Patent KR-0184235-B1 (KR)
Inventor: GESNER THOMAS G
IPC: C12N15/09
Filed: 1990-08-07
Granted: 1999-04-01
Abstract: 본 발명의 한 측면에 따르면 본 발명은 실질적으로 사람의 다른 단백질과는 유리된 신규의 인간 거핵구 형성 인자(meg-CSF)를 제공한다. 이 단백질은 재조합 유전 공학 기술에 의해 제조될 수 있다. 또한 자연적으로 또는 다른 인자 유도하에 이 인자를 생산하는 세포 원료로부터 정제될 수도 있다. 또한 meg-CSF는 화학적 기술 또는 상기한 기술들의 조합에 의해 합성될 수 있다. 
     본 발명의 meg-CSF는 쥐의 골수 표적세포를 사용한 검정에서 중간 및 큰 크기의 거핵구로 구성된 콜로니의 성장 및 발달을 자극하는 것으로 밝혀졌다. meg-CSF는 상기 검정에서 단백질 1밀리그램당 5×10 7 희석 단위 이상인 생물학적 활성을 나타낸다. meg-CSF는 하기의 실시예 8에 기술한 바와 같이 인체 세포를 사용한 검정에서도 활성을 나타낸다. 
     활성 meg-CSF는 비환원 조건하에서 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정한 겉보기 분자량이 약 28∼38kd이다. meg-CSF는 환원 조건하에서 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정한 겉보기 분자량이 20∼27kd이다. 
     약 28∼38kd의 활성 meg-CSF는 하기의 표 1∼4의 서열을 모두 또는 일부를 함유함을 특징으로 한다. 또한, 하기의 (a)∼(d)에 언급한 동일하거나 대체적으로 동일한 4개의 아미노산 서열 또는 그의 단편 중 하나 이상을 함유함을 특징으로 한다. 
     본 발명의 또 다른 측면은 인간 meg-CSF 단백질의 발현을 코딩하는 DNA 서열이다. 이 DNA 서열은 상기한 바와 같이 인간 meg-CSF 단백질 발현을 코딩하는 단리된 DNA 서열을 포함할 수도 있다. meg-CSF 단백질 모두 또는 일부를 코딩하는 DNA 서열은 동일하거나 대체적으로 동일한 표 1, 5 또는 6의 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 단편을 함유함을 특징으로 한다. 이 DNA 서열은 추가의 코딩 서열을 함유할 수 있다. 또한 DNA 서열은 meg-CSF 코딩 서열의 측면에 위치하는 5' 및 3' 인간 비코딩 서열을 포함할 수 있다. 이 DNA 서열은 또한 아미노 말단 시그날 펩타이드를 코딩할 수 있다. 표 1은 게놈 클론의 5' 최가장자리에서 시작하고 Exon Ⅱ와 Ⅲ 사이에 나타나는 인트론(intron)내의 Bg Ⅲ 부위에서 끝나는 것으로 추정되는 부분 게놈 서열을 나타낸다. 표 1은 Exon Ⅰ 및 Exon Ⅱ의 오픈 리딩 프레임을 코드하는 서열을 함유한다. 이는 N-말단 Exon 및 Meg cDNA 전 길이 내에 존재하는 ExonⅠ의 5' 게놈 서열에 함유되는 다른 추가의 Exon을 함유할 수도 있다. 표 5는 사람의 뇨로부터 분리되고 COS-1 세포에서 발현되는 인간 meg-CSF의 부분 게놈 코딩 서열을 형성하는 다른 공지된 Exon Ⅲ을 나타낸다. 표 6은 게놈 서열로부터 유래된 Exon Ⅰ∼Ⅲ을 함유하는 추정되는 부분 cDNA 코딩서열을 나타낸다. 
     본 발명의 DNA 서열은 사람의 생물학적 활성 인간 meg-CSF 단백질을 코딩할 수 있으며, 적당한 조건하에서 또는 유전 코드가 퇴화됨이 없다면 적당한 조건하에서 표 1, 5 또는 6의 단리된 DNA 서열에 하이브리다이징될 수 있는 DNA 서열을 함유할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명의 DNA 서열은 대립형질성변이, 종 변이 또는 의도적 변이에 근거한 비코딩 서열, 시그날 서열 또는 코딩 서열에 있어서의 변형을 포함하거나 함유할 수 있다. 
     본 발명의 또다른 측면은 사람의 뇨로부터 본 발명의 meg-CSF 조성 또는 그의 단편을 분리 및 정제하는 방법이다. 본 발명에 의해 제공된 정제 방법은 뇨를 농축시키고 ; 이를 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 행하고 ; 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 행한 후 ; 생성된 물질을 렉틴 친화성 크로마토그래피에 이어 양이온 교환 우수성능(fine performance) 액체 크로마토그래피(FPLC)를 행하고 각 HPLC 작동에 대하여 다른 용매 용액을 사용하여 역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통하여 3회 용출을 행한다. 
     본 발명의 또다른 측면은 쥐의 피브린 혈병 검정에서 5×10 7 희석 단위/mg 이상의 비활성에 의해 특징지어지는, 뇨로부터 정제되거나 재조합 또는 합성 기술에 의해 생성되는 동종의 meg-CSF이다. 
     또한 본 발명에 의해 제공되는 것은 벡터 DNA와 인간 meg-CSF를 코딩하는 DNA 서열로 이루어지는 재조합 DNA 분자이다. DNA 분자는 선택된 숙주 세포에서  meg-CSF의 복제와 발현을 지시할 수 있는 조절 서열과 연관하여 작용하는 meg-CSF DNA를 제공한다. 재조합 meg-CSF 단백질의 발현에 사용되는 상기 DNA 분자로 형질 전환된 숙주 세포가 또한 본 발명에 의해 제공된다. 
     본 발명의 DNA 분자 및 형질 전환 세포는 또다른 측면, 즉, 재조합 인간 meg-CSF 단백질, 또는 그의 펩타이드 단편을 생산하는 신규의 방법에 사용된다. 이 방법에서는 단백질 발현을 조절할 수 있는 적합한 조절 또는 발현 조절 서열과 함께 연관되어 작용되는 meg-CSF 단백질 또는 그의 단편의 발현을 코딩하는 DNA  서열(또는 상기한 바와 같은 재조합 DNA 분자)로 형질전환된 세포주를 재조합 DNA 발현시킬 수 있는 적절한 조건하에서 배양한다. 이어서 발현된 meg-CSF 단백질을 적당한 통상적인 방법에 의해 숙주세포, 세포 분해물 또는 배양 배지로부터 수거한다. 뇨로부터 meg-CSF를 분리하는데 이용한 것과 동일한 정제 단계 또는 그의 변형법을 통해 조정 배지는 가공될 수 있다. 청구하고 있는 이 방법은 단백질 발현을 위한 숙주 세포로서 다수의 공지된 세포를 사용할 수 있다. 현재 meg-CSF의 생산에 바람직한 세포주는 포유류 세포주와 박테리아 세포이다. 
     본 발명의 또다른 측면으로서, 재조합 meg-CSF 단백질을 제공한다. 이 단백질은 대체적으로 사람의 다른 단백질성 물질과 유리되어 있으며 하나 이상의 펩타이드 단편을 코딩하는 DNA 서열 또는 여기서 기재하고 있는 서열을 함유하고 있다. 본 발명의 meg-CSF 단백질은 또한 하나 이상의 물리적, 생화학적, 약리학적 또는 생물학적 활성을 함유함을 특징으로 한다. 
     본 발명의 또다른 측면으로는 치료학적 유효량의 동종 또는 재조합 meg-CSF, 또는 유효량의 하나 이상인 그의 활성 펩타이드 단편을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이들 약제학적 조성물은 혈소판 부족에 의한 질병 상태 또는 장애를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 meg-CSF 조성물 또는 그의 약제학적 유효 단편은 화학치료 또는 혈소판 감소증으로부터 기인된 재생불량성 빈혈의 치료에 사용될 수 있다. meg-CSF는 골수 이식 환자의 보조적 치료로서 사용될 수 있다. 
     따라서, 본 발명의 또다른 측면은, 적당한 약제학적 담체 중의 치료학적 유효량의 meg-CSF 또는 그의 하나 이상의 펩타이드 단편을 환자에게 투여함으로써 혈소판 부족에 기인한 상기의 또는 그외의 병리학적 상태를 치료하는 방법이다. 이러한 치료 방법은 meg-CSF 또는 그의 하나 이상의 펩타이드 단편과 함께 하나 이상의 그외의 TPO-유사 인자, 사이토킨, 조혈소, 인터류킨, 성장 인자 또는 항체 유효량을 동시에 또는 차례로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 
     본 발명의 또다른 측면은 사람의 meg-CSF 또는 그의 단편에 대하여 유도되는 항체이다. 따라서, 이러한 측면의 일부로서 본 발명은 이러한 항체를 분비할 수 있는 세포주 및 그의 생산 방법 및 진단 또는 치료 방법에의 용도를 청구하고 있다. 
     본 발명의 또다른 측면 및 잇점은 하기의 바람직한 구현예에 대한 상세한 기술을 참고로 하여 명백해질 것이다.