ANALISIS LIGNIN DAN STRUKTUR ANATOMI PLANLET TOMAT ( Lycopersicum esculentum

## MILL) HASIL SELEKSI ASAM SALISILAT SECARA IN VITRO
ANALYSIS OF LIGNIN AND ANATOMY STRUCTURE OF TOMATO PLANTLET ( Lycopersicum esculentum MILL) RESULTS IN VITRO SALICYLIC ACID SELECTION

## Endang Nurcahyani dan Lindawati
Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung
Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung Jl. Soemantri Brojonegoro No.1, Bandar Lampung, Lampung, Indonesia, 35145

## Abstrak
Kajian  tentang  seleksi  planlet  tomat  dengan  asam  salisilat  konsentrasi  0,  15,  30,  45,  dan  60  ppm secara in  vitro terhadap  struktur  anatomi  dan  lignifikasi,  telah  dilaksanakan  di  Laboratorium  Kultur Jaringan,  Jurusan  Biologi,  Fakultas  MIPA,Universitas  Lampung. Penelitian  ini  dilakukan  dari  bulan Juni  sampai  Agustus  2014.  Data  yang  diperoleh  selama  seleksi  dengan  asam  salisilat  berupa  data kualitatif dan data kuantitatif. Data kualitatif disajikan dalam bentuk deskriptif komparatif dan di dukung foto. Dalam penelitian ini digunakan rancangan acak lengkap dengan 6 ulangan. Analisis ragam dan uji  BNT  dilakukan  pada  taraf  nyata  5%. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  ketebalan  lignin  pada xilem  batang  planlet  tomat  yang  diimbas  asam  salisilat  pada  konsentrasi  15,  30,  dan  60  ppm  me- nunjukkan  ketebalan  yang  lebih  besar  dibandingkan  kontrol,  sedangkan  pada  konsentrasi  45  ppm ketebalannya  lebih  kecil  dibandingkan  kontrol. Struktur  anatomi  batang  planlet  tomat  yang  diimbas asam  salisilat  dibandingkan  dengan  kontrol  terdapat  perbedaan    pada  bagian  epidermis,  jari-jari empulur,  dan  kambium. Pada  epidermis,  jari-jari  empulur,  dan  kambium  batang  yang  diimbas  asam salisilat mengalami lignifikasi.
Kata kunci: planlet tomat, lignin, struktur anatomi, asam salisilat, in vitro .

## Abstract
Studies on the selection of tomato plantlets with salicylic acid concentrations of 0, 15, 30, 45, and 60 ppm  in  vitro  against  anatomical  structures  and  analysis  of lignin,  has  been  carried  out in  the  Tissue Culture  Laboratory,  Department  of    Biology,  Faculty  of  Math  and  Sciences,  University  of  Lampung. This research was conducted from June to August 2014. The data obtained during the selection with the salicylic acid in the form of quantitative and qualitative data. Qualitative data were presented in the form of comparative descriptive and supported the picturess. The study used a completely randomized design with six replications. Analysis of variance and LSD test was performed at 5% significance level. The results showed that the thickness of the lignin in the stem xylem tomato plantlets scanned salicylic acid  at  a  concentration  of  15,  30,  and  60  ppm  showed  a  greater  thickness  than  control  groups, whereas  at  concentrations  of  45  ppm  thickness  was  smaller  than  the  control.  Anatomical  structures stem  of  tomato  plantlets  were  scanned  salicylic  acid  compared  with  controls  andicated  some differences in the epidermis, the radius of the pith, and cambium. In the epidermis, the radius of the stem cambium pith and salicylic acid scanned underwent lignification (lignified). Keywords: tomato plantlets, lignin, anatomical structure, salicylic acid, in vitro .

## PENDAHULUAN
Tomat ( Lycopersicum esculentum Mill) merupakan  salah  satu  komoditas  hortikultura yang  memiliki  nilai  ekonomi  yang  tinggi  dan masih  memerlukan  penanganan  yang  serius dalam  hal  untuk  meningkatkan  hasil  dan kualitas  buah  tomat.    Produksi  tomat  di Indonesia  rata-rata  masih  rendah,  yaitu  6,3 ton/ha  apabila  dibandingkan  dengan  negara- negara seperti Taiwan, Saudi Arabia, dan India
dengan  hasil  produksinya  adalah  21  ton/ha, 13,4  ton/ha,  dan  9,5  ton/ha.    Salah  satu kendala  dari  rendahnya  produksi  tomat  yang ada  di  Indonesia  adalah  pemberantasan penyakit  yang  kurang  efisien  terhadap  infeksi mikroba patogen penyebab penyakit (Wasonowati , 2011).  Mikroba  patogen  yang sering  menyerang  tanaman  tomat  adalah Fusarium  oxysporum f.sp. lycopersici ( Fol ). Fol dapat menghambat pertumbuhan suatu
Vol. 2 No. 2 November 2014 : hal. 77-81 ISSN : 2338-4344
tanaman,  sehingga  perlu  adanya  pencegahan (Soesanto dan Rahayuniati, 2009).
Salah satu alternatif cara pengendalian penyakit  yang  efisien,  efektif,  dan  aman terhadap lingkungan, antara lain menggunakan varietas yang tahan atau resisten. Penggunaan varietas  unggul  yang  tahan  terhadap  penyakit dengan daya hasil tinggi merupakan salah satu alternatif  pengendalian  penyakit  yang  penting dan  tidak  menimbulkan  dampak  negatif  seperti penggunaan  pestisida  (Nurcahyani et  al ., 2012).    Pengembangan  kultivar  tahan Fol tersebut  dapat  dilakukan  antara  lain  dengan metode  seleksi in  vitro yaitu  mengkulturkan eksplan  berupa  jaringan  atau  organ  pada medium  yang  mengandung  asam  salisilat konsentrasi selektif (Suryanti, et al. , 2009).
Asam  salisilat  (AS)  merupakan  signal  penting dalam  ketahanan  tanaman,  digunakan  sebagai senyawa pengimbas ketahanan terhadap penyakit  layu Fusarium pada  tanaman  pisang (Suryanti, et al. , 2009), melon (Sujatmiko et al ., 2012),  jagung  (Hoerussalam et  al .,  2013). Ketahanan  terimbas  merupakan  ketahanan yang  terekspresi  setelah  patogen  menyerang (Huang,  2001).  Beberapa  parameter  dapat menggambarkan terjadinya
mekanisme ketahanan  tanaman  terhadap  infeksi  patogen antara lain peningkatan senyawa fenol, peningkatan enzim peroksidase termasuk kelompok Pathogenesis  Related-protein (PR- protein), dan adanya lignifikasi (Vidhyasekaran, 1997;  Agrawal et  al .,  1999;  Lea  &  Leegood, 1999).
Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  dan menganalisis  karakter  ekspresi  spesifik  planlet tomat  tahan  asam  salisilat  secara in  vitro meliputi  lignifikasi  dan  struktur  anatomi  nya. Planlet  tomat  yang  tahan  asam  salisilat nantinya  apabila  diregenerasikan menjadi tanaman dapat menghasilkan galur yang tahan terhadap infeksi Fol, dengan demikian diharapkan  akan  dapat  meningkatkan  kembali kualitas  dan  produksi  tanaman  tomat  di Indonesia.

## BAHAN dan METODE
Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium Kultur  Jaringan,  Jurusan  Biologi,  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam, Universitas  Lampung  dari  bulan  Juni  sampai Agustus 2014.
Persiapan medium tanam dan seleksi. Medium  yang  digunakan  adalah Murashige  & skoog (MS)  padat  dengan  penambahan  ZPT (Zat Pengatur Tumbuh) BAP 1 mg/L. Sterilisasi
medium  dengan  menggunakan  autoklaf  pada tekanan  17,5  psi,  121 0 C  selama  15  menit. Medium  MS  yang  sudah  disterilkan  kemudian ditambah asam salisilat (AS) dengan konsentrasi  0  ppm  (kontrol),  15  ppm,  30  ppm, 45  ppm,  dan  60  ppm.  Sebelum  digunakan, medium  ini  di  inkubasikan  selama  7  hari  pada suhu  kamar  (25 o C)  untuk  memastikan  bahwa asam  salisilat  telah  tersaring  dengan  baik. Apabila  dalam  waktu  7  hari  tidak  terjadi kontaminasi  pada  medium,  maka  medium dapat digunakan.

## Sterilisasi benih tomat yang akan ditanam
Benih  tomat  dicuci  dengan  aquades  dan dikocok,  lalu  dimasukkan  ke  dalam  larutan chlorox 10%  dikocok  selama  10  menit.  Benih dibilas  dengan  aquades.  Benih  kemudian ditanam  pada  medium  MS  yang  sudah ditambah  asam  salisilat  dan  BAP.  Penanaman benih  dilakukan  di  dalam  LAF Cabinet .  Setiap botol  kultur  ditanami  3  benih,  sehingga  total benih  yang  ditanam  sebanyak  150  dalam  50 botol kultur. Benih-benih tomat tersebut dikecambahkan  pada  medium  MS  sampai terbentuk  planlet.  Inkubasi  kultur  dilakukan pada  ruangan  dengan  penyinaran  ±  1000  lux, 24 jam/hari dan suhu ± 20 ºC.

## Analisis lignin
Pengamatan  lignifikasi  pada  irisan  melintang batang  planlet  tomat  menggunakan  metode Ruzin  (1999).    Planlet  tomat  dicabut  kemudian batangnya  dibersihkan  dari  sisa  agar.    Batang yang  sudah  bersih  difiksasi  dengan  cara direndam  dalam  FAA  dan  disimpan  selama  24 jam.  Batang selanjutnya dijepit dibagian tengah gabus,  dan  diiris  dengan sliding  microtom secara  melintang  dengan  ketebalan  5- 10  μm.
Potongan  irisan  melintang  direndam  dalam safranin  encer  (1%  w/v)  selama  1,5  jam, kemudian  dibilas  dengan  akuades.    Potongan batang  yang  telah  dibilas  direndam  dalam larutan  alkohol  konsentrasi  70%  selama  2-5 menit  kemudian  direndam  dalam  safranin  dan dikering-anginkan.  Sesudah  kering,  potongan batang  diletakkan  di  atas  gelas  preparat  dan ditutup  dengan  gelas  penutup.  Selanjutnya gelas  preparat  diamati  di  bawah  mikroskop dengan  perbesaran  400  kali.  Jaringan  batang yang terlignifikasi akan tampak berwarna merah muda.  Pengaruh  asam  salisilat,  selanjutnya dideteksi efeknya antara lain melalui pengukuran  ketebalan  lignin  pada  dinding xilem.  Pengukuran  ketebalan  lignin  dengan menggunakan mikrometer okuler.

## Analisis anatomi jaringan batang
Pembuatan preparat awetan penampang melintang  batang  planlet  tomat  menurut  Ruzin (1999). Batang planlet tomat difiksasi
menggunakan  larutan  alkohol  70%.  Setelah  itu
dilakukan  pengirisan  melintang  batang  dengan menggunakan sliding  microtom , ketebalan  20- 30  mikrometer.    Irisan  ditampung  dalam Petridish yang  diberi  alkohol  70%.    Lalu dilanjutkan pewarnaan dengan safranin 1% dan di  bilas  menggunakan  akuades,  kemudian ditambahkan  anilin  blue  dalam  alkohol  70% selama  24  jam.    Kemudian  preparat  diletakkan di  atas  gelas  benda,  ditutup  dengan  gelas penutup  yang  sebelumnya  diberi  balsam kanada.  Preparat  dikeringkan  di  atas hot  plate dengan  suhu  45  ºC  hingga  balsam  kanada mengering. Terakhir dilakukan pemberian nama disebelah kiri gelas penutup dengan melekatkan etiket yang diberi keterangan nama spesies.

## Rancangan Percobaan dan Analisis Data
Penelitian  dilaksanakan  dalam  rancangan  acak lengkap  dengan  5  perlakuan  dan  6  ulangan. Perlakuan  adalah  penambahan  asam  salisilat ke  dalam  medium  MS  ( Murashige  &  Skoog ) dengan    konsentrasi  0  ppm  (kontrol),  15  ppm, 30  ppm,  45  ppm,  dan  60  ppm.  Satuan percobaan  adalah  planlet  tomat  yang  ditanam pada medium MS. Data yang diperoleh selama seleksi  dengan  AS  berupa  data  kualitatif  dan data  kuantitatif.    Data  kualitatif  disajikan  dalam bentuk  deskriptif  komparatif  dan  didukung  foto. Data  kuantitatif  dari  setiap  parameter  dianalisis dengan menggunakan Analisis Ragam ( Analysis  of  Variance )  atau  Anova.    Analisis ragam  atau  anova  dilakukan  pada  taraf  nyata 5%  dan  uji  lanjut  dengan  uji  BNT    pada  taraf nyata 5%.

## HASIL dan PEMBAHASAN

## A. Lignifikasi
Parameter  yang  dapat  menunjukkan  terjadinya mekanisme  ketahanan  planlet  tomat  hasil pengimbasan  asam  salisilat  adalah  terjadinya lignifikasi  pada  jaringan  berkas  pengangkut. Penambahan  tebal  lignin  pada  dinding  xilem telah  di  amati  pada  batang  planlet  tomat  yang di imbas asam salisilat (konsentrasi 15 ppm, 30 ppm,  45  ppm,  dan  60  ppm)  dan  kontrol. Menurut Bouizgarne et al ., (2006), pembentukan  lignin  melibatkan  peran  enzim peroksidase.  Peroksida  merupakan  pendonor enzim  peroksidase  untuk  pembentukkan  lignin. Peroksida  yang  meningkat  akan  meningkatkan pula aktivitas enzim peroksidase yang berperan dalam pembentukan lignin.
Berdasarkan  pengamatan,  lignin  terbentuk hampir  pada  semua  perlakuan,  oleh  karena itu pengaruh  perlakuan  cekaman  asam  salisilat bisa  dideteksi  efeknya  melalui  pengukuran ketebalan lignin pada dinding xilem (Tabel 1).
Tabel 1.  Rata-rata ketebalan lignin (µm) pada xilem planlet tomat yang tidak diimbas (kontrol) dan diimbas asam salisilat (15, 30, 45, dan 60 ppm).
Perlakuan Rata –rata ketebalan lignin (µm) 0 ppm 3,33 ± 0.210 a 15 ppm 4,16 ± 0.166 b 30 ppm 4,00 ± 0.258 b 45 ppm 2,50  ± 0.255 c 60 ppm 4,66 ± 0.333 b
Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf  5%
Tabel  1  menunjukkan  adanya  peningkatan ketebalan  lignin  pada  dinding  sel  xilem  pada perlakuan  15  ppm,  30  ppm  dan  60  ppm dibandingkan kontrol, sedangkan pada konsentrasi  45  ppm  mengalami  penurunan dibandingkan  kontrol.    Hal  ini  menunjukkan bahwa  planlet  memberi  tanggapan  ketahanan melalui  penambahan  tebal  lignin  setelah diperlakukan  dengan  asam  salisilat.  Sistem ketahanan  tanaman  tergantung  pada  interaksi inang, patogen, dan lingkungan.
Lignifikasi  yang  terjadi  pada  dinding  epidermis akar  pada  penelitian    ini  didukung  oleh penelitian De Ascensao & Dubery (2000), yang mengutarakan  bahwa  lignifikasi  terjadi  pada dinding sel epidermis akar pisang yang diinfeksi Fusarium oxysporum f. sp. cubense .  Selain itu He et  al .,  (2002),  mengemukakan  bahwa kandungan  lignin  akar Asparagus officinals yang  resisten  mengalami  peningkatan  setelah di  inokulasi  dengan Fusarium  oxysporum f.  sp asparagi. Hammerschmidt  &  Dann  (1985) menyatakan  pula  bahwa  pada  dinding  sel epidermis daun mentimun ( Cucumis sativus L.), melon  ( Cucumis  melo L.)  dan  semangka ( Citrullus  vulgaris Schrad)  terjadi  lignifikasi setelah diinokulasi dengan spora jamur Colletotrichum lagenarium (Pass).

## B. Analisis Anatomi Jaringan Batang
Analisis  anatomi  jaringan  batang  dilakukan dengan  mengamati  perbedaan  anatomi  batang planlet tomat yang tahan terhadap pengimbasan  asam  salisilat  dan  kontrol. Berdasarkan  pengamatan,  struktur  anatomi batang  planlet  tomat  pada  umumnya  tersusun atas  epidermis,  korteks  dan  stele  (berkas vaskuler dan empulur). Berdasarkan pengamatan,  struktur  anatomi  batang  planlet tomat  tersusun  atas  epidermis,  korteks,  floem, kambium,  jari-jari  empulur,  xilem,  dan  empulur. Hasil pengamatan epidermis batang terdiri atas selapis  sel  dan  tersusun  rapat  tanpa  adanya ruang antar sel. Pada planlet tomat tahan asam salisilat , dinding  sel  epidermis  lebih  tebal  dari
79 /  Biologi Eksperimen dan Keanekaragaman Hayati                                                                                 Endang Nurcahyani
pada  kontrol,  demikian  pula  pada  jari-jari empulur dan kambiumnya (Gambar 1).
Menurut  Bouizgarne et  al .  (2006)  penambahan asam  salisilat  pada  konsentrasi  non-toksik mengakibatkan peningkatan dan  pengaktifan O 2 dan  H 2 O 2 .  Aktivitas  H 2 O 2 berhubungan  dengan peroksidase  dalam  pembentukan  lignin.  H 2 O 2
merupakan pendonor peroksidase untuk pembentukan  lignin.  Penampang  melintang anatomi batang tomat,  memperlihatkan struktur umum  penyusun  batang  tomat  dan  penebalan epidermis,  jari-jari  empulur  serta  kambium disajikan pada Gambar 1 dan 2.
Gambar 1. Penampang  melintang  anatomi  batang  planlet  tomat,  memperlihatkan  struktur  umum penyusun batang planlet. (kanan) Konsentrasi asam salisilat 0 ppm, (kiri) konsentrasi asam salisilat  60  ppm.  (Ep)  epidermis,  (em)  empulur,  (Fl)  Floem,  (JE)  jari-jari  empulur,  (kor) korteks, (kb) kambium, (xy) xylem.
Gambar 2. Penampang melintang anatomi batang planlet tomat yang menunjukkan   penebalan epidermis, jari-jari empulur dan kambium. A. berkas pengangkut konsentrasi 0 ppm, B. berkas pengangkut konsentrasi 60 ppm. (Ep) epidermis,  (kb) kambium, (JE) jari-jari empulur.

## KESIMPULAN
a.  Lignin  yang  terdapat  pada  xilem  batang planlet  tomat  yang  diimbas  asam  salisilat pada    konsentrasi  15,  30,  dan  60  ppm menunjukkan  ketebalan  yang  lebih  besar dibandingkan control.
b.  Analisis  anatomi  batang  planlet  tomat  yang diimbas  asam  salisilat  dengan  batang planlet  tomat  yang  tidak  diimbas  terdapat perbedaan    pada  bagian  epidermis,  jari-jari empulur,  dan  kambium.    Pada  epidermis, jari-jari  empulur  dan  kambium  batang  yang diimbas asam salisilat mengalami penebalan dibandingkan kontrol.

## DAFTAR PUSTAKA
Agrawal, A.A., S. Tuzun,S., and E. Bent.  1999. Induced Plant Defenses Againts Phatogens  and  Herbivores,  Biocemistry,
Ecology,  and  Agryculture .  APS  Press,  St. Paul. Minessota. 390p.
Bouizgarne,  B,  HEM.  Bouteau,  C.  Frankart,  D.
Reboutier,  K.  Madiona,  AM.  Pennarun,  M. Monestiez,  J.  Trouverie,  Z.  Amiar,  J. Briand, M. Brault, JP. Rona, Y. Ouhdouch, and EI. Hadrami. 2006. Early Physiological Responses of Arabidopsis thaliana Cells to Fusaric Acid : Toxic and Signallling Effects. New Phytologist 169: 209 – 218. kb JE 142 µm A Ep k b JE 142 µm B Ep ep em x y k b 250µm JE FL B ep em Xy k b 250 µm kor JE Fl Analisis Lignin dan Struktur Anatomi Planlet Tomat /  80
De  Ascensao,  A.  R.  D.  C.  F.,  and  I.A.  Dubery.
2000. Panama disease: Cell wall reinforcement in banana roots in response to elicitors from Fusarium oxysporum f. sp. cubense race fuor. Phytopathology
90:1173-1180. Hammerschimdt, R. & E.K. Dann. 2000.Induced  Resistance  to  Disease. Environmentally  Safe  Approach  to  Crop Disease  Control.    Chapter  8. Lewish Publishers, Boca Raton . 177-194. He  CY,  T.  Hsiang,  and  DJ.  Wolyn.  2002.
Induction  of  Systemic  Disease  Resistance and  Pathogen  Defence  Responses  in Asparagus officinalis Inoculated with Pathogenic Strains of Fusarium
oxysporum . Plant Pathology 51: 225-230 Hoerussalam , A.  Purwantoro,  dan  A.  Khaeruni. 2013. Induksi Ketahanan Tanaman Jagung ( Zea  Mays L.)  Terhadap  Penyakit  Bulai Melalui Seed Treatment Serta Pewarisannya  Pada  Generasi  S1. Ilmu Pertanian Vol. 16  : 42 – 59 . Huang,  J.S.    2001. Plant  Patogenesis  and Resistence,  Biochemisrty  and  Physiology of Plant-Microbe  Interactions .  Kluwer Academic Publisher. Dordrecht.
Lea,P.  and  R.C.  Leegood.  1999. Plant Biocemistry and moleculer Biology . 2 nd ed.
John Wiley & Sons Ltd. Chichester.364 p.
Nurcahyani  E,  I.  Sumardi,  B.  Hadisutrisno, dan E.  Suharyanto.    2012.    Penekanan
Perkembangan  Penyakit  Busuk  Batang Vanili  ( Fusarium  oxysporum f.  sp. vanillae )  Melalui  Seleksi  Asam  Fusarat Secara In  Vitro . J.  HPT  Tropika Vol.12 No.1: 12-22. Soesanto,L  dan  R.F.  Rahayuniati.    2009. Pengimbasan  Ketahanan  Bibit  Pisang Ambon  Terhadap  Penyakit  Layu  Fusarium dengan Beberapa Jamur Antagonis. J.HPT Tropika. Vol 9. No 2; pp 130-140. Sujatmiko,B.,  E.  Sulistyaningsih,  dan  H.R.
Murti.    2012.    Studi  Ketahanan  Melon ( Cucumis Melo L) Terhadap Layu Fusarium  Secara In-Vitro dan  Kaitannya Dengan Asam  Salisilat. Ilmu Pertanian Vol. 15 pp 1 -18.
Suryanti,  Y.D.  Chinta,  dan  D.  Sumardiyono.
2009.    Pengimbasan  Ketahanan  Pisang TerhadapPenyakit  Layu  Fusarium  Dengan Asam Salisilat In Vitro . Jurnal
Perlindungan Tanaman Indonesia 15(2): pp 90 –95 . Vidhyasekaran.P.    1997. Fungal  Pathogenisis in Plants and Crops, Molecular Biology and Host  Defense  Mechanism .    Marcell
Dekker. New York.  553p. Wasonowati, C. 2011. Menigkatkan pertumbuhan tanaman tomat (
Lycopersicum  esculentum Mill)  dengan sistem  budidaya  hidroponik. Agrovigor volume 4. pp 21-28.