Patent ES-2602184-T3 (ES)
Title: Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas
Inventor: HELLINGA HOMME
IPC: C12N9/22
Filed: 2006-10-18
Granted: 2017-02-20
Abstract: Un método para producir una meganucleasa recombinante que tiene especificidad por un semisitio de secuencia de reconocimiento alterada que difiere en al menos un par de bases respecto de un semisitio dentro de una secuencia de reconocimiento de la meganucleasa I-Crel seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, comprendiendo dicho método: A. diseñar una secuencia polipeptídica que tiene una similitud de al menos el 85 % con los restos 2-153 de la meganucleasa I-Crel de SEQ ID NO: 1, comprendiendo dicho diseño modificar la secuencia de los restos 2-153 de la meganucleasa I-Crel de SEQ ID NO: 1, en donde (1) se ha alterado la especificidad en la posición -1: (a) a una T en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en C70, L70, Y75, Q75, H75, H139, Q46 y H46; (b) a una A en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en Y75, L75, C75, Y139, C46 y A46; (c) a una G en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en E70, E75, E46 y D46; (d) a una C en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en H75, R75, H46, K46 y R46; o (e) a cualquier base en una hebra codificante mediante una modificación de G46; y/o (2) se ha alterado la especificidad en una posición -2: (a) a una A en una hebra codificante 81 mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en V44, I44, L44 y N44; (b) a una C en una hebra codificante mediante una modificación de E70; (c) a una A o una T en una hebra codificante mediante una modificación que comprende C44; y/o (3) se ha alterado la especificidad en una posición -3: (a) a una A en una hebra codificante mediante una modificación de C24; (b) a una C en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en F68, K24 y R24; (c) a una T en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en M68, C68, L68 y F68; (d) a una C o una T en una hebra codificante mediante una modificación que comprende Y68; y/o (4) se ha alterado la especificidad en una posición -4: (a) a una C en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en E77 y K26; (b) a una G en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en E26 y R77; (c) a una C o una T en una hebra codificante mediante una modificación que comprende S77; o (d) a cualquier base en una hebra codificante mediante una modificación que comprende S26, y/o (5) se ha alterado la especificidad en una posición -5: (a) a una C en una hebra codificante mediante una modificación que comprende E42; (b) a una G en una hebra codificante mediante una modificación que comprende R42; (c) a una A o una G en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en C28 y Q42; o (d) a cualquier base en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en M66 y K66; y/o (6) se ha alterado la especificidad en una posición -6: (a) a una T en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en 60 C40, I40, V40, C79, I79, V79 y Q28; (b) a una C en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en E40 y R28; o (c) a una G en una hebra codificante mediante una modificación que comprende R40; y/o (7) se ha alterado la especificidad en una posición -7: (a) a una C en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en E38, K30 y R30; (b) a una G en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en K38, R38 y E30; (c) a una T en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en I38 y L38; o (d) a una A o una G en una hebra codificante mediante una modificación que comprende C38; o (e) a cualquier base en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en H38, N38 y Q30; y/o (8) se ha alterado la especificidad en una posición -8: (a) a una T en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en L33, V33, I33, F33 y C33; (b) a una C en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en E33 y D33; (c) a una G en una hebra codificante mediante una modificación que consiste en K33; o (d) a una A o una C en una hebra codificante mediante una modificación que comprende R32; o (e) a una A o una G en una hebra codificante mediante una modificación que comprende R33; y/o (9) se ha alterado la especificidad en una posición -9: (a) a una C en una hebra codificante mediante una modificación que comprende E32; (b) a una G en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en R32 y K32; (c) a una T en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en L32, V32, A32 y C32; (d) a una C o una T en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que 30 consiste en D32 e I32; o (e) a cualquier base en una hebra codificante mediante una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en S32, N32, H32, Q32 y T32, en el que dicha secuencia polipeptídica no comprende los restos 2-153 de la meganucleasa I-Crel de SEQ ID NO: 1 únicamente con las siguientes modificaciones que alteran la especificidad: N75, A68/N70/N75, D44/K70/N75, R44/AG8/T70/N75, A44/L70/N75, A44/D68/K70/N75, A44/G68/N75, K44/T68/G70/N75, D44/N70/N75, A44/T68/S70/N75, R44/N70/N75, A44/S68/N75, A26, C26, C26/R66, R66, C33, H33, T68/K70/N75, K70/N75, N70/N75, T70/N75, A70/N75, T44/N75, A68/K70/N75, N68/K70/N75, G70/N75, SG8/K70/N75, N68/N75, H70/N75, S70/N75, G68/K70/N75, Q70/N75, Q68/K70/N75, H68/K70/N75, A32, A140, F33, A30, A44, A38, A44/A140, K32, R32, N33, R33, A68, A33, G33, I33, K33, L33, P33, Q33, S33, T33, A28, A70, D33, E33, M33, V33 and W33; y B. producir una meganucleasa recombinante que comprenda dicha secuencia polipeptídica.