1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—1
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►B VIERTE RICHTLINIE DER KOMMISSION
vom 5. Dezember 1972
zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futter-
mitteln
(73/46/EWG)
(ABl.L83vom30.3.1973,S.21)
Geändert durch:
Amtsblatt
Nr. Seite Datum
►M1Richtlinie 81/680/EWGderKommissionvom30.Juli1981 L246 32 29.8.1981
▼B
VIERTE RICHTLINIE DER KOMMISSION
vom 5. Dezember 1972
zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die
amtliche Untersuchung von Futtermitteln
(73/46/EWG)
DIEKOMMISSIONDEREUROPÄISCHENGEMEINSCHAFTEN—
gestütztaufdenVertragzurGründungderEuropäischenWirtschaftsge-
meinschaft,
gestütztaufdieRichtliniedesRatesvom20.Juli1970überdieEinfüh-
rung gemeinschaftlicher Probenahmeverfahren und Analysemethoden
für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln(1) in der Fassung der
Richtlinie vom20.Juli1972(2),insbesondereaufArtikel 2,
inErwägungnachstehenderGründe:Die obengenannte Richtlinie bestimmt, daß die amtlichen Untersu-
chungen von Futtermitteln zur Feststellung, ob die auf Grund derRechts- oder Verwaltungsvorschriften festgelegten Anforderungenhinsichtlich Beschaffenheit und Zusammensetzung der Futtermittel
erfüllt sind,nachgemeinschaftlichen Probenahmeverfahren undAnaly-
semethoden durchgeführtwerden.
Die Richtlinien Nr. 71/250/EWG, Nr. 71/393/EWG und Nr. 72/199/
EWG der Kommission vom 15. Juni 1971(
3), vom 18. November
1971(4) und vom 27. April 1972(5) haben bereits eine Reihe von
Analysemethoden festgelegt. Der Stand der seitdem durchgeführtenArbeiten ermöglicht es nunmehr, eine vierte Serie von Analyseme-
thodenfestzulegen.
Die in dieser Richtlinie vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der
Stellungnahme desStändigenFuttermittelausschusses —
HATFOLGENDERICHTLINIEERLASSEN:
Artikel 1
Die Mitgliedstaaten schreiben vor, daß die Analysen für die amtliche
UntersuchungvonFuttermitteln aufdenGehaltanFeuchtigkeit intier-ischen und pflanzlichen Fetten und Ölen sowie auf den Gehalt anMagnesium und Rohfaser in Futtermitteln nach den in Anlage I zudieserRichtlinie beschriebenen Methodendurchgeführtwerden.
Artikel 2
Die Mitgliedstaaten schreiben vor, daß die Analysen für die amtliche
Untersuchung von Futtermitteln auf ihren Gehalt an Retinol (VitaminA), Thiamin (Aneurin, Vitamin B
1) sowie Ascorbinsäure und Dehy-
droascorbinsäure (Vitamin C) nach den in Anlage II zu dieserRichtlinie beschriebenen Methodendurchgeführt werden.1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—2
(1) ABl.Nr.L170vom3.8.1970,S.2.
(2) ABl.Nr.L171vom29.7.1972,S.39
(3) ABl.Nr.L155vom12.7.1971,S.13.
(4) ABl.Nr.L279vom20.12.1971,S.7.
(5) ABl.Nr.L123vom29.5.1972,S.6.▼M1
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Artikel 3
DieMitgliedstaaten setzenspätestens zum1.Januar1974die erforder-
lichen Rechts- oder Verwaltungsvorschriften in Kraft, um den
Bestimmungen dieser Richtlinie nachzukommen. Sie setzen dieKommissionunverzüglich hiervoninKenntnis.
Artikel 4
DieseRichtlinie istanalle Mitgliedstaaten gerichtet.1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—3
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ANLAGE I
1.BESTIMMUNG VON FEUCHTIGKEIT IN TIERISCHEN UND
PFLANZLICHEN FETTEN UND ÖLEN
1.Zweck und Anwendungsbereich
Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Feuchtigkeit (Wasser
und andere flüchtige Bestandteile) und an flüchtigen Stoffen in tierischen
undpflanzlichen Fettenundölen.
2.Prinzip
DieProbewirdbei103ºCgetrocknet,biskeinGewichtsverlustmehreintritt.
DerGewichtsverlustwirdbestimmt.
3.Geräte
3.1. Schale mit flachem Boden, aus korrosionsbeständigem Material, Durch-
messer:8—9cm,Höheca.3cm
3.2. Quecksilber-Thermometer, mit verstärkter Kugel undAusdehnungsraum
am oberen Ende, von ca. 80 ºCbis mindestens 110 ºC graduiert, Länge
ca.10cm
3.3. Sandbadoderelektrische Heizplatte3.4. Exsikkator, dereinwirksamesTrocknungsmittel enthält3.5. Analysenwaage.
4.Ausführung
Etwa20gderhomogenisiertenProbewerdenauf1mggenauindietrockene
tarierte Schale(3.1),diedasThermometer (3.2)enthält, eingewogenundauf
demSandbadbzw.derHeizplatte(3.3)soerhitzt,daßbeistetigemUmrühren
mit dem Thermometer nach ca. 7 Min. eine Temperatur von 90 ºC erreicht
wird.
Entsprechend der Häufigkeit, mit der Gasblasen vom Boden der Schale
aufsteigen, wird die Heizintensität verringert. Die Temperatur darf 105 ºC
nicht überschreiten. Das Umrühren wird unter ständigem Abkratzen des
BodensderSchale biszumEndederBlasenbildung fortgesetzt.
Umsicherzustellen,daßdieFeuchtigkeitvölligentferntwird,istdasErhitzen
mehrmals bei103ºC±2ºCzuwiederholen, wobeimanzwischenaufeinan-
derfolgenden Erhitzungen auf 93 ºC abkühlen läßt. Dann läßt man bis zur
Raumtemperatur im Exsikkator (3.4) abkühlen und wägt. Dieses Verfahren
ist zu wiederholen, bis der Gewichtsverlust zwischen zwei aufeinanderfol-
gendenWägungen2mgnichtüberschreitet.
NB.:Eine Gewichtserhöhung der Probe nach wiederholter Erwärmung zeigt
eine Oxydation des Fettes an. Indiesem Fall legt man der Berechnung
das Ergebnis der Wägung zugrunde, die kurz vor dem Auftreten der
Gewichtszunahme ausgeführtwurde.
5.Berechnung der Ergebnisse
Der Gehalt an Feuchtigkeit der Probe in v. H. wird durch folgende Formel
wiedergegeben:
M
1/C0M2 ðÞ /C1100
M0
M0= GewichtderProbeing,
M1= GewichtderSchalemit InhaltingvordemErhitzen,
M2= GewichtderSchalemit InhaltingnachdemErhitzen.
Ergebnisseunter0,05v.H.solltenmitderBezeichnung„wenigerals0,05v.
H.“angegeben werden.
WiederholbarkeitDerUnterschiedzwischen2Parallelbestimmungendarfbeieinundderselben
Probe0,05v.H.absolutnichtüberschreiten.1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—4
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2.BESTIMMUNG VON MAGNESIUM
—durchAtomabsorptions-Spektrophotometrie —
1.Zweck und Anwendungsbereich
Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Magnesium in Futter-
mitteln. Sie eignet sich besonders zur Bestimmung von Magnesiumgehalten
unter5v.H.
2.Prinzip
DieProbewirdveraschtundinverdünnterSalzsäuregelöst.WenndieProbe
keine organischen Bestandteile enthält, wird sie unmittelbar in verdünnter
Salzsäure gelöst.DieLösungwirdverdünntundderMagnesiumgehalt durch
Atomabsorptions-Spektrophotometrie bei 285,2 nm im Vergleich zu Eichlö-
sungenbestimmt.
3.Reagenzien
3.1. Salzsäure p.a.,D:1,163.2. Salzsäure p.a.,D:1,193.3. Magnesiumbandoder-draht,oderMagnesiumsulfat(MgSO
4·7H2O)p.a.
vakuumgetrocknet beiRaumtemperatur
3.4. Strontiumsalzlösung (Chlorid oder Nitrat) 2,5 v. H. (G/V) Strontium
(=76,08gSrCl2·6H2Op.a./1oder60,38gSr(NO3)2p.a./1)
3.5. Magnesium-Standardlösung: 1 g Magnesium (3.3), das zuvor sorgfältig
von seinem Oxidfilm befreit wurde, oder eine entsprechende Menge
Magnesiumsulfat (3.3) wird auf 1 mg genau abgewogen und in einen
1000-ml-Meßkolben gebracht; dann werden 80 ml Salzsäure (3.1)
hinzugefügt, nach Auflösen des Magnesiums wird auf 1000 ml mit
Wasseraufgefüllt. 1mldieserLösungenthält 1,000mgMagnesium.
4.Geräte
4.1. VeraschungsschalenausPlatin,QuarzoderPorzellan4.2. Elektrischer Muffelofenmit Thermostat4.3. Atomabsorptions-Spektrophotometer.
5.Ausführung
5.1.Herstellung der Analysenlösung
5.1.1.Futtermittel, die ausschließlich aus anorganischen Bestandteilen
bestehen
5 g der Probe, auf ein mg genau gewogen, werden mit
250—300 ml Wasser in einen 500-ml-Meßkolben gebracht. Man
fügt 40 ml Salzsäure (3.1) hinzu und hält etwa 30 Min. in
leichtemSieden.NachdemAbkühlenwirdmitWasserzurMarke
aufgefüllt, gemischt und durch ein trockenes Faltenfilter in ein
trockenes Becherglas filtriert. Der erste Anteil des Filtrats von
etwa30mlwirdverworfen.
BeiAnwesenheitvonKieselsäurewerden5gderProbemiteiner
ausreichenden Menge (15—30 ml) Salzsäure (3.2) auf einem
Wasserbad zur Trockne eingedampft. Die weitere Behandlung
erfolgtwieunter5.1.2ab3.Satzbeschrieben.
5.1.2.Futtermittel, die überwiegend aus anorganischen Bestandteilen
bestehen
5 g der Probe, auf 1 mg genau gewogen, werden bei 550 ºC im
Muffelofen verascht, bis die Asche keine Kohleteilchen enthält.
Zur Abscheidung von Kieselsäure wird die Asche mit einer
ausreichenden Menge (15—30 ml) Salzsäure (3.2) versetzt und
auf dem Wasserbad zur Trockne eingedampft. Anschließend
erhitztman1Std.imTrockenschrankbei105ºC.DerRückstand
wird mit 10 ml Salzsäure (3.1) aufgenommen und mit heißem
Wasser in einen 500-ml-Meßkolben übergespült. Es wird kurz
aufgekochtundnachdemAbkühlenmitWasserzurMarkeaufge-
füllt, umgeschüttelt und durch ein trockenes Faltenfilter in ein
trockenes Becherglas filtriert. Der erste Anteil des Filtrats von
etwa30mlwirdverworfen.1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—5
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5.1.3.Futtermittel, die überwiegend aus organischen Bestandteilen
bestehen
5gderProbewerdenauf1mggenauineine Veraschungsschale
eingewogen und bei 550 ºC im Muffelofen verascht, bis die
Asche keine Kohleteilchen enthält. Die Asche wird mit 5 ml
Salzsäure (3.2) übergossen und auf dem Wasserbad zur Trockne
eingedampft und hierauf 1 Std. bei 105 ºC in einem Trocken-
schrank getrocknet, um die Kieselsäure unlöslich zu machen.
Hierauf wird der Rückstand mit 5 ml Salzsäure (3.1) aufgen-
ommen und mit heißem Wasser in einen 250-ml-Meßkolben
übergespült,kurzaufgekochtundnachdemAbkühlenmitWasser
zur Marke aufgefüllt, gemischt und durch ein trockenes Falten-
filter in trockene Bechergläser filtriert. Der erste Anteil des
Filtratsvonetwa30mlwirdverworfen.
5.2.Messung der Atomabsorption
Aus der Magnesium-Standardlösung (3.5) werden durch Verdünnen mit
Wasser mindestens 5 Eichlösungen steigender Konzentrationen herge-
stellt, entsprechend dem optimalen Meßbereich des Atomabsorptions-
Spektrophotometers. Jeder Eichlösung werden 10 ml Strontiumsalzlö-
sung (3.4) zugesetzt, bevor mit Wasser zu einem Volumen von 100 ml
aufgefüllt wird.
Ein aliquoter Teil des nach 5.1.1, 5.1.2 oder 5.1.3 gewonnenen Filtrats
wird mit Wasser so verdünnt, daß man eine Magnesiumkonzentration
erhält, die im Konzentrationsbereich der Eichlösungen liegt. Die Salz-
säurekonzentration dieser Lösung darf 0,4 N nicht überschreiten. Vor
dem Auffüllen auf ein Volumen von 100 ml werden 10 ml Strontium-
salzlösung(3.4)hinzugefügt.
Die Messung der Atomabsorption erfolgt bei der Analysenlösung und
denEichlösungenbeieinerWellenlänge von285,2nm.
6.Berechnung der Ergebnisse
DerMagnesiumgehaltderProbeistmitHilfederEichlösungenzuberechnen.
DasErgebnisistinv.H.derProbeauszudrücken.
Wiederholbarkeit
DerUnterschiedzwischen2Parallelbestimmungendarfbeieinundderselben
Probe5v.H.relativ nichtüberschreiten.
3.BESTIMMUNG VON ROHFASER
1.Zweck und Anwendungsbereich
Die Methodeerlaubt die Bestimmung desGehalts ansäure- undalkaliunlös-
lichen fettfreien organischen Bestandteilen in Futtermitteln, konventionell
ausgedrücktalsRohfaser.
2.Prinzip
DiegegebenenfallsentfetteteProbewirdnacheinandermitkochenderSchwe-
felsäure und mit kochender Kaliumhydroxidlösung bestimmter
Konzentrationen behandelt. DerRückstandwirddurchFiltration überAsbest
abgetrennt, gewaschen, getrocknet, gewogen und bei 900 ºC verascht. Der
GewichtsverlustbeidieserVeraschungentsprichtderRohfaserderEinwaage.
3.Reagenzien
3.1. 0,26NSchwefelsäure3.2. Behandelter Asbest: Asbest für Gooch-Tiegel wird mit etwa dem
5fachen Gewicht an verdünnter Salzsäure (1 Vol. Salzsäure, D:
1,19 + 3 Vol. Wasser) versetzt. Man kocht die Mischung etwa 45 Min.
lang, läßt abkühlen und filtriert durch einen Büchner-Trichter. Der
Rückstand wird mit Wasser gewaschen, bis das letzte Waschwasser
völligfreivonSäureist,anschließend wirdmit Aceton(3.6)nachgewa-
schen. Der Asbest wird im Trockenschrank getrocknet, anschließend
2 Std. bei 900 ºC geglüht und nach dem Abkühlen in einem geschlos-
senen Gefäß aufbewahrt. Der so behandelte Asbest kann mehrfach
verwendet werden. Er muß den Anforderungen entsprechen, die bei 5.1
imBlindversuchgenanntsind.
3.3. Antischaummittel (z.B.Silikon)
3.4. 0,23NKaliumhydroxidlösung1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—6
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3.5. 0,5NSalzsäure
3.6. Aceton,rein
3.7. Diäthyläther, rein.
4.Geräte
4.1. Bechergläser, mindestens600mlInhalt,mit Markebei200ml
4.2. Porzellanplatten, Durchmesser: ca. 80 mm, Dicke: ca. 4 mm, mit
ungefähr 32Löchernvonjeca.4mmDurchmesser
4.3. SaugflaschenmitdurchbohrtemGummistopfen,ca.2lInhalt,mitMarke
bei 800 ml und mit einem Glastrichter von 120 mm Durchmesser
versehen
4.4. Filterplatten, Durchmesser: ca. 40 mm, Dicke: ca. 4 mm, Rand konisch
dem Trichter angepaßt (4.3), mit ca. 16 Löchern von je ca. 4 mm
Durchmesser, mit einem Drahtgeflecht bedeckt, das eine Maschenweite
von ca. 1 mm besitzt. Filterplatten und Drahtgeflecht müssen beständig
gegenSäureundLaugesein
4.5. VeraschungsschalenausPlatinoderQuarz4.6. Elektrischer Muffelofenmit Thermostat
4.7. Exsikkator
4.8.Vorbereitung des Asbestfilters
2,0 g behandelter Asbest (3.2) werden in 100 ml Wasser aufge-
schwemmt. Unter Anwendung von Vakuum wird über eine Filterplatte,
welche mit einem Drahtgeflecht (4.4)bedeckt undinden Trichter einer
Saugflasche(4.3)gelegtwurde,abgesaugt.DasFiltratwirdaufgefangen
und nochmals über denselben Filter filtriert. Das letzte Filtrat wird
verworfen.
5.Ausführung
3 g der Probe werden auf 1 mg genau eingewogen und mit 2 g behandelten
Asbests (3.2) in ein Becherglas (4.1) gebracht. 200 ml Schwefelsäure (3.1)
und einige Tropfen Antischaummittel (3.3) werden hinzugegeben. Es wird
schnell zum Sieden erhitzt und genau 30 Min. gekocht. Um das Volumen
konstant zu halten, wird das Becherglas mit einem Kühlsystem bedeckt, z.
B. mit einem 500-ml-Rundkolben, durch den Kühlwasser geleitet wird. Das
Kochen wird unterbrochen, indem etwa 50 ml kaltes Wasser hinzugefügt
werden, und es wird sogleich unter Anwendung von Vakuum durch ein
Asbestfilter filtriert, welches vorher wie unter 4.8 beschrieben vorbereitet
wird.
Der Rückstand wirdfünfmal mit je etwa 100 ml heißem Wassergewaschen,
so daß das Endvolumen des Filtrats ca. 800 ml beträgt. Anschließend wird
der Rückstand quantitativ in das Becherglas (4.1) zurückgegeben, in das
vorher eine Porzellanplatte (4.2) zur Vermeidung eines Siedeverzugs gelegt
wurde. 200 ml Kaliumhydroxidlösung (3.4) werden hinzugefügt, es wird
schnellzumSiedenerhitztundgenau30Min.gekocht.Nachdemsofortigen
Zusatz von etwa 50 ml kaltem Wasser wird unter Anwendung von Vakuum
durch einen neuen Asbestfilter filtriert, welcher vorher wie unter 4.8
beschrieben vorbereitet wurde. Der Rückstand wird mit heißem Wasser bis
zur neutralen Reaktion der letzten Waschflüssigkeit (Prüfung mit Lackmu-
spapier) und danach dreimal mit Aceton (3.6) gewaschen (zusammen etwa
100mlAceton).
Der Rückstand wird quantitativ in eine Veraschungsschale (4.5) übergeführt
—wennerforderlich—,aufgelockertundimTrockenschrankbei130ºCbis
zur Gewichtskonstanz getrocknet und nach dem Abkühlen im Exsikkator
schnell gewogen. Die Schale mit Inhalt wird nunmehr in dem Muffelofen
(4.6) bei 900 ºC 30 Min. geglüht. Nach dem Abkühlen im Exsikkator wird
schnell gewogen.
EinBlindversuch wirdnachdemselbenVerfahreninAbwesenheitderAnaly-
senprobe mit behandeltem Asbest (3.2) durchgeführt. Der Gewichtsverlust
nachdemGlühenvon6gAsbestdarfnichtmehrals10mgbetragen.
6.Berechnung der Ergebnisse
Der Gehalt an Rohfaser in Hundertteilen der Probe wird mit Hilfe folgender
Formelberechnet:1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—7
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a/C0b ðÞ /C1100
3
wobei
a = GlühverlustbeimHauptversuch,
b = GlühverlustbeimBlindversuch.
Wiederholbarkeit
DerUnterschiedzwischen2Parallelbestimmungendarfbeieinundderselben
Probe bei Gehalten von weniger als 10 v. H. Rohfaser 0,3 absolut und bei
Gehaltenvon10v.H.Rohfaserundmehr3v.H.relativnichtüberschreiten.
7.Bemerkungen
7.1. Futtermittel, die mehr als 10 v. H. Fett enthalten, werden vor der
AnalysemitDiäthylätherentfettet. HierzuwirddieProbe(3gauf1mg
genau eingewogen) auf einen wie unter 4.8 beschriebenen Asbestfilter
gebracht und dreimal mit je ca. 50 ml Diäthyläther (3.7) überschichtet.
Der Diäthyläther wird unter Anwendung von Vakuum jedesmal
vorsichtig abgesaugt. Die entfettete Probe und der Asbest werden dann
quantitativ in ein Becherglas (4.1) gebracht, und die Analyse wirdnach
5fortgesetzt.
7.2. Futtermittel, die nicht direkt extrahierbare Fette enthalten, müssen wie
unter 7.1 beschrieben entfettet und zusätzlich nach dem Auswaschen
des Rückstands der Säurehydrolyse einer erneuten Entfettung unter-
worfen werden. Dazu wird der Rückstand der Säurehydrolyse dreimal
mit Aceton (3.6) (zusammen 100 ml) und anschließend dreimal mit je
50mlDiäthyläther(3.7)gewaschen.DanachwirdderRückstandquanti-
tativineinBecherglas(4.1)übergeführtunddieAnalysewieunter52.
Absatzfortgeführt(Behandlungmit Kaliumhydroxidlösung).
7.3. BeiFuttermittelnmiteinemhohenGehaltanCalcium(über2v.H.Ca)
wird die Einwaage (3 g auf 1 mg genau abgewogen) 5 Min. lang mit
100mlkalter0,5NSalzsäure(3.5)ineinemBecherglas(4.1)vorbehan-
delt.EswirdsofortfiltriertundmitkaltemWasserausgewaschen.Dabei
dienendiefürdieSchwefelsäurekochungvorgesehenen2,0gAsbestals
Filtrierhilfsmittel.FallsSchwierigkeitenbeiderFiltrationauftreten,wird
die Salzsäureaufschwemmung mit Aceton verdünnt. Dann wird weiter
wiebei5verfahren.1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—8
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ANLAGE II
1.BESTIMMUNG VON RETINOL (VITAMIN A)
1.Zweck und Anwendungsbereich
DieMethodeerlaubtdieBestimmungvonRentinol(VitaminA)inFuttermit-
teln, Konzentraten und Vormischungen. Die untere Grenze der
Bestimmbarkeit beträgt 10000 IE/kg für stark pigmentierte Futtermittel und
4000IE/kgfüralleanderenProdukte(1).JenachdemzuerwartendenGehalt
anRetinol sinddieErzeugnisseinzweiGruppenzuunterteilen:
Gruppe A:Gehalte vonwenigerals200000IE/kg,
Gruppe B:Gehalte von200000IE/kgundmehr.
2.Prinzip
Die Probe wird in Gegenwart eines Antioxidans oder unter Stickstoff-
Atmosphäre mit einer Kaliumhydroxidlösung unter Zusatz von Äthanol heiß
hydrolysiert. Die Mischungwirdmit 1,2-Dichloräthan extrahiert, der Extrakt
wird zur Trockne eingedampft und mit Petroläther aufgenommen. Die
LösungwirdübereineAluminiumoxid-Säulechromatographiert (beiErzeug-
nissen der Gruppe B wird nur in bestimmten Fällen chromatographiert). Die
BestimmungvonRetinolerfolgtbeiErzeugnissenderGruppeAdurchphoto-
metrische Auswertungbei 610 nm nach Entwicklung eines Farbkomplexes
gemäß der Carr-Price-Reaktion, bei Erzeugnissen der Gruppe B durch UV-
spektrophotometrische Auswertungbei325nm.
3.Reagenzien
a)zur Analyse von Erzeugnissen der Gruppe A und B
3.1. Äthanol,96v.H.(V/V)
3.2. Natriumascorbatlösung 10v.H.(G/V)p.a.oder
3.3. Stickstoff,gereinigt3.4. Kaliumhydroxidlösung50v.H.(G/V)p.a.3.5. 1NKaliumhydroxidlösung3.6. 0,5NKaliumhydroxidlösung3.7. 1,2-Dichloräthan p.a.3.8. Petroläther,reinst,Siedeintervall30—50ºC.Wennerforderlich,wie
folgt reinigen: 1000 ml Petroläther werden mit 20-ml-Portionen
konzentrierter Schwefelsäure so lange geschüttelt, bis letztere
farblos bleibt. Dann wird die Säure entfernt und der Petroläther
einmal mit 500 ml Wasser, zweimal mit 250 ml einer 10 v.H.
Natriumhydroxidlösungunddreimalmitje500mlWassernachein-
andergewaschen.MantrenntvonderwäßrigenSchichtab,trocknet
während ca. 1 Std. über Aktivkohle und wasserfreiem Natrium-
sulfat,filtriert unddestilliert.
3.9. Aluminiumoxid zur Chromatographie, standardisiert nach Brock-
mann. Es wird 8 Std. lang bei 750 ºC erhitzt, im Exsikkator
abgekühlt und in braunen Schliffflaschen aufbewahrt. Vor der
weiteren Verwendung zur Chromatographie wird wie folgt ange-
feuchtet: 10 g Aluminiumoxid und 0,7 ml Wasser werden in eine
braune Flasche gegeben, die Flasche wird hermetisch geschlossen,
5 Min. lang im siedenden Wasserbad kräftig geschüttelt und
abkühlen gelassen. Die Aktivität desvorbereiteten Aluminiumoxids
wird durch Analyse einer bekannten Menge (500 IE) Retinol nach
5.3und5.4überprüft.
3.10. Aluminiumoxid basisch,Aktivität I1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—9
(1) 1IE=0,3µgRetinol.
▼B
3.11. Diäthyläther, reinst. Zur Entfernung von Peroxiden und Wasser-
spuren auf einer basischen Aluminiumoxid-Säule (3.10) gereinigt
(25gAluminiumoxid füretwa250mlDiäthyläther)
3.12. Petroläthermischungen (3.8) mit 4, 8, 12, 16 und 20 v.H. (V/V)-
Diäthyläther (3.11)
3.13. Natriumsulfidlösung,ausNatriumsulfidp.a.,0,5Molin70v.H.(V/
V)Glycerin
b)nur zur Analyse von Erzeugnissen der Gruppe A
3.14. Benzolp.a.,kristallisierbar3.15. Chloroformp.a.ZurEntfernungvonÄthanol,PhosgenundWasser-
spuren wird auf einer basischen Aluminiumoxid-Säule (3.10)
gereinigt (50 g Aluminiumoxid für etwa 200 ml Chloroform; es
empfiehlt sich, die ersten 50 ml des Eluats nochmals über dieselbe
Säulezureinigen)
3.16. Carr-Price-Reagenz: ca. 25 g Antimontrichlorid p.a. (im Exsikkator
aufbewahrt)werdenmit100mlChloroform(3.15)biszurSättigung
der Lösung geschüttelt. Ein kleiner Bodensatz von Antimontrich-
lorid-Kristallen stört nicht. 2 ml Essigsäureanhydrid p.a. werden
hinzugegeben und das Reagenz in brauner Schliffstopfenflasche im
Eisschrankaufbewahrt.Esistmehrere Wochenhaltbar.
3.17. Retinol-Standard, spektrophotometrisch geprüft
c)nur zur Analyse von Erzeugnissen der Gruppe B
3.18. Isopropanol,zurChromatographie.
4.Geräte
4.1. Wasserbad4.2. Vakuum-Rotations-Verdampfer mit Rundkolben von verschiedenem
Inhalt
4.3. Chromatographieröhre aus Glas (Länge: 300 mm, innerer Durchmesser:
ca.13mm)
4.4. Spektralphotometer mit Küvetten von 10 mm Schichtdicke (aus Quarz
fürdieMessungimUV-Bereich)
4.5. UV-Lampe,365nm.
5.Ausführung
NB.:AlleArbeiten werdenbeigedämpftem Tageslicht, gegebenenfalls unter
VerwendungvonbraunenGlasgefäßen,durchgeführt.
5.1.Einwaage
Je nach dem vermuteten Gehalt an Retinol wird eine Menge der fein
zerkleinerten Probe wie folgt eingewogen: bei Konzentraten (Gehalte
über 20000 IE/g): 0,1bis 1,0 g; bei Vormischungen (Gehalte zwischen
400und20000IE/g):3,0bis5,0g;
beiMineralmischungen: 10bis20g;beiErzeugnissenderGruppeA:30g.DieEinwaagewirdsofortineinen500-ml-Rundschliffkolbenumgefüllt.
5.2.Hydrolyse und Extraktion (
1)
40 ml Äthanol (3.1), 2 ml Natriumascorbatlösung (3.2)(2), 10 ml Kali-
umhydroxidlösung (3.4) und 2 ml Natriumsulfidlösung (3.13) werden
nacheinander dereingewogenen Probezugegeben.1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—10
(1) Bei Milchaustauschfutter oder bei anderen zur Klumpenbildung oder Quellung
neigenden Erzeugnissen sind die unter 5.2 erster und zweiter Absatz aufgeführtenReagenzienmengen zuverdoppeln.
(
2) Der Zusatz von Natriumascorbat kann unterbleiben, wenn die Hydrolyse unter Stick-
stoff-Atmosphäreerfolgt.
▼B
Die Mischung wird bei 70—80 ºC 30 Min. lang am Rückflußkühler
erhitzt und anschließend unter fließendem Wasser abgekühlt. Darauf
werden 50 ml Äthanol (3.1) und exakt mit einer Pipette 100 ml 1,2-
Dichloräthan (3.7)zugegeben.DieMischungwirdkräftigdurchgeschüt-
teltunddieüberstehendeFlüssigkeitineinenScheidetrichter dekantiert.
Man gibt 150 ml Kaliumhydroxidlösung (3.5) zu, schüttelt während
10 Sek. und wartet die Schichtentrennung ab. Die Dichloräthanphase
(Unterschicht) wirdineinenScheidetrichter abgelassen,mangibt40ml
Kaliumhydroxidlösung (3.6) zu, schüttelt während 10 Sek. und wartet
dieSchichtentrennungab.DieDichloräthanphasewirdineinenScheide-
trichter abgelassen und dann 6- bis 8mal mit 40-ml-Portionen Wasser
bis zur Alkalifreiheit (Phenolphthaleinprobe) gewaschen. Die Dichlorä-
thanphase wird aufgefangen und die Wasserspuren werden mit
Filterpapierschnitzeln entfernt.
Ein aliquoter Teil derDichloräthanlösung wirdbei40ºCWassertempe-
ratur im Vakuum zur Trockne eingeengt und der Rückstand schnell in
5mlPetroläther (3.8)aufgenommen.
Bei Erzeugnissen der Gruppe A wird, wie unter 5.3.1 angegeben, chro-
matographiert.
Bei Erzeugnissen der Gruppe B wird die Lösung in einen 50-ml-
Meßkolben gegeben, mit Petroläther (3.8) zur Marke aufgefüllt und
gemischt. Dann wird die Extinktion wie unter 5.4.2 angegeben
gemessen.
5.3.Chromatographie
5.3.1.Erzeugnisse der Gruppe A
Ein Chromatographierohr (4.3) wird bis zu einer Höhe von
200 mm mit Aluminiumoxid (3.9), welches mit Petroläther (3.8)
befeuchtet wurde, gefüllt. Die unter 5.2 erhaltene Lösung wird
auf die Säule gegeben, dann werden sofort 20 ml Petroläther
(3.8) hinzugefügt. Anschließend wird das Chromatogramm nach-
einandermitje10-ml-PortionenderPetroläthermischungenmit4,
8, 12, 16 und 20 v.H. Diäthyläther (3.12), unter schwachem
Vakuum oder auch Überdruck eluiert. Die Tropfgeschwindigkeit
wirdauf2bis3Tropfen/Sek. einreguliert.
Die Carotin-Fraktion wird im Durchlaufchromatogramm zuerst
erhalten(1). Die Retinol-Fraktion steigt im allgemeinen mit der
20 v.H. Diäthyläther-Petroläthermischung (3.12) ab. Die Elution
wird im UV-Licht (kurzes Beleuchten mit einer Hg-Lampe)
kontrolliert. Der fluoreszierende Retinol-Horizont trennt sich
dabei deutlich von den nachfolgenden gelb gefärbten Xantho-
phyllbändern. Die Retinol-Fraktion des Eluats wird in einer
Vorlageaufgefangen.
5.3.2.Erzeugnisse der Gruppe B
Die Chromatographie muß nur durchgeführt werden, wenn die
Messungen der unter 5.4.2 erwähnten Extinktion nicht nach
5.4.2vorschriftsmäßig sind.
Wenn die Chromatographie erforderlich ist, wird ein aliquoter
Teil der unter 5.2 erhaltenen Petrolätherlösung, der etwa 500 IE
Retinol enthält, auf die Chromatographiesäule gegeben. Die
Chromatographie wirdwieunter5.3.1beschrieben fortgeführt.
5.4.Messung der Extinktion
5.4.1.Erzeugnisse der Gruppe A
Das unter 5.3.1 erhaltene Retinol-Eluat wird im Vakuum zur
Trockne eingeengt und in 2 ml Benzol (3.14) aufgenommen.
0,3 ml davon werden mit 3 ml Carr-Price-Reagenz (3.16)
versetzt. Es entwickelt sich eine blaue Färbung, deren Extinktion
im Spektralphotometer bei 610 nm, genau 30 Sek. nach Reakti-
onsbeginn, gemessen wird. Die Berechnung des Vitamin-A-
Gehalts erfolgt über eine Eichkurve, die mit Benzollösungen von
Retinol-StandardinsteigendenKonzentrationenunterZugabevon
Carr-Price-Reagenz (2 bis 16) IE Retinol-Standard (3.17) pro
0,3mlBenzol(3.14)+3mlCarr-Price-Reagenz(3.16)aufgestellt1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—11
(1) Der Carotingehalt kann durch Extinktionsermittlung bei 450 nm bestimmt werden
E1%
1cm¼2600 :
▼B
wird. Die Eichkurve ist mit dem Standard und dem frisch
bereiteten Carr-Price-Reagenz regelmäßig und in kurzen Zeit-
abständen zuüberprüfen.
5.4.2.Erzeugnisse der Gruppe B
Ein aliquoter Teil der unter 5.2 erhaltenen Petrolätherlösung, der
etwa200IERetinolenthält,wirdimVakuumzurTrockneeinge-
engt und in 25 ml Isopropanol (3.18) aufgenommen. Die
Extinktion wirdimSpektralphotometer bei 325,310und334nm
gemessen. Das Absorptionsmaximum liegt bei 325 nm. Der
Retinol-Gehalt derLösungberechnet sichaus:
E325·18,30=IERetinol/ml
DasVerhältnisderExtinktionen
E310:E325undE334:E325
mußjedoch denWert6:7=0,857erreichen.
WeichteinesdieserVerhältnissestärkerab(<0,830oder>0,880),
muß der Messung der Extinktionen eine Chromatographie nach
demVerfahren5.3.2vorausgehen.
ZeigtdienachderChromatographievorgenommeneMessungder
Extinktionenan,daßdieobengenanntenVerhältnisseimmernoch
vomWert0,857stärkerabweichen(<0,830oder>0,880),dannist
die Bestimmung nach dem für die Erzeugnisse der Gruppe A
vorgeschriebenen Verfahrendurchzuführen.
6.Berechnung der Ergebnisse
Der Gehalt an Retinol der Probe wird unter Berücksichtigung des Gewichts
der Einwaage und der Verdünnungsverhältnisse im Analysengang berechnet.
DieErgebnissewerdeninIERetinolprokgausgedrückt.
WiederholbarkeitDer Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und
derselben Probe
— beiGehalten vonweniger als75000IE/kg20v.H.relativ,
— beiGehalten von75000bis150000IE/kg15000IEabsolut,
— beiGehalten von150000bis250000IE/kg10v.H.relativ,— beiGehalten von250000bis500000IE/kg25000IEabsolut,
— beiGehalten vonmehrals500000IE/kg5v.H.relativ
nichtüberschreiten.
2.BESTIMMUNG VON THIAMIN (ANEURIN, VITAMIN B
1)
1.Zweck und Anwendungsbereich
DieMethodeerlaubtdieBestimmungvonThiamin (Aneurin,Vitamin B1)in
Futtermitteln, Konzentraten und Vormischungen. Die untere Grenze der
Bestimmbarkeit beträgt5mg/kg.
2.Prinzip
Die Probe wird mit verdünnter Schwefelsäure heiß behandelt und enzyma-
tisch hydrolysiert. Die Lösung wird alkalisch oxydiert, und das erhaltene
Thiochrom wirdmitIsobutanolextrahiert undfluorimetrisch bestimmt.
3.Reagenzien
3.1. Thiamin-Standardlösung100µg/ml:112,3mgreinstes,imVakuumbis
zur Gewichtskonstanz getrocknetes Thiaminhydrochlorid werden in
1000 ml 0,2 N Schwefelsäure (3.2) gelöst. Kühl und dunkel aufbe-
wahrthält sichdieseLösungeinenMonat.
3.2. 0,2NSchwefelsäure3.3. Natriumdisulfit, rein(Na
2S2O5)
3.4. Kaliumhexacyanoferrat(III)-Lösung 20v.H.(G/V)p.a.3.5. Kaliumhydroxidlösung25v.H.(G/V)p.a.
3.6. Oxidationsmischung: 2 ml Kaliumhexacyanoferrat(III)-Lösung (3.4)
werden mit 48 ml Kaliumhydroxidlösung (3.5) gemischt. Diese
Mischunghältsichhöchstens4Std.1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—12
▼B
3.7. Isobutanolp.a.
3.8. 2,5NNatriumacetatlösung p.a.
3.9. Multienzympräparat aus Protease, Phosphatase und Amylase (z.B.
„Clarase“)
3.10. Äthanol96v.H.(V/V).
4.Geräte
4.1. Wasserbad4.2 Zentrifuge (3500 U/Min.), dazu eingeschliffene Gläser mit Schliff-
stopfen,30bis50mlInhalt
4.3. Fluorimeter.
5.Ausführung
5.1.Enzymatische Hydrolyse
In zwei 250-ml-Meßkolben A und B werden gleiche Mengen der fein
zerkleinerten Probe, die etwa 100 µg Thiamin enthalten, gegeben und
125 ml Schwefelsäure (3.2) hinzugefügt. In den Kolben A wird
außerdem 1,0mlderStandardlösung(3.1)pipettiert (interner Standard).
DieKolbenwerdenkräftiggeschüttelt,15Min.langineinemsiedenden
Wasserbad unter gelegentlichem Schütteln erwärmt und auf etwa 45 ºC
abgekühlt.DannwerdenjedemKolben20mlNatriumacetatlösung (3.8)
und0,5gMultienzympräparat(3.9)zugesetzt,undeswird20Min.lang
bei Raumtemperatur stehen gelassen. Man fügt 20 ml Natriumacetatlö-
sung (3.8) zu, füllt mit Wasser zur Marke auf und filtriert. Die Filtrate
A und B werden aufgefangen, nachdem die ersten 15 ml verworfen
wurden.Dannwerdendiefolgenden Lösungenvorbereitet:
5.1.1.Blindprobenlösung T
5mldesFiltratsAundca.10mgNatriumdisulfit(3.3)werdenin
einZentrifugenglas(4.2)gegeben.DasGlaswird15Min.langin
einsiedendesWasserbadgestelltundanschließendaufRaumtem-
peraturabgekühlt.
5.1.2.Lösungen A (interner Standard) und B (Probe)
Es werden 5 ml des Filtrats A in ein Zentrifugenglas (4.2) und
5mldesFiltrats BineinanderesZentrifugenglas (4.2)gegeben.
5.2.Oxydation
Den Lösungen T, Aund Bwerden 5ml Oxydationsmischung (3.6)und
— eine Minute danach — 10 ml Isobutanol (3.7) zugesetzt. Die Gläser
werden verschlossen, 5 Sek. kräftig geschüttelt und nach etwa einer
Minute zur Schichtentrennung zentrifugiert. Jedem Zentrifugenglas
werden 5 ml der oben schwimmenden Isobutanol-Phase entnommen
und in einen 25-ml-Meßkolben pipettiert. Die Kolben werden mit
Äthanol (3.10) zur Marke aufgefüllt und es wird gemischt (Extrakte T,
AundB).
5.3.Messung der Fluoreszenzintensität
DiefluorimetrischenMessungensindbeiderWellenlängevorzunehmen,
bei der das Gerät für die Thiochromfluoreszenz den größten Ausschlag
zeigt. DieAnregungerfolgt bei365nm.
Die Fluoreszenzintensität der Extrakte A und B wird gemessen, indem
derNullwertdesFluorimetersaufdieFluoreszenzintensität desExtrakts
Teingestellt wird.
6.Berechnung der Ergebnisse
Der Gehalt an Thiamin in mg/kg der Probe wird nach folgender Formel
berechnet:
d/C1b
a/C0b ðÞc
Esbedeuten:
a = Fluoreszenzintensität desExtrakts A(internerStandard),
b = Fluoreszenzintensität desExtrakts B(Probe),
c = GewichtderAnalysenprobeing,1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—13
▼B
d = bei der Analysenprobe zugesetzte Thiaminmenge in µg (interner
Standard).
Wiederholbarkeit
Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und
derselben Probe
— beiGehalten vonweniger als500ppmThiamin10v.H.relativ und
— beiGehalten von500ppmThiamin undmehr5v.H.relativ
nichtüberschreiten.
3.BESTIMMUNG VON ASCORBINSÄURE UND DEHYDROASCOR-
BINSÄURE
(VITAMIN C)
1.Zweck und Anwendungsbereich
Die Methode erlaubt die Bestimmung der Summe von Ascorbinsäure und
Dehydroascorbinsäure (Vitamin C) in Futtermitteln, Konzentraten und
Vormischungen. Die untere Grenze der Bestimmbarkeit beträgt 5 mg/kg. Je
nachdem zuerwartenden GehaltanVitamin CsinddieErzeugnisseinzwei
Gruppenzuunterteilen:
Gruppe A:Gehalte vonwenigerals10g/kg
Gruppe B:Gehalte von10g/kgundmehr.
2.Prinzip
Die Probe wird in verdünnter Metaphosphorsäure suspendiert und mit Chlo-
roform extrahiert. Die wäßrige Phase wird zur Umwandlung der
Ascorbinsäure in Dehydroascorbinsäure mit einer 2,6-Dichlorphenolindophe-
nollösung behandelt und danach mit einer 2,4-Dinitrophenylhydrazinlösung
versetzt. Das entstehende Hydrazon wird mit einem Gemisch von Äthyla-
cetat, Eisessig und Aceton extrahiert und der Extrakt über eine
Kieselgelsäule chromatographiert. Das Eluat wird zur Trockne verdampft
undderRückstandmitverdünnterSchwefelsäureaufgenommen.DieExtink-
tiondieserLösungwirdbei509nmphotometrisch bestimmt.
Bei Erzeugnissen der Gruppe A wird das aus der Chromatographiesäule
gewonneneEluataußerdemzurAbtrennungdesHydrazonsderDünnschicht-
chromatographie unterworfen.
3.Reagenzien
3.1. L-Ascorbinsäure-Standardlösung 0,05 v.H.: 50 mg L-Ascorbinsäure
p.a. werden in ca. 20 ml Metaphosphorsäurelösung (3.2) gelöst und
mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt. Die Lösung ist kurz vor Gebrauch
herzustellen.
3.2. Metaphosphorsäurelösung 10 v.H. (G/V): 200 g Metaphosphorsäure
p.a.,imMörserzerkleinert,werdeninWassergelöstundauf2000ml,
mit Wasser aufgefüllt. Diese Lösung ist bei 4 ºC aufzubewahren. Sie
isteineWoche langhaltbar.
3.3. Chloroformp.a.3.4. 2,6-Dichlorphenolindophenollösung0,5v.H.(G/V)aus2,6-Dichlorphe-
nolindophenol p.a.KurzvorGebrauchherzustellen.
3.5. Filterflockenmasse (S.undS.Nr.121odergleichwertiges Material)
3.6. 2,4-Dinitrophenylhydrazinlösung 2 v.H. (G/V): 2 g 2,4-Dinitrophenyl-
hydrazin p.a. werden in 100 ml verdünnter Schwefelsäure (25 ml
Schwefelsäure p.a., D: 1,84, auf 100 ml mit Wasser aufgefüllt) gelöst.
ImKühlschrankistdieseLösungeine Wochelanghaltbar.
3.7. Stickstoffoder
3.8. Kohlendioxid3.9. GemischvonÄthylacetat p.a./Eisessigp.a./Aceton p.a.:96/2/2inVol.
3.10. GemischvonDichlormethan p.a./Eisessigp.a.:97/3inVol.
3.11. Kieselgel, granuliert, Teilchengröße: 0,05bis0,2mm
3.12. Kieselgel H,nachStahl,fürDünnschichtchromatographie1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—14
▼B
3.13. VerdünnteSchwefelsäure:105mlWasserwerdenineinemMeßkolben
mit Schwefelsäurep.a.,D:1,84,auf200mlaufgefüllt
3.14. Laufmittel für Dünnschichtchromatographie: 75 ml Diäthyläther p.a.
werden mit 25 ml Äthylacetat p.a. und 4,0 ml Eisessig 96 v.H. (G/V)
p.a.gemischt.Nach2-bis3maligem Gebrauchfrischzubereiten.
4.Geräte
4.1. Ultrathermostat auf20ºCeingestellt4.2. Zentrifuge (3500 U/Min.), dazu Gläser mit eingeschliffenem Stopfen,
40bis50mlInhalt
4.3. Vakuum-Rotationsverdampfer, mit 250-ml-Rundkolben
4.4. Chromatographieröhre,ausGlas(Länge:100mm,innererDurchmesser:
20mm),mitFritte(z.B.Allihn'schesRohr)
4.5. Spektralphotometer oderFilterphotometer mit 10mmKüvetten4.6. ApparaturzurDünnschichtchromatographie, mitKieselgel(3.12)-Platten,
Schichtdicke:0,5bis0,6mm.(Fertigplattenkönnenverwendetwerden.)
Die Platten werden während 2½ bis 3 Std. im Trockenschrank bei
120—130 ºC getrocknet und nach dem Abkühlen mindestens 24 Std.
vordemGebrauchimExsikkatoraufbewahrt.
4.7. Trockenschrank, auf120—130ºCgeregelt.
5.Ausführung
5.1.Extraktion
Zwei 250-ml-Meßkolben mit Schliff, A und B, werden mit gleichen
Mengen der fein zerkleinerten Probe, die etwa 200 µg Vitamin C
enthalten, beschickt. In den Kolben A werden außerdem 0,4 ml der
Standardlösung (3.1) pipettiert, und es wird durch leichtes Schütteln
gemischt (interner Standard). Dann werden bei 4 ºC in jeden Kolben
30mlChloroform(3.3)und25mlMetaphosphorsäurelösung(3.2)zuge-
geben, kurz umgeschüttelt und 10 bis 15 Min. lang stehen gelassen.
Nach Zusatz von 25 ml Wasser werden die Kolben verschlossen,
10 Sek. kräftig durchgeschüttelt und 10 bis 15 Min. lang im Ultrather-
mostat (4.1) belassen. Anschließend wird zentrifugiert, um die wäßrige
Phase von der Chloroform-Phase zu trennen. Die wäßrigen Extrakte A
(interner Standard)undBwerdenwiefolgtweiterverarbeitet.
5.2.Oxydation
40 ml der nach 5.1 erhaltenen etwas trüben überstehenden Lösung
werden abpipettiert, in ein Reagenzglas mit Schliffstopfen, das 0,5 bis
1 ml 2,6-Dichlorphenolindophenollösung (3.4) enthält, übergeführt und
gemischt. Die entstehende rote Färbung muß mindestens 15 Min. lang
bestehen bleiben. Dann werden ca. 300 mg Filterflockenmasse (3.5)
hinzugefügt,eswirdgeschütteltunddurcheintrockenesFaltenfilterfilt-
riert. DasFiltratbrauchtnichtklarzusein.
5.3.Reaktion mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin und Extraktion des Hydrazons
10mldesnach5.2erhaltenenFiltratswerdenabpipettiert,ineinZentri-
fugenglas(4.2)mit2ml2,4-Dinitrophenylhydrazinlösung (3.6)gegeben
und gemischt. Das Glas wird kurz mit Stickstoff (3.7) oder Kohlen-
dioxid (3.8) gespült, verschlossen und 15 Std. (über Nacht) im
Ultrathermostaten (4.1) belassen. Dann werden 3 ml Wasser, 20 ml des
Äthylacetat/Eisessig/Aceton-Gemischs (3.9) und ca. 800 mg Filterflok-
kenmasse (3.5) zugegeben. Das Glas wird verschlossen, während
30Sek.kräftigdurchgeschütteltundzentrifugiert.Vonderklarenoberen
Phase werden 15 ml in einen Kolben pipettiert und am Rotationsver-
dampfer (4.3) unter Vakuum eingedampft, bis ein öliger Rückstand
verbleibt. Der Rückstand wird mit 2 ml des Äthylacetat/Eisessig/
Aceton-Gemischs (3.9) aufgenommen und bei 50 ºC vollständig
aufgelöst. Nach dem Abkühlen werden 10 ml des Dichlormethan/
Eisessig-Gemischs(3.10)zugesetzt undeswirdgemischt.
5.4.Säulenchromatographie
Ein Chromatographierohr (4.4) wird 30 mm hoch mit dem Dichlorme-
than/Eisessig-Gemisch (3.10)gefüllt. 5gKieselgel (3.11)werdendurch
kräftiges Schütteln in 30 ml des Dichlormethan/Eisessig-Gemischs
(3.10) suspendiert und in das Rohr eingegossen. Man läßt absetzen und
packtanschließend mitleichtem Stickstoff(3.7)-Druckdichter.1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—15
▼B
Man gibt die nach 5.3 erhaltene Lösung auf die Säule, spült mit etwas
Dichlormethan/ Eisessig-Gemisch (3.10) in die Säule hinein, füllt das
Rohr mit demselben Gemisch (3.10) auf und wäscht so lange aus (3
bis 4 Füllungen von ca. 5 ml), bis das Eluat farblos abläuft. Die
gelbgefärbte FraktiondesEluatswirdverworfen.
Nunwirdder rötliche Säulenkopf mit dem Äthylacetat/Eisessig/Aceton-
Gemisch(3.9)eluiert unddaserhaltene Eluat zurTrockneeingedampft.
5.4.1.Bei Erzeugnissen der Gruppe A (Gehalte an Vitamin C weniger
als 10 g/kg) wird der Rückstand mit 2,0 ml des Äthylacetat/
Eisessig/Aceton-Gemischs (3.9) aufgenommen und unmittelbar
wie unter 5.5 angegeben auf einer Dünnschichtplatte chromato-
graphiert.
5.4.2.Bei Erzeugnissen der Gruppe B (Gehalte an Vitamin C von 10 g/
kg und mehr) wird der Rückstand mit 4,0 ml verdünnter Schwe-
felsäure (3.13) aufgenommen und bis zur vollständigen Lösung
kräftig geschüttelt. Die Extinktion dieser Lösung wird wie unter
5.6angegeben gemessen.
5.5.Dünnschichtchromatographie
Das nachfolgende Verfahren wird doppelt ausgeführt. Man trägt 0,5 ml
der nach 5.4.1erhaltenen Lösungauf die Platte (4.6) auf.Manchroma-
tographiert bei Kammersättigung mit dem Laufmittel (3.14) während
mindestens 20 Min., bis zur guten Abtrennung der rosa gefärbten Zone
desHydrazons,undläßtanderLufttrocknen.DierosaZonewirdabge-
grenzt, mittels eines Spatels abgekratzt und quantitativ in ein
Chromatographierohr (4.4)gebracht.
Maneluiertnacheinandereinmalmit2mlunddannzweimalmit1,5ml
des Äthylacetat/Eisessig/Aceton-Gemischs (3.9) und preßt in einen
kleinen Rundkolben ab (das letzte Eluat soll farblos sein). Man dampft
bis zur Trockne, nimmt den öligen Rückstand in 4,0 ml verdünnte
Schwefelsäure (3.13) auf, schüttelt kräftig durch, um den Rückstand
vollständigaufzulösen, undmißtwiefolgtdieExtinktion.
5.6.Messung der Extinktion
DieExtinktion wird20bis30Min.nachZugabe derSchwefelsäure bei
509 nm photometrisch bestimmt. Die Messungen werden im Vergleich
mit verdünnterSchwefelsäure(3.13)ausgeführt.
5.7.Blindversuch
Ein Blindversuch wird unter den gleichen Bedingungen ohne Probe
durchgeführt.
6.Berechnung der Ergebnisse
Der Gehalt an Vitamin C der Probe in g/kg wird nach folgender Formel
berechnet:
c/C0a ðÞ /C12
b/C0c ðÞ /C110d
wobei:
a = Extinktion desBlindwerts,
b = Extinktion derinternen Standardlösung,c = Extinktion derProbelösung,
d = GewichtderAnalysenprobeing.
Wiederholbarkeit
Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und
derselben Probe
— beiGehalten vonweniger als10gVitaminCprokg10v.H.relativ und
— beiGehalten von10gVitamin Cprokgundmehr5v.H.relativ
nichtüberschreiten.1973L0046—DE—19.08.1981—001.001—16