e- Jurnal Rekayasa dan Teknologi Budidaya Perairan
Volume I No 2 Februari 2013 ISSN: 2302-3600
POTENSI EKSTRAK KULIT BUAH DAN BIJI RAMBUTAN ( Nephelium lappaceum ) SEBAGAI SENYAWA ANTI BAKTERI PATOGEN PADA IKAN ©
Azwar Ibrahim * , Y. T. Adiputra †,‡ , Agus Setyawan † dan Siti Hudaidah †

## ABSTRAK
Limbah tanaman buah berpotensi sebagai bahan pengobatan alternatif. Rambutan ( Nephelium  lappaceum )  merupakan  tanaman  buah  yang  memiliki  peluang digunakan  sebagai  bahan  pengobatan  pada  infeksi  bakteri  patogen  pada  ikan. Penelitian in  vitro ekstrak  etanol  dari  kulit  dan  biji  rambutan  dilakukan  untuk mempelajari  kemampuannya  sebagai  senyawa  anti  bakteri  patogen  pada  ikan. Penelitian  dilakukan  dengan  dua  tahap  yaitu  pengujian  penghambatan  dan pengujian Minimum  Inhibitory  Concentration (MIC).  Pengujian  penghambatan yang  dilakukan  adalah  uji  penghambatan  pertumbuhan  bakteri  dan  uji  cakram. Hasil uji penghambatan pertumbuhan bakteri menunjukkan bahwa kulit rambutan tidak  memiliki  kemampuan  sebagai  anti  bakteri  patogen  pada  ikan.  Berlawanan, hasil  uji  penghambatan  pertumbuhan  bakteri  menunjukkan  biji  rambutan berpotensi sebagai senyawa antibakteri pathogen pada ikan antara lain Aeromonas hydrophila , A . salmonicida dan Streptococcus sp.  Uji  cakram  menunjukkan kemampuan  biji  rambutan  untuk  menghambat  pertumbuhan  tiga  bakteri  patogen tersebut paling baik bekerja pada konsentrasi 75% dengan diameter zona hambat lebih  dari  10  mm.  Konsentrasi  minimal  yang  efektif  untuk  menghambat pertumbuhan  tiga  bakteri  patogen  adalah  pada  konsentrasi  50-75%  dan  semakin tinggi  konsentrasinya  menunjukkan  kandungan  bahan  aktif  flavonoid  dalam  biji rambutan semakin berfungsi sebagai anti bakteri patogen pada ikan.
Kata kunci : ekstrak etanol, bakteriostatik, flavonoid, MIC, rambutan
© e-JRTBP 2013
* Mahasiswa Jurusan Budidaya Perairan
† Staf Pengajar Jurusan Budidaya Perairan, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung
‡ Alamat Korespondensi : yudha_adiputra@yahoo.com
Pendahuluan Peningkatan produksi akuakultur terutama menggunakan metode budidaya ikan yang intensif memberikan banyak implikasi terhadap munculnya  penyebab-penyebab  ikan budidaya  menjadi  stres  antara  lain kepadatan tinggi, transportasi, penanganan dan seleksi dan kualitas air (Christybapita et al ., 2007; Magnadόttir,  2006;  Sakai,  1999). Pembudidaya memahami bahwa semakin tingginya teknologi dan
intensifnya  metode  budidaya  maka kemungkinan  ikan  terinfeksi  penyakit semakin  besar  (Dügenci et  al .,  2003). Penyakit  terutama  yang  disebabkan oleh  bakteri  menjadi  salah  satu tantangan dalam akuakultur dan memerlukan  perhatian  khusus  untuk mencegah  terjadinya  wabah  penyakit bakterial.  Salah  satu  cara  yang  paling banyak  digunakan  untuk  mencegah infeksi bakteri adalah dengan meminimalisasi  penyebab  stres  pada ikan  dan  meningkatkan  sistem  imun tubuh  ikan  pada  ukuran  larva  dan dewasa  (Magnadόttir,  2006;  Bricknell and  Dalmo,  2005),  dengan  pemberian bahan-bahan  aktif  yang  terkandung dalam  tanaman  (Citarasu,  2010;  Ardό et al ., 2008; Rao et al ., 2006).
Tanaman  mendapatkan  perhatian  lebih karena  fungsinya  dapat  digunakan sebagai  pengobatan  (Ji et  al .,  2008; Tolo et  al .,  2006)  terutama  pada  ikan atau  udang  (Yin et  al .,  2006).  Potensi tanaman  sebagai  bahan  obat  terus berkembang dengan kemampuan kerjanya  tidak  saja  pada  satu  spesies bakteri  patogen  tetapi  juga  bekerja pada  bakteri  patogen  yang  sudah resisten terhadap
pengobatan menggunakan antibiotik (Vaseeharan et al .,  2011).  Potensi  lainnya  adalah campuran  beberapa  bahan  aktif  dari
tanaman dari Cina dan vaksin konvensional atau dalam bentuk minyak  atsiri  dapat  digunakan  sebagai pencegah penyakit dengan meningkatkan sistem imun ikan (Galina et  al .,  2009;  Mousavi et  al ., 2011).
Beberapa  jenis  tanaman  yang  banyak digunakan  sebagai  bahan  pengobatan dan peningkatan sistem imun ikan atau udang dari berbagai negara antara lain: Cina- Astragalus  membranaceus , A . radix  Lonicera  japonica , Ganoderma licudum , Pericarpium  citri  reticulatae , Crataegus pinnatifida , Radix codonopsis , R . isatidis , Herba taraxaci dan Fructus  hordei  germinatus (Yin  et al., 2009; Ardό et al ., 2008; Xue et al .,
2008);  India- Eclipta  alba , Solanum trilobatum , Ocimum sanctum , Withania somnifera dan Myristica  fragrans (Christybapita et al ., 2007; Divyagnaneswari et  al ., 2007;  Sivaram et  al .,  2004);  Bolivia- Baccharis pentlandii , B . platypoda , Chromoleana tunariense , Erechtites  hieracifolius , Mikania psilostachya , Phichea sagittalis , Tagetes  maxima , Tessaria fastigiata dan Wulffia  baccata (Parejo et  al .,  2003).  Salah  satu  tanaman  yang berpotensi  sebagai  bahan  pengobatan adalah rambutan ( Nephelium lappaceum ). Menurut Setiawan (2003), kulit  buah  rambutan  mengandung tannin  dan  saponin,  sedangkan  biji rambutan  mengandung  lemak  dan polifenol.  Selain  itu,  kulit  buah rambutan  juga  mempunyai  aktivitas antibakteri terhadap bakteri Escherichia  coli dan Staphylococcus aureus (Khasanah,  2011).  Penelitian menggunakan  rambutan  sebagai  bahan pengobatan untuk ikan dan udang tidak banyak  dilakukan,  oleh  sebab  itu penelitian ini dilakukan untuk mempelajari  kemampuan  kulit  buah
dan  biji  rambutan  untuk  digunakan sebagai  senyawa  anti  bakteri  patogen pada  ikan.  Penelitian  ini  penting dilakukan untuk membuka potensi baru pengobatan penyakit ikan menggunakan bahan-bahan alamiah.

## Bahan dan Metode
Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei sampai  dengan  Juni  2012  bertempat  di Laboratorium  Stasiun  Karantina  Ikan-
Pengendalian  Mutu  dan  Keamanan Hasil  Perikanan  Kelas  I  Lampung  dan Laboratorium Budidaya Perikanan Jurusan  Budidaya  Perairan  Universitas Lampung. Penelitian  dilakukan  dengan    tiga tahap. Tahap persiapan, meliputi sterilisasi  alat, pembuatan ekstrak kulit buah  dan  biji  rambutan  dengan  pelarut etanol  70%  dan  pembuatan  media isolat  bakteri.  Kulit  buah  dan  biji rambutan  diperoleh  dari  Kota  Metro, Lampung. Kulit buah dan biji rambutan dikeringkan  dengan  cara  dijemur  lalu diblender  hingga  halus.  Hasil  blender kemudian  diayak  dan  menghasilkan tepung  kulit  buah  dan  biji  rambutan masing-masing 300 gram. Tepung kulit buah  dan  biji  rambutan  di  maserasi dengan  larutan  etanol  70%  dengan perbandingan  1  :  5  (w  :  v).  Hasil maserasi lalu  dievaporasi dengan vacum  evaporator pada  suhu  35 o C hingga kering.
Tahap  pelaksanaan,  meliputi  pengujian penghambatan dan pengujian Minimum
Inhibitory  Concentration (MIC)  dari ekstrak  kulit  buah  dan  biji  rambutan terhadap pertumbuhan bakteri. Pengujian  penghambatan  dilakukan dengan  menggunakan  metode paper disc .  Metode  ini  digunakan  untuk melihat  diameter  zona  hambat  dari
ekstrak  kulit  buah  dan  biji  rambutan. Paper disc direndam ekstrak kulit buah dan  biji  rambutan  +  15  menit  dengan konsentrasi  25%,  50%,  75%,  dan 100%,  lalu  diletakkan  di  media  isolat empat  bakteri  patogen  pada  ikan  yaitu Aeromonas hydrophila , A . salmonicida , Streptococcus sp. dan Vibrio alginolyticus dan  diinkubasi  selama  24 jam.  Pengujian Minimum  Inhibitory Concentration (MIC) dilakukan dengan menggunakan  metode serial  tube dillution .  Uji  MIC  dilakukan  dengan membuat larutan ekstrak dengan konsentrasi 25%, 50%, 75%, dan 100% pada  media  cair  MHB  ( Muller  Hilton Broth ) .  Tabung  reaksi  yang  digunakan sebagai wadah diisi MHB sebanyak 4,5 ml  lalu  ditambahkan  0,5  ml  ekstrak kulit  buah  dan  biji  rambutan  secara berseri  dengan  konsentrasi  25%,  50%, 75%, dan 100% pada masing – masing tabung  lalu  diinokulasi  bakteri  dengan kepadatan 10 7 cfu/ml, diinkubasi selama  24  jam. Tahap  pengamatan, meliputi penentuan ekstrak yang efektif menghambat pertumbuhan bakteri, pengukuran  diameter  zona  hambat  dan konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan empat bakteri  patogen  pada  ikan  yaitu
Aeromonas hydrophila , A . salmonicida , Streptococcus sp. dan Vibrio alginolyticus . Hasil penelitian dianalisis secara deskriptif dan dibandingkan  dengan  pustaka  yang relevan.
Hasil dan Pembahasan Pemanfaatan tanaman sebagai pengobatan  dan  peningkatan  sistem imun  ikan  dapat  memperluas  manfaat tanaman  bukan  hanya  sebagai  bahan makanan tetapi limbahnya dapat
dimanfaatkan secara maksimal. Rambutan yang dikenal sebagai tanaman  buah  hanya  dimanfaatkan buahnya  sedangkan  kulit  buah  dan bijinya  tidak  termanfaatkan  secara maksimal dan menjadi limbah. Penelitian  ini  merupakan  dasar  dari pemanfaatan  rambutan  sebagai  bahan pengobatan  pada  penyakit  ikan  yang disebabkan  bakteri.  Limbah  rambutan dieksplorasi  manfaatnya  berupa  kulit buah  dan  bijinya  sebagai  antibakteri patogen  pada  ikan.  Kulit  buah  dan  biji rambutan dapat diekstrak dengan menggunakan  pelarut  etanol.  Etanol merupakan  pelarut  yang  termasuk golongan polar. Pelarut polar merupakan pelarut yang dapat
melarutkan  senyawa  flavanoid  dan tanin yang terkandung dalam kulit buah dan biji rambutan (Khasanah, 2011). Pengujian  penghambatan  berupa  uji penghambatan  pertumbuhan  bakteri dan  uji  cakram  dilakukan  untuk mengetahui pengaruh senyawa
antibakteri  yang  terkandung  di  dalam ekstrak  kulit  buah  dan  biji  rambutan terhadap bakteri  empat bakteri  patogen pada ikan antara lain A . hydrophila , A . salmonicida , Streptococcus sp.,  dan V . alginolyticus .  Hasil  uji  penghambatan menunjukkan bahwa ekstrak kulit buah rambutan  tidak  berpengaruh  terhadap pertumbuhan  bakteri A . hydrophila , A . salmonicida , Streptococcus sp.,  dan V .
alginolyticus (Tabel 1). Tidak
terbentuknya  zona  hambat  disekitar paper disc sehingga bakteri masih tetap tumbuh  merupakan  indikasi  bahwa ekstrak  kulit  buah  rambutan  tidak berpotensi  sebagai  senyawa  antibakteri patogen  (Gambar  1).  Berlawanan dengan  hasil  ekstrak  kulit  buah,  pada ekstrak  biji  rambutan  berpengaruh dalam menghambat pertumbuhan bakteri A . hydrophila , A . salmonicida ,
dan Streptococcus sp.,  sedangkan terhadap  bakteri V . alginolyticus tidak berpengaruh  (Tabel  1).  Terbentuknya zona  hambat  disekitar paper  disc menunjukkan  ekstrak  biji  rambutan berpotensi  sebagai  antibakteri  patogen pada ikan (Gambar 1).
Ekstrak  biji  rambutan  yang  memiliki daya  hambat  terhadap  pertumbuhan bakteri A . hydrophila , A . salmonicida ,
dan Streptococcus sp.,  selanjutnya dilakukan  pengukuran  diameter  zona hambat  untuk  menentukan  seberapa besar daya hambat ekstrak biji rambutan dalam menghambat pertumbuhan bakteri. (Tabel 2, Gambar 1). Soetjipto (2008) menyatakan diameter  zona  hambat  20  mm  atau lebih  dikategorikan  sangat  kuat,  zona hambat  10  sampai  20  mm  kuat,  5 sampai  10  mm  sedang,  dan  diameter kurang 5 mm berarti lemah. Konsentrasi yang memiliki zona hambat paling luas ada pada konsentrasi  75%  dengan  zona  hambat diatas  10  mm,  sehingga  konsentrasi 75%  merupakan  dosis  yang  paling efektif  karena  memiliki  zona  hambat yang kuat. Perlakuan dengan konsentrasi 25% dan 50%
menghasilkan  daya  hambat  masing- masing  bakteri  dibawah  5  mm  dan diatas  5  mm,  sehingga  digolongkan zona hambat lemah dan sedang. Hal ini diduga  karena  pada  konsentrasi  ini, bakteri  membentuk  respon  resistensi terhadap  senyawa  antibakteri  ekstrak biji rambutan.
Pada perlakuan konsentrasi 75%, ekstrak biji rambutan menghasilkan  zona  hambat  terluas yaitu > 10 mm yang digolongkan kuat. Hal  ini  diduga  pada  konsentrasi  ini senyawa-senyawa antibakteri pada ekstrak biji rambutan bekerja maksimal sehingga  dapat  merusak  dinding  sel bakteri yang mengganggu metabolisme
sel yang akhirnya menghambat pertumbuhan bakteri. Sedangkan konsentrasi 100%, zona hambat menurun  terutama  pada  bakteri A . hydrophila dan A .  s almonicida yang mengalami  penurunan  drastis.  Pada
bakteri Streptococcus sp.  zona  hambat masih  tergolong  kuat  karena  luasnya diatas  10  mm,  sedangkan  bakteri A . hydrophila dan A . salmonicida zona hambat sedang karena diatas 5 mm.
Gambar  1.  Zona  hambat  yang  terbentuk  dari  ekstrak  kulit  buah  rambutan ( Nephelium  lappaceum )  ( A) dan  biji  rambutan  ( B )  pada  uji penghambatan.
Tabel 1. Hasil uji penghambatan ekstrak kulit buah dan biji rambutan ( Nephelium lappaceum )  dengan  menggunakan  empat  jenis  bakteri  patogen  pada ikan. Asal Ekstrak Jenis Bakteri Patogen Aeromonas hydrophila A . salmonicida Streptococcus sp. Vibrio alginolyticus Kulit Buah - - - - Biji + + + - Keterangan:    ( + ) =  menghambat ( - ) =  tidak menghambat
Uji  MIC    (Tabel  3)  dilakukan  untuk mengetahui konsentrasi terendah
ekstrak biji rambutan dalam menghambat  pertumbuhan  bakteri A .
hydrophila , A . salmonicida , dan Streptococcus sp.  Konsentrasi  ekstrak biji  rambutan  yang  diujikan  adalah
25%,  75%,  50%,  100%,  0%  dan kontrol  dengan  masa  inkubasi  24  jam. Ekstrak  biji  rambutan  menghambat pertumbuhan bakteri A . hydrophila dan A . salmonicida pada  konsentrasi  50%, sedangkan  bakteri Streptococcus sp. pada konsentrasi 75%, hal ini
A B
ditunjukkan  adanya  perubahan  warna media  dari  keruh  menjadi  bening.
Media MHB pada bakteri A . hydrophila dan A . salmonicida mulai terjadi  perubahan  warna  dari  keruh menjadi  bening  pada  konsentrasi  50% dan  semakin  bening  pada  konsentrasi yaitu pada konsentrasi 75% dan 100%, sedangkan  bakteri Streptococcus sp. mulai menjadi bening pada konsentrasi 75%  dan  100%.  Hasil  konsentrasi  0% dan  25%  pada  bakteri A . hydrophila dan A . salmonicida dan  ditambah
konsentrasi  50%  bakteri Streptococcus
sp. warna yang dihasilkan sama dengan kontrol positif. Hasil uji MIC menunjukkan  bahwa  semakin  tinggi konsentrasi  ekstrak  biji  rambutan semakin dapat menghambat pertumbuhan  bakteri,  hal  ini  berarti semakin  tinggi  konsentrasi  ekstrak semakin tinggi kandungan bahan antibakteri yang dihasilkan.
Tabel  2.  Diameter  zona  hambat  (mm)  ekstrak  biji  rambutan  ( Nephelium lappaceum )  pada uji penghambatan terhadap tiga bakteri patogen pada ikan. Konsentrasi Ekstrak Biji Rambutan Diameter Zona Hambat (mm) Aeromonas hydrophila A . salmonicida Streptococcus sp. Kontrol + 32 32 35 Kontrol - 0 0 0 25% 3 2 4 50% 7 6 5 75% 15 14 17 100% 6 7 12
Bahan  aktif  yang  terkandung  dalam ekstrak  biji  rambutan  yang  terbukti berdasarkan  pengujian  penghambatan dan pengujian MIC. Bahan aktif dalam ekstrak    biji  rambutan  diperkirakan termasuk  golongan  flavonoid  (Marston and  Hostettmann,  2006).  Flavonoid yang  diperoleh  dari  biji  rambutan termasuk kuat - sangat kuat dengan dua tipe penghambatan bakteri yaitu sebagai bakteriostatik dan bakterisidal.
Dua tipe penghambatan bakteri didukung oleh hasil pengamatan pengujian penghambatan dan pengujian MIC  dimana  bakteri-bakteri  patogen yang diuji memperoleh hasil terhambat pertumbuhannya  oleh  ekstrak  biji rambutan  yang  bersifat  bakteriostatik. Bakteri-bakteri  patogen  juga  tidak dapat  tumbuh  dalam  media  pada
kondisi  normal  dengan  diberi  ekstrak biji  rambutan  yang  disebut  bersifat bakterisidal.
Biji  rambutan  yang  diekstrak  dengan etanol mengandung bahan aktif senyawa-senyawa flavanoid (Khasanah,  2011).  Bahan  aktif  dari ekstrak  biji  rambutan  efektif  bekerja sebagai  bakteriostatik  dan  bakterisidal karena  diduga  dapat  menghambat  dan merusak  dinding  atau  membran  sel bakteri yang terdiri dari lapisan protein. Mekanisme  kerja  senyawa-senyawa fenol termasuk flavanoid  sebagai antibakteri adalah dengan mendenaturasi  protein  sel  bakteri  dan merusak  membran  sel  (Brooks et  al , 1996).  Penghambatan  dan  perusakan dinding  dan  membran  sel  ini  dapat dilakukan  dengan  terbentuknya  ikatan-
ikatan  hidrogen  dan  kovalen  antara bahan aktifnya yang bersifat hidrofobik
sehingga  menganggu  integrasi  dinding dan membran sel bakteri (Hugo, 1998).
Tabel  3.    Pengujian Minimum  Inhibitory  Concentration (MIC)  (%)  dari  ekstrak biji  rambutan (Nephelium  lappaceum) pada  tiga  bakteri  patogen  pada ikan. Konsentrasi Ekstrak Biji Rambutan (%) Pertumbuhan Bakteri Aeromonas hydrophila A . salmonicida Streptococcus sp. 0 + + + 25 + + + 50 - - + 75 - - - 100 - - - Keterangan: ( + ) =  bakteri tumbuh ( - ) =  bakteri tidak tumbuh
Pemanfaatan  ekstrak  biji  rambutan selanjutnya  dapat  dilanjutkan  dengan pengujian  yang  dilakukan in  vivo antara lain uji toksisitas pada ikan atau hewan  uji  lain  misalnya Artemia sp. dan Daphnia sp.  untuk  mengetahui apakah  ekstrak  rambutan  menjadi bahan  beracun  bagi  inang.  Terbuka juga  peluang  keberlanjutan  penelitian ini  dengan  mempelajari  efektifitas ekstrak  rambutan  untuk    menaikkan sistem  imun  ikan  dengan  meneliti pengaruh  pemberian  ekstrak  dengan kondisi  hematologi,  pertahanan  tubuh seluler  dan  humoral  pada  ikan  yang diuji  tantang  dengan  patogen-patogen yang menginfeksi ikan.

## Kesimpulan
Ekstrak  etanol  biji  rambutan  lebih efektif  dibandingkan  kulit  buah  dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen  pada  ikan  antara  lain: A . hydrophila , A . salmonicida , dan Streptococcus sp.  Ekstrak  etanol  biji rambutan memiliki zona hambat terbesar  pada  konsentrasi  75%  dengan diameter  zoan  hambat  diatas  10  mm yang termasuk dalam kategori
antibakteri  kuat.  Ekstrak  etanol  biji rambutan  berdasarkan  uji  MIC  dapat menghambat A . hydrophila dan A . salmonicida pada  konsentrasi  50%, sedangkan Streptococcus sp.  pada konsentrasi 75%.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan  terima  kasih  kami  tujukan kepada  Kepala  dan  Staff  Stasiun Karantina Ikan-Pengendalian Mutu dan Keamanan  Hasil  Perikanan  Kelas  I Lampung  dalam  penyediaan  tempat, alat,  dan  isolat  bakteri  uji  pada penelitian ini.

## Daftar Pustaka
Ardό,  L.,  Yin,  G.,  Xu,  P.,  Váradi,  L.,
Szigeti,  G.,  Jeney,  Z  and  Jeney,
G. 2008. Chinese herbs ( Astragalus  membranaceus and Lonicera  japonica )  and  boron enhance the non-specific immune response of Nile tilapia ( Oreochromis niloticus ) and resistance  against Aeromonas hydrophila .  Aquaculture  275:26- 33. Brooks,  G.F.,  Butel,  J.  S.,  Ornston,  L. N. 1996. Mikrobiologi Kedokteran (Medical
Microbiology)/Jawetz, Melnick & Adelberg . Buku Kedokteran EGC. Jakarta.753 hlm. Bricknell,  I  and  Dalmo,  R.  A.  2005.
The  use  of  immunostimulants  in fish  larval  aquaculture.  Fish  & Shellfish  Immunology  19:457- 472.
Christybapita,  D.,  Divyagnanneswari and  Michael,  R.  D.  2007.  Oral administration  of Eclipta  alba leaf aqueous extract enhances the non-specific  immune  responses and disease resistance of Oreochromis  mossambicus .  Fish & Shellfish Immunology 23:840- 852. Citarasu, T. 2010. Herbal biomedicines:  a  new  opportunity for aquaculture industry. Aquacul Int 18:403-414. Divyagnaneswari,  M.,  Christybapita,
D.  and  Michael,  R.  D.  2007.
Enhancement of nonspecific immunity  and  disease  resistance in Oreochromis  mossambicus by Solanum  tribatum leaf  factions. Fish  &  Shellfish  Immunology 23:249-259.
Dügenci,  S.  K.,  Arda,  N.  and  Candan A.  Some  medicinal  plants  as immunostimulants  for  fish.  J.
Ethnopharmacology 88:99-106.
Galina, J., Yin, G., Ardo, L and Jeney,
Z. 2009. The use of immunostimulating  herbs  in  fish. An  overview  of  research.  Fish
Physiol Biochem 35:669-676.
Hugo,  W.  B.  1998.  Bacteria  -  Biology of Microorganisms. In : Hugo, W. B.  and  Russell,  A.  D  (eds), Pharmaceutical Microbiology.
Blackwell  Science.  Oxford.  p.  3- 34.
Ji, S.C., Takaoka, O., Jeong, G. S., Lee, S.  W.,  Ishimaru,  K.,  Seoka,  M
and  Takii,  K.  2007.  Dietary medicinal  herbs  improve  growth and  some  non-specific  immunity of  red  sea  bream Pagrus  major .
Fisheries Science 73:63-69. Khasanah,  A.N.,  2011.  Uji  Aktivitas Penangkap Radikal Ekstrak Etanol,  Fraksi-Fraksi  dari  Kulit Buah dan Biji Rambutan ( Nephelium  lappaceum L.) Serta Penetapan  Kadar  Fenolik  dan Flavonoid Totalnya . Skripsi. Universitas Muhammadiyah Surakarta. Magnadόttir, B. 2006. Innate immunity of  fish  (overview).  Fish  &
Shellfish  Immunology  20:137-
151.
Marston, A. and Hostettmann, K. 2006.
Separation  and  Quantification  of Flavonoid. In :  Andersen,  Ø.  M
and  Markham,  K.  R  (eds),
Flavonoids, Chemistry, Biochemistry  and  Applications. CRC-Taylor  &  Francis.  Florida.
p. 1-36.
Mousavi, S. M., Wilson, G., Raftos, D., Mirzargar,  S.  S.  and  Omidbiagi, R.  2011.  Antibacterial  activities of a new combination of essential oils  against  marine  bacteria. Aquacult Int 19:205-214. Parejo,  I.,  Viladomat,  F.,  Bastida,  J., Rosas-Romero, A., Saavedra, G.,
Murcia,  M.  A.,  Jiménez,  A.  M and Codina, C. 2003. Investigation  of  Bolivian  plant extracts for their radical scavenging activity and antioxidant activity. Life Sciences 73:1667-1681. Rao,  Y.  V.,  Das,  B.  K.,  Jyotyrmayee and  Chakrabarti,  R.  2006.  Effect of Achyranthes aspera on immunity  and  survival  rate  of Labeo rohita infected with
Aeromonas  hydrophila .  Fish  &
Shellfish  Immunology  20:263-
273.
Reyes-Becerril,  M.,  Tovar-Ramirez,
D.,  Ascencio-Valee,  F.,  Civera- Cerecedo,  R.,  Gracia-Lopez,  V and Barbosa-Solomieu, V. Effects  of  dietary  live  yeast Debaryomycetes  hansenii on  the immune    and  antioxidant  system in juvenile leopard grouper
Mycteroperca rosacea exposed to stress. Aquaculture 280:39-44. Sakai, M. 1999. Current research status of fish immunostimulants. Aquaculture 172:63-92. Soetjipto, H. 2008. Aktivitas Antibakteri  Minyak  Astiri  dan Toksisitas Ekstrak Bunga Legetan  ( Spilanthes  paniculata Wall.).  Berkala  Ilmiah  Biologi 2(7):53-59 Sivaram,  V.,  Babu,  M.  M.,  Immanuel, G.,  Murugadass,  S.,  Citarasu,  T. and  Marian,  M.  P.  2004.  Growth and immune response of juvenile greasy  groupers  ( Epinephelus tauvina ) fed wth herbal antibacterial active principle supplemented diets against Vibrio harveyi infections.  Aquaculture 237:9-20.
Tolo,  F. M.,  Rukunga, G. M., Muli, F. W.,  Njagi,  E.  N.  M.,  Njue,  W., Kumon,  K.,  Mungai,  G.  M., Muthaura,  C.  N.,  Muli,  J.  M., Keter,  L.K.,  Oishi,  E.  and  Kofi- Tsekpo,  M.  W.  2006.  Anti-viral activity  of  the  extracts  of  a Kenyan  medicinal  plant Carissa edulis agaist  herpes  simplex virus. J. Ethnopharmacology 104:92-99.
Vaseeharan, B., Prasad, G. S., Ramasamy,  P.  and  Brennan,  G. 2011.  Antibacterial  activity  of Allium sativum against multidrug-resistant Vibrio harveyi isolated  from  black  gill- diseased Fenneropenaeus indicus.
Aquacult Int 19:531-539.
Xue,  J.,  Xu,  Y.,  Jin,  L.,  Liu,  G.,  Sun, Y.,  Li,  S.  and  Zhang,  J.  2008. Effects  of  traditional  Chinese medicine on immune reponses in abalone, Haliotis  discus  hannai Ino. Fish & Shellfish Immunology 24:752-758. Yeh, S. P., Chang, C. A., Chang, C. Y., Liu,  C.  H.  and  Chen,  W.  2008. Dietary sodium alginate administration  effects  fingerling growth and resistance to Strepococcus sp.  and    iridovirus, and juvenile non-specific immune responses of the orange- spotted grouper, Epinephelus coioides . Fish & Shellfish
Immunology 25:19-27. Yin,  G.,  Ardό,  L.,  Thompson,  K.  D., Adams,  A.,  Jeney,  Z  and  Jeney, G. 2009. Chinese herbs ( Astragalus radix and Ganoderma  lucidum )  enhance immune reponse of carp,
Cyprinus  carpio ,  and  protection against Aeromonas  hydrophila . Fish  &  Shellfish  Immunology 26:140-145.
Yin,  G.,  Jeney,  G.,  Racz,  T.,  Jun,  P., Jeney,  Z.  2006.  Effects  of  two Chinese  herbs  ( Astragalus  radix and Scutellaria  radix )  on  non- specific  immune  reponse  of tilapia,  Oreochromis  niloticus. Aquaculture 253:39-47.