Kebiasaan Konsumsi Fast Food terhadap Obesitas...

## EKSTRAK ETHANOL PEGAGAN (Centella asiatica) MENINGKATKAN
OSIFIKASI TULANG DAN PANJANG BADAN LARVA ZEBRAFISH  (Danio rerio) MODEL STUNTING USIA 9 HARI PASCA FERTILISASI (Ethanolic extract of Centella asiatica increase bone ossification and increase the body length and in zebrafish (Danio rario) larvae Stunting Model at 9 day post fertilization)
Evi Zahara 1 * , Een Nuraenah 2 , Tri Yuliyani 3 , Darwitri 4 , Husnul Khotimah 5 , Umi Kalsum 5 , I Wayan Arsana Wiyasa 5 , Nurlaili Ramli 6 , Agus Hendra Al-Rahmad 7 , Mohammad Muljohadi Ali 5
1 Program Studi D-III Kebidanan Meulaboh, politeknik Kesehatan Kemenkes, Aceh, Indonesia. Email: zaharaevi@yahoo.com
2 Program Studi D-III Kebidanan politeknik Kesehatan Kemenkes, Jakarta III,. Indonesia, enadha.nuraenah@gmail.com .
3 Dinas Kesehatan Banjar, Kalimantan Selatan, Indonesia, Email: yuliyani1907@gmail.com 4 Program Studi D-III Kebidana politeknik Kesehatan Kemenkes, Tanjungpinang, Indonesia, dwitri84@gmail.com 5 Department Farmakologi, Fakultas Kedokteran. Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia. Email: husnul_farmako.fk@ub.ac.id
5 Departement of Obstetric and Gynecology, Saiful Anwar Hospital, Fakultas Kedokteran. Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia. Email ; arsanawaiyasa@gmail.com .
6 Program Studi D-IV Kebidanan politeknik Kesehatan Kemenkes, Aceh, Indonesia. Email: nurlaili.ramli@poltekkesaceh.ac.id
7 Jurusan Gizi Politeknik Kesehatan Kemenkes, Aceh, Indonesia. Email: 4605.ah@gmail.com
Received: 29/6/2018                       Accepted: 31/10/2018                       Published online: 29/11/2018

## ABSTRAK
Centella  asiatica  (Linn)  Urban  dikenal  dengan  nama pegagan. Centella Asiatica (CA) kaya akan mikro maupun makro nutrisi yang diperlukan bagi tubuh terutama masa pertumbuhan.  Penelitian  ini  bertujuan  mengetahui  efek ekstrak etanol  CA  terhadap  osifikasi  tulang  dan panjang badan  larva  zebrafish  model  stunting  yang  diinduksi rotenone  pada  9  hari  post  fertilisasi.  Penelitian  ini menggunakan  zebrafish  mulai  2  hpf  (hour  post fertilisation) - 9 dpf (day post fertilisation), populasi larva sejumlah  300  yang  dibagi  5  kelompok  yang  terdiri  dari kelompok  kontrol,  kelompok  rotenon  (dipapar  rotenone 12,5  ppb)  dan  3  kelompok  rotenone+CA  yang  diberikan pegagan selama 4, 5 dan 6 hari secara berurutan. Ekstrak CA  diperoleh  melalui    metode  maserasi  dengan  pelarut etanol.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  rotenone dapat menghambat pertumbuhan panjang larva >2SD dan menurunkan  osifikasi  tulang  pada  kelompok  rotenon secara  signifikan  dibanding  kontrol.  Pemberian  ekstrak CA dapat meningkatkan ekspresi tulang rawan kelompok rotenone+CA5 maupun rotenone+CA6 dan meningkatkan ekspresi  tulang  keras  kelompok  rotenone+CA5  serta meningkatkan  panjang  badan  kelompok  rotenone_CA secara  signifikan  dibanding  kelompok  rotenone.  Dapat disimpulkan bahwa lamanya pemberian ekstrak CA dapat meningkatkan osifikasi tulang dan meningkatkan panjang badan mencapai 99.6% pada 9 dpf
Kata kunci:   Zebrafish,  Centella  asiatica,  osifikasi tulang, panjang badan.
* Penulis untuk korespondensi: zaharaevi@yahoo.com

## ABSTRACT
Centella  asiatica  (Linn)  Urban  is  known  as  Gotu  Kola. Centella  asiatica  (CA)  is  rich  of  micro  and  macro nutrients. The aim of this study was to investigate the effect of  ethanol  extract  of  CA  on  bone  ossification  and  body length in zebrafish larva stunting model at 9 dpf. This study used zebrafish at 2 hpf (hour post-fertilization) - 9 dpf (day post  fertilization).  The  population  of  300  larvae  divided into 5 groups consisting of control group, rotenone group (exposed  by  12.5  ppb  of  rotenone)  and  3  rotenone+CA groups  that  exposed  to  CA  extract  for  4,  5  and  6  days, respectively. The CA extract  was obtained by maceration method  with  ethanol  solvent.  The  results  showed  that rotenone  12,5  ppb  able  to  inhibit  the  growth  of  larvae >2SD  of  body  length  and  decrease  bone  ossificatio  at rotenone  group, were  significantly  different  from  the control group. Administration of CA extract was increase expression  of  cartilage  at  rotenone+CA5  as  well rotenone+CA6 group and increase expression of bone at rotenone+CA5  group  and  also  increase  body  length rotenone+CA groups significantty different from rotenone group.  It can be concluded that the  period of  CA extract exposured  can  correct  the  length  of  the  body  reaching 99.6%  at  9  dpf  and  increased  bone  ossification  in  time dependent manner.
Keywords:    Zebrafish, Centella asiatica, bone ossification, body length.
P-ISSN : 2527-3310 E-ISSN : 2548-5741 Jurnal AcTion: Aceh Nutrition Journal, Nopember 2018 (3)2: 95-102 doi: 10.30867/action.v3i2.87

## PENDAHULUAN
Stunting merupakan suatu keadaan dimana panjang  atau  tinggi  badan  melebihi  -2  SD  dari rata-rata anak pada usia dan jenis kelamin yang sama. 1 Stunting diidentifikasikan sebagai prioritas utama kesehatan global karena kejadian stunting yang tinggi. 2 Tingginya prevalensi anak stunting  (37.2%)  membuat  Indonesia  masuk dalam  lima  besar  di  dunia. 3 Kematian  anak secara global mencapai 14-17% akibat stunting. 4 Dampak    stunting  jangka  panjang    meliputi keterbatasan kognitif dan  performa pendidikan 5 produktifitas ekonomi dewasa yang lebih rendah dan  resiko  mewarisi  stunting  pada  generasi selanjutnya. 6 Proses stunting sudah dimulai sejak masa pranatal dan diketahui pada usia 2 tahun. 7
Stunting  bisa  disebabkan  karena  toksikan, inflamasi,  malnutrisi,  infeksi  berkelanjutan  dan faktor lingkungan. 8
Pertumbuhan panjang badan erat kaitannya  dengan  osifikasi  tulang  yang  sedang berlangsung.  Osifikasi  merupakan  merupakan proses  pembentukan  tulang.  Dimana  sel masenkim  dan  kartilago  diubah  menjadi  tulang selama  perkembangan.  Pertumbuhan  tulang rawan  dibutuhkan  untuk  penambahan  panjang tulang  panjang,  selanjutnya  tulang  rawan  ini akan digantikan oleh sel- sel tulang pembentuk tulang  ( osteoblast ). 9 Osteoblast  selanjutnya menjadi  osteosit  (sel tulang  matang  pembentuk tulang)  yang  tertanam  kuat  pada  matriks tulang. 10
Penggunaan  pestisida  sebagai  salah  satu faktor  lingkungan  dapat  memicu  terjadinya stunting.  Rotenone  merupakan  salah  satu pestisida  dengan  konsentrasi  12,5  ppb  mampu menginduksi stunting. 11 Rotenon bekerja menghambat  kompleks  I  mitokondria  dan menghambat  proses  sintesis  ATP  sehingga jumlah ATP menurun dan memicu peningkatan Reactive  Oxygen  Species (ROS)  yang  dapat menyebabkan kematian sel dan bahaya oksidatif lainnya. 12 Stres  oksidatif  dapat  meningkatkan osteoklastogenesis oleh RANKL yang selanjutnya  menghambat  diferensiasi  osteoblast yang  berdampak  pada  hambatan  pertumbuhan tulang. 13
Centella asiatica (CA) merupakan tumbuhan yang kaya akan nutrisi. Zat gizi makro yang  terkandung  dalam  CA  berupa  karbohidrat
sebesar  6.7%,  protein  2  %  dan  lemak  0.2%. 14 Adapun kandungan zat gizi mikro dari 100 g CA adalah Na 107.8mg, K 345 mg, Ca 174 mg Mg 87  mg,  P  17  mg  dan  Fe  14.86  mg. 14 Centella asiatica juga  kaya  akan fitonutrient berupa vitamin  A  sebanyak  0.44  mg,  B1  0.09  mg,  B2 0.19  mg,  B3  0.1  mg  dan  vitamin  C  48.5  mg. 15 Selain  nutrisi  CA  juga  memiliki  kandungan bahan  aktif  penting  berupa  saponin  dan triterpenoid yang meliputi: asiaticosida, madekasosida, asiatic asid dan cetelloside yang dapat berperan sebagai anti oksidan. 16 Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa dengan pemberian ekstrak CA konsentrasi 5  g/mL pre- hatching paling  optimal  meningkatkan  panjang badan  larva zebrafish dibanding  konsentrasi 1,25  g/mL maupun 2,5  g/mL melalui peningkatan ekspresi IGF-1 dan IRS, 19 peningkatan  osifikasi  tulang  dan  penurunan ekspresi RANKL. 11
Berdasarkan uraian diatas maka penelitian ini  dilakukan  untuk  mengetahui  efek  ekstrak etanol Centella  asiatica pre sampai post hatching terhadap  osifikasi  tulang  dan  panjang badan  larva zebrafish stunting  usia  9  dpf  yang diinduksi rotenon.

## METODE
Penelitian ini adalah true  experimental laboratoric menggunakan  desain post  test  only control group .

## 1.  Subjek Penelitian
Penelitian ini  menggunakan embrio zebrafish ( Danio  rerio )  usia  2  hpf  yang selanjutnya  diikuti  perkembangannya  sampai usia  9  dpf  yang  diperoleh  dari  hasil  fertilisasi zebrafish  dewasa wild  type. Zebrafish  dewasa diperoleh dari laboratorium Farmakologi Fakultas  Kedokteran  Universitas  Brawijaya (FKUB) Malang yang telah diuji dan tersertifikasi di laboratorium Hidrologi Fakultas Perikanan Universitas Brawijaya. 18

## 2.  Persiapan ekstrak etanol Centella asiatica
Simplicia Centella  asiatica tersertifikasi oleh  UPT  Materia  Medica  Batu,  Malang,  Jawa Timur,  Indonesia.  Salah  satu  zat  aktif  yang
terkandung  dalam  CA  adalah Asiaticoside
0,29%.  Pengukuran Asiticoside menggunakan LC-MS ( Liquid Chromatography-Mass
Spectrometry )  (Thermo  Scientific,  Accela). Bagian CA yang digunakan dalam penelitian ini adalah  daun  tanpa  stolon  dan  akar. 18 Ekstraksi dilakukan  dengan  cara  maserasi  100  gram simplicia  CA  diperoleh  ekstrak  CA  sebanyak 10.99  gram.  Ekatrak  CA  dilarutkan  dengan embrionik  medium.  Larutan  ekstrak  etanol  CA yang digunakan dalam penelitian ini adalah 5 μg / mL.

## 3.  Pembuatan larutan rotenone
Rotenon  yang  digunakan  berasal  dari sigma  (R8875)  kemurniannya  >  95%.  Serbuk rotenon  dilarutkan  dalam  DMSO  sebagai  stok dengan  konsentrasi  2  x  10 7 μg/L,  selanjutnya diencerkan  sampai  mencapai  12,5  ppb  dengan embrionic medium. 18

## 4.  Embrionic Medium
Larutan stok embrionik medium disiapkan dalam 200 ml terkandung 0,08 g CaCl, KCl 0,06 g, NaCl 2 g, MgSO4 0,815 g (modifikasi penelitian terdahulu). 19

## 5.  Perlakuan Penelitian
Dalam penelitian ini, larva zebrafish dari 2 hpf dibagi menjadi 5 kelompok dengan masing- masing  kelompok  berisi  60  embrio  yang ditempatkan di well plate, sehingga total sampel adalah 300 embrio.
Larva zebrafish di bagi dalam 5 kelompok yaitu:
a. Kontrol  (K)  larva  yang  tidak  diberikan  paparan rotenon dan Centella asiatica.
b. Rotenon  (R)  yang  hanya  diberikan  paparan rotenone konsentrasi 12,5 ppb usia 2 – 72 hpf.
c. Rotenon+CA4    adalah  sampel  yang  diberikan paparan  rotenone  12,5  ppb  usia  2  –  72  hpf  dan ditambah  pemberian  larutan  ekstrak  etanol Centella asiatica dosis 5  g/ml usia 2 hpf – 4 dpf. d. Rotenon+CA5    adalah  sampel  yang  diberikan paparan  rotenone  pada  usia  2  hpf  –  72  hpf  dan ditambah  pemberian  larutan  ekstrak Centella dosis 5  g/ml pada usia 2 hpf – 5 dpf.
e. Rotenon+CA6    adalah  sampel  yang  diberikan paparan  rotenone  pada  usia  2  hpf  –  72  hpf  dan
ditambah  pemberian  larutan  ekstrak  etanol Centella dosis 5  g/ml usia 2 hpf – 6 dpf.

## 6.  Pengukuran Panjang Badan
Pengukuran  panjang  badan  dilakukan setiap 24 jam pada usia 3 sampai 9 dpf, dengan cara  menempatkan  larva zebrafish pada  objek glass  dengan  air  minimal,  posisi  larva  diatur sedemikian rupa dan diamati dengan mikroskop stereo  (Olympus  SZ61)  selanjutnya  difoto mengunakan software optilab    versi  2.2.1  dan mengukur Standar  Leght (SL)  menggunakan skala  pada  software  immage  Raster  ver.3  yang sudah  dikalibrasi  sebelumnya.  Pengukuran panjang badan larva mulai dari ujung hidung (tip of the snout) sampai pangkal sirip ekor (caudal fin) atau snout-fin . 20 Pengukuran  rasio  panjang kepala dan panjang badan larva zebrafish yaitu, dari snout-operkulum dan dibandingkan dengan hasil  pengukuran  keseluruhan  panjang  larva (ujung hidung ke pangkal sirip ekor) pengukuran menggunakan satuan mm (milimeter). 19

## 7.  Pengukuran Osifikasi Tulang
Pengukuran tulang larva zebrafish dilakukan pada usia 9 dpf dengan metode whole- mount immunohistochemistry .  Larva  yang telah di-euthanasia  ditempatkan  dalam  PFA  4% selama 2 jam. 21 Jumlah sampel untuk pewarnaan ini  adalah  5 zebrafish untuk  masing-masing kelompok.

## a. Tulang Rawan
Pewarnaan  tulang  rawan  menggunakan larutan Alcian  blue (ANC030  dari  ScyTek Laboratories).  Prosedur  pewarnaan Alcian  Blue mengikuti  protokol  kerja  ScyTek  Laboratories. Larva  diinkubasi  dalam  larutan  Asam  Asetat selama  3  menit  dan  dalam  larutan  Alcian  Blue (pH 2,5) selama 30 menit pada suhu kamar atau 15  menit  pada  37°  C.  Larva  dibilas  selama  2 menit  dengan  aquadest  sebanyak  2  kali. Dehidrasi  dengan  alkohol  tergradasi  kemudian ditempankan  ke  87%  gliserol  dan  dilakukan pengambilan gambar.

## b. Tulang Keras
Pewarnaan  tulang  keras  menggunakan Alizarin  red (Art  6279  Alizarinrot  S)  1  mg/ml. Protokol  pewarnaan Alizarin  red adalah  larva
zebrafish tetap  dalam  alkohol  96%  selama  12 jam,  direndam  larva  dalam  aquadest  selama  1 malam,  kemudian  dalam  1%  KOH  dengan  3% hidrogen peroksida (5 ml 3% H2O2 + 100 ml 1% KOH)  untuk  15  menit.  Larva  dicuci  selama  10 menit  dalam  air  suling,  kemudian  direndam dalam  larutan Alizarin  red 1  mg  /  ml  (0,005%) selama  3  hari,  dan  dibilas  5x  dengan  aquadest dan  kemudian  ditempankan  ke  87%  gliserol selanjutnya  dapat  diamati  kepadatan  warna tulang.
Hasil pewarnaan Alcian Blue dan Alizarin Red diamati  di  bawah  mikroskop  stereo (Olympus SZ61). Pengambilan gambar menggunakan  DSLR  Panasonic  DMC-G6 Lumix pembesaran 40x. Pengukuran kepadatan warna (Integrated Density) menggunakan perangkat lunak Image J v1.50.

## 8. Ethical clearance
Prosedur dalam penelitian ini telah memenuhi  standar  protokol  Komite  Etika Kedokteran  Universitas  Brawijaya  Malang Indonesia nomor 403 / EC / KEPK / 12/2017.

## 9.  Analisis statistik
Analisis  statistik  menggunakan  software SPSS  V.23. Untuk mengetahui perbedaan antar kelompok  digunakan  uji  One  Way  ANOVA. Data disajikan dalam mean ± standar deviasi dan dianggap signifikan jika p <0,05.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## 1.  Efek  Ekstrak  Centella  asiatica  terhadap Osifikasi Tulang
Hasil  menunjukkan  bahwa  kelompok rotenon  mengalami  penurunan  ekspresi  tulang rawan  dan  tulang  keras  secara  signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol  yang di ukur  pada  usia  9  dpf  seperti  ditunjukkan  pada tabel 1 dan gambar 1.
Hasil  penelitian  ini  juga  didukung  oleh penelitian  sebelumya  dimana  rotenon  12,5  ppb telah  terbukti  menyebabkan  stunting  dengan menurunkan  IGF-1, 17 penurunan  osifikasi tulang. 11 Rotenon dapat menghambat kompleks I  mitokondria  dan  menghambat  NADH- ubiquinone  reduktase.  Proses  ini  menyebabkan
peningkatan ROS berlebih 22 mengganggu sintesa ATP tulang rawan, 23 menyebabkan peningkatan apoptosis. 24,25 ROS  yang  berlebihan  di  dalam tubuh  menyebabkan  ketidakseimbangan  antar pro-oksidan dan antioksidan dengan skala yang mengarah ke kelebihan pro-oksidan sebagai ciri terjadinya  stres  oksidatif. 26 Beberapa  penelitian lainnya melaporkan dampak stres oksidatif pada diferensiasi osteoklas serta pada fungsinya yang menghasilkan  peningkatan  resorpsi  tulang. 27 Penelitian in vitro dan hewan telah menunjukkan bahwa  stres  oksidatif  mengurangi  tingkat pembentukan tulang dengan mengurangi diferensiasi dan kelangsungan hidup osteoblas. 28 Apoptosis  bone  lining  cells yang  tinggi berpengaruh  terhadap  proses    pembentukan tulang  baru. 24 Peningkatan  status  oksidatif menyebabkan  up-regulasi  RANKL  dan  dan down-regulasi  osteoprotegrin  (OPG)  melalui aktivasi protein kinase (ERK1 /2, JNK dll) dan atau  faktor  lain  yang  mempengaruhi  faktor transkripsi  spesifik. 29 RANKL  mengaktifkan diferensiasi  dan  aktifitas  osteoclast  yang berinteraksi  dengan  reseptor  spesifik  di pre- osteoclast dan memediasi osteclastogenesis serta resorpsi tulang. Sedangkan OPG diproduksi oleh jalur  pensinyalan  WNT/ β catenin  merupakan soluble  reseptor  yang  mampu  mengikat  dan memblokir  RANKL  yang  dapat  menghambat aktivitas osteoclast. 30
Pemberian  ekstrak  etanol  CA  5µg/mL pada kelompok rotenon+CA5 dan  rotenon+CA6 meningkatkan ekspresi tulang rawan dan tulang keras secara signifikan pada larva zebrafish usia 9 dpf dibanding kelompok rotenon seperti yang ditunjukkan pada tabel 2. Dari pewarnaan tulang rawan  dan  tulang  keras  larva zebrafish 9  dpf menunjukkan ekspresi  tulang  rawan  dan tulang keras  lebih  kuat  pada  kelompok  rotenon+CA5 dan rotenon+CA6 dibanding kelompok rotenon seperti pada gambar 2.
Centella asiatica dengan kandungan bahan aktif Asiaticoside berperan sebagai anti oksidan. Anti  oksidan  dapat  menangkal  oksidan, berkontribusi mengaktifkan diferensiasi osteoblas,  proses  mineralisasi  dan  pengurangan aktifitas osteoklas. 31 Bukti epidemiologis mengindikasikan  adanya  hubungan  asupan  diet antioksidan dengan  kesehatan tulang. 31 CA juga kaya zat mineral seperti Zn, Ca, P, K, Na, Fe, Cu,
Cr dan Mg. 25 Studi lainnya menyebutkan bahwa diet  tinggi  calcium  memainkan  peran  dalam pembentukan tulang dengan merangsang proliferasi  dan  diferensiasi  osteoblast. 32 Mg dapat meningkatkan proliferasi dan rediferensiasi chondrocyte dan  diferensiasi osteogenik  osteoblas. 33 Dengan  demikian  CA yang  mengandung  bahan  aktif  dan  nutrisi  yang tinggi  dapat  menjadi  alternatif  pilihan  herba yang dimanfaatkan untuk mencegah stunting.
Gambar 1. Representatif whole-mount staining tulang rawan dan tulang keras larva Zebrafish  usia 9 dpf

## Tabel 1. Efek lama pemberian ekstrak etanol Centella asiatica terhadap osifikasi tulang
Kelompok Ekspresi Tulang Rawan Ekspresi Tulang Keras Mean ± SD (x10 7 ) Mean ± SD (x10 7 ) Kontrol 51,1 ± 0,29 b 3,35 ±0,38 b Rotenon 45,9 ± 0,56 a 2,80 ±0,53 a Rotenon+ CA4 46,3 ± 0,27 a 3,17 ±0,28 ab Rotenon+ CA5 51,7 ± 0,55 b 3,43 ±0,50 b Rotenon+ CA5 50,4 ± 0,54 b 3 ±0,44 ab

## 2.  Efek  Ekstrak  Centella  asiatica  terhadap Panjang Badan
Rerata panjang badan larva zebrafish usia 3  dpf  menunjukkan  tidak  ada  perbedaan signifikan  antar  kelompok  (p<0,05)  dan
perbedaan  panjang  badan  antar  kelompok  tidak mencapai  2  SD.  Sedangkan  pada  6  dpf menunjukkan  perbedaan  yang  signifikan  antar kelompok  (p  <0,05)  seperti  yang  ditunjukkan pada  tabel  1.  Rerata  panjang  badan  kelompok rotenon  usia 6 dpf <-2 SD (0,17) dibandingkan dengan kontrol  (SD=0,08).

## Tabel 1. Rerata Panjang Badan Larva Zebrafish
Kelompok 3 dpf 6 dpf 9 dpf Kontrol 3,4 ± 0,08 3,76 ± 0,07 b 3,79 ± 0,08 b Rotenon 3,36 ± 0,08  3,59 ± 0,09 a 3,64 ± 0,07 a Rotenon+CA4 3,4 ± 0,06 3,73 ± 0,06 b 3,77 ± 0,09 b Rotenon+CA5 3,39 ± 0,07  3,76 ± 0,07 b 3,79 ± 0,06 b Rotenon+CA6 3,39 ± 0,06  3,74 ± 0,08 b 3,76 ± 0,08 b
Paparan  rotenon  konsentrasi  12,5  ppb  dan  CA 5  g/ml . CA4 paparan CA selama 4 hari, CA 5 selama 5 hari dan CA6  selama  6  hari.  Notasi  yang  berbeda  ( a dan b ) menunjukkan  adanya  perbedaan  yang  signifikan  antar kelompok (  = 0,05).

## Gambar 1. Grafik pertumbuhan panjang tubuh larva zebrafish
Kriteria  stunting  pada  anak  dapat  di tentukan apa bila z-score <-2 SD pada kelompok umur  dan  jenis  kelamin  yang  sama.  Standar antropometri anak di Indonesia didasarkan pada indeks  panjang  badan  menurut  umur. 34 Pada penelitian  ini  analogi  usia zebrafish mengacu pada  penelitian  Soribes,  (2013)  dimana  3  dpf pada zebrafish setara  dengan  bayi  baru  lahir,  6 dpf  setara  dengan  usia  2  tahun  dan  9  dpf zebrafish setara  dengan  usia  8  tahun  pada manusia. 35 Berdasarkan  hal  tersebut  maka kelompok  rotenon  memenuhi  kriteria  stunting.
3,10 3,20 3,30 3,40 3,50 3,60 3,70 3,80 3,90 3 dpf 4 dpf 5 dpf 6 dpf 7 dpf 8 dpf 9 dpf Kontrol Rotenon Roteno+CA4 Roteno+CA5 Roteno+CA6
Rotenone memiliki berat molekul kurang 394.43 g/Mol sehingga dapat dengan mudah menembus chorion dan menimbulkan efek bagi embrio. 36,37
Rotenone  bersifat  toksik  bagi  embrio  dengan mekanisme  kerja    mengganggu  transportasi elektron mitokondria yang menghambat pemanfaatan oksigen dalam tubuh pada akhirnya menyebabkan  kematian  sel, 38 mempengaruhi perkembangan  embrio  dan  penundaan  umum yang ditandai dengan kurangnya datasemen ekor selain pembentukan somit tertunda. 39
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa lamanya  pemberian  ekstrak  CA  sejak  masa  pra hatching (embrio) sampai dengan post hatching yang identik dengan post natal secara signifikan meningkatkan panjang badan di semua kelompok  perlakuan  (p  <0,05).  Kelompok  P2 (paparan  CA  sampai  hari  ke  5)  menunjukkan panjang  tubuh  paling  optimal  dibandingkan dengan P1 (paparan CA sampai hari ke 4) dan P3 (paparan CA sampai hari ke 6) yang dapat dilihat pada  tabel  1  dan  gambar  1.  Pemberian  ekstrak CA  dapat  meningkatkan  pertumbuhan  panjang badan  larva  sebesar  99.6%  yang  di  ukur  pada usia 9 dpf.
Sejalan dengan hasil penelitian sebelumnya yang melaporkan bahwa pemberian ekstrak CA konsentrasi 5  g/mL pada masa pre- hatching (3  dpf)  mampu  mengkoreksi  panjang badan  larva zebrafish model  stunting  yang diinduksi  rotenon  sebesar  97,1%  melalui peningkatan  IGF-1  dan  peningkatan  IRS, 17 peningkatan  ekspresi  VEGF  dan  VEGFR-2. 40 Dengan  demikian  pemberian Centella  asiatica pada pre-hatching sampai dengan post-hatching pada zebrafish dapat  meningkatkan  koreksi panjang badan larva zebrafish lebih besar 2.5% dibanding hanya diberikan pre-hatching saja. Centella asiatica kaya akan mikro nutrien seperti vitamin B1, B2 dan B3 dan vitamin C 41 serta nutrisi makro seperti karbohidrat dan asam amino. 14 Konsumsi  makro  dan  mikro  nutrient secara  adekuat  dapat  mendukung  proses pertumbuhan  tubuh,  namun jika  nutrisi  yang  di perlukan tidak terpenuhi maka dapat menimbulkan  gangguan  pertumbuhan  maupun gangguan  metabolisme  tubuh  lainnya. 42 Selain itu CA juga mengandung bahan aktif Asiaticoside yang  dapat  berperan  sebagai  anti oksidan sehingga mampu mentralisir efek ROS
berlebih  di  dalam  tubuh. 43 Peningkatan  ROS memicu  terjadinya  stres  oksidatif  dan  jika berlangsung  dalam  jangka  waktu  lama  dapat menyebabkan  downregulation  signal  sehingga menurunkan respon insulin selanjutnya mengganggu proses diferensiasi, proliferasi dan jalur  siklus  sel.  Hal  ini  berdampak  terhadap hambatan  pertumbuhan  pada  otot  rangka  dan tulang. 44

## KESIMPULAN
Penelitian ini membuktikan bahwa pemberian ekstrak etanol Centella asiatica pada pre sampai  dengan post  hatching dapat meningkatkan  osifikasi  tulang  sehingga  dapat mencegah  stunting  pada zebrafish sejak pre sampai dengan post hatching .

## KEPUSTAKAAN
1. de  Onis  M.,  Dewey  K.  G.,  Borghi  E., Onyango A. W., Blössner M., Daelmans B. et  al.  The  World  Health  Organization’s Global  target  for  reducing  childhood stunting  by  2015:  rational  and  proporsed action.  Maternal  &child  Nutrition  2013;  9 (2): 6-26.
2. UNICEF.  Tracking  Progress  on  Child  and Maternal Nutrition: A survival and development  priority.  UNICEF.  2009; Available from: http://www.unicef.org/publications/ index_51656.html.
3. Badan  Penelitian  Dan  Pengembangan Kesehatan  RI.  2013.  Riskesdas  2013. Jakarta; 209
4. Black  RE,  Victora  CG,  Walker  SP,  Bhutta ZA,  Christian  P,  de  Onis  M,  Ezzati  M, Grantham-McGregor S, Katz J, Martorell R, et  al.  Maternal  and  child  underutrition  and overweight  in  low-income  and  middle- income  countries. Lancet .  2013;  382:427- 51.
5. Berkman  DS,  Lescano  AG,  Gilman  RH, Lopez  SL,  Black  MM.  Effects  of  stunting, diarrhoeal  disease,  and  parasitic  infection during  infancy  on  cog-  nition  in  late childhood:  a  follow-up  study. Lancet .
2002;359(9306):564–71.
6. Victora  CG.,  Adair  L,  Fall  C,  Hallal  PC, Martorell  R, et  al .  Maternal  and  child undernutrition:  consequences  for  adult health  and  human  capital. Lancet. 2008; 371:340–357.
7. MCA  Indonesia.  2013. Stunting  dan  Masa Depan Indonesia . pp.2-5
8. Bourke CD, Berkley JA & Prendergast AJ. Immune  Dysfunction  as  a  Cause  and Consequence  of  Malnutrition.  Trends  in Immunology, 2016; 37(6), 386–398.
9. Tsang KY, Chan D and Cheah KSE. Fate of grouth  plate  hypertrophic  chondrocytes: Death  or  lineage  extension? Develop Growth Differ. 2015; 57(2): 179-192.
10. Helmi, Z. Buku Ajar Gangguan
Muskuloskeletal . Anatomi  dan  Fisiologi
Tulang .  Cetakan  kedua.  Jakarta.:  Salemba Medika; 2013.
11. Primihastuti  D,  Ali  MM  &  Kalsum  U. Pengaruh Ekstrak Etanol Pegagan (Centella asiatica)  Terhadap  Ossifikasi  Tulang  dan Osteoklastogenesis  pada  Model  Stunting Larva  Zebrafish  Model  Stunting.  Tidak diterbitkan. Universitas Brawijaya. Malang. 2017.
12. Wauquier,  F.,  Leotoing,  L.,  Coxam,  V., Guicheux,  J.,  Wittrant,  T.  2009.  Oxidative stress  in  bone  remodelling  and  disease. Trends Mol Med . 15(1):468-77 .
13. Shen CL, Cao JJ, Dagda RY, Tenner T E.Jr, Chyu MC, & Yeh JK. Supplementation with green  tea  polyphenols  improves  bone microstructure  and  quality in aged, orchidectomized  rats. Calcified  Tissue International . 2011; 88(6), 455-463.
14. Joshi  K  &  Chaturvedi  P.  Green  Leafy Vegetable: An Overview, 2013; 4 (1), 135- 149.
15. Hashim  P.  Cetella  asiatica  in  food  and beverage  application  and  its  potential antioxidant  and  neuroprotective  effect. International Food Research Journal. 2011; 18(4):pp. 1215-1222.
16. Randriamampionona D, Diallo B, Rakotoniriana F, Rabemanantsoa C, Cheuk K,  Corbisier  AM,  et  al.  Comparative analysis  of  active  constituents  in  Centella asiatica samples from Madagascar:
Application  for  ex  situ  conservation  and clonal propagation. Fitoterapia . 2007.78(7): 482-489.
17. Cory’ah,  F.A.,  Khotimah,  H.,  Nurdiana. 2017. Pengaruh  Ekstrak  Etanol  Pegagan (Centella  Asiatica)  terhadap  Panjang Badan Ekspresi Insulin Like Growth Faktor 1  (IGF-1)  dan  Insulin  Reseptor  Substrat (IRS)  pada Larva Zebrafish (Danio Rario) Model  Sunting  Dengan  Indksi  Rotenon . Tidak  diterbitkan,  Universitas  Brawijaya. Malang. 2017.
18. Khotimah  H,  Sumitro  SB,  &  Widodo  MA. Zebrafish  Parkinson’s  Model :  Rotenone decrease  motility  ,  Apoptosis  of  Zebrafish Brain. International Journal of PharmTech Research . 2015b; 8(4), 614–621.
19. Avdesh  A,  Chen  M,  Marin-lverson  MT, Mondal A, Ong D, Rainey-Smith S, Martins RN.  Regular  care  and  maintenance  of zebrafish  (Danio  rerio)  laboratory:  an introduction.
Jornal of Visualized Experiments . 2012; 18(69):e4196.
20. Spence R, Gerlach G, Lawrence C & Smith C.  The  Behaviour  and  Ecology  of  The Zebrafish Danio Rerio. Biological Reviews. 2008; 13-34.
21. Shi-ying  L,  Jing-Feng  C,  Zhi-guo  Z,  Xio- hua LV, Ya-jun Y, Jing-jing Z. Salvianolic acid B stimulates osteogenesis in dexamethasone-treated  zebrafish  larvae. Acta  Pharmacological  Sinica .  2016;    37: 1370-1380
22. Saravanan  KS,  Sindhu  KM,  Senthikumar KS, Mohanakumar KP. L-De-phenyl protects against rotenone-induced, oxidative stress-mediated dopaminergic
neurodegeneration  in  rats. Neurochem  Int. 2006; 49: 28–40.
23. Martin  JA,  Martin  A,  Molinari  A,  Morgan W,  Ramalingam  W,    Buckwalter  JA  and McKinley  TO.  Mitochondria  electron transport  and  couplet  in  articular  cartilage. Osteoartritis  and  cartilage  /  OARS, Osteoarthritis  Research  Society. 2013; 20(4): 323-329.
24. Hock  JM,  Krishnan  V,  Onyia  JE,  Bidwell JP,  Milas  J,  Stanislaus  D.  Osteoblast apoptosis and bone turnover. J Bone Miner Res . 2001; 16:975–984.
25. Alikhani Z,  Alikhani M,  Boyd CM, Nagao K,  Trackman  PC,  Graves  DT.  Advanced glycation  end  products  enhance  expression of  pro-apoptotic  genes  and  stimulate fibroblast  apoptosis  through  cytoplasmic and mitochondrial pathways. J Biol Chem . 2005; 280:12087–12095.
26. Juranek I and Bezek S. Controversy of free radical hypothesis: Reactive oxygen species-cause  or  consequence  of  tissue injury? General Physiology and Biophysics.
(2005; 24(3): 263-278.
27. Lean  JM,  Davies  JT,  Fuller  K,  Jagger  CJ, Kirstein  B,  Partington  GA et  al .  A  crucial role  for  thiol  antioxidants  in  estrogen- deficiency  bone  loss. J  Clin  Invest .  2003; 112(6), 915-923.
28. Baek KH, Oh KW, Lee WY, Lee SS, Kim, MK,  KwonHS et  al .  Association  of oxidative stress  with postmenopausal osteoporosis  and  the  effects  of  hydrogen peroxide  on  osteoclast  formation  in  human bone marrow cell cultures. Calcified Tissue International . 2010; 87(3), 226-235.
29. Fontani F, Marcucci G, Iantomasi T, Brandi ML,  Vincenzini  MT.  Glutathione,  N- acetylcysteine and lipoic acid down-regulate starvation-induced apoptosis, RANKL/OPG ratio and sclerostin in osteocytes: involvement of JNK and ERK1/2 signalling. Calcif Tissue Int. 2015; 96:335– 346
30. Bellido T.
Osteocyte-driven bone remodeling. Calcif  Tissue  Int. 2014;94:25– 34.
31. Domazetovic V, Marcucci G, Lantomasi T, Brandi  ML  and  Vincenzini  MT.  Oxidative stress  in  bone  remodeling:  role  of antioxidants. Clinica Case In Mineral Bone Metabolism . 2017; 14(2):209-216.
32. Winarto, W.R. dan M. Surbakti. Khasiat dan Manfaat  Pegagan. Agromedia  Pustaka, Jakarta. 2003.
33. Dou  Y,  Mujeeb  A,  Zheng  Y,  Ge  Z. Optimalization  of  dual  effects  of  Mg-1Ca alloys  on  the  of  chondrocytes  and osteoblasts  in  vitro. Progres  in  Natural Science  Material  International .  24:  433-
440.
34. Kementrian  Kesehatan  RI.  2016. Info .
Situasi Balita Pendek . 2442–7659.
35. Sorribes  A.  The  Otogeny  of  sleep-wake cycles in zebrafish: a comparison to humans. Frontiers in neural Circuits. 2013. 178 36. Crofton KM. Thyroid Disrupting
Chemicals:  Mechanisms  and  Mixtures. International  Journal  of  Andrology .  2008;
31(2): 209-223.
37. Zubairi SI, Sarmidi MR, Aziz RA. A Study of  Rotenone  from  Derris  Roots  of  Varies Location, Plant Parts and Types of Solvent Used. Advances in  Environmental  Biology. 2014; 8(2): 445-449
38. Ott KC. Rotenone. A brief breif riview of its chemistry,  environmental  fate  and  the toxicity of rotenone formulation. 2006.
39. Melo  KM,  Oliveira  R,  Grisolia  CK, Domingues  I,  Pieczarka  JC,  Filho  JdS, Nagamachi CY. Short-term exposure to low dose  of  rotenone  induces  developmental, biochemical,  behavioral,  and  histological change  in  fish. Environmental  Science  and Pollution  Research. 2015;  22(18):  pp 13926-13938.
40. Wardani,  DW .  Pengaruh  Ekstrak  Etanol Pegagan  (Centella  asiatica)  Terhadap Ekspresi  Vascular  Endothelial  Growth Factor  Receptor-2  pada  Model  Stunting Larva  Zebrafish  Model  Stunting. [Tesis]. Universitas Brawijaya. Malang. 2017.
41. Sutardi,  S.  Kandungan  Bahan  Aktif Tanaman  Pegagan  dan  Khasiatnya  untuk Meningkatkan  Sistem  Imun  Tubuh. Jurnal Penelitian  Dan  Pengembangan  Pertanian . 2017;   35(3), 121.
42. Prentice A, Schoenmakers I, Laskey MA, de Bone  S,  Ginty  F  &  Goldberg  GR. Symposium  on  ‘Nutrition  and  health inchildren  and  adolencents’  session  1: Nutrition  in  growth  and  development nutrition  and  bond  growth  development. Proceedings of the Nutrition Society. 2006;
64(4): pp. 340-360
Bender  DA. Free  Radicals  an  Antioxidant Nutrients. In:  Murray  K,  Bender  DA, Botham KM, et al. Eds. Harper’s Illustrated Biochemistry, Ed 28 th Mc Graw Hill Lange 2009;482-86.