Patent ES-2537340-T3 (ES)
Title: Producción a gran escala de hialuronidasa soluble
Inventor: BAKER DAVID
IPC: C12N9/26
Filed: 2009-03-06
Granted: 2015-06-05
Abstract: Un método para producir rHuPH20 soluble, en donde rHuPH20 soluble hace referencia a una forma soluble de PH20 humana (también conocida como proteína de superficie de espermatozoides PH20) que es expresada recombinantemente, por ejemplo, en células de Ovario de Hámster Chino (CHO), comprendiendo el método: a) inocular medio celular en un biorreactor con un inóculo de células que codifican rHuPH20 soluble para producir un cultivo celular, en donde: las células comprenden entre 150 y 300 copias de ácido nucleico que codifica rHuPH20 soluble; el biorreactor contiene al menos 100 litros de cultivo celular; se inoculan 1010 - 1011 células por 100 litros de cultivo celular; y las células se cultivan a una temperatura de ajuste; b) alimentar las células con un primer medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, insulina humana y extracto de levadura en cantidades suficientes para incrementar el crecimiento celular y la densidad celular máxima, y para incrementar la síntesis de rHuPH20 soluble, en donde el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 0,5% a 20% del volumen de cultivo celular; c) alimentar las células con un segundo medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para incrementar la síntesis de rHuPH20 soluble e inducir la detención del ciclo celular; y disminuir la temperatura en comparación con la temperatura de la etapa a) a una temperatura suficiente para incrementar la detección del ciclo celular, aumentar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; en donde: la cantidad de L-alanil-L-glutamina se reduce en comparación con la cantidad de L-alanil-L-glutamina de la etapa b); la cantidad de extracto de levadura se incrementa en comparación con la cantidad de extracto de levadura de la etapa b); y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 0,5% a 20% del volumen de cultivo celular; d) alimentar las células con un tercer medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para incrementar la síntesis de rHuPH20 soluble e incrementar la detención del ciclo celular, y reducir la temperatura en comparación con la temperatura de la etapa c) a una temperatura suficiente para incrementar la detención del ciclo celular, aumentar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; en donde: la cantidad de L-alanil-L-glutamina se reduce en comparación con la cantidad de L-alanil-L-glutamina en la etapa c); las cantidades de extracto de levadura, glucosa y butirato de sodio se incrementan en comparación con las cantidades de extracto de levadura, glucosa y butirato de sodio en la etapa c); y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 0,5% a 20% del volumen del cultivo celular; e) alimentar la células con un cuarto medio de alimentación que contiene glucosa, L-alanil-L-glutamina, extracto de levadura y butirato de sodio en cantidades suficientes para incrementar la síntesis de rHuPH20 soluble e incrementar la detención del ciclo celular, y disminuir la temperatura en comparación con la temperatura en la etapa d) a una temperatura suficiente para incrementar la detención del ciclo celular, incrementar la viabilidad celular y estabilizar la hialuronidasa soluble; en donde: la cantidad de L-alanil-L-glutamina y glucosa se reducen en comparación con la cantidad de L-alanil-L45 glutamina y glucosa de la etapa d); la cantidad de butirato de sodio se reduce en comparación con la cantidad de butirato de sodio en la etapa d); y el medio de alimentación se añade al cultivo a un volumen de 0,5% a 20% del volumen de cultivo celular; f) continuar cultivando las células hasta que la viabilidad cae por debajo de al menos 50%; g) obtener el líquido de cultivo de la cosecha; y h) purificar la rHuPH20 del líquido de cultivo celular de la cosecha.