Patent AR-123690-A1 (AR)
Title: Plataforma de nanoporos lista para usar para la detección attomolar de oligos de adn / arn usando una sonda complementaria marcada con osmio
Inventor: KANAVARIOTI ANASTASSIA
IPC: C12Q1/6816
Filed: 2021-10-04
Abstract: Método para detectar la presencia de una molécula diana de ácido nucleico en una muestra biológica. En determinados aspectos, el método comprende el contacto de una muestra de prueba que comprende (i) una muestra biológica que comprende una molécula diana de ácido nucleico y (ii) una sonda de oligonucleótido de hebra simple osmilada que comprende por lo menos un residuo de pirimidina unido de manera covalente a un grupo de tetróxido de osmio (OsO₄)-2,2-bipiridina sustituida o no sustituida (Grupo OsBp).  Reivindicación 1: Un método para detectar la presencia de una molécula diana de ácido nucleico en una muestra biológica, caracterizado porque dicho método comprende los pasos de: (a) contactar una muestra de prueba que comprende (i) una muestra biológica que comprende una molécula diana de ácido nucleico y (ii) una sonda de oligonucleótido de hebra simple osmilada que comprende por lo menos un residuo de pirimidina unido de manera covalente a un grupo de tetróxido de osmio (OsO₄)-2,2-bipiridina sustituida o no sustituida (Grupo OsBp), en donde la secuencia de la sonda es por lo menos parcialmente complementaria de la secuencia de la molécula diana de ácido nucleico, para permitir la formación de un complejo de sonda / diana hibridizado, opcionalmente, en donde por lo menos un residuo de pirimidina osmilado es un residuo de timidina (T); (b) usar un dispositivo de nanoporos para detectar en la muestra de prueba el número de eventos, en donde la sonda osmilada no hibridizada atraviesa el nanoporo; y (c)(i) comparar el número de eventos detectados en la muestra de prueba con un número de eventos de muestras de sondas correspondientes, en donde la sonda osmilada no hibridizada atraviesa el nanoporo en la ausencia de la diana de ácido nucleico, en donde una reducción en el número de eventos detectados en la muestra de prueba con relación al número de eventos de muestras de sondas es indicativa de la formación del complejo de sonda / diana hibridizado del paso (a) y de la presencia de la molécula diana de ácido nucleico en la muestra de prueba; (c)(ii) comparar el número de eventos detectados en la muestra de prueba con el ruido de una muestra basal correspondiente que no contiene ninguna sonda osmilada, en donde la ausencia de un aumento del número de eventos detectados en la muestra de prueba con relación al ruido de la muestra basal es indicativa de la formación del complejo de sonda / diana hibridizado del paso (a) y de la presencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra de prueba; y/o (c)(iii) comparar el número de eventos detectados en la muestra de prueba con el número de eventos de muestras control correspondientes, en donde la sonda osmilada no hibridizada atraviesa el nanoporo en la presencia de una cantidad conocida de la molécula diana de ácido nucleico, en donde una reducción del número de eventos detectados en la muestra de prueba con relación al número de eventos de muestras control es indicativa de una formación aumentada del complejo de sonda / diana hibridizado del paso (a) y de la presencia de una mayor cantidad de la molécula diana de ácido nucleico en la muestra de prueba ante la muestra control o en donde un aumento del número de eventos detectados en la muestra de prueba con relación al número de eventos de muestras control, usando la misma cantidad de sonda, es indicativa de más sonda no hibridizada y por consiguiente de una menor cantidad de la molécula diana de ácido nucleico en la muestra de prueba en comparación con la muestra control; opcionalmente: en donde el dispositivo de nanoporos no requiere la conjugación de la sonda con una proteína, una nanopartícula, un homopolímero o un polipéptido para detectar la sonda o en donde la sonda no está conjugada a una proteína, una nanopartícula, un homopolímero o un polipéptido; y/o, en donde la detección no se logra mediante el conteo de bloqueos largos producidos por el complejo de sonda / diana hibridizado que bloquea el nanoporo o mediante fusión de un complejo de sonda / diana hibridizado en el nanoporo. Reivindicación 27: Una molécula de sonda de oligonucleótido de hebra simple osmilada, caracterizada porque comprende por lo menos un residuo de pirimidina unido de manera covalente a un grupo de tetróxido de osmio (OsO₄)-2,2-bipiridina sustituida o no sustituida (grupo OsBp); opcionalmente, en donde por lo menos un residuo de pirimidina osmilado es un residuo de timidina (T).