Patent ES-2709212-T3 (ES)
Title: Análisis biomolecular a gran escala con marcadores de secuencia
Inventor: ASBURY THOMAS
IPC: C12Q1/68
Filed: 2014-06-30
Granted: 2019-04-15
Abstract: Un método de determinación de un perfil de clonotipo de ácidos nucleicos recombinados que codifican una pluralidad de cadenas de receptor inmunitario en una muestra, comprendiendo el método las etapas de: (a) unir marcadores de secuencia a moléculas de ácido nucleico recombinadas de genes de receptores de linfocitos T o genes de inmunoglobulina a partir de una muestra de un individuo que comprende linfocitos T y/o linfocitos B y/o ADN sin células para formar conjugados de marcador-ácido nucleico, en donde al menos un ácido nucleico recombinado o copias del mismo tienen distintos marcadores de secuencia unidos; (b) amplificar los conjugados de marcador-ácido nucleico; (c) secuenciar una muestra de los conjugados de marcador-ácido nucleico para proporcionar lecturas de secuencias teniendo cada una, una tasa de error y comprendiendo cada una, una secuencia de marcados y una secuencia de ácido nucleico recombinado; (g) alinear las lecturas de secuencias como secuencias de marcadores para formar grupos de lecturas de secuencia que tienen los mismos marcadores de secuencia; (e) fusionar lecturas de secuencia de grupos para determinar clonotipos, en donde los grupos de las lecturas de secuencias de fusionan en distintas secuencias de ácidos nucleicos recombinados siempre que dichos grupos de lecturas de secuencias sean distintos con una probabilidad de al menos el noventa y cinco por ciento; y (f) determinar el perfil de clonotipo de la muestra determinando los niveles de los clonotipos; y en donde las etapas de unión y amplificación comprenden: (i) combinar en una mezcla de reacción con condiciones de extensión de cebador un primer conjunto de cebadores con la muestra, en donde cada cebador del primer conjunto tiene una porción específica a receptor de modo que la porción específica a receptor se hibrida a un ácido nucleico recombinado distinta en un emplazamiento predeterminado y se extiende para formar un primer producto de extensión, y en donde cada cebador del primer conjunto tiene un extremo 5' no complementario que contiene un primer sitio de unión y un marcador de secuencia dispuestos entre la porción específica a receptor y el primer sitio de unión del cebador; (ii) retirar de la mezcla de reacción cebadores no extendidos del primer conjunto; (iii) añadir a la mezcla de reacción en condiciones de extensión de cebador un segundo conjunto de cebadores, en donde cada cebador del segundo conjunto tiene una porción específica a receptor de modo que la porción específica a receptor se hibrida al primer producto de extensión en un emplazamiento predeterminado y tiene un extremo 5' no complementario que contiene un segundo sitio de unión de cebador, y en donde cada cebador del segundo conjunto se extiende para formar un segundo producto de extensión, de modo que cada segundo producto de extensión comprende un primer sitio de unión de cebador, un segundo sitio de unión de cebador, al menos un marcador de secuencia y ácido nucleico recombinante que codifica una porción de una cadena de receptor de linfocitos T o una cadena de receptor de linfocitos B; y (iv) llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa en la mezcla de reacción para formar un amplicón, usando la reacción en cadena de la polimerasa cebadores directos específicos para el primer sitio de unión de cebador y cebadores indirectos específicos para el segundo sitió de unión de cebador.