## AKTIVITAS ANTIBAKTERI DAN ANALISIS KLT-BIOAUTOGRAFI DARI
FRAKSI DAUN MENGKUDU ( Morinda citrifolia L.)
Aprilia Pratiwi Aslah 1) , Widya Astuty Lolo 1) , Imam Jayanto 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Noni  is  a  nutritious  plant  because  it  has  several  ingredients  that  are  important  for  health.  Antibacterial components in noni leaves include glycosides, acubins, saponins and flavonoids. The purpose of this study was to determine the fraction of the extract of noni leaf ethanol whether it has an antibacterial effect and know the class of compounds indentifed as having antibacterial activity after TLC-Bioautografi testing was carried out. The samples were extracted using maceration method with 96% ethanol solvent and fractionation using liquid- liquid fractionation method with methanol, ethyl acetat and n-hexane solvents. Antibacterial activity testing was carried out with concentration variants of 20%, 30% and 40% with agar diffusion method (Kirby and Bauer). The  results  showed  that  methanol  fraction,  ethyl  acetat  fraction  and  Noni  hexane  leaf  fraction  effectively inhibited Staphylococcus aureus and Escherichia coli bacteria. The largest fraction of inhibiting zone was the concentration  of  40%  methanol  which  was  categorized  as  strong.  TLC  monitoring  was  carried  out  using  the mobile phase of chloroform : n-hexane (2:1). Antibacterial activity testing carried out by contact bioautography method  showed  that  there  were  spots  on  the  TLC  choromatogram,  which  produced  inhibitory  zones. Characteristics  of  blotches  were  performed  with  AlCl 3 spotting  and  it  was  thought  that  the  spots  were flavonoids.
Keywords : Noni, Antibacterial, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, TLC-Bioautografi.

## ABSTRAK
Mengkudu merupakan tanaman yang berkhasiat karena mempunyai beberapa kandungan senyawa yang penting bagi kesehatan tubuh. Komponen yang berkhasiat antibakteri dalam daun mengkudu antara lain adalah glikosida, acubin,  saponin  dan  flavonoid.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  fraksi  dari  esktrak  etanol daun  mengkudu  apakah  memiliki  efek  antibakteri  dan  mengetahui  golongan  senyawa  yang  teridentifikasi memiliki aktivitas antibakteri setelah dilakukan pengujian KLT-Bioautografi . Sampel diekstraksi menggunakan metode  maserasi  dengan  pelarut  etanol  96%  dan  fraksinasi  dengan  metode  fraksinasi  cair-cair  dengan  pelarut metanol, etil asetat dan n-heksan. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan varian konsentrasi 20%, 30% dan  40%  dengan  metode  difusi  agar  (Kirby  dan  Bauer).  Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa  fraksi  metanol, fraksi  etil  asetat  dan  fraksi  n-heksan  daun  Mengkudu  efektif  menghambat  bakteri staphylococcus  aureus dan Escherichia  coli. fraksi  yang  paling  besar  zona  hambatnya  yaitu  fraksi  metanol  konsentrasi  30%  yang dikategorikan kuat, dilakukan pemantauan KLT menggunakan fase gerak kloroform : n-heksan (2:1). Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode bioautografi kontak hasilnya menunjukkan terdapat bercak pada kromatogram  KLT  yang  menghasilkan  zona  hambat.  Karakteristik  bercak  dilakukan  dengan  penampak  bercak AlCl 3 dan diduga bahwa bercak tersebut Flavonoid.
Kata kunci : Mengkudu , Antibakteri, Staphylococcus aureus, Escherichia coli , KLT-Bioautografi

## PENDAHULUAN
Penggunaan  bahan  alami  sebagai  zat hambat  mikroorganisme  adalah  langkah kembali ke alam untuk memanfaatkan bahan alami. Senyawa dalam tumbuhan, mengharuskan kita untuk mengetahui senyawa  kimia  yang  mampu  memberikan efek terapi.
Mengkudu  merupakan  tanaman  khas Indonesia  yang  telah  dimanfaatkan  untuk berbagai  pengobatan.  Daun  mengkudu mengandung  senyawa  kimia  yang  sangat bermanfaat  bagi  manusia  dan  banyak mengandung  protein,  zat  kapur,  zat  besi, karoten, askorbin, alkaloid, saponin, flavonoid,  polifenol,  alizarin,  antraquinon, scolopetin, acubin, imunostimulan (Sastrohamidjojo,  1996).  Sebagai  salah  satu spesies  tanaman  obat  daun  mengkudu  telah diuji  klinis  menyangkut  kandungan  kimia, khasiat dan keamanan penggunannya (Rukmana, 2010).
Hasil  penelitian  Diassanti  (2011), menyatakan bahwa daun mengkudu memiliki kandungan  saponin,  flavonoid,  polifenol, tanin,  dantriterpen.  Zat  aktif  tersebut  dapat menghambat  pertumbuhan  terhadap  bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
Hasil  penelitian  Djauharia  (2003),  telah membuktikan  bahwa  pada  daunmengkudu terdapat  senyawa  aktif  yang  berfungsi sebagai zat antibakteri.
Penggunaan  ekstrak  daun  mengkudu juga  telah  dilakukan  oleh  Widiana  (2011), hasilnya  ekstrak  tersebut  juga  berpengaruh terhadap  pertumbuhan Escherichia  coli dan Salmonella  sp .  Penelitian  yang  dilakukan oleh Jayaraman (2008) menunjukkan bahwa ekstrak  mengkudu  memiliki  efek  anti  jamur terhadap Candida  albicans,  Tricophyton
mentagrophytes,  Penicillium  sp.,  Rhizopus, Aspergilus  plavus, dll.  Selain  itu  juga memiliki efek anti bakteri terhadap
Pseudomonas
aeruginosa,
Proteus morganii,  Staphylococcus  aureus,  Bacillus subtilis dan Escherichia coli, Salmonella sp. dan Shigella sp . Berdasarkan penelitian adanya aktivitas  antibakteri  dan  kandungan  kimia daun  mengkudu  yang  memiliki  senyawa bioaktif  alami.  Hal  ini  perlu  dilakukan penelitian lanjutan terhadap daun mengkudu dengan  menguji  aktivitas  antibakteri  dan analisis  KLT-Bioautografi  dari  senyawa aktif tersebut.

## METODOLOGI PENELITIAN

## Waktu dan Tempat

## Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada bulan  Februari  sampai  April  2019.  Tempat pengambilan  sampel  dilakukan  di  desa Amongena  1,  Kecamatan  Langoan  Timur, Kabupaten  Minahasa.  Preparasi  sampel  dan pengamatan  dilakukan  di  Laboratorium Penelitian  Farmasi  Lanjutan,  Program  Studi Farmasi,  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sam Ratulangi Manado.

## Bentuk Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  dengan menggunakan  metode  eksperimental  yang artinya penelitian  ini  dilakukan  untuk mengetahui  akibat  yang  ditimbulkan  dari suatu  perlakuan  yang  diberikan  secara sengaja oleh peneliti.

## Alat dan Bahan
a. Alat
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  yaitu  jas  lab,    masker,  sarung  tangan, gunting,  alat maserasi, autoklaf, cawan petri ( Normax ),  cawan  porselin,  chamber,  gelas Erlenmeyer  ( pyrex ),  gelas  kimia  ( pyrex ), gelas ukur ( pyrex ), tabung reaksi, rak tabung reaksi,  corong  pisah,  pinset,  pembakar spritus, inkubator, lemari pendingin, blender,    batang  pengaduk,  oven,  lampu spiritus,  lampu  UV  254  nm  dan  366  nm, Laminary  Air  Flow(N  Biotek ),  aluminium foil,  micropipet, pipet tetes, spatula, penangas air, rotary evaporator , vial, jangka sorong,  jarum  ose,  lempeng  KLT,    pipa kapiler.
b. Bahan
Bahan  yang  digunakan  adalah  sampel ekstrak  daun  mengkudu  ( Morinda  citrifolia L), akudes, bakteri uji Escherchia coli (gram negatif)  dan Staphylococcus  aureus (gram positif),  Medium Nutrient  Agar (NA), Kloramfenikol paper  disk ,  cakram  ( paper disk ),  n-heksan,    etil  asetat,    etanol,    label, tissue , aluminium  foil ,  kertas  saring,  kapas, larutan  H 2 S0 4 1%  ,  Larutan  BaCl 2 +    2H 2 O 1,75% , pereaksi AlCl 3

## Prosedur Penelitian

## Ekstraksi
Sampel  diekstraksi  dengan  metode maserasi  menggunakan  pelarut  etanol  96%. Serbuk  ditimbang  sebanyak  600  g  dan dimasukkan kedalam wadah maserasi kemudian  ditambahkan  pelarut  etanol  96% sebanyak  1,8  L  dan  ditutup  dengan aluminium  foil dan  dibiarkan  selama 3  hari sambil  sesekali  didaduk.  Setelah  3  hari,
sampel  yang  direndam  disaring  dengan menggunakan  kertas  saring  menghasilkan filtrat  1  dan  debris  1.  Kemudian  dilakukan remaserasi  selama  2  hari  dengan  merendam debris 1 dengan etanol 96% sebanyak 1,2 L. kemudian Sampel tersebut disaring menggunakan  kertas  saring  menghasilkan filtrat  2  dan  debris  2.  Filtrat    1  dan  2 dicampur  menjadi  satu  kemudian  disaring, lalu hasil penyaringan dipekatkan menggunakan oven sehingga  diperoleh ekstrak  kental  sebanyak  36  g,  kemudian ekstrak  disimpan  dalam  wadah,  sebelum digunakan untuk pengujian.

## Fraksinasi
Fraksinasi  sampel  dilakukan  dengan metode  fraksinasi  cair-cair  menggunakan corong  pisah . Dengan  menggunakan  tiga pelarutyaitu  n-heksan,  etil  asetat,  dan metanol.  Sebanyak  10,00  g  ekstrak  kental dimasukkan  kedalam  Erlenmeyer  dan  di larutkan  dengan  metanol  sebanyak  100  mL. Setelah sampel larut, sampel dimasukkan ke dalam corong pisah dan ditambahkan pelarut n-heksan  sebanyak  100  mL.  Sampel kemudian  dikocok  berulangkali  dalam corong  pisah  hingga  homogen.  Sampel dibiarkan  hingga  membentuk  dua  lapisan yaitu lapisan metanol dan n-heksan. Masing- masing  kedua  lapisan  metanol  dan              n- heksan  ditampung  dalam  wadah  yang berbeda.  Lapisan  n-heksan  selanjutnya dipekatkan  menggunakan oven hingga kering  lalu  ditimbang  dengan  timbangan analitik dan diperoleh fraksinat.
Selanjutnya lapisan metanol dimasukkan  kedalam  corong  pisah  dan ditambahkan pelarut etil asetat sebanyak 100 mL.  Sampel  dibiarkan  membentuk  dua
lapisan yaitu lapisan metanol dan lapisan etil asetat. Masing-masing kedua lapisan metanol  dan  etil  asetat  ditampung  dalam wadah yang berbeda. Lapisan etil asetat dan metanol
selanjutnya dipekatkan menggunakan oven hingga  kering  lalu ditimbang  dengan  timbangan  analitik  dan diperoleh fraksinat.

## Sterilisasi dan Pembuatan Media Sterilisasi Alat
Alat-alat  gelas  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  disterilkan  terlebih dahulu  dengan  menggunakan  autoklaf  pada suhu  121 0 C  selama  15  menit.  Pinset,  jarum ose, dan L glass dipijarkan diatas api bunsen dan media disterilkan di autoklaf pada suhu 121 0 C selama 15 menit.
Pembuatan Media Nutrient Agar Ditimbang sebanyak 10,08 g nutrient agar kemudian  dilarutkan  dengan  aquades sampai  120  mL,  diaduk  sampai  homogen. Media  yang  telah  homogen  kemudian disterilkan  dengan  menggunakan  autoklaf pada  suhu  121 0 C  selama  15  menit  dan dibiarkan  media  sampai  cukup  dingin. Selanjutmya  media nutrient  agar yang masih  cair  dituang  sebanyak  18  mL  ke dalam cawan petri dibiarkan hingga memadat.

## Pembuatan Media Agar Miring
Pembuatan  agar  miring  dilakukan dengan  memasukkan  10  mL  media  yang telah  disterilkan  dalam  tabung  reaksi kemudian  disumbat  dengan  kapas  steril  dan dimiringkan  sekitar  45 0 .  Diidiamkan  hingga memadat  pada  suhu  ruangan.  Media  agar miring digunakan sebagai peremajaan bakteri.

## Pengujian Aktivitas Antibakteri
Pembuatan  Larutan  standar  Mc  Farland 0,5
Larutan  H 2 S04  1%  sebanyak  9,95 mL dicampurkan dengan larutan BaCl 2. .2H 2 O  1,75%  sebanyak  0,05%  mL dalam  Erlenmeyer.  Kemudian  dikocok sampai terbentuk larutan yang keruh sebagai standar kekeruhan suspensi mikroba uji.

## Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Bakteri  uji  yaitu Staphylococcus aureus dan Escherichia  coli yang  telah diinokulasi  diambil  kurang  lebih  1  ose kemudian  disuspensikan  ke  dalam  tabung yang  berisi  10  mL  larutan  NaCL  0,9%. Selanjutnya  dibandingkan  dengan  standar kekeruhan larutan Mc Farland 0,5.

## Kontrol Positif dan Kontrol Negatif
Kontrol  Positif  untuk  pengujian aktivitas antibakteri ini menggunakan Kloramfenikol paper disc dan untuk kontrol negatif menggunakan akuades

## Pembuatan Larutan Uji
Dibuat larutan stok dengan konsentrasi 100% dengan cara ditimbang 1 g fraksi metanol, fraksi etil asetat dan fraksi n- heksan  kemudian  masing-masing  dilarutkan dengan  akuades  hingga  1  mL.  Larutan  uji fraksi  metanol,  fraksi  etil  asetat,  fraksi  n- heksan    20%,  30%  dan  40%  dibuat  dengan cara  mengambil  masing-masing  sebanyak 0,2  mL,  0,3  mL,  0,4  mL  untuk  setiap konsentrasinya  dan  dicukupkan  volumenya dengan akuades hingga 1 mL.

## Pengujian Aktivitas Antibakteri
Pada penelitian ini digunakan metode difusi agar ( disc diffusion Kriby and Bauer ).  Aktivitas  penghambatan  diuji  pada bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Escherichia coli ATCC 25922. Digunakan kertas cakram yang berukuran  6 mm  untuk    pengujian  aktivitas  antibakteri. Suspensi  bakteri  kemudian  diinokulasikan ke  dalam  media  dengan  menggunakan L- glass dan dihomogenkan. Sampel yang telah ditentukan  konsentrasinya  20%,  30%,  dan 40%  selanjutnya  ditotolkan  pada  masing- masing  kertas  cakram.  Masing-masing cawan  petri  diberi  label  sesuai  dengan komponen  pengujian.  Kertas  cakram  yang terdiri  dari  kontrol  positif,  kontrol  negatif dan  kertas  cakram  yang  telah  ditotolkan larutan  uji  diletakkan  dalam  cawan  petri dengan  menggunakan  pinset  lalu  diinkubasi selama 1 x 24 jam.
Pengamatan dan Pengukuran Zona

## Bening
Pengamatan dilakukan setelah 1 x 24 jam  masa  inkubasi.  Zona  bening  yang terbentuk  sekitaran  cakram  menunjukkan kepekaan  bakteri  terhadap  antibiotik  atau larutan  uji  antibakteri  sebagai  bahan  uji. Diameter  zona  bening  diukur  dalam  satuan milimeter (mm) menggunakan jangka sorong.  Kemudian  zona  bening  yang  telah diukur dibandingkan berdasarkan pedoman.

## Pengujian Fraksi Teraktif dengan Metode KLT-Bioautografi
Fraksi  yang  memiliki  zona  hambat yang  paling  besar  dilakukan  pemantauan KLT.  Kemudian  hasil  pemantauan  KLT dilakukan  pengujian  aktivitas  antibakteri dengan metode KLT-Bioautografi.

## Persiapan Plat KLT
Pemisahan  senyawa  dari  fraksi teraktif dilakukan dengan menggunakan plat silika  sebagai  fase  diam  dengan  ukuran  1  x 10  cm.  Selanjutnya  diberi  tanda  garis  pada tepi  atas  dan  bawah  plat  dengan  jarak  1  cm untuk  menunjukkan  posisi  awal  totolan  dan tepi  atas  sebagai  tanda  batas  dari  proses elusi.  Selanjutnya  plat  diaktifkan  dengan cara dipanaskan pada suhu 105 0 C selama 10 menit  untuk  menghilangkan  kadar  air  yang terdapat pada plat KLT.

## Persiapan Fase Gerak (Eluen)
Eluen  yang  digunakan  sebagai  fase gerak  yaitu  kloroform  :  n-heksan  (2:1). Eluen yang berada dalam chamber dijenuhkan terlebih dahulu dengan menggunakan kertas saring selama 10 menit, agar menyamakan tekanan uap pada seluruh bagian bejana.

## Penotolan Sampel Fraksi
Fraksi  metanol  dengan  konsentrasi 30%  ditotolkan  pada  tiga  lempeng  yang berbeda  dengan  jarak  1  cm  dari  tepi  bawah plat  dengan  menggunakan  pipa  kapiler. Kemudian dikeringkan dengan cara diangin- anginkan. Lempeng pertama diamati dengan lampu  UV  254  nm  dan  lampu  UV  366  nm. Lempeng kedua disemprotkan reagen Aluminium  Klorida  (AlCl 3 )  untuk  melihat senyawa  flavonoid  dan  lempeng  ke  tiga digunakan untuk uji bioautografi.

## Uji Bioautografi
Sebanyak  10  ml  medium nutrient agar dituangkan  ke  dalam  cawan  petri secara  aseptis  dan  dibiarkan  sampai  media memadat kemudian sebanyak 20 μl mikroba
uji diinokulasi ke dalam media . Kromatogram  hasil  pemisahan  senyawa secara  KLT  kemudian  diletakkan  di  atas permukaan medium yang memadat. Didiamkan  selama  30  menit  dilemari pendingin, kemudian lempeng (kromatogram)  diangkat  dan  dikeluarkan dari medium. Selanjutnya diinkubasi selama 1  x  24  jam  pada  suhu  37 0 C  untuk pengamatan hasil.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi dan Fraksinasi
Sampel  daun  Mengkudu  dibersihkan dari  kotoran  yang  menempel  disekitarnya. Kemudian  dikeringkandi  tempat  yang  tidak terkena sinar matahari secaralangsung untuk mencegah adanya senyawa kimia yang rusak akibat terkena sinarmatahari langsung.Sampel daun Mengkudu
selanjutnya  diekstraksi  dengan  metode maserasi  yang  diperkirakan  tidak  dapat merusak senyawa kimia yang terdapat dalam sampel. Maserasi dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol 96% dan dalam ruangan tertutup untuk menghindari pengaruh  cahaya  (sinar  matahari)  terhadap stabilitas  senyawa-senyawa  yang  akan diambil.
Perendaman  sampel  dalam  maserasi dapat  membuat  dinding  sel  dari  sampel pecah dan membuat  senyawa-senyawa  yang ada  dalam  sampel  yang  terdapat  dalam sitoplasma  akan  tertarik  oleh  pelarut. Dinding  sel  pecah  di  karenakan  adanya perbedaan  konsentrasi  di  dalam  dan  di  luar sel.  Konsentrasi  di  luar  sel  lebih  tinggi dibandingkan  konsentrasi  di  dalam sel  yang rendah  sehingga  dinding  sel  pecah  karena tidak  bisa  menahan  tekanan  dari  perbedaan
konsentrasi  (Harbone,1996).  Sampel  yang telah  di  maserasi  selama  3  hari  kemudian dilakukan remaserasi kembali dengan penggantian  pelarut  sebanyak  dua  kali dengan pelarut etanol. Maserasi lebih efisien dilakukan  berulangkali  dibandingkan  hanya sekali (Khopkar, 2008 dalam Mujipradhana, 2018).
Hasil  maserasi  kemudian  disaring dan dilakukan pemekatan. Pemekatandilakukan  dengan  bantuan oven dengan  suhu  40 0 C.  Zat  yang  bersifat termolabil  harus  dipekatkan  dengan  suhu dibawah titik didihnya. Sehingga kandungan senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam pelarut tidak mengalami kerusakan oleh suhu yang tinggi (Hermansah et al., 2015).
Pada penelitian ini fraksinasi dilakukan dengan metode fraksinasi cair-cair yaitu metode pemisahan dengan menggunakan  dua  cairan  yang  tidak  saling bercampur. Pelarut dengan massa jenis lebih tinggi  berada  di  lapisan  bawah  sedangkan pelarut  dengan  massa  jenis  lebih  kecil berada di lapisan atas. Fraksi yang diperoleh di uapkan menggunakan oven dan digunakan untuk uji aktivitas antibakteri.

## Uji Aktivitas Antibakteri Mengkudu
Pengujian  aktivitas  antibakteri  dari fraksi  metanol,  fraksi  etil  asetat,  dan  fraksi n-heksan  pada  bakteri  uji Staphylococcus aureus dan Escherichia  coli menggunakan metode difusi agar (difusi Kirby dan Bauer). Bakteri uji yang digunakan adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli . Penggunaan  bakteri  ini  bertujuan  untuk mengetahui apakah fraksi dari daun mengkudu  memiliki  aktivitas  antibakteri
serta  untuk  mengetahui  apakah  fraksi  dari mengkudu bersifat spektrum luas.
Dalam pengujian yang telah dilakukan  hasil  yang  didapat  yaitu  adanya zona  hambat  disekeliling  cakram  yang ditandai dengan adanya zona bening. Hal ini menunjukan  adanya  kepekaan  bakteri  uji terhadap fraksi dari Mengkudu dan antibiotik  yang  digunakan  sebagai  kontrol positif. Pengamatan dilakukan setelah diinkubasi  pada  suhu  37 0 C  selama  1  x  24 jam  dengan  pengulangan  sebanyak  tiga  kali pada masing-masing bakteri uji, pengulangan  yang  dilakukan  untuk  lebih mengakuratkan hasil yang diperoleh.
Dalam pengujian ini dilakukan pada variasi  konsentrasi  20%,  30%  dan  40%, pengujian  antibakteri  menggunakan  variasi konsentrasi  ini  dilakukan  untuk  mengetahui pengaruh dari pemberian konsentrasi ekstrak yang  berbeda  terhadap  bakteri  uji.  Hasil pengukuran rata-rata diameter daya antibakteri  dari  fraksi  metanol,  fraksi  etil asetat dan     fraksi n-heksan terhadap bakteri uji Staphylococcusaureus dan Escherichia coli dapat dilihat pada Tabel 1 dan Tabel 2.
Tabel  1.  Hasil  rata-rata  diameter  zona  hambat terhadap  bakteri  uji Staphylococcus aureus .
Tabel  2.  Hasil  rata-rata  diameter  zona  hambat terhadap bakteri uji Escherichia coli
Pada penelitian ini fraksi n-heksan, fraksi  etil  asetat  dan  fraksi  metanol  lebih efektif  menghambat  pertumbuhan  bakteri Escherichia coli dibandingkan bakteri Staphylococcus aureus. Respon yang berbeda  dari  dua  bakteri  ini  terhadap senyawa  antibakteri  disebabkan  karena adanya  perbedaan  komposisi  dan  struktur dinding sel.
Menurut  Radji  (2012),  perbedaan struktur  dinding  sel  bakteri  Gram  negatif dan  bakteri  Gram  positif  mempengaruhi sensitivitas  terhadap  bakteri.  Dinding  sel bakteri  Gram  positif  terdiri  atas  sekitar  40 lapisan peptidoglikan sehingga peptidoglikan  mencapai  70%  dari  massa kering  dinding  sel.  Hal  ini    menyebabkan dinding sel menjadi tebal dan kaku. Berbeda dengan  bakteri  gram  negatif  yang  memiliki dinding sel peptidoglikan hanya sekitar 10% dari  massa  kering  dinding  sel,  sehingga menyebabkan  dinding  sel  bakteri  Gram negatif  lebih  tipis  (Pelczar,  1988).  Bakteri Gram  negatif  mempunyai  kandungan  lipid yang  banyak  serta  memiliki  protein  porin yang berperan sebagai saluran masuknya zat aktif  ke  dalam  sel  bakteri.  Masuknya  zat aktif  ini  merusak  aktivitas  enzim  dalam  sel dan menyebabkan kerusakan sel. Kadar lipid yang  tinggi  didalam  sel  akan  meningkatkan
permeabilitas  zat  aktif  kedalam  sel  (Ardila, et al ., 2013).
Hasil yang diperoleh dari pengukuran  rata-rata  zona  hambat  diketahui bahwa  fraksi  metanol  dan  fraksi  etil  asetat dengan  konsentrasi  30%  dan  40%  terhadap bakteri  uji Escherichia  coli digolongkan kategori  kuat.  Fraksi  metanol dan fraksi  etil asetat  dengan  konsentrasi  20%  digolongkan kategori  sedang.  Untuk  fraksi  n-heksan konsentrasi  40%  digolongkan  kategori  kuat dan  fraksi  n-heksan  20%  dan  30% digolongkan  kategori  sedang.  Untuk  bakteri uji Staphylococcus  aureus ditunjukkan hanya  fraksi  metanol  dengan  konsentrasi 40%  digolongkan  kategori  kuat.  Sedangkan untuk  fraksi  yang  lainnya  dikategorikan sedang.  Dilihat  dari  hasil  yang  ada menunjukkan ketiga fraksi bersifat spektrum luas,  artinya  kandungan  senyawa  yang terkandung  memiliki  antibakteri  terhadap bakteri  Gram  positif  maupun  bakteri  Gram negatif.
Diameter zona hambat yang ditunjukkan  pada  fraksi  metanol  lebih  besar dari  pada  fraksi  etil  asetat  dan  fraksi  n- heksan.  Hal  ini  disebabkan  karena  daun mengkudu mengandung senyawa antibakteri yang  bersifat  polar  seperti  flavonoid, glikosida  dan  tannin.  Sehingga  fraksi metanol lebih mudah menarik senyawa polar yang  terkandung  dalam  daun  mengkudu (Sitepu, 2012).
Kemampuan  suatu  bahan  antibakteri dalam meniadakan kemampuan hidup organisme  tergantung  pada  konsentrasi bahan  yang  digunakan  (Schlegel,  1994). Berdasarkan  hasil  uji  aktivitas  antibakteri pada  Tabel  1  dan  Tabel  2,  menunjukkan diameter  zona  hambat  pertumbuhan  bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli yang  terbentuk  pada  konsentrasi  40%  lebih besar dibandingkan konsentrasi ekstrak 20% dan  30%.  Menurut  Ajizah  (2004),  bahwa semakin  besar  konsentrasi  suatu  bahan antibakteri  yang  diberikan  maka  aktivitas antibakteri  semakin  besar  pula.  Semakin tinggi  konsentrasi  ekstrak  maka  kandungan senyawa  fitokimia  berkhasiat  antibakteri juga akan semakin banyak.
Kriteria kekuatan daya hambat antibakteri  yaitu diameter zona hambat  < 5 mm dikategorikan lemah, zona hambat 5-10 mm  dikategorikan  sedang,  zona  hambat  10- 20  mm  dikategorikan  kuat  dan  >  20  mm dikategorikan  sangat  kuat  (Davis  dan  Stout 1971).
Pengujian Fraksi Teraktif Dengan Metode KLT-Bioautografi
Pengujian  secara  KLT-Biautografi dilakukan  terhadap  fraksi  metanol  secara kromatografi  lapis  tipis.  Pengujian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  kandungan senyawa yang terdapat dalam fraksi metanol daun  Mengkudu  pada  kromatogram  dengan melihat  zona  hambat  yang  terbentuk  pada media agar. Pengujian ini  dilakukan dengan menggunakan  lempeng  KLT  yang  telah diberi  tanda batas bagian bawah dan bagian atas lempeng sebagai tanda batas elusi. Jarak elusi  yang  dibuat  adalah  8  cm  dengan harapan  jarak  ini  cukup  untuk  memisahkan senyawa-senyawa  yang  akan  terelusi  pada plat  KLT.  Lempeng  KLT  yang  akan digunakan  sebelumnya  dipanaskan  terlebih dahulu dengan suhu 105 0 C selama 10 menit yang  bertujuan  untuk  menghilangkan  kadar air yang terdapat dalam lempeng (Sastrohamidjojo, 1991).
Pemisahan  senyawa  fraksi  metanol menggunakan
perbandingan eluen kloroform : n-heksan (2:1). Pemilihan eluen ini  didasarkan  pada  hasil  orientasi  eluen yang  telah  dilakukan  yang  dimana  pada eluen  ini  menghasilkan  pemisahan  terbaik dengan  jumlah  noda  terbanyak  setelah dideteksi  bercak  pada  lampu  UV  254  nm dan 366 nm.
Menurut
Saifudin (2014), karakterisitik  eluen  yang  baik  ditandai dengan  banyaknya  spot  yang  muncul,  spot yang  terbentuk  tidak  berekor,  dan  jarak antara spot satu dengan spot lainnya jelas.
Selanjutnya dilakulan pengujian bioautografi  yang  merupakan  pengujian lanjutan.  Pada  penelitian  ini  digunakan metode  bioautografi  kontak,  metode  ini menjadi  pilihan  karena  mempertimbangkan kesederhanaan dalam pengerjaan, dan hasilnya  lebih  jelas  terlihat.  Lempeng  yang telah  dielusi  dikontakkan  dipermukaan media padat berisikan masing-masing inokulasi bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli selama 30 menit.  Lempeng kemudian  diangkat  dari  media  dan  media agar diinkubasi selama 1 x 24 jam, sehingga diperoleh  zona  hambatan  dipermukaan media  bekas  lempeng  dikontakkan  yang menunjukkan  lokasi  dari  senyawa  yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antibakteri. Dari hasil KLT-Bioautografi
menunjukkan  bahwa  terdapat  zona  hambat pada  kedua  bakteri  uji.  Pada  bakteri Escherichia  coli zona  hambat  terbesar  yang muncul terdapat pada bercak dengan nilai Rf 0,00 sedangkan pada bakteri Staphylococcus aureus menunjukkan  adanya  zona  hambat
terbesar  ditunjukkan  pada  bercak  dengan nilai Rf 0,38.

## Identifikasi Senyawa Aktif
Untuk  mengetahui  senyawa  yang diduga memiliki aktivitas antibakteri terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus dan Escherichia coli , maka dilakukan identifikasi  senyawa.  Menurut  Rukmana (2010)  senyawa  dari  daun  mengkudu  yang memiliki  aktivitas  antibakteri  antara  lain adalah  flavonoid,  glikosida  dan  saponin. Flavonoid  merupakan  senyawa  polifenol yang  mempunyai  fungsi  sebagai  senyawa antibakteri dengan cara mengganggu intergritas membran sel bakteri (Wijayati, et al ., 2014).
Dari hasil pengamatan yang dilakukan  dengan  menggunakan  penampak bercak  Aluminium  Klorida  (AlCl 3 )  terlihat terjadi  perubahan  warna  pada  bercak  pada nilai  Rf    0,00,  0,31,  0,38,  0,62    menjadi warna  kuning.  Menurut  penelitian  yang dilakukan  Irwan (2017),  menyatakan bahwa penyemprotan dengan pereaksi AlCl 3 ditandai dengan warna noda menjadi kuning sehingga  menunjukkan  bahwa  senyawa tersebut positif flavonoid. Menurut Markham  (1998),  flavonoid  merupakan senyawa  polar  maka  umumnya  flavonoid cukup  larut  dalam  pelarut  polar  seperti etanol,  metanol,  butanol,  aseton  dan  air. Adanya  gula  yang  terikat  pada  flavonoid cenderung  menyebabkan  flavonoid  mudah larut dalam pelarut polar.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa :
1. Fraksi  n-heksan,  fraksi  etil  asetat  dan fraksi metanol memiliki aktivitas antibakteri terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus  aureus dan Escherichia  coli dengan  zona  hambat paling besar pada konsentrasi 40%.
2. Senyawa aktif daun Mengudu ( Morinda citrifolia  L .)  yang  berperan  sebagai antibakteri  pada  fraksi  metanol  diduga positif mengandung senyawa Flavanoid.

## SARAN
Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut  untuk  uji  KLT-Bioautografi  dengan menggunakan  metode  KLT-Bioautografi langsung.

## DAFTAR PUSTAKA
Ajizah,  A.  2004.  Sensitivitas Salmonellan thypimurium Terhadap Ekstrak Daun
( Psidium guajaya L ). Jurnal
Bioscientiae .7( 1 ) : 31-38.
Ardila, R., Nurmiati., Agustien A. 2013. Uji Antimikroba Curcuma spp. Terhadap
Pertumbuhan Candida albicans, Staphylococcus aureus dan Escherichia  coli . Jurnal  Biologi UNAND . 2( 1 ) : 1-7.
Davis,  W.W.,  Stout,  T.R.  1971.  Disc  Plate
Method of Microbiological Assay. Journal of microbiology . 22 (4):659-665.
Diassanti, A. 2011. Uji Ekstrak Etanol Daun
Mengkudu (Morinda citrifolia) sebagai Antimikroba terhadap Methicillin  Resistant  Staphylococcus aureus (MRSA)  Secara  In  Vitro [Skripsi].  Fakultas  Matematika  dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawiijaya, Malang.
Harborne,  J.B.  1987. Metode  Fitokimia . Edisi II. ITB press, Bandung.
Hermansah, A., Harlia., Zahara, T. A. 2015.
Skrinning Fitokimia dan Uji
Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Kulit Batang  Laban  (Vitex  Pubescens Vahl). Jurnal  Kimia  Khatulistiwa .  4 ( 2 ) : 69-70.
Khopkar,  S.M.  2008. Konsep  Dasar  Kimia
Analitik . UI Press, Jakarta. Markham, K.R. 1998. Cara Mengidentifikasi Flavonoid . ITB Press, Bandung.
Mujipradhana, V., Defny, W., Edi, S. 2018.
Aktivitas  Antimikroba  dari  Ekstrak ascidian herdmania momus pada Mikroba  Patogen  Manusia. Jurnal Pharmacon. 7 ( 3 ).
Pelczar, M. J., Chan, E. C. S., 1988. Dasar-
Dasar Mikrobiologi . UI Press, Jakarta.
Radji,  M.  2011. Bukui  Ajar  Mikrobiologi Panduan  Mahasiswa  Farmasi  dan Kedokteran . Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Rukmana,  R.  2010. Mengkudu  Budi  Daya dan  Prospek  Agribisnis .  Kanisius, Yogyakarta.
Saifudin,  Aziz.  2014. Senyawa  Alam Metabolit  Sekunder  Teori,  Konsep dan Teknik Pemurnian . Budi Utama, Yogyakarta.
Sastromidjojo,  H.  1991. Kromatografi . Liberty. Yogyakarta.
Schlegel,  H.  G.  1994. Mikrobiologi  Edisi
Keenam . UGM Press, Yogyakarta.
Sitepu., Josua. 2012. Perbandingan
Efektifitas  Daya  Hambat  terhadap Staphylococcus Aureus dari Berbagai Jenis Ekstrak Buah Mengkudu
( Morinda  Citrofolia  L .)  (In  vitro) [Skripsi].  Fakultas  Matematika  dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.
Voight,  R.  1994. Buku  Pelajaran  Teknologi Farmasi . UGM Press, Yogyakarta.
Widiana,  R.,    Gustiana,  I.,  Harsinta,  N.
2011.  Daya  Hambat  Ekstrak  Daun
Mengkudu  ( Morinda  citrifolia  L.) Terhadap Pertumbuhan Bakteri Penyebab Diare. Jurnal Saintek . 3( 1 )
: 60-64.
Wijayati,
B.A., Citraningtyas, G., Wehantouw, F. 2014. Potensi Ekstrak  Etanol  Tangkai  Daun  Talas ( Colocasia  Esculenta  L.) Sebagai Alternatif  Obat  Luka  Pada  Kulit Kelinci, Jurnal Pharmacon 3( 3).