Menara Perkebunan 2009, 77 (1), 23-35.

## Produksi, isolasi dan karakterisasi superoksida dismutase dari
Spirulina platensis yang dibiakkan dalam serum lateks
Production, isolation, and characterization of superoxyde dismutase from Spirulina platensis cultured on latex serum
TRI-PANJI 1) , SUHARYANTO 1) & Marini WIJAYANTI 2)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan, Bogor  16151, Indonesia
2) Program Studi Biokimia, Fakultas Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor, Indonesia

## Summary
Spirulina  platensis is  a  blue-green microalga  which  is  frequently  used  for  food and  feed  supplements  and  cosmetic  active agent.  This  microalga  also  produces  a  strong antioxidant  namely  superoxide  dismutase (SOD)  used  as  cosmetic  active  agent  for  anti aging and anti free radicals. SOD was isolated from S.  platensis cell  biomass  from  local isolate  grown  on  latex  serum  on  semipilot (3.5 m 3 ) and pilot scale (40 m 3 ) then dried with spray  drying  or  sun  drying  and  characterized. SOD  was  purified  with  sequential  two-stage sedimentation  using  ammonium  sulphate  and fractionated in chromatographic column containing Sephadex G 200. The fractions were analysed  to  determine  the  activity,  cofactor metal  and  amino  acid  composition  of  the antioxidant. The results showed that sedimentation  of  SOD  extract  with  80% ammonium  sulphate  produced  SOD  with higher  activity  compared  to  that  of  SOD  from commercial S.  platensis biomass.  This  SOD was successfully isolated and purified.
Metaloenzyme SOD was composed of subunits with  molecular  weight  of  77.78;  71.74;  and 19.2 kDa, which contained nine types of amino acids  with  tyrosine  and  lysine  as  the  major amino  acid  components.  Zn  was  the  most predominant  metal  on  SOD,  then    followed  by Fe  and  Mn.  The  main  subunit  cofactors consisted of Zn 72%, Fe 25%, Mn 2%, and Cu 1%,  which    were    different    from    the    small subunit that contained of Zn 55%, Mn 31%, Fe
14%,  and  Cu  4%.  The  stability  of  SOD  was achieved  on  pH  7.5  and  temperature  below 25 o C.
[ Key  words: Latex  serum,  metalo  enzyme, superoxide  dismutase,  blue-green microalga, antioxidant]

## Ringkasan
Spirulina platensis adalah mikroalga hijau biru yang banyak digunakan sebagai suplemen pangan,  pakan,  dan  bahan  aktif  kosmetika. Mikroalga  ini  juga  menghasilkan  antioksidan kuat yaitu  superoksida  dismutase (SOD),  yang merupakan bahan aktif kosmetika anti penuaan dini  dan  pencegah  efek  radikal  bebas.    SOD diisolasi  dari  biomassa  sel S.  platensis isolat lokal yang dibiakkan dalam serum lateks skala semipilot  (3,5  m 3 )  dan  pilot  (40  m 3 )  serta dikeringkan  dengan  cara  pengeringan  kabut ( spray drying ) atau penjemuran untuk kemudian  dikarakterisasi.  SOD  dimurnikan dengan  pengendapan  bertingkat  menggunakan ammonium  sulfat  dan  dipisahkan  dengan kolom  kromatografi  berisi  Sephadex  G  200. Hasil  pemisahan  kemudian  dianalisis  untuk menentukan  aktivitas,  logam  kofaktor  serta komposisi  asam  amino  anti  oksidan  tersebut. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pengendapan  ekstrak  SOD  dengan  ammonium sulfat  80%  menghasilkan  aktivitas  SOD  lebih tinggi  dari  SOD  asal  biomassa S.  platensis komersial. SOD tersebut telah berhasil diisolasi dan  dimurnikan.  Metaloenzim  SOD  tersusun
Tri Panji et al.
atas  subunit  dengan  BM  77,78;  71,74;  dan 19,2  kDa,  yang  mengandung  sembilan  jenis asam  amino  dengan  tirosin  dan  lisin  sebagai komponen  asam  amino  utama.  Logam  yang dominan  pada  SOD  adalah  Zn,  disusul kemudian  Fe  dan  Mn.  Kofaktor  sub  unit  besar terdiri  dari  Zn  72%,  Fe  25%,  Mn  2%,  dan  Cu 1%,  berbeda  dengan  sub  unit  kecil  yang mengandung  Zn  55%,  Mn  31%,  Fe  14%,  dan Cu  4%. Stabilitas  SOD S.  platensis dicapai pada pH 7,5 dan suhu di bawah 25 o C.

## Pendahuluan
Spirulina  platensis atau  lebih  populer disebut sebagai Spirulina adalah sianobakteri  atau  mikroalga  hijau  biru. Mikroalga  ini  mampu  tumbuh  pada berbagai    tingkat  salinitas  (Richmond, dalam Borowitzka  &  Borowitzka,  1987), pH  sangat  basa  (pH  8-11)  dengan kandungan senyawa karbonat dan bikarbonat  yang  tinggi  (Aiba  &  Ogawa, 1977), dan dengan pasokan unsur nitrogen (Mateles  &  Tanennbaum,  1968).  Mikro- alga  yang  dijuluki magic  food dan wonderful  food ini  banyak  digunakan sebagai makanan fungsional dan penghasil berbagai  bahan  aktif  penting  bagi  dunia kesehatan  (Arad,  1988),  antara  lain  asam gamma  linolenat  (GLA)  (Cohen et  al ., 1987).  Beberapa  bahan  aktif  lain  juga diproduksi  secara  intraseluler  seperti senyawa karotenoid (termasuk beta karotena/  provitamin  A),  asam  nikotinat, riboflavin  (vitamin  B 2 ),  thiamin  (vitamin B 1 ), sianokobalamin (vitamin B 12 ), pigmen  fikosianin,  klorofil,  dan  lain- lainnya  (Ciferi,  1983;  Richmond dalam Borowitzka & Borowitzka, 1987). Biomassa S.  platensis juga  merupa- kan penghasil enzim superoksida dismutase (SOD) dengan aktivitas sebesar 1.500.000  unit  per  kg  (Belay dalam Vonshak,  1997).  Menurut  produsennya,
Cyanotech  Corp ., Hawaian  Spirulina mengandung  SOD  hingga  2.376.000  unit per  kg.  SOD  merupakan  antioksidan  dan bahan  aktif  kosmetika  untuk  menghambat penuaan ( anti aging ), menghambat toksisitas  yang  diinduksi  obat  (drug- induced  toxicities)  dan  kerusakan  saraf akibat  cekaman  oksidatif  (Vila et  al ., 2004).  Harga  SOD  asal S.  platensis (500 unit/mg protein) dalam bentuk murni dalam katalog Sigma (2005) berkisar US$ 55,20.  Peluang  komersialisasi  produk bioaktif  dari S.  platensis tersebut  untuk kesehatan dan kosmetika cukup prospektif karena  terjaminnya  ketersediaan  bahan baku  dan  kualitas  produk  serta  tingginya daya kompetitif terhadap produk impor.
Produksi  lateks  pekat  relatif  kecil, sekitar  5%  dari  total  produksi  karet Indonesia.  Namun,  produksi  lateks  pekat menghasilkan  limbah  yang  memiliki  kadar polutan  organik  yang  tinggi  antara  lain ditandai  dengan  nilai  COD  di  atas  25.000 ppm  dan  N  total  (Kjeldahl)  sekitar  4.000 ppm  (Tri-Panji et  al .,  1994).  Dari  suatu pabrik  pengolahan  karet  jenis  ini  dengan kapasitas  medium  dapat  dihasilkan  limbah cair  sekitar  250  m 3 per  hari.  Survei  yang dilakukan di suatu PTP Nusantara menunjukkan  bahwa  untuk  mengolah limbah sebanyak ini diperlukan biaya cukup tinggi,  lebih  dari  Rp  775  juta  per  tahun, namun  limbah  olahan  masih  berbau  busuk. Di  sisi  lain  limbah  pekatnya  dalam  bentuk serum  lateks  dapat  dimanfaatkan  sebagai media  tumbuh S.  platensis (Tri-Panji  & Suharyanto, 2000) . Hasil penelitian Tri-Panji et al . (1996) menunjukkan bahwa medium serum lateks pekat  yang    baik  untuk  pertumbuhan S. platensis mengandung    N-NH 4 + sekitar 250  mg/L  dan  memiliki  COD  sekitar 2.000  ppm.  Selanjutnya,  Tri-Panji et  al. (2005) berhasil  mengoptimalkan  medium
Produksi, isolasi dan karakterisasi superoksida dismutase dari Spirulina platensis ….
tumbuh S. platensis , peningkatan aktivitas dan  isolasi  SOD  dari  biomassa  mikroalga tersebut.  Senyawa  N-NH 4 + dimanfaatkan sebagai  sumber  nitrogen    untuk  meng- hasilkan  protein.  Selain  membutuhkan nitrogen untuk
pertumbuhannya,
S.  platensis juga  membutuhkan  sumber karbon.  Kemampuan S.  platensis dalam menggunakan bahan organik sebagaimana senyawa karbon anorganik dalam medium yang  mengandung  serum  lateks  pekat menunjukkan bahwa mikroalga ini mampu tumbuh  dalam  kondisi  miksotropik  dan tumbuh  lebih  baik  dalam  medium  yang mengandung  hidrolisat  protein  (Chen  & Zhang, 1997; Marquez et al ., 1993; Singh et  al .,  1995).  Serum  lateks  pekat  yang banyak mengandung protein dan karbohidrat  merupakan  sumber  C  organik yang murah. Sejak tahun 2003 S. platensis telah  dibudidayakan  secara  komersial  di Indonesia  baik  dalam  medium  sintetik maupun  dalam  serum  lateks  dengan dukungan  Program Start  Up Capital dari Kementerian  Riset  dan  Teknologi  melalui Pemodalan  Nasional  Madani  Techno
Venture bekerjasama dengan Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia  dan  PT  Protamin  Nutrilina.
Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh teknik  produksi,  isolasi,  serta  uji  aktivitas dan  karakteriristik  SOD  dari S.  platensis yang  dibiakkan  dalam  serum  lateks dengan beberapa cara pengeringan biomassa.

## Bahan dan Metode
Pembiakan S. platensis
Spirulina  platensis yang  digunakan merupakan  mikroalga  isolat  lokal  koleksi BPBPI.    Mikroalga  ditumbuhkan  dalam medium  dengan  komposisi  serum  lateks
5%,  natrium  karbonat  1.25%  dan  dengan tambahan  garam-garam  mineral  lain sebagai  suplemen  sesuai  dengan  yang digunakan  oleh  Aiba  &  Ogawa  (1977). Biomassa S.  platensis diperoleh  dari  hasil pembiakan  dalam  kolam  skala  semipilot (3,5  m 3 )  dan  pilot  (40  m 3 )  dengan pemberian iluminasi sinar matahari langsung dan aerasi dengan pompa aerator secara  kontinu  selama  3-4  minggu. Biomassa  mikroalga  dipanen  dengan  cara penyaringan dengan kain belacu, kemudian  dicuci  dengan  air  suling, ditiriskan  dan  dikeringan.  Pengeringan dilakukan  dengan  dua  macam  cara  yaitu penjemuran  secara  langsung  selama  ±  7 hari  atau  dengan spray  drying selama delapan  jam  sampai  diperoleh  kisaran kadar  air  3-5%,  kemudian  ditumbuk dengan  mortar  porselin  sampai  menjadi serbuk halus berukuran sekitar 100 mesh.

## Pemisahan SOD dari biomassa sel
Pemisahan enzim dari biomassa dilakukan  dengan  metode  Kim et  al. (1998)  dengan  sedikit  modifikasi  sebagai berikut. Serbuk biomassa kering S.  platensis (1  g)  digerus  halus  dalam nitrogen cair menggunakan mortar, dibagi ke  dalam  dua  tabung,  masing-masing 0,5 g, kemudian ditambahkan bufer fosfat pH  7.8  sebanyak  empat  kali  volume (2  mL).  Larutan  EDTA  0.1  mM ditambahkan  ke  dalam  salah  satu  tabung, (1  mL)  selanjutnya  kedua  tabung  tersebut disentrifugasi  pada  10  000  x  g  selama 30  menit.  Supernatan  hasil  sentrifus digunakan  sebagai  ekstrak  enzim  kasar Pemurnian SOD dilakukan dengan pengendapan  bertingkat  menggunakan amonium  sulfat  dengan  berbagai  kon- sentrasi.  Pengendapan  pertama  meng- gunakan  amonium  sulfat  40%  jenuh  dan
Tri Panji et al.
disentrifugasi  pada  11.000  x  g  selama  30 menit  untuk  pengendapan molekul  besar. Supernatan diambil, ditambahkan amonium sulfat padatan hingga 80% jenuh dan  disentrifugasi  kembali  pada  kondisi yang sama. Endapan hasil sentrifus  kedua yang diharapkan mengandung SOD dilarutkan  kembali  dalam  bufer  fosfat  pH 7,8  dan  dibagi  ke  dalam  tiga  tabung dengan  volume  yang  sama  untuk  setiap perlakuan  dengan  EDTA  atau  tanpa EDTA.    Masing-masing  larutan  enzim tersebut kemudian didialisis dengan selopan dalam bufer fosfat  pH 7,8 selama 24  jam  dalam  suhu  4 o C.    Hasil  dialisis disentrifugasi kembali dan diambil endapannya dan dilarutkan dengan 0,5 mL buffer  fosfat  pH  7,8.    Di  dalam  fraksi tersebut,  SOD  yang  lebih  murni  akan diperoleh.  SOD  dari  biomassa Spirulina impor  yang  tersedia  di  pasar  diekstraksi dengan  cara  yang  sama  untuk  diperiksa aktivitas enzim SOD-nya sebagai pembanding.  Pemurnian  SOD  lebih  lanjut dilakukan  dengan  kromatografi  kolom menggunakan  eluen  bufer  fosfat  pH  7,8 dengan  menggunakan  Sephadex  G-200 dengan  kolom  1  x  10  cm  (Kim et  al ., 1998).

## Aktivitas SOD  penentuan jenis isoform
Aktivitas  SOD  ditentukan  menurut metode  Bergmeyer et  al. (1987)  dengan sedikit  modifikasi  yaitu  menggunakan campuran  larutan  bufer  fosfat  pH  7,8, akuades,  larutan  hidroksilamin    klorida 0,5 mM, antraquinon sulfonat 0,2 mM dan enzim  diaporase  750  U/L.    Campuran pereaksi  kemudian  ditambah  dengan larutan  sampel  hasil  dialisis  dan  larutan NADH 10  mM  sambil  dikocok.  Reaksi
pewarnaan  dilakukan  dengan  menambah- kan  larutan  sulfanilamida  1  %  b/v,  bufer fosfat  yang  sama,  dan  larutan  naptiletilen diamin 0.02 % b/v, dikocok dan dibiarkan selama  20  menit  pada  suhu  ruang  (28- 30 o C).    Warna  larutan  hasil  reaksi  dibaca absorbansinya  pada  panjang  gelombang 560  nm.  Aktivitas  relatif  SOD  ditentukan sebagai    perbandingan  antara  aktivitas SOD  satu  sampel  dengan  sampel  yang mempunyai  aktivitas  SOD  tertinggi  pada serangkaian  pengujian.    Rumus  yang digunakan adalah:
A: Absorbansi
Jenis isoform SOD ditentukan berdasarkan kepekaan aktivitasnya
terhadap  sianida  dan  kandungan  logam kofaktor SOD. Campuran pereaksi  enzim yang digunakan dalam penentuan aktivitas SOD  ditambahkan  KCN  1,5  mM.    Enzim SOD  sensitif  sianida  adalah Cu,  Zn  SOD, sedangkan  yang  insensitif  sianida  adalah Fe,  Mn  SOD  (Glick  &  Pasternak  1994). Aktivitas  SOD  optimum  diuji  pada  suhu 35-70 o C selama 20 menit dan pH 3,0-10.

## Karakterisasi SOD
Karakterisasi SOD  meliputi  penentuan bobot  molekul  total  dan  subunitnya, komposisi  asam  amino  dan  kofaktor logam.  Bobot  molekul  total  dan  subunit- nya dilakukan dengan kromatografi permeasi gel/GPC dan SDS-PAGE dengan konsentrasi gel pemisah 10% dan stacking gel  4%  akrilamida.  Pita  bobot  molekul SOD  dapat  diketahui  dari  plot  Ferguson Rf  pita-pita  protein  terhadap  log  bobot
Aktivitas SOD relatif = A maks. - A terendah X 100%
A maks. - A sampel
Produksi, isolasi dan karakterisasi superoksida dismutase dari Spirulina platensis ….
molekul  protein  standar.  Komposisi  asam amino  ditentukan  dengan  khromatografi cair  kinerja  tinggi  (HPLC).  Serbuk  SOD sebanyak  0,2  g  dihidrolisis  dalam  5  mL HCl 6 N  pada suhu 100 o C selama 16 jam.
Hasil hidrolisis dikeringkan dengan pompa vakum bertekanan 50 torr (dilakukan dua  kali),  kemudian  dilarutkan kembali  dalam  bufer  dabsilasi  (larutan NaHCO 3 baru)  dan  larutan  dabsil  klorida (4- dimetilaminoazobenzena-4’-sulfonil klorida).  Analisis  asam  amino  dilakukan menggunakan HPLC dengan kondisi suhu kolom  38 o C,  kolom  pico  tag  (3,9  x 150  mm), kecepatan alir  eluen  (asetonitril
60  %  dan  bufer  natrium  asetat  pH  5,75)
1mL/menit (program linier), batas
maksimum  tekanan  3000  psi,  program gradient,  serta  detektor  UV-Vis,  panjang gelombang 436 nm (Tri-Panji & Suharyanto, 1993). Kofaktor logam
dengan  menganalisis  kandungan  logam Zn,  Cu,  Fe  dan  Mn  dengan  metode destruksi  basah  HNO 3 -HClO 4 dan Atomic Absorption  Spectrophotometry (AOAC, 1984).

## Hasil dan Pembahasan

## Isolasi superoksida dismutase (SOD)
Hasil  pemisahan  SOD  dari  biomassa S.  platensis yang  dibiakkan  dalam  kolam pembiakan skala 3,5 m 3 dan 40 m 3 dengan SDS-PAGE  menunjukkan  tampilan  dua pita  tipis  berdekatan  dengan  bobot molekul  77,61  dan  71,20  kDa  dan  satu pita  tebal  tunggal  dengan  bobot  molekul 19,20  kDa  (Gambar  1).  Hasil  pita  protein SOD  berbeda  sesuai  dengan  perlakuan pascapanen  terutama  proses  pengeringan. Penjemuran biomassa diduga dapat mendenaturasi protein SOD karena radiasi ultra  violet  dan  panas  dari  sinar  matahari
langsung dalam waktu lama sehingga BM protein  menjadi  lebih  kecil  dari  protein enzim  total  dan  membentuk  sub  unit-sub unit.    Berbeda  halnya  dengan  hasil pengeringan  secara spray  drying ,  enzim SOD  tidak  mengalami  denaturasi  karena pemanasan  yang  relatif  singkat.    Bobot molekul SOD pertama dan kedua merupakan  bobot  molekul  sub  unit  SOD hasil  pemecahan  SOD  total  akibat pemakaian  SDS  dan  merkaptoetanol  pada proses  elektroforesis.  Kedua  sub  unit  ini jika bergabung akan menjadi bobot
Gambar  1.  Profil  protein  SOD:  Plot  Ferguson BM  protein  standar  (A)  dan  enzim SOD  (B),  serta  hasil  SDS  PAGE enzim SOD dari dua jenis biomassa yang dihasilkan dengan cara pengeringan yang berbeda (C)
Figure  1.  Profile  of  SOD  protein:  Ferguson plot  of  MW  of  standard  protein  (A) and  SOD  enzyme  (B),  and  SDS PAGE  of  SOD  enzyme  from  two kinds  of  biomass  resulted  from different drying method (C)
Keterangan/ explanation : A : Protein standar BioRad/ Standard protein BioRad B : SOD hasil pengeringan biomassa dengan spray dryer/SOD from dried biomass with spray dryer C : SOD hasil pengeringan biomassa dengan sun drying /SOD from dried biomass with  sun drying
199,5 kDa 77,6 kDa 71,2 kDa 19,2 kDa 14,5 kDa 21,4 kDa 30,9 kDa 44,7 kDa 66,2 kDa 97,7 kDa 114,8 kDa A          B             C
Tri Panji et al.
molekul  total  SOD  sekitar  148,81  kDa. Bobot  molekul  ketiga  sangat  kecil (19,2  kDa)  yang  mungkin  berasal  dari pemecahan  satu  subunit  SOD  menjadi empat  sub-subunit  akibat  pengeringan yang terlalu lama pada proses penjemuran.

## Karakterisasi SOD
Untuk mengetahui kemampuan biakan dalam memproduksi SOD, biomassa  kering S.  platensis ditentukan aktivitas dan sensitivitas SOD-nya terhadap  sianida,  serta  dibandingkan dengan  SOD  dari  biomassa  sejenis  asal impor yang diperoleh di pasaran.
Aktivitas SOD diukur berdasarkan peningkatan  atau  penurunan  absorbansi nitrit  pada  panjang  gelombang  560  nm. Semakin  tinggi  absorbansi  nitrit  maka semakin  rendah  aktivitas  SOD  dalam sampel.
Aktivitas  SOD  dalam  ekstrak  kasar biomassa S.  platensis yang  diperoleh dengan  medium  serum  lateks  tidak berbeda  secara  nyata  dengan  aktivitas SOD dalam biomassa komersial. Aktivitas SOD  pada  ekstrak  kasar  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  yang  berasal  dari fraksinasi  amonium  sulfat  40%  dan  80%, baik  untuk  SOD  dari  biomassa  kultur dalam  medium  serum  lateks  maupun biomassa  impor.  Aktivitas  SOD  dalam sampel ekstrak kasar lebih tinggi dibandingkan dengan aktivitas SOD dalam sampel yang dimurnikan dengan amonium sulfat. Hal ini mungkin disebabkan protein dalam  ekstrak  kasar  enzim  SOD  masih dalam  keadaan  utuh  sehingga  aktivitas katalitiknya  tidak  terganggu.    Hal  ini berarti  bahwa  teknik  pemisahan  protein menggunakan  fraksinasi  amonium  sulfat tidak  dapat  memisahkan  seluruh  enzim
SOD  dalam  biomassa  sel S.  platensis. Aktivitas  SOD  dalam  fraksi  amonium sulfat 40% yang diperoleh dengan medium serum  lateks  lebih  rendah  dibandingkan dengan  aktivitas  SOD  dalam  biomassa yang  diperoleh  dari  pasaran.  Sebaliknya, aktivitas SOD dalam biomassa S. platensis asal  medium  serum  lateks  pada  fraksinasi dengan  amonium  sulfat  80%  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  yang  berasal  dari produk  pasaran  (Tabel  1).    SOD  dari kedua  jenis  biomassa S.  platensis relatif sensitif  terhadap  sianida.  Pada  fraksi ekstrak kasar, SOD S. platensis komersial sedikit lebih sensitif dibandingkan dengan SOD S. platensis asal medium lateks. Hal sebaliknya diperoleh pada fraksi amonium sulfat 80%.
SOD  mempunyai  banyak  isoform yang diklasifikasikan oleh kofaktor logam yang  mempengaruhi  aktivitasnya,  yaitu Cu, Zn-SOD, dan Fe, Mn-SOD (Kaminaka et  al .,  1999).    Perbandingan persentase  logam  dalam  ekstrak  murni dapat  menunjukkan  jenis  logam  kofaktor yang  dominan  dalam  SOD S.  platensis. Ekstrak  murni  SOD  dalam  biomassa S.  platensis mengandung  5,33  g  atom  per mol enzim atau 54,5% Zn dari total logam kofaktor yang dianalisis.  Logam lain yang terdapat dalam jumlah cukup besar adalah Mn  dan  Fe  masing-masing  29%  dan 14,5%, sedangkan Cu hanya 2% dari total logam  kofaktor  yang  dianalisis.  Hasil  ini berbeda  dengan  yang  diperoleh  Lumsden et al . (1976) yang mengelompokkan SOD S. platensis sebagai Fe, Mn-SOD. Berdasarkan  sensitivitasnya  terhadap sianida,  SOD  sensitif  sianida  adalah  Cu, Zn-SOD,  sedangkan  yang  tidak  sensitif sianida adalah Fe, Mn-SOD.  Enzim SOD yang  dapat  bekerja  optimal  dalam  sel tubuh  manusia  adalah  Cu,  Zn-SOD,  dan .
Produksi, isolasi dan karakterisasi superoksida dismutase dari Spirulina platensis ….
Tabel 1.   Perbandingan  aktivitas  enzim  SOD  dalam  biomassa Spirulina yang  ditumbuhkan  dalam medium serum lateks dan Spirulina impor yang tersedia di pasar. Aktivitas enzim SOD diukur berdasarkan A 560 dari reaksi penghambatan reduksi nitrit dan konversi kadar nitritnya.* )
Table 1.    The comparison of SOD enzyme activity between Spirulina biomass grown on medium of latex serum with imported Spirulina available on market . The SOD enzyme activity was measured based  on A 560 from  inhibition  reaction  of  nitrite  reduction  and  the  conversion  of  nitrite content.* )
Tanpa KCN Without KCN
Dengan KCN
With KCN
Sampel biomassa
Spirulina
Sample of Spirulina biomass Tahap ekstraksi Extraction phase Aktivitas SOD SOD activity (A 560 ) Kadar nitrit per 100 mg biomassa Nitrite content per 100 mg biomass (µM) Aktivitas SOD (A 560 ) (penurunan atau peningkatan aktivitas, %)
SOD activity (A 560 )
(Activity increase or decrease, %)
Kadar nitrit per 100 mg biomassa Nitrite content per 100 mg biomass (µM) Medium lateks Latex medium Ekstrak kasar Crude extract 0,015 0,0113 0,017 ( turun 11,8%) (decrease 11.8%) 0,0207 Hasil pengendapan dengan (NH 4 ) 2 SO 4 40 % Sedimentation results with 40% (NH 4 ) 2 SO 4 0,039 0,0264 Tak terdeteksi Undetected Tak terdeteksi Undetected Hasil pengendapan dengan (NH 4 ) 2 SO 4 80 % Sedimentation results with (NH 4 ) 2 SO 4 80% 0,021 0,1972 0,077 (turun 72,7%) (decrease 72.7%) 1,.5117 Pasaran Commercial Ekstrak kasar Crude extract 0,015 0,0113 0,019 (turun 21,05%) (decrease 21.05%) 0,0300 Hasil pengendapan dengan amonium sulfat 40 % Sedimentation results with ammonium sulphate 40% 0,031 0,0184 Tak terdeteksi Undetected Tak terdeteksi Undetected
Hasil pengendapan dengan amonium sulfat 80 %
Sedimentation results with ammonium sulphate 80% 0,026 0,3146 0,016 (naik 38,4%) (increase 38.4%) 0,0798
* ) Konversi hasil absorbansi A 560 menjadi konsentrasi nitrit dibuat berdasarkan persamaan pada grafik standar nitrit yaitu  y (absorbans A 560 ) = 0,0284 x (kadar nitrit, µM) + 0,0126;  R 2 = 0,9970 *) Conversion  of absorbans A 560 result  changed into  nitrite  concentration  based  on equation  on curve of standard nitrite which is y (absorbance A 560 ) = 0.0284 x (nitrite content, µM) + 0,0126;  R 2 = 0.9970

## Tri Panji et al.
Mn-SOD  (Glick  &  Pasternak  1994). Berdasarkan sifatnya yang sensitif terhadap  sianida,  SOD  dalam  biomassa S  platensis kemungkinan  adalah  jenis  Cu,
Zn-SOD.    Namun,  SOD  dalam  biomassa tersebut kemungkinan juga dapat mengandung  Fe,  Mn-SOD dalam  jumlah yang lebih kecil mengingat penghambatan aktivitas  SOD  yang  terjadi  relatif  tidak terlalu  tinggi    khususnya  pada  ekstrak kasar, yaitu 11,8% .
Pada  umumnya,  SOD  mengandung Cu,  Zn  dengan  perbandingan  yang seimbang  per  mol  enzim.  Kim et  al .
(1998)  melaporkan  bahwa  kadar  Cu  dan Zn dalam molekul enzim SOD Scapharca broughtonii yaitu  1,89  g  dan  1,23  g  atom per  mol  enzim,  sedangkan  kandungan  Fe dan  Mn  sangat  rendah,  yaitu  masing- masing  0,12  dan  0,02  g  atom  per  mol enzim,  sehingga  enzimnya  dikategorikan sebagai  Cu,  Zn-SOD.    Hasil  analisis logam  kofaktor  dalam  SOD S.  platensis masih  belum  dapat  memastikan  jenis isoform  SOD,  tetapi  jika  penetapan  jenis kofaktor SOD berdasarkan logam tertinggi maka  SOD S.  platensis hasil  kultur medium  serum  lateks  termasuk  Zn-SOD, sedangkan  jika  dilihat  dari  keseimbangan konsentrasi  logamnya,  mungkin  termasuk dalam  kelompok  Fe,  Mn-SOD.    Madhavi et  al. (1996)  melaporkan  bahwa  Cu,  Zn- SOD biasanya terdapat dalam sel eukariot sedangkan  sel  prokariot  seperti  bakteri, sianobakteri  atau  mikroalga  tidak  biasa mengandung  Cu,  Zn,  tetapi  mengandung Fe-SOD. Lumsden et  al .  (1976)  menemukan bahwa  SOD  dalam S.  platensis termasuk manganodismutase dan feridismutase (Mn,  Fe-SOD). S.  platensis hasil  kultur dalam  medium  serum  lateks  tersebut mempunyai  kofaktor  SOD  yang  khas dengan  kandungan  Zn  yang  relatif  tinggi
dan  kandungan  Mn,  Fe,  dan  Cu  yang relatif  lebih  rendah  dalam  enzim  SOD murninya  sehingga  cenderung  termasuk Zn-SOD.    Perbedaan  hasil  yang diperoleh dalam  pengelompokan  isoform    SOD S.  platensis dalam  penelitian  ini  dengan yang  diperoleh  Lumsden et  al .  (1976) belum  diketahui  dengan  pasti  penyebab- nya.  Namun, kemungkinan dapat disebab- kan  oleh  perbedaan  komposisi  medium, kondisi pertumbuhan dan galur S.  platensis yang  digunakan.  Uji  aktivitas SOD S.  platensis dengan  penambahan kofaktor  logam  divalen  seperti  Cu,  Zn, Mn,  dan  Fe  perlu  dilakukan  untuk memastikan  kelompok  isoform  SOD tersebut.
Pengaruh jenis kofaktor SOD S.  platensis dalam  pemanfaatannya  untuk makanan  fungsional  tidak  berpengaruh besar  di  dalam  sel  tubuh  manusia.  Hal tersebut disebabkan dalam saluran pencernaan manusia terdapat enzim-enzim yang  akan  memotong  SOD  dalam makanan,  dan  ketika  hasil  pemecahan  ini sampai di dalam sel akan disusun kembali dengan  kofaktor  yang  sesuai  dengan kebutuhan  sel  tubuh  manusia,  biasanya Cu,  Zn-SOD  dan  Mn-SOD  (Beyer et  al ., 1987).    Dengan  demikian,  mineral  logam yang  perlu  dikonsumsi  adalah  yang diperlukan  oleh  sel  tubuh  manusia  untuk memacu  aktivitas  SOD  dalam  sel,  yaitu Cu,  Zn,  dan  Mn  (Hasim,  komunikasi pribadi).

## Stabilitas SOD terhadap pH dan suhu
Perlakuan suhu terhadap ekstrak kasar SOD  menunjukkan  bahwa  semakin  tinggi suhu,  semakin  turun  aktivitas  SOD (Gambar  2).    SOD  merupakan  suatu protein  mempunyai  situs  aktif  peng- katalisis  oksigen  radikal  toksik.  Situs
Produksi, isolasi dan karakterisasi superoksida dismutase dari Spirulina platensis ….
Gambar 2.  Pengaruh pH dan suhu terhadap aktivitas relatif SOD yang diisolasi dari biomassa S.platensis pada dua jenis  pengeringan, a) Spray dryer (atas) dan oven (bawah)
Figure 2.   Effect of pH and temperature on  SOD  relative activity isolated from S. platensis biomass on two kind of drying method, a) Spray dryer (above) and oven (below).
ini berfungsi jika yang konformasi protein SOD  tidak  berubah  akibat  denaturasi. Perubahan  konformasi  ini  menyebabkan penurunan aktivitas SOD.  Stabilitas SOD yang  rendah  pada  suhu  ruangan  (25 o C) menyebabkan  kerja  SOD S.  platensis harus pada suhu yang rendah. Preparasi uji aktivitas  SOD  biasanya  dilakukan  pada suhu maksimal 4 o C, kecuali saat menung- gu  perubahan  warna  setelah  pencampuran pereaksi  warna  selesai  dilakukan  (Elstner
et. al. dalam Bergmeyer & Mariannegrabl, 1987).  Penurunan  aktivitas  enzim  SOD lebih  dari  47%  terjadi  pada  suhu  di  atas 50 o C. Hal ini menunjukkan bakwa ekstrak enzim  SOD  hanya  dapat  dipergunakan pada suhu dingin untuk menjaga stabilitas SOD  yang  terkandung  di  dalamnya. Enzim  SOD  paling  stabil  pada  pH  7,5. Krutika  &  Subramanian  (2007)  melapor- kan  bahwa  SOD  dari S.  platensis stabil pada  pH  6,5-10.  Perubahan  pH  mem-
Kering oven Spray dryer A k ti v it as re la ti f R el at iv e ac ti v it y (% ) 120 100 80 60 40 20 0 3          4           5           6          6,5        7         7,5       7,8          8           9       10 pH A k ti v it as re la ti f R el at iv e ac ti v it y (% ) 100 80 60 40 20 0
25         30          35         40          45           50         55         60          65          70
Suhu/ Temperature (ºC)
Tri Panji et al.
pengaruhi  stabilitas  SOD,  semakin  jauh pH dari pH stabil, semakin turun aktivitas SOD  (Gambar  2).    Stabilitas  SOD  dari ekstrak  biomassa  hasil spray  drying relatif  tidak  berbeda  dalam  uji  secara kualitatif  dengan  ekstrak  biomassa  hasil oven  45 o C  (selama  24  jam).  Perubahan keasaman  dan  suhu  pada  lingkungan enzim dapat mengubah konformasi protein karena  berubahnya  susunan  asam-asam amino pembentuknya.

## Kofaktor logam SOD
Penetapan  kofaktor  logam  enzim SOD S.  platensis digunakan  untuk pencirian  sensitivitasnya.  Perbedaan  ko- faktor  logam  pada  enzim  ini  me- nyebabkan  perbedaan  aktivitas,  meskipun sama-sama  mampu  mengkatalisis  pe- mangsaan  radikal  bebas  pada  oksigen toksik.    Perbedaan  aktivitas  ini  dapat berupa sensitivitas terhadap KCN (Fe, Mn tidak  sensitif,  sementara  Cu,  Zn  sensitif KCN),  atau  dapat  pula  menjadi  faktor bekerja  atau  tidaknya  enzim  ini  bila menggantikan  fungsi  SOD  yang  secara alami  mempunyai  kofaktor  logam  yang berbeda.
Ekstrak  SOD S.  platensis murni  hasil kromatografi  kolom  menunjukkan  bahwa 55%  kofaktor  logamnya  berupa  Zn,  30% Mn,  dan  15%  Fe,  sedangkan  Cu  tidak terdeteksi  (Tabel  2).    Jenis  enzim  SOD S. platensis termasuk yang kurang sensitif KCN  (Elstner et  al. ,  1987),  karena  Cu tidak ada atau sedikit sekali, meskipun Zn mendominasi.    Perbandingan  Mn  dan  Fe dalam  kofaktor  logam  enzim  SOD  cukup besar meskipun kalah dengan Zn, sehingga  sifat  kurang  sensitifnya  lebih mendominasi.  Tahapan berikutnya adalah penggunaan SDS-PAGE untuk pemisahan pita  protein  BM  tinggi  dan  yang  lebih rendah, sehingga kemudian dapat
dianalisis  logam  kofaktor  dan  dapat diketahui  perbedaan  kofaktor  pada  sub- sub unit SOD.
Pada  sub  unit  SOD  dengan  bobot molekul  77,78  kDa  mengandung  Zn sampai 72 % dari total logam yang ada, Fe 25%,  sedangkan  Mn  dan  Cu  masing- masing hanya 2% dan 1%.  Sub unit SOD yang  berbobot  molekul  71,738  kDa mengandung  Zn  55%,  Mn  31%,  Fe  14%, sedangkan  Cu  hanya  4%.    Kofaktor  Cu pada  SDS-PAGE  muncul  sampai  4%, sementara  dalam  ekstrak  SOD  dari kromatografi  kolom  tidak  terdeteksi.    Hal ini  dapat  disebabkan  oleh  tingginya konsentrasi  SOD  yang  ada  pada  SDS- PAGE,  setelah  dibebaskan  dari  pelarut buffer  fosfat  dan  air.    Komposisi  yang berbeda  antara  masing-masing  sub  unit dan  bobot  molekul  yang  tidak  sama  antar subunit,  dapat  diperkirakan  bahwa  SOD S.  platensis merupakan  SOD  gabungan dua  subunit  dengan  bobot  molekul  total sekitar 149,52 kDa.
Komposisi asam amino SOD S. platensis
Enzim  SOD  murni  dalam  fase kromatografi kolom mempunyai  sembilan macam  asam  amino  esensial  yang  dapat ditentukan  komposisinya  menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) (Tabel 3).  Fraksi yang murni mempunyai kadar  tirosin  dan  lisin  yang  tinggi  (163 µmol/ml  atau  14,64%  dari  total  asam amino  yang  terdeteksi).    Asam  amino serin,  glisin,  alanin,  prolin,  metionin, sistein,  isoleusin  dan  fenilalanin  tidak terdeteksi.  Komposisi  asam  amino  ini dapat  berbeda  dengan  perbedaan  sumber SOD  maupun  asupan  yang  diterima  oleh sumber, karena asam amino yang terbentuk  di  dalam  sel  hidup  sesuai dengan  nutrien  yang  terdapat  pada  sel tersebut.
Produksi, isolasi dan karakterisasi superoksida dismutase dari Spirulina platensis ….
Tabel 2. Konsentrasi logam pada subunit SOD dan total enzim.
Table 2. Metal concentration on SOD subunits and total enzyme.
Tabel 3. Komposisi asam amino SOD S. platensis Table 3. Amino acid composition of S. platensis SOD BM subunit Subunit MW Logam Metal Kadar (ppm) Content (ppm) % Kofaktor logam % Metal cofactor Mn 0,05 1,5 Cu 0,03 0,9 Fe 0,84 25,3 77,780 kDa Zn 2,40 72,2 Mn 2,00 31,4 Cu 0,26 4,1 Fe 0,92 14,4 71,738 kDa Zn 3,20 50,2 Mn 3,40 29,0 Cu 0,18 2,0 Fe 1,66 14,5 Total ekstrak enzim murni Zn 5,33 54,5
Kadar ( Content ),   µmol/mL Asam amino ( Amino acid ) Fraksi ( fraction ) 7 Fraksi ( fraction ) 6 Asam aspartat ( Aspartic acid ) 0,124 0,107 Asam glutamat ( Glutamic acid ) 0,102 0,079 Serin ( Serine ) - - Glisin ( Glycine ) - - Histidin ( Histidine ) 0,079 0,063 Arginin ( Arginine ) 0,096 0,038 Threonin ( Threonine ) 0,076 0,042 Alanin ( Alanine ) - - Prolin ( Proline ) - - Tirosin ( Tyrosine ) 0,140 0,069 Valin ( Valine ) 0,117 0,111 Metionin ( Methionine ) - - Sistein ( Cysteine ) - - Isoleusin ( Isoleucine ) 0,083 0,073 Leusin ( Leucine ) - - Fenilalanin ( Phenylalanine ) - - Lisin ( Lysine ) 0,140 0,114
Tri Panji et al.

## Kesimpulan
Biomassa S. platensis hasil pembiakan dalam serum lateks merupakan penghasil  potensial  enzim  SOD.    SOD dapat  diisolasi  dengan  cara  ekstraksi menggunakan  bufer  fosfat  pH  7,8, pengendapan
bertingkat dengan ammonium  sulfat  40-80%,  diikuti  dengan dialisis  dan  pemurnian  dengan  kroma- tografi kolom Sephadex G-200.
Kemurnian  SOD  hasil  isolasi  dapat diketahui dengan uji aktivitas dan elektro- foresis  SDS-PAGE.  SOD S.  platensis tersusun  atas  sembilan  jenis  asam  amino dengan komponen utama tirosin dan lisin. SOD  memiliki  bobot  molekul  total 149,52  kDa,  dengan  subunit  77,78  dan 71,7  kDa.  Logam  yang  dominan  pada SOD adalah Zn, disusul kemudian Fe dan Mn. Kofaktor subunit besar terdiri dari  Zn 72%,  Fe  25%,  Mn  2%,  dan  Cu  1%, berbeda  dengan  subunit  kecil  yang mengandung  Zn  55%,  Mn  31%,  Fe  14%, dan    Cu  4%.  Stabilitas  SOD S.  platensis dicapai  pada  pH  7,5  dan  suhu  di  bawah 25 o C.  Radiasi  matahari  berlebih  dapat menyebabkan  denaturasi  SOD  sehingga bobot molekul subunit-nya dapat mencapai 19,2 kDa.

## Daftar Pustaka
AOAC  (Association  of  Official  Analytical Chemist)  (1984). Official  methods  of analysis  of  the  Association  of  Official Analytical  Chemists  14th  ed .  Arlington, VA 22209 USA
Aiba,  S.  &  T.  Ogawa  (1977).  Assesment  of growth  yield  of  a  blue  green  algae Spirulina  platensis in  axenic  and continuous  culture. J.  Gen.  Microbiol ., 102, 179-182.
Arad,  S  (1988).  Production  of  biochemicals from red microalgae. In Proceedings of Aquaculture  International  Congress  and Exposition. September 6-9, 1988.
Vancouver,  British  Columbia  Pavilion Coporation.
Belay, A (1997). Mass culture of Spirulina out doors. The earthrise farms experience In Vonshak,  A.    (Ed.).  Spirulina  platensis (Arthrospira) , Physiology,  Cell-biology and  Biotechnology .  London,Taylor  & Francis Ltd., 131-158.
Bergmeyer,  H.U.,  J.  Bergmeyer  &  M.  Gral. (Eds.)  (1988). Methods  of  Enzymatic Analysis . Vol. III, VCH Verlagsgesellschaft  mbH,  Weinheim
(Fed. Rep. Germany), p 293-302.
Beyer,  W.  F.,  Fridovich,  I.    Mullenbach  G.  & Hallewell.  R.A  (1987).    Examination  of the  role  of  arginine-143  in  the  human copper and zinc superoxide dismutase by site-specific mutagenesis. J. Biol. Chem. 262, 1182-11187.
Chen, F & Y. Zhang (1997). High cell density mixotrophic culture of Spirulina platensis on  glucosa  for  phycocyanin production  using  a  fed-bacth  system.
J.  Enzyme  &  Microbol.  Technol., 20 ,
221-224.
Ciferi,  O  (1983). Spirulina ,  the  edible microorganism. Microbiol.    Rev., 47 , 551-578.
Cohen, Z., A. Vonshak & A. Richmond (1987).
Fatty  acid  composition  of Spirulina strain grown under various environmental  conditions. Phytochem .
26 , 255-2258.
Elstner,  E.  F.,  R.  J.  Youngman,  W.  Oswald (1987). Superoxide dismutase. In; Bergmeyer, J & Mariannegrabl. Methods of  Enzimatic  Analysis.  Vol.  3  Enzyme Oxydoreductases, Transferases. Weinheim, Federal Republic of Germany: VCH.
Produksi, isolasi dan karakterisasi superoksida dismutase dari Spirulina platensis ….
Glick, B.K. & J. Pasternak (1994). Molecular Biotechnology .    Washington  D.C.,  ASM Press.
Kaminaka,  H.,  S.  Morita,  M.  Tokumoto, H.  Yokoyama,  T.  Masumora  &  K. Tanaka  (1999).  Molecular  cloning  and characterization  of  a  cDNA  for  an  iron- superoxide  dismutase  in  rice  ( Oryza sativa L .).  Biosci. Biotechnol. Biochem . 63 (2), 302-308.
Kim,  Y.T,    S.J.  Park  &  S.K.  Kim  (1998). Purification  and  characterization  of  Cu, Zn  superoxide  dismutase  from  ark  shell
Scapharca broughtonii . Biosci.
Biotechnol.  Biochem ., 62 (11),  2211- 2216.
Krutika,  D  &  S.  Subramanian  (2007). Purification  and  biochemical  charac- teriation of a superoxide dismutase from the  soluble  fraction  of  the  cyono- bacterium,  Spirulina  platensis. World  J Microbiol.  Biotechnol ., 23 (12),  1661- 1666.
Lumsden,  J.,  R.  Cammack  &  O.H  David (1976). Purification and physicochemical properties  of  superoxide  dismutase  from two photosynthetic microorganisms. Biochem. Biophys. Acta, 438 , 380-392.
Madhavi  DL,  S.S.  Desphandee  &  D.K. Salunkhe  (1996). Food  Antioxidant . New York, Marcell Dekker.
Marquez,  F.J.,  K.  Sasaki,  T.  Kakizono, N.  Nishio  &  S.  Nagai  (1993).  Growth characteristic  of Spirulina  platensis in mixotrophic and heterotrophic condition. J. Ferment. Bioeng ., 76 (5), 408-410.
Mateles,  R.I.  &  S.R.  Tanennbaum  (1968). Single  Cell  Proteins .  Massachussetts, MIT Press.
Richmond, A. (1987). Spirulina . In; Borowitzka,  M.A.  &  L.J.  Borowitzka.
1988.  (Ed). Microalgae  Biotecnology. England, Cambridge University Press, p. 85-122.
Singh,  G.,  R.M.  Kotharri,  R.K.  Sharma  & V. Ramamurthy (1995). Enhancement of Spirulina  platensis productivity  by  a protein    hidrolysate. Appl.  Biochem. Biotech., 50 , 285-290.
Sigma  Chemical  Company  (2005) .  Sigma Catalog . Sigma, USA
Tri-Panji  &  Suharyanto  (1993).  Ganggang mikro Spirulina platensis untuk pengolahan  limbah  lateks  pekat. Warta Pusat Penelitian Bioteknologi Perkebunan , 1, 28-29. Tri-Panji,  Suharyanto  &    Y.  Away  (1994). Produksi protein sel tunggal
menggunakan  limbah  lateks  pekat. Menara Perkebunan, 62 (2), 36-40.
Tri-Panji,  S.  Achmadi  &  E.  Tjahjadarmawan
(1996).  Produksi  asam  gammalinolenat dari  ganggang  mikro Spirulina  platensis menggunakan  limbah  lateks  pekat. Menara Perkebunan , 64 (1), 34-44.
Tri-Panji  &  Suharyanto  (2000).  Optimization media from low-cost nutrient sources for growing Spirulina platensis and carotenoid production. Menara Perkebunan, 68 (1), 64-44.
Tri-Panji,  M.  Wijayanti,  Suharyanto  &  M. Bintang (2005). Optimasi media tumbuh untuk  peningkatan  aktivitas  dan  isolasi enzim superoksida dismutase dari biomassa Spirulina  platensis . J.  Mikrob. Ind., 10 (1), 37-41.
Vila,  J.,  C.  Gemma,  A.  Bachstetter,  Y.  Wang, I.  Stromberg  &  P.C.  Bickford  (2004).
Spirulina,  aging,  and  neurobiolo gy. Neurobiology of Aging, 25 (3), 313-324.