Patent ES-2877820-T3 (ES)
Title: Composiciones y métodos para la clonación rápida de receptores de células T
Inventor: ODUNSI KUNLE
IPC: C07K14/725
Filed: 2017-08-01
Granted: 2021-11-17
Abstract: Un método para clonar una pluralidad de secuencias variables de cadena α y β de TCR a partir de receptores de células T (TCR) de una población oligoclonal de células T, el método comprende: 1) obtener ARN de una población oligoclonal de células T, en donde el ARN comprende un ARNm que codifica las secuencias variables de las cadenas α y β de TCR, y generar el primer ADNc monocatenario a partir del ARNm, en donde el primer ADNc monocatenario incluye un ADNc monocatenario que codifica las cadenas α de TCR y un ADNc monocatenario que codifican las cadenas β de TCR, en donde los ADNc monocatenarios se generan mediante el uso de una transcripción inversa y cebadores oligo-dT, para obtener una muestra de la primera cadena del ADNc amplificada a partir del ARNm; 2) dividir la muestra de 1) en una primera y una segunda muestras y realizar reacciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que comprenden: en la primera muestra, una síntesis de la segunda cadena de ADNc para obtener amplicones de ADNc bicatenarios que codifican las cadenas β de TCR mediante el uso de todos los cebadores: **(Tabla)** en la segunda muestra, una síntesis de la segunda cadena de ADNc para obtener amplicones de ADNc bicatenario que codifican las cadenas α de TCR mediante el uso de todos los cebadores: **(Tabla)** 3) incubar la primera y segunda muestras con una exonucleasa durante un período de tiempo suficiente para degradar los cebadores que no se incorporaron a los amplicones y el ADNc monocatenario si está presente, y posteriormente inactivar la exonucleasa mediante el uso de un tratamiento térmico; 4) realizar en la primera muestra una amplificación por la PCR de los amplicones que codifican las cadenas β de TCR mediante el uso del cebador específico de etiqueta HTTCR A - ACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCTGCGGCCGCCACCATG (SEQ ID NO: 1) y el cebador HTTCR B - CTCAAACACAGCGACQCTCGGACGTG (SEQ ID NO:2) para obtener amplicones que codifican las cadenas β de TCR, en donde los amplicones que codifican las cadenas β de TCR comprenden además un sitio de reconocimiento de endonucleasas de restricción, una secuencia de Kozak y una secuencia de ATG que inicia la traducción; realizar en la segunda muestra una amplificación por la PCR de los amplicones que codifican las cadenas α de TCR mediante el uso del cebador específico de etiqueta HTTCR D GGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCCATG (SEQ ID NO: 48) y HT-TCR E AGGCAGACAGACTTGTCACTGGATTTAGAG (SEQ ID NO: 49) que codifican las cadenas α de TCR, en donde los amplicones que comprenden las cadenas α de TCR comprenden además una secuencia P2A y una secuencia ATG de inicio; y 5) ensamblar los amplicones que codifican las cadenas β de TCR y las cadenas α de TCR de 4) en vectores de ADN para proporcionar una pluralidad de vectores de ADN, cada uno de los cuales comprende segmentos de ADN que codifican solo una de las cadenas β de TCR y solo una de las cadenas α de TCR, en donde los vectores comprenden un segmento de fusión Cβ-2A entre los segmentos que codifican la cadena β de TCR y la cadena α de TCR, lo que proporciona de esta manera una pluralidad de vectores de ADN, cada vector en la pluralidad solo codifica una única cadena β de TCR y una única cadena α de los TCR de la población de células T oligoclonales.