## MULTIPLEX PCR UNTUK MENDETEKSI Candida Spp
Anita 1) , Asaad Maidin 2 ,) Nasrum Massi 2
1) Akademi Analis Kesehatan Muhammadiyah Makassar, 2) Bagian Imunologi Dan Mikkrobiologi, Fakultas Kedokteran, Univeritas Hasanudddin, Makassar Alamat Korespondensi: anitadinar1983@gmail.com

## Abstrak
Candida  spp  merupakan  infeksi  jamur  tersering  pada  manusia  yang  dapat  menyebabkan infeksi  primer  dan  sekunder  pada  penderita  tuberkolosis  paru.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengukur keakuratan (sensitifitas dan spesifitas ) Multiplex PCR  untuk mendeteksi Candida spp. Desain penelitian adalah observational studi dengan jumlah sampel 55 sputum BTA positip yang dipilih  berdasarkan  propotional  ramdoms  sampling.  Pengambilan  sputum,  data  faktor  biomedis meliputi:  umur,  jenis  kelamin,  riwayat  tentang  penyakit  tuberkulosis,  riwayat  penyakit  lainnya, riwayat  pengobatan  dikumpulkan  oleh  petugas  laboratorium  yang  terlatih.  Analisis  data digunakan  untuk  mengukur  sensitifitas  dan  spesifitas    Multiplex  PCR  untuk  mendeteksi  Candida spp. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kelompok umur  29-33 tahun dan 40-45 tahun memiliki resiko  terinfeksi  oleh  jamur  Candida  spp,    sebanyak  7  orang  (20%).  6  orang  (17.1  %)  laki-laki dari  kelompok  umur  29-33    tahun  dan  1  orang  (2.8  %)  dari  kelompok  umur  40-45  tahun sedangkan untuk  perempuan terdapat 3 orang (8.5 %) dari kelompok umur 46-51 tahun memilki resiko  untuk  terinfeksi    jamur  Candida  spp.Untuk  Multiplex  PCR  memiliki  sensitivitas  dan spesifitas  yaitu  100%.  Multiplex  PCR  mendeteksi    Candida  albicans,  Candida  krusei,  Candida parapsilosis, Candida tropicalis, dan Candida dubliniensis. Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa  untuk  mendeteksi  Candida  spp  dari  sputum  pasien  tuberkulosis  dapat  menggunakan Multiplex PCR yang merupakan metode identifikasi yang sensitif, akurat, dan cepat. Oleh karena itu  kami  menyarankan  untuk  dilakukan  penelitian  tentang  identifikasi  Candida  spp  dari  berbagi sumber specimen.
Kata kunci:  Candida spp, , Multiplex PCR

## PENDAHULUAN
Spesies Candida merupakan infeksi jamur  tersering  penyebab  kandidiasis pada  manusia,  dapat  terjadi  di  seluruh dunia  dan  menyerang  segala  usia,  baik laki-laki maupun wanita (Maharani S.,2012).
Laporan dari Fridkin, (2003) dalam jurnal    Ells  R  dkk.,  (2009)  menyatakan bahwa meskipun Candida albicans masih merupakan penyebab utama infeksi jamur,  tetapi  terdapat  pula  beberapa spesies  non Candida albicans yang  dapat menyebabkan  manifestasi  sistemik  dan sejumlah  infeksi  (Liguori  G  dkk.,  2010). Spesies  non Candida  albicans yang  juga merupakan  agen  oportunistik  patogen antara lain Candida dubliniensis, Candida glabrata , Candida krusei , Candida parapsilosis , dan Candida tropicalis (Ells R dkk., 2009).
Sekitar  dua  dekade  terakhir  invasi penyakit  infeksi  jamur  terus  mengalami peningkatan  sebagai  akibat  penggunaan steroid  dan  antibiotik  spektrum  luas,
terjadinya  infeksi  primer  dan  sekunder pada penderita tuberkolosis paru, terdapatnya  faktor  predisposisi  yaitu penyakit  kronik  yang  berat  termasuk penyakit  kegananasan  atau  penyakit kronik  lainnya  seperti  diabetes  melitus (Widyasari K dkk., 2012)
Secara fenotip Candida dubliniensis dan Candida albicans
tampak  sama,  sehingga  sering  terjadi kesalahan identifikasi (Ells R dkk., 2009).
Keduanya memiliki
clamidospora,
memproduksi germ tube,
dan menghasilkan  profil  asimilasi  karbohidrat yang sama (Chowdhry dkk., 2010).
Dalam  beberapa  dekade  ini  telah dikembangkan  pula  sejumlah  metode molekular untuk mendeteksi Candida spp dalam waktu yang cepat dengan sensitifitas  dan  spesifitas  yang  tinggi seperti  nested  PCR,  Taqman  PCR, multiplex  PCR,  light  cycler  PCR  dan fluorescent PCR (Tarini dkk.,2010).

## METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah autoklaf ( Sanyo ), Bio Safety  Cabinet ( ESCO  class  II  Type  A2 ), lampu  Bunsen,  inkubator  ( Memmert ), kaca  objek  ( Sail  Brand ), kotak  kaca objek,  lemari  asam  ( ESCO ),  mikropipet ( Bio-Rad )  20  µl  dan  100  µl, mesin  PCR (Bio-rad),mikroskop ( Nikon ), neraca analitik  ( Kernew ), ose  bulat,  pH  meter ( Schoft  Instrument ), plate  well , rak tabung, sentrifugasi    ( Sorvall  Legendt ), serological  pipet  5  µl,  10  µl  ,  15  µl ( Falcott ),  stopwatch  ( lingcheng ),  tabung eppendorf ( Axygen ), tabung Falcon 50 ml,
vortex ( Heidolph ), pinset, gunting, waterbath  (Memmert),  freezer,  gelas kimia,  erlenmeyer,  sendok  timbangan, stirer magnetik Bahan-bahan yang digunakan dalam  penelitian  adalah  sampel  sputum penderita  tb,  kapas,  alkohol,  karbol fuksin,  methilen  blue,  medium  NA, medium SDA (Sabaroud Dextrose Agar ), medium  peptone, glukosa, agar, NaCl, air steril, primer ITS1 (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’), ITS2 (5’-  GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’), CA3 (5’- GGTTTGCTTGAAAGACGGTAG  -3’), CA4 (5’-AGTTTGAAGATATACG
TGGTAG-3’),  PCR  Hot  Star  (Qiagen) (terdiri dari enzim, taq polymerase, dNTP, buffer, MgCl).
Prosedur Penelitian Pemeriksaan Sputum
Sampel  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  sputum  (dahak)  dari pasien  suspek  tuberkulosis  yang  berasal dari  batuk  spontan  dan  dalam,  yang bersifat  mukopurulen  atau  kental  dan berawarna kuning sampai kehijauan.

## Ekstraksi DNA Metode Qiagen
Sebanyak  20  µl  Qiagen  Protease dimasukkan  ke  dalam  tabung  eppendorf yang steril.1,5 ml , lalu tambahkan 200 µl sampel sputum, Lalu ditambahkan 200  µl Buffer  AL    kemudia  di  vortex  15  detik  . Selanjutnya  disimpan  pada  suhu  56 0 C selama 10 menit. Kemudian di sentrufugasi  dengan  kecepatan  6000  rpm selama  1  menit  pada  suhu  ruangan. Tambahkan  200  µl    etanol  (96-100  %) kemudian di vortex 15 detik Supernatannya  dibuang  lalu  campuran dipindahkan  ke  QiAmp    spin  column  (2 ml collection tube) kemudian di sentrifugasi  dengan  kecepatan  8000  rpm selama  1  menit  lalu  buang  supernatan kemudian  tambahkan  500  µl  l  Buffer AW1    disentrifugasi  dengan  kecepatan 8000  rpm  selama  1  menit  pada  suhu ruangan,  lalu  supernatannya  dibuang kemudian  tambahkan  500  µl  l  Buffer AW2  disentrifugasi  dengan  kecepatan 14.000 rpm selama lalu buang supernatant kemudain  pindahkan  ke  eppendorf  yang steril.1,5 ml tambahkan 200 µl Buffer AE diamkan  1  menit  lalu  disentrifugasi dengan  kecepatan  8000  rpm  selama  3 menit  .  DNA  siap  untuk  di  Multiplex PCR.
Deteksi  DNA  Candida  spp  dengan Multiplex-Polymerase  Chain  Reaction (PCR)
Hasil  ekstraksi  DNA  dimasukkan ke  dalam  larutan  :  1x  hotstar    buffer (Qiagen ) antara lain 1 mM MgCl 2 , 1 mM dNTP  ,  28,75  µl  H 2 0    20    µM  ITS1  dan ITS2,  20  µM  CA3  dan  CA4,  0,025  U HotStar taq DNA polymerase, 10 µl DNA template,  sehingga  total  volume  untuk PCR  50  µl.  Program  siklus  untuk  proses PCR  :  Siklus  1  (1x)  95 0 C  selama  15 menit,  siklus  2  (40x)  94 0 C  selama  30 detik,  60 0 C  selama  60  detik  ,  72 0 C selama  45  detik  Siklus  ke  3  (1x)  72 0 C selama 10 menit (Tarini dkk.,2010).Target  Produk  PCR  dapat dilihat pada  Tabel ( 1). Pembuatan 2% Gel Agarose (Elekroforesis) Gel  agarose  ditimbang  sebanyak  2 gram (Biorad) dalam 100 ml  Tris Borate EDTA (TBE) yang terdiri dari 100 gr Tris Base,  27,5  gr  asam  borat,  20  ml  0.5  M EDTA  pH  8.0  dalam  1  liter  air. Ditambahkan 135 ml air dan dipanasakan sampai mendidih. Selanjutnya
ditambahkan  1  µl  (0,2  µg/ml)  ethidium bromide  dan  dimasukkan  dalam  cetakan gel  yang  telah  dipasangi  sisir.  Setelah memadat  (30  menit),  gel  kemudian dimasukkan ke dalam mesin elelktroforesis  yang  berisi  larutan  TBE
0,5x.Selanjutnya  2  µl  DNA  sampel  hasil
PCR  yang  telah  dicampur  dengan  cairan “loading dye (4 gram sukrosa ditambahkan  25  mg  bromphenol  blue dalam  10  mm  air)”.  Elektroforesis dijalankan  pada  10  mA,  100  volt,  selama 60-90 menit .Kemudian diamati menggunakan geldog.Sampel positif Candida  spp  dilaporkan    berupa  ada tidaknya band yang terbentuk.

## Analisa Data
Data  yang  dilaporkan  berupa  data biomedik  (umur,  jenis  kelamin,  riwayat tentang  penyakit  tuberkulosis,  riwayat penyakit  lainnya,  riwayat  pengobatan), sedangkan  data  laboratorium    hasil Multiplex  PCR  dilaporkan    berupa  ada tidaknya  band  yang  terbentuk.  Analisa data  penelitian  ini  adalah  dalam  bentuk analisa  deskriktif  yang  disajikan  dalam bentuk tabel.
HASIL PENELITIAN Berdasarkan penelitian yang dilakukan untuk mendeteksi Candida Spp didapatkan hasil, yaitu total sampel dalam penelitian  ini  yaitu  35  sputum  dari penderita  tuberkulosis  sebanyak  35  orang di Infection Centre Rumah Sakit Wahidin Sudirohusodo.
Tabel  1.  Karasteristik pasien  berdasarkan
kelompok umur dan jenis kelamin Umur Jenis Kelamin Laki-laki (%) Perempuan (%) 18-22 1 (2.8) 2 (5.7) 23-28 4 (11.4) 2 (5.7) 29-33 6 (17.1) 1 (2.8) 34-39 1 (2.8) 1 (2.8) 40-45 5 (14.2) 2 (5.7) 46-51 2 (5.7) 3 (8.5) 52-57 1 (2.8) 2 (5.7) 58-63 2 (5.7) 0
Tabel  1  memperlihatkan  bahwa  35 sampel  sputum  ini  yang  bersumber  dari kelompok  umur  ≤  28  tahun  sebanyak  9 orang,  umur  29-45  tahun  sebanyak  16 orang dan ≥ 45 tahun sebanyak 10 orang . Terdapat  7  orang  (20  %)    pasien  dari kelompok  umur  antara  29-33  tahun memiliki  resiko  terinfeksi  oleh  jamur Candida  spp diikuti  oleh  kelompok  umur
40-45  tahun  yaitu  sebanyak  7  orang (20%).    Dari  35  total  sampel  terdapat  22 orang  pasien  yang  berjenis  kelamin  laki- laki dan yang berjenis kelamin perempuan adalah 13 orang. Tabel 1 juga memperlihatkan  terdapat  6  orang  (11  %) laki-laki dari kelompok umur 29-33 tahun memilki  resiko  terinfeksi  jamur Candida spp diikuti dengan kelompok umur antara 40-45  tahun  sebanyak  6  orang  (17.1  %). Sedangkan  untuk    perempuan  terdapat  3 orang (8.5 %) dari kelompok umur 46-51 tahun  memilki  resiko  untuk  terinfeksi jamur Candida spp
Hasil  amplifikasi  terhadap  DNA dari  sputum  pasien  suspek  tuberkulosis diperoleh  positif Candida  spp ditandai dengan ada tidaknya band yang terbentuk setelah  elektroforesis (Gambar  1) . Hasil amplifikasi sampel sputum dengan metode  Multiplex  PCR  yang  diamati dengan  menggunakan  gel  elektroforesis, dan diperoleh sampel positif Candida spp .
Gambar  1.  Hasil  multiplex  PCR  (sampel 22, 299 bp adalah C. parapsilosis;  sampel  24,  218 bp  C.  albicans  /  C.  tropicalis; sampel 5, 198 bp C. dubliniensis;  sampel  19,  110
bp C. albicans)

## PEMBAHASAN
Primer  yang  digunakan  untuk Multiplex PCR dalam peneltian ini adalah primer  yang  sama  yang  digunakan peneltian  yang  dilakukan  oleh  Tarini (2010),  Indonesia,  dan  Ligouri  (2010), Itali,  yaitu  universal  primer  jamur  (ITS1 dan  ITS2)  dan  spesifik  primer  untuk jamur Candida  spp dan Candida  albican (CA3  dn  CA4).  Fujita  dkk,  menyatakan dalam  jurnal  penelitian  Tarini  (2010)
bahwa ITS1 terletak diantara gen 18S dan gen 28S rRNA. ITS terbagi ITS1 (terletak antara  gen  18S  dan  gen  5.8S  rRNA)  dan ITS2  (terletak  antara  gen  5.8S  dan  gen 28S  rRNA).  Perbedaan  sekuens  pada ITS1-5.8S  rDNA-  ITS2,  ITS1  dan  ITS2 merupakan penanda utama untuk mendeteksi dan mengidentifiksi jamur. Untuk  uji  sensitifitas  Multiplex
PCR  menggunakan   primer  tersebut  telah dilakukan  oleh  Tarini  (2010)  dimana Multiplex  PCR  dibandingkan  dengan kultur.  Masing-msaing  200  µl  suspensi koloni Candida  albican di  kultur  pada medium  Sabaroud  Dektrosa  Agar  37 0 C dan  200  µl  dilakukan  Multiplex  PCR. Pada  peneltian  tersebut  disimpulkan bahwa Candida  albican dapat  dideteksi pada  serial  pengenceran  2  X10 2 atau setara dengan 2.6-2.9 unit sel/ml.
Untuk  uji  spesitifitas  Multiplex PCR  menggunakan  primer  ini  telah  pula dilakukan  oleh  Tarini  (2010)  dimana jamur  lain  antara  lain A.  niger,  A.flavus , dan A. fumigates dan  bakteri S .
pneumoniae,  S.  alpha  haemolyticus,  S. beta haemolyticus, S. gamma
haemolyticus,  S.  aureus,S.  epidermidis,
Morraxella,  Diptheroid,  H.  influenzae,
dan N. sica  dideteksi  negatip  oleh Multiplex  PCR.
Hasil Multiplex PCR dari spesimen sputum  di  deteksi Candida  albican dengan  target  band  110  bp  dan  218  bp, sedangkan  untuk Candida  dubliniensis target bandnya 198 bp, Candida parasilopsis target  bandnya  229  bp dan Candida tropicalis target bandnya 218 bp ( Gambar 1 ) .
Multiplex  PCR  dapat  mendeteksi
Candida  spp dengan  waktu  yang  lebih cepat yaitu  7  jam  dengn  nilai sensitifitas dan  spesitifitas  sebesar  100  %.  Hal  ini disebabkan  karena  Multiplex  PCR  selain dapat  mendeteki Candida  spp dapat  pula mendeteksi Candida  glabrata , Candida krusei , Candida  parapsilosis , Candida kefyr, Candida  tropicalis, dan Candida dubliniensis dibandingkan dengan metode kultur  yang  hanya  dapat  mendeteksi Candida dubliniensis dan Candida
albican.
Dengan Multiplex PCR konsentrasi DNA  yang  digunakan  pada  penelitian  ini untuk  mendeteksi Candida  spp dari sputum  BTA  positip  yaitu  10  pg.  Hal  ini sama  yang  dilakukan  oleh  Tarini  dkk.,
(2010) dalam penelitiannya dimana konsentrasi  dna  yang  digunakan  untuk mendeteki Candida  spp adalah  0,98  -  16
pg. Menurut Jaeger dkk., (2000) menyatakan  bahwa  limit  deteksi  DNA jamur  menggunakan  metode  molekular yaitu  10  pg  atau  setara  dengan  100  sel jamur,  dimana  1  sel Candida  albican , dnanya terdiri dari 37 fg . Perbedaan limit dna  untuk  mendeteksi  jamur  disebabkan oleh  berbagai  faktor  antara  lain  desain primer  ataupun  perbedaan  sensitifitas enzim  yang  digunakan  untuk  melisiskan sel jamur (Tarini dkk.,2010)
Non Candida albican juga merupakan  oppurtunistik  patogen  yang berbahaya dan beberapa diantaranya telah menunjukkan  tingkat  resistensi  yang cukup  tinggi  terhadap  obat  antijamur sehingga sangat diperlukan metode identifikasi  secara  molekuler  yang  dapat membantu  manajemen  dan  epidemologi infeksi  jamur  terutama  pada  kelompok pasien  yang  beresiko  seperti  pasien tuberkulosis ataupun pada pasien immunokompromise (Allam dkk., 2012). KESIMPULAN Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa Multiplex PCR
merupakan  metode  identifikasi  yang sensitif, akurat, dan cepat untuk mendeteksi Candida  spp dari sputum pasien tuberkulosis.

## SARAN
Dapat  dilakukan  peneltian  lebih lanjut  mengenai  penggunaan  Multiplex PCR untuk mendeteksi keberadaan Candida spp dari berbagi sumber specimen.

## DAFTAR PUSTAKA
Ayman  A.,  Ihab  M.  Salem.  (2012). Evaluation  of  Rapid  Molecular Identification of Clinically Important Candida  Spp Isolated From Immunocompromised Patients Using RF-PCR. Journal of American Sciense , 8 : 2.
Chowdhry.,  dkk.,  (2010).  Application  of hypertonic  Sabaroud  glucose agar for differentiation of Candida dubliniensis from Candida  albicans . Diagnostic Microbiology and Infectious
Disease , 69:440-442. Ells  R.,  (2009). Candida  albicans or Candida  dubliniensis .  Mycoses Diagnosis, Therapy and Prophylaxis  of  Fungal  Diseases 54: 1-16. Liguori G., dkk.,(2010). Candida albicans identification: comparison among  nine  phenotypic  systems and  a  multiplex  PCR. J  PREV MED HYG , 51:121-124. Ligouri G dkk.,(2010). Comparison between  multiplex  PCR  and phenotypic  systems  for Candida spp identification. Medical Journal Indone sia a , 33:63-67. Maharani  S.,(2012),  Pengaruh  Pemberain Larutan Ektrak Siwak ( Salvadora persica ) Pada Berbagai  Konsentrasi  Terhadap Pertumbuhan Candida albicans. Semarang. Moran  P,  dkk.,  (2011). Candida  albicans versus Candida dubliniensis :Why  Is C.  albicans More Pathogenic. International Journal of Microbiology.7 pages.
Sandra  A.,  dkk.  (2010).  Identification    of
Candida spp  by  Phenotypic Test and PCR.. Brazilian Journal  of  Microbiology .41:
286-294.
Sukamto,  (2004)  Pemeriksaan  Jamur
Bilasan Bronkus Pada Penderita Bekas  Tuberkulosa  Paru.  USU digital library.
Tarini  dkk.,  (2010),  Development  of multiplex-PCR  assay  for  rapid detection  of Candida  spp , Medical  Journal    Indonesia . 19: 83-7.
Widyasari  K  dkk.,  (2012).  Invitro
susceptibility  of Candida  spp isolate from pulmonary tuberculosis  suspected  patients to  antifungal  agent  in  Jakarta. Journal of Medicine and Medical  Sciences .  Vol  3(3),pp 138-140.