Patent ES-2937986-T3 (ES)
Title: Método de caracterización de las modificaciones causadas por el uso de nucleasas de diseño
Inventor: CATHOMEN TONI
IPC: C12Q1/6869
Filed: 2019-09-19
Granted: 2023-04-03
Abstract: Se divulga un método para la detección de alto rendimiento de modificaciones de todo el genoma en un genoma de ácido nucleico obtenido de una célula o tejido causado por la actividad de una nucleasa de diseño que comprende los siguientes pasos: a) Extracción del ADN genómico de las células que fueron expuestas a una nucleasa de diseño en condiciones que permitan a la nucleasa de diseño introducir una rotura de doble cadena (DSB) de ADN en el ADN genómico de la célula, b) fragmentación del ácido nucleico para obtener fragmentos aleatorios, c) realizar una reparación final para para obtener extremos romos, d) ligadura con un enlazador que comprende una secuencia complementaria a un llamado "cebador enlazador", e) realizar una primera reacción de amplificación de ácido nucleico con un "cebador enlazador" y un llamado "cebador ON-target",en el que un cebador se encuentra aguas arriba y otro cebador aguas abajo del sitio en el objetivo, en el que al menos un cebador señuelo está presente en la mezcla de reacción, f) realizar una segunda reacción de amplificación de ácidos nucleicos mediante la cual se añaden los llamados "cebadores anidados" a la mezcla de reacción, donde un cebador es complementario al locus en el objetivo y un cebador complementario a la secuencia enlazadora, 9) llevar a cabo una reacción adicional de amplificación de ácido nucleico en la que al menos un código que contiene cebadores se agrega a la mezcla de reacción, h) secuenciación del producto de amplificación anidado y con código de barras, e i) alineación de los productos secuenciados con medios bioinformáticos adecuados a una secuencia de referencia para identificar una ubicación cromosómica que contiene una modificación genómica basada en al menos una rotura de doble cadena de ADN.en el que al menos un cebador señuelo está presente en la mezcla de reacción, f) realizar una segunda reacción de amplificación de ácido nucleico en la que se añaden los llamados "cebadores anidados" a la mezcla de reacción, en la que un cebador es complementario al locus en el objetivo y un cebador complementaria a la secuencia enlazadora, 9) realizar una reacción adicional de amplificación de ácido nucleico mediante la cual se agrega al menos un código que contiene cebadores a la mezcla de reacción, h) secuenciar el producto de amplificación anidado y con código de barras, e i) alinear los productos secuenciados con bioinformática adecuada significa a una secuencia de referencia para identificar una ubicación cromosómica que contiene una modificación genómica basada en al menos una rotura de doble cadena de ADN.en el que al menos un cebador señuelo está presente en la mezcla de reacción, f) realizar una segunda reacción de amplificación de ácido nucleico en la que se añaden los llamados "cebadores anidados" a la mezcla de reacción, en la que un cebador es complementario al locus en el objetivo y un cebador complementaria a la secuencia enlazadora, 9) realizar una reacción adicional de amplificación de ácido nucleico mediante la cual se agrega al menos un código que contiene cebadores a la mezcla de reacción, h) secuenciar el producto de amplificación anidado y con código de barras, e i) alinear los productos secuenciados con bioinformática adecuada significa a una secuencia de referencia para identificar una ubicación cromosómica que contiene una modificación genómica basada en al menos una rotura de doble cadena de ADN.f) realizar una segunda reacción de amplificación de ácidos nucleicos en la que se añaden a la mezcla de reacción los llamados "cebadores anidados", en los que un cebador es complementario al locus en el objetivo y un cebador es complementario a la secuencia enlazadora, 9) realizar un ácido nucleico adicional reacción de amplificación en la que al menos un código que contiene cebadores se agrega a la mezcla de reacción, h) secuenciación del producto de amplificación anidado y con código de barras, e i) alineación de los productos secuenciados con medios bioinformáticos adecuados a una secuencia de referencia para identificar una ubicación cromosómica que contiene un modificación genómica basada en al menos una rotura de doble cadena de ADN.f) realizar una segunda reacción de amplificación de ácidos nucleicos en la que se añaden a la mezcla de reacción los llamados "cebadores anidados", en los que un cebador es complementario al locus en el objetivo y un cebador es complementario a la secuencia enlazadora, 9) realizar un ácido nucleico adicional reacción de amplificación en la que al menos un código que contiene cebadores se agrega a la mezcla de reacción, h) secuenciación del producto de amplificación anidado y con código de barras, e i) alineación de los productos secuenciados con medios bioinformáticos adecuados a una secuencia de referencia para identificar una ubicación cromosómica que contiene un modificación genómica basada en al menos una rotura de doble cadena de ADN.9) realizar una reacción adicional de amplificación de ácidos nucleicos mediante la cual se agrega al menos un código que contiene cebadores a la mezcla de reacción, h) secuenciar el producto de amplificación anidado y con código de barras, e i) alinear los productos secuenciados con medios bioinformáticos adecuados a una secuencia de referencia para identificar una ubicación cromosómica que contenga una modificación genómica basada en al menos una rotura de doble cadena de ADN.9) realizar una reacción adicional de amplificación de ácidos nucleicos mediante la cual se agrega al menos un código que contiene cebadores a la mezcla de reacción, h) secuenciar el producto de amplificación anidado y con código de barras, e i) alinear los productos secuenciados con medios bioinformáticos adecuados a una secuencia de referencia para identificar una ubicación cromosómica que contenga una modificación genómica basada en al menos una rotura de doble cadena de ADN.  (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)