## TINJAUAN
PUSTAKA Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats- Associated Protein Cas9 (CRISPR/Cas9) Terenkapsulasi Nanopartikel Berbasis
Hibridisasi Polimer Lipid (LPNs) sebagai Modalitas Mutakhir Terapi pada Huntington ’s Disease
Re Septian Ilhamsyah 1 , Annisa Dewi Nugrahani 1 , Ade Firman Kurniawan 1
1 Fakultas Kedokteran Universitas Padjadjaran, Bandung

## ABSTRAK
Pendahuluan: Huntington’s Disease (HD)  merupakan penyakit neurodegeneratif langka yang  dapat  menyebabkan  gangguan  fungsi  motorik,  kognitif  dan  psikiatrik  pada penderitanya  akibat  perpanjangan  rantai  CAG  pada  HTT  sebagai  manifestasi  akibat adanya polimorfisme dari mutasi gen HTT (mHTT). Namun penanganannya saat ini masih bersifat  simtomatik  dan  belum  dapat  menangani  HD  secara  efektif  dan efisien.  Sebagai langkah intervensi mutakhir, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats- Associated Cas9 Protein (CRISPR/Cas9) hadir sebagai revolusi pendekatan biomolekular yang  prospektif  dalam  menangani Huntington’s  Disease (HD)  didukung  dengan  vektor nanopartikel berbasis hibridisasi polimer lipid (LPNs) yang memiliki fitur yang sangat baik sebagai vektor CRISPR/Cas9 pada sistem saraf pusat.
Tujuan: Tujuan dari tinjauan pustaka ini adalah untuk mengetahui potensi CRISPR/Cas9 terenkapsulasi LPNs sebagai modalitas mutakhir dalam menangani HD.
Metode: Dengan  melakukan  analisis  dan  sintesis  dari  81  jurnal full-text yang  relevan dengan  topik  dan  kurun  waktu  tidak  lebih  dari  sepuluh  tahun  terakhir,  penulis  membuat kajian pustaka ini.
Pembahasan: CRISPR/Cas9 dapat mengintervensi area N-Terminal pada alel HTT yang mengalami  mutasi  (mHTT)  secara  spesifik.  Hal  ini  mengakibatkan  ekspresi  dari  mHTT teratenuasi secara signifikan sehingga dapat menurukan ekspresi dari astrosit reaktif dan mencegah  terbentuknya  agregat  mHTT  secara  lebih  lanjut,  sekaligus  mengameliorasi kondisi  pada  penderita  HD.  Dengan  didukung  oleh  nanopartikel  LPNs  sebagai  vektor dalam  upaya  melewati Blood-Brain  Barrier (BBB)  dengan  sifat  toksisitas  dan imunogenisitas yang rendah, vektor ini mampu meningkatkan efektifitas dan efisiensi dari tatalaksana mutakhir ini.
Kesimpulan: CRISPR/Cas9  terenkapsulasi  LPNs  dapat  menjadi  kandidat  utama modalitas kuratif mutakhir dalam penanganan kasus HD secara efektif, spesifik, aman, dan efisien.
Kata Kunci:  CRISPR/Cas9, huntingtin, Huntington’s Disease, LPNs, mHTT

## ABSTRACT
Introduction: Huntington’s disease (HD) is a rare neurodegenerative disease resulting in motoric,  cognitive,  and  psychiatric  dysfunction  caused  by  CAG  repeat  elongation  in  the mutated  HTT  gene  (mHTT).  Currently,  there  has  not  been  any  effective  and  efficient curative treatment and there are only symptomatic treatments. To overcome this situation, Clustered  Regularly  Interspaced  Short  Palindromic  Repeats-Associated  Cas9  Protein (CRISPR/Cas9)  emerges  as  a  prospective  revolutionaire  biomolecular  approach  toward
Huntington’s  disease  supported  by  Lipid  Polymer  Nanoparticles  (LPNs)  vector  with excellent features as a vector that deliver CRISPR Cas9 to the central nerveous system. Objective: As a solution, the objective of this literature review is to identify the potency of CRISPR/Cas9 encapsulated by LPNs as a novel therapeutic strategy against HD. Method:The authors constructed this literature review by analizing and synthesizing 81 full text journal published no longer than 10 years ago that are relevant with the topic discussed in this literature review.
Discussion: CRISPR/Cas9 is able to intervene the N-Terminal of the mutated HTT gene (mHTT)  specifically  this  intervention  results  in  attenuated  expression  of  the  mHTT significantly  which  hamper  the  expression  of  reactive  astrocyte  and  prevent  further aggregation  of  the mHTT,  thus  ameliorate  the  condition  of  HD’s  patients.  LPNs  play  as vector that deliver CRISPR/Cas9 in order to be able to get through the blood brain barrier. Having low toxicit yand immunogenecity, this vector could improve effectivity and efficiency of this novel therapeutic strategy.
Conclusion : CRISPR/Cas9 encapsulated by LPNs could be a promising novel therapeutic strategy to treat HD efficiently, effectively, and safely.
Keywords: CRISPR/CAS9, huntingtin, Huntington disease, LPNs, mHTT

## 1.  PENDAHULUAN
Huntington’s disease (HD) adalah  suatu  bentuk  neurodegeneratif yang  dapat  menyebabkan  gangguan fungsi motor, kognitif dan psikiatrik pada penderitanya.  Nama  Huntington  diambil dari nama “ huntingtin ”, yaitu protein yang dihasilkan  oleh  gen  HTT  yang  apabila bermutasi dapat bersifat toksik pada sel saraf terutama pada daerah striatum dan dapat berujung
pada berbagai kelainan. [1] Sebagai  sebuah  penyakit neurodegeneratif  yang  langka  akibat kelainan autosom dominan, HD memiliki prevalensi  yang  sangat  variatif  di berbagai  area  di  seluruh  dunia. [2,3]
Penyakit  ini  umumnya  diderita  oleh  ras kaukasia,  khususnya  di  Amerika  Utara (7.33/100.000, CI=95%), Australia
(5.63/100.000, CI=95%), dan Eropa Barat (3.66/100.000, CI=95%). [2] Khusus di  Asia,  HD  memang  sangat  jarang terjadi  karena  berdasarkan  studi,  hanya terdapat  sekitar  0,4  penderita  di  antara 100.000  penduduk. [3] Setiap  dekade, populasi HD diperkirakan akan meningkat sebanyak 15-20%. [2,3] Kondisi ini  tidak  menutup  kemungkinan  bahwa
Indonesia  akan  terkena  dampaknya mengingat  bahwa  pada  era  globalisasi, penyakit genetik sudah mewabah selayaknya penyakit infeksi, memperluas jangkauan  demografis  akibat  adanya hubungan  seperti  pernikahan  antar  ras yang berbeda, [4] sehingga perlu mendapat perhatian khusus. HD merupakan penyakit neurodegeneratif yang menyerang pada usia  produktif  manusia.  Gejala  utama yang  menegakkan diagnosis  HD  adalah adanya  gerakan  tak  disadari (chorea) yang  biasanya  dimulai  di  usia  20  -  60 tahun dengan rata - rata usia 40 tahun. [5] Bahkan  dalam  beberapa  kasus,  gejala awal sudah muncul pada usia anak anak dan  balita. [6] Meskipun  diagnosis  HD ditegakkan  ketika  adanya  kelainan motorik,  tetapi  gangguan  kognitif  dan psikologis  sudah  dimulai  bertahun  - tahun  sebelum  gejala  motorik  muncul. Hal ini dapat berdampak pada perubahan  interaksi  dengan  orang  lain terutama  keluarga  yang  dapat  berujung pada ketidakharmonisan
rumah tangga. [7] Studi  menunjukkan  bahwa lebih  dari  50  %  orang  dewasa  dengan resiko  HD  memiliki  riwayat  kejadian buruk  pada  masa  kanak  kanak  meliputi konflik dengan anggota keluarga, teman, dan orang tua, serta mengalami kesulitan dalam aktivitas sehari-hari. [8]
Namun  hingga  saat  ini  belum ada terapi kuratif yang dapat menyembuhkan HD. Tatalaksana saat ini masih  berupa  penanganan  simtomatik untuk  mengurangi  gangguan  motorik, kognitif  dan  psikologis.    Penderita  HD pada  umumnya  tidak  sanggup  untuk melakukan pekerjaannya beberapa tahun setelah  muncul  gejala  dan membutuhkan  penanganan  intensif  24 jam pasca 10 tahun semenjak munculnya  gejala  motorik. [9] Perjalanan HD tergolong lama apabila dibandingkan
dengan penyakit neurodegeneratif lainnya dengan durasi rata-rata 15 tahun dari  awal  ditegakkan  diagnosis  hingga akhir hayat. [5] Meskipun tergolong penyakit  yang  langka,  gejala  awal  yang dimulai  pada  usia  produktif,  disertai penanganan penyakit yang berkepanjangan  dan  relatif  mahal  dapat menyebabkan penderita HD berkontribusi menjadi beban bagi keluarga  atau  bahkan  negara  di  usia yang  seharusnya  dia  dapat  menjadi tulang  punggung.  Tetapi,  hal  ini  dapat diatasi  dengan  hadirnya  teknologi  yang mampu mengatenuasi sekaligus mengameliorasi gen HTT yang bermutasi  dengan  biaya  yang  lebih murah  sehingga  dapat  menyembuhkan dan  mengurangi  waktu  serta  biaya perawatan pasien HD.
Sebagai sebuah prospektif, Clustered  Regularly  Interspaced  Short Palindromic  Repeats –Associated  Cas9 Protein (CRISPR/Cas9)  hadir  sebagai agen  terapeutik  melalui  pendekatan biomolekular  sekaligus  sebagai  revolusi teknologi rekayasa genetik paling mutakhir yang dapat memotong fragmen gen  dengan  bantuan  protein  Cas9 secara  akurat  dengan  dipandu  oleh guide RNA nuclease (gRNA). CRISPR/Cas9 pada HD bekerja dengan cara  memotong  N-terminal  atau  HTT Exon1  dari  gen  HTT  secara  efektif  dan presisi yang tinggi. [10] Akan tetapi, Blood Brain  Barrier (BBB)  yang  dibentuk  oleh sel astrosit  dan endotelium  kapiler  yang tersusun rapat sehingga tidak memungkinkan adanya aktivitas transitosis,  merupakan  tantangan  besar dalam  administrasi  terapi  pada  penyakit sistem  saraf  pusat.  Keberadaan  BBB mampu  melindungi  neuron  dan  sel  glia dari toksin bakteri, agen infeksi, dan zat asing,  termasuk  komponen  obat, [11] sehingga  diperlukan  vehikulum  agar suatu  obat  mampu  mencapai site  of action miliknya. Sebagai  solusinya,  nanopartikel berbasis  hibridisasi  polimer  lipid  (LPNs) merupakan terobosan vehikulum (vektor)
terbaru yang dapat mengantarkan molekul  seperti  CRISPR/Cas9  melewati BBB  karena  ukurannya  yang  kecil  dan sifatnya  yang  memiliki  integritas  tinggi, sehingga mampu mengontrol
pengeluaran  substansi  terenkapsulasi dengan  biokompatibilitas  yang  tinggi.
Tentunya  kombinasi  dari  CRISPR/Cas9 yang  terenkapsulasi  oleh  nanopartikel LPNs hadir sebagai solusi mutakhir yang memiliki prospektif tinggi untuk menangani HD. [12] Oleh karena itu, tujuan kami  melakukan  tinjauan  pustaka  ini adalah  untuk  mengetahui  potensi  dari
CRISPR/Cas9 yang terenkapsulasi dengan  vektor  nanopartikel  berbasis hibridisasi  polimer  lipid  (LPNs)  sebagai modalitas mutakhir untuk atenuasi ekspresi gen mHTT pada penderita HD.

## 2.  METODE
Sebagai  sebuah  literatur,  karya  tulis ini merupakan hasil analisis dan sintesis dari berbagai referensi. Penulis menggunakan  beberapa  kata  kunci berupa CRISPR/Cas9, huntingtin,
Hu ntington’s  Disease ,  LPNs,  mHTT yang  diketik  pada  mesin  pencarian seperti  untuk  mendapatkan  jurnal-jurnal yang  berkaitan.  Jurnal-jurnal  tersebut diseleksi  oleh  penulis  melalui  proses inklusi  dan  eksklusi  lalu  dipilihlah  81 jurnal full text yang berhubungan dengan topik  yang  dibahas.  Referensi-referensi tersebut  diambil  dari  Pubmed, Google Scholar ,  dan Clinical  Key dengan  tahun publikasi  dalam  kurun  waktu  10  tahun terakhir. Kemudian, penulis menganalisis dan  membuat  literatur  berdasarkan jurnal-jurnal tersebut.

## 3.  HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Patogenesis  dari  Huntington’s
Disease (HD) Secara molekular, HD disebabkan  oleh  terlalu  banyaknya pengulangan  asam  amino  CAG  pada gen  HTT  yang  berjumlah  40  atau  lebih. Gen  HTT  terletak  pada  kromosom 4p16.3 dan mengodekan protein huntingtin. [13] Protein  huntingtin  yang utuh  terdiri  dari  domain  utama  teratur yang  tersusun  secara  selang-seling diantara  fragmen  protein lain  yang  tidak teratur.  Bagian  yang  teratur  disebut HEAT  (huntingtin, Elongation  factor 3, protein  phosphatise  2A  dan  TOR1), sedangkan pada bagian fragmen protein yang  tidak  teratur  merupakan  tempat dimana  terjadinya Post-Translational Modifications (PTM) seperti pemotongan proteolisis,  glikosilasi  dan  fosforilasi. [14]
Pada huntingtin, proteolisis oleh
caspase,  endoprotease  dan  caspain merupakan  PTM  yang  paling  umum terjadi. PTM merupakan proses fisiologis untuk mengaktifkan, menonaktifkan atau mengangkut suatu protein. [15] Salah satu hasil pemotongan proteolisis segmen tak teratur pada huntingtin adalah N-terminal atau  biasa  disebut  dengan  HTT  exon1 yang  merupakan  hasil  transkripsi  exon pertama dari gen HTT. HTT exon1 terdiri dari 3 domain; pertama, domain  dengan 17  asam  amino  (N17/  HTT NT );  kedua, domain  polyQ; dan  yang ketiga adalah proline  rich  domain  (PRD).  PolyQ  atau polyglutamine  dikodekan  oleh  rantai CAG  yang  termasuk  dalam  exon pertama  gen  HTT. [16] Pada  kondisi normal,  HTT  mengandung  rantai  CAG sebanyak  6-35  unit.  Glutamine  akan ditranskripsikan  oleh  setiap  rantai  CAG; semakin  panjang  polyQ  maka  semakin cepat HTT exon1 menjadi agregat/inklusi dan bersifat toksik. [5] Panjang  rantai  CAG  pada  HTT berbanding  terbalik  dengan  usia  awal serangan  HD,  meskipun  baik  huntingtin normal  maupun  abnormal  sama-sama mengalami fragmentasi pada HTT exon1.  Individu  dengan  panjang  CAG berjumlah 40 sampai 49 akan mengalami gejala  awal  HD  di  usia  sekitar  30-50 tahun.  Panjang  CAG  berjumlah  50 sampai  59  akan  memulai  gejala awal  di usia 20-30 tahun sedangkan jumlah CAG yang  melebihi  60  akan  menyebabkan Juvenile  Huntington’s  Disease (JHD) yaitu ketika gejala awal terjadi pada usia dibawah 21 tahun. [17] Pengaruh panjang polyQ terhadap  konformasi  HTT  exon1  yang dapat  mempercepat  terjadinya  agregasi huntingtin  masih  diperdebatkan  untuk menjadi penyebab utama HD. [18]
Mekanisme  bagaimana  panjang  polyQ mampu menyebabkan serangan dini dari HD masih belum banyak diketahui. HTT exon1  dihasilkan  melalui  fragmentasi proteolisis  dari  huntingtin  utuh,  namun bila  terjadi  pemanjangan  CAG,  mRNA pada nukleus mampu mentranskripsikan HTT  exon1  saja  tanpa  elemen  lain, sehingga
mempersingkat proses pembentukan  HTT  exon1. [9] Fragmen huntingtin  ini  dapat  mengganggu  fungsi sel  baik  pada  sitoplasma  maupun nukleus.  Di  dalam  nukleus,  fragmen  ini mengalami  oligomerasi  dan  agregasi yang berujung pada pembentukan inklusi
sehingga  mampu  mengganggu  proses transkripsi  melalui  interaksinya  dengan protein  regulator  transkripsi  seperti  p53, cAMP response  element-binding ,  dan CREB binding protein . [19] HTT exon1 juga berinteraksi dengan protein yang berperan dalam transkripsi untuk proliferasi  dan  keberlangsungan  hidup sel seperti; PGC- 1α yang berperan untuk metabolisme energi, Sp1 dan
koaktivatornya,  serta  cystathionine  γ- lyase yang merupakan enzim biosintesis untuk  cystein. [20] Di  dalam  sitoplasma, fragmen  tersebut  juga  akan  mengalami oligomerasi dan fragmentasi yang berujung  pada  kerusakan  sel  dengan mengganggu  sistem  degradasi  protein pada sel yaitu sistem ubiquitin- proteosom  dan  autofagi. [21] Agregat fragmen  yang  mengandung  polyQ  juga berinteraksi dengan membran luar mitokondria,  sehingga  menyebabkan gangguan aliran ion kalsium yang dapat mengakibatkan  gangguan  pembentukan ATP  dan  menginduksi  apoptosis.  Selain itu, degenerasi neuron juga dapat terjadi karena  fragmen  polyQ  merusak  organel transport axonal. [22,23]
Keberadaan agregat fragmen huntingtin mengganggu berbagai  fungsi  sel  seperti  transkripsi, komunikasi  intrasel,  sekresi,  daur  ulang endositik, sistem pertahanan, dan disfungsi  sinaps. [24] Berbagai  macam gangguan
yang timbul seperti
eksitotoksik  sel  saraf  akibat  kerusakan pada  jaras  impuls  dan  sel  autonom menyebabkan  gejala  neurologis  dan non-neurologis pada HD. [25]
Gen HTT yang bermutasi
(mHTT)  merupakan  penyebab  utama terjadinya  HD,  maka  dari  itu  beberapa percobaan  dilakukan  untuk  merekayasa mHTT dengan berbagai metode.
Walaupun sejauh ini fungsi fisiologis dari huntingtin normal belum banyak diketahui  secara  pasti,  studi  terbaru mengindikasikan  bahwa  eradikasi  gen HTT  normal  pada  otak  mencit  dewasa tidak  mengganggu  kelangsungan  hidup dan  pertumbuhan  baik  neuron  mencit ataupun  mencit  itu  sendiri. [26,27] Hal  ini mengimplikasikan bahwa intervensi pada mHTT  tidak  akan  mengganggu  fungsi fisiologis tubuh. [26,27]
3.2  Potensi Clustered Regularly Interspaced  Short  Palindromic Repeats-Associated  Cas9  Protein (CRISPR/Cas9) dalam Proses Intervensi  Hunti ngton’s  Disease (HD):  Struktur  dan  Mekanisme Aksi  dalam  Atenuasi  Ekspresi mHTT Sebagai langkah intervensi mutakhir, Clustered Regularly Interspaced  Short  Palindromic  Repeats- Associated Cas9 Protein (CRISPR/Cas9) hadir sebagai pendekatan biomolekular yang prospektif dalam  menangani Huntington’s  Disease (HD)  dengan  mengintervensi  area N- Terminal pada alel HTT yang mengalami mutasi  (mHTT). [28,29,30,31] CRISPR/Cas9 merupakan  teknik  rekayasa  genetika yang  diadopsi  dari  sistem  imunitas adaptif prokariot yang terdiri dari repetisi sekuens basa[32,33,34] yang  dipandu  oleh guide RNA  nuklease  (gRNA)  untuk memotong substansi genetik asing. [33,35,36] Terdapat  tiga  tipe  sistem CRISPR  yang  telah  diidentifikasi  pada prokariot,  namun  CRISPR  II  merupakan tipe yang terbaik karena walaupun hanya terasosiasi  dengan  satu  protein  Cas9, sistem  ini  melakukan  kinerjanya  secara efektif. [33,47] Sejauh ini, CRISPR/Cas9
menjadi terapi melalui pendekatan biomolekular yang mudah, paling efektif, paling  murah,  serta  paling  akurat dibandingkan dengan pendekatan lainnya  seperti Zinc  Finger  Nuclease (ZFN)  dan  TALENs. [32,33,48,49] Walaupun siRNA  dan antisense  oligonucleotide pada kasus Huntington’s Disease sudah teruji memiliki efek terapeutik yang cukup baik,  modalitas  ini  masih  memiliki ketergantungan terhadap Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) serta tidak  mampu    membedakan  alel  normal HTT  dengan  alel  HTT  mutan  yang terekspansi lebih lanjut sehingga CRISPR/Cas9  menjadi  kandidat  paling unggul  sebagai  agen  terapeutik  pada HD. [28,29,40,41]
Secara  struktural,  sistem  ini terdiri  atas  dua  komponen  utama  yaitu gRNA  yang  terdiri  dari  crRNA  dan tracrRNA  serta  protein  Cas9  sebagai enzim  endonuklease  untuk  memotong
sekuens  target. [32,33,38,39] crRNA  terdiri dari  20  unit  sekuens  basa  untuk mengarahkan protein Cas9 agar
berikatan  dengan  DNA  target  melalui Watson-Crick Base Pairing yang difiksasi oleh  tracrRNA  sehingga  membentuk area yang kemudian akan dipotong oleh protein Cas9. [32,33,38,39] Namun, CRISPR/Cas9 membutuhkan Protospacer  Adjacent  Motif (PAM)  yang terdiri dari 2-6 pasang basa (NGG) yang spesifik terhadap protein Cas9 dan diikuti oleh sekuens DNA target untuk menginisiasi  pengikatan  antara  gRNA dengan DNA target pada proses tersebut secara spesifik. [32,33,35,49]
Gambar 1 . Skema struktur dari CRISPR/Cas9. [42] Pada eksperimen yang dilakukan  oleh  Yang et  al (2017) [28] , disusunlah empat gRNA sebagai bagian dari  CRISPR/Cas9  yang  menargetkan empat  area  DNA,  yaitu  T1,  T2,  T3,  T4 pada  alel  mHTT  yang  mengekspresikan exon  1  disertai  dengan  repetisi  CAG (area  polyQ)  sebanyak  120  pasang disertai  dengan  kontrol  (Lampiran  1). [28] Berdasarkan hasil studi in vitro pada sel lini HEK293 yang ditransfeksikan dengan gRNA dan Cas9 (CRISPR/Cas9), didapatkan  penurunan  ekspresi  dan agregat  dari  mHTT  secara  sangat signifikan dibandingkan dengan kontrolnya khususnya dengan menggunakan  kombinasi  dual  gRNA spesifik  T1  dan  T3  secara  bersamaan pada vektor yang sama. [28]
Gambar 2 . Penurunan ekspresi dan agregat dari mHTT secara signifikan pasca transfeksi CRISPR/Cas9 pada sel lini HEK293 dibandingkan dengan kontrol (HTT – gRNA) pada preparat mikroskopis. [28]
Tidak hanya pada eksperimen in vitro ,  mencit  HD140Q-KI [43] yang  telah diinduksi  oleh  mHTT  secara  homozigot dan heterozigot,
kemudian ditransfeksikan dengan gRNA/Cas9 (CRISPR/Cas9)  dengan  promotor  CMV untuk  mencit  homozigot  mHTT  dan promotor methyl-CpG –binding  protein (Mecp2) untuk mencit heterozigot mHTT melalui injeksi di kedua sisi striatum. [28,43,44,45] Tiga  minggu  pasca transfeksi,  didapatkan  bahwa  terjadi penurunan ekspresi mHTT secara dramatis
pada mencit yang ditransfeksikan gRNA/cas9 (CRISPR/Cas9)  dibandingkan  dengan kontrolnya,  baik  pada  mHTT  homozigot maupun  heterozigot  (target  spesifik  T1 dan  T3)  pada  gambar  3. [28,43,44] Hal  ini pun berbanding lurus dengan meningkatnya kemampuan motorik mencit [43,44,45,46] yang  terpapar  oleh
CRISPR/Cas9 dibuktikan
dengan peningkatan  hasil  pada  tes  rotarod, keseimbangan  balok  ( balance  beam ), dan kekuatan genggaman ( grip strength ) serta  penurunan  reduksi  berat  badan (gram) pada mencit (gambar 4) sebagai dampak  dari  atenuasi  ekspresi  mHTT secara  signifikan  khususnya  pada  area striatum. [28,43,44,45,46]
Gambar 3 . Penurunan secara dramatis dari ekspresi mHTT yang ditransfeksikan dengan gRNA/Cas9 (CRISPR/Cas9) dibandingkan dengan kontrol pada studi in vivo mencit HD140Q-KI mHTT homozigot dan
heterozigot. (***P<0.001) [28]
Gambar 4 . Penurunan ekspresi mHTT secara signifikan yang berbanding lurus dengan peningkatan kemampuan motorik pada tes rotarod, balance beam, dan grip strength, serta penurunan reduksi berat badan pada studi in vivo mencit HD140Q-KI. (**P<0.012,
***P<0.001) [28]
Hal ini diakibatkan karena gRNA/Cas9  (CRISPR/Cas9)  mampu secara  spesifik  mendeteksi  DNA  target dengan adanya sekuens PAM dan gRNA (tepatnya  pada  bagian  crRNA)  yang akan  berusaha  untuk  berikatan  dengan DNA  target  yang  berkomplemen  dan kemudian protein Cas9 akan memotong area  tersebut  dan  regio  yang  sejajar dengannya  sehingga  terjadi  mutasi frameshift diikuti  oleh  rekombinasi  gen secara non-homolog (NHEJ). [47-52]
Sebagai  dampaknya,  ekspresi  dari
mHTT  teratenuasi  secara  signifikan sehingga  menurukan  ekspresi  dari astrosit reaktif dan mencegah terbentuknya agregat mHTT secara lebih lanjut. [28,43,44,45] Tentunya,  kondisi  ini dapat  mengameliorasi  kondisi  neuron sekaligus  meningkatkan  kemampuan motorik tanpa efek samping yang berarti karena area yang akan diintervensi telah dipastikan  aman  melalui  NCBI Blast dengan aktivasi off-target yang minimum atau bahkan tidak ada. [53-55] 3.3  Nanopartikel  Berbasis  Hibridisasi Polimer Lipid (Lipid-Polymer Hybrid Nanoparticles/ LPNs) sebagai  Platform  Vektor  Terapi Gen CRISPR/Cas9 Terbarukan Sebagai sebuah prospektif dalam suatu tatalaksana penyakit, terapi gen seperti CRISPR/Cas9, sangat terasosiasi dengan kapasitas pengembangan vehikulum (vektor) yang aman  dan  efisien  dalam  melindungi substansi terapeutik dari paparan eksogen yang berbahaya serta meningkatkan dampak yang menguntungkan  pada  sel  dan  jaringan target. [56,57] Sebagai  terobosan  terkini, nanoteknologi berupa nanopartikel hadir sebagai  teknologi  yang  sedang  intensif dikaji  sebagai  vehikulum  terbaik  dari berbagai agen terapeutik karena keuntungan-keuntungan yang dimilikinya. [46,57-62] Nanopartikel merupakan material yang memiliki ukuran berkisar di antara  1-100  nm. [63,64] Akibat  ukurannya yang kecil, substansi ini mampu menembus Blood  Brain  Barrier (BBB) sebagai tantangan terbesar dalam terapi neurologis, [58,65,66] menuju site  of  action dengan  efektifitas  yang  tinggi  dengan sifat  imunoinert  yang  rendah  sehingga dapat menghindari penangkapan sistem retikuolendotel,  alhasil  bioavailabilitas agen terapeutik menjadi tinggi. [58,60,65,67]
Berbagai substansi organik, anorganik, ataupun hibrid melalui proses polimerisasi  digunakan  sebagai  bahan baku  produksi  nanopartikel. [58-67] Semua jenis  nanopartikel  dapat  diproduksi dalam  berbagai  ukuran  dan  varietas yang dapat digunakan sebagai vehikulum  agen  terapeutik  terapi  gen seperti CRISPR/Cas9 yang berkelanjutan dan dapat bertahan dalam jangka  waktu  yang  lama. [60] Di  antara
substansi  tersebut,  nanopartikel  hibrid menjadi kandidat utama karena efisiensi transfer yang tinggi, proses sintesis yang mudah,  serta  tingkat  toksisitas  yang rendah  dibandingkan  dengan  material lainnya  dan  sejauh  ini  sudah  teruji  baik secara in vitro maupun in vivo . [60,68,69,70]
Nanopartikel berbasis hibridisasi polimer lipid  ( Lipid-Polymer Hybrid Nanoparticles /  LPNs)  merupakan  salah satu  jenis  dari  nanopartikel  hibrid  yang cukup  mudah  untuk  disintesis  dan merupakan  kombinasi  dari  nanopartikel polimer  yang  memiliki  durasi  sirkulasi yang berkepanjangan [71,72] dan nanopartikel liposom yang masih memiliki keterbatasan karena mudahnya tereliminasi  oleh  sistem  retikuloendotel walaupun memiliki biokompabilitas yang baik  karena  merupakan  analog  dari membran  sel [73,74] sehingga  kombinasi keduanya  merupakan  solusi  terbaik dalam  mengatasi  kekurangan  masing- masing  material  dan  meningkatkan efektifitas. [60] LPNs  disintesis  melalui proses nanopresipitasi, emulsifikasi- pelarutan-evaporasi, [75,76,77] maupun two- step  methods dengan  proses spray drying dan soft lithography . [78]
Secara  struktural,  LPNs  terdiri dari  (1)  inti  polimer  tempat  agen terapeutik seperti terapi gen terenkapsulasi,  (2)  lapisan  lipid  dalam untuk  menyokong  biokompatibilitas  inti polimer sekaligus sebagai tameng pencegah  kebocoran  substansi  yang terenkapsulasi, (3) dan lapisan lipid-PEG luar sebagai pembungkus yang meningkatkan  waktu  sirkulasi  secara in vivo serta stabilisasi sterik. [60,79]
Gambar 3 . Skema struktur dari LPNs. [60]
Oleh  karena  struktur  tersebut, LPNs memiliki  fitur  yang  dengan integritas tinggi, kapabilitas untuk mengontrol pengeluaran substansi
terenkapsulasi,  biokompatibilitas  dan bioavailabilitas yang tinggi [58-67] , disertai dengan  adanya  modifikasi  rantai  PEG pada  lapisan  lipid  terluar  menggunakan grup methoxyl, sehingga dapat menurunkan imunogenisitas yang sudah terbukti  oleh  berbagai  studi  baik  secara in  vitro maupun in  vivo . [79,80] Selain  itu, substansi  ini  dapat  menembus  BBB, memiliki  sifat  toksisitas  yang  rendah, disertai dengan peluang produksi dalam skala besar. Apabila dilihat dari perspektif  molekular,  ikatan  di  dalam LPNs  sangat  prospektif  sebagai  vektor dalam terapi gen CRISPR/Cas9 khususnya  pada  HD. [58-81] Seluruh keuntungan
yang dimiliki oleh CRISPR/Cas9  berupa  efektifitas  yang sangat  baik  disertai  sifatnya  yang memiliki presisi tinggi dalam mengintervensi  suatu  area  gen  yang bersifat  sangat  molekular  dan  tidak menimbulkan efek samping yang berarti karena  minimnya off-target ,  didukung dengan berbagai keuntungan dari vektor
LPNs, tentunya hal ini menjadikan terapi
CRISPR/Cas9 yang terenkapsulasi dengan  LPNs  sebagai  kandidat  utama dengan  prospektif  yang  sangat  tinggi untuk  menangani  HD  secara  efektif  dan efisien. [53-55, 58-81]

## 4.  SIMPULAN
Huntington’s Disease (HD) merupakan  penyakit  neurodegeneratif langka  akibat  adanya  mutasi  pada  gen HTT (mHTT) yang terletak pada kromosom 4p16.3 sehingga menyebabkan  terjadinya  elongasi  dari rantai  CAG  yang  dapat  bermanifestasi berupa  timbulnya  gangguan  fungsi motorik,  kognitif  dan  psikiatrik  pada penderita HD di usia produktif. Walaupun kondisi ini memerlukan perhatian khusus akibat  beban  yang  ditimbulkan  akibat HD, sejauh ini tatalaksana yang ada saat ini belum mampu menangani HD secara efektif  dan  efisien  sehingga  diperlukan solusi mutakhir dalam menangani kondisi ini.
Oleh  karena  itu,  CRISPR/Cas9 hadir sebagai  revolusi pendekatan biomolekular paling mutakhir yang dapat mengintervensi dan mengatenuasi ekspresi mHTT pada HD secara spesifik, akurat,  aman,  dan  efisien  sekaligus mengameliorasi  kondisi  penderita  HD
secara  efektif.  Dengan  didukung  oleh vektor  nanopartikel  berbasis  hibridisasi polimer lipid (LPNs), CRISPR/Cas9 yang terenkapsulasi oleh substansi ini mampu menembus  BBB  dengan  sifat  toksisitas yang  rendah,  disertai  dengan  peluang produksi  dalam  skala  besar,  sehingga modalitas  ini  berprospektif  sangat  tinggi untuk menjadi kandidat utama modalitas terapeutik  mutakhir  pada  penderita  HD. Sehingga  dapat  disimpulkan  dari  81 jurnal yang telah disintesis dan dianalisis bahwa  CRISPR/Cas9  terenkapsulasi nanopartikel efektif menurunkan ekspresi mHTT pada HD.
5.  SARAN
Tentunya, hal ini memicu perkembangan ilmu pengetahuan karena dibutuhkan  studi  lebih  lanjut  khususnya pada fase uji klinis untuk mengoptimalisasi  kinerja  dari  sistem  ini. Selain  itu  pendekatan  holistik  melalui kerja  sama  dengan  pemerintah  dan sosialisasi  kepada  masyarakat  sangat dibutuhkan agar inovasi ini dapat segera diterapkan  kepada  pasien  mengingat urgensi  yang  ditimbulkan  oleh  penyakit ini cukup tinggi.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Pringsheim  T,  Wiltshire  K,  Day  L, Dykeman J, Steeves T, Jette N. The incidence and prevalence of Huntington's  disease:  A  systematic review and meta-analysis. Movement Disorders. 2012;27(9):1083-1091. 2.  Rawlins  M,  Wexler  N,  Wexler  A, Tabrizi  S,  Douglas  I,  Evans  S  et  al.
The  Prevalence  of  Huntington's Disease.
Neuroepidemiology. 2016;46(2):144-153. 3.  WHO  |  Genes  and  human  disease [Internet].  Who.int.  2016  [cited  24 March 2018]. Available from: http://www.who.int/genomics/public/
geneticdiseases/en/index2.html
4.  Goldin  I,  Mariathasan  M.  The Butterfly  Defect  :  How  Globalization Create Systemic Risks, and What To Do  About  It.  New  Jersey:  Princeton University Press; 2014.
5.  Peggy C. et al. Huntington disease : A  Single  -  Gene  Degenerative
Disorder  of  the  Striatum.  Clinical Research. 2016. 6. Quarrell O, O’Donovan KL,
Bandmann  O,  Strong  M.  The prevalence  of  juvenile  Huntington’s disease: a review of the literature and meta-analysis. PLoS Curr. 2012;4.
7.  Quaid,  K.  A.  et  al.  Living  at  risk: concealing risk and preserving hope in  Huntington  disease.  J.  Genet. Couns.2008; 17, 117 –128.
8.  Van  der  Meer,  L.  B.,  van  Duijn,  E., Wolterbeek, R. & Tibben, A. Adverse childhood experiences of persons at risk  for  Huntington’s  disease  or BRCA1/2  hereditary  breast/ovarian cancer.  Clin.  Genet.  81.  2012;  18 – 23.
9.  Gillian  P.Bates,  Ray  Dorsey,  et  al. Huntington Disease. Primer. 2015. 10.  Kolli  N,  Lu  M,  Maiti  P,  Rossignol  J, Dunbar  G.  CRISPR-Cas9  Mediated Gene-Silencing of the Mutant Huntingtin Gene in an In Vitro Model of Huntington’s Disease. International  Journal  of  Molecular
Sciences. 2017;18(4):754.
11.   Junqueiras.  Basic  Histology  Text and Atlas 13th. 2013;179.
12.  Zhang  L,  Zhang  L.  Lipid –Polymer Hybrid  Nanoparticles:  Synthesis, Characterization  and  Applications. Nano  LIFE.  2010;01(01n02):163- 173.
13.  Ross, C. A. et al. Huntington disease: natural  history,  biomarkers  and prospects for therapeutics. Nat. Rev. Neurol.2014; 10, 204 –216.
14.  Aiken, C. T. et al. Phosphorylation of threonine 3: implications for huntingtin aggregation and neurotoxicity.  J.  Biol.  Chem.  2009; 284. 15.  Wetzel, R. & Mishra, R. in Huntington’s Disease (eds Bates, G. P.,  Tabrizi,  S.  J.  &  Jones,  L).2014; 274 –322.
16.  Zuccato,  C.  &  Cattaneo,  E.  in Huntington’s Disease (eds Bates, G. P.,  Tabrizi,  S.  J.  &  Jones,  L.).2014; 243 –273.
17.  Nicolas  G,  Devys  D,  Goldenberg  A, et al. Juvenile Huntington disease in an  18-month-old  boy  revealed  by global developmental delay a reduced  cerebellar  volume.  Am  J Med  Genet  A.  2011;155A(4):815- 818.
18.  Klein,  F.  A.  C.  et  al.  Linear  and extended:  a  common  polyglutamine conformation recognized by the three antibodies  MW1,  1C2  and  3B5H10. Hum.  Mol.  Genet.2013;  22,  4215 – 4223.
19.  Paul  BD,  Sbodio  JI,  Xu  R,  Vandiver
MS, Cha JY, Snowman AM, Snyder SH.  2014.  Cystathionine  g-lyase deficiency mediates neurodegeneration  in  Huntington’s disease. Nature. 2014; 96 –100.
20.  Chaturvedi  RK,  Calingasan  NY,
Yang L, Hennessey T, Johri A, Beal MF. Impairment of PGC-1a expression, neuropathology and hepatic  steatosis  in  a  transgenic mouse model  of  Huntington’s disease  following  chronic  energy deprivation. Hum Mol Genet 19.2010; 3190 –3205.
21.  Maria  J.S,  Floriana  L.  et  al. Huntington’s  Disease:  Mechanisms of  Pathogenesis  and  Therapeutic Strategies. 2018.
22.  `Morfini  GA,  You  YM,  Pollema  SL, Kaminska  A,  Liu  K,  Yoshioka  K, Bjo¨rkblomB,  Coffey  ET,  Bagnato C,HanD, et al. Pathogenic huntingtin inhibits  fast  axonal  transport  by activating JNK3 and phosphorylating kinesin.  Nat  Neurosci.  2009;  864 – 871.
23.  Liot G, Zala D, Pla P, Mottet G, Piel M,  Saudou  F.  Mutant  Huntingtin alters  retrograde  transport  of  TrkB receptors  in  striatal  dendrites.  J Neurosci. 2013; 6298 –6309.
24.  Campesan  S,  Green  EW,  Breda  C, Sathyasaikumar KV, Muchowski PJ, Schwarcz  R,  Kyriacou  CP,  Giorgini F.  2011.  The  kynurenine  pathway modulates  neurodegeneration  in  a Drosophila  model  of  Huntington’s disease. Curr Biol. 2011; 961 –966.
25.  Wang, N. et al. Neuronal targets for reducing mutant huntingtin expression to ameliorate disease in a mouse model of Huntington disease. Nat. Med. 2014; 536 –541.
26.  Wang G. et al. Ablation of Huntingtin in  adult  neurons  is  nondeleterious but its deletion in young mice causes acute  pancreatitis.  Proc  Natl  Acad Sci USA. 2016;113(12):3359-3364.
27.  Liu  X.  et  al.  N-terminal  huntingtin knock-in mice: implications of removing  the  N-terminal  region  of
huntingtin  for  therapy.  Plos  Genet. 2016;12(5):e1006083.
28.  Yang S, Chang R, Yang H, Zhao T,
Hong Y, Kong H et al. CRISPR/Cas9-mediated gene editing  ameliorates  neurotoxicity  in mouse model  of  Huntington’s disease. Journal of Clinical Investigation. 2017;127(7):2719- 2724. 29.  Monteys AM, Ebanks SA, Keiser MS, Davidson  BL.  CRISPR/Cas9  editing of the mutant huntingtin allele in vitro and in vivo. Mol Ther . 2017;25(1):12 –23.
30.  Carroll JB, et al. Potent and selective antisense  oligonucleotides  targeting single-nucleotide  polymorphisms  in the  Huntington  disease  gene/allele- specific silencing of mutant huntingtin. Mol Ther . 2011;19(12):2178 –2185.
31.  Drouet  V,  et  al.  Allele-specific silencing  of  mutant  huntingtin  in rodent  brain  and  human  stem cells. PLoS One . 2014;9(6):e99341. 32.  Wang X, Gong Y, Jin B, Wu C, Yang J,  Wang  L,  et  al.  Long  non-coding RNA urothelial carcinoma associated 1 induces cell replication by inhibiting BRG1  in  5637  cells.  Oncology reports. 2014;32(3):1281-90.
33.  Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala
V,  Scott  DA,  Zhang  F.  Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 2013;8(11):2281-308.
34.  Jinek  M,  Chylinski  K,  Fonfara  I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A  programmable  dual-RNA –guided DNA  endonuclease  in  adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-21. 35.  Kunin  V,  Sorek  R,  Hugenholtz  P. Evolutionary conservation of sequence  and  secondary  structures in CRISPR repeats. Genome biology. 2007;8(4):R61.
36.  Marraffini LA, Sontheimer EJ. CRISPR  interference:  RNA-directed adaptive  immunity  in  bacteria  and archaea.  Nature  reviews  Genetics. 2010;11(3):181.
37.  Shah  SA,  Erdmann  S,  Mojica  FJ,
Garrett  RA.  Protospacer  recognition motifs: mixed identities and
functional  diversity.  RNA  biology.
2013;10(5):891-9. 38.  Cox  DBT,  Platt  RJ,  Zhang  F. Therapeutic genome editing: prospects  and  challenges.  Nature medicine. 2015;21(2):121-31. 39.  Karvelis  T,  Gasiunas  G,  Siksnys  V. Methods for decoding Cas9 protospacer  adjacent  motif  (PAM) sequences: a brief overview.
Methods. 2017. 40.  Skotte  N,  Southwell  A,  Østergaard M, Carroll J, Warby S, Doty C et al. Allele-Specific Suppression of Mutant  Huntingtin  Using  Antisense Oligonucleotides: Providing a Therapeutic Option for All Huntington Disease Patients. PLoS ONE.
2014;9(9):e107434.
41.  Skotte  N,  Southwell  A,  Østergaard M, Carroll J, Warby S, Doty C et al.
Allele-Specific Suppression of Mutant  Huntingtin  Using  Antisense Oligonucleotides: Providing a Therapeutic Option for All Huntington Disease Patients. PLoS ONE. 2014;9(9):e107434. 42.  Horvath P, Barrangou R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 2010
Jan 8;327(5962):167-70.
43.  Chan  A,  Jiang  J,  Chen  Y,  Li  C, Prucha  M,  Hu  Y  et  al.  Progressive Cognitive  Deficit,  Motor  Impairment and Striatal Pathology in a Transgenic Huntington Disease Monkey  Model  from  Infancy  to Adulthood. PLOS ONE. 2015;10(5):e0122335. 44.  Rangel-Barajas C, Rebec G. Dysregulation of Corticostriatal Connectivity in Huntington’s Disease: A Role  for Dopamine
Modulation.  Journal  of  Huntington's
Disease. 2016;5(4):303-331. 45.  Morigaki R, Goto S. Striatal Vulnerability in Huntington’s Disease:  Neuroprotection  Versus Neurotoxicity. Brain Sciences. 2017;7(12):63. 46.  Suelves  N,  Kirkham-McCarthy  L,
Lahue  R,  Ginés  S.  A  selective inhibitor  of  histone  deacetylase  3 prevents cognitive deficits and suppresses  striatal  CAG  repeat expansions  in  Huntington’s  disease mice. Scientific Reports. 2017;7(1).
47.  Ran F, Hsu P, Wright J, Agarwala V, Scott D, Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 2013;8(11):2281-2308. 48.  Lalonde  S,  Stone  O,  Lessard  S, Lavertu A, Desjardins J, Beaudoin M
et al. Frameshift indels introduced by genome editing can lead to in-frame exon skipping. PLOS ONE. 2017;12(6):e0178700.
49.  Bauer  D,  Canver  M,  Orkin  S. Generation  of  Genomic  Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. 2014;(83). 50.  Su  T,  Liu  F,  Gu  P,  Jin  H,  Chang  Y, Wang  Q  et  al.  A  CRISPR-Cas9 Assisted Non-Homologous End- Joining Strategy for One-step Engineering  of  Bacterial  Genome. Scientific Reports. 2016;6(1).
51.  Geisinger J, Turan S, Hernandez S,
Spector L, Calos M. In vivoblunt-end cloning through CRISPR/Cas9-
facilitated non-homologous end- joining.  Nucleic  Acids  Research. 2016;44(8):e76-e76.
52.  Maruyama  T,  Dougan  S,  Truttmann M,  Bilate  A,  Ingram  J,  Ploegh  H. Increasing  the  efficiency  of  precise genome  editing  with  CRISPR-Cas9 by  inhibition  of  nonhomologous  end joining. Nature Biotechnology. 2015;33(5):538-542. 53.  Kaur K, Tandon H, Gupta A, Kumar
M.  CrisprGE:  a  central  hub  of CRISPR/Cas-based
genome
editing.Database.2015;2015
54.  Nymark  M,  Sharma  A,  Sparstad  T,
Bones A, Winge P. A CRISPR/Cas9 system  adapted  for  gene  editing  in marine  algae.  Scientific  Reports. 2016;6(1).
55.  Naito  Y,  Hino  K,Bono  H,  Ui-Tei  K. CRISPRdirect: software for designing  CRISPR/Cas  guide  RNA with reduced off-target sites.Bioinformatics.2014;31.1120- 1123.
56.  Jiménez  Blanco  J,  Benito  J,  Ortiz Mellet  C,  García  Fernández  J. Molecular  nanoparticle-based  gene delivery  systems.  Journal  of  Drug Delivery  Science  and  Technology.
2017;42:18-37.
57.  Naldini  L.  Gene  therapy  returns  to centre stage. Nature. 2015;526(7573):351-360. 58.  Dizaj S, Jafari S, Khosroushahi A. A sight  on  the  current  nanoparticle- based gene delivery vectors. Nanoscale Research Letters. 2014;9(1):252. 59.  Morachis JM, Mahmoud EA, Sankaranarayanan  J,  Almutairi  A. Triggered rapid degradation  of nanoparticles  for  gene  delivery. J
Drug Deliv. 2012;9:1 –7.
60.  Hadinoto  K,  Sundaresan  A,  Cheow W. Lipid –polymer hybrid nanoparticles  as  a  new  generation therapeutic  delivery  platform:  A review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics.  2013;85(3):427- 443.
61.  Albanese  A,  Tang  P,  Chan  W.  The Effect  of  Nanoparticle  Size,  Shape, and Surface Chemistry on Biological
Systems. Annual Review of Biomedical Engineering. 2012;14(1):1-16. 62.  Nitta  SK,  Numata  K.  Biopolymer- based  nanoparticles  for  drug/gene delivery and tissue engineering. Int J Mol  Sci. 2013;9(1):1629 –1654.  doi:
10.3390/ijms14011629.
63.  Khan I, Saeed K, Khan I. Nanoparticles: Properties, applications  and  toxicities.  Arabian Journal of Chemistry. 2017;. 64.  Moreno-Vega A, Gómez-Quintero T, Nuñez-Anita  R,  Acosta-Torres  L, Castaño  V.  Polymeric  and  Ceramic Nanoparticles in Biomedical Applications. 2012.
65.  The  Use  of  Nanoparticles  for  Gene Therapy  in  the  Nervous  System. Journal  of  Alzheimer's  Disease,  vol 31. 2012;31:697-710.
66.  Saraiva  C,  Praça  C,  Ferreira  R, Santos  T,  Ferreira  L,  Bernardino  L. Nanoparticle-mediated  brain  drug delivery:  Overcoming  blood –brain barrier  to  treat  neurodegenerative diseases.  Journal  of  Controlled Release. 2016;235:34-47.
67.  Lönn P, Kacsinta A, Cui X, Hamil A, Kaulich M, Gogoi K et al. Enhancing Endosomal  Escape  for  Intracellular Delivery  of  Macromolecular  Biologic Therapeutics.  Scientific  Reports.
2016;6(1).
68.  Qu  X,  Li  P,  Liu  D,  Liu  C,  Zhang  N.
Enhanced gene transfer with multilayered  polyplexes  assembled with  layer-by-layer  technique. IET
Nanobiotechnol. 2012;9(3):122 –128. doi: 10.1049/iet-nbt.2011.0031.
69.  Gabizon  A,  Amitay  Y,  Tzemach  D, Gorin  J,  Shmeeda  H,  Zalipsky  S. Therapeutic efficacy of a lipid-based prodrug of mitomycin C in pegylated liposomes:  Studies  with  human gastro-entero-pancreatic ectopic tumor  models.  Journal  of  Controlled Release. 2012;160(2):245-253.
70.  T ros de Ilarduya C, Sun Y, Düzgüneş
N.  Gene  delivery  by  lipoplexes  and polyplexes.  European  Journal  of
Pharmaceutical
Sciences.
2010;40(3):159-170. 71.  Wang Q, Shen M, Zhao T, Xu Y, Lin
J, Duan Y et al. Low toxicity and long circulation  time  of  Polyampholyte- coated  magnetic  nanoparticles  for blood pool contrast agents. Scientific Reports. 2015;5(1).
72.  Lin W, Ma G, Ji F, Zhang J, Wang L,
Sun  H  et  al.  Biocompatible  long- circulating star carboxybetaine polymers. Journal of Materials
Chemistry B. 2015;3(3):440-448.
73.  Zylberberg  C,  Gaskill  K,  Pasley  S, Matosevic  S.  Engineering  liposomal nanoparticles  for  targeted  gene therapy.
Gene Therapy. 2017;24(8):441-452. 74.  Yang  J,  Bahreman  A,  Daudey  G,
Bussmann  J,  Olsthoorn  R,  Kros  A. Drug  Delivery  via  Cell  Membrane Fusion  Using  Lipopeptide  Modified Liposomes.  ACS  Central  Science.
2016;2(9):621-630. 75.  Konwar R, Ahmed A. NANOPARTICLE:  AN  OVERVIEW OF PREPARATION, CHARACTERIZATION AND APPLICATION. International Research  Journal  of  Pharmacy. 2016;4(4):47-57. 76.  Sah  E,  Sah  H.  Recent  Trends  in Preparation
of Poly(lactide-co- glycolide)  Nanoparticles  by  Mixing Polymeric  Organic  Solution  with Antisolvent. 2015.
77.  Aili  D,  Mager  M,  Roche  D,  Stevens M. Hybrid  Nanoparticle−Liposome Detection  of  Phospholipase  Activity.
Nano Letters. 2011;11(4):1401- 1405.
78.  Li X, Anton N, Arpagaus C, Belleteix F,  Vandamme  T.  Nanoparticles  by spray  drying  using  innovative  new technology:  The  Büchi  Nano  Spray Dryer  B-90.  Journal  of  Controlled Release. 2010;147(2):304-310.
79.  Wang  Y,  Huang  L.  Composite Nanoparticles  for  Gene  Delivery. Nonviral Vectors for Gene Therapy - Lipid-  and  Polymer-based  Gene Transfer. 2014;:111-137.
80.  Krishnamurthy S, Vaiyapuri R, Zhang L,  Chan  J.  Lipid-coated  polymeric nanoparticles for cancer drug delivery. Biomaterials Science. 2015;3(7):923-936. 81.  Zhang L, Wang P, Feng Q, Wang N, Chen  Z,  Huang  Y  et  al.  Lipid nanoparticle-mediated efficient delivery  of  CRISPR/Cas9  for  tumor therapy. NPG Asia Materials. 2017;9(10):e441.

## LAMPIRAN
Lampiran 1 . Sekuens DNA target pada ekson 1 mHTT (T1-T4) dan kontrol. [1]
Lampiran  2 .  Skema  desain  sekuens  gRNA  dengan  target  spesifik  T1  dan  T3  pada mHTT. [1]