## PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL DAN
UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK DAUN AFRIKA (Vernonia amygdalina Del.) PADA MENCIT JANTAN DDY
Christine Meidiawati * , Ummu Mastna Zuhri, Sesilia Andriani Keban,
Wiwi Winarti 1
Fakultas Farmasi, Universitas Pancasila
Email: christinemeidiawati@gmail.com

## ABSTRAK
Salah satu tanaman berkhasiat antifertilitas yang banyak tumbuh adalah daun afrika  ( Vernonia  amygdalina Del).  Tanaman  ini  secara  empiris  untuk  mengobati berbagai  penyakit,  namun  belum  ada  data  ilmiahnya.  Penelitian  ini  bertujuan memperoleh  ekstrak  etanol  70%  daun Vernonia amygdalina Del.  yang  aman digunakan  dalam  dosis  tertentu  terhadap  hewan  uji  mencit  DDY.  Penapisan fitokimia  dilakukan  berdasarkan  pustaka  Farnsworth  dan  Departemen  Kesehatan Republik  Indonesia  tahun  2000.  Penetapan  kadar  flavonoid  total  menggunakan metode kolorimetri aluminium klorida dan alkaloid total dengan metode kompleks bromocresol  green .  Uji  keamanan  I  yang  dilakukan  adalah  uji  toksisitas  akut (LD ₅₀ )  dengan  metode  Weil  C.S.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  ekstrak daun Afrika mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, kuinon, dan steroid/triterpenoid.  Kadar  flavonoid  totalnya  adalah  1,27%,  sedangkan  uji keamanan I ditemukan bahwa ekstrak etanol 70% daun Afrika memiliki LD 50 yang lebih  besar dari 16 g/kg BB termasuk dalam kategori praktis tidak toksik.
Kata kunci: Vernonia amygdalina Del., flavonoid, toksisitas akut

## ABSTRACT
One of the plants that is efficacious as an antifertilitas that grows is Vernonia amygdalina Del. This plant empirically has been to treat various diseases, but have no scientific data. Aims of this research is to obtain a ethanol 70% extract of leaves of Vernonia amygdalina Del.  which  safely  for  use  to  test  animals  mice DDY.
Phytochemical screening carried out based on the literature from Farnsworth and the Ministry of Health of the Republic of Indonesia (2000). Determination of total flavonoid using the colorimetric method of aluminum chloride and total alkaloid with  complex  methods  bromocresol  green.  Safety  testing  I  which  is  conducted  is acute toxicity test (LD ₅₀ ) by the method of Weil C.S. The results showed that the Africa leaf extract contains alkaloids, flavonoids, saponins, tannins, quinones, and steroids/triterpenoids. It was found that the levels of total flavonoids was 1.27%, while for safety testing I are found that the 70% ethanol extract of Africa leaves has a LD50 greater than 16 g / kg that are categorized practically non-toxic.
Keywords: Vernonia amygdalina Del., flavonoid, toxicity test

## PENDAHULUAN
Pertambahan penduduk di Indonesia setiap tahun terus meningkat. Berdasarkan laporan data statistik Indonesia, hal ini tidak lepas dari  tingginya  angka  kelahiran  bayi yang  mencapai  4,5  juta/tahun  (BPS, 2013).  Program  KB  telah  berjalan lama,  namun  kesadaran  masyarakat akan  pentingnya  program  ini  masih rendah.  Sebanyak  95%  penduduk Indonesia  telah  mengetahui  program KB,  tetapi  yang  mengikuti  program KB hanya 61%. Beberapa alasan yang membuat  enggan mengikuti program
KB karena khawatir efek sampingnya,  prosedur  penggunaan yang rumit, dan jarang membutuhkan tenaga  ahli  untuk  menggunakannya (Harnowo, 2012).
Salah  satu  cara  mencegah kehamilan  yang  umum  digunakan masyarakat  yakni  penggunaan  obat antifertilitas.  Obat  antifertilitas  yang umum tersedia di Indonesia berupa pil dosis tinggi yang mengandung estrogen  50  –  150  mcg  dan progesteron  1  –  10  mg,  pil  dosis rendah yang mengandung estrogen 30 – 50 mcg dan progesteron 1 mg, serta pil mini yang mengandung
progesteron kurang dari 1 mg. Ketiga jenis obat antifertilitas  tersebut memiliki kekurangan masing-masing, diantaranya memerlukan kedisiplinan dari  pemakai,  mengurangi  ASI  pada pil  yang  mengandung  estrogen, meningkatkan resiko infeksi klamidia, kembalinya kesuburan agak lambat  (gangguan  siklus  kesuburan), dan  tidak  dianjurkan  pada  wanita berumur di atas 30 tahun karena akan mempengaruhi keseimbangan metabolisme  tubuh.  Selain  itu,  obat antifertilitas  ini  juga  memiliki  efek samping,  diantaranya  pendarahan, tekanan  darah  tinggi,  retensi  cairan, perubahan  berat  badan,  anemia, tromboemboli, rambut rontok, depresi,  pusing  dan  sakit  kepala. Penggunaan  obat  antifertilitas  oral umumnya  memiliki  kontraindikasi dengan  pengguna  yang  memiliki penyakit  hipertensi,  diabetes,  dan hiperkolesterolemia,  sehingga  tidak semua  orang  dapat  menggunakan obat antifertilitas (MedlinePlus, 2012; Petitti,  2003;  Donna  &  Siri,  2006; Pramilla & Malcolm, 2008).
Mengingat masih adanya kekurangan  dan  efek  samping  yang ditimbulkan  akibat  penggunaan  obat
antifertilitas  oral,  maka  saat  ini banyak  peneliti  yang  terdorong menemukan sumber bahan antifertilitas yang berasal dari tanaman.  Salah  satu  tanaman  yang banyak tumbuh di lingkungan sekitar kita adalah Vernonia amygdalina Del. Tanaman  ini  merupakan  pohon  kecil yang tumbuh di daerah Afrika tropis. Di  beberapa  bagian  barat  Afrika, tanaman  ini  dikenal  dengan  sebutan “ bitter-leaf ”  karena  rasa  daunnya yang pahit. Di Indonesia, tanaman ini juga  dikenal  dengan  sebutan  daun Afrika Selatan. Daun dari tanaman ini banyak  digunakan  sebagai  sayuran dan  obat  berbagai  penyakit  seperti diabetes, kolesterol tinggi, dan hipertensi.  Walaupun  penggunaan tanaman  ini  secara  empiris  sudah banyak  dilakukan,  namun  belum diperkuat oleh data ilmiah.
Senyawa  yang  dikandung  oleh tanaman Vernonia  amygdalina Del . meliputi:  antrakuinon  (+++),  tanin terlarut (++), tanin terkondensasi (+), flavonoid (+), alkaloid (+++), alkaloid  indol  (+),  alkaloid  steroid (+++), saponin (+++), glikosida (++), dan  terpenoid  (+++)  (Sani  dkk., 2012).  Berdasarkan  kandungannya
maka  tanaman  ini  mengandung saponin untuk sintesis hormon steroid dan  digunakan  sebagai  estrogen kontraseptif.  Alkaloid  steroid  sangat mirip dengan saponin yang digunakan sebagai bahan dasar sintesis beberapa hormon steroid untuk bahan kontrasepsi  oral  (Robinson  dkk., 2009). Sementara flavonoid diketahui dapat merangsang pembentukan estrogen pada mamalia dan strukturnya ada keserupaan keruangan dengan hormon
estrogenik.  Struktur  yang  analog dengan hormon ini akan mengikat diri pada reseptor dan bekerja menghambat reseptor tersebut (Koeman, 1983). Senyawa tanin yang terkandung  di  dalam  daun  Afrika dapat  menghambat  pertumbuhan  sel dan  bersifat  sitotoksik  pada  sel  yang mengalami  pembelahan  cepat  seperti pada  proses  oogenesis  (Robinson dkk.,  2009;  Wahyuni,  2002).  Oleh karena  itu  diperkirakan  bahwa  tanin bersifat sitotoksik terhadap sel ovum.
Berdasarkan  uraian  di  atas  dan uji pendahuluan yang telah dilakukan diketahui  dosis  ekstrak  yang  dapat mengurangi  jumlah  kelahiran  yaitu 250 mg/200 g dan 500 mg/200 g berat
badan  tikus  dan  diharapkan  dari penelitian  ini  akan  ditemukan  nilai LD ₅₀ dan  diuji  keamanan  dari  dosis tersebut.

## METODE PENELITIAN
Bahan  yang  digunakan  adalah daun  Afrika  ( Vernonia  amygdalina Del  ),  aquades,  etanol  70%,  dapar fosfat, asam klorida 1%, kloroform P, ammonia  25%,  asam  klorida  pekat, pereaksi  Dragendroff  LP,  pereaksi Mayer  LP,  serbuk  magnesium  P, asam  klorida  pekat,  amil  alkohol  P, asam  klorida  2  N,  besi  (III)  klorida 1%  P,  pereaksi  Stiassny  (campuran formaldehida  LP  dan  asam  klorida pekat 2 : 1), natrium asetat P, natrium hidroksida  1  N,  eter  P,  asam  sulfat pekat,  ammonia  10%  P,  petroleum eter  P,  asam  klorida  encer  P,  asam nitrat  10%, Nutrient  Agar (NA),
Potato Dextrose Agar (PDA), aseton
P,  CMC  Na  0,1%,  larutan  formalin 10%, mencit jantan ( DDY ) berumur ± 2  bulan  dengan  berat  badan  15-30 gram, dan pakan mencit.
Alat-alat yang digunakan
adalah Spektrofotometer serapan atom,  maserator  kinetik,  lemari pendingin, penangas air, oven, tanur,
inkubator, vakum rotavapor , mikropipet, desikator, blender, seperangkat  alat  gelas,  ayakan  4/18, cawan  petri,  cawan  penguap,  botol timbang, krus porselen, penjepit besi, labu alas bulat, penjepit kayu, spatula, batang  pengaduk,  kertas  saring, kapas, kertas saring bebas abu, coloni counter ,  sonde,  syringe,  timbangan analitik,  kandang  mencit,  timbangan mencit,  mikroskop, Karl  Fischer ,  ph meter.
Pembuatan Ekstrak Etanol 70% serbuk daun Afrika (Vernonia amygdalina Del.) dilakukan sebanyak 1000 g serbuk daun Afrika diekstraksi secara maserasi kinetik menggunakan etanol 70% lalu disaring. Remaserasi dilakukan  13  kali  dari  maserat berwarna  hijau  kehitaman  pekat sampai  tidak  berwarna.  Filtrat  yang terkumpul dipekatkan dengan rotavapor (Frank, 1995).
Penapisan  fitokimia  terhadap serbuk dan ekstrak kental daun Afrika dilakukan  berdasarkan  metode  yang tercantum dalam Phytochemical Screening  Farnsworth. Identifikasi dilakukan    untuk  golongan  alkaloid, flavonoid,  saponin,  tanin,  kuinon,
steroid/triterpenoid,  minyak  atsiri, dan kumarin.
Penetapan kadar flavonoid total menggunakan  metode  kolorimetri aluminium klorida. Ditimbang 1 gram ekstrak kental ke dalam labu takar 10 mL,  ditambahkan  4  mL  air  suling, ditambahkan 0,3 mL NaNO 2 5% lalu
didiamkan selama 5 menit. Ditambahkan 0,3 mL AlCl 3 10% lalu didiamkan selama 5 menit, ditambahkan  2  mL  NaOH  1  M  dan ditambahkan aquadest sampai volume
10  mL.  Serapan  diukur  pada  λ  510 nm. Kadar dihitung dengan menggunakan  kurva  baku  Kuersetin ( Sigma Aldrich ).
Penetapan  kadar  alkaloid  total menggunakan metode Kompleks
Bromocresol Green . Ditimbang 1 mg ekstrak  kental,  dilarutkan  dalam DMSO, ditambahkan 1 mL HCl 2 N, kemudian disaring. Larutan kemudian dimasukkan  ke  dalam  corong  pisah dan  ditambahkan  5  mL  larutan  BCG (69,8 mg BCG dalam 3 mL NaOH 2 N diencerkan dengan aquadest sampai 1 L) dan 5 mL larutan Buffer fosfat  pH  4,7.  Campuran  tersebut diekstraksi dengan 1, 2, 3, dan 4 mL kloroform. Fase kloroform kemudian
diambil  dan  dicukupkan  volumenya menjadi 10 mL. Serapan diukur pada λ  470  nm.  Kadar  alkaloid  total dihitung dengan menggunakan kurva baku Atropin.
Uji  toksisitas  akut  dilakukan dengan  memberikan  ekstrak  daun Afrika dosis tunggal tertentu kemudian  diamati  gejala  toksis  dan kematian yang terjadi selama 24 jam untuk  melihat  pengaruh  pemberian ekstrak  daun  Afrika.  Tahap  I digunakan  4  kelompok  mencit  yang terdiri atas 5 ekor mencit jantan pada masing-masing kelompok. Dosis satu kelompok  dengan  kelompok  lainnya memiliki kelipatan dua, yaitu kelompok  1  menerima  16  g/kg  BB mencit, kelompok 2 menerima 8  g/kg BB  mencit,  kelompok  3  menerima  4 g/kg  BB  mencit,  dan  kelompok  4 menerima 2  g/kg BB mencit.
Uji  toksisitas  akut  (LD ₅₀ ) ekstrak standar daun Afrika dilakukan dengan  metode  Weil  C.S  dengan menggunakan  mencit  jantan  galur DDY sebagai  hewan  percobaan melalui  jalur  pemberian  oral  dan jumlah  kematian  dihitung  setelah  24 jam. Perhitungan nilai LD ₅₀ dilakukan dengan menggunakan tabel
biometrik  dari  Weil  (Weil,  1952).
Selama penelitian
dilakukan pengamatan  selain  jumlah  kematian mencit  yakni  perubahan  perilaku, perubahan  fisik,  penurunan  nafsu makan dan minum, penurunan aktivitas  motorik.  Perubahan  fisik yang  diamati  seperti  kerusakan  bulu (rontok) dan kulit (pucat, kemerahan, melepuh,  udem).  Perubahan  perilaku yang diamati seperti gerakan menjilat, menggaruk, tremor, menggeliat.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Jumlah  ekstrak  kental  daun Afrika  diperoleh  sebanyak  287,49 gram,  DER  5,22  dan  persentase rendemen  yang  dihasilkan  sebesar 19,17%. Semakin tinggi nilai rendemen  menandakan  bahwa  bahan baku  berpeluang  dimanfaatkan  lebih besar.  Rendemen  ekstrak  dihitung berdasarkan perbandingan berat akhir ekstrak yang dihasilkan dengan berat awal dikalikan dengan 100%.
Rendemen  yang  dihasilkan  cukup tinggi karena  pelarut yang digunakan adalah  etanol  70%  yang  dapat melarutkan  senyawa  fitokimia  lebih maksimal  karena  mengandung  30% air  yang  membantu  proses  ekstraksi
sehingga sebagian senyawa ada yang tertarik ke dalam etanol dan ada pula yang  tertarik  dalam  air.  DER  ( Drug Extract  Ratio )  merupakan  simplisia yang digunakan dengan ekstrak yang diperoleh (Sani dkk., 2012).
Hasil  pengukuran  serapan  dan penetapan kadar flavonoid total dapat dilihat pada tabel 1. Kadar flavonoid total  yang  diperoleh  dari  proses ekstraksi menggunakan pelarut etanol 70% sebesar 1,27%. Hal ini menunjukkan  bahwa  selama  proses ekstraksi,  pelarut  mampu  menyari kandungan  flavonoid  yang  terdapat dalam serbuk simplisia daun Afrika.
Penapisan  fitokimia  dilakukan untuk mengetahui metabolit sekunder yang  terkandung  dalam  ekstrak sebagai  senyawa  yang  memiliki aktivitas  biologis.  Hasil  penapisan fitokimia  dari  ekstrak  daun  Afrika ( Vernonia  amygdalina  Del. .)  dapat dilihat pada tabel 2.
Berbeda dengan flavonoid, penetapan kadar alkaloid total memberikan  hasil  yang  negatif. Absorbansi sampel tidak terukur. Hal ini  kemungkinan  disebabkan  oleh terikatnya  alkaloid  pada  steroid sehingga menjadi tidak terdeteksi.
Untuk melihat pengaruh
pemberian ekstrak daun  Afrika salah satunya  dilakukan  dengan  melihat kematian  yang  terjadi  pada  setiap kelompok  mencit  yang  kemudian dapat  digunakan  untuk  perhitungan LD 50 .  Setelah  24  jam  pemberian ekstrak  daun  Afrika  secara  per  oral
dengan dosis 40, 80, 160, 320 mg/20g tidak  ada  satupun  mencit  yang  mati pada masing-masing kelompok.
Sehingga penelitian ini tidak dilanjutkan  ke  tahap  2  karena  pada dosis tertinggi tidak ada mencit yang mati  yang  dikategorikan  sebagai praktis tidak toksik.
Tabel 1. Hasil pengukuran serapan dan penetapan kadar flavonoid total Sampel Bobot sampel (mg) Serapan sampel Serapan BP Kadar flavonoid total (%) Dengan AlCl 3 Tanpa AlCl 3 Dengan AlCl 3 Tanpa AlCl 3 Ekstrak 1 30,7210 0,1281 0,0146 0,4700 0,0876 1,25 Ekstrak 2 30,7146 0,1284 0,0109 1,29 Ekstrak 3 30,7129 0,1276 0,0132 1,26 Rata-rata kadar flavonoid total (%) 1,27 Tabel 2. Hasil penapisan fitokimia serbuk simplisia dan ekstrak daun Afrika No. Identifikasi Hasil ekstrak daun Afrika 1. Alkaloid + 2. Flavonoid + 3. Saponin + 4. Tanin + 5. Kuinon + 6. Steroid/triterpenoid +/+ 7. Minyak atsiri - 8. Kumarin - Keterangan:  (+) memberikan reaksi yang positif (-) memberikan reaksi yang negatif Pengamatan  dilakukan  pada
jam  ke  1,  3,  6  dan  24  jam.  Pada kelompok  1,  2  dan  3  kondisi  mencit terlihat normal tidak terjadi
perubahan perilaku maupun
perubahan  fisik.  Pada  kelompok  4 jam  ke  3  terjadi  penurunan  aktivitas motorik pada beberapa mencit seperti
gerakan yang minimal dan melambat, tetapi  tidak  terjadi  perubahan  fisik seperti  bulu  rontok  dan  kulit  rusak. Pada kelompok 4 jam ke 6 ada mencit yang  mengalami  penurunan  nafsu makan  dan  minum  serta  penurunan aktivitas  motorik  seperti  diam  dan menyendiri. Pada kelompok 4 jam ke
24  seluruh  mencit  tetap  bertahan, tidak ada satu pun yang mati dan tidak terjadi  perubahan  fisik  pada  seluruh mencit  hanya  ada  mencit  yang mengalami penurunan aktivitas motorik  seperti  bingung  dan  gelisah. Pengamatan  tersebut  dapat  dilihat
pada tabel 3. Hasil penelitian ini
menggunakan  metode  Weil  C.S.
selama  24  jam  setelah  pemberian ekstrak  daun  Afrika  tidak  ada  satu pun  mencit  yang  mati  pada  setiap kelompoknya.  Daun  Afrika  pada penelitian ini memiliki LD 50 lebih dari 16  g/kg  BB,  dimana  hasil  tersebut masuk  dalam    kategorikan  praktis tidak toksik (Loomis, 1978
Tabel 3. Tabel pengamatan uji toksisitas akut
Kelompok Jam ke- Kerusakan Bulu Kerusakan Kulit Penurunan aktivitas motorik Penurunan nafsu makan dan minum Keterangan I 1 - - - - Keadaan aktivitas motorik normal 3 - - - - 6 - - - - 24 - - - - II 1 - - - - Keadaan aktivitas motorik normal 3 - - - - 6 - - - - 24 - - - - III 1 - - - - Keadaan aktivitas motorik normal 3 - - - - 6 - - - - 24 - - - - IV 1 - - - - - 3 - - √ - Gerakan melambat 6 - - √ √ Diam dan menyendiri 24 - - √ - Gelisah dan bingung

## KESIMPULAN
Hasil  uji  penapisan  fitokimia dari  ekstrak  etanol  70%  daun  Afrika memberikan  hasil  positif  untuk
senyawa golongan alkaloid,
flavonoid,  saponin,  tannin,  kuinon,
dan steroid/triterpenoid. Kadar
flavonoid total yang diperoleh adalah
1,27%,  sedangkan  untuk  alkaloid total  tidak  dapat  diukur  serapannya
dengan menggunakan metode kompleks bromo cresol green .  Uji toksisitas  akut  menunjukkan  bahwa ekstrak  etanol  70%  daun  Afrika memiliki LD 50 lebih dari 16 g/kg BB, sehingga  masuk  dalam    kategorikan praktis tidak toksik.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  peneliti  ucapkan teruntuk  Universitas  Pancasila  yang telah memberikan dana untuk penelitian  ini,  dan  kepada  Fakultas
Farmasi  Universitas  Pancasila  yang telah menyediakan sarana dan prasarana.

## REFERENSI
Badan  Pusat  Statistik.  Data  Statistik Indonesia  :  Fertilitas.  2013. Diambil dari
http://www.datastatistik- indonesia.com/portal/index.php
?option=com_content&task= view&id=300&Itemid=300&li mit=1&limitstart=2. Diakses pada tanggal 20 April 2014. Donna  S.,  Siri  L.K.  (editor),  2006, The Handbook of Contraception: A  Guide  for PracticalManagement , New
Jersey:  Humana  Press  Inc;  13- 73.
Frank  C.  1995.  Toksikologi  Dasar
Asas, Organ  Sasaran  dan Penelitian  Resiko.  Edisi  II. Diterjemahkan oleh Edi Nugroho.  Jakarta:  UI  Press.  h. 85-93 Harnowo,  PA.  2012 . 95%  Orang Indonesia Tahu KB Tapi Enggan Ikut Programnya. Diambil dari http://health.detik.com/read/20 12/04/16/150253/1893499/763/ 95-orang-indonesia-tahu-kb- tapi-enggan-ikut-programnya. Diakses  pada  tanggal  20  April 2014.
Koeman, J.H. 1983. Pengantar Umum Toksokologi.  Gadjah  Mada University Press, Yogyakarta.
Loomis TA. Toksikologi dasar. Edisi III  (Drs.  Imono  Argo  Donatus, Penerjamah).  Semarang:  IKIP Semarang Press; 1978.
MedlinePlus.  2012.  Estrogen  and Progestin (Oral Contraceptives). The American Society of Health-System Pharmacists. Diambil dari http://www.nlm.nih.gov/medlin eplus/ druginfo/ meds/a601050.html. diakses pada tanggal 20 April 2014.
Petitti,  DB.  2003.  Combination Estrogen–Progestin Oral Contraceptives. New England J Med. 349(15):1443-1448. Diambil  dari  www.nejm.org. Diakses  pada  tanggal  20  April 2014.
Pramilla, S., Malcolm, P. 2008, Atlas Of Contraception Second
Edition ,  United  Kingdom  : Informa Health Care; 39-48.
Robinson B, Gesham L, Izevbigie E,
Cameron  JA  (2009).  Vernonia amygdalina  extracts  inhibit  the growth  of  estrogen  receptor poositive/negative human breast  carcinoma  cells  in  vitro. FASEB J., 23:965.19. Sani  Ali  A,  Alemika  Emmanuel  T, Abdulraheem Rafat O, Abdulkareem SS, Abdulraheem Ramat  B,  Ilyas  Mohammed. 2012.  A  study  review  of documented  phytochemistry  of Vernonia  amygdalina (family Asteraceae )  as  the  basis  for pharmacologic activity of plant extract.  Journal  of  Natural
Sciences Research. 2(7): 6.
Wahyuni, A. 2002. Pengaruh Solasodin  terhadap  Diameter Tubulus Seminiferus dan Gambaran Sel-sel Spermatogenik  Mencit  (Mus musculus) Dewasa. Jurnal
Kedokteran YARSI. 10 (2): 56-
65.
Weil CS. 1952. Tables for convenient calculation  of  median  effective dose  (LD ₅₀ or  ED ₅₀ )  and instructions in their use.
Biometrics,  p.249 – 263.