KARAKTERISASI KULTUR MAKROFAG HASIL ISOLASI Mouse Peritoneum Makrofag (MPM)
Erna Susanti 1 , Retty Ratnawati 2 ,Aulanni’am 3 , Achmad  Rudijanto 4
1 Akafarma “ Putra Indonesia Malang”, Program Doktor Ilmu Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang
2 Lab. Ilmu Faal Divisi Fisiologi Molekuler Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya
3 Laboratorium Biokimia , Fakultas MIPA Universitas Brawijaya
4 Divisi Endokrin dan Metabolik Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya

## ABSTRACT
The aims of this study is to determine the MPM isolation techniques, results of the isolation and  identification,  so  it  can  be  used  as  a  reference  for  the  studies  using  macrophage  cell cultures. The most appropriate source for culturing macrophages are the primary culture of MPM.  Resident  peritoneal  macrophages  (RPM)  is  a  free-living  phagocytic  cells  in  the peritoneal  cavity.  Millions  of  resident  macrophages  can  be  taken  from  the  mice.  The peritoneal  cavity  is  an  easy  place  to  harvest  the  resident  macrophages.  Identification  of macrophages was conducted using flowcytometry  with specific marker CD 11B.  While the morphology  of  macrophages  in  culture  was  observed  microscopically  The  results  of  the study showed the average number of macrophages 1.03 x 106 cells / ml were isolated from peritoneal cavity of mice. The result of identification with flowcytometry with marker CD 11 B  shows  positive  results  macrophages.  While  the  observation  of  morphological characteristics  of  macrophages  cultures  show  the  same  characteristics  as  the  result  of research conducted by Kim in 1997 and Wang et al, 2010 so that it can be concluded that macrophages  can  be  isolated  from  the  peritoneal  cavity  and  can  be  used  as  a  source  of primary cultures of macrophages with good results and can be applied to studies related to the function and activation of macrophages in vitro. Keyword; Kultur Makrofag, Isolasi Mouse Peritoneum Makrofag (Mpm)
Pendahuluan Makrofag merupakan fagosit
mononuklear  yang  terdistribusi  luas  di  dalam tubuh. Sel tersebut berperan pada perkembangan,  homeostasis  dan  respon  imun alamiah  dan  adaptif.  Fisiologi  makrofag  dapat berubah tergantung lingkungan dimana makrofag  berada  serta  rangsangan  lokal  yang terjadi. Makrofag jaringan berasal dari monosit atau dari proliferasi sel yang membentuk koloni makrofag  resident.  Monosit  berasal  dari  sel progenitor  di  sumsum  tulang  yang  mengalami tahapan  dari  monoblast,  promonosit  dan monosit  selanjutnya  dilepaskan  di  sirkulasi. Monosit akan berdeferensiasi menjadi makrofag setelah  meninggalkan  sirkulasi  dan  masuk  ke jaringan. Di jaringan makrofag dapat teraktivasi dengan adanya rangsangan dan dapat mengubah aktivitas fisiologisnya (Zhang X,dkk., 2008).
Rongga  peritoneum  merupakan  tempat yang mudah untuk memanen makrofag resident yang  belum  mengalami  manipulasi.  Untuk meningkatkan jumlah makrofag dapat dilakukan  dengan  jalan  diberikan  penginduksi steril  seperti  Brewer  thioglycolate  Broth  atau
pepton  protease  yang  diinjeksikan  ke  rongga peitoneum  sebelum  sel  dipanen.Bahan  tersebut dapat  meningkatkan  migrasi  monosit  ke  dalam rongga peritoneum. Dengan induksi thioglikolat akan  didapatkan  paling  tidak  5  sampai  6  kali jumlah  makrofag  tanpa  diinduksi  (Zhang X,dkk., 2008).
Sumber yang paling sesuai untuk kultur makrofag    adalah    kultur primer  dari  makrofag tikus. Resident  Peritoneal  Makrofag (RPM) merupakan  sel  fagosit  yang  hidup  bebas  pada rongga  peritoneal.  Jutaan resident makrofag dapat diambil dari satu mencit. Jumlah sel yang banyak  dapat  dihasilkan  dengan  menginjeksi bahan  penginduksi  inflamasi  steril  seperti thioglycollate atau  Bio-Gel polyacrylamide   ke dalam  rongga  peritoneal.  Makrofag  yang didapatkan  diperkirakan lebih mature daripada resident makrofag,  dan  monosit  yang  diambil dari darah . Untuk eksperimen dapat digunakan makrofag  yang  teraktivasi    dengan  cara menginduksi bahan stimulasi inflamasi misalnya Mycobacterium  bovis Bacillus– Calmette–Guerin (BCG), strain Pasteur.
Pemurnian  makrofag  dari  cairan  peritoneal
mudah  dilakukan  menggunakan  kemampuan makrofag  untuk  melekat  pada  kultur  jaringan plastik. Adesi makrofag membutuhkan sejumlah  reseptor  penting  seperti scavenger receptor (SR)  dan reseptor  komplemen  tipe  3 (CR-3) (Davies JQ dan Gordon S, 2006).
Untuk  studi  dan  penelitian  dengan kultur  makrofag  selain  dapat  diperoleh  dari hasil  isolasi    dari  makrofag  peritoneal  dapat diisolasi dari murine bone marrow serta human monosit  derived  makrofag .  Bone  marrow adalah  sumber  baik  makrofag mature maupun prekursor  makrofag.    Dalam  jumlah  besar makrofag  dapat  diambil  dari  bone  marrow dengan  mengambil  sel immature dari  femur tikus  dan  mengkultur  dengan  spesifik growth factors .  Cara  ini  menghasilkan  sel  dengan populasi  yang  homogen  dan  sering  dianggap lebih  mudah  dibandingkan  dengan  proses
isolasi  secara  khusus  dari Resident  Bone Marrow  Cells (RBMM)    dengan  cara  mekanik dan enzimatik (Davies JQ dan Gordon S, 2006).
Human makrofag paling sering diambil dengan  memurnikan  monosit  darah  pada sirkulasi  yang  selanjutnya  secara  in  vitro  akan berdeferensiasi  menjadi  makrofag  mature.  Sel darah  putih  dengan  perbedaan  densitas  akan dapat  dipisahkan  dengan  sentrifugasi.  Monosit dipisahkan  dari  limfosit  dengan  melekatkan pada  kultur  jaringan  atau  dengan  gelatin  yang dicoated pada  tempat  kultur  yang  akan mendapatkan  kemurnian    antara  90  -95% (Davies JQ dan Gordon S, 2006).
Untuk  memeriksa  tingkat  kemurnian kultur  sel  yang  kita  dapatkan  dapat  ditentukan dengan menggunakan marker spesifik untuk sel makrofag yang dapat dilihat  pada tabel 1.
Tabel 1.  Penanda Antigen Makrofag
(Sumber: Davies and Gordon, 2006)
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui  tehnik  isolasi  MPM  ,  hasil  isolasi serta  identifikasinya  sehingga  dapat  digunakan sebagi acuan untuk penelitian yang menggunakan kultur sel makrofag.
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian
ini dilakukan di Laboratorium  Biomedik  Fakultas  Kedokteran Universitas  Brawijaya  Malang,  pada  bulan Januari  sampai  dengan  Maret  2015.  Penelitian ini telah mendapatkan kelayakan etik penelitian dari Komisi Etik Fakultas Kedokteran
Universitas Brawijaya Malang.
Bahan dan Cara Kerja
Sampel yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  Mencit  BABL/C  yang memenuhi  kriteria  usia  6-8  minggu  dan    bebas patogen.  Bahan  yang  digunakan  Medium RPMI, Phosphat  Buffer  Saline (  PBS)  tanpa
Calsium  dan  Magnesium,  medium  komplit makrofag.
Isolasi Mouse  Peritoneum  Makrofag ( MPM ) dan kultur makrofag  dilakukan dengan prosedur  sebagai  berikut  :  mencit    dimatikan dengan  dislokasi  tulang  leher  atau  dengan pemberian chloroform kemudian bagian abdomen  disemprot  dengan  alkohol  70  %. Bagian  abdomen  dibedah  bagian  kulit  luar  dan disterilisasi  dengan  alkohol  70  %,  kemudian sejumlah  10  ml  medium  RPMI  dingin diinjeksikan  dengan  menggunakan  jarum  19  G ke lapisan peritonium. Abdomen ditepuk- tepuk selama  10  detik  lalu  diambil  cairan  peritonium dengan  menggunakan  jarum  25G.  Konsentrasi makrofag  yang  digunakan  sekitar  10 6 sel  /  ml dimasukkan dalam tiap mikroplate 24 well yang berisi  cover  slip  kemudian  ditambahkan
medium  kompleks  200μl  dan  diinkubasikan pada inkubator CO 2 5% selama 2 jam pada suhu 37 0 C,  sel  yang  tidak  melekat  dibuang sedangkan  sel  yang  melekat  dicuci  dengan medium  RPMI  sebanyak  1  kali.  Setelah  dicuci ditambahkan  medium  komplet  ke  dalam  tiap mikroplate  24  well  sebanyak  500  µl  dan diinkubasi  kembali  pada  inkubator  CO 2 5% selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Setelah 24 jam kultur  makrofag  siap  digunakan  (Reni  S,  dkk., 2010).
Untuk  Identifikasi  Makrofag  dengan Marker  CD  11  B  Fluositometry  dilakukan  cara sebagai  berikut;  Suspensi  sel  hasil  isolasi makrofag peritoneum ditambahkan antibodi CD 11B  FITC  0,5  µl  didiamkan  20  meit  di  ruang gelap.  Selanjutnya  ditambahkan  sel  staining buffer  PBS  2  %  dalam  FBS  sebanyak  30  µl dimasukkan  appendorf  dan  dicek  dengan flowsitometri.
Data  yang  didapat  dari  penelitian  ini berupa data kualitatif berupa morfologi makrofag  hasil  kultur  dari  MPM  dan  hasil flowsitometri.
Hasil dan Pembahasan
Berdasarkan  penelitian  Wang et  al , 2008 tentang karakterisasi murin makrofag dari bone marrow, spleen dan peritoneum mendapatkan temuan bahwa Peritoneum Macrophage (PMs)  menunjukkan  makrofag yang lebih matur dibandingkan dengan Spleenic Macrophage (SPMs)  dan Bone  Marrow Macrophage (BMs).  PMs  memiliki  ekspresi MHCII  dan  CD  86  dalam  jumlah  tinggi.  MHC II  dan  CD  86  diekspresikan  tinggi  pada makrofag  yang  telah  berfungsi  sempurna  yang menunjukkan maturitasnya. Sedangkan CD 115 dan GR 1 umumnya diekspresikan oleh monosit maupun  makrofag  yang  belum  mengalami diferensiasi  dan  makrofag  immature.[wang, 27,28].  Dibandingkan  dengan  kultur  sel  dari cell line seperti J 774A1, RAW 264.7, P388D1, U937    kultur  sel  dari  kultur  primer  dari  BMs, PMs  dan  SPMs  lebih  umum  digunakan  karena kultur cell  line memiliki  kekurangan  ketika dilakukan subkultur secara terrus menerus akan menyebabkan gene  loss dan  merusak  fungsi imun  makrofag.  Untuk  mendapatkan  kultur MPM  diperlukan  tahapan  isolasi  yang  tepat sehingga  didapatkan  makrofag  dalam  jumlah yang  diharapkan.  Adapun  tahapan  isolasi makrofag  dari  peritoneum  mencit  dapat  dilihat pada gambar 1.
Gambar  1:  A)  Mencit  yang  telah  dieutanasia  dan  siap  dibedah  bagian  kulit  luar  abdomen  ;b) Menginjeksikan RPMI dingin ke rongga peritoneum; c) abdomen ditepuk- tepuk selama 10 detik; d) cairan peritoneum diambil.
A D C B
Untuk  menentukan  jumah  sel  hasil  isolasi  diukur  dengan  hematositometer  dengan  hasil sebagaimana terlihat pada tabel 1.
Tabel 1. Jumlah sel makrofag hasil perhitungan dengan hematositometer Mencit ke- Jumlah Sel Makrofag 1 1,19 x 10 6 sel/ ml 2 1,04 x 10 6 sel/ ml 3 0,85 x10 6 sel/ ml 4 1,10 x 10 6 sel/ ml 5 0,98 x 10 6 sel/ ml Rata- rata 1,03 x 10 6 sel/ ml
Berdasarkan  jumlah  sel  rata  –  rata    yang  didapatkan  menunjukkan  bahwa  hasil  isolasi makrofag sesuai dengan pustaka yang ada. Menurut Cohn, 1978, Fortier et al .,1982 umumnya jumlah makrofag  yang  dapat  diisolasi  dari  makrofag  berkisar  antara  0.5–1  ×  10 6 makrofag  tiap  mencit. [4,5] Untuk  membuktikan  apakah  hasil  isolasi  dari  rongga  peritoneum  tersebut  sel  makrofag  atau  bukan dilakukan  identifikasi  dengan  marker  CD  11B.  Adapun    hasil  identifikasi  makrofag  secara flowsitometri dengan marker CD 11B ditunjukkan gambar 2.
Gambar 2. Hasil identifikasi makrofag marker CD 11 B dengan flowsitometri.
Karakterisasi  makrofag  dengan  fluoresensi  menggunakan  monoklonal  antibodi  yang  terlabel yang secara spesifik mengenali protein yang diekspresikan oleh makrofag. Penanda permukaan dapat digunakan  untuk  membedakan  makrofag  dengan  sel  lainnya  dalam  ppulasi  sel  yang  heterogen. Flowsitometri  dapat  mengidentifikasi  dan  memilah  sel  yang  dikehendaki  dalam  populasi  sel  yang heterogen.  CD  11B  merupakan  salah  satu  marker  spesifik  untuk  mengidentifikasi  makrofag sebagaimana terlihat pada tabel 3 (Kim J, 1997).
Untuk  membuktikan  kultur  yang  dilakukan  benar-  benar  kultur  makrofag  atau  sel  lain dilakukan  pengamatan  karakteristik  morfologi  kultur  makrofag  dari  hasil  isolasi  MPM  sebagaimana terlihat pada gambar 3.
A B C
D
Tabel 3. Antibodi Monoklonal Yang Umum Digunakan Untuk Karakterisasi Makrofag
Gambar  3.  Hasil  morfologi  kultur  makrofag  :  a)  kultur  makrofag  hari  1;  b)  kultur makrofag  hari  ke-1  setelah  dicuci  ;  c,d)  replikasi  ke  -2  kultur  makrofag pada hari ke 1 sebelum dan setelah pencucian;  e, f) Replikasi ke -3.
Dibandingkan  dengan  kajian  pustaka  ,  penelitian  Kim  1997  menunjukkan  karakteristik morfologi  yang  sama  dengan  hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan.  Sejalan  juga  dengan  penelitian yang dilakukan oleh Wang et al , 2010 sebagaimana terlihat pada gambar 4 (Wang C, dkk., 2013).
Gambar 4. Hasil penelitian Kim, 1997 dan Wang et al 2010 karateristik morfologi MPM.
KESIMPULAN :
1. Makrofag  dapat  diisolasi  dari  rongga peritoneum  dengan  hasil  rata  rata  1,03 x 10 6 sel/ ml.
2. MPMs dapat digunakan sebagai sumber kultur  primer  makrofag  berdasarkan hasil  identifikasi  dengan  flowsitometri dengan  marker  CD  11B  dan  hasil karakteristik  morfologi    kultur  dengan hasil yang baik dan dapat diaplikasikan
untuk penelitian- penelitian yang berhubungan dengan fungsi dan aktivasi makrofag secara in vitro.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  saya  sampaikan  kepada Dirjen Pendidikan Tinggi Kementerian
Pendidikan  Nasional  yang  telah  mendanai penelitian  ini  melalui  Hibah  Disertasi  Doktor Tahun 2015.
E

## F

## DAFTAR PUSTAKA
Zhang  X,  Goncalves  R,  Mosser  D,  2008,The Isolation  and  Characterization  of Murine  Macrophages, Curr  Protoc Immunol .  Chapter: Unit–14.1.p. 8 Davies  JQ,  Gordon  S,  2006.  Methods  in
Molecular  Biology,  vol.  290:  Basic
Cell Culture Protocols, Third Edition, Edited  by:  C.  D.  Helgason  and  C.  L. Miller Humana Press Inc., Totowa. Reni  S,  Sumarno,  Widjajanto  E,  2010,  Susu
kuda  Sumbawa  meningkatkan  respon imun  seluler  makrofag  peritoneal mencit terhadap Salmonella typhimurium, Jurnal Kedokteran Brawijaya . Vol XXVI. No.1. Cohn Z., 1978, The Activation of Mononuclear Phagocytes:  Fact,  Fancy,  and  Future. J. Immunol ,121:813–816. Fortier  AH,  Hoover  DL,  Nacy  CA.,  1982, Intracellular replication of Leishmania tropica in mouse peritoneal macrophages: Amastigote infection of resident cells and inflammatory exudate macrophages.
Infect.
Immun,38:1304–1308
Kim  J,  Keshava  C,  MurphyA,  Pitas  R, Parthasarathy  S,    1997,  Fresh  mouse peritoneal  macrophages  have  low scavenger receptor activity, Journal of Lipid Research , Volume 38, 1997 Wang C, Yu X, Cao Q, Wang Y, Zheng G, Tan T,  Zhao  H,  Zhao  Y,  Wang  Y,  Harris D,  2013,  Characterization  of  murine macrophages  from  bone  marrow,
spleen and peritoneum, BMC
Immunology 14:6.
Wang Y, Cui X, Tai G, Ge J, Li N, Chen F, Yu F, Liu Z: A critical role of activin A in maturation of mouse peritoneal macrophages in vitro and in vivo. Cell Mol Immunol 2009, 6:387–392. Andreesen  R,  Brugger  W,  Scheibenbogen  C, Kreutz  M,  Leser  HG,  Rehm  A,  Lohr GW:  Surface  phenotype  analysis  of human  monocyte  to  macrophage maturation.  J  Leukoc  Biol  1990, 47:490–497