Patent SU-1830945-A1 (SU)
Title: Рекомбинантная плазмидная днк pldb (alphoil), обеспечивающая биосинтез и секрецию человеческого интерлейкина-2 в дрожжах, способ ее конструирования и штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae - секреторный продуцент человеческого интерлейкина-2
IPC: C12N15/81
Filed: 1988-12-26
Granted: 1999-08-10
Abstract: 1. Рекомбинантная плазмидная ДНК plDB(ALPHOIL), обеспечивающая биосинтез и секрецию человеческого интерлейкина-2 в дрожжах, мол.м. 5,3 мДа и размером -8,1 т.п.о., содержащая: - Hind III - Sal I - фрагмент плазмидной ДНК бифункционального бактериально-дрожжевого вектора plDB 207 размером 6,3 т.п. о. , включающий бактериальный ген устойчивости к ампициллину, бактериальную область инициации репликации, дрожжевой ген LEU2, а также фрагмент дрожжевой двумикронной плазмиды, обеспечивающий репликацию плазмиды в клетках дрожжей; - Sal I - Bam H1 - фрагмент полилинкера плазмиды pUC 19 размером 20 п.о.; - Bam H1 - Sau 3A - фрагмент промотора гена PHO5 дрожжей плазмиды pVY 18 размером 0,35 т.п.о. с участком, ответственным за регуляцию активности промотора неорганическим фосфатом; - Eco 471 - Hind III - фрагмент гена MFA1pha1 дрожжей из плазмиды p69A с промотором и препрообластью кодирующего участка этого гена размером 0,45 т. п. о.; - Cfr 131 - Sal I - фрагмент плазмиды pAA12, 13-23 с кодирующей частью интерлейкина-2 человека размером 0,56 т.п. о.; - Sma I - Hind III - фрагмент плазмиды pMS46 с терминатором транскрипции гена PH05 дрожжей размером 0,4 т.п.о.; - сайты рестрикции: 2 Sal I, 2 Bam H1, 2 Xba I и 2Eco R I; генетические маркеры: - бактериальный ген fla, обеспечивающий синтез бета-лактамазы в бактериях и устойчивость к ампициллину; - дрожжевой ген LEU2, обеспечивающий биосинтез изопропилмалатдегидрогеназы в дрожжах и возможность роста мутантов LEU2 на селективных средах без лейцина; - регуляторные области и гены; - бактериальный локус ori, обеспечивающий репликацию плазмиды в клетках E.coli; - фрагмент двумикронной ДНК дрожжей, обеспечивающий автономную репликацию плазмиды в дрожжах; - регуляторный участок промотора гена PHO5 дрожжей, обеспечивающий регулируемость экспрессии интерлейкина-2; - фрагмент промотора и начало кодирующей части гена NFalpha1 дрожжей, обеспечивающий инициацию транскрипции и транспорт интерлейкина-2 по секреторному пути дрожжей; - терминатор транскрипции гена PHO5, обеспечивающий правильную терминацию транскрипции гена интерлейкина-2 в дрожжах; - кодирующую часть гена интерлейкина-2, кодирующую структуру этого белка.2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК plDB(ALPHOIL), обеспечивающей биосинтез и секрецию человеческого интерлейкина-2 в дрожжах, заключающийся в том, что конструируют плазмиду pAC 137 в результате сборки Bam H1-Sau 3A -фрагмента промотора PHO5 из плазмиды pVY 18 размером 0,35 т. п.о., Eco 471 - Hind III - фрагмента гена MFA1pha1 из плазмиды p69A размером 0,51 т.п.о. и векторного Sal I - Hind III - фрагмента ДНК плазмиды plDB 207 размером 6,3 т.п.о., далее фрагмент гена интерлейкина-2 из плазмиды pAA 12, 13-23, ограниченный рестрикционными сайтами Cfr 131 размером 0,80 т.п.о., лигируют с векторной частью плазмиды pAC 137, гидролизованной рестриктазой Hind III, получают плазмиду pACL, осуществляют стыковку конструкций - Sal I - Xba I - фрагмента плазмиды PACIL размером 1,1 т.п.о. с терминатором транскрипции гена PHO5 и Xba I - Hind III - фрагмента плазмиды pMSIL размером 0,9 т.п.о. с векторной частью плазмиды plDB 207 - Sal I - Hind III - фрагментом размером 6,3 т.п.о. с последующим подтверждением структуры плазмиды pIDB(ALPHOIL) рестрикционным анализом.3. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevislae ВКПМУ-1038 секреторный продуцент человеческого интерлейкина-2.