1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 1
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►B ACHTE RICHTLINIE DER KOMMISSION
vom 15. Juni 1978
zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futter-
mitteln
(78/633/EWG)
(ABl. L 206 vom 29.7.1978, S. 43)
Geändert durch:
Amtsblatt
Nr. Seite Datum
►M1Richtlinie 81/680/EWG der Kommission vom 30. Juli 1981 L 246 32 29.8.1981
▼B
ACHTE RICHTLINIE DER KOMMISSION
vom 15. Juni 1978
zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die
amtliche Untersuchung von Futtermitteln
(78/633/EWG)
DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN —
gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Wirtschaftsge-
meinschaft,
gestützt auf die Richtlinie 70/373/EWG des Rates vom 20. Juli 1970
über die Einführung gemeinschaftlicher Probenahmeverfahren undAnalysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln(
1),
zuletzt geändert durch die Beitrittsakte, insbesondere auf Artikel 2,
in Erwägung nachstehender Gründe:
Die obengenannte Richtlinie bestimmt, daß die amtlichen Untersu-
chungen von Futtermitteln zur Feststellung, ob die aufgrund derRechts- oder Verwaltungsvorschriften festgelegten Anforderungenhinsichtlich Beschaffenheit und Zusammensetzung der Futtermittel
erfüllt sind, nach gemeinschaftlichen Probenahmeverfahren und Analy-
semethoden durchgeführt werden.
Mit den Richtlinien der Kommission 71/250/EWG vom 15. Juni
1971(
2), 71/393/EWG vom 18. November 1971(3), 72/199/EWG vom
27. April 1972(4), 73/46/EWG vom 5. Dezember 1972(5), 74/203/
EWG vom 25. März 1974(6), 75/84/EWG vom 20. Dezember 1974(7)
und 76/372/EWG vom 1. März 1976(8) wurde bereits eine Reihe von
Analysemethoden festgelegt. Der Stand der seitdem durchgeführtenArbeiten ermöglicht es nunmehr, eine achte Reihe von Analyseme-thoden festzulegen.
Die in dieser Richtlinie vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der
Stellungnahme des Ständigen Futtermittelausschusses —
HAT FOLGENDE RICHTLINIE ERLASSEN:
Artikel 1
(1) Die Mitgliedstaaten schreiben vor, daß die Analysen für die
amtliche Untersuchung von Futtermitteln auf ihren Gehalt an Zink-
Bacitracin, Flavophospholipol, Eisen, Kupfer, Mangan und Zink nach
den in der Anlage zu dieser Richtlinie beschriebenen Methoden durch-geführt werden.
Artikel 2
Die Mitgliedstaaten setzen zum 1. Januar 1979 die erforderlichen
Rechts- oder Verwaltungsvorschriften in Kraft, um den Bestimmungen
dieser Richtlinie nachzukommen. Sie setzen die Kommission unverzüg-lich hiervon in Kenntnis.1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1) ABl. Nr. L 170 vom 3. 8. 1970, S. 2.
(2) ABl. Nr. L 155 vom 12. 7. 1971, S. 13.
(3) ABl. Nr. L 279 vom 20. 12. 1971, S. 7.
(4) ABl. Nr. L 123 vom 29. 5. 1972, S. 6.
(5) ABl. Nr. L 83 vom 30. 3. 1973, S. 21.
(6) ABl. Nr. L 108 vom 22. 4. 1974, S. 7.
(7) ABl. Nr. L 32 vom 5. 2. 1975, S. 26.
(8) ABl. Nr. L 102 vom 15. 4. 1976, S. 8.▼M1
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Artikel 3
Diese Richtlinie ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet.1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 3
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ANLAGE
1.BESTIMMUNG VON ZINK-BACITRACIN — DURCH DIFFUSION IN
AGARNÄHRBODEN
1. ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH
Die Methode erlaubt die Bestimmung von Zink-Bacitracin in Futtermit-
teln, Konzentraten und Vormischungen. Die untere Grenze der
Bestimmbarkeit beträgt 5 mg/kg (5 ppm)(*). Die Methode ist bei
Anwesenheit von Störsubstanzen — insbesondere größerer Mengen
Kupfer oder Ascorbinsäure — nicht gültig.
2. PRINZIP
Die Probe wird bei pH 2 mit einer Mischung aus Methanol/Wasser/
Salzsäure extrahiert. Der Extrakt wird auf pH 6,5 gebracht, eingeengt
(falls erforderlich) und verdünnt. Seine antibiotische Aktivität wird
durch Messung der Diffusion des Zink-Bacitracins in einem mit Micro-
coccus luteus (Syn. M. flavus) beimpften Agarnährboden bestimmt. Die
Diffusion wird durch die entstehenden Hemmzonen mit dem Testorga-
nismus nachgewiesen. Der Durchmesser dieser Hemmzonen wird für
den Bereich der angewandten Konzentrationen als dem Logarithmus
der Konzentration an Antibiotikum direkt proportional angesehen.
3. TESTORGANISMUS: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240
3.1.Haltung der Stammkultur
Agarschrägröhrchen mit dem Kulturnährboden (4.1) werden mit Micro-
coccus luteus beimpft und 24 Stunden bei 30 bis 37º C bebrütet. Die
Kultur wird im Kühlschrank bei etwa 4º C aufbewahrt und alle zwei
Wochen neu überimpft.
3.2.Herstellung der Keimsuspension (a)
Eine junge Kultur auf Agarschrägröhrchen (3.1) wird mit 2 bis 3 ml
Natriumchloridlösung (4.3) abgewaschen. Mit dieser Suspension wird
eine Rouxflasche, die 250 ml des Nährbodens (4.1) enthält, beimpft
und 18 bis 20 Stunden bei 30 bis 37º C bebrütet.
Die Kultur wird mit 25 ml Natriumchloridlösung (4.3) aufgenommen.
Danach wird die Suspension homogenisiert und eine Teilmenge mit
Natriumchloridlösug (4.3) auf1/10verdünnt. Bei 650 nm und 1 cm
Schichtdicke gegen Natriumchloridlösung (4.3) sollte die Lichtdurch-
lässigkeit dieser Teilmenge etwa 75 v. H. betragen.
4. NÄHRBÖDEN UND REAGENZIEN
4.1.Kulturnährböden (b)
Fleischpepton 6,0 g
Trypton 4,0 g
Hefeextrakt 3,0 g
Fleischextrakt 1,5 gGlukose 1,0 g
Agar 15,0 g
Wasser 1 000 mlph 6,5 bis 6,6 (nach Sterilisation)
4.2.Testnährboden (
b)
Trypton 10,0 g
Hefeextrakt 3,0 gFleischextrakt 1,5 g
Glukose 1,0 g
Agar 20,0 gTween 80 1 ml
Wasser 1 000 ml
pH 6,5 (nach Sterilisation)1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 4
(*) 1 mg Zink-Bacitracin (Futtermittel-Qualität) entspricht 42 Internationalen Einheiten
(IE).
(a) Andere Methoden, die entsprechende Bakteriensuspensionen ergeben, können
verwendet werden.
(b) Jeder handelsübliche Nährboden entsprechender Zusammensetzung, der dieselben Erge-
bnisse erbringt, kann verwendet werden.
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4.3. Natriumchlorid-Lösung 0,8 v. H. (G/V): 8 g Natriumchlorid p. a.
werden in Wasser aufgelöst und auf 1 000 ml verdünnt; die Lösung
wird sterilisiert.
4.4. Mischung aus Methanol, rein/Wasser/Salzsäure p. a. (D: 1,18 bis 1,19):
80/17, 5/2,5 (V/V/V).
4.5.Phosphatpuffer, pH 6,5:
Dikaliumphosphat K2HPO4p. a. 22,15 g
Monokaliumphosphat KH2PO4p. a. 27,85 g
Wasser bis 1 000 ml
4.6. Salzsäure p. a., D: 1,18 bis 1,19
4.7. Salzsäure p. a., 0,1 N
4.8. Natriumhydroxidlösung p. a., 1 N4.9. Bromkresol-Purpurlösung 0,04 v. H. (G/V):
0,1 g Bromkresol-Purpur werden in 18,5 ml 0,01 N Natriumhydroxidlö-
sung aufgelöst, bis 250 ml mit Wasser aufgefüllt und gemischt.
4.10. Standardsubstanz: Zink-Bacitracin von bekannter Aktivität (in IE).
5. STANDARDLÖSUNGEN
Eine Menge der Standardsubstanz (4.10), die 1050 IE (gemäß der ange-
gebenen Aktivität) entspricht, wird eingewogen und 15 Minuten mit
5 ml 0,1 N Salzsäure (4.7) stehengelassen. Nach Zusatz von 30 ml
Wasser wird der pH-Wert auf 4,5 mit Phosphatpuffer pH 6,5 (4.5) (ca.
4 ml) eingestellt und die Lösung bis 50 ml mit Wasser aufgefüllt und
gemischt (1 ml = 21 IE).
Aus dieser Lösung werden durch aufeinanderfolgende Verdünnungen
mit Phosphatpuffer pH 6,5 (4.5) folgende Lösungen hergestellt:
S
80,42 IE/ml
S40,21 IE/ml
S20,105 IE/ml
S10,0525 IE/ml
6. HERSTELLUNG DES EXTRAKTS
6.1.Extraktion
6.1.1.Konzentrate,VormischungenundMineralfutter
Einer abgewogenen Menge von 2,0 bis 5,0 g der Probe werden 30 ml
der Mischung (4.4) zugesetzt und kurz geschüttelt. Nach einer Kontrolle
des pH-Wertes, der etwa 2 betragen soll, wird 10 Minuten geschüttelt,
30 ml Phosphatpuffer pH 6,5 (4.5) zugesetzt und erneut 15 Minuten
geschüttelt. Dann wird mit Phosphatpuffer (4.5) verdünnt, um einen
erwarteten Zink-Bacitracin-Gehalt von 0,42 IE/ml (= U8) zu erhalten.
6.1.2.Protein-Konzentrate
Einer abgewogenen Menge von 10,0 g der Probe werden 50 ml der
Mischung (4.4) zugesetzt und kurz geschüttelt. Nach einer Kontrolle
des pH-Wertes, der etwa 2 betragen soll, wird 10 Minuten geschüttelt,
50 ml Phosphatpuffer pH 6,5 (4.5) zugesetzt und erneut 15 Minuten
geschüttelt. Dann wird mit Phosphatpuffer (4.5) verdünnt, um einen
erwarteten Zink-Bacitracin-Gehalt von 0,42 IE/ml (= U8) zu erhalten.
6.1.3.SonstigeFuttermittel
Einer abgewogenen Menge von 10,0 g der Probe (20,0 g für einen
erwarteten Zink-Bacitracin-Gehalt von 5 mg/kg) werden 25 ml der
Mischung (4.4) zugesetzt und 10 Minuten gemischt. Dann werden
25 ml Phosphatpuffer pH 6,5 (4.5) zugesetzt, 15 Minuten geschüttelt
und zentrifugiert. 20 ml der überstehenden Lösung werden abgen-
ommen und der pH-Wert auf 6,5 mit 1 Natriumhydroxidlösung (4.8)
eingestellt, wobei die Bromkresol-Purpurlösung (4.9) als Indikator
gebraucht wird. Dann wird die Lösung in einem Rotationsverdampfer
bei einer 35º C nicht überschreitenden Temperatur bis auf etwa 4 ml
eingedampft. Der Rückstand wird mit Wasser verdünnt, um einen
erwarteten Zink-Bacitracin-Gehalt von 0,42 IE/ml (= U8) zu erhalten.
6.2.Testlösungen
Von der Lösung U8wurden die Lösungen U4(erwarteter Gehalt:
0,21 IE/ml), U2(erwarteter Gehalt: 0,105 IE/ml) und U1(erwarteter1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 5
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Gehalt: 0,0525 IE/ml) durch aufeinanderfolgende Verdünnung (1+1)
mit Phosphatpuffer (4.5) hergestellt.
7. TESTVERFAHREN
7.1.Beimpfung des Nährbodens
Der Testnährboden (4.2) wird mit der Keimsuspension (3.2) bei ca.
50 ºC beimpft. Bei Vorversuchen auf Platten mit dem Testnährboden
(4.2) wird die Menge der Keimsuspension ermittelt, die möglichst
große, aber noch scharfe Hemmzonen mit den verschiedenen verwen-
deten Konzentrationen an Zink-Bacitracin ergibt.
7.2.Herstellung der Platten
Der Test ist als Diffusionstest auf Platten mit je vier Konzentrations-
stufen der Standardlösung (S8,S4,S2,S1) und der Testlösung (U8,U4,
U2,U1) angelegt.
Jede Platte erhält unbedingt alle vier Konzentrationen des Standards
und des Extrakts. Daher muß die Plattengröße so bemessen sein, daß
mindestens acht Löcher mit einem Durchmesser von 10 bis 13 mm
und mindestens 30 mm zwischen den Lochzentren in die Nährbodens-
chicht gestanzt werden können.
Der Test sollte vorzugsweise auf Platten durchgeführt werden, die aus
einer Glasscheibe mit einem darauf gelegten plangedrehten Alumu-
nium- oder Kunststoffring von 20 mm Höhe und 200 mm
Durchmesser hergestellt werden. Auf die Platten wird eine Menge des
nach 7.1 beimpften Testnährbodens (4.2) gegossen, daß sich eine ca.
2 mm dicke Schicht ergibt (50 ml für eine Platte von 200 mm Durch-
messer). Nachdem die Schicht fest geworden ist, werden die Löcher
gestanzt und genau abgemessene Mengen der Standard- und Test-
lösungen einpipettiert (zwischen 0,10 und 0,15 ml pro Loch, je nach
Lochdurchmesser).
Jede Konzentration muß mindestens in 4facher Wiederholung ange-
wendet werden, so daß für jeden Test 32 Hemmzonen ausgewertet
werden.
7.3.Inkubation
Die Inkubation erfolgt während 16 bis 18 Stunden bei 28 bis 30º C.
8. AUSWERTUNG
Der Durchmesser der Hemmzonen wird auf 0,1 mm genau gemessen.
Für jede Konzentration werden die Mittelwerte auf Semilogarithmenpa-
pier aufgetragen, wobei der Logarithmus der Konzentrationen gegen
den Durchmesser der Hemmzonen eingetragen wird. Für die Standar-
dlösung sowie für den Extrakt werden die geeignetsten Geraden —
wie beispielsweise nachstehend berechnet — gezogen.
Der geeignetste Punkt für das niedrigste Niveau der Standardlösung
(SL) wird nach folgender Formel ermittelt:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Der geeignetste Punkt für das höchste Niveau der Standardlösung (SH)
wird nach folgender Formel ermittelt:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C0s1
10
Genauso werden auch die geeignetsten Punkte für das niedrigste (UL)
und höchste Niveau (UH) des Extrakts ermittelt, indem in der obigen
Formel — anstelle von s1,s2,s4und s8—u1,u2,u4und u8eingesetzt
werden. Die ermittelten SL- und SH-Werte werden auf dasselbe
Diagramm aufgetragen. Indem man die beiden Punkte miteinander
verbindet, erhält man die geeignetste Gerade für die Standardlösung.
Ebenso wird mit den UL- und UH-Werten verfahren, um die geeig-
netste Gerade für den Extrakt zu erhalten.
In Abwesenheit von Störfaktoren sollten die Geraden parallel sein. Die
Geraden können als parallel angesehen werden, wenn die Werte (SH-
SL) und (UH-UL) nicht mehr als 10 v. H. vom Mittelwert abweichen.1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 6
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Falls die Geraden nicht parallel sind, kann man entweder u1und s1oder
u8und s8ausschalten. Dann sind die Werte SL, SH, UL und UH mit
folgenden Formeln zu ermitteln, um die geeignetste Gerade zu erhalten:
(a′)S L¼5s1þ2s2/C0s4
6oder5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)S H¼5s4þ2s2/C0s1
6oder5s8þ2s4/C0s2
6
Ebenso wird für UL und UH verfahren. Mit diesen Alternativen soll
auch die Parallelität der Geraden überprüft werden. Ergebnisse, die aus
drei Niveaus ermittelt wurden, sollen in dem Analyseprotokoll vermerkt
sein.
Wenn die Geraden als parallel anzusehen sind , wird der Logarithmus
der relativen Aktivität (log. A) durch eine der folgenden Formeln ermit-
telt:
Für4Niveaus
(c) log A ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Für3Niveaus
(d) Log Au1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
oder
(d′) log Au2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þS8/C0u2/C0s2
Tatsächliche Aktivität = angenommene Aktivität × relative Aktivität.
WenndieGeradennichtalsparallelanzusehensind , wird die Bestim-
mung wiederholt, Wenn auch dann keine Parallelität erreicht wurde, istder Logarithmus der relativen Aktivität (log. A) mit der Formel (c) zu
ermitteln. Das erhaltene Ergebnis ist als angenähert anzusehen; dies
sollte im Analysenprotokoll vermerkt werden.
9. WIEDERHOLBARKEIT
Der Unterschied zwischen den Ergebnissen zweier Bestimmungen eines
Analytikers sollte bei ein- und derselben Probe bei Gehalten von:
5 bis 25 mg/kg Zink-Bacitracin 20 v. H. des höheren Resultats,mehr als 25 bis 50 mg/kg 5 mg/kg absolut,
mehr als 50 mg/kg 10 v. H. des höheren Resultats
nicht überschreiten.
2.BESTIMMUNG VON FLAVOPHOSPHOLIPOL — DURCH DIFFU-
SION IN AGARNÄHRBODEN
1. ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH
Die Methode erlaubt die Bestimmung von Flavophospholipol in Futter-
mitteln, Konzentraten und Vormischungen. Die untere Grenze der
Bestimmbarkeit beträgt 1 mg/kg (1 ppm).
2. PRINZIP
Die Probe wird mit verdünntem Methanol durch Erhitzen am Rückfluß
extrahiert. Nach Zentrifugieren wird der Extrakt (falls erforderlich)
durch Behandlung mit Ionenaustauschern gereinigt und verdünnt. Seine
antibiotische Aktivität wird durch Messung der Diffusion des Flavo-
phospholipols in einem mit Staphylococcus aureus beimpften
Agarnährboden bestimmt. Die Diffusion wird durch die entstehenden
Hemmzonen mit dem Testorganismus nachgewiesen. Der Durchmesser
dieser Hemmzonen wird für den Bereich der angewandten Konzentra-
tionen als dem Logarithmus der Konzentration an Antibiotikum direkt
proportional angesehen.1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 7
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3. TESTORGANISMUS: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P
3.1.Haltung der Stammkultur
Agarschrägröhrchen mit Kulturnährboden (4.1) werden mit Staphylo-
coccus aureus beimpft und 24 Stunden bei 37º C bebrütet. Die Kultur
wird im Kühlschrank bei etwa 4º C aufbewahrt und jeden Monat neu
überimpft.
3.2.Herstellung der Keimsuspension (a)
Von der Stammkultur (3.1) werden 2 Schrägröhrchen wöchentlich über-
impft, 24 Stunden bei 37º C bebrütet und im Kühlschrank bei etwa 4º C
aufbewahrt.
24 Stunden vor dem Test werden mit dieser Kultur 2 bis 4
Schrägröhrchen mit Kulturnährboden (4.1) beimpft und 16 bis 18
Stunden bei 37º C bebrütet. Dann werden die Keime mit Natriumchlo-
ridlösung (4.3) aufgenommen und die Suspension verdünnt, um eine
Lichtdurchlässigkeit bei 578 nm und 1 cm Schichtdicke gegen
Natriumchloridlösung (4.3) von etwa 40 v. H. zu erhalten.
4. NÄHRBÖDEN UND REAGENZIEN
4.1.Kulturnährboden (b)
Fleischpepton 6,0 g
Trypton 4,0 gHefeextrakt 3,0 g
Fleischextrakt 1,5 g
Glukose 1,0 gAgar 15,0 gWasser 1 000 mlpH 6,5 (nach Sterilisation)
4.2.Testnährboden
4.2.1.Basalschicht (
c)
Fleischpepton 6,0 g
Hefeextrakt 3,0 gFleischextrakt 1,5 gAgar 10,0 gWasser 1 000 mlpH 6,5 (nach Sterilisation)
4.2.2.Keimschicht
Wie unter 4.1 mit Zusatz von 2,0 g Silikon-Antischaum-Emulsion(
d)
4.3. Natriumchloridlösung 0,4 v. H. (G/V): 4 g Natriumchlorid p. a. werden
in Wasser aufgelöst und auf 1 000 ml verdünnt; die Lösung wird steri-
lisiert.
4.4. Methanol, rein
4.5. Methanol 50 v. H. (V/V): 500 ml Methanol (4.4) werden mit 500 ml
Wasser verdünnt
4.6. Methanol 80 v. H. (V/V): 800 ml Methanol (4.4) werden mit 200 ml
Wasser verdünnt
4.7. Tris (hydroxymethyl)-aminomethan p. a.
4.8. Kaliumchlorid-Methanollösung 1,5 v. H. (G/V): 1,5 g Kaliumchlorid p.
a. werden in 20 ml Wasser aufgelöst und bis 100 ml mit Methanol (4.4)
aufgefüllt.
4.9. Kationenaustauscher: Dowex 50 WX 8, 20 bis 50 mesh, Na-Form
(Serva Kat. Nr. 41600) oder gleichwertiges
4.10. Anionenaustauscher: Dowex 1×2, 50 bis 100 mesh, CI-Form (Serva
Kat. Nr. 41010) oder gleichwertiges1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 8
(a) Andere Methoden, die entsprechende Bakteriensuspensionen ergeben, können
verwendet werden.
(b) Jeder handelsübliche Nährboden entsprechender Zusammensetzung, der dieselben Erge-
bnisse erbringt, kann verwendet werden, z. B. Oxoid Antibioticum Medium 1 (CM 327)
mit Zusatz von Oxoid Agar Nr. 3 (L 13).
(c) Jeder handelsübliche Nährboden entsprechender Zusammensetzung, der dieselben Erge-
bnisse erbringt, kann verwendet werden, z. B. Oxoid Antibioticum Medium 2 (CM 335)mit Zusatz von Oxoid Agar Nr. 3 (L 13).
(
d) z. B. SE 2 (Wacker Chemie GmbH, München).
▼B
4.11. Glaswolle
4.12. pH-Indikatorpapier (pH 6,6 bis 8,1)4.13. Ascorbinsäure4.14. Standardsubstanz: Flavophospholipol von bekannter Aktivität.
5. GERÄTE
5.1. Glasrohr für Chromatographie, Innendurchmesser: 9 mm, Länge: 150
bis 200 mm, mit einem Hahn am unteren engeren Ende und Schliff
(für den Anschluß des Tropftrichters 5.2) am oberen Ende
5.2. Tropftrichter mit Behälter vom 250 ml, Hahn und Schliff
5.3. Erlenmeyerkolben, 250 ml Inhalt, mit Schliff
5.4. Rückflußkühler mit Schliff.
6. STANDARDLÖSUNGEN
Eine genau abgewogene Menge der Standardsubstanz (4.14) wird in
50 v. H. Methanol (4.5) aufgelöst und verdünnt, um eine Stammlösung,
die 100 µ g Flavophospholipol pro ml enthält, zu erhalten. In verschlos-
senen Flaschen und bei 4º C aufbewahrt, bleibt diese Lösung 2 Monatelang haltbar.
Aus dieser Stammlösung werden durch aufeinanderfolgende Verdün-
nungen mit 50 v. H. Methanol (4.5) folgende Lösungen hergestellt:
S
80,2 µg/ml
S40,1 µ g/ml
S20,05 µ g/ml
S10,025µ g/ml.
7. HERSTELLUNG DES EXTRAKTS
7.1.Extraktion
7.1.1.Konzentrate,VormischungenundMineralfutter
Einer abgewogenen Menge von 2,0 bis 5,0 g der Probe werden 150 mg
Ascorbinsäure (4.13) zugesetzt und in einem Erlenmeyerkolben (5.3)
mit 150 ml 50 v. H. Methanol (4.5) gemischt. Der pH-Wert wird auf
8,1 bis 8,2 mit ca. 400 mg Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (4.7)
eingestellt und mit Indikatorpapier (4.12) kontrolliert. Nach 15 Minuten
wird der pH-Wert mit Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (4.7) erneut
auf 8,1 bis 8,2 eingestellt und die Mischung 10 Minuten am Rückfluß
(5.4) unter ständigem Rühren gekocht. Nach Abkühlen wird abzentri-
fugiert und der Exakt dekantiert.
7.1.2.SonstigeFuttermittel
Eine Menge von 5,0 bis 30,0 g der Probe, die mindestens 30 µg Flavo-
phospholipol enthält, wird eingewogen und in einem Erlenmeyerkolben
(5.3) mit 150 ml 50 v. H. Methanol (4.5) gemischt. Der pH-Wert wird
auf 8,1 bis 8,2 mit ca. 400 mg Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (4.7)
eingestellt und mit Indikatorpapier (4.12) kontrolliert. Nach 15 Minuten
wird der pH-Wert mit Tris(thydroxymethyl)-aminomethan (4.7) erneutauf 8,1 bis 8,2 eingestellt und die Mischung 10 Minuten am Rückfluß
(5.4) unter ständigem Rühren gekocht. Nach Abkühlen wird abzentri-
fugiert und der Extrakt dekantiert.
7.2.Reinigung (bei Konzentraten, Vormischungen und Mineralfutter
nicht erforderlich)
110 ml des Extraktes werden mit 11 g Kationenaustauscher (4.9)
versetzt und eine Minute am Rückfluß (5.4) unter ständigem Rühren
gekocht.
Nach Abtrennung des Kationenaustauschers durch Zentrifugieren oder
Filtrieren werden 100 ml des Extraktes mit 150 ml Methanol (4.4)
versetzt und die Lösung 12 bis 15 Stunden bei 4 ºC aufbewahrt. Die
Abtrennung der Ausflockung erfolgt durch Filtration der gekühlten
Lösung.
Am unteren Ende eines Glasrohrs (5.1) wird ein Glaswollstopfen (4.11)
eingeführt, anschließend werden 5 ml des Anionenaustauschers (4.10)
in das Rohr gegossen und die Säule mit 100 ml 80 v. H. Methanol
(4.6) gewaschen. Mit Hilfe des Trichters (5.2) werden mindestens
100 ml des Filtrats, das 16 µg Flavophospholipol enthalten sollte
(200 ml für 30 g Futtermittelprobe mit 1 ppm) auf die Säule gegeben.1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 9
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Falls erforderlich, wird das Filtrat vor Aufbringen auf die Säule mit
80 v. H. Methanol (4.6) verdünnt, um einen erwarteten Flavophospholi-
polgehalt von 16 µg/100 ml zu erhalten. Die Durchflußgeschwindigkeit
wird auf ca. 2 ml/Minute eingestellt, der Durchlauf verworfen. Die
Säule wird dann mit 50 ml 80 v. H. Methanol (4.6) gewaschen und
der Durchlauf verworfen.
Das Flavophospholipol wird mit der Kaliumchlorid-Methanollösung
(4.8) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von ca. 2 ml/Minute eluiert.
50 ml des Eluats werden in einem Meßzylinder aufgefangen und mit
30 ml Wasser gemischt. Diese Lösung sollte 0,2 µg/ml (= U8) Flavo-
phospholipol enthalten.
7.3.Testlösungen
Falls erforderlich (d. h. wenn keine Reinigung vorgenommen wurde),
wird der in 7.1.1 erhaltene Extrakt mit 50 v. H. Methanol (4.5)
verdünnt, um einen erwarteten Flavophospholipolgehalt von 0,2 µg/ml
(= U8) zu erhalten.
Von der Lösung U8werden die Lösungen U4(erwarteter Gehalt: 0,1 µg/
ml), U2(erwarteter Gehalt: 0,05 µg/ml) und U1(erwarteter Gehalt:
0,025 µg/ml) durch aufeinanderfolgende Verdünnung (1+1) mit 50 v.
H. Methanol (4.5) hergestellt.
8. TESTVERFAHREN
8.1.Beimpfung des Nährbodens
Der Testnährboden (4.2.2) wird mit der Keimsuspension (3.2) bei ca.
50º C beimpft. Bei Vorversuchen auf Platten mit dem Testnährboden
(4.2.2) wird die Menge der Keimsuspension ermittelt, die möglichst
große, aber noch scharfe Hemmzonen mit den verschiedenen verwen-
deten Konzentrationen an Flavophospholipol ergibt (etwa 30 ml pro
Liter).
8.2.Herstellung der Platten
Der Test ist als Diffusionstest auf Platten mit je vier Konzentrations-
stufen der Standardlösung (S8,S4,S2,S1) und der Testlösung (U8,U4,
U2,U1) angelegt. Jede Platte erhält unbedingt alle vier Konzentrationen
des Standards und des Extrakts. Daher muß die Plattengröße so
bemessen sein, daß mindestens acht Löcher mit einem Durchmesser
von 10 bis 13 mm und mindestens 30 mmzwischen den Lochzentren
in die Nährbodenschicht gestanzt werden können. Der Test sollte
vorzugsweise auf Platten durchgeführt werden, die aus einer Glas-
scheibe mit einem darauf gelegten plangedrehten Aluminium- oder
Kunststoffring von 20 mm Höhe und 200 mm Durchmesser hergestellt
werden.
Auf die Platten wird eine Menge der Basalschicht (4.2.1) gegossen, daß
sich eine 1,5 mm dicke Schicht ergibt (45 ml für eine Platte von
200 mm Durchmesser). Nachdem die Schicht fest geworden ist, wird
mit einer Menge der Keimschicht (4.2.2) — beimpft wie unter 8.1 —
überschichtet, um eine Schicht von 1 mm zu erhalten (30 ml für eine
Platte von 200 mm Durchmesser). Nachdem auch diese Schicht fest
geworden ist, werden die Löcher gestanzt und genau abgemessene
Mengen der Standard- und Testlösungen einpipettiert (zwischen 0,10
und 0,15 ml pro Loch, je nach Lochdurchmesser).
Jede Konzentration muß mindestens in 4facher Wiederholung ange-
wendet werden, so daß für jeden Test 32 Hemmzonen ausgewertet
werden.
8.3.Inkubation
Die Inkubation erfolgt während 16 bis 18 Stunden bei 28 bis 30º C.
9. AUSWERTUNG
Der Durchmesser der Hemmzonen wird auf 0,1 mm genau gemessen.
Für jede Konzentration werden die Mittelwerte auf Semilogarithmenpa-
pier aufgetragen, wobei der Logarithmus der Konzentrationen gegen
den Durchmesser der Hemmzonen eingetragen wird. Für die Standar-
dlösung sowie für den Extrakt werden die geeignetsten Geraden —
wie beispielsweise nachstehend berechnet — gezogen.
Der geeignetste Punkt für das niedrigste Niveau der Standardlösung
(SL) wird nach folgender Formel ermittelt:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
101978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 10
▼B
Der geeigneste Punkt für das höchste Niveau der Standardlösung (SH)
wird nach folgender Formel ermittelt:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Genauso werden auch die geeignetsten Punkte für das niedrigste (UL)
und höchste Niveau (UH) des Extraktes ermittelt, indem in der obigen
Formel — anstelle von s1,s2,s4und s8—u1,u2,u4und u8eingesetzt
werden.
Die ermittelten SL- und SH-Werte werden auf dasselbe Diagramm
aufgetragen. Indem man die beiden Punkte miteinander verbindet, erhält
man die geeignetste Gerade für die Standardlösung. Ebenso wird mit
den UL- und UH-Werten verfahren, um die geeignetste Gerade für den
Extrakt zu erhalten.
In Abwesenheit von Störfaktoren sollten die Geraden parallel sein. Die
Geraden können als parallel angesehen werden, wenn die Werte
(SH—SL) und (UH—UL) nicht mehr als 10 v. H. vom Mittelwert
abweichen.
Falls die Geraden nicht parallel sind, kann man entweder u1und s1oder
u8und s8ausschalten. Dann sind die Werte SL, SH, UL und UH mit
folgenden Formeln zu ermitteln, um die geeignetste Gerade zu erhalten:
(a′)S L¼5s1þ2s2/C0s4
6oder5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)S H¼5s4þ2s2/C0s1
6oder5s8þ2s4/C0s2
6
Ebenso wird für UL und UH verfahren. Mit diesen Alternativen soll
auch die Parallelität der Geraden überprüft werden. Ergebnisse, die aus
drei Niveaus ermittelt wurden, sollen in dem Analyseprotokoll vermerkt
sein.
Wenn die Geraden als parallel anzusehen sind , wird der Logarithmus
der relativen Aktivität (log. A) durch eine der folgenden Formeln ermit-
telt:
Für4Niveaus
(c) log :A¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Für3Niveaus
(d) log :A¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
oder
(d′) log :A¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Tatsächliche Aktivität = angenommene Aktivität × relative Aktivität.
WenndieGeradennichtalsparallelanzusehensind , wird die Bestim-
mung wiederholt. Wenn auch dann keine Parallelität erreicht wurde, ist
der Logarithmus der relativen Aktivität (log. A) mit der Formel (c) zu
ermitteln. Das erhaltene Ergebnis ist als angenähert anzusehen; dies
sollte im Analysenprotokoll vermerkt werden.
10. WIEDERHOLBARKEIT
Der Unterschied zwischen den Ergebnissen zweier Bestimmungen eines
Analytikers sollte bei ein- und derselben Probe bei Gehalten von:
1 bis 2 mg/kg Flavophospholipol 0,5 mg/kg absolut,
mehr als 2 bis 10 mg/kg 25 v. H. des höheren Resultats,mehr als 10 bis 25 mg/kg 20 v. H. des höheren Resultats,mehr als 25 bis 50 mg/kg 5 mg/kg absolut,mehr als 50 mg/kg 10 v. H. des höheren Resultats1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 11
▼B
nicht überschreiten.
3.BESTIMMUNG DER SPURENELEMENTE EISEN, KUPFER,
MANGAN UND ZINK
1. ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH
Die Methode erlaubt die Bestimmung der Spurenelemente Eisen,
Kupfer, Mangan und Zink in Futtermitteln. Die unteren Grenzen der
Bestimmbarkeit betragen:
Eisen (Fe): 20 mg/kg
Kupfer (Cu): 10 mg/kg
Mangan (Mn): 20 mg/kgZink (Zn): 20 mg/kg
2. PRINZIP
Die Probe wird nach Zerstörung eventuell vorhandener organischer
Substanz in Salzsäure gelöst. Die Elemente Eisen, Kupfer, Mangan
und Zink werden nach entsprechender Verdünnung der Analysenlösung
mittels Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt.
3. REAGENZIEN
Vorbemerkungen
Das zur Herstellung der Reagenzien und Analysenlösungen verwendete
Wasser muß „frei“ von den zu bestimmenden Kationen sein. Hierfür
kann Wasser verwendet werden, das, entweder in einer Borsilikatglas-
oder Quarzapparatur zweifach destilliert oder durch doppelten Ionen-
austausch gereinigt wurde.
Die zur Analyse verwendeten Reagenzien müssen mindestens von p.a. -
Qualität sein. Die Abwesenheit des zu bestimmenden Elements wird
mittels eines Blindversuchs kontrolliert. Falls erforderlich, sind die
Reagenzien einer zusätzlichen Reinigung zu unterziehen.
Anstelle der nachfolgend beschriebenen Standardlösungen können auch
handelsübliche Standardlösungen verwendet werden, deren Reinheit
garantiert und vor Verwendung kontrolliert wurde.
3.1. Salzsäure p.a., d: 1,19
3.2. Salzsäure p.a., 6 N
3.3. Salzsäure p.a., 0,5 N
3.4. Fluorwasserstoffsäure, 38 bis 40 %ig (v/v); Eisengehalt: weniger als
1 mg/l Glührückstand (als Sulfat): weniger als 10 mg/l
3.5. Schwefelsäure p.a., d: 1,84
3.6. Wasserstoffperoxid p.a., ca. 100 Vol. Sauerstoff (30 % Gew. %)
3.7. Eisen-Standardlösung (1000 µg Fe/ml): 1 g Eisendraht p.a. wird in
200 ml 6 N Salzsäure (3.2) gelöst, es werden 16 ml Wasserstoffperoxid
(3.6) zugegeben, dann wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.
3.7.1. Eisen-Gebrauchsstandardlösung (100 µ g Fe/ml): Die Standardlösung
(3.7) wird im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt.
3.8. Kupfer-Standardlösung (1 000 µ g Cu/ml): 1 g Kupfer p.a. in Pulver-
form wird in 25 ml 6 N Salzsäure (3.2) gelöst, es werden 5 ml
Wasserstoffperoxid (3.6) zugegeben, dann wird mit Wasser auf 1 l
aufgefüllt.
3.8.1. Kupfer-Gebrauchsstandardlösung (10 µ g Cu/ml): Die Standardlösung
(3.8) wird im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt und anschließend
die entstehende Lösung wiederum im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser
verdünnt.
3.9. Mangan-Standardlösung (1000 µ g Mn/ml): 1 g Mangan p.a. in Pulver-
form wird in 23 ml 6 N Salzsäure (3.2) gelöst, dann wird mit Wasser
auf 1 l aufgefüllt.
3.9.1. Mangan-Gebrauchsstandardlösung (10 µ g Mn/ml): Die Standardlösung
(3.9) wird im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt und anschließend
die entstehende Lösung wiederum im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser
verdünnt.1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 12
▼B
3.10. Zink-Standardlösung (1000 µg Zn/ml): 1 g Zink p.a. in Streifen- oder
Plattenform wird in 25 ml 6 N Salzsäure (3.2) gelöst; dann wird mit
Wasser auf 1 l aufgefüllt.
3.10.1. Zink-Gebrauchsstandardlösung (10 µ g Zn/ml): die Standardlösung
(3.10) wird im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt und die entste-
hende Lösung wiederum im Verhältnis 1 + 9 mit Wasser verdünnt.
3.11. Lanthanchloridlösung: Es werden 12 g Lanthanoxid in 150 ml Wasser
aufgelöst, 100 ml 6 N Salzsäure (3.2) zugegeben und mit Wasser auf
1 l aufgefüllt.
4. GERÄTE
4.1. Muffelofen mit Regelvorrichtung und Temperaturanzeige.
4.2. Glasgeräte müssen aus resistentem Borsilikatglas sein. Empfohlen wird,
Glasgeräte zu benutzen, die ausschließlich der Bestimmung von Spuren-
elementen vorbehalten bleiben.
4.3. Platin- und eventuell Quarzschalen.4.4. Atomabsorptions-Spektrophotometer; das Gerät muß hinsichtlich seiner
Empfindlichkeit und Genauigkeit innerhalb des vorgesehenen Meßbe-
reichs den Methodenanforderungen genügen.
5. AUSFÜHRUNG
5.1.Proben mit organischen Bestandteilen
5.1.1.VeraschungundHerstellungderAnalysenlösung (*)
(i) 5 bis 10 g der Probe (auf ± 0,2 mg genau abgewogen) werden in
eine Quarz- oder Platinschale (4.3) gegeben (siehe Hinweis (b))
und im Trockenschrank bei 105 ºC getrocknet; dann wird die
Schale in den kalten Muffelofen (4.1) verbracht. Der Ofen wird
geschlossen (siehe Hinweis (c)) und die Temperatur innerhalb ca.
90 Min. langsam auf 450 bis 475 ºC erhöht. Diese Temperatur
wird 4 bis 16 Stunden (z. B. über Nacht) aufrechterhalten, um
Kohleteilchen zu entfernen; dann wird der Ofen geöffnet und man
läßt abkühlen (siehe Hinweis (d)).
Die Asche wird mit Wasser angefeuchtet und in ein 250-ml-
Becherglas überführt. Die Schale wird mit insgesamt etwa 5 ml
Salzsäure (3.1) ausgespült und letztere langsam und vorsichtig in
das Becherglas gegeben (durch CO
2-Bildung eventuell stürmische
Reaktion). Unter Schüttelnwird Salzsäure (3.1) tropfenweise zuge-
geben bis die Schaumbildung aufhört. Die Salzsäure wird unter
gelegentlichem Umrühren mit einem Glasstab bis zur Trockne
abgedampft.
Man gibt dann zum Rückstand 15 ml 6 N Salzsäure (3.2) und
anschließend etwa 120 ml Wasser. Umgerührt wird mit dem Glas-
stab, der in dem Becherglas belassen wird; dieses wird mit einem
Uhrglas abgedeckt. Die Flüssigkeit wird zu schwachem Sieden
gebracht und dieses so lange aufrechterhalten, bis die Asche
vollständig gelöst ist. Dann wird durch ein aschefreies Filterpapier
filtriert und das Filtrat in einem 250-ml-Meßkolben aufgefangen.
Man wäscht das Becherglas und den Filter mit 5 ml heißer 6 N
Salzsäure (3.2) und zweimal mit kochendem Wasser aus und füllt
den Meßkolben mit Wasser bis zur Marke auf (HCI-Konzentration
etwa 0,5 N).
(ii) Sollte der Filterrückstand schwarz aussehen (Kohlenstoff), so gibt
man ihn in die Veraschungsschale zurück und verascht abermals1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 13
(*) Grünfutter (frisch oder getrocknet) kann größere Mengen pflanzlicher Kieselsäure
enthalten, welche Spurenelemente binden kann und daher entfernt werden muß. FürProben dieser Futtermittel muß also nach folgendem geändertem Verfahren vorge-gangen werden:Das Verfahren 5.1.1 (i) wird bis zur Filtration durchgeführt. Das den unlöslichen
Rückstand enthaltende Filterpapier wird zweimal mit kochendem Wasser ausgewa-
schen, in eine Platinschale (4.3) gegeben und im Muffelofen bei weniger als 550 ºCbis zum Vollständigen Verschwinden aller Kohleteilchen verascht. Nach demAbkühlen werden einige Tropfen Wasser, danach 10 bis 15 ml Fluorwasserstoffsäure(3.4) zugegeben und bei circa 150 ºC zur Trockne eingedampft. Verbleibt im Rück-
stand noch Kieselsäure, so wird diese erneut in einigen ml Fluorwasserstoffsäure
(3.4) gelöst und anschließend zur Trockne eingedampft. Dann werden 5 TropfenSchwefelsäufe (3.5) zugesetzt und so lange erhitzt, bis keine weißen Dämpfe mehrauftreten Nach Zugabe von 5 ml 6 N Salzsäure (3.2) und etwa 30 ml Wasser wirderhitzt, die Lösung in den 250-ml-Meßkolben filtriert und dieser mit Wasser bis zur
Marke aufgefüllt (HCI-Konzentration etwa 0,5 N). Man verfährt dann ab 5.1.3.
▼B
bei 450º C bis 475º C. Diese Veraschung, die nur wenige Stunden
erfordert (etwa 3 bis 5 Std.) ist beendet, wenn die Asche weiß oder
nahezu weiß aussieht. Der Rückstand wird mit etwa 2 ml Salzsäure
(3.1) aufgenommen, zur Trockne eingedampft, und mit 5 ml 6 N
Salzsäure (3.2) versetzt. Nach dem Erwärmen wird die Lösung in
den Meßkolben filtriert und dieser mit Wasser bis zur Marke aufge-
füllt (HCl-Konzentration etwa 0,5 N).
Hinweise:
(a) Bei der Bestimmung von Spurenelementen ist unbedingt auf die
Gefahr von Verunreinigungen, insbesondere durch Zink, Kupfer
und Eisen zu achten. Deshalb müssen die bei der Probenvorberei-
tung benutzten Geräte frei von diesen Metallen sein.
Um die Verunreinigungsrisiken einzuschränken, ist in staubfreier
Luft, mit absolut reinen Geräten und sorgfältig gewaschenen Glas-
geräten zu arbeiten. Die Zinkbestimmung ist für Verunreinigungen
durch Glasgeräte, Reagenzien, Staub usw. besonders empfindlich.
(b) Die Einwaage wird nach dem etwa zu erwartenden Gehalt des
Futtermittels an Spurenelementen unter Berücksichtigung der
Empfindlichkeit des verwendeten Spektrophotometers berechnet.
Bei Futtermitteln, die einen sehr niedrigen Gehalt an Spurenele-
menten aufweisen, kann es erforderlich sein, eine Probe von 10 bis
20 g einzuwägen und das Volumen der Analysenlösung auf 100 ml
zu begrenzen.
(c) Die Veraschung erfolgt im geschlossenen Muffelofen ohne
Einblasen von Luft oder Sauerstoff.
(d) Die vom Pyrometer angezeigte Temperatur darf 475º C nicht über-
schreiten.
5.1.2.SpektrophotometrischeBestimmung
5.1.2.1. Herstellen der Eichlösungen
Aus den Gebrauchsstandardlösungen 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 und 3.10.1
werden für jedes der zu bestimmenden Spurenelemente eine Reihe von
Eichlösungen hergestellt. Jede dieser Eichlösungen hat eine etwa 0,5 N
HCl-Konzentration und (im Falle von Eisen, Mangan und Zink) eine
Lanthanchlorid-Konzentration, die 0,1 % La (g/v) entspricht. Die
gewählten Spurenelementkonzentrationen müssen im Empfindlichkeits-
bereich des verwendeten Spektrophotometers liegen. Die nachfolgenden
Tabellen zeigen als Beispiel die Zusammensetzung typischer Reihen
von Eichlösungen. Je nach Typ und Empfindlichkeit des verwendeten
Spektrophotometers kann es jedoch erforderlich sein, für die Eichlö-
sungen eine andere Konzentration zu wählen.
Eisen
µg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
ml Gebrauchsstan-
dardlösung (3.7.1)
(1 ml = 100 µg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5
+ ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml Lanthanchloridlösung (3.11) und mit Wasser auf 100 ml
auffüllen
Kupfer
µg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml
Gebrauchs-
standard-
Lösung
(3.8.1)
(1 ml
=1 0µg
Cu)01 24681 0
+m l6N
HCL (3.2)88 8888 8
mit Wasser auf 100 ml auffüllen1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 14
▼B
Mangan
µg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml Gebrauchsstan-
dardlösung (3.9.1)
(1 ml = 10 µg Mn) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml Lanthanchoridlösung (3.11) und mit Wasser auf 100 ml
auffüllen
Zink
µg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
ml verdünnte
Standardlösung
(3.10.1)
(1 ml = 10 µg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8
+ ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml Lanthanchloridlösung (3.11) und mit Wasser auf 100 ml
auffüllen
5.1.2.2. Herstellen der Meßlösungen
Für die Kupferbestimmung kann die nach 5.1.1 hergestellte Analysenlö-
sung in der Regel direkt verwendet werden. Gegebenenfalls wird ein
aliquoter Teil dieser Analysenlösung in einen 100-ml-Meßkolben pipet-
tiert und mit 0,5 N Salzsäure (3.3) zur Marke aufgefüllt, um ihre
Konzentration in den Bereich der Eichlösungen zu bringen.
Für die Bestimmung der Elemente Eisen, Mangan und Zink wird ein
aliquoter Teil nach 5.1.1 hergestellten Analysenlösung in einen 100-
ml-Meßkolben pipettiert. Man gibt 10 ml Lanthanchloridlösung (3.11)
hinzu und füllt mit 0,5 N Salzsäure (3.3) zur Marke auf (siehe 8
„Bemerkung“).
5.1.2.3. Blindversuch
Es wird ein Blindversuch ausgeführt, der alle Verfahrensschritte
umfassen muß, nur daß das Probematerial selbst weggelassen wird.
Die Eichlösung „0“ ersetzt nicht den Blindversuch.
5.1.2.4. Messung der Atomabsorption
Die Absorption der Eichlösungen und der zu analysierenden Lösungen
ist mit oxydierender Luft-Azetylenflamme bei folgenden Wellenlängen
zu messen:
Fe: 248,3 nm
Cu: 324,8 nmMn: 279,5 nm
Zn: 213,8 nm
Jede Messung ist viermal auszuführen.
5.2.Mineralische Futtermittel
Enthält die Probe keine organischen Substanzen, so erübrigt sich eine
vorherige Veraschung. Man verfährt dann wie unter 5.1.1 (i) ab 2.
Absatz beschrieben. Ein Abrauchen mit Fluorwasserstoffsäure kann
entfallen.
6. BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
Die Spurenelement-Konzentration in der Analysenlösung wird mit Hilfe
einer Eichkurve berechnet und das Ergebnis in mg Spurenelement/kg
Probe (ppm) ausgedrückt.1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 15
▼B
7. WIEDERHOLBARKEIT
Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestim-
mungen eines Analytikers sollte an derselben Probe bei Gehalten an
dem betreffenden Spurenelement von:
— bis 50 mg/kg 5 mg/kg absolut,
— mehr als 50 bis 100 mg/kg 10 % des höheren Resultats,
— mehr als 100 bis 200 mg/kg 10 mg/kg absolut,
— mehr als 200 mg/kg 5 % des höheren Resultats
nicht überschreiten.
8. BEMERKUNG
Die Anwesenheit größerer Mengen Phosphat kann bei der Bestimmung
von Eisen, Mangan und Zink zu Interferenzen führen, die durch Zugabe
von Lanthanchloridlösung (3.11) beseitigt werden. Ist jedoch in der
Probe das GewichtsverhältnisCaþMg
Pgrößer als 2, so kann auf den
Zusatz von Lanthanchloridlösung verzichtet werden.1978L0633 — DE — 19.08.1981 — 001.001 — 16