Patent AR-123795-A1 (AR)
Title: Variantes de endonucleasa cas modificadas por ingeniería genética para una edición genómica mejorada
Inventor: ALARCON CLARA
IPC: C12N9/22
Filed: 2021-10-14
Abstract: Se proporcionan composiciones y métodos para la modificación genómica de una secuencia diana en el genoma de una célula, usando endonucleasas Cas modificadas por ingeniería genética novedosas. Los métodos y las composiciones emplean un sistema de polinucleótido guía / endonucleasa para proporcionar un sistema eficaz para modificar o alterar secuencias diana dentro del genoma de una célula u organismo. También se proporcionan novedosos efectores y sistemas de endonucleasa y elementos que comprenden tales sistemas, tales como sistemas de polinucleótido guía / endonucleasa que comprenden una endonucleasa. También se proporcionan composiciones y métodos para sistemas de polinucleótido guía / endonucleasa que comprenden al menos una endonucleasa, opcionalmente unida de manera covalente o no covalente a, o ensamblada con, al menos una subunidad proteica adicional, y para composiciones y métodos para el suministro directo de endonucleasas como ribonucleótido-proteínas.  Reivindicación 1: Un polipéptido de Cas modificado por ingeniería genética, que comprende: (a) un dominio RuvC triplemente dividido C-terminal y tres motivos de dedos de zinc; y (b) uno o más de los siguientes aminoácidos en posiciones en relación con una alineación con SEQ ID Nº 20: glicina en 226, glicina en 230, glutamato en 327, glutamato en 329, cisteína en 376, cisteína en 379, cisteína en 395, cisteína en 398 y cisteína en 406; en el que el polipéptido de Cas modificado por ingeniería genética no comprende al menos uno de los siguientes: fenilalanina en la posición relativa 38, alanina en la posición relativa 40, histidina en la posición relativa 79, glutamato en la posición relativa 81, alanina en la posición relativa 87, treonina en la posición relativa 335, cisteína en la posición relativa 409, glutamato en la posición relativa 421, lisina en la posición relativa 467 o glutamato en la posición relativa 468 y en el que el polipéptido de Cas modificado por ingeniería genética es capaz de unirse de manera específica de sitio a un sitio diana de un polinucleótido. Reivindicación 2: Un polipéptido de Cas modificado por ingeniería genética que comprende un polinucleótido que comparte al menos el 95% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID Nº 23 - 26, 31 - 44, 80 - 85, 90 - 142, 197 y 331 - 333. Reivindicación 16: Una composición sintética que comprende el polipéptido de Cas modificado por ingeniería genética de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 15, que comprende además un polinucleótido heterólogo. Reivindicación 19: Una composición sintética que comprende: (a) un polipéptido de Cas modificado por ingeniería genética de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 15; (b) un polinucleótido de ADN bicatenario diana; y (c) un polinucleótido guía que comprende un dominio de direccionamiento variable que comprende una región de complementariedad con un polinucleótido de ADN bicatenario diana; en la que el polipéptido de Cas reconoce una secuencia de PAM en el polinucleótido de ADN bicatenario diana, en la que el polinucleótido guía y el polipéptido de Cas forman un complejo que se une al polinucleótido de ADN bicatenario diana. Reivindicación 20: Un polinucleótido que codifica el polipéptido de Cas modificado por ingeniería genética de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 15 o la composición sintética de una cualquiera de las reivindicaciones 16 - 19. Reivindicación 24: Una célula eucariota que comprende el polipéptido de Cas modificado por ingeniería genética de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 15, la composición sintética de una cualquiera de las reivindicaciones 16 - 19 o el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 20 - 22. Reivindicación 29: Un método de introducción de una edición dirigida en un polinucleótido diana, comprendiendo el método: (a) proporcionar el polipéptido de Cas y polinucleótido guía de una cualquiera de las reivindicaciones 7 - 9, en el que el polipéptido de Cas / polinucleótido guía forman un complejo que reconoce una secuencia de PAM en el polinucleótido diana; y (b) poner en contacto el complejo de polipéptido de Cas / polinucleótido guía con la diana; e (c) introducir una edición dirigida en el polinucleótido diana.