## POTENSI SENYAWA METABOLIT YANG DIHASILKAN
Lactobacillus plantarum ATCC 8014 SEBAGAI BAHAN BIOPRESERVASI DAN ANTI BAKTERI
PADA BAHAN PANGAN ASAL HEWAN
(Potential of Metabolites Compounds Produced by Lactobacillus plantarum ATCC 8014 as Biopreservatives and Anti-bacterial Materials in Animal Food Products)
Akhmad Hidayatulloh 1 , Jajang Gumilar 2 , Ellin Harlia 1
1 Laboratorium Mikrobiologi dan Penanganan Limbah Peternakan,
2 Labotorium Teknologi Pengolahan Produk Peternakan Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran Jl. Raya Bandung – Sumedang KM 21 Jatinangor 45363 Sumedang Jawa Barat Indonesia Email: hidayatulloh@unpad.ac.id

## ABSTRACT
Lactobacillus  plantarum is  a  probiotic-lactic  acid  bacteria  that  normally  lives  in  the  human digestive  tract.  These  bacteria  are  known  to  produce  metabolites  that  have  inhibitory  activity against pathogenic bacteria and food spoilage. Therefore, the metabolites produced by L. plantarum was potential to be used as a biopreservation for animal food products, especially milk and meat. In order to obtain accurate data about the optimal production time of these metabolites and their antibacterial activity, the growth curve of L. plantarum which was incubated up to 48 hours at 37 o C and 5.0% of CO 2 was observed. Observations were also made on the inhibition of Gram-negative pathogenic bacteria ( Escherichia coli and Salmonella typhimurium ) and Gram-positive ( Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes ) which are often found in meat and milk. The results showed that the  metabolites  produced  during  the  incubation  process  can  inhibit  Gram-negative  and  Gram- positive pathogenic bacteria. The best production of metabolites is at the 24 th hour which shows the diameter of the inhibition zone of 11.9 mm for L. monocytogenes ; 11.6 mm for E. coli ; 12.5 mm for S. typhimurium; and 9.1 mm for S. aureus . Therefore, the production process of biopreservation for food from the results of L. plantarum’s metabolism has a potential to be developed and applied to food of animal origin, especially milk and meat.
Keywords : Lactobacillus plantarum, metabolites, biopreservation, anti-bacterial, pathogenic bacteria.

## ABSTRAK
Lactobacillus  plantarum merupakan  bakteri  asam  laktat  probiotik  yang  secara  normal  hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri ini diketahui dapat menghasilkan senyawa metabolit yang  memiliki  aktivitas  penghambatan  terhadap  bakteri  patogen  dan  pembusuk  pangan.  Oleh karena itu senyawa metabolit yang dihasilkan oleh L. plantarum memiliki potensi sebagai bahan biopreservasi untuk bahan pangan asal hewan khususnya susu dan daging. Guna mendapatkan data akurat tentang waktu optimal produksi senyawa metabolit tersebut dan aktivitas antibakterinya maka  kurva  pertumbuhan L.  plantarum yang  diinkubasi  hingga  48  jam  pada  suhu  37 o C  dan konsentrasi  CO 2 sebanyak  5,0%  diamati.  Pengamatan  juga  dilakukan  terhadap  daya  hambat bakteri  patogen  Gram  negatif  ( Escherichia  coli dan Salmonella  typhimurium )  dan  Gram  positif ( Staphylococcus aureus dan Listeria monocytogenes ) yang sering ditemukan pada daging dan susu . Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa metabolit yang dihasilkan selama proses inkubasi dapat menghambat bakteri patogen Gram negatif dan Gram positif. Produksi senyawa metabolit terbaik yaitu pada jam ke-24 yang menunjukkan diameter zona hambat sebesar 11,9 mm untuk L. monocytogenes ; 11,6 mm untuk E. coli; 12,5 mm untuk S. typhimurium; dan 9,1 mm untuk S. aureus. Oleh karena itu proses produksi bahan biopreservasi untuk bahan pangan dari hasil metabolisme L. plantarum berpotensi untuk dikembangkan dan diaplikasikan pada bahan pangan asal hewan khususnya susu dan daging.
Kata kunci : Lactobacillus plantarum, senyawa metabolit, bahan biopreservasi, anti bakteri, bakteri patogen.

## PENDAHULUAN
Lactobacillus  plantarum merupakan  salah satu  jenis  Bakteri  Asam  Laktat  (BAL)  yakni bakteri  yang  dapat  membentuk  asam  laktat sebagai  hasil  metabolisme  gula.  Bakteri  asam laktat  diketahui  yang  dapat  menghambat pertumbuhan  bakteri  patogen  dan  bakteri pembusuk,  oleh  karena  itu  BAL  telah  banyak digunakan sebagai bahan pengawet alami pada bahan  makanan (Bassi et  al . 2009 ; Akbar  dan Anal, 2014).
BAL  dapat  digunakan  sebagai  bahan pengawet  karena  selama  proses  fermentasi menghasilkan metabolit primer yaitu asam laktat yang dapat menghambat pertumbuhan  bakteri patogen  secara  langsung  dengan  menurunnya nilai  pH.  Selain  itu  BAL  juga  menghasilkan metabolit sekunder yang juga turut andil dalam menghambat  pertumbuhan  senyawa  patogen diantaranya adalah hidrogen peroksida (H 2 O 2 ), asam  lemak  hidroksil,  diasetil,  reutrin,  dan senyawa protein (bakteriosin, trypsin, peptida) (Dalie, et al . 2010). Lactobacillus plantarum tergolong ke dalam filum  Firmicutes,  ordo  Lactobacillales,  famili Lactobacillaceae,  dan  genus Lactobacillus . Lactobacillus plantarum berbentuk batang dengan ukuran  0,9-1,2  hingga  1,0-8,0  µm,    berbentuk tunggal  ataupun  berpasangan  dalam  rantai yang pendek (Todorov dan Franco, 2010).
Lactobacillus  plantarum merupakan  bakteri Gram  positif  yang  sebagian  besar  dapat ditemukan di susu, daging, sayuran fermentasi, dan  saluran  pencernaan  manusia. Lactobacillus plantarum dapat hidup dalam kondisi anaerobik fakultatif atau dengan kata lain bakteri tersebut dapat tumbuh baik dalam kondisi aerob maupun anaerob.  Dalam  keadaan  aerob, Lactobacillus plantarum dapat mengonversi oksigen menjadi  peroksida.  Dalam  keadaan  anaerob L.  plantarum mampu  melakukan  fermentasi dengan  mengubah  gula  menjadi  asam  laktat atau  alkohol  dalam  kondisi  heterofermentatif (Puspadewi, et al. 2011). Lactobacillus plantarum menunjukkan  efektivitas  yang  baik  dalam menekan  pertumbuhan Listeria  innocua pada proses  pembuatan  keju  dengan  bahan  dasar susu  pasteurisasi  tanpa  adanya  penambahan nisin (Mills, et al. 2011). L.  plantarum dengan  kode  ATCC  8014 merupakan salah satu strain murni L. plantarum yang dimiliki oleh ATCC. ATCC atau American Type  Culture  Collection merupakan  organisasi non-profit yang bergerak dalam bidang koleksi dan distribusi kultur mikroba terutama bakteri.
Lactobacillus  plantarum ATCC  8014  merupakan isolat  yang  berasal  dari  silase  jagung  yang ditemukan  dan  dimurnikan  pada  tahun 1980.  Penggunaan L.  plantarum sebagai  anti bakteri  telah  banyak  dikaji  karena  memiliki potensi  yang  besar  jika  dikembangkan  secara massal. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan mendapatkan  data  akurat  tentang  waktu optimal  produksi  senyawa  metabolit  dari L. plantarum dan  mempelajari  aktivitas  daya hambat terhadap bakteri patogen Gram negatif ( Escherichia coli dan Salmonella typhimurium ) dan Gram positif ( Staphylococcus aureus dan Listeria monocytogenes ).

## MATERI DAN METODE
Penelitian  dilakukan  secara  eksploratif. Data  yang  didapatkan  dari  penelitian  ini disajikan  secara  deskriptif.  Isolat L.  plantarum ATCC ® 8014 ™ diperoleh  dari  Laboratorium Mikrobiologi  Fakultas  Kedokteran  Universitas Padjadjaran  dalam  media  agar  miring  MRS Agar.  Penelitian  diawali  dengan  pembuatan inokulum,  kemudain  dilanjutkan  dengan pengamatan  kurva  pertumbuhan,  pengukuran pH,  dan  diakhiri  pengujian  zona  hambat  dari senyawa  metabolit  yang  dihasilkan  oleh L. plantarum.
Pembuatan Inokulum dilakukan menambahkan  sebanyak  satu loop isolat L. plantarum ATCC  8014  dari  agar  miring  pada 5  mL  media  MRS Broth dalam  tabung  reaksi steril  yang  kemudian  diinkubasi  selama  24 jam  pada  suhu  37 o C  dengan  konsentrasi  CO 2 5%. Sebanyak 5 µL inokulum yang berumur 24 jam  tersebut  diinokulasikan  ke  dalam  masing masing  tabung  reaksi  berisi  5  mL  media  MRS Broth dengan  jumlah  tabung  12  buah.  Masing masing  tabung  reaksi  tersebut  kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C dan konsentrasi CO 2 5% dengan masa inkubasi yang bervariasi. Masa inkubasi  dari  masing  masing  tabung  yakni  3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, dan 48 jam. Setelah masa inkubasi dari masing masing tabung selesai, sampel siap untuk diuji berdasarkan  parameter  yang  telah  ditentukan (Modifikasi Gong, et al . 2010). Kurva pertumbuhan L. plantarum didapat dari pengukuran kerapatan optikal atau Optical Density (OD)  setiap  3  jam  selama  48  jam  (12 titik pengamatan) dengan metode turbidimetri menggunakan  spektrofotometer  pada  panjang gelombang  600  nm.  Kemudian,  dilakukan pengukuran  pH  menggunakan  pH  meter
terhadap  sampel  yang  telah  diketahui  nilai kerapatan optikalnya.
Pengujian zona hambat senyawa metabolit L. plantarum dimulai dengan ekstraksi senyawa metabolit. Sebanyak 2 mL sampel dari masing masing  tabung  reaksi  yang  telah  selesai  masa inkubasinya  dimasukkan  ke  dalam microtube dan disentrifugasi dengan kecepatan 12500 rpm (revolution  per  minutes) selama  15  menit  pada suhu  4 O C.  Supernatan  dikoleksi  dan  disaring menggunakan  membran  dengan  diameter  0,2 mikron  sehingga  supernatan  bebas  dari life cell. Supernatan  yang  mengandung  senyawa metabolit tersebut kemudian digunakan sebagai sampel uji zona hambat.
Bakteri  patogen  yakni Escherichia  coli ATCC ® 11229 ™ , Salmonella typhimurium ATCC ® 14028 ™ Listeria monocytogenes ATCC ® 7644 ™ dan Staphylococcus aureus ATCC ® 6538 ™ diencerkan dengan mencampurkan satu ose biakan bakteri uji  ke  dalam  tabung  reaksi  yang  berisi  NaCl 0,9%  kemudian  dihomogenkan  menggunakan vorteks . Kekeruhan dari larutan uji distandarisasi menggunakan  larutan  McFarland  0,5  yang setara  dengan  jumlah  bakteri  1,5  x  10 8 /mL. Bakteri  uji  tersebut  kemudian  disebarkan diatas  permukaan  media Nutrient  Agar (NA) menggunakan kapas swab steril. Kertas cakram yang  digunakan  berdiameter  6  mm  dengan daya  serap  50  μL  tiap  cakram.  Kertas  cakram direndam  dalam  larutan  ekstrak  kurang  lebih 20  μL  kemudian  diletakkan  pada  permukaan media NA. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 o C selama  24  jam.  Daerah  pada  sekitaran  cakram menunjukkan  kepekaan  mikroba  terhadap ekstrak  senyawa  metabolit L.  plantarum yang digunakan  sebagai  bahan  uji  yang  dinyatakan dengan diameter zona hambat. Setelah inkubasi selesai kemudian diukur diameter zona hambat yang  terbentuk  menggunakan  jangka  sorong (Venkadesan dan  Sumathi, 2015).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kurva Pertumbuhan L. plantarum ATCC 8014 Kurva  pertumbuhan L.  plantarum yang dihasilkan  dapat  dilihat  pada  Gambar  1. Pengamatan  pada  kurva  pertumbuhan menunjukkan bahwa pertumbuhan L. plantarum selama  48  jam  terdiri  dari  tiga  fase  yaitu  fase lag,  fase  log,  dan  fase  stasioner.  Hal  tersebut sesuai dengan kurva pertumbuhan bakteri pada umumnya (Wang, et al. 2015). Kurva pertumbuhan L. plantarum dimulai dengan fase lag (adaptasi) pada jam ke-0 sampai jam  ke-3.  Pada  fase  ini  bakteri  melakukan penyesuaian  diri  terhadap  lingkungan  yang baru.  Fase  adaptasi  berada  dalam  rentang waktu  yang  singkat  dikarenakan  media  yang digunakan  untuk  pertumbuhan  sama  dengan media  yang  digunakan  untuk  peremajaan. Menurut Puspawati, et al . (2010), selama fase lag bakteri  tidak  hanya  bertambah  biomassanya, ukuran sel bakteri juga mengalami peningkatan serta  terjadi  pula  perubahan  komposisi  kimia dari bakteri tersebut.
Fase  berikutnya  yaitu  fase  logaritmik (fase  pertumbuhan)  terjadi  mulai  jam  ke-3 sampai jam ke-24. Pada fase ini, pertumbuhan bakteri  berlangsung  sangat  cepat,  bakteri memperbanyak diri dengan cepat dan konstan menjadi  dua  kali  populasi  sebelumnya.  Pada fase  ini  kebutuhan  energi  juga  meningkat dibandingkan  dengan  pada  fase  adaptasi. Pada fase logaritmik hingga awal fase stasioner umumnya dihasilkan senyawa metabolit primer yang diproduksi yaitu asam laktat, asam asetat dan hidrogen peroksida. Selanjutnya pada jam ke-24  sampai  jam  ke-48  kurva  pertumbuhan relatif  tetap.  Pada  fase  ini  merupakan  fase stasioner dimana jumlah sel  yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Pada fase stasioner
Gambar 1 . Kurva Pertumbuhan L.plantarum ATCC 8014
ukuran sel menjadi lebih kecil meskipun nutrisi sudah berkurang (Kumar, et al. 2010). Kurva  pertumbuhan  digunakan  untuk menentukan waktu optimal L. plantarum dalam memproduksi senyawa metabolit yang bersifat anti  bakteri.  Suspensi  bakteri  semakin  keruh dengan  bertambahnya  waktu  inkubasi,  hal  ini menandakan  semakin  banyak  jumlah  bakteri yang tumbuh.  Dari hasil pengukuran OD, bakteri L. plantarum memperlihatkan adanya perbedaan tingkat kepadatan bakteri selama masa inkubasi. Dengan meningkatnya pertumbuhan L. lantarum maka  meningkat  pula  nilai  OD  selama  masa inkubasi  yang  sejalan  dengan  peningkatan jumlah  biomasanya.  Meningkatnya  jumlah biomassa akan meningkatkan jumlah senyawa metabolit yang dihasilkan oleh L. plantarum.
Pengaruh  Pertumbuhan L.  plantarum ATCC 8014 terhadap pH
Berdasarkan  hasil  pengamatan  pH  pada setiap  titik  kurva  pertumbuhan L.  plantarum, dihasilkan  kurva  nilai  pH  berdasarkan pertumbuhan L.  plantarum seperti  pada Gambar 2. Nilai pH memperlihatkan pengaruh perumbuhan L.  plantarum dan  produk  yang dihasilkan.
Penurunan  Perubahan  nilai  pH  terjadi mulai  jam  ke-6,  hal  tersebut  terjadi  karena bakteri telah mamasuki fase logaritmik. Dalam fase  logaritmik  terjadi  akumulasi  asam  laktat dan  asam-asam  organik  hasil  hidrolisis  lemak dan  hasil  metabolisme.  Salah  satu  faktor  yang mempengaruhi  produksi  asam  adalah  faktor
Gambar 2 . Kurva waktu pertumbuhan terhadap nilai pH
Tabel 1. Uji daya hambat metabolit dari L. plantarum ATCC 8014 terhadap bakteri patogen Gram negatif dan Gram positif
Sampel Diameter zona hambat (mm) L. monocytogenes E. coli S. thypimurium S. aureus Antibiotik 41,8 28,1 37,1 30,4 15 Jam 12,2 9,70 91,0 9,20 18 Jam 14,0 11,7 11,1 9,50 21 Jam 11,8 10,1 11,4 8,20 24 Jam 11,9 11,6 12,5 9,10
lingkungan  yaitu  pH  dan  suhu.  Setiap  spesies mikroba  bahkan  strain    dapat  memiliki  nilai pH  dan  suhu  optimum  yang  berbeda  (Abdel- Rahman et al . 2013).
Aktivitas  anti  bakteri L.  plantarum ATCC 8014
Berdasarkan hasil uji zona hambat senyawa metabolit  yang  dihasilkan  oleh L.  platarum terhadap  bakteri  patogen  Gram  negatif  dan positif, didapatkan hasil yang dapat dilihat pada Tabel  1.  Hasil  pengujian  menunjukkan  daya hambat  terbaik  didapatkan  dari L.  plantarum yang diinkubasi selama 15, 18, 21, dan 24 jam. Sampel  senyawa  metabolit  tersebut  berada dalam  fasa  logaritmik.  Produksi  senyawa metabolit sejalan dengan pertumbuhan bakteri. Diketahui  senyawa  metabolit  mulai  terbentuk saat  memasuki  tengah  fase  eksponensial  dan menurun produksinya pada fase stasioner (Ruiz et al . 2010). Zona hambat yang dihasilkan oleh senyawa metabolit L. Plantarum terhadap bakteri patogen Gram  negatif  dan  positif  merupakan  akibat dari adanya metabolit primer yaitu asam laktat, etanol,  diasetil,  dan  karbondioksida  maupun karena  adanya  metabolit  sekunder  yaitu bakteriosin  dan  senyawa  hidrogen  peroksida (Maurya  dan  Thakur,  2012).  Berdasarkan luas  area  yang  terbentuk,  terdapat  4  kategeri kekuatan  zona  hambat  bakteri  yakni  diameter 5-9  mm    mempunyai  kekuatan  daya  hambat lemah,  diameter  10-14  mm  kekuatan  daya hambat  sedang,  diameter  15-20  mm  kekuatan daya  hambat  kuat,  >  21  mm  kekuatan  daya hambat sangat kuat (Nandi, et al. 2017). Data di atas  menunjukkan  bahwa  senyawa  metabolit L.  plantarum tersebut  memiliki  daya  hambat terhadap  bakteri  patogen  dengan  kekuatan sedang.

## KESIMPULAN DAN SARAN
Bakteri Lactobacillus plantarum ATCC 8014 dapat  menghasilkan  senyawa  metabolit  yang memiliki aktivitas antibakteri yang digolongkan ke  dalam  bahan  yang  memiliki  daya  hambat dengan  kekuatan  sedang.  Senyawa  metabolit dari L. plantarum dihasilkan secara optimal pada fase logaritmik yakni 15-24 jam masa inkubasi. Senyawa  metabolit  dari L.  plantarum dapat menghambat  bakteri  patogen  Gram  positif dan  negatif  yang  sering  ditemukan  dalam bahan  pangan  asal  hewani  terutama  daging dan  susu,  sehingga  memiliki  potensi  yang
cukup baik untuk dikaji lebih mendalam terkait penggunaanya  secara  langsung  pada  bahan pangan asal hewani.
Proses  produksi  bahan  biopreservasi untuk bahan pangan dari hasil metabolisme L. plantarum berpotensi untuk dikembangkan dan diaplikasikan pada bahan pangan asal hewan khususnya susu dan daging.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdel-Rahman,  M.A.,  Y.  Tashiro,  and  K, Sonomoto. 2013. Recent advances in lactic acid production by microbial fermentation processes. Biotechnol. Adv. , 31: 877–02.
Akbar,  A.  and  A.K.  Anal.  2014.  Occurrence  of Staphylococcus  aureus and  evaluation  of anti-staphylococcal  activity  of Lactococcus lactis subsp. lactis in  ready-to-eat  poultry meat. Ann. Microbiol. , 64(1): 131-138.
Bassi,  E.L.,  M.  Hassouna,  N.  Shinzato,  and  T. Matsui. 2009. Biopreservationof refrigerated and  vacuum-packed  dicentrarchus  labrax by  lactic  acid  bacteria.  J.  Food  Sci. 6(74): M335–M339.
Dalie,  D.K.D.,  A.M.  Deschamps,  and  F. Richarrd-Forget. 2010. Lactic acid bacteria: potential for control of mould growth and mycotoxins:  a  review.  Food  Control.  21: 370-380.
Gong,  H.S.,  X.C.  Meng,  and  H.  Wang.  2010. Plantaricin MG active against gram-nega- tive bacteria produced by Lactobacillus plan- tarum KLDS1.0391 isolated from “Jiaoke”, a traditioanl fermented cream from China. Food control, 21(1): 89-96.
Kumar, M., S.K. Tiwari, and S. Srivastava. 2010. Purification and characterization of entero - cin  LR/6,  a  bacteriocin  from Enterococcus faecium LR/6. Appl. Biochem. Biotechnol., 160: 40–49.
Maurya, A.P. and R.L. Thakur. 2012. Inhibition spectrum, purification and characterization of bacteriocin from Leuconostoc NT-1. Curr Sci., 103(12): 1405-1407
Mills, S., L. Serrano, C. Griffin, P.M. O’connor, G. Schaad,  and  C.  Bruining.  2011.  Inhibitory activity  of Lactobacillus plantarum LMG P-26358 against Listeria innocua when used as an adjunct starter in the manufacture of cheese. Microbial Cell Factories. 10(1): S7.
Nandi,  A.,  S.K.  Dan,  G.  Banerjee,  K.  Ghosh, E.  Ringo,  and  A.K.  Ray.  2017.  Probiotic potential of autochonous bacteria isolated from  the  gastrointestinal  tract  of  four freshwater  teleost.  Probiotics  Antimicro Prot. 9(1) : 12-21.
Puspadewi,  R.,  A.  Putranti  dan  A.  Gina.  2011.
Aktifitas  metabolit  bakteri Lactobacillus plantarum dan peranannya dalam menjaga kesehatan  saluran  pencernaan . Prosiding Konferensi  Nasional  Sains.  Fakultas MIPA Universitas Jenderal Achmad Yani. Cimahi.
Puspawati,  N.N.,  L.  Nuraida,  dan  D.R. Adawiyah. 2010.  Penggunaan berbagai jenis bahan pelindung untuk mempertahankan viabilitas bakteri asam laktat yang diisolasi dari air susu ibu pada proses pengeringan beku. J.Teknol. Ind. Pangan, 1: 59-65.
Ruiz,  B.,  A.  Chávez,  A.  Forero,  Y.  García- Huante,  A.  Romero,  and  M.  Sánchez. 2010.  Production  of  microbial  secondary metabolites:  regulation  by  the  carbon source. Crit. Rev. Microbiol ., 36: 146–167.
Todorov, S. D. dan B. D. G. D. M. Franco. 2010. Lactobacillus  plantarum :  characterization of  the  species  and  application  in  food production.  Food  Reviews  International, 26(3): 205-229.
Venkadesan, D. and V. Sumathi . 2015. Screening of lactic acid bacteria for their antibacterial activity  against  milk  borne  pathogens. International  Journal  of  Aplied  Research, 1(11): 970-973.
Wang, L., D. Fan, W. Chen, and E.M. Terentjev. 2015 . Bacterial growth, detachment and cell size control on polyethylene terephthalate surfaces . Sci. Rep ., 5: 15159.