Mandala of Health : A Scientific Journal Vol.12, No.1, Maret 2019, Hal. 130-139 ISSN    : 0216-3098 e-ISSN : 2615-6954 DOI: 10.20884/1.mandala.2019.12.1.1513

## DETEKSI  VIRUS DENGUE SEROTIPE-3 DAN PERAN SPERMATEKA DALAM PENULARAN SECARA TRANSVENEREAL PADA NYAMUK

## Aedes aegypti BETINA
DETECTION OF DENGUE VIRUS SEROTYPE-3 AND THE ROLE OF SPERMATHECA ON TRANSVENEREAL TRANSMISSION IN ADULT

## FEMALE Aedes aegypti MOSQUITO
Devita Febriani Putri * Tusy Triwahyuni Departemen Parasitologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Malahayati Lampung Jln. Pramuka no. 27, Kemiling, Bandar Lampung

## ABSTRAK
Penularan  transvenereal  berpotensi  menyebarkan  virus  dengue  melalui  perilaku  kawin. Pengendalian  vektor  Demam  Berdarah  Dengue  (DBD)  dengan  strategi  perilaku  kawin  nyamuk secara alami telah diterapkan untuk menurunkan perluasan daerah endemis DBD.  Dengan dasar tersebut, pemahaman perilaku kawin nyamuk Ae. aegypti penting untuk diketahui. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi virus dengue serotipe 3 (DENV-3) pada organ spermateka nyamuk Ae.  aegypti betina  yang  telah  terinfeksi  DENV-3  secara  transvenereal  di  laboratorium. Pembedahan organ spermateka pada nyamuk betina dilakukan setelah nyamuk Ae. aegypti betina kawin dengan nyamuk Ae. aegypti jantan yang positif DENV-3. Keberadaan DENV-3 pada organ spermateka nyamuk betina dilakukan dengan melakukan pengujian pooling sampel menggunakan metode One-Step RT-PCR  untuk  screening  virus  dengue  (profil  pita  DNA  spesifik  511  bp). Sampel  yang  hasil  pengujiannya  positif  virus  dengue,  dilanjutkan  dengan  metode  Semi-Nested PCR untuk serotyping DENV-3 (profil pita DNA spesifik 290 bp). Hasil penelitian dari 7 sampel pooling organ  spermateka  dari  nyamuk  betina  positif  DENV-3  hasil  penularan  transvenereal nyamuk jantan positif DENV-3 secara intratorakal menunjukkan tidak ada satupun sampel yang terdeteksi adanya DENV-3. Tidak ditemukan virus DENV-3 pada organ spermateka nyamuk Ae. aegypti betina yang telah terinfeksi DENV-3 secara transvenereal pada 7 sampel yang digunakan. Perlu  pengujian  lebih  lanjut  pada  organ  ovarium  nyamuk  betina  untuk  memastikan  mekanisme terjadinya penularan transvenereal  virus dengue pada Ae. aegypti dalam upaya mencari strategi baru dalam pengendalian vektor DBD.
Kata kunci : nyamuk Aedes aegypti , penularan transvenereal, perilaku kawin, spermateka, virus dengue serotipe 3

## ABSTRACT
Transvenereal  transmission  have  the  potential  to  spread  dengue  virus  through  mating behavior. Vector control of Dengue Hemorrhagic Fever (DHF) with a strategy of mosquito mating behavior naturally has been applied to reduce the expansion of dengue endemic areas. Therefore understanding the behavior of mating Ae. aegypti mosquitoes is  important  to  know. This  study aims to detect dengue virus serotype 3 (DENV-3) in the spermatheca organs of female Ae. aegypti mosquitoes infectious DENV-3 transvenereal male Ae. aegypti mosquitoes positive for DENV-3. Surgical  spermal  organs  on  female  mosquitoes  are  carried  out  after  tracing  the  mating  female mosquitoes with male Ae. aegypti mosquitoes positive for DENV-3. The presence of DENV-3 in spermattheca organs of female mosquitoes was proven by testing pooling samples using the One- Step RT-PCR method for screening dengue virus (511 bp specific DNA band profile). Samples that  tested  positive  for  dengue  virus,  followed  by  the  Semi-Nested  PCR  method  for  DENV-3 serotyping (specific DNA band profile 290 bp). The results of 7 samples of spermatheca organ pooling  from  DENV-3  positive  female  mosquitoes  resulting  from  intrathoracal  transvenereal transmission  of  male  positive  DENV-3  mosquitoes  showed  that  none  of  the  samples  detected DENV-3. There was no DENV-3 detected in spermattheca organs of female mosquitoes from 7 samples.  Further  testing  of  the  ovarian  organs  of  a  female  mosquito  is  needed  to  ensure  the mechanism  of  transvenereal  transmission  dengue  virus  to Ae.  aegypti in  an  effort  to  find  new strategies in DHF vector control.
Keywords: Aedes aegypti mosquito, dengue virus serotype 3, mating behavior, spermateca, transvenereal transmission
Penulis korespondesi:
Devita Febriani Putri Departemen Parasitologi, Fakultas Kedokteran Universitas Malahayati Jln. Pramuka n0 27 Kemiling Bandar Lampung Email: devita@malahayati.ac.id

## PENDAHULUAN
Demam  Berdarah  Dengue  (DBD)  adalah  penyakit  tular  vektor  pada  manusia  yang terdistribusi luas di negara tropis maupun subtropis di dunia. Infeksi DBD disebabkan virus dengue dari  genus  Flavivirus  dengan  4  serotipe,  yaitu  virus  dengue  serotipe-1  (DENV-1),  DENV-2, DENV-3, DENV-4. Aedes aegypti merupakan jenis nyamuk yang berperan sebagai vektor utama virus  dengue  secara  horizontal  (Kreamer et  al., 2015).  Sampai  saat  ini  belum  ada  vaksin  yang efektif mencegah penyakit ini untuk segala usia, sehingga pengendalian vektor nyamuk Ae. aegypti merupakan salah satu jalan untuk pencegahan kasus DBD agar tidak meluas (WHO, 2019).
Penyebaran virus dengue antar nyamuk Ae. aegypti atau yang dikenal dengan penularan vertikal telah lama dibuktikan baik secara laboratorium maupun di alam. Virus dengue terbukti dapat  ditransmisikan secara transovarial  dari nyamuk  betina  yang infeksius  pada keturunannya. (Angel dan Joshi, 2008; Arunachalam et al. , 2008; Seran, 2010; Thongrungkiat et al. , 2011; Goff et al. , 2011; Martins et al. , 2012; Espinosa et al. , 2014; Martinez et al. , 2014). Penularan vertikal virus dengue merupakan cara pertahanan ketika kondisi lingkungan dan iklim tidak kondusif untuk perkembangbiakan virus (Angel & Joshi, 2008; Arunachalam et al. , 2008). Fenomena penularan virus dengue secara transvenereal dari nyamuk jantan infeksius ke nyamuk betina non infeksius juga telah dibuktikan (Putri, 2018). Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa nyamuk jantan yang terinfeksi virus dengue dari penularan vertikal berpotensi menyebarkan virus dengue  pada saat  kawin dengan nyamuk betina. Namun  mekanisme terjadinya penularan transvenereal  virus dengue pada Ae. aegypti belum diketahui secara pasti.
Spermateka pada nyamuk betina merupakan salah satu organ vital untuk kopulasi nyamuk yang berfungsi menampung cairan sperma dari nyamuk jantan setelah perkawinan terjadi. Nyamuk jantan hanya perlu mengawini nyamuk betina satu kali, kemudian cairan sperma akan disimpan di spermateka dan selanjutnya dapat membuahi telur seumur hidupnya (Pascini et al. , 2012; Degner dan Harrington, 2016). Selama proses perkawinan berlangsung, kelenjar aksesori nyamuk jantan mengeluarkan seminal  fluid (cairan  seminal)  yang  berfungsi  sebagai  media  spermatozoa  untuk berenang  ke  organ  spermateka  nyamuk  betina  (Arthur,  2014). Seminal  fluid memungkinkan pembawa virus dengue melalui penularan transvenereal pada nyamuk karena virus dengue tidak terdeteksi pada spermatogonia, spermatosit, spermatid, dan spermatozoa (Tu et al. , 1998). Deteksi virus dengue pada organ spermateka nyamuk Ae. aegypti betina yang positif virus dengue hasil perkawinan  dengan  nyamuk Ae.  aegypti jantan  infeksius  akan  memberikan  pemahaman  dan memperkuat bukti tentang mekanisme penularan transvenereal virus dengue pada nyamuk vektor DBD Ae. aegypti. Penelitian ini bertujuan untuk  mendeteksi virus dengue serotipe 3 (DENV-3) pada  organ  spermateka  nyamuk Ae.  aegypti betina  yang  telah  terinfeksi  DENV-3  secara transvenereal di laboratorium.

## METODE PENELITIAN
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan rancangan penelitian Post test only  control  group  design. Lokasi  penelitian  dilakukan  di  Insektarium  dan  Laboratorium Departemen  Parasitologi  Fakultas  Kedokteran,  Kesehatan  Masyarakat  dan  Keperawatan Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta serta Laboratorium Biologi Molekuler B2P2VRP Salatiga. Populasi penelitian merupakan hasil kolonisasi nyamuk Ae. aegypti di  Insektarium Departemen Parasitologi  FKKMK  UGM,  yang  terbebas  dari  infeksi  DENV  sejak  tahun  1986.  Pengambilan sampel dengan cara purposive sampling .
Mandala of Health : A Scientific Journal                 ISSN: 0216-3098

## Alat dan Bahan
Alat yang diperlukan meliputi berbagai peralatan untuk deteksi molekuler dan dissecting microscope. Bahan yang diperlukan meliputi nyamuk Ae. aegypti jantan hasil suntik intratorakal DENV-3  dengan  masa  inkubasi  5  dan  14  hari,  dan  nyamuk Ae.  aegypti betina  berumur  1  hari. Virus  dengue  didapatkan  dari  supernatan  kultur  sel  C6/36  yang  diinfeksikan  DENV-3,  dan merupakan  prototipe  DENV-3  strain  H87  yang  berasal  dari  laboratorium  Namru-2  di  Jakarta. Selain  itu,  beberapa  kit  reagen  juga  digunakan  dalam  penelitian  ini,  meliputi  kita  isolasi  RNA, amplifikasi RNA dan bahan untuk elektroforesis.

## Jalannya penelitian
Penelitian  ini  terbagi  menjadi  beberapa  tahapan  yaitu  penyediaan  nyamuk Ae.  aegypti betina yang infeksius DENV-3 melalui penularan transvenereal, pembedahan organ spermateka, dan  deteksi  DENV-3  pada  organ  spermateka  dan  keseluruhan  tubuh  tanpa  organ  spermateka ( whole body) Ae. aegypti betina.
1. Penyediaan nyamuk Ae. aegypti betina infeksius DENV-3 melalui penularan transvenereal. Nyamuk Ae.  aegypti jantan  infeksius  (nyamuk  jantan  yang  terinfeksi  DENV  3  secara intratorakal) dimasukkan ke kandang dengan nyamuk Ae. aegypti betina non-infeksius (nyamuk betina yang tidak terinfeksi DENV-3) berumur 1 hari dan dipelihara dalam satu kandang selama 7 hari dengan tujuan agar terjadi perkawinan semi alami. Nyamuk diberikan larutan gula 10 %, sebagai pakannya yang diganti setiap hari. Pada hari ke 7, nyamuk jantan kemudian dikoleksi dan  disimpan  di  freezer  -80˚C,  sedangkan  nyamuk  betina  diberikan  pakan  darah  dengan menggunakan  darah  mencit.  Nyamuk  betina  dipelihara  selama  7  hari  untuk  bertelur  dan selanjutnya  telurnya  diberi  label,  kemudian  dikoleksi  dan  disimpan  di  freezer  80˚C.  Semua perlakuan dilakukan di insektarium dengan kondisi suhu 27 ± 2 o C; kelembaban 88 ± 6% dan 12  jam  cahaya,  12  jam  gelap  (Umniyati et  al. ,  2008).  Nyamuk  jantan  yang  telah  dikoleksi, kemudian dideteksi keberadaan virus denguenya dengan menggunakan metode PCR. Nyamuk jantan  yang  terdeteksi  positif  DENV-3  ditelusuri  nyamuk  betinanya,  lalu  nyamuk  betina dibedah, lalu dideteksi organ spermateka dan whole body menggunakan metode PCR (Lanciotti et al. , 1992).
2. Pembedahan organ Spermateka Nyamuk Ae. aegypti Betina
Ice pack dipersiapkan diatas dissecting microscope. Nyamuk betina yang telah dikoleksi (berumur 14 hari) hasil kawin dengan nyamuk jantan infeksius yang terdeteksi positif DENV- 3 dibersihkan dengan melepaskan kaki dan sayapnya di atas cawan petri. Tubuh nyamuk betina diletakkan di kaca benda tepat di garam fisilogis, denga posisi perut nyamuk (abdomen) berada disebelah kanan. Jarum ditangan kiri ditusukkan ke bagian torak nyamuk, jarum ditangan kanan merobek segmen ke 7 dari abdomen nyamuk. Setelah segmen 7 dan ke 8 terpisah, tarik ujung abdomen  (segmen  ke  8)  perlahan  sampai  spermateka  keluar.  Spermateka  dan whole  body (seluruh tubuh nyamuk tanpa organ spermateka) kemudian diletakkan secara terpisah di tabung mikro 1,5 ml  yang telah berisi  garam  fisiologis.  Sampel kemudian disimpan untuk  dideteksi dengan metode PCR.
3. Deteksi DENV-3
Sampel yang dideteksi organ spermatekanya adalah sampel yang berasal dari nyamuk betina  yang  positif  virus  setelah  dideteksi  menggunakan  PCR.  Ekstraksi  RNA  pada  nyamuk dilakukan menggunakan QIAamp Viral RNA Mini kit (Qiagen). Hasil isolasi RNA kemudian disimpan  di deepfreezer -80 o C  sampai  tahapan  RT-PCR  siap  dikerjakan.  Amplifikasi  RNA dilakukan dengan Master mix One-Step RT-PCR kit (Qiagen) yang terdiri dari 1µl One-Step
RT-PCR Enzyme mix, 1µl dNTP mix, 5 µl Q -solution, 6 µl RNAse-free water, 5 µl Buffer, dan 5 µl RNA serta 1µl primer D1(5’-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3’) dan 1µl  primer  D2  (5’-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3’)  sehingga  masing  - masing  tabung  PCR  berisi  volume  total  reaksi  25µl.  Tahapan One-Step RT-PCR  dilakukan sebagai  berikut: Reverse Transcription (RT) untuk  merubah RNA menjadi  cDNA dilakukan pada suhu 50°C selama 30 minutes, selanjutnya amplifikasi cDNA dengue dilakukan dengan metode  PCR  dengan  40  siklus  tahapan  sebagai  berikut:  predenaturasi  dilakukan  pada  94°C selama 2 menit, denaturasi pada 94°C selama 15 detik, annealing pada 55°C selama 30 detik, elongation pada 68°C selama 1 menit, dan yang terakhir post-elongation 72°C selama 5 menit. Hasil yang diperoleh dari tahapan ini adalah cDNA dengue.
Semi - nested PCR selanjutnya dilakukan dengan mempersiapkan reagen sebagai berikut: 15 µl Master Mix reagen Promega Gotaq (green), 3 µl cDNA, 1 µl Primer D1, 4 µl (masing- masing  1  µl)  dari  Primer  TS1(5’-CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3’),  Primer  TS2  (5’- CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3’), Primer TS3 (5’-TAACATCATCATGAGAC AGAGC-3’),  dan  Primer  TS4  (5’-CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA-3’),  7  µl  ddH 2 O sehingga  masing  -masing  tabung  PCR  berisi  volume  total  reaksi  30µl.  Selanjutnya  PCR dilakukan dengan tahapan sebagai berikut:  predenaturasi pada 94°C selama 2 menit,  denaturasi pada 94°C selama 15 detik sebanyak 40 siklus, annealing 55°C selama 30 detik, elongasi 68°C selama 1 menit, dan yang terakhir post- elongasi 72°C selama 5 menit. Elektroforesis dilakukan terhadap semua produk PCR ( One-Step RT-PCR dan semi nested PCR) pada tegangan 120 V selama 1 jam. Visualisasi hasil PCR dilakukan dengan menggunakan gel eletrophoresis 1,5% dan didokumentasikan menggunakan Geldoc Biorad ® .

## Analisis Data
Hasil analisis dari deteksi DENV-3 pada organ spemateka dengan metode One-Step RT- PCR ditunjukkan dengan adanya profil pita DNA spesifik pada ukuran 511 bp. Hasil analisis dari serotyping DENV-3 dengan metode semi-nested PCR ditunjukkan dengan adanya profil pita DNA spesifik pada ukuran 290 bp.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Nyamuk Ae. aegypti jantan yang telah disuntik DENV-3 secara intratorakal dengan  masa inkubasi selama 5 dan 14 hari terdeteksi positif mengandung DENV-3 dengan metode PCR. Hal ini  membuktikan  bahwa  DENV-3  yang  disuntikkan  berkembang  selama  masa  inkubasi  yang ditentukan,  sehingga  berpotensi  untuk  menularkan  DENV-3  ke  nyamuk  betina  non-infeksius melalui perilaku seksual (penularan transvenereal). Pembedahan organ spermateka pada nyamuk betina dilakukan setelah ditelusuri nyamuk betina hasil perkawinan dengan nyamuk Ae. aegypti jantan yang positif DENV-3. Gambar 1 memperlihatkan hasil pembedahan organ spermateka yang dilihat  dari dissecting  microscope .  Total  nyamuk  betina  yang  dibedah  adalah  7  ekor.  Organ spermateka  dan whole  body nyamuk  betina  disimpan  di  dalam  box  sampel  dan  dimasukan  di freezer - 80°C, untuk dideteksi One-Step RT-PCR.
B
A
Gambar 1 . Organ spermateka nyamuk Ae. aegypti betina
A. Pembedahan organ spermateka pada segmen 8 dengan perbesaran 10x
B. Organ spermateka dengan perbesaran 40x
Pada tahap berikutnya, whole body nyamuk betina diuji keberadaan virus dengue dengan menggunakan PCR.  Hasil yang positif kemudian diuji organ spermatekanya. Hasil uji One-Step RT-PCR  pada whole    body dan  organ  spermateka  nyamuk  betina Ae.  aegypti positif  DENV-3 secara  pooling  perkandang  dapat  dilihat  pada  Tabel  I.  Sampel  pooling  organ  spermateka  dari nyamuk  betina  positif  DENV-3  hasil  penularan  transvenereal  nyamuk  jantan  positif  DENV-3 secara intratorakal menunjukkan tidak ada satupun sampel yang terdeteksi DENV-3.
Table I. Hasil uji One-Step RT-PCR pada whole body dan organ spermateka nyamuk betina Ae. aegypti positif DENV 3 secara pooling perkandang
Masa Inkubasi Nyamuk Jantan Total Whole Body Nyamuk Betina yang diuji Hasil Uji PCR (pooling) Total Organ Spermateka yang diuji Hasil Uji PCR (pooling) 5 5 positif 5 negatif 14 2 positif 2 negatif
Pada  perkawinan  nyamuk Ae.  aegypti ,  organ  kantung  aksesori  nyamuk  jantan  akan mensekresikan cairan dalam bentuk semen ( seminal fluid ), yang berfungsi sebagai media sperma berenang menuju organ spermateka nyamuk betina (Arthur et al. , 2014). Selama kopulasi, cairan sperma    yang  terdapat seminal  fluid dan  spermatozoa  dari  nyamuk  jantan  akan  masuk  melalui vagina ditransfer  ke bursa  seminalis nyamuk  betina.  Gerakan  peristaltik  menyebabkan  cairan sperma masuk ke kelenjar spermateka. Kelenjar spermateka akan memberikan nutrisi dan energi serta  perlindungan  dari  stress  oksidatif  untuk  mempertahankan  sperma  selama  disimpan  di spermateka.  Ketika  telur  matang  yang  disimpan  di  bursa  kopulatriks  siap  dibuahi,  telur  akan melewati lubang ( spermatecha vestibulum ) pada kelenjar spermateka, untuk merangsang kelenjar spermateka  melepaskan  sedikit  sperma.  Sperma  memasuki  mikrofil  (yang  terdapat  pada permukaan kulit telur) dan masuk ke dalam telur. Fertilisasi (pembuahan) terjadi di oviduct ketika
Segmen ke 7 Segmen ke 8 Organ Spermateka
satu  sperma  berfusi  dengan  nukleus  telur.  Oviposition  (peletakan  telur)  terjadi  setelah  proses pembuahan  telur  selesai  dan  telur  siap  untuk  perkembangan  embrio  (Degner  dan  Harrington, 2016).
Tu et al. (1998), meneliti tentang ultrastruktur sistem reproduksi nyamuk Ae. aegypti jantan infeksius DENV-2, dengan menggunakan IFAT dan mikroskop elektron dan menemukan bahwa DENV-2  terdapat  pada  matrik,  sel  epitelium,  sel  kolumnar  pada  kantung  aksesoris,  dan  sel epitelium  dan  sel  otot  dari vesikula  seminalis ,  tetapi  tidak  terdapat  pada spermatogonia, spermatosit, spermatid, dan spermatozoa . Virus dengue yang ditularkan nyamuk jantan infeksius ke nyamuk betina melalui cairan sperma karena nyamuk jantan dan betina  dikawinkan secara semi alami  di  kandang.  Cairan  sperma  terdiri  dari  sperma  matang  (spermatozoa),  dan seminal  fluid , yang artinya penularan transvenereal virus dengue pada nyamuk jantan infeksius ke nyamuk betina melalui seminal fluid (Choochote et al., 2001).
Organ  spermateka  akan  terisi  cairan  sperma  ( seminal  fluid dan  spermatozoa)  setelah perkawinan  terjadi.  Hasil  penelitian  menyatakan  bahwa  tidak  satupun  organ  spermateka  yang berasal dari nyamuk betina positif DENV-3 secara transvenereal, terdeteksi positif dengan metode PCR. Kemungkinan seminal fluid yang mengandung DENV-3 sudah tidak lagi berada di organ spermateka,  tetapi  mulai  menuju  oviduct  beserta  spermatozoa,  yang  kemudian  akan  membuahi telur (Clement, 1999). Hal ini menyebabkan DENV-3 tidak terdeteksi di organ spermateka, tetapi terdeteksi whole body nyamuk betina.
Chen et al . (1993) yang melakukan studi pewarnaan organ dengan tehnik imunoflouresen pada Ae.  aegypti dan Ae.  albopictus yang  infeksius  DENV-1.  DENV-1  ditemukan  pada  organ ovariola, oviduct ,  dan  kantung  aksesoris  pada  nyamuk  betina,  membuktikan  bahwa  DENV terdapat pada saluran reproduksi nyamuk betina. Linthicum et al . (1996) juga membuktikan bahwa DENV 3 terdeteksi pada calyx (yang terdapat pada organ nyamuk betina) setelah 16 sampai 22 hari  diinfeksikan  pada  nyamuk  betina Ae.  aegypti .  Hal  ini  memungkinkan  DENV-3  dapat terdeteksi di ovarium nyamuk betina yang dapat menguatkan pembuktian penularan transvenereal. Tetapi keterbatasan sampel, sehingga pemeriksaan organ ovarium tidak dilakukan pada penelitian ini.
Penularan  virus  dengue  melalui  perilaku  kawin  nyamuk Ae.  aegypti (penularan transvenereal)  merupakan  bagian  dari  penularan  vertikal  nyamuk  yang  masih  jarang  diteliti. Penelitian terbaru skala laboratorium oleh Putri (2018) juga telah membuktikan bahwa nyamuk Ae. aegypti jantan yang infeksius DENV-3 secara intratorakal dengan masa inkubasi 5 hari dan 14 hari,  dapat  menularkan  DENV-3  ke  nyamuk Ae.  aegypti betina  yang  non  infeksius.  Putri et  al. (2018) menyebutkan bahwa perilaku poligami alami nyamuk jantan juga berperan penting pada penyebaran  virus  dengue  secara  venereal  ke  nyamuk  betina.  Fakta  ini  menyebabkan  jika  satu nyamuk  jantan  infeksius  DENV-3  dapat  mengawini  nyamuk  betina  yang  non  infeksius  dengan jumlah tertentu, sebagai akibatnya nyamuk betina infeksius akan menghasilkan telur fertil  yang infeksius. Tidak ditemukannya virus dengue pada pemeriksaan organ spermateka nyamuk betina, memerlukan pemahaman  lebih  lanjut  tentang mekanisme  pertahanan  virus  dengue  secara transvenereal  pada  nyamuk  vektor  DBD.  Pengetahuan  tentang  perilaku  kawin  nyamuk  terkait faktor yang berhubungan seperti fisik optimal dari nyamuk, mekanisme fisiologi yang meregulasi perkawinan nyamuk, serta kondisi lingkungan yang sesuai dan faktor lainnya, perlu dikaji lebih lanjut. Kajian ini memberikan informasi penting dalam pengembangan strategi pengendalian DBD yang lebih efektif dari segi mekanisme kawin vektor.
Mandala of Health : A Scientific Journal                 ISSN: 0216-3098

## KESIMPULAN
Virus DENV-3 tidak terdeteksi di organ spermateka betina. Virus DENV-3 terdeteksi pada whole body nyamuk betina. Perlu pengujian lebih lanjut pada organ ovarium nyamuk betina untuk memastikan mekanisme terjadinya penularan transvenereal virus dengue pada Ae. aegypti dalam upaya mencari strategi baru dalam pengendalian vektor DBD.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Purwono, Ibu Kuswati, Ibu Atin, dan Ibu  Rumbi,  selaku  staf  laboratorium  Departemen  Parasitologi, Fakultas  Kedokteran,  Kesehatan Masyarakat dan Keperawatan, Universitas Gadjah Mada atas dukungan dan kerjasamanya selama berjalannya  proses  penelitian.    Penulis  juga  mengucapkan  terima  kasih  kepada  para  staf Laboratorium Biologi Molekuler, B2P2VRP Salatiga, Kementerian Kesehatan atas bantuan dan asistensinya dalam penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Arthur,  B.  J.,  Emr,  K.S.,  Wyttenbach  R.A.,  Hoy,  R.R.  2014.  Mosquito  ( Aedes  aegypti )  flight tones: frequency, harmonicity, spherical spreading, and phase relationships. The Journal of the Acoustical Society of America . 135(2): 933–41.
Arunachalam,  N.,  Tewari,  S.C.,  Thenmozhi,  V.,  Rajendran,  R.,  Paramasivan,  R.,  Ayanar,  K., Tyagi,  B.K.  2008.  Natural  vertical  transmission  of  dengue  viruses  by Aedes  aegypti in Cennai, Tamil, India. Indian. J. Med. Res . 127: 395-7.
Chen, W., I. H.,  Wei,  E. Hsu, Cheni, E. 1993. Vector competence of Aedes  albopictus and Ae. aegypti (Diptera: Culicidae) to dengue I virus on Taiwan: development of the virus in orally and parenterally infected mosquitoes. J. Med. Entomol . 30: 524–30.
Choochote, W., Tippawangkosol, P., Jitpakdi, A., Sukontason, K.L., Pitasawat, B., Sukantonson, K., Jariyapan, N. 2001. Polygamy: the possibly significant behavior of Aedes Aegypti and Aedes  Albopictus in  relation  to  efficient  transmission  of  dengue  virus. Research  Notoe Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health . 32 (4): 745-48.
Clement, A., N. 1999. The Biology of mosquitoes . Sensory Reception and Behaviour Volume 2. CABI Publishing. London School of Hygiene and Tropical Medicine. 333 – 88.
Degner, E.C. and Harrington, L.C. 2016. A mosquito sperm's journey from male ejaculate to egg: Mechanisms,  molecules,  and  methods  for  exploration. Molecular  reproduction  and development . 83(10): 897-911.
Espinosa, M., Giamperetti, S., Abril, M., Seijo, A. 2014. Vertical transmission of dengue virus in Aedes aegypti collected in Puerto Iguazu, Misiones, Argentina. Rev. Inst. Med . Trop. Sao Paulo. 56: 165–67.
Goff, L. G., Revollo, J., Guerra, M., Cruz, M., Simon, B.Z., Roca, Y., Flores, V.J., Herve, J.P. 2011. Natural vertical transmission of dengue viruses by Aedes aegypti in Bolivia. Parasite . 18: 277–80.
Kraemer, M.U.G, Sinka, M.E., Duda, K.A., Mylne, A.Q.N., Shearer, F.M., et al . 2015. The global distribution of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Ae. albopictus . eLife . 4:1–18.
Lanciotti,  R.  S.,  Calisher,  C.  H.,  Gubler,  D.  J.,  Chang,  G.  J.,  &  Vorndam,  A.  V.  1992.  Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase- polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology . 30 (3):  545–551.
Linthicum,  K.J.,  Platt,  K.,  Myint,  K.S.,  Lerdthusnee,  K.,  INNI,  B.L.  and  GHN,  D.W.V.  1996. Dengue  3  virus  distribution  in  the  mosquito Aedes  aegypti :  an  immunocytochemical study. Medical and veterinary entomology . 10(1): 87-92.
Martınez, N. E., Dzul-manzanilla, F., Gutierrez, C., Ibarralopez, J., Bibiano-marın, W., Lopez- damian, L., Martinijaimes, A., Huerta, H., Che Mendoza, A., Ayora, G., et al. 2014. Natural vertical transmission of dengue-1 virus in Aedes aegypti populations in Acapulco, Mexico. J. Am. Mosq . Control Assoc. 30: 143–146.
Martins, V.E.P., Alencar, C.H., Kamimura, M.T., De Carvalho Araujo, F.M., De Simone, S.G., Dutra, R.F., Guedes, M.I.F. 2012. Occurrence of natural vertical transmission of Dengue-2 and  Dengue-3  viruses  in Aedes  aegypti and Aedes  albopictus in  Fortaleza,  Ceara,  Brazil. PLoS ONE . 7: e41386.
Pascini, T.V., Ramalho-Ortigão, M. and Martins, G.F., 2012. Morphological and morphometrical assessment  of  spermathecae  of Aedes  aegypti females. Memórias  do  Instituto  Oswaldo Cruz . 107(6): 705-712.
Putri, D.F., Widya, A., Sugeng, M.J. and Sitti, U.R., 2018. The potency of polygamy behavior in Aedes  aegypti mosquitoes  by  venereal  transmission  dengue  virus. Jurnal  Kesehatan Masyarakat . 13(3): 382-388.
Putri, D.F. 2018. Kajian  penularan transvenereal  virus dengue serotipe-3  dan perilaku poligami nyamuk Aedes  Aegypti L.  serta  dampak  pada  progeninya  dalam  kondisi  insektarium. Disertasi. Universitas Gadjah Mada.
Seran, M.D. 2010. Uji laboratorium penularan tran-stadial virus dengue pada stadium telur, larva, pupa dan imago dari nyamuk Aedes aegypti (Diptera:  Culicidae). Tesis . Ilmu Kedokteran Tropis. Fakultas Kedokteran. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Thongrungkiat, S., Maneekan, P., Waspiyamongkol, L., Prumongkol, S. 2011. Prospective field study of transovarial dengue virus transmission by two different forms of Aedes aegypti in an urban area of Bangkok, Thailand. Jur. of Vec. Ecology . 36:147-52.
Tu,  W.C.,  Chenn,  C.C., Hou,  R.  F.  1998.  Ultrastructural  studies  on  the  reproductive  system  of male Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) infected with dengue 2 virus. J. Med. Entomol . 35: 71–6.
Umniyati, S. R., Sutaryo, Wahyono, D., Artama, W. T., Mardihusodo, S. J., Soeyoko,  Utoro, T. 2008. Application of monoclonal antibody DSSC7 for detecting dengue infection in Aedes
aegypti based  on  immunocytochemical  streptavidin  biotin  peroxidase  complex  assay (ISBPC). Dengue Bulletin , 32: 83–98.
WHO.  2019.  Immunization,  Vaccine  and  Biologicals:  Vaccine  and  Diseases  Dengue.  World
Health Organization. Geneva.
Available at:
https://www.who.int/immunization/diseases/dengue/revised_SAGE_recommendations_den gue_vaccines_apr2018/en/.