Patent RU-2750940-C1 (RU)
Inventor: NEROEV VLADIMIR VLADIMIROVICH
IPC: C12Q1/68
Filed: 2020-08-07
Granted: 2021-07-06
Abstract: Изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Изобретение представляет собой способ определения уровня экспрессии гена, кодирующего CCL-2 в тканях глаза кролика (Oryctolagus cuniculus), с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени и набора для его определения. При осуществлении способа проводят: а) использование одного референсного гена GAPDH для нормирования полученных результатов; б) подбор оригинальных пар праймеров для исследуемого и референсного генов: CCL2_1 F-5'-ATGAAGGTCTCTGCAACGCT-3', CCL2_1R-5'-CCCTTGGCCAGTTTGGTCАТ-3', GAPDHF-5'-GATTGTCAGCAACGCATCCTG-3', GAPDH_R-5'-CTCCACAATGCCGAAGTGGT-3'; в) гомогенизацию тканей глаза в течение 90 с при скорости 45000 об/мин; г) выделение мРНК из образцов с последующим добавлением к пробе 1 мкл ингибитора РНКаз; д) синтез кДНК методом обратной транскрипции; е) амплификацию исследуемого и референсного генов при помощи ПЦР в режиме реального времени с фиксацией флуоресценции при помощи интеркалирующего красителя SYBR Green (Евроген); ж) определение относительного количества гена CCL-2 и референсного гена GAPDH при помощи калибровочной кривой, построенной при амплификации образца с известной концентрацией ДНК, пятикратно разведенного в 4 раза; эффективность амплификации, определяемая уравнением калибровочной кривой, используется в расчетах относительной величины и нормированной экспрессии исследуемого гена. Набор для определения уровня экспрессии гена, кодирующего CCL-2 кролика Oryctolagus cuniculus, включает: а) оригинальные олигонуклеотидные праймеры для гена CCL-2 кролика Oryctolagus cuniculus: CCL21F-5'-ATGAAGGTCTCTGCAACGCT-3', CCL2_1R-5'-CCCTTGGCCAGTTTGGTCAT-3'; б) оригинальные олигонуклеотидные праймеры для гена GAPDH кролика Oryctolagus cuniculus: GAPDHF-5'-GATTGTCAGCAACGCATCCTG-3', GAPDH_R-5'-CTCCACAATGCCGAAGTGGT-3'; в) реакционную смесь ПНР в режиме реального времени для амплификации гена CCL-2, содержащую: вода дистиллированная 9,4 мкл, буфер 1,5 мкл (Евроген), прямой праймер CCL-2_F (концентрация 1 мкМ; Mw 60,98 г/моль) 1 мкл, обратный праймер CCL-2_R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,56 г/моль) 1 мкл, dNTP 0,5 мкл, кДНК 1 мкл, SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл, Taq-полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан); г) реакционную смесь ПЦР в режиме реального времени для амплификации гена GAPDH, содержащую:  вода дистиллированная 9,4 мкл, буфер 1,5 мкл (Евроген), прямой праймер GAPDH_F (концентрация 1 мкМ; Mw 63,86 г/моль) 1 мкл, обратный праймер GAPDH_R (концентрация 1 мкМ; Mw 60,83 г/моль) 1 мкл, dNTP 0,5 мкл, кДНК 1 мкл, SYBR Green I [1:25000] 0,3 мкл, Taq-полимераза (0,5 ед./мкл) 0,3 мкл (Биосан); д) протокол реакции амплификации генов CCL-2 и GAPDH, включающий: первичная денатурация - 3 мин, 95°С, амплификационный цикл (х45), денатурация - 15 с, 95°С, отжиг праймеров - 20 с, 56,2°С, элонгация и съем флуоресцентного сигнала - 30 с, 72°С. Изобретение обеспечивает получение протокола пробоподготовки, постановки и расчетов результатов ОТ-ПЦР с оптимально подобранным для этого комплектом реагентов, позволяющих с высокой точностью воспроизвести реакцию в условиях ПЦР-лабораторий, для дальнейшего использования в экспериментальной офтальмологии, в доклинических исследованиях медицинских изделий и, в частности, при испытании противовоспалительных лекарственных средств. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 1 пр.