## ANALISIS KERAGAMAN GENETIK TIGA STRAIN
NILA MERAH ( Oreochromis sp)

## DENGAN ANOVA RAPD
Iskandariah 1* , Otong Zenal Arifin 1 dan Rudhy Gustiano 2
1 Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar Jl. Sempur No.1, Bogor *e-mail : iskandariah.3010@gmail.com
2 Balai Riset Budidaya Ikan Hias

## ABSTRACT
Analysis Genetic Variation of Three Strains of Red Tilapia by Anova of RAPD.

## By. Iskandariah, Otong Zenal Arifin and Rudhy Gustiano
Study on the genetic variance of three strains of red tilapia (Oreochromis sp) had been conducted in the Biology Molecular Laboratory, Research Institute for Freshwater Aquaculture (RIFA) Bogor.  Three different strains, Red NIFI from Thailand,  Red Tilapia from Lido lake and Red Tilapia from Bogor’s farmer were analyzed in the  study.  Observation used Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD) with OPA-03, OPA-04, OPC 14 and OPC-15 primers.  The results showed that only OPA-03 primer was able to amplify numerous  samples.    Further  analysis  showed  that  the  percentage  of  polimorphic  range  was  between  16.67  –  38.89%,  heterozygosity value 0.0378 – 0.1536 and genetic distance among strain 0.3051 – 0.6037.
Keywords : RAPD, genetic, strain, nile tilapia, oreochromis

## ABSTRAK
Penelitian  mengenai  variasi  genetik  tiga  strain  nila  merah  dari  3  lokasi  yang  berbeda  telah  dilakukan  di  Laboratorium Molekuler Biologi, Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar (BRPBAT) Bogor.  Strain yang diamati meliputi jenis nila Red NIFI dari Thailand,  nila  merah  dari  Danau  Lido  dan  nila  merah  dari  Petani  Bogor.  Penelitian  menggunakan  metode  analisis  Random  Amplified Polymorphism DNA (RAPD), dengan menggunakan primer OPA-03, OPA-04, OPC-14 dan OPC-15.  Hasil pengamatan menunjukkan hanya OPA-03 yang dapat menghasilkan amplifikasi dalam jumlah sampel yang memadai.  Hasil analisis menunjukkan bahwa persentase polimorfik berkisar antara 20.00-40.00%, dengan nilai heterozigositas 0.0604–0.1516 dan jarak genetik antar strain 0.1770-0.4865.
Kata kunci : RAPD, genetik, strain, ikan nila, oreochromis

## PENDAHULUAN
Ikan nila merah merupakan ikan introduksi asal Filipina (1981) dan Thailand (1989).  Beberapa keunggulan yang dimiliki seperti mudah berkembang  biak,  pertumbuhan  relatif  cepat,  tahan terhadap  hama  penyakit  dan  toleransi  yang  cukup luas  terhadap  perubahan  lingkungan  menyebabkan teknologi budidaya ikan ini berkembang cukup luas di beberapa daerah di Indonesia bahkan produksinya  telah  diekspor  ke  beberapa  negara Eropa,  Singapura,  Jepang  dan  Amerika  Serikat. Selain dapat diekspor dalam bentuk fillet segar juga dapat diekspor dalam keadaan hidup.
Budidaya  ikan  nila  merah  dapat  dilakukan di  kolam,  sawah,  tambak,  keramba,  jaring  apung, baik diperairan tawar, payau maupun di tepi pantai. Tingginya animo masyarakat dalam membudidayakan  ikan  nila  merah  ini  berdampak pada  perubahan  kualitas  genetik  turunan  yang dihasilkan  akibat  kurangnya  pemahaman  mengenai pengelolaan  induk  yang  baik.    Penurunan  kualitas
genetik  ikan  secara  umum  ditandai  dengan  sifat- sifat  seperti  pertumbuhan  lambat,  tingkat  kematian tinggi, kematangan gonad pada usia dini dan ukuran individu yang kecil.
Penelitian  perbaikan  genetik  untuk  ikan nila  hitam  telah  banyak  dilakukan  di  Indonesia, namun untuk nila merah belum banyak dikaji. Pada penelitian  yang  dilakukan  oleh  Nugroho  dan Maskur  (2002)  dengan  menggunakan  metode mtDNA  menunjukkan  terdapat  indikasi  bahwa salah satu induk nila merah adalah berasal dari nila hitam.    Menurut  Nugroho  dan  Maskur  (2002), beberapa  peneliti  berpendapat  bahwa  ikan  nila merah  merupakan  hasil  hibrid  dari  nila  hitam  dan nila  putih/bule,  namun  demikian  hasil  riset  yang mendukung pendapat tersebut belum ada.
Mengingat  peranan  ikan  nila  merah  yang cukup  strategis  bagi  perikanan  budidaya  di Indonesia,  maka  penelitian  dasar  yang  menunjang untuk  perbaikan  mutu  genetik  ikan  nila  merah penting untuk dilakukan.  Tujuan dari penelitian ini adalah  untuk  mengetahui  keragaman  genetik  ikan
nila  merah  yang  dikoleksi  dari  3  lokasi  yang berbeda,  yaitu  Red  NIFI,  Merah  Lido  dan  Merah Petani  dengan  menggunakan  metode Random Amplified  Polymorphism  DNA (RAPD),  sebagai informasi  dasar  dalam  meningkatkan  mutu  genetik ikan nila merah.

## BAHAN DAN METODE

## Ikan Uji
Ikan  uji  yang  digunakan  adalah  3  strain ikan  nila  merah  koleksi  yang  diambil  dari  lokasi yang berbeda, yaitu Red NIFI dari Thailand ukuran 5-8  cm  (10  sampel),  nila  merah  dari  Danau  Lido ukuran  5-8  cm  (10  sampel)  dan  nila  merah  dari Petani  Bogor  ukuran  3-5  cm  (10  sampel).  Sampel ikan  nila  yang  digunakan  berupa  sirip  yang dipotong  dan  disimpan  dalam  larutan  alkohol  70% untuk digunakan dalam proses analisis.

## Ekstraksi DNA
DNA  ikan  diekstraksi  dari  potongan  sirip dengan  menggunakan  metode Phenol-Chloroform (Nugroho,  2001).    Potongan  sirip  sebanyak  5  –  10 mg dimasukkan dalam mikrotube 1,5 ml yang telah diisi  dengan  500  ml  TNES  Urea,  kemudian ditambah  10  µl  protein  kinase.    Setelah  di vortex selama 1 menit sampel diinkubasi pada suhu 37 ºC selama  24  jam.  Selanjutnya  ditambah  larutan Phenol  Chloroform sebanyak  1000  µl  dan  di vortex selama  1  menit.  Sampel  kemudian  disentrifius dengan  kecepatan  10.000  rpm  selama  10  menit. Supernatan diambil dan dimasukkan dalam mikrotube  baru,  lalu  ditambah  dengan  1000  µl ethanol 90%  dan  10  µl  CH 3 COONa.    Sampel  lalu di vortex selama  1  menit  sampai  terlihat  gumpalan berwarna  putih.    DNA  diendapkan  dengan  cara mensentrifiusnya  dengan  kecepatan  10.000  rpm selama 10 menit, lalu dikeringkan pada suhu kamar. Pelet  DNA  dilarutkan  dengan  100  µl  Tris-EDTA (TE) buffer dan  disimpan  pada  suhu  4  ºC  sebelum digunakan pada tahap selanjutnya.

## Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD)
Primer  yang  digunakan  adalah  OPA-03 dengan  urutan  basa  AGT  CAG  CCA  C.    Proses amplifikasi  dilakukan  dengan  metode Polymerize Chain  Reaction (PCR)  dengan  komposisi  reaksi: 1µl  DNA,  1.5  µl  primer,  12.5  µl  2X  PCR Master Mix dan  10  µl  H 2 O;  dengan  total  volume  25  µl. Selanjutnya dimasukkan dalam thermocycler dengan 1 siklus denaturasi pada suhu 94 ºC selama
2  menit,    35  siklus  penggandaan  yang  terdiri  dari denaturasi  pada  suhu  94  ºC  selama  1  menit, annealing pada  suhu  36  ºC  selama  1  menit  dan elongasi  pada  suhu  72  ºC  selama  2,5  menit;  dan elongasi  akhir  pada  suhu  72  ºC  selama  7  menit. Hasil PCR kemudian dielektroforesis menggunakan gel  agarose  1%  dalam  Tris-Boric-EDTA  (TBE) buffer 1%. Hasilnya diamati dengan UV illuminator dan dicetak gambarnya dengan Polaroid.

## Analisis Data
Analisis  data  menggunakan  software Tools For Population Genetic Analysis (TFPGA).  Variasi genetik  antar  populasi  menggunakan Analysis Moleculer  of  Varians (AMOVA)  dan  Fst, sedangkan kekerabatan antar populasi menggunakan  jarak  genetik  (D)  yang  dianalisis berdasarkan  Wright  (1978)  modifikasi  Rogers (1972).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari  4  jenis  primer  yang  dicoba,  yakni  : OPA-03,  OPA-04,  OPC-14  dan  OPC-15,  hanya OPA-03  yang  dapat  menghasilkan  amplifikasi dalam jumlah sampel yang banyak. Jumlah fragmen yang  dihasilkan  melalui  analisa  menggunakan pimer  OPA-03  sebanyak  8  sampai  11  fragmen, dengan ukuran fragmen berkisar antara 200 sampai 1600 bp dan jumlah lokus sebanyak 15 lokus. Hasil amplifikasi  primer  OPA-03  pada  strain  nila Red NIFI  disajikan  pada  Gambar  1,  sedangkan  strain nila  merah  Danau  Lido  pada  Gambar  2  dan  strain nila merah petani pada Gambar 3.
Secara  umum  keragaman  genetik  ikan  nila merah yang diuji relatif rendah dengan kisaran nilai polimorfisme  20.00-40.00%  dan  heterozigositas 0.0604-0.1516    (Tabel  1).  Hasil  yang  sama  juga terjadi  pada  penelitian  Iskandariah et  al. (2009), lima  strain  ikan  nila  yang  diuji  meliputi  ikan  nila merah Danau Lido, Red NIFI, nila lokal Kuningan, nila lokal Bogor dan nila BEST memiliki persentase polimorfisme  berkisar  antara  22.22  –  38.89%  dan heterozigositas 0.0378 – 0.1536. Rendahnya tingkat keragaman  genetik  ini  disebabkan  karena  ikan  air tawar mempunyai tingkat migrasi yang lebih rendah sehingga  peluang  terjadinya  persilangan  dengan jenis  dan  ras  lainnya  juga  semakin  kecil (Kirpichnikov, 1981; Tave, 1991).
Analisis  statistik  dengan  menggunakan AMOVA  menunjukkan  bahwa  terdapat  perbedaan genetik  secara  nyata  antara  strain  nila  Red  NIFI dengan  nila  merah  Danau  Lido  dan  nila  merah Petani  (P<0.05),  sedangkan  antara  nila  merah
Danau  Lido  dan  nila  merah  Petani  tidak  terdapat perbedaan yang nyata (P>0.05). Hal ini disebabkan karena antara strain nila merah Danau Lido dan nila merah  Petani  kemungkinan  mempunyai  hubungan kekerabatan  berdasarkan  strain  yang  pernah  di datangkan  ke  Indonesia,  sedangkan  nila  Red  NIFI yang  digunakan  merupakan  ikan  introduksi  baru. Hasil analisa statistik ditampilkan pada Tabel 2.
Jarak  genetik  tertinggi  antara  strain  nila merah Red NIFI dan nila merah Petani dan terendah antara  nila  merah  Danau  Lido  dengan  nila  merah petani  (Tabel  3).  Dendogram  yang  dibentuk berdasarkan  jarak  genetik  tersebut  menunjukkan
bahwa antara strain nila merah Danau Lido dan nila merah  Petani  terdapat  hubungan  kekerabatan  yang lebih  dekat,  dibandingkan  dengan  hubungan kekerabatan antara strain nila Red NIFI dan 2 strain lainnya  (Gambar  2).    Kedekatan  hubungan kekerabatan  antara  strain  nila  merah  Danau  Lido dan nila merah Petani disebabkan karena keduanya mempunyai  asal-usul  induk  yang  relatif  sama, sementara  nila Red NIFI  merupakan  generasi terbaru dari Thailand.  Keadaan serupa juga terjadi pada ikan kingfish yang dikoleksi Jepang, Australia dan New Zealand (Nugroho et al ., 2001).
Tabel 1.  Nilai Polimorfisme dan Heterozigositas Tiga Strain Nila Merah Menggunakan Primer OPA-03
No. Keterangan Strain Red NIFI Nila Merah D.Lido Nila Merah Petani 1. Polimorfisme 40.0000% 26.6667% 20.0000% 2. Heterozigositas 0.1516 0.0926 0.0604 Tabel 2.  Hasil Uji Fst Berpasangan Tiga Strain Nila Merah Menggunakan Primer OPA-03 Strain Red NIFI Nila Merah D. Lido Nila Merah Petani Red NIFI **** Nila Merah D. Lido 0.0000 **** Merah Petani 0.0000 0.9140 **** Tabel 3.  Jarak Genetik antar 3 Populasi Nila Merah dengan Primer OPA-03 Strain Red NIFI Nila Merah D. Lido Nila Merah Petani Red NIFI **** Nila Merah D. Lido 0.4195 **** Merah Petani 0.4865 0.1770 ****
Gambar 4.  Dendogram dari 3 Strain Nila Merah yang Diamati.
1= Red NIFI; 2= Nila Merah Danau Lido; 3= Nila Merah Petani

## KESIMPULAN
Strain  nila Red NIFI,  nila  Merah  Danau Lido  dan  nila  Merah  Petani  mempunyai  tingkat keragaman  genetik  yang  rendah  dengan  kisaran polimorfisme  20.00-40.00%  dan  heterozigositas antara  0.0604-0.1516.  Terdapat  perbedaan  genetik secara nyata antara strain ikan nila merah Red NIFI dengan  nila  Merah  Lido  dan  Merah  Petani, sedangkan  antara  nila  Merah  Lido  dan  Merah Petani  tidak  terdapat  perbedaan  yang  nyata.    Jarak genetik  tertinggi  antara strain  nila  merah Red NIFI dan  Merah  Petani  dan  terendah  antara  nila  Merah Lido dengan Merah petani.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada Balai  Riset  Perikanan  Budidaya  Air  Tawar. Penelitian ini merupakan bagian penelitian perikanan  budidaya  air  tawar  yang  dibiayai  oleh DIPA TA 2009.

## DAFTAR PUSTAKA
Iskandariah,  I.  I.  Kusmini,  O.  Z.  Arifin  dan  R. Gustiano.  2009. Variasi  genetik  5  populasi ikan  nila  (Oreochromis  niloticus)  dengan metode analisis Random Amplified Polymorphism  DNA  (RAPD) .    Seminar
nasional perikanan Indonesia 2009. Sekolah Tinggi Perikanan, Jakarta.
Kirpichnikov,  V.  S.    1981.    Genetic  based  of  fish selection. 410 pp. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany.
Miller, M. P.  1997. Tools For Population Genetic Analysis (TFPGA) version 1. 3 . Department of  Biological  Science.  Northern  Arizona University, Arizona, USA, 30 pp.
Nugroho, E. 2001. Capability of mitochondria DNA D-Loop  markers  from  shark  species identification.
Indonesian Fisheries
Research  Journal,  7 (1) : 62 – 66 .
Nugroho,  E.,  D.  J.  Ferrell,  P.  Smith  and  N.
Taniguchi.  2001.  Genetic  divergence  of kingfish  from  Japan,  Australia  and  New Zealand inferred by microsatellite DNA and mitochondrial DNA control region markers .
J. Fisheries Science,  67 : 843 – 850 .
Nugroho, E dan Maskur. 2002.  Benarkah ikan nila merah  adalah  hasil  hybrid?  (melacak  asal usul  nila  merah  dengan  menggunakan molecular  genetic  markers ). Warta penelitian  perikanan  Indonesia,  Vol.  8  No. 1 : 8–11 .
Tave,  D.  1993. Genetics  for  fish  managers .    The AVI Publ. Comp. Inc. NY, USA, 418 pp.
Wright,  1978.  Modifikasi  Rogers  1972. Analysis Moleculer  of  Varians (AMOVA)  dan  Fst, sedangkan  kekerabatan  antar  populasi menggunakan  jarak  genetik  (D)  yang dianalisis .