Patent KR-20150085806-A (KR)
Title: 암 줄기세포 검출을 위한 cd133 앱타머
Inventor: DUAN WEI
IPC: C12N5/09
Filed: 2013-08-02
Abstract: 최근 암 줄기세포는 종양 조직의 형성 및 성장 그리고 전통적 화학요법들이 처음에는 종양을 축소시킬 수 있지만, 종양 전체를 근절하는 것에는 실패하여, 궁극적으로 재발한다는 결과를 설명하는 자연적 화학요법 내성에 책임 있는 것으로 평가되고 있다.    암 줄기세포 가설에 따르면, CD133 양성 세포는 긴시간 종양 성장을 결정함에 따라서 임상 결과에 영향을 미치는 것으로 의심된다.    최근 CD133 양성 세포의 부분 및 그들의 클러스터(clusters)안에 위상적 조직(topological organisation) 둘다에 종양 등급(grade)의 부정적인 진행-프리 생존(adverse progression-free survival) 및 전체의 독립적 생존, 절제술 범위 또는 환자의 연령이 중요한 예후 인자라는 사실을 발견하였다.  
CD133-양성 암 줄기세포의 검출 및 타겟팅을 위한 현재 병리학적 기술들은 종래의 항체 기반 시스템이 사용되지만, CD133 항체의 이용은 크기 및 조직 침투에 그것의 상대적 불능 때문에 민감도가 떨어진다.  
따라서, CD133 +  세포에 앱타머의 생성은 암의 박멸에 유리할 것이다.    이에 본 발명자는 빠른 내부화 및 우수한 종양 침투를 보이는 CD133에 특이적인 앱타머를 발견하여 현재의 문제점를 해결하고자 하였다. 
본 발명은 특이적으로 CD133에 결합하는 분리된 RNA 앱타머를 제공한다.   일 예에서, CD133은 인간 CD133 이다. 
일 예에서, 본 발명의 앱타머는 CD133이 발현된 HT-29 세포에서 82-145 nM 범위의 해리 상수를 가진다.    또 다른 예에서, 본 발명의 앱타머는 CD133이 발현된 Hep3B 세포에서 32-52 nM 범위의 해리 상수를 나타낸다. 
일 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 공통적 서열 5'-CCCUCCUACAUAGGG-3'(서열목록 제1서열)을 포함한다.  
또 다른 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 다음으로부터 선택된 서열을 포함한다:  
(i) 5’ -GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA CCC A CC CUC CUA CAU AGG G AG GAA  
CGA GUU ACU AUA GAG CUU CGA CAG GAG GCU CAC AAC- 3’(서열목록 제2서 
열); 
(ii) 5’ -GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA CCC A CC CUC CUA CAU AGG G AG GAA  
CGA GUU ACU AUA G-3’(서열목록 제3서열); 
(iii) 5’ -GCU CAA CCC A CC CUC CUA CAU AGG G AG GAA CGA GU-3’(서열목 
록 제4서열); 
(iv) 5’ -CC A CC CUC CUA CAU AGG G UG G-3’(서열목록 제5서열); 및 
(v) 5’ - CC CUC CUA CAU AGG G -3’(서열목록 제1서열). 
또 다른 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 공통적 서열 5’ -CAGAACGUAUACUAUUCUG- 3’(서열목록 제6서열)을 포함한다. 
또 다른 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 공통적 서열 5’ -AGAACGUAUACUAUU- 3’(서열목록 제7서열)을 포함한다. 
또 다른 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 서열 5’ -GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA GGA AAG CGC UUA UUG UUU GCU AUG UU A GAA CGU AUA CUA UU U CGA CAG GAG GCU CAC AAC AGG C-3’(서열목록 제8서열)을 포함한다. 
특정 예에서, 본 발명은 2'-플루오로-피리미딘 변형 및 CD133에 특이적으로 결합하는 분리된 RNA 앱타머를 제공한다. 
또 다른 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제6서열을 필수적으로 구성한다. 
또 다른 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제6서열을 구성한다. 
또 다른 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 15 염기 내지 100 염기 서열 길이의 공통적 서열 CCCUCCUACAUAGGG(서열목록 제1서열), 또는 공통적 서열 CAGAACGUAUACUAUUCUG(서열목록 제6서열), 또는 공통적 서열 AGAACGUAUACUAUU(서열목록 제7서열)을 포함한다.    또 다른 예에서, 15 내지 40 염기 길이. 또 다른 예에서, 19 염기 내지 100염기의 서열 길이. 추가 예에서, 길이는 19 내지 40 염기이다. 
서열은 앱타머의 결합 루프을 유지하는 공통적 서열에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함 할 수 있다.    일 예에서 서열은 공통적 서열에 하나 이상을 치환을 포함한다.    일 예에서, 서열은 적어도 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제6서열에 따른 앱타머의 기본 영역 공통적 서열에 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 개의 치환을 포함한다.    또 다른 예에서, 기본 영역은 앱타머의 예측된 이차원적인 구조이다. 
일 예에서, 앱타머는 앱타머의 안정성이 개선된( 인 비트로  또는  인 비보 ) 하나 이상의 변형(변형된 앱타머)를 포함한다.    적합한 변형들은 본 명세서의 다른 곳에서 논의된다.    일 예에서, 피리미딘 염기는 2‘-플루오로(2'-F)로 변형된다.    또 다른 예에서, RNA 앱타머의 3’말단은 뉴클레아제 절단으로부터 보호하기 위해 변형된다.    또 다른 예에서, 앱타머는 5‘ 말단에 형광물질 또는 반전된(inverted) dT 결합에 의해 변형된다. 
본 발명은 또한 서열목록 제1서열, 서열목록 제6서열, 또는 서열목록 제7서열의 서열을 포함하는 앱타머의  CD133 결합에 상당히 동일한 능력을 가지는 분리된 RNA 앱타머를 제공한다. 
일 예에서, 앱타머는 특이적으로 CD133 +  세포에 결합한다.    또 다른 예에서, CD133 +  세포(들)은 줄기세포(들)이다.    또 다른 예에서, 줄기세포는 분리된 암 줄기세포(들)이다.    또 다른 예에서, 암 줄기세포(들)은 (i) CD133 발현, (ii) 종양성, (iii) 자가 재생 가능, (iv) 분화 가능 및 (v) 종래 치료에 의한 세포 사멸 저항의 특징을 가지고 있다. 
암 줄기세포는 생물학적 시료와 같은 원천으로부터 선택적으로 형성, 분리, 농축 또는 정제되어 질 수 있다.    또 다른 예에서, 암 줄기세포(들)은 CD133 +  발현을 기초로 농축된 세포들을 대신한다.    또 다른 예에서, 세포들은 최소 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 의 암 줄기세포를 포함한다. 
일 예에서, CD133 발현 세포 및/또는 암 줄기세포는  인 비보  존재한다.    
또 다른 예에서, CD133 발현 세포 및/또는 암 줄기세포는  인 비트로  존재한다.    추가된 예에서 CD133 발현 세포 및/또는 암 줄기세포는 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료내에 존재한다. 
또 다른 예에서, 본 발명의 CD133 발현 세포 및/또는 암 줄기세포는 CD44, ABCG2, β 카테닌, CD117, ALDH, VLA-2, CD166, CD201, IGFR, EpCAM 및 EGF1R을 포함한 하나 이상의 추가 항원을 발현할 수 있다. 
또 다른 예에서, 본 발명에 따른 암 줄기세포는 뇌암 줄기세포, 유방암 줄기세포, 전립선암 줄기세포, 췌장암 줄기세포, 대장암 줄기세포, 간암 줄기세포, 폐암 줄기세포, 난소암 줄기세포, 피부암 줄기세포 또는 흑색종 줄기세포 이다. 
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머를 포함하는 진단제을 제공한다. 
일 예시에서, 상기 RNA 앱타머를 포함하는 진단제는 검출 가능한 표지와 커플링한다.  
본 발명의 앱타머는 비 특이적 항체 결합 및 우수한 신호 대 잡음 비율(superior signal to noise ratio)과 관련있는 문제들를 피할 수 있다는 것을 당업자들은 이해할 것이다. 
일 예에서, 본 발명의 진단제는  인 비보  또는  인 비트로  CD133 발현 암 줄기세포를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 
일 예에서, 본 발명의 RNA 앱타머는 대상 또는 종양으로 의심되거나 갖는 또는 종양, 종양을 갖는 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료로부터 얻은 CD133 발현 세포 및/또는 암 줄기세포, 검출을 위해 진단학적으로 사용될 수 있다.    검출은  검출 가능한 표지에 앱타머를 연결함으로 가능할 수 있다.    검출 표지의 예는 각종 효소, 보결기, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 전자 밀도 라벨, MRI 용 라벨 및 방사성 물질을 포함한다.  
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 생물학적 시료들을 조직학적 검사에 사용하기 위해  본 명세서에 기재된 RNA 앱타머 또는 진단제를 제공한다.    조직학적 제제를 준비하는 방법은 당업자들에게 익숙할 것이다.  
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머를 포함하는 항암제를 제공한다. 
일 예에서, 항암제는 모이어티(moiety)에 커플링된 본 발명의 RNA 앱타머를 포함한다. 
일 예에서, 본 발명의 항암제는 대상의 암 치료를 위해 사용된다.    일 예에서, 대상은 본 발명의 RNA 앱타머를 가진 치료 이점 중에 하나이다.    또 다른 예에서, 대상은 암으로 진단된 것 중 하나이다.    추가 예에서, 대상은 뇌암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 간암, 폐암, 난소암, 피부암, 흑색종 또는 CD133 +  세포가 존재하는 다른 암으로부터 선택된 암 중에 하나이다. 
본 발명의 앱타머는 모이어티(moiety)에 커플링할 수 있고, CD133 발현 암 줄기세포(들)을 포함하는 것으로 의심되는 종양 부위에 직접적인 모이어티(moiety)로 사용된다.    모이어티(moiety)의 예로는 독소, 방사성 핵종 또는 암 줄기세포를 죽이는 데 사용 가능한 화학적 제제 또는 CD133 발현 세포를 포함하는 종양 위치 및 크기를 알 수 있는 조영제를 포함한다. 
본 발명의 RNA 앱타머를 포함하는 항암제는 추가적으로 하나 이상의 유효 성분을 포함 할 수 있다. 
본 발명은 또한 CD133 발현 세포(들) 및/또는 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료로부터 암 줄기세포(들) 분리, 정제 또는 농축를 위한 방법, 본 발명의 RNA 앱타머와 세포를 접촉시키는 방법 또는 본 발명의 진단제를 제공한다.    일 예에서, 상기 방법은  인 비트로 에서   실시된다. 
CD133 발현 세포들 분리, 정제, 농축 방법들은 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서의 다른 곳에 기재된다. 
본 발명은 또한 CD133 발현 세포(들) 및/또는 대상 또는 암으로 진단, 의심되어지는 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료에 암 줄기세포의 검출 방법, 본 발명의  분리된 RNA 앱타머 또는 본 발명의 진단제와 세포를 접촉시키는 방법을 제공한다.  
본 발명은 또한 본 발명의 RNA 앱타머 또는 본 발명의 항암제 대상으로 제공되어 포함된 대상의 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 
일 예로서, 암은 CD133 발현 세포 및/ 또는 암 줄기세포가 존재하거나 존재하는 것으로 의심되는 임의의 암이다.    또 다른 예에서, 대상은 암으로 진단된 것 중 하나이다.    추가 예에서, 대상은 CD133 +  세포가 존재하는 뇌암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 간암, 폐암, 난소암, 피부암, 흑색종 또는 다른 암으로부터 선택된 암 중에 하나이다. 
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머 또는 항암제의 의학적 용도에 관한 것이다. 
본 발명은 또한 대상에 암을 치료 또는 예방하기 위해서 본 명세서에 기재된  RNA 앱타머 또는 항암제의 용도에 관한 것이다. 
본 발명은 또한 대상에 암을 치료 또는 예방을 위해서 약제학적 조제에서 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머 또는 항암제의 용도에 관한 것이다. 
본 발명은 또한 siRNA 또는 리보자임에 커플링된 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머를 포함하는 전달체에 관한 것이다. 
본 발명은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 함께 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머, 항암제 또는 전달체의 치료학적 유효량을 포함한 조성물을 제공한다. 
본 발명은 또한 종양의 분자 이미지화 용도을 위해서 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머 또는 전달체를 제공한다. 
본 발명의 RNA 앱타머의 종양 침투 능력은 종양의 분자 이미징을 통해 항체 보다 뚜렷한 장점을 제공한다.    예를 들어, RNA 앱타머는 CD133의 발현 세포 관련 종양의 검출 및 이미징을 촉진하는 제제에 커플링할 수 있다.    적합한 제제의 예로는 본 명세서에 기재된 검출 표지들을 포함한다. 
본 명세서에 기재된 RNA 앱타머, 진단제, 항암제, 전달체 또는 약제학적 조성물은  단독 또는 다른 치료방법과 혼합하여 사용될 수도 있다.    예를 들어, RNA 앱타머, 진단제, 항암제, 전달체 또는 약제학적 조성물은 화학요법 또는 방사선 치료와 혼용하여 사용될 수 있다.    이론상 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 화학요법 또는 방사선 치료 제제는 전형적인 암 줄기세포의 자손 세포로 빠르게 분할하는 세포들을 타겟하여 종양을 축소하는데 사용될 수도 있다는 것을 가정한다.    진단제는 종양에서 암 줄기세포의 유무를 검출함으로써 암 줄기세포를 제거하기 위한 종래 임의의 치료법의 효과를 결정하는데 사용될 수 있다.    본 발명의 RNA 앱타머를 포함하는 항암제, 전달체, 또는 약제학적 조성물은 암 줄기세포를 특이적으로 감소하기 위해 종양 부위에 투여할 수 있다.    따라서, RNA 앱타머를 포함하는 항암제, 전달체 또는 약제학적 조성물은 화학요법 또는 방사선 요법 치료와 함께 또는 화학요법 또는 방사선 요법 치료 후에 사용될 수 있다.    
또한, 본 발명의 RNA 앱타머는 암 줄기세포에 존재하는 항원을 타겟으로 하나 이상의 추가 앱타머를 조합할 수 있다는 것이 고려된다. 
본 명세서의 각 예는 대상에 암을 치료, 예방 또는 개선하기 위한 방법으로  필요한 부분만 약간 수정하여  적용 취해져야 한다. 
본 명세서의 각 예는 종양의 분자 이미징에  필요한 부분만 약간 수정하여  적용 취해져야 한다.