Journal Syifa Sciences and Clinical Research (JSSCR)
Volume 4 Nomor 3, 2022
Journal Homepage: http://ejurnal.ung.ac.id/index.php/jsscr , E-ISSN: 2656-9612 P-ISSN:2656-8187 DOI : https://doi.org/10.37311/jsscr.v4i3.15927
Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder Daun Spigelia anthelmia L. dan Uji Aktifitas Antioksidan Menggunakan Metode DPPH ( 1,1-Diphenyl-2-Picrylhidrazy )
Muhammad Taupik 1 , A. Mu’thi Andy Suryadi 2 , Jafar La Kilo 3* , Wiwit Zuriati Uno 4 ,Samsul Bahri Badjeber 5
1,2,3,4,5 Jurusan FarmasiFakultas Olahraga dan Kesehatan, Universitas Negeri Gorontalo, Jl. Jenderal Sudirman No. 06 Kota Gorontalo 96128, Indonesia
* Penulis Korespondensi. Email: jafar.chem@ung.ac.id

## ABSTRAK
Spigelia anthelmia adalah salah satu jenis tumbuhan gulma yang tergolong toksik dan termasuk dalam handbook  of  poisonous  and  injurios  plant . Spigelia  anthelmia termasuk  dalam  daftar tumbuhan herb  of  medicine .  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  kandungan metabolit  sekunder  dari  ekstrak  daun Spigelia  anthelmia L.  serta  uji  aktifitas  antioksidan menggunakan  metode  DPPH  ( 1,1-Dyphenil-2-picrylhidrazy ).  Sampel  diekstrak  menggunakan metode maserasi total dengan menggunakan pelarut metanol dan dilanjutkan dengan partisi menggunakan  pelarut  N-heksan,  etil  asetat,  dan  metanol.  Identifikasi  kandungan  senyawa metabolit sekunder menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis dengan eluen metanol : n-heksan  (1:4),  etil  asetat  :  n-heksan  (4:1),  etil  asetat  :  n-heksan  (4:1)  dan  untuk  uji  aktifitas antioksidan  menggunakan  metode  Spektrofotometri  UV-Vis.  Hasil  identifikasi  dengan kromatografi  lapis  tipis  dengan  menggunakan  pereaksi  semprot  AlCl 3 ,  lieberman  buchard, dragendrof  dan  cerium  sulfat  menunjukan  bahwa  ekstrak  daun Spigelia  anthelmia L. mengandung senyawa alkaloid, senyawa flavonoid dan senyawa terpenoid. Hasil uji aktifitas antioksidan dari ekstrak daun Spigelia antelmia L. dilakukan pada panjang gelombang UV 516 nm dengan nilai absorbansi yaitu 0,654 A. dengan persamaan linear yaitu y = 0,027 x – 42,83 dengan koefisien korelasi (R 2 ) = 0,983 dan memiliki IC 50 yang paling kuat pada fraksi metanol yaitu 7,69 µg/ml.
Kata Kunci: Spigelia anthelmia L.; Senyawa Metabolit Sekunder; Kromatografi Lapis Tipis; Spektrofotometri UV-Vis.
Diterima:
04-06-2022 Disetujui: 07-10-2022 Online: 01-12-2022

## ABSTRACT
Spigelia anthelmia is a type of weed plant that is classified as toxic and is included in the list of herb of medicine. The research aims to determine the secondary metabolite content of Spigelia anthelmia L. leaves extract  and  antioxidant  activity  test  using  the  DPPH  (1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazy)  method.  The research samples are extracted by applying the total maceration method with methanol as a solvent and followed by partition method using n-hexane, ethyl acetate, and methanol as solvents. The identification of flavonoid compounds content is performed by employing Thin Layer Chromatography method with methanol  as  eluent:  n-hexane  (1:4),  ethyl  acetate:n-hexane  (4:1),  ethyl  acetate:n-hexane  (4:1). Meanwhile, the antioxidant activity test is performed by employing UV-Vis Spectrophotometry method. The  result  of  identification  by  thin  layer  chromatography  using  AlCl 3 spray  reagent,  Lieberman Burchard. Dragendrof, and cerium sulfate, indicate that the Spigelia anthelmia L. leaves extract contains alkaloids, flavonoids, and terpenoids. In addition, the antioxidant activity test of Spigelia anthelmia L. leaves extract is carried out at wavelength of UV 516 nm with an absorbance value of 0,654 A. with a
linear equation of y = 0,027 x – 42,83 with a correlation coefficient (R 2 ) = 0,0983 and has the strongest IC 50 at the methanol fraction for 7,69 µg/ml.
Copyright © 2022 Jsscr. All rights reserved.
Keywords:
Spigelia anthelmia L.Secondary; Metabolite Compounds; Thin Layer Chromatography; UV-Vis Spectrophotometry
Received: 2022 -06-04 Accepted: 2022 -10-07 Online: 2022 -12-01

## 1. Pendahuluan
Obat  tradisional  telah  dikenal  dan  digunakan  secara  turun  temurun  oleh masyarakat  indonesia.  Maraknya  penggunaan  obat  tradisional  di  indonesia berhubungan  dengan  banyaknya  jenis  tumbuhan  di  negeri  ini.  Pemanfaatan  obat tradisional  pada  umumnya  lebih  diutamakan  untuk  menjaga  kesehatan,  meskipun pemanfaatan  lainnya  ditunjukan  untuk  menjaga  kesehatan,  meskipun  pemanfaatan lainnya ditunjukan sebagai pengobatan suatu penyakit. Pada dasarnya obat tradisional ini  dibuat  dari  tumbuhan  atau  campuran  dari  ekstrak  tumbuhan  untuk  mengobati penyakit atau menjaga kesehatan.
Beberapa  tanaman  yang  ada  di  Indonesia  mengandung  senyawa  metabolit sekunder  yang  dapat  diambil  untuk  dijadikan  obat  tradisional.  Senyawa  metabolit sekunder  merupakan  sumber  bahan  kimia  yang  tidak  akan  pernah  habis,  sebagai sumber  inovasi  dalam  penemuan  dan  pengembangan  obat-obat  baru  ataupun  untuk menunjang  kepentingan  industri.  Senyawa  metabolit  sekunder  yang  terdapat  dalam tumbuhan mengandung zat bioaktif yang berkaitan dengan kandungan kimia dalam tumbuhan, sehingga sebagian tumbuhan dapat di jadikan sebagai bahan obat, salah satu tumbuhan yang dapat dijadikan obat adalah tumbuhan Gulma [1].
Tumbuhan gulma merupakan tanaman pengganggu yang kehadirannya tidak diinginankan  oleh  lahan  pertanian  karena  menurunkan  hasil  yang  bisa  dicapai  oleh tanaman produksi. Tumbuhan gulma terdiri dari berbagai macam jenis salah satunya adalah jenis Spigelia anthelmia . Spigelia anthelmia adalah salah satu jenis tumbuhan gulma yang tergolong toksik dan tercantum dalam handbook of poisonous and injurios plant oleh Nelson [2]. Pada penelitian Duke [3] Spigelia anthelmia termasuk dalam daftar tumbuhan herb of medicine .
Dengan  berkembangnya  ilmu  pengetetahuan  maka  pemanfaatan  tanaman sebagai  obat  semakin  maksimal,  oleh  karena  itu  penelitian  ini  menelusuri  apakah tumbuhan gulma jenis ini memiliki aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH  yang  pada  tiap  fase  pemisahan  dimulai  dari  saat  ekstraksi,  partisi,  fraksinasi sampai isolasi senyawa, sehingga diketahui senyawa aktif yang memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa obat.  Metode DPPH digunakan dalam penelitian ini karena  dapat  menganalisis  ada  tidaknya  senyawa  antioksidan    Pengujian  senyawa antioksidan  pada  tanaman Spigelia  anthemia L.  perlu  dilakukan  lebih  intensif,  agar potensi  tumbuhan ini  dapat digunakan sebagai bahan obat yang bisa dikembangkan lagi.

## 2. Metode Penelitian Alat dan Bahan

## Alat
Batang  pengaduk,  Blender  (philips®),  Cawan  porselin,  Gelas  kimia  (pyrex®), Gelas ukur (pyrex®), Kain saring, Kertas saring, Labu ukur (pyrex®), Lampu UV 366 nm  (memmert  type  UN260®),  Neraca  analitik  (Krem®),  Pipet  tetes,  Sendok  tanduk, Spektrofotometer UV-Vis (Shmidzu®), Toples kaca, Wadah.
Bahan
Bahan-bahan  yang akan  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah Alkohol  70%, Alumunium foil, Daun Kemangi Cina ( Spigelia anthelmia L.), DPPH (Himedia) p.a, Etil asetat,  Kloroform,  Lempeng  KLT,  pereaksi  AlCl 3 p.a,  pereaksi  Cerium  sulfat  p.a, pereaksi Dragendorf p.a, pereaksi Lieberman Burchard p.a, Metanol, Metanol p.a, N- heksan.
Prosedur Penelitian Pengumpulan Sampel
Sampel  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  yaitu  daun Spigelia  anthelmia L. yang diambil dari desa/kelurahan Tuladenggi, Kecamatan Dungingi, Kota Gorontalo, Provinsi Gorontalo.

## Pembuatan Serbuk Simplisia
Cara  pembuatan  serbuk  simplisia  daun  Kemangi  Cina  ( Spigelia  anthelmia L.)  yaitu pertama  dikumpulkan  sampel  yang  akan  digunakan.  Dilakukan  sortasi  basah  untuk memisahkan  kotoran  atau  benda  asing  yang  ada  pada  sampel.  Lalu  dilakukan pencucian  dengan  air  yang  mengalir,  setelah  itu  dikeringkan.  Kemudian  dirajang sampel  menggunakan  gunting,  setelah  itu  dikeringkan  sampel  sampai  benar-benar kering lalu dilakukan sortasi kering untuk memisahkan kotoran atau benda asing pada sampel setelah dikeringkan. Kemudian dihaluskan simplisia menjadi serbuk simplisia menggunakan blender.
Ekstraksi 1. Maserasi
Serbuk  simplisia  daun  kemangi  cina  ( Spigelia  anthelmia L.)  ditimbang sebanyak 90  gr serbuk, lalu sampel dimasukan ke dalam wadah kaca dan ditambahkan sebanyak 1000 mL  pelarut  metanol  sampai  sampel  tersebut  terendam  sempurna  dengan  sesekali dilakukan  pengadukan.  Proses  ini  dilakukan  secara  berulang-ulang  atau  remaserasi agar proses penarikan senyawa dapat berlangsung lebih sempurna. Ampas dan filtrat yang  diperoleh  kemudian  dilakukan  penyaringan  dengan  menggunakan  kain  saring sehingga  menghasilkan  filtrat  metanol  dan  residu.  Kemudian  filtrat  metanol  yang didapatkan dikumpulkan didalam wadah dan dipekatkan dengan alat Rotary evaporator sampai mendapatkan ekstrak kental metanol.

## 2. Partisi Cair-Cair
Pertama  dipartisi  menggunakan  pelarut  N-Heksan  dimana  ekstrak  kental  metanol dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan  dicampurkan  dengan  N-Heksan  (1:1) kemudian dikocok menggunakan vortex dan didiamkan sehingga terbentuk 2 lapisan yaitu fraksi tidak larut N-Heksan (fraksi metanol) dan fraksi larut N-Heksan, kemudian disaring  sehingga  diperoleh  fraksi  larut  N-Heksan  dan  fraksi  tidak  larut  N-Heksan. Proses  tersebut  dilakukan  secara  berulang-ulang  sampai  fraksi  larut  N-Heksan  yang
diperoleh benar-benar sudah tidak berwarna atau bening. Fraksi larut N-Heksan (fraksi metanol)  dilanjutkan  dengan  dipartisi  menggunakan  pelarut  etil  asetat  yang perbandingan  pelarut  dan  sampelnya  1:1,  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  tabung reaksi  kemudian  dikocok  menggunkan vortex dan  didiamkan  sehingga  terbentuk  2 lapisan  yaitu  fraksi  tidak  larut  etil  asetat  (fraksi  metanol)  dan  fraksi  larut  etil  asetat, kemudian disaring sehingga diperoleh fraksi larut etil asetat dan fraksi tidak larut etil asetat, proses tersebut dilakukan secara berulang-ulang sampai fraksi larut etil asetat yang di peroleh benar-benar sudah tidak berwarna atau bening. Fraksi tidak larut etil asetat dilanjutkan dengan dipartisi dengan pelarut metanol. Hasil dari masing-masing dari  fraksi  yang  diperoleh  dipekatkan  menggunakan rotary  evaporator sehingga mendapatkan ekstrak kental.
Analisis  Senyawa  Metabolit  Sekunder  Dengan  Menggunakan  Kromatogrfi  Lapis Tipis
Plat KLT disiapkan dengan cara, dipotong plat silika G 60 F 254 dengan ukuran 1x10 cm. Kemudian ditandai plat dengan pensil jarak 1 cm dari tepi bawah dan begitu juga pada bagian tepi atas, lalu diberi penanda garis dibagian bawah dan juga pada tepi atas. Setiap golongan senyawa memiliki campuran fase gerak yang berbeda. Setiap campuran fase  gerak  masukan  kedalam  gelas  kimia  lalau  ditutup  rapat  dan  dilakukan  proses penjenuhan selamat 60 menit.
Sampel  yang  telah  di  pekatkan  menggunakan rotary  evaporator kemudian ditotolkan pada plat silika yang telah di beri tanda garis dari tepi bawah menggunakan pipa kapiler. Sampel yang telah ditotolkan pada plat silika dimasukkan ke dalam gelas kimia untuk di elusi dengan masing-masing fase gerak golongan senyawanya yang telah di  jenuhkan.  Selanjutnya  gelas  kimia  ditutup  rapat  selama  30  menit  hingga  fase geraknya  mencapai  jarak  1  cm  dari  tepi  atas  plat.  Kemudian  plat  diangkat  dan dikeringankan dengan cara diangin-anginkan.
Noda  atau  bercak  yang  terbentuk  pada  plat  KLT  silika  G 60 F 254 disemprotkan dengan  reagen  penampak  bercak  dan  di  amati  dibawah  sinar  UV  pada  panjang gelombang 254 dan 366 nm. Pengamatan bercak yang dilakukan meliputi jumlah bercak, warna bercak dan jarak migrasi bercak dari temapt asalnya atau perhitungan nilai Rf ( Retardation factor ).

## Uji Aktifitas Antioksidan Menggunakan Metode DPPH

## 1. Pembuatan Larutan DPPH 0,05 mM
Serbuk  DPPH  (BM  394,32)  0,0097  mg  dilarutkan  dengan  metanol  p.a  kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, volumenya dicukupkan dengan methanol p.a sampai  tanda  batas  (DPPH  0,05  mM).  Larutan  DPPH  0,05  mM  dipipet  50  µL, dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL dicukupkan dengan metanol p.a hingga tanda batas (DPPH 0,05 mM).
2. Penentuan Panjang Gelombang
Larutan  DPPH  0,05  mM  sebanyak  2  ml  dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  lalu ditambahkan metanol p.a sebanyak 2 ml, dikocok dengan vortex hingga homogen lalu dituang  ke  dalam  kuvet  dan  diukur  pada  panjang  gelombang  400-  800  nm  dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

## 3. Pembuatan Larutan Blanko
Larutan  DPPH  0,05  mM  sebanyak  2  mL  dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi, ditambahkan  metanol  p.a  sebanyak  2  mL,  kemudian  dikocok  dengan vortex hingga homogen, diinkubasi dalam ruangan gelap selama 30 menit.
4. Pembuatan Larutan Vitamin C (Kontrol Positif)
Pembuatan larutan pembanding vitamin C dengan konsentrasi 1000 ppm dengan cara ditimbang 50 mg, lalu dilarutkan dengan metanol p.a. lalu 25 dimasukkan dalam labu ukur  50  mL,  volume  dicukupkan  dengan  metanol  p.a  sampai  tanda  batas.  Pada pembuatan larutan serinya pada konsentrasi 5, 10, 15, 20, 25 ppm dengan cara dipipet 50, 100, 150, 200, 250 µL, dan dimasukkan ke dalam vial lalu ditambahkan hingga 10 mL. Pengukuran serapan larutan uji pembanding dilakukan dengan cara diambil 2 mL dan dimasukkan ke dalam vial, kemudian ditambahkan larutan DPPH 0,05 mM sebanyak 2 mL, dikocok dengan vortex hingga homogen, dan diinkubasi selama 30 menit diruang gelap. Kemudian diukur pada panjang gelombang DPPH.
5. Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Daun kemangi cina (Spigelia anthelmia L.)
a. Pembuatan larutan induk 1000 ppm Ekstrak daun Kemangi Cina ( Spigelia anthelmia L.) ditimbang 50 mg, dilarutkan dengan  methanol  p.a  lalu  dimasukkan  ke  dalam  labu  ukur  50  mL,  volume dicukupkan dengan methanol p.a sampai tanda batas.
b. Pembuatan larutan uji seri konsentrasi 5,10,15,20 dan 25 ppm Larutan induk ekstrak daun Kemangi Cina ( Spigelia anthelmia L.) masing-masing dipipet  50,  100,  150,  200,  250  (µL),  dimasukkan  ke  dalam  labu  ukur  10  mL, volume dicukupkan dengan metanol p.a sampai tanda batas.
c. Pengukuran serapan dengan menggunakan spektrofotometri UV-Vis Larutan  uji  ekstrak  daun  kemangi  cina  ( Spigelia  anthelmia L.)  sebanyak  2  mL dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi,  ditambahkan  larutan  DPPH  0,05  mM sebanyak 2 mL, dikocok dengan vortex hingga homogen, diinkubasi dalam ruang gelap selama 30 menit. Selanjutnya, serapan diukur pada panjang gelombang 516 nm.

## Penentuan Persen Inhibisi
Data hasil absorbansi masing-masing sampel digunakan untuk mencari % inhibisinya. Menurut [14], rumus untuk mencari % inhibisi adalah sebagai berikut:
% Inhibisi = Absorbansi Blanko-Absorbansi Sampel
Absorbansi Blanko x 100% Keterangan:
Ablanko = absorbansi pada DPPH tanpa sampel Asampel = absorbansi pada DPPH setelah ditambah sampel Hasil perhitungan dimasukkan dalam persamaan linier dengan persamaan Y= aX + b Keterangan : Y = % inhibisi a = Gradien X = konsentrasi (µg/ml) b = Konstanta Penentuan Nilai IC 50 (Inhibitory Concentrations)
Persaman  liner  yang  dihasilkan  digunakan  untuk  memperoleh  nilai  IC 50 .  Nilai  IC 50 merupakan konsentrasi yang diperoleh pada saat % inhibisi sebesar 50 dari persaman Y=  aX  +  b.  Pada  saat  %  inhibisi  =  50,  maka  rumus  untuk  menghitung  nilai  IC 50 persamannya menjadi :
50 = ax +b x 50-b a x
Harga X adalah IC 50 dengan satuan µg/ml [15]. Validasi Data Validasi data yang digunakan dalam penelitian ini antara lain:
1. Akurasi
% perolehan kembali = Kadar Hasil Analisis Kadar sesungguhnya × 100% [13] 2. Presisi
Standar Deviasi = √Ʃ ( X – X ̅) 2 n-1 × 100% [13] 3. LOD dan LOQ LOD = 3,3 x σ S [13]
LOQ = 10 x σ S [13] 4. Linearitas
Y =  bx + a [13] Keterangan : X = nilai masing-masing K = 3 untuk batas deteksi N = frekuensi penetapan (LOD), 10 untuk batas kuantitas (LOQ) X = rata – rata (mean) pengukuran y = luas area puncak N – 1 = derajat kebebasan b = slope Q = batas LOD dan LOQ x = konsentrasi sampel SI = arah garis linear a = intersep σ = simpangan baku respon analitik dari blanko S = Slope (b pada persamaan garis y = bx + a)

## 3. Hasil dan Pembahasan
Ekstrak Daun Spigelia anthelmia L.
Tabel 1. Hasil rendamen yang diperoleh Berat Sampel (g) Volume Pelarut (mL) Berat Ekstrak (g) Rendamen (%) 90 3000 mL 12,9 14,33%
Pada tabel 1 menunjukkan hasil ekstraksi sampel 90 gr daun Spigelia anthelmia L. menggunakan  pelarut  metanol  sebanyak  3000  mL.  Ekstrak  kental  yang  didapatkan seberat 12,9 gr dengan jumlah persen rendamen sebanyak 14,33%. Presentasi rendamen yang baik menurut Dirjen POM [4] yakni 10% - 15%. Hal ini menandakan bahwa proses ekstraksi berlangsung sempurna.
Partisi Cair-Cair Ekstrak Daun Spigelia anthelmia L.
Metode partisi cair-cair sesuai dengan metode pemisahan menurut Martina [5], dimana  metode  ekstraksi  yang  didasarkan  pada  sifat  kelarutan  komponen  suatu senyawa dalam dua pelarut yang tidak saling bercampur. Metode ini juga digunakan karena  keuntungannya  dimana  prosesnya  sederhana,  biaya  yang  murah  serta  cocok untuk  bahan  yang  tidak  tahan  panas  atau  mudah  menguap  [6].  Pada  pengujian  ini menggunakan tiga fase gerak yakni 4:1 metanol : n-heksan, 1:4 etil asetat : n-heksan dan 4:1 etil asetat : n-heksan. Pemilihan ketiga jenis pelarut ini berdasarkan perbedaan sifat kepolarannya  sehingga  bisa  memisahkan  senyawa  pada  sampel  yang  bersifat  polar, semi polar, dan non polar.
Tabel 2. Hasil Partisi Cair-Cair Ekstrak Berat Akhir (gram) Fraksi N-Heksan 1,955 Fraksi Etil Asetat 0,316 Fraksi Metanol 2,654
Berdasarkan  tabel  2  menunjukkan  bahwa  pada  ketiga  fraksi  diperoleh  berat akhir untuk fraksi n-heksan sebanyak 1,955 gram, fraksi etil asetat sebanyak 0,316 gram, dan fraksi metanol sebanyak 2,654 gram.

## Hasil Uji Kualitatif Menggunakan Metode KLT
Identifikasi dengan Kromatografi lapis tipis dilakukan dengan tujuan untuk melihat pola kromatogram  komponen  senyawa  aktif  yang  terkandung  dalam  ekstrak  daun Spigelia anthelmia L . Pada metode kromatografi lapis tipis ini dilakukan dengan prinsip trial and error dimana prinsip ini digunakan untuk mencari eluen dengan perbandingan tertentu yang dapat memberikan pemisahan yang baik.
Tabel 3. Hasil Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder Daun Spigelia anthelmia L. dengan Pereaksi Semprot Sampel Fase Gerak UV 254 nm UV 366 nm Nilai Rf Ekstrak metanol Metanol:N-Heksan (4:1) Etil Asetat:N-Heksan (4:1) Adanya bercak noda (+) Alkaloid (+) Terpenoid 0,17 0,8; 0,7; 0,55 Fraksi n- heksan Metanol:N-Heksan (4:1) Etil Asetat:N-Heksan (4:1) N-Heksan:Etil Asetat (4:1) Adanya bercak noda (+) Flavonoid (+) Terpenoid 0,8 0,8; 0,71; 0,7; 0,55; 0,33 Fraksi etil asetat Metanol:N-Heksan (4:1) Etil Asetat:N-Heksan (4:1) Adanya bercak noda (+) Flavonoid 0,66
N-Heksan:Etil Asetat (4:1) (+) Terpenoid 0,8; 0,71; 0,7; 0,55 Fraksi metanol Etil Asetat:N-Heksan (4:1) - (+) Alkaloid 0,17
Menurut  Sari  [7],  fungsi  dari  pereaksi  AlCl 3 adalah  untuk  membentuk  reaksi antara AlCl 3 dengan golongan flavonoid membentuk kompleks antara gugus hidroksil dan keton yang bertetangga atau dengan gugus hidroksil yang saling bertetangga. AlCl 3 akan  bereaksi  dengan  gugus  keton  pada  C4  dan  gugus  OH  pada  C3  atau  C5  pada senyawa  flavon  atau  flavonol  membentuk  senyawa  kompleks  yang  stabil  berwarna kuning.
Pada  uji  alkaloid  setelah  disemprotkan  dengan  dragendroff  menghasilkan bercak noda berwarna orange yang menunjukkan hasil positif, karena pada uji alkaoid setelah disemprotkan dragendroff akan menunjukkan bercak noda warna coklat jingga berlatar belakang kuning. Hal ini disebabkan karena terjadinya pergantian ligan dimana nitrogen yang mempunyai pasangan elektron bebas pada alkaloid membentuk ikatan kovalen koordinat dengan ion k dari kalium tetraiodobismutat menghasilkan kompleks kalium-alkaoid (berwarna coklat).
Dari  hasil  yang  diperoleh  dapat  disimpulkan  bahwa  ekstrak  daun Spigelia anthelmia L. mengandung senyawa metabolit sekunder yaitu positif senyawa alkaloid setelah disemprotkan dengan dragendroff menghasilkan bercak noda berwarna orange dengan nilai Rf 0,17. Menurut Harbone [8] nilai Rf alkaloid yng paling umum yaitu 0,07- 0,62 dengan melihat hasil identifikasi dengan pereaksi kimia. Positif senyawa flavonoid dengan bercak noda berpendar kuning pada fraksi etil asetat dengan nilai Rf 0,66 dan 0,8 dalam hal ini menurut Mustapa et al [9] nilai Rf flavonoid berkisar pada range 0,69- 0,81, dan positif terpenoid dimasing-masing eluen dengan bercak noda berwarna merah pada ekstrak metanol, fraksi n-heksan dan etil asetat hal ini didukung dengan nilai Rf yang didapatkan 0,33; 0,55; 0,7; 0,71 dan 0,8 pada penelitian Yusuf [10] range nilai Rf terpenoid yaitu 0,2 – 0,8 yang ditandai dengan terbentuknya warna merah jingga atau violet.

## Penentuan Panjang Gelombang Maksimum DPPH
Pada  pengujian  aktifitas  antioksidan  secara  kuantitatif  dilakukan  dengan menggunakan metode DPPH. Pemilihan penggunakan metode ini  mudah diterapkan karena senyawa radikal DPPH yang digunakan bersifat relatif stabil dibanding dengan metode lainnya. Metode DPPH ini tergolong metode yang sederhana, mudah, cepat dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel untuk evaluasi aktifitas antioksidan dari senyawa bahan alam [10].
Prinsip  pengukuran  aktifitas  antioksidan  secara  kuantitatif  menggunakan metode DPPH adalah adanya perubahan intensitas warna ungu DPPH yang sebanding dengan konsentrasi larutan DPPH tersebut. Warna akan berubah menjadi kuning saat elektronnya berpasangan. Perubahan intensitas warna ungu ini terjadi karena adanya peredaman radikal bebas yang dihasilkan oleh bereaksinya molekul DPPH dengan atom hidrogen yang dilepaskan oleh molekul senyawa sampel sehingga terbentuk senyawa difenil pikril hidrazin dan menyebabkan terjadinya perubahan warna DPPH dari ungu menjadi  kuning.  Perubahan  warna  ini  mengakibatkan  perubahan  absorbansi  pada panjang  gelombang  maksimum  DPPH  menggunakan  spektrofotometri  UV-Vis sehingga  akan  diketahui  nilai  aktifitas  peredaman  radikal  bebas  yang  dinyatakan dengan nilai Inhibitory concentration (IC 50 ) [10].
Preparasi  untuk  larutan  blanko  dilakukan  untuk  menentukan  panjang gelombang  maksimum  dari  senyawa  DPPH  menggunakan  spektrofotometri  UV-Vis. Panjang  gelombang  yang  digunakan  yaitu  516  nm.  Radikal  DPPH  memiliki  warna komplementer ungu dan memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang 515 – 520 nm [11].
Gambar 1. Hasil Absorbansi Ekstrak Daun Spigelia anthelmia L. Untuk meningkatkan akurasi dari data yang akan didapatkan maka, pengujian ini dilakukan replikasi sebanyak 3 kali (triplo). Pada ekstrak metanol didapatkan hasil persen inhibisi pada masing-masing variasi sampel yakni 5 µg/ml sebesar 39,9592%; 10 µg/ml sebesar 44,7502%; 15 µg/ml sebesar 53,4658%; 20 µg/ml sebesar 63,6595%; dan 25 µg/ml sebesar 69,7247%. Hal ini menunjukkan adanya peningkatan aktivitas dalam penghambatan radikal bebas seiring dengan bertambahnya konsentrasi sampel ekstrak metanol.  Dari  persamaan  regresi  linear  berdasarkan  log  konsentrasi  terhadap  persen inhibisi  dengan  persamaan  y  =  1,568x  +  30,78  dan  r 2 =  0,987,  dimana  nilai  r 2 menunjukkan bahwa ada pengaruh yang signifikan perlakuan terhadap sampel, dari data tersebut didapatkan nilai IC 50 sebesar 12,24 µg/ml.
Pada  fraksi  n-heksan  didapatkan  hasil  persen  inhibisi  pada  masing-masing variasi sampel yakni 5 µg/ml sebesar 19,9796 %; 10 µg/ml sebesar 29,9694 %; 15 µg/ml sebesar 38,5321 %; 20 µg/ml sebesar 41,5392 %; dan 25 µg/ml sebesar 51,2742 %. Dari persamaan regresi linear berdasarkan log konsentrasi terhadap persen inhibisi dengan persamaan y = 1,483x + 14,01 dan R² = 0,976 , dimana nilai R 2 menunjukkan bahwa ada pengaruh  yang  signifikan  perlakuan terhadap sampel,  dari  data  tersebut  didapatkan nilai IC 50 sebesar 24,26 µg/ml.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 505 510 515 520
525
Pada  fraksi  etil  asetat  didapatkan  hasil  persen  inhibisi  pada  masing-masing variasi sampel yakni 5 µg/ml sebesar 23,1396 %; 10 µg/ml sebesar 26,3506 %; 15 µg/ml sebesar 37,0030 %; 20 µg/ml sebesar 44,5973 %; dan 25 µg/ml sebesar 49,7451 %. Dari persamaan regresi linear berdasarkan log konsentrasi terhadap persen inhibisi dengan persamaan y = 1,429x + 14,73 dan R² = 0,977, dimana nilai R 2 menunjukkan bahwa ada pengaruh  yang  signifikan  perlakuan terhadap sampel,  dari  data  tersebut  didapatkan nilai IC 50 sebesar 24,01 µg/ml.
Pada fraksi metanol didapatkan hasil persen inhibisi pada masing-masing variasi sampel yakni 5 µg/ml sebesar 47,5535 %; 10 µg/ml sebesar 53,0581 %; 15 µg/ml sebesar 55,3516 %; 20 µg/ml sebesar 61,4169 %; dan 25 µg/ml sebesar 66,5647 %. Dari persamaan regresi linear berdasarkan log konsentrasi terhadap persen inhibisi dengan persamaan y = 0,927x + 42,87 dan R² = 0,985, dimana nilai R 2 menunjukkan bahwa ada pengaruh yang  signifikan  perlakuan  terhadap  sampel,  dari  data  tersebut  didapatkan  nilai  IC 50 sebesar 7,69 µg/ml.
Pada  kontrol  positif  didapatkan  hasil  persen  inhibisi  yakni  5  µg/ml  sebesar 48,7524 %; 10 µg/ml sebesar 52,5449 %; 15 µg/ml sebesar 59,2814 %; 20 µg/ml sebesar 64,5209  %  dan  25  µg/ml  sebesar  68,9121  %.  Menurut  Penelitian  Rahayu  [11],  persen aktivitas antioksidan merupakan salah satu parameter yang menunjukkan kemampuan suatu antioksidan dalam menghambat radikal bebas .
Hasil Absorbansi Ekstrak Daun Spigelia anthelmia L.
Table 4. Hasil Absorbansi Ekstrak Daun Spigelia anthelmia L.
No  Bahan Konsentrasi teoritis (µg/ml) Absorbansi Aktivitas Hambatan (%) Persamaan Liniear Nilai IC50 (µg/ml) 1 ekstrak metanol 5 0,391  0,394  0,393 39,95 y = 1,568x + 30,78 r = 0,974 r 2 = 0,987 12,24 10 0,361  0,362  0,361 44,75 15 0,303  0,305  0,305 53,46 20 0,237  0,239  0,237 63,65 25 0,198  0,199  0,199 69,72 2 Fraksi metanol 5 0,342  0,344  0,343 47,55 y = 0,027x + 42,83 r = 0,966 r 2 = 0,983 7,69 10 0,305  0,307  0,309 53,05 15 0,291  0,293  0,292 55,35 20 0,252  0,253  0,252 61,41 25 0,219  0,219  0,218 65,56 3 Fraksi n- heksan 5 0,521  0,526  0,523 19,97 y = 1,483x + 14,01 r = 0,952 r² = 0,976 24,26 10 0,458  0,459  0,457 29,96 15 0,401  0,403  0,402 38,53 20 0,382  0,383  0,382 41,53 25 0,319  0,319  0,318 51,27 4 Fraksi etil 5 0,501  0,503  0,503 23,13 y = 1,429x + 14,73 24,01 10 0,481  0,481  0,483 26,35
Nilai IC 50 merupakan salah satu parameter yang digunakan dalam menunjukkan aktivitas  antioksidan  dimana  menunjukkan  konsentrasi  suatu  zat  antioksidan  yang dapat menyebabkan 50% atau setengah konsentrasi dari radikal bebas (DPPH). Menurut Parkash [11] bahwa penggolongan sifat antioksidan IC50 yaitu ˂ 50 dikategorikan sangat kuat, 50-100 kuat, 100-150 sedang dan 150-200 lemah. Pada hasil uji keempat ekstrak diperoleh Nilai IC 50 dimana fraksi metanol yakni 7,69 ug/ml, fraksi n-heksan yakni 24,26 ug/ml, fraksi etil asetat 24,01 ug/ml dan ekstrak metanol yakni 12,24 ug/ml, sedangkan untuk kontrol positif yakni vitamin C didapatkan nilai IC 50 yakni sebesar 6,59 ug/ml. Dari keempat ekstrak diatas dapat dilihat bahwa fraksi metanol memiliki penghambat antioksidsan  yang  paling  baik  berhubungan  dengan  kandungan  senyawa  metabolit sekunder  yang  dikandungnya,  flavonoid  merupakan  antioksidan  eksogen  yang mengandung  gugus  fenolik  dan  telah  dibuktikan  bermanfaat  dalam  mencegah kerusakan  sel  akibat  stress  oksidatif.  Mekanisme  kerja  dari  flavonoid  sebagai antioksidan adalah dengan mendonorkan ion hidrogen sehingga dapat menstabilkan radikal bebas yang reaktif dan bertindak sebagai  scavenger/penangkal radikal bebas [11].
Validasi Data 1. Presisi
Presisi  merupakan  ukuran  tingkat  keterulangan  metode  analisis  yang  ditampilan dalam  simpangan  baku  relatif  dari  sampel  yang  berbeda  secara  signifikan  secara statistik. Hasil absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menghitung Standar Deviasi (SD) dan RSD ( Relative Standard Deviation ) [12]. Pada uji presisi dilakukan pada larutan DPPH  yang  dilihat  absorbansinya sebanyak  6 kali didapatkan RSD ( Relative Standard Deviation ) atau standar deviasi relatif sebesar 0,211392167 %, dimana menurut Harmita, persyaratan untuk nilai SD < 2 sehingga menunjukkan bahwa uji presisi masuk dalam kriteria penilaian nilai SD.
Tabel 5 . Uji Presisi DPPH 0,05 mM Absorbansi 1 0,669 2 0,669 3 0,668 4 0,670 5 0,670
asetat 15 0,411  0,413  0,412 37,00 r = 0,954 r² = 0,977 20 0,362  0,363  0,362 44,59 25 0,329  0,329  0,328 49,74 5 Vitamin C 5 0,342  0,343  0,342 48,75 y = 1,045x + 43,11 r = 0,976 r 2 = 0,993 6,59 10 0,315  0,317  0,319 52,54 15 0,271  0,273  0,272 59,28 20 0,237  0,238  0,236 64,52 25 0,208  0,208  0,207 68,91
6 0,668 AVE 0.669 SD 0,0014142136 RSD(%) 0,211392167 2. LOD, LOQ, & Linearitas (Vit C Metode DPPH)
Batas  deteksi  ( Limit  of  Detection, LOD)  merupakan  konsentrasi  analit  yang  masih dapat  terdeteksi  walaupun  tidak  selalu  dapat  dikuantifikasi.  Sedangkan  Batas kuantifikasi ( Limit of Quantification, LOQ ) merupakan konsentrasi analit terendah dari sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitas (LOQ)  dapat  dihitung  secara  statistik  melalui  persamaan  regresi  liniear  dari  kurva standar  [12].  Dari  hasil  perhitungan  didapatkan  bahwa  batas  deteksi  yakni  0,051512 mg/L dan batas kuantitas adalah 0,156097 mg/L.
Tabel 6 . Hasil Uji Linearitas, LOD dan LOQ Konsentrasi (µg/ml) Absorbansi  % Inhibisi  Kons diketahui (µg/ml) % Recovery 5 0.342 49.42 5,397129 107,9425 10 0.317 54.42 9,023923 90,2392 15 0.272 64.66 15,473684 103,1578 20 0.237 80.64 20,488038 102,4401 25 0.177 84.29 24,688995 98,7559 Average 100,5071 SE of intercept 0,008774964 SD of intercept 0,019621417 LOD* 0,051512073 LOQ* 0,156097191
Uji  lineraitas  dapat  dilakukan  dengan  menghitung  secra  statistik  melalui koefisien  korelasi  dari  konsentras  dan  absorbansi  larutan  baku  [12].  Linearitas  dapat tercapat apabila nilai koefisien korelasi (r) semakin mendekati 1 (r = +1 atau r = -1). Nilai r  yang  mendekati  1  menandakan  hubungan  antara  liniear  antara  konsentrasi  analit dengan  absorbansi  yang  terukur.  Pada  kontrol  positif  yakni  vitamin  C  dilakukan  uji linearitas, Untuk nilai persamaan linearitasnya didapatkan persamaan y = 1,045x + 43,11 dengan nilai R² = 0.993 serta nilai r = 0.986. Menurut Harmita [13], nilai r sebagai syarat koefisien korelasi yakni ≥ 0,900.
Tabel 7 . Hasil Uji Akurasi Ekstrak Metanol Konsentrasi µg/ml Ʃ Absorbansi % Inhibisi Konsentrasi diketahui % Recovery 5 0,3926 39,9592 5,8482 116,3364 10 0,3613 44,7502 8,9094 89,0940 15 0,3043 53,4658 14,4642 96,4280 20 0,2376 63,6595 20,9630 104,8150
25 0,1980 69,7247 24,8341 99,3664 Average 101,3274 Fraksi n- heksan Konsentrasi Ʃ Absorbansi % Inhibisi Konsentrasi Diketahui % Recovery 5 0,5233 19,9796 4,0188 105.2847 10 0,4580 29,9641 10,7552 94.96897 15 0,4020 38,5321 16,5340 110,2266 20 0,3823 41,5392 18,5569 107,5520 25 0,3186 51,2742 25,1247 80,3760 Average 98,2875 Fraki etil asetat Konsentrasi Ʃ Absorbansi % Inhibisi Konsentrasi Diketahui % Recovery 5 0,5026 23,1396 5,8782 117,5640 10 0,3623 26,3506 8,1315 81,3150 15 0,4120 37,0030 15,5843 103,8953 20 0,4816 44,5973 20,8957 104,4785 25 0,3286 49,7451 24,4996 97,9984 Average 101,0502 Fraksi metanol Konsentrasi ∑ Absorbansi % Inhibisi Konsentrasi Diketahui % Recovery 5 0,3430 47,5535 5 101,0460 10 0,3070 53,0581 10,9816 109,8160 15 0,2920 55,3516 13,4627 89,7513 20 0,2523 61,4169 20 100 25 0,2186 66,5647 25,5339 102,1356 Average 100,5478 Vitamin C Konsentrasi ∑ Absorbansi % Inhibisi Konsentrasi Diketahui % Recovery 5 0,3423 48,7524 5,3971 107,9425 10 0,3170 52,5449 9,0239 90,2392 15 0,2720 59,2814 15,4736 103,1578 20 0,2370 64,5209 20,4880 102,4409 25 0,2076 68,9121 24,6889 98,7559 Average 100,5071
Berdasarkan  data  yang  diperoleh  didapatkan  hasil  % recovery pada  fraksi    metanol sebesar  101,3274  %,  pada  fraksi  N-heksan  sebesar  98,2875  %,  pada  fraksi    etil  asetat sebesar  101,0502  %,  pada  fraksi  metanol    sebesar    100,5478  %,  dan  100,5071  %  pada vitamin C. Hal ini jika dibandingkan dengan persyaratan menurut Harmita [13], yakni berkisar antara 98 % - 102 %. Dari persyaratan tersebut dapat diartikan bahwa nilai uji peroleh  kembali  % Recovery dikatakan  baik  karena  masuk  dalam  kriteria  syarat. Menurut Harmita [13], syarat uji validasi sebagai berikut:
Tabel 8 . Syarat Uji Validasi Parameter Syarat Keterangan Akurasi 98 – 102 % Memenuhi syarat Presisi SD < 2 Memenuhi syarat Linearitas r 2 ≥ 0.9000 Memenuhi syarat Batas Deteksi - - Batas Kuantitas - - 4. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa:
Daun Spigelia  anthelmia  L. positif  senyawa  alkaloid  setelah  disemprotkan  dengan dragendroff menghasilkan bercak noda berwarna orange dengan nilai Rf 0,17. Positif senyawa flavonoid yang menunjukkan bercak noda berpendar kuning dengan nilai Rf 0,66 dan 0,8 dan positif terpenoid dengan bercak noda berwarna merah dengan nilai Rf yang didapatkan 0,33; 0,55; 0,7; 0,71 dan 0,8.
Ekstrak  yang  memiliki  aktifitas  antioksidan  paling  besar  yakni  pada  Fraksi metanol dengan nilai IC 50 sebesar 7,69 µg/ml dan pada ekstrak metanol sebesar 12,24 µg/ml yang mengandung senyawa alkaloid,  fraksi n-heksan sebesar 24,26 µg/ml yang mengandung  senyawa  terpenoid    dan  fraksi  etil  asetat  sebesar  24,01  µg/ml  yang mendung senyawa flavonoid.

## Referensi
[1]  Adikara,  I  Putu  Arya,  Dkk.  2013. Studi  Histopatologi  Hati  Tikus  Putih  (Rattus Novergicus) Yang Diberi Ekstrak Etanol Daun Kedondong (Spondias Dulcis) Secara Oral. Buletin Veteriner Udayana . ISSN: 2085-2495. Vol. 5 No. 2.
[2]  Nelson, L.S., Shih, R, D. Balick M.J. & Lampe. K.F., 2007. Handbook Of Poisonous And Injurious Plants , springer.
[3]  Duke, J.A. 2010. Handbook Of Medicinal Herb . CRC.
[4]  Ditjen POM. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. DepKes RI , Jakarta. Halaman 3-5, 13-17, 30-31.
[5]  Martina, R. 2018. Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Alkaloid Ekstrak Metanol Sponge Aaptos sp . Bandar Lampung: Universitas Lampung.
[6]  Setiawan,  I.  2010. Optimasi  Ekstrak  Cair  Cair  Fraksi  Etanol  Daun  Dandang  Gendis (Clinacanthus mutans). Bandung: IPB.
[7]  Sari, Dkk. 2017. Analisis Kualitatif Merkuri Pada Lotion Pemutih Yang Dijual Di Online Shop Daerah Kota Banjarmasin . Jurnal Ilmiah Ibnu Sina. Banjarmasin .Vol 2 No 1. Hal. 13-19.
[8]  Harborne,  J.  B.  1987. Metode  Fitokimia.  Penuntun  Cara  Modern  Menganalisis Tumbuhan. Terjemahan K. Padmawinata & I. Soediro, Penerbit ITB; Bandung.
[9]  Mustafa R., Albadri, Ahmed A., dan Abdulelah, Furqan M. (2019 ). Nanoemulsion Preparation,  Identification  and  Evaluation  Review. Journal  of  Global  Pharma Technology. 196-208
[10]  Yusuf, Sumarno, 2010, Pengaruh Penambahan Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.) dan Perebusan terhadap Residu Formalin dan Profil Protein Udang Putih (Letapenaeusa vannamei)  Berformalin  serta  Pemanfaatannya  sebagai  Sumber  Pendidikan  Gizi  dan Keamanan Pangan pada Masyarakat , Surabaya, Pasca Sarjana FK UB.
[11]  Prakash, A. 2001. Antioxidant Activity . Journal Of Analytical Chemsitry. Medallion Laboratories: Analytical Progress. Vol 10, No. 2
[12]  Gandjar, I. G. dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis . Yogjakarta: Pustaka Pelajar.
[13]  Harmita.  2004. Petunjuk  Pelaksanaan  Validasi  Metode  dan  Cara  Perhitungannya. Fakultas Farmasi: Universitas Indonesia.
[14]  Ghosal, M & Mandal, P. 2012. Phytochemical Screening and Antioxidant Activities of Two  Selected  'Bihi'  Fruits  Used  as  Vegetables  in  Darjeeling  Himalaya. International Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences. ISSN: 0975-1491.
[15] Nurjanah, Izzati, L. & Abdullah, A. 2011. Aktivitas Antioksidan dan Komponen Bioaktif Kerang Pisau (Solen spp) . Bogor: Universit as Diponegoro. ISSN: 0853-
7291.