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►B VERORDNUNG (EG) Nr. 86/94 DER KOMMISSION
vom 19. Januar 1994
zur Erstellung einer Referenzmethode für die Bestimmung von Sitosterin und Stigmasterin in
Butter
(ABl. L 17 vom 20.1.1994, S. 7)
Geändert durch:
Amtsblatt
Nr. Seite Datum
►M1Verordnung (EG) Nr. 175/1999 der Kommission vom 26. Januar 1999 L 20 22 27.1.1999
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VERORDNUNG (EG) Nr. 86/94 DER KOMMISSION
vom 19. Januar 1994
zur Erstellung einer Referenzmethode für die Bestimmung von
Sitosterin und Stigmasterin in Butter
DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN —
gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft,
gestützt auf die Verordnung (EWG) Nr. 804/68 des Rates vom 27. Juni
1968 über die gemeinsame Marktorganisation für Milch und Milcher-zeugnisse (
1), zuletzt geändert durch die Verordnung (EWG) Nr. 2071/
92 (2), insbesondere auf Artikel 6 Absatz 7,
in Erwägung nachstehender Gründe:Gemäß den Artikeln 3 und 6 der Verordnung (EWG) Nr. 570/88 der
Kommission (
3), zuletzt geändert durch die Verordnung (EG) Nr. 3049/
93 (4), kann Butter gekennzeichnet werden und müssen die gekenn-
zeichneten Erzeugnisse kontrolliert werden.
Damit eine unzulässige Verwendung subventionierter Butter ausge-
schlossen ist, sind die Bedingungen hinsichtlich der Markierung mitKennzeichnungsstoffen genauestens zu erfüllen.
Wegen der Bedeutung der Markierung mit Kennzeichnungsstoffen für
das Funktionieren dieser Regelungen bedarf es gemeinsamer Verfahrenfür den Nachweis sämtlicher Kennzeichnungsstoffe; diese Verfahrensollten gemeinschaftsweit einheitlich angewendet werden. Dies dientinsbesondere der Gleichbehandlung aller diese Regelung in Anspruchnehmenden Marktteilnehmer und der Beseitigung etwaiger Wettbe-werbsverzerrungen als Folge der gegenwärtig von Mitgliedstaat zuMitgliedstaat unterschiedlichen Analyseverfahren.
Mit der Verordnung (EWG) Nr. 3942/92 der Kommission (
5) wurde
eine Referenzmethode zur Bestimmung von Stigmasterin und Sitosterinin Butterfett festgelegt. Diese Methode kann in leicht abgewandelterForm auch zur Bestimmung von Sterinkennzeichnungsstoffen in Butterverwendet werden.
Es sollten die Genauigkeit der Methode und die zulässigen Abwei-
chungen bestimmt werden.
Die in dieser Verordnung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der
Stellungnahme des Verwaltungsausschusses für Milch und Milcher-zeugnisse —
HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN:
Artikel 1
Die zur Bestimmung des Stigmasteringehalts oder β-Sitosteringehalts
von Butter nach Artikel 6 der ►M1Verordnung (EG) Nr. 2571/97 ◄
anzuwendende Referenzmethode ist im Anhang beschrieben.
(1) ABl. Nr. L 148 vom 28. 6. 1968, S. 13.
(2) ABl. Nr. L 215 vom 30. 7. 1992, S. 64.
(3) ABl. Nr. L 55 vom 1. 3. 1988, S. 31.
(4) ABl. Nr. L 273 vom 5. 11. 1993, S. 7.
(5) ABl. Nr. L 399 vom 31. 12. 1992, S. 29.
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Butter ist dann korrekt gekennzeichnet worden, wenn die Ergebnisseden Anforderungen gemäß Punkt 8 dieses Anhangs genügen.
Artikel 2
Diese Verordnung tritt am dritten Tag nach ihrer Veröffentlichung im
Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften in Kraft.
Diese Verordnung gilt ab 1. April 1994.
Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmit-
telbar in jedem Mitgliedstaat.
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ANHANG
BESTIMMUNGVONSITOSTERINBZW.STIGMASTERININBUTTER-
FETT DURCH KAPILLARSÄULEN-GASCHROMATOGRAPHIE
1. ZWECK UND ANWENDUNGSBEREICH
Die Methode beschreibt ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung
von Sitosterin bzw. Stigmasterin in Butterfett. Sitosterin ist dabei dieSumme von β-Sitosterin und 22-Dihydro- β-Sitosterin; die anderen Sito-
sterine sind als unbedeutend zu betrachten. Die Methode ist auf Probenanwendbar, die gemäß der Verordnung (EWG) Nr. 570/88 entnommenwurden.
2. PRINZIP
Die Butter wird mit ethanolischer Kaliumhydroxidlösung verseift. Die
unverseifbaren Bestandteile werden mit Diethyl-Ether extrahiert.
Die Sterine werden zu Trimethyl-Silyl-Ether derivatisiert und durch
Kapillarsäulen-Gaschromatographie mit Betulin als internem Standardanalysiert.
3. GERÄTE
3.1. 150-ml-Verseifungskolben mit Rückflußkühler und Schliffverbindungen.3.2. 500-ml-Scheidetrichter.3.3. 250-ml-Kolben.3.4. Druckausgleichtrichter (etwa 250 ml) zum Auffangen von überschüs-
sigem Diethyl-Ether.
3.5. Glassäule, 350 mm × 20 mm, mit Sinterglasfritte.3.6. Wasserbad oder Heizhaube.3.7. Reagenzgläser, 2 ml.3.8. Zur Verwendung mit einer Kapillarsäule geeigneter Gaschromatograph,
ausgerüstet mit einem „Split-System“ und folgenden Bestandteilen:
3.8.1. ein Säulenofen, der die gewünschte Temperatur mit einer Genauigkeit
v o n±1 °C halten kann;
3.8.2. ein Probeneinlaßsystem mit verstellbarer Temperatur;
3.8.3. ein Flammenionisationsdetektor und ein Signal-Verstärker;3.8.4. ein Aufzeichnungsgerät mit Integrator für den Signal-Verstärker (3.8.3).3.9. Eine Quarzglas(Fused Silica)-Kapillarsäule, vollständig beschichtet mit
BP1 oder einem vergleichbaren Material mit einer einheitlichen Stärkevon 0,25 µm. Die Säule muß die Trimethyl-Silyl-Derivate von Lano-sterin und Sitosterin trennen können. Geeignet ist eine mit BP1beschichtete Säule von 12 m Länge und 0,2 mm Innendurchmesser.
3.10. Eine 1-µl-Gaschromatographie-Mikrospritze mit gehärteter Nadel.
4. REAGENZIEN
Alle Reagenzien müssen von anerkannter Analysenqualität sein. Es ist
destilliertes Wasser oder Wasser von mindestens gleichem Reinheitsgradzu verwenden.
4.1. Ethanol, Reinheitsgrad mindestens 95 %.4.2. 60 %ige Kaliumhydroxid-Lösung (600 g Kaliumhydroxid (mindestens
85 %) in Wasser lösen und bis zu einem Liter mit Wasser auffüllen).
4.3. Betulin, Reinheitsgrad mindestens 99 %.
4.3.1. Interne Standardlösungen. Betulin in Diethyl-Ether (4.4).
4.3.1.1. Die zur Bestimmung von Sitosterin verwendete Betulinlösung soll eine
Konzentration von 1,0 mg/ml aufweisen.
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4.3.1.2. Die zur Bestimmung von Stigmasterin verwendete Betulinlösung soll
eine Konzentration von 0,4 mg/ml aufweisen.
4.4. Diethyl-Ether, analyserein (frei von Peroxiden oder Rückständen).4.5. Natriumsulfat, wasserfrei, granular, zuvor 2 Stunden lang bei 102 °C
getrocknet.
4.6. Silylierungs-Reagenz, z. B. TRI-SIL (erhältlich von Pierce Chemical
Co., Kat.-Nr. 49001) oder vergleichbares Reagenz. (Achtung: TRI-SIList entflammbar, giftig, ätzend und ein potentielles Kanzerogen. DasLaborpersonal muß mit den Sicherheitsdaten zu TRI-SIL vertraut seinund die erforderlichen Vorsichtsmaßregeln treffen.)
4.7. Lanosterin.4.8. Sitosterin, bekannter Reinheitsgrad mindestens 90 % (P).
Anmerkung 1: Die Reinheit der Standardstoffe für die Eichung ist
durch Normalisierung zu bestimmen. Dazu wird angenommen, daß dasChromatogramm alle in der Probe vorhandenen Sterine wiedergibt, daßdie Gesamtfläche der Peaks 100 % der Sterinbestandteile darstellt unddaß alle Sterine ein gleich starkes Detektorsignal hervorrufen. Es istsicherzustellen, daß das System in den interessierenden Konzentrations-bereichen linear verläuft.
4.8.1. Sitosterin-Standardlösung: Lösung von Sitosterin (4.8) in Diethyl-Ether
(4.4) mit einer Konzentration von rund 0,5 mg/ml, auf 0,001 mg/mlgenau (W
1).
4.9. Stigmasterin, bekannter Reinheitsgrad mindestens 90 % (P).4.9.1. Stigmasterin-Standardlösung: Lösung von Stigmasterin (4.9) in Diethyl-
Ether (4.4) mit einer Konzentration von rund 0,2 mg/ml, auf 0,001mg/ml genau (W
1).
4.10. Testlösung für die Prüfung der Auflösung: Lösung von Lanosterin (4.7)
(0,05 mg/ml) und Sitosterin (4.8) (0,5 mg/ml) in Diethyl-Ether (4.4).
5. AUSFÜHRUNG
5.1. Herstellung der Standardlösungen für die Chromatographie. Die interne
Standardlösung (4.3.1) muß der entsprechenden Sterin-Standardlösungund der verseiften Probe gleichzeitig zugesetzt werden (siehe 5.2.2).
5.1.1. Sitosterin-Standardlösung für die Chromatographie: je 1 ml der Sito-
sterin-Standardlösung (4.8.1) in 2 Reagenzgläser (3.7) überführen undden Diethyl-Ether durch einen Stickstoffstrom entfernen. 1 ml derinternen Standardlösung (4.3.1.1) zugeben und den Diethyl-Ether durcheinen Stickstoffstrom entfernen.
5.1.2. Stigmasterin-Standardlösung für die Chromatographie: je 1 ml der Stig-
masterin-Standardlösung (4.9.1) in 2 Reagenzgläser (3.7) überführenund den Diethyl-Ether durch einen Stickstoffstrom entfernen. 1 ml derinternen Standardlösung (4.3.1.2) zugeben und den Diethyl-Ether durcheinen Stickstoffstrom entfernen.
5.2. Vorbereitung der unverseifbaren Bestandteile.
5.2.1. Die Butterprobe bei höchstens 35 °C schmelzen lassen. Die Probe durch
Rühren gründlich durchmischen. Ungefäh r 1 g Butterfett (W
2)au f1m g
genau in einen 150-ml-Kolben (3.1) einwiegen. 50 ml Ethanol (4.1) und10 ml Kaliumhydroxid-Lösung (4.2) zugeben. Rückflußkühler anbringenund 30 Minuten auf rund 75 °C erhitzen. Kühler entfernen und den
Kolben auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
5.2.2. 1,0 ml der internen Standardlösung (4.3.1.1 bei der Bestimmung von
Sitosterin bzw. 4.3.1.2 bei der Bestimmung von Stigmasterin) in denKolben geben. Gründlich mischen. Den Inhalt des Kolbens quantitativ ineinen 500-ml-Scheidetrichter (3.2) überführen, in dem man den Kolbennacheinander mit 50 ml Wasser und 250 ml Diethyl-Ether (4.4) ausspült.Den Scheidetrichter 2 Minuten kräftig schütteln und Trennung der
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Phasen abwarten. Die untere Wasserschicht ablaufen lassen und die
Etherschicht viermal mit je 100 ml Wasser ausschütteln.
Anmerkung 2: Damit keine Emulsion entsteht, ist es wichtig, die ersten
beiden Waschvorgänge mit Wasser vorsichtig auszuführen (10Drehungen). Beim dritten Waschvorgang kann 30 Sekunden lang kräftiggeschüttelt werden. Sollte sich eine Emulsion bilden, so kann diesedurch Zugabe von 5 — 10 ml Ethanol zerstört werden. Bei Zugabe vonEthanol muß unbedingt noch weiter zweimal kräftig mit Wasser ausge-schüttelt werden.
5.2.3. Die klare seifenfreie Etherschicht durch eine Glassäule (3.5) mit 30 g
wasserfreiem Natriumsulfat (4.5) laufen lassen. Den Ether in einem250-ml-Kolben (3.3) auffangen. Siedesteinchen zugeben und auf einemWasserbad oder einer Heizhaube fast bis zur völligen Trockenheiteindampfen lassen; dabei die überschüssigen Lösungsmittel auffangen.
Anmerkung 3: Werden die Probenextrakte bei zu hoher Temperatur
vollständig getrocknet, so können Sterine verloren gehen.
5.3. Vorbereitung der Trimethyl-Silyl-Ether.
5.3.1. Die im Kolben verbliebene Etherlösung in ein 2-ml-Reagenzglas (3.7)
mit 2 ml Diethyl-Ether übertragen und den Ether durch einen Stickstoff-strom entfernen. Den Kolben mit 2 weiteren 2-ml-Aliquoten Diethyl-Ether ausspülen, dabei jedes Mal den Inhalt in das Reagenzglas über-tragen und den Ether durch einen Stickstoffstrom entfernen.
5.3.2. Die Probe durch Zugabe von 1 ml TRI-SIL (4.6) silylieren. Glas
verschließen und zwecks Auflösen kräftig schütteln. Bei unvollständigerAuflösung auf 65 — 70 °C erwärmen. Vor der Injektion in den
Gaschromatographen mindestens 5 Minuten stehen lassen. Die Stan-dards in gleicher Weise wie die Proben silylieren. Die Mischung zurPrüfung der Auflösung (4.10) in gleicher Weise wie die Proben sily-lieren.
Anmerkung 4: Die Silylierung ist in wasserfreier Umgebung vorzu-
nehmen. Die unvollständige Silylierung von Betulin wird durch einenzweiten Peak dicht neben dem von Betulin angezeigt.
Die Silylierung wird in Gegenwart von Ethanol (ungenügendes Spülen
bei der Extraktion) beeinträchtigt. In diesem Fall muß bei der Extraktionein fünftes Mal gespült werden (30 Sekunden kräftiges Schütteln).
5.4. Gaschromatographische Analyse.
5.4.1. Wahl der Arbeitsbedingungen.
Den Gaschromatographen nach der Anleitung des Herstellers vorbe-
reiten.
Als Leitlinie gelten die folgenden Arbeitsbedingungen:
— Säulentemperatur: 265 °C
— Temperatur des Injektors: 280 °C
— Temperatur des Detektors: 300 °C
— Durchflußgeschwindigkeit des Trägergases: 0,6 ml/min.— Wasserstoffdruck: 84 kPa— Luftdruck: 155 kPa— Splitverhältnis: 10: 1 bis 50: 1. Das Splitverhältnis nach der Anlei-
tung des Herstellers optimieren und daraufhin die Linearität desDetektorsignals im interessierenden Konzentrationsbereich überprüfen.
Anmerkung 5: Es ist unbedingt darauf zu achten, daß die Infektions-
röhre regelmäßig gereinigt wird.
Menge der eingespritzten Substanz 1 µl TMSE-Lösung.Vor Beginn jeglicher Analysen warten, bis das System äquilibriert ist
und ein zufriedenstellend stabiles Response-Signal liefert.
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Diese Bedingungen können je nach Beschaffenheit der Säule und des
Gaschromatographen abgewandelt werden, damit Chromatogrammeentstehen, die den folgenden Anforderungen genügen:
— Der Sitosterin-Peak muß vom Lanosterin-Peak genügend abgesetzt
sein. Abbildung 1 zeigt ein typisches Chromatogramm, wie es ausder silylierten Testlösung zur Prüfung der Auflösung erhaltenwerden sollte (4.10).
— Die realtiven Retentionszeiten der folgenden Sterine sollten ungefähr
betragen:
Cholesterin 1,0
Stigmasterin: 1,3Sitosterin: 1,5Betulin: 2,5.
— Die Retentionszeit für Betulin sollte rund 24 Minuten betragen.
5.4.2. Analyseverfahren
1 µl der silylierten Standardlösung (Stigmasterin bzw. Sitosterin)
einspritzen und die Parameter für die Eichung des Integrators einstellen.
Nochmals 1 µl der silylierten Standardlösung einspritzen, um die
Response-Faktoren in bezug auf Betulin zu bestimmen.
1 µl der silylierten Probelösung einspritzen und Peakflächen messen.
Am Anfang und am Ende einer jeden gaschromatographischen Analysemuß die Standardlösung eingespritzt werden. Als Leitlinie sollte nach je6 Probelösungen die Standardlösung eingespritzt werden.
Anmerkung 6: Bei der Integration des Stigmasterin-Peaks ist auch das
durch die Punkte 1, 2 und 3 in Abbildung 2b markierte Tailing mit zuerfassen.
Bei der Integration des Sitosterin-Peaks ist die Fläche des Peaks von
22-Dihydro- β-Sitosterin (Stigmastanin), das unmittelbar nach Sitosterin
eluiert wird, mit zu erfassen, wenn das gesamte Sitosterin berechnetwerden soll.
6. BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
6.1. Die Fläche der Sterin-Peaks und der Betulin-Peaks für die zu Beginn
und am Ende eines Durchgangs eingespritzten Standardlösungenbestimmen und R
1berechnen:
R1=durchschnittliche Peakfläche von Sterin im Standard
durchschnittliche Peakfläche von Betulin im Standard
Fläche des Sterin-Peaks (Stigmasterin oder Sitosterin) und des Betulin-
Peaks in der Proble bestimmen und R2berechnen:
R2=Peakfläche von Sterin in der Probe
Peakfläche von Betulin in der Probe
W1= Steringehalt des Standards (mg) in 1 ml Standardlösung (4.8.1
oder 4.9.1).
W2= Gewicht der Probe (g) (5.2.1).
P = Reinheitsgrad des Standardsterins (4.8 oder 4.9).
Steringehalt der Probe (mg/kg) =R2
R1×W1
W2×P×1 0 .
7. GENAUIGKEIT DER METHODE
7.1. Wiederholbarkeit.
7.1.1. Stigmasterin.
Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von derselben Person mit
denselben Geräten am gleichen Testmaterial so rasch wie möglich nach-einander ausgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 19,3 mg/kgvoneinander abweichen.
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7.1.2. Sitosterin.
Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die von derselben Person mit
denselben Geräten am gleichen Testmaterial so rasch wie möglich nach-einander ausgeführt worden sind, dürfen um nicht mehr als 23,0 mg/kgvoneinander abweichen.
7.2. Vergleichbarkeit.
7.2.1. Stigmasterin.
Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die in verschiedenen Labors mit
verschiedenen Geräten am gleichen Testmaterial durchgeführt wordensind, dürfen um nicht mehr als 31,9 mg/kg voneinander abweichen.
7.2.2. Sitosterin.
Die Ergebnisse zweier Bestimmungen, die in verschiedenen Labors mit
verschiedenen Geräten am gleichen Testmaterial durchgeführt wordensind, dürfen um nicht mehr als 8,7 % des Durchschnitts der Bestim-mungen voneinander abweichen.
7.3. Quellen der Präzisionsdaten.
Die Präzisionsdaten stammen aus einem 1992 durchgeführten Versuch,
an dem 8 Labors beteiligt waren und bei dem 6 Proben (3 Blindproben)auf Stigmasterin und 6 Proben (3 Blindproben) auf Sitosterin untersuchtwurden.
8. TOLERANZGRENZEN
▼
M1
8.1. Zur Prüfung der richtigen Kennzeichnung des Erzeugnisses sind dem
gekennzeichneten Erzeugnis drei Proben zu entnehmen.
▼B
8.2. Stigmasterin.
8.2.1. Der Stigmasterinzusatz beträgt 150 g bei mindestens 95 % reinem
Stigmasterin je Tonne Butterfett, d. h. 142,5 mg/kg, bzw. 170 g beimindestens 85 % reinem Stigmasterin je Tonne Butterfett, d. h. 144,5mg/kg.
▼
M1
8.2.2. Die bei der Analyse der drei Proben des Erzeugnisses erzielten Ergeb-
nisse werden zur Kontrolle der Kennzeichnungsstoff-Beimischungsquoteund der Kennzeichnungsstoffreinheit verwendet, wobei das niedrigsteErgebnis mit folgenden Grenzwerten (kritische Differenz für einen95 %-Vertrauensbereich (CrD95-Wert)) verglichen wird:
— 116,0 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 95 % reinem
Stigmasterin),
— 118,0 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 85 % reinem
Stigmasterin),
— 81,0 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 95 % reinem
Stigmasterin),
— 82,0 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 85 % reinem
Stigmasterin).
Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem nied-
rigsten Ergebnis, das man durch Interpolierung zwischen 116,0 mg/kgund 81,0 mg/kg bzw. 118,0 mg/kg und 82,0 mg/kg erhält, verwendet.
▼
B
8.3. Sitosterin.
8.3.1. Der Zusatz von Sitosterin beträgt 600 g bei mindestens 90 % reinem
Sitosterin je Tonne Butter, d. h. 540 mg/kg.
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▼M1
8.3.2. Die bei der Analyse der drei Proben des Erzeugnisses erzielten Ergeb-
nisse werden zur Kontrolle der Kennzeichnungsstoff-Beimischungsquoteund der Kennzeichnungsstoffreinheit verwendet, wobei das niedrigsteErgebnis mit folgenden Grenzwerten (kritische Differenz für einen95 %-Vertrauensbereich (CrD95-Wert) verglichen wird:— 486,0 mg/kg (95 % der Beimischungsmindestquote bei 90 % reinem
Sitosterin),
— 358,0 mg/kg (70 % der Beimischungsmindestquote bei 90 % reinem
Sitosterin).
Es wird die Kennzeichnungsmittelkonzentration der Probe mit dem nied-rigsten Ergebnis, das man durch Interpolierung zwischen 486,0 mg/kgund 358,0 mg/kg erhält, verwendet.
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