Patent RU-2740097-C1 (RU)
Title: Способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCov19) у приматов
Inventor: Chernykh Oleg Yurevich
IPC: C12Q1/68
Filed: 2020-08-11
Granted: 2021-01-11
Abstract: Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Описан способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCoV19). Способ включает выделение РНК из биологического материала по выбору: мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смывы, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал, образцы культуральной жидкости, экстракты фекалий, фрагменты органов брюшной полости, взятый от животных, инфицированных возбудителем коронавирусной инфекции сорбционным методом. Далее синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего и положительного контролей образцов мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов: внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага MS2 с концентрацией 5×10 3  копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл и положительного контрольного образца в виде смеси рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя коронавирусной инфекции и фрагмент генома бактериофага MS2, взятых в соотношении 1:1. Потом измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналу для специфического сигнала и каналу Cy5/Red для сигнала внутреннего контроля и интерпретацию результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией - Threshold, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считают положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный. Согласно изобретению биологический материал берут у приматов, инфицированных возбудителем коронавирусной инфекции нового типа nCoV19, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа nCoV19 и фрагмент генома бактериофага MS2 со следующими нуклеотидными последовательностями: 
     nCoV19-F 5'- GGAACTTCTCCTGCTAGA -3' - прямой праймер 
     nCoV19-R 5' - GCTGGTTCAATCTGTCAA -3' - обратный праймер 
     nCoV19-Р 5' -ROX- AAGCAAGAGCAGCATCACCGC -3' -BHQ2 - зонд 
     MS2F, 5'-TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3' - прямой праймер 
     MS2R, 5'-GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3' - обратный праймер 
     MS2P, Cy5 5'-CACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3'-BHQ2-зонд. Для специфического сигнала накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналу ROX/Orange. Изобретение расширяет арсенал средств диагностики коронавирусной инфекции у приматов, как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований. Изобретение расширяет функциональные возможности и получение достоверной диагностики коронавирусной инфекции нового типа (nCovl9) у приматов, в способе выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCovl9) у приматов. 4 табл., 1 пр.