1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 1
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►B VERORDNUNG (EWG) Nr. 2568/91 DER KOMMISSION
vom 11. Juli 1991
über die Merkmale von Olivenölen und Oliventresterölen sowie die Verfahren zu ihrer Bestim-
mung
(ABl. L 248 vom 5.9.1991, S. 1)
Geändert durch:
Amtsblatt
Nr. Seite Datum
►M1Verordnung (EWG) Nr. 3682/91 der Kommission vom 17. Dezember
1991L 349 36 18.12.1991
►M2Verordnung (EWG) Nr. 1429/92 der Kommission vom 26. Mai 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3Verordnung (EWG) Nr. 1683/92 der Kommission vom 29. Juni 1992 L 176 27 30.6.1992
Berichtigt durch:
►C1Berichtigung, ABl. L 347 vom 28.11.1992, S. 69 (2568/91)
►C2Berichtigung, ABl. L 290 vom 6.10.1992, S. 15 (1429/92)
▼B
VERORDNUNG (EWG) Nr. 2568/91 DER KOMMISSION
vom 11. Juli 1991
über die Merkmale von Olivenölen und Oliventresterölen sowie die
Verfahren zu ihrer Bestimmung
DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN —
gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsge-
meinschaft,
gestützt auf die Verordnung Nr. 136/66/EWG des Rates vom 22.
September 1966 über die Errichtung einer gemeinsamen Marktorgani-sation für Fette(
1), zuletzt geändert durchdie Verordnung (EWG)
Nr. 3577/90(2), insbesondere auf Artikel 35a,
in Erwägung nachstehender Gründe:
Im Anhang der Verordnung Nr. 136/66/EWG sind die Bezeichnungen
und Begriffsbestimmungen für Olivenöle und Oliventresteröle zurVermarktung im innerstaatlichen und innergemeinschaftlichen Handelsowie im Handel mit Drittländern festgelegt.
Unbeschadet der bereits geltenden einschlägigen Bestimmungen
müssen zur Unterscheidung der Olivenölkategorien die entsprechendenchemisch-physikalischen Merkmale sowie die organoleptischen Merk-male nativer Olivenöle festgelegt werden, damit Reinheit und Qualitätder betreffenden Erzeugnisse gewährleistet sind.
Die Merkmale der einzelnen Olivenöle müssen gemeinschaftsweit
einheitlich bestimmt werden. Daher müssen gemeinschaftlicheVerfahren für die chemische Analyse und die organoleptische Prüfungfestgelegt werden. Allerdings sollten während einer Übergangszeit auchandere in den Mitgliedstaaten übliche Analyseverfahren zulässig sein,
wobei jedoch vorzusehen ist, daß bei abweichenden Ergebnissen die
nach dem gemeinschaftlichen Verfahren erzielten Ergebnisse gelten.
Die Festlegung der chemisch-physikalischen Merkmale von Olivenölen
und der Analyseverfahren erfordert eine Anpassung der Zusatzvor-schriften zu Kapitel 15 der Kombinierten Nomenklatur.
Zur Bewertung der organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle
müssen Gruppen von ausgewählten und geschulten sensorischenPrüfern gebildet werden; dafür ist eine ausreichende Zeitspanne vorzu-sehen. Da einige Mitgliedstaaten solche Prüfergruppen nicht ohneweiteres zusammenstellen können, muß ihnen die Möglichkeit einge-räumt werden, die in anderen Mitgliedstaaten eingesetzten
Prüfergruppen zu befassen.
Damit das einwandfreie Funktionieren der für die Einfuhr von Oliven-
tresteröl geltenden Abschöpfungsregelung gewährleistet ist, muß eineinheitliches Verfahren zur Bestimmung des Ölgehalts dieser Erzeug-nisse vorgesehen werden.
Um Nachteile für den Handel auszuschließen, sollte Olivenöl, das vor
Inkrafttreten dieser Verordnung abgefüllt wurde, während einerbestimmten Zeit nochvermarktet werden dürfen.
Die Verordnung (EWG) Nr. 1058/77 der Kommission(
3), zuletzt
geändert durchdie Verordnung (EWG) Nr. 1858/88(4), ist aufzuheben.
Der Verwaltungsausschuß für Fette hat nicht innerhalb der ihm von
seinem Vorsitzenden gesetzten Frist Stellung genommen —1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 2
(1) ABl. Nr. 172 vom 30. 9. 1966, S. 3025/66.
(2) ABl. Nr. L 353 vom 17. 12. 1990, S. 23.
(3) ABl. Nr. L 128 vom 24. 5. 1977, S. 6.
(4) ABl. Nr. L 166 vom 1. 7. 1988, S. 10.
▼B
HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN:
Artikel 1
(1) Native Olivenöle im Sinne der Nummer 1 Buchstaben a), b) und
c) des Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG sind Öle, deren
Merkmale mit den in Anhang I Nummern 1, 2 und 3 dieser Verord-
nung genannten Merkmalen übereinstimmen.
(2) Natives Lampantöl im Sinne der Nummer 1 Buchstabe d) des
Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Öl, dessen Merkmale
mit den in Anhang I Nummer 4 dieser Verordnung genannten Merk-malen übereinstimmen.
(3) Raffiniertes Olivenöl im Sinne der Nummer 2 des Anhangs der
Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit den inAnhang I Nummer 5 dieser Verordnung genannten Merkmalen überein-stimmen.
(4) Olivenöl im Sinne der Nummer 3 des Anhangs der Verordnung
Nr. 136/66/EWG ist Öl, dessen Merkmale mit den in Anhang INummer 6 dieser Verordnung genannten Merkmalen übereinstimmen.
(5) Rohes Oliventresteröl im Sinne der Nummer 4 des Anhangs der
Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit den inAnhang I Nummer 7 dieser Verordnung genannten Merkmalen überein-stimmen.
(6) Raffiniertes Oliventresteröl im Sinne der Nummer 5 des
Anhangs der Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merk-male mit den in Anhang I Nummer 8 dieser Verordnung genanntenMerkmalen übereinstimmen.
(7) Oliventresteröl im Sinne der Nummer 6 des Anhangs der
Verordnung Nr. 136/66/EWG ist Olivenöl, dessen Merkmale mit denin Anhang I Nummer 9 dieser Verordnung genannten Merkmalen über-
einstimmen.
Artikel 2
(1) Die Merkmale der Öle gemäß Anhang I dieser Verordnung
werden nachfolgenden Analysenverfah ren bestimmt:
— freie Fettsäuren, berechnet in Prozent Ölsäure, nach dem Verfahren
des Anhangs II;
— Peroxidzahl nach dem Verfahren des Anhangs III;
— aliphatische Alkohole nach dem Verfahren des Anhangs IV;— Sterinfraktion nach dem Verfahren des Anhangs V;
— Erythrodiol nach dem Verfahren des Anhang VI;
— gesättigte Fettsäuren in 2-Stellung der Triglyceride nachdem
Verfahren des Anhangs VII;
— Trilinoleingehalt nach dem Verfahren des Anhangs VIII;
— spektrophotometrische Analyse nach dem Verfahren des Anhangs
IX;
— Fettsäurezusammensetzung nach dem Verfahren der Anhänge XA
und XB;
— flüchtige halogenierte Lösungsmittel nach dem Verfahren des
Anhangs XI;
— Bestimmung der organoleptischen Merkmale nativer Olivenöle nach
dem gemäß Absatz 2 angewandten Verfahren des Anhangs XII;
— Raffinationsnachweis nach dem Verfahren des Anhangs XIII.
(2) Die organoleptischen Merkmale werden ►
M3von einem mit
der sensorischen Analyse vertrauten Prüfer oder unter Hinzuziehungvon Sensorikern ◄nachdem im Prüfbogen gemäß Anh ang XII vorge-
sehenen Verfahren bewertet. Stellt der Analytiker Abweichungen
zwischen den von ihm erfaßten und den aufgrund der Produktbezeich-nung zu erwartenden organoleptischen Merkmalen fest, so muß er dieProbe von einer Gruppe von sensorischen Prüfern gemäß den Bestim-mungen des Anhangs XII prüfen lassen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 3
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Die Kontrollanalysen werden von der Gruppe nachdenselben Bestim-
mungen durchgeführt.
Die Prüfergruppe bewertet die organoleptischen Eigenschaften im
Zusammenhang mit Interventionsmaßnahmen nach den Vorschriftendes Anhangs XII.
Artikel 3
Unbeschadet der Einführung der Analysenverfahren gemäß Artikel 2
dürfen die Mitgliedstaaten bis 31. Oktober 1992 andere erprobte undwissenschaftlich begründete Verfahren verwenden, soweit der freieVerkehr mit den in Anwendung der Gemeinschaftsverfahren alsvorschriftsmäßig anerkannten Erzeugnissen nicht behindert wird. Die
betreffenden Mitgliedstaaten notifizieren der Kommission diese
anderen Verfahren vor ihrer Verwendung.
Führt eines dieser anderen Verfahren zu einem anderen Ergebnis als
das Gemeinschaftsverfahren, so gilt das nach dem Gemeinschaftsver-
fahren erzielte Ergebnis.
Artikel 4
(1) Zur Beurteilung der organoleptischen Merkmale bilden die
Mitgliedstaaten Gruppen von sensorischen Prüfern, die nach den
Regeln des in Anhang XII beschriebenen Verfahrens geschult wurden.
(2) Sollte ein Mitgliedstaat in seinem Hoheitsgebiet nicht ohne
weiteres eine Prüfergruppe bilden können, so kann er eine in einemanderen Mitgliedstaat tätige Prüfergruppe befassen.
Artikel 5
Die zusätzlichen Vorschriften 2, 3 und 4 zu Kapitel 15 der Kombi-
nierten Nomenklatur werden durchdie des Anh angs XIV ersetzt.
Artikel 6
(1) Der Ölgehalt von Trester und anderen Rückständen der Olivenö-
lextraktion (KN-Codes 2306 9011 und 2306 9019) wird nachdemVerfahren des Anhangs XV bestimmt.
(2) Der Ölgehalt gemäß Absatz 1 wird in Massenprozenten, bezogen
auf die Trockenmasse, berechnet.
Artikel 7
Für andere als im Anhang XI aufgeführte unerwünschte Stoffe gelten
die entsprechenden Gemeinschaftsvorschriften.
Artikel 8
(1) Die Mitgliedstaaten teilen der Kommission die Maßnahmen mit,
die sie zur Durchführung dieser Verordnung getroffen haben.
(2) Die Mitgliedstaaten übermitteln der Kommission zu Beginn
jedes Halbjahres eine Zusammenstellung der analytischen Daten derim vorangegangenen Halbjahr durchgeführten Bestimmungen.
Diese Ergebnisse werden vom Verwaltungsausschuß für Fette nach
dem Verfahren des Artikels 39 der Verordnung Nr. 136/66/EWGgeprüft.
Artikel 9
Die Verordnung (EWG) Nr. 1058/77 wird aufgehoben.
Artikel 10
(1) Diese Verordnung tritt am dritten Tag nachih rer Veröffentli-
chung im Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften in Kraft.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 4
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Das Verfahren des Anhangs XII ist jedoch, außer wenn es sich um
Interventionsmaßnahmen handelt, ab ►M11. November 1992 ◄
anwendbar.
(2) Diese Verordnung gilt nicht für Olivenöl und Oliventresteröl, das
vor dem Tag des Inkrafttretens dieser Verordnung abgefüllt und biszum 31. Oktober 1992 vermarktet wurde.
Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmit-
telbar in jedem Mitgliedstaat.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 5
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ANHÄNGE
Inhalt
Anhang I: Merkmale von Olivenölen …
Anhang II: Bestimmung der freien Fettsäuren …
Anhang III: Bestimmung der Peroxidzahl …Anhang IV: Bestimmung des Gehalts an aliphatischen Alkoholen mit der
Kapillar-Gaschromatographie …
Anhang V: Bestimmung der Zusammensetzung und des Gehalts an
Sterinen mit der Kapillar-Gaschromatographie …
Anhang VI: Bestimmung des Erythrodiols und des Uvaols …Anhang VII: Bestimmung von Fettsäuren in 2-Stellung der Triglyceride …
Anhang VIII: Bestimmung des Trilinoleingehalts …
Anhang IX: UV-spektrophotometrische Analyse …Anhang XA: Gaschromatographische Analyse der Fettsäuremethylester …
Anhang XB: Vorbereitung der Fettsäuremethylester …
Anhang XI: Bestimmung des Gehalts an flüchtigen halogenierten Lösungs-
mitteln in Olivenöl …
Anhang XII: Organoleptische Prüfung von nativem Olivenöl …
Anhang XIII: Raffinationsnachweis …Anhang XIV: Zusätzliche Anmerkungen 2, 3 und 4 zu Kapitel 15 der Kombi-
nierten Nomenklatur
Anhang XV: Ölgehalt der Oliventrester …
Anhang XVI: Bestimmung der Iodzahl …1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 6
ANHANG I
MERKMALE VON OLIVENÖLEN
KategorieGehalt an
freien Fett-
säuren
%Peroxid-
zahl meq
O2/kgHalogen-
ierte
Lösungs-
mittel
mg/kg (1)Aliphati-
sche Alko-
hole
mg/kgGesättigte
Fettsäuren
in 2-Stel-
lung der
Triglyce-
ride
%Erythrodiol
+ Uvaol
%Trilinolein
%Cholesterin
%Brassica-
sterin
%Campe-
sterin
%Stigma-
sterin
%Beta-Sito-
sterin
%(2)Delta-7-
Stigma-
sterin
%Gesamtste-
rine
mg/kg
1. Natives Olivenöl
extra M 1,0 M 20 M 0,20 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000
2. Natives Olivenöl M 2,0 M 20 M 0,20 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 0003. Gewöhnliches
natives Olivenöl M 3,3 M 20 M 0,20 M 300 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000
4. Lampantöl > 3,3 > 20 > 0,20 M 400 M 1,3 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 1 0005. Raffiniertes
Olivenöl M 0,5 M 10 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 000
6. Olivenöl M 1,5 M 15 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 0007. Rohes Oliventre-
steröl m 2,0 — — — M 1,8 m 12 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 2 500
8. Raffiniertes Oliven-
tresteröl M 0,5 M 10 M 0,20 — M 2,0 m 12 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 800
9. Oliventresteröl M 1,5 M 15 M 0,20 — M 2,0 > 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,2 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1 800
M = Höchstgehalt, m = Mindestgehalt.
(1) Höchstgehalt für die Summe aller Verbindungen bei Nachweis mittels Elektroneneinfang-Detektor. Für jede einzelne Verbindung beträgt der Höchst gehalt 0,10 mg/kg.
(2) Summe aus Delta-5,23-Stigmastadienol, Chlerosterin, Beta-Sitosterin, Sitostanol, Delta-5-Avenasterin und Delta-5,24-Stigmastadienol.
Anmerkung: Auch wenn nur ein einziges Merkmal nicht mit dem vorgeschriebenen Grenzwert übereinstimmt, muß das Öl einer anderen Klasse zugeordnet oder als nicht seinen Reinheitskriterien entsprechend bezeichnet werden.▼B1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 7
KategorieGehalt an
Summe der
trans-
Isomere der
►C2Ölsäure
◄
%Summe der
trans-
Isomere der
Leinölsäure
und der
►
C2
Linolsäure
◄
%K232K270K270nach
Behandlung
mit Alumi-
niumoxidDelta KSensorische
Prüfung Myristin-
säure
%Linolen-
säure
%Arachin-
säure
%Eicosen-
säure
%Behensäure
%Lignocerin-
säure
%
1. Natives Olivenöl
extra M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,03 < 0,03 M 2,40 M 0,20 M 0,10 M 0,01 ≥6,5
2. Natives Olivenöl M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,03 < 0,03 M 2,50 M 0,25 M 0,10 M 0,01 ≥5,5
3. Gewöhnliches natives
Olivenöl M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,03 < 0,03 M 2,50 M 0,25 M 0,10 M 0,01 ≥3,5
4. Lampantöl M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,10 < 0,10 M 3,70 > 0,25 M 0,11 — < 3,55. Raffiniertes Olivenöl M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,20 < 0,30 M 3,40 M 1,20 — M 0,16 —6. Olivenöl M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,20 < 0,30 M 3,30 M 1,00 — M 0,13 —7. Rohes Oliventresteröl M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,20 < 0,10 —————
8. Raffiniertes Oliven-
tresteröl M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,40 < 0,35 M 5,50 M 2,50 — M 0,25 —
9. Oliventresteröl M 0,1 M 0,9 M 0,7 M 0,5 M 0,3 M 0,5 < 0,40 < 0,35 M 5,30 M 2,00 — M 0,20 —▼M21991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 8
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ANHANG II
BESTIMMUNG DER FREIEN FETTSÄUREN
1. ANWENDUNGSBEREICH
Bestimmung der freien Fettsäuren in Olivenölen. Der Gehalt an freien
Fettsäuren wird über den Gehalt an freien Säuren in konventioneller
Weise berechnet.
1.1.Prinzipder Methode
Die Probe wird in einem geeigneten Lösungsmittelgemischgelöst. Dann
werden die vorhandenen freien Säuren mit einer ethanolischen Kaliumhy-
droxidlösung titriert.
1.2.Reagenzien
Alle Reagenzien müssen anerkannte Anaylsenqualität aufweisen; als
Wasser ist destilliertes Wasser oder Wasser gleicher Reinheit zu
verwenden.
1.2.1. Diethylether/Ethanol 95%ig (V/V), Mischung 1:1.
Vorsicht: Diethylether ist leicht brennbar und kann explosive Peroxide
bilden. Es muß daher unter besonderen Vorsichtsmaßnahmen
verwendet werden.
Das Diethylether/Ethanol-Gemisch muß unmittelbar vor dem Gebrauch
mit einer Kaliumhydroxidlösung (1.2.2) unter Zusatz von 0,3 ml
Phenolphthaleinlösung (1.2.3) pro 100 ml Lösungsmittelgemisch neutrali-
siert werden.
Anmerkung: Wenn Diethylether nicht benutzt werden kann, so kann auch
eine Mischung aus Ethanol und Toluol verwandt werden.
Eventuell kann auchEth anol durch2-Propanol ersetzt
werden.
1.2.2. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung, 0,1 molar oder, falls erforderlich,
0,5 molar.
Die genaue Konzentration der ethanolischen Kaliumhydroxidlösung muß
bekannt sein und unmittelbar vor der Verwendung überprüft werden. Die
Lösung sollte mindestens 5 Tage vorher hergestellt und in eine braune
Flasche, die mit einem Gummistopfen verschlossen wird, dekantiert
werden. Sie muß farblos oder nur schwach gefärbt sein.
Anmerkung: Eine stabile farblose Kaliumhydroxidlösung kann wie folgt
hergestellt werden: 1 000 ml Ethanol mit 8 g Kaliumhy-
droxid und 0,5 g Aluminiumspäne eine Stunde am
Rückflußkühler kochen. Sofort destillieren. Die erforderliche
Menge Kaliumhydroxid in dem destillierten Ethanol lösen
und mehrere Tage stehen lassen. Die klare Lösung von
dem ausgefallenen Karbonat abdekantieren.
Die Lösung kann auch ohne Destillation wie folgt herge-
stellt werden: 1 000 ml Ethanol mit 4 ml Aluminiumbutylat
mehrere Tage stehen lassen. Die überstehende Flüssigkeit
abdekantieren und die erforderliche Menge Kaliumhydroxid
darin lösen. Diese Lösung ist gebrauchsfertig.
1.2.3. Phenolphthalein, Lösung von 10 g/l in 95-96%igem Ethanol oder Alkali-
blau (bei sehr stark gefärbten Fetten), Lösung von 20 g/l in 95-96%igem
Ethanol.
1.3.Geräte
Übliche Laborgeräte u. a.:
1.3.1. Analysenwaage,1.3.2. 250-ml-Erlenmeyerkolben,
1.3.3. 10-ml-Bürette mit 0,05-ml-Graduierung.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 9
▼B
1.4.Verfahren
1.4.1. Die Bestimmung erfolgt mit der filtrierten Probe. Beträgt der Gesamtge-
halt an Wasser und Verunreinigungen weniger als 1 %, so wird die
Bestimmung mit der unfiltrierten Probe durchgeführt.
1.4.2. Probe
Die Größe der Einwaage richtet sich nach dem zu erwartenden Gehalt an
freien Fettsäuren (Angaben in der nachstehenden Tabelle).
Erwarteter Gehalt an
freien FettsäurenEinwaage
(in g)Genauigkeit der
Einwaage
(in g)
< 1 20 0,05
1—4 10 0,024—15 2,5 0,01
15—75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Die Probe in den Erlenmeyerkolben (1.3.2) einwiegen.
1.4.3. Durchführung der Bestimmung
Die Probe (1.4.2) in 50 bis 150 ml der neutralisierten Diethylether/
Ethanol-Mischung (1.2.1) lösen. Mit der 0,1 molaren Kaliumhydroxidlö-
sung (1.2.2) (Anmerkung 2) unter Schütteln bis zum Umschlag des
Indikators titrieren. (Die Rosafärbung des Phenolphthaleins muß
mindestens 10 Sekunden anhalten.)
Anmerkungen: 1. Die ethanolische Kaliumhydroxidlösung (1.2.2) kann
durch eine wäßrige Kaliumhydroxid- oder Natriumhydro-
xidlösung ersetzt werden, wenn die zugeführte
Wassermenge keine Phasentrennung bewirkt.
2. Werden zur Titration mehr als 10 ml der 0,1 molaren
Kaliumhydroxidlösung benötigt, so ist eine 0,5 molare
Lösung zu verwenden.
3. Wird die Lösung während der Titration trübe, so ist eine
ausreichende Menge Lösungsmittelmischung (1.2.1) zuzu-
fügen, bis die Lösung wieder klar ist.
1.5.Berechnung des Gehalts an freien Fettsäuren in % Ölsäure
Der Gehalt an freien Fettsäuren in Gewichtsprozent ist
V/C2c/C2M
1000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
Dabei sind:
V = Verbrauchan Kaliumh ydroxidlösung in ml,
c = genaue Konzentration der Kaliumhydroxidlösung in mol/l,
M = Molekulargewicht in g der Säure, die für die Berechnung
zugrunde gelegt wird (= 282),
m = Probeneinwaage in g.
Als Ergebnis gilt das arithmetische Mittel von zwei Bestimmungen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 10
▼C1
▼B
▼B
ANHANG III
BESTIMMUNG DER PEROXIDZAHL
1. ZWECK
Diese Norm beschreibt ein Verfahren für die Bestimmung der Peroxidzahl
von Ölen und Fetten.
2. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Norm gilt für tierische und pflanzliche Öle und Fette.
3. DEFINITION
Die Peroxidzahl ist die Gesamtmenge solcher Substanzen in der Probe,
ausgedrückt in Milliäquivalenten aktiven Sauerstoffs pro kg, die unter den
beschriebenen Arbeitsbedingungen Kaliumiodid oxidieren.
4. PRINZIP
Behandlung der in Essigsäure und Chloroform gelösten Probe mit einer
Kaliumiodidlösung. Titration des freigesetzten Iods durcheine eingestellte
Natriumthiosulfatlösung.
5. GERÄTE
Die Geräte müssen frei von reduzierenden oder oxidierenden Substanzen
sein.
Anmerkung: Schliffflächen nicht einfetten.
5.1. Mikrobechergläschen, 3 ml.5.2. 250-ml-Schliffkolben mit Stopfen, die zuvor getrocknet und mit einem
reinen, trockenen Inertgas (Stickstoff oder vorzugsweise Kohlendioxid)
gefüllt wurden.
5.3. 25- oder 50-ml-Bürette, mit 0,1-ml-Graduierung.
6. REAGENZIEN
6.1. Chloroform, analytisch rein, durch Einleiten von reinem, trockenem
Inertgas von Sauerstoff befreit.
6.2. Eisessig, analytischrein, durchEinleiten von reinem, trockenem Inertgas
von Sauerstoff befreit.
6.3. Kaliumiodid, gesättigte wäßrige Lösung, frischzubereitet, frei von Iod und
Iodaten.
6.4. Natriumthiosulfat, genau 0,01 oder 0,002 N wäßrige Lösung, unmittelbar
vor der Verwendung eingestellt.
6.5. Stärkelösung, wäßrige Dispersion, von 10 g/l, aus natürlicher löslicher
Stärke frischh ergestellt.
7. PROBE
Die Probe ist unter Lichtabschluß zu entnehmen und zu lagern und kühl in
vollständig gefüllten Glasgefäßen, die mit Glas- oder Korkstopfen
verschlossen sind, aufzubewahren.
8. VERFAHREN
Die Bestimmung soll bei diffusem Tageslicht oder künstlichem Licht
durchgeführt werden. In ein Mikrobechergläschen (5.1) oder aber in einen
Kolben (5.2) die Probemenge auf 0,001 g genau einwiegen, unter Berücks-
ichtigung der erwarteten Peroxidzahl gemäß nachstehender Tabelle:1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 11
▼B
Erwartete Peroxidzahl
(meq O2/kg)Probemenge
(g)
0 bis 12 5,0 bis 2,0
12 bis 20 2,0 bis 1,220 bis 30 1,2 bis 0,830 bis 50 0,8 bis 0,5
50 bis 90 0,5 bis 0,3
Den Stopfen von dem Kolben (5.2) abnehmen und den Mikrobecher mit
der Probemenge einführen. 10 ml Chloroform (6.1) hinzufügen. Die Probe
schnell unter Rühren auflösen, 15 ml Essigsäure (6.2), dann 1 ml Kalium-
iodidlösung (6.3) hinzufügen. Den Stopfen rasch einsetzen, eine Minute
schütteln und genau fünf Minuten unter Lichtabschluß bei einer Temperatur
von 15 bis 25 ºC stehenlassen.
Etwa 75 ml destilliertes Wasser zugeben. Das freigesetzte Iod mit Natrium-
thiosulfatlösung (6.4) unter kräftigem Schütteln titrieren (0,002-N-Lösung
für erwartete Werte unter 12 und 0,01-N-Lösung für erwartete Werte über
12). Stärkelösung (6.5) als Indikator verwenden.
Zwei Bestimmungen mit derselben Probe durchführen.
Zur gleichen Zeit einen Blindversuch durchführen. Übersteigt das Ergebnis
des Blindversuchs 0,05 ml einer 0,01-N-Natriumthiosulfatlösung (6.4), so
sind die unreinen Reagenzien zu ersetzen.
9. ABFASSUNG DER ERGEBNISSE
Die Peroxidzahl (P. V.), ausgedrückt in Milliäquivalenten aktiven Sauer-
stoffs pro kg, wird nachfolgender Formel errech net:
P:V:¼
V/C2T/C21000
m
Dabei sind:
V = die Anzahl ml der eingestellten Natriumthiosulfatlösung (6.4), die
für die Bestimmung verbraucht werden, korrigiert durch den entspre-
chenden Wert des Blindversuchs,
T = die genaue Normalität der Natriumthiosulfatlösung (6.4),
m = das Gewicht der Probe in g.
Als Ergebnis gilt das arithmetische Mittel der beiden so durchgeführten
Bestimmungen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 12
▼B
ANHANG IV
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN ALIPHATISCHEN ALKOHOLEN
MIT DER KAPILLARGASCHROMATOGRAPHIE
1. ANWENDUNGSBEREICH
Die Methode beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammen-
setzung und des Gehalts an aliphatischen Alkoholen.
2. KURZBESCHREIBUNG
Das Fett wird mit 1-Eicosanol als internem Standard versetzt, mit etha-
nolischer Kaliumhydroxidlösung verseift und das Unverseifbare mit
Ethylether extrahiert. Die Alkoholfraktion wird dünnschichtchromato-
graphisch über basische Kieselgelplatten vom Unverseifbaren
abgetrennt. Die aus dem Kieselgel isolierten Alkohole werden in Trime-
thylsilylether überführt und mit Hilfe der Kapillar-Gaschromatographie
untersucht.
3. GERÄTE UND HILFSMITTEL
3.1.— Kolben, 250 ml, mit Rückflußkühler und Schliffstopfen,
3.2.— Scheidetrichter, 500 ml,
3.3.— Kolben, 250 ml,
3.4.— komplette Apparatur für die Dünnschichtchromatographie mit Glas-
platten 20 × 20 cm,
3.5.— UV-Lampe, Wellenlänge 366 oder 254 nm,
3.6.— Mikroliterspritzen, 100 und 500 µl,
3.7.— Glasfiltertiegel mit Porenfilter G 3 (Porosität 15 — 40 µm), etwa 2 cm
Durchmesser, 5 cm Höhe, geeignetem Anschlußstück für die Vakuum-
filtration und Schliffmuffe 12/21,
3.8.— Vakuumflasche, 50 ml, mit Schliffmuffe 12/21, für Glasfiltertiegel
(3.7),
3.9.— 10-ml-Röhrchen mit konischem Boden und dichtschließendem Stopfen,
3.10.— Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen
mit Splitsystem, bestehend aus:
3.10.1.— thermostatisierbarem Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte
Temperatur mit einer Genauigkeit von ± 1ºC,
3.10.2.— temperaturregelbare Verdampfeinrichtung mit Verdampfer aus persila-
nisiertem Glas,
3.10.3.— Flammenionisations-Detektor mit Verstärker,
3.10.4.— Integrator mit Schreiber, mit Verstärker zu koppeln,
3.11.— Kapillarsäule aus Glas oder fused silica, 20 — 30 m Länge, 0,25 —
0,32 mm Innendurchmesser, Innenwand belegt mit SE-52 oder SE-54
oder einer gleichwertigen stationären Phase, Schichtdicke 0,10 —
0,30 µm,
3.12.— Mikroliterspritze für die Gaschromatographie, 10 µl, mit gehärteter
Nadel,
4. REAGENZIEN
4.1.— Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 2 N: 130 g Kaliumhydroxid
(Titer mindestens 85 %) in 200 ml destilliertem Wasser unter Kühlen
lösen und mit Ethanol auf 11 auffüllen. Die Lösung sollte in gut
verschlossenen braunen Glasflaschen aufbewahrt werden,
4.2.— Ethylether, analysenrein,
4.3.— wasserfreies Natriumsulfat, analysenrein,
4.4.— mit Kieselgel beschichtete Glasplatten ohne Fluoreszenzindikator,
Schichtdicke 0,25 mm (gebrauchsfertig im Handel erhältlich),
4.5.— Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 0,2 N: 13 g Kaliumhydroxid in
20 ml destilliertem Wasser lösen und mit Ethanol auf 1 l auffüllen,1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 13
▼B
4.6.— Benzol für die Chromatographie (siehe 5.2.2),
4.7.— Aceton für die Chromatographie (siehe 5.2.2),
4.8.— Hexan für die Chromatographie (siehe 5.2.2),
4.9.— Ethylether für die Chromatographie (siehe 5.2.2),
4.10.— Chloroform, analysenrein,
4.11.— Referenzlösung für die Dünnschichtchromatographie: 5%ige Lösung
von C20bis C28-Alkoholen in Chloroform,
4.12.—2 ′,7′-Dichlorfluorescein, 0,2%ige ethanolische Lösung, leicht alkalisch
durch Zusatz einiger Tropfen alkoholischer 2-N-Kaliumhydroxid-
Lösung,
4.13.— wasserfreies Pyridin für die Chromatographie,
4.14.— Hexamethyldisilazan,
4.15.— Trimethylchlorsilan,
4.16.— Standardlösung der Trimethylsilylether der aliphatischen Alkohole von
C20—C28, unmittelbar vor Gebrauchansetzen aus einer Misch ung der
reinen Alkohole,
4.17.— 1-Eicosanol, 0,1%ige Lösung (m/V) in Chloroform (interner Standard),
4.18.— Trägergase: Wasserstoff oder Helium, rein für die Gaschromatographie,
4.19.— Hilfsgase: Wasserstoff und Luft, rein, für die Gaschromatographie.
5. VERFAHREN
5.1.Herstellung des Unverseifbaren
5.1.1. Mit einer 500-µl-Mikroliterspritze so viel von der 0,1%igen 1-Eicosa-
nollösung in Chloroform (4.17) in einen 250-ml-Kolben geben, daß die
Menge an 1-Eicosanol (ebensogut kann ►C11-Heneicosanol ◄
verwendet werden) etwa 10 % des Gehalts an aliphatischen Alkoholen
des zur Analyse verwandten aliquoten Teils der Probe entspricht. So
werden z. B. für 5 g Olivenöl oder Samenöl 250 µl der 0,1%igen 1-
Eicosanollösung benötigt und für Oliventresteröl 1500 µl.
Die Probe im Stickstoffstrom bis zur Trocknung eindampfen. In den
gleichen Kolben genau 5 g der trockenen und filtrierten Probe
einwiegen.
5.1.2. Die Probe bei aufgesetztem Rückflußkühler mit 50 ml 2-N-ethanoli-
scher Kaliumhydroxidlösung versetzen, auf dem Wasserbad erhitzen
und unter kräftigem Schütteln und schwachem Sieden verseifen (wobei
die Lösung klar wird). Die Probe weitere 20 Minuten am Sieden halten
und dann durchden Rückflußküh ler mit 50 ml destilliertem Wasser
versetzen; den Rückflußkühler entfernen und den Kolben auf etwa
30 ºC abkühlen.
5.1.3. Den Kolbeninhalt quantitativ in einen 500-ml-Scheidetrichter über-
führen, wobei mehrfach mit insgesamt 50 ml destilliertem Wasser
nachgespült wird. Die Probe mit etwa 80 ml Ethylether versetzen, 30
Sekunden kräftig schütteln und absetzen lassen (Anmerkung 1).
Die wäßrige Phase in einen anderen Scheidetrichter ablassen und dann
noch zweimal nach dem gleichen Verfahren mit 60 — 70 ml Ethylether
extrahieren.
Anmerkung 1: Etwaige Emulsionen können mit Hilfe einer Waschfla-
sche durch Zusatz kleiner Mengen Ethylalkohol oder
Methylalkohol zerstört werden.
5.1.4. Die Etherauszüge in einem Scheidetrichter vereinigen und mehrmals
mit jeweils 50 ml destilliertem Wasser waschen, bis das Waschwasser
neutral reagiert.
Das Waschwasser ablassen, die Etherphase mit wasserfreiem Natrium-
sulfat trocknen und über wasserfreiem Natriumsulfat in einen zuvor
gewogenen 250-ml-Kolben filtrieren. Scheidetrichter und Filter mit
kleinen Mengen Ethylether nachspülen.
5.1.5. Den Ether bis auf wenige ml abdestillieren, den Rückstand unter
leichtem Vakuum oder im Stickstoffstrom trocknen, ¼ Stunde im Trok-
kenschrank bei 100 ºC nachtrocknen, im Exsikkator abkühlen lassen
und wiegen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 14
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5.2.Abtrennen der Alkoholfraktion
5.2.1. Herstellung der basischen Platten
Die Kieselgelplatten (4.4) vollständig ca. 10 Sekunden lang in eine
ethanolische 0,2-N-Kaliumhydroxidlösung (4.5) eintauchen, dann unter
einem Abzug 2 Stunden trocknen lassen, anschließend noch 1 Stunde
bei 100 ºC im Trockenschrank.
Die Platten aus dem Trockenschrank nehmen und in einem Exsikkator
über Calciumchlorid bis zum Gebrauch aufbewahren. (Derart behan-
delte Platten müssen innerhalb von 14 Tagen gebraucht werden.)
Anmerkung 2: Bei Verwendung von basischen Kieselgelplatten zur
Abtrennung der Alkoholfraktion erübrigt sich die
Behandlung des Unverseifbaren mit Aluminiumoxid.
Auf diese Weise bleiben sämtliche sauren Verbindungen
(Fettsäuren und andere) an der Startlinie. So erhält man
eine saubere Trennung der Zone der aliphatischen Alko-
hole und Terpenalkohole von den Sterinen.
5.2.2. Die Entwicklerkammer bis zu einer Höhe von etwa 1 cm mit einem
Benzol/Aceton-Gemisch95:5 (V/V) besch icken. Statt dessen kann
auch ein Hexan/Ethylether-Gemisch 65:35 (V/V) verwandt werden.
Die Kammer mit einem geeigneten Deckel verschließen und mindestens
eine halbe Stunde stehen lassen, damit sich ein Gleichgewicht zwischenFlüssigkeit und Dampfphase einstellt. An der Innenwand der Kammer
können Filterpapierstreifen befestigt werden, die in das Fließmittel
eintauchen. Dadurch kann die Laufzeit um ein Drittel verkürzt und
eine gleichmäßige Elution der Komponenten erzielt werden.
Anmerkung 3: Um gut reproduzierbare Trennungen zu erzielen, ist das
Gemischjedesmal frischanzusetzen.
5.2.3. Von einer 5%igen Lösung des Unverseifbaren (5.1.5) in Chloroform
mit einer 100-µl-Spritze 0,3 ml als durchgehenden, gleichmäßigen
Strich 2 cm vom unteren Plattenrand entfernt auf die Dünnschichtplatte
(5.2.1) auftragen. In der Verlängerung der Startlinie werden am Rande
2—3 µl der Standardlösung der aliphatischen Alkohole (4.11) aufge-
tragen, um die Alkoholzone nach der Entwicklung identifizieren zu
können.
5.2.4. Die Platte in die nach5.2.2 vorbereitete Entwicklerkammer stellen. Die
Temperatur der Umgebung sollte 15 — 20 ºC betragen. Die Kammer
mit dem Deckel verschließen und die Platte so lange entwickeln, bis
die Fließmittelfront bis 1 cm unter den oberen Plattenrand gestiegen
ist. Dann die Platte aus der Entwicklerkammer nehmen und das
Lösungsmittel in einem warmen Luftstrom abdampfen oder die Platte
eine geraume Zeit unter dem Abzug liegen lassen.
5.2.5. Die Platte vorsichtig und gleichmäßig mit 2 ′,7′-Dichlorfluoresceinlö-
sung besprühen. Die Lage der Zone der aliphatischen Alkohole mit
Hilfe des Flecks der Standardlösung bestimmen. Die Zone der aliphati-
schen Alkohole und die Zone der unmittelbar darüber liegenden
Terpenalkohole werden mit einem schwarzen Stift umrandet.
Anmerkung 4: Da unter den Bedingungen dieses Verfahrens die
Terpenalkohole beträchtliche Mengen an aliphatischen
Alkoholen enthalten, müssen beide Zonen zusammen
erfaßt werden.
5.2.6. Das in der markierten Zone liegende Kieselgel mit einem Metallspatel
abkratzen, fein mahlen und in einen Glasfiltertiegel (3.7) überführen.
Mit 10 ml warmem Chloroform versetzen, mit Hilfe des Metallspatels
gründlichvermisch en und unter Vakuum filtrieren. Das Filtrat in der
an den Glasfiltertiegel angeschlossenen Vakuumflasche (3.8) auffangen.
Den Rückstand im Glasfiltertiegel dreimal mit je 10 ml Ethylether
waschen und das Filtrat wiederum in der Vakuumflasche auffangen.
Das Filtrat bis auf ein Volumen von etwa 4—5 ml eindampfen und
den Rest der Lösung in das zuvor gewogene 10-ml-Probenglas (3.9)
überführen. Durch vorsichtiges Erhitzen unter einem schwachen Stick-
stoffstrom bis zur Tocknung eindampfen. Mit einigen Tropfen Aceton
versetzen, wieder bis zur Trocknung eindampfen, etwa 10 Minuten im
Trockenschrank auf 105 ºC erhitzen, anschließend im Exsikkator
abkühlen lassen und wiegen.
Der Rückstand in dem Probengläschen enthält die Fraktion der aliphati-
schen Alkohole.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 15
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5.3.Herstellung der Trimethylsilylether (TMSE)
5.3.1. Dem Probengläschen mit der Fraktion der aliphatischen Alkohole je
Milligramm aliphatischem Alkohol 50 µl Silanisierungsreagenz, beste-
hend aus einem Gemisch aus Pyridin, Hexamethyldisilazan und
Trimethylchlorsilan im Verhältnis 9:3:1 (V/V/V) (Anmerkung 5)
zusetzen. Dabei darf es nicht zur Aufnahme von Wasser kommen
(Anmerkung 6).
Anmerkung 5: Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich;
daneben gibt es auchandere Silanisierungsreagenzien,
wie beispielsweise N,O- bis -Trimethylsilyltrifluorace-
tamid + 1 % Trimethylchlorsilan, das mit gleichen
Teilen wasserfreiem Pyridin gemischt werden muß.
5.3.2. Das Probengläschen verschließen und gründlich, nicht zu stark schüt-
teln, bis sich die aliphatischen Alkohole gelöst haben. Die Probe
mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und dann
einige Minuten zentrifugieren. Die klare Lösung kann nun gaschromato-
graphisch untersucht werden.
Anmerkung 6: Die Beobachtung einer leichten Opaleszenz ist normal
und bedeutet keine Störung. Die Bildung eines weißen
Niederschlags oder der Eindruck einer Rosafärbung sind
Anzeichen der Anwesenheit von Feuchtigkeit oder der
Zersetzung des Reagens. In diesem Fall soll der Test
wiederholt werden.
5.4.Gaschromatographische Analyse
5.4.1. Vorarbeiten, Einfahren der Säule5.4.1.1. Die Säule in den Gaschromatographen einsetzen, wobei das Einlaßteil
an den mit dem Trennsystem verbundenen Verdampfer und das Auslaß-
teil an den Detektor angeschlossen wird. Überprüfung des
Gaschromatographen auf Dichtigkeit der Gasleitungen, Betriebsbereit-
schaft des Detektors, des Trennsystems, des Schreibers usw.
5.4.1.2. Wird die Säule zum erstenmal verwendet, ist es ratsam, sie einzufahren.
Einen schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromato-
graphen einschalten und allmählich auf eine Temperatur von
mindestens 20 ºC über der Arbeitstemperatur (Anmerkung 7) aufheizen.
Diese Temperatur ist mindestens 2 Stunden konstant zu halten, und
dann sind die Analysenbedingungen einzustellen (Gasstrom, Split,
Zünden der Flamme, Schreiberanschluß, Ofentemperatur, Injektor,
Detektor). Dann eine Empfindlichkeit wählen, die mindestens doppelt
so groß ist wie bei der Durchführung der Analyse. Die Grundlinie
muß linear verlaufen, ohne Peaks oder Drift.
Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluß der
Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule
hin.
Anmerkung 7: Die Einfahrtemperatur muß in jedem Fall 20 ºC unter
der für die stationäre Phase angegebenen Maximaltem-
peratur liegen.
5.4.2. Wahl der Arbeitsbedingungen
5.4.2.1. Anhaltspunkte für die Arbeitsbedingungen:
Säulentemperatur: anfangs isotherm 8 Minuten bei 180 ºC, dann stufen-
weise um 5 ºC pro Minute bis auf 260 ºC ansteigend, anschließend 15
Minuten bei 260 ºC;
Verdampfertemperatur: 280 ºC;Detektortemperatur: 290 ºC;Strömungsgeschwindigkeit des Trägergases: Helium 20—35 cm/s,
Wasserstoff 30—50 cm/s;
Splitverhältnis:
1/50—1/100;
Geräteempfindlichkeit: das 4- bis 16fache der Mindestdämpfung;Detektorempfindlichkeit: 1—2 mV f. s.;Papiervorschub: 30—60 cm/Std;
Einspritzvolumen: 0,5—1 µl TMSE-Lösung.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 16
▼B
Diese Bedingungen können entsprechend den Kenndaten der Säule und
des Gaschromatographen derart geändert werden, daß die damit aufge-
zeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen erfüllen:
— die Retentionszeit des C26-Alkohols muß 18 ± 5 Minuten betragen;
— der Peak des C22-Alkohols muß bei Olivenöl 80 ± 20 % und bei
Samenölen 40 ± 20 % der gesamten Skala erreichen.
5.4.2.2. Zur Überprüfung der vorstehenden Bedingungen werden wiederholt
Proben von TMSE-Alkohol-Gemischen eingespritzt und die Arbeitsbe-
dingungen optimiert.
5.4.2.3. Die Parameter für die Peak-Integration sind so zu wählen, daß für die in
Betracht kommenden Peaks korrekte Werte erzielt werden.
5.4.3. Durchführung der Analyse5.4.3.1. Mit der 10-µl-Mikroliterspritze 1 µl Hexan entnehmen, 0,5 µl Luft und
anschließend 0,5—1 µl Probenlösung aufziehen, dabei den Kolben der
Spritze so weit einziehen, daß die Nadel leer ist. Die Nadel in die
Membran des Injektors einführen, nach 1—2 Sekunden schnell
einspritzen, dann nachetwa 5 Sekunden die Nadel langsam h eraus-
ziehen.
5.4.3.2. Das Chromatogramm aufzeichnen, bis alle vorhandenen aliphatischen
Alkohole eluiert sind.
Die Grundlinie muß stets den vorgeschriebenen Anforderungen (5.4.1.2)
genügen.
5.4.4. Identifizierung der Peaks
Die einzelnen Peaks werden ahand der Retentionszeiten und durch
Vergleichmit dem unter denselben Bedingungen analysierten TSME-
Gemisch der aliphatischen Alkohole identifiziert.
Abbildung 1 zeigt ein Chromatogramm der Alkoholfraktion eines
nativen Ölivenöls.
5.4.5. Quantitative Bestimmung
5.4.5.1. Die Peakflächen von 1-Eicosanol und der aliphatischen Alkohole von
C
22bis C28werden mit Hilfe eines Integrators ermittelt.
5.4.5.2. Der Gehalt an den einzelnen aliphatischen Alkoholen in mg/100 g Fett
wird nachfolgender Formel berech net:
Alkohol x =Ax·ms· 100
As·m
Darin bedeuten:
Ax= Peakfläche des Alkohols x in mm2,
As= Peakfläche von 1-Eicosanol in mm2,
ms= zugesetzte Menge 1-Eicosanol in mg,
m = Menge der für die Bestimmung entnommenen Probe in g.
6. ERGEBNISSE
Der Gehalt an den einzelnen aliphatischen Alkoholen wird in mg/100 g
Fett angegeben und zum „Gesamtgehalt an aliphatischen Alkoholen“
addiert.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 17
▼B
ANLAGE
Bestimmung der linearen Strömungsgeschwindigkeit
In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatographen werden 1 bis
3 µl Methan (oder Propan) eingespritzt und die von dem Gas benötigte Durch-
laufzeit durchdie Säule vom Zeitpunkt des Einspritzens bis zum Peak-Austritt
(tM) gemessen.
Die lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tMdefiniert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tMdie gemessene Zeit in
Sekunden.
Abbildung 1: Chromatogramm der Alkoholfraktion eines nativen Olivenöls
1 = Eicosanol (int. Stand.),
►C12 = Docosanol, ◄
3 = Tricosanol,
4 = Tetracosanol,5 = Pentacosanol,6 = Hexacosanol,
7 = Heptacosanol,
8 = Octacosanol.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 18
▼B
ANHANG V
BESTIMMUNG DER ZUSAMMENSETZUNG UND DES GEHALTS AN
STERINEN MIT DER KAPILLAR — GASCHROMATOGRAPHIE
1. UMFANG UND ANWENDUNGSBEREICH
Diese Methode beschreibt das Verfahren zur Bestimmung der Sterinzu-
sammensetzung und des Steringehalts von Fetten.
2. KURZBESCHREIBUNG
Das Fett wird mit α-Cholestanol als innerem Standard versetzt und mit
ethanolischer Kaliumhydroxidlösung verseift. Die Sterinfraktion wird
aus dem Unverseifbaren dünnschicht-chromatographisch über basische
Kieselgelplatten abgetrennt.
Die aus dem Kieselgel isolierten Sterine werden in Trimethylsilylether
überführt und mit Hilfe der Kapillar-Gaschromatographie untersucht.
3. GERÄTE UND HILFSMITTEL
3.1. Kolben, 250 ml, mit Rückflußkühler und Schliffstopfen,
3.2. Scheidetrichter, 500 ml,
3.3. Kolben, 250 ml,3.4. komplette Apparatur für die Dünnschichtchromatographie mit Glas-
platten 20 × 20 cm,
3.5. UV-Lampe, Wellenlänge 366 oder 254 nm,
3.6. Mikroliterspritzen, 100 und 500 µl,3.7. Glasfiltertiegel mit Porenfilter G 3 (Porosität 15—40 µm), etwa 2 cm
Durchmesser, 5 cm Höhe, mit geeignetem Anschlußstück für die
Vakuumfiltration und Schliffmuffe 12/21,
3.8. Vakuumflasche, 50 ml, mit Schliffmuffe 12/21, für Glasfiltertiegel
(3.7),
3.9. 10-ml-Röhrchen mit konischem Boden und dicht schließendem Stopfen,3.10. Gaschromatograph, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen,
mit Splitsystem, bestehend aus:
3.10.1. einem thermostatisierbaren Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte
Temperatur mit einer Genauigkeit von ± 1 ºC,
3.10.2. einer temperaturregelbaren Verdampfereinrichtung mit Verdampfer aus
persilanisiertem Glas,
3.10.3. einem Flammenionisations-Detektor mit Verstärker,
3.10.4. einem Integrator mit Schreiber, mit Verstärker zu koppeln,
3.11. einer Kapillarsäule aus Glas oder fused silica, 20—30 m Länge,
0,25—0,32 mm Innendurchmesser, Innenwand belegt mit SE-52 oder
SE-54 oder einer gleichwertigen stationären Phase, Schichtdicke
0,10—0,30 µm,
3.12. Mikroliterspritze für die Gaschromatographie, 10 µl, mit gehärteter
Nadel.
4. REAGENZIEN
4.1. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 2 N: 130 g Kaliumhydroxid
(Titer mindestens 85 %) in 200 ml destilliertem Wasser unter Kühlen
lösen und mit Ethanol auf 1 Liter auffüllen. Die Lösung ist in gut
verschlossenen Braunglasflaschen haltbar (Ethanol 95 % V/V),
4.2. Ethylether, analysenrein,
4.3. wasserfreies Natriumsulfat, analysenrein,
4.4. kieselgelbeschichtete Glasplatten ohne Fluoreszenzindikator, Schicht-
dicke 0,25 mm (gebrauchsfertig im Handel erhältlich),
4.5. Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung 0,2 N: 13 g Kaliumhydroxid
werden in 20 ml destilliertem Wasser gelöst und mit Ethanol auf 1 Liter
aufgefüllt,1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 19
▼B
4.6. Benzol für die Chromatographie (siehe 5.2.2),
4.7. Aceton für die Chromatographie (siehe 5.2.2),4.8. Hexan für die Chromatographie (siehe 5.2.2),4.9. Ethylether für die Chromatographie (siehe 5.2.2),4.10. Chloroform, analysenrein,4.11. Referenzlösung für die Dünnschichtchromatographie: Cholesterin oder
Phytosterole, 5 % ige Lösung in Chloroform,
4.12. 2 ′,7′-Dichlorfluorescein, 0,2%ige ethanolische Lösung, leicht alkalisch
durch Zusatz einiger Tropfen alkoholischer 2-N-Kaliumhydroxid-
Lösung,
4.13. wasserfreies Pyridin für die Chromatographie,4.14. Hexamethyldisilazan,
4.15. Trimethylchlorsilan,
4.16. Standardlösung von Sterin-Trimethylsilylethern unmittelbar vor
Gebrauchansetzen mit reinen Sterinen oder Sterinmisch ungen aus
Ölen, in denen sie enthalten sind,
4.17. α-Cholestanol, 0,2%ige Lösung (m/V) in Chloroform (interner
Standard),
4.18. Trägergas: Wasserstoff oder Helium, rein, für die Gaschromatographie,4.19. Hilfsgase: Wasserstoff und Luft, rein, für die Gaschromatographie.
5. VERFAHREN
5.1.Herstellung des Unverseifbaren
5.1.1. Mit einer 500-µl-Mikroliterspritze so viel der 0,2%igen α-Cholesta-
nollösung in Chloroform (4.17) in einen 250-ml-Kolben geben, daß die
Menge an Cholestanol etwa 10 % des Steringehalts des zur Analyse
verwandten aliquoten Teils der Probe entspricht. So werden z. B. für
5 g Olivenöl 500 µl der 0,2%igen α-Cholestanollösung benötigt,
1 500 µl für Samenöle oder Oliventresteröl. Im Stickstoffstrom bis zur
Trocknung abdampfen. In den gleichen Kolben genau 5 g der trockenen
und filtrierten Probe einwiegen.
Bei tierischen und pflanzlichen Fetten, die größere Mengen an Chole-
sterin enthalten, kann ein Peak mit der gleichen Retentionszeit wie
Cholestanol auftreten. In diesem Fall ist die Sterinfraktion einmal mit
und einmal ohne internen Standard zu analysieren.
5.1.2. Die Probe bei aufgesetztem Rückflußkühler mit 50 ml 2-N-ethanoli-
scher Kaliumhydroxidlösung versetzen, auf dem Wasserbad erhitzen
und unter kräftigem Schütteln und schwachem Sieden verseifen (wobei
sichdie Lösung klärt). Die Probe weitere 20 Minuten am Sieden h alten
und dann durchden Rückflußküh ler mit 50 ml destilliertem Wasser
versetzen, den Rückflußkühler entfernen und den Kolben auf etwa
30 ºC abkühlen.
5.1.3. Den Kolbeninhalt quantitativ in einen 500-ml-Scheidetrichter über-
führen, wobei mehrfach mit insgesamt 50 ml destilliertem Wasser
nachgespült wird. Die Probe mit etwa 80 ml Ethylether versetzen, 30
Sekunden kräftig schütteln und absetzen lassen (vgl. Hinweis 1).
Die wäßrige Phase in einen anderen Scheidetrichter ablassen und dann
noch zweimal nach dem gleichen Verfahren mit 60—70 ml Ethylether
extrahieren.
Hinweis 1: Etwaige Emulsionen können mit Hilfe einer Waschflasche
durch Zusatz kleiner Mengen Ethyl- oder Methylalkohol
zerstört werden.
5.1.4. Die Etherauszüge in einem Scheidetrichter vereinigen und mehrmals
mit jeweils 50 ml destilliertem Wasser waschen, bis das Waschwasser
neutral reagiert.
Das Waschwasser ablassen, die Etherphase mit wasserfreiem Natrium-
sulfat trocknen, über wasserfreiem Natriumsulfat in einen zuvor
gewogenen 250-ml-Kolben filtrieren. Scheidetrichter und Filter mit
kleinen Mengen Ethylether nachspülen.
5.1.5. Den Ether bis auf wenige ml abdestillieren, den Rückstand unter
leichtem Vakuum oder im Stickstoffstrom trocknen, ¼ Stunde im Trok-1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 20
▼B
kenschrank bei 100 ºC nachtrocknen, im Exsikkator abkühlen lassen
und wiegen.
5.2.Trennung der Sterinfraktion
5.2.1. Herstellung der basischen Platten
Die Kieselgelplatten (4.4) vollständig ca. 10 Sekunden lang in eine 0,2-
N-ethanolische Alkalihydroxidlösung (4.5) eintauchen, dann unter
einem Abzug 2 Stunden trocknen lassen, anschließend noch 1 Stunde
bei 100 ºC im Trockenschrank.
Die Platten aus dem Trockenschrank nehmen und in einem Exsikkator
über Calciumchlorid bis zum Gebrauch aufbewahren. (Derart behan-
delte Platten müssen innerhalb von 15 Tagen gebraucht werden.)
Hinweis 2: Bei Verwendung von alkalischen Kieselgelplatten zur Tren-
nung der Sterinfraktion erübrigt sichdie Beh andlung des
Unverseifbaren mit Aluminiumoxid. Auf diese Weise
bleiben sämtliche sauren Verbindungen (Fettsäuren und
andere) an der Startlinie. So erhält man eine saubere Tren-
nung der Sterinzone von denen der aliphatischen Alkohole
und Terpenalkohole.
5.2.2. Die Entwicklerkammer bis zu einer Höhe von etwa 1 cm mit einem
Benzol/Aceton-Gemisch95:5 (V/V) besch icken. Statt dessen kann
auch ein Hexan/Ethylether-Gemisch 65:35 (V/V) verwandt werden.
Die Kammer mit einem geeigneten Deckel verschließen und mindestens
eine halbe Stunde stehen lassen, damit sich ein Gleichgewicht zwischen
Flüssigkeit und Dampfphase einstellt. An der Innenwand der Kammer
können Filterpapierstreifen befestigt werden, die in das Fließmittel
eintauchen. Dadurch kann die Laufzeit um ein Drittel verkürzt und
eine gleichmäßige Elution der Komponenten erzielt werden.
Hinweis 3: Das Gemischist jedesmal frischanzusetzen, damit die
Wiederholbarkeit gewährleistet ist.
5.2.3. Von einer 5%igen Lösung des Unverseifbaren (5.1.5) in Chloroform
mit einer 100-µl-Spritze 0,3 ml als durchgehenden, gleichmäßigen
Strich 2 cm vom unteren Plattenrand entfernt auf die Dünnschichtplatte
(5.2.1) auftragen. In der Verlängerung der Startlinie werden am Rande
2—3 µl der Sterin-Standardlösung (4.11) aufgetragen, um die Sterin-
zone nachder Entwicklung zu identifizieren.
5.2.4. Die Platte in die nach5.2.2 vorbereitete Entwicklerkammer stellen. Die
Temperatur der Umgebung sollte 15—20 ºC betragen. Die Kammer mit
dem Deckel verschließen und die Platte so lange entwickeln, bis die
Fließmittelfront bis 1 cm unter den oberen Plattenrand gestiegen ist.
Dann die Platte aus der Entwicklerkammer nehmen und das Lösungs-
mittel in einem warmen Luftstrom abdampfen oder die Platte eine
geraume Zeit unter dem Abzug liegen lassen.
5.2.5. Die Platte vorsichtig und gleichmäßig mit 2 ′,7′-Dichlorfluoresceinlö-
sung besprühen. Die Lage der Sterinzone mit Hilfe des Flecks der
Standardlösung bestimmen und mit einem schwarzen Stift den fluores-
zierenden Bereichmarkieren.
5.2.6. Das in der markierten Zone liegende Kieselgel mit einem Metallspatel
abkratzen, fein mahlen und in einen Glasfiltertiegel (3.7) überführen.
Mit 10 ml warmem Chloroform versetzen, mit Hilfe des Metallspatelsgründlichvermisch en und unter Vakuum filtrieren. Das Filtrat in der
an dem Glasfiltertiegel angeschlossenen Vakuumflasche (3.8)
auffangen.
Den Rückstand im Glasfiltertiegel dreimal mit je 10 ml Ethylether
waschen und das Filtrat wiederum in der Vakuumflasche auffangen.
Das Filtrat bis auf ein Volumen von etwa 4—5 ml eindampfen und
den Rest der Lösung in das zuvor gewogene 10-ml-Probenglas (3.9)
überführen. Durch vorsichtiges Erhitzen unter einem schwachen Stick-
stoffstrom bis zur Trocknung eindampfen. Mit einigen Tropfen Acetonversetzen, wieder bis zur Trocknung eindampfen, etwa 10 Minuten im
Trockenschrank auf 105 ºC erhitzen, anschließend im Exsikkator
abkühlen lassen und wiegen.
Der Rückstand in dem Probengläschen besteht aus der Sterinfraktion.
5.3.Herstellung der Trimethylsilylether (TMSE)
5.3.1. Dem Probengläschen mit der Sterinfraktion werden je Milligramm
Sterin 50 µl Silanisierungsreagenz, bestehend aus einem Gemisch aus
Pyridin, Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan im Verhältnis1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 21
▼B
9:3:1 (V/V/V), zugesetzt (Hinweis 4) unter Ausschluß von Feuchtigkeit
(Hinweis 5).
Hinweis 4: Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich;
daneben gibt es auchandere Silanisierungsreagenzien, z.
B. N,O-bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % Trime-
thylchlorsilan, das mit gleichen Teilen wasserfreiem
Pyridin gemischt werden muß.
5.3.2. Das Probengläschen verschließen und gründlich (nicht zu stark) schüt-
teln, bis sichdie Sterine gelöst h aben. Die Probe mindestens 15
Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und dann einige Minuten
zentrifugieren. Die klare Lösung kann gaschromatographisch untersucht
werden.
Hinweis 5: Die Beobachtung einer leichten Opaleszenz ist normal und
bedeutet keine Störung. Die Bildung eines weißen Nieder-
schlags oder der Eindruck einer Rosafärbung sind
Anzeichen der Anwesenheit von Feuchtigkeit oder der
Zersetzung des Reagens. In diesem Fall soll der Test
wiederholt werden.
5.4.Gaschromatographische Analyse
5.4.1. Vorbereiten, Einfahren der Säule
5.4.1.1. Die Säule in den Gaschromatographen einsetzen, wobei das Einlaßteil
an den mit dem Trennsystem verbundenen Verdampfer und das Auslaß-
teil an den Detektor angeschlossen wird.
Überprüfung des Gaschromatographen (Dichtigkeit der Gasleitungen,
Betriebsbereitschaft des Detektors, des Trennsystems, des Schreibers
usw.).
5.4.1.2. Wird die Säule zum erstenmal verwendet, ist es ratsam, sie einzufahren.
Einen schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromato-
graphen einschalten und allmählich auf eine Temperatur von
mindestens 20 ºC über der Arbeitstemperatur (Hinweis 6) aufheizen.
Diese Temperatur ist mindestens 2 Stunden konstant zu halten, und
dann sind die Analysenbedingungen einzustellen (Gasstrom, Split,
Zünden der Flamme, Schreiberanschluß, Einstellen der Ofentemperatur,
Injektor, Detektor). Dann eine Empfindlichkeit wählen, die mindestens
doppelt so groß ist wie bei der Durchführung der Analyse. Die Grund-
linie muß linear verlaufen, ohne Peaks oder Drift.
Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluß der
Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule
hin.
Hinweis 6: Die Einfahrtemperatur muß in jedem Fall 20 ºC unter der
für die stationäre Phase angegebenen Maximaltemperatur
liegen.
5.4.2. Wahl der Arbeitsbedingungen
5.4.2.1. Anhaltspunkte für die Arbeitsbedingungen:
Säulentemperatur: 260 ºC ± 5 ºC,Verdampfertemperatur: 280 ºC,
Detektortemperatur: 290 ºC,
Strömungsgeschwindigkeit: Helium 20—35 cm/s; Wasserstoff
30—50 cm/s,
Splitverhältnis: 1:50—1:100,
Geräteempfindlichkeit: das 4- bis 16fache der Mindestdämpfung,Detektorempfindlichkeit: 1—2 mV f. s.,
Papiervorschub: 30—60 cm/Std.,
Einspritzvolumen: 0,5—1 µl TMSE-Lösung.Diese Bedingungen können entsprechend den Charakteristiken der
Säule und des Gaschromatographen derart geändert werden, daß die
damit aufgezeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen
erfüllen:
— die Retentionszeit von β-Sitosterin muß 20 ± 5 Minuten betragen;1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 22
▼B
— der Campesterin-Peak muß bei Olivenöl (Durchschnittsgehalt 3 %)
15 ± 5 % des Skalenbereichs und bei Sojaöl (Durchschnittsgehalt
20 %) 80 ± 10 % des Skalenbereichs betragen;
— alle enthaltenen Sterine müssen getrennt werden; die anderen Peaks
müssen ebenfalls völlig aufgelöst sein, d. h. der Peakverlauf muß
auf die Grundlinie zurückführen, bevor der nächste Peak beginnt;
eine unvollständige Auflösung ist nur unter der Bedingung akzep-
tabel, daß der RRT-1,02-Peak mit Hilfe der Senkrechten quantitativ
zu bestimmen ist.
5.4.3. Durchführung der Analyse5.4.3.1. Mit der 10-µl-Mikroliterspritze 1 µl Hexan entnehmen, 0,5 µl Luft und
anschließend 0,5—1 µl Probenlösung aufziehen; dabei den Kolben der
Spritze so weit einziehen, daß die Nadel leer ist. Die Nadel in die
Membran des Injektors einführen, nach 1—2 Sekunden schnell
einspritzen, dann nachetwa 5 Sekunden die Nadel langsam h eraus-
ziehen.
5.4.3.2. Das Chromatogramm aufzeichnen, bis alle Sterin-TMS-Ether eluiert
sind.
Die Grundlinie muß stets den vorgeschriebenen Anforderungen (5.4.1.2)
genügen.
5.4.4. Identifizierung der Peaks
Die einzelnen Peaks werden anhand der Retentionszeiten und durch
Vergleichmit dem unter denselben Bedingungen analysierten TSME-
Gemischder Sterine bestimmt.
Die Sterine werden in folgender Reihenfolge eluiert: Cholesterin, Bras-
sicasterin, 24-Methylen-Cholesterin, Campesterin, Campestanol,
Stigmasterin, ∆7-Campesterin, ∆5, 23-Stigmastadienol, Chlerosterin, β-
Sitosterin, Sitostanol, ∆5-Avenasterin, ∆5, 24-Stigmastadienol, ∆7-Stig-
mastenol, ∆7-Avenasterin.
In Tabelle I sind die Retentionszeiten relativ zu β-Sitosterin für eine
SE-52- und SE-54-Säule aufgeführt.
Die Abbildungen 1 und 2 zeigen die typischen Chromatogramme
einiger Öle.
5.4.5. Quantitative Bestimmung5.4.5.1. Mit Hilfe des Integrators werden die Peak-Flächen von α-Cholestanol
und der Sterine berechnet. Dabei sind etwa auftretende Peaks von
Substanzen, die in Tabelle I nicht aufgeführt sind, nicht zu berücksich-
tigen. Der Responsefaktor von ►
C1α-Cholestanol ◄soll gleich1,00
gesetzt werden.
5.4.5.2. Der Gehalt an den einzelnen Sterinen in mg/100 g Fett wird nach
folgender Formel berechnet:
Sterin x =Ax·ms· 100
As·m
Darin bedeuten:
Ax= Peakfläche des Sterins x in mm2,
As= Peakfläche von α-Cholestanol in mm2,
ms= zugesetzte Menge an α-Cholestanol in mg,
m = Menge der für die Bestimmung entnommenen Probe in g.
6. ERGEBNISSE
6.1. Der Gehalt an den einzelnen Sterinen wird in mg/100 g Öl angegeben,
ihre Summe als „Gesamtsterine“.
6.2. Der prozentuale Anteil jedes einzelnen Sterins errechnet sich aus dem
Quotienten der Peakfläche des entsprechenden Peaks und der Summe
der Peakflächen aller Sterine nach der Formel
►C1% Sterin x = ◄Ax
ΣA. 1001991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 23
▼B
Darin bedeuten:
Ax= Peakfläche des Sterins x,
ΣA = Summe der Peakfläche aller Sterine.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 24
▼B
ANLAGE
Bestimmung der linearen Strömungsgeschwindigkeit
In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatographen werden 1 bis
3 µl Methan (oder Propan) eingespritzt und bis zum Peak-Austritt (tM) gemessen.
Die lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tMdefiniert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tMdie gemessene Zeit in
Sekunden.
Tabelle I
Relative Retentionszeit der Sterine
Pe-
akIdentifizierungRelative Retentions-
zeit
SE 54 SE 52
1 Cholesterin ∆-5-Cholesten-3 β-ol 0,67 0,63
2 Cholestanol 5 α-Cholestan-3 β-ol 0,68 0,64
3 Brassicasterin [24S]-24-Methyl- ∆-5,22-cholestadien-3 β-ol 0,73 0,71
4 24-Methylen-Cholesterin 24-Methylen- ∆-5,24-cholestadien-3 β-ol 0,82 0,80
5 Campesterin [24R]-24-Methyl- ∆-5-cholesten-3 β-ol 0,83 0,81
6 Campestanol [24R]-24-Methyl-cholestan-3 β-ol 0,85 0,82
7 Stigmasterin [24R]-24-Ethyl- ∆-5,22-cholestadien-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆-7-Campesterol [24R]-24-Methyl- ∆-7-cholesten-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆-5,23-Stigmastadienol [24R,S]-24-Ethyl- ∆-5,23-cholestadien-3 β-ol 0,95 0,95
10 Chlerosterin [24S]-24-Ethyl- ∆-5,25-cholestadien-3 β-ol 0,96 0,96
11►C1B-Sitosterin ◄► C1[24R]-24-Ethyl- ∆-5-cholestan-3B-
ol◄1,00 1,00
12►C1Sitostanol ◄► C124-Ethyl-cholestan-3B-ol ◄ 1,02 1,02
13 ∆-5-Avenasterin [24Z]-24-Ethyliden- ∆-5-cholesten-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆-5,24-Stigmastadienol [24S,R]-24-Ethyl- ∆-5,24-cholestadien-3 β-ol 1,08 1,08
15 ∆-7-Stigmastenol [24S,R]-24-Ethyl- ∆-7,24-cholestadien-3 β-ol 1,12 1,12
16 ∆-7-Avenasterin [24Z]-24-Ethyliden- ∆-7-cholesten-3 β-ol 1,16 1,161991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 25
▼B
Abbildung 1
Gaschromatogramm der Sterinfraktion von rohem Oivenöl
1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 26
▼B
Abbildung 2
Gaschromatogramm der Sterinfraktion von raffiniertem Olivenöl
1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 27
▼B
ANHANG VI
BESTIMMUNG DES ERYTHRODIOLS UND DES UVAOLS
EINLEITUNG
Das (üblicherweise als Summe von Erythrodiol und Uvaol angegebene)
Erythrodiol ist ein Bestandteil des Unverseifbaren, das für verschiedene
Fette charakteristisch ist. Seine Konzentration ist in extrahierten
Olivenölen erheblich höher als in anderen Ölen (Olivenöl aus Pressung,
Traubenkernöl), in denen es auch vorkommt. Deshalb kann es zum Nach-
weis für das Vorhandensein von extrahiertem Olivenöl dienen.
1. ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH
Die Methode beschreibt ein Verfahren für die Bestimmung des Erythro-
diolgehalts in Fetten.
2. PRINZIP DER METHODE
Das Fett wird mit einer ethanolischen Kaliumhydroxidlösung verseift,
dann das Unverseifbare mit Ethylether extrahiert und über eine Aluminiu-
moxidsäule gereinigt.
Die Fraktionierung des Unverseifbaren wird durch Dünnschichtchromato-
graphie auf Kieselgelplatten durchgeführt, anschließend werden die
Zonen der Sterinfraktion und der Erythrodiolfraktion isoliert. Die von
der Platte isolierten Sterine und das Erythrodiol werden in Trimethylsily-
lether überführt, dann wird die Mischung gaschromatographisch
untersucht. Das Ergebnis wird angegeben als Prozent Erythrodiol der
Gesamtmenge von Erythrodiol plus Sterine.
3. GERÄTE
3.1. Die im Anhang V (Bestimmung des Steringehalts) beschriebenen Geräte.
4. REAGENZIEN
4.1. Die im Anhang V (Bestimmung des Steringehalts) vorgeschriebenen
Reagenzien.
4.2. Referenzlösung von 0,5 % Erythrodiol in Chloroform.
5. VERFAHREN
5.1.Herstellung des Unverseifbaren
Es wird gemäß 5.1.2 des in Anhang V beschriebenen Verfahrens vorge-
gangen.
5.2.Abtrennung des Erythrodiols und der Sterine
5.2.1. Vergleiche 5.2.1 in Anhang V.
5.2.2. Vergleiche 5.2.2 in Anhang V.5.2.3. Eine 5%ige Lösung des Unverseifbaren in Chloroform herstellen. Mit
einer 0,1-ml-Mikroliterspritze 0,3 ml dieser Lösung auf eine Dünnschicht-
platte 1,5 cm vom unteren Plattenrand entfernt in einem möglichst
dünnen und gleichmäßigen Strich auftragen. An einem Ende der Platte
werden als Referenzsubstanzen einige Mikroliter der Lösungen von
Cholesterin und Erythrodiol aufgetragen.
5.2.4. Die Platte in die nach5.2.2 vorbereitete Entwicklerkammer geben. Die
Raumtemperatur soll etwa 20 ºC betragen. Die Kammer sofort mit dem
Deckel verschließen und so lange entwickeln, bis die Lösungsmittelfront
1 cm unter dem oberen Plattenrand angekommen ist. Die Platte aus der
Entwicklerkammer nehmen und das Lösungsmittel in einem warmen
Luftstrom abdampfen.
5.2.5. Die Platte gleichmäßig mit der alkoholischen 2 ′,7′-Dichlorfluoresceinlö-
sung besprühen. Unter UV-Licht den Verlauf der Sterin- und
Erythrodiolzone an Hand der Referenzsubstanzen identifizieren und etwas
außerhalb der fluoreszierenden Zonen markieren.
5.2.6. Die markierten Kieselgelzonen mit einem Metallspatel abkratzen. Das
von der Platte isolierte Material in ein 50-ml-Becherglas geben, 15 ml1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 28
▼B
warmes Chloroform zugeben, gut schütteln und in einen Glasfiltertiegel
füllen. Dreimal mit je 10 ml warmem Chloroform auswaschen und die
Filtrate in einem 100-ml-Rundkolben sammeln. Bis auf ein Volumen
von 4—5 ml eindampfen, in ein vorher gewogenes, konisches 10-ml-
Zentrifugenröhrchen geben, im warmen Stickstoffstrom trocknen und
anschließend wiegen.
5.3. Herstellung der Trimethylsilylether
Nach dem in Anhang V unter 5.3 beschriebenen Verfahren vorgehen.
5.4. Gaschromatographische Analyse
Nach der Beschreibung unter 5.4 des vorgenannten Verfahrens vorgehen.Die Bedingungen der gaschromatographischen Analyse müssen so
gewählt werden, daß nicht nur die TMS-Ether der Sterine, sondern auch
die TMS-Ether von Erythrodiol und Uvaol getrennt werden.
Nachdem Einspritzen das Sch reiberpapier ablaufen lassen, bis alle
Sterine, Erythrodiol und Uvaol eluiert sind. Identifizieren der Peaks
(Erythrodiol und Uvaol haben im Vergleich zu β-Sitosterin relative
Retentionszeiten von etwa 1,45 und 1,55) und Berechnung der Flächen-
prozente, wie für Sterine beschrieben.
6. ABFASSUNG DER ERGEBNISSE
% Erythrodiol =A
1+A2
A1+A2+ΣASterine× 100
Hierin bedeuten:
A1= Fläche des Erythrodiolpeaks in mm2,
A2= Fläche des Uvaolpeaks in mm2,
ΣASterine= Summe der vorhandenen Sterinpeaks in mm2.
Das Ergebnis wird mit einer Dezimale nachdem Komma angegeben.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 29
▼B
ANHANG VII
BESTIMMUNG VON FETTSÄUREN IN 2-STELLUNG DER TRIGLYCE-
RIDE
1. ZWECK
Diese Methode beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Zusammen-
setzung des Teils der Fettsäuren eines Öles oder Fettes, die in 2-Stellung
(βoder innere Stellung) des Glycerins verestert sind.
2. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Methode gilt für Öle und Fette mit einem Schmelzpunkt unter 45 ºC,
bedingt durchdie Besonderh eiten der Wirkungsweise der Pankreaslipase.
Sie ist nicht uneingeschränkt anwendbar auf Öle und Fette mit höheren
Anteilen an Fettsäuren mit zwölf oder weniger Kohlenstoffatomen
(Kokos- und Palmkernöl, Butterfett), hoch ungesättigten Fettsäuren (mit
mehr als vier Doppelbindungen), die zwanzig oder mehr Kohlenstoff-
atome enthalten (Fisch- und Seetieröle), oder Fettsäuren mit
sauerstoffhaltigen Gruppen außer der Säuregruppe.
3. PRINZIP
Wenn nötig, Neutralisierung von sauren Ölen und Fetten in einem
Lösungsmittel. Reinigung über eine Aluminiumoxidsäule. Teilhydrolyse
der Triglyceride durchPankreaslipase in einer vorgegebenen Zeit. Abtren-
nung der gebildeten Monoglyceride durch Dünnschichtchromatographie
und Umesterung dieser Monoglyceride mit Methanol. Die gewonnenen
Methylester werden gaschromatographisch analysiert.
4. GERÄTE
4.1. 100-ml-Rundkolben.4.2. 25-ml-Rundkolben mit Schliff.4.3. 1 m langes Steigrohr mit Schliffansatz für den Kolben 4.2.4.4. 250-ml-Kolben.4.5. 50-ml-Becherglas.4.6. 500-ml-Scheidetrichter.4.7. Glassäule für die Säulenchromatographie, 13 mm Innendurchmesser,
400 mm Länge, mit Hahn und gläsernem Frittenboden.
4.8. 10-ml-Zentrifugenglas, mit Schliffstopfen.
4.9. 5-ml-Bürette, Graduierung 0,05 ml.4.10. 1-ml-Injektionsspritze, mit dünner Kanüle.4.11. Mikroliterspritze, zur Abgabe von Tropfen von jeweils 3—4 µl.4.12. Beschichtungsgerät für Dünnschichtplatten.4.13. Glasplatten für Dünnschichtchromatographie, 20 × 20 cm.4.14. Entwicklerkammer für die Dünnschichtchromatographie, mit Schliffrand,
für 20 × 20 cm Platten.
4.15. Sprüher für die Dünnschichtchromatographie.4.16. Trockenschrank, einstellbar auf 103 ± 2 ºC.
4.17. Thermostat, regulierbar zwischen 30 und 45 ºC ± 0,5 ºC.
4.18. Rotationsverdampfer.4.19. Elektrisches Schüttel- und Vibriergerät zum kräftigen Schütteln des
Zentrifugenglases.
4.20. Ultraviolettlampe zur Betrachtung der Dünnschichtplatten.
Und für die Kontrolle der Lipasetätigkeit:
4.21. Ein pH-Meßgerät.
4.22. Propellerrührer.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 30
▼B
4.23. 5-ml-Bürette.
4.24. Stoppuhr.
Und für die eventuelle Zubereitung der Lipase:
4.25. Laborrührgerät zum Zerkleinern und Mischen heterogener Materialien.
5. REAGENZIEN
5.1. n-Hexan oder, falls nicht verfügbar, Petrolether (Kp. 30—50 ºC), für die
Chromatographie.
5.2. 2-Propanol oder Ethanol 95 %ig (V/V), analytisch rein.
5.3. 2-Propanol oder Ethanol, 1:1 wäßrige Lösung.5.4. Diethylether, peroxidfrei.
5.5. Aceton.
5.6. Ameisensäure, mindestens 98 %ig (m/m).5.7. Fließmittel: Mischung aus n-Hexan (5.1), Diethylether (5.4) und Ameisen-
säure (5.6) im Verhältnis von 70:30:1 (V/V/V).
5.8. Aktiviertes Aluminiumoxid für die Chromatographie, neutral, Aktivi-
tätsstufe Brockmann 1.
5.9. Kieselgel, mit Bindemittel für die Dünnschichtchromatographie.5.10. Pancreaslipase mit ausreichender Aktivität (Anmerkungen 1 und 2).
5.11. Natriumhydroxid, 120 g/l wäßrige Lösung.
5.12. Salzsäure, 6 N.5.13. Kalziumchlorid (CaCl
2), 220 g/l wäßrige Lösung.
5.14. Natriumcholat (Enzymqualität), 1 g/l wäßrige Lösung.
5.15. Pufferlösung: 1 M wäßrige Lösung von tris-Hydroxymethylaminomethan
durchZusatz von Salzsäure (5.12) auf pH 8 gebrach t (durchPotentiometer
überprüfen).
5.16. Phenolphthalein, Lösung von 10 g/l in 95 %igem (V/V) Ethanol.
5.17. 2′,7′-Dichlorfluorescein, Lösung von 2 g/l in 95 %igem (V/V) Ethanol,
schwach alkalisch durch Zusatz eines Tropfens 1-N-Natriumhydroxidlö-
sung pro 100 ml.
Und für die Kontrolle der Lipasetätigkeit:
5.18. Neutralisiertes Öl.5.19. Natriumhydroxid, 0,1 N wäßrigre Lösung.
5.20. Natriumcholat (Enzymqualität), wäßrige Lösung von 200 g/l.
5.21. Gummiarabikum, wäßrige Lösung von 100 g/l.
6. VORBEREITUNG DER PROBE
Liegt der Gehalt an freien Fettsäuren nach einer Bestimmung gemäß
Anhang II unter 3 %, so ist direkt über Aluminiumoxid, wie unter 6.2
beschrieben, zu reinigen. Weist die Probe einen Gehalt an freien Fett-
säuren von über 3 % gemäß Anhang II auf, so ist sie in Gegenwart eines
Lösungsmittels gemäß 6.1 mit Alkali zu neutralisieren und dann über
Aluminiumoxid gemäß 6.2 zu geben.
6.1.Neutralisierung durch Alkali in Gegenwart eines Lösungsmittels
Etwa 10 g rohes Öl in einen Scheidetrichter (4.6) geben und 100 ml
Hexan (5.1), 50 ml 2-Propanol (5.2), einige Tropfen Phenolphthaleinlö-
sung (5.16) und so viel Natriumhydroxidlösung (5.11) hinzufügen, wie
dem Gehalt des Öls an freien Fettsäuren zuzüglich 0,3 % Überschuß
entspricht. Eine Minute lang kräftig schütteln, 50 ml destilliertes Wasser
zugeben, erneut schütteln und absetzen lassen.
Nach dem Absetzen die untere, die Seifen enthaltende Schicht sowie
etwaige Zwischenschichten (Schleim, unlösliche Stoffe) entfernen. Die
Hexanlösung des neutralisierten Öls mehrmals mit25—30 ml der 2-Propa-
nollösung (5.3) waschen, bis die Rosafärbung des Phenolphthaleins
verschwindet.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 31
▼B
Den größten Teil des Hexans unter Vakuum im Rotationsverdampfer
(4.18) abdestillieren, das Öl bei 30—40 ºC unter Vakuum in einem Stick-
stoffstrom trocknen, bis das Hexan vollständig entfernt ist.
6.2.Reinigung über Aluminiumoxid
Eine Suspension von 15 g aktiviertem Aluminiumoxid (5.8) in 50 ml
Hexan (5.1) herstellen und unter Rühren in die Chromatographiesäule
(4.7) gießen. Das Aluminiumoxid gleichmäßig absetzen lassen und
warten, bis das Lösungsmittel auf 1—2 mm über dem Absorptionsmittel
abgelaufen ist. Auf die Säule vorsichtig eine Lösung von 5 g Öl in 25 ml
Hexan (5.1) gießen; die gesamte aus der Säule ablaufende Flüssigkeit in
einem Rundkolben (4.1) sammeln.
7. HERSTELLUNG DER DÜNNSCHICHTPLATTEN
Die Glasplatten (4.13) sorgfältig mit Ethanol, Petrolether und Aceton
reinigen, um jeden Fettrest zu beseitigen. In einen Erlenmeyerkolben
(4.4) 30 g Kieselgel (5.9) geben, 60 ml destilliertes Wasser hinzufügen,
verschließen und eine Minute kräftig schüttteln. Die Suspension sofort in
das Beschichtungsgerät (4.12) geben und eine 0,25 mm dicke Schicht auf
die Platten auftragen. Die Platten 15 Minuten an der Luft und eine Stunde
im Trockenschrank (4.16) bei 103 ± 2 ºC trocknen. Die Platten vor
Verwendung in einem Exsikkator auf Raumtemperatur abkühlen.
Fertigplatten sind im Handel erhältlich.
8. VERFAHREN8.1.Hydrolyse durch Pancreaslipase
In das Zentrifugenglas (4.8) etwa 0,1 g der vorbereiteten Probe einwiegen;
handelt es sich um ein festes Fett, muß es in 0,2 ml Hexan (5.1), evtl.
unter schwachem Erwärmen, gelöst werden.
20 mg Lipase (5.10) und 2 ml der Pufferlösung (5.15) hinzufügen.
Sorgfältig und vorsichtig schütteln und dann 0,5 ml der Natriumcholatlö-
sung (5.14) und 0,2 ml der Kalziumchloridlösung (5.13) hinzufügen. Das
Glas mit dem Schliffstopfen verschließen, vorsichtig schütteln
(Befeuchten des Stopfens vermeiden), das Glas sofort bei 40 ± 0,5 ºC in
den Thermostaten (4.17) stellen und genau eine Minute mit der Hand
schütteln.
Das Glas aus dem Thermostaten nehmen und mit Hilfe des Vibriergeräts
(4.19) genau 2 Minuten lang kräftig schütteln.
Sofort in fließendem Wasser abkühlen; 1 ml Salzsäure (5.12) und 1 ml
Diethylether (5.4) hinzufügen. Verschließen und kräftig mit dem elektri-
schen Schüttelgerät schütteln. Stehen lassen und die organische Phase
mit Hilfe der Spritze (4.10), gegebenenfalls nachZentrifugieren,
abnehmen.
8.2.Abtrennung der Monoglyceride durch Dünnschichtchromatographie
Den Extrakt mit der Mikroliterspritze (4.11) auf die Dünnschichtplatte
auftragen, und zwar 1,5 cm vom unteren Rand entfernt, als dünnen,
einheitlichen Strich. Die Platte in die gut gesättigte Entwicklerkammer
(4.14) stellen und mit dem Fließmittel (5.7) bei etwa 20 ºC bis 1 cm
vom oberen Plattenrand entfernt entwickeln.
Die Platte an der Luft bei der gleichen Temperatur wie in der Entwickler-
kammer trocknen und mit 2 ′,7′-Dichlorfluoresceinlösung (5.17)
besprühen. Die Zone der Monoglyceride (Rf etwa 0,035) unter UV-Licht
(4.20) markieren.
8.3.Analyse der Monoglyceride durch Gaschromatographie
Die nach8.2 erh altene Kieselgelzone mit einem Spatel abkratzen
(vermeiden, daß auchdie auf der Startlinie verbleibenden Bestandteile
mit erfaßt werden) und in das Methylierungskölbchen (4.2) überführen.
Das gesammelte Kieselgel, so wie es vorliegt, nachdem Verfah ren gemäß
Anhang XB behandeln, die Monoglyceride in Methylester überführen,
dann die Ester gaschromatographisch nach dem Verfahren gemäß Anhang
XA untersuchen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 32
▼B
9. FORMULIERUNG DER ERGEBNISSE
Die Zusammensetzung der Fettsäuren in 2-Stellung auf eine Dezimalstelle
genau angeben (Anmerkung 3).
10. ANMERKUNGEN
Anmerkung 1: Prüfung der Lipasetätigkeit
Aus einem Gemischvon 165 ml Gummiarabikumlösung
(5.21), 15 g gemahlenem Eis und 20 ml neutralisiertem
Öl (5.18) mit einem geeigneten Rührgerät eine Ölemulsion
herstellen.
10 ml dieser Emulsion in ein Becherglas (4.5) geben,
anschließend 0,3 ml Natriumcholatlösung (5.20) und 20 ml
destilliertes Wasser hinzufügen.
Das Becherglas bei 37 ± 0,5 ºC (Anmerkung 4) in einen
Thermostaten stellen; die Elektroden eines pH-Meters
(4.21) und einen Spiralrührer (4.22) einsetzen.
Mit Hilfe einer Bürette (4.23) tropfenweise Natriumhydro-
xidlösung (5.19) hinzufügen bis zu einem pH-Wert von
8,5.
Eine ausreichende Menge der wäßrigen Lipasesuspension
(siehe nachstehend) hinzufügen. Sobald das pH-Meter 8,3
anzeigt, die Stoppuhr anstellen (4.24) und Natriumhydro-
xidlösung (5.19) so zutropfen lassen, daß der pH-Wert bei
8,3 gehalten wird. Das Volumen der pro Minute
verbrauchten Alkalilösung notieren.
Die Werte in ein Koordinatensystem eintragen, und zwar
die Zeitablesungen als Abszisse und die Anzahl ml Alkali-
lösung zur Konstanthaltung des pH-Werts als Ordinate.
Dabei muß sicheine Gerade ergeben.
Die vorstehend erwähnte Lipasesuspension ist eine Suspen-
sion von eins zu Tausend in Wasser. Für jeden Versuch
soviel der Suspension verwenden, daß in 4 bis 5 Minuten
etwa 1 ml Alkalilösung verbraucht wird. Normalerweise
werden etwa 1—5 mg Lipasepulver gebraucht. Die Lipase-
einheit wird als die Menge Enzym definiert, die 10
Mikroäquivalente Säure pro Minute freisetzt. Damit ergibt
sichdie Aktivität A des verwendeten Pulvers, ausgedrückt
als Lipaseeinheiten in mg, anhand folgender Formel:
A¼V/C210
m
Dabei entspricht V der Anzahl der pro Minute
verbrauchten ml Natriumhydroxidlösung (5.19), berechnet
aus der graphischen Darstellung, m ist das Gewicht der
Lipaseprobe in mg.
Anmerkung 2: Herstellung der Lipase
Lipasen mit ausreichender Lipasetätigkeit sind im Handel
erhältlich. Sie können aber auch im Labor wie folgt herge-
stellt werden: 5 kg frisches Schweinepankreas auf 0 ºC
abkühlen; das umhüllende feste Fett und die anhängenden
Gewebe entfernen und im Mixer zerkleinern, bis ein flüs-
siger Brei ensteht. Diesen Brei mit dem Rührgerät (4.25)
4—6 Stunden mit 2,5 l wasserfreiem Aceton rühren,
anschließend zentrifugieren. Den Rückstand noch dreimal
mit dem gleichen Volumen Aceton, dann zweimal mit
einer Mischung von Aceton und Diethylether 1: 1 (V/V)
und zweimal mit Diethylether extrahieren. Den Rückstand
im Vakuum 48 Stunden lang trocknen, bis ein stabiles
Pulver entsteht, das im Kühlschrank aufbewahrt werden
sollte.
Anmerkung 3: In jedem Fall ist es ratsam, die Zusammensetzung der
Gesamtfettsäuren der gleichen Probe zu bestimmen, da ein
Vergleichmit den Fettsäuren in 2-Stellung bei der Interpre-
tation der Werte von Nutzen ist.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 33
▼B
Anmerkung 4: Die Hydrolysentemperatur wird auf 37 ºC eingestellt, wenn
ein flüssiges Öl verwendet wird. Sie wird jedochfür die
Untersuchungsproben auf 40 ºC festgelegt, um auch die
Untersuchung von Fetten mit Schmelzpunkten bis zu 45 ºC
zu ermöglichen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 34
▼B
ANHANG VIII
BESTIMMUNG DES TRILINOLEINGEHALTS
1. ZWECK
Die vorliegende Norm beschreibt ein Verfahren zur Trennung und quantita-
tiven Bestimmung der Zusammensetzung von Triglyceriden in
Abhängigkeit von Molekulargewicht und Grad der Ungesättigtheit, ausge-
drückt in „äquivalenten Kohlenstoffzahlen“ (siehe Anmerkung 1).
2. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Norm gilt für alle pflanzlichen Öle, die Triglyceride langkettiger
Fettsäuren enthalten. Das Verfahren eignet sich insbesondere zum Nach-
weis von kleinen Mengen linolsäurereicher halbtrocknender Öle in den
Ölen, die überwiegend Ölsäure als ungesättigte Fettsäure enthalten, wie z.
B. Olivenöl.
3. PRINZIP
Trennung der Triglyceride durch Umkehrphasenchromatographie in
Abhängigkeit von ihren äquivalenten Kohlenstoffzahlen und Auswertung
der Chromatogramme.
4. GERÄTE
4.1. Flüssigchromatograph, der so ausgestattet ist, daß die Temperatur der Säule
über einen Thermostaten kontrolliert werden kann.
4.2. Einspritzsystem mit einer 10-µl-Probenschleife.
4.3. Detektor: Differentialrefraktometer. Im Bereich der höchsten Empfindlich-
keit sollten wenigstens 10−4Einheiten des Brechungsindexes erreicht
werden.
4.4. Säule: Säule aus rostfreiem Stahl von 250 mm Länge und 4,5 mm Durch-
messer, gefüllt mit Kieselgelpartikeln, die mit Oktadecylsilan belegt sind
(Durchmesser 5 µm). Die durchschnittliche Kohlenstoffbelegung sollte bei
etwa 22—23 % liegen (siehe Anmerkung 2).
4.5. Schreiber und/oder Integrator.
5. REAGENZIEN
Die Reagenzien müssen analytischrein sein. Die Fließmittel sollten entgast
sein. Sie können mehrere Male wiederverwendet werden, ohne daß dadurch
die Trennleistungen beeinflußt werden.
5.1. Chloroform.
5.2. Aceton.
5.3. Acetonitril.5.4. Fließmittel: Aceton/Acetonitril. Das Mischungsverhältnis ist so einzu-
stellen, daß damit die gewünschte Trennung erzielt wird. Man geht
zunächst von einem Mischungsverhältnis von 1:1 aus.
5.5. Lösungsmittel: Aceton oder eine Mischung von Aceton/Chloroform im
Verhältnis 1:1.
5.6. Triglyceride als Referenzsubstanzen. Entweder mit Hilfe der im Handel
verfügbaren Triglyceride (Tripalmitin, Triolein usw.) ein Diagramm aus
den Retentionszeiten und den äquivalenten Kohlenstoffzahlen aufzeichnen
oder ein Referenzchromatogramm des Sojaöls verwenden (siehe Anmer-
kungen 3 und 4 sowie Abbildungen 1 und 2).
6. VORBEREITUNG DER PROBEN
Von der zu analysierenden Probe wird eine 5 %ige Lösung hergestellt,
indem genau 0,5 g ± 0,001 g der Probe in einen 10-ml-Meßkolben einge-
wogen und mit dem Lösungsmittel (5.5) auf 10 ml aufgefüllt werden.
7. VERFAHREN
7.1. Das HPLC-Gerät in Betrieb setzen. Das Fließmittel (5.4) wird mit einer
Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 ml/min durch die Säule gepumpt, um
das gesamte System zu reinigen. Es wird so lange gewartet, bis eine stabile1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 35
▼B
Grundlinie erreicht ist. Anschließend werden 10 µl der gemäß Ziffer 6
hergestellten Probe eingespritzt.
8. BERECHNUNG UND ABFASSUNG DER ERGEBNISSE
Es wird die Methode der inneren Standardisierung angewandt, d. h. man
geht davon aus, daß die Summe der Peakflächen, die den verschiedenen
Triglyceriden entsprechen, 100 % darstellen. Der relative prozentuale
Anteil eines jeden Triglycerids wird berechnet nach der Formel
% Triglycerid =Peakfläche
Summe der Peakflächen× 100
Das Ergebnis ist auf eine Stelle nachdem Komma anzugeben.
Anmerkung 1: Die Reihenfolge der Elution kann durch die Berechnung der
„äquivalenten Kohlenstoffzahlen“ (NCE) ermittelt werden.
Diese sind wie folgt definiert:
NCE = NC − 2n.
Dabei ist NC die Zahl der Kohlenstoffatome und n die Zahl
der Doppelbindungen.
Wenn no,n1und n1ndie Zahlen der Doppelbindungen sind,
die von der Öl- bzw. der Linol- und Linolensäure stammen,
so kann die äquivalente Kohlenstoffzahl berechnet werden
nachder Formel
NCE = NC − dono−d1n1−d1nn1n.
Die Koeffizienten do,d1und d1nkönnen mit Hilfe der
Triglyceride, die als Referenzsubstanzen benutzt wurden,
berechnet werden. Unter den in dieser Methode beschrie-
benen Bedingungen gilt etwa folgende Beziehung
NCE = NC − 2,60 no− 2,35 n1− 2,17 n1n.
Anmerkung 2: Beispiele: Lichrosorb RP 18 (Merck) Art 50333,
Lichrospher 100 CH-18 (Merck) Art 50377 oder
ähnliches Füllmaterial.
Anmerkung 3: Man kann ebenfalls mit mehreren Triglyceriden als Refe-
renzsubstanzen und mit Hilfe der korrigierten
Retentionszeit TR ′=T R−T RLösungsmitteldie Selektivität in
bezug auf Triolein wie folgt berechnen:
α=TR′
TR′Olein
Die graphische Darstellung von log α= f (Zahl der Doppel-
bindungen) ermöglicht es, die Retention von allen
Triglyceriden zu bestimmen, die die Fettsäuren enthalten,
die in den als Referenzsubstanzen verwendeten Triglyce-
riden vorkommen (siehe Abbildung 2).
Anmerkung 4: Die Trennfähigkeit der Säule muß eine klare Trennung des
Trilinolein-Peaks (LLL) auchvon den Peaks der Triglyce-
ride ermöglichen, die eine nur wenig unterschiedliche
Retentionszeit besitzen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 36
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Abbildung 1
Chromatogramm eines Sojaöls
Anmerkung: P = Palmitinsäure; St = Stearinsäure; O = Ölsäure; L = Linol-
säure; Ln = Linolensäure.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 37
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Abbildung 2
Graphische Darstellung von log αals Funktion von f (Zahl der Doppelbin-
dungen)
Anmerkung: La = Laurinsäure; My = Myristinsäure; P = Palmitinsäure; St
= Stearinsäure; O = Ölsäure; L = Linolsäure; Ln = Linolen-
säure.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 38
▼B
ANHANG IX
UV-SPEKTROPHOTOMETRISCHE ANALYSE
EINLEITUNG
Die spektrophotometrische Untersuchung im Ultraviolettlicht kann
Angaben über die Qualität eines Fettes, seine Haltbarkeit und die infolge
technologischer Verfahren eingetretenen Veränderungen erbringen.
Die Absorption bei den in dem Verfahren vorgesehenen Wellenlängen ist
bedingt durchdas Vorkommen konjugierter Dien- und Triensysteme. Die
Absorption wird als spezifische Extinktion E1cm1 % angegeben (Extinktion
einer 1 %igen Lösung des Fettes in dem vorgeschriebenen Lösungsmittel
bei einer Schichtdicke von 1 cm). Sie wird üblicherweise als K bezeichnet
(auchExtinktionskoeffizient genannt).
1. ANWENDUNGSBEREICH
Das Verfahren beschreibt die Durchführung der spektrophotometrischen
Untersuchung von Fetten im Ultraviolettlicht.
2. PRINZIP
Das zu untersuchende Fett wird in dem vorgeschriebenen Lösungsmittel
gelöst, anschließend wird die Extinktion der Lösung bei der vorgeschrie-
benen Wellenlänge im Vergleichzum reinen Lösungsmittel bestimmt. Die
spezifischen Extinktionen werden mit Hilfe der abgelesenen spektrophoto-
metrischen Werte errechnet.
3. GERÄTE
3.1. Spektrophotometer, geeignet zum Messen der Extinktionen im UV-Licht
zwischen 220 und 360 nm und mit der Möglichkeit, einzelne nanometrische
Einheiten ablesen zu können.
3.2. Rechteckige Quarzküvetten mit Deckel und einer optischen Länge von
1 cm. Die Extinktionen der mit Wasser oder einem geeigneten Lösungs-
mittel gefüllten Küvetten dürfen nicht mehr als 0,01 Einheiten
voneinander abweichen.
3.3. 25-ml-Meßkolben.3.4. Chromatographische Säule von 450 mm Länge und 35 mm Durchmesser,
ausgestattet mit einem Abflußrohr von etwa 10 mm Durchmesser.
4. REAGENZIEN
4.1. — Isooktan (2,2,4-Trimethylpentan), spektrophotometrisch rein: es muß im
Vergleichzu destilliertem Wasser eine Durch lässigkeit von mindestens
60 % bei 220 nm und mindestens 95 % bei 250 nm haben; oder
— Cyclohexan, spektrophotometrisch rein: es muß im Vergleich zu destil-
liertem Wasser eine Durchlässigkeit von mindestens 40 % bei 220 nm
und mindestens 95 % bei 250 nm haben;
— andere geeignete Lösungsmittel, in denen Fette sichvollständig lösen
lassen (Ethylalkohol für Rizinusöl).
4.2. Basisches Aluminiumoxid zur Säulenchromatographie, das gemäß Anlage 1
vorbereitet und geprüft wurde.
4.3. n-Hexan, zur Chromatographie.
5. VERFAHREN
5.1. Die zu untersuchende Probe muß absolut homogen und frei von suspen-
dierten Verunreinigungen sein. Die bei Raumtemperatur flüssigen Öle
werden bei einer Temperatur von etwa 30 ºC über Papier filtriert. Die
festen Fette werden homogenisiert und bei einer Temperatur von höchstens
10 ºC über ihrem Schmelzpunkt filtriert.
5.2. Etwa 0,25 g der so vorbereiteten Probe in einen 25-ml-Meßkolben
einwiegen, mit dem vorgeschriebenen Lösungsmittel auffüllen und homo-
genisieren. Die so hergestellte Lösung muß absolut klar sein. Wenn die
Lösung trüb ist oder Verunreinigungen enthält, muß schnell über Papier
filtriert werden.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 39
▼B
5.3. Mit der so hergestellten Lösung wird eine Küvette gefüllt und die Extink-
tion bei der entsprechenden Wellenlänge zwischen 232 und 276 nm
gemessen, wobei das Lösungsmittel als Referenzlösung verwendet wird.
Die abgelesenen Extinktionen müssen im Bereichvon 0,1 bis 0,8 liegen;
andernfalls müssen die Messungen unter Verwendung von entsprechend
stärker konzentrierten oder verdünnten Lösungen wiederholt werden.
5.4. Wird eine Bestimmung der spezifischen Extinktion nach Behandlung mit
Aluminiumoxid verlangt, so ist wie folgt zu verfahren: 30 g basisches
Aluminiumoxid werden in einer Hexansuspension in die Säule gegeben.
Nachdem Absetzen des Adsorbens wird übersch üssiges Hexan bis auf
1 cm oberhalb der Aluminiumoxidfüllung entfernt.
10 g Fett, das wie unter 5.1 beschrieben homogenisiert und filtriert wurde,
wird in 100 ml Hexan gelöst und die Lösung auf die Säule gegeben. Das
Eluat wird gesammelt und das Lösungsmittel im Vakuum bei Temperaturen
unter 25 ºC entfernt.
Mit dem so erhaltenen Fett wird sofort weiter verfahren wie unter 5.2
beschrieben.
6. ABFASSUNG DER ERGEBNISSE
6.1. Angegeben werden die bei den verschiedenen Wellenlängen bestimmten
spezifischen Extinktionen (Extinktionskoeffizienten), die wie folgt zu
berechnen sind:
Kλ¼Eλ
c/C1s
Dabei bedeuten:
Kλ= die spezifische Extinktion (Extinktionskoeffizient) bei der
Wellenlängeλ,
Eλ= die bei der Wellenlänge λgemessene Extinktion,
c = die Konzentration der Lösung in g/100 ml,s = die Länge der Küvette in cm.
Die Ergebnisse werden mit zwei Dezimalstellen angegeben.
6.2. Die spektrophotometrische Untersuchung von Olivenöl nach dem amtlichen
Verfahren der EWG-Verordnungen sieht die Bestimmung der spezifischen
Extinktion in einer Isooktanlösung bei den Wellenlängen 232 und 270 nm
sowie die Bestimmung von ∆K gemäß folgender Formel vor:
∆K¼K
m/C0Km/C04þKmþ4
2
Dabei ist Kmdie spezifische Extinktion bei der Wellenlänge m, bei der im
Bereichvon 270 nm das Maximum der Absorption liegt.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 40
▼B
ANLAGE I
Vorbereitung des Aluminiumoxids und Prüfung seiner Aktivität
A.1.1. Vorbereitung des Aluminiumoxids
Das zuvor im Trockenschrank bei 380—400 ºC 3 Stunden lang getroc-
knete Aluminiumoxid in ein gut verschließbares Gefäß geben, je 100 g
Aluminiumoxid 5 ml destilliertes Wasser zugeben, das Gefäß rasch
verschließen, mehrfach schütteln und vor der Verwendung mindestens
12 Stunden stehen lassen.
A.1.2. Überprüfung der Aktivität des Aluminiumoxids
Eine chromatographische Säule mit 30 g Aluminiumoxid füllen und
weiter wie unter 5.4 beschrieben verfahren. Über die Säule gibt man
eine Mischung bestehend aus
— 95 % nativem Olivenöl mit einer spezifischen Extinktion bei 268 nm
von weniger als 0,18 und
— 5 % Erdnußöl, das bei der Raffination mit Bleicherde behandelt
wurde und eine spezifische Extinktion bei 268 nm von mindestens 4
aufweist.
Weist die Mischung nach dem Passieren der Säule eine spezifische
Extinktion bei 268 nm von mehr als 0,11 auf, so ist das Aluminiumoxid
geeignet, anderenfalls ist der Wasserzusatz zu erhöhen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 41
▼B
ANLAGE II
Eichung des Spektrophotometers
A.2. Das Gerät muß regelmäßig (mindestens alle 6 Monate) im Hinblick auf
die Einstellung der Wellenlänge und die Genauigkeit der Anzeige über-
prüft werden.
A.2.1. Die Überprüfung der Einstellung der Wellenlänge kann mit Hilfe einer
Quecksilberdampflampe oder geeigneter Filter erfolgen.
A.2.2. Zur Überprüfung der photoelektrischen Zelle und des Photomultipliers
wird wie folgt verfahren: 0,2 g reines Kaliumchromat für die Spektro-
photometrie einwiegen und in einer 0,05-N-Kaliumhydroxidlösung
lösen, dann in einen Meßkolben geben und auf 1 000 ml auffüllen.
Anschließend genau 25 ml der so hergestellten Lösung in einen 500-ml-
Meßkolben überführen und mit der gleichen Kaliumhydroxidlösung
auffüllen. Die Extinktion der so hergestellten Lösung bei 275 nm messen
und dabei die Kaliumhydroxidlösung als Referenzlösung verwenden. Die
mit einer 1-cm-Küvette gemessene Extinktion muß 0,2 ± 0,005 betragen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 42
▼B
ANHANG XA
GASCHROMATOGRAPHISCHE ANALYSE DER FETTSÄUREMETHY-
LESTER
1. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Norm enthält allgemeine Anweisungen zur Anwendung der
Gaschromatographie mit gepackten Säulen oder mit Kapillarsäulen zur
Bestimmung der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung einer
Mischung von Fettsäuremethylestern, die nach dem in Anhang XB
beschriebenen Verfahren hergestellt wurden.
Das Verfahren eignet sich nicht für polymerisierte Fettsäuren.
2. REAGENZIEN.2.1.Trägergas
Inertgas (Stickstoff, Helium, Argon, Wasserstoff usw.), vollständig
getrocknet und mit einem Sauerstoffgehalt unter 10 mg/kg.
Anmerkung 1: Der ausschließlich in Kapillarsäulen als Trägergas
verwendete Wasserstoff kann die Analysengeschwindig-
keit verdoppeln, ist aber gefährlich.
Sicherheitsvorrichtungen sind verfügbar.
2.2.Hilfsgase
2.2.1. Wasserstoff (Reinheit über 99,9 %), frei von organischen Verunreini-
gungen.
2.2.2. Luft oder Sauerstoff, frei von organischen Verunreinigungen.
2.3.Referenzstandard
Eine Mischung aus reinen Fettsäuremethylestern oder die Methylester
eines Fetts mit bekannter Zusammensetzung, die möglichst der Zusam-
mensetzung des zu analysierenden Fetts ähnlich sind.
Eine Oxidation der mehrfach ungesättigten Fettsäuren muß vermieden
werden.
3. GERÄTE
Die vorliegenden Instruktionen gelten für die übliche Ausrüstung für
die Gaschromatographie mit gepackter Säule oder Kapillarsäule und
Flammenionisationsdetektor. Jedes Gerät, das die in 4.1.2 beschriebene
Leistung und Trennung erbringt, ist geeignet.
3.1.Gaschromatograph
Der Gaschromatograph muß über folgende Bestandteile verfügen:
3.1.1. Einspritzsystem
Verwendet wird ein Einspritzsystem entweder in Verbindung
a) mit gepackten Säulen und möglichst geringem Totvolumen (es muß
in diesem Fall auf Temperaturen erhitzt werden können, die um
20—50 ºC über der Säulentemperatur liegen) oder
b) mit Kapillarsäulen. In diesem Fall muß das Einspritzsystem speziell
für diese Säulen vorgesehen sein. Es kann das Split-System oder das
System der splitlosen „On Column“-Injektion sein.
Anmerkung 2: Sind Fettsäuren mit weniger als 16 Kohlenstoffatomen
nicht vorhanden, so kann ein Injektor mit beweglicher
Nadel verwendet werden.
3.1.2. Ofen
Der Ofen sollte so ausgelegt sein, daß die Säule auf mindestens 260 ºC
aufgeheizt und die Temperatur bei gepackten Säulen auf 1 ºC und bei
Kapillarsäulen auf 0,1 ºC genau konstant gehalten werden kann. Letz-
tere Bedingung ist vor allem dann wichtig, wenn eine „Fused Silica“-
Säule verwendet wird.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 43
▼B
In jedem Fall, besonders aber bei Fettsäuren mit weniger als 16 Kohlen-
stoffatomen, wird eine Heizung mit Temperaturprogramm empfohlen.
3.1.3. Gepackte Säule3.1.3.1. Säule aus einem Material, das unempfindlichist gegenüber den zu
analysierenden Substanzen (z. B. Glas oder rostfreier Stahl).
Größe der Säule:
a) Länge: 1—3 m. Eine relativ kurze Säule sollte verwendet werden,
wenn langkettige Fettsäuren (über C
20) vorkommen. Bei der Analyse
von Säuren mit 4 oder 6 Kohlenstoffatomen wird eine 2 m lange
Säule empfohlen;
b) Innendurchmesser: 2—4 mm.
Anmerkung 3: Sind mehrfach ungesättigte Bestandteile mit mehr als
drei Doppelbindungen vorhanden, so können sie in einer
Säule aus rostfreiem Stahl zersetzt werden.
Anmerkung 4: Es kann ein System mit zwei gepackten Säulen
verwendet werden.
3.1.3.2. Füllung, bestehend aus folgenden Bestandteilen:
a)Trägermaterial: Mit Säure gewaschenes und silanisiertes Kieselgur
oder sonstiges geeignetes neutrales Trägermaterial mit einem engen
Korngrößenbereich (Schwankungsbereich 25 µm innerhalb der
Grenzwerte von 125 bis 200 µm), wobei die durchschnittliche
Korngröße auf den Innendurchmesser der Säule abgestimmt wird.
b)Stationäre Phase: Polare Flüssigkeit vom Typ Polyester (z. B.
►C1Diethylenglykolpolysuccinat ◄, Butandiolpolysuccinat, Ethy-
lenglykolpolyadipat usw.), Cyanosilicone oder sonstige
Flüssigkeiten, die die erforderliche chromatographische Trennung
ermöglichen (siehe Ziffer 4). Die stationäre Phase sollte 5—20 %
(m/m) der Füllung ausmachen. Für bestimmte Trennungen kann
eine nichtpolare stationäre Phase verwendet werden.
3.1.3.3. Vorbereitung der Säule
Nachdem die Säule vom Detektor getrennt worden ist, den Ofen
allmählich auf 185 ºC aufheizen und einen Inertgasstrom von
20—60 ml/min mindestens 16 Stunden bei 185 ºC sowie weitere 2
Stunden bei 195 ºC durchdie frischh ergestellte Säule leiten.
3.1.4. Kapillarsäule3.1.4.1. Kapillare aus einem Material, das nicht mit den zu analysierenden
Stoffen reagiert (üblicherweise Glas oder „Fused Silica“). Der Innen-
durchmesser sollte zwischen 0,2 und 0,8 mm liegen. Die Innenflächen
müssen vor dem Auftragen der stationären Phase einer geeigneten
Behandlung unterzogen werden (beispielsweise Oberflächenvorberei-
tung, Desaktivierung). In den meisten Fällen ist eine Länge von 25 mausreichend.
3.1.4.2. Die stationäre Phase ist üblicherweise vom Typ Polyglykol (Polyethy-
lenglykol 20000), Polyester (Butandiolpolysuccinat) oder polarem
Polysiloxan (Cyanosilicon). Vernetzte (cross linked) Säulen sind
geeignet.
Anmerkung 5: Bei Verwendung von polaren Polysiloxanen können bei
der Identifizierung und Trennung von Linolensäure und
C
20-Säuren Schwierigkeiten auftreten.
Die Beschichtung sollte dünn, beispielsweise nur 0,1 bis 0,2 µm, sein.
3.1.4.3. Einbau und Vorbereitung der Säule
Beim Einbau der Kapillarsäule müssen die üblichen Vorsichtsmaß-
nahmen, wie Anordnung der Säule im Ofen (Träger), Auswahl und
Zusammenbau der Verbindungsstücke (Abdichtung), Ausrichten der
Säulenenden in dem Einspritzsystem und im Detektor (Verringerung
von Totvolumen), getroffen werden. Die Säule wird mit dem Trägergas-
strom gespült (z. B. bei einer Säulenlänge von 25 m und einem
Innendurchmesser von 0,3 mm mit 0,3 bar (30 kPa)).
Zur Vorbereitung der Säule wird das Temperaturprogramm des Ofens
auf 3 ºC/min eingestellt und die Säule, ausgehend von der Raumtempe-
ratur, auf eine Temperatur von 10 ºC unter der Zersetzungsgrenze der
stationären Phase erhitzt. Diese Ofentemperatur wird 1 Stunde beibe-
halten, bis die Grundlinie stabilisiert ist. Dann auf 180 ºC
zurückschalten und unter isothermen Bedingungen weiterarbeiten.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 44
▼B
Anmerkung 6: Entsprechend vorbehandelte Fertigsäulen können im
Handel bezogen werden.
3.1.5. Der Detektor sollte auf eine höhere Temperatur als die Säulentempe-
ratur erhitzt werden können.
3.2.Spritze
Die Spritze sollte eine maximale Kapazität von 10 µl und eine Graduie-
rung in 0,1 µl haben.
3.3.Schreiber
Wird die von dem Schreiber aufgezeichnete Kurve zur Berechnung der
Zusammensetzung der analysierten Mischung verwendet, so wird ein
mit dem verwendeten Gerät kompatibler Schreiber von hoher Präzision
benötigt. Der Schreiber sollte folgende Merkmale aufweisen:
a) Ansprechgeschwindigkeit unter 1,5 s, vorzugsweise 1 s (die
Ansprechgeschwindigkeit ist die Zeit, die der Schreiber benötigt,
um nachplötzlich er Auslösung eines Signals (100 %) von 0 % auf
90 % auszuschlagen);
b) Papierbreite mindestens 20 cm;
c) Vorschubgeschwindigkeit einstellbar zwischen 0,4 und 2,5 cm/min.
3.4.Integrator oder Rechner (fakultativ)
Eine schnelle und genaue Berechnung ist mit Hilfe eines elektronischen
Integrators oder Rechners möglich, der eine lineare Reaktion bei ange-
messener Empfindlichkeit liefern soll. Dabei muß die Korrektur bei
Abweichungen von der Grundlinie zufriedenstellend sein.
4. VERFAHREN
Die in 4.1 bis 4.3 beschriebenen Verfahren beziehen sich auf den
Gebraucheines Flammenionisationsdetektors.
Alternativ kann auch ein Gaschromatograph mit einem Katharometer-
Detektor (der auf dem Prinzip der Änderungen der Wärmeleitfähigkeit
beruht) verwendet werden. In diesem Fall müssen die Betriebsbedin-
gungen entsprechend Ziffer 6 geändert werden.
4.1.Versuchsbedingungen
4.1.1. Ermittlung der optimalen Betriebsbeding ungen
4.1.1.1. Gepackte Säule
Bei der Ermittlung der Versuchsbedingungen müssen folgende Varia-
blen berücksichtigt werden:
a) Länge und Durchmesser der Säule;
b) Art und Menge der stationären Phase;
c) Säulentemperatur;
d) Trägergasstrom;
e) erforderliche Trennleistung;
f) Größe der zu untersuchenden Probe, die so ausgewählt sein muß,
daß Detektor und Elektrometer eine lineare Anzeige ergeben;
g) Analysendauer.
Im allgemeinen führen die in den Tabellen 1 und 2 genannten Werte zu
dem gewünschten Ergebnis, d. h. mindestens 2 000 theoretische Böden
pro Meter Säulenlänge für Methylstearat und dessen Elution innerhalb
von 15 Minuten.
Sofern die Geräte es erlauben, sollte das Einspritzsystem etwa 200 ºC
und der Detektor mindestens genauso heiß wie die Säule sein.
Im allgemeinen liegt das Verhältnis der Strömungsgeschwindigkeit des
Wasserstoffs für den Flammenionisationsdetektor und der des Träger-
gases zwischen 1:2 und 1:1 je nach Säulendurchmesser. Der
Sauerstoffstrom beträgt etwa das 5- bis 10-fache des Wasserstoffstroms.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 45
▼B
Tabelle 1
Innendurchmesser der Säule in mm Trägergasstrom in ml/min
2 15 bis 25
3 20 bis 40
4 40 bis 60
Tabelle 2
Konzentration der stationären Phase
in % (m/m)Säulentemperatur in ºC
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Kapillarsäule
Die Eigenschaften der Kapillarsäule, nämlich Leistungsfähigkeit und
Durchlässigkeit, bedingen, daß die Trennung der Bestandteile und die
Analysendauer weitgehend von der Strömungsgeschwindigkeit des
Trägergases in der Säule abhängen. Daher ist eine Optimierung der
Betriebsbedingungen durchEinwirkung auf deren Parameter (einfach er
ausgedrückt: auf den Druckverlust der Säule) notwendig, je nachdem,
ob eine bessere Trennung oder eine schnellere Analyse gewünscht wird.
4.1.2. Bestimmung der Zahl der theoretischen Böden (Leistungs-
fähigkeit) und der Auflösung (siehe Abbildung 1)
Die Analyse wird mit einer Mischung aus etwa gleichen Teilen Methyl-
stearat und Methyloleat (beispielsweise Methylestern der Kakaobutter)
durchgeführt.
Die Säulentemperatur und der Trägergasstrom sind so zu wählen, daß
das Maximum des Methylstearat-Peaks etwa 15 Minuten nach dem
Lösungsmittelpeak aufgezeichnet wird. Dabei muß eine ausreichende
Menge Methylestermischung verwendet werden, damit der Methyl-
stearat-Peak etwa Dreiviertel des vollen Skalenanschlags erreicht.
Die Zahl der theoretischen Böden n wird nach folgender Formel
berechnet:
n¼16drIðÞ
ωIðÞ/C20/C21
2
Die Auflösung R wird berechnet nach der Formel:
R¼2∆
ωIðÞþωIIðÞ
Dabei sind:
dr(I)= die Retention in Millimetern, vom Start des Chromato-
gramms bis zum Maximum des Methylstearat-Peaks;
ω(I)+ω(II)= die Breite des Methylstearat- bzw. Methyloleat-Peaks
in Millimeters, gemessen zwischen den Schnittpunkten
der Wendetangenten mit der Grundlinie;
∆ = die Entfernung zwischen den Maxima des Methyl-
stearat- und des Methyloleat-Peaks in Millimetern.
Der Auflösungsindex Ir wird berechnet nach der Formel:
a
b
Dabei sind:
a = Höhe des kleinsten Peaks, gemessen von der Grundlinie;1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 46
▼M2
▼C2
▼C2
b = Höhe des niedrigsten Punktes im Tal zwischen den beiden
angrenzenden Peaks, gemessen von der Grundlinie.
Abbildung 1
Chromatogramm zur Bestimmung der Zahl der theoretischen Böden (Leistungs-
fähigkeit) und der Auflösung
Die Betriebsbedingungen sind so zu wählen, daß sich für Methylstearat
wenigstens 2 000 theoretische Böden pro Meter Säule ergeben und eine
Auflösung von wenigstens 1,25 erreicht wird.
4.2.Zu untersuchende Probe
Mit Hilfe der Spritze (3.2) werden 0,1 bis 2 µl der nachAnh ang XB
hergestellten Methylester auf die Säule gespritzt. Sind die Ester nicht
gelöst, so sind 100 mg/ml in chromatographisch reinem Heptan zu
lösen und davon etwa 0,1 bis 1 µl einzuspritzen.
Müssen Bestandteile bestimmt werden, die lediglichin Spuren
vorkommen, so kann die Probengröße gesteigert werden (bis zum Zehn-
fachen).
4.3.Analyse
Im allgemeinen soll unter den in 4.1.1 beschriebenen Bedingungen
gearbeitet werden. Es kann jedochmit einer niedrigeren Säulentempe-
ratur gearbeitet werden, wenn eine Bestimmung von Fettsäuren mit
weniger als 12 Kohlenstoffatomen erforderlich ist. Bei der Bestimmung
von Fettsäuren mit mehr als 20 Kohlenstoffatomen kann die Temperatur
erhöht werden. In beiden Fällen kann auch mit Temperaturprogramm
gearbeitet werden. Beispiel: Enthält die Probe Fettsäuremethylester mit
weniger als 12 Kohlenstoffatomen, so wird die Probe bei 100 ºC (oder
bei 50—60 ºC falls Buttersäure vorkommt) eingespritzt und die Tempe-
ratur sofort mit einer Anstiegsrate von 4—8 ºC/min bis zum Optimum
erhöht. In manchen Fällen können die beiden Verfahren kombiniert
werden.
Nach dem programmierten Aufheizen wird die Elution bei gleichblei-
bender Temperatur fortgesetzt, bis alle Bestandteile eluiert sind.
Verfügt das Gerät über keine programmierbare Heizung, so ist bei1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 47
▼B
▼B
zwei festliegenden Temperaturen zwischen 100 ºC und 195 ºC zu
arbeiten. Gegebenenfalls ist es ratsam, die Analyse mit zwei Phasen
von unterschiedlicher Polarität durchzuführen, um die Abwesenheit
von verdeckten Peaks beispielsweise bei gleichzeitigem Vorkommen
von C18:3und C20:0oder C18:3und C18:2konjugiert, sicherzustellen.
4.4.Herstellung von Referenzchromatogrammen und Referenzkurven
Die Referenz-Standardmischung (2.3) wird unter den gleichen Arbeits-
bedingungen wie die Probe analysiert und die Retentionszeiten oder die
Retention der vorkommenden Fettsäuren bestimmt. Für jeden Grad der
Ungesättigtheit wird auf halblogarithmischem Papier eine graphische
Darstellung angefertigt, die den Logarithmus der Retentionszeit oder
der Retention als Funktion der Zahl der Kohlenstoffatome zeigt. Unter
isothermen Bedingungen müßten die graphischen Darstellungen der
geradzahligen Säuren mit dem gleichen Grad der Ungesättigtheit gerade
Linien ergeben. Die Geraden sollten annähernd parallel verlaufen.
Es müssen Bedingungen vermieden werden, unter denen verdeckte
Peaks auftreten, d. h. Bedingungen, unter denen die Auflösung zugering ist, um zwei Bestandteile zu trennen.
5. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE
5.1.Qualitative Analyse
Die Methylester-Peaks der Probe werden aus der nach 4.4 erstellten
graphischen Darstellung identifiziert, wenn nötig durch Interpolation.
5.2.Quantitative Analyse
5.2.1. Bestimmung der Zusammensetzung
Abgesehen von Ausnahmefällen wird die Methode der inneren Norma-
lisierung angewandt, d. h. man geht davon aus, daß alle Bestandteile
der Probe auf dem Chromatogramm erscheinen, so daß die Gesamtheit
der Peakflächen 100 % der Bestandteile darstellt (vollständige Elution).
Enthält das Gerät einen Integrator, so sind dessen Daten zu verwenden.
Andernfalls muß die Fläche unter jedem Peak durch Multiplikation der
Peakhöhe mit der Breite auf halber Höhe bestimmt werden. Gegebenen-
falls sind auch die verschiedenen während der Aufzeichnung
verwendeten Abschwächungen zu berücksichtigen.
5.2.2. Berech nung
5.2.2.1. Allgemeiner Fall
Der Gehalt eines Bestandteils i (ausgedrückt in Massenprozent Methy-
lester) wird durchBestimmung des prozentualen Anteils der jeweiligen
Peakfläche im Verhältnis zur Summe aller Peakflächen berechnet. Dazu
wird folgende Formel verwendet:
Ai
ΣA/C2100
Hierbei sind:
Ai= die Peakfläche, die dem Bestandteil i entspricht,
ΣA = die Summe aller Peakflächen.
Das Ergebnis ist auf eine Stelle nachdem Komma anzugeben.
Anmerkung 7: In diesem allgemeinen Fall wird davon ausgegangen,
daß das auf relative Flächen bezogene Berechnungser-
gebnis den jeweiligen Massenprozenten entspricht. Für
die Fälle, in denen diese Annahme nicht zulässig ist,
siehe 5.2.2.2.
5.2.2.2. Anwendung von Korrekturfaktoren
In bestimmten Fällen, beispielsweise in Gegenwart von Fettsäuren mit
weniger als 8 Kohlenstoffatomen oder von Fettsäuren mit sekundären
Gruppen, bei Verwendung eines Wärmeleitfähigkeits-Detektors oder
wenn eine besonders hohe Genauigkeit erforderlich ist, sollten Korrek-
turfaktoren angewandt werden, um die prozentualen Peakflächen in
Massenprozente der Bestandteile umzurechnen. Die Korrekturfaktoren
werden mit Hilfe eines Chromatogramms bestimmt, das durch Analyse
einer Referenzmischung von Methylestern bekannter Zusammensetzung1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 48
▼B
unter den gleichen Bedingungen wie bei der Analyse der Probe erstellt
wurde.
Für diese Referenzmischung ergibt sich der prozentuale Massenanteil
des Bestandteiles i aus der Formel:
mi
Σm/C2100
Hierin sind:
mi= die Masse des Bestandteils in der Referenzmischung,
Σm = die Gesamtheit aller Massen der verschiedenen Bestandteile
der Referenzmischung.
Aus dem Chromatogramm der Referenzmischung (4.4) wird der prozen-
tuale Anteil (Fläche/Fläche) des Bestandteils i wie folgt berechnet:
Ai
ΣA/C2100
Hierin sind:
Ai= die Peakfläche des Bestandteiles i,
ΣA = die Summe aller Peakflächen.
Der Korrekturfaktor ergibt sichaus der Formel
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Im allgemeinen werden die Korrekturfaktoren auf KC16bezogen, so daß
die relativen Faktoren nachfolgender Formel berech net werden:
K0
i¼Ki
KC16
Der Gehalt der Probe an jedem Bestandteil i, ausgedrückt in Massen-
prozent Methylester, ist:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Die Ergebnisse sind auf eine Stelle nachdem Komma anzugeben.
5.2.2.3. Verwendung eines inneren Standards
In bestimmten Fällen ist es erforderlich, einen inneren Standard zu
verwenden (beispielsweise, wenn nicht alle Fettsäuren quantitativ
bestimmt werden sollen, wie beim Vorkommen von Säuren mit 4 und
6 Kohlenstoffatomen neben Säuren mit 16 oder 18 Kohlenstoffatomen,
oder wenn die absolute Menge an Fettsäuren in der Probe bestimmt
werden soll). Dazu werden häufig Fettsäuren mit 5, 15 oder 17 Kohlen-
stoffatomen verwendet.
Auchfür den inneren Standard sollte der Korrekturfaktor bestimmt
werden (sofern einer verwendet wird).
Der Anteil des Bestandteils i in Massenprozent, ausgedrückt als Methy-
lester, ergibt sichdann aus der Formel:
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
Hierin ist:
Ai= die Peakfläche des Bestandteils i,
As= die Peakfläche des inneren Standards,
K′i= der Korrekturfaktor für den Bestandteil i (bezogen auf KC16),
K′s= der Korrekturfaktor für den inneren Standard (bezogen auf
KC16),
m = die Masse der zu untersuchenden Probe in Milligramm,
ms= die Masse des inneren Standards in Milligramm.
Das Ergebnis ist auf eine Stelle nachdem Komma anzugeben.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 49
▼M2
6. SONDERFALL, BESTIMMUNG VON TRANS-ISOMEREN
Der Gehalt an trans-Isomeren in Fettsäuren mit 10-24 Kohlenstoff-
atomen kann durchTrennung der Meth ylester bestimmt werden, wobei
Kapillarsäulen mit besonderer Polarität verwendet werden.
6.1. Kapillarsäulen (fused silica) mit einem Innendurchmesser von 0,25 -
0,32 mm, einer Länge von 50 m und belegt mit einer Cyanopropylsili-
conschicht von 0,1 bis 0,3µm (Typ SP 2340, SP 2380, CP Sil 88, Silar
10 und ähnlichen Typen).
6.2. Die Methylester werden nach dem im Anhang XB unter B beschrie-
benen Verfahren hergestellt. Fette mit einem Gehalt an freien
Fettsäuren von mehr als 3 % müssen nach dem im Anhang VII unter
Punkt 6.1 beschriebenen Verfahren neutralisiert werden.
6.3. Die Arbeitsbedingungen für die Gaschromatographie sind wie folgt:
— Säulentemperatur programmiert von 150-220 ºC (z. B. 15 Minuten
bei 165 ºC, danachAnstieg von 5 ºC/Minute auf 200 ºC;
— Injektortemperatur: 250 ºC bei Verwendung eines Split-Systems
oder Anfangstemperatur der Säule bei Verwendung eines „on
column“-Systems;
— Detektortemperatur: 260 ºC;— Trägergasstrom: (Helium oder Wasserstoff) 1,2 ml/min.
Abbildung 1
Musterchromatogramm einer kapillargaschromatographischen Bestim-
mung von trans-Fettäuren
Die Einspritzmenge soll so bemessen sein, daß unter den gegebenen
Empfindlichkeitsbedingungen die Höhe des Peaks für Arachinsäureme-
thylester 20 % oder mehr des Vollausschlags beträgt.
6.4. Die Identifizierung der verschiedenen Methylester erfolgt mit Hilfe der
Retentionszeiten, die mit denen eines Referenzgemisches verglichen
werden (vgl. 2.3).
Die Ester der trans-Fettsäuren werden vor den entsprechenden cis-
Isomeren eluiert. In Abbildung 2 wird ein Beispiel eines entspre-
chenden Chromatogramms gezeigt.
6.5. Die Leistungsfähigkeit der Säule, bestimmt nach Punkt 4.1.2, soll die
Trennung bestimmter kritischer Paare ermöglichen. So soll z. B. die
Gruppe der trans-Isomere der Ölsäuren von dem Peak der Ölsäure
getrennt werden (trans C18:1/cis C18:1), und zwar mit einem
Auflösungsindex, der über 2 liegt.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 50
▼C2
▼C2
6.6. Der prozentuale Gehalt der verschiedenen trans-Fettsäuren wird
berechnet aus dem Verhältnis der entsprechenden Peakfläche zur
Summe der Flächen aller vorkommenden Peaks.
Bestimmt werden die prozentualen Gehalte nachstehender Fettsäuren:
— „trans“-Oktadecensäuren (T 18:1), im Anhang I dieser Verordnung
als Summe der trans-Isomere der Ölsäure bezeichnet;
— „cis-trans“- und „trans-cis“-Oktadecadiensäure (CT/TC 18:2), im
Anhang I dieser Verordnung als Summe der trans-Isomere der
Linolsäure bezeichnet;
— „trans-cis-trans“-, „cis-cis-trans“-, „cis-trans-cis“-, „trans-cis-cis“-
Oktadecatriensäure [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18:3], im Anhang
I dieser Verordnung als Summe der trans-Isomere der Linolensäure
bezeichnet.
Anmerkung 8: Im Hinblick auf die Besonderheiten dieser Methode sind
die Ergebnisse mit zwei Dezimalstellen anzugeben.
►M27.◄SONDERFALL — VERWENDUNG EINES KATHAROMETER-
DETEKTORS (BASIERT AUF DEM PRINZIP DER ÄNDERUNG
DER WÄRMELEITFÄHIGKEIT)
Zur Bestimmung der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung
eines Gemisches von Fettsäuremethylestern kann auch ein Gaschroma-
tographmit einem Detektor verwendet werden, der auf der Grundlage
von Änderungen der Wärmeleitfähigkeit (Katharometer) arbeitet. In
diesem Fall müssen die in den Ziffern 3 und 4 beschriebenen Arbeits-
bedingungen gemäß der Tabelle 3 geändert werden.
Für die quantitative Analyse sind die in 5.2.2.2 beschriebenen Korrek-
turfaktoren anzuwenden.
Tabelle 3
Variable Daten/Arbeitsbedingungen
Säule Länge: 2—4 m
Innendurchmesser: 4 mm
Trägermaterial Korngröße zwischen 160 und
200 µm
Konzentration der stationären
Phase15 % (m/m) bis 25 % (m/m)
Trägergas Helium oder, wenn nicht
vorhanden, Wasserstoff, mit
möglichst geringem Sauerstoffge-
halt
Hilfsgase Keine
Temperatur des Einspritzsystems 40—60 ºC höher als die der Säule
Säulentemperatur 180—200 ºC
Strömungsgeschwindigkeit des
TrägergasesIm allgemeinen zwischen 60 und
80 ml/min
Menge der eingespritzten Probe Im allgemeinen zwischen 0,5 und
2µ l
►M28.◄UNTERSUCHUNGSBERICHT
Im Untersuchungsbericht müssen das zur Herstellung der Methylester
angewandte Verfahren, das gaschromatograpische Verfahren und die
Ergebnisse genau angegeben werden. Darüber hinaus sind alle Arbeits-
bedingungen zu nennen, die einen Einfluß auf die Ergebnisse gehabt
haben können, auch wenn sie nicht in dieser Internationalen Norm
aufgeführt wurden oder als fakultativ gelten.
Der Untersuchungsbericht muß alle zur vollständigen Identifizierung
der Probe notwendigen Informationen enthalten.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 51
▼B
▼B
ANHANG XB
VORBEREITUNG DER FETTSÄUREMETHYLESTER GEMÄSS
ANHANG VI ABSCHNITTE I UND II DER VERORDNUNG (EWG)
Nr. 72/77 ODER GEMÄSS DEM NACHSTEHEND BESCHRIEBENEN
VERFAHREN
EINLEITUNG
Die Wahl der Methode ist abhängig von der Zusammensetzung der Fett-
säuren, vom Gehalt an freien Fettsäuren des zu untersuchenden Fettes und
von der auszuführenden gaschromatographischen Analyse.
In Frage kommen
— für Fette mit Fettsäuren unter C12 nur Verfahren in geschlossenen
Ampullen oder mit Dimethylsulfat,
— für Fette mit einem Gehalt an freien Fettsäuren von über 3 % nur
Verfahren mit Methanol-Salzsäure oder Dimethylsulfat,
— für gaschromatographische Bestimmungen von trans-Isomeren nur
Verfahren mit Natriummethylat oder Dimethylsulfat,
— das Verfahren mit Methanol-Hexan-Schwefelsäure muß angewandt
werden für die Herstellung von Methylestern aus kleinen Fettmengen
nach deren dünnschichtchromatographischer Abtrennung.
Das Unverseifbare kann vernachlässigt werden, wenn es einen Gehalt von
3 % nicht überschreitet; anderenfalls müssen die Methylester aus den Fett-
säuren hergestellt werden.
1. METHODEN
Im folgenden werden 5 Methoden für die Herstellung der Methylester aus
Fetten beschrieben:
a) mit Natriummethylat,
b) mit Natriummethylat in einer verschlossenen Ampulle,
c) mit Methanol-Salzsäure in einer verschlossenen Ampulle,
d) mit Dimethylsulfat,
e) mit Methanol-Hexan-Schwefelsäure.
Methode A
2. PRINZIP DER METHODE
Das zu untersuchende Fett wird unter Rückfluß mit Methanol und Natrium-
methylat erhitzt. Die gewonnenen Methylester werden mit Ethylether
extrahiert.
3. GERÄTE
3.1. 100-ml-Kolben mit Rückflußkühler, oben mit einem Calciumchloridrohr
verschlossen, mit Schliffanschlüssen.
3.2. 50-ml-Meßzylinder.
3.3. 5-ml-Meßpipette, mit 0,1-ml-Graduierung.
3.4. 250-ml-Scheidetrichter.3.5. 200-ml-Kolben.
4. REAGENZIEN
4.1. Wasserfreies Methanol.4.2. Natriummethylat, etwa 1%ige Lösung in Methanol; Herstellung durch
Auflösen von 0,34 g metallischem Natrium in 100 ml wasserfreiem
Methanol.
4.3. Ethylether.
4.4. Natriumchlorid, 10%ige Lösung.4.5. Petrolether, Kp 40º — 60 ºC.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 52
▼B
5. VERFAHREN
5.1. In den 100-ml-Kolben 2 g des über Natriumsulfat getrockneten und
filtrierten Fettes einwiegen; 35 ml Methanol hinzufügen, den Kühler
aufsetzen und unter Rückfluß einige Minuten kochen lassen.
5.2. Das Erwärmen unterbrechen, die Kühlung abstellen und schnell 3,5 ml
Natriummethylatlösung zugeben. Die Kühlung wieder anstellen und unter
Rückfluß mindestens 3 Stunden sieden lassen. Die Methylierung ist
beendet, wenn das gesamte Fett in Lösung gegangen ist und das Reaktions-
gemischbei Raumtemperatur klar bleibt.
5.3. Abkühlen lassen und das Reaktionsgemisch in einen 250-ml-Scheidetrichter
überführen, 30 — 40 ml Ethylether, 100 ml Wasser und 5 — 6 ml 10%ige
Natriumchloridlösung zugeben. Schütteln und die Schichten absetzen
lassen. Die wäßrige Phase in einen zweiten Scheidetrichter ablassen und
erneut mit 25 ml Ethylether extrahieren. Die vereinigten Etherfraktionen
mit 50 ml Petrolether Kp 40 — 60ºC versetzen — dadurch erfolgt eine
Abtrennung von Wasser, das dann entfernt wird. Die Etherphase dreimal
mit je 10 — 15 ml Wasser waschen, über Natriumsulfat trocknen, durch
ein Filter in einen 200-ml-Kolben filtrieren.
Das Lösungsmittel auf dem Wasserbad abdestillieren und den Rückstand in
einem Strom von reinem Stickstoff trocknen.
Methode B
2. PRINZIP DER METHODE
Das zu untersuchende Fett wird mit einer methanolischen Natriummethy-
latlösung in einer verschlossenen Ampulle bei 85—90 ºC umgesetzt.
3. GERÄTE
3.1. Dickwandige Glasampulle, ca. 5 ml Inhalt (Länge 40—45 mm, Durch-
messer 14—16 mm).
3.2. 1-ml-Meßpipette, mit 0,1-ml-Graduierung.
4. REAGENZIEN
4.1. Natriummethylat, 1,5%ige Lösung in Methanol, hergestellt durch Auflösen
von 0,50 g metallischem Natrium in 100 ml wasserfreiem Methanol.
5. VERFAHREN
5.1. In die Ampulle 2 g des über Natriumsulfat getrockneten und filtrierten
Fettes einwiegen, 0,3 g (ca. 0,4 ml) Natriummethylatlösung hinzufügen
und die Ampulle über der Flamme zuschmelzen.
5.2. Die Ampulle zwei Stunden in ein Wasserbad von 85—90 ºC stellen und
von Zeit zu Zeit schütteln. Das Ende der Veresterung in der Ampulle zeigt
sichdarin, daß der Inh alt nachAbsetzen des Glycerins und des Rückstands
der Reagenzien klar wird.
5.3. Auf Raumtemperatur abkühlen. Die Ampulle erst öffnen, wenn die Methy-
lester gebraucht werden. Sie brauchen für die Verwendung im
Gaschromatographen nicht weiter behandelt zu werden.
Methode C
2. PRINZIP DER METHODE
Das zu untersuchende Fett wird mit Methanol-Salzsäure in einer verschlos-
senen Ampulle bei 100 ºC umgesetzt.
3. GERÄTE
3.1. Dickwandige Glasampulle, ca. 5 ml Inhalt (Länge 40—45 mm, Durch-
messer 14—16 mm).
3.2. Geeichte Pipetten von 1 und 2 ml.
4. REAGENZIEN
4.1. 2%ige methanolische Salzsäure. Herstellung mit gasförmiger Salzsäure und
wasserfreiem Methanol (Anmerkung 1, Methode E).
4.2. Hexan für die Gaschromatographie.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 53
▼B
5. VERFAHREN
5.1. In die Ampulle 2 g des über Natriumsulfat getrockneten und filtrierten
Fettes einwiegen, 2 ml der methanolischen Salzsäurelösung hinzufügen
und die Ampulle über der Flamme zuschmelzen.
5.2. Die Ampulle 40 Minuten in ein Wasserbad von 100 ºC stellen.5.3. Unter fließendem Wasser abkühlen, öffnen, 2 ml destilliertes Wasser und
1 ml Hexan hinzufügen. Zentrifugieren und die Hexanphase abnehmen, sie
ist fertig zum Gebrauch.
Methode D
2. PRINZIP DER METHODE
Das zu untersuchende Fett wird mit methanolischer Kaliumhydroxidlösung
verseift, dann mit Dimethylsulfat behandelt. Nach Zusatz von Salzsäure
erfolgt eine Abtrennung der Methylester. Durch anschließende Behandlung
mit Aluminiumoxid erhält man sehr reine Methylester.
3. GERÄTE
3.1. Reaktionsgefäß aus dickwandigem Glas, etwa 20 ml Inhalt, mit Schliff-
stopfen 10/19 und Sicherheitshaken.
3.2. Rückflußkühler mit Schliff 10/19.
3.3. Glasfiltertiegel G 2, 20 mm Durchmesser.3.4. Glasröhrchen, etwa 10 ml Inhalt, mit konischem Boden.3.5. 1- und 5-ml-Spritzen.
4. REAGENZIEN
4.1. Kaliumhydroxid, 10%ige Lösung in Methanol für die Gaschromatographie.
4.2. Indikator aus Bromkresolgrün: 0,05%ige Lösung in Methanol.4.3. Dimethylsulfat (d = 1,335 bei 15 ºC).4.4. Konzentrierte Salzsäure, d = 1,19, Verdünnung 1:1 mit Methanol für die
Gaschromatographie.
4.5. Aluminiumoxid, standardisiert nachBrockmann, für die Adsorptionsch ro-
matographie.
5. VERFAHREN
5.1. In das 20 ml fassende Reaktionsgefäß etwa 2 g (ungefähr 2,2 ml) des über
Natriumsulfat getrockneten und filtrierten Fettes einfüllen, 5 ml Kaliumhy-
droxidlösung und einige Siedesteinchen zugeben. Den Rückflußkühler
aufsetzen und auf kleiner Flamme 5 Minuten unter Schütteln erhitzen. Die
Verseifung ist vollständig, wenn die Lösung klar aussieht. Unter flie-
ßendem Wasser abkühlen und den Rückflußkühler entfernen.
5.2. Zwei Tropfen Indikatorlösung zugeben, dann langsam mit einer Spritze 1 ml
Dimethylsulfat. Das Reaktionsgefäß fest verschließen und 2—3 Minuten
schütteln, während das untere Ende in ein siedendes Wasserbad getaucht
wird. Die Reaktion ist beendet, wenn der Indikator von blau nachgelb
umschlägt. Unter fließendem Wasser abkühlen, öffnen und 5 ml methanoli-
sche Salzsäure zugeben.
5.3. Einige Sekunden schütteln, das Gefäß schräg halten und durch leichtes
Klopfen das Absetzen der Methylester in Form einer öligen Masse
beschleunigen (Anmerkung A). Die Methylester mit Hilfe einer Spritze,
die bis auf den Boden des Gefäßes reicht, aufnehmen, so viel Aluminiu-
moxid zugeben, wie etwa ¼ des Volumens der Methylester entspricht,
schütteln und durch ein Papierfilter filtrieren.
Anmerkung A: Sofern keine sofortige Abtrennung der Methylester erfolgt,
5 ml Wasser in das Gefäß geben und schütteln.
Methode E
2. PRINZIP DER METHODE
Das zu untersuchende Fett wird unter Rückfluß mit einer Mischung aus
Methanol, Hexan und Schwefelsäure erhitzt. Die dabei entstehenden
Methylester werden mit Petrolether extrahiert.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 54
▼B
3. GERÄTE
3.1. Reaktionsgefäß von etwa 20 ml Inhalt, mit Steigrohr von etwa 1 m Länge
und Schliffverschluß.
3.2. 5-ml-Pipette, graduiert.
3.3. 50-ml-Scheidetrichter.3.4. 10- und 25-ml-Meßzylinder.3.5. Versuchsgefäß, 15 ml Inhalt, mit konischem Boden.
4. REAGENZIEN
4.1. Methylierungsreagenz: wasserfreies Methanol, Hexan und Schwefelsäure (d
= 1,84) im Verhältnis 75:25:1 (V/V/V) gemischt.
4.2. Petrolether, Kp. 40—60 ºC.
4.3. Wasserfreies Natriumsulfat.
5. VERFAHREN
5.1. In das 20-ml-Reaktionsgefäß das von einer Dünnschichtplatte gewonnene
Material einfüllen und 5 ml Methylierungsreagenz zufügen.
5.2. Den Rückflußkühler anschließen und im siedenden Wasserbad 30 Minuten
erhitzen (Anmerkung 2).
5.3. Die Mischung quantitativ mit Hilfe von 10 ml destilliertem Wasser und
10 ml Petrolether in einen 50-ml-Scheidetrichter überführen. Kräftig schüt-
teln, die Phasen absetzen lassen, die wäßrige Schicht ablaufen lassen und
die Petroletherschicht zweimal mit je 20 ml destilliertem Wasser waschen.
In den Scheidetrichter eine kleine Menge wasserfreies Natriumsulfat geben,
schütteln, einige Minuten stehen lassen und abfiltrieren. Das Filtrat in das
15-ml-Gefäß mit konischem Boden füllen.
Das Lösungsmittel im Wasserbad unter Einleiten von Stickstoff abdampfen.
Anmerkung 1: Kleinere Mengen gasförmiger Salzsäure können im Labor
leicht hergestellt werden, indem man in eine käufliche Salz-
säure ( ρ= 1,18) konzentrierte Schwefelsäure ( ρ= 1,84)
eintropfen läßt. Das freigesetzte Gas kann leicht getrocknet
werden, indem man es über konzentrierte Schwefelsäure
leitet. Salzsäure wird schnell von Methanol absorbiert,
deshalb müssen beim Lösen Vorkehrungen getroffen
werden, z. B. indem man das Gas umgekehrt durch einen
kleinen Trichter leitet, dessen Rand die Oberfläche der Flüs-
sigkeit berührt. Größere Mengen an methanolischer
Salzsäure lassen sichauf Vorrat h erstellen, da die Lösung
in dunklen Glasflaschen mit Glasstöpsel haltbar ist.
Anmerkung 2: Zur Kontrolle des Siedevorgangs sollte man einen Glasstab
in das Reaktionsgefäß stellen und die Temperatur des
Wasserbades nicht über 90 ºC ansteigen lassen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 55
▼B
ANHANG XI
BESTIMMUNG DES GEHALTS AN FLÜCHTIGEN HALOGENIERTEN
LÖSUNGSMITTELN IN OLIVENÖL
1. PRINZIP
Gaschromatographische Headspace-Analyse.
2. GERÄTE
2.1. Gaschromatograph mit Elektroneneinfangdetektor (ECD).
2.2. Headspace-Vorrichtung.2.3. Gaschromatographische Glassäule von 2 m Länge und 2 mm Durchmesser.
Stationäre Phase: 10 % OV 101 oder eine gleichwertige Phase, aufgezogen
auf mit Säure gewaschenem und silanisiertem Kieselgur mit einer
Korngröße von 80—100 Mesh.
2.4. Träger- und Hilfsgas: Stickstoff für die Gaschromatographie, geeignet für
Elektroneneinfangdetektoren.
2.5. Glasfläschchen 10—15 ml, versehen mit einem Verschluß aus Aluminium
und Teflon, der eine Entnahme mit Hilfe einer Spritze ermöglicht.
2.6. Klemmen für absolut dichten Verschluß.
2.7. Spritzen 0,5 bis 2 ml, zum Einspritzen von Gas.
3. REAGENZIEN
Standard: Flüchtige halogenierte Lösungsmittel mit einem für die Gaschro-
matographie geeigneten Reinheitsgrad,
Pentan mit einem für die Gaschromatographie geeigneten Reinheitsgrad.
4. ANALYSENVERFAHREN
4.1. Etwa 3 g Öl in ein Glasfläschchen (das nicht wieder verwendet werden
darf) genau einwiegen und das Fläschchen mit dem Verschluß absolut dicht
verschließen. Das Fläschchen bei 70 ºC eine Stunde in einen Thermostaten
stellen. Mit Hilfe einer Spritze genau ein Volumen von 0,2 bis 0,5 ml aus
dem Dampfraum entnehmen und auf die Säule des Gaschromatographen
spritzen. Der Gaschromatograph ist wie folgt einzustellen:
— Verdampfungstemperatur: 150 ºC,
— Säulentemperatur: 70 bis 80 ºC,— Detektortemperatur: 200 bis 250 ºC.
Es können auchandere Temperaturen eingestellt werden, sofern dabei
gleichwertige Ergebnisse erziehlt werden.
4.2. Referenzlösungen: Standardlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen
von flüchtigen halogenierten Lösungsmitteln zwischen 0,05 und 1 mg/kg
herstellen unter Verwendung von Olivenöl, das frei von Lösungsmittel-
spuren ist. Falls erforderlich, werden die halogenierten Lösungsmittel mit
Pentan verdünnt.
4.3. Quantitative Auswertung. Das Verhältnis bilden zwischen den Peakflächen
oder den Peakhöhen der Probe und der Standardlösung, deren Konzentra-
tion der erwarteten Konzentration am nächsten liegt. Liegt der relative
Unterschied über 10 %, so muß die Analyse mit einer neuen Standar-
dlösung wiederholt werden, bis ihre Konzentration innerhalb des
obengenannten relativen Unterschieds liegt. Der Gehalt wird auf der Basis
des Mittelwerts einzelner Einspritzungen ermittelt.
4.4. Abfassung der Ergebnisse. Die Ergebnisse werden in mg/kg (ppm) ange-
geben. Die Nachweisgrenze des Verfahrens liegt bei 0,01 mg/kg.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 56
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ANHANG XII
ORGANOLEPTISCHE PRÜFUNG VON NATIVEM OLIVENÖL
1. UMFANG UND ANWENDUNGSBEREICH
Diese Arbeitsvorschrift bestimmt die Kriterien zur Bewertung des
Flavours von nativem Olivenöl und beschreibt die dafür zu verwendende
Methodik.
2. KURZBESCHREIBUNG
Das beschriebene Verfahren gilt nur für die organoleptische Bewertung
und Einstufung von nativem Olivenöl für den direkten Genuß. Dabei
wird das native Olivenöl von einer Gruppe ausgewählter Prüfer mit Hilfe
eines Prüfbogens nacheiner Bewertungstabelle gemäß den von ih m
hervorgerufenen Sinneseindrücken eingestuft.
3. SENSORISCHE PRÜFUNG: GRUNDBEGRIFFE
Siehe Kapitel „Sensorische Prüfung: Grundbegriffe“.
4. SPEZIFISCHE BEGRIFFE FÜR OLIVENÖL
4.1. Angenehme Sinneseindrücke, die durch folgende typische Qualitätsmerk-
male nativen Olivenöls hervorgerufen werden:
Fruchtig: In Aroma und Bukett an gesunde, frische und erntereife Früchte
erinnernd.
Nach reifen Früchten: Bezeichnung für Olivenöl aus vollreifen Früchten,
allgemein mit schwachem Bukett und süßem Aroma.
Nach grünen Früchten: Bezeichnung für Öl aus grünen Früchten.
4.2. Sinneseindrücke, die je nach Intensität als mehr oder weniger angenehm
empfunden werden und die keine Fehlermerkmale bedeuten, aber die die
Harmonie der Fruchtigkeit beeinflussen.
Apfelartig: Flavour von an Äpfel erinnerndes Olivenöl.
Süß:Bezeichnung für den Wohlgeschmack von Olivenöl ohne aufdring-
liche Süße und ohne hervortretende Bitterkeit, Adstringenz und Schärfe.
Grasig:Bezeichnung für das typische, an frisch gemähtes Gras erin-
nernde Aroma mancher Olivenöle.
Nach grünen Blätter (bitter): Bezeichnung für das von zu grünen Oliven
oder von mitvermahlenen Blättern und Stengeln herrührende Flavour von
Olivenöl.
Bitter:Bezeichnung für den typischen Geschmack von Olivenöl grüner
oder grünlicher Oliven. Je nach Intensität als mehr oder weniger ange-
nehm empfunden.
Adstringierend: Bezeichnung für die Adstringenz mancher Olivenöle.
Scharf:Typische stechende Geschmacksempfindung bei Ölen, die zu
Beginn des Wirtschaftsjahres aus zumeist grünen Oliven erzeugt werden.
Sie entsteht, wenn Phenolverbindungen die über die ganze Mundhöhle
verteilten Enden des Trigeminusnervs reizen.
Mandelartig: Dieser Begriff bezeichnet zweierlei: einmal das typische
Flavour frischer Mandeln und zum zweiten das Flavour getrockneter,
gesunder Mandeln, das mit einem ranzigen Anklang verwechselt werden
kann. Im Kontakt mit Zunge und Gaumen als Abgang wahrnehmbar,
erinnert an süßliche Olivenöle mit verhaltenem Bukett.
Fad oder schal: Flavour von Olivenöl mit schwach ausgeprägten organo-
leptischen Eigenschaften infolge des Verlusts seiner Aromastoffe.
Heuartig: Bezeichnung für das typische, an mehr oder weniger trockenes
Heu erinnernde Flavour mancher Olivenöle.
4.3. Sinneseindrücke, die stets — auch wenn sie kaum wahrnehmbar sind —
als unangenehm empfunden werden und ein organoleptisches Fehler-
merkmal bedeuten.
Espartoartig: Bezeichnung für das typische Flavour von Olivenöl aus
Oliven, die mit Hilfe neuer Espartograskörbe gepreßt wurden. Dieses1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 57
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Aroma kann in verschiedenen Nuancen auftreten, je nachdem, ob Körbe
aus grünem oder trockenem Espartogras verwendet wurden.
Erdig:Bezeichnung für das typische Flavour von Olivenöl, das von
anhaftender Erde oder Schlamm ungewaschener Oliven herrührt. Dieses
Flavour kann in Einzelfällen von modrigen Anklängen begleitet sein.
Alt:Bezeichnung für das typische Flavour von zu lange in Lagerbehältern
aufbewahrtem Olivenöl. Kann auch durch zu langes Aufbewahren in
Verpackungsbehältern auftreten.
Wurmstichig: Bezeichnung für das typische Flavour von Olivenöl aus
stark von Larven der Olivenfliege (Dacus oleae) befallenen Oliven.
Metallisch: An Metall erinnerndes Flavour. Typischfür Olivenöl, das
beim Vermahlen, Schlagen, Pressen oder Lagern unter unsachgerechten
Bedingungen zu lange mit Lebensmitteln oder Metalloberflächen in
Kontakt stand.
Muffig:Bezeichnung für das typische Flavour von Olivenöl mit erhebli-
chem Schimmel- und Hefepilzbefall infolge mehrtägiger feuchter
Lagerung.
Ranzig:Bezeichnung für das durch Autoxidation infolge des zu langen
Kontakts mit der Luft entstehende typische Flavour von Fetten und
Ölen. Dieses Flavour ist unerwünscht und irreversibel.
Stichig („atrojado“): Bezeichnung für das typische Aroma von Öl aus
Oliven, die sichbereits in einem fortgesch rittenen Zustand der Zersetzung
durchGärung befanden.
Lakig:Bezeichnung für das Flavour von Olivenöl aus in Salzlake aufbe-
wahrten Oliven.
Tresterartig: Bezeichnung für das typische Flavour von Oliventrestern.
Seifig:Bezeichnung für ein Flavour, das einen schmierseifenartigen
Sinneseindruck vermittelt.
Fruchtwasserartig: Bezeichnung für das typische Flavour von Olivenöl,
das von mangelhaftem Dekantieren und zu langem Kontakt mit Frucht-
wasser herrührt.
Wein- oder Essigartig: Bezeichnung für das typische Flavour von an
Wein oder Essig erinnerndes Olivenöl, das vor allem durchdie anomal
starke Bildung von Essigsäure, Ethylacetat und Ethanol verursacht wird.
Gurkenartig: Durch zu langes Lagern in luftdichten Behältnissen, insbe-
sondere in Dosen, hervorgerufenes Flavour von Olivenöl, das von 2,6-
Nonadienal herrührt.
Brandig oder erhitzt: Bezeichnung für das typische Flavour von Olivenöl,
das durchübermäßige und/oder zu lange Erwärmung bei der Gewinnung
verursacht wird, insbesondere durch unsachgemäße warme Behandlung
bei der Herstellung der Paste.
Schlammig: Bezeichnung für das typische Aroma von Olivenöl, das aus
dekantiertem Ölschlamm aus unterirdischen Becken oder Behältern
gewonnen wurde.
Nach Preßmatten: Bezeichnung für das typische Flavour von Olivenöl,
das mit Hilfe von Preßmatten gewonnen wurde, die mit vergorenen
Rückständen verschmutzt werden.
Schmierölartig: Bezeichnung für den Geruch von Olivenöl aus einer
Ölmühle, deren Ausrüstung nicht sachgerecht von Benzin-, Fett- oder
Mineralölresten gereinigt wurde.
Roh:Bezeichnung für Olivenöl, das im Mund einen dickflüssigen
pastösen Sinneseindruck hinterläßt.
5. PRÜFGLAS FÜR ÖLE
Siehe Kapitel „Prüfglas für Öle“.
6. PRÜFRAUM
Siehe Kapitel „Leitlinien für die Einrichtung des Prüfraums“.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 58
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7. HILFSMITTEL
Jedem Prüfer sind in seiner Kabine die zur Erfüllung seiner Aufgabe
notwendigen Hilfsmittel zur Verfügung zu stellen. Diese Hilfsmittel
umfassen:
— Gläser (genormt) mit den Proben, die nacheinem Zufallssch lüssel mit
einem Ziffernpaar oder einem Ziffern-Buchstaben-Paar gekenn-
zeichnet sind. Die Kennzeichnung ist mit einem unverwischbaren
und geruchlosen Stift anzubringen;
— Uhrgläser mit identischer Markierung zum Abdecken der Gläser;— Prüfbogen, vgl. Abbildung 2, mit Ausfüllhinweisen;— Bleistift oder Kugelschreiber;— Schälchen mit Apfelstücken;— Glas Wasser von Raumtemperatur.
8. VERFAHREN
Dieser Abschnitt regelt die Vorkenntnisse für die Durchführung der
sensorischen Prüfung von nativem Olivenöl; ferner dient er der Regle-
mentierung des Verhaltens und der Arbeitsweise der an der Prüfung
teilnehmenden Prüfer, die sowohl den allgemeinen als auch den beson-
deren Empfehlungen für das Verkosten von Olivenöl Rechnung zu
tragen haben.
8.1.Aufgaben des Prüfungsleiters bzw. des Vorsitzenden der Gruppe
(bzw. des Panels)
Der Prüfungsleiter muß ausreichend vorgebildet sein und über die nötige
Sach- und Fachkunde für die zur Beurteilung anstehenden Olivenöle
verfügen. Er ist die Schlüsselfigur der Prüfergruppe und trägt die Verant-
wortung für Organisation und Ablauf der Prüfungsarbeit. Er lädt die
Prüfer rechtzeitig ein und klärt sie über die Durchführung der Prüfungen
auf, enthält sich aber jedweder Meinungsäußerung über die Proben.
Er ist verantwortlichfür das Vorh andensein der Hilfsmittel, deren pein-
liche Sauberkeit, die Vorbereitung und Verschlüsselung der Proben,
deren Übergabe an die Prüfer gemäß der geeigneten Prüfungsfolge sowie
für das Einsammeln und die statistische Auswertung der Prüfdaten, damit
gewährleistet ist, daß mit möglichst geringem Aufwand möglichst zuver-
lässige Ergebnisse erzielt werden.
Die Arbeit des Prüfungsleiters erfordert sensorisches Feingefühl, Sorgfalt
bei der Prüfungsvorbereitung, strengste Ordnung hinsichtlich ihrer Durch-
führung sowie Geschick und Geduld bei der Planung und Durchführung
der Prüfungen. Aufgabe des Prüfungsleiters ist es, die Mitglieder zu moti-
vieren und bei ihnen Interesse, Neugier und Wettbewerbsgeist zu wecken.
Er hat sich einer Meinungsäußerung zu enthalten und muß sicherstellen,
daß möglicherweise tonangebende Prüfer die anderen nicht beeinflussen.
Ihm obliegen ferner Schulung, Auswahl und Überwachung der Prüfer auf
ihre gebotene Eignung.
8.2.Prüfbedingungen
8.2.1. Probenumfang
Jedes Glas muß 15 ml Öl enthalten.
8.2.2. Temperatur der Probe
Die zur Prüfung anstehenden Proben sind im Glas auf einer Temperatur
von 28 ºC ± 2 ºC zu halten. Die gewählte Temperatur gestattet am besten
die Erfassung der organoleptischen Unterschiede bei Normaltemperatur,
wenn Öle als Zutaten verwendet werden. Bei tieferen oder höheren
Temperaturen kommen entweder die Aromastoffe kaum zur Entfaltung
oder aber es entfalten sich die für erhitzte Öle typischen Aromastoffe.
8.2.3. Prüf ungszeiten
Die für das Verkosten von Olivenöl geeignetste Tageszeit ist der
Vormittag. Geruchs- und Geschmackssinn sind zu bestimmten Tages-
zeiten nachweislich besonders empfindlich.
So ist die Empfindlichkeit von Geruchs- und Geschmackssinn vor den
Mahlzeiten besonders groß und geht danach zurück.
Übertreibung ist aber auch hier zu vermeiden, da Hungergefühle die
Prüfer ablenken, ihr Unterscheidungsvermögen beeinträchtigen und insbe-
sondere ihre Präferenz- und Akzeptanzschwelle herabsetzen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 59
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9. PRÜFER
Die an der organoleptischen Prüfung von Speiseolivenöl als Prüfer teil-
nehmenden Personen sind zu schulen und entsprechend ihrer Eignung
zur Unterscheidung ähnlicher Proben auszuwählen, wobei zu berücksich-
tigen ist, ob und inwieweit ihre Urteilsfähigkeit im Zuge der Schulung
zunimmt (vgl. entsprechenden Absatz).
Zur Prüfung benötigt man 8 bis 12 Prüfer nebst einigen Reserveprüfern
zur Deckung von Ausfällen.
9.1.Allgemeine Verhaltensmaßregeln für Kandidaten und Prüfer
Diese Empfehlungen gelten für das Verhalten der Kandidaten und Prüfer
bei ihrer Arbeit.
Wer vom Prüfungsleiter zur Teilnahme an einer organoleptischen Prüfung
aufgefordert wurde, muß zu der ihm genannten Uhrzeit zur Teilnahme in
der Lage sein und hat dazu folgende Vorschriften zu beachten:
9.1.1. Er stellt mindestens 30 Minuten vor der festgesetzten Uhrzeit das
Rauchen ein.
9.1.2. Parfüm, Kosmetika oder Seife, deren Geruchbei der Prüfung nochwah r-
nehmbar ist, darf nicht verwendet werden. Zum Händewaschen ist
unparfümierte oder schwachparfümierte Seife zu verwenden; dabei sind
die Hände so lange mit Wasser nachzuspülen und abzutrocknen, bis
jedweder Geruchbeseitigt ist.
9.1.3. Der Prüfer muß bei Prüfungsantritt seit mindestens einer Stunde nüchtern
sein.
9.1.4. Wer an einer Unpäßlichkeit und insbesondere einer Beeinträchtigung des
Geruchs- oder Geschmacksempfindens oder an einer die Konzentrations-
fähigkeit beeinflußenden psychischen Belastung leidet, hat dies dem
Prüfungsleiter mitzuteilen, damit dieser ihn von seiner Aufgabe entbindet
oder aber die geeigneten Maßnahmen trifft, wobei auch eine mögliche
Abweichung von den Durchschnittswerten der übrigen Mitglieder der
Gruppe zu berücksichtigen ist.
9.1.5. Der die vorstehenden Vorschriften erfüllende Prüfer sucht die ihm zuge-
wiesene Kabine auf; dies hat so leise und diskret wie möglich zu
geschehen.
9.1.6. Nachdem er darin Platz genommen hat, prüft er, ob alle erforderlichen
Hilfsmittel vorhanden und ordentlich vorbereitet sind und vergewissert
sich, ob die Kennzeichnung des Glases mit der Kennzeichnung des damit
abgedeckten Uhrglases übereinstimmt.
9.1.7. Er liest die Hinweise auf dem Prüfbogen sorgfältig durchund beginnt erst
dann mit der Prüfung der Proben, wenn er sichüber seine Aufgabe voll-
ends im klaren ist. Unklarheiten sind mit dem Prüfungsleiter unter vier
Augen zu klären.
9.1.8. Der Prüfer nimmt das Glas zur Hand, hält es dabei mit dem Uhrglas
bedeckt schräg und schwenkt es dabei einmal ganz um, damit die Innen-
seite möglichst ganz benetzt wird. Er lüftet das Uhrglas und inhaliert das
Bukett der Probe in leichten, ruhigen und langen Zügen durch die Nase
so lange, bis er sichein Urteil über die zur Prüfung ansteh ende Probe
gebildet hat. Das eigentliche Riechen darf nicht länger als 30 Sekunden
dauern. Gelangt er nachdieser Zeit nich t zu einem Urteil, legt er eine
kleine Pause ein und macht einen weiteren Versuch. Nach dem Riechen
prüft er das Flavour (Gesamtsinneseindruck aus Geruchs-, Geschmacks
und Tastempfindung). Dazu nippt er einen kleinen Schluck Öl von etwa
3 ml. Sehr wichtig ist, daß alle geschmacksempfindlichen Teile des
Mundes mit dem Öl benetzt werden, vom vorderen Teil des Mundes
und der Zungenspitze über die Ränder des Zungenrückens bis zum
Gaumen und zur Zungenwurzel, da die Grundgeschmacke süß, salzig,
sauer und bitter an verschiedenen Stellen der Zunge und des Gaumens
unterschiedlich stark wahrgenommen werden.
Es ist unbedingt darauf zu achten, daß genügend Olivenöl von der
Zungenspitze bis zum Gaumen und zur Kehle langsam verteilt wird,
wobei auf die Reihenfolge des Auftretens der Bitterkeit und der Schärfe
zu achten ist. Anderenfalls kann es bei manchen Olivenölen vorkommen,
daß beide Sinneseindrücke nicht wahrgenommen werden oder die Bitter-
keit von der Schärfe verdeckt wird.
Durchkurzes, wiederh oltes Einsaugen von Luft durchden Mund wird die
Probe in der gesamten Mundhöhle verteilt, so daß die flüchtigen Aroma-
stoffe über den Gaumen in die Nase gelangen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 60
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Auchdie Tastempfindungen sind zu erfassen; so müssen die Merkmale
Fließfähigkeit, Dickflüssigkeit, Schärfe oder Stechen erfaßt und je nach
den Erfordernissen der Probe quantifiziert werden.
9.1.9. Bei der organoleptischen Prüfung von nativem Olivenöl wird in jedem
Prüfgang eine einzige Probe bewertet, damit keine Kontrastwirkungen
durchdas sofortige Verkosten anderer auftreten.
Da es bei aufeinanderfolgenden Prüfgängen zu Ermüdungserscheinungen
oder zur Dämpfung der Sinneswahrnehmung durch die vorangehenden
Eindrücke kommt, sind die Ölreste des vorherigen Prüfgangs mit einem
geeigneten Mittel aus dem Mund zu entfernen.
Dazu empfiehlt sich ein kleines Stück Apfel von etwa 15 g, das nach dem
Kauen ausgespuckt werden kann; anschließend ist der Mund mit Wasser
von Zimmertemperatur zu spülen. Zwischen dem Ende eines Prüfgangs
und dem Beginn des nächsten müssen mindestens 15 Minuten vergehen.
9.2.Vorauswahl der Kandidaten
Der Prüfungsleiter führt eine Vorauswahl der Kandidaten in Einzelgesprä-
chen durch, um ihre Persönlichkeit und ihr Umfeld kennenzulernen. An
die physiologischen und psychologischen Voraussetzungen werden keine
sehr hohen Anforderungen gestellt, da jeder Gesunde diese Aufgabe
wahrnehmen kann. Alter, Geschlecht und bestimmte Gewohnheiten
(Rauchen) usw. bleiben in der Bedeutung hinter anderen Gesichtspunkten
wie Gesundheit, persönliches Interesse und Abkömmlichkeit für diese
Arbeit zurück.
Der Prüfungsleiter klärt den Kandidaten im einzelnen über die von ihm
wahrzunehmende Aufgabe auf und unterrichtet ihn über den Zeitaufwand
dafür. Anschließend sammelt er Anhaltspunkte zur Prüfung des Interesses
und der Motivation des Kandidaten sowie seiner tatsächlichen Abkömm-
lichkeit. Der folgende Fragebogen kann dabei als Grundlage verwendet
werden.
1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 61
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Der Prüfungsleiter nimmt anhand dieser Daten eine Vorauswahl vor,
wobei er die Kandidaten aussondert, die an dieser Arbeit wenig Interesse
zeigen, wenig Zeit aufbringen können oder nicht in der Lage sind, ihre
Vorstellungen zu artikulieren.
9.3.Bestimmung der „Durchschnittsschwelle der Gruppe“ für „typische
Merkmale“
Es werden vier Öle ausgewählt, welche die Merkmale „stichig“ („atro-
jado“), „weinartig“, „ranzig“ und „bitter“ jeweils typgerecht und so
deutlichwie möglichverkörpern.
Mit aliquoten Mengen jedes Typs und einem geeigneten Substrat werden
Verdünnungsreihen in Abstufungen um den Faktor 2 angesetzt, bis bei
den zwei oder drei letzten Verdünnungsstufen kein Unterschied gegen-
über dem Glas mit dem reinen Substrat mehr wahrnehmbar ist. Zwei
Gläser mit dem reinen Substrat bilden den Abschluß der Reihe.
Die Reihe wird mit Verdünnungen höherer Konzentration bis auf 8 aufge-
stockt.
Es werden so viele Muster der verschiedenen Konzentrationen angesetzt,
daß jedem der Kandidaten für jedes Merkmal vollständige Verdünnungs-
reihen bereitgestellt werden können.
Zur Ermittlung der „Durchschnittsschwelle“ der Kandidaten sind jedem
von jeder Verdünnungsstufe ein Glas mit 15 ml der Verdünnung sowieein Glas mit 15 ml des reinen Substrats bereitzustellen. Der Kandidat
muß nach Durchführung der Prüfung angeben, ob sie identisch oder
verschieden voneinander sind.
Die gleiche Prüfung wird mit Verdünnungsreihen der verbleibenden Prüf-
merkmale durchgeführt.
Die Zahl der richtigen Antworten aller Kandidaten für die jeweilige
Verdünnungsstufe wird aufgezeichnet und als Prozentsatz der Anzahl der
durchgeführten Prüfungen angegeben.
In einem Koordinatensystem werden die Prozentsätze der richtigen
Antworten für die jeweilige Verdünnungsstufe auf der Ordinate und die
geprüften Verdünnungsstufen in ansteigender Reihenfolge auf der
Abszisse eingetragen.
Abbildung 1 zeigt ein praktisches Beispiel für diese Darstellung. Als
Wahrnehmungsschwelle gilt die Verdünnungsstufe, für die zu 75 % rich-
tige Beurteilungen abgegeben wurden. Sie wird ermittelt durch
Extrapolation dieses Punktes von der Kurve auf die Abszisse.
Diese Schwellenkonzentration, die je nach Intensität des Merkmals für
jedes geprüfte Olivenöl unterschiedlich ausfallen kann, dürfte für die
einzelnen Gruppen von Kandidaten ähnlich sein; sie ist unabhängig von
Gebräuchen, Gewohnheiten oder persönlicher Präferenz und infolge-
dessen ein gemeinsamer Bezugspunkt für jede Gruppe von
Durchschnittsmenschen, so daß sie zur Harmonisierung der verschiedenen
Prüfergruppen hinsichtlich der Geruchs- und Geschmacksempfindlichkeit
verwendet werden kann.
Anhand der ermittelten Schwellenkonzentration der Gruppe ist wie folgt
zu verfahren:
Es wird eine Verdünnungsreihe mit zunehmender und abnehmender
Konzentration in der Weise angesetzt, daß die Schwellenkonzentration
mit dem Platz 10 dieser Reihe zusammenfällt. Daraus ergibt sich folge-
richtig, daß die Verdünnungen 11 und 12 stärker verdünnt sind, so daß
sehr schwer festzustellen ist, daß sie Öl mit dem entsprechenden
Merkmal enthalten.
Ausgehend von der Konzentration C
10können die übrigen Verdünnungen
nachfolgender Formel angesetzt werden:
C10·an
Darin bedeuten:a = Konstante für den Verdünnungsfaktor 1,5,
n = Exponent mit einem Wert von 9 bis − 2.
Beispiel:Gegeben sei ein Schwellenwert für ranziges Olivenöl von 0,32. Mit C
10= 0,32 und a = 1,5 ergeben sichfolgende Verdünnungsstufen:1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 62
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Probe 1 23456789 1 0 1 1 1 2
Konzentration 12,30 8,20 5,47 3,65 2,43 1,62 1,08 0,72 0,48 0,32 0,21 0,14
Durch Ansetzen von Verdünnungsreihen nach dieser Arbeitsvorschrift
anhand der nach diesem Berechnungsverfahren bestimmten Schwellen-
werte für die übrigen Merkmale erhält man für alle Laboratorien Skalen
mit gleicher Reizabstufung für jedes einzelne Merkmal, selbst wenn die
Fehler der verwendeten Olivenöle unterschiedlich stark festzustellen sind.
9.4.Auswahl der Prüfer nach dem Verfahren der „Intensitätseinstufung“
Zur Auswahl sind zwei- bis dreimal so viele Kandidaten heranzuziehen,
wie zur Bildung der Prüfergruppe erforderlichsind, damit die mit der
höchsten Sinnenschärfe und dem größten Unterscheidungsvermögen
ausgewählt werden können. Die Prüfung sollte immer mit dem gleichen
Erzeugnis wie das später zu Prüfende durchgeführt werden (daher wird
immer Olivenöl verwendet).
Abbildung 1
Bei der Auswahl des Verfahrens ist unabhängig von seiner Leistungs-
fähigkeit auch seine Wirtschaftlichkeit hinsichtlich der Ölmenge, der
Anzahl der Proben und des Zeitaufwands zu berücksichtigen. Ein
Auswahlverfahren ist umso wirksamer, je besser es gelingt, das optimale
Niveau der folgenden drei abhängigen Variablen zu bestimmen: a)
„Kosten“ in Abhängigkeit von der Anzahl der Prüfungen, b) „Anteil“
der möglicherweise geeigneten Kandidaten, die durch Zufall leider ausge-
sondert werden, und c) „Anzahl“ der ungeeigneten Kandidaten, die das
Glück hatten, das Auswahlverfahren dennoch zu bestehen.
Für die Auswahl wird das Verfahren der „Intensitätseinstufungsprüfung“
(intensity rating test) gemäß den Normen ASTM (American Society for
Testing and Materials), STP (Special Technical Publication) Nr. 440, S.
53, verwendet, das in folgenden Punkten abgeändert wurde:
1. Verringerung der Zahl der Proben in der Prüfreihe;1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 63
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2. Erweiterung der Reizstoffpalette durch Aufnahme weiterer Geruchs-
und Geschmacksnoten für die Auswahl, um den häufigsten wahrnehm-
baren Fehlern von Olivenöl Rechnung zu tragen;
3. Variation des Konzentrationsverhältnisses in der Prüfreihe und4. statistische Auswertung der Ergebnisse.
Geräte und Hilfsmittel:— Flaschen oder Kolben, 1 500 ml,
— dunkelfarbige Prüfgläser,
— Reagenzgläser, 10 ml, 15 ml, 1 000 ml und 1 500 ml.
Reagenzien:— Merck-Paraffin (Nr. 7.160, DAB 6, USP XX) oder geruch- und
geschmackloses Ölsubstrat (frisch raffiniertes Oliven- oder anderes
Öl)
— Olivenöle: stichig („atrojado“), weinartig, ranzig und bitter.
9.4.1. Verfahren
Nachdem Ansetzen der Verdünnungen wird, ausgeh end von 25 Kandi-
daten, mit dem Auswahlverfahren begonnen. Die Auswahl wird nach
dem nachstehend beschriebenen Verfahren für jede Geschmacksnote
durchgeführt.
1. Verdünnungsreihen mit 12 verschlüsselt gekennzeichneten Gläsern
(eine Reihe pro Kandidat) werden vorbereitet. In jedes Prüfglas
werden 15 ml Probe mit der nachder Formel C
10·anjeweils herge-
stellten Konzentration gegeben.
2. Nachdem Füllen werden die Gläser mit aufliegendem Uh rglasdeckel
mindestens eine Stunde vor Beginn der Prüfungen bei einer Tempe-
ratur von 20—22 ºC im Prüfungsraum stehen gelassen, um sie auf
Raumtemperatur zu bringen.
3. Die 12 Gläser werden vom Prüfungsleiter in absteigender Reihenfolge
der Konzentrationen in einer Reihe aufgestellt.
Anschließend wird jeder Kandidat aufgefordert, die Prüfung einzeln
durchzuführen; dazu sind ihm folgende Anweisungen zu erteilen:
9.4.2. Anweisungen für die Kandidaten
Die 12 vor dem Kandidaten aufgestellten Gläser enthalten jeweils
Verdünnungen der Reize „stichig“ („atrojado“), „weinartig“, „ranzig“
und „bitter“. Die Gläser unterscheiden sich hinsichtlich der Intensität des
Geruchs, wobei das mit dem stärksten Geruch ganz links steht und die
Konzentrationen stufenweise nach rechts abnehmen. Das ganz rechts
stehende Glas kann so wenig von dem Geruchsstoff enthalten, daß er
nicht mehr wahrnehmbar ist.
Gehen Sie bitte wie folgt vor: Machen Sie sich mit den Gerüchen der
einzelnen Gläser der Reihe vertraut. Beginnen Sie dabei mit dem Geruch
des rechten Glases (Nr. 12) und versuchen Sie, sich die Intensität des
Geruchs zu merken. Sinnenermüdung ist zu vermeiden.
Sobald Sie sich die Reihenfolge der Verdünnungsstufen gemerkt haben,
verlassen Sie den Prüfraum.
Anschließend nimmt der Prüfungsleiter ein Glas aus der Reihe heraus,
stellt es gleichauf mit dem ganz rechts stehenden und schließt die Lücke
durchVersch ieben der übrigen Gläser. Sie betreten darauf wieder den
Prüfstand und setzen die Prüfung fort.
Die Prüfung besteht aus folgender Aufgabe:
Das herausgenommene Glas ist an seinen ursprünglichen Platz in der
Reihe zurückzustellen. Dazu kann beliebig oft ein Geruchsvergleich der
Gläser durchgeführt werden. Zu beachten ist, daß das Glas bei korrekter
Plazierung stärker als das unmittelbar rechts daneben stehende und
schwächer als das unmittelbar links daneben stehende riechen muß. Diese
Prüfung wird mit drei weiteren Gläsern wiederholt.
Zur Erleichterung der Prüfung und der Abgabe der Antworten erhalten
die Kandidaten zusammen mit den vorstehenden Anweisungen folgendes
Formblatt.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 64
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9.4.3. Ergebnisse
Der Übersichtlichkeit halber notiert der Prüfungsleiter die von den
einzelnen Kandidaten gemachten Angaben wie folgt:
9.4.4. Statistische Auswertung der Antworten
Im vorliegenden Fall sind die an ihren ursprünglichen Platz zurückzustel-
lenden Gläser für alle Kandidaten gleich; nach den statistischen
Berechnungen für diesen Fall muß es sich dabei um die folgenden Gläser
mit den für das jeweilige Merkmal aufgeführten Seriennummern handeln:
Stichig
(„atrojado“) (St)Weinartig (W) Ranzig (R) Bitter (B)
Glas Nr. Glas Nr. Glas Nr. Glas Nr.
(10, 5, 7, 2) (11, 3, 8, 6) (7, 4, 10, 2) (6, 3, 11, 9)
Die der entsprechenden Position des Glases in der Reihe entsprechende
Nummer darf nicht variieren, da die statistischen Berechnungen für
diesen Fall auf der Wahrscheinlichkeit beruhen, mit der die Gläser durch
Zufall an ihren rechten Platz zurückgestellt werden.
Damit die Kandidaten keine Informationen untereinander austauschen
können, hat der Prüfungsleiter folgende Regeln zu beachten:
1. Es muß ausgeschlossen sein, daß die Kandidaten Informationen
austauschen können. Für jeden Kandidaten müssen unterschiedliche
Aufschriften verwendet werden.
2. Es muß ausgeschlossen sein, daß die Kandidaten in Erfahrung bringen
können, welche Gläser herausgenommen wurden.
3. Jedem Kandidaten sind die Gläser mit den vorstehenden Nummern in
einem anderen Prüfungsgang zu präsentieren.
Die Ergebnisse jedes Kandidaten werden wie folgt benotet:
Die 12 Gläser mit den entsprechenden Verdünnungsstufen des Merkmals
i seien in abnehmender Reihenfolge ihrer Konzentration mit ei
1,ei
2,…ei
12bezeichnet (i = ein beliebiges der Merkmale stichig („atrojado“), wein-
artig, ranzig und bitter).
Es seien ei
kein beliebiges Glas und K ′der von dem Kandidaten gewählte
Platz des betreffenden Glases in der Reihe. Die Werte für K und K ′sind
demnach ganze Zahlen zwischen 1 und 12 einschließlich und bezeichnen
den tatsächlichen und den vom Kandidaten gewählten Platz des betref-
fenden Glases in der Reihe.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 65
▼B
T (maximal zulässige Abweichung) sei ein vorab auf einen bestimmten
Betrag, in unserem Fall auf den Betrag 3, festgesetztes Kriterium, das
bei K′−K > T den automatischen Ausschluß des Kandidaten zur Folge
hat(1).
Ist dagegen K ′−K≤T, so wird der Kandidat allgemein nicht ausge-
schlossen, sondern kann weiter an der Prüfung teilnehmen, da er in der
Lage ist, das herausgenommene Glas an den richtigen Platz zurückzu-
stellen, zumindest aber an zwei unmittelbar benachbarte Plätze.
In diesem Fall ist die Note, die ein Kandidat erhält, der ein bestimmtes
Geschmacksmerkmal (Konzentration) beurteilt hat (z. B. stichig („atro-
jado“), gleich dem Quadrat aus der Differenz zwischen der richtigen
Stelle in der Reihenfolge der Gläser und der Stelle, an die der Kandidat
das Glas gestellt hat
Phst=( K′−K)2
Da ein Kandidat anhand von vier Intensitätsstufen (Verdünnungsstufen)
jedes einzelnen Merkmals geprüft wird, bestimmt sichdie Einzelbewer-
tung für das folgende Merkmal (z. B. „stichig“ („atrojado“)) wie folgt:
ZSt=PSt
h+PSt
j+PSt
l+PSt
m
Zum besseren Verständnis nachstehend einige Beispiele:
Beispiel 1:
Nehmen wir an, der Kandidat A habe die Fragen nach den vier Inten-
sitätsstufen der Versuchsreihe des Merkmals (i) wie folgt beantwortet:
Richtiger Platz des
Glases in der Reihe
(K)Gewählter Platz
(K′)Differenz zu dem richtigen Platz
(K′−K)
7 7 7−7 = 0
4 5 4−5 = −1
10 6 10−6 = 4 (1)
2 4 2−4 = −2
(1) Dieser Kandidat scheidet aus, da er bei der Prüfung nur einen Wert von T > 3
erreicht hat.
Beispiel 2:
Nehmen wir an, der Kandidat ordnet die Verdünnungsstufen eines Merk-
mals wie folgt zu:
Richtiger Platz des
Glases in der Reihe
(K)Gewählter Platz
(K′)Differenz zu dem richtigen Platz
(K′−K)
7 7 7−7 = 0
4 4 4−4 = 0
10 7 10−7 = 3
2 3 2−3 = −1
Dieser Kandidat scheidet nicht aus. Er hat für dieses Auswahlmerkmal
folgende Benotung erreicht:
Zi=O2+O2+32+( −1 )2=1 0
Die Gesamtbewertung für die Auswahl oder das Ausscheiden des Kandi-
daten aufgrund seiner Antworten zu den vier Auswahlmerkmalen
geschieht wie folgt:1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 66
(1) Der Prüfungsleiter muß den Kandidaten unbedingt veranlassen, die Prüfung mit
Bedacht zu absolvieren, damit sein Geruchssinn nicht abstumpft.▼C1
▼B
▼B
PSt
h+PSt
j+PSt
i+PSt
m=ZSt
PW
h+PW
j+PW
i+PW
m=ZW
PR
h+PR
j+PR
i+PR
m=ZR
PB
h+PB
j+PB
i+PB
m=ZB
Z Gesamt = ZSt…+ZB
Darin bedeutet:
St = stichig („atrojado“),
W = weinartig,
R = ranzig,
B = bitter.
Es stellt sichnun die Frage, bis zu welch em Betrag von Z davon auszu-
gehen ist, daß der Kandidat über Sinnenschärfe, Geruchsgedächtnis und
Zuordnungsvermögen in dem Maße verfügt, wie es zur richtigen Beant-
wortung im Hinblick auf die vier Merkmale erforderlichist. Z ist
definitionsgemäß nie negativ, und ein Betrag Z = 0 bedeutet, daß der
Kandidat alle 16 ihm präsentierten Verdünnungsstufen (vier für jedes
Merkmal) erkannt und richtig zugeordnet hat. Ist der Betrag von Z von
Null verschieden, so bedeutet dies, daß der Kandidat die Bereiche, zu
denen die ausgewählten Verdünnungen gehören, zwar erkannt hat, den
genauen Platz jedochnich t feststellen konnte, da er über kein gutes
Unterscheidungsvermögen hinsichtlich der Verdünnungsreihe, die ihm
für ein oder mehrere Merkmale präsentiert wurden, verfügt.
Es empfiehlt sich daher, einen kritischen Wert Zcfestzulegen, für den bei
ausschließlich zufälliger Platzbewertung durch den Kandidaten innerhalb
der von ihm zuvor erkannten Bereiche die Wahrscheinlichkeit eines
Gesamtwerts Z < Zcein hinreichend kleiner Wert αist, der vorher fest-
gelegt werden kann. Mit anderen Worten, die Wahrscheinlichkeit, daß
mit diesem Verfahren ein Prüfer ausgewählt wird, dessen Unterschei-
dungsvermögen für die bei der Auswahl herangezogenenen Merkmale
unzureichend ist, ist kleiner als α.
Bei gegebenem α,das in unserem Fall auf 0,05 festgelegt wurde, ergibt
sichZcaus der Wahrscheinlichkeitsverteilung der Variablen Z, die sich
ihrerseits aus den Wahrscheinlichkeitsverteilungen der Variablen P ergibt
(K′).
Aus der statistischen Berechnung ergibt sich für Zcein Betrag von 34.
Nachdem der von jedem Kandidaten erreichte Wert Z feststeht, scheiden
all jene Kandidaten aus, die einen Wert von über 34 erreicht haben.
So erhalten die Kandidaten A und B folgende Bewertungen:
Merkmal Kandidat A Kandidat B
Stichig („atrojado“) (St) ZSt=1 0 ZSt=1 2
Weinartig (W) ZW=1 0 ZW=1 1
Ranzig (R) ZR=1 0 ZR=1 5
Bitter (B) ZB=4 ZB=0
Σ=3 4 Σ=3 8
Die Kandidaten A und B kommen auf jeweils 34 bzw. 38 Punkte;
demnach hat der Kandidat A die Prüfung bestanden, B dagegen nicht
und scheidet aus. Nachdem die Kandidaten mit über 34 Punkten ausge-
schieden sind, werden die übrigen in der Reihenfolge der von ihnen
erzielten Punkte in einer Eignungsliste aufgelistet und die zwölf besten
ausgewählt.
9.5.Schulung
Die Schulung verfolgt hauptsächlich folgende Ziele:
a) Die Prüfer sollen mit den zahlreichen Geruchs- und Geschmacksnoten
von nativem Olivenöl vertraut gemacht werden.
b) Die Prüfer sollen mit den spezifischen sensorischen Methoden vertraut
gemacht werden.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 67
▼B
c) Die Fähigkeit jedes einzelnen, die sensorischen Merkmale wahrzu-
nehmen, zu identifizieren und quantitativ zu bestimmen, soll geschult
werden.
d) Sinnenschärfe und Gedächtnis für die verschiedenen Merkmale sollen
verbessert werden, damit eine zuverlässige Beurteilung gewährleistet
ist.
Entsprechend den Möglichkeiten der Teilnehmer sowie der Untersuchung
umfaßt die Schulung gewöhnlich eine Reihe von Prüfungsgängen, bei
denen die Prüfer die Öle einzeln prüfen und anschließend die dabei ange-
troffenen Schwierigkeiten gemeinsam mit dem Leiter diskutieren und die
Bewertungen erläutern, um Kriterien und Meinungsbildung zu vereinheit-
lichen.
Der nach einer bestimmten Zahl von Prüfungsgängen erreichte Stand der
Schulung wird anhand der Zunahme des Prozentsatzes richtiger Bewer-
tungen bei Unterscheidungsprüfungen oder anhand der Analyse der
Varianz der durchschnittlichen Einzelbewertungen der Gruppe bei
Skalenprüfungen ermittelt.
Der praktische Nutzen dieser Schulung wurde eingehend erörtert; heute
gilt sie als sehr effizient und sogar als unverzichtbar zur Erzielung zuver-
lässiger, richtiger sensorischer Daten.
9.6.Leistungskontrolle
Erfahrene Prüfer nehmen gewöhnlich regelmäßig an sensorischen
Prüfungen teil, die ihnen sehr viel abverlangen. Ihre Bewertungen sind
in technischer und gewerblicher Hinsicht oft von großer Tragweite; dahermüssen sie sich nach ihrer Auswahl und Schulung Leistungskontrollen
unterziehen, damit die Verläßlichkeit der Ergebnisse gewährleistet ist.
Daher müssen die an Routineprüfungen teilnehmenden Prüfer regelmäßig
in bestimmten Abständen ihre Leistungsfähigkeit nachweisen.
10. VERFAHREN FÜR DIE BEWERTUNG DER ORGANOLEPTISCHEN
EIGENSCHAFTEN VON NATIVEM OLIVENÖL
NachErfüllung der Bedingungen und Bereitstellung der erforderlich en
Mittel entsprechend den vorstehenden Normen sowie nach Auswahl der
Prüfergruppe unterzieht jeder Prüfer das ihm zur Prüfung bereitgestellte
Glas mit dem Prüfmuster einer Geruchs- und Geschmacksprüfung(
1);
dabei prüft er die olfaktorischen, gustatorischen, taktilen und kinästheti-
schen Merkmale anhand des in Abbildung 2 abgebildeten Prüfbogens, in
den er das Vorhandensein und die Intensität der Merkmale einträgt.
Alsdann bewertet er die Qualität des Öls.
10.1.Verwendung des Prüfbogens in Abbildung 2 (Flavourbeschreibung
und Qualitätsbewertung)
In der linken Hälfte des Bogens sind einige der typischsten sensorischen
Merkmale aufgeführt, die bei Olivenöl am häufigsten auftreten und für
sein Flavour kennzeichnend sind. Werden außer den aufgeführten Merk-
malen weitere Merkmale wahrgenommen, so sind diese mit dem oder den
treffendsten Begriff(en) dafür in der Rubrik „Andere“ zu vermerken.
Die wahrgenommenen Merkmale sind entsprechend ihrer Intensität durch
Ankreuzen (+) des dafür vorgesehenen Kästchens entsprechend der nach-
stehenden Bewertungstabelle zu bewerten:
1 = kaum wahrnehmbar,
2 = schwach,
3 = mittel,
4 = stark,5 = extrem.
Die rechte Hälfte des Bogens enthält eine Neun-Punkte-Bewertungsta-
belle (9 = außergewöhnliche Qualität, 1 = ungenügend), anhand derer
der Prüfer eine einheitliche Gesamtbewertung der Ölmerkmale vornimmt.
Bei dieser Bewertung ist den guten Eigenschaften und den Fehlern, die
bereits in der linken Hälfte im einzelnen vermerkt wurden, Rechnung zu
tragen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 68
(1) Sofern er bei der Geruchsprobe ein extrem oder stark unangenehm vorschmeckendes
Merkmal feststellt, kann er ausnahmsweise darauf verzichten und dies auf dem Prüf-
bogen vermerken.
▼B
Die erste Spalte (Fehler) der Bewertungstabelle umfaßt fünf Rubriken,
wonach Olivenöle hauptsächlich aufgrund des völligen Fehlens oder des
mehr oder weniger ausgeprägten Auftretens von Flavourfehlern beurteilt
werden; da die Bewertungstabelle jedochneun Punkte umfaßt, sind die
in der zweiten Spalte (Merkmale) aufgeführten Nuancen und Aspekte zu
berücksichtigen, die zu der Gesamtbewertung der Qualität entscheidend
beitragen.
10.2.Endgültige Bewertung
Der Prüfungsleiter sammelt die von den einzelnen Prüfern abgegebenen
Bewertungen ein und überprüft, ob die wahrgenommenen und die in der
„Profilbeschreibung“ vermerkten Merkmale und Intensitäten mit der in
der „Bewertungstabelle“ erteilten Bewertung in Einklang stehen.
Bei deutlichen Abweichungen muß der Prüfungsleiter den Prüfer auffor-
dern, seinen Bewertungsbogen zu überprüfen.
Erforderlichenfalls muß der Prüfer die Untersuchung wiederholen.
Schließlich stellt der Prüfungsleiter die Bewertungen durch die Gesamt-
gruppe in einer Tabelle zusammen und berechnet das arithmetische
Mittel und die Art des Fehlers (des Mittelwerts).
Wenn die Art des Fehlers größer ist als der Fehler der Methode, so muß
er die Untersuchung durch die gesamte Gruppe wiederholen lassen.
Nur im Fall von Revisionsanalysen müssen die Untersuchungen so oft
wiederholt werden, bis drei Bewertungen je Probe vorliegen. Die endgül-
tige Bewertung ist der Mittelwert von drei Bewertungen, wobei das
Ergebnis auf eine Dezimalstelle angegeben wird.
Wenn der Mittelwert für die Intensität von bitter und/oder pikant über 2,5
liegt, so wird dem Öl die entsprechende Bewertung gegeben, wobei
zusätzlichangegeben wird, daß es besonders bitter und/oder pikant ist.
Abfassung der Ergebnisse: Der Prüfungsleiter bestimmt auf der Basis des
Mittelwerts die Kategorie, in die die Probe entsprechend den in Anhang I
vorgesehenen Grenzwerten eingeordnet wird. ►M3Zu diesem Zweck
berücksichtigt der Prüfungsleiter bis zum 31. Oktober 1993 einen Tole-
ranzwert von + 0,5, wenn der Mittelwert mindestens 5 Punkte erreicht.
Er gibt im Untersuchungsbericht nur die Kategorie an, in die die Probe
eingeordnet wird. Wird die Prüfung durcheinen Prüfer gemäß Artikel 2
Absatz 2 Unterabsatz 1 dieser Verordnung durchgeführt, so bestimmt
dieser die Kategorie nachdemselben Verfah ren. ◄
Anmerkung: Die Proben sind bis zu ihrer Untersuchung verschlossen im
Kühlschrank aufzubewahren und sind jedesmal wieder dort
hinzubringen, bis die dritte Untersuchung abgeschlossen ist.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 69
▼M3
Abbildung 2
Natives Olivenöl
SENSORISCHE PRÜFUNG: GRUNDBEGRIFFE
1. UMFANG UND ANWENDUNGSBEREICH
Diese Norm enthält eine Zusammenstellung der bei der sensorischen
Prüfung zu verwendenden Begriffe und ihrer Definitionen.
2. BEGRIFFE2.1.Allgemeine Begriffe
Sensorische Prüfung (Substantiv):
Sinnenprüfung der organoleptischen Eigenschaften.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 70
▼B
▼B
Wahrnehmung (Substantiv):
Sinnliches Erfassen äußerer Gegenstände und Vorkommnisse.Organoleptisch (Adjektiv) (Merkmal oder Eigenschaft):
Bezeichnet Eigenschaften eines Erzeugnisses, die mit Hilfe der Sinnesor-
gane wahrgenommen werden können.
Sachverständiger (Substantiv) (auf dem Gebiet der Prüfung der organo-
leptischen Eigenschaften):
Auf die sensorische Prüfung eines bestimmten Erzeugnisses speziali-
sierter Prüfer, der über Grundkenntnisse über dessen Herstellung und die
Marktpräferenzen verfügt.
Prüfer(Substantiv):
Ausgewählte und geschulte Person mit Unterscheidungsvermögen und
Sinnesschärfe zur sensorischen Prüfung der organoleptischen Eigen-
schaften eines Lebensmittels.
Prüfergruppe (Substantiv):
Gruppe von eigens ausgewählten und geschulten Prüfern, die zur sensori-
schen Prüfung des Erzeugnisses unter kontrollierten Bedingungen
zusammentritt.
Empfindung (Substantiv):
Durch einen Sinnesreiz verursachtes subjektives Phänomen. Dieses
Phänomen ist hinsichtlich seiner Art, seiner Bewertung sowie seiner
Intensität subjektiv unterscheidbar und objektiv über das betreffende
Sinnesorgan beschreibbar.
Sinnenschärfe (Substantiv):
Fähigkeit der Sinnesorgane zur qualitativen und quantitativen Wahrneh-
mung eines schwach ausgeprägten Sinnesreizes oder von geringen
Unterschieden zwischen Sinnesreizen.
Verkostung (Substantiv):
Vorgang des Wahrnehmens, Prüfens und Beurteilens organoleptischer
Eigenschaften, insbesondere der olfaktorischen, gustatorischen, taktilen
und kinästhetischen Eigenschaften eines Lebensmittels.
Akzeptanz (Substantiv):
Positive Reaktion eines einzelnen oder einer Gruppe, die ein Erzeugnis
aufgrund seiner organoleptischen Eigenschaften auslöst.
Harmonie (Substantiv):
Eigenschaft eines Erzeugnisses, die eine angenehme Gesamtempfindung
verursacht. Diese Empfindung wird verursacht durch die Wahrnehmung
ihrer Einzelbestandteile in Form von olfaktorischen, gustatorischen,
taktilen und kinästhetischen Reizen, da die Einzelbestandteile in jeweils
geeigneten Konzentrationsverhältnissen vorliegen.
Anklang(Substantiv):
Tatbestand der bereitwilligen Aufnahme eines Erzeugnisses aufgrund
seiner organoleptischen Eigenschaften durch den einzelnen oder eine
Gruppe.
Unterscheidung (Substantiv):
Qualitative und/oder quantitative Unterscheidung zweier oder mehrerer
Reize.
Kompensation (Substantiv):
Ergebnis des Zusammenwirkens mehrerer Sinnesreize derart, daß ein
jeder davon schwächer wahrnehmbar ist, als wenn er allein vorläge.
Aussehen (Substantiv):
Mit den Augen wahrgenommenes Gesamtbild der organoleptischen
Eigenschaften: Größe, Form, Farbe, Erscheinungsbild, Trübheit, Klarheit,
Fließvermögen, Schaum und Efferveszenz. Dieser Begriff ist dem Begriff
Erscheinungsbild vorzuziehen.
Eigenschaft (Substantiv):
Wahrnehmbares Merkmal.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 71
▼B
2.2.Physiologische Begriffe
Reizstoff (Substantiv):
Physikalisch oder chemisch beschreibbarer Stoff, der eine spezifische
Reaktion der externen oder internen Sinnesrezeptoren hervorruft.
Geschmack (Substantiv) (Geschmackssinn):
Einer der Sinne, dessen Rezeptoren sichim Mund und insbesondere auf
der Zunge befinden und auf verschiedene gelöste Verbindungen
reagieren.
Gustatorisch (Adjektiv):
Bezeichnet die Eigenschaft eines Erzeugnisses zur Reizung des
Geschmackssinns und Hervorrufung einer oder mehrerer der vier Grund-
geschmacke: süß, salzig, sauer und bitter.
Rezeptor (Substantiv):
Auf die Aufnahme von Reizen spezialisierter Teil eines Sinnesorgans, der
in der Lage ist, Reize zu empfangen und an die Nervenzellen weiterzu-
leiten.
Anmerkung: Die Rezeptoren werden nachder Art der Energie, die den
entsprechenden Sinnesreiz auslösen, unterschieden (Licht,
Wärme, Schall usw.).
Geruch(Substantiv):
Funktion der Geruchsorgane hinsichtlich der Wahrnehmung und Unter-
scheidung von Molekülen, die in der Gasphase von außen mittelbar oder
unmittelbar durch die Nase mit ihm in Berührung kommen.
Intensität (Substantiv):
Stärke der Energie einer Eigenschaft, die oberhalb der Schwelle mit Hilfe
einer quantitativen Werteskala bestimmt werden kann.
Anpassung (Substantiv):
Vorübergehende Änderung der Sinnesschärfe bei der Wahrnehmung von
sensorischen Reizstoffen als Ergebnis einer ständigen, wiederholten
Einwirkung eines bestimmten oder eines diesem ähnlichen Reizstoffs.
Hemmung (Substantiv):
Ausbleiben der Reaktion eines Sinnesorgans oder eines seiner Teile unter
der Einwirkung eines geeigneten Reizstoffs, dessen Intensität oberhalb
der Schwelle liegt.
Reaktion (Substantiv):
Wirkung, mit der die Sinneszellen auf einen oder mehrere Reize eines
bestimmten Sinns reagieren.
Körper(Substantiv):
In der Mundhöhle wahrgenommene taktile Empfindung, die ein Gefühl
für die Dichte, Viskosität, Konsistenz oder Kompaktheit eines Erzeug-
nisses liefert.
Duftigkeit (Substantiv):
Frischer, weicher und milder Geruch.Riechen(Verb) (Fähigkeit des Geruchssinns):
Fähigkeit der Geruchswahrnehmung.
Objektiv (Adjektiv):
a) Bezeichnung für die Vermittlung einer wirklichkeitsgetreuen und
überprüfbaren Darstellung eines Sachverhalts unter Vernachlässigung
menschlicher Faktoren (z. B. Vorlieben, Gewohnheiten, Affekte);
b) Bezeichnung für eine Technik, die es trotz der Verwendung sensori-
scher oder instrumentaler Verfahren erlaubt, selbstverursachte Fehler
zu vermeiden.
Anmerkung: Von der Verwendung des Begriffs instrumentell als
Synonym wird abgeraten.
Subjektiv (Adjektiv):1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 72
▼B
Bezeichnung für die Vermittlung einer Wahrnehmung, die nicht allein
durchden Reizstoff h ervorgerufen wird, sondern auchdurchunser
Denken und Fühlen.
Kinästhetik:Gesamtheit der Empfindungen, die sich beim Pressen der Probe bei der
Bewegung in der Mundhöhle oder beim Pressen zwischen den Fingern
ergeben (Beispiel: Zerdrücken von Käse zwischen den Fingern).
Schwelle (Substantiv):
—absolute Schwelle
Mindestmenge eines Reizstoffes,
— die eine Empfindung hervorruft (Wahrnehmungsschwelle) oder
— bei der diese Empfindung identifiziert wird (Identifizierungs-
schwelle);
—Unterscheidungsschwelle
Mindestmenge eines Reizstoffs, bei der ein merklicher Unterschied in
der Intensität der Empfindungen feststellbar ist;
—Oberschwelle
Höchststärke eines Reizstoffs, oberhalb derer eine Zunahme der
Stärke nicht mehr wahrgenommen wird;
—Präferenzschwelle
Mindestmenge eines Reizstoffs oder kritische supraliminare Konzen-
tration dieses Reizstoffs, die im Vergleichzu einem neutralenReizstoff angenehme bzw. unangenehme Empfindungen hervorruft,
z. B. bei der Wahl zwischen einer Zuckerlösung und Wasser.
Anmerkung: Es ist zu unterscheiden zwischen absoluter Präferenz-
schwelle und Unterscheidungspräferenzschwelle.
Subliminar (Adjektiv):
Unterhalb der absoluten Schwelle.
Supraliminar (Adjektiv):
Oberhalb der absoluten Schwelle.Sinnenermüdung:
Besonderer Fall der Sinnengewöhnung, bei dem ein Rückgang der
Sinnesschärfe zu verzeichnen ist.
Kompensation (Substantiv):
Ergebnis des Zusammenwirkens mehrerer Reizstoffe derart, daß jeder
schwächer wahrgenommen wird, als wenn er alleine vorkäme.
Synergistisch (Adjektiv):
Ergebnis des Zusammenwirkens bestimmter Stoffe in der Weise, daß die
Intensität der durch ihre Mischung hervorgerufenen organoleptischen
Eigenschaften stärker ist als die Summe der einzeln wirkenden Kompo-
nenten.
Kontrastwirkung (Substantiv):
Steigerung der Reaktion auf die Unterschiede zweier gleichzeitig oder
nacheinander wirkender Reizstoffe. Gegenteil von Konvergenzwirkung.
Konvergenzwirkung (Substantiv):
Abschwächung der Reaktion auf die Unterschiede gleichzeitig oder nach-
einander wirkender Reizstoffe. Gegenteil von Kontrastwirkung.
2.3.Begriffe für organoleptische Eigenschaften
Sauer(Adjektiv):
a) Bezeichnung für den vorherrschenden Geschmack verdünnter
wässriger Lösungen der meisten Säuren (z. B. Zitronensäure, Milch-
säure, Traubensäure);
b) Bezeichnung für die Eigenschaft von Stoffen, im Reinzustand oder als
Gemisch diesen Grundgeschmack hervorzurufen.
Das zugehörige Substantiv lautet: Azidität.
Säuerlich (Adjektiv):1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 73
▼B
Bezeichnung für die Geruchs- und Geschmackswirkung von vor allem bei
der Fermentierung freiwerdenden Säuren sowie von Lebensmitteln, die
diese Empfindungen hervorrufen.
Einige Faktoren, die zu dieser Empfindung beitragen, stehen in Bezie-
hung zur Fermentierung, zum Beispiel die Milchsäure- oder
Essigsäurebildung eines Lebensmittels.
Bitter(Adjektiv):
a) Bezeichnung für den vorherrschenden Geschmack verdünnter wäßriger
Lösungen von verschiedenen Stoffen wie Chinin, Koffein sowie
bestimmter Alkaloide;
b) Bezeichnung für die Eigenschaft von Stoffen, im Reinzustand oder als
Gemisch diesen Grundgeschmack hervorzurufen.
Das zugehörige Substantiv lautet: Bitterkeit.
Salzig(Adjektiv):
a) Charakteristische Geschmacksempfindung, wie sie in typischer Weise
von einer Natriumchloridlösung hervorgerufen wird;
b) Bezeichnung für die Eigenschaft von Stoffen, im Reinzustand oder als
Gemisch diesen Grundgeschmack hervorzurufen.
Das zugehörige Substantiv lautet: Salzigkeit.Süß(Adjektiv):
a) Bezeichnung für den vorherrschenden Geschmack wäßriger Lösungen
verschiedener Stoffe, z. B. Saccharose;
b) Bezeichnung für die Eigenschaft von Stoffen, im Reinzustand oder als
Gemisch diesen Grundgeschmack hervorzurufen.
Das zugehörige Substantiv lautet: Süße.
Adstringierend (Adjektiv):
a) Bezeichnung für eine komplexe Empfindung, wie sie von einer
verdünnten wäßrigen Lösung mancher Stoffe, z. B. von bestimmten
Tanninen (Kaki- oder Schlehentannin), hervorgerufen wird;
b) Bezeichnung für die Eigenschaft von Stoffen, im Reinzustand oder als
Gemischdiese Empfindung h ervorzurufen.
Das zugehörige Substantiv lautet: Adstringenz.Flavour(Substantiv):
Als Flavour bezeichnet man den durch das Zusammenwirken von olfakto-
rischen, gustatorischen, taktilen und kinästhetischen Empfindungen
hervorgerufenen Gesamtsinneseindruck, der für ein Lebensmittel kenn-
zeichnend ist und als mehr oder weniger angenehm oder unangenehm
empfunden wird.
Geschmack (Substantiv):
a) Empfindung, die durchdie von bestimmten löslich en Substanzen
hervorgerufene Reizung der Geschmackspapillen hervorgerufen wird;
b) Bezeichnung für die von solchen Stoffen hervorgerufene besondere
Empfindung.
Grundgeschmack (Substantiv):
a) Beim Einatmen bestimmter flüchtiger Stoffe über das Riechorgan
wahrgenommener Gesamtsinneseindruck;
b) Bezeichnung für die von solchen Stoffen hervorgerufene besondere
Empfindung.
Geruch(Substantiv):
a) Kombination von Empfindungen, die durch das Geruchsorgan wahr-
genommen werden beim Einziehen bestimmter flüchtiger Substanzen
durchdie Nase;
b) Eigenschaft einer spezifischen Empfindung, die von den obenge-
nannten Substanzen herrührt.
Aroma(Substantiv):
a) Beim Verkosten eines Lebensmittels indirekt über das Riechorgan
wahrgenommene angenehme Empfindungen;1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 74
▼B
b) in der Parfümerie sowie in der Umgangssprache wird der Begriff auch
für dieselben direkt über die Nase wahrgenommenen Empfindungen
verwendet.
Nachgeschmack (Substantiv):
Von den zuerst wahrgenommenen Empfindungen abweichender Gesamt-
sinneseindruck, der sicheinstellt, nach dem der Reizstoff den Mund
verlassen hat.
Aromatisch (Adjektiv):
a) Bezeichnung für den von manchen Stoffen im Reinzustand oder als
Gemisch beim Verkosten hervorgerufene, als Aroma bezeichnete
Empfindung;
b) Bezeichnung für Stoffe, die bei der Geruchsprüfung durch die Nase
eine duftige, frische Empfindung hervorrufen.
Textur(Substantiv):
Eigenschaften eines Erzeugnisses im festen oder rheologischen Zustand,
welche die mechanischen Rezeptoren insbesondere der Mundregion beim
Verkosten anregen können.
Hinweis: Mit diesem Begriff werden ausschließlich objektiv vorhandene
Eigenschaften bezeichnet, nicht aber hervorgerufene Empfin-
dungen, die mit allgemeinen Begriffen wie Konsistenz,
Faserigkeit, Geschmeidigkeit usw. bezeichnet werden.
Kauen:Vorgang, bei dem das Lebensmittel mit allen geschmacksempfindlichen
Teilen des Mundes in Berührung gebracht wird, damit die von ihm
hervorgerufenen Empfindungen im Mund wahrgenommen werden
können.
Hinweis: Dieses Glossar kann ergänzt werden unter Heranziehung der
Normen ISO 5492/I-V und anderer Veröffentlichungen, wie
beispielsweise die von J. L. Magnen unter dem Titel „Les
Cahiers techniques du Centre National de Coordination des
Etudes et Recherches sur la Nutrition et l'Alimentation“ usw.
PRÜFGLAS FÜR ÖLE
1. UMFANG UND ANWENDUNGSBEREICH
Diese Vorschrift beschreibt die Eigenschaften des Glases zur organolepti-
schen Prüfung von Speiseölen (Geruch, Geschmack, Flavour).
Sie beschreibt ferner die Vorrichtung zum Anwärmen und Temperieren
auf die für diese Prüfung geeignete Temperatur.
2. BESCHREIBUNG
In Abbildung 1 ist ein Prüfglas mit den am besten für diesen Zweck
geeigneten Merkmalen dargestellt; diese lassen sichwie folgt zusammen-
fassen:
a) höchstmögliche Standfestigkeit, um ein Umstoßen und Vergießen des
Inhalts zu verhindern;
b) Standfläche paßt in die Öffnungen des Anwärmblocks hinein, was
eine gleichmäßige Erwärmung des Glasbodens ermöglicht;
c) eine Form, die am Boden am weitesten ist, so daß die flüchtigen
Bestandteile der Öle vollständig freigesetzt werden. Sie verengt sichim Mundbereich, so daß die gleichen Verbindungen konzentriert
werden, wodurchsich ergestellt wird, daß sie durchdie Nase besser
wahrgenommen und identifiziert werden können;
d) dunkles Glas. Es verhindert, daß der Prüfer die Farbe des Öles
erkennt, dadurchvoreingenommen wird und sichmöglich erweise von
einer objektiven Bestimmung ablenken läßt.
2.1.Maße
Das in Abbildung 1 dargestellte Glas hat folgende Maße:
— Gesamtvolumen …............................. 130 ml ± 10 ml,
— Gesamthöhe …................................. 60 mm ± 1 mm,— Durchmesser der Kelchöffnung ….............. 50 mm ± 1 mm,1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 75
▼B
— größter Kelchdurchmesser …................... 70 mm ± 1 mm,
— Durchmesser des Kelchbodens …............... 35 mm ± 1 mm,
— Wandstärke …................................. 1,5 mm ± 0,2 mm,
— Stärke des Glasbodens … ....................... 5mm±1mm.
Zu jedem Glas gehört ein Uhrglas mit einem um 10 mm größeren Durch-
messer als der der Kelchöffnung. Dieses Glas dient als Deckel, damit
nichts von dem Aroma verloren geht und kein Staub eindringen kann.
2.2.Fertigungsdaten
Das Glas muß aus resistentem, dunklem, blasen- und kratzerfreiem Glas
gefertigt sein, so daß die Farbe des Inhalts nicht erkennbar ist.
Der Glasrand muß gleichmäßig, glatt und leicht umgebogen sein.
Das Glas muß getempert sein, damit es den bei den Prüfungen auftre-
tenden Temperaturschwankungen standhält.
2.3.Vorschriften für den Gebrauch
Zur Reinigung der Gläser ist geruchsfreie Seife bzw. Spülmittel zu
verwenden und anschließend ausreichend mit Wasser nachzuspülen, um
jedwede Rückstände von Reinigungsmittel zu entfernen. Schließlich
werden sie mit destilliertem Wasser nachgespült, man läßt abtropfen und
trocknet sie in einem Trockenschrank.
Konzentrierte Säuren oder gar Chromsäuregemische dürfen nicht
verwendet werden.
Die Gläser sind bis zum Gebrauchim Trockensch rank oder in einem
Schrank zum Schutz gegen Fremdgeruch aufzubewahren.
Vor jeder Verwendung ist jedes Glas durchRiech en auf Fremdgeruchzu
prüfen. Bei der Versuchsvorbereitung sind die Kennzeichen eines jeden
Glases sowie das enthaltene Ölmuster sorgfältig aufzuzeichnen. Nur der
Prüfungsleiter darf wissen, welches Kennzeichen welcher Ölprobe
entspricht.
3. VORRICHTUNG ZUM ANWÄRMEN DER PROBEN
Die organoleptische Prüfung der Proben muß bei einer bestimmten
Temperatur geschehen, die bei Speiseölen 28 ± 2 ºC betragen muß. Damit
dies gewährleistet ist, muß sich in jeder Kabine in Reichweite des Prüfers
eine Anwärmvorrichtung gemäß Abbildung 2 befinden. Sie besteht aus
einem Aluminiumblock in einem thermostatisch gesteuerten Wasserbad
und gewährleistet eine gleichmäßige Temperatur. Dieser Block weist
eine Reihe von paßgenauen Vertiefungen für den Boden auf. Der Unter-
schied zwischen der Temperatur der Anwärmvorrichtung und dem Öl in
den Gläsern in den Vertiefungen der einzelnen Blöcke darf höchstens
± 2 ºC betragen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 76
▼B
Abbildung 1 — Prüfglas
Maße (in mm)1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 77
▼B
Abbildung 2 — Vorrichtung zum Anwärmen der Proben
(Maße in mm)
LEITLINIEN FÜR DIE EINRICHTUNG EINES PRÜFRAUMS
1. EINLEITUNG
Der Prüfraum soll den an der sensorischen Prüfung teilnehmenden
Prüfern zweckmäßige, bequeme und genormte Arbeitsbedingungen
bieten, um ihnen die Arbeit zu erleichtern und die Wiederholbarkeit und
Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.
2. UMFANG UND ANWENDUNGSBEREICH
Diese Vorschriften regeln die Grundvoraussetzungen für die Einrichtung
eines Prüfraums.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 78
▼B
3. ALLGEMEINE SPEZIFIKATION DER EINRICHTUNG
Der Raum muß ungeachtet seiner Fläche (3.1) folgenden Anforderungen
genügen:
Der Raum muß angenehm und gut ausgeleuchtet (3.2), aber neutral
gehalten sein. Daher empfiehlt sich ein beruhigender, glatter und heller
Wandanstrich zur Schaffung einer entspannten Atmosphäre(1).
Der Raum muß leicht zu reinigen und darf keinen Geräuschquellen
ausgesetzt sein; daher ist er nach Möglichkeit mit einer Schallisolierung
zu versehen. Ferner darf er keinerlei Fremdgeruch ausgesetzt sein und
ist nachMöglich keit mit einer geeigneten Lüftungsanlage auszurüsten.
Sofern die Umgebungstemperaturen es verlangen, ist der Prüfraum mit
einer Klimaanlage auszustatten, die eine konstante Temperatur von 20
bis 22 ºC gewährleistet.
3.1.Maße
Die Maße hängen stark von den Möglichkeiten der Laboratorien bzw.
Unternehmen ab. Allgemein muß der Raum zur Aufnahme von etwa 10
Kabinen und einem Bereichzur Vorbereitung der Proben ausreich en.
Je größer der Raum ist, desto besser ist es natürlich, da in diesem Fall
Nebenräume beispielsweise für die Reinigung des Materials, die Herrich-
tung von Speisen und das Zusammentreten „offener Prüfgruppen“
eingerichtet werden können.
3.2.Beleuchtung
Die allgemeine natürliche oder künstliche Beleuchtung (z. B. mit Tages-
licht-Röhrenleuchten) muß gleichmäßig, regelbar und diffus sein.
3.3.Lufttemperatur und -feuchtigkeit
Der Raum muß ständig angenehme Lufttemperatur und -feuchtigkeit
aufweisen. Es empfiehlt sich eine Temperatur von 20—22 ºC und eine
relative Luftfeuchtigkeit von 60 bis 70 %, sofern keine besonderen
Bedingungen gelten.
4. BESCHREIBUNG DER KABINEN4.1.Allgemeine Merkmale
Die Kabinen sind nebeneinander angeordnet, gleichausgestattet und
durchTrennwände so voneinander getrennt, daß die Prüfer beim Sitzen
keinen Kontakt zueinander haben. Sie können aus jedwedem geeigneten,
reinigungsfreundlichen und haltbaren Material gefertigt werden (z. B.
Holz, glasierte Sperrholzplatten, Walzplatten usw.). Bei Verwendungvon Anstrichen müssen diese nach dem Trocknen völlig geruchlos sein.
Die in jeder Kabine aufgestellten Stühle müssen bequem und höhenver-
stellbar sein.
Außerdem muß jede Kabine über eine richtungs- und helligkeitsverstell-
bare Einzelbeleuchtung verfügen.
Jede Kabine sollte ferner über einen Schalter mit einer außerhalb der
Kabine gelegenen Lichtquelle verbunden sein, mit der der Prüfer dem
Betreuer diskret melden kann, daß er mit der Prüfung fertig ist, weitere
Proben wünscht, ein Hilfsmittel benötigt, eine Unregelmäßigkeit festge-
stellt hat oder eine Information benötigt usw.
4.2.Maße
Die Kabinen müssen genügend Platz bieten und bequem sein.
Allgemein sind folgende Maße vorzusehen:Länge:0,75 m (ohne Spülbecken),
0,85 m (mit Spülbecken);
Tiefe:0,50 m (Tisch),1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 79
(1) Farbe und Beleuchtung können die Ergebnisse der sensorischen Prüfung beeinflussen.
▼B
0,20 m (Trennwandaufmaß);
Trennwandhöhe:
mindestens 0,60 m ab Tischhöhe;Tischhöhe:
0,75 m.
4.3.Anordnung
Die Tischplatte muß leicht zu reinigen sein.Ein Teil dieser Tischplatte ist für ein Spülbecken mit fließendem Wasser
vorgesehen. Sofern dies nicht möglich sein sollte, ist dieser Bereich für
eine Schüssel, einen Spucknapf oder ähnliches vorzusehen.
Falls die Proben während der Prüfung auf einer konstanten Temperatur
über oder unter der Raumtemperatur gehalten werden müssen, ist eine
geeignete Einrichtung dafür vorzusehen (Wasserbad, Heizplatte usw.).
In einer Höhe von etwa 1,10 Metern kann auch ein Regal angebracht
werden, um verschiedene Hilfsmittel (Gläser, kleine Geräte usw.)
abstellen zu können.
Sofern die Anordnung der Kabinen in dem Raum es erlaubt, sollte eine
Einrichtung für die Bereitstellung der Proben vorgesehen werden. Diese
könnte als Schiebefenster (Abbildung 1), Drehfenster mit vertikaler
Achse für Standgläser (hohe Gläser) (Abbildung 2) oder mit horizontaler
Achse für Probengefäße geringer Höhe (Abbildung 3) vorgesehen
werden. Es kommt lediglichdarauf an, daß die Öffnung groß genug ist,
daß die Tabletts mit den Probengefäßen hindurchpassen.
5. NEBENRÄUME
Sofern genügend Platz vorhanden ist, sind getrennte Räumlichkeiten für
die Vorbereitung der Proben (Versuchsküche für den Fall der Durchfüh-
rung von Prüfungen mit Speisen o. a.), Regale für das Abstellen der
Gläser oder Hilfsmittel sowie für Besprechungen vor oder nach den
Prüfungen vorzusehen. Diese Räumlichkeiten sind sauber zu halten und
dürfen keinesfalls so gelegen oder beschaffen sein, daß die Arbeit der
Prüfer im Prüfraum durch Gerüche, Geräusche oder Gespräche
beeinträchtigt werden kann.
Abbildung 4 zeigt ein Beispiel eines Prüfraums mit Nebenräumen.
Hinweis: Bei den beschriebenen Verhältnissen handelt es sich um Ideal-
bedingungen; sollte es nicht möglich sein, eine vergleichbare
Einrichtung ausschließlich für die sensorische Prüfung bereitzu-
stellen, könnten die Prüfungen in einem Raum durchgeführt
werden, der die beschriebenen Mindestbedingungen (Licht,
Temperatur, Schall-Isolierung, Gerüche) erfüllt und in dem
transportable Kabinen aus Faltelementen so aufgestellt werden,
daß zumindest die Prüfer voneinander getrennt sind.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 80
▼B
EINRICHTUNG DER KABINE
Abbildung 1
1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 81
▼B
DREHFENSTER MIT VERTIKALER ACHSE
Abbildung 2
1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 82
▼B
DREHFENSTER MIT HORIZONTALER ACHSE
Abbildung 3
1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 83
▼B
LABOR FÜR DIE SENSORISCHE PRÜFUNG
Abbildung 4 — Beispiel eines Prüfraums
1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 84
▼B
ANHANG XIII
RAFFINATIONSNACHWEIS
1. NEUTRALISIEREN UND BLEICHEN DES OLIVENÖLS IM LABO-
RATORIUM
1.1.Neutralisieren des Öls
1.1.1. Geräte
— hohes 300-ml-Becherglas,
— Laborzentrifuge mit 100-ml-Gläsern,
— 250-ml-Becherglas,
— 100-ml-Rundkolben,— 1-Liter-Scheidetrichter.
1.1.2. Reagenzien
— 12%ige wäßrige Natriumhydroxidlösung,
— 1%ige Lösung von Phenolphthalein in Äthylalkohol,
— Hexan, analysenrein,
— Isopropylalkohol, analysenrein.
1.1.3. Verfahren
a)Öle mit einem Gehalt an freien Fettsäuren, berechnet als Ölsäure, von
weniger als 30 %
Man gibt 50 g rohes Öl in ein hohes 300-ml-Becherglas und erwärmt
im Wasserbad auf 65 ºC. Unter langsamem Rühren gibt man — mit
einem Überschuß von 5 % — so viel 12%ige Natriumhydroxidlösung
hinzu, wie dem Gehalt des Öls an freien Fettsäuren entspricht. Unter
Aufrechterhaltung der Temperatur von 65 ºC wird 5 Minuten weiter-
gerührt.
Das Ganze wird in 100-ml-Zentrifugengläser überführt und die Seifen-
masse durchZentrifugieren abgetrennt. Das dekantierte Öl wird in ein
250-ml-Becherglas gegeben und mit 50 bis 60 ml kochendem destil-
liertem Wasser gewaschen. Die wäßrige Phase wird mit Hilfe eines
Saughebers entfernt. Die Waschungen werden wiederholt, bis auch
Spuren von Seifenresten entfernt sind (Verschwinden der Rosafärbung
des Phenolphthaleins).
Zur Entfernung der geringen Restwassermengen wird das Öl zentri-
fugiert.
b)Öle mit einem Gehalt an freien Fettsäuren, berechnet als Ölsäure, von
mehr als 30 %
In einen 1-Liter-Scheidetrichter gibt man 50 g rohes Öl, 200 ml
Hexan, 100 ml Isopropylalkohol und — mit einem Überschuß von
0,3 % — so viel 12%ige Natriumhydroxidlösung, wie dem Gehalt
des Öls an freien Fettsäuren entspricht.
Eine Minute lang kräftig rühren. 100 ml destilliertes Wasser hinzu-
geben, erneut rühren und stehen lassen. Nach der Phasentrennung
wird die untere seifenhaltige Schicht abgelassen. In vielen Fällen
bildet sich zwischen den beiden Phasen (ölhaltige obere und wäßrige
untere Schicht) eine Zwischenschicht, die Schleimstoffe und unlös-
liche Substanzen enthält und die ebenfalls entfernt werden muß.
Anschließend wird die Hexanlösung des neutralen Öls mit Portionen
von jeweils 50 bis 60 ml einer Lösung aus Isopropylalkohol und
destilliertem Wasser im Verhältnis 1:1 (Volumenteile) bis zum
Verschwinden der Rosafärbung des Phenolphthaleins gewaschen.
Darauf wird das Hexan durchAbdestillieren im Vakuum (z. B. mit
Hilfe eines Rotationsverdampfers) vollständig entfernt.
1.2.Bleichen des neutralisierten Öls
1.2.1. Geräte
— 250-ml-Dreihalskolben mit Schliffansätzen für:
a) Thermometer mit Unterteilung in 1 ºC für Messungen bis 90 ºC,
b mechanisches Rührwerk, 250 bis 300 Umdrehungen/min, geeignet
zum Betrieb im Vakuum,1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 85
▼B
c) Anschluß für die Vakuumpumpe;
— Vakuumpumpe für 15 bis 30 Millibar Endvakuum, mit Manometer.
1.2.2. Verfahren
In den Dreihalskolben werden etwa 100 g neutralisiertes Öl eingewogen.
Thermometer und Rührwerk einführen, Vakuumpumpe anschließen und
auf 90 ºC unter Umrühren erwärmen; die Temperatur wird unter
ständigem Rühren so lange aufrechterhalten, bis das zu untersuchende
Öl vollständig vom Wasser befreit ist (etwa 30 Minuten).
Danachwird das Vakuum unterbroch en und 2 bis 3 g aktivierte Blei-
cherde zugegeben.
Dann wird wieder ein Vakuum mit einem Druck von 15 bis 30 Millibar
hergestellt, wobei über eine Zeit von 30 Minuten die Temperatur auf
90 ºC und die Drehzahl des Rührwerks bei etwa 250 Umdrehungen/min
gehalten werden. Danach wird in einem thermostatisch regulierten Trok-
kenschrank warm filtriert (50—60 ºC).1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 86
▼B
ANHANG XIV
ZUSÄTZLICHE ANMERKUNGEN 2, 3 UND 4 ZU KAPITEL 15 DER
KOMBINIERTEN NOMENKLATUR
1.„Anmerkung 2.A: Als Olivenöl im Sinne der Positionen 1509 und 1510 gilt
nur das ausschließlich aus der Verarbeitung von Oliven
gewonnene Öl, nicht jedoch wiederverestertes Olivenöl
und Mischungen von Olivenöl mit anderen Ölen.
Die Anwesenheit von wiederverestertem Olivenöl oder
von anderen Ölen wird mit den in den Anhängen V, VII,
IX, X und XII angegebenen Verfahren bestimmt. Die
Sterin- und Fettsäurezusammensetzungen aller Olivenöle
der Positionen 1509 und 1510 sind in den nachstehenden
Tabellen aufgeführt.
Tabelle I — Gehalt an Fettsäuren in GHT
der GesamtfettsäurenTabelle II — Gehalt an Sterinen in GHT
der Gesamtstearine
Myristinsäure M 0,1 Cholesterin M 0,5
Linolensäure M 0,9 Brassicasterin M 0,2
Arachinsäure M 0,7 Campesterin M 4,0
Eicosensäure M 0,5 Stigmasterin ≤Campesterin
Behensäure M 0,3 Beta-Sitosterin (1) m 93,0
Lignocerinsäure M 0,5 Delta-7-Stigma-
sterinM 0,5
M = maximaler Gehalt.
m = minimaler Gehalt.
(1) Summe aus Delta-5,23-Stigmastadienol + Cholesterin + Beta-Sitosterin + Sitostanol +
Delta-5-Avenasterin + Delta-5,24-Stigmastadienol.
Anmerkung 2.B: Als ‚native Olivenöle‘ gelten Öle, die aus Oliven
ausschließlich durch mechanische oder andere physikalische
Verfahren unter Bedingungen, insbesondere Temperaturbe-
dingungen, gewonnen werden, die nicht zur
Verschlechterung der Öle führen und die keine andere
Behandlung erfahren haben als Reinigen, Dekantieren,
Zentrifugieren und Filtrieren. Sie sind nachstehend in den
Ziffern I und II definiert. Ausgeschlossen sind Öle, die mit
Hilfe von Lösungsmitteln gewonnen wurden (Position
1510).
I. Als ‚Lampantöl‘ im Sinne der Unterposition 1509 1010
gilt natives Olivenöl, das unabhängig von seinem Gehalt
an freien Fettsäuren folgende Merkmale aufweist:
a) Gehalt an aliphatischen Alkoholen höchstens 400 mg/
kg;
b) Gehalt an Erythrodiol + Uvaol höchstens 4,5 GHT;
c) Gehalt an gesättigten Fettsäuren in 2-Stellung der
Triglyceride höchstens 1,3 GHT und/oder
d) eines der folgenden Merkmale:
1) Peroxidzahl mehr als 20 meq aktiver Sauerstoff je
kg;
2) Gesamtgehalt an flüchtigen halogenierten
Lösungsmitteln mehr als 0,2 mg/kg oder Gehalt
an einem bestimmten flüchtigen halogenierten
Lösungsmittel mehr als 0,1 mg/kg;
3) Extinktionskoeffizient K270größer als 0,25, nach
Behandlung der Ölprobe mit aktiviertem Alumi-
niumoxid 0,11 oder weniger. Öle mit einem als
Ölsäure berechneten Gehalt an freien Fettsäuren
von mehr als 3,3 g je 100 g können nach Behan-
deln mit aktiviertem Aluminiumoxid gemäß dem
Verfahren in Anhang XV einen Extinktionskoeffi-
zienten K270größer als 0,11 aufweisen. In diesem
Fall muß die Ölprobe nachNeutralisieren und1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 87
▼B
Bleichen im Laboratorium folgende Merkmale
aufweisen:
— Extinktionskoeffizient K270kleiner oder gleich
1,20;
— Schwankung des Extinktionskoeffizienten
(∆K)(1) bei 270 nm zwischen 0,01 und
höchstens 0,16;
4) sensorische Merkmale mit wahrnehmbaren unan-
nehmbaren Geschmacksfehlern, mit einem
Bewertungsergebnis von unter 3,5.
II. Als ‚natives Olivenöl‘ im Sinne der Unterposition
15091090 gilt Olivenöl, das folgende Merkmale
aufweist:
a) Gehalt an freien Fettsäuren, berechnet als Ölsäure,
höchstens 3,3 g je 100 g;
b) Peroxidzahl höchstens 20 meq aktiver Sauerstoff je
kg;
c) Gehalt an aliphatischen Alkoholen höchstens 300 mg/
kg;
d) Gesamtgehalt an flüchtigen halogenierten Lösungs-
mitteln höchstens 0,2 mg/kg, oder Gehalt an einem
bestimmten flüchtigen halogenierten Lösungsmittel
höchstens 0,1 mg/kg;
e) Extinktionskoeffizient K270höchstens 0,250, nach
Behandlung der Ölprobe mit aktiviertem Aluminiu-
moxid höchstens 0,10(2);
f) Schwankung des Extinktionskoeffizienten ( ∆K)(1)i m
Bereich von 270 nm höchstens 0,010;
g) sensorische Merkmale mit einem Bewertungsergebnis
über 3,5, auch mit wahrnehmbaren, jedoch noch
annehmbaren Geschmacksfehlern;
h) Gehalt an Erythrodiol + Uvaol höchstens 4,5 GHT;
i) Gehalt an gesättigten Fettsäuren in 2-Stellung der
Triglyceride höchstens 1,3 GHT.
Anmerkung 2.C: Als Olivenöl im Sinne der Unterposition 15099000 gilt
Olivenöl, das durchBeh andeln von Olivenölen der Unterpo-
sitionen 1509 1010 und/oder 15091090 gewonnen wurde,
auchvermisch t mit nativen Olivenölen, das folgende Merk-
male aufweist:
a) Gehalt an freien Fettsäuren, berechnet als Ölsäure,
höchstens 3,3 g je 100 g;
b) Gehalt an aliphatischen Alkoholen höchstens 350 mg/kg;
c) Extinktionskoeffizient K270größer als 0,250, jedochnich t
größer als 1,20 und nachBeh andlung der Ölprobe mit
aktiviertem Aluminiumoxid größer als 0,10;
d) Schwankung des Extinktionskoeffizienten ( ∆K)(1)i m
Bereich von 270 nm zwischen mehr als 0,01 und nicht
mehr als 0,16;
e) Gehalt an Erythrodiol + Uvaol höchstens 4,5 GHT;
f) Gehalt an gesättigten Fettsäuren in 2-Stellung der
Triglyceride höchstens 1,5 GHT.
Anmerkung 2.D: Als ‚rohe Öle‘ im Sinne der Unterposition 1510 0010
gelten Öle, insbesondere Tresteröle, die folgende Merkmale
aufweisen:
a) Gehalt an freien Fettsäuren, berechnet als Ölsäure, mehr
als 2 g je 100 g;1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 88
(1) Diese Schwankung ist wie folgt definiert:
∆K=Km− 0,5 (Km−4+Km+4)
Kmbezeichnet den Extinktionskoeffizienten für die im Bereich von 270 nm liegende
Wellenlänge, die im Maximum der Absorptionskurve liegt,
Km−4und Km+4bezeichnen die Extinktionskoeffizienten für eine um 4 nm niedriger
bzw. höher liegende Wellenlänge als Km.
(2) Wenn der Extinktionskoeffizient K270größer als 0,25 ist, muß die Bestimmung nach
Behandeln mit aktiviertem Aluminiumoxid wiederholt werden. K270darf jetzt 0,10 nicht
übersteigen.
▼B
b) Gehalt an Erythrodiol + Uvaol mehr als 12 GHT;
c) Gehalt an gesättigten Fettsäuren in 2-Stellung der
Triglyceride höchstens 1,8 GHT.
Anmerkung 2.E: Als Öle der Unterposition 1510 0090 gelten Öle, die durch
Behandeln von Ölen der Unterposition 1510 0010
gewonnen wurden, auchvermisch t mit nativen Olivenölen,
und die nicht die Merkmale der Öle der Ziffern I und II
aufweisen, sofern sie einen Gehalt an gesättigten Fettsäuren
in 2-Stellung der Triglyceride von höchstens 2 GHT
aufweisen.“
2.„Anmerkung 3: Zu den Unterpositionen 1522 0031 und 15220039 gehören
nicht:
a) Rückstände aus der Verarbeitung von Fettstoffen, die Öl
enthalten, dessen Iodzahl nach der Bestimmung mit dem
Verfahren des Anhangs XVI weniger als 70 oder mehr
als 100 beträgt:
b) Rückstände aus der Verarbeitung von Fettstoffen, die Öl
enthalten, dessen Iodzahl zwischen 70 und 100 liegt, bei
dem jedochdie Fläch e des Peaks, der dem Retentionsvo-
lumen des Beta-Sitosterins entspricht und der gemäß
Anhang V der in der nachstehenden zusätzlichen Anmer-
kung 4 genannten Verordnung bestimmt worden ist,
weniger als 93 % der Gesamtfläche der Sterinpeaks
ausmacht.“
3.„Anmerkung 4: Für die Bestimmung der Merkmale der obengenannten
Erzeugnisse sind die in den Anhängen der Verordnung
(EWG) Nr. 2568/91 beschriebenen Analysenverfahren anzu-
wenden.“1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 89
▼B
ANHANG XV
1. ÖLGEHALT DER OLIVENTRESTER
1.1.Geräte
— Geeigneter Extraktionsapparat mit 200- bis 250-ml-Kolben,
— elektrischbeh eiztes Bad (Sandbad, Wasserbad usw.) oder Heizplatte,— Analysenwaage,— Trockenschrank, eingestellt auf höchstens 80 ºC,— elektrischer Trockenschrank mit Thermostat, eingestellt auf 103 ºC
± 2 ºC, der unter Einblasen von Luft oder unter vermindertem Druck
betrieben werden kann,
— mechanische Mühle, leicht zu reinigen, mit der die Trester ohne Erwär-
mung und ohne merkliche Verringerung ihres Gehalts an Wasser und
Öl zerkleinert werden können,
— Extraktionshülse und Watte oder Filterpapier, frei von mit Hexan extra-
hierbaren Stoffen,
— Exsikkator,— Sieb, Maschendurchmesser 1 mm,— Siedesteinchen, zuvor getrocknet.
1.2.Reagenzien
— technisches n-Hexan; Rückstand bei vollständiger Verdampfung unter
0,002 g/100 ml.
2. ARBEITSVORSCHRIFT2.1.Vorbereitung der Probe
Die Probe wird, wenn nötig, in der zuvor gut gereinigten mechanischen
Mühle so weit gemahlen, daß die Teilchen vollständig das Sieb passieren
können.
Etwa ein Zwanzigstel der Probe ist zur Reinigung der Mühle zu benutzen;
dieses Mahlgut ist zu verwerfen. Der Rest ist fein zu mahlen, das Mahlgut
aufzufangen, sorgfältig zu mischen und unverzüglich zu analysieren.
2.2.Untersuchungsprobe
Etwa 10 g der Probe werden nachdem Mah len auf 0,01 g genau für die
Untersuchung abgewogen.
2.3.Vorbereitung der Extraktionshülse
Die Probe wird in die Hülse gegeben und diese mit einem Wattebausch
verschlossen. Bei Verwendung von Filterpapier wird das Mahlgut darineingeschlagen.
2.4.Vertrocknung
Wenn die Trester sehr feucht sind (Gehalt an Wasser und flüchtigen
Stoffen größer als 10 %), ist vorzutrocknen, wobei die gefüllte Hülse
(bzw. das Filterpapier) so lange wie nötig in den auf höchstens 80 ºC
geheizten Trockenschrank gestellt wird, um den Gehalt an Wasser und
flüchtigen Stoffen auf unter 10 % zu senken.
2.5.Vorbereitung des Kolbens
Der Kolben, der 1 bis 2 Siedesteinchen enthält und zuvor im Trocken-
schrank bei 103 ºC ± 2 ºC getrocknet und danach mindestens 1 Stunde
lang im Exsikkator abgekühlt wurde, wird auf 1 mg genau gewogen.
2.6.Erste Extraktion
Die Hülse (bzw. das Filterpapier) mit der Probe wird in den Extraktionsap-
parat gestellt, die benötigte Menge Hexan in den Kolben gegeben, der
Kolben an den Extraktionsapparat angeschlossen und das Ganze auf das
elektrische Heizbad gestellt. Die Heizung ist so einzustellen, daß der Rück-
fluß mindestens 3 Tropfen in der Sekunde beträgt (mäßiges, nicht heftiges
Sieden).1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 90
▼B
Nach4stündiger Extraktion läßt man abküh len. Die Hülse wird aus dem
Extraktionsapparat genommen und in einen Luftstrom gestellt, um den
größten Teil des Lösungsmittels, mit dem sie durchtränkt ist, zu entfernen.
2.7.Zweite Extraktion
Die Hülse wird in die Mikrokugelmühle entleert, und es wird so fein wie
möglich gemahlen. Das Mahlgut wird quantitativ in die Hülse zurückge-
geben und diese wieder in den Extraktionsapparat gestellt.
Es wird nochmals 2 Stunden extrahiert, wobei der die erste Extraktion
enthaltene Kolben verwendet wird.
Die im Extraktionskolben enthaltene Lösung muß klar sein. Wenn nicht, ist
sie über Filterpapier zu filtrieren, wobei der erste Kolben und das Filterpa-
pier mehrmals mit Hexan gewaschen werden. Das Filtrat und die
Waschflüssigkeit werden in einem zweiten, zuvor getrockneten und auf
1 mg abgewogenen Kolben aufgefangen.
2.8.Entfernung des Lösungsmittels und Wiegen des Extrakts
DurchDestillieren auf dem elektrisch en Heizbad wird der größte Teil des
Lösungsmittels entfernt. Die letzten Lösungsmittelspuren werden durch
20minütiges Erhitzen des Kolbens im Trockenschrank bei 103 ºC ± 2 ºC
beseitigt. Die Beseitigung der Lösungsmittelreste wird durchzeitweiliges
Einführen eines Luftstroms oder besser eines Inertgasstroms oder durch
Arbeiten unter vermindertem Druck erleichtert.
Den Kolben läßt man wenigstens 1 Stunde im Exsikkator abkühlen und
wiegt ihn dann auf 1 mg genau.
Danachwird der Kolben erneut 10 Minuten unter den gleich en Bedin-
gungen erhitzt, im Exsikkator abgekühlt und gewogen.
Der Unterschied zwischen den Ergebnissen der zwei Wägungen darf
höchstens 10 mg betragen. Wenn nicht, ist erneut 10 Minuten zu erhitzen,
dann wieder abkühlen zu lassen und zu wiegen, bis der Gewichtsunter-
schied höchstens 10 mg beträgt. Das letzte Gewicht des Kolbens wird
notiert.
Für jede Untersuchung werden mit der gleichen Probe zwei Bestimmungen
durchgeführt.
3. ERGEBNISSE
3.1.Berechnung und Formel
a) Der Extrakt des Rohprodukts läßt sich in Gewichtsprozenten durch
nachstehende Formel berechnen:
S=m1×100
m0
Dabei sind:
S = Gewichtsprozente des Extrakts des Rohprodukts,
m0= Gewicht der Untersuchungsprobe in g,
m1= Gewicht des Extrakts nach der Trocknung in g.
Als Ergebnis ist das arithmetische Mittel aus den beiden Bestimmungen
zu nehmen, falls die Bedingungen der Wiederholbarkeit erfüllt sind.
Das Ergebnis wird auf eine Dezimalstelle angegeben.
b) Der Extrakt, bezogen auf den Trockenstoff, läßt sichberech nen durch
die Formel:
S×100
100 − U= Extrakt in % Fett, bezogen auf den Trockenstoff.
Dabei sind:
S = Gewichtsprozente des Extrakts des Rohprodukts (vgl. a)),
U = sein Gehalt an Wasser unf flüchtigen Stoffen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 91
▼B
3.2.Wiederholbarkeit
Die Differenz zwischen den Ergebnissen von zwei gleichzeitig oder schnell
nacheinander von ein und demselben Analytiker vorgenommenen Bestim-
mungen darf nicht mehr als 0,2 g Hexan-Extrakt je 100 g Probe betragen.
Andernfalls ist die Analyse mit zwei weiteren Untersuchungsproben zu
wiederholen. Liegt die Differenz wieder über 0,2 g, so ist als Ergebnis das
arithmetische Mittel aus allen vier Bestimmungen zu nehmen.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 92
▼B
ANHANG XVI
BESTIMMUNG DER IODZAHL
1. ANWENDUNGSBEREICH
Diese Internationale Norm beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der
Iodzahl von tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen, nachfolgend als
„Fette“ bezeichnet.
2. DEFINITION
In dieser Internationalen Norm gilt folgende Definition:
2.1. Iodzahl: Iodmenge, die unter den in dieser Internationalen Norm beschrie-
benen Versuchsbedingungen von der Probe aufgenommen wird.
Die Iodzahl wird in Gramm Iod pro 100 g Probe angegeben.
3. PRINZIP
Die zu untersuchende Probe wird in dem Lösungsmittel gelöst und mit dem
Wijs-Reagens versetzt. Nacheiner bestimmten Zeit werden Kaliumiodidlö-
sung und Wasser zugegeben und das freigesetzte Iod mit einer
Natriumthiosulfatlösung titriert.
4. REAGENZIEN
Alle Reagenzien müssen von anerkannter analysenreiner Qualität sein.
4.1. Kaliumiodidlösung, 100 g/l, die kein Iodat oder freies Iod enthält.4.2. Stärkelösung
5 g lösliche Stärke mit 30 ml Wasser mischen und in 1 000 ml kochendes
Wasser geben; 3 Minuten kochen und abkühlen lassen.
4.3. Natriumthiosulfat, eingestellte Standardlösung c (Na
2S2O3·5 H2O) = 0,1
mol/l, höchstens 7 Tage vor der Verwendung eingestellt.
4.4. Lösungsmittel, hergestellt durch Mischen gleicher Volumenteile Cyclo-
hexan und Essigsäure.
4.5. Wijs-Reagens, das Iodmonochlorid in Essigsäure enthält. Es soll das im
Handel erhältliche Wijs-Reagens verwendet werden.
Anmerkung: Das Reagens enthält 9 g ICl3+ 9 g I in Essigsäure.
5. GERÄTE
Übliche Laboreinrichtung und insbesondere nachstehende Geräte:
5.1. Mikrobechergläschen, die sich für die zu untersuchende Probe und zum
Einführen in die Kolben (5.2) eignen.
5.2. 500-ml-Erlenmeyerkolben mit Schliffstopfen, vollständig trocken.
6. VORBEREITUNG DER ANALYSEPROBE
Die homogenisierte Probe wird über Natriumsulfat getrocknet und filtriert.
7. VERFAHREN7.1.Probemenge
Die Menge der zu untersuchenden Probe hängt von der erwarteten Iodzahl
ab (Tabelle 1).1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 93
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Tabelle 1
Erwartete Iodzahl Masse der zu untersuchenden Probe
weniger als 5 3,00 g
5—20 1,00 g
21—50 0,40 g
51—100 0,20 g
101—150 0,13 g
151—200 0,10 g
Die zu untersuchende Probe wird in einem Mikrobechergläschen (5.1) auf
0,1 mg genau eingewogen.
7.2.Bestimmung
Die Probe wird in einen 500-ml-Kolben (5.2) gegeben und mit 20 ml
Lösungsmittel (4.5) versetzt, um das Fett zu lösen. Genau 25 ml Wijs-
Reagens (4.6) zugeben, den Kolben mit dem Stopfen verschließen,
schwenken und dunkel stellen. Für das Wijs-Reagens sollen keine Pipetten
verwendet werden, die mit dem Mund aufgezogen werden müssen.
Dann wird in ähnlicher Weise eine Blindprobe vorbereitet; die das
Lösemittel und das Reagens, nicht aber die Probe enthält.
Bei Proben mit Iodzahlen unter 150 muß der Kolben 1 Stunde dunkel
gestellt werden; bei Iodzahlen über 150 sowie bei polymerisierten oder
stark oxidierten Erzeugnissen sind es 2 Stunden.
NachAblauf dieser Zeit wird in jeden Kolben 20 ml Kaliumiodidlösung
(4.1) und 150 ml Wasser gegeben.
Nun mit der eingestellten Natriumthiosulfat-Standardlösung (4.3) titrieren,
bis die durchIod bedingte Gelbfärbung kaum nochsich tbar ist. Einige
Tropfen Stärkelösung (4.2) zugeben und weiter titrieren, bis die Blau-
färbung unter starkem Schütteln verschwindet.
Anmerkung: Eine potentiometrische Bestimmung des Endpunkts ist
zulässig.
7.3.Zahl der Bestimmungen
Es werden zwei Bestimmungen mit der gleichen Probe durchgeführt.
8. DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE
Die Iodzahl wird nach folgender Gleichung berechnet:
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
m
Hierin bedeuten:
c = die genaue zahlenmäßige Angabe der Konzentration der verwen-
deten Natriumthiosulfat-Standardlösung (4.3) in mol pro Liter;
V1= Volumen der für den Blindversuchverwendeten Natriumth iosulfat-
Standardlösung (4.3) in Millilitern;
V2= Volumen der zur Bestimmung verwendeten Natriumthiosulfat-
Standardlösung (4.3) in Millilitern;
m = Masse der untersuchten Probe (7.1) in Gramm.
Als Ergebnis ist das arithmetische Mittel der beiden Bestimmungen anzu-
geben.1991R2568 — DE — 03.07.1992 — 003.001 — 94