Sudirman Numba : Analisis Pola Segregasi DNA Genom Kloroplas Hasil Hibridasi Somatik Tanaman Kentang Menggunakan Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

## ANALISIS POLA SEGREGASI DNA GENOM KLOROPLAS HASIL HIBRIDISASI SOMATIK TANAMAN KENTANG MENGGUNAKAN TEKNIK
RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA)
(Analysis of Chloroplast Genome Segregation Pattern in the Somatic Hybridization Potato Using Rflp Method from Amplified Polymerase Chain Reaction (PCR))
Sudirman Numba*

## *)Study Program of  Agrotechnology, Agriculture Faculty, UMI Makassar

## ABSTRACT
Segregation pattern of the chloroplast genome in  somatic hybridization potato between S. tuberosum cv. BF-15  and  the  wild  species  of  S.  stenotomum  was  identified  through  RFLP  analysis  in  3.2  kb  fragment produced  from  PCR  amplification  for  specific  regions  of  DNA  chloroplast.  PCR  amplification  was performed  by  using  rbcL  primer  and  ORF106,  i.e.  specific  primer  located  on  konsenrvatiive  sequence which flanking 3.2 kb fragment region of DNA chloroplast. PCR amplification product used two primers, in conformity with the target region on DNA chloroplast, where generated fragments or DNA bands with a  size  of  about  3.2  kb.  The  3.2  kb fragment  produced  from  amplification  was  cut  by  using  two  kinds  of restriction enzymes HhaI and RSAI.  Restriction Enzym treatment  with HhaI resulted in four bands each measuring; those  were 2.0 kb, 1.2 kb, 0.8 kb and 0.4 kb.  While the  treatments  by using  RSAI restriction enzymes, also resulted in four bands each measuring, those were 1.6 kb, 0.7 kb, 0.3 kb and 0.2 kb. Band pattern that produced from restriction enzyme showed that monomorphic nature or not polymorphic at all elder  fusion  plant,  so  this  method  can  not  be  used  to  identify  the  patterns  of  chloroplast  genome segregation in plant which is produced by somatic hybridization.
Keywords : DNA chloroplast, rbcL (ribulose 1.5-bisphosphate carboxylase gene), Open reading frame 106 (ORF106), PCR, RFLP, S.tuberosum, S. stenoton

## PENDAHULUAN
Informasi mengenai pola segregasi material  genetik  organel  sel,  khususnya genom  kloroplas  pada  tanaman  hibrida somatik sangat diperlukan, karena beberapa  sifat  agronomi  yang  penting disandikan  oleh  genom  kloroplas.    Selain itu genom kloroplas lebih mudah teridentifikasi  dibanding  genom  mitokon dria yang seringkali mengalami rearrange ment (penyusunan ulang).
Keragaman  fenotipik  di  lapang terjadi pada tanaman hibrida somatik kentang hasil hibridisasi somatik antara S. tuberosum cv.  BF-15  dan  spesies  liarnya S. stenotomum , seperti yang  dapat dilihat pada  jumlah  umbi  per  tanaman  maupun bobot  umbi  pertanaman  (Purwito,  1999). Keragaman tersebut mungkin ada kaitannya dengan pola segregasi kloroplas pada  tanaman  hibrida  somatik,  karena diketahui  bahwa  kloroplas  merupakan organel  yang bertanggung jawab terhadap
Sudirman Numba : Analisis Pola Segregasi DNA Genom Kloroplas Hasil Hibridasi Somatik Tanaman Kentang Menggunakan Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
kemampuan tanaman untuk berfoto sintesis.
Identifikasi  pola  segregasi  genom kloroplas  kentang  hibrida  somatik  hasil fusi antara BF-15 dan S.phureja dilakukan oleh  Sihachakr et  al .,  (komunikasi pribadi)  dengan  menggunakan  metode RAPD pada DNA genom kloroplas.  DNA murni genom kloroplas digunakan sebagai DNA cetakan pada analisis RAPD.   Hasil identifikasi  menunjukkan  bahwa  pola segregasi  kloroplas  terjadi  secara  acak, karena  dari  sepuluh  tanaman  hibrida somatik  terdapat  dua  tanaman  yang membawa    genom  kloroplas  BF-15  dan delapan tanaman yang membawa kloroplas S. phureja .
Berdasarkan hasil analisis keragaman  genetik  antara  tetua  fusi menunjukkan  bahwa S.  phureja lebih sekerabat terhadap BF-15 (tingkat kesamaan sekitar 70 %) dibanding dengan S.  stenotomum terhadap  BF-15  (tingkat kesamaan sekitar 60 %), sehingga dengan demikian  kemungkinan  pola  segregasi genom  kloroplas  pada  hasil  hibridisasi somatik  antara  BF-15  dan S.phureja berbeda dengan BF-15 dan S.stenotomum . Analisis restriction  fragment  length polymorphism (RFLP)  terhadap  fragmen hasil amplifikasi PCR dari DNA kloroplas
telah  dikembangkan,  dan  menjadi  metode handal  dan  terbaru  yang  dapat  digunakan untuk  mendeteksi  variasi  DNA  kloroplas. Arnold et  al .  (1991)  melaporkan  bahwa polimorfisme  pola  pita  DNA  yang dihasilkan dapat digunakan untuk mengidentifikasi  tetua  dari  biji  suatu tanaman.
Analisis  RFLP  terhadap  fragmen hasil  amplifikasi  PCR  dari  genom kloroplas  memiliki  beberapa  kelebihan dibanding  analisis  RFLP  menggunakan DNA pelacak dari DNA kloroplas, karena prosedurnya  lebih  sederhana,  jumlah DNA  yang  dibutuhkan  lebih  sedikit,  serta lebih  efisien  dari  segi  waktu  dan  biaya (Liston, 1992).  Oleh karena itu metodeini lebih  menguntungkan  digunakan  dalam mendeteksi variasi DNA kloroplas.
Analisis  keragaman  DNA  kloroplas tanaman  terong  ( S.  melongena )  dan spesies  liarnya  telah  dilakukan  untuk tujuan  studi  taksonomi  (Sakata et  al ., 1991; Sakata and Lester, 1994), dan untuk mengidentifikasi  pola  segregasi  DNA sitoplasmik pada tanaman hibrida somatik (Guri  dan  Sink,  1988;  Daunay et  al ., 1993), akan tetapi metode yang digunakan pada  studi  tersebut  tidak  didasarkan  pada analisis RFLP pada hasil amplifikasi PCR.
Sudirman Numba : Analisis Pola Segregasi DNA Genom Kloroplas Hasil Hibridasi Somatik Tanaman Kentang Menggunakan Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Penggunaan  primer  spesifik  yang dapat  mengamplifikasi  bagian  tertentu dari genom kloroplas juga dapat digunakan untuk mempelajari pola segregasi  genom  kloroplas.      Pola segregasi    dapat  dipelajari  dengan melakukan  pemotongan  menggunakan enzim  restriksi  terhadap  fragmen  hasil amplifikasi  yang  dihasilkan.    Oghihara et al .,  (1991)  melaporkan  bahwa  dengan menggunakan  primer  spesifik  dari  sekuen konservatif  antara  gen Ribulosa-1,5- bisphosphate carboxylase ( rbc L) dan open reading  frame  106  (ORF1-6) dapat mengamplifikasi  daerah  yang  bervariasi dari DNA kloroplas sebesar 3,2 kb.
Keragaman  DNA  dari  fragmen berukuran  3,2  kb  tersebut  ditemukan terjadi  pada  beberapa  spesies  tanaman (Arnold et al ., 1991 ; Liston et al ., 1992 ;
Badenes  dan  Parfitt,  1995  ;  Yonemori et al .,  1996),  seperti  pada  tanaman  terong ( Solanum  melongena )  dilaporkan  bahwa fragmen  ini  dapat  menunjukkan  pola  pita yang polimorfik bila dipotong menggunakan enzim restriksi seperti Taq I,
Alu I, Rsa I, Sty I, Ase I, Hinf I  dan Xba I (Isshiki et  al .,  1998).    Dengan  demikian maka  primer  spesifik  tersebut  berpotensi untuk digunakan pada studi pola segregasi
genom  kloroplas  pada  tanaman  kentang hasil hibridisasi somatik.
Untuk  mempelajari  pola  segregasi genom  kloroplas  dan  untuk  mengetahui apakah  ada  hubungan  antara  keragaman fenotipik  di  lapang  dengan  pola  segregasi kloroplas  hasil  fusi  BF-15  + S.steno tomum ,  maka  dilakukan  percobaan  untuk mengidentifikasi  tipe  kloroplas  pada masing-masing    tanaman  hibrida  soma tiknya.
Informasi yang diperoleh dari percobaan ini diharapkan dapat digunakan untuk  membantu  menyeleksi  tanaman hibrida  somatik  yang  memiliki  potensi produksi  yang  tinggi,  serta  memiliki  sifat ketahanan terhadap hama penyakit.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium  Biologi  Molekuler  dan Selluler  PAU  Bioteknologi  IPB  dan Laboratorium Terpadu Pusat Studi Pemuliaan  Tanaman,    Jurusan  Budidaya Pertanian Institut Pertanian Bogor.
Bahan  tanaman  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  yaitu  daun  tanaman kentang yang diambil dari tempat perbanyakan  pada  Laboratorium  Kultur Jaringan  Kentang  Jurusan Budidaya
Sudirman Numba : Analisis Pola Segregasi DNA Genom Kloroplas Hasil Hibridasi Somatik Tanaman Kentang Menggunakan Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
tanaman  Fakultas  Pertanian  IPB  Bogor. Contoh daun diambil dari tetua fusi  yang digunakan    Purwito  (1999)  yaitu  BF-15, Nicola,  Aminca,  Cardinal,  SpV-10  dan S. stenotonum, serta tanaman hasil hibridisasi  somatik  antara  BF-15  dan S.stenotomum (A-5,  A-5A,  A-5C,  A-10C, A-17,  A-18A,  A-18B1,  A-18B3,  A-18B4, A-18C,  A-18D,  A-18E1,  A-18E3,  A- 18E4,  A-18E5,  A-18E6,  A-18E8,  A-20, A-20A, A-20B, dan A-20C).

## Amplifikasi  PCR  Menggunkan  Primer Spesifik
Penelitian  ini  dilakukan  dengan melakukan  amplifikasi  PCR  mengguna kan  primer  spesifik  untuk  bagian  tertentu dari  genom  kloroplas,  seperti  yang dilaporkan oleh Arnold et al . (1991) yaitu primer spesifik rbcL (5’-

## ATGTCACCACAAACAGAAACTAAA
GCAAGT-3’)    dan  primer ORF106 (5’- ACTACAGATCTCATACTACCCC-3’) yang digunakan mengamplifikasi beberapa  DNA  total  genom  tetua  fusi. Fragmen  DNA  hasil  Amplifikasi  PCR berukuran  3,2  kb  seperti  yang  dilaporkan Oghihara et.al (1991)  kemudian  dipotong menggunakan  dua  macam  enzim  restriksi yaitu Rsa I, dan Hha I.
Jenis enzim restriksi yang menghasilkan  pola  pita  DNA  yang menunjukkan  polimorfisme  dari  fragmen berukuran  3,2  kb  tersebut,  selanjutnya digunakan  untuk  mengidentifikasi  pola segregasi  kloroplas  pada  tanaman  hasil hibridisasi somatik.
1. Ekstraksi DNA Total Genom Tanaman dan Analisis PCR Ekstraksi DNA total genom tanaman  yang  akan  digunakan  sebagai DNA cetakan dan prosedure analisis PCR
dilakukan seperti pada percobaan sebelumya.
Campuran reaksi untuk PCR ( Polymerase  Chain  Reaction )  disiapkan dengan  total  volume  100  L  (Arnold  et al., 1991) yang masing-masing mengandung 250 ng/  L DNA cetakan , 10 mM  dNTP  (dATP,  dGTP,  dTTP  dan dCTP), 70 pmol primer, 2,5 unit Taq DNA polymerase dan  1,5  M  Buffer+MgCl 2 . Amplifikasi dilakukan dengan menempat- kan  campuran  reaksi  pada  blok,    dimana suhu pra amplifikasi 94  C selama 1 menit untuk terjadinya denaturasi DNA.
Selanjutnya mengatur reaksi siklus dengan program step cycle ( DNA Thermal Cycler ) sampai  mencapai  30  siklus  yang  masing- masing  siklus  terdiri  dari  3  tahap  yaitu
Sudirman Numba : Analisis Pola Segregasi DNA Genom Kloroplas Hasil Hibridasi Somatik Tanaman Kentang Menggunakan Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
tahap 1 untuk denaturasi dengan pemanasan  94  C  selama  1  menit,  tahap  2 untuk  pelekatan  primer  pada  suhu  55  C selama  1  menit  dan  tahap  3  untuk perpanjangan  pada  suhu  72  C  selama  4 menit.    Setelah  30  siklus  ditambahkan waktu  inkubasi  pada  suhu  72  C  selama  5 menit  untuk  memastikan  bahwa  DNA yang diamplifikasi telah mengalami renaturasi, untuk keperluan tersebut digunakan  program thermal  delay yaitu inkubasi  pada  suhu  72  C  selama  5  menit, kemudian diikuti  pendinginan (4  C).

## 2. Pemotongan  Fragmen  DNA  3,2  kb dengan Enzim Restriksi
Sebanyak  10  l  aliquots  hasil amplifikasi PCR dari DNA tetua dan hasil hibridisasi  somatik  antara  BF-15  dan S. stenotomum selanjutnya  dipotong  dengan masing-masing enzim restriksi ( Hha I, dan
Rsa I).  Fragmen  DNA  hasil  pemotongan enzim restriksi tersebut selanjutnya ditambahkan  dengan  3  L buffer  loading (mengandung  bromo  fenol  blue  dan sukrosa),  kemudian  dimigrasikan  pada elektroforesis  gel  agarosa  (1,8  %)  dengan tegangan 45 volt selama 2 jam.  Gel hasil elektroforesis  selanjutnya  direndam  pada larutan  etidium  bromida  selama  lima
menit,  lalu  dibilas  dengan  aquades.  Gel kemudian  diamati  dengan  menggunakan UV  transilluminator,  dan  pola  pita (profil)  DNA  hasil  amplifikasi  diamati dan difoto menggunakan kamera polaroid.

## 3. Analisis  Pola  Segregasi  Genom Kloroplas
Enzim restriksi dengan hasil pemotongan  yang  menunjukkan  pola  pita yang  polimorfik  antara  dua  tetua  yang difusikan yaitu BF-15 dan S. stenotomum , selanjutnya digunakan untuk menguji pola pita  DNA  kloroplas  terhadap  semua tanaman  hasil  fusi  dari  kedua  tetua tersebut.    Pola  segregasi  DNA  kloroplas pada  tanaman  hasil  hibridisasi  somatik ditentukan  dengan  membandingkan  pola pita  DNA  atau  tipe  kloroplas  kedua tetuanya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Ekstraksi    DNA  Total  Genom

## Tanaman dan Analisis PC
Hasil  amplifikasi  PCR  dengan primer rbcL dan ORF106 pada DNA tetua fusi sebagai cetakan (template) menunjuk- kan  bahwa  selain  fragmen  berukuran  3,2 kb  yang  dihasilkan  oleh  primer  spesifik tersebut, juga  terdapat  fragmen  berukuran
1,2  kb.    Fragmen  dengan  ukuran  sekitar 3,2  kb  muncul  pada  semua  sampel  yang dianalisis  dan  menunjukkan  bahwa  tidak terdapat  variasi  antara  setiap  tetua  fusi, hal ini berarti pula  bahwa  bagian tertentu dari  DNA  kloroplas  yang  dijadikan  target dapat teramplifikasi secara benar.
Sedangkan fragmen dengan ukuran sekitar
1,2 kb hanya muncul pada sampel BF-15,
S.phureja ,  Aminca,  Cardinal,  Nicola, tetapi  tidak  muncul  pada S.  stenotomum . Data  mengenai  hasil  amplifikasi  PCR menggunakan  primer rbcL dan ORF106 pada  tetua  fusi  dan  beberapa  hibrida somatik  disajikan  pada  Gambar  1.
Gambar 1.  Profil DNA Hasil ampilfikasi PCR  dengan Menggunakan Primer rbcL dan ORF 106 . 1-kb ladder (M), BF-15 (1), S.stenotonum (2), S.phureja (3), Aminca (4), Cardinal (5), Nicola (6), SpV-10 (7), BFP-56 (8), A.5A (9), Amcar.33 (10), BF-15.P10 (11).
Pada tanaman terong ( S. melongena ) dan  beberapa  spesies  liarnya    dilaporkan bahwa  amplifikasi  dengan  menggunakan primer rbcL dan ORF106 hanya menghasilkan  fragmen  tunggal  berukuran sekitar  3,2  kb  (Isshiki  et  al,  1998), sedangkan fragmen dengan ukuran sekitar 1,2 kb tidak ditemukan. Fragmen berukuran sekitar 1,2 kb ini kemungkinan tidak  spesifik  terdapat  pada  kloroplas karena  DNA  cetakan  yang  digunakan adalah DNA total genom tanaman.

## 2. Pemotongan DNA Hasil Amplifikasi dengan Enzim Restriksi
Fragmen    DNA  yang  merupakan hasil amplifikasi PCR kemudian dipotong dengan menggunakan enzim restriksi Rsa I dan
H ha I. Hasil
pemotongan menunjukkan  bahwa  fragmen  3,2  kb  dan 1,2  kb  bila  dipotong  dengan  enzim restriksi Hha I  menghasilkan    empat fragmen  dengan  ukuran  masing-masing 0,4  kb,    0,8  kb,    1,2  kb  dan  2,0  kb. Demikian  pula  bila  dipotong  dengan
M      1       2      3      4      5      6      7      8      9    10     11
3,2 kb

## 1,2 kb
Sudirman Numba : Analisis Pola Segregasi DNA Genom Kloroplas Hasil Hibridasi Somatik Tanaman Kentang Menggunakan Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
enzim  restriksi Rsa I  juga  menghasilkan empat  fragmen  dengan  ukuran  masing- masing 0,2 kb., 0,3 kb, 0,7 kb dan 1,6 kb. Data hasil pemotongan fragmen DNA 3,2 kb  dan  1,2  kb  menggunakan  enzim restriksi Hha I  dan Rsa I  disajikan  pada Gambar 2.
Gambar 2 menunjukkan bahwa pola pita  hasil  pemotongan  dari  kedua    enzim restriksi  yang  digunakan  ( Rsa I  dan Hha I) pada  semua  sampel  masih  bersifat monomorfik,  sehingga  metode  analisis RFLP  dari  fragmen  3,2  kb  tersebut  tidak dapat  digunakan  untuk  identifikasi  pola segregasi genom kloroplas pada  tanaman hasil hibridisasi somatik antara BF-15 dan S. stenotomum .    Dengan  demikian  masih harus dicari enzim lain yang memungkinkan memberikan hasil pemotongan yang bersifat polimorfik.
Hasil  penelitian  sebelumnya  pada Solanum melongena (Isshiki et al .,  1998) menggunakan  beberapa  enzim  restriksi
lain,  ternyata  dapat    menunjukkan  variasi pada  daerah amplifikasi  yaitu Alu I, Ase I,
Bam HI, Hinf I, Msp I, Scr FI, Sty I, Taq I, dan Xba I.    Kemungkinan  lain  dari  hasil yang  monomorfik  tersebut  disebabkan karena  memang  tidak  ada  variasi  pada daerah yang teramplifikasi.
Pada waktu yang hampir bersamaan, studi  tentang  pola  segregasi  kloroplas pada  tanaman  hasil  hibridisasi  somatik antara  BF-15  dan S.  phureja serta  BF-15 dan S.  stenotomum, juga  dilakukan  oleh Sihachackr et.al .  (2000).    Pendekatan yang digunakan adalah dengan melakukan    analisis  RAPD  pada  genom kloroplas.    Analisis  RAPD  dilakukan dengan cara mengisolasi organel kloroplas dan  memisahkannya  dengan  organel mitokondria  dan  inti  sebelum  kegiatan ekstraksi DNA kloroplas, sehingga diperoleh  total  DNA    kloroplas  yang murni  tanpa  terkontaminasi  dengan  DNA mitokondria dan inti.
Sudirman Numba : Analisis Pola Segregasi DNA Genom Kloroplas Hasil Hibridasi Somatik Tanaman Kentang Menggunakan Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Gambar 2.  Profil  DNA Hasil ampilfikasi PCR   yang dipotong dengan enzim restriksi Hha I (A), Rsa I  dan Hha I  (B).  1-kb  ladder  (M),  BF-15  (1), S.  stenotonum (2),  S. phureja (3), Aminca (4), Cardinal (5), Nicola (6),  1-kb ladder (M), BF-15 (1), S. phureja (2), D.25 A  (3)  dengan Rsa I,    100  bp  ladder  (M),  B-15 (4),  S.phureja  (5),  D.25  A  (6)  dengan Hha I
Hasil  penelitian  sebelumnya  pada Solanum  melongena (Isshiki et  al .,    1998 dan  Ames  et  al.,  2008)    menggunakan beberapa  enzim  restriksi  lain,  ternyata dapat    menunjukkan  variasi  pada  daerah amplifikasi  yaitu Alu I, Ase I, Bam HI, Hinf I, Msp I, Scr FI, Sty I, Taq I,  dan Xba I. Kemungkinan  lain  dari  hasil  yang monomorfik  tersebut  disebabkan  karena memang  tidak  ada  variasi  pada  daerah yang teramplifikasi.
Pada waktu yang hampir bersamaan, studi  tentang  pola  segregasi  kloroplas pada  tanaman  hasil  hibridisasi  somatik antara  BF-15  dan S.  phureja serta  BF-15 dan S.  stenotomum, juga  dilakukan  oleh Sihachackr et.al .  (2000).    Pendekatan
yang digunakan adalah dengan melakukan    analisis  RAPD  pada  genom kloroplas.  Analisis  RAPD  dilakukan dengan cara mengisolasi organel kloroplas dan  memisahkannya  dengan  organel mitokondria  dan  inti  sebelum  kegiatan ekstraksi DNA kloroplas, sehingga diperoleh  total  DNA    kloroplas  yang murni  tanpa  terkontaminasi  dengan  DNA mitokondria dan inti.
Selanjutnya  dilaporkan  bahwa  hasil analisis  RAPD  genom  kloroplas  pada tetua fusi dan hasil hibridisasi somatiknya, menunjukkan bahwa pola segregasi genom  kloroplas    pada  tanaman  kentang hasil  hibridisasi  somatik  bersifat  acak, dimana  dari  10  tanaman  hibrida  somatik
M     1      2      3      4      5 6 (A) 2,0 kb 1,2 kb 0,8 kb 0,4 kb M   1     2      3    M     4     5     6 (B) 1,6 kb 0,7 kb 0,3 kb 0,2 kb (B)
Sudirman Numba : Analisis Pola Segregasi DNA Genom Kloroplas Hasil Hibridasi Somatik Tanaman Kentang Menggunakan Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
antara  BF-15  dan  S. phureja terdapat  dua nomor  individu  yang  identik  dengan genom  kloroplas  BF-15  dan  delapan nomor  individu  yang  identik  dengan genom  kloroplas S.  phureja .    Demikian pula  terjadi  pada  hibridisasi  somatik antara BF-15 dan S. stenotomum , sebagian tanaman  hasil  hibridisasi  somatiknya mengikuti  tipe  kloroplas  tetua  BF-15  dan sebagian  lainnya  mengikuti  tipe  kloroplas tetua S.  stenotomum (sihachakr,  2000) (komunikasi pribadi).
Dengan  demikian  maka  analisis segregasi genom kloroplas lebih
memungkinkan dilakukan dengan menggunakan metode RAPD pada genom kloroplas  murni,  dibanding  menggunakan metode  RFLP  hasil  amplifikasi  PCR daerah  tertentu  dari  DNA  kloroplas.    Hal yang  penting  diperhatikan  pada  analisis RAPD genom kloroplas adalah kemampu- an  untuk  memisahkan  dan  memurnikan organel kloroplas  dari organel mitokond- ria  dan  inti.  Perbedaan  hasil  yang diperoleh  dari  analisis  RFLP  DNA kloroplas antara kentang ( Solanum tuberosum L)  dan  terong  ( Solanum melongena L)  dengan  spesies  liarnya, adalah  kemungkinan  fragmen  3,2  kb  dari DNA kloroplas kentang lebih konservatif.
Informasi  tersebut  menunjukkan pula  bahwa  pada  tanaman  kentang  hasil hibridisasi somatik, hanya satu tipe genom kloroplas  tetua  yang  bartahan  dan  yang lainnya  akan  mengalami  kejadian sorting out .      Selain  itu,  diketahui  pula  bahwa genom  kloroplas  tanaman  kentang  hasil hibridisasi  somatik  tidak  mengalami rekombinasi  dan rearrangement ,  karena pola  pita  DNA  kloroplas  tanaman  hasi hibridisasi  somatiknya  semuanya  identik dengan pola pita DNA kloroplas tetuanya.

## KESIMPULAN
1. Amplifikasi  genom  kloroplas  pada semua  tetua  fusi  menggunakan  primer rbc L  dan ORF 106    dengan  PCR menghasilkan fragmen DNA berukuran 3,2 kb.Analisis RFLP pada fragmen 3,2 kb  menggunakan  enzim  restriksi Rsa I dan Hha I pada semua sampel tetua fusi yang digunakan menghasilkan pola pita yang bersifat monomorfik.
2. Metode  analisis  RFLP  pada  fragmen DNA    berukuran  3,2  kb  hasil amplifikasi  PCR  menggunakan  primer rbc L dan ORF 106 dari genom kloroplas, tidak dapat digunakan untuk identifikasi  pola  segregasi  genom kloroplas  tanaman  hasil  hibridisasi
Sudirman Numba : Analisis Pola Segregasi DNA Genom Kloroplas Hasil Hibridasi Somatik Tanaman Kentang Menggunakan Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
somatik antara BF-15 dan S. stenotomu .

## DAFTAR PUSTAKA
Ames, M., and Spooner, M,.D.  2008. DNA from herbarium specimens settles a controversy about origins of the European potato. American. Journal. Botanic. 95 (2) 252-257
Arnold,  M.L.,  C.M.  Buckner  and  J.J. Robinson,  1991.    Polen  mediated introgression  and  hybrid  speciation in Lousiana irises.  Proc. Natt. Acad Sci USA 88: 1398-1402.
Badenes,  M.L.  and  D.E.  Parfitt,  1995.
Phylogenetic relationships of cultivated  Prunus  species  from  an analysis of chloroplast DNA variation.    Theor  Appl  Genet.  90: 1035-1041.
Barone  A,  Li  J,  Sebastiano  A,  Cardi  T, Frusciante  L.  2002.    Evidence  for tetrasomic inheritance in a tetraploid
Solanum commersonii (+) S.
tuberosum somatic  hybrid  through the use of molecular markers. Theor Appl Genet. 104:539–546
Behera  TK,  Singh  N.  2002.  Inter-specific crosses  between  eggplant  ( Solanum melongena L.) with related Solanum species. Sci Hortic  95:165–172.
Chen  ZJ,  Ni  Z.  2006.    Mechanism  of genomic  rearrangements  and  gene
expression
change in plant
polyploids. Bioessay 28:240–252
Daunay, M.C., M.H. Chaput, D. Sihachakr,  M.  Allot,  F.  Vedel  And D.  Ducreux,  1993.    Production  and
characterization  of  fertile  somatic
hybrids of eggplant (Solanum melongena L.) with Solanum aethiopicum  L.  Theor  Appl  Genet
85: 841-850.
Furini  A,  Wunder  J.  2004.    Analysis  of eggplant ( Solanum melongena )- related  germplasm:  morphological and  AFLP  data  contribute  to phylogenetic interpretations and germplasm  utilization.  Theor  Appl Genet. 108:107–208.
Guri, A. and K.C. Sink, 1988. Interspesific  somatic  hybrid  plants between eggplant (Solanum melongena)  and  Solanum  torvum.
Theor Appl Genet 76: 321-326.
Isshiki,  S.,  T.  Uchiyama,  Y.  Tashiro  and
S.  Miyazaki,  1998.    FRLP  analysis of PCR amplified region of chloroplast  DNA  in  eggplant  ang related Solanum species.  Euphytica 102: 295-299.
Isshiki  S,  Okubo  H,  Fujieda  K.    2000. Segregation  of  isozymes  in  selfed progenies of a synthetic amphidiploid between Solanum integrifolium and S.  melongena .
Euphytica  112:9–14.
Isshiki  S,  Suzuki  S,  Yamashita  K.  2003. RFLP  analysis  of  mitochondrial DNA  in  eggplant  and  related Solanum  species.  Genet  Resour Crop Evol. (2003) 50:133–137.
Liston,  A.,  I.H.  Rieseberg  and  M.A. Hanson,  1992.    Variation  in  the chloroplast  genes rpo C1  and rpo C2 of  the  genus  Astragulus  (Fabaceae); evidence from restriction site mapping  of  a  PCR  amplified  frag- ment.  Amer  J.  Bot  79:  953-961. Ogihara.Y.T.Terachi and T. Sasamuka.  1991.    Molecular  analy- sis  of  the  hot  spot  region  related  to length mutations in wheat chloroplat
DNAs.    1  nucleotide  divergence  of genes  and  intergenic  spacer  regions located  in  the  hot  spot  region. Genetics 129: 873-884
Purwito,  A.  1999.    Fusi  protoplas  Intra dan  inter  spesifik  pada  tanaman kentang.    Disertasi  Doktor  pada Program  Pasca  Sarjana  Institut
Pertanian Bogor (tidak dipublikasi).
Sakata,  Y.,  T.  Nishio  and  P.J.  Matthews, 1991.  Chloroplast DNA analysis of eggplant ( Solanum melongena ) related  species  for  their  taxonomic affinity. Euphytica 55: 21-26.
Sakata,  Y.  and  R.N.  Lester,  1994. Chloroplast DNA diversity in eggplant  ( Solanum  melongena )  and its related species S. incanum and S. marginatum. Euphytica 80: 1-4.
Sihachakr,  D.,  Fock,  C.  Collonier,  A.
Purwito,J. Luisetti, V. Souvannavong, F. Vedel, A. Servaes, A. Ambroise, H. Kodja and
G. Ducreux, 2000.
Spooner, M.D.,Jorge Núñez,J., and Trujillo, G.  2007.  Extensive simple
sequence  repeat  genotyping  of potato  landraces  supports  a  major reevaluation  of  their  gene  pool structure  and  classification.  The
National  Academy  of  Sciences  of the USA.
Resistance  to  bacterial  wilt  in  somatic hybrids between Solanum tuberosum and S.  phureja .    Plant Sci. (accepted)
Yonemori,  K.,  D.  E.  Parfitt,  S.  Kanzaki,
A.  Sugiura,  N.  Utsunomiya  and  S.
Subhandrabandu,  1996.    RFLP analysis  of  an  amplified  region  of CpDNA for phylogeny of the genus Diospyras,  J  Jpn.Soc.Hor.Sci.  64: 771-777.