BioEksakta: Jurnal Ilmiah Biologi Unsoed Volume 2, Nomor 1 (2020): 11 - 15 E-ISSN: 2714-8564

## Identifikasi  Streptococcus pneumoniae  yang  dibawa oleh Nasofaring Penderita Otitis Media Akut di Kabupaten Banyumas
Miranti Oviani 1 ,  Dodi Safari 2 , Anton Budhi Darmawan 2 , Daniel Joko Wahyono 1 *
1 Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto 53122, Indonesia
2 Lembaga Biologi Molekuler Eijkman, Jakarta *email : danieljokowahyono13 @gmail.com .
Rekam Jejak Artikel:
Diterima  : 29/08/2019 Disetujui  : 03/03/2020

## Abstract
The  aims  of  this  study  are  to  detect  Streptococcus  pneumoniae  carried  by  nasopharnyx  of children in primary school (aged 6-12 years) that diagnosed with Acute Otitis Media (AOM). The design of this study is nonexperimental survey with the descriptive analysis. Sampling was conducted in September - December 2018 in Banyumas district primary schools. Detection of S. pneumoniae was performed with microbiology methods. The result of this study showed that 26 bacteria isolates were obtained from nasopharynx in children diagnosed with AOM. Based on colony characteristics and optochin disk assay, 35% (9/26) of bacterial isolates were identified as S. pnemunoniae.
Keywords: Acute Otitis Media, children, Streptococcus pneumoniae
Abstrak Tujuan penelitian ini untuk mendeteksi Streptococcus pneumoniae yang dibawa oleh nasofaring anak-anak  penderita  Otitis  Media  Akut  (OMA)  usia  sekolah  dasar  (6-12  tahun).  Desain penelitian  ini  adalah  penelitian  survei  noneksperimental  dengan  metode  analisis  deskriptif. Pengambilan  sampel  dilakukan  pada  bulan  September  2018  hingga  Desember  2018  di  SD Kabupaten  Banyumas.  Deteksi S.  pneumoniae pada  sampel  OMA  dapat  dilakukan  melalui metode  identifikasi S.  pneumoniae secara  mikrobiologi.  Sebanyak  26  isolat  bakteri  berhasil diperoleh  dari  nasofaring  anak  yang  didiagnosis  menderita  OMA.  Berdasarkan  karakteristik morfologi koloni dan uji optochin , 35% (9/26) isolat teridentifikasi sebagai S. pneumoniae . Kata kunci: Otitis Media Akute, anak-anak, Streptococcus pneumoniae

## PENDAHULUAN
Streptococcus  pneumoniae merupakan  bakteri yang  dapat  menginfeksi  saluran  pernapasan  dan menyebabkan mortalitas yang tinggi pada anak-anak dengan sistem imun yang lemah (Pinti et al ., 2016). Setiap tahunnya, sekitar 541.000 anak-anak di bawah 5  tahun  di  dunia  meninggal  karena  infeksi  dari bakteri ini (WHO, 2004). S. pneumoniae adalah  flora normal  yang  terdapat  pada  permukaan  mukosal saluran  pernapasan  bagian  atas.  Bakteri  ini  dapat mengolonisasi  nasofaring  bersama  dengan  bakteri lainnya  (Kadioglu et  al .,  2008).  Kolonisasi nasofaring  yang  dilakukan  oleh S.  pneumoniae umumnya  tidak  menunjukkan  gejala  penyakit  atau disebut dengan karier (CDC, 2015). Namun, apabila S.  pneumoniae yang  mengolonisasi  nasofaring berpindah  ke  jaringan  dan  organ  lain  maka  akan menyebabkan  penyakit  (Nonmark-Henriques  dan Toumanen,  2013).  Salah  satu  bagian  tubuh  yang menjadi tempat menyebarnya S. pneumoniae adalah telinga  tengah. S.  pneumoniae yang  mengolonisasi nasofaring  dapat  berpindah  ke  telinga  tengah sehingga  menyebabkan  otitis  media  (Keller et  al ., 2016).  Kolonisasi S.  pneumoniae merupakan  salah satu sumber utama dalam penyebaran patogen secara horizontal dalam suatu komunitas. Apabila salah satu anggota  keluarga  membawa S.  pneumoniae, maka pada  kondisi  tertentu  dapat  ditransmisikan  ke
anggota  keluarga  lainnya  (Bogaert et  al .,  2004). Persentase S.  pneumoniae yang  ditemukan  pada nasofaring anak-anak sehat di Semarang pada tahun 2010  adalah  sebanyak  43%  (Farida et  al .,  2014), sedangkan  pada  anak-anak  sehat  usia  di  bawah  5 tahun di Lombok terdapat 53% S. pneumoniae yang mengolonisasi nasofaring (Hadinegoro et al ., 2016). Nasofaring  dapat  menjadi  reservoir  bakteri yang  dapat  menyebabkan  penyakit  OMA  (Bosch et al ., 2013).  Apabila terjadi gangguan keseimbangan mikrobiota di nasofaring, maka S. pneumoniae dapat berpindah  ke  telinga  tengah  melalui  saluran eustachius dan  menyebabkan  OMA.  Korona- Glowniak et  al .  (2018)  melaporkan  bahwa S. pneumoniae dapat  ditemukan  pada  nasofaring penderita OMA. Sehingga pada penelitian ini, isolasi S.  pneumoniae dilakukan  dari  sampel  usapan nasofaring  anak-anak  penderita  OMA.  Studi mengenai kolonisasi S. pneumoniae pada nasofaring di  Indonesia  pada  anak-anak  penderita  otitis  media berusia di atas 5 tahun belum pernah dilakukan. Oleh karena  itu,  peneliti  tertarik  melakukan  penelitian untuk  mendeteksi S.  pneumoniae yang  dibawa  oleh nasofaring  anak-anak  penderita  otitis  media  berusia di atas 5 tahun.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendeteksi S. pneumoniae yang dibawa oleh nasofaring anak-anak penderita  OMA  usia  sekolah  dasar  (6-12  tahun)  di
wilayah Kabupaten Banyumas. Hasil penelitian akan bermanfaat  untuk    memberikan  gambaran  tentang jumlah S. pneumoniae yang dideteksi pada anak-anak penderita OMA usia 6-12 tahun di wilayah kabupaten Banyumas  dan  memberikan  gambaran  mengenai implementasi program vaksinasi pneumokokal.

## MATERI DAN METODE

## Skrining Sampel OMA
Penelitian  ini  telah  memperoleh  persetujuan etik  ( ethical  approval )  (Ref.  4015/KEPK/FK/2018) dari  Komisi  Etika  Penelitian,  Fakultas  Kedokteran, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto. Skrining  untuk  menentukan  anak-anak  yang  diduga menderita  OMA  pertama  kali  dilakukan  di  SDN Pangebatan,  Karanglewas  dengan  jumlah  total  anak yang  diskrining  adalah  400  anak  (kelas  1-6), sedangkan untuk skrining kedua di SDN Karanglewas  Kidul  dengan  jumlah  total  anak  200 anak (kelas 1-6). Kriteria inklusi diduga OMA adalah anak yang mengalami batuk pilek kurang lebih satu minggu  dan  mengalami  sakit  pada  bagian  telinga tengah.  Jumlah  total  anak  yang  diduga  menderita OMA adalah sebanyak 89 anak (34 anak dari skrining pertama dan 55 anak dari skrining kedua).
Teknik Pengambilan Sampel (Satzke et al., 2013). Sampel swab nasofaring  diambil  dengan menggunakan FLOQS  swab steril  pada  bulan September 2018 hingga Desember 2018. Hasil swab dari  masing-masing  pasien  yang  positif  OMA dimasukkan  ke  dalam cryotube yang  berisi  1  ml media  STGG  yang  merupakan  media  transport  dan penyimpanan  bakteri S.  pneumoniae , FLOQS  swab dipotong  dengan  gunting  steril  sehingga cryotube dapat  ditutup  rapat,  lalu  dihomogenkan  dengan vortex dan disimpan pada biomedical freezer -80 0 C.
Pengayaan  Bakteri  S.  Pneumoniae  (Carvalho  et al., 2010).
Swab nasofaring  dari freezer dibiarkan mencair lalu  divortex  selama  10-15  detik.  Sebanyak  200  µl diambil dan dimasukkan ke dalam tabung kaca yang berisi  5  ml  THYB  dan  1  ml  serum  kelinci,  lalu dihomogenkan  dan  diinkubasi  pada suhu  37 0 C dengan 5% CO 2 selama 5-6 jam.
Pembuatan  Kultur  Bakteri  pada  Medium  Agar Darah 8% (Auranen et al., 2013).
Sampel swab nasofaring  yang  telah  diperkaya diambil 10 ul untuk ditumbuhkan pada medium agar darah 8% dengan metode gores quadrant . Setelah itu, diinkubasi  selama  18-24  jam  pada  temperatur  37 0 C dengan 5% CO 2.
Identifikasi dan Karakterisasi Koloni S. Pneumoniae (Carvalho et al., 2010).
Koloni bakteri yang tumbuh pada medium agar darah  8%  diamati  karakter  makro-morfologinya. Karakter  koloni  dari S.  pneumoniae adalah transparan, lembab, berair, dan dikelilingi oleh zona
berwarna  hijau  yang  menunjukan  terjadinya  α- hemolisis.
Identifikasi S. pneumoniae dengan Optochin Disk (Carvalho et al., 2010).
Koloni dengan karakter S. pneumoniae digores ke  dalam  medium  agar  darah  8%.  Kemudian  5  µg optochin  disk dengan  diameter  6  mm  diletakkan  di atas area yang telah di streak . Setelah itu, diinkubasi pada  suhu  37 0 C,  5%  CO 2 selama  18-24  jam.  Jika isolat  sensitif  terhadap optochin (zona  hambat  ≥14 mm)  maka  diduga  isolat  tersebut  adalah S. pneumoniae .
Uji  Kelarutan  Garam  Empedu  (Carvalho  et  al., 2010).
Sebanyak  dua  tabung  reaksi  berisi  masing masing  2  ml  (tabung  uji)  dan  1  ml  (tabung  kontrol negatif)  saline  0.85%  disiapkan.  Koloni S. pneumoniae yang  berumur  18-20  jam  dipanen menggunakan disposable loop 10 µl dan diresuspensi ke  dalam  tabung  uji  hingga  kekeruhannya  setara dengan  McFarland  standar  1  dan  kemudian dihomogenkan  dengan  vortex.  Tabung  McFarland standar  1  atau  densitometer  menentukan  kekeruhan suspensi  sehingga  suspensi  yang  setara  dengan McFarland 1 dapat tercapai. Sebanyak 1 ml suspensi yang  sudah  homogen  pada  tabung  uji  dipindahkan menggunakan  pipet  ke  tabung  kontrol  negatif  dan dihomogenkan.  Larutan  sodium  deoxycholate  2% ditambahkan ke tabung uji (1 ml) kemudian divortex. Semua suspensi dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu ruang. Suspensi diamati pada 10 menit pertama dan 2 jam berikutnya. Suspensi pada tabung uji yang berubah  menjadi  bening  (lisis  total)  setelah penambahan  sodium  deoxycholate  2%  disimpulkan sebagai  positif  uji  kelarutan  garam  empedu sebaliknya  suspensi  yang  masih  keruh  dianggap sebagai  negatif.  Penentuan  ini  bisa  dibandingkan dengan kontrol S. pneumoniae ATCC.
Pembuatan  stok  S.  pneumoniae  (Carvalho  et  al., 2010).
Koloni yang teridentifikasi sebagai S. pneumoniae ditumbuhkan  kembali  pada  medium agar  darah  8%  dan  diambil  dengan  menggunakan disposable  loop ,  kemudian  dimasukkan  pada  1  ml medium  STGG  lalu  dihomogenkan  menggunakan vortex . Kultur pada STGG disimpan pada biomedical freezer bertemperatur -80 o C.

## Perhitungan  Persentase  S.  pneumoniae  pada Sampel Nasofaring
Persentase S.  pneumoniae diketahui  dengan menghitung  jumlah  isolat S.  pneumoniae yang ditemukan  pada  sampel  nasofaring  penderita  OMA dibandingkan dengan total isolat asal sampel usapan nasofaring yang diteliti.
% S. pneumoniae = jumlah isolat 𝑆.𝑝𝑛𝑒𝑢𝑚𝑜𝑛𝑖𝑎𝑒 total isolat uji x 100%

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Identifikasi
S. pneumoniae berdasarkan morfologi
Sebanyak  26  isolat  bakteri  asal  usapan nasofaring  dari  penderita  OMA  telah  berhasil diisolasi  dan  diberi  kode  OMP0002,  OMP0003, OMP0006, OMP0007, OMP0008, OMP0015, OMP0017, OMP0018, OMP0019, OMP0020, OMP0022, OMP0023, OMP0025, OMP0026, OMP0030, OMP0032, OMP0033, OMP0041, OMP0046, OMP0048, OMP0057, OMP0064, OMP0069,  OMP0075,  OMP0088,  OMP0089.  Hasil pengkulturan  pada  medium  agar  darah  8% menunjukkan  bahwa  sebanyak  42%  (11/26)  isolat memiliki karakter morfologi koloni mirip dengan S. pneumoniae .  Sedangkan  58%  (15/26)  isolat  lainnya tidak  memiliki  morfologi  koloni  seperti S. pneumoniae .    Menurut  CDC  (2015),  koloni S. pneumoniae berbentuk bulat, berwarna keabu-abuan, bersifat  basah  atau  mukoid,  berukuran  kecil, permukaan  koloni  cembung  dan  pada  awal pertumbuhan  sama  seperti S.  viridans .  Namun, setelah  waktu  inkubasi  18  –  24  jam  koloni S. pneumoniae akan  terbentuk  cekungan  dibagian tengah atau disebut dengan flattened and depressed center (FDC).  Selain  itu,  karakter  yang  paling penting  dari S.  pneumoniae adalah  memiliki  zona hijau di sekitar koloni yang menunjukkan terjadinya alfa hemolitik (Gambar 1).
Gambar 1 .  Morfologi koloni S. pneumoniae. Dokumen  pribadi.  (I)  permukaan  koloni mukoid, (II) alfa hemolitik di sekitar koloni.
Morfologi S.  pneumoniae yang  dikultur  pada medium  agar  darah  akan  memiliki  zona  hijau  di sekitar  koloni  atau  disebut  dengan  alfa  hemolitik (Gambar 4.1). Hal ini dapat terjadi karena hemolisin S.  pneumoniae yang  mampu  melisiskan  sel  darah merah (Bridy-Pappas et al ., 2005), sedangkan warna hijau  di  sekitar  koloni  disebabkan  oleh  adanya hidrogen  peroksida  yang  dihasilkan  oleh S. pneumoniae yang  mampu  mengoksidasi  ion  Fe 2+ pada  hemoglobin  darah  menjadi  ion  Fe 3+ sehingga menjadi methemoglobin yang berwarna hijau (ASM, 2016). Medium agar darah merupakan medium yang cocok untuk kultur S. pneumoniae . Pneumolisin pada S.  pneumoniae dapat  memecah  eritrosit,  sehingga protein yang mengandung heme bisa terlepas. Heme maupun  hemoglobin  pada  sel  darah  merah  dapat memberikan  pertumbuhan  yang  optimal  bagi S. pneumoniae (Tam et al ., 1993).
Pengamatan  morfologi  koloni  lebih  lanjut  dari 11  isolat  yang  mirip  dengan S.  pneumoniae menunjukkan  bahwa  sebanyak  7  isolat  memiliki koloni  bentuk  bulat  dengan  adanya  cekungan  di bagian  tengah  atau  disebut  juga  dengan  FDC, berukuran  kecil,  dan  terdapat  alfa  hemolitik, sedangkan  2  isolat  lainnya  memiliki  koloni  bentuk bulat  yang  berukuran  lebih  besar  dan  permukaan yang  lebih  mukoid  dibandingkan  dengan  yang  lain, dan 2 isolat lainnya memiliki koloni berukuran kecil, bersifat  alfa  hemolitik  dan  permukannya  kering. Menurut  Dunne et  al .,  (2010),  morfologi  dari S. pneumoniae bervariasi  dari  bulat  sempurna  atau cembung saat usia koloni masih muda, bagian tengah terdapat cekungan atau  FDC,  dan  mukoid. Menurut Abdelnour et al . (2009), apabila kapsul polisakarida pada  koloni S.  pneumoniae sangat  tebal  maka  akan menyebabkan permukaan menjadi terlihat mukoid.

## Identifikasi S. pneumoniae dengan menggunakan
optochin disk
Sebanyak 11 isolat yang diduga S. pneumoniae dilakukan uji optochin .  Hasil uji optochin menunjukkan  bahwa  sebanyak  9  isolat  (OMP0002, OMP0006, OMP0015, OMP0017, OMP0019, OMP0026,  OMP0032,  OMP0033,  dan  OMP0046) memiliki  zona  hambat  dengan  diameter  ≥  14  mm yang  menunjukkan  isolat  tersebut  sensitif  terhadap optochin , sedangkan 2 isolat lainnya (OMP0022 dan OMP0069)  tidak  memiliki  zona  hambat  di  sekitar optochin yang  menunjukkan  bahwa  isolat  tersebut resistan  terhadap optochin (Gambar  4.2).  Isolat dengan  morfologi S.  pneumoniae yang  sensitif terhadap optochin sudah  dipastikan  sebagai S. pneumoniae, sedangkan isolat yang resistan bisa saja sebagai S.  pneumoniae apabila  memiliki  karakter morfologi S.  pneumoniae .  Apabila  ada  isolat  yang resisten  terhadap optochin dan  memiliki  morfologi yang sangat mirip dengan S. pneumoniae , maka harus dilakukan uji kelarutan garam empedu (CDC, 2015). Oleh  karena  kedua  isolat  yang  resistan  terhadap optochin (OMP0022  dan  OMP0069)  memiliki morfologi  permukaan  kering,  tidak  terbentuk  FDC, dan  berukuran  kecil , maka  tidak  dilakukan  uji kelarutan garam empedu.
Gambar 2 .  Hasil streak uji optochin .  Sumber: Dokumen pribadi. (I) Sensitif optochin , dan (II) resisten optochin .
I I I I I I I
Cakram optochin yang  digunakan  memiliki diameter  sebesar  6  mm  dengan  berat  5  µg  yang mengandung senyawa ethylhydrocupreine hydrochloride (CDC, 2015). Senyawa yang terkandung dalam cakram optochin dapat melakukan interaksi dengan kompleks subunit F 0 F 1 ATPase pada membran sel. Interaksi ini menyebabkan terganggunya pompa ion H + , hidrolisis dan  sintesis ATP, sehingga bakteri tidak dapat tumbuh di sekitar cakram optochin dan terbentuk zona hambat (Pikis et al ., 2001). Enzim F 0 F 1 ATPase terdapat pada struktur bakteri  yang  terdiri  dari  dua  kompleks.  Kompleks yang pertama adalah membran intergral F 0 terdiri dari subunit  a,  b,  dan  c  sebagai  saluran  pompa  proton. Kompleks  yang  kedua  adalah  kompeks  sitoplasmik F 1 yang  terdiri  dari  subunit  α,  β,  γ,  δ,  dan  ξ  yang merupakan  situs  katalisator  untuk  hidrolisis  ATP (Ferrandiz  dan  De  La  Campa.,  2002).  Enzim  F 0 F 1 ATPase  pada  rantai  respirasi  berperan  dalam mensintesis ATP dari gradient proton yang terbentuk. Apabila  enzim  ini  terhambat  atau  berikatan  dengan kompleks yang lain, maka gradient proton tidak akan terbentuk,  sehingga  proses  sintesis  dan  hidrolisis ATP tidak akan terjadi (Pikis et al ., 2001).

## SIMPULAN
Berdasarkan  karakterisasi  morfologi  koloni dan  pengujian optochin  disk ,  sekitar  35%  (9/26) isolat  bakteri  asal  nasofaring  anak-anak  penderita Otitis  Media  Akut  usia  6-12  tahun  di  wilayah kabupaten  Banyumas  teridentifikasi  sebagai S. pneumoniae .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada Co-Ass  THT  Fakultas  Kedokteran  Universitas Jenderal  Soedirman  yang  telah  membantu  dalam proses skrining awal anak-anak penderita OMA.

## DAFTAR REFERENSI
Abdelnour,  A.,  C.  Soley,  S.  Guevara,  N.    Porat,  R. Dagan, & A. Arguedas., 2009. Streptococcus pneumoniae serotype  3 among  Costa  Rican children with otitis media: Clinical, epidemiological characteristics and antimicrobial    resistance  patterns. BMC Pediatri , 9, pp. 52-56.
Auranen,  K.,  Rinta-Kokko,  H.,  Goldblatt,  D., Nohynek  H.,  &  O'Brien,  K.  L.,  2013. Colonisation  endpoints  in Streptococcus pneumoniae vaccine  trials. Vaccine ,  32,  pp. 153-158.
Bogaert,  D.,  De  Groot,  R.,  &  Hermans,  P.  W.  M., 2004. Streptococcus
pneumoniae colonisation:  the  key  to  pneumococcal disease. Lancet Infect Dis, 4, pp. 144-1454.
Bosch, A. A., Biesbroek, G., Trzcinski, K., Sanders, E. A., & Bogaert, D., 2013. Viral and bacterial interactions  in  the  upper  respiratory  tract.
PLoS Pathog , 9, pp. 1003057.
Bridy-Pappas,  A.  E.,  Pharm,  D.,  Margolis,  M.  B.,
Pharm, D., Center, K. J. M. D.,  & Isaacman, D. J. M D., 2005. Streptococcus pneumoniae : Description of the pathogen disease epidemiology,  treatment,  and  prevention. Pharmacotherapy , 25(9), pp. 1193-1212.
Carvalho,  M.  D.  G.,  Pimenta,  F.  C.,  Jackson,  D., Roundtree, A., Ahmad, Y., Millar, E. V.,   & Beall, B. W., 2010. Revisiting pneumococcal carriage by use of broth enrichment and PCR techniques for enhanced detection of carriage and serotypes. Journal of clinical microbiology , 48 (5), pp. 1611-1618.
CDC,  2015. Epidemiology  and  prevention  of vaccine-preventable  disease:  Pneumococcal disease. USA:  Centers  for  Disease  Control and Prevention.
Dunne, E. M., Lupiwa, T., & Montgomery, J., 2010. Streptococcus  pneumoniae serogroups  and colony morphology: a look back. Papua New Guinea Medical Journal , 53, pp. 166-168.
Farida, H., Severin, J. A., Gasem M. H., Keuter, M., &  Wahyono,  H..  2014.  Nasopharyngeal carriage  of Streptococcus  pneumoniae- prone age  groups  in  Semarang,  Java  Island, Indonesia. PLoS ONE , 9.
Ferrandiz, M. J.,  & De la Campa,  A. G., 2002. The membrane-assosiated F 0 F 1 ATPase is essential  for  the  viability  of Streptococcus pneumoniae.  FEMS  Microbiology  Letters , 212, pp. 133-138.
Hadinegoro,  S.R.,  Prayitno,  A.,  Khoer,  M.  M., Djelantik, I. G. G., Dewi, N. E., Indriyani, A. K.,  Muttaqin,  Z.,  &  Safari,  D.,  2016. Nasopharyngeal  carriage  of Streptococcus pneumoniae in  healthy  children  under  five years  old  in  central  lombok  regency, Indonesia. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 3(3), pp. 1-9.
Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., & Andrew, P.  W.,  2008.  The  Role  of Streptococcus pneumoniae :  Emergence  and  pathogenesis. mBio, 7(2), pp. 1792-1815.
Keller, L. E., D. A. Robinson, & L. S. McDaniel, L. S.,  2016.  Nonecapsulated Streptococcus pneumoniae :  emergence  and  pathogenesis. American Society for Microbiology , 7(2), pp. 1-12.
Korona-Glowniak,  I.,  Zychowski,  P.,  Siwiec,  R., Mazur,  E.,  Niedxielska,  G.,  &  Malm,  A., 2018.  Resistant Streptococcus  pneumoniae
strains in children with acute otitis media-high risk of persistent colonization after treatment. BMC Infectious Disease , 18, pp. 1-12.
Nonmark-Henriques, B., Toumanen, E. I., 2013. The pneumococcus:  Epidemiology  microbiology, and pathogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med , 3, pp. 010215.
Pikis, A., Campos, J. M., Rodriguez, W. J., & Keith, J.  M.,  2001.  Optochin  resistance  in Streptococcus pneumoniae: Mechanism, significance,  and  clinical  implications. The Journal  of  Infectious  Disease ,  184,  pp.  582- 590.
Pinti, M., Appay, V., Campisi, J., Frasca, D., Fulop, T.,  Sauce,  D.,  Larbi,  A.,  Weinberg,  B.,  & Cossarizza,  A.,  2016.  Aging  of  the  immune system-focus on inflammation and vaccination. European Journal
of
Immunology , 46, pp. 2286–2301.
Satzke,  C.,  Turner,  P.,  Virolainen-Julkunen,  A., Adrian, P. V., & Antonio, M., 2013. Standard method  for  detecting  uppers  respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae : Updated  recommendations  from  the  world health  organization  pneumococcal  carriage working group. J. Vaccine , 32, pp. 165-179.
Tam,  S.  S.,  Lee,  C.,  &  Winter,  R.E.,  1993.  Hemin utilization  is  related  to  virulence  of Streptococcus pneumoniae . American Society for Microbiology . 61(12), pp. 5401-5405.