## Studi Dinamika Molekul Stabilisasi Metaloproteinase Matriks 9 oleh Asam Kafeat
(Molecular Dynamics Studies of Matrix Metalloprotenase-9 Stabilization by Caffeic Acid)

## Enade Perdana Istyastono
Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta, Indonesia. E-mail: enade@usd.ac.id
Article Info: Received: 10 Mei 2020 in revised form: 11 Mei 2020 Accepted: 21 Juli 2020 Available  Online:  30  September
2020

## ABSTRACT
Caffeic acid, a cathecol-containing phytochemical found in coffee, has been reported as a potent matrix metalloproteinase 9 (MMP9) inhibitor. The IC 50 value  of  caffeic  acid  as  MMP9  inhibitor  could  reach  below  20  nM.  The research presented in this article employed molecular dynamics simulations to  unravel  the  atomic  mechanism  of  the  MMP9  inhibition  by  caffeic  acid. Molecular  dynamics  simulations  of  MMP9  for  10  ns  using  YASARA- Structure  were  performed  with  and  without  caffeic  acid  as  the  studied ligand.  The  results  showed  that  caffeic  acid  stabilized  the  stucture  of  the MMP9.
Keywords :
Metaloproteinase matriks 9
Asam kafeat Dinamika molekul YASARA-Structure
Corresponding Author: Enade Perdana Istyastono Fakultas Farmasi Universitas Tadulako Yogyakarta 55282 Indonesia email: enade@usd.ac.id
Copyright © 2019 JFG-UNTAD
This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.
How to cite (APA 6 th Style): Istyastono, E.P. (2020). Studi Dinamika Molekul Stabilisasi Metaloproteinase Matriks 9 oleh Asam Kafeat. Jurnal Farmasi Galenika :Galenika Journal of Pharmacy (e-Journal), 6 (2), 280-285. doi:10.22487/j24428744.2020.v6.i2.15131
Jurnal Farmasi Galenika (Galenika Journal of Pharmacy) 2020; 6 (2): 280 - 285 ISSN : 2442-8744 (electronic); 2442-7284 (printed) Journal Homepage: https://bestjournal.untad.ac.id/index.php/Galenika DOI: 10.22487/j24428744.2020.v6.i2.15013

## ABSTRAK
Asam  kafeat,  senyawa  fitokimia  dengan  residu  katekol  yang  ditemukan  di  kopi,  dilaporkan  sebagai  inhibitor poten pada metaloproteinase matriks 9 (MMP9). Nilai IC 50 penghambatan MMP9 oleh asam  kafeat  dilaporkan mencapai  kurang  dari  20  nM.  Penelitian  yang  dipaparkan  pada  artikel  ini  bertujuan  mengungkap  mekanisme inhibisi MMP9 oleh asam kafeat di tingkat atomik. Simulasi dinamika molekul MMP9 selama 10 ns dilakukan baik  tanpa  ligan  maupun  dengan  asam  kafeat  sebagai  ligan.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  asam  kafeat mampu menstabilkan struktur MMP9.
Kata kunci: Metaloproteinase matriks 9; Asam kafeat; Dinamika molekul; YASARA-Structure

## PENDAHULUAN
Asam  kafeat  merupakan  senyawa  alami  dengan  residu  katekol  dan  asam  karboksilat  yang dihubungkan  oleh  residu  etilena  (Gambar  1).  Senyawa  ini  dapat  ditemukan  pada  biji  hijau  kopi Robusta ( Coffea robusta ) maupun Arabika ( Coffea arabica ) dengan kadar mencapai 6% (Naidu et al., 2008).  Kadar  ini  meningkat  pada  biji  kopi  sangrai  akibat  degradasi  asam  klorogenat  (Królet  et  al., 2020).  Baik  asam  klorogenat  maupun  asam  kafeat  merupakan  inhibitor  poten  pada  enzim metaloproteinase  matriks  9  (MMP9)  dengan  nilai  IC 50 secara  berturut-turut,  30-50  nM  (Jin  et  al., 2005) dan 10-20 nM (Park et al., 2005).

## Gambar 1. Struktur asam kafeat.
Indonesia merupakan penghasil dan eksportir kopi terkemuka di dunia dengan peningkatan konsumsi yang  signifikan  akhir-akhir  ini  (Wang  &  Ghalih,  2017).  Di  lain  pihak,  prevalensi  luka  diabetes  di Indonesia juga merupakan tertinggi di dunia (Yusuf et al., 2016). Peningkatan penderita diabetes juga diprediksi meningkat pesat di Indonesia  (Guariguata et al., 2014). Enzim MMP9 dilaporkan berperan penting  pada  proses  angiogenesis  sel  kanker  (Jones  et  al.,  2019)  dan  juga  pada  lambatnya penyembuhan  luka  diabet  (Hariono  et  al.,  2018).  Oleh  karena  itu,  penelitian  tentang  kegunaan  asam kafeat pada kopi sebagai inhibitor MMP9 untuk penyembuhan luka diabetes perlu menjadi perhatian khusus.
Penelitian  yang  dipaparkan  pada  artikel  ini  bertujuan  untuk  mengungkapkan  mekanisme  inhibisi aktivitas  MM9  pada  tingkat  atomik oleh  asam  kafeat.  Teknik penambatan molekul  asam  kafeat  pada model homolog MMP9 (Wicaksono et al., 2020) diikuti dengan simulasi dinamika molekul ( molecular dynamics /MD) selama 10 ns dilakukan untuk mencapai tujuan tersebut. Asam kafeat terbukti mampu menstabilkan  struktur  MMP9.  Selain  itu,  luaran  dari  penelitian  ini  berupa  kompleks  MMP9  dengan asam  kafeat  hasil  MD  membuka  peluang  untuk  pengembangan  protokol  penapisan  virtual  berbasis struktur (PVBS) dengan fokus pada basis data senyawa bahan alam.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Perangkat  keras  yang  digunakan  adalah  komputer  dengan  prosesor  Intel®  Core TM i5-7500  @  340 GHz,  memori  8  GB  dan  sistem  operasi  Windows10  64-bit.  Perangkat  lunak  yang  digunakan  adalah YASARA-Structure  19.12.14  (Krieger  &  Vriend,  2015).  Struktur  model  homolog  lengkap  MMP9 terkompleks  CC27  (mmp9_final.yob)  diunduh  dari  Mendeley  Data  DOI:  10.17632/xj7yt48jwb.1
(Wicaksono  et  al.,  2020)  digunakan  sebagai  bahan  dasar  penambatan  molekul  dan  simulasi  MD. Perangkat lunak Microsoft Excel digunakan untuk analisis kuantitatif hasil-hasil simulasi.

## Metode
Berkas  struktur  MMP9  terkompleks  CC27  mmp9_final.yob  unduhan  dari  Mendeley  Data  dibuka  di YASARA-Structure.  Ditambahkan simulation  cell untuk  penambatan  molekul  dalam  bentuk cubic dengan jarak 10 Å dari bagian terluar ligan CC27. Setelah penambahan simulation cell , ligan dihapus dari  sistem  dan  kemudian  sistem  simulasi  disimpan  sebagai mmp9-asamkafeat_receptor.sce. YASARA-Structure  kemudian  di- restart untuk  konstruksi  struktur  asam  kafeat  dengan  input  berupa format  struktur  SMILES  asam  kafeat  “C1=CC(=C(C=C1/C=C/C(=O)O)O)O”  yang  diperoleh  dari https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Caffeic-acid.  Modul  BuildSMILES  digunakan  untuk mengubah struktur SMILES menjadi dalam bentuk tiga dimensi (3D). Dilanjutkan protonasi pada pH 7,4  dengan  perintah  pada  konsol  YASARA-Structure  berikut  “pH  value=7.4,update=Yes”.  Sebelum ditambatkan  dilakukan  energi  minimisasi  dengan  pengaturan default dan  disimpan  sebagai  mmp9- asamkafeat_ligand.yob.
Penambatan  molekul  menggunakan macro YASARA-Structure  dock_run.mcr  dengan  pengaturan default (Krieger  et  al.,  2002;  Krieger  &  Vriend,  2015) . Hasil  penambatan  terbaik  (mmp9- asamkafeat_001.yob) kemudian disimpan sebagai r2md.sce dan siap sebagai input file untuk simulasi MD.  Simulasi  MD  dilakukan  pada folder MD_WL.  Berkas macro md_run.mcr  bawaan  YASARA- Structure  (Krieger  &  Vriend,  2015)  digunakan  untuk running simulasi  MD  setelah  dimodifikasi sedikit pada pengaturan duration dan saveinterval supaya simulasi berjalan 10 ns dengan pengambilan snapshot setiap 10 ps, serta penambahan pengaturan AddSpring sebagai constraint menjaga stabilitas jejaring ikatan ionik dengan kofaktor Zn  (Antoni et al., 2013; Hariono et al., 2018). Setelah simulasi MMP9-asam kafeat selesai, dilanjutkan simulasi MD MMP9 saja di folder MD_NL. Berkas r2md.sce pada MD_WL dikopikan ke MD_NL dan dibuka di YASARA-Structure untuk menghapus atom-atom asam  kafeat  pada  sistem  dan disimpan dengan nama file yang  sama.  Simulasi  MD dilakukan dengan macro yang sama dengan macro pada simulasi MD MMP9-asam kafeat.
Hasil  simulasi  MD  dianalisis  dengan  menggunakan macro md_analyze.mcr  bawaan  dari  YASARA- Structure. YASARA-Structure digunakan untuk melakukan inspeksi visual hasil MD. Microsoft Excel digunakan  untuk  analisis  hasil  simulasi  secara  kuantitatif  untuk  melakukan  perhitungan  rerata  dan standar deviasi (SD).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Bertujuan  mengungkapkan  aktivitas  asam  kafeat  sebagai  inhibitor  poten  MMP9  pada  level  atomik, penelitian yang dipaparkan pada artikel ini menjalankan simulasi MD selama 10 ns pada struktur utuh human MMP9 tanpa ligan dan struktur utuh human MMP9 dengan asam kafeat sebagai ligan. Sebagai permulaan digunakan model homolog MMP9 dengan CC27 sebagai ligan hasil pemodelan Wicaksono et al. (2020). Stabilisasi struktur backbone MMP9 selama proses simulasi dijadikan indikasi aktivitas asam  kafeat  pada  enzim  tersebut.  Secara  objektif,  digunakan  nilai root-mean-square  deviation (RMSD)  atom-atom backbone MP9  pada  setiap snapshot dibandingkan  dengan  koordinat input  file . Patut  dicatat,  sebagai input  file ,  asam  kafeat  ditambatkan  menggantikan  struktur  CC27  di  kantung ikatan, tepatnya pada sisi katalitik dari MMP9. Grafik nilai RMSD disajikan pada Gambar 2.
Secara  visual,  Gambar  2  menunjukkan  asam kafeat  menstabilkan  atom-atom backbone MMP9.  Nilai RMSD pada simulasi tanpa asam kafeat meningkat terus, sementara relatif datar pada simulasi dengan asam kafeat, terutama pada 2 ns terakhir. Proses stabilisasi sudah nampak signifikan setelah melalui 4 ns pertama, namun pada 4-8 ns tampak ada lonjakan nilai RMSD pada simulasi dengan asam kafeat, sementara nilai RMSD pada simulasi tanpa asam kafeat tampak relatif datar. Pemilihan waktu simulasi 10  ns  ini  mengacu  pada  Liu  et  al.  (2017)  yang  meneliti  stabilitas  protein-ligan  dengan  melihat  nilai RMSD backbone pada  simulasi  MD.  Namun,  hal  ini  bukan  hal  yang  kaku  mengingat  bahwa  nilai
RMSD backbone suatu  protein  pada  simulsi  MD  juga  tergantung  dari  dimensi  protein  secara keseluruhan  (Sargsyan  et  al.,  2017).  Menurut  Liu  et  al.  (2017),  stabilitas  tercapai  jika  deviasi  nilai RMSD pada  5  ns  terakhir  dalam  simulasi  MD  10 ns  kurang  dari  1  Å.  Tabel  1  menyajikan  beberapa parameter  yang  teramati  pada  5  ns  terakhir  dalam  simulasi  MD  10  ns  dengan  maupun  tanpa  asam kafeat.
Gambar 2. Kurva nilai RMSD atom-atom backbone MMP9 selama simulasi. Kurva berwarna abu-abu merepresentasikan nilai RMSD pada simulasi tanpa asam kafeat, sedangkan kurva hitam merepresentasikan simulasi dengan asam kafeat.
Tabel  1.  Beberapa  parameter  turunan  dari  nilai-nilai  RMSD backbone pada  5  ns  dan  1  ns  terakhir selama simulasi MD 10 ns.
Ligan pada Simulasi MD Parameter turunan dari RMSD backbone pada 5 ns terakhir Parameter turunan dari RMSD backbone pada 1 ns terakhir RMSD (Å)  RMSD (Å) RMSD (Å)  RMSD (Å) Tanpa ligan 10,996 ± 1,077 1,383 ± 1,077 12,773 ± 0,548 0,834 ± 0,548 Asam kafeat 10,713 ± 0,800 1,803 ± 0,800 11,345 ± 0,309 0,679 ± 0,309
Mengacu pada kriteria yang diusulkan Liu et al. (2017), MMP9 pada simulasi MD selama 10 ns baik dengan  asam  kafeat  maupun  tanpa  ligan  belum  dapat  dikatakan  stabil.  Nilai  RMSD  pada  5  ns terakhir  belum  mencapai  di  bawah  1  Å  (Tabel  1).  Hal  ini  diduga  karena dimensional  curse akibat
struktur protein yang besar dengan 707 sekuens asam amino  (Sargsyan et al., 2017; Wicaksono et al., 2020).  Oleh  karena  itu  dilakukan  pula  analisis  pada  1  ns  terakhir  dari  10  ns  simulasi  MD.  Hasil analisis  nilai  RMSD backbone pada  1  ns  terakhir  menunjukkan  bahwa  asam  kafeat  menstabilkan MMP9  karena  dapat  secara  signifikan  menurunkan  pergeseran  atom-atom  yang  ditandai  nilai  rerata RMSD  lebih  rendah  1,428  Å  dibandingkan  simulasi  tanpa  ligan  (Tabel  1).  Hasil  uji  statistik t-test independen  satu  arah  dengan  taraf  kepercayaan  95%  memperkuat  bahwa  nilai  RMSD backbone simulasi  MD  1  ns  terakhir  dengan  asam  kafeat  lebih  rendah  daripada  tanpa  ligan  dengan  nilai p < 0.00001.
Hasil penelitian mengindikasikan bahwa pada level atomik salah satu mekanisme asam kafeat menjadi inhibitor  MMP9  adalah  berikatan  pada  kantung  ikatan  dan  menstabilkan  MMP9.  Di  lain  pihak, penelitian  ini  juga  menghasilkan  luaran  penting  berupa  kompleks  MMP9-asam  kafeat  yang  dapat digunakan  untuk  pengembangan  protokol  PVBS,  terutama  jika  berfokus  pada  penemuan  inhibitor MMP9  dari  bahan  alam.  Penelitian  lebih  lanjut  dengan  MD  dan  sekuens  yang  tepat  perlu  dilakukan untuk pengembangan protokol penapisan virtual berbasis struktur (PVBS). Struktur-struktur snapshot akhir  hasil  simulasi  MD  (r2md_last.sce)  yang  dihasilkan  dalam  penelitian  yang  dipaparkan  dalam manuskrip ini dapat diperoleh dengan mengirim e-mail ke penulis.

## KESIMPULAN
Simulasi  MD  10  ns  mengindikasikan  mekanisme  aksi  asam  kafeat  sebagai  inhibitor  poten  MMP9 adalah dengan menduduki sisi katalitik dan menstabilisasi struktur MMP9.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian yang disajikan pada artikel ini memperoleh dana dari Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat  (LPPM)  Universitas  Sanata  Dharma  dengan  nomor  kontrak:  005/Penel./LPPM- USD/I/2020.

## DAFTAR PUSTAKA
Antoni,  C.,  Vera,  L.,  Devel,  L.,  Catalani,  M.  P.,  Czarny,  B.,  Cassar-Lajeunesse,  E.,  et  al.  (2013). Crystallization of bi-functional ligand protein complexes. J. Struct. Biol. , 182 (3), 246–254.
Guariguata,  L.,  Whiting,  D.  R.,  Hambleton,  I.,  Beagley,  J.,  Linnenkamp,  U.,  &  Shaw,  J.  E.  (2014). Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res. Clin. Pract. , 103 (2), 137–149.
Hariono, M., Yuliani, S. H., Istyastono, E. P., Riswanto, F. D. O., & Adhipandito, C. F. (2018). Matrix metalloproteinase  9  (MMP9)  in  wound  healing  of  diabetic  foot  ulcer:  Molecular  target  and structure-based drug design. Wound Medicine , 22 (September 2018), 1–13.
Jin,  U.  H.,  Lee,  J.  Y.,  Kang,  S.  K.,  Kim,  J.  K.,  Park,  W.  H.,  Kim,  J.  G.,  et  al.  (2005).  A  phenolic compound,  5-caffeoylquinic  acid  (chlorogenic  acid),  is  a  new  type  and  strong  matrix metalloproteinase-9 inhibitor: Isolation and identification from methanol extract of Euonymus alatus. Life Sci. , 77 (22), 2760–2769.
Jones, J. I., Nguyen, T. T., Peng, Z., & Chang, M. (2019). Targeting MMP-9 in Diabetic Foot Ulcers. Pharmaceuticals , 12 (2), 79.
Krieger, E., Koraimann, G., & Vriend, G. (2002). Increasing the precision of comparative models with YASARA NOVA - A self-parameterizing force field. Proteins , 47 (3), 393–402.
Krieger,  E.,  &  Vriend,  G.  (2015).  New  ways  to  boost  molecular  dynamics  simulations. J.  Comput. Chem. , 36 (13), 996–1007.
Król, K., Gantner, M., Tatarak, A., & Hallmann, E. (2020). The content of polyphenols in coffee beans as roasting, origin and storage effect. Eur. Food Res. Technol. , 246 (1), 33–39.
Liu,  K.,  Watanabe,  E.,  &  Kokubo,  H.  (2017).  Exploring  the  stability  of  ligand  binding  modes  to proteins by molecular dynamics simulations. J. Comput. Aided Mol. Des. , 31 (2), 201–211.
Naidu,  M.M.,  Sulochanamma,  G., Sampathu,  S. R.,  & Srinivas,  P.  (2008).  Studies  on  extraction  and antioxidant potential of green coffee. Food Chem. , 107 (1), 377–384.
Park,  W.,  Kim,  S.,  &  Kim,  C.  (2005).  A  new  matrix  metalloproteinase-9  inhibitor  3,4- dihydroxycinnamic  acid  (caffeic  acid)  from  methanol  extract  of  Euonymus  alatus:  Isolation and structure determination. Toxicology , 207 (3), 383–390.
Sargsyan,  K.,  Grauffel,  C.,  &  Lim,  C.  (2017).  How  Molecular  Size  Impacts  RMSD  Applications  in Molecular Dynamics Simulations. J. Chem. Theory Comput. , 13 (4), 1518–1524.
Wang,  T.,  &  Ghalih,  M.  (2017).  Evaluation  of  Grey  Forecasting  Method  of  Total  Domestic  Coffee Consumption in Indonesia. IJBER , 6 (4), 67–72.
Wicaksono, R. G., Hariono, M., & Istyastono, E. P. (2020). Molecular dynamics studies of full human matrix  metalloproteinase  9  liganded  with  N-hydroxy-2-[(4-phenylphenyl)sulfonyl-propan-2- yloxyamino]acetamide. J. Pharm. Sci. Community , 17 (1), 1-7.
Yusuf, S., Okuwa, M., Irwan, M., Rassa, S., Laitung, B., Thalib, A., et al. (2016). Prevalence and Risk Factor of Diabetic Foot Ulcers in a Regional Hospital, Eastern Indonesia. Open J. Nurs. , 6 (1), 1–10.