Patent ES-2538459-T3 (ES)
Title: Detección de las secuencias de áidos nucleico diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO
Inventor: CHUN JONG YOON
IPC: C12Q1/68
Filed: 2012-01-11
Granted: 2015-06-22
Abstract: Método para detectar una secuencia de ácidos nucleicos diana en un ADN o en una mezcla de ácidos nucleicos mediante un ensayo PTOCE (escisión y extensión de PTO), el cual comprende: (a) Hibridación de la secuencia de ácidos nucleicos diana con un oligonucleótido situado corriente arriba (upstream) y un PTO (Oligonucleótido de sondeo y marcaje); en el que dicho oligonucleótido situado corriente arriba comprende una secuencia de nucleótidos complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana con la cual se hibrida; el PTO comprende: (I) un segmento localizador en 3' que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana con la cual se hibrida; y (II) un segmento de marcaje en 5' que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con la secuencia de ácidos nucleicos diana; en el que dicho segmento localizador en 3' se hibrida con la secuencia de ácidos nucleicos diana y el segmento de marcaje en 5' no se hibrida con dicha secuencia de ácidos nucleicos diana; el oligonucleótido situado corriente arriba está ubicado antes del PTO; (b) Puesta en contacto del resultado de la etapa (a) con una enzima dotada de actividad 5'-nucleasa en condiciones para la escisión del PTO; el oligonucleótido situado corriente arriba o su hebra extendida induce la escisión del PTO por la enzima dotada de actividad 5'-nucleasa de tal modo que la escisión libera un fragmento que comprende el segmento de marcaje en 5' o una parte del segmento de marcaje en 5' del PTO; (c) Hibridación del fragmento desprendido del PTO con un CTO (Oligonucleótido de captura y molde); el CTO comprende en dirección 3' a 5': (I) un segmento de captura que comprende una secuencia nucleotídica complementaria con el segmento de marcaje en 5' o una parte de este segmento del PTO, y (II) un segmento molde que comprende una secuencia nucleotídica no complementaria con el segmento de marcaje en 5' ni con el segmento localizador en 3'; de forma que el fragmento desprendido del PTO se hibrida con el segmento de captura del CTO; (d) Realización de una reacción de extensión con el resultante de la etapa (c) y una polimerasa de ácidos nucleicos dependiente de molde; en ella el fragmento hibridado con el segmento de captura del CTO se extiende y se forma un ácido nucleico bicatenario extendido; este ácido nucleico bicatenario extendido tiene un valor de Tm que puede ajustarse con (I) la secuencia y/o la longitud del fragmento, (II) la secuencia y/o la longitud del CTO o (III) la secuencia y/o la longitud del fragmento y la secuencia y/o la longitud del CTO; (e) Fusión del ácido nucleico bicatenario extendido a lo largo de un intervalo de temperaturas que da una señal diana indicadora de la presencia del ácido nucleico bicatenario extendido; en ella la señal diana es provista por: (I) al menos un marcador unido al fragmento y/o al CTO, (II) un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión, (III) un marcador incorporado al ácido nucleico bicatenario extendido durante la reacción de extensión y un marcador unido al fragmento y/o al CTO, o (IV) un marcador intercalante; y