## Aktivitas Ekstrak Etanol Daun Cincau Hijau (Cyclea barbata Miers) sebagai Penghambat Pembentukan Biofilm Bakteri Salmonella typhi
The Activity of Ethanolic Extract of Cyclea barbata Miers as Inhibitor of Bacterial Biofilm Formation of Salmonella typhi
1 Dimes Atika Permanasari, 2 Elly Nurus Sakinah, 3,4 Ali Santosa
1 Mahasiswa Fakultas Kedokteran, Universitas Jember
2 Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran, Universitas Jember Jalan Kalimantan No. 37 Kampus Tegalboto Jember  Kode Pos 68121
3 SMF Ilmu Penyakit Dalam, RSD dr.Soebandi Jember
4 Fakultas Kedokteran Universitas Jember Jl. dr.Soebandi No. 124, Jember 68111, Indonesia. Telp.: (+62331) 487441. Fax: (+62331) 487564 e-mail : dimesatika@ymail.com

## ABSTRAK
Biofilm  merupakan  matriks  yang  terdiri  dari  extracellular  polysaccharides  yang  berasal  dari  sel  mikrobial  yang bereplikasi  melekat  secara  irreversible  pada  permukaan.  Biofilm  pada  bakteri  S.typhi  strain  DT104  dapat mengeluarkan  senyawa  untuk  perlindungan.  Biofilm  dapat  menempel  pada  permukaan  alat  makan,  sehingga menyebabkan sumber kontaminasi pada makanan. Daun cincau hijau (Cyclea barbata Miers) merupakan tumbuhan yang memiliki flavonoid yang dapat menjadi penghambat pembentukan biofilm pada bakteri. Flavonoid merupakan golongan  senyawa  fenol  yang  berfungsi  sebagai  antibakteri  dengan  membentuk  senyawa  kompleks  yang mengganggu  keutuhan  membran  sel  dan  penghambat  biofilm  pada  bakteri.  Penelitian  ini  bertujuan  mengetahui aktivitas daun cincau hijau sebagai penghambat pembentukan biofilm S.typhi DT 104. Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian Quasy Experimental dengan design studi rancangan acak lengkap. Penelitian ini menggunakan 28 sampel yang terdiri dari 5 kelompok dosis esktrak daun cincau hijau dengan dosis 0.29 mg/ml , 0.33 mg/ml, 0.40 mg/ml, 0.50 mg/ml, 0.67 mg/ml, kelompok positif (suspensi bakteri dengan H 2 O 2 ) dan kelompok negatif (suspensi bakteri dengan H 2 O). Hasil penelitian ini menunjukkan peningkatan dosis akan mempengaruhi penurunan biofilm yang ditunjukkan penurunan Optical Density. Dengan uji One Way Anova adalah p= 0,004. Dapat disimpulkan ekstrak etanol daun cincau hijau mampu menghambat pembentukan biofilm pada  S.typhi DT 104 dan terdapat hubungan antara konsentrasi ekstrak etanol daun cincau hijau dengan penghambatan pembentukan biofilm bakteri S.typhi.

## Kata kunci: biofilm, daun cincau hijau, S.typhi

## ABSTRACT
Biofilm is a matrix consist of extracelullar polysaccharides from the replication of microbial cells that are irreversibly attached on the cell surface. Biofilm in bacteria S.typhi  strain DT104   contains food substance for protection. Biofilm can be attached to the clutery, causing  food contaminaton. Cyclea barbata Miers is a plant has flavonoid that can inhibited bacteria biofilm formation. Flavonoid is phenolic compounds that has function as antibacterial by forming complex compounds disturbing the integrity of cell membranes and inhibiting biofilm. This study aims to determine the  activity  of  the  Cyclea  barbata  Miers  as  inhibitor  of  S.typhi  DT  104  biofilm  formation.  This  study  used  Quasy Experimental design with completely randomized  design This study used 28 samples consist of 5 doses groups (0.29 mg/ ml, 0.33 mg / ml, 0.40 mg / ml, 0.50 mg / ml, 0.67 mg / ml), positive group (a bacterial suspension with H2O2) and  negative  group  (a  bacterial  suspension  with  H2O)  The  result  showed  that  the  increasing  doseof  extract  will decrease the biofilm formation revealed by decreasing of Optical Density and showed One Way Anova test resulted p  =  0.004.  In  conclusion, the ethanolic  extract  of  Cyclea  barbata  Miers  was  able  to  inhibit  S.typhi  DT  104  biofilm formation and there was a correlation between the concentration of ethanoic  extract of Cyclea barbata Miers and inhibition of S.typhi biofilm formation.
Key words: biofilm, Cyclea barbata Miers, S.typhi

## Pendahuluan
Infeksi bakteri S.typhi penyebab demam tifoid meru- pakan salah satu kasus tertinggi bagi kesehatan khu- susnya  di  Indonesia.  Penyakit  ini  mempunyai  faktor resiko dari lingkungan dan perilaku kebersihan sehari- hari yang rendah, maka terjadilah angka kejadian dari penyakit demam tifoid. WHO (World  Health Organi- sation) memperkirakan terdapat sekitar 17 juta kasus per  tahun  dengan  600.000  kasus  meninggal  dunia dikarenakan  demam  tifoid  (Depkes  RI,  2013).  Dari data  Departemen  Kesehatan  pada  tahun  2010 (Depkes  RI,  2010),  menjelaskan  bahwa  penderita demam tifoid dan paratifoid yang tercatat dirawat di Rumah Sakit  sebanyak 41.081 kasus dan 279 pasien diantaranya  telah meninggal.
Biofilm  merupakan  matriks  yang  terdiri  dari extracellular polysaccharides berasal dari bakteri yang bereplikasi melekat secara irreversible pada permukaan (Williamson, et al, 2009). Mekanisme bio- film yang terbentuk oleh S.typhi DT 104 dapat diham- bat  dari  beberapa  strategi  intervensi  yang  mampu mengganggu  dan  mencegah  terbentuknya  biofilm. Beberapa  contoh  seperti  disinfektan  dan  senyawa molekul  alami  yang  dapat  menghambat  pemben- tukan biofilm (Gunardi, 2014).
Ekstrak daun cincau hijau memiliki aktivias antibakteri terhadap E. coli dan S. typhi yang ditunjukkan dengan terbentuknya  zona  hambat  dikarenakan  aktivitas senyawa flavonoid (Asmardi, et al, 2014). Kandungan flavonoid  dalam  daun  cincau  juga  dapat  berfungsi sebagai  penghambat  pembentukan  biofilm  dengan cara menghambat ekspresi gen bakteri  (Loresta, et al, 2012).
Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui aktivitas ekstrak etanol daun cincau hijau sebagai penghambat pembentukan  biofilm  pada  bakteri  dan  mengetahui hubungan  konsentrasi  ekstrak  etanol  dengan penghambatan pembentukan biofilm S.typhi.

## Metode Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian quasy experimental  meggunakan  studi  rancangan  acak lengkap. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan  7  sampel  yaitu  5  dosis  ekstrak  secara
serial, kontrol positif dan kontrol negatif dengan 4 kali replikasi. Variabel bebas yang digunakan adalah dosis ekstrak daun cincau hijau 0.29 mg/ml , 0.33 mg/ml, 0.40  mg/ml,  0.50  mg/ml,  0.67  mg/ml  dan  variabel terikat  adalah  penghambatan  biofilm  bakteri  S.typhi strain DT 104. Pada kelompok kontrol negatif adalah suspensi bakteri dengan H 2 O yang dapat membentuk biofilm, sedangkan kelompok positif adalah suspensi bakteri  dengan  H 2 O 2 yang  tidak  dapat  membentuk biofilm.
Pengujian  efek  ekstrak  etanol  daun  cincau  hijau menggunakan metode Microtiter Plate Biofilm Assay (Loresta, et al, 2012). Bakteri yang diinkubasi selama 24  jam  pada  media  Mueller  Hinton  Broth  (MHB). Kemudian  jumlah  bakteri  diukur  menggunakan metode 0,5 Mc Farland standart. Pada masing-masing plate diberikan MHB sebanyak 50 mL/well dan bakteri, kemudian  pada  kelompok  perlakuan  diberikan konsentrasi  ekstrak  sebanyak  100  ml/well.  Pada kontrol  negatif  ditambahkan  H202  sebanyak  100 ml/well,  sedangkan  kelompok  positif  ditambahkan H20  sebanyak  100ml/well.  Kemudian  diinkubasi selama    24  jam.  Mikroplate  dicuci  dengan  Phospat Buffer  Saline  (PBS)  steril  sebanyak  tiga  kali. Ditambahkan  200  μL  metanol  selama  15  menit kemudian  dibuang  dan  dikeringkan.  Ditambahkan 200  μL  kristal  violet  0,1%  selama  5  menit.  Dicuci dengan  PBS  dan  ditambahkan  200  μL  asam  asetat glacial 33%, kemudian dibaca hasilnya menggunakan microplate reader (BIO-RAD Model 550) pada panjang gelombang 570nm. Hasil pembacaan merupakan nilai absorbansi  atau  Optical  Density  (OD)  yang menggambarkan kuantitas pembentukan biofilm. Analisis  data  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah One Way Anova dengan taraf signifikan p<0,05. Serta  menggunakan  uji  Korelasi  dan  Regresi  untuk mengetahui  pengaruh  ekstrak  daun  cincau  hijau terhadap penghambatan biofilm bakteri S.typhi

## Hasil Penelitian
Hasil  penelitian  rata-rata  biofilm  bakteri  S.typhi terlihat pada Tabel 1 berikut ini.
Tabel 1. Rata-rata Biofilm S.typhi Kelompok Rata-rata biofilm ± SD K (+) 0,198±0,058 K (-) 0,121±0,007 P1 0,133±0,132 P2 0,132±0,006 P3 0,131±0,016 P4 0,129±0,0129 P5 0,129±0,0129
Untuk mengetahui seberapa besar efek ekstrak etanol 96%  daun  cincau  hijau  terhadap  penghambat pembentukan  biofilm  S.typhi  bisa  terlihat  pada Gambar 1 berikut ini.
Gambar 1. Grafik penurunan biofilm S.typhi
Berdasarkan  uji  normalitas  Shapiro  Wilk  didapatkan nilai p>0,05 untuk semua kelompok penelitian untuk biofilm  S.typhi.  Uji  homogenitas  menunjukkan  nilai p=0,795.  Uji  One  Way  Anonova  menunjukkan  nilai p=0,04,  yang  artinya  terdapat  perbedaan  yang bermakna  antar  kelompok  perlakuan.  Uji  korelasi Pearson    didapatkan  nilai  signifikan  p=0,011  yang menunjukkan  terdapat  hubungan  antara  kelompok perlakuan  dan  kelompok  kontrol.  Pada  uji  regresi ditemukan persamaan y = -0,10x+ 0,178 dan koefien determinasi  sebesar  0,261,  hal  ini  menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi ekstrak etanol daun cincau hijau maka semakin besar penurunan biofilm bakteri  S.typhi.  Semakin  besar  konsentrasi  ekstrak maka  semakin  besar  pula  kandungan  zat  aktif flavonoid yang terkandung dalam ekstrak tersebut.

## Pembahasan
Pada penelitian ini, semua kelompok perlakuan diberi ekstrak  etanol  daun  cincau  hijau  yang  mempunyai efek penghambatan pembentukan biofilm dibandingkan dengan kontrol negatif. Kontrol negatif yaitu  S.typhi  yang  hanya  ditambahakan  dengan  H 2 0 menunjukkan  produksi  biofilm  yang  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  kelompok  lainnya.  Hal  ini berarti bakteri S.typhi strain DT104 dapat membentuk biofilm.
Flavonoid  yang  terkandung  dalam  ekstrak  daun cincau hijau dimungkinkan mampu menekan ekspresi gen  yjcC  pada  S.typhi  yang  mengakibatkan peningkatan pembentukan biofilm. Penelitian sebelumnya  menunjukkan  bahwa  faktor  seperti produksi  zat  exopolymeric,  ekspresi  flagella  dan regulasi  exoribonucleases  dapat  terlibat  dalam pembentukan biofilm S.typhi (Kim dan Wei, 2009). Hal ini  sesuai  dengan  penelitian  sebelumnya  dengan bakteri  gram  positif,  bahwa  mekanisme  kerja flavonoid  berfungsi  sebagai  antibakteri  dengan  cara membentuk  senyawa  kompleks  terhadap  protein extraseluler  yang  mengganggu  keutuhan  membran sel  bakteri.  Mekanisme  kerjanya  dengan  cara mendenaturasi  protein  sel  bakteri  dan  merusak membran  sel  tanpa  dapat  diperbaiki  lagi  (Juliantina, et al, 2008). Minimum
Biofilm Inhibition Concentration (MBIC) merupakan konsentrasi terrendah  dari  suatu  bahan  antibiofilm  yang  dapat menghambat  pembentukan  biofilm  (Chamdit  dan Siripermpool, 2012). Pada kadar flavonoid yang lebih pekat,  maka  dapat  mencapai  MBIC  pada  bakteri S.typhi.
Pada Uji Korelasi Pearson didapatkan hasil signifikansi p= 0,011. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun cincau hijau dapat menghambat pembentukan biofilm  pada  bakteri  S.typhi  secara  in  vitro  dan terdapat  hubungan  antara  konsentrasi  ekstrak  daun cincau  hijau  dengan  penghambatan  pembentukan biofilm  dengan  arah  korelasi  negatif,  semakin  besar konsentrasi  ekstrak  etanol  daun  cincau  hijau  maka semakin tinggi penghambatan pembentukan biofilm pada  bakteri  dengan  kekuatan  korelasi  sedang  p=  - 0,511.
K(-) K(+) P1 P2 P3 P4 P5 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Kelompok Perlakuan R ata -r ata Ju m lah B io fi lm Sal m o n e lla typ h i
Persamaan regresi yang didapat dalam penelitian ini y = -0,010 + 0,178 dan koefisien determinasi sebesar R² =  0,261.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  semakin  besar konsentrasi  ekstrak  etanol  daun  cincau  hijau  maka semakin  tinggi  pula  potensi  untuk  menghambat pembentukan  dengan  pengaruh  sebesar  26% .
Semakin  besar  konsentrasi  ekstrak  maka  semakin besar  kandungan  zat  aktif  tanin  dan  flavonoid  yang terkandung dalam ekstrak tersebut, sehingga semakin besar pula pengaruh dalam menghambat pembentukan biofilm (Loresta, et al, 2012).

## Simpulan dan Saran
Berdasarkan  hasil  dari  penelitian  dapat  disimpulkan aktivitas  daun  cincau  hijau  (Cyclea  barbata  Miers)
dapat  menghambat  pembentukan  biofilm    pada bakteri S.typhi secara in vitro, dan terdapat hubungan antara  ekstrak  daun  cincau  hijau  dan  bakteri  S.typhi dengan  semakin  tinggi  konsentrasi  ekstrak  etanol daun  cincau  hijau  yang  diberikan  maka  semakin rendah pembentukan biofilm bakteri S.typhi.
Berdasarkan  kesimpulan  diatas,  pada  penelitian tersebut  saran  yang  diberikan  peneliti  adalah penelitian lebih lanjut mengenai efek antibiofilm dari ekstrak  daun  cincau  hijau  terhadap  bakteri  Gram negatif  lainnya.  Serta  dapat  menggunakan  metode lain seperti Mikroskop elektron dan Media Congo Red Agar  (MCRA)  sebagai indikator pembentukan biofilm secara kualitatif.

## Daftar Pustaka

## Asmardi A, Roza RM, Fitmawati. Aktivitas Antibakteri
Ekstrak Daun Cyclea babata(L) Miers. Terhadap Bakteri Escherichia coli dan  S.typhi. Pekanbaru: Fakultas MIPA Universitas Riau: 2014

## Chamdit S dan Siripermpool P. Antimicorbial Effect of
Clove  and  Lemongrass  Oils  against  Planktonic Cells  and  Biofilms  of  Staphyhlococcus  aureus,
Mahidol University :J. Pharm. Sci; 2012
Depkes  RI.  Profil  Kesehatan  Indonesia,  Jakarta: Departemen  Kesehatan  Republik  Indonesia;
2010
Depkes  RI.  Sistematika  Pedoman  Pengendalian
Penyakit  Demam  Tifoid.  Jakarta:  Direktoral
Jendral  Pengendalian  Penyakit  dan  Penyehatan
Lingkungan; 2013
Gunardi  WD.  Peranan  Biofilm  dalam  Kaitannya dengan  Penyakit  Infeksi.  Jakarta:  FK  UKRIDA;
2014
Juliantina F, Citra DA, Nirwani B, Nurmasitoh T, Bowo
ET.  Manfaat  Sirih  Merah  (Piper  crocatum)
Sebagai  Agen  Anti  Bakterial  Terhadap  Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. UII. Yogyakarta (http://journal.uii.ac.id); 2008
Kim, SH, Wei, Cl. Molecular characterization of biofilm formation  and  attachment  of    Salmonella
enterica  serovar  typhimurium  DT104  on  food contact surfaces. Available from:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19 777884; 2009
Loresta  S,  Murwani  S,  Trisunuwati  P.  Efek  Ekstrak Etanol  Daun  Kelor  (Moringa  oleifera)  terhadap Pembentukan  Biofilm  Staphylococcus  aureus secara  In  Vitro.  Malang:  FKH  Universitas Brawijaya; 2012
Williamson  AE,  Cardon  JW,  Drake  DR.  Antimicrobial susceptibility  of  monoculture  biofilms  of  a clinical isolate of Enterococcus faecalis. J Endod; 2009