THE EFFECT OF PILI PROTEIN Streptococcus Agalactiae ON β-Defensin-2 EXPRESSION IN THE WHITE RAT ( Rattus novergicus ) WISTAR STRAIN FALLOPIAN TUBES
Nur Rohmah Prihatanti 1,2 , Hening Ryan Aryani 1,3 , Istifadatul Ilmiya 1,4 , Noorhamdani A.S. 5 , Dwi Yuni Nur Hidayati 5
1 Program Studi Magister Kebidanan , Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Jl. Veteran, Lowokwaru, Malang.
2 Poltekkes Kemenkes Banjarmasin, Jl. Mistar Cokrokusumo No.1A, Banjarbaru.
3 Poltekkes Kemenkes Malang, Jl. Besar Ijen No.77C, Klojen, Malang.
4 Akademi Kebidanan Jember, Jl. Pangandaran No.42, Sumbersari, Jember.
5 Departemen Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Jl. Veteran, Lowokwaru, Malang.
Corresponding author: Nur Rohmah Prihatanti ( nur.rohmahpri@gmail.com )

## ARTICLE HISTORY
Received: 18 October 2020                        Revised: 1 December  2020           Accepted: 15 December 2020

## Abstract
One  of  the  infections  of  the  female  genital  organs  is  a  fallopian  tube  infection. Fallopian tube infections can be caused by Streptococcus agalactiae . Prevention of infection by Streptococcus agalactiae can be done through vaccination. The pili protein streptococcus agalactiae is a good vaccine candidate. Pili Streptococcus agalactiae plays a role in facilitating the bonding between Streptococcus agalactiae and host cells. The pili protein Streptococcus agalactiae is obtained from the pili cutting process. The white rats ( Rattus novergicus ) wistar strain were grouped into 5 groups (control and treatment). One week after the last  injection of pili protein Streptococcus  agalactiae ,  white  rats  ( Rattus  novergicus )  were  sacrificed  by decapitation  technique.  The  fallopian  tube  tissues  are  collected  and  performed immunohistochemical examination. Immunohistochemical results of β-defensin-2 expression were observed using a 400x magnification microscope and calculated using  Image- J software. There  is a significant difference in the expression of β- defensin-2 in the fallopian tube of white rat ( Rattus novergicus ) between the control and treatment groups. The higher the dose of pili protein Streptococcus agalactiae , the  higher  t he  expression  of  β-defensin-2  in  the  white  rats  ( Rattus  novergicus ) wistar strain fallopian tubes.
Key words: β-defensin-2, Fallopian Tube, Pili Protein Streptococcus agalactiae
PENGARUH PROTEIN PILI Streptococcus Agalactiae TERHADAP EKSPRESI β-Defensin-2 PADA TUBA FALLOPI TIKUS PUTIH
( Rattus novergicus ) GALUR WISTAR

## Abstrak
Salah  satu  infeksi  pada  organ genitalia  wanita  adalah  infeksi  tuba  falopi.  Infeksi tuba fallopi dapat disebabkan oleh Streptococcus agalactiae . Pencegahan infeksi yang  disebabkan  oleh Streptococcus  agalactiae dapat  dilakukan  dengan vaksinasi. Protein pili Streptococcus agalactiae merupakan kandidat vaksin yang baik.  Pili Streptococcus  agalactiae berperan  penting  dalam  memfasilitasi  ikatan antara Streptococcus  agalactiae dengan  sel  inang.  Protein  pili Streptococcus agalactiae didapatkan dari proses pemotongan pili. Tikus putih ( Rattus novergicus ) galur  wistar  dikelompokkan  menjadi  5  kelompok  (kontrol  dan  perlakuan).  Satu minggu setelah pemberian protein pili Streptococcus agalactiae terakhir, tikus putih ( Rattus  novergicus )  galur  wistar  dikorbankan  menggunakan  teknik  dekapitasi. Jaringan tuba falopi diambil dan dilakukan pemeriksaan imunohistokimia. Ekspresi β-defensin-2  hasil  imunohistokimia  diamati  menggunakan  mikroskop  dengan perbesaran  400x  dan  dihitung  menggunakan  software Image-J .  Terdapat perbedaan  ekspresi  β-defensin-2  yang  signifikan  pada  tuba  fallopi  tikus  putih ( Rattus novergicus ) galur wistar kelompok kontrol dan perlakuan. Semakin tinggi dosis  protein  pili Streptococcus  agalactiae ,  semakin  tinggi  pula ekspresi  β- defensin-2 pada tuba fallopi tikus putih ( Rattus novergicus ) galur wistar.
Kata kunci: β-defensin-2, Tuba Fallopi, Protein Pili Streptococcus agalactiae

## Pendahuluan
Infeksi pada organ genitalia wanita dapat meningkatkan risiko gangguan reproduksi seperti infertilitas dan perkembangan penyakit radang panggul. Salah satu infeksi pada organ genitalia wanita adalah infeksi tuba fallopi dengan prevalensi di dunia mencapai 16,1%. 1 Infeksi  tuba  fallopi  dapat  disebabkan  mikroorganisme  seperti Streptococcus agalactiae yang  ditularkan  secara  seksual  atau  flora  endogen  yang  naik  dari  organ genitalia  bawah  (vagina  maupun  serviks)  yang  selanjutnya  menyebar  ke  tuba  fallopi. Prevalensi infeksi yang disebabkan oleh Streptococcus agalactiae secara rektovaginal di dunia adalah 17,9%. 2
Pengobatan infeksi yang disebabkan oleh Streptococcus agalactiae salah satunya adalah dengan penisilin. Namun, telah dilaporkan terjadi peningkatan kejadian resistensi terhadap penisilin di seluruh dunia yang mengakibatkan pengobatan menjadi tidak efektif dan membutuhkan  waktu penyembuhan yang  lebih  lama.  Sehingga  diperlukan upaya pencegahan infeksi melalui vaksinasi. 4
Protein pili Streptococcus agalactiae merupakan kandidat vaksin yang baik karena pili Streptococcus  agalactiae berperan  penting  dalam  memfasilitasi  ikatan  antara Streptococcus  agalactiae dengan  sel  inang  dan  respons  imun  yang  dibentuk menghasilkan sistem imunitas yang baik. 5
Pemberian protein pili Streptococcus agalactiae dilakukan melalui injeksi subkutan yang  dikombinasi  dengan Freund’s  adjuvant.  Freund’s  adjuvant berperan  sebagai imunostimulator yang mampu meningkatkan fungsi dan aktivitas sistem imun. Freund’s adjuvant dibagi  menjadi  dua  yaitu Complete  Freund’s  Adjuvant (CFA)  untuk  injeksi pertama dan Incomplete Freund’s Adjuvant (IFA) untuk injeksi 2 dan 3 sebagai booster . 6 Complete Freund’s Adjuvant (CFA) mengandung mikobakteri kering dan diberikan pada injeksi pertama bertujuan untuk menarik makrofag dan sel lain ke tempat injeksi
yang  dapat  meningkatkan  respons  imun  sehingga  penggunaan Complete  Freund’s Adjuvant (CFA)  direkomendasikan  pada  injeksi  awal. Incomplete  Freund's  Adjuvant (IFA) mengandung cairan minyak mineral kental berwarna putih yang homogen dan tidak mengandung  sel  bakteri. Incomplete  Freund's  Adjuvant (IFA)  akan  menyelimuti  dan melepaskan  antigen  secara  perlahan  dan  mentransportasi  antigen  ke  seluruh  sistem limfatik sehingga membuat sistem imun lebih kuat karena diperlukan waktu tambahan dalam  memproduksi  sel  B  dan  T  untuk  memori  imun  yang  lebih  besar. Incomplete Freund's Adjuvant (IFA) digunakan pada injeksi booster . 6
Pemberian protein pili Streptococcus agalactiae dapat mempengaruhi sistem imun karena  protein  pili Streptococcus  agalactiae sebagai  antigen  yang  masuk  ke  dalam tubuh  dikenali  oleh  Antigen  Presenting  Cell  (APC).  Antigen  ditangkap  sel  dendritik kemudian  disajikan  ke sel  T  naif  dan mengakibatkan  terjadinya  diferensiasi  sel  T  naif menjadi Th1, Th2, Th17, dan Treg. Th17 menghasilkan sitokin IL-17 yang akan memacu sel  untuk  mengekspresikan  peptida  β-defensins.  β-defensins  dapat  menginduksi respons  imun  adaptif. 7 Salah  satu  anggot a  β-defensins  adalah  β-defensin-2  yaitu peptida  antimikroba  yang  diproduksi  oleh  sejumlah  sel  khususnya  sel  epitel  dan menunjukkan aktivitas antimikroba yang kuat. 8 Pemberian protein pili Streptococcus agalactiae diharapkan mampu meningkatkan ekspresi β-defensin-2  di  tuba  fallopi  sehingga  dapat  mencegah  kolonisasi  dan menghambat adhesi mikroba khususnya Streptococcus agalactiae di tuba fallopi.

## Metode

## Alat
Bacterial pili cutter , tabung falcon, tabung eppendorf (Onemed), sentrifus (Becman Coulter  Allegra  64R  High  Speed  Centrifuge),  mikropipet  (Dragon  Lab),  nanodrop spektrofotometer (Thermo scientific), spuit 1 cc (Onemed), set alat bedah minor (pinset, skalpel,  klem,  gunting,  pemegang  jaringan),  papan  alas  pembedahan,  toples  kaca tertutup tempat organ (berisi larutan formalin 10%), wadah tempat penyimpanan jaringan sementara, cover glass dan object glass (Gea medical), mikroskop (Olympus BX51).
Bahan Bakteri Streptococcus agalactiae , Tri Chloroacetic Acid (TCA), Phospat Buffer Saline (PBS), Aquabidest , Complete  Freund’s  Adjuvant (CFA) dan Incomplete  Freund’s Adjuvant (IFA) (G-Biosciences), formalin 10%, NaCl 0,9%, xylol, etanol, buffer sitrat pH 6,0, background  snipper , β-defensin-2 antibody (Santa  Cruz  Biotechnology,  Inc.), Strepavidin  Horseradish  Peroxidase (SA-HRP), Chromagen  Diaminobenzidine (DAB), Mayer’s Hematoxilen, entellan (Merck).

## Prosedur
Pemotongan Protein pili Streptococcus agalactiae Protein  pili Streptococcus  agalactiae didapat  dari  proses  pemotongan  pili.  Pili Streptococcus  agalactiae dipotong  dengan bacterial  pili  cutter selama  30  detik  pada suhu  4°C  dengan  kecepatan  6000  rpm.  Sampel  hasil  proses  pemotongan  disentrifus selama 10 menit pada suhu 4°C dengan kecepatan 12000 rpm dan diulang sebanyak 3 kali  guna  mengisolasi  pemotongan  produk  protein  pili Streptococcus  agalactiae. Supernatan  yang  mengandung  protein  pili Streptococcus  agalactiae dipisahkan  dari endapan dan disuspensi dengan alkohol absolut.
Protein pili Streptococcus agalactiae yang telah disuspensi dengan alkohol absolut disentrifus  selama  10  menit  pada  suhu  4°C  dengan  kecepatan  12000  rpm,  endapan yang dihasilkan merupakan bagian dari protein pili Streptococcus agalactiae. Protein pili
Streptococcus  agalactiae yang  telah  terisolasi  dilakukan  pengukuran  konsentrasi menggunakan nanodrop spektrofotometer.
Protein pili Streptococcus agalactiae sesuai dosis (25 µg/mL, 50 µg/mL, 75 µg/mL) disuspensi  dengan  Phosphat  Buffer  Saline  (PBS)  dan  dikombinasi  dengan Freund’s adjuvant menggunakan vortex dengan perbandingan volume 1:1 atau 50 µL:50 µL.

## Pemberian Protein pili Streptococcus agalactiae
Protein Pili Streptococcus agalactiae diberikan pada tikus putih ( Rattus novergicus ) galur  wistar  usia  10-12  minggu.  Protein  Pili Streptococcus  agalactiae diberikan  pada tikus putih ( Rattus novergicus ) galur wistar secara injeksi subkutan di bagian abdomen menggunakan spuit 1 cc.
Tikus  putih  ( Rattus  novergicus )  galur  wistar  sejumlah  25  ekor  dikelompokkan menjadi 5 kelompok (kontrol dan perlakuan), masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor. Kelompok kontrol negatif (KN) diberi injeksi aquabidest 50 µL, kelompok kontrol positif (KP)  diberi  injeksi Freund’s  Adjuvant 50  µL,  kelompok  perlakuan  1  (P1)  diberi  injeksi protein  pili Streptococcus  agalactiae dosis  25  µg/mL  dikombinasi  dengan Freund’s adjuvant 50  µL,  kelompok  perlakuan  2  (P2)  diberi  injeksi  protein  pili Streptococcus agalactiae dosis  50  µg/mL  dikombinasi  dengan Freund’s  adjuvant 50  µL,  kelompok perlakuan  3  (P3)  diberi  injeksi  protein  pili Streptococcus  agalactiae dosis  75  µg/mL dikombinasi dengan Freund’s adjuvant 50 µL. Seluruh  tindakan  pada  tikus  putih  ( Rattus  novergicus )  galur  wistar  dilakukan sebanyak 3 kali yaitu pada hari 1, 7, dan 14. Pada penggunaan Freund’s adjuvant , hari 1,  tikus  putih  ( Rattus  novergicus )  galur  wistar  diberi  injeksi  protein  pili Streptococcus agalactiae dikombinasi  dengan Complete  Freund’s  Adjuvant (CFA),  hari  7  dan  14 sebagai  injeksi booster 2  dan  3  diberi  injeksi  protein  pili Streptococcus  agalactiae dikombinasi dengan Incomplete Freund’s Adjuvant (IFA). 9

## Pemeriksaan Ekspresi β-defensin-2
Satu minggu setelah injeksi terakhir pada kelompok kontrol dan perlakuan, tikus putih ( Rattus novergicus ) galur wistar dikorbankan dengan teknik dekapitasi. 9 Jaringan tuba fallopi  diambil  dan  dilakukan  pemeriksaan  imunohistokimia.  Jaringan  tuba  fallopi ditanam dalam blok paraffin, dipotong dengan ketebalan 4 µm, selanjutnya  diletakkan pada object  glass dan  dilakukan  proses  pembuatan  imunohistokimia.  Pembuatan imunohistokimia  melalui  tahap  deparafinisasi  dan  rehidrasi, blocking jaringan  tuba fallopi, dan diinkubasi dengan β-defensin-2 anbtibody sehingga ikatan antigen antibodi yang terjadi spesifik untuk β-defensin-2. Tahap akhir, preparat ditetesi satu tetes medium mounting entellan, ditutup dengan cover glass , dan diberi label. Hasil imunohistokimia terhadap ekspresi β-defensin-2 diamati dan dianalisa dengan mikroskop tipe Olympus BX51  perbesaran  400x.  Ekspresi  β-defensin-2  dikuantifikasi  menggunakan  software Image-J.

## Hasil
Gambar 1. Hasil  pemeriksaan  imunohistokimia  terhadap  ekspresi  ß-defensin-2  tuba fallopi  tikus  putih  (Rattus  novergicus)  galur  wistar  pada  Kelompok  Kontrol dan Perlakuan (ditunjukkan dengan warna coklat)
Tabel 1. Ekspresi β-Defensin-2 pada Tuba Fallopi Tikus Putih ( Rattus novergicus ) galur wistar yang telah dikuantifikasi menggunakan Image-J Perlakuan Rata ± SD p-value KN 19,75 ± 5,39 KP 22,82 ± 11,9 P1 32,02 ± 9,18 0,013* P2 33,33 ± 5,61 P3 33,42 ± 3,57
Keterangan:*  =  Perbedaan  rerata  signifikan  terhadap  kontrol  negatif  pada  tingkat  0,05  (P<0,05), Jumlah hewan perkelompok 5 ekor.
KN KP P1 P2 P3
Gambar 2. Histogram  Pengaruh  Pemberian  Protein  Pili Streptococcus  agalactiae terhadap  Rata- Rata  Ekspresi  β-Defensin-2  pada  Tuba  Fallopi  Tikus  Putih ( Rattus novergicus ) galur wistar

## Pembahasan
Hasil  penelitian  menunjukkan  terdapat  perbedaan  yang  signifikan  ekspresi  β- defensin-2 pada tuba fallopi tikus putih ( Rattus novergicus ) galur wistar antara kelompok kontrol dan perlakuan. Gambaran pada kelompok kontrol negatif yang diberi aquabidest menunjukkan sangat sedikit ekspresi β-defensin-2, kelompok kontrol positif yang diberi Freund’s Adjuvant menunjukkan ekspresi β-defensin-2 lebih banyak daripada kelompok kontrol  negatif,  dan  pada  kelompok  perlakuan  yang  diberi  protein  pili Streptococcus agalactiae dikombinasi dengan Freund’s Adjuvant menujukkan ekspresi β-defensin-2 yang semakin meningkat pada dosis yang semakin tinggi. Rerata ekspresi β-defensin-2 paling  tinggi  ditunjukkan  pada  tuba  fallopi  tikus  putih  ( Rattus  novergicus )  galur  wistar yang diberi protein pili Streptococcus agalactiae dosis 75 µg/mL.
Peningkatan  ekspresi  β-defensin-2  dibuktikan  berdasarkan  hasil  kuantifikasi menggunakan  software image-j pada  lima  lapangan  pandang  kelompok  kontrol  dan perlakuan. Ekspresi  β-defensin-2  pada  kelompok  kontrol  negatif  didapatkan  rerata 19,75%,  rerata  kelompok kontrol  positif  22,82%, dan  terus meningkat  pada kelompok perlakuan, rerata kelompok perlakuan dosis 25 µg/mL adalah 32,02%, rerata kelompok perlakuan  dosis  50  µg/mL  adalah  33,33%,  dan  rerata  kelompok  perlakuan  dosis  75 µg/mL  adalah  33,42%.  Hasil  penelitian  yang  telah  dikuantifikasi  selanjutnya  dianalisa menggunakan  uji anova  one  way ,  didapatkan p-value 0,013  (nilai  signifikan  <0,05) menunjukkan bahwa terdapat perbedaan ekspresi β-defensin-2 pada tuba fallopi tikus putih  ( Rattus  novergicus )  galur  wistar  yang  signifikan  antara  kelompok  kontrol  dan perlakuan.
Peningkatan ekspresi β-defensin-2 pada tuba fallopi tikus putih ( Rattus novergicus ) galur  wistar  terjadi  karena  kehadiran  protein  pili Streptococcus  agalactiae sebagai antigen pada lapisan mukosa tuba fallopi ditangkap oleh Antigen Presenting Cell (APC) diperankan  oleh  sel  dendritik  yang  kemudian  dipresentasikan  kepada  sel  T  naif menyebabkan diferensiasi  sel  T  naif  menjadi  sel  T helper (Th),  sel  Th  berdiferensiasi salah  satunya  menjadi  Th17.  Antigen  yang  masuk  mengakibatkan  Th17  mengalami peningkatan produksi IL-17 secara signifikan. Peningkatan produksi IL-17 memacu sel epitel pada lapisan mukosa tuba fallopi untuk memproduksi β-defensin-2 yang berperan penting sebagai antimikroba. 7
Ekspresi  β-defensin-2  yang  mengalami  peningkatan  pada  penelitian  ini  sesuai dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Clavellina (2012) bahwa terjadi peningkatan ekspresi  β-defensin-2  pada  membran  sel  yang  dipapar Streptococcus  agalactiae . 10 Peningkatan ekspresi  β-defensin-2  juga  ditunjukkan  pada  hasil  penelitian  yang  telah dilakukan  oleh  Mufida  (2019)  bahwa  pemberian  protein  pili  mampu  menginduksi
ekspresi β-defensin-2, sedangkan adjuvant tidak menginduksi ekspresi β-defensin-2 dan sekaligus  menjelaskan  bahwa adjuvant hanya  berfungsi  sebagai  imunostimulator, sehingga  repons  imun  yang  dihasilkan  adalah  karena  dipengaruhi  oleh  adanya pemberian protein pili. 8

## Kesimpulan
Pemberian  protein  pili Streptococcus  agalactiae dapat  meningkatkan  ekspresi  β- defensin-2 pada tuba fallopi tikus putih ( Rattus novergicus ) galur wistar. Semakin tinggi dosis  pemberian  protein  pili Streptococcus  agalactiae semakin tinggi pula ekspresi β- defensin-2.  Sehingga  protein  pili Streptococcus  agalactiae dapat  menjadi  kandidat vaksin yang baik dalam mencegah infeksi pada organ genitalia wanita khususnya pada tuba fallopi yang disebabkan oleh Streptococcus agalactiae.

## Daftar Pustaka
1. Owhor, L.E., Reese, S., and Kölle, S. Salpingitis Impairs Bovine Tubal Function and Sperm-Oviduct Interaction. Scientific Reports . 2019;9(1);1-15.
2. Kwatra, G., Cunnington, M.C., Merrall, E., Adrian, P.V., Ip, M., Klugman, K.P., et al. Prevalence  of  Maternal  Colonisation  with  Group  B  Streptococcus:  A  Systematic Review and Meta-Analysis. The Lancet Infectious Diseases. 2016;16(9);1076-1084.
3. Hayati,  Z.  Infeksi  Streptokokus  Grup  B  (SGB)  pada  Ibu  Hamil  dan  Neonatus: Diagnosis dan Pencegahan. Jurnal Kedokteran Yarsi. 2010;18(1);79-85.
4. Banno,  H.,  Kimura,  K.,  Seki,  T.,  Jin,  W.,  Wachino,  J.,  Yamada,  K.,  et  al.  High Isolation Rate and Multidrug Resistance Tendency of Penicillin-Susceptible Group B Streptococcus with Reduced Ceftibuten Susceptibility in Japan. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 2018;37(8);1511-1519.
5. Cozzi, R., Malito, E., Lazzarin, M., Nuccitelli, A., Castagnetti, A., Bottomley, M.J., et al. Structure and Assembly of Group B Streptococcus Pilus 2b Backbone Protein. PLoS ONE. 2015;10(5);1-21.
6. Sari, R., Setyawan, A., dan Suparmono. Peningkatan Imunogenitas Vaksin Inaktif Aeromonas salmonicida dengan Penambahan Adjuvant pada Ikan Mas (Cyprinus carpio).  e-Jurnal  Rekayasa  dan  Teknologi  Budidaya  Perairan  [Serial  Online]. 2013;I(2);152-162.
7. Fitrianingsih,  A.A.,  Rachma,  L.N.,  dan  Milliana,  A.  Protein  Adhesi  Sub  Unit  Pili Shigella  flexneri  18  kDa  Meningkatkan  Ekspresi  Protein  Antimikroba  β-defensin pada Mencit (Strategi Pengembangan Vaksin Shigellosis Berbasis Protein Ahesi). Journal of Islamic Medicine. 2018;2(4);44-53.
8. Mufida, D.C., Agustina, D., Armiyanti, Y., Handono, K., Prawiro, S.R., dan Santoso, S.  Intranasal  Immunization  with  The  54  kDa  Hemagglutinin  Pili  Protein  of Streptococcus  pneumoniae  That  Increase  The  Expression  of  β ‑ defensin ‑ 2.  Drug Invention Today. 2019;11(10);2609-2615.
9. Wang, J.L., Bu, R.E., Wu, J.H., Xi, L.G.W., Chen, J.L., Sun, L.J., et al. Immunizing Mice  Using  Different  Combination  Antigens  of  The  PI-2a  Fimbria  Subunit  of Streptococcus agalactiae. Iranian Journal of Veterinary Research. 2019;20(3);199- 203.
10. Clavellina,  V.Z.,  Lopez,  G.G.  and  Espinosa,  P.F.  Evidence  of  in  vitro  differential secretion  of  human  beta-defensins-1,-2,  and-3  after  selective  exposure  to Streptococcus agalactiae in human fetal membranes. The Journal of Maternal-Fetal & Neonatal Medicine. 2012;25(4);358-363.