Jurnal Pharmascience, Vol 2, No. 1, Februari 2015, hal: 35 – 43 ISSN : 2355 – 5386
Research Article
Aktivitas Imunomodulator Fraksi n-Heksan dari Herba Sambiloto ( Andrographis paniculata , (Burm.F) Nees )

## Terhadap Mencit yang Diinduksi Vaksin Hepatitis B dengan Parameter Ig G
Mamik Ponco Rahayu Fakultas Farmasi, Universitas Setia Budi, Surakarta Email: pi_er@yahoo.co.id

## Abstrak
Herba  sambiloto  ( Andrographis  paniculata Burm.  Nees)  mengandung  banyak  komponen senyawa kimia yang telah banyak di teliti dengan aktivitas sebagai hepatoprotektor dan salah satu kandungan zat aktifnya yaitu andrographolid. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas dari  A.  paniculata  yang  mempunyai  aktivitas  sebagai  imunomodulator  dan  hepatoprotektor terhadap  mencit  Balb/c  yang  telah  diinduksi  vaksin  hepatitis  B.  Ekstraksi  herba  sambiloto menggunakan  alat  Soxhlet  dengan  pelarut  yang  berseri.  Vaksin  hepatitis  B  digunakan  sebagai penginduksi  mencit  Balb/c.  Sebagai  tolok  ukur  imunostimulator  adalah  peningkatan  jumlah antibodi IgG dengan ELISA tidak langsung. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak n-heksan (2,7  mg/20  g  BB  mencit)  menunjukkan  peningkatan  IgG  tertinggi.  Tiga  fraksi  teraktif  dengan peningkatan jumlah  IgG  tertinggi  sampai  terendah yaitu F2 (0,569 mg/20  g BB  mencit),  F1(0,126 mg/20 g BB mencit), F4(0,094 mg/20 g BB mencit).
Kata  Kunci  :  Herba  sambiloto  ( Andrographis  paniculata Burm.  Nees),  Imunomodulator, Hepatoprotektor, Vaksin Hepatitis B

## Abstract
Andrographis herbs (Andrographis paniculata Burm. Nees) has many active compounds , which shown hepatoprotector activity and one of its component is andrograpolide. Therefore, the aim of this study  were  to  search  the  active  compounds  from  A.  paniculata  as  imunomodulator  from  the  BALB/c mice was induced by hepatitis B vaccine. Andrographis herbs was extracted using Soxhlet by series of solvents. The isolation process was guided with in vivo imunommodulatory assay induced by hepatitis B vaccine  in  Balb/c  mice.  The    imunostimulant  activity  was  assesed  through  the  increasing  of  IgG antibody.   Hexane extract (2.7 mg /20 g mice) was increasing the titer of IgG higher than others. The fractions activity on increasing IgG titer from highest to lowest were F2 (0.569 mg/20 g mice), F1(0.126 mg/20 g mice), F4(0.094 mg/20 g mice).
Keywords  :  Andrographis  herbs  (Andrographis  paniculata  Burm.  Nees),  Immunomodulator, Hepatoprotektor, hepatitis B vaccine

## I. PENDAHULUAN
Indonesia adalah negara yang mempunyai carrier hepatitis  B  terbanyak  nomor  tiga  setelah  Cina  dan India.  Menurut  WHO,  Indonesia  termasuk  daerah hepatitis  B  yang  endemis  dengan  tingkat  penderita sedang  dan  berat.  Penderita  hepatitis  B  sebagian besar akan sembuh dengan baik dan hanya sebagian kecil  saja  yang  langsung  meninggal  oleh  ganasnya virus  atau  karena  ketahanan  tubuh  yang  rendah. Pengobatan hepatitis B dapat melalui immunomodulator  meliputi  semua  bahan  yang memacu respon imun untuk menghancurkan sel hati yang  terinfeksi  dengan  virus  hepatitis  B  dan membersihkan hati dari virus (Anonim, 2006).
Menurut pandangan sistem pengobatan tradisional  obat-obat  alam  termasuk  obat-obat nabati, dapat mèmpengaruhi mekanisme pertahanan  alamiah  tubuh.  Seiring  dengan  makin berkembangnya pemahaman mengenai respon imun tubuh  dalam  menghadapi  infeksi  maupun  penyakit lain,  makin  berkembang  pula  penelitian  mengenai komponen  yang  dapat  mempengaruhi  respon  imun tersebut.    Ada  beberapa  obat  tradisional  yang memiliki    aktivitas  tersebut,  salah  satunya  adalah tanaman sambiloto (Andrographis  paniculata Ness) dengan kandungan aktifnya andrografolid. Berdasarkan  penelitian  Xu  Y et  al .,  (2007)  bahwa ekstrak  sambiloto  dapat  meningkatkan  produksi IFN-γ  dari  mencit  yang  divaksinasi  dengan Salmonella typhimurium.
Widyawaruyanti et al ., (1995) melaporkan bahwa ekstrak  non  polar  dan  semi  polar  dari  herba
sambiloto dapat menghambat pertumbuhan Plasmodium falciparum secara in vitro dengan sifat imunostimulan terhadap sekresi IFN-γ dan imunosupressan  terhadap  sekresi  TNF-ά.  Senyawa murni andrografolid mempunyai aktivitas imunostimulan  yang  lebih  rendah  daripada  ekstrak sambiloto,  dimungkinkan  ada  senyawa-  senyawa lain  yang  secara  sinergis  meningkatkan  respon imun  mencit  terhadap  antigen  sel  darah  merah domba  (Puri  , et  al .,  1993).  Oleh  karena  itu dilakukan fraksinasi ekstrak sambiloto menggunakan  pelarut  yang  berbeda  polaritasnya sehingga  dapat  diketahui  senyawa-senyawa  aktif yang mempunyai aktifitas sebagai imunomodulator.
Vaksin  hepatitis  B  sebagai  antigen  dapat menginduksi  produksi  antibodi  anti-HBs  yang memberikan imunitas terhadap hepatitis B. Produksi anti-HBs dapat ditingkatkan atau diturunkan oleh senyawa aktif  yang terdapat dalam bahan alam. Dalam penelitian ini digunakan vaksin hepatitis  B  yang  mengandung  5  µg/0,5  mL  HbsAg karena lebih aman dibanding dengan virus hepatitis yang  aktif.  Antibodi  anti-HBs  yang  diukur jumlahnya  adalah  IgG,  tingginya  jumlah  IgG menunjukkan  adanya  respon  kronis.    Tujuan  dari penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  aktivitas ekstrak  sambiloto  mempunyai    potensi  sebagai imunomodulator  dan    terhadap  regenerasi  sel  hati pada mencit  Balb/c  yang diinduksi vaksin  hepatitis B.

## II. METODE PENELITIAN

## A. Bahan
Bahan  utama  :  herba  sambiloto  diperoleh  dari daerah  Matesih,  Karanganyar  dan  mencit  Balb/c (umur  kurang  lebih  3  bulan,  dengan  berat  badan kurang  lebih  20  g  diperoleh  di    Laboratorium Farmakologi,  Fakuktas  Farmasi  UGM,  Imboost® (imunostimulator).  Bahan  penyari  :  n-heksan,  etil asetat, metanol.  Bahan KLT : fase diam (Silika gel GF254);  fase  gerak  (Toluen,  n-heksan,  etil  asetat, metanol,kloroform)
Bahan  untuk  ELISA  :  kalium  klorida,  natrium klorida, natrium fosfat, tween 20, asam sitrat, asam sulfat,  hidrogen  peroksida  30%,  ortho-peroksida (OPD)(Sigma),  asam  sulfat,  peroksida  conjugate antimouse  (Sigma),  vaksin  hepatitis  (Engerix  B), kloroform, aquadest, tween 80, Buffer posphat(  Na 2 HPO 4 dan  KH 2 PO 4 ).  Alat:  Ependroff Tube,  tip  biru,  tip  kuning,    alat-alat  gelas  yang lazim digunakan di laboratorium.

## B. Cara Kerja
1. Pengumpulan dan Penyerbukan
Herba  sambiloto  diambil  secara  keseluruhan mulai  dari  bagian  atas  tanah  sampai  bunganya. Bagian  untuk  daun  yang  diambil  berwarna  hijau gelap,  bebas  dari  penyakit  ditandai  dengan  tidak adanya bercak-bercak hitam atau lubang. Pengambilan herba dilakukan pada sore hari. Bahan yang  akan  dikeringkan  dicuci  bersih  setelah  itu dipotong-potong  kemudian  herba  dikeringkan dengan  oven  pada  suhu  40°C.  Bahan  yang  sudah
kering  segera  diserbuk  dengan  mesin  penyerbuk, serbuk yang didapat diayak dengan ayakan no.40.

## 2. Pembuatan Ekstrak
Ekstrak  sambiloto  diperoleh  dengan  penyarian bertingkat  menggunakan  pelarut  yang  berbeda polaritasnya  dari  n-heksan,  etil  asetat  dan  metanol secara sokhlet.

## 3. Fraksinasi ekstrak sambiloto
Pemisahan  senyawa-senyawa  aktif  dari ekstrak sambilloto dengan menggunakan kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  dan  kromatografi kolom  vakum  (KKV).  Fase  diam  yang  digunakan adalah  silika  gel  GF 254 dan  sebagai  fase  geraknya pelarut  organik  dan  campurannya  dengan  polaritas yang  semakin  meningkat.  Prosedur  pelaksanaan KLT  dan  KKV  disesuaikan  menurut  Richard., (1998)  dan  Sarker., et  al ,  (2006).  Fase  diam  yang digunakan  untuk  fraksinasi  adalah  silika  gel  F254 tanpa  gypsum  seberat  40  g  dimasukkan  ke  dalam kolom  (20  cm  x  5  cm)  kemudian  diatasnya ditaburkan  ekstrak  dalam  bentuk  serbuk.  Elusi dilakukan  secara  gradien  dimulai  dari  pelarut nonpolar  sampai  polar  sehingga  diharapkan senyawa dapat terpisah secara berurutan mulai dari yang nonpolar sampai polar. Eluen yang digunakan yaitu  n-heksan;  n-heksan  -  etil  asetat  (9:1);  n- heksan - etil asetat (8:2); n-heksan - etil asetat (7:3); n-heksan  -  etil  asetat  (6:4);  n-heksan  -  etil  asetat (5:5);  n-heksan  -  etil  asetat  (4:6);  etil  asetat,  etil asetat - metanol (9:1); etil asetat -metanol (8:2); etil
asetat - metanol (7:3); etil asetat -metanol (6:4); etil asetat -metanol (5:5).
4. Persiapan  hewan  uji  dan  pengambilan    sampel uji
Sejumlah  30  ekor  mencit  sehat  umur  ±12 minggu berat  ± 20 g dibagi menjadi 3 kelompok @ 5 ekor yaitu  Kelompok I sebagai kelompok ekstrak yang  dibagi  menjadi  3  grup  @5  ekor  (ekstrak  n- heksana,  ekstrak  etil  asetat  ,ekstrak  metanol); Kelompok  II  @5  ekor  sebagai  kontrol  positif imunostimulator (Imboost ® ), hepatoprotektor (Curcuma  plus®)  dan    Kelompok  III  @5  ekor sebagai  kontrol  negatif  (CMC  1%).  Kelompok hewan uji  diaklimatisasi  selama 1 minggu sebelum diberi  vaksin  Hepatitis  B,  untuk  kelompok  hewan uji ekstrak dengan pemberian  peroral dengan dosis 2,7 mg/20 g BB mencit Balb/c sekali sehari masing- masing  kelompok  ekstrak  n-heksana  (EH),  ekstrak etil  asetat  (EEA),  ekstrak  metanol  (EM)  dengan konsentrasi  0,5  %.  Setelah  dikondisikan  pada semua  kelompok  dilakukan  vaksinasi  I  (dihitung sebagai  hari  ke  0  setelah  7  hari  pengkondisian) dengan  diberi  vaksin  Hepatitis  B  yang  dilakukan secara  intraperitoneal.  Vaksinasi  kedua  dilakukan pada  hari  ke  28,  selama  pemberian  vaksin  tetap diberi  perlakuan  yang  sama  pada  masing-masing kelompok.  Pada  hari  ke  32  yaitu  4  hari  setelah vaksin  kedua  dilakukan  pengambilan  darah  dari plexus retroorbitalis dengan pipa kapiler berheparin untuk penetapan jumlah IgG. Penetapan jumlah IgG dengan metode ELISA tak langsung.
5. Penetapan kadar IgG dengan metode ELISA
Microplate  dilapisi  dengan  antigen  5  g/ml dalam  PBS  sebanyak  100  l  untuk  setiap  sumuran lalu  diinkubasi  semalam  pada  suhu  4 o C.  Setelah dicuci  dengan  PBST  0,05  %  sebanyak  4x  200  l setiap sumuran, lempeng diblok dengan BSA 0,5 % dalam  PBS  dan  diinkubasi  selama  1  jam  di waterbath 37 o C. Lempeng  dicuci 4x dengan PBST 0,05  %  kemudian  diisi  serum  dengan  pengenceran 1:100 dalam PBS sebanyak 100  l setiap sumuran. Setelah  diinkubasi  selama  2  jam  pada  suhu  kamar, lempeng dicuci 4x dengan PBST 0,05 %. Sebanyak 100  l  isotipe  spesifik  untuk  masing-masing imunoglobulin,  dimasukkan  ke  masing-masing sumuran dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar.  Lempeng  dicuci  4x  dengan  PBST  0,05  %, lalu  konjugat  peroksidase  dimasukkan  ke  setiap sumuran sebanyak 100  l. Setelah inkubasi selama 15  menit  pada  suhu  kamar,  lempeng  dicuci  4x dengan  PBST  0,05  %.  Substrat  OPD  ditambahkan ke  masing–masing  sumuran  sebanyak  100  l  dan diinkubasi  15  menit  di  tempat  gelap  pada  suhu kamar.  Reaksi  dihentikan  dengan  H 2 SO 4 2,5  M sebanyak  50  l  untuk  setiap  sumuran.  OD  dibaca dengan ELISA reader pada  490 nm.

## 6. Analisis data
Data  yang  diperoleh  dievaluasi  secara  statistik yang  melibatkan  semua  kelompok  perlakuan. Metode  statistic  yang  digunakan  terlebih  dahulu dilakukan uji normalitas dan uji homogenitas varian.
Jika  data  dinyatakan  normal  dan  homogen  maka digunakan  uji  ANOVA  dilanjutkan  uji  LSD,  jika hasil  yang  diperoleh  sebaliknya  maka  digunakan analisis  non-parametrik  yaitu  uji  Kruskall  Wallis dan  dilanjutkan  dengan  uji  Mann  Whitney  dengan taraf kepercayaan 95%.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## A. Ekstraksi Herba Sambiloto
Ekstraksi  serbuk  herba  Sambiloto  dilakukan secara bertingkat dengan metode Soxhlet menggunakan  pelarut  yang  berbeda  polaritasnya yaitu  n-heksan,  etil  asetat  dan  metanol.  Ekstraksi dengan  pelarut  n-heksan  dilakukan  untuk  menyari senyawa-senyawa  yang  bersifat  non  polar,  pelarut etilasetat  untuk  menyari  senyawa  yang  bersifat semipolar dan ekstraksi dengan metanol dimaksudkan  untuk  menyari  senyawa-senyawa yang  bersifat  polar.  Berat  ekstrak  n-heksan  yang diperoleh dari 550 g serbuk herba sambiloto adalah 4,53 g, dari hasil tersebut  dapat  dihitung rendemen ekstrak  terhadap  berat  serbuk  sebesar  0,83  %. Ekstrak  berwarna  hijau  kekuningan  dengan  aroma dan rasa  yang sangat  pahit. Ekstrak  yang diperoleh dengan pelarut etil asetat berwarna hijau tua, aroma menusuk  tajam  dan  rasa  yang  pahit.  Berat  ekstrak etil asetat dari 300 g serbuk herba sambiloto adalah 25,89  g  dengan  rendemen  ekstrak  terhadap  berat serbuk  sebesar  8,63  %.  Ekstrak  metanol  yang diperoleh  berwarna  coklat  dengan  aroma  dan  rasa yang tidak pahit dengan rendemen ekstrak terhadap serbuk diperoleh 9,61 %.

## B. Penentuan Aktivitas Imunomodulatar Herba Sambiloto
Aktivitas  imunomodulator  dari  ekstrak  herba sambiloto  ditentukan  dengan  Bioassay  guided isolation  menggunakan  metode in  vivo  bioassay . Tahapan  ekstraksi  secara  bertingkat  dari  pelarut  n- heksan,  etil  asetat  dan  metanol  dilakukan  untuk mengetahui  aktivitas  imunomodulator  yang  paling kuat.
Penentuan aktivitas imunostimulator berdasarkan pengukuran jumlah  IgG dengan metode ELISA tak langsung.  Pemilihan  metode  ini  karena  merupakan konfigurasi paling sederhana yang dapat digunakan untuk  mengukur  titer  IgG.  Prinsip  dari  metode  ini adalah  mereaksikan  antigen  dengan  antibodi  yang dilabel enzim sehingga terbentuk kompleks antigen- antibodi.  Kompleks  antigen-antibodi  yang  dilabel enzim  dipisahkan  dari  antigen  dan  antibodi  yang bebas  lalu  diinkubasikan  dengan  suatu  substrat. Substrat  kromogenik  yang  semula  tidak  berwarna kemudian  menjadi  berwarna  apabila  dihidrolisis oleh  enzim.  Intensitas  warna  yang  terjadi  diukur dengan  spektrofotometer  dan  hasilnya  dinyatakan dalam  optical  density  yang  menunjukkan  nilai  titer antibodi IgG. Semakin tinggi intensitas warna maka antibodi yang dihasilkan semakin banyak.
Dalam  penelitian  ini,  vaksin  hepatitis  B digunakan  sebagai  antigen  untuk  menginduksi produksi  antibodi  anti-Hbs  karena  lebih  aman dibanding dengan virus hepatitis B yang aktif.  IgG dalam  serum  diinkubasi  pada  suhu  4°C  sehingga pengikatan  dengan  antigen  yang  terikat  pada
substrat  padat  akan  terjadi.  Antigen  yang  terikat dapat  terlepas  pada  konsentrasi  tinggi  dan  akan menghambat pengikatan antibodi pada antigen yang terikat  substrat  karena  terjadi  kompetisi  antara antigen  terikat  substrat  padat  dengan  antigen  yang terlepas  untuk  berikatan  dengan  antibodi.  Untuk mengurangi  reaksi  pengikatan  non  spesifik  pada antigen  ini  maka  dilakukan  pencucian  dengan larutan  yang  mengandung  PBST  20.  Reaksi pengikatan  non-spesifik  harus  dihambat  dengan cara pemblokan substrat padat dengan BSA.
Horseradish  peroxidase  merupakan  enzim  yang digunakan  untuk  melabel  antibodi  sehingga  dapat diketahui  adanya  antibodi  IgG  yang  terikat. Pengukuran  titer  antibodi  pada  hari  ke-0  tidak dilakukan  karena  diasumsikan  sama  pada  semua kelompok  perlakuan.  Dari  hasil  pengukuran  titer antibodi  IgG  pada  hari  ke-32  (4  hari  setelah Imunisasi  II  ),  kelompok  perlakuan  ekstrak  n- heksan  herba  sambiloto  dosis  2,7  mg/20  g  BB mencit  mempunyai  nilai  optical  densiti  yang  lebih tinggi  dibandingkan  kelompok  ekstrak  etil  asetat dan metanol.
Gambar  1 .  Rata-rata  jumlah  IgG  dari  kelompok ekstrak dosis 2,7 mg/BB mencit, kontrol  positif  Imboost®  dosis    0.56 mg/BB mencit dan kontrol negatif.
Dari  gambar  histogram  di  atas  terlihat  bahwa rata-rata  jumlah  IgG  tertinggi  dimiliki  oleh  ekstrak n-heksan  (1,257±  0,16),  kemudian  di  ikuti  oleh kontrol  positif  (1,038  ±0,098),  ekstrak  etil  asetat (1,025  ±  0,08),  ekstrak  methanol  (0,890  ±0,11), Kristal  etil  asetat  (0,878  ±0,03)  dan  terendah kontrol  negatif  (0,861±0,01)  .  Gambar  histogram terendah  dimiliki  oleh  kontrol  negatif  dan  kristal dari  etil  asetat.  Berdasarkan    analisa  satistik  secara ANOVA  diperoleh  ada  perbedaan  yang  signifikan, kemudian untuk melihat perbedaan antar kelompok dilanjutkan  dengan  uji  LSD.  Hasil  uji  LSD diperoleh  bahwa  ekstrak  n-heksan  mempunyai perbedaan yang signifikan terhadap semua kelompok  perlakuan.  Ekstrak  etil  asetat  meskipun mempunyai  pengaruh  terhadap  produksi  antibodi yang  tinggi  dibanding  ekstrak  metanol    tapi  tidak berbeda signifikan dengan kelompok yang lain.
Uji  aktivitas  imunostimulator  lanjutan  dilakukan pada  5  fraksi  dari  ekstrak  n-heksan  dengan pemberian  dosis  pada  masing-masing  fraksi berbeda karena diperhitungkan berdasarkan rendemen  yang  dihasilkan  dari  proses  fraksinasi terhadap  dosis  awal  pemberian  ekstrak.  Semakin banyak ekstrak  yang terfraksinasi, maka pemberian dosis  juga  akan  semakin  besar,  sehingga  dari  sini dapat  diketahui  juga  komponen  yang  dapat memberikan  aktivitas  Produk  antibodi  hasil pemberian vaksin hepatitis B sebanyak 2 kali, yaitu berturut-turut  pada  hari  ke-0  dan  ke-28  ditetapkan jumlahnya  dengan  metode  ELISA  tidak  langsung. Pengambilan  sampel  darah  dari  plexus  retro
orbitalis  mencit  dengan  pipa  kapiler  berheparin pada hari ke-32 (4 hari setelah pemberian vaksin II).
Gambar  2. Rata-rata  jumlah  IgG  dengan  metode ELISA  tidak  langsung    pada    mencit Balb/c yang di induksi vaksin hepatitis B.
Pada  gambar  histogram  diatas  menunjukkan bahwa  jumlah  IgG  kelima  fraksi  berturut-turut sebagai berikut : fraksi 1(1,068  ±  0,107 ), fraksi 2 (1,180   ±  0,064), fraksi 3 (0,903  ±  0,023), fraksi 4  (0,968    ±    0,070)  dan  fraksi  5  (0,997    ±    0,033). Berdasarkan  uji  statistik  ANOVA  satu  arah, diperoleh  perbedaan  yang  signifikan  pada  semua kelompok  perlakuan.  Hasil  rata-rata  jumlah  IgG menunjukkan urutan potensi sebagai imunostimulator  respon  imun  humoral  terhadap vaksin  hepatitis  B  dari  masing-masing  kelompok perlakuan.  Dari  gambar  di  atas  dapat  diketahui kelompok  perlakuan  yang  memiliki  aktivitas meningkatkan  produksi  antibodi  IgG  terbesar adalah fraksi  2. Urutan  berikutnya fraksi  1, disusul fraksi 5, 4 dan 3. Antara fraksi 1 dan 2 mempunyai jumlah yang sama tinggi jika dibandingkan dengan
rata-rata  kelompok  fraksi  yang  lain  sehingga  perlu dilakukan  uji  statistik  LSD  untuk  mengetahui signifikasi    antar  fraksi.  Fraksi  2  mempunyai perbedaan yang signifikan terhadap semua kelompok  perlakuan  sedangkan  fraksi  1  meskipun mempunyai nilai yang tinggi tapi tidak menunjukkan  perbedaan  signifikan  terhadap  fraksi 3,  4  dan  kontrol  positif.  Nilai  optical  density  dari kelompok kontrol positif (Imboost®) menunjukkan perbedaan  yang  signifikan  dibanding  kelompok kontrol  (CMC  1%).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa Imboost®  dengan  kandungan  ekstrak  echinaceae mempunyai  kemampuan  meningkatkan  produksi IgG atau mempunyai efek sebagai imunostimulator respon imun humoral terhadap vaksin hepatitis B.
Berdasarkan  besar  dosis  yang  diberikan  kepada kelompok perlakuan masing-masing fraksi berbeda. Penurunan jumlah IgG terjadi pada fraksi 3 dengan dosis  yang  terbesar  dibandingkan  dengan  fraksi yang  lainnya.  Hal  ini  terjadi  kemungkinan  karena adanya  kejenuhan  reseptor  pada  sel  limfosit  untuk merespons  stimuli  dari  fraksi  3  sehingga  tidak terjadi  peningkatan  jumlah  IgG  atau  adanya kandungan  senyawa  yang  berbeda-beda  antara kelompok  fraksi  sehingga  memberikan  perbedaan aktivitas  juga.  Fraksi  2  dengan  besar  dosis  yang tidak jauh berbeda dengan kontrol positif Imboost® menunjukkan  aktivitas  peningkatan  jumlah  IgG paling  tinggi  dibanding  fraksi  lainnya.  Dosis terkecil  dari  fraksi  4  mempunyai  aktivitas  yang hampir  sama  dengan  fraksi  3  yaitu  kurang menunjukkan  aktivitas  tetapi  bila  dibandingkan
dengan  kelompok  kontrol  negatif  masih  ada perbedaan yang bermakna sehingga kedua fraksi ini juga  mempunyai  peran  dalam  mempengaruhi respon  secara  humoral  meskipun  dengan  aktivitas yang kecil.
Hasil penentuan aktivitas imunostimulator berdasarkan  jumlah  titer  antibodi  IgG,  pengujian terhadap  ekstrak  herba  sambiloto  dengan  metode ELISA tidak langsung menunjukkan bahwa ekstrak dari  pelarut  n-Heksan  mempunyai  jumlah  titer antibodi  tertinggi  dibanding  ekstrak  etil  asetat  dan metanol.    Perbedaan  aktivitas  biologis  dalam mempengaruhi  produksi  antibodi  kemungkinan disebabkan  sifat  fisika  kimia  kandungan  senyawa dalam  masing-masing  ekstrak  berbeda.  Sifat  fisika kimia memegang peranan penting dalam pengangkutan  obat  untuk  mencapai  reseptor. Sebelum  mencapai  reseptor,  molekul  obat  harus melewati  sawar  membran  sehingga  sifat  fisika kimia berperan dalam absorbsi dan distribusi obat.
Peningkatan  produksi  Antibodi  tertinggi  terjadi pada  mencit  dengan  pemberian  ekstrak  n-heksan, golongan senyawa yang dapat ditarik oleh   pelarut ini  adalah  bersifat  non  polar  misalnya  terpenoid. Senyawa  yang  bersifat  non  polar  bersifat  mudah larut  dalam  lemak  dengan  nilai  KD  yang  besar sehingga  semakin  mudah  menembus  membran  sel secara difusi. Semakin banyak senyawa  yang dapat menembus  membran  sel  kemungkinan  senyawa  ini untuk  berinteraksi  dengan  reseptor  semakin  besar dan aktivitas biologisnya semakin meningkat.
Peningkatan  respon  imun  secara  humoral  dari ekstrak  n-heksan  kemungkinan  juga  disebabkan pengaruh  lamanya  penyimpanan  antigen  dalam tubuh.  Senyawa  yang  bersifat  lipofilik  yang  tahan terhadap  proses  metabolisme  akan  diakumulasikan pada jaringan lemak, sehingga akan tersimpan lama. Antigen  yang  tersimpan  lama  dalam  tubuh  akan memberi  kesempatan  pada  sistem  limfoid  untuk menuju  ke  antigen,  dimungkinkan  populasi  dari limfosit  T  dan  B  meningkat  sehingga  respon  imun juga  semakin  meningkat  (Baratawidjaya,  2004; Roitt, 2003).
Hasil  fraksinasi  dari  ekstrak  n-Heksan  dengan Kromatografi  Kolom  Vakum  menggunakan  eluen secara  gradient.  Lima  belas  fraksi  yang  dihasilkan selanjutnya  dikelompokkan  menjadi  lima  fraksi yaitu  Fraksi  1;  Fraksi  2;  Fraksi  3;  Fraksi  4  dan Fraksi  5,  penggabungan  ini    berdasarkan  profil kromatogram yang sama.
Penentuan fraksi teraktif sebagai imunostimulator berdasarkan peningkatan jumlah titer  IgG.  Fraksi 2 mempunyai  aktivitas  yang  tinggi  dibandingkan dengan fraksi-fraksi yang lain berdasarkan peningkatan  jumlah  titer  IgG.  Fraksi  teraktif sebagai  imunostimulator  bila  dibandingkan  dengan ekstrak  n-heksan  mempunyai  perbedaan,  fraksi  2 dengan  nilai  optical  density  sebesar  1,180      ±  0,11 dan ekstrak n-heksan 1,257 ± 0,16.
Berdasarkan  hasil  peningkatan  jumlah  IgG tersebut  menunjukkan  ekstrak  n-heksan  setelah dilakukan  fraksinasi  mempunyai  aktivitas  yang sedikit menurun yaitu ditandai dengan menurunnya
jumlah  titer  antibodi  yang  dapat  diproduksi  oleh mencit Balb/c.
Perbedaan  aktivitas  kemungkinan  dipengaruhi oleh senyawa-senyawa yang terkandung di masing- masing fraksi. Hasil identifikasi secara kromatografi  lapis  tipis  dengan  eluen  yang  sesuai dan berbagai pereaksi semprot di perkirakan  fraksi 1  mengandung  golongan  senyawa  terpenoid.  F2 mengandung  golongan  senyawa  terpenoid,  steroid dan  flavonoid.  F3  mengandung  golongan  senyawa terpenoid;  F4  mengandung  golongan  senyawa alkaloid dan terpenoid.
Berdasarkan hasil identifikasi secara KLT bahwa fraksi  2  mempunyai  jenis  golongan  senyawa  kimia yang  terbanyak  dibanding  fraksi  yang  lain, dimungkinkan  ada  efek  sinergisme  antar  senyawa sehingga fraksi 2 ini mempunyai aktifitas sebagai  imunostimulator  yang  kuat  dibanding kelompok  perlakuan  yang  lain.  Senyawa-senyawa flavonoid,  terpen  menurut  Wagner  (1985)  dapat mempengaruhi aktivitas respon imun.

## IV. KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan ekstrak  n-heksan  mempunyai  aktivitas  sebagai imunostimulator  yang  lebih  kuat  dibandingkan ekstrak etil asetat

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2006, Hepatitis B , www.liverfoundation.org,  diakses  tanggal  5 Februari 2008.
Burgess, G.W., 1994,  Prinsip  Dasar  ELISA  dan Variasi Konfigurasi, dalam Burgess, B.W., ELISA dalam  Diagnosis  dan  Penelitian ,  diterjemahkan oleh Wayan T. Artama, Gadjah Mada University, Jogjakarta.
Burmester, G.R., Antonio, P., 2003, Color Atlast of Imunology , Thieme Stuttgar Germany.
Chang,  M.H.  2003,  Decreasing  Incidence  of Hepatocellular Carcinoma among Children following  Universal  hepatitis  B  immunization, Liver International (5): 309-314. Channel,  R.J.P.,  1998, Natural  Product  Isolation , Humana Press Inc., New Jersey Ediati,S., 2007, The Immunomodulatory Mechanism Extract of Morinda citrifolia L., Fruit on Hepatocelluler Carcinoma of Mice, International Conference On Traditional
Medicine And Medicinal Plants , Surabaya, 8-9 Liang,  C.,  Qiu,  F.,  Wang,  N.,  Yao,  X.,  2004, Four New  Andrographolide  Metabolites  in  Human Urine ,  Traditional  Chinese  Medicines  &  Natural Products Research Center Shenzhen
Sarker.,  S.D.,  Zahid  Latif,  Z.,  Gray,  A.I.,2006,
Natural  Products  Isolation  Second  Edition , Humana Press Inc., New Jersey Sheeja, K., Kuttan G., 2007, Activation of cytotoxic T lymphocyte responses and attenuation of tumor growth  in  vivo  by  Andrographis  paniculata extract and andrographolide, in Immunopharmacol Immunotoxicol , Department of Immunology,  Amala  Cancer  Research  Centre, Amala Nagar, Thrissur, India 29(1):81-93.
Wagner,  H.,  1984, Plant  Drug  Analysis  a  Thin Layer Chromatography Atlas , Springer-Verlag, p. 164 Widyawaruyanti,  A.,  1999, Uji  Imunostimulan Andrographolid  Terhadap  Sekresi  IFN-γ  Dan TNF-ά  Oleh  Sekresi  Limfosit  T  Helper-1  Mencit Dalam Percobaan Kultur Sel , Abstrak, AirLangga University Library
Xu Y, A. Chen, S. Fry, R.A. Barrow, R.L, Marshall and T.K.S.Mukkur., 2007, Modulation of immune response  in  mice  immunised  with  an  inactivated Salmonella vaccine and gavaged with Andrographis paniculata extract or andrographolide. Int Immunopharmacology .