Patent TN-2016000429-A1 (TN)
Title: Criblage et propriétés d'une nouvelle protéase thermoactive et thermostable produite par la souche VP3 d'Aeribacillus pallidus d'intérêt biotechnologique dans la formulation des détergents de lavage et dans la synthèse peptidique.
Inventor: ALIF CHEBBI
IPC: C12N15/00
Filed: 2016-10-07
Abstract: La présente invention concerne, la purification à homogénéité d'une nouvelle protéase nommée SPVP produite à partir de la souche VP3 d'Aeribacillus pallidus et la caractérisation biochimique de cette enzyme. Cette souche à été nouvellement isolée à partir d'un champ pétrolier géothermique TPS "Thyna Petroleum Services", situé à 11 km au nord-ouest de la ville de Sfax, Tunisie au cours d'une enquête antérieure réalisée au Laboratoire des Bioprocédés Environnementaux (LBPE) au CBS. La production, à l'échelle Erlenmeyer, est optimale de 3000 U/mL après 22 h de culture à 45 °C. Les techniques de purification utilisées dans ce travail, ont permis d'aboutir à une solution enzymatique homogène ayant une masse moléculaire de 29 kDa déterminée par SDS-PAGE. Sa pureté a été également vérifiée par le séquençage de son extrémité NH2-terminale (25 aa), qui montre une forte homologie avec les protéases à sérine de Bacillus avec une identité qui varie de 55 à 78%. L'optimum de l'activité protéase est obtenu à pH 10 et à 60 °C sur caséine. Cette enzyme demeure pratiquement stable aux pH basiques (7-10) pendant 24 h. Il s'agit d'une enzyme appartenant à la famille des protéases à sérine de fait qu'elle est inhibée par les inhibiteurs spécifiques des enzymes à sérines (PMSF et DFP). Sa thermoactivité et sa thermostabilité sont considérablement améliorées par le calcium à 2 mM et le xylitol à 10%. La SPVP se distingue par une large spécificité vis-à-vis des substrats protéiques et elle douée d'une meilleure efficacité catalytique en comparaison avec les protéases Alcalase Ultra 2,5 L et la Thermolysine. La SPVP est une bonne candidate dans la synthèse peptidique car elle montre une stabilité remarquable par rapport à la thermolysine du Bacillus thermoproteolyticus, en présence de divers solvants organiques à 50% (v/v) et en particulier en présence de cyclohexane, de DMSO, d'acétate d'Ethyle, de chloroforme, de 1-buthanol et de méthanol. L'enzyme SPVP présente également une stabilité remarquable en présence des surfactants (SDS), des tensioactifs (Tween 20, Tween 80 et Triton X-100) et des agents de blanchiments (Perborate de sodium et H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>). La protéase SPVP présente une stabilité et compatibilité remarquable avec les détergents liquides et solides (Alyss, Ecovax, Dipex, Nadhif, Dixan et Skip) par rapport à l'enzyme commerciale Alcalase Ultra 2,5. Egalement l'ajout de la protéase SPVP à la solution détergente améliore les performances du détergent Dipex dans le sens d'une meilleure décoloration des taches du sang. D'autre part, le gène spVP codant la nouvelle protéase SPVP a été cloné, séquencé et exprimé chez le système Escherichia coli BL21(DE3) pLysS. La protéine recombinante (rSPVP) s'exprimant chez E. coli BL21(DE3) pLysS dans l'espace extracellulaire (1000 U/mL), possède des caractéristiques identiques à celles trouvées pour la protéine native (SPVP). En conclusion, la protéase SPVP semble répondre à la majorité des propriétés d'une bonne protéase détergente et qui peut en plus assure la synthèse peptidique.