## Ekspresi mRNA BRLF1 Virus Epstein-Barr dari Biopsi Jaringan Tumor Formalin- Fixed Paraffin Embedeed Sebagai Petanda  Biologi Molekul Diagnosis Karsinoma Nasofaring
Arin Herkilini 1 , P. Maria Hendrati 1 , Nur Signa Aini Gumilas 2 , Hidayat Sulistyo 2
1 Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto
2 Fakultas Kedokteran Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto E-mail : arin_herkilini@yahoo.com

## Abstract
Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is a malignant tumor that grows in the nasopharynx with a predilection in the fossa Rosenmuller.  Epithelial  malignancies  are  often  found  in  populations  of  China  and  Southeast  Asia,  including Indonesia. The NPC incidence in year 2008 as many as 84,400 cases and 51,600 of these cases resulted in death. A total of 120 new cases per year NPC found in hospitals Prof. dr. Margono Soekarjo (RSMS), Purwokerto. The NPC is difficult  to be  diagnose  caused  its  primary tumor  lies  closed  to the  skull base  as  well  as  various  structures  of  vital organs.  Therefore, methods that can  detect  early  NPC  required  for  inspection.The  etiology  of  NPC  is multifactorial consisting  of  genetic  factors,  factors  of  infection  Epstein-Barr  Virus  (EBV)  and  environmental factors.EBV  has  two phases  in  the  cycle  of  infection  that  is  the  phase  of  lytic  and  latent  phase.    BRLF1  has  an  important  function  as mediator transition from latent e NPC. The research aimed  to analysis mRNA BRLF1 expression as a biomarker of NPC  diagnosis  by  RT-PCR  and  to  determine  the  positivity  of  RT-PCR  method  to  detect  the  expression  of  mRNA BRLF1. The research design was cross sectional study. Samples were FFPE tumor biopsy of NPC WHO III  and the total  samples  were  22  individu  from  Department  of  Pathology  Anatomy,    Prof.  Dr.  Margono  SoekarjoHospital, Purwokerto with informed consent. The positivity of mRNA BRLF1 from FFPE tumor biopsy of NPC WHO III  was in 63.6%indicating a high expression..
Keywords : mRNA BRLF1, Epstein-Barr Virus, FFPE, Nasopharyngeal Carcinoma

## Abstrak
Karsinoma  Nasofaring  (KNF)  adalah  tumor  ganas  yang  tumbuh  di  nasofaring  dengan  predileksi  pada  fosa Rosenmuller.  Keganasan  epitel  sering  ditemukan  pada  populasi  Cina  dan  Asia  Tenggara,  termasuk  Indonesia. Kejadian KNF di tahun 2008 sebanyak 84.400 kasus dan 51.600 kasus ini mengakibatkan kematian. Sebanyak 120 kasus  baru  per  tahun  KNF  ditemukan  di  RSUD  dr.  Dr.  Margono  Soekarjo  (RSMS),  Purwokerto.  KNF  sulit  untuk didiagnosis karena tumor utamanya terletak dekat dengan dasar tengkorak serta berbagai struktur organ vital. Oleh karena  itu,  metode  yang  dapat  mendeteksi  KNF  awal  diperlukan  untuk  pemeriksaan.  Etiologi  KNF  bersifat multifaktorial  yang  terdiri  dari  faktor  genetik,  faktor  infeksi  Virus  Epstein-Barr  (EBV)  dan  faktor  lingkungan.  EBV memiliki dua fase dalam siklus infeksi yaitu fase fase litik dan laten. BRLF1 memiliki fungsi penting sebagai mediator transisi  dari  laten  ke  fase  litik.  Ekspresi  mRNA  BRLF1  yang  dilakukan  dengan  metode  RT-PCR  dapat  digunakan untuk mendukung diagnosis KNF, sehingga metode ini dapat meningkatkan efisiensi pemeriksaan KNF. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis ekspresi mRNA BRLF1 sebagai biomarka diagnosis KNF dengan teknik RT-PCR dan untuk  mengetahui  sensitivitas  metode  RT-PCR  untuk  mendeteksi  ekspresi  mRNA  BRLF1.  Desain  penelitiannya adalah  penelitian cross  sectional .  Sampel  adalah  biopsi  tumor  FFPE  dari  pasien  KNF    WHO  III  dan  total  sampel adalah 22 individu pada Departmen Patologi Anatomi, Rumah Sakit Prof. Dr. Margono Soekarjo, Purwokerto dengan informed  consent .  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  positivitas  ekspresi mRNA  BRLF1  dari  biopsi  tumor  FFPE NPC WHO III adalah 63,6%  yang menunjukkan ekspresi tinggi.
Kata kunci : mRNABRLF1, Epstein-Barr Virus, FFPE, Karsinoma Nasofaring

## Pendahuluan
Penyakit  kanker  merupakan  salah  satu masalah kesehatan yang penting di dunia. Angka kejadian  dan  kematian  akibat  kanker  terus meningkat  setiap  tahunnya.  Salah  satu  jenis penyakit  kanker  adalah  karsinoma  nasofaring. Karsinoma  nasofaring (KNF) merupakan penyakit genetik multifaktor yang endemik yang mempunyai  perbedaan  yang  signifikan  dalam distribusi geografis (Jemal et al.,2011).
Insidensi  KNF  diperkirakan  ada  sekitar 84.400  kasus  dan  51.600  kematian  pada  tahun 2008,  di  mana  insidensi  ini  mewakili  sekitar  0,7 persen dari semua insidensi kanker secara global. Insidensi KNF menduduki urutan ke-24 di seluruh
dunia  dan  urutan  ke-22  di  negara  berkembang dari  semua  insiden  kanker  (Jemal  et  al.,  2011). KNF relatif rendah di dunia yaitu umumnya kurang dari  1  per  100.000  penduduk  per  tahun,  namun insidensi  KNF  ditemukan  tinggi  pada  penduduk yang  hidup  di  Cina  Selatan  dan  di  daerah  Cina lainnyayaitu  50  per  100.000  penduduk  per  tahun (Haryanto &Mubarika, 2000), beda halnya dengan Amerika  dan  Eropa  yaitu  0,5  per  100.000 penduduk per tahun dan hanya 1-2% dari seluruh tumor ganas kepala dan leher (Munir et al., 2007). KNF  mempunyai  perbedaan  signifikan  dalam distribusi geografis dan etnis. Insidensi KNF pada pria  cenderung  lebih  tinggi  dibandingkan  wanita dengan rasio 2,3:1 (Chang & Adami, 2006).
Data dari berbagai rumah sakit di Indonesia menunjukkan  bahwa  KNF  merupakan  tumor ganas bidang THT yang paling banyak dijumpai di Indonesia  dan  menduduki  urutan.  Insidensi  KNF di  Indonesia  hampir  merata  di  setiap  daerah;  di Rumah  Sakit  Cipto  Mangunkusomo  (RSCM) Jakarta  ditemukan  lebih  dari  100  kasus  setahun, RS. Hasan Sadikin Bandung 60 kasus, Makassar 25  kasus,  Palembang  25  kasus,  Denpasar  15 kasus,  11  kasus  di  Padang  dan  Bukittinggi,  serta 120  kasus  per  tahun  di  RSUD  Prof.  Margono Soekarjo  (RSMS)  Purwokerto.  Demikian  pula  di Medan,  Semarang,  Surabaya  dan  kota-kota lainnya  menunjukkan  distribusi  KNF  yang  merata di  Indonesia  (Notopuro,  2008).  Di  wilayah Kabupaten Banyumas, insidensi KNF menunjukan peningkatan 3,3 kali pada tahun 2009 dibandingkan  dengan  tahun  2008  jumlah  pasien baru  KNF  pada  tahun  2009  sebanyak  119  orang (Hafiidhaturrahmah,  2010).  Berdasarkan  rekam medis  RSUD  Prof.  Dr.  Margono  Soekarjo  jumlah kunjungan  pasien  KNF  pada  tahun  2013  sebesar 371  pasien  dengan  perincian  74  pasien  berasal dari  wilayah  Kabupaten  Banyumas,  sedangkan pada  tahun    2014  jumlah  kunjungan  pasien  KNF sebanyak 332 pasien dengan perincian 73 pasien berasal dari wilayah Kabupaten Banyumas (Dinas Kesehatan Banyumas, 2014).
Etiologi KNF bersifat multi faktor yang terdiri dari  faktor  genetik,  faktor  lingkungan,  dan  faktor infeksi  Epstein-Barr  virus  (EBV)    (Fields  et  al., 1996).  Faktor  genetik  penyebab  KNF  yaitu kelainan  kromosom,  polimorfisme  gen.  Faktor lingkungan  yang  dapat  menimbulkan  penyakit KNF  yaitu  sering  memakan  ikan  asin  dan makanan  yang  diawetkan.  Hal  ini  didukung  oleh pernyataan  Liebowitz  (1994)  bahwa,  peningkatan insidensi  KNF  juga  dilaporkan  berkaitan  erat dengan  faktor  makanan,  seperti  makanan  yang diawetkan, difermentasi, dan diasapi.
Infeksi Epstein-Barr Virus (EBV) merupakan faktor  penyebab  utama  timbulnya  KNF.  Epstein Barr-Virus  (EBV)  adalah  herpesvirus  limfotropik yang dapat menginfeksi dan bereplikasi dalam sel epitel  dan  limfosit  B  (Alex  &  Jenson,  2006). Menurut  Kuo  et  al.  (2001)  keberadaan  EBV  pada penderita KNF dapat diketahui dengan ditemukannya  DNA  EBV  dalam  spesimen  biopsi jaringan  penderita  KNF. Virus  EBV ini  dapat  pula menyebabkan  pertumbuhan  immortal  limfosit  B pada penderita KNF (Savitri & Sofia, 2005).
Genom  EBV  merupakan  DNA  untai  ganda yang  tertutup  oleh  protein  kapsid  berbentuk ikosahedral  dikelilingi  oleh  amplop  lipid  yang mempunyai  tonjolan  glikoprotein.  Gen  yang diekspresikan  pada  fase  laten  yaitu  gen Epstein- Barr Virus NuclearAntigen (EBNA), Latent Membrane Protein (LMP), dan EBV Encoded RNA (EBER)  (Gullo  et  al.,  2008).  Pada  fase  litik  daur infeksi  EBV  terjadi  serangkaian  ekspresi  gen litik,   replikasi  genom  virus  dan  produksi  virion.
Jenis  gen  litik  EBV,  antara  lain  BRLF1,  BALF1, BZLF1,  dan  BCLF1.Ekspresi  gen  litik  BRLF1 hanya  ditemukan  pada  jaringan  tumor    pasien KNF,  sedangkan  gen  litik  lain  BALF1,  BZLF1, BCLF1  ekspresinya  tidak  spesifik  pada  jaringan tumor  KNF  baik  pada  penderita  KNF   maupun individu  sehat  karier  EBV.  Ekspresi  gen  litik BRLF1 dapat dide teksi pada darah tepi penjamu (Feng et al., 2000). Gen litik immediate-early EBV yaitu BZLF1 dan BRLF1 berperan penting sebagai mediator transisi fase  laten menuju fase litik  daur infeksi  EBV.  Replikasi  virus  oleh  gen  BZLF1 secara  efisien  membutuhkan  gen  transaktivator lain BRLF1 (Muray et al., 2001). Rta (BRLF1 transcriptional  activator )  diduga  mem- fasilitasi  pertumbuhan  tumor,  sehingga  gen BRLF1  berkontribusi  terhadap  perkembangan KNF.  Oleh  karena  itu,  analisis  ekspresi  gen  litik BRLF1  dapat  digunakan  untuk  menegakkan diagnosis  KNF  dan  meningkatkan  efisiensi  dalam penanganan KNF (Brennan, 2006).
Ekspresi  mRNA  BRLF1  Epstein-Barr  Virus merupakan  petanda  sensitif  dan  spesifik  untuk diagnosis  kanker  karsinoma  nasofaring  dan memberikan  bukti  yang  cukup  menjanjikan sebagai  petanda  molekuler  untuk  deteksi  dini, staging , prognosis, dan/atau pemantauan kekambuhan kanker karsinoma nasofaring (Cacais,  2008).  Pengukuran  aktivitas  mRNA Epstein-Barr  Virus  (EBV)  pada  lokasi  tumor primer,  dilakukan  dengan  menggunakan  sampel berupa  blok  parafin  biopsi  jaringan  tumor  KNF. Sampel  ini  digunakan  karena  mudah  didapatkan, dapat  digunakan  kembali,  untuk  pengukuran aktivitas  mRNA,  dan  penggunaannya  tidak terbatas oleh waktu.
Ekspresi  transkrip  (mRNA)  gen  EBV  dulu dideteksi  dengan  menggunakan  teknik  Northern Blotting.  Pada  saat  ini,  deteksi  mRNA  gen  EBV dengan  teknik reverse  transcriptase PCR  (RT- PCR),  karena  teknik  ini  lebih  sensitif  untuk mendeteksi  mRNA  yang  mengalami  proses pembuangan intron ( spliced mRNA) dalam jumlah kecil dan memerlukan lebih sedikit jumlah sampel klinis  (Wahyono  et  al.,  2010).  Teknik reverse transcriptase PCR  (RT-PCR),  terdiri  dari  dua tahap, pertama, sintesis cDNA dari mRNA dengan cara reverse transcription dan selanjutnya amplifikasi  cDNA  dengan  teknik  PCR.  RT-PCR digunakan untuk mendapatkan panjang klon DNA secara  utuh  dari  jumlah  mRNA  yang  sangat sedikit dan mendeteksi transkript mRNA yang unik dari  sel-sel  abnormal  di  dalam  lingkungan  sel-sel yang normal (Auerkari et al., 1998).
Kesulitan  diagnosa  dini  pada  KNF  sampai saat  ini  masih merupakan  masalah  besar.  Hal  ini disebabkan  oleh  karena  gejala  penyakit  yang tidak  khas  dan  letak  tumor  yang  tersembunyi sehingga  sulit  untuk  diperiksa.  Di  samping  itu, pemeriksaan  serologi  dan  histopatologi  yang belum  memadai  seperti  pewarnaan  immuno-
histokimia  serta  hampir  seluruh  penderita  datang pada  stadium lanjut  (Munir  et  al.,  2007).  Menurut Lu et al. (2010), hanya sekitar 0,9-2,9% penderita yang  datang  pada  stadium  dini,  dan  selebihnya datang  pada  stadium  akhir.  Keadaan  inilah  yang menyebabkan penatalaksanaan KNF belum memberikan hasil yang memuaskan.

## Metode
Penelitian  dilaksanakan  di  Laboratorium Patologi Anatomi RSUD Prof dr.Margono Soekarjo  Purwokerto,  Laboratorium  Genetika  dan Biologi  Molekuler  Fakultas  Biologi  Unsoed,  dan Laboratorium  Riset  Fakultas  Kedokteran  Unsoed. Penelitian  dilakukan  selama  bulan  September 2015 - Januari 2016.
Rancangan  penelitian  yang  digunakan adalah  penelitian  deskriptif  yang  berbentuk  studi belah  lintang  (cross  sectional).  Sampel  penelitian ini  adalah  biopsi  jaringan  tumor    penderita  KNF yang  didiagnosis  pasti  sebagai  KNF  WHO-3  dari hasil  pemeriksaan Patologi Anatomi dari Poli THT RSUD  Prof.  dr.  Margono  Soekarjo,  Purwokerto. Berdasarkan  atas  proporsi  jumlah  pasien  KNF dibandingkan  dengan  kanker  lain  adalah  5,46 persen  (Incidency  Primary  Cancer  in  Indonesia Pathology  Base,  1990),  maka  besar  sampel minimal  yang  diperlukan  dalam  penelitian  ini adalah    22  orang  (Sastroasmoro  dan  Ismael, 2002).
Isolasi  RNA  berdasarkan  protokol  kit Purelink  FFPE  RNA  Isolation  (Invitrogen,  USA). Sebanyak  3-8  irisan  dari  10µl  sampel  biopsi jaringan tumor penderita KNF (0,5-1 cm2) diambil, kemudian  ditambahkan  300µm  larutan  Melting Buffer.Lysate (a) disentrifugasi dengan kecepatan 15.700xg (13.000 rpm), selama 10-20 detik.Lysate diinkubasi  pada  suhu  72°C,  selama  10  menit (setiap 2-3 menit dilakukan homogenisasi dengan tapping untuk melarutkan parafin. Lysate ditambahkan  20µl  Proteinase  K,  kemudian divortex  selama  15  detik  sehingga  homogen  dan diinkubasi  pada  suhu  60°C,  selama  60  menit, sehingga  diperoleh  lysate  non  visible  pada  akhir inkubasi.Lysate    disentrifugasi  pada  kecepatan 13.000  rpm,  selama  1  menit.  Lapisan  paraffin pada permukaan lysate ditembus dengan menggunakan  pipet  (1mL),  kemudian  lysate dipindahkan ke dalam tabung 1,5mL baru (RNAse clean  tube).Lysate  ditambahkan  sebanyak  400  µl binding  buffer,  kemudian  ditambahkan  800  µl 100%  ethanol,  dihomogenasi  lysate  dengan divorteks. Sebanyak 700 µl lysate (h) dimasukkan ke  dalam  spin  cartridge  dengan  tabung  koleksi (Tahap  1).  Lysate  (h)  disentrifugasi  dengan kecepatan  2900  rpm  selama  1  menit.  Kemudian larutan  dibuang  melalui  spin  cartridge  ditampung di dalam tabung koleksi. Spin cartridge dipasangkan  kembali  pada  tabung  koleksi. Sebanyak 700 µl lysate (h) dimasukkan ke dalam spin  cartridge  dengan  tabung  koleksi  (Tahap  II).
Kemudian  disentrifugasi  lysate  (h) dengan kecepatan  2900  rpm  selama  1  menit.  Kemudian larutan  dibuang  melalui  spin  cartridge  ditampung di dalam tabung koleksi. Spin cartridge dipasangkan  kembali  pada  tabung  koleksi. Kemudian  dicuci  dengan  wash  buffer  sebanyak 500  µl  dan  diulang  sebanyak  2-3  kali  perlakuan. Disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1  menit.  Larutan  yang  melalui  spin  cartridge ditampung di dalam tabung pencuci dibuang, spin cartridge  dipasangkan  pada  1,5  mL  tabung recovery.Sebanyak  50  µl  RNA-se  free  water dipanaskan pada suhu 65°C, kemudian dimasukkan  ke  dalam  spin  cartridge  dengan tabung  recovery,  diinkubasi  selama  1  menit, disentrifugasi  dengan  kecepatan  13.000  rpm selama  1  menit  ,  larutan  ditampung  melalui  spin cartridge  delam  tabung  recovery  sehingga  akan diperoleh  larutan  RNA  kualitas  I  dengan  volume 50 µl. Prosedur elusi sekali lagi diulang, diperoleh larutan  RNA  kualitas  II.Larutan  RNA  bisa digunakan  untuk  analisis  RT-PCR  dengan diletakkan di atas es. Larutan RNA bisa disimpan pada suhu -80°C (dalam jangka waktu lama).
Sintesis  cDNA  berdasarkan  protokol  kit Super  Script  III  First  Strand  System  (Invitrogen, USA). Annealed RNA mix dibuat dalam volume 10 µL  dengan  komposisi  sebagai  berikut  :  50  µM Oligo d(T) 20 primer sebanyak 1,0 µL (1x reaksi), 10  mM  dNTP  mix  sebanyak  1,0  µL  (1x  reaksi), template  RNA  sebanyak  7,0  µL  (1x  reaksi), DEPC- treated water sebanyak 1,0 µL (1x reaksi). Diinkubasi di waterbath pada suhu 65°C selama 5 menit  dan  diletakkan  di  atas  es  selama  2-3 menit.Dibuat cDNA synthesis mix pada volume 10 µL  dengan  komposisi  sebagai  berikut  :  10  X  RT Buffer sebanyak 2,0 µL (1x reaksi), 25 Mm MgCl2 sebanyak  4,0  µL  (1x  reaksi),  0,1  DTT  sebanyak 2,0  µL  (1x  reaksi),  RNaseOUT  (140  U/  µL) sebanyak  1,0  µL  (1x  reaksi),  Superscript  III  RT (200  U/  µL)  sebanyak  1,0  µL  (1x  reaksi). Dicampurkan  Annealed  RNA  Mix  dan  cDNA synthesis  mix  diinkubasi  di  waterbath  pada  suhu 50°C,  selama  50  menit  dan  diinkubasi  pada waterbath  pada  suhu  85°C,  selama  5  menit. Sebanyak 1 µL Rnase H dicampurkan, selanjutnya  diinkubasi  di  waterbath  pada  suhu 37°C, selama 20 menit.
Teknik RT- PCR digunakan untuk mendeteksi ekspresi mRNA  BRLF1 pada sampel penderita  KNF  WHO-3.  Primer  yang  digunakan pada  RT-  PCR  akan  menghasilkan  amplikon fragmen cDNA berukuran 157 pb. Campuran PCR dibuat  berdasarkan  protokol  kit  Dream  Taq  PCR kit  (Thermo  Scientific,  USA)  dibuat  dalam volume 15  μL    yang  komposisinya  terdiri  dari  7,5  μL Dream  Taq  PCR  Master  Mix    (Dream  Taq  DNA Polymerase,  2X  Dream  Taq  Buffer,  4 mM  MgCl 2 , 0,4 mM dGTP, 0,4 mM d ATP , 0,4 mM dCTP, 0,4 mM  dTTP),  1,0  μM  primer  sisi  kiri  ( forward/left primer ) adalah 5’-
AGCAGAGCGAGCGGGAAGAG- 3’  dan  primer sisi  kanan  ( reverse/right  primer )  adalah  5’- TCGCTCTCTTGGTGGACCGC- 3’,  ddH 2 O  (water PCR  grade)  5  µL  dan  0,5  µg/µL  cetakan DNA.Campuran PCR ini dimasukkan dalam mesin PCR  (Applied  Biosystem Thermocycler  -Verity  96 well,  USA).  Tahap  amplifikasi  dilakukan  pada mesin  PCR  sebanyak  35  siklus  dengan  kondisi PCR  sebagai  berikut  :    denaturasi  awal  95°C selama 3 menit, denaturasi 95°C selama 30 detik, penempelan    62,4°C  selama  2  menit  30  detik, pemanjangan  72°C  selama  1  menit  30  detik, pemanjangan  akhir  72°C  selama  5  menit.  Hasil RT-PCR  dipisahkan  dengan  elektroforesis  gel agarose 1%. Hasil elektroforesis tersebut kemudian  divisualisasi  dengan  Gel-Doc  1000. (Hitachi, Japan).

## Hasil dan Pembahasan
Konsentrasi  cDNA  diukur  menggunakan nanodrop  spektrofotometer.  Hasil  pengukuran konsentrasi  cDNA  berkisar  74,5-1.213  ng/µl. Kemurnian cDNA diukur nilai absorbansinya pada panjang  gelombang  (λ)  260/280  nm  dan  (λ) 260/230  nm.  Hasil  pengukuran  kemurnian  cDNA (λ260/280)  pada  penelitian  ini,  berkisar  antara
0,617577197-1,59193707,  sedangkan  pada  nilai absorbansi λ260/230 berkisar antara 0,505836576- 1,745922747.
Sampel  diambil  dari  biopsi  jaringan  tumor KNF dalam blok parafin penderita KNF tipe WHO- 3 menggunakan 22 sampel yang diambil di RSUD Prof.  Dr.  Margono  Soekarjo,  diisolasi  untuk dideteksi  ekspresi  mRNA  BRLF1  menggunakan metode RT- PCR. Hasil primer-blast menunjukkan bahwa primer yang digunakan dalam penelitian ini merupakan pr imer spesifik untuk mengamplifikasi  fragmen  gen  BRLF1 Forward primer (5’-AGCAGAGCGAGCGGGAAGAG-3’) dan reverse primer (5’- TCGCTCTCTTGGTGGACCGC- 3’) digunakan
untuk  amplifikasi    yang  akan  menghasilkan fragmen  DNA  dengan  panjang  157  bp.  Hasil optimasi  RT-PCR  diperoleh  suhu  annealing  yaitu 62,4ºC.    Pita  cDNA  yang  terbentuk  dibandingkan ukurannya dengan DNA ladder 100 bp. Gambar 1 dan  2.  menunjukkan  ekspresi  mRNA  BRLF1 menggunakan metode RT- PCR yang
menggunakan  primer    spesifik  dan  bernilai  positif dengan produk berukuran
157 bp.
Gambar  1.  Visualisasi  ekpresi  mRNA  BRLF1  EBV  dengan  RT-PCR  (M,  Marka  DNA  100  bp;  Ekpresi mRNA BRLF1 EBV positif pada sumuran no. 1 - 10 (EBV-6, EBV-9, EBV-3, EBV-4, EBV-15, EBV- 18,  EBV-17,  EBV-10,  EBV-2  danEBV-16).Ekpresi  mRNA  BRLF1  EBV  negatif  pada  sumuran  no. 11(EBV-1).
Menurut  Feng  et  al.  (2000),  jaringan  tumor karsinoma nasofaring dapat mewakili replikasi litik EBV  pada  sel  epitel.  Studi  yang  dilakukan menggunakan  beberapa  gen  antara  lain,  BZLF1, BALF2, BRLF1  dan  BCLF1,  baik  di  KNF maupun biopsi  kontrol.  Dalam  hasil  penelitian  Feng  et  al. (2000)  yang  menggunakan  sampel  darah  perifer, menunjukkan  hasil  ekspresi  EBV  IE  gen  BZLF1 terdeteksi  4  dari  10  pasein  KNF  (40%),  gen BALF2  terdeteksi  3  dari  10  pasien  KNF,  namun pada  gen  BRLF1  dan  BCLF1  tidak  terdeteksi dalam  sampel  baik  KNF maupun  individu  kontrol. Pada  sampel  biopsi  menunjukkan  ekspresi BZLF1,  BALF1,  dan  BCLF1  terdeteksi  5  dari  7 biopsi  KNF  (71,42%),  serta  terdeteksi  3  dari  5 biopsi kontrol (60%),  sedangkan ekspresi gen IE BRLF1  terdeteksi  pada  4  dari  7  biopsi  jaringan tumor  KNF  (57,14%),  tapi  tidak terdeteksi  pada  5 biopsi  kontrol.  Ekspresi  gen  BRLF1hanya    dapat terdeteksi  biopsi  KNF  saja,  ini  menunjukkan bahwa  replikasi  EBV  secara  in  vivo  pada  sel tumor epitel KNF berbeda dari sel non-ganas EBV pada individu kontrol.
Berdasarkan  hasil  kemurnian  tersebut, menunjukkan bahwa sampel penelitian terkontaminasi,  baik  oleh  protein  atau  bahan organik  lain.  Sambrook  &  Russel    (2001) menyatakan  bahwa  DNA  dengan  rasio  λ260 nm/280  nm  pada  kisaran  antara  1,8-2,0  memiliki kemurnian  sesuai  persyaratan  kemurnian  dalam analisis  molekuler.  Pada  kemurnian  DNA  yang nilainya  lebih  rendah  dari  1,8  menunjukkan sampel DNA terkontaminasi oleh protein, sedangkan  kemurnian  DNA  yang  nilainya  lebih tinggi dari 2,0 artinya sampel DNA terkontaminasi oleh  RNA.  Menurut  Tenriulo  et  al.  (2001), kontaminasi  protein  dan  bahan  organik  lainnya pada  larutan  DNA  ditunjukkan  dengan  nilai  rasio λ260  nm/280  nm  adalah  <1,8,  sebaliknya kontaminasi  fenol  ditunjukkan  nilai  rasio  tersebut λ260 nm/280  nm adalah>2,0. Pada perbandingan absorbansi  λ  260/230  nm  DNA  murni  berkisar antara  2-2,2.  Jika  nilainya  lebih  rendah  dari  2 maka  DNA  terkontaminasi  oleh  karbohidrat, bahan organik, atau kemikalia lain (Boyer, 2005).
Rendahnya  kemurnian  cDNA  ini  dapat berasal dari rendahnya kemurnian RNA. Complementary  DNA (cDNA)  adalah  DNA  dibuat berdasarkan  sekuen  mRNA.  Pembuatan  cDNA melalui pemanfaatan enzim reverse transcriptase, yang melakukan sintesis DNA dari template RNA. Kuantitas  RNA  yang  baik  dibutuhkan  untuk
melakukan reverse  transcription yang  optimal, sehingga  diperoleh  cDNA  dengan  kuantitas  yang baik (Godfrey et al, 2000). Kemurnian RNA dalam penelitian ini pada λ 260/280 adalah 0,62  – 1,59. Kemurnian  RNA  dan  cDNA  yang  rendah  yang rendah didapatkan dari biopsi jaringan tumor blok parafin. Formalin  fixed  parafin-embedded (FFPE) secara rutin digunakan untuk diagnosis histopatologi  seperti  kanker  di  rumah  sakit,  serta dapat digunakan sebagai bahan sampel penelitian untuk ekspresi mRNA.
Penelitian  ekspresi  mRNA  BRLF1  EBV pada  jaringan  tumor  KNF  dalam  blok  parafin penderita  KNF  tipe  WHO-3  menggunakan  22 sampel  yang  diambil  di  RSUD  Prof.  Dr.  Margono Soekarjo,  serta  penelitian  ini  dilaksanakan  pada bulan  September    2015  -  Januari  2016.  Ekspresi mRNA  BRLF1  EBV  menggunakan  sampel  yang diambil secara consecutive sampling yaitu semua subjek yang datang dan memenuhi kriteria inklusi dimasukkan  dalam  penelitian  sampai  jumlah subjek yang diperlukan terpenuhi.

## Simpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan,  dapat  disimpulkan  bahwa  (1)  Metode RT-PCR  dapat  digunakan  untuk  menganalisis ekspresi  mRNA  BRLF1  pada  sampel  biopsi jaringan  dalam  blok  paraffin  penderita  KNF;  (2) Positivitas  ekspresi  mRNA  BRLF1  daribiopsi jaringan  tumor  FFPE  adalah  63,6%.  mRNA BRLF1 daribiopsi jaringan tumor FFPE terekspresi tinggi  pada  penderita  KNF  WHO  III,  sehingga ekspresi  mRNA  BRLF1  berpotensi  sebagai petanda biologi molekul potensial dalam diagnosis KNF. Perlu dilakukan penelitian lanjutan mengenai  ekspresi  relatif  mRNA  BRLF1  EBV dengan  menggunakan  teknik real-time RT-PCR (RT-qPCR) dihubungkan dengan berbagai tingkat stadium  KNF  untuk  menganalisis  progresivitas tumor.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepada Direktorat  Penelitian  &  Pengadian  Masyarakat – Kemenristekdikti  atas  pendanaan  penelitian  ini melalui  Hibah  Penelitian  Fundamental  Tahun 2015-2016  dan  LPPM  Unsoed  sebagai  pengelola pendaanan penelitian ini.

## Daftar  Referensi
Adham,  M.,  Kurniawan  A.  N.,  Muhtadi  A.  I.,
Roezin A., Hermani B.,  Gondhowiardjo S., Tan  I.  B.  &  Middeldorp  J.  M.  2012. Nasopharyngeal  Carcinoma  in  Indonesia:
Epidemiology Incidence Signs and Symptoms at Presentation. Chinese Journal Cancer , 31(5), pp.185-196 Alex,  T.  &  Hall  B.  J.  2006. Epstein-Barr  Virus . New York : Taylor & Francis Group.
Ariwibowo,  Hendrawan.  2013.  Faktor  Risiko Karsinoma  Nasofaring. Jurnal  CDK/204 . Vol. 40(5).
Auerkari,  Sunarto,  &  Ahmad  D.  1998.  RT-PCR ( Reverse  Transcription-  Polymerase  Chain
Reaction ): Suatu Cara Pendeteksi Perubahan-Perubahan  Ekspresi  Gen  pada Penyakit. Jurnal Kedokteran Gigi Universitas Indonesia, 5 (3), pp. 162-165. Barnes,  Eveson  J.W.,  Reichart  P.,  Sidransky  D (Eds.): World Health Organization Classification  of  Tumours.  2005. Pathology and  Genetics  of  Head  and  Neck  Tumours . Lyon : IARC Press, pp. 85-97 .
Bhende, P. M., Seaman W. T., Delecluse H. J. & Kenney,  S.  C.,  2004.  The  EBV  Switch Protein  Z, Preferentially Binds and Activates the Methylated Viral Genom. Nat Genet , 36(10), pp.1999-2004.
Feng,  F.,  Ren,  E.  C.,  Liu,  D.,  Chan,  S.,  Hhu,    H. 2000. Expression of Epstein-Barr Virus lytic gene  BRLF1  in  nasopharyngeal  carcinoma :  potensial  use  in  diagnosis. Journal  of Genetics Virology , 81, pp. 2417-2423.
Ferreira,  C.,  Thiemy,  V.,  Maria.,  Nicole,  D.,  Seth, A.  2004.  Reverse  Trancriptase  PCR  : Principles  and  Application  in  Dentistry. Journal  of  Applel  Oral  Science ,  12  (1),  pp. 1-11.
Fields,  B.  N.,  Knipe,  D.  M.  &  Howley,  P.  1996. Fields  Virology .  Philadelphia:  Lippincott- Raven.
Haryanto,  A.,  &  Sofia  M.,  2012.  Isolasi  dan Amplifikasi  Gen  Penyandi  Domain  C- Terminus Latent Membrane Protein (LMP- I)  Epstein-barr  Virus  (EBV)  dari  Penderita Karsinoma  Nasofaring  (KNF). Journal  of Sains Veterinary ,18(2), pp.1-7.
Hafiidhaturrahmah,  D.A.B.,  2010. Distribusi  Data
Kanker Nasofaring Di RSUDMargono Soekarjo  Purwokerto  Tahun  2009 .  Referat. Purwokerto  :  SMF  Telinga  Hidung  dan Tenggorokkan  (THT)  Fakultas  Kedokteran Universitas Jenderal Soedirman.
Haryanto,  A.  &    S.  Mubarika.  2007.  Isolasi  dan Amplikasi  Gen  Penyandi  Domain  C- Terminal Latent  Membrane  Protein  (Imp-1)
Epstein-Barr  Viris  (EBV) dari  Penderita Karsinoma  Nasofaring  (KNF). Journal  of Sains Veterinary, 17 (2), pp.1-7.
Henny,  F.  2006.  Ekspresi  Protein  Mutan  p53 pada  Karsinoma  Nasofaring. Skripsi. Medan.:Fakultas  Kedokteran  Universitas SumateraUtara.
Hewajuli,  Dyah  Ayu.,  dan  Dharmayanti.  2014.
Perkembangan Teknologi Reverse Transcriptase-Polymerase  Chain  Reaction dalam Mengidentifikasi Genom Avian Influenza  dan  Newcastle  Disease. Bogor: Balai Besar Penelitian Veteriner.
Jemal  A,  Bray  F,  Center  CC,  Ferlay  J,  Ward  E,
Forman  D.  2011.  Global  cancer  statistics . Cancer Journal of Clinician , 6s1, pp. 69-90.
Munir,  D.  2010. Karsinoma  Nasofaring. Medan: USU Press.
Rezeki,  M.,  Parwati,  I.,  Bethy.,  Tjandrawati,  A. 2014. Validitas Multiplex Real Time Polymerase Chain Reaction untuk Diagnosis  Limfadenitis  Tuberkulosis  pada Spesimen Blok Parafin. Majalah Kedokteran Bandung, 46 (3), pp. 162-167.
Roezin  A  &  Adham  M.  2007. Karsinoma Nasofaring. Dalam : Soepardi EA, Iskandar N,  Bashiruddin  J,  Restuti  RD,  editor.  Buku Ajar  Ilmu  Kesehatan  :  Telinga  Hidung Tenggorok  Kepala  dan  Leher  Edisi  ke  6 . Jakarta : Balai Penerbit FKUI.
Sambrook J.,  &  Russel,  D.W.,  2001. Molecular Cloning:    A    LaboratoryManual (Third Edition).    New  York  :  Cold  Spring  Harbor LaboratoryPress.
Savitri,  E  &  Sofia  M.  H.  2012.Profil  Viral  Load Ebstein-Barr  Virus  dan  Titer  Antibodi  Ig  A (VCA-P18+  EBNA-1)  pada  Karsinoma Nasofaring  di  Makassar  dan  Yogyakarta. Journal  of  Indonesian  Medical  Association, 62(5), pp. 174-177.