## Mikropropagasi tebu
( Saccharum officinarum. L)

## menggunakan sistem perendaman sesaat
Micropropagation of sugarcane (Saccharum officinarum . L ) using temporary immersion system
Hayati MINARSIH *) , Imron RIYADI, SUMARYONO & Asmini BUDIANI
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia Jl. Taman Kencana No. 1, Bogor 16128 Indonesia
Diterima tanggal 4 Februari 2013/disetujui tanggal 1 Mei 2013

## Abstract
To  achieve  Indonesian  sugar  self-sufficiency,  the national  production  needs  to  be  escalated  through  land extensification  that  requires  a  large  numbers  of  cane planting  materials.  This  can  be  achieved  by  mass propagation  of  sugarcane  through  in  vitro  culture.  Solid medium  is  commonly  used  for  callus  proliferation  in sugarcane  tissue  culture.  However,  solid  medium  is considered  inefficient  in  terms  of  plantlet  production  level, labour  and  space.  The  use  of  liquid  medium  may  solve  the problem  by  allowing  automation  to  increase  plantlet production  scale  and  uniformity.  Temporary  immersion system  (TIS)  is  based  on  a  short  periodic  immersion  of explants  in  a  liquid  medium  for  a  specific  frequency  and duration.  Research  on  in  vitro  mass  propagation  of sugarcane  using  TIS  was  conducted  at  the  Indonesian Biotechnology  Research  Institute  for  Estate  Crops.  Callus initiated from immature unfolded leaves of PSJT 941 and PS 881 was cultured on liquid MS medium in TIS with different frequencies  (12  and  24  h)  and  durations  (1  and  3  min)  of immersion.  Each  treatment  was  replicated  three  times.  The callus biomass of two elite cane varieties (PSJT 941 and PS 881)  cultured  in  TIS  for  six  weeks  was  higher  (2  –  4  times fold)  than  that  of  on  solid  medium.  The  PSJT  941  variety reached  the  highest  calli  biomass  with  immersion  for  three min every 24 h. However, PS 881 variety reached its highest biomass  with  immersion  for  one  minute  every  24  h.  The propagation  of  sugarcane  using  TIS  culture  was  proven  to produce  higher  calli  biomass  up  to  four  folds  and  to  form more  numbers  and  uniform  shoots  compared  to  the  solid medium  culture.  The  callus  was  succesfully  regenerated  to shoots and plantlets.
[Keywords : In-vitro culture, callus initiation, callus explant, calli biomass].

## Abstrak
Untuk  mencapai  swasembada  gula,  perlu  dilakukan peningkatan  produksi  gula  nasional  melalui  perluasan  areal pertanaman  tebu  sehingga  diperlukan  bibit  dalam  jumlah besar.  Hal  tersebut  dapat  diatasi  antara  lain  dengan perbanyakan  tebu  melalui  kultur in  vitro .  Penggunaan medium padat pada perbanyakan kalus tebu melalui kultur in vitro merupakan teknik yang umum digunakan saat ini. Akan tetapi  penggunaan  medium  padat  dianggap  kurang  efisien dalam  hal  jumlah  planlet  yang  diproduksi,  tenaga  kerja  dan ruang  yang  digunakan.  Penggunaan  medium  cair  dapat mengatasi  kelemahan  tersebut  dengan  dimungkinkannya otomatisasi sehingga dapat meningkatkan skala produksi dan keseragaman  planlet.  Sistem  perendaman  sesaat  (SPS)
merupakan  teknik  kultur in  vitro dalam  medium  cair menggunakan bejana bersekat dimana kontak antara eksplan dan  medium  terjadi  hanya  secara  sesaat  dan  periodik. Penelitian  perbanyakan  massal  bibit  tebu  melalui  SPS dilakukan  di  Balai  Penelitian  Bioteknologi  Perkebunan Indonesia.  Kalus  diinisiasi  dari  daun  menggulung  varietas PSJT  941  dan  PS  881  yang  ditumbuhkan  pada  media  MS cair  dalam  kultur  SPS  dengan  frekuensi  yang  berbeda  yaitu setiap 12 dan 24 jam dan dengan lama perendaman selama 1 dan 3 menit. Setiap perlakuan diulang tiga kali. Bobot basah (biomassa)  kalus  dari  dua  varietas  tebu  (PSJT  941  dan  PS 881)  yang  ditumbuhkan  dengan  metode  SPS  setelah  enam minggu  menunjukkan  peningkatan  yang  lebih  tinggi  yaitu antara  2  -  4  kali  lipat  dibandingkan  dengan  kontrol  pada media  padat.  Peningkatan  biomassa  tertinggi  pada  varietas PSJT  941  diperoleh  pada  perlakuan  SPS  dengan  interval perendaman  24  jam  dan  lama  perendaman  tiga  menit. Sedangkan  pada  PS  881,  peningkatan  tertinggi  biomassa diperoleh  pada  interval  perendaman  24  jam  dan  lama perendaman  satu  menit.  Perbanyakan  dengan  metode  SPS terbukti dapat meningkatkan biomassa kalus lebih dari empat kali  lipat  dan  pembentukan  tunas  yang  lebih  seragam dibandingkan  dengan  pada  media  padat.  Kalus  yang dihasilkan dapat diregenerasikan menjadi tunas dan planlet.
[Kata  kunci  :  Kultur in-vitro ,  inisiasi  kalus,  eksplan  kalus, biomassa kalus].

## Pendahuluan
Produksi  gula  nasional  mengalami  kemerosotan dalam tiga dasawarsa terakhir karena bergesernya areal pertanaman tebu dari lahan sawah ke lahan kering atau marjinal. Untuk meningkatkan produksi gula nasional, perlu  dilakukan  perluasan  areal  pertanaman  tebu  ke lahan-lahan  marjinal  dengan  menggunakan  varietas- varietas  yang  toleran  terhadap  kekeringan  dan  tingkat produksi  tinggi.  Jumlah  bibit  yang  dibutuhkan  untuk menunjang program swasembada tersebut sangat besar yaitu sekitar 1,5 - 2 miliar bibit per tahun. Hal tersebut sulit  untuk  dipenuhi  hanya  dari  perbanyakan  tanaman secara  konvensional  melalui  stek  batang  atau  bagal. Selain  itu,  pembibitan  tebu  yang  dilakukan  secara berjenjang  juga  menyulitkan  pengadaan  bibit  tebu dalam  jumlah  besar.  Masalah  tersebut  dapat  diatasi antara  lain  dengan  perbanyakan  tebu  melalui  kultur jaringan.
Perkembangan  kultur  jaringan  tebu  diawali dengan keberhasilan Hawaian Sugar Planters Association  Experiment  Station  menginduksi  kalus
*) Penulis korespondensi:hmiskan@yahoo.com
Mikropropagasi tebu (Saccharum officinarum . L ) menggunakan sistem ………….(Minarsih et al .)
melalui  kultur in  vitro (Nickell,  1964)  serta  keber- hasilan meregenerasi kultur kalus menjadi planlet tebu menggunakan  media  MS  (Murashige  &  Skoog,  1962; Michael,  2007)  yang  telah  dimodifikasi.  Hal  tersebut menjadi  titik  tolak  perkembangan  penelitian  kultur jaringan  tebu  yang  kemudian  diterapkan  dalam berbagai  aspek  seperti  mikropropagasi,  pemuliaan, konservasi  plasma  nutfah,  eliminasi  patogen  sistemik, dan  rekayasa  genetika  (Lakshmanan et  al .,  2005). Penyediaan  bibit  tebu  melalui  kultur in  vitro atau mikropropagasi  memiliki  beberapa  keunggulan  di antaranya  adalah  bibit  tebu  yang  dihasilkan  bebas penyakit  terutama  penyakit-penyakit  sistemik  dan dapat  dilakukan  secara  cepat  dan  massal  (Cha-um et al., 2006; Khan & Khatri, 2006).
Teknik  mikropropagasi  merupakan  perbanyakan klonal  tanaman  menggunakan  eksplan  dari  jaringan meristematik  atau  non-meristematik.  Tanaman  dapat diregenerasi baik secara langsung dari eksplan maupun secara tidak langsung melalui kalus yang diinisiasi dari eksplan  (Geisjkes et  al .,  2003).  Dalam  kultur  jaringan tebu, planlet dapat dihasilkan dari meristem pucuk dan samping maupun dari jaringan daun muda (Geisjkes et al., 2003).  Dari  satu  mata  tunas  atau  meristem  atau jaringan  daun  muda  pada  tanaman  tebu  setelah  1  -  2 bulan dapat terbentuk kalus dan 1 - 2 bulan berikutnya kalus  dapat  diregenerasi  menghasilkan  ±  20  tunas/ anakan  baru  (Mariska  &  Suci,  2011).  Kultur  kalus sampai  saat  ini  merupakan  metode  yang  banyak digunakan  untuk  penyediaan  bibit  tebu  secara  massal dan  cepat.  Meskipun  pada  dasarnya  setiap  jaringan tanaman  tebu  dapat  digunakan  sebagai  eksplan  untuk inisiasi  kalus,  akan  tetapi,  daun  muda  diketahui merupakan  eksplan  yang  lebih  baik  karena  mampu menghasilkan  kalus  morfogenik  pada  setiap  level (Laksmanan et al., 2005).
Penggunaan  medium  padat  pada  fase  proliferasi kalus  tebu  merupakan  teknik  yang  umum  digunakan saat  ini.  Namun  penggunaan  medium  padat  dianggap tidak efisien dalam hal tingkat produksi planlet, tenaga kerja dan ruang (Sumaryono et al., 2007). Penggunaan medium  cair  dapat  mengatasi  kelemahan  tersebut dengan  dimungkinkannya  otomatisasi  sehingga  dapat meningkatkan  skala  produksi  secara  massal  (Hvoslef- Eide et  al .,  2003).  Penggunaan  medium  cair  dengan sistem  perendaman  sesaat  ( Temporary  Immersion System )  telah  dikembangkan  untuk  meningkatkan  laju pertumbuhan  dan  keseragaman  kalus  serta  embrio somatik  pada  beberapa  tanaman  perkebunan  di antaranya  kelapa  sawit  (Sumaryono et  al .,  2007),  teh (Tahardi et  al .,  2003)  dan  sagu  (Kasi  &  Sumaryono,
2007; Riyadi & Sumaryono, 2009). Sistem perendaman  sesaat  (SPS)  merupakan  teknik  kultur in vitro dalam  medium  cair  menggunakan  bioreaktor dimana  kontak  antara  eksplan  dan  medium  terjadi hanya secara periodik. Teknik ini telah dikembangkan pula untuk perbanyakan massal benih tebu di Australia menggunakan  eksplan  tunas  yang  ditumbuhkan  pada
media semi solid (SmartSett) (Mordocco et al ., 2009). Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  teknologi produksi  bibit  tebu  unggul  secara  massal,  cepat  dan seragam  melalui  kultur in  vitro dengan  sistem perendaman sesaat (SPS) menggunakan eksplan kalus.

## Bahan dan Metode

## Bahan tanam
Varietas yang digunakan adalah PSJT 941 dan PS 881  yang  merupakan  varietas  unggul  dari  Pusat Penelitian  Perkebunan Gula  Indonesia  (P3GI), Pasuruan.  Bahan  tanaman  tebu  yang  dikumpulkan berupa  stek  batang  (dua  mata  tunas)  sebanyak  paling sedikit  dua  stek  per  varietas.  Stek  tunas  tersebut kemudian  ditanam  dalam  media  tanah  di  rumah  kaca. Setelah tumbuh, tunas digunakan untuk eksplan kultur jaringan.

## Inisiasi kalus pada media padat
Kalus  diperoleh  dari  diferensiasi  jaringan meristematik  daun  muda  yang  masih  menggulung yang  ditanam  pada  media  dasar  MS  (Murashige  & Skoog, 1962) ditambah air kelapa muda 10%, sukrosa 30  g/L,  agar  dan  2,4-D  3  mg/L  yang  disebut  sebagai media  MS  I.  Dari  media  tersebut  dapat  dihasilkan kalus  yang  belum  mengalami  diferensiasi.  Untuk mempertahankan  kalus  dalam  status  embriogenik, maka  setiap  3-4  minggu  dilakukan  subkultur  pada media  yang  sama  selama  kurang  lebih  8-10  minggu sampai diperoleh kalus dengan jumlah yang memadai. Kultur diletakkan di ruang gelap bersuhu 26 + 1 ºC.

## Proliferasi  kalus  embriogenik  menggunakan  sistem perendaman sesaat (SPS)
Kalus  primer  yang  masih  berstruktur  remah disubkultur  ke  medium  cair  MS  I  pada  sistem perendaman  sesaat  (SPS).  Lama  dan  interval perendaman  diatur  secara  otomatis  dengan  pengatur waktu Autonic  double  timer (Riyadi  &  Sumaryono, 2009)  yang  disesuaikan  dengan  perlakuan.  Secara detail, perlakuan yang diuji adalah :
1.  Kontrol = media padat dalam botol jam.
2.  I12D1 =  media  cair  SPS  dengan  interval  12  jam selama satu menit.
3.  I12D3    =  media  cair  SPS  dengan  interval  12  jam selama tiga menit.
4.  I24D1    =  media  cair  SPS  dengan  interval  24  jam selama satu menit.
5.  I24D3    =  media  cair  SPS  dengan  interval  24  jam selama tiga menit.
Kultur  kalus  dan  pro-embrio  tersebut  diletakkan  di ruang  terang  di  bawah  lampu  TL  dengan  intensitas cahaya sebesar 20 μmol foton/m 2 /detik dengan periode penyinaran 12 jam dan suhu ruangan 26 ± 1 o C selama enam minggu.
Sebagai  pembanding  dilakukan  kultur  pada medium  padat  sesuai  prosedur  baku  yang  dikem- bangkan  di  P3GI,  Pasuruan  (Sugiyarta  &  Winarsih, 2009). Selanjutnya tahapan proliferasi kalus embriogenik  dilakukan  pada  SPS  dengan  komposisi medium  mengacu  pada  prosedur  baku  (Sugiyarta  & Winarsih,  2009).  Pengamatan  pada  fase  ini  meliputi biomassa kalus dengan cara semua kalus yang dipanen ditimbang  secara  aseptik  menggunakan  timbangan digital,  selanjutnya  kalus  disubkultur  untuk  tahap regenerasi.

## Regenerasi tunas pada kultur SPS
Induksi  dan  regenerasi  kalus  embriogenik  fase dewasa  dilakukan  pada  media  MS  tanpa  2,4-D. Kemudian kalus embriogenik fase dewasa disub-kultur pada  media  MS  II  yang  mengandung  IAA  (2  mg/L) dan  BAP  (0,2  mg/L).  Subkultur  dilakukan  setiap  dua minggu  sebanyak  dua  kali.  Kultur  disimpan  dalam ruang  terang  pada  suhu  26  +  1 o C.  Pada  fase  ini pengamatan  meliputi  penghitungan  bobot  basah  tunas dengan  cara  ditimbang  dan  penghitungan  jumlah  total tunas  yang  terbentuk  dengan  cara  menghitung  semua tunas  yang  terbentuk.  Seperti  pada  tahap  proliferasi kalus,  perlakuan  yang  diuji  pada  kultur  SPS  meliputi interval dan durasi perendaman media yang terdiri atas lima  perlakuan  yaitu  :  Kontrol,  I12D1,  I12D3,  I24D1 dan I24D3.

## Pembesaran planlet
Tunas yang terbentuk disubkultur pada media MS II padat dalam botol jam. Selanjutnya tunas yang telah mencapai tinggi ≥ 5 cm dipindah ke media MS II cair untuk  induksi  akar.  Untuk  pembentukan  perakaran, planlet  disubkultur  ke  media  cair  dalam  tabung  kaca dengan diameter 3 cm dan  tinggi 25 cm.  Planlet  yang telah  mempunyai  perakaran  sempurna  selanjutnya diaklimatisasi.

## Analisis statistik
Data  yang  diperoleh  dari  hasil  pengamatan  pada semua  parameter  diuji  statistik  dengan  menggunakan rancangan acak lengkap (RAL)  yang diulang tiga kali. Data  yang  diperoleh  diuji  statistik  sederhana  dan dilanjutkan  dengan  uji Duncan  Multiple  Range  Test (DMRT) pada taraf nyata 5%.

## Hasil dan Pembahasan
Tabel  1  menunjukkan  peningkatan  bobot  basah (biomassa) kalus dari dua varietas tebu (PSJT 941 dan PS  881)  yang  ditumbuhkan  dengan  metode  SPS dibandingkan  kontrol  setelah  enam  minggu.  Terlihat bahwa  peningkatan  biomassa  tertinggi  pada  varietas PSJT  941  (lebih  dari  dua  kali  lipat  dibandingkan dengan kontrol) diperoleh pada perlakuan SPS dengan interval  24  jam  dan  lama  perendaman  tiga  menit.
Sedangkan  pada  PS  881,  peningkatan  tertinggi  (lebih dari  empat  kali  lipat  dibandingkan  dengan  kontrol) diperoleh  pada  interval  perendaman  24  jam  dengan lama  perendaman  satu  menit.  Perbanyakan  dengan metode  SPS  terbukti  dapat  meningkatkan  biomassa kalus  2  -  4  kali  lipat  tergantung  jenis  varietas dibandingkan  dengan  kultur  pada  media  padat. Proliferasi  kalus  dan  pro-embrio  asal  kultur  pertama dilakukan  pada  media  padat  dan  cair  SPS  sesuai perlakuan.  Pada  tahap  ini,  perlakuan  yang  digunakan sama  dengan  kultur  pertama  yaitu  optimasi  interval dan  lama  perendaman  media.  Pada  tahap  selanjutnya, kalus embriogenik fase dewasa, kecambah dini bahkan tunas (pada media padat) asal kultur kedua disubkultur kembali  pada  media  MS  II  padat  dan  cair  SPS  sesuai perlakuan sebelumnya. Hasil pengamatan menunjukan bahwa  pertumbuhan  biomassa  kalus  embriogenik  dan tunas  pada  kultur  SPS  jauh  lebih  baik  dibandingkan pada  kultur  media  padat.  Perkembangan  kalus  pada kultur  SPS  dari  mulai  proliferasi  sampai  dengan regenerasinya ditunjukkan pada Gambar 2.
Pengamatan  mikroskopis  menggunakan  mikro- skop  Zeis  digital  (perbesaran  10  x  10)  terhadap pembentukan  dan  perkembangan  embrio  somatik  tebu asal  kultur  SPS,  ditunjukkan  pada  Gambar  3.  Terlihat bahwa  agregrat  kalus  embriogenik  hasil  kultur  cair SPS  telah  membentuk  struktur  yang  mirip  embrio (embrio somatik) (Gambar 3a). Selain itu, Gambar 3b. menunjukkan proses perkembangan kalus embriogenik yang  tumbuh  dan  berkembang  menjadi  tunas  atau kecambah.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  kalus  yang dikulturkan pada SPS berpotensi menghasilkan embrio somatik  yang  dapat  tumbuh  dan  berkembang  menjadi kecambah dan planlet.
Struktur yang mirip embrio ( embryo-like structure ) pada tanaman dapat diperoleh dari sel selain gamet  yang  disebut  dengan  embrio  somatik  (Khan  & Katri, 2006;  Deo et al ., 2010). Embrio somatik secara genetik  identik  dengan  induknya  karena  terbentuk tanpa  melalui  fertilisasi  (pembuahan).  Embriogenesis somatik  dapat  dilakukan  secara  langsung  dan  tidak langsung.  Proses  secara  tidak  langsung  melalui pembentukan kalus sebelum produksi embrio, sedangkan  pada  embriogenesis  somatik  langsung, produksi  embrio  terjadi  secara  langsung  dari  jaringan (eksplan) tanpa melalui fase kalus (Slater et al ., 2003; Desai et  al .,  2004).  Hasil  penelitian  sebelumnya menunjukkan  bahwa  morfologi  dan  perkembangan sementara antar embrio somatik dengan embrio zigotik sangat  mirip  dan  keduanya  melalui  beberapa tahap yang berbeda yang disebut dengan fase globuler, jantung,  torpedo  dan  kotiledon  atau  planlet,  untuk tanaman  dikotiledon  (Zimmerman,  1993  dalam Deo,  2010; Rose & Nolan, 2006), serta fase globular, elongasi,  skutelar  dan  koleoptilar  untuk  monokotil (Eudes et  al .,  2003;Gill et  al .,  2004).  Pada embriogenesis  yang  terjadi  di  tanaman  monokotil khususnya  famili  rumput-rumputan,  perubahan  dari
Mikropropagasi tebu (Saccharum officinarum . L ) menggunakan sistem ………….(Minarsih et al .)
Tabel 1. Perbanyakan kalus tebu menggunakan kultur SPS pada umur enam minggu.
Table 1. Sugarcane calli proliferation using TIS culture for six- weeks in culture . No. Perlakuan Treatments Varietas Varieties Parameter Laju proliferasi Proliferation rate (SPS/control) (%) Penambahan biomassa (kali lipat) Biomass increment (fold) Fase lanjut Advanced stage (%) 1. Kontrol PSJT 941 15,85 c 75,0 a 100 c 2. I12D1 PSJT 941 27,35 b 50,0 b 172 b 3. I12D3 PSJT 941 25,76 b 61,7 ab 162 b 4. I24D1 PSJT 941 17,76 c 56,7 b 112 c 5. I24D3 PSJT 941 35,32 a 56,7 b 223 a 6. Kontrol PS 881 15,82 c 82,0 a 100 c 7. I12D1 PS 881 33,49 b 60,0 b 212 b 8. I12D3 PS 881 19,17 bc 50,0 b 121 c 9. I24D1 PS 881 73,53 a 75,0 a 465 a 10. I24D3 PS 881 23,25 bc 36,7 c 147 c
Keterangan  ( Note ):  Angka  dalam  kolom  yang  sama  dan  diikuti  oleh  huruf  yang  sama  berarti  tidak  berbeda nyata  menurut  uji  Jarak  Berganda  Duncan  (P<  0,05).  ( Number  in  the  same  column followed by similar letter (s) are not significantly different according to Duncan  Multiple Range Test (P<0.05).
fase  globular  mengikuti  serangkaian  proses  yang muncul  secara  simultan  (Kackar  &  Shekhawat,  2007; Deo et  al .,  2010).  Pembentukan  dan  perkembangan embrio  somatik  pada  kopi  ( C.  arabica )  telah  berhasil dilakukan  melalui  kultur  SPS  (Gatica-Arias et  al ., 2008).
Hasil  pengamatan  kultur  SPS  pada  tahap regenerasi  tunas  varietas  PSJT  941,  menunjukkan bahwa  perlakuan  I24D1  dan  I24D3  memberikan  hasil bobot  segar  tunas  rata-rata  yang  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  perlakuan  lainnya  termasuk kontrol  (kultur  padat)  yang  mencapai  6  g/bejana (Gambar  4A).  Sedangkan  untuk  parameter  jumlah tunas  tertinggi  dicapai  pada  perlakuan  I24D1  yang menghasilkan  tunas  sebanyak  230  buah/bejana (Gambar  4B).  Bobot  segar  dan  jumlah  tunas  yang diperoleh  pada  perlakuan  interval  perendaman  selama 24  jam  jauh  lebih  tinggi  dibanding  perlakuan  interval perendaman 12 jam dan kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa  interval  perendaman  setiap  24  jam  merupakan perlakuan  yang  paling  optimal  untuk  klon  PSJT  941 sehingga  memberikan  hasil  paling  baik  dibandingkan dengan  perlakuan  lainnya.  Dengan  kombinasi  durasi perendaman  selama  satu  menit  dapat  meningkatkan hasil  dibandingkan  dengan  durasi  perendaman  selama tiga menit.
Varietas  PS  881  memberikan  hasil  yang  agak berbeda  dengan  varietas  PSJT  941.  Jumlah  biomassa tertinggi  dicapai  oleh  perlakuan  I12D3  dan  I24D1 yang  menghasilkan  bobot  segar  sebanyak  8  g/bejana, kemudian  diikuti  oleh  perlakuan  I12D1  yang menghasilkan  bobot  segar  sebanyak  7  g/bejana (Gambar  5A).  Bobot  segar  terendah  diperoleh  pada kontrol  (media  padat)  yaitu  sebesar  3  g/bejana.  Pada parameter  jumlah  tunas,  perolehan  hasil  pada  masing-
masing perlakuan berbeda dengan hasil yang diperoleh pada  parameter  bobot  segar.  Jumlah  tunas  tertinggi dicapai oleh perlakuan I24D1 yang mencapai sebanyak 900  tunas/bejana,  diikuti  oleh  perlakuan  I24D3  yaitu sebesar  200  tunas/bejana.  Sedangkan  jumlah  tunas pada  tiga  perlakuan  lainnya  kurang  dari  60 tunas/bejana  (Gambar  5B).  Hasil  ini  menunjukkan bahwa  perlakuan  I24D1  merupakan  perlakuan  terbaik dalam  menghasilkan  biomassa  tebu  varietas  PS  881 yang dalam hal ini hampir sama dengan varietas PSJT 941.
Biomassa  kalus  pada  perlakuan  I12D3  hampir sama  dengan  I12D1  namun  jumlah  tunas  sangat berbeda  (Gambar  5B).  Hal  tersebut  menunjukkan perlunya  optimasi  kondisi  kultur  SPS  untuk  masing- masing  varietas  atau  klon  tanaman  yang  digunakan. Fenomena  yang  sama  diungkapkan  pula  oleh Mordocco et  al .  (2009)  untuk  sistem  perendaman sesaat (RITA ® ) yang dikembangkannya pada beberapa varietas  tebu.  Tinggi  tunas  rata-rata  tebu  varietas  PS 881  dan  PSJT  941  sangat  berbeda  dengan  hasil pangamatan  pada  parameter  lainnya.  Pada  varietas  PS 881,  tinggi  tunas  tertinggi  (4,5  cm)  dicapai  pada kontrol (media padat), kemudian diikuti oleh perlakuan I24D1  yang  mencapai  3  cm  (Gambar  6).  Hasil  ini mirip  dengan  varietas  PSJT  941  yang  menghasilkan tunas  tertinggi  sebesar  5  cm  pada  kontrol  (media padat),  diikuti  oleh  perlakuan  I24D1  yang  mencapai 3  cm  (Gambar  7).  Tingginya  perolehan  parameter tinggi tunas pada perlakuan kontrol (media padat)  disebabkan  oleh  proses  pertumbuhan  yang lebih  cepat  dibandingkan  pada  kultur  SPS.  Hal ini menyebabkan proses proliferasi biomassa lebih  rendah  dibandingkan  dengan  kultur  SPS.
Gambar 2. Proliferasi dan regenerasi kalus tebu varietas PSJT 941 pada kultur SPS. A). Kultur kalus awal dengan 0,05 g/bejana,
B).  Proliferasi  kalus  setelah  enam  minggu,  C).  Proliferasi  kalus  embriogenik  dan  perkembangannya  setelah  12 minggu dalam kultur SPS, D). Regenerasi planlet setelah 18 minggu sejak kultur pertama.
Figure 2.    Callus  proliferation and  regeneration  of  sugarcane  variety  PSJT  941 in TIS  culture.  A)  Initiation of  callus  culture with 0.05 g calli, B) Callus proliferation after six-weeks, C) Callus proliferation and regeneration after 12 weeks, D) Plantlets regeneration after 18 weeks sice the first culture.
Gambar 3. Pengamatan mikroskopis embrio somatik tebu asal kultur SPS: A). Agregrat kalus yang telah menghasilkan struktur mirip  embrio  somatik,  B).  Proses  munculnya  kecambah  atau  perkecambahan  dari  kalus  embriogenik.  Keterangan: tanda panah menunjukkan struktur agregrat mirip embrio somatik; B) tanda panah menunjukkan kecambah awal.
Figure 3. Microscopic observations of somatic embryos derived from TIS culture: A). Callus aggregates which produce somatic embryo-like  structure,  B).  Initiation  process  of  somatic  embryo  regeneration.  Note  A)  Arrows:  somatic  embryo aggregates; B) Arrows: young shoot.
A B C D A B
Mikropropagasi tebu (Saccharum officinarum . L ) menggunakan sistem ………….(Minarsih et al .)
0 50 100 150 200 250 Control I12D1 I12D3 I24D1 I24D3 102.5 17.0 19.7 238.0 173.0 J u m la h tu n a s (b u a h ) Perlakuan kultur c d d a ab 0 1 2 3 4 5 6 7 Control I12D1 I12D3 I24D1 I24D3 4.99 4.32 3.35 6.03 6.02 B o b o t s e g a r (g ) Perlakuan kultur a b bc c a a
Gambar 4. A). Biomassa tebu varietas PSJT 941 pada lima perlakuan kultur selama enam minggu dalam media MS regenerasi. B). Pertumbuhan tunas  tebu  varietas  PSJT  941  pada  lima  perlakuan  kultur  selama  enam  minggu  dalam  media  MS regenerasi. Angka di atas bar yang diikuti dengan huruf yang sama, tidak berbeda nyata menurut uji jarak berganda Duncan (P<0,05]).
Figure  4. A).  Biomass  of  sugarcane  variety  PSJT  941  at  five  treatments  after  six-weeks  in  MS  regeneration  medium.  B). Number  of  sugarcane  shoot  variety  PSJT  941  at  five  treatments  after  six-weeks  in  MS  regeneration  medium. Numbers above bars followed by similar letter(s) are not significantly different according to Duncan Multiple Range Test (P<0.05).
Gambar  5.  A).  Biomassa  tebu  varietas  PS  881  pada  lima  perlakuan  kultur  selama  enam  minggu  dalam  media  MS  regenerasi tahap 2. B). Pertumbuhan tunas tebu varietas PS 881 pada lima perlakuan kultur selama enam minggu dalam media MS  regenerasi  tahap  2.  Angka  di  atas  bar  yang  diikuti  dengan  huruf  yang  sama,  tidak  berbeda  nyata  menurut  uji jarak berganda Duncan (P<0,05).
Figure 5.   A). Biomass of sugarcane variety PS 881 at five treatments after six-weeks in MS regeneration medium stage 2. B). Number  of  sugarcane  shoot  variety  PS  881  at  five  treatments  after  six-weeks  in  MS  regeneration  medium  stage  2. Numbers  above  bars  followed  by  similar  letter(s)  are  not  significantly  different  according  to  numbers  Duncan Multiple Range Test (P<0.05).
Dalam masa kultur yang sama kultur media padat lebih cepat  menghasilkan  planlet  namun  jumlahnya  lebih rendah  dibandingkan  dengan  kultur  SPS  (Gambar  8b dan  8d).  Sebaliknya,  kultur  SPS  akan  menghasilkan biomassa total dan planlet yang lebih banyak meskipun tingkat  pendewasaannya  lebih  lambat  dibandingkan dengan  kultur  media  padat  (Gambar  8a  dan  8c). Kelebihan  kultur  SPS  adalah  tingkat  proliferasi biomassa  yang  jauh  lebih  tinggi  dalam  masa  kultur yang  sama  dengan  kultur  pada  media  padat,  sehingga
hasil  akhir  jauh  lebih  banyak  dibandingkan  dengan kultur  media  padat  sebagaimana  ditunjukkan  pada tanaman  sagu  (Riyadi  &  Sumaryono,  2009).  Di samping itu, pada SPS frekuensi kontak antara eksplan dengan  media  kultur  sangat  singkat  (1x2  atau  3x2 menit  per  24  jam)  dibandingkan  dengan  pada  media padat  yang  mengalami  kontak  secara  kontinyu.  Hal tersebut  dapat  menurunkan  potensi  mutasi  genetik tanaman hasil  kultur  SPS dibandingkan dengan  media padat (Sumaryono et al ., 2007).
Perlakuan kultur /Culture treatment B o b o t se g ar / fres h w ei g h t (g ) A B 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Control I12D1 I12D3 I24D1 I24D3 3.341 7.143 8.231 8.231 6.695 B o b o t s e g a r (g ) Perlakuan kultur b a a a a Perlakuan kultur /Culture treatment Ju ml ah t u n as / N u m b er o f sh o o t B o b o t se g ar / fres h w ei g h t (g ) Perlakuan kultur /Culture treatment Ju ml ah t u n as / N u m b er o f sh o o t B o b o t se g ar / Fr es h w ei g h t (g ) Perlakuan kultur /Culture treatment A B a a a a Perlakuan kultur /Culture treatment
Gambar  6.  Tinggi  tunas  tebu  varietas  PS  881  pada  lima perlakuan  kultur  selama  enam  minggu  dalam media MS regenerasi tahap 2. Angka di atas bar yang  diikuti  dengan  huruf  yang  sama,  tidak berbeda  nyata  menurut  uji  jarak  berganda Duncan (P<0,05).
Figure 6.    Height of sugarcane shoot variety PS 881 at five treatments  after  six-weeks  in  MS  regenerating medium  stage  2.  Numbers  above  bars  followed by similar letter(s) are not significantly different according  to  Duncan  Multiple  Range  Test (P<0.05).
Gambar  7.  Tinggi  tunas  tebu  varietas  PSJT  941  pada  lima perlakuan  kultur  selama  enam  minggu  dalam media  MS  regenerasi.  Angka  di  atas  bar  yang diikuti  dengan  huruf  yang  sama,  tidak  berbeda nyata  menurut  uji  jarak  berganda  Duncan (P<0,05).
Figure  7.    Height  of  sugarcane  shoot  variety  PSJT  941  at five treatments after six-weeks in MS regenerating  medium  stage  2.  Numbers  above bars  followed  by  similar  letter(s)  are  not significantly  different  according  to  Duncan Multiple Range Test (P<0,05).
Gambar 8. Pertumbuhan dan perkembangan  kultur in vitro tebu dalam  media MS setelah enam  minggu pada media MS padat dan SPS. A). Pertumbuhan kalus embriogenik dan tunas varietas PS 881 pada media cair SPS, B). Pertumbuhan tunas PS  881  pada  kultur  media  padat,  C).  Perkembangan  tunas  varietas  PSJT  941  pada  media  cair  SPS  ,  dan  D). Perkembangan tunas varietas PSJT 941 pada media padat.
Figure 8. Growth and regeneration of sugarcane in vitro culture after six weeks in solid and TIS liquid MS media. A). Growth of embryogenic calli and shoots in TIS liquid culture medium of variety PS 881, B). Shoot regeneration of PS 881 in solid medium, C). Regeneration of shoots of PSJT 941 variety in TIS liquid culture medium and D). Regeneration of PSJT 941 plantlets in solid medium.

## Kesimpulan
Pertumbuhan  biomassa  kalus  embriogenik  pada kultur  SPS  meningkat  2-4  kali  lipat  dibandingkan dengan  kultur  media  padat.  Kultur  SPS  menghasilkan tunas  dan  planlet  yang  lebih  seragam  dibandingkan dengan  media  padat,  sebaliknya  regenerasi  dan produksi tunas lebih cepat terjadi pada media padat.

## Ucapan Terima Kasih
Penelitian  ini  terlaksana  atas  dana  dari  DIPA- APBN berdasarkan Kontrak Pengadaan Jasa Konsultansi  Penelitian  Pemuliaan  Tanaman  Perke- bunan  antara  Pusat  Penelitian  dan  Pengembangan Perkebunan  dengan  PT.  Riset  Perkebunan  Nusantara Tahun 2010 (No.01/JK-Bun/2010).
B
C D A 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 Control I12D1 I12D3 I24D1 I24D3 5.0 1.8 2.3 3.0 2.7 Tinggi tun as (cm) a b bc bc c Perlakuan kultur /Culture treatment Ji n g g i tu n as / S h o o t h ei g h t (c m ) Ti n g g i tu n as / S h o o t h ei g h t (c m ) Perlakuan kultur /Culture treatment 5 4 3 2 1 0
Mikropropagasi tebu (Saccharum officinarum . L ) menggunakan sistem ………….(Minarsih et al .)

## Daftar Pustaka
Amalraj  VA  &  N  Balasundaram  (2006).  On  the  Taxonomy of  the  members  of  "Saccharum  Complex". Genet Resour Crop Evol 53(1), 35-41.
Cha-um  S,  NT  Hien  &  C  Kirdmanee.  (2006).  Disease  free production of sugarcane varieties ( Saccharum officinarum L.)  using  in  vitro  meristem  culture.
Biotechnol 5(4), 443-448.
Deo  PC,  AP  Tyagi,  M  Taylor,  R  Harding  &  D  Becker
(2010).  Factors  affecting  somatic  embryogenesis  and transformation  in  modern  plant  breeding. The  South Pacific J Nat & Appl Sci 28, 27-40.
Desai  NS,  P  Suprasanna  &  VA  Bapat  (2004).  Simple  and reproducible  protocol  for  direct  somatic  embryo- genesis from cultured immature inflorescence segments  of  sugarcane  ( Saccharum spp.). Curr  Sci 87(6), 764-768.
Eudes  F,  S  Acharya,  LB  Selinger  &  KJA  Cheng  (2003).  A novel method to induce direct somatic embryo-genesis, secondary  embryogenesis  and  regeneration  of  fertile green cereal plants. Plant Cell Tiss Org Cult 73, 147– 157.
Gatica-Arias  AM,  G  Arrieta-Espinoza  &  AME  Esquivel (2008). Plant  regeneration  via  indirect  somatic embryogenesis  and  optimisation  of  genetic  trans- formation in C offea arabica L. cvs. Caturra and Catuaí.
Electronic J of Biotech 11(1), 1-12.
Geisjkes  RJ,  LF  Wang,  P  Lakshmanan,  MG  McKeon,  N Berding, RS Swain, AR Elliot, CPL Grof, J Jackson & GR  Smith  (2003).  Smartsett TM seedlings:  Tissue culture  seed  plants  for  the  Australian  sugar  industry. Sugarcane Int May/ June, 13-17.
Gill  NK,  R  Gill  &  SS  Gosal  (2004).  Factors  enhancing somatic  embryogenesis  and  plant  regeneration  in sugarcane  ( Saccharum  officinarum L.). Indian  J Biotechnol 3, 119-123.
Hvoslef-Eide AK, C Munster, PH Heyerdahl, RL Yngved & OAS  Olsen  (2003).  Liquid  culture  system  for  plant propagation. Acta Hort 625, 173-185.
Kackar  A  &  NS  Shekhawat  (2007).  Plant  regeneration through  somatic  embryogenesis  and  polyamine  levels in cultures of grasses of Thar Dessert. J Cell and Mol Biol 6 (2), 121-127.
Kasi  PD  &  Sumaryono  (2007).  Morphological  changes during  the  development  of  somatic  embryos  of  sago
( Metroxylon sagu Rottb.). Indonesian J Agric Sci 8(2), 43-47.
Khan  IA  &  A  Khatri  (2006).  Plant  regeneration  via organogenesis  or  somatic  embryogenesis  in  sugar- cane: Histological studies. Pak J Bot 38(3), 631-636.
Lakshmanan  P,  RJ  Geijskes,  KS  Aitken,  CPL  Grof,  GD
Bonnett & GR Smith (2005). Sugarcane biotechnology:  The  challenges  and  opportunities. In Vitro Cell Dev Biol Plant 41(4), 345-363.
Mariska  I  &  R  Suci  (2011).  Pengadaan  bibit  tebu  melalui kultur  jaringan. J  Litbang  Pertanian  Edisi  6  –  12  Juli 2011. No,3413 Tahun XLI.
Michael  PS  (2007).  Micropropagation  of  elite  sugarcane planting  materials  from  callus  culture  in  vitro. In : Proceedings of the Royal Society of New South Wales . Vol. 140, p. 79–86.
Mordocco  AM,  JA  Brumbley  &  P  Lakshmanan  (2009). Development  of  a  temporary  immersion  system (RITA ® ) for mass production of sugarcane ( Saccharum spp.)  interspecific  hybrids. In  Vitro  Cell  &  Develop Biol 45 (4), 450-457.
Murashige T & Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth  and  bioassays  with  tobacco  tissue  culture. Physiol Plant 15, 473-497.
Nickell  LG  (1964).  Tissue  and  cell  cultures  of  sugarcane: another research tool. Hawaii Plant Rec 57, 223-229.
Riyadi  I  &  Sumaryono  (2009).  Pengaruh  interval  dan  lama perendaman  terhadap  pertumbuhan  dan  pendewasaan embrio  somatik  tanaman  sagu  ( Metroxylon  sagu Rottb.) Menara Perkebunan 77 (2), 100-109.
Rose RJ & KE Nolan (2006). Genetic regulation of somatic embryogenesis with particular references to Arabidopsis thaliana and Medicago truncatula . In vitro Cell Dev Biol Plant 42, 473-481.
Slater  A,  NW  Scott  &  MR  Fowler  (2003). Plant Biotechnology . England, Oxford University Press.
Sugiyarta  E  &  S  Winarsih  (2009).  Rapid  propagation  of sugarcane  planting  materials  by  using  stratified Rayungan method. Sugar Tech 11(1), 22-17.
Sumaryono,  I  Riyadi,  PD  Kasi  &  G  Ginting  (2007). Pertumbuhan  dan  perkembangan  kalus  embriogenik dan  embrio  somatik  kelapa  sawit  ( Elaeis  guineensis Jacq.). Menara Perkebunan 75 (1), 32-42.