e- Jurnal Rekayasa dan Teknologi Budidaya Perairan
Volume I No 1 Oktober 2012 ISSN: 2302-3600

## PENGARUH WAKTU PEMBERIAN PROBIOTIK YANG BERBEDA
TERHADAP RESPON IMUN  NON-SPESIFIK IKAN MAS
( Cyprinus carpio L.)  YANG DIUJI TANTANG DENGAN BAKTERI

## Aeromonas salmonicida

## EFFECT OF DIFFERENT TIME OF PROBIOTIC ADMINISTRATION TO NON- SPECIFIC IMMUNE RESPONSE  OF COMMON CARP
( Cyprinus carpio ) AGAINST Aeromonas salmonicida
Septiarini * , Esti Harpeni * dan Wardiyanto *

## ABSTRACT †
Common  carp  ( Cyprinus  carpio )  is  one  of  the  consumption  fish  which  has  high economic  value.  However,  the  efforts  to  increase  carp  production  obstracted  by diseases such as furunculosis by A. salmonicida . So that we have to consider the disease  prevention  method  which  safer  such  as  probiotic.  The  aims  of  this research  were  to  know  effect  of  the  time  administrations  of  probiotic  on  non- specific immune responses and to know the best time administration of probiotic on  non-specific  immune  responses  of  common  carp  injected  by A.  salmonicida . The  research  was  conducted  from  August  to  October  2011.  The  research  used three  treatments  (without  administration  of  probiotic,  administration  of  probiotic once  every  day,  and  administration  of  probiotic  once  every  five  days)  with  four replications. Data of total leukocyte and percentage of differential leukocyte were analyzed  by  using  ANOVA,  while  RPS  and  water  qualities  were  analyzed descriptively. The results showed the time administrations of probiotic showed a real  impact  on  improving  non-specific  immune  responses  characterized  by increased total leukocyte in carp, administration of probiotic once every five days resulted  better  non-specific  immune  responses,  which  had  been  seen  from  the highest  total  leukocyte  and  the  highest  RPS  after  being  injected  by A. salmonicida .
Key words: common carp, probiotic, A. salmonicida, leukocyte.
* Jurusan Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Lampung
† Corresponding Author: jrtbp@yahoo.com
P endahuluan
Usaha  peningkatan  produksi  ikan  mas ( Cyprinus  carpio )  tidak  terlepas  dari masalah  penyakit  yang  diantaranya disebabkan  oleh  bakteri Aeromonas salmonicida sebagai penyebab penyakit
furunculosis .  Penanggulangan  penyakit pada  budidaya  ikan  umumnya  masih menggunakan antibiotik yang mempunyai  dampak  negatif  cukup tinggi, baik bagi ikan maupun manusia yang mengonsumsinya. Namun, penggunaan antibiotik tidak bisa
dihindari  jika  wabah  penyakit  sudah terjadi.  Oleh  karena  itu,  diupayakan metode  pencegahan  penyakit  yang dinilai  lebih  aman  yaitu  dengan penggunaan probiotik.
Mekanisme kerja probiotik diantaranya dapat sebagai penstimulasi sistem imun non-spesifik pada ikan. Namun, pemberian  probiotik  yang  dilakukan secara terus menerus dapat
menurunkan  keefektifannya,  sehingga pemberian  probiotik  dengan  waktu berselang diharapkan akan lebih efektif dan  dapat  menghasilkan  sistem  imun yang lebih baik karena setiap probiotik yang  masuk  ke  dalam  tubuh  dapat langsung  merangsang  aktifnya  sistem imun. Peningkatan sistem imun tersebut  diharapkan  dapat  melindungi ikan  mas  dari  serangan  bakteri A. salmonicida sehingga  kesehatan  ikan mas  dapat  meningkat  dan  didapatkan sintasan yang tinggi.

## Bahan dan Metode
Penelitian  dilaksanakan  pada  bulan Agustus  sampai  Oktober  2011,  di Laboratorium Budidaya Perikanan, Universitas  Lampung.  Bahan-bahan yang  digunakan  antara  lain  ikan  mas berukuran  ±  10  cm  sebanyak  50  ekor untuk  uji  LD 50 dan  120  ekor  untuk perlakuan,  pelet  komersil,  probiotik,
biakan  bakteri A.  salmonicida ,  garam, minyak  imersi,  media  TSA,  media TSB, alkohol 70%, larutan EDTA 10%, methanol, larutan Turk’s dan Giemsa. Penelitian dirancang menggunakan Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL) dengan  3  perlakuan  yaitu  perlakuan  1 (pakan  tanpa  penambahan  probiotik), perlakuan  2  (pakan  dan  probiotik diberikan  setiap  hari),  dan  perlakuan  3 (pakan dan probiotik diberikan setiap 5 hari  sekali).  Tiap  perlakuan  diulang sebanyak  4  kali  ulangan,  dengan asumsi  ukuran  dan  kondisi  ikan, lingkungan,  serta  konsentrasi  bakteri uji tantang pada masing-masing perlakuan uji homogen.
Uji  LD 50 dilakukan  untuk  mengetahui konsentrasi bakteri yang dapat menyebabkan kematian ikan uji sebanyak 50% dari populasi awal. Dari hasil  uji  tersebut,  dapat  diketahui konsentrasi bakteri yang akan diinfeksikan  pada  ikan  uji.  Uji  LD 50 dilakukan dengan menyuntikkan bakteri A.  salmonicida pada  ikan  mas dengan  konsentrasi  berbeda  yaitu  10 4 , 10 5 ,  10 6 ,  10 7 ,  dan  10 8 cfu/ml  dengan menggunakan teknik pengenceran berseri.  Tiap  perlakuan  menggunakan 10  ekor  ikan.  Penyuntikan  dilakukan sesuai  perlakuan  konsentrasi  secara intraperitoneal sebanyak  0,1  ml/ekor ikan.  Pengamatan  jumlah  kematian ikan dilakukan selama 7 hari. Probiotik dicampurkan ke pakan yang sebelumnya telah diukur dosisnya yaitu 3,3 ml/kg pakan. Pengenceran probiotik  menggunakan  air  dengan perbandingan 1:50. Pencampuran dilakukan dengan cara menyemprotkan larutan probiotik ke pakan menggunakan sprayer dan  kemudian dikeringanginkan selama ± 2 jam.
Penentuan  waktu  pemberian  pakan berprobiotik  berdasarkan  penelitian
Agustina dkk. (2006) yaitu: tanpa  penambahan  probiotik,  probiotik diberikan  setiap  hari  dan  probiotik diberikan  setiap  5  hari  sekali.  Pakan berprobiotik  diberikan  sesuai  waktu pemberian  selama  28  hari  waktu pemeliharaan dengan frekuensi dua kali sehari menggunakan feeding rate 3%. Uji  tantang  dilakukan  pada  hari  ke-22 waktu  pemeliharaan  dengan  metode injeksi yaitu menyuntikkan A. salmonicida ke  dalam  tubuh  ikan secara intraperitoneal dengan menggunakan konsentrasi bakteri sesuai  hasil  LD 50 yaitu  10 6 cfu/ml  ke semua  ikan  uji  dalam  perlakuan. Pengambilan  sampel  darah  dilakukan pada hari ke- 0, 14, 21, dan 28. Sampel darah diambil dari satu  ekor ikan  yang dipilih secara acak pada setiap akuarium.  Sebelum  digunakan,  jarum suntik  dan  tabung eppendorf dibilas dengan  larutan  EDTA  10%  untuk mencegah pembekuan darah. Pengambilan  darah  dilakukan  melalui vena  caudalis yang  berada  di  pangkal ekor ikan menggunakan jarum suntik 1 ml.  Ikan  yang  telah  diambil  darahnya kemudian  dikembalikan  ke  akuarium semula.  Kemudian  darah  disimpan dalam tabung eppendorf untuk kemudian dilihat parameter hematologinya. Pemeriksaan  darah  dilakukan  untuk melihat  pola  peningkatan  respon  imun dengan  menghitung  total  leukosit  dan diferensial leukosit dalam darah menggunakan hemositometer. Pengamatan  diferensial  leukosit  dalam penelitian meliputi pengamatan neutrofil, monosit, dan limfosit, dengan rumus : Persentase  perlindungan  relatif  yang menunjukkan tingkat keberhasilan probiotik  dalam  melindungi  ikan  dari infeksi  bakteri A.  salmonicida pada masing-masing perlakuan dapat
dihitung  menggunakan  rumus  sebagai berikut (Passarela, 2006):
[ ]
DF p :  Kematian  Ikan  yang  diberi Probiotik DFN p :  Kematian  Ikan  yang  tak  di beri Probiotik
Data  hasil  penghitungan  total  leukosit dan  diferensial  leukosit  dianalisis dengan ANOVA ( Analysis of Variance ) menggunakan software SPSS 19 pada selang kepercayaan 95% dan jika hasil berbeda nyata dilanjutkan dengan uji BNT pada selang kepercayaan  95%.  Sedangkan  RPS dianalisis secara deskriptif.

## Hasil dan Pembahasan
Leukosit  pada  ikan  berbentuk  lonjong sampai bulat dan tidak berwarna. Total leukosit  ikan  normal berkisar  antara 20.000-150.000 sel/mm 3 ( Erika, 2008 ) . Total  leukosit  pada  semua  perlakuan masih  dalam  kisaran  normal  (Gambar 1).  Hasil  uji  ANOVA  menunjukkan bahwa pada hari ke-0, waktu pemberian  probiotik  yang  berbeda tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap  total  leukosit  pada  taraf  5% ( P >0,05).  Total  leukosit  perlakuan  A, B,  dan  C  pada  hari  ke-0  menunjukkan nilai yang hampir sama yaitu 41.025±267; 40.750±317; dan 40.963±348  sel/mm 3 .  Hal  tersebut diduga  karena  belum  ada  perlakuan pemberian  probiotik  pada  ikan  mas sehingga  leukosit  belum  teraktifasi.
Total leukosit/mm 3 =    jumlah sel leukosit terhitung x pengenceran
Pengaruh  yang  nyata  baru  ditunjukkan pada hari ke-14, 21, dan 28 (P=0,000). Hasil  uji  lanjut  BNT  menunjukkan bahwa  pada  hari  ke-14  dan  21,  semua perlakuan  menunjukkan  hasil  yang berbeda.  Total  leukosit  pada  perlakuan B  dan  C  lebih  tinggi  dibandingkan dengan perlakuan A (Gambar 1). Hasil uji  lanjut  BNT  menunjukkan  bahwa pada  hari  ke-28,  semua  perlakuan menunjukkan hasil yang berbeda nyata.
Semua
perlakuan
mengalami peningkatan  total  leukosit  setelah diinfeksi  dengan A.  salmonicida yaitu berturut-turut sebesar 22.612,5; 23.512,5; dan 34.950,0 sel/mm 3
dibandingkan pada hari ke-21 (Gambar
1).  Peran  probiotik  di  sini  yaitu meningkatkan  sistem  imun  yang  sudah ada  dalam  tubuh.  Peningkatan  total leukosit mengindikasikan adanya respon  perlawanan  tubuh  terhadap antigen  penyebab  penyakit  (Alamanda dkk., 2007). Perlakuan C menghasilkan total leukosit yang lebih tinggi dibandingkan perlakuan B. Hal tersebut menunjukkan bahwa  pemberian  probiotik  setiap  5 hari  sekali  menghasilkan  sistem  imun yang  lebih  baik  dibandingkan  dengan pemberian  setiap  hari  dilihat  dari tingginya  total  leukosit  yang  berperan dalam  imunitas  non-spesifik  (Agustina dkk., 2006).
Gambar 1.  Total  leukosit  tiap  pengamatan  pada  tiap  perlakuan,  (A)  tanpa pemberian  probiotik,  (B)  pemberian  probiotik  setiap  hari,  (C) pemberian  probiotik  setiap  5  hari  sekali,  (H0)  hari  ke-0  sebelum pemberian  probiotik,  (H14)  hari  ke-14  setelah  pemberian  probiotik, (H21)  hari  ke-21  setelah  pemberian  probiotik,  dan  (H28)  hari  ke-28 setelah pemberian probiotik (6 hari setelah uji tantang)
Persentase  neutrofil  dalam  populasi leukosit  ikan  normal  berkisar  antara  6- 8%  (Yuliawati,  2010).  Persentase neutrofil  pada  perlakuan  A,  B,  dan  C selama penelitian berturut-turut berkisar  8-15,5%;  8-17%;  dan  8,25- 18,75% (Gambar 2). Hasil uji ANOVA menunjukkan  bahwa  pada  hari  ke-0, waktu pemberian probiotik yang berbeda  tidak  memberikan  pengaruh yang nyata terhadap persentase
neutrofil  ikan  mas  pada  taraf  5%
( P >0,05). Persentase neutrofil perlakuan  A,  B,  dan  C  pada  hari  ke-0 menunjukkan  nilai  yang  hampir  sama yaitu 8±0,41%; 8±0,41%; dan 8,25±0,48%  (Gambar  2).  Hal  tersebut karena  belum  ada  benda  asing  baik bakteri probiotik maupun A. salmonicida yang  masuk  ke  dalam tubuh  ikan  mas  sehingga  neutrofil belum teraktifasi. Pengaruh yang nyata
0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 A B C Total Leu ko si t (sel /m m 3 ) H0 H14 H21 H28 normal
baru  ditunjukkan  pada  hari  ke-14 ( P =0,000),  hari  ke-21  ( P =0,000),  dan hari  ke-28  ( P =0,015).  Hasil  uji  lanjut BNT  menunjukkan  bahwa  pada  hari ke-14 dan 21, antar perlakuan B dan C tidak  berbeda  nyata,  namun  keduanya berbeda  nyata  terhadap  perlakuan  A. Tingginya  persentase  neutrofil  pada perlakuan  dengan  pemberian  probiotik menunjukkan  bahwa  probiotik  yang masuk ke dalam tubuh dapat meningkatkan persentase neutrofil dalam  darah.  Probiotik  mengandung lipopolisakarida  (Khasani,  2007)  yang dapat menstimulasi sistem imun melalui peningkatan aktifitas fagositosis  oleh  neutrofil  dan  monosit (Hastuti  dan  Karoror,  2007).  Namun,
pada hari ke-21 terjadi sedikit penurunan  persentase  neutrofil  yang diduga  karena  pada  saat  yang  sama, terjadi  peningkatan  persentase  limfosit karena  telah  dilakukan  pemberian probiotik  yang  kesekian  kalinya  (21 kali  pada  perlakuan  B  dan  5  kali  pada perlakuan C), sehingga memicu terbentuknya sistem imun spesifik oleh limfosit. Hasil uji lanjut BNT menunjukkan  bahwa  pada  hari  ke-28, hanya  antar  perlakuan  A  dan  C  yang berbeda nyata, sedangkan antar perlakuan  A  dan  B,  serta  antar perlakuan B dan C tidak berbeda nyata. Meskipun  demikian,  semua  perlakuan menunjukkan  peningkatan  persentase neutrofil pada hari ke-28 yaitu berturut- turut  sebesar  7%;  5,75%;  dan  6,75% dibandingkan pada hari ke-21 (Gambar 2).  Peningkatan  jumlah  neutrofil  yang tinggi  dalam  sirkulasi  darah  disebut heterofilia  yang  terjadi  karena  adanya infeksi  penyakit  oleh  bakteri  dan  juga karena  kondisi  stress  (Erika,  2008).
Peningkatan persentase neutrofil
mengindikasikan  peningkatan  sistem imun (Alamanda dkk., 2007).
Sel monosit berbentuk oval dengan inti ada  yang  berbentuk  oval  dan  ada  yang berbentuk  seperti  jantung.  Persentase monosit  dalam  populasi  leukosit  ikan normal berkisar antara 0,1-3% (Yuliawati,  2010).  Persentase  monosit pada  perlakuan  A,  B,  dan  C  selama penelitian  berturut-turut  berkisar  3,75- 6%; 3,5-6%; dan 3-6,25% (Gambar 3). Hasil uji ANOVA menunjukkan bahwa pada  hari  ke-0,  14,  21,  dan  28,  waktu pemberian  probiotik  yang  berbeda tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap  persentase  monosit  ikan  mas pada  taraf  5%  ( P >0,05).  Hal  tersebut menunjukkan bahwa pemberian probiotik  (setiap  hari  maupun  setiap  5 hari  sekali)  dan  tanpa  pemberian probiotik tidak menunjukkan perbedaan  yang  signifikan  terhadap persentase monosit dalam leukosit ikan mas. Persentase monosit pada perlakuan A sedikit menurun pada hari ke-14  dan  terus  meningkat  pada  hari ke-21 dan 28. Sedangkan pada perlakuan  B  terjadi  peningkatan  pada hari ke-14, penurunan pada hari ke-21, dan  kembali  terjadi  peningkatan  pada hari ke-28. Perlakuan C terus mengalami peningkatan hingga hari ke- 28  (Gambar  3).  Semua  perlakuan mengalami peningkatan persentase monosit setelah diinfeksi A. salmonicida pada  hari  ke-28  yaitu berturut-turut  sebesar  1,75%;  2%;  dan 2% dibandingkan pada hari ke-21. Sel  limfosit  pada  ikan  berbentuk  oval dengan  inti  sel  besar  berwarna  violet hampir  memenuhi  sel.  Persentase limfosit  dalam  populasi  leukosit  ikan normal berkisar antara 60-80%
(Yuliawati,  2010).  Persentase  limfosit pada  perlakuan  A,  B,  dan  C  selama penelitian  berturut-turut  berkisar  78,5- 88,25%;  77-88,5%;  dan  75-88,75% (Gambar  4).  Hasil  uji  ANOVA
menunjukkan  bahwa  pada  hari  ke-0, waktu pemberian probiotik yang berbeda  tidak  memberikan  pengaruh yang nyata terhadap persentase limfosit ikan  mas  pada  taraf  5%  ( P >0,05). Persentase limfosit perlakuan A, B, dan C  pada  hari  ke-0  menunjukkan  nilai yang  hampir  sama  yaitu  88,25±0,48%; 88,50±0,50%;  dan  88,75±0,25%.  Hal tersebut  karena  belum  ada  perlakuan yang diberikan pada ikan mas. Pengaruh  yang  nyata  baru  ditunjukkan pada  hari  ke-14  ( P =0,000),  hari  ke-21 ( P =0,002),  dan  hari  ke-28  ( P =0,030). Hasil  uji  lanjut  BNT  menunjukkan bahwa  pada  hari  ke-14  dan  21,  antar perlakuan B dan C tidak berbeda nyata,
namun keduanya berbeda nyata terhadap perlakuan A, yang ditunjukkan  dari  persentase  limfosit perlakuan B tidak jauh berbeda dengan perlakuan C, namun keduanya memiliki  persentase  limfosit  lebih rendah dibandingkan dengan perlakuan A.  Erika  (2008)  menyatakan  hal  yang serupa  bahwa  jumlah  limfosit  yang rendah  dalam  sirkulasi  darah  akan diimbangi  dengan  jumlah  neutrofil yang  tinggi,  dan  sebaliknya.  Hasil  uji
lanjut  BNT  menunjukkan  bahwa  pada hari  ke-28,  hanya  antar  perlakuan  A dan  C  yang  berbeda  nyata,  sedangkan antar  perlakuan  A  dan  B,  serta  antar perlakuan B dan C tidak berbeda nyata. Meskipun  demikian,  semua  perlakuan menunjukkan  penurunan  persentase limfosit pada hari ke-28 yaitu berturut- turut sebesar 8,75%; 7,75%; dan 8,75% dibandingkan pada hari ke-21, walaupun masih dalam batas normal. Nilai RPS dari hasil penelitian dianalisis  secara  deskriptif.  Persentase perlindungan  relatif  pada  perlakuan  B dan  C  cukup  baik  yaitu  di  atas  50% (Setyawan, 2006). Persentase perlindungan  relatif  dari  perlakuan  C yaitu 94,74%, lebih tinggi dibandingkan perlakuan B yaitu
73,68%  (Gambar  5).  Agustina  dkk. (2006)  menunjukkan  hal  yang  serupa bahwa  pemberian  probiotik  setiap  5 hari  sekali  memberikan  respon  imun yang lebih baik sehingga menghasilkan sintasan  yang  lebih  tinggi  yaitu mencapai  90%.  Pemberian  probiotik secara terus menerus dan dalam jangka waktu lama dapat menurunkan efektifitasnya (Agustina et al ., 2006).
Gambar 2.  Persentase  neutrofil  tiap  pengamatan  pada  tiap  perlakuan,  (A)  tanpa pemberian  probiotik,  (B)  pemberian  probiotik  setiap  hari,  (C) pemberian  probiotik  setiap  5  hari  sekali,  (H0)  hari  ke-0  sebelum pemberian  probiotik,  (H14)  hari  ke-14  setelah  pemberian  probiotik, (H21)  hari  ke-21  setelah  pemberian  probiotik,  dan  (H28)  hari  ke-28 setelah pemberian probiotik (6 hari setelah uji tantang).
0 5 10 15 20 A B C Per sen tase N e u tr o fi l ( % ) H0 H14 H21 H28 normal
Gambar 3.  Persentase  monosit  tiap  pengamatan  pada  tiap  perlakuan,  (A)  tanpa pemberian  probiotik,  (B)  pemberian  probiotik  setiap  hari,  (C) pemberian  probiotik  setiap  5  hari  sekali,  (H0)  hari  ke-0  sebelum pemberian  probiotik,  (H14)  hari  ke-14  setelah  pemberian  probiotik,
(H21)  hari  ke-21  setelah  pemberian  probiotik,  dan  (H28)  hari  ke-28 setelah pemberian probiotik (6 hari setelah uji tantang) Gambar 4.  Persentase  limfosit  tiap  pengamatan  pada  tiap  perlakuan,  (A)  tanpa pemberian  probiotik,  (B)  pemberian  probiotik  setiap  hari,  (C) pemberian  probiotik  setiap  5  hari  sekali,  (H0)  hari  ke-0  sebelum pemberian  probiotik,  (H14)  hari  ke-14  setelah  pemberian  probiotik, (H21)  hari  ke-21  setelah  pemberian  probiotik,  dan  (H28)  hari  ke-28 setelah pemberian probiotik (6 hari setelah uji tantang)
Gambar 5.  Nilai RPS ( Relative Percent Survival ), (B) pemberian probiotik setiap hari, (C) pemberian probiotik setiap 5 hari sekali
0 2 4 6 8 10 A B C Per sen tase M o n o si t (% ) H0 H14 H21 H28 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 A B C Pe rse n tas e Lim fo sit ( % ) H0 H14 H21 H28 0.00% 50.00% 100.00% B C RP S normal normal

## Daftar Pustaka
Agustina,  D.T.,  Marnani,  S.,  dan
Irianto,  A.  2006.  Pengaruh  Pola Pemberian  Probiotik  A3-51  per Oral terhadap Kelangsungan Hidup Bawal Air Tawar ( Collosoma  macropomum Bry.) setelah  Diuji  Tantang  dengan Bakteri Aeromonas  hydrophila . (Skripsi).  Universitas  Jenderal
Soedirman. Alamanda,  I.E.,  Handajani,  N.S.,  dan Budiharjo,  A.  2007.  Penggunaan Metode Hematologi dan Pengamatan  Endoparasit  Darah untuk  Penetapan  Kesehatan  Ikan Lele Dumbo ( Clarias gariepinus ) di Kolam Budidaya Desa Mangkubumen  Boyolali. Jurnal Biodiversitas 8 (1):34-38. Erika, Y. 2008. Gambaran Diferensiasi Leukosit pada Ikan Mujair
( Oreochromis  mossambica )  di Daerah Ciampea Bogor. (Skripsi). Institut Pertanian Bogor. Hastuti,  S.D.  dan  Karoror,  R.J.  2007. Pengaruh Pemberian LPS (Lipopolisacharida) terhadap Aktivitas  Fagositosis  dan  Jumlah Eritrosit Darah Ikan Nila (Oreochromis sp. ) . Jurnal Protein
15 (1): 10-5
Khasani,  I.  2007.  Aplikasi  Probiotik Menuju Sistem Budidaya Perikanan  Berkelanjutan.  Media Akuakultur 2(2):1-3 Maulina,  I.,  K.  Haetami  dan  Junianto.
2006.  Pengaruh  Meniran  dalam Pakan  untuk  Mencegah  Infeksi Bakteri Aeromonas sp.  pada Benih Ikan Mas ( Cyprinus carpio ). Universitas Padjajaran. Passarela, M.P. 2006. Uji Tantang pada Ikan Gurame ( Osphronemus gouramy ) yang Diimunisasi dengan  Vaksin Inaktif  Anti Aeromonas  hydrophila Peroral melalui  Pelet.  (Skripsi).  Institut Pertanian Bogor. Setyawan, A. 2006. Uji Lapang Vaksin Polivalen Vibrio pada Ikan Kerapu Macan ( Epinephelus fuscoguttatus ) di  Karamba Jaring Apung.  (Skripsi).    Universitas
Gadjah Mada.
Yuliawati, F. 2010. Efektivitas Ekstrak
Meniran ( Phyllanthus niruri ) sebagai  Antibakteri  pada  Ikan Patin ( Pangasianodon hypophthalmus )  yang  Diinfeksi dengan Aeromonas  hydrophila . (Skripsi). Universitas Lampung.