EISSN: 2407-7690 https://ejournal3.undip.ac.id/index.php/jmr

## Sitotoksisitas Ekstrak Etanol dan n-Heksana Daun Rhizopora Apiculata dengan Indikator Indeks Mitosis Allium Cepa
Sri Rejeki Rahayuningsih 1 *, Annisa Anindyta 1 , Tri Mayanti 2
1 Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran
2 Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran Jl. Ir. Soekarno km. 21 Jatinangor, Sumedang, Jawa Barat 45363 Indonesia *Corresponding author, e-mail: sri.rejeki@unpad.ac.id
ABSTRAK: Rhizophora apiculata merupakan salah satu mangrove yang biasa digunakan sebagai sumber  obat  tradisional  oleh  masyarakat  pesisir  pantai  karena  mengandung  metabolit  sekunder. Tumbuhan obat tradisional dapat memiliki efek genotoksik, mutagenik, dan sitotoksik. Oleh karena itu, perlu dilakukan evaluasi efek sitotoksik dengan Allium asay . Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui  sitotoksitas  ekstrak  etanol  dan n -heksana R.  apiculata terhadap  pembelahan  sel dengan  melihat  indeks  mitosis A.  cepa .  Pada  penelitian  ini  digunakan  metode  eksperimental, perlakuan tunggal  ekstrak  etanol R.  apiculata konsentrasi  125,  250,  500,  dan  1.000  ppm, kontrol negatif akuades penambahan CMC, serta kontrol positif etilmetanasulfat (EMS). Penelitian dengan protokol  yang  sama  dilakukan  untuk  ekstrak  n-heksana R.  apiculata .  Penurunan  nilai  indeks mitosis  digunakan  untuk  acuan  sitotoksisitas.  Data  hasil  pengamatan  menunjukkan  nilai  indeks mitosis  perlakuan  ekstrak  etanol  dan n- heksana  mengalami  penurunan  sejalan  dengan peningkatan  konsentrasi  ekstrak.  Perlakuan  ekstrak  etanol  dan n -heksana  konsentrasi  500  ppm dan 1000 ppm bersifat letal terhadap sel akar A. cepa .
Kata Kunci : Allium assay; Indeks mitosis ; Rhizophora apiculata; sitotoksisitas; Allium cepa
Cytotoxicity Ethanol  And n-hexane Leaf Extract Of Rhizophora apiculata To Mitotic Index of Allium cepa
ABSTRACT: Rhizophora apiculata is mangrove that was used for traditional medicine due to their secondary  metabolite.  Traditional  medicine  plants  have  genotoxic,  mutagenic,  and  cytotoxic effects. Therefore, evaluation cytotoxic effect with Allium assay is necessary. The aim in this study to  know  ethanol  and  n-hexane  leaf  extract  of  R.  apiculata  effects  to  A.  cepa  cell  divisions.  This study  use  experimental  method,  single  factor  treatment  ethanol  extract  of  R.  apiculata  with consentration  125,  250,  500,  and  1000  ppm,  aquades  with  CMC  as  negative  control,  and ethylmetanasulphat (EMS) as positive control. Reasearch with same protocol is done for n- hexane extrct  of  R.  apiculata.  Cytotoxicity  is  seen  based  on  decresed  of  mitotic  index.  Based  on observation,  ethanol  and  n-hexane  extract  mitotic  index  was  showing  decrese  value  in  line  with increasing extract concentration. Ethanol dan n-hexane extract of  R. apiculata concentration 500 ppm and 1000 ppm are lethal to cells.

## Keywords: Allium assay; cytotoxicity; mitotix indeks; Rhizophora apiculata; Allium cepa

## PENDAHULUAN
Rhizoporaceae  merupakan  famili  mangrove  yang  memiliki  kemampuan  toleransi  terhadap garam  serta  menghasilkan  senyawa  kimia  pada  akar  dan  daun  yang  dapat  mencegah pertumbuhan tumbuhan invasif dan alga pada ekosistem (Baskaran & Mohan, 2012). Rhizophora merupakan tumbuhan obat karena manfaat produk metabolit sekunder secara medik, antara lain: alkaloid,  glikosid,  minyak  esensial,  dan  molekul  organik  lainnya.  Beberapa  spesies  yang  sering dijumpai adalah Rhizophora apiculata, R. mucronata, dan R. mangle (Halim et al., 2013). R.  apiculata merupakan  mangrove  yang  telah  digunakan  sebagai  bahan  untuk  sterilisasi, pewangi, dan pertumbuhan (Gao & Xiao, 2012). Selain itu, kulit batang, akar, daun, dan bunganya
Journal of Marine Research Vol 10, No.4 November 2021, pp. 545-550
dapat digunakan sebagai obat beri-beri, febrifige , haematoma, hepatitis, serta borok (Darlian et al ., 2011).  Daun R.  apiculata mengandung  senyawa  bioaktif  alkaloid,  tanin,  steroid,  saponin,  fenol, glikosida, flavonoid, dan terpenoid yang bersifat antiseptik, antivirus, antiinflamasi, dan antibakteri (Putri et al., 2015).
Pada beberapa penelitian tumbuhan yang digunakan sebagai makanan dan obat tradisional terdapat  efek  mutagenik,  sitotoksik,  dan  genotoksik  pada in  vitro dan in  vivo  assays .  Pada penggunaan  jangka  panjang  dapat  meningkatkan  potensi  mutagenik  atau  genotoksik  yang berhubungan  dengan  formasi  tumor  pada  beberapa  individu    (Celik  &  Aslanturk,  2010). Allium assay memiliki sensitivitas untuk mendeterminsi efek sitotoksik atau genotoksik pada bermacam- macam zat. Metode ini telah digunakan untuk meneliti mutagenesis fisika dan kimia, agen polutan, ekstrak  tumbuhan,  dan  efek  sitogenetik  beberapa  bahan  aktif  melalui  pembelahan  sel  mitosis. Hasil positif allium assay mengindikasikan zat uji berpotensi berbahaya bagi kesehatan (Sumitha & Thoppil, 2016).
Pada penelitian mengenai toksisitas tanaman obat, Azadirachta indica (Mimba) sebagai obat malaria  diketahui  menyebabkan  aberasi  kromosom  pada allium  assay (Akaneme  &  Amaefule, 2012).  Selain  itu, Inula  viscosa sebagai  obat  tradisional  antiinflamasi,  antiseptik,  dan  antipiretik menyebabkan aberasi kromosom dan formasi mikronukleus pada allium assay (Celik & Aslanturk, 2010).
Penelitian  mengenai  efek  genotoksisitas R.  apiculata belum  pernah  dilakukan  baik  di Indonesia  maupun  di  negara  lain.  Oleh  karena  itu,  penellitian  ini  penting  dilakukan  mengingat pengetahuan masyarakat mengenai efek genotoksik dan sitotoksik tumbuhan obat tradisional yang menyebabkan  gangguan  pada  pembelahan  sel  masih  kurang.    Pembelahan  sel  dapat  dihitung indeks mitosisnya, Nilai indeks mitosis akan turun dan lebih kecil dari normal 100% apabila terjadi gangguan  oleh  faktor  lingkungan  maupun  zat  asing  yang  masuk  ke  dalam  sel  seperti  misalnya senyawa metabolit sekunder.

## MATERI DAN METODE
Pada penelitian ini digunakan metode eksperimental. Pengambilan sampel dilakukan dengan mengambil 5 daun R. apiculata dari pucuk dan diekstraksi dengan maserasi etanol dan n-heksana. Penelitian menggunakan metode eksperimen pola Rancang Acak Lengkap dengan analisis Anava (α.05)  dengan  perlakuan  ekstrak  etanol  dan  n-heksana R.  apiculata empat  konsentrasi  ekstrak yaitu,  125,  250,  500,  dan  1.000  µg/ml  (Ping et  al., 2012),  kontrol  negatif  akuades  penambahan Carboxymethyl  cellulose  (CMC),  serta  kontrol  positif  etilmetanasulfat  (EMS).  Pada  setiap perlakuan dilakukan empat kali pengulangan. Perendaman dalam akuades dan ekstrak dilakukan selama  96  jam  hingga  muncul  akar  pada  umbi  bawang.  Pembuatan  preparat  dilakukan berdasarkan  Akinboro et  al. (2011)  dengan  squashing  akar  bawang  dan  diamati  1000  sel  pada setiap  preparat  untuk  mengetahui  nilai  indeks  mitosis.  Untuk  mengetahui  kandungan  metabolit sekunder ekstrak etanol dan n-heksana daun R.apiculata dilakukan uji fitokimia.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  uji  fitokimia  ekstrak  etanol  daun R . apiculata secara  kualitatif  diperoleh  mengandung senyawa fenolik, flavonoid, steroid, triterpenoid, dan tanin Data lengkap dapat dilihat pada Tabel 1. Pengaruh ekstrak etanol daun R. apiculata terhadap sel akar bawang dapat dilihat melalui indeks mitosis, aberasi kromosom, dan panjang akar. Berdasarkan  hasil pengamatan perlakuan ekstrak etanol diperoleh hasil bahwa nilai indeks mitosis tertinggi terdapat pada perlakuan kontrol negatif sebesar  49,53%,  sedangkan  nilai  indeks  mitosis  terendah    terdapat  pada  perlakuan  konsentrasi ekstrak etanol R. apiculata , yaitu sebesar 6%. Data lengkap dapat dilihat pada Tabel 2. Menurut  Antonsie-wiez  (1990)  dan  Panda and Sahu  (1985) dalam Paul et  al. (2013), penurunan  indeks  mitosis  di  bawah  22%  dari kontrol  negatif  dapat menyebabkan  efek  letal  pada organisme  uji,  sedangkan  penurunan    indeks  mitosis  di  bawah  50%  menyebabkan  efek  subletal dan  disebut  nilai  batas  sitotoksik  ( cytotoxic  limit  value ).  Hal  ini  disebabkan  adanya  zat  sitotoksik dalam  media  tumbuh  yang  menyebabkan  terhambatnya  aktivitas  mitosis.  Pada  hasil  nilai  indeks mitosis penurunan perbandingan nilai indeks mitosis terhadap kontrol negatif diperoleh perlakuan
kontrol  positif,  ekstrak  etanol  500  ppm,  dan  ekstrak  etanol  1000  ppm  menyebabkan  efek  letal, sedangkan perlakuan ekstrak etanol 125 ppm dan 250 ppm menyebabkan efek subletal.
Hasil  perhitungan  Anava  menunjukkan  bahwa  perlakuan  konsentrasi  ekstrak  etanol R. apiculata ,  kontrol  negatif    dan  kontrol  positif  berpengaruh  nyata  terhadap  indeks  mitosis. Berdasarkan hasil Uji Jarak Berganda Duncan, pemberian keempat konsentrasi ekstrak etanol R. apiculata tidak memberikan hasil yang berbeda nyata dengan kontrol positif. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak etanol R. apiculata 125 ppm, 250 ppm, 500 ppm, dan 1000 ppm dapat memberikan  pengaruh  toksik  yang  sama  dengan  kontrol  positif  terhadap  indeks  mitosis  sel  akar bawang.
Penurunan  indeks  mitosis  juga  menunjukkan  adanya mitodepressive akibat  terhambatnya sel  memasuki  fase  mitosis  atau  terhambatnya  protein  spesifik  tertentu  dalam  siklus  sel  karena adanya  molekul  lain  yang  menghalangi  DNA  polimerase.  Selain  itu,  terhalangnya  sel  memasuki fase G2 juga dapat menyebabkan terganggunya siklus sel (Boumaza et al., 2016). Menurut  Dai  & Mumper  (2010),  senyawa  fenolik  yang  digunakan  pada  sel  kanker  dapat mengganggu  fungsi  dasar  sel.  Fenolik  dapat  menghambat  fase  I  dalam  metabolit  enzim,  seperti cytochrome P450. Selain itu, fenolik dapat menginduksi sel untuk terhambat dalam fase sel yang berbeda,  G1,  S,S-G2,  dan  G2  dengan  secara  langsung  menurunkan  regulasi  siklin  dan cyclins- dependents  kinases (CDKs)  atau  menginduksi  ekspresi  gen  p21,  p27,  dan  p53  secara  tidak langsung.  Keberadaan  senyawa  fenolik  dalam  ekstrak  etanol R.  apiculata dapat  memengaruhi siklus  sel  normal,  sehingga  pembelahan  sel  terhambat.  Selain  itu  senyawa  triterpenoid  dapat memengaruhi  pembelahan  sel A.  cepa. Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan  oleh Bhattacharya  &  Haldar  (2012),  senyawa  triterpenoid Trichosanthes  dioica dapat  menghambat pertumbuhan  akar  dan  mitosis  sel.  Selain  itu,  triterpenoid  juga  dapat  bersifat  sitotoksik  pada neoplastic  lines dengan  menghambat  aktivitas  seluler  dan  menambah  jumlah  sel  apoptosis (Chudzik et al., 2015).
Tabel 1. Hasil Uji Kandungan Metabolit Sekunder Ekstrak Etanol dan Ekstrak n-Heksana Daun B. Gymnorrhiza
Metabolit Sekunder Jenis Pelarut Etanol Heksan Fenolik + - Flavonoid + - Steroid - + Triterpenoid + + Saponin - - Tanin + - Alkaloid + -
Tabel 2. Pengaruh ekstrak etanol daun R. apiculata terhadap pembelahan sel akar bawang Allium cepa
Konsentrasi Ekstrak Total Sel Diamati Total Sel Membelah Indeks Mitosis (IM) (%) Penurunan IM terhadap kontrol (%) P M A T Kontrol Negatif 4000 1716 89 66 110 49, 53 ± 0,11 0 Kontrol Positif   4000 216 28 7 15 6,53 ± 0,01 13 125 ppm 4000 569 10 5 4 14,68 ± 0,02 30 250 ppm 4000 416 7 8 14 11,13 ± 0,007 22 500 ppm 4000 247 1 2 4 6,4 ± 0,01 13 1000 ppm 4000 222 6 5 3 6 ± 0,004 12
Journal of Marine Research Vol 10, No.4 November 2021, pp. 545-550
Tabel 3. Pengaruh  ekstrak n -  heksana  daun R.  apiculata terhadap  pembelahan  sel  akar  bawang Allium cepa
Konsentrasi Ekstrak Total Sel Diamati Total Sel Membelah Indeks Mitosis (IM) (%) Penurunan IM terhadap kontrol (%) P M A T Kontrol Negatif 4000 1504 238 116 248 52,65 ± 0,02 0 Kontrol Positif 4000 216 28 7 15 6,53 ± 0,01 12 125 ppm 4000 654 23 14 22 17,83 ± 0,02 34 250 ppm 4000 555 18 11 17 15,1 ± 0,01 29 500 ppm 4000 406 11 3 8 10,7 ± 0,002 20 1000 ppm 4000 387 17 31 6 11, 03 ± 0,007 21
Komponen  fitokimia  yang  yang  ditemukan  dalam  ekstrak n -  heksana  antara  lain  flavonoid, steroid,  dan  triterpenoid.  Pada  perlakuan  ekstrak n -  heksana  diperoleh  hasil  indeks  mitosis tertinggi terdapat pada perlakuan kontrol negatif sebesar 52,65%, sedangkan nilai indeks mitosis terendah  pada  perlakuan  kontrol  positif,  yaitu  6,53%.  Data  lengkap  indeks  mitosis  ekstrak n - heksana dapat dilihat pada Tabel 3.
Penurunan    perbandingan  nilai  indeks  mitosis  terkecil  terjadi  pada  perlakuan  kontrol  positif sebesar  12%  .  Pada  perlakuan  kontrol  positif,  ekstrak n- heksana  500  ppm  dan  1000  ppm penurunan  perbandingan  nilai  indeks  mitosis  dibawah  22%  sehingga  dapat  dikatakan menyebabkan  efek  letal.  Pada  perlakuan  ekstrak n -heksana  konsentrasi  125  ppm  dan  250  ppm penurunan  perbandingan  indeks  mitosis  terhadap  kontrol  negatif  di  bawah  50%  maka  dapat dikatakan perlakuan tersebut menyebabkan efek subletal.
Penurunan nilai indeks mitosis dapat terjadi karena terhambatnya siklus sel, perkembangan sel  dari  fase  S  menuju  fase  M  yang  lambat,  penghambatan  dalam  sintesis  DNA  sehingga menghambat sel memasuki mitosis atau menahan sel dalam keadaan metafase karena gangguan pada  spindel  dan  menyebabkan  kematian antiproliferative dan  apoptosis  sel  yang  ditafsirkan sebagai  efek  toksik  langsung  dari  ekstrak  (Kundu  &  Ray,  2016).  Nilai  indeks  mitosis  yang  lebih rendah dibandingkan dengan kontrol negatif menunjukkan adanya perubahan dalam pertumbuhan dan perkembangan A. cepa (Atoyebi et al ., 2015).
Hasil  perhitungan  Anava  dengan  taraf  nyata  95%  menunjukkan  bahwa  perlakuan konsentrasi ekstrak n- heksana R. apiculata , kontrol negatif dan kontrol positif berpengaruh nyata terhadap indeks mitosis. Berdasarkan hasil Uji Jarak Berganda perlakuan ekstrak n- heksana 125  ppm  dan  250  ppm  memberikan  hasil  yang  signifikan  bila  dibandingkan  dengan  perlakuan ekstrak n- heksana 500 ppm, 1000 ppm, dan kontrol positif. Pengaruh  perlakuan  ekstrak n -heksana  terhadap  nilai  indeks  mitosis  sel  akar  bawang menunjukkan  adanya  efek  yang  diberikan  oleh  ekstrak  terhadap  fase  pembelahan  sel  akar bawang. Hal ini dapat dikarenakan adanya interaksi langsung antara komponen di dalam ekstrak dengan DNA bawang (Kahaliw et al . 2018). Flavonoid merupakan kelompok antioksidan (Carocho & Ferreira, 2013). Menurut Lu et al. (2013) kelompok antioksidan dapat menyebabkan kerusakan langsung  pada  DNA  dan  sel  karena  mempunyai  banyak  ikatan  elektron  yang  lemah.  Ikatan elektron  lemah dissociative  electron  transfer (DET)  pada  basa  guanin  dapat  menyebabkan lepasnya ikatan kimia dan terjadi single strand break dan double strand breaks pada DNA. Double strand  breaks pada  DNA  sulit  untuk  diperbaiki  dan  dapat  menyebabkan  mutasi  genetik  serta apoptosis sel.

## KESIMPULAN
Pada  pengujian  sitotoksisitas  ekstrak R  apiculata ,  ekstrak  etanol  n-heksana  bersifat  letal pada  konsentrasi  500  ppm  dan  1000  ppm.  Kedua  konsentrasi  tersebut  menunjukkan  hasil menurunkan  presentase  indeks  mitosis  dibawah  22%  yang  tidak  berbeda  nyata  dengan  kontrol positif  EMS,  sedangkan  konsentrasi  125  dan  250  ppm  kedua  ekstrak  hanya  menurunkan presentase  indeks  mitosis  dibawah  50  %  dan  termasuk katagori  subletal.  Penurunan  nilai  indeks
Journal of Marine Research Vol 10, No.4 November 2021, pp. 545-550
mitosis  dapat  disebabkan  oleh  fitokimia  yang  terkandung  dalam  ekstrak,  sehingga  memengaruhi pembelahan sel akar A. cepa. Pada penelitian ini kurang diketahui senyawa metabolit mana yang memberikan pengaruh signifikan, maka penelitian selajutnya sebaiknya dilakukan uji sitotoksisitas pada senyawa fitokimia yang telah dimurnikan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini dapat diselesaikan dengan baik dengan dana hibah RISTEK DIKTI DAN atas bantuan  dari  berbagai  pihak  dalam  hal  perizinan  maupun  tehnis  pengerjaan  di  lapangan  dan laboratorium

## DAFTAR PUSTAKA
Akaneme,  Ifeoma,  F.  &  Amaefule,  C.C.,  2012.  Evaluation  of  the  cytotoxicity  and  genotoxicity  of aqueous  leaf  extracts  of Azadirachta  indica A.  Juss  using  the  allium  assay. Journal  of Medicinal Plant Research . 6(22):3898-3907. DOI: 10.5897/JMPR12.427
Akinboro, A., Mohammed, K., Rathnasamy, S. & Muniandy, V.R. 2011. Genotoxicity ssessment of water  samples  from  the  Sungai  Dua  River  in  Pulau  Pinang,  Malaysia,  using  the Allium  cepa test. Tropical Life Science Research, 22(2):23-25
Atoyebi, S.M., Oyeyemi, I.T., Dauda, B.A. & Bakare, A.A. 2015. Genotoxicity and anti-genotoxicity of  aqueous  extract  of  herbal  recipes  containing Luffa  cylindrica (L), Nymphaea  lotus (L)  and Spondias  mombin (L)  using  the Allium  cepa (L)  assay. African  Journal  of  Pharmacy  and Pharmacology. 9(15):492-499.
Baskaran,  R.  &  Mohan,  P.M.  2012.  In  vitro  antibacterial  activity  of  leaf  extracts  of Rhizophora mucronata L.  against  multi  drug  resistant Vibrio spp.  Isolated  from  marine  water  Lobster’s larvae hatcheries. Indian Journal of Geo-Marine Sciences. 41(3):218-222.
Bhattacharya,  S.  &  Haldar,  P.K.  2012.  Evaluation  of  antimitotic  and  genotoxic  effects  of  the triterpenoid  enriched  extract  from Trichosanthes  dioica root. American  Eurasian  Journal  of Toxicological Sciences . 4(1):20-23. DOI: 10.3109/13880209.2013.795176
Boumaza,  A.,  Lalaoui,  K.,  Khallef,  M.,  Sbayou,  H.,  Talbi,  H.  &  Hilali,  A.,  2016.  Assessment  of cytotoxic and genotoxic effects of Clodinafop-propargyl commercial formulation on Allium cepa L. Journal of Materials and Environmental Science, 7(4):1245-1251 Carocho, M. & Ferreira, I.C.F.R. 2013. A review on ntioxidants, prooxidants and relted controversy: Natural  and  synthetic  compounds,  screening  and  analysis  methodologies  and  future perspectives. Food and Chemical Toxicology . (51):15-25 DOI: 10.1016/j.fct.2012.09.021 Celik, T.A. & Aslanturk, O.S. 2010. Evaluation of cytotoxicity and genotoxicity of Inula viscosa leaf extracts  with  allium  test. Journal  of  Biomedicine  and  Biotechnology, 189252:  8  pages.  DOI: 10.1155/2010/189252 Chudzik,  M.,  Korzonek-Szlacheta,  I.  &  Król,  W.,  2015.  Triterpenes  Potentially  Cytotoxic Compounds. Molecules . 20(1):1610-1625. DOI: 10.3390/molecules20011610 Dai,  J.  &  Mumper,  R.J.  2010.  Plant  phenolic:  Extraction,  analysis,  nd  their  antioxidant  and anticancer properties. Molecules . 15(1):7313-7352. DOI: 10.3390/molecules15107313 Darlian,  L.,  Imran,  G.  &  Fachruddin.  2011.  Skrining  bioaktivitas  ekstrak  kulit  akar  bakau  merah ( Rhizophora  apiculata bl.)  terhadap  daya  hambat  pertumbuhan  koloni  bakteri Streptococcus sp. Jurnal Progres Kimia Sains, 1(2):73-82 Gao,  M.  &  Xiao,  H.  2012.  Activity-guided  isolation  of  antioxidant  compounds  from  Rhizophora apiculata. Molecules , 17(9):10675-10682. DOI: 10.3390%2Fmolecules170910675 Halim,  N.H.A.,  Abidin,  N.A.Z.  &  Me,  R.  2013.  A  study  of  chemical  compounds  in Rhizophora apiculata . The  Open  Conference  Proceeedings  Journal. 4(1):108-110.  DOI:  10.2174/221 0289201304020108 Kundu, L.M. & Ray, S. 2016. Mitotic abnormalities and micronuclei inducing potentials of colchicine and  leaf  aqueous  extracts  of  Clerodendrum  viscosum  Vent.  in  Allium  cepa  root  apical meristem cells. Caryologia ,70(1):7-14  DOI: 10.1080/00087114.2016.1254452.
Lu, L.Y., Ou, N. & Lu, Q. 2013. Antioxidant induces DNA damage, cell death, and mutagenicity in human lung and skin normal cells. Scientific Reports . 3(3169):1-11 Paul,  A.,  Nag,  S.  &  Sinha,  K.  2013.  Cytological  effects  of  blitox  on  root  mitosis  of llium  cepa L. Internationala Journal of Scientific and Research Publications . 3(5):1-7. Putri,  A.M.,  Prayitno, S.B.  &  Sarjito.  2015.  Perendaman  berbagai  dosis  ekstrak  daun  bakau ( Rhizophora  apiculata )  untuk  pengobatan  kepiting  bakau  ( Scylla  serrata )  yang  diinfeksikan bakteri Vibrio harveyi . Journal of Aquaculture Management and Technology , 4(4):141-149