Research Article UNPAD

## UN CO RRECTED P RO OF

## Anti-Inflammatory Activity  of  Dysmenorrhea  Herbal  Medicine  Through Inhibition of the Cyclooxygenase Enzyme and Metabolomic Analysis
Fajar Prasetya1, Nurul M. Mus1, Mentarry Bafadal1, Nur R. K. Nisaa1, Ani Isnawati2, Lucie Widowati 2*
1Fakultas Farmasi, Universitas Mulawarman, Samarinda, Kalimantan Timur 2Pusat Riset Bahan Baku Obat dan Obat Tradisional, BRIN
Submitted 07 February 2024; Revised 04 June 2024; Accepted 11 June 2024; Published 31 July 2024 *Corresponding author: luci003@brin.go.id

## Abstract
Dysmenorrhea is the cramping or pain that occurs during menstruation. Although effective in treating dysmenorrhea, long-term use of NSAIDs can cause gastrointestinal side effects and bleeding. The aim of this study is to determine the anti-inflammatory activity of a traditional herbal remedy for dysmenorrhea, consisting of extracts of Andrographis paniculata, turmeric, moringa, red ginger, and dark chocolate, on cyclooxygenase (COX) enzymes, as determined by the TMPD method spectrophotometrically, and to identify the compounds and their concentrations in the samples using LC-HRMS. Based on the test results, all components of the dysmenorrhea herbal remedy exhibited inhibitory activity on COX-2 enzymes above 50% at a concentration of 1000 ppm. Metabolomic analysis using LC-HRMS showed that dark chocolate samples, turmeric rhizome infusion, ginger rhizome infusion, and ethanol extract of Andrographis paniculata herb contain compounds reported to have anti-inflammatory activity, such as andrographolide and its derivatives, theobromine, betaine, and pipecolic acid, with concentrations above 7%.
Keywords: Bitter, COX, Dysmenorrhea, Dark chocolate, Metabolomic analysis, Moringa, Red ginger, Turmeric

## Aktivitas Antiinflamasi Ramuan Jamu Dismenor melalui Penghambatan Enzim Siklooksigenase dan Analisis Metabolomiknya

## Abstrak
Dismenore  adalah  rasa  kram  atau  nyeri  yang  terjadi  ketika  menstruasi.  Meskipun  efektif  dalam pengobatan  dismenore,  penggunaan AINS  jangka  panjang  dapat  menyebabkan  efek  samping  pada sistem gastrointestinal dan terjadi pendarahan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antiinflamasi ramuan jamu dismenore yang terdiri dari ekstrak sambiloto, kunyit, kelor, jahe merah,dan coklat hitam terhadap enzim siklooksigenase (COX) yang ditentukan dengan menggunakan metode TMPD  secara spektrofotometri dan mengetahui kandungan dan kadar senyawa pada sampel tersebut menggunakan metode LC-HRMS. Berdasarkan hasil pengujian, seluruh komponen penyusun jamu dismenor memiliki aktivitas penghambatan pada enzim COX-2 di atas 50 % pada konsetrasi 1000 ppm  dan  berdasarkan  hasil  analisis  metabolomik  menggunakan  LC-HRMS  menunjukkan  bahwa sampel coklat hitam, infusa rimpang kunyit, infusa rimpang jahe dan ektrak etanol herba sambiloto mengandung senyawa yang telah dilaporkan memiliki aktivitas anti inflamasi seperti andrographolide dan turunannya, theobromine, betaine dan  asam pipekolat  dengan kadar kandungan di atas 7%. Kata  Kunci: Analisis  metabolomik,  Coklat  hitam,  COX,  Dismenor,  Jahe  merah,  Kelor,  Kunyit, Sambiloto

## UN CO RRECTED P RO OF
1.  Pendahuluan Sindrom  pramenstruasi  (PMS)  dan dismenore  primer  merupakan  keluhan ginekologi  yang  umum  di  kalangan wanita  di  usia  reproduksi.  Sebanyak  80  % wanita  mengalami  dismenor  saat  periode menstruasi. 8 Dismenor  adalah  nyeri  yang terjadi pada saat menstruasi. Gejala sistemik dismenor  yang  dapat  muncul  dapat  berupa kram, sakit kepala, rasa lesu, kelelahan yang berlebihan,  kesulitan  tidur  atau  keinginan untuk  tidur,  nyeri  pada  payudara,  perasaan berat di bagian bawah perut, nyeri punggung, serta sensasi nyeri pada lutut dan paha bagian dalam. Selain itu, dapat timbul pula mialgia, arthralgia,  dan  pembengkakan  pada  kaki. Gejala lain dismenor yang berkaitan dengan sistem  pencernaan  mencakup  perubahan nafsu  makan,  mual,  muntah,  dan  kembung, termasuk  sembelit,  diare,  frekuensi  buang air  kecil  yang  meningkat,  dan  peningkatan produksi  keringat. 1,2,3,4 Dismenore  dapat memberikan dampak buruk yang cukup besar pada  kesejahteraan  emosional,  psikologis, fungsional,  seperti  kecemasan,  stres,  mudah tersinggung  dan  suasana  hati  tertekan sehingga memengaruhi tingkat kualitas hidup para penderitanya. 1
Rasa  nyeri  yang  timbul  selama siklus  menstruasi  diakibatkan  oleh  adanya peningkatan ekspresi enzim siklooksigenase 6 yang pada akhirnya meningkatkan produksi  mediator  inflamasi  prostaglandin. Prostaglandin yang terlibat yaitu prostaglandin F2α (PGF2α) dan prostaglandin E2 (PGE2). PGF2α berperan dalam mengatur penyempitan pembuluh  darah  yang  mengakibatkan hipoksia  lokal  pada  jaringan  endometrium serta dapat merangsang kontraksi otot polos yang  mendukung  perdarahan  menstruasi. Sedangkan  PGE2  dapat  meningkatkan pembengkakan  serta  merekrut  leukotriene yang juga merupakan mediator pro-inflamasi. 5 Hal inilah yang mendorong penggunaan obat- obat anti inflamasi non-steroid sebagai terapi lini  pertama  untuk  pengobatan  dismenor. 7 seperti asam mefenamat, natrium diklofenak, ibuprofen, dan naproxen.
Namun  saat  ini,  pemanfaatan  bahan alam  dalam  bidang  pengobatan  juga
telah  memiliki  peranan  penting  dalam pengembangan  solusi  kesehatan  yang berkelanjutan dan efektif. Bahan alam, seperti tumbuhan obat dan senyawa-senyawa alami, telah lama digunakan dalam berbagai tradisi pengobatan  di  seluruh  dunia.  Keberagaman sumber  daya  alam  memberikan  potensi besar  untuk  menemukan  zat-zat  aktif  baru yang dapat digunakan dalam formulasi obat. Dengan  memanfaatkan  kearifan  lokal  dan pengetahuan tradisional, potensi besar bahan alam  sebagai  sumber  terapi  yang  inovatif dan  berkelanjutan  untuk  menjaga  kesehatan manusia dapat dioptimalkan khususnya pada pengobatan dismenor.
Pada penelitian ini peneliti memanfaatkan  sampel  kunyit,  jahe  merah, kelor dan sambiloto, dan coklat sebagai bahan baku  ramuan  jamu  dismenor  berdasarkan pertimbangan bahwa kurkumin yang banyak terdapat  pada  kunyit,  memiliki  efektivitas yang  baik  dalam  mengurangi  keparahan gejala  PMS  secara  psikologis,  fisik  dan perilaku sehingga kunyit potensial digunakan sebagai pengobatan herbal untuk mengurangi keparahan dan durasi dismenore. 9,10 Senyawa 6-gingerol  yang  terdapat  pada  jahe  dapat mengurangi  kadar  PGE2  dengan  menekan aktivitas enzimatik siklooksigenase dan PGE sintase  yang  secara  kooperatif  megkatalisis konversi  asam  arakidonat  menjadi  PGE2. 11 Selain  itu,  dalam  pengobatan  tradisional Indonesia, jahe merah telah digunakan secara empiris  sebagai  herbal  untuk  mengatasi batuk  berdahak  dan  migrain  serta  terbiasa menetralisir perut kembung, menghangatkan badan, memperbaiki pencernaan, dan menjaga stamina. 12 Senyawa andrographolide pada sambiloto  juga  dapat  mengurangi  ekspresi beberapa  gen  proinflamasi,  termasuk siklooksigenase-2  (COX-2). 13 Moringa oleifera kaya akan flavonoid dengan aktivitas antioksidan dan anti-inflamasi yang tinggi. 14 Penelitian  lain  juga  menunjukkan Moringa oleifera dapat  menekan  inflamasi  melalui penghambatan  produksi  mediator  inflamasi NO. 15 Sedangkan  cocoa  ( raw chocolate ) baik  dalam  penelitian  in  vitro  maupun  in vivo dilaporkan mampu mengurangi sitokin, kemokin,  spesies  oksigen  reaktif  (ROS),

## UN CO RRECTED P RO OF
NO,  dan  molekul  lain  yang  terlibat  dalam respons inflamasi dan nyeri meliputi senyawa golongan  polifenol,  metilxantin  (kafein  dan teobromin),  anandamide,  amina  biogenik, alkaloid, dan triptofan. 16 Quercetin pada kakao juga  dilaporkan  telah  terbukti  memberikan aktivitas  anti-inflamasi,  antioksidan,  dan analgesik. 17 Berdasarkan pendekatan tersebut,  ramuan  jamu  kunyit,  jahe  merah, kelor, sambiloto dan coklat diharapkan dapat menjadi herbal potensial sebagai antiinflamasi untuk mengurangi keluhan gejala dismenor. Sebagai  uji  pendahuluan,  dilakukan pengujian  penghambatan  terhadap  enzim siklooksigenase  (COX)  oleh  coklat,  ekstrak air  kunyit,  ekstrak  air  jahe  merah,  ekstrak air  kelor,  ekstrak  etanol  sambiloto  untuk mengetahui aktivitas anti inflamasinya secara in vitro.

## 2.  Metode
2.1.  Alat Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian ini, antara lain timbangan analitik, freeze dryer ,  mikro  pipet  Socorex  Swiss, vorteks, Sonikator Sonics Vibra Cell , 96-wells plate Cayman Chemical , microplate reader, dan  beberapa  peralatan  gelas  yang  umum digunakan di laboratorium.
2.2.  Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain rimpang kunyit, rimpang jahe merah,  daun  kelor,  herba  sambiloto,  coklat 72  %  ( Couverture ),  air  suling,  DMSO, kit colorimetric COX (ovine) inhibitor screening assay No. 760111 (Cayman Chemical Comp.) , Natrium Diklofenak.
2.3.  Prosedur Penelitian
2.3.1. Ekstraksi Sampel Simplisia  kering  rimpang  kunyit,  jahe merah  dan  kelor  dipanaskan  pada  suhu  90 derajat celcius selama 15 menit menggunakan aquadest  dengan  perbandingan  jumlah simplisia  kering  dan  akuades  100  g:1  L, lalu  di- freeze dry .  Herba  sambiloto  kering diekstraksi menggunakan etanol 96 % dengan perbandingan 100 g:1 L, 2x24 jam.
2.3.2. Preparasi Sediaan
Setiap pembanding (Natrium diklofenak)  dan  sampel  (ekstrak  kunyit, ekstrak  jahe  merah,  ekstrak  kelor,  ekstrak sambiloto dan coklat 72 %) dilarutkan dalam DMSO 0.4 % 50 µl kemudian disonikasi untuk mempercepat  kelarutannya  dan  dicukupkan dengan aquades hingga mencapai konsentrasi 200 dan 1000 ppm.
2.3.3. Pengujian Aktivitas Inhibisi COX Metode penghambatan enzim siklooksigenase 1 dan 2 menggunakan metode TMPD secara kolorimetri sesuai pada panduan kit colorimetric COX (ovine) inhibitor screening assay No.  760111.  Sebanyak  160 μL assay buffer dan 10 μL hemin dimasukkan ke dalam 3 wells sebagai background wells. Assay buffer sebanyak 150 μL, hemin 10 μL, dan enzim COX 1 atau COX 2 sebanyak 10 μL dimasukkan dalam 3 wells sebagai 100 % initial activity wells . Assay  buffer  sebanyak 150  μL,  10  μL  hemin,  enzim  COX  1  atau COX 2 10 μL, dan 10 μL sampel uji (masing- masing ekstrak) dengan konsentrasi 200 ppm dan 1000 ppm dimasukkan ke dalam inhibitor wells. Pelarut  10  μL  ditambahkan  masing- masing ke dalam 100 % initial activity wells dan background wells . Plate dikocok beberapa detik  dan  diinkubasi  selama  5  menit  pada 25℃. Kemudian semua wells yang digunakan ditambahkan larutan substrat kolorimetrik 20 μL dan asam arakidonat 20 μl. Plate dikocok secara  hati-hati  selama  beberapa  detik  dan diinkubasi  kembali  selama  10  menit  pada 25℃,  lalu  dilakukan  pembacaan  absorbansi pada  λ  590  nm  menggunakan microplate reader . Nilai  absorbansi background wells,
100% initial activity wells , dan setiap sampel pada inhibitor wells diambil nilai rata-ratanya, kemudian  dilakukan  perhitungan  sebagai berikut:

## UN CO RRECTED P

## RO OF
2.3.4. Ekstraksi sampel untuk analisis metabolomik Proses ekstraksi menggunakan metode sebagaimana yang dilakukan oleh Windarsih A, dkk (2022) yaitu sebanyak 50 mg sampel ekstrak  etanol  sambiloto  ditimbang  dan ditempatkan ke dalam tabung mikrosentrifuge. Sampel  diekstraksi  dengan  menggunakan 1  mL  MeOH  grade  MS,  divortex  selama 30  detik,  dan  kemudian  disonikasi  selama 30  menit  pada  suhu  ruangan.  Setelah  itu, sampel  disentrifugasi  pada  kecepatan 1400×g  selama  5  menit  untuk  memisahkan supernatan  dan  pellet.  Supernatan  diambil dan difiltrasi menggunakan filter PTFE 0,22 μm.  Supernatan  yang  telah  difiltrasi  siap untuk diinjeksikan dalam analisis LC-HRMS. Sebagai  langkah  persiapan,  MeOH  grade MS digunakan sebagai sampel kosong dalam analisis metabolomik. 19

## 2.3.5. Analisis  metabolomik  dengan  LC-
HRMS Analisis  sampel  (ekstak  kunyit, sambiloto, coklat dan jahe merah) dilakukan menggunakan kromatografi cair (Pompa Binari UHPLC Thermo Scientific™ Vanquish™ ) dan spektrometri  massa  resolusi  tinggi  Orbitrap (Spektrometer Massa Resolusi Tinggi Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Q Exactive™
Thermo  Scientific™ )  sebagaimana  yang dilakukan oleh Windarsih A, dkk (2022) yaitu Kromatografi  cair  dilakukan  menggunakan kolom analitis Thermo Scientific™ Accucore™ Phenyl-Hexyl 100 mm × 2,1 mm ID  ×  2,6  μm.  Fasa  gerak  yang  digunakan adalah air MS-grade yang mengandung 0,1% asam formik (A) dan metanol MS-grade yang mengandung 0,1% asam formik (B), dengan teknik  gradien  pada  laju  alir  0,3  mL/menit. Pertama,  fase  gerak  B  diatur  pada  5%  dan ditingkatkan  secara  bertahap  hingga  90% dalam  16  menit.  Kemudian,  dipertahankan pada  90%  selama  4  menit  dan  kembali  ke kondisi awal (5% B) hingga 25 menit. Suhu kolom diatur pada 40℃, dan volume injeksi adalah 3 μl. Skrining tanpa target dilakukan menggunakan  mode  akuisisi  full  MS/dd- MS2 pada polaritas/ionisasi positif. Nitrogen digunakan  untuk  gas sheath,  auxiliary ,  dan
sweep dengan pengaturan pada 32, 8, dan 4 arbitary unit (AU). Tegangan semprot adalah 3,30  kV,  suhu  kapiler  diatur  pada  320◦C, dan suhu pemanas gas tambahan diatur pada 30◦C.  Rentang  pemindaian  dilakukan  pada 66,7–1000 m/z, dan resolusi yang digunakan adalah  70.000  untuk full MS  dan  17.500 untuk  dd-MS2  dalam  mode  ionisasi  positif. Sistem diatur oleh perangkat lunak XCalibur 4.4 ( Thermo Scientific , Bremen, Jerman). 19
3.  Hasil dan Pembahasan Cyclooxygenase (COX)  atau  yang disebut juga dengan Prostaglandin H Sintase (PGHS)  adalah  enzim  bifungsional  yang menunjukkan aktivitas COX dan peroksidase. Komponen COX mengubah asam arakidonat menjadi hidroperoksil endoperoksida (PGG2),  dan  enzim  peroksidase  mengubah PGG2  menjadi  PGH2  (prostaglandin H2). 18 Uji  skrining  penghambat  kolorimetri COX  ( ovine )  Cayman  bekerja  dengan  cara mengukur  komponen  peroksidase  COX. Aktivitas peroksidase diuji secara kolorimetri dengan  memantau  munculnya  TMPD  yang teroksidasi pada panjang gelombang 590 nm.
Pada  penelitian  ini,  hasil  pengujian aktivitas  antiinflamasi  dinyatakan  dengan %  inhibisi  enzim  COX.  Hasil  pengujian menunjukkan  ekstrak  sambiloto  memiliki aktivitas  penghambatan  baik  pada  enzim COX-1  maupun  enzim  COX-2  dengan persen  inhibisi  masing-masing  sebesar 4.5%  (1000  ppm)  dan  74.29%  (1000  ppm). Sedangkan ekstrak kelor, jahe merah, kunyit dan  coklat  hitam  hanya  memiliki  aktivitas penghambatan  pada  enzim  COX-2  masing- masing  71.02%,  67.14%,  65.78%,  dan 68.99% pada konsentrasi 1000 ppm. Namun, Natrium  diklofenak  sebagai  pembanding tetap memiliki aktivitas penghambatan paling baik (Tabel 1).
Berdasarkan hasil analisis metabolomik menggunakan  LC-HRMS,  data  kandungan senyawa  sampel  uji,  formula  senyawa, retention time (RT)  dan  kadar  senyawa ditunjukkan  pada  tabel  2.  Pada  penelitian ini,  senyawa  dominan  yang  dilaporkan jika  kadarnya  melebihi  3  %.  Analisis metabolomik  sampel  dengan  LC-HRMS

## UN CO RRECTED P
RO OF menggunakan library ChemSpider dan mzCloud . Kromatogram sampel uji disajikan pada gambar 1, 2, 3, 4.
Senyawa-senyawa  dominan  yang terkandung pada sampel uji turut berkontribusi terhadap  aktivitas  penghambatan  pada enzim  siklooksigenase  seperti  senyawa andrographolide dan turunannya (14-Deoxy- 11,12-didehydro andrographolide )  yang
terdapat  pada  sambiloto, theobromine pada  coklat, betaine yang  terkandung pada  rimpang  jahe  merah,  herba  sambiloto dan  rimpang  kunyit  serta  asam pipekolat pada  rimpang  jahe  merah.  Aktivitas  anti inflamasi  ini  juga  didukung  oleh  berbagai riset  seperti  senyawa  andrographolide  dan turunannya yaitu 14-Deoxy-11,12-didehydro andrographolide telah  dilaporkan  memiliki
No Sampel Kandungan Senyawa Formula Berat Molekul RT Kadar (%) 1 Kunyit Betaine C 5 H11 N O2 117.07877 0.816 12.56 (+)-ar-Turmerone C 15 H20 O 216.15064 7.509 9.29 alpha-methylstyrene C 9 H10 118.078 7.507 5.77 D-(+)-Pipecolinic acid C 6 H11 N O2 129.07872 0.886 5.24 2 Coklat Theobromine C 7 H8 N4 O2 180.0642 2.018 38.67 Theobromine C 7 H8 N4 O2 180.0642 1.869 24.36 Caffeine C 8 H10 N4 O2 194.0798 4.164 8.40 3 Sambiloto 14-Deoxy-11,12-didehydro andrographolide C 20 H28 O4 332.1974 9.804 9.66 Andrographolide C 20 H30 O5 350.2078 7.802 7.79 Betaine C 5 H11 N O2 117.0788 0.804 4.68 Eicosatetraynoic acid C 20 H24 O2 296.1766 9.81 4.03 3-{2-[(1R,4aS,5R,8aS)-5,8a- dimethyl-2-methylidene- 5-({[(2R,3R,4S,5S,6R)-
3,4,5-trihydroxy-
6-(hydroxymethyl) oxan-2-yl] oxy} methyl)- decahydronaphthalen-1-yl] ethyl}-2,5-dihydrofuran-2- one C 26 H40 O8 480.2706 9.08 3.99 Cannabidivarin C 19 H26 O2 286.1923 9.677 3.6 4 Jahe Merah D - (+)-Pipecolinic acid C 6 H11 N O2 129.0787 0.887 20.18 Betaine C 5 H11 N O2 117.0788 0.822 12.18 1-Naphthol C 10 H8 O 144.057 10.26 4.43 Citral C 10  H16 O 152.1198 3.7 3.99 Table 2. Kandungan dan kadar senyawa komponen penyusun ramuan jamu dismenor
Sampel % Inhibisi COX-1 COX-2 200ppm 1000ppm 200ppm 1000ppm Sambiloto 4.073 4.515 10.96 74.29 Kelor 4.578 - 26.72 71.02 Jahe Merah - - 2.12 67.14 Kunyit - - 2.34 65.78 Coklat Hitam - - 14.70 68.99 Na. diklofenak 6.26 10.009 67.39 76.50
Table 1. Hasil Pengujian Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Sampel Terhadap Enzim COX

## UN CO RRECTED P RO OF
aktivitas antiinflamasi dengan berbagai model pendekatan penyakit inflamasi 20 salah satunya 14-Deoxy-11,12-didehydro andrographolide mampu menurunkan NF-κB yang merupakan faktor  transkripsi  untuk  memproduksi sitokin proinflamasi baik pada mencit model asma 21 dan pada model hewan fibrosis hati 22 sementara andrographolide salah  satunya dilaporkan  dapat  mengobati  arthritis  yang diinduksi CFA dengan menghambat ekspresi sejumlah  molekul  terkait  arthritis,  termasuk COX-2, NF-κB, p-p38, CD40, TNF-α, IL-1β, dan IL-6. 23 Asam pipekolat juga memberikan
efek  anti-inflamasi  yang  signifikan  melalui pengurangan  sitokin  pro-inflamasi  pada makrofag  melalui  penghambatan  sinyal mTORC1. 24 Betaine memiliki  efek  anti- inflamasi melalui penghambatan jalur sinyal NF-κB  yang  terlibat  dalam  produksi  sitokin pro-inflamasi, 25 sedangkan theobromine juga  bekerja  sebagai  anti  inflamasi  dengan cara  menekan  produksi  sitokin  proinflamasi TNF-α yang diinduksi oleh IL-1ß. 26
4.  Kesimpulan Pada penelitian ini, dapat disimpulkan
Gambar 1. Kromatogram sampel ekstrak herba sambiloto

## UN CO RRECTED P RO OF
bahwa  seluruh  komponen  penyusun  ramuan jamu dimenor memiliki aktivitas inhibisi pada enzim COX khususnya enzim COX-2 dengan persen  penghambatan  di  atas  50  %  pada konsetrasi  1000  ppm  sehingga  komponen penyusun  jamu  tersebut  dapat  digunakan sebagai  ramuan  untuk  mengatasi  dismenor. Hasil  LC-HRMS  pada  komponen  penyusun jamu  juga  menunjukkan  adanya  berbagai senyawa  yang  sebelumnya  telah  dilaporkan memiliki  potensi  sebagai  antiinflamasi seperti andrographolide dan  turunannya, theobromine, betaine serta    asam pipekolat dengan kadar kandungan di atas 7%.

## Ucapan Terimakasih
Penelitian  ini  didanai  oleh  Badan  Riset  dan Inovasi Nasional (BRIN) dan didukung oleh fasilitas  riset,  dan  dukungan  ilmiah  serta teknis dari Laboratorium Karakterisasi Lanjut Yogyakarta di BRIN.
Referensi
1.  Adib-Rad, H., Kheirkhah, F., Faramarzi,  M.,  Omidvar,  S.,  Basirat, Z., & Haji Ahmadi, M. (2022). Primary Dysmenorrhea
Associated with Psychological  Distress  in  Medical
Gambar 3. Kromatogram sampel infusa rimpang jahe merah
Gambar 4. Kromatogram sampel infusa rimpang kunyit

## UN CO RRECTED P RO OF
Sciences Students in The North of Iran: A  Cross-Sectional  Study.  International journal  of  fertility  &  sterility,  16(3),
224–229. https://doi.org/10.22074/
ijfs.2022.542056.1216 2.  Nagy  H,  Carlson  K,  Khan  MAB. Dysmenorrhea. [Updated 2023 Nov 12]. In:  StatPearls  [Internet]. Treasure  Island (FL): StatPearls Publishing; 2023.
3.  Alsaleem MA. Dysmenorrhea, associated symptoms,  and  management  among students  at  King  Khalid  University, Saudi  Arabia:  An  exploratory  study. J  Family  Med  Prim  Care.  2018  Jul- Aug;7(4):769-774.
4.  Calis  KA,  Dang  DK,  Kalantaridou  SN, Erogul  M.  Dysmenorrhea:  practice essentials, background, pathophysiology. New York (NY): Medscape; 2019.
5.  Evans, J.; Salamonsen, L.A. Inflammation, leukocytes and menstruation. Rev. Endocr. Metab. Disord. 2012;13:277–288.
6.  Oladosu  FA,  Tu  FF,  Hellman  KM. Nonsteroidal antiinflammatory
drug  resistance  in  dysmenorrhea: epidemiology, causes, and treatment. Am J Obstet Gynecol. 2018 Apr;218(4):390- 400.
7.  Doty  E,  Attaran  M.  Managing  primary dysmenorrhea. J Pediatr Adolesc Gynecol. 2006 Oct;19(5):341-4
8.  Bahrami, Afsane & Ariakia, Fatemeh & A.Ferns, Gordon & Ghayour-Mobarhan, Majid.  The  prevalence  of  menstrual problems  amongst  adolescent  girls  in northeastern Iran. Journal of Advances in Medical and Biomedical Research.2022; 30:1-8.
9.  Tabari,  Naghmeh  &  Kheirkhah, Masoomeh  &  Mojab,  Faraz  &  Salehi, Masoud.  An  Investigation  of  the  Effect of  Curcumin  (Turmeric)  Capsule  on  the Severity and Duration of Dysmenorrhea in Students of Iran University of Medical Sciences. Journal of Evolution of Medical and Dental Sciences.2020; 9:3444-3451.
10. Khayat  S,  kheirkhah  M,  Fanaei  H, Behboodi  Moghadam  Z,  pourmohsen M, Kasaeiyan A. Comparison the effects of Ginger and Curcumin in treatment of
premenstrual syndrome. Iran South Med J. 2015;18(3):575-586.
11. Hwang, Y. H., Kim, T., Kim, R., & Ha,
H.  The  Natural  Product  6-Gingerol Inhibits Inflammation-Associated Osteoclast  Differentiation  via  Reduction of Prostaglandin E₂ Levels. International journal of molecular sciences.
2018;19(7):2068.
12. Hendra, R. J., Rusdi, R. A., & Misfadhila, S. (2022). Phytochemical and Traditional Uses of Red Ginger: A Review (Zingiber officinale var. rubrum).
13. Tan W.S.D., Liao W., Zhou S., Wong W.S.F. Is there a future for andrographolide to be an  anti-inflammatory  drug?  Deciphering its major mechanisms of action. Biochem. Pharmacol. 2017;139:71–81.
14. Xu,  Y.  B.,  Chen,  G.  L.,  &  Guo,  M.  Q. Antioxidant  and  Anti-Inflammatory Activities  of  the  Crude  Extracts  of Moringa  oleifera  from  Kenya  and Their  Correlations  with  Flavonoids. Antioxidants  (Basel,  Switzerland).2019; 8(8):296.
15. Fard, M. T., Arulselvan, P., Karthivashan,
G., Adam, S. K., & Fakurazi, S. Bioactive Extract  from  Moringa  oleifera  Inhibits the Pro-inflammatory Mediators in Lipopolysaccharide Stimulated Macrophages. Pharmacognosy magazine.
2015;11(Suppl 4):S556–S563.
16. De  Feo,  M.,  Paladini,  A.,  Ferri,  C., Carducci, A., Del Pinto, R., Varrassi, G., & Grassi, D. Anti-inflammatory and anti- nociceptive effects of cocoa: a review on future perspectives in treatment of pain. Pain and Therapy. 2020;9:231-240.
17. Borghi SM, Pinho-Ribeiro FA, Fattori V, Bussmann AJ, Vignoli JA, Camilios-Neto D, Casagrande R, Verri WA., Jr Quercetin inhibits  peripheral  and  spinal  cord nociceptive mechanisms to reduce intense acute swimming-induced muscle pain in mice. PLoS One. 2016;11(9):e0162267.
18. Liu  J,  Seibold  SA,  Rieke  CJ,  Song  I, Cukier  RI,  Smith  WL.  Prostaglandin endoperoxide  H  synthases:  peroxidase hydroperoxide specificity
and cyclooxygenase activation. J Biol Chem.

## UN CO RRECTED P RO OF
2007 Jun 22;282(25):18233-18244. 19. Windarsih  A,  Suratno,  Warmiko HD,  Indrianingsih  AW,  Rohman
A, Ulumuddin YI. Untargeted metabolomics  and  proteomics  approach using  liquid  chromatography-Orbitrap high  resolution  mass  spectrometry  to detect  pork  adulteration  in  Pangasius hypopthalmus  meat.  Food  Chem.  2022 Aug 30;386:132856.
20. Li, X., Yuan, W., Wu, J., Zhen, J., Sun, Q., & Yu, M. Andrographolide, a natural anti- inflammatory agent: An Update. Frontiers in pharmacology. 2022;13:920435.
21. Lim  J.  C.,  Goh  F.  Y.,  Sagineedu  S. R.,  Yong  A.  C.,  Sidik  S.  M.,  Lajis  N.
H.,  et  al.  A  semisynthetic  diterpenoid lactone  inhibits  NF-κB  signalling  to ameliorate  inflammation  and  airway hyperresponsiveness  in  a  mouse  asthma model.  Toxicol.  Appl.  Pharmacol. 2016;302:10–22.
22. Liu  Y.  T.,  Chen  H.  W.,  Lii  C.  K.,
Jhuang  J.  H.,  Huang  C.  S.,  Li  M.  L., et  al.  A  diterpenoid,  14-deoxy-11, 12-didehydroandrographolide,
in andrographis
paniculata reduces steatohepatitis  and  liver  injury  in  mice fed  a  high-fat  and  high-cholesterol  diet. Nutrients. 2020;12 (2): E523.
23. Gupta S., Mishra K. P., Kumar B., Singh S. B., Ganju L. Andrographolide attenuates complete  freund's  adjuvant  induced arthritis via suppression of inflammatory mediators and pro-inflammatory cytokines. J. Ethnopharmacol. 2020; 261:
113022.
24. Zhang, N., Wang, X., Feng, M. et al. Early- life  exercise  induces  immunometabolic epigenetic  modification  enhancing  anti- inflammatory  immunity  in  middle-aged male  mice.  Nat  Commun.2024;15:3103. https://doi.org/10.1038/s41467-024-
47458-3
25. Zhao,  Guangfu,  et  al.  "Betaine  in inflammation:  mechanistic  aspects  and applications."  Frontiers  in  immunology 9. 2018;1070.
26. Gu,  Ronghe,  et  al.  "Theobromine mitigates IL-1β-induced oxidative stress,
inflammatory response, and degradation of type II collagen in human chondrocytes." International  Immunopharmacology  82. 2020; 106226.