Patent RU-2748249-C1 (RU)
Inventor: SHISHKINA LARISA NIKOLAEVNA
IPC: G01N33/483
Filed: 2020-11-09
Granted: 2021-05-21
Abstract: Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения концентрации противовирусных препаратов в биоматериалах лабораторных животных. Проводят подготовку и анализ биоматериала из органов или тканей лабораторных животных, получавших указанные противовирусные препараты, с использованием приборного анализатора. В 96-луночных планшетах получают монослои чувствительных к вирусу перевиваемых культур клеток и готовят раствор противовирусного препарата с известной концентрацией (Cb, в мкг/мл) и исследуемый биоматериал в виде гомогената органов или сыворотки крови лабораторных животных, получавших этот противовирусный препарат, с неизвестной концентрацией (Сх, в мкг/мл), которая является искомой. Готовят последовательные кратные разведения раствора противовирусного препарата с известной концентрацией (Cb) и исследуемого биоматериала с неизвестной концентрацией (Сх) в питательной среде, которые последовательно вносят равными объемами (мл) в ряды лунок 96-луночных планшетов с монослями клеток. В несколько рядов лунок вносят вирус в дозе, вызывающей 100%-ный цитопатический эффект в контроле вируса, и используют для оценки противовирусной активности раствора противовирусного препарата с известной концентрацией (Cb) и исследуемого биоматериала с неизвестной концентрацией (Сх). В ряды лунок с контролем вируса вносят вирус в дозе, вызывающей 100%-ный цитопатический эффект, и питательную среду, а в ряды лунок с контролем клеток вносят только питательную среду; при этом во всех рядах лунок планшетов с монослоем клеток находится одинаковый суммарный объем культуральной жидкости. Все планшеты с монослоями клеток выдерживают в термостате при температуре +37°С в течение времени, достаточного для развития 100%-ного цитопатического эффекта в контроле вируса. В каждую лунку планшетов добавляют раствор витального красителя - нейтрального красного, инкубируют в течение времени, достаточного для его поглощения оставшимися жизнеспособными клетками. После удаления непоглощенного красителя путем промывания лунок планшетов физиологическим раствором в них вносят раствор, лизирующий клетки. Во всех лунках измеряют оптическую плотность перешедшего в раствор красителя для оценки противовирусной активности раствора противовирусного препарата с известной концентрацией (Cb) и исследуемого биоматериала с неизвестной концентрацией (Сх) с использованием планшетного ридера в качестве приборного анализатора при длине волны 490 нм. Результаты измерения оптической плотности в зависимости от концентрации присутствующего в лунках препарата представляют в виде диаграмм в полулогарифмической системе координат, на которых по оси абсцисс в логарифмической шкале измерения приведены объемы (в мл) раствора противовирусного препарата с известной концентрацией (Cb) и исследуемого биоматериала с неизвестной концентрацией (Сх), находящиеся в последовательных рядах лунок планшетов, а по оси ординат в линейной шкале измерения - оптическая плотность раствора красителя в лунках планшетов. С использованием компьютерной программы SoftMaxPro-4.0 рассчитывают 50%-ную вирус-ингибирующую концентрацию (IC50, в мл) раствора противовирусного препарата с известной концентрацией (Cb) и исследуемого биоматериала с неизвестной концентрацией (Сх) в лунках планшетов, где IC50- это концентрация препарата в питательной среде, при которой не разрушаются и остаются жизнеспособными 50% клеток в инфицированном монослое. Для раствора противовирусного препарата, приготовленного с известной концентрацией (Cb, в мкг/мл), IC50определены в виде Vb (в мл), а для исследуемого биоматериала с неизвестной искомой концентрацией (Сх, в мкг/мл) IC50определены в виде Vx (в мл). В результате на основании известной концентрации Cb раствора противовирусного препарата и полученных показателей Vb раствора противовирусного препарата с известной концентрацией (Cb) и Vx исследуемого биоматериала с неизвестной концентрацией (Сх) рассчитывают искомую концентрацию препарата Сх в исследуемом биоматериале лабораторных животных по формуле: Сх (мкг/мл) = Cb (мкг/мл) × Vb (мл) : Vx (мл). Способ обеспечивает возможность определения концентрации противовирусных препаратов в биоматериалах лабораторных животных за счет определения концентрации препарата с помощью колориметрического метода, не требующего использования сложного, высокотехнологичного оборудования. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 3 пр.