## ANALYSIS OF PARACETAMOL LEVELS IN BLOOD AND SERUM

## ANALISIS KADAR PARACETAMOL PADA DARAH DAN SERUM
Nyoman Sudarma 1 , I Putu Gede Subhaktiyasa 2
Program Studi Teknologi Laboratorium Medis Program Diploma Tiga STIKes Wira Medika Bali, Indonesia

## ABSTRAK
Paracetamol  merupakan  golongan  obat  analgesik  yaitu  penahan  rasa  sakit/nyeri dengan  cara  kerja  menghambat  sintesis  prostaglandin  terutama  di  sistem  saraf  pusat. Paracetamol  yang  diberikan  secara  oral  akan  diserap  cepat  dan  mencapai  kadar  serum puncak dalam waktu 30-120 menit. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui kadar paracetamol pada darah dan serum. Sampel yang digunakan adalah sampel darah dan serum dari responden yang mengkonsumsi obat paracetamol 500 mg. Sampel darah diambil 2 jam setelah  mengkonsumsi  obat  paracetamol.  Untuk  mendapatkan  serum,  darah  harus dilakukan proses sentrifugasi, dengan proses sentrifugasi zat-zat pengganggu dalam darah dapat  diminimalkan.  Analisis  kadar  paracetamol  pada  darah  dan  serum  secara  kualiatif dianalisis  menggunakan  kromatografi  gas-spektrometri  massa  (GC-MS).  Ekstraksi paracetamol pada sampel darah dan serum menggunakan metode Solid Phase Extraction (SPE). Hasil ekstraksi diderivatisasi menggunakan BSTFA yang mengandung TMCS 1% dan  dianalisis  menggunakan  kromatografi  gas-spektrometri  massa  (GC-MS).  Analisis kuantitatif  dilakukan  dengan  menghitung  kadar  paracetamol  menggunakan  rumus persaaman  garis  regresi  y  =  50207x  +  56321.Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa sampel darah dan serum menunjukkan positif paracetamol pada retention time 15.056 dan 15.101. Kadar paracetamol pada sampel darah yaitu 175,2 ppm dan kadar paracetamol pada sampel serum yaitu 56,7 ppm.
Kata kunci : Paracetamol, Darah, Serum, Gas Chromatography-Mass Spectrometry.

## ABSTRACT
Paracetamol is a group of analgesics that is pain relief in the way of work and inhibits  the  synthesis  of  prostaglandins  especially  in  the  central  nervous  system. Paracetamol given orally will be absorbed quickly and reach peak serum levels within 30- 120 minutes. The purpose of this research is to determine the level of paracetamol in blood and  serum. The  sample  used  were  blood  and  serum  samples  from  respondents  who consumed  the  500  mg  paracetamol  drug.  Blood  samples  were  taken  2  hours  after consuming the drug paracetamol. To get serum, blood must be centrifuged, with the process of  centrifugation  of  confounding  substances  in  the  blood  can  be  minimized.  Qualitative analysis  of  paracetamol  levels  in  blood  and  serum  was  analyzed  using  gas chromatography-mass  spectrometry  (GC-MS).  Paracetamol  extraction  on  blood  and serum samples using the Solid Phase Extraction (SPE) method. The extraction results were
derivatized using BSTFA containing 1% TMCS and analyzed using gas chromatography- mass  spectrometry  (GC-MS).  Quantitative  analysis  was  performed  by  calculating paracetamol  levels  using  the  equation  of  the  regression  line  y  =  50207x  +  56321.  The results of this research showed that blood and serum samples showed positive paracetamol at 15,056 and 15,101 retention times. The level of paracetamol in blood samples was 175,2 ppm and the level of paracetamol in serum samples was 56,7 ppm.
Keywords: Paracetamol, Blood, Serum, Gas Chromatography-Mass Spectrometry.
Alamat Korespondensi : STIKes Wira Medika Bali Email : sudarma842@gmail.com

## PENDAHULUAN
Paracetamol adalah golongan obat analgesik non opioid yang dijual secara bebas. Indikasi paracetamol adalah untuk sakit kepala, nyeri otot sementara, sakit menjelang  menstruasi,  dan  diindikasikan  juga  untuk  demam.  Obat  ini  menjadi pilihan analgesik yang relatif aman bila dikonsumsi dengan benar sesuai petunjuk penggunaan (Anief, 2009).
Paracetamol yang diberikan secara oral diserap cepat dan mencapai kadar serum puncak dalam waktu 30-120 menit. Adanya makanan dalam lambung akan sedikit memperlambat penyerapan sediaan paracetamol. Paracetamol terdistribusi dengan cepat pada hampir seluruh jaringan tubuh. Lebih kurang 25% paracetamol dalam darah terikat pada protein plasma. Waktu paruh paracetamol adalah 1,25-3 jam. Penderita kerusakan hati dan konsumsi paracetamol dengan dosis toksis dapat memperpanjang  waktu  paruh  zat  ini.  Paracetamol  diekskresikan  melalui  urin sebagai  metabolitnya,  yaitu asetaminofen  glukoronid,  asetaminofen  sulfat, merkaptat dan bentuk yang tidak berubah (3-5%) (Olson, 2007).
Banyak kesalahan dalam mengkonsumsi obat ini, karena digunakan secara terus menerus untuk menghilangkan gejala sakit yang timbul. Karena paracetamol merupakan  obat  bebas  yang  digunakan  secara  luas  oleh  masyarakat,  maka kemungkinan  terjadinya  kesalahan  dalam  penggunaan  yang  dapat  menyebabkan keracunan paracetamol cukup besar (Olson, 2007).
Ada  beberapa  penelitian  mengenai  paracetamol  pada  cairan  tubuh  yang telah  dilakukan.  Penelitian  dilakukan  diantaranya  oleh  Eriawan  (2014)  dengan judul  penelitian  Aplikasi  Metode  HPTLC–Spektrofotodensitometri  Dalam Pengukuran Kadar Paracetamol Pada Urin, penelitian ini menggunakan ekstraksi fase  padat Solid  Phase  Extraction (SPE)  dan  didapatkan  hasil  rata-rata  kadar Paracetamol yang diperoleh yaitu 6,76 ppm.
Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Darmapatni  (2014)  dengan  karya  ilmiah yang  berjudul  Analisis  Kualitatif  Senyawa  Paracetamol  (Acetaminophen)  Pada Urin  Dan  Rambut  Menggunakan  Kromatografi  Gas  –  Spektrometri  Massa  (GC- MS), dalam penelitian ini digunakan ekstraksi fase padat Solid Phase Extraction (SPE), hasil penelitian menunjukkan bahwa sampel urine dari 1 jam hingga sehari setelah  mengonsumsi  tablet  paracetamol,  positif  acetaminophen-TMS  dan  pada sampel rambut hasil positif telah ditunjukkan pada 1 jam hingga 720 jam setelah mengkonsumsi tablet paracetamol.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Soysa dan Kolambage (2010) mengenai metode HPLC/UV cepat untuk analisis konsentrasi paracetamol urin dan plasma/serum,  dilakukan  proses  sentrifugasi  pada  x10.000  g  protein  yang dihilangkan secara memadai dan residu tak larut lainnya dari serum, plasma, dan urin. Untuk mendapatkan serum, darah harus dilakukan proses sentrifugasi. Proses sentrifugasi  ini  perlu  dilakukan  untuk  memisahkan  darah  dengan  komponennya, agar komponen tersebut tidak mempengaruhi hasil pemeriksaan (Nugraha, 2015). Menurut  Sadikin  (2014)  darah  yang  telah  disentrifugasi  akan  tampak  gumpalan darah  yang  bentuknya  tidak  beraturan  dan  bila  penggumpalan  berlangsung sempurna,  gumpalan  darah  tersebut  akan  terlepas  atau  dengan  mudah  dapat dilepaskan dari dinding tabung. Selain itu akan tampak pula bagian cair dari darah. Bagian ini, karena sudah terpisah dari gumpalan darah maka tidak lagi berwarna merah keruh akan tetapi berwarna kuning jernih. Diharapkan paracetamol yang ada dalam serum sebagai hasil yang didapatkan lebih baik dibandingkan dalam darah. Dengan  adanya  perlakuan  sentrifugasi,  zat  -zat  penganggu  akan  hilang,  maka dengan  hilangnya  zat-zat  penganggu  tersebut  pengukuran  paracetamol  akan  jauh lebih baik.
Analisis  kadar  paracetamol  pada  darah  dan  serum  menggunakan  metode Gas  Chromatography-Mass  Spectrometry (GC-MS).  Proses  ekstrasi  sampel menggunakan  ekstrasi  fase  padat  atau Solid  Phase  Extraction  (SPE).  Gas Chromatography  -  Mass  Spectrometry (GC-MS)  mampu  mendeteksi  kadar  obat dengan konsentrasi kurang dari 1µg/L dan membutuhkan waktu pengerjaan yang relatif singkat (Wirasuta, 2007).

## METODE PENELITIAN
Jenis  penelitian  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  yaitu  penelitian eksperimental  dengan  melakukan  pemeriksaan  kadar  paracetamol  pada  darah dengan perlakuan disentrifugasi dan tidak disentrifugasi. Penelitian ini dilakukan pada  bulan  Januari  –  Februari  2020.  Penelitian  dilaksanakan  di  Laboratorium Forensik  Cabang  Denpasar.  Sampel  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  yaitu sampel  darah  dan  serum  dari  1  orang  responden  yang  mengkonsumsi  obat paracetamol 1 tablet (500 mg). Sampel darah diambil 2 jam setelah mengkonsumsi obat paracetamol. Proses pemeriksaan sampel dilakukan sebagai berikut :

## Pengambilan sampel darah dan serum
Dilakukan  pengambilan  sampel  darah  vena  sebanyak  6  cc,  3  cc  untuk sampel darah dengan menggunakan tabung vacutainer tutup ungu dan 3 cc untuk sampel  serum  dengan  menggunakan  tabung  vacutainer  tutup  merah.  Dilakukan proses sentrifugasi pada tabung vacutainer tutup merah untuk memperoleh serum.

## Ekstraksi sampel darah dan serum
Penelitian ini dilanjutkan dengan proses ekstraksi sampel darah dan serum menggunakan SPE ( Solid Phase Extraction ). Masing-masing sebanyak 3 cc darah dan serum, dimasukkan ke dalam catridge yang sudah berisi kertas whatman dan silica  gel .  Setelah  sampel  mencapai  batas  bawah,  kemudian  dielusi  dengan kloroform sebanyak 15 mL, ditunggu  sampai terdapat tetesan hasil ekstraksi. Hasil ekstraksi  kemudian  dikeringkan  di  dalam laminar  airflow sampai  tersisa  1  mL. Sebanyak 1 mL eluat disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang diperoleh kemudian ditampung di dalam tabung mikro kemudian
diderivatisasi. Supernatan diderivatisasi dengan ditambahkan BSTFA sebanyak 10 µl.  Tabung  disegel  menggunakan  aluminium  foil  kemudian  dipanaskan  dengan suhu 60 o C selama 30 menit. Setelah dipanaskan, sampel didinginkan sampai suhu kamar, kemudian siap diinjeksikan pada GC-MS.

## Preparasi Larutan Standar Paracetamol
Ditimbang  1  butir  tablet  (500  mg)  paracetamol,  kemudian  digerus menggunakan  mortir  dan  stemper  hingga  halus.  Pembuatan  larutan  standar paracetamol  100  ppm  dengan  cara  ditimbang  2,59  mg  serbuk  paracetamol kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL lalu dilarutkan dengan metanol sampai tanda batas. Pembuatan larutan standar paracetamol 3, 7 dan 10 ppm dengan cara  dipipet  0,3,  0,7  dan  1  mL  larutan  standar  paracetamol  100  ppm  kemudian dimasukkan  ke  dalam  labu  ukur  10  mL  lalu  diencerkan  dengan  metanol  sampai tanda batas. Seluruh larutan standar diderivatisasi sebelum diinjeksikan ke sistem GCMS.

## Pengkondisian GC-MS
Analisis GC dilakukan dengan Agilent 6890N kromatografi gas dilengkapi dengan Agilent 5973 detektor massa selektif. Helium (99%) digunakan sebagai gas pembawa pada laju alir 1 mL/menit. 1μL ekstrak disuntikkan dengan suhu injektor 250 o C, suhu interface 270 o C, suhu  detektor  230 o C  dan split  rasio  1:20.  Program temperatur  pada  kolom  adalah  suhu  awal  kolom  70 o C  ditahan  selama  5  menit, dinaikkan 10 o C/menit hingga suhu 270 o C dan ditahan 5 menit sehingga diperoleh total waktu 30 menit.
Dalam  penelitian  ini  analisis  data  disajikan  dalam  bentuk  tabel.  Data  di analisis secara kualitatif dan kuantitatif. Untuk analisa kualitatif akan dilihat dari nilai  Rt  ( Retention  time )  yang  keluar  pada  GC-MS.  Nilai  Rt  ( Retention  time ) sampel  akan  dibandingkan  dengan  nilai  Rt  ( Retention  time )  pada  standar paracetamol.  Untuk  analisa  kuantitaif  akan  dilihat  dari  nilai  luas  puncak  sampel digunakan untuk menghitung kadar sampel melalui rumus persamaan garis regresi kurvakalibrasi. y = mx + a.

## HASIL DAN DISKUSI
Tabel 1. Hasil Analisis Kadar Paracetamol Pada Darah Dan Serum
Volume Retention Time Luas Puncak Kadar (ppm) Larutan Standar 1 1 µL 15.056 2542499 3 ppm Larutan Standar 2 1 µL 15.120 4851224 7 ppm Larutan standar 3 1 µL 15.169 4900530 10 ppm Sampel Darah 1 µL 15. 056 8853183 175,2 ppm Sampel Serum 1 µL 15.101 2903979 56,7 ppm
Berdasarkan Tabel 1. pada sampel darah dan sampel serum responden yang mengkonsumsi obat paracetamol pada pengambilan 2 jam setelah mengkonsumsi obat  paracetamol,  terdeteksi  hasil  positif  senyawa  paracetamol  yang  ditunjukkan dengan nilai retention time yang sama atau mendekati dengan nilai retention time pada larutan standar paracetamol. Pada sampel darah nilai retention time nya yaitu 15.056, pada sampel serum nilai retention time nya yaitu  15.101.
Berdasarkan analisis  kadar  paracetamol  pada  darah  dan serum  yang  telah dilakukan,  hasil  pemeriksaan  sampel  secara  kualitatif  dapat  diketahui  dari kromatogram yang berupa Rt ( Retention time ) yang sama atau mendekati dengan standar  paracetamol  yang  menunjukkan  terdeteksinya  senyawa  paracetamol. Kromatogram standar paracetamol 3 ppm dapat dilihat pada Gambar 1. berikut :
Gambar 1. Kromatogram larutan standar paracetamol 3 ppm
Kromatogram larutan standar 7 ppm dapat dilihat pada Gambar 2 berikut:
Gambar  2.  Kromatogram larutan standar paracetamol 7 ppm
Kromatogram larutan standar 10 ppm dapat dilihat pada Gambar 3. berikut:
Gambar 3.  Kromatogram larutan standar paracetamol 10 ppm
Gambar 1, Gambar 2, dan Gambar 3 menunjukkan kromatogram dengan nilai retention  time pada  ketiga  larutan standar  paracetamol.  Nilai retention  time pada pengukuran larutan standar paracetamol 3 ppm, 7 ppm, dan 10  ppm secara berturut-turut    adalah  15.056,  15.120,  dan  15.169.    Nilai retention  time larutan standar paracetamol akan dibandingkan dengan nilai retention time sampel darah dan serum. Kromatogram yang menyajikan nilai retention time sampel darah dapat dilihat pada Gambar 4. berikut :
DOI: https://doi.org/10.36376/bmj.v8i3
Nilai retention time sampel darah memiliki nilai retention time 15. 056, nilai ini sama dengan nilai retention time pada standar paracetamol 3 ppm.
Kromatogram pada sampel serum dapat dilihat pada Gambar 5 berikut :
Gambar 5.  Kromatogram sampel serum
Nilai retention time pada sampel serum adalah  15.101, nilai ini mendekati dengan nilai retention time pada larutan standar 7 ppm . Secara kualitatif,  pada sampel darah dan serum terdeteksi senyawa paracetamol yang ditunjukkan dengan nilai retention  time yang  sama  dan  mendekati  dengan  nilai retention  time pada standar.
Untuk  analisa  secara  kuantitatif,  digunakan  luas  puncak  sampel  dalam pembuatan  kurva  kalibrasi  standar  paracetamol  untuk  menentukan  kadar paracetamol  pada  sampel  darah  dan  serum.  Kurva  kalibrasi  dapat  dilihat  pada Gambar 6. berikut:
Gambar 6.  Kurva kalibrasi standar paracetamol
y = 502071x + 563210 R² = 0,901 Lu as P u n cak ( Y ) Konsentrasi ppm (X)
Kurva Kalibrasi Standar Paracetamol
Kadar  sampel  dihitung  dari  persamaan  regresi  yang  dibuat  dengan  cara memplot antara konsentrasi larutan standar paracetamol 3 ppm, 7 ppm, dan 10 ppm dengan  luas  puncak  larutan  standar  2542499,  4851224  dan  4900530.  Sehingga dihasilkan  persamaan  regresi  y  =  50207x  +  56321.  Dengan  nilai  linearitas  (R 2 ) 0.901. Kadar paracetamol pada sampel dihitung dengan memasukkan y sebagai luas puncak  dan  x  sebagai  kadar  paracetamol.  Luas  puncak  pada  sampel  darah  yaitu 8853183 dan luas puncak sampel serum yaitu 2903979. Berdasarkan perhitungan, diperoleh hasil analisis kadar paracetamol pada sampel darah yaitu 175,2 ppm dan sampel serum yaitu 56,7 ppm. Berdasarkan penelitian Soysa dan Kolambage (2010) menyatakan bahwa kadar paracetamol pada serum adalah 10,71 ± 3,95 mg pada 1 jam  setelah  pemberian  oral  paracetamol.  Hal  ini  selaras  dengan  penelitian  yang telah dilakukan bahwa pada darah  dan serum terdeteksi paracetamol dengan kadar 175,2  ppm  dan  56,7  ppm.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  paracetamol  telah terdistribusikan ke seluruh tubuh dengan waktu paruh (1-3) jam (Ganiswara, 2007).
Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan,  perbandingan  hasil  analisis antara  sampel  darah  dan  sampel  serum  dapat  dilihat  melalui  kromatogram  yang dihasilkan pada Gambar 4. untuk kromatogram  sampel darah dan Gambar 5. untuk kromatogram sampel serum. Jika dilihat dari kromatogram yang dihasilkan, hasil analisis  sampel  serum  menunjukkan  hasil  yang  lebih  baik  dibandingkan  dengan darah bahwa pada sampel serum dihasilkan puncak yang lebih sedikit serta terpisah- pisah, sedangkan pada sampel darah dihasikan puncak yang bertumpuk dan tidak terpisah.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  dengan  hilangnya  zat-zat  penganggu  pada darah akan menghasilkan hasil analisis yang lebih baik dalam mendeteksi senyawa paracetamol dalam suatu sampel.

## SIMPULAN DAN SARAN
Berdasarkan hasil pemeriksaan kadar paracetamol pada sampel darah dan serum  yang  diambil  2  jam  setelah  mengkonsumsi  obat  paracetamol  dengan menggunakan  metode Gas  Chromatography-Mass  Spectrometry (GC-MS), diperoleh simpulan yaitu kadar paracetamol pada sampel darah yaitu 175,2 ppm, kadar paracetamol pada sampel serum yaitu 56,7 ppm. Adapun saran yang dapat disampaikan  diharapkan  peneliti  selanjutnya,  menggunakan  sampel  yang  lebih banyak jumlahnya, sehingga dapat dilihat perbandingan sampel satu dengan sampel yang  lainnya,  waktu  pengambilan  sampel  dilakukan  pada  3  jam  setelah mengkonsumsi  obat  paracetamol  serta  menggunakan  konsentrasi  larutan  standar paracetamol  yang  lebih  kecil,  sehingga  dapat  mendeteksi  sampel  dengan  kadar paracetamol yang kecil.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Melalui kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terimakasih kepada Pusat Laboratorium Forensik (Puslabfor) Bareskrim Polri Cabang Denpasar, dr. I Putu Oka Dharmawan, MARS.,IBCLC, dan Ida Ayu Gede Reina Widya Kirana, serta semua pihak yang telah membantu sehingga penelitian ini dapat terselesaikan.

## DAFTAR PUSTAKA
Anief, M. 2009. Prinsip Umum dan Dasar Farmakologi . Yogyakarta. Gadjah Mada University Press.
Darmapatni,  K.A.G.,  Putra,  A.A.B.,  Ariati,  N.K.,  Suaniti,  N.M.  2014.  Analisis Senyawa  Parasetamol  ( Acetaminophen )  Pada  Urin  Dan  Rambut Menggunakan  Kromatografi  Gas-Spektrometri  Massa  (GC-MS). Jurnal Kimia. 8 (2) : 257-262. Eriawan,  A.  2014. Aplikasi  Metode  HPTLC-SPEktofotodensitometri  dalam Pengukuran Kadar Paracetamol Pada Urine. Karya Tulis Ilmiah. Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Wira Medika Bali.
Ganiswara,  S.  2007. Obat  Otonom  dalam  Farmakologi    dan  Terapi .  Edisi  5. Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatra Utara.
Nugraha,  G.  2015. Panduan  Pemeriksaan  Laboratorium  Hematologi  Dasar . Jakarta.CV. Trans Info Media.
Sadikin, M. 2014. Biokimia Darah . Jakarta. Widya Medika.
Soysa, P., Kolambage, S. 2010. Rapid HPLC/UV Method For Analysis Of Urinary And  Plasma/Serum  Paracetamol  Concentrations. Journal  of  the  National Science Foundation of Sri Lanka . 38(2) : 131-137. Wirasuta, I.M.A.G., Suardamana, K. 2007. Analisis Toksikologi Tantangan Baru Bagi  Farmasis  Indonesia .  Jurusan  Farmasi  FMIPA  Universitas  Udayana, Lembaga  Forensik  Sains  dan  Kriminologi  Universitas  Udayana  dan Laboratorium Ilmu Penyakit Dalam Rumah Sakit Sanglah, Denpasar.