Patent ES-2655509-T3 (ES)
Title: Método para la cuantificación relativa de la secuencia, la expresión o los cambios de copias de ácidos nucleicos, usando reacciones combinadas de polimerasa, ligadura y nucleasa
Inventor: BARANY FRANCIS
IPC: C12Q1/68
Filed: 2013-02-14
Granted: 2018-02-20
Abstract: Un método de identificación de la presencia de una o más secuencias de nucleótidos diana en una muestra, que comprende: proporcionar una muestra que contiene potencialmente la una o más secuencias de nucleótidos diana; proporcionar uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótidos, comprendiendo cada conjunto (a) una primera sonda de oligonucleótidos que tiene una porción 5' específica de cebador y una porción específica de la diana, y (b) una segunda sonda de oligonucleótidos que tiene una porción 3' específica de cebador, una porción específica de la diana y una secuencia de nucleótidos 5', en donde dicha secuencia de nucleótidos 5' es complementaria a al menos una porción de la porción 3' específica de cebador y se hibrida con dicha porción complementaria de la porción 3' específica de cebador para formar una segunda sonda de oligonucleótidos horquillada cuando dicha segunda sonda no se hibrida con una secuencia de nucleótidos diana, en donde las sondas de oligonucleótidos primera y segunda de un conjunto de sondas se configuran para que se hibriden adyacentes entre sí en la secuencia de nucleótidos diana con una unión entre las sondas de oligonucleótidos primera y segunda y, en donde, en un conjunto de sondas, la porción específica de la diana de la segunda sonda de oligonucleótidos tiene un nucleótido idéntico de solapamiento en la unión con la primera sonda de oligonucleótidos; poner en contacto la muestra y el uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótidos en condiciones eficaces para que las sondas de oligonucleótidos primera y segunda de un conjunto de sondas se hibriden en posiciones adyacentes de una manera específica de base con sus secuencias de nucleótidos diana correspondientes, si están presentes en la muestra, en donde tras la hibridación el nucleótido idéntico de solapamiento de la segunda sonda de oligonucleótidos forma una aleta en la unión que comprende el nucleótido idéntico de solapamiento; escindir el nucleótido idéntico de solapamiento de la segunda sonda de oligonucleótidos con una enzima que tiene actividad nucleasa 5', liberando de este modo un fosfato en el extremo 5' de la segunda sonda de oligonucleótidos; ligar las sondas de oligonucleótidos primera y segunda del uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótidos juntas en la unión para formar secuencias producto ligadas, en donde cada secuencia producto ligada comprende la porción específica de cebador 5', las porciones específicas de la diana y las porciones específicas de cebador 3' de las sondas de oligonucleótidos primera y segunda de un conjunto de sondas de oligonucleótidos; detectar las secuencias producto ligadas en la muestra; e identificar la presencia de una o más secuencias de nucleótidos diana en la muestra basándose en dicha detección, opcionalmente en donde la muestra se selecciona entre el grupo que consiste en tejido, células, suero, sangre, plasma, líquido amniótico, esputo, orina, fluidos corporales, secreciones corporales, excreciones corporales, ácidos nucleicos circulantes sin células, ácidos nucleicos fetales sin células circulantes en la mujer embarazada, células tumorales circulantes, tumor, biopsia del tumor y exosomas.