## Original Research
Optimasi dan Evaluasi Whole Genome Sequencing SARS  CoV-2  Di  Balai  Laboratorium  Kesehatan dan  Pengujian  Alat  Kesehatan  Provinsi  Jawa Tengah
Optimization  and  Evaluation  of  Whole  genome sequencing  of  SARS  CoV-2  at  the  Center  for Health Laboratory and Testing of Medical Devices in Central Java Province
Hediningsih,  Yekti;  Nurhaﬁd,  Mohammad;  Wahyuni,  Endah; Hapsari,  Dyah  Ayu  Kunti;  Purnomo,  Purnomo;  Marwiyah, Marwiyah;  Sulistiyanto,  Hendrik;  Farhati,  Ismi;  Handayani,  Sekti; Peni, Wiwik

## Yekti Hediningsih
Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah, Indonesia
Mohammad Nurhaﬁd m.nurhaﬁd15@gmail.com PT. Artha Genetikalab Indonesia, Indonesia

## Endah Wahyuni
Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah, Indonesia Dyah Ayu Kunti Hapsari Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah, Indonesia

## Purnomo Purnomo
Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah, Indonesia

## Marwiyah Marwiyah
Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah, Indonesia

## Hendrik Sulistiyanto
Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah, Indonesia

## Ismi Farhati
Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah, Indonesia

## Sekti Handayani
Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah, Indonesia Wiwik Peni Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah, Indonesia
Ringkasan: SARS  CoV-2  merupakan  virus  yang  menyebar hampir  keseluruh  Negara  di  dunia  termasuk  Indonesia.  Whole genome  sequencing  merupakan  metode  yang  paling  tepat digunakan  untuk  mendeteksi  beberapa  varian  dan  mutasi  gen dari SARS CoV-2. Tujuan dari penelitian ini yaitu mengetahui dan evaluasi pengerjaan whole genome SARS CoV-2 berdasarkan nilai keberhasilan dan indikator sekuensing di Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah. Metode  survei  digunakan  dalam  penelitian  ini  di  mana  sampel diambil  dari  beberapa  daerah  yaitu  Jawa  tengah,  Jawa  Barat, Banten dan Jakarta. Analisis keberhasilan didasarkan pada hasil fasta  dari  analisis  Dragen  COVID  Lineage.  Hasil  penelitian menunjukan  bahwa  persentase  keberhasilan  dari  empat  batch pengerjaan menunjukkan bahwa dua batch terakhir mendapatkan persentase lebih tinggi dibandingkan dengan dua batch pertama. Primer pool artic yang digunakan yaitu versi V3 dan V4 diduga kuat  sebagai  faktor  yang  mempengaruhi  keberhasilan  tersebut di  mana  versi  V4  menunjukkan  performa  yang  lebih  baik  dan cocok  digunakan  dalam  pengerjaan  whole  genome  sequencing SARS  CoV-2  di  Balai  Laboratorium  Kesehatan  dan  Pengujian Alat  Kesehatan  Provinsi  Jawa  Tengah.  Beberapa  indikator digunakan sebagai penilaian standar evaluasi yaitu cluster density, passing ﬁlter dan Q30 yang disesuaikan dengan instrument yang digunakan.
Kata  kunci: Whole  genome  sequencing,  Primer  pool  artic, Indikator sekuensing, SARS CoV-2.
Abstract: SARS  CoV-2  is  a  virus  that  has  spread  to  almost all  countries  in  the  world,  including  Indonesia. Whole  genome sequencing is most appropriate for detecting several variants and gene  mutations  of  SARS  CoV-2.  e  purpose  of  this  study

## Health Information: Jurnal Penelitian
Poltekkes Kemenkes Kendari, Indonesia ISSN: 2085-0840 ISSN-e: 2622-5905 Periodicity: Bianual vol. 15, no. 1, 2023 jurnaldanhakcipta@poltekkes-kdi.ac.id
Received: 19 October 2022 Accepted: 25 January 2023
URL: http://portal.amelica.org/ameli/journal/504/5043980001/
DOI: https://doi.org/10.36990/hijp.v15i1.706
Funding Funding source: Nihil. Corresponding author: m.nurhaﬁd15@gmail.com
Authors retain copyright and grant the journal right of ﬁrstpublication with the work simultaneously licensed under a CreativeCommons Attribution-ShareAlike 4.0 International License thatallows others to share the work with an acknowledgment of theworks authorship and initial publication in this journal and able toenter into separate, additional contractual arrangements for the non-exclusive distribution of the journals published version of the work(e.g., post it to an institutional repository or publish it in a book).
is work is licensed under Creative Commons Attribution- ShareAlike 4.0 International.
was  to  identify  and  evaluate  the  entire  SARS  CoV-2  genome based on success and sequencing indicators at the Central Java Province Health Laboratory and Medical Device Testing Center. e survey method used in this study where samples were taken from  several  regions,  namely  Central  Java,  West  Java,  Banten and  Jakarta.  e  analysis  is  based  on  fasta  results  from  the Dragen  COVID  lineage  analysis.  e  results  showed  that  the proportion  of  success  of  the  four  working batch es  showed  that the  last  two batch es  got  a  higher  percentage  than  the  ﬁrst  two batch es. Pool artic primers used, namely versions V3 and V4 are strongly  suspected  as  factors  that  inﬂuence  the  success  where the V4 version shows better performance and is suitable for use in the whole genome sequencing of SARS CoV-2 at the Central Java Provincial Health Laboratory and Medical Device Testing Center. Several indicators are used as evaluation standards, namely cluster density , passing ﬁlter and Q30 which are adjusted to the instrument used.
Keywords: Whole  genome  sequencing ,  Pool  artic  primer, Sequencing indicator, SARS CoV-2.

## PENDAHULUAN
SARS CoV-2 merupakan virus baru yang pertama kali ditemukan di Wuhan, China  pada  akhir  tahun  2019  dan  menyebar  hampir  ke  seluruh  Negara  di dunia (Phelan et al., 2020). Organisasi kesehatan dunia (WHO) mengumumkan pada  awal  tahun  2020  bahwa  penyakit  COVID-19  sebagai  keadaan  darurat kesehatan  masyarakat.  Di  Indonesia,  kasus  COVID-19  pertama  dan  kedua diumumkan pada tanggal 12 Maret 2020. Berdasarkan kasus yang ditemukan, mulai teridentiﬁkasi klaster-klaster dari SARS CoV-2 yang tersebar di beberapa wilayah di Indonesia. Hingga awal tahun 2022, persebaran semakin meningkat hingga  tercatat  beberapa  varian  baru  terutama  varian  Delta  dan  Omicron (Turista  et  al.,  2020).  Salah  satu  daerah  di  Indonesia  tercatat  sebagai  daerah dengan tingkat kasus tergolong tinggi adalah Provinsi Jawa Tengah (Philips & Wicaksono, 2020)
Berbagai teknik molekuler banyak digunakan untuk mendeteksi keberadaan dari  SARS  CoV-2  seperti  deteksi  gen  spesiﬁk, genotyping hingga  pengurutan asam  nukleat. Whole  genome  sequencing (WGS)  merupakan  salah  satu metode  pengurutan  asam  nukleat  secara  utuh.  Metode  tersebut  diketahui memiliki keunggulan lebih dibandingkan dengan metode lain, misalnya targeted sequencing.  Whole  genome  sequencing mampu  mendeteksi  perubahan  asam nukleat  yang  terjadi  pada  semua  gen  sehingga  metode  tersebut  dijadikan sebagai  metode  monitoring  perkembangan  dan  persebaran  SARS  CoV-2  di suatu wilayah. Beberapa penelitian menunjukan bahwa metode WGS berhasil digunakan pada genome virus SARS CoV-2 untuk mengetahui mutasi, pemetaan
Yekti Hediningsih, et al. Optimasi dan Evaluasi Whole Genome Sequencing SARS CoV-2 Di Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Keseha...
persebaran hingga deteksi beberapa varian baru (Gunadi et al., 2020; Massi et al., 2022). Di Indonesia, metode WGS masih sangat jarang sekali dilakukan. Hal tersebut karena metode WGS merupakan cara baru dan proses pengerjaannya yang memerlukan pelatihan keterampilan lanjutan.
Pengembangan  dan  perbaikan  metode  WGS  perlu  dilakukan  guna mendapatkan hasil secara maksimal. Optimasi dapat dilakukan sebagai langkah untuk  mengetahui  komponen-komponen  yang  digunakan  serta  proses  dalam pengerjaan. Primer merupakan komponen yang sangat penting dalam persiapan sampel  amplikon.  Laju  mutasi  yang  sangat  cepat  dari  SARS  CoV-2  diduga menjadi faktor yang mempengaruhi dalam keberhasilan ampliﬁkasi Polymerase Chain Reaction dan sekuensing. Selain itu, untuk mengevaluasi hasil sekuensing ada  beberapa  indikator  penting  yang  dapat  terapkan  sebagai  luaran  kualitas dari  hasil  pengerjaan  WGS  yaitu  nilai cluster  density,  passing  ﬁlter dan  Q30. Nilai  indikator  tersebut  dibandingkan  dengan  nilai  standar  sesuai  dengan instrumen  dan  reagen  kit  yang  digunakan  sehingga  didapatkan  nilai  untuk mengevaluasi  pengerjaan  proses  sekuensing.  Menurut  Kastanis  et  al.  (2019) dalam  percobaannya  menggunakan  lima  instrumen miseq  sequencing untuk mancari  metode  dan  indikator  penting  dalam  mendapatkan  kualitas  hasil standar.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  dan  evaluasi  berdasarkan indikator  penting  dalam  pengerjaan whole  genome SARS  CoV-2  di  Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Provinsi Jawa Tengah.

## METODE
Penelitian dilakukan secara survei. Sampel didapatkan dan dikumpulkan dari beberapa laboratorium dan rumah sakit di Jawa Tengah, Jawa barat, Banten dan Jakarta untuk dilakukan observasi. Secara umum, tahapan yang dilakukan dalam mengerjakan whole genome sequencing meliputi pengumpulan sampel, preparasi sampel, preparasi perpustakaan DNA, sekuensing dan analisis data. Penelitian ini terdiri dari empat batch pengerjaan dengan jumlah sampel dalam setiap batch sebanyak 96 sampel. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biomolekuler, Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah pada bulan Maret hingga Juli 2022.

## Pengumpulan Sampel
Sampel dikumpulkan dari beberapa laboratorium dan rumah sakit dari lokasi asal yang berbeda. Sampel yang didapatkan merupakan sampel positif COVID-19 dan  untuk  observasi  lebih  lanjut  hingga  analisis whole  genome .  Pengambilan sambel  dari  hasil  swab  nasofaring  dan  dihomogenkan  dalam viral  transport medium untuk disimpan pada suhu -20℃.

## Ekstraksi RNA Virus
Ekstraksi RNA virus menggunakan Singuway Extraction RNA Kit dengan mesin automatic extraction mengikuti penelitian yang sebelumnya telah dimodiﬁkasi (Xiong  et  al.,  2020).  Sebanyak  25µl  larutan  ilution  buﬀer  diambil  dari plate
yang akan digunakan dengan tujuan untuk meningkatkan kosentrasi RNA hasil ekstraksi. Kemudian sebanyak 200µl larutan viral transport medium (VTM) yang berisi sampel virus hasil swab dimasukan ke dalam plate sesuai kode sampel yang ditentukan. Masukan plate ke dalam mesin ekstraksi dan jalankan sesuai program yang digunakan.

## Preparasi Perpustakaan DNA
Persiapan perpustakaan DNA menggunakan reagen Illumina COVIDSeq Test yang kemudian dilakukan beberapa modiﬁkasi untuk dapat disesuaikan dengan kondisi dilaboratorium. Anneal RNA dilakukan dengan menyiapkan plate PCR . Sebayak 8,5µL dimasukan ke dalam setiap well-plate PCR . Tambahkan sebanyak 8,5µL sampel hasil ekstraksi ke dalam well . Tutup plate menggunakan seal dan shake dengan kecepatan 1,000xg selama 1 menit kemudian masukan dalam mesin PCR untuk running . Selanjutnya synthesis ﬁrst strain cDNA dilakukan dengan menyiapkan mastermix yang berisi larutan ﬁrst strain mix dan RVT. Sebanyak 8µL mastermix dimasukan ke dalam well plate yang berisi sampel hasil anneal RNA. Seal dan shake dengan kecepatan 1.000x g selama satu menit kemudian masukan plate dalam  mesin  PCR  untuk running .  Selanjutnya  yaitu amplify DNA virus yang dilakukan dengan membuat dua mastermix yang berbeda yaitu mastermix berisi primer pool versi V3 dan V4 yang dilakukan pada batch yang berbeda (Clark et al., 2022). Sebanyak dua plate PCR disiapkan untuk mastermix pertama dan kedua. Sebanyak 20µl mastermix dimasukan ke dalam well sesuai plate . Tambahkan sebanyak 5µl sampel cDNA ke dalam well satu dan dua. Seal dan shake dengan kecepatan 1.000x g selama 1 menit kemudian masukan dalam mesin PCR untuk running (Bhoyar et al., 2021). Langkah selanjutnya yaitu tagmentation yang dilakukan dengan menyiapkan mastermix berisi  EBLTs,  TB1  dan Nuclease  ee  water .  Campurkan  hasil ampliﬁkasi  PCR primer  pool 1  dan primer  pool 2  masing-masing  10µl  sesuai kode  sampel  pada plate baru.  Tambahkan  sebanyak  30µl mastermix kesetiap well yang  berisi  sampel. Seal dan shake dengan  kecepatan  1000x  g  selama  1 menit. Kemudian masukan pada mesin PCR untuk running . Setelah PCR selesai, tambahkan  sebanyak  10µl  ST2  ke  dalam  setiap well.  Seal dan shake dengan kecepatan 1000x g selama satu menit. Lakukan inkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Tempatkan plate sampel pada magnetic stand selama 3 menit. Buang semua supernatant dan lakukan pencucian menggunakan TWB sebanyak dua kali.  Langkah  selanjutnya  yaitu amplify  tagmentation dilakukan  dengan  cara menyiapkan mastermix yang berisi EPM HT dan Nuclease ee water . Sebanyak 40µl mastermix dan  10µl  index  ditambahkan  pada  setiap  sampel  yang  telah dicuci. Seal dan shake dengan  kecepatan  1000x  g  selama  1  menit.  Kemudian masukan plate ke dalam mesin PCR untuk di running (Bhoyar et al., 2021). Langkah selanjutnya yaitu pool and clean up libraries dilakukan dengan cara mengambil  sebanyak  5µl  dari  setiap  sampel  dan  dimasukan  pada  mikro tube 2ml, tambahkan sebanyak 396 ITB ke dalam tube dan inkubasi selama 5 menit pada  suhu  ruang.  Letakan tube pada magnetic  stand selama  3  menit.  Buang semua supernatant lalu tambahkan 1ml ethanol 80% dan inkubasi selama 30 detik. Lakukan langkah tersebut sebanyak dua kali. Bersihkan semua sisa ethanol hingga  benar-benar  bersih,  lalu  tambahkan  sebanyak  50µl Resuspen  buﬀer ke
Yekti Hediningsih, et al. Optimasi dan Evaluasi Whole Genome Sequencing SARS CoV-2 Di Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Keseha...
dalam tube.  Vortex dan spindown  tube kemudian  inkubasi  selama  2  menit. Letakan  kembali tube pada magnetic  stand selama  2  menit.  Sebanyak  20µl supernatant diambil  dan  dimasukkan  pada tube baru  sebagai  stok.  Langkah selanjutnya yaitu normalisasi dan pengenceran dilakukan dengan cara sebanyak 2µl sampel dari stok diencerkan menggunakan RSB dengan hasil pengenceran 10  kali.  Hasil  pengenceran  di  lakukan quantify menggunakan qubit untuk mengetahui nilai kosentrasi. Hasil pengenceran 10 kali kemudian diencerkan kembali menjadi 4nm. Hasil pengenceran 4nm kemudian dilakukan pembukaan untai DNA hingga menjadi untai tunggal menggunakan NaOH 10%. Lakukan pengenceran hingga kosentrasi akhir yaitu 10pm untuk dimasukkan pada mesin Illumina Miseq sequencing (Pillay et al., 2020).

## Pengolahan dan Analisis Data
Analisis  data  hasil  penelitian  dilakukan  secara  deskriptif.  Hasil  sekuensing berupa FASTQ dianalisis menggunakan program sequencing analysis viewer yang menghasilkan nilai cluster density, passing ﬁlter dan Q30. Data yang didapatkan kemudian  dibandingkan  untuk  evaluasi  pengerjaan  yang  didasarkan  pada keberhasilan sequencing. Parameter keberhasilan sekuensing dalam penelitian ini yaitu didapatkannya hasil analisis Dragen COVID lineage .

## HASIL
Pengerjaan whole genome sequencing diawali dengan proses ekstraksi RNA virus SARS CoV-2. Kemudian dilakukan ampliﬁkasi PCR untuk proses penempelan enzim reverse transcriptase serta penggandaan secara invitro.

## Gambar 1
Visualisasi Hasil Ampliﬁkasi PCR No. 1 dan No. 12 DNA Marker 100bp, No. 2-9 sampel setiap batch , No. 10 kontrol negatif, No. 11 kontrol positif DOI: https://doi.org/10.36990/hijp.v15i1.706.g734

## Gambar 2
Tampilan Hasil Analisis Sequencing Analysis Viewer (SAV) WGS Batch 18 menggunakan Instrumen Miseq
DOI: https://doi.org/10.36990/hijp.v15i1.706.g735
Proses  ampliﬁkasi  PCR  berhasil  yang  ditandai  dengan  pita  DNA  hasil visualisasi  gel  elektroforesis  dengan  panjang  produk  400bp.  DNA  marker digunakan sebagai standar untuk mengetahui panjang produk hasil ampliﬁkasi. Visualisasi yang dilakukan pada penelitian ini diambil dari dua sampel secara acak pada setiap batch untuk mengetahui keberhasilan dalam mendapatkan materi genetik serta penggandaan RNA virus. Sebanyak delapan sampel visualisasi hasil PCR  yang  menunjukan  keberhasilan  sesuai  dengan  kontrol  positif  pada well nomor 11 yaitu 400bp, dan kontrol negative pada well 10 menunjukan hasil yang sesuai di mana PCR yang dilakukan tanpa materi virus (Gambar 1). Whole genome sequencing dilakukan dengan empat kali running pada batch 12, 14, 17 dan 18. Dua set primer artic digunakan sebagai pembanding yaitu primer versi V3 dan V4 yang digunakan pada masing-masing 2 batch . Primer versi V3 digunakan  pada batch 12  dan  14  sedangkan  primer  versi  V4  digunakan  pada batch 17 dan 18.

## Tabel 1
Jenis Primer dan Persentase Keberhasilan
DOI: https://doi.org/10.36990/hijp.v15i1.706.g735
Sebanyak 384 sampel dalam empat batch dengan masing-masing batch terdiri dari 96 sampel menunjukan hasil persentase keberhasilan yang bervariasi antar batch . Persentase keberhasilan menunjukan keberhasilan meningkat dari batch 12 hingga batch 18 dengan masing-masing persentase berturut-turut 61%, 73%, 95% dan 100%. Perbedaan dua batch pertama yaitu 12 dan 14 dengan dua batch terakhir yaitu 17 dan 18 pada penelitian ini diduga karena primer yang digunakan berbeda.  Dua batch pertama,  primer  yang  digunakan  merupakan primer  pool artic versi V3 sedangkan dua batch terakhir, primer yang digunakan yaitu primer
Yekti Hediningsih, et al. Optimasi dan Evaluasi Whole Genome Sequencing SARS CoV-2 Di Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Keseha...
pool  artic versi  V4. Primer  pool  artic versi  V4  menunjukan  hasil  yang  lebih stabil dibandingkan dengan primer pool artic versi V3 yang ditunjukan dengan persentase keberhasilan yang lebih tinggi (Tabel 1).
Hasil sekuensing dilakukan analisis untuk evaluasi proses pengerjaan whole genome sequencing . Analisis dilakukan dengan menggunakan program sequencing analysis viewer (SAV) dari Illumina. Program tersebut dapat digunakan untuk melihat beberapa indikator untuk menilai hasil sekuensing.

## Tabel 2
Hasil Analisis WGS menggunakan SAV
DOI: https://doi.org/10.36990/hijp.v15i1.706.g737
Setiap  indikator  untuk  melihat  kualitas  hasil  sekuensing  menunjukan  nilai yang bervariasi di setiap batch pengerjaan. Indikator dari cluster density tertinggi ditunjukan pada batch 18 di mana nilai tersebut merupakan nilai yang optimal yaitu 1379±32. Nilai cluster density pada batch 12, 14 dan 17 menunjukan nilai yang rendah ( under cluster ) yaitu 839±24-1086±25. Nilai cluster PF pada batch 14, 17 dan 18 menunjukan nilai yang optimal yaitu 92,88±0,57%-96,66±0,58%. Namun pada batch 12 nilai yang rendah yaitu 55,10±36,69. Kemudian nilai Q30 dengan nilai optimal pada setiap batch yaitu 91,84%-95,68% (Tabel 2).

## PEMBAHASAN
Whole  genome  sequencing merupakan  salah  satu  aplikasi  dari next  generation sequencing yang penggunaannya menjadi tren dalam mencari informasi genetik suatu organisme (Park & Kim, 2016). Sejak munculnya pandami COVID-19, whole  genome  sequencing digunakan  sebagai  metode  monitoring  perubahan struktur  asam  nukleat  seluruh  gen  dari  SARS  CoV-2.  Balai  Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah salah satu pusat rujukan sekaligus tempat yang mengerjakan whole genome SARS CoV-2 dalam monitoring  kasus  COVID-19  di  Jawa  Tengah.  Berdasarkan  hasil  penelitian, keberhasilan  dari  empat batch yang  teliti,  bahwa  dua batch terakhir  memiliki persentase keberhasilan lebih tinggi dibandingkan pada dua batch pertama. Hal tersebut diduga karena primer yang digunakan berbeda yaitu primer pool artic versi V3 dan V4. Menurut Clark et al. (2022) penggunaan jenis primer sangat mempengaruhi hasil sekuensing dari whole genome sequencing . Hasil penelitian tersebut  merekomendasikan  primer  versi  V4  lebih  baik  untuk  menghasilkan genome SARS CoV-2 dengan kosentrasi yang rendah. Selain itu, primer pool artic versi V4 baik digunakan untuk studi genome SARS CoV-2 yang telah bermutasi. Berbagai instrument dapat digunakan sebagai alat untuk pengurutan genome SARS  CoV-2.  Namun  setiap  alat  yang  digunakan  umumnya  memiliki  nilai standar  dari  indikator  yang  digunakan  sebagai  acuan  dalam  melihat  kualitas
hasil  sekuensing.  Menurut  Ravi  et  al.  (2018)  analisis  indikator  dengan  nilai ideal  untuk  instrument  Miseq  dengan  reagen  Miseq  V3  yaitu cluster  density 1200-1400k/mm. Cluster PF  >85%  dan  >70%  untuk  Q30%.  Nilai  dari parameter  tersebut  berbeda  jika  instrument  yang  digunakan  juga  berbeda. Nilai  dari  indikator cluster  density dalam  penelitian  ini  yaitu batch 12,  14 dan  17  menunjukan  nilai  yang  tergolong under  clustering (rendah)  karena tidak mencapai nilai indikator standar. Meski demikian, genome yang melalui standar  pada ﬂowcell cukup  optimal  sehingga  signal  dalam  pembacaan  tetap terdeteksi dengan baik seperti pada batch 18 dengan nilai cluster density yang optimal. Cluster passing ﬁlter pada penelitian ini menunjukan nilai yang ideal yaitu 92,88±0,57-96,66±0,58 kecuali pada batch 12 di mana nilai passing ﬁlter menunjukan  nilai  yang  rendah  yaitu  55,10±36,69  dan  jauh  dibawah  standar >85%.  Hal  tersebut  dapat  menjadi  salah  satu  faktor  rendahnya  persentase keberhasilan dalam pengerjaan whole genome sequencing pada batch 12 (Tabel 1). Parameter dalam WGS seperti cluster density, cluster PF dan Q30 menjadi indikator  yang  sangat  penting  untuk  evaluasi  proses  sekuensing  (Kastanis  et al.,  2019). Cluster  density merupakan  klaster  yang  dibentuk  dalam ﬂowcell secara  klonal.  Jumlah  klaster  yang  terbentuk  dipengaruhi  oleh  kualitas  dari perpustakan  DNA  dalam  proses  penyiapan.  Penyiapan  perpustakaan  DNA dilakukan  dengan  prosedur  dan  ketelitian  dalam  pengerjaan  karena  tahapan ini menjadi tahapan yang sangat penting sebagai penentu kualitas hasil whole genome sequencing (Ravi et al., 2018). Cluster PF merupakan klaster yang dapat melalui ﬁlter pembacaan dan menunjukkan kemurnian klaster. Jika garis density berdekatan dengan garis PF maka hasil sekuensing semakin baik. Garis tersebut menunjukan perbandingan kepadatan klaster klonal dengan klaster yang dapat melalui ﬁlter. Garis yang berdekatan menunjukan perbandingan yang selaras dari keduanya (Kircher et al., 2012). Sedangkan Q30 merupakan intensitas signal dari pembacaan, semakin tinggi nilai Q30 maka intensitas pembacaan semakin tinggi (Kircher  et  al.,  2012;  Ravi  et  al.,  2018).  Beberapa  indikator  ideal  ditunjukan seperti pada Gambar 2.
Pengurutan  menggunakan  metode whole  genome  sequencing merupakan metode  yang  baik  dilakukan  untuk  mendapatkan  beberapa  informasi  genetik secara  menyeluruh.  Beberapa  studi  menunjukan  bahwa  hasil  sekuensing menggunakan  metode  pengurutan whole  genome  sequencing memberikan informasi yang kompleks tentang karakteristik basa nukleutida dalam rangkaian genome .  Beberapa  informasi  seperti  anotasi,  mutasi  hingga lineage dari  SARS CoV-2 ditemukan dari hasil analisis tersebut sehingga dapat digunakan sebagai monitoring  dari  persebaran  mutasi  varian  virus  SARS  CoV-2.  Berdasarkan penelitian  Umair  et  al.,  (2021)  metode whole  genome  sequencing mampu mendeteksi  varian  G614  di  beberapa  wilayah  di  Pakistan.  Penelitian  lain, mengenai  deteksi  mutasi  dan lineage dari  SARS  CoV-2  di  beberapa  negara berhasil  dilakukan  menggunakan  metode whole  genome  sequencing untuk monitoring perubahan varian di Negara tersebut (Frampton et al., 2021; Martins et al., 2021).
Yekti Hediningsih, et al. Optimasi dan Evaluasi Whole Genome Sequencing SARS CoV-2 Di Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Keseha...

## KESIMPULAN DAN SARAN
Optimasi pengerjaan whole genome sequencing menggunakan primer pool artic V3 dan V4 menunjukan keberhasilan lebih tinggi dengan penggunaan primer pool artic versi V4 seperti yang ditunjukan pada batch 17 dan 18. Hasil evaluasi berdasarkan keberhasilan dan indikator penting dari percobaan ini, primer pool versi V4 dapat direkomendasikan sebagai primer untuk pengerjaan whole genome sequencing SARS CoV-2.

## Kekurangan Penelitian
Beberapa parameter tidak dapat diobservasi seperti kualitas sampel virus menjadi faktor  lain  terhadap  persentase  keberhasilan.  Selain  itu,  data  hasil  sekuensing perlu menggunakan beberapa perangkat lunak dalam memastikan kualitas dan keberhasilan pengerjaan whole genome sequencing . Data yang didapatkan hanya berdasarkan dari perangkat lunak dan program yang tersedia dai Illumina.

## Mengakui
Ucapan terimakasih kepada Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah.

## DAFTAR PUSTAKA
Bhoyar, R. C., Senthivel, V., Jolly, B., Imran, M., Jain, A., Divakar, M. K., Scaria, V., & Sivasubbu, S. (2021). An optimized, amplicon-based approach for sequencing of SARS-CoV-2 from patient samples using COVIDSeq assay on Illumina MiSeq sequencing platforms. STAR Protocols, 2 (3), 100755. https://doi.org/10.1016/j. xpro.2021.100755
Clark,  A.  C.  R.,  Hardison,  M.  T.,  Houdeshell,  H.  N.,  Vest,  A.  C.,  &  Darcy,  A.
(2022). Evaluation of an optimized protocol and Illumina ARTIC V4 primer pool for sequencing of SARS-CoV-2 using COVIDSeq TM and DRAGEN TM COVID Lineage App workﬂow .
Frampton,  D.,  Rampling,  T.,  Cross,  A.,  Bailey,  H.,  Heaney,  J.,  Byott,  M.,  Scott,  R., Sconza, R., Price, J., Margaritis, M., Bergstrom, M., Spyer, M. J., Miralhes, P. B., Grant, P., Kirk, S., Valerio, C., Mangera, Z., Prabhahar, T., Moreno-Cuesta, J., …
Nastouli, E. (2021). Genomic characteristics and clinical eﬀect of the emergent SARS-CoV-2 B.1.1.7 lineage in London, UK: a whole-genome sequencing and hospital-based cohort study. e Lancet Infectious Diseases, 21 (9), 1246–1256. h ttps://doi.org/10.1016/S1473-3099(21)00170-5
Gunadi,  Wibawa,  H.,  Marcellus,  Hakim,  M.  S.,  Daniwijaya,  E.  W.,  Rizki,  L.  P., Supriyati,  E.,  Nugrahaningsih,  D.  A.  A.,  Aﬁahayati,  Siswanto,  Iskandar,  K., Anggorowati,  N.,  Kalim,  A.  S.,  Puspitarani,  D.  A.,  Athollah,  K.,  Arguni,  E.,
Nuryastuti, T., & Wibawa, T. (2020). Full-length genome characterization and phylogenetic analysis of SARS-CoV-2 virus strains from Yogyakarta and Central Java, Indonesia. PeerJ, 8 , 1–15. https://doi.org/10.7717/peerj.10575
Kastanis, G. J., Santana-Quintero, L. V., Sanchez-Leon, M., Lomonaco, S., Brown, E. W., & Allard, M. W. (2019). In-depth comparative analysis of Illumina ® MiSeq
run metrics: Development of a wet-lab quality assessment tool. Molecular Ecology Resources, 19 (2), 377–387. https://doi.org/10.1111/1755-0998.12973 Kircher, M., Sawyer, S., & Meyer, M. (2012). Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Research, 40 (1), 1–8. https://doi.org/10.1093/nar/gkr771
Martins, A. F., Zavascki, A. P., Wink, P. L., Volpato, F. C. Z., Monteiro, F. L., Rosset, C., De-Paris, F., Ramos, Á. K., & Barth, A. L. (2021). Detection of SARS-CoV-2 lineage P.1 in patients from a region with exponentially increasing hospitalisation rate,  February  2021,  Rio  Grande  do  Sul,  Southern  Brazil. Eurosurveillance,
26 (12), 0–4. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2021.26.12.2100276
Massi, M. N., Abidin, R. S., Farouk, A.-E., Halik, H., Soraya, G. V., Hidayah, N., Sjahril,
R.,  Handayani,  I.,  Hakim,  M.  S.,  Gazali,  F.  M.,  Setiawaty,  V.,  &  Wibawa,  T. (2022). Full-genome sequencing and mutation analysis of SARS-CoV-2 isolated from Makassar, South Sulawesi, Indonesia. PeerJ, 10 , e13522. https://doi.org/10 .7717/peerj.13522
Park, S. T., & Kim, J. (2016). Trends in next-generation sequencing and a new era for whole genome sequencing. International Neurourology Journal, 20 , 76–83. https:/ /doi.org/10.5213/inj.1632742.371
Phelan, A. L., Katz, R., & Gostin, L. O. (2020). e Novel Coronavirus Originating in Wuhan, China: Challenges for Global Health Governance. JAMA - Journal of the American Medical Association, 323 (8), 709–710. https://doi.org/10.1001/jama. 2020.1097
Philips,  V.,  &  Wicaksono,  T.  Y.  (2020).  Karakter  dan  Persebaran  Covid-19  di Indonesia. CSIS Commentaries, April , 1–12.
Pillay,  S.,  Giandhari,  J.,  Tegally,  H.,  Wilkinson,  E.,  Chimukangara,  B.,  Lessells,  R., Moosa,  Y.,  Mattison,  S.,  Gazy,  I.,  Fish,  M.,  Singh,  L.,  Khanyile,  K.  S.,  San,  J. E.,  Fonseca,  V.,  Giovanetti,  M.,  Alcantara,  L.  C.  J.,  &  de  Oliveira,  T.  (2020). Whole genome sequencing of sars-cov-2: Adapting illumina protocols for quick and accurate outbreak investigation during a pandemic. Genes, 11 (8), 1–13. https:// doi.org/10.3390/genes11080949
Ravi,  R.  K.,  Walton,  K.,  &  Khosroheidari,  M.  (2018).  Miseq:  A  next  generation sequencing platform for genomic analysis. Methods in Molecular Biology, 1706 , 223–232. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7471-9_12
Turista, D. D. R., Islamy, A., Kharisma, V. D., & Ansori, A. N. M. (2020). Distribution of COVID-19 and phylogenetic tree construction of sars-CoV-2 in Indonesia. Journal of Pure and Applied Microbiology, 14 (May), 1035–1042. https://doi.org /10.22207/JPAM.14.SPL1.42
Umair, M., Ikram, A., Salman, M., Khurshid, A., Alam, M., Badar, N., Suleman, R., Tahir, F., Sharif, S., Montgomery, J., Whitmer, S., & Klena, J. (2021). Whole- genome  sequencing  of  SARS-CoV-2  reveals  the  detection  of  G614  variant  in Pakistan. PLoS ONE, 16 (3 March), 1–11. https://doi.org/10.1371/journal.pon e.0248371 Xiong,  D.,  Dai,  W.,  Gong,  J.,  Li,  G.,  Liu,  N.,  Wu,  W.,  Pan,  J.,  Chen,  C.,  Jiao,  Y., Deng, H., Ye, J., Zhang, X., Huang, H., Li, Q., Xue, L., Zhang, X., & Tang, G. (2020). Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPRCas12a. PLoS Biology,
18 (12 December), 1–12. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000978
Yekti Hediningsih, et al. Optimasi dan Evaluasi Whole Genome Sequencing SARS CoV-2 Di Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Keseha...

## Catatan kaki
Editor  Akademis: Arli  Aditya  Parikesit  (Indonesia  International  Institute  for  Life  Sciences, INDONESIA).
Pernyataan Konﬂik Kepentingan: Para penulis menyatakan tidak terdapat konﬂik kepentingan dengan pihak manapun.
Kontribusi  Penulis:  YH (Konseptualisasi,  Metodologi); MN (Kurasi  data,  Visualisasi, Penyiapan naskah - dra, Penyiapan naskah - reviu & pengeditan); EW (Investigasi); DAKH (Investigasi); P (Investigasi); M (Investigasi); HS (Investigasi); IF (Analisis formal); SH (Analisis formal); WP (Analisis formal).
Berbagi Data: Data penelitian tersedia melalui korespondensi dengan penulis.
Pernyataan  Penerbit: Poltekkes  Kemenkes  Kendari  menyatakan  tetap  netral  sehubungan dengan klaim dari perspektif atau buah pikiran yang diterbitkan.

## Author notes
m.nurhaﬁd15@gmail.com