Patent ES-2899186-T3 (ES)
Title: Humanización rápida de anticuerpos
Inventor: SHORT JAY M
IPC: C12P21/08
Filed: 2011-12-28
Granted: 2022-03-10
Abstract: Un método para producir un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo humanizado que exhibe afinidad por un antígeno unido a un anticuerpo molde, comprendiendo el método: a. sintetizar bibliotecas de fragmentos de ADN de doble hebra de cadena pesada de inmunoglobulina que comprenden bibliotecas que codifican fragmentos de regiones determinantes de complementariedad y bibliotecas de codificación de fragmentos de marcos, en las que cada biblioteca de fragmentos de regiones determinantes de complementariedad comprende al menos un fragmento de ADN de doble hebra que codifica un fragmento de región determinante de complementariedad de cadena pesada que tiene una secuencia al menos 90 % idéntica a una región determinante de complementariedad de cadena pesada correspondiente del anticuerpo molde y cada biblioteca de fragmento de marco comprende al menos un fragmento de ADN de doble hebra que codifica al menos un fragmento de marco de cadena pesada seleccionado de un conjunto de marco humano obtenido a partir de anticuerpos humanos expresados funcionalmente; b. sintetizar bibliotecas de fragmentos de ADN de doble hebra de cadena ligera de inmunoglobulina que comprenden bibliotecas de codificación de fragmentos de regiones determinantes de complementariedad y bibliotecas de codificación de fragmentos de marcos, en las que cada biblioteca de fragmentos de regiones determinantes de complementariedad comprende al menos un fragmento de ADN de doble hebra que codifica un fragmento de región determinante de complementariedad de cadena ligera que tiene una secuencia al menos 90 % idéntica a una región determinante de complementariedad de cadena ligera correspondiente del anticuerpo molde y cada biblioteca de fragmentos de marco comprende al menos un fragmento de ADN de doble hebra que codifica un marco de cadena ligera seleccionado de un conjunto de marcos obtenido a partir de anticuerpos humanos expresados funcionalmente; c. ensamblar las bibliotecas de fragmentos de cadena pesada mediante ligación en fase líquida por etapas de fragmentos codificantes de la estructura de cadena pesada de las bibliotecas que codifican fragmentos de marco de cadena pesada y fragmentos codificantes de la región determinante de la complementariedad de cadena pesada que codifican fragmentos de las bibliotecas que codifican fragmentos de regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada en el orden de: marco1 - región determinante de complementariedad 1 - marco2 - región determinante2 de complementariedad - marco3 - región determinante de complementariedad3 para producir una biblioteca de codificación de dominio variable de cadena pesada humanizada que comprende uno o más nucleótidos; d. ensamblar a partir de las bibliotecas de fragmentos de la cadena ligera por ligación en fase líquida escalonada de fragmentos codificantes de la estructura de cadena ligera de las bibliotecas que codifican fragmentos de marco de cadena ligera fragmentos codificantes de la región determinante de complementariedad de cadena ligera que codifican fragmentos de las bibliotecas que codifican fragmentos de regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera en el orden de: marco1 - región determinante de complementariedad 1 - marco2 - región determinante2 de complementariedad - marco3 - región determinante de complementariedad3 para producir una biblioteca de codificación de dominio variable de cadena ligera humanizada que comprende uno o más nucleótidos; e. clonar el uno o más polinucleótidos en la biblioteca que codifica dominio variable de cadena pesada humanizada ensamblada y el uno o más polinucleótidos en la biblioteca que codifica dominio variable de cadena ligera ensamblada en un vector de expresión para crear una construcción que codifica el anticuerpo de humanización o fragmento de anticuerpo, en donde el vector de expresión comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una región marco 4 de cadena pesada seleccionada de un dominio variable de cadena pesada humana de un anticuerpo humano expresado funcionalmente y una secuencia de nucleótidos que codifica el marco 4 derivado de un dominio variable de cadena ligera humana de un anticuerpo humano expresado funcionalmente; f. transfectar la construcción en células; g. expresar uno o más anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpos humanizados en las células; y h. seleccionar uno o more anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpos humanizados expresados en la etapa (g) para seleccionar un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo humanizado que exhibe afinidad por el antígeno unido al anticuerpo molde.