## JUMLAH  OSTEOBLAS PADA PROSES PENYEMBUHAN TULANG PASCA IMPLANTASI HIDROKSIAPATIT SINTESIS DARI KALSIT

## (NUMBER OF OSTEOBLAST IN BONE HEALING PROCESS AFTER IMPLANTATION OF SYNTHETIC HYDROXYAPATITE FROM CALCITE)
Hengky Bowo Ardhiyanto*, Widowati Siswomihardjo**, Tetiana Haniastuti***
*Bagian Bedah Mulut Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Jember
Jl. Kalimantan 37 Jember ** Bagian Biomaterial *** Bagian Biologi Oral Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Gadjah Mada
Jl. Denta Sekip Utara, Yogyakarta 55281 E-mail: hengky_ardhiyanto@yahoo.com

## Abstract
Bone has natural repair mechanism, but there are some critical sized defects which will not allow the tissues to regenerate themselves. Hydroxyapatite (HA), a popular bone substitute material, can be  synthesized from many sources including rocks, namely calcite. The purpose of the present study is to investigate the number of osteoblast on bone healing process after  implantation  of  synthesized  HA  from  calcit  as  bone  graft.  Fifty-eight  Sprague  Dawley  rats  were  divided  into  3 groups. The first group was the group which the rats were implanted with  synthesized HA from calcite; the second group was the group which the rats were implanted with 200 HA; while the third group as control group. The defects (size 3 mm in diameter, depth 3mm) were created on the condyle of femur. Six rats of each group were sacrificed after the 14 th , 28 th , and  56 th days  after  the  implantation.  Specimens  were  then  processed  histologically  and  stained  with  haematoxylin- eosin.The results showed that the number of osteoblast in rats implanted with 200 HA were greater compared to the rats implanted with synthesized HA from calcite; however, the number of osteoblast in rats implanted with synthesized HA from calcite were greater compared to control group. Statistically there was no significant differences of the number of osteoblasts among groups (p>0.05). In conclusion, synthesized HA from calcite may increase the number of osteoblast in bone healing process although the increasing number was not significant.
Key words: hydroxyapatite, bone healing, osteoblast

## Abstrak
Tulang memiliki respons penyembuhan secara alami, namun defek yang besar seringkali menyebabkan tulang tidak dapat beregenerasi dengan  baik.  Hidroksiapatit (HA)  adalah  material  pengganti tulang  yang  sudah  sering digunakan  sebagai bone graft . Material ini dapat disintesis dari berbagai sumber, antara lain dari batuan kalsit. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui jumlah sel osteoblas pada proses penyembuhan tulang setelah diimplantasi dengan hidrosiapatit sintesis dari  kalsit  sebagai  material bone  graft .  Limapuluh  delapan  ekor  tikus Sprague  dawley dibagi  menjadi  3  kelompok. Kelompok  pertama  adalah tikus  yang diimplantasi  dengan  HA  kalsit, kelompok  kedua  adalah tikus  yang diimplantasi dengan  HA  200,  dan  kelompok  ketiga  tidak  mendapat  perlakuan  (kontrol).  Defek  dibuat  pada  kondilus  tulang  femur dengan  ukuran  yang  sama  (diameter  3mm  dan  kedalaman  3mm).  Enam  ekor  tikus  pada  masing-masing  kelompok dikorbankan  pada  hari  ke-14,  28  dan  56.  Spesimen  kemudian  diproses  secara  histologis  dan  diwarnai  dengan hematoksilin-eosin.  Hasil  penelitian  menunjukkan  jumlah  sel  osteoblas  pada  tikus  yang  diimplantasi  dengan  HA  200 lebih tinggi jika dibandingkan dengan HA sintesis kalsit. Jumlah sel osteoblas pada tikus yang diimplantasi dengan HA sintesis  kalsit  lebih  tinggi  bila  dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol,  secara  statistik  tidak  terdapat  perbedaan  yang bermakna  jumlah  osteoblas  antar  kelompok  (p>0,05).  Sebagai  kesimpulan,  implantasi  HA  sintesis  dari  kalsit  sebagai bone  graft dapat  meningkatkan  jumlah  sel  osteoblas  pada  proses  penyembuhan  tulang,  namun  peningkatannya  tidak bermakna.
Kata kunci: hidroksiapatit, penyembuhan tulang, osteoblas

## PENDAHULUAN
Dalam  praktek  bedah  mulut,  kerusakan  tulang pada daerah maksilofasial biasanya disebabkan oleh trauma, neoplasma, infeksi maupun kelainan konge- nital. 1 Kasus-kasus tersebut seringkali menimbulkan defek  pada  tulang.  Sampai  saat  ini  rekonstruksi defek  pada  tulang  masih  menjadi  tantangan  bagi para ahli bedah mulut, karena proses penyembuhan- nya  seringkali  mengalami  gangguan  atau  bahkan kegagalan. 2,3
Untuk membantu proses penyembuhan pada defek tulang  yang  besar,  perlu  dilakukan  terapi  dengan menggunakan  suatu  material  pengganti  yaitu bone graft .  Selain  harus  bersifat  biokompatibel, bone graft harus  memiliki  3  fungsi  dasar  yaitu  osteo- genesis, osteoinduksi, dan osteokonduksi. 4
Tingginya  tingkat  kebutuhan bone  graft me- nyebabkan  para  peneliti  dan  ahli  bedah  terus  me- ngembangkan material sintetis alloplast atau alloim- plant sebagai alternatif bone graft . Material tersebut berasal  dari  bahan  sintetik  non-logam  yang  diper- oleh  dari  bahan  keramik  (kalium  fosfat),  komposit dan polimer. 3
Komponen  utama  pembentuk  tulang  dan  enamel gigi pada manusia adalah hidroksiapatit (HA). 4 HA ternyata dapat disintesis dari bahan alam, salah satu- nya adalah dari  batuan kalsit. 5 Dalam geologi, kal- sit  kaya  akan  fosfor,  banyak  terdapat  pada  bekuan material  vulkanik  gunung  berapi,  batuan  metamor- fik,  dan  sedimen  contohnya  batu  gamping.  Kalsit merupakan  mineral  utama  pembentuk  batu  gam- ping,  dengan  unsur  kimia  pembentuknya  yaitu  kal- sium  (Ca 2+ )  dan  karbonat  (CO 3 ).  Karena  sifat kimiawinya  tersebut,  maka  kalsit  berpotensi  untuk dikembangkan sebagai bahan baku pembuatan HA. 5 Tingkat  keberhasilan  suatu bone  graft ditandai dengan distimulasinya osteoblas  ataupun pre osteo- blas. Bone graft diharapkan mampu menjadi media yang cocok bagi pre osteoblas untuk menempel dan berdiferensiasi  menjadi  osteoblas.  Osteoblas  ke- mudian  akan  mensekresi  matriks  tulang  baru  yang nantinya akan terkalsifikasi. 6 Penelitian ini bertujuan untuk  mengetahui  pengaruh  HA  sintesis  dari  kalsit terhadap  jumlah  sel  osteoblas  sebagai  parameter pada  proses  penyembuhan  pada  defek  tulang  tikus Sprague dawley.

## BAHAN DAN METODE
Jenis  penelitian  ini  merupakan  penelitian  eksperi- mental laboratoris, yang dilakukan di Laboratorium Biomedik  Fakultas  Kedokteran  Gigi  Universitas Jember.  Seluruh  prosedur  penelitian  ini  telah mendapatkan     persetujuan     dari     Komisi     Etik
Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.  Hidroksiapatit  sintesis  kalsit  (PT. Omya, Surabaya, Jawa Timur) dibuat melalui proses hydrothermal .
Kalsit  dikalsinasi  melalui  proses  reaksi  endother- mik dan dekomposisi pada karbonat atau hidroksida, sehingga  akan  membentuk  oksida  padat  dengan tujuan untuk mengurai CaCO 3 menjadi CaO. Proses ini dilakukan dengan cara memanaskan kalsit dalam oven dengan kenaikan temperatur bertahap 3 o C per menit hingga mencapai suhu 900 o C dan dipertahan- kan  selama 2  jam. Larutan Diamonium Hydrogen Phosphat (DHP) 0,5  M dibuat  dengan melarutkan serbuk DHP 132 M sebanyak 66 gr dalam akuades sebanyak  1  l.  Serbuk  kalsit  sebanyak  0,5  gram  di- campur dengan larutan DHP 0,5 M sebanyak 40 ml. Hasil  campuran  tersebut  kemudian  dipanaskan dengan microwave pada  daya  400  watt  selama  20 menit.  Larutan  yang didapat disaring dengan kertas saring, dibilas dengan  akuades,  kemudian dikering- kan dalam inkubator selama 5 jam pada suhu 50 o C. 5 Pembuatan bone  graft dilakukan  dengan  me- masukkan  serbuk  HA  sebanyak  35  mg  kedalam cetakan  yang  terbuat  dari  bahan stainless  steel ukuran diameter 3 mm dan ketebalan 3 mm. Setelah dimasukkan  dalam  cetakan,  serbuk  ditekan  dengan menggunakan  mesin  hidrolik  manual  bertekanan 120  Mpa  hingga  padat.  Bahan  kemudian  dikemas menggunakan  aluminium  foil  dan  disterilkan  de- ngan autoclave pada suhu 121 0 C selama 30 menit. 5
Limapuluh  delapan  ekor  tikus Sprague  dawley jantan  dan  sehat  dibagi  menjadi  3  kelompok  yaitu kelompok  tikus  yang  diimplantasi bone  graft HA sintesis  dari  kalsit,  kelompok  tikus  yang  diimplan- tasi bone graft HA 200 (Tai Hei, Tokyo, Japan), dan kelompok  kontrol.  Sebelum  dilakukan  perlakuan, tikus dianestesi secara intra muscular dengan meng- gunakan  Ketamin  hidroklorida  (dosis  8  mg/100 gram  berat  badan).  Defek  dibuat  pada  kondilus tulang  femur  berukuran  diameter  3  mm  dengan kedalaman 3 mm dengan menggunakan bur tulang. Setelah itu dilakukan implantasi material bone graft dan luka ditutup dengan menjahit flap .
Enam  ekor  tikus  dari  tiap-tiap  kelompok  di- korbankan  pada  hari  ke-14,  28,  dan  56  pasca  im- planttasi  dengan  cara  dekapitasi.  Kondilus  tulang femur  diambil  dan  difiksasi  dalam  larutan buffered formalin 10% dengan pH 7,4 selama 24 jam. Spesi- men  kemudian  ditanam  dalam  blok  parafin,  di- potong secara serial, dan diwarnai dengan Hematok- silin-Eosin (HE).
Sel  osteoblas  diamati  dengan  menggunakan  mi- kroskop   pembesaran   400   kali.  Jumlah  osteoblas dihitung pada 6 lapang pandang yang berbeda. Data yang  diperoleh  merupakan  rerata  jumlah  osteoblas
dari  6  lapang  pandang.  Data  selanjutnya  dianalisis dengan  menggunakan  uji one-way ANOVA  dan LSD.

## HASIL
Hasil  pengamatan  mikroskopis  pada  hari  ke-14 pada semua kelompok terlihat sel-sel osteoblas pada daerah di bawah lapisan periosteum dan endosteum, serta  daerah  tepian soft  callus yang  terbentuk  pada defek  tulang.  Pada  kelompok  implantasi  dengan menggunakan  HA  sintesis  kalsit  (Gambar  1A)  dan HA 200 (Gambar 2A) gambaran soft callus terlihat meluas mengitari tepian material implan sedangkan pada kelompok kontrol negatif gambaran soft callus mulai  mengisi  defek  tulang  yang  kosong  (Gambar 3A).

## A                              B                                 C
Gambar 1.  Gambaran  histologis  osteoblas  pada  proses pembentukan  tulang  pada  kelompok  tikus yang  diimplantasi  dengan  HA  sintesis  dari kalsit (Pembesaran 100x). (A) hari ke-14, (B) hari  ke-28,  (C)  hari  ke-56.  Bentukan  tulang baru  mengitari  tepian  material bone  graft (BG),  dan  sel osteoblas  berada  di tepian soft callus .  Pada  hari  ke-56  osteoblas  pada soft callus mulai  berubah  menjadi  osteosit  dan nampak  gambaran hard  callus .  SC= soft callus , HC= hard callus , BG= bone graft , P= periosteum, T=  tulang
Jumlah  osteoblas  pada  hari  ke-28  semakin  me- ningkat  pada  semua  kelompok  dibandingkan  de- ngan  hari  ke-14. Soft  callus mulai  meluas  ke  arah tepi bagian dalam material implan ke arah sumsum tulang  pada  kelompok  implantasi  dengan  meng- gunakan  HA  sintesis  dari  kalsit  (Gambar  1B)  dan HA  200  (Gambar  2B).  Pada  kelompok  kontrol, gambaran soft  callus tampak  mengisi  defek  tulang yang kosong (Gambar 3B).
Pada  hari  ke-56,  pada  semua  kelompok  jumlah osteoblas  mengalami  penurunan  dibandingkan  de- ngan hari ke-28. Pada kelompok implantasi dengan menggunakan  HA  sintesis  kalsit  (Gambar  1C)  dan HA  200  (Gambar  2C)  dan,  osteoblas  pada soft  ca- llus mengalami  perubahan  menjadi  osteosit  karena mengalami  kalsifikasi,  sedangkan  beberapa  sel osteoblast  yang  lainnya  berada  pada  bagian  perio- steum.

## A                            B                             C
Gambar 2.  Gambaran  histologis   osteoblas  pada  proses pembentukan  tulang  pada  kelompok  tikus yang  diimplantasi  dengan  menggunakan  HA 200  (Pembesaran  100x).  (A)  hari  ke-14,  (B) hari  ke-28,  (C)  hari  ke-56.  Bentukan  tulang baru  mengitari  tepian  material bone  graft (BG),  dan  sel osteoblas  berada  di tepian soft callus .  Pada  hari  ke-56  osteoblas  pada soft callus mulai  berubah  menjadi  osteosit  dan nampak  gambaran hard  callus .    SC= soft callus , HC= hard callus , BG= bone graft , P= periosteum, T= tulang
Pada beberapa daerah, soft callus mulai me-ngalami perubahan menjadi bentukan yang lebih padat yaitu hard  callus yang  membentuk  tulang  muda  atau woven  bone di  sekitar  tepi  dalam  material  implan. Pada  kelompok  kontrol,  gambaran soft  cal-lus mengisi defek tulang yang kosong (Gambar 3C).

## A                              B                             C
Gambar 3.  Gambaran  histologis  osteoblas  pada  proses pembentukan  tulang  pada  kelompok  kontrol negatif  (Pembesaran  100x  ).  (A)  hari  ke-14 terlihat  osteoblas  di  tepian soft  callus ,  (B) pada hari ke-28 bentukan tulang baru mengisi daerah  defek  tulang,  (C)  pada  hari  ke-56 osteoblas  pada soft  callus mulai  berubah menjadi osteosit dan nampak gambaran hard callus .  SC= soft  callus ,  HC= hard  callus , BG= bone graft , P= periosteum, T= tulang
Rerata  jumlah  sel  osteoblas  pada  kelompok  im- plantasi  HA  200  sedikit  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  kelompok  HA  sintesis  kalsit  (Tabel  1). Kedua kelompok implantasi tersebut memiliki jum- lah osteoblas yang lebih tinggi dibanding kelompok kontrol  negatif.  Namun,  secara  statistik  tidak  ter- dapat  perbedaan  jumlah  osteoblast  yang  bermakna antar  kelompok  (p>0,05).  Hal  ini  berarti  bahwa pemberian bone  graft implantasi  HA  pada  kedua kelompok  perlakuan  tersebut  menyebabkan  pe- ningkatan  jumlah  osteoblas,  walaupun   tidak   ber- makna.(Tabel 1).
Tabel 1.  Rerata  jumlah  osteoblas  pada  tiap  periode  hari
perlakuan Kelompok perlakuan Hari ke-14 Hari ke-28 Hari ke-56 Rerata ± SD Rerata ±SD Rerata ± SD HA 200 73,37 ± 5,37 95,20 ± 8,62 41,84 ± 5,59 HA sintesis kalsit 73,24 ± 4,20 95,12 ± 8,37 41,74 ± 4,99
Kontrol Negatif
68,65 ± 2,99 89,59 ± 8,22 37,68 ± 10,43

## PEMBAHASAN
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  terjadi peningkatan jumlah osteoblas pasca implantasi HA, walaupun peningkatannya tidak bermakna. Hal  ter- sebut kemungkinan disebabkan manipulasi material HA  yang  kurang  tepat  sehingga  menyebabkan  ma- terial  ini  menjadi  tidak  dapat  berfungsi  dengan maksimal  dalam  menstimulasi  sel  osteoprogenitor pada proses osteogenesis. Material HA yang dipakai dalam  penelitian  ini  kemungkinan  terlalu  kompak dan kurang porus. Porusitas pada bone graft sangat berpengaruh,  karena  luas  permukaan bone  graft akan  semakin  tinggi  sehingga  akan  meningkatkan sifat  osteokonduktifitas. 7 Kolonisasi  sel  osteoblas menjadi  lebih  cepat,  dan  materialnya  lebih  mudah untuk direabsorbsi. HA dengan pori yang intercom- nected akan  mempercepat  proses  vaskularisasi  se- hingga  akan  membentuk  ikatan  antar  tulang  yang sangat  kuat.  HA  berpori  sangat  penting  dalam menghubungkan  ikatan  antara  material  dengan  tu- lang.  Dimensi  dan  bentuk  pori  merupakan  faktor penting  terjadinya  proses  osteointegrasi.  HA inter- conected antar  pori  dengan  permukaan  kasar  akan memudahkan  penetrasi  sel  osteoblast  dan  menjadi media  yang  baik  bagi  sel  osteoblas  untuk  me- nempel. 8 Proses  penempelan  sel  osteoblas  ke  per- mukaan  matriks bone  graft berlangsung  secara perlahan-lahan  (biasanya  dalam  hitungan  jam) kemudian sel akan menyebar ke permukaan matriks bone  graft .  Proses  penempelan  sel  osteoblas  ke seluruh permukaan material bone graft biasanya ber- langsung  lama  (dalam  hitungan  jam),  tergantung pada kompatibilitas permukaan material bone graft, dan  ekspresi  dari  komponen  biologis  adhesif,  yang meliputi   sekresi  ECM  ( extra  cellular  matrix )  serta hasil  penempelan  sel  dengan  permukaan  material. Proses ini, dimediasi oleh formasi fokus adhesi dan pembentukan plak yang tersusun dari integrin trans- membran  yang menghubungkan  antara  sitoskeleton dengan  ECM  hasil  sekresi  antara  material  dengan sel. 9
Meskipun  tidak  bermakna,  rerata  jumlah   osteo-
blas pada HA 200 sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan HA sintesis kalsit. Hal tersebut kemungkin- an  disebabkan  oleh  perbedaan  struktur  HA.  Pe- meriksaan  dengan scanning  electron  microscopy menunjukkan bahwa bentuk partikel HA kalsit tidak beraturan  dengan  ukuran  tidak  homogen.  Partikel HA 200 cukup padat dan teraglomerasi serta mem- punyai  ukuran  partikel  yang  lebih  homogen.  Pe- nyebaran  pertikel  kedua  material  HA  ini  cukup merata  dengan  bentuk  permukaan  kasar.  Ukuran kristal  HA  sintesis  kalsit  lebih  besar  dibandingkan dengan  HA  200.  Hal  tersebut  kemungkinan  me- nyebabkan  HA  sintesis  kalsit  kurang  stabil  di- bandingkan dengan HA 200. 5 Tingkat homogenitas ukuran  partikel  material  juga  menentukan  respon adaptasi  sel  dengan  material  untuk  bisa  hidup.  Se- makin  sesuai  ukurannya  dengan  kondisi  tulang maka material tersebut semakin efektif. 7 Hasil kajian impurity material  HA  dengan  uji  karakterisasi ato- mic  absorption  spectroscopy ,  diketahui  bahwa  ter- dapat  perbedaan  rasio  Ca/P  antara  HA  200  dengan HA  sintesis  Kalsit.  Hal  ini  disebabkan  oleh  per- bedaan  kandungan  asam  fosfor  dan  kurang  sem- purnanya ikatan molekul Ca 2+ pada sisi kristal apatit, tetapi  kemurnian  HA  sintesis  kalsit  yaitu  1,6886 sudah  mendekati  standart  kemurnian  HA  stokio- metri (JCPDS 09-432) sebesar 1,6667. 5 Kandungan ion  Ca 2+ dan  P  ini  berfungsi  untuk  me-nentukan percepatan  derajad  mineralisasi callus dan  ke- butuhan  energi  sel  pada  proses  osteogenesis.  Ada- nya perbedaan-perbedaan inilah yang menyebabkan perbedaan  respon  sel  sel-sel  osteoprogenitor  antara HA sintesis kalsit dengan HA 200. Sel-sel osteopro- genitor dengan mudah akan menempati media yang cocok  dan  analog  dengan  kondisi  tulang  yang  se- benarnya  untuk  bisa  berproliferasi  dan  berdiferen- siasi untuk menstimulasi proses osteogenesis. 8
Pada  hari  ke-14  osteoblas  sudah  dapat  terlihat, walaupun  jumlahnya  tidak  sebanyak  pada  hari  ke 28.  Pada  hari  ke-14  merupakan  akhir  dari  fase  in- flamasi  dan  awal  fase  reparatif.  Pada  fase  ini  in- teraksi  antar  sel  akan  menstimulasi growth  factor , sitokin dan reseptor  yang menyebabkan  sel-sel me- senchymal  pluripoten  yang  berasal  dari  periosteum maupun dari sumsum tulang berdiferensiasi menjadi sel-sel fibroblas, kondroblas, dan osteoblas. 10 Osteo- induktif  faktor  ( Growth  factor )  seperti bone  mor- phogenetic protein (BMP) dan transforming growth factor -β  (TGF-β)  pada  HA  sebagai  material graft juga membantu menstimulasi formasi pembentukan tulang baru sehingga tampak peningkatan jumlah sel osteoblas pada hari ke-28. 10
Komposisi  perbaikan  jaringan  akan  berbeda  pada setiap harinya karena pada tulang akan memperbaiki stabilitas  secara  mekanik  menjadi  lebih  rigid  dan
stabil. Terlihat pada hari ke-56 jumlah sel osteoblas menurun.  Hal  ini  disebabkan  karena  terjadi  proses mineralisasi  tulang.  Proses  mineralisasi  tulang  di- sebabkan  oleh  osteoblas  yang  mensekresi  matriks ekstraseluler (ECM) yang terjadi pada fase reparatif antara  minggu  ke-2  hingga  hitungan  tahun.  Osteo- blas  berkumpul  pada  dasar  kavitas  resopsi  dan membentuk  osteoid  yang  mulai  untuk  mineralisasi dengan  rasio  ~1µm/hari.  Osteoblas  akan  mendepo- sisi  tulang  yang  baru  serta  pembuluh  darah  akan menyertai  osteoblast  tersebut.  Matriks  tulang  yang baru  terbentuk  tersebut  menyelimuti  osteosit  dan pembuluh darah membentuk sistem haversi. Osteo- blas  akan  terus  membentuk  dan  melakukan  mi- neralisasi osteoid hingga kavitas terisi. 6,10
Berdasarkan  hasil penelitian yang  telah dilakukan dapat  disimpulkan  bahwa  implantasi  HA  sintesis dari  kalsit  sebagai bone  graft dapat  meningkatkan jumlah  sel  osteoblas  pada  proses  penyembuhan tulang  walaupun  peningkatannya  tidak  bermakna. Penelitian  lebih  lanjut  perlu  dilakukan  untuk  me- nyempurnakan  preparasi  material  HA  sintesis  dari kalsit  sehingga  dapat  dijadikan  alternatif  material bone graft pada defek tulang.

## Daftar Pustaka
1. Greenberg  AM,  Prein  J.  Craniomaxillofacial  re- constructive  and  corrective  bone  surgery.  Principles of Internal Fixation Using the AO/ASIF Technique. New York: Springer-Verlag, 2002: 5.
2. Zhao  J,  Zhiyuan  Z, Shaoyi  W, Xiaojuan S, Xiuli Z,
Chen J, et al. Apatite-coated  silk  fibroin scaffolds to healing mandibular border defects in canines. J Bone 2009; 45: 517-27.
3. Rimondini  L,  Nicolò  NA,  Milena  F,  Gaetano  G, Matilde T, Giardino R. In vivo experimental study on bone  regeneration  in  critical  bone  defects  using  an injectable biodegradable PLA/PGA copo-lymer. Oral Surgery,  Oral  Medicine,  Oral  Patholog,  Bologna: Instituti Ortopedic Giardino 2004: 1-9.
4. Othsuki M. Bone-grafting materials their uses advan- tages and disadvantages. JADA 2002; 133: 1125-6.
5. Syamsuddin.  Analisis  uji  tekan  dan  porositas material  kompaksi  sinter  Ha/ZnO  sebagai  material substitusi  tulang.  Tesis, Yogyakarta:  Universitas Gadjah Mada, 2010: 28-45.
6. Lieberman  JR,  Friedlaender  GE.  Bone  regeneration and repair: Biology  and  clinical  applications, 1 st ed, New Jersey: Humana Press, 2005: 45-3, 241-61.
7. Peon E, Fuentes G, Delgado JA, Morejon L, Almirall A,  García  R.  Preparation  and  characterization  of porous  blocks  of  synthetic  hydroxyapatite.  Latin American Applied Research 2004: 34, 225-28.
8. Abdurrahim  T,  Sopyan  I.  Recent  progress  on  the development of porous bioactive calcium phosphate for  biomedical  applications.  Recent  Patents  on Biomedical Engineering 2008, 1, 213-29.
9. Liu  X,  Lim  JY,  Donahue  HJ,  Dhurjati  R,  Mastro AM,  Vogler  EA.  Influence  of  substratum  surface chemistry/energy and topography on the human fetal osteoblastic  cell  line  hFOB  1.19:  Phenotypic  and genotypic  responses  observed  in  vitro:  J  Bio- materials 2007, 28(31): 4535-50.
10. Miller MD, Hart JA, Thompson R. Review of ortho- paedics. 6 th ed. Virginia: Saunders, 2012: 11-5.