Menara Perkebunan , 2008, 76(2), 61-73
Deteksi metilasi DNA  genom Elaeis guineensis Jacq hasil kultur jaringan dengan teknik Randomly Amplified Fingerprint (RAF) DNA dan Reverse Phase HPLC (RP-HPLC)
Analysis  DNA genom methylation of Elaeis guineensis Jacq from tissue culture by Randomly Amplified  Fingerprint DNA (RAF) and  Reverse Phase HPLC (RP-HPLC)
Nurita TORUAN-MATHIUS 1) ,  Nesti F. SIANIPAR 2) , G.A.WATTIMENA 3) , Hajrial ASWIDINNOOR 3) , Maggy THENAWIDJAYA-SUHARTONO 4)
&  Gale  GINTING 5)
1) PT SMART, Biotechnology Department, Plant Production Division, Bogor, Indonesia
2) Jurusan Biologi, Universitas Pelita Harapan, Jakarta, Indonesia
3) Jurusan Agronomi,  Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor,  Indonesia
4) Jurusan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor,  Indonesia
5) Balai Penelitian  Marihat,  Medan, Indonesia

## Summary
Embryo somatic (ES) abnormalities of  oil palm  were  probably  caused  by  numbers  and location  of    DNA  genom  cytosin  methylation. Quantity  of  methylation  could  be  determined by Reverse phase HPLC (RP-HPLC) techniques,  while  location  of  DNA  cytosin methylation was detected by Random Amplified Fingerprint  DNA  (RAF-DNA)  technique.  The objective  of    this  research  was  to  determine numbers    and  pattern  of  DNA  cytosin methylation    of  normal  or  abnormal  ES  and normal  ortet  as  a  standard.    DNA  genomic  of samples were cut by  HpaII and MspI enzymes at    CCGG  site,  and  amplified  by  RAF.  HpaII cut  at m CCGG    sequences,  but  if    second  C were methylated  the sequences can not be cut by  HpaII.While  Msp1  will  cut  if  internal  of cytosine was methylated  (C m CGG). The results showed  that  AB16,  AE11,  AO12  and    AP12 primers could detect the changes of methylation site on normal ortet and abnormal ES  cotyledone.    RP-HPLC  analyses  showed that  DNA  cytosin  methylation  content  between ES  globular  and  ES  cotyledone,  both  normal and  abnormal    and  also  normal  plantlet  and
ortet  were  unsignificantly  different.  DNA methyl  content  was  around      0.25  –  2.72  %. Internal  and  fully  methylation  was  found  on 124  –  457  bp.  Abnormal  ES    of  MK638  clone showed  the  hipomethylation  pattern.  It  was concluded  that  methylation  cytosine  content was  very  low  and  it  seems  that  DNA methylation  undirectly    affects  on  process  of morphology  abnormalities.    Abnormalities  of ES globular and cotyledone might be caused by the change of  DNA genom sequences.
[ Key  words: Oil  palm , DNA  methylation, embryo  somatic  -  abnormality, RAF-DNA, RP-HPLC]

## Ringkasan
Abnormalitas  pada  embrio  somatik  (ES) tanaman  kelapa  sawit  diduga  disebabkan  oleh kandungan  serta  lokasi  terjadinya  metilasi sitosin DNA genom. Kandungan metilasi dapat ditetapkan dengan teknik Reverse Phase HPLC (RP-HPLC),  sedang  lokasi  terjadinya metilasi sitosin DNA genom ES dapat dideteksi dengan teknik Random  Amplified  Fingerprint DNA (RAF-DNA).  Tujuan  penelitian  ini  adalah
Toruan – Mathius et al.
untuk  menetapkan  pola  metilasi  sitosin  DNA genom  ES  kotiledon  normal  dan  abnormal, sebagai pembanding adalah ortet yang normal. DNA  genom  contoh  dipotong  dengan  enzim Hpa II  dan Msp I  yang  mengenali  situs  CCGG, selanjutnya  diamplifikasi  dengan  RAF.  Enzim Hpa II memotong sekuen m CCGG tetapi jika C kedua  mengalami  metilasi  sekuen  tersebut tidak  terpotong. Msp 1  akan  memotong  apabila sitosin  internal  termetilasi  (C m CGG).  Hasil yang  diperoleh  menunjukkan  bahwa  terjadi perubahan    situs  metilasi  antara  ortet    normal dan  ES  kotiledon  abnormal.  Perubahan  situs metilasi sitosin dapat dibedakan dengan primer RAF,  yaitu  AB16,  AE11,  AO12  dan  AP12. Hasil  analisis  RP-HPLC  menunjukkan  bahwa perbedaan kandungan metilasi sitosin DNA ES globular  maupun  kotiledon  masing-masing antara  yang  normal  dan  abnormal,  serta  antara planlet  dan  ortet  normal  sangat  kecil. Kandungan metil sitosin berkisar antara 0,25 – 2,72  %.  Tampak  bahwa  pada  124  -  457  pb terjadi  metilasi  internal,  eksternal  maupun metilasi  penuh.  Pada  ES  abnormal  klon MK638  menunjukkan  terjadi  hipometilasi sitosin.  Perbedaan kandungan  metilasi sitosin yang  sangat  kecil  diduga  tidak  berpengaruh langsung terhadap proses abnormalitas. Abnormalitas  yang  terjadi  pada  ES  globular dan  kotiledon  kemungkinan  akibat  terjadinya perubahan sekuens DNA genom.

## Pendahuluan
Abnormalitas pembuahan pada tanaman  kelapa  sawit  asal  kultur  jaringan dikenal  dengan  istilah  mantel , yaitu mesokarp  tidak  berkembang  dan  dapat juga  terjadi    bunga  jantan  steril  (Corley et  al., 1986).  Abnormalitas  terjadi  pada rata-rata  5-10  %  dari  populasi  bibit  asal kultur  jaringan  (Jaligot et  al .,  2000),  dan bersifat  epigenetik  (Tregear et  al., 2002). Abnormalitas  yang  terjadi  pada  bibit klonal  kelapa  sawit  tersebut  diduga berhubungan  erat  dengan  perubahan  pola metilasi  DNA  selama  dalam  kultur
(Phillips et al ., 1990; Jaligot et al ., 2000). Matthes et  al .  (2001)  menyatakan  adanya korelasi  yang  nyata  antara  hipometilasi dengan  pembungaan  mantel  pada  bibit kelapa sawit asal kultur jaringan. Menurut Kaepller et  al .  (2000)  adanya  hubungan antara  hipermetilasi  dari  residu  sitosin DNA  dalam  gen  atau  promoter  gen  yang menekan  ekspresi  gen.  Grandbastein (1998)  mengemukakan  bahwa  akibat  ter- jadinya  metilasi  secara  konsisten  menye- babkan  adanya  abnormalitas  pembungaan tanaman  kelapa  sawit  setelah  beberapa tahun di lapang.
Berbagai  analisis  digunakan  untuk mengungkapkan  kejadian  abnormalitas bunga dan buah kelapa sawit yang berasal dari  kultur  jaringan.  Studi  ploidi  (Rival et al ., 2004) dan transposon (Kubis et al., 2003)  menunjukkan  bahwa  tidak  ada hubungan  abnormalitas  buah  bersayap dengan  perbedaan  ploidi  dan  aktivitas transposon,  tetapi  berhubungan  dengan perubahan pola metilasi DNA.
Bentuk  metilasi  DNA  genom  yang umum  adalah  metilasi  pada  basa  sitosin yang  dikatalisis  oleh  enzim  metiltrans- ferase  dengan  menambahkan  gugus  metil ke  basa  sitosin  (Martienssen  &  Colot, 2001).  Metilasi  DNA  pada  tanaman diimplikasikan  pada  pengaturan  ekspresi gen,  yaitu  berpengaruh  langsung  terhadap transkripsi  DNA    atau  tidak  langsung melalui  perubahan  struktur  kromatin (Antequera  &  Bird,  1988;  Adams,  1990). Kaliz  &  Purugganan  (2004)  melaporkan bahwa  ada  dua  tipe  utama  metilasi  yang dihubungkan  dengan  perubahan  epi- genetik,  yaitu  metilasi  DNA  dan    Histon. Gardner et  al .  (1991)  melaporkan  bahwa pada  eukariot    metilasi  yang  tinggi mengakibatkan  rendahnya  ekspresi  gen atau  sebaliknya.  Davey et  al .  (1997) berpendapat  bahwa  regulasi  ekspresi  gen terjadi melalui perubahan struktur
Deteksi metilasi DNA  genom Elaeis guineensis Jacq hasil kultur jaringan.....
kromatin  lokal.    Metilasi  dan  demetilasi sitosin  pada  daerah  promotor  merupakan mekanisme  yang  penting  meregulasi ekspresi gen pada sel dan jaringan spesifik (Boyes & Bird ,1991).
Fraga  &  Esteller  (2002)  menyatakan bahwa  metilasi  sitosin  pada  posisi  lima dari  cincin  pirimidin  merupakan  epi- genetik yang sangat penting pada tanaman,  metil  sitosin  umumnya  ditemu- kan  pada  sitosin  yang  terikat  pada  basa guanin  dengan  sekuens  trinukleotida (C p N p G).  Ehrlich  &  Ehrlich  (1998) mengemukakan bahwa adanya lima metilsitosin  pada  promoter  gen  spesifik akan mengubah pelekatan faktor transkrip- sional  dan  protein  lainnya  pada  DNA.  Di samping  itu  dapat  juga  terjadi  penarikan metil-DNA- binding protein  dan  histon deasetilase  yang  akan  mengubah  struktur kromatin di sekitar daerah awal trasnkripsi pada  gen.  Kedua  mekanisme  tersebut memblok  transkripsi  dan  menyebabkan gen silencing .  Wolffe et  al .  (1999) menyatakan  bahwa  residu  metilasi  C dalam  DNA  genomik  memegang  peranan dalam regulasi ekspresi gen.
Menurut    Lewin  (1997)  enzim Hpa II memotong sekuen CCGG tetapi apabila C keduanya  mengalami  metilasi,  sekuen tersebut  tidak  terpotong. Msp I  tidak memotong  apabila  C  eksternal  termetilasi ( m CCGG)  tetapi  akan  memotong  apabila sitosin  internal  termetilasi  (C m CGG) (McClelland et  al .,  1994).    Matthes et  al. (2001)  membuktikan  penurunan  metilasi diperoleh  pada  situs  CCGG.  Sekuen CCGG  ini  berhubungan  dengan  ekspresi gen  karena  ditemui  juga  pada  daerah promotor,  yaitu  pada  GC  boks.  Metilasi DNA  dapat  menghambat  transkripsi secara  langsung  dengan  menghalangi penempelan faktor transkripsi ke promotor.  Ng  &  Bird  (1999)  menge- mukakan  pembentukan  struktur  kromatin
pada  tempat  yang  termetilasi  merupakan penyebab tidak aktifnya transkripsi.
Beberapa  teknik  digunakan  untuk mempelajari  keberadaan  atau    lokasi  ter- jadinya  metil  sitosin  dalam  genom,  salah satunya dengan teknik
Randomly
Amplified  Fingerprinting (RAF) DNA, yaitu  teknik  yang  mengkombinasikan antara  teknik    RFLP  dan  cDNA Ampli- fication  Fingerprinting (DAF).    Dalam teknik  RAF,  pada  tahap  awal    DNA genom  dipotong  dengan  enzim  kemudian diamplifikasi  menggunakan  teknik  RAF. Sedang  tingkat  metil  sitosin  dalam  DNA genom  dapat  diukur  dengan Reverese Phase High Performance Liquid Chroma- tography (RP-HPLC)  atau  dengan  sistem enzim  maupun  kimiawi  (Fraga et  al., 2002). Matthes et al. (2001) membuktikan penurunan  metilasi  diperoleh  pada  situs CCGG.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  me- netapkan  kuantitas  metilasi  DNA  sitosin dan posisi terjadinya metilasi dihubungkan dengan  abnormalitas  pada  ortet,  embrio somatik  serta  planlet,  masing-masing menggunakan teknik RP-HPLC dan teknik RAF.

## Bahan dan Metode
Bahan  tanam  yang  digunakan  dalam percobaan ini adalah ES fase globular dan kotiledon,  sedang  planlet  dan  ortet digunakan  sebagai  pembanding.  Masing- masing  sampel  dari     klon MK  638   yang memiliki morfologi normal dan abnormal. Penetapan  bentuk  normal  dan  abnormal berdasarkan  Sianipar et al .  (2007). DNA contoh  diisolasi  menggunakan  metode Orozco-Castillo et  al. (1994)  dengan memodifikasi  beberapa  komponen  dalam proses  awal  ekstrasi  DNA.  Uji  kualitas dan  penetapan  kuantitas  DNA  dilakukan
Toruan-Mathius et al.
dengan  metode  elektroforesis  gel  agarose menurut  Sambrook et al. (1989).
Deteksi  situs  metilasi  DNA  dengan  teknik RAF-sensitif metilasi
Deteksi  situs  metilasi  sitosin  DNA yang  digunakan  berdasarkan  protokol RAF menurut Waldron et  al .  (2002) yang dimodifikasi, khususnya pemotongan DNA  genom  yang  diuji  dengan  enzim sensitif  metilasi  DNA.  Sebanyak    0,5  µg DNA  genom  yang  diuji  dipotong    dengan 5  U Hpa II  dan  5  U Msp I,  dalam    5  µL bufer  Tango  10  X  yang  mengandung 10  mM  Tris-Asam  asetat  pH  7,4;  10  mM Magnesium  asetat;  66  mM  Potasium asetat;  dan  0,1  mg/mL  BSA    diinkubasi pada  suhu  37 o C    selama  dua  jam.  Hasil pemotongan  enzim  difraksinasi  dengan elektroforesis  1,4  %  gel  agarose  dalam bufer  1  x  TAE,  dan  diberi  pewarnaan 0,5  ug/mL  etidium  bromida.  DNA  yang telah  dipotong  dengan  enzim Hpa II  dan Msp I diencerkan 10 kali dengan bufer TE kemudian  disimpan  di  lemari  pendingin untuk digunakan dalam percobaan selanjutnya.
Teknik RAF-sensitif metilasi
Amplifikasi DNA dengan PCR dilakukan  berdasarkan  metode  Waldron et  al .  (2002)  menggunakan  empat  primer RAF  10-mer.  Sebelum  melakukan  PCR dibuat  campuran  utama  (master  mix)  lalu di masukkan ke dalam Eppendorf 0,5 mL. Selanjutnya  sebanyak  5  µL  (10ng/µL) DNA  dari  masing-masing  contoh  yang diuji  dimasukkan  ke  dalam  Eppendorf 0,2  mL  steril,  kemudian  ditambahkan 15  µ L campuran  utama    dan    disentri- fugasi  dengan  kecepatan    5000  rpm selama lima menit.
Amplifikasi DNA yang telah dipotong dengan  enzim Msp I  atau Hpa II  dilakukan menggunakan  primer  10-mer  oligonuk- leotida  yang  sudah  dilabel  dengan  FAM (6-  karboksi  fluoresein).  Reaksi  amplifi- kasi dilakukan menggunakan alat Thermal cycler Gene  PCR  (ABI  9700)  dengan siklus  termal  sebanyak  30  kali  dengan tahapan    sebagai  berikut  :  denaturasi  lima menit pada suhu 94°C kemudian setengah menit  pada  suhu  94°C;  penempelan  satu menit  pada  suhu  57°C,  satu  menit  pada suhu  56°C,  satu  menit  pada  suhu  55°C, satu  menit  suhu  54°C,  satu  menit  53°C dan  waktu  ekstensi  (tahap  ramping)  lima menit  pada  suhu  tetap  72°C.  Hasil  PCR diencerkan  sebanyak  10  kali  dengan  TE bufer dan disimpan pada suhu -20 o C. Fragmentasi  DNA  hasil  amplifikasi dilakukan  dengan  elektroforesis  meng- gunakan  2  µL  sampel  ditambah  dengan 0,2  uL  Gene  Scan TM -500  LIZ  dan  7,8µL HiDi  pewarna  formamid.  Campuran didenaturasi pada suhu 95 o C selama lima menit dan didinginkan dalam es selama 10 menit.    Campuran  kemudian  dimasukkan ke  dalam  kapiler  yang  panjangnya  50  cm pada  alat    3130  DNA  Analyser  (Applied Biosystems) selama 32 menit untuk empat contoh. Data berupa fragmen RAF-sensitif metilasi    adalah    dalam  bentuk  elektro- ferogram,  yang  disimpan  menggunakan software ABI 3130.

## Kuantifikasi  metilasi  sitosin  dengan  RP- HPLC
DNA  genom  diisolasi  dari  0,5  g bahan  tanam  yang  diuji  menurut  metode Orozco-Castillo et  al .  (1994).  Tingkat metilasi absolut diukur dengan teknik RP- HPLC  dengan  metode  enzimatik  menurut Kubis et  al. (2003).  Sebanyak  1-10  µg DNA  yang  diuji  diencerkan  dalam  air,
Deteksi metilasi DNA  genom Elaeis guineensis Jacq hasil kultur jaringan.....
selanjutnya  dipanaskan  selama  dua  menit dalam  air  mendidih  dan  segera  didingin- kan  dalam  es.  Sebanyak  5  µL  10  mM ZnSO4  dan  10  µL  nuklease  S1  (1U/µ L dalam  30  mM  Sodium  asetat  pH  5,4) ditambahkan  kemasing-masing  sampel dan  campuran  kemudian  diinkubasi  pada 37 o C  selama  16  jam.  Sebanyak  10  µL dari 0,5 M Tris  pH 8,3 dan 10 µL  alkalin fosfatase (Sigma, 100 U/mL dalam 2,5 M amonium sulfat) dan campuran diinkubasi pada  suhu  37 o C  selama  dua  jam,  dan disentrifugasi untuk membuang protein.
Sebanyak  20  µL  sampel  DNA  yang diuji  disuntikkan  ke  dalam  suatu  kolom superkoil  LC-18S  (150  mm  x  4,6  mm, Supelco)  dan  dipisahkan  dengan  alat Waters  otomatis  HPLC.  Elusi  dilakukan dalam  fase  mobil  pada  0,05  M  NH 4 H 2 PO 4 ,  8%  metanol  pH  4,2  dengan kecepatan  aliran  1  mL/menit  pada  suhu ruang.  Identifikasi  puncak    nukleosida spesifik  yang  diperoleh    dibandingkan dengan  sampel  standar  sitidin,  5-metil- sitidin  dan  campuran  uji  nukleosida. Pengujian  dilakukan  secara  duplo.  Basa nukleotida dideteksi pada 254 nm, sedang presentase  5-metilsitidin  (5mC)  dihitung dengan rumus  (5 mC/[5mC + C] x 100.

## Hasil dan Pembahasan
Deteksi  situs  metilasi  sitosin  dengan teknik RAF
Hasil  RAF    yang  diperoleh  meng- hasilkan  fragmen  DNA  yang    polimorfis dalam    bentuk  elektroferogram  (Gambar 1).  Pola  metilasi  yang  diperoleh  setelah pemotongan Msp I  dan Hpa II   dari  ortet normal  dan  ES  kotiledon  abnormal menghasilkan  tiga    kelas  fragmen,  yaitu terjadinya metilasi penuh ( fully-metilated ), etilasi internal ( hemimetilated ) dan metilasi eksternal.
Dari  enam  primer  yang  diuji  ternyata hanya primer AB-16, AE - 11, AO-12 dan AP-20  yang  dapat  mengamplifikasi  DNA contoh  setelah  dipotong  dengan  enzim Msp I  dan Hpa II.  Amplifikasi  DNA genom ES kotiledon normal menggunakan primer AB-16 menunjukkan bahwa terjadi metilasi sitosin  pada lokasi sekitar 124 pb sampai 385 pb. Namun, pada ES kotiledon abnormal  di  lokasi  yang  sama  (124  pb) tidak  ditemukan    metilasi  sitosin  terme- tilasi.  Hal  ini  berarti  terjadi  perubahan sekuens basa DNA sehingga DNA genom ES kotiledon normal sebagai cetakan tidak komplemen  dengan    basa-basa  nukleotida primer AB-16.
Hasil  elektroforegram  menunjukkan bahwa  pada  ortet  normal  terjadi  metilasi penuh  ( m C m CGG)  yang  terdapat  di  lokasi sekitar  124  pb  (Tabel  1  &  Gambar  1). Tampak bahwa  pola metilasi yang terjadi pada  ortet  normal  dan  ES  kotiledon abnormal  adalah  berbeda.  Pada  ortet normal  situs  metilasi  sitosin  terdapat  di sekitar  124  pb  dan  378  pb,  sedangkan pada  ES  kotiledon  abnormal    dilokasi sekitar  138  pb,  375  pb  dan  385  pb.  Pada ES  kotiledon  abnormal  terjadi  metilasi eksternal pada sekitar 375 pb dan 385 pb, serta metilasi penuh di situs 138 pb (Tabel 1 & Gambar 1).
Menurut McCleland et al . (1994) dan Belluci et  al .  (2002)  enzim Msp I  hanya memotong    C 5m CGG,  tetapi  tidak  me- motong  pada 5m CCGG.  Oleh  sebab  itu metilasi internal terdeteksi dengan pemotongan enzim Msp I yang  tidak dapat memotong  pada  sitosin,  karena  sitosin termetilasi  (C 5m CGG).  Hasil  RAF  dari DNA  ortet  normal  dengan  primer  AE- 11(5’-AAGACCGGGA-3’)  menunjukkan bahwa  terjadi  metilasi  secara  penuh  pada 168  pb,  sedangkan    pada  446  pb  dan  457 pb  terjadi  metilasi  internal.  Pada  ES kotiledon  abnormal    terjadi  mutasi  titik
Toruan-Mathius et al.
pada  168  pb  dan  446  pb,    dan    metilasi internal pada 457 pb. Tampak bahwa baik pada  ortet normal maupun  ES  kotiledon abnormal    terjadi  metilasi  internal  di lokasi  sekitar  457  pb  (Tabel  1  &  Gambar 1).
Hasil  amplifikasi  DNA  genom  tanpa dan  dengan  pemotongan  enzim  meng- gunakan  primer  AO-12  (5’-TCCCGG TCTC-3’),  menunjukkan    bahwa  pada ortet  normal  terjadi  metilasi  penuh  pada
lokasi sekitar 195 pb dan 290 pb. Pada ES kotiledon  abnormal  terjadi  mutasi  titik pada lokasi 195 pb dan 290 pb (Tabel 1 & Gambar 1).  Hal  ini berarti  primer AO 12 komplemen dengan DNA tanaman normal,    sedangkan  pada  ES  kotiledon abnormal  tidak  komplemen.  Hasil  yang diperoleh  kemungkinan  disebabkan    ada- nya  perubahan  satu  basa  dalam  sekuens DNA  genom  ES  abnormal,  yang  disebut sebagai mutasi titik.
Gambar  1.  Deteksi  fluoresen  teknik  RAF  dengan  primer  AB-16  (5’-CCCGGATGGT-3’)  yang  dilabel dengan  FAM  (6-carboxy-fluorecein)  pada  tanaman  kelapa  sawit      klon  MK638.  (  R1-EG) ortet normal. (R1-2K-) kotiledon abnormal,  (HR1-EG) ortet normal dipotong dengan Hpa II,  (HR1-2K-)    ES  kotiledon  abnormal  dipotong  dengan Hpa II,  (MR1-EG)    ortet  normal dipotong dengan Msp I, (MR1-2K-) ES kotiledon abnormal dipotong dengan Msp I.
Figure  1.      RAF    fluorescense  detection  with  AB-16  (5’-CCCGGATGGT-3’)  primer  labeled  with  FAM (6-carboxy-fluorecein)  of  oil  palm  MK  638  clone.  (  R1-EG)  normal    ortet.    (R1-2K-) abnormal  cotyledone,    (HR1-EG)  normal    ortet    cut  by  Hpa II ,  (HR1-2K-)    abnormal  ES cotyledone  cut by  Hpa II , (MR1-EG)  normal ortet cut by Msp I , (MR1-2K-) abnormal ES cotyledone  cut by  Msp I .
R1_EG
110     120      130    140      150     160      170     180     190     200    210   205      215     225        235        245       255       265        275        285 800 400 400 800 R1_2k- 110   120      130     140     150     160     170     180     190     200    210  205      215       225        235        245       255       265        275         285 0 0 800 400 800 0 0 400 0 200 400 HR1_EG 110    120     130     140       150    160      170     180     190     200     210  205      215      225        235        245       255       265        275        285 0 200 400 0 200 400 HR1_2k- 110    120      130    140      150     160      170     180     190     200     210  205      215       225        235       245       255       265        275       285 0 200
400
MR1_EG 110     120    130     140      150     160      170     180     190     200    210  205      215      225        235       245       255       265        275       285 MR1_2k- 110    120      130    140      150     160      170     180     190     200    210   205     215      225        235        245       255       265        275       285 0 200 400 0 200 400 0 200 400 0 200 400
Deteksi metilasi DNA  genom Elaeis guineensis Jacq hasil kultur jaringan.....
Tabel 1. Hasil deteksi lokasi  metilasi sitosin  DNA genom dengan metode RAF   pada klon MK 638. Table 1. Location detection of DNA genom methylated  cytosine by RAF technique  of  MK 638 clone.
Primer AB-16 (5’-CCCGGATGGT-3’) Contoh Sample Utuh Full Dipotong dengan Cut by Hpa II Msp I
Keterangan
Explanation Band (pb) 124 EG 2K- + - + - + - Metilasi penuh (Fully methylation) m C m CGG
Mutasi  titik (Point  mutation) 138 EG 2K- -
+ - + - +
Primer tidak komplemen (Uncomplemented primer) Metilasi penuh (Fully methylation) m C m CGG
Mutasi  titik (Point mutation) 375 EG 2K- - + - + - - Tidak ada homologi (Non homology)
Mutasi  titik dan metilasi eksternal (Point  and eksternal methylation) m CCGG 378 EG 2K- + - + - + - Metlasi penuh (Fully methylation) m C m CGG Mutasi  titik (Point mutation) 385 EG 2K- - + - + - - Primer tidak komplemen (Uncomplemented primer )
Mutasi  titik dan metilasi eksternal
(Point mutation and external methylation) Metilasi penuh (Fully methylation) m CCGG
Primer AE-11
(5’-AAGACCGGGA-3’)
Band (pb) 168 EG 2K- + - + - + -
Metilasi penuh (Full methylation) m C m CGG
Mutasi  titik (Point methylation) 446 EG 2K- + - + - - - Metilasi eksternal (External methylation) m CCGG
Mutasi  titik (Point mutation) 457 EG 2K- + + - - + + Metilasi internal (Internal mutation)
Metilasi internal (Internal methylation)
Primer AO-12 (5’-TCCCGGTCTC-3’)
Band (pb) 195 EG 2K- + - + - + - Metilasi penuh (Fullmethylation) Mutasi  titik (Point mutation) 290 EG 2K- + - + - + - Metilasi penuh (Full methylation) m C m CGG Mutasi  titik (Point mutation)
Primer AP-20 (5’-CCCGGATACA-3’)
Band (pb) 235 EG 2K- - + - + - - Tidak ada homologi (Nonhomology)
Metilasi eksternal dan mutasi titik (External methylation  and point mutation) m CCGG
Keterangan  : EG (ortet normal), 2K- (ES kotiledon abnormal), ada fragmen  (+),  tidak ada fragmen (-)
Explanation : EG (normal ortet ), 2K- (Abnormal ES cotyledon), fragment present   (+), No fragment (-)
Toruan-Mathius et al.
DNA genom ES kotiledon abnormal yang dipotong  dengan  enzim Hpa II  dan Msp I kemudian  diamplifikasi  dengan  primer AO-11,  menunjukkan  tidak  kom-plemen sehingga  tidak  terdeteksi  terjadi-  nya metilasi.  Namur  demikian,  terjadi  mutasi titik  pada  lokasi  195  pb  dan  290  pb. Amplifikasi  DNA  genom  ES  abnormal dengan primer AP-20 (5’-CCGGATACA- 3’)    memberikan    hasil  bahwa  terjadi metilasi  eksternal  dan  mutasi  titik  pada lokasi sekitar 235 pb (Tabel 1).
Penggunaan Msp I  dan Hpa II  sebagai enzim  pemotong  DNA  genom  dengan tujuan  untuk  mendeteksi  lokasi  terjadinya metilasi  sitosin  sudah  digunakan  pada beberapa  tanaman,  yaitu  padi,  apel, arabidopsis  dan Pisum. Metode  ini  telah digunakan untuk mengetahui metilasi CpG dengan    menggunakan  enzim  pengenal pada  situs  CCGG,  yaitu  pada  genom  padi (Xiong et  al .,  1999),  karakterisasi  per- ubahan    metilasi    yang  berkaitan  dengan mikropropagasi    Apel  (Xu et  al., 2004), dan  variasi  somaklonal  kelapa  sawit (Matthes et al ., 2001). Empat  dari  enam  primer  yang  diuji, yaitu  AB-16  ,  AE-11,  AO-12  dan  AP-20 dapat  mendeteksi  terjadinya  metilasi internal,  metilasi  eksternal,  dan  metilasi penuh  pada  DNA  genom  ES  kotiledon abnormal  dan  ortet  normal.  Bird  (1996) menyatakan  bahwa  metilasi  DNA  terjadi pada  tempat  spesifik  genom  eukariot termetilasi  adalah  tidak  seragam.  Hanya daerah  spesifik  yang  termetilasi,  sedang- kan  domain  lain  yang  tersisa  tidak termetilasi.  Sebagian  besar  kelompok metil  ditemukan  pada  CG.  DNA  eukariot tingkat  tinggi,  termetilasi  pada    C  dari beberapa  sitosin.  Shapiro  (1976)  dan Matassi et  al .  (1992)  melaporkan  bahwa proporsi sitosin yang termodifikasi dengan
metilsitosin(5-mC)    lebih  dari  30  %  pada beberapa spesies tanaman.
Abnormalitas  ES  kotiledon  yang terjadi  dalam  penelitian  perbanyakan tanaman  kelapa  sawit  melalui  kultur jaringan, diduga disebabkan variasi somaklonal  selama dalam   kultur.    Larkin &  Scowcroft  (1981)  menyebutkan  variasi pada  tanaman  yang  diregenerasi  secara in vitro sebagai variasi somaklonal.  Menurut Leroy  &  Branchard  (2000)  perubahan kromosom  terjadi  dengan  frekuensi  yang tinggi pada tahap awal atau kultur sel cair, adalah  sebagai  penyebab  abnormalitas. Chen et al . (1988) dan  Miura et al . (2001) menyatakan bahwa abnormalitas fenotipik dapat  disebabkan  oleh  akumulasi  mutasi. Menurut  Kakutani et  al. (1996)  hipo- metilasi  DNA  dapat  meningkatkan  laju mutasi  karena  terjadi  transposisi  elemen atau peningkatan laju rekombinasi penyusunan genom kembali.
Van  Harten  (1998)  dan  Hershkovitz et  al. (1990)  menyatakan  ketidakaturan mitotik  berperan  dalam  ketidakstabilan kromosom,  terjadi  amplifikasi  gen  atau delesi  dan  inaktif  gen  atau  aktif  kembali gen-gen  silent.  Beberapa  aktivitas  gen tanaman  muncul  berhubungan  dengan metilasi  sedangkan  gen-gen  lain  tidak mengalami-nya,  sehingga  dikatakan  ada regulasi perubahan gen melalui perubahan metilasi in  vitro Transposisi  dan  pindah silang  disebutkan  juga  sebagai  faktor penyebab.    Menurut    Pesche  &  Phillips (1992) beberapa tipe utama variasi genetik terjadi  karena  (1)  aktivasi  elemen  tran- sposon,  (2)  aberasi  kromosom,  dan  (3) perubahan metilasi.
Pada  tanaman  tingkat  tinggi  5m-C ditemukan  pada  beberapa  sekuens  genom nuklear, yang lebih sering ditemukan pada dinukleotida  CG  dan  trinukleotida  CNG.
Metilasi  sitosin    pada  nukleotida  CG  dan CNG ditemukan sepanjang kromosom dan
bertindak  meregulasi  ekspresi  gen  yang terjadi, pada level gen  atau secara
Deteksi metilasi DNA  genom Elaeis guineensis Jacq hasil kultur jaringan.....
regional  yang  mempengaruhi  daerah  kro- mosom.  Fungsi  metilasi  regional  adalah untuk  menginaktifkan  heterokromatin  dan elemen  pada  atau  dekat  heterokromatin yang  menyebabkan  frekuensi  metilasi pada  daerah  kromatin  lebih  besar  (Bird, 1986).  Struktur    heterokromatin  memper- lambat  transkripsi,  sedangkan  struktur eukromatin mengaktivasi gen (Richards & Elgin, 2000). Beberapa pendapat menyata- kan  bahwa  regulasi  gen  terjadi  melalui perubahan struktur kromatin lokal (Davey et al ., 1997).
Dapat  disimpulkan  bahwa  pada  ortet normal  primer AB-16, AE-11, dan AO-12 sedangkan  pada  ES  kotiledon  abnormal hanya primer AB-16 yang dapat mendeteksi  metilasi  penuh.  Situs  terjadi- nya  metilasi  penuh  berbeda  pada  ortet normal dan ES kotiledon abnormal.
Kuantifikasi    metilasi  sistosin  dengan teknik RP-HPLC
Kandungan  metil  sitosin  dari  ES  fase kotiledon,  ES  globular,  planlet  dan  ortet yang normal dan abnormal adalah  sangat kecil. Pada klon 638 perbedaan kandungan metilsitosin antara ES globular normal dan abnormal  0,64  %,  antara    ES  kotiledon normal  dan  abnormal  0,25  %,  antara planlet  dan  ortet  normal  2,72%.    Data  ini menunjukkkan perubahan kandungan metil  sitosin  antara  ES  globular  normal dan  abnormal  menurun,  perubahan  ini disebut  hipometilasi  (Gambar  2).    Hal  ini menunjukkan  bahwa  perubahan    metilasi sitosin pada DNA genom ES globular, ES kotiledon,  planlet  dan  ortet    tidak berhubungan  langsung  dengan  proses abnormalitas.    Abnormalitas  yang  terjadi diduga  kemungkinan  disebabkan  oleh perubahan  sekuens  DNA  genom  atau
mutasi.  Hal  ini  masih  perlu  untuk  diteliti lebih lanjut.
Baurens et  al. (2003)  mengatakan bahwa  untuk  mempelajari  metilasi  sitosin pada  DNA  genom  dengan  pengukuran jumlah  sitosin  yang  termetilasi  pada tingkat  genom,  membutuhkan  degradasi lengkap  DNA  secara  enzimatik.  Namun metode ini tidak  dapat  menentukan  lokasi sitosin  termetilasi  pada  genom.  Menurut Rival et  al .  (2004)  ditemukan  juga hipometilasi  pada  kalus  pertumbuhan cepat  (100%  regeran  abnormal)  diban- dingkan  dengan  kalus  kompak  (5% regeneran  abnormal)  pada    klon  yang sama.    Shah et  al .  (1999)  membuktikan terjadi  hipermetilasi  pada  tanaman  kelapa sawit  abnormal.    Kubis et  al .  (2003) menyatakan    perbedaan  tingkat  metilasi sitosin  antara    kalus    dan  ortet  adalah sekitar  2,2  %,  atau  tidak  berbeda  nyata. Tingkat metilasi lebih rendah pada pohon- pohon  yang  berasal  dari  klon  buah bersayap dibandingkan dengan ortet tetua Chen et  al .  (1988)  dan    Miura et  al . (2001)  mengatakan  bahwa  abnormalitas fenotipik  disebabkan  akumulasi  mutasi. Finnegan et al . (1996) menyatakan bahwa sejumlah  aberasi  perkembangan  yang terjadi, dihipotesiskan sebagai hasil hipometilasi genom global yang  diinduksi secara  genetik  atau  epigenetik  dalam sekuens  tunggal  pada  tanaman  maupun hewan. Kakutani et al . (1996) menemukan terjadinya  hipometilasi    sitosin  pada tanaman Arabidopsis thaliana yang termutasi. Jacobsen & Meyerowitz (1997) menyatakan  bahwa  hipotemetilasi  DNA dapat  meningkatkan  laju  mutasi  karena terjadi  transposisi  elemen  atau  pening- katan laju rekombinasi penyusunan kembali  genom.  Perubahan  pada  level metilasi  menginduksi  mutasi  atau  supresi
gen.  Metilasi  menyebabkan  perubahan morfologi  dan  fisiologi  secara  nyata  pada
tanaman.
Toruan-Mathius et al.
Gambar  3. Persentase 5-metilsitosin dari embriosomatik, planlet dan ortet normal klon MK 638.
Figure    3. 5-methylcytosin percentage of embryosomatic, plantlet and normal ortet of MK 638 clone.
Kaeppler  &  Phillips  (1993)  melapor- kan bahwa perubahan metilasi DNA dapat menghasilkan  perubahan  struktur  kro- matin,  sehingga  replikasi  terlambat  pada heterokromatin,  kekacauan  kromosom, perubahan ekspresi gen. Hipometilasi pada kromosom  spesifik  berhubungan  dengan ketidakstabilan  kromosom  sebagai  penye- bab kekacauan kromosom, atau efek dosis gen yang abnormal karena kehilangan atau pertambahan fragmen kromosom. Fraga & Esteller  (2002)  menyatakan  bahwa  meti- lasi  sitosin  pada  posisi  lima  dari  cincin pirimidin    merupakan  epigenetik  yang sangat penting pada tanaman, metil sitosin umumnya  ditemukan  pada  sitosin  yang terikat  pada  basa  guanin  dengan  sekuens trinukleotida (C p N p G). Sebagian besar hipotesis pola metilasi yang  terbentuk  selama  perkembangan mengalami  demetilasi  pada  jaringan spesifik  dimana  kelompok  metil  dilepas- kan dari tempat kritis dari suatu gen yang telah dijadwalkan terekspresi pada tipe sel tertentu.  Pada  perkembangan  awal  sel embrio,  sebagian  besar  gen  termetilasi
kemudian  diferensiasi  sel  membentuk jaringan  spesifik  terjadi  penghilangan kelompok  metil  pada  basa  sitosin  atau demetilasi  menyebabkan  gen-gen  ter- ekspresi  pada  jaringan  tersebut  (Gardner et  al .,  1991).  Lewin    (1997)  juga  me- ngatakan  kondisi  metilasi  dapat  hilang dengan  dua  cara  yaitu  gagal  terjadi metilasi  pada  situs  hemimetilasi  dan diturunkan  melalui  replikasi  selanjutnya dan gugus metil secara efektif dihilangkan oleh enzim demetilase.
Untuk  lebih  memahami  fenomena abnormalitas  pada  embrio  somatik  yang dihasilkan  dari  perbanyakan  tanaman kelapa  sawit  menggunakan  teknik  kultur jaringan, diperlukan penelitian lebih lanjut menggunakan  lebih  banyak  klon  dan berbagai  tingkat  perkembangan  embrio somatik.

## Kesimpulan
Teknik  RAF  menggunakan  primer AB-16,  AE-11,  AO-12  dan  AP-12  dapat mendeteksi  situs  atau  lokasi  terjadinya
60 10 50 0 40 30 20 P ers en ta se 5 m C P er ce n ta g e o f 5 m C Asal DNA contoh Origin of DNA sample
Globular Normal (Normal globular)
Globular Abnormal (Abnormal globular)
Kotiledon Normal (Normal cotyledone)
Kotiledon Abnormal (Abnormal cotyledone)
Planlet (Plantlet)
Ortet (Ortet)
metilasi  pada  ES  kotiledon  abnormal  dan ortet  normal.  Terjadi  metilasi  internal,
eksternal dan penuh  pada 124 bp- 457 bp untuk  ES  kotiledon  abnormal  maupun Deteksi metilasi DNA  genom Elaeis guineensis Jacq hasil kultur jaringan.....
ortet normal Perbedaan kandungan
metilasi sitosin  antara ES globular normal dan abnormal, antara ES kotiledon normal dan  abnormal,  antara  planlet  dan    ortet normal  adalah berkisar  antara  0,25  – 2,72 %,  artinya  terjadi  hipometilasi.  Hal  ini mengindikasikan  bahwa    metilasi  sitosin tidak  berpengaruh  langsung  terhadap proses  abnormalitas  pada  embriosomatik tanaman kelapa sawit.

## Ucapan Terimakasih
Penelitian  ini  didanai  oleh  Dewan Riset  Nasional  dalam  proyek  ”RUSNAS KELAPA  SAWIT”  untuk  tahun  2007, yang  pelaksananannya  dilakukan  di  Lab. Plant  Tree  Breeding  and  Biotechnology, SEAMEO  BIOTROP.  Untuk  penelitian analisis RAF dilaksanakan di laboratorium Biotechnology PT BISI, Surabaya.

## Daftar Pustaka
Adams,  R.L.P.  (1990).  DNA  methylation.  The effect  of  minor  bases  on  DNA-protein interaction. Biochem J ., 265 , 309-320.
Antequera,  F.  &  A.P.  Bird  (1988).  Unmethy- lation CpG island association with gene in higher  plant  DNA. EMBO  J ., 7 ,  2295- 2299.
Baurens,  F.C,  F.  Bonnot,  D.    Bienvenu, S.  Causse  &  T.  Legavre  (2003).  Using SD-AFLP  and  MSAP  to  asses  CCGG methylation  in  the  banana  genome. Plant Mol. Biol. Rep., 21 , 339-348.
Belluci,  M.  F.,  F.  Paolocci,  Damiani  & S. Arcioni (2002). Plant DNA methylation and  gene  expression. In Jain,  S.M. et.al . (Eds). Molecular  Techniques  in  Crop Improvement. USA,  Kluwer  Academic Pub. p. 501-509.
Bird,  A.P.  (1996).  Gene  number,  noise reduction  and  biological  complexity. Trends Genet., 11 , 94-100.
Bird  AP.  (1986).    CpG-rich  islands  and  the function  of  DNA  methylation. Nature
321, 209 – 213.
Boyes, J. & A. Bird (1991). DNA methylation inhibits  transcription  indirectly  via  a methyl-CpG  binding  protein. Cell, 64 , 1123–1134.
Chen, R.Z., U. Pettersson, C. Beard, L.  Jackson-Grusby  &  R.  Jaenisch  (1988). DNA  hypomethylation  leads  to  elevated mutation rates. Nature, 395, 89-93.
Corley,  R.H.V.,  C.H.  Lee,  I.H.  Law  & C.Y.  Wong  (1986).  Abnormal  flower development  in  oil  palm  clones. Planter,
62 , 233-240.
Davey, C., S. Pennings  & J.Allen (1997). CpG methylation re-models chromatin structure in vitro . J. Mo.l Biol ., 267, 276 -288.
Ehrlich, M.  & K. C. Ehrlich (1993). Effect of DNA  methylation  on  the  binding  of vertebrate and plant proteins to DNA. EXS 64 , 145-168.
Finnegan,  E.J.,  W.J.  Peacock  &  E.S.  Dennis
(1996).  Reduce  DNA  methylation  in Arabidopsis  thaliana results  in  abnormal plant  development. In.  Proc.  Natl.  Acad.
Sci. USA., 93, 8449 – 8454.
Fraga,  M.F.  &  M.  Esteller  (2002).  DNA methylation:  A  profile  of  methods  and applications. Bio Tech ., 33 , 632-649.
Gardner,  E.J.,  M.J.Simmons  &  D.P  Snustad (1991). Principle of Genetics . 8 th edition. New  York,  John  Wiley  &  Sons,  Inc. 649 p.
Grandbastein, M.A. (1998). Activation of plant retrotransposons  under  stress  conditions.
Trends Plant Sci ., 3, 181-187.
Toruan-Mathius et al.
Hershkovitz,  M.,  Y.  Gruenbaum,  P.  Renbaum,
A.  Razin  &  A.    Loyer  (1990).  Effect  of
CpG  methylation  on  gene  expression  in transfected plant protoplasts. Gene, 94 , 189-193.
Jacobsen,    S.E.  &  E.M.  Meyerowitz  (1997). Hypermethylated SUPERMAN epigenetic alleles in Arabidopsis. Science , 277 , 1100 – 1103. Jaligot  E.,  A.  Rival,  T.  Beule,  S.  Dussert,  & J.L.  Verdeil  (2000).  Somaclonal  variation in  oil  palm  ( Elaeis  guineensis Jacq.):  the DNA  methylation  hypothesis. Plant  Cell Rep ., 19 (7), 684 - 690. Kaepller,  S.M.,  H.F.  Kaeplller  &  Y.  Rhee (2000).  Epigenetic  aspects  of  somaclonal variation  in  plants. Plant  Mol.  Biol ., 43 ,179-188.
Kaeppler,  S.M.  &  R.L.  Phillips  (1993).  Tissue culture-induce DNA methylation variation in maize. PNAS, 90 (19), 8773-8776.
Kalisz,    S.  &  M.D.  Purugganan  (2004). Epiallelesvia DNA methylation: consequences  for  plant  evolution. Trends in Ecol.& Evol., 19 (6), 309 – 314.
Kakutani,  T.,  J.A.  Jeddeloh,  S.K.  Flowers, K.  Minakota  &  E.  J.  Richards  (1996). Developmental  abnormalities  and  epimu- tations  association  with  DNA  hypo- methylation  mutation. PNAS, 93 (22), 12406 – 12411.
Kubis,  S.  E.,  A.  M.  M.  .F.  Castilho, A.V.  Vershinin  &  J.  S.  Helsop-Harrison (2003).  Retroelements,  transposons  and methylation  status  in  the  genome  of  oil palm ( Elaeis guineensis ) and the relationship to somaclonal variation. Plant Mol. Biol., 52 , 69-79.
Larkin,  P.  J.  &  W.  R.  Scowcroft  (1981). Somaclonal  variation-A  novel  source  of variatiability  from  cell  culture  for  plant
improvement. Theor.  Appl.  Genet., 60,
167-214.
Leroy,  X.J.,  K.  Leon  &  M.  Branchard  (2000). BIP-ISSR  and  Somaclonal  variation:  a new  molecular  technique  for  a  important in  vitro  phenomenon. Electronic  J.  of Biotech ., 3 , 10-11.
Lewin,  B.  (1997). Genes  VI .  New  York, Oxford Univ. Press. 1260p.
Martienssen,  R.A.  &  V.  Colot    (2001).  DNA methylation  and  epigenetic  inheritance  in plants  and  filamentous  fungi. Science,
293 ,  1070-1074.
Matthes,  M.,  R.Singh,  S.C.  Cheah  &  A.  Karp (2001).  Variation  in  oil  palm  ( Elaeis quineensis Jacq.)  tissue  culture-derived regenerants  revealed  by  AFLPs  with methylation-sensitive  enzymes. Theor. Appl. Genet ., 102, 971-979.
Matassi,  G.,  R.  Melis,  K.C.  Kuo,  G.    Macaya,
C.W.  Gehrke  &  G.  Bernardi  (1992).
Large-scale  methylation  patterns  in  the nuclear genomes of plant. Gene, 122, 239
– 245.
McClelland,  N.,  M.  Nelson  &  E.  Raschke (1994). Effect of site-spesific modification on  restriction  endonucleases  and  DNA modification methyltransferase. Nucl.
Acids Res., 22 , 3640-3659.
Miura, A., S.Yonebayashi, K.Watanabe, T.Toyama & H. Shimada (2001).
Mobilization of transposons by a mutation abolishing    full  DNA  methylation  in Arabidopsis . Nature, 411 , 212 -214.
Ng,  H.H.  &  A.P.Bird  (1999).  DNA  methy- lation  and  chromatin  modification. Cuur Opinion  Genet. Dev., 9, 158-163.
Orozco-Castillo  C.,  K.J.  Chalmers.,  R.  Waugh &  W.Powell  (1994).  Detection  of  genetic
diversity  and  selective  gene  introgression in  coffee  using  RAPD  markers. Theor.
Appl. Gen., 87, 934-940.
Peschke, V.M. & R.L.  Philips (1992). Genetic implication  of  somaclonal  variation  in
Deteksi metilasi DNA  genom Elaeis guineensis Jacq hasil kultur jaringan.....
plants. In  Advances  in  Genetic .  Vol  29. USA, Academic Press. Inc. p, 41-75.
Richards,  E.J.  &  S.C.R.  Elgin  (2002). Epigenetic  codes  for  heterochromatin formation  and  silencing:rounding  up  the usual suspects. Cell, 108 , 489-500.
Rival,  A.,  E.  Jaligot,  T.  Beule,  J.L.  Verdil  & J.  Tregear  (2004).  Inheritance  of  random amplified  polymorphic  DNA  (RAPD) marker in Theobroma cacao L. J Am. Soc. Hort. Sci., 120 (4), 681-686.
Sambrook,  J.,  E.F.  Fritsch  &  T.  Maniatis (1989). Molecular Cloning . A. Laboratory Manual. Cold  Spring  Harbor  Lab.  Press.
2 nd ed.
Shapiro,    H.S.  (1976).  Distribution  of  purines and  pyrimidines  in  deoxyribonucleic acids. In. Fasman,  G.D.  (Ed). CRC Handbook of Biochemistry and Molecular Biology vol 2 . 3 rd edition. Cleveland, CRC Press. p, 241-281.
Shah,  F.H.,  G.K.A.  Parveez  &  A.  B.  Maharen (1999).  Levels  of  C-methylation  as molecular  markers  in  oil  palm. In . N.  Rajanaidu  &  B.S.  Jalani  (Eds). Proc. Symp.  The Science of Oil Palm Breeding Kuala  Lumpur,  Palm  Oil  Res.  Inst.  of Malaysia.  p 256-273.
Sianipar, N, F., G. A. Wattimena, H.  Aswidinnoor,  M.S.  Thenawidjaya, N.  Toruan-Mathius  &  G.  Ginting  (2007). Karakterisasi  secara  morfologi  abnor- malitas    embriosomatik   kelapa    sawit
( Elaeis  guineensis Jacq.)  dari  eksplan daun. J. Agro Biogen ., 3 (1), 32-39.
Tregear,  J.  W.,  F.  Marcillo,  A.  Berger, R.  Singh,  S.  C.  Cheah,  C.  Hartman, A.  Rival  &  Y.  Duval  (2002).  Charac- terization of a defensin gene expressed in oil  palm  inflorescence:induction  during tissue  culture  and  possible   association with  epigenetic  somaclonal  variation events. J.Exp Bot ., 53 (373),1387-1396.
Van  Harten, A.M. (1998). Mutation Breeding. Theory and Practical Applications . Cambridge, Cambridge Univ. Press. 353p.
Waldron, J. (2002). Randomly amplified DNA fingerprinting:  a  culmination  of  DNA marker  technologies  based  on  arbitrarily- primed  PCR  amplification. J.  Biomed.  &
Biotech., 2 (3), 141-150.
Wolffe, A.P., P.L. Jones & P.A. Wade (1999). DNA  demethylation. PNAS, 96 (11),
5894-5896.
Xiong,  L.Z.,  C.G.  Xu,  M.A.  Saghai-Maroof  &
Q.  Zang  (1999).  Patterns  of  cytosine methylation  in an elite rice hybrid and  its parental  lines,  detected  by  a  methylation- sensitive amplification polymorphism technique. Mol.  Gen.  Genet., 261 ,    439- 446.
Xu  Mingliang,  Li  Xiangqian  &  S.S.  Korban (2004).  DNA-methylation  alterations  and exchanges during in vitro cellular differentiation  in  rose  ( Rosa  hybrida L.). Theor. Appl. Genet ., 109, 899-910.