Patent BR-112016003057-A2 (BR)
Title: composições e métodos para análise multimodal de ácidos nucleicos cmet
Inventor: Jork NOLLING
IPC: C12Q1/68
Filed: 2014-08-07
Abstract: reivindicaãães 1. ensaio para detecã§ã£o de alteraã§ãµes em cmet caracterizado por compreender: -contatar uma porã§ã£o de uma amostra de ã¡cido nucleico com dois conjuntos de primers em que o primeiro conjunto de primers de detecta alteraã§ãµes na variaã§ã£o do nãºmero de cã³pias do gene cmet e o segundo conjunto de primers detecta alteraã§ãµes no nã­vel de expressã£o do gene cmet; em que o primeiro conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos uma sequãªncia especã­fica do gdna de cmet e pelo menos uma sequãªncia especã­fica de gdna de cada um de pelo menos dois genes de referãªncia, em que um gene de referãªncia estã¡ localizado no cromossomo 7 e um gene de referãªncia nã£o estã¡ localizado no cromossomo 7 para detectar variaã§ã£o do nãºmero de cã³pias do gene cmet; em que o segundo conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam sequãªncias especã­ficas de de mrna de cmet e sequãªncias especã­ficas de mrna de pelo menos dois genes de referãªncia; -realizar um regime de ciclos de amplificaã§ã£o por pcr que compreende separaã§ã£o de filamentos, emparelhamento de primers, e extensã£o de primer em uma mistura de reaã§ã£o que compreende uma porã§ã£o da amostra e os dois conjuntos de primers; -detectar o nã­vel de amplicon para cada par de primers; -normalizar o nã­vel de amplicons de cmet para os amplicons do gene de referãªncia; e comparar o nã­vel normalizado de amplicons de cmet com um nã­vel de referãªncia; em que um nã­vel mais elevado de um amplicon de cmet de gdna especã­fico, em comparaã§ã£o com o nã­vel de referãªncia indica a presenã§a de uma alteraã§ã£o de amplificaã§ã£o do gene de cmet na amostra, e uma alteraã§ã£o do nã­vel de um amplicon de cmet de mrna especã­fico em comparaã§ã£o a um nã­vel de referãªncia indica a presenã§a de uma alteraã§ã£o no nã­vel de expressã£o de gene de cmet na amostra. 2. ensaio, de acordo com a reivindicaã§ã£o 1, caracterizado por que o primeiro conjunto de primers compreende ainda um subconjunto de pares de primers que amplificam pelo menos uma sequãªncia especã­fica de gdna especã­fico de egfr; e o ensaio compreende ainda comparar o nã­vel normalizado de amplicons de egfr com um nã­vel de referãªncia; em que um nã­vel mais elevado de um amplicon de gdna especã­fico de egfr em comparaã§ã£o com o nã­vel de referãªncia indica a presenã§a de uma alteraã§ã£o de amplificaã§ã£o de gene de egfr na amostra. 3. ensaio, de acordo com a reivindicaã§ã£o 1 ou 2, caracterizado por que o gene de referãªncia do primeiro conjunto de primers, que estã¡ localizado no cromossomo 7 ã© kdelr-2; e o ensaio compreende ainda comparar o nã­vel normalizado de amplicons de kdelr-2 com um nã­vel de referãªncia; em que um nã­vel mais elevado de um amplicon de kdelr-2 de gdna especã­fico em comparaã§ã£o com o nã­vel de referãªncia indica a presenã§a de uma alteraã§ã£o de amplificaã§ã£o de gene kdelr-2 na amostra. 4. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes 1 a 3, caracterizado por que a presenã§a de uma alteraã§ã£o de amplificaã§ã£o de gene de cmet, egfr e kdelr-2 indica a presenã§a de amplificaã§ã£o do cromossomo 7. 5. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes 1 a 4, caracterizado por que o gene de referãªncia do primeiro conjunto de primers que nã£o estã¡ localizado no cromossomo 7 ã© sod1 ou spg21. 6. ensaio, de acordo com a reivindicaã§ã£o 5, caracterizado por que o primeiro conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos uma sequãªncia especã­fica do gdna de cada um dos sod1 e spg21. 7. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 6, caracterizado por que um conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos um amplicon de cada gene. 8. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 7, caracterizado por que um conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos dois amplicons de cada gene. 9. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 8, caracterizado por que um conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos trãªs amplicons de cada gene. 10. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 9, caracterizado por que os conjuntos de primers compreendem subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos dois amplicons de gdna especã­fico de cada um dos cmet, egfr, e kdelr-2 e pelo menos dois amplicons de mrna especã­fico de cada dentre cmet, sod1 e sgp21. 11. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 10, caracterizado por que os conjuntos de primers compreendem subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos trãªs amplicons de gdna especã­fico de cada um de cmet, egfr, e kdelr-2 e pelo menos trãªs amplicons de mrna especã­fico de cada um de cmet, sod1 e sgp21. 12. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 11, caracterizado por que compreende ainda: -contatar uma segunda porã§ã£o da amostra com um terceiro conjunto de pares de primers, em que o terceiro conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam sequãªncias de cmet compreendendo variaã§ãµes na sequãªncia; -realizar um regime de amplificaã§ã£o por pcr que compreende ciclos de separaã§ã£o de filamento, emparelhamento de primer, e extensã£o de primer em uma mistura de reaã§ã£o que compreende a segunda porã§ã£o da amostra e do terceiro conjunto de primers; -detectar o nã­vel de amplicon para cada par de primers, em que a presenã§a de um amplicon indica a presenã§a da variaã§ã£o de sequãªncia para a qual o par de primers ã© especã­fico. 13. ensaio, de acordo com a reivindicaã§ã£o 12, caracterizado por que uma ou mais variaã§ãµes de sequãªncia de cmet sã£o snps. 14. ensaio, de acordo com a reivindicaã§ã£o 12 e 13, caracterizado por que o cmet snp ã© selecionado dentre o grupo consistindo de: s1058p; v1101i; h1112y; h1124d; g1137v; m1149t; v1206l; l1213v; k1262r; m1268t; v1238i; y1248c; e d1246n (seq id no: 131). 15. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 12 a 14, caracterizado por que s1058p; v1101i; h1112y; h1124d; g1137v; m1149t; v1206l; l1213v; k1262r; m1268t; v1238i; y1248c; e d1246n sã£o detectados (seq id no: 131). 16. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 12 a 15, caracterizado por que os mesmos regimes de ciclos tã©rmicos de pcr sã£o utilizados para ambas as reaã§ãµes. 17. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 16, caracterizado por que a amostra de ã¡cido nucleico ã© preparada a partir de uma amostra de tumor ffpe. 18. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 17, caracterizado por que a amostra compreende cã©lulas tumorais de um indivã­duo diagnosticado com uma condiã§ã£o selecionada a partir do grupo consistindo de: cã¢ncer gã¡strico; cã¢ncer renal; colangioma; cã¢ncer de pulmã£o; cã¢ncer cerebral; cã¢ncer cervical; cã¢ncer de colo; cã¢ncer de cabeã§a e pescoã§o; hepatoma; cã¢ncer do pulmã£o de cã©lulas nã£o pequenas; melanoma; mesotelioma; mieloma mãºltiplo; cã¢ncer de ovã¡rio; sarcoma; e cã¢ncer de tireã³ide. 19. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 18, caracterizado por que um ou mais primers sã£o primers de domã­nio duplo. 20. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 19, caracterizado por que produtos amplificados a partir de dois ou mais pares de primers de um subconjunto de primers podem ser distinguidos. 21. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 20, caracterizado por que os produtos amplificados a partir de dois ou mais pares de primers sã£o um subconjunto de primer sã£o distinguidos por serem de tamanhos diferentes. 22. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 21, caracterizado por que os produtos amplificados a partir de dois ou mais pares de primers de um subconjunto de primer sã£o distinguidos por serem rotulados com diferentes marcadores detectã¡veis. 23. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 22, caracterizado por que os produtos amplificados a partir do primeiro conjunto de primers e do segundo conjunto de primers sã£o distinguidos por serem rotulados com diferentes marcadores detectã¡veis. 24. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 23, caracterizado por que um ou mais primers sã£o selecionados a partir do grupo consistindo de seq id nos: 1-83. 25. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 24, caracterizado por que um ou mais primers compreendem uma sequãªncia de qualquer uma dentre seq id nos: 89-124. 26. ensaio, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 1 a 25, caracterizado por que os primers estã£o presentes na mistura de reaã§ã£o em torno das concentraã§ãµes da tabela 2. 27. mã©todo de detecã§ã£o de alteraã§ãµes de cmet caracterizado por compreender -contatar uma porã§ã£o de uma amostra de ã¡cido nucleico com um conjunto de primers, que detectam alteraã§ãµes na variaã§ã£o do nãºmero de cã³pia de gene cmet; em que o conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos uma sequãªncia especã­fica de gdna de cmet e pelo menos uma sequãªncia especã­fica de gdna de cada um de pelo menos dois genes de referãªncia, em que um gene de referãªncia estã¡ localizado no cromossomo 7 e um gene de referãªncia nã£o estã¡ localizado no cromossomo 7 para detectar variaã§ã£o do nãºmero de cã³pia de gene cmet; -realizar um regime de amplificaã§ã£o por pcr que compreende ciclos de separaã§ã£o de filamentos, emparelhamento de primers, e extensã£o de primer na mistura de reaã§ã£o que compreende uma porã§ã£o da amostra e o conjunto de primers; -detectar o nã­vel de amplicon para cada par de primers; -normalizar o nã­vel de amplicons de cmet aos amplicons de gene de referãªncia; e comparar o nã­vel normalizado de amplicons de cmet com um nã­vel de referãªncia; em que um nã­vel mais elevado de um amplicon de cmet de gdna especã­fico, em comparaã§ã£o com o nã­vel de referãªncia indica a presenã§a de uma alteraã§ã£o de amplificaã§ã£o do gene de cmet na amostra. 28. mã©todo, de acordo com a reivindicaã§ã£o 27, caracterizado por que o conjunto de primers compreende ainda um subconjunto de pares de primers que amplificam pelo menos uma sequãªncia especã­fica de gdna de egfr; e o ensaio compreende ainda comparar o nã­vel normalizado de amplicons de egfr a um nã­vel de referãªncia; em que um nã­vel mais elevado de um amplicon de egfr de gdna especã­fico, em comparaã§ã£o com o nã­vel de referãªncia indica a presenã§a de uma alteraã§ã£o de amplificaã§ã£o do gene de egfr na amostra. 29. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 28, caracterizado por que o gene de referãªncia do conjunto de primers que estã¡ localizado no cromossomo 7 ã© kdelr-2; e o mã©todo compreende ainda a comparaã§ã£o do nã­vel normalizado de amplicons de kdelr-2 a um nã­vel de referãªncia; em que um nã­vel mais elevado de um amplicon de kdelr-2 de gdna especã­fico em comparaã§ã£o com o nã­vel de referãªncia indica a presenã§a de uma alteraã§ã£o de amplificaã§ã£o do gene de kdelr-2 na amostra. 30. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 29, caracterizado por que a presenã§a de uma alteraã§ã£o de amplificaã§ã£o do gene de cmet, egfr e kdelr-2 indica a presenã§a de amplificaã§ã£o do cromossomo 7. 31. mã©todo, de acordo com as reivindicaã§ãµes 27 a 30, caracterizado por que o gene de referãªncia do conjunto de primers que nã£o estã¡ localizado no cromossomo 7 ã© sod1 ou spg21. 32. mã©todo, de acordo com a reivindicaã§ã£o 31, caracterizado por que o conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos uma sequãªncia de gdna especã­fica de sod1 e spg21. 33. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 32, caracterizado por compreender ainda contatar a porã§ã£o de uma amostra de ã¡cido nucleico com um segundo conjunto de primers, em que o segundo conjunto de primers detecta alteraã§ãµes no nã­vel de expressã£o do gene cmet; em que o segundo conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam sequãªncias de mrna especã­fico de cmet e pelo menos sequãªncias de mrna especã­fico de pelo menos dois genes de referãªncia; e em que uma alteraã§ã£o do nã­vel de um amplicon cmet de mrna especã­fico, em comparaã§ã£o com o nã­vel de referãªncia indica a presenã§a de uma alteraã§ã£o do nã­vel de expressã£o do gene de cmet na amostra. 34. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 33, caracterizado por que o primeiro conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos uma sequãªncia de gdna especã­fica de cada um de sod1 e spg21. 35. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 34, caracterizado por que um conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos um amplicon de cada gene. 36. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 35, caracterizado por que um conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos dois amplicons de cada gene. 37. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 36, caracterizado por que um conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos trãªs amplicons de cada gene. 38. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 37, caracterizado por que os conjuntos de primers compreendem subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos dois amplicons de gdna especã­fico de cada um de cmet, egfr, e kdelr-2 e pelo menos dois amplicons de mrna especã­fico de cada de cmet, sod1 e sgp21. 39. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 38, caracterizado por que os conjuntos de primers compreendem subconjuntos de pares de primers que amplificam pelo menos trãªs amplicons de gdna especã­fico de cada um de cmet, egfr, e kdelr-2 e pelo menos trãªs amplicons especã­ficos de mrna de cada de cmet, sod1 e sgp21. 40. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 39, caracterizado por compreender ainda: -contatar uma segunda porã§ã£o da amostra com um terceiro conjunto de pares de primers, em que o terceiro conjunto de primers compreende subconjuntos de pares de primers que amplificam sequãªncias de cmet compreendendo variaã§ãµes na sequãªncia; -realizar um regime de amplificaã§ã£o por pcr que compreende ciclos de separaã§ã£o de filamentos, emparelhamento de primers, e extensã£o de primer em uma mistura de reaã§ã£o que compreende a segunda porã§ã£o da amostra e o terceiro conjunto de primers; -detectar o nã­vel de amplicon para cada par de primers, em que a presenã§a de um amplicon indica a presenã§a da variaã§ã£o da sequãªncia para a qual que o par de primers ã© especã­fico. 41. mã©todo, de acordo com a reivindicaã§ã£o 40, caracterizado por que uma ou mais variaã§ãµes na sequãªncia de cmet sã£o snps. 42. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 39 a 41, caracterizado por que o cmet snp ã© selecionado de entre o grupo consistindo de: s1058p; v1101i; h1112y; h1124d; g1137v; m1149t; v1206l; l1213v; k1262r; m1268t; v1238i; y1248c; and d1246n (seq id no: 131). 43. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 39 a 42, caracterizado por que s1058p; v1101i; h1112y; h1124d; g1137v; m1149t; v1206l; l1213v; k1262r; m1268t; v1238i; y1248c; e d1246n sã£o detectados (seq id no: 131). 44. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 39 a 43, caracterizado por que os mesmos regimes de ciclos tã©rmicos de pcr sã£o utilizados para ambas as reaã§ãµes. 45. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 39 a 44, caracterizado por que a amostra de ã¡cido nucleico ã© preparada a partir de uma amostra de tumor ffpe. 46. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 45, caracterizado por que a amostra compreende cã©lulas tumorais de um indivã­duo diagnosticado com uma condiã§ã£o selecionada a partir do grupo consistindo de: cã¢ncer gã¡strico; cã¢ncer renal; colangioma; cã¢ncer de pulmã£o; cã¢ncer cerebral; cã¢ncer cervical; cã¢ncer de colo; cã¢ncer de cabeã§a e pescoã§o; hepatoma; cã¢ncer do pulmã£o de cã©lulas nã£o pequenas; melanoma; mesotelioma; mieloma mãºltiplo; cã¢ncer de ovã¡rio; sarcoma; e cã¢ncer de tireã³ide. 47. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 46, caracterizado por que um ou mais primers sã£o primers de domã­nio duplo. 48. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 47, caracterizado por que produtos amplificados a partir de dois ou mais pares de primers de um subconjunto de primers podem ser distinguidos. 49. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 48, caracterizado por que os produtos amplificados a partir de dois ou mais pares de primers sã£o um subconjunto de primer sã£o distinguidos por serem de tamanhos diferentes. 50. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 49, caracterizado por que os produtos amplificados a partir de dois ou mais pares de primers de um subconjunto de primer sã£o distinguidos por serem rotulados com diferentes marcadores detectã¡veis. 51. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 50, caracterizado por que os produtos amplificados a partir do primeiro conjunto de primers e o segundo conjunto de primers sã£o distinguidos por serem rotulados com diferentes marcadores detectã¡veis. 52. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 51, caracterizado por que um ou mais primers sã£o selecionados a partir do grupo consistindo de seq id nos: 1-83. 53. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 52, caracterizado por que um ou mais primers compreendem uma sequãªncia de qualquer uma dentre seq id nos: 89-124. 54. mã©todo, de acordo com qualquer uma das reivindicaã§ãµes de 27 a 53, caracterizado por que os primers estã£o presentes na mistura de reaã§ã£o em torno das concentraã§ãµes da tabela 2.