## PENGARUH TEKNIK ISOLASI DNA GENOM TANAMAN TEMBAKAU TERHADAP KUALITAS DAN KUANTITAS HASIL EKSTRAKSI

## THE EFFECT OF TOBACCO PLANT GENOMIC DNA ISOLATION TECHNIQUES ON THE QUALITY AND QUANTITY OF EXTRACTION PRODUCTS
Ahmad Ilham Tanzil, Wahyu Indra Duwi Fanata
Program Studi Agroteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Jember
Email korespondensi: aitanzil@unej.ac.id

## ABSTRAK
Tanaman tembakau  merupakan  komoditas  perkebunan  penting  di  Indonesia.  Namun belakang sering terjadi kendala dalam budidaya. Adapun kendala tersebut diantaranya cekaman abiotik  dan  biotik.  Dalam  menanggulangi  hal  tersebut  perlu  dilakukan  perbaikan  varietas tanaman melalui program pemuliaan berbasis molekuler. Program bioteknologi tersebut perlu dilakukan  penelitian  optimalisasi  dalam  proses  isolasi  DNA  agar  hasil  yang  dihasilkan  bisa digunakan  untuk  analisa  lebih  lanjut.  Adapun  metode  yang  digunakan  menggunakan perbandingan  teknik  ekstraksi  menggunakan  alat  dan  gerus  dengan  bahan  kimia.  Sedangkan sampel  daun  tembakau  digunakan  menggunakan  perbandingan  sampel  basah  dan  sampel kering. Dari hasil yang didapatkan bahwa perlakuan metode gerus dengan bahan kimia (nitrogen cair) menggunakan sampel basah mampu meningkatkan hasil dari kualitas maupun kuantitas konsentrasi DNA.
Kata kunci: Isolasi DNA, Nitrogen Cair, Konsentrasi DNA, Pemuliaan Berbasis Molekuler, Genom

## ABSTRACT
Tobacco plants are an important plantation commodity in Indonesia. However, problems often  occur  in  cultivation.  These  obstacles  include  abiotic  and  biotic  stress.  To  overcome  this problem, it is necessary to improve plant varieties through molecular-based breeding programs. This  biotechnology  program  needs  to  carry  out  optimization  research  on  the  DNA  isolation process so that the results produced can be used for further analysis. The method used uses a comparison  of  extraction  techniques  using  tools  and  grinding  with  chemicals.  Meanwhile, tobacco leaf samples were used with a comparison of wet samples and dry samples. From the results obtained, the treatment of the grinding method with chemicals and wet samples was able to increase the quality and quantity of DNA concentration.
Key  words  :  DNA  Isolation,  Liquid  Nitrogen,  DNA  Concentration,  Molecular  Based  Breeding, Genome

## PENDAHULUAN
Studi genetik terutama studi
populasi  genetik  terhadap  jenis  tumbuhan berlangsung sangat lambat disebabkan oleh banyak kesulitan yang menghambat seperti
penyediaan  sampel  segar  setelah  dibawa dalam  perjalanan  jauh  sering  menginduksi senyawa  fenol  dan  polisakarida  pada berbagai  tumbuhan.  Senyawa  tersebut dapat  mengontaminasi  sediaan  DNA  dan
akan  menghambat  analisis  lebih  lanjut. Isolasi untuk mendapatkan DNA berkualitas tinggi  merupakan  satu  kaidah  dasar  yang harus  dipenuhi  dalam  analisis  molekuler. Permasalahan  dalam  isolasi  DNA  masih merupakan  hal  penting  yang  perlu  diatasi (Leigh Greathouse et al., 2019; Restu & dan Gusmiaty, 2012; Sajali et al., 2018 ) .
Berbagai  teknik  analisis  dalam pemuliaan  tanaman  dan  biologi  molekuler yang berdasarkan pada hibridisasi molekuler atau PCR membutuhkan DNA dalam jumlah yang  cukup  dan  kualitas  yang  baik  (Amani, 2011).  Oleh  karena  kandungan  senyawa sekunder dalam sel tanaman berbeda-beda, maka setiap tanaman membutuhkan prosedur  isolasi  yang  optimum  agar diperoleh DNA genom yang dapat digunakan sebagai  bahan  dalam  analisis  molekuler. Optimasi prosedur tersebut dapat dilakukan terhadap  komposisi  larutan  buffer  lisisnya ataupun  teknik  penanganan  fisik  dalam pemisahan  DNA  genom  dari  senyawa  lain. Pada  prinsipnya  optimasi  prosedur  ini bertujuan  melindungi  DNA  genom  dari degradasi  akibat  senyawa  sekunder  yang dilepaskan  ketika  sel  dihancurkan  atau kerusakan akibat penanganan fisik (Harris & Hoelzel, 1993).
Beberapa teknik dan prosedur telah dipublikasikan,  tetapi  seringkali  tidak  dapat diaplikasikan  karena  genus  atau  bahkan spesies  tanaman  bersifat  sangat  spesifik. Modifikasi  metode  standar  ekstraksi  DNA diperlukan  pada  ekstraksi  DNA  dari  daun tanaman yang mengandung banyak polisakarida  atau  metabolit  sekunder.
Berdasarkan penelitian (Langga & Kuswinanti,  2012)  memperlihatkan  hasil ekstraksi  DNA  yang  kurang  optimal  baik
kualitas  maupun  kuantitas  DNA  yang dihasilkan sehingga mempengaruhi intensitas  pita  DNA  hasil  amplifikasi  yang
tidak jelas. Hal tersebut menunjukkan bahwa metode  isolasi  DNA  yang  telah  dilakukan pada  padi  tidak  dapat  diaplikasikan  secara maksimal  pada  tanaman  seperti  tembakau. Oleh  karena  itu  pemilihan  dan  optimalisasi metode isolasi yang memungkinkan diperolehnya DNA genom tanaman
tembakau perlu dilakukan.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  ini  dilaksanakan  dari bulan Agustus – November   2023   di   Green House  Agroteknopark    dan  Laboratorium Terpadu CDAST  Universitas Jember. Adapun alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  analog  distruptor  genie,  sentrifius, oven,    timbangan, mikropipet,    gelas ukur, eletroforesis,  nano  drop,  microwave,  gel doc,  mortar,    dan  alat      tulis.  Bahan      yang digunakan   dalam penelitian   ini   yaitu   bibit tembakau      varietas  bligon  1  (T1),  jepril  1 (T2),  kemloko  3  (T3),  tanah,  nitrogen  cair, buffer lisis, buffer ekstraksi, gel elektroforesis.
Isolasi  DNA  menggunakan  sampel daun  basah  (segar)  dan  daun  kering  (yang telah  di  oven  suhu  80 o C  selama  48  jam). Metode alat menggunakan analog distruptor genie (de Jonge et al., 2020; Mokoena et al.,
2023) sedangkan metode
gerus menggunakan  bantuan  nitrogen  cair suhu  - 196 o C  (Abdel-Latif &  Osman,  2017;  Sahu  et al.,  2012).  Setelah  daun  hancur,  baru diberikan buffer lisis. Hingga nanti didapatkan DNA dan diberi buffer TE. Analisa kuantitas  konsentrasi  DNA  diukur  dengan Nano-Drop  (Sophian  &  Syukur,  2021)  dan analisa  kualitas  DNA  diukur  dengan elektroforesis gel 1%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil konsentrasi DNA yang
dihasilkan disajikan dalam grafik berikut:
Gambar 1. Hasil Kuantitas DNA
Keterangan: T1 = Var. Bligon 1; T2 = Var. Jepril 1; T3 = Var. Kemloko 3 ; Sampel Basah dan Kering; Metode
Gerus dan Mekanik Berdasarkan hasil gambar 1 menyatakan bahwasannya perlakuan metode sampel basah mampu
meningkatkan hasil konsentrasi DNA. Hal ini diduga  bahwa  sampel  basah  masih  dalam kondisi  segar  sehingga  lebih  mudah  dalam melaksanakan  ekstraksi  DNA  dibandingkan sampel  kering.  Selaras  dengan  hasil penelitian Chase & Hills (1991) bahwasannya sampel daun yang segar lebih disukai karena menghasilkan  DNA  yang  bagus.  Sedangkan metode gerus memiliki kuantitas DNA lebih baik dibandingkan dengan metode mekanik. Hal  ini diduga karena  penggerusan menggunakan nitrogen cair mampu menghasilkan serbuk halus sehingga semua bagian  sel  dapat  diekstraksi  dibandingkan metode mekanik. Pernyataan Haymes, et. al. (2004)  bahwasannya  penggunakan  metode mekanik  menggunakan  distruptor  genie tidak sebaik dengan metode yang lain.
Parameter dalam mengukur kuantitas  DNA  dapat  dilihat  dari  tingkat kemurnian. Tingkat kemurnian dapat diketahui  melalui  kuantitas  DNA  dari kontaminan  yang  ikut  terisolasi.  Adapun caranya  yaitu  dengan  membagi  nilai A260/280. Jika nilai sekitar 1,8-2 maka dapat dikatakan  murni.  Namun  jika  dibawah  1,8 kemungkinan  ada  kontaminasi  fenol  atau protein dalam larutan. Nilai hasil konsentrasi A260/280 tampak seperti gambar 2 dibawah ini.  Dari  keseluruhan  hasil  tampak,  nilai konsetrasi  masih  dibawah  1,8  yang  artinya terdapat  kontaminasi  protein.  Solusi  dalam permasalah  ini,  maka  dalam  isolasi  DNA perlu  ditambahkan  protease.  Jika  nilai kemurniannya  di  bawah  1,8,  DNA  yang diisolasi  mungkin  demikian  terkontaminasi protein,  begitu  pula  sebaliknya  jika  nilai kemurniannya diatas 2,1 maka dapat diduga demikian  isolasi  DNA  yang  dilakukan terkontaminasi RNA (Eppendorf, 2016).
0 100 200 300 400 500 600 T1 T2 T3 T1 T2 T3 T1 T2 T3 T1 T2 T3 Basah Kering Basah Kering
Gerus
Mekanik Ko n se n tr as i DN A ( µ g) Perlakuan

## Hasil Kuantitas DNA
Gambar 2. Hasil Kuantitas Konsentrasi DNA
Keterangan: T1 = Var. Bligon 1; T2 = Var. Jepril 1; T3 = Var. Kemloko 3; Sampel Basah dan Kering; Metode Gerus dan Mekanik
Gambar  2  menunjukan  hasil  kuantitas konsentrasid DNA setelah  diamati di NanoDrop. DNA  atau  RNA  pada  umumnya  merupakan rangkaian  nukleotida  yang  terdiri  dari  5  jenis dimana  kelima  jenis  tersebut  nukleotida  jika dibaca nilai serapannya pada panjang gelombang A260/A280 akan mempunyai nilai yang berbeda- beda,  misalnya  cDNA,  nilai  kemurnian  1,8-2,1 merupakan  nilai  akumulasi  4  Jenis  nukleotida adalah guanin (1,15), adenin (4,50), sitosin (1,51), dan  timin  (1,47).  sedangkan  untuk  RNA,  timin akan digantikan oleh urasil yang mempunyai nilai serapan  (4,00).  karena  nilai  serapan  urasil  lebih tinggi  dibandingkan  yang  lain  nukleotida penyebab adanya urasil jika dibaca pada panjang gelombang  A260/A280  akan  menunjukkan  nilai kemurnian  yang  diatas  2,1  (University,  2020). Ektraksi  DNA  ialah  proses  perpanduan  antara
seni  dan  sains  karena  banyak  faktor  yang mempengaruhi (Nugroho et. al. 2019)
Berdasarkan hasil gambar 3 menyatakan bahwasannya  perlakuan  metode  sampel  basah mampu  meningkatkan  hasil  konsentrasi  DNA. Kualitas  ekstraksi  DNA  sangat  dipengaruhi  oleh ketiga  faktor  diantaranya  proses  pengancuran, kualitas bahan jaringan tanaman, serta kuantitas jaringan tanaman (Ferniah & Pujianto, 2013). Hal ini  diperkuat  dengan  penelitian  (Guha  et  al., 2018)  bahwa  sampel  basah  akan  membuat  pita band  menjadi  terang  dan  tebal.  Hasil penggerusan dengan menggunakan nitrogen cair lebih  baik  dibandingkan  dengan  metode mekanik. Nitrogen cair sangat bermanfaat dalam proses pengerusan jaringan tanaman
dikarenakan  suhu  yang  dingin  mampu  menjaga
DNA  tetap  tidak  terdegradasi  (Kamba  &  Deb,
2018).
Gambar 3. Hasil Kualitas Pita DNA
Keterangan: 1-3 perlakuan sampel basah dan gerus, 4-6 perlakuan sampel kering dan gerus, 7-9 perlakuan sampel basah dan mekanik, 10-12 perlakuan sampel kering dan mekanik
Elektroforesis  adalah  suatu  teknik pemisahan  molekul-molekul  berdasarkan muatan  listrik  yang  diaplikasikan  pada molekul  tersebut.  Dalam  konteks  analisis DNA, elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen
DNA berdasarkan  ukuran  mereka.  Salah  satu aspek  penting  dalam  analisis  elektroforesis DNA  adalah  kualitas  pita  DNA  yang dihasilkan  (Gambar  3).  Kualitas  pita  DNA dapat  diukur  berdasarkan  kecerahan  atau intensitas  pita  yang  terbentuk  pada  gel elektroforesis.  Hasil  elektroforesis  DNA sering  kali  menunjukkan  variasi  dalam kecerahan  pita,  yaitu  ada  yang  tampak terang dan ada yang tampak kurang terang. Penyebab variasi dalam kecerahan pita DNA dapat  disebabkan  oleh  beberapa  faktor, antara lain konsentrasi DNA, kualitas isolasi DNA,  keberadaan  kontaminan,  dan  kondisi elektroforesis.  Konsentrasi  DNA  yang  tinggi
cenderung  menghasilkan  pita  yang  lebih terang  karena  jumlah  molekul  DNA  yang lebih  banyak.  Namun,  konsentrasi  yang sangat  tinggi  juga  dapat  menyebabkan overloading,  di  mana  pita-pita  DNA bertumpuk  dan  sulit  untuk  dipisahkan dengan  jelas.  Sebaliknya,  konsentrasi  DNA yang  rendah  dapat  menghasilkan  pita  yang kurang  terang  atau  bahkan  tidak  terlihat sama sekali.
Kualitas isolasi DNA juga memainkan peran penting dalam membentuk pita yang jelas, karena kontaminan atau fragmen DNA yang  tidak  diinginkan  dapat  mengganggu visualisasi  pita  target.  Selain  itu,  faktor  lain yang  dapat  mempengaruhi  kecerahan  pita DNA  adalah  kondisi  elektroforesis,  seperti tegangan listrik, durasi, dan jenis buffer yang digunakan.  Penggunaan  tegangan  listrik yang terlalu tinggi atau terlalu rendah dapat memengaruhi  migrasi  DNA  dalam  gel,
sehingga mempengaruhi intensitas pita yang terbentuk.  Durasi  elektroforesis  yang  tidak tepat  juga  dapat  menghasilkan  pita  yang tidak optimal. Pemilihan  buffer  yang  sesuai juga  penting  untuk  memastikan  kondisi elektroforesis yang optimal dan pembentukan pita DNA yang jelas. Beberapa studi  telah  mendukung  hubungan  antara faktor-faktor  ini  dengan  kualitas  pita  DNA dalam  elektroforesis.  Misalnya,  penelitian oleh Smith et al. (2018) menunjukkan bahwa konsentrasi  DNA  yang  tepat  dan  kondisi elektroforesis  yang  optimal  sangat  penting untuk mendapatkan hasil elektroforesis yang
akurat.  Begitu  juga,  penelitian  oleh  Jones dan  Brown  (2020)  menyoroti  pentingnya kualitas  isolasi  DNA  dalam  mempengaruhi kecerahan  pita  DNA.  Dalam  praktiknya, untuk mendapatkan hasil elektroforesis DNA yang optimal, penting untuk memperhatikan semua faktor yang telah disebutkan di atas dan mengoptimalkan kondisi eksperimental sesuai dengan tujuan analisis yang diinginkan.

## KESIMPULAN
1. Hasil kuantitas DNA berdasarkan konsentrasi DNA lebih baik menggunakan sampel basah dan metode gerus dengan nitrogen cair dibandingkan pita band DNA
sampel kering dengan metode alat
2. Hasil kuantitas DNA berdasarkan perbandingan panjang gelombang
A260/A280  lebih  tinggi  menggunakan sampel basah dan metode gerus dengan nitrogen cair dibandingkan pita band DNA sampel kering dengan metode alat
3. Hasil  kualitas  DNA  berdasarkan  uji elektrofesis  lebih  tebal  pita  band  DNA sampel  basah  dengan  metode  gerus dibandingkan  pita  band  DNA  sampel kering dengan metode alat

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terimakasih kepada pihak Universitas  Jember  dan  LP2M  yang  telah memberikan  pendanaan  hibah  penelitian skim hibah dosen pemula Bantuan Pendanaan Program Hibah Internal Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat Tahun 2023. Berdasarkan Surat Keputusan  Rektor  Universitas  Jember Nomor  7575/UN25/KP/2023  Tanggal:  30 Maret 2023 dan Perjanjian Penerima  Hibah Dosen Pemula Nomor: 3437/UN25.3.1/LT/2022  Tanggal  3  April 2023  mendapatkan  anggaran  penelitian dengan judul Optimalisasi Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Padi, Tebu, dan Tembakau untuk Kegiatan Pemuliaan Berbasis
Molekuler sumber dana DIPA PNBP 2023.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdel-Latif,  A.,  &  Osman,  G.  (2017). Comparison  of  three  genomic  DNA extraction methods to obtain high DNA quality  from  maize. Plant  Methods , 13 (1).
https://doi.org/10.1186/s13007-016-
0152-4
Amani,  J.,  Kazemi,  R.,  Abbasi,  A.  R.,  &
Salmanian,  A.  H.  (2011).  A  simple  and rapid  leaf  genomic  DNA  extraction method for polymerase chain reaction analysis. Iranian journal of biotechnology, 9(1), 69-71.
Chase, M. W., & Hills, H. H. (1991). Silica gel: an ideal material for field preservation of leaf samples for DNA studies. Taxon, 40(2), 215-220.
de  Jonge, W. J., Brok, M., Kemmeren, P., &
Holstege, F. C. P. (2020). An Optimized
Chromatin Immunoprecipitation Protocol for Quantification of Protein- DNA Interactions. STAR Protocols , 1 (1).
https://doi.org/10.1016/j.xpro.2020.1
00020 Eppendorf. (2016). Nucleic Acid Photometry.
22331.
Ferniah,  R.  S.,  &  Pujiyanto,  S.  (2013).
Optimasi  Isolasi  DNA  Cabai  (Capsicum annuum  L.)  Berdasar  Perbedaan Kualitas  dan  Kuantitas  Daun  serta Teknik  Penggerusan.  Bioma  :  Berkala Ilmiah Biologi, 15(1), 14-19. https://doi.org/10.14710/bioma.15.1. 14-19
Guha, P., Das, A., Dutta, S., & Chaudhuri, T. K.  (2018).  A  rapid  and  efficient  DNA extraction  protocol  from  fresh  and frozen  human  blood  samples. Journal of  Clinical  Laboratory  Analysis , 32 (1). https://doi.org/10.1002/jcla.22181
Harris,  S.  A.,  &  Hoelzel,  A.  R.  (1993).
Molecular Genetic Analysis of Populations. A Practical Approach. The Journal  of  Applied  Ecology , 30 (1). https://doi.org/10.2307/2404283
Haymes, K. M., Ibrahim, Mischke, S., Scott, D. L.,  &  Saunders,  J.  A.  (2004).  Rapid isolation  of  DNA  from  chocolate  and date  palm  tree  crops.  Journal  of agricultural and food chemistry, 52(17), 5456-5462.
Jones, R., & Brown, D. (2020). Effects of DNA isolation quality on DNA gel electrophoresis  results.  Journal  of Genetic Analysis, 40(2), 78-85.
Kamba,  J.  O.  Y.  R.  I.  S.  O.  N.,  &  Deb,  C.  R.
(2018). A new simple and efficient DNA extraction  protocol  for  orchid  without liquid  nitrogen  and  phenol.  Plant  Cell Biotechnol Mol Biol, 19(3-4), 143-147.
Langga,  I.  F.,  &  Kuswinanti,  T.  (2012). Tanaman  Bitti  (Vitex  cofassus  Reinw) Serta  Analisis  Keragaman  Genetik Dengan Teknik RAPD-PCR Optimization of  Temperature  and  Length  of Incubation  in  Extracting  Bitti  Plant (Vitex  cofassus  Reinw.)  Dna  and Genetic  Variety  Analysis  with  RAPD-
PCR. J.  Sains  &  Teknologi,  Desember , 12 (3), 265 – 276.
Leigh Greathouse, K., Sinha, R., & Vogtmann, E.  (2019).  DNA  extraction  for  human microbiome  studies:  The  issue  of standardization.  In Genome  Biology (Vol. 20, Issue 1). BioMed Central Ltd. https://doi.org/10.1186/s13059-019- 1843-8
Mokoena,  N.  Z.,  Steyn,  H.,  Hugo,  A.,  Dix- Peek, T., Dickens, C., Gcilitshana, O. M. N., Sebolai, O., Albertyn, J., & Pohl, C. H.  (2023).  Eicosapentaenoic  acid influences the pathogenesis of Candida albicans  in  Caenorhabditis  elegans  via inhibition  of  hyphal  formation  and stimulation  of  the  host  immune response. Medical  Microbiology  and Immunology , 212 (5), 349 – 368. https://doi.org/10.1007/s00430-023-
00777-6
Nugroho,  K.,  Terryana,  R.  T.,  &  Lestari,  P. (2019). Metode ekstraksi DNA tanaman tanpa presipitasi etanol untuk kegiatan polymerase chain reaction (PCR). Jurnal Bioteknologi  dan  Biosains  Indonesia,
6(1), 29-38.
Restu,  M.,  &  dan  Gusmiaty,  M.  (2012).
Optimalisasi  Teknik  Ekstraksi  dan Isolasi  DNA  Tanaman  Suren  (Toona Sureni Merr.) untuk Analisis Keragaman Genetik berdasarkan
Random  Amplified  Polymorphic  DNA (RAPD). Jurnal  Natur  Indonesia , 14 (2),
138 – 142.
Sahu,  S.  K.,  Thangaraj,  M.,  &  Kathiresan,  K.
(2012).  DNA  Extraction  Protocol  for
Plants  with  High  Levels  of  Secondary Metabolites and Polysaccharides
without  Using  Liquid  Nitrogen  and Phenol. ISRN Molecular Biology , 2012 ,
1 – 6. https://doi.org/10.5402/2012/205049
Sajali,  N.,  Wong,  S.  C.,  Hanapi,  U.  K.,  Abu Bakar @ Jamaluddin, S., Tasrip, N. A., & Mohd  Desa,  M.  N.  (2018).  The Challenges  of  DNA  Extraction  in Different  Assorted  Food  Matrices:  A Review. In Journal of Food Science (Vol.
83, Issue 10, pp. 2409 – 2414). Blackwell
Publishing Inc. https://doi.org/10.1111/1750-
3841.14338 Smith, A., Johnson, B., & Williams, C. (2018). The  impact of DNA concentration  and electrophoresis  conditions  on  gel electrophoresis  results.  Journal  of
Molecular Biology, 25(3), 112-120. Sophian, A., & Syukur, A. (2021). Analysis of Purity  and  Concentration  of  Isolated DNA in Making Raw DNA of Rat Species: Analysis of Purity and Concentration of Isolated DNA in Making Raw DNA of Rat Species.  Eruditio:  Indonesia  Journal  of Food and Drug Safety, 1(2), 1-5. University,  E.  (2020).  EIGC.  005  _ Quantitation with NanoDrop Standard Operating  Procedure  Staff  Review Page:  Standard  Operating  Procedure Approval  Page:  Manual  Prosedure,  1 – 5.