ISOLASI FLAVONOID DARI BIJI KAKAO ( Theobroma cacao )
Bustanul Arifin*, Afrizal, Hasnirwan, Rio Rinaldo
Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Andalas Padang
email : ba_arifin@yahoo.co.id

## ABSTRAK
Telah  dilakukan  isolasi  senyawa  flavonoid  dari  biji  cacao    ( Theobroma  cacao )  pada  fraksi  etil asetat. Isolasi dilakukan dengan maserasi menggunakan metanol dan dilakukan fraksinasi dengan n-heksan dan etil asetat. Fraksi etil asetat dilakukan  kolom kromatografi bertekanan tinggi ( flash colom chromatografphy ). Hasil isolasi berupa kristal bewarna kuning dan telah memberikan noda tunggal  dengan  beberapa  eluen  menggunakan  kromatografi  lapisan  tipis  (TLC).  Kromatografi kertas dua arah didapatkan Rf  0,45 menggunakan eluen BAA (4:1:5) dan Rf 0,48 menggunakan eluen  asam  asetat  15%.  Spektroskopi  ultraviolet  dengan  menggunakan  pelarut  metanol memberikan  serapan  pada  λ maks 281  dan  328  nm.  Menggunakan  pereaksi  geser  NaOCH 3 serapan λ maks 290  dan 411  nm,  AlCl 3 λ maks 293  dan 385  nm  dan  HCl  λ maks 280  dan  330  nm,  NaOOCCH 3 serapan λ maks 281 dan 330 nm dan H 3 BO 3 serapan λ maks 295 dan 381 nm.  Spektroskopi infra merah (IR) memberikan serapan pada angka gelombang 3407,6; 2360,4; 1663,3; 409,8 cm -1 . Berdasarkan data  tersebut  diperkirakan  senyawa  hasil  isolasi  dari  λ maks 281  dan  328  nm  adalah  suatu  flavonol yang tersubstitusi dengan gugus hidroksi pada posisi 7, 3’ dan 4’.
Kata kunci: isolasi, flavonoid, cacao

## PENDAHULUAN
Kekayaan  alam  yang  melimpah  pada sumber  daya  alam  hayati,  telah  dimanfaatkan oleh  masyarakat  Indonesia  untuk  berbagai keperluan,  antara  lain  sebagai  bahan  baku industri,  pangan  dan  sebagai  obat.  Banyak jenis tumbuhan  yang  sudah  dimanfaatkan  sejak  lama sebagai  makanan  dan  obat–obatan  tradisional tapi  belum  diketahui  senyawa  kimia  yang terkandung  di  dalamnya  (Gunawan  dkk,  1983; Achmad dkk, 1990).
Penggunaan tumbuhan obat untuk menyembuhkan  berbagai  macam  penyakit  telah lama  dilakukan  manusia.  Hal  ini  mendorong para  ahli  untuk  mengkaji  kandungan  tumbuhan tersebut  yang  berperan  sebagai  sumber  obat. Sampai saat ini masih banyak potensi tumbuhan obat  yang  belum  diteliti.  Dari  sekian  banyak spesies  tumbuhan,  hanya  sedikit  yang  telah dikaji  secara  fitokimia  dan  lebih  sedikit  lagi yang  telah  mengkaji  aktivitas  biologis  dan farmakologisnya (Gunawan dkk, 1983; Achmad dkk, 1990).
Kandungan  kimia  yang  memberikan efek  fisiologi  dan  farmakologi  lebih  dikenal dengan  senyawa  aktif.  Senyawa  aktif  ini merupakan  hasil  metabolisme  sekunder  dari tumbuhan  itu  sendiri  dimana  penyebaran  dan jumlahnya  dalam  tiap  bagian  tumbuhan  tidak sama.  Hal  ini  mendorong  para  ahli  untuk melakukan penelitian tentang isolasi, sintesis, uji bioaktifitas  dan  pemanfaatannya  lebih  lanjut (Gunawan  dkk,  1983;  Achmad  dkk,  1990; Geissman, 1962).
Salah  satu  tumbuhan  yang  digunakan sebagai  bahan  makanan  dan  obat  tradisional adalah  biji  kakao.  Bagian  biji  kakao  banyak dimanfaatkan  oleh  masyarakat  yang  berguna sebagai  antioksidan  yang  dapat  mengurangi pembentukan  radikal  bebas  penyebab  kanker. Kakao juga  mengandung senyawa bioaktif yang bermanfaat  mencegah  terjadinya  penimbunan kolesterol  pada  dinding  pembuluh  darah (Achmad dkk, 1990).
Biji kakao mengandung banyak senyawa  kimia  seperti  glukosa,  fruktosa, sukrosa,  tanin,  lemak  dan  protein.  Sedangkan
metabolit  sekunder  yang  ada  pada  tanaman  ini seperti  steroid,  terpenoid,  fenolik,  kumarin, alkaloid  dan  flavonoid.  Penelitian  yang  telah dilaporkan  bahwa  dalam  biji  kakao  terdapat flavonoid,  merupakan  antioksida  yang  sangat bagus (Achmad dkk, 1990).
Berdasarkan  hal  tersebut  di  atas  serta kandungan senyawa aktif yang telah dilaporkan, maka penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi salah  satu  dari  senyawa  metabolit  sekunder tersebut yaitu flavonoid. Penelitian ini dilakukan dengan metoda ekstraksi secara maserasi dengan menggunakan pelarut metanol, fraksinasi dengan  n-heksan  dan  etil  asetat,  pemisahan  dan pemurnian komponen kimia dengan
kromatografi,  serta  karakteristisasi  senyawa dengan melakukan pemeriksaan
secara konvensional dan spektrofotometri.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi,
mengidentifikasi dan mengkarakterisasi  senyawa  flavonoid  dari  biji kakao  ( Theobroma  cacao ). Masalah  yang dibahas  pada  penelitian  ini  adalah  mengisolasi senyawa  flavonoid.  kemudian  diidentifikasi jenis flavonoid yang didapatkan. Jenis flavonoid hasil isolasi dikarakterisasi untuk memperkirakan struktur senyawa tersebut.

## METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan untuk pengerjaan  isolasi  adalah  seperangkat  alat distilasi,  seperangkat  alat rotary  evaporator (Betracher  Lamag),  lemari  pengering  atau  oven (Fisher  Scientific  Isotemp  oven,  model  630  F), lampu  UV(λ  =  254  nm  dan  366  nm), melting point  apparatus (Fisher Jhon), spektrofotometer UV-Vis  (Type  UV-160  A;  Shimadzu),  kolom kromatografi  (50  cm  x  2,5  cm  i.d),  plat  KLT (silika  gel  60  F 254 ),  gelas ukur  berbagai  ukuran, botol  berbagai  ukuran,  chamber,  plat  tetes, corong pisah, kapiler, alumunium foil, kromatografi kertas  dan kertas saring.
Bahan-bahan  yang  digunakan  untuk  uji fitokimia  adalah  HCl  pekat,  logam  Mg,  asam asetat,  logam  natrium,  AlCl 3 ,  natrium  asetat, H 3 BO 3 ,  aseton,  akuades.  Sedangkan  bahan- bahan untuk pengerjaan isolasi adalah biji kakao ( Theobroma  cacao ),  metanol,  etil  asetat,  n- heksana dan silika gel 60 F 254.

## Persiapan Sampel
Sampel  diambil  di  kota  Pariaman, Propinsi Sumatera Barat sebanyak 2  kg. Bagian
yang  diisolasi  adalah  biji  kakao  ( Theobroma cacao ) .

## Uji Pendahuluan Flavonoid
Sampel  segar  daun  sebanyak  2  gram  dipotong halus,  dimasukkan  ke  dalam  sebuah  tabung reaksi,  kemudian  dimaserasi  dengan  metanol dan  dipanaskan  di  atas  penangas  air  selama  15 menit.  Hasil  maserasi  dalam  kondisi  panas disaring  dan  dimasukan  ke  dalam  tabung  reaksi lainnya.  Tambahkan  beberapa  tetes  larutan  HCl pekat  dan  beberapa  butir  bubuk  Mg  ke  dalam ekstrak  metanol.  Terbentuknya  warna  merah menandakan adanya senyawa flavonoid (Harbone 1987a, 1987b; Harbone dkk 1975).

## Isolasi Senyawa Flavonoid
Sampel  dimaserasi  pada  temperatur kamar  menggunakan  pelarut  metanol  beberapa kali  sampai  ekstraksi  sempurna.  Hasil  maserasi dipekatkan  dengan  rotary  evaporator  pada  suhu 40 0 C. Ekstrak pekat tersebut difraksinasi dengan n-heksana,  kemudian  dilanjutkan  fraksi  dengan etil  asetat.  Setiap  fraksi  yang  didapatkan dilakukan  uji  terhadap  senyawa  flavonoid. Fraksi  yang  positif  flavonoid  (fraksi  etil  asetat) dipekatkan dengan rotary evaporator.
Ekstrak  pekat  dari  fraksi  etil  asetat sebanyak 5 gram dilakukan kolom kromatografi bertekan  tinggi  menggunakan  eluen  n-heksana, etil  asetat  dan  metanol  dengan  sistim  kepolaran bertingkat.  Hasil  kromatografi  kolom  tersebut selanjutnya diuji dengan KLT dengan menggunakan  pengungkap  noda  uap  yodium. Untuk  fraksi  yang  mempunyai  pola  noda  dan harga  Rf  yang  sama  digabung  menjadi  satu fraksi  dan  selanjutnya  dipekatkan  dengan  rotari evaporator.  Frakri  yang  positif  flavonoid dilakukan  kolom  kromatografo  kembali  dengan berbagai  eluen dengan sistem kepolaran beryingkat.
Fraksi  yang  diperoleh  dilakukan  uji flavonoid  dan  dilakukan  kromatografi  kertas untuk  menentukan  adanya  senyawa  flavonoid. Fraksi  yang  positif  terhadap  uji  flavonoid dimurnikan    dengan    kromatografi    kertas preparatif  menggunakan  eluen  n-butanol:asam asetat:air  (4:1:5).  Hasil  isolasi  senyawa  yang didapatkan dilakukan karakterisasi untuk mengetahui strukturnya (Harbone 1987a, 1987b). Karakterisasi senyawa hasil isolasi Untuk menentukan golongan flavonoid, hasil isolasi diperiksa dengan metoda
kropmatografi  kertas  2  arah,  dengan  eluen campuran n-butanol, asam asetat, dan air (4 : 1 : 5)  serta  asam  asetat  15  %.  Kemudian dibandingkan  dengan  kromatogram  standar. Untuk menentukan strukturnya digunakan analisis
spektroskopi spektrofotometer
ultraviolet  dan  infra  merah.  Khusus  untuk spektofotometer
ultraviolet dilakukan penambahan  pereaksi  geser  natrium  metoksida (NaOCH 3 ),  alumunium  klorida/asam  klorida (AlCl 3 /HCl)  dan  natrium  asetat/asam  borat (NaOOCCH 3 /H 3 BO 3 ) (Harbone 1987a, 1987b).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Salah  satu  metabolit  sekunder  yang terdapat dalam sampel adalah senyawa flavonoid.  Hal  ini  dibuktikan  dengan  Sianidin test  menggunakan  HCl  pekat  dan  bubuk  Mg menghasilkan  warna  merah  muda.  Fraksi  etil asetat  memberikan  warna  merah  dengan pereaksi  Mg/HCl  berarti  mengandung  senyawa flavonoid.
Fraksi  etil  asetat  dilakukan  kolom kromatografi, hasil kromatografi kolom ditampung  dalam  vial  10  mL  dan  di  KLT. Berdasarkan  hasil  KLT,  fraksi-fraksi  yang memiliki pola noda dan Rf yang sama digabung diperoleh  8  fraksi.  Fraksi  yang  mengandung flavonoid  adalah  fraksi  5,  6,  dan  7,  sedangkan fraksi lainnya mengandung flavonoid.
Selanjutnya  dilakukan  pemurnian  terhadap fraksi 5 dengan kromatografi kolom kembali dan diperoleh  4  fraksi.  Fraksi  yang  mengandung flavonoid  adalah  fraksi  1,  2  dan  4  sedangkan fraksi 3 tidak mengandung flavonoid. Selanjutnya  fraksi  1  dilakukan  pemurnian dengan  kromatografi    kertas    preparatif menggunakan    eluen    n-butanol:asam  asetat:air (4:1:5).
Hasil  kromatografi  kertas  preparatif diperoleh senyawa murni kristal/bubuk bewarna kuning. Senyawa hasil isolasi memberikan noda tunggal dengan eluen yaitu eluen n-heksana : etil asetat (5 : 5) Rf 0,45 eluen n-heksana : etil asetat (2 : 8) Rf 0,55 eluen etil asetat : aseton  (5 : 5) Rf 0,75 serta etil asetat : metanol (1 : 1) Rf 0,88. Kromatografi  kertas  dua  arah  didapatkan  Rf 0,45  menggunakan  eluen  BAA  (4:1:5)  dan  Rf 0,48 menggunakan eluen asam asetat 15%.
Sedangkan senyawa hasil isolasi memberikan  puncak  pada  panjang  gelombang 328  nm  sebagai  puncak  I  dan  281  nm  sebagai puncak  II.  Bila  menggunakan  pereaksi  geser maka  akan  berpeluang  mengalami  pergeseran panjang  gelombang.  Pada  pita  I  terjadi
pergeseran batokromik sebesar 83 nm dan pita II pergeseran  batokromik  sebesar  9  nm  ,  setelah penambahan  pereaksi  geser  NaOMe.  Hal  ini menindikasikan  bahwa  senyawa  flavonoid  hasil isolasi  tidak  memiliki  gugus  –OH  yang tersubtitusi pada cincin B, kemungkinan adanya gugus hidroksi pada cincin A.
Penambahan  AlCl 3 akan  membentuk komplek yang tahan asam antara gugus hidroksi dan  keton,  dan  komplek  yang  tidak  tahan  asam antara  gugus  hidroksi  yang  bertetangga  (gugus orto-hidroksi).  Jadi  spektrum  AlCl 3 berguna untuk  menditeksi  5-OH  dan  orto-dihidroksida. Sedangkan  penambahan  HCl  akan  memutus kompleks  yang  tidak  tahan  asam,  jadi  spektrum AlCl 3 /HCl  hanya  merupakan  pengaruh  gugus hidroksi-keto  dan  mendeteksi  ada  atau  tidaknya 5-OH saja.
Spektrum  UV  senyawa  hasil  isolasi dengan  penambahan  AlCl 3, terjadi  pergeseran batokromik sebesar 57 nm dan pita II pergeseran batokromik  sebesar  12  nm,  menunjukan  tidak adanya  gugus  hidroksi  yang  berdekatan  dengan gugus  keton,  dan  gugus  orto-dihidroksi  pada cincin B. Hal ini diperkuat dengan tidak adanya pergeseran setelah penambahan AlCl 3 /HCl. Penambahan pereaksi geser yaitu NaOAc  merupakan  basa  yang  lebih  lemah  dari pada  NaOMe,  karena  itu  spektrum  NaOAc hanya dapat mendeteksi ada atau tidaknya gugus hidroksi  yang  paling  asam,  terutama  untuk gugus  7-OH  atau  yang  setara.  Spektrum NaOAc/H 3 BO 3 berguna  untuk  mendeteksi  ada atau  tidaknya  gugus  orto-dihidroksi  antara  2 gugus hidroksi paling asam berdekatan (6,7-OH atau  7,8-OH  pada  cincin  A  dan  3’,4’-OH  pada cincin  B),  karena  NaOAc/H 3 BO 3 menjembatani kedua gugus tersebut.
Dari spektrum UV senyawa hasil isolasi dengan penambahan NaOAc didapatkan pergeseran  batokromik  sebesar  2  nm,  hal  ini diperkirakan  karena  adanya  7-OH.  Setelah penambahan  NaOAc/H 3 BO 3 terjadi  pergeseran batokromik sebesar 53 nm dan pita II pergeseran batokromik  sebesar  14  nm,  diperkirakan  karena adanya  orto-dihidroksi  pada  cincin  B.  Data  ini diperkuat dengan pereaksi geser AlCl 3 /HCl.
Mengacu  pada  hasil  analisa  preaksi geser  terhadap  spektrum  UV  senyawa  hasil isolasi,  maka  diperkirakan  bahwa  senyawa  ini termasuk jenis  senyawa  flavonol  yang  memiliki gugus hidrokksi pada posisi 7, 3’ dan4’.
Spektrum  IR  senyawa  hasil  isolasi serapan  melebar  pada  angka  gelombang  3407,6 cm -1 yang  merupakan  gugus  OH  dan  diperkuat
dengan  adanya  serapan  yang  kuat  pada  daerah sidik jari 1054 cm -1 , yang  Khas untuk gugus C- O alkohol.
Munculnya serapan pada angka gelombang  1663,3  cm -1 menindikasikan  adanya gugus C=O, yang khas untuk keton siklik.  Pada angka panjang gelombang 1610 cm -1 memperlihatkan  adanya  gugus  C=C  aromatik, adanya  cincin  benzen  pada  409,8  cm -1 ,  adanya C-H  alifatis  pada  angka  gelombang  2932  cm -1 , dan  pada  angka  gelombang  1026  cm -1 memperlihatkan adanya serapan stretching C-O- C.
Senyawa hasil isolasi dengan kromatografi  kertas  2  arah  dengan  eluen  n- butanol:asam asetat:air (4:1:5) Rf 0,45 dan asam asetat  15%  Rf  0,48.  Pola  noda  yang  dihasilkan dibandingkan  indentik  dengan  flavonol-O- glikosida.
Berdasarkan hasil penerjemahan spektrum yang dihasilkan, senyawa hasil isolasi pada  sistem  deteksi  UV,  IR,  dan  KKt  2  arah menunjukan  bahwa  senyawa  hasil  isolasi merupakan  senyawa  flavonol  yang  memiliki gugus OH pada posisi 7, 3’ dan 4’.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan terhadap  biji  kakao,  maka  dapat  disimpulkan bahwa:
1. Hasil  isolasi  dari  fraksi  etil  asetat diperoleh  senyawa  flavonoid  berupa bubuk berwarna kuning, hasil kromatografi  lapisan  tipis    dengan eluen  n-heksana:etil  asetat  (5  :  5) memberikan harga Rf 0,45 menggunakan  eluen  n-heksana  :  etil asetat (2 :  8)  Rf 0,55  dengan  eluen etil asetat : aseton  (5 : 5) Rf 0,75 serta etil asetat : metanol (1 : 1) Rf 0,88.
2. Senyawa hasil
isolasi dengan kromatografi
kertas dua arah
didapatkan  Rf    0,45  menggunakan eluen  BAA  (4:1:5)  dan  Rf  0,48 menggunakan eluen asam asetat 15%. 3. Analisa data pemeriksaan kimia, kromatografi kertas 2 arah,
spektrometri  UV  dan  IR  disimpulkan bahwa  senyawa  hasil  isolasi  adalah senyawa flavonoid golongan flavonol.
4. Analisa  spektrum  UV  dengan  pereaksi geser  menunjukkan  bahwa  senyawa flavon  memiliki  gugus  OH  pada  posisi C 7 , C 3’ , dan C 4’ .
Untuk  lebih  sempurnanya  penelitian  ini,  maka dapat  disarankan  penelitian  ini  lebih  lanjut melakukan  pengukuran  spektroskopi  massa  dan spektroskopi  NMR  serta  uji  efek  fisiologis  dan farmakologis terhadap senyawa hasil isolasi.

## DAFTAR RUJUKAN
Achmad, S.A., E.H. Hakim dan L. Makmur. (1990).  Flavonoid  dan  Phyto  Medica, Kegunaan  dan  Prospek. Phyto  Medica , Vol. I.
Cody, V. , E. Middleton, J. B. Harborne and A.  Berezt.  (1987). Flavonoids  in Biology  and  Medicine  II,  Biochemical Celluler  and  Medicinal  Properties . Alan R. Liss, Inc. , New York. Geissman,  T.  A..  (1962). The  Chemistry  of Flavonoid Compunds . Pergamon Press,
New Yor k.
Gunawan,  D  .  ,  Dj.  Wahyono,  I.  A.  Donatus, Taroeno  dan  Mulyono.  (1983). Risalah Simposium  Penelitian  Tumbuhan  Obat  III ,
Proceeding: Simposium Penelitian Tumbuhan  Obat  Indonesia,  Yogyakarta, 12-15  September  1983,  Fakultas  Farmasi
Universitas Gajah Mada, Yogyakarta
Harbone,  J.B.  (1987a). Metoda  Fitokimia , Terbitan ke-2 ITB, Bandung.
Harbone, J. B. , T.J.. Mabry and H. Mabry. (1975) The  Flavonoids ,  Chapman  and Hall, London.
Harbone,  J.B.  (1987b). Phytochemical Methods (Metoda  Fitokimia,  Penuntun Cara Moderen Menganalisis Tumbuhan), Terbitan ke-2, diterjemahkan oleh Kosasih
Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung.