## Induksi kalus daun binahong (Anredera cordifolia L.) dalam upaya pengembangan tanaman obat tradisional
(Callus induction of binahong leaves (Anredera cordifolia L.) for the development of traditional medicinal plant)
Lili Sugiyarto* dan Paramita Cahyaningrum Kuswandi**
Jurdik Biologi, FMIPA, Universitas Negeri Yogyakarta (UNY), Kampus Karangmalang, Sleman, DI Yogyakarta 55281 tel. 081331946350*,faks. (0274) 548203 dan e-mail: liloels@gmail.com *, paramita@uny.ac.id**
diterima 2 Desember 2013, disetujui 3 Februari 2014

## Abstrak
Salah  satu  tanaman  yang  memiliki  prospek  yang  cukup  bagus  dalam  proses  pengembangan  dan budidayanya  sebagai  tanaman  obat  adalah  tanaman  binahong  (Anredera  cordifolia  L.).  Metabolit  sekunder  telah banyak  digunakan  sebagai  zat  warna,  pewarna  makanan,  dan  obat-obatan.  Induksi  kalus  melalui  metode  kultur jaringan digunakan untuk menghasilkan metabolit sekunder yang kadarnya  lebih tinggi  daripada diambil langsung dari  tanamannya.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  menginduksi  kalus  daun  binahong  pada  beberapa  variasi konsentrasi  ZPT  pada  media  MS  (Murashige  and  Skoog).  Metode  yang  digunakan  dengan  perbanyakan  kalus dengan  sumber  eksplan  daun  binahong  dengan  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL).  Eksplan  daun  ditanam  pada media  MS  yang  mengandung konsentrasi  2,4  D berbeda  (1;2;3ppm), 0,5ppm IBA+0,5ppm  BAP; 0,5ppm  IBA+1,0 ppm  BAP  ;  1,0  ppm  IBA+0,5  ppm  BAP,  masing-masing  15  ulangan.  Hasil  penelitian  menunjukkan  penambahan 2,4-D (konsentrasi 1 dan 2 ppm) mampu menginduksi kalus daun binahong pada hari ke-3 dan ke-5 setelah tanam (hst),  kontrol  pada  hari  ke-10  sedangkan  perlakuan  kombinasi  di  atas  10  hst.  Pada  media  2,4-D  (1  dan  2  ppm), kalus yang dihasilkan berwarna putih bening, kompak dan berair, media 2,4-D 3 ppm kalusnya berwarna putih dan remah, sedangkan kalus yang terbentuk pada media kombinasi IBA dan BAP berwarna hijau dan kompak. Rerata diameter tertinggi selama 8 minggu pada media  2,4-D 1 ppm mencapai 2,07 cm, diikuti 3 ppm dan 2 ppm sekitar 1,8  cm,  sedangkan  pada  media  kombinasi  diameter  kalus  kurang  dari  0,3  cm.  Persentase  terbentuknya  kalus tertinggi  pada  media  2,4-D  1ppm  dan  kombinasi  0,5ppm  IBA  +  0,5  ppm  BAP  yaitu  100%,  sedangkan  terendah pada  kontrol  yaitu  20%.  Pertumbuhan  kalus  optimal  pada  minggu  ke-3  untuk  semua  perlakuan,  sedangkan memasuki  minggu  ke-4  eksplan  yang  muncul  kalus  mengalami  penurunan  dan  ada  yang  stagnan  (tetap).  Hasil analisis  ANOVA  persentase  eksplan  yang  muncul  kalus  pada  beberapa  media  perlakuan  yang  digunakan  pada penelitian ini tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan.
Kata kunci: induksi, daun binahong, kalus, zpt

## Abstract
A  plant  that  has  a  good  prospect  in  the  development  and  cultivation  as  medicinal  plant  is  binahong (Anredera  cordifolia  L.).  Secondary  metabolites  have  been  used  as  coloring  substance,  food  coloring,  and medicine.  Callus  induction  using  tissue  culture  has  been  used  to  produce  secondary  metabolite  with  a  higher concentration than obtained directly from the plant.  The aim of this research was to induce  callus from the leaf of Binahong  using  various  concentrations  of  Plant  Growth  Hormones  in  MS  media.  The  method  used  in  the propagation  of  callus  used  the  leaf  explant  of  binahong  with  Completely  Randomized  Design  (CRD).  The  leaf explants  were  planted  on  MS  media  with  different  2,4-D  concentrations  (1;2;3  ppm),  0,5ppm  IBA+0,5ppm  BAP; 0,5ppm IBA+1,0  ppm BAP; and 1,0 ppm  IBA+0,5 ppm BAP, each with 15 repetitions. The result showed that  the addition of 2,4-D (1 and 2 ppm) was able to induce callus from Binahong leaves on 3 and 5 days after planting, and also 10 days after planting in the controlled and combination treatment. In the 2,4-D media (1 and 2 pm), the callus produced were watery white and compact, while in the 3 ppm 2,4-D media the callus were white and friable. In the media with a combination of BAP and INA the callus were green and compact. The highest average diameter of the
callus  after  8  weeks  in  the  1  ppm  2,4-D  media  reached  2.07  cm  followed  by  the  2  ppm  and  3  ppm  2,4-D  media producing  a  diameter  of  1.8  cm.  In  the  combination  media  (BAP  and  IBA),  the  callus  diameter  was  less  than  0.3 cm. The highest percentage of callus formed was in the media MS+1 ppm 2,4-D and a combination of MS +0,5ppm IBA+0,5ppm  BAP  that  reached  100%.  The  lowest  was  found  in  the  control  (MS)  which  reached  only  20%.  The optimum growth of callus was at 3 weeks and after  that it declined or stayed stagnant. The result of the analysis of variance (ANOVA) showed that there was no significant difference in the media used in this research.
Key words: induction, binahong leaf, callus, plant growth

## Pendahuluan
Binahong (Anredera cordifolia L.) merupakan  tanaman  obat  yang  potensial  yang dapat  mengatasi  berbagai  jenis  penyakit.  Di negara  Eropa  maupun  Amerika  tanaman  ini cukup  dikenal,  tetapi  para  ahli  belum  tertarik untuk  meneliti  tanaman  ini  lebih  mendalam, padahal  berbagi  khasiat  sebagai  obat  telah diketahui. Bagian dari tanaman binahong hampir semuanya  dapat  dimanfaatkan,  mulai  dari batang,  akar,  bunga,  dan  daun,  akan  tetapi bagian  yang  banyak  digunakan  sebagai  bahan obat herbal adalah bagian daun [1].
Teknik  in  vitro  atau  kultur  jaringan merupakan  salah  satu  teknik  yang  dapat digunakan  untuk  induksi  kalus  daun  binahong untuk menghasilkan metabolit sekunder. Berdasarkan  tekstur  dan  komposisi  sel,  kalus dapat  dibedakan  menjadi  kalus  kompak  dan kalus  meremah.  Kalus  dengan  tekstur  kompak akan  menghasilkan  metabolit  sekunder  yang lebih  banyak  dibandingkan  kalus  dengan  tekstur meremah.  Metabolit  sekunder  yang  dihasilkan dari kultur kalus biasanya lebih banyak jenisnya, karena  seringkali  timbul  zat-zat  alkaloid  atau senyawa-senyawa  lain  yang  sangat  berguna untuk  pengobatan  [2].  Penelitian  ini  bertujuan untuk  menginduksi  kalus  daun  binahong  pada media  MS  dengan  beberapa  variasi  konsentrasi ZPT.  Keberhasilan  dari  kalus  yang  terbentuk akan  digunakan  sebagai  sumber  eksplan  pada penelitian  selanjutnya  yaitu  kultur  kalus  pada kultur media cair.

## Kajian Pustaka
Binahong (Anredera cordifolia L.) merupakan tanaman  obat  yang  berpotensi  mengatasi berbagai  jenis  penyakit.  Di  negara  Eropa maupun  Amerika  tanaman  ini  cukup  dikenal, tetapi  para  ahli  belum  tertarik  untuk  meneliti
tanaman  ini  lebih  mendalam,  padahal  berbagi khasiat sebagai obat telah diketahui. Bagian dari tanaman  binahong  hampir  semuanya  dapat dimanfaatkan,  mulai  dari  batang,  akar,  bunga, dan  daun,  akan  tetapi  bagian  yang  banyak digunakan  sebagai  bahan  obat  herbal  adalah bagian daun [1].
Karakteristik  pada  setiap  kalus  berbeda- beda,  terdapat  kalus  dengan  tekstur  lembut (soft), dan remah (friable), keras dan kompak [3]. Karekteristik  kalus  sendiri  tergantung  pada komposisi  media  pengulturan,  khususnya  zat pengatur  tumbuh,  dan  jenis  eksplan.  Sehingga dari  induksi  kalus  yang  dilakukan  melalui  kultur jaringan inilah nantinya akan diapatkan metabolit sekunder.

## Metode Penelitian
Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium Kultur  Jaringan,  Fakultas  MIPA,  Universitas Negeri  Yogyakarta.  Bahan  yang  digunakan adalah daun binahong dan media MS (Murashige and Skoog). Pembentukan kalus akan ditumbuhkan pada media MS yang mengandung 2,4  D  dengan  konsentrasi  berbeda  (1;2;3ppm), 0,5ppm  IBA+0,5ppm  BAP;  0,5ppm  IBA+1,0  ppm BAP  ;  1,0  ppm  IBA+0,5  ppm  BAP,  masing- masing  15  ulangan.    Sebelum  ditanam,  terlebih dahulu  daun  binahong  disterilisasi  dengan mencuci  bersih  menggunakan  larutan  detergen selama 15 menit. Kemudian dibilas hingga bersih menggunakan  air  mengalir,  dan  kemudian dimasukkan kedalam erlemmeyer sebelum dimasukkan  ke  dalam  LAF.  Sterilisasi  eksplan dilakukan  dengan  menggunakan  alkohol  70%, kemudian dilanjutkan dengan larutan clorox 10%. Kemudian eksplan dibilas menggunakan aquadest  steril  sebanyak  3  kali.  Data  diambil seminggu  sekali  selama  4  minggu.  Variabel- variabel  yang  diamati  adalah  :  waktu  inisiasi
kalus, morfologi kalus, diameter kalus, persentase terbentuknya kalus.
Data  bobot  persentase  eksplan  yang muncul  kalus  dianalisis  varian  pada  menurut Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL).  Analisis dilanjutkan  dengan  uji  DMRT  (Duncan’s  Multiple Range Test) jika ada perbedaan antar perlakuan.
Tabel  1.  Beberapa  konsentrasi  ZPT  (perlakuan) yang digunakan.
No Perlakuan Jumlah eksplan 1 MS 15 2 MS+1 ppm 2,4 D 15 3 MS+2 ppm 2,4 D 15 4 MS+3 ppm 2,4 D 15 5 MS+0,5 ppm
IBA+0,5 ppm BAP 15 6 MS+0,5 ppm IBA+1,0 ppm BAP 15 7 MS+1,0 ppm
IBA+0,5 ppm BAP 15 Total 105 Penelitian telah dilakukan di kebun percobaan  dan  laboratorium  kultur  jaringan, Fakultas  MIPA,  Universitas  Negeri  Yogyakarta. Bahan yang digunakan adalah biji durian varietas local.  Perkecambahan  biji  dilakukan  di  kebun percobaan dengan menanam biji di polibag berisi media tanah dan kompos. Untuk perkecambahan biji  diperlukan  polibag  ukuran  sedang,  media tanam  (kompos  dan  tanah)  serta  peralatan bercocok  tanam.  Setelah  tunas  mulai  muncul, nodia  dan  daun  dipindah  ke  media  MS  yang mengandung  sitokinin  BAP.  Untuk  sterilisasi digunakan bahan-bahan berupa detergen, bakterisida,  fungisida,  aquades,  alkohol  70%, larutan  Clorox  (bayclin)  10%,  dan  tissue. Aluminium foil dan kertas payung juga digunakan dalam sterilisasi alat-alat. Media yang digunakan adalah  MS  +  2  ppm  BAP  dan  MS  +  4  ppm  BAP untuk induksi tunas dari nodia, sedangkan untuk induksi  kalus  pada  daun  digunakan  media  MS dengan  tambahan  2,4-D  (0,4  ppm,  1ppm,  dan 1,5ppm).  Dalam  perlakuan  in  vitro,  dibutuhkan alat-alat  berupa  botol-botol  media  dan  tutup tahan panas atau aluminium foil.  Selain itu juga akan  digunakan  pinset,  lampu  Bunsen,  scalpel, petridish,  beaker,  magnetic  stirrer,  autoklaf,
timbangan  digital,  label,  dan  almari  Laminair  air flow (LAF).

## Hasil dan Diskusi

## Waktu munculnya kalus
Munculnya  kalus  pada  media  2,4-D  1  ppm adalah  3  hari  setelah  tanam  (hst),  diikuti  2,4-D 2ppm  5  hst  dan  2,4D  3ppm,  sedangkan  kalus pada  media  kontrol  muncul  pada  10  hst  dan media  kombinasi  IBA  dan  BAP  setelah  10  hst (Gambar 1).
Gambar  1.  Grafik  hubungan  medium  perlakuan dengan  hari  muncul  kalus  (hst).  Keterangan gambar:  Po:  MS  (kontrol),  P1:  MS+1ppm  2,4-D, P2:  MS+2ppm  2,4-D,  P3:  MS+3ppm  2,4-D,  P4:
MS+0,5ppm IBA+0,5ppmBAP, P5: MS+0,5ppmIBA+1ppm BAP, P6:
MS+1ppmIBA+0,5ppmBAP.
Penambahan  2,4-D  dalam  media  kultur akan merangsang pembelahan dan pembesaran sel  pada  eksplan  sehingga  dapat  memacu pembentukan  dan  pertumbuhan  kalus  serta meningkatkan senyawa kimia alami flavonoid [4]. Hal  serupa  juga  disampaikan  oleh  [5],  yang menyatakan  bahwa  2,4-D  dapat  menyebabkan elongasi  sel,  pembengkakan  jaringan  dan pembentukan  kalus.  Munculnya  kalus  pada media  2,4-D  1  ppm  adalah  3  hari  setelah  tanam (hst),  diikuti  2,4-D  2ppm  5  hst  dan  2,4D  3ppm, sedangkan  kalus  pada  media  kontrol  muncul pada  10  hst  dan  media  kombinasi  IBA  dan  BAP setelah 10 hst. Senyawa 2,4-D merupakan salah satu  jenis  auksin  yang  sangat  efektif  untuk menginduksi  pembentukan  kalus  seperti  yang terjadi  pada  induksi  kalus  daun  binahong  ini. Walaupun auksin yang berperan utama, terkadang sitokinin juga diperlukan untuk proliferasi kalus, namun pada penelitian ini, 2,4-D
10 3 5 11 15 11 13 0 2 4 6 8 10 12 14 16 P0 P1 P2 P3 P4 P5 P6 H a ri s e te la h t a n a m ( H S T ) Perlakuan WAKTU INISIASI
yang  lebih  efektik  untuk menginduksi  kalus  lebih cepat.

## Morfologi kalus (Tipe dan warna)
Tabel 2. Morfologi kalus yang terbentuk. Media Tipe kalus Warna kalus MS (Kontrol) kompak Putih bening,berair MS + 1 ppm 2,4-D kompak Putih bening,berair MS + 2 ppm 2,4-D kompak Putih bening,berair MS + 3 ppm 2,4-D remah Putih MS + 0,5 ppm IBA + 0,5 ppm BAP kompak Hijau MS + 0,5 ppm IBA + 1 ppp BAP kompak Hijau MS + 1 ppm IBA + 0,5 ppm BAP kompak hijau
Pada  umur  4  minggu  setelah  tanam, dengan  konsentrasi  2,4-D  (1  dan  2  ppm),  kalus yang terbentuk berwarna putih bening, berair dan kompak,  sedangkan  pada  konsentrasi  3  ppm kalus  yang  muncul  berwarna  putih  susu  dan remah.  Berdasarkan  tekstur  dan  komposisi selnya,  kalus  dapat  dibedakan  menjadi  kalus yang  kompak  dan  remah.  Kalus  kompak mempunyai  tekstur  padat  dan  keras,  yang tersusun  dari  sel-sel  kecil  yang  sangat  rapat, sedangkan  kalus  remah  mempunyai  tekstur lunak  dan  tersusun  dari  sel-sel  dengan  ruang antar sel yang banyak. Perbedaan struktur kalus menimbulkan  adanya  perbedaan  kemampuan memproduksi metabolit sekunder. Menurut Scragg  (1994)  cit  [6],  metabolit  sekunder  akan lebih banyak  dihasilkan pada kalus yang dikultur pada  kultur  cair  dibandingkan  kultur  padat dengan  jenis  media  yang  sama.  Pada  media kombinasi  IBA  dan  BAP,  menghasilkan  kalus yang  kompak  dan  berwarna  hijau.  Warna  kalus yang  hijau  disebabkan  adanya  konsentrasi sitokinin  (BAP)  dalam  media.  Sitokinin  yang
ditambahkan  mampu  mengaktifkan  proses- proses  metabolisme  dan  sintesis  protein  yang mampu  menghambat  perombakan  butir-butir klorofil Wattimena (1991) dalam [7]. Penampakan  kalus  pada  media  2,4-D  (1  dan 2ppm),  awalnya  berwarna  putih  bening  hingga minggu  ke-4,  kemudian  memasuki  minggu  ke-5 warna  kalus  berubah  warnanya  menjadi  coklat muda  dan  akhirnya  kehitaman  setelah  di subkultur. Hal ini disebabkan adanya metabolisme  senyawa  fenol  yang  berlebihan pada jaringan yang mulai terbentuk. Warna kalus yang  kecoklatan  terdapat  pada  hampir  semua perlakuan  yang  terbentuk  kalus  dan  sering terangsang akibat sterilisasi eksplan S. Andaryani (2010)  dalam [8].  Pada  permukaan  bawah  kalus juga  terlihat  jaringan  yang  berair,  hal  ini  karena permukaan bawah langsung bersentuhan dengan  media  dan  berperan  sebagai  area penyerapan media. Foto kalus pada minggu ke-8 dapat di lihat pada gambar 2.
(A)                         (B) (C)                      (D)                            (E)
Gambar 2. Morfologi kalus dengan mikroskop stereo (A). 1 ppm 2,4-D;(B). 2 ppm 2,4-D; (C.) 3 ppm 2,4-D;(D). 1 ppm IBA+0,5 ppm BAP; dan (E). 0,5 ppm IBA+0,5 ppm BAP.

## Rerata diameter kalus
Rerata  diameter  tertinggi  selama  8 minggu pada media  2,4-D 1 ppm mencapai 2,07 cm,  diikuti  3  ppm  dan  2  ppm  sekitar    1,8 cm,sedangkan  pada  media  kombinasi  diameter kalus  kurang  dari  0,3  cm.  Hal  ini  menunjukkan bahwa  senyawa  2,4-D  sebagai  ZPT  tunggal mampu menginduksi kalus daun binahong paling banyak  dibandingkan  yang  kombinasi  IBA  dan BAP.  Konsentrasi  2,4-D  yang  digunakan,  1  ppm lebih optimal dibandingkan dengan 2 dan 3.
Gambar 3. Grafik rerata diameter kalus selama 8 minggu

## Persentase kalus yang muncul
Persentase kalus yang muncul tertinggi pada  medium  1  ppm  2,4-D  dan  kombinasi  0,5 ppm  IBA+0,5  ppm  BAP  yang  mencapai  100%, diikuti 2 ppm 2,4-D mencapai 80%, 3 perlakuan media  dengan  ZPT  yang  mencapai  60%,  dan terakhir  kontrol  yang  hanya  20%.  Persentase kalus  yang  muncul  optimal  pada  minggu  ke-3, sedangkan memasuki mingg ke-4 eksplan yang muncul  kalus  mengalami  penurunan  dan  ada yang  stagnan  (tetap).  Persentase  kalus  yang rendah pada eksplan daun binahong kebanyakan  terkontaminasi  oleh  bakteri,  yang menghambat  tumbuhnya  kalus,  sehingga  perlu lebih  hati-hati  dan  meningkatkan  kebersihan dan  kesterilan  bekerja  pada  waktu  di  dalam LAF.
Gambar 4. Grafik persentase eksplan yang muncul  kalus.
Hasil analisis ANOVA persentase eksplan yang  muncul  kalus  pada  beberapa  media perlakuan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini juga tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan.

## Kesimpulan
Penambahan 2,4-D (1 dan 2 ppm) dalam media  dapat  menginduksi  kalus  daun  binahong bertipe  kompak  dan  berwarna  putih  bening  dan berair,  dan  kalus  pada  media  2,4-D  3  ppm bertipe  remah  dan  berwarna  putih.  Sedangkan pada media kombinasi IBA dan BAP, kalus yang muncul bertipe kompak dan berwarna hijau. Tipe kalus  remah  merupakan  kalus  yang  dapat digunakan  untuk  kultur  sel  untuk  mendapatkan metabolit sekunder.

## Pustaka
[1] F. Manoi, Warta Penelitian dan Pengembangan  Tanaman  Industri,  15  (1)
(2009) pp. 3 – 5.
[2] D. P. Hendaryono dan A. Wijayani, Teknik Kultur Jaringan, Kanisius, Yogyakarta, 1994.
[3] E. Thomas dan M. R. Davey, From Single Cell to Plant, Wykehan Publisher Itd., London, 1975.
[4] R. Bekti, E. Solichatun, dan Anggarwulan, Biofarmasi 1(1) (2003) p. 6.
[5] R. M. L. Pierik, In Vitro Culture of Higher Plants, Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, The Netherlands, 1987, p. 71.
[6] S. Anas, Produksi Katarantin Melalui Kultur Jaringan, Lubuk Agung, Bandung, 2011.
[7] D. P. Wardani, Solichatun, dan A. D. Setyawan.2004, Biofarmasi 2(1) (2004) pp. 35-43.
[8] P. N. Indah dan D. Ermavitalini, Jurnal Sains dan Seni Pomits Vol. 2 (1) (2013) pp. 2337- 3520.