## AMPLIFIKASI IN VITRO DAN IN VIVO FRAGMEN 0,4 KB D-LOOP mtDNA SAMPEL FORENSIK
Mukhammad Asy’ari*, A. Saifuddin Noer**
* Laboratorium Biokimia jurusan Kimia FMIPA UNDIP Semarang ** Laboratorium Rekayasa Genetika PAU Bioteknologi ITB Bandung

## ABSTRAK
Daerah  DNA  mitokondria  (mtDNA)  manusia  yang  mempunyai  tingkat  polimorfisme  tertinggi adalah  D-loop.  Urutan  nukleotida  D-loop  mtDNA  dapat  dijadikan  alat  untuk  menentukan  identitas genetik seseorang. Saat ini aplikasinya banyak digunakan untuk memecahkan kasus-kasus di bidang forensik. Isolasi fragmen 0,4 kilobasa (kb) D-loop mtDNA dapat dilakukan dengan mengekstrak mtDNA dari  dalam  sel,  kemudian  menggandakan  (amplifikasi)  mtDNA  secara  in  vitro  dengan  metoda Polymerase Chain Reaction (PCR) dan secara in vivo dengan metoda Kloning. Pada penelitian ini telah berhasil  diamplifikasi  secara  in  vitro  fragmen  0,4  kb  mtDNA  sampel  forensik  dengan  metoda  PCR menggunakan  primer  M1  (5’CACCATTAGCACCCAAAGCT-3’)  dan  M2  (5’GATTTCAC GGAGGATGGTG-3’) dan secara in vivo dengan metoda kloning menggunakan vektor pGEM-T dalam sel inang Eschericia coli JM 109. Identifikasi hasil PCR dilakukan dengan metoda elektroforesis gel agarosa  1%  menggunakan  pewarna  fluorisen  Etidium  Bromida.  Sedangkan  sel  rekombinan  hasil kloning diseleksi menggunakan media selektif mengandung antibiotik ampisilin dan zat pewarna kultur rekombinan  yaitu  X-gal  dan  IPTG  sebagai  indusernya.  Identifikasi  plasmid  rekombinan  yang mengandung fragmen 0,4 kb D-loop mtDNA dilakukan menggunakan enzim restriksi Pst I. Hasil kloning diperoleh jumlah koloni putih (sel rekombinan) : biru (sel non rekombinan) adalah 2 : 1. Hasil analisis restriksi enzim PstI pada plasmid rekombinan diperoleh fragmen berukuran 3,4 kb, hal ini menunjukkan bahwa DNA insert berukuran 0,4 kb sesuai dengan fragmen mtDNA hasil PCR. Plasmid rekombinan selanjutnya digunakan pada penelitian berikutnya, yaitu penentuan urutan nukleotida dengan metode sekuensing sehingga dapat diketahui identitas genetika dari sampel forensik yang dianalisis.
Kata kunci: D-loop mtDNA, PCR, kloning, enzim PstI, sampel forensik

## IN VITRO AND IN VIVO AMPLIFICATION OF 0,4 KB D-LOOP mtDNA

## FRAGMENT OF FORENSIC SAMPLE

## ABSTRACT
D-loop is the highest polymorphism region on Human mitochondrial DNA (mtDNA). Nucleotides sequence of mtDNA D-loop usually using as evidence genetic identities. Recently, applied of D-loop region to solved a riddle forensic case. Isolation of 0,4 kilobase (kb) mtDNA D-loop fragments were done trough extraction of mtDNA from the cells, then amplified of mtDNA trough in vitro methods that is  Polymerase  Chain  Reaction  (PCR)  and  in  vivo  methods  that  is  cloning.  In  this  research  have successed in vitro amplified 0,4 kb mtDNA D-loop fragment from forensic samples. PCR reaction using primers:  M1  (5’CACCATTAGCACCCAAAGCT-3’)  and  M2  (5’GATTTCAC  GGAGGATGGTG-3’), whereas cloning using pGEM-T vector and Eschericia coli JM 109 as host cell. PCR product identified by agarose 1% electrophoresis using fluoriscent dye that is ethydium bromide. Whereas, to selection recombinat cells using selective media that contains ampicilin and culture dye that is X-gal and IPTG as inducer. To identified recombinat cells contains 0,4 kb mtDNA D-loop fragments using restriction enzyme that is PstI. The result of cloning are white (recombinat cells) and blue (non recombinant cells) colony with equal 2 : 1. The result of restriction analysis of PstI enzyme on recombinant plasmid is 3,4 kb  fragment  contain  0,4  kb  insert  DNA  is  appropriate  with  mtDNA  fragment  of  PCR  product. Recombinant  plasmid  using  for  further  research  to  determine  nucleotides  sequence  by  sequencing methods to understand genetic identities of forensic samples.
Keyword : mtDNA D-loop, PCR, cloning, PstI enzyme, forensic sample

## PENDAHULUAN
D-loop merupakan daerah pada DNA mitokondria  (mtDNA)  yang  mempunyai  laju evolusi  lima  kali  lebih  cepat  dibandingkan daerah  lain  pada  DNA  mitokondria  (Aquadro dan Greenberg, 1983; Cann, 1987). Pada tahun 1991  tingkat  homologi  urutan  nukleotida fragmen 0,4 kb D-loop mtDNA (posisi nukleo- tida  16.042-16388)  digunakan  untuk  menentu- kan  hubungan  segaris  keturunan  ibu  (maternal) antar  individu  (Orego  dan  King,  1990),  yang selanjutnya banyak digunakan untuk memecahkan kasus-kasus di bidang forensik.
Barang  bukti  organik  ( organic  evidence material ) pada kasus forensik biasanya ter-dapat dalam  jumlah  sangat  sedikit,  misalnya  sehelai rambut,  percikan  darah  yang  kering  dan  kotor, serpihan sel otot atau setetes keringat, sehingga tidak  mungkin  dapat  diidentifikasi  dengan  cara konvensional  (Moore,  dan  Isenberg,  1999). Proses  pembuktian  hubungan  maternal  pada kasus  tersebut  dilakukan  identifikasi  secara genetika melalui beberapa tahap yaitu: ekstraksi mtDNA  dari  sampel  forensik,  amplifikasi in vitro dengan  metode  PCR,  amplifikasi in  vivo dan  skrining  mtDNA  dengan  metode  kloning dan penentuan urutan nukleotida dengan metode sekuensing. Kesulitan yang sering timbul adalah pada  tahap  ekstraksi  dan  amplifikasi  mtDNA. Hal  ini  disebabkan  kondisi  sampel  yang  sudah rusak dan sangat sedikit jumlahnya.
Keberhasilan dalam mengektraksi dan mengamplifikasi fragmen mtDNA sangat mempengaruhi proses selanjutnya yaitu sekuensing.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengatasi permasalahan  tersebut  di  atas  yaitu  dengan
mengisolasi  fragmen  0,4  kb  D-loop  mtDNA sampel  forensik  secara  efektif  dan  meng- amplifikasinya  dengan  metode  PCR  dan kloning.  Penelitian  ini  merupakan  tahap  awal, tapi  sangat  penting  dan  menentukan  dari rangkaian  proses  identifikasi  genetika  dalam pembuktian kasus forensik.

## BAHAN DAN METODE
Tahapan kerja dalam penelitian ini meliputi: (1) penyiapan  templat  mtDNA,  (2)  amplifikasi templat  mtDNA  secara in  vitro dengan  metode PCR dan (3) kloning fragmen hasil PCR dengan menggunakan kit vektor pGEM-T dan sel inang E.coli JM 109.

## Penyiapan templat mtDNA
Sampel  yang  digunakan  adalah  tiga  sampel forensik  (diperoleh  dari  Laboratorium  Forensik Fak. Kedokteran UNPAD Bandung). Penyiapan sampel  dilakukan  dengan  menimbang  1  mg sampel kemudian dicuci dengan bufer TE pH 8 sampai  dihasilkan  pelet  ber-warna  putih (Sambrook et al ., 1989). Lisis dilakukan dengan mencampurkan pelet sampel dengan 40 µL bufer lisis 10X dan ditambahkan ddH 2 O steril hingga volume  400  µL.  Campuran  reaksi  diinkubasi pada suhu 55 o C selama 1 jam (Waterbath-Grant Instrmnt)  dan  dilanjutkan  pada  suhu  95 o C selama  5  menit.  Kemudian  disentrifugasi (Eppendorf  5417C)  pada  20.000  g  selama  3 menit,  diambil  supernatan  yang  selanjutnya digunakan sebagai templat reaksi PCR (Noer et al ., 1994).

## Amplifikasi in vitro fragmen 0,4 kb mtDNA
Amplifikasi in  vitro fragmen  0,4  kb  D-loop mtDNA  menggunakan  sepasang  primer  yaitu M1 (5’CACCATTAGCACCCAAAGCT-3’)
dan M2 (5’GATTTCACGGAGGATGGTG-3’).
Proses  PCR  dilakukan  sebanyak  30  siklus, dengan tahap denaturasi pada suhu 94 o C selama 1  menit,  annealing  pada  suhu  50 o C  selama  1 menit  dan  tahap  extension  pada  suhu  72 o C selama 1 menit (Perkin Elmer, 1992).
Hasil PCR dianalisis melalui elektro-foresis gel agarosa  1  %  (b/v).  Marker  DNA  standar  yang digunakan adalah pUC19/ Hinf I.
Pemurnian hasil PCR dilakukan dengan metode presipitasi  etanol  (Sambrook et  al .,  1989).
Konsentrasi  DNA  dihitung  berdasarkan  hasil perbandingan  intensitas  fluorisen  dari  pita sampel  dengan  pita  marker.  Selanjutnya  DNA hasil  pemurnian  tersebut  siap  diligasikan  ke dalam vektor pGEM-T.

## Kloning
Prosedur  kerja  kloning  dibagi  dalam  4  tahap yaitu:  (1)  ligasi  fragmen  hasil  PCR  ke  dalam vektor  pGEM-T,  (2)  pembuatan  sel  kompeten, (3) transformasi sel inang dengan vektor plasmid rekombinan  (4)  seleksi  dan  isolasi  plasmid rekombinan.
(1). Ligasi hasil PCR dengan vektor pGEM-T
Reaksi  ligasi  pGEM-T  dan  60  ng  fragmen hasil  PCR  murni  dilakukan  menggunakan kit  pGEM-T.  Hasil  ligasi  ini  merupakan plasmid  pGEM  rekombinan  yang  siap digunakan untuk mentransformasi sel inang E.coli JM 109 (Promega, 1998).
(2). Pembuatan sel kompeten E.coli JM 109
Metode  yang  digunakan  dalam  pembuatan sel  kompeten  merujuk  pada  metode  Cohn (Sambrook et al ., 1989).
(3). Tranformasi sel inang E.coli JM109
Sel E.coli JM109  kompeten  selanjutnya ditranformasi oleh plasmid pGEM rekombinan,  dengan  metode  heat  shock (Sambrook et al ., 1989). Hasil transformasi ditumbuhkan  pada  media  SOC  (Promega, 1998),  kemudian  ditumbuhkan  kembali  di atas  media  padat  selektif  LB  (mengandung ampicillin, X-gal dan IPTG) pada suhu 37 o C selama  14–18  jam  (Promega,  1998; Sambrook et al ., 1989).
(4). Seleksi dan isolasi plasmid rekombinan
Seleksi  dilakukan  berdasarkan  perbedaan warna koloni sel yang tumbuh, koloni warna putih  (plasmid  rekombinan)  dan  biru  (non rekombinan).  Isolasi  plasmid  rekombinan dilakukan dengan metode maniatis termodifikasi  (Sambrook et  al .,  1989).
Pemurnian  plasmid  rekombinan  dilakukan dengan  metode  presipitasi  etanol  dan analisis  hasil  menggunakan  elektroforesis agarosa 1%, pemotongan plasmid rekombinan  menggunakan  enzim Pst I  dan marker DNA  / Hind III.

## PEMBAHASAN

## Fragmen mtDNA hasil PCR
Hasil  PCR  dari  tiga  sampel  (S1,  S2,  S3) diperoleh  fragmen  mtDNA  berukuran  sekitar 400 pb (0,4 kb), ditunjukkan oleh satu pita yang terletak di antara pita 517 dan 396 pb pada DNA standar  pUC/ Hin fI  (M), seperti  tercantum  pada gambar  1.  Hasil  ini  sesuai  prediksi,  yaitu fragmen  442  pb  daerah  D-loop  mtDNA  pada posisi  15.978-16.419  (Anderson et  al ,  1981;
Aquadro dan Greenberg, 1983).
Gambar 1. Fragmen hasil PCR
Amplikon dipastikan bukan kontaminan karena hasil PCR kontrol negatip (K-) tidak menunjukkan adanya pita pada gel elektroforesis dan  posisi  pita  sampel  sejajar  dengan  kontrol positip (K+).

## Sel Rekombinan Hasil Kloning
Proses  kloning  fragmen  0,4  kb  mtDNA  hasil PCR  diawali  dengan  meligasikan  fragmen mtDNA  pada  plasmid  pGEM-T.  Perbandingan molar antara pGEM-T dan fragmen DNA sisipan adalah  1:8.  Hasil  transformasi  sel  inang E.coli
JM  109  oleh  plasmid  rekombinan  diperoleh koloni  ber-warna  putih  dan  biru  seperti  yang tercantum pada tabel 1.
Tabel 1. Hasil Transformasi E.coli JM109
Sampel Jumlah Koloni S1 (Sampel 1) 60 putih + 24 biru S2 (Sampel 2) 50 putih + 20 biru S3 (Sampel 3) 65 putih + 26 biru Kontrol positip > 500 koloni
Kontrol negatip  0 koloni
Dari  tabel  1  menunjukkan  bahwa  proses  ligasi dan transformasi sel E.coli JM109 telah berhasil.
Perbandingan jumlah koloni putih (sel rekombinan):biru  (sel  non  rekombinan)  adalah
2:1,  hal  ini  menunjukkan  proses  transformasi berlangsung dengan baik. Koloni putih disebabkan  gen lacZ pada  vektor  pGEM  yang mengode enzim  -galaktosidase tidak berfungsi karena  mengalami  insersi  DNA.  Sebaliknya pada  koloni  biru  terjadi  karena  adanya penguraian  X-gal  menjadi  galaktosa  dan  5- bromo-4-kloroindigo (berwarna biru). Penguraian  X-gal  ini  diinduksi  oleh  adanya isopropiltio-  -D-galaktosida (IPTG) dan dikatalisis  oleh  enzim  -galaktosidase  yang dihasilkan oleh gen lacZ yang tidak mengalami insersi DNA (Jones, 1998).

## Identifikasi DNA Plasmid Rekombinan
Untuk mengidentifikasi adanya plasmid rekombinan  dalam  sel  koloni  putih  dilakukan dengan metode pemotongan DNA plasmid oleh enzim  restriksi Pst I.  Penggunaan  enzim Pst I karena  sisi  pemotongannya  hanya  satu  dan terdapat  pada  bagian polycloning  sites plasmid pGEM-T (promega, 1998) serta tidak memotong pada DNA insert.
Gambar 2. Hasil restriksi DNA plasmid rekombinan dengan Pst I
Hasil elektroforesis  DNA  hasil  isolasi  dari  tiga koloni putih tanpa pemotongan enzim Pst I (RS1,
RS2,  RS3 uncut )  menghasilkan  dua  fragmen yaitu fragmen > 23 kb dan sekitar 2,1 kb, seperti tercantum  pada  gambar  2.  Fragmen  >  23  kb adalah  DNA  kromosom  sedangkan  fragmen sekitar  2,1  kb  diperkirakan  adalah  plasmid rekombinan  yang  masih  dalam  bentuk  sirkuler. Untuk  membuktikan  bahwa  fragmen  tersebut adalah  plasmid  rekombinan  maka  harus dipotong dengan enzim Pst I. Hasil elektroforesis
DNA  sampel  yang  sudah  terpotong  enzim Pst I diperoleh satu pita pada posisi sedikit di atas pita kontrol  plasmid  pGMT  berukuran  3000  pb  (3 kb),  sehingga  ukuran  plasmid  rekombinan diperkirakan  sekitar  3400  pb  (3,4  kb),  jadi ukuran  fragmen  DNA  insertnya  adalah  0,4  kb, sesuai  dengan  ukuran  fragmen  mtDNA  hasil PCR.  Berdasarkan  pola  restriksi  enzim Pst I tersebut  dapat  disimpulkan  bahwa  sel  koloni putih yang diperoleh merupakan sel rekombinan. Sel  rekombinan  ini  siap  untuk  digunakan  pada penelitian  selanjutnya,  yaitu  penentuan  urutan nukleotida  fragmen  0,4  kb  mtDNA  dengan metode  sekuensing  sehingga  dapat  diketahui identitas  genetika  dari  sampel  forensik  yang dianalisis.

## DAFTAR PUSTAKA
Anderson, S., Bankier, A.T., de Barrell, B.G., de Bruijn,  M.H.,  Coulson,  A.R.,  Drouin,  J., Eperon,  I.C.,  Nierlich,  D.P.,  Roe,  B.A., Sanger,  F.,  Screier,  P.H.,  Smith,  A.J., Staden,  R.,  and  Young,  I.G.,  1981,
Sequence and organization of the human mitochondrial  genome, Nature, 290 (5806); 457–465.
Aquadro,  C.F.,  and  Greenberg,  B.D.,  1983, Human mitochondrial DNA variation and evolution; analysis of nucleotide sequences from seven individuals, Genet,
103; 287–312.
Cann,  R.L.,  Stoneking,  M.,  and  Wilson,  A.C.,
1987, Mitochondrial  DNA  and  human evolution, Nature, 325: 31–36.
Jones,  P.,  1998, Vectors  Cloning  Applications- essential Techniques , John Wiley & Sons,
BIOS Scient Publishers, NewYork.
Moore,  J.M.  and  Isenberg,  A.R.,  1999, Mitochondrial  DNA  Analysis  of  the  FBI
Laboratory , Forensic Science Communication, Vol. I, Number 2.
Noer,  A.S.,  Martasih,  F.,  Mulyani,  S., Muktiningsih, dan Wirahadikusumah, M., 1994, Analisis Variasi Urutan Nukleotida D-loop  mtDNA  Manusia  dari  Berbagai Daerah di Indonesia , Proceeding Seminar Bersama UKM-ITB, I, 201–204.
Orrego, C., and King, M.C., 1990, Determination of familial relationships, di dalam PCR protocols a guide to methods and application , Academic Press, Inc. San Diego, California, USA.
Perkin  Elmer,  1992, DNA  Thermal  Cycler;
Users  Manual, The  Perkin  Elmer Corporation, USA.
Promega,  1998, Technical  Manual,  pGEM-T and  pGEM ® –T Easy  Vector  Systems, USA.
Sambrook,  J.,  Fritsch,  E.F.  and  Maniatis,  T.,
1989, Molecular  Cloning:  A  Laboratory Manual ,  Vol.  1,2,3  Cold  Spring  Harbor Laboratory Press New York