Patent AR-124287-A1 (AR)
Title: Linfocitos citolíticos naturales editados genéticamente
Inventor: KYRYCHENKO VIKTORIIA
IPC: C12N5/10
Filed: 2021-11-30
Abstract: La presente invención se refiere, entre otras cosas, a una célula modificada por ingeniería genética (por ejemplo, iPSC, NK derivada de IPS, o célula NK) que comprende un gen B2M alterado y un polinucleótido insertado que codifica uno o más de SERPINB9, una fusión de IL15 e IL15Ra, y/o HLA-E. La célula modificada puede comprender además un gen CIITA alterado y un polinucleótido insertado que codifica un CAR, en donde el CAR puede ser un CAR anti-BCMA o un CAR anti-CD30. La célula modificada por ingeniería genética puede comprender además un gen ADAM17 alterado, un gen FAS alterado, un gen CISH alterado y/o un gen REGNASA-1 alterado. También se proporcionan métodos para producir células modificadas por ingeniería genética y se describen usos terapéuticos de las células modificadas por ingeniería genética. También se describen secuencias de ARN guía dirigidas a las secuencias diana descritas.  Reivindicación 1: Una célula modificada por ingeniería genética caracterizada porque comprende: (a) un gen de b-2-microglobulina (B2M) alterado; y (b) una inserción de un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido en el gen B2M alterado, en donde el primer polinucleótido codifica una proteína SERPINB9 y el segundo polinucleótido codifica una proteína de fusión de interleucina-15 (IL15) y la subunidad a del receptor de interleucina-15 (IL15Ra); en donde la célula expresa la proteína SERPINB9 y la proteína de fusión de IL15 e IL15Ra y la célula tiene expresión alterada de B2M. Reivindicación 21: Una célula modificada por ingeniería genética caracterizada porque comprende: (a) un gen B2M alterado; (b) una inserción de un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido, opcionalmente en donde el primer polinucleótido y el segundo polinucleótido se insertan en el gen B2M alterado, en donde el primer polinucleótido codifica SERPINB9 y el segundo polinucleótido codifica una proteína de fusión de interleucina-15 (IL15) y la subunidad a del receptor de interleucina-15 (IL15Ra), (c) un gen CIITA alterado; (d) una inserción de un tercer polinucleótido que codifica un CAR y un cuarto polinucleótido que codifica HLA-E, opcionalmente en donde el CAR y HLA-E se insertan en el gen CIITA alterado; (e) un gen CISH alterado, y (f) un gen FAS alterado; en donde la célula expresa la proteína SERPINB9, la proteína de fusión de IL15 e IL15Ra, el CAR y el trímero de HLA-E y la célula tiene una expresión alterada de B2M, CIITA, CISH y FAS. Reivindicación 24: Un método in vitro para generar una célula modificada por ingeniería genética, caracterizado porque comprende el método administrar a una célula: (a) una primera nucleasa guiada por ARN y un primer ARNg dirigido a un sitio diana en un locus del gen B2M; y (b) un primer vector que comprende un ácido nucleico, comprendiendo el ácido nucleico: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína SERPINB9 y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de IL15 e IL15Ra; (ii) una secuencia de nucleótidos que tiene homología de secuencia con una región genómica situada a la izquierda del sitio diana en el locus del gen B2M; y (iii) una secuencia de nucleótidos que tiene homología de secuencia con una región genómica situada a la derecha del sitio diana en el locus del gen B2M, en donde (i) está flanqueado por (ii) y (iii); en donde el locus del gen B2M se escinde en el sitio diana y la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína SERPINB9 y la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de IL15 e IL15Ra se insertan en el locus del gen B2M, alterando de este modo el gen B2M. Reivindicación 50: Un método in vitro para generar una célula modificada por ingeniería genética, caracterizado porque comprende el método administrar a una célula: (a) una primera nucleasa guiada por ARN y un primer ARNg dirigido a un sitio diana en un locus del gen B2M; (b) un primer vector que comprende un ácido nucleico, comprendiendo el ácido nucleico: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína SERPINB9 y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de IL15 e IL15Ra; (ii) una secuencia de nucleótidos que tiene homología de secuencia con una región genómica situada a la izquierda del sitio diana en el locus del gen B2M; y (iii) una secuencia de nucleótidos que tiene homología de secuencia con una región genómica situada a la derecha del sitio diana en el locus del gen B2M, en donde (i) está flanqueado por (ii) y (iii); (c) una segunda nucleasa guiada por ARN y un segundo ARNg dirigido a un sitio diana en un locus del gen CIITA; (d) un segundo vector que comprende un ácido nucleico, comprendiendo el ácido nucleico: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un CAR y una secuencia de nucleótidos que codifica un trímero de HLA-E; (ii) una secuencia de nucleótidos que tiene homología de secuencia con una región genómica situada a la izquierda del sitio diana en el locus del gen CIITA; y (iii) una secuencia de nucleótidos que tiene homología de secuencia con una región genómica situada a la derecha del sitio diana en el locus del gen CIITA, en donde (i) está flanqueado por (ii) y (iii); (e) una tercera nucleasa guiada por ARN y un tercer ARNg dirigido a un sitio diana en un locus del gen CISH; y (f) una cuarta nucleasa guiada por ARN y un cuarto ARNg dirigido a un sitio diana en un locus del gen FAS; en donde el locus del gen B2M se escinde en el sitio diana y la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína SERPINB9 y la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de IL15 e IL15Ra se insertan en el locus del gen B2M, alterando de este modo el gen B2M; en donde el locus del gen CIITA se escinde en el sitio diana y la secuencia de nucleótidos que codifica el CAR y la secuencia de nucleótidos que codifica el trímero de HLA-E se insertan en el locus del gen CIITA, alterando de este modo el gen CIITA; en donde el locus del gen CISH se escinde en el sitio diana y se introduce al menos una mutación de inserción-eliminación en el gen CISH, alterando de este modo el gen CISH; y en donde el locus del gen FAS se escinde en el sitio diana y se introduce al menos una mutación de inserción-eliminación en el gen FAS, alterando de este modo el gen FAS.