ISSN: 1410-8917
e-ISSN: 2597-9914
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 21 (2) (2018): 64 – 69
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi

## Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Isolation and Testing of Bacteria from Steroid Compounds obtained from Anting-anting Leaf ( Acalypha indica L.)
Ditya Vega Fauzia a* , Dewi Kusrini a , Enny Fachriyah a
a Organic Chemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
* Corresponding author: vega.dty@gmail.com A r t i c l e   I n f o A b s t r a c t
Keywords:
Anting-anting leaves, Steroid, Antibacterial activity
Isolation of steroid compounds from the leaves of the earrings ( Acalypha indica L.) and the antibacterial  test  has  been  performed.  This  study  aims  to  obtain  information  about secondary  metabolite  compound  leaves  of  Anting-anting,  obtaining  and  identifying steroid isolates from the leaves of Anting-anting and knowing the antibacterial activity of the  positive  fraction  of  steroid  compounds.  The  research  stages  include  sample preparation,  phytochemical  test,  isolation,  separation,  purification  of  steroid compounds, identification of steroid isolates using LC-MS/MS, and antibacterial test by paper disc method. The results of phytochemical screening show that the leaves of the earrings  contain  alkaloid  compounds,  flavonoids,  steroids,  saponins,  tannins,  and quinones. From the results of steroid isolation, we found steroid isolates weighing 0.0065 grams (0.0058%). Identification of steroid isolates using LC-MS/MS at a retention time of 7.49 min with [M+H] + 399 m/z indicated the presence of a brassicasterol compound. The results of antibacterial test of fraction A from chloroform extract containing steroid compound  showed  antibacterial  activity  against Staphylococcus  aureus bacteria  and Escherichia coli bacteria.

## A b s t r a k
Kata Kunci:
Daun anting- anting, Steroid, Aktivitas Antibakteri
Isolasi senyawa steroid dari daun anting-anting ( Acalypha indica L.) dan uji antibakterinya telah dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh informasi tentang senyawa metabolit sekunder daun anting-anting, memperoleh dan mengidentifikasi isolat steroid dari daun anting-anting serta mengetahui aktivitas antibakteri dari fraksi positif senyawa steroid.  Tahap  penelitian  meliputi  preparasi  sampel,  uji  fitokimia,  isolasi,  pemisahan, pemurnian senyawa steroid, identifikasi isolat steroid menggunakan LC-MS/MS, dan uji antibakteri dengan metode cakram kertas. Hasil penapisan fitokimia menunjukkan bahwa daun anting-anting memiliki kandungan senyawa alkaloid, flavonoid, steroid, saponin, tannin,  dan  kuinon.  Dari  hasil  isolasi  steroid,  didapatkan  isolat  steroid  seberat  0,0065 gram (0,0058%). Identifikasi isolat steroid dengan menggunakan LC-MS/MS pada waktu retensi 7,49 menit dengan [M+H]+ 399 m/z menunjukkan adanya senyawa brassicasterol. Hasil uji antibakteri fraksi A dari ekstrak kloroform yang mengandung senyawa steroid menunjukkan  aktivitas  antibakteri  terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus dan  bakteri Escherichia coli .

## 1. Pendahuluan
Penggunaan  tanaman  tertentu  sebagai  obat merupakan  warisan  turun  temurun  dari  nenek  moyang kita.  Salah  satu  tanaman  yang  berpotensi  menjadi
tanaman obat adalah anting-anting ( Acalypha indica L.). Tanaman  anting-anting  secara  tradisional  sudah dimanfaatkan  untuk  pengobatan  disentri,  malnutrisi, mimisan, muntah darah, kencing darah dan malaria [1].
Tanaman anting-anting telah diteliti memiliki berbagai macam khasiat seperti obat sakit gusi, memiliki efek anti racun,  penyembuhan  luka,  antioksidan  [2], anti inflamasi [3], antimikroba [4], obat antikanker [5] serta antidiuretik  [6].  Kandungan  fitokimia  yang  terdapat dalam tanaman anting-anting meliputi alkaloid, tannin, steroid,  saponin,  senyawa  fenolik,  dan  flavonoid  [7]. Senyawa  steroid  yang  berhasil  diisolasi  pada  tanaman anting-anting  adalah  stigmasterol, γ -sitosterol,  dan β ‐ sitosterol  [8]  dan  pada  familia Eurphobiaceae adalah brassicasterol  [9].  pada  penelitian  ini  akan  dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa steroid fraksi kloroform dari  daun  anting-anting  dan  uji  aktivitas  antibakteri dengan  menggunakan  bakteri Escherichia  coli dan Staphylococcus aureus .

## 2. Metode Penelitian

## Preparasi dan Penapisan fitokimia
Sampel penelitian berupa daun Anting-anting yang diperoleh  dari  daerah  Kota  Bekasi.  Daun  anting-anting yang diperoleh dibersihkan, dikeringkan dan dihaluskan menjadi serbuk dan diuji penapisan fitokimia.

## Pembuatan Ekstrak Entanol
Sebanyak  1.100  gram  serbuk  daun  anting-anting dimaserasi  dengan  etanol  96%  hingga  jernih.  Ekstrak yang diperoleh kemudian dievaporasi sampai mendapat ekstrak etanol dan ditimbang. Ekstrak etanol dilarutkan dalam  etanol  selanjutnya  dilakukan  penghilangan klorofil dengan menambahkan akuades (1:1) lalu disaring dan diuapkan.

## Isolasi, Pemisahan, dan Pemurnian Senyawa Steroid
Ekstak  etanol-air  sebanyak  60,74  gram  dilakukan isolasi  steroid  dengan  kromatografi  cair  vakum menggunakan fasa diam silika gel 60 GF 254 dan fasa gerak menggunakan  pelarut  n-heksana,  kloroform,  dan  etil asetat.  Masing-masing  fraksi  dilakukan  uji  kandungan steroid menggunakan KLT dengan penambahan pereaksi Liebermann-Burchard.  Fraksi  kloroform  dengan  hasil positif  steroid  dipisahkan  lebih  lanjut  dengan kromatografi  kolom  gravitasi  menggunakan  fasa  diam silika gel 60 dan fasa gerak berupa campuran kloroform : etil asetat (4:6). Eluat-eluat yang dihasilkan dari kolom ditampung setiap 15 mL dalam botol vial. Masing-masing botol  vial  dianalisis  pola  noda  yang  terbentuk  dengan KLT.  Eluat-eluat  yang  memiliki  pola  noda  yang  sama digabungkan menjadi fraksi-fraksi besar (fraksi besar A, B,  dan  C)  kemudian  dilakukan  analisis  steroid menggunakan  metode  KLT  dengan  penambahan pereaksi  Liebermann-Burchard.  Fraksi  positif  steroid dilakukan pemisahan dengan KLT preparatif menggunakan fasa diam plat silika gel 60 F 254 ukuran 20 cm x 20 cm, ketebalan 0,5 mm-2,0 mm dan fasa gerak berupa  campuran  kloroform  :  etil  asetat  (3:1)  hingga didapatkan isolat steroid.

## Uji Kemurnian
Uji kemurnian isolat steroid dilakukan dengan KLT berbagai  eluen  tunggal  dan  campuran  serta  KLT  dua
dimensi dengan eluen campuran hingga diperoleh noda tunggal.

## Identifikasi Struktur
Isolat  steroid  yang  telah  murni  diidentifikasi strukturnya menggunakan LC-MS/MS.

## Uji Aktiviitas Antibakteri
Fraksi  A  hasil  kromatografi  kolom  gravitasi  yang positif  mengandung  senyawa  steroid  diuji  aktivitas antibakterinya  dengan  menggunakan  metode  cakram kertas  berdasarkan  pengukuran  diameter  zona  bening. Kertas cakram yang berdiameter ±6 mm dimasukkan ke dalam  fraksi  A  ekstrak  kloroform  dengan  masing- masing konsentrasi sebesar 100 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm, larutan kontrol positif dan kontrol negatif.  Dalam  penelitian  ini,  Amoxcicillin  dengan konsentrasi 2000 ppm digunakan sebagai kontrol positif dan  aquades  yang  ditambahkan  dengan  tween  20 digunakan sebagai  kontrol  negatif. Kertas  cakram  yang berisi  larutan  uji  diletakkan  pada  media  agar  sebagai media  uji.  Selanjutnya  diinkubasi  selama  24  jam  pada suhu  37 o C.  Zona  bening  di  sekitar  cakram  yang  terlihat diukur menggunakan jangka sorong.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Penapisan  fitokimia  bertujuan  untuk  mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder yang terkandung  dalam  serbuk  dan  ekstrak  etanol  daun anting-anting. Hasil penapisan fitokimia disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1 .Hasil uji penapisan fitokimia serbuk dan ekstrak etanol daun anting-anting Uji Hasil Serbuk Ekstrak Etanol
Flavonoid + + Alkaloid + + Steroid + + Triterpenoid - - Saponin + + Tanin + + Kuinon + +

## Pembuatan Ekstrak Etanol
Sebanyak  1.100  gram  serbuk  daun  anting-anting dimaserasi  dengan  pelarut  etanol  96%,  disaring  dan dievaporasi  hingga  diperoleh  ekstrak  kental  etanol berwarna coklat kehitaman pekat sebanyak 100,56 gram. Ekstrak  kental  etanol  yang  didapat  kemudian dihilangkan  kandungan  klorofilnya  menggunakan akuades hangat (1:1) yang bertujuan untuk mengikat dan memisahkan klorofil dan didapatkan ekstrak etanol-air dengan massa 60,74 gram.

## Isolasi, Pemisahan, dan Pemurnian Steroid
Isolasi  senyawa  steroid  pada  ekstrak  etanol-air dilakukan  dengan  menggunakan  metode  kromatografi cair vakum dengan fasa diam silika gel 60 GF 254 dan fasa
gerak berupa n-heksana, kloroform, dan etil asetat yang dielusi  secara  berurutan.  Dihasilkan  fraksi  n-heksana, fraksi  kloroform,  dan  fraksi  etil  asetat  yang  kemudian diuji kandungan senyawa steroidnya dengan menggunakan  pereaksi  Liebermann-Burchard.  Fraksi klorofrom  yang  positif  mengandung  senyawa  steroid kemudian  dipisahkan  senyawa  steroidnya  dengan menggunakan  metode  kromatografi  kolom  gravitasi. Fasa  diam  yang  digunakan  adala  silika  gel  60  dan  fasa gerak merupakan campuran kloroform:etil asetat (4:6). Eluat yang dihasilkan sebanyak 38 botol vial, kemudian masing-masing  botol  vial  dianalisis  dengan  KLT menggunakan  fasa  gerak  kloroform  :  etil  asetat  (4:6) yang ditunjukkan pada gambar 1.
Gambar 1. Profil KLT fraksi kloroform hasil kromatografi kolom gravitasi menggunakan fasa gerak kloroform : etil asetat (4:6) pada UV λ 365 nm
Fraksi A yang positif mengandung senyawa steroid saat disemprot reagen Liebermann-burchard dipisahkan senyawa  steroid  menggunakan  KLT  Preparatif  dengan fasa  diam  silika  gel  60GF 254 dan  fasa  gerak  berupa campuran  kloroform  :  etil  asetat  (3:1).  Hasil  KLT preparatif  fraksi  A  hasil  kromatografi  kolom  gravitasi ditunjukkan pada gambar 2.
Gambar 2. Profil KLT preparatif fraksi A dengan eluen kloroform : etil asetat (3:1) di bawah lampu UV λ 365 nm
Pita ke-6 kemudian diuji kemurnian menggunakan plat KLT dengan eluen kloroform menghasilkan 5 buah noda.  Perlu  dilakukan  pemurnian  kedua  untuk memisahkan  5  noda  yang  teridentifikasi  dengan menggunakan  KLT  preparatif.  Pemurnian  kedua dilakukan  dengan  menggunakan  plat  KLT  Preparatif silika  gel  60GF 254 dengan  eluen  kloroform  :  etil  asetat (9:1).
Gambar 3. Hasil KLT preparatif ke-2 pita ke-6 dengan eluen kloroform : etil asetat (9:1) dibawah lampu UV λ 365 nm
Pita A 5 selanjutnya dikerok, dilarutkan, dan disaring hingga  didapat  isolat  steroid.  Isolat  steroid  kemudian diuji kemurniannya dengan metode KLT  berbagai eluen tunggal  dan  campuran  seperti  kloroform,  n-heksana, dan  etil  asetat.  Hasil  uji  kemurnian  isolat  steroid ditunjukkan pada gambar 4.
Gambar 4. Hasil Uji kemurnian isolat steroid dengan eluen tunggal dan campuran di bawah lampu UV λ 365 nm. Keterangan: Fasa gerak (A) = etil asetat, (B) = kloroform : etil asetat (7:3), (C) = kloroform, (D) = n- heksana
Uji  kemurnian  dilanjutkan  menggunakan  metode KLT dua dimensi dengan eluen (a) kloroform : etil asetat (6:4). Setelah  diputar  90 o ,  eluen  kedua  yang  digunakan adalah  (b)  kloroform  :  etil  asetat  (4:6).  seperti  yang ditunjukkan pada gambar 5.
Gambar 5. Hasil uji kemurnian KLT dua dimensi isolat steroid di bawah lampu UV λ 365 nm
Berdasarkan  analisis  menggunakan  KLT  dua dimensi,  didapatkan  satu  noda  yang  menunjukkan bahwa  isolat  steroid  relatif  murni.  Isolat  yang  didapat kemudian diuapkan dan diperoleh isolat steroid sebesar 0,0065 gram.

## Analisis Isolat Steroid
Isolat  steroid  selanjutnya  dianalisis  dengan instrumen LC-MS/MS untuk mengetahui perkiraan jenis serta  struktur  senyawa  yang  terdapat  pada  isolat berdasarkan  berat  molekul  yang  teridentifikasi. Kromatogram LC isolat steroid ditunjukkan pada gambar 6.
Gambar 6. Kromatogram LC isolat steroid (bawah)
Hasil kromatogram LC terdapat tujuh puncak. Salah satu  puncak  dengan  waktu  retensi  7,49  menit  yang menunjukkan  adanya  senyawa  steroid  yang  akan teridentifikasi  struktur  dan  berat  molekulnya  dengan melihat spektogram massa yang dihasilkan. Spektogram pada waktu retensi 7,49 menit ditunjukkan pada gambar 7.
Gambar 7. Spektrogram massa isolat steroid pada waktu retensi 7,49 menit
Pada spektrogram dengan waktu retensi 7,49 menit terdapat  ion  molekular  [M+H] + 399  m/z  sehingga memiliki berat molekul 398 g/mol. Bersadarkan hasil LC- MS/MS  di  atas  diusulkan  senyawa  hasil  isolasi  adalah senyawa  golongan  steroid  yaitu  Brassicasterol. Berdasarkan  kemotaksonomi,  penelitian  yang  telah dilakukan  mengenai  isolasi  senyawa  golongan  steroid dari tanaman Euphorbia hirta yang merupakan salah satu tanaman  dari  familia Euphorbiaceae dengan  berat molekul  398  g/mol  adalah  Brassicasterol [9] .  Tanaman anting-anting  merupakan  salah  satu  tanaman  dari familia Euphorbiaceae, sehingga  kemungkinan  senyawa yang  teridentifikasi  dengan  berat  molekul  398  g/mol pada tanaman anting-anting adalah Brassicasterol.

## Gambar 8. Struktur Brassicasterol

## Uji Aktivitas Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri dilakukan untuk
mengetahui bioaktivitas suatu senyawa dalam menghambat  pertumbuhan  suatu  jenis  bakteri. Penelitian  ini  dilakukan  dengan  metode  difusi  cakram kertas,  dimana  kertas  saring  berdiameter  6  mm  yang berisi  sejumlah  senyawa  aktif  ditempatkan  pada permukaan medium padat yang telah diinokulasi bakteri uji  pada  permukaan  medianya.  Setelah  inkubasi, diameter  zona  hambat  sekitar  cakram  dipergunakan untuk  mengukur  kekuatan  hambatan  senyawa  aktif tersebut  terhadap  organisme  uji  [10].  Uji  aktivitas antibakteri  dilakukan  terhadap  fraksi  A  hasil kromatografi kolom gravitasi yang positif mengandung senyawa  steroid.  Konsentrasi  fraksi  A  dari  ekstrak kloroform  yang  digunakan  adalah  100,  250,  500,  1000 dan  2000  ppm  dengan  kontrol  positif  yang  digunakan adalah  larutan  amoxcicillin  2000  ppm  dan  kontrol negatif berupa aquades yang ditambahkan tween 20. Uji aktivitas  antibakteri  yang  dilakukan  terhadap  fraksi  A hasil  kromatografi  kolom  gravitasi  yang  positif mengandung senyawa steroid ditunjukkan pada tabel 2.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 21 (2) (2018): 64 – 69
Tabel 2. Hasil pengukuran diameter zona hambat uji antibakteri Konsentrasi (ppm) Diameter zona hambat (mm) Staphylococcus aureus Escherichia coli 2000 10 7,5 1000 9 6 500 9 6 250 9 5 100 7 5 Kontrol negatif 0 0 Kontrol positif 10 10
Gambar 8. Hasil uji aktivitas antibakteri fraksi A ekstrak kloroform hasil kromatografi kolom gravitasi
Pada  tabel  2  terlihat  bahwa  diameter  zona  hambat bakteri Staphylococcus  aureus lebih  besar  dibandingkan dengan  bakteri Escherichia  coli .  Bakteri  gram  positif cenderung lebih sensitif terhadap komponen antibakteri. Hal  ini  disebabkan  oleh  struktur  dinding  selnya  yang lebih  sederhana  sehingga  memudahkan  senyawa antibakteri  untuk masuk  ke  dalam  sel  dan menemukan sasaran untuk menghambat pertumbuhan bakteri. Pada bakteri gram negatif yang memiliki struktur dinding sel yang lebih kompleks berupa lipoprotein, lipopolisakarida,  dan  peptidoglikan  [11].  Dengan demikian,  bakteri Escherichia  coli memiliki  pertahanan yang  lebih  kuat  terhadap  komponen  antibakteri dibandingkan  dengan  bakteri Staphylococcus  aureus sehingga memiliki daerah zona hambat yang lebih kecil.
Menurut  [12],  kategori daya  hambat  uji  antibakteri adalah diameter zona hambat <10 mm dikatakan kurang efektif,  diameter  11-15  kategori  lemah,  diameter  16-20 mm  dikatakan  kategori  sedang,  dan  diameter  >20  mm dkatakan  kategori  tinggi.  Pada  diameter  zona  hambat bakteri Escherichia  coli dengan  berbagai  konsentrasi diketahui  bahwa  respon  penghambatan  pertumbuhan bakterinya  merupakan  respon  lemah,  sedangkan  untuk diameter  zona  hambat  bakteri Staphylococcus  aureus diketahui respon penghambatan bakteri pada konsentrasi  100  ppm  sampai  konsentrasi  1000  ppm termasuk  kedalam  respon  kurang  efektif  dan  untuk konsentrasi  2000  ppm  cenderung  lemah.  Senyawa steroid bekerja sebagai senyawa aktif antibakteri dengan cara  berinteraksi  dengan  membran  sel  [13].  Senyawa steroid dapat berinteraksi dengan membran fosfolipid sel sehingga  menyebabkan  integritas  membran  sel menurun, morfologi membran sel berubah dan akhirnya
dapat  menyebabkan  membran  sel  rapuh  dan  akhirnya lisis [14].

## 4. Kesimpulan
Senyawa  metabolit  sekunder  yang  terkandung dalam  serbuk  dan  ekstrak  etanol  daun  Anting-anting ( Acalypha indica L.) meliputi alkaloid, flavonoid, saponin, tannin,  kuinon,  dan  steroid.  Isolat  steroid  dari  daun anting-anting ( Acalypha indica L.) yang diperoleh adalah 0,0065 gram dengan rendemen 0,0058% dan identifikasi senyawa  steroid  menggunakan  instrumen  LC-MS/MS diduga  senyawa  brassicasterol.  Fraksi  A  ekstrak kloroform  hasil  kromatografi  kolom  gravitasi  dengan kandungan  senyawa  steroid  memiliki  bioaktivitas antibakteri  terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus dan Escherichia coli.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Arief  Pambudi,  Syaefudin,  Nita  Noriko,  Risa Swandari, Purwanty Rara Azura, Identifikasi Bioaktif Golongan  Flavonoid  Tanaman  Anting-Anting ( Acalypha  indica L.), Jurnal  AL-AZHAR  INDONESIA SERI SAINS DAN TEKNOLOGI , 2, 3, (2014) 178-187
[2]  Anirban  Mullick,  Sunanda  Mandal,  Rituparna Bhattacharjee, Anindita Banerjee, In-Vitro Assay of Antioxidant and Antibacterial Activity of Leaf Extract and Leaf Derived Callus Extract of Acalypha indica L., International  Journal  of  Pharmacy  and  Biological Sciences (IJPBS) , 3, 1, (2013) 504-510
[3]  D.  Jagatheeswari,  J.  Deepa,  H.  Sheik  Jahabar  Ali,  P. Ranganathan, Acalypha  indica L  -  an  Important Medicinal Plant: a Review of Its Traditional Uses, and Pharmacological  Properties, International  Journal  of Research in Botany , 3, 1, (2013) 19-22
[4]  J. Rajaselvam, J. M. Benila smily, R. Meena, A Study of Antimicrobial  Activity  of Acalypha  indica Against Selected  Microbial  Species, International  Journal  of Pharma  Sciences  and  Research  (IJPSR) ,  3,  9,  (2012) 473-476
[5]  Rajeshwari  Sivaraj,  Pattanathu  K.  S.  M.  Rahman,  P. Rajiv,  S.  Narendhran,  R.  Venckatesh,  Biosynthesis and  characterization  of Acalypha  indica mediated copper  oxide  nanoparticles  and  evaluation  of  its antimicrobial and anticancer activity, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy , 129, (2014) 255-258 https://doi.org/10.1016/j.saa.2014.03.027
[6]  P.  Vijayarekha,  N.  Sangottaiyan,  A.  Noorjahan,  S. Ambiga,  Antibacterial  Activity  of Acalypha  indica Linn, International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences , 4, 6, (2015) 1133-1138
[7]  Chandra  Mohan,  S.  Dinakar,  Anand  Thirupathi,  R. Elayaraja,  B.  Sathiyapriya,  Phytochemical,  GC-MS analysis  and  Antibacterial  activity  of  a  Medicinal Plant Acalypha  indica , International  Journal  of PharmTech Research , 4, 3, (2012) 1050-1054
[8]  Manisha  Masih,  Tanushree  Banerjee,  Bhaskar Banerjee, Anita Pal, Antidiabetic Activity of Acalypha indica Linn. on Normal and Alloxan Induced Diabetic Rats, International  Journal  of  Pharmacy  and Pharmaceutical Sciences , 3, 3, (2011) 51-54
[9]  Ewelina  Pióro- Jabrucka,  Anna  Pawełczak,  Jarosław L.  Przybył,  Katarzyna  Bączek,  Zenon  Węglarz,
Accumulation of  phenolic  and  sterol  compounds  in Euphorbia hirta (L.), Herba Polonica , 57, 2, (2011) 30-
36
[10] E.  Jawetz,  Mikrobiologi  Kedokteran,  23rd  ed., Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, 2007.
[11]  Michael  J.  Pelczar,  E.  C.  S.  Chan,  Dasar-dasar mikrobiologi, R.S. Hadioetomo, Universitas Indonesia Press, Jakarta, 1988.
[12] David Greenwood, Antimicrobial Chemotherapy, 3rd ed., Oxford University Press, 1995.
[13] Mohamed  Sham  Shihabudeen,  Hansi  Priscilla,  D. Kavitha  Thirumurugan,  Antimicrobial  activity  and phytochemical  analysis  of  selected  Indian  folk medicinal  plants, International  Journal  of  Pharma
Sciences and Research (IJPSR) , 1, 10, (2010) 430-434
[14] Audrey M. Glauert, J. T. Dingle, J. A. Lucy, Action of Saponin on Biological Cell Membranes, Nature , 196,
(1962) 953 10.1038/196953a0