Patent RU-2620953-C2 (RU)
Inventor: TSEN Chin-Pin
IPC: C40B30/04
Filed: 2012-05-18
Granted: 2017-05-30
Abstract: Изобретение относится к биохимии. Изобретение обеспечивает способ селективной амплификации одной или нескольких целевых бактериальных ДНК в образце, включающий: гибридизацию множества гибридизационных зондов, выбранных из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6, с указанной целевой микробной ДНК, где каждый из указанных гибридизационных зондов содержит 5'-концевой участок, имеющий последовательность небактериальной ДНК, выбранную из вирусной последовательности или искусственно сконструированной последовательности, и 3'-концевой участок, имеющий последовательность, комплементарную участку последовательности гена бактериальной 16S rRNA; удаление негибридизированных гибридизационных зондов и любого несвязанного 3'-концевого участка целевой бактериальной ДНК; удлинение 3'-концов гибридизационных зондов и целевой бактериальной ДНК с образованием двухцепочечных удлиненных с помощью праймера матриц. Затем проводят ПЦР для селективного амплифицирования удлиненных с помощью праймера матриц при помощи набора праймеров, который включает по меньшей мере один праймер, имеющий небактериальную последовательность, комплементарную небактериальной последовательности гибридизационных зондов. Также обеспечивается способ детекции бактериальной инфекции у субъекта, включающий: добавление множества гибридизационных зондов, выбранных из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6, в образец субъекта, где каждый из указанных гибридизационных зондов содержит 5'-концевой участок, имеющий последовательность небактериальной ДНК, выбранную из вирусной последовательности или искусственно сконструированной последовательности, 3'-концевой участок, имеющий последовательность, комплементарную участку последовательности гена бактериальной 16S rRNA; гибридизацию гибридизационных зондов с бактериальной ДНК в образце; удаление негибридизированных гибридизационных зондов и любого несвязанного 3'-концевого участка бактериальной ДНК; удлинение 3'-концов гибридизационных зондов и бактериальной ДНК с образованием двухцепочечных удлиненных с помощью праймера матриц; амплифицирование удлиненных с помощью праймера матриц путем проведения способа ПЦР при помощи набора праймеров, который включает по меньшей мере один прямой праймер, имеющий небактериальную последовательность, комплементарную небактериальной последовательности гибридизационного зонда; и анализирование амплифицированных ПЦР-продуктов для определения присутствия или отсутствия бактерии. Также описан гибридизационный зонд для создания удлиненной с помощью праймера ДНК-матрицы из целевой бактериальной ДНК в образце для селективной амплификации с помощью способа ПЦР, при этом указанный гибридизационный зонд содержит: 5'-концевой участок, имеющий небактериальную последовательность, выбранную из вирусной последовательности и искусственно сконструированной последовательности; и 3'-концевой участок, имеющий последовательность, комплементарную участку последовательности гена бактериальной 16S rRNA, где указанный гибридизационный зонд выбран из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6. Описан набор, содержащий множество таких зондов. Способы настоящего изобретения основаны на новом подходе, согласно которому метят 5'-конец целевых ДНК-матриц небактериальной меченой последовательностью для того, чтобы отличить матрицы от эндогенных контаминирующих веществ, присутствующих в реактивах для ПЦР. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 1 пр.