## Variasi Rasio Amonium dan Nitrat terhadap Perkembangan Embrio Somatik Bawang Putih ( Allium sativum ) secara In Vitro

## Singgih Tri Wardana
Jurusan Biologi, FMIPA Universitas Sriwijaya, Sumatera Selatan, Indonesia
Abstract: This research was aimed to conduct different  NH 4 + : NO 3 - ratios on the development of somatic em- bryos of garlic (Allium sativum) by in vitro technique. This research used complete random design with four levels of NH 4 + : NO 3 - ratios, i.e. 1:2,  1:3, 1:4, and 1:5.The cell suspension culture used MS medium with 0,25 mg l -1 BAP. The results showed that the different NH 4 + : NO 3 - ratios resulted significant effect on the develop- ment of somatic embryos ( globular, scutelar, and coleoptiler stages).1:3 ratio of  NH 4 + : NO 3 - was optimum to improve the development of somatic embryos.
Keywords: NH 4 + : NO 3 - ratios, somatic embryo, garlic, in vitro

## 1 PENDAHULUAN
awang  putih  ( Allium  sativum L.)    merupakan salah satu komoditi sayuran  yang banyak dikon- sumsi  oleh  masyarakat.  Tanaman  ini  mengandung vitamin A, B 1 , B 2 , dan C serta sejumlah mineral (sul- fur,  potassium,  besi,  iodine,  fosfor  dan  selenium). Tanaman  ini  juga  mengandung  senyawa  metabolit inulin  dan  allicin  yang  dapat  dimanfaatkan  sebagai antibiotik,  antiparasitik,  antioksidan,  antimikroba antivirus,  antitumor,  antitrombin,  menghambat  pe- nuaan  dini  dan  menurunkan  kolesterol  (Schwartz dan Krishna, 1999 ; Amagase, 2006).
Bawang  putih( Allium  sativum L.)  merupakan anggota  famili  Liliaceae,  tumbuhan  ini  memiliki bunga yang steril sehingga tidak dapat menghasilkan biji.Selama  ini  perbanyakan  tanaman  bawang  putih dilakukan secara vegetatif, yaitu dengan mengguna- kan  umbi  ( bulbus ).  Masalah  yang  sering  dijumpai dalam  perbanyakan  menggunakan  umbi  ini  adalah tanaman yang dihasilkan tidak seragam, jumlah pro- duksi  yang  belum  mencukupi  kebutuhan,  serta  pe- nyebaran  virus  yang  tidak  terkendali  (Ayabe  dan Sumi,  1998).  Usaha  untuk  mengatasi  kendala  yang dijumpai    pada  perbanyakan  secara  konvensional tanaman bawang putih adalah dengan teknik kultur in  vitro yaitu  melalui  embriogenesis  somatik.  Menu- rut Rao(1996), embriogenesis somatik secara in vitro merupakan  pilihan  perbanyakan  vegetatif  yang  te- pat,  efisien  dan  lebih  praktis  untuk  perbanyakan klonal,  karena  dapat  diperoleh  tanaman  yang  sera- gam dalam jumlah besar. Hal ini disebabkan embrio somatik  yang  dihasilkan  bersifat  bipolar  seperti  em- brio zigotik, yaitu calon tunas dan calon akar terben-
tuk  secara  bersamaan  sehingga  tahap  perakaran tidak diperlukan.
Perbanyakan  tanaman  bawang  putih  melalui embriogenesis  somatik  secara in  vitro menghasilkan bibit tanaman dalam jumlah besar dan secara gene- tik  identik  dengan  induknya  (Bockish et  al ,  1997  ; Ayabe  dan  Sumi,  1998),  dapat  menghasilkan  bibit tanaman yang bebas virus (Ayabe dan Sumi, 2001), embrio  somatik  yang  terbentuk  selanjutnya  dapat digunakan  untuk  membuat  biji  artifisial  (Kim  dan Park, 2002).
Embriogenesis  somatik  secara in  vitro melalui dua fase utama. Pertama, diferensiasi sel-sel somatik membentuk  sel  embriogenik,  dilanjutkan  proliferasi sel embriogenik tersebut. Kedua, sel-sel embriogenik berdiferensiasi  membentukembrio  somatik  (Jime- nez, 2001). Faktor yang mempengaruhi perkemban- gan  sel  embriogenik  membentuk    embrio  somatik salah  satunya  adalah  sumber  nitrogen  dan  konsen- trasi  nitrogen.  Di  dalam  medium  yang  digunakan untuk  kultur in  vitro ,  sumber  nitrogen  terdapat  da- lam  bentuk  nitrogen  anorganik  berupa  amonium (NH 4 ) dan nitrat (NO 3 ), dan nitrogen organik berupa asam amino, antara lain glutamin, alanin, asam glu- tamat, asparagin, dan prolin  (George, 1993).
Penambahan  maupun  pengurangan  konsentrasi nitrogen  berpengaruh  pada  embriogenesis  somatik. Penambahan  maupun  pengurangan  konsentrasi NH 4 + dan  NO 3 - pada  medium  dasarmengakibatkan perubahan rasio antar kedua sumber nitrogen terse- but.
Pengaruh  rasio  NH 4 + danNO 3 - terhadap  embri- ogenesis  somatik,  antara  lain  pada Medicago  sativa
B
diperlukan 12 mM NH 4 + dan 48 mM NO 3 - atau rasio NH 4 + danNO 3 - adalah  1  :4  untuk  induksi  sel  em- briogenik, sedang untuk diferensiasi sel embriogenik membentuk  embrio  somatik  diperlukan  20  mM NH 4 + dan 40 mM NO 3 - atau rasio NH 4 + danNO 3 - ada- lah  1  :  2  (Meijer  dan  Brown,  1987).  Pada Citrus  si- nensis menunjukkan  penambahan  berat  kalus  em- briogenik yang paling tinggi dengan perlakuan rasio NH 4 + danNO 3 - yaitu  1  :  3  (Niedz,  1994).  Wardana (2004) melaporkan bahwa rasio NH 4 + danNO 3 - yaitu 1  :  3    berpengaruh  positif  dalam  induksi  kalus  em- briogenik pada Allium sativum .
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menentukan  rasio ammonium  dan  nitrat  (NH 4 + :NO 3 - )  terbaik  untuk memacu  perkembangan (diferensiasi) embrio soma- tik  bawang  putih  ( Allium  sativum L).  secara in  vitro.
Diharapkan  hasil  penelitian  ini  dapat  sebagai  infor- masi  dasar  studi  embriogenesis  somatik,  khususnya pada Allium  sativum L.,  dan  sebagai  alternatif  me- tode perbanyakan klonal Allium sativum L.

## 2 METODE PENELITIAN
Penelitian eksperimental ini  dilaksanakan di Labora- torium Fisiologi Tumbuhan  Jurusan Biologi Fakultas MIPA  Universitas  Sriwijaya,  Palembang.Bahan  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  kalus  em- briogenik  bawang  putih  hasil  koleksi,  Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap dengan 4 perlakuan, termasuk kontrol (Ta- bel 1.). Masing-masing perlakuan dengan ulangan 20 kali .
______________________________________________________
Tabel 1. Perlakuan rasio NH 4 + danNO 3 - yang bervariasi  (Wardana, 2004).
Perlakuan  Konsentrasi Sumber Nitrogen Konsentrasi (mM) NH 4 + :NO 3 - Rasio NH 4 + : NO 3 - Nitrogen Total (mM) K (kontrol) 20 mM NH 4 NO 3 20 mM KNO 3 20 :40 1 : 2 60 S1 15 mM NH 4 NO 3 30 mM KNO 3 15 :45 1 : 3 60 S2 12 mM NH 4 NO 3 36 mM KNO 3 12 :48 1 : 4 60 S3 10 mM NH 4 NO 3 40 mM KNO 3 10 :50 1 : 5 60 ______________________________________________________
Penelitian  ini  digunakan  metode  kultur  suspensi dengan media dasar MS.. Koleksi kalus embriogenik bawang  putih  sebanyak  2  g  dibuat  suspensi  sel  ke dalam 50 ml medium dasar dengan penambahan 1 mg.l -1 2,4-D, dan diperlakukan secara agitatis dengan menggunakan  shaker  pada  kecepatan  100  rpm  se- lama  2  –  5  jam.  Kemudian  kecepatan  shaker  ditu- runkan  sampai  60  rpm  selama  7  hari.  Selanjunya sebanyak 1,5 ml suspensi sel tersebut dimasukkan ke dalam  cawan  petri  yang  telah  berisi  6  ml  medium perlakuan (medium dasar MS dengan penambahan 0,25  mg.l -1 BAP  dengan  rasio  NH 4 + :  NO 3 - yang  ber- variasi seperti pada Tabei 1.), dan dipelihara secara statis  dalam  kondisi  aseptis  dalam  ruang  inkubasi dengan  suhu  25  -  26 o C,serta  dalam  kondisi  terang, selama  3  minggu.  Dilakukan  pengamatan  dan  sub- kultur  setiap 7 hari sekali.  Pengamatan dan penghi- tungan jumlah embrio somatik digunakan haemocy- tometer dan hand  counter di  bawah  mikroskop  ca- haya.  Data  kuantitatif  dianalisis  dengan  sidik  ragam pada taraf   5 %, jika ada perbedaan yang nyata di- lanjutkan dengan uji LSD pada taraf 5 %. Data yang bersifat kualitatif dianalisis secara deskriptif.

## 3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Perkembangan  embrio  somatik  pada  penelitian  ini serupa  dengan  perkembangan  embrio  zigotik  pada tanaman  monokotil  secara  umum,  yaitu  berturut- turut dari stadium globuler, skutelar, dan koleoptiler. Berdasarkan  hasil  analisis  sidik  ragam  (ANOVA), perlakuan  rasio  NH 4 + danNO 3 - berpengaruh  nyata terhadap perkembangan embrio somatik, baik pada stadium  globuler,  skutelar,  dan  koleoptiler.  Kedua hal  tersebut  diatas  menunjukkan  bahwa  nitrogen dalam  bentuk  NH 4 + danNO 3 - berperan  penting  da- lam embriogenesis somatik pada Allium sativum L., dan  rasio  NH 4 + danNO 3 - sangat  menentukan  per- kembangan  embrio  somatik  pada Allium  sativum L. Hal  tersebut  sesuai  dengan  pendapat  Singh et  al. (1999)  yang  menyatakan  bahwa  senyawa  nitrogen berfungsi  sebagai  karier,  katalis,  transporter,  atau molekul  pengatur  lain  dalam  proses  aktivasi  sistem sinyal  transduksi  yang  dapat  merubah  struktur  kro- matin, transkripsi atau jalur lain, sehingga gen yang mengkode  pembentukkan  embrio  somatik  mampu diekspresikan.
Hasil penelitian variasi rasio amonium dan nitrat terhadap  perkembangan  embrio  somatik  bawang
putih disajikan pada Tabel 2. berikut ini.
______________________________________________________ Tabel 2. Pengaruh rasio NH 4 + danNO 3 - terhadap rerata jumlah embrio somatik pada tiap stadium perkembangan embrio.
Perlakuan  Rasio NH 4 + :NO 3 - Stadium Perkembangan Embrio (embrio/ml suspensi) Globuler Skutelar Koleoptiler K (kontrol) 1 : 2 4,24 . 10 5   a 6,64 . 10 5   a 6,48  . 10 5   a S1 1 : 3 4,84 . 10 5   a 6,86 . 10 5   a 8,24  . 10 5   b S2 1 : 4 2,68 . 10 5   b 2,24 . 10 5   b 2,04  . 10 5   c S3 1 : 5 1,26 . 10 5   c 0,48 . 10 5   c 0,24  .  10 5  d
Keterangan: Angka yang diikuti dengan huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang tidak nyata pada uji LSD 5%.
______________________________________________________
Rasio NH 4 + danNO 3 - yaitu 1 : 2 dan 1 : 3  terjadi pe- ningkatan  jumlah  embrio  somatik  yang  lebih  baik bila dibanding dengan rasio 1 : 4 dan 1 : 5. Pada ra- sio  NH 4 + danNO 3 - 1  :  4  ,  walaupun  embrio  somatik yang  terbentuk  mengalami  perkembangan  sampai pada  stadium  koleoptiler,  tetapi  jumlah  embrio  so- matik tiap-tiap stadium perkembangan lebih rendah dibanding pada rasio 1 : 2 dan 1 : 3. Hal ini diduga pada rasio 1 : 4 , penyerapan NH 4 + danNO 3 - oleh sel- sel embrio somatik mulai terhambat. Penghambatan penyerapan  NH 4 + danNO 3 - terutama  terjadi  pada  ra- sio 1 : 5 . Penghambatan penyerapan NH 4 + danNO 3 - ini  terjadi  karena  terjadi  peningkatan  pH  medium yang  menjadi  lebih  alkalis  (basa).  Perubahan  pH medium  menjadi  lebih  alkalis  karena  konsentrasi NO 3 - jauh  lebih  tinggi  dari  konsentrasi  NH 4 + .  Ren- dahnya  NH 4 + danNO 3 - yang terserap oleh sel menye- babkan rendahnya inkorporasi NH 4 + danNO 3 - dalam membentuk senyawa yang lebih komplek yang ber- peran  dalam  embriogenesis  somatik,  sehingga  per- kembangan embrio somatik terhambat.
NH 4 + danNO 3 - pada rasio 1 : 2 dan 1 : 3 , embrio somatik  berkembang  dengan  baik,  terutama  pada rasio  1  :  3  ,  dimana  jumlah  embrio  somatik  pada tiap-tiap  stadium  lebih tinggi dibanding  rasio 1 : 2  . Hal  tersebut  menunjukkan  NH 4 + danNO 3 - terserap dengan baik oleh sel, sehingga  dapat berinkorporasi membentuk senyawa yang lebih komplek yang ber- peran dalam embriogenesis somatik. Perubahan pH medium pada rasio 1 : 2 maupun 1 : 3 diduga tetap pada kisaran netral, sehingga penyerapan NH 4 + danNO 3 - maupun  komponen  medium  lainnya tidak  terhambat.  Hal  tersebut  sesuai  dengan  hasil penelitian  Niedz  (1994)  bahwa  perbandingan NH 4 + danNO 3 - pada  rasio  1  :  3  menyebabkan  peru- bahan pH pada kisaran netral, dan terjadi peningka- tan berat basah kalus embriogenik, serta diferensiasi embrio somatik.
Penyerapan  NH 4 + danNO 3 - serta  inkorporasinya dalam membentuk senyawa yang lebih komplek da-
pat  dijelaskan  oleh  pendapat  Stasolla et  al .  (2003) yang  menyatakan  bahwa  NH 4 + yang  diserap  lang- sung  oleh  sel  maupun  NH 4 + hasil  reduksiNO 3 - akan segera  dimetabolisir  membentuk  asam  amino  glu- tamin,  asam  glutamat  dan  arginin.  Thorpe  dan  Sta- solla  (2001)  menambahkan  bahwa  akumulasi  gluta- min  di  dalam  sel  akan  meningkatkan  sintesis  asam amino  triptofan  sebagai  prekursor    auksin  endogen (IAA). IAA ( indole acetic acid ) berperan dalam men- gaktivasi  sinyal  transduksi  sehingga  sel  dapat  men- gadakan  pemrograman  kembali  ekspresi  gen  dan menginduksi pembelahan sel ke arah  embriogenesis somatik.
Joy et  al .  (1997)  melalui  studi  spektroskopik 15 N NMR,  menjelaskan  bahwa  setelah  masuk  ke  dalam sel, maka NH 4 + danNO 3 - dapat mengadakan inkorpo- rasi  membentuk  asam  amino  glutamin,  asam  gluta- mat  dan  alanin.  Selanjutnya  pada  perkembangan embrio dapat dideteksi terbentuk arginin dan polia- min  sebagai  hasil  inkorporasi  glutamin,  asam  gluta- mat  dan  alanin.  Santanen  dan  Simola  (1994)  me- nambahkan bahwa pada kalus embriogenik, konsen- trasi S-adenosil metionin (SAM) dekarboksilase lebih tinggi dibanding pada  kalus non embriogenik. SAM berfungsi antara lain untuk biosintesis poliamin yang diperlukan  dalam  pengaturan  dan  perkembangan embrio somatik.
Berdasarkan  pada    tersebut  diatas,  maka  penga- ruh rasio NH 4 + danNO 3 - yang berbeda terhadap per- kembangan  embrio  somatik  pada  penelitian  ini,  te- rutama berhubungan dengan 3 hal pokok, yaitu : 1) penyerapan  NH 4 + danNO 3 - ,2)  perubahan  pH  me- dium kultur, dan 3) inkorporasi NH 4 + danNO 3 - mem- bentuk senyawa yang lebih komplek yang berperan dalam embriogenesis somatik.

## 4 SIMPULAN
Rasio  NH 4 + danNO 3 - berpengaruh  nyata  terhadap perkembangan embrio somatik bawang putih secara in  vitro ,  baik  pada  stadium  globuler,  skutelar,  dan
koleoptiler.Perkembangan  embrio  somatik  paling optimal pada rasio NH 4 + danNO 3 - 1 : 3.
REFERENSI _____________________________
[1] Amagase H. 2006. Clarifying the real bioactive consti- tuents of garlic. J. Nutr . 136: 716-725.
[2] Ayabe M. & Sumi S. 1998 . Establishment of novel tis- sue culture method stem-disc culture and its practical application to micropropagation of garlic ( Allium sati- vum L.). Plant Cell Rep . 17: 773-779.
[3] Ayabe M. & Sumi, S. 2001. A novel and efficient tissue culture method – “stem-disc dome culture” – for pro- ducing virus free garlic ( Allium sativum L .). Plant Cell Rep. 20: 503-507.
[4] Bockish T, Saranga Y, Altman. 1997. A Garlic micro- propagation by somatic embryogenesis. Acta Hort . 447: 241-242.
[5] George EF. 1993. Plant propagation by tissue cul- ture:The Technology, Part 1 2nd edition. Exegetic Li- mited, London. England.
[6] JimenezVM. 2001. Regulation of in vitro somatic em- bryogenesis with emphasis on the role of endogenous hormones. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal . vol. 13, no. 2:196-223.
[7] Joy IVRW., Vogel HJ &Thorpe TA. 1997. Inorganic nitrogen metabolism in embryogenic white spruce cul- tures :A nitrogen 14 – 15 NMR study. J. Plant Physiol . 151 : 306 – 315.
[8] Kim MA &Park JK. 2002. High frequency plant regene- ration of garlic ( Allium sativum L.) calli immobilized in calcium alginate gel. Biotechnol.Bioprocess Eng. 7: 206-
211.
[9] Meijer EGM &Brown DCW. 1987. Role of exogenous reduced nitrogen and sucrose in rapid high frequency somatic embryogenesis in Medicago sativa. Plant Cell Tiss. Org.Cult . 10:11-19.
[10] Niedz RP. 1994. Growth of embryogenic sweet orange callus on media varying in the ratio of nitrat to ammo- nium nitrogen . Plant Cell Tiss. Org. Cult . 39 : 1-5.
[11] Rao KS. 1996. Embryogenesis in flowering plants: re- cent approaches and prospects . Journal of Biosciences. Vol.21, No.6: 827-841.
[12] Santanen A &Simola LK. 1994. Catabolism of putre- cine and spermidine in embryogenic and non- embryogenic callus lines of Picea abies . Physiologia Plantarum . 90 : 125 – 129.
[13] Schwartz HF &KrishnaSM. 1999. Compendium of Onion and Garlic Diseases, the American Phytopatho- logical Society, St. Paul, USA.
[14] Singh RP, Murch SJ & Saxena PK. 1999. Role of nitro- gen in morphogenesis in vitro . Science Publisher Inc. USA.
[15] Stasolla C, Yeung EY & Thorpe TA. 2003. Somatic em- bryogenesis in white spruce : physiology and biochemi- stry . Dalam : Bhojwani, S.S. dan W.Y. Soh (eds). Agro- biotechnology and plant tissue culture. Science Publ. Inc. Enfield, NH, USA.
[16] Thorpe TA & Stasolla C. 2001. Somatic embryogenesis . Dalam : Bhojwani, S.S. dan W.Y. Soh (eds). Current trends in the embryology of angiosperm. Kluwer Aca- demic Publ. Dordrecht, The Netherlands.
[17] Wardana ST. 2004. Induksi kalus embriogenik bawang putih ( Allium sativum L.) dengan  rasioNH 4 : NO 3 yang bervariasi. Jurnal Penelitian Sains . 16 : 88 – 96. _______