## Original Research

## HIJP : HEALTH INFORMATION JURNAL PENELITIAN

## Deteksi Metilasi Gen IGF2/H19 Pada DNA Sel Darah Tepi Anak Stunting Usia 3-5 tahun

## Detection of methylated gene IGF2/H19 in peripheral blood of stunted children age 3-5 years old
Ahmad  Rusdan  Handoyo  Utomo 1* ,  Dian Widiyanti 2 , Intan Razari 3 , Harliansyah 4 , Syukrini Bahri 5
1,3,4 Sekolah  Pascasarjana  Program  Studi  Biomedis, Universitas YARSI, Indonesia;
2,5 Fakultas Kedokteran, Universitas YARSI, Indonesia *Email Korespondensi: ahmad.rusdan@yarsi.ac.id
Kata kunci: Stunting , metilasi DNA, gen IGF2
Keywords: Stunting , DNA methylation, IGF2 gene
Poltekkes Kemenkes Kendari, Indonesia ISSN: 2085-0840 ISSN-e: 2622-5905 Periodicity: Bianual vol. 16 no. 1 2024 jurnaldanhakcipta@poltekkes-kdi.ac.id Received: 08 September 2023 Accepted: 30 April 2024
Funding sources: Ditjen Diktiristek; DOI: 10.36990/hijp.v16i1.1123 URL: https://myjurnal.poltekkes- kdi.ac.id/index.php/hijp/article/view/1123 Contract number: 0536/E5/PG.02.00/2023 Corresponding author: ahmad.rusdan@yarsi.ac.id
Ringkasan: Stunting atau tinggi badan anak tidak sesuai  umur  masih  merupakan  tantangan kesehatan  di  Indonesia.  Keberadaan  stunting adalah  indikasi  asupan  gizi  yang  kurang  secara kronis  yang  berdampak  kepada  keterlambatan pertumbuhan,  kecerdasan,  dan  kerentanan mengalami  penyakit  seperti  infeksi  dan  obesitas. Kekurangan  gizi  kronis  berdampak  pada  jumlah donor  metil  yang  diperlukan  untuk  mengatur ekspresi gen dengan memodifikasi DNA. Metilasi pada  situs  DNA  yang  menyandi  IGF2  ( insulin growth factor ) pada lokus DMR ( differential methylated region )  berpotensi  mengatur  tingkat  ekspresi  gen IGF2.  Untuk  mengevaluasi  adanya  perbedaan metilasi  DNA  gen  IGF2,  studi  retrospektif case control dilakukan dengan merekrut 23 anak stunting dan  23  anak  normal  di  rentang  usia  3-5  tahun. Dengan menggunakan MSP (Methylation Specific PCR),  metilasi  DNA  pada  gen  IGF2  ditemukan lebih tinggi di DNA darah anak stunting dibanding anak  normal  (median  22%  vs  17,83%,  p  value >0.05)  namun  tidak  bermakna  secara  statistik. metilasi DNA IGF2 ditemukan lebih tinggi pada anak  laki-laki  dibanding  perempuan  yang bermakna  secara  statistik  (median  28,68%  vs 14,80%,  nilai  p  0,04).  Perbedaan  persentase metilasi  DNA  pada  gen IGF2 perlu  dieksplorasi lebih  jauh  untuk  menjelaskan  mekanisme terjadinya stunting akibat malnutrisi kronis.
Abstrack  : Stunting  or  children's  height  that  does  not match their age is still a health challenge in Indonesia. The presence of stunting is an indication of chronically deficient nutritional intake that has an impact on delays in growth, intelligence, and susceptibility to diseases such as infection and obesity. Chronic malnutrition impacts the number of
methyl  donors  required  to  regulate  gene  expression  by modifying DNA. Methylation at the DNA site that codes for  IGF2  (insulin  growth  factor)  at  the  DMR (differentially methylated region) locus has the potential to regulate the level of IGF2 gene expression. For evaluating differences  in  DNA  methylation  of  the  IGF2  gene,  a retrospective case-control study was conducted by recruiting 23 stunted children and 23 normal children aged 3-5 years. Using  MSP  (methylation-specific  PCR),  DNA methylation of the IGF2 gene was found to be higher in the blood DNA of stunted children than in normal children (median 22% vs 17.83%, p-value>0.05), but it was not
statistically  significant.  IGF2  DNA  methylation  was higher in boys than girls, which was statistically significant (median 28.68% vs 14.80%, p-value 0.04). Differences in the percentage of DNA methylation in the IGF2 gene need  to  be  studied  further  to  explain  the  mechanism  of stunting due to chronic malnutrition.

## PENDAHULUAN
Stunting atau  tinggi  badan  anak  tidak  sesuai  umur  masih  merupakan  tantangan  kesehatan  di Indonesia. Di Indonesia prevalensi stunting mencapai 24% pada anak usia dibawah 2 tahun (Laksono et  al.,  2022).  Untuk  mempelajari  mekanisme  biologi  molekuler  perlu  dikembangkan  metode  deteksi metilasi  yang  mudah  dilakukan  di  negara  berkembang  dimana  stunting  masih  merupakan  masalah nasional. Keberadaan stunting adalah indikasi asupan gizi yang kurang secara kronis yang berdampak kepada  keterlambatan pertumbuhan,  kecerdasan,  dan  kerentanan mengalami  penyakit  seperti  infeksi dan obesitas. Meskipun kekurangan gizi pada 1000 hari pertama adalah salah satu faktor yang sudah diketahui luas, mekanisme terjadinya stunting akibat malnutrisi kronis masih belum banyak diketahui (de  Onis  &  Branca,  2016).  Dalam  proses  pertumbuhan  janin  dalam  kandungan,  ekspresi  gen  yang bertanggungjawab terhadap pertumbuhan sangat tergantung dari jumlah asupan nutrisi  mikro seperti kandungan  donor  metil.  Donor  metil  yang  ditemukan  dalam  asam  folat  misalnya  diperlukan  dalam upaya janin melakukan regulasi ekspresi gen yang dikenal dengan proses epigenetic (Ramos-Lopez et al.,  2019).  Donor  metil  akan  di  inkorporasi  ke  dalam  susunan  DNA  janin  dan  akan  mempengaruhi regulasi atau tingkat ekspresi gen pertumbuhan. Ekspresi gen IGF2 atau Insulin Growth Factor 2 ditengari berperan  dalam  pertumbuhan.  Metilasi  pada  situs  DNA  yang  menyandi  IGF2  pada  lokus  DMR (differential methylated region) bisa mengatur tingkat ekspresi gen IGFR2 (Bouwland-Both et al., 2013). Beberapa studi menunjukkan bahwa tingkat asupan bisa mempengaruhi metilasi pada IGF2 seperti studi kelaparan di Belanda (Tobi et al., 2012; Vaiserman & Lushchak, 2021), dan Cina (Shen et al., 2019).
Hingga kini belum diketahui hubungan kausalitas antara metilasi DNA dengan stunting. Apabila hubungan antara metilasi dengan stunting bisa dievaluasi secara mudah maka upaya pencegahan stunting bisa lebih presisi karena metilasi DNA erat hubungannya dengan asupan yang bisa diperbaiki dengan intervensi nutrisi. Tujuan penelitian ini, Untuk mengevaluasi hubungan antara metilasi DNA pada gen IGF2  yang  berfungsi  dalam  pertumbuhan,  kami  melakukan  studi  pendahuluan  dengan  mendeteksi tingkat metilasi pada DNA darah dari kelompok anak normal dan anak stunting dibandingkan dengan menggunakan metode MSP ( Methylation Specific PCR ) (Tedjokusumo et al., 2021). Hingga kini belum ada studi metilasi DNA IGF2 di Indonesia dalam konteks stunting.

## METODE

## Jenis Penelitian
Desain penelitian ini adalah preliminary study case-control retrospective dari kohort penelitian sebelumnya di desa lokus stunting Pandeglang Banten (Surono et al., 2021)dan telah mendapatkan persetujuan dari kaji etik Universitas YARSI No. 004/KEP-UY/BIA/I/2020.

## Lokasi dan Waktu Penelitian
Proses ekstraksi DNA, analisa metilasi DNA dilakukan di Universitas YARSI di tahun 2023.

## Pengumpulan Data
DNA dari darah anak normal (N=23) dan stunting (N=23) diekstraksi dan diperlakukan konversi bisulfit sebelum dilakukan MSP ( methylation specific PCR ). Setelah konversi bisulfit, DNA diamplifikasi dengan primer paternal dan primer maternal sesuai instruksi dari kit CpG WIZ H19-IGF2 amplification kit  (Merck  Milipore,  USA)  dengan  thermal  cycler  MyGo.  Data  persentase  metilasi  dihitung  dengan rumus kuantifikasi citra produk PCR primer paternal dibagi dengan total kuantifikasi citra produk PCR primer  paternal  dan  produk  PCR  primer  maternal  sebagaimana  yang  dilakukan  sebelumnya (Tedjokusumo et al., 2021).

## Pengolahan dan Analisis Data
Sebelum diolah lebih lanjut, data persentase metilasi IGF2 dicek normalitasnya. Karena distribusi data  persentase  metilasi  tidak  normal,  maka  perbandingan  persentase  metilasi  IGF2  antar  variabel menggunakan uji Kruskal Wallis. Nilai P kurang dari 0,05 berarti bermakna secara statistik.

## HASIL
Tabel 1. Demografi anak yang diperiksa Variabel Normal (N=23) Stunting (N=23) Jenis Kelamin Laki-laki 15 15 Perempuan 8 8 Rentang usia (bulan) 36-67 35-60
Terlihat di Tabel 1, tidak ada perbedaan bermakna jumlah atau proporsi jenis kelamin dan rentang usia antara kelompok anak normal dan anak stunting. Amplifikasi PCR menggunakan primer paternal (P  untuk  deteksi  sekuen  yang  termetilasi)  dan  primer  maternal  (M  untuk  deteksi  sekuen  yang  tidak termetilasi) berhasil dilakukan seperti yang terlihat di Grafik 1. Citra dari produk PCR primer paternal dan primer maternal dikuantifikasi untuk mendapatkan persentase metilasi yang terangkum di Tabel 2.
Grafik 1. Produk PCR pada metilasi alel paternal (P) dan maternal (M) Gen IGF2 pada kelompok anak normal (PN) dan anak stunting (PS)
Tabel 2. Persentase Metilasi DNA Gen IGF2 pada kelompok anak stunting dan normal
Variabel Rerata  SD Median  IQR25%  IQR75%  Nilai P Status Normal 21,50%  4,60%  17,83% 6,80% 24,30% >0,05 Stunting 26,16%  5,80%  22,00% 11,70% 39,50% Jenis Kelamin Laki-laki 28,68%  5,15%  22,94% 13,50% 34,50% 0,04 Perempuan  14,80%  3,79%  12,84% 1,90% 22%
Uji Kruskal-Wallis persentase metilasi DNA antara kelompok anak normal dan kelompok stunting, Nilai P Sig (2 -tailed) =  ≤ 0,05 ; IQR interquartile range
Berdasarkan Tabel 2, nilai median metilasi DNA pada gen IGF2 ditemukan sebesar 22% di DNA darah anak stunting sedangkan pada anak normal median metilasinya 17,83%, nilai (p >0.05) dimana perbedaan tidak bermakna secara statistik. Menariknya, metilasi DNA IGF2 ditemukan lebih tinggi pada anak laki-laki dibanding perempuan yang bermakna secara statistik (median 28,68% vs 14,80%, nilai p 0,04).

## PEMBAHASAN
Data  pemeriksaan  metilasi  gen  IGF2  menunjukkan  persentase  metilasi  yang  lebih  tinggi  pada kelompok anak stunting daripada anak normal meskipun tidak bermakna secara statistik. Pengaturan ekspresi gen IGF2 melalui proses metilasi cukup kompleks karena lokasi sekuen DNA yang termetilasi berada di belakang gen IGF2 yaitu di lokasi sekuen dari gen H19. Di masa awal pertumbuhan embrio, sekuen gen H19 di alel IGF2 maternal tidak mengalami metilasi sehingga lokasi tersebut bisa diikat oleh protein  insulator  CTCF  (Yang  et  al.,  2003).  Pengikatan  sekuen  yang  tidak  termetilasi  oleh  CTCF menghambat proses ekspresi gen IGF2. Akibatnya gen IGF2 tidak diekspresikan oleh alel maternal. Namun,  ekspresi  gen  IGF2  berasal  dari  alel  paternal  yang  termetilasi.  Metilasi  pada  alel  paternal membuat protein CTCF tidak bisa mengikat sekuen pengaturan sehingga IGF2 bisa diekspresikan oleh alel paternal.

## M       P       M        P       M       P       M        P       M        P       M       P        M       P       M        P       M        P
500 ng 250 ng 150 ng Control
DNA 500 ng 250 ng 150 ng Control DNA NTC PN 43 PS 40 Ket : M : Maternal primer P  : Paternal primer
Control DNA adalah DNA sampel yang tidak di konversi bisulfit
Dampak peningkatan metilasi pada IGF2 ini terhadap pertumbuhan masih kurang jelas terutama kaitannya dengan stunting. Ibu hamil yang mengalami kelaparan baik akibat perang seperti di Belanda maupun gejolak sosial seperti Cina memberikan hasil yang bertolak belakang. Metilasi DNA gen IGF2 cenderung menurun  pada  mereka  yang  mengalami  kelaparan  di  Belanda,  namun meningkat  di  Cina (Shen  et  al.,  2019).  Sementara  itu  studi  metilasi  DNA  pada  gen  IGF2  yang  berkaitan  dengan pertumbuhan masih jarang dilakukan (Bouwland-Both et al., 2013), apalagi asosiasinya dengan stunting belum dilakukan. Data metilasi pada anak stunting yang ditemukan di studi ini perlu dielaborasi lebih lanjut.
Persentase  metilasi  DNA  gen  IGF2  juga  ditemukan  lebih  tinggi  pada  anak  laki-laki  dibandingkan perempuan. Meskipun belum diketahui secara pasti dampak peningkatan metilasi IGF2 pada anak laki- laki, publikasi sebelumnya menunjukkan bahwa anak laki-laki memiliki tingkat metilasi secara umum lebih tinggi daripada perempuan (Taylor et al., 2020) dan juga lebih berisiko untuk mengalami stunting (Iqbal et al., 2019).

## KESIMPULAN DAN SARAN
Metilasi  DNA  gen  IGF2  berpotensi  menjadi  penanda  biologis  yang  menjanjikan  untuk ditindaklanjuti terutama pada anak-anak laki laki yang rentan terkena stunting. Perlu studi lanjutan untuk menguji asosiasi antara asupan tipe nutrisi dengan tingkat metilasi gen IGF2 atau gen yang lain yang bisa diteliti  dengan  metode  nextgeneration  sequencing  (NGS).  Penelitian  di  Gambia  menggunakan  sel plasenta  menemukan  beberapa  gen  yang  termetilasi  dan  berasosiasi  dengan  perubahan  berat  badan maupun panjang badan (Quilter et al., 2021). Hanya saja penelitian tersebut belum menjelaskan adanya asosiasi  yang  jelas  antara  perbedaan  tingkat  metilasi  beberapa  gen  tersebut  dengan  stunting. Alternatifnya,  pemeriksaan  methylation  dengan  metode  methylation  microarray  Infinium  juga  bisa dilakukan sebagaimana laporan sebelumnya untuk menemukan metilasi yang berasosiasi dengan fungsi kognitif akibat malnutrisi.

## KEKURANGAN KAJIAN
Jumlah  sampel  anak  yang  diperiksa  tidak  memiliki statistical  power yang  mencukupi  untuk mendeteksi perbedaan persentase metilasi antara anak normal dan anak stunting. Namun data ini bisa menjadi pertimbangan untuk studi lebih lanjut. Demikian pula, temuan bahwa metilasi DNA gen IGF2 lebih tinggi pada anak laki-laki daripada perempuan bisa menjadi variable menarik untuk memahami mekanisme kerentanan anak laki-laki terkena stunting.

## PERNYATAAN

## Ucapan Terimakasih
Terima kasih kepada para relawan orang tua dari anak-anak yang berkenan untuk diperiksa penanda biologis  dalam  penelitian  stunting,  dan  juga  kepada  para  kader  di posyandu,  serta  kepada  staf  dinas Kesehatan Pandeglang atas dukungan terhadap penelitian ini.

## Pendanaan
Hibah  Kementerian  Pendidikan,  Kebudayaan,  Riset,  Dan  Teknologi Dosen  Pemula  Dikti  Nomor 0536/E5/PG.02.00/2023

## Kontribusi Setiap Penulis
Ahmad  Rusdan  Handoyo  Utomo  melakukan  perancangan  penelitian,  Analisa  hasil,  penulisan manuskrip;  Dian  Widiyanti  melakukan  pengurusan  kaji  etik,  perekrutan  subyek  dan  mendapatkan persetujuan  dari  orang  tua  setelah  penjelasan  ( informed  consent );  Intan  Razari  melakukan  pemeriksaan
metilasi PCR; Harliansyah melakukan kajian literatur terkait stunting dan hormone IGF2; Syukrini Bahri melakukan pengambilan darah dan transportasi dari Pandeglang ke laboratorium Universitas YARSI

## Pernyataan Konflik Kepentingan
Tidak ada konflik kepentingan.

## DAFTAR PUSTAKA
Bouwland-Both, M. I., Van Mil, N. H., Stolk, L., Eilers, P. H. C., Verbiest, M. M. P. J., Heijmans, B. T., Tiemeier, H., Hofman, A., Steegers, E. A. P., Jaddoe, V. W. V., & Steegers-Theunissen, R. P. M. (2013). DNA methylation of IGF2DMR and H19 is associated with fetal and infant growth: The generation R study. PLoS ONE , 8 (12). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081731 de  Onis,  M.,  &  Branca,  F.  (2016).  Childhood  stunting:  A  global  perspective.  In Maternal  and  Child Nutrition (Vol. 12, pp. 12–26). Blackwell Publishing Ltd. https://doi.org/10.1111/mcn.12231 Iqbal, M. S., Rahman, S., Haque, M. A., Bhuyan, M. J., Faruque, A. S. G., & Ahmed, T. (2019). Lower intakes  of  protein,  carbohydrate,  and  energy  are  associated  with  increased  global  DNA methylation in 2- to 3-year-old urban slum children in Bangladesh. Maternal and Child Nutrition , 15 (3). https://doi.org/10.1111/mcn.12815
Laksono, A. D., Wulandari, R. D., Amaliah, N., & Wisnuwardani, R. W. (2022). Stunting among children under  two  years  in  Indonesia:  Does  maternal  education  matter? PLoS  ONE , 17 (7  July). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0271509
Peter, C. J., Fischer, L. K., Kundakovic, M., Garg, P., Jakovcevski, M., Dincer, A., Amaral, A. C., Ginns, E. I., Galdzicka, M., Bryce, C. P., Ratner, C., Waber, D. P., Mokler, D., Medford, G., Champagne, F. A., Rosene, D. L., McGaughy, J. A., Sharp, A. J., Galler, J. R., & Akbarian, S. (2016). DNA Methylation  Signatures  of  Early  Childhood  Malnutrition  Associated  With  Impairments  in Attention and Cognition. Biological Psychiatry , 80 (10), 765–774.
https://doi.org/10.1016/j.biopsych.2016.03.2100
Quilter,  C.  R.,  Harvey,  K.  M.,  Bauer,  J.,  Skinner, B.  M., Gomez,  M.,  Shrivastava,  M.,  Doel,  A. M.,
Drammeh, S., Dunger, D. B., Moore, S. E., Ong, K. K., Prentice, A. M., Bernstein, R. M., Sargent, C. A., & Affara, N. A. (2021). Identification of methylation changes associated with positive and negative growth deviance in Gambian infants using a targeted methyl sequencing approach of genomic DNA. FASEB BioAdvances , 3 (4), 205–230. https://doi.org/10.1096/fba.2020-00101 Ramos-Lopez,  O.,  Riezu-Boj,  J.  I.,  Milagro,  F.  I.,  &  Martinez,  J.  A.  (2019).  Epigenetics  of undernutrition.  In Handbook  of  Nutrition,  Diet,  and  Epigenetics (Vol.  1,  pp.  457–481).  Springer International Publishing. https://doi.org/10.1007/978-3-319-55530-0_24
Shen, L., Li, C., Wang, Z., Zhang, R., Shen, Y., Miles, T., Wei, J., & Zou, Z. (2019). Early-life exposure to severe famine is associated with higher methylation level in the IGF2 gene and higher total cholesterol in late adulthood: The Genomic Research of the Chinese Famine (GRECF) study. Clinical Epigenetics , 11 (1). https://doi.org/10.1186/s13148-019-0676-3
Surono, I. S., Widiyanti, D., Kusumo, P. D., & Venema, K. (2021). Gut microbiota profile of Indonesian stunted  children  and  children  with  normal  nutritional  status. PLoS  ONE , 16 (1  January). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0245399
Taylor, R. M., Smith, R., Collins, C. E., Mossman, D., Wong-Brown, M. W., Chan, E. C., Evans, T. J., Attia, J. R., Buckley, N., Drysdale, K., Smith, T., Butler, T., & Hure, A. J. (2020). Global DNA methylation and cognitive and behavioral outcomes at 4 years of age: A cross-sectional study. Brain and Behavior , 10 (4). https://doi.org/10.1002/brb3.1579
Tedjokusumo,  V.  L.  I.,  Chandra,  S.  P.,  Surjadjaja,  E.,  Artadana, I. B. M.,  &  Putra,  S. E. D.  (2021). Methylation analysis of Igf2 / H19 Imprinting Control Region (ICR) in Type II Diabetes Mellitus induced  mice  using  Methylation-Specific  PCR. Journal  of  Physics:  Conference  Series , 1882 (1). https://doi.org/10.1088/1742-6596/1882/1/012098
Tobi, E. W., Slagboom, P. E., van Dongen, J., Kremer, D., Stein, A. D., Putter, H., Heijmans, B. T., & Lumey,  L.  H.  (2012).  Prenatal  famine  and  genetic  variation  are  independently  and  additively associated  with  dna  methylation  at  regulatory  loci  within  IGF2/H19. PLoS  ONE , 7 (5). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0037933
Vaiserman,  A.,  &  Lushchak,  O.  (2021).  Prenatal  famine  exposure  and  adult  health  outcomes:  an epigenetic  link.  In Environmental  Epigenetics (Vol.  7,  Issue  1).  Oxford  University  Press. https://doi.org/10.1093/eep/dvab013
Yang, Y., Hu, J. F., Ulaner, G. A., Li, T., Yao, X., Vu, T. H., & Hoffman, A. R. (2003). Epigenetic Regulation of Igf2/H19 Imprinting at CTCF Insulator Binding Sites. Journal of Cellular Biochemistry , 90 (5), 1038–1055. https://doi.org/10.1002/jcb.10684