Patent RU-2700410-C1 (RU)
Inventor: Dyachuk Vyacheslav Alekseevich
IPC: G01N33/53
Filed: 2019-05-20
Granted: 2019-09-17
Abstract: Изобретение относится к улучшенному  методу иммуноокрашивания биологического материала для использования в конфокальной микроскопии.  Метод включает подготовку материала, фиксацию, удаление фиксатора, блокирование неспецифического связывания антител, инкубацию с первичными антителами в блокирующем буфере, отмывку от первичных антител, инкубацию с вторичными антителами в блокирующем буфере, отмывку от вторичных антител, дегидратацию, просветление и визуализацию объекта, согласно изобретению. В качестве блокирующего буфера используют фосфатный буфер, содержащий 0,1-1,0% неионного детергента, 20,0% диметилсульфоксида, 1,0% бычьего сывороточного альбумина, не более 10,0% овечьей сыворотки и 0.03% азида натрия. В качестве неионных детергентов используют Tween-20 или Triton X-100. Фиксацию проводят в растворе 4% параформальдегида с метанолом на фосфатном буфере в течение 5-6 часов при +4°С; удаление фиксатора ведут отмывочным буфером 3 раза по 20 мин при комнатной температуре; блокирование неспецифического связывания антител проводят в течение 12 часов блокирующим буфером при +4°С; инкубацию с первичными антителами в блокирующем буфере ведут в течение 5-7 суток при комнатной температуре и постоянном перемешивании, последующую отмывку от первичных антител ведут в отмывочном буфере, 6 раз по 20 мин, при комнатной температуре; инкубацию с вторичными антителами в блокирующем буфере проводят в течение 2 суток при комнатной температуре и постоянном перемешивании, отмывку от вторичных антител ведут 6 раз по 20 мин при комнатной температуре в отмывочном буфере. Удаление фиксатора, отмывку от первичных и вторичных антител, как правило, ведут отмывочным буфером, содержащим фосфатный буфер с добавлением неионных детергентов, сохраняющих структуру тканей, в концентрациях от 0,1 до 1,0%. Дегидратацию осуществляют инкубацией материала в 50% метаноле в течение 10 мин, а затем переносят в 100% метанол на 20 мин, с последующим замещением раствора на 100% свежий метанол и выдерживают не менее 20 мин при постоянном перемешивании; оптическое просветление путем химического обесцвечивания проводят инкубацией материала в смеси бензилового спирта и бензилбензоата в соотношении 1:2, в течение 1 часа при комнатной температуре, с дальнейшим замещением свежим раствором бензилового спирта и бензилбензоата в соотношении 1:2 и инкубируют в нем в течение ночи при постоянном перемешивании, после чего проводят визуализацию объекта. Визуализацию объекта обычно ведут с помощью конфокальной микроскопии в комбинации режимов Z-stack и TILE-scan. Состав блокирующего буфера в предлагаемых условиях экспозиции позволяет исключить неспецифическое окрашивание по всей глубине образца, маркировать только определенные структуры, и получать их четкое изображение. Метод позволяет без труда визуализировать тканевые структуры, залегающие на глубине более 150 мкм, что является  преимуществом метода, позволяющего адаптировать его для разных биологических объектов и значительно расширить круг исследуемых биологических материалов размером до 6 см 3 . 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 5 пр.