## ISOLASI DAN KARAKTERISASI GEN SITRAT SINTASE BAKTERI
Pseudomonas aeruginosa DARI FILOSFER
Hevea brasiliensis Muell. Arg.
Isolation and Characterization of Citrat Synthase Gene of Pseudomonas aeruginosa isolated from Hevea brasiliensis Phylosphere
1) 2) 2)
Radite TISTAMA , Utut WIDYASTUTI  , dan SUHARSONO
1) Balai Penelitian Sungei Putih, Pusat Penelitian Karet Sungei Putih  Galang Sumatera Utara, PO BOX 1415 Medan 20001 Email : raditetistama@yahoo.com
2) Departemen Biologi, Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor
Diterima tanggal 11 April 2013 / Disetujui tanggal 17 September 2013
Jurnal Penelitian Karet, 2013, 31 (2)  : 127 - 138 Indonesian  J.  Nat. Rubb. Res. 2013, 31 (2) : 127 - 138
A bstract
Pseudomonas  aeruginosa is  a  major  of rhizosphere  bacteria  which  has  many  usefull characters  for  agriculture  and  environment.  The bacteria  secrete  organic  acid  which  help  release phosphor  and  protect  plant  root  from  aluminium toxicity. Citrate is a major organic acid secreted by Pseudomonas  i n  the  soil.  Citrate  showed  higher affinity  to  aluminium  and  provide  higher phosphorus than that of the other organic acid. The organic  acid  is  synthesized  from  a  reaction between  oxaloacetate  and  acetyl  CoA,  catalysed by citrate synthase in the Kreb cycle. The research was conducted to isolate and characterize citrate synthase (CS) of Pseudomonas aeruginosa which had  been  isolated  from  rubber  tree  leaf  surface. Specific primer for CS gene was designed based on CS  gene  sequences  of  some  bacteria  which  were kept in Genebank.  The primer was used to amplify CS gene by using PCF machine. The CS gene was successfully isolated from phylosphere bacterium Pseudomonas  aeruginosa .  Pseudomonas aeruginosa CS gene (PaCS) consisted of 1287 bp and  coded  428  amino  acid.  The  PaCS  had  high similarity in amino acid and hidrophosity with the other bacteria CS gene and it might have similarity in enzyme activities.
Keywords:  Citrate  synthase, Pseudomonas aeruginosa, Hevea brasiliensis

## Abstrak
Pseudomonas  aeruginosa merupakan bakteri utama di dalam rizosfer yang mempunyai sifat-sifat  yang  dapat  dimanfaatkan  di  dalam pertanian  dan  lingkungan.  Bakteri  tersebut mensekresikan  asam  organik  yang  dapat melepaskan  fosfor  dan  melindungi  akar  dari keracunan  aluminium.  Sitrat  merupakan  asam organik  yang  dominan  disekresikan  oleh
P s e u d o m o n a s d i   d a l a m   t a n a h .   S i t r a t menunjukkan  afinitas  terhadap  aluminium  dan m e n y e d i a k a n   f o s f o r   y a n g   l e b i h   t i n g g i dibandingkan  asam  organik  lainnya.  Asam organik  ini  disintesis  dari  sebuah  reaksi  antara aksaloasetat dan asetil KoA, dikatalisis oleh sitrat sintase  (CS)  di  dalam  siklus  Kreb.  Penelitian  ini dilakukan  untuk  mengisolasi  dan  meng- karakterisasi  sitrat  sintase  dari Pseudomonas aeruginosa yang  telah  diisolasi  dari  permukaan daun  tanaman  karet.  Primer  spesifik  untuk  gen CS  didesain  berdasarkan  sekuen  gen  sitrat sintase  beberapa  bakteri  yang  disimpan  di Genbank.  Primer  tersebut  digunakan  untuk mengamplifikasi  gen  CS  dengan  menggunakan mesin  PCR.  Gen  CS  telah  berhasil  diisolasi  dari bakteri  filosfere Pseudomonas  aerugunosa. Gen CS Pseudomonas  aeruginosa (PaCS)  tersebut terdiri atas 1287 pb dan menyandikan 428 asam amino.  PaCS mempunyai kesamaan asam amino yang tinggi dan hidrofobisitas dengan CS bakteri lainnya  dan  diduga  mempunyai  persamaan aktivitas enzim.
Kata kunci:  S i t r a t   s i n t a s e , P s e u d o m o n a s aeruginosa, Hevea brasiliensis

## PENDAHULUAN
Bakteri  gram  negatif Pseudomonas merupakan  salah  satu  mikroba  utama  di rhizosfer yang memberi beberapa keuntung- an  bagi  tanaman  seperti  meningkatkan ketahanan tanaman terhadap patogen (Atilla et  al., 2008),  menyediakan  unsur  fosfor (Buch et al., 2008), dan memicu pertumbuh- an akar dengan mensekresikan indole acetic acid  (IAA)  (Khare  dan  Arora  2010).  Bakteri gram  negatif  ini  juga  dapat  hidup  dalam jaringan  tanaman  tanpa  memberikan  efek negatif  bahkan  menguntungkan  bagi
tanaman  inangnya,  seperti  meningkatkan toleransi  terhadap  herbisida  (Ahemad  dan Khan, 2010).
Pseudomonas banyak  dimanfaatkan dalam  beberapa  proses  biologi  seperti biodegradasi komponen organik (Idise et al., 2010), sebagai antimikroba patogen (Chin-A- Woeng et  al., 2003),  mengurangi  cekaman oksidatif  (Hassett et  al., 1993),  mengkelat logam (Lemire et  al., 2010) dan meningkat- kan toleransi terhadap cekaman aluminium (de la Fuente et al., 1997).
Kemampuan  beberapa  spesies  dalam genus Pseudomonas dalam  melarutkan fosfat (Buch et al., 2008; Ahemad dan Khan, 2010)  dikaitkan  dengan  kemampuan mensekresikan  asam  organik  oleh  bakteri tersebut.    Sitrat  merupakan  asam  organik yang  dominan  disekresikan  oleh  bakteri- bakteri dalam genus ini. Sekresi sitrat oleh Pseudomonas diperlukan  untuk  mengatasi keracunan aluminium (Mailloux et al., 2008). Aluminium  adalah  racun  bagi  organisme karena  merusak  fungsi  sel  dengan mengganggu  fungsi-fungsi  kation  penting seperti Fe, Ca dan Mg (Mundy et al., 1997).
Biosintesis  asam  sitrat  melibatkan kondensasi oksaloasetat dan asetil KoA yang dikatalisis  oleh  sitrat  sintase  (CS)  yang mengatur  aliran  karbon  ke  dalam  siklus asam  trikarboksilat.  Siklus  ini  mempunyai dua fungsi yaitu menyediakan energi seluler dan prekusor biosintesis senyawa yang lain (Park et  al., 1994).  Transkripsi  gen  CS meningkat beberapa kali lipat pada saat fase eksponensial atau jika bakteri ditumbuhkan pada medium minimal (Jin dan Sonenshein, 1994). Pseudomonas fluorescens mengguna- kan isositrat liase dan isositrat dehidrogease NADP dependent untuk  metabolisme  sitrat pada saat dicekam Al (Lemire et al., 2010).
Gen  sitrat  sintase Pseudomonas (P.) aeruginosa pertama  kali  diisolasi  oleh Donald et  al. (1989)  dengan  cara  membuat pustaka  genom.  Gen  ini  mempunyai homologi  yang  tinggi  dengan  CS  dari P. stutzeri,  P.  putida  dan  P.  alcaligenes. Sitrat s i n t a s e   d a r i   b a k t e r i   i n i   d i h a m b a t aktivitasnya oleh NADH. Mitcell et al. (1995) melaporkan  bahwa P.  aeruginosa memiliki dua tipe sitrat sintase CS I dan CS II. Bacillus subtilis juga  mempunyai  dua  tipe  sitrat sintase, tetapi enzim ini dihambat oleh ATP (Jin dan Sonensheins, 2006).
Ekspresi  gen  CS  penting  untuk meningkatkan  sintesis  dan  efluk  sitrat  ke dalam rizosfer. Beberapa kelompok peneliti telah melakukan ekspresi berlebih gen CS ke tanaman  untuk  meningkatkan  toleransi tanaman terhadap cekaman Al (de la Fuente et al., 1997; Barone et al., 2008). Ekspresi berlebih  gen  CS  mitokondria  Arabidopsis (At-mtCS)  di  tanaman  wortel  atau s e b a l i k n y a   m e n i n g k a t k a n   t o l e r a n s i terhadap cekaman Al  (Koyama et al., 1999). Anoop et  al. (2003)  juga  melaporkan introduksi  At-mtCS  ke  dalam  khamir  dan kanola  meningkatkan  level  sitrat  di  dalam sel-sel tunas dan memicu sekresi sitrat dua kali  lipat  saat  diperlakukan  dengan  Al. Sebaliknya,  Delhaized et  al. (2001) melaporkan bahwa ekspresi berlebih gen CS aeruginosa  di  dalam  tanaman  tidak meningkatkan akumulasi sitrat di jaringan akar maupun meningkatkan sekresi  sitrat.
Penelitian  ini  bertujuan  mengisolasi dan  mengkarakterisasi  gen  sitrat  sintase bakteri  pseudo  endofitik Pseudomonas aeruginosa .

## BAHAN DAN METODE
Bakteri P.  aeruginosa diperoleh  dari koleksi  Laboratorium  Proteksi  Tanaman Balai  Penelitian  Sungei  Putih  Pusat Penelitian  Karet.  Bakteri  tersebut  diisolasi dari permukaan daun Hevea brasiliensis di Perkebunan  Sungei  Putih.  Analisis polymerase chain reaction (PCR) dan urutan DNA  dilakukan  di  Laboratorium  Biorin P u s a t   P e n e l i t i a n   B i o t e k n o l o g i   d a n Sumberdaya Genetik IPB Bogor.
Kultur Bakteri P. aeruginosa
Medium  yang  digunakan  untuk menumbuhkan bakteri adalah Luria Bertani (LB)  agar  dan  LB  cair.  Komposisi  medium terdiri  dari  5  g/L  ekstrak  khamir,  10  g/L NaCl, dan 10 g/L pepton. Media agar dibuat dengan menambahkan dengan 7 g/L bacto agar  kemudian  disterilkan  dengan  otoklaf O pada suhu 121 C selama 15 menit. Bakteri diambil dari stok penyimpan dan digoreskan pada  LB  agar  dan  diinkubasi  pada  suhu kamar  selama  24  jam.  Koloni  tunggal diambil dan ditumbuhkan di dalam medium 10  ml  LB  cair.  Kultur  bakteri  digoyang dengan  kecepatan  175  rpm  selama  12-16 jam pada suhu kamar.

## Tistama, Widyastuti dan Suharsono

## Isolasi DNA Bakteri P. aeruginosa
DNA  bakteri  diekstrak  dengan  cetyl trimetil  ammonium  bromide  (CTAB) mengikuti  Metode  Sambrook  dan  Russel (2001).  Sebanyak  1,5  ml  biakan  bakteri diendapkan dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm (Jouan BR4i) selama 10 menit. Pada pelet bakteri ditambahkan 600
O µl  2%  CTAB  suhu  65 C  dan  1,2  µl β- mercaptoethanol, lalu  diinkubasikan  pada O suhu 65  C selama 1 jam. Ekstrak dibalik- balik  setiap  10  menit,  supaya  homogen. Tabung berisi ekstrak dimasukkan ke dalam es  dan  ditambah  600  µl  CI  (kloroform: isoamilalkohol  24:1).  Setelah  beberapa  kali ekstrak  sel  dibolak-balik,  komponen padatan  sel  dipisahkan  dengan  cara disentrifugasi  pada  10.000  rpm  (Jouan O BR4i)  suhu  4 C,  selama  10  menit. Supernatan  dipindahkan  ke  dalam  tabung baru dan ditambah 1 kali volume PCI (fenol: kloroform:  isoamilalkohol=25:24:1),  dan O disentrifugasi  pada  10000  rpm  suhu  4 C selama  10  menit.  Supernatan  dipindahkan ke  dalam  tabung  baru  lagi  dan  ditambah dengan 0,1 kali volume 2 M Na asetat pH 5,2 dan 2 kali volume etanol absolut. Campuran O tersebut  diinkubasikan  di  suhu  -20 C s e l a m a   s e m a l a m .   P r e s i p i t a t   D N A diendapkan  dengan  disentrifugasi  pada 10.000  rpm  selama  15  menit.  Pelet  dicuci d e n g a n   5 0 0   µ l   e t a n o l   7 0 % .   D N A diresuspensikan  dengan  30  µl  buffer  Tris- EDTA atau ddH O.
2
Spesies  bakteri  dipastikan  dengan m e n g a m p l i f i k a s i   d a e r a h   1 6 S   r R N A menggunakan  primer  forward  63F:  5`CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC`3 dan reverse 1381R: 5`GGG CGG WGT GTA CAA GGC`3 (Marchesi et al., 1998). Kondisi polymerase chain reaction (PCR) diatur sebagai berikut :
O pra  PCR  94 C,  5  menit,  diikuti  siklus O denaturasi  94 C,  30  detik,  penempelan
O primer  52 C,  30  detik,  pemanjangan  pada
O 72 C, 1,5 menit, yang diulang 30 siklus, dan
O pasca  PCR  pada  72 C,  5  menit,  diikuti O dengan 15  C selama 10 menit.

## Isolasi Gen Sitrat Sintase P. aeruginosa
Gen sitrat sintase (CS) diisolasi dengan menggunakan  primer  spesifik  berdasarkan urutan gen CS dari P. aeruginosa yang ada di Gene  Bank.  Urutan  primer  adalah  sebagai b e r i k u t :   p r i m e r   f o r w a r d 5'ATGGCTGACAAAAAAGCGCAG3'  dan
reverse  5'TCAGCCGCGATCCTTGAGGGC3'. Kondisi  PCR  diatur  dengan  siklus  sebagai O berikut:  pra  PCR  94 C,  5  menit,  diikuti O proses  denaturasi  95 C,  30  detik,
O
penempelan  primer  55 C,  30  detik,
O
pemanjangan  pada  72 C,  1,5  menit,  yang
O diulang 30 siklus, dan pasca PCR pada 72 C,
O 5 menit, diikuti dengan pendinginan15 C, 10 menit.
Kandidat  gen  sitrat  sintase  yang diamplifikasi  dari  P.  aeruginosa  (PaCS)  ini kemudian di klon ke dalam plasmid pGEM-T E a s y   ( P r o m e g a   I n c . ) ,   d e n g a n   c a r a mencampurkan 1 µl hasil PCR, 25 ng pGEM- T easy, 1,5 unit T4 DNA ligase, 2,5 µl 2x rapid buffer ligasi, dan ddH O hingga volume total 2 menjadi 5 µl. Campuran diinkubasikan pada suhu  kamar  selama  1  jam,  kemudian
O diinkubasikan  pada  suhu  4 C  selama  12 jam.
Introduksi pGEM-T PaCS ke dalam E. coli DH5α
Hasil ligasi ditransfer ke dalam E. coli DH5α . Satu koloni E. coli diinokulasikan ke dalam  2  ml  media  LB.  Kultur  bakteri
O digoyang  di  suhu  37 C  selama  semalam. Dari  kultur  ter sebut  diambil  10  μl  untuk dikulturkan  kembali  ke  10  ml  LB.  Kultur O digoyang di suhu 37 C selama 2 - 3 jam atau OD  = 0,25 - 3. Kultur disimpan di dalam es 600 selama  15  menit.  Dua  jenis  larutan  0,1  M CaCl   dan  0,1  M  CaCl   yang  mengandung 2
2
15%  gliserol  juga  disimpan  di  dalam  es. Sebanyak  1,5  ml  kultur  sel  disentrifugasi pada 5000 rpm selama 10 menit pada suhu O 4 C. Medium dibuang dan sel diresuspensi- kan  dengan  450  µl  0,1  M  CaCl .  Suspensi 2 dibiarkan di es selama 30 menit, kemudian d i s e n t r i f u g a s i   s e p e r t i   s e b e l u m n y a . Supernatan dibuang dan pelet diresuspensi- kan dengan 45 µl 0,1 M CaCl  + 15% gliserol 2 dan sel bakteri sudah menjadi kompeten.
Hasil  ligasi  dicampurkan  ke  dalam  sel kompeten dan dibiarkan disimpan di dalam es selama 30 menit. Campuran sel kompeten
O dipanaskan  pada  suhu  42 C  selama  60 detik,  lalu  dengan  cepat  dimasukkan  ke dalam es selama 5 menit. LB ditambahkan ke  dalam  campuran  tersebut  kemudian diinkubasikan  selama  1  jam.  Kultur  sel  ini d i s e b a r k a n   p a d a m e d i a   L B   y a n g mengandung 50 μg/ml ampisilin.
Isolasi dan karakterisasi gen sitrat sintase bakteri P. aeruginosa dari filosfer Hevea brasiliensis Muell. Arg.
Plasmid  hasil  ligasi  diamplifikasi dengan primer yang didesain dari urutan T7 dan SP16 untuk mendapatkan urutan DNA utuh.  Kondisi  PCR  adalah  sama  dengan kondisi saat isolasi gen PaCS .

## Pengurutan DNA dan Analisisnya
Urutan  DNA  penyusun  gen  16S  dan PaCs  dianalisis  menggunakan  DNA sequencer ABI  Prism  model 310  versi  3.7. Selanjutnya,  urutan  DNA  dianalisis homologinya dengan menggunakan program basic  local  aligment  search  tools (BLAST) (Altschul et  al .,  1997).  Urutan  asam  amino PaCS  diketahui  dengan  cara  mendeduksi urutan  DNA  yang  diperoleh  menggunakan program translation dari  perangkat  lunak Bioedit.  Analisis  keberadaan  situs  restriksi di dalam gen menggunakan perangkat lunak yang sama.
Pohon  filogenetik  dibuat  dengan menggunakan  Program  MEGA4  (Tamura  et al., 2007). Urutan DNA hasil sequencing dan urutan  DNA  dari  gen  CS  dari  berbagai spesies Pseudomonas yang  akan  dianalisis disimpan  dalam  bentuk  file  FASTA menggunakan perangkat lunak Bioedit. File tersebut kemudian dibuka dengan program MEGA4,  kemudian  data  di  sejajarkan dengan  cara  memilih  menu  bar align ClustalW .  Data  yang  telah  disejajarkan dianalisis kekerabatan dengan memilih data dan analisis filogenetik. Pohon kekerabatan dibuat  dengan  memilih  menu  bar Neigbor- Joining Tree . Penjajaran urutan asam amino penyusun  bakteri  CS  maupun  tanaman menggunakan  perangkat  lunak  bioedit dengan  memilih  menu  bar align  ClustalW . Urutan  gen  CS  dari  beberapa  tanaman digunakan sebagai pembanding.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
PCR  menggunakan  primer  universal untuk  16S  bakteri  menghasilkan  fragmen DNA  berukuran  1301  pb  (Gambar  1). Analisis BLAST berdasarkan  urutan nukleotida  menunjukkan  bahwa  urutan tersebut mempunyai kesamaan 99% dengan gen  penyandi  16S  ribosomal  RNA  dari beberapa galur P. aeruginosa . Hasil analisis sebelumnya menggunakan uji biokimia dan mikroskopik, galur bakteri ini diidentifikasi sebagai Pseudomonas  flourescens (Data tidak dipublikasikan). Perbandingan spesies bakteri  banyak  menggunakan  urutan  gen
16S  rRNA  sebagai  dasar  menyusun filogenetik  (Weisburg et  al .,  1990).  Alasan menggunakan  gen  ini  dikarenakan  16S rRNA  secara  fungsional  konstan,  dan mempunyai  urutan  yang  lebih  bervariasi (Woose, 1987).   Gen 16S rRNA merupakan bagian dari operon (Coenye dan Vandamme, 2003).  Kombinasi  primer  16S  rRNA  dapat mengidentifikasi beberapa spesies sekaligus tanpa  harus  dikulturkan  terlebih  dahulu, sehingga proses identifikasi lebih cepat dan dapat mencakup bakteri-bakteri yang tidak atau belum dapat dikulturkan (Weisburg et al . 1990).
Primer untuk isolasi gen sitrat sintase (CS)  didesain  berdasarkan  urutan  gen CS dari beberapa galur P. aeruginosa yang telah didaftarkan  di  Gene  Bank.  Amplifikasi  gen CS  dari P.  aeruginosa SP01  dengan  PCR menghasilkan fragmen berukuran 1300 pb. Fragmen ini telah berhasil diklon ke dalam plasmid  kloning pGEM-T  Easy dan kemudian telah berhasil diintroduksikan ke E.coli DH5α untuk diperbanyak (Gambar 2). Pengurutan DNA dari fragmen ini dilakukan dengan menggunakan  primer yang didesain dari  urutan  promoter    SP6  dan  T7  yang mengapit gen CS di pGEM-T Easy .
Gen  CS  di  genus Pseudomonas memiliki kesamaan urutan di 8 asam amino pertama  dari  kodon  star  dan  kodon  stop, sehingga  memudahkan  untuk  mengisolasi gen  tersebut  dengan  desain  berdasarkan urutan  dari  sisi  5'  dan  di  sisi  3'nya. PaCS terdiri atas 1287 pb dan dideduksi menyandi 428 asam amino.Variasi gen CS pada strain P.  aeruginosa berada  di  urutan  DNA  di urutan  724-748  pb  atau    di  urutan  asam amino 242-248. Gen sitrat sintase pertama diisolasi dari P. aeruginosa berukuran 1287 pb  dan  mempunyai  homologi  yang  tinggi dengan  spesies Pseudomonas lainnya (Donald et al ., 1989). Ukuran CS eukariotik lebih  besar  dari  prokariotik  yaitu  sekitar 1700 pb (Park et al .,1997; Min et al ., 2011) (Gambar 3).
Hasil  analisis BLAST menunjukkan bahwa  fragmen  DNA  yang  disisipkan  di plasmid  pGEM-T  adalah  gen  sitrat  sintase karena mempunyai kesamaan 96% dengan sitrat sintase tipe II P.aeruginosa PAO1 dan 95%  P. aeruginosa PA7  (Tabel  1).  Urutan tersebut dimulai dengan star kodon ATG dan diakhiri  dengan  stop  kodon  TGA,  dengan demikian urutan merupakan gen utuh sitrat

## Tistama, Widyastuti dan Suharsono
Gambar 1.  Urutan nukleotida fragmen DNA 16S rRNA P. aeuroginosa SP01. Fragmen tersebut tersusun oleh 1301 pb
Figure    1.  Sequence of nucleotide fragments of DNA 16S rRNA P. aeuroginosa SP01 Fragments are composed by 1301 pb
GGGAGTAGACAGCTCTGGATCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCT GGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTGAGGGAGA AAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTG GTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTC ACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGG ACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTG TAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTA CCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGC AAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTGGATG TGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGAGTACGGT AGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACC AGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGA GCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGG GATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGG CCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG GTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCA GAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCT CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACC AGCACCTCGGGTGGGCACTCTAAGGAAACTGCCGGTGACAAACCGGAAGGAAGGGGG GGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTC GGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTC CGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGGAATCAGA ATGCCCGTTGGTGGCGCC
Gambar 2.   PCR  koloni  bakteri E.  coli DH5α  hasil  transformasi pGEM-T easy yang mengandung  gen  sitrat  sintase.  Urutan  gen  sitrat  sintase  di  Pa4  dan  Pa5 mempunyai orientasi  yang berlawanan.
Figure    2.   PCR colony of bacteria of E. coli DH5α transformed from pGEM-T easy containing citrate  synthase  gene.  Citrate  synthase  gene  sequences  in  PA4  and  PA5  has opposite orientation.
Isolasi dan karakterisasi gen sitrat sintase bakteri P. aeruginosa dari filosfer Hevea brasiliensis Muell. Arg.
1     ATG GCT GAC AAA AAA GCG CAG TTG ATC ATC GAG GGC TCA GCC CCC   45 1     Met Ala Asp Lys Lys Ala Gln Leu Ile Ile Glu Gly Ser Ala Pro   15 46    GTC GAA CTG CCC GTC CTA TCC GGT ACC ATG GGT CCC GAT GTA GTG   90
16    Val Glu Leu Pro Val Leu Ser Gly Thr Met Gly Pro Asp Val Val   30 91    GAT GTA CGG GGC CTC ACC GCC ACG GGC CAC TTC ACC TTC GAT CCT   135
31    Asp Val Arg Gly Leu Thr Ala Thr Gly His Phe Thr Phe Asp Pro   45 136   GGC TTC ATG TCG ACC GCC TCC TGC GAG TCG AAG ATC ACC TAT ATC   180
46    Gly Phe Met Ser Thr Ala Ser Cys Glu Ser Lys Ile Thr Tyr Ile   60 181   GAC GGC GAC AAA GGC GTC CTC CTC CAT CGC GGC TAC CCC ATC GAG   225
61    As  Gly Asp Lys Gly Val Leu Leu His Arg Gly Tyr Pro Ile Glu   75 226   CAA CTG GCA GAG AAA TCC GAC TAC CTG GAA ACC TGC TAC CTG CTG   270 76    Gln Leu Ala Glu Lys Ser Asp Tyr Leu Glu Thr Cys Tyr Leu Leu   90 271   CTG AAC GGC GAG CTG CCC ACC GCC GCG CAG AAG GAA CAG TTC GTC   315 91    Leu Asn Gly Glu Leu Pro Thr Ala Ala Gln Lys Glu Gln Phe Val   105 316   GGC ACC ATC AAG AAC CAC ACC ATG GTT CAC GAG CAG TTG AAG ACC   360 106   Gly Thr Ile Lys Asn His Thr Met Val His Glu Gln Leu Lys Thr   120 361   TTC TTC AAC GGC TTC CGC CGC GAC GCC CAC CCG ATG GCC GTG ATG   405 121   Phe Phe Asn Gly Phe Arg Arg Asp Ala His Pro Met Ala Val Met   135 406   TGC GGC GTG ATC GGC GCC CTC TCG GCC TTC TAC CAC GAC TCC CTG   450 136   Cys Gly Val Ile Gly Ala Leu Ser Ala Phe Tyr His Asp Ser Leu   150 451   GAC ATC AAT AAC CCG AAG CAT CGC GAA GTC TCC GCG CAT CGC CTG   495 151   Asp Ile Asn Asn Pro Lys His Arg Glu Val Ser Ala His Arg Leu   165 496   ATC GCC AAG ATG CCG ACC ATC GCC GCC ATG GTG TAC AAG TAC TCC   540 166   Ile Ala Lys Met Pro Thr Ile Ala Ala Met Val Tyr Lys Tyr Ser   180 541   AAG GGC GAG CCG ATG ATG TAT CCG CGT AAC GAC CTG AAC TAC GCG   585 181   Lys Gly Glu Pro Met Met Tyr Pro Arg Asn Asp Leu Asn Tyr Ala   195 586   GAA AAC TTC CTG CAC ATG ATG TTC AAC ACC CCC TGC GAG ACC AAG   630 196   Glu Asn Phe Leu His Met Met Phe Asn Thr Pro Cys Glu Thr Lys   210 631   CCG ATC AGC CCC GTG CTG GCC AAG GCC ATG GAC CGC ATC TTC ATT   675 211   Pro Ile Ser Pro Val Leu Ala Lys Ala Met Asp Arg Ile Phe Ile   225
676   CTC CAC GCC GAC CAC GAG CAG AAC GCC TCC ACC TCC ACG GTG CGT   720 226   Leu His Ala Asp His Glu Gln Asn Ala Ser Thr Ser Thr Val Arg   240 721   CTG TTC GCC TGC ATC GCC TCC   765 GGC CGG CTC CTC CGG CGC CAT CCG 241   Leu Phe Ala Cys Ile Ala Ser   255 Gly Arg Leu Leu Arg Arg His Pro 766   GGC ATC GCC GCC CTG TGG GGA CCG GCC CAT GGC GGC GCG AAC GAA   810 256   Gly Ile Ala Ala Leu Trp Gly Pro Ala His Gly Gly Ala Asn Glu   270 811 G CG GTG CTG CGC ATG CTC GAC GAG ATC GGC GAC GTG TCC AAC ATC   855 271   Ala Val Leu Arg Met Leu Asp Glu Ile Gly Asp Val Ser Asn Ile   285 856   GAC AAG TTC GTC GAG AAG GCC AAG GAC AAG AAC GAT CCG TTC AAG   900 286   Asp Lys Phe Val Glu Lys Ala Lys Asp Lys Asn Asp Pro Phe Lys   300 901   CTG ATG GGC TTC GGC CAT CGT GTC TAC AAG AAC TTC GAC CCG CGC   945 301   Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys Asn Phe Asp Pro Arg   315 946   GCC AAG GTC ATG AAG CAG ACC TGC GAC GAG GTC CTC CAG GAG CTG   990 316   Ala Lys Val Met Lys Gln Thr Cys Asp Glu Val Leu Gln Glu Leu   330 991   GGC ATC AAC GAC CCG CAA CTG GAA CTG GCG ATG AAG CTA GAA GAA   1035 331   Gly Ile Asn Asp Pro Gln Leu Glu Leu Ala Met Lys Leu Glu Glu   345
1036  ATC GCC CGC CAC GAC CCC TAC TTC GTG GAA CGC AAC CTG TAC CCG   1080 346   Ile Ala Arg His Asp Pro Tyr Phe Val Glu Arg Asn Leu Tyr Pro   360 1081  AAC GTC GAC TTC TAC TCG GGG ATC ATC CTC AAG GCG ATC GGC ATT   1125 361   Asn Val Asp Phe Tyr Ser Gly Ile Ile Leu Lys Ala Ile Gly Ile   375 1126  CCG ACC AGC ATG TTC ACC GTG ATC TTC GCC CTG GCG CGT ACC GTC   1170
376   Pro Thr Ser Met Phe Thr Val Ile Phe Ala Leu Ala Arg Thr Val   390
1171  GGC TGG ATC TCG CAC TGG CAG GAA ATG CTC TCC GGC CCC TAC AAG   1215 391   Gly Trp Ile Ser His Trp Gln Glu Met Leu Ser Gly Pro Tyr Lys   405 1216  ATC GGC CGC CCG CGC CAG CTC TAT ACC GGC CAC ACC CAG CGC GAC   1260 406   Ile Gly Arg Pro Arg Gln Leu Tyr Thr Gly His Thr Gln Arg Asp   420 1261  TTC ACC GCC CTC AAG GAT CGC GGC TGA   1287 421   Phe Thr Ala Leu Lys Asp Arg Gly End
Gambar 3.  Deduksi asam amino dari hasil urutan DNA. Protein PaCS terdiri atas 428  asam amino. Huruf berwarna merah menunjukkan daerah yang spesifik dari gen PaCS dibanding gen sitrat sintase dari strain P. aeruginosa maupun Pseudomonas sp. Figure    3.  Deduced amino acid of sequence of DNA results. PACS protein consists of 428 amino acids.  Red  letters  indicate  specific  regions  of  gene  PACS  compared  with  citrate synthase gene from a strain of  P. aeruginosa and Pseudomonas sp

## Tistama, Widyastuti dan Suharsono
sintase  tipe  II  dari  P.  aeruginosa,  yang kemudian  diberi  nama  gen  PaCS.  Mitchell (1996)  melaporkan  bahwa  P.  aeruginosa mempunyai  dua  jenis  sitrat  sintase  yaitu sitrat  sintase  I  dan  II  yang  perannya bervariasi tergantung fase pertumbuhannya. CS  I  berperan  lebih  dominan  pada  fase logaritmik, sementara   CS II lebih berperan pada  fase  stationer.  CS  II  merupakan  jenis enzim yang sensitif terhadap NADH (Donald et  al.,  1989),  seperti  halnya  CS  II  dari kebanyakan  bakteri  gram  negatif.  Berbeda dengan  bakteri  gram  negatif  lainnya  CS Bacillus  subtilis  dihambat  oleh  ATP  seperti halnya  CS  bakteri  gram  positif  atau eukariotik (Jin dan Sonenshein, 1996).
Analisis  restriksi  menggunakan perangkat  lunak  bioedit  menunjukkan bahwa  enzim  endonuklease  yang  tidak memotong  urutan  PaCS  tetapi  terdapat  di dalam multiple cloning site (MCS) pGEMT-T Easy adalah AflII, ApaI, BamHI, BglII, BstEII, ClaI, DraI, EcoRI, EcoRV, HindIII, HpaI, MluI, NdeI, NheI, NotI, NsiI, PstI, PvuII, RsrII, SfiI, SmaI,  SpeI,  SspI,  StuI,  XbaI,  XhoI.  Enzim- enzim  tersebut  dapat  digunakan  untuk pengklonan  gen  ke  dalam  plasmid  atau untuk  penyisipan  ke  dalam  kaset  pada kontruksi  gen.  Informasi  ini  juga  penting untuk  pemotongan  DNA  total  tanaman transgenik  untuk  analisis  sisipan  PaCS dengan menggunakan southern blot.
Hasil  analisis  filogenetik,    CS  dari  P. aeruginosa  SP01  mengelompok  dengan  CS dari strain yang lain termasuk P. aeruginosa
Tabel 1.   Hasil analisis Blastx dari urutan hasil amplifikasi PCR fragmen DNA CS Table 1.   Blastx  analysis  resulted  from  sequence  the  results  of  PCR  amplification  of  DNA fragments CS
No. Asesi Deskripsi Description Skor Score Perkiraan cakupan Query coverage Nilai kesalahan E-value Identik maksimal Maximal Identic 1 NP 250271.1 Type II citrate synthase P. aeruginosa PAO1) 815 99% 0.0 96% 2 YP 001349048.1 Type II citrate synthase P. aeruginosa PA7) 812 99% 0.0 95% 3 AAAA25769.1 Citrate synthase (P. aeruginosa) 811 99% 0.0 95% 4 ZP 01364931.1 Hypothetical protein PaerPA 010002043 (P. aeruginosa) 770 94% 0.0 96% 5 YP 001187996.1 Type II citrate synthase (P. medocina ymp) 757 99% 0.0 88%
PAO1 yang digunakan dalam penelitian de la Fuente  et  al.  (1997).  Gen  CS  dari  masing- masing spesies Pseudomonas sp mempunyai urutan  yang  khas  sehingga  mengelompok dalam  satu  grup.  Hal  ini  memperkuat penelitian  sebelumnya  yang  menyebutkan bahwa  gen  CS  dapat  digunakan  untuk menganalisis  kekerabatan  seperti  halnya 16S  rRNA  (Roux  et  al.,  1997;  Hernandez- Lucas et al., 2004) (Gambar 4).
Pada E.coli, CS berbentuk heksamerik sedangkan  pada  jantung  babi  berbentuk dimerik  (Bhayana  dan  Duckword,  1984). Bentuk  heksamerik  ini  kemungkinan berkaitan dengan hidrofobisitas asam amino penyusun  CS.  Analisis  hidrofobisitas menunjukkan bahwa CS dari P. aeruginosa mempunyai  enam  puncak  hidrofobik.  Jika dibandingkan  CS  dari  P.  aeruginosa  SP01 dengan galur PA01 maka perbedaan terjadi hanya pada puncak ke-5 yang disusun oleh asam amino 240-260. Hal ini terjadi karena penyusun  asam  amino  di  daerah  242-248 galur  SP01  berbeda  dari  galur  yang  lain. Perbedaan  hidrofobisitas  antara  CS  dari  P. aeruginosa  SP01  dengan  CS  P.  flourescens terjadi pada puncak ke 1, 3, 4, 5, sedangkan jika dibandingkan dengan P. putida semua puncak  terdapat  perbedaan.  Tingkat perbedaan  hidrofobisitas  ini  meningkat sesuai dengan jarak evolusi masing-masing spesies.  Hidrofobisitas  asam-asam  amino menentukan  struktur  tiga  dimensi  dan menentukan aktivitas suatu enzim (Darnell et  al.,  1990).  Berdasarkan  hidrofobisitas asam  amino  penyusun  enzim  CS  dapat
Isolasi dan karakterisasi gen sitrat sintase bakteri P. aeruginosa dari filosfer Hevea brasiliensis Muell. Arg.
P. aeruginosa M29728
P. aeruginosa CP000438.1
P. aeuginosa CH482384.1
P.aeruginosa FM209186.1
P. aeruginosa SP01
P. aeruginosa CH482383.1
P. aeruginosa PAO1 P. stutzeri A1501
P. mendocina CP000680.1
P.fluorescens CP000094.2
P. fluorescens AM181176.4
P. putida AE015451.1
P. syringae pv. aptata AY610697
P.syringae pv. coronafaciens AY610700
P. syringae pv. actinidiae AY610696
Psyringae pv. maculicola AY610714
P.syringae pv. broussonetiae AY610699
P. syringae pv. glycinea AY610701
P. syringae pv. lachrymans AY610711
P.savastanoi AY610743
0.02
Gambar 4. Pohon filogenetik Pseudomonas sp berdasarkan urutan gen sitrat sintase Figure 4. Phylogenetic tree of Pseudomonas sp based on the sequence citrate synthase gene
diduga struktur tiga dimensi enzim tersebut. Perbedaan  hidrofobisitas  asam  amino penyusun enzim-enzim yang semakin tinggi diduga aktivitas enzim-enzim tersebut juga semakin berbeda (Gambar 5).
Hasil  penjajaran  urutan  asam  amino penyusun  sitrat  sintase  antar  spesies Pseudomonas  menunjukkan  adanya kemiripan yang tinggi satu dengan lainnya. Namun,  urutan  asam  amino  sitrat  sintase Pseudomonas  sp  berbeda  dengan  sitrat sintase  dari  tanaman.  Kemiripan  susunan amino sitrat sintase antara A. thaliana dan N.  tabacum  juga  relatif  lebih  rendah dibandingkan  kemiripan  antar  spesies Pseudomonas  (Gambar  6).  Meskipun mempunyai  perbedaan  dalam  hal  urutan dan  struktur,  enzim  sitrat  sintase  bakteri telah  diketahui  dapat  berfungsi  normal  di dalam jaringan tanaman (de la Fuente et al., 1997; Barone et al.,  2008).
CS mempunyai peran yang strategis dalam menghasilkan  energi  baik  pada  prokariotik maupun  eukariotik.  Sitrat  sintase  juga b e r p e r a n   d a l a m   v i r u l e n s i   p a d a Agrobacterium . Mutasi gen CS pada spesies tersebut  menyebabkan  penurunan  daya virulensi  (Suksomtip et  al .,  2005).  Mutasi pada  gen  CS  ini  juga  berpengaruh  dalam pembentukan  spora Bacillus sp  (Donald et al ., 1989). Sitrat sintase Aspergillus nidulans disandikan oleh gen Cit A berukuran 471 pb dan berlokasi di dalam mitokondria (Min et al .,  2010).  Gen Cit A  ini  ditemukan  sebagai kopi  tunggal,  mempunyai  7  intron  dan inisiasi transkripsinya pada posisi -26 (Park et al ., 1997; Min et al ., 2010). Pada bakteri Coynebacterium  glutamicum ,  sitrat  sintase disandikan oleh glt A. Ekspresi gen tersebut diatur oleh faktor transkripsi RamA, RamB dan GlxR yang   terletak di bagian hulu dari gen tersebut (van Ooyen et al ., 2011).

## Tistama, Widyastuti dan Suharsono
Gambar 5. Analisis hidrofobisitas asam-asam amino penyusun sitrat sintase P. aeruginosa SP01 dengan Pseudomonas sp lainnya dengan metode Kyte and Doolitte.
Figure    5.  Analysis of the hydrophobicity of the amino acids making up citrate synthase P. Pseudomonas aeruginosa sp SP01 with the method of Kyte and other Doolittle.
Isolasi dan karakterisasi gen sitrat sintase bakteri P. aeruginosa dari filosfer Hevea brasiliensis Muell. Arg.
Posisi Position Rata-rata hidrofobisitas Mean hydrophobicity
Perbandingan hidrofobisitas CS P. aeruginosa SP 01 dengan P. aeruginosa PA01 Comparison of the hydrophobicity CS P. SP 01
P. aeruginosa SP01 dengan P. flourescens P. aeruginosa aeruginosa PA01 Posisi Position Rata-rata hidrofobisitas Mean hydrophobicity Posisi Position Rata-rata hidrofobisitas Mean hydrophobicity P. aeruginosa SP01 dengan P. putida P. SP01 with P. aeruginosa putida.

## KESIMPULAN DAN SARAN
1.  Gen sitrat sintase telah berhasil diisolasi dari Pseudomonas  aeruginosa SP01. Gen  tersebut  berukuran  1287  pb  dan menyandikan 428 asam amino.
2.  PaCS  mempunyai  kemiripan  urutan asam  amino  dan  hidrofobisitas  dengan sitrat  sintase Pseudomonas  aeruginosa P A 0 .   K e m i r i p a n   u r u t a n   d a n hidrofobisitas ini mendukung kemiripan aktivitas  antara  kedua  enzim  sitrat sintase ini.
Ekspresi  gen  CS P.  aeruginosa SP01 perlu  diuji  ekspresinya  di  dalam  jaringan tanaman  untuk  mengetahui  perannya dalam  toleransi  terhadap  cekaman aluminium.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahemad , M.,  and  M.S.  Khan.  2010. Phosphate-solubilizing  and  plant- growth  promoting  Pseudomonas aeruginosa  PS1  improves  green  gram performance in quizalatop-p-ethyl and clodinatop amended soil. Arch of Envir Contami and  Toxicol 58 (2): 361-372.
Altschul, S.F., T.L. Madden, A.A. Scaffer, Z. Zhang,  W.  Miller,  and  D.J.  Lipman. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a  new  generation  of  protein  database search  programs. Nucleic  Acids  Res 25(17): 3389-3402.
Anoop , V.M., U. Basu, M.T. McCammon, L. McAlister-Henn, and G.J. Taylor 2003. Modulation of citrate metabolism alters aluminium  tolerance  in  yeast  and transgenic  canola  overexpressing  a mitochondrial  citrate  synthase. Plant Physiol 132: 2205-2217.
Atilla , C., A. Ueda, S.L. Cirillo, J.D. Chen, W. Chen, T.K. Wood. 2008. Pseudomonas aeruginosa PAO1 virulence factors and poplar  tree  response  in  rhizosphere. Micro Biotechnol 1(1): 17-19.
Barone,  P.,  D.  Rosellini,  P.  LaFayette,  J. Bouton,  F.  Veronesi,  and  W.  Parrott. 2008.  Bacterial  citrate  synthase expression  and  soil  aluminum tolerance  in  transgenic  alfafa. Plant Cell Rep 27: 893-901.
Bhayana,  V.  and  H.W.  Duckwork  1984. Amino acid sequencing of E. coli citrate synthase. Biochem 23: 2900-2905.
Buch,  A.B.,  G.  Archana,  and  G.  Naresh- Kumar. 2008. Metabolic channeling of g l u c o s e   t o w a r d s   g l u c o n a t e   i n phosphate-solubilizing Pseudomonas aeruginosa P4  under  phosphorus deficiency. Res Microbiol 159: 635-642.
Chin-A-Woeng, T.F.C., G.V. Bloemberg, and B.J.J.  Lugtenberg.  2003.  Phenazine and  their  role  in  bicontrol  by Pseudomonas bacteria. New  Phytol 157: 503-523.
Coenye,  T.,  and  P.  Vandamme.  2003. Intragenomic  heterogeneity  between multiple 16S ribosomal RNA operons in sequenced  bacterial  genomes. FEMS Microbiol. Lett 228: 45-49.
Darnell,  J.,  H  Lodish,  and  D.  Baltimore. nd 1990. Molcular Cell Biology . 2  Edition
.  Scientific  America  Books.  New  York USA.1105 p.
de  la  Fuente,  J.M.,  V.  Ramire-Rondriguez,
J.L.  Cabrera-Ponce  and  L.  Harrere- Estrell.  1997.  Aluminum  tolerance  in transgenic plant by alteration of citrate synthesis. Science 276: 1566-1568.
Delhaize,  E.,  D.M.  Hebb,  and  P.R.  Ryan.
2001.  Expression  of  a Pseudomonas aeruginosa citrate  synthase  gene  in tobacco  is  not  associated  with  either enhanced  citrate  accumulation  or efflux. Plant Physiol 125: 2059-2067.
Donald,  L.J.,  G.F.  Molgat,  and  H.W.
D u c k w o r t h .   1 9 8 9 .   C l o n i n g , sequencing, and expression of the gene for NADH sensitive citrate synthase of Pseudomonas  aeruginosa.  J.  of  Bact 171(10): 5542-5550.
Hassett , D.J., W.A. Woodruff, D.J. Wozniak, M.L.  Vasil,  M.S.  Cohen,  and  D.E. O h m a n .   1 9 9 3 .   C l o n i n g   a n d characterization  of  the  Pseudomonas aeruginosa  sodA  and  sodB  genes encoding  manganese  and  iron cofactored  superxide  dismutase: Increased  manganese  superoxide dismutase  activity  in  alginate- producing bacteria. J. Bacteriol: 7668- 7665.

## Tistama, Widyastuti dan Suharsono
Hernandez-Lucas, I., M.Rosel-Hernandez, L. Segovia, J. Rojas, E. Martinez-Romero. 2004.  Phylogenetic  relationships  of rhizobia  based  on  citrate  synthase gene  sequences.  Syst. Appl.  Microbial 27: 703-706.
Idise,  O.E.,  J.B.  Ameh,  S.E.  Yakubu,  and C.A. Okuofu. 2010. Biodegradation of a refinery  effluent  treated  with  organic fertilizer by modified strain of Bacillus cereus and Pseudomonas  aeruginosa . Afric. J. Biotech 9(22): 3298-3302.
Jin,  S.  and  A.  Sonenshein.  1994. Transcriptional  regulation  of  Bacillus subtilise  citrate  synthase  genes.  J. Bact 176(15): 4680-4690.
Khare , E.  and  Arora  N.K.  2010.  Effect  of indol-3-acetic  acid  (IAA)  produced  by P s e u d o m o n a s   a e r u g i n o s a i n suppression of charcoal rot disease of chickpea. Curr. Microbiol 61(1): 64-68.
Koyama,  H.,  E.  Takita,  A.  Kawamura,  T. Harai,  and  D.  Shibata.  1999. Overexpression  of  mithochondria citrate  synthase  gene  improves  the growth of carrot cells in Al-phosphate medium. Plant Cell. Physiol 40(5): 482- 488.
Lemire, J. R. Mailloux, C. Auger, D. Whalen, and V.D. Appana. 2010. Pseudomonas fluorescens orchestrates  a  fine metabolic-balancing  act  to  counter aluminum toxicity. Envir. Microb 12(6): 1384-1390.
Mailloux, R.J., J. Lemire, S. Kalyuzhnyi, and V.  Appanna.  2008.  A  novel  metabolic network  leads  to  enhanced  citrate b i o g e n e s i s   i n P s e u d o m o n a s flourescens exposed  to  aluminum toxicity. Extremophiles 12: 451-459.
Marchesi , J.R.,  T.T.  Sato,  A.J.  Weightman, T.A.  Martin,  J.C.  Fry,  S.J.  Hiom, D.Dymock, W.G. Wade. 1998.   Design and  evaluation  of  useful  bacterium spesific  PCR  primers  that  amplify genes  coding  for  bacterial  165  rRNA.
Appl. & Envir. Mricob 64(2): 795-799.
Min, I.S., J.Y. Bang, S.W. Seo, C.H. Lee, and P.J.  Maeng  PJ.  2010.  Differential expression  of cit A  gene  encoding  the mitochondrial  citrate  synthase  of Aspergillus  nidulans in  response  to developmental  status  and  carbon sources. J. Microbiol 48 (2): 188-198.
Mitchell,  C.G,  S.C.  Anderson,  and  E.L.  el- Mansi.  1995.  Purification  and characterization  of  citrate  synthase i s o e n z i m e s   f r o m P s e u d o m o n a s aeruginosa. Biochem. J 2: 507-511.
Mundy, W.R., T.M. Freudenrich, and P.R.S.
K o d a v a n t i .   1 9 9 7 .   A l u m i n u m p o t e n t i a t e s   g l u t a m a t e - i n d u c e d calcium  accumulation  and  iron- induced oxygen free radical formation in primary neuronal cultures. Mol. and Chem. Neuropath 32(1-3): 41-57.
Park, B.W., K.H. Han, C.Y. Lee, C.H. Lee, P.J. M a e n g .   1 9 9 7 .   C l o n i n g   a n d characterization  of  the cit A  gene encoding  the  mitochondrial  citrate synthase of Aspergillus nidulans. Mol. Cell 7(2): 290-295.
Roux,  Raoult.  1997.  Citrate  synthase  gene c o m p a r i s o n ,   a   n e w   t o o l   f o r phylogenetic  analysis,  and  its application  for  the Rickettsiae . Int.  J. Syst. Bact 47(2): 252-261.
Sambrook,  J.  and  D.W.  Russell.  2001. M o l e c u l a r   C l o n i n g .   A   M a n u a l Laboratory. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.
Suksomtip,  M.,  P.  Liu,  T.  Anderson,  S. Tungpradapkul, D.W. Wood, and E.W. Nester.  2005.  Citrate  synthase mutants  of Agrobacterium are attenuated  in  virulence  and  display reduced vir gene induction. J. Bact 187 (14): 4844-4856.
Tamura,  K.,  J.  Dudley,  M.  Nei,  and  S. Kumar.  2007.  MEGA4:  Molecular Evolutionary  Genetics  Analysis software  version  4.0.  Mol.  Biol.  Evol 24: 1596-1599.
Isolasi dan karakterisasi gen sitrat sintase bakteri P. aeruginosa dari filosfer Hevea brasiliensis Muell. Arg.
van Ooyen, J., D. Emer, M. Bussman, and M. Bott.  2011.  Citrat  synthase  in C o r y n e b a c t e r i u m   g l u t a m i c u m i s encoded by two glt A transcripts which are  controlled  by  RamA,  RamB  and GlxR. J. Biotech 154(2-3): 140-148.
Weisburg,  W.G.,  S.M.  Barns,  D.A.  Pelletier, and  D.J.  Lane.  1990.  16S  ribosomal DNA  amplification  for  phylogenetic study. J. Microb 173(2): 697-703.
Woose,  C.R.  1987.  Bacterial  evolution. Microb. Rev 51(2): 221-271.
Tistama, Widyastuti dan Suharsono