Deteksi Marker Genetik dari Sekuen Protein Hewan untuk Autentikasi Halal Melalui Pendekatan Bioinformatika
Detection of Potential Genetic Marker from Animal Protein Sequence for Halal Authentication using Bioinformatic Approach
Maghfirotul Amaniyah 1a , Ruth Ema Febrita 2 , Junaedi Adi Prasetyo 3
1 Program Studi Teknologi Pengolahan Hasil Ternak, Politeknik Negeri Banyuwangi, Jl. Raya Jember – Banyuwangi Km. 13, Banyuwangi, 68461, Indonesia
2,3 Program Studi Teknik Informatika, Politeknik Negeri Banyuwangi, Jl. Raya Jember – Banyuwangi Km. 13, Banyuwangi, 68461, Indonesia a Korespondensi : Maghfirotul Amaniyah, E-mail: maghfirotulamaniyah@poliwangi.ac.id Diterima: 29 – 09 – 2022 , Disetujui: 31 – 12 - 2023

## ABSTRACT
Awareness of safety or guarantee of halal food authenticity becomes a problem for Muslims. Bioinformatics offers  breakthrough  analysis  of  specific  genes  from  genetic  material  databases  for  managing  biological information.  This  study  aims  to  find  markers  of  protein  sequences  in  the  mammalian  group  using bioinformatics. The selection of protein sequence samples was IGF2 (insulin-like growth factor 2) and CytB (cytochrome B). Analysis of the relationship between samples using a phylogenetic tree construction based on protein sequences of halal mammal species compared with non-halal mammals, especially pigs and dogs. We analyze the protein structure and physicochemical properties to determine the special characteristics of the 'halal' marker. The phylogenetic tree analysis shows that the pig species occupies a different group from  the  mammals  commonly  consumed  in  Indonesia  and  is  most  closely  related  to  the  dog  species. Prediction of sample protein properties provides information on isoelectric point and solubility similarity between pig and dog species. Two marker blocks of amino acid polymorphism in pig and dog sequences of IGF2 protein were obtained by multiple sequence alignment methods, YDTWKQSAQRLRRGLPALLRARRGR and HGGASPEASG sequences, respectively. These findings can be a marker reference in testing DNA-based halal products, especially using the PCR method.
Keywords : bioinformatic, halal marker, IGF2, livestock, polymorphism

## ABSTRAK
Keamanan pangan dari sudut pandang agama Islam menekankan pada jaminan kehalalan suatu makanan, sehingga  aspek  halal  menjadi  kebutuhan  primer  bagi  masyarakat  Indonesia.  Studi  bioinformatika menawarkan pendekatan untuk analisis materi genetik organisme dari database yang telah tersedia secara luas. Penelitian ini bertujuan untuk menemukan marker dari sekuens protein beberapa sampel kelompok mamamlia secara in silico dengan pendekatan bioinformatika. Pemilihan sampel urutan protein didasarkan pada protein yang telah banyak dilaporkan secara luas yaitu protein IGF2 ( insulin like growth factor 2 ) dan CytB  ( cytochrome  B ).  Analisis  kekerabatan  antar  sampel  menggunakan  konstruksi  pohon  filogenetik berdasarkan sekuens protein sampel spesies mamalia halal yang dibandingkan dengan sampel mamalia non-halal  seperti  babi  dan  anjing.  Tahap  terakhir  adalah  analisis  struktur  dan  sifat  fisikokimia  protein target  untuk  menentukan  marker  'halal'.  Analisis  pohon  filogenetik  menunjukkan  bahwa  spesies  babi menempati kelompok yang berbeda dengan mamalia yang umum dikonsumsi di Indonesia dan paling dekat hubungannya dengan spesies anjing. Prediksi sifat protein sampel memberikan informasi kesamaan titik isoelektrik dan karakteristik kelarutan antara sekuens protein spesies babi dan anjing. Dua blok penanda pada  sekuen  babi  dan  anjing  dari  protein  IGF2  didapatkan  dengan  metode multiple sequence  alignment berupa urutan polimorfisme asama amino YDTWKQSAQRLRRGLPALLRARRGR dan HGGASPEASG. Hasil ini dapat menjadi penanda baik secara struktur (urutan) maupun posisinya sebagai acuan dalam pengujian produk halal berbasis DNA, khususnya dengan metode PCR.
Kata kunci : bioinformatika, hewan ternak, IGF2, marker halal, polimorfisme
Amaniyah, M., Febrita, R. E., & Prasetyo, J. A. (2023). Deteksi Marker Genetik dari Sekuen Protein Hewan untuk Autentikasi Halal Melalui Pendekatan Bioinformatika. Jurnal Agroindustri Halal, 9(3), 289 – 299.

## PENDAHULUAN
Makanan  merupakan  salah  satu  kebutuhan  primer  manusia,  yang  pemenuhannya merupakan bagian dari pemenuhan hak asasi manusia. Menjaga keamanan pangan penting dilakukan  agar  pangan  yang  dikonsumsi  masyarakat  tidak  menimbulkan  bahaya  bagi kesehatan, merugikan serta tidak bertentangan dengan hukum agama atau kepercayaan, dan budaya  di  masyarakat  (Undang-Undang  Republik  Indonesia  Tentang  Pangan,  2012). Kesadaran akan pentingnya jaminan autentikasi makanan halal menjadi isu dan masalah bagi sebagian masyarakat di dunia, terutama di negara yang memiliki mayoritas penduduk Muslim. Setiap  negara  memiliki  perhatian  dan  kepentingan  tersendiri  untuk  menentukan  prioritas dalam membidik isu keaslian makanan halal. Isu kehalalan bagi konsumen muslim, seperti daging dan produk olahan daging, diharuskan tidak mengandung bahan babi,  serta melalui cara penyembelihan yang halal (Nakyinsige et al ., 2012).
Ciri-ciri makanan halal tidak dapat dipastikan oleh konsumen secara langsung karena tidak terlihat terutama pada makanan olahan. Sjakoer et al . (2022) dalam hasil observasinya terhadap UMKM di Jawa Timur melaporkan bahwa  hampir 50% responden tidak memiliki supplier bahan baku yang jelas sehingga status kehalalan bahan baku tidak mudah ditelusuri. Dalam rangka perlindungan jaminan makanan halal, pemerintah Indonesia memiliki BPJPH (Badan Penyelenggara Jaminan Produk Halal) yang berperan mengatur pemberian sertifikat halal pada suatu produk. Mekanisme pemeriksaan kehalalan suatu produk dilakukan melalui inspeksi lokasi produksi serta pengujian pada laboratorium (Kamsari, 2019).
Waluyo et al . (2021) telah melaporkan studi penggunaan analisis in silico terhadap gen Aktin  sebagai  kandidat  untuk  deteksi  DNA  Non-Halal.  Hasil  studi  tersebut  menunjukkan bahwa  suatu  produk  pangan  dapat  dikatakan  halal  atau  haram  melalui  identifikasi  atau pendekatan  molekuler  dengan  melihat  sifat  atau  struktur  protein  yang  terkandung  di dalamnya.  Jika  suatu  makanan  mengandung  struktur  protein  seperti  yang  terdapat  pada hewan  tertentu,  maka  dapat  diasumsikan  bahwa  makanan  tersebut  mengandung  bahan hewani. Untuk melakukan penelitian tentang sifat-sifat protein dan DNA diperlukan data yang berkaitan  dengan  strukturnya.  Metode  pemeriksaan  halal  yang  tepat  dan  sensitif  sangat penting  sebagai  jaminan  kualitas,  jaminan  hukum,  dan  perlindungan  konsumen.  Prosedur pengujian yang sudah digunakan untuk autentikasi halal antara lain pendekatan biologis dan kimiawi,  menggunakan  metode  DNA-based,  protein-based,  atau  lipid-based  (Ballin,  2010 Guntarti et al ., 2017; Premanandh & bin Salem, 2017; He & Yang, 2018; Hermanto et al ., 2022). Urutan  DNA  dapat  diaplikasikan  dalam  analisis  kandungan  kontaminan  dalam  bahan makanan mentah maupun olahan. Protein yang berbeda telah ditargetkan untuk identifikasi kualitas  daging untuk  analisis  spesies  daging  (Davoli  &  Braglia,  2007;  Fajardo et  al .,  2010; Lopez-Oceja et al ., 2017; von Bargen et al ., 2014).
Website  UniProt  ( Universal  Protein  Resource )  dan  NCBI  ( National  Center  for Biotechnology Information ) telah menyediakan database sekuens protein dari berbagai level organisme  yang  dapat  diakses  secara  bebas  oleh  publik.  Pemanfaatan  database  protein mamalia  untuk  analisis  deteksi  marker  genetik,  termasuk  penanda  suatu  kehalalan, merupakan  hal  yang  potensial  untuk  dilakukan.  Berdasarkan  database  tersebut,  dapat diprediksi sifat khusus dari suatu kelompok protein terpilih hingga polimorfisme dari urutan sekuennya sebagai acuan penentuan marker spesifik. Adanya polimorfisme asam amino pada urutan residu tertentu suatu kelompok protein dapat memberikan pengaruh perbedaan sifat protein tersebut (Laksono & Sinuraya, 2018). Penerapan bioinformatika untuk deteksi gen potensial  pada  hewan  ternak  diharapkan  menjadi  terobosan  baru  untuk  mencari  bahan (marker spesifik). Marker spesifik merupakan komponen penting dalam metode pengecekan
autentifikasi  halal  berbasis  DNA  atau  protein  (Erwanto et  al .,  2014;  Hsieh et  al .,  2016). Penggunaan  pendekatan  analisis  bioinformatika  sebagai  bahan  rekomendasi  autentikasi makanan  halal  berbasis  DNA  dapat  menjadi  salah satu langkah  inisiasi. Studi  ini  bertujuan untuk menemukan koleksi sekuens protein hewan ternak mamalia yang berpotensi sebagai bahan  pendeteksi  autentikasi  makanan  halal  secara  in  silico  menggunakan  pendekatan bioinformatika. Penelitian ini juga merupakan tahap inisiasi untuk membandingkan metode analisis  sampel  molekuler  menggunakan  machine  learning  pada  penelitian  sebelumnya (Febrita  &  Amaniyah,  2021).  Kami  menggunakan  gen  ternak  yang  umum  dikonsumsi  di Indonesia  menggunakan  sumber  database  yang  ada  di  UniProt  dan  NCBI.  Pada  penelitian selanjutnya,  hasil dari studi  ini diharpkan dapat  digunakan  sebagai data  pendukung  untuk pendeteksian autentikasi halal makanan berbasis DNA dan protein, khususnya daging olahan.

## MATERI DAN METODE
Penelitian  ini  menggunakan  pendekatan  eksperimental  in  silico  berdasarkan  analisis bioinformatika. Kelompok mamalia yang diperbolehkan untuk dikonsumsi di Indonesia (sapi, domba,  kambing,  kuda,  dan  kerbau)  digunakan  sebagai  sampel  yang  representatif dibandingkan dengan sekuens mamalia lainnya yang dilarang untuk dikonsumsi bagi umat Islam (babi, anjing, tikus dan mencit). Kami menganalisis menggunakan beberapa situs web dan  program  bioinformatika  untuk  mendapatkan  beberapa  informasi  dari  sekuen  protein yang dipakai sebagai sampel.

## Pemilihan Sampel Uji
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini berupa 14 sekuen protein masing-masing dari gen IGF2 ( Insulin Like Growth Factor 2 ) dan Cyt-B ( Cytochrome B ) spesies terpilih yang diambil dari genbank NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) dan Universal Protein Resource (UniProt)  (www.uniprot.org)  (Tabel  1).  Protein  ini  telah  dilaporkan  untuk  mendeteksi kualitas daging pada beberapa spesies (Huang et al ., 2013; Davoli & Braglia, 2007; Lopez-Oceja et al ., 2017).
Tabel 1. Sekuen protein dari sampel Sampel Organisme IGF2 CytB Acc. No. Sumber Acc. No. Sumber Babi ( Sus scrofa ) P23695.1 Uniprot P24964 Uniprot Anjing ( Canis lupus familiaris ) J9P961 Uniprot Q34101 Uniprot Sapi ( Bos taurus ) P07456.4 Uniprot P00157 Uniprot Kuda ( Equus caballus ) P51459.2 Uniprot P48665 Uniprot Domba ( Ovis aries ) P10764.2 Uniprot P24959 Uniprot Kambing ( Capra hircus ) Q153G7 Uniprot P24953 Uniprot Kerbau ( Bubalus bubalis ) XP_025142717.1 NCBI Q33950 Uniprot Monyet ( Macaca mulatta) A0A5F8AD35 Uniprot Q6IYG6 Uniprot Simpanse ( Pan troglodytes) A0A2I3SPQ3 Uniprot Q9T9V5 Uniprot Manusia ( Homo sapiens ) P01344.1 Uniprot P00156 Uniprot Mencit ( Mus musculus ) P09535.1 Uniprot P00158 Uniprot Tikus ( Rattus norvegicus ) P01346.1 Uniprot P00159 Uniprot Ayam ( Gallus gallus ) P33717.2 Uniprot P18946 Uniprot Zebrafish ( Danio rerio ) Q9PUD0 Uniprot Q9MIX8 Uniprot (Acc. No: Nomor akses pada website)
Sekuen  diambil  dalam  format  fasta  sebagai  bahan  analisis  selanjutnya.  Sekuen  dari spesies  terpilih  diajukan  di  dalam  penelitian  ini  sebagian  besar  berdasarkan  data  hewan ternak kelompok mamalia yang umum di konsumsi di Indonesia. Sekuen protein spesies dari ayam dan ikan dijadikan sebagai sekuen pembanding non mamalia.

## Analisis Filogenetik
Analisis ini dilakukan untuk mengetahui kekerabatan atau kedekatan secara genetik dari sampel yang diuji. Setiap spesies memiliki susunan DNA dan protein yang spesifik sehingga dapat  dijadikan  sebagai  penanda  yang  berbasis  DNA  untuk  aplikasi  di  berbagai  bidang. Analisis  kekerabatan  dilakukan  melalui  pembuatan  pohon  filogenetik  yang  dikonstruksi menggunakan sekuen protein gen IGF2 dan CytB dari sampel spesies mamalia, dan sekuen pembanding  berupa  ayam  dan  ikan.  Urutan  residu  protein  disejajarkan  menggunakan software MEGAX sebagai data konstruksi pohon filogenetik berdasarkan metode Neighbour Joining dengan  nilai bootstrap 1000  (Hall,  2013;  Kumar et  al .,  2018).  Pohon  filogeneteik digunakan untuk mengetahui evolusi atau jarak mutasi DNA yang terjadi pada gen target. Gen target spesifik yang hanya terdapat pada kelompok mamalia akan digunakan untuk analisis perbandingan selanjutnya. Panjang cabang pohon filogenetik menjadi gambaran evolusi atau jarak mutasi yang terjadi pada gen target.

## Analisis Sekuen Protein
Analisis  protein  bertujuan  untuk  mengetahui  kelompok  protein  yang  potensial  untuk bahan deteksi  protein  produk  ‘halal’.  Karakter  spesifik  dari  protein -protein  yang  hanya dimiliki  oleh spesies babi  dibandingkan dengan  karakter  protein dari  spesies  lainnya  yang kemudian akan menjadi acuan pembeda. Analisis ini dilakukan melalui perbandingan struktur dan sifat protein yang dimiliki babi dan mamalia pembanding lainnya.
Analisis  prediksi  struktur  protein  gen  target  terpilih  dilakukan  menggunakan  open software PredictProtein (http://ppopen.informatik.tu-muenchen.de/) dan prediksi struktur protein  tersier  dimodelkan  menggunakan  Swiss-Model  (https://swissmodel.expasy.org/ interactive).  Sifat  fisikokimia  protein  yang  diamati  meliputi  hidrofobisitas,  kelarutan,  titik isoelektrik,  dan  pI.  Analisis  hidrofobik  menggunakan  Kyte-Dollylte  Hydropath  plot (https://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fastawww.cgi?rm=misc1),  analisis  kelarutan dengan  Protein  Sol  (https://protein-sol.manchester.ac.uk/),  sedangkan  berat  molekul  dan titik isoelektrik (pI) diestimasi dengan software
Compute pI/Mw (https://web.expasy.org/compute_pi/).
Selanjutnya, analisis Multiple Sequence Alignment (MSA) dibuat untuk mengetahui posisi dan  ketepatan  sekuen  yang  berbeda  (polimorfisme  asam  amino)  sebagai  marker  untuk mencari kemiripan sekuen protein IGF2 yang dimiliki oleh sekelompok sampel terpilih. MSA dilakukan menggunakan Clustal Omega software 1.2.1
(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).  Region  yang  berisi  residu  atau  asam  amino yang konservatif ditetapkan sebagai marker penanda (Sievers & Higgins, 2014).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Analisis Kekerabatan Sampel
Evolusi dapat didefinisikan sebagai perkembangan bentuk biologis dari bentuk lain yang sudah ada sebelumnya atau bentuk awal ke bentuk tertua saat ini melalui seleksi alam atau modifikasi. Dalam penelitian biologi modern, seleksi dalam evolusi molekuler dapat dilakukan melalui analisis filogenetik untuk menganalisis sejarah evolusi organisme untuk memprediksi garis  keturunan  organisme  tersebut.  Perspektif  evolusioner  dapat  dibangun  dengan menggunakan sekuens DNA atau protein sebagai data molekuler organisme yang ada karena
materi  genetik  mengakumulasi  mutasi  yang  terjadi  seiring  waktu  sehingga  menyebabkan perubahan fenotipik (Xiong, 2006).
Analisis filogenetik dapat menggambarkan prediksi kekerabatan secara genetik diantara sampel  sekuen  protein  yang  diuji.  Hasil  hubungan  evolusioner  sampel  protein  IGF2 menunjukkan posisi empat kelompok (cluster) (Gambar 1A). Kelompok pertama terdiri dari manusia, primata dan simpanse. Babi dan anjing menempati kelompok berbeda, begitu juga dengan kelompok tikus dan mencit. Kelompok lainnya terdiri dari sapi, kambing, domba dan kerbau. Outgroup dalam analisis filogenetik ini berupa ayam dari kelompok aves dan zebrafish ( Danio rerio ) dari kelompok ikan menunjukkan posisi cabang pohon filogenetik yang berbeda dengan  kelompok  hewan  mamalia  uji  lainnya.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  sampel  sekuen protein  IGF2  diasumsikan  dapat  digunakan  untuk  menunjukkan  kekerabatan  antara kelompok  mamalia  dan  non-mamalia  (ayam  dan  ikan).  Pohon  filogenetik  yang  dibangun mengungkapkan hubungan parafiletik antara cluster babi ( Sus scrofa ) dan cluster sapi ( Bos taurus ),  yang  menunjukkan  adanya  prediksi  variasi  spesifik  pada  urutan  asam  amino (polimorfisme  asam  amino)  dalam  urutan  protein  IGF2  antara  kedua  spesies  kelompok. Huang et al . (2013) melaporkan bahwa karakter polimorfisme IGF2 dapat digunakan sebagai penanda genetik untuk seleksi dalam program pemuliaan sapi potong. Hal ini menunjukkan bahwa polimorfisme intraspesies diharapkan lebih tinggi antara protein IGF2 mamalia yang dapat dikonsumsi oleh umat Islam (cluster B. taurus ) dan S. scrofa , sehingga berpotensi untuk dikembangkan untuk tujuan autentikasi halal.
Gambar 1.  Konstruksi pohon Filogenetik sekuen protein ( A ) IGF2 dan ( B ) CytB dari mamalia, burung dan ikan. Pohon filogenetik dikonstruksi menggunakan metode neighbour joining algorithm dalam MEGA X. Bar menunjukkan perkiraan divergensi sekuen
Di sisi lain, protein CytB dari sampel menunjukkan pola konstruksi pohon filogenetik yang  sedikit  berbeda  dari  protein  IGF2  (Gambar  1B).  Kelompok  pertama  terdiri  dari  sapi, kambing, domba dan kerbau. Kelompok kedua terdiri dari tikus dan mencit dan kelompok ketiga terdiri dari manusia, primata dan simpanse. Sampel kuda, babi dan anjing menunjukkan kedekatan dengan kelompok sapi dan tikus. Aina et al ., (2020) melaporkan bahwa sekuen DNA protein  Cyt-B  dapat  dipakai  sebagai  marker  standar  untuk  mengidentifikasi  adanya kontaminasi daging babi dalam makanan berdasarkan analisis Real Time-PCR menggunakan primer CYTBWB2-wb yang terbukti spesifik untuk mendeteksi kontaminasi daging babi pada produk bakso.
Berdasarkan pohon filogenetik dari dua sampel protein, menunjukkan bahwa spesies babi  adalah  kerabat  terdekat  dengan  anjing  (keduanya  merupakan  mamalia  yang  dilarang untuk dikonsumsi oleh umat Islam). Hasil ini menunjukkan bahwa  mereka babi dan anjing adalah kelompok yang berbeda dari anggota kelompok sapi, kambing, domba dan kerbau yang biasanya  dikonsumsi  untuk  daging  di  Indonesia.  Hasil  ini  dapat  digunakan  sebagai  bahan referensi  untuk  studi  lebih  lanjut  terkait  hubungan  evolusi  antara  babi  (atau  anjing)  dan hewan lain yang dikategorikan haram, tetapi masih dikonsumsi di Indonesia.

## Analisis Sekuen Protein
Asam amino standar terdiri atas 20 jenis, meskipun beberapa organisme memiliki asam amino  tambahan.  Pada  tahapan  sintesis  protein,  residu  dalam  protein  dimodifikasi  secara kimiawi  melalui  proses  pascatranslasi yang  mengubah  sifat  fisik  dan  kimia,  hingga  fungsi protein. Tahapan prediksi analisis protein pada penelitian ini menggunakan 9 sampel sekuen protein mamalia, yaitu sapi, kambing, domba, kerbau, kuda, babi, anjing, manusia, dan tikus.
Sampel protein IGF2 dan CytB yang digunakan dalam penelitian ini memiliki panjang urutan asam amino yang berbeda sehingga memiliki berat molekul yang berbeda pula (Tabel 2).  Hal  menarik  dari  analisis  sifat  fisikokimia  protein  ini  adalah  kemiripan  karakter  titik isoelektrik  dan  kelarutan  antara  sekuen  protein  IGF2  dari  spesies  babi  dan  anjing.  Kedua sekuen ini memiliki titik isoelektrik dan nilai kelarutan lebih tinggi dibandingkan sekuen asam amino sampel lainnya. Hasil prediksi ini didukung oleh hasil studi Hamdani et al . (2018) yang melaporkan  bahwa  terkait  sifat  fisikokimia  sekuen  protein  IGF2,  spesies  babi  ( Sus  scrofa ) memiliki titik isoelektrik serta kelarutan yang lebih tinggi dibandingkan dengan spesies sapi ( Bos taurus ). Sampel  protein CytB juga menunjukan kemiripan karakter titik isoelektrik dari spesies  babi  dan  anjing  dengan  nilai  lebih  rendah  dibandingkan  sampel  mamalia  lainnya. Karakter sifat kelarutan sampel protein CytB mamalia menunjukkan nilai yang hampir sama pada  semua  sampel  yang  digunakan.  Analisis  hidrofobik  menggunakan  Kyte-Dollylte Hydropath plot menunjukkan prediksi semua sekuen protein IGF2 yang diujikan cenderung bersifat hidrofilik dan sekuen protein CytB cenderung bersifat hidrofobik (Gambar 2 dan 3). Protein IGF2 dipilih untuk di analisis terlebih dahulu terkait sifat protein lanjutan berdasarkan hasil perbandingan analisis sifat fisikokimia protein yang lebih stabil dibandingkan protein CytB.
Tabel 2. Prediksi parameter fisikokimia protein sampel mamalia IGF2 dan CytB
Sampel Organisme IGF2 CytB Panjang sekuen (bp) Berat Mol. (Dalton) pI Sol Panjang sekuen (bp) Berat Mol. (Dalton) pI Sol Babi 181 20312.51 10.00 0.592 379 42781.97 6.85 0.218 Anjing 238 26460.64 9.61 0.576 379 42593.51 6.85 0.222 Sapi 179 19681.51 9.11 0.467 379 42590.62 7.75 0.229 Kuda 181 20360.55 9.01 0.386 379 42761.84 7.22 0.267 Domba 179 19616.32 8.84 0.427 379 42849.12 7.19 0.207 Kambing 179 19654.41 8.84 0.423 379 42871.10 7.19 0.207 Manusia 244 20140.35 9.50 0.482 380 42717.59 7.83 0.291 Mencit 180 20030.14 9.38 0.495 381 43209.58 7.80 0.232 Kerbau 235 25783.45 8.43 0.398 379 42783.89 7.79 0.232
(pi: Titik Isoelektrik; Sol: kelarutan protein)
Gambar 2. Prediksi hidrofobisitas sekuen protein IGF2 sampel mamalia. Plot hidrofobisitas yang menampilkan area dominan di bawah garis threshold menunjukkan prediksi kecenderungan sifat hidrofilik pada sekuen sampel.
Gambar 3. Prediksi hidrofobisitas sekuen protein CytB sampel mamalia. Plot hidrofobisitas yang menampilkan area dominan di atas garis threshold menunjukkan prediksi kecenderungan sifat hidrofobik pada sekuen sampel.

## Analisis struktur protein
Berbagai  jenis  protein  memiliki  fungsi  yang  berbeda  akibat  perbedaan  urutan  asam amino-asam  aminonya,  yang  ditentukan  berdasarkan  urutan  DNA  dan  disandi  dalam  kode genetik.  Perbedaan  urutan  asam  amino  akan  mempengaruhi  pelipatan  protein  menjadi struktur tiga dimensi khusus hingga reaktivitas kimia suatu protein (Gutteridge & Thornton, 2005).  Suatu  struktur  protein dapat  diketahui  melalui  model  matematika protein  melalui prediksi formasi molekul secara komputasi berdasarkan data teori tanpa mendeteksi struktur protein secara langsung di laboratorium (Zhang, 2008). Analisis struktur sekunder dan tersier sekuen  protein  IGF2  dari  9  sampel  mamalia  yang  dianalisis  menunjukkan  keragaman  pola urutan  struktur  (gambar  tidak  ditampilkan).  Hasil  analisis  sifat  struktur  protein  IGF2  dari spesies  babi  dan  anjing  secara  khusus  dianalisis  melalui  pembandingan  untuk  mengetahui secara detail perbedaan karakternya (Gambar 3). Kedua protein terdeteksi memiliki struktur sekunder dan tersier yang cenderung berbeda dengan jumlah struktur alfa helix sebanyak 6
buah dengan posisi yang berbeda. Protein IGF2 spesies babi tersusun atas 2 struktur beta, sedangkan spesies anjing memiliki 5 struktur beta.
Gambar 3. Perbandingan prediksi struktur protein IGF2 sekunder dan tersier antara (A) spesies babi dan (B) spesies anjing. Struktur heliks (warna biru); struktur beta (warna ungu).
Analisis multiple  sequence  alignment (MSA)  dilakukan  untuk  mengetahui  posisi  blok marker yang berupa polimorfisme asam amino antar sampel sekuen protein IGF2 secara lebih rinci.  Gambar  4  menunjukkan  keberadaan  dua  blok  marker  (polimorfisme  asam  amino dibandingkan  sampel  sekuen  protein  mamalia  lainnya)  yang  terdapat  pada  kedua  sekuen protein anjing dan babi. Kami menemukan dua blok marker yang terdiri dari 25 sekuens asam amino YDTWKQSAQRLRRGLPALLRARRGR dan 10 sekuens asam amino HGGASPEASG. Posisi marker di seluruh sekuen bervariasi tergantung pada panjang sekuens protein. Namun, pola posisi  urutan  blok  YDTWKQSAQRLRRGLPALLRARRGR  selalu  ada  sebelum  urutan  blok HGGASPEASG.  Berdasarkan  pola  ini  dapat  diasumsikan  bahwa  karakter  atau  sekuen  yang berada  sebelum  dan  setelah  blok  HGGASPEASG,  bukan  penciri  atau  marker  pada  protein anjing dan babi. Analisis MSA ini memiliki temuan penanda yang sesuai dengan analisis N- Gram pada penelitian sebelumnya (Gambar 5) (Febrita & Amaniyah, 2021).
Cow         DVSASTTVLPDDVTAYPVGKFFQYDIWKQSTQRLRRGLPAFLRARRGR 140 Buffalo     DVSASTTVLPDDVTAYPVGKFFQYDIWKQSTQRLRRGLPAFLRARRGR 196 Sheep       DVSASTTVLPDDFTAYPVGKFFQSDTWKQSTQRLRRGLPAFLRARRGR 140 Goat        DVSASTTVLPDDFTAYPVGKFFQSDTWKQSTQRLRRGLPAFLRARRGR 140 Mouse       DVSTSQAVLPDDFPRYPVGKFFQYDTWRQSAGRLRRGLPALLRARRGR 140 Horse       DVSTPPTVLPDDSPRYPVVKLFQYNAWKQSTQRLRRGLPALLRTRRGR 140 Human       DVSTPPTVLPDNFPRYPVGKFFQYDTWKQSTQRLRRGLPALLRARRGH 140 Pig         DVSTPPTVLPDNFPRYPVGKFFRYDTWKQSAQRLRRGLPALLRARRGR 140 Dog         DVSTPPTVLPDNFPRYPVGKFFQYDTWKQSAQRLRRGLPALLRARRGR 197 ***:  :****:   *** *:*: : *:**: ********:**:***: Cow         TLAKELEALREAKSHRPLIALPTQDPATHGGASSKASSD-- 179 Buffalo     TLAKELEALREAKSHRPLIALPTQDPATHGGASSEASSD-- 235 Sheep       TLAKELEALREAKSHRPLIALPTQDPATHGGASSEASSD-- 179 Goat        TLAKELEALREAKSHRPLIALPTQDPATHGGASPEASSD-- 179 Mouse       MLAKELKEFREAKRHRPLIVLPPKDPAHG-GASSEMSSNHQ 180 Horse       MLVKELEAFREAQRHRPLIALPTEDPTPHGAAFVEVSSDLQ 181 Human       VLAKELEAFREAKRHRPLIALPTQDPA-HGGAPPEMASNRK 180 Pig         TLAKELEAVREAKRHRPLTARPTRDPAAHGGASPEASGHRK 181 Dog         MLAKELEAFREAKRHRPLIALPTHDPATHGGASPEASGNQK 238 *.***: .***: **** . * .**:   .*  : :.. Gambar 4. Multiple sequence alignment urutan asam amino IGF2. Daerah konservatif antara sekuen sampel bab dan anjing ditunjukkan oleh warna abu-abu
Gambar 5. Ilustrasi posisi marker non-halal pada sekuen protein IGF2 pada hewan babi dan anjing (Febrita & Amaniyah, 2021).

## KESIMPULAN
Analisis pohon filogenetik sekuens protein IGF2 ( insulin like growth factor 2 ) dan CytB ( cytochrome B ) menunjukkan bahwa spesies babi menempati klaster yang berbeda dengan mamalia yang umum dan dapat dikonsumsi di Indonesia. Berdasarkan analisis urutan protein, spesies  babi  paling  dekat  hubungannya  dengan  anjing.  Analisis  sifat  protein  menunjukkan kesamaan titik isoelektrik dan karakteristik kelarutan antara sekuens protein spesies babi dan anjing.  Analisis multiple  sequence  alignment yang  diterapkan  untuk  mendeteksi  posisi  dan urutan marker ‘non - halal’ dalam struktur protein (IGF2) pada hewan menunjukkan adanya dua  blok  marker  yang  terdapat  pada  sekuens  protein  babi  dan  anjing.  Marker  ‘non - halal’ terdiri dari 25 sekuens asam amino YDTWKQSAQRLRRGLPALLRARRGR dan 10 sekuens asam amino HGGASPEASG. Temuan tersebut dapat menjadi penanda baik secara struktur (urutan) maupun  posisinya,  sehingga  dapat  dijadikan  acuan  dalam pengujian  produk  halal  berbasis DNA  khususnya  dengan  metode  PCR  sehingga  biaya  dan  waktu  dapat  diminimalkan.  Data relevan terkait karakter gen selektif pada beberapa sampel hewan dapat digunakan sebagai informasi pendukung pemilihan penanda gen halal.

## DAFTAR PUSTAKA
Aina,  G.  Q.,  Rohman,  A.,  &  Erwanto,  Y.  (2020).  Wild  boar-specific  PCR  assay  and  sequence analysis  based  on  mitochondrial  cytochrome-B  gene  for  Halal  authentication  studies. Indonesian Journal of Chemistry , 20 (2), 483 – 492. https://doi.org/10.22146/ijc.42552 Ballin, N. Z. (2010). Authentication of meat and meat products. Meat Science, 86 (3), 577-587. https://doi.org/10.1016/j.meatsci.2010.06.001
Davoli, R., & Braglia, S. (2007). Molecular approaches in pig breeding to improve meat quality.
Briefing in Functional Genomics and Proteomics, 6 (4), 313-321.
https://doi.org/10.1093/bfgp/elm036
Erwanto, Y., Abidin, M. Z., Muslim, E. Y. P., Sugiyono, S., & Rohman, A. (2014). Identification of pork  contamination  in  meatballs  of  Indonesia  local  market  using  polymerase  chain reaction-restriction  fragment  length  polymorphism  (PCR-RFLP)  analysis. Asian-
Australasian journal of animal sciences , 27 (10),
1487-1492. https://doi.org/10.5713/ajas.2014.14014
Fajardo, V., González Isabel, I., Rojas, M., García, T., & Martín, R. (2010). A review of current PCR-based  methodologies  for  the  authentication  of  meats  from  game  animal  species.
Trends in Food Science & Technology , 21 (8), 408-421. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2010.06.002
Febrita, R. E. & Amaniyah, M. (2021). Deteksi gen potensial hewan ternak untuk autentikasi produk halal menggunakan analisis n-gram. In Seminar Nasional Terapan Riset Inovatif (SENTRINOV)  Ke-6. Jurnal  Seminar  Nasional  Terapan  Riset  Inovatif  (SENTRINOV) , 7 (1), 260 – 267.
Guntarti, A., Rohman, A., Martono, S., & Yuswanto, A. (2017). Authentication of Wild Boar Meat in  Meatball  Formulation  Using  Differential  Scanning  Calorimetry  and  Chemometrics. Journal of Food and Pharmaceutical Sciences , 5 (1), 8-12.  https://doi.org/10.14499/jfps Gutteridge, A., & Thornton, J. M. (2005). Understanding nature’s catalytic toolkit. Trends in biochemical sciences , 30 (11), 622-629. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2005.09.006 Hall,  B.  G.  (2013).  Building  phylogenetic  trees  from  molecular  data  with  MEGA. Molecular Biology and Evolution , 30 (5), 1229 – 1235. https://doi.org/10.1093/molbev/mst012
Hamdani,  A.  D.,  Suryohastari,  R.  B.,  Virgianti,  D.  P.,  &  Putrie,  R.  F.  W.  (2018).  Short Communication: Genetic diversity of the IGF2 gene as a source of genetic marker for halal authentication. Nusantara Bioscience , 10 (4), 203 – 209. https://doi.org/10.13057/nusbiosci/n100401
He,  Z.,  &  Yang,  H.  (2018).  Colourimetric  detection  of  swine-specific  DNA  for  halal authentication using gold nanoparticles. Food Control , 88 , 9 – 14. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2018.01.001
Hermanto, S., Rudiana, T., Zein, M. I. H. L., & Wisudawati, A. W. (2022). Methods Validation of Pork  Authentication  in  Processed  Meat  Products  (Sausages)  Through  Densitometry Analysis. Indonesian Journal of Halal Research , 4 (1), 35 – 44. https://doi.org/10.15575/ijhar.v4i1.11892
Hsieh, M. K., Shih, P. Y., Wei, C. F., Vickroy, T. W., & Chou, C. C. (2016). Detection of undeclared animal by-products in commercial canine canned foods: Comparative analyses by ELISA and  PCR-RFLP  coupled  with  slab  gel  electrophoresis  or  capillary  gel  electrophoresis. Journal of the Science of Food and Agriculture , 96 (5), 1659 – 1665. https://doi.org/10.1002/jsfa.7268
Huang, Y. Z., Wang, J., Zhan, Z. Y., Cao, X. K., Sun, Y. J., Lan, X. Y., Lei, C. Z., Zhang, C. L., & Chen, H. (2013). Assessment of association between variants and haplotypes of the IGF2 gene in beef cattle. Gene , 528 (2), 139 – 145. https://doi.org/10.1016/j.gene.2013.07.035 Kamsari, D. H. A. (2019). Mekanisme Pengajuan Sertifikasi Halal dan Fasilitasi Halal Bagi UMK.
Badan Penyelenggara Jaminan Produk Halal. Kementerian Agama. http://www.halal.go.id/cms/assets/files/Materi_Pak_Amru_compressed.pdf
Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., & Tamura, K. (2018). MEGA X: Molecular evolutionary genetics  analysis  across  computing  platforms. Molecular  Biology  and  Evolution , 35 (6), 1547 – 1549. https://doi.org/10.1093/molbev/msy096
Laksono,  J.  P.,  &  Sinuraya,  R.  K.  (2018).  Review  Artikel:  Polimorfisme  Gen  Serotonin Mempengaruhi Pengobatan Risperidone dan Clozapine Pada Pasien
Skizofrenia. Farmaka , 16 (3), 83-90.
Lopez-Oceja,  A.,  Nuñez,  C.,  Baeta,  M.,  Gamarra,  D.,  &  de  Pancorbo,  M.  M.  (2017).  Species identification in meat products: A new screening method based on high resolution melting analysis of cyt b gene. Food Chemistry , 237 , 701 – 706. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.06.004
Nakyinsige, K., Man, Y. B. C., & Sazili, A. Q. (2012). Halal authenticity issues in meat and meat products. Meat science , 91 (3), 207-214. https://doi.org/10.1016/j.meatsci.2012.02.015
Undang-Undang Republik Indonesia Tentang Pangan Nomor 18 Tahun 2012 Pasal 1 ayat 5 (2012).  https://www.kemhan.go.id/ppid/wp-content/uploads/sites/2/2016/09/uu18- 2012bt.pdf.
Premanandh,  J.,  &  bin  Salem,  S.  (2017).  Progress  and  challenges  associated  with  halal authentication  of  consumer  packaged  goods. Journal  of  the  Science  of  Food  and Agriculture , 97 (14): 4672-4678. https://doi.org/10.1002/jsfa.8481
Sievers, F., & Higgins, D. G. (2014). Clustal omega, accurate alignment of very large numbers of sequences. Methods in Molecular Biology , 1079 , 105 – 116. https://doi.org/10.1007/978- 1-62703-646-7_6
Sjakoer, N. A. A., Noerhayati, E., Mardiayani, S. A., & Said, M. M. U. (2022). Gambaran kesiapan UMKM menuju industri halal Jawa Timur: An Overview of Small and Medium Enterprise (SME) Readiness towards The East Java Halal Industry. Jurnal Agroindustri Halal , 8 (2), 189. von  Bargen,  C.,  Brockmeyer,  J.,  &  Humpf,  H.  U.  (2014).  Meat  authentication:  A  new  HPLC- MS/MS  based  method  for  the  fast  and  sensitive  detection  of  horse  and  pork  in  highly processed  food. Journal  of  Agricultural  and  Food  Chemistry , 62 (39),  9428 – 9435. https://doi.org/10.1021/jf503468t
Waluyo, S., Malau, J., Raekiansyah, M., Yulian, E., & Hardiman, I. (2021). In Silico Analysis of Actin Gene as a Candidate for DNA Non-Halal Detection Base on Real-Time PCR. Indonesian Journal of Halal Research , 3 (2), 70 – 74. https://doi.org/10.15575/ijhar.v3i2.12123 Xiong, J. (2006). Essential bioinformatics . Cambridge University Press.
Zhang, Y. (2008). Progress and challenges in protein structure prediction. Current opinion in structural biology , 18 (3), 342-348. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2008.02.004