Penggunaan Thidiazuron, 2, 4 – D dan Giberellin
PENGGUNAAN THIDIAZURON, 2, 4 – D DAN GIBERELLIN DALAM PEMBENTUKAN EMBRIO SOMATIK PULE PANDAK ( Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) MELALUI KULTUR in vitro
(The Use of Thidiazuron, 2, 4 - D and Giberellin in Formation of  Somatic embryo of Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz by in vitro culture 1 )
H ERU S UGITO 1) , Y ANTO S ANTOSA 2) , E DHI S ANDRA 3)
1) Program Magister Profesi Konservasi Biodiversitas Sekolah Pascasarjana IPB, Bogor 16680
2) Lab. Ekologi Satwaliar Dept. KSH Fakultas Kehutanan IPB, Bogor 16680
3) Lab. Konservasi Tumbuhan Dept. KSH Fakultas Kehutanan IPB, Bogor 16680
Diterima 10 Februari 2006 / Disetujui 29 Maret 2006

## ABSTRACT
Rauvolfia  serpentina  (L.)  Benth.  ex Kurz,  is one of the  tropical  forest  plant  species which  is  exploited as plant  medicine  and  pertained  as  world rareness.  To  be  able  to  make  balance  to  storey,  level  request  of  Rauvolfia  serpentina  (L.)  Benth.  ex  Kurz  simplisia  raw  material  and  saving  it  from destruction, require to be by activity of conservation, one of the effort by in vitro culture forming of somatic embryo. Somatic embryo by in vitro is forming of embryo from cell is non sexual which is culture. Somatic embryo application beside for the of quickly, also can be yielded by the amount of seed which is not limited its amount, as well as to support program repair of crop. This research to know giving influence and regulator dose grow, consist of 2 attempt. I. Factorial Attempt which use completely randomized experimental disign, what consist of 2 factor, first is thidiazuron concentration which consist of 4 level, that is  0 ppm 2  ppm,  4 ppm,  6 ppm, 8  ppm,  second  is  concentration 2, 4-D  which consist  of  4 level,  that  is 0  ppm,  0.5  ppm, 1  ppm, 1.5  ppm,  2 ppm  .II. Factorial Attempt which use completely randomized experimental disign, what consist of 2 factor, first is thidiazuron concentration which consist of 4 level, that is 0 ppm, 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm, second is giberellin concentration which consist of 4 level, that is 0 ppm, 0.5 pp m, 1 ppm, 1.5 ppm, 2.0 ppm. Pursuant to manner statistical analysis result is non parametric Kruskal-Wallis to callus score and embryo at 14 day after initiation not there are difference between treatment, but 28 and 42 day after initiation there are difference between treatment. The use thidiatzuron + 2,4-D give, forming of somatic embryo with the best treatment (6 ppm Thidiatzuron + 0,5 ppm 2, 4 D). Growth of embryo happened at age 35 day after initiation. Thidiazuron + giberellin forming of callus only.
Key word : Rauvolfia serpentina, thidiazuron, 2,4-D, giberellin, somatic embryo

## PENDAHULUAN
Pule  pandak  ( Rauvolfia  serpentina (L.)  Benth.  ex Kurz) merupakan salah satu spesies tumbuhan hutan tropika yang  dimanfaatkan  sebagai  tumbuhan  obat.  Heyne  (1987) menyatakan tanaman tersebut digunakan secara tradisional, sebagai  obat  untuk  sesak  nafas,  nyeri  perut,  murus,  sakit kepala  dan  gigitan  ular,  demam,  tekanan  darah  tinggi, digigit  ular,  disentri,  kolera,  perut  mulas,  kehilangan  selera makan, nyeri rahim, radang usus buntu dan lain-lain.
Saat  ini  kebutuhan  bahan  baku  simplisia  pule  pandak masih  dipenuhi  dari  hasil  pemanenan  langsung  dari  alam. Disisi  lain  kebutuhan  bahan  baku  simplisia  pule  pandak baik  dalam  negeri  maupun  dari  negara-negara  industri farmasi, terus meningkat dan belum terpenuhi. Pemanfaatan tumbuhan  obat  ini  diambil  bagian  akarnya  dan  dipanen hanya mengandalkan dari alam. Hal ini dikhawatirkan akan terjadi  kekurangan  suplai  bahan  baku  dan  bahkan  terjadi kepunahan.  Untuk  dapat  mengimbangi  tingkat  permintaan
bahan  baku  simplisia  pule  pandak  dan  menyelamatkannya dari kepunahan, perlu dilakukan kegiatan konservasi. Untuk itu  maka  perlu  produksi  bibit  secara  masal  dan  terjamin kelestariannya.  Salah  satu  upaya  adalah  melalui  kultur in vitro, dengan pembentukan embrio somatik.
Salah  satu  faktor  yang  mempengaruhi  pembentukan embrio  somatik  adalah  jenis  dan  komposisi  zat  pengatur tumbuh.  Thidiazuron  merupakan  kelompok  sitokinin  yang sangat kuat untuk pembentukan pucuk, 2, 4 – D merupakan kelompok  auksin  untuk  pembentukan  akar  dan  giberellin merupakan  hormon  yang  bersifat  memicu  dormansi.  Dari kombinasi zat pengatur tumbuh thidiazuron + 2, 4 – D atau kombinasi thidiazuron + giberellin diharapkan dapat terjadi pembentukan embrio somatik untuk pule pandak.
Penelitian  ini  bertujuan  mendapatkan  dosis  terbaik kombinasi thidiazuron + 2, 4 – D dan kombinasi thidiazuron +  giberellin  dalam  pembentukan  embrio  somatik  pule pandak melalui kultur in vitro .
Media Konservasi Vol. XI, No. 2 Agustus 2006 :  66 – 71

## METODE PENELITIAN
Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium  Kultur  Jaringan Pusat  Pengembangan  Penataran  Guru  Pertanian  Cianjur, mulai September sampai November 2005.
Bahan  penelitian  yang  digunakan  antara  lain:  eksplan pule pandak yang berasal dari planlet koleksi Laboratorium Kultur  Jaringan  Fakultas  Kehutanan  IPB.  Senyawa  atau unsur penyusun media Murashige and Skoog (MS) meliputi unsur  hara  makro,  unsur  hara  mikro,  vitamin,  gula,  agar- agar  dan  zat  pengatur  tumbuh  (thidiazuron,  2,  4  –  D, giberellin), aquades dan bahan sterilisasi
Peralatan  yang  digunakan  adalah  timbangan  analitik, laminar  air  flow  cabinet,  disekting  set,  sprayer,  lampu spirtus,  autoklaf,  pH  meter,  peralatan  gelas,  hot  plate magnetik stirer dan botol kultur sebanyak 500 botol.
Penelitian ini terdiri dari 2 percobaan yaitu:
1.  Pengaruh  Kombinasi  Thidiazuron  +  2,  4  –  D  ter- hadap Pembentukan Embrio somatik Pule pandak
Percobaan dilakukan dalam rancangan faktorial dalam pola acak lengkap dengan ulangan sebanyak masing-masing 5 kali,  dengan kombinasi zat pengatur tumbuh Thidiazuron yaitu 0 ppm (T 0 ); 2 ppm (T 1 ); 4 ppm (T 2 ); 6 ppm (T 3 ) dan 8 ppm (T 4 ) dengan 2, 4 – D yaitu 0 ppm (D 0 ); 0,5 ppm (D 1 ); 1,0 ppm (D 2 ); 1,5 ppm (D 3 ) dan 2,0 ppm (D 4 ).
2.  Pengaruh  Kombinasi  Thidiazuron  +  Giberellin  ter- hadap Pembentukan Embrio somatik Pule pandak
Percobaan dilakukan dalam rancangan faktorial dalam pola acak lengkap dengan ulangan sebanyak masing-masing 5  kali,  dengan  kombinasi  zat  pengatur  tumbuh  thidiazuron yaitu 0 ppm (T 0 ); 2 ppm (T 1 ); 4 ppm (T 2 ); 6 ppm (T 3 ) dan 8 ppm (T 4 ) dengan giberellin yaitu 0 ppm (G 0 ); 0,5 ppm (G 1 ); 1,0 ppm (G 2 ); 1,5 ppm (G 3 ) dan 2,0 ppm (G 4 ).
Sebelum  pembuatan  media,  semua  alat  harus  dalam keadaan steril. Media yang digunakan untuk induksi embrio somatik  adalah  media  Murashige  and  Skoog  yang ditambahkan  dengan  sukrosa  30  g/l,  thidiazuron,  2,  4  –  D, giberellin  sesuai  perlakuan.  Dalam  pembuatan  media, langkah  pertama  adalah  pembuatan  larutan  stok  yang meliputi  stok  hara  makro,  stok  hara  mikro,  stok  Fe- EDTA , stok vitamin dan stok zat pengatur tumbuh.
Media  diatur  pada  pH  5,5  –  5,8,  kemudian  meng- gunakan  pemadat  agar  8  gr/l  sambil  dipanaskan  hingga mendekati  mendidih,  kemudian  dibagi-bagi  dalam  botol kultur  sebanyak  25  ml  tiap  botol  dan  ditutup  dengan menggunakan penutup plastik. Setelah itu media disterilkan dengan menggunakan autoklave dengan suhu 121 o C selama 30 menit.
Bahan  tanam  diambil  dari  eksplan  pule  pandak  yang berasal  dari  Laboratorium  Kultur  Jaringan  Fakultas
Kehutanan IPB. Tunas dari planlet yang terbentuk dipotong- potong  pada  bagian  yang  sama  dalam  kondisi  aseptik selanjutnya eksplan siap diisolasi. Kultur disimpan di dalam ruangan  temperatur  25 o C,  cahaya  menggunakan  lampu neon.
Pertumbuhan  eksplan  diamati  dari  saat  isolasi  dengan interval  pengamatan  14  Hari  Setelah  Inisiasi  (HSI)  dengan peubah sebagai berikut :
1.  Pertumbuhan  Eksplan (dinyatakan dalam skor) Skor 1 = Eksplan hidup, tetapi tidak membentuk kalus Skor 2 = Eksplan membentuk sedikit kalus Skor 3 = Eksplan membentuk kalus yang sedang Skor 4 = Eksplan membentuk kalus yang melimpah Skor 5 = Eksplan membentuk kalus dan planlet Skor 6 = Eksplan membentuk embrio.
2.  Kecepatan  terbentuknya  kalus/embrio  dan  warna  kalus/ embrio dilakukan secara visual mulai awal terbentuknya kalus sampai terbentuknya embrio.
Untuk mengetahui pengaruh perlakuan yang dicobakan terhadap data yang menggunakan skor, dianalisis dengan  menggunakan  statistik  non  parametrik  Kruskal  – Wallis (Siegel, 1992).
Rumus yang digunakan adalah sebagai berikut :
2          k      R 2 i h =                     Σ               - 3(N+1) N(N+1)     j=1     n i dimana : k  :  banyak sampel n 1 :  banyak kasus dalam sampel ke-j
N  :  banyak kasus dalam sampel.
Data  pengamatan  percobaan  disajikan  dengan  tabel, histogram dan foto.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengaruh  Kombinasi  Thidiazuron  +  2,  4  –  D  terhadap Pembentukan Embrio somatik`pule pandak
Hasil  analisis  Kruskal  –  Wallis  terhadap  skor pertumbuhan  eksplan  pada  pengamatan  14  hari  HSI menunjukkan  bahwa  tidak  ada  perbedaan  antar  perlakuan. Hal  ini  disebabkan  eksplan  masih  menyesuaikan  dengan media  yang  baru  sehingga  belum  menampakkan  pengaruh perlakuan.  Pada  pengamatan  28  HSI  dan  42  HSI menunjukan  bahwa  ada  perbedaan  antar  perlakuan,  karena eksplan sudah menyesuaikan dengan media yang baru. Pada saat itu  kondisi eksplan  sudah normal, teratur, terbentuklah kalus, dan susunan hormon dirubah sehingga sebagian besar dari  sel-sel  tersebut  mulai  memisah  dan  berubah  bentuk menjadi  embryoid,  dan  hanya  menunggu  untuk  dibebaskan
Penggunaan Thidiazuron, 2, 4 – D dan Giberellin
untuk  menjadi  embrio,  tidak  menjadi  akar  atau  tunas.  Sel- sel  kalus  yang  berubah  bentuk  menyerupai  embrio dinamakan embrio somatik (Ammirato 1992).
Hasil  pengamatan  secara  visual  menunjukkan  bahwa kombinasi  Thidiatzuron  +  2,  4  -  D  terjadi  pembentukan embrio.  Hal  ini  berarti  bahwa  pule  pandak  mempunyai respon membentuk embrio pada perlakuan thidiatzuron + 2, 4  –  D  karena  thidiazuron  merupakan  jenis  sitokinin  yang paling  kuat  untuk  pembelahan  sel  yang  kemudian dikombinasikan  dengan  jenis  auksin  2,  4  –  D  yang merangsang  pembesaran  sel.  Komposisi  media  dan pemilihan  zat  pengatur  tumbuh  yang  sesuai  selain mendorong terbentuknya kalus juga mendorong terbentuknya embriogenesis.
Saat  pembentukan  embrio  pada  masing-masing perlakuan  tidak  sama.  Tingkat  kecepatan  pembentukan embrio  dari  eksplan,  dalam  teknik  kultur  jaringan  erat hubungannya dengan zat pengatur tumbuh. Laju pertumbuhan yang cepat dihasilkan dengan ketersediaan zat
pengatur  tumbuh  menyatakan  bahwa  dengan  mengatur komposisi  zat  pengatur  tumbuh  terjadi  seleksi  sel-sel  yang mempunyai  karakter  tertentu.  Hal  ini  berarti  bahwa  zat pengatur  tumbuh  menentukan  komposisi  embrio  yang tumbuh.  Untuk  tanaman  jati  embriogenesis  terjadi  setelah tujuh kali mengalami sub kultur, sementara untuk percobaan ini  satu  kali  sub  kultur  sudah  terjadi  pembentukan  embrio somatik.  Hal  ini  merupakan  suatu  yang  luar  biasa  karena diduga  eksplan  berasal  dari  planlet  yang  kondisinya  sudah normal  dan  viabilitasnya  tinggi.  George  dan  Sherrington (1984) juga menyatakan bahwa adanya zat pengatur tumbuh yang mendukung akan menyebabkan terjadinya pembelahan dan  pengembangan  sel  sedikit  demi  sedikit  yang mengakibatkan  terbentuknya  embrio  di  atas  permukaan eksplan. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa perlakuan kombinasi  6  ppm  thidiatzuron  +  0,5  ppm  2,  4  –  D memberikan  persentase  pembentukan  embrio  tertinggi (100%) (Gambar 1).
Gambar 1.  Pengaruh thidiatzuron + 2,4 – D terhadap persentase pembentukan embrio.
Embrio yang terbentuk dengan menggunakan thidiatzuron dan 2, 4 – D dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2.  Embrio yang terbentuk pada media thidiatzuron + 2, 4 – D,  a). T 4 D 0, b). T 2 D 3 , c). T 3 D 2, d). T 3 D 1 .
0 20 40 60 80 100 120 D 0 D 1 D 2 D 3 D 4 D 0 D 1 D 2 D 3 D 4 D 0 D 1 D 2 D 3 D 4 D 0 D 1 D 2 D 3 D 4 D 0 D 1 D 2 D 3 D 4 T0 T1 T2 T3 T4
Media Konservasi Vol. XI, No. 2 Agustus 2006 :  66 – 71
Menurut  Wareing  dan  Philips  (1970 dalam Abidin, 1982),  didalam  tanaman  terdapat  2  fase  pertumbuhan  yaitu fase  pembelahan  dan  fase  pembesaran  sel.  Pada  fase pembelahan  zat  pengatur  tumbuh  yang  berperan  adalah sitokinin, selanjutnya sel akan mengalami pembesaran yang distimulir  oleh  auksin.  Menurut  Watimena et  al .  (1992) auksin  dalam  konsentrasi  rendah  akan  menstimulir pembesaran  dan  perpanjangan  sel  setelah  terjadinya pembelahan  sel  yang  distimulir  oleh  sitokinin,  namun  efek penghambat  dan  pendorong  proses  pembelahan  sel  oleh sitokinin  tergantung  pada  hormon  yang  lain  terutama auksin. Menurut Ammirato (1982) konsentrasi optimal dari zat  pengatur  tumbuh  untuk  embrio  somatik  berbeda-beda dan sifatnya spesifik untuk setiap genotip tanaman.
Pengamatan terhadap perkembangan dan pertumbuhan eksplan  menunjukkan  bahwa  7  Hari  Setelah  Isolasi  (HSI),
eksplan  mulai  membengkak  dan  warna  berubah  dari  hijau menjadi  hijau  kecoklatan.  Warna  kecoklatan  ini  diduga karena  pengaruh  senyawa-senyawa  hasil  proses  oksidasi fenol di dalam eksplan. Di tempat ini terdapat bintik-bintik yang kemudian berubah menjadi kerut-kerut pada hari ke 10 pertumbuhan kalus dimulai dari sini. Dari hasil pengamatan terhadap  kecepatan  terbentuknya  kalus  dan  persentase pembentukan  kalus  perlakuan  dengan  menggunakan thidiatzuron  +  2,  4  –  D  yang  paling  cepat.  Perlakuan kombinasi  thidiatzuron  dan  2,  4  –  D  memberikan  saat inisiasi  kalus  10  –  20  HSI,  sedangkan  kombinasi thidiatzuron  dan  giberellin  kalus  terbentuk  sekitar  25  –  40 HSI.  Kecepatan  terbentuknya  kalus  dan  warna  kalus  dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1.  Pengaruh zat pengatur tumbuh terhadap kecepatan terbentuknya kalus dan warna kalus.
Perlakuan Kecepatan Terbentuknya Kalus (HSI) Warna Thidiazuron + 2,4 –D Thidiazuron + Giberellin 10 – 20 25 - 40 Hijau,  dan  agak  putih  kekuningan,  agak padat. Putih, remah
Secara  visual  tampak  bahwa  perlakuan  kombinasi thidiatzuron  +  2,  4  –D  menghasilkan  pertumbuhan  kalus yang lebih baik dibanding perlakuan kombinasi thidiatzuron
+ giberellin. Bentuk dan struktur kalus dari kedua perlakuan disajikan pada Gambar 3 dan Gambar 4.
Gambar 3.  Bentuk dan struktur kalus dari media thidiatzuron + 2, 4 – D.
Gambar 4.  Bentuk dan struktur kalus dari media thidiatzuron + giberellin.
Penggunaan Thidiazuron, 2, 4 – D dan Giberellin
Abidin  (1982),  menyatakan  bahwa  didalam  tanaman, zat  pengatur  tumbuh  tidak  bekerja  sendiri-sendiri,  tetapi bekerja  secara  berinteraksi.  Thidiatzuron  kadang-kadang diperlukan bersama-sama 2, 4 – D untuk mendapatkan kalus yang baik sehingga dapat membentuk embrio.
Menurut  Ammirato  (1982),  kebutuhan  thidiatzuron dalam  kultur  jaringan  tanaman  berbeda-beda.  Pengaruh konsentrasi auksin dan sitokinin terhadap pertumbuhan dan perkembangan tergantung jenis tanamannya.
Media  tanam  yang  digunakan  dalam  kultur  jaringan sangat  berpengaruh  terhadap  metabolisme  sel.  Pada umumnya  media  diperkaya  dengan  zat  pengatur  tumbuh. Zat  pengatur  tumbuh  merupakan  komponen  media in  vitro yang sangat penting kehadirannya.
George  dan  Sherrington  (1984),  menyatakan  bahwa pemberian  2,  4  –  D  adalah  untuk  merangsang  pembelahan dan  pembesaran  sel.  Penambahan  auksin  dalam  jumlah besar  cenderung  menyebabkan  terjadinya  pertumbuhan kalus dari ekspan dan menghambat regenerasi tanaman.
Pengaruh Kombinasi Thidiazuron + Giberellin Terhadap Pembentukan Embrio somatik pule pandak
Hasil  analisis  Kruskal  –  Wallis  terhadap  perkem- bangan  eksplan  mulai  14  HSI  menunjukkan  tidak  adanya
pengaruh  perlakuan,  tetapi  pada  28  HSI  dan  42  HSI menunjukkan adanya pengaruh perlakuan. Hasil pengamatan  menunjukkan  bahwa  kombinasi  thidiazuron  + giberellin  tidak  membentuk  embrio,  tetapi  eksplan membentuk  kalus.  Hal  ini  disebabkan  kombinasi  zat pengatur  tumbuh  yang  diberikan  tidak  mendukung terjadinya  pembelahan  dan  pengembangan  sel  sehingga tidak  terbentuknya  embrio  di  atas  permukaan  eksplan. Warna  dan  struktur  kalus  juga  mempengaruhi.  Munculnya kalus  yang  berwarna  putih  dan  berstruktur  remah,  diduga menghambat  pem-bentukan  embrio.  Santoso  (2002) menyatakan  pemberian  giberellin  yang  dibarengi  dengan sitokinin  dalam  konsentrasi  yang  sama  akan  mendorong morfogenesis yang normal tetapi kadang malah menghambat.
Untuk perlakuan thidiatzuron dan giberellin persentase pembentukan kalus tertinggi dihasilkan oleh perlakuan : 0 ppm thidiatzuron + 1 ppm giberellin, 0 ppm thidiatzuron + 1,5 ppm giberellin, 0 ppm thidiatzuron + 2 ppm giberellin, 2 ppm  thidiatzuron  +  0  ppm  giberellin,2  ppm  thidiatzuron  + 0,5 ppm giberellin, 2 ppm thidiatzuron + 1,5 ppm giberellin, 4ppm  thidiatzuron  +  0  ppm  giberellin,  yaitu  100% pembentukan kalus (Gambar 5).
Gambar 5.  Pengaruh thidiatzuron + giberellin terhadap persentase pembentukan kalus

## KESIMPULAN
1)  Kombinasi  zat  pengatur  tumbuh  thidiazuron  +  2,  4  –  D menghasilkan  pembentukan  embrio  dengan  perlakuan terbaik pada T 3 D 1 (6 ppm thidiatzuron + 0,5 ppm 2, 4 – D)  dengan  pertumbuhan  embrio  pada  umur  35  Hari Setelah Inisiasi.
2)  kombinasi zat pengatur tumbuh thidiazuron + giberellin tidak  menghasilkan  pembentukan  embrio,  tetapi  hanya menghasilkan pembentukan kalus.
3)  Perlakuan  tanpa  menggunakan  zat  pengatur  tumbuh tidak menghasilkan kalus dan embrio.

## DAFTAR PUSTAKA
Abidin  Z.  1982.  Dasar-dasar  Pengetahuan  Tentang  Zat Pengatur Tumbuh. Bandung. Angkasa.
Ammirato.    1992.    Embryogenesis  in  Evan,  Sharp, Ammirato  and  Yamada.    1984.    Technique  for Propagation and Breeding.  Hand  Book of Plant Cell Culture. Macmillan. New York.  Publishing Company.
George  EF & PD Sherington.  1984. Plant Propagation by Tissue  Culture .    England:  Exegetics    Ltd.    Eversley Basingstoke,  Hants
0 20 40 60 80 100 120 G0 G1 G2 G3 G4 G0 G1 G2 G3 G4 G0 G1 G2 G3 G4 G0 G1 G2 G3 G4 G0 G1 G2 G3 G4 T0 T1 T2 T3 T4
Media Konservasi Vol. XI, No. 2 Agustus 2006 :  66 – 71
Heyne  K.   1987. Tumbuhan Berguna Indonesia .  Jakarta. Yayasan Sarana Wanajaya.
Siegel Sidney.  1992.  Statistik Non Parametrik Untuk Ilmu- ilmu Sosial.  Jakarta. P.T. Gramedia.
Santoso  U.  &  N.    Fatimah.    2002.    Kultur  Jaringan Tanaman.    Malang.  Universitas  Muhammadiyah Malang.
Wattimena  GA,  LW  Gunawan,  NA  Mattjik,  E  Syamsudin, NMA  Wiendi  &  A  Ernawati.    1992. Bioteknologi Tanaman .  Lab  Kul-Jar  Tan,  PAU.  Bioteknologi. Bogor.  Institut Pertanian Bogor.