KARAKTERISASI SIDIK JARI DNA ISOLAT Corynespora cassiicola YANG BERASAL DARI BERBAGAI SENTRA

## PERKEBUNAN KARET INDONESIA
Characterization of DNA Finger Printing of Corynespora cassiicola Isolates from Different Regions of Rubber Plantation
Fetrina OKTAVIA, M. MUNIR, H. SURYANINGTYAS, dan KUSWANHADI Balai Penelitian Sembawa, Pusat Penelitian Karet Jalan Raya Palembang – P. Balai KM 29, PO BOX 1127 Palembang 30001
Jurnal Penelitian Karet, 2011, 29 (2)  : 118 - 129 Indonesian  J.  Nat. Rubb. Res. 2011, 2 9 (2) : 118 - 129

## Abstract
One  of  the  important  steps  to  obtain  a superior clone resistant to Corynespora Leaf Fall  Desease  (PGDC)  is  a  selection  test  of resistance  of  rubber  clones to  Corynespora cassiicola fungi.  To  obtain  a  good  result, genetic  information  of C.  Cassiicola isolates used is needed. DNA finger printing of seven C. cassiicola isolates have been done by using RAPD  technique. C.  cassiicola isolates  were isolated from rubber clone of GT 1 derived from seven  regions  of  rubber  plantation  in Indonesia i.e Bengkulu (CBK), Lampung (CLP), West  Kalimantan  (CKB),  Central  Java  (CJT), South Sumatra (CSS), Jambi (CJB) and North Sumatra (CSU). The result of RAPD analysis by using 15 primers showed that the genetic diversity of seven C. cassiicola isolates was high  (89 . 3%).  The  genetic  similarity  value amongs the isolates had a variation, of which the  highest  genetic  similarity  was  found between  South  Sumatra  and  Jambi  isolates (68 . 49%),  and  the  lowest  was  between Lampung  and  South  Sumatra  (51 . 09%).  The UPGMA  analysis  showed  that  the  isolates were  separated  into  four  groups.  It  was concluded that 10 of 15 primers used i.e  OPN- 04, OPN-05, OPN-11, OPN-12, OPN-19, OPN- 20,  OPH-04,  OPH-09.  OPH-12  and  OPH-16 could  produce  a  different  specific  pattern  in each  of  seven  isolates.  Therefore  this technique  could  be  used  as  an  alternative method for the identification of C. cassiicola isolates.
Keywords : Hevea brasiliensis, Corynespora cassiicola, genetic  analysis, RAPD,  primer,  UPGMA,  leaf  fall disease

## Abstrak
Salah  satu  tahapan  penting  untuk mendapatkan  klon  unggul  yang  tahan terhadap Penyakit Gugur Daun Corynespora (PGDC) adalah uji ketahanan klon-klon karet terhadap  serangan  jamur Corynespora cassiicola .  Untuk  mendapatkan  hasil  yang tepat,  diperlukan  informasi  genetik  dari isolat C. cassiicola yang digunakan. Analisis sidik jari DNA dari tujuh isolat C. cassiicola sudah  dilakukan  dengan  menggunakan teknik  RAPD.  Isolat C.  cassiicola diisolasi dari  klon  karet  GT  1  di  tujuh  sentra perkebunan  karet  di  Indonesia  yaitu B e n g k u l u   ( C B K ) ,   L a m p u n g   ( C L P ) , Kalimantan Barat (CKB), Jawa Tengah (CJT), Sumatera  Selatan  (CSS),  Jambi  (CJB)  dan Sumatera Utara (CSU). Hasil analisis RAPD menggunakan  15  primer  menunjukkan bahwa  keragaman  genetik  tujuh  isolat C. cassiicola cukup  tinggi  (89,3%).  Nilai kesamaan  genetik  antara  isolat  bervariasi, dimana  kesamaan  genetik  tertinggi ditemukan  antar  isolat  Sumatera  Selatan dengan Jambi yaitu (68,49%) dan kesamaan terendah  antara  isolat  Lampung  dengan Sumatera Selatan (51,09%). Analisis UPGMA menunjukkan isolat terbagi ke dalam empat kelompok. Dari 15 primer yang digunakan, 10  primer  yaitu  OPN-04,  OPN-05,  OPN-11, OPN-12, OPN-19, OPN-20, OPH-04, OPH-09. OPH-12 dan OPH-16 mampu menghasilkan pola  spesifik  pada  masing-masing  isolat, sehingga  dapat  digunakan  sebagai  metode identifikasi alternatif.
Kata kunci : Hevea brasiliensis, Corynespora cassiicola ,  analisis  genetik, seleksi  klon,  RAPD,  primer, isolat,  UPGMA,  penyakit  gugur daun
Diterima tgl. 19 September 2011/Disetujui 15  Oktober 2011

## PENDAHULUAN
Salah satu tujuan program pemuliaan tanaman  karet  adalah  menghasilkan  klon- klon  unggul  yang  memiliki  produksi  tinggi dan  tahan  terhadap  penyakit,  antara  lain terhadap Penyakit Gugur Daun Corynespora (PGDC)  yang  disebabkan  oleh  jamur Corynespora  cassiicola .  PGDC  menyerang tanaman karet pada semua tingkatan umur, baik pada tanaman di pembibitan maupun tanaman  menghasilkan.  Serangan  PGDC mengakibatkan  terhambatnya  pertum- buhan  dan terjadinya penurunan  produksi yang  cukup  signifikan  sehingga  secara ekonomi sangat merugikan.
Pengendalian  PGDC  secara  kimiawi dirasakan  kurang  efektif,  karena  selain berdampak  negatif  terhadap  lingkungan juga memerlukan biaya yang cukup mahal. Salah satu alternatif yang dapat dilakukan untuk  mengatasi  hal  tersebut  adalah dengan  cara  penanaman  klon-klon  yang tahan terhadap penyakit tersebut, sehingga seleksi  klon-klon  karet  yang  tahan  perlu dilakukan.
Proses seleksi resistensi klon terhadap PGDC  sudah  dimulai  sejak  tahap  awal persilangan,  yaitu  dengan  memilih  tetua yang  memiliki  resistensi  tinggi.  Seleksi lanjutan  dilakukan  terhadap  genotipe- genotipe baru hasil persilangan dengan cara pengujian  di  tingkat  laboratorium,  kebun kayu  okulasi/entres  sampai  tanaman m e n g h a s i l k a n .   D a r i   p e n g u j i a n   i n i ditemukan  genotipe-genotipe  baru  yang memiliki produksi tinggi dan tahan terhadap PGDC.  Ada  kalanya  dari  pengujian ditemukan  suatu  genotipe  baru  tahan terhadap serangan PGDC pada suatu lokasi, namun tidak tahan bila diuji di lokasi yang berbeda. Selain itu tingkat ketahanan suatu klon terhadap serangan PGDC juga berbeda antar daerah. Hal ini diduga terjadi karena adanya  perbedaan  ras  dari  isolat C. cassiicola yang menyerang.
C.  cassiicola memiliki  miselium berwarna coklat kegelapan dan merupakan jamur patogen yang termasuk dalam famili Dentiacea dan genus Corynespora . Jamur ini sudah  tersebar  di  lebih  dari  70  negara. Jamur ini tidak hanya menyerang tanaman karet,  tapi  juga  tanaman  lainnya  dimana sudah  tercatat  lebih  dari  280  spesies
tanaman  yang  meliputi  buah-buahan, sayur-sayuran,  dan  tanaman  kehutanan yang  terinfeksi  jamur  tersebut  (Farr et  al ., 2007).  Pada  tanaman  karet,  serangan C. cassiicola diketahui pertama kali pada tahun 1936  di  Sierra  Leone,  Afrika  Barat,  dan menyerang  perkebunan  karet  di  Indonesia pada  tahun  1980.  Daerah  yang  pernah mengalami serangan berat C. cassiicola yaitu Sumatera  Utara,  Sumatera  Selatan,  Jawa Barat, dan Jawa Tengah (Situmorang et al ., 1996).
Salah satu faktor yang mempengaruhi cepatnya  penyebaran  jamur C.  cassiicola adalah  kemampuan  patogen  tersebut membentuk  ras  baru  yang  lebih  virulen (Situmorang et  al .,  1996).  Klon-klon  karet akan memberikan reaksi yang berbeda pada masing-masing ras tersebut. Perbedaan ras dari  isolat C.  cassiicola dapat  ditentukan dengan  melihat  perbedaan  morfologi koloninya,  bentuk  dan  ukuran  konidia, tingkat patogenisitas dan perbedaan genetik (Darmono et  al .,  1996;  Nghia et  al .,  2008; Shimomoto et  al .,  2011).  Perbedaan  secara morfologi  memiliki  kelemahan,  karena adanya  faktor  pengaruh  lingkungan  yang dapat  menyebabkan  perubahan  morfologi. Alternatif  terbaik  adalah  dengan  melihat perbedaan genetik yang bebas dari pengaruh lingkungan.
Perbedaan  genetik  antar  isolat  dapat terjadi  karena  adanya  mutasi,  substitusi, insersi, dan delesi pada materi genetik suatu isolat.  Analisis  perbedaan  genetik  suatu patogen dapat dilakukan dengan mengamati sidik  jari  DNA  (DNA finger  printing )  dari masing-masing isolat dengan menggunakan marka  molekuler.  Prinsip  dasar  dari  sidik jari  DNA  tersebut  adalah  perbedaan  pola- pola fragment DNA yang dihasilkan (Weising et al ., 2005).
Analisis  molekuler  terhadap  variasi genetik isolat C. cassiicola yang diisolasi dari tanaman  karet  dari  berbagai  lokasi  sudah banyak  dilakukan  seperti  analisis  isolat yang  diisolasi  dari  perkebunan  karet  di S r i l a n k a   d a n   A u s t r a l i a   d e n g a n menggunakan  teknik  rDNA-ITS  dan  RFLP ( Restriction  Fragment  Length  Polymorphism ) (Silva et  al .,  1998),  di    Malaysia  dengan menggunakan  teknik  RAPD  ( Random Amplified Polymorphic DNA ), rDNA-ITS (Atan dan  Hamid,  2003)  dan  ISSR  (Nghia et  al .,
Karakterisasi sidik jari DNA isolat C. cassiicola yang berasal dari berbagai sentra perkebunan karet Indonesia
2008), di Cina dengan menggunakan teknik rDNA-ITS  (rDNA- Internal  Transcribed Spacer )  dan  ISSR  ( Inter  Simple  Sequence Repeat ) (Qi et al ., 2009, 2010) serta di Jepang dengan  menggunakan  teknik  RAPD (Shimomoto et al ., 2011). Untuk Indonesia, analisis  isolat C.  cassiicola dari  beberapa sentra  perkebunan  karet  sudah  pernah dilakukan  oleh  Darmono et  al .  (1996)  dan Situmorang  (2002)  dengan  menggunakan teknik  RAPD,  namun  belum  terlihat perbedaan  genetiknya,  sehingga  belum dapat  digunakan  untuk  karakterisasi m a s i n g - m a s i n g   i s o l a t .   D e n g a n menggunakan  primer  yang  lebih  banyak diharapkan  perbedaan  genetik  antar  isolat dapat  diperoleh,  sehingga  dapat  dijadikan sebagai  alat  identifikasi  strain  isolat  yang menyerang suatu klon.
Penelitian ini bertujuan untuk melihat sidik jari DNA tujuh isolat C. cassiicola asal klon GT 1 dari beberapa sentra perkebunan karet di Indonesia. Sidik jari tersebut dapat digunakan  untuk  membedakan  masing- masing isolat tersebut sehingga seleksi klon unggul tahan terhadap penyakit gugur daun Corynespora dapat dilakukan lebih tepat.

## BAHAN DAN METODE

## Persiapan Isolat
Penelitian  dilaksanakan  di  Laborato- rium  Fisiologi,  Balai  Penelitian  Sembawa dari  bulan  Januari  -  Juni  2011.  Penelitian menggunakan tujuh isolat C. cassiicola yang diisolasi dari klon karet GT 1 tahun tanam 2000  di  beberapa  sentra  perkebunan  di Indonesia  (Tabel  1).  Isolat  ditumbuhkan dalam media PDA ( Potato Dextrose Agar ) (500 mL  ekstrak  kentang,  10  g  dekstrosa,  15  g agar,  500  ml  aquades)  selama  10  hari, kemudian  diambil  1  potong  (O,5  mm) masing-masing biakan dan dimasukkan ke dalam  100  ml  media  PDA  cair  (500  mL ekstrak  kentang,  30  g  sukrosa,  500  ml aquades). Biakan diinkubasi selama 10 hari o pada  24 C  dan  dikocok  dengan  kecepatan 200 rpm.

## Ekstraksi DNA
Ekstraksi  DNA  dilakukan  dengan m e n g g u n a k a n   m e t o d e   C T A B   y a n g
dimodifikasi oleh Situmorang (2002). Miselia diambil  dari  isolat  dan  dicuci  dua  kali dengan  air  steril  menggunakan  penyaring dua  lapis  kain  kasa.  Satu  gram  miselium digerus  dengan  nitrogen  cair.  Tepung miselium  dimasukkan  ke  dalam  tabung sentrifus berukuran 16 ml yang berisi buffer ekstraksi [12,6 ml NaCl 5 M, 2 ml EDTA 0,5 M (pH 8), 5 ml Tris HCl 1 M (pH 8), 10 ml CTAB 10%, 20,4 ml akuabides]. Campuran dikocok dengan  vorteks  kemudian  diinkubasi  pada 65°C selama 30 menit. Ke dalam campur-an ditambahkan  lagi  larutan  PCI  ( Phenol : chloroform :  isoamil  alkohol  =  25  :  24  :  1), divorteks dan disentrifus dengan kecepatan 11  000  rpm  selama  15  menit.  Supernatan diambil  dan  dimasukkan  ke  dalam  tabung baru,  kemudian  ditambahkan  larutan  CI ( chloroform :  isoamil  alkohol  =  24  :  1)  dan disentrifus dengan kecepatan 11 000 rpm se- lama  5  menit.  Supernatan  diambil  dan dimasukkan  ke  dalam  tabung  baru kemudian ditambahkan isopropanol dingin, digoyang  pelan  kemudian  dimasukkan  ke
O dalam freezer pada  suhu  4 C  selama  30 m e n i t .   L a r u t a n   d i s e n t r i f u s   d e n g a n kecepatan  11  000  rpm  selama  15  menit. Pelet  yang  terbentuk  dicuci  dengan  etanol 70%  dingin  dan  disentrifus  dengan kecepatan  11  000  rpm  selama  15  menit, kemudian  dikeringkan.  Pelet  DNA  yang diperoleh  dilarutkan  dalam  1  ml buffer TE [Tris HCl 10 mM (pH 8.0), EDTA 1 mM] dan O disimpan pada suhu 4 C.

## Amplifikasi PCR
Amplifikasi  PCR  dilakukan  menurut metode  William et  al .  (1990)  dengan menggunakan 15 primer acak (OPN-04, 05, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, OPH-04, 08, 09, 12, dan 16) yang berasal dari OPERON Technology.  PCR  dilakukan  dalam  volume 25 L yang terdiri atas 2,5 L DNA template 25 ng/L, 2,5 L buffer 10X + MgCl , 2,5 L dNTP 10 2 mM,  0,5  L  taq  DNA polymerase 5  U/L,  1  L primer  10  mM  dan  18,3  L  ddH O.  Reaksi 2 dilakukan dengan menggunakan mesin PCR T-Personal  Biometra  (Jerman)  dengan kondisi program 45 siklus yang terdiri atas
o denaturasi selama 1 menit pada suhu 95 C,
o annealing 1  menit  pada  suhu  53 C  dan O extension selama  2  menit  pada  suhu  72 C. Siklus  terakhir  diikuti  dengan  inkubasi O selama 4 menit pada suhu 72 C.

## Oktavia, Munir, Suryaningtyas dan Kuswanhadi
Hasil  amplifikasi  DNA  dianalisis dengan menggunakan 1% gel agarose dalam 1X buffer TAE  (0,04  M  Tris-acetic  dalam  1 m M   E D T A ) .   G e l   d i w a r n a i   d e n g a n menggunakan ethidium bromide (Sambrook et al ., 1989). Selanjutnya gel difoto di bawah UV transiluminator.

## Analisis Data RAPD
Analisis  keragaman  genetik  isolat C. cassiicola dilakukan dengan membuat skor terhadap  pita-pita  DNA  yang  dihasilkan. Berdasarkan  hasil  penskoran  disusun dendogram  dengan  menggunakan  program Numerical  Taxonomy  and  Multi - variate Analysis System (NTSYS-pc) versi 1.8 (Rohlf, 1993). Koefisien kesamaan genetik dan jarak genetik dianalisis dengan analisis gerombol yang digunakan untuk menentukan matrik j a r a k   g e n e t i k   b e r d a s a r k a n   m e t o d e Unweighed  Pair-Group  Averages (UPGMA). Karakterisasi  genetik  isolat C.  cassiicola dilakukan  secara  visual  dengan  mem- perhatikan pola pita DNA yang terbentuk.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Identifikasi Morfologi
Salah  satu  cara  untuk  meng- identifikasi  isolat C.  Cassiicola adalah dengan melihat perbedaan morfologi koloni yang  dihasilkan.  Dari  tujuh  isolat  yang dianalisis,  ditemukan  perbedaan  pada bentuk,  tekstur,  dan  warna  miselium  dari masing-masing isolat. Pada isolat CBK dan
CSU,  koloni  miselium  berbentuk  bulat dengan  pinggiran  rata,  tekstur  miselium seperti kapas ( cottony ), dan berwarna putih. Meskipun  bentuk  dan  tekstur  miselium sama  dengan  isolat  CBK  dan  CSU,  warna isolat  CKB,  CJB  dan  CJT  berbeda,  dimana isolat CKB berwarna putih agak gelap, CJB gelap kehitaman dan CJT awalnya berwarna putih  dan  menjadi  gelap  seiring  dengan bertambahnya  umur  kultur.  Isolat  CSS berbentuk  bulat  dengan  pinggiran  rata, tekstur  miselium stelate ,  warna  miselium pada  awal  inokulasi  putih  dan  seiring bertambahnya  umur  kultur  isolat,  warna koloni  miselium  menjadi  gelap  atau  hitam. Berbeda  dengan  bentuk  keenam  isolat lainnya, bentuk isolat CLP tidak beraturan, tekstur  seperti  kapas  dan  berwarna  putih (Gambar 1).
Perbedaan  morfologi  antar  ketujuh isolat  yang  diamati  tidak  berhubungan dengan  kedekatan  asal  geografis,  seperti isolat  CSS  dan  CJB  yang  secara  geografis cukup  dekat,  namun  memiliki  perbedaan pada  tekstur  miselium  atau  CKB  dan  CSU yang  secara  geografis  cukup  jauh  tetapi memiliki  kesamaan  pada  bentuk,  tekstur dan  warna miselum .  Hal  yang  sama  juga dilaporkan  oleh  Darmono et.  al (1996), dimana  perbedaan  morfologi  isolat C . cassiicola tidak  berhubung-an  dengan  asal klon dan geografis.
Salah  satu  permasalahan  yang d i h a d a p i   p a d a   i d e n t i f i k a s i   i s o l a t berdasarkan  perbedaan  morfologi  adalah p e r u b a h a n   w a r n a   m i s e l i u m   a k i b a t perubahan waktu kultur. Hal ini merupakan s a l a h   s a t u   k e l e m a h a n   i d e n t i f i k a s i

## Tabel 1. Daerah asal dan kode isolat yang dianalisis
Table 1. Origin and code of the analyzed isolates
No Isolat Isolate Asal Wilayah Origin Kode Isolat Isolate Code 1 Corynespora casiicola Bengkulu CBK 2 Corynespora casiicola Lampung CLP 3 Corynespora casiicola Kalimantan Barat CKB 4 Corynespora casiicola Jawa Tengah CJT 5 Corynespora casiicola Sumatera Selatan CSS 6 Corynespora casiicola Jambi CJB 7 Corynespora casiicola
Sumatera Utara
CSU
Karakterisasi sidik jari DNA isolat C. cassiicola yang berasal dari berbagai sentra perkebunan karet Indonesia
Gambar 1.  Morfologi koloni tujuh isolat C. cassiicola
Figure 1.  Morphology of colony of seven C. cassiicola isolates

## CBK CLP
CKB                                    CJT CSS CJB CSU CBK  =  Isolat asal Bengkulu (Isolate from Bengkulu)
CLP  =  Isolat asal Lampung (Isolate from Lampung)
CKB  =  Isolat asal Kalimantan Barat (Isolate from West Kalimantan) CJT  =  Isolat asal Jawa Tengah (Isolate from Central Java) CSS  =  Isolat asal Sumatera Selatan (Isolate from South Sumatera) CJB  =   Isolat asal Jambi (Isolate from Jambi) CSU  =  Isolat asal Sumatera Utara (Isolate from North Sumatera)
Oktavia, Munir, Suryaningtyas dan Kuswanhadi
berdasarkan  morfologi  karena  adanya p e n g a r u h   l i n g k u n g a n   y a n g   d a p a t mengakibatkan perubahan.

## Identifikasi Molekuler
Keragaman genetik isolat C. cassiicola
Hasil  analisis  RAPD  tujuh  isolat C. cassiicola yang diisolasi dari klon karet GT 1 dari  tujuh  sentra  perkebunan  karet  di Indonesia yang diuji dengan 15 primer acak terpilih  menunjukkan  bahwa  polimorfisme DNA  ketujuh  isolat  tersebut  cukup  tinggi y a i t u   8 9 , 3 %   ( T a b e l   2 ) .   T i n g g i n y a p o l i m o r f i s m e   D N A   y a n g   d i h a s i l k a n menunjukkan  bahwa  keragaman  genetik ketujuh  isolat  tersebut  cukup  tinggi. P o l i m o r f i s m e   m e r u p a k a n   g a m b a r a n amplifikasi  yang  diperoleh  dari  perbedaan fragmen  DNA  yang  diamati  dan  diskor sebagai  ada  tidaknya  perbedaan  sekuen, sehingga  menunjukkan  adanya  variasi (Oktavia et al ., 2009). Jumlah pita DNA yang dihasilkan  oleh  masing-masing  primer berkisar 5 - 14 pita yang berukuran 150 - 10 000 bp   (Tabel 2). Setiap pita DNA mewakili karakter  molekuler  yang  bersifat  spesifik karena  merupakan  hasil  pelipatgandaan satu  potongan  DNA,  namun  pita  tersebut tidak  dapat  secara  otomatis  dianggap berasosiasi dengan sifat tertentu kecuali jika dapat  dibuktikan  dengan  hasil  analisis keterpautan (Darmono et al ., 1996).
Dari  dendogram  yang  disusun berdasar-kan  polimorfisme  pita-pita  DNA yang  dihasilkan  terlihat  bahwa  pada kesamaan  genetik  66%  terbentuk  4 kelompok  isolat  dimana  kelompok  pertama terdiri dari isolat yang berasal dari Bengkulu (CBK),  kelompok  kedua  terdiri  dari  isolat Lampung (CLP) dan Sumatera Utara (CSU), kelompok  ketiga  terdiri  dari  isolat Kalimantan Barat (CKB), Sumatera Selatan (CSS)  dan  Jambi  (CJB),  serta  kelompok keempat  terdiri  dari  isolat  Jawa  Tengah (CJT).
Matrik  kesamaan  genetik  menun- jukkan proporsi pita DNA yang sama-sama dimiliki oleh masing-masing isolat. Proporsi kepemilikan pita DNA ini akan menentukan persentase  kesamaan  genetik  antar  isolat. Kesamaan genetik tertinggi ditemukan antar
isolat  Sumatera  Selatan  dan  Jambi  yaitu 0,6849  (68,49%)  dan  kesamaan  terendah antara  isolat  Lampung  dan  Sumatera Selatan yaitu 0,5109 (51,09%) (Tabel 3). Dari hasil analisis tersebut terlihat bahwa tingkat kesamaan  genetik  masing-masing  isolat tidak  semuanya  tergantung  kepada kedekatan  lokasi geografis (Gambar 2). Hal yang  sama  juga  ditemukan  pada  analisis isolat C.  cassiicola dari  sentra  perkebunan karet di Malaysia  dan Cina.
Sidik Jari DNA Isolat C. cassiicola untuk Identifikasi Ras
Identifikasi  isolat C.  cassiicola secara molekuler memberikan hasil yang lebih tepat dibandingkan  dengan  identifikasi  secara morfologi,  karena  identifikasi  DNA  tidak dilakukan  terhadap  produk-produk  hasil genom  dan  tidak  terpengaruh  oleh  kondisi lingkungan.  Berdasarkan  sidik  jari  DNA yang  dihasilkan  dari  hasil  analisis  RAPD, maka isolat dapat dibedakan satu sama lain.
Dari 15 primer yang digunakan untuk analisis sidik jari DNA 7 isolat C. cassiicola , 10  primer  mampu  menghasilkan  pola  pita DNA  yang  spesifik  pada  masing-masing isolat,  sementara  5  primer  lainnya  hanya menghasilkan  2 - 5  pola  pita.  Primer  yang memberikan pola pita spesifik yaitu OPN-04, OPN-05, OPN-11, OPN-12, OPN-19, OPN-20, OPH-04,  OPH-09.  OPH-12  dan  OPH-16. Kesepuluh primer tersebut dapat digunakan untuk membedakan isolat C. cassiicola yang b e r a s a l   d a r i   B e n g k u l u ,   L a m p u n g , Kalimantan Barat, Jawa Tengah, Sumatera Selatan, Jambi dan Sumatera Selatan.
G a m b a r   3   m e n u n j u k k a n   h a s i l amplifikasi  DNA  tujuh  isolat C.  cassiicola yang  menghasilkan  pola  spesifik  pada masing-masing isolat dengan menggunakan 10 primer. Jumlah pita DNA yang dihasilkan dari  amplifikasi  masing-masing  primer bervariasi,  dimana  pada  primer  OPN-04 berkisar 4 - 8 pita (Gambar 3A), OPN-05 2-6 pita per isolat (Gambar 3B), OPN-11 2-9 pita per  isolat  (Gambar  3C),  OPN-12  2  -  4  pita (Gambar 3D), OPN-19 3 - 7 pita (Gambar 3E), OPN-20 7 - 10 pita (Gambar 3F), OPH-04 4 - 5 pita (Gambar 3G), OPH-09 4 - 9 pita (Gambar 3H), OPH-12 2 - 7 pita (Gambar 3I) dan OPH- 16 2 - 6 pita (Gambar 3J).
Karakterisasi sidik jari DNA isolat C. cassiicola yang berasal dari berbagai sentra perkebunan karet Indonesia

## Tabel 2.  Sekuen nukleotida primer RAPD dan jumlah pita DNA yang dihasilkan
Table 2.  RAPD primer nucleotide sequence and number of DNA fragment produced
No Primer Primer Sekuen primer 5’            3’ Sequence of primer Jumlah pita DNA Number  of DNA fragments Total Polimorfik Polymorphic Persentase pita polimorfik Persentage of polymorphic fragment (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15 OPN-04 OPN-05 OPN-11 OPN-12 OPN-14 OPN-15 OPN-17 OPN-18 OPN-19 OPN-20 OPH-04 OPH-08 OPH-09 OPH-12 OPH-16 GACCGACCCA ACTGAACGCC TCGCCGCAAA CACAGACACC TCGTGCGGGT CAGCGACTGT CATTGGGGAG GGTGAGGTCA GTCCGTACTG GGTGCTCCGT GGAAGTCGCC GAAACACCCC TGTAGCTGGG ACGCGCATGT TCTCAGCTGG 12 8 11 7 8 7 5 7 13 14 11 7 12 7 10 11 7 11 6 8 3
5 2 13 14
11 4 12 7 10 91,7 87,5 100 85,7
100 42,9 100 28,6 100 100 100
57,1 100
100 100
Gambar 2. Koefisien kesamaan genetik tujuh isolat C. cassiicola Figure 2. Coefficient of genetic similarity of seven C. cassiicola isolates Koefisien kesamaan Coefficient of Similarity 0,55 0,60 0,65 0,70 CBK CLP CSU CKB CSS CJB CJT 1 2 3 4 0,57 0,63 0,59 0,60 0,66 0,68
CBK  = Isolat asal Bengkulu (Isolate from Bengkulu)
CLP  = Isolat asal Lampung (Isolate from Lampung ) CKB  =  Isolat asal Kalimantan Barat (Isolate from West Kalimantan) CJT  =  Isolat asal Jawa Tengah (Isolate from Central Java) CSS =  Isolat asal Sumatera Selatan (Isolate from South Sumatera) CJB  =  Isolat asal Jambi (Isolate from Jambi) CSU  =  Isolat asal Sumatera Utara (Isolate from North Sumatera)
Oktavia, Munir, Suryaningtyas dan Kuswanhadi
M= Marker 1 kb Ladder 1. CBK= Isolat asal Bengkulu (Isolate from Bengkulu)
2. CLP = Isolat asal Lampung (Isolate from Lampung)
3. CKB= Isolat asal Kalimantan Barat (Isolate from West Kalimantan) 4. CJT = Isolat asal Jawa Tengah (Isolate from Central Java) 5. CSS =  Isolat asal Sumatera Selatan (Isolate from
South Sumatra) 6. CJB =  Isolat asal Jambi (Isolate from Jambi)
7. CSU =  Isolat asal Sumatera Utara (Isolate from North Sumatra)
Gambar  3.  Amplifikasi PCR yang menghasilkan pola spesifik pada tujuh isolat C. cassiicola dengan menggunakan primer OPN-04 (A), OPN-05 (B), OPN-11 (C), OPN-12 (D), OPN-19(E), OPN-20 (F), OPH-04 (G), OPH-09 (H), OPH-12 (I) dan OPH-16 (J).
Figure 3.  PCR amplification yielding specific pattern on seven C. cassiicola isolates by using OPN-04 (A), OPN-05 (B), OPN-11 (C), OPN-12 (D), OPN-19 (E), OPN-20 (F), OPH-04 (G), OPH-09 (H), OPH- 12 (I) and OPH-16 (J) primers
A B C D E F G H I J
Karakterisasi sidik jari DNA isolat C. cassiicola yang berasal dari berbagai sentra perkebunan karet Indonesia
Hasil amplifikasi DNA dengan 5 primer yang tidak menghasilkan pola spesifik pada semua isolat dapat dilihat pada Gambar 4. Amplifikasi  DNA  dengan  primer  OPN-14 menghasilkan 4 pola berbeda dengan jumlah pita  DNA  0  -  7  per  isolat.  Pola  pertama ditemukan  pada  isolat  yang  berasal  dari Bengkulu,  pola  kedua  pada  isolat  yang berasal  dari  Lampung,  Jawa  Tengah  dan Jambi, pola ketiga pada isolat yang berasal dari  Kalimantan  Barat  dan  pola  ke  empat pada  isolat  yang  berasal  dari  Sumatera Selatan.  Sementara  itu  pada  isolat  yang berasal  dari  Sumatera  Utara  tidak dihasilkan pita DNA (Gambar 4A).
Gambar  4B  menunjukkan  hasil amplifikasi  dengan  primer  OPN-15  yang menghasilkan 3 pola berbeda. Pola pertama ditemukan  pada  isolat  yang  berasal  dari Bengkulu  dan  Jawa  Tengah,  pola  kedua pada  isolat  yang  berasal  dari  Lampung, Jambi,  dan  Sumatera  Utara,  serta  pola ketiga  pada  isolat  yang  berasal  dari Kalimantan Barat dan Sumatera Selatan.
Hasil amplifikasi dengan primer OPN- 17 menghasilkan 5 pola pita yang berbeda. Pola  pertama  ditemukan  pada  isolat  yang berasal  dari  Bengkulu,  pola  kedua  pada isolat  yang  berasal  dari  Kalimantan  Barat, pola  ketiga  pada  isolat  dari  Jawa  Tengah, pola  keempat  pada  isolat  dari  Sumatera Selatan  dan  pola  kelima  pada  isolat  dari Jambi  dan  Sumatera  Utara.  Jumlah  pita DNA  yang  dihasilkan  masing-masing  isolat berkisar  0  -  4  pita,  dimana  isolat  dari
Lampung  tidak  meng-hasilkan  pita  DNA (Gambar 4C).
Amplifikasi  DNA  dengan  mengguna- kan  primer  OPN-18  menghasilkan  2  pola, dimana isolat yang berasal dari Kalimantan Barat  memiliki  pola  yang  berbeda  dengan keenam  isolat  lainnya.  Perbedaan  itu ditentukan  oleh  satu  pita  DNA  spesifik berukuran  250  bp  yang  hanya  ditemukan pada  isolat  dari  Kalimantan  Barat.  Jumlah pita  DNA  yang  dihasilkan  masing-masing isolat adalah 6 (Gambar 4D).
Gambar  4E  menunjukkan  hasil amplifikasi  dengan  primer  OPH-08  yang menghasilkan 5 pola berbeda. Pola pertama ditemukan  pada  isolat  yang  berasal  dari Bengkulu  dan  Lampung,  pola  kedua  pada isolat  dari  Kalimantan  Barat,  pola  ketiga pada isolat dari Jawa Tengah, pola keempat pada isolat dari Sumatera Selatan, dan pola kelima pada isolat dari Jambi dan Sumatera Utara.  Jumlah  pita  DNA  yang  dihasilkan masing-masing  isolat  berkisar  3  -  5  pita. Amplifikasi  dengan  primer  OPH-08 menghasilkan  2  pita  DNA  spesifik  yang hanya  ditemukan  pada  isolat  dari  Jawa Tengah.
Dari  hasil  amplifikasi  DNA  diatas terlihat bahwa tidak semua primer mampu menghasilkan  pola  spesifik,  meskipun demikian sudah ditemukan 10 primer yang menghasilkan  pola  berbeda  yang  dapat digunakan  untuk  mengidentifikasi  masing- masing isolat. Pola spesifik hasil 15 primer
Tabel 3. Koefisien kesamaan genetik tujuh isolat C. cassiicola Table 3. Genetic similarity coefficient among seven C. cassiicola isolates Isolat Isolate CBK CLP CKB CJT CSS CJB CSU CBK 1,0000 CLP 0,5735    1,0000 CKB 0,5890    0,5455 1,0000 CJT 0,5793 0,6107 0,5816 1,0000 CSS 0,5695 0,5109 0,6667 0,5890 1,0000 CJB 0,6207 0,6565 0,6525 0,6286 0,6849 1,0000 CSU 0,5185 0,6281 0,5649 0,5846 0,6471 0,6462 1,0000 CBK  = Isolat asal Bengkulu (Isolate from Bengkulu) CLP  = Isolat asal Lampung (Isolate from Lampung ) CKB  =  Isolat asal Kalimantan Barat (Isolate from West Kalimantan) CJT  =  Isolat asal Jawa Tengah (Isolate from Central Java) CSS =  Isolat asal Sumatera Selatan (Isolate from South Sumatera) CJB  =  Isolat asal Jambi (Isolate from Jambi) CSU  =  Isolat asal Sumatera Utara (Isolate from North Sumatera)

## Oktavia, Munir, Suryaningtyas dan Kuswanhadi
pada  7  isolat C.  cassiicola disarikan  pada Tabel 4.
Dari  Tabel  4  diketahui  bahwa  teknik RAPD  dapat  digunakan  untuk  meng- identifikasi  isolat C.  cassiicola ,  dimana untuk kepentingan identifikasi dibutuhkan minimal  dua  buah  pola  spesifik,  agar keduanya  dapat  saling  mengkonfirmasi. Dengan  menggunakan  kombinasi  2  primer dari  10  primer  yang  menghasilkan  pola spesifik  maka  ketujuh  isolat  dapat diidentifikasi,  sehingga  seleksi  ketahanan klon  terhadap  PGDC  dapat  dilakukan dengan tepat.

## Identifikasi Morfologi vs Molekuler
Secara  umum  identifikasi  spesies jamur dilakukan dengan melihat perbedaan konidia di bawah mikroskop. Namun hal ini
susah  dilakukan  pada  spesies  yang  sama, karena secara umum bentuk konidia suatu spesies  adalah  sama.  Untuk  mengatasi  hal tersebut  biasanya  digunakan  perbedaan morfologi miselium yang dihasilkan. Dengan memperhatikan ciri-ciri bentuk, tekstur dan warna  miselium,  tujuh  isolat C.  cassiicola asal klon GT 1 dapat dibedakan. Namun per- masalahan  yang  muncul  adalah  ciri-ciri tersebut  tidak  konsisten,  dimana  seiring perubahan  waktu  kultur  ciri-ciri  tersebut juga berubah. Kelemahan identifikasi secara morfologi tersebut dapat dilengkapi dengan identifikasi  secara  genetik  yang  tidak dipengaruhi oleh perubahan lingkungan.

## KESIMPULAN
1. Tujuh  isolat C.  cassiicola dapat diidentifikasi  secara  morfologi  dan genetik  dengan  menggunakan  teknik RAPD.
Tabel 4.  Pola spesifik yang dihasilkan oleh 15 primer pada tujuh isolat C. cassiicola Table 4.  Specific pattern produced by 15 primers from seven C. cassiicola isolates No Isolat/ Primer CBK CLP CKB CJT CSS CJB CSU 1 2 3 4 5 6 7 8
9 10 11 12
13 14 15 OPN -04 OPN -05 OPN -11 OPN -12 OPN -19 OPN -20 OPH-04 OPH-09 OPH-12 OPH-16 OPN -14 OPN -15 OPN -17 OPN -18 OPH-08 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 1 3 2 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 3 4 2 4 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 2 2 5 2 5 7
7 7 7 7 7 7 7 7 7 2 2 5 2 5
Angka yang sama pada baris yang sama menunjukkan pola yang sama Same figures in the same row show the same pattern
CBK =  Isolat asal Bengkulu (Isolate from Bengkulu)
CLP = Isolat asal Lampung (Isolate from Lampung) CKB =  Isolat asal Kalimantan Barat (Isolate from West Kalimantan)
CJT =  Isolat asal Jawa Tengah (Isolate from Central Java) CSS =  Isolat asal Sumatera Selatan (Isolate from South Sumatra)
CJB =  Isolat asal Jambi (Isolate from Jambi) CSU =  Isolat asal Sumatera Utara (Isolate from North Sumatra)
Karakterisasi sidik jari DNA isolat C. cassiicola yang berasal dari berbagai sentra perkebunan karet Indonesia
2. Dari  analisis  RAPD  menggunakan  15 primer  pada  7  isolat C.  cassiicola, terbentuk  4  kelompok  dengan  koefisien k e s a m a a n   g e n e t i k   6 6 % ,   d i m a n a kelompok  satu  terdiri  dari  isolat  asal Bengkulu,  kelompok  dua  isolat  asal Lampung dan Sumatera Utara, kelompok tiga  isolat  asal  Kalimantan  Barat, Sumatera  Selatan  dan  Jawa  barat  dan kelompok  empat  terdiri  dari  isolat  asal Jawa tengah.
3. Sepuluh  dari  15  primer  yang  diuji mampu menghasilkan pola spesifik pada m a s i n g - m a s i n g   i s o l a t ,   s e h i n g g a kesepuluh  primer  tersebut  dapat digunakan sebagai alat identifikasi isolat C. cassiicola.
4. Pengujian  patogenisitas  dari  masing- masing kelompok ras perlu dilaksanakan sehingga pengendalian yang tepat dapat dilakukan.

## DAFTAR PUSTAKA
A t a n ,   S .   a n d   N . H .   H a m i d .   2 0 0 3 . Differentiating  races  of Corynespora cassiicola using  RAPD  and  internal transcribed  spacer  markers. J.  Rubb.
Res ., 6 (1), 58-64.
Anh-Nghia, N., J. Kadir, E. Sunderasan, M.P. Abdullah, A. Malik, and S. Napis. 2008. Morphological  and  Inter  Simple Sequence  Repeat  (ISSR)  markers analyses  of Corynespora  cassiicola Isolates  from  rubber  plantations  in Malaysia. Mycopathologia ,  166,  189- 201.
Darmono,  T.W.,  A.  Darussamin,  dan  S. Pawirosoemardjo.  1996.  Keragaman diantara  isolat Corynespora  cassiicola
yang  berasosiasi  dengan Hevea brasiliensis di  Indonesia. Pros.  Lok. Penyakit  Gugur  Daun  Corynespora pada Tanaman Karet , 16-17 Desember 1996,  Pusat  Penelitian  Karet,  Medan, Indonesia, 79-92.
Farr,  D.F.,  A.Y.  Rossman,  M.E.  Palm,  and E.B. McCray. 2007. Fungal Databases. Systematic  Botany  and  Mycology Laboratory,  ARS,  USDA.  http:// nt.arsgrin.gov.
Oktavia, F., M. Lasmingsih dan Kuswanhadi. 2009.  Identifikasi  klon  karet  anjuran dengan  teknik  RAPD. J.  Penel . Karet , 27 (1), 21-31.
Qi  Y.X.,  Y.X.  Xie,  X.  Zhang,  J.  Pu,  H.Q. Zhang, S. Huang and H. Zhang. 2009. Molecular  and  pathogenic  variation i d e n t i f i e d   a m o n g   i s o l a t e s   o f C o r y n e s p o r a   c a s s i i c o l a . M o l . Biotechnol ., 41, 145-151.
Qi,  Y.X.,  X.  Zhang,  J.  Pu,  X.  Liu,  Y.  Lu,  H. Zhang, H.Q. Zhang, Y.C. Lv, and Y.X. X i e .   2 0 1 0 .   M o r p h o l o g i c a l   a n d molecular  analysis  of  genetic  varia- bility  within  isolates  of Corynespora cassiicola from different hosts. Eur . J.
Plant. Pathol., 130 (1), 83-95.
Rohlf,  F.J.  1993.  NTSYS-PC. Numerical Taxonomy  and  Multivariate  Analisys System . New York, Eeter software.
Sambrook,  J.E.F.  Fritsch,  and  Maniatis. 1989. Molecular Cloning : A Laboratory M a n u a l . C o l d   S p r i n g   H a r b o r Laboratory Press. New York,
Shimomoto, Y., T. Sato, H. Hojo, Y. Morita, S. Takeuchi, H. Mizumoto, A. Kiba and Y. Hikichi. 2011. Pathogenic and genetic v a r i a t i o n   a m o n g   i s o l a t e s   o f Corynespora cassiicola in Japan . Plant Pathology , 60, 253-260.
Silva,  W.P.K.,  D.S.  Multani,  B.J.  Deverall, and  B.  Lyon. 1995.  RFLP  and  RAPD analysis  in  the  identification  and differentiation  of  isolates  of  the  leaf spot  fungus Corynespora  cassiicola.
Australian J. Botany, 43, 609-618.
S i t u m o r a n g ,   A . ,   A .   B u d i m a n ,   S . P a w i r o s o e m a r d j o ,   d a n   M . Lasminingsih. 1996. Epidemi penyakit gugur  daun Cory - nespora dan pencegahannya  pada  tanaman  karet. Pros.  Lok.  Penyakit  Gugur  Daun Corynespora pada Tanaman Karet , 16- 17  Desember  1996,  Pusat  Penelitian Karet, Medan, Indonesia, 111-132.

## Oktavia, Munir, Suryaningtyas dan Kuswanhadi
Situmorang,  A.  2002.  Sebaran  Penyakit Gugur Daun, Viru-lensi dan Genetika Cory - nespora  cassiicola Asal  Sentra P e r k e b u n a n   K a r e t   I n d o n e s i a . Disertasi. Institut Pertanian Bogor.
Weising, K., H. Nybom, K. Wolff and G. Kahl. 2005.  DNA  Finger  Printing In  Plants, Principles,  Methods a nd  Applications .
CRC Press, London.
William,  J.G.K.,  A.R.  Kubelik,  J.A.    Livak, K.J.  Rafalski,  and  S.V.  Tingey.  1990. DNA  poly-morphism  amplified  by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res ., 18, 6531 - 6535.
Karakterisasi sidik jari DNA isolat C. cassiicola yang berasal dari berbagai sentra perkebunan karet Indonesia