Patent PE-20220260-A1 (PE)
Title: Composicion probiotica para argopecten purpuratus y procedimiento de cultivo de este en el que se utiliza dicha composicion probiotica
Inventor: SERRANO HUINOCANA WILBERT
IPC: A23K50/80
Filed: 2021-07-30
Abstract: La presente invencion se refiere a un procedimiento de cultivo de Argopecten purpuratus, caracterizado porque comprende: a) capturar muestras de adultos de concha de abanico mediante buceo autonomo; b) extraer el contenido intestinal de las muestras de adultos de concha de abanico mediante puncion con jeringa, donde se extrae un pellet fecal mediante homogenizacion con solucion fisiologica esteril con glicerol, inyectando y extrayendo la solucion en el conducto intestinal para disolver el pellet fecal hasta obtener un homogenizado; c) transferir el homogenizado a un tubo eppendorf esteril que se mantiene en refrigeracion a 4°C; d) realizar los aislamientos primarios en 5 diferentes medios de cultivo: agar marino (AM), agar nutritivo (AN), agar Man Rogosa-Sharpe (MRS) (Merck), agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS) (Merck) y Agar Medio Minimo; e) caracterizar morfologicamente y hacer el reconteo de las colonias de manera permanente, transfiriendose las nuevas colonias a nuevas placas de agar para la obtencion de cepas puras; f) verificar la pureza de las cepas mediante la observacion y comparacion de caracteristicas culturales en referencia al aislamiento primario, mediante la observacion en el microscopio mediante tincion Gram; g) preservar las cepas resuspendiendo cepas de cultivos jovenes de cada una de las cepas en un medio de cultivo fresco, adicionando gliceros al 20% (v/v) como un agente crioprotector, almacenando las muestras a -80°C; h) identificar molecularmente los cultivos activos de cada una de las cepas seleccionadas, mediante la amplificacion PCR del ADN genomico, usando cebadores universales para bacterias GM3 forward y GM4 reverse de la subunidad pequena del acido ribonucleico ribosomal (ARNr) 16S, secuenciando el genoma para identificar su similaridad con la SEQ ID NO: 2; i) realizar pruebas de antagonismo de las cepas seleccionadas mediante la tecnica "Cross streak" y evaluar la actividad antibacteriana de los extractos de las cepas que logran inhibir todas las cepas patogenas mediante la presencia de halos de inhibicion; j) llevar a cabo pruebas de supervivencia de larvas en experimentos de bajo volumen en matraces de dos litros observandose la evolucion de crecimiento y supervivencia de larvas por 10 dias, luego utilizar Streptomyces sp para prueba en campo usando tanques o pozas de 7000 litros; k) tomar muestras de Streptomyces sp criopreservadas en el paso g), reactivar el cultivo en fermentador con el medio adecuado para obtener biomasa bacteriana suficiente que es peletizada por centrifugacion hasta obtener un pellet celular, el cual es sometido a liofilizacion; l) en la liofilizacion, el pellet celular se mezcla con una solucion crioprotectora y trasladar la mezcla a viales para congelamiento gradual de la muestra para preservar el buen estado de las celulas, encender la bomba de vacio hasta una presion de 0.050 mBar. El proceso de liofilizacion dura de 24-48 h, trasladandose el liofilizado a un tubo de centrifuga esteril donde se pulveriza; m) el polvo o liofilizado es utilizado como alimento para larvas de concha de abanico en estadio inicial, adicionandose 20 gramos para 7000 litros; n) medir la supervivencia mediante formulas de tasa de supervivencia y tasa relativa de supervivencia.