Patent ES-2876432-T3 (ES)
Title: Técnicas de síntesis de ácidos nucleicos
Inventor: RONAGHI MOSTAFA
IPC: C12Q1/68
Filed: 2015-05-14
Granted: 2021-11-12
Abstract: Un método para sintetizar un ácido nucleico que comprende una secuencia diana, comprendiendo el método: (i) proporcionar una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico que solapan, en donde la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico tiene secuencias complementarias de al menos otro fragmento de la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico, en donde un primer fragmento de la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico comprende un primer adaptador escindible y un extremo 5' de la secuencia diana, en donde un extremo del primer fragmento comprende el primer adaptador escindible, y en donde un último fragmento de la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico comprende un extremo 3' de la secuencia diana, en donde un extremo del último fragmento comprende un segundo adaptador escindible, en donde proporcionar una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico que solapan comprende: (a) generar una pluralidad del primer fragmento, que comprende: proporcionar una pluralidad de oligonucleótidos inmovilizados sobre un sustrato de síntesis mediante hibridación con una pluralidad de primeros cebadores inmovilizados complementarios de los extremos 5' de los oligonucleótidos, en donde cada oligonucleótido respectivo comprende el primer adaptador escindible en un extremo 5', extender los oligonucleótidos para generar polinucleótidos extendidos, en donde la extensión comprende incorporar una pluralidad de nucleótidos o ácidos nucleicos individuales en los extremos 3' de los oligonucleótidos de la pluralidad de oligonucleótidos, unir un adaptador de amplificador en los extremos 3' de los polinucleótidos extendidos que tienen la primera secuencia terminal, reasociar los extremos 3' de los polinucleótidos extendidos con el sustrato de síntesis mediante una pluralidad de segundos cebadores inmovilizados complementarios de los extremos 3' de los polinucleótidos extendidos para formar puentes, amplificar los puentes para formar una pluralidad de grupos amplificados de los puentes, secuenciar la pluralidad de grupos amplificados de los puentes para determinar la presencia de la primera secuencia terminal en uno o más de la pluralidad de grupos amplificados de los puentes y una tasa de error de síntesis, y recoger selectivamente el uno o más de la pluralidad de grupos amplificados de los puentes basándose en la tasa de error de síntesis; y (b) combinar los grupos amplificados recogidos que tienen la primera secuencia terminal con una segunda pluralidad de grupos amplificados, en donde al menos una parte de la segunda pluralidad de grupos amplificados comprende una secuencia complementaria de solo una parte de la primera secuencia terminal, obteniendo así una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico; (ii) inmovilizar el primer fragmento sobre un sustrato con un primer cebador inmovilizado complementario del primer adaptador escindible; (iii) ensamblar la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico en una molécula de polinucleótido ensamblada mediante hibridación de las secuencias complementarias, en donde la molécula de polinucleótido ensamblada es parcialmente bicatenaria y comprende huecos en ambas cadenas, en donde el polinucleótido ensamblado se inmoviliza sobre el sustrato por el primer cebador inmovilizado complementario del primer adaptador escindible; (iv) amplificar la molécula de polinucleótido ensamblada sobre el sustrato para generar un grupo amplificado que comprende amplicones de la molécula de polinucleótido ensamblada sobre el sustrato; (v) secuenciar el grupo amplificado para determinar una tasa de error de síntesis; y (vi) recoger selectivamente el grupo amplificado basándose en la tasa de error de síntesis.