Hasil Penelitian

## VALIDASI MODIFIKASI METODE WEIßHAAR UNTUK ANALISIS 3-MCPD ESTER DALAM MINYAK GORENG SAWIT

## [Validation of Modified Weißhaar’s Method for 3-MCPD Esters Analysis in Palm Oil]
Tanti Lanovia 1,2) *, Nuri Andarwulan 1,3) dan Purwiyatno Hariyadi 1,3)
1) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Pusat Riset Obat dan Makanan Badan POM-RI, Jakarta
3) Southeast Asian Food and Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Diterima 20 September 2014 / Disetujui 30 Desember 2014

## ABSTRACT
The 3-monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) and 3-MCPD esters were found in any type of refined vegetable oil -mostly produced during the refining  process-  and  recognized  as  emerging  food  contaminants.  Several  analytical  methods  have  been  developed  and  one  of  which  was  a Weißhaar's method. The study aims to validate the modified Weißhaar's method for analysis of 3-MCPD and 3-MCPD esters in refined palm oil. Ion fragments were used for identification and quantification of 3-MCPD and 3-MCPD-d 5 . 3-MCPD was determined by GC-MS after released from its ester by transesterification with sodium methoxide and derivatized with phenylboronic acid. The validation showed that liniarity response (r=0.994) was observed from a linear regression by using external standard and internal standard at a concentration range of 0.008 and 0.377 µg mL -1 . The LOD of the validated method was 0.06 µg g -1 while its LOQ was 0.20 µg g -1 , precision (relative standard deviation, RSD) was 6.16%, and accuracy (as percentage of recovery) was in the  range of 95.83-113.27%. This results indicated that the modified method was valuable and sensitive for detection of 3-MCPD and 3-MCPD esters. Using the validated method, 3-MCPD esters content of a  commercial palm oil sample was determined and calculated as the difference between total 3-MCPD and free 3-MCPD, which was 13.24 µg g -1 . Total 3-MCPD content of several palm oils were at  a  concentration  range  of  13.94-34.52  µg  g -1 .  These  results  also  showed  that  there  was  a  correlation  between  3-MCPD  with  diacylglyceride (DAG). Samples with DAG content gave a high test results of 3-MCPD with a coefficient of correlation of r=0.752.
Keywords: analytical method, Weißhaar's method, palm oil, 3-MCPD, 3-MCPD esters

## ABSTRAK
Senyawa 3-monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) dan esternya merupakan kontaminan yang umumnya terbentuk pada proses pengolahan pangan.  Kontaminan  ini  termasuk food  emerging yang  berpotensi  mempengaruhi  kesehatan  manusia.  Beberapa  metode  analisis  telah dikembangkan untuk penetapan kadar 3-MCPD dan esternya dan salah satunya adalah metode Weißhaar yang digunakan untuk menguji minyak safflower . Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode analisis Weißhaar yang dimodifikasi dan metode ini digunakan untuk minyak goreng sawit.  3-MCPD  ester  dibebaskan  dari  esternya  oleh  natrium  metoksida  secara  transesterifikasi  kemudian  3-MCPD  bebas  diderivatisasi  dengan phenylboronic  acid dan    diidentifikasi  secara  GC-MS  dengan  menggunakan  fragmen  ion.  Validasi  metode  analisis  yang  dilakukan  memberikan hasil sebagai berikut: dari persamaan regresi y= 0.076x + 0.005, y adalah rasio area baku pembanding eksternal dan internal, x adalah konsentrasi baku  pembanding  eksternal,  didapatkan  linearitas  yang  ditunjukkan  oleh  koefesien  korelasi  (r)  0.994  pada  rentang  kerja  0.008-0.377  µg  mL -1 ; batas deteksi pada 0.06 µg g -1 , batas kuantitasi pada 0.20 µg g -1 ; presisi dinyatakan sebagai koefisien variasi sebesar 5.89%; akurasi dihitung sebagai  persen  rekoveri  dengan  nilai  95.83–113.27%.  Hasil  validasi  metode  analisis  ini  memenuhi  kriteria  yang  telah  dipersyaratkan.  Kadar  3- MCPD ester dihitung sebagai selisih 3-MCPD total dan 3-MCPD, pada minyak goreng sawit komersial didapatkan hasil 13.24 µg g -1 . Penetapan kadar 3-MCPD total dalam minyak goreng sawit komersial telah dilakukan dan didapatkan hasil dengan kisaran konsentrasi 13.94-34.52 µg g -1 . Sampel dengan kandungan diasilgliserida yang tinggi akan memberikan hasil pengujian yang tinggi pula pada kadar 3-MCPD dengan koefesien korelasi sebesar (r) 0.752.
Kata kunci: metode analisis, metode Weißhaar , minyak goreng sawit, 3-MCPD, 3-MCPD ester
PENDAHULUAN 1
Senyawa  3-MCPD  dan  esternya  merupakan  kontaminan yang terdapat dalam pangan, zat ini terbentuk pada saat pem- buatan  dan  pengolahan  beberapa  bahan  pangan  (Stadler  dan Lineback,  2009).  Ditemukannya  3-MCPD  dan  esternya  dalam pangan  menjadi  perhatianpara  akademisi,  pembuat  kebijakan
*Penulis Korespondensi:
E-mail: lanovia.tanti@gmail.com
dan pihak industri, terutama setelah Hrncirik (2010) menemukan 3-MCPD ester dalam pangan olahan,   selain semakin banyak- nya  bahan  dan  produk  pangan  yang  diketahui  mengandung kontaminan  tersebut  juga  karena  kekhawatiran  akan  dampak- nya terhadap kesehatan.
Laporan  uji  toksikologi  klinik  pada  hewan  uji  menyatakan bahwa  3-MCPD  memberikan  efek  pada  ginjal  dan  organ reproduksi hewan jantan, namun belum ada laporan tentang uji klinik  dan  epidemiologi  pada  manusia.  Berdasarkan  uji  klinik tersebut  batasan  3-MCPD  dalam  pangan  telah  ditetapkan
Hasil Penelitian
dengan tolerable  daily  intake (TDI)  2  μg  kg -1 bb  (berat  badan) oleh Commission Regulation (EC) No 1881/2006 dan European Union menyatakan batasan maksimal 0.02 mg kg -1 dalam HVP dan kecap (cairan dengan 40% bahan kering). Walaupun belum ada  pernyataan  tentang  batasan  untuk  3-MCPD  ester  serta bukti  yang  menunjukkan  bahwa  3-MCPD  ester  menyebabkan gangguan  kesehatan  seperti  3-MCPD,  namun  3-MCPD  ester tetap  menimbulkan  kekhawatiran,  karena  dianggap  sebagai sumber  pembentukan  3-MCPD.  Selain  itu  ditemukan  juga  3- MCPD ester dalam pangan yang kadarnya mencapai 5 sampai 396  kali  lebih  tinggi  dari  3-MCPD  (Svejkovska et  al .  2004). German  Federal  Institute  for  Risk  Assessment ( Bundesinstitut fur  Risikobewertung ,  BfR)  memperkirakan  semua  3-MCPD esterakan  dibebaskan  menjadi  3-MCPD  selama  proses  pen- cernaan dalam usus dan telah mengeluarkan himbauan kepada pihak  industri  untuk  menurunkan  kadar  3-MCPD  ester  dalam pangan (Karasek et al. 2010).
Mekanisme  pembentukan  3-MCPD  dan  esternya  dalam pangan belum sepenuhnya dapat dipahami. Dugaan sintesisnya adalah reaksi antara klorin dan lipid yang terjadi selama proses pengolahan,  pemasakan  dan  penyimpananyang  dipicu  oleh pemanasan  atau  reaksi  enzim-katalis  (Watkins,  2009).  Pem- bentukan  3-MCPD  secara  enzimatis  diteliti  dengan  meng- gunakan  model  sistem  yang  terdiri  dari  lipase,  minyak  nabati, natrium  klorida  dan  air,  pembebasannya  dari  3-MCPD  ester dilakukan  melalui  reaksi  hidrolisis  yang  dikatalisis  oleh  enzim lipase dalam pangan atau tubuh (Robert et al . 2004; Zelinkova et al . 2006). Kadarnya dalam minyak berbanding lurus dengan konsentrasi  minyak  dan  natrium  klorida.  Selama  proses pemanasan beberapa bahan pangan terjadi peningkatan kadar kontaminan 3-MCPD yang disebabkan oleh adanya lemak dan garam (Abu-El-Haj et al . 2005). Penelitian yang dilakukan oleh Svejkovska et  al. (2006)  juga  membuktikan  bahwa  3-MCPD ester    adalah  komponen  yang  tidak  stabil  dan  relatif  mudah terurai pada pemanasan.
Pada  tahun  19783-MCPD  ditemukan  pada hyrolyzed vegetable proteins (HVP) dan kecap, sedangkan 3-MCPD ester ditemukan  dalam  minyak rapeseed diawal  tahun  1980-an. Selanjutnya  kedua  komponen  ini  ditemukan  dalam  beberapa pangan olahan dan minyak nabati (Watkins, 2009; Stadler dan Lineback,  2009).  3-MCPD  ester  ditemukan  pada  semua  jenis minyak nabati dengan konsentrasi 0.6-14 ppm dan kandungan tertinggi  terdapat  padaminyak  goreng  sawit  (Greyt,  2012).  Hal ini  menimbulkan  kekhawatiran  karena  saat  ini  penggunaan minyak goreng sawit telah menggantikan posisi minyak kedelai yang sebelumnya menempati posisi teratas untuk penggunaan- nya  pada  proses  pengolahan  pangan.  Berbagai  pihak  dengan berbagai  cara  telah  melakukan  mitigasi  untuk  menekan keberadaan  3-MCPD  ester  dalam  pangan  dan  salah  satunya adalah di bidang pengembangan metode analisis identifikasi 3- MCPD ester baik secara langsung ataupun tidak  langsung.
Kandungan  3-MCPD  ester  yang  beragam  dalam  minyak sawit kemungkinan dipengaruhi  oleh wilayah budidaya dengan kondisi  iklim,  tanah  dan  cara  tanam  yang  berbeda,  selain  itu jenis  tanaman  sawit,  teknik  panen  dan  pengolahan  tentunya juga memberikan pengaruh. Mekanisme pembentukan 3-MCPD dan  esternya  dalam  pangan  belum  sepenuhnya  dapat dipahami.  Dugaan  sintesisnya  adalah  reaksi  antara  klorin  dan
lipid  yang  terjadi  selama  proses  pengolahan,  pemasakan  dan penyimpanan  yang  dipicu  oleh  pemanasan  atau  reaksi  enzim- katalis (Watkins, 2009). Klorindalam minyak goreng untuk  pem- bentukan 3-MCPD esterini belum dapat dipastikan sumbernya, namun ada kemungkinan klorinberasal dar ibahan baku berupa bahan organik yang tidak larut dalam air (Matthaus et al . 2012). Dugaan lain pembentuk 3-MCPD dan esternya adalah gliserol, garam,  air  serta  asilgliserol  dan  gliserol  sebagai  prekursornya (Zelinkova et  al .  2006).  Tentunya  kondisi  yang  berbeda  akan mempengaruhi  jumlah  klorin  dan  diasilgliserol  dalam  minyak yang  diduga  sebagai  prekursor  pembentuk  3-MCPD  dan esternya.
Berbagai  pihak  dengan  berbagai  cara  telah  melakukan mitigasi  untuk  menekan  keberadaan  3-MCPD  ester  dalam pangan  dan  salah  satunya  adalah  di  bidang  pengembangan metode analisis identifikasi 3-MCPD ester baik secara langsung ataupun  tidak    langsung. The  European  Commision’s  Join Research  Centre pada  tahun  2009  menyelenggarakan  uji profisiensi  untuk  menilai  kemampuan  laboratorium  dalam melakukan  pengujian  3-MCPD  ester  yang  diikuti  oleh  34 laboratorium pada 11 negara Uni Eropa, Swiss dan Makedonia. Kinerja  laboratorium  pada  pengujian  3-MCPD  ester  dalam minyak  zaitun  menunjukkan  85%  laboratorium  memberikan hasil  yang  memuaskan  sedangkan  untuk  minyak  goreng  sawit hanya  56%  (Karasek et  al .  2010).  Dari  hasil  uji  profisiensi tersebut  disarankan  perlu  dilakukan  validasi  metode  analisis sebelum  melakukan  pengujian  rutin  dengan  menggunakan metode terpilih.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  memvalidasi  metode  analisis Weißhaar  yang  dimodifikasi  untuk  penetapan  kadar  3-MCPD danesternya dalam minyak goreng sawit dan menentukan kadar 3-MCPD  dan  esternya  dalam  minyak  goreng  sawit  komersial yang beredar dipasaran.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  adalah  minyak  goreng  sawit bermerek  dan  curah  yang  diperoleh  dari  super  market  dan pasar tradisional.

## Penentuan metode analisis
Metode  analisis  yang  digunakan  adalah  metode  Weißhaar (2008)  terdiri  dari  3  tahapan  yaitu  ekstraksi,  derivatisasi  dan analisis dengan kromatografi gas-spektrometri massa. 3-MCPD dibebaskan dari 3-MCPD ester  secara transesterifikasi dengan natrium  metoksida  dalam  metanol,  kemudian  diderivatisasi dengan  PBA,  selanjutnya  3-MCPD  bebas  ditentukan  dengan GC-MS. 3-MCPD-d 5 (Fluka, Sigma-Aldrich), digunakan sebagai baku  pembanding  internal.  Modifikasi  dilakukan  pada penggunaan pelarut, isoheksan diganti dengan heksan (Merck), dan  kondisi  penggunaan  GC-MS  (Tabel  1  dan  2).  Metode analisis  ini  dipilih  berdasarkan  kemudahan  penerapannya  di laboratorium.
Hasil Penelitian
ISSN: 1979-7788 Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Tabel 1.   Parameter penggunaan GC Kondisi Penggunaan Metode Weißhaar Metode Modifikasi GC/MS GC-MS (Thermo Scientific) GC-MS  320-MS  (Varians) yang dilengkapi autosampler Kolom Rtx-5MS 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 µm (Restek, Varian) Rtx-5MS 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 µm (Restek, Varian) Suhu injector 250°C 180°C Suhu oven 80°C (1 menit), 300°C dengan laju 10°C/menit (37 menit) 60°C (1 menit), 90°C dengan laju  6°C/menit  (1  menit), 280°C dengan laju 20°C/menit (5 menit) Gas pembawa Helium Helium Aliran kolom 0.8 mL/menit 1.2 mL/menit Penyuntikan Splitless Rasio split 10 Volume penyuntikan 1 µL 1 µL Tabel 2.  Parameter penggunaan MS Kondisi Penggunaan Metode Weißhaar Metode Modifikasi Mode aquisition Selected Ion Monitoring (SIM) Selected Ion Monitoring (SIM) Mode ionisasi Electron impact (EI) Electron impact (EI) Suhu interface - 280°C Suhu ion source - 200°C m/z 196, 201 (analisis kuantitatif); 147, 150 (kualifikasi) 147, 150 (analisis kuantitatif); 91, 93, 196, 201 (kualifikasi)
Preparasi sampel dilakukan dengan menggunakan 100 mg sampel minyak yang dimasukkan ke dalam tabung kaca 10 mL bertutup  ulir,  ditambahkan  0.5  mL  campuran methyl  tert-butyl ether (MTBE) (Sigma-Aldrich) dan etil asetat (Merck) (8:2), baku internal  dengan  kadar  0.13  µg  mL -1 ,  dicampur  dan  dibiarkan pada suhu kamar sekurangnya 2 jam, kemudian ditambahkan 1 mL  natrium  metoksida  (Merck)  (0.5  mol  L -1 dalam  metanol (Merck)  HPLC  grade),  divorteks  selama  30  detik,  kemudian didiamkan  pada  suhu  kamar  selama  10  menit.  Selanjutnya  ke dalam  campuran  tersebut  ditambahkan  3  mL  heksan  (Merck), 0.1  mL  asam  asetat  glasial  (Merck),  dan  3  mL  natrium  klorida (Merck)  (200  g  L -1 ),  divorteks  selama  30  detik.  Setelah  fase organik campuran tersebut dibuang, pada fase air ditambahkan 3 mL heksan dan kembali fase organik dibuang. Pada fase air ditambahkan 250 µL reagen penderivat (5 g Phenylboronic acid (PBA)  (Sigma-Aldrich)  yang  dilarutkan  dalam  19  mL  aseton (Merck) dan 1 mL air), tabung ditutup dan panaskan pada suhu 80°C dalam penangas air selama 20 menit. Setelah didinginkan pada  suhu  kamar,  derivat  siklik  fenilboronat  dari  3-MCPD diekstrak dengan 3 mL heksan (Weißhaar, 2008). Fase organik dipisahkan dan dianalisis sesuai prosedur.
Larutan baku kerja dibuat dalam satu seri pada konsentrasi tertentu, dengan cara menambahkan larutan baku pembanding eksternal pada volume tertentu yang ditambahkan kedalam 100 mg minyak goreng sawit. Perlakuan yang sama seperti sampel juga dilakukan pada larutan baku kerja dan penetapan 3-MCPD bebas,  tanpa  penambahan  natrium  metoksida  saat  proses preparasi.  Instrumen  utama  yang  digunakan  untuk  analisis adalah  GC-MS  320  (Varians)  yang  dilengkapi  dengan autosampler , instrumen penunjang yang digunakan antara lain penangas air dan vorteks.

## Parameter penggunaan GC
GC/MS
: GC-MS 320-MS (Varians) yang dilengkapi autosampler Kolom :  Kolom  Rtx-5MS  30  m  x  0,25 Temperatur injektor : 180°C Temperatur oven :  60°C  (1  menit),  90°C  dengan laju  6°C/menit  (1  menit),  280°C dengan  laju  20°C/menit  (5 menit) Gas pembawa : Helium Aliran kolom : 1.2 mL/menit Penyuntikan : Rasio split 10 Volume penyuntikan : 1 µL Parameter penggunaan MS Mode aquisition : Selected Ion Monitoring (SIM) Mode ionisasi : Electron impact (EI) Temperatur interface : 280°C Tenperatur ion source : 200°C m/z 3-MCPD :  147(analisis  kuantitatif);  91,  196 (kualifikasi) m/z 3-MCPD-d 5 : 150 (analisis kuantitatif), 93, 201
(kualifikasi)

## Validasi metode analisis
Parameter validasi yang diuji meliputi linearitas dan rentang kerjanya,  spesifisitas,  presisi,  akurasi,  batas  deteksi  dan kuantifikasi.  Identifikasi  puncak  ditentukan  dengan  melihat waktu  retensi,  spektrum  dan  kromatogram  sampel  yang ditambahkan  baku  pembanding  eksternal  (Codex  Stan,  2012; ICH,  2005;  Magnusson  dan  Ornemak,  2014).  Kuantifikasi dilakukan  menggunakan  kurva  baku  pembanding  eksternal dengan  delapan  konsentrasi  danbaku  pembanding  internal dengan  konsentrasi  tetap  yang  ditambahkan  kedalam  sampel (sampel spike ).  Konsentrasi  baku  pembanding  eksternal  yang digunakan 0.008-0.377 µg mL -1 dan baku pembanding internal sebesar 0.13 µg mL -1 , konsentrasi dalam larutan akhir setelah derivatisasi  (Tabel  3).  Linearitas  yang  ditunjukkan  dengan persamaan regresi y=bx+a dievaluasi dengan memetakan area daerah  puncak  yang  merupakan  rasio  dari  area  baku  pem- banding  eksternal  dan  baku  pembanding  internal  (y)  terhadap konsentrasi  baku  pembanding  eksternal  (x)  yang  umumnya membentuk  hubungan  linear,  sedangkan  hubungan  antara kedua  peubah  dinyatakan  sebagai  koefesien  korelasi  (r). Spesifisitas adalah kemampuan metode untuk merespon secara khusus analit yang ditentukan tetapi tidak untuk komponen lain dari  matriks,  namun  hanya  sedikit  metode  yang  benar-benar spesifik, jadi istilah ini lebih sering digunakan untuk menyatakan bahwa parameter spesifisitas menunjukan bahwa metode dapat digunakan  untuk  menentukan  analit  secara  kuantitatif  tanpa adanya  gangguan,  hal  ini  dapat  dilihat  pada  kromatogram puncak  analit  yang  terpisah.  Presisi  adalah  fungsi  dari konsentrasi  yang  menyatakan  kedekatan  diantara  serangkaian pengukuran beberapa sampel homogen, uji dilakukan pada dua konsentrasi  yang  berbeda  dengan  enam  ulangan.  Akurasi merupakan  kedekatan  antara  nilai  terukur  dan  nilai  diterima, nilai  benar  atau  nilai  referensi,  ditentukan  secara  rekoveri
Hasil Penelitian
dengan  penambahan  baku  pembanding  eksternal  pada  atau disekitar konsentrasi target, uji dilakukan pada satu konsentrasi dengan  tujuh  ulangan.  Batas  deteksi  adalah  kuantitas  terkecil dari  analit  yang  memberikan  tinggi  puncak  tiga  kali noise , secara  signifikan  lebih  besar  dari  pada  kesalahan  pengukuran blanko  secara  acak  dinyatakan  sebagai  penjumlahan konsentrasi rerata dengan tiga kali standar deviasi dari sepuluh ulangan.  Batas  kuantitasi  adalah  kuantitas  terkecil  dari  analit yang  dapat  ditentukan  secara  kuantitatif  dengan  presisi  dan akurasi  yang  memenuhi  syarat,  dinyatakan  sebagai  pen- jumlahan  konsentrasi  rerata  dengan  sepuluh  kali  standar deviasi dari sepuluh ulangan.

## Penetapan  kadar    3-MCPD  dan  esternya  dalam  minyak goreng sawit komersial
Penetapan  kadar  3-MCPD  bebas  dan  3-MCPD  total  atau kadar setelah dilakukan hidrolisis dilakukan dengan mengguna- kan  metode  analisis  yang  telah  divalidasi,  3-MCPD  ester dihitung  sebagai  selisih  antara  kadar  3-MCPD  total  dengan  3- MCPD bebas. Analisis dilakukan sebanyak enam ulangan.
Penetapan  kadar  asam  lemak  bebas  dan  mono- diasilgliserol dalam minyak goreng sawit komersial
Kadar asam lemak bebas dalam minyak goreng ditetapkan mengikuti
AOAC (2005) dan penetapan kadar monodiasilgliserol mengikuti AOCS (2003).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Metode analisis
Uji  pendahuluan  dilakukan  sebelum  metode  analisis divalidasi,  uji  ini  bertujuan  untuk  mencari  kondisi  pengujian terbaik  yang  sesuai  dengan  kondisi  laboratorium  pengujian yang  digunakan,  tahapannya  meliputi:  penentuan  pereaksi, kondisi GC-MS, waktu retensi 3-MCPD dan 3-MCPD-d 5 dan ion m/z yang digunakan untuk analisis kuantitatif.
Prinsip dari penetapan 3-MCPD ester adalah mengubah 3- MCPD ester menjadi 3-MCPD bebas. Tahapan yang dilakukan adalah  menambahkan  baku  pembanding  internal  ke  dalam sampel,  kemudian  dilanjutkan  dengan  transesterifikasi  meng- gunakan  natrium  metoksida  dalam  metanol  (metanolisis), netralisasi  dan salting  out ,  derivatisasi  dengan  PBA  yang
selanjutnya  dianalisis  secara  GC-MS.  Larutan  baku  pem- banding  eksternal  3-MCPD  dan  larutan  baku  pembanding internal  3-MCPD-d 5 ditambahkan  mininal  dua  jam  sebelum preparasi.  Setelah  sampel  di  preparasi  kemudian  analit  dalam sampel  ditentukan  dengan  detektor  spektrum  massa  meng- gunakan ion m/z 91.147, 196 untuk  3-MCPD dan ion m/z 93, 150, 201 untuk 3-MCPD-d 5 (Svejkovska et al. 2006; Zelinkova et  al. 2006;  Weßhaar,  2008).  Kromatogram  yang  dihasilkan diidentifikasi  dengan  memperhatikan  respon  spektrum,  luas area dan gangguan pada puncak.
Intensitas  spektrum  terbesar  pada  3-MCPD  dihasilkan olehion m/z 147 3-MCPD dan ion m/z 150 untuk 3-MCPD-d 5. Hal ini  menjadi  salah  satu  alasan  pemilihan  ion  tersebut  untuk analisis kuantitatif, walaupun spektrum yang umumnya diguna- kan  untuk  penentuan  kuantitatif  adalah  spektrum  ion  dengan berat  molekul  terbesar  (Gambar  1).  Kromatogram total  ion chromatogram (TIC)  pada  mode  deteksi scan menghasilkan luas  puncak  gabungan  seluruh  spektrum  massa  yang sebanding  dengan  konsentrasi  analit,  namun  puncak  baku pembanding  internal  dan  eksternal  tidak  terpisah  sempurna, maka  untuk  mengatasinya  digunakan  mode  ion  selektif  (SIM) yang dapat memisahkan puncak analit (Gambar 2). SIM waktu siklusnya  lebih  pendek  dari  pada  mode  deteksi scan ,    akurasi dan  presisinya  lebih  baik  sehingga  analisis  kuantitatif  menjadi lebih optimal (Collin et al . 2009).
Penentuan  ion  kuantitasi  selain  dari  spektrum  dapat  pula menggunakan kromatogramnya, ion yang dipilih harus memiliki puncak tanpa interferensi atau sedikit mungkin gangguan serta memiliki  sensitifitas  tinggi  yang  ditunjukkan  oleh  luas  area puncak. Kromatogram 3-MCPD pada ion m/z 91 terlihat puncak matriks lebih dominan dari puncak analit, pada ion m/z 196 tidak terlihat  puncak  matriks  namun  ada  interferensi  pada  puncak analit, kedua sisi bagian bawah puncak analit terlihat lebih lebar sedangkan luas area puncaknya lebih kecil dibandingkan kedua ion yang lain sehingga ion kuantitaf yang dipilih adalah ion m/z 147 yang interferensinya paling kecil dan luas area puncaknya lebih besar. Pemilihan ion kuantitatif 3-MCPD-d 5 hanya melihat besaran  luas  area  puncak,  karena  pada  ketiga  kromatogram tidak  terlihat  adanya  gangguan.  Ion  hasil  derivatisasi  yang terbentuk  untuk  masing-masing  nilai m/z dapat  dilihat  pada Tabel 4.
Tabel 3.  Konsentrasi baku pembanding eksternal dan internal
3-MCPD 3-MCPD-d 5 Volume (mL) Konsentrasi Volume (mL) Konsentrasi Pengambilan Pengenceran (ug/mL) Pengambilan Pengenceran (ug/mL) 0 0 12.561 0 0 12.500 0.002 3 0.008 0.032 3 0.133 0.004 3 0.017 0.032 3 0.133 0.008 3 0.033 0.032 3 0.133 0.016 3 0.067 0.032 3 0.133 0.032 3 0.134 0.032 3 0.133 0.048 3 0.201 0.032 3 0.133 0.064 3 0.268 0.032 3 0.133 0.090 3 0.377 0.032 3 0.133
Hasil Penelitian
Gambar 1.  Spektrum  mass  hasil  derivatisasi  PBA  untuk  3-MCPD-d 5
(atas) dan 3-MCPD (bawah)
Tabel 4.  Karakteristik  ion  ( m/z )  pada  spektrum  massa  3-MCPD  dan 3-MCPD-d 5 terderivatisasi
MW M-(CH 2 CL)- (C 7 H 7 )- 3-MCPD 196 147 91 3-MCPD-d5 201 150 93
Keterangan: M =

## Metode analisis tervalidasi
Pada  metode  kuantitatif  perlu  ditentukan  rentang konsentrasi  analit  dimana  metode  dapat  digunakan  untuk pengujian.  Hal  ini  merujuk  pada  berbagai  konsentrasi  analit dalam  larutan  yang  diukur  bukan  dalam  sampel  sebenarnya. Pada penelitian ini rentang konsentrasi analit ditambahkan pada sampel  sebelum  dipreparasi  untuk  mendapatkan  larutan  uji dengan  rentang  konsentrasi  tersebut,  hal  ini  dilakukan  untuk meminimalkan pengaruh matriks sampel pada penetapan kadar analit  dalam  sampel  sebenarnya.  Dalam  rentang  kerja  yang digunakan  kemungkinan  ada  respon  yang  memiliki  hubungan linear  dengan  konsentrasi  analit  (Magnusson  dan Ornemak, 2014). Hubungan tersebut tergambar pada kurva linearitas yang dibuat  dengan  menggunakan  8  tingkatan  konsentrasi  baku pembanding  eksternal  (0.008–0.377  µg  mL -1 )  dan  konsentrasi tetap  baku  pembanding  internal  (0.13  µg  mL -1 ).  Persamaan regresi  yang  diperoleh  adalah  y  =  0.076x–0.005  dengan koefisien korelasi (r) sebesar 0.994 (Gambar 3).
Tahapan  preparasi  sangat  mempengaruhi  hasil  pengujian, isolasi yang efektif akan menghasilkan analit yang terpisah dari matriksnya.  Kromatogram  yang  dihasilkan  dapat  memperlihat- kan  puncak  analit  yang  terpisah  dari  puncak-puncak  lain sehingga  memudahkan  identifikasi  dan  pengukuran,  bahkan pada  sampel  yang  mengandung  analit  dengan  konsentrasi rendah.  Kromatogram  yang  memperlihatkan  puncak  tanpa interferensi  bisa  menyatakan  bahwa  metode  analisis  yang digunakan spesifik (Gambar 4).
Pengujian  keterulangan  (presisi)  hanya  tergantung  dari sebarannya  dan  sama  sekali  tidak  berhubungan  dengan  nilai benarnya sedangkan akurasi merupakan nilai pengukuran yang mendekati  nilai  benar.  Akurasi  dilakukan  dengan  uji  rekoveri yaitu  menambahkan  baku  pembanding  eksternal  ke  dalam blanko  sampel  dengan  konsentrasi  tertentu  ( spike ).  Limit deteksi  dan  limit  kuantitasi  dilakukan  dengan  menambahkan baku pembanding eksternal dengan kadar sangat rendah pada sampel  blanko,  namun  analit  masih  dapat  membentuk  puncak yang tingginya lebih kurang 3 kali tinggi noise . Hasil pengujian seperti terlihat pada Tabel 5.

## Kadar 3-MCPD dan esternya dalam minyak goreng sawit
Metode  analisis  tervalidasi  digunakan  untuk  menetapkan kadar 3-MCPD total dan 3-MCPD bebas dalam minyak goreng sawit komersial bermerek yang diperoleh dari pasar tradisonal, hasilnya  tercantum  pada  Tabel  6.  Perhitungan  3-MCPD  ester pada  minyak  goreng  sawit  ditentukan  berdasarkan  selisih  3- MCPD  total  dan  3-MCPD  bebas,  yaitu  sebesar  13.24  µg  g -1 . Hasil yang didapatkan mendekati kadar  3-MCPD ester sampel minyak goreng sawit pada uji profisensi EU-JRC yang dinyata- kan  oleh  Karasek et  al. (2010)  yaitudengan  kisaran  hasil  0.6- 18.8  µg  g -1 dan  laboratorium  yang  memenuhi  nilai z  score sebanyak  56%.  Hasil  ILSI  (2009)  juga  melaporkan  bahwa minyak goreng sawit mengandung 3-MCPD ester dengan kadar 4.5-13 µg g -1 .
In te ns ita s (% ) 100 75 50 25 0 50 100 150
200 250
3-MCPD-d s 150.0 1.792e+6 50.9 255696 93.0 541095 106.8 151657 148.9 422451
151.1 174895 201.0 527656 203.3 108557 m/z
H 2  Cl O O B Ph-H3 Cl O O B Ph
In te ns ita s (% ) 100 75 50 25 0 50 100 150 200 250 m/z 3-MCPD 50.3 23462 64.5 8957 91.0 44193 103.6 22433 146.9 14561 6 145.8 38932 148.2 9099 196.0 42915 198.1 17192 Cl O O B Ph
Hasil Penelitian
Cl O O B Ph kCounts 10 5 0 20 15 E 17 18 19 20 Apex: 17.796 min Area: 95730 147.0>

## Minutes
Gambar 2.  Kromatogram TIC derivatisasi 3-MCPD-d 5 dan 3-MCPD (A), 3-MCPD-d 5 m/z 201 (B),3-MCPD-d 5 m/z 150 (C), 3-MCPD m/z 196 (D), 3-MCPD m/z 147 (E)
Tabel 5.  Hasil uji presisi, rekoveri, batas deteksi dan batas kuantitasi
SD KV 2/3 KV HorRat Persyaratan (%) Horwitz (%) Presisi  (µg g -1 ) 4.06 0.25 6.16 8.64 0.680 KV<2/3KV Horwitz HorRat 0.5-2.0 (Horwitz 2006) Rekoveri (%) 95.83-113.27 6.26 6.16 10 µg g -1 , 80-115% (AOAC. 2002) 1 µg g -1 , 75-120% (AOAC. 2002) Batas deteksi 0.06 (µg g -1 ) Batas kuantitasi 0.20 (µg g -1 )
5 3 1 kCounts 17 18 19 20 TIC Derivat 3-MCPD Derivat 3-MCPD-ds A Minutes 1.5 0.5 kCounts B Apex: 17.720 min Area: 11304 201.0> 17 18 19 20 0.0 1.0 2.0 2.5 H2 Cl O O B Ph-H3 Minutes H2 Cl O O B Ph-H3 Apex: 17.726 min Area: 53623 150.0> 5.0 C 17 18 19 20 kCounts Minutes 2.5 0.0 7.5 10.0 12.5 Apex: 17.799 min Area: 20804 Cl O O B Ph 1 3 D 17 18 19 20 kCounts 2 4 5 6 196.0> Minutes
Hasil Penelitian
y = 0.571x + 0.005 R = 0.994 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 R as io A re a Konsentrasi y = 5.579x - 6.535 R = 0.750 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 2 4 6 8 10 Ka da r 3 -M C PD T ot al (p pm ) Kadar DAG (%)
Gambar 3.  Kurva linearitas 3-MCPD
Analisis  3-MCPD  total  juga  dilakukan  terhadap  sebelas sampel  minyak  goreng  sawit  komersial  bermerek  dan  curah yang menunjukkan kadar 3-MCPD total bervariasi antara 13.94- 34.52  µg  g -1 (Tabel  6).  Hal  ini  diduga  terjadi  akibat  pengaruh proses  pengolahan,    lama  waktu  dan  atau  cara  penyimpanan minyak  goreng  sawit.  Kadar  air  yang  tinggi  dan  enzim  lipase yang  ada  dalam  minyak  goreng  sawit  selama  penyimpanan minyak  goreng  sawit  dapat  membentuk  asilgliserol,  terutama diasilgliserol,  yang  akan  menjadi  prekursor  pembentukan  3- MCPD ester (Karsulinova et al. 2007).
Tabel 6.  Kadar 3-MCPD dan 3-MCPD ester dalam minyak goreng
Kode Sampel 3-MCPD Total (µg g -1 ) 3-MCPD Bebas (µg g -1 ) 3-MCPD Ester (µg g -1 ) S1 15.77 3.54 12.23 S2 15.99 3.59 12.39 S3 16.86 3.79 13.08 S4 18.17 3.69 14.48 S5 17.99 3.81 14.19 S6 16.95 3.92 13.03 Rerata 16.96 3.72 13.23 SD 0.99 0.14 0.92 KV (%) 5.83 3.81 6.96 2/3 KV Horwitz (%) 6.97 8.75 7.23
Sebelas  sampel  minyak  goreng  sawit  yang  telah  diketahui konsentrasi  3-MCPD  totalnya  juga  ditentukan  kadar diasilgliserida  (DAG),  triasilgliserida  (TAG)  dan  kandungan asam  lemak  bebasnya  (ALB).  Penentuan  ini  dilakukan  untuk melihat  korelasinya  dengan  kandungan  3-MCPD  dan  esternya dalam  minyak  goreng  sawit.  seperti  terlihat  pada  Gambar  5. Dugaan adanya korelasi antara diasilgliserol dan pembentukan 3-MCPD dan esternya tidak terlihat secara nyata, namun disisi lain  dengan  membandingkan  antara  konsentrasi  diasilgliserol dan konsentrasi 3-MCPD total pada 11 sampel minyak goreng sawit  ini,  secara  umum  konsentrasi  3-MCPD  total  meningkat dengan bertambahnya konsentrasi diasilgliserida. Diasilgliserida memperlihatkan korelasinya dengan kandungan 3-MCPD total, sampel  dengan  diasilgliserida  tertinggi  7.87%  mengandung  3-
MCPD total sebanyak 34.517 µg g -1 sementara sampel dengan diasilgliserida  terendah  3.62%  mengandung  3-MCPD  total sebanyak 13.94 µg g -1 (Tabel 7 dan Gambar 5).
Tabel 7.  Kadar  3-MCPD  total,  DAG,  TAG  dan  ALB  dalam  minyak goreng sawit komersial No Sampel 3-MCPD total (µg g -1 ) DAG (%) TAG (%) ALB (%) 1 23.60 5.21 94.80 0.19 2 14.79 5.17 94.83 0.17 3 25.50 5.59 94.34 0.15 4 34.52 7.87 92.13 0.11 5 26.79 5.90 94.10 0.13 6 33.36 5.56 94.44 0.13 7 27.10 6.31 93.69 0.13 8 31.62 6.27 93.72 0.23 9 16.66 5.63 94.37 0.18 10 33.92 6.26 93.74 0.11 11 13.94 3.62 96.38 0.11 Rerata 25.62 5.76 94.23 0.15 SD 7.65 1.03 1.029 0.04
Gambar 5.  Hubungan  antara  diasilgliserida  dengan  3-MCPD  yang terkandung dalam minyak goreng sawit
Greyt  (2010)  pada  penelitiannya  menyatakan  bahwa diasilgliserida  memiliki  korelasi  dengan  3-MCPD  ester,  jika kadar diasilgliserida lebih besar dari 4%, maka  kadar 3-MCPD ester  umumnya  lebih  besar  dari  5  ppm.  Penentuan  3-MCPD bebas atau prosedur preparasi sampel tanpa metanolisis tidak dilakukan pada 11 sampel minyak goreng sawit sehingga tidak bisa  ditentukan  konsentrasi  3-MCPD  bebas.  Pada  10  dari  11 sampel minyak goreng sawit kandungan diasilgliseridanya lebih dari 4%, kemungkinan besar kandungan 3-MCPD esternya lebih dari  5  ppm  karena  konsentrasi  3-MCPD  total  13.94-34.62%, dimana  konsentrasi  3-MCPD  ester  dalam  pangan  lebih  tinggi dari 3-MCPD bebas.
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Gambar 6.  Kromatogram 3-MCPD ion m/z 91 (A), 3-MCPD-d 5 ion m/z 93 (B), 3-MCPD ion m/z147 (C), 3-MCPD-d 5 ion m/z 150 (D), 3-MCPD ion m/z 196 (E), dan 3-MCPD-d 5 ion m/z 201 (F)

## KESIMPULAN
Modifikasi metode Weißhaar yang dilakukan pada penelitian ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi kadar 3-MCPD dan esternya  dalam  minyak  goreng  sawit.  Hasil  validasi  metode analisis  3-MCPD  dalam  minyak  goreng  sawit  telah  memenuhi kriteria akurasi, presisi, linieritas, dan spesifisitas yang ditunjuk- kan  oleh  persamaan  linear  (r)  0.994,  rentang  kerja  dengan konsentrasi 0.008 sampai 0.377 µg mL -1 , batas deteksi 0.06 µg g -1 , batas kuantitasi 0.20 µg g -1 , presisi (koevesien variasi (KV)) 6.16%, dan akurasi (persen rekoveri) 95.83-113.27%.
Metode  analisis  tervalidasi  dapat  diaplikasikan  untuk  me- nentukan  kadar  3-MCPD  dan  esternya  pada  minyak  goreng sawit  komersial.  Sampel  minyak  goreng  sawit  yang  dianalisis pada penelitian ini diperoleh kadar 3-MCPD total sebesar 16.96 µg g -1 , 3-MCPD sebesar 3.72 µg g -1 , sedangkan 3-MCPD ester bisa  dihitung  berdasarkan  selisih  antara  kadar  3-MCPD  total dan 3-MCPD sebesar 13.24 µg g -1 . Sebelas sampel yang diuji berdasarkan  metode  analisis  tervalidasi  didapatkan  jumlah  3- MCPD total yang diperoleh berkisar antara 13.94-34.52 µg g -1 . Hasil  analisis  memperlihatkan  adanya  korelasi  antara konsentrasi  3-MCPD  dalam  sampel  dengan  kandungan diasilgliserida.  Sampel  dengan  kandungan  diasilgliserida  tinggi
D Filtered M1-0.25 1.xms 150.0> S/N (P): 2785 S: 172657 N: 62 3-MCPD-d s Apex: 17.837 min Area: 644888 0 kCounts 150.0> 25 50 75 100 125 150 3-MCPD-d s Apex: 17.829 min Area: 111913
S/N (P): 922 S: 30426
N: 33 Filtered M1-0.25 1.xms 201.0> kCounts 0 5 10 15 20 25 17.0 17.5 18.0 18.5
Waktu (Menit)
19.0
F
201.0> E kCounts 196.0> 3-MCPD Apex: 17.910 min Area: 1384
S/N (P): 8
S: 230 N: 29 Filtered M1-0.25 1.xms 196.0> Interferensi 0 100 200 300 400 500 C Filtered M1-0.25 1.xms 147.0> S/N (P): 9 S: 1092 N: 122 3-MCPD Apex: 17.907 min Area: 4280 147.0> kCounts 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 B Filtered M1-0.25 1.xms 93.0> S/N (P): 522 S: 71582 N: 137 3-MCPD-d s Apex: 17.833 min Area: 281207 25 75 93.0> kCounts 50 100 0 A Filtered M1-0.25 1.xms 91.0> S/N (P): 14
S: 2301 N: 161
3-MCPD Apex: 17.832 min Area: 8741 4 6 91.0> kCounts 5 7 3 8
Hasil Penelitian
akan memberikan hasil pengujian yang tinggi pula terhadap 3- MCPD,  hubungan  ini  dinyatakan  dengan  koefesien  korelasi sebesar (r) 0.752.

## DAFTAR PUSTAKA
[AOAC]  Assosiation  of  Official  Agricultural  Chemists,  Official Method.  2005.  AOAC  official  method  940.28:  Fatty  Acid (Free)  in  Crude  and  Refined  Oils.  Official  methods  of analysis of AOAC International. 18 th edition. Chapter 41, p. 12-13.
[AOCS] American Oil Chemist’s Society, Official Method.  2003. AOCS  official  method  Cd  11b-91:  Determination  of  Mono- and  Diglycerides  by  Capillary  Gas  Chromatofraphy. Sampling and Analysis of Commercial Fats and Oils, p. 1-5.
Abu-El-Haj  S,  Bogusz  MJ,  Ibrahim  Z,  Hassan  H,  Al  Tufail  M. 2007.  Rapid  and  simple  determination  of  chloropropanols (3-MCPD  and  1,3-DCP)  in  food  products  using  isotope dilution  GC–MS.  Food  Control  18:  81–90.  DOI: 10.1016/j.foodcont.2005.08.014.
Codex  Stan.  2010.  Codex  general  standard  for  contaminants and  toxins  in  food  and  feed.  Codex  standard  193-1995. http://www.codexalimentarius.net/input/download/ standards/17/CXS_193e.pdf. [09 Maret 2013].
Collin  OL,  Zimmermann  CM,  Jackson  GP.  2009.  Fast  gas chromatography negative chemical ionization tandem mass spectrometry  of  explosive  compounds  using  dynamic collision-induced  dissociation.  Int  J  of  Mass  Spectrometry 279:  93–99.  DOI: 10.1016/j.ijms.2008.10.009.
Magnusson  B,  Ornemak  U.  2014.  The  Fitness  for  Purpose  of Analytical  Methods.  A  Laboratory  Quide  to  Method Validation and Related Topics. 2 nd ed. Eurachem Guide.
Greyt.  2010.  Development  in  edible  oil  refining  for  the production  of  high  quality  food  oils.  http://www.aocs.org /files/ResourcesPDF/refining_desmet_ballestra.pdf. [02 Desember 2012].
Greyt.  2012.  Review  on  3-MCPD  and  glycidyl  esters  in vegetable  oils  and  fats.  http://aocs.files.cms-plus.com/ ResourcesPDF/MCPD-GE-mitigation-AOCS-2012(DGW)- final. pdf. [02 Desember 2012].
Horwitz W, Albert R. 2006. The Horwitz ratio (HorRat): A useful index  of  method  performance  with  respect  to  precision.  J AOAC Int 89: 1095-109.
Hrncirik  K.  2010.  3-MCPD  ester  formation  in  vegetable  oil refining  current  state  of  knowledge.  http://www.ovid- verband.de/fileadmin/user_upload/ovid-verband.de/ downloads/Unilever_Hrncirik.pdf [26 November 2012].
[ICH]  International  conference  on  harmonisation  of  technical requirements for registration of  pharmaceuticals for human use. 2005. Validation of analytical procedures.   http://www. ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Product/Guidelines/ Quality/Q2R1/Step4/Q2R1Guideline.pdf [23 Maret 2011].
[ILSI]  International  Life  Sciences  Institute.  2009.    3-MCPD esters in Food Products.  Summary Report of a Workshop held in February 2009 in Brussels, Belgium.
Karasek  L,  Wenzl  T,  Ulberth  F.  2010.  Profisensy  Test  on  The Determination of 3-MCPD Esters in Edible Oil. Luxembourg: Publication  Office  of  the  Europoan  Union.  DOI: 10.2787/2587.
Karsulinova L, Folprechtova B, Dolezal M, Dostalova J, Velisek J.  2007.  Analysis  of  the  lipid  fractions  of  coffee  creamers, cream  aerosol,  and  bouillon  cubes  for  the  their  health  risk associated constituens. Czech J Food Sci 25: 257-264.
Matthaus B, Freundenstein A, Vosmann K, Pudel F, Rudolph T,
Franke K, Strijowski U. 2012. Mitigation of 3-MCPD esters in refined  vegetable  oils.  http://www.bakingbiscuit.com/id- 2012-01-sweet-baking/articles/mitigation-of-3-mcpd-esters- in-refined-vegetable-oils.html. [20 Desember 2012].
Robert MC, Oberson, JM, Stadler RH. 2004. Model studies on th formation of monochloropropanediols in the presence of lipase.  J  Agr  Food  Chem  52:  5102-5108.  DOI:  10.1021/ jf049837u.
Stadler  RH,  Lineback  DR.  2009.  Process-Induced  Food Toxicants.  Occurrance,  Formation,  Mitigation  and  Health Risks.  A  John  Wiley  &  Sons,  Incc.,  Publication.  Hoboken, New Jersey.
Svejkovska  B,  Dolezal  M,  Velisek  J.  2006.  Formation  and decomposition of 3-chloropropane-1,2-diol esters in models simulating processed foods. Czech J Food Sci 24: 172-179.
Svejkovska  B,  Novotny  O,  Divinova  V,  Reblova  Z,  Dolezal  M, Velisek  J.  2004.  Ester  of  3-chloropropane-1,2-diol  in foodstuffs. Czech J Food Sci Czech 5: 190-196.
Watkins  C.  2009.  Chloroesters  in  Foods:  An  Emerging  Issue. Inform Magazine. April edition. AOCS. Urbana.
Weißhaar R. 2008. Determination of total 3-chloropropane-1,2- diol  (3-MCPD)  in  edible  Oils  by  cleavage  of  MCPD  esters with Sodium Methoxide.  Eur J Lipid Sci Technol 110: 183- 186. DOI: 10.1002/ejlt.200700197.
Zelinkova  Z,  Svejlkovska  B,  Velisek  J,  Dolezal  M.  2006.  Fatty acids esters of 3-chloropropane-1,2-diol in edible oils. Food Addit  Contam  23:  1290-1298.  DOI:  10.1080/02652030600 887628.