## ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA KIMIA  ANTI VARICELLA
ZOSTER DARI DAUN PETAY ( Parkia speciosa Hassk.)
Sofyan Ramani 1 , Shirly Kumala 1 dan Partomuan Simanjuntak 1,2
1) Jurusan Obat Bahan Alam Magister Farmasi Universitas Pancasila, Srengseng Sawah, Jagakarsa, Jakarta. 2) Puslit Bioteknologi, LIPI, Jln. Raya Bogor KM 46 Cibinong 16911
1 e-mail : sofyan_ramani@yahoo.co.id

## Abstrak
Senyawa  kimia  dari  daun  petay  ( Parkia  spesiosa Hassk.)  yang  berpotensi  sebagai  anti  varicella zoster  virus  (VZV)  telah  diisolasi  dan  ditentukan  struktur  kimianya.  Isolasi  dilakukan  dengan  cara maserasi daun petay dengan  etilasetat dan pemurnian dengan kromatografi kolom ( SiO2 :  n-heksan  – etilasetat    10  :  1  sampai  2  :  1)  memberikan  isolat  murni  yang  berbentuk  kristal  berwarna  putih. Berdasarkan  interpretasi  data  spektrometer  UV,  IR, 1 HNMR,  MS  dan  membandingkan  dengan  data 1 HNMR, senyawa tersebut ditetapkan sebagai senyawa ‘Taraxerol’ C 30 H 50 O BM 426,16.
Kata kunci : Daun petay, Parkia spesiosa Hassk., cacar, varicella zoster herpes

## 1. Pendahuluan
Penggunaan  bahan  alam  sebagai  obat tradisional di Indonesia telah dilakukan oleh nenek moyang kita sejak berabad-abad yang lalu  terbukti  dari  adanya  naskah  lama  pada daun  lontar  Husodo  (Jawa),  Usada  (Bali), Lontarak  pabbura  (Sulawesi  Selatan), dokumen  Serat  Primbon  Jampi,  Serat Racikan  Boreh  Wulang  Dalem  dan  relief candi  Borobudur  yang  menggambarkan orang    sedang    meracik    obat    (jamu) dengan      tumbuhan      sebagai  bahan bakunya. [1]
Tumbuhan obat tradisional di Indonesia mempunyai  peran  yang  sangat  penting terutama  bagi  masyarakat  di  daerah pedesaan  yang fasilitas kesehatannya masih sangat terbatas.  Sejak dahulu tanaman  yang ada    di      Indonesia          menjadi              bahan penelitian  dan  kajian  mendalam  dari  para pakar  dunia.  Penelitian  terhadap  berbagai tanaman  yang  berkhasiat  terus  dilakukan. Berbagai penemuan telah membawa pandangan  baru  bagi  dunia  pengobatan khususnya  sebagai  pengobatan  alternative ketika  pengobatan  modern  perlahan  beralih dari masyarakat. [2]
Sekarang,  penelitian  dan  pengembangan tumbuhan  obat  baik  di  dalam  maupun  di luar  negeri  berkembang  dengan  pesat, terutama dalam bidang khasiat obat maupun analisis  zat  kimia  berdasarkan  indikasi tumbuhan  obat  yang  telah  digunakan  oleh sebagian  masyarakat  dengan  khasiat  yang teruji  secara  empiris.  Hasil  penelitian
tersebut  tentunya  lebih  memantapkan  para pengguna  tumbuhan  akan  khasiat  maupun kegunaannya. [3]
Salah  satu  tanaman  yang  secara tradisional  digunakan  sebagai  obat  adalah daun  tanaman  petay  ( Parkia  speciosa Hassk . ),  yang  masyarakat  menggunakannya sebagai obat luka akibat cacar air  dan racun serangga tomcat (Paederus littoralis) . [4]
Berdasarkan  latar  belakang  tersebut maka perlu dilanjutkan penelitian mengenai pelarut  yang  tepat  untuk  mengisolasi  serta mengetahui kandungan senyawa kimia yang terdapat dalam daun tanaman petay ( Parkia speciosa  Hassk. )  yang  berkhasiat  sebagai anti varicella zoster.
2. Metode Penelitian
Bahan  dan  alat  yang  digunakan penelitian ini adalah :
a. Bahan penelitian
Bahan  tanaman  yang  digunakan  pada penelitian ini adalah daun petay ( Parkia  speciosa Hassk)  yang  diperoleh dari  desa  Bakomtani,  Rancamaya  Bogor. Identitas  tumbuhan  tersebut  dideterminasi di  Herbarium  Bogoriense  Pusat  Penelitian Biologi,  Lembaga  Ilmu  Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong .
b. Bahan kimia Bahan  kimia  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah n -heksan, etil asetat, butanol, aquadest, lempeng KLT silika gel GF4 54 , silika gel 60 (70–230 Mesh),methanol HPLC, sel media
Dulbecco’s  Modified  Eagle’s  Medium (DMEM,  Gibco),  Fetal  Bovine  Serum (FBS,  Sigma),  Phosphate  Buffered  Saline (PBS)  pH  7.2,  biakan  sel  Madin-Darby Bovine  Kidney  (MDBK)  (P172),  virus Infectious  Bovine  Rhinotrachetis  (IBR) standar galur Colorado.
c. Alat Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu  seperangkat  alat  gelas laboratorium,  penangas  air  (Memmert), timbangan  analitik  (Mettler  Toledo), vacuum rotary evaporator (BUCHI Water Bath B-480), kolom kromatografi, chamber KLT, Bio Safety Cabinet (Jisico),
Nunc  TC  plate  96  (Tommy,Kit-man), pipet (Corning), tube (Corning), centrifuge/ ultracentrifuge (Beckman
coulter XL-100K), liquid handler, vortex ( Biosan,  V-1  plus  ),  incubator  37°C (Memmert),  incubator  CO 2 (Sanyo),
refrigerator (Toshiba), sonicator (Bransonic sonifier B12), inverted microscopes (Olympus CKX41), spektrofotometer  UV-Vis  (Hitachi  U- 1600), spektrofotometer Fourier-
transform Infrared (FTIR,  Shimadzu  IR Prestige  21),  spektrometri  resonansi magnetik inti (RMI, JEOL JNM ECA-500 MHz, LC MS-ESI (Mariner Biospectrometry-Finnigan Instrument), Column C-18 (15mmx1mm) d. Prosedur
1) Pengumpulan  Bahan  Tanaman  dan Penetapan Identitas Biologi Bahan  tumbuhan  yang  digunakan pada  penelitian  ini  adalah  daun  petay ( Parkia  speciosa Hassk.).  Determinasi dilakukan  di  Herbarium  Bogoriense, Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga  Ilmu  Pengetahuan  Indonesia (LIPI), Cibinong.
Sampel  daun  yang  telah  dipilih selanjutnya  dibersihkan  dari  kotoran, dan  dikeringkan  di  udara  terbuka, kemudian  dihaluskan  menjadi  serbuk yang homogen dengan derajat kehalusan 4/18  yang  dipersyaratkan  oleh  Materia Medika Indonesia.
2) Pembuatan ekstrak Sebanyak  1,5  kg  serbuk  daun  petay diekstraksi  dengan  metode  maserasi menggunakan pelarut etilasetat
sebanyak  15  liter.  Ekstraksi  pertama dilakukan tiga kali 24 jam menggunakan 3 liter etilasetat. Selanjutnya menggunakan 3 liter etilasetat setiap 1 x 24  jam,  maserat  dipisahkan  dan ditampung.  Maserat  dipekatkan  dengan vacuum  rotary  evaporator pada  suhu
40-50 o C  sampai  tidak  ada  lagi  pelarut yang dibebaskan, kemudian dikeringkan di  atas penangas air sambil dialirkan  udara  panas.  Setelah  itu didinginkan kemudian ditimbang, sehingga  didapatkan  ekstrak    kering etilasetat.    Selanjutnya  diekstraksi bertingkat dengan menggunakan air dan n -butanol  berturut-turut  masing-masing volume  200  ml  sehingga  diperoleh ekstrak etilasetat, ekstrak air dan ekstrak n -butanol.  Lakukan  uji  aktivitas  anti VZV terhadap ekstrak etilasetat, ekstrak air dan ekstrak n -butanol.
3) Pengujian  toksisitas  dan  aktivitas anti VZV. Untuk  pengujian  toksisitas  dan aktivitas  anti  VZV  pada  sel  MDBK, ekstrak  daun  petai  (etilasetat,  air, butanol)    dititrasi  dari  10 -1 sampai dengan  10 -12 .  Kurang  lebih  100  µl  dari setiap  dilusi  dimasukkan  ke  dalam  96 TC plate dengan 4 replika dari kolom 1 sampai dengan kolom ke 11. Kolom 12 digunakan  untuk  kontrol  sel  tanpa ekstrak.
Contoh  yang  diuji  dan  virus  IBR dicampurkan dengan volume yang sama dan  divortek  selama  kurang  lebih  5 detik,  dan  kemudian  diinkubasi  pada suhu 37° C selama satu jam agar terjadi kontak  antara  virus  dan  contoh.
Campuran tersebut
kemudian disentrifuge  pada  kecepatan  3000  RPM selama  15  menit.  Supernatan  diambil dan  disentrifuge  pada  kecepatan  lebih tinggi  30.000  RPM  selama  120  menit pada suhu 4°C. Supernatan dibuang dan pellet  diambil  dan  diresuspensi  dengan PBS. Hasil resuspensi kemudian dititrasi pada sel
MDBK  dari  larutan  awal  sampai dengan  10 -7 .  Kurang  lebih  100  µl  dari setiap  dilusi  diinfeksikan  ke  dalam  sel MDBK  dan  kemudian  diinkubasi  di dalam  incubator  CO 2 5%  pada  suhu
37°C.  Sel  kemudian  diamati  selama  5 hari  ditandai  dengan  adanya  perubahan sitopatik ( Cytopathic Effect/ CPE ) yaitu terjadinya kerusakan pada sel oleh virus IBR.  Setelah  didapatkan  jumlah  spot yang  terbanyak  dan  intensitas  warna yang  kuat  pada  uji  KLT  serta  hasil positif  uji  aktivitas  anti  VZV,  maka selanjutnya  dilakukan  ekstraksi  dengan pelarut yang sesuai.
4) Fraksinasi  dan  Pemurnian  Senyawa Kimia Metabolit Sekunder Setelah  diperoleh  ekstrak  yang mempunyai  aktivitas  terhadap  anti VZV,  ekstrak  kering  (EE)  difraksinasi secara  bertingkat  dari  pelarut  yang bersifat  non  polar sampai  pelarut  yang bersifat  polar.  Sebelum  difraksinasi ekstrak  kering  ditambahkan  celite secukupnya,
dihomogenkan
dan
dihaluskan. Kemudian campuran dimasukkan ke dalam kolom
kromatografi  dengan  fasa  diam  silika gel  60  (70-230  Mesh)  dan  dieluasi berturut-turut  menggunakan  fase  gerak ( n -heksana  :  etil  asetat)  metode  gradien dengan perbandingan (10:1 sampai 2:1). Dilakukan  kromatografi  kolom  (EE-F1- n-1 sampai n…) selanjutnya menggunakan  metode  isokratik  fase gerak ( n -heksana : etil asetat) perbandingan 15 : 1 sehingga diperoleh kristal putih.
5) Analisis  Spektroskopi  UV,  IR,
NMR dan LCMS.
Isolat  yang  diperoleh  dari  hasil kromatografi  kolom,  diambil  data spektroskopinya kemudian
diinterpretasikan.
3. Hasil dan Pembahasan
a. Hasil Pembuatan Ekstrak, Fraksi, Dan Subfraksi Ekstrak  simplisia  daun Parkia speciosa Hassk  diperoleh  dengan  cara maserasi  menggunakan  pelarut  etilasetat sebanyak 5 x 3 liter selama 24 jam, untuk maserasi pertama dilakukan selama 3 x 24 jam sambil sekali-sekali diaduk. Pemilihan etilasetat sebagai pelarut dalam proses maserasi berdasarkan pertimbangan pada pengujian pendahuluan  yang  dilakukan  yaitu
pemeriksaan hasil kromatografi lapis tipis (KLT)  menggunakan  eluen  ( n -heksan– etilasetat)  dengan  perbandingan  masing- masing    (10:1  sampai  1:  1),  pelarut etilasetat  menghasilkan  jumlah  bercak yang  lebih  banyak  dibandingkan  pelarut butanol maupun air, dan intensitas cahaya yang  dihasilkan  lebih  kuat/  terang (Gambar 1),
Gambar 1. KLT  ekstrak  etilasetat,  ekstrak butanol  dan  ekstrak  air  daun  petay eluen ( n -heksan–etilasetat) perbandingan   (10:1 sampai 1: 1) Selain itu ekstrak mempunyai aktivitas  sebagai  anti  VZV  (lampiran  4) dan  proses  penguapan  etilasetat  dengan titik  didih  (TD  77°C)  lebih  cepat dibandingkan  butanol  (TD  117.6°C)  dan air  (TD  100°C).  Ekstrak  hasil  penyarian dengan  etilasetat  kemudian  dipekatkan dengan vacuum  rotary  evaporator pada suhu 40-50 o C. Rendemen (ekstrak kering) yang dihasilkan sebanyak 7,76%.
b. Uji Toksisitas Dan Anti Vzv Untuk  mengetahui  efektifitas  ekstrak petai  terhadap  virus Infectious  Bovine Rhinotracheitis (IBR),  ekstrak  petai  diuji dengan  menggunakan  virus  IBR  strain Colorado  yang  tersedia  di  BB  Litvet. Prosedur  yang  digunakan  mengikuti prosedur  uji  Virus  Neutralisasi  dari Organisasi  Kesehatan  Hewan  Dunia (OIE) dengan sedikit modifikasi.
c. Uji Toksisitas Campuran  larutan  uji  dengan  virus IBR  di  sentrifuge  pada  kecepatan  3000
RPM selama 15 menit untuk menurunkan material dan sisa pelarut yang menyebabkan toksisitas di sel. Supernatan diambil  dan  disentrifuge  selama  30.000 RPM  selama  120  menit  pada  suhu  4°C untuk  mengendapkan  virus  IBR.  Hasil pengujian  toksisitas  menunjukkan  tidak adanya  perubahan  sitopatik    ( Cytopathic Effect/  CPE )  atau  tidak  terjadinya kerusakan  pada  sel  yang  telah  dicampur ekstrak  daun  petay  dengan  tirasi  10 -1 sampai  10 -11 yang  diinfeksi  oleh  virus IBR,  seperti  terlihat  pada  Tabel  1.berikut ini : Tabel 1. Uji Toksisitas VZV ekstrak daun petay
d. Uji aktivitas anti VZV Cara  kerja  yang  dilakukan  untuk pengujian  anti  VZV  pada  contoh  ekstrak daun  petay  sama  dengan  cara  kerja  uji toksisitas. melihat ada tidaknya kerusakan sel (CPE: Cytopathic Effect ). (Tabel 2.)
Tabel  2. Hasil  pengujian  aktivitas  ekstrak  daun petai  terhadap  virus  IBR  pada  sel MDBK Hasil  menunjukkan  bahwa  tidak  ada CPE pada sel yang diinfeksi menggunakan  virus  yang  telah  dicampur dengan ekstrak daun petai, seperti terlihat pada  sel  kontrol.  Sementara  itu  CPE terlihat pada sel yang diinfeksi menggunakan virus IBR.(Gambar 2)
Gambar 2 .  Perbedaan  sel  MDBK  yang mengalami  CPE  (A)  dan  yang tidak mengalami CPE (B) e. Pengujian  isolat  daun  petai  terhadap virus
Isolat (A dan B) yang didilusi dengan
2 mL PBS dan virus dengan volume yang sama  dicampurkan  dan  di  vortek  selama kurang  lebih  5  detik,  dan  kemudian diinkubasi  pada  suhu  37 ° C  selama  satu jam  agar  terjadi  kontak  antara  virus  dan contoh.  Campuran  tersebut  kemudian disentrifuge  pada  kecepatan  3000  RPM selama  15  menit  untuk  menurunkan material dan sisa isolat yang menyebabkan toksisitas di sel. Supernatan kemudian  dititrasi  pada  sel  MDBK  dari
10 -1 sampai  dengan    10 -10 .  Kurang  lebih 100  µl  dari  setiap  dilusi  diinfeksikan  ke dalam  sel  MDBK  (P.172)  dan  kemudian diinkubasi  di  dalam  inkubator  CO 2 5% pada  suhu  37°C.  Sel  kemudian  diamati selama 5 hari untuk melihat ada tidaknya kerusakan  sel  (CPE: Cytopathic  Effect ). Hasil  yang  tertera  pada  tabel  3 menunjukkan  bahwa  masih  terlihat  CPE pada pengenceran 10 -1 dan 10 -3 dari isolat yang telah dicampur dengan virus IBR. Tabel 3. Hasil pengujian isolat daun petai dengan virus IBR pada sel MDBK
f. Identifikasi Senyawa Hasil Pemisahan Kromatografi Kolom Isolat  yang  diperoleh  dari  hasil kromatografi kolom, diamati secara visual kemudian  dianalisis  dengan  spektrometri UV, IR, NMR dan LCMS.
1) Spektrum UV Hasil analisis spektrum Ultra Violet (UV)  untuk  isolat  F4  (Gambar  3) memberikan  serapan  puncak  pada panjang  gelombang  211,  258,  325  dan 341  nm  dengan  puncak  serapan maksimum  pada  panjang  gelombang 211 nm.
Gambar 3. Spektrum UV untuk isolat F4.
2) Spektrum IR Hasil analisis spektrum FTIR untuk isolat F4.20-24 (Gambar 4.) menghasilkan  puncak  spectrum  pada bilangan  gelombang  (cm -1 )  3481,  2932,
2852, 1460, 1383, 1037 serta
memberikan  gambaran  tidak  adanya gugus  karbonil  di  daerah  bilangan gelombang  1630-1850  cm -1 ,  adanya alkana  stretching  C–H  di  daerah bilangan  gelombang  2850-3000    cm -1 , gugus  hidroksil  di  daerah  bilangan gelombang 3200-3700 cm -1 dan adanya tekuk  –C-H  di  daerah  bilangan gelombang 1300-1475 cm -1 .
Gambar  4. Spektrum FTIR isolat F4
3) Spektrum  Magnetik  Inti  (RMI) Proton
Hasil  analisa spektrum RMI  proton untuk isolat F4 (Gambar 5)
Gambar  5 . Spektrum 1 H-NMR isolat  F4
Menghasilkan  pergeseran  kimia proton 1 H  NMR  (CDCl3  ,  500  MHz (ppm)  :    δH  0.80  (3H,s),    0.82  (3H,s), 0.87  (H,m),    0.90  (3H,s),  0.90  (3H,s), 0.92  (3H,s),    0.94  (3H,s),    0.97  (3H,s), 0.99  (H,m),  0.99  (H,m),  1.02  (H,m), 1.09  (3H,s),    1.23  (H,m),  1.25(2H,m), 1.33  (H,m),  1.35  (H,m),  1.38  (H,m), 1.46  (H,m),    1.46  (H,m),    1.48  (H,m),
211 258 325 341
1.54(H,m),    1.63  (H,m),  1.64  (H,m),
1.64  (H,m),  1.64  (H,m),  1.66  (H,m),
1.67  (H,m),  1.67  (H,m),  1.92  (H,m), 2.04 (H,m), 3.20 (H,d),  5.53 (H,dd).
4) Kromatografi Cair – Spektro Massa Hasil  analisa  kromatografi  cair menunjukkan  bahwa  waktu  retensi isolat  adalah  3.8  ,  dan  hasil  spektrum massa  menunjukkan  bahwa  bobot molekul  isolat  adalah  426.16  (Gambar 6)
Gambar  6 . Spektrum massa isolat F4

## g. Evaluasi Hasil Identifikasi
Berdasarkan perbandingan data
pengukuran  senyawa  isolat  dengan Taraxerol  maka  senyawa  isolate  adalah Taraxerol (tabel 4) dengan rumus molekul C 30 H 50 O,  bobot  molekul  426,16,  struktur kimia dapat dilihat pada Gambar 7.
HO 26 1 5 10 13 18 22 23 24 25 27 28 29 30 Gambar  7 Struktur kimia Taraxerol
C 30 H 50 O,  m/z 426,16
Tabel 4 .  Perbandingan pergeseran kimia proton (δH) senyawa isolat F4 dengan Taraxerol
4. Kesimpulan
a. Uji pendahuluan terhadap ekstrak etil asetat,    fraksi  etil  asetat,  fraksi butanol  dan  fraksi  air  menunjukkan aktivitas  anti  varicella  zoster  virus (VZV)  dan  tidak  menunjukkan adanya toksisitas.
b. Uji  bioaktivitas  terhadap  fraksi  etil asetat  menghasilkan  6  sub  fraksi sederhana.  Sub  fraksi  1  meng- hasilkan  kristal  yang  menunjukkan aktivitas anti varicella zoster virus.
c. Pemurnian  sub  fraksi  1  meng- gunakan  silica  gel  dengan  pelarut
Heksan-etilasetat menghasilkan
kristal  yang  menunjukkan  aktivitas anti  VZV.  Pemurnian  fraksi  11 menggunakan  silica  gel  dengan pelarut n Heksan-etilasetat  (15  :  1) menghasilkan  kristal  murni  yang menunjukkan aktivitas anti VZV.
d. Identifikasi  isolat  murni  dengan menggunakan  metode  FT-IR, 1 H-
NMR,  dan  LC-MS  menghasilkan
426,16
rangkuman informasi yang menunjukkan bahwa isolat mempunyai  berat  molekul  m/z  426.1
adalah Taraxero l.
5. Daftar Pustaka
[1]. Sukandar  E.Y.  Tren  d  an.  2012. Paradigma  Dunia  Farmasi,  Industri-
Klinik-Teknologi Kesehatan,
disampaikan dalam orasi ilamiah Dies Natalies ITB, diakses Januari.
[2]. Sulaksana,  J.  Budi.  S.,  Dadang,  I.  J. Tempuyung,  2004.  Budi  Daya  dan Pemanfaatan  Untuk  Obat.,  Cetakan pertama, Jakarta: Penebar Swadaya.
[3]. Dalimartha, S., 2000.Atlas Tumbuhan Obat  Indonesia  Jilid  1.,  Jakarta Cetakan pertama Trubus Agriwidya.
[4]. Uus  Kuswara,    Masyarakat  Cirebon dan  Majalengka  Sumber  gambar: susanharsawardana.wordpress.com pengobatan-galihgumelar.com sidomi .com/80459/ tomcat -berbahaya/ http: //kesehatan.kompasiana.  com/medis /2012/04/11/ daun-petai-bisa-obati- luka-akibat-virus-herpes-dan-racun- tomcat-454037.html, diakses 23 April 2014 [5]. Ye  J.C.,  2010.  Extraction  And Analysis  Of  Β-Sitosterol  In  Herbal Medicines. J Med Plants Res . 4:522-7 .