## Identifikasi    Synaptula (Echinodermata : Holothuroidea) Raja Ampat Berdasarkan

## Gen COI
Robitoh Desi Kurniasari 1 , Aris Soewondo 2 , Abdul Hamid Toha 3 1), 2) Jurusan Biologi FMIPA Universitas Brawijaya Malang
3) Jurusan Biologi  FMIPA Universitas Papua Email korespondensi : Robitoh  D.K ; nia.robitoh@gmail.com

## ABSTRAK
Identifikasi spesies yang terkoleksi di perairan Raja Ampat perlu dilakukan untuk mendapatkan data  biodiversitas  perairan  Raja  Ampat.  Synaptula  merupakan  salah  satu  timun  laut  dan    merupakan organisme  salah  satu  organisme  yang  cryptic  species.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengidentifikasi Synaptula yang dikoleksi dari perairan Raja Ampat menggunakan metode molekuler dengan marker gen COI.  Alasan  memilih  Synaptula    untuk  diidentifikasi  dikarenakan  spesiemen  tersebut  masih teridentifikasi sampai tingkat genus. Metode identifikasi secara molekuler yang digunakan adalah DNA barcoding,  dengan  tahapan,  isolasi  DNA,  PCR,  dan  sekuensing.  Hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan menunjukkan  bahwa  Synaptula  dari  Raja  Ampat  (UNP  101)  memiliki  kemiripan  yang  tinggi  dengan spesies Plakobranchus ocellatus dari Sulawesi dan Philipina, namun  Synaptula UNP 101 dari Raja Ampat dengan Synaptula reciprocans  jarak genetik sebesar 76.8% dan nilai similaritas sebesar 23.6% sehingga dapat  diartikan  bahwa  memiliki  perbedaan  yang  besar.  Perbedaan    hasil  identifikasi  kemungkinan disebabkan  oleh  kontaminasi  DNA  template  Synaptula  oleh  DNA  template  Plakobranchus  UNP  67A dikarenakan proses identifikasi dilakakukan dalam waktu yang bersamaan.
Kata Kunci : gen COI,identifikasi, Synaptula.

## ABSTRACT
Identification  of  species  Raja  Ampat  required  in  order  to  obtain  marine  biodiversity  in  Raja Ampat. Synaptula  is one of the organism that inhabit in Raja Ampat and belonging to sea cucumber. Sea cucumber  is  an  organism  that  difficult  to  distinguish  through  morphological  characteristic..  This  study aimed to identify Synaptula from Raja Ampat based on mitochondrial gene, cytochrome c oxidase subunit 1 (COI). The results of the study that Synaptula of Raja Ampat (UNP 101) is Plakobranchus ocellatus, the result is  different with identification through  morphological. Synaptula of Raja Ampat (UNP 101) has a high similarity with Plakobranchus ocellatus species from Sulawesi and the Philippines. Genetic distance Synaptula  of  Raja  Ampat  (UNP  101)  with  Synaptula  reciprocans  is  76.8%,  while  similarity  values  is 23.6%.  The  difference  in  the  results  of  species    identification  may  be  caused  by  contamination  DNA Plakobranchus  UNP  67A  to  DNA  Synaptula  UNP  101,  contamination  is  likely  to  occur  during  the identification process which simultaneity.
Keywords: COI gene, identification, Synaptula .

## PENDAHULUAN
Raja  Ampat  merupakan  gugusan  pulau- pulau  kecil  di  pulau  Papua.  Lokasi  kepulauan Raja  Ampat      merupakan  ekosistem  koral Indonesia  yang  paling  asli  dan  paling  kaya. Potensi  sumberdaya  terumbu  karang  yang dimiliki  kabupapten  Raja  Ampat,  merupakan bagian  dari  “segitiga  karang  dunia”  (coral truangle) yang terdiri dari Indonesia, Filipina, Papua  New  Guinea,  Jepang,  dan  Australia. Raja  Ampat  memiliki  ekositem  yang  paling kaya  diantara  pulau-pulau  penyusun  segitiga karang  [1].  Synaptula    merupakan  salah  satu spesies  timun  laut  yang  ditemukan  di  Raja Ampat.
Identifikasi  terhadap  Synaptula    perlu dilakukan karena diperlukan pendataan terhadap  keragaman  spesies  di  Indonesia. Identifikasi  terhadap  Synaptula  memerlukan metode identikasi molekuler, karena Synaptula merupakan cryptic spesies. Metode identifikasi  molekuler  yang  digunakan  adalah DNA  barcoding  dengan  penanda  gen  COI (mtDNA).  Pada  hewan,  penggunaan  mtDNA dalam  identifikasi  spesies  didasari  oleh analisis biogeografi dan sistematik sering tidak sejalan  dengan  identifikasi  morfologi.   Salah satu  penyebabnya  adalah  karakter  morfologi seringkali  memperlihatkan  fenomena  species cryptic. Sedangkan mtDNA hewan merupakan genom  sitoplasmik  yang  diwariskan  secara
uniparental  dan  tidak  mengalami  rekombinasi sehingga  species  sibling  bisa  dipastikan mempunyai  mtDNA  dengan  nilai  kesamaan yang  tinggi.   Salah  satu  ruas  mtDNA  yang banyak  digunakan  sebagai  barcode  yaitu cytochrome oxidase 1 (CO1) yang dipopulerkan  oleh  Hebert  et  al.  (2003).  Gen cytochrome  oxidase  1  (CO1)  adalah  segmen dari DNA mitokondria yang terdiri atas 648bp [2].
Synaptula merupakan salah satu spesies yang  tergolong  kedalam  ordo  apodida. Karakter  morfologi  apodida  adalah tubuhnya yang silindris, sistem pernafasannya mengerucut  ke  atas  bagian  tubuh,  tidak memiliki  papilla  pada  bagian  anal,  memiliki spikula  atau  ossicles  yang  sering  termasuk kedalam  golongan  anchors  yang  berfungsi untuk attachment kedasar substrat dan membantu  pergerakannya  sebagai  alternative alat gerak menggantikan tidak adanya struktur podia.  Keberadaan  anchors  ini  merupakan kekhasan  yang  dimiliki  famili  synaptidae  dan perbedaan  struktur  anchors  dapat  digunakan sebagai  salah  satu  karakter  morfologi  yang membedakan antar genus pada family synaptidae  [3]. Synaptula  yang  ditemukan  di perairan  Raja  Ampat  perlu  diidentifikasi dengan  metode  DNA  barcoding  dengan penanda  gen  COI  sehingga  didapatkan  jenis taksanya  dan  data  yang  didapatkan  dapat digunakan  untuk  kepentingan  manajemen konservasi.

## METODE PENELITIAN
Penelitian  bertempat  di  Laboratorium Biologi  Molekuler    Jurusan  Biologi  Fakultas MIPA Universitas Brawijaya. Sampel makroinvertebrata  Synaptula    (UNP  101) diambil pada 4 Juni 2013 di aljuy bay, Waigeo dan disimpan dalam botol berisi etanol 95%.
Ekstraksi  DNA  Synaptula  dilakukan menggunakan  Gsync  DNA  Extraction  Kit (Geneaid).  Kemudian  Elektroforesis  Gel Agrose Hasil Isolasi DNA untuk melihat hasil ekstraksi  DNA.    DNA  yang  telah  diisolasi diamplifikasi  sekuen  gen  CO1  dengan  primer universal  gen  CO1    LCO1490  (5’-GGT  CAA CAA  ATC  ATA  AAG  ATA  TTG  G-3’  dan HCO2198,  5’-TAA  ACT  TCA  GGG  TGA CCA  AAA  AAT  CA-3’[4].  Racikan  untuk PCR terdiri dari   ddH2O 12µl (diganti dengan larutan  BSA),  pcr  mix  kapa  Taq  Extra HotStart ReadyMix PCR kit (1,25 U per 50µl reaksi  DNA  polimerase,  KAPA  Taq  Extra
buffer (1X), dNTPs (masing-masing dNTP 0,3 mM  (1X)),  MgCl 2 (2  mM  1X)  dan  stabiliser) sebanyak  10  µl,  1  µl  masing-masing  primer (10  µM),  dan  1  µl    DNA  template.  Program PCR  :  hot  start  95°C  selama  3  menit, denaturation 95°C selama 30 detik, annealing 50°C  selama  30  detik,  extension  72°C  selama 1  menit(30  siklus),  dan  post  extension  72°C selama  1  menit.  Sampel  hasil  PCR  disimpan pada  suhu  -20 0 C.  Hasil  PCR  kemudian dilakukan  Elektroforesis  gel  agarose  untuk melihat  DNA  amplikon  yang  didapatkan  dan panjang base pair.
DNA  amplikon  hasil  PCR  kemudian  di sekuensing  untuk  mengetahui  susunan  basa pada  organisme  makroinvertebrata  Synaptula Raja  Ampat.  Sekuen  yang  didapatkan  dari sekuensing  kemudian  dianalisis  menggunakan software  bioedit  dan  disejajarkan  dengan  data base  di  NCBI.  Hasil  pensejajaran  kemudian dipilih sekuan yang memiliki kesamaan diatas 85% dengan sekuen sampel Synaptula.  sekuen yang dipilih kemudian dialigment dan disamakan  panjang  sekuen  dan  dilakukan perhitungan jarak genetic menggunakan software  Mega  5.1.  Berdasarkan  jarak  genetic yang telah didapatkan dihitung nilai similaritasnya  dengan  persamaan  (1-jarak genetik) X 100% kemudian hasilnya diterjemahkan  kedalam  pohon  filogenetik untuk mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies  berdasarkan  gen  COI  menggunakan maximum  likehood  (ML)  dengan  metode estimasi jarak p-distance (boostrap 1000) pada software MEGA 5.1 .

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## DNA  isolasi  dari  jaringan  organisme
Synaptula    menggunakan    Gsync  DNA ExtractionKit  (Geneaid).  DNA  hasil  isolasi dilihat  kualitasnya  dengan  uji  kualitatif elektroforesis gel agarose .

## Gambar  1:  hasil  uji  kualitatif  isolasi  DNA
Synaptula  (yang  ditunjuk  garis  merah  merupakan pita DNA yang Synaptula)
DNA specimen berhasil diisolasi namun menunjukkan smear yang kemungkinan disebabkan  DNA  yang  terisilasi  belum  murni masih terdapat kontaminan seperti protein dan RNA.
DNA yang didapatkan kemudian dilakukan  amplifikasi  gen  COI    dengan metode PCR menggunakan  primer LCO-1490 dan  HCO-2198  .  Gen  COI  digunakan  sebagai marker genetic dikarenakan gen COI memiliki tingkat  evolusi  yang  tinggi  sehingga  dapat digunakan  untuk  membedakan  meski  dalam kekerabatan  yang  dekat.  Gen  COI  digunakan sebagai  marker  genetic  dikarenakan  gen  COI memiliki  tingkat  evolusi  yang  tinggisehingga dapat  digunakan  untuk  membedakan  meski dalam kekerabatan yang dekat.
Berdasarkan    hasil  uji  kualitatif  gel agarose  0.8%  diketahui  bahwa  sekuen  gen COI  dapat  teramplifikasi  dengan  panjang amplikon  ±750  bp  namun  pita  DNA  hasil amplifikasi  tipis  (ditunjuk  oleh  kotak  merah  ) hal  ini  kemungkinan  disebabkan  oleh  DNA Synaptula    yang  terisolasi  belum  murni sehingga sekuen yang teramplifikasi saat PCR sedikit.  DNA  Synaptula  diulang  sebanyak  4 tube dalam proses PCR.
Gambar 2 : hasil uji kualitatif DNA Synaptula hasil PCR (M=marker).
Hasil    sekuensing  yang  didapatkan dari hasil PCR cukup baik .  Berdasarkan data sekuen  yang  didapatkan  dari  keempat  sampel PCR  dari  Synaptula    .Sekuen    forward kemudian di
BLAST di NCBI
(http://blast.ncbi.nml.nih.gov). Berdasarkan data  yang  didapatkan/  hasil  blast  tidak  sesuai dengan  identifikasi  berdasarkan  karakter morfologi  yang  telah  dilakukan  sebelumnya hal ini yang  menujuk pada spesies Synaptula, kemungkianan dikarenakan penggunaan primer  CO1  yang  sama  dan  bersifat  universal dan  proses  identifikasi  dilakukan  secara bersamaan    sehinga  terjadi  pembacaan  region yang sama.
Hipotesis  tersebut  didasarkan  pada hasil  alignment  dari  sampel  J1,J2,K1,K2,dan UNP 67A sebagai berikut ;

## Gambar  3.  Hasil  aligment  sekuen  hasil  sekuensing
Synaptula  dan  UNP  67A  (beda  basa nukleotida ditunjuk oleh tanda bintang)
Dari  hasil  alignment  menunjukkan bahwa    hanya  terdapat  2  basa  yang  berbeda (ditandai  dengan  tanda  bintang  )  antara Synaptula  UNP  101  (J1,J2,K1,  dan  K2) terhadap  UNP  67A (Plakobranchus  ocellatus) dan  didapatkan  hasil  BLAST  yang  memiliki kemiripan yang tinggi dengan Plakobranchus.
Hal  ini  berbeda  dengan  identifikasi morfologi yang merujuk pada spesies Synaptula.  Hal  ini  kemungkinan  disebabkan oleh  kontaminasi  DNA  template  Synaptula dengan DNA tempalate Plakobranchus dikarenakan proses pengerjaan proses
identifikasi yang bersamaan.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  data  hasil  sekuensing bahwa
spesimen / organisme
makroinvertebrata yang dikoleksi pada tanggal 4 Juni 2013 di Waigeo, yang sebelumnya telah diidentifikasi  berdasarkan  karakter  morfologi sebagai  Synaptula  memiliki kemiripan  yang tinggi dengan spesies Plakobranchus ocellatus  dari  Sulawesi  dan  Philipina,  namun jika  dibandingkan  antara  Synaptula  UNP  101 dari Raja Ampat dengan Synaptula reciprocans    sangat  jauh  berbeda  .  Perbedaan hasil  identifikasi  berdasar  karakter  morfologi dan  molekuler  (berdasar  sekuen  gen  COI) kemungkinan  disebabkan  oleh  kontaminasi DNA  template  Synaptula  oleh  DNA  template Plakobranchus  UNP  67A  dikarenakan  proses identifikasi  dilakakukan  dalam  waktu  yang bersamaan.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Terimakasih  kepada  bapak  ibu  dan keluarga  yang  telah  memberikan  segala
M * *
dukungan  yang  telah  diberikan  dan  juga teman-teman  satu  tim  MB-RAI      yang  telah berjuang bersama menyelesaikan studi bersama-sama.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] McKenna,  S.A,Gerald  R  Allen,  and Suer  suryadi.  2002.  A  Marine  Rapid Assessment  Of  The  Raja  Ampat Islands, Papua Province,Indonesia.Conservation International. [2] Hebert  PD,  Cywinska  A,  Ball  SL, deWaardJR. 2003. Biological identificationsthrough  DNA  barcodes. Proc. R. Soc.Lond 270: 313-321.
[3] Myers,  P.,  R.  Espinosa,  C.  S.  Parr, T.
Jones,  G.  S.  Hammond,  and  T.  A. Dewey.  2013.  The  Animal  Diversity Web (online). Accessed at http://animaldiversity.org. diakses pada 1 November 2013.
[4] Folmer M, M Black, W Hoeh, R Lutz &  R  Vrijenhoek.  1994.  DNA  primers for amplification of mitochondrialcytochrome  c  oxidase subunit I from diverse metazoaninvertebrates. Molecular Marine  Biology  andBiotechnology  3:
294-299.