Jurnal Farmasi Galenika ( Galenika Journal of Pharmacy ) 2018; 4 (1): 44 – 49 ISSN : 2442-8744 (electronic) http://jurnal.untad.ac.id/jurnal/index.php/Galenika/index DOI : 10.22487/j24428744. 2018.v4.i1.9965
Uji  Pendahuluan  Anti-biofilm  Esktrak  Teh  Hijau  dan  Teh  Hitam  Pada Streptococcus mutans melalui Metode Microtiter Plate
(An  initial  study  on  anti-biofilm  activity  of  green  tea  dan  black  tea  extracts  on Streptococcus mutans via mictotiter plate assay  )

## Andi Arjuna, Winda Setya Pratama, Sartini, Mufidah
Fakultas Farmasi, Universitas Hasanuddin, Makassar, Indonesia, 90245
Article Info: Received: 02 Maret 2018 in revised form: 16 Maret 2018 Accepted: 30 Maret 2018 Available Online: 30 Maret 2018

## ABSTRACT
Tea ( Camellia sinensis L.) has activity as an antibacterial, widely studied to plankton cells, without further researching  into biofilm  cell. Therefore, this research  had  been  conducted  to  initially  evaluate  the  activity  of  green  and black  tea  extracts  in  inhibiting Streptococcus  mutans biofilm.  Green  and black tea leaves were extracted using 70% methanol. Determination of MIC was  subsequently  performed  by  microdilution  method.  Next,  the  biofilm formation  and  inhibition  was  run  through  microtiter  plate  method  using flexible  U-bottom  PVC  96  wells,  which  then  observed  using  microplate reader on λ = 515 nm. As the results, MIC  for green and  black tea extract stood at 4 mg/mL, 6  mg/mL, respectively. The biofilm inhibitory activity of black tea extract was at 8 and 10 mg/mL inhibiting 6% and 12.5% S.mutans . Green tea extract showed that concentration of 4  to 10  mg/mL  was able to inhibit  biofilm  growth  by  24%;  45%;  48%  and  53%.  Thus,  through microtiter  plate  assay,  it  could  be  concluded  that  tea  extract  has  potent antibiofilm  to S.mutans ,  where  green  tea  extract  has  better  activity  than black tea extract.
Keywords : biofilm black tea green tea microtiter plate Streptococcus mutans
Corresponding Author: Andi Arjuna Fakultas Farmasi Universitas Tadulako Makassar, 90245
Indonesia
Mobile:  082345748488 Email: andiarjuna@unhas.ac.id
Copyright © 2017 JFG-UNTAD
This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.

## How to cite (APA 6th Style):
Arjuna, A., et al. (2018). Uji Pendahuluan Anti-biofilm Ekstrak Teh Hijau dan Teh Hitam pada Streptococcus mutans melalui Metode Microtiter Plate . Jurnal Farmasi Galenika : Galenika Journal of Pharmacy, 4(1), 44-49. doi:10.22487/j24428744.2017.v3.i1.9965

## ABSTRAK
Teh  ( Camellia  sinensis L.)  telah  diketahui  memiliki  aktivitas  antibakteri  yang  sangat  luas  dipalajari  terutama pada  bakteri  plankton,  tanpa  adanya  penelitian  yang  dalam  mengenai  aktivitas  biofilmnya.  Sehingga,  telah dilakukan  penelitian  mengenai  uji  pendahuluan  aktivitas  ekstrak  teh  hitam  dan  teh  hijau  dalam  menghambat biofilm Streptococcus  mutans .  Daun  teh  hitam  dan  teh  hijau  masing-masing  dimaserasi  dengan  metanol  70%. Nilai  KHM  dari  sampel  tersebut  selanjutnya  ditentukan  melalui  metode  makrodilusi.  Pembentukan  dan penghambatan  biofilm  selanjutnya  dilakukan  melalui  metode microtiter  plate (menggunakan  well  96  yang fleksibel  dan flat  bottom ),  dilanjutkan  dengan  pengamatan  menggunakan  microplate  reader  pada λ  =  515  nm. Nilai KHM ekstrak teh hijau dan teh hitam diperoleh masing-masing pada konsentrasi 4 mg/ mL dan 6 mg/ mL. Hasilnya, ekstrak teh hitam dengan konsentrasi 8 dan 10 mg/ mL mampu menghambat biofilm S.mutans masing- masing sebesar 6% dan 12.5%. Sedangkan pada esktrak teh hijau konsentrasi 4 sampai 10 mg/ mL menghambat biofilm S.mutans masing-masing  24%;  45%;  48%,  dan  53%.  Sehingga,  melalui  metode microtiter  plate dapat disimpulkan bahwa semua ekstrak teh memilki potensi besar sebagai antibiofilm S.mutans, dimana ekstrak hijau menunjukkan aktivitas yang lebih baik dibandingkan ekstrak teh hitam.
Kata Kunci : biofilm, microtiter plate , Streptococcusmutans, teh hijau, teh hitam

## PENDAHULUAN
Biofilm merupakan  salah  satu  produk  hasil  interaksi dari quorum  sensing (QS)  dari  masing-masing mikroorganisme . Proses pembentukan biofilm diawali  ketika  mikroba  soliter  melekat  pada  suatu permukaan  yang  cocok,  selanjutnya  akan  menempel dan  mengeluarkan  signal  QS.  Pada  saat  terjadi komunikasi, bakteri akan mengeluarkan signal ( auto- inducers) untuk  memanggil  bakteri-bakteri  lainnya (Irie  &  Parsek,  2008).  Mikroorganisme,  baik  bakteri gram positif -gram negatif maupun fungi mempunyai sistem QS yang  berbeda-beda.  Pada  bakteri  gram negatif  menghasilkan  signal  AHL  ( Acyl  homserine lactones) ,  bakteri  gram  positif  menghasilkan  signal peptida, sedangkan pada fungi menghasilkan senyawa  farnesol  ataupun  tirosol  sebagai  sistem quorum sensing antar selnya (Kalia, 2013; Kim et al , 2015). Setelah mengeluarkan signal QS, bakteri akan mensekresikan EPS ( extracellular polymeric substance )    sebagai  matriks  pelindung  yang  kokoh. Setelah itu, bakteri membentuk mikrokoloni dan akan berkembang  membentuk  biofilm  (Michael et  al , 2003).
Bakteri Streptococcus mutans merupakan mikroorganisme kariogenik
yang memicu terbentuknya plak biofilm pada gigi yang memetabolisme  sukrosa  menjadi  gula  yang  lengket (Kawarai et  al, 2016).  Meningkatnya  resistensi mikroba,  seperti  pada  bakteri Streptoccus  mutans , Staphylococcus aureus, dan Eschericia coli terhadap
antibiotika  diketahui  dapat  dicegah  dengan  cara menghambat  aktivitas  QS  antar  mikroba,  dengan asumsi jika biofilm berhasil dimanipulasi pembentukannya,  penetrasi  antibiotika  akan  lebih mudah  terhadap  mikroba  target  (Amaya et  al ,  2012; Chu et al , 2013; Jiménez-Gómez et al , 2007; Kim et al , 2015; Koh & Tham, 2011) .
Studi  penghambatan  terbentuknya biofilm sekarang ini  telah  banyak  dilakukan  untuk  mengevaluasi kemampuan  berbagai  esktrak  yang  memilki  aktivitas antibakteri.  Salah  satu  tanaman  yang  dikenal memiliki  aktivitas  antibakteri  yaitu  tanaman  teh ( Camellia  sinensis L .) .  Teh    mengalami  proses pengolahan  tertentu  dan  dikategorikan  menjadi  tiga, yaitu tanpa fermentasi (teh hijau dan teh putih), semi- fermentasi (teh merah) dan melalui proses fermentasi (teh   hitam) (Bancirova, 2010; McKay & Blumberg, 2002).
Penelitian-penelitian  mengenai  evaluasi  aktivitas antibakteri  dari  tanaman  teh  ( Camellia  sinensis L.) telah  banyak  dilakukan  terhadap  bakteri plankton , namun belum banyak diketahui aktivitas penghambatan  koloni  biofilm  pada  bakteri.  Oleh karena itu, dalam penelitian  ini telah dilakukan  studi aktivitas  antibiofilm  dari  ekstrak  daun  teh  ( Camellia sinensis L.)  hijau  dan  teh  hitam  terhadap  bakteri Streptococcus mutans, sebagai bentuk uji pendahuluan kemampuan ekstrak ini dalam manipulasi pembentukan biofilm S.mutans .

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat-alat  yang  digunakan  adalah microplate  reader (Biotek ® ), evaporator (Heidolph ® ), inkubator (Memmert ® ) ,  lampu  UV,  seperangkat  alat  gelas (Pyrex ® ), wells microplate 96 flat bottom.
Bahan  yang  digunakan  adalah  teh  hitam,  teh  hijau (diperoleh  dari  Malino  Highland,  Sulawesi  Selatan), isolat  bakteri Streptococus  mutans (Lab  Mikrobiologi Farmasi UNHAS) , Brain heart infusion broth (BHIB) (Merck ® ), Nutrient  broth (NB)  (Merck ® ), Nutrient Agar (NA)(Merck ® ),  DMSO,  metanol,  etanol  96%, kristal violet (Merck ® ), Mouthwash (Listerine ® ).

## Metode
Penyiapan sampel teh dan mikroba S.mutans
Penyiapan  sampel  –Sampel  dipersiapkan  sesuai dengan  prosedur  standar  ekstraksi  sampel  dengan maserasi,  dengan  sedikit  penyesuaian  jenis  sampel dan penyarinya. Sampel teh kering (teh hijau dan teh hitam)  sebanyak    10  gram  dimasukkan  ke  dalam bejana  maserasi  dan  direndam  dalam  cairan  penyari metanol  70%  sebanyak  50  mL  (1:5),  disimpan  pada suhu ruang selama 3 hari sambil sesekali diaduk dan kemudian disaring. Ampas yang diperoleh  kemudian diekstraksi  kembali.  Ekstrak  metanol  teh  yang diperoleh kemudian digabung dan disaring menggunakan kertas Whatmann No.1 dan filtrat yang didapatkan  kemudian  dipekatkan  menggunakan evaporator  dengan  suhu  dibawah    45°C  hingga didapatkan  ekstrak  kental  (Kaur,  Kaur,  &  Rana, 2015; Kawarai et al., 2016).
Penyiapan mikroba - Medium yang digunakan adalah Nutrient  Agar (NA)dan Brain  Heart  Infusion  Broth (BHIB)  yang  dipersiapkan  sesuai  dengan  prosedur (12).  Isolat  bakteri  uji S.mutans diinokulasikan  ke media NA miring dan inkubasi pada 37°C selama 24 jam (O'Toole, 2011).

## Penentuan Kadar Hambat Minimum
Penentuan  nilai  KHM  dilakukan  dengan  metode broth  micro  dilution. Masing-masing  ekstrak  daun teh  dibuat  larutan  stok  20%  dalam  DMSO  20%. Diambil  masing-masing  ekstrak  dengan  konsentrasi 2,  4,  6,  8  dan  10  mg/mL,  lalu  dimasukkan  dalam tabung  reaksi  dan  dicukupkan  hingga  1  mL  dengan BHIB. Suspensi bakteri  Mc Farland setara 1,5 x 10 8
CFU/mL  dalam  BHIB  (1:150)  sebanyak  1  mL dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi . Selanjutnya
diinkubasi  pada  suhu  37 ◦ C  selama  24  jam. Konsentrasi  terendah  yang  menghasilkan  efek penghambatan  tercatat  sebagai  KHM(Kaur  et  al., 2015;  Kawarai  et  al.,  2016).  Kontrol  positif  yaitu Listerine ® dengan  konsentrasi  45%  v/v,  media  dan suspensi bakteri dan kontrol negatif.
Evaluasi pembentukan biofilm S.mutans
Untuk melihat pembentukan biofilm dari Streptococcus  mutans, dimasukkan  75  µL  BHIB  + 2%  sukrosa  dan  25  µL  suspensi  bakteri  (1,5  x  10 8 CFU / mL) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Setelah inkubasi, microplates kemudian dibilas menggunakan air steril dan sumuran pada microplate diwarnai dengan 0,1% kristal violet selama 15 menit, kemudian dibilas, apabila microplates tetap berwarna ungu,  maka  telah  terbentuk  biofilm  pada  sumuran microplates (O'Toole, 2011).
Evaluasi penghambatan biofilm S.mutans
Seteleh variasi konsentrasi 2, 4, 6, 8 dan 10  mg/mL esktrak dipersiapkan, masing-masing sampel dimasukkan  ke  dalam microplates ,  ditambahkan  100 µL  suspensi  bakteri S.mutans dalam  BHIBdan dicukupkan  dengan  media  BHIB  hingga  200  µL. Sampel kemudian diinkubasi pada suhu 37° C selama 24  jam.  Setelah  diinkubasi,  isi microplate dibuang dan  dibilas  dengan  menggunakan  air  mengalir. Sumuran microplate kemudian  ditambahkan  larutan 0,1 %  kristal  violet.  Setelah  15  menit,  larutan  kristal violet dibuang dan dibilas kembali menggunakan air. Selajutnya microplate diisi  dengan  etanol    96% dan diinkubasi  selama  15  menit.  Media  BHIB  dan suspensi  bakteri  sebagai  kontrol  negatif  dan Listerine ® 45%  v/v  sebagai  kontrol  positif,  kontrol pelarut  yaitu  DMSO  20  %  v/v.  Kontrol  media  yaitu hanya  berisi  media  BHIB.  Biomasa  dari  lapisan biofilm  diukur  dengan  menggunakan  alat microplate reader dengan panjang  gelombang 515 nm  (O'Toole, 2011).

## Pengumpulan dan analisis data
Persentase  penghambatan  biofilm  dihitung  dengan menggunakan  rumus  berikut,  (Pratiwi,  Lagendijk, Hertiani, De Weert, & Van Den Hondel, 2015):
% 𝑝𝑒𝑛𝑔ℎ𝑎𝑚𝑏𝑎𝑡𝑎𝑛 = (1 − ( 𝜒𝑂𝐷𝑡 −𝜒𝑂𝐷𝑚𝑐 𝜒𝑂𝐷𝑣𝑐 ))𝑥100%
Keterangan :
ODt = Optical Density (515 nm) sumuran yang diuji ODmc  = Optical Density kontrol media ODvc = Optical Density kontrol pelarut
Data  yang  diperoleh  dari  pengujian  nilai  KHM  dan pengukuran  kuantitatif  dari  penghambatan  biofilm. Selanjutnya  akan  dilakukan  pengumpulan  dan analisis data berdasarkan hasil pengukuran yang telah dilakukan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Aktivitas  antibakteri  dari  ekstrak  teh  hijau  dan  teh hitam  sebelumnya  ditentukan  dengann  metode mikrodilusi.  Nilai  konsentrasi  hambat  dari  kedua ekstrak  ini  masing-masing  4  mg/mL  untuk  ekstrak teh  hijau,  dan  6  mg/mL  untuk  esktrak  teh  hitam. Kedua  konsentrasi  ini  lebih  tinggi  dari  nilai konsentrasi  hambat  minimumnya  yang  dirujuk  dari berbagai  pustaka  yaitu  0,104  mg/mL  untuk  teh  hijau dan 0.088 mg/mL untuk teh hitam (Kaur et al ., 2015). Walaupun  demikian,  dengan  mempertimbangkan sampel  yang  digunakan,  maka  konsentrasi  hambat eksperimen  dijadikan  acuan  dalam  pengujian antibiofilm S.mutans dari berbagai konsentrasi kedua esktrak.
Pembentukan  dan  evaluasi  penghambatan  biofilm dilakukan  dengan  metode mirotiter  plate. Untuk mengevaluasi  biofilm  yang  dibentuk  oleh S.mutans , suspensi  bakteri  setara  dengan  1,5  x  10 8 CFU/mL McFarland  dimasukkan  kedalam  masing-masing sumuran  ( microtiter  wells ),  dicampurkan  dengan medium.  Setelah  masa  inkubasi  24  jam,  sumuran dicuci dan diwarnai dengan Kristal Violet  0.1%, jika terbentuk  warna  ungu  yang  tidak  tercuci  maka banyaknya  zat  warna  yang  terikat  diasumsikan  sama dengan  banyaknya  biofilm  mikroba  pada  sumuran (O'Toole, 2011) (gambar 1).
Gambar 1. Evaluasi pembentukan biofilm S.mutans pada microplate 96 wells U-shape bottom. Biofilm diklaim terbentuk (A), dan tidak terbentuk (B). A merupakan campuran S.mutans dan medium, sedangkan B merupakan medium tanpa S.mutans . Setelah inkubasi 24 jam, masing- masing sumuran dicuci dan diwarnai dengan kristal violet 0.1%.
Gambar  1  menunjukkan  sumuran  yang  berwarna ungu  (A)  sebagai  representatif  terbentuknya  biofilm mikroba,  yaitu S.mutans .  Jika  diamati  dari  samping warna  ungu  terbentuk  merata  pada  dinding.  Hal  ini disebabkan  karena S.mutans merupakan  bakteri non- motile. Berbeda  dengan  bakteri  yang  melakukan pergerakan  banyak,  biasanya  warna  ungu  sumuran akan  terpusat  pada  permukaan  atas  sumuran.  Selain itu,  sebagai  bakteri  anaerob  fakultatif,  biofilm  yang terbentuk  cenderung  membentuk  pola  cincin  pada permukaan  sumuran  yang  mengindikasikan  tetap adanya kecendrungan kebutuhan terhadap oksigen(Kim et al., 2015; O'Toole, 2011).
Terbentuk dan stabilnya zat warna kristal violet pada biofilm S.mutans yang  menempel  pada  sumuran, pada  dasarnya  mengikuti  mekanisme  pengecatan gram  pada  umumnya.  Sebagai  bakteri  gram  positif S.mutans memiliki susunan dinding sel yang kompak dengan  lapisan  peptidoglikan  ( murein )  dan teichoic acid mampu  mencegah  sel  protoplasnya  mengalami lisis  osmotik  sekaligus  penahan  keluarnya  zat  warna kristal  violet  saat  dibilas  dengan  dapar  posfat (Kawarai et al., 2016).
Gambar 2. Efek ekstrak teh hitam (atas) dan esktrak teh hijau (bawah) pada pembentukan dan penghambatan biofilm S.mutans . Kuantitas yang digambarkan sebagai rata-rata±SD dari tiga kali pengujian.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 2 4 6 8 10 A P re se n tas e p en gh am b at an b io fil m Ab so rb a n si ( a .u ) Konsentrasi Ekstrak Teh Hitam (mg/mL) Pembentukan biofilm Presentase penghambatan 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 2 4 6 8 10 A P re se n tas e p en gh am b at an b io fil m
A b so rb an si (a.u ) Konsentrasi Ekstrak Teh Hijau (mg/mL) Pembentukan biofilm Penghambatan  biofilm A
B
Stabilnya  warna  ungu  pada  sumuran  kemudian dimanfaatkan untuk mengevauasi kemampuan ekstrak teh hijau dan teh hitam memanipulasi biofilm S.mutans yang  terbentuk.  Pada  gambar  2,  walaupun presentase
penghambatan kontrol positif ( mouthwash )  mencapai  71%,  kedua  sampel  ekstrak juga  tetap  menunjukkan  kemampuan  penghambatan terbentuknya biofilm yang signifikan.
Ekstrak  teh  hijau  memberikan  hasil  yang  lebih signifikan  dibandingkan  dengan  ekstrak  teh  hitam. Misalnya pada konsentrasi 6 mg/mL saja, ekstrak teh hijau  telah  memiliki  aktivitas  penghambatan  sebesar 45%  dimana  penghambatan  oleh  ekstrak  teh  hitam masih pada 1%. Rata-rata pembentukan biofilm yang terbentuk  pada  umumnya  juga  ditekan  oleh  ekstrak teh  hijau.  Pada  konsentrasi  terkecil  pun,  absorbansi pembentukan  biofilm S.mutans hanya  mencapai 0.307  a.u  <  0.468  a.u  oleh  ekstrak  teh  hitam. Penghambatan  biofilm  dari  ekstrak  teh  hitam  mulai efektif  pada  konsentrasi  8  mg/mL,  sebesar  6%  dan pada  konsentrasi10  mg/mL  yaitu  sebesar  12,5%, sedangkan  penghambatan  ekstrak  teh  hijau  pada kondisi  yang  sama  adalah  masing-masing  48%  dan 53%.
Perbedaan  hasil  presentase  penghambatan  antara kedua  teh  yang  digunakan  diduga  kuat  oleh  karena perbedaan konsentrasi kandungan fenoliknya. Ekstrak  teh  hijau  selalu  memiliki  kandungan  fenolik lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  esktrak  teh  hitam (Bancirova,  2010;  Kawarai  et  al.,  2016).  Hal  ini dipengaruhi karena pada proses pembuatan teh hitam, setelah  daun  teh  digulung,  kandungan  senyawa fenolik  pada  daun  teh  ini  diketahui  akan  mengalami oksidasi  oleh polyphenol  oxidase selama  90-120 menit. Berbeda dengan pengolahan  teh hijau, setelah dipetik,  daun  teh  ini  biasanya  akan  dikukus  untuk meminimalisir oksidasi sehingga dapat menginaktivasi polyphenol  oxidase sebelum  proses pengeringan  dilanjutkan  (McKay  &  Blumberg, 2002).
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  ekstrak  teh hijau  dengan  kandungan  fenolik  yang  lebih  tinggi berpotensi  menghambat    pembentukan  biofilm S.mutans dibandingkan  dengan  ekstrak  teh  hitam. Ekstrak teh hijau menunjukkan aktivitas penghambatan  biofilm  dari  konsentrasi  ≥2  mg/mL. Sedangkan  pada  ekstrak  teh  hitam  penghambatan hanya  akan  dicapai  pada  konsentrasi  ekstrak  ≥8 mg/mL.

## KESIMPULAN
Ekstrak  teh  hijau  dan  teh  hitam  memiliki  potensi sebagai anti-biofilm S.mutans yang dievaluasi dengan metode microtiter plate . Pada konsentrasi 10 mg/mL, ekstrak teh hijau memiliki potensi lebih tinggi (53%) dibandingkan  dengan  ekstrak  teh  hitam  (13%) menghambat biofilm S.mutans .

## UCAPAN TERIMAKASIH
Terimakasih  kepada  Laboratorium  Mikrobiologi Farmasi,  Farmakognosi-Fitokimia,  dan  Biofarmaka UNHAS sebagai sarana penunjang penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Amaya, S., Pereira, J. A., Borkosky, S. A., Valdez, J. C.,  Bardón,  A.,  &  Arena,  M.  E.  (2012). Inhibition of quorum sensing in Pseudomonas  aeruginosa  by  sesquiterpene lactones. Phytomedicine, 19 (13), 1173-1177.
Bancirova, M. (2010). Comparison of the antioxidant capacity  and  the  antimicrobial  activity  of black  and  green  tea. Food  Research International, 43 (5), 1379-1382.
Chu, W., Zhou, S., Jiang, Y., Zhu, W., Zhuang, X., & Fu,  J.  (2013).  Effect  of  traditional  Chinese herbal  medicine  with  antiquorum  sensing activity on Pseudomonas aeruginosa. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2013 .
Irie, Y., & Parsek, M. R. (2008). Quorum sensing and microbial biofilms Bacterial biofilms (pp. 67- 84): Springer.
Jiménez-Gómez,  P.,  Pozuelo  de  Felipe,  M.,  Llinares Pinell,  F.,  &  Garcia  de  los  Rios,  J.  (2007). Quorum-sensing  in  Pseudomonas  aeruginosa and  Salmonella:  Active  natural  compounds as  antagonists. Commun  Curr  Res  Edu Topics Trends App Microbiol, 1 , 41-51.
Kalia,  V.  C.  (2013).  Quorum  sensing  inhibitors:  an overview. Biotechnology  advances,  31 (2), 224-245.
Kaur,  H.,  Kaur,  S.,  &  Rana,  S.  (2015).  Antibacterial Activity  and Phytochemical Profile of Green Tea,  Black  Tea  and  Divya  Peya  Herbal  Tea. Int J Pure App Biosci, 3 (3), 117-123.
Kawarai, T., Narisawa, N., Yoneda, S., Tsutsumi, Y., Ishikawa,  J.,  Hoshino,  Y.,  &  Senpuku,  H. (2016).  Inhibition  of  Streptococcus  mutans
biofilm formation using extracts from Assam tea  compared  to  green  tea. Archives  of  oral biology, 68 , 73-82.
Kim,  H.-S.,  Lee,  S.-H.,  Byun,  Y.,  &  Park,  H.-D. (2015).  6-Gingerol  reduces  Pseudomonas aeruginosa  biofilm  formation  and  virulence via  quorum  sensing  inhibition. Scientific reports, 5 .
Koh,  K.  H.,  &  Tham,  F.-Y.  (2011).  Screening  of traditional  Chinese  medicinal  plants  for quorum-sensing  inhibitors  activity. Journal of  Microbiology,  Immunology  and  Infection,
44 (2), 144-148.
McKay, D. L., & Blumberg, J. B. (2002). The role of tea  in  human  health:  an  update. Journal  of the  American  College  of  Nutrition,  21 (1),  1- 13.
Michael, T. M., John, M., & Jack, P. (2003). Biology of  microorganisms. Pearson  Education,  Inc. Upper Saddle River, New Jersey , 66-67.
O'Toole,  G.  A.  (2011).  Microtiter  dish  biofilm formation  assay. Journal  of  visualized experiments: JoVE (47).
Pratiwi,  S.  U.,  Lagendijk,  E.  L.,  Hertiani,  T.,  De Weert, S., & Van Den Hondel, C. A. (2015). Antimicrobial effects of Indonesian
medicinal  plants  extracts  on  planktonic  and biofilm  growth  of  Pseudomonas  aeruginosa and  Staphylococcus  aureus. Journal  of Horticulture, 2015 .