Juni 2022, Vol. 9 No. 1: 57 – 65
pISSN : 2355-9942, eISSN:2656-792X
Terakreditasi Nasional, Dirjen Pendidikan Tinggi, Riset, dan Teknologi
Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Riset dan Teknologi RI
S.K. No. 105/E/KPT/2022 Received: 10 Agustus 2021, Accepted: 11 Juni 2022 Published online: 30 Juni 2022
Doi: https://doi.org/10.35508/nukleus.v9i1.4988 https://ejurnal.undana.ac.id/index.php/nukleus/article/view/4988

## PENGARUH PERBEDAAN WAKTU EKUILIBRASI TERHADAP KUALITAS SEMEN BEKU BABI LANDRACE DALAM PENGENCER DURASPERM MODIFIKASI DENGAN AIR BUAH LONTAR
(Effect of different equilibration time on the quality of landrace boar frozen semen on modification diluent durasperm with palmyra juice)
Maria G. Mega * , Wilmientje M. Nalley, Aloysius Marawali, Henederiana L. L. Belli Program Studi Peternakan, Fakultas Peternakan, Kelautan, dan Perikanan, Universitas Nusa Cendana Jln. Adisucipto, Penfui, Kupang, Nusa Tenggara Timur, Indonesia 850001
* Correspondent author, email : rastimega1999@gmail.com

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menguji  pengaruh  lama  waktu  ekuilibrasi  terhadap  kualitas  spermatozoa  dan mendapatkan waktu ekuilibrasi yang optimal dalam proses kriopreservasi semen babi landrace. Semen diperoleh dari seekor babi landrace berumur 2-3 tahun  yang dikoleksi  menggunakan teknik glove gland  method. Semen dievaluasi  secara  mikroskopis  dan  makroskopis.  Semen  berkualitas  baik  diencerkan  dalam  pengencer  dasar, selanjutnya  di  holding  time  selama  dua  jam  pada  suhu  27-28oC.  Semen  kemudian  disentrifugasi  2000  rpm selama  15  menit,  supernatan  dibuang  dan  pellet  diencerkan  kembali  dalam  pengencer  dasar  dengan perbandingan 1:1. Kemudian, semen diencerkan dengan pengencer perlakuan yaitu durasperm modifikasi + 6% laktosa + 4% gliserol dengan konsentrasi 500 x  106/0,5 mL. Selanjutnya, semen dikemas dalam straw 0,5 ml, kemudian  di  ekuilibrasi  pada  suhu  3-5oC  sesuai  perlakuan,  yakni  perlakuan  1  jam  ekuilibrasi  (P1),  2  jam ekuilibrasi (P2) dan 3 jam ekuilibrasi (P3).  Setelah ekuilibrasi, straw dibekukan 5 cm di atas permukaan N2 cair selama 10 menit pada suhu ±-110 oC dan simpan dalam container N2 cair -196oC. Untuk menguji semen beku dilakukan dengan cara tempatkan semen beku pada suhu 37oC selama 30 detik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa  kualitas  spermatozoa  yang  tertinggi  (P<0,05)  terdapat  pada  P2  dan  P3  bila  dibandingkan  dengan  P1 (P>0,05), dengan nilai motilitas P2 : 28,13±2,39%; P3 : 25,00±4,08%; dan P1 18,15±3,23%. Dapat disimpulkan bahwa  waktu  ekuilibrasi  2  jam  dan  3  jam  mampu  mempertahankan  kualitas  semen  beku  babi  landrace  dan secara statistik tidak berbeda nyata.
Kata-kata kunci: kriopreservasi, ekuilibrasi, semen, babi landrace

## ABSTRACT
An experiment was carried out to recognize the effect of long equilibration time on the quality of spermatozoa and  to  obtain  optimal  equilibration  time  in  the  process  cryopreservation  of  landrace  pig  semen.  Semen  was obtained  from  a  landrace  boar  aged  2-3  years  using  glove  hand  method.  The  semen  was  than  evaluated macroscopically and microscopically, good quality semen was diluted in a basic diluent, than kept for two hours at a temperature of 27-28oC. The semen were then centrifuged at 2000 rpm for 15 minutes, the supernatant was discarced  and  the  pellets  was  re-diluted  into  basic  diluent  with  a  ratio  of  1:1.  Then,  semen  was  diluted  in treatment diluent with modified durasperm + 6% lactose + 4% glycerol  with a concentration of 500 x 106/0.5 mL.  Furthermore,  the  semen  was  packaged  in  0.5  ml  straws,  then  equilibrated  at  a  temperature  of  3-5oC appropriate  to  treatment,  with  1  hour  equilibration  (T1),  2  hours  equilibration  (T2)  and  3  hours  equilibration (T3). After equilibration, the straws was frozen horizontally 5 cm above the liquid N2 vapor for 10 minutes at a temperature of ± -110oC and then stored in a liquid N2 container  (-196oC). To test frozen semen, it was done by stored frozen semen at 37oC for 30 seconds. The results showed that the highest quality of spermatozoa (P <0.05) was found in T2 and T3 when compared to T1 (P> 0.05), with the motility value was T2: 28.13 ± 2.39%; T3: 25.00 ± 4.08%; and T1 18,15±3,23%. It can be concluded that 2 hours and 3 hours equilibration time was able to maintain the quality of frozen semen landrace boars and the statistically was not significant.
Keywords: cryopreservation, equilibration, semen, landrace pig

## PENDAHULUAN
Kriopreservasi  semen  merupakan  salah satu  teknologi  di  bidang  reproduksi,  yang bertujuan  untuk  memaksimalkan  pemanfaatan pejantan  unggul.  Namun,  kualitas  semen  pasca pembekuan  masih  rendah,  hal  ini  disebabkan karena  sperma  babi  sangat  rentan  mengalami cold  shock  saat  dipaparkan  pada  suhu  rendah, sehingga  mengakibatkan  terjadinya  kerusakan membran sperma bahkan menyebabkan kematian  spermatozoa.  Penyebab  utama  adalah karena, komposisi membran plasma spermatozoa  babi  lebih  tinggi  dibandingkan dengan ternak sapi, dimana persentase phosphatidylethanolamine
24% dan
sphingomyelin  14%,  sedangkan  spermatozoa sapi  hanya  memiliki  phosphatidylethanolamine 9,7%  dan  sphingomyelin  11,5%  (White,  1993). Untuk meminimalisir bahkan mencegah kerusakan membran spermatozoa saat pembekuan,  dibutuhkan  krioprotektan  untuk meningkatkan motilitas post thawing spermatozoa babi.
Krioprotektan  merupakan  suatu  zat  kimia non  elektronik  yang  berfungsi  mereduksi kematian  spermatozoa  pada  proses  pembekuan, baik  yang  berupa  efek  larutan  maupun pembentukan  kristal  es  ekstraseluler  dan intraseluler. Krioprotektan yang biasa digunakan adalah  gliserol  dan  beberapa  jenis  gula  seperti glukosa,  sukrosa,  maltosa,  laktosa  dan  rafinosa. Laktosa merupakan gula disakarida yang efektif dalam menurunkan suhu pembentukan kristal es, dapat mengurangi toksisitas kimia dan
mencegah  pemasukan  air  yang  berlebihan kedalam  sel  (Herdis et  al .,  2005).  Menurut Bebas  dan  Gorda  (2020),  konsentrasi  gliserol 4% dapat mempertahankan kualitas semen beku babi dengan nilai motilitas pasca thawing adalah 42,60±1,34%.
Waktu  ekuilibrasi  merupakan  salah  satu metode  yang  ikut  memengaruhi  kualitas  semen beku. Menurut Bearden et al . (2004), ekuilibrasi merupakan waktu yang dibutuhkan spermatozoa untuk  menyesuaikan  diri  dengan  pengencer sebelum  proses  pembekuan  atau  waktu  yang dibutuhkan krioprotektan untuk mencapai keseimbangan pada kedua sisi membran plasma, sehingga  tingkat  kematian  spermatozoa  dapat diminimalisir  dan  dapat  dicegah.  Waktu ekuilibrasi  2  jam  pada  suhu  4-5oC  mampu mempertahankan  kualitas  semen  beku  babi dibandingkan  pada  ekuilibrasi  4  jam  (Passarelli et  al .  2020),  dengan  motilitas  pasca  thawing yang dihasilkan adalah 26,16±1,54%. Sedangkan  pada  sapi  membutuhkan  waktu ekuilibrasi  4  jam  dengan  nilai  motilitas  pasca thawing yang diperoleh 65,10±4,26% (Arifiantini dan Yusuf, 2010).
Tujuan  penelitian  ini  adalah  menguji pengaruh  perbedaan  waktu  ekuilibrasi  terhadap kualitas  semen  beku  babi  landrace  dalam pengencer  durasperm  modifikasi  dengan  air buah lontar serta mendapatkan waktu ekuilibrasi yang optimal dalam proses kriopreservasi semen babi landrace.

## METODE PENELITIAN

## Persiapan Pengencer Dasar Modifikasi
Durasperm sebanyak 47,51 gram
dilarutkan  dalam  1000  mL  aquabidest  dan dihomogen  menggunakan  stirrer  pada  spinbar. Sebanyak 80 mL pengencer durasperm dicampur dengan 20 mL kuning telur, kemudian ditambahkan dengan 6 mL air buah lontar dalam 94  mL  pengencer  durasperm  kuning  telur. Selanjutnya  tambahkan  antibiotik  penicillin  0,5 mL dan streptomycin 0,4 m.

## Persiapan Pengencer Penelitian
Laktosa  sebanyak  0,06  gram  (6%), dilarutkan  dengan  100  mL  pengencer  dasar modifikasi.  Kemudian  ditambahkan  4%  gliserol
dalam  96  mL  pengencer  dasar  modifikasi  dan laktosa.

## Koleksi Semen dan Evaluasi Semen Segar
Penampungan  semen  dilakukan  dengan metode  glove  hand  menggunakan  dummy  sow yang  diperoleh  dari  seekor  babi  landrace berumur  2-3  tahun.  Semen  hasil  penampungan langsung  dibawa  ke  laboratorium  kemudian dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis. Evaluasi  makroskopis  meliputi  volume,  warna, konsistensi  dan  pH.  Pengamatan  mikroskopis meliputi: motilitas spermatozoa yang merupakan spermatozoa yang bergerak progresif, penilaiannya  0%  sampai  100%  dengan  skala 5%. Konsentrasi spermatozoa dihitung
menggunakan  haemocytometer  dengan  cara menghitung jumlah spermatozoa dalam 5 kamar kecil kemudian dikali 106. Viabilitas spermatozoa dihitung menggunakan zat pewarna differensial  eosin-nigrosin.  Spermatozoa  yang hidup  tidak  berwarna,  sedangkan  yang  mati ditandai  berwarna  merah  pada  bagian  kepala. Penilaian  abnormalitas  spermatozoa  ditandai dengan  morfologi  spermatozoa  tidak  normal baik  abnormalitas  primer  maupun  sekunder. Membran  plasma  utuh  dievaluasi  dengan metode  hypoosmotic  swelling  (HOS)  test kemudian dievaluasi dengan pengamatan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 10 x 40.

## Pengenceran Semen
Semen  hasil  koleksi  diencerkan  dalam  4 tabung  yang  berisi  pengencer  dasar  modifikasi dengan  perbandingan  1:1,  dilakukan  secara perlahan-lahan  melewati  dinding  tabung  berisi larutan  pengencer,  kemudian  tabung  diputar secara  perlahan  agar  pengencer  dan  semen tercampur  homogen.  Selanjutnya  dilakukan holding  time  pada  suhu  27-28oC  selama  dua jam. Setelah itu, disentrifugasi dengan kecepatan 2000  rpm  selama  15  menit,  supernatan  dibuang dan pellet diencerkan kembali dengan perbandingan 1:1 menggunakan pengencer dasar modifikasi.  Selanjutnya  semen  diencerkan dalam  pengencer  penelitian  yang  mengandung gliserol dan laktosa dengan konsentrasi spermatozoa  500  x  106/0,5  mL.  Semen  yang telah  diencerkan  dalam  pengencer  penelitian, selanjutnya  dikemas  dalam  straw  0,5  mL kemudian diberi kode.
Ekuilibrasi, Pembekuan dan Pencairan Kembali
Straw yang telah dikemas dalam straw 0,5 mL  dan  telah  diberi  kode,  selanjutnya  disusun dalam  rak  pembekuan  untuk  di  ekuilibrasi  pada suhu  3-5oC  selama  1,  2  dan  3  jam  sesuai perlakuan,  yaitu  perlakuan  1  jam  ekuilibrasi
(P1), 2 jam ekuilibrasi (P2) dan 3 jam ekuilibrasi (P3).  Setelah  straw  yang  berisi  semen  telah  di ekuilibrasi  sesuai  perlakuan,  straw  langsung ditempatkan  di  atas  permukaan  uap  N2  cair dengan jarak 5 cm selama 10 menit pada suhu ±- 110oC.  Setelah  10  menit,  straw  dicelupkan kedalam  N2  cair.  Kemudian  straw  disimpan dalam  kontainer  N2  cair  pada  suhu  -196oC hingga dilakukan evaluasi lebih lanjut. Pengujian  kualitas  semen  setelah  pembekuan dilakukan  dengan  cara  dicairkan  dalam  water bath  yang  berisi  air  bersuhu  37oC  selama  30 detik.

## Variabel Penelitian
Variabel  yang  diteliti  dilakukan  pada setiap  tahap  yaitu  pasca  pengenceran,  pasca ekuilibrasi  dan  pasca thawing  yang  meliputi:  1) Motilitas spermatozoa ditentukan secara subjektif  kuantitatif  dengan  membandingkan spermatozoa motil bergerak kedepan (progresif) dan  tidak  progresif  pada  lima  lapang  pandang. Penilaiannya  terhitung  antara  0%  sampai  100% dengan  skala  5%.  2)  Viabilitas  spermatozoa dihitung  minimal  200  sel  dari  10  lapang pandang.  Rumus  perhitungan  viabilitas  = (jumlah spermatozoa  hidup  : total  spermatozoa) x 100 %. 3) Abnormalitas spermatozoa dihitung dengan  rumus  =  (spermatozoa  abnormal  :  total spermatozoa) x 100%. 4) Membran plasma utuh dievaluasi dengan metode hypoosmotic swelling (HOS)  test.  Spermatozoa  yang  memiliki membran  plasma  utuh  ditandai  ekor  melingkar atau  menggelembung,  sedangkan  yang  rusak ditandai  ekor  lurus.  5)  Recovery  rate  adalah kemampuan  pemulihan  spermatozoa  setelah pembekuan, dengan rumus = (spermatozoa motil setelah  thawing  :  spermatozoa  motil  semen segar) x 100%.

## Analisis Data
Data  dianalisis  menggunakan  analysis  of variance  (ANOVA),  dilanjutkan  dengan  Uji Duncan menggunakan software SPSS 20.0.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik Semen
Volume  semen  yang  diperoleh  adalah 109,5±2,52 mL, berwarna putih susu, konsistensinya  encer  dengan  pH  6,63±0,15, yang secara rinci tertera pada Tabel 1.
Hasil  ini  berbeda  dari  hasil  yang dilakukan  oleh  Garner  dan  Hafez  (2000),  yang menghasilkan  volume  semen  200-250  mL;
(Bebas  dan  Gorda,  2020)  melaporkan  volume 180  mL;  dan  (Banamtuan et  al .  2021), melaporkan volume 101,75±20,46 mL. Perbedaan  rataan  volume  semen  dari  berbagai penelitian  disebabkan  karena  jenis  ternak,  usia, berat  badan,  frekuensi  pengambilan  semen, lingkungan  dan  metode  koleksi semen  (Sangma et  al .,  2020).  Hasil  ini  juga  tidak  berbeda  jauh
dengan laporan Yusuf et al . (2017), yakni semen berwarna  putih-krem  dengan  konsistensi  encer dan  pH  6,72±0,10;  ;  menurut  Banamtuan et  al . (2021),  semen  yang  dihasilkan  berwarna  putih- krem,  konsistensi  encer  dan  pH  6,8;  dan  Knox (2011),  melaporkan  semen  berwarna  putih  susu dengan  konsistensi  encer;  Gadea  (2003)  pH 7,4±0,2.  Kualitas  semen  segar  yang  diperoleh adalah  motilitas  70,00%,  viabilitas  85,82± 4,45%, abnormalitas 3,46±0,33% dan konsentrasi  270,25±60,83  x  106/mL.  Hasil  ini tergolong  normal,  karena  standar  karakteristik
semen adalah motilitas ≥ 60% dan abnormalitas ≤15%  (Knox,  2011),  viabilitas  ≥80  (Gadea, 2003)  dan  konsentrasi  150  –  300  x  106/mL (Garner  dan  Hafez,  2000).  Hasil  ini  tidak berbeda jauh dari yang dilaporkan Kaka (2020), dimana  motilitas  71,67±5,16%  dan  viabilitas 79,19±5,85, namun lebih tinggi nilai abnormalitas  10,67±3,27%  dan  lebih  rendah nilai  konsentrasi  256,33±18,99  x  106/mL. Sedikit lebih tinggi dari hasil penelitian (Foeh et al . 2019), motilitas 80% dan viabilitas 93±0,7% dan abnormalitasnya 3,5±1,19%.
Tabel 1. Karakteristik semen segar babi landrace
Variabel Rataan ± standard deviasi Volume (mL) 109,5 ± 2,52 Warna Putih susu Konsistensi Encer pH 6,36 ± 0,15 Motilitas (%) 70,00 ± 0,00 Viabilitas (%) 85,82 ± 4,45 Abnormalitas (%) 3,46 ± 0,33 Konsentrasi (10 6 sel/mL) 270,25 ± 60,83 Membran plasma utuh (%) 86,65 ± 4,22 Perbedaan  karakteristik  semen  segar  babi landrace pada setiap penelitian sangat dipengaruhi  oleh  bangsa,  umur,  tingkat  libido, frekuensi  ejakulasi  dan  lingkungan  (Johnson et al ., 2000). Sedangkan nilai konsentrasi spermatozoa  salah  satunya  dipengaruhi  oleh ukuran  lingkar  skrotum,  semakin  besar  ukuran skrotum  maka  semakin  meningkat  konsentrasi spermatozoa karena besarnya kandungan hormon  testosteron  yang  berperan  merangsang proses spermatogenesis (Saputra et al ., 2017). Nilai membran plasma utuh yang diperoleh  adalah  86,65  ±  4,22%,  hasil  ini  tidak berbeda jauh dari penelitian yang dilakukan oleh Sangma et  al .  (2020),  yang  melaporkan  nilai MPU  81,74±0,45%  dan  sedikit lebih  tinggi  dari yang  dilaporkan  oleh  Banamtuan et  al .  (2021),
yakni  90,79±2,79%.  Perbedaan  nilai  membran plasma utuh dipengaruhi bangsa, pola pemeliharaan  dan  kandungan  pengencer  (Lubis et al ., 2013).

## Pengaruh  Perlakuan  terhadap  Motilitas Semen Beku Babi Landrace
Berdasarkan  hasil  analisis,  perbedaan waktu  ekuilibrasi  berpengaruh  tidak  nyata (P>0,05)  terhadap  kualitas  semen  babi  landrace pasca pengenceran dan pasca ekuilibrasi. Hal ini diduga  karena  pengencer  yang  digunakan termasuk  kategori  baik  untuk  mempertahankan kualitas semen babi landrace pasca pengenceran dan  pasca  ekuilibrasi  sehingga  spermatozoa belum mengalami cold shock.
Tabel 2. Motilitas spermatozoa babi landrace
Tahapan pengamatan semen Waktu ekuilibrasi P1 P2 P3 Pasca pengenceran 70,00 ± 0,00 a 70,00 ± 0,00 a 70,00 ± 0,00 a Pasca ekuilibrasi 65,63 ± 3,75 a 62,50 ± 0,00 a 65,63 ± 2,39 a Pasca thawing 18,75 ± 3,23 a 28,13 ± 2,39 b 25,00 ± 4,08 b
Superskrip yang sama pada baris yang sama menunjukkan perbedaan yang tidak nyata antar perlakuan (P>0,05), P1 : 1 jam ekuilibrasi, P2 : 2 jam ekuilibrasi dan P3 : 3 jam ekuilibrasi
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa, perbedaan waktu ekuilibrasi berpengaruh  nyata  (P<0,05)  terhadap  motilitas pasca thawing  spermatozoa  babi landrace.  Nilai motilitas tertinggi terdapat pada P2 28,13±2,39%  dan  P3  25,00±4,08%  pasca thawing  (P<0,05)  sedangkan  nilai  motilitas terendah  terdapat  pada  P1  18,75  ±  3,23 (P>0,05).  Namun,  hasil  ini  masih  belum memenuhi  standar  nasional  Indonesia  (SNI), yakni  nilai  motilitas  pasca  thawing  minimal mencapai  40%.  Hasil  penelitian  ini  pula  lebih rendah dari penelitian yang dilakukan Bebas dan Gorda  (2020),  yang  menghasilkan  motilitas 42,60  ±  1,34%  pasca  thawing  dengan  waktu ekuilibrasi 2 jam, namun tidak berbeda jauh dari yang  laporkan  oleh  Yusuf et  al .  (2017),  bahwa nilai motilitas pasca thawing yang di ekuilibrasi selama  2  jam  menghasilkan  21,67±7,53%- 30,00±4,47%  dan  (Passarelli et  al .    (2020), menghasilkan  26,16±1,54%.  Hal  ini  diduga karena  perbedaan  penggunaan  bahan  pengencer pada  setiap  penelitian,  sehingga  menghasilkan motilitas pasca thawing yang berbeda. Pernyataan ini didukung oleh Solihati dan Kune (2009),  yang  menyatakan  bahwa  setiap  bahan pengencer  memiliki  kemampuan  yang  berbeda dalam  mempertahankan  kualitas  spermatozoa dari bangsa ternak yang sama atau berbeda.
Rataan  nilai  motilitas  hasil  penelitian tertinggi  yang  terdapat  pada  perlakuan  P2  dan P3  pasca  thawing  (P<0,05),  diduga  karena konsentrasi gliserol sudah berdifusi kedalam sel spermatozoa secara sempurna sehingga tercapainya  keseimbangan  konsentrasi  elektrolit intra  dan  ekstra  sel.  Hal  ini  juga  didukung dengan  peranan  dari  laktosa  yang  ditambahkan sebagai  kombinasi  pengencer  yang  berperan sebagai  sumber  energi  bagi  spermatozoa  serta dapat  menjaga  tekanan  osmotik  dan  membantu mengeluarkan  air  yang  berlebihan  dalam  sel sehingga  terjadinya  cold  shock,  pembengkakan sel dan pembentukan kristal sel dapat terhindari.
Menurut  Azizah  dan  Arifiantini  (2009), pengontrolan  waktu  ekuilibrasi  selama  proses kriopreservasi semen berfungsi untuk memberikan  kesempatan  pada  gliserol  agar dapat  masuk  kedalam  sel  spermatozoa  untuk mengikat  sebagian  air  bebas,  sehingga  dapat mencegah  pembentukan  kristal-kristal  es  dalam medium pengencer selama proses kriopreservasi serta  dapat  mencegah  terjadinya  dehidrasi  pada spermatozoa.
Rendahnya  nilai  motilitas  spermatozoa pada  P1  diduga  karena  waktu  ekuilibrasi  yang
relatif singkat, sehingga penyesuaian spermatozoa  dengan  pengencer  belum  tercipta secara  optimal  serta  gliserol  belum  penetrasi secara  sempurna  kedalam  sel  spermatozoa. Kondisi  ini  mengakibatkan  spermatozoa  mudah mengalami  cold  shock.  Efek  cold  shock  akan merubah membran spermatozoa dari konfigurasi normal  ke  konfigurasi  hexagonal  yang  dapat menyebabkan  kerusakan  pada  membran  plasma spermatozoa,  sehingga  kematian  spermatozoa pasca thawing meningkat (Morel, 1999).
Kualitas  semen  beku  babi  relatif  lebih rendah  dibandingkan  ternak  lainnya.  Penelitian ini  memperoleh  motilitas  18,75±3,23%  sampai 28,13±2,39%.  Sedangkan  motilitas  pada  ternak sapi  65,10±4,26  (Arifiantini  dan  Yusuf,  2010); pada  kerbau  lumpur  44,15±1,70%  (Febriani et al .,  2014);  Kambing  49,54±9,45%  (Kartina, 2014); dan Domba 53,00±3,69% (Herdis, 2015). Perbedaan  ini  diduga  karena  berhubungan dengan  komposisi  membran  plasma  yang berbeda  antar  ternak  babi  dengan  ternak  lain, dimana semen babi memiliki phosphatidylethanolamine 24% dan sphingomyelin  14%  (Johnson et  al .  2000), sedangkan semen sapi mengandung phosphatidylethanolamine 9,7%
dan sphingomyelin  11,5%.  Hal  ini  mengakibatkan rentanya  spermatozoa  babi  mengalami  cold shock  pada  suhu  pembekuan  yaitu  suhu  ±- 110oC, yang berakibat pada kerusakan membran plasma  semen  hingga  terjadinya  kematian spermatozoa.

## Pengaruh  Perlakuan  terhadap  Viabilitas Semen Beku Babi Landrace
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa perbedaan waktu ekuilibrasi berpengaruh tidak  nyata  (P>0,05)  terhadap  nilai  viabilitas spermatozoa sebelum pembekuan (pasca pengenceran  dan  pasca  ekuilibrasi).  Hal  ini diduga karena suhu ekuilibrasi 3-5oC merupakan  suhu  yang  optimum  untuk  proses preservasi semen  babi.  Pernyataan  ini  didukung oleh  (Suryadi,  2016)  bahwa  spermatozoa  yang disimpan  pada  suhu  3-5oC  menghasilkan viabilitas 81,62±7,70%.
Rataan  nilai  viabilitas  pasca  thawing tertinggi  terdapat  pada  P2  47,73±4,57%  dan  P3 49,53±11,44%  (P<0,05%.).  Hal  ini  diduga karena gliserol sudah penetrasi secara sempurna kedalam  sel  spermatozoa  sehingga  tercapainya keseimbangan  konsentrasi  elektrolit  intra  dan ekstra  sel  serta  spermatozoa  sudah  dapat memanfaatkan semaksimal mungkin
penggunaan  laktosa  dalam  proses  glikolisis  dan siklus  krebs,  untuk  menghasilkan  energi  berupa adenosin  triphosphate  (ATP).  Menurut  Azizah dan  Arifiantini  (2009),  gliserol  dapat  mengikat sebagian  air  bebas  dalam  sel  sehingga  tidak terjadinya  pembentukan  kristal  es.  Laktosa juga mampu menjaga tekanan osmotik, mengeluarkan  air  yang  berlebihan  dari  dalam sel,  menstabilkan  membran  sperma  dan  sebagai
sumber energi (Vishwanath dan Shannon, 2000). Hasil penelitian ini tidak berbeda jauh dari hasil yang dilaporkan oleh (Foeh et al . 2017), bahwa waktu  ekuilibrasi  2 jam  menghasilkan  viabilitas 44,84±0,14-52,96±0,96%.  Berbeda  jauh  dari yang  dilaporkan  oleh  Bebas  dan  Gorda  (2020), bahwa  waktu  ekuilibrasi  2  jam  menghasilkan viabilitas  65,80±1,09%;  dan  68,20±2,06%  - 70,80±0,70% (Yusuf et al ., 2017).
Tabel 3. Viabilitas spermatozoa babi landrace
Tahap pengamatan semen Waktu ekuilibrasi P1 P2 P3 Pasca pengenceran 84,93 ± 3,70 a 84,93 ± 3,70 a 84,93 ± 3,70 a Pasca ekuilibrasi 82,52 ± 4,37 a 84,93 ± 6,51 a 79,15 ± 3,27 a Pasca thawing 32,29 ± 5,05 a 47,73 ± 4,57 b 49,53 ± 11,44 b
Superskrip yang sama pada baris yang sama menunjukkan perbedaan yang tidak nyata antar perlakuan (P>0,05), P1 : 1 jam ekuilibrasi, P2 : 2 jam ekuilibrasi dan P3 : 3 jam ekuilibrasi.
Persentase  viabilitas  terendah  terdapat pada  perlakuan  P1  32,29±5,05%  (P>0,05),  hal ini diduga karena waktu ekuilibrasi yang singkat sehingga  gliserol  belum  sempurna  berdifusi masuk  ke  dalam  sel  serta  spermatozoa  belum maksimal memanfaatkan laktosa sebagai sumber energi. Kondisi ini yang menyebabkan spermatozoa mengalami cold shock dan terjadinya  pembentukan  kristal  es  yang  akan merusak  sel  spermatozoa  saat  pembekuan. Menurut Watson (2000), cold shock berpengaruh terhadap perubahan struktur phospholipid  membran  plasma  spermatozoa yang mengakibatkan terlepasnya enzim aspartat- aminotransferase  pada  mitokondria,  sehingga terhambatnya  produksi  energi  dalam  bentuk adenosin triphosphate  (ATP).  Menurut  Gao  dan Critser  (2000),  ekuilibrasi  yang  terlalu  cepat mengakibatkan  air  dalam  sel akan  keluar  dalam jumlah  sedikit  karena  tahap  ekuilibrium  belum tercapai sempurna. Air yang masih berada dalam sel  tersebut  akhirnya  berubah  menjadi  es  atau intracellular  ice  formation  (IIF)  yang  akan
merusak  sel  spermatozoa  bahkan  kematian spermatozoa.

## Pengaruh  Perlakuan  terhadap  Abnormalitas Semen Beku Babi Landrace
Berdasarkan  Tabel  4,  dapat  diketahui bahwa perbedaan waktu ekuilibrasi berpengaruh tidak  nyata  (P>0,05)  terhadap  abnormalitas spermatozoa pasca pengenceran. Namun perbedaan  waktu  ekuilibrasi  pada  suhu  3-5oC berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap abnormalitas  spermatozoa  pasca  ekuilibrasi.  P1 tidak berbeda nyata dengan P2 (P>0.05) serta P1 dan  P2  berbeda  nyata  dengan  P3  (P<0,05). Tidak  adanya  perbedaan  yang  nyata  antara  P1 dan P2 disebabkan spermatozoa mengalami cold shock  yang  diduga  karena  spermatozoa  belum secara  sempurna  menyesuaikan  diri  dengan pengencer.  Adanya  perbedaan  yang  nyata  pada P3  dikarenakan  spermatozoa  sudah  seoptimal mungkin  menyesuaikan  diri  dengan  pengencer sehingga  spermatozoa  belum  mengalami  cold shock.
Tabel 4. Abnormalitas spermatozoa babi landrace
Tahapan pengamatan semen Waktu ekuilibrasi P1 P2 P3 Pasca pengenceran 3,46 ± 0,25 a 3,46 ± 0,25 a 3,46 ± 0,25 a Pasca ekuilibrasi 3,55 ± 0,08 a 3,71 ± 0,27 a 2,11 ± 1,29 b Pasca thawing 6,26 ± 0,80 a 4,78 ± 0,23 b 4,85 ± 0,57 b
Superskrip yang sama pada baris yang sama menunjukkan perbedaan yang tidak nyata antar perlakuan (P>0,05), P1 : 1 jam ekuilibrasi, P2 : 2 jam ekuilibrasi dan P3 : 3 jam ekuilibrasi.
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa perbedaan waktu ekuilibrasi berpengaruh
nyata (P<0,05) terhadap abnormalitas
spermatozoa  pasca  thawing.  Pada  perlakuan  P2
4,78±0,23%  dan  P3  4,85  ±0,57%  menghasilkan persentase  abnormalitas  yang  relatif  rendah dibandingkan  P1  6,26±0,80%.  Hasil  ini  diduga karena  pada  P2  dan  P3,  spermatozoa  sudah secara  optimal  menyesuaikan  diri  dengan pengencer dan krioprotektan, sehingga tercapainya  keseimbangan  konsentrasi  cairan ekstra dan intra sel yang mampu mempertahankan  tekanan  osmotik  sel  selama pembekuan hingga terjadinya kerusakan selubung  lipoprotein  dan  kerusakan  membran sel dapat dihindari. Pernyataan ini sesuai dengan pendapat Herdiawan (2004), bahwa keseimbangan  konsentrasi  cairan  ekstra  dan intra  sel  mampu  mempertahankan  tekanan osmotik  sel,  sehingga  selubung  lipoprotein  dan membran  sel  tidak  akan  mengalami  kerusakan selama pembekuan, kondisi ini yang menyebabkan  rendahnya  nilai  abnormalitas spermatozoa pasca thawing.
Nilai abnormalitas tertinggi terdapat pada perlakuan  P1  6,26±0,80,  hal  ini  diduga  karena gliserol  belum  sempurna  masuk  kedalam  sel spermatozoa  dan  kurang  adanya  kesempatan laktosa untuk mengeluarkan air yang berlebihan dari dalam sel, sehingga spermatozoa mengalami cold shock, terjadinya pembengkakan sel dan pembentukan kristalisasi es. Hal ini mengakibatkan kerusakan spermatozoa  secara  mekanik  yang  berakibat pada tingginya abnormalitas spermatozoa. Proses  pendinginan  dan  pemanasan  kembali akan  merusak  membran  yang  ada  dalam membran  plasma,  sehingga  mengakibatkan keabnormalitasan spermatozoa (Ax et al ., 2000).
Pengaruh  Perlakuan  terhadap  Membran Plasma  Utuh  (MPU)  Semen  Beku  Babi Landrace
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa perbedaan waktu ekuilibrasi berpengaruh tidak  nyata  (P>0,05)  terhadap  membran  plasma utuh  spermatozoa  pasca  pengenceran  dan  pasca ekuilibrasi.  Hal  ini  diindikasikan  karena pengencer  mampu  mempertahankan  keutuhan
membran  plasma  ketika  spermatozoa  melewati suhu 27 – 28oC dan suhu 3 – 5oC
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa perbedaan waktu ekuilibrasi berpengaruh nyata  (P<0,05)  terhadap  membran  plasma  utuh spermatozoa  pasca  thawing.  Pada  perlakuan  P2 48,39±4,86%  dan  perlakuan  P3  49,93±11,43% menghasilkan  persentase  membran  plasma  utuh yang relatif tinggi dibandingkan P1 32,29±5,05%.  Hasil  ini  tidak  berbeda  jauh  dari penelitian yang dilakukan oleh (Hu et al . 2009), yang  melaporkan  bahwa  persentase  membran plasma  utuh  mencapai  44,61%,  dengan  lama ekuilibrasi  2  jam.  Hal  ini  diduga  karena  pada perlakuan  P2  dan  P3,  gliserol  sudah  sempurna masuk  kedalam  membran  plasma,  mampu mengikat  gugus  fosfolipid  secara  optimal  dan terciptanya keseimbangan osmolalitas ekstra dan intra sel sehingga spermatozoa tetap stabil serta mampu memodifikasi struktur permukaan kristal-kristal  es  menjadi  tidak  tajam.  Laktosa juga sudah secara optimal melindungi membran plasma karena laktosa adalah senyawa pereduksi yang akan menetralisir kerja hidrogen peroksida sehingga  dapat  merusak  ikatan  ganda  asam lemak tak jenuh dari fosfolipid bilayer membran plasma spermatozoa, akibatnya membran plasma  spermatozoa  tetap  stabil  dan  utuh (Tambing et al ., 2003).
Rataan  nilai  membran  plasma  utuh terendah terdapat  pada P1  32,84±4,88% (P>0,05), hal ini diduga karena lama ekuilibrasi yang  relatif  cepat  sehingga  mengakibatkan besarnya  kerusakan  pada  membran  plasma spermatozoa, yang disebabkan karena spermatozoa  belum  menyesuaikan  diri  dengan pengencer  secara  optimal,  sehingga  ketika melewati proses pembekuan dan proses thawing spermatozoa  mengalami  cold  shock  yang berakibat pada kerusakan membran. Spermatozoa  yang  cold  shock  akan  mengalami peningkatan  kontraksi  lapisan  protein  sehingga mantel  pelindung  sperma  pecah  atau  membran mengalami kerusakan (Jadi et al ., 2015).
Tabel 5. Keutuhan membran plasma spermatozoa babi landrace
Tahapan pengamatan semen Waktu ekuilibrasi P1 P2 P3 Pasca pengenceran 85,93 ± 3,29a 85,93 ± 3,29a 85,93 ± 3,29a Pasca ekuilibrasi 83,49 ± 4,70a 85,49 ± 6,21a 80,17 ± 3,59a Pasca thawing 32,84 ± 4,88a 48,39 ± 4,86b 49,39 ± 11,43b
Superskrip yang sama pada baris yang sama menunjukkan perbedaan yang tidak nyata antar perlakuan (P>0,05), P1 : 1 jam ekuilibrasi, P2 : 2 jam ekuilibrasi dan P3 : 3 jam ekuilibrasi.

## Pengaruh Perlakuan terhadap Recovery Rate
(RR) Semen Beku Babi Landrace
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa, perbedaan waktu ekuilibrasi berpengaruh  nyata  (P<0,05)  antar  perlakuan terhadap  recovery  rate  semen  beku  babi landrace,  dimana    perlakuan  P1  berbeda  nyata dengan  P2  dan  P3  sedangkan  perlakuan  P2  dan P3  tidak  berbeda  nyata.  Hal  ini  diperjelas dengan  rataan  nilai  RR  yang  diperoleh,  yaitu rataan RR tertinggi terdapat pada P2
40,18±3,41% yang diikuti dengan P3
35,71±5,83%  (P<0,05)  sedangkan  rataan  nilai terendah terdapat  pada P1  26,79±4,61%
(P>0,05).  Tingginya  nilai  RR  pada  P2  dan  P3 diduga  karena  pada  perlakuan  P2  dan  P3, spermatozoa sudah secara optimal menyesuaikan  diri  dengan  pengencer,  sehingga terjadinya  cold  shock  dan  kristal  es  dapat diminimalisir bahkan dapat dicegah.
Menurut Suherlan et al . (2015), penilaian recovery  rate  berfungsi  untuk  menunjukan keefisienan  proses  pembekuan,  semakin  tinggi nilai  RR  maka  proses  pembekuan  semakin  baik yang  berkaitan  dengan  tingginya  keutuhan membran  plasma  yang  mendukung  proses metabolisme  untuk  menghasilkan  pergerakan spermatozoa.

## SIMPULAN
Dapat disimpulkan bahwa waktu
ekuilibrasi 2  jam dan 3 jam mampu mempertahankan  kualitas  semen  beku  babi landrace.

## DAFTAR PUSTAKA
Arifiantini R, Yusuf T. 2010. Developing of tris soy  milk  diluent  for  frisian  holstein  bull frozen semen. Hayati Journal of Biosciences 17(2): 91-94.
Ax  RL,  Dally  M,  Didion  BA,  Lenz  RW,  Love CC,  Hafes  B.  Bellin,  ME.  2000.  Semen Evaluation.  In:  Reprod  in  Farm  Anim. Hafes  B.  Hafes  ESE  (Ed).  7th  ed.  Pp. 365–389.
Azizah,  Arifiantini  R.  2009.  Kualitas  semen beku  kuda  pada  pengencer  susu  skim dengan konsentrasi gliserol yang berbeda.
Jurnal of Veteriner 10(2): 63-70.
Banamtuan  AN,  Nalley  WM,  Hine  TM.  2021.
Kualitas  semen  cair  babi  duroc  dalam pengencer durasperm yang disuplementasi air  buah  lontar  dan  sari  tebu .  Jurnal  Sain
Peternakan Indonesia 16(1): 41-48.
Bearden  HJ,  Fuquay  JW,  Willard  S.  2004.
Applied Animal Reproduction, 6th Eddition.  Pearson  Education,  Inc.,  Upper Saddle River, New Jersy. Pp: 1-456.
Bebas  W,  Gorda  W.  2020.  Kadar  krioprotektan gliserol  dan  dimethylsulfoxide  terbaik pada  pengencer  astaxanthin  fosfat  kuning telur  bebek  terhadap  kualitas  semen  beku babi. Jurnal Veteriner 21(36): 115-123.
Febriani GD, Hamdan, Melia J. 2014. Pengaruh waktu ekuilibrasi terhadap kualitas semen kerbau  lumpur  (Bubalus  bubalis)  setelah
thawing. Jurnal Medika  Veterinaria 8(1): 1-4.
Foeh  NDFK,  Gaina  CD,  Titong  AP,  Buta  CA,
Bei  MS.  2019.  Daya  tahan  spermatozoa semen  cair  babi  landrace  pada  metode penyimpanan  berbeda. Jurnal  Kajian Veterine 7(1): 47-52.
Foeh,  NDFK,  Arifiantini  RI,  Yusuf,  TL.  2017. The  quality  of  boar  frozen  semen  diluted in  BTS®  and  MII®  with  different cryoprotectant supplemented with sodium dodecyl  sulphate. Jurnal  Kedokteran Hewan 11(1): 6-10.
Gadea J. 2003. Review: semen extenders used in the  artificial  inseminarion  of  swine. Spanish Journal of Agricultural Research 1(2): 17-27.
Gao  D,  Critser  JK.  2000.  Mechanisms  of cryoinjury  in  living  cells. ILAR  Journal 41(4): 187-196.
Garner DL, Hafez ESE. 2000. Spermatozoa and seminal plasma. In  :Hafez B. Hafez ESE (Editor)  Reproduction  in  Farm  Animals. 7th  Ed.  Philadelphia  (US).  Lippincott  E Williams and Wilkins. pp. 96–109.
Herdiawan  I.  2004.  Pengaruh  laju  penurunan suhu  dan  jenis  pengencer  terhadap kualitas  semen  beku  domba  priangan. Jurnal  Ilmu  Ternak  Dan  Veteriner 9(2): 98-107.
Herdis.  2015.  Daya  motil  dan  keutuhan membran  plasma  spermatozoa  domba garut  (Ovise  aries)  pada  penambahan kolesterol  dalam  pengencer  Tris  kuning telur. JSTI. 17(1): 16-23.
Herdis,  Rizal  M,  Boediono  A,  Arifiantini  RI,
Aku  AS,  Yulnawati.  2005.  Optimasi kualitas semen beku domba garut melalui penambahan trehalosa ke dalam pengencer  kuning  telur. Journal  of  the Indonesian  Tropical  Animal  Agriculture 30(4): 229-236.
Hu  J-H,  Li  Q-W,  Li  G,  Jiang  Z-L,  Bu  S,  Yang H,  Wang  L-Q.  2009.  The  cryoprotective effect  of  trehalose  supplementation  on boar spermatozoa quality. Animal Reproduction Science 112(1-2): 107-118. Jadi  ML,  Supit  MA,  Kusumaningrum  D,  Angi
AH.  2015.  Evaluasi  kualitas  semen  beku akibat perbedaan metode lama equilibrasi dan lama penurunan suhu selama prosesing semen. Partner 15(2): 170-177.
Johnson,  L.  A.,  Weitze,  K.  F.,  Fiser,  P.,  & Maxwell,  W.  M.  C.  (2000).  Storage  of boar semen. Animal Reproduction Science 62(1-3): 143-172.
Kaka  A.  2020.  Karakteristik  dan  daya  fertilitas spermatozoa  babi  peranakan  landrace. Jurnal  Peternakan  Indonesia 22(3):  277- 283.
Kartina.  2014.  Pengaruh  lama  ekuilibrasi terhadap daya hidup spermatozoa kambing  peranakan  etawa  (PE). Skripsi .
Jurusan Produksi Ternak, Fakultas Peternakan, Universitas Hasanuddi, Makassar.
Knox  RV.  2011.  Semen  Processing,  Extending And  Storage  For  Artificial  Insemination In  Swine.  In  Departemen  of  Anumal
Science.
University of Illinois
publications. (pp. 1–7).
Lubis TM,  Dasrul, Thasmi  CN,  Akbar T.  2013.
Spermatozoa after cold storage efektifitas penambahan  vitamin  C  dalam  pengencer susu  skim  kuning  telur  terhadap  kualitas spermatozoa kambing boer setelah penyimpanan dingin. Jurnal Sains Pertanian 3(1): 347-361.
Morel  GCGD.  1999.  Artificial  Insemination. Cabi  Publishing.  Wallingford.  United Kingdom. (pp. 1–416).
Passarelli MDS, Pavaneli APP, Ravagnani GM, Martins  MP,  Pedrosa  AC,  Martins SMMK,  de  Alcântra  RNR,  Rigo  VHB,
Yasui  G,  Yeste  M.  2020.  Effects  of different  equilibration  times  at  5°  C  on boar sperm cryotolerance. Animal Reproduction Science 219(10): 106-547. Sangma TFM, Ahmed K, Choudhury MD, Galib
ZU, Ahmed N, Das A. 2020.
Characteristics of fresh crossbred hampshire boar semen. Haryana Veteriner 59(1): 98-101.
Saputra DJ, Ihsan MN, Isnaini N. 2017. Korelasi antara  lingkar  skrotum  dengan  volume semen, konsentrasi dan motilitas spermatozoa  pejantan  sapi  bali. Jurnal Ternak Tropika : 18(2): 59-68.
Solihati  N,  Kune  P.  2009.  Pengaruh  jenis pengencer  terhadap  motilitas  dan  daya tahan  hidup  spermatozoa  semen  cair  sapi simmental.  Jurnal  Fakultas  Peternakan Universitas Padjadjaran, Bandung.
Suherlan  NE,  Soeparna,  Hidajat  K.  2015.
Pengaruh  penambahan  berbagai  tingkat DMF (Dimethylformamide ) sebagai agen krioprotektan terhadap keutuhan membran plasma  dan  recovery  rate  semen  beku domba lokal. Jurnal Ilmu-IImu Peternakan 4(4): 1-12. Suryadi.  2016.  Daya  tahan  semen  cair  babi dalam
pengencer BTS yang disuplementasi  kuning  telur  pada  suhu penyimpanan berbeda. Skripsi .
Departemen Ilmu Produksi danTeknologi. Peternakan-Fakultas  Peternakan-Institusi Pertanian Bogor.
Tambing  SN,  Sutama  IK,  Arifiantini  RI.  2003. Efektivitas  berbagai  konsentrasi  laktosa dalam  pengencer  tris  terhadap  viabilitas semen  cair  kambing  saanen. Jurnal  Ilmu Ternak dan Veteriner 8(2): 84-90.
Vishwanath  R,  Shannon  P.  2000.  Storage  of bovine  semen  in  liquid  and  frozen  state. Animal Reproduction Science 62(1-3): 23- 53.
Watson PF. 2000. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal
Reproduction Science 60: 481-492.
White  IG.  1993.  Lipids  and  calcium  uptake  of sperm  in  relation  to  cold  shock  and preservation:  a  review. Reproduction, Fertility and Development 5(6): 639-658. Yusuf TL, Arifiantini RI, Dapawole RR, Nalley WM.  2017.  Kualitas  semen  beku  babi dalam pengencer Komersial yang disuplementasi  dengan  trehalosa. Jurnal Veteriner 18(1): 69-75.