Patent EP-4264282-A1 (EP)
Inventor: RUGGERI ZAVERIO M
IPC: G01N33/86
Filed: 2021-11-03
Abstract: La présente invention concerne une méthode d'évaluation du risque de maladies thrombotiques et hémorragiques liées à des processus de coagulation sanguine. En particulier, la présente invention concerne une méthode ex vivo d'analyse de la fonction de coagulation d'un échantillon sanguin d'un sujet, comprenant les étapes consistant : a) à utiliser un échantillon de sang total prélevé d'un sujet où est ajoutée une substance anticoagulante; b) à traiter l'échantillon sanguin de l'étape a) par une solution constituée de sondes fluorescentes, pour marquer des plaquettes et la fibrine susceptible de lier plus ou moins spécifiquement les plaquettes à la fibrine et émettant de la lumière fluorescente à deux fréquences différentes d'émission, et par une solution de récalcification de l'échantillon sanguin, les deux solutions susmentionnées étant distinctes ou combinées en un seul réactif; c) à introduire ledit échantillon sanguin recalcifié dans un dispositif analytique comportant au moins une chambre de perfusion, dans laquelle au moins une paroi est constituée d'une matière transparente contenant une substance cythoadhésive et sur laquelle il existe des marques de référence conçues pour identifier la hauteur à laquelle la surface sur laquelle va se produire le phénomène d'adhésion des plaquettes et de la fibrine, l'échantillon sanguin étant amené à s'écouler dans la chambre de perfusion dans des conditions connues et mesurables d'écoulement; d) lors de l'écoulement sanguin dans la chambre de perfusion, à acquérir alternativement au moins deux séries d'images fluorescentes, afin qu'au moins l'une d'entre elles soit acquise à une longueur d'onde d'émission caractéristique de la sonde fluorescente pour les plaquettes, tandis qu'au moins une autre série d'images fluorescentes est acquise à une autre longueur d'onde d'émission caractéristique des images acquises de la sonde fluorescente pour la fibrine; e) à binariser les pixels des images acquises pour les plaquettes et pour la fibrine, afin de générer une première courbe d'aire couverte par des pixels éclairés en fonction du temps (t) pour la formation d'un agrégat de plaquettes et une seconde courbe d'aire couverte de pixels éclairés en fonction du temps pour la formation de fibrine; f) à générer une première courbe d'intensité moyenne de fluorescence en fonction du temps pour la formation de l'agrégat de plaquettes et une seconde courbe d'intensité moyenne de fluorescence en fonction du temps pour la formation de fibrine; la méthode comprenant au moins l'une des étapes suivantes, consistant : g) à générer une première courbe de densités intégrées, définie comme le produit de l'aire et de l'intensité de fluorescence en fonction du temps pour la formation de l'agrégat de plaquettes, et une seconde courbe de densités intégrées, définie comme le produit de l'aire et de l'intensité de fluorescence en fonction du temps pour la formation de fibrine; h) à générer une courbe de nombre de particules en fonction du temps, le nombre de particules dérivant du nombre d'agrégats de plaquettes constitué de plus de 2 pixels éclairés; i) à générer une courbe de tailles de particules en fonction du temps, la taille de particules dérivant de la taille moyenne des agrégats de plaquettes constitués de plus de 2 pixels éclairés; j) à générer des valeurs de pente maximale, définies en tant que points maximaux relatifs de la première fonction dérivée calculée pour les courbes du paramètre obtenu lors d'une ou de plusieurs étapes e), f), g), h) et i); k) à générer des valeurs d'accélération maximale, définies comme les points relatifs de maximums de la seconde fonction dérivée calculés pour les courbes du paramètre obtenu à une ou plusieurs des étapes e), f), g), h) et i); l) à générer des valeurs de rapport F/P, défini comme le rapport des SSC de fibrine aux SSC des plaquettes du paramètre obtenu à au moins l'une des étapes e), f) et g); la méthode comprenant en outre les étapes consistant : m) à générer une valeur de temps de retard représentant le temps de formation de fibrine, défini comme le temps correspondant à la première occurrence de cinq images consécutives où la valeur de l'aire mesurée liée à la fibrine dépasse 1 % de la valeur maximale de la courbe; n) à générer les valeurs de SSC (surface sous la courbe) dérivant de l'aire sous la courbe du paramètre obtenu lors d'au moins l'une des étapes e), f), g), h) et i).