Patent WO-2020096492-A1 (WO)
Inventor: Gamolski Anton
IPC: C12N15/63
Filed: 2019-11-05
Abstract: La présente invention se rapporte à l'ingénierie génétique et peut être utilisée en biotechnologie, en médecine et en agriculture pour la fabrication de produits de thérapie génique. La construction d'un vecteur D'ADN de thérapie génique pour une thérapie génique ciblée vise à augmenter le niveau d'expression du gène thérapeutique dans un tissu cible. 4 contient le promoteur et la région régulatrice du gène d'ostéocalcine humaine 2 qui est spécifique de tissu pour des cellules de tissu osseux, à savoir les ostéoblastes et les odontoblastes, un vecteur d'ADN de thérapie génique de 2019 pb GDTT1.8NAS5 avec la séquence nucléotidique SEQ ID No. 5 contient le promoteur et la région régulatrice du gène de protéine tensioactive humaine B qui est spécifique de tissu pour les cellules épithéliales des cellules épithéliales bronchiques et alvéolaires, un vecteur d'ADN de thérapie génique de 1940 pb GDTT1.8NAS6 avec la séquence nucléotidique SEQ ID No. 6 contient le promoteur et la région régulatrice du gène de la synapsine humaine I qui est spécifique de tissu pour des cellules du tissu nerveux, à savoir les neurones, un vecteur d'ADN de thérapie génique de 2620 pb GDTT1.8NAS7 avec la séquence nucléotidique SEQ ID No. 7 contient le promoteur et la région régulatrice du gène de néphrine humaine qui est spécifique de tissu pour des cellules rénales, à savoir les podocytes, un vecteur d'ADN de thérapie génique de 2240 pb GDTT1.8NAS8 avec la séquence nucléotidique SEQ ID No. 8 contient le promoteur et la région régulatrice du gène de l'antigène leucocytaire CD45 commun humain qui est spécifique de tissu pour des cellules sanguines, à savoir des cellules sanguines hématopoïétiques, un vecteur d'ADN de thérapie génique de 2604 pb GDTT1.8NAS9 avec la séquence nucléotidique SEQ ID No. 9 contient le promoteur et la région régulatrice du gène de protéine B29 humaine spécifique de tissu pour des cellules sanguines, à savoir les lymphocytes, un vecteur d'ADN de thérapie génique de 2048 pb GDTT1.8NAS10 avec la séquence nucléotidique SEQ ID No. 10 contient le promoteur et la région régulatrice du gène de protéine CD68 humaine qui est spécifique de tissu pour des cellules sanguines, à savoir les macrophages, un vecteur d'ADN de thérapie génique de 1978 pb GDTT1.8NAS11 avec la séquence nucléotidique SEQ ID No.11 contient le promoteur et la région régulatrice du gène d'insuline humaine qui est spécifique de tissu pour des cellules du pancréas, à savoir des cellules bêta du pancréas. En même temps, le procédé de production du vecteur d'ADN de thérapie génique pour une thérapie génique ciblée implique la construction initiale d'un vecteur de 2408 PB contenant une origine de réplication de 688 pb, un terminateur de transcription de 467 pb hGH-TA, un ARN-out de région régulatrice de 137 pb du transposon TnlO, un gène de résistance à la kanamycine de 1018 pb et un polylieur de 68 pb, suivie d'un clivage du vecteur par les endonucléases de restriction Sail et BamHI et d'une ligature avec un promoteur et une région régulatrice : un site contenant la région de promoteur du gène de myoglobine humaine de 352 pb est utilisé pour la production d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS1 pour une thérapie génique ciblée, un site contenant la région de promoteur du gène d'élastase humaine de 270 pb est utilisé pour la production d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS2 pour une thérapie génique ciblée, un site contenant la région de promoteur du gène de molécule d'adhésion intercellulaire humaine 2 de 399 pb est utilisé pour la production d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS3 pour une thérapie génique ciblée, un site contenant la région de promoteur du gène d'ostéocalcine humaine 2 de 569 pb est utilisé pour la production d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS4 pour une thérapie génique ciblée, un site contenant la région de promoteur du gène de protéine tensioactive humaine B de 635 pb est utilisé pour la production d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS5 pour une thérapie génique ciblée, un site contenant la région de promoteur du gène de protéine de synapsine humaine I de 556 pb est utilisé pour la production d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS6 pour une thérapie génique ciblée, un site contenant la région de promoteur du gène de néphrine humaine de 1236 pb est utilisé pour la production d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS7 pour une thérapie génique ciblée, un site contenant la région de promoteur du gène d'antigène CD45 de leucocyte commun humain de 856 pb est utilisé pour la production d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS8 pour une thérapie génique ciblée, un site contenant la région de promoteur du gène de protéine humaine B29 de 1220 pb est utilisé pour la production d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS9 pour une thérapie génique ciblée, un site contenant la région de promoteur du gène de protéine CD68 humaine de 658 pb est utilisé pour la production d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS10 pour une thérapie génique ciblée, un site contenant la région de promoteur du gène d'insuline humaine de 594 pb est utilisé pour la production d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS11 pour une thérapie génique ciblée, puis le clivage du gène de résistance à la kanamycine par les sites de restriction Spel. Un procédé de production de souche d'Escherichia coli JM110-NAS a été développé pour la production du vecteur d'ADN de thérapie génique choisi parmi : GDTT1.8NAS1, ou GDTT1.8NAS2, ou GDTT1.8NAS3, ou GDTT1.8NAS4, ou GDTT1.8NAS5, ou GDTT1.8NAS6, ou GDTT1.8NAS7, ou GDTT1.8NAS8, ou GDTT1.8NAS9, ou GDTT1.8NAS10, ou de GDTT1.8NAS11 qui implique la construction d'un fragment d'ADN linéaire contenant un ARN-in de transposon TnlO permettant une sélection positive sans antibiotique (64 pb), le gène sacB de levansucrase, dont le produit assure la sélection dans un milieu contenant du saccharose (1422 pb), le gène catR de résistance au chloramphénicol, requis pour prélever des clones de souche dans lesquels une recombinaison homologue s'est produite (763 pb), et deux séquences homologues (329 pb et 233 pb) assurant une recombinaison homologue dans la région du gène recA simultanément à une inactivation génique, lesdites séquences homologues étant obtenues par amplification par PCR du fragment de gène recA à l'aide d'ADN génomique d'Escherichia coli JM110-NAS en tant que matrice, et une paire d'amorces LHA-F (5-GCTGACGCTGCAGGTGATC) et LHA-R (5-GACAAGATGTGTGTCTACCGCTTCAGGTTACCCGCCAG), et une paire d'amorces RHA-F (5-TGGCAGGGCGGGGCGTAACTACGCCTCTGTTCGTCTCGA) et RHA-R (5-CTCAGCAGCAACTCACGTAC), puis les cellules d'Escherichia coli sont transformées par électroporation, et les clones survivants dans un milieu contenant 10 g/ml de chloramphénicol sont sélectionnés. La souche Escherichia coli JM110-NAS a été produite pour la production du vecteur d'ADN de thérapie génique choisi parmi GDTT1.8NAS1, ou GDTT1.8NAS2, ou GDTT1.8NAS3, ou GDTT1.8NAS4, ou GDTT1.8NAS5, ou GDTT1.8NAS6, ou GDTT1.8NAS7, ou GDTT1.8NAS8, ou GDTT1.8NAS9, ou GDTT1.8NAS10, ou GDTT1.8NAS11 qui permet une sélection positive sans antibiotique et contenant un fragment linéaire constitué de l'ARN-in du transposon Tn10, du gène levansucrose sacB et du gène catR de résistance au chloramphénicol dans le chromosome dans la région du gène recA. L'invention concerne un procédé d'obtention d'une souche portant un vecteur d'ADN de thérapie génique choisi parmi GDTT1.8NAS1, ou GDTT1.8NAS2, ou GDTT1.8NAS3, ou GDTT1.8NAS4, ou GDTT1.8NAS5, ou GDTT1.8NAS6, ou GDTT1.8NAS7, Ou GDTT1.8NAS8, ou GDTT1.8NAS9, ou GDTT1.8NAS10, ou GDTT1.8NAS11, à savoir : Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS1, ou Escherichia coli JM -. L 10-NAS-GDTT1.8NAS2, ou Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS3, ou Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS4, ou Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS5, ou Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS6, ou Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS7, ou Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS8, ou Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS9, ou Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS10, ou Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS11 qui implique de rendre électrocompétentes les cellules de la souche JM110-NAS d'Escherichia coli de soumettre ces cellules à une électroporation avec un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS1, ou GDTT1.8NAS2, ou GDTT1.8NAS3, ou GDTT1.8NAS4, ou GDTT1.8NAS5, ou GDTT1.8NAS6, ou GDTT1.8NAS7, ou GDTT1.8NAS8, ou GDTT1.8NAS9, ou GDTT1.8NAS10, ou GDTT18NAS11 Ensuite, les cellules sont versées dans des boîtes d'agar (boîtes de Pétri) comprenant un milieu sélectif contenant du Yeastrel, de la peptone, 6 % de saccharose, et 10 µg/ml de chloramphénicol pour la sélection de clones de souche stable. La souche d'Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS1 portant le vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS1 pour la production du vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS1 permettant une sélection sans antibiotique, la souche d'Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS2 portant le vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS2 pour la production du vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS2 permettant une sélection sans antibiotique, la souche d'Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS3 portant le vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS3 pour la production du vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS3 permettant une sélection sans antibiotique, la souche d'Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS4 portant le vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS4 pour la production du vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS4 permettant une sélection sans antibiotique, la souche d'Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS5 portant le vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS5 pour la production du vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS5 permettant une sélection sans antibiotique, la souche d'Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS6 portant le vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS6 pour la production du vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS6 permettant une sélection sans antibiotique, la souche d'Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS7 portant le vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS7 pour la production du vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS7 permettant une sélection sans antibiotique, la souche d'Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS8 portant le vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS8 pour la production du vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS8 permettant une sélection sans antibiotique, la souche d'Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS9 portant le vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS9 pour la production du vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS9 permettant une sélection sans antibiotique, la souche d'Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS10 portant le vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS10 pour la production du vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS10 permettant une sélection sans antibiotique, la souche d'Escherichia coli JM-110-NAS-GDTT1.8NAS11 portant le vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS11 pour la production du vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS11 permettant une sélection sans antibiotique ont été produites. Un procédé de production de vecteur d'ADN de thérapie génique à l'échelle industrielle a été mis au point qui consiste augmenter l'échelle de la culture bactérienne jusqu'aux quantités nécessaires pour augmenter la biomasse bactérienne dans un fermenteur industriel, après quoi la biomasse est utilisée pour extraire une fraction contenant le produit d'ADN thérapeutique, c'est-à-dire le vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS1, ou GDTT1.8NAS2, ou GDTT1.8NAS3, ou GDTT1.8NAS4, ou GDTT1.8NAS5, ou GDTT1.8NAS6, ou GDTT1.8NAS7, ou GDTT1.8NAS8, ou GDTT1.8NAS9, ou GDTT1.8NAS10, ou GDTT1.8NAS11, puis la filtrer à en plusieurs étapes, et la purifier par des procédés chromatographiques. Un procédé de sélection d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS1, ou GDTT1.8NAS2, ou GDTT1.8NAS3, ou GDTT1.8NAS4, ou GDTT1.8NAS5, ou GDTT1.8NAS6, ou GDTT1.8NAS7, ou GDTT1.8NAS8, ou GDTT1.8NAS9, ou GDTT1.8NAS10, ou GDTT1.8NAS11 pour une thérapie génique ciblée a été développé, chacun desdits vecteurs contenant différents promoteurs et régions régulatrices spécifiques de tissu du gène humain afin de construire le vecteur d'ADN de thérapie génique spécifique de tissu approprié contenant le gène thérapeutique, assurer une expression efficace de ce gène thérapeutique exclusivement dans la lignée cellulaire cible, le tissu cible humain grâce à la présence d'un promoteur et d'une région régulatrice qui sont spécifiques d'un tissu seulement pour cette lignée cellulaire cible, le tissu cible humain dans le vecteur ADN de thérapie génique. Ledit procédé comprend la sélection d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS1 pour la construction d'un vecteur d'ADN de thérapie génique contenant un gène thérapeutique pour une thérapie génique ciblée visant à augmenter le niveau d'expression de ce gène thérapeutique dans les cellules de tissu musculaire, la sélection d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS2 pour la construction d'un vecteur d'ADN de thérapie génique contenant un gène thérapeutique pour une thérapie génique ciblée visant à augmenter le niveau d'expression de ce gène thérapeutique dans les cellules cutanées, la sélection d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS3 pour la construction d'un vecteur d'ADN de thérapie génique contenant un gène thérapeutique pour une thérapie génique ciblée visant à augmenter le niveau d'expression de ce gène thérapeutique dans les cellules endothéliales vasculaires, la sélection d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS4 pour la construction d'un vecteur d'ADN de thérapie génique contenant un gène thérapeutique pour une thérapie génique ciblée visant à augmenter le niveau d'expression de ce gène thérapeutique dans des cellules osseuses, à savoir dans les ostéoblastes et les odontoblastes, la sélection du vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS5 pour la construction d'un vecteur d'ADN de thérapie génique contenant un gène thérapeutique pour cibler un vecteur d'ADN contenant un gène thérapeutique pour une thérapie génique ciblée visant à augmenter le niveau d'expression de ce gène thérapeutique dans des cellules sanguines, à savoir dans les lymphocytes, la sélection d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS10 pour la construction d'un vecteur d'ADN de thérapie génique contenant un gène thérapeutique pour une thérapie génique ciblée visant à augmenter le niveau d'expression de ce gène thérapeutique dans des cellules sanguines, à savoir dans les macrophages, la sélection d'un vecteur d'ADN de thérapie génique GDTT1.8NAS11 pour la construction d'un vecteur d'ADN de thérapie génique contenant un gène thérapeutique pour une thérapie génique ciblée visant à augmenter le niveau d'expression de ce gène thérapeutique dans des cellules du pancréas, à savoir dans les cellules bêta du pancréas.