## Borneo Journal Of Medical Laboratory Technology

## PENDAHULUAN
Akumulasi logam berat di tanah, air tanah, sedimen, dan  air  permukaan  memberikan  efek  yang  sangat berbahaya.  Logam  berat  dapat  terakumulasi sehingga  memiliki  efek  negatif  jangka  panjang  pada
ekosistem.  Logam  berat  beracun  seperti  Timbal (Pb)  tidak  memiliki  peran  biologis  dalam  tubuh tetapi  memiliki  efek  toksik,  mutagenik  serta karsinogenik  pada  manusia  dan  organisme  lainnya (Anggaini et  al,  2022 ).  Logam  Pbyang  terlarut  di dalam  air  sangat  berbahaya  bagi  kehidupan

## IDENTIFIKASI BAKTERI PEREDUKSI LOGAM Pb DALAM BIOREMEDIASI SAMPEL AIR SUNGAI CITARUM MENGGUNAKAN ANALISIS GEN 16S rRNA

## Identification of Pb Metal Reducting Bacteria In Bioremediation from Citarum River
Water Samples Using 16s rRNA Gene Analysis
Ni’matul Murtafi’ah 1*
Suci Rizki Nurul Aeni 2
*1 Institut Kesehatan Rajawali, Bandung, Indonesia
2 Institut Kesehatan Rajawali, Bandung,
Indonesia
*email: nimatul.murtafiah@yahoo.co.id

## Abstrak
Teknik bioremediasi adalah upaya menghilangkan logam berat Pb dalam sampel air sungai Citarum.. Konsentrasi tinggi di semua jenis logam berat memiliki efek negatif pada lingkungan sehingga dibutuhkan bakteri pereduksi logam Pb sebagai solusi  pencemaran.  Bioremediasi  tersebut  menggunakan  bakteri  Bakteri diidentifikasi  dengan  metode  molekuler  yaitu  teknik  analisis  sekuensing  karna lebih akurat. Untuk mengetahui urutan nukleotida pada isolat bakteri pereduksi logam  Pb  serta  mengetahui  secara  pasti  spesies  bakteri  memiliki  kemampuan sebagai  pereduksi  logam  Pb.  Metodologi   yang  digunakan  adalah pengumpulan data  primer  yaitu  melalukukan  penelitian  secara  langsung  yaitu  tahapan pemurnian  bakteri  melalui  Teknik  pewarnaan  gram,  koloni  murni  kemudian dilanjutkan ke tahap isolasi DNA. DNA hasil isolasi kemudian dielektroforesis. Hasil  elektroforesis  kemudian  dimurnikan  dan  lanjutkan  ke  tahap  sequensing. Hasil  Uji  kelayakan  yaitu  diperolehnya  DNA  Murni  dari  bakteri  pereduksi, tahap  selanjutnya  adalah  amplifikasi  PCR  berupa  Gen  16S  rRNA  bakteri pereduksi  Pb,  Hasil  penelitian  dimulai  pada  tahap  isolasi  DNA  diperoleh  hasil kemurnian 1,80. Hasil PCR berupa amplikasi gen 16S rRNA bakteri pereduksi Pb,  Elektroforesis  diperoleh  hasil  pita  DNA  berukuran  ±1400  bp.  Analisis pohon filogenetik yang memiliki hasil kekerabatan 99,60% pada Bacillus cereus yang  mempunyai  kemampuan  dalam  mereduksi  Pb.  Spesies  Bacillus  cereus mampu  melaksanakan  mekanisme  detosifikasi  terhadap  efek  toksik  logam  Pb seperti. biosorpsi, bioakumulasi,  reduksi,  solubilisasi,  presipitasi (pembentukan kompleks ekstraseluler) dan metilasi.
Kata Kunci: Timbal (Pb), Sekuensing Gen 16S rRNA, Bacillus cereus
Keywords :
Lead (Pb), 16S rRNA Gene Sequencing, Bacillus cereus

## Abstract
The bioremediation technique is an effort to remove the heavy metal Pb in samples of Citarum river water. High concentrations of all types of heavy metals have a negative effect  on  the  environment  so  that  Pb  metal  reducing  bacteria  are  needed  as  a pollution  solution.  The  bioremediation  uses  bacteria.  Bacteria  are  identified  by molecular  methods,  namely  sequencing  analysis  techniques  because  they  are  more accurate.  To  determine  the  nucleotide  sequence  of  isolates  of  Pb  metal  reducing bacteria and to know for certain which bacterial species have the ability to reduce Pb metal. The methodology used is primary data collection, namely conducting research directly, namely the stages of bacterial purification through gram staining techniques, pure  colonies  then  proceed  to  the  DNA  isolation  stage.  The  isolated  DNA  is  then electrophoresed.  The  electrophoresis  results  are  then  purified  and  proceed  to  the sequencing stage. The results of the feasibility test were to obtain pure DNA from the reducing bacteria. The next step was PCR amplification in the form of the 16S rRNA gene of Pb reducing bacteria. The results of the research started at the DNA isolation stage and obtained a purity of 1.80. The PCR results were in the form of amplification of the 16S rRNA gene of Pb reducing bacteria. Electrophoresis obtained the results of DNA  bands  measuring  ±  1400  bp.  Phylogenetic  tree  analysis  with  99.60% relatedness  to  Bacillus  cereus  which  has  the  ability  to  reduce  Pb.  Bacillus  cereus species are able to carry out detoxification mechanisms against the toxic effects of Pb metals  such  as.  biosorption,  bioaccumulation,  reduction,  solubilization,  precipitation (formation of extracellular complexes) and methylation.
Borneo Journal of Medical Laboratory Technology (BJMLT), Vol 5 No 2 April 2023, Page 303 – 315
organisme.  Logam  Pb  dengan  paparan  yang  lebih tinggi  terhadap  manusia  dapat  menyebabkan penghambatan eritrosit glutathione reductase, yang menurunkan  methemoglobin  dengan  hemoglobin (Awad et  al,  2015 ).  Timbal  dapat  masuk  ke  dalam tubuh  melalui  air  tercemar.  Salah  satu  keberadaan cemaran  Pb  yaitu  ditemukan  dalam  air  sungai Citarum.  Hal  tersebut  sesuai  dengan  yang dilaporkan  oleh  Happy,  Musyamsir,  dan  Dhahyat (Besser et al, 2018 ) yaitu DAS sungai Citarum telah tercemar  Pb dengan  kadar  yang  cukup  tinggi  yaitu 0,08-0,01 mg/L.
Logam timbal sangat berbahaya bagi makhluk hidup karena  bersifat  karsinogenik,  dapat  menyebabkan mutasi,  serta  dapat  terakumulasi  dalam  tubuh karena  proses  penguraiannya  lambat  dan berlangsung  lama  (Das  and  Chandran,  2011). Masuknya timbal ke dalam tubuh terabsorbsi sangat lambat, sehingga terjadi penumpukkan dan menjadi dasar timbulnya keracunan (Suhendrayatna, 2001). Bakteri  diperlukan  untuk  meminimalkan  kadar  Pb yang  tinggi.  Bakteri  ini  disebut  bakteri  asli  atau bakteri  dari  ekosistem  yang  telah  beradaptasi dengan  lingkungan  aslinya  sehingga  memiliki kemampuan  untuk  mengurangi  risiko  penanganan lingkungan yang terkontaminasi Pb (Ahmad, 2018). Bakteri  dapat  diketahui  kemampuannya  dalam menurunkan  kadar  Pb  melalui  uji  eksperimental. Identifikasi  bakteri  pereduksi  Pb  dapat  dilakukan dengan berbagai metode yaitu metode mikrobiologi konvensional  dan  identifikasi  berbasis  molekuler.
Pada metode mikrobiologi konvensional menggunakan  tes  fenotipe  yaitu  tes  fisiologi,  tes gram  dan  tes  biokimia  membutuhkan  waktu  yang lama  pada  saat  identifikasi,  sedangkan  pada identifikasi  berbasis  molekuler  melalui  analisis sekuensing,  waktu  yang  dibutuhkan  jauh  lebih singkat (Ihsan et al, 2020 ).
Sekuensing  DNA  adalah  proses  urutan  basa nukleotida  pada  suatu  segmen  molekul  DNA.
Urutan  tersebut  dikenal  sebagai  sekuens  DNA, merupakan  informasi  paling  mendasar  suatu  gen atau  genom  karena  mengandung  instruksi  yang dibutuhkan  untuk  pembentukan  tubuh  mahluk hidup  (Lokapirnasari et  al,  2017 ).  Sekuensing  gen
16S  rRNA  dilakukan  untuk  menentukan  urutan nukleotida  dalam  fragmen  DNA  yang  terdeteksi oleh  hasil  visual  dari  DNA  yang  diamflikasi  dalam proses  PCR  menggunakan  mesin  sekuensing  DNA otomatis.  Hasil  sekuensing  DNA  dianalisis  untuk mencari  kesamaan  urutan  nukleotida  gen  16S rRNA  dalam  menentukan  spesies  bakteri  (Kepel and Fatimawali, 2015).

## METODE PENELITIAN
Penelitian di  lakukan  di  Laboratorium Institut Kesehatan Rajawali. Jenis Penelitian yang digunakan pada  penelitian  ini  adalah  deskritif.  Populasi  yang diuji pada penelitian ini yaitu bakteri yang terdapat pada  sungai  citarum.Sampel  yang  digunakan  pada penelitian adalah sungai citarum.
Data yang digunakan pada penelitian ini adalah data  primer,  data  primer  pada  penelitian  ini  yaitu pengumpulan  data  yang  dilakukan  dengan  cara melakukan pemeriksaan analisis sekuensing gen 16S rRNA  pada  isolat  bakteri  pereduksi  logam  Pb. Kemudian  nukleotida  yang  didapatkan  dianalisis lebih lanjut merujuk NCBI untuk menentukan jenis bakteri.

## Isolasi DNA
Pada  tahap  isolalsi  DNA  menggunakan  metode Wizard  Genomik  DNA  (Promega).  Sampel  kultur bakteri diambil 1 ose ditambah 1 ml aquades steril dalam  tabung  mikrosentrifugal  1,5  ml,  dibiarkan semalam,  Sampel  disentrifugasi  dengan  kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit, supernatan dibuang ke dalam  tabung,  ditambahkan  600 μ l  larutan  lisis nuclei,  dikocok  dengan  pipet  agar  sel-sel tersuspensi.  Sampel  diinkubasi  pada  suhu  80 o C
selama  5  menit  supaya  sel  menjadi  lisis.  Kemudian tabung  dibolak-balik  supaya  tercampur.  Sampel diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  30  menit, didinginkan  pada  suhu  kamar  ke  dalam  sampel ditambahkan  200 μ l  larutan  protein  presipitat, divortex  pada  kecepatan  tinggi  selama  20  detik untuk  mencampur  protein  presipitat  dengan  lisat sel. Sampel diinkubasi selama 5 menit, disentrifugasi pada  13.000  rpm  selama  3  menit.  Supernatan dipindahkan  ke  dalam  tabung  mikrosentrifugal. Kemudialn  pada  sampel  ditambahkan  600 μ l isopropanol,  dicampur  dengaln  membolak-balik tabung.  Sampel  disentrifugasi  pada  13.000  rpm selama  2  menit,  supernatan  dibuang  dan  tabung dikeringkan  dengan  membalikkan  di  atas  kertas tissue. Sampel ditambahkan 600 μ l etanol 70% dan dikocok dengan membolak-balikkan tabung beberapa  kali  untuk  mencuci  DNA.  Sampel disentrifugasi  pada  13.000  rpm  selama  2  menit,  isi tabung  dituang  dan  dikeringkan  di  atas  kertas tissue,  dibiarkan  10-15  menit  (kering  anginkan), ditambahkan 100 μ l larutan DNA rehidrasi ke dalam tabung,  diinkubasi  pada  suhu  4 o C  semalam.  DNA disimpan  pada  suhu  2-8 o C.  Setelah  didapat  DNA murni, dilanjutkan pada tahap PCR.

## Tahap PCR
Reaksi PCR sebanyak 50 µL terdiri atas komponen 25  µL  2x  MyTaq  TM  HS  Red  Mix,  1µL  masing- masing  primer  (20µM),  Water  (dH2O)  20µL  dan sampel  DNA  2µL,  kemudian  dipredenaturasi  pada suhu 95°C selalmal 1 menit, didenaturasi pada suhu 95°C selama 15 detik, dengan pengulangan 35 kali, Annealing pada suhu 52°C selama 15 detik, dengan pengulangan  30  kali,  Extension  pada  suhu  72°C selama  10  detik,  dengan  pengulangan  30  kali,  Last Extension pada suhu 72°C selama 1 menit. Setelah diperoleh  amplifikasi  DNA  kemudian  dilakukan visualisasi menggunakan Elektroforesis.

## Tahap Elektroforesis
Pada tahap Elektroforesis dibuat Gel Agarosa 0,8% kemudian dipanaskan dengan menggunakan microwave. Gel Agarosa dicetak dengan menggunakan  aparatus  elektroforesis,  Setelah  gel agarose  membeku,  masukkan  kedalam  tempat elektroforesis lalu masukkan loading buffer. Sampel dimasukan masing-masing 1µL dan marker 1 µL. Di nyalakan  mesin  elektroforesis,  set  waktu  sesuai kebutuhan  dan  tekan  start.  Hasil  elektroforesis diamati  dengan  sinar  UV.  Setelah  diperoleh  pita DNA, selanjutnya dilakukan sekuensing. Sekuensing dilakukan untuk mengetahui urutan basa nukleotida menggunakan  metode  sanger.  Penentuan  urutan DNA  (Sekuensing)  dikirim  ke  1 st Base  Malaysia. Sekuens yang didapat kemudian diolah menggunakan  software  Bio  Edit,  selanjutnya  hasil pengolahan data dilakukan BLAST pada situs NCBI agar  diperoleh  jenis  spesies  bakteri.  Kemudian dilakukan  Analisis  Pohon  Filogenetik  menggunakan software  Mega  XI  untuk  mengetahui  kekerabatan antar spesies bakteri.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## A. Hasil
Penelitian  diawali  dari  tahap  pemurnian bakteri. Koloni dimurnikan dengan cara distreak ke medium  NA  padat  dalam  cawan  petri.  Untuk koloni  murni,  perlu  dilakukan  pewarnaan  gram untuk memastikan bahwa koloni tersebut memang murni.  Pewarnaan  gram  bakteri  dapat  dilihat  pada gambar 1
Borneo Journal of Medical Laboratory Technology (BJMLT), Vol 5 No 2 April 2023, Page 303 – 315
Hasil  pewarnaan  pada  preparat  koloni  Pb  B adalah  gram  positif.  Bakteri  ini  berbentuk  basil. Berikut  ini  hasil  pengamatan  makroskopik  bakteri isolate Pb B.
Tabel 1. Pengamatan Makroskopik Bakteri Isolat Pb
B Karakteristik Koloni Kode Pb B Bentuk koloni Bulat Warna koloni Putih – krem Tekstur Smooth Bentuk sel Basil Pembesaran 100x
Setelah  melakukan  pengamatan  makroskopik  dan mikroskopik, Isolat Pb B dilakukan pengujian secara biokimia  diperoleh  hasi  uji  yang  dapat  dilihat  pada Tabel 2.
Tabel 2. Pengamatan Uji Biokimia pada Sampel
No Media Uji Biokimia Pb B 1 TSIA K/A 2 Glukosa + 3 Sukrosa - 4 Laktosa - 5 Manitol + 6 VP - 7 MR + 8 Indol - 9 Katalase +
Berdasarkan hasil uji biokimia yang dilakukan bahwa isolate bakteri PbB dapat memfermentasikan glukosa. Uji biokimia merupakan salah satu tahapan yang  harus  diketahui  berdasarkan  sifat  biokimia bakteri dalam identifikasi.
Pada tahapan identifikasi berbasis molekuler dimulai  dengan  tahap  isolasi  DNA.  Prinsip  isolasi DNA  adalah  mendapatkan  DNA  murni  yang  tidak tercampur  dengan  komponen  sel  lainnya  seperti protein  dan  karbohidrat.  Pada  isolasi  DNA menggunakan  metode Wizard  Genomic  DNA
Purification , Promega. Hasil isolasi DNA kromosom dari  isolat  Pb  B  diukur  konsentrasi  dan kemurniannya  dengan  menggunakan  alat  nanodrop spektrofotometer  ND-1000.  Tujuan  pengukuran adalah  untuk  memastikan  DNA  yang  akan digunakan  untuk  proses  amplifikasi  16S  rRNA dengan  teknik  PCR  mempunyai  konsentrasi  dan kemurnian  yang  sesuai  untuk  amplikasi.  Hasil pemurnian dan konsentrasi DNA dapat dilihat pada Tabel 3.

## Tabel 3. Hasil Pemurnian dan Konsentrasi DNA
Kode Sampel Konsentrasi ng/ µL Kemurnian (260/280) Pb B 86,4 1,80
Nilai  kemurnian  pada  sampel  Pb  B  sebesar 1,80.  DNA  dapat  dikatakan  murni  karena  sesuai dengan kualitas DNA yang ditetapkan yaitu 1,8-2,0. Hal  ini  sesuai  dengan  ( Jimenez-Montenegro et  al ,
2022 )  nilai  rasio  kemurnian  antara  1,8  dan  2 dianggap optimal, sedangkan nilai yang lebih rendah menunjukkan  adanya  senyawa  pencemar  lainnya seperti protein.
Isolat Pb B dilanjutkan pada tahap amplikasi PCR dari hasil isolasi DNA. PCR ( Polymerase Chain Reaction ) merupakan metode yang digunakan untuk mengamplifikasi sekuen DNA spesifik secara cepat dalam kondisi in vitro .
Proses  amplifikasi  PCR  yang  dilakukan berjalan  dengan  baik.  Pita  DNA  yang  tebal menunjukkan  konsentrasi  DNA  yang  tinggi,  dan pita yang teragregasi (tidak tersebar) menunjukkan seluruh  DNA  yang  telah  diekstraksi  sepenuhnya (Irmawati, 2013). Hasil Amplifikasi Gen 16S rRNA pada isolat Pb B dapat dilihat pada gambar 2.

## Gambar 3. Hasil Sekuensing Produk PCR
Berdasarkan  Gambar  3  Hasil  Sekuensing produk  PCR  isolat  Pb  B  ditemukan  adanya Homopolymer yang mana mengakibatkan pembacaan menjadi noise sehingga isolat Pb B perlu dikloning.  Homopolimer  dapat  menyebabkan kualitas  rendah  dari  hasil  pembacaan  sequensing (Lott et  al,  2017 ).  Sehingga,  Isolat  Pb  B  harus  di lakukan cloning gen 16S rRNA.
Berdasarkan  gambar  4  Plasmid  pTA2 merupakan  vector  sistem  ekspresi  prokariot  yang
memiliki promotor P lac sehingga gen sisipan dapat diekspresikan  pada  sel  prolkariot.  Konsentrasi plasmid sebesar 86,4. Selain itu, pTA2 mengandung multiple cloning sites (MCS) sebagai tempat sisipan gen dengan urutan enzim restriksi sebagai berikut: EcoRI,PstI,SmaI,BamHI,SpeI,XbaI,NotI,EagI,BstXI,Sa c2,SacI.
Plasmid Pta2 memiliki gen resisten ampisilin ORF1996-2853  dan  lacZ  untuk  seleksi  klon  pada tahap  transformasi  sehingga  plasmid  ini  dapat bereplikasi  pada  sel  bakteri  karena  memiliki  situs replikasi  pUC  ori.  Penanda  selektif  ( selectable marker )  yang  terdapat  pada  vektor  merupakan Amp r ,  suatu  penanda  yang  memampukan  bakteri untuk resisten pada keberadaan antibiotic Ampisilin (Langden et al, 2017 ).
Hasil  ligase  dengan  gen  sisipan  dengan vektor  pTA2  ditransformasi  ke  sel E.coli Top10.
Transformasi  ini  menghasilkan  8  koloni E.coli tumbuh pada hasil ligase, tidak terdapat koloni pada control negative (sel kompeten saja_ dan tidak ada koloni  yang  tumbuh  pada  control  ligase  DNA sisipan.  Selanjutnya,  koloni  hasil  ligase  diseleksi dengan  menggunakan  metode  PCR  koloni menggunakan enzim  DreamTaq. Hasil PCR koloni Pb B-pTA2 dapat dilihat pada gambar 5.
Gambar 5. Hasil Elektroforesis dari PCR isolat Pb B
Sekuensing  gen  16S  rRNA dilakukan menggunakan metode dideoxy Sanger. Metode sequencing sanger
Gambar  4.  Plasmid  pTA2  vektor  sebagai backbone pengkloningan gen 16S rRNA
Band DNA isolat 1400 bp
Gambar 2. Elektroforesis Hasil Amplifikasi Gen 16S rRNA pada Isolat Pb B Bakteri Pereduksi
menghasilkan sekuens DNA berkualitas tinggi yang relatif  panjang  (500e1000  bp),  dan  telah  lama dianggap  sebagai  standar  referensi  untuk sekuensing DNA (Besser et al, 2018 ). Urutan basa nukleotida  gen  16S  rRNA  isolat  Pb  B  diperoleh setelah  amplikon  dimurnikan  dan  disekuensing.
Sekuensing  dibaca  menggunakan  program  DNA Star.  Perbandingan  urutan  basa  nukleotida  antara isolat Pb B dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel  4.  Urutan  Basa  dari  Isolat  Pb  B Pereduksi Logam
Hasil  dari  sekuensing  berupa  sekuen  nukleotida  di analisis  dengan  menggunakan  program  BLAST
( Basic  Local  Alignment  Search  Tools )  pada  website NCBI  ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov ).  Hasil  dari

## No
Kode sampel Hasil sekuensing 1 Pb B CTGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTT GCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGT CAAGCTCTAAACACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTT CTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAG GGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAA ATATTAACGCTTACAATTTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCT CTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTT TCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGG TACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCCAATACT*GGTTACCTTGTT ACGACTTCACCCCAATCATCTGTCCCACCTTAGGCGGCTGACTCCAAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTG TTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCATGCTGATC CGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATG AGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATA AGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAA CTTAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCT GACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGAT GTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCG TCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGTGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTA AAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTT GCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCAT ATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTTCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAAT GACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAAT AATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTT AGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGACCCGAA AGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTC CCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTG CCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCG CCTTTCAATTTCGAACCATGCAGTTCAAAATATTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTC TTATGGGCAAGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAATCCATTC GCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTGAGCCAGGATCAAACTCTA*GTATTGGGAA TTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCC TTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT CACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACT CACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGC
Borneo Journal of Medical Laboratory Technology (BJMLT), Vol 5 No 2 April 2023, Page 303 – 315
BLAST  ( Basic  Local  Alignment  Search  Tools )  dapat
dilihat pada Gambar 6
Gambar 6. Hasil BLAST isolat Pb B Bakteri Pereduksi Logam Pb.
Gambar 6. menunjukkan hasil analisis BLAST (Basic Local  Aligment  Search  Tools)  dari  bakteri  Pb  B adalah    Bacillus  cereus  strain  C-LM-2  16S ribosomal  RNA  gene,  partial  sequence,  sequence ini    diambil  sebagai  hasil  yang  paling  sesuai  dengan strain  DNA  yang  diperoleh  karena  memiliki  nilai Max Score dan total score sama yaitu 2761, query coverage100%,  e-value  sama  dengan  0  dan  max ident 99,60% Analisis filogenetik dengan
menggunakan  data  molekuler  seperti  DNA  atau protein  dapat  menggambarkan  hubungan  evolusi antar  spesies.  Hubungan  evolusi  diantara  sekuen digambarkan  dengan  menempatkan  sekuen  sebagai cabang  luar  dari  sebuah  pohon.  Hubungan  cabang pada  bagian  dalam  pohon  merefleksikan  tingkat dimana  sekuen  yang  berbeda  saling  berhubungan (Dharmayanti, 2011).
Gambar 7. Pohon Filogenetika  Pb B Berdasarkan Perbandingan Sekuens 16S rRNA
Ni’matul Murtafi’ah, Suci Rizki Nurul Aeni. 202 3. Identification of Pb Metal Reducting Bacteria In Bioremediation from Citarum River Water Samples Using 16s rRNA Gene Analysis

## Gambaran  Filogeni tree
Pada  Gambar  7.  dapat  dilihat  bahwa  bakteri Bacillus cereus tidak  berada  pada  cabang  maupun  node  yang sama  dengan  bakteri-bakteri  yang    ada  dalam  pohon filogenetik.  Bakteri  pereduksi  logam  Pb  isolate  Pb  B mempunyai  cabang  tersendiri,  terpisah  dari  kesepuluh bakteri yang ada dalam pohon filogenetik.Tetapi dalam tabel  homologi  Blast  diketahui  bahwa  isolat  Pb  B mempunyai homologi sekuens 16S rRNA paling dekat dengan Bacillus  cereus ,  hal  tersebut  menunjukkan bahwa secara filogenetik bakteri logam Pb pada sungai citarum  tidak  mempunyai  kesamaan  spesies  dengan kesepuluh  spesies  bakteri  di  dalam  pohon  filogenetik, tetapi  mempunyai  kemiripan  urutan  basa  sebesar 99,60%  dengan Bacillus  cereus strain  C-LM  16  S ribosomal  RNA  gene.  Isolat  Pb  B  memiliki  nenek moyang  yang  sama  tetapi  mengalami  perubahan  yang berbeda ketika berevolusi. Selain itu, bakteri isolat Pb B  bukan  merupakan  spesies  bakteri  baru  karena  nilai homologi isolat Pb Bberada pada persentase 99,60%.

## B. Pembahasan
Penelitian di mulai dari tahap pemurnian bakteri. Pada  penelitian  ini  menggunakan  sampel  dari  sungai citarum,  medium  yang  digunakan  adalah  media  NA (Nutrien  Agar).  Koloni  dimurnikan  dengan  cara  di streak  dalam  medium  NA  pada  cawan  petri.  Menurut Gofar (2012) Teknik ini diualang dengan cara subkultur hingga  didapatkan  koloni  tunggal  ,  sehgingga  koloni tunggal dapat di lakukan identifikasi lebih lanjut dengan karakteristik kolobni bersel satu. Selanjutnya jika koloni murni  selanjutnya  dilakukan  pewarnaan  gram  dan  uji biokimia.
Pewarnaan  gram  adalah  salah  satu  Teknik pewarnaan  yang  berfungsi  menentukan  kelompok bakteri gram positif dan gram negatif. Pewarnaan gram menggunal  kal  n  4  mal  cal  m  realgen  yal  itu  Kristal  l Violet, Iodine Lugol, Etal nol 96%, dan safralnin. Balkteri
yal ng mempunyali  sifat gral m positif al kal n berwal rna ungu,   sedal ngkal n  bal kteri    yal ng   memiliki    sifalt gralm  negaltif  alkaln berwarna  merah (Wulandari and Purwaningsih,  2019).  Setelalh  dilalkukan  pewal  rnalan gram  ,  diamati  di  bawah  mikroskop  dengan perbesaran  100x.  Hasil   pewal rnal  al n  gral  m   bal kteri  pal dal  preparat Pb B   al dal lal h gral m negal tif. Bal kteri gral m negal tif ini berwalrnal meral h  kal renal sel   bal kteri  mengikat warna  safranin,  bakteri  tersebut memiliki  bentuk  baltalng atau basil, (Pelczar and Chan, 2019).
Pada  Gram  negatif,  jumlah  lipid  yang  lebih tinggi  dalam  pembentukan  pori-pori  besar  sehingga memfasilitasi  kebocoran  kompleks  kristal  violet-iodin dan mengakibatkan dekolonisasi bakteri yang kemudian mengambil  pewarnaan  counter  kompleks.  Sebaliknya, dinding sel Gram positif tebal dan terutama terdiri dari protein  dan  mukopeptida  yang  berikatan  silang,  bila diwarnai  dengan  alkohol  menyebabkan  dehidrasi  dan penutupan  pori-pori  dinding  sel  karena  memiliki peptigolikan  yang  tebal  sehingga  tidak  memungkinkan hilangnya  kompleks  dan  sel  mempertahankan  noda primer (Varghese, 2014). Bakteri yang mempertahankan  pewarna  primer  tampak  biru  tua atau  ungu  dan  tidak  hilang  warnanya  bila  diwarnai dengan metode Gram disebut Gram positif, sedangkan bakteri  yang  kehilangan  kristal  violet  menggunakan pewarna  tandingan,  safranin  tampak  merah  disebut Gram negatif (Nurhidayati et al, 2015 ). Bagian luar dari lapisan peptidoglikan tersusun atas lapisan lipoprotein, fosfolipid,  dan  polimer  yang  unik  untuk  dinding  sel gram negatif yang disebut lipopolisakarida (Hamidah et al, 2019 ).
Isolalsi DNA palda  penelitian ini  menggunal kan metode wizal rd genomik  DNAl. DNA yang diperoleh mempunyali  kualitas  baik  (murni)  adalah  dapat digunakan  untuk  aplikasi  molekuler  lain  selain  proses
amplifikasi.  DNAdengan  kualitas  baik  akan  dipotong oleh enzim restriksi dengal n sempurnal   kal renal   tidal k al dal nyal    kontal minal n dal lal m  DNAl      yal ng menggal  nggu  kerjal          dal  ri  enzim  restriksi.  DNA yalng memiliki nilali  dibalwah 1.8 artinya terkontal minal si protein  pal dal      DNAl      salmpel ini diduga  kal renal      kural ng mal ksimal lnya   pal dal      sal al t prepital si DNA     sal mpel, sedal ngkal n  nilal i  dial tal s  2.0   artinya  kontaminasi  RNAl  ,  hal  l  ini  dibuktikan dengan  munculnyal                pital                RNA  pal da  gel agarosal  yal ng memiliki ukural n lebih  rendal h dal ripal dal   DNAl   genom  (kurang dari 250 bp)  Munculnyal kontal minal n  RNAl       bisal        disebal bkal n  oleh kural ng  mal ksimal lnyal              kerjal  RNA  pada  tahap purifikasi(Murtiyaningsih, 2017).
Prinsip  dari  teknik  PCR  adalah  memperbanyak bagian  spesifik    dengan  enzim  DNA  polymerase  yang diinisiasi  oleh  pelekatan  primer  menghubungkan deoksiribonukleotidamtrifosfat  (dNTP)  dalam  r eaksi termal  (Raven  and Johson, 2018). Optimalsi  metode PCR perlu  dilakukan untuk  mengefisienkan  waktu dan penggunaan  material  sehingga  pendeteksian  dapat dilakukan dengan cepat  dan  akurat  (Joko et  al,  2011 ).
Optimasi  PCR    harus    mencakup  konsentrasi  larutan yang  diperlukan  untuk  amplifikasi,  suhu  hibridisasi yang  diperlukan  untuk  setiap  primer.  Proses  sintesis dan  penggandaan DNA  menggunakan  PCR terdiri  dari tiga   tahap: denaturation, annealing, dan extension . Setiap tahap  tersebut  diatur  pada  kondisi  suhu  yang  berbeda (Wicaksono, 2013).
Elektroforesis  DNA  gel  merupakan  sebuah metode untuk memisahkan molekul  DNA  berdasarkan ukurannya  (Intarapanich et al, 2015 ).  Marker  DNA yang  digunakan    adalah   DNA  ladder 1    Kb,  serta  di elektroforesis    dengan  0,8%  TBE  Agarose.  Kelebihan dari gel  Agarosa  ini  lebih  mudah,  sederhana  dan  laju pemisahannya  lebih  cepat  membentuk    fragmen- fragmen  dan  tidak  bersifat   toksik  (Harahap,  2018). Hasil Elektroforesis  DNA  divisualisasikan dengan  sinar UV   dan  menunjukan hasil  positif  dengan terbentuknya
pita  DNApada  ukuran    ±1400bp.  Menurut Nikunjkumar  dan  Dhruvi (2012)  gen16SrRNA memiliki ukuran  cukup  panjang  jika  digunakan  keperluan bioinformatika  (±1500      bp)  dapat  mengaplifikasi daerah 16S rRNA dari seluruh bakteri. Selain itu, suhu annealing yang telah  dioptimasi  pada program untuk proses amplifikasi DNA juga berjalan dengan baik.
Sekuensing  yang  digunakan  pada  penelitian  ini menggunakan  metode  sanger.  Hasil  sekuensing  yang diperoleh  dari  1st  Base  Malaysia  selanjutnya dianalisis pada  Gen  Bank  menggunakan  analisis  BLAlST.  Analisis BLAST dilakukan dengan tujuan untuk membandingkan  hasil  yang  diperoleh  dengan  hasil sekuen  DNA  dari  seluruh  dunia  yang  didepositkan pada data base Gen Bank.
Halsil  BLAST  tersebut  berupa Max  Score dan Total  Score , Query  Cover , E-  Value dan Identities . Max Score dan Total Score adalah jumlah  keselarasan semua segmen  dari  urutan  data  base  yang  cocok  dengan urutan nukleutida. Query coverage adalah presentasi dari panjang nukleutida  yang selaras  dengan data  base yang terdapat  pada  BLAST  (Narita et  al,  2014 ).  Nilai E- Vallue merupakan nilai dugaan yang memberikan  ukuran statistik    yang    signifikan    terhadap    kedua  sekuens. Maka  apabila  nilai  E-value  yang  didapatkan  semakin tinggi  menunjukan  tingkat  homologi  antar  sekuens semakin    rendah,  sedangkan  nilai  E-value  y a n g s e m a k i n   rendah  menunjukan  tingkat  homologi antar  sekuens  semakin tinggi (Sabbathini and Pujiyanto, 2017).
Hasil BLAST menunjukkan bahwa Spesies isolat Pb B memiliki nilai Maximum score 2761, Total score 2761,  Cover  100%,  Identitas  99,60%,  daln  E-Value 0,0.Bakteri Bacillus  cereus memiliki  kemampuan  dalam mereduksi  logam  Pb.  Kemampuan  bakteri  dalam menurunkan  konsentrasi  logam  berat  Pb  disebabkan karena  kemampuan  bakteri  dalam  mengakumulasi logam  berat  Pb.  Bakteri  memiliki  permukaan  sel bermuatan  negatif  karena  terbentuk  dari  berbagai struktur  anion  seperti  gugus  karboksil  sedangkan
logam  berat  adalah  ion  bermuatan  positif  sehingga dapat  terjadi  ikatan  antara  permukaan  sel  bakteri  dan ion  logam  berat  Pb  akibat  dari  terjadinya  tarik- menarik. Bakteri dapat mengakumulasi logam berat Pb di  dalam  sel  membentuk  ikatan  antara  logam  berat dengan suatu protein dalam sel disebut metalotionein. Metalotionein  merupakan  protein  pengikat  logam (metal  binding  protein)  yalng  berperan  dalam  proses pengikatan  atau  penyekapan  logam  di  dalam  jaringan setiap makhluk hidup (Yulaipi and Aunurohim, 2013).
Analisis  Filogenetik  adalah  analisis  yang bertujuan  untuk  menyusun  hubungan  filogenetik digambarkan  dalam  suatu  garis  bercabang-cabang seperti  pohon  disebut  pohon  filogenetik  (Irawan, 2013).  Pohon  filogeni  adalah  sualtu  bentuk  gambaran dari  silsilah  makhluk  hidup  seperti  bakteri  yang bercabang-cabang  menyerupai  pohon  (Lubis,  2014). Analisis  filogenetik  menggunakan  data  molekuler seperti  DNA  atau  protein  dapat  menggambarkan hubungan evolusi antar spesies (Dharmayanti, 2011). Pohon  Filogenetik  di  desain  menggunakan  program MEGA  11,  dengan  menggunalkan  metode  Neighbor- Joining. Menurut Muzzazinah (2017) metode neighbor- joining merupakan dasar pembuatan pohon filogenetik berdasarkan  perbedan  antara  dua  sekuen  dimana pohon  filogenetik  dengan  nilai  bootstrap  tinggi setidaknya  diatas  70%  merupakan  pohon  filogenetik yang baik. Menurut Zein dan Sulandari (2009). Semakin panjang cabang pohon filogenetik maka semakin besar perubahan  evolusi  yang  terjadi  sehingga  semakin  jauh pula  kekerabatannyal.  Pada  desain  pohon  filogenetik menunjukkan  bahwa  isolat  Pb  B  memiliki  hubungan kekerabatan pada Bacillus cereus .

## KESIMPULAN
Isolat  Bakteri  Pb  B  yang  merupakan  bakteri gram positif yang diperoleh dari hasil batch penurunan kadar  logam Pb Sungai Citarum  memiliki kemampuan dalam  mereduksi  Logam  Pb  serta  Isolat  Bakteri  Pb  B
memiliki  kekerabatan  yang  sangat  erat  dengan  bakteri Bacillus cereus .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  ditunjukan  kepada  LLDIKTI IV  yang  telah  memfasilitasi  kegiatan  hibah  PDP  tahun 2022 serta LPPM Institut Kesehatan Rajawali telah memberikan  dukungan  dalam  melakukan penelitian.  Ketua  laboratorium  Institut  Kesehatan Rajawali  yang  telah  memberikan  izin  penelitian  di laboratorium Bakteriologi.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, R.Z., 2018. Mycoremediation to remove heavy metal  pollution  in  post-mining  areas  for farmland utilization.
Angraini,  N.,  Agustina,  T.E.  and  Hadiah,  F.,  2022.
Pengaruh  pH  dalam  Pengolahan  Air  Limbah Laboratorium  Dengan  Metode  Adsorpsi untuk Penurunan Kadar Logam Berat Pb, Cu, dan  Cd. Journal  Ilmu  Lingkungan , 20 (2), pp.345-355.
Awad,  G.E.,  Mostafa,  H.,  Danial,  E.N.,  Abdelwahed, N.A.  and  Awad,  H.M.,  2015.  Enhanced production  of  thermostable  lipase  from Bacillus cereus ASSCRC-P1 in waste frying oil based  medium  using  statistical  experimental design. Journal  of  Applied  Pharmaceutical Science , 5 (9), pp.007-015.
Besser,  J.,  Carleton,  H.A.,  Gerner-Smidt,  P.,  Lindsey, R.L.  and  Trees,  E.,  2018.  Next-generation sequencing technologies and their application to  the  study  and  control  of  bacterial infections. Clinical microbiology and infection , 24 (4), pp.335-341.
Besser,  J.,  Carleton,  H.A.,  Gerner-Smidt,  P.,  Lindsey, R.L.  and  Trees,  E.,  2018.  Next-generation sequencing  technologies  and  their  application  to the study and control of bacterial infections. Clinical  microbiology  and  infection , 24 (4), pp.335-341.
Das, N. and Chandran, P., 2011. Microbial degradation of  petroleum  hydrocarbon  contaminants:  an overview. Biotechnology research international , 2011 .
Dharmayanti,  N.L.P.I.,  2011.  Filogenetika  molekuler: metode taksonomi organisme berdasarkan sejarah evolusi. Wartazoa , 21 (1), pp.1-10.
Gofar, N., 2012. Aplikasi Isolat Bakteri Hidrokarbonoklastik asal Rizosfer Mangrove pada Tanah  Tercemar  Minyak  Bumi. Jurnal  Lahan Suboptimal: Journal of Suboptimal Lands , 1 (2).
Hamidah, M.N., Rianingsih, L. and Romadhon, R., 2019. Aktivitas antibakteri isolat bakteri asam laktat dari peda  dengan  jenis  ikan  berbeda  terhadap  E.  coli dan  S.  aureus. Jurnal  Ilmu  dan  Teknologi Perikanan , 1 (2), pp.11-21.
Harahap,  M.R.,  2018.  Elektroforesis:  Analisis elektronika  terhadap  biokimia  genetika. CIRCUIT: Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro , 2 (1).
Ihsan, Y.N., Fellatami, K., Permana, R., Mulyani, Y. and Pribadi,  T.D.K.,  2020.  ANALISIS  BAKTERI PEREDUKSI KONSENTRASI LOGAM TIMBAL Pb (CH3COO)  2  MENGGUNAKAN  GEN  16S Rrna. Jurnal  Kelautan:  Indonesian  Journal  of  Marine Science and Technology , 13 (2), pp.151-162.
Intarapanich,  A.,  Kaewkamnerd,  S.,  Shaw,  P.J.,
Ukosakit,  K.,  Tragoonrung,  S.  and  Tongsima,  S., 2015.  Automatic  DNA  diagnosis  for  1D  gel electrophoresis images using bio-image processing technique. BMC genomics , 16 (12), pp.1-11.
Irawan,  B.,  2013. Karsinologi  Dengan  Penjelasan Deskriptif  dan  Fungsional .  Airlangga  University Press.
Irmawati.2013  Perubahan  keragaman  genetik  ikan kerapu  tikus  (cromileptes  altivelis)  generasi pertama pada stok hatchery.
Jiménez-Montenegro,  L.,  Mendizabal,  J.A.,  Alfonso,  L. and  Urrutia,  O.,  2022.  DNA  extraction procedures  and  validation  parameters  of  a  real- time PCR method to control milk containing only A2 β -casein. Food Control , 142 , p.109259.
Joko,  T.,  Kusumandari,  N.  and  Hartono,  S.,  2011.
Optimasi metode PCR untuk deteksi Pectobacterium  carotovorum,  penyebab  penyakit busuk  lunak  anggrek. Jurnal  Perlindungan  Tanaman Indonesia , 17 (2), pp.54-59.
Kepel,  B.,  2015.  Fatimawali.  Penentuan  jenis  dengan analisis gen 16SrRNA dan uji daya reduksi bakteri resisten  merkuri  yang  diisolasi  dari  feses  pasien dengan  tambalan  amalgam  merkuri  di  Puskesmas Bahu  Manado. Jurnal  Kedokteran  Yarsi , 23 (1), pp.45-55.
Langden, S.S., Budiharjo, A. and Kusharyoto, W., 2017. TRANSFORMASI  DAN  KLONING  PLASMID PJ804:  77539  PADA  E.  coli  TOP’10. Jurnal Akademika Biologi , 6 (1), pp.65-70.
Lokapirnasari, W.P., Dewi, A.R., Fathinah, A., Hidanah, S.  and  Harijani,  N.,  2017.  Effect  of  probiotic supplementation  on  organic  feed  to  alternative antibiotic  growth  promoter  on  production performance and economics analysis of
quail. Veterinary world , 10 (12), p.1508.
Lott,  S.C.,  Wolfien,  M.,  Riege,  K.,  Bagnacani,  A., Wolkenhauer,  O.,  Hoffmann,  S.  and  Hess,  W.R., 2017.  Customized  workflow  development  and data modularization concepts for RNA-sequencing and  metatranscriptome  experiments. Journal  of biotechnology , 261 , pp.85-96.
Lubis, K., 2014. Cara pembuatan pohon filogeni. Jurnal Pengabdian Kepada Masyarakat , 20 (75), pp.66-69.
Murtiyaningsih,  H.,  2017.  Isolasi  DNA  genom  dan identifikasi kekerabatan genetik nanas menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA). Agritrop: Jurnal Ilmu-Ilmu
Pertanian (Journal of Agricultural Science) , 15 (1).
Muzzazinah, 2017. Metode filogenetik pada indigofera. Prosiding  Seminar  Nasional  Pendidikan  Biologi Dan Biologi, 25 – 40
Narita,  V.,  Arum,  A.L.,  Isnaeni,  S.  and  Fawzya,  N.Y., 2014.  Analisis  bioinformatika  berbasis  web  untuk eksplorasi enzim kitosanase berdasarkan kemiripan  sekuens. Jurnal  Al-Azhar  Indonesia  Seri Sains dan Teknologi , 1 (4), pp.197-203.
Nikunjkumar,  B.D., Dhruvil. 2012.  Molecular identification  of  bacteria  using  16s  rDNA sequencing. Gujarat University, Gujarat, India . Nurhidayati, S., Faturrahman, F. and Ghazali, M., 2015. Deteksi  bakteri  patogen  yang  berasosiasi  dengan Kappaphycus  alvarezii  (Doty)  bergejala  penyakit ice-ice. Jurnal Sains Teknologi & Lingkungan , 1 (2).
Pelczar,  M.J  &  Chan,  E.C.S,  2019  Dasar-dasar mikrobiologi. UI Press, Jakarta.
Raven  and  Johson,  2018.  Teknik  Perancangan  Primer Untuk Sekuen Gen Mdr-1 Varian 1199 Pada Sampel  Buffy Coat  Pasien  Anak Dengan  Lla .1: 105-111.
Sabbathini,  G.C.  and  Pujiyanto,  S.,  2017.  Isolasi  dan identifikasi bakteri genus Sphingomonas dari daun padi  (Oryza  sativa)  di  area  persawahan Cibinong. Jurnal Akademika Biologi , 6 (1), pp.59-64.
Suhendrayatna.  2001.  Bioremoval  logam  berat dengan menggunakan  mikroorganisme:  Suatu  Kajian Kepustakaan. Makalah. Disampaikan pada Seminar Bioteknologi, Kagoshima University, Tokyo.
Varghese,  N.P.P.,  Joy,  2014. Microbiology  Laboratory Manual Book. Kerala Agricultural University. India .
Wicaksono  ,N.B, 2013. Mesin  PCR pada Instrumentasi Laboratorium Klinik.125-137
Wulandari, D. and Purwaningsih, D., 2019. Identifikasi dan  karakterisasi  bakteri  amilolitik  pada  umbi Colocasia esculenta L. secara morfologi, biokimia, dan  molekuler. Jurnal  Bioteknologi  dan  Biosains Indonesia , 6 (2), pp.247-258.
Yulaipi,  S.  and  Aunurohim,  A.,  2013.  Bioakumulasi logam  berat timbal  (Pb) dan  hubungannya  dengan laju  pertumbuhan  Ikan  mujair  (Oreochromis mossambicus). Jurnal  Sains  dan  Seni  ITS , 2 (2), pp.E166-E170.
Zein  MSA  &  Sulandari  S,  2009.  Investigasi  Asal  Usul Ayam  Indonesia  menggunakan Sekuens
Hypervariable-1  D-loop  DNA  Mitokondria. Jurnal Veteriner.10(1):41 - 49.