Patent KR-0121324-B1 (KR)
Inventor: GEARING DAVID PAUL
IPC: C12N15/19
Filed: 1988-03-31
Granted: 1997-11-28
Abstract: 본 발명에 의한 LIF는 다음 두가지 특성을 가지는 분자로서 정의된다: 
     (1) 백혈병 세포의 관련된 분자와 함께 M1 세포와 같은 골수양 백혈병 세포의 증식을 억제하는 능력을 가진다; 및 (2) M1 세포 또는 쥐 또는 인체 대식세포상의 특이 세포성 수용체에 결합하기 위한, 쥐 LIF 또는 인체 LIF의 한정 서열을 갖는 분자와 경쟁한다.  LIF는 골수양 백혈병의 일부 형태를 억제하는 치료적비 증식제로서뿐 아니라 대식세포 기능 및, 감염에 대한 다른 반응 변형 및 이와 관련된 임상 시험과 조사연구를 위한 시약으로서 사용될 수 있는 잠재성을 가지고 있다. 
     용어 LIF 활성을 가지는 폴리펩티드는 상술한 LIF의 특성을 가진 폴리펩티드 또는 글리코폴리펩티드를 의미하며, 본 명세서에서 설명되는 바와 같이, 쥐 또는 인체 LIF의 아미노산 서열과 완전히 또는 부분적으로 상동인 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하지만 이것에 한정되는 것은 아니다.  이용어는 또한 쥐 또는 인체 LIF의 아미노산 서열의 단지 일부분과 완전히 또는 부분적으로 상동인 폴리펩티드로서 상술한 LIF 특성을 가지는 것을 포함한다.  이 용어는 또한, 숙주 세포에서 발현에 의해 산출된 것으로 발현시에는 불활성적이지만 숙주 세포에 의해 프로세싱되어 활성 분자를 산출하는 폴리펩티드 또는 글리코폴리펩티드뿐 아니라 발현시에는 불활성적이지만 생체외 또는 생체내에서 선택적으로 절단가능하여 활성 분자를 산출할 수 있는 폴리펩티드 또는 글리코펩티드를 포함한다. 
     쥐의 LIF는 다음의 생물학적 특성을 가지는 분자이다. 
     (a) 증식 능력이 상실된 쥐의 골수양 백혈병 세포주 M1 세포에서의 대식세포 분화 및 G-CSF에 의해 상승작용되는 클론원성(clonogenic) 백혈병 세포의 사멸 유도; 
     (b) 복강, 비장 및 골수로부터의 M1 세포 및 정상적인 쥐 단일구 및 대식세포상의 고 친화성 수용체에는 선택적으로 결합(그 수용체 수는 대식세포 성숙 또는 기능적 활성화에 따라 증가함) 하지만 상기 조직으로 부터의 과립구, 적혈구 또는 임파구 세포에는 결합하지 않음; 
     (c) 고 친화성 수용체에 대한 125 I-LIF의 특이성 결함은 G-CSF, GM-CF, 멀티-CSF(인터류킨-3), M-CSF, 인터류킨 1,2,4 또는 6, 엔도톡신 또는 여러가지 다른 성장 인자들에 의해 경쟁받지 않지만 비라벨된 LIF에 의해서는 경쟁받음; 
     (d) 정상 또는 무흉선증 마우스의 혈청에서는 박테리아 엔도톡신에 의해 상승하지만 엔도톡신-내성 C3H/HeJ 마우스에서는 상승하지 않음; 
     (e) 폐, 타액선, 복막 세포 및 골간을 비롯한 여러 조직에 의해 생산됨; 
     (f) CSF없이 성장할때 정상적인 과립구-대식세포 선조 세포의 시험관내 생존 시간의 감소; 
     (g) 쥐의 백혈병 세포주 WEH1265와 WR19인 GM-CSF 또는 멀티-CSF를 발현하는 레트로비루스로 감염됨으로써 백혈병원성으로 형질전환된 쥐의 골수양세포인 WEHI-3D + 쥐 골수양 백혈병 세포의 증식 억제 또는 분화 유도의 불능; 
     (h) 과립구, 대식세포, 호산구, 거핵구, 적혈구 및 마스트 셀 계통의 정상적인 선조 세포의 증식을 자극할 수 없으며 정상의 과립구, 대식세포, 거핵구, 호산구 또는 천연 세포독성 세포 선조체의 시험관내 CSF에 의한 자극에 대한 정량적 반응을 변경시키거나 그 선조체의 클론성 증식 또는 연속 세포주 32CD1.13과 FDCF-1의 세포 증식을 억제할 수 없음; 
     (i) M1과 WEHI-3B D + 쥐의 골수양 백혈병 세포에서 분화를 유도하며 M1 세포에 대한 LIF의 작용을 상승 협력하는 G-CSF의 능력에도 불구하고 특히 세포성 수용체에 대해 결합하기 위해 과립구 콜로니자극 인자(G-SCF)의 요오드화 유도체와 결합할 수 없음; 
     (j) LIF의 작용이 종양괴사 인자(TNF)에 대하여 특이적으로 산출된 항혈청에 의해 억제될 수 없음; 
     (k) 쥐 LIF에 대한 전사체가 LB3과 E9.D4 T 세포의 세포질에서 계속 존재하고 이 세포들에서 렉틴 콘카발린 A에 의해 유도되지 않으며 많은 다른 형태의 세포에서 존재함. 
     쥐의 LIF는 또는 다음 특성들을 가지는 것으로 결정되었다; 
     (L) 환원제(2-메르캅토에탄올 또는 디티오트레이톨)존재 또는 부재하에 소듐 도데실 설페이트를 함유한 8-25% 구배의 폴리아크릴아미드 겔에서 전기 영동에 의해 측정시 분자량이 58,000±5,000이고 엔도글리코시다체, N-글리카나제로 처리된 후 분자량이 23,000±5,000인 단일 소단위(subunit) 당단백질; 
     (m) 8.6 내지 9.3이 등전점; 
     (n) 제 10 도, 11 도 및 15 도에 상세히 나타낸 일차 아미노산 서열; 
     (o) 제 10 도, 11 도 및 15 도에 상세히 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 암호됨; 
     (p) 1-2×10 8 유니트/mg의 특이 활성(60 유니트는 1밀리리터에서, 쥐의 M1 골수양 백혈병 세포에 의해 클론 형성시 50%가 감소되는 LIF의 양을 나타냄); 
     (q) 제 19 도에 나타낸 바와 같은 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 의해 결합된 쥐의 염색체 11(아무스/차이니스 햄스터 난소 체세포 하이브리드의 판넬 분석으로 측정됨)상의 독특한 유전자에 의해 암호됨; 
     (r) 제 27 도에 나타내는 바와같은 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 의해 염색체성 DNA에서 결합된 인체 유전자 서열과 상동임. 
     인체 LIF는 하기의 천연 및/또는 효모 유도된 재조합 생성물의 생물학적 특성을 가지는 분자이다 : 
     (a) 증식 능력이 없는 쥐의 골수양 백혈병 세포주 M1의 세포내 대식세포 분화 및 클론원성 백혈병 세포의 사멸 유도; 
     (b) 과립구, 대식세포, 호산구 및 적혈구 계통의 정상적인 인체 선조 세포의 증식을 자극시키는 능력이 없음; 
     (c) G-CSF와 하게 인체 백혈구 세포주 U937의 세포 증식을 부분적으로 억제하며, GM-CSF와 함께 인체 백혈병 세포주 U937과 HL60의 증식을 부분적으로 억제하는 능력을 가짐; 
     (d) M1 세포와 주의 대식세포상의 쥐의 LIF 수용체에 특이적으로 결합하며 상기 세포들에 쥐의 125 I-LIF이 결합하는 것에 대해 완전하게 경쟁; 
     (e) 인체 간암 세포주 Hep-2G 상의 특이적 세포성 수용체에 결합; 인체 LIF는 또한 다음 특성들을 갖는 것으로 밝혀졌다; 
     (f) 성숙 단백질에서 아미노산 잔기의 약 80%가 쥐의 LIF와 동일; 
     (g) 제 25 도, 26 도 및 29 도에 나타낸 일차 아미노산 서열; 
     (h) 제 27 도에 나타낸 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 의해 염색체 DNA에 결합된 독특한 유저자에 의해 암호됨; 
     (i) 이것의 유저자 서열의 일부분으로서, 제 25 도에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가짐. 
     본 발명의 일차적 관점에서, 백혈병-억제 인자(LIF)가 거의 순수한 형태로 제공된다.  본 발명은 또한 거의 순수한 LIF의 생산 방법, 특히, 크렙스 Ⅱ 복수 종양 세포로부터 정제함으로써 거의 순수한 쥐의 LIF를 생산하는 방법 및, 인체 방광암 세포주 5637(ATCC No : HTB 9)부터 정제함으로써 거의 순수한 인체 LIF를 생산하는 방법을 제공한다.  거의 순수한 LIF는 LIF의 아미노산 서열 또는 그 일부분을 암호하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 효모 세포, 포유동물 세포 및  이. 콜리와 같은 세포에 의해 또한 생산될 수 있다. 
     거의 순수한 형태란 적어도 90%의 폴리펩티드 또는 글리코폴리펩티드가 적합한 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기 영동될때 하나의 밴드로서 나타나는(그 밴드는 LIF 활성과 일치함)폴리펩티드 또는 글리코폴리펩티드의 형태를 의미한다. 
     또 다른 관점에서는, LIF 단백질을 완전히 또는 부분적으로 암호화는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 DNA 클론의 분리 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 LIF의 특징인 것으로 결정된 독특한 아미노산서열을 암호하며 또한 LIF의 완전한 아미노산 서열을 추론할 수 있도록 하는 능력을 가지는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 
     또다른 관점에서, 본 발명은 LIF(또는 그것과 거의 유사한 유사체)를 완전하게 또는 부분적으로 암호하는 전술한 뉴클레오티드 서열이, 완전하게  또는 부분적으로 LIF의 합성 및 생산을 유도할 수 있는 형태로 함유된 재조합 DNA 분자에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 관점은 또한 재조합 DNA 분자가 삽입되어 있는 클로닝 벡터(플라스미드 등)와 숙주 세포까지도 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 DNA 분자의 발현 또는 펩티드 합성으로 생산된 합성 LIF, 완전히 또는 부분적으로, 또는 그것과 거의 유사한 유사체에 관한 것이다.