Pembuatan Perpustakaan Genom Kedelai ( Glycine max (L.) Merrill)
Kultivar Lumut di dalam Fag Lambda

## Suharsono
Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IPB, Jl. Kamper, Gd PAU, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16610 Departemen Biologi, FMIPA, IPB, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16610

## Abstract
Genomic  library  of  soybean  cv.  Lumut  had  been  constructed  in  phage  vector.  Partial digestion  of  total  DNA  by  0.014  units  Sau3AI  per  g  DNA  at  37 o C  for  30  minutes  gave  long fragment  DNA.  Ligation  between  insert  DNA  and  vector  with  molarity  ratio  of  insert  DNA  to  vector = 2.9 : 1 followed by phage packaging, resulted in the titer of 2.8x10 4 to 3.6x10 5 pfu for 0.5  g insert plant DNA. Among them, 60 to 91% were recombinants depending on packaging extract protein.  By  using  1  g  insert  plant  DNA  and  packaging  extract  protein  from  Stratagene,  we obtained 6.6x10 5 pfu recombinant. Since the length of insert DNAs in  recombinant phages were 15 kb in average and the genome size of diploid soybean was 2.23x10 6 kb and 90% of the genom was  present  in  2  copies,  then  the  genomic  library  constructed  had  contained  all  genome  of soybean cv. Lumut.
Key words: genomic library, partial digestion,  phage, soybean, Lumut cultivar

## Pendahuluan
Kedelai merupakan komoditas yang sangat penting di Indonesia baik sebagai bahan pangan  maupun  pakan.  Meskipun  berbagai  usaha  untuk  meningkatkan  produksi  kedelai nasional telah banyak dilakukan, baik melalui program intensifikasi maupun ekstensifikasi, pada  kenyataannya  produksi  nasional  belum  dapat  mencukupi  kebutuhan  dalam  negeri sehingga sampai dengan saat ini Indonesia masih mengimpor kedelai.
Baik  usaha  intensifikasi  maupun  ekstensifikasi  memerlukan  tanaman  yang  secara genetik berkualitas baik.  Salah  satu  tahapan  yang  sangat  penting  bagi  program perbaikan genetik adalah isolasi dan karakterisasi suatu gen yang menyandi sifat unggul tertentu.
Gen  pada  suatu  organisme  dapat  diisolasi  melalui  penapisan  terhadap perpustakaan genom menggunakan pelacak heterolog dari organisme lain. Perpustakaan genom  adalah  kumpulan  semua  gen  yang  dimiliki  oleh  suatu  organisme,  termasuk  pula daerah bukan penyandi, sehingga sangat penting untuk mengisolasi suatu gen.
Peranan suatu gen terhadap sifat tertentu dapat diketahui dengan membandingkan struktur  gen  dan  pengendali  ekspresinya  di  antara  dua  individu  yang  berbeda.  Untuk mengetahui  peranan  suatu  gen  dalam  menentukan  toleransi  terhadap  aluminium, diperlukan perbandingan  antara gen dari  kultivar yang toleran dan gen dari kultivar yang peka  terhadap  aluminium.  Perpustakaan  genom  kedelai  kultivar  Slamet  yang  toleran terhadap aluminium telah dikonstruksi (Suharsono, 2002).   Sementara itu, pembuatan perpustakaan  genom  dari  kedelai  yang  peka  terhadap  aluminium  sangat  penting dilakukan  karena  dari  perpustakaan  genom  ini  dapat  diisolasi  dan  dipelajari  gen  yang berhubungan  dengan  toleransi  terhadap  aluminium.  Pada  penelitian  ini,  perpustakaan genom  dikonstruksi  dari  tanaman  kedelai  kultivar  Lumut  sebagai  kultivar  yang  peka terhadap aluminium.

## Materi dan Metode
Kedelai  kultivar  Lumut  yang  peka  terhadap  cekaman  aluminium  (Jusuf et al .  1999) digunakan sebagai bahan tanaman. Sebagai vektor pengklonan digunakan  BlueSTAR-1 dari Novagen yang telah dipotong dengan Xho I dan disisipi dengan dCTP dan dTTP pada ujung  potongannya  sehingga  menghasilkan  ujung  menggantung  TC  (Gambar  1). Escherichia  coli galur  ER1647,  galur  BM25.8,  dan  galur  XL-1  Blue  berturut-turut digunakan  sebagai  inang  untuk  mengamplifikasi  fag  rekombinan,  untuk  memproses eksisi  fag  rekombinan  menjadi  plasmid  rekombinan,  dan  untuk  mengamplifikasi  plasmid rekombinan.
Gambar 1.  Vektor  pengklonan  BlueSTAR  yang  telah  dipotong  dan  mengalami penyisipan nukleotida dTTP dan dCTP pada ujung potongannya
Figure 1.  BlueSTAR cloning vector cut and filled-in by dTTP and dCTP nucleotides at the respective end
DNA total tanaman diisolasi dari daun tanaman kedelai berumur dua bulan. Isolasi DNA tanaman dilakukan seperti Suharsono (2002).   DNA  hasil  isolasi  ini  kemudian dipotong  parsial  dengan  enzim Sau 3AI  (Takara)  pada  konsentrasi  0,43;  0,28;  0,23;  dan 0,014 unit tiap  g DNA pada suhu 37 o C selama 30 menit. Agar dapat disisipkan ke dalam vektor  BlueStar-1, setelah dipotong secara parsial, ujung  fragmen  DNA  tanaman  disisipi  dengan  dua  nukleotida  dATP  dan  dGTP  sesuai dengan prosedur Novagen (1997). Sebanyak 20  g fragmen DNA dicampur dengan insert fill  in  buffer yang  mengandung  50  mM  Tris-HCl  pH  7,3;  10  mM  MgCl 2 ;  50  g/ml  BSA (bovine serum albumine) ; 1 mM dATP dan 1mM dGTP (Novagen); 4  l 100 mM DTT; dan 20 unit Klenow DNA polimerase (Takara) dalam volume total 400  l. Campuran diinkubasi pada suhu 30 o C selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan pemanasan pada suhu 70 o C selama 10 menit. Fragmen dengan ukuran 7 hingga 20 kb diisolasi menggunakan kolom (Chroma Spin 1000, Clontech) sesuai dengan prosedur Clontech (1995).
Sebanyak  1  g  fragmen  DNA  tanaman  yang  ujungnya  telah  disisipi  nukleotida dicampur  dengan  1  g  Bluestar-1  (Novagen);  9  unit T4  DNA  ligase  (Takara);  dan  bufer ligasi (30 mM Tris-HCl pH 7,8; 10 mM MgCl 2 ; 10 mM DTT; 1 mM ATP; 5% polyethylene glycol 8000)  dalam  volume  total  20  l.  Campuran  diinkubasi  pada  suhu  4 o C  selama  24 jam.
Setelah  proses  ligasi,  DNA  rekombinan  dikemas  di  dalam  protein  mantel menggunakan  dua  macam  ekstrak  protein,  yaitu  dari  Novagen  dan  dari  Stratagene. Sebanyak 10  l reaksi ligasi dicampur dengan 50  l protein ekstrak pengemas (Novagen atau  Stratagene)  sesuai  dengan  prosedur  Suharsono  (2002).  Campuran  diinkubasi  pada suhu  22 o C  selama  dua  jam.  Reaksi  dihentikan  dengan  menambahkan  440  l  bufer  SM (5,8 g/l NaCl; 2g/l MgSO 4 .7H 2 O; 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,01% gelatin). Jumlah  titer  ditentukan  dengan  melakukan  transfeksi  ke E.  coli galur  ER1647 dengan  mencampur  100  l E.  coli (OD 600 =1)  dengan  100  l  fag  .  Untuk  memudahkan penghitungan,  fag  hasil  pengemasan  diencerkan  100  kali.  Campuran  diinkubasi  di dalam  balok  pemanas pada  suhu  37 o C  selama  30  menit.  Setelah  ditambahkan  4  ml
Pemotongan dengan Xho I

## Penambahan dTTP dan dCTP
Kedua lengan dan stuffer tidak cocok
agarosa  cair  permukaan  ( molten  top  agarose )  (10  g/l bacto-tryptone ,  5  g/l  NaCl,  6  g/l agarosa)  yang  bersuhu  47 o C,  campuran  disebar  pada  cawan  petri  yang  mengandung media  H  (10  g/l bacto-tryptone ,  8  g/l  NaCl,  15  g/l bacto-agar )  sesuai  prosedur  Novagen (1997).  Sebelum  disebar  pada  media  H,  X-gal  ditambahkan  ke  dalam  agarosa  cair permukaan  dengan  konsentrasi  akhir 500  g/ml  untuk  mengidentifikasi  rekombinan. Setelah  agarosa  yang  di  permukaan  menjadi  beku,  cawan  diinkubasi  pada  suhu  37 o C selama  semalam.  Plak ( plaque )  yang  berwarna  biru  adalah  plak bukan  rekombinan,  dan plak yang jernih tidak berwarna adalah plak rekombinan.
Eksisi  plasmid  rekombinan  dilakukan  dengan  mencampur  100  l E.  coli galur BM25.8  (OD 600 =1)  dengan  100  l  fag  .  Campuran  diinkubasi  di  dalam  balok  pemanas pada suhu 37 o C selama 30 menit dan disebar pada media LB (10 g/l bacto-tryptone , 5 g/l ekstrak khamir, 10 g/l NaCl pH7,5) padat (1,5% bacto-agar ) yang mengandung antibiotika 100 mg/l ampisilin.
Untuk isolasi plasmid rekombinan, satu koloni bakteri E. coli ditumbuhkan di dalam 2 ml  media  LB  yang  mengandung  100  mg/l  ampisilin  di  dalam  inkubator  bergoyang  (250 rpm)  pada  suhu  37 o C  selama  semalam.  Isolasi  plasmid  rekombinan  dari  bakteri E.  coli dilakukan dengan mengikuti prosedur Suharsono (2002).
Selanjutnya, satu koloni bakteri E. coli galur XL1-Blue dikultur dalam 2 ml media LB cair  semalam  di  dalam  inkubator  bergoyang  (kecepatan  250  rpm)  pada  suhu  37 o C, kemudian  disubkultur  dalam  100 ml  2  x  YT cair  yang  telah  mengalami modifikasi  (20  g/l bacto-tryptone, 5 g/l bacto- yeast extract , 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgSO 4 .7H 2 O, 10  mM  MgCl 2 .6H 2 O)  dengan  kondisi  yang  sama  hingga  OD 600 =0,6.  Pembuatan  bakteri kompeten  dan  transformasi  genetik  bakteri  dengan  plasmid  dilakukan  dengan  mengikuti prosedur Suharsono (2002).

## Hasil dan Pembahasan
DNA  kedelai  kultivar  Lumut  berukuran  besar,  yakni  7  hingga  20  kb,  diperoleh  dari pemotongan  1  g  DNA  menggunakan  0,014  unit Sau 3AI  (Takara)  pada  suhu  37 o C selama  30 menit. Suharsono  (2002)  melaporkan  hasil  pemotongan  DNA dengan  ukuran fragmen yang sama pada kedelai kultivar Slamet menggunakan jumlah enzim Sau 3AI dan kondisi  pemotongan  yang  sama  dengan  penelitian  ini.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa pemotongan dengan enzim Sau 3AI pada konsentrasi 0,014 unit tiap  g DNA kedelai pada kondisi  37 o C  selama  30  menit  dapat  dijadikan  sebagai  acuan  untuk  mendapatkan fragmen  DNA  berukuran  besar  walaupun  hasil  pemotongan  sangat  ditentukan  oleh bebeberapa  faktor  seperti  kemurnian  DNA,  spesies  asal  DNA,  keadaan  (kemurnian) enzim  restriksi  ( Sau 3AI),  lama  dan  suhu  inkubasi.  Pemberian  enzim Sau 3AI  lebih  dari 0,014 unit menyebabkan DNA total tanaman kedelai terpotong menjadi fragmen-fragmen berukuran  lebih  kecil  daripada  20  kb  (Gambar  2).  Ukuran  fragmen  DNA  yang  besar sangat penting dalam konstruksi perpustakaan genom.
Pemotongan  DNA  tanaman  kedelai  dengan  enzim Sau 3AI  menghasilkan  ujung menggantung  GATC.  Nukleotida  dGTP  dan  dATP  disisipkan  ke  dalam  ujung  potongan yang  menjorok  ke  dalam  sehingga  ujung  potongan  yang  menggantung  menjadi  GA. Adanya  perubahan  struktur  ujung  menggantung  dari  GATC  menjadi  GA  menyebabkan kedua  ujung  GA  pada  satu  fragmen  DNA  yang  sama  atau  dua  fragmen  DNA  yang berbeda tidak dapat saling menyambung. Dengan demikian, proses penyisipan nukleotida dapat  menghindari  terbentuknya  sambungan  antarfragmen  DNA  tanaman  sendiri. Demikian  juga,  penyisipan  nukleotida  dCTP  dan  dTTP  pada  ujung  fag  (TCGA) menghasilkan  ujung  menggantung  TC  sehingga  tidak  akan  terjadi  penyambungan antarvektor.  Ujung  menggantung  GA  pada  fragmen  DNA  tanaman  kedelai  hanya  cocok dengan ujung menggantung TC pada vektor sehingga proses penyambungan akan terjadi antara  DNA  tanaman  kedelai  kultivar  Lumut  dan  vektor  .  Spesifikasi  kecocokan  antara ujung  DNA  tanaman  kedelai  dan  vektor  dimaksudkan  untuk  mendapatkan  efisiensi perakitan  vektor  rekombinan  yang  tinggi.  Pada  penelitian  ini  fag  rekombinan  yang terbentuk  berkisar  antara  60%  dan  91%.  Suharsono  (2002)  melaporkan  bahwa  pada
konstruksi perpustakaan genom kultivar Slamet, diperoleh fag rekombinan sebanyak 85% .
Gambar 2.  DNA total kedelai kultivar Lumut yang dipotong dengan berbagai konsentrasi Sau 3AI pada suhu 37 o C selama 30 menit. Lajur 1 dan 6 =  / Eco T14; lajur 2-5 =  DNA  total  kedelai  dipotong  dengan Sau 3AI  masing-masing  dengan konsentrasi 0,014; 0,023; 0,028; dan 0,043 unit tiap  g DNA Figure 2. Total  DNA  of  soybean  cv.  Lumut  cut  by  different concentration  of Sau 3AI  at
37 o C  for  30  minutes.  Lane  1  and  6  =  / Eco T14;  lane  2-5  =  total  DNA  of soybean  cut  respectively  by Sau 3AI  at  0.014,  0.023,  0.028,  and  0.043  unit per  g DNA
Setelah  dilakukan  penyisipan  nukleotida  pada  kedua  ujung  fragmen  DNA,  fragmen DNA  yang  berukuran  besar  dimurnikan  menggunakan  kolom  Chroma  Spin  1000 (Clontech).  Hasilnya,  dari  sekitar  20  g  DNA total  kedelai  didapatkan  sekitar  4  g  (20%) fragmen DNA berukuran besar  (Gambar 3). Suharsono  (2002) juga melaporkan  efisiensi pemurnian fragmen DNA berukuran besar dari pemotongan parsial yang sama pada DNA kedelai kultivar Slamet sehingga jumlah 20% dapat dijadikan sebagai acuan bagi efisiensi proses  pemurnian  DNA  setelah  DNA  mengalami  proses  pemotongan  dan  penyisipan dengan nukleotida.
Pencampuran  0,5  g  fragmen  DNA  kedelai  dan  0,5  g  DNA  vektor  atau perbandingan molaritas DNA sisipan:vektor = 2,9:1 menghasilkan titer berkisar antara 2  x 10 4 dan  3,6  x  10 5 pfu  ( plaque  forming  unit =  unit  plak  yang  terbentuk)  tiap  0,5  g  DNA sisipan (Tabel 1).  Berdasarkan atas hasil seleksi biru-putih, dari jumlah titer ini, 60 hingga 91% merupakan pfu rekombinan (Gambar 4).
Jumlah titer  dan  jumlah  fag  rekombinan  yang  terbentuk  sangat  bergantung  kepada protein  ekstrak  yang  digunakan  untuk  mengemas  DNA  fag.  Ekstrak  protein  dari Stratagene  lebih  efisien  dalam  mengemas  DNA  fag  daripada  ekstrak  protein  dari Novagen.  Pengemasan  dengan  ekstrak  protein  dari  Novagen  menghasilkan  rendemen paling  tinggi  3,4  x  10 4 pfu  dengan  persentase  rekombinan  tertinggi  sebesar  71%, sedangkan  pengemasan  dengan  ekstrak  protein  dari  Stratagen  mencapai  3,6  x  10 5 pfu dan  91%nya  adalah  rekombinan  untuk  tiap  0,5  g  DNA  sisipan  (Tabel  1).  Suharsono (2002)  melaporkan  bahwa  pada  konstruksi  perpustakaan  genom  kultivar  Slamet, didapatkan rendemen 5 x 10 5 pfu dan 85% di antaranya adalah rekombinan.
1 2 3 4 5 6 kb 19,2 7,7 6,2 4,2 3,5 2,7 1,9 1,5 0,9
Gambar 3.  Fragmen  DNA  tanaman  kedelai  kultivar  Lumut  berukuran  besar  hasil pemotongan  parsial  dengan  enzim Sau 3AI  dan  telah mengalami  penyisipan nukleotida pada kedua ujungnya. Lajur 1= marka 1 kb; lajur 2= fragmen DNA kedelai
Figure 3. Large  fragment  of  plant  DNA  resulting  from  partial  digestion  by Sau 3AI  and nucleotide filled-in. Lane 1= 1 kb ladder ; lane 2= soybean DNA fragment
Tabel 1.  Jumlah  plak  yang  terbentuk  dari  ligasi  DNA  tanaman  kedelai  kultivar  Lumut dengan vektor fag lambda
Table 1.  The  number  of  plaque  forming  unit  from the  ligation  between  DNA  of  soybean
cv. Lumut and lambda phage vector No. Ekstrak protein Jumlah DNA (  g) Titer total (pfu) Titer rekombinan  Sisipan pfu Persentase 1 Novagen 0,5 0,5 4 x 10 4 2,4 x 10 4 60% 2 Novagen 0,5 0,5 5,6 x 10 4 3,4 x 10 4 61% 3 Novagen 0,5 0,5 2,8 x 10 4 2 x 10 4 71% 4 Stratagene 0,5 0,5 3,6 x 10 5 3,3 x 10 5 91%
Untuk  mengetahui  ukuran  sisipan  DNA  tanaman  di  dalam  fag  rekombinan,  plak yang jernih secara  acak diambil menggunakan ujung pipet yang telah dipotong sehingga berukuran sedikit lebih besar daripada ukuran plak. Gel yang mengandung plak kemudian dielusi  di  dalam  500  l  bufer  SM selama  semalam.  Fag  ini  kemudian  ditransfeksikan  ke dalam E.  coli BM25.8.    Dengan  adanya loxP yang  dimiliki  oleh  vektor  dan  enzim rekombinase cre yang  disintesis  oleh E.  coli BM25.8,  maka  bagian  tertentu  fag  dan sisipannya  dapat  mengalami  eksisi  dan  membentuk  plasmid  rekombinan.  Hal  ini  karena terjadi  proses  rekombinasi  pada loxP .  Hasil  eksisi  terbaik  didapatkan  dari  suspensi  fag hasil elusi yang diencerkan 100 kali dan kemudian dilakukan transfeksi pada E. coli galur BM25.8.
Plasmid  yang  berada  di  dalam E. coli galur  BM25.8 tidak efisien  dalam melakukan replikasi  sehingga  setelah  diisolasi,  plasmid  tersebut  diintroduksikan  ke  dalam E.  coli galur  XL1-Blue.  Keberadaan  plasmid  di  dalam  XL1-Blue  diseleksi  menggunakan ampisilin. Dengan menggunakan XL1-Blue pada media 2 x YT, rendemen yang diperoleh rata-rata adalah 1  g DNA plasmid tiap mililiter biakan bakteri semalam.
1 2 kb 10 6 8 5 4 3 2 1,5 1
Gambar 4.  Seleksi biru-putih terhadap plak. 1= plak rekombinan (jernih), 2 = plak bukan rekombinan (biru)
Figure 4. Blue-white  selection  on  plaques.  1=  recombinant  plaques  (clear),  2  =  non- recombinant plaques (blue)
Setelah  mengalami  eksisi,  semua  plak  jernih  yang  diambil  secara  acak menghasilkan  plasmid  yang  berukuran  lebih  besar  daripada  vektornya  yang  berukuran 2,139  kb.  Setelah  dipotong  dengan  enzim Bam HI,  plasmid  menghasilkan  fragmen  DNA berukuran  2,139  kb  yang  merupakan  vektornya  dan  beberapa  fragmen  sisipan  yang ukurannya 15 hingga 20 kb (Gambar 5).
Gambar 5.  Plasmid rekombinan turunan dari  Bluestar-1 yang dipotong dengan Bam HI. Lajur  1  dan  10  =  / Eco T14;  lajur  2-9  =  plasmid  rekombinan/ Bam HI. Tanda panah (  ) menunjukkan ukuran vektor (2,139 kb)
Figure 5. Recombinant plasmid derived from  Bluestar-1 cut by Bam HI. Lane 1 and 10 =  / Eco T14;  lane  2-9  =  recombinant  plasmid/ Bam HI.  Arrow  (  )  indicates vector size (2.139 kb)
Ukuran  yang  besar  ini  (15  hingga  20  kb)  sangat  menguntungkan  dalam  konstruksi perpustakaan  genom  karena  perpustakaan  genom  hanya  membutuhkan titer  yang  relatif sedikit.  Makin  besar  ukuran  fragmen  DNA  yang menyisip ke  dalam  vektor, makin  sedikit jumlah  vektor  rekombinan  yang  dibutuhkan  untuk membawa  genom  organisme  di  dalam perpustakaan  genom.  Keuntungan  lainnya  ialah  perpustakaan  genom  dapat  digunakan untuk  mengisolasi  gen  secara  utuh  dan  untuk  pemetaan  gen  secara  fisik  karena  dapat mengandung lebih dari satu gen.Genom  kedelai  haploid  berukuran  1,115  x  10 6 kb (Arumuganathan dan Earle 1991) sehingga genom kedelai kultivar Slamet diploid adalah 2,23  x  10 6 kb.  Pada  tanaman  kedelai,  lebih  dari  90%  ruas  DNA  yang  tidak  berulang dijumpai  lebih  dari  dua  kopi  (Shoemaker et  al .,  1996)  sehingga  ukuran  genom  kedelai diploid yang membawa masing-masing ruas satu kopi (tidak berulang)  adalah 1,23 x 10 6 kb. DNA sisipan rata-rata berukuran 15 kb sehingga untuk memuat seluruh gen kedelai di
2 1 1 2 3 4 5 6 8 7 9 10 1,5 1,9 2,7 19,3 7,7 6,2 3,5 kb 0,9
dalam suatu perpustakaan genom diperlukan 0,4125 x 10 5 fag rekombinan bila potongan- potongan DNA tidak saling tumpang tindih (Suharsono, 2002).
Pengemasan  dengan  ekstrak  protein  dari  Stratagene  dilakukan  menggunakan  2  x 0,5  g DNA sisipan sehingga jumlah titernya adalah 2 x (3,3 x 10 5 pfu rekombinan) = 6,6 x 10 5 pfu rekombinan. Dengan menggunakan rumus N = (ln(1-P))/(ln(1-f)), yang dalam hal ini  N  = jumlah  fag  rekombinan,  f  =  rasio  besarnya  DNA  sisipan  terhadap  ukuran  genom (Sambrook et al ., 1989), maka peluang (P) untuk mendapatkan satu kopi  potongan DNA sembarang di dalam perpustakaan genom kultivar Lumut adalah 99%. Bila genom kedelai hanya  memperhatikan  genom  yang  tidak  berulang  (2,23  x  10 6 kb),  maka  peluang  untuk mendapatkan  sembarang  gen  di  dalam  perpustakaan  genom  lebih  besar  daripada  99% sehingga  perpustakaan  genom  kultivar  Lumut  ini  telah  mengandung  seluruh  gen  yang dimiliki oleh kedelai.

## Kesimpulan
DNA  total  kedelai  kultivar  Lumut  yang  dipotong  dengan  0,014  unit  Sau3AI  tiap  g DNA  pada  suhu  37 o C  selama  30  menit  menghasilkan  potongan  DNA  berukuran  besar. Potongan  DNA  telah  disisipkan  ke  dalam  DNA  fag  lambda  untuk  membentuk perpustakaan genom yang mengandung seluruh genom dari kedelai kultivar Lumut.

## Ucapan Terima Kasih
Penelitian ini dibiayai oleh Proyek RUT 8 berjudul Isolasi dan Karakterisasi Gen-gen pada  Tanaman  Kedelai  yang  Mendapat  Cekaman  Aluminium.  Terima  kasih  ditujukan kepada  Ko  Shimamoto,  Laboratory  of  Plant  Molecular  Genetic,  Nara  Institut  of  Science and  Technology,  Japan,  yang  telah  menyediakan  fasilitas  laboratorium  untuk  penelitian ini.  Ucapan  terima  kasih  juga  disampaikan  kepada  Utut  Widyastuti  atas  bantuan  teknis yang diberikan.

## Daftar Pustaka
Arumuganathan,  H.  and  E.D.  Earle.  1991. Nuclear  DNA  content  of  some important plant species.  Plant Mol. Biol. Rep. 9: 208-218.
Clontech. 1995. Chroma Spin Columns. Product Protocol. Clontech, California.
Jusuf, M, Suharsono, and D. Sopandie. 1999. Molecular Biology of Soybean Tolerance to Aluminium Stress.  Report of  Graduate Team Research Grant, Urge Project, Batch II.  Directorate General of Higher Education, Jakarta.
Novagen. 1997.  BlueStar Vector System. Novagen, Inc., Madison.
Sambrook,  J.,  E.F.  Fritsch,  and  T.  Maniatis.  1989.  Molecular  Cloning,  a  Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, New York.
Shoemaker, R.C., K. Polzin, J. Labate, J. Specht, E.C. Brummer, T. Olson, N. Young, V. Concibido, J. Wilcox, J.P. Tamulonis, G. Kochert, and H.R. Boerma. 1996. Genome duplication in soybean ( Glycine subgenus soja ). Genetics 144: 329-338.
Stratagene.  1999.  Gigapack  III  Gold  Packaging  Extract,  Gigapack  III  Plus  Packaging Extract,  and  Gigapack  III  XL  Packaging  Extract.  Instruction  Manual.  Stratagene Cloning System, California.
Suharsono. 2002. Konstruksi pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Hayati 9(3): 67-70.