DERAJAT KEASAMAN (pH) VINEGAR DALAM MEDIA LIMBAH FERMENTASI BIJI KAKAO AKIBAT PENAMBAHAN KONSENTRASI Acetobacter aceti DAN WAKTU

## INKUBASI
Wiwik Kusmawati
IKIP Budi Utomo Malang Email: wiwikkusmawati@gmail.com

## ABSTRAK
The  study  was  aimed  to  identify  the  degree  of  acidity  (pH)  vinegar  in  a  medium  waste fermentation  of  cocoa  beans  due  to  the  addition  of  Acetobacter  aceti  concentration  and time  of  incubation.This  research  utilised  two  factor,  factorial  design  with  completely randomized  design  (CRD).  Thefirst  factor  is  the  Acetobacter  aceti  consentration  (10%, 13%,  dan  16%).  The  second  is  the  time  of  incubation  (6,  8,  dan  10  day).  Results  were analyzed  by  using  SPSS  program  version  11  personal  computer,  two  way  ANOVA  and multiple comparison test with significance level of 0,05.The results of analysis of variance showed  that  there  were  differences  in  the  degree  of  acidity  (pH)  of  vinegar  in  a  medium waste fermentation of cocoa beans due to the addition of  Acetobacter aceti concentration and time of incubation. While Duncan's test results showed the treatment inoculation 13% starter  Acetobacter  aceti  with  6  days  of  incubation  time  significantly  different  from  the other  treatments  with  minimal  pH  is  2,02.  So  that  these  results  meet  the  standards  of vinegar. From  these experiment we suggested that consentration of  Acetobacter aceti and incubation period has effects in the degree of acidity (pH) vinegar in fermentation waste of cacao seed medium.
Keywords: Degree of acidity (pH), fermentation waste of cacao seed medium, Acetobacter aceti.

## PENDAHULUAN
Vinegar  merupakan  salah  satu  asam  organik yang  paling  penting  karena  banyak  digunakan dalam  industri  untuk  memproduksi  asam-asam alifatis, pembuatan obat-obatan (aspirin), pembuatan warna (indigo) dan parfum (Tjokroadikoesoemo,  1993).  Sedangkan  vinegar dalam  industri  makanan  berfungsi  sebagai  agen anti  mikrobial  dan  meningkatkan  cita  rasa (Douglas dan Glen, 1982).
Menurut  Rahman  (1992)  vinegar  dapat dibuat  dari  bahan  baku  yang  mengandung  gula, termasuk juga dari limbah fermentasi biji kakao. Apalagi perkembangan luas tanaman kakao pada Pelita  V  lebih  dari  400.000  hektar.  Sehingga dapat diperhitungkan produksi kakao di Indonesia akan mencapai sekitar 250.000 ton di akhir tahun 1990-2000 (Anonymous, 1988).
Tersedianya bahan baku yang cukup melimpah menunjukkan bahwa Indonesia sangat berpotensi  untuk  mengembangkan  produksi vinegar. Namun, pada kenyataannya sampai saat ini  Indonesia  masih  mengimpor  vinegar  yang cukup besar.
Limbah  fermentasi  biji  kakao  diperoleh sesudah  biji  kakao  difermentasi.  Lama  waktu fermentasi  biji  kakao  tergantung  pada  jenis
kakao  yang  akan  difermentasi.  Fermentasi dimaksudkan  untuk  memperoleh  biji  kakao kering  dengan  aroma  dan  warna  yang  disukai konsumen.  Selama  itu  pula  enzim  menguraikan senyawa  polifenol,  protein  dan  gula  yang selanjutnya  akan  menghasilkan  senyawa  aroma, perbaikan  cita  rasa  dan  perubahan  warna (Iswanto, 1997).
Pada akhir fermentasi timbul bau asam cuka yang  keras  dan pulp mudah  dilepaskan. Melepasnya pulp dari  biji  menghasilkan  cairan yang  selain  merembes  ke  dalam  biji,  juga mengalir keluar melalui lubang kotak fermentasi (Alamsyah, 1991).
Cairan  ini  merupakan  limbah  yang  berasal dari pulp dan belum dimanfaatkan atau dibuang begitu saja. Menurut Ardhana (1990) biji kakao yang  telah  difermentasi  selama  18  jam  akan menghasilkan  cairan  dengan  kadar  etanol sampai 12%, glukosa sampai 8%, sukrosa 6,1% dan  asam  asetat  sampai  5,27%.  Sedangkan Junianto (1995) mengatakan limbah ini menghasilkan  asam  asetat  0,22%,  alkohol  3,9% dan gula reduksi 17,299%.
Terbentuknya  vinegar  memerlukan  dua proses.  Proses  pertama  adalah  pengubahan  gula menjadi  alkohol  oleh  khamir  (fermentasi

## Wiwik Kusmawati
alkoholik).  Proses  kedua  adalah  pengubahan etanol  menjadi  asam  asetat  oleh  bakteri  asam asetat  (fermentasi  oksidatif)  (Frazier  dan Westhoff, 1983).
Menurut  Desrosier  (1977)  pada  fermentasi oksidatif,  starter  atau  bibit  yang  cocok  harus ditambahkan  untuk  menyediakan  jenis  bakteri yang  diperlukan.  Starter  yang  baik  adalah berasal  dari  biakan  murni  (Sa’id,  1987).  Strain yang  digunakan  untuk  produksi  asam  asetat adalah Acetobacter aceti karena kemampuannya dibawah  kondisi  aerasi  dan  keasaman  yang tinggi  mengubah  etanol  secara  cepat  dengan hasil asam asetat tinggi (Crueger dan Anneliese, 1992).  Sehingga  penelitian  mengenai  galur Acetobacter  aceti yang  dapat  mengubah  etanol menjadi  asam  asetat  dapat  menjadikan  cara pembuatan  asam  cuka  dengan  fermentasi oksidatif  menjadi  penting  kembali  (Sardjoko, 1991).
Pemberian  starter  dilakukan  dengan  cara menuangkan  hasil  biakan  bakteri Acetobacter aceti ke  dalam  fermentor.  Menurut  Wibowo et al . (1990) proporsi starter pada umumnya 3-10% dibanding  volume  total  media.  Persiapan starter dilakukan  agar  fase  adaptasi  dalam  media fermentasi seminimal mungkin, sehingga proses fermentasinya berlangsung lebih cepat. Sedangkan  Purwaningsih  (1989)  mengatakan starter Acetobacter aceti yang ditambahkan pada fermentor  kurang  lebih  sebanyak  10%  dari volume  medium.  Rahman  (1992)  mengatakan pada  pembuatan  vinegar  dari  aren  nira,  starter yang  ditambahkan  kurang  lebih  sebanyak  20% dari  volume  medium.  Dan  waktu  inkubasi  akan memperbaiki  cita  rasa  dan  kadar  asam  asetat yaang dihasilkan (Desrosier, 1977).
Selama  fermentasi  oksidatif  itu Acetobacter aceti mengoksidasi  etanol  dan  menghasilkan asam  asetat.  Starter Acetobacter  aceti 11,5% akan  menghasilkan  kadar  asam  asetat  5%  dan efisiensi  pengubahan  sekitar  86%  (Pudjiraharti et  al .,  1988).  Penelitian  yang  dilakukan  oleh Kusmawati  (1999)  inokulasi  13%  starter Acetobacter aceti dengan waktu inkubasi 6 hari berbeda  nyata  dengan  perlakuan  lain  dengan kadar asam asetat maksimal yaitu 4,02%.
Di  samping  itu  selama  fermentasi,  pH berubah menurun. Penurunan pH terjadi apabila memproduksi  asam-asam  organik  misalnya asam  asetat,  asam  laktat  dan  lain-lain  (Sa’id, 1987). Perubahan pH yang terjadi pada medium fermentasi masih dalam batas toleransi optimum untuk proses fermentasi aerob dan pertumbuhan Acetobacter  aceti yakni  3,0-4,0  sehingga  tidak
perlu  penambahan  buffer  (Pudjiraharti et  al ., 1988).  Standar  pH  vinegar  yaitu  2,0-4,0  (Sa’id, 1987).  Sedangkan  menurut  Holt et  al .  (1994) mengatakan  pH  vinegar  yang  diperoleh  adalah 4,0-5,0.
Berdasarkan  uraian  di  atas,  penting  untuk dilakukan  penelitian  tentang  Derajat  Keasaman (pH)  Vinegar  dalam  Media  Limbah  Fermentasi Biji  Kakao  Akibat  Penambahan  Konsentrasi Acetobacter aceti dan Waktu Inkubasi.

## METODE PENELITIAN Pengambilan Sampel
Sampel  diambil  dengan  cara  menampung tetesan  limbah  fermentasi  biji  kakao  pada lembaran  plastik  yang  diletakkan  di  bawah kotak fermentasi biji kakao. Plastik ini dipasang sejak biji kakao yang baru dipetik, dimasukan ke dalam kotak fermentasi. Plastik dipasang sekitar 18 jam untuk menampung limbah yang mengalir dari  kotak  fermentasi,  limbah  yang  tertampung dalam  plastik  dimasukkan  ke  dalam  botol-botol kaca  steril.  Botol-botol  ini  ditutup  dengan aluminium foil dan plastik. Kemudian dimasukan  di  dalam  termos  yang  telah  diisi dengan  es  dan  dibawa  ke Laboratorium  Biologi Universitas Muhammadiyah Malang.

## Pemeliharaan Kultur
Untuk fermentasi alkoholik digunakan kultur murni Saccharomyces cerevisiae yang dipelihara pada media Malt Extract Agar Miring selama  24  jam  pada  suhu  30 0 C.  Sedangkan untuk fermentasi oksidatif digunakan Acetobacter  aceti yang  dipelihara  padamedia agar miring selama 24 jam pada suhu 30 0 C.

## Pembuatan Starter
Untuk fermentasi alkoholik kultur Saccharomyces  cerevisiae yang  telah  ditanam pada media Malt Extract Agar Miring diambil 2 ose  dan  diinokulasikan  ke  dalam  578  ml  media limbah  fermentasi  biji  kakao  yang  telah dipasteurisasi selama  15  menit  pada  suhu  72 0 C. Selanjutnya diaerasi 12-14 gelembung per menit dan  diinkubasi selama  24 jam  pada  suhu  kamar (25-29 0 C).  Setelah  inkubasi  media  ini  dipakai sebagai starter.
Untuk  fermentasi  oksidatif  biakan  murni Acetobacter  aceti yang  telah  ditanam  pada media  agar  miring  diambil  2  ose  dan diinokulasikan  ke  dalam  5  ml  media  cair  dan diinkubasi  selama  24  jam  pada  suhu  30 0 C. Setelah  waktu  yang  ditentukan  tercapai,  dari media  cair  diinokulasikan  ke  dalam  150  ml media  limbah  fermentasi  biji  kakao  yang  telah
dipasteurisasi selama  15  menit  pada  suhu  72 0 C. Kultur  ini  kemudian  diaerasi  12-14  gelembung per  menit  dan  diinkubasi  selama  18  jam  pada suhu  kamar.  Setelah  inkubasi  media  ini  dipakai sebagai starter.

## Proses Fermentasi
Limbah  fermentasi  biji  kakao  yang  telah diperoleh  dimasukkan  pada  botol  (sebagai fermentor  alkoholik)  sebanyak  1000  ml  secara aseptis  dan  dipasteurisasi  pada  suhu  72 0 C selama 15 menit. Kemudian didinginkan sampai sekitar 30-31 0 C. Setelah  dingin  (30 0 C)  diinokulasi  dengan starter Saccharomyces cerevisiae sebanyak 10% dari  volume  substrat  dalam  fermentor  (=  100 ml)  dan  ditutup  dengan  kapas,  diinkubasi  pada suhu  30 0 C  selama  3  hari  atau  sampai pembentukan gelembung CO 2 berhenti.
Agar  tidak  menganggu  proses  fermentasi selanjutnya, Saccharomyces  cerevisiae yang terdapat  pada  fermentor  dimatikan  terlebih dahulu, dengan cara substrat bersama fermentor dipasteurisasi  pada  suhu  72 0 C  selama  15  menit. Disamping itu diamati pula apakah Saccharomyces cerevisiae telah mati atau belum dengan  cara  mengamati  dibawah  mikroskop, menggunakan pewarnaan larutan methylen blue . Apabila Saccharomyces cerevisiae yang ditemukan  ternyata  masih  hidup,  ditunjukkan dengan  warna  jernih  maka  lama  pasteurisasi ditambah  hingga  tidak  ditemukan  lagi  adanya Saccharomyces  cerevisiae yang  masih  hidup. Setelah  proses  fermentasi  alkoholik  berakhir dilakukan  pengambilan  sampel  dan  pengukuran kadar alkohol.
Untuk  menuju  proses  oksidasi  etanol menjadi  asam  asetat,  substrat  yang  telah dipasteurisasi  pada  suhu  72 0 C  selama  15  menit, dalam  keadaan  panas  substrat  dipindahkan  ke dalam botol fermentor untuk fermentasi oksidasi yang sudah disterilkan terlebih dahulu sebanyak 100  ml.  Substrat  yang  telah  dingin  diinokulasi dengan  starter Acetobacter  aceti secara  aseptis dengan perlakuan:
1  =  Konsentrasi Acetobacter  aceti 10%  dari volume substrat
2  =  Konsentrasi Acetobacter  aceti 13%  dari volume substrat
3  =  Konsentrasi Acetobacter  aceti 16%  dari volume substrat
Kemudian  diaerasi  12-14  gelembung  per menit  dan  diinkubasi  pada  suhu  kamar. Pengukuran  kadar  asam  asetat  dilakukan  pada hari ke-6, ke-8 dan ke-10.

## Pengukuran pH
Pengukuran  pH  dilakukan  dengan  cara mengukur  langsung  sampel  yang  baru  diambil dengan pH meter.

## Analisis Data
Jika  data  berdistribusi  normal  dan  varian datanya  homogen,  maka  data tersebut  dianalisis dengan  analisis  sidik  ragam  dan  uji  beda  jarak nyata Duncan’s.

## HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan  dari  hasil  penelitian  diperoleh data sebagai berikut:

## Tabel 1
Derajat keasaman (pH) vinegar hasil fermentasi oksidatif limbah fermentasi biji kakao Perlakuan Ulangan Total  Rerata I II III A 1 W 1 2,12 2,88  2,23 7,23 2,5 A 1 W 2 2,13 2,47  2,9 7,5 2,73 A 1 W 3 2,23 3,02  3,02 8,27 3,55 A 2 W 1 1,94 1,99  2,14 6,07 2,02 A 2 W 2 2,46 2,85  2,23 7,54 2,41 A 2 W 3 2,88 2,82  2,47 8,17 3,22 A 3 W 1 3,54 4,23  4,38 12,15  2,5 A 3 W 2 3,54 3,46  3,64 10,64  2,76 A 3 W 3 3,28 3,28  3,09 9,65 4,05 Total 24,12 27 26,10  77,22  25,73
Keterangan: A 1 W 1 = Inokulasi 10% Acetobacter aceti dan waktu inkubasi selama 6 hari. A 1 W 2 = Inokulasi 10% Acetobacter aceti dan waktu inkubasi selama 8 hari. A 1 W 3 = Inokulasi 10% Acetobacter aceti dan waktu inkubasi selama 10 hari. A 2 W 1 = Inokulasi 13% Acetobacter aceti dan waktu inkubasi selama 6 hari. A 2 W 2 = Inokulasi 13% Acetobacter aceti dan waktu inkubasi selama 8 hari. A 2 W 3 = Inokulasi 13% Acetobacter aceti dan waktu inkubasi selama 10 hari. A 3 W 1 = Inokulasi 16% Acetobacter aceti dan waktu inkubasi selama 6 hari. A 3 W 2 = Inokulasi 16% Acetobacter aceti dan waktu inkubasi selama 8 hari. A 3 W 3 = Inokulasi 16% Acetobacter aceti dan waktu inkubasi selama 10 hari.
Hasil  analisis  sidik  ragam  menunjukkan bahwa  ada  perbedaan  derajat  keasaman  (pH) vinegar  dalam  media  limbah  fermentasi  biji kakao akibat penambahan konsentrasi Acetobacter aceti dan waktu inkubasi. Sedangkan hasil uji Duncan’s 5% menunjukkan perlakuan  inokulasi  13%  starter Acetobacter aceti dengan  waktu  inkubasi  6  hari  berbeda nyata dengan perlakuan lain dengan pH minimal yaitu 2,02.
Perbedaan kadar asam asetat yang dihasilkan pada  tiap  perlakuan  menyebabkan  pH  yang diperoleh  juga  berbeda,  yaitu  sekitar  2,02-4,05. Perubahan pH ini masih dalam kisaran pH untuk vinegar,  sehingga  telah  memenuhi  standar  pH vinegar  yaitu  2,0-4,0  (Sa’id,  1987).  Sedangkan menurut  Holt et  al .  (1994)  mengatakan  pH vinegar yang diperoleh adalah 4,0-5,0.
Ada beberapa faktor yang mempengaruhinya antara  lain:  jenis  senyawa  dan  aktivitas Acetobacter  aceti .  Alkohol  adalah  senyawa hidroksida  yang  bersifat  polar  atau  mudah menguap  dan  merupakan  basa  lemah  yang memiliki  pH  8,0-9,0.  Ini  berarti  kadar  alkohol dalam medium berpengaruh terhadap peningkatan pH. Sehingga semakin tinggi kadar alkohol  dalam  medium  pH  semakin  meningkat begitu  pula  sebaliknya.Sedangkan  asam  asetat merupakan senyawa karboksilat yang mempunyai  sifat  sebagai  asam  lemah.  Apabila
dalam  medium  terjadi  penambahan  asam  atau asam asetat maka akan terjadi penurunan pH.
Selama  fermentasi  oksidatif  ini Acetobacter aceti mengoksidasi alkohol menjadi asam asetat dan  air  yang  menyebabkan  kadar  alkohol menurun. Sesuai dengan kadar asam asetat yang terbentuk  semakin  berkurangnya  kadar  alkohol karena  proses  tersebut  menjadikan  sifat  basa dalam  medium  berkurang  dan  sebaliknya meningkatkan  derajat  asamnya,  yang  ditandai dengan  penurunan  pH.  Maka  pada  perlakuan inokulasi 13% Acetobacter aceti karena mempunyai  kadar  asam  asetat  maksimal dibandingkan  dengan  perlakuan  inokulasi  10% dan  16% Acetobacter  aceti menyebabkan  pH- nya juga lebih rendah.
Disamping  itu  oksidasi  asam  asetat  menjadi karbon  dioksida  dan  air  menyebabkan  karbon dioksida  akan  dilepas  sebagai  gas  dan  air  akan tetap  berada  dalam  medium.  Dengan  demikian kadar  alkohol  akan  terus  menurun  sampai  pada pengamatan  terakhir,  sehingga  pH  mengalami perbedaan.
Bahkan  Fessenden  dan  Fessenden  (1986) mengatakan  adanya  asam  asetat  dan  alkohol bersama-sama  dalam  media  menyebabkan terbentuknya senyawa ester. Dengan terbentuknya  senyawa  ester  ini  menyebabkan pH  mengalami  perbedaan.  Reaksi  terbentuknya senyawa  ester  dari  alkohol  dan  asam  asetat adalah sebagai berikut:

## Kesimpulan
Dari  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan bahwa  ada  perbedaan  derajat  keasaman  (pH) vinegar  dalam  media  limbah  fermentasi  biji kakao akibat penambahan konsentrasi Acetobacter aceti dan waktu inkubasi.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonymous.  1988. Bercocok  Tanam  Kakao . Dinas Perkebunan Daerah Propinsi Dati I Jawa Timur, Jawa Timur. Alamsyah,  T.  S.,  1991, Peranan  Fermentasi dalam  Pengolahan  Biji  Kakao  Kering , Puslit Jember, Jember. Ardhana, 1990, Microbial Ecology and Biochemistry of Cocoa Bean Fermentation , Sinauer Ass. INC., Sunderland. Crueger, W., C.,
Anneliese,
1984, Biotechnology: A Text book of Industrial Microbiology , Sinauer Ass. INC., Sunderland.
Desrosier,  N.  W.,  J.  N.,  Desrosier,  1977, The Technology of Food Preservation , Fourth Edition,  The  Avi  Publ.  Companyy  Inc., Connecticut. Frazier,  W.  C.,  D.  C.,  Westhoff,  1988, Food Microbiology , McGraw-Hill Book Company, Singapore.
Holt,  J.  G.,  Krieg,  N.  R.,  Sneath,  P.  H.  A., Staley,  J.  T.,  dan  Williams,  S.  T.,  1994, Bergey’s  Manual  of  Determinative
Bacteriology , Ninth edition, Williams and Wilkins, Baltimore, Maryland. Iswanto,  H.,  1997, Fermentasi  Biji  Kakao
Menentukan  Cita  Rasa  Coklat  Sejati ,
Trubus  328-Thn.  XXIII-Maret  1997, Jakarta. Kusmawati,  W.,  1999, Analisis  Kadar  Asam Asetat  Vinegar  dalam  Media  Limbah Fermentasi Biji Kakao Akibat Pengaruh Konsentrasi Acetobacter aceti dan Waktu Inkubasi, Universitas Muhammadiyah Malang, Malang.
Rahman,  A.,  1992, Teknologi  Fermentasi , Penerbit Arcan, Jakarta. Sa’id,  E.  G.,  1987, Bioindustri:  Penerapan Teknologi  Fermentasi ,  Penerbit  Pusat Antar  Universitas  (PAU)  Biotek  IPB
bekerjasama  dengan  PT  Mediyatama Sasana Perkasa, Jakarta.
Sardjoko, 1991, Bioteknologi: Latar Belakang dan Penerapannya , PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Schlegel,  H.  G.,  Schmidt,  1994, Mikrobiologi Umum , UGM Press, Yogyakarta.
Tjokroadikoesoemo,  P.  S.,  1993, HFS  dan
Industri Ubi Kayu  Lainnya , PT
Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Wibowo,  D.,  1990, Teknologi  Fermentasi ,
Pusat Antar Unoversitas-Pangan dan Gizi UGM, Yogyakarta.
O C ǁ ǁ CH 3 – C – O – OH + HO – C 2 H 5 ⇄ CH 3 – C – O – C 2 H 5 + H 2 O