Abstrak — Bakteri  karbonoklastik  adalah  bakteri  yang  dapat menghasilkan  kalsium  karbonat  (CaCO 3 ).  Presipitasi  CaCO 3 oleh  bakteri  dikarenakan  adanya  aktifitas  urease  yang menghidrolisis  urea  menjadi  amonium  sehingga  meningkatkan pH  lingkungan  dan  membentuk  ion  karbonat,  yang  selanjutnya berikatan  dengan  ion  kalsium  terbentuk  CaCO 3 .  Inokulum bakteri  karbonoklastik  diisolasi  dari  pegunungan  kapur  di Gresik  ,  Bangkalan  dan  Tuban  .  Isolasi  menggunakan  medium selektif  CCP  ( Calcium  Carbonate  Precipitation ).  Koloni  yang tumbuh  dipurifikasi  selanjutnya  dilakukan  uji  konfirmasi keberadaan urease. Isolat terpilih di identifikasi dengan panduan Bergey ’ s Manual of Determinative Bacteria . Semua isolat yaitu SG 2, SG 3, SG 4, SG 5 (dari Gresik), JB 2 , JB 3 (dari Bangkalan), AT  2,  AT  3  (dari  Tuban)  dapat  menghasilkan  urease  dan membentuk kristal CaCO 3 . Isolat SG 3, SG 4, JB 2 , JB 3, AT 2, AT  3  teridentifikasi  sebagai  genus Bacillus ,  isolat  SG  2 terindentifikasi  sebagai  genus Sulfidobacillus dan  isolat  SG  5 teridentifikasi sebagai genus Escherichia .
Kata Kunci — Bakteri Karbonoklastik, CaCO 3 , Generic Assignment, Urease .

## I. PENDAHULUAN
AKTERI  karbonoklastik  adalah  bakteri  yang  dapat menghasilkan  kalsium  karbonat  (CaCO 3 ).  Bakteri karbonoklastik  dapat  ditemukan  di  pegunungan  kapur,  gua- gua  karst  ataupun  di  sedimen,  beberapa  bakteri  tersebut diantaranya  dari  anggota  genus  Sporosarcina,  Bacillus, Brevundimonas serta Lysinibacillus [1]. Bakteri karbonoklastik  berpotensi  untuk  memperkuat  struktur  beton. Biobeton  dengan  penambahan  bakteri  karbonoklastik  terbukti bermanfaat  untuk  struktur  konstruksi  tahan  lama  dan  juga memperbaiki  sifat  beton  serta  mengurangi  biaya  perawatan beton [2].
Menurut  [3],  bakteri  karbonoklastik  yang  mampu menghasilkan  kristal  CaCO 3 berpotensi  digunakan  sebagai biobeton untuk memperkuat struktur beton. Jika terdapat retak mikro  pada  struktur  beton,  bakteri  mampu  berfungsi  sebagai self-healing  concrete yang  artinya  memperbaiki  retak  mikro pada beton secara otomatis. Beberapa penelitian menyebutkan, bakteri  karbonoklastik  dapat  digunakan  untuk  meningkatkan kekuatan  beton  dan  merekatkan  retak  rambut  pada  beton. Bakteri karbonoklastik ( Bacillus ) mempunyai endospora yang dapat bergerminasi ketika air dan udara masuk melalui retakan mikro  dalam  beton  dan  akan  membentuk  kristal  CaCO 3 sehingga  dapat  memperbaiki  retak  mikro  pada  beton. Berdasarkan  penelitian  [4],  pembentukan  CaCO 3 oleh  bakteri dikarenakan  hidrolisis  urea  oleh  urease  yang  menghasilkan amonium dan karbonat. Amonium bertindak untuk menaikkan pH  lingkungan  yang  merupakan  kondisi  menguntungkan
untuk  pengendapan  CaCO 3 .  Karbonat  mengikat  ion  kalsium dan  menghasilkan  pembentukan  kristal  CaCO 3 yang diendapkan  lingkungan.  Berdasarkan  fenomena  diatas, dilakukan penelitian isolasi, identifikasi bakteri karbonoklastik yang  dapat  membentuk  kristal  CaCO 3 sehingga  dapat digunakan untuk memperkuat struktur beton.

## II. METODOLOGI

## Waktu dan Tempat Penelitian
A.
Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium  Mikrobiologi  dan Bioteknologi Departemen Biologi FMIPA ITS Surabaya pada bulan  Januari  sampai  dengan  Mei  2017.  Lokasi  sampling isolat  bakteri  karbonoklastik  di  daerah  Pegunungan  Suci, Kecamatan  Manyar,  Kabupaten  Gresik.  Bukit  Jaddih,  Desa Jaddih, Kecamatan Socah, Kabupaten Bangkalan. Gua Akbar, Desa
Gedongombo, Semanding, Kecamatan Tuban, Kabupaten Tuban.

## Isolasi dan Purifikasi Bakteri
B.
Sample  didapatkan  dengan  mengambil  material  kapur, dimasukkan  kedalam  botol  sample  steril,  ditutup,  dilabel  dan disimpan.  Sampel  dihaluskan  dengan  menggunakan  mortal dan pastle, dimasukkan dalam larutan fisiologis (0,9% NaCl), dilakukan  pengenceran  yang  bertingkat.  Sampel  diambil sebanyak  100  µL  dituang  pada  cawan  yang  berisi  media selektif  dengan  metode  spread  plate.  Media  selektif  yang digunakan  adalah  media Calcium  Carbonate  Precipitation (CCP)  dengan  komposisi  (per  liter)  20  g  urea;  2,12  g NaHCO 3 ; 10 g NH 4 Cl; 3 gr Natrium Broth ; 30 mM CaCl 2 ; 20 g  agar,  pH  diatur  8,5  dengan  NaOH  2M  [4]. Isolat  kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari.
Koloni  yang  tumbuh  adalah  isolat  bakteri  karbonoklastik. Koloni dipurifikasi sampai diperoleh kultur murni. Satu isolat diambil  secara  aseptis  dengan  jarum  ose,  diinokulasikan  ke media  CCP  dengan  metode  16  goresan  dan  diinkubasi  pada suhu  ruang  ±  24  jam.  Koloni  yang  tumbuh  diamati  sampai diperoleh koloni yang seragam.

## Uji Kualitatif Enzim Urease
C.
Isolat  terpilih  diuji  aktivitas  ureasenya  secara  kualitatif  di media urea cair. Per 100 ml mengandung 0,9 gr urea basebroth dan 5  ml  urea 40%. Isolat diambil sebanyak 1 ose,  kemudian diinokulasi  pada  media  urea  cair  5  ml,  diinkubasi  pada  suhu ruang selama 1-2 hari. Jika terjadi warna dari kuning menjadi merah muda menunjukkan isolat tersebut menghasilkan enzim urease. Dipilih 3 isolat yang menghasilkan enzim urease yang lebih  tinggi  yang  menunjukkan  warna  lebih  merah  dibanding isolat lainnya [5].

## Isolasi Bakteri Karbonoklastik dari Pegunungan Kapur
Gian Rukmana dan Enny Zulaika
Departemen Biologi, Fakultas Ilmu Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS)
e-mail : enny@bio.its.ac.id
B
Tabel 1. Isolat Bakteri Pengendap CaCO 3 Isolat CaCO 3 Isolat CaCO 3 Isolat CaCO 3 SG 1 + JB 1 + AT 1 + SG 2 + JB 2 + AT 2 + SG 3 + JB 3 + AT 3 + SG 4 + JB 4 + AT 4 + SG 5 + JB 5 + AT 5 +
Gambar 1. Purifikasi Isolat JB 2 dan SG 5 dengan Metode Gores 16.
Tabel 2. Hasil Uji Kualitatif Enzim Urease Isolat Hasil Isolat Hasil Isolat Hasil SG 1 - JB 1 - AT 1 - SG 2 + JB 2 + AT 2 + SG 3 + JB 3 + AT 3 + SG 4 + JB 4 - AT 4 - SG 5 + JB 5 - AT 5 -
Gambar 2. Hasil Uji Kualitatif Keberadaan Enzim Urease.
Identifikasi Bakteri
D.
Isolat  terpilih  di  identifikasi  berdasarkan  buku  panduan Bergey ’ s  Manual  of  Determinative  Bacteria .  Identifikasi berdasarkan  morfologi  sel,  sifat  Gram,  pewarnaan  endospora, motilitas, uji kebutuhan oksigen dan uji katalase [6].

## III. HASIL DAN DISKUSI

## Isolasi & Purifikasi Bakteri
A.
Isolat bakteri yang berasal dari sampel tanah kapur kawasan daerah  Pegunungan  Suci,  Gresik,  Bukit  Jaddih,  Bangkalan serta  Gua  Akbar,  Tuban  ditumbuhkan  pada  Medium  CCP ( Calcium  Carbonate  Precipitation ).  Proses  isolasi  bakteri dilakukan dengan cara melarutkan 1 gram sampel tanah kapur dalam  9  ml  akuades  steril  dan  dihomogenkan  dengan menggunakan vortex. Kemudian dilanjutkan dengan pengenceran  bertingkat  hingga  konsentrasi  10 -6 .  Hal  ini dilakukan supaya didapatkan jumlah bakteri yang tidak terlalu padat.  Pengenceran  bertingkat  berfungsi  agar  koloni  bakteri yang  tumbuh  dalam  media  agar  plate  tidak  mencapai  300 koloni [7]. Dari pengenceran 10 -1 hingga 10 -6 diambil masing- masing  0,1  ml  untuk  diinokulasikan  pada  Medium  CCP ( Calcium Carbonate Precipitation ) dalam cawan petri.
Isolat bakteri yang tumbuh merupakan bakteri karbonoklastik  yang  dapat  membentuk  CaCO 3 .  Koloni  yang tumbuh  membentuk  butiran  kristal  dan  diindikasikan  sebagai CaCO 3 sebab  bakteri  diisolasi  dengan  medium  selektif  CCP agar  terseleksi  bakteri  dengan  kode  SG  yang  berasal  dari Pegunungan  Suci  yaitu  SG  1,  SG  2,  SG  3,  SG  4  dan  SG  5. Bakteri  dengan  kode  JB  yang  berasal  dari  Bukit  Jaddih, Bangkalan  yaitu  JB  1,  JB  2,  JB  3,  JB  4  dan  JB  5.  Bakteri dengan  kode  AT  yang  berasal  dari  Gua  Akbar,  Tuban  yaitu AT 1, AT 2, AT 3, AT 4 dan AT 5 dapat dilihat pada Tabel 1.
Kemudian  dilakukan  pemurnian  dengan  metode  16  gores pada  medium  CCP  baru  dengan  tujuan  mendapatkan  kultur murni  bakteri.  Pemurnian  dengan  menggunakan  metode  16 gores dapat mempermudah proses pemurnian karena memiliki prinsip kerja goresan bertingkat (Gambar 1).
Mikroorganisme  akan  terlepas  dari  jarum  ose  sepanjang permukaan  agar.  Pada  arah  menuju  akhir  goresan  hanya sedikit  sel  bakteri  yang  tersisa  pada  jarum  ose,  sehingga individu sel bakteri akan tumbuh pada tempat yang berbeda di permukaan  agar.  Jika  medium  yang  digunakan  mengandung nutrisi yang dibutuhkan oleh bakteri untuk tumbuh, sel tunggal membentuk mikrokoloni. Mikrokoloni kemudian terus tumbuh menjadi koloni [8].

## Uji Kualitatif Adanya Enzim Urease B.
Urease disebut juga  urea amidohidrolase  merupakan enzim yang  mengkatalis  hidrolisis  dari  urea  menjadi  ammonia  dan karbonat.  Urease  merupakan  enzim  sitosolik  dan  umum ditemukan  pada  bakteri,  yeast,  dan  beberapa  tumbuhan  [9]. Enzim  ini  menggunakan  urea  sebagai  substrat  yang  akan dihidrolisis  menjadi  amonia  dan  asam  karbonat  sebagai produk akhir. Urease berperan dalam memudahkan organisme menggunakan urea sebagai sumber nitrogen [10][11].
Uji  kualitatif  enzim  urease  dilakukan  pada  semua  isolat yang  terseleksi.  Dari  15  isolat,  terseleksi  8  isolat  yang  dapat menghasilkan enzim urease ditandai dengan perubahan warna kuning menjadi warna merah muda. Kedelapan isolat tersebut adalah SG 2, SG 3, SG 4, SG 5, JB 2, JB 3, AT 2 dan AT 3. Isolat  lainnya  tidak  terjadi  perubahan  warna  sehingga  isolat tersebut  diindikasikan  tidak  dapat  membentuk  CaCO 3 ditunjukkan pada Tabel 2 dan Gambar 2.
Kemampuan  bakteri  membentuk  CaCO 3 dikarenakan bakteri  toleran  terhadap  konsentrasi  urea  dan  kalsium  yang tinggi. Bakteri akan menghasilkan urease akan menghidrolisis
urea sehingga melepas ion karbonat (CO 3 2- ) , selanjutnya CO 3 2- akan  terikat  dengan  ion  kalsium  (Ca 2+ )  dari  CaCl 2 dan membentuk CaCO 3 dan H 2 O [12].
Identifikasi Genus C.
Menurut [13], identifikasi dan Generic Asistment digunakan untuk  mengidentifikasi apakah isolat termasuk anggota  genus yang sudah ada atau genus baru (novel). Identifikasi dilakukan dengan menggunakan panduan Bergey ’ s Manual of Determinative Bacteriology [14]. Identifikasi terhadap 8 isolat menggunakan  profile  matching  dengan  karakter  kunci  sesuai genus  masing-masing.  Hasil  identifikasi  genus  selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 3 sampai 5.
Tabel 3.

## Identifikasi dengan
Profile Matching No Karakter kunci Bacillus Bacillus S G 3 S G 4 JB 2 JB 3 A T 2 A T 3 1 Sel Batang +
+ + + + + + 2 Gram + + + + + + + 3 Motilitas + + + + + + + 4 Endospora + + + + + + +
5 Aerob/ Fakultatif anaerob -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ -/+ 6 Katalase + + + + + + +
Berdasarkan  Tabel  3,  isolat  SG  3,  SG  4, JB  2,  JB  3,  AT  2 dan AT 3 diidentifikasi sebagai genus Bacillus . Menurut [14], genus Bacillus mempunyai  karakter  kunci  sel  batang,  Gram positif,  motil,  memiliki  endospora,  bersifat  aerob/fakultatif anaerob, dan katalase positif.
Tabel 4.
Identifikasi dengan Profile Matching No Karakter kunci Sulfidobacillus Sulfidobacillus SG 2 1 Sel Batang + + 2 Gram + + 3 Motilitas - - 4 Endospora + + 5 Aerob/ Fakultatif anaerob +/- +/- 6 Katalase + +
Berdasarkan  Tabel  4  isolat  SG  2  diidentifikasi  sebagai genus Sulfidobacillus .  Menurut  [14],  genus Sulfidobacillus mempunyai  karakter  kunci  sel  batang,  Gram  positif,  motil, memiliki  endospora,  bersifat  aerob/fakultatif  anaerob,  dan katalase positif.
Tabel 5. Identifikasi dengan Profile Matching No Karakter kunci Escherichia Escherichia SG 5 1 Sel Batang + + 2 Gram - - 3 Motilitas + + 4 Endospora - - 5 Aerob/ Fakultatif anaerob -/+ -/+ 6 Katalase + +
Berdasarkan  Tabel  5  isolat  SG  5  diidentifikasi  sebagai genus Escherichia .  Menurut  [14],  genus Escherichia mempunyai  karakter  kunci  sel  batang,  Gram  negatif,  motil, tidak  memiliki  endospora,  bersifat  aerob/fakultatif  anaerob, dan katalase positif.

## IV. KESIMPULAN
Isolasi sampel  kapur dari pegunungan  kapur didapatkan 15 isolat karbonoklastik yaitu SG 1, SG 2, SG 3, SG 4, SG 5, JB 1, JB 2, JB 3, JB 4, JB 5, AT 1, AT 2, AT 3, AT 4 dan AT 5. Genus  bakteri  karbonoklastik  yang  positif  menghasilkan urease adalah genus Bacillus ( SG 2,SG 3, SG 4, JB 2, JB 3, AT  2,  AT  3),  genus Sufidobacillus (SG2)  dan  genus Escherichia (SG 5).

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terimakasih  kepada  Dr.  Enny Zulaika, MP. atas dukungannya melalui pendanaan PNBP ITS tahun anggaran 2016 No. Kontrol 01711/IT2.11/PN.08/2016.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  Dhami, N. Kaur, M. S. Reddy, and A. Mukherjee., “ Biomineralization of Calcium  Carbonate  Polymorphs  by  the  Bacterial  Strains  Isolated  from Calcareous Sites, ” J. Microbiol. Biotechnol. , vol. 23, no. 5, 2013.
[2]  J. Bashir, Ifrahkathwari, Tiwary, and A. Khushpreetsingh, “ Bio Concrete The Self Healing Concrete, ” Indian J. Sci. Technol. , vol. 9, no. 47, 2016.
[3]  W.  Jianyun,  Y.  C.  Ersan,  N.  Boon,  and  N.  De  Belie, “ Application  Of Microorganisms  In  Concrete:  A  Promising  Sustainable  Strategy  To Improve  Concrete  Durability, ” Appl  Microbiol  Biotechnol ,  vol.  100,  no. 7, pp. 2993 – 3007, 2016.
[4]  S. Wei, H. Cui, Z. Jiang, H. Liu, H. He, and N. Fang, “ Biomineralization processes of calcite induced by bacteria isolated from marine sediments, ” Brazilian J. Microbiol. , vol. 2, no. 46, pp. 455 – 464, 2015.
[5]  F. Hammes, N. Boon, and J. Villiers, “ Strain-specific ureolytic microbial calcium carbonate precipitation, ” Appl Env. Microbiol , vol. 69, pp. 4901 – 4909, 2003.
[6]  J.  P.  Harley  and  L.  M.  Prescott, Laboratory  Exercises  in  Microbiology . USA: Mc Graw Hill, 2002.
[7]  J. h. Corry, J. Atabay, Forsythes, and L. Mansfield, Culture media for the isolation of campylobacters, helicobacter and arcobacters. In: Handbook of Culture Media for Food Microbiology . Amsterdam: Elsevier, 2003.
[8]  J. Slonczewski and J.W. Foster, Microbiology: An Evolving Science . New York: CSHI Press, 2009.
[9]  B.  Sujoy  and  A.  Aparna, “ Enzymology,  Immobilization  and  Application of Urease Enzyme, ” Int. Res. J. Biol. Sci , vol. 2, pp. 51 – 56, 2013.
[10] B.  Krajewska, “Ureases 1. Functional, Catalytic and Kinetic Properties :
A review, ” Sci. Res. Essays , vol. 7, pp. 2104 – 2111, 2009.
[11] Y.  Qin  and  J.  M.  S.  Cabral, “Properties and Applications of Urease :  A review, ” Biocatal. Biotransformation , vol. 20, pp. 1 – 14, 2002. [12] V.  P.  L.A et  al. , “Scale  Up  Of  Biogrout :  a  Biological  Ground Reinforcement  Method, ” in Proceeding  of  the  17th  International Conferences on Soil Mechanics and Geotechnical Engineering , 2009, pp. 2328 – 2333. [13] E.  Zulaika, “ Eksplorasi  Bakteri  Resisten  Merkuri  (BRM)  Endogenik Kalimas  Surabaya  yang  Berpotensi  Sebagai  Kandidatus  Agensia Bioremediasi Pencemaran Merkuri, ” Universitas Airlangga, 2013.
[14] J.  G.  Holt,  N.  R.  Krieg,  P.  H.  A.  Sneath,  J.  .  Staley,  and  S.  .  Williams,
Bergey ’ s Manual of Determinative Bacteriology . Philadelphia: Lippincot Williams & Wilkins, 1994.