Patent RU-2620944-C1 (RU)
Inventor: ILLARIOSHKIN SERGEJ NIKOLAEVICH
IPC: C12Q1/68
Filed: 2016-12-27
Granted: 2017-05-30
Abstract: Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ выявления экспансии тринуклеотидных CGG-повторов в 5'- нетранслируемой, промоторной области гена FMR1 при заболевании синдрома атаксии/тремора, ассоциированного с ломкой Х-хромосомой (FXTAS), который проводят путем исследования образца ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Анализ длин амплифицированных фрагментов проводят с помощью капиллярного гель-электрофореза с лазер-индуцированной флуоресцентной детекцией продуктов полимеразной цепной реакции с флуоресцентно-меченым праймером и последующим выявлением наличия экспансии CGG-повторов в исследуемом ДНК-образце, ассоциированных с FXTAS. При этом выявление наличия экспансии CGG-повторов в исследуемом ДНК-образце осуществляют путем проведения амплификации локуса тандемных CGG-повторов промоторной области гена FMR1 в ПЦР с использованием двух оригинальных специфических олигонуклеотидных праймеров: прямого FMR1 F: 5'-CGCTCAGCTCCGTTTCGG-3' и обратного, меченного флуоресцентной меткой - FAM, FMR1 R: 5'-(FAM)AAGTACCTTGTAGAAAGCGCCA-3', фланкирующих анализируемый регион ДНК. Причем реакцию ПЦР фрагментов ДНК, содержащих тандемные CGG-повторы, проводят в реакционной среде, содержащей: 50 мМ KCl, 50 мМ Трис-HCl с рН 8,8, 2,5 мМ MgCl 2 , 250 мкМ дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP), 1М бетаина, 100 мкМ 7-диазагуаназин-5'-трифосфата (7-deaza-GTP), 5% диметилсульфоксида (DMSO), 0,5 ед. термостабильной ДНК-полимеразы с ингибирующими активность фермента антителами и по 0,5 пмоль каждого праймера, прямого и обратного, при следующих условиях: начальное плавление ДНК проводят в течение 900 секунд при температуре 98°С. Далее проводят 35 циклов амплификации, включающие денатурацию при 97°С в течение 45 секунд, отжиг праймеров при температуре 62°С в течение 30 секунд и синтез участка ДНК при температуре 72°С в течение 240 секунд. А завершающую элонгацию осуществляют при температуре 72°С в течение 1500 секунд, а затем размер полученных флуоресцентно-меченых фрагментов - ампликонов ДНК оценивают методом фрагментного анализа на капиллярном генетическом секвенаторе. При этом для детектируемых пиков электрофореграммы количество CGG-повторов в промоторной области гена FMR1 (N) высчитывают по формуле: N=(1,04X-237)/3, где 1,04 - поправочный коэффициент; X - размер ампликона ДНК-образца соответствующего пика на электрофореграмме; 237 - размер области ампликона вне повторов (5'-конец и 3'-конец); 3 - число нуклеотидов в одном повторе. В случае детектирования у женщин одного пика на электрофореграмме, а у мужчин отсутствия детектируемого пика повторно проводят выявление наличия экспансии CGG-повторов в исследуемом ДНК-образце путем амплификации локуса тандемных CGG-повторов промоторной области гена FMR1 в ПЦР с использованием тех же олигонуклеотидных праймеров: прямого FMR1 F: 5'-CGCTCAGCTCCGTTTCGG-3' и обратного FMR1 R: 5'-AAGTACCTTGTAGAAAGCGCCA-3' без метки с последующим разделением полученных ампликонов электрофорезом. А количество CGG-повторов в промоторной области гена FMR1 (N) высчитывают по формуле: N=(X-237)/3, где X - размер ампликона ДНК-образца соответствующей полосы на электрофореграмме; 237 - размер области ампликона вне повторов (5'-конец и 3'-конец); 3 - число нуклеотидов в одном повторе. Способ обеспечивает повышение точности выявления экспансии тринуклеотидных CGG-повторов в 5'- нетранслируемой, промоторной области гена FMR1 в области премутации и «серой зоны» за счет высокой чувствительности способа. Изобретение может быть использовано для выявления микросателлитного генотипирования экспансии тандемных CGG-повторов в гене FMR1 (fragile X mental retardation 1) при заболевании FXTAS (Fragile X associated tremor/ataxia syndrome; синдром тремора/атаксии, ассоциированный с ломкой X-хромосомой). 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.