BioEksakta: Jurnal Ilmiah Biologi Unsoed Volume 6, Nomor 1 (2024): 22-26 E-ISSN: 2714-8564

## Primordial Germ Cells (PGCs) Embrio Ikan Nilem (Osteochilus vittatus)
pada Beberapa Tahap Perkembangan
Aulidya Nurul Habibah *1 , Gratiana Ekaningsih Wijayanti 2
1 Prodi S1 Biologi Terapan, Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto 53122, Indonesia
2 Prodi S1 Biologi, Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto 53122, Indonesia * Corresponding author , Email: aulidya.nurul.habibah@unsoed.ac.id
Rekam Jejak Artikel:
Diterima  : 02/02/2024 Disetujui  : 21/03/2024

## Abstract
Primordial Germ Cells (PGCs) are gametes precursors that are important in fish reproduction. PGCs  are  allocated  outside  the  gonad  and  migrate  towards  the  gonad  primordia  during  fish embryonal development. Knowledge of the allocation and migration of PGCs is important in the development  of  gametogenesis  research  models  and  improved  aquaculture  production.  This research aims to determine the location of PGCs in the embryo stage of nilem fish using the in situ hybridization method with vasa germ cell markers of nilem fish. Nilem fish embryos aged 30  minutes,  60,  180  and  240  minutes  after  fertilization  were  fixed  in  10%  NBF  then dechorionated. Next, in situ hybridization was carried out with the Nilem fish vasa germ cell marker. PGCs were found in the area around the blastomere cleavage groove in embryos aged 30 minutes, 60 minutes and detected in the blastoderm of animal pole region in embryos aged 18 minutes and 240 minutes which had entered the blastula and gastrula stages.
Key Words : Embryo, In situ hybridization, Osteochilus vittatus, Primordial Germ Cells, Vasa.

## Abstrak
Primordial Germ Cells (PGCs) merupakan prekusor gamet yang penting dalam reproduksi ikan. PGCs  dialokasikan  di  luar  gonad  dan  bermigrasi  menuju  gonad  primordia  selama  masa perkembangan embrional ikan. Pengetahuan mengenai alokasi dan migrasi PGCs penting dalam pengembangan model penelitian gametogenesis dan peningkatan produksi akuakultur. Penelitian ini  bertujuan  mengetahui  lokasi  PGCs  pada  tahap  embrio  ikan  nilem  menggunakan  metode hibridisasi in situ dengan penanda vasa germ cell ikan nilem. Embrio ikan nilem umur 30 menit, 60,  180  dan  240  menit  paska  fertilisasi  difiksasi  dalam  NBF  10%  kemudian  didechorionasi. Selanjutnya dilakukan hibridisasi in situ dengan penanda vasa germ cell ikan nilem. PGCs pada embrio ikan nilem ditemukan pada daerah di sekitar alur pembelahan blastomere pada embrio umur 30 menit, 60 menit dan terdeteksi pada blastoderma di daerah kutub animalis pada embrio umur 18 menit dan 240 menit yang telah memasuki tahapan blastula dan gastrula.
Kata kunci: Embrio, Hibridisasi in situ, Osteochilus vittatus, Primordial Germ Cells, Vasa.

## PENDAHULUAN
Primordial  germ  cells (PGCs)  atau  sel germinalis merupakan prekusor gamet yang penting dalam  reproduksi  ikan.  PGCs  dialokasikan  di  luar gonad  primordia  dan  bermigrasi  menuju  gonad primordia  selama  masa  perkembangan  embrional. PGCs  memiliki  peran  dalam  pewarisan  informasi genetik  dari  induk  ke  anakan  (Cao et  al. ,  2012). Yoshikawa et  al .  (2018)  menyatakan  bahwa  PGCs dapat  mempengaruhi  fertilitas  ikan  spesies  hybrid. Salah satu mekanisme yang berperan dalam fertilitas adalah  penahanan  mitosis  PGCs  yang  dapat menyebabkan infertilitas pada ikan hybrid.
PGCs  memiliki  karakteristik  sel  unipotent.
Karakteristik tersebut diantaranya memiliki aktivitas alkalin fosfatase dan ekspresi gen-gen spesifik pada tahap  perkembangan  embrio  (Miguel et  al., 2017). Pengetahuan  mengenai  identifikasi,  determinasi PGCs selama perkembangan embrio dilakukan untuk mengetahui  kapan  dan  dimanakah  PGCs  berasal/ muncul  selama  perkembangan  embrio  kemudian bermigrasi  menuju  gonad  primordia.  Adapun penelitian  mengenai germ  cells telah  banyak
dilakukan  pada  Drosophila,  katak  dan  embrio  tikus. Pengetahuan  mengenai  migrasi  PGCs  pada  masa embrional  ikan,  sangat  penting  kaitannya  untuk mempelajari proses migrasi sel tunggal secara in vivo . Mekanisme  yang  mendasari  migrasi  dan  tujuan migrasi  PGCs  harus  jelas  untuk  memastikan  PGCs sampai  pada  organ  target  sehingga  berkontribusi terhadap fertilitas organisme (Aalto et al ., 2021). Informasi  mengenai primordial  germ  cells sangat  penting  kaitannya  dengan  perkembangan gonad  ikan.  Pengetahuan  mengenai germ  cells , termasuk  didalamnya  PGCs  dapat  digunakan  untuk usaha  rekayasa  dalam  bidang  akuakultur  dan  untuk penelitian  perkembangan.  Cantú  and  Laird  (2017) menyatakan bahwa banyak hal yang dapat dipelajari dari  mekanisme  migrasi  PGCs  menuju  gonad primordia sebagai pengetahuan fundamental maupun potensi  fungsional.  Pengetahuan  mengenai  PGCs termasuk  aspek  migrasinya  dapat  dijadikan  dasar aplikasi  gametogenesis in  vitro. PGCs  juga  dapat diisolasi  dan  dikultur  secara in  vitro. Teknik  isolasi dan kultur in vitro PGCs telah banyak dilakukan pada mamalia (Miguel et al ., 2017). Lebih lanjut, Coelho
et  al .  (2019)  melakukan  penelitian  mengenai  PGCs ikan neotropis Prochilodus lineatus . PGCs pada ikan tersebut dapat ditransplantasikan dan dapat dimanipulasi  untuk  menghasilkan  chimera  sel germinal.  Lin et  al .  (2012)  menggunakan  ikan medaka  untuk  melabeli  sel-sel  germinal  khususnya PGCs sehingga dapat digunakan untuk manipulasi sel germinal  pada  ikan  rainbow  trout  yang  merupakan ikan  budidaya  bernilai  ekonomis  penting.  Melalui pendekatan  ikan  model  yaitu  medaka,  diharapkan selanjutnya labeling sel germinal dapat diaplikasikan ke ikan rainbow trout untuk manipulasi sebagai upaya peningkatan  produksi  ikan  tersebut.  Percobaan mengenai  transplantasi  oogonia  dan  spermatogonia berhasil dilakukan pada ikan masu salmon oleh Lee et al. (2021). Oogonia dan spermatogonia diinjeksikan ke rongga peritoneum ikan masu salmon triploid, dan menghasilkan gamet yang terdiferensiasi dengan rasio kelamin anakan 1:1.
Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan pada beberapa jenis ikan, mengetahui alokasi PGCs dan migrasinya menjadi pengetahuan yang bermanfaat  bagi  ilmu  pengetahuan  maupun  sektor perikanan.  PGCs  dapat  diisolasi  kemudian  dikultur secara  in  vitro.  Teknik  isolasi  dan  kultur  in  vitro PGCs telah banyak dilakukan pada mamalia (Miguel et al ., 2011). Pengetahuan mengenai PGCs termasuk aspek  migrasinya  dapat  dijadikan  dasar  aplikasi gametogenesis in  vitro .  Coelho et  al (2019) melakukan penelitian mengenai PGCs ikan neotropis Prochilodus  lineatus .  PGCs  pada  ikan  tersebut ditransplantasikan  dan  dapat  dimanipulasi  untuk menghasilkan  chimera  sel  germinal.  Manipulasi PGCs bertujuan untuk meningkatkan produksi ikan. Pada  penelitian  ini,  ikan  nilem  digunakan  sebagai model penelitian karena merupakan spesies indigenuous  kabupaten  Banyumas  yang  sudah dibudidayakan dan mudah didapatkan dari pembudidaya  serta  memiliki  nilai  ekonomis  yang cukup  tinggi.  PGCs  embrio  ikan  nilem  dideteksi menggunakan vasa homolog penanda germ cell ikan nilem pada penelitian ini.

## MATERI DAN METODE
Materi  penelitian  embrio  ikan  nilem  diperoleh melalui  fertilisasi  terbantu  di  laboratorium  Struktur dan  Perkembangan  Hewan,  Fakultas  Biologi, Universitas  Jenderal  Soedirman.  Bahan  untuk hibridisasi in situ meliputi probe vasa germ cells O. vittatus (Wijayanti, belum dipublikasikan) dan bahan untuk  pre  hibridisasi,  tahap  hibridisasi  dan  post hibridisasi menggunakan kit dari BioTNA Biospot kit dan Neutral  Buffered  Formaline (NBF)  10%  untuk fiksasi embrio. Alat-alat yang digunakan meliputi alat untuk dechorionasi embrio ikan nilem meliputi jarum spuit 1 mL, object glass dan mikroskop cahaya merk Olympus,  peralatan  hibridisasi in  situ meliputi inkubator, humidity chamber, waterbath . Penelitian  dilakukan  menggunakan  metode observasi  dan  dianalisis  secara  deskriptiv.  Prosedur
penelitian terdiri atas fiksasi embrio ikan nilem umur 30 menit, 60 menit, 180 menit dan 240 menit paska fertilisasi, dechorionasi embrio ikan nilem, hibridisasi dan observasi hasil hibridisasi in situ . Embrio ikan nilem diperoleh dengan pemijahan terbantu di laboratorium Struktur dan Perkembangan Hewan  Fakultas  Biologi  Universitas  Jenderal Soedirman.  Induk  ikan  nilem  Jantan  dan  betina matang  kelamin  diinduksi  menggunakan  GnRH analog merk Ovaprim dengan dosis 0.5 mL/kg untuk induk  betina  dan  0.3  mL/kg  untuk  induk  jantan (Simanjuntak  dan  Wijayanti  2005).  Setelah  delapan jam  dari  induksi  Ovaprim,  ikan  betina  distripping pada area abdomen menuju lubang urogenital. Telur yang  keluar  ditampung.  Stripping  juga  dilakukan pada induk nilem Jantan dengan mengurut abdomen menuju  lubang  urogenital.  Sebelum  diurut,  area  di sekitar lubang urogenital dibersihkan dan dipastikan kering  untuk  menghindari  aktivasi  terlalu  dini  pada spermatozoa. Milt yang  berisi  spermatozoa  yang keluar  dari  lubang  urogenital  ditampung  kemudian dicampurkan  dengan  telur.  Air  ditambahkan  sedikit demi sedikit dan perlahan untuk aktivasi spermatozoa.  Telur  diamati  apakah  sudah  berhasil difertilisasi dengan munculnya membran vitelin yang membesar  dan  terbentuk  hillock.  Pada  menit  ke-30, 60, 180 dan 240 paska fertilisasi, embrio ikan diambil dan  difiksasi  dalam  NBF  10%  untuk  tahap selanjutnya. Pengambilan embrio pada menit ke 30, 60,  180  dan  240  paska  fertilisasi  dilakukan  dengan asumsi embrio pada tahapan yang berbeda, mulai dari 4 sel, 16 sel, blastula hingga gastrula ( Nugrahesthi et al ., 2023).
Dechorionasi dilakukan mengacu pada Habibah et  al .  (2022).  Tahap  hibridisasi in situ terdiri  atas  : tahapan  persiapan,  tahapan  pre-treatment,  tahapan denaturasui  dan  hibridisasi,  tahapan  post  hibridisasi dan  deteksi.  Tahap  persiapan  meliputi  pembuatan larutan heat pre-treatment (larutan heat pre - treatment 20x dilarutkan dalam air terdeionisasi dan dipanaskan pada suhu 95 o C), menyiapkan buffer SSC 1X dan 2X, membuat larutan pencuci TBST buffer, menyiapkan semua reagen ( Enzyme Solution, Anti-DIG antibody, Polymer HRP labeling, Nuclear Blue Solution ) pada suhu ruang dan pembuatan larutan DAB (kromogen DAB dilarutkan (20x) dilarutkan dalam buffer DAB dan  dicampur  merata).  Tahap pre-treatment diawali dengan  pencucian  PBST  dan  de-peroksidasi  dalam hydrogen  peroksidase  block selama  10  menit, dilanjutkan dengan pencucian dengan PBST, diikuti dengan  inkubasi  pada  larutan heat  pre-teatment dalam suhu 95 o C selama 30 menit.  Kemudian sampel didiamkan  15  menit  dan  diberi  air  deionisasi dilanjutkan dengan tahap aplikasi enzim hibridisasi in situ dalam humidity chamber pada suhu 37 o C selama 10  menit  diikuti  dengan  dehidrasi  dalam  alkohol bertingkat:  70%,  85%,  95%,  2x  100%  selama masing-masing 2 menit kemudian dikering anginkan. Tahap  hibridisasi  dan  denaturasi  merupakan  tahap aplikasi probe pada  sampel  embrio  ikan  dan
denaturasi  pada  suhu  96 o C  selama  10  menit, dilanjutkan  dengan  hibridisasi  dalam humidity chamber pada  suhu  37 o C  selama  2-16  jam.  Tahap post-hibridisasi dan deteksi diawali dengan merendam sampel pada larutan Saline Sodium Citrate (SSC)  2x  lalu  SSC  1x  pada  suhu  45 o C.  Hal  ini dilakukan  dengan  tujuan  membersihkan unbinding probe pada sampel. Kemudian sampel dicuci dengan buffer  1X phosphate - buffered saline solution (PBST). Selanjutnya  diaplikasikan  reagen Hi-Effect Block pada sampel dan inkubasi selama 30 hingga 60 menit  pada  suhu  ruang  dalam humidity chamber untuk mengurangi background pewarna non-spesifik. Kemudian dicuci dengan buffer 1X PBST selama 5 menit.  Selanjutnya  Avidin  HRP  labeling  diteteskan pada  sampel  dan  diinkubasi  selama  30  menit  pada suhu ruang dalam humidity chamber . Sampel dicuci dalam  buffer  1X  PBST  selama  1  menit  sebanyak  3 kali  (dalam  tahap  ini,  disiapkan  DAB working solution yaitu  dengan  melarutkan  DAB  chromogen (20X)  dalam  19  kali  volume  DAB  buffer).  Larutan DAB working  solution diteteskan  pada  sampel  dan diamati  pada  mikroskop  selama  perkembangan warna dan diakhiri dengan penggunaan buffer PBST untuk menghilangkan larutan DAB. Sampel kemudian  ditetesi  air  keran  dan  dicuci  selama  2 menit.  Sampel  diberi  counterstain  dengan  larutan Nuclear  Blue selama  1-3  menit.  Kemudian  kembali dicuci  dengan  air  keran,  lalu  dilakukan  dehidrasi bertingkat dalam alkohol 70%, 85%, 95%, dan 100%, masing-masing  selama  2  menit.  Sampel  dikering anginkan dan diamati dengan mikroskop cahaya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hibridisasi in  situ merupakan  sebuah  teknik laboratorium  yang  dilakukan  untuk  melokalisir sekuens  RNA  atau  DNA  pada  sampel  biologi. Jaringan atau sel dipaparkan atau diberi probe yang merupakan  sepotong  DNA single-stranded yang berikatan dengan pewarna kemikalia atau fluoresens.
Probe yang  telah  dilabeli  tersebut  akan  berikatan dengan  sekuens  yang  sesuai  pada  sampel  biologi. Lokasi tempat berikatan antara probe dengan sekuens target  tersebut  dapat  diamati  dengan  mikroskop ( National  Human  Genome  Institute ,  2024).  Pada penelitian  ini,  hibridisasi in  situ dilakukan  pada embrio ikan nilem dalam tahapan 4 sel, 16 sel, morula dan  blastula.  Pada  tahap  tersebut,  PGCs  dapat dideteksi dan dilokalisir keberadaannya menggunakan penanda vasa.
Primordial  germ  cells (PGCs)  mewariskan faktor  maternal  spesifik  seperti  vasa  dan  nanos  1 (nos1) mRNA (Saito et al ., 2006). Pada penelitian ini, marker yang digunakan dalam hibridisasi in situ ada vasa germ  cells ikan  nilem. Probe yang  digunakan adalah sekuens pasangan basa pada vasa germ cells O. vittatus .  Deteksi  yang  dilakukan  pada  tahapan embrio umur 30 menit, 60 menit, 180 menit dan 240 menit  paska  fertilisasi.  Tahapan  ini  mewakili beberapa  tahapan  embrio  ikan  nilem  sebelum menetas  dari chorion ,  merujuk  pada  Nugrahesthi et al .  (2023).  Embrio  umur  30  menit  paska  fertilisasi menunjukkan  tahapan  empat  sel  dengan  hasil hibridisasi in  situ pada  gambar  1.  Bagian  masing- masing  blastomer  embrio  ikan  nilem  terlihat  jelas seperti  sebuah  area  dengan  garis/  alur  yang memisahkan masing-masing area tersebut. Satu area hasil  pembelahan  segmentasi  merupakan  blastomer. Berdasarkan  pengamatan  di  bawah  mikroskop, terdapat  konsentrasi  masa  yang  terwarnai  dengan metode  hibridisasi in situ menggunakan  vasa germ cells ikan  nilem.  Konsentrasi  masa  yang  diduga sebagai  PGCs  terdapat  pada  daerah  dekat  alur pembelahan di salah satu blastomere. Demikian pula pada  embrio  ikan  nilem  umur  60  menit  paska fertilisasi,  ditemukan  konsentrasi  masa  yang terwarnai  di  dekat  alur  pembelahan  pada  salah  satu blastomer (Gambar 1 , A, B). Pada embrio umur 180 menit  dan  240  menit,  PGCs  terdeteksi  di  daerah blastoderma (Gambar 1, C, D).
Gambar 1. Embrio ikan nilem ( O. vittatus ) umur 30 menit (A), 60 menit (B), 180 menit (C) dan 240 menit (D) paska fertilisasi dengan hibridisasi in situ menggunakan penanda vasa homolog. PGCs ditunjukkan dengan tanda panah. Perbesaran 4x. Bar menunjukkan 100 μm.
A B C D
Yoon et  al .  (1997)  mempelajari  tentang  vasa pada  ikan  zebrafish.  Hasil Northern blotting menunjukkan  bahwa  transkrip  homolog  (vas)  vasa ikan  zebrafish  muncul  pada  embrio  setelah pembuahan,  kemungkinan  disuplai  secara  maternal. Pada penelitian ini, vasa germ cells menandai PGCs pada  tahapan  embrio  30  menit  setelah  fertilisasi (tahap 4 sel) dan dideteksi keberadaannya pada tahap selanjutnya, 60 menit, 180 menit dan 240 menit paska fertilisasi. Pola vasa RNA pada embrio ikan zebrafish telah diteliti menggunakan wholemount hibridisasi in situ ,  dari  satu  -sel  tahap  perkembangan  hingga  10 hari.  Hasil  menunjukkan  bahwa  vas  RNA  adalah penanda  spesifik  sel  germinal,  memungkinkan deskripsi PGCs ikan zebrafish untuk pertama kalinya. Transkrip  vasa  terdeteksi  dalam  pola  baru, terlokalisasi ke bidang pembelahan dalam tahap sel 2 dan 4 embrio. Selama pembelahan berikutnya, RNA dipisahkan sebagai kelompok subseluler ke sejumlah kecil sel yang mungkin akan berkembang menjadi sel germinal. Berdasarkan hasil penelitian ini, memungkinkan adanya cara terbaru untuk manipulasi genetik pada ikan zebrafish. Selain itu, pengetahuan mengenai vasa RNA akan menjadi dasar studi lebih lanjut  tentang  pola  lokalisasi  RNA  baru  dan perkembangan germ - line secara umum. Wang et al . (2015) menyatakan bahwa deteksi PGCs menggunakan metode histologi hanya dapat dilakukan  setelah  tahapan  gastrula.  Pada  penelitian ini, embrio dalam tahapan empat sel, 16 sel, blastula, dan  awal  gastrula,  maka  digunakan  metode  deteksi menggunakan embrio utuh ( whole mount ). Zhou et  al. (2020)  meneliti  pola  ekspresi  vasa pada perkembangan gonad pada ikan vivipar rockfish ( Sebastes schlegelii ) (Ssvas) menggunakan hibridisasi in  situ .  Hasil  menunjukkan  bahwa  Ssvas gagal  dalam  lokalisasi  di  alur  pembelahan  sampai akhir  tahap  gastrula,  ketika  PGC  muncul  dan bermigrasi  ke  genital  ridge  dan  terbentuk  gonad primordia  memanjang  saat  10  hari  setelah  lahir. Kajian perkembangan PGC pada lalat, ikan, burung, amfibi  dan  mamalia  menunjukkan  keragaman  jalur migrasi yang mengejutkan dengan variasi jalur yang banyak serta mekanisme molekuler yang mendasarinya. Pada umumnya, migrasi dimulai dari posterior embrio di sebagian besar organisme (Cantú and  Laird,  2017).  Nagasawa et  al. (2013)  berhasil mengidentifikasi  PGCs  ikan  salmon  menggunakan whole mount hibridisasi in situ. Pola distribusi PGCs pada  salmon  berbeda  dengan  ikan  zebrafish;  yaitu spesifik  pada  tahapan  mid-blastula,  sel-sel  yang mengekspresikan  vasa  secara  acak  terdistribusi  pad bagian  blastodisc,  dan  kemudian  bermigrasi  ke daerah embryonic  shield .  Pada  penelitian  ini,  PGCs ditemukan di area ventral blastoderma pada tahapan blastula  dan  gastrula  (umur  embrio  180  menit  dan 240 menit paska fertilisasi).
Hibridisasi whole  mount  in  situ adalah  salah satu  metode  yang  sangat  kuat  untuk  mempelajari ekspresi  gen  selama  masa  perkembangan  embrio.
Hibridisasi in situ dengan fluorescence adalah salah satu  metode  untuk  mengetahui  ekspresi  gen  atau beberapa  gene  overlapping  pada  embrio  ayam. Metode  ini  menjadi  salah  satu  metode  yang  dapat dikolaborasikan  dengan  imunohistokimia  ataupun tunggal  hanya  hibridisasi in situ (Denkers et  al ., 2004).  Metode  hibridisasi in situ dengan  fluoresen digunakan  oleh  Li et  al. (2019)  untuk  mengetahui ekspresi vasa pada ikan yellow croaker Larimichthys croceas. Metode hibridisasi whole mount in situ yang dilakukan pada ikan cod, salmon dan zebrafish untuk mengetahui  ekspresi  gen  nanos  pada  calon  PGCs (Škugor et  al .,  2014).  Vauti et  al. (2020) mengembangkan  hibridisasi whole  mount  in  situ untuk  mengetahui  ekspresi  gen  pada  embrio  ikan zebra  ( Danio  rerio ).  Pada  penelitian  ini  digunakan hibridisasi in situ embrio, dan dapat disebut sebagai hibridisasi whole  mount  in  situ karena  digunakan embrio utuh yang telah didechorionasi.

## SIMPULAN
Deteksi  PGCs  pada  embrio  ikan  nilem  dapat dilakukan  menggunakan  metode  hibridisasi whole mount in  situ dengan  penanda  vasa.  Embrio didechorionasi terlebih dulu dan difiksasi dalam NBF 10% sebelum masuk tahapan hibridisasi in situ . PGCs terdeteksi  sebagai  kumpulan  masa  yang  menyerap warna  kuat  pada  daerah  di  sekitar  celah/  alur  antar blastomer pada embrio ikan nilem di umur 30 menit dan 60 menit paska fertilisasi. Pada embrio umur 180 menit dan 240 menit paska fertilisasi, embrio dalam tahap blastula hingga gastrula awal, PGCs terdeteksi pada  daerah  ventral  blastoderma  di  area  kutub animalis. Deteksi pada tahapan larva ikan nilem perlu dilakukan  untuk  mengetahui  alur  migrasi  PGCs selama perkembangan embrio.

## Ucapan Terima Kasih
Terimakasih  penulis  sampaikan  kepada  LPPM Universitas  Jenderal  Soedirman.  Penelitian  ini dilaksanakan menggunakan pendanaan LPPM Universitas Jenderal Soedirman skema Riset Dasar.

## DAFTAR REFERENSI
Aalto  A,  Olguin-Olguin  A  and  Raz  E  E.  2021.
Zebrafish  Primordial  Germ  Cell  Migration. Front. Cell Dev. Biol. 9:684460.
Cantú,  A.  V.,  Diana  J.  Laird.  2017.  A  Pilgrim's Progress: Seeking Meaning In Primordial Germ Cell  Migration.  Stem  Cell  Research  (24),  pp. 181–187.
Cao,  M.,  Y.Yang,  H.Xu,  J.  Duan,  N.  Cheng,  J. Wang,W. Hu, H. Zhao. 2012. Germ cell specific expression of Vasa in rare minnow, Gobiocypris rarus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A 162, pp. 163–170.
Coelho,  G.  C.Z.,  I.  S.  Yo,  T.  M.  Mira-López,  P.  S. Monzani,  D.  R.  Arashiro,  T.  Fujimoto,  J.  A. Senhorini and G. S. Yasui. 2019. Preparation Of
A Fish Embryo For Micromanipulation: Staging Of  Development,  Removal  Of  Chorions  And Traceability  Of  PGC  In  Prochilodus  Lineatus. Int. J. Dev. Biol. 63, pp. 57-65.
Denkers,  N.,  P.  G.-Villalba,  Ch.  K.  Rodesch,  K.  R. Nielson,  and  T.  Jo  Mauch.  2004.  FISHing  for
Chick  Genes:  Triple-Label  Whole-Mount Fluorescence  In  Situ  Hybridization  Detects Simultaneous and Overlapping Gene
Expression  in  Avian  Embryos.  Developmental Dynamics 229, pp. 651–657
Habibah,  AN,  Pertiwi  RPC,  Sulistyo  I.  2022. Toksisitas limbah cair batik terhadap perkembangan embrio ikan nilem (Osteochilus vittatus).  Prosiding  Pengembangan  Sumber Daya Perdesaan dan Kearifan Lokal Berkelanjutan  XI.  Purwokerto,  12-13  Oktober 2021.
Lee, S., Woo Young Bang, Hee-Sun Yang, Dae-Sung Lee,  Ha  Yeun  Song.  2021.  Production  Of Juvenile Masu Salmon ( Oncorhynchus masou ) From  Spermatogonia-Derived  Sperm  And Oogonia-Derived  Eggs  Via  Intraperitoneal Transplantation  Of  Immature  Germ  Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications .535
Li, Yu, W. Song, Y. Fei Zhu, T. Yu Zhu, L. Bo Ma, M. You Li. 2019. Evolutionarily conserved vasa identifies embryonic and gonadal germ cells in spinyhead  croaker Collichthys  lucidus .  J  Fish Biol., pp. 1–9.
Lin, F., Qinghua Liu, Mingyou Li, Zhendong Li, Ni Hong,  Jun  Li,  Yunhan  Hong.  2012.  Transient and Stable GFP Expression in Germ Cells by the vasa  Regulatory  Sequences  from  the  Red Seabream  ( Pagrus major ).  Int.  J.  Biol.  Sci.  8 8(6), pp. 882-890
Miguel, M. P. De, Yago Alcaina and Diego Sainz de la  Maza.  2017.  Primordial  Germ  Cell Reprogramming.
Nagasawa,  K.  Jorge  M.O.  Fernandes,  Goro Yoshizaki,  Misako  Miwa,  And  Igor  Babiak. 2013. Identification and Migration of Primordial  Germ  Cells  in  Atlantic  Salmon, Salmo  salar:  Characterization  of  Vasa,  Dead End,  and  Lymphocyte  Antigen  75  Genes. Molecular  Reproduction  &  Development  80, pp. 118–131.
National  Human  Genom  Institute.  2024.  In  Situ Hybridisation. [Online] Tersedia pada: https://www.genome.gov/genetics-glossary/in- situ-hybridization [Diakses 22 Februari 2024].
Yoon,  Ch.,  Koichi  Kawakami  and  Nancy  Hopkins. 1997.  Zebrafish  Vasa  Homologue  RNA  Is Localized To The Cleavage Planes Of 2- And 4- Cell-Stage  Embryos  And  Is  Expressed  In  The
Primordial  Germ  Cells.  Development  124,  pp. 3157-3166.
Nugrahesthi,  G.H.,  Wijayanti,  G.E.  And  Habibah, A.N., 2023. Embryo and larvae development of Nilem Fish, Osteochilus vittatus reared in batik liquid waste. Nusantara Bioscience, 15(1).
Saito,  Taiju,  T.  Fujimoto,  Sh.  Maegawa,  K.  Inoue, Minoru  Tanaka,  Katsutoshi  Arai  and  Etsuro Yamaha.  2006.  Visualization  of  Primordial Germ  Cells  In  Vivo.  Int.  J.  Dev.  Biol.  50,  pp. 691-700.
Simanjuntak SBI, Wijayanti GE. 2005. Penggunaan hormon  untuk  inkubasi  pemijahan  Ikan  Nilem (Osteochilus  hasselti).  Prosiding  Seminar
Nasional Biologi
dan
Akuakultur
Berkelanjutan. Universitas Jenderal Soedirman,
Purwokerto.
Škugor, A. Krasimir Slanchev, J. Seilø Torgersen, H.
Tveiten,  Ø.  Andersen.  2014.  Conserved Mechanisms
for Germ Cell-Specific Localization  of  nanos3  Transcripts  in  Teleost Species  with  Aquaculture  Significance.  Mar Biotechnol, 16, pp. 256–264.
Vauti F, Stegemann LA, Vo¨gele V, Ko¨sterRW.2020.  All-Age  Whole  Mount  In Situ  Hybridization  To  Reveal  Larval  And Juvenile Expression Patterns In Zebrafish. PLoS ONE 15(8): e0237167.
Wang,  X.,  Qinghua  Liu,  Yongshuang  Xiao,  Yang Yang,  Yanfeng  Wang,  Zongcheng  Song,  Feng You,  Hao  An,  Zhizhong  Xiao,  Shihong  Xu, Daoyuan Ma, and Jun Li. 2015. The dnd RNA Identifies  Germ  Cell  Origin  and  Migration  in Olive Flounder ( Paralichthys olivaceus ) BioMed Research International Vol., Article ID 428591, 9
Yoon,  Ch.,  Koichi  Kawakami  and  Nancy  Hopkins. 1997.  Zebrafish  Vasa  Homologue  RNA  Is Localized To The Cleavage Planes Of 2- And 4- Cell-Stage  Embryos  And  Is  Expressed  In  The Primordial  Germ  Cells.  Development  124,  pp. 3157-3166 .
Yoshikawa,H.,  D.  Xu,  Y.  Ino,  T.  Yoshino,  T. Hayashida, J. Wang, R. Yazawa, G. Yoshizaki, and Y. Takeuchi. 2018. Hybrid Sterility in Fish Caused  by  Mitotic  Arrest  of  Primordial  Germ Cells. Genetics Society of America.
Zhou Li, Xueying Wang, Shuran Du, Yanfeng Wang, Haixia  Zhao,  Tengfei  Du1,  ,  Jiachen  Yu,  Lele Wu, Zongcheng Song, Qinghua Liu and Jun Li. 2020.  Germline  Specific  Expression  of  a  vasa Homologue Gene in the Viviparous Fish Black Rockfish  ( Sebastes schlegelii )  and  Functional Analysis  of  the  vasa  30  Untranslated  Region. Front. Cell Dev. Biol., 28 October 2020.