*Corresponding author.

## OPTIMALISASI PEROKSIDASE DARI BUAH BELIMBING MANIS (Averrhoa carambola) UNTUK DEGRADASI SENYAWA FENOL
Ni Made Ratna Dwiyanthi 1 , Made Vivi Oviantari 2 , I Putu Parwata 3
1 Jurusan Analis Kimia FMIPA Universitas Pendidikan Ganesha
2 Jurusan Analis Kimia FMIPA Universitas Pendidikan Ganesha
3 Jurusan Analis Kimia FMIPA Universitas Pendidikan Ganesha e-mail: iputuparwata@gmail.com

## Abstrak
Tujuan  dari  penelitian  ini  untuk  mengetahui  pH  dan  suhu  optimal  yang  diperlukan  oleh ekstrak  peroksidase  dari  buah  belimbing  manis  dalam  mengkatalisis  reaksi  degradasi senyawa fenol. Subjek penelitian ini adalah peroksidase yang diisolasi dari buah belimbing manis  ( Averrhoa  carambola )  yang  sudah  matang,  sedangkan  objek  penelitian  adalah  pH dan suhu optimum yang diperlukan oleh  peroksidase dari buah belimbing manis ( Averrhoa carambola )  untuk  mendegradasi  fenol.  Peroksidase  diekstraksi  dari  buah  belimbing  manis ( Averrhoa carambola ) yang sudah matang menggunakan blender dan disentrifugasi dengan kecepatan  5000  rpm  selama  120  menit.  Ekstrak  enzim  kemudian  diuji  aktivitasnya  dalam mendegradasi  fenol  pada  variasi  pH  dan  suhu.  Pengukuran  konsentrasi  fenol  dilakukan dengan  menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa degradasi  senyawa  fenol  dengan  biokatalisator  peroksidase  dari  buah  belimbing  manis berlangsung optimum pada pH 5 dan suhu 65 ˚ C dengan nilai efisiensi 72,71%.
Kata kunci : peroksidase, buah belimbing manis, degradasi, fenol.

## Abstract
The purpose of this study is to determine the optimum pH and temperature required by  the  peroxidase  extracted  from  star  fruit  to  catalyse  the  degradation  of  phenolic compound.  The  subjects  of  this  study  were  the  peroxidase  that  isolated  from  mature  star fruit (Averrhoa carambola), while the objects were the optimum pH and temperature required by  the  enzyme  to  degrade  phenol.  Peroxidase  were  extracted  from  mature  star  fruit (Averrhoa carambola) using blender and then sentrifuge at 5000 rpm for 120 minutes. The enzyme  extract  was  then  tested  on  degradation  of  phenol  at  the  variation  of  pH  and temperature.  Measurement  of  phenol  concentration  was  performed  using  UV-Vis spectrophotometer. The result showed that the optimum degradation of phenolic compound by  peroxidase  extracted  from  star  fruit  lasted  at  pH  5  and  temperature  of  65 ˚ C  with  the efficiency of 72,71%
Keywords: peroxidase, star fruit,degradation, phenol

## Pendahuluan
Dewasa ini perkembangan industri di Indonesia cukup pesat. Perkembangan  industri  ini  memberikan dampak positif dan dampak negatif bagi kehidupan  manusia  dan  lingkungannya.
Dampak negatifnya antara lain dihasilkannya  produk  samping  berupa limbah  padat  dan  cair  yang  berdampak terhadap makhluk hidup dan lingkungan sekitarnya.  Limbah  cair  yang  dihasilkan mengandung  banyak  senyawa  organik yang  berbahaya  bagi  tubuh.  Salah  satu
senyawa  organik  yang  terdapat  pada limbah  cair  industri  seperti  industri tekstil,  petrokimia,  farmasi  dan  industri kimia  yaitu  senyawa  fenol  (Rocha  dkk, 2007).
Limbah  yang  mengandung  fenol dapat mempengaruhi ekosistem
perairan  dan  melalui  berbagai  aktivitas manusia, fenol dapat terakumulasi dalam tubuh dan menyebabkan gangguan  pencernaan,  kerusakan  otak, paru-paru,  ginjal,  hati,  pankreas,  dan limpa (Isyuniarto et al., 2005).
Konsentrasi fenol dalam limbah umumnya  berada  dalam  kisaran  10 – 3000  mg/L  (Shetty  et  al.,  2007), sedangkan  keberadaan  senyawa  fenol di  lingkungan  perairan  yang  masih diangggap  aman,  sesuai  dengan  KEP No.  51/MENLH/  10/1995  tentang  baku mutu kadar beban pencemaran maksimum  air  limbah,  yakni  0,5 –  1,0
mg/L.  Selain  itu,  nilai  ambang  batas fenol  dalam  baku  air  minum  adalah 0.002 mg/L seperti yang dinyatakan oleh Badan Pengendalian Dampak Lingkungan  (Bapedal)  (Slamet  et  al., 2005). Beberapa penelitian
menggunakan  cara  kimia  dan  fisika untuk  menghilangkan  fenol.  Secara kimia  misalnya  menggunakan  radiasi sinar ultraviolet, teknik ultrasonik dengan  atau  tanpa  katalis  penggunaan ozon,  fotokatalisis,  serta  reaksi  Fenton.
Metode-metode tersebut
memiliki kelemahan antara lain biaya yang tinggi,
adanya senyawa sampingan yang bersifat  toksik,  dan  proses  mineralisasi yang tidak sempurna sehingga
pengolahan  yang  dilakukan  kurang efektif.  Untuk  itu  perlu  diterapkan  suatu metode yang lebih efektif untuk mengatasi  kekurangan  dari  metode tersebut.
Degradasi  enzimatik  dipercaya dapat  mengolah  limbah  fenol  dengan bekerja secara selektif terhadap substrat tertentu,  tidak  menghasilkan  reaksi samping  sehingga  ramah  lingkungan, memiliki  laju  reaksi  yang  tinggi,  range pH  yang  luas  dan  prosesnya  lebih mudah dikontrol (Handayani, 2008).
Enzim  yang  dapat  digunakan sebagai biokatalis pada degradasi senyawa  fenol  adalah  peroksidase. Peroksidase  terdapat  pada  tumbuhan, hewan dan mikroba. Salah satu tumbuhan yang mengandung peroksidase  adalah  belimbing  manis (Laurenti dan Clemente, 2010).
Belimbing  manis  merupakan  tanaman yang  tumbuh  subur  di  daerah  tropis seperti  Indonesia.  Pemanfaatan  buah belimbing  sampai  saat  ini  terbilang kurang  efektif  karena  kurang  diminati untuk  konsumsi  maupun  pembuatan produk  olahan  lain.  Untuk  itu  penelitian
ini memanfaatkan ekstrak buah belimbing manis sebagai sumber peroksidase untuk mendegradasi senyawa fenol Aktivitas  enzim  dipengaruhi  oleh beberapa faktor, terutama pH dan suhu. Enzim  bekerja  secara  optimal  pada  pH dan suhu tertentu. Di bawah atau di atas nilai optimum tersebut, kerja enzim akan menurun.  Oleh  karena  itu,  penelitian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  pH  dan suhu optimum yang diperlukan peroksidase  dari  buah  belimbing  manis ( Averrhoa carambola ) dalam mendegradasi fenol.

## Metode Penelitian Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  antara  lain buah  belimbing manis, H 2 O 2 , NH 4 OH, fenol, 4- aminoantipirin,  larutan  buffer  universal pH  4;  5;  6;  7  dan  8,  kalium  ferisianida (K 3 Fe(CN) 6 ),  aquades, aluminium  foil , wrapping plastic .

## Peralatan
Peralatan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UVmini-1240), sentrifuge (Thermo  Sientific  SL  16R), neraca  analitik  (Kern  ABj),  kaca  arloji, botol  sampel,  corong,  spatula,  pipet tetes,  batang  pengaduk,  gelas  kimia  50 mL  (Pyrex),  labu  ukur  50  mL,  100mL dan  1000mL  (Herma), water  bath (Memmert),  Erlenmeyer  100  mL  (Schott Duran),  pH  meter  (Schott  Instrument Lab  850),  pipet  volumetri,  pipet  ukur, blender,  kasa,  gelas  ukur  dan  pipet mikro.

## Cara Kerja Ekstraksi  Peroksidase  dari  Buah Belimbing Manis
Sebanyak  50  g  buah  belimbing dihomogenkan  dalam  50  mL  larutan buffer  universal  (pH  7)  pada  suhu kamar,  kemudian  dihancurkan  dengan blender  agar  didapatkan  sari  kasar. Homogenat  disaring  dengan  kasa  dan disentrifugasi  dengan  kecepatan  5000 rpm selama 120 menit. Hasil sentrifugasi dipisahkan dari endapannya menggunakan metode dekantasi.
Supernatan  yang  diperoleh  merupakan ekstrak enzim kasar ( crude extract ).
Uji  Degradasi  Fenol  pada  Variasi  pH dan Suhu
Sebanyak  10  mL  larutan  fenol dengan konsentrasi 100
ppm dimasukkan  ke  dalam  botol  sampel. Preparasi  larutan  fenol  pH  4  dilakukan dengan  penambahan  larutan  HCl  0,01 M,  kemudian  ditambah  dengan  1  mL larutan  buffer  pH  4  dan  10  mL  larutan H2O2.  Campuran  ditambahkan  dengan 2,5 mL ekstrak enzim sehingga konsentrasi  sampel  menjadi  35  ppm, kemudian diinkubasi selama 5 jam pada suhu  kamar.  Untuk  kontrol  negatif, ekstrak  enzim  ditambahkan  setelah inkubasi  selama  5  jam  pada  suhu kamar.  Kadar  fenol  hasil  degradasi diukur  menggunakan  Spektrofotometer UV-Vis.  Cara  yang  sama  dilakukan
untuk perombakan pada pH 5, 6, 7, dan 8. Pengulangan dilakukan sebanyak dua kali.  Variasi  suhu  menggunakan  cara yang  sama  dengan  pH  optimum  (pH  6) dan suhu inkubasi divariasikan, yaitu 55, 60, 65, 70, 75, 80, dan 85 ˚C.

## Hasil dan Pembahasan Ekstraksi  Peroksidase  dari  Buah Belimbing Manis
Hasil  ekstraksi  enzim  ditunjukkan pada  Gambar  1.  Berdasarkan  Gambar 1.  diketahui  bahwa  ekstrak  kasar  yang telah  disentrifugasi  tampak  lebih  bening dibandingkan  dengan  ekstrak  sebelum disentrifugasi  yang  berwarna  oranye pekat. Perubahan warna tersebut dikarenakan adanya pengendapan residu-residu  yang  tidak  diinginkan selama proses sentrifugasi pada bagian dasar  tabung.  Supernatan  dipisahkan dari endapannya dengan metode dekantasi.
Gambar 1. Ekstrak Kasar Peroksidase Buah Belimbing Manis (a. Ekstrak Kasar Enzim Sebelum Sentrifugasi; b. Ekstrak Kasar Enzim Setelah Sentrifugasi)

## Degradasi Fenol pada Variasi pH
Efisiensi  degradasi  fenol  oleh ekstrak  peroksidase  buah  belimbing manis  pada  variasi  pH  disajikan  pada Gambar 2. Efisiensi degradasi fenol oleh peroksidase  dipengaruhi  oleh  faktor- faktor  lingkungan.  Enzim  dapat  bekerja secara  optimal  dalam  kondisi  yang optimal pula. Salah satu kondisi
lingkungan  yang  mempengaruhi  kerja enzim  adalah  pH.  Enzim  bekerja  pada kisaran  pH  tertentu  dan  pada  pH tersebut  keadaan  ionisasi  yang  tepat terjadi  pada  sisi  aktif  enzim  sehingga pengikatan  substrat  berlangsung  efektif pada  kecepatan  optimum  (Sadikin, 2002).

## a          b
Gambar 2. Efisiensi Degradasi Fenol Oleh Peroksidase dari Buah Belimbing Manis pada Variasi pH
Berdasarkan hasil penelitian, pada pH  4  memiliki  nilai  efisiensi  degradasi rendah, yaitu sebesar 37,08%. Pada pH 5 terjadi peningkatan nilai efisiensi yang cukup tajam, yaitu  dengan nilai efisiensi 60,89%.  Pada  pH  6,  7,  dan  8  nilai efisiensi  berturut-turut  menurun  menjadi 46,56; 41,91; dan 29,42%.
Pada pH yang asam, seperti pH 4,
aktivitas enzim menurun karena konsentrasi H + yang tinggi mempengaruhi  muatan  listrik  enzim.
Peroksidase  merupakan  enzim  yang bersifat anion, sehingga mudah berikatan dengan H + . Pada kondisi yang terlalu  asam,  histidin  akan  terprotonasi oleh  H + sehingga  tidak  dapat  menerima proton  dari  peroksida  (Azevedo  dkk, 2003).
Pada  pH  5  masih  bersifat  asam, namun  bukan  asam  kuat.  Pada  pH  ini, dengan  konsentrasi  ion  H + yang  lebih sedikit dibandingkan pada pH 4, pengaruhnya  terhadap  muatan  listrik enzim  juga  berkurang  sehingga  enzim dapat mengikat dan mengkatalisis substrat lebih banyak. Pada  pH  6  dan  7,  efisiensi degradasi mengalami penurunan secara teratur,  namun  masih  cukup  tinggi.
Dalam tingkat
keasaman ini,
peroksidase masih dapat bekerja dengan baik dalam mengkatalisis proses  degradasi  fenol.  Pada  pH  8, terjadi  penurunan  efisiensi  degradasi yang cukup tajam. Pada tingkat keasaman ini, enzim masih aktif bekerja mendegradasi  fenol,  namun  degradasi terjadi  dalam  jumlah  yang  minimum.
Pada kondisi ini ion OH - terdapat dalam jumlah  yang  berlebih  dalam  lingkungan. Histidin  akan  mengikat  atom  H  dari  ion OH - dan  besi  heme  mengikat  atom  O dari  ion  OH - .Akibat  dari  pengikatan tersebut,  terjadi  kompetisi  antara  ion OH - dengan substrat H 2 O 2 pada sisi aktif enzim.
Berdasarkan hasil penelitian
degradasi  senyawa  fenol  menggunakan peroksidase  dari  buah  belimbing  manis, pH optimum yang didapatkan adalah pH 5.  Hal  ini  sesuai  dengan  penelitian Laurenti dan Clemente (2010) mengenai karakteristik  peroksidase  dari  buah belimbing  manis  yang  memiliki  rentang pH  4-7,5  sebagai  rentang  pH  optimum. Penelitian  (Handayani  et  al.,  2008) dengan  sumber  peroksidase  dari  daun mangkokan mendapatkan pH optimum 7 dan  penelitian  oleh  (Zulfahair  et  al., 2008)  dengan  sumber  peroksidase  dari kulit  batang  ubi  kayu  mendapatkan  pH optimum untuk degradasi fenol yaitu pH 8.  Perbedaan  ini  menunjukkan  tingkat keasaman
optimum peroksidase berbeda tergantung pada asal enzimnya (Hidayat, 1998).

## Degradasi Fenol pada Variasi Suhu
Efisiensi  degradasi  fenol  oleh ekstrak  peroksidase  buah  belimbing manis  pada  variasi  pH  disajikan  pada Gambar  4.  Berdasarkan  Gambar  4, pada  suhu  55  dan  60˚C,  nilai  efisiensi degradasi  masih  rendah  yakni  dengan nilai  berturut-turut  sebesar  26,59  %  dan 26,19  %.  Nilai  efisiensi  mencapai  titik tertinggi  pada  suhu  65˚C  yakni  sebesar
72,71  %.  Pada  suhu  70,  75,  80,  dan 85˚C, nilai efisiensi berturut-turut menurun  dengan  nilai  57,41  %,  55,04 %, 46,58 %, dan 42,33%.
Gambar 4. Efisiensi Degradasi Fenol oleh Peroksidase Buah Belimbing Manis pada
Variasi Suhu
Peroksidase  merupakan  enzim yang  bersifat  termofilik  yaitu  memiliki ketahanan  terhadap  suhu  tinggi  dan aktif  pada  suhu  tersebut.  Pada  suhu  55 dan  60˚C,  efisiensi  degradasi  cukup rendah.  Pada  suhu  ini  kinerja  enzim berkurang,  namun  enzim  tidak  rusak hanya  bentuknya  masih  kaku.  Energi kinetik  enzim  dan  substrat  belum  cukup untuk menyebabkan benturan pembentuk  kompleks  enzim-substrat (Zulfahair et al., 2008).
Kenaikan efisiensi
degradasi hingga  46%  terjadi  pada  suhu  65˚C. Efisiensi  pada  suhu  ini  merupakan efisiensi  tertinggi  dengan  energi  kinetik enzim  dan  substrat  mencapai  nilai optimum (Handayani et al., 2008). Pada suhu  70  hingga  85˚C,  efisiensi  enzim berkurang  15  sampai  30%  dari  suhu 65˚C.  Nilai  efisien  dan  aktivitas  enzim pada  suhu-suhu  tersebut  cenderung stabil.  Pada  suhu  ini,  enzim  mengalami inaktivasi  sebagian,  walaupun  tidak sepenuhnya  karena  masih  terdapat aktivitas  enzim.  Penurunan  aktivitas terjadi  karena  penurunan  pembentukan kompleks  karena  energi  kinetik  yang tinggi  tidak  dapat  menyatukan  substrat dan  enzim  secara  tepat  (Handayani  et al., 2008).
Rentang suhu optimal untuk peroksidase  diperkirakan  antara  60˚C hingga  85˚C  (Laurenti  &  Clemente,
2010). Pada penelitian ini suhu optimum degradasi  fenol  adalah  65˚C  Suhu  ini merupakan  batasan  suhu  tinggi  yang dapat  meningkatkan  kerja  peroksidase. Selain  itu,  peroksidase  yang  diperoleh dari  eksrak  buah  belimbing  manis  ini juga  menghasilkan  aktivitas  yang  cukup baik  pada  rentang  suhu  yang  cukup lebar yaitu 65- 85˚C.
Suhu  optimum  yang  tinggi  yaitu 65˚C  menegaskan  bahwa  peroksidase merupakan  golongan  enzim  termofilik. Hasil penelitian dari (Laurenti & Clemente,  2010)  yang  melaporkan bahwa  aktivitas  peroksidase  dari  buah belimbing manis dipengaruhi oleh waktu dan  suhu  lingkungan,  secara  umum mengalami  penurunan  sekitar  85%  dari aktivitas  enzimnya  setelah  10  menit perlakuan  termal  pada  suhu  85˚C. Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh,  penurunan  aktivitas  enzim pada  suhu  85˚C  sekitar  58%  dari aktivitas  pada  suhu  optimal.  Hal  ini menunjukkan  penelitian  ini  lebih  unggul dibandingkan  penelitian  yang  dilakukan oleh  (Laurenti  &  Clemente,  2010) dengan sumber enzim yang sama.

## Simpulan dan Saran
Pada  penelitian  ini,  degradasi senyawa  fenol  dengan  biokatalisator peroksidase  dari  buah  belimbing  manis berlangsung  optimum  pada  pH  5  dan
suhu  65˚C  dengan  nilai  efisiensi 72,71%.
Peneliti yang berminat untuk melakukan  penelitian  sejenis  dapat melakukan pemurnian enzim lebih lanjut dan dapat menambahkan variasi konsentrasi, waktu kontak serta
perbandingan  konsentrasi  fenol  dan H 2 O 2 .

## Daftar Pustaka
Azevado,  Ana  M,  Veronica  C.  Martins,
Duarte  M.F.  Prazeres,  Vojislav
Vojinic,  Joaquim  M.S.  Cabral  dan Luis p. Fonsesa. 2003. Horseradish Peroxidase: A Valuable  Tool  in  Biotechnology. Biotechnology Annual Review, Volume 9 (hlm 199-247) Handayani,  Santi  Nur,  Zulfahair  dan Fofika Diah Rizaeni. 2008. Penggunaan  Enzim  Peroksidase dari Daun Mangkokan untuk Penurunan  Kadar  Fenol.  Makalah disajikan  dalam  Seminar  Nasional Aplikasi  Sains  dan  Teknologi 2008.  Universitas  Negeri  Jendral Soedirman. Purwokerto 13 Desember 2008. Isyuniarto,  Widdi  Usada,  Agus  Purwadi dan  Suryadi.  2005.  Degradasi Fenol  Dalam  Limbah  Pengolahan Minyak Bumi dengan Ozon. Yogyakarta  :  Pusat  Penelitian  dan Pengembangan  Teknologi  Maju. ISSN 76:02163128.
Laurenti,  C  and  E.  Clemente.2010. Some  Properties  of  Peroxidase Extracted  from  Pulp  of  Star  Fruit. Brazil  :  Laboratorio  de  Bioquimica de Alimentos . Brazil Rocha  LL,  de  Aquir  Cordeiro  R, Cavalcante  RM,  do  Nascimento
RF, Martins SC, Santaella ST, dan Melo  VM.  2007.  Isolation  and Characterization of Phenol- degrading  Yeast  from  an  Oil Refinery  Wastewater  in  Brazil. Mycophatologia Volume 164
(hlm:183-188).
Sadikin,  M.  2002.  Biokimia  Enzim.
Jakarta : Widya Medika. Shetty  KV.  Kalifathulla  I,  Srinikethan  G. 2007.  Performance  of  Pulsed Plate Bioreactor for Biodegradation of Phenol. J Hazard Mat Volume 140 (hlm:346- 352). Slamet, R. Arbianti dan Daryanto. 2005. Pengolahan Limbah Organik (Fenol) dan Logam Berat (Cr6+atau  Pt4+)  secara  Simultan dengan  Fotokatalisis  TiO2,  ZnO-
TiO2,  dan  CdS-TiO2.  Makara Teknologi,  Volume  9,  No  2, November 2005. (hlm 66-71
Yohan,  Hidayat.  1998.  Pemanfaatan
Peroksidase  dari  Lobak  Sebagai Katalis Untuk Penanganan Limbah Fenol dengan Hidrogen Peroksida. SKRIPSI (tidak diterbitkan). Jurusan Kimia Universitas Diponegoro Semarang. Zulfahair  dan  Santi  Nur  Handayani. 2008.  Pemanfaatan  Kulit  Batang Ubi  Kayu  Sebagai  Sumber  Enzim
Peroksidase Untuk Penurunan Kadar  Fenol.  Makalah  disajikan dalam  Seminar  Nasional  Aplikasi Sains dan Teknologi 2008. Universitas Negeri Jendral Soedirman. Purwokerto 13 Desember 2008.