Patent ES-2683037-T3 (ES)
Title: Diagnóstico de tumores malignos linfoides y detección de enfermedad residual mínima
Inventor: SHERWOOD ANNA M
IPC: C12Q1/68
Filed: 2012-12-07
Granted: 2018-09-24
Abstract: Un método para detectar enfermedad residual mínima para un tumor maligno hematológico linfoide en un sujeto después de la terapia, comprendiendo el método (a) amplificación de ADN extraído de una primera muestra en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) utilizando cebadores del segmentos V y J para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado que comprenden cada una una región que codifica CDR3 de TCR, en donde la primera muestra se ha obtenido del sujeto antes de la terapia y comprende una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides, (b) secuenciación de alto rendimiento de dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado para determinar las frecuencias relativas de regiones que codifican CDR3 de TCR reordenadas de manera única en la primera muestra, identificando así la región que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera única de los uno o más clones de células T malignas, (c) amplificación de ADN extraído de una segunda muestra en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) utilizando los cebadores del segmento V y J para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado comprendiendo cada una una región que codifica CDR3 de TCR, en donde la segunda muestra se ha obtenido del sujeto después de la terapia y comprende una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides, y (d) secuenciación de alto rendimiento de dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado producidas a partir de la segunda muestra para determinar la frecuencia relativa de la región que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera única de los uno o más clones de células T malignas en la segunda muestra, en donde la presencia de la región que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera única de los uno o más clones de células T malignas a una frecuencia relativa de al menos una frecuencia de uno de cada 106 a uno de cada 105 regiones que codifican CDR3 de TCR indica enfermedad residual mínima para el tumor maligno hematológico linfoide; en donde la PCR múltiple comprende adicionalmente una pluralidad de oligonucleótidos molde que tiene una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I] en donde (i) V es un polinucleótido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 o 210, y no más de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región variable (V) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos V comprende una secuencia oligonucleotídica única, (ii) J es un polinucleótido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120 o 120-150, y no más de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región de empalme (J) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos J comprende una secuencia oligonucleotídica única, (iii) U1 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (1) una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (2) una primera secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada 5' con respecto a la primera secuencia de nucleótido adaptador universal, (iv) U2 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (1) una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (2) una segunda secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, (v) B1, B2, B3 y B4 son cada uno independientemente nada o cada uno comprende un oligonucleótido B que comprende una secuencia código de barras de oligonucleótido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, nucleótidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos B comprende una secuencia oligonucleotídica única que identifica de forma única, como una combinación pareada, (1) la secuencia oligonucleotídica V única de (i) y (2) la secuencia oligonucleotídica J única de (ii), y (vi) R no es nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción que comprende una secuencia oligonucleotídica que está ausente de (i) - (v).