1973L0046—DE—13.08.1998—003.001—1
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►B VIERTE RICHTLINIE DER KOMMISSION
vom 5. Dezember 1972
zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futter-
mitteln
(73/46/EWG)
(ABl.L83vom30.3.1973,S.21)
Geändert durch:
Amtsblatt
Nr. Seite Datum
►M1Richtlinie 81/680/EWGderKommissionvom30.Juli1981 L246 32 29.8.1981
►M2Richtlinie 92/89/EWGderKommissionvom3.November1992 L344 35 26.11.1992
►M3Richtlinie 98/54/EGderKommissionvom16.Juli1998 L208 49 24.7.1998
▼B
VIERTE RICHTLINIE DER KOMMISSION
vom 5. Dezember 1972
zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die
amtliche Untersuchung von Futtermitteln
(73/46/EWG)
DIEKOMMISSIONDEREUROPÄISCHENGEMEINSCHAFTEN—
gestütztaufdenVertragzurGründungderEuropäischenWirtschaftsge-
meinschaft,
gestütztaufdieRichtliniedesRatesvom20.Juli1970überdieEinfüh-
rung gemeinschaftlicher Probenahmeverfahren und Analysemethodenfür die amtliche Untersuchung von Futtermitteln(
1) in der Fassung der
Richtlinie vom20.Juli1972(2),insbesondereaufArtikel 2,
inErwägungnachstehenderGründe:
Die obengenannte Richtlinie bestimmt, daß die amtlichen Untersu-
chungen von Futtermitteln zur Feststellung, ob die auf Grund der
Rechts- oder Verwaltungsvorschriften festgelegten Anforderungenhinsichtlich Beschaffenheit und Zusammensetzung der Futtermittelerfüllt sind,nachgemeinschaftlichen Probenahmeverfahren undAnaly-semethoden durchgeführtwerden.
Die Richtlinien Nr. 71/250/EWG, Nr. 71/393/EWG und Nr. 72/199/
EWG der Kommission vom 15. Juni 1971(
3), vom 18. November
1971(4) und vom 27. April 1972(5) haben bereits eine Reihe von
Analysemethoden festgelegt. Der Stand der seitdem durchgeführtenArbeiten ermöglicht es nunmehr, eine vierte Serie von Analyseme-thodenfestzulegen.
Die in dieser Richtlinie vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der
Stellungnahme desStändigenFuttermittelausschusses —
HATFOLGENDERICHTLINIEERLASSEN:
Artikel 1
Die Mitgliedstaaten schreiben vor, daß die Analysen für die amtliche
UntersuchungvonFuttermitteln aufdenGehaltanFeuchtigkeit intier-ischen und pflanzlichen Fetten und Ölen sowie auf den Gehalt anMagnesium und Rohfaser in Futtermitteln nach den in Anlage I zudieserRichtlinie beschriebenen Methodendurchgeführtwerden.
Artikel 2
Die Mitgliedstaaten schreiben vor, daß die Analysen für die amtliche
Untersuchung von Futtermitteln auf ihren Gehalt an Retinol (VitaminA),►
M3 ◄nach den in Anlage II zu dieser Richtlinie
beschriebenen Methodendurchgeführt werden.
Artikel 3
DieMitgliedstaaten setzenspätestens zum1.Januar1974die erforder-
lichen Rechts- oder Verwaltungsvorschriften in Kraft, um den1973L0046—DE—13.08.1998—003.001—2
(1) ABl.Nr.L170vom3.8.1970,S.2.
(2) ABl.Nr.L171vom29.7.1972,S.39
(3) ABl.Nr.L155vom12.7.1971,S.13.
(4) ABl.Nr.L279vom20.12.1971,S.7.
(5) ABl.Nr.L123vom29.5.1972,S.6.▼M1
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▼M1
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Bestimmungen dieser Richtlinie nachzukommen. Sie setzen die
Kommissionunverzüglich hiervoninKenntnis.
Artikel 4
DieseRichtlinie istanalle Mitgliedstaaten gerichtet.1973L0046—DE—13.08.1998—003.001—3
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ANLAGE I
1.BESTIMMUNG VON FEUCHTIGKEIT IN TIERISCHEN UND
PFLANZLICHEN FETTEN UND ÖLEN
1.Zweck und Anwendungsbereich
Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Feuchtigkeit (Wasser
und andere flüchtige Bestandteile) und an flüchtigen Stoffen in tierischen
undpflanzlichen Fettenundölen.
2.Prinzip
DieProbewirdbei103ºCgetrocknet,biskeinGewichtsverlustmehreintritt.
DerGewichtsverlustwirdbestimmt.
3.Geräte
3.1. Schale mit flachem Boden, aus korrosionsbeständigem Material, Durch-
messer:8—9cm,Höheca.3cm
3.2. Quecksilber-Thermometer, mit verstärkter Kugel undAusdehnungsraum
am oberen Ende, von ca. 80 ºCbis mindestens 110 ºC graduiert, Länge
ca.10cm
3.3. Sandbadoderelektrische Heizplatte3.4. Exsikkator, dereinwirksamesTrocknungsmittel enthält3.5. Analysenwaage.
4.Ausführung
Etwa20gderhomogenisiertenProbewerdenauf1mggenauindietrockene
tarierte Schale(3.1),diedasThermometer (3.2)enthält, eingewogenundauf
demSandbadbzw.derHeizplatte(3.3)soerhitzt,daßbeistetigemUmrühren
mit dem Thermometer nach ca. 7 Min. eine Temperatur von 90 ºC erreicht
wird.
Entsprechend der Häufigkeit, mit der Gasblasen vom Boden der Schale
aufsteigen, wird die Heizintensität verringert. Die Temperatur darf 105 ºC
nicht überschreiten. Das Umrühren wird unter ständigem Abkratzen des
BodensderSchale biszumEndederBlasenbildung fortgesetzt.
Umsicherzustellen,daßdieFeuchtigkeitvölligentferntwird,istdasErhitzen
mehrmals bei103ºC±2ºCzuwiederholen, wobeimanzwischenaufeinan-
derfolgenden Erhitzungen auf 93 ºC abkühlen läßt. Dann läßt man bis zur
Raumtemperatur im Exsikkator (3.4) abkühlen und wägt. Dieses Verfahren
ist zu wiederholen, bis der Gewichtsverlust zwischen zwei aufeinanderfol-
gendenWägungen2mgnichtüberschreitet.
NB.:Eine Gewichtserhöhung der Probe nach wiederholter Erwärmung zeigt
eine Oxydation des Fettes an. Indiesem Fall legt man der Berechnung
das Ergebnis der Wägung zugrunde, die kurz vor dem Auftreten der
Gewichtszunahme ausgeführtwurde.
5.Berechnung der Ergebnisse
Der Gehalt an Feuchtigkeit der Probe in v. H. wird durch folgende Formel
wiedergegeben:
M
1/C0M2 ðÞ /C1100
M0
M0= GewichtderProbeing,
M1= GewichtderSchalemit InhaltingvordemErhitzen,
M2= GewichtderSchalemit InhaltingnachdemErhitzen.
Ergebnisseunter0,05v.H.solltenmitderBezeichnung„wenigerals0,05v.
H.“angegeben werden.
WiederholbarkeitDerUnterschiedzwischen2Parallelbestimmungendarfbeieinundderselben
Probe0,05v.H.absolutnichtüberschreiten.1973L0046—DE—13.08.1998—003.001—4
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2.BESTIMMUNG VON MAGNESIUM
—durchAtomabsorptions-Spektrophotometrie —
1.Zweck und Anwendungsbereich
Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an Magnesium in Futter-
mitteln. Sie eignet sich besonders zur Bestimmung von Magnesiumgehalten
unter5v.H.
2.Prinzip
DieProbewirdveraschtundinverdünnterSalzsäuregelöst.WenndieProbe
keine organischen Bestandteile enthält, wird sie unmittelbar in verdünnter
Salzsäure gelöst.DieLösungwirdverdünntundderMagnesiumgehalt durch
Atomabsorptions-Spektrophotometrie bei 285,2 nm im Vergleich zu Eichlö-
sungenbestimmt.
3.Reagenzien
3.1. Salzsäure p.a.,D:1,163.2. Salzsäure p.a.,D:1,193.3. Magnesiumbandoder-draht,oderMagnesiumsulfat(MgSO
4·7H2O)p.a.
vakuumgetrocknet beiRaumtemperatur
3.4. Strontiumsalzlösung (Chlorid oder Nitrat) 2,5 v. H. (G/V) Strontium
(=76,08gSrCl2·6H2Op.a./1oder60,38gSr(NO3)2p.a./1)
3.5. Magnesium-Standardlösung: 1 g Magnesium (3.3), das zuvor sorgfältig
von seinem Oxidfilm befreit wurde, oder eine entsprechende Menge
Magnesiumsulfat (3.3) wird auf 1 mg genau abgewogen und in einen
1000-ml-Meßkolben gebracht; dann werden 80 ml Salzsäure (3.1)
hinzugefügt, nach Auflösen des Magnesiums wird auf 1000 ml mit
Wasseraufgefüllt. 1mldieserLösungenthält 1,000mgMagnesium.
4.Geräte
4.1. VeraschungsschalenausPlatin,QuarzoderPorzellan4.2. Elektrischer Muffelofenmit Thermostat4.3. Atomabsorptions-Spektrophotometer.
5.Ausführung
5.1.Herstellungder Analysenlösung
5.1.1.Futtermittel, die ausschließlich aus anorganischen Bestandteilen
bestehen
5 g der Probe, auf ein mg genau gewogen, werden mit
250—300 ml Wasser in einen 500-ml-Meßkolben gebracht. Man
fügt 40 ml Salzsäure (3.1) hinzu und hält etwa 30 Min. in
leichtemSieden.NachdemAbkühlenwirdmitWasserzurMarke
aufgefüllt, gemischt und durch ein trockenes Faltenfilter in ein
trockenes Becherglas filtriert. Der erste Anteil des Filtrats von
etwa30mlwirdverworfen.
BeiAnwesenheitvonKieselsäurewerden5gderProbemiteiner
ausreichenden Menge (15—30 ml) Salzsäure (3.2) auf einem
Wasserbad zur Trockne eingedampft. Die weitere Behandlung
erfolgtwieunter5.1.2ab3.Satzbeschrieben.
5.1.2.Futtermittel, die überwiegend aus anorganischen Bestandteilen
bestehen
5 g der Probe, auf 1 mg genau gewogen, werden bei 550 ºC im
Muffelofen verascht, bis die Asche keine Kohleteilchen enthält.
Zur Abscheidung von Kieselsäure wird die Asche mit einer
ausreichenden Menge (15—30 ml) Salzsäure (3.2) versetzt und
auf dem Wasserbad zur Trockne eingedampft. Anschließend
erhitztman1Std.imTrockenschrankbei105ºC.DerRückstand
wird mit 10 ml Salzsäure (3.1) aufgenommen und mit heißem
Wasser in einen 500-ml-Meßkolben übergespült. Es wird kurz
aufgekochtundnachdemAbkühlenmitWasserzurMarkeaufge-
füllt, umgeschüttelt und durch ein trockenes Faltenfilter in ein
trockenes Becherglas filtriert. Der erste Anteil des Filtrats von
etwa30mlwirdverworfen.1973L0046—DE—13.08.1998—003.001—5
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5.1.3.Futtermittel, die überwiegend aus organischen Bestandteilen
bestehen
5gderProbewerdenauf1mggenauineine Veraschungsschale
eingewogen und bei 550 ºC im Muffelofen verascht, bis die
Asche keine Kohleteilchen enthält. Die Asche wird mit 5 ml
Salzsäure (3.2) übergossen und auf dem Wasserbad zur Trockne
eingedampft und hierauf 1 Std. bei 105 ºC in einem Trocken-
schrank getrocknet, um die Kieselsäure unlöslich zu machen.
Hierauf wird der Rückstand mit 5 ml Salzsäure (3.1) aufgen-
ommen und mit heißem Wasser in einen 250-ml-Meßkolben
übergespült,kurzaufgekochtundnachdemAbkühlenmitWasser
zur Marke aufgefüllt, gemischt und durch ein trockenes Falten-
filter in trockene Bechergläser filtriert. Der erste Anteil des
Filtratsvonetwa30mlwirdverworfen.
5.2.Messungder Atomabsorption
Aus der Magnesium-Standardlösung (3.5) werden durch Verdünnen mit
Wasser mindestens 5 Eichlösungen steigender Konzentrationen herge-
stellt, entsprechend dem optimalen Meßbereich des Atomabsorptions-
Spektrophotometers. Jeder Eichlösung werden 10 ml Strontiumsalzlö-
sung (3.4) zugesetzt, bevor mit Wasser zu einem Volumen von 100 ml
aufgefüllt wird.
Ein aliquoter Teil des nach 5.1.1, 5.1.2 oder 5.1.3 gewonnenen Filtrats
wird mit Wasser so verdünnt, daß man eine Magnesiumkonzentration
erhält, die im Konzentrationsbereich der Eichlösungen liegt. Die Salz-
säurekonzentration dieser Lösung darf 0,4 N nicht überschreiten. Vor
dem Auffüllen auf ein Volumen von 100 ml werden 10 ml Strontium-
salzlösung(3.4)hinzugefügt.
Die Messung der Atomabsorption erfolgt bei der Analysenlösung und
denEichlösungenbeieinerWellenlänge von285,2nm.
6.Berechnung der Ergebnisse
DerMagnesiumgehaltderProbeistmitHilfederEichlösungenzuberechnen.
DasErgebnisistinv.H.derProbeauszudrücken.
WiederholbarkeitDerUnterschiedzwischen2Parallelbestimmungendarfbeieinundderselben
Probe5v.H.relativ nichtüberschreiten.
3.BESTIMMUNG DER ROHFASER
1.Zweck und Anwendungsbereich
DieMethodeerlaubtdieBestimmungdesGehaltesansäure-undalkaliunlös-
lichen fettfreien organischen Bestandteilen in Futtermitteln, konventionell
ausgedrücktalsRohfaser.
2.Prinzip
Die Probe wird, falls erforderlich, entfettet und nacheinander mit siedender
Schwefelsäure und mit siedender Kalilauge definierter Konzentrationen
behandelt.DerRückstandwirddurchFiltrationübereingesintertesGlasfilter
abgetrennt, gewaschen, getrocknet, gewogen und bei einer Temperatur von
475 bis 500 ºC verascht. Der beim Veraschen auftretende Massenverlust
entspricht demRohfasergehalt derProbe.
3.Reagenzien
3.1. Schwefelsäure,c=0,13mol/l.
3.2. Antischaummittel (z.B.n-Octanol).3.3. Filtrationshilfsmittel: Celite 545, vier Stunden bei 500 ºC geglüht, oder
einäquivalentes Produkt(8.6).
3.4. Aceton.3.5. Petrolether, Siedebereich 40-60ºC.3.6. Salzsäure,c=0,5mol/l.
3.7. Kalilauge, c=0,23mol/l.1973L0046—DE—13.08.1998—003.001—6
▼M2
▼M2
4.Geräte
4.1. Heizeinrichtung für den Aufschluß mit Schwefelsäure oder Kalilauge,
ausgestattet mit einer Halterung für den Glasfiltertiegel (4.2) und mit
einem Abflußrohr mit Hahn für den Flüssigkeitsablauf, für den Vakuu-
manschlußund,sofernmöglich,auchfürdieZufuhrvonDruckluft.Vor
der täglichen Benutzung muß die gesamte Apparatur mit Wasser 5 min
aufBetriebstemperatur erhitzt werden.
4.2. Glasfiltertiegel, mit eingeschmolzenem gesintertem Glasfilter, Poren-
weite 40-90 µm. Vor dem erstmaligen Gebrauch wird der Tiegel einigeMinutenbei500ºCgeglühtunddannabkühlen gelassen(8.6).
4.3. Siedezylinder (mindestens270ml)miteinem Rückflußkühler.4.4. Trockenschrank mit Thermostat.4.5. Muffelofenmit Thermostat.4.6. Extraktionseinrichtung, ausgestattet mit einer Halterung für den Glasfil-
tertiegel (4.2) und mit einem Abflußrohr mit Hahn für den
FlüssigkeitsablaufundfürdenVakuumanschluß.
4.7. VerbindungsringezurVerbindungvonHeizeinrichtung(4.1),Filtertiegel
(4.2) und Siedezylinder (4.3), Verbindungsringe zur Verbindung von
Extraktionseinrichtung (4.6)undFiltertiegel.
5.Ausführung
1 g der Probe wird auf 0,001 g genau in einen Glasfiltertiegel (4.2) einge-
wogen (vgl. Bemerkungen 8.1, 8.2, 8.3), und es wird 1 g
Filtrationshilfsmittel (3.3)hinzugefügt.
DerGlasfiltertiegel(4.2)wirdindieHeizeinrichtung(4.1)eingesetztundmit
dem Siedezylinder (4.3) verbunden. 150 ml auf Siedetemperatur erhitzte
Schwefelsäure (3.1) werden in den mit dem Tiegel verbundenen Siedezy-
linder überführt, und es werden erforderlichenfalls einige Tropfen
Antischaummittel (3.2) hinzugefügt. Die Flüssigkeit wird innerhalb von5 ± 2 min zum Sieden erhitzt und genau 30 min im kräftigen Sieden
gehalten.
DerHahninderAbflußleitung(4.1)wirdgeöffnetunddieSchwefelsäuremit
Hilfe von Vakuum durch den Glasfiltertiegel abgesaugt. Der Filterrückstand
wird unter Verwendung von Vakuum dreimal mit je 30 ml kochendem
Wasser gewaschen. Nach jedem Waschvorgang wird der Filtertiegel mit
Rückstandtrockengesaugt.
DerAuslaufhahnwirdgeschlossen,undeswerden150mlsiedendeKalilauge
(3.7) und einige Tropfen Antischaummittel (3.2) in den Siedezylinder (4.3)
gegeben. Die Flüssigkeit wird innerhalb von 5 ± 2 min zum Sieden erhitzt
und genau 30 min im kräftigen Sieden gehalten. Die Filtration und das
Waschen des Rückstandes werden in der gleichen Weise durchgeführt wie
nachderBehandlungmit Schwefelsäure.
Nach dem letzten Waschen wird der Rückstand trocken gesaugt und der
Tiegel mit Inhalt an die Extraktionseinrichtung (4.6) angeschlossen. Unter
Anlegen von Vakuum wird der Rückstand dreimal mit je 25 ml Aceton
(3.4) gewaschen, wobei der Rückstand nach jedem Waschvorgang trocken
gesaugtwird.
DerFiltertiegel mitInhaltwirdimTrockenschrankbei130ºCgetrocknet, in
einem Exsiccator abgekühlt und schnell gewogen. Danach wird der Filter-
tiegel mit Inhalt in einen Muffelofen gebracht, und es wird mindestens
30 min bei einer Temperatur von 475 bis 500 ºC bis zur Massekonstanz
verascht.
Nach dem Veraschen wird der Tiegel zunächst im Muffelofen und dann im
Exsiccator abgekühlt undanschließend gewogen.
Es wird ein Blindversuch ohne Probe durchgeführt. Der beim Veraschen
auftretende Masseverlustdarf4mgnichtüberschreiten.
6.Berechnung der Ergebnisse
Der Rohfasergehalt in Prozenten der Probe wird mit folgender Formel
berechnet:1973L0046—DE—13.08.1998—003.001—7
▼M2
b/C0c ðÞ /C2100
a
Hierinbedeuten:
a = MassederAnalysenprobeing,
b = MassenverlustingnachdemVeraschenbeimHauptversuch,c = MassenverlustingnachdemVeraschenbeimBlindversuch.
7.Wiederholbarkeit
Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen, die auf der gleichen
Probedurchgeführtwerden,darfnichtüberschreiten:
— 0,3absolutbeieinem Rohfasergehalt vonweniger als10%.
— 3%relativ vomWertdeshöherenErgebnissesbeieinem Rohfasergehalt
von10%undmehr.
8.Bemerkungen
8.1. Futtermittel, welche mehr als 10 % Fett enthalten, müssen vor der
BestimmungmitPetrolether(3.5)entfettet werden.DazuwirdderGlas-
filtertiegel (4.2) mit Inhalt an die Extraktionseinrichtung (4.6)
angeschlossen und unter Anlegen von Vakuum dreimal mit je 30 ml
Petroleumbenzin gewaschen. Anschließend wird die Probe trocken
gesaugt und der Tiegel mit Inhalt an die Heizeinrichtung (4.1) ange-
schlossen.Danachist,wieunterZiffer5beschrieben, fortzufahren.
8.2. Futtermittel,dieFettenthalten,welchesnichtdirektmitPetrolether(3.5)
extrahiert werden kann, müssen, wie unter 8.1 angegeben, entfettet
werden und nach dem Kochen mit Säure ein weiteres Mal entfettet
werden.
Nach dem Kochen mit Säure und dem anschließenden Waschvorgang
wird der Tiegel mit Inhalt an die Extraktionseinrichtung (4.6) ange-
schlossen unddreimal mit je 30 mlAceton unddanach weitere dreimal
mit je 30 ml Petroleumbenzin entfettet. Der Filtertiegel (4.2) wird
trockengesaugtunddieAnalyse,wieunterZiffer5beschrieben,fortge-
setzt, beginnendmit derBehandlungdurchKalilauge.
8.3. BeiFuttermitteln,diemehrals5%Carbonat,berechnetalsCalciumcar-
bonat enthalten, wird der Tiegel (4.2) mit der eingewogenen
Probemenge an die Heizeinrichtung (4.1) angeschlossen. Die Probe
wirddreimalmitje30mlSalzsäure(3.6)behandelt.NachjederZugabe
läßtmandieProbevordemAbsaugenetwa1minstehen.Anschließend
wird einmal mit 30 ml Wasser gewaschen. Danach ist, wie unter Ziffer
5angegeben, fortzufahren.
8.4. Wenn ein Gerät benutzt wird, bei dem mehrere Glasfiltertiegel an
derselben Heizeinrichtung gleichzeitig befestigt werden, dürfen zwei
Einzelbestimmungen derselben Probe nicht in derselben Serie durchge-
führtwerden.
8.5. Wenn nach dem Sieden mit Säure bzw. Lauge Schwierigkeiten bei der
Filtration eintreten, wird Druckluft durch das Auslaßrohr der Heizein-
richtung zugeführtundanschließend dieFiltration fortgesetzt.
8.6. Die Veraschungstemperatur soll 500 ºC nicht überschreiten, um die
Haltbarkeitsdauer der Glasfiltertiegel zu verlängern. Beim Erhitzen und
Abkühlensindvorallem übermäßige Temperatursprünge zuvermeiden.1973L0046—DE—13.08.1998—003.001—8
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ANLAGE II
1.BESTIMMUNG VON RETINOL (VITAMIN A)
1.Zweck und Anwendungsbereich
DieMethodeerlaubtdieBestimmungvonRentinol(VitaminA)inFuttermit-
teln, Konzentraten und Vormischungen. Die untere Grenze der
Bestimmbarkeit beträgt 10000 IE/kg für stark pigmentierte Futtermittel und
4000IE/kgfüralleanderenProdukte(1).JenachdemzuerwartendenGehalt
anRetinol sinddieErzeugnisseinzweiGruppenzuunterteilen:
Gruppe A:Gehalte vonwenigerals200000IE/kg,
Gruppe B:Gehalte von200000IE/kgundmehr.
2.Prinzip
Die Probe wird in Gegenwart eines Antioxidans oder unter Stickstoff-
Atmosphäre mit einer Kaliumhydroxidlösung unter Zusatz von Äthanol heiß
hydrolysiert. Die Mischungwirdmit 1,2-Dichloräthan extrahiert, der Extrakt
wird zur Trockne eingedampft und mit Petroläther aufgenommen. Die
LösungwirdübereineAluminiumoxid-Säulechromatographiert (beiErzeug-
nissen der Gruppe B wird nur in bestimmten Fällen chromatographiert). Die
BestimmungvonRetinolerfolgtbeiErzeugnissenderGruppeAdurchphoto-
metrische Auswertungbei 610 nm nach Entwicklung eines Farbkomplexes
gemäß der Carr-Price-Reaktion, bei Erzeugnissen der Gruppe B durch UV-
spektrophotometrische Auswertungbei325nm.
3.Reagenzien
a)zur Analyse von Erzeugnissen der Gruppe A und B
3.1. Äthanol,96v.H.(V/V)3.2. Natriumascorbatlösung 10v.H.(G/V)p.a.oder3.3. Stickstoff,gereinigt3.4. Kaliumhydroxidlösung50v.H.(G/V)p.a.
3.5. 1NKaliumhydroxidlösung
3.6. 0,5NKaliumhydroxidlösung3.7. 1,2-Dichloräthan p.a.3.8. Petroläther,reinst,Siedeintervall30—50ºC.Wennerforderlich,wie
folgt reinigen: 1000 ml Petroläther werden mit 20-ml-Portionen
konzentrierter Schwefelsäure so lange geschüttelt, bis letztere
farblos bleibt. Dann wird die Säure entfernt und der Petroläther
einmal mit 500 ml Wasser, zweimal mit 250 ml einer 10 v.H.
Natriumhydroxidlösungunddreimalmitje500mlWassernachein-
andergewaschen.MantrenntvonderwäßrigenSchichtab,trocknet
während ca. 1 Std. über Aktivkohle und wasserfreiem Natrium-
sulfat,filtriert unddestilliert.
3.9. Aluminiumoxid zur Chromatographie, standardisiert nach Brock-
mann. Es wird 8 Std. lang bei 750 ºC erhitzt, im Exsikkator
abgekühlt und in braunen Schliffflaschen aufbewahrt. Vor der
weiteren Verwendung zur Chromatographie wird wie folgt ange-
feuchtet: 10 g Aluminiumoxid und 0,7 ml Wasser werden in eine
braune Flasche gegeben, die Flasche wird hermetisch geschlossen,
5 Min. lang im siedenden Wasserbad kräftig geschüttelt und
abkühlen gelassen. Die Aktivität desvorbereiteten Aluminiumoxids
wird durch Analyse einer bekannten Menge (500 IE) Retinol nach
5.3und5.4überprüft.
3.10. Aluminiumoxid basisch,Aktivität I
3.11. Diäthyläther, reinst. Zur Entfernung von Peroxiden und Wasser-
spuren auf einer basischen Aluminiumoxid-Säule (3.10) gereinigt
(25gAluminiumoxid füretwa250mlDiäthyläther)
3.12. Petroläthermischungen (3.8) mit 4, 8, 12, 16 und 20 v.H. (V/V)-
Diäthyläther (3.11)1973L0046—DE—13.08.1998—003.001—9
(1) 1IE=0,3µgRetinol.
▼B
3.13. Natriumsulfidlösung,ausNatriumsulfidp.a.,0,5Molin70v.H.(V/
V)Glycerin
b)nur zur Analyse von Erzeugnissen der Gruppe A
3.14. Benzolp.a.,kristallisierbar
3.15. Chloroformp.a.ZurEntfernungvonÄthanol,PhosgenundWasser-
spuren wird auf einer basischen Aluminiumoxid-Säule (3.10)
gereinigt (50 g Aluminiumoxid für etwa 200 ml Chloroform; es
empfiehlt sich, die ersten 50 ml des Eluats nochmals über dieselbe
Säulezureinigen)
3.16. Carr-Price-Reagenz: ca. 25 g Antimontrichlorid p.a. (im Exsikkator
aufbewahrt)werdenmit100mlChloroform(3.15)biszurSättigung
der Lösung geschüttelt. Ein kleiner Bodensatz von Antimontrich-
lorid-Kristallen stört nicht. 2 ml Essigsäureanhydrid p.a. werden
hinzugegeben und das Reagenz in brauner Schliffstopfenflasche im
Eisschrankaufbewahrt.Esistmehrere Wochenhaltbar.
3.17. Retinol-Standard, spektrophotometrisch geprüft
c)nur zur Analyse von Erzeugnissen der Gruppe B
3.18. Isopropanol,zurChromatographie.
4.Geräte
4.1. Wasserbad
4.2. Vakuum-Rotations-Verdampfer mit Rundkolben von verschiedenem
Inhalt
4.3. Chromatographieröhre aus Glas (Länge: 300 mm, innerer Durchmesser:
ca.13mm)
4.4. Spektralphotometer mit Küvetten von 10 mm Schichtdicke (aus Quarz
fürdieMessungimUV-Bereich)
4.5. UV-Lampe,365nm.
5.Ausführung
NB.:AlleArbeiten werdenbeigedämpftem Tageslicht, gegebenenfalls unter
VerwendungvonbraunenGlasgefäßen,durchgeführt.
5.1.Einwaage
Je nach dem vermuteten Gehalt an Retinol wird eine Menge der fein
zerkleinerten Probe wie folgt eingewogen: bei Konzentraten (Gehalte
über 20000 IE/g): 0,1bis 1,0 g; bei Vormischungen (Gehalte zwischen
400und20000IE/g):3,0bis5,0g;
beiMineralmischungen: 10bis20g;
beiErzeugnissenderGruppeA:30g.
DieEinwaagewirdsofortineinen500-ml-Rundschliffkolbenumgefüllt.
5.2.Hydrolyse und Extraktion (1)
40 ml Äthanol (3.1), 2 ml Natriumascorbatlösung (3.2)(2), 10 ml Kali-
umhydroxidlösung (3.4) und 2 ml Natriumsulfidlösung (3.13) werden
nacheinander dereingewogenen Probezugegeben.
Die Mischung wird bei 70—80 ºC 30 Min. lang am Rückflußkühler
erhitzt und anschließend unter fließendem Wasser abgekühlt. Darauf
werden 50 ml Äthanol (3.1) und exakt mit einer Pipette 100 ml 1,2-
Dichloräthan (3.7)zugegeben.DieMischungwirdkräftigdurchgeschüt-teltunddieüberstehendeFlüssigkeitineinenScheidetrichter dekantiert.
Man gibt 150 ml Kaliumhydroxidlösung (3.5) zu, schüttelt während
10 Sek. und wartet die Schichtentrennung ab. Die Dichloräthanphase
(Unterschicht) wirdineinenScheidetrichter abgelassen,mangibt40ml
Kaliumhydroxidlösung (3.6) zu, schüttelt während 10 Sek. und wartet
dieSchichtentrennungab.DieDichloräthanphasewirdineinenScheide-
trichter abgelassen und dann 6- bis 8mal mit 40-ml-Portionen Wasser
bis zur Alkalifreiheit (Phenolphthaleinprobe) gewaschen. Die Dichlorä-1973L0046—DE—13.08.1998—003.001—10
(1) Bei Milchaustauschfutter oder bei anderen zur Klumpenbildung oder Quellung
neigenden Erzeugnissen sind die unter 5.2 erster und zweiter Absatz aufgeführtenReagenzienmengen zuverdoppeln.
(
2) Der Zusatz von Natriumascorbat kann unterbleiben, wenn die Hydrolyse unter Stick-
stoff-Atmosphäreerfolgt.
▼B
thanphase wirdaufgefangen und die Wasserspurenwerdenmit Filterpa-
pierschnitzeln entfernt.
Ein aliquoter Teil derDichloräthanlösung wirdbei40ºCWassertempe-
ratur im Vakuum zur Trockne eingeengt und der Rückstand schnell in
5mlPetroläther (3.8)aufgenommen.
Bei Erzeugnissen der Gruppe A wird, wie unter 5.3.1 angegeben, chro-
matographiert.
Bei Erzeugnissen der Gruppe B wird die Lösung in einen 50-ml-
Meßkolben gegeben, mit Petroläther (3.8) zur Marke aufgefüllt und
gemischt. Dann wird die Extinktion wie unter 5.4.2 angegeben
gemessen.
5.3.Chromatographie
5.3.1.Erzeugnisse der Gruppe A
Ein Chromatographierohr (4.3) wird bis zu einer Höhe von
200 mm mit Aluminiumoxid (3.9), welches mit Petroläther (3.8)
befeuchtet wurde, gefüllt. Die unter 5.2 erhaltene Lösung wird
auf die Säule gegeben, dann werden sofort 20 ml Petroläther
(3.8) hinzugefügt. Anschließend wird das Chromatogramm nach-
einandermitje10-ml-PortionenderPetroläthermischungenmit4,
8, 12, 16 und 20 v.H. Diäthyläther (3.12), unter schwachem
Vakuum oder auch Überdruck eluiert. Die Tropfgeschwindigkeit
wirdauf2bis3Tropfen/Sek. einreguliert.
Die Carotin-Fraktion wird im Durchlaufchromatogramm zuerst
erhalten(1). Die Retinol-Fraktion steigt im allgemeinen mit der
20 v.H. Diäthyläther-Petroläthermischung (3.12) ab. Die Elution
wird im UV-Licht (kurzes Beleuchten mit einer Hg-Lampe)
kontrolliert. Der fluoreszierende Retinol-Horizont trennt sich
dabei deutlich von den nachfolgenden gelb gefärbten Xantho-
phyllbändern. Die Retinol-Fraktion des Eluats wird in einer
Vorlageaufgefangen.
5.3.2.Erzeugnisse der Gruppe B
Die Chromatographie muß nur durchgeführt werden, wenn die
Messungen der unter 5.4.2 erwähnten Extinktion nicht nach
5.4.2vorschriftsmäßig sind.
Wenn die Chromatographie erforderlich ist, wird ein aliquoter
Teil der unter 5.2 erhaltenen Petrolätherlösung, der etwa 500 IE
Retinol enthält, auf die Chromatographiesäule gegeben. Die
Chromatographie wirdwieunter5.3.1beschrieben fortgeführt.
5.4.Messungder Extinktion
5.4.1.Erzeugnisse der Gruppe A
Das unter 5.3.1 erhaltene Retinol-Eluat wird im Vakuum zur
Trockne eingeengt und in 2 ml Benzol (3.14) aufgenommen.
0,3 ml davon werden mit 3 ml Carr-Price-Reagenz (3.16)
versetzt. Es entwickelt sich eine blaue Färbung, deren Extinktion
im Spektralphotometer bei 610 nm, genau 30 Sek. nach Reakti-
onsbeginn, gemessen wird. Die Berechnung des Vitamin-A-
Gehalts erfolgt über eine Eichkurve, die mit Benzollösungen von
Retinol-StandardinsteigendenKonzentrationenunterZugabevon
Carr-Price-Reagenz (2 bis 16) IE Retinol-Standard (3.17) pro
0,3mlBenzol(3.14)+3mlCarr-Price-Reagenz(3.16)aufgestellt
wird. Die Eichkurve ist mit dem Standard und dem frisch
bereiteten Carr-Price-Reagenz regelmäßig und in kurzen Zeit-abständen zuüberprüfen.
5.4.2.Erzeugnisse der Gruppe B
Ein aliquoter Teil der unter 5.2 erhaltenen Petrolätherlösung, der
etwa200IERetinolenthält,wirdimVakuumzurTrockneeinge-
engt und in 25 ml Isopropanol (3.18) aufgenommen. Die
Extinktion wirdimSpektralphotometer bei 325,310und334nm
gemessen. Das Absorptionsmaximum liegt bei 325 nm. Der
Retinol-Gehalt derLösungberechnet sichaus:1973L0046—DE—13.08.1998—003.001—11
(1) Der Carotingehalt kann durch Extinktionsermittlung bei 450 nm bestimmt werden
E1%
1cm¼2600 :
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E325·18,30=IERetinol/ml
DasVerhältnisderExtinktionen
E310:E325undE334:E325
mußjedoch denWert6:7=0,857erreichen.
WeichteinesdieserVerhältnissestärkerab(<0,830oder>0,880),
muß der Messung der Extinktionen eine Chromatographie nach
demVerfahren5.3.2vorausgehen.
ZeigtdienachderChromatographievorgenommeneMessungder
Extinktionenan,daßdieobengenanntenVerhältnisseimmernoch
vomWert0,857stärkerabweichen(<0,830oder>0,880),dannist
die Bestimmung nach dem für die Erzeugnisse der Gruppe A
vorgeschriebenen Verfahrendurchzuführen.
6.Berechnung der Ergebnisse
Der Gehalt an Retinol der Probe wird unter Berücksichtigung des Gewichts
der Einwaage und der Verdünnungsverhältnisse im Analysengang berechnet.
DieErgebnissewerdeninIERetinolprokgausgedrückt.
Wiederholbarkeit
Der Unterschied zwischen zwei Parallelbestimmungen darf bei ein und
derselben Probe
— beiGehalten vonweniger als75000IE/kg20v.H.relativ,
— beiGehalten von75000bis150000IE/kg15000IEabsolut,
— beiGehalten von150000bis250000IE/kg10v.H.relativ,
— beiGehalten von250000bis500000IE/kg25000IEabsolut,— beiGehalten vonmehrals500000IE/kg5v.H.relativ
nichtüberschreiten.1973L0046—DE—13.08.1998—003.001—12
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