Patent ES-2811520-T3 (ES)
Title: Análisis biomolecular a gran escala con marcadores de secuencia
Inventor: ASBURY THOMAS
IPC: G16B20/00
Filed: 2014-06-30
Granted: 2021-03-12
Abstract: Un método para controlar la enfermedad residual mínima de un cáncer en un paciente después del tratamiento, en donde el método comprende las etapas de: (a) unir marcadores de secuencias a moléculas de ácidos nucleicos recombinados de genes de receptores de linfocitos T o genes de inmunoglobulina a partir de una muestra obtenida del paciente para formar conjugados marcador-ácido nucleico, en donde la muestra comprende linfocitos T y/o linfocitos B y/o ADN libre de células, en donde al menos un ácido nucleico recombinado o copias del mismo tienen etiquetas de secuencia diferentes unidas y son características del cáncer del paciente; (b) amplificar los conjugados de marcador-ácido nucleico; (c) secuenciar una muestra de los conjugados de marcador-ácido nucleico para proporcionar lecturas de secuencias teniendo cada una, una tasa de error y comprendiendo cada una, una secuencia de marcados y una secuencia de ácido nucleico recombinado; (d) alinear las lecturas de secuencias como secuencias de marcadores para formar grupos de lecturas de secuencia que tienen los mismos marcadores de secuencia; (e) fusionar lecturas de secuencia de grupos para determinar clonotipos, en donde los grupos de las lecturas de secuencias se fusionan en distintas secuencias de ácidos nucleicos recombinados siempre que dichos grupos de lecturas de secuencias sean distintos con una probabilidad de al menos el noventa y cinco por ciento; y (f) determinar el perfil de clonotipo de la muestra determinando los niveles de los clonotipos; y (g) detectar en el perfil de clonotipo la presencia, ausencia y/o nivel de clonotipos correlacionados con el cáncer del paciente, monitorizando de esta manera la mínima enfermedad residual en el paciente; y en donde las etapas de unión y amplificación comprenden: (i) combinar en una mezcla de reacción con condiciones de extensión de cebador un primer conjunto de cebadores con la muestra, en donde cada cebador del primer conjunto comprende una porción específica del receptor, un extremo 5' no complementario que contiene un primer sitio de unión del cebador y una etiqueta de secuencia dispuesta entre la porción específica del receptor y el primer sitio de unión del cebador, en donde la porción específica del receptor se hibrida con un ácido nucleico recombinado diferente en una ubicación predeterminada y se extiende para formar un primer producto de extensión; (ii) retirar de la mezcla de reacción cebadores no extendidos del primer conjunto; y (iii) añadir a la mezcla de reacción en condiciones de extensión de cebador un segundo conjunto de cebadores, en donde cada cebador del segundo conjunto comprende una porción específica del receptor y un extremo 5' no complementario que contiene un segundo sitio de unión del cebador, en donde la porción específica del receptor se hibrida al primer producto de extensión en una ubicación predeterminada, y en donde cada cebador del segundo conjunto se extiende para formar un segundo producto de extensión, y en donde cada segundo producto de extensión comprende un primer sitio de unión del cebador, un segundo sitio de unión de cebador, un marcador de secuencia y ácido nucleico recombinante que codifica una porción de una cadena de receptor de linfocitos T o una cadena de receptor de linfocitos B.