## SELEKSI PARSIAL PROBIOTIK UNTUK PERTUMBUHAN ABALON: ISOLASI SELEKTIF, RESISTENSI ANTIBIOTIK DAN PATOGENSITAS
Partial Selection of Probiotic for Abalone Growth: Selective Isolation, Antibiotic Resistance and Pathogenicity
Faturrahman
Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Mataram Jl. Majapahit 62, Mataram 83125, Nusa Tenggara Barat, Indonesia e-mail: faturjr@gmail.com

## Abstrak
Bakteri  probiotik telah  lama  digunakan  untuk  perbaikan  pertumbuhan  organisme    perairan. Tujuan penelitian  ini    adalah    untuk mengisolasi  bakteri  kandidat  probiotik yang  berasosiasi  dengan Gracilaria spp., mengevaluasi sifat resistensinya terhadap antibiotik dan derajat patogensitasnya. Resistensi diukur berdasarkan diameter zona  bening  yang  terbentuk  dan  derajat  patogenisitas berdasarkan  jumlah  spat abalon yang mati. Hasil isolasi diperoleh 11 isolat bakteri agarolitik  yang  berasosiasi dengan Gracilaria, 6 isolat diperoleh  dari pantai Kuta, 3 isolat dari  tanjung An dan 2 isolat dari pantai Gerupuk.  Isolat-isolat tersebut  memiliki morfologi koloni dan sel yang beragam serta aktivitas agarolitik yang berbeda. Data hasil uji resistensi menunjukkan bahwa lebih dari 50%  isolat (6 isolat) bersifat  intermediet atau resisten terhadap  antibiotik. Lima  isolat  yang  peka yaitu Alg2.2,  Alg3.1,  Alg4.2,    Alg5.1,  dan    Alg5.2 tidak bersifat  pathogen  ketika  diuji  tantang  dengan    spat  abalon. uji  tahap  lanjutan    perlu  dilakukan    untuk menilai potensi isolate tersebut  menjadi kandidat probiotik.
Kata Kunci: probiotik, bakteri agarolitik, resistensi antibiotik, patogensitas

## Abstract
Probiotic bacteria have long been used to improve the growth of aquatic organisms. The purpose of this study was to isolate candidate probiotic bacteria associated with Gracilaria spp., evaluate the  degree of resistance  to antibiotics and its pathogenicity. Resistance is  measured  by the diameter  of clear  zone formed and  the  degree  of pathogenicity based  on  the  number of  dead abalone spat. Results obtained 11 isolates of agarolytic bacteria, 6 isolates obtained from Kuta beach, 3 isolates from the headland An and 2 isolates from Gerupuk beach. These isolates had colony and cell morphological characters as diverse and different  agarolytic activities. Resistance test  shows  that  more than  50%  of isolates (6 isolates) are intermediate or  resistant to  antibiotics. Five isolates were sensitive, Alg2.2, Alg3.1, Alg4.2, Alg5.1, and Alg5.2, non-pathogenic when tested challenged with abalone spat. Advanced stages of testing needs to be done to assess the potential of a candidate probiotic
Keyworld: probiotic, agarolytic bacteria, antibiotic resistance, pathogenicity

## PENDAHULUAN
Salah  satu    kendala  yang  dihadapi pembudidaya  abalon  adalah  laju  pertumbuhannya yang lambat.  Abalon yang  mengkonsumsi rumput laut  sebagai  pakan  tunggal  menunjukkan  laju pertumbuhan  yang  rendah    karena defisiensi sejumlah  nutrisi  esensial (Doeschate  dan  Coyne 2008)  seperti  protein.  Menurut  Setyono  (2008), abalon tropis dialam umumnya mengkonsumsi alga merah  seperti Gracilaria, Laurencia, Hypnea dan
Amphiroa,  sedangkan  pada  abalon  budidaya diberikan  pakan  tunggal  berupa Gracilaria sp.. Gracilaria memiliki  kandungan  protein  yang rendah  yaitu  sekitar  3-7%,  akan  tetapi  kaya  akan agar-agar, hingga 47.34% (Soegiarto dan  Sulistijo 1985).
Herbivora laut termasuk abalon umumnya memiliki  enzim-enzim  pendegradasi  dinding  sel komponen  pakan  didalam  saluran  pencernaannya (Gomez-Pinchetti  dan  Garcia-Reina,  1993)  dan memiliki    kemampuan untuk menggunakan agar-
agar,  alginat,  karagenan  sebagai  sumber  energi (Erasmus et al.  1997).  Disamping  itu,  dalam saluran  pencernaan  abalon  juga  ditemukan  enzim- enzim  polisakarase  eksogen  yang  disumbangkan oleh  bakteri  enterik.  Menurut Erasmus et  al.
(1997) kelompok  bakteri  enterik  memainkan peranan  penting  bagi  penyediaan    nutrisi  abalon dengan  menghidrolisis    komplek  polisakarida menjadi  molekul  sederhana  yang  dapat  diserap oleh  abalon.  Lebih  lanjut  dijelaskan  bahwa sebanyak  70-90%  aktivitas  bakteri  polisakarolitik menghasilkan enzim-enzim polisakarase ekstraseluler  yang  disekresikan kedalam  saluran pencernaan  abalon  (Erasmus et  al.  1997). Katabolisme  monosakarida    oleh  bakteri  enterik menghasilkan  sejumlah  besar  asam  asetat  dan format  yang  dapat  digunakan  sebagai  sumber energi  atau  prekursor  sintesis  asam  amino  oleh abalon (Thompson et al. 2004).
Michel et  al.  (2006)  dalam  ulasannya menyebutkan  bahwa  beberapa  kelompok  bakteri laut  menghasilkan  enzim  agarase  ekstraseluler yang  dapat  mendegradasi  agar-agar  menjadi agarooligosakarida dan galaktosa. Dengan demikian,  pendekatan  yang  dapat dilakukan  untuk mempercepat  laju    pertumbuhan  abalon H.asinina adalah  dengan  meningkatkan  kecernaan  agar-agar melalui introduksi  bakteri  probiotik  yang  dapat memproduksi enzim agarase.
Salah  satu    persyaratan    suatu  strain bakteri  dapat  digunakan  sebagai probiotik adalah harus  bersifat  sensitif  atau  tidak  resisten  terhadap antibiotik  umum  yang  digunakan  pada  hewan  dan manusia. Pada penelitian ini telah dilakukan seleksi parsial bakteri kandidat probiotik sebagai penyedia enzim agarase ekstraseluler untuk abalon.

## METODE
Pengambilan Sampel. Sampel Gracilaria spp.  Diperoleh  dari perairan Teluk Gerupuk, pantai  Kuta  dan Tanjung  An Lombok Tengah dan disimpan  dalam  plastik. Semua sampel  dimasukkan  dalam ice  box dan segera dibawa  ke laboratorium untuk dikulturkan.
Isolasi Selektif Bakteri Agarolitik. Sebanyak    0.1  ml    kultur  sampel  disebar    pada medium marine  agar (MA) dan Thiosulphate Citrate  Bile  Salt  Sucrose (TCBS), lalu  diinkubasi pada 29 o C.   Setelah 24 jam, koloni  yang tumbuh diambil, dibuat  replikanya  dan  dimurnikan  dengan metode  cawan  gores. Selanjutnya isolat murni ditumbuhkan pada  medium marine  broth (MB)
selama 24 jam pada 29 o C. Sel dan supernatannya dipisah  dengan  cara  disentrifugasi  pada  3000  rpm selama  10  menit.  Sebanyak  100  µL    supernatan yang  mengandung  ekstrak  kasar  enzim  yang dimasukkan  ke  dalam  sumur  pada  media  cawan agar  (1.2%  agar  Merck),  diinkubasi  selama  4  jam dan  diamati  ada  tidaknya  zona  bening  setelah dituangi Lugol’s  iodin.
Pemeliharaan Isolat. Isolat bakteri agarolitik  dipelihara  dalam  larutan  Dubos’  yang mengandung  (gr/L)  : NaNO 3 ,  0.5;  K 2 HPO 4 ,  0.1; MgSO 4 .7H 2 O,  0.5;    dan  FeSO 4 .7H 2 O,  0.01,  agar 0.2%;    dituang  dalam  botol  Bijou  dan  sebelum diotoklaf, pH disesuaikan menjadi 7.2.
Resistensi  Antibiotik. Isolat  bakteri agarolitik    diuji  resistensinya  terhadap  4  jenis antibiotik  mewakili  kategori  agen  anti  mikroba yang  umumnya  digunakan  pada  hewan  dan manusia.  Antibiotik  yang  digunakan  dalam penelitian ini  meliputi Vancomycin, erythromycin, tetracyclin  dan  rifampicin.    Resistensi  antibiotik dihitung  berdasarkan  ukuran  zona  hambatan  yang terbentuk  menggunakan  metode  cakram  (paper disk).  Interpretasi  zona  hambatan  untuk  resistensi, intermediat  dan  rentan  ditentukan  berdasarkan Jonhson  and  Case  (2007).  Isolat  yang  memiliki profil resistensi terhadap ke-4 antibiotik dieliminasi sebagai kandidat CE.
Standard tingkat resistensi dan kerentanan isolat  bakteri  terhadap  antibiotik  menggunakan standard yang dikeluarkan oleh National Commitee for  Clinical  Standard,  USA,  dalam  Johnson dan Case (2007), ditampilkan pada Tabel 1.
Uji Patogenisitas Isolat Kandidat Probiotik  (Cai et  al.  2006).  Uji  ini  dilakukan terhadap spat abalon umur 60 hari (ukuran 0.5-0.7 cm)  dan Gracilaria sp.  yang  diperoleh  dari  Balai Budidaya  Laut  Lombok  NTB.    Mula-mula  isolat kandidat probiotik diprakultur pada medium SWM broth pada 29 o C selama 24 jam. Kemudian dibuat serial pengenceran    10 5 ,10 6 ,  dan  10 7 CFU/ml menggunakan larutan fisiologis. Sebelum digunakan  benih  abalon  yang  masih  melekat  pada substratnya  direndam  dalam  larutan  antibiotik (rifampisin  50  µg/ml,  tetrasiklin  10  µg/ml, kloramfenikol  20  µg/ml).    Selanjutnya  kedalam 1000 ml air laut steril  dalam stoples yang berisi 10 ekor  benih    ditambahkan  masing  masing  serial pengenceran  isolat  kandidat  probiotik  dan  satu kontrol  tanpa  probiotik  (K0  =  Kontrol,  K1=  10 5 cfu/ml,      K2=  10 6 cfu/ml,  dan    K3=  10 7 cfu/ml). Tiap-tiap perlakuan    diulang  3  kali.    Pengamatan terhadap  mortalitas  dilakukan  tiap  hari  selama  6 hari.
Tabel 1. Interpretasi zona hambat dari kultur uji Disk symbol Antimicrobial agent Disk Content Diameter of zona of inhibition (mm) Resistant Intermediate Susceptible Va E R Te Vancomycin Erythromycin Rifampisin Tetracyclin 30 µg 15 µg 5 µg 30 µg <9 <13 <16 <14 10-11 14-22 17-19 15-18 >12 >23 >20 >19

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi Bakteri Agarolitik
Hasil  isolasi diperoleh  11 isolat  bakteri yang berasosiasi  dengan Gracilaria, 6  isolat diperoleh dari  pantai  Kuta, 3  isolat  dari tanjung An  dan 2  isolat  dan  pantai  Gerupuk. Isolat-isolat tersebut memiliki  karakter  morfologi  koloni  dan sel  yang  beragam.  Terdapat 9
isolat (82%) berbentuk batang dan sisanya kokus,  warna koloni umumnya  putih-krem  atau  kuning  kecoklatan (Tabel 2).
Tabel 2.  Isolat bakteri  agarolitik yang berasosiasi Gracilaria spp. asal  pantai Gerupuk, Pantai Kuta dan
Tanjung An No Kode Asal isolate Karakter morfologi koloni dan sel 1 Alg1.1 Pantai Gerupuk Kokus, putih, licin, bulat, dan kecil 2 Alg1.3 Pantai Gerupuk Batang pendek, krem, licin, bulat, motil 3 Alg2.1 Pantai  Kuta Batang, kuning kecoklatan, irregular 4 Alg2.2 Pantai  Kuta Batang, pink, permukaan licin, bulat 5 Alg3.1 Pantai  Kuta Batang pendek, koloni krem,  bulat, licin, motil 6 Alg4.1 Tanjung An Batang, kuning kecoklatan,   motil 7 Alg4.2 Tanjung An Batang, krem, koloni bulat, motil 8 Alg5.1 Pantai  Kuta Batang panjang,  menghasilkan H 2 S, putih susu 9 Alg5.2 Pantai  Kuta Kokus, krem, ireguler, non motil 10 Alg5.3 Pantai  Kuta Batang, putih, permukaan kasar, non motil 11 Alg6.3 Tanjung An Batang, kuning kecoklatan, irregular Hasil  verifikasi  aktivitas    agarolitik  dari kesebelas  isolat  bakteri  setelah    dideteksi  dengan indikator Lugol’s iodin menunjukkan bahwa semua
isolat mampu membentuk  zona terang kekuningan disekitar  latar  gelap  coklat  (Gambar 1A  dan 1B).
Gambar 1. (A) Koloni bakteri agarolitik menyebar tipis pada permukaan medium A  dengan 1.8% agar, (B) zona bening yang terbentuk dari supernatan yang diproduksi pada kultur cair MB umur 24 jam.
B A
Koloni  isolat  bakteri  agarolitik  pada medium A agar ada yang bersifat mengumpul  dan ada koloni yang menyebar tipis di permukaan agar- agar. Mengumpul atau menyebarnya koloni bakteri di  permukaan  agar-agar  berhubungan  dengan motilitas isolat.  Isolat  yang  motil  cenderung
menyebar  dipermukaan  agar  karena  terbentuknya cairan pada permukaan agar-agar sebagai hasil dari likuifikasi  agar-agar.          Kemampuan  tiap    isolat agarolitik    membentuk  zona  bening  pada  media agar berbeda-beda (Tabel 3).
Tabel 3. Ukuran diameter zona bening  isolat bakteri  agarolitik
No Isolat Diameter koloni + zona bening (mm) Diameter  zona bening supernatan (mm) 1 Alg1.1 14.00 17 2 Alg1.3 19.33 24 3 Alg2.1 23.33 19 4 Alg2.2 33.33 36.5 5 Alg3.1 54.33 42.5 6 Alg4.1 19.33 24 7 Alg4.2 60.67 49.5 8 Alg5.1 24.67 22 9 Alg5.2 31.33 36 10 Alg5.3 21.67 20.5 11 Alg6.3 23.33 22
Kesebelas  isolat  menampilkan  aktivitas agarolitik  yang  berbeda-beda  berdasarkan    ukuran diameter  zona  bening  yang  dibentuk,  paling  kecil dicapai  oleh  isolat  Alg1.1.  dan  paling  besar dihasilkan  Alg4.2.    Tabel 3 juga  memperlihatkan bahwa  aktivitas  agarolitik,    baik  itu  menggunakan supernatan  maupun  kultur  sel  secara  konsisten menunjukkan  ukuran  diameter  zona  bening    yang hampir  sama.  Sebanyak  6  isolat  menunjukkan derajat  agarolitik  yang  tinggi  dengan  ukuran diameter  zona  bening  lebih  dari  30  mm  yaitu Ail1.1,  Abn1.1,  Alg3.1,  Alg4.2,  Alg2.2  dan Alg5.2. Perbedaan ukuran diameter zona bening ini kemungkinan  disebabkan  oleh  kemampuan  isolat dalam  memproduksi  enzim  agarase,  kelengkapan jenis  enzim  agarase  yang  dihasilkan  dan  juga  oleh ukuran molekul enzim agarase yang berbeda-beda. Vera et  al.  (1998)  membagi  bakteri  agarolitik kedalam  3  kelompok  berdasarkan  ukuran  berat molekul  enzim  dan  hubungannya  dengan  aktivitas degradasi gel agar-agar. Kelompok  I dengan berat molekul
30-35 kDa, terdiri dari Pseudoalteromonas atlantica ATCC 19291,
P.antartica N-1, Streptomyces  coelicolor dan Pseudomonas sp. galur PT-5;  kelompok  II dengan berat molekul 50-59 kDa,  terdiri dari Alteromonas sp.  galur  C-1, Pseudomonas sp.  galur  W-7  dan P.atlantica t6c;  dan  kelompok    III  dengan  berat molekul  lebih  dari  100  kDa  yang  terdiri  atas spesies-spesies Vibrio dengan kemampuan
degradasi  gel  agar-agar  yang  relatif  rendah. Kelompok  I  dan  II  dikenal  memiliki  kemampuan yang tinggi dalam melunakkan dan mendangkalkan agar-agar  karena  memiliki  berat  molekul  agarase rendah  yang  dapat  berdifusi  melalu  pori-pori  gel agar-agar.  Perkecualian  pada Alteromonas sp. galur C-1 yang dapat mencairkan agar-agar karena mampu  menghasilkan  enzim  agarase  dalam konsentrasi yang tinggi.

## Resistensi Terhadap Antibiotik
Saat    ini,  salah  satu    persyaratan  suatu isolat  bakteri  dapat  digunakan  sebagai  probiotik adalah  tidak  menunjukkan  resistensi  terhadap  satu atau  lebih  antibiotik  yang  umum  digunakan  pada manusia  dan  hewan.  Prosedur  uji  dan  standar resistensi  antibiotik  didasarkan  pada  Johnson  and Case  (2007). Uji      resistensi  isolat  dilakukan terhadap 4 jenis  antibiotik,  yaitu    tetrasiklin, rifamisin,  ampisilin, dan vancomisin  (Tabel 4). Isolat-isolat  yang  menunjukkan    resistensi  atau intermediet langsung dieliminasi  sebagai kandidat probiotik dan    tidak  diuji  lagi  terhadap  antibiotic yang  lain,  sementara  isolate-isolat  yang  peka  diuji terhadap antibiotik yang lainnya.
Rekapitulasi dan interpretasi data resistensi  isolat  terhadap antibiotik  tetrasiklin, rifamisin, ampisilin dan vancomisin disajikan pada Tabel 5.
Tabel 4. Data uji resistensi isolat terhadap antibiotik tetrasiklin, rifamisin, ampisilin dan vankomisin
No Kode isolate Zona hambatan (mm) Tetrasiklin Rifamisin Ampisilin Vankomisin 1 Alg1-2 13.00 - - - 2 Alg1-3 16.25 - - - 3 Alg2-1 16.50 - - - 4 Alg2-2 29.50 22.50 18.25 16.25 5 Alg3-1 27.00 26.25 34.00 14.00 6 Alg4-1 27.50 18.75 19.50 22.50 7 Alg4-2 30.75 21.75 20.50 15.25 8 Alg5-1 32.50 25.50 24.50 19.75 9 Alg5-2 34.00 21.25 18.25 16.25 10 Alg5-3 31.00 16.50 - - 11 Alg6-3 15.50 - - -
* standar resistensi tetrasiklin (10 µg):  <14  mm resisten, 15-18 mm intermediet, >19 peka; rifamisin (5 µg):  <16  mm resisten, 17- 19 mm intermediet, >20 peka; ampisilin (10 µg), G+:  <28  mm resisten, - mm intermediet, >29 peka, G- :  <13  mm resisten, 14-16 mm intermediet, >17 peka; vankomisin (30 µg),   <9  mm resisten,     10-11 mm intermediet, >12 peka * tanda (-) : isolat tidak diuji karena bersifat  resisten
Tabel 5. Interpretasi resistensi isolat terhadap 4 jenis antibiotik No Isolat Sifat Resistensi Tetrasiklin Rifamisin Ampisilin Vancomisin 1 Alg1-2 Resisten - - - 2 Alg1-3 Intermediet - - - 3 Alg2-1 Intermediet - - - 4 Alg2-2 Peka Peka Peka Peka 5 Alg3-1 Peka Peka Peka Peka 6 Alg4-1 Peka Intermediet - - 7 Alg4-2 Peka Peka Peka Peka 8 Alg5-1 Peka Peka Peka Peka 9 Alg5-2 Peka Peka Peka Peka 10 Alg5-3 Peka Resisten - - 11 Alg6-3 Intermediet - - - Data hasil penelitian menunjukkan bahwa lebih  dari  50%    isolat  (6  isolat)  bersifat intermediet  atau  resisten  terhadap  antibiotik. Sebanyak 4 isolat,  yaitu Alg1.2,  Alg1.3,  Alg2.1 dan  Alg6.3  menunjukkan  kecenderungan  resisten terhadap  antibiotik tetrasiklin  dan  2  isolat  yaitu Alg4.1  dan  Alg5.3  cenderung  resisten  terhadap rifamisin,  sehingga    harus  dieliminasi  sebagai kandidat probiotik.
Tetrasiklin  bekerja  menghambat  sintesis protein, sedangkan  rifamisin  merupakan inhibitor RNA  polimerase  sehingga  menghambat  laju transkripsi.  Banyaknya  isolate  yang  resisten terhadap  kedua  antibiotik  ini  kemungkinan disebabkan  oleh  kemampuan  bakteri  untuk melipatgandakan  jumlah  produksi  mRNA  dan proteinnya, sehingga  bakteri  mampu  bertahan
hidup  meskipun  diberi  antibiotik  tetrasiklin  dan rifamisin.
Hasil  uji lanjutan isolat  yang  peka (Alg2.2,  Alg3.1,  Alg4.2,    Alg5.1,  dan    Alg5.2) terhadap antibiotik ampisilin  dan  vankomisin menunjukkan  bahwa  kelima  isolat  tidak  bersifat resisten terhadap kedua antibiotik. Ampisilin dan Vancomisin  merupakan  antibiotic  yang  bekerja menghambat  sintesis  dinding  sel.      Ampisilin termasuk turunan  β -laktam  yang  mekanisme kerjanya  merusak  sintesis  peptidoglikan. Oleh karena  itu  terdapat  perbedaan  standar  ukuran resistensi antara Gram positif dengan Gram negatif yang  disebabkan  oleh  adanya  perbedaan  struktur dinding sel keduanya.
Terhadap  isolat  yang  bersifat  resisten secara  langsung    dieliminasi  sebagai  kandidat competitive  exclusion. Eliminasi  terhadap  ke-7
isolat  tersebut  karena diketahui  bahwa  bakteri dapat  mengembangkan  resistensi  terhadap  agen antimikrobial,  hal  ini  dapat  menjadi  ancaman  bagi kesehatan  manusia.  Kemunculan  bakteri  resisten dapat  menjadi  salah  satu  petunjuk  penting  dari tersebarluasnya  resistansi  antibiotik  dari  patogen oportunistik, dimana bakteri resisten tersebut dapat meningkatkan  potensi  ancaman  melalui  transfer gen  resistensi  kepada  patogen  manusia  melewati saluran  gastrointestinal  atau  lingkungan.  Oleh sebab,  itu  haruslah  dipertimbangkan  pentingnya seleksi  bakteri  yang  akan  digunakan  sebagai
probiotik, dimana bakteri tersebut tidak menunjukkan resistensi terhadap antibiotik standar yang  dipergunakan  oleh  manusia  dan  hewan (Brashear et al. 2003).

## Patogenisitas Isolat Kandidat Probiotik
Sebelum  dinyatakan  sebagai  kandidat probiotik,  ketiga  isolat  diuji    patogenisitasnya terhadap    terhadap  spat  atau  fase  juvenil  awal abalon. Perlakuan dalam uji patogenisitas terhadap abalon dilakukan dengan berbagai level konsentrasi sel isolat bakteri agarolitik. Tabel 6.  Rataan  mortalitas  spat  abalon    (ukuran  0.5-0.7  cm)    yang  diberi  isolat  bakteri  agarolitik  pada konsentrasi berbeda selama 6 hari pengamatan Konsentrasi inokulum (cfu/mL) Mortalitas  (%) Alg2.2 Alg3.1 Alg4.2 Alg5.1 Alg5.2 0 0 1.65 0 1.65 0 10 5 0 0 0 3.33 0 10 6 0 1.65 0 0 0 10 7 3.33 0 1.65 0 0 Hasil penelitian pada Tabel 6
menunjukkan bahwa semua isolat bakteri agarolitik kandidat probiotik yang diuji tidak bersifat patogen terhadap  spat.  Hal  ini  dapat  terlihat  rataan mortalitas  spat  abalon  yang  rendah  (berkisar  0- 3.33%). Kematian yang terjadi pada spat baik pada kontrol  maupun  perlakuan  lebih  disebabkan  oleh kekuranghatian  pada  saat  pemindahan  spat      dari feeder plate (substrat tempat spat abalon menempel) pada bak pemeliharaan larva ke wadah uji.  Cai et  al.  (2006)  menggunakan  konsentrasi 10 3 -10 6 cfu/ml  untuk  menguji  patogenisitas V. haemolyticus terhadap  juvenil  abalon.  Suatu  galur bakteri  disebut  patogen  atau  virulen  bila  memiliki LD50 pada 10 4 -10 5 cfu/ml, dan suatu galur bakteri dipertimbangkan tidak virulen bila memiliki LD50 pada  >10 8 cfu/ml.  Selanjutnya  ketiga  isolat  diuji patogenisitasnya terhadap Gracilaria sp.
Data ini menunjukkan bahwa ketiga isolat aman digunakan sebagai kandidat probiotik abalon. Selama  ini  eksplorasi  bakteri  kandidat  probiotik akuakultur  lebih  ditujukan  pada    bakteri  asam laktat  yang  telah  dikenal  luas  aman  bagi  manusia, seperti Lactobacillus sp., Carnobacterium sp., dan Bifidobacterium sp.  (Gatesoupe  2008;  Suzer et  al. 2008).    Namun  demikian,    golongan  bakteri  ini bukan merupakan mikrobiota normal pada moluska sehingga jarang ditemukan pada saluran
pencernaannya,  akibatnya  seleksi  probiotik  lebih diarahkan pada bakteri yang dominan pada saluran pencernaan  moluska  seperti Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas dan Bacillus (Zhou et al. 2012; Prado et al. 2010; Tanaka et al. 2002).

## SIMPULAN
Berdasarkan  hasil  dan  pembahasan  dapat disimpulkan bahwa dari 11 isolat bakteri agarolitik berasosisasi Gracilaria spp. hanya 5 isolat, Alg2.2, Alg3.1, Alg4.2,  Alg5.1, dan  Alg5.2, yang bersifat sensitif  terhadap  antibiotic  tetrasiklin,  rifamisin, ampisilin  dan  vankomisin.  Kelima  isolate  tidak bersifat pathogen terhadap abalon.  Perlu dilakukan seleksi    lanjutan    untuk  menilai potensi isolate tersebut sebagai kandidat probiotik akuakultur.

## DAFTAR PUSTAKA
Brashear  M.M.,  D. Jaroni, and J. Trimble, 2003. Isolation,  selection  and  characterization  of Lactic  Acid  bacteria  as  Competitive exclusion  product  to  reduced Escherichia coli 0157:H7  in  cattle. J Food Protec 66: 355-363.
Cai J,  Han Y , Wang  Z. 2006. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from    abalone  ( Haliotis diversicolor supertexta L.) postlarvae
associated with mass mortalities. Aquaculture 257: 161-166.
Doeschate  KI,  Coyne  VE.  2008. Improved  growth rate  in  farmed Haliotis  midae through probiotic  treatment. Aquaculture 284:174- 179.
Erasmus JH, Cook PA,  Coyne VE. 1997. The role of  bacteria  in    the  digestion  of  seaweed  by the  abalone Haliotis  midae. Aquaculture 155: 377-386.
Gatesoupe  FJ.  2008. Updating  the  importance  of lactic  acid  bacteria  in  fish  farming:  natural occurrence and probiotic treatments. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 14: 107-114. Gomez-Pinchetti  JL,  Garcia-Reina  G.  1993. Enzymes  from  marine  phycophages  that degrade cell walls of seaweeds. Mar Biol 4: 553-558.
Johnson  TR,    Case  CL.  2007. Laboratory experiment  in  microbiology.  Singapore. Pearson Benjamin Cummings.
Michel  G,  Nyval-Collen  P,  Barbeyron  T,  Czjzek M,  Helbert  W.  2006.  Bioconversion  of  red seaweed  galactans:  a  focus  on bacterial agarases and carrageenases. J Appl Microbiol Technol 71:23-33.
Prado  S,  Romalde  JL,  Barja  JL.  2010. Review  of probiotics for use in bivalve  hatcheries. Vet Microbiol 145:187-197.
Setyono DED. 2008. Biologi  dan  ekologi  abalon.
Oceana 33:1-13.
Soegiarto  A,  Sulistijo,  1985.  The  potential  of marine  algae  for  biotechnology  products  in
Indonesia.  Di  dalam  : Workshop  on  marine algae biotechnology; Jakarta, Desember 11- 13, 1985.
Suzer C. 2008. Bacillus spp. bacteria as probiotics in  gilthead  sea  bream  (Sparus  aurata, L.,) larvae:  Effects  on  growth  performance  and digestive  enzyme  activities. Aquaculture 280:140-145.
Tanaka  R.,  T. Sawabe,  M. Yoshimizu,  and  Y. Ezure, 2002.  Distribution    of Vibrio halioticoli around  an  Abalone-farming Center in Japan. Microbes and Environments. 17(1):6-9.
Thompson  F.L,  Ida  T, and  Swings  J., 2004. Biodiversitas  of Vibrio s. Microbiol  and Mol Biol Rev. 68(3): 403-431.
Vera  J,  Alvares  R,  Murano  E,  Slebe  JC,  Leon  O. 1998.  Identification  of  a  marine  agarolityc
Pseudoalteromonas
isolate and characterization  of  its  extracellular  agarase. J Appl Environ Microbiol 64: 4374-4383.
Verschuere,  L.,  Rombout  G.,  Sorgeloos  P.,  and Verstraete  W.,  1997.  Probiotic  Bacteria  as biological  control  agents  in  aquaculture. Microbiol and Mol Biol Rev.  64(4): 655- 671.
Zhao J, Shi B, Jiang QR, Ke CH. 2012. Changes in gut-associated ﬂora  and  bacteria l  digestive enzymes  during  the  development  stages  of abalone
(Haliotis diversicolor ). Aquaculture xxx: xxx-xxx (article In Press).