Patent ES-2546190-T3 (ES)
Title: Método para determinar mutaciones de resistencia a fármacos en cualquiera de las regiones de proteína no estructural NS3 a NS5B del virus de la hepatitis C (HCV) para los genotipos 1 a 6
Inventor: STUYVER LIEVEN JOZEF
IPC: C12Q1/70
Filed: 2009-10-06
Granted: 2015-09-21
Abstract: Métodos para determinar mutaciones resistencia a fármacos en cualquiera de las regiones de proteína no estructural NS3 a NS5B del virus de la Hepatitis C (HCV) para los genotipos 1 a 6, más en particular para los genotipos específicos de subtipo 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 4a y 4d, presentes en una muestra que comprende: a) obtener dicha muestra de un paciente, b) extraer material genético viral de dicha muestra, c) amplificar la región NS5B de HCV para generar un amplicón de ADN de 388 pares de bases usando cebadores que tienen secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 1-5, d) secuenciar el amplicón para obtener una secuencia de 329 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 3-5, e) realizar análisis de árboles filogenéticos usando la información de secuencia de 329 pares de bases de NS5B para obtener información de subtipo de HCV en dicha muestra del paciente, f 1) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 6-9, 42-45, 104-107, 120-123, 145-148 o 180-183 para la generación de un amplicón de ADN que comprende la proteína no estructural NS3 (181 aminoácidos N-terminales), g 1) secuencia el amplicón de NS3 para obtener una secuencia de 543 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 8 y 9; 43 y 45-46; 104 y 106; 120 y 122; 146 y 148 o 180 y 182 o f2) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 13-16, 54 y 59-66, 124-133, 158 y 160-168 o 194-197 para la generación de un amplicón de ADN que comprende la polimerasa NS5B, g 2) secuenciar el amplicón de la polimerasa NS5B para obtener una secuencia de 1776 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 15-16 y 87-92; 54, 59 y 61-66; 124 y 127-133; 158-159, 161 y 163-168 o 197-204 o f 3) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 30-33, 67-70, 93-96, 108-111, 134-137 o 169-172 para la generación de un amplicón de ADN que comprende NS3/4A, g 3) secuenciar el amplicón de la proteasa NS3/4A para obtener una secuencia de 2055 pares de bases usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 34-41; 68 y 71-77; 95 y 97-103; 112- 119; 136 y 138-144 o 171 y 173-179 o f4) usar cebadores específicos de subtipo que tienen las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 47-50, 78-81,149-151 y 159 o 184-187 para la generación de un amplicón de ADN que comprende NS4B/5A, g 4) secuenciar el amplicón de NS4B y NS5A para obtener una secuencia de los dos genes NS4B y NS5A usando las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 51-57; 79 y 81-87; 152-159 o 185 y 187-193; h) alinear la secuencia obtenida en la etapa (g1), (g2), (g3) o (g4) con una secuencia de HCV de referencia o de tipo silvestre, i) determinar una o más mutaciones de resistencia a fármacos en el material genético viral presente en la muestra del paciente.