BioEksakta: Jurnal Ilmiah Biologi Unsoed Volume 5, Nomor 4 (2023): 235-244 E-ISSN: 2714-8564

## Karakterisasi dan Pengaruh Senyawa Antibakteri Streptomyces spp. dalam Menghambat Pertumbuhan Vibrio cholerae
Ajeng Putri Retno Andani, Oedjijono * , Dini Ryandini
Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman, Jl. dr. Suparno 63 Purwokerto 53122 *Correspondent email : oedjijono@unsoed.ac.id
Rekam Jejak Artikel:
Diterima  : 15/08/2022 Disetujui  : 02/12/2023

## Abstract
Streptomyces is a microorganism that is often used in making various types of antibiotics which have the ability to inhibit the growth of several types of bacteria. This study aimed to determine the ability of Streptomyces spp. isolated from mangrove sediments in inhibiting the growth of Vibrio  cholerae ,  to  know  the  inhibitory  activity  of  antibacterial  compounds  produced  by Streptomyces spp.  against V.  cholerae ,  and  to  know  the  characteristics  of  antibacterial compounds  produced  by Streptomyces spp.The  research  stages  included  the  screening  of Streptomyces spp. isolates (SA34, SA37, SA40, SAE4034) against V. cholerae , production of antibacterial  compounds,  test  of  antibacterial  inhibitory  activity  using  Kirby  Bauer  method, determination  of  MIC  value  (%),  separation  of  antibacterial  compounds  by  TLC  and phytochemical methods, bioautography test, treatment of varies temperature (40 o C, 60 o C. 80 o C, 100 o C)  and  pH  (2,  4,  6,  9)  over  antibacterial  compound  activity,  and  confirmation  tests  of bacterial characteristics. Data were analyzed descriptively. The screening result showed that the highest inhibition toward the growth of V. cholerae was shown by Streptomyces sp. SAE4034. The crude extract was able to inhibit V. cholerae with an inhibitory zone diameter of 11.5-17.5 mm,  MIC  value  of  30%,  and  produced  compounds  with  R f values  ranging  from  0.31-0.70. Antibacterial compound of Streptomyces sp. SAE4034 which was able to inhibit the growth of V. cholerae bacteria had a R f value of 0.43 and the compound belonged to the alkaloid group. A treatment using temperature 40 o C still produced high inhibition with an inhibition zone of 14 mm  and  its  inhibitory  activity  decreased  with  higher  temperature  treatment  up  to  100 o C. Likewise  with  the  pH treatment, the  highest  inhibitory  activity  was  obtained  at  pH  6  with  an inhibition  zone  of  16  mm,  while  at  pH  2,  4,  and  9  the  antibacterial  activity  of  the  extract decreased Key Words : antibacterial, pH, Streptomyces, temperature, V. cholerae .

## Abstrak
Streptomyces merupakan mikroorganisme yang sering dimanfaatkan dalam pembuatan berbagai jenis  antibiotik  yang  memiliki  kemampuan  menghambat  pertumbuhan  beberapa  jenis  bakteri. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  kemampuan Streptomyces spp.  yang  diisolasi  dari sedimen  mangrove  dalam  menghambat  pertumbuhan  bakteri Vibrio cholerae , mengetahui kekuatan senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh Streptomyces spp. terhadap V. cholerae , dan mengetahui karakteristik dari senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh Streptomyces spp. Tahap penelitian  meliputi  penapisan  isolat  bakteri Streptomyces spp.  (SA34,  SA37,  SA40,  SAE4034) yang  menghambat V.  cholerae ,  produksi  senyawa  antibakteri,  uji  aktivitas  antibakteri  dengan metode Kirby Bauer ,  penentuan  nilai  MIC (%),  pemisahan  senyawa  antibakteri  dengan  metode TLC,  uji  fitokimia,  uji  bioautografi,  uji  aktivitas  senyawa  antibakteri  pada  variasi  suhu  (40 o C, 60 o C. 80 o C, 100 o C) dan pH (2, 4, 6, 9), serta uji konfirmasi karakter bakteri. Data dianalisis secara deskriptif. Hasil penapisan menunjukkan bahwa penghambatan terhadap pertumbuhan V. cholerae tertinggi ditunjukkan oleh isolat SAE4034. Ekstrak kasar mampu menghambat V . cholerae dengan diameter zona hambat 11,5-17,5 mm; nilai MIC 30%, dan menghasilkan senyawa bioaktif dengan nilai R f berkisar antara 0,31-0,70. Senyawa yang mampu menghambat memiliki nilai R f 0,43 dan senyawa  tersebut  termasuk  golongan  alkaloid.  Perlakuan  suhu  40 o C  tetap  tinggi  dengan  zona hambat 14 mm dan aktivitas penghambatannya menurun sejalan dengan perlakuan suhu yang lebih tinggi sampai 100 o C. Perlakuan pH 6 menunjukkan  aktivitas penghambatan tertinggi dengan zona hambat 16 mm, sebaliknya pada pH 2, 4, dan 9 aktivitas antibakteri ekstrak kasar menurun. Kata kunci: antibakteri , pH, Streptomyces, suhu , V . cholerae

## PENDAHULUAN
Streptomyces  adalah  mikroba  yang  banyak digunakan  untuk  memproduksi  berbagai  antibiotik. Lebih dari 22.000 senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan  oleh  mikroba,  sekitar  70%  di  antaranya
diproduksi  oleh  aktinomisetes,  20%  oleh  fungi,  7% Bacillus spp.  dan  1–2%  oleh  bakteri  lainnya. Kelompok Streptomyces merupakan kelompok yang penting karena lebih dari 10.000 antibiotik yang telah ditemukan  saat  ini,  50–55%  diproduksi  oleh  marga
tersebut  (Subramani  &  Aalbersberg,  2012).  Salah satu  lingkungan  non-terestrial  sebagai  sasaran eksplorasi  aktinomisetes  adalah  ekosistem  hutan bakau,  seperti  kawasan  mangrove  Segara  Anakan Cilacap,  Jawa  Tengah  (Akbar et  al .,  2017).  Isolat Streptomyces spp.  yang  telah  diisolasi  dari  tanah rizosfer  mangrove  Segara  Anakan  terbukti  mampu menghambat  pertumbuhan  beberapa  bakteri  dan fungi  patogen  namun  belum  diketahui  kemampuan penghambatannya terhadap Vibrio cholerae . Vibrio  cholerae adalah  bakteri  patogen  Gram negatif, halofilik yang berbentuk batang melengkung, bersifat aerob, motil, serta mempunyai satu flagel di kutub. V . cholerae memiliki  habitat  di  perairan seperti  pantai  dan  muara  yang  hangat. V . cholerae biasanya  mencemari  makanan  yang  bersumber  dari laut  seperti  kerang.  Vibrio  menyebabkan  penyakit kolera  pada  manusia  (Pruzzo et  al .,  2005).  Bakteri tersebut  akan  mengeluarkan  enterotoksin  di  dalam saluran pencernaan manusia, sehingga menyebabkan diare  dan  muntah.  Hal  ini  akan  menyebabkan kehilangan banyak cairan tubuh sehingga mengalami dehidrasi (Nomer et al ., 2019).
Pengujian kemampuan isolat Streptomyces spp. dalam  menghambat  pertumbuhan V.  cholerae dilakukan  dengan  menguji  aktivitas  daya  hambat antibakteri  dengan  metode Kirby Bauer dan penentuan  nilai Minimum  Inhibitory  Concentration (MIC).  Metode Kirby Bauer adalah  metode  uji aktivitas  antibakteri  dengan  menggunakan  kertas cakram  yang  telah  ditambahkan  dengan  zat  uji  ke media berisi mikroba yang akan diperiksa. Penentuan nilai  MIC  adalah  metode  untuk  mengetahui konsentrasi  minimum  senyawa  antibakteri  dalam menghambat pertumbuhan mikroba lain. Karakterisasi  senyawa  antibakteri  dilakukan  dengan pemisahan  senyawa  antibakteri  dilakukan  dengan metode Thin  Layer  Chromatography (TLC),  uji fitokimia  dan  uji  bioautografi.  TLC  adalah  metode pemisahan komponen dalam suatu senyawa berdasarkan  fase  diam  dan  fase  gerak.  Deteksi senyawa  dalam  suatu  ekstrak  dapat  menggunakan kombinasi  antara  metode  TLC  dengan  metode fitokimia. Hasil uji TLC digunakan untuk mengetahui golongan senyawa yang bersifat menghambat bakteri uji dengan metode bioautografi (Wall, 2007).
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  mengetahui kemampuan isolat Streptomyces spp. dalam menghambat  pertumbuhan  bakteri V . cholerae , mengetahui  kekuatan  senyawa  antibakteri  yang dihasilkan  oleh  isolat Streptomyces spp.  terhadap pertumbuhan  bakteri V . cholerae dan  mengetahui karakteristik  senyawa  antibakteri  yang  dihasilkan oleh isolat Streptomyces spp. asal sedimen mangrove. Manfaat  dari  penelitian  ini  adalah  memberikan informasi  tentang  potensi  isolat Streptomyces spp. asal  sedimen  mangrove  dalam  menghasilkan senyawa antibakteri dan kemampuan penghambatannya terhadap V . cholerae.

## MATERI DAN METODE
Penelitian  menggunakan    isolat Streptomyces spp. (SA34, SA37, SA40, SAE4034) dan V . cholerae koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Biologi.      Penelitian  karakterisasi  senyawa  yang dihasilkan  oleh  bakteri  tersebut  dan  aktivitas penghambatannya  terhadap V.  cholerae dilakukan dengan  metode  survei.  Tahapan  penelitian  meliputi penapisan isolat Streptomyces spp. yang menghambat V . cholerae , pengujian kekuatan senyawa antibakteri Streptomyces spp.  dengan  metode Kirby Bauer dan penentuan  nilai Minimum  Inhibition  Concentration (MIC)  serta  karakterisasi  senyawa  antibakteri Streptomyces spp.  dengan  metode Thin  Layer Chromatography (TLC) dan fitokimia, uji bioautografi,  uji  aktivitas  senyawa  antibakteri  pada variasi suhu dan pH.

## Preparasi penelitian
Preparasi penelitian meliputi sterlisasi alat dan medium serta rekultur isolat Streptomyces spp. dan V. cholerae. dengan  autoklaf  pada  suhu  121ºC  dan tekanan 2 atm selama 15 menit ( Atlas et al ., 2010). Rekultur  isolat Streptomyces spp.  dilakukan  dengan metode gores kontinyu pada medium Starch Casein Nitrate  Agar (SCNA),  diinkubasi  pada  suhu  ruang selama  5  hari.  Rekultur  isolat V . cholerae dengan metode gores kontinyu  pada medium Nutrient  Agar miring, diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1x24 jam.
Penapisan  kemampuan  isolat  Streptomyces  spp. dalam menghambat pertumbuhan Vibrio cholerae
Penapisan  dilakukan  dengan  metode  gores silang.  Sebanyak  1  ose  masing-masing  isolat Streptomyces spp.  digoreskan  pada  bagian  tengah permukaan  medium  NA,  kemudian  diinkubasi selama  7  hari  pada  suhu  ruang  hingga  terjadi sporulasi.  Sebanyak  1  ose  isolat V . cholerae digoreskan  dengan  jarak  5  mm  secara  tegak  lurus terhadap  goresan  isolat Streptomyces spp.  Biakan diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang. Aktivitas antibakteri  diamati  secara  kualitatif  dengan  cara melihat  jarak  penghambatan  pertumbuhan V . cholerae terhadap koloni bakteri aktinomisetes. Isolat aktinomisetes yang menunjukkan aktivitas penghambatan tertinggi selanjutnya dipilih untuk uji produksi senyawa antibakterinya (Kang et al ., 2010).
Produksi senyawa antibakteri isolat Streptomyces sp. terpilih (Ryandini et al., 2018)
Isolat Streptomyces sp.  terpilih  ditumbuhkan pada  medium  SCNA,  diinkubasi  selama  7  hari. Sebanyak  20  plug  inokulum  yang  telah  dilubangi dengan cork  borer diinokulasi  ke  dalam  200  mL medium Starch  Casein  Nitrate  Broth (SCNB). Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 21 hari. Setelah masa inkubasi, kultur disaring menggunakan kertas saring Whatman untuk memisahkan miselium dan  filtrat.  Miselium  dikeringkan  dan  diukur  berat keringnya menggunakan timbangan analitik.
Filtrat yang diperoleh diekstraksi menggunakan pelarut etil-asetat dengan perbandingan antara filtrat dan  pelarut  1:1  (v/v)  dan  dilakukan  pengulangan sebanyak  2  kali.  Lapisan  bagian  atas  yang mengandung senyawa antibakteri diuapkan menggunakan  alat rotatory  evaporator pada  suhu 70 o C selama 2 jam hingga didapatkan ekstrak kasar. Ekstrak kasar kemudian diukur persentasenya dengan menggunakan rumus:
Hasil (% )= 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑘𝑒𝑟𝑖𝑛𝑔 x 100%
Uji aktivitas daya hambat ekstrak kasar senyawa antibakteri terhadap Vibrio cholerae (Ryandini et al., 2018)
Uji
aktivitas antibakteri dilakukan menggunakan metode Kirby Bauer . Sebanyak 0,1 mL isolat V . cholerae diinokulasi  ke  dalam  10  mL medium  Nutrient  Broth  (NB)  kemudian  diinkubasi pada  suhu  37ºC  selama  24  jam.  Sebanyak  0,1  mL kultur V . cholerae diinokulasikan  ke  dalam  cawan petri yang berisi 20 mL medium MHA secara spread plate .  Sebanyak  20  µL  ekstrak  kasar  diteteskan  ke kertas  cakram  berdiameter  6  mm  untuk  pengujian aktivitas  penghambatan  terhadap V . cholerae . Antibiotik tetrasiklin 100 µg/mL digunakan sebagai kontrol positif dan sebagai kontrol negatif adalah 20 µL DMSO 5%. Biakan diinkubasi pada 37 o C selama 24  jam.  Zona  hambat  diamati,  diukur  diameternya dan dihitung rata-rata diameternya .
Penentuan  nilai  MIC  ekstrak  senyawa  aktif Streptomyces sp.
Penentuan  nilai  MIC dilakukan  dengan  cara memasukkan sebanyak 0,8 mL medium NB ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 0,1 mL ekstrak Streptomyces sp. yang telah dilarutkan dalam DMSO 5%  sebagai  larutan  pengencer  dengan  konsentrasi 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, dan  100%.  Sebanyak  0,1  mL V . cholerae ditambahkan  ke  setiap  tabung.  Perlakuan  untuk kontrol  positif  dilakukan  dengan  menambahkan sebanyak  0,1  mL  kultur V . cholerae ke  dalam medium  NB,  kemudian  ditambahkan  antibiotik tetrasiklin.  Kontrol  negatif  dibuat  dengan  cara menambahkan  sebanyak  0,1  mL  kultur  bakteri V . cholerae ke  dalam  medium  NB.  Semua  tabung diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  24  jam. Konsentrasi yang merupakan nilai  MIC dari ekstrak senyawa aktif ditunjukkan oleh tabung yang tampak bening yang menandakan tidak adanya pertumbuhan bakteri.

## Pemisahan  Senyawa  Antibakteri  Ekstrak  Kasar dengan Metode TLC (Ryandini et al., 2018)
Sebanyak  10  µL  ekstrak  senyawa  antibakteri diteteskan  pada  lempeng  kromatografi  (TLC alumunium sheet silica gel 60 F254) yang telah diberi penanda  garis start dan  garis finish .  Lempeng direndam  dalam  larutan  eluen  berupa  campuran kloroform,  etil  asetat,  dan  asam  asetat  dengan perbandingan 3:3:1. Lempeng dikeringkan di dalam
oven  dengan  suhu  80 o C  selama  2  jam.  Lempeng kemudian diamati di dalam UV cabinet pada panjang gelombang 366 nm. Spot yang terbentuk diukur nilai R f nya dengan menggunakan rumus sebagai berikut:

## 𝑅𝑓 𝑣𝑎𝑙𝑢𝑒 = 𝐴𝑠 𝐴𝑜
Keterangan:
As = Jarak tempuh sempel
Ao = Jarak yang ditempuh oleh pelarut
Analisis senyawa bioaktif ekstrak kasar Streptomyces  sp.  dengan  metode  fitokimia (Fajriaty et al., 2018)
Identifikasi  senyawa  golongan  poliketida dilakukan dengan mengamati spot pada sinar UV 254 nm  yang  tampak  padam  tetapi  menampilkan  warna tertentu  pada  panjang  gelombang  366  nm. Identifikasi  senyawa  golongan  alkaloid  dengan penyemprotan  lempeng  menggunakan  pereaksi Dragendroff , kemudian dipanaskan dalam oven suhu 100 o C  selama  5  menit.  Adanya  senyawa  golongan alkaloid  ditunjukkan  oleh  terbentuknya  bercak kuning  jingga  atau  orange.  Identifikasi  senyawa golongan  terpenoid  dengan  penyemprotan  lempeng menggunakan pereaksi vanilin asam sulfat, kemudian dipanaskan dalam oven suhu 100 o C selama 10 menit. Adanya  senyawa  golongan  terpenoid  ditunjukkan oleh terbentuknya bercak ungu kehitaman. Identifikasi  senyawa  golongan  flavonoid  dengan penyemprotan  lempeng  menggunakan  pereaksi sitroborat,  kemudian  dipanaskan  dalam  oven  suhu 100 o C  selama  5  menit.  Adanya  senyawa  golongan flavonoid  ditunjukkan  oleh  terbentuknya  spot berwarna kuning, hijau, atau ungu yang terlihat pada pengamatan di bawah sinar UV 366 nm.

## Uji  bioautografi  ekstrak  kasar  Streptomyces  sp. terhadap Vibrio cholerae
Uji  bioautografi  bertujuan  untuk  mendeteksi senyawa  aktif  yang  memiliki  aktivitas  antibakteri. Sebanyak  1  mL  kultur Vibrio  cholerae dimasukkan ke dalam cawan petri kemudian ditambahkan 20 mL medium  NA  secara pour  plate .  Hasil  campuran dihomogenisasi kemudian didiamkan hingga medium memadat. Plat TLC dengan spot senyawa diletakkan di atas medium NA yang telah padat dengan metode kontak langsung,  dibiarkan selama 20 menit. Setelah itu,  diinkubasi  pada  suhu  37  ºC  selama  24  jam. Adanya zona bening (zona hambat) pada medium NA menunjukkan  bahwa  senyawa  dengan  nilai  R f tertentu memiliki aktivitas antibakteri.
Uji  aktivitas  senyawa  antibakteri  yang  diberi perlakuan variasi suhu dan pH (Thirumurugan & Vijayakumar, 2015)
Uji pengaruh suhu terhadap aktivitas antibakteri ekstrak Streptomyces sp.  dilakukan  dengan  cara mencampurkan ekstrak kasar dengan larutan DMSO 5%.  Larutan  ekstrak  selanjutnya  diberi  perlakuan dengan  variasi  suhu  40 o C,  60 o C,  80 o C,  atau  100 o C selama  10  menit  dalam watherbath ,  kemudian didinginkan  selama  15  menit  pada  suhu  ruang.
Aktivitas  antibakteri  diuji  menggunakan  metode Kirby  Bauer dengan  mengukur  diameter  zona hambat.
Uji  pengaruh  pH  terhadap  aktivitas  antibakteri ekstrak Streptomyces sp. dilakukan dengan mencampurkan  ekstrak  kasar  dalam  larutan  DMSO 5%. Larutan ekstrak selanjutnya diatur nilai pH 2, 4, 6  dan  9.  Ekstrak  disimpan  dalam waterbath selama 10 menit pada suhu optimum, kemudian didinginkan selama  15  menit  pada  suhu  ruang.  Aktivitas antibakteri  diuji  menggunakan  metode Kirby  Bauer dengan mengukur diameter zona hambat.

## Karakterisasi morfologi koloni
Karakterisasi  morfologi  meliputi  pengamatan bentuk koloni, tepi koloni, elevasi koloni, permukaan koloni, ukuran koloni, dan warna koloni.

## Pengujian sifat Gram (Schaad et al., 2001)
Uji Gram dengan KOH 3%, yaitu larutan KOH 3%  ditetes  di  atas object  glass ,  kemudian  diambil biakan murni isolat Streptomyces sp. dan dicampurkan  merata  menggunakan  jarum  ose. Interpretasi kelompok bakteri Gram negatif ditandai dengan terbentuknya lendir saat jarum ose ditarik ke atas.  Interpretasi  kelompok  bakteri  Gram  positif ditandai dengan tidak terbentuk lendir saat jarum ose ditarik ke atas.

## Pengamatan morfologi hifa (Mukti et al., 2018)
Sebanyak 1 ose isolat Streptomyces sp. dikultur pada medium SCNA, cover glass steril diletakkan di atas medium agar yang telah diinokulasi Streptomyces sp. Biakan diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari. Bentuk hifa diamati dengan mikroskop cahaya  pada  perbesaran  1000X  meliputi  tipe  hifa aerial,  hifa  atau  miselium  substrat,  dan  tipe  rantai spora.

## Uji Oksidase (Ramadhaniah, 2013)
Sebanyak  1  ose  isolat  diulaskan  di  atas object glass yang  sudah  diberi  kertas  saring,  kemudian ditetesi reagen tetramethyl-p–phenylenediamine dihydricloride .  Interpretasi  positif  jika  terbentuk warna  biru  kehitaman  dan  interpretasi  negatif  jika tidak berubah warna.

## Uji Katalase (Brown, 2007)
Sebanyak  1  ose  isolat  diulaskan  diatas object glass kemudian  ditetesi  reagen  H 2 O 2 .  Interpretasi positif jika terbentuk gelembung gas dan interpretasi negatif jika tidak terbentuk gelembung gas.

## Uji oksidatif fermentatif (Kismiyati et al., 2009)
Isolat  bakteri  diinokulasikan  secara  tusukan ( stab inoculation ) menggunakan tusuk steril sedalam ¾ bagian dari medium ke dalam dua tabung medium OF. Salah satu tabung ditetesi dengan parafin steril, kemudian kultur diinkubasi selama 2 x 24 pada suhu ruang.  Oksidatif  positif  diindikasikan  dengan perubahan  medium  yang  tidak  ditambah  parafin menjadi  kuning,  fermentatif  positif  diindikasikan dengan  perubahan  medium  yang  ditambahkan
parafin  menjadi  kuning,  dan  oksidatif-fermentatif jika kedua medium berwarna kuning.
Uji fermentasi karbohidrat (Kismiyati et al., 2009) Sebanyak  1  ose  isolat  diinokulasikan  pada media basal yang ditambah dengan 5% gula (glukosa, laktosa,  sukrosa,  fruktosa,  rafinosa,  ramnosa, inositol,  manitol,  arabinosa,  atau  xylosa)  dan  diberi indikator phenol red, Inkubasi selama 7 x 24 jam pada suhu  ruang.  Interpretasi  positif  ditandai  perubahan warna  medium  menjadi  kuning  dan  terbentuk gelembung gas.

## Uji Nutrisional (Kismiyati et al., 2009)
Sebanyak  1  ose  isolat  diinokulasikan  pada medium  basal  yang  ditambah  dengan  5%  gula glukosa,  laktosa,  fruktosa,  sukrosa,  maltosa,  atau mannitol,  kemudian  diinkubasi  selama  7  x  24  jam pada  suhu  ruang.  Interpretasi  positif  ditandai perubahan kekeruhan medium.

## Uji  kebutuhan  suhu  dan  pH  pertumbuhan
(Damayanti et al., 2020)
Sebanyak 1 ose isolat diinokulasikan ke dalam medium  NB  dan  diinkubasi  pada  suhu  40 o C  dan 60 o C,  selanjutnya  diinkubasi  selama  5  x  24  jam. Sebanyak  1  ose  isolat  diinokulasikan  ke  dalam medium NB dengan pH 6 dan 9, kemudian diinkubasi selama  5  x  24  jam  pada  suhu  ruang.  Interpretasi positif  ditandai  dengan  tumbuhnya  bakteri  dengan meningkatnya kekeruhan medium.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penapisan kemampuan antibakteri Streptomyces spp. secara kualitatif berdasarkan Kang et  al .  (2010)  menunjukkan  bahwa Streptomyces sp. SAE4034  mampu  menghambat V . cholerae. Streptomyces sp.  SA34  dan Streptomyces sp.  SA37 tidak mampu menghambat pertumbuhan V . cholerae , sedangkan Streptomyces sp.  SA40  menghambat dengan kemampuan rendah (Gambar 1). Selanjutnya Streptomyces sp.  SAE4034  digunakan  untuk  uji lanjut.  Keberhasilan  penapisan  kemampuan  isolat diketahui dari jarak pertumbuhan koloni bakteri.
Arifuzzaman et  al .  (2010)  menyatakan  bahwa seleksi  isolat  aktinomisetes  yang berpotensi  sebagai penghasil antibakteri diamati secara kualitatif dengan memberi skor dari zona hambat yang terbentuk, yaitu tidak  berpotensi  (-),  berpotensi  (++),  dan  sangat berpotensi  (+++)  (Tabel  1).  Berdasarkan  kriteria tersebut,  isolat  SAE4034  termasuk  isolat  yang potensial dalam menekan pertumbuhan V. cholerae .
Tabel 1. Pengamatan penapisan kemampuan isolat dalam menghambat pertumbuhan Vibrio cholerae
No. Kode Isolat Aktivitas Penghambatan 1. SA34 - 2. SA37 - 3. SA40 ++ 4. SAE4034 +++
Keterangan:  (-)  =  tidak  berpotensi;  (++)  =  berpotensi;  (+++)  = sangat berpotensi
Gambar 1. Penapisan aktivitas kemampuan Streptomyces spp. terhadap pertumbuhan V. cholerae Keterangan: Isolat SA34 (a); Isolat SA37 (b); Isolat SA40 (c); Isolat SAE4034 (d).
Hasil penelitian aktivitas daya hambat senyawa antibakteri Streptomyces sp.  SAE4034  terhadap pertumbuhan V.  cholerae menghasilkan  diameter zona hambat berkisar antara 11,5-17,5 mm (Gambar 2).  Menurut  Rita  (2010),  ada  empat  kategori    daya hambat  senyawa  antibakteri,  yaitu  dikategorikan sangat kuat apabila memiliki diameter ≥20 mm, kuat apabila memiliki diameter 10-20 mm, sedang apabila memiliki  diameter  5-10  mm,  dan  lemah  apabila memiliki  diameter  ≤5  mm.  Ryandini et  al .  (2018) melaporkan  bahwa  ekstrak  kasar Streptomyces sp. SAE4034 menghambat pertumbuhan bakteri MDR S. aureus , E. coli, dan K. pneumoniae dengan diameter zona hambat 21,5 mm; 12,5 mm dan 12,5 mm untuk masing-masingnya.  Thirumurugan  &  Vijayakumar (2015)  melaporkan  bahwa  isolat Streptomyces sp. ECR77  menunjukkan  aktivitas  hambat  maksimum terhadap bakteri V . cholerae sebesar 13,66 mm pada konsentrasi 25 μL.
Pengujian aktivitas senyawa antibakteri Streptomyces sp.  SAE4034  dilakukan  dengan membuat dua seri konsentrasi ekstrak menggunakan pelarut  DMSO  5%.  Hasil  pengujian  menunjukkan bahwa  senyawa  antibakteri  dengan  konsentrasi  512 µg/mL  membentuk  zona  hambat  lebih  besar  yaitu 17,5  mm,  sedangkan  pada  konsentrasi  128  µg/mL mengalami penurunan, yaitu 11,5 mm. Kenaikan dan penurunan zona hambat akibat perbedaan konsentrasi disebabkan  oleh  sifat  kelarutan  zat  antibakteri  pada ekstrak  yang  akan  mempengaruhi  kecepatan  difusi pada media agar (Mujim, 2010).
Gambar  2. Pengujian  aktivitas  senyawa  antibakteri Streptomyces sp. SAE4034 dalam menghambat pertumbuhan V.  cholerae menggunakan  metode Kirby Bauer.
Keterangan:  kontrol  positif  antibiotik  tetrasiklin  konsentrasi  100 µg/mL  (a);  kontrol  negatif  larutan  DMSO  5%  (b);  ekstrak Streptomyces sp.  SAE4034  konsentrasi  512  µg/mL  (c);  ekstrak Streptomyces sp. SAE4034 konsentrasi 128 µg/mL (d).
Hasil pengujian MIC menunjukkan bahwa pada konsentrasi  20%,  suspensi  bakteri  sudah  terlihat sedikit  jernih.  Pengujian  senyawa  antibakteri  pada konsentrasi 30%-100% menunjukkan bahwa suspensi terlihat jernih dibandingkan dengan kontrol tanpa  ekstrak  kasar  dimana  medium  tampak  keruh (Gambar  3).  Wardana et  al .  (2017)  melaporkan bahwa Streptomyces sp. SAE404 mampu menghambat E. coli dan S. aureus pada  nilai  MIC
Gambar 3. Pengujian aktivitas senyawa antibakteri Streptomyces sp. SAE4034 terhadap V. cholerae menggunakan metode MIC
Gambar 4. Hasil uji TLC dan uji bioautografi ekstrak Streptomyces sp. SAE4034 Keterangan: uji TLC menggunakan eluen kloroform, etil asetat, asam asetat (3:3:1) di bawah sinar UV 366 nm, nilai R f 0,31 (1); 0,43 (2); 0,65 (3) (a); uji bioautografi terhadap V . cholerae pada medium NA(b).
20%.  Sitanggang et  al .  (2019)  menyatakan  bahwa konsentrasi  senyawa  antibakteri  konsentrasi  10%, 20%,  30%,  40%,  50%,  60%,  70%,  80%,  90%,  dan 100%  mempunyai  kategori  penghambatan  lemah sampai dengan kuat. Konsentrasi 10-20% mempunyai kategori penghambatan lemah, konsentrasi  30-50%  kategori  sedang,  dan  60-100% kategori kuat.
Hasil  uji  golongan  senyawa  menggunakan metode TLC yang diamati di bawah sinar UV 366 nm menghasilkan 3 spot dengan nilai R f 0,31; 0,43; dan 0,65  (Gambar  4.a).  Ekstrak  kasar Streptomyces sp. SAE4034 yang menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus , E.  coli, K.  pneumoniae , P.  aeruginosa, dan Enterococcus sp.  pada  hasil  TLC  senyawa  aktifnya menghasilkan 4 spot dengan nilai R f 0,36; 0,45; 0,54; dan 0,6 (Ryandini et al ., 2018).
Faktor-faktor  yang  menyebabkan  variasi  nilai R f antara  lain  preparasi  sampel  sebelum  pengujian, karakteristik  dan  ukuran  plat  TLC  yang  digunakan, volume  dan  komposisi  eluen  sebagai  fase  gerak, kondisi kesetimbangan, kadar air pada plat TLC, suhu dalam  ruang,  dan  ukuran  sampel.  Pemilihan  eluen merupakan faktor yang paling berpengaruh pada hasil
uji  TLC.  Eluen  dapat  terdiri  dari  satu  pelarut  atau campuran  dari  dua  sampai  enam  pelarut.  Nilai  R f berkisar antara 0 dan 1 dengan nilai R f terbaik antara 0,2-0,8 untuk deteksi UV (Wulandari, 2011).
Hasil  uji  bioautografi  untuk  mengetahui aktivitas  dari  masing-masing  spot  melalui  interaksi antara  spot  pada  plat  TLC  dengan  bakteri  uji menunjukkan  bahwa,  spot  dengan  nilai  R f 0,43 mampu menghambat pertumbuhan V . cholerae yang ditunjukkan  dengan  terbentuknya  zona  jernih (Gambar  4.b).  Bioautografi  adalah  uji  aktivitas senyawa antimikroba in situ bersama dengan uji TLC (Wardana et al ., 2017). Hasil TLC dan bioautografi disajikan pada Gambar 4.
Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak Streptomyces sp. SAE4034 menghasilkan 5 spot yang terdiri  atas  senyawa  alkaloid,  terpenoid,  dan flavonoid. Spot dengan nilai R f 0,34 dan 0,43 adalah golongan senyawa alkaloid, spot dengan nilai R f 0,32 adalah golongan senyawa terpenoid, dan spot dengan nilai  R f 0,65  dan  0,70  adalah  golongan  senyawa flavonoid  (Gambar  5).  Senyawa  yang  mampu menghambat  pertumbuhan V . cholerae adalah senyawa  alkaloid  dengan  nilai  R f 0,43.    Senyawa
Gambar 5. Hasil identifikasi senyawa ekstrak Streptomyces sp. SAE4034 menggunakan metode fitokimia Keterangan:  senyawa  alkaloid  menggunakan  reagen Dragendroff ,  nilai  R f 0,34  (1);  0,43  (2)  (a);  senyawa  terpenoid menggunakan reagen anilin asam sulfat, nilai R f 0,32 (3) (b); senyawa flavonoid menggunakan reagen sitroborat pada sinar UV 366 nm, nilai R f 0,65 (4); 0,70 (5) (c).
alkaloid diketahui mampu menghambat pertumbuhan bakteri karena memiliki gugus basa yang mengandung nitrogen. DNA bakteri akan mengalami kerusakan,  dan  merusak  dinding  sel  karena  lapisan dinding  sel  bakteri  tidak  terbentuk  secara  sempurna sehingga  menyebabkan  sel  mati  (Juliantina et  al ., 2009).
Spot  senyawa  flavonoid  dan  terpenoid  tidak menunjukkan  penghambatan  terhadap  pertumbuhan V . cholerae. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  kedua senyawa  tersebut  tidak  mengandung  senyawa antibakter  yang  menghambat  pertumbuhan V. cholerae. Menurut  Nugraha et  al .  (2017),  senyawa flavonoid  dapat  bersifat  antibakteri  terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus . Flavonoid menghambat pertumbuhan bakteri dengan cara  merusak  dinding  sel,  menonaktifkan  kerja enzim,  berikatan  dengan  adhesin,  dan  merusak membran sel.  Senyawa terpenoid dapat menghambat pertumbuhan  bakteri Branhamella  catarrhalis , Staphylococcus  epidermidis dan Straphylococcus aureus .  Senyawa  terpenoid  menghambat  sintesis protein,  mudah larut dalam lipid sehingga mengakibatkan senyawa ini lebih mudah menembus dinding sel bakteri Gram positif dan sel bakteri Gram negatif (Rosyidah et al ., 2010).
Ekstrak  kasar  dengan  perlakuan  suhu  40 o C menunjukkan aktivitas penghambatan tinggi terhadap V. cholerae dengan zona penghambatan sebesar 14,5 mm.  Perlakuan  ekstrak  kasar Streptomyces sp. SAE4034  pada  suhu  60 o C,  80 o C,  dan  100 o C menunjukkan  aktivitas  penghambatan  pertumbuhan bakteri V . cholerae semakin menurun (Gambar 6).
Thirumurugan & Vijayakumar (2015) melaporkan bahwa antibakteri dari isolat Streptomyces sp. ECR77 memiliki aktivitas penghambatan  terhadap  bakteri V . cholerae dan V . parahaemolyticus dengan  suhu  optimum  berkisar pada  suhu  20-45 o C.  Senyawa  antibakteri  isolat Streptomyces sp.    ECR77    memiliki    titik    lebur
Gambar 6. Aktivitas senyawa antibakteri Streptomyces sp. SAE4034 dalam menghambat V. cholerae pada variasi suhu
Gambar 7. Aktivitas senyawa antibakteri Streptomyces sp. SAE4034 dalam menghambat V. cholerae pada variasi pH
senyawa  aktif  pada  suhu  110 o C  dan  aktivitas senyawanya  akan  hilang  dalam  waktu  10  menit. Menurut  Fajar et  al .  (2014),  Pada  suhu  tinggi, senyawa  alkaloid  yang  bersifat  basa  terdegradasi menjadi  senyawa  yang  bersifat  asam,  hal  ini menyebabkan  gugus  alkaloid  rusak  dan  kandungan senyawa aktifnya menurun atau menghilang.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pH optimum aktivitas senyawa antibakteri Streptomyces sp. SAE4034 dalam menghambat V. cholerae adalah pada pH 6 dengan diameter zona hambat sebesar 16 mm.   Ekstrak    kasar Streptomyces sp.   SAE4034
14,5 13,5 13,5 13 12 12,5 13 13,5 14 14,5 15 40 60 80 100 Dia me te r Zon a
Ha mb at (mm) Suhu o C 14 15 16 13,4 12 13 14 15 16 17 2 4 6 9 Dia me te r Zon a
Ha mb at (mm) pH
Tabel 2. Hasil karakterisasi Streptomyces sp. SAE4034 Karakteristik Hasil Karakteristik Hasil Makromorfologi Fermentasi karbohidrat Bentuk koloni Bulat Fruktosa (A/G) +/+ Tepi koloni Undulate Rafinosa (A/G) +/+ Elevasi koloni Timbul Ramnosa (A/G) -/- Permukaan koloni Powdery Inositol (A/G) -/- Ukuran koloni 2-5 Mm Manitol (A/G) -/- Warna koloni Cream Arabinosa (A/G) +/+ Mikromorfologi Xylosa (A/G) +/- Gram Positif Nutrisional Hifa aerial Spiral Glukosa + Miselium substrat + Laktosa - Rantai spora Panjang Fruktosa + Biokimiawi Sukrosa + Oksidase + Maltosa - Katalase + Manitol - Oksidatif/Fermentatif -/+ Fisiologis Fermentasi karbohidrat Suhu 40°C - Glukosa (A/G) +/+ Suhu 60°C - Laktosa (A/G) -/- pH 6 + Sukrosa (A/G) +/+ pH 9 +
dengan  perlakuan  pH  2,  4,  dan  9  menunjukkan aktivitas  penghambatan  semakin  menurun  (Gambar 7).
Thirumurugan & Vijayakumar (2015)
melaporkan bahwa antibakteri dari isolat Streptomyces sp. ECR77 memiliki aktivitas penghambatan  terhadap  bakteri V . cholerae dan V . parahaemolyticus dengan  pH  optimum  berkisar  7,0 hingga  8,0;  pada  pH  tersebut  senyawa  yang terkandung  akan  lebih  stabil.  Menurut  Fajar et  al . (2014), semakin tinggi suhu penyimpanan maka pH akan  semakin  rendah  dan  bersifat  asam.  Sifat  asam inilah yang menyebabkan senyawa aktif pada ekstrak mengalami degradasi.
Hasil karakterisasi makromorfologi, mikromorfologi, biokimiawi, nutrisional dan fisiologis  (Tabel  2.)  dan  mengacu  pada  buku “ Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Second Edition ”  dan  dibandingkan  dengan  penelitian sebelumnya.  Ryandini et  al .  (2018)  pada  penelitian sebelumnya  melaporkan  bahwa  isolat Streptomyces sp.  SAE4034  mempunyai  koloni  berbentuk  bulat, dengan permukaan  koloni bertepung, ukuran  koloni 2-3 mm, dan koloni berwarna cream, miselium aerial berbentuk spiral dan terfragmentasi menjadi kokoid, miselium substrat positif, difusi pigmen negatif, dan memiliki  rantai  spora  yang  panjang.  Goodfellow et al .  (2012)  menyatakan  Genus  Streptomyces  adalah bakteri  aerobik,  Gram positif,  tidak  tahan  asam  dan mampu membentuk substrat bercabang dan miselium aerial. Miselium aerial membentuk hingga tiga rantai spora pada saat matang.
Berdasarkan hasil penelitian ini, isolat Streptomyces sp.  SAE4034  bersifat  oksidase, katalase  dan  fermentatif.  Ryandini et  al .  (2018) melaporkan bahwa isolat Streptomyces sp. SAE4034 positif  pada  uji  katalase  dan  oksidase.  Menurut
Goodfellow et al . (2012) beberapa Streptomyces sp. positif oksidase, katalase, fosfatase, urease. Ryandini et al . (2018) melaporkan bahwa isolat Streptomyces sp. SAE4034 positif pada fruktosa, sukrosa, rafinosa, arabinosa,  dan  xylosa,  sedangkan  negatif  pada ramnosa, inositol dan manitol. Beberapa Streptomyces  dapat  tumbuh  dengan  baik  pada glukosa,  sukrosa,  arabinosa,  galaktosa,  rafinosa, menunjukkan  pertumbuhan  yang  moderat  pada fruktosa,  xylosa,  inositol,  dan  ramnosa,  serta  tidak ada  pertumbuhan  pada  laktosa  dan  manitol (Goodfellow et al ., 2012).
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  isolat Streptomyces sp. SAE4034 tidak dapat tumbuh pada suhu 40 o C dan 60 o C, dan tumbuh pada pH 6 dan 9. Ryandini et  al .  (2018)  melaporkan  bahwa  isolat Streptomyces sp.  SAE4034  tumbuh  optimum  pada suhu  ruang,  pH 8,5, dan  salinitas  3%.  Pertumbuhan optimal Streptomyces yaitu pada suhu 30°C, toleransi terhadap  pH  berkisar  6-9,5,  dan  kadar  NaCl  hingga 6%.  Kebanyakan  Streptomycetes  adalah  mesofil tumbuh  pada  suhu  antara  10-37°C.  Beberapa  strain dapat tumbuh pada suhu 45°C dan bersifat neutrofil tumbuh antara pH 5,0 dan 9,0, dengan optimum pada pH 7,0 (Goodfellow et al ., 2012).

## SIMPULAN
Streptomyces sp. SAE4034 mampu menghambat  pertumbuhan V.  Cholerae dan  pada konsentrasi  ekstrak Streptomyces sp.  SAE4034 sebanyak  128  µg/mL  dan  512  µg/mL  berturut-turut mampu  menghambat V.  cholerae dengan  diameter zona hambat sebesar 11,5 mm dan 17,5 mm dengan nilai  MIC  sebesar  30%.  Senyawa  antibakteri  yang dihasilkan oleh Streptomyces sp. SAE4034 memiliki nilai R f berkisar antara 0,31-0,70, dan senyawa aktif yang  mampu  menghambat V . cholerae termasuk
golongan  alkaloid.  Aktivitas  senyawa  antibakteri tinggi  pada  suhu  40 o C  dengan  zona  hambat  14  mm pH 6 dengan zona hambat 16 mm.

## DAFTAR REFERENSI
Akbar, R. A., Ryandini, D. & Kusharyati, D. F., 2017. Potensi Aktinomisetes Asal Tanah Perakaran Mangrove  Segara  Anakan  Cilacap  Sebagai Penghasil Antifungi Terhadap Yeast Patogen Candida albicans . Journal of Tropical Biodiversity and Biotechnology , 2(2), pp. 39- 44.
Arifuzzaman,  M.,  Khatun,  M.  R.  &  Rahman,  H., 2010. Isolation and Screening of Actinomycetes  from  Sundarbans  Soil  for Antibacterial  Activity. African  Journal  of Biotechnology , 9(29), pp. 4615-4619.
Atlas,  R.  M.,  2010. Handbook  of  Microbiogical Media  Fourth  Edition .  Washington,  D.  C: CRC Press.
Berdy, J., 2005. Bioactive microbial metabolites. The Journal of antibiotics , 58(1), pp. 1-26.
Brown,  A.  E.,  2007. Microbiological  Applications . New York : Higher Education.
Damayanti, S. S., Komala, O. & Effendi, E. M., 2020. Identifikasi Bakteri Dari Pupuk Organik Cair Isi  Rumen  Sapi. EKOLOGIA ,  18(2),  pp.  63- 71.
Fajar, A., Ibrahim, R. & Dewi, E. N., 2014. Stabilitas Ekstrak Kasar Pigmen Klorofil, Beta Karoten, Dan  Caulerpin  Alga  Hijau  ( Caulerpa racemosa )  Pada  Suhu  Penyimpanan  Yang Berbeda.
Jurnal Pengolahan dan Bioteknologi Hasil Perikanan , 3(1), pp. 1-10.
Fajriaty,  I.,  Hariyanto,  I.  H.,  Andres,  A.  & Setyaningrum,  R.,  2018.  Skrining  Fitokimia dan  Analisis  Kromatografi  Lapis  Tipis  dari Ekstrak Etanol Daun
Bintangur ( Calophyllum  soulattri Burm.  F.). Jurnal Pendidikan  Informatika  dan    Sains , 7 (1),  pp. 54-67.
Goodfellow,  M.,  Kämpfer,  P.,  Busse,  H.,  Trujillo, M.E., Suzuki, K., Ludwig, W. & Whitman, W. B.,  2012. Bergey's  manual  of  systematic bacteriology:  Volume  5:  The  Actinobacteria Part  A.  2 nd Edition .  New  York:  Springer Science & Business Media.
Juliantina, F., Citra, D. A., Nirwani, B., Nurmasitoh,
T. & Bowo, E. T., 2009. Manfaat Sirih Merah ( Piper crocatum ) Sebagai Agen Anti
Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Jurnal kedokteran dan kesehatan indonesia , (1), pp. 12-20.
Kang, M. J., Strap, J. L. & Crawford., 2010. Isolation and  Characterization  of  Potent  Antifungal Strains  of  the  Streptomyces  violaceusniger Clade  Active  Against Candida  albicans.  J. Ind. Microbiol. Biotechnol , 37, pp. 35-41.
Kismiyati,  S.  R.,  Yusuf,  R.  N.  &  Kusdawari,  R., 2009.  Isolasi  dan  Identifikasi  Bakteri  Gram Negatif  pada  Luka  Ikan  Maskoki  ( Carassius auratus )  Akibat  Infeksi  Ektoparasit Argulus sp. Jurnal  Ilmiah  Perikanan  dan  Kelautan , 1(2), pp. 129-134.
Mujim,  S.,  2010.  Pengaruh  Ekstrak  Rimpang  Jahe ( Zingiber officinale Rosc.) Terhadap Pertumbuhan Pythium sp. Penyebab Penyakit Rebah Kecambah Mentimun Secara In Vitro. Jurnal  Hama  dan  Penyakit  Tumbuhan Tropika , 10(1), pp. 59-63.
Mukti, P. K., Hastuti, U. S. & Sulisetijono, S., 2018.
Karakterisasi,  Identifikasi,  dan  Observasi Histologik Letak Fungi Endofit yang Diisolasi dari  Tanaman Cordilyne  fruticosa (L.)  A. Chev.  In Proceeding  Biology  Education Conference:  Biology,  Science,  Enviromental, and Learning , 15(1), pp. 862-869.
Nomer, N. M. G. R., Duniaji, A. S. & Nocianitri, K.
A., 2019. Kandungan Senyawa Flavonoid dan
Antosianin Ekstrak Kayu Secang
( Caesalpinia  sappan L.)  SERTA  Aktivitas Antibakteri Terhadap Vibrio cholerae . Jurnal Ilmu  dan  Teknologi  Pangan  (ITEPA) , 8(2), pp. 216-225.
Nugraha, A. C., Prasetya, A. T. & Mursiti, S., 2017. Isolasi,  Identifikasi,  Uji  Aktivitas  Senyawa Flavonoid  Sebagai  Antibakteri  Dari  Daun Mangga. Indonesian  Journal  of  Chemical Science , 6(2), pp. 91-96.
Pruzzo, C., Gallo, G. & Canesi, L., 2005. Persistence of  Vibrios  In  Marine  Bivalves:  The  Role  of
Interactions With Haemolymph Components. Environmental
microbiology , 7(6), pp. 761-772.
Ramadhaniah,  F.  A.,  2013.  Keragaman  Bakteri Endofit  pada  Kultivar  Nanas  ( Ananas comosus (L.)  Merr)  Leor  dan  Duri  di Kabupaten  Subang. Skripsi .  Bandung  : Universitas Pendidikan Indonesia.
Rita,  W.  S.,  2010.  Isolasi,  Identifikasi,  dan  Uji Aktivitas  Antibakteri  Senyawa  Golongan Triterpenoid  pada  Rimpang  Temu  Putih ( Curcuma  zedoaria (Berg.)  Roscoe). Jurnal Kimia , 4(1), pp. 20-26.
Rosyidah,  K.,  Nurmuhaimina,  S.  A.,  Komari,  N.  & Astuti,  M.  D.,  2010.  Aktivitas  Antibakteri Fraksi Saponin Dari Kulit Batang Tumbuhan
Kasturi  ( Mangifera  casturi ). Alchemy ,  7  (2), pp. 25-31.
Ryandini, D., Ocky, K. R. & Oedjijono., 2018. Isolate Aktinomisetes SA32 Origin of Segara Anakan Mangrove  Rhizosphere  and  its  Capability  in Inhibiting  Multi-Drugs  Resistant  Bacteria Growth. J  MicrobBiochem  Technol , 10(1), pp. 1-7.
Ryandini,  D.,  Pramono,  H.  &  Sukanto,  S.  (2018). Antibacterial Activity of Streptomyces
SAE4034  Isolated  From  Segara  Anakan Mangrove  Rhizosphere  Against  Antibiotic Resistant  Bacteria. Biosaintifika:  Journal  of Biology & Biology Education , 10(1), 117-124.
Schaad  N.  W.,  Jones,  J.  B.  &  Chun,  W.,  2001. Laboratory  Guide  for  Identification  of  Plant Pathogenic Bacteria . USA: American Phytopatological Society Press.
Sitanggang, F. M. C., Duniaji, A. S. & Pratiwi, I. D.
P.  K.,  2019.  Daya  Hambat  Ekstrak  Buah
Andaliman  ( Zanthoxylum  acanthopodium DC) dalam Etil Asetat Terhadap Pertumbuhan Escherichia coli . Jurnal Ilmu Dan Teknologi Pangan , 8(3), pp. 257-266.
Subramani,  R.  &  Aalbersberg,  W.,  2012.  Marine Aktinomisetes:  an  Ongoing  Source  of  Novel Bioactive Metabolites. Microbiological research , 167(10), pp. 571-580.
Thirumurugan,  D.  &  Vijayakumar,  R.,  2015. Characterization and Structure Elucidation of Antibacterial  Compound  of Streptomyces sp. ECR77  Isolated  from  East  Coast  of India. Current  Microbiology , 70(5),  pp.  745- 755.
Wall,  P.  E.,  2007. Thin-Layer  Chromatography:  A
Modern
Practical Approach. United Kingdom: Royal Society of Chemistry.
Wardana, R. S., Ryandini, D. & Oedjijono, O., 2017. Antibacterial  Capacity  of  Streptomyces Isolate  From  a  Mangrove  Plant  Rhizosphere Avicennia  marina. Scripta  Biologica , 4(2), pp. 131-134.
Wulandari,  L.,  2011. Kromatografi  Lapis  Tipis . Jember: PT. Taman Kampus Presindo.