## EFEK INTERAKSI MASA EKUILIBRASI DAN LAJU PENURUNAN SUHU TERHADAP PENINGKATAN KEUTUHAN MEMBRAN PLASMA SPERMA DOMBA PRIANGAN PASCA THAWING
(The Interaction Effect of Equilibration Time and Freezing Rate toward the Membran Plasma Sperm Integrity of Priangan Ram Sperm Post thawing)
Ken Ratu Gharizah Alhuur 1 , Soeparna 2 , dan Rd. Siti Darodjah 2
1 Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran
2 Departemen Produksi Ternak, Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran Jl. Raya Bandung-Sumedang Km.21, Jawa Barat 40600
Email : kenalhuur@gmail.com

## ABSTRACT
In general, the freezing process of semen will have a detrimental effect on the structure and function of spermatozoa. The critical point in the semen freezing process is when the temperature drops to freezing, but this can be overcome by applying the right equilibration period. This study aimed to find out the best the equilibration length, the freezing rate,  their interaction in the semen freezing process towards membrane sperm cell integrity of the frozen semen post thawing. This study used Priangan sheep’s semen and was carried out according to a completely randomized design with a 3 x 3 split-plot design arrangement. The main plot was equilibration length, i.e., 0.5,  1.5, and 2.5 hours. The subplot was the freezing rate, i.e., 7.5ºC/mins, 13.5ºC/mins, and 19.5ºC/mins. The result of the study showed that there was a significant interaction (P<0.05) between the equilibration length of 1.5 hours and the freezing rate of 13.5°C/mins on the motility and the membrane sperm cell integrity. In conclusion, the best sperm quality was obtained from the equilibration length of 1.5 hours and the freezing rate of 13.5°C/mins.
Keyword : Membrane Sperm Cell Integrity, Equilibration Length, Freezing Rate.

## ABSTRAK
Proses pembekuan semen pada umumnya akan memberikan efek merugikan pada struktur dan fungsi spermatozoa. Titik kritis pada proses pembekuan semen adalah pada saat penurunan suhu ke titik beku, namun hal ini dapat diatasi dengan penerapan masa ekuilibrasi yang tepat. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui lama ekuilibrasi dan laju penurunan suhu terbaik serta interaksi antara keduanya dalam proses pembekuan sperma terhadap keutuhan membran plasma sperma dari semen beku pasca thawing . Penelitian ini menggunakan semen domba Priangan dan dengan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola 3 (petak utama) x 3 (anak petak). Sebagai petak utama (main plot) adalah lama waktu ekuilibrasi pada suhu 5ºC yang terdiri atas 3 taraf, yakni: 0,5 jam, 1,5 jam2,5 jam. Sebagai anak petak (subplot) adalah laju penurunan suhu pembekuan dari suhu 5ºC sampai -160ºC yang terdiri atas 3 taraf, yakni 7,5ºC/menit, 13,5ºC/menit, 19,5ºC/menit. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat interaksi yang nyata lebih tinggi (p<0,05) antara perlakuan lama ekuilibrasi 1,5 jam dan laju penurunan suhu 13,5ºC/menit terhadap keutuhan membran plasma sperma. Kualitas terbaik ditunjukkan pada interaksi antara perlakuan lama ekuilibrasi 1,5 jam dan laju penurunan suhu 13,5ºC/menit.
Kata Kunci: Keutuhan membran plasma sperma, Lama ekuilibrasi, Laju penurunan suhu pembekuan

## PENDAHULUAN
Salah  satu  cara  untuk  mengoptimalkan perkembangan  populasi  domba  Priangan  di Jawa Barat dapat dilakukan melalui inseminasi
buatan.  Umumnya,  semen  yang  digunakan dalam program inseminasi buatan adalah semen beku.  Semen  beku  memungkinkan  materi genetik pejantan unggul hasil seleksi disebarkan ke sejumlah ternak betina yang memiliki jarak

## Alhuur, dkk
tempuh  jauh,  ataupun  untuk  digunakan  pada waktu  yang  akan  datang,  sehingga  dapat meningkatkan potensi genetik domba Priangan secara luas.
Kelemahan penggunaan semen beku dalam program inseminasi buatan pada domba adalah angka konsepsi induk betina yang dikawinkan secara buatan dengan menggunakan semen beku cenderung lebih rendah dibandingkan dengan semen  segar,  karena  pada  dasarnya,  proses pembekuan dan thawing akan pada semen akan memberikan efek merugikan terhadap struktur dan fungsi spermatozoa  (Suyono dkk ., 2018). Masalah  utama  yang  terjadi  selama proses  pembuatan  semen  beku  adalah terjadinya  cekaman  dingin  pada  sel  sperma yang dibekukan yang menyebabkan kematian, pengeluaran air yang berlebihan dari dalam sel sperma, pembentukan kristal es, dan terjadinya penumpukan  elektrolit-elektrolit  dan  bahan terlarut lainnya di dalam larutan atau di dalam sel, yang mengakibatkan terjadinya perubahan intraseluler,.  Kristal-kristal  es  di  dalam  atau di  luar  sel  akan  menyebabkan  kerusakan sperma  secara  mekanik.  Kematian  sel  sperma pasca thawing dipengaruhi  oleh  perubahan permeabilitas  sel  sperma  yang  disebabkan oleh  larutnya  selubung  lipoprotein  dinding sel  sperma  akibat  konsentrasi  elektolit  yang berlebih. (Minter and DeLiberto, 2005; Zelpina, et al., 2012). Penurunan  kualitas  sperma  umumnya terjadi secara drastis setelah sperma mengalami pembekuan  karena  adanya cold  shock ,  salah satunya  ditandai  dengan  rusaknya  membran plasma  utuh  yang  biasanya  diikuti  dengan rusaknya  tudung  akrosom  sperma,  akibatnya enzim-enzim  yang  diperlukan  selama  proses fertilisasi keluar dari badan sel, sehingga terjadi kegagalan  fertilisasi  (Herdis,  dan  Darmawan, 2012).
Laju  penurunan  suhu  dalam  proses pembekuan semen merupakan salah satu faktor penting  yang  mempengaruhi  kualitas  semen. Metode  laju  penurunan  suhu  didasari  oleh suhu  kritis  sperma  pada  proses  pembekuan. Suhu  kritis  sperma  ini  berkisar  antara  -10ºC sampai  -25ºC,  dan  kerusakan  terutama  terjadi pada  suhu  -17  ºC  akibat  kenaikan  konsentrasi elektrolit selama pembekuan, sementara sperma membeku pada suhu 0,53ºC (Byrne, et al ., 2000; Minter and DeLiberto, 2005; Srianto, dkk., 2012). Pada  pembekuan  semen  yang  menggunakan metode  pembekuan  lambat  terjadi  kerusakan sperma  yang  ditunjukan  dengan  terjadinya
pengeluaran  air  dalam  jumlah  banyak  untuk mencapai keseimbangan potensial kimiawi intra dan  ekstraselluler,  akibatnya  sel  mengalami dehidrasi,  sehingga  konsentrasi  larutan meningkat  dan  spermatozoa  menjadi  rusak. Sedangkan  bila  sperma  dibekukan  dengan metode  cepat,  maka  keseimbangan  potensial akan terganggu dan pengeluaran panas menjadi tidak  sempurna,  sehingga  bagian  intraseluler membeku menjadi kristal es yang halus, proses pembekuan ini mengakibatkan sel tidak dapat mengeluarkan  air  dengan  cepat  sehingga kristal es yang terbentuk merusak integritas sel dan  menyebabkan  melemahnya  daya  gerak, bahkan sampai menyebabkan kematian sperma (Herdiawan, 2004).
Penerapan  metode  laju  penurunan  suhu sedang  dalam  proses  pembekuan  semen  akan mencegah  terjadinya  cekaman  dingin  lanjutan yang  dapat  terjadi  ketika  sperma  memasuki suhu  kritis,  dan  penerapan  lama  ekuilibrasi yang  optimal  memberi  kesempatan  bagi gliserol  untuk  berdifusi  dengan  baik  sehingga memberikan  perlindungan  yang  optimal  bagi sperma  dalam  menghadapi  cekaman  dingin selama proses pembekuan.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui lama  ekuilibrasi  dan  laju  penurunan  suhu terbaik  serta  interaksi  antara  keduanya  dalam proses pembekuan sperma terhadap keutuhan membran plasma sperma dari semen beku pasca thawing .

## MATERI DAN METODE

## Penampungan semen
Semen domba Priangan ditampung dengan menggunakan  vagina  buatan.  Semen  berasal dari  3  ekor  domba  Priangan,  yang  masing- masing domba ditampung semennya sebanyak 3 kali. Penampungan semen yang berasal dari ternak yang sama dilakukan dengan jarak waktu minimal dua hari antara penampungan. Semen yang telah ditampung segera dievaluasi secara mikroskopis  dan  makroskopis.  Semen  yang memenuhi  kriteria,  dengan  motilitas  minimal 60-90 %, abnormalitas sperma kurang dari 15%, dan membran plasma utuh diatas 60% (Solihati, dkk.,  2018)  akan  diproses  lebih  lanjut  untuk proses pengenceran semen. Perhitungan volume pengencer  yang  dibutuhkan  berdasarkan produksi  dan  kualitas  semen  yang  didapat dengan rumus (Hanifi, dkk., 2016):
JITP Vol. 8 No. 2, Juli  2020

## Pengenceran dan pengemasan semen
Bahan  pengencer  yang  digunakan  adalah tris-kuning  telur  dengan  perbandingan  4:1 (Novita  dkk.,  2019).  Larutan  tris-kuning  telur ditambahkan  dengan  gliserol  7%  dengan metode  satu  tahap  ( one-step  method). Larutan tris-kuning telur yang mengandung gliserol 7% ditambahkan  antibiotik  1  mg streptomycin dan 1000 IU penicillin setiap ml larutan pengencer (Herbowo,  2017).  Semen  yang  memenuhi kelayakan  setelah  evaluasi  makroskopis  dan mikroskopisakan  diproses  dimasukkan  ke dalam  larutan  Tris-kuning  telur  sesuai  angka pengenceran yang didapatkan, dan dimasukkan ke dalam straw.

## Ekuilibrasi dan pembekuan semen
Segera  setelah  proses filling dan sealing , straw berisi semen diletakkan dalam rak straw kemudian  dimasukkan  ke  dalam refrigerator untuk menjalani proses penurunan suhu yang lambat  dari  suhu  kamar  25ºC  ke  5ºC  selama 2  jam  (Tuhu, et  al .,  2013)  dan  selanjutnya diekuilibrasi  pada  suhu  5ºC  selama  waktu yang dicobakan, yaitu 0,5 jam; 1,5 jam; dan 2,5 jam.  Setelah  diekuilibrasi,  semen  dalam  straw dimasukkan  ke  dalam  mesin  ICE  CUBE  14M untuk dibekukan dengan laju penurunan suhu yang  dicobakan,  yaitu  7,5ºC/menit,  13,5ºC/ menit,  dan  19,5ºC/menit.  Pengaturan  laju penurunan suhu menggunakan program yang tersedia pada mesin pembekuan semen sampai suhu  -160ºC.  Setelah  semen  dibekukan,  semen beku  terus  diberi  uap  dengan  N2  cair  sampai suhu -196ºC dan dimasukan ke dalam container penyimpan semen beku.

## Evaluasi semen
Evaluasi  semen  dilakukan  dalam  periode empat waktu, yaitu pada keadaan semen segar, sebelum  ekuilibrasi,  setelah  ekuilibrasi,  dan pasca thawing . Evaluasi semen beku dilakukan setelah  straw  di thawing di  dalam  suhu  37ºC selama 2 menit (Tuhu, et al., 2013).

## Variabel penelitian dan pengukurannya

## Motilitas
Motilitas  dievaluasi  dengan  mengamati pergerakan individu sperma dengan mikroskop binokuler  perbesaran  400x,  dan  dihitung berdasarkan jumlah spermatozoa motil progresif dari satu lapangan pandang dan dihitung dalam persen (Hanifi, et al ., 2016).

## Abnormalitas sperma
Hal  yang  diamati  dalam  evaluasi abnormalitas sperma ini meliputi abnormalitas kepala  (terlalu  kecil,  terlalu  besar,  kepala  dua pada  satu  ekor  dan  kepala  terputus),  dan abnormalitas  ekor.  Evaluasi  dilakukan  pada minimal  200  spermatozoa  diamati  dengan menggunakan  mikroskop  cahaya  perbesaran 400 kali (Herdis, 2015).

## Keutuhan membran sperma
Variabel  yang  diamati  dalam  penelitian ini  adalah  keutuhan  membran  sperma. Pengukuran dimulai dengan melarutkan 0,1 ml semen dengan 9,9 ml larutan hypo-osmotik , atau menggunanakan metode Hypo-Osmotik Swelling atau HOS test (Dasrul dkk., 2012). Pengamatan dan  perhitungan  dilakukan  terhadap  sperma yang mengembung (M) dan tidak mengembung (TM)  pada  bagian  ekornya.  Sperma  yang mengembung  atau  bengkok  pada  bagian ekornya  menandakan  membran  sel  sperma utuh,  demikian  sebaliknya  (Arsiwan,  2014). Sperma yang diamati paling sedikit berjumlah 200 sel. Perhitungan berdasarkan rumus sebagai berikut:

## Keutuhan membran =

## Rancangan percobaan dan analisis data
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental  berdasarkan  Rancangan  Acak Lengkap (RAL) Faktorial dengan pola 3 (petak utama)  x  3  (anak  petak).  Sebagai  petak  utama (main plot) adalah lama waktu ekuilibrasi pada suhu 5ºC yang terdiri atas 3 taraf, yakni: E0,5 = 0,5 jam, E1,5 = 1,5 jam, E2,5 = 2,5 jam. Sebagai anak  petak  (subplot)  adalah  laju  penurunan suhu pembekuan dari suhu 5ºC sampai -160ºC yang  terdiri  atas  3  taraf,  yakni:  T7,5  =  7,5ºC/ menit,  T13,5  =  13,5ºC/menit,  T19,5  =  19,5ºC/ menit.  Hasil  penelitian  dianalisis  statistik menggunakan  sidik  ragam,  dan  perhitungan tersebut diuji lanjut menggunakan uji Duncan, untuk melihat perbedaan antar perlakuan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik semen segar domba priangan
Berdasarkan  hasil  evaluasi  semen  segar domba Priangan yang ditampung menggunakan vagina  buatan,  diperoleh  rataan  karakteristik kualitas  makroskopis  dan  mikroskopis  semen segar domba Priangan (Tabel 1).
Berdasarkan  Tabel  1  karakteristik  semen segar  domba  Priangan  yang  digunakan  dan dinilai secara makroskopis dan mikroskopis tidak berbeda jauh dibandingkan karakteristik semen hasil penelitian Waluyo (2005). Konsentrasi dan motilitas sperma yang tinggi sangat berpotensi untuk  diproses  menjadi  semen  beku,  karena dapat  meningkatkan  jumlah  dosis  IB  yang dihasilkan dan kemungkinan motilitas sperma pasca pembekuan masih di atas ambang batas normal yang dapat digunakan untuk inseminasi, yaitu  60%  (Solihati  dkk.,  2018),  semen  yang ditampung  rata-rata  menunjukkan  motilitas 91,56%,  dengan  demikian  semen  tersebut layak  untuk  diproses  lebih  lanjut.  Perolehan konsentrasi  sperma  yang  tinggi  pada  domba Priangan  yang  digunakan  dapat  dipengaruhi oleh  kondisi  fisik  ternak,  seperti  umur  yang masih  tergolong  produktif,  bobot  badan  yang optimal, kualitas pakan yang baik, dan frekuensi penampungan semen yang optimal.
Efek  interaksi  masa  ekuilibrasi  dan  laju penurunan  suhu  pembekuan  terhadap keutuhan  membran  plasma  sperma  domba priangan
Hasil  penelitian  mengenai  efek  masa ekuilibrasi dan laju penurunan suhu pembekuan terhadap  membran  plasma  sperma  domba Priangan berdasarkan analisa statistik tersebut diperoleh  bahwa  lama  ekuilibrasi  dan  laju penurunan  suhu  memberikan  pengaruh  nyata lebih  baik  (P<0,05)  dan  mempunyai  interaksi nyata  lebih  baik  (P<0,05)  terhadap  keutuhan membran  plasma  sperma  domba  Priangan pasca pembekuan. Terjadinya interaksi tersebut disebabkan lama ekuilibrasi dan laju penurunan suhu  mempunyai  efek  mempengaruhi  satu sama lain terhadap keutuhan membran plasma sperma domba Priangan pasca pembekuan. Keutuhan membran plasma sperma pada lama  ekuilibrasi  1,5  jam  nyata  lebih  tinggi dibandingkan lama ekuilibrasi 0,5 jam dan 2,5
Tabel 2. Rataan membran plasma sperma domba Priangan dengan berbagai interaksi masa ekuilibrasi dan laju penurunan suhu pembekuan Lama ekuilibrasi (Jam) Laju penurunan suhu (ºC/menit) Rataan 7,5 13,5 19,5 0,5 36,17% Aa 43,00% Ac 39,00% Ab 39,39% 1,5 40,83% Ca 50,33% Cc 42,33% Cb 44,50% 2,5 39,8%3 Ba 44,50% Bc 40,33% Bb 41,56% Rataan 38,94% 45,94% 40,56% Ket:   * Huruf kecil yang berbeda kearah baris yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05)
* Huruf capital yang berbeda kearah kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05)
Tabel 1. Rataan evaluasi karakteristik semen segar domba Priangan Parameter Hasil penelitian Penelitian terdahulu (Waluyo, 2005) Volume (ml/ejakulat) 0,9 0,3 – 1,5 ml Warna Krem Krem Konsistensi Kental Kental pH 7 6,8 – 7 Bau Amis khas domba Amis Khas domba Gerakan Massa +++ +++ Konsentrasi (juta/ml) 3100 juta/ml 2900 Juta/ml Motilitas Sperma (%) 91,56% 82% Abnormalitas Sperma (%) 4.22% 8% Membran Plasma Utuh (%) 90.94% 77,2% Tudung Akrosom Utuh (%) 89,3% 89,8%
JITP Vol. 8 No. 2, Juli  2020
jam,  dan  perlakuan  lama  ekuilibrasi  2,5  jam menunjukkan keutuhan membran plasma yang lebih baik dibandingkan hasil lama ekuilibrasi 0,5 jam. Keutuhan membran plasma sperma pada perlakuan  laju  penurunan  suhu  pembekuan 13,5ºC/menit  menunjukkan  hasil  yang  nyata lebih tinggi dibandingkan laju penurunan suhu 7,5ºC/menit  dan  19,5ºC/menit,  dan  perlakuan laju  pembekuan  19,5ºC/menit  menunjukkan keutuhan  membran  plasma  yang  lebih  tinggi dibandingkan  laju  penurunan  suhu  7,5ºC/ menit.
Berdasarkan hasil yang disajikan pada Tabel 2, lama ekuilibrasi 1,5 jam menghasilkan rataan keutuhan  membran  plasma  yang  lebih  tinggi yaitu 44,50 %, dibandingkan lama ekuilibrasi 0.5 jam dan 1.5 jam yaitu sebesar 39,39 dan 41,56 %. Laju  pembekuan    13,5ºC/menit  menunjukkan rataan keutuhan membran plasma sperma yang lebih baik, yaitu sebesar 45,94 %, dibandingkan dengan  laju  pembekuan  7,5ºC/menit  dan 19,5ºC/menit  yang  secara  berturut-turut  yaitu 38,94 dan 40.56 %.
Tingginya kerusakan membran sel sperma pada ekuilibrasi 0,5 jam disebabkan tidak terjadi proteksi  sperma  yang  optimal  oleh  gliserol terhadap cekaman dingin, akibat gliserol belum menyerap secara optimal ke dalam sel sperma. Hal ini mengakibatkan konsentrasi intraseluler sperma  menjadi  tidak  seimbang,  akibatnya kadar air dalam sel sperma meningkat dan pada proses  pembekuan  terbentuk  kristal-kristal es  yang  dapat  merusak  selubung  lipoprotein dinding  sel  sperma  (Azizah  dan  Arifiantini, 2009).  Kerusakan  membran  plasma  sperma yang  terjadi  pada  lama  ekuilibrasi  2,5  jam diakibatkan  penumpukan  asam  laktat  dan zat-zat sisa metabolisme yang berakibat toksik bagi sperma, dan terbentuknya perioksida lipid menyebabkan  kerusakan  struktur  membran sperma  (Suherman,  2016).  Penumpukan konsentrasi  asam  laktat  yang  tinggi  tersebut dapat  berpengaruh  pada  tekanan  osmotik larutan. Sesuai dengan yang disampaikan oleh Tuhu dkk. (2013), bahwa peningkatan tekanan osmotik  pada  plasma  semen  mengakibatkan penurunan  permeabilitas  membran  sperma dan  mengakibatkan  peningkatan  kerusakan membran.  Masa  ekuilibrasi  yang  terlalu  lama juga  menyebabkan  zat  radikal  bebas  yang berasal  dari  metabolisme  sperma  menumpuk di  dalam  larutan  semen,  sementara  fosfolipid membran  sel  sperma  domba  sangat  rentan terhadap serangan radikal bebas (Solihati dkk., 2018).
Kerusakan  membran  sel  sperma  yang terjadi  pada  laju  penurunan  suhu  pembekuan lambat -7,5ºC/menit disebabkan terjadi dehidrasi akibat konsentrasi intraseluler yang berlebihan dan  menimbulkan  perubahan  osmotik  selama pembekuan. Perbedaan konsentrasi intraseluler yang berlebihan ini dapat melarutkan selubung lipoprotein  sperma  sehingga  membran  sel sperma mengalami kerusakan. Laju penurunan suhu pembekuan yang terlalu cepat juga akan memberikan  efek  merugikan  bagi  sperma.  Sel sperma yang mengalami laju penurunan suhu pembekuan cepat akan mengeluarkan air yang sedikit  dan  belum  mencapai  keadaan  yang ekuilibrium, sehingga ketika mencapai titik beku, sisa  air  di  dalam  sel  sperma  tersebut  berubah menjadi  kristal-kristal  es  instraseluler.  Kristal es intraseluler yang terbentuk pada pembekuan cepat  -19,5ºC/menit,  menekan  membran  sel sehingga  terjadi  kerusakan  mekanis  berupa pecahnya  membran  sel  dan  substansi  kimia dalam sel sperma keluar (Muzakkir dkk., 2017).

## KESIMPULAN
Terdapat  interaksi  antara  perlakuan  lama ekuilibrasi  1,5  jam  dan  laju  penurunan  suhu 13,5ºC/menit  terhadap  keutuhan  membran plasma sperma Domba Priangan pasca thawing . Tingkat  perlakuan  lama  ekuilibrasi  1,5  jam memberikan  respon  yang  baik  terhadap keutuhan  membran  plasma,  dan  tingkat perlakuan  laju  penurunan  suhu  13,5ºC/menit memberikan respon terbaik terhadap keutuhan membran plasma sperma domba Priangan.

## DAFTAR PUSTAKA
Arsiwan, A., T. Saili, dan S. Rahadi. 2014. Membran plasma  utuh  spermatozoa  epididimis kambing  peranakan  ettawa  dalam  natrium klorida  dengan  konsentrasi  berbeda.  Jurnal Ilmu dan Teknologi Peternakan Tropis, 1(1): 79-87.
Azizah dan R. I. Arifiantini. 2009. Kualitas semen beku kuda pada pengencer susu skim dengan konsentrasi  gliserol  yang  berbeda.  Jurnal Veteriner, 10(2): 63 -69.
Byrne,  G.P.,  P.  Lonergan,  M.  Wade,  P.  Duffy, A.  Donovan,  J.  P.  Hanrahan,  and  M.  P. Bloand.  2000 . Effect  of  freezing  rate  of  ram spermatozoa on subsequent fertility in vivo and  in  vitro.  Anim.  Reprod.  Sci.,  62:  265  – 275.
Alhuur, dkk
Dasrul,  D.,  R.  Rasmaidar,  dan  A.  Harris.  2012. Efektivitas  penambahan  vitamin  E (alfa- tokoferol )  dalam  medium  pencucian  sperma dengan  sentrifugasi  terhadap  kualitas spermatozoa  sapi  Brahman.  Agripet,  12(2): 7-13.
Hanifi,  H.,  M.  N.  Ihsan,  dan  T.  Susilawati.  2016.
Pengaruh  lama  ekuilibrasi  pada  proses pembekuan  terhadap  kualitas  semen sapi  wagyu  menggunakan  pengencer Andromed®. J. Ternak Tropika, 17(1): 31-41.
Herbowo,  M.  T.  2017.  Kriopreservasi  Semen Kerbau  Lumpur (Bubalus  bubalis) dalam Pengencer  Tris  atau  Skim  Kuning  Telur dengan Krioprotektan Gliserol atau Dimetilformamida. Thesis. Sekolah Pascasarjana IPB, Bogor Herdiawan, I. 2004. Pengaruh laju penurunan suhu dan jenis pengencer terhadap kualitas semen beku domba priangan. JITV, 9(2): 98 – 104. Herdis,  D.  2012.  Pengaruh  maltosa  sebagai krioprotektan ekstraselluler dalam meningkatkan  kualitas  semen  beku  guna mendukung keberhasilan teknologi inseminasi buatan. Jurnal Sains dan Teknologi Indonesia, 14(3): 197 - 201.
Herdis,  D.  2015.  Daya  motil  dan  keutuhan membran plasma spermatozoa domba Garut ( Ovis  aries )  pada  penambahan  kolesterol dalam  pengencer  semen  tris  kuning  telur. JSTI, 17(1):18.
Minter, L. J., and T. J. DeLiberto. 2005. Influence of extender, freezing rate, and thawing rate on post-thaw motility, viability and morphology of  Coyote (Canis  latrans) spermatozoa . Theriogenology, 64: 1898-1912.
Muzzakir,  D.,  S.  Wahyuni,  M.  Akmal,  dan  M.
Sabri.  2017.  Pengaruh  lama  ekuilibrasi terhadap  kualitas  spermatozoa  sapi  aceh setelah pembekuan menggunakan pengencer Andromed®. Jurnal Ilmiah Peternakan, 5(2): 115-128.
Nur,  Z.,  Z.  Berrin,  U.  Buren,  T.  Serife,  S.  Hakan, C.  G.  Ozguden,  G.  Ulgen,  and  D.  Ibrahim. 2011. Effect of freezing rate on acrosome and chromatin  integrity  in  ram  semen. Ankara Univ Vet Fak Derg, 58: 267-272.
Novita  R.,  T.  Karyono,  dan  Rasminah.  2019.
Kualitas semen sapi Brahman pada presentase tris kuning telur yang berbeda. Jurnal Sains Peternakan Indonesia, 14(4): 351-358.
Solihati,  N.,  S.  D.  Rasad,  R.  Setiawan,  dan  S. Nurjanah.  2018.  Pengaruh  kadar  gliserol terhadap kualitas semen domba lokal. Jurnal Biodjati 3(1): 63-71.
Srianto,  P.,  S.  Trilas,  dan  M.  Pantja.  2012.
Peningkatan  Kualitas  Semen  Beku  Melalui Perbaikan  Kualitas  Diluter. Universitas Airlangga, Surabaya.
Suherman, H. 2017. Kualitas semen beku domba garut ( Ovis aries ) pada penambahan sukrosa dalam  pengencer  semen  tris  kuning  telur. Berita  Biologi  Jurnal  Ilmu-Ilmu  Hayati, 16(1):31-38.
Tuhu A. D., Y. S. Ondho, dan D. Samsudewa. 2013. Pengaruh perbedaan waktu pelepasan water jacket  dalam  proses  ekuilibrasi  terhadap kualitas  semen  beku  sapi  jawa  pada  tahap before freezing dan post thawing . Jurnal Animal Agricultural, 2(1): 473.
Waluyo, S. T. 2005. Pengaruh Penggunaan Prolin dalam  Pengencer  Susu  Skim  pada  Sperma Beku  Terhadap  Kualitas  Sperma  Domba Priangan.  Balai  Besar  Diklat  Agribisnis Peternakan dan Kesehatan Cinagara, Bogor. Hal. 22-25.
Zelpina  E.,  B.  Rosadi,  dan  T.  Sumarsono.  2012. Kualitas  spermatozoa  post  thawing  dari semen  beku  sapi  perah.  Jurnal  Ilmu-ilmu Peternakan, 15(2): 94-102.