## PEWARNAAN GRAM BUFFY COAT UNTUK DETEKSI AWAL PASIEN BAKTEREMIA

## Leka Lutpiatina
Jurusan Analis Kesehatan Poltekkes Kemenkes Banjarmasin Jl Mistar Cokrokusumo 4a Banjarbaru
e-mail : leka.zns@gmail.com
Abstract : Bacteremia is one public health problem. Bacteremia was ranked as the tenth leading cause of death in the United States. Gram staining of buffy coat can be used for early detection of patients with bacteremia. Rapid diagnostic tests with these Gram staining can be interpreted within  an  hour  and  the  research  that  has  been  conducted  Richmond  et  al.  2002,  have  a sensitivity of 75% and specificity of 79%. This study aimed to study the sensitivity and specificity of Gram buffy coat with the gold standard blood culture media biphasic fever suspected patients. This  study  was  an  observational  study  with  cross  sectional  study.  The  study  population  was suspected fever patients in hospitals Ratu Zalecha Martapura months from March to May 2013. The  samples  were  suspect  fever  patients  in  hospitals  Queen  Zalecha  Martapura  March-May 2013 were taken by purposive with the inclusion criteria: Patients District General Hospital Ratu Zalecha Martapura, aged ≥10 years, had fever ≥ 5 days, had symptoms of abdominal pain, willing to  follow  the  study.  Gram  staining  microscopic  results  were  analyzed  by  application  epicalc. Microscopic  results  buffy  coat  Gram  staining  Gram-negative  rods are  found  as many  as  seven (26%) and were not found Gram-negative rods as many as 20 (74%). Culture results of this study are Gram negative bacterial growth as much as 6 (22%) and no growth as many as 21 (78%). Conclusion The results of microscopic Gram stain buffy coat has a value of 67% sensitivity and 86% specificity.
Keywords : Gram stain, Buffy Coat, bacteraemia
Abstrak : Bakteremia adalah salah satu masalah kesehatan masyarakat. Bakteremia menempati peringkat kesepuluh sebagai penyebab utama kematian di Amerika Serikat (Kung H et.al ., 2008). Pewarnaan  Gram  dari buffy  coat dapat  digunakan  untuk  deteksi  awal  pasien  bakteremia.  Tes diagnostik  yang  cepat  dengan  pewarnaan  Gram  ini  dapat  di  interpretasikan  dalam  waktu  satu jam  dan  dalam  penelitian  yang  telah  dilakukan  Richmond et  al. 2002,  mempunyai  sensitifitas 75%  dan  spesifisitas  79%.  Penelitian  ini  dimaksudkan  untuk  mempelajari  sensitifitas  dan spesifisitas  pewarnaan  Gram buffy  coat dengan  gold  standar  kultur  darah  media  bifasik  pada pasien tersangka demam. Penelitian ini merupakan penelitian observasional dengan rancangan cross sectional study . Populasi penelitian  adalah pasien tersangka demam di RSUD Ratu Zale- cha  Martapura  bulan  Maret-Mei  2013.  Sampel  penelitian  adalah  pasien  tersangka  demam  di RSUD  Ratu  Zalecha  Martapura  bulan  Maret-Mei  2013  yang  diambil  secara purposive dengan Kriteria  inklusi  :  Pasien  Rumah Sakit  Umum  Daerah  Ratu  Zalecha  Martapura,  berumur ≥10  ta- hun, memiliki gejala demam ≥ 5 hari, memiliki gejala sakit perut, bersedia mengikuti penelitian. Hasil  mikroskopis  pewarnaan  Gram  dianalisis  dengan  aplikasi epicalc .  Hasil  mikroskopis pewarnaan Gram buffy coat yaitu ditemukan batang Gram negatif sebanyak 7 (26%) dan yang tidak  ditemukan  batang  Gram  negatif  sebanyak  20  (74%).  Hasil  kultur  penelitian  ini  terdapat pertumbuhan bakteri Gram negatif sebanyak 6 (22%) dan tidak terdapat pertumbuhan sebanyak 21 (78%). Kesimpulan hasil mikroskopis pewarnaan Gram buffy coat mempunyai nilai sensitifitas 67% dan spesifisitas 86%.
Kata kunci : Pewarnaan Gram, Buffy Coat, Bakteremia

## Medical Laboratory Technology Journal
Available online at : http://ejurnal-analiskesehatan.web.id

## PENDAHULUAN
Demam adalah manifestasi sistemik yang paling sering terjadi pada respons radang dan merupakan gejala utama penyakit infeksi. Zat- zat yang dapat menimbulkan demam (pirogen) antara  lain  adalah  endotoksin  bakteri  gram negatif dan sitokin yang dilepaskan dari sel-sel limfoit,  seperti  interleukin-1(Jawezt et  al ., 2010).
Berbagai  aktivator  dapat  merangsang fagosif  monoluklear  dan  sel-sel  lain  untuk melepaskan  inerleukin-1.  Aktivator-aktivator tersebut  diantaranya  adalah  mikroba  dan produknya;  toksin,  termasuk  endotoksin; kompleks antigen antibodi; proses radang; dan lain-lain.  Interleukin-1  dibawa  aliran  darah  ke pusat  pengatur  suhu  di  hipotalamus, mencetuskan  respons  fisiologik  yang menyebabkan  demam,  misalnya  peningkatan produk  panas,  pengeluaran  panas  yang berkurang (Jawezt et al ., 2010).
Jenis  -  jenis  demam  diantaranya  adalah demam  berkepanjangan  ( Prolonged  fever ) yaitu  demam  berlangsung  lebih  lama  dari sekitar  10-14  hari.  Penyebab  demam berkepanjangan  antara  lain  karena  Infeksi bakteri, virus atau jamur, misalnya endokarditis infektif, demam tifoid, tuberkulosis atau infeksi jangka panjang lainnya (Colin Tidy, 2013).
Infeksi karena bakteri yang menimbulkan demam  dapat  mempengaruhi  hampir  semua sistem  organ  dalam  tubuh,  yaitu  sistem  saraf pusat,  sistem  pernafasan,  sistem pencernaan, sistem urogenital dan sistem peredaran darah. Sistem  peredaran  darah  (termasuk  jantung dan  paru-paru)  dapat  diserang  oleh  bakteri dengan gejala demam, nyeri tubuh, menggigil, kelemahan,  atau  kebingungan.  Kondisi  yang disebut  dengan  sepsis  terjadi  ketika  bakteri memasuki aliran darah (Davis CP, 2013).
Infeksi  bakteri  dimulai  pada  saat  bakteri masuk  ke  dalam  tubuh  dan  melekat  pada  sel epitel  sehingga  menjadi  tempat  infeksi  primer. Bakteri-bakteri  memperbanyak  diri  dan menyebar  langsung  ke  aliran  darah  melalui jaringan  atau  sistem  limfatik.  Infeksi  tersebut diistilahkan  sebagai  bakteremia  yang  dapat bersifat  sementara  atau  persisten.  Bakteremia memungkinkan  bakteri  menyebar  luas  ke dalam  tubuh  dan  mencapai  jaringan  yang cocok  untuk  multiplikasinya  (Jawezt et  al .,
2010).
Bakteremia  adalah  salah  satu  masalah kesehatan masyarakat. Bakteremia menempati peringkat  kesepuluh  sebagai  penyebab  utama kematian  di  Amerika  Serikat  (Kung  H et.al ., 2008).  Insiden  bakteremia  telah  meningkat selama  dekade  terakhir  dan  umumnya disebabkan  oleh  komplikasi  pasca  operasi, kateter  intravaskular  dan,  infeksi  lokal  yang rumit  (Odetola et  al .  2003  ;  Gura,  2004). Mortalitas    pasien  secara  keseluruhan sebanyak 20% dan pasien dengan syok septik dan kegagalan organ sebanyak 90% (Segal & Chamberlain 2000 ; Bearman & Wenzel 2005).
Perkiraan kejadian bakteremia pada studi di  Finlandia  berkisar  125  kasus  per  100.000 orang pertahun (Skogberg K., et al ., 2008) dan 189  kasus  per  100.000  orang  pertahun  di Olmsted  County,  Minnesota  (Uslan  DZ et.al ., 2007).  Prevalensi  pasien  bakteremia  di Denmark  bagian  utara  dengan  tingkat morbiditas tinggi meningkat dari 19,8% selama 1992-1996 menjadi 29,7% selama 2002- 2006. Proporsi  bakteremia  Gram  negatif  meningkat antara  periode  1992-1996  dan  periode  2002- 2006,  sedangkan  proporsi  bakteremia  Gram positif menurun antara periode 1992-1996 dan periode 2002-2006 (Sogaard M, et.al., 2013).
Bakteri yang dapat menyebabkan demam diantaranya  adalah  bakteri  penyebab  infeksi sistem  gastrointestinal  (sistem  pencernaan) seperti Salmonella , Escherichia coli , Klebsiella dan Serratia . Infeksi oportunistik yang disebab- kan  bakteri  genus  Pseudomonas  juga  dapat menimbulkan demam.
Demam  tifoid  yang  disebabkan  oleh salmonella merupakan  salah  satu  penyakit karena  infeksi  bakteri.  Demam    tifoid  menjadi salah  satu  masalah  kesehatan  dunia.  Demam tifoid  terjadi  baik  di    negara  tropis  maupun negara  subtropis,  terlebih  pada  negara berkembang.  Besarnya  angka  kejadian demam  tifoid  sulit  ditentukan  karena mempunyai  gejala  dengan  spektrum  klinis yang  luas  (Muliawan  &  Surjawidjaya  1999). Data Centres  for  disease  Control  and Prevention (CDC)  demam  tifoid  masih  umum di  negara  berkembang,  dengan  kasus  sekitar 21,5 juta orang setiap tahun (CDC, 2010).
Kasus demam  tifoid ini tersebar secara merata di seluruh propinsi di Indonesia dengan insidensi  daerah  pedesaan  358/100.000 penduduk/tahun  dan  daerah  perkotaan 760/100.000  penduduk/  tahun  atau  sekitar 600.000  dan  1.5  juta  kasus  per  tahun  (Parry, 2002). Rekam medik Rumah Sakit Umum Ratu Zalecha  mencatat  kasus  demam  tifoid  tahun 2011  sebanyak  2,6%  dan  tahun  2012 sebanyak  2,0%  dari  jumlah  pasien keseluruhan.  Data  Hasil  Riset  Dasar Kesehatan (RISKESDAS) tahun 2007, demam tifoid  menyebabkan  1,6%  kematian  penduduk Indonesia  pada  semua  umur  (Depkes  RI, 2008).
Manifestasi  klinis  demam  tifoid  tidak khas  dan  sangat  bervariasi  sesuai  dengan patogenesis  demam  tifoid  (Ashkenazy  & Cleary,  2000).  Penentuan diagnosis pasti dari penyakit  ini  diperlukan  pemeriksaan laboratorium.  Pemeriksaan  laboratorium  yang dapat  digunakan  adalah  pemeriksaan  darah tepi,  pemeriksaan  bakteriologis  dengan  isolasi dan  biakan  bakteri,  uji  serologis,  dan pemeriksaan  bakteri  secara  molekuler (Karsinah et al., , 1994; Tumbelaka,  2005). Kultur  merupakan gold  standard dalam menegakkan diagnosis demam tifoid (Karsinah et al., , 1994). Kultur darah dengan hasil biakan yang positif memastikan demam tifoid (Widodo D,  2009).  Biakan  darah  terhadap Salmonella juga  tergantung  dari  saat  pengambilan  pada perjalanan  penyakit.  Beberapa  peneliti melaporkan  biakan  darah  positif  40-80%  atau 70-90%  dari  pasien  pada  minggu  pertama sakit  dan  positif  10-50%  pada  akhir  minggu ketiga  (WHO,  2003;  Tumbelaka,    2005). Sensitivitasnya  akan  menurun  pada  sampel pasien yang telah mendapatkan antibiotika dan meningkat  sesuai  dengan  volume  darah  dan rasio  darah dengan media  kultur  yang  dipakai (Parry, 2002).
Kultur darah adalah salah satu prosedur yang  paling  sensitif  untuk  mendeteksi  bakteri dalam  darah.  Diagnosis  bakteremia  dengan menggunakan  kultur  darah  telah  dianggap sebagai  standar  emas  selama  bertahun-tahun (Shafazand & Weinacker 2002).
Pemeriksaan  kultur  mempunyai spesifisitas  yang  tinggi  tetapi  sensitivitasnya
rendah  dan  adanya    kendala  berupa  lamanya waktu  yang  dibutuhkan  (5-7  hari)  serta peralatan yang lebih canggih untuk identifikasi bakteri  sehingga  tidak  praktis (Pawitro, Noorvitry & Darmowandowo  2002; Tumbelaka 2005).  Tes  yang    ideal  untuk  suatu pemeriksaan  laboratorium  seharusnya  bersifat sensitif,  spesifik  dan  cepat  diketahui  hasilnya (Bakr et  al .,  2011).  Kegagalan  dalam  isolasi/ biakan  dapat  disebabkan  oleh  keterbatasan media  yang  digunakan  (WHO,  2003;  Wain et al ., 2001).
Modifikasi  media Triple  Sugar  Iron Agar ( TSIA )  yang  berupa  media  padat  dan Tryptic Soy  Broth ( TSB )  yang  berupa  media  cair diharapkan  dapat  meningkatkan  pertumbuhan bakteri.  Media  cair TSB mengandung  pepton kasein  dan  pepton  kedelai  yang  kaya  asam amino,  senyawa  nitrogen,  kalsium  dan  fosfor. Media  cair TSB ini  juga  diharapkan  dapat melisiskan sel fagosit. Media padat agar miring TSIA diharapkan  dapat  menampung pertumbuhan bakteri pada media cair sehingga pada  permukaan  media  padat  tumbuh  koloni karakteristik  yang  mudah  dideteksi  dan dilakukan  identifikasi.  Media  bifasik  ini diharapkan  dapat  lebih  cepat  mendeteksi pertumbuhan bakteri pada specimen darah.
Buffy  coat adalah  lapisan  tipis  di  bagian tengah  darah  yang  disentrifugasi.  Lapisan  ini berwarna  putih  abu-abu  dan  mengandung leukosit dan trombosit yang diapit oleh lapisan plasma  yang  ringan  dan  lapisan  eritrosit  yang lebih berat (Richmond et al ., 2002).
Pewarnaan  Gram  dari buffy  coat dapat digunakan  untuk  deteksi  awal  pasien bakteremia. Tes diagnostik yang cepat dengan pewarnaan  Gram  ini  dapat  di  interpretasikan dalam  waktu  satu  jam  dan  dalam  penelitian yang  telah  dilakukan  Richmond et  al. 2002, mempunyai  sensitifitas  75%  dan  spesifisitas 79%.
Penelitian  ini  dimaksudkan  untuk mempelajari  sensitifitas  dan  spesifisitas pewarnaan  Gram buffy  coat terhadap  kultur darah  menggunakan  media  bifasik  pada pasien  tersangka  demam.  Hasil  penelitian  ini diharapkan dapat diterapkan sebagai tes yang akurat untuk diagnosa demam.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  ini  merupakan  penelitian observasional  dengan  rancangan cross sectional  study .  Populasi  penelitian  ini  adalah pasien tersangka demam di RSUD Ratu Zale- cha Martapura bulan Maret-Mei 2013. Sampel penelitian  ini adalah  pasien  tersangka demam di RSUD Ratu Zalecha Martapura bulan Maret- Mei  2013  yang  diambil  secara purposive den- gan Kriteria inklusi Pasien Rumah Sakit Umum Daerah Ratu Zalecha Martapura, berumur ≥10 tahun,  memiliki  gejala  demam  ≥  5  hari, memiliki gejala sakit perut, bersedia mengikuti penelitian.  Kriteria eksklusi : Pasien menderita malaria,  pasien  menderita  demam  berdarah, pasien  yang  fisiknya  sangat  lemah.  Jumlah sampel sebanyak 27 pasien.
Penelitian  dilaksanakan  di  Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Analis Kesehatan Politek- nik Kesehatan Kemenkes Banjarmasin dan la- boratorium  RSUD  Ratu  Zalecha  Martapura pada bulan Maret-Juni 2013.

## Prosedur kultur darah media bifasik
Diambil  5  ml  darah    kemudian  di  inokulasikan pada  media  agar  bifasik  Inkubasi  suhu  37 o C selama  1-7  hari.  Positif  apabila  terlihat kekeruhan  dan  tumbuh  koloni  dengan karakteristik smooth ,  tidak  berwarna,  diameter 1-4  mm  dengan  atau  tanpa  H 2 S,  konfirmasi dengan  pemeriksaan  mikroskopis  pewarnaan Gram.  Identifikasi  dengan  uji  biokimia  dan  uji serologi.  Negatif  apabila  tidak  terjadi pertumbuhan setelah 7 hari.

## Prosedur pewarnaan Gram
Buat  sediaan  pada  objek  gelas, keringkan,  kemudian  rekatkan  (fiksasi)  3x  di atas  api  bunsen.  Tuangi  dengan  aquades biarkan selama 5 menit, buang larutan. Tuangi dengan  larutan  karbol-gentian-violet,  biarkan
selama 5 menit. Zat warna dibuang dan bubuhi dengan  larutan  mordant  (lugol),  diamkan selama kira-kira 1-3 menit. Lugol dibuang dan preparat  dicelupkan  ke  dalam  alkohol  96%, sampai  warna  gentian  violet  lepas  (sampai gentian  violet  tidak  ada  luntur  lagi).  Cuci dengan  air  kran  sampai  bersih,  kemudian bubuhi  dengan  cat-penutup  (counter  stain) larutan  water-fuchsin,  biarkan  kira-kira  1-2 menit.Cuci  dengan  air  kran,  keringkan  pada temperatur  kamar,  lihat  dengan  mikroskop memakai  lensa  rendam  minyak.  Gram positif  berwarna ungu. Gram negatif berwarna merah (Joubori S, 2006)
Hasil  mikroskopis  pewarnaan  Gram dianalisis dengan aplikasi epicalc .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian  ini  telah  dilakukan  pada  27 sampel  darah  dari  27  pasien di  RSUD  Ratu Zalecha  Martapura  pada  bulan  Maret  sampai dengan  Mei  2013.  Hasil  mikroskopis pewarnaan  Gram buffy  coat yaitu  ditemukan batang  Gram  negatif  sebanyak  7  (26%)  dan yang    tidak  ditemukan  batang  Gram  negatif sebanyak 20 (74%).
Hasil  kultur  penelitian  ini  terdapat pertumbuhan bakteri Gram negatif sebanyak 6 (22%)  dan  tidak  terdapat  pertumbuhan sebanyak  21  (78%),  hasil  yang  lebih  jelas dapat  dilihat  pada tabel  1.  Jenis  bakteri  Gram negatif yang tumbuh pada   darah agar  bifasik dapat dilihat pada tabel 2.
Hasil  uji  serologi  Widal  dapat  dilihat pada  tabel  3,  sedangkan  hasil  uji  serologi Widal  pasien  tersangka  demam  dengan  hasil kultur  darah  agar  bifasik  positif  dapat  dilihat pada  tabel  4.  Hasil  mikroskopis  pewarnaan Gram  dari buffy  coat dan  hasil  kultul  darah agar  bifasik  pasien  tersangka  demam  dapat dilihat pada tabel 5.
Tabel 1.  Hasil proporsi bakteri Gram negatif pada kultur darah agar bifasik pasien tersangka demam
Hasil kultur Jumlah (%) Kultur darah agar  bifasik Ada pertumbuhan 6 (22) Tidak ada pertumbuhan 21 (78)
Tabel 3.  Hasil uji serologi Widal pasien tersangka demam
Hasil Widal S.thypi Antigen O n (%) S.thypi Antigen H n (%) S.parathypi A Antigen O n (%) S.parathypi B Antigen O n (%) Negatif 6 (22) 9 (33) 13 (48) 10 (37) 1:80 7 (26) 3 (11) 8 (30) 7 (26) 1:160 5 (19) 9 (33) 3 (11) 3 (11) 1:320 9 (33) 6 (22) 3 (11) 7 (26)
Keterangan : Angka menunjukkan titer antibodi
Tabel 4  Hasil uji serologi Widal pasien tersangka demam dengan hasil kultur darah agar bifasik positif Jenis bakteri (no.sampel) S.thypi Antigen O (titer) S.thypi Antigen H (titer) S.parathypi A Antigen O (titer) S.parathypi B Antigen O (titer) E. coli , no sampel 8 1:320 1:320 1:320 1:320 Serratia sp, no sampel 12 1:80 1:80 1:160 - Klebsiella sp, no sampel 16 1:320 1:160 1:80 1:320 Pseudomonas sp, no sampel 18 1:80 - - 1:80 Serratia sp, no sampel 21 1:80 1:160 - - Klebsiella sp, no sampel 24 1:320 1:160 - 1:80 Keterangan : Angka menunjukkan titer antibodi Tabel 5.  Hasil mikroskopis pewarnaan Gram dari buffy coat dan hasil kultur darah agar bifasik pasien tersangka demam Pewarnaan Gram Kultur darah agar  bifasik Terdapat pertumbuhan bakteri Tidak terdapat pertumbuhan bakteri Total Ditemukan  bakteri Gram (-) 4 3 7 Tidak ditemukan bakteri Gram (-) 2 18 20 Total 6 21 27
Tabel 2.  Jenis bakteri Gram negatif hasil kultur darah agar  bifasik pasien tersangka demam Bakteri Jumlah isolat positif E.coli Serratia sp 1 2 Klebsiella. sp Pseudomonas . sp
2 1
Uji diagnostik dari data tersebut menghasilkan nilai  sensitifitas  sebesar  67%,    spesifisitas 86%,  nilai  duga  positif  57%,  dan    nilai  duga negatif 90%.
Hasil  Mikroskopis  Pewarnaan  Gram Buffy Coat Hasil mikroskopis pewarnaan Gram buffy coat dibanding  hasil  kultur  darah  agar  bifasik mempunyai  nilai  sensitifitas,  spesifisitas,  nilai duga positif, nilai duga negatif, secara berturut- turut  adalah  67%,  86%,  57%,  90%.  Hal  ini tidak  berbeda  jauh  dengan  penelitian  yang dilakukan  oleh  Richmond et  al. 2002,  yang mempunyai  sensitifitas  75%  dan  spesifisitas 79%,  nilai  duga  positif  43%  dan    nilai  duga negatif  94%.
Mikroskopis  pewarnaan  Gram buffy  coat dengan hasil negatif terdapat pada dua sampel dengan  hasil  kultur    positif,  konsentrasi  yang besar  dari  bakteri  dalam  sampel  diperlukan untuk  dapat  terlihat  dalam  pemeriksaan mikroskopis.  Konsentrasi  bakteri  dalam  darah yang dapat divisualisasikan harus mencapai > 4x10³  cfu/ml  (Richmond et  al. 2002).  Hasil positif dengan terlihatnya batang Gram negatif pada  pewarnaan  Gram  tetapi  tidak  diiringi dengan pertumbuhan koloni pada kultur dapat menandakan  ditemukannya  bakteri  yang  tidak viable (hidup) didalam preparat Gram.
Kegunaan  pewarnaan  Gram  dari buffy coat sebagai  alat  yang  cepat  dalam  mende- teksi  bakteremia  pada  pasien  dewasa  yang mengalami tanda dan gejala klinis sepsis telah dibuktikan  (Richmond et  al. 2002).  Metode pewarnaan  Gram  dari buffy  coat dan  kultur dengan  menggunakan  darah  perifer  yang ditampung  pada  tabung  hematokrit  kapiler, juga  telah  menghasilkan  prosedur  diagnosis dini  bayi  bakteremia  dan  septikemia  (Joubori S, 2006).

## Hasil Pemeriksaan Kultur
Hasil  penelitian  ini  tidak  ditemukan pertumbuhan Salmonella ,  tetapi  terdapat pertumbuhan bakteri Gram negatif lain yaitu E. Coli , pseudomonas. sp, Serratia .  sp  dan klebsiella sp.  Penelitian  yang  dilakukan  oleh Zulfikar  A.  Butta  (2006)  menemukan  bahwa kultur  darah  mempunyai  nilai  keberhasilan sebesar  40-80%.  Keberhasilan  memperoleh
isolat S.typhi dari  kultur  darah  widal  positif sebesar  10,74%  (Amarantini et  al. 2009). Penelitian  Damayanti et  al. pada  pasien  den- gan  hasil  widal  positif  dilakukan  kultur  darah sebanyak 136 sampel dengan hasil 60 sampel (44,1%)  kultur  darah  positif,  terdiri  dari  44 sampel (32,4%) positif Staphylococcus sp. dan 16 sampel (11,8%) positif bakteri batang Gram negatif  anggota  familia Enterobacteriaceae yaitu: Enterobacter  cloacae,  Salmonella  typhi, Serratia  marcescens,  Escherichia  coli, Salmonella ssp., Klebsiella ssp. (Damayanti S, et al., 2012). Hal ini menunjukkan adanya jenis bakteri lain selain Salmonella. typhi pada kultur darah widal positif.
Penelitian  yang  serupa  dilakukan  oleh Itah  dan  Uweh  (2005)  pada  100  pasien tersangka  demam,  ditemukan  bakteri  pada 39%  sampel  yaitu Staphylococcus  aureus, Escherichia  coli,  Streptococcus  faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae,  Proteus  vulgaris  dan  Salmonella typhi. Frekuensi  bakteri  yang  tertinggi  dalam sampel  darah  adalah Staphylococcus  aureus 35,9%  diikuti  oleh Escherichia  coli 15,4%, sedangkan pseudomonas  aerogenosa 11%, Klebsiella  pneumoniae 13  %  dan Salmonella typhi 10%  (itah  &  uweh,  2005).  Hal  ini menunjukkan kecilnya frekuensi ditemukannya Salmonella pada  pasien  tersangka  demam. Penelitian yang dilakukan ini menggunakan 27 sampel,  sehingga  terdapat  kemungkinan masih  belum  ditemukannya Salmonella ,  dan hanya  ditemukan  bakteri  Gram  negatif  lain yang  frekuensinya  lebih  tinggi  sesuai  dengan penelitian yang dilakukan Itah dan Uweh.
Daerah endemik memiliki  nilai keberhasilan  kultur  darah  yang  lebih  rendah, hal  ini  kemungkinan  karena  tingginya penggunaan  antibiotik  (Butta  ZA,  2006). Rekam  medik  Rumah  Sakit  Umum  Ratu Zalecha  mencatat  kasus  demam  pada  tahun 2011  sebanyak  2,6%  dan  tahun  2012 sebanyak  2,0%  dari  jumlah  pasien keseluruhan.  Tingginya  kasus  demam  ini  juga sesuai Informasi dokter poliklinik Rumah Sakit Umum  Ratu  Zalecha  Martapura    yang  juga menyatakan  bahwa  pasien  yang  berobat  ke Rumah  Sakit,  rata-rata  sebelumnya  telah melakukan pengobatan di puskesmas terdekat dan telah mengkonsumsi antibiotik. Hal ini juga
menjelaskan  hasil  negatif  pertumbuhan Salmonella pada penelitian.
Organisme  yang  ketika  terisolasi  dari kultur darah yang dianggap sebagai penyebab bakteremia  atau  fungemia  adalah  termasuk Staphylococcus  aureus,  Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli dan Enterobacteriaceae lainnya, Pseudomonas aeruginosa , dan Candida albicans (Hall K.K, & Lyman J.A., 2006). Penelitian ini menghasilkan pertumbuhan Enterobacteriaceae dan Pseudomonas sp dengan proporsi positif pada kultur darah bifasik 22%, sehingga bakteri hasil penelitian  ini  dianggap  benar-benar  sebagai bakteri  penyebab  bakteremia  pada  pasien tersangka demam.
E.coli dapat  masuk  kedalam  peredaran darah  dan  menyebabkan  sepsis, Klebsiella dapat  menyebabkan  infeksi  lokal  dan bakteremia  pada  pasien  yang  lemah. Serratia dapat  menyebabkan  bakteremia  terutama pada  pasien  yang  dirawat  di  rumah  sakit, Pseudomonas dapat  memasuki  aliran  darah dan menyebabkan sepsis yang fatal (Jawezt et al .,2010).  Bakteremia  dan  sepsis  yang disebabkan  bakteri-bakteri  tersebut  dapat menyebabkan  demam  seperti  pada  pasien demam,  sehingga  dalam  penelitian  ini didapatkan  hasil  ditemukan    bakteri  selain Salmonella.
Organisme  yang  ditemukan  mewakili kontaminasi  dalam  kultur  darah  menurut  Hall K.K,  &  Lyman  J.A.  (2006)  adalah    termasuk S t a p h y l o c o c c u s k o a g u l a s e - n e g a t i f , Corynebacterium sp, Bacillus sp selain Bacillus anthracis , Propionibacterium acnes, Micrococcus sp, Streptokokus  viridans, Enterococci ,  dan Clostridium  perfringens . Bakteri  yang  juga  ditemukan  sebagai kontaminan  pada  penelitian  ini  adalah S t a p h y l o c o c c u s k o a g u l a s e - n e g a t i f , Corynebacterium sp, Bacillus sp.
Kontaminasi  dapat  berasal  karena pengambilan  sampel  yang  tidak  steril,  pada penelitian  ini  pengambilan  sampel  pasien demam  tidak  dilakukan  langsung  oleh  Peneliti tetapi  dilakukan  oleh  analis  di  RSUD  Ratu Zalecha.  Kontaminasi  yang  ditemukan  pada kultur  darah  dengan  media  bifasik  sesuai dengan  penelitian  Parikh et  al., (2012)  juga
menyebutkan  kontaminasi  kultur  darah konvensional  dengan  menggunakan  media TSB  (7,0%)  lebih  banyak  dibandingkan  kultur dengan metode sentrifugasi lisis (0,5%).

## Hasil Uji Serologi Widal
Uji  Widal  dengan  hasil  negatif  palsu dapat  terjadi  jika  darah  yang  dikumpulkan terlalu awal stadium penyakit, karena itu, hasil negatif  tidak  mengesampingkan  demam  dan dapat    digunakan  sebagai  dasar  untuk  titrasi komparatif berikutnya. Hasil positif palsu dapat dikaitkan dengan pemberian imunisasi demam dan  adanya  reaksi  silang  antibodi  (Wain  & Hosoglu, 2008)
Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Benedikt Ley  (2010) juga  telah  melaporkan  adanya reaksi  silang  antibodi  pada  uji  widal  dengan bakteri Klebsiella sp dan Staphylococcus sp. Bakteri S.  typhi merupakan  bakteri batang  Gram  negatif  yang  komponen  selnya sama  dengan  bakteri  batang  gram  negatif yang  lain,  seperti E.  coli,  Ser.  marcescens , Enterobacter  cloacae , Klebsiella  pneumoniae (Damayanti  S, et  al .,  2012).  Lipopolisakarida merupakan  komponen  struktural  utama permukaan dari  membran  luar  bakteri  Gram- negatif,  dan  komponen  enterobacteria  terdiri dari  lipid  A,  daerah  inti  ( core  region ),  dan antigen  O  terdapat  dalam  banyak  bakteri. Reaktivitas  silang  antibodi  disebabkan  oleh epitop umum yang terletak di daerah inti ( inner core  region )  dari  LPS  ini  (Loennies,  et  al., 2003).

## KESIMPULAN
Hasil mikroskopis pewarnaan Gram buffy coat dibanding  hasil  kultur  darah  agar  bifasik mempunyai  nilai  sensitifitas  67%  dan spesifisitas 86%.

## DAFTAR PUSTAKA
Alfred  Young  Itah  and  Edet  Ekpo  Uweh. (2005).  ‘Bacteria  isolated  from  blood, stool  and  urine  of  typhoid  patients  in  a developing  country’. Southeast  Asian  J Trop  Med  Public  Health ,  Vol  36,  No.  3, pp. 673-677.
Amarantini,  C.,  W.  Asmara,  H.  Kushadiwijaya &  L.  Sembiring.  (2009).  ‘Seleksi  Bakteri Salmonella  typhi dari  Kultur  Darah Penderita  Demam  Tifoid’. Prosiding Seminar  Nasional  Penelitian,  Pendidikan dan  Penerapan  MIPA .  Fakultas  MIPA. Universitas  Negeri  Yogyakarta.  ISBN: 978-979-96880
Ashkenazy,  S.,  Cleary,  TG.  (2000). Infeksi Salmonella ..  Dalam:  Wahab,  AS, penyunting. Ilmu kesehatan anak nelson , EGC, Vol.II. Edisi.15, Jakarta Bakr,  WM.,  Attar,  LA.,  Ashour,  MS.,  Toukhy, AM.  (2011).  ‘The  dilemma  of  widal  test- which  brand  to  use?  A  study  of  four different  widal  brand:  a  cross  sectional comparative  study’. Ann    clin  microb , Vol.10. No.7 Bearman,  GM.,  Wenzel,  RP.  (2005). Bacteremias:  a  leading  cause  of  death. Arch Med Res, Vol. 36, pp. 646-659 Benedikt  Ley,  George  Mtove,  Kamala  Thrie- mer, Ben Amos, Lorenz von Seidlein, Ilse Hendriksen, Abraham Mwambuli, Aikande Shoo,  Rajabu  Malahiyo,  Shaali  M  Ame, Deok  R  Kim,  Leon  R  Ochiai,  John  D Clemens,  Hugh  Reyburn,  Harald  Wilfing, Stephen Magesa and Jacqueline L Deen. (2010).  ‘Evaluation  of  the  Widal  tube agglutination  test  for  the  diagnosis  of typhoid  fever  among  children  admitted  to a  rural  hdospital  in  Tanzania  and  a comparison  with  previous  studies’, BMC Infectious Diseases , Vol.10, No.180
Bergey,  David,  H.,  John,  G.,  Holt,  Noel,  R., Krieg,  Peter,  H.A.,  Sneath.  (1994). Bergey's  manual  of  determinative bacteriology . Edisi. 9th CDC. (2010). Thypoid fever , national center for emerging  and  zoonotic  infectious  dis- eases,  USA,  http://www.cdc.gov/nczved/ divisions/dfbmd/diseases/typhoid_fever/
Choo,  KE.,  Lim, WY.,  Razif,  AR.,  Ariffin, WA. , Oppenheimer,  SJ.,  Abraham,  T.  (1992). Usefulness of the Widal test in childhood typhoid  fever .  Dalam  :  Pang  T,  Koh  CL,
Puthucheary  SD,  Eds.  Typhoid  Fever  : Strategies for the 90’s. Singapore : World Scientific. pp 200.
Departemen  Kesehatan  Republik  Indonesia.
(2008). Profil  kesehatan  Indonesia ,
Jakarta.
Gura,  KM.,  (2004).  Incidence  and  nature  of epidemic  nosocomial  infections. J  Infus Nurs Vol. 27. pp. 175-180 Haque,  A.,  Ahmed,  J.,  Qureshi,  JA.  (1999), ‘Early detection of typhoid by polymerase chain  reaction’, Ann Saudi Med, Vol. 19, No.4, pp. 337-40
Harshal, R., Parikh, Anuradha, S., De, Sujata, M.,  Baveja.  (2012).  ‘Comparison  of  the lysis  centrifugation  method  with  the conventional  blood  culture  method  in cases of sepsis in a tertiary care hospita’l, Journal  of  Laboratory  Physicians ,  Vol.  4, No. 2, pp. 89-93 Jawetz,  Melnick,  Adelberg’s.  (2010), Medical Mikrobiology .
John Wain, Salih Hosoglu. (2008).’ The labora- tory  diagnosis  of  enteric  fever’, J  Infect Developing  Countries ,  Vol.  2,  No.6,  pp. 421-425
Karsinah,  Suharto,  W.  Mardiastuti,  M.  Lucky. (1994). Batang negatif gram .  Dalam: Staf Pengajar  FK  UI,  penyunting,  Buku  ajar mikrobiologi  kedokteran,  Edisi  Revisi, Bina Rupa Aksara, Jakarta, pp.168-73,. Kung,  H.,  Hoyert,  DL.,  Xu,  J.,  Murphy,  SL. (2008).  Deaths  data  for  2005, Natl  Vital Stat Rep, Vol. 56, pp. 1-121.
Massi, MN., Shirakawa, T., Gotoh, A., Bishnu, A.,  Hatta,  M.,  Kawabata,  M.  (2003), ‘Rapid diagnosis of typhoid fever by PCR assay  using  one  pair  of  primers  from flagellin  gene  of Salmonella  typhi ’, J Infect Chemother , Vol.9, No.3, pp 233-7. Mette  Sogaard.  Mette  Norgaard.  Claus Dethlefsen.  and  Henrik  Carl  Schonhey- der . (2013). ‘ Temporal changes in the in- cidence  and  30-day  mortality  associated with  bacteremia  in  hospitalized  patients from  1992  through  2006:  a  population- based  cohort  study’, Oxford  Journals Clinical  Infectious  Diseases ,  Vol.  52,  No. 1, pp. 61-69.
Muliawan,  SY.,  Surjawidjaya,  JE.  (1999). Diagnosis  dini  demam  tifoid  dengan menggunakan  protein  membran  luar  S. Typhi sebagai antigen spesifik .  CDK,  pp. 11-3.
Odetola,  FO.,  Moler,  FW.,  Dechert,  RE., VanDerElzen,  K.,  Chenoweth,  C.  (2003). Nosocomial  catheter-related  bloodstream infections  in  a  pediatric  intensive  care unit:  risk  and  rates  associated  with various  intravascular  technologies. Pediatr  Crit  Care  Med ,  Vol.  4,  pp.  432- 436 Parry, CM. (2002). Typhoid fever . N Engl J Med, Vol. 347, No. 22 Patrick,  R.,  Murray,  Ellen  jabaron,  James,  H., Jorgensen, Marie Louise Landry, Michael, A.,  Praller.  (2007). Manual  of  clinical microbiology  9 th Edition ,  ASM  press, American  Socielity  for  Microbiology, Washington DC Pawitro,  UE.,  Noorvitry,  M.,  Darmowandowo,
W.  (2002). Demam  tifoid .  Dalam  : Soegijanto  S,  Ed. Ilmu  penyakit  anak  : diagnosa dan penatalaksanaan , Salemba Medika, edisi.1, pp.1-43, Jakarta.
Richmond,  C.,  Reyes.,  M.D.,  Emmanuel Edwin,  R.,  Dy,  M.D.,  and  Shirley Cresswell,  HCLD.  (2002). ‘ The  utility  of buffy coat Gram stain for the detection of bacteremia in patients with sepsis’ ,  Phil J Microbiol  Infect  Dis ,  Vol.    31,  No.  2,  pp. 70-73
Sabiha  al-  joubori.  (2006).  ‘Buffy  coat  smear and  culture:  An  early  diagnostic procedure  in  bacteremic  and  septicemia Pediatric  Patients’, Mustansiriya  Medical Journal , Vol. 6, No . 1, pp. 7-14 Segal,  G.S.,  Chamberlain,  J.M.  (2000).
Resource  utilization  and  contaminated blood cultures in children at risk for occult bacteremia. Arch  Pediatr  Adolesc  Med , Vol. 154, pp. 469-473
Shafazand,  S., Weinacker,  A.B.  (2002).  Blood cultures in the critical care unit: improving utilization  and  yield. Chest ,  Vol.122, pp.1727-1736
Sharon,  M., Tennant, Mary,  A.,  Boyd,  Deanna Toema, Johan Melendez, Yongxia Zhang, James, E., Galen, Chris, D., Geddes  and Myron, M., Levine. (2013). ‘New diagnos- tic approaches to detect  Salmonella spp. in blood’, 8th International Conference on Typhoid Fever and Other Invasive Salmo-
nellose, Speaker abstracts , Dhaka, Bang- ladesh.
Skogberg,  K.,  Lyytikäinen,  O.,  Ruutu,  P., Ollgren,  J.,  Nuorti,  J.P.  (2008),  ‘Increase in bloodstream infections in Finland 1995
–2002’, Epidemiol Infect , Vol. 136, pp.108 -114.
Sogaard,  M.,  Norgaard,  M.,  Schonheyder,  H.
(2007). ‘First notification of positive blood cultures: high accuracy of the Gram stain report (Epub ahead of publication)’. J Clin Microbiol, Vol. 45, No.4, pp. 1113-7. Sri  Darmawati,  Langkah  Sembiring,  Widya Asmara,  Wayan,  T.,  Artama.  (2012). ‘Keanekaragaman  spesies  bakteri  pada kultur  darah  widal  positif  asal  kota Semarang  berdasarkan  karakter  feno- tipik’.  Seminar  Nasional  ix  Pendidikan Biologi FKIP UNS, pp 496-501 Stanley  Lemeshow,  David,  W.,  Hosmer,  Jr., Jenelle  Klar  and  Stephan,  K.,  Lwanga. (1990). Adequacy  of  sample  size  in health studies , WHO
Sven  Müller-Loennies,  Lore  Brade,  C.,  Roger MacKenzie,  Franco,  E.,  Di  Padova. (2003).  ‘Helmut  Brade, Identification  of  a Cross-reactive Epitope Widely Present in Lipopolysaccharide  from  Enterobacteria and  Recognized  by  the  Cross-protective Monoclonal  Antibody  WN1  222-5’. Journal of Biological Chemistry, No. 278, pp. 25618-25627 Tumbelaka,  A.R.,  (2005). Tata  laksana  terkini demam  tifoid  pada  anak .  Simposium Infeksi–Pediatri  Tropik  dan  Gawat Darurat  pada  Anak.  IDAI  Cabang  Jawa Timur.  Malang,  IDAI  Jawa  Timur,  pp.37- 50.
Uslan,  D.Z.,  Crane,  S.J.,  Steckelberg,  J.M. (2007).’ Age–  sex-associated  trends  in bloodstream infection: a population-based study  in  Olmsted  County,  Minnesota’, Arch Intern Med, Vol.167, pp.834-839. Wain, J., Bay, PVB., Vinh, H., Duong, N.M., Diep, T.S., Walsh, A.L., et al. (2001). ‘Quantitation of bacteria in bone marrow from patients with typhoid fever : relationship between counts and clinical features’, J Clin Microbiol , Vol. 39, No. 4, pp. 1571-6.