Patent ES-2868328-T3 (ES)
Title: Cuantificación precisa y masivamente paralela de ácido nucleico
Inventor: TAMMINEN MANU
IPC: C12Q1/6869
Filed: 2018-08-23
Granted: 2021-10-21
Abstract: Un método para la detección de alto rendimiento de una o más secuencia de nucleótidos diana en una pluralidad de muestras, comprendiendo el método las etapas de: (i) proporcionar para cada secuencia de nucleótidos diana en cada una de las muestras: una primera sonda, una segunda sonda y un oligo de puente, en donde la primera sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una primera secuencia específica de oligo de puente, opcionalmente una primera secuencia de código de barras, y una primera porción específica de diana en el extremo 3' de la primera sonda; y en donde la segunda sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una segunda porción específica de diana, opcionalmente una segunda secuencia de código de barras, y una segunda secuencia específica de oligo de puente en el extremo 3' de la segunda sonda; y en donde el oligo de puente contiene secuencias complementarias a la primera secuencia específica de oligo de puente y la segunda secuencia específica de oligo de puente en la primera sonda y en la segunda sonda, respectivamente, y opcionalmente un tercer código de barras; en donde al menos una de la primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras o el tercer código de barras está presente en la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente, respectivamente; y en donde una secuencia promotora para una ARN polimerasa T7 está presente en la primera sonda, la segunda sonda o el oligo de puente, (ii) poner en contacto, para cada una de la una o más secuencia de nucleótidos diana, la primera sonda y la segunda sonda con, preferentemente para cada una de las muestras en un tubo separado, el oligo de puente y permitir auto-hibridar en una pluralidad de complejos de ligación; (iii) poner en contacto los ácidos nucleicos presentes en la pluralidad de muestras a probar para las secuencias de nucleótidos diana con la pluralidad de complejos de ligación; (iv) permitir que la primera porción específica de diana y la segunda porción específica de diana de la respectiva primera sonda y segunda sonda hibriden con secciones esencialmente adyacentes en la secuencia diana, formando de esta manera un complejo de hibridación; (v) ligar la primera sonda y la segunda sonda en los complejos de hibridación para proporcionar complejos de ligación ligados, (vi) poner en conjunto los complejos de ligación ligados de la pluralidad de muestras, (viii) amplificar el ARN del uno o más complejos ligados usando ARN polimerasa T7 que inicia la síntesis de ARN desde el promotor de ARN polimerasa T7 embebido en los complejos de ligación ligados; (xi) opcionalmente, preparar el ADNc a partir de las moléculas de ARN usando una molécula de oligonucleótido de ADN que es complementaria inversa a un sitio universal 2; (xii) someter las moléculas de ARN o ADNc a tecnología de secuenciación de alto rendimiento para determinar la secuencia o secuencias identificadoras; e (xiii) identificar la presencia y/o el número de la secuencia de nucleótidos diana en la pluralidad de muestras mediante determinación de al menos parte de la primera porción específica diana y/o la segunda porción específica diana, y/o al menos parte del primer código de barras, y/o el segundo código de barras y/o al menos parte del tercer código de barras.