Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra
# Korespondensi:  Balai  Riset  Perikanan  Budidaya  Air  Tawar  dan Penyuluhan  Perikanan.  Jl.  Sempur  No.  1,  Bogor  16154, Indonesia Tel.  +  62  251  8313200 E-mail:  hestahamdani@gmail.com

## DUPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION UNTUK DETEKSI SIMULTAN KOI HERPESVIRUS
DAN Aeromonas hydrophila PADA IKAN MAS (Cyprinus carpio)
Hessy  Novita,  Tuti  Sumiati, Desy  Sugiani,  dan  Taukhid
Instalasi Riset Pengendalian Penyakit Ikan Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar dan Penyuluhan Perikanan Jl. Sempur  No. 1, Bogor 16154
(Naskah diterima: 16 September 2019; Revisi final: 10 Februari 2020; Disetujui publikasi: 10 Februari 2020)

## ABSTRAK
Koi herpesvirus (KHV) dan Aeromonas hydrophila adalah patogen yang dapat mengkoinfeksi ikan mas secara bersamaan. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode duplex polymerase chain reaction (dPCR), deteksi simultan untuk diagnosis KHV dan bakteri Aeromonas hydrophila pada ikan mas. Dua pasang primer yang menargetkan sekuen spesifik SphI dan gen aerolisin, yang sering digunakan untuk mendeteksi KHV dan A. hydrophila dalam uji reaksi tunggal PCR dan menghasilkan target pita PCR 290 bp dan 417 bp. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode duplex PCR dapat mendeteksi ganda infeksi KHV dan A. hydrophila pada ikan mas dan metode ini lebih efektif mendeteksi dua patogen secara bersamaan dalam satu reaksi PCR  pada  suhu  pradenaturasi,  94°C  selama  dua  menit,  denaturasi  pada  suhu  95°C  selama  satu  menit, annealing pada suhu, 55°C selama satu menit, dan 72°C selama satu menit, dengan 30 siklus amplifikasi dan final extention pada  suhu 72°C  selama lima  menit. Metode  dPCR untuk  deteksi simultan  kedua patogen adalah salah satu metode yang dapat diaplikasikan untuk deteksi koinfeksi virus dan bakteri dalam satu reaksi PCR.
KATA KUNCI: pathogen; duplex PCR, KHV; Aeromonas hydrophila; SphI; gen aerolisin
ABSTRACT: Duplex PCR for simultaneous detection of koi herpesvirus (KHV) and Aeromonas hydrophila in common carp (Cyprinus carpio). By: Hessy Novita, Tuti Sumiati, Desy Sugiani, and Taukhid
Koi herpesvirus (KHV) and Aeromonas hydrophila are pathogens that can co-infect common carp. This study aimed to develop a duplex polymerase chain reaction (dPCR) method to detect KHV and Aeromonas hydrophila in common carp simultaneously. Two pairs of primers targeted the specific sequences of SphI and aerolysin genes, often used in detecting KHV and A. hydrophila, in a single PCR reaction test and produced target bands of PCR 290 bp and 417 bp. This proposed method was more effective in simultaneously detecting the two pathogens in one PCR reaction at pre- naturation temperature of 94°C for two minutes, denaturation at 95°C for one minute, annealing at temperature, 55°C for one minute, and 72°C for one minute, with 30 cycles of amplification and final extension at 72°C for five minutes. The findings showed that the duplex PCR method could be used to double detect KHV and A. hydrophila infection in common carp. The duplex PCR method for simultaneous detection of both pathogens is one method that can be applied for the detection of co-infection of viruses and bacteria in a PCR reaction.
KEYWORDS: pathogen; duplex PCR; KHV; Aeromonas hydrophila; SphI; aerolisyn gene

## PENDAHULUAN
Koi  herpesvirus  (KHV)  atau  saat  ini  lebih  tepat disebut sebagai Cyprinid herpes virus-3 (CyHV-3) telah menimbulkan kerugian besar pada budidaya ikan mas (Cyprinus carpio) dan ikan  koi (Cyprinus carpio koi)  di seluruh dunia dengan penularan yang sangat cepat dan
virulensi yang tinggi sehingga menyebabkan wabah penyakit dengan mortalitas tinggi (Ronen et al., 2003). KHV  dapat  menyebabkan  kematian  massal  dengan mortalitas  80%-95%  dari  ikan  mas  dan  koi  yang dibudidayakan  sehingga  menyebabkan  kerugian ekonomi yang tinggi hampir di seluruh dunia antara lain  di  Jepang,  USA,  Israel,  negara-negara  di  Eropa, Afrika, dan Indonesia. Kerugian yang sangat besar pada industri akuakultur ini dapat terjadi dikarenakan ikan mas  dan  koi  merupakan  komoditas  utama  ikan konsumsi dan ikan hias.
Di  Indonesia,  penyebaran  penyakit  ini  telah terjangkit hampir semua daerah yang membudidayakan ikan mas. Budidaya ikan secara intensif, pameran ikan koi dan perdagangan di dalam dan luar negeri tanpa peraturan  dan  pembatasan  yang  tegas  dalam pemeriksaan  dan  penerapan  program  karantina merupakan penyebab cepatnya penyebaran penyakit ini  secara  global  (Gilad  et  al.,  2003;  Pikarsky  et  al., 2004). Penyakit virus  ini muncul pada saat  suhu air berkisar antara 18°C-28°C atau pada permissive tempera- ture (Gilad et al., 2003; Perelberg et al., 2003). Pada umumnya gejala klinis ikan mas yang terinfeksi KHV berupa  kerusakan  (nekrosis)  parah  pada  insang. Kematian  pada  ikan  yang  terinfeksi  teramati  mulai terjadi pada hari ketujuh setelah infeksi dan kematian dapat terus terjadi hingga mencapai mortalitas di atas 90% dalam waktu 2-3 minggu (Hedrick et al., 2000).
Infeksi KHV biasanya diikuti oleh adanya koinfeksi bakteri berupa luka atau bercak merah di permukaan tubuh yang disebabkan oleh bakteri seperti Aeromonas hydrophila  (Ye  et  al.,  2013).  Bakteri  Aeromonas hydrophila merupakan salah satu bakteri patogen yang membahayakan  bagi  budidaya  perikanan  air  tawar karena  dapat  menginfeksi  semua  stadia.  Bakteri  A. hydrophila  menyebabkan  penyakit  motile  aeromonas septicemia (MAS) atau penyakit bercak merah dengan gejala  klinis  berupa  luka  di  bagian  tubuh  ikan  dan bercak merah  pada bagian  tubuh. Infeksi  bakteri A. hydrophila  dapat  terjadi  akibat  perubahan  kondisi lingkungan, stres, perubahan suhu, dan ketika inang tersebut  telah  terinfeksi  oleh  virus,  bakteri  atau parasit  lainnya  (infeksi  sekunder),  oleh  karena  itu bakteri  ini  disebut  dengan  bakteri  yang  bersifat patogen oportunistik (Dooley et al., 1985).
Virus  KHV  yang  menginfeksi  ikan  mas  secara bersamaan dengan A. hydrophila sering ditemukan bila dilakukan  deteksi  secara  tunggal  dengan  PCR.  Dari masalah  tersebut  perlu  dilakukan  penelitian  untuk dapat  mendeteksi  virus  KHV  dan  A.  hydrophila  atau double  infeksi  dengan  metode  duplex  PCR.  Metode duplex  PCR  (dPCR)  merupakan  modifikasi  dari  PCR yang  memungkinkan  amplifikasi  secara  simultan dengan dua pasang primer untuk mengamplifikasi tem- plate DNA dalam satu reaksi tunggal untuk target yang berbeda.  Teknik  ini  digunakan  untuk  diagnosis penyakit yang berbeda dalam sampel yang sama (Belàk et al., 2009). Metode duplex PCR lebih efisien, hemat waktu, dan biaya jika dibandingkan dengan single PCR atau uniplex PCR. Beberapa peneliti telah menggunakan teknik  dPCR  untuk  deteksi  patogen,  Yasmon  et  al. (2010)  telah  mendeteksi  secara  simultan  Legionella species dan Legionella pneumophila dengan dPCR pada sampel air di Jakarta. Thanananta & Thanananta (2008) mendeteksi E. coli yang berasal dari air menggunakan
dPCR dengan target gen lacZ dan uidA. Penelitian ini bertujuan  untuk  mengembangkan  deteksi  simultan virus KHV dan bakteri A. hydrophila dalam satu reaksi PCR,  sehingga  nantinya  metode  ini  dapat  menjadi metode yang  lebih efektif dan efisein  dalam proses deteksi kedua patogen ini.

## BAHAN DAN METODE

## Tahap  Persiapan
Sampling  sampel  ikan  mas  sakit  dari  sentra budidaya ikan mas yaitu dari daerah Sukabumi, Danau Maninjau, dan sampel koleksi IRP2I, untuk isolasi DNA virus  KHV  dan  bakteri  A.  hydrophila,  perbanyakan dsDNA  dengan  metode  PCR  menggunakan  spesifik primer dengan reaksi tunggal PCR dan duplex PCR.

## Ektraksi DNA KHV dan Bakteri A. hydrophila
DNA  bakteri  A.  hydrohila  dikultur  pada  media trypticase soy broth (TSB) kemudian digores ke media trypticase soy agar (TSA) dan inkubasi pada 28°C selama 18  jam,  selanjutnya  bakteri  diekstraksi  dengan metode perebusan. Satu lup koloni diencerkan dengan ddH 2 O  500  µL  dan  diinkubasi  pada  suhu 100°C. Suspensi sel kemudian disentrifuse  pada 10,000 x g selama 10 menit pada suhu 4°C. Supernatan dibuang dan pellet dilarutkan dengan 50 ìL ddH 2 O, kemudian diukur konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh dengan  nannodrop,  dan  disimpan  pada  suhu  20°C sampai DNA digunakan sebagai template PCR.
Ekstraksi  DNA  KHV  dari  jaringan  yang  terinfeksi KHV  menggunakan  (gSYNC  DNA  extraction  kit  quick genoaid kit: geneaid) dilakukan dengan menggunakan petunjuk  ekstraksi  DNA  mengikuti  prosedur  yang tertulis  dalam  protokol  dari  kemasan  kit.  Sampel jaringan insang sebanyak 25 mg digerus sampai hancur menggunakan pestle lalu dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 mL. Hasil gerusan ditambahkan 200 µL GST Buffer dan 20 µL proteinase K, di- vortex dan selanjutnya mengikuti protokol yang telah tersedia pada kemasan kit.  Hasil  ekstraksi  DNA  kemudian  disimpan  dalam freezer -20°C sebelum diamplifikasi dengan mesin PCR.

## Single PCR
DNA  KHV  dan  bakteri  A.  hydrophila  dari  sampel ikan  mas  yang  telah  diekstraksi  kemudian  masing- masing diamplifikasi dengan PCR. Komposisi larutan PCR untuk deteksi KHV dan A. hydrophila pada 25 µL/ reaksi  dengan  mencampurkan  master  mix 12,5  µL (promega); nuclease free water 8,5 µL; primer 10 pmol untuk forward 1 µL; reverse 1 µL; dan template DNA 2 µL. Proses amplifikasi menggunakan masing-masing dua  pasang  primer  yang  spesifik  untuk  KHV  dan  A. hydrophila.  Untuk  mendeteksi  KHV  menggunakan
primer KHV yang dimodifikasi oleh Yuasa et al. (2005) dan standar OIE (2016), sedangkan primer yang untuk deteksi A.  hydrophila  berdasarkan rujukan  literature (Nam  &  Joh,  2007)  yang  telah  dimodifikasi,  urutan primer, dan ukuran produk amplifikasinya dapat dilihat pada Tabel 1.

## Optimasi  Duplex  PCR  (dPCR)
Optimasi  dPCR  untuk  simultan  deteksi  KHV  dan A. hydrophila dalam reaksi PCR dilakukan berdasarkan Tabel 2. diketahui suhu setiap primer berbeda-beda sedangkan prinsip kerja dPCR yaitu menggunakan dua pasang  primer  dalam  satu  kali  running  PCR  dengan suhu PCR yang sama. Oleh karena itu, perlu dilakukan optimasi kondisi suhu PCR terlebih dahulu. Optimasi awal dilakukan dengan menggunakan uniplex PCR untuk menentukan suhu annealing optimum masing-masing primer kemudian dilanjutkan dengan optimasi dPCR. Kisaran gradien suhu yang digunakan dalam optimasi suhu annealing kedua pasangan primer adalah 55°C; 56°C;  60°C;  63°C;  dan  67°C  dengan  reaksi  PCR  30 siklus, 35 siklus, dan 40 siklus. Hasil optimasi suhu pada single kemudian digunakan dalam dPCR, faktor lain  yang  diperhatikan dalam  dPCR  adalah  optimasi konsentrasi master mix dan primer.  Komposisi dPCR untuk membuat campuran menggunakan master mix KAPA 2G fast multiplex dapat dilihat pada Tabel 3.

## Running  Elektroforesis
Agarose ditimbang 1,5%; kemudian dilarutkan dalam 100  mL  TAE  satu  kali,  agarose  dipanaskan  sampai
mendidih dengan microwave, larutan agar didinginkan hingga  suhu  60°C  selama  kurang  lebih  15  menit, kemudian  dicetak  dalam  tray  agarose  yang  telah dilengkapi  dengan  sisir  untuk  membentuk  sumur- sumur  gel.  Gel  didiamkan  sampai  mengeras  (30-45 menit). Setelah mengeras, gel diambil dan diletakkan ke  dalam  bak  elektroforesis  yang  berisi  buffer  TAE satu kali. Amplicon PCR sebanyak 10 µL diberi load- ing  dye  sebanyak  2 µL,  di- running  dalam  gel elektroforesis bersama-sama dengan 5 µL DNA marker 100 bp. Setelah semua hasil PCR diinjeksikan ke dalam sumur-sumur  gel  elektroforesis,  selanjutnya elektroforesis dijalankan dengan tegangan 100 volt, selama 25 menit.

## Visualisasi  Hasil  Amplifikasi
Gel  hasil  elektroforesis  direndam  dalam  larutan ethidium bromida (konsentrasi 10 µ/100 mL aquadest) selama  15  menit.  Selanjutnya  gel  dibilas  dengan aquadest  selama  10  menit.  Gel  hasil  elektroforesis diamati menggunakan geldoc yang sekaligus dilakukan pengambilan foto untuk dokumentasi dengan kamera digital  dengan  target  pita  PCR  417  bp  untuk  A. hydrophila dan KHV pada taget pita PCR 290 bp.

## Limit of Detection (LOD) dPCR KHV dan A. hydrophila
LOD (limit of detection) dari dPCR DNA KHV dan A. hydrophila adalah melakukan pengenceran serial DNA dengan konsentrasi yang digunakan untuk pengujian adalah 100 ng/mL, 10 ng/mL, 1 ng/ml, 100 pg/mL, 10
Tabel 1. Reaksi  PCR  dan  primer  untuk  mendeteksi  KHV  (OIE,  2016;  Yuasa  et  al.,  2005)  dan A. hydrophila (Nam & Joh, 2007)
Table 1. PCR reactions and primer for detecting KHV (OIE, 2016; Yuasa et al., 2005) and A. hydrophila (Nam & Joh, 2007)
Target gen Gene target Target spesifik Specific target Produk PCR PCR product  (bp) Pradenaturasi (Predenaturation ) : 94°C; 30 detik (seconds ) Denaturasi (Denaturation ) : 94°C; 30 detik (seconds ) Annealing : 63°C; 30 detik (seconds ) Extention : 72°C; 30 detik (seconds ) Final-extention : 72°C; 7 menit (minute ) Jumlah siklus (Number of cycles ) : 40 siklus (cycle )
Pradenaturasi (Predenaturation ) : 94°C; 2 menit (minute )
Denaturasi (Denaturation ) : 94°C; 1 menit (minute ) Annealing : 56°C; 30 detik (seconds ) Extention : 72°C; 45 detik (seconds ) Final-extention : 72°C; 5 menit (minute )
Jumlah siklus (Number of cycles ) : 30 siklus (cycle )
F;  5’- GAG CGA GAA GGT GAC CAC CAA GAA C-3’ R; 5’-TTC  CAG TCC  CAC CAC TTC ACT  TCA C-3’
Sekuen Primer (5’ ke 3’,) dan suhu PCR Primer sequence (5 'to 3',) and PCR temperature
A. hydrophila 417 290 SphI KHV F-5’GAC ACC ACA TCT GCA AGG AG3’ R-5’GAC ACA TGT TAC AAT GGT CGC-3” Aerolisin
pg/mL, 1 pg/mL. 100 fg/mL, 10 fg/mL, 1 fg/mL, dan 100 Ag/mL. Pengenceran dilakukan dengan menambahkan ddH 2 O  dan  diamplifikasi  menggunakan  dPCR, selanjutnya dielektroforesis dan dokumentasi. Kode sampel untuk menghitung LOD adalah KHV2 dan AH.

## HASIL DAN BAHASAN
Isolasi  KHV  dan  A.  hydrophila  dari  jaringan  ikan mas  diperoleh  dari  daerah  budidaya  ikan  mas  yaitu Sukabumi,  Danau  Maninjau,  dan  isolat  koleksi Laboratorium  Instalasi  Riset  Pengendalian  Penyakit Ikan (IRP2I). Ikan mas yang diisolasi kedua patogen tersebut tidak semuanya menunjukkan terinfeksi oleh ko-infeksi KHV dan A. hydrophila yang bisa dilihat dari Tabel 4.
Gejala ikan yang terinfeksi ko-infeksi KHV dan A. hydrophila adalah pada insang ditemukan bercak putih, geripis  di  pinggir  insang,  adanya  luka,  dan
pembengkakan di hati dan ginjal (Gambar 1). Biasanya kondisi ini diikuti dengan infeksi sekunder bakterial seperti  kulit  melepuh  maupun  luka  borok  di permukaan tubuh, kadang-kadang disertai pendarahan pada  sirip/badan.  Koleksi  sampel  isolat  tersebut dipreparasi dengan identifikasi uji PCR. Pada uji PCR menggunakan  metode  single  PCR  dan  dilanjutkan dengan pengujian deteksi duplex PCR.

## Single PCR
Hasi deteksi single PCR, DNA KHV dan A. hydrophila dari jaringan yang terinfeksi menunjukkan hasil PCR positif KHV dan A. hydrophila, pada pita DNA 290 bp. Sedangkan A. hydrophila terdeteksi pada pita DNA 417 bp. Hasil PCR pada kedua patogen yang menginfeksi ikan  mas,  memperlihatkan  bahwa  masing-masing patogen  dapat  dideteksi  secara  tunggal  dengan menggunakan  PCR.  Sehingga  dapat  dikembangkan untuk uji dPCR, dengan optimasi suhu PCR, terutama
Tabel 2. Optimasi suhu dPCR berdasarkan modifikasi pada suhu annealing single PCR
Table 2. Optimization of dPCR temperature based on modification of a single PCR annealing temperature
Tabel 3. Optimasi konsentrasi mastermix KAPA2G Fast Multiplex berdasarkan modifikasi dari manual dari kit
Table 3. The concentration optimization of KAPA2G Fast Multiplexmastermix modi- fied from the kit manual Larutan PCR (PCR mix ) Jumlah (Amount ) (µL) Buffer 12.5 F/R primer KHV (10 pmol) 1; 1.5 F/R primer aerolisin (10 pmol) 1; 1.5 DNA KHV 2 DNA A. hydrophila 2 Nuclease free water 6.5; 5.5 Tahapan PCR (PCR step ) Suhu PCR (PCR temperature ) Pradenaturasi 94°C selama 2-5 menit (94°C for 2-5 minute ) 95°C selama 1 menit (95°C for 1 minute ) 55°C 56°C 60°C 63°C 67°C Selama 30 detik; satu menit (For 30 seconds; one minute ) Extention 72°C selama 30 detik; satu menit (72°C for 30 seconds; one minute ) Final Extention 72°C selama lima menit (72°C for five minute ) Siklus (Cycle ) 30, 35, 40
Denaturasi Denaturation Annealing
untuk  masing-masing  suhu  annealing  pada  kedua patogen baik KHV dan A. hydrophila yaitu pada rentang suhu  63°C  dan  56°C.  Sampel  ikan  yang  terdeteksi positif  ko-infeksi  KHV  dan  A.  hydrophila  digunakan sebagai  sampel  untuk  uji  optimasi  duplex  PCR  yang bisa dilihat pada Gambar 4 dan 5.
Tabel 4. Hasil skrining isolat KHV dan A. hydrophila dari daerah Sukabumi, Danau Maninjau, dan IRP2I
Table 4. Screening results of KHV and A. hydrophila isolates from Sukabumi, Maninjau Lake, and IRP2I Asal daerah (Origin ) Koi Herpes Virus (KHV) Aeromonas hydrophila Sukabumi Dua isolat (Two  isolate ) Satu isolat (One isolate ) Danau Maninjau (Lake  Maninjau ) Dua isolat (Two isolate ) - IRP2I Satu isolat (One isolate ) Satu isolat (One isolate ) Gambar 1. Koleksi sample jaringan insang dari ikan yang terinfeksi KHV (tanda infeksi ditunjukkan dengan bercak putih pada insang).
Figure 1. Collection of gills’ samples from KHV-infected common carp (sign of infection is shown by the appearance of white patches on the gills).
Gambar 2. Deteksi KHV dengan single PCR, dengan target pita DNA KHV pada 290 bp. M; marker 100 bp, (1) sampel Sukabumi-1, (2) sampel Sukabumi-2, (3) sampel Danau Maninjau-1, (4) sampel Danau Maninjau-2, (5) sampel IRP2I, (6) kontrol negatif, (7) ) kontrol positif.
Figure 2. Detection of KHV with a single PCR, targeting the DNA KHV band at 290 bp. M: marker 100 bp, (1) Sukabumi sample-1, (2) Sukabumi sample-2, (3) Maninjau Lake sample-1, (4) Maninjau Lake sample-2, (5) IRP2I sample, (6) negative control, (7) positive control
Pada pengujian deteksi KHV dan A. hydrophila telah diketahui konsentrasi dan kemurnian dengan nanodrop yang bisa dilihat pada Tabel 5. Nilai kemurnian DNA dapat  ditentukan  dengan  besarnya  nilai  rasio absorbansi A 260/280 . Hasil pengukuran nilai kemurnian DNA  sampel  ikan  mas  yang  terkena  KHV  (Tabel  4.)
290 bp M 1 2 3 4 5 6 7
memberikan  hasil  berkisar  antara  1,84-1,96  dan konsentrasi  DNA-nya  berkisar  99,5-197,6  ng/mL. Sedangkan  untuk hasil  pengukuran nilai  kemurnian DNA A. hydrophila (Tabel 4) memberikan hasil berkisar antara  1,90-2,20  dan  konsentrasi  DNA  nya  berkisar 137,1-295,6 ng/mL. Menurut Sambrook et al. (2001), hasil isolasi DNA dikatakan murni jika nilai rasio antara 1,8-2,0.

## Optimasi  Duplex  PCR
Optimasi  dilakukan  untuk  mendapatkan  reaksi duplex PCR yang paling optimum dengan melakukan single  PCR  pada  tahap  awal.  Adapun  optimasi  yang dilakukan meliputi konsentrasi master mix yang dipakai, suhu annealing, dan waktu/lama extention. Optimasi PCR dengan reaksi amplifikasi menggunakan dua pasang primer  dengan  variasi  suhu  annealing,  agar mendapatkan  kondisi  PCR  yang  optimal  dan
menghasilkan produk PCR spesifik atau terbentuk pita DNA  dengan  ukuran  yang  sesuai.  Tidak  terbentuk dimer  primer,  smear  atau  multi  band,  dan  yang terpenting untuk mencari suhu annealing yang tepat agar semua  primer dapat bekerja. Suhu  optimal an- nealing  untuk  duplex  PCR  KHV  dan  A.  hydrophila ditentukan dengan pemeriksaan visual dengan hasil pita  DNA  pada  gel  agarose.  Suhu  optimal  annealing didefinisikan  sebagai  suhu  annealing  yang menghasilkan  produk  PCR  spesifik  tertinggi  sesuai dengan target pita DNA KHV dan A. hydrophila. Pada suhu annealing 60°C dan 63°C, intensitas pita 290 bp DNA KHV masih terdeteksi dan DNA A. hydrophila pada 417 bp menunjukkan pita DNA negatif, dan pada suhu annealing dari 67°C kedua gen target negatif (Gambar 4). Sedangkan DNA KHV dan A. hydrophila, pita DNA spesifik  menunjukkan  DNA  positif  terdeteksi  pada suhu annealing dari suhu 55°C dan 56°C.
Gambar 3. Deteksi A. hydrophila dengan single PCR, dengan target pita DNA pada 417
bp.  M:  marker  100  bp,  (1)  kontrol  negatif,  (2)  kontrol  positif,  (3)  sampel Sukabumi, (4) sampel IRP2I, (5) sampel Danau Maninjau-1.
Figure 3. Detection of A. hydrophila with a single PCR, targeting the DNA KHV band at 417 bp.  M:  marker  100  bp,  (1)  negative  control,  (2)  positive  control,  (3)  Sukabumi sample, (4) IRP2I sample, (5), Maninjau Lake-1 sample.
M          1            2            3           4           5 417 bp
Tabel 5. Hasil pengukuran konsentrasi DNA isolat KHV dan A. hydrophila dari ikan mas Table 5. The results of measurement of KHV and A. hydrophila DNA isolate concentrations from common carp Isolat Isolate Konsentrasi DNA DNA concentration  (ng/mL) Kemurnian DNA DNA purity  (280/260) KHV-1 99.5 1.85 KHV-2 130.8 1.88 KHV-3 98.2 1.96 KHV-4 97.3 1.83 KHV-5 197.6 1.84 AH-1 295.6 1.86 AH-2 206.9 2.20
Suhu annealing optimal dari primer yang digunakan untuk DNA KHV dan A. hydrophila adalah pada suhu 55°C (Gambar 5). Gambar 5 menunjukkan visualisasi DNA  KHV  A.  hydrophila  dari  sampel  yang  terinfeksi ko-infeksi  KHV  dan  bakteri  A.  hydrophila,  pita  DNA menunjukkan  positif  virus  KHV  dan  bakteri  A. hydrophila  pada  ukuran  290  bp  dan  417  bp.  Hasil optimasi untuk amplifikasi DNA dengan menggunakan termalcycler  dengan  suhu  dPCR  sebagai  berikut: pradenaturasi  pada  suhu  94°C  selama  dua  menit, denaturasi pada suhu 95°C selama satu menit, anneal- ing pada suhu, 55°C selama satu menit, dan extention
72°C selama satu menit, diikuti siklus amplifikasi 30 dan final extention pada suhu 72°C selama lima menit dengan komposisi master mix adalah untuk 25 µL/reaksi dengan master mix 12,5 µL; nuclease free water 6,5 µL; primer 10 pmol untuk forward 1 µL, reverse 1 µL, dan template DNA masing-masing 2 µL.
Pada  proses  optimasi  telah  berhasil  dilakukan amplifikasi  KHV  dan  A.  hydrophila  secara  simultan menggunakan  duplex  PCR  di  dalam  satu  campuran reaksi yang sama sehingga akan muncul dua pita pada satu lane.  Pada tahap  ini  tidak  ditemukan pita  non-
Gambar 4. Hasil deteksi duplex PCR KHV A. hydrophila pada suhu annealing (a) 60°C, (b) 63°C, dan (c) 67°C. M: marker (100 bp), (1) sampel-1, (2) sampel-2, (3) kontrol positif  pada 290 bp, 417 bp, (4) kontrol negatif (-).
Figure 4. Results of detection of duplex PCR KHV A. hydrophila at annealing temperature (a) 60°C, (b) 63°C, and (c) 67°C. M: marker (100 bp), (1) sample-1, (2) sample-2, (3) positive control at 290 bp, 417 bp, (4) negative control (-).
Gambar 5. Hasil deteksi dPCR KHV A. hydrophila pada suhu annealing 55°C dan 56°C. M: marker (100 bp), (1) sampel-1, (2) sampel-2, dinyatakan positif (+) bila muncul pita PCR pada 290 bp, 417 bp, (3) kontrol positif  pada 290 bp, 417 bp, (4) kontrol negatif (-), tidak menghasilkan pita.
Figure 5. Results of  detection of dPCR of  KHV A.  hydrophila at  annealing temperatures  of 55°C and 56° C. M: marker (100 bp), (1) sample-1, (2) sample-2, stated of positive (+) if the PCR band appears at 290 bp, 417 bp, (3) positive control at 290 bp, 417 bp, (4) negative control (-), does not result of band. 417 bp 290 bp 290
M            1             2            3            4 M                    1             2           3           4
55 ° C                                                               56 ° C 290 bp ° M       1        2        3       4                M       1        2       3       4                M        1       2       3       4 a. 60 ° C                                                      b. 63 ° C                                           C.   67 ° C
spesifik  yang  berukuran kecil  dan  ukuran  amplikon untuk  masing-masing  target  sudah  sesuai.  Hasil  ini disebabkan  karena  penurunan  suhu  annealing, kesesuaian konsentrasi primer, dan volume DNA tem- plate. Konsentrasi primer yang terlalu rendah atau yang terlalu  tinggi  dapat  menyebabkan  tidak  terjadinya proses  amplifikasi  (Harini  et  al.,  2008).  Selain  itu, faktor utama yang membedakan antara PCR single dan duplex adalah penambahan jumlah primer dalam satu reaksi, yaitu satu pasang primer untuk PCR single dan dua pasang primer untuk duplex PCR (Rizal et al., 2018). Metode  deteksi  PCR  yang  digunakan  dalam pendeteksian  keberadaan  virus  dan  bakteri  sangat berperan  dalam  melakukan  pendeteksian  dini  dan cepat terhadap keberadaan lebih  dari satu penyakit yang  menyerang  ikan  mas.  Deteksi  ko-infeksi  virus dan bakteri penyebab penyakit KHV-MAS pada pada ikan  mas  adalah  dengan  menggunakan  PCR  reaksi tunggal yang memerlukan waktu kurang lebih tiga jam dengan  40  siklus  sedangkan  dengan  dPCR  hanya membutuhkan waktu hanya dua jam dengan 30 siklus.

## Limit Deteksi Duplex KHV  A.  hydrophila
Limit  of  detection  (LOD)  adalah  nilai  konsentrasi terendah  deteksi  yang  dapat  dilakukan.  Nilai  LOD ditentukan dengan melihat konsentrasi minimum DNA KHV dan A. hydrophila yang dapat tervisualisasi oleh elektroforesis dan menunjukkan band sepanjang 247 bp dan 290 bp. Hasil dari masing-masing konsentrasi DNA  KHV  A.  hydrophila  dengan  mengencerkan konsentrasi  DNA  tersebut  menjadi  beberapa  serial berikut; 100 ng/mL, 10 ng/mL, 1 ng/mL, 100 pg/mL, 10 pg/mL, 1 pg/mL, 100 fg/mL, 10 fg/ml, 1 fg/mL, dan 100 Ag/mL. Sebagai target dPCR dalam menentukan batas deteksi  dari  pengujian  yang  akan  dilakukan (Gambar 6).
Gambar 6 merupakan hasil visualisasi PCR dengan konsentrasi  100  ng/mL  sampai  100  Ag/mL, menunjukkan bahwa band atau pita hasil amplifikasi dPCR  yang  masih  terlihat  tebal  dan  jelas  terdeteksi pada konsentrasi 1 pg/mL.

## KESIMPULAN
Ko-infeksi  oleh  KHV  dan  A.  hydrophila  penyebab penyakit  KHV-MAS  pada  ikan  mas  dapat  dideteksi simultan melalui pengujian menggunakan PCR dengan suhu optimasi pradenaturasi pada suhu 94°C selama dua  menit,  denaturasi  pada  suhu  95°C  selama  satu menit, annealing pada suhu, 55°C selama satu menit, dan 72°C selama satu menit, diikuti siklus amplifikasi 30 dan final extention pada suhu 72°C selama lima menit dengan komposisi master mix adalah untuk 25 µL/reaksi dengan master mix 12,5 µL; nuclease free water 6,5 µL; primer 10 pmol untuk forward 1 µL, reverse 1 µL dan template DNA masing-masing 2 µL. Metode duplex PCR untuk deteksi simultan kedua patogen adalah salah satu metode yang dapat diaplikasikan untuk deteksi ko-infeksi virus dan bakteri dalam satu reaksi PCR.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian dibiayai oleh Anggaran Pendapatan Biaya Negara  (APBN)  2016.  Penulis  ucapkan  terima  kasih kepada  Instalasi  Riset  Pengendalian  Penyakit  Ikan (IRP2I),  Depok,  Balai  Riset  Perikanan  Budidaya  Air Tawar dan Penyuluhan Perikanan (BRPBATPP), Bogor. Penulis  juga  mengucapkan  terima  kasih  pada Muslikha, Ainin M., Ahmad Wahyudi, dan Johan Afandi yang telah membantu dalam penelitian ini.

## DAFTAR  ACUAN
Belák, S., Thorén, P., LeBlanc, N., & Viljoen, G. (2009).
Advances in viral disease diagnostic and molecu-
Gambar 6. Visualisasi DNA konsentrasi; (1) 100 ng/mL, (2) 10 ng/mL, (3) 1 ng/mL, (4) 100 pg/mL, (5) 10 pg/mL, (6) 1 pg/mL, (7) 100 fg/mL, (8) 10 fg/mL, (9) 1 fg/mL, (10) 100 Ag/mL, (11) kontrol negatif, (12) kontrol positif, (13) M; Marker 100 Bp. Figure 6. Visualization of DNA concentration; (1) 100 ng/mL, (2) 10 ng/mL, (3) 1 ng/mL, (4) 100 pg/mL, (5) 10 pg/mL, (6) 1 pg/mL, (7) 100 fg/mL, (8) 10 fg/mL, (9) 1 fg/mL, (10) 100 Ag/mL. (11) negative control, (12) positive control. (13) M; Marker 100 Bp.
1      2     3     4      5     6      7      8     9    10    11    12   13 417 bp 290 bp
lar epidemiological technologies. Expert Review of Molecular Diagnostics, 9(4), 367-381.
Dooley, J., Lallier, R., Shaw, D.H., & Trust, T.J. (1985).
Electrophoretic and immunochemical analyses of the  lipopoly saccharides  from  various strains  of Aeromonas hydrophila. J. Bacteriol., 164(1), 263-9.
Gilad, O.,  Yun, S.,  Andree, K.B.,  Adkison, M.A.,  Way, K.,  Willits,  N.H.,  Bercovier,  H.,  &  Hedrick,  R.P. (2003):  Molecular  comparison  of  isolates  of  an emerging fish pathogen, the koi herpesvirus, and the effect  of water  temperature on  mortality of experimentally  infected  koi.  J.  Gen.  Virol.,  84, 2661-2668.
Harini,  S.S.,  Leelombik,  M.,  Kameshwari,  M.N.S.,  & Sathyanarayana, N. (2008). Optimization of DNA isolation  and  PCR-RAPD  methods  for  molecular analysis of urginea indica Kunth. International Jour- nal of Integrative Biology, 2, 138-144.
Hedrick,  R.P.,  Gilad,  O.,    Yun,  S.,  Spangenberg,  J.V., Marty,  G.D.,  Nordhausen,  R.W.,  Kebus,  M.J., Bercovier,  H.,  &  Eldar,  A.  (2000).  A  herpesvirus associated  with  mass  mortality  of  juvenile  and adult  koi,  a  strain  of  common  carp.  Journal  of Aquaticanimal Health, 12, 44-57.
Office International des Epizooties (OIE). (2016). Koi herpesvirus disease. 2 Maret 2016; 17 hlm. http:/ /www.oied.int, diunduh 4 Agustus 2016.
Nam,  I.Y.  &  Joh,  K.  (2007).  Rapid  detection  of  viru- lence factor of Aeromonas isolate from a trout farm by hexaplex-PCR. Departements of Bioscience and Biotechnology, Hankuk University of Foreign Stud- ies, Young-In, Republic of Korea. The Jurnal of Mi- crobiology, 4(45), 297-304.
Pikarsky,  E.  (2004).  Pathogenesis  of  acute  viral  dis- ease induced in fish by carp interstitial nephritis and gill necrosis virus. J. Virol., 78, 9544-9551.
Perelberg,  A.,  Smirnov,  M.,  Hutoran,  M.,  Diamant,
A.,  Bejerano,  Y.,  &  Kotler,  M.  (2003).  Epidemio- logical description of a new viral disease afflict- ing  cultured  Cyprinus  carpio  in  Israel.  The  Israeli Journal of Aquaculture, 55(1), 5-12.
Rizal, A.A., Risa, T., April, H.W., & Dyah, H.S. (2018). Deteksi parasit darah pada sapi perah berdasarkan analisis  PCR  Duplex.  Acta  Vet.  Indonesian,  6(2), 48-55.
Ronen,  A.,  Perelberg,  A.,  Abramowitz,  J.,  Hutoran, M.,  Tinman,  S.,  Bejerano,  I.,  Mand,  S.,  &  Kotler, M. (2003). Efficient vaccine against the virus caus- ing  a  lethal  disease  in  cultured  Cyprinus  carpio. Vaccine, 21, 4677-4684.
Sambrook, J. & Russel, D.W. (2001). Molecular clon- ing; A laboratory manual. 3rd Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, xxvii, Vol. 3.
Thanananta, N. & Thanananta, T. (2008). Detection of E. coli in water using duplex polymerase chain re- action  technique.  Thai  Journal  of  Genetics,  1(2), 109-113.
Yasmon,  A.,  Yusmania,  Karuniawati,  A.,  &  Bela,  B. (2010). Simultaneous detection of Legionella spe- cies  and  Legionella  pneumophila  by  duplex  PCR (dPCR) assay in cooling tower water samples from Jakarta, Indonesia. Med. J. Indones., 19(4), 223-227.
Ye,  Y.W., Fan,  T.F.,  Li, H.,  Lu,  J.F., Jiang,  H.,  & Hu,  W. (2013). Characterization of Aeromonas hydrophila from  hemorrhagic  diseased  freshwater  fishes  in Anhui  Province,  China.  Int.  Food  Res.  J.,  20, 1449-52.
Yuasa, K., Motohiko, S., Jun, K., Takafumi, I., & Takaji, I. (2005). Improvement of a PCR method with the Sph I-5. Primer set for the detection of koi herp- esvirus (KHV). Fish Pathology, 40(1), 37-39.