EXPRESSION OF INDUCIBLE NITRIC OXIDE SYNTHASE (iNOS) IN KIDNEY OF CARP ( Cyprinus carpio L.) LINEAR ALKYLBENZENE SULFONAT (LAS)

## EXPOSURE
Ekspresi inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) dalam Ginjal Ikan Mas ( Cyprinus carpio. L) Setelah Paparan Linear Alkylbenzene Sulfonat (LAS)
Ruku R. Borut *
Program Studi Budidaya Perairan, Universitas Pattimura Jl. Mr. Chr. Soplanit Kampus Poka, Ambon, 97234, Maluku-Indonesia
*Corresponding author, email: rukubdp76@gmail.com
Received: June 2016 Published: July 2016

## ABSTRACT
This study aims to determine the expression of iNOS in renal tissue of carp to contamination LAS (linear alkyl benzene  sulfonate). The  method  used  in  this  study  is  an  experimental  method  using  laboratory  based  study  of molecular exploration. The experimental design used was completely randomized design (CRD), with exposure treatment LAS namely (A) 0.01 mg / L, (B) 0.02 mg / L, (C) 0.03 mg / L, (D) 0.04 mg / L, (E) 0.05 mg / L and control (without LAS). The parameters measured were the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in renal tissue cranial carp after 96 hours of exposure to LAS. Detection of iNOS in renal tissue cranial carp do with immunohistochemical methods. T-test results showed that iNOS expression in the kidney tissue cranial carp at  each  treatment  LAS  exposure  was  significantly  higher  (P  <0.05)  than  controls.  The  mean  value  of  iNOS expression  in  control  cells  was  6.25%,  a  14.5%  cell  treatment,  treatment  and  21%  of  the  cells,  the  cells  C treatment 32.5%, 36.5% D treatment of cells, and treatment E 28.25% cell.
Keywords : LAS, expression, iNOS, common carp

## PENDAHULUAN
LAS  berbahaya  untuk  spesies  akuatik (vertebrata, invertebrata dan alga) (The Soap and Detergent  Association,  2005).    Toksisitas  LAS pada  beberapa  organisme  akuatik  adalah  ikan LC 50 -96  jam  1,67  mg/L,  Daphnia  EC 50 –48  jam 1,62  mg/L  dan  alga  IC 50 –96  jam  29  mg/L (Heinze,  2007;  OECD,  2005;  The  Soap  and Detergent  Association,  2005).    Toksisitas  kronis untuk ikan air tawar nilainya berkisar antara 0,25 –  3,4  mg/L  (The  Soap  and  Detergent Association, 2005).
Ikan  mas  sangat  peka  terhadap  faktor lingkungan  setelah  berumur  diatas  tiga  bulan dengan  ukuran    8-12  cm.  Di  samping  itu  ikan mas  di  kolam  air  tenang  ( Stagnant  water ) memiliki  kecepatan  tumbuh  3  cm  setiap bulannya.  Pertumbuhan  organisme  perairan dipengaruhi  oleh  pH,  DO,  BOD,  suhu,  salinitas dan  alkalinitas  berpengaruh  nyata  terhadap mortalitas  ikan  mas  ( Cyprinus  carpio  L. ) (Suwindere, 1983).  Secara biologis organisme di lingkungan  perairan  sensitif  dalam  merospon
perubahan  yang  terjadi  di  air.    Kesatuan  biotik dari  sistem  ekologi  menggambarkan  kesehatan fauna.  Perubahan  kadar  polutan  kimia  pada populasi  ikan  dapat  menyebabkan  perubahan secara biokimia, histologi dan fisiologi. Perubahan  tersebut  mengindikasikan  bagaimana kondisi lingkungan mempengaruhi suatu populasi  ikan.  Efek  toksik  dari  suatu  polutan dapat  ditentukan  pada  tingkat  seluler  atau jaringan  sebelum  terjadi  perubahan  signifkan pada perilaku atau penampilan pada ikan.
Respon  seluler  terhadap  stress  eksternal  di perairan  dapat  ditunjukkan  oleh  ginjal  ikan  mas karena  dapat  memicu  timbulnya  iNOS.  Akibat dari paparan suatu stressor antara lain penurunan pertumbuhan,  resistensi  penyakit,  keberhasilan reproduksi,  pernapasan  dan  kemampuan  renang (Barton,  1997 dalam Iwama  dkk.,  1999).  Oleh karena  itu  pendeteksian  dini  keberadaan  suatu stressor  di  perairan  sangat  penting,  untuk  sedini mungkin  dapat  dilakukan  upaya  rehabilitasi terhadap  lingkungan  perairan  yang  tercemar dengan  perubahan  yang  terjadi  dalam  ekspresi iNOS  selanjutnya  dapat  dijadikan  biomarker,
Ruku R. Borut / Ind. J. Chem. Res. , 2016, 4(1), 339-343
yang  merupakan  sistem  peringatan  dini  adanya paparan  polutan  dan  indikasi  adanya  perubahan kondisi lingkungan perairan.
Ginjal  adalah  tempat  utama  dari  polutan lingkungan penyebab toksisitas, dengan konsekuensi  fungsi  ginjal  yang  terganggu  akan berpotensi  mengancam  kehidupan.  Dengan demikian  penting  untuk  memahami  mekanisme seluler  yang  mendasari  fungsi  ginjal  normal  dan menentukan polutan nephrotoksik yang mempengaruhinya.  Kontribusi  penting  pada pengetahuan tentang fungsi ginjal dan nephrotoksisitas  polutan  telah  dilakukan  oleh para peneliti menggunakan pendekatan komparatif dengan hewan-hewan akuatik.
Berbagai  uraian  di  atas  maka  masalah  yang dirumuskan dalam penelitian ini adalah bagaimana  ekspresi inducible  Nitric  Oxide Synthase (iNOS)  dalam  ginjal  ikan  mas  setelah 96  jam  paparan  LAS  dengan  tujuan  untuk mengetahui ekspresi iNOS dalam jaringan ginjal cranial ikan mas ( Cyprinus carpio L.) setelah 96 jam  paparan  LAS.    Hasil  penelitian  ini diharapkan dapat dikembangkan sebagai biomarker  untuk  menandai  kondisi  stress  pada ikan  mas  dan  menandai  keberadaan  bahan pencemar LAS di lingkungan perairan.

## METODOLOGI
a. Materi dan Metode Penelitian ini menggunakan metode eksperimen  dengan  eksplorasi  laboratorium berdasarkan  kajian  molekuler.    Rancangan percobaan  yang  digunakan  adalah  Rancangan Acak  Lengkap  (RAL),  dengan  perlakuan  dosis paparan linear alkylbenzene sulfonat (LAS): 0,01 mg/L,  0,02  mg/L,  0,03  mg/L,  0,04  mg/L,  0,05 mg/L dan kontrol.  Kontrol adalah ikan mas yang tidak diberi paparan  LAS.  Peubah yang diamati adalah inducible  Nitric  Oxide  Synthase (iNOS) yang  terdapat  dalam  jaringan  ginjal  ikan  mas ( Cyprinus  carpio L.)  setelah  96  jam  paparan LAS.  Pendeteksian  iNOS  pada  jaringan  ginjal ikan mas dilakukan dengan metode imunohistokimia (Ramos-Vara, 2005).
b. Alat dan Bahan
Alat  dan  bahan  Alat  yang  digunakan dalam  adalah  DO  meter  type  oxi315i  merk WTW;  pH  meter  type  ad140ph  merk  ama-digit; timbangan  analitik  tipe  AA-250  merk  Denver Instrument  Company;  timbangan  analitik  tipe XL-3100 merk Denver Instrument; botol sampel;
dan  perlengkapan  bedah.inkubator  55-63oC;  hot plate;  pinset;  pipet  tetes,  kotak  preparat, waterbath  suhu  95oC;  pembuat  blok;  freezing mikrotom; pisau mikrotom dan Bunsen. Sedangkan untuk analisis imunohistokimia iNOS alat  yang  digunakan  adalah  mikropipet  1000µL, 100µL,  20µL  dan  spuit;  mikroskop  Fluorescent Nikon Optiphot-2. Bahan yang digunakan adalah jaringan  ginjal  cranial  ikan  mas;  slide;  cover slide; 4% paraformaldehid dalam PBS (phosphate  buffered  saline);  ethanol  bertingkat (70%,  80%,  90%,  dan  absolute);  xylol  dan parafin. Sedangkan untuk analisis imunohistokimia  iNOS  bahan  yang  digunakan adalah  PBS  pH  7,4  (pembuatan  PBS  dengan mencampurkan  8  mM  Na2HPO4;  1,4  mM KH2PO4;  140  mM  NaCl;  2,7  mM  KCl;  dan ditepatkan  pada  PH  7,4  dengan  menggunakan NaOH);  aquades;  3%  H2O2  dalam  PBS;  5% FBS  (Fetal  Bovine  Serum);  antibodi  primer antibodi primer (Antibody NOS2 Rabit Polyclonal  lgG  Merk  Santa  Cruz  Biotechnology no  Katalog  H-174);  DAB  (diamono  benzidine); mayer’s hematoxilen dan entellan.
c. Analisis Data
Data inducible  nitric  oxide  shyntase (iNOS)  dalam  jaringan  ginjal  cranial  ikan  mas akan  dianalisis  secara  deskriptif  dalam  bentuk tabel  dan  gambar,  untuk  menjelaskan  apakah sintesis  iNOS  pada  ikan  mas  dapat  dipicu  oleh linear  alkylbenzene  sulfonat  (LAS).    Hasil  ini akan  menjadi  dasar  dalam  penggunaan  iNOS sebagai biomarker keberadaan LAS di lingkungan perairan budidaya maupun alami.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
a. inducible Nitric Oxide Synthesa (iNOS) Analisis  iNOS  dalam  ginjal  ikan  mas  yang terkontaminasi  LAS,  secara  kuantitatif  dengan metode  imunohistokimia.  Hasil  analisis  tersebut dapat  dilihat  pada  (Tabel  1).  Hasil  analisis statistik dengan menggunakan Uji-t menunjukkan  bahwa  ekspresi  iNOS  dalam jaringan  ginjal  ikan  mas  pada  semua  perlakuan konsentrasi LAS nyata lebih tinggi (P<0.05) dari kontrol,  dengan  nilai  rerata  pada  kontrol  =  6.25 %sel,  perlakuan  A  =  22.00  %sel  (P=0.0272), perlakuan B = 28.75 %sel (P=0,0479), perlakuan C = 24.5 %sel (P=0.0229), perlakuan D = 19.25 %sel (P=0,0312), dan perlakuan E = 23.00 %sel (P=0,0117).    Adapun  nilai  peningkatan  ekspresi
iNOS pada perlakuan A = 17.00 %sel, perlakuan B  =  23.75  %sel,  perlakuan  C  =  19.50  %sel, perlakuan  D  =  14.25  %sel  dan  perlakuan  E  = 18.00 %sel.  Standar deviasi pada kontrol ± 2.94 sedangkan pada perlakuan berkisar antara ± 2.94 sampai ± 5.44 (Tabel 1)
Ekspresi  iNOS  pada  ginjal  ikan  mas  terjadi pada jaringan tubulus, dan di jaringan lain seperti sitoplasma dan dalam inti sel. Hasil penelitian ini menujukkan  sel-sel  yang  terdistribusi  tidak merata. Intensitas peningkatan ekspresi sel iNOS pada  waktu  pengamatan  96  Jam  (Tabel  1).  Hal ini  didukung  oleh  data  sel  secara  kuantitatif menunjukkan  nilai  rerata    kuantitas  sel  yang terekspresi pada tiap perlakuan terdapat fenomena  yang  berbeda  yaitu  jumlah  sel  yang terekspresi iNOS tidak merata pada jaringan ikan mas.  LAS  dapat  memicu  peningkatan  ekspresi iNOS dalam jaringan ginjal ikan mas. Peningkatan  ekspresi  iNOS  terjadi  pada  semua perlakuan  kontaminasi  LAS  berdasarkan  waktu pengamatan  96  jam,  dengan  nilai  peningkatan berkisar antara 14.25–23.75 % sel.
Pengamatan  iNOS  dalam  penelitian  ini menunjukkan  bahwa  iNOS  dalam  sel  ginjal cranial ikan  mas  terdistribusi  pada  sitoplasma maupun nukleus/inti sel.  Hal ini dapat didukung dengan pernyataan Cronstein et al (1993),Huang et  al (1995),  Kendall et  al (2000)  Newton (2000),  Qiu et  al (2004),  bahwa  iNOS merupakan molekuler intraseluler yang ditemukan  di  dalam  sitosol,  mitokondria, retikulum  endoplasma,  dan  nukleus  eukariot. Dalam  synthase  NO  (NOS),  ekspresi  iNOS dihasilkan  oleh  stimulasi  beragam  cytokiner ataupun infeksi bacteria. Nathan (1992). memperlihatkan  bahwa  adenosin,  yang  menjadi nukleosida  endogenus,  punya  sejumlah  aksi biologis  terhadap  beragam  sel  dan  dapat memodulasi  beragam  fungsi  sel  yang  terlibat
dalam  respon  inflamasi.  (Cronstein et  al ,  1991, 1993).
Rangsangan LAS dapat memicu peningkatan ekspresi iNOS dalam jaringan ginjal cranial ikan  mas.    Peningkatan  ekspresi  iNOS secara  kuantitatif  terjadi  pada  perlakuan  LAS selama  pengamatan  96  jam.    Dengan  demikian paparan  LAS  mulai  dari  konsentrasi  0,01  mg/L dapat  memicu  peningkatan  ekspresi  iNOS  yang dapat terdeteksi mulai dari 24 jam sampai 96 jam setelah paparan LAS. Berdasarkan hasil penelitian ini di dukung oleh pernyataan Wang et al .  (2001)  menunjukkan  hasil  yang  sama,  sebab pada  ikan  mas/karper  transkripsi  iNOS  dapat dideteksi  4  jam  setelah  dirangsang  dengan  LPS dan  transkripsi  maksimum  tampak/nyata  dalam 12  sampai  48  jam  terjadi  peningkatan  ekspresi iNOS  pada  jaringan  insang,  dan  hati  ikan  mas ( Cyprinus  carpio L.)  yang  dipapar  dengan  LPS. Penelitian  (Burgner,  1999)  yamg  menyatakan bahwa,    iNOS  secara  cepat  terekspresi  jika terstimuli  oleh  zat-zat  tertentu,  misalnya  sitokin proinflamasi.  Sekali  terbentuk  iNOS  dapat  tetap aktif  selama  24  sampai  36  jam  serta  dapat mensintesis  NO 100-1000  kali  lebih  banyak daripada nNOS dan eNOS.
Ekspresi  iNOS  dalam  ginjal cranial ikan mas  diberi  perlakuan  LAS  tidak  merata  pada jaringan.    Hasil  penelitian  ini  dapat  dilihat  dari tingginya  nilai  standar  deviasi  baik  pada  kontrol maupun perlakuan.  kontrol (Tanpa LAS) standar deviasi  berkisar  antara  ±  2,94,  sedangkan  pada kelompok  perlakuan  berkisar  antara  ±  2,94 sampai  ±  ±  5.44  (Tabel  2).    Kondisi  ini menunjukkan  bahwa  paparan  konsentrasi  LAS pada  ikan  mas  yang  dicobakan  dalam  penelitian ini berada dalam  kondisi  stress, dan pada semua kelompok  perlakuan  ekspresi  iNOS  pada keseluruhan  sel  di  jaringan  ginjal cranial bervariasi.  Konsentrasi  LAS  yang  dicobakan dalam penelitian ini adalah seperseratus dari nilai
rata-rata  LC50-96  jam  LAS  untuk  ikan.    Heinze (2007),  OECD  (2005)  dan  The  Soap  and Detergent Association (2005) menyatakan bahwa nilai  LC50-96  jam  LAS  pada  ikan  adalah  1,67 mg/L.

## b. Kualitas Air
Hasil  pengukuran  parameter  kualitas  air selama  penelitian  pada  kelompok  kontrol  dan perlakuan  adalah  suhu  berkisar  antara  22,1-22,8 o C, Oksigen terlarut 5,50-6,63 mg/L dan pH 7,4- 7,8  (gambar  9).    Kisaran  parameter  kualitas  air tersebut  berada  dalam  kondisi  optimum  bagi kehidupan  dan  pertumbuhan  ikan  mas.    (Sutisna dan    Sutarmanto.    1995)  menyatakan  bahwa lingkungan perairan yang ideal untuk ikan mas di jaringan  yang  berketinggian  150  -600  m  di  atas permukaan  laut  dengan  suhu  air  berkisar  antara 20  –  35 o C.    Selanjutnya  (Sutisna  dan Sutarmanto, 1995) menjelaskan bahwa kandungan  oksigen  terlarut  sebesar  5  ppm optimal bagi pembenihan ikan mas. CO 2 berkisar antara 10 -100 ppm, kandungan amoniak kurang dari 1 ppm, pH air berkisar antara 6,7 – 8,2.
Berdasarkan  hasil  penelitian  ini  kondisi parameter  kualitas  air  tidak  fluktuatif.    Hal  ini penting  dalam  penelitian  ini  sebab  kondisi kualitas  air  yang  fluktuatif  pada  taraf  tertentu dapat menyebabkan stress seluler pada ikan yang memicu  ekspresi  iNOS.    Hasil  penelitian  ini didukung  pernyataan  (Kerwin  Junior, et  al , 1995)    bahwa  iNOS  bersifat  inducible  oleh cytokine  dan  stimuli  lainnya,  termasuk  hypoxia. Hal  yang  sama  dikemukakan  oleh  (Wang et  al , 2001)  menyatakan  bahwa  ekspresi  iNOS  pada ikan  rainbow  trout  ( Oncorhynchus  mykiss ) menunjukkan bahwa ekspresi iNOS dapat dipicu oleh  kejutan  suhu  dan  hypoksia  (kondisi  tanpa oksigen).

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  ditarik kesimpulan  :  kontaminasi  LAS  (0.01  mg/L selama 96 jam sudah dapat memicu peningkatan ekspresi iNOS pada sitoplasma dan inti sel dalam jaringan ginjal ikan mas ( Cyprinus carpio L.).

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan  terima  kasih yang sedalam- dalamnya  penulis  sampaikan  kepada:  Ibu  Erina Ramadiyanti,  S.Si,  M.Si.  atas  perkenannya sehingga penulis dapat bergabung dalam payung riset  dengan  judul:  Ekspresi  Stress  Protein HSP70  dan  MAPK  p38  pada  Regulasi  iNOS dalam  Hepatosit Cyprinus  carpio L.  yang Mengalami Pemaparan LAS.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonymous,  2004.  Detergen.  Badan  Pengawas Obat  dan  Makanan  Republik  Indonesia. Deputi Bidang Pengawasan Produk Terapetik dan NAPZA. www.pom.go.id.htm. 23 Juli 2007.
Cronstein BN, Eberle MA, Gruber HE, Levin RI, 1991, Methotrexate inhibits neutrophil function  by  stimulating  adenosine  release from connective tissue cells. Proc Natl Acad Sci USA 88:2441-2445.
Cronstein  BN,  Naime  D,  Ostad  E,1993,  The antiinflammatory mechanism
of
methotrexate.  Increased  adenosine  release  at inflamed sites diminishes leukocyte accumulation  in  an  in  vivo  model  of inflammation. J Clin Invest 92:2675-2682
Iwama,  G.K,  2008,  Stress  in  Fish.  Institute  for Marine  Biosciences,  National  Research Council of Canada, Nova Scotia.
http://www-heb.pac.dfo-mpo.gc.ca/pdf. 28 Pebruari 2008.
Gambar 1. Data Pengukuran Beberapa Parameter Kualtas Air  Selama 96 Jam yang meliputi Suhu, Oksigen Terlarut dan pH.
Iwama,  G.K.;  L.O.B.  Afonso;  A.  Todgham;  P. Ackerman  dan  K.  Nakano,  2003,  Are  Hsps Suitable  for  Indicating  Stressed  States  in Fish.  The  Journal  of  Experimental  Biology 207:15-19.
Iwama, G.K.; L.O.B. Afonso dan M.M. Vijayan, 2004a, Stress in Fish. AquaNet Workshop on
Fish Walfare. September 27, 2004. http://aquanet.ca/  iwama/pdf.  15  Agustus 2007.
Kendall HK, Haase HR, Li H, Xiao YG, Bartold
PM,  2000,  Nitric  oxide  synthase  type-II  is synthesized  by  human  gingival  tissue  and cultured  human  gingival  fibroblasts.  J Periodontal Res 35:194- 200.
Kerwin,  J.  F.,  Jr,  Lancaster,  J.  R.,  Jr  and Feldman,  P.  L, 1995,  Nitric  oxide:  a  new paradigm  for  second  messengers. J.  Med. Chem. 38, 4343-4362.
Nathan  C,  1992,  Nitric  oxide  as  a  secretory product  of  mammalian  cells.  FASEB  J 6:3051-3064.  Nathan  CF,  Hibbs  JB  (1991).
Role of nitric oxide synthesis in macrophage antimicrobial  activity.  Curr  Opin  Immunol 3:65-70.
Newton, 2000, Molecular mechanism of Glucocorticoid  Action  :  What  is  important?. Thorax 2000;55:603-613.
Heinze,  J.,  2007,  LAS.  General  Ingredient Information.  Cleangredients  a  Project  of GreenBlue.
http://db.cleangredients.org/ingredients.php. 23 Juli 2007.
Wang.T, Mike. D, Peter. G and Christopher J. S., 2001, Molecular  cloning,  gene  organization and expression of rainbow trout ( Oncorhynchus  mykiss )  inducible  nitric oxide  synthase  (iNOS)  gene.*Department  of Zoology,  University  of  Aberdeen,  Aberdeen AB24  2TZ,  U.K.,  and  .Institute  of  Child Health,  University  of  Sheffield,  Sheffield S10 2TH, U.K.
Sudiana,  I  Made,  2004,  Peran  Komunitas Mikroba  Lumpur  Aktif  dalam  Perombakan Detergen Alkil Sulfonat Linear dan Benzena Alkil  Sulfonat.  Pusat  Penelitian  Biologi- LIPI. Bogor. Indonesia
Sutisna,  D.  H.    dan    R.  Sutarmanto,  1995,
Pembenihan  Ikan  Air  Tawar .  Kanisius. Jogyakarta.