## IMPLANTASI   HORMON LHRH-a UNTUK MEMACU PERKEMBANGAN GONAD IKAN KERAPU BEBEK GENERASI KE-2 (F-2)

## IMPLANTATION OF LHRH-a HORMONE TO STIMULATION OF GONAD DEVELOPMENT OF HUMPBACK GROUPER SECOND GENERATION ( F-2 )

## Tridjoko
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Budidaya Laut, Gondol Bali Email: tridjoko_gondol@yahoo.co.id

## ABSTRACT
This  study  aimed  to  determine  the  effect  of  LHRH-a  hormone  implantation  on  gonadal development of humpback grouper, Cromileptes altivelis 2 nd generation (F-2). Individuals used were 20 female grouper fish with weight range of 600-800 gram/fish and total length range of 28.0-30.0  cm.  The  treatment  used  5  fish  each  with  tagging.  Grouper  fishes  were  stocked  into the  75  m3  circular  concrete  tank.  Hormone  of  LHRH-a  with  dosage  of  50  μg/kg  body  weight was used as implant treatment of (A) 1 time,, (B) 2 times, (C) 3 times, and (D) without implant. The  results  showed  that  implantation  of LHRH-a hormone were significantly stimulate gonad development of humpback grouper second generation (F-2). Treatment of 3 times implant every month  showed  the  best  results  produced    oocyte  diameter  up  to  480  μm,  while  the  control  of oocyte diameter only reached <400 μm.
Keywords : LHRH-a hormone, implantation, Humpback grouper, gonad development

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk   mengevaluasi pengaruh implantasi  hormon LHRH-a  terhadap perkembangan  gonad  ikan  kerapu  bebek, Cromileptes  altivelis generasi  ke-2  (F-2).    Individu yang digunakan adalah 20 ekor ikan kerapu bebek betina dengan kisaran bobot antara 600-800 gram/ekor dan panjang total antara 28,0-30,0 cm. Pada setiap perlakuan digunakan 5 ekor ikan dan  masing-masing  diberi  tanda.  Bak  yang  digunakan  adalah  bak  semen  berbentuk  bulat volume  75  m 3 .  Sebagai  perlakuan  adalah  implantasi  pelet  hormon  LHRH-a  dosis  50  μg/kg bobot  tubuh  dengan  frekuensi  implantasi  berbeda,  yaitu:  (A)  1  kali  implantasi  ;  (B)  2  kali implantasi    (C)  3  kali  implantasi  dan  (D)  tanpa  implantasi.  Pengambilan  sampel  dilakukan setiap 2 bulan yaitu untuk melihat perkembangan diameter oosit. Hasil penelitian menunjukkan bahwa  implantasi    hormon  LHRH-a    berpengaruh  nyata  terhadap  perkembangan  gonad  ikan kerapu  bebek  generasi  ke-2.  Pada  perlakuan  3  kali  implantasi      berturut-turut  setiap  bulan menunjukkan  hasil  yang  terbaik  yaitu  dengan    diameter  oosit  mencapai  480  μm.  Sedangkan yang kontrol diameter oosit hanya mencapai < 400 μm.
Kata Kunci : hormon LHRH-a, implantasi, ikan kerapu bebek, perkembangan gonad

## I. PENDAHULUAN
Salah  satu  faktor  yang  menjadi kendala  dalam  usaha  pembenihan  ikan kerapu  khususnya  ikan  kerapu  bebek adalah  ketersediaan  induk.  Selama  ini induk  ikan  kerapu  bebek  yang  dipijahkan berasal  dari  alam  yang  biasa  ditangkap oleh  para  nelayan.  Untuk  memperoleh
induk  ikan  kerapu  bebek  ini  relatif  sulit, karena  hanya  ada  pada  perairan-perairan tertentu saja. Untuk menanggulangi tantangan tersebut, maka sebagai alternatif sudah  dilakukan  kajian  dan  usaha-usaha untuk  menyediakan  induk  dari  hasil budidaya  generasi  pertama  (F-1)  dan ternyata  sudah  berhasil  memijah  dengan baik  (Tridjoko,  2003;  Sari et  al .,  2013).
Dari  generasi    F-1    yang  telah  berhasil memijah,  selanjutnya  telah  menghasilkan calon  induk  generasi  ke-2  (F-2) (Tridjoko et  al., 2006  ;  Tridjoko et  al .,  2012). Dengan  keberhasilan  memproduksi  benih ikan  kerapu  bebek  F-2  tersebut  maka diharapkan  teknologinya  terus  dapat diperbaiki  dan  dimodifikasi  untuk  jenis ikan  kerapu  lain  sehingga  produksinya terus  dapat  ditingkatkan.  Oleh  karena  itu hal-hal  yang  perlu  diperhatikan  dalam proses  pembenihan  hingga  menghasilkan juvenil  antara  lain  :  kondisi  induk,  proses kematangan  gonad,  penanganan  telur, teknik  pemeliharaan  larva,  teknik  pembe- rian pakan, dan penyakit. Dengan demikian tahapan demi tahapan penelitian perlu  dicermati  dengan  saksama  sehingga didapatkan  kualitas  dan  kuantitas  benih yang diharapkan.
Penggunaan hormon LHRH-a
pada ikan merupakan salah satu cara untuk memacu  perkembangan  gonad.  Hormon berperan  sangat  penting    dalam  proses reproduksi  ikan.  Perkembangbiakan  ikan secara  alami  banyak  bergantung  pada kesiapan induk   matang telur yang  hanya terjadi pada musim-musim tertentu. Untuk perkembangbiakan  secara  buatan,  rekaya- sa    hormon  dapat  dilakukan  dengan  cara implantasi hormon LHRH-a  (Vanstone et al., 1977;  Crim,  1985;  Lee et  al., 1986; Kuo et  al., 1988;  Tridjoko et  al .,  1997). Disamping  hormon  LHRH-a  ,  hormon 17  -metiltestoteron  (17  -MT)  mempu- nyai  fungsi  penting,  yaitu      secara  alami baik  langsung  maupun  tidak  langsung merangsang  perkembangan  gonad  ikan kerapu  betina  dan  jantan.  Hasil  penelitian Yashiro et  al .  (1993)    membuktikan bahwa  hormon  17  -MT  dapat  memper- cepat  proses  perubahan  kelamin  betina menjadi  jantan  pada  ikan Ephinephelus malabaricus .    Pada  ikan  tersebut  biasa didapatkan  yang  jantan  pada  umur  lebih dari  5  tahun  dengan  bobot  tubuh  kurang lebih 6 kg. Namun setelah disuntik dengan
hormon  17  -MT  didapatkan  yang  jantan antara  umur  34  -  50  bulan.  Selanjutnya Debas et  al .  (1989)  menyatakan  bahwa hormon testosteron dosis 500 pg/kg induk ikan  efektif    digunakan  untuk  injeksi perubahan  kelamin  betina  menjadi  jantan pada  ikan Epinephelus  microdon. Namun pada sea bass , Dicentrarchus labrax yang efektif  pada  dosis  2500  pg/kg  (Yashiro et al ., 1993). Ikan kerapu termasuk ikan yang bersifat  “protogynous  hermaphrodite”  di mana  betina  dewasa  akan  mengalami perubahan  kelamin  menjadi  jantan  seperti pada C.  altivelis (Mishima  dan  Gonzales,
1994); E.  fario (Kuo et  al., 1988); E. microdon (Debas et al ., 1989).
Pada  beberapa  spesies  teleostei, ovulasi dapat dirangsang dengan penyuntikan  LHRH-a.  Hal  ini  dapat dibuktikan  oleh  Hirose  dan  Ishida  (1974) dalam Hoar et  al .,  (1983)  dengan  sekali penyuntikan  LHRH  berdosis  tinggi  (  2,  4 dan  8  mg/g)  efektif  dalam  merangsang ovulasi dengan keberhasilan berturut-turut 40,50  dan  83  %  pada  ikan  ayu  dewasa ( Plecogosus  altivelis ).  Sedangkan  Hoar (1983)  melakukan  penyuntikan  LHRH setiap hari selama 5 hari dengan dosis : 1, 2 atau 10 mg/g, efektif dalam merangsang ovulasi  ikan  mas  koki  (  80%).  Namun demikian  penelitian  mengenai  implantasi hormon  LHRH-a  terhadap  perkembangan oosit  ikan  kerapu  bebek  (F-2)  belum pernah dilakukan. Tujuan penelitian implantasi  dengan  menggunakan  hormon LHRH-a  ini  adalah  untuk  mengetahui pengaruh hormon  terhadap  perkembangan oosit ikan kerapu bebek (F-2)

## II. METODE PENELITIAN
Ikan yang digunakan dalam percobaan  ini  adalah  ikan  kerapu  bebek hasil  budidaya  generasi  ke-2  (F-2). Jumlah  induk  betina  yang  digunakan sebanyak    20  ekor  dengan  kisaran  bobot tiap  ekor  antara  600-800  gram  dan
panjang  total  antara  28,0  -  30,0  cm.  Tiap sampel  individu    yang  diimplantasi  diberi tanda  berupa    “ microchip ”  yang  berisi kode  di  punggung  sebelah  kanan    untuk memudahkan identifikasi, sedangkan yang tidak diimplantasi tidak diberi tanda.
Percobaan  ini  dilakukan  di  Balai Besar  Penelitian  dan  Pengembangan Budidaya  Laut    Gondol  Bali  selama  8 bulan. Bak yang digunakan untuk percobaan  adalah  bak  beton  volume  75 m3  yang  diisi  20  ekor  sesuai  dengan perlakuan.  Pada bak pemeliharaan dileng- kapi  dengan  aerasi  sebagai  sumber oksigen  dan  pergantian  air  diupayakan antara  200-400%/hari  dengan  sistem  air mengalir  terus-menerus.    Pengambilan sampel  untuk  melihat  perkembangan diameter  oosit        dilakukan  dengan  cara kanulasi,   yaitu dengan memasukkan pipa plastik    diameter  1  mm  ke  dalam  saluran pelepasan  telur,  kemudian  disedot  dan dilihat  di  bawah  mikroskop  yang  telah dilengkapi  dengan  mikrometer.  Selama pemeliharaan  ikan  diberi  pakan  berupa ikan  segar,  cumi-cumi  dan  ditambahkan vitamin  mix  sebanyak  3  -  5%  biomassa/ hari.
Sebagai
perlakuan adalah
implantasi      hormon  LHRH-a  dosis  50 μg/kg  bobot  tubuh  dengan  frekuensi implantasi  berbeda,  yaitu:  (A)  1  kali implantasi  ;  (B)  2  kali  implantasi,  (C)  3 kali  implantasi  dan  (D) tanpa implantasi. Masing-masing  perlakuan  digunakan  5 individu. Pembuatan pelet hormon mengikuti  prosedur   seperti yang disaran- kan  Lee et  al. (1986)  dan  Prijono  (1987) yaitu  mencampurkan  hormon  LHRH-a dengan cocoa  butter dan  kolesterol.  Pelet hormon  tersebut  diimplantasikan  pada bagian  punggung  (dorsal)  induk  kerapu bebek betina.
Pengamatan tingkat kematangan  gonad  berdasarkan  perkem- bangan ukuran telur dan   dilakukan setiap 2  bulan  dengan  cara  induk  ikan  kerapu dibius dengan 2- penoxy ethanol dosis  50 -
150  ppm  hingga  induk  pingsan.  Kanulasi dimasukkan  pada  saluran  pelepasan  telur kemudian  disedot  perlahan-lahan  untuk mengetahui  perkembangan  gonad  atau diameter  oosit.      Tahap  berikutnya  induk ikan  disadarkan  kembali  dengan  cara melepaskan  ikan  tersebut  pada  media  air yang segar, selanjutnya dilepas kembali ke dalam      bak  pemeliharaan  semula. Analisis  data  dilakukan  pada  pengukuran diameter  oosit,  untuk  selanjutnya  dilaku- kan  analisis  sidik  ragam  pada  tingkat kepercayaan  95%,  serta  uji  beda  nyata terkecil  (BNT)  untuk  melihat  pengaruh perlakuan.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pengamatan kisaran diameter oosit  pada  perlakuan  A  dari  bulan  Maret sampai dengan bulan September
menunjukkan  semakin  membesar  seiring dengan  perjalanan  waktu.  Demikian  juga pada  perlakuan  B  kisaran  diameter  oosit pada bulan Maret hingga bulan September mengalami  kenaikan.  Pada  perlakuan  C kisaran  diameter  oosit  pada  bulan  Maret hingga  bulan  September  adalah  sebagai berikut:  70-80,  190-200,  270-280,  dan 450-480  μm.  Namun  kisaran  diameter oosit  induk  ikan  kerapu  bebek  F-2  pada perlakuan D menunjukkan kecenderungan lebih  kecil  bila  dibandingkan  dengan perlakuan  lainnya  (Tabel  1).  Pengaruh implantasi  dengan  menggunakan  pelet hormon  LHRH-a  secara  keseluruhan menunjukkan adanya peningkatan perkembangan  gonad.  Terutama  pada perlakuan  3  kali  implan  nampak  jelas responsnya  hingga  akhir  percobaan.  Hal ini  diduga  karena  adanya    mekanisme perkembangan  yang  merupakan  aksi umpan  balik  positif  testoteron  terhadap sekresi  hormon  gonadotropin  (GTH)  dari hipofisa. Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa testoteron atau androgen  lain  yang  dapat  diaromatisasi
merangsang  penimbunan  GTH  hipofisa (Crim et  al .,  1988)  dalam  darah. Konsentrasi  GTH  yang  meningkat  akan merangsang    perkembangan  oosit.    Pada ovarium ikan terdapat bakal sel telur yang dilindungi  suatu  jaringan  pengikat  yang bagian  luarnya  dilapisi  peritoneum  dan bagian dalamnya dilapisi epitelium. Sebagian  dari  sel-sel  epitelium  akan membesar  dan  berisi  nucleus.  Butiran  ini kelak  akan  menjadi  telur.  Sebagian  dari epitelium  menjadi  pipih  dengan  inti  yang
memanjang,  kemudian  melingkupi  sel telur sebagai lapisan granulose dan bagian luar terdapat lapisan teka yang berasal dari jaringan  pengikat.    Oleh  karena  itu  maka selama  perkembangan  oosit    ukurannya bervariasi (Hoar et al ., 1983).
Dari  hasil  pengamatan  perkem- bangan gonad ikan kerapu bebek,
menunjukkan bahwa perlakuan implantasi pelet hormon LHRH-a  berpengaruh nyata terhadap diameter oosit (P<0.05).
Tabel 1. Hasil pengamatan diameter oosit  ikan kerapu bebek generasi ke-2 (F-2).
Perlakuan Nomor  kode sampel Diameter oosit (μm ) Maret Mei Juli September A 2A76 60 150 225 350 8900 50 140 220 360 C432 60 125 220 375 9A42 60 175 225 400 751F 55 150 220 375 B 433C 65 180 250 400 556E 60 190 250 425 326B 65 180 240 400 67G1 65 185 245 375 6560 70 185 250 400 C 1458 75 200 270 475 2916 70 190 275 450 45D7 80 195 275 460 2235 75 200 280 480 B495 75 195 280 470 D TK 50 125 220 375 TK 50 125 220 350 TK 50 175 210 325 TK 50 150 215 300 TK 50 125 215 325
Keterangan : TK = Tidak diberi kode.
Tabel 2. Rata-rata diameter oosit  pada akhir percobaan.
Perlakuan Rata-rata ± standar deviasi A B C D 372 ± 18.90 b 400 ± 17.67 b
467 ± 12.04 c

## 335 ± 28.50 a
Keterangan: Nilai  pada  kolom  yang  diikuti  dengan  huruf  yang  sama  adalah  tidak berbeda nyata (P>0,05).
Gambar 1. Perkembangan oosit ikan kerapu bebek selama penelitian berlangsung.
Pada  Gambar  1  terlihat  jelas bahwa  induk  ikan  kerapu  bebek  yang diimplantasi  3  kali  berturut-turut  setiap bulan, sangat  responsif  terhadap  perkem- bangan  oosit.  Induk  yang  diimplan  1  kali hingga bulan September rata-rata diameter oosit  sebeser  372  μm.  Sedangkan  pada induk  yang  tanpa  diimplan  rata-rata diameter  oosit  hingga  percobaan  berakhir adalah 335 μm. Secara keseluruhan semua perlakuan menunjukkan terjadinya perkembangan  oosit,  tetapi  yang diimplan 3  kali      adalah  yang  paling    cepat  dan sudah  menunjukkan  kematangan  telur tahap akhir. Secara histologis kematangan telur  tahap  akhir  ditandai  dengan  posisi inti  selnya  yang  berada  di  kutub,
sedangkan  telur-telur  yang  masih  dalam fase  dorman  atau  belum  mengalami kematangan  tahap  akhir  ditandai  dengan posisi  inti  selnya  yang  masih  di  tengah (Nagahama,  1983).    Implantasi  hormon LHRH-a secara fisiologis dapat melepaskan GTH dengan  perlahan-lahan. Hormon  gonadotrofin    akan    merangsang perkembangan  sel-sel  granulosa  dan setelah  mencapai  perkembangan  tertentu sel-sel granulosa akan melepaskan estradiol.  Estradiol  akan  merangsang  hati untuk membentuk vittellogenin yang akan merangsang proses vitelogenesis di dalam ovarium. Setelah mencapai tingkat tertentu proses vitellogenesis berakhir sel- sel granulosa akan mensekresikan hormon
steroid  perangsang  kematangan  gonad (MIS  = maturation  inducing  steroid ) (Nagahama,  1983;  Lam,  1985).  MIS merangsang  GVBD  ( germinal  vesicle break  down )  yang  merupakan  tanda kematangan  akhir  dari  oosit.  Penggunaan hormon  untuk  proses  kematangan  gonad efektif  apabila  digunakan  bertepatan  pada saat musim pemijahan di alam (Tamaru et al., 1987).  Demikian  juga  hasil  penelitian Crim et  al. (1983)  dalam  Tamaru  (1990)
menyimpulkan bahwa organ yang
berperan  untuk  proses  pematangan  gonad pada  ikan  dipengaruhi  oleh  perubahan musim  dan  hormonal.    Oleh  karena  itu, dengan melakukan 3 kali implan berturut- turut selama 3 bulan ternyata cukup efektif dalam  memicu perkembangan oosit  induk ikan kerapu bebek F-2.

## IV. KESIMPULAN
Implantasi    hormon  LHRH-a berpengaruh  nyata  terhadap  perkem- bangan gonad ikan kerapu bebek generasi ke  2  (F-2).  Pada  perlakuan  3  kali implantasi  yang  dilakukan  berturut-turut setiap  bulan    menunjukkan  hasil  yang terbaik  dengan  diameter  oosit  mencapai 480 μm. Sedangkan yang kontrol diameter oosit hanya mencapai < 400 μm.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bpk/Ibu: Bagus Winaya, M. Rivai, kelompok  Peneliti/Teknisi  serta  para Siswa/
Mahasiswa
Praktek Kerja Lapangan/Magang  yang  telah  membantu selama penelitian ini berlangsung.

## DAFTAR PUSTAKA
Crim,  L.W.  1985.  Methods  for  acute  and chronic hormone administration in fish. In: Proceeding for a
workshop held at Tungkang
Marine  Laboratory  Taiwan,  April 22-24, 1985. 1-9pp.
Crim,  L.  W.,  N.M.  Serwood,  and  C.E. Wilson.  1988.  Sustamed  hormone release  II  effectiveness  of  LHRH analogue  (LHRH)  administration by  either  single  time  injection  or cholesterol  pellet  implantation  on plasma.  Gonadotropin  levels  in abrassay  model  fish,  the  juvenile rainbar  trout. Aquaculture ,  74:87- 95.
Debas,L.,  Fostier,  A.,  Fuchs,  J.,  Weppe,
M., Nedelec, G., Benett, A., Cauty, C., Jalabert, B. 1989. The sexuality of  cultured  hermaphroditic  fish species:  analysis  of  morphological and  endocrinological  features  in  a protogynous  hermaphrodite; Epi- nephelus  microdon ,  as  a  basic  for further  to  control  reproduction  in the  grouper.  Advances  in  tropical aquaculture:  workshop  held  in Tahiti,  Frech  Polynesia,  February, Actes  Collog,  IFREMER,  Tahiti, French Polynesia, 9p. Hoar,  W.S.  D.J.,  Randal,  and  E.M Donaldson. 1983. Fish physiology. volume  IX.  Reproduction  part  B behaviour  and  fertility  control.
Academic Press Inc. London. 277- 346pp.
Kuo,  C.M.,  Y.Y.  Ting,  and  S.L.  Yeh.
1988.  Induce  sex  reversal  and spawning of blue spotted  grouper,
Ephinephelus  fario . Aquaculture , 74:113-126.
Lam,T.J.  1982.    Application  of  endocri- nology  to  fish  culture. Can.  Fish Aquat. Sci. 39:121-137.
Lee,  C.S.,  C.S.  Tamaru,  and  C.D.  Kelly.
1986. Technique for making chronic  release  LHRH-a  and  17a MT pellet for intramuscular implantation  in  fishes. Aquacul- ture , 59:161-168.
Mishima,  H.  and  B.  Gonzales.  1994. Some  biological  and  ecological aspect  on Cromileptes  altivelis around  Palawan  Island,  Philip- pines. Suisanzoshoku, 42(2):345- 349
Nagahama,  Y.  1983.  The  functional morphology  of  teleost  gonads. In: Hoar  (Ed.).  Fish  physiology.  Vol. IX. Reproduction, Part A, endocri- ne  tissues  and  hormones.  Acade- mic Press. New York. 233-275pp. Prijono,  A.  1987.  Petunjuk  pembuatan pellet  hormon  LHRH-a,  choles- terol  dan  silastik  hormon  17a  MT untuk implantasi induk ikan bandeng Chanos-chanos . Sub Balai  Penelitian  Budidaya  Pantai,
Gondal, Bali. 11hlm.
Sari  B.M,  Tridjoko,  dan  Haryanti.  2013.
Keragaman  genetik  ikan  kerapu bebek ( Cromileptes altivelis ) generasi  F-1  dan  F-3. J.  Ilmu  dan Teknologi  Kelautan  Tropis ,  5(1): 103-111.
Tamaru,  C.S.,  C.S.  Lee.,  C.D.  Kelly,  and J.E.  Banno.  1987.  Effectiviness  of chronic  LHRH-a  and  17  a  MT therapy,  administered  at  different times prior to the spawning season, on  the  maturation  of  milkfish ( Chanos-chanos ). Thesis, the University  of  Tokyo,  Faculty  of Agriculture, 40-44pp.
Tamaru,  C.S.  1990.  Studies  on  the  use  of chronic and acute LHRH-a treatments  on  controlling  matura- tion  and  spawning  in  the  milkfish ( Chanos-chanos Forskal).  Thesis, the University of Tokyo, Faculty of Agriculture, 158p.
Tridjoko,  B.  Slamet  dan  D.  Makatutu. 1997.  Pematangan  induk  kerapu bebek ( Cromileptes altivelis ) dengan rangsangan suntikan hormon  LHRHa  17-  metyltes-
tosteron.  J .  Penelitian  Perikanan
Indonesia, 3(4):30-34. Tridjoko, B. Slamet , D. Makatutu, dan K. Sugama. 1999. Pengamatan pemijahan  dan    perkembangan telur  kerapu  bebek  ( Cromileptes altivelis ) pada bak secara
terkontrol. J. Penelitian Perikanan
Indonesia , 2(2):55-62. Tridjoko. 2003. Pengamatan perkembang- an  gonad  dan  pemijahan  ikan kerapu bebek, Cromileptes altivelis hasil budidaya (F1/ turunan  pertama)  pada  bak  secara terkontrol.    Prosiding  vol.  2 Seminar Nasional Perikanan Indonesia. Sekolah Tinggi Perikanan, Jakarta. Tridjoko,  Haryanti,  I.G.N.  Permana,  dan S.  Ismi.,  2006.  Evaluasi  kualitas induk ikan kerapu bebek,
Cromileptes  altivelis hasil  budi- daya  (F-1). Aquacultura  Indone- siana , 7(1):45-52.
Tridjoko,  K.  Suwirya,  dan  S.B.  Moria. 2012.  Reproduksi  ikan  kerapu bebek  turunan  ke  2  (F-2)  dan induk  kerapu  bebek  dari  alam  (F-
0).  Prosiding  Indoaqua,  Forum Inovasi Teknologi Akuakultur. Puslitbangkan, Jakarta. Hlm.:
1067-1073.
Vanstone,  W.E.,  Tiro,  Jr.,  L.B.  Villaluz,
A.C. Ramsingh, D.C. Kumagai, S. Dulduco,  P.T.  Barnes,  M.M.L., and  C.E.  Duenas.  1977.  Breeding and  larval  rearing  of  the  milkfish Chanos-chanos  (Pisces  Chanidae ) SEAFDEC,  Aquaculture  Depart- ment, Tech. Report 3:3-17. Yashiro, N., J. Kongkumnerd, V. Vatanakul,  and  N.  Ruangpanit. 1993.  Histological  changes  in gonad  of  grouper, Epinephelus malabaricus .  The  Proceeding  of Grouper Culture, Songkhla, Thailand. 16-26pp.
Yashiro, N., V. Vatanakul, J. Kongkumnerd, and N. Ruangpanit.
1993.  Variation  of  sex  steroids levels  in  maturing  grouper.  The Proceeding  of  Grouper  Culture, Songkhla, Thailand. 8-15pp.
Diterima   : 25 Oktober 2013 Direvisi    : 6 Desember 2013 Disetujui  : 10 Desember 2013