Patent ES-2807222-T3 (ES)
Title: Detección de metilación de ADN usando reacciones combinadas de ligamiento y nucleasa
Inventor: BARANY FRANCIS
IPC: C12Q1/683
Filed: 2015-03-31
Granted: 2021-02-22
Abstract: Un método para identificar, en una muestra, una o más moléculas de ácido nucleico diana que se diferencian de otras moléculas de ácido nucleico en la muestra en uno o más restos metilados, comprendiendo dicho método: proporcionar una muestra que contiene una o más moléculas de ácido nucleico diana que contienen potencialmente uno o más restos metilados dentro de al menos una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción sensible a la metilación; someter la muestra a una digestión con enzima de restricción sensible a la metilación para escindir moléculas de ácido nucleico diana en la muestra que tienen restos sin metilar dentro de la al menos una secuencia de enzima de restricción sensible a la metilación; proporcionar uno o más conjuntos de sondas oligonucleotídicas, comprendiendo cada conjunto de sondas (a) una primera sonda oligonucleotídica que tiene una parte específica de diana, y (b) una segunda sonda oligonucleotídica que tiene una parte específica de diana, en donde la primera y la segunda sondas oligonucleotídicas de un conjunto de sondas se configuran para que se hibriden adyacentes entre sí en la secuencia de nucleótidos diana con una unión entre la primera y la segunda sondas oligonucleotídicas, y en donde, en un conjunto de sondas, la parte específica de diana de la segunda sonda oligonucleotídica tiene un nucleótido de solapamiento idéntico en la unión con la primera sonda oligonucleotídica; poner en contacto la muestra y los uno o más conjuntos de sondas oligonucleotídicas en condiciones eficaces para que la primera y la segunda sondas oligonucleotídicas de un conjunto de sondas se hibriden en posiciones adyacentes de una manera específica de la base con su molécula de ácido nucleico diana correspondiente, si estuviera presente en la muestra, en donde después de la hibridación el nucleótido de solapamiento idéntico de la segunda sonda oligonucleotídica forma una aleta en la unión que comprende el nucleótido de solapamiento idéntico; escindir el nucleótido de solapamiento idéntico de la segunda sonda oligonucleotídica con una enzima que tiene actividad de 5' nucleasa, liberando de ese modo un 5' fosfato en la segunda sonda oligonucleotídica; ligar la primera y la segunda sondas oligonucleotídicas de los uno o más conjuntos de sondas oligonucleotídicas juntas en la unión para formar un producto de ligamiento hibridado con su molécula de ácido nucleico diana complementaria, en donde dicho producto de ligamiento y su molécula de ácido nucleico diana hibridada comprenden al menos una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción sensible a la metilación; mezclar al menos una enzima de restricción sensible a la metilación con los productos de ligamiento hibridados para formar una mezcla de reacción de enzima de restricción sensible a la metilación; someter la mezcla de reacción de enzima de restricción sensible a la metilación a condiciones adecuadas para la escisión del producto de ligamiento y su molécula de ácido nucleico diana hibridada si dicha molécula de ácido nucleico diana no contiene uno o más restos metilados dentro de la al menos una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción sensible a la metilación, en donde dicha escisión no se producirá si dicha molécula de ácido nucleico diana contiene uno o más restos metilados dentro de la al menos una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción sensible a la metilación; detectar y distinguir productos de ligamiento sin escindir en la muestra; e identificar la presencia de una o más moléculas de ácido nucleico diana que se diferencian de otras moléculas de ácido nucleico en la muestra en uno o más restos metilados basándose en dicha detección.