ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (2) (2010) : 41 – 45

## Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi
Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Uji Aktivitas Isolat L- Asparaginase Dari Rimpang Temulawak ( Curcuma xanthorrhiza Roxb ) Terhadap Sel Hela
Arthuro Romualdo a , Wuryanti a* , Suprihati b
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275 b ENT-HNS Department, Faculty of Medicine, Diponegoro University
* Corresponding author: wuryanti@live.undip.ac.id
Art ic le   Info

## Ab s t rac t
Keywords: Asparaginase ,
Curcuma xanthorrhiza Roxb ,
isolation, HeLa cell
L- asparaginase is  a  hydrolase  enzyme  that  catalyzes  the  hydrolysis  of  asparagine  into aspartic acid and ammonia. L- asparaginase is known to help treat cancer by inhibiting the synthesis of cancer cell proteins without damaging normal cells. Methods performed were enzyme  isolation  including  extraction,  fractionation  with  ammonium  sulphate; characterization by specific activity test and cytotoxicity test on HeLa cells. The highest specific  activity  of  ammonium  sulfate  isolate  L- asparaginase fraction  was  found  in  the fourth fraction of 22,639 units/mg. Furthermore, the fourth fraction was tested on HeLa cells in the cytotoxicity test. Based on the results of the cytotoxicity test, this isolate had inhibitory activity on the growth of HeLa cells with LC 50 value of 309.74 ppm.

## Ab s t rak
Kata kunci:
Asparaginase , temulawak, isolasi, HeLa
L- asparaginase adalah enzim hidrolase yang mengkatalisis hidrolisis asparagin menjadi asam  aspartat  dan  amonia.  L- asparaginase diketahui  membantu  pengobatan  kanker dengan menghambat sintetis protein sel kanker tanpa merusak sel normal. Metode yang dilakukan adalah isolasi enzim meliputi ekstraksi, fraksinasi dengan ammonium sulfat; karakterisasi dengan uji aktivitas spesifik dan uji sitotoksisitas pada sel HeLa. Aktivitas spesifik  tertinggi  isolat  L- asparaginase fraksi  amonium  sulfat  terdapat  pada  fraksi keempat  sebesar  22,639  unit/mg.  Selanjutnya  fraksi  keempat  diujikan  pada  sel  HeLa dalam uji sitotoksisitas. Berdasarkan hasil uji sitotoksisitas, isolat ini memiliki aktivitas penghambatan terhadap pertumbuhan sel HeLa dengan nilai LC 50 sebesar 309,74 ppm.

## 1. Pendahuluan
Penyakit  kanker  merupakan  penyebab  kematian nomor dua di dunia. Sampai saat ini, pengobatan modern yang  dilakukan  adalah  kemoterapi  dan  radiasi  sebagai ganti pembedahan. Kemoterapi dan radiasi menimbulkan efek samping yang dapat membahayakan bagi  penderita  kanker.  Memang  pada  stadium  dini, kemoterapi  dan  radiasi  memberikan  hasil  yang  efektif namun  pada  stadium  lanjut,  proses  ini  kurang bermanfaat atau bahkan dapat membahayakan penderita oleh  karena  pada  stadium  lanjut  sel  kanker menginvasi sel  sekitar  ( metastasis), maka  organ  yang  terkena langsung  ataupun  sekitarnya  dapat  terganggu  juga. Alasan  lain  adalah  karena  kemoterapi  menggunakan
senyawa  kimia  intensitas  tinggi  sehingga  dapat mengganggu sel normal dalam radius aktif dari senyawa obat.  Sehingga  dewasa  ini,  kemoterapi  dimodifikasi dengan menggunakan obat dari bahan-bahan alam yang dapat  meningkatkan  keampuhan  kemoterapi  namun menurunkan efek sampingnya. Indonesia adalah negara dengan  kekayaan  bahan  alam  melimpah,  termasuk rempah-rempah  seperti  jahe,  kunyit  dan  temulawak. Berdasarkan penelitian dari Qing-Long, 2002, diketahui bahwa  enzim  L- asparaginase dari  bakteri  E-Coli  dapat menghambat  pertumbuhan  sel  kanker  leukimia limfoblastik . Enzim L-asparaginae diketahui terkandung dalam  banyak  organisme,  meliputi:  bakteri  [1],  tubuh manusia  [2],  dan  tumbuhan  [3].  L- asparaginase
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (2) (2010) : 41 – 45
mengkatalisis hidrolisis L-asparagin menjadi L-aspartat dan  amonia.  Berdasarkan  referensi  yang  ada,  tidak banyak  penelitian  dalam  negeri  yang  mengembangkan khasiat  temulawak  sebagai  antikanker.  Penelitian  luar negeri juga belum ada yang menguji potensi antikanker L- asparaginase terhadap  sel  Hela.  Oleh  karena  itu, penelitian  ini  bertujuan  menguji  potensi  antikanker  L- asparaginase terhadap  sel  HeLa.  Sumber  enzim  yang digunakan  adalah  temulawak  ( Curcuma  xanthorrhiza Roxb ).  Secara  khusus,  penelitian  ini  bertujuan  untuk mengisolasi  enzim  L- asparaginase dari  temulawak, melakukan pemurnian terhadap isolat, menguji aktivitas spesifik  isolat  dan  isolat  dengan  aktivitas  spesifik tertinggi akan diujikan terhadap sel Hela.

## 2. Metodologi
Bahan. Temulawak,  BSA  ( Bovine  Serum  Albumin ),
TCA ( Trichloracetic
acid ), tris-hidroksimetil- aminometan, folin-ciocalteau ,  kalium-natrium  tartrat, L-asparagin ( Merck ), amonium sulfat, raksa(II) klorida, asam  klorida, natrium  karbonat, kalium  iodida, barium (II)  klorida,  natrium  hidroksida,  tembaga  (II)  sulfat, akuades,  sel  HeLa  yang  dibiakkan  oleh  LPPT  UGM, larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2, larutan dapar natrium fosfat (NaPO 42- ) 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14  M  NaCl,  medium  RPMI  1640  (Sigma),  FBS  ( Fetal Bovine  Serum )  10%  (v/v)  (Gibco),  larutan  MTT  dalam media  RPMI  (Sigma)  dan  kertas  saring  yang  semuanya berkualitas p.a
Alat. sentrifuge ( Centrific-228 ), inkubator ( Memmert ), blender  ( Philip ), neraca  analitik  ( Kern  870 ), pHmeter  ( Orain-420A ), magnetic  stirer ( Thermolyne Cimarec ),  kulkas  ( Sharp ),  botol  semprot,  pisau stainlessteel ,  alat-alat  kultur  sel,  spektrofotometer  UV- Vis  ( Shimadzu ),  gelas  beker,  tabung  reaksi,  labu  ukur, botol  vial,  corong  kaca,  mikropipet,  pipet  tetes,  kertas saring, pengaduk, laminar air flow , 96- well plate (Nunc), mikroskop fluoresen dan ELISA reader .
Isolasi Enzim L- asparaginase
Rimpang  temulawak  ( Curcuma  xanthorrhiza  Roxb ) sebanyak 1000 g dipotong kecil dan ditambahkan 500 mL buffer Tris-hidroksimetil-aminometan 0,2 M pH 8,6 dan dihaluskan dengan blender selama 20  menit. Campuran didiamkan  selama  1,5  jam  lalu  disaring.  Filtrat disentrifugasi  pada  3400  rpm  selama  10  menit.  Filtrat hasil proses sentrifugasi disebut ekstrak kasar (EK).

## Fraksinasi dengan Amonium Sulfat
Fraksinasi  enzim  dilakukan  dengan  menggunakan garam amonium sulfat dengan 5 tingkat kejenuhan, yaitu 0-20%  (F 1 ),  20-40%  (F 2 ),  40-60%  (F 3 ),  60-80%  (F 4 ), 80-100%  (F 5 ).  Amonium  sulfat  ditimbang  sesuai  fraksi yang  dikehendaki  agar  diperoleh  konsentrasi  yang diinginkan,  lalu  dimasukkan  ke  dalam  larutan  ekstrak kasar  (EK)  sedikit  demi  sedikit  sambil  diaduk  dengan magnetic stirer dalam penangas es. Campuran didiamkan selama  1  malam  dalam  lemari  es,  kemudian disentrifugasi pada 3500 rpm selama 50 menit. Endapan yang  diperoleh  dipisahkan  dari  filtrat  dan  disuspensi dalam  3  mL  buffer Tris-hidroksimetil-aminometan  0,2
M  pH  8,6.  Endapan  yang  disuspensi  tersebut  disebut Fraksi 1 (F 1 ). Filtrat hasil sentrifugasi didiamkan selama 1 malam  lalu  diproses  lagi  sesuai  prosedur  seperti  yang dilakukan sebelumnya untuk mendapatkan Fraksi 2 (F 2 ), Fraksi 3 (F 3 ), Fraksi 4 (F 4 ), Fraksi 5 (F 5 ).

## Dialisis dengan Membran Selofan
Selofan  yang  berisi  suspensi  endapan  fraksinasi direndam  dalam  bufer  Tris-hidroksimetil-aminometan 0,002  M  pH  =  8,6  pada  keadaan  dingin  dan  tiap  2  jam buffer  diganti  serta  diuji  kandungan  amonium  sulfat pada  larutan  perendam  dengan  larutan  BaCl 2 0,01  M hingga  tidak  terbentuk  endapan  putih.  Fraksi  yang diujikan pada sel kanker dikeringkan dengan Freeze dryer.

## Penentuan Unit Aktivitas Enzim
Sebanyak 6 tabung reaksi masing-masing diisi 1 mL larutan L-asparagin 0,1665 M ; 0,1 mL endapan suspensi (EK,  F 1 ,  F 2 ,  F 3 ,  F 4 ,  F 5 ),  dan  0,4  mL  bufer  Tris- hidroksimetil-aminometan  0,2  M  pH  =  8,6  diinkubasi pada  37 o C  selama  30  menit,  kemudian  ditambah  1  mL larutan  TCA  1,5  M  dan  disentrifugasi  pada  3400  rpm selama  15  menit  untuk  memisahkan  endapannya. Sebanyak  0,25  mL  filtrat  diambil  lalu  ditambah  dengan 4,25 mL akuades dan 0,5 mL pereaksi Nessler, absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis. Sebagai kontrol  adalah  0,1  mL  endapan  yang  disuspensi,  yang telah  dihilangkan  aktifitasnya  (dengan  dipanaskan), ditambah 0,4 mL bufer Tris-hidroksimetil-aminometan 0,2 M pH = 8,5 dan 0,5 mL larutan L-asparagin 0,1665 M. Aktivitas enzim ditentukan regresi linier terhadap kurva standar amonium sulfat.

## Penentuan Kadar Protein
Sebanyak 0,1 mL larutan protein hasil fraksinasi (EK, F 1 , F 2 , F 3 , F 4 , F 5 ) ditambah 2 mL Lowry C, diinkubasi pada 37°C  selama  30  menit  sambil  sesekali  dikocok. Selanjutnya ditambah 0,2 mL Lowry D dan diinkubasi 10 menit  pada  suhu  kamar  dengan  sesekali  dikocok, kemudian  diukur  absorbansinya.  Absorbansi  larutan diukur  pada  panjang  gelombang  optimum  BSA  dengan spektrofotometer  UV-Vis.  Kadar  protein  ditentukan regresi linier terhadap kurva standar BSA.

## Uji Aktivitas Hambat Isolat Terhadap Sel HeLa
Larutan uji yang telah dibuat disiapkan. Kultur hasil inisiasi dihomogenkan. Kontrol terdiri dari sel, medium RPMI, dan buffer natrium fosfat 5 Mm pH = 7,2. Blanko terdiri dari medium RPMI, buffer natrium fosfat 5 mM pH =  7,2.  Perlakuan  untuk  uji  toksisitas  terdiri  dari  sel, medium RPMI, buffer natrium fosfat 5 mM pH = 7,2 dan isolat  enzim  L- asparaginase .  Sampel  yang  diuji  adalah larutan yang dibuat dari serbuk hasil fraksinasi enzim L- asparaginase dengan  aktivitas  spesifik  tertinggi  pada beberapa variasi konsentrasi.

## Perhitungan Persen Kematian dengan Metode ELISA
Larutan  MTT  dimasukkan  kedalam  sumuran.  Sel yang hidup akan membentuk kristal formazan berwarna ungu  yang  intensitasnya  dapat  diukur  dengan  ELISA Reader.  Absorbansi  yang  terbaca  sebanding  dengan jumlah sel hidup.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (2) (2010) : 41 – 45 43

## Analisis Hasil
Sitotoksisitas  variasi  konsentrasi  sampel  enzim  L- asparaginase dianalisa  dengan  menghitung  prosentase kematian  sel  yang  diperoleh  dari  perhitungan menggunakan modifikasi rumus Abbot [4]:
Persen kematian= A-B A ×100%
Keterangan:
A = Nilai rata-rata absorbansi dari beberapa kontrol
B = Nilai rata-rata absorbansi dari beberapa perlakuan
Efek  toksisitas  dianalisis  dari  pengamatan  dengan persen  kematian.  Dengan  mengetahui  kematian  sel kanker, kemudian dicari angka probit melalui kurva dan dibuat persamaan garis :
Y = AX+ B
Y = Angka probit (50)
X = Nilai LC 50

## 3. Hasil dan Pembahasan
Isolasi Enzim L- asparaginase
Enzim L- asparaginase rimpang temulawak merupakan  enzim  ekstraseluler,  untuk  mengisolasinya diekstrak  dari  jaringan.  Ekstraksi  dilakukan  dengan dihaluskan  menggunakan  blender  dengan  buffer  yang sesuai  sebagai  pelarut.  Buffer  diperlukan  untuk mempertahankan  pH  optimum  enzim.  Buffer  yang digunakan  adalah  tris-  hidroksimetil  aminometan. Ekstraksi  menghasilkan  campuran  kuning  kecoklatan terdiri  dari  senyawa-senyawa  dan  komponen  sel  dari temulawak.  Untuk  mendapatkan  enzim,  dipisahkan antara  senyawa-senyawa  dan  komponen  sel  selain senyawa.  Pertama,  dilakukan  penyaringan  pada  untuk memisahkan  antara  bagian  padatan  dan  larutan. Langkah  selanjutnya  adalah  sentrifugasi.  Sentrifugasi bekerja  dengan  prinsip  pengendapan  berdasarkan  gaya sentrifugal.  Hasil  akhir  diperoleh  endapan  yang  berisi sisa-sisa  komponen  sel  dan  filtrat  yang  berisi  protein enzim dan protein non enzim.
Setelah disentrifugasi, dilakukan penyaringan untuk memisahkan  endapan  dan  filtrat.  Filtrat  hasil penyaringan disebut ekstrak kasar (EK). Salah satu cara pemurnian enzim adalah fraksinasi dengan menggunakan  garam.  Fraksinasi  dilakukan  bertingkat menggunakan  tingkat  kejenuhan  garam  yang  berbeda. Dari variasi konsentrasi garam, diperoleh beberapa fraksi protein. Fraksinasi bertujuan untuk memisahkan protein enzim asparaginase dengan  protein  lainnya.  Metode fraksinasi  berdasarkan  teori  bahwa  ada  pengaruh  dari jumlah  penambahan  garam  yang  berbeda  terhadap kelarutan protein dalam suatu larutan.
Penambahan  garam  ke  dalam  larutan  yang mengandung  protein  menyebabkan  kompetisi  antara garam  dan  protein  dalam  memperebutkan  air.  Garam akan  lebih  kuat  dalam  mengikat  air,  sehingga  protein akan  mengendap.  Penurunan  kelarutan  protein  akibat naiknya  konsentrasi  garam  yang  terjadi  pada  proses
fraksinasi ini disebut salting out . Garam yang digunakan garam  amonium  sulfat  karena  sebagian  besar  protein enzim  tahan  terhadap  garam  tersebut,  kelarutannya besar dalam air, mempunyai efek menstabilkan terhadap enzim dan mempunyai kekuatan ion yang lebih besar dari pada garam monovalen [5].
Proses fraksinasi dilakukan pada sebuah wadah yang diberikan es batu untuk menjaga suhu lingkungan untuk menghindari  denaturasi  protein.  Denaturasi  protein adalah kerusakan enzim oleh karena terputusnya ikatan- ikatan  yang  menunjang  struktur  dan  protein  [6]. Fraksinasi diikuti dengan sentrifugasi untuk memisahkan endapan dan filtrat ( supernatan ).
Suspensi  endapan  protein  hasil  fraksinasi  masih mengandung  amonium  sulfat,  maka  amonium  sulfat dipisahkan  dari  suspensi  dengan  dialisis  menggunakan membran  selofan  [7].  Proses  dialisis  dilakukan  dengan merendam  membran  selofan  berisi  fraksi  enzim  pada larutan  buffer  encer.  Untuk  mengidentifikasi  adanya amonium  sulfat  dilakukan  penambahan  Barium  klorida (BaCl 2 )  dengan  larutan  diambil  sedikit  lalu  diteteskan larutan  BaCl 2 .  Amonium  sulfat  akan  bereaksi  dengan BaCl 2 menghasilkan endapan BaSO 4 yang berwarna putih. Dialisis  dihentikan  apabila  penambahan  BaCl 2 dalam bufer  tidak  menimbulkan  endapan  putih.  Dengan demikian  diperoleh  enzim  L- asparaginase yang  bebas dari amonium sulfat. Enzim yang akan diujikan terhadap sel  kanker  dikeringkan  dengan  menggunakan freeze dryer .
Freeze dryer adalah alat untuk menghilangkan kadar air  dan  mengawetkan  suatu  senyawa.  Prinsip  kerja  dari freeze  dryer adalah  pembekuan  material  dengan pengurangan  tekanan  udara  dan  menambahkan  sedikit panas  untuk  membuat  air  beku  dalam  suatu  material menyublim  sehingga  didapat  serbuk  enzim  yang  tidak rusak.  Setelah freeze  dryer diperoleh  enzim  kering  yang akan  diujikan  pada  sel  HeLa.  Berdasarkan  hasil  uji aktivitas spesifik, fraksi keempatlah yang akan diujikan pada sel HeLa.

## Uji Aktivitas Spesifik Enzim
Enzim  L- asparaginase hasil  isolasi  ditentukan aktivitasnya  dengan  mereaksikan  enzim  tersebut menggunakan  substrat  yang  sesuai.  Substrat  yang digunakan  adalah  L-asparagin.  Enzim  L- asparaginase akan  mengkatalisis  reaksi  hidrolisis  L-asparagin menjadi L-aspartat dan amonia (NH 3 ).
Aktivitas  spesifik  enzim  L- asparaginase dihitung dari  unit  aktivitas  enzim  per  mg  protein.  Satu  unit aktivitas  enzim  L- asparaginase didefinisikan  sebagai kemampuan  enzim  yang membentuk  1  μmol  NH 4+ per menit  pada  kondisi  optimum  [8].  Aktivitas  enzim  L- asparaginase diukur  dari  amonia  yang  dihasilkan,  dan diuji dengan menggunakan pereaksi Nessler menghasilkan  senyawa  kompleks  berwarna  coklat kekuningan.  Warna  tersebut  diukur  absorbansinya dengan  spektro  UV-Vis  dan  absorbansi  yang  terukur kemudian diplotkan pada kurva standar amonium sulfat untuk mengetahui besarnya unit aktivitas yang terdapat pada  ekstrak  kasar  dan  tiap-tiap  fraksi  enzim.  Untuk
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (2) (2010) : 41 – 45
menentukan  nilai  aktivitas  spesifik  tidak  hanya dipengaruhi  oleh  unit  aktivitas  tetapi  juga  dipengaruhi oleh kadar protein suatu fraksi. Kadar protein pada tiap fraksi diukur dengan metode Lowry [8]. Pada metode ini, protein  akan  bereaksi  dengan  pereaksi  Lowry, menghasilkan  senyawa  kompleks  berwarna  biru  dan  di plotkan  pada  kurva  standar  BSA  dan  dapat  diukur absorbansinya  dengan  menggunakan  spektrofotometer UV-Vis.
Nilai  aktifitas  spesifik  diketahui  dari  pengukuran unit aktivitas dan kadar protein dari tiap fraksi. Besarnya aktifitas spesifik merupakan rasio dari unit aktivitas dan kadar protein.
Gambar 1 Grafik aktivitas spesifik L- asparaginase
Fraksi  dengan  unit  aktivitas  besar  belum  tentu aktivitas  spesifiknya  besar,  begitu  pula  fraksi  enzim dengan  kadar  protein  kecil  belum  tentu  aktivitas spesifiknya  besar.  Aktivitas  spesifik  ditentukan  oleh perbandingan unit aktivitas terhadap kadar protein.

## 3. Pengujian Terhadap Sel HeLa
Isolat  di  uji  pada  sel  HeLa  menggunakan  metode ELISA  ( Enzyme  Linked  Immunosorbent  Assay ).  Metode MTT  adalah  suatu  metode  standar  kolorimetri  untuk mengukur pertumbuhan sel. Metode ini dapat digunakan untuk menentukan toksisitas agen obat potensial.
Medium  yang  digunakan  sel  HeLa  adalah  RPMI. Ekstrak  yang  telah  divariasi  konsentrasi  diujikan terhadap sel HeLa pada sumuran (plate). Plate diinkubasi dalam  inkubator  CO 2 selama  24  jam  untuk  mengetahui aktivitasnya.  Sel  HeLa  memerlukan  bikarbonat  sebagai ion  bufer  untuk  mempertahankan  pH  pada  medium kultur.
Prinsip dari metode MTT adalah adanya pemecahan garam dimetiltiazol tetrazolium [3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-
tetrazolium bromida] oleh sistem enzim suksinat reduktase (suksinat dehidrogenase)  pada  mitokondria  sel  hidup  sehingga terbentuk kristal formazan berwarna ungu [9]. Semakin tinggi  intensitas  warna  ungu  berarti  sel  hidup  semakin banyak.  Intensitas  dibaca  dengan  ELISA Reader dan output  berupa  absorbansi . Semakin  banyak  kristal formazan  yang  terbentuk  maka  semakin  tinggi  nilai absorbansi  yang  diperolah  dan  mengindikasikan kematian yang rendah.
Reaksi  MTT  dihentikan  dengan  penambahan  10% SDS  ( Sodium  Dodecyl  Sulfate )  dalam  0,01N  HCl  yang berfungsi  melarutkan  kristal  formazan  yang  terbentuk. Pengukuran  dengan  ELISA Reader dilakukan  pada panjang  gelombang  550  nm  [10].  Absorbansi  yang terbaca sebanding dengan jumlah sel yang hidup.
Gambar 3. Foto Sel HeLa
Gambar 4. Sel+Ekstrak (telah mati)
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (2) (2010) : 41 – 45
Besarnya  penghambatan  oleh  L- asparaginase pada sel  HeLa  ditunjukkan  pada  uji  sitotoksisitas  oleh besarnya nilai LC 50 . Nilai LC 50 menunjukkan konsentrasi yang digunakan untuk membunuh 50 % dari populasi sel HeLa atau setengah dari jumlah sel HeLa mula-mula.
Tabel 1. Persen Kematian Sel Pada Variasi Konsentrasi Konsentrasi (ppm) Persen kematian (%) Log konsentrasi 1000 102.2 3 500 67.19 2.7 250 17.41 2.4 125 18.3 2.1 62.5 14.73 1.8 31.25 18.75 1.49 15.6 18.75 1.19 7.8 18.97 0.89 3.9 14.06 0.59 1.95 14.51 0.29
Gambar 5. Kurva Aktivitas Hambat Isolat L- asparaginase Terhadap Sel HeLa
Persamaan  regresi  linier yang  diperoleh  dari  grafik yaitu  y  =  23,048  x – 7,4271.  Persamaan  tersebut  untuk menghitung  nilai  LC 50 dengan  memasukkan  nilai  50 sebagai  y  sehingga  didapatkan  nilai  x.  Nilai  x menunjukan  nilai  log  dari  konsentrasi  dari  fraksi  ke-4 enzim  L- asparaginase .  Nilai  x  yang  menunjukkan konsentrasi  fraksi  ke-4  enzim  L- asparaginase adalah antilog 2,491 yaitu 309,74. Hal ini berarti kematian dari sel  HeLa  mencapai  50  %  dengan  adanya  penambahan enzim L- asparaginase dengan konsentrasi 309,74 ppm.

## 4. Kesimpulan
Enzim  L- asparaginase diisolasi  dari  rimpang temulawak ( Curcuma xanthorrhiza Roxb ). Isolat memiliki aktivitas  spesifik  tertinggi  pada  fraksi  ke-4  amonium sulfat  (kemurnian  60-80)  dengan  aktivitas  spesifik enzim sebesar 22, 639 unit/mg protein. Isolat fraksi ke-4 amonium  sulfat  memiliki  aktivitas  penghambatan  pada
pertumbuhan sel HeLa dengan nilai LC 50 sebesar 309, 74 ppm.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Qing-Long  Guo,  Min-Shu  Wu,  Zhen  Chen, Comparison  of  antitumor  effect  of  recombinant  L- asparaginase with wild type one in vitro and in vivo, Acta Pharmacologica Sinica, 23, 10, (2002) 946-951
[2] P. Konečná, B. Klejdus, H. Hrstková, Monitoring The Asparaginase  Levels  in  Children  with  Acute Lymphoblastic  Leukaemia  Treated  with  Different Asparaginase  Preparations,  Scripta  Medica,  (2004) 55-62
[3]  A.  A.  El-Bessoumy,  M.  Sarhan,  J.  Mansour, Production,  isolation,  and  purification  of  L- asparaginase  from  Pseudomonas  aeruginosa  50071 using solid-state fermentation, Journal of biochemistry  and  molecular  biology,  37,  4,  (2004) 387-393
[4]  B.  N.  Meyer,  N.  R.  Ferrigni,  J.  E.  Putnam,  L.  B. Jacobsen,  D.  E.  Nichols,  Jerry  L.  McLaughlin,  Brine shrimp:  a  convenient  general  bioassay  for  active plant constituents, Planta medica, 45, 05, (1982) 31- 34
[5]  Robert K. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd edition ed., Srpinger, Newyork, 1987.
[6]  Albert  L.  Lehninger,  Dasar-dasar  biokimia, Erlangga, Jakarta, 2000.
[7]  Felix  Franks, Characterization of  Proteins, Humana Press, 2007.
[8]  J.  H.  Paul,  Isolation  and  characterization  of  a Chlamydomonas L-asparaginase, Biochemical Journal, 203, 1, (1982) 109-115 http://dx.doi.org/10.1042/bj2030109
[9]  R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Aplication, Lissing, New York, 1986.
[10] T.  Mosmann,  Rapid  colorimetric  assay  for  cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity  assays,  Journal  of  immunological methods, 65, 1-2, (1983) 55-63
Kurva Log Konsentrasi vs % Kematian y = 23.048x - 7.4271 r = 0.4986 -20 0 20 40 60 80 100 120 0 1 2 3 4 Log Konsentrasi % K e m a ti a n Log Konsentrasi vs % Kematian Linear (Log
Konsentrasi vs % Kematian)