JURNAL BIOSAINS (Journal of Biosciences)
http://jurnal.unimed.ac.id/2012/index.php/biosains email : jbiosains@unimed.ac.id

## PERTUMBUHAN KULTUR KONSORTIUM DALAM MINYAK SELAMA BIODEGRADASI DI BAWAH KONDISI AEROB

## GROWTH CONSORTIUM CULTURE IN OIL DURING BIODEGRADATION UNDER AEROBIC CONDITION
1,2 Marlinda Nilan Sari Rangkuti, 3 Palsan Sannasi, 4 Sahilah Abdul Mutalib
1 School of Environmental Science and Natural Resources, Faculty of Science and Natural Resources, The National University of Malaysia, Bangi 43600, Selangor, Malaysia Email: marlinda@unimed.ac.id
2 Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Negeri Medan, Medan 20221
3 Faculty of Agro Based Industry, UniversityMalaysia Kelantan, Kampus Jeli 17600, Kelantan, Malaysia 4 School of Chemical Science and Food Technology Pusat Sains Kimia Dan Teknologi Makanan, The National University of Malaysia, Bangi 43600, Selangor, Malaysia

## ABSTRACT
This  study  reported  the  ability  of  the  Consortium  Culture  (5%  v/v)  was  grown  in  minimum  salts medium (MSM) with the addition of 1% (v / v) crude oil, at different incubation times (0, 2, 4, 6 and 8 weeks). The Consortium Culture (CC) can live and use crude oil as the sole source of carbon and energy. The analysis result  shows  that  the  highest  percentage  of  biodegradation  is  at  the  second  week  with  the  percentage  of hydrocarbon  residue  of  42  and  it  has  been  used  up  in  the  eighth  week.  These  results  indicate  that  the consortium culture can be utilized as a biodegradation agent and this phenomenon can used to enhance the bioremediation ability of the petroleum hydrocarbon polluted environment.

## Keywords : Consortium Culture, hydrocarbon, Biodegradation, Growth

## Pendahuluan
Salah  satu  masalah  lingkungan  saat  ini  adalah kontaminasi  hidrokarbon  minyak  mentah  yang dihasilkan  dari  kegiatan  industri  petrokimia.  Serta produk  minyak  yang  dilepaskan  ke  lingkungan apakah yang disengaja atau tidak disengaja menjadi perhatian  khusus  juga.  Minyak  mentah  adalah campuran  kompleks  yang  terutama  terdiri  dari berbagai hidrokarbon jenuh dan aromatik.
Komponen  hidrokarbon  telah  dikenal sebagai  polutan  organik  karsinogenik  dan neurotoksik.  Metode  mekanik  dan  kimia  umumnya digunakan  untuk  menghilangkan  pencemaran minyak mentah dari lingkungan yang
terkontaminasi  cukup  efektif  tetapi  terbatas  dalam hal penggunaan dan biaya yang dibutuhkan mahal.
Bioremediasi  adalah  pendekatan  teknologi yang menjanjikan untuk pemulihan lingkungan yang terkontaminasi  karena  biaya  efektif  dan  akan menghasilkan mineralisasi lengkap. Fungsi bioremediasi  pada  dasarnya  adalah  biodegradasi, yang  menyelesaikan  mineralisasi  kontaminan organik  menjadi  karbon  dioksida,  air,  senyawa anorganik,  protein,  dan  sel  atau  transformasi kontaminan  organik  kompleks  dengan  senyawa organik sederhana lainnya oleh agen biologis seperti mikroorganisme.  Hidrokarbon  di  lingkungan biasanya terdegradasi oleh bakteri, ragi, dan jamur.
Banyak  mikroorganisme asli  dalam  air  dan tanah mampu
mengurangi kontaminasi hidrokarbon.  Efisiensi  biodegradasi  yang  telah dilaporkan  antara  6%  (Jones  dkk.,  1970),  82% (Pinholt  dkk.,  1979)  untuk  jamur  tanah;  0,13% (Jones dkk., 1970), 50% (Pinholt  dkk., 1979) untuk bakteri  tanah;  dan  0,003%  (Hollaway  dkk.,  1980), 100%  (Philip  &  Stuart,  1974)  untuk  bakteri  laut. Beberapa  ilmuwan  melaporkan  bahwa  populasi campuran  dengan  kapasitas  enzimatik  yang  luas diperlukan  untuk  mengurangi  campuran  kompleks hidrokarbon  seperti  minyak  mentah  di  tanah (Bartha & Bossert, 1984), air tawar (Cooney, 1984), dan  lingkungan  laut  (Atlas,  1985  dan  Floodgate, 1984). Bakteri adalah agen yang paling aktif untuk mendegradasi  polusi  minyak,  dan  mereka  bekerja sebagai  pengurai  utama  tumpahan  minyak  pada lingkungan  (Rahman  dkk.,  2003  &  Brooijmans  dkk, 2009).  Yakimov  dkk,  2007,  melaporkan  bahwa beberapa  bakteri  bahkan  dikenal  secara  khusus “memakan” hidrokarbon. Tahta-Holst, 2007
menemukan  bahwa Acinetobacter sp  dapat menggunakan  rantai  panjang n -alkana  C 10 -C 40 sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Adapun  tujuan  dari  penelitian  ini  adalah untuk  menganalisis  (1)  kemampuan  Konsortium Kultur  untuk  hidup  dan  berkembang  biak  dalam medium garam minimum (MSM) yang ditambahkan dengan  minyak  mentah  dan  (2)  kemampuan Konsortium Kultur untuk mendegradasi hidrokarbon minyak mentah dalam kondisi aerobik.
Bahan Dan Metode Sumber Mikroorganisme Konsorsium Kultur terdiri dari enam kultur bakteri Gram-negatif ( Pseudomonas sp., Serratia sp., Flavobacterium sp., Chryseomonas sp., Xanthomonas sp.,  dan Agrobacterium sp.)  Dan  tiga  bakteri  Gram- positif ( Bacillus sp., Arthrobacter sp. dan Micrococcus sp.).
Sumber Minyak Mentah Minyak  mentah  diperoleh  dari  ExxonMobil Oil  Refinery,  Port  Dickson,  Negeri  Sembilan, Malaysia.
Media Dan Persiapan Inokulum Inokulum  KK  disiapkan  dalam  nutrient broth  (NB),  sebagai  media  pertumbuhan  kultur. Waktu  inkubasi  yang  diperlukan  untuk  mencapai OD 600 , 0.5 (2.5×10 8 cfu/mL) adalah antara 8-12 jam,
itu adalah waktu optimal untuk mentransfer KK (5% v/v) ke medium garam minimum (MSM).

## Pertumbuhan KK Dalam Minyak Mentah
Sejumlah  5%  (v/v)  KK  dari  kultur semalaman  dipindahkan  ke  dalam  labu  Erlenmeyer (250  ml)  yang  mengandung  100  ml  medium  MSM steril (Abu-Ruwaida dkk, 1991; Rahman dkk, 2002) ditambahkan  dengan  1%  (v/v)  minyak  mentah, sebagai  sumber  karbon  tunggal  untuk  uji biodegradasi.  Selanjutnya  set  labu  Erlenmeyer ditempatkan  dalam  shaker  dengan  putaran  (200 rpm)  pada  29  ±  2ºC  (untuk  meniru  suhu  ruangan) selama delapan minggu. Pada setiap interval waktu 2 minggu, 2.0 ml kultur diambil dari masing-masing set labu Erlenmeyer.
Pertumbuhan  KK  diamati  dengan  menggunakan teknik  spread  plate  dan  dilaporkan  sebagai  jumlah unit koloni yang terbentuk per mililiter (cfu/mL).

## Analisis struktur populasi KK dengan mikroskop elektron pemindai (SEM)
Sebanyak  1  mL  kultur  semalaman dipindahkan  ke  dalam  tabung  ependorf  sebelum disentrifuse (Hettich Mikro-12-24 Zentrifugen) pada pusingan  10.000  rpm  selama  5  menit.  Supernatan dikeluarkan  dan  pelet  dimasuk  dengan  air  suling terionisasi  dan  disentrifuse  kembali.  Langkah  ini diulangi lagi 2-3 kali untuk membersihkan pelet sel daripada  semua  sisa  medium.  Biomassa  kemudian diendapkan di dalam 0.5-1 mL air suling terionisasi. Alikuot  sampel  (100  L)  diletakkan  ke  atas membran  filter  Whatman  (diameter  25  mm  dan ukuran  lubang  0.22  m)  yang  dilekatkan  pada potongan Aluminum (Al) dan dikeringkan pada suhu 35 ºC semalaman. Potongan ini kemudian dilakukan percikan  salutan  (sputter  coater,  SC500)  dengan pancaran gas Ar pada tekanan 0.1-00.5 torr selama 1 menit  dan  disalut  dengan  emas  (Au)  setebal  2  m selama 1.5 menit pada suhu 26 ºC. Sampel kemudian diamati dengan alat SEM (Philips XL30 Series) yang beroperasi pada arus 20 kV.
Ekstraksi Minyak Mentah Untuk analisis GC-FID Pada  setiap interval  waktu  dua  minggu,  50 ml  sampel  diambil  dari  setiap  set  labu  Erlenmeyer untuk  mengekstraksi  sisa  minyak  mentah. Selanjutnya,  sampel  dituangkan  ke  dalam  corong pisah,  30  mL n -heksana  ditambahkan  (EPA,  1999) dan  minyak  mentah  sisa  dalam  sampel  diekstraksi dengan  menggoncang  corong  pemisah  dengan penuh  kuat  selama  2  menit.  Kemudian  sampel
dibiarkan  selama  15  menit  untuk  memungkinkan pemisahan fasa organik dari fasa cair. Lapisan cairan dipindahkan  dari  corong  pisah  dan  lapisan  organik dipindahkan ke tempat lain. Proses ekstraksi diulang dua  kali,  setiap  proses  ditambahkan  dengan  30  mL n -heksana untuk memastikan ekstraksi lengkap dari sisa minyak mentah.
Ekstrak yang diperoleh kemudian dikumpulkan  dalam  labu  alas  bulat  dan  diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator (EYERLAN- 1000,  Jepang)  dalam  penangas  air  dengan  suhu 60ºC.  Residu  minyak  mentah  kemudian  dilarutkan dengan  menambahkan  1.0  mL n -heksana  untuk analisis GC-FID. Satu mikroliter dari ekstrak minyak mentah  dianalisis  pada  30  m  kolom  kapiler  poli dimetil  siloxane  (HP1)  dalam  kromatografi  gas kapiler  (Agilent-Auto  System)  yang  dilengkapi dengan  detektor  ionisasi  nyala  (FID)  menggunakan perangkat  lunak  HP  Chemstation.  Suhu  oven  awal ditetapkan  pada  30ºC  dan  meningkat  4ºC  pada tingkat  min -1 hingga  300ºC  sebagai  suhu  akhir (Hamzah  dkk.,  2010).  Degradasi  diperkirakan sebagai  perbedaan  antara  konsentrasi  hidrokarbon awal dan akhir dalam sampel.
Analisis Data Statistik
Data  dianalisis  dengan  menggunakan analisis  varian  satu  arah  (ANOVA)  dengan  uji perbandingan  ganda  Tukey-HSD.  Semua  tes dilakukan rangkap tiga dan nilai min dilaporkan.

## Hasil Dan Pembahasan
Degradasi  cepat  dan  sempurna  dari mayoritas  polutan  organik  umumnya  terjadi  dalam kondisi  aerobik.  Serangan  intraseluler  awal terhadap  pencemar  organik  adalah  proses  oksidasi dan aktivasi, dan penambahan oksigen sebagai kunci dari reaksi enzimatik dikatalisis oleh oksigenase dan peroksidase.  Degradasi  hidrokarbon  minyak  bumi dapat  dimediasi  oleh  sistem  enzim  tertentu. Mekanisme  lain  yang  terlibat  adalah  (1)  adhesi  sel mikroba ke substrat dan (2) biosurfaktan (Hommel, 1990).
Melalui  pengamatan  dengan  menggunakan mikroskop  elektron  scanning  (SEM)  menunjukkan bahwa  KK  dapat  hidup  dan  berkembang  dalam medium  MSM  yang  ditambahkan  dengan  minyak mentah  (Gambar  1).  Ini  juga  menunjukkan  bahwa KK membentuk interaksi ikatan ion dengan minyak untuk  menggunakannya  sebagai  satu-satunya sumber karbon dan energi.
Gambar 1 Hasil mikroskop elektron pemindai (SEM) menunjukkan KK dalam minyak mentah (a. Pembesaran 10.000 x) (b. Pembesaran 20.000 x).
Pada grafik 1 menunjukkan kemampuan KK 5  (v/v)  untuk  tumbuh  dalam  medium  garam mineral dengan tambahan minyak mentah 1  (v/v) sebagai  sumber  karbon  tunggal.  Populasi  KK meningkat  secara  bertahap  selama  minggu  kedua hingga  minggu  keempat,  tetapi  setelah  minggu
keenam  hingga  minggu  kedelapan  populasi  KK menurun.  Hasil  ini  menunjukkan  kemampuan  KK untuk  memanfaatkan  minyak  mentah  sebagai  satu- satunya  sumber  karbon  dan  energi  untuk perkembangbiakan.
Tidak  ada  fase  lag  yang  diamati,  itu menunjukkan  kemampuan  KK  untuk  tumbuh, beradaptasi dalam minyak mentah dan memanfaatkan hidrokarbon sebagai sumber karbon tunggal  sangat  cepat.  Pada  grafik  1  juga menunjukkan peningkatan yang signifikan (p  0,05)
total koloni yang layak, dari 3 × 10 5 (cfu/mL) pada hari pertama hingga 4 × 10 7 (cfu/mL) pada minggu kedua  dan  mencapai  maksimum  7  ×  10 9 (  cfu/mL) pada minggu keempat. Total populasi menurun pada 5  ×  10 6 (cfu/mL)  setelah  minggu  keenam  dan menurun lebih lanjut dalam minggu kedelapan.
Grafik  1  Perbandingan  pertumbuhan  KK  (5  (v/v)  dalam  medium  garam  minimum  (MSM)  dengan penambahan  1  (v/v)  minyak  bumi  dan  kontrol  (cfu/mL)  selama  proses  biodegradasi hidrokarbon  minyak  mentah  dalam  kondisi  aerobik.  Titik  data  mewakili  rata-rata  tiga  tabung replikasi, sedangkan bar kesalahan mewakili standar deviasi.
Aktifitas  biodegradasi  (Grafik  2)  dibaca pada  52%  pada  minggu  2  dan  meningkat  menjadi 100% dalam minggu 8. Hasil ini mirip dengan hasil penelitian sebelumnya, misalnya, Zhang dkk., (2005) melaporkan  minyak  mentah  lebih  dari  58% terdegradasi oleh Pseudomonas aeruginosa . Degradasi oleh mikroba dipengaruhi oleh komposisi
minyak,  beberapa  minyak  terdegradasi  lebih lengkap  daripada  yang  lain  (Hamzah  et  al.  2010). Terjadi penurunan pertumbuhan KK setelah minggu ke  6  hingga  minggu  ke  8  hal  ini  terjadi  karena menipisnya  persediaan  minyak  mentah  sebagai sumber  karbon  tunggal  di  dalam  medium  garam minimum.
0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 Ju m lah s el ( lo g 10 cf u /m L )
Waktu inkubasi (minggu) Consortium Culture Kawalan Konsortium kultur Kontrol
0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 Laju d e gr ad as i (% ) Waktu Inkubasi (Minggu) Consortim Culture
Kawalan
Grafik 2 Perbandingan hidrokarbon minyak mentah sisa dalam medium MSM dengan penambahan  KK dan kontrol. Data mewakili rata-rata tiga replikasi labu Erlenmeyer, sedangkan bar kesalahan mewakili standar deviasi.
Kemampuan KK untuk hidup dan sepenuhnya  mengurangi  minyak  mentah  dalam waktu  delapan  minggu  menunjukkan  bahwa  KK dapat bertahan hidup dalam minyak mentah setelah inokulasi.  pH  7  digunakan  dalam  penelitian  ini sebagai  pH  optimal,  yang  selain  pH  optimal  dapat merusak  kemampuan  populasi  mikroorganisma untuk  mendegradasi  hidrokarbon  (Rahman  dkk, 1999;  Meredith  dkk.,  2000).  Kelangsungan  hidup mikroorganisme  setelah  diinokulasi  dalam  media yang  mengandung  minyak  mentah  telah  terbukti menjadi  faktor  utama  dalam  memastikan  tingkat biodegradasi  hidrokarbon  di  tanah  atau  di  air (Ramos dkk., 1997).
Komposisi konsorsium mikroba merupakan faktor  penting  untuk  memastikan  peningkatan sinergisme  dalam  aktivitas  katabolik.  Haramaya dkk.,  (1997)  melaporkan  bahwa  konsorsium  kultur mikroba  menunjukkan  laju  aktivitas  biodegradasi lebih tinggi bila dibandingkan dengan  kultur murni Acinetobacter saat  digunakan  untuk  mendegradasi minyak mentah ringan dan berat. Salleh dkk., (2003) melaporkan bahwa konsorsium bakteri yang terdiri dari Pseudomonas aeruginosa (1 strain) dan Bacillus sp  (dua  strain  yang  berbeda),  telah  terbukti  secara efektif  mendegradasi  hidrokarbon  dalam  air,  tanah dan  pasir  yang  terkontaminasi  dengan  minyak mentah.  Rahman  dkk.,  (2002)  dan  Kalme  dkk., (2008)  juga  melaporkan  efisiensi  yang  lebih  baik dari  biodegradasi  minyak  mentah  oleh  campuran
kultur  bakteri  jika  dibandingkan  dengan  kultur tunggal.  Kehadiran  berbagai  bakteri  dalam  kultur bakteri  campuran  meningkatkan  persaingan  dalam memanfaatkan  sumber  karbon  tunggal  baru, “memaksa”  campuran  bakteri  untuk  beradaptasi dengan cepat terhadap lingkungan.

## Kesimpulan
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa KK dapat  hidup  dan  berkembang  biak  dengan memanfaatkan minyak mentah sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Selain itu, KK juga dapat mendegradasi hidrokarbon minyak mentah sepenuhnya.  Dengan  kemampuan  ini,  KK  memiliki potensi untuk digunakan sebagai agen bioremediasi lingkungan tercemar minyak mentah.

## Daftar Pustaka
Abu-Ruwaida,  A.S.,  Banat,  I.M.,  Haditirto,  S.  & Khamis,  A.  1991.  Nutritional  requirements and growth characteristics of a biosurfactant producing Rhodococcus bacterium. J. Microbiol. Biotechnol. 7:53-61. Ainon Hamzah, Amir Rabu, Raja Farzarul Hanim Raja Azmy  &  Noor  Aini  Yussoff.  2010.  Isolation and  characterization  of  bacteria  degrading sumandak  and  south  angsi  oils.  Sains Malaysiana 39 (2): 161-168 Atlas, R. M. 1985. Effects of hydrocarbons on micro- organisms  and  biodegradation  in  Arctic
Konsortium Kultur Kontrol
ecosystems,  in  Petroleum  Effects  in  the Arctic  Environment,  F.  R.  Engelhardt,  Ed., pp. 63–99, Elsevier, London, UK,.
Bartha,  R. and Bossert, I. 1984. The  treatment and disposal  of  petroleum  wastes  in Petroleum Microbiology.  Atlas,  R.M.  Ed.,  pp.  553-578. Macmillan. New York. NY. USA.
Brooijmans,  R.J.W.,  Pastink,  M.I.  and  Siezen,  R.J. 2009.  Hydrocarbon-degrading  bacteria:  the oil-spill clean-up crew. Microbial Biotechnology. vol. 2, no. 6, pp. 587–594,
Cooney, J.J. 1984.  The fate of petroleum pollutants in fresh  water  ecosystems.  in Petroleum Microbiology.  Atlas,  R.M.  Ed.,  pp.  399-434. Macmillan. New York. NY. USA.
EPA.  1999.  Analytical  Method  Guidance  for  EPA Method  1664    Implementation  and  Use. United  States  Environmental  Protection, USA.
Floodgate, G. 1984. The fate of petroleum in marine ecosystems.  in Petroleum  Microbiology,  R. M. Atlas, Ed., pp. 355–398, Mac million, New York, NY, USA. Haramaya, S., Sugiura, K., Ishihara, M. & Shimauci, T. 1997.  Physicochemical  properties  and biodegradability  of  crude  oil.  Enviromental Science and Technolnology 31:45-51. Hollaway,  S.L.,  Faw,  G.M.  and  Sizemore,  R.K.  1980. The bacterial community composition of an active  oil  field  in  the  Northwestern  Gulf  of Mexico. Marine  Pollution  Bulletin.  vol.  11. no. 6. pp. 153-156.
Jones,  J.,  Knight,  M.  and  Byron,  J.A.  1970.  Effect  of gross population by kerosene hydrocarbons on the microflora of a moorland soil. Nature. vol. 227. p. 1166.
Kalme, S., Parshetti, G. & Gomare, S. 2008. Diesel and kerosene  degradation  by Pseudomonas desmolyticum NCIM  2112  and  Nocardia hydrocarbonoxydans  NCIM  2386.  Current Microbiology 58:581-586.
M.  Throne-Holst,  A.  Wentzel,  T.  E.  Ellingsen,  H.-K. Kotlar,  and  S.  B.  Zotchev,.  2007.
Identification  of  novel  genes  involved  in long-chain n -alkane degradation by Acinetobacter sp. strain DSM
17874. Applied and Environmental Microbiology,  vol.  73,  no.  10,  pp.  3327– 3332, Meredith,  W.,  Kelland,  S.J.  &  Jones,  D.M.  2000.
Influence  of  biodegradation  on  crude  oil acidity  and  carboxylic  acid  composition.
Organic Geochemistry 31:1059-1073. Phillips, G.J.M. and Stewart, J.E. 1974. Distribution of hydrocarbon utilizing bacteria in Northwestern  Atlantic  waters  and  coastal sediments. Canadian Journal of Microbiology. vol. 20, no. 7. pp. 955-962. Pinholt, Y., Struwe, S. and Kjoller, A. 1979. Microbial changes  during  oil  decomposition  in  soil. Holarctic Ecology. vol. 2. pp. 195-200. Rahman, K.S.M., Rahman, T.J., Kourkoutas, Y., Petsas,
I.,  Marchant,  R.  and  Banat,  I.M.  2003.
Enhanced  bioremediation  of  n-alkane  in petroleum sludge using bacterial consortium amended with rhamnolipid and micronutrients. Bioresource Technology. vol. 90, no. 2, pp. 159–168 Rahman, K.S.M., Thahira-Rahman, J., Lakhsmanaperumalsamy,  P.  &  Banat,  I.M. 2002.  Towards  efficient  crude    oil degradation by a mixed bacterial consortium. Bioresource Technology 85:257-261. Ramos,  J.L.,  Duque,  E.,  Rodríguez-Herva,  J.J.,  Godoy, P.,  Haidour,  A.,  Reyest,F.  &  Fernandez- Barrero,  A.  1997.  Mechanisms  for  solvent tolerance  in  bacteria.  The  Journal  of Biological Chemistry 227:3887-3890.
Saleh,  A.B,  Mohamad,  G.F.,  Abdul  Rahman,  R.N.Z.  & Basri,  M.  2003.  Bioremediation  of petroleum  hydrocarbon  pollution.  Indian Journal of Botechnology 2:411-425.
Sannasi, P., Kader, J., Ismail, B.S. & Salmijah, S. 2006.
Sorption  of  Cr  (VI),  Cu  (II)  and  Pb  (II)  by growing  and  no  growing  cell  of  bacterial consortium. Bioresource Technology 97:740-747. Yakimov, M.M., Timmis, K.N. and Golyshin, P.N. 2007. Obligate  oil-degrading  marine  bacteria.
Current  Opinion  in  Biotechnology.  vol.  18, no. 3, pp. 257–266,