1 Validasi Metode Analisis Β-Karoten
Siti Fatmawati, dkk

## VALIDASI METODE ANALISIS β-KAROTEN DALAM EKSTRAK
ETANOL 96% Spirulina maxima
DENGAN

## SPEKTROFOTOMETRI VISIBEL

## ANALYTICAL METHOD VALIDATION OF β-CAROTENE ON
Spirulina maxima 96% ETHANOLIC EXTRACT WITH

## SPECTROPHOTOMETRY VISIBLE
Siti Fatmawati Fatimah*, Vani Aisyah, Laela Hayu Nurani, Citra Ariyani Edityaningrum,
Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta *Penulis korespondensi : fatmafatima28@gmail.com

## ABSTRAK
Validasi  metode  analisis  (VMA)  penentuan  kandungan  β-karoten  dalam Spirulina maxima perlu  dilakukan  agar  didapatkan  hasil  yang  valid  dan  dapat  dipertanggung jawabkan  secara  ilmiah.  Tujuan  penelitian  adalah  membuktikan  metode  analisis penetapan  kadar  β-karoten  dalam  ekstrak  etanol  96% Spirulina  maxima menggunakan spektrofotometer  visibel  memenuhi  syarat  validitas.  Parameter  yang  digunakan  dalam VMA  diantaranya  spesifisitas,  linieritas,  akurasi,  presisi,  limit  deteksi  dan  limit kuantitas.  Syarat  yang  harus  dipenuhi  ditiap  parameter  yaitu  nilai  korelasi  (r)  ≥  0,98 untuk linieritas, persen perolehan kembali masuk dalam range 98-102% dan nilai RSD ≤ 2% untuk akurasi, nilai RSD ≤ 2% untuk presisi, profil spektragram spektrofotometri visibel  yang  sama  antara  sampel  dan  standar  untuk  uji  spesifisitas.  Hasil  penelitian dengan parameter validasi diantaranya linieritas dengan nilai r=0,998, persen perolehan kembali  dalam  rentang  98-101%,  presisi  keberulangan  sistem  dengan  RSD  1,14  %, presisi  antara  0,99  %  dan  uji  spesifisitas  sesuai  profil  spektragram  spektrofotometri visibel  yang  sama  antara  sampel  dan  standar.  Nilai  LOD  yang  diperoleh  yaitu  1,656 ug/mL  dan  LOQ  5,017  ug/mL.  Berdasarkan  hasil  tersebut  maka  analisis  penetapan kadar  β-karoten  dalam  ekstrak  etanol  96% Spirulina  maxima dengan  metode spektrofotometri  visibel  memenuhi  syarat  validitas  menurut  Petunjuk  Operasional Penerapan CPOB tahun 2013.
Kata  kunci : Spirulina  maxima , β-karoten, validasi  metode analisis,  spektrofotometri visibel.

## ABSTRACT
Analytical validation methods of β-carotene content determination on Spirulina maxima has  to  be  done  so  that  the  obtained  results  are  valid  and  can  be  accountable scientifically. The purpose of the research was to prove the validity of analytical method to determine the β-carotene content on 96% ethanol extract of Spirulina maxima using a  spectrophotometer  visible.  The  parameters  were  in  linearity,  specificity,  accuracy, precision,  limit  of  detection  and  limit  of  quantity.  The  requirement  must  be  met, correlation (r)  value ≥  0.98 percent  for  linearity, range of  percent  recovery about 98- 102%,  accuracy  value  at  ≤  2%,  precision  value  at  ≤  2%,  same  spectrogram  profile between  samples  and  standards  to  test  the  specificity.  Research  results  were  r=  0.998 for  linierity,  98-101%  for  percent  recovery  range,  precision  value  at  1.144%, intermediate precision at 0.987% and match spectrogram profile between samples and standards  for  spesifity.  LOD  values  obtained  i.e.  1.656  ug/mL  and  LOQ  5.017  ug/mL. Based  on  the  results,  the  analytical  method  of  β-carotene  determination  on  Spirulina maxima 96% ethanol extract with spectrophotometry visible method were qualify base on Petunjuk Operasional Penerapan CPOB tahun 2013.
Keyword :  Spirulina  maxima,  β-carotene,  validity  of  analytical  method, spectrophotometry visible

## PENDAHULUAN
WHO  melaporkan  lebih  dari  tiga  juta  anak  balita  meninggal  akibat  malnutrisi tiap tahunnya dengan resiko 13 kali lebih besar dibandingkan anak yang normal. Akibat jangka  panjang  menyebabkan  perkembangan  mental  dan  pertumbuhan  otak  terganggu secara irreversible .  Malnutrisi  juga  dapat  terjadi  akibat  efek  samping  terapi  pasien kanker  yaitu  penurunan  nafsu  makan,  rasa  mual  dan  muntah. Food  Drug  Association (FDA) mengakui malnutrisi dapat menggunakan Spirulina dengan kandungan β karoten yang  tinggi  (10  mg  tiap  3  gram  bubuk  spirulina)  serta  vitamin  A  (Lorenz,  2002).  β- karoten  dalam Spirulina  maxima dapat  dikonversi  menjadi  vitamin  A  yang  berfungsi untuk  menjaga pertumbuhan jaringan epitel, mata, rambut dan tulang (Kamiensky dan Keogh,  2006).  Berbagai  macam  manfaat  β-karoten  yang  dapat  ditemukan  dalam Spirulina  maxima sehingga  perlu  dilakukan  analisis  kandungan  β-karoten  dengan menggunakan metode yang tepat.
Metode analisis yang digunakan untuk menetapkan kadar β–karoten telah banyak dilakukan  seperti  KLT  densitometri  (Starek et  al. ,  2014)  dan  HPLC  (Luterotti et  al. , 2013)  namun  belum  dilakukan  pada  sampel Spirulina  maxima .  Selain  dengan menggunakan  metode  KLT  densitometri  dan  HPLC,  analisis  senyawa  β–karoten  di dalam Spirulina  maxima dapat  dilakukan  dengan  metode  spektrofotometri  visibel karena  β-karoten  memiliki  gugus  kromofor  di  dalam  rumus  strukturnya  yang
3 Validasi Metode Analisis Β-Karoten
Siti Fatmawati, dkk
merupakan  syarat  suatu  senyawa  dapat  dianalisis  dengan  metode  spektrofotometri visibel (Harmita, 2006).
Senyawa β-karoten di dalam Spirulina maxima dapat  dianalisis dengan metode spektrofotometri  visibel  apabila  metode  tersebut  telah  dilakukan  validasi  metode analisis  (VMA)  dengan  parameter  spesifisitas,  linieritas,  akurasi,  presisi,  limit  deteksi dan limit kuantitas. VMA senyawa β-karoten di dalam ekstrak etanol Spirulina maxima perlu  dilakukan  agar  diperoleh  metode  analisis  yang  valid,  akurat,  tepat,  cermat  dan dapat  dipertanggungjawabkan  secara  ilmiah  sehingga  nantinya  dapat  digunakan  untuk menetapkan  kadar  zat  aktif  β-karoten  sebagai  syarat  untuk  memperoleh  bahan  baku simplisia yang berkualitas, aman, dan berkhasiat secara farmakologis.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah timbangan neraca (AND GR 202), alat gelas, corong dan labu takar 5 dan 10 mL class A (Iwaki Pyrex), mikropipet 10-100 µL dan 100-100 µL (Socorex), kertas saring, alat vortek, sentrifuge , rotary evaporator (Büchi), corong, kuvet  kuarsa  (Hellma)  dan instrumen  spektrofotometer  UV-1800  SHIMADZU.  Bahan yang   digunakan  dalam   penelitian   adalah   standar   β-karoten (Calbiochem), aseton absolut  pro  analisis  (Merck),  etanol  96%  (Brataco),  ekstrak  etanol  96% Spirulina maxima.

## Jalannya Penelitian
Pembuatan Larutan Induk
Sepuluh miligram standar β-karoten ditimbang dan dipindahkan ke labu takar 10 mL.  Aseton  absolut  pro  analisis  ditambahkan  kedalam  labu  takar  sampai  batas  10  mL sehingga diperoleh kadar 0,994 mg/mL larutan (Biswas et al , 2011).
Pembuatan Kurva Baku
Enam  seri  kadar  dari  larutan  induk  seperti  terlihat  pada  Tabel  I  diencerkan dengan  pelarut  aseton  hingga  tanda  5  mL  kemudian  dibaca  serapannya  dengan spektrofotometer  visibel  pada  panjang  gelombang  maksimal  dan  waktu  yang  sesuai dengan operating time . Kemudian ditentukan persamaan regresi liniernya (Octaviani et al , 2014).
Media Farmasi V ol. 15 No.1 Maret 2018 : 1-13 4

## Tabel I. Konsentrasi Kurva Baku β-karoten
Volume larutan induk (µL) 70 80 90 100 110 120 Konsentrasi (µg/mL) 13,916 15,904 17,892 19,880 21,868 23,856

## Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Larutan  induk  dipipet  sebanyak  100  µL  dimasukkan  ke  dalam  labu  takar  5  mL dan  ditambahkan  pelarut  aseton  p.a  sampai  tanda  5  mL.  Larutan  dibaca  serapannya pada panjang gelombang 350 – 550 nm. Panjang gelombang yang dipilih berdasarkan nilai absorbansi maksimal (Octaviani et al , 2014).

## Penetapan Operating Time
Larutan  induk  dipipet  sebanyak  100  µL  dimasukkan  ke  dalam  labu  takar  5  mL dan ditambahkan pelarut aseton p.a sampai tanda 5 mL. Larutan dibaca serapannya pada λ maksimal, sampai diperoleh waktu serapan stabil (Octaviani et al , 2014).

## Uji Kesesuaian Sistem
Larutan  induk  dipipet  sebanyak  100  µL  dimasukkan  ke  dalam  labu  takar  5  mL dan  ditambahkan  pelarutan  aseton  p.a  sampai  tanda  5  mL.  Larutan  dibaca  serapannya sebanyak 6 kali berturut-turut dan dilihat % RSD ( Bahera et al , 2012).
Penetapan Kadar β-Karoten pada Sampel ( Spirulina maxima )
Ekstrak  etanol  96% Sprirulina  maxima ditimbang  10  mg  dimasukkan  kedalam labu takar 10 mL dan ditambahkan aseton p.a sampai tanda. Larutan divortek 10 menit kemudan  disentrifus  10  menit.  Bagian  supernatan  diambil,  disaring  dengan  kertas saring . Larutan  dibaca  pada  λ  maksimal  dan  sesuai operating  time .  Penetapan  kadar dilakukan replikasi sebanyak 3 kali (Biswas et al , 2011).
Validasi Metode Analisis
Spesifisitas
Ekstrak    etanol    96% Sprirulina    maxima ditimbang    sebanyak    10    mg dimasukkan  ke  dalam  labu  takar  10  mL  dan  ditambahkan  aseton  pro  analisis  sampai
5 Validasi Metode Analisis Β-Karoten Siti Fatmawati, dkk
tanda  10  mL.  Larutan  divortek  selama  10  menit  dan  selanjutnya  disentrifus  selama  10 menit.  Bagian  supernatan  diambil,  disaring  dengan  kertas  saring . Larutan  dibaca serapannya  pada  λ  maksimal.  Spektra  yang  dihasilkan  pada  sampel  dibandingkan dengan standar β-karoten ( Anonim, 2013 ).

## Linieritas
Lineritas  ditentukan  dengan  dibuat  enam  seri  kadar  dari  yang  dilarutkan  dalam labu  takar  5  mL.  Tiap  larutan  dibaca  serapannya  pada  λ  maksimal  dan  waktu  sesuai dengan operating time . Kemudian dihitung nilai korelasi (r) (Anonim, 2013) .

## Akurasi
Seri larutan induk β- karoten seperti tersaji pada Tabel II ditambahkan ke dalam 10 mg ekstrak etanol 96% Sprirulina maxima, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 10  mL.  Ditambahkan  aseton  p.a  sampai  tanda.  Larutan  divortek  10  menit  dan selanjutnya  disentrifus  10  menit.  Masing-masing  larutan  dibaca  pada  λ  maksimal  dan waktu yang sesuai dengan operating time, selanjutnya dihitung persen recovery dengan persamaan 1.
……………………..(1)
C F
: Konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pengukuran
C A : Konsentrasi sampel sebenarnya C *A : Konsentrasi analit yang ditambahkan
Tabel II. Seri larutan akurasi β-karoten
Seri larutan Persentase yang ditambahkan (%) Konsentrasi standar β-karoten yang ditambahkan (µg/mL) 1 40 6,518 2 30 4,889 3 20 3,259

## Presisi
Presisi keberulangan sistem ( Repeatability ) dilakukan dengan dipipet 100 µL dari larutan  induk  dimasukkan  ke  dalam  labu  takar  5  mL.  Ditambahkan  pelarut  aseton  p.a
Media Farmasi V ol. 15 No.1 Maret 2018 : 1-13 6
sampai  tanda.  Dilakukan 6  kali  pengulangan.  Larutan  dibaca serapannya  dengan spektrofotometer visibel pada λ maksimal dan pada operating time .
Presisi antara dilakukan oleh 2 operator berbeda, namun menggunakan instrumen dan  hari  yang  sama.  Uji  presisi  antara  dilakukan  dengan  cara  memipet 100  µL  dari larutan  induk,  dimasukkan  ke  dalam  labu  takar  5  mL  dan  ditambahkan  pelarut  aseton p.a  sampai  dengan 6  kali  pengulangan.  Larutan dibaca  serapannya  dengan spektrofotometer visibel pada λ maksimal dan pada operating time .
LOD ( Limit Of Detection ) dan LOQ ( Limit Of Quantification )
LOD  dan LOQ ditentukan  dengan  menggunakan  data standar deviasi (  ) dan slope (b) dari kurva baku yang diperoleh dengan persamaan  2 dan 3.
…………………..(2)
……………………(3).
Keterangan:   : Simpangan baku respon, S : Slope dari Kurva Kalibrasi

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Adanya ikatan ganda terkonjugasi dalam struktur β-karoten menandakan adanya gugus  kromofor  yang  menyebabkan  terbentuknya  warna  pada  senyawa  β-karoten (Sandmann,  1994).  Selain  itu,  struktur  β-karoten  juga  memiliki  spektrum  yang  khas yakni  antara  400-500  nm  dengan  dua  puncak  utama  di  sekitar  450  nm  sesuai  dengan pelarut yang digunakan dan biasanya ada dua puncak tambahan pada kedua sisi puncak utama  seperti  yang  terlihat  pada  gambar  2  (Gao  dan  Kispert,  2003).  Berdasarkan  hal tersebut  maka  penetapan  kadar  senyawa  β-karoten  dapat  dilakukan  menggunakan metode spektrofotometri visible.
Gambar 2. Spektra serapan β-Karoten (Kopczynski et al ,2007).
7 Validasi Metode Analisis Β-Karoten

## Siti Fatmawati, dkk
Upaya  mengevaluasi  suatu  metode  analisis,  menjamin  prosedur  analisis, menjamin keakuratan dan mengurangi resiko penyimpangan yang mungkin timbul saat analisis  β-karoten  dalam  sampel  ekstrak  etanol  96% Spirulina  maxima, maka  perlu dilakukan  validasi  metode  dengan  menggunakan  intrumen  spektrofotometer  visible. Pada upaya ini dibagi menjadi 2 tahap yaitu prevalidasi dan pelaksanaan VMA.
Prevalidasi

## Pembuatan Kurva Baku
Tujuan  pembuatan  kurva  baku  adalah mengetahui  hubungan  antara  konsentrasi larutan  dengan  nilai  absorbansinya.  Kurva  baku  yang  baik  memiliki  nilai  linieritas  r ≥ 0,98  (Anonim,  2013),.  Nilai  r  yang  memenuhi  syarat  menunjukkan  bahwa  dengan adanya perubahan  kadar  maka  akan  mempengaruhi  nilai  absorbansi  secara  linier Berdasarkan  Tabel  III  diperoleh persamaan  regresi  linier yaitu  y  =  0,0299x-0,0106 dengan  nilai  r=  0,993.  Berdasarkan  hal  tersebut  maka  hasil  kurva  baku  tersebut  dapat digunakan untuk penetapan kadar, uji akurasi, dan penentuan nilai LOD dan LOQ saat VMA.
Tabel III. Hasil pembacaan kurva baku standar β Karoten Konsentrasi (µg/mL) 13,916 15,904 17,892 19,880 21,868 23,856 Absorbansi 0,405 0,456 0,524 0,609 0,631 0,699

## Penentuan Panjang Gelombang
Menurut  Gandjar  dan  Rohman  (2007),  alasan  penentuan  panjang  gelombang dilakukan  yaitu  pada  panjang  gelombang  maksimal  akan  dihasilkan  kepekaan  yang maksimal,  di  sekitar panjang  gelombang maksimal  akan berlaku hukum  Lambert-Beer dan jika dilakukan pengukuran ulang maka kemungkinan kesalahan  yang terjadi kecil. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  panjang  gelombang  maksimal  dalam  pembacaan absorbansi  β-karoten  yaitu  454  nm  dengan  profil  memiliki  3  puncak  yang  merupakan ciri  khas  spektra  β-karoten  (Gambar  3).  Panjang  gelombang  maksimal  tersebut  sesuai dengan  penelitian  Hiyama  yang  menyatakan  panjang  gelombang  β-karoten  dalam aceton sebesar 454 nm (Hiyama et al, 1969).
Penetapan Operating Time
Tujuan  penentuan operating  time adalah  untuk  mengetahui  waktu  pembacaan serapan β- karoten yang stabil. Absorbansi yang stabil dihasilkan pada menit 3 sampai
Media Farmasi V ol. 15 No.1 Maret 2018 : 1-13 8
menit ke 30, sehingga operating time yang tepat dalam pelaksanaan VMA adalah 3-30 menit.
Gambar 3. Hasil pembacaan spectra β-karoten

## Uji Kesesuaian Sistem
Uji  kesesuaian  system  dilakukan  untuk  mengetahui  bahwa  alat  spektrofotometer visibel  yang  digunakan  dapat  berfungsi  dengan  baik  saat  digunakan  untuk  penetapan kadar. Uji tersebut dapat diterima apabila dalam pembacaan absorbansi secara berulang sebanyak 6 kali diperoleh RSD ≤ 2%  (Bahera et al, 2012). Berdasar tabel IV, nil ai RSD uji kesesuaian sistem adalah  0,82%. Hasil tersebut  menunjukkan  alat spektrofotometer visibel  yang  digunakan  untuk  analisis  memiliki  sistem  yang  stabil  dalam  pembacaan absorbansinya  sehingga  dapat  digunakan  dalam  VMA  β-karoten  dalam  ekstrak  etanol 96% S pirulina maxima .
Tabel IV. Uji kesesuaian sistem spektrofotometer visible Pengujian ke- 1 2 3 4 5 6 Absorbansi 0,618 0,606 0,607 0,614 0,609 0,605 Rata-rata  ± RSD 0,61 ± 0,82%

## Penentuan kadar
Hasil  penentuan  kadar β-karoten  pada  e kstrak  etanol  96% Spirulina  maxima digunakan  untuk  menentukan  nilai  persen  perolehan  kembali  atau recovery pada uji akurasi. Berdasar penelitian Thomas ( 2010), Spirulina maxima memiliki kandungan β- karoten  pada  rentang  150-250  mg dalam  100 gramnya.  Hasil  penentuan  kadar  berasal dari  nilai  absorbansi  sampel  yang  terlihat  pada  Tabel  V, yang  dihitung  sesuai  dengan persamaan kurva baku  y = 0,0299x-0,0106. Berdasarkan persamaan tersebut  diperoleh
9 Validasi Metode Analisis Β-Karoten Siti Fatmawati, dkk
kadar  rata-rata  β-  karoten  dalam  ekstrak  ethanol  96% Spirulina maxima sebanyak 162,963 mg dalam 100 gram ekstrak.
Tabel V. Penetapan kadar β–karoten ekstrak etanol 96% Spirulina maxima Absorbansi 0,474 0,475 0,481 Kadar β-karoten dalam sampel (mg/100 gram) 162,070 162,410 164,410 Rata-rata  ± RSD 162,963 ± 0,885 %

## Validasi Metode Analisis
Berdasarkan Petunjuk Operasional Penerapan CPOB tahun 2013, parameter yang dapat digunakan untuk melihat kevalidan suatu metode analisis diantaranya spesifisitas, linieritas, akurasi, presisi, LOD ( Limit Of Detection) dan LOQ ( Limit Of Quantitation ).

## Spesifisitas
Spesifitas  merupakan  kemampuan  metode  analisis  untuk  menguji  secara  tepat suatu analit dengan adanya komponen lain (Anonim 2014). Melalui λ maksimal 454 nm terdapat  respon  positif  adanya  senyawa β-  karoten  pada  larutan  standard  dan  larutan sampel  yang  di  dalamnya  terdapat  komponen  senyawa  lain  sehingga  dapat  digunakan untuk penetapan kadar β- karoten pada sampel.

## Linieritas
Uji  linieritas  dilakukan  untuk  melihat  absorbansi  yang  terukur,  sebanding terhadap kadar senyawa uji  secara linier (Anonim, 2013). Semakin linier maka kinerja metode  yang  digunakan  untuk  rentang  konsentrasi  yang  diukur  dalam  kondisi  sangat baik.  Sama  halnya  dengan  penentuan  kurva  baku,  nilai  uji  linieritas  yang  diharapkan adalah  r  ≥  0,98  (Anonim,  2013),  dengan  menggunakan  6  tingkat  konsentrasi  yang berbeda kemudian  dibaca  absorbansi  pada  panjang  gelombang  maksimal  454  nm. Berdasar  tabel  VI,  persamaan  regresi  linier  yang  dihasilkan  yaitu  y  =  0,031x-0,0345 dengan nilai r = 0,998.
Tabel VI. Linieritas standard β-karoten Konsentrasi (µg/mL) 13,916 15,904 17,892 19,880 21,868 23,856 Absorbansi 0,407 0,450 0,512 0,587 0,648 0,705

## Akurasi
Tabel VII. Akurasi penetapan kadar β-carotene
Absorbansi C F (µg/mL) C A (µg/mL) C *A (µg/mL) Recovery (%) RSD (%) 0,674 22,890 101,154 0,674 22,890 16,296 6,518 101,154 0,292 0,675 22,923 101,667 0,623 21,184 99,983 0,624 21,217 16,296 4,889 100,667 0,683 0,622 21,151 99,298 0,573 19,512 98,665 0,574 19,545 16,296 3,259 99,692 1,027 0,575 19,579 100,718 C F : Kadar β- karoten sampel + standar C A : Kadar β- karoten dalam sampel C *A : Konsentrasi Standar yang ditambahkan
dilakukan dengan metode yang sama secara berulang kali oleh analis yang sama pada  kondisi  sama  dan  dalam  interval  waktu  yang  pendek  (Riyanto,  2014).  Presisi antara  dilakukan  Akurasi  menunjukkan  derajat  kedekatan  hasil  analis  dengan  kadar analit  yang  sebenarnya.  Uji  tersebut  dilakukan  dengan  penambahan  sejumlah konsentrasi  standar  β-karoten  kedalam  sampel  ekstrak  etanol  96% Spirulina  maxima yang telah diketahui  kadarnya  (Tabel  VII) . Persen perolehan kembali  yang diharapkan adalah 98-102 % dan nilai RSDnya ≤ 2% (Anonim, 2013). Tabel VII menunjukkan nilai recovery berada  pada  rentang  98-101  %  dan  nilai  RSDnya  ≤  2%.  Hal  tersebut  berarti terdapat derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya.

## Presisi
Rohman  (2014)  menyatakan  pengujian  presisi  dilakukan  untuk  menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil yang diukur di bawah kondisi yang ditentukan. Semakin presisi  metode  analisis,  maka  simpangan  baku  (RSD)  yang  diperoleh  semakin  kecil.
11 Validasi Metode Analisis Β-Karoten

## Siti Fatmawati, dkk
Nilai simpangan baku  yang diharapkan adalah ≤ 2%. Presisi  dapat dinyatakan sebagai repeatability (keterulangan) dan ruggedness (presisi antara). Presisi keterulangan untuk melihat dampak keragaman dalam laboratorium sehinga dilakukan pada hari atau analis atau peralatan yang berbeda namun pada laboratoium yang sama (Anonim, 2014).
Tabel VIII. Hasil uji ripitabilitas Pengujian ke- 1 2 3 4 5 6 Absorbansi 0,612 0,612 0,605 0,617 0,620 0,603
Rata-rata  ± RSD
0,612 ± 1,079 %
Presisi  keberulangan  sistem  dilakukan  dengan  membuat  6  larutan  dengan konsentrasi  yang  sama  dan  kemudian  dilakukan  pembacaan  absorbansi  seperti  pada tabel  VIII.  RSD  1,144%  menunjukkan  metode  spektrofotometri  visible  memiliki keseragaman nilai yang tinggi.
Tabel IX. Hasil uji presisi antara
Pengujian ke- Absorbansi operator A Absorbansi operator B 1 0,610 0,612 2 0,612 0,600 3 0,609 0,623 4 0,608 0,602 5 0,612 0,602 6 0,602 0,608 X±RSD 0,608±0,987%
Presisi  antara  dilakukan  pada  hari  dan  alat  yang  sama,  namun  dengan  operator yang  berbeda  dengan  hasil  pada  Tabel  IX.  RSD    0,987%  menunjukkan  metode  yang digunakan  dalam  kondisi  valid  karena  keseragaman  data  yang  dihasilkan  tinggi meskipun terdapat keragaman kondisi laboratorium.
LOD ( Limit of Detection )
LOD merupakan  konsentrasi  terendah  dalam  analit  yang  dapat  dideteksi  namun tidak perlu  terkuantisasi  di  bawah  kondisi    pengujian  yang  disepakati    (Kantasubrata, 2008). LOD dapat berfungsi sebagai parameter untuk melihat sensitivitas suatu metode analisis (Gandjar dan Rohman, 2007). Nilai LOD dapat dihitung dari persamaan regresi
linier  kurva  baku  y  =  0,0299x-0,0106 dengan simpangan  baku  (σ)  0,015  dan slope (s) 0,0299.  Berdasarkan  data  tersebut,  diperoleh  LOD  1,656    ug/mL  yang  berarti  bahwa konsentrasi  tersebut  merupakan  konsentarsi  terendah  β-karoten yang dapat diperoleh tanpa terkuantitas secara tepat.
LOQ ( Limit of Quantitation )
LOQ  merupakan  nilai  kuantitas  terkecil  analit  dalam  sampel  yang  masih memenuhi kriteria cermat (Riyanto,2014). Seperti nilai LOD, nilai LOQ dapat  dihitung dari  persamaan  regresi  linier  kurva  baku  y  =  0,0299x-0,0106 dengan simpangan  baku (σ)  0,015  dan slope (s)  0,0299.  Berdasarkan  data  tersebut  diperoleh  batas  kuantitas sebesar  5,017  ug/mL  yang  berarti  bahwa  konsentrasi  terendah  β-karoten  yang  dapat diperoleh dengan terkuantitas secara tepat adalah 5,017 ug/mL.

## KESIMPULAN
Hasil parameter validasi metode analisis yang telah dilakukan yaitu uji spesifisitas memenuhi  syarat,  uji  linieritas  dengan  harga  r=0,998,  presisi  keberulangan  sistem RSD=1,144 % dan presisi antara RSD=0,987%, akurasi persen perolehan kembali pada rentang 98-101 %, LOD dengan hasil 1,656 ug/mL dan LOQ dengan hasil 5,017 ug/mL. Berdasarkan  Petunjuk  Operasional  Penerapan  CPOB  tahun  2013,  analisis  β  karoten dalam ekstrak etanol 96% Spirulina maxima dengan spektrofotometri visibel memenuhi syarat validitas.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim,  2013, Petunjuk  Operasional  Penerapan  CPOB ,  603-623,  Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta
Anonim, 2014, Farmakope Indonesia Edisi V, Departemen Kesehatan RA: Jakarta Bahera,  S.,  Ghanty,  S.,  Ahmad,  F.,  Santra,  S.,  Banerjee,  S.,  2012,  UV-Visible Spectrophotometric  Method  Development  and  Validation  of  Assay  of Paracetamol Tablet Formulation, Analytical & Bioanalytical Techniques , 3(6): 1-6 Biswas,A.K.,  Chalti,  M.K.,  Sahoo,  J.,  2011,  A  simple  UV-Vis  spectrophotometric method  for  determination  β-carotene  content  in  raw  carrot,  sweet  potato  and supplemented chicken meat nuggets, Elsevier Food Science and Technology , 44: 1809-1811
Gandjar,  I.G.,  dan  Rohman,  A.,  2007, Kimia  Farmasi  Analisis ,  245-255,  Pustaka Pelajar, Yogyakarta
13 Validasi Metode Analisis Β-Karoten
Siti Fatmawati, dkk
Gao,Y., dan Kispert,L.D., 2003, Reaction of carotenoids and ferric chloride: equilibria, isomerization, and products, J. Phys Chem, 107: 5333 – 5338 Harmita, 2006, Buku Ajar Analisis Fisikokimia, 31-35, Departemen Farmasi FMIPA UI,
Depok
Hiyama, T., Nishimura,  M.,  Chance, B.,1969, Determination of carotenes by  thinlayer chromatography , Biochem , 29: 339-342
Kamiensky,M.,  dan  Keogh,J.,  2006, Vitamin  and  Minerals, 137-140,  Mc.GrawHill Companies Inc, US
Kantasubrata, J., 2008, Validation Metode, 117-135, Pusat Penelitian LIPI, Bandung Kopczynski, M., Ehlers, F., Lenzer, F., Oum, K., 2007, Evidence for an intramolecular charge transfer state in 12 '-apo-beta-caroten-12 '-al and 8 'apo-beta-caroten-8 '-al:
Influence of solvent polarity and temperature, J. Phys. Chem, 111: 5370-5381
Lorenz, R., T., 2002, Spirulina Microalgae, Cyanotech Corporation: USA.
Luterotti, S., Markovic, K., Franko, M., Bicanic, D., Madzgalj, A., 2013, Comparison of spectrophotometric and HPLC methods for determination of carotenoids in foods, Elsevier, 140 : 390-396
Octaviani,  T.,  Guntarti,  A.,  Susanti,H.,  2014,  Penetapan  Kadar  β-Karoten  pada Beberapa  Jenis  Cabe  (Genus  Capsicum)  dengan  Metode  Spektrofotometri Tampak, Pharmaciana, 4(2): 101-108
Riyanto,  2014,  Validation  dan  verifikasi  metode  uji  sesuai  dengan  ISO/IEC  17025 Laboratorium Pengujian dan Kalibrasi, 21-71, Deepublish, Yogyakarta
Rohman,  A.,  2014, Validasi  dan  Penjaminan  Mutu  Metode  Analisis  Kimia ,  96-107, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta
Sandmann,  G.,  1994,  Carotenoid  biosynthesis  in  microorganisms  and  plants ,  Eur  J Biochem ,1994: 978
Starek, M., Guja, A., Dabrowska, M., Krzek, J., 2014, Assay of β-Carotene in Dietary Supplement and Fruit Juices by TLC-Densitometry, Springer, 8 : 1347-1353 Thomas,  S,S.,  2010. The  role  of  parry  organic  spirulina  in  health  management, 23, Parry Nutraceuticals, Division of EID Parry (India) Ltd, India