
Amtsblatt
Nr. Seite Datum
►M1Richtlinie 81/680/EWGderKommissionvom30.Juli1981 L246 32 29.8.1981
▼B
SIEBTE RICHTLINIE DER KOMMISSION
vom 1. März 1976
zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die
amtliche Untersuchung von Futtermitteln
(76/372/EWG)
DIEKOMMISSIONDEREUROPÄISCHENGEMEINSCHAFTEN—
gestütztaufdenVertragzurGründungderEuropäischenWirtschaftsge-
meinschaft,
gestütztaufdieRichtliniedesRatesvom20.Juli1970überdieEinfüh-
rung gemeinschaftlicher Probenahmeverfahren und Analysemethoden
für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln(1), zuletzt geändert
durchdieBeitrittsakte(2),insbesondere aufArtikel2,
inErwägungnachstehenderGründe:Die obengenannte Richtlinie bestimmt, daß die amtlichen Untersu-
chungen von Futtermitteln zur Feststellung, ob die auf Grund derRechts- oder Verwaltungsvorschriften festgelegten Anforderungenhinsichtlich Beschaffenheit und Zusammensetzung der Futtermittel
erfüllt sind,nachgemeinschaftlichen Probenahmeverfahren undAnaly-
semethoden durchgeführtwerden.
DieRichtlinien71/250/EWG,71/393/EWG,72/199/EWG,73/46/EWG,
74/203/EWG und 75/84/EWG der Kommission vom 15. Juni 1971(
3),
vom18.November 1971(4),vom27.April1972(5),vom5.Dezember
1972(6),vom25.März1974(7)undvom20.Dezember 1974(8)haben
bereits eine Reihe von Analysemethoden festgelegt. Der Stand der
seitdem durchgeführten Arbeiten ermöglicht es nunmehr, eine siebenteReihe vonAnalysemethoden festzulegen.
Die in dieser Richtlinie vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der
Stellungnahme desStändigenFuttermittelausschusses —
HATFOLGENDERICHTLINIEERLASSEN:
Artikel 1
Die Mitgliedstaaten schreiben vor, daß die Analysen für die amtliche
Untersuchung von Futtermitteln auf ihren Gehalt an Aflatoxin B1nach
denin derAnlage zudieser Richtlinie beschriebenen Methodendurch-
geführt werden.
Artikel 2
Die Mitgliedstaaten setzen spätestens zum 1. Oktober 1976 die erfor-
derlichen Rechts- oder Verwaltungsvorschriften in Kraft, um denBestimmungen dieser Richtlinie nachzukommen. Sie setzen dieKommissionunverzüglich hiervoninKenntnis.
Artikel 3
DieseRichtlinie istanalle Mitgliedstaaten gerichtet.1976L0372—DE—19.08.1981—001.001—2
(1) ABl.Nr.L170vom3.8.1970,S.2.
(2) ABl.Nr.L73vom27.3.1972,S.14.
(3) ABl.Nr.L155vom12.7.1971,S.13.
(4) ABl.Nr.L279vom20.12.1971,S.7.
(5) ABl.Nr.L123vom29.5.1972,S.6.
(6) ABl.Nr.L83vom30.3.1973,S.21.
(7) ABl.Nr.L108vom22.4.1974,S.7.
(8) ABl.Nr.L32vom5.2.1975,S.26.▼M1
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ANLAGE
BESTIMMUNG VON AFLATOXIN B1
A. METHODE MIT EINDIMENSIONALER DÜNNSCHICHTCHROMATO-
GRAPHIE
1. Zweck- und Anwendungsbereich
DieMethodeerlaubtdieBestimmungdesGehaltesanAflatoxinB1in folgenden Futtermitteln: Erdnuß-, Kokos-, Lein-, Soja-, Sesam-,
Babassu- und Maiskeimkuchen, Getreide und Getreideerzeugnisse,
Erbsenmehl, Kartoffelschlempe, getr., und Kartoffelstärke. Die
untereGrenzederBestimmbarkeit beträgt 0,01mg/kg(10ppb).
Wenn Störsubstanzen vorhanden sind, welche die Auswertung
erschweren, muß die Analyse nach der Methode B (zweidimensio-
nale Dünnschichtchromatographie) wiederholt werden.
2. Prinzip
DieProbewirdmitChloroformextrahiert.DerExtraktwirdfiltriert
und ein aliquoter Teil durch Chromatographie an einer Kiesel-
gelsäule gereinigt. Das Eluat wird eingedampft und der Rückstand
in einer definierten Menge Chloroform oder Benzol-Acetonitrilge-
misch gelöst. Ein aliquoter Teil dieser Lösung wird
dünnschichtchromatographisch untersucht. Die Aflatoxin-B1-Menge
wird im UV-Licht visuell oder fluorodensitometrisch im Vergleich
zubekanntenMengenAflatoxin-B1-Standardermittelt.DieIdentität
vonAflatoxinB1imFuttermittelextrakt mußdurchdasangegebene
Verfahrenbestätigtwerden.
3. Reagenzien
Anmerkung: Wenn nichts anderes angegeben ist, sind Reagenzien
von„p.a.“-Qualität zuverwenden.
3.1. Aceton
3.2. Chloroform,mit 0,5bis1,0%Äthanol96%ig(V/V)stabilisiert
3.3. n-Hexan
3.4. Methanol
3.5. Diäthyläther, wasserfrei,peroxidfrei3.6. Benzol-Acetonitril-Gemisch 98:2(V/V)
3.7. MischungausChloroform(3.2)undMethanol (3.4)97:3(V/V)
3.8. Kieselgel für Säulenchromatographie, 0,05 bis 0,20 mm Teil-
chengröße
3.9. Watte, hydrophilundmit Chloroformentfettet, oderGlaswolle
3.10. Natriumsulfat, wasserfrei,gekörnt
3.11. Inertgas,z.B.Stickstoff
3.12. 1N-Salzsäure
3.13. Schwefelsäure50%(V/V)
3.14. Kieselgur(Hyflosupercel),mitSäuregewaschen
3.15. Kieselgel G-HR oder gleichwertiges für Dünnschichtchromatogra-
phie
3.16. Standardlösung mit etwa 0,1 µg Aflatoxin B
1je ml in Chloroform
(3.2) oder in Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6), hergestellt und
kontrolliert nachPunkt7.
3.17. Qualitative Standardlösung mit etwa 0,1µg Aflatoxin B1und B2je
ml in Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6).
Diese Konzentrationen sind als Anhaltspunkte gegeben. Sie sind,
entsprechend dem unterschiedlichen Fluoreszenzvermögen, so zu
wählen, daß sich für beide Aflatoxine dieselbe Fluoreszenzinten-
sitätergibt.
3.18. Fließmittel:1976L0372—DE—19.08.1981—001.001—3
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3.18.1. Mischung aus Chloroform (3.2) und Aceton (3.1) 9:1 (V/V). Tren-
nkammer mit nichtgesättigter Atmosphäre
3.18.2. MischungausDiäthyläther(3.5),Methanol(3.4)undWasser96:3:1
(V/V/V).Trennkammer mit nichtgesättigter Atmosphäre
3.18.3. Mischung aus Diäthyläther (3.5), Methanol (3.4) und Wasser
94:4,5:1,5(V/V/V).Trennkammer mitgesättigter Atmosphäre
3.18.4. Mischung aus Chloroform (3.2) und Methanol (3.4) 94:6 (V/V).
Trennkammer mit gesättigter Atmosphäre.
3.18.5. Mischung aus Chloroform (3.2) und Methanol (3.4) 97:3 (V/V).
Trennkammer mit gesättigter Atmosphäre
4. Geräte
4.1. Mahl-undMischgerät4.2. Schüttelmaschine oderMagnetrührer4.3. Faltenfilter, Schleicher & Schüll Nr. 588 oder gleichwertige Filter,
Durchmesser24cm
4.4. Chromatographierohr aus Glas, (innerer Durchmesser 22 mm,
Länge300mm),mitTeflonhahn und250-ml-Vorratsbehälter
4.5. Vacuumrotationsverdampfer mit500-ml-Rundkolben4.6. 500-ml-Erlenmeyerkolben mitSchliffstopfen4.7. AusrüstungfürDünnschicht-Chromatographie4.8. Glasplatten für Dünnschicht-Chromatographie, 200 × 200 mm. Sie
werden wie folgt vorbereitet (die angegebenen Mengen reichen für
fünf Platten): 30 g Kieselgel G-HR (3.15) werden in einem Erlen-
meyerkolben mit 60 ml destilliertem Wasser versetzt, der Kolben
wird verschlossen und eine Minute geschüttelt. Die Suspension
wird in einer einheitlichen Schichtdicke von 0,25 mm auf die
Platten aufgetragen. Manläßt die Platten an der Luft trocknen und
bewahrt sie dann im Exsikkator über Kieselgel als Trocknungs-
mittel auf. Vor Verwendung werden sie eine Stunde im
Trockenschrank bei110ºCaktiviert.
Fertigplatten können verwendet werden, sofern sie einen ähnlichen
Trenneffekt ergeben wie die in der oben beschriebenen Weise
hergestellten.
4.9. Analysenlampe für langwelligen UV-Bereich (360 nm). Die Lich-
tintensitätmußausreichen,umeinenAflatoxin-B
1-Fleckvon1,0ng
auf einer Dünnschichtplatte in 10 cm Entfernung von der Lampe
nochdeutlichzuerkennen.
4.10. 10-ml-Reagenzgläser, graduiert,mitSchliffundPolyäthylenstopfen4.11. UV-Spektralphotometer4.12. Fluorodensitometer (wahlweise)
5. Ausführung
5.1. Vorbereitung der Probe (siehe unter Bemerkungen,Teil C,Punkt 1)
Die Probe wird gemahlen, so daß sie vollständig durch ein 1-mm-
Sieb(gem.ISO-EmpfehlungR565)hindurchgeht.
5.2. Extraktion
50,0gdergemahlenenundhomogenisiertenProbewerdenineinen
500 ml-Erlenmeyerkolben (4.6) eingewogen, man fügt 25 g
Kieselgur(3.14),25mlWasserund250mlChloroform(3.2)hinzu.
DerKolbenwirdverschlossenund30MinutenmitdemGerät(4.2)
geschüttelt bzw. gerührt. Anschließend filtriert man durch ein
Faltenfilter (4.3), die ersten 10 ml des Filtrats werden verworfen,
dienächsten50mlaufgefangen.
5.3. Säulenchromatographische Reinigung
Das untere Ende des Chromatographie-Rohrs (4.4) wird mit einem
Watte- oder Glaswollepfropfen (3.9) versehen, das Rohr zu etwa
zwei Dritteln mit Chloroform (3.2) gefüllt, dann fügt man 5 g
Natriumsulfat (3.10) hinzu, wobei darauf zu achten ist, daß die
Natriumsulfatschicht eine ebene Fläche bildet. Anschließend gibt
man 10 g Kieselgel (3.8) in kleinen Portionen hinzu. Nach jeder1976L0372—DE—19.08.1981—001.001—4
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Zugabe ist vorsichtig zu rühren, um Luftblasen zu entfernen. Man
läßt das Kieselgel 15 Minuten absetzen und fügt dann vorsichtig
15 g Natriumsulfat (3.10) hinzu. Man läßt dann die Flüssigkeit bis
unmittelbar andieOberfläche desNatriumsulfatsablaufen.
50mldesnach5.2erhaltenen Filtrats werdenmit 100mln-Hexan
(3.3) gemischt. Man gibt die Mischung quantitativ auf die. Säule
und läßt die Flüssigkeit bis zur Oberfläche des Natriumsulfats
einsickern. Anschließendfügtman100mlDiäthyläther (3.5)hinzu
und läßt die Flüssigkeit wieder bis zur Oberfläche des Natriumsul-
fats einsickern. Die Durchflußgeschwindigkeit soll 8 bis 12 ml/
Minute betragen, ein Trockenlaufen der Säule ist zu vermeiden.
Der Durchlauf wird verworfen. Man eluiert danach mit 150 ml
Chloroform-Methanol-Gemisch (3.7), wobei das gesamte Eluat
aufgefangen wird.
Das Eluat wird im Vakuumrotationsverdampfer (4.5) bei einer
Temperatur von weniger als 50º C unter einem inerten Gasstrom
(3.11) bis fast zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit
Chloroform(3.2)oderBenzol-Acetonitril-Gemisch (3.6)quantitativ
in ein 10-ml-Reagenzglas (4.10) überführt, die Lösung im inerten
Gasstrom (3.11) eingeengt und anschließend mit Chloroform (3.2)
oderBenzol-Acetonitril-Gemisch(3.6)aufeinVolumenvon2,0ml
aufgefüllt.
5.4. Dünnschicht-Chromatographie
AufeinerDünnschicht-Platte(4.8)werden2cmvomunterenRand
entferntnebeneinanderimAbstandvon2cmfolgendeMengender
StandardlösungunddesExtraktes punktförmigaufgetragen:
— 10, 15, 20, 30 und 40 µl der Aflatoxin-B1-Standardlösung
(3.16);
— 10 µl des nach 5.3 gewonnenen Extrakts und 20 µl der Stand-
ardlösung(3.16) übereinander auf denselben Punkt;
— 10und20µldesnach5.3gewonnenenExtrakts.
Die Platte wird vor Licht geschützt, mit einem der Fließmittel
(3.18) entwickelt. Zur Auswahl eines geeigneten Fließmittels trägt
man vorher 25 µl der qualitativen Standardlösung (3.17) auf eine
derPlatten aufundprüft,obbeiderEntwicklung einevollständige
TrennungderAflatoxine B1undB2erreicht wird.
Man läßt das Fließmittel im Dunkeln verdampfen und betrachtet
dann die Platte im UV-Licht in 10 cm Abstand von der Lampe
(4.9). Die Flecke von Aflatoxin B1weisen eine blaue Fluoreszenz
auf.
5.5. Quantitative Bestimmung
Die Bestimmung ist entweder visuell oder durch Fluorodensitome-
trie,wienachstehend beschrieben, vorzunehmen.
5.5.1. Visuelle Bestimmung
Die im Extrakt enthaltene Menge Aflatoxin B1wird bestimmt,
indem man die Fluoreszenzintensität der Flecke des Extrakts mit
denenderStandardlösungvergleicht.Fallserforderlich,istzuinter-
polieren. Die durch Übereinanderauftragen von Extrakt und
Standardlösung erzielte Fluoreszenzintensität muß stärker sein als
die von 10 µl des Extrakts und es darf nur ein einziger Fleck
erkennbar sein. Ist die Fluoreszenz-Intensität von 10 µl Extrakt
stärker als dievon 40-µl-Standardlösung, soistderExtrakt auf das
10- oder 100fache mit Chloroform (3.2) oder Benzol-Acetonitril-
Gemisch(3.6)zuverdünnenunderneutinderbeschriebenenWeise
aufeine Dünnschichtplatte aufzutragen.
5.5.2. Durch Fluorodensitometrische Messung
Die Fluoreszenzintensität der Aflatoxin-B1-Flecke wird mit Hilfe
des Fluorodensitometers (4.12) bei 443 nm gemessen bei einer
Anregungmit365nm.DurchVergleichderFluoreszenzintensitäten
vonExtrakt-undStandardfleckenbestimmtmandieindenExtrakt-
Fleckenenthaltene MengevonAflatoxin B1.
5.6. Identifizierung von Aflatoxin B1
DieIdentifizierungvonAflatoxinB1imExtrakterfolgtdurchnach-
stehendbeschriebene Verfahren.1976L0372—DE—19.08.1981—001.001—5
▼B
5.6.1. Behandlung mit Schwefelsäure
Das nach 5.4 erhaltene Chromatogramm wird mit Schwefelsäure
(3.13) besprüht. Die Fluoreszenz der Aflatoxin-B1-Flecke muß im
UV-Lichtvonblaunachgelbumschlagen.
5.6.2. Zweidimensionale Chromatographie mit Bildung von
AflatoxinB1-hemiacetal(AflatoxinB2a)
Anmerkung: Die nachfolgend beschriebenen Arbeitsgänge müssen
genau nach der in Abbildung 3 wiedergegebenen
Skizze durchgeführtwerden.
5.6.2.1. AuftragenderLösungen
In eine Platte (4.8) werden, parallel zu zwei angrenzenden Seiten
(jeweils6cmvomRandentfernt),zweigeradeLinienalsBregren-
zung für die Lösungsmittelfronten geritzt. Auf die Platte trägt man
mitHilfeeinerKapillarpipetteodereinerMikroliterspritzefolgende
Lösungenauf
—bei Punkt A: Ein Volumen des nach 5.3 erhaltenen gereinigten
Probenextraktes,dasetwa2,5NanogrammAflatoxinB1enthält;
—bei Punkt B und C: Jeweils25µlderStandardlösung(3.16).
5.6.2.2. Entwicklung
Das Chromatogramm wird mit dem Fließmittel (3.18.1) (1-cm-
Schicht in einer Trennkammer mit nicht gesättigter Atmosphäre)
im Dunkeln in Richtung I entwickelt bis die Lösungsmittelfront
die Begrenzungslinie erreicht. Man nimmt danach die Platte aus
derTrennkammerundläßtsieimDunkelnfünfMinutenbeiRaum-
temperatur trocknen. Während man den Rest der Platte mit einer
Glasscheibe abdeckt, besprüht man einen 2,5 cm breiten Streifen
(schraffierte Fläche in der Abbildung 3), der die Punkte A und B
überdeckt, mit Salzsäure (3.12), bis eine Dunkelfärbung auftritt.
Manläßt10MinutenimDunkelnreagieren undtrocknetdiePlatte
dannineinem LuftstrombeiRaumtemperatur.
Anschließend entwickelt man das Chromatogramm mit dem Fließ-
mittel (3.18.1) (1-cm-Schicht in einer Trennkammer mitungesättigter Atmosphäre) in Richtung II, bis die Lösungsmittel-
front die Begrenzungslinie erreicht. Man nimmt die Platte aus der
Trennkammer undläßt siebeiRaumtemperatur trocknen.
5.6.2.3. Interpretation desChromatogramms
ManbetrachtetdasChromatogrammunterUV-Licht(4.9)undprüft
aufnachfolgende Merkmale:
a) VorhandenseineinesblaufluoreszierendenFlecksvonAflatoxin
B
1, von der bei C aufgetragenen Standardlösung stammend
(gewandert inRichtungI).
b) VorhandenseineinesblaufluoreszierendenFlecksvonAflatoxin
B1(nicht mit Salzsäure umgesetzt) und eines intensiven blau
fluoreszierenden Flecks von Aflatoxin B1-hemiacetal beide von
derbeiBaufgetragenenStandardlösungstammendundinRich-
tungIIgewandert.
c) Vorhandensein ähnlicher Flecke, wie unter b) beschrieben, die
von dem bei A aufgetragenen Probenextrakt stammen. Die
Lage dieser Flecke ergibt sich erstens aus der Laufstrecke des
Aflatoxins B1von Punkt A in Richtung I (dieselbe Strekke, die
derbeiCaufgetragene Standardzurückgelegt hat)undzweitens
aus der Laufstrecke von dort in Richtung II des nicht umge-
setzten Aflatoxins B1und des Aflatoxin B1-hemiacetals
(dieselben Strecken, die von dem bei B aufgetragenen Standard
zurückgelegt wurden). Die Fluoreszenz-Intensitäten der beiden,
von dem Extrakt und der bei B aufgetragenen Standardlösung
stammenden Halbacetalflecke sollten dabei einander entspre-
chen.
6. Berechnung der Ergebnisse
6.1. Visuelle Messung
Der Aflatoxin-B1-Gehalt der Probe in Mikrogramm pro kg (ppb)
wirdnachfolgender Formelberechnet:1976L0372—DE—19.08.1981—001.001—6
▼B
S/C1Y/C1V
W /C1X
Hierbeisind:
Y und X die Mengen — in Mikroliter — der Aflatoxin-B1-Stand-
ardlösung (3.16) bzw. des Extrakts, deren Fluoreszenz-Intensität
identisch ist.
S = KonzentrationinMikrogrammAflatoxinB1jemlderStand-
ardlösung(3.16);
V= Endvolumen des Extrakts in Mikroliter, unter Berücksichti-
gungetwaigerVerdünnung;
W = Gewicht der Probe in Gramm, bezogen auf die für die
säulenchromatographische Reinigung verwendete Extrakt-
menge.
6.2. Messungen durch Fluorodensitometrie
DerGehaltanAflatoxinB1derProbeinMikrogrammprokg(ppb)
wirdnachfolgender Formelberechnet:
S/C1V
W /C1Y
Hierbeisind:
Y = Volumen des auf die Platte aufgetragenen Extrakts in
Mikroliter (10oder20µl);
S = Aflatoxin-B1-Gehalt des Extraktflecks in Nanogramm, den
man aus der Messung erhält (bezogen auf das angewendete
VolumenY);
V= Endvolumen des Extrakts in Mikroliter, unter Berücksichti-
gungetwaigerVerdünnung;
W = Gewicht der Probe in Gramm, bezogen auf die für die
säulenchromatographische Reinigung verwendete Extrakt-
menge.
7. Herstellung und Kontrolle der Standardlösung (3.16)
7.1. Bestimmung der Aflatoxin-B1-Konzentration
Eine Aflatoxin-B1-Standardlösung wird in Chloroform (3.2) oder
Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6) mit einer Konzentration von 8
bis 10 µg je ml hergestellt. Das Absorptionsspektrum wird
zwischen 330 und 370 nm mit einem Spektralphotometer (4.11)
gemessen.
DieExtinktion(A)istimFalleinerChloroformlösungbei363nm,
imFalleinerLösunginBenzol-Acetonitril-Gemisch bei348nmzu
messen.
DieAflatoxin-B1-KonzentrationinMikrogrammjemlLösungwird
nachfolgenden Formelnberechnet:
312 /C1A/C11000
20600beiderChloroformlösung;
312 /C1A/C11000
19800beiderLösungimBenzol-Acetonitril-Gemisch.
Die zur Herstellung einer Standardarbeitslösung mit einer Afla-
toxin-B1-Konzentration von etwa 0,1 µg je ml erforderlichen
Verdünnungen werden im Dunkeln vorgenommen. Diese Lösung
ist,bei4ºCimKühlschrankaufbewahrt, zweiWochen haltbar.
7.2. Kontrolle der chromatographischen Reinheit
Auf einer Dünnschichtplatte (4.8) werden 5 µl der Aflatoxin-B1-
Standardlösung, die 8—10 µg Aflatoxin B1je ml enthält (siehe
7.1) aufgetragen. Das Chromatogramm wird nach 5.4 entwickelt.
Im UV-Licht darf nur ein einziger Fleck erkennbar sein; außerdem
darfanderStellederursprünglichenAuftragungkeineFluoreszenz
wahrnehmbarsein.1976L0372—DE—19.08.1981—001.001—7
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8. Wiederholbarkeit
Der Unterschied zwischen den Ergebnissen zweier Parallelbestim-
mungen eines Analytikers sollte in derselben Probe bei Gehalten
von
— 10bis20µg/kgAflatoxinB125v.H.deshöherenResultats,
— mehrals20bis50µg/kgAflatoxinB15µg/kgabsolut,
— mehr als 50 µg/kg Aflatoxin B110 v.H. des höheren Resultats
nichtüberschreiten.
9. Vergleichbarkeit
SieheunterBemerkungen, Teil C,Punkt2,
B. METHODEMITZWEIDIMENSIONALERDÜNNSCHICHTCHROMATO-
GRAPHIE
1. Zweck und Anwendungsbereich
DieMethodeerlaubtdieBestimmungdesGehaltesanAflatoxinB1in Futtermitteln, sofern diese nicht unter den Anwendungsbereich
der Methode A fallen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit
beträgt 0,01 mg/kg (10 ppb). Die Methode ist nicht anwendbar bei
Futtermitteln, dieCitrus-Trester enthalten.
2. Prinzip
DieProbewirdmitChloroformextrahiert.DerExtraktwirdfiltriert
und ein aliquoter Teil durch Chromatographie an einer Kiesel-
gelsäule gereinigt. Das Eluat wird eingedampft und der Rückstand
in einer definierten Menge Chloroform oder Benzol-Acetonitril-Gemisch gelöst. Ein aliquoter Teil dieser Lösung wird der zweidi-
mensionalen Dünnschichtchromatographie unterworfen. Die
Aflatoxin-B
1-Menge wird im UV-Licht visuell oder fluorodensito-
metrisch im Vergleich zu bekannten Mengen Aflatoxin-B1-
Standard ermittelt. Die Identität von Aflatoxin B1im Futtermittel-
extrakt mußdurchdasangegebene Verfahrenbestätigt werden.
3. Reagenzien
Anmerkung: Wenn nichts anderes angegeben ist, sind Reagenzien
von„p.a.“-Qualität zuverwenden.
3.1. Aceton
3.2. Chloroform,mit 0,5bis1,0%Äthanol96%ig(V/V)stabilisiert
3.3. n-Hexan
3.4. Methanol3.5. Diäthyläther, wasserfrei,peroxidfrei
3.6. Benzol-Acetonitril-Gemisch 98:2(V/V)
3.7. MischungausChloroform(3.2)undMethanol (3.4)97:3(V/V)3.8. Kieselgel für Säulenchromatographie, 0,05 bis 0,20 mm Teil-
chengröße
3.9. Watte, hydrophilundmit Chloroformentfettet, oderGlaswolle3.10. Natriumsulfat, wasserfrei,gekörnt3.11. Inertgas,z.B.Stickstoff
3.12. 1N-Salzsäure
3.13. Kieselgur(Hyflosupercel),mitSäuregewaschen3.14. Kieselgel G-HR oder gleichwertiges für Dünnschichtchromatogra-
phie
3.15. Fließmittel:3.15.1 Mischung aus Diäthyläther (3.5), Methanol (3.4) und Wasser 94:4,
5:1,5(V/V/V).Trennkammer mit gesättigter Atmosphäre.
3.15.2. Mischung aus Chloroform (3.2) und Aceton (3.1) 9:1 (V/V). Tren-
nkammer mit nichtgesättigter Atmosphäre.1976L0372—DE—19.08.1981—001.001—8
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3.16. Standardlösung mit etwa 0,1 µg Aflatoxin B1je ml in Chloroform
(3.2) oder in Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6), hergestellt und
kontrolliert nachPunkt7derMethodeA.
4. Geräte
SieheunterPunkt4derMethodeA.
5. Ausführung
5.1. Vorbereitung der Probe
werden ausgeführt wie in den
Punkten 5.1, 5.2 und 5.3 der
MethodeAbeschrieben/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C1505.2. Extraktion
5.3. Säulenchromatographische
Reinigung
5.4. Zweidimensionale Dünnschichtchromatographie
5.4.1. Auftragen der Lösungen (sieheSkizzeinAbbildung1)
IneinePlatte(4.8)werdenparallelzuzweibenachbartenSeiten(in
einem Abstand von 5 und 6 cm von der jeweiligen Kante) zwei
gerade Linien geritzt als Begrenzung für die Lösungsmittelfronten.
Auf die Platte werden mit Hilfe einer Kapillarpipette oder einer
Mikroliterspritze folgendeLösungenaufgetragen:
—Bei Punkt A: 20µldesnach5.3erhaltenen gereinigten Proben-
extraktes
—bei Punkt B: 20µlderStandardlösung(3.16)
—bei Punkt C: 10µlderStandardlösung(3.16)
—bei Punkt D: 20µlderStandardlösung(3.16)
—bei Punkt E: 40µlderStandardlösung(3.16)
Man trocknet in einem schwachen Strom von Inertgas (3.11). Die
erhaltenen Flecke sollten einen Durchmesser von etwa 5 mm
aufweisen.
5.4.2. Entwicklung (sieheSkizzeinAbbildung1)
Das Chromatogramm wird mit dem Fließmittel (3.15.1) (1-cm-
Schicht in einer Trennkammer mit gesättigter Atmosphäre) im
Dunkeln in Richtung I entwickelt, bis die Lösungsmittelfront die
Begrenzungslinie erreicht hat. Man nimmt danach die Platte aus
der Trennkammer und läßt sie15 Minutenbei Raumtemperatur im
Dunkelntrocknen.
Anschließend entwickelt man das Chromatogramm unter Verwen-
dung des Fließmittels (3.15.2) (1-cm-Schicht in einer
Trennkammer mit nicht gesättigter Atmosphäre) im Dunkeln in
Richtung II, bis die Lösungsmittelfront die Begrenzungslinie erre-
icht hat.Manentfernt diePlatte ausderTrennkammer undläßt sie
beiRaumtemperatur imDunkelntrocknen.
5.4.3. Auswertung des Chromatogramms (siehe Skizze in Abbil-
dung2)
Man betrachtet das Chromatogramm unter UV-Licht, wobei die
Platte 10 cm von der Lampe (4.9) entfernt sein soll, und bestimmt
die Lage der von den Standardlösungen stammenden blau fluores-
zierenden Flecke B, C, D und E von Aflatoxin B
1. Man zieht
senkrecht zur jeweiligen Laufrichtung durch diese Punkte zwei
gedachte Geraden. Der Schnittpunkt P dieser Geraden ergibt den
Ort, an dem der aus dem bei A (Abbildung 1) aufgetragenen
Probenextrakt stammende Aflatoxin-B1-Fleck zu erwarten ist.
Tatsächlich findet sich der Aflatoxin-B1-Fleck jedoch meist beim
Punkt Q, dem Schnittpunkt zweier gedachter Geraden, die einen
Winkel von etwa 100º bilden und durch die Punkte B bzw. C
gehen.ManbestimmtdieimProbenextraktenthalteneMengeAfla-
toxinB1wieunter5.5beschrieben.
5.4.4. Ergänzende Chromatographie
In eine neue Platte (4.8) ritzt man parallel zu zwei benachbarten
Seiten zwei gerade Linien, wie in der Skizze der Abbildung 1
gezeigt wird und trägt auf Punkt A (siehe Abbildung 1) überein-
ander20 µl des nach 5.3 erhaltenen gereinigten Probenextraktes
und 20 µl Standardlösung (3.16) auf. Man entwickelt das Chroma-1976L0372—DE—19.08.1981—001.001—9
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togramm wie unter 5.4.2beschrieben. Manbetrachtet dasChroma-
togramm imUV-Licht(4.9)undprüft,ob
— sich die Aflatoxin-B1-Flecke von Extrakt und Standardlösung
überlagern und
— die Fluoreszenz dieses Flecks eine höhere Intensität aufweist,
alsderAflatoxin-B1-FleckbeiPunktQdererstenPlatte.
5.5. Quantitative Bestimmung
Die Bestimmung ist entweder visuell oder durch Fluorodensitome-
trie,wienachstehend beschrieben, vorzunehmen.
5.5.1. Visuelle Bestimmung
DieimExtraktenthalteneMengeAflatoxinB1wirdbestimmtdurch
Vergleich der Fluoreszenzintensität des vom Extrakt stammenden
Flecks mit derjenigen der FleckeC, D und E der Standardlösung.
Falls erforderlich, ist zu interpolieren. Ist die Fluoreszenzintensität
von 20 µl Extrakt stärker als die von 40 µl Standardlösung, so ist
der Extrakt auf das 10- oder 100-fache mit Chloroform (3.2) oder
Benzol-Acetonitril-Gemisch (3.6) zu verdünnen und erneut in der
beschriebenen Weiseaufeine Dünnschichtplatte aufzutragen.
5.5.2. Durch fluorodensitometrische Messung
Die Fluoreszenzintensität der Aflatoxin-B1-Flecke wird mit Hilfe
des Fluorodensitometers (4.12) bei 443 nm gemessen bei einer
Anregung mit 365 nm. Die Aflatoxinmenge ergibt sich aus dem
VergleichderFluoreszenzintensitätdesProbenflecksmitderjenigen
derStandardflecke C,DundE.
5.6. Identifizierung von Aflatoxin B1
SieheunterPunkt5.6derMethodeA.
6. Berechnung der Ergebnisse
SieheunterPunkt6derMethodeA.
7. Wiederholbarkeit
SieheunterPunkt8derMethodeA.
8. Vergleichbarkeit
SieheunterBemerkungen, Teil C,Punkt2
C. BEMERKUNGENBETREFFENDMETHODEAUNDB
1.Entfettung
Proben mit mehr als 5 v.H. Fett sind nach der unter 5.1 beschriebenen
Vorbereitung mit Petroläther (Kp 40—60º C) zu entfetten. In diesem Fall
sind die Ergebnisse auf das Gewicht der nicht entfetteten Originalprobe zu
beziehen.
2.Vergleichbarkeit der Ergebnisse
DieVergleichbarkeitderErgebnisse,dasheißtdieAbweichungzwischenden
von 2 oder mehr Laboratorien bei derselben Probe erhaltenen Ergebnisse,
wurdewiefolgtbewertet:
± 50 v.H. des Mittelwertes der Ergebnisse bei Mittelwerten an Aflatoxin B1von10bis20µg/kg;±10µg/kgvomMittelwert beiMittelwerten vonmehrals20bis50µg/kg;
±20v.H.desMittelwertes beiMittelwerten vonmehrals50µg/kg.1976L0372—DE—19.08.1981—001.001—10
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ANLAGE
Abbildung 1
Abbildung 21976L0372—DE—19.08.1981—001.001—11
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Abbildung 31976L0372—DE—19.08.1981—001.001—12