Andryansyah et al : Kualitas semen beku.......................

## KUALITAS SEMEN BEKU KAMBING PERANAKAN ETAWAH PADA PERMUKAAN NITROGEN CAIR DENGAN JARAK YANG BERBEDA
(FROZEN SEMEN QUALITY OF PE GOAT IN LIQUID NITROGEN SURFACE  WITH DIFFERENT DISTANCE)
Revy Andryansyah, Teguh Sumarsono, Fachroerrozi Hoesni, Bayu Rosadi *
Program Studi Peternakan Fakultas Peternakan Universitas Jambi Jl. Jambi-Ma. Bulian KM 15 Mendalo Darat Jambi 36361 *Correspondent author email : bayurosadi@unja.ac.id

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh jarak semen beku kambing PE dari  permukaan nitrogen cair selama proses penanganan terhadap kualitas spermatozoa. Sebanyak 30 straw semen beku kambing PE produksi  BBIB  Singosari  dibagi  ke  dalam  6  perlakuan  yaitu:  P0  (kontrol,  straw  disimpan  dalam  nitrogen cair), perlakuan lainnya berdasarkan jarak straw dari permukaan nitrogen cair yaitu P1 (5 cm), P2 (10 cm), P3  (15  cm),  P4  (20  cm),  dan  P5  (25  cm)  masing-masing  dipaparkan  selama  5  menit.  Peubah  yang  diamati adalah motilitas, viabilitas, dan abnormalitas spermatozoa. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penempatan semen beku kambing PE pada permukaan nitrogen cair dengan jarak yang berbeda menurunkan motilitas dan viabilitas spermatozoa (P<0,05) dan  tidak mempengaruhi abnormalitas spermatozoa (P>0,05). Motilitas dan viabilitas  spermatozoa  menurun  pada  P4  dan  P5.  Dapat  disimpulkan  bahwa  penempatan  semen  beku kambing  PE  hingga  15  cm  dari  permukaan  nitrogen  cair  selama  5  menit  tidak  menurunkan  kualitas spermatozoa.
Kata kunci : spermatozoa, preservasi, nitrogen cair, kambing PE

## ABSTRACT
The research was undertaken to study the effect of frozen semen distance from liquid nitrogen surface during handling  on  spermatozoa  quality  of  PE  goat.  Thirty  straws  of  PE  goat  frozen  semen  was  allotted  into  six treatments  i.e.  T0  (control,  straws  submerged  in  liquid  nitrogen),  T1  to  T5  based  on  distance  of  straws  to liquid  nitrogen  surface  were  5,  10,  15,  20,  and  25  cm.  Variables  measured  were  motility,  viability,  and abnormality of spermatozoas.  The results showed that PE goat frozen semen exposed in different distance to liquid nitrogen surface decreased (P<0.05) motily and viability of spermatozoas and had no effect (P>0.05) on  abnormality  of  spermatozoas.  The  motily  and  viability  was  decreased  in  T4  and  T5.  In  conlusion, exposing PE goat frozen semen from liquid nitrogen surface at 15 cm or less for 5 min maintain the quality of spermatozoas.
Key words: spermatozoa, preservation, liquid nitrogen, PE goat

## PENDAHULUAN
Kambing peranakan etawah (PE) merupakan  kambing  tipe  dwiguna  yang memiliki  kemampuan  beradaptasi  sangat  baik di  Indonesia.  Produksi  susu  yang  dihasilkan oleh  kambing  peranakan  etawah  rata  rata  0,5- 2,2  kg/ekor/hari  (Andriani et  al ,  2003)    rata- rata bobot badan kambing dewasa adalah 40 kg (Rasminati,  2013).  Menurut  Adiati  dan Priyanto  (2011)  usaha  pemeliharaan  kambing PE  lebih  banyak  ditujukan  untuk  produksi
anak.  Pengembangbiakan  kambing  PE  masih mengandalkan  perkawinan  alami  terkendala kurangnya pejantan unggul yang menyebabkan produktivitasnya  kurang  optimal.  Oleh  karena itu  perlu  adanya  upaya  untuk  mengoptimalkan produktivitas  kambing  tersebut  yaitu  dengan menggunakan  teknologi  inseminasi  buatan (IB).
Inseminasi  buatan  merupakan  teknologi yang  signifikan  yang  telah  digunakan  untuk
Andryansyah et al : Kualitas semen beku.......................
meningkatkan  usaha  ternak,  memungkinkan percepatan  kemajuan  genetik  dan  seleksi (Medeiros et  al., 2002),  dimana  keberhasilan kriopreservasi  semen  memperbaiki  efisiensi dan keberhasilan IB.
Kriopreservasi spermatozoa  merupakan  proses  berurutan mulai penurunan temperatur, dehidrasi, pembekuan, penyimpanan, dan thawing . Dibanding  sel-sel  lain,  sel  spermatozoa seharusnya  kurang  sensitif  terhadap  kerusakan kriopreservasi  karena  kandungan  air  yang rendah  dan  fluiditas  membran  yang  tinggi (Ugur et  al., 2019).  Walupun  demikian, kriopreservasi merusak integritas spermatozoa, perubahan  struktur  dan  fungsi  membran  serta metabolisme  sel  (Hammerstedt et  al., 1990), menurunkan  motilitas,  fragmentasi  DNA, menurunkan  daya  fertilisasi  (Wakayama  and Yanagimachi,  1998;  Bailey et  al., 2000, Takeda et al., 2015).
Kerusakan  spermatozoa  berkaitan  dengan cekaman  akibat  perubahan  suhu  ekstrim  yang dialami spermatozoa selama proses kriopreservasi  khususnya  proses  pendinginan dan  pembekuan  (Baust et  al., 2009).  Selama pendinginan spermatozoa terpapar banyak efek meusak  mencakup  decoupling  metabolik, ketidakseimbangan  ion,  aktivasi  protease,
asidois seluler, penurunan energy, transisi fase membran, destabilisasi sitoskeleton, dan produksi  radikal  bebas  (reactive  oxygen species,  ROS).  Selama  proses  pembekuan, spermatozoa  juga  terkena  efek  merusak pembentukan  kristal  es.  Rizal et  al .  (2010) menyatakan  bahwa  pada  saat thawing ,  semen mengalami tekanan yang berat akibat peningkatan suhu yang drastis.
Paparan  spermatozoa  terhadap  perubahan suhu  yang  drastis  dapat  terjadi  selama  proses penanganan  semen  beku.  Untuk  keperluan operasional  IB,  semen  beku  disimpan  dalam kontainer nitrogen cair. Inseminator mengambil  semen  beku  dalam  kemasan  straw setiap kali IB untuk dibawa dalam wadah berisi nitrogen  cair  yang  lebih  kecil,  proses  ini mencakup  turun  naik  canister  penyimpan kumpulan  straw.  Ketika  volume  nitrogen  cair dalam  kontainer  sudah  menurun,  saat  canister diangkat  mendekati  mulut  container,  canister tidak  terisi  penuh  atau  bahkan  kosong  dari nitrogen  cair.    Straw  berisi  spermatozoa  akan terpapar  dengan  fluktuasi  suhu  yang  cukup drastis.  Berdasarkan  ini    maka  dilakukan penelitian  tentang  kualitas  spermatozoa  semen beku kambing PE berdasarkan jarak penyimpanan dari permukaan nitrogen cair.

## METODE PENELITIAN

## Semen Beku
Pada penelitian ini digunakan semen beku kambing  PE  yang  diproduksi  oleh  BBIB Singosari.  Semen  beku  dalam  kemasan  straw 0.25  ml  mempunyai  no  seri  produksi  yang sama  berarti  berasal  dari  satu  ejakulat  yang sama,  hal  ini  menjamin  keseragaman  unit percobaan.  Straw  disimpan  dalam  container nitrogen  cair  kapasitas  13  liter  (Taylor- Wharton,  USA).  Container  diisi  nitrogen  cair sepertiga  dari  kapasitasnya  sehingga  tersisa duapertiga  ruang  kosong  di  atas  permukaan nitrogen cair.
Perlakuan  Jarak  Straw  dari  Permukaan Nitrogen Cair
Tiga puluh straw semen beku kambing PE dibagi  secara  acak  ke  dalam  6  perlakuan sebagai berikut:
P0  =  Kontrol  (straw  direndam  dalam  nitrogen cair)
P1 = Straw diangkat dengan jarak  5 cm diatas permukaan N 2 cair P2 = Straw diangkat dengan jarak 10 cm diatas permukaan N 2 cair
P3 = Straw diangkat dengan jarak 15 cm diatas permukaan N 2 cair P4 = Straw diangkat dengan jarak 20 cm diatas permukaan N 2 cair P5 = Straw diangkat dengan jarak 25 cm diatas permukaan N 2 cair Pada  setiap  perlakuan,  canister  berisi kumpulan  straw  diangkat  sampai  jarak  yang ditentukan dari permukaan nitrogen cair. Straw ditahan  dalam  posisi  tersebut  selama  5  menit, selanjutnya  straw  dimasukkan  kembali  ke dalam cairan nitrogen dalam container.

## Penilaian Kualitas Spermatozoa
Semen  beku  diambil  dari  penyimpanan dalam  container  kemudian  thawing  dilakukan pada  suhu  37 o C  selama  30  detik.  Semen dikeluarkan  dari  straw  dan  diamati  untuk mengukur motilitas, viabilitas dan abnormalitas spermatozoa.
Pengukuran Motilitas
Motilitas  dihitung  menggunakan  metode estimasi  (Junaedi et  al., 2016).  Motilitas spermatozoa  diamati  dengan  cara  meletakkan satu  tetes  semen  ditambah  10  tetes  NaCl
Andryansyah et al : Kualitas semen beku.......................
fisiologis.  Motilitas  spermatozoa  dihitung dengan  estimasi  dari  lima  lapang  pandang, dinyatakan dalam persentase.
Viabilitas Penghitungan viabilitas menggunakan pewarnaan  eosin  negrosin.  Sebanyak  2  tetes larutan  eosin  negrosin  ditempatkan  pada  gelas objek bersih, satu tetes semen dicampurkan ke dalam larutan eosin nigrosin, selanjutnya diulas memakai  gelas  objek  lainnya.  Perhitungan persentase hidup didasarkan atas perbandingan jumlah  spermatozoa  yang  hidup  (kepala  tidak berwarna)  dengan  total  spermatozoa  yang dihitung.  Jumlah  total  spermatozoa  yang diamati minimal 200 setiap pengamatan. Abnormalitas Spermatozoa
Abnormalitas  adalah  penyimpangan  dari bentuk  morfologi  normal  spermatozoa  yang dapat menyebabkan penurunan daya fertilitasnya. Penghitungan abnormalitas spermatozoa dilakukan menggunakan pewarnaan  yang  sama  dengan  spermatozoa hidup.  Jumlah  spermatozoa  yang  dihitung minimal  200  setiap  pengamatan.  Persentase abnormalitas dihitung menggunakan rumus:

## Analisis Data
Data  yang  didapatkan  dari  setiap  peubah yang diamati analisis dengan sidik ragam, Bila perlakuan  berpengaruh  nyata,  dilakukan  uji lanjut Duncan (Steel dan Torrie, 1993). Proses penghitungan  data  menggunakan  program SPSS.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa jarak straw  terhadap  permukaan  nitrogen  cair mempengaruhi motilitas dan viabilitas spermatozoa (P<0.05), tetapi tidak mempengaruhi abnormalitas spermatozoa
(P>0.05; Tabel 1).
Tabel 1. Motilitas, viabilitas dan abnormalitas spermatozoa kambing PE
Perlakuan Suhu ( o C)* Peubah Motilitas (%) Viabilitas (%) Abnormalitas (%) P0 -196 47.91±4.34 a 50.05±2.34 a 3.81±1.66 P1 -50 >* 47.52±4.52 a 48.87±2.85 ab 4.55±2.08 P2 -50 >* 45.48±5.21 ab 47.45±3.31 abc 3.91±2.06 P3 -42,0 44.01±5.28 ab 46.81±1.86 abc 4.92±1.67 P4 -20,7 41.74±4.54 ab 43.41±3.23 cd 3.35±1.54 P5 -3,2 38.99±3.74 b 41.51±1.97 d 3.00±0.81
Keterangan  :  Superskrip  yang  berbeda  pada  kolom  yang  sama  menunjukkan  perbedaan  nyata (P<0,05) *Daya ukur termometer yang digunakan sampai -50 o C.
Dari  tabel  terlihat  bahwa  penempatan semen beku kambing PE dengan jarak tertentu dari  permukaan  nitrogen  cair  menurunkan motilitas  spermatozoa  (P<0.05).  Motilitas  P5 lebih  rendah  dari    P0,  tetapi  tidak  berbeda dengan  P1,  P2,  P3,  dan  P4,    tidak  ada perbedaan  antara    P1,  P2,  P3,  dan  P4.  Tabel memperlihatkan  semakin  jauh  jarak  straw  dari permukaan  nitrogen  cair,  maka  suhu  semakin tinggi.  Pada  P0  suhu  nitrogen  cair  (-196 o C) naik  sampai  -3 o C  pada  P5,  perbedaan  suhu mempengaruhi peubah yang diukur.
Pada  semua  perlakuan  (kecuali  P0), spermatozoa  terpapar  pada  suhu  lebih  tinggi dari  suhu  nitrogen  cair  selama  5  menit, kemudian  terpapar  kembali  dengan  suhu nitrogen  cair  sebelum  dithawing.  Penurunan
motilitas  secara  signifikan  terjadi  pada  P5, suhu  terukur  pada  posisi  tersebut  adalah  -3 o C. Motilitas  dapat  dipertahankan  sampai  P4 dengan  kondisi  suhu  -20,7 o C.  Dengan  lama pemaparan  selama  5  menit,  diduga  perubahan kriogenik yang terjadi pada spermatozoa belum sampai  menurunkan  daya  gerak  spermatozoa. Rosadi et  al. (2015)  melaporkan  penyimpanan semen beku pada suhu -20 o C selama 30 menit mempertahankan  motilitas  spermatozoa  diatas 40%, tetapi menurun setelah 45 menit.
Fluktuasi  suhu  yang  dialami  spermatozoa menimbulkan sumber-sumber cekaman diantaranya decoupling metabolik , ketidakseimbangan  ion,  aktivasi  protease, asidosis  seluler,  penekanan  energi,  produksi ROS  (Baust et  al., 2009).  Konsentrasi  ROS
Andryansyah et al : Kualitas semen beku.......................
yang  tinggi  berkaitan  dengan  peningkatan peroksidasi  lipid  yang  meningkat  di  membran plasma spermatozoa dan menurunkan viabilitas spermatozoa  (Scherle et  al., 2011).    Tingkat fluktuasi suhu pada P5 lebih tinggi dibandingkan perlakuan lainnya, diduga tingkat  kerusakan  kriogenik  termasuk  yang diakibatkan  produksi  ROS  juga  lebih  tinggi. Membran plasma merupakan platform dinamis untuk  lokalisasi  macam-macam  komponen yang  secara  aktif  berpartisipasi  dalam  seluruh aspek proses motilitas mencakup pembentukan tenaga,  perlekatan,  signaling  dan  regulasi (Keren,  2011).      Proses  fisiologis  sel  yang mendukung  mekanisme  gerak  spermatozoa terganggu  dengan  kerusakan  membran  karena tingginya produksi
ROS. Sebagai konsekuensinya motilitas spermatozoa
menurun.
Penempatan  semen  beku  pada  permukaan nitrogen  cair  menurunkan  viabilitas  kambing PE  (P<0.05).  Viabilitas  spermatozoa  yang nyata  lebih  rendah  terjadi  pada  mulai    P4  dan berlanjut  ke  P5.  Karena  disparitas  antara  suhu nitrogen cair (P0) dengan suhu pada P4 dan P5 lebih  besar  dibandingkan  perlakuan  lainnya, diduga  kerusakan  kriogenik  karena  cekaman akibat  fluktuasi  suhu juga  lebih  besar  pada  P4 dan  P5.  Tingkat  kerusakan  kriogenik  yang spermatozoa menyebabkan kematian sel (apoptosis). Apoptosis berkaitan dengan kerusakan  kriogenik  DNA  spermatozoa  dan pembentukan  ROS  menyebabkan  kerusakan DNA (Johnston et al., 2012).  Kerusakan DNA berhubungan  dengan  beberapa  mekanisme yang  terjadi  selama  kriopreservasi,  kerusakan pita  ganda  karena  produksi  ROS  yang  tinggi (McCarthy et  al., 2009),  kerusakan  enzim- enzim perbaikan DNA (Bogle et al., 2017), dan cekaman  mekanik  areal  genom  molekul  DNA dimana  kompaksi  kromatin  meningkat  karena
pengerucutan  sel  (Kopeika et  al., 2015). Keberadaan  DNA  yang  utuh  sangat  krusial bagi  spermatozoa.  DNA  mengandung  intruksi genetik  untuk  perkembangan  dan  fungsi spermatozoa  dengan  mengkode  sekuen  residu asam-asam  amino  dalam  protein.    Sintesis protein spesifik spermatozoa seperti halnya sel- sel  yang  lain  memperantarai  respon  terhadap rangsangan lingkungan untuk mempertahankan hidup  dan  menjalankan  fungsinya.  Kerusakan pada DNA menyebabkan spermatozoa kehilangan kemampuan untuk merespon rangsangan dari lingkungan sehingga mengakibatkan apoptosis. Penempatan semen beku diatas permukaan  nitrogen  cair  tidak  mempengaruhi abnormalita spermatozoa kambing PE (P>0,05). Abnormalitas tidak bertambah akibat cekaman  yang  dialami  spermatozoa  akibat perlakuan. Abnormalitas yang teramati disebabkan oleh proses selama spermatogenesis, perjalanan spermatozoa sampai di epididimis, serta proses kriopreservasi  dalam  proses  produksi  semen beku.  Kerusakan  kriogenik  spermatozoa  yang menyebabkan penurunan motilitas dan viabilitas tidak menyebabkan kerusakan morfologi  secara  keseluruhan,  persentase abnormalitas  tidak  terpengaruh.  Persentase abnormalitas  pada  penelitian  ini  rendah  dan dalam  batas  toleransi  untuk  fertilitas.  Tingkat abnormalitas morfologi 8-10% tidak mempunyai  pengaruh  yang  berarti  bagi fertilitas,  tetapi  abnormalitas  lebih  dari  25% dari  satu  ejakulat  menyebabkan  penurunan fertilitas (Bearden dan Fuquay, 1997). Apabila persentase abnormalitas spermatozoa lebih dari 15%  menunjukkan  adanya  infertilitas  atau ketidak suburan pejantan dan akan menurunkan  fertilitas  karena  tidak  dapat membuahi sel telur (Hartono, 2019).

## SIMPULAN
Dari  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan bahwa  pemaparan  semen  beku  kambing  PE setinggi  15  cm  atau  kurang  dari  permukaan
nitrogen cair selama 5 menit tidak menurunkan kualitas spermatozoa.

## DAFTAR PUSTAKA
Adiati  U,  D  Priyanto.  2011.  Karakteristik Morfologi  Kambing  PE  Di  Dua  Lokasi Sumber Bibit. Seminar Nasional Teknologi  Peternakan  dan  Veteriner. Balai Penelitian Ternak Ciawi. Adriani  A,  Sudono  T,  Sutardi,  Manalu  W, Sutama  IK.  2003.  Optimalization  of  kids
Andryansyah et al : Kualitas semen beku.......................
and  milk  yield  of  Etawah-Grade  does  by superovulation  and  zinc  supplementation.
J.  Forum  Pascasarjana  IPB .  Vol  26  (4): 335-352.
Bailey  JL,  Bilodeau  JF,  N  Cormier.  2000. Semen  cryopreservation  in  domestic animals:  a  damaging  and  capacitating phenomenon. J Androl . 21:1–7
Baust  JG,  Gao  D,  JM  Baust.  2009.
Cryopreservation: an emerging paradigmchange. Organogenesis .  5(3): 90–96.
Bearden  HJ  and  JW  Fuguay.  1980. Applied Animal  Reproduction .  Reston  Publishing Company.  Inc.  Printice  Hall  Company, Reston Virginia
Bogle  OA,  Kumar  K,  Attardo-Parrinello  C, Lewis  SEM,  Estanyol  JM,  JL  Ballescà. 2017.  Identification of protein changes in human spermatozoa throughout the cryopreservation  process .  J.  Andrology . 5(1):10–22.
Hammerstedt RH, Graham JK, Nolan JP. 1990.
Cryopreservation  of  mammalian  sperm: what  we  ask  them  to  survive. J  Androl .
11(1):73–88.
Hartono  M.  2019.  Kualitas  Semen  Kambing
Peranakan Boer. Jurnal Penelitian
Pertanian Terapan 10(1): 52-58.
Junaedi, Arifiantini I, Sumantri C, Gunawan A.
2016.  Penggunaan  Dimethyl  Sulfoxide Sebagai  Krioprotektan  dalam  Pembekuan Semen  Ayam  Kampung. Jurnal  Veteriner 17 (2): 300-308.
Johnston  SD,  Satake  N,  Zee  Y,  López- Fernández C, Holt WV, J Gosálvez. 2012. Osmotic  stress  and  cryoinjury  of  koala sperm:  an  integrative  study  of  the  plasma membrane, chromatin stability and mitochondrial function.
Reproduction .143(6):787–97.
Keren  K.  2011.  Cell  motility:  the  integrating role  of  the  plasma  membrane. J  Eur Biophys. 40(9): 1013–1027.
Kopeika  J,  Thornhill  A,  Khalaf  Y.  2015.  The effect  of  cryopreservation  on  the  genome of  gametes  and  embryos:  principles  of cryobiology  and  critical  appraisal  of  the evidence. Hum Reprod Update.
21(2):209–27.
McCarthy  MJ,  Baumber  J,  Kass  PH,  SA Meyers.  2009.  Osmotic  stress  induces oxidative  cell  damage  to  rhesus  macaque spermatozoa1. Biol  Reprod .  82(3):644– 651.
Medeiros  CMO,  Forell  F,  Oliveira  ATD,
Rodrigues  JL.  2002.  Current  status  of sperm  cryopreservation:  why  isn’t  it better? Theriogenology 57(1):327–344. Rasminati N. 2013. Grade Kambing Peranakan Ettawa  pada  Kondisi  Wilayah  yang Berbeda. Sains Peternakan 11 (1): 43-48 Rizal M, dan Herdis. 2010. Peranan Antioksidan Dalam Meningkatkan Kualitas  Semen  Beku. Wartazoa 20  (3): 139-145.
Rosadi  B,  Sumarsono  T,  Darmawan.  2015.
Motilitas  Spermatozoa  Kerbau  Lumpur pada Penyimpanan Semen Beku dalam Es. Jurnal  Ilmu-Ilmu  Peternakan 18  (2):98- 101.
Scherle  CC,  Maia  MS,  Bicudo  S,  Rodello  L, Azevedo H. 2011. Lipid peroxidation and generation  of  hydrogen  peroxide  in frozen-thawed  ram  semen  supplemented with  catalase  or  Trolox. Small  Ruminant Research 95 (2–3): 144-149.
Takeda K, Uchiyama K, Kinukawa M, Tagami T,  Kaneda  M,  Watanabe  S.  2015. Evaluation of sperm DNA damage in bulls by TUNEL assay as a parameter of semen quality. J Reprod Dev 61(3): 185–190. Wakayama T, Yanagimachi R. 1998.
Development  of  normal  mice  from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa. Nat  Biotechnol 16(7):  639– 646.