Patent AR-035233-A1 (AR)
Title: Metodo para identificar moleculas de union a arn
IPC: C07K14/47
Filed: 2002-03-26
Abstract: Un método para identificar moléculas de unión a ARN que se lleva a cabo en células vivas o extractos de células vivas (traducción in vitro), método que, debido a su naturaleza, es rápido para usar en el análisis de la unión de una gran cantidad de moléculas pequenas a estructuras específicas de ARN. Admás, este método tiene una cantidad de ventajas en comparación con el descubrimiento clásico de drogas: i) es posible modificar genes blanco de cualquier familia de genes (en el ámbito de las proteínas, solamente unas pocas clases de proteínas se consideran "direccionables"), ii) el concepto elimina selectivamente tejidos, ya que el blanco de ARN puede seleccionarse en una región del transcripto que tiene una escasa homología con otras secuencias, y iii) puede ser posible una regulación positiva y negativa. El método comprende los pasos de: (a) predecir la estructura de un fragmento de ARN por un método in silico, (b), seleccionar un fragmento de ARN adecuado predicho del paso (a), fragmento de ARN que comprende al menos un segmento individual; (c) sintetizar el fragmento de ADN que corresponde al fragmento de ARN del paso (b); (d) insertar el fragmento de ADN del paso (c) en la proximidad río arriba de un gen informante de ensayo, gen informante de ensayo que produce una senal al traducirse, formando así una construcción informante; gen informante de ensayo que produce una senal al traducirse, formando así una construcción informante, y (e) realizar un ensayo de gen informante, ensayo que monitorea la interacción entre una molécula a evaluar por unión a ARN y el fragmento de ARN de la construcción informante. Preferiblemente una estructura de ARN adecuada para direccionamiento de drogas muestra las siguientes características: los segmentos individuales deberían mantener su estructura, según las predicciones, en un contexto de hasta 400 nucleótidos de secuencia nativa, y los segmentos/estructuras están contenidos dentro de fragmentos de secuencia menores de 100 nucleótidos. El gen informante puede estar ligado operativamente a un fragmento de ARN, o un fragmento activo del mismo. Genes informantes, tales como, por ejemplo, luciferasa, b-galactosidasa, fosfatasa alcalina o la proteína fluorescente verde pueden ser utilizados para determinar la actividad de transcripción en ensayos de análisis. Además, se describen fragmentos específicos de ARN. Reivindicación 1: Un método para identificar moléculas de unión a ARN, CARACTERIZADO PORQUE comprende los pasos de: (i) predecir la estructura de un fragmento de ARN; (ii) seleccionar un fragmento de ARN adecuado predicho del paso (a), fragmento de ARN que comprende al menos un segmento individual; (iii) sintetizar el fragmento de ARN que corresponde al fragmento de ARN del paso (b); (iv) insertar el fragmento de ARN del paso (c) en la proximidad río arriba de un gen informante de ensayo, gen informante de ensayo que produce una senal al traducirse, formando así una construcción informante; y (v) realizar un ensayo de gen informante, ensayo que monitorea la interacción entre una molécula a evaluar por unión a ARN y el fragmento de ARN de la construcción informante.