## PERTUMBUHAN L.CASEI PADA BERBAGAI LAMA FERMENTASI MINUMAN
SINBIOTIK DARI EKSTRAK CINCAU HIJAU ( PREMNA OBLONGIFOLIA MERR)

## L. CASEI  GROWTH ON VARIOUS FERMENTATION TIME SINBIOTIC BEVERAGE OF GREEN CINCAU EXTRACT (PREMNA OBLONGIFOLIA MERR )
Suharyono ¹ ) , Samsul Rizal ¹ ) , Fibra Nurainy ¹ ) , Muhamad Kurniadi ² )
1) Dosen  Jurusan Teknologi Hasil Pertanian Fakultas Pertanian Universitas Lampung, Jl.Ir.Sumantri Brojonegoro No.1 Bandar Lampung  35145
2) Peneliti UPT.Balai Pengembangan Proses dan Teknologi LIPI, Desa Gading, Playen Gunungkidul, Yogyakarta, Tlp.0274392570, email :HM_KUR@yahoo.com

## ABSTRACT
The objective of this research was to get optimal fermentation time in creating of sinbiotic beverage from green cincau leave  extract  in  such  a  way  that  high  total content  of  lactic  acid bactery  will  be  obtained.  The design  which  was  utilized  to  conduct  this  research  was  Completely Randomized  Design.  The  experiment  was arranged in three times repetation with single factor i.e fermentation duration which consist of 7 stage i.e 0 hour as a control, 8, 16, 24, 32, 40, and 48 hours at temperature of 37 o C. The result of obtained observation then was examined its homogenity with Bartlett test and growing data with Tuckey test, then the data were analyzed its heteregoneity to know the presence of difference betwen 1% and 5% of Less Significant Differential. The result showed that the appropriate and optimal duration of fermentation to produce sinbiotic beverage of green cincau leaves extract was16 hours with product characteristic possess highest total amount of LAB at 1,78x10 10 CFU/ml with pH 3,40 and acid total 3.30%.
Keywords : Extract of green cincau leave, Fermentation,  Lactobacillus casei, Sinbiotic beverage

## ABSTRAK
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  mendapatkan  waktu  fermentasi  optimal  dalam  pembuatan minuman sinbiotik dari ekstrak cincau hijau sehingga didapat total kandungan bakteri asam laktat. Rancangan percobaan  dalam  penelitian  ini  adalah  rancangan  kelompok  acak  lengkap.  Penelitian  disusun  dalam  tiga  kali pengulangan dengan satu faktor lama fermentasi yang terdiri dari 7 tahap yaitu 0 sebagai kontrol,, 8, 16, 24, 32, 40, dan 48 jam pada suhu 37 o C. Hasil pengamatan kemudian diuji dengan Uji Bartlett dan dengan Uji Tuckey, untuk  mengetahui  adanya  perbedaan  antara  1%  dan  5%  dari  perbedaan  yang  kurang  signifikan.  Hasilnya menunjukkan bahwa lama fermentasi optimal untuk menghasilkan minuman sinbiotic cincau hijau ekstrak daun adalah 16 jam dengan karakteristik produk memiliki jumlah tertinggi di BAL 1,78 x10 10 CFU / ml dengan pH 3,40 dan total asam 3,30%.
Kata kunci : ekstrak daun cincau hijau, fermentasi, Lactobacillus casei. minuman sinbiotik

## PENDAHULUAN
Cincau  merupakan  bahan  makanan tradisional yang  telah lama  dikenal masyarakat  dan  digunakan  sebagai  isi minuman  segar.  Cincau  disenangi  karena mempunyai rasa khas, segar dan dingin serta harganya  murah.  Menurut  Nurdin,dkk. (2006), berdasarkan pengujian in vitro dan in vivo Komponen  Pembentuk  Gel  (KPG) cincau  berpotensi  sebagai  prebiotik  dan mampu  meningkatkan  total  BAL.  Hal  ini dikarenakan KPG cincau hijau memiliki sifat laksatif  dan  sekaligus  mampu  meningkatkan densitas  bakteri  asam  laktat  (BAL)  digesta tikus percobaan.
Salah  satu  bentuk  pengembangan produk  olahan  dari  daun  cincau  hijau  yaitu dengan  memanfaatkannya  sebagai  substrat
dalam pembuatan  minuman  sinbiotik. Untuk membuat  suatu  produk  sinbiotik  diperlukan kandungan  substrat  (prebiotik)  yang  mampu menjaga kelangsungan hidup dan pertumbuhan  bakteri  yang  menguntungkan bagi  inangnya  (probiotik).  Apabila  suatu minuman  mengandung  kombinasi  dari keduanya  dan  bersifat  sinergis  maka minuman  tersebut  disebut  sebagai  minuman sinbiotik (Anonim, 2008).
Proses  fermentasi  dapat  berlangsung dengan  baik  dengan  adanya  inokulum sebagai  starter  dan  media  fermentasi  yang menyediakan  nutrient  untuk  pertumbuhan bakteri (prebiotik), bahan pembentuk sel, dan biosintesis produk metabolisme. Jenis bakteri asam  laktat  (BAL)  dan  substrat  yang digunakan  merupakan  faktor  yang  penting untuk  memperoleh  minuman  fermentasi
laktat yang berkualitas. Selain itu, penetapan lama  fermentasi  juga  akan  berpengaruh terhadap sifat organoleptik minuman fermentasi  laktat  yang  dihasilkan.  Lama fermentasi  akan  mempengaruhi  karakteristik minuman  fermentasi  yang  dihasilkan  karena adanya perbedaan total asam yang dihasilkan oleh  BAL  dan  akan  berimbas  pada menurunnya  pH  produk  dan  rasa  yang dihasilkan.    Waktu  fermentasi  yang  terlalu lama  menghasilkan  minuman  sinbiotik dengan  pH  yang  rendah,  hal  ini  disebabkan produksi asam laktat oleh bakteri asam laktat terus  berlangsung  sehingga  kandungan  total asam  meningkat  dan  pertumbuhan  bakteri asam  laktat  juga  meningkat  (Trivalianza, 2004).  Akibat  pH  yang  terlalu  rendah  maka rasa minuman sinbiotik menjadi terlalu asam sehingga  dapat  menurunkan  penerimaan konsumen  dan  kemampuan  untuk  tumbuh (viabilitas)  sel  bakteri  probiotik.  Sehingga nantinya  dapat  mengurangi  efektifitas konsumsi  minuman  sinbiotik.  Bila  waktu fermentasi  terlalu  singkat  maka  pH  masih stabil,  total  asam  masih  rendah,  dan pertumbuhan bakteri asam laktat juga rendah (Trivalianza, 2004).
Hasil  penelitian  Nurainy  dan  Samsu (2007),  menunjukkan  bahwa  konsentrasi ekstrak  cincau  hijau  terbaik  yang  dapat difermentasi  oleh Lactobacillus  casei adalah
0,5%  dengan  lama  fermentasi  48  jam.
Sedangkan  untuk  konsentrasi  susu  skim  dan sukrosa terbaik masing-masing 2%
(Suharyono  dkk.,  2009).  Penelitian  lebih lanjut  untuk  menentukan  lama  fermentasi yang  optimum  bagi Lactobacillus  casei masih diperlukan agar menghasilkan minuman  sinbiotik  dari  ekstrak  daun  cincau hijau  dengan  karakteristik  terbaik  yang ditunjukkan  oleh  kadar  serat  pangan  yang
1x10 7 koloni/ml  atau  setara  dengan  jumlah total  BAL  minuman  prebiotik  pada umumnya.

## METODE PENELITIAN

## Bahan dan Alat
Bahan  utama  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  daun  cincau  dari tanaman cincau pohon ( Premna oblongifolia
Merr) yang  dipetik  mulai  dari  daun  ke  5  ke arah pangkal. Daun cincau hijau ini diperoleh dari  THP  Universitas  Lampung  Bandar Lampung.
Inokulum kultur murni Lactobacillus  casei diperoleh  dari  Pusat Antar  Universitas  (PAU)  Pangan  dan  Gizi Universitas  Gadjah  Mada,  Yogyakarta. Enzim  untuk  analisis  kadar  serat  seperti enzim  -amilase,  pepsin  dan  pankreatin. Bahan  kimia  yang  digunakan  seperti  asam sitrat,  buffer  fosfat,  MRS  Broth  dan  MRS Agar  untuk  pertumbuhan  kultur,  NaCl 0,85%,  etanol,  NaOH  0,1  N,  air  destilat, indikator  phenolphtalein  dan  bahan  analisis kimia lainnya.
Alat-alat  yang  digunakan  adalah timbangan  dua  digit  (Mettler  PJ  3000), timbangan  4  digit  (OHAUS,  Explorer  Pro), blender (Phillips),  inkubator (Memmert), pH meter  (Hanna  Instruments  8424),  autoklaf (Wise  Clave,  Daihan  Scientific),  stirrer (VWR Hotplate/Stirrer), waterbath (Polyscience Waterbath), microwave
(Panasonic),  oven  (Heraeus  dan  Phillips Harris  Ltd),  furnace  (Thermolyne  1500), colony  counter  (Stuart  Scientific),  baskom plastik,  kain  saring  (Hero),  wadah  botol, spatula, pisau stainless steel, alumunium foil, erlenmeyer, dan alat-alat gelas untuk analisis kimia dan mikrobiologi.

## Rancangan Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  dalam Rancangan Acak Kelompok  Lengkap (RAKL).  Percobaan  disusun  3  kali  ulangan dengan  faktor tunggal  yaitu  lama  fermentasi yang  terdiri  dari  7  taraf  yaitu  0  jam  sebagai kontrol,  8,  16,  24,  32,  40,  dan  48  jam  pada suhu 37 o C.
Data  hasil  pengamatan  yang  diperoleh diuji kesamaan ragamnya dengan uji Bartlett dan  kemenambahan  data  diuji  dengan  uji Tuckey,  kemudian  data  dianalisis  sidik ragam  untuk  mengetahui  ada  tidaknya perbedaan  antar  perlakuan.  Data  selanjutnya dianalisis  lanjut  dengan  uji  Beda  Nyata Terkecil (BNT) pada taraf nyata 1% dan 5%.
Pelaksanaan Penelitian
1. Ekstraksi daun cincau hijau
1.1. Pembuatan bubuk daun cincau
Pembuatan  bubuk  daun  cincau dilakukan  dengan  menggunakan  metode Nurdin,dkk.  (2004).  Daun  cincau  yang digunakan adalah daun cincau yang tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda, yaitu 5 ruas  dari  pucuk  cabang  dahan  cincau. Daun  cincau  yang  diperoleh  kemudian dicuci  hingga  bersih  dan  tangkai daunnya  dibuang.  Daun  cincau  yang telah  dibersihkan  kemudian  dipotong menjadi  ukuran  sekitar  3  cm  x  1,5  cm. Daun  tersebut  lalu  dikeringkan  dengan menggunakan  oven  pada  suhu  50 o C selama  24  jam.  Daun  cincau  dianggap kering  bila  daun  terasa  renyah  bila diremas.  Daun  cincau  yang  telah  kering kemudian dihancurkan dengan menggunakan  blender  hingga  menjadi bubuk.

## 1.2.Proses ekstraksi bubuk daun cincau
Sebanyak  25  gram  bubuk  daun cincau  hijau  dicampurkan  dengan  air panas        (suhu  +  100 o C)  sebanyak  500
ml. Air yang akan digunakan sebelumnya  ditambahkan  asam  sitrat 0,1% (b/v). Kemudian dilakukan
15  menit  untuk  membantu  proses ekstraksi.  Campuran  tersebut  disaring dengan  menggunakan  kain  saring
peremasan  hingga  diperoleh  cairan kental  ekstrak  daun  cincau.  Cairan ekstrak daun cincau tersebut dikeringkan dalam  oven  pada  suhu  50 o C  selama  48 jam. Hasil pengeringan tersebut kemudian dihancurkan dengan menggunakan  blender  hingga  tingkat kehalusan  tertentu.  Diagram  alir  proses ekstraksi bubuk daun cincau  hijau dapat dilihat pada Gambar 1.

## 2. Persiapan starter
Persiapan  starter  dilakukan  dengan memodifikasi  metode  Trivalianza  (2004). Kultur  bakteri  yang  akan  digunakan ( Lactobacillus casei) dipindahkan dari kultur
stok  ke  dalam  tabung  reaksi  berisi  media MRS  Broth  steril,  selanjutnya  diinkubasi selama  24  jam  pada  suhu  37 o C.  Kemudian sebanyak  1-2  ose  kultur Lactobacillus  casei diinokulasikan  ke  dalam  media  yang mengandung susu skim steril (0,5 gram susu skim dalam 10 ml aquadest, disterilisasi pada suhu  121 o C  selama  15  menit),  selanjutnya diinkubasi  selama  48  jam  pada  suhu  37 o C. Kultur yang dihasilkan disebut sebagai kultur induk.
Selanjutnya dari kultur induk diinokulasikan  ke  media  yang  mengandung susu skim steril yaitu sebanyak 4% (v/v) (0,4 ml  kultur  induk  ditambahkan  ke  dalam  9,6 ml  media  susu  skim)  dan  diinkubasi  selama 48  jam  pada  suhu  37 o C  sehingga  dihasilkan kultur  antara.  Kultur  antara  diinokulasikan sebanyak  4%  (v/v)  (4  ml  kultur  antara ditambahkan  ke  dalam  96  ml  media  susu skim)  ke  dalam  media  yang  mengandung susu skim steril dengan penambahan sukrosa 3%  (b/v),  kemudian  diinkubasi  pada  suhu 37 o C  selama  24  jam  untuk  mendapatkan kultur kerja.
Pada  proses  pembuatan  minuman sinbiotik  ekstrak  daun  cincau  hijau,  kultur kerja  sebanyak  4%  (v/v)  (4  ml  kultur  kerja ditambahkan  ke  dalam  96  ml  media)  akan digunakan  sebagai  starter  atau  inokulum. Kultur  induk  disimpan  di  dalam  lemari pendingin (suhu kurang dari 10 o C) dan setiap seminggu  diperbaharui  kembali  dengan  cara mengambil  1  sampai  2  oose  starter  induk kemudian  dimasukkan  susu  skim  yang  telah disterilisasikan.  Untuk  penyimpanan  kultur dilakukan  pada  media  MRS  Agar  dengan menggunakan  metode  tusuk,  karena  bakteri bersifat mikroaerofilik.

## 3. Pembuatan minuman sinbiotik ekstrak daun cincau hijau
Proses  pembuatan  minuman  sinbiotik dari  ekstrak  cincau  hijau  diterapkan  dengan menggunakan  metode  Suharyono  dkk., (2009).  Sebanyak  2%(b/v)  susu  skim  dan 2%(b/v) sukrosa ditambahkan aqudes hingga volumenya  menjadi    100  ml,  selanjutnya dilakukan  penambahan  ekstrak  cincau  hijau sebanyak 0,5% (b/v), kemudian campuran ini diaduk hingga rata mengunakan stirer selama 2 menit. Campuran ini dipasteurisasi pada
Gambar 1. Diagram Alir Pembuatan Bubuk Ekstrak Daun Cincau
Sumber : Nurdin, dkk. (2004)
suhu  80-85 o C  selama  15  menit,  kemudian didinginkan  hingga  suhu  37 o C.  Selanjutnya dilakukan inokulasi kultur kerja Lactobacillus  casei sebanyak  4%  (v/v)  dan diinkubasi  dalam  inkubator  pada  suhu  37 o C selama  0,  8,  16,  24,  32,  40,  dan  48  jam. Diagram  alir  proses  pembuatan  minuman sinbiotik  ekstrak  daun  cincau  hijau  dapat dilihat pada Gambar 2.

## Analisis
1. Total Bakteri Asam Laktat (BAL) Sebanyak  1  ml  sampel  diencerkan dengan  9  ml  larutan  garam  fisiologis    steril. Dari campuran tersebut diperoleh pengenceran  10 -1 .  Campuran  kemudian dihomogenkan dan diambil 1 ml larutan dari tabung  pertama  dan  dimasukkan  kedalam tabung  reaksi  kedua  yang  juga  berisi  9  ml larutan  garam  fisiologis  sehingga  diperoleh pengenceran  10 -2 dan  seterusnya  sampai diperoleh pengenceran yang diinginkan. Dari pengenceran  yang  dikehendaki  diambil dengan pipet 1 ml sampel lalu dimasukkan ke dalam  cawan  petri  steril,  lalu  ditambahkan kira-kira  10-15  ml  media  MRS  Agar  steril. Cawan  yang  telah  berisi  media  dan  sampel
ini  diratakan  dengan  cara  menggerakkan secara  vertikal  membentuk  angka  8  dan biarkan  sampai  membeku,  kemudian  cawan diinkubasi  dengan  posisi  terbalik  pada  suhu 37 o C selama 24 jam dan dihitung koloni yang tumbuh dengan menggunakan alat penghitung  koloni (colony  counter) .  Total koloni  yang  terhitung  harus  memenuhi standar
(ICMF) yaitu antara 30
sampai  dengan  300  koloni  per  cawan  petri (Fardiaz, 1987).
genceran Faktor Pen x ung oni terhit Jumlah kol CFU/ml BAL Total 1 ) (

## 2. Total Asam Tertitrasi
Sebanyak  1  ml  sampel  ditambahkan  9 ml air destilat. Campuran tersebut kemudian dititrasi  dengan  larutan  NaOH  0,1  N.  Untuk mengamati  perubahan  warna  dari  tidak berwarna  menjadi  merah  muda  digunakan phenolphtalein  sebagai  indikator  titik  akhir titrasi.
Gambar 2 . Diagram Alir Pembuatan Minuman Sinbiotik Ekstrak Daun Cincau Hijau (Sumber : Suharyono dkk., 2009)
Total asam tertitrasi ditentukan sebagai asam laktat dengan persamaan :
% 100 x ) ( 1 , 0 90 ) / (% ml sampel
Volume NaOH N NaOH ml v b tertitrasi asam Total

## Keterangan : N = Normalitas larutan NaOH

## 3. Derajat Keasaman (pH)
Nilai pH ditentukan dengan
menggunakan  pH  meter.  Sebelum  dilakukan pengukuran,  pH  meter  harus  dikalibrasi terlebih  dahulu  dengan menggunakan laruitan  buffer  7,0  dan  4,0.  Selanjutnya dilakukan  pengukuran  terhadap  larutan sampel dengan mencelupkan elektrodanya ke dalam larutan sampel dan dibiarkan beberapa saat sampai diperoleh pembacaan yang stabil.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Total  Bakteri  Asam  Laktat  Minuman Sinbiotik Ekstrak Daun Cincau Hijau
Hasil  analisis  ragam  menunjukkan bahwa  lama  fermentasi  berpengaruh  sangat nyata  terhadap  total  bakteri  asam  laktat (BAL)  minuman  sinbiotik  ekstrak  daun cincau  hijau.  Log  total  BAL  tertinggi dihasilkan  oleh  minuman  sinbiotik  yang difermentasi  selama  16  jam,  yaitu  sebesar 10,25. Berdasarkan Uji Beda Nyata Terkecil (BNT) pada taraf 5%, nilai ini tidak berbeda nyata  dengan  minuman  sinbiotik  yang difermentasi selama 24 dan 32 jam.
Pertumbuhan merupakan salah satu ciri atau  sifat  mikroorganisme  yang  penting dalam  fermentasi.  Pertambahan  jumlah Lactobacillus  casei dapat  didefinisikan sebagai  pertumbuhan.  Selama  fermentasi  0 hingga 8 jam terjadi peningkatan jumlah sel

## Gambar  3. Log  Total  BAL  Minuman  Sinbiotik  Ekstrak  Daun  Cincau  Hijau  yang Difermentasi selama 0 hingga 48 jam
Keterangan  : Nilai tengah yang diikuti dengan huruf yang sama dinyatakan tidak berbeda menurut uji BNT 5% = 0,187
bakteri  asam  laktat,  dari  8,29x10 9 CFU/ml menjadi  1,09x10 10 CFU/ml  atau  sebesar  0,1 log  total  bakteri  ( Gambar  3 ).  Pertambahan jumlah  mikroba  tidak  terjadi  secara signifikan, diduga bakteri asam laktat berada dalam  fase  lag atau  pertumbuhan  awal . Fase ini berlangsung segera setelah inokulasi pada media  nutrien  dan  merupakan  periode adaptasi.
Jika  mikroba  dipindahkan  ke  dalam suatu  media,  mula-mula  akan  mengalami fase  adaptasi  untuk  menyesuaikan  dengan kondisi  lingkungan  sekitarnya  yang  baru. Lamanya  fase  adaptasi  dipengaruhi  oleh beberapa  faktor,  diantaranya  media  dan lingkungan  pertumbuhan  serta  jumlah inokulum  awal.  Media  dan  lingkungan pertumbuhan  sama  seperti  media  dan lingkungan  sebelumnya,  mungkin  tidak diperlukan  waktu  adaptasi.  Begitu  pula dengan  jumlah  inokulum,  semakin  tinggi jumlah  awal  sel  maka  fase  adaptasi  akan berlangsung  singkat  (Marniza  dan  S.Rizal, 2004).
Setelah  fase  adaptasi  sel,  yaitu  terjadi perubahan-perubahan  yang  diperlukan,  sel beranjak  ke  fase  pertumbuhan  lambat.  Pada fase  ini  bakteri  asam  laktat  akan  mulai membelah  dengan  kecepatan  rendah  karena baru mulai menyesuaikan diri dengan kondisi lingkungan dan media yang baru. Pertambahan  jumlah Lactobacillus  casei
dapat  pula  terjadi  sangat  cepat,  tanpa melewati  fase  lag,  diduga  berhubungan dengan  kondisi  lingkungan  dan  media pertumbuhan  yang  sama  seperti  media  dan lingkungan sebelumnya,
sehingga dimungkinkan  tidak  perlu  waktu  adaptasi. Namun berdasarkan hasil penelitian, pertambahan jumlah bakteri asam laktat pada fermentasi  ke  0  menuju  8  jam  berjalan lambat, hal ini mungkin disebabkan sel masih berada  dalam  fase  adaptasi  dan  tingkat pertumbuhannya belum optimal.
Peningkatan  jumlah  sel  bakteri  terus berlanjut  hingga  waktu  fermentasi  16  jam, yaitu nilai log total BAL menjadi 10,25. Pada fermentasi 8 hingga 16 jam, sel berada dalam fase  logaritmik  yaitu  fase  dimana  bakteri asam  laktat  membelah  dengan  cepat  dan konstan  mengikuti  kurva  logaritmik.  Fase logaritmik  merupakan  periode  pertumbuhan seimbang  atau  status  mantap  dengan  laju pertumbuhan spesifik konstan (Judoamidjojo,dkk.,  1990).  Dalam  seluruh proses  fermentasi,  komposisi  kimia  media mengalami  perubahan  karena  nutrien  akan dikonsumsi  dan  zat-zat  metabolit  akan diproduksi,  sehingga  lingkungan  berada dalam  suatu  status  yang  mantap.  Menurut Caldwell  (1994),  sel  akan  membelah  diri dengan  laju  yang  konstan,  massa  sel bertambah dan pertumbuhan sel berada
9,90 10,04 10,25 10,21 10,09 10,02 9,59 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 0 8 16 24 32 40 48 Lama Fermentasi (jam) c a b b c a b c a b a d 0
Gambar 4. Kurva Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat pada Minuman Sinbiotik Ekstrak Daun Cincau Hijau selama Fermentasi 0 hingga 48 jam
dalam  keadaan  seimbang  pada  fase pertumbuhan logaritmik.
Pada  waktu  fermentasi  24  jam pertumbuhan  sel  bakteri  mulai  menurun, namun  nilainya  relatif  konstan  dan  tidak terlalu  signifikan  ( Gambar  4 ).  Pada  waktu fermentasi  ini  jumlah  log  total  sel  bakteri asam laktat sebanyak 10,21. Jumlah sel yang relatif  konstan  ini  menunjukkan  bahwa  sel bakteri berada dalam fase pertumbuhan tetap (statis).  Menurut  Judoamidjojo,dkk.  (1990), fase  stasioner  akan  terjadi  bila  semua  sel berhenti  membelah  diri  atau  bila  sel  hidup dan  sel  mati  mencapai  keseimbangan.  Pada fase ini jumlah populasi yang relatif konstan karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati.
Penurunan  laju  pertumbuhan  kembali terjadi  pada  waktu  fermentasi  32  hingga  40 jam, namun nilai penurunan log total  bakteri asam laktat cukup signifikan dari 10,21 pada waktu  fermentasi  24  jam  menjadi  10,02. Menurunnya jumlah sel bakteri ini menunjukkan  sel  telah  memasuki  fase menuju  kematian.  Pada  fase  ini  jumlah  sel yang  hidup  lebih  sedikit  dibandingkan dengan  sel  yang  mati,  hal  ini  diduga disebabkan  oleh  nutrisi  yang  telah  sangat berkurang  dan  kondisi  lingkungan  yang kurang mendukung untuk bertahan hidup.
Fase  kematian  terjadi  setelah  waktu fermentasi  ke-40  jam.  Hal  ini  diketahui  dari penurunan  log  total  bakteri  asam  laktat. Jumlah  log  total  sel  bakteri  yang  masih
bertahan hidup pada waktu fermentasi 48 jam yaitu  9,59.  Penurunan  jumlah  populasi mikroba  ini  dapat  disebabkan  oleh  telah habisnya  nutrisi  di  dalam  media  dan  energi cadangan di dalam sel telah habis. Selain itu hasil-hasil  metabolisme  mikroba  itu  sendiri kemungkinan  beracun,  sehingga  dapat menjadi  penyebab  kematian  sel.  Menurut Caldwell (1994),  jumlah sel  yang  mati  lebih banyak  sehingga  terjadi  penurunan  jumlah populasi mikroba.

## Total Asam Tertitrasi Minuman Sinbiotik Ekstrak Daun Cincau Hijau
Hasil sidik ragam menunjukkan bahwa lama  fermentasi  berpengaruh  sangat  nyata terhadap  total  asam  minuman  sinbiotik ekstrak  daun  cincau  hijau.  Minuman sinbiotik  ekstrak  daun  cincau  hijau  yang difermentasi  selama  48  jam  menghasilkan nilai  total  asam  tertinggi,  yaitu  4,95  %/ml . Berdasarkan Uji Beda Nyata Terkecil (BNT) pada  taraf  5%,  nilai  tersebut  menunjukkan perbedaan yang nyata dengan nilai total asam lainnya ( Gambar 5 ).
Dari Gambar 5 , terlihat bahwa pada 0 jam, jumlah total asam yang terhitung sangat kecil  yaitu  1,50%.  Asam  yang  terdapat  di dalam  minuman  sinbiotik  ini  diduga  berasal dari  asam  sitrat  yang  tersisa  pada  ekstrak daun  cincau  hijau,  karena  pada  proses pembuatan  bubuk  ekstrak  daun  cincau ditambahkan  asam  sitrat  yang  berfungsi sebagai penghambat terbentuknya gel dari
10,04 10,02 9,59 9,90 10,09 10,21 10,25 9,2 9,4 9,6 9,8 10 10,2 10,4 0 8 16 24 32 40 48 Lama fermentasi (jam) 0
Gambar  5. Nilai  Perubahan  Total  Asam  Minuman  Sinbiotik  Ekstrak  Daun  Cincau  Hijau yang Difermentasi selama 0 hingga 48 jam
Keterangan  : Nilai tengah yang diikuti dengan huruf yang sama dinyatakan tidak berbeda menurut uji BNT 5% = 0,688
ekstrak daun cincau sehingga seluruh serbuk daun  cincau  hijau  dapat  terlarut.  Selain  itu asam  sitrat  digunakan  untuk  membantu proses  pemecahan  pektin  dari  dinding  sel serbuk daun cincau hijau.
Pada fermentasi ke 16 jam, jumlah total asam  yang  terhitung  sebesar  3,30%.  Jumlah ini  meningkat  dari  perlakuan  sebelumnya, diduga Lactobacillus  casei telah  melakukan proses  fermentasi  terhadap  substrat  ekstrak daun  cincau  hijau  dan  menghasilkan  asam laktat sebagai  produk fermentasinya.  Jumlah total asam pada lama fermentasi 16 jam tidak berbeda  nyata  dengan  lama  fermentasi  24 dan  32  jam  yaitu  sebesar  3,60  dan  3,90%. Dalam  penelitian  ini,  laju  peningkatan  total asam  tidak  selalu  berbanding  lurus  dengan peningkatan  jumlah  sel  bakteri  asam  laktat. Walaupun Lactobacillus casei telah
memasuki  fase  stasioner,  namun  pada  fase ini,  jumlah  total  asam  yang  terdapat  dalam minuman sinbiotik terus meningkat. Menurut Judoamidjojo,dkk.  (1990),  selama  fase pertumbuhan  logaritmik  akan  dihasilkan asam  laktat  yang  merupakan  metabolit primer. Setelah  sel  memasuki  fase stasioner, laju  pertumbuhannya  menurun  karena substrat  berkurang  dan  juga  penumpukan metabolit  primer.  Penumpukan  asam  laktat dapat  mengaktifkan  enzim-enzim  yang memetabolisir  asam  laktat  lebih  lanjut
menjadi  asam-asam  lemak  rantai  pendek seperti asetat, propionat, dan butirat.
Selama  proses  fermentasi,  komposisi kimia  media  mengalami  perubahan  sebagai akibat  penggunaan  nutrisi  oleh  bakteri  asam laktat  dan  produksi  zat-zat  metabolit.  Asam laktat  yang  terbentuk  merupakan  metabolit primer  dari  proses  fermentasi  ini.  Pada  fase stasioner,  massa  sel  total  mungkin  konstan tetapi  banyaknya  sel  hidup  cenderung menurun,  proses  metabolisme  mungkin  saja masih  berlangsung  dan  terjadi  penimbunan produk  (metabolit  primer  dan  sekunder) dalam  media.  Dengan  demikian,  meskipun terjadinya  penurunan  jumlah  sel  bakteri, namun  jumlah  asam  sebagai  produk metabolitnya tetap tinggi.
Menurut  Judoamidjojo,dkk.  (1990), sintesis metabolit sekunder dimulai pada saat habisnya beberapa zat gizi di dalam medium pertumbuhan bakteri asam laktat. Keterbatasan  zat  gizi  tersebut  menyebabkan terakumulasinya  induser  enzim  metabolit sekunder dan terlepasnya gen-gen yang dapat memicu sintesis metabolit sekunder. Biosintesis  metabolit  sekunder  berkaitan dengan terjadinya induksi enzim yang berasal dari  hasil  metabolisme  sel  sendiri.  Beberapa zat  yang  diduga  sebagai  metabolit  sekunder adalah  asam-asam  lemak  rantai  pendek seperti  asam  asetat,  propionat  dan  butirat serta beberapa senyawa antibakteri.
1,50 2,40 3,30 3,60 3,90 4,50 4,95 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 0 8 16 24 32 40 48 Lama fermentasi (jam)
e
c d c b a c
Gambar  6. Nilai  Perubahan  pH  Minuman  Sinbiotik  Ekstrak  Daun  Cincau  Hijau  yang Difermentasi selama 0 hingga 48 jam
Menurut  Nur  (2005),  asam-asam organik  yang  terbentuk  dari  hasil  fermentasi merupakan  hasil  hidrolisis  substrat  (dalam hal  ini  ekstrak  cincau  hijau)  dan  akibat aktivitas  bakteri.  Bakteri Lactobacillus casei mempunyai sifat heterofermentatif yang akan memfermentasi monosakarida  (glukosa) menjadi  senyawa-senyawa  dengan  struktur lebih  sederhana  (asam  laktat  sebagai  produk utama,  dan  sejumlah  kecil  asam  asetat, butirat, propionat, CO 2 , dan beberapa produk akhir lainnya).
Total  asam  yang  terhitung  dalam minuman  sinbiotik  ini  sebagian  besar merupakan  asam  laktat  dan  sebagian  kecil merupakan  asam-asam  lemak  rantai  pendek seperti  asam  asetat,  propionat,  dan  butirat. Akan  tetapi,  persentase  asam  propionat  dan butirat  lebih  sedikit  dibandingkan  dengan asam  asetat,  karena  asam  propionat  dan butirat    akan  terurai  lebih  lanjut  menjadi asam  asetat.  Hal  ini  karena  struktur  yang dimiliki oleh asam asetat lebih sederhana jika dibandingkan dengan struktur asam propionat  dan  butirat.  Asam  asetat  hanya memiliki  dua  atom  karbon  sehingga  berat molekulnya  akan  lebih  rendah  dibandingkan dengan  asam  propionat  yang  memiliki  tiga atom karbon dan asam butirat yang memiliki empat atom karbon (Anonim, 2007). Reduksi asam  laktat  menjadi  asam  propionat  terjadi melalui alur metil malonil KoA.
Pembentukan  asam  propionat  dari  asam
laktat berlangsung menurut persamaan reaksi sebagai berikut :
3CH 3 -CHOH-COOH (laktat)
2CH 3 -CH 2 -COOH  +  CH 3 -COOH  + (propionat) (asetat)
CO 2 + H 2 O
Derajat Keasaman (pH) Minuman Sinbiotik Ekstrak Daun Cincau Hijau
Hasil  analisis  ragam  menunjukkan bahwa  lama  fermentasi  berpengaruh  sangat nyata terhadap pH minuman sinbiotik ekstrak daun  cincau  hijau  ( Tabel  1 ).  Minuman sinbiotik  ekstrak  daun  cincau  hijau  yang difermentasi  selama  48  jam  menghasilkan nilai  derajat  keasaman  (pH)  terendah,  yaitu 3,02  akan  tetapi  nilai  tersebut  tidak  berbeda nyata  dengan  pH  minuman  sinbiotik  ekstrak daun  cincau  hijau  yang  difermentasi  selama 32 dan 40 jam ( Gambar 6 ).
Selama  masa  fermentasi  0  hingga  48 jam,  jumlah  asam  yang  terbentuk  semakin banyak. Peningkatan jumlah asam laktat akan mempengaruhi  pH  lingkungan.  Semakin tinggi jumlah asam laktat dalam lingkungan, maka  potensi  menurunnya  pH  lingkungan juga semakin besar sehingga pH produk yang dihasilkan  menurun. Pada  lama  fermentasi 0 dan 8 jam, nilai pH yang terhitung pada pH- meter adalah 4,81 dan 4,03. Pada pH 4, asam
4,81 4,03 3,40 3,16 3,09 3,04 3,02 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 0 8 16 24 32 40 48 Lama fermentasi (jam) a e b c d d e d e 0
Lama Total Persentase Persentase Fermentasi Asam Perubahan Jumlah pH Perubahan Nilai (jam) (%/ml) Asam pH 0 1,50 4,81 60 16,23 8 2,40 4,03 37,5 15,48 16 3,30 3,40 9,09 7,05 24 3,60 3,16 8,33 2,32 32 3,90 3,09 15,38 1,72 40 4,50 3,04 10 0,55 48 4,95 3,02
laktat  mudah  mengalami  disosiasi  sehingga menghasilkan H + dalam jumlah banyak. Pada pengukuran  pH-meter,  ion  H + inilah  yang akan  terukur.  Oleh  karena  itu,  semakin banyak jumlah asam laktat maka semakinbesar  pula  ion  H + yang  terukur, sehingga pH semakin rendah.
Penguraian  substrat  dan  senyawa pektin  oleh  bakteri  asam  laktat  akan menghasilkan  energi  untuk  aktivitas  bakteri asam  laktat,  serta  menghasilkan  senyawa- senyawa  lain  termasuk  asam  laktat.  Asam laktat  yang  dihasilkan  oleh Lactobacillus casei tersebut  akan  tersekresikan  keluar  sel dan  akan  terakumulasi  dalam  produk fermentasi.  Dengan  meningkatnya  jumlah asam  yang  disekresikan  tersebut,  maka keasaman  produk  sinbiotik  akan  meningkat, dan  peningkatan  akumulasi  asam  ini  akan menyebabkan  terjadinya  penurunan  pH (Misgiyarta dan Widowati, 2003).
Dalam  penelitian  ini,  laju  penurunan pH berbanding lurus dengan laju peningkatan total  asam.  Semakin  lama  waktu  fermentasi maka  total  asam  akan  meningkat,  maka derajat  keasaman  (pH)  minuman  sinbiotik akan  semakin  menurun.  Penurunan  pH  ini disebabkan  oleh  penumpukan  asam-asam organik sebagai  hasil dari proses  fermentasi. Asam  organik  terbentuk  akibat  terjadinya pemecahan polimer pektin menjadi monomer yang  lebih  sederhana  oleh  bakteri  asam laktat.
Bakteri asam laktat akan menghidrolisis  serat  (pektin)  pada  ekstrak
cincau  hijau  yang  berupa  karbohidrat kompleks  menjadi  monosakarida,  dan selanjutnya  monosakarida  tersebut  akan difermentasi menjadi senyawa-senyawa dengan  struktur  yang  lebih  sederhana, termasuk asam laktat.
Dari Tabel  1 diketahui  bahwa persentase  peningkatan  total  asam  tidak sebanding  dengan  persentase  penurunan  pH. Pada fermentasi 32, 40, dan 48 jam nilai pH produk  tidak  berbeda  nyata,  hal  ini disebabkan  oleh  kemampuan  mikroba  untuk merombak  senyawa-senyawa  organik  sudah menurun.  Bakteri  asam laktat  telah memasuki  fase  kematian,  dengan  demikian penurunan  pH  tidak  akan  terjadi  secara signifikan.  Penurunan  pH  tetap  terjadi sebagai  akibat  terakumulasinya  total  asam, namun  sebagian  besar  bukan  lagi  berupa asam  yang  esensial  (asam  laktat)  melainkan asam-asam lemah rantai pendek seperti asam asetat, propionat dan butirat yang merupakan hasil hidrolisis asam laktat.
Akibat  metabolisme  sel  bakteri  asam laktat akan dihasilkan senyawa lain termasuk asam  laktat.  Asam  laktat  yang  dihasilkan oleh  bakteri  asam  laktat  akan  terekskresikan keluar  sel  dan  akan  terakumulasi  dalam cairan  fermentasi.  Dengan  meningkatnya jumlah asam yang diekskresikan oleh bakteri asam  laktat  karena  proses  akumulasi  asam dalam  substrat,  maka  akan  meningkatkan keasaman  produk.  Peningkatan  akumulasi
asam  dalam  produk  ini  dapat  diketahui dengan penurunan pH.
Selama  masa  fermentasi,  jumlah  asam yang terbentuk semakin meningkat. Semakin lama  waktu  fermentasi  maka  semakin memicu  terbentuknya  asam  dengan  struktur yang  lebih  sederhana,  yang  memiliki  rantai terpendek.  Terbentuknya  asam-asam  lemah seperti asam asetat, propionat, dan butirat ini disebabkan oleh hidrolisis asam laktat. Asam asetat,  propionat,  dan  butirat  cenderung memiliki kekuatan yang hampir sama karena memiliki nilai pKa masing-masing yaitu 4,76 untuk  asam  asetat,  4,82  untuk  asam propionat,  dan  4,87  untuk  asam  butirat sedangkan  asam  laktat  bersifat  sedikit  lebih kuat  dengan  nilai  pKa  3,85  (Anonim,2007). Sebagian besar asam organik yang merupakan  asam  lemah,  tidak  mengalami ionisasi  secara  sempurna,  bahkan  terkadang sebagian  besar  asam  berada  dalam  larutan sebagai molekul yang tidak terionisasi.

## SIMPULAN DAN SARAN

## Simpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian,  dapat disimpulkan bahwa terdapat lama fermentasi yang  optimal  untuk  menghasilkan  minuman sinbiotik  ekstrak  cincau  hijau  dengan  total bakteri  asam  laktat  (BAL)  dan  serat  pangan yang  tinggi  yaitu  16  jam.  Jumlah  total  BAL tertinggi sebesar 1,78x10 10
CFU/ml, memiliki nilai pH 3,40 dan total asam 3,30%.

## Saran
Perlu  optimasi  lebih  lanjut  terhadap sifat organoleptik minuman sinbiotik ekstrak cincau hijau agar dapat diterima konsumen.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2007 . Keasaman dari Asam Organik. http://www.chemistry.org diakses 5 Oktober 2007.
Anonim.  2008.  Pelopor  Probiotik  di
Indonesia  -  PT  Yakult  Indonesia Persada. http://www.yakult.co.id/profil.html diakses 12 Februari 2008
Caldwell,  D.R.  1994.  Microbial  Physiology and  Metabolism. Wm.C.  Brown Publishers. Nurainy,  F  dan  Samsu  U.2007.  Optimasi Produksi  Minuman  sinbiotik  dari ekstrak Cincau Hijau ( Premna oblogiofolia). Laporan Penelitian  Dosen
Muda. LP Unila. Bandar Lampung
Judoamidjojo,  M.,  A.A.  Darwis,  dan  E.G.
Rajawali Pers. Jakarta Marniza  dan  S.  Rizal.  2004.  Teknologi Fermentasi  (Buku  Ajar).  TPSDP Universitas Lampung. Bandar Lampung Misgiyarta  dan  Sri  Widowati.  2003.  Seleksi dan  Karakterisasi  Bakteri  Asam  Laktat (BAL)  Indigenus  (Prosiding  Hasil Penelitian  Rintisan  dan  Bioteknologi Tanaman). Balai Penelitian Bioteknologi  dan  Sumberdaya  Genetik Pertanian. Yogyakarta Nur, H.S. 2005.Pembentukan  Asam Organik oleh  Isolat  Bakteri  Asam  Laktat  pada Media  Daging  Buah  Durian  ( Durio ziberthinus Murr). J.Bioscientiae. Vol.2(1). Hal. 1-10
Nurdin,S.U.,  A.S.Zuidar,  dan  R.Krisnawati. 2004.  Pengaruh  Konsentrasi  Asam Sitrat  terhadap  Rendemen  dan  Sifat Serat  Pangan  dari  Daun  Cincau  Pohon ( Premna oblongifolia Merr.). Prosiding Seminar Nasional dan Kongres PATPI. Jakarta, 17-18 Desember 2004
Nurdin,S.U., S. Rizal, dan Suharyono.  2006. Potensi  Komponen  Pembentuk  Gel
Cincau  Hijau  ( Premna  oblongifolia Merr.) sebagai Serat Pangan dibandingkan  dengan  Inulin  dan Selulosa.  Prosiding  Seminar  Nasional
PATPI, 2-3 Agustus 2006. Yogyakarta.
Suharyono,  Samsul  R.  dan  Fibra  N.  2009.
Karakteristik  Minuman  Sinbiotik  dari Ekstrak  Daun  Cincau  Hijau  (Premna Oblongiofolia Merr) dengan Konsentrasi  Sukrosa  dan  Susu  Skim yang  Berbeda.  Prosiding  Seminar Nasional Sains MIPA dan Aplikasinya.
Tgl  16-17  November.  Fakultas  MIPA Unila. Bandar Lampung.
Trivalianza, O. 2004. Pengaruh Penambahan Gum  Xanthan  terhadap  Karakteristik Minuman Laktat Sari Kulit Nanas yang
Difermentasi  oleh  L. Casei Selama Penyimpanan. Skripsi. Jurusan Teknologi  Hasil  Pertanian.  Universitas Lampung. Bandar Lampung