# Korespondensi:  Kelompok  Keilmuan  Genetika  dan Bioteknologi  Molekuler,  Sekolah  Ilmu  dan  Teknologi  Hayati, Institut  Teknologi  Bandung.  Jl.  Ganesha  No.10,  Lb.  Siliwangi, Coblong,  Kota  Bandung,  Jawa  Barat  40132 Tel.  +  62  898  9387809 E-mail:  annisa.fitriah.faisal@gmail.com
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra
DETEKSI DINI Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) PADA UDANG VANAME (Litopenaeus vannamei) MENGGUNAKAN METODE PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
Annisa Fitriah  Faisal # dan Adi  Pancoro
Kelompok Keilmuan Genetika dan Bioteknologi Molekuler, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi  Bandung
Jl. Ganesha No.10, Lb. Siliwangi, Coblong, Kota Bandung, Jawa Barat 40132
(Naskah diterima: 9 Juli 2018; Revisi final: 9 November 2018; Disetujui publikasi: 9 November 2018)

## ABSTRAK
Sejak  akhir tahun  2014,  wabah kotoran  putih  atau  yang sering  disebut  juga WFD  (White  Feces  Disease), merupakan salah satu masalah yang sering terjadi pada petambak udang di Indonesia. Wabah ini diketahui disebabkan oleh Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) dan telah mengakibatkan retardasi pertumbuhan hingga kematian pada udang. Hingga saat ini, penyakit WFD dapat dideteksi dengan cara uji histologi, hibridisasi in situ, dan PCR. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan metode deteksi dini penyakit EHP pada udang vaname  dengan metode  PCR melalui  perancangan primer  yang spesifik  dan sensitif.  Pada penelitian  ini dilakukan isolasi EHP pada udang vaname yang terinfeksi, kemudian dideteksi dengan metode PCR yang mentarget SWP (spore wall protein) dari EHP serta pengujian spesifitas dan sensitivitasnya. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa EHP dapat diisolasi dari udang yang terinfeksi dan dapat didesain dua pasang primer yaitu SWP-EHP1 dan SWP-EHP3 yang mentarget spore wall protein EHP. Kedua primer ini dapat digunakan untuk deteksi EHP menggunakan PCR, dengan produk PCR pada primer SWP-EHP1 yaitu 398 bp dan primer SWP-EHP3 sebesar 415 bp, serta nilai suhu annealing optimal pada 48 o C.Hasil pengujian sensitivitas primer, diketahui bahwa primer SWP-EHP1 dapat mendeteksi EHP hingga jumlah DNA target sebanyak 7,74 x 10 2 kopi sedangkan primer SWP-EHP3 dapat mendeteksi hingga 16,2 x 10 2 kopi.
KATA KUNCI: udang vaname; WFD; Enterocytozoon hepatopenaei; PCR
ABSTRACT: Detection of EHP (Enterocytozoon hepatopanaei) from whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei) by Polymerase Chain Reaction (PCR) method. By: Annisa Fitriah Faisal and Adi Pancoro
Since 2014, white feces disease (WFD) is one of the emerging problems for whiteleg shrimp farming industries in Indonesia. This outbreak is known to be caused by Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) infection to shrimp. EHP infection resulted in growth retardation to a mass mortality in shrimp. To date, WFD can be detected by histology, in situ hybridization and PCR. This study aimed to obtain an early detection method of EHP on whiteleg shrimp by PCR method through specific and sensitive primers design. In this study, we isolated the DNA of EHP from infected whiteleg shrimp, then detected by PCR method which targeted spore wall protein (SWP) from EHP as well as sensitivity and specificity testing. As a result, EHP can be isolated from infected shrimp and can be designed 2 pairs of primers (SWP- EHP1 and SWP-EHP3) targeting spore wall protein of EHP. These primers could be used for EHP detection using PCR, with PCR products from primers SWP-EHP1 was 398 bp and from SWP-EHP3 primers was 415 bp, with an optimum annealing temperature of 48 o C. Primers sensitivity test results revealed that primers SWP-EHP1 could detect EHP to 7.74 x 10 2 copies while the primers SWP-EHP3 could detect up to 16.2 x 10 2 copies.
KEYWORDS: whiteleg shrimp; WFD; Enterocytozoon hepatopenaei; PCR

## PENDAHULUAN
Udang vaname merupakan salah satu komoditas ekspor perikanan andalan Indonesia yang memiliki nilai jual tinggi. Komoditas ini berkontribusi besar dalam perolehan  devisa  negara  dengan  total  nilai  ekspor perikanan mencapai 30-55%. Pada tahun 2011 hingga 2014  volume  ekspor  udang  Indonesia  mengalami peningkatan yang cukup signifikan yaitu dari 158.062 ton  dengan  nilai  ekspor  US$  1.309.674  menjadi sebesar  196.623  ton  dengan  nilai  ekspor  US$ 2.140.862  (Aristiyani,  2017).  Meningkatnya  volume ekspor  udang  juga  sejalan  dengan  meningkatnya produksi udang setiap tahunnya. Menurut data Dirjen Perikanan Budidaya (2014), produksi udang vaname selama lima tahun terakhir dari tahun 2010-2014 terus mengalami peningkatan rata-rata sebesar 20,49%.
Seiring  dengan  meningkatnya  produksi  udang, kegiatan budidaya komoditas ini tidak terlepas dari berbagai  masalah  terutama  yang  disebabkan  oleh adanya infeksi penyakit. Penyakit udang merupakan salah  satu  masalah  bagi  pembudidaya  udang  dan menjadi faktor pembatas bagi pengembangan budidaya udang (Selvin et al., 2015). Pada lima tahun terakhir ini,  Enterocytozoon  hepatopenaei  (EHP)  merupakan parasit mikrosporidian yang bertanggung jawab dalam terjadinya  wabah  WFD  (White  Feces  Disease)  yang mengakibatkan  penghambatan  pertumbuhan  pada udang  hingga  kematian  (Rajendran  et  al.,  2016). Penyakit ini baru teridentifikasi pada tahun 2009 di Thailand  dan  saat  ini  telah  menyebar  ke  beberapa negara di Asia Tenggara termasuk Indonesia. Beberapa wilayah yang terkena dampak wabah WFD di Indone- sia  di antaranya  Jawa Tengah,  Jawa Barat,  Sumatera Utara, Lampung, Bali, Lombok, dan Sulawesi (Tang et al., 2016).  Kerugian ekonomi yang  disebabkan oleh infeksi  EHP  ini  semakin  berkembang  sehingga dianggap  menjadi  ancaman  bagi  industri  budidaya udang  di  tanah  air.  Maka  dari  itu  diperlukan pengembangan metode diagnosis yang spesifik dan sensitif  agar  patogen  dapat  dimonitor  dan ditanggulangi dengan cepat.
Saat ini, sudah dikembangkan metode deteksi EHP pada  udang  melalui  uji  histologi,  hibridisasi  in  situ dan  PCR.  Metode  deteksi  PCR  yang  telah  ada  yaitu mentarget  gen  18S  rRNA  EHP  yang  memungkinkan memberikan hasil positif palsu dikarenakan reaktivitas silang.  Pada  penelitian  ini  dilakukan  perancangan primer spesifik untuk uji PCR EHP pada udang dengan mentarget SWP (Spore Wall Protein) yang terdapat pada EHP.  SWP  diketahui  memiliki  fungsi  menjaga morfologi  spora  dan  cekaman  lingkungan  serta memiliki  peranan  penting  dalam  proses  infeksi terhadap sel inang (Yang et al., 2014). Berdasarkan hal tersebut  maka  tujuan  dari  penelitian  ini  adalah
melakukan  upaya  deteksi  keberadaan  infeksi  EHP secara  dini  dengan  merancang  primer  spesifik  dan sensitif untuk uji PCR pada udang vaname.

## BAHAN DAN METODE

## Perancangan  primer  (in  silico)
Perancangan primer dilakukan melalui studi in silico dimulai dengan mengumpulkan semua sekuen spore wall protein Enterocytozoon hepatopenaei (SWP EHP) yang terdapat  pada  database  GenBank  NCBI  (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/). Semua sekuen yang diperoleh dilakukan pensejajaran menggunakan program Clustal Omega.  Selanjutnya  dibuat  pohon  filogenetik menggunakan program Mega 6.0.
Perancangan kandidat primer SWP EHP dilakukan dengan memilih sekitar 18-23 sekuen nukleotida pada daerah yang lestari yang ditentukan berdasarkan hasil pensejajaran  ketujuh  sekuen  SWP  EHP.  Primer dirancang  menjadi  2  pasang  yang  setiap  pasangnya diberi kode primer SWP-EHP1 dan primer SWP-EHP3.

## Persiapan  Sampel
Sampel  udang  vaname  yang  digunakan  pada penelitian ini sebanyak 24 ekor, diperoleh dari LP2IL (Loka  Pemeriksaan  Penyakit  Ikan  dan  Lingkungan), Serang. Sementara untuk pengujian spesifitas primer digunakan sampel kepiting yang berasal dari perairan di Lampung dan lobster yang berasal dari perairan di Sukabumi.  Sampel  yang  telah  didapatkan  tersebut masing-masing  di  ambil  bagian  organ  insang  dan hepatopankreas sekitar 10-30 mg dan diawetkan pada larutan fiksatif berupa ethanol 85% sebagai persiapan untuk isolasi DNA.

## Isolasi  DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Ge- nomic  DNA  Mini  Kit  (Geneaid).  Hasil  isolasi  DNA kemudian dilakukan pengujian kualitas dan kuantitas DNA nya dengan elektroforesis dan spektrofotometer.

## Uji  PCR  (Polymerase  Chain  Reaction)
Reaksi PCR dilakukan menggunakan kedua primer hasil desain pada tahap sebelumnya dan menggunakan kit MyTaq TM HS Red Mix (BioLine). Sebanyak 1  L DNA hasil isolasi dimasukkan ke dalam tabung 0,2 mL berisi 12,5  L My Taq HS Red Mix; 0,5  L Primer-F (20  M); 0,5  L Primer-R (20 ìM); dan 10,5  L ddH2O hingga volume reaksi PCR sebanyak 25  L. Siklus PCR dimulai dengan  denaturasi  awal  pada  suhu  95 o C  selama  1 menit, sebanyak 1 siklus. Kemudian denaturasi pada suhu 95 o C selama 15 detik. Proses annealing optimal pada suhu 48 o C selama 15 detik. Proses selanjutnya yaitu ekstensi yang dilakukan pada suhu 72 o C selama
10 detik serta ekstensi akhir pada suhu 72 o C selama 7  menit.  Proses  denaturasi  hingga  ekstensi  akhir dilakukan  sebanyak  30  siklus.  Hasil  PCR dielektroforesis  selama  30  menit  dengan  tegangan 70  volt  dan  divisualisasi  dengan  menggunakan  UV Transilluminator.

## Uji  Spesifitas  Primer
Uji Spesifitas primer dilakukan dengan pengujian PCR  terhadap  DNA  cetakan  sampel  selain  udang vaname yaitu organ insang dan hepatopankreas dari kepiting dan lobster. Hasil yang diperoleh dapat dilihat berdasarkan keberadaan pita DNA pada rentang ukuran 398 bp ataupun 415 bp, sesuai dengan ukuran produk PCR masing-masing  primer.

## Uji  Sensitivitas  Primer
Pengujian  sensitivitas  primer  dilakukan  dengan mengkloning  produk  PCR  SWP-EHP  yang  diperoleh dari  hasil  PCR  menggunakan  primer-primer  di  atas. Vektor kloning yang digunakan yaitu vektor pGEM ® - T Easy. Proses kloning meliputi 3 tahap utama yaitu: persiapan  produk  sekuen  DNA  yang  akan  diligasi, proses  ligasi  ke  dalam  vektor  kloning  yaitu  vektor pGEM ® -T Easy kemudian dilakukan transformasi pada sel kompeten E. coli DH5  . Terdapat dua plasmid hasil konstruksi yaitu pGEM-EHP1 dan pGEM-EHP3. Metode transformasi  yang  digunakan  yaitu  dengan  metode kejut panas.Hasil transformasi dikultur pada medium LB padat yang telah mengandung Ampisilin 100 ìg/mL, IPTG (100 mM), dan x-gal (50  g/mL) selama 16 jam. Konfirmasi  keberhasilan  transformasi  dilakukan dengan  PCR  koloni.  Koloni  yang  diduga  positif membawa fragmen gen sisipan dikultur kembali pada medium LB cair yang mengandung Ampisilin 100 ìg/ mL  selama  16  jam.  Plasmid  diisolasi  dengan menggunakan  Presto  Mini  Plasmid  Kit  (Geneaid). Konstruk plasmid dikonfirmasi kembali dengan reaksi pemotongan  menggunakan  Fast  Digest  EcoR1 (Thermo  Scientific)  dan  sekuensing  menggunakan primer universal SP6 dan  primer T7 (Macrogen, Ko- rea).  Sekuen  hasil  pembacaan  kemudian  dilakukan pensejajaran pada situs NCBI (https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).  Plasmid  dihitung dengan rumus bilangan Avogadro kemudian dilakukan serial pengenceran untuk digunakan pada pengujian sensitivitas primer. Pengenceran dilakukan hingga 10 kali. Masing-masing plasmid digunakan 1 ìL sebagai tempat untuk dilakukan pengujian PCR.

## HASIL DAN BAHASAN

## Perancangan  Primer
Perancangan  primer  untuk  uji  PCR  pada  udang vaname  yang  terinfeksi  EHP  dilakukan  dengan
mentarget SWP (Spore Wall Protein) yang terdapat pada EHP.  SWP  merupakan  bagian  protein  dinding  spora yang dimiliki oleh EHP yang bersifat resisten terhadap lingkungan dan berfungsi menjaga morfologi spora. Protein  ini  diketahui terlibat  dalam  interaksi  inang- patogen pada penambatan spora terhadap permukaan sel inang heparin selama proses infeksi terhadap sel inang (Jaroenlak et al., 2018; Yang et al., 2014). Langkah pertama  pada  perancangan  primer  dimulai  dengan pencarian semua sekuen SWP EHP yang terdapat pada database (Tabel 1).
Semua sekuen SWP EHP yang diperoleh kemudian dilakukan  pensejajaran  dan  sekuen  primer  dipilih sekitar  18-23  sekuen  dari  daerah  yang  lestari. Perancangan primer yang tepat dan spesifik merupakan hal yang sangat penting untuk menunjang keberhasilan dari  reaksi  PCR  terutama  yang  bertujuan  untuk mendeteksi penyakit. Primer dirancang sebanyak dua pasang yaitu primer SWP-EHP1 dan SWP-EHP3 (Tabel 2). Masing-masing primer dirancang berdasarkan pa- rameter  primer  yang  baik.  Menurut  Lorenz  (2012), parameter primer yang baik meliputi panjang primer yang terdiri atas sekitar 17-30 nukleotida, kandungan GC  ideal  yaitu  50%,  tidak  ada  sekuen  nukleotida tunggal  yang  berulang  3-4  kali,  tidak  membentuk struktur sekunder maupun hairpin, tidak komplemen antara dua primer dan perbedaan nilai T m (melting tem- perature) antara primer forward dan reverse tidak lebih dari 5 o C.

## Uji  PCR  (Polymerase  Chain  Reaction)
Produk PCR yang dihasilkan menggunakan primer SWP-EHP1 yaitu berukuran 398 bp, sedangkan primer SWP-EHP3  yaitu  415  bp.  Elektroferogram  hasil  PCR pada  semua  sampel  dengan  menggunakan  masing- masing primer SWP-EHP1 dan SWP-EHP3 dapat dilihat pada  Gambar  1  dan  2.  Jumlah  keseluruhan  sampel udang  vaname  yang  didapatkan  yaitu  24  ekor. Berdasarkan  hasil  PCR  yang  diperoleh,  12  sampel ternyata  dinyatakan  positif  terinfeksi  EHP  dan  12 sampel lainnya negatif EHP. Kedua belas sampel yang dinyatakan positif EHP tersebut di antaranya sampel no  7,  8,  9,  10,  11,  13,  14,  16,  17,  18,  19,  dan  21 sedangkan yang negatif EHP yaitu sampel no 1, 2, 3, 4,  5,  6,  12,  15,  20,  22,  23,  dan  24.  Hasil  PCR  yang diperoleh  ini  sama  antara  hasil  PCR  dengan menggunakan primer SWP-EHP1 maupun SWP-EHP3.

## Uji  Spesifitas  Primer
Primer  yang  spesifik  pada  pengujian  PCR  untuk tujuan diagnostik sangat penting untuk menghindari terjadinya positif palsu. Pada penelitian ini digunakan sampel  lobster  dan  udang  yang  memiliki  tingkat kekerabatan yang dekat dengan udang. Pada Gambar
Tabel 1. Sekuen  spore  wall  protein  Enterocytozoon  hepatopenaei  yang terdapat pada database NCBI
Table 1. Enterocytozoon hepatopenaei spore wall protein sequences from
NCBI
Tabel 2. Perancangan primer SWP EHP untuk deteksi dini EHP dengan metode PCR
Table 2. SWP EHP primer design for early detection of EHP by PCR method
Gambar 2. Elektroferogram hasil PCR semua sampel udang menggunakan primer SWP- EHP3. L: ladder 100 pb, sampel: 1-24(1-18: organ insang & hepatopankreas; 19-24: organ hepatopankreas), K(-): kontrol negatif, K(+): kontrol positif.
Figure 2. Electropherogram  PCR  result  of  all  shrimp  sample  using  SWP-EHP3  primers.  L: ladder 100 bp, sample: 1-24 (1-18: gill & hepatopancreas; 19-24: hepatopancreas), K(-): negative control, K(+): positive control.
Gambar 1. Elektroferogram hasil PCR  semua sampel udang menggunakan  primer SWP- EHP1. L: ladder 100 pb, sampel: 1-24 (1-18: organ insang & hepatopankreas; 19- 24: organ hepatopankreas), K (-): Kontrol negatif, K(+): Kontrol positif.
Figure 1. Electropherogram PCR result of all shrimp sample using SWP-EHP1 primers. L: lad- der 100 bp, sample: 1-24 (1-18:gill & hepatopancreas; 19-24:hepatopancreas), K(-): Negative control, K(+): Positive control. Nama kode No. akses SWP_EHP_A KX258197.1 SWP_EHP_B KY483639.1 SWP_EHP_C KY593133.1 SWP_EHP_D KY593129.1 SWP_EHP_E KY674357.1 SWP_EHP_F KY593132.2
L        1         2         3         4         5        6        7        8         9       10     11      12     K(-)     K(+)
L       13       14      15       16       17      18     19      20       21      22     23      24     K(-)     K(+)
L        1         2         3         4         5        6        7        8        9       10     11      12     K(-)     K(+)
L       13       14      15      16      17      18     19      20       21      22     23      24      K(-)     K(+) Sekuen (Sequence ) CCA TTG GTC AAA TAC AAT TTC Sekuen (Sequence ) GCA TAA ATT CAT CCA TTT CTA C Panjang basa (Base length ) 21 Panjang basa (Base length ) 22 GC (%) 33.3 GC (%) 31.8 Tm ( o C) 53.5 Tm ( o C) 54.7 Sekuen (Sequence ) GGT CAA ATA CAA TTT CAA ACA C Sekuen (Sequence ) CTC CAT TTA TCA TAC TTA AAT GC Panjang basa (Base length ) 22 Panjang basa (Base length ) 23 GC (%) 31.8 GC (%) 30.4 Tm ( o C) 54.7 Tm ( o C) 55.7 Primer 1 (SWP-EHP1F) Primer 1 (SWP-EHP1R)
Primer 3 (SWP-EHP3F)
Primer 3 (SWP-EHP3R)
3, dapat dilihat tidak adanya keberadaan pita DNA pada semua sampel. Hal ini menunjukkan baik lobster dan kepiting  bukan  merupakan  inang  yang  cocok  bagi parasit EHP. Seperti beberapa kasus wabah WFD yang terjadi  selama  ini  di  Thailand  dan  India,  organisme yang diserang oleh EHP yaitu organisme penaeid seperti udang vaname (Litopenaeus vannamei) dan udang windu (Penaeus monodon) (Tangprasittipap et al., 2013; Tourtip et al., 2009).

## Uji  Sensitivitas  Primer
Pengujian  sensitivitas  dilakukan  terhadap rancangan  primer  SWP-EHP1  dan  SWP-EHP3  untuk mengetahui  konsentrasi  terkecil  patogen  EHP  yang dapat  dideteksi  dengan  PCR  menggunakan  primer tersebut. Tahap awal yang dilakukan pada pengujian ini yaitu memperbanyak DNA cetakan SWP EHP dengan cara kloning. Kloning merupakan teknik yang digunakan untuk  perbanyakan  fragmen  gen  target  dengan mengintroduksi DNA rekombinan ke dalam suatu sel inang  (Bertero  et  al.,  2017;  Brown,  &  Vallier,  2017). Uji sensitivitas primer dilakukan terhadap primer SWP- EHP1 dan SWP-EHP3, maka pada penelitian ini dibuat 2 konstruk: pGEM-HP1 dan pGEM-HP3.
Keberhasilan  hasil  transformasi  dikonfirmasi melalui beberapa cara, yaitu pertama dengan seleksi antibiotik  (Jang  &  Magnuson,  2013).  Hal  ini memungkinkan sel yang telah berhasil ditransformasi untuk bertahan dan tumbuh pada kondisi di mana sel yang  tidak  membawa  transforman  akan  mati. Sedangkan pada seleksi koloni biru/putih, hidrolisis X-gal oleh  -galactosidase akan menyebabkan warna biru pada koloni dan mengindikasikan bahwa koloni tersebut  mengandung  vektor  tanpa  DNA  target. Sebaliknya koloni putih mengindikasikan bahwa koloni mengandung insersi DNA target (Padmanabhan et al., 2011). Selanjutnya dilakukan konfirmasi dengan PCR koloni  serta  analisis  menggunakan  enzim  restriksi EcoR1. Pada plasmid pGEM ® -T Easy terdapat dua sisi pengenalan oleh EcoR1, maka ketika dilakukan reaksi restriksi hasilnya akan terbentuk 2 pita DNA yaitu pita
yang ukuran besar merupakan plasmid dan pita DNA yang  berukuran  kecil  merupakan  DNA  target.  Pada Gambar 4 dapat dilihat elektroferogram hasil reaksi restriksi dari 10 sampel yang diduga membawa gen target. Sumur 1 hingga 6 merupakan konstruk pGEM- HP1  sedangkan  sumur  no  13-16  merupakan  pGEM- HP3. Hasil restriksi dapat terlihat adanya 2 pita pada semua sampel. Hal ini mengkonfirmasi kembali bahwa hasil transformasi yang dilakukan berhasil.
Konfirmasi terakhir yaitu sekuensing menggunakan primer T7 dan SP6. Berdasarkan hasil BLAST, sekuen teratas yang muncul merupakan 6 sekuen SWP EHP. Hal  ini  mengkonfirmasi  bahwa  kloning  berhasil dilakukan. Untuk mengetahui hubungan evolusi dari sekuen SWP EHP yang didapatkan pada penelitian ini dengan  sekuen  SWP  EHP  beserta  SWP  dari mikrosporidian lainnya, maka dilakukan pembuatan pohon filogenetika (Gambar 5).
Pada  gambar  pohon  filogenetik,  dapat  dilihat sekuen isolat SWP pGEM-HP1/pGEM-HP1berada pada klade yang sama dengan SWP EHP A-B karena memiliki ansestor  yang  sama  dibandingkan  dengan  SWP  D. Diketahui  bahwasanya  sekuen  SWP  EHP  kode  D berasal  dari  Venezuela  sedangkan  SWP  EHP  kode lainnya berasal dari Asia Tenggara (Tang et al., 2017). Dilihat berdasarkan hasil pensejajaran (Gambar 6), pada deretan sekuen SWP pGEM-HP1/pGEM-HP3 EHP yang didapatkan pada penelitian ini terdapat perbedaan satu nukleotida yaitu G yang mana pada sekuen SWP EHP keenam kode lainnya menunjukkan A. Hal ini dapat disebut juga dengan subtitusi transisi. Perubahan yang terjadi  kemungkinan  dapat  disebabkan  oleh  faktor lingkungan (Rùz¡ièka et al., 2017). Perbedaan ini juga bisa  diakibatkan  karena  SWP  EHP  yang  digunakan diperoleh  dari  negara  yang  berbeda.  Walaupun demikian, apabila sekuen nukleotida SWP pGEM-HP1/ pGEM-HP3  EHP  ditranslasikan,  tidak  menyebabkan perubahan  asam  amino  proteinnya.  Apabila  dilihat berdasarkan hasil BLAST, nilai identity antara sekuen SWP EHP dalam penelitian ini dengan SWP EHP lainnya mencapai 99%. Dilihat dari parameter lainnya seperti
Gambar 3. Elektroferogram hasil PCR sampel lobster dan kepiting menggunakan primer  SWP-EHP1  dan  SWP-EHP3.  M:  ladder  100  pb,  L:  lobster,  K: kepiting,  1:  primer  SWP-EHP1,  3:  primer  SWP-EHP3,  a:  insang,  b: hepatopankreas, dan K(-): kontrol negatif. Figure 3. Electropherogram PCR result of lobster and crab samples using SWP-EHP1 and SWP-EHP3 primers. M: ladder 100 bp, L: lobster, K: crab, 1: primer SWP-EHP1, 3: primer SWP-EHP3, a: gill, b: hepatopancreas and K(-): nega- tive control. L1a     L1b     L3a     L3b      K(-)       M                 K1a     K1b     K3a      K3b    K(-)     M
max score, e-value, dan lain-lain bisa disimpulkan bahwa sekuen SWP EHP ini memiliki tingkat similaritas yang tinggi  dengan  SWP  EHP  lainnya.  Menurut  Pearson (2014),  pencarian  tingkat  similaritas  sekuen  DNA merupakan  salah  satu  cara  untuk  mengidentifikasi sekuen homolog. Apabila ada dua/lebih sekuen yang berbagi lebih banyak kesamaan, maka bisa dikatakan bahwa  kedua  sekuen  tersebut  homolog.  Adapun sekuen SWP EHP pada penelitian ini dapat disimpulkan homolog  dengan  sekuen  SWP  EHP  kelima  kode lainnya.
Proses terakhir yaitu pengujian sensitivitas kedua pasang primer dengan dilakukan PCR terhadap serial pengenceran pGEM-HP1 maupun pGEM-HP3 sehingga tingkat  sensitivitas  primer  dalam  mendeteksi  EHP dapat  diketahui.  Hasil  perhitungan  dapat  diketahui jumlah  kopi  pGEM-HP1  yaitu  7,74  x  10 10 kopi  dan pGEM-HP3  yaitu  16,2  x  10 10 kopi.  Pada elektroferogram hasil PCR serial pengenceran pGEM- HP1dan pGEM-HP3, dapat dilihat keberadaan pita DNA terdapat  pada  pengenceran  10 10 hingga  10 2
(Gambar 7). Hal ini dapat disimpulkan bahwa primer SWP-EHP1 dapat mendeteksi EHP hingga 7,74 x 10 2 kopi sedangkan primer SWP-EHP3 dapat mendeteksi hingga 16,2 x 10 2 kopi. Menurut Lorenz (2012), jumlah molekul target yang optimal untuk reaksi PCR yaitu berkisar antara 10 4 -10 7 kopi DNA. Hasil penelitian ini tentunya  belum  melebihi  spesifikasi  deteksi menggunakan real time PCR. Pada penelitian (Forootan et  al.,  2017),  diketahui  bahwa  jumlah  DNA  target terendah  yang  yang  dapat  terdeteksi  menggunakan real time PCR yaitu hingga ±2,5 molekul.

## KESIMPULAN
Deteksi  dini  keberadaan  infeksi  Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) pada udang vaname dapat dilakukan dengan uji PCR menggunakan pasangan primer SWP- EHP1  dan  SWP-EHP3  (Forward  dan  Reverse).  Hasil pengujian sensitivitas primer, diketahui bahwa primer SWP-EHP1 dapat mendeteksi EHP hingga 7,74 x 10 2 kopi sedangkan primer SWP-EHP3 dapat mendeteksi hingga 16,2 x 10 2 kopi.
Gambar 4. Elektroforegram hasil reaksi restriksi menggunakan EcoR1. Keterangan: M: ladder 1Kb, 1-6: sampel pGEM-HP1, 13-16: sampel pGEM-HP3.
Figure 4. Electropherogram restriction result using EcoR1. M: ladder 1 Kb, 1-6: pGEM- HP1 sample, 13-16: pGEM-HP3 sample.
Gambar 5. Pohon filogenetika pGEM-HP1 dan pGEM-HP3 beserta SWP lainnya.
Figure 5. Phylogenetic tree of pGEM-HP1 and pGEM-HP3 with other SWP.
M           1            2            3           4            5            6          13         14         15         16
14
SWP EHP E KY674357.1
SWP EHP C KY593133.1
SWP EHP F KY93132.2
SWP EHP A KX258197.1 SWP EHP pGEMHP1 SWP EHP pGEMHP3 SWP EHP D KY593129.1 SWP Enterocytozoon bieneusi XM 002649457.1 SWP12 Nosema bombycis EF683112.1 687
SWP Encephalitozoon cuniculi mRNA AJ133745.1
SWP12 Nosema philosamiae KT287071.1 687 SWP12 Nosema antheraeae KC193258.1 687 SWP12 Nosema pernyi KJ210726.1 687
SWP Encephalitozoon intestinalis AF355750.1 1370 SWP Encephalitozoon hellem FJ870923.1 1530 SWP Encephalitozoon romaleae XM 009267193.1 1293
SWP Vittaforma corneae XM 007604116.1 Vibrio harveyi 16SrRNA DQ420168.1 12 70 100 100 12 53 63 100 98 38 82 94 44 97 60 SWP EHP B KY483639.1
SWP_EHP_D_KY593129.1  ------------------------------------------------------------ 0 SWP_EHP_pGEMHP3       ------------------------------------------------------------ 0 SWP_EHP_pGEMHP1       ------------------------------------------------------------ 0 SWP_EHP_B_KY483639.1  TTTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGTAATTACGAGTTTGGCGGCACAATTCTCAAACA 60 SWP_EHP_E_KY674357.1  -------------------GGTTTAAGTAATTACGAGTTTGGCGGCACAATTCTCAAACA 41 SWP_EHP_A_KX258197.1  -TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGTAATTACGAGTTTGGCGGCACAATTCTCAAACA 59 SWP_EHP_C_KY593133.1  ------------------------AAGTAATTACGAGTTTGGCGGCACAATTCTCAAACA 36 SWP_EHP_F_KY593132.2  ------------------------AAGTAATTACGAGTTTGGCGGCACAATTCTCAAACA 36 SWP_EHP_D_KY593129.1  -TTTCATCATTGGTCAAATACAATTTCAAACACGGTAAATCTTAAAGCTTTAAAGAGAGA 59 SWP_EHP_pGEMHP3       -----------GGTCAAATACAATTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCATTAAAAAGAGA 49 SWP_EHP_pGEMHP1       ------CCATTGGTCAAATACAATTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCATTAAAAAGAGA 54 SWP_EHP_B_KY483639.1  TTTTCACCATTGGTCAAATACAATTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCATTAAAAAGAGA 120 SWP_EHP_E_KY674357.1  TTTTCACCATTGGTCAAATACAATTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCATTAAAAAGAGA 101 SWP_EHP_A_KX258197.1  TTTTCACCATTGGTCAAATACAATTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCATTAAAAAGAGA 119 SWP_EHP_C_KY593133.1  TTTTCACCATTGGTCAAATACAATTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCATTAAAAAGAGA 96 SWP_EHP_F_KY593132.2  TTTTCACCATTGGTCAAATACAATTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCATTAAAAAGAGA 96 ********************** ***** ******** ***** *****
SWP_EHP_D_KY593129.1  TGATATTCATGCAGATACAGCATTTGTAGGATACGAACTTTCAAATACAGTTGGTGACAA 119 SWP_EHP_pGEMHP3       CGATATTTACACAGACACAGCATTTGTGGGATATGAGCTTTCAAATACAGTTGGAGACAA 109 SWP_EHP_pGEMHP1       CGATATTTACACAGACACAGCATTTGTGGGATATGAGCTTTCAAATACAGTTGGAGACAA 114 SWP_EHP_B_KY483639.1  CGATATTTACACAGACACAGCATTTGTAGGATATGAGCTTTCAAATACAGTTGGAGACAA 180 SWP_EHP_E_KY674357.1  CGATATTTACACAGACACAGCATTTGTAGGATATGAGCTTTCAAATACAGTTGGAGACAA 161 SWP_EHP_A_KX258197.1  CGATATTTACACAGACACAGCATTTGTAGGATATGAGCTTTCAAATACAGTTGGAGACAA 179 SWP_EHP_C_KY593133.1  CGATATTTACACAGACACAGCATTTGTAGGATATGAGCTTTCAAATACAGTTGGAGACAA 156 SWP_EHP_F_KY593132.2  CGATATTTACACAGACACAGCATTTGTAGGATATGAGCTTTCAAATACAGTTGGAGACAA 156
****** *  **** *********** ***** ** ***************** *****
SWP_EHP_D_KY593129.1  GCAACTAAAAGAAGTTTGTAATGATTTTTCTAAAGCATACGAATGTATAGCAGAAGATAA 179 SWP_EHP_pGEMHP3       ACAGCTTAAAGAAGTTTGCAATGATTTTTCTAAAGCATATGAATGCATATCAGAAGATAA 169 SWP_EHP_pGEMHP1       ACAGCTTAAAGAAGTTTGCAATGATTTTTCTAAAGCATATGAATGCATATCAGAAGATAA 174 SWP_EHP_B_KY483639.1  ACAGCTTAAAGAAGTTTGCAATGATTTTTCTAAAGCATATGAATGCATATCAGAAGATAA 240 SWP_EHP_E_KY674357.1  ACAGCTTAAAGAAGTTTGCAATGATTTTTCTAAAGCATATGAATGCATATCAGAAGATAA 221 SWP_EHP_A_KX258197.1  ACAGCTTAAAGAAGTTTGCAATGATTTTTCTAAAGCATATGAATGCATATCAGAAGATAA 239 SWP_EHP_C_KY593133.1  ACAGCTTAAAGAAGTTTGCAATGATTTTTCTAAAGCATATGAATGCATATCAGAAGATAA 216 SWP_EHP_F_KY593132.2  ACAGCTTAAAGAAGTTTGCAATGATTTTTCTAAAGCATATGAATGCATATCAGAAGATAA 216
** ** *********** ******************** ***** *** **********
SWP_EHP_D_KY593129.1  AAGAAAAATGAATGAAAAAATGGGAGATATTTTTGAAGAGTTGAGTATTTTAAAAAAGAA 239 SWP_EHP_pGEMHP3       AAGGAAAATGAATGAAAAAATGGGAGATATTTTTGAAGAATTAAGTATTTTAAAAAAGAA 229 SWP_EHP_pGEMHP1       AAGGAAAATGAATGAAAAAATGGGAGATATTTTTGAAGAATTAAGTATTTTAAAAAAGAA 234 SWP_EHP_B_KY483639.1  AAGGAAAATGAATGAAAAAATGGGAGATATTTTTGAAGAATTAAGTATTTTAAAAAAGAA 300 SWP_EHP_E_KY674357.1  AAGGAAAATGAATGAAAAAATGGGAGATATTTTTGAAGAATTAAGTATTTTAAAAAAGAA 281 SWP_EHP_A_KX258197.1  AAGGAAAATGAATGAAAAAATGGGAGATATTTTTGAAGAATTAAGTATTTTAAAAAAGAA 299 SWP_EHP_C_KY593133.1  AAGGAAAATGAATGAAAAAATGGGAGATATTTTTGAAGAATTAAGTATTTTAAAAAAGAA 276 SWP_EHP_F_KY593132.2  AAGGAAAATGAATGAAAAAATGGGAGATATTTTTGAAGAATTAAGTATTTTAAAAAAGAA 276
*** *********************************** ** *****************
SWP_EHP_D_KY593129.1  ATGCAAACAAATTGATCATCAACGTAAAACTGTAAGCAATTTGAGATATGATTTAGAAGA 299 SWP_EHP_pGEMHP3       GTGCAAACAAATTGATCATCAACGCAAAACTGTAAATAACCTAAGATATGATTTAGAAGA 289 SWP_EHP_pGEMHP1       GTGCAAACAAATTGATCATCAACGCAAAACTGTAAATAACCTAAGATATGATTTAGAAGA 294 SWP_EHP_B_KY483639.1  GTGCAAACAAATTGATCATCAACGCAAAACTGTAAATAACCTAAGATATGATTTAGAAGA 360 SWP_EHP_E_KY674357.1  GTGCAAACAAATTGATCATCAACGCAAAACTGTAAATAACCTAAGATATGATTTAGAAGA 341 SWP_EHP_A_KX258197.1  GTGCAAACAAATTGATCATCAACGCAAAACTGTAAATAACCTAAGATATGATTTAGAAGA 359 SWP_EHP_C_KY593133.1  GTGCAAACAAATTGATCATCAACGCAAAACTGTAAATAACCTAAGATATGATTTAGAAGA 336 SWP_EHP_F_KY593132.2  GTGCAAACAAATTGATCATCAACGCAAAACTGTAAATAACCTAAGATATGATTTAGAAGA 336
*********************** **********  **  * *****************
SWP_EHP_D_KY593129.1  AATATTACAATCAAATATTTATAAAGAAGATCAAAAAGAAAATTTAGAAAAAAAGTTAGG 359 SWP_EHP_pGEMHP3       AATATTGCAATCAAACATTTATAAAGAAGATCAAAAAGAAAATTTAGAAAAAAAATTAGG 349 SWP_EHP_pGEMHP1       AATATTGCAATCAAACATTTATAAAGAAGATCAAAAAGAAAATTTAGAAAAAAAATTAGG 354 SWP_EHP_B_KY483639.1  AATATTGCAATCAAACATTTATAAAGAAGATCAAAAAGAAAATTTAGAAAAAAAATTAGG 420 SWP_EHP_E_KY674357.1  AATATTGCAATCAAACATTTATAAAGAAGATCAAAAAGAAAATTTAGAAAAAAAATTAGG 401 SWP_EHP_A_KX258197.1  AATATTGCAATCAAACATTTATAAAGAAGATCAAAAAGAAAATTTAGAAAAAAAATTAGG 419 SWP_EHP_C_KY593133.1  AATATTGCAATCAAACATTTATAAAGAAGATCAAAAAGAAAATTTAGAAAAAAAATTAGG 396 SWP_EHP_F_KY593132.2  AATATTGCAATCAAACATTTATAAAGAAGATCAAAAAGAAAATTTAGAAAAAAAATTAGG 396 ****** ******** ************************************** *****

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  dibiayai  oleh  Program  Penelitian, Pengabdian  kepada  Masyarakat,  dan  Inovasi  (P3MI) Kelompok  Keahlian  ITB.  Ucapan  terima  kasih  juga disampaikan kepada Loka Pemeriksaan Penyakit Ikan dan Lingkungan (LP2IL) Serang, yang telah membantu dalam penyediaan sampel udang vaname.

## DAFTAR  ACUAN
Aristiyani, R. (2017). Analisa Daya Saing Udang Indo- nesia di Pasar Internasional. Universitas Lampung.
Bertero, A., Brown, S., & Vallier, L. (2017). Methods of Cloning.  Basic  Science  Methods  for  Clinical  Re- searchers. Elsevier  Inc.
Dirjen  Perikanan  Budidaya.  (2014).  Data  Statistik Series  Produksi  Perikanan  Budidaya  Indonesia. Direktorat  Jenderal  Perikanan  Budidaya, Kementerian Kelautan & Perikanan.
Forootan, A., Sjöback, R., Björkman, J., Sjögreen, B., Linz, L., & Kubista, M. (2017). Methods to deter- mine  limit  of  detection  and  limit  of  quantifica- tion  in  quantitative  real-time  PCR  (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification, 12, 1–6.
Gambar 7. Elektroferogram hasil PCR serial pengenceran pGEM-HP1 (atas) dan pGEM- HP3 (bawah). L: ladder 100 bp, 1-10: pengenceran 10 10 - 10 1 dan K(-): kontrol
negatif.
Figure 7. Electropherogram PCR result of pGEM-HP1(Top) and pGEM-HP3 (bottom) serial dilution. L: ladder 100 bp, 1-10: dilution of 10 10 - 10 1 and K(-): negative control.
M         10 10 10 9 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 K(-)
M        10 10 10 9 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 K(-)
Gambar 6. Hasil pensejajaran sekuen pGEM-HP1 dan pGEM-HP3 dengan SWP-EHP kode lainnya.
Figure 6. Multiple sequence alignment  result of pGEM-HP1 and  pGEM-HP3 with other SWP  EHP code sequences.
SWP_EHP_D_KY593129.1  AGAAACAGCTGAAAAAACACTGGTAGAAATGGATGAATTTATGCATTTAAGCATGATAAA 419 SWP_EHP_pGEMHP3       AGAAACATCTGAAAAAACACTAGTAGAAATGGATGAATTTATGCATTTAAGTATGATAAA 409 SWP_EHP_pGEMHP1       AGAAACATCTGAAAAAACACTAGTAGAAATGGATGAATTTATGC---------------- 398 SWP_EHP_B_KY483639.1  AGAAACATCTGAAAAAACACTAGTAGAAATGGATGAATTTATGCAT-------------- 466 SWP_EHP_E_KY674357.1  AGAAACATCTGAAAAAACACTAGTAGAAATGGATGAATTTATGCATTTAAGTATGATAAA 461 SWP_EHP_A_KX258197.1  AGAAACATCTGAAAAAACACTAGTAGAAATGGATGAATTTATGCATTTAAGTATGATAAA 479 SWP_EHP_C_KY593133.1  AGAAACATCTGAAAAAACACTAGTAGAAATGGATGAATTTATGCATTTAAGTATGATAAA 456 SWP_EHP_F_KY593132.2  AGAAACATCTGAAAAAACACTAGTAGAAATGGATGAATTTATGCATTTAAGTATGATAAA 456 ******* ************* ********************** SWP_EHP_D_KY593129.1  TGGCGTAATTAA------------------------------------------------ 431 SWP_EHP_pGEMHP3       TGGAGA------------------------------------------------------ 415 SWP_EHP_pGEMHP1       ------------------------------------------------------------ 398 SWP_EHP_B_KY483639.1  ------------------------------------------------------------ 466 SWP_EHP_E_KY674357.1  TGGAGTAATCAAGAAAATTGCAAAGACACATCGTGAGACCTAAATCTCCCTACTCTCGTC 521 SWP_EHP_A_KX258197.1  TGGAGTAATCAAGAAAATTGCAAAGACACATCGTG------------------------- 514 SWP_EHP_C_KY593133.1  TGGAGTAATCAA------------------------------------------------ 468 SWP_EHP_F_KY593132.2  TGGAGTAATCAA------------------------------------------------ 468 SWP_EHP_D_KY593129.1  -- 431 SWP_EHP_pGEMHP3       -- 415 SWP_EHP_pGEMHP1       -- 398 SWP_EHP_B_KY483639.1  -- 466 SWP_EHP_E_KY674357.1  CT 523 SWP_EHP_A_KX258197.1  -- 514 SWP_EHP_C_KY593133.1  -- 468 SWP_EHP_F_KY593132.2  -- 468
Jang,  C.  &  Magnuson,  T.  (2013).  A  Novel  Selection Marker  for  Efficient  DNA  Cloning  and Recombineering in E . coli, PLoS ONE, 8(2), 1-7. Jaroenlak,  P.,  Boakye,  D.W.,  Vanichviriyakit,  R.,
Williams,  B.A.P.,  Sritunyalucksana,  K.,  & Itsathitphaisarn, O. (2018). Identification, charac- terization and heparin binding capacity of a spore- wall,  virulence  protein  from  the  shrimp microsporidian,  Enterocytozoon  hepatopenaei (EHP). Parasites and Vectors, 11(1), 1-15.
Lorenz,  T.C. (2012).  Polymerase  Chain Reaction:  Ba- sic Protocol Plus Troubleshooting and Optimiza- tion  Strategies.  Journal  of  Visualized  Experiments, (63), 1-15.
Padmanabhan,  S.,  Banerjee,  S.,  &  Mandi,  N.  (2011). Screening  of  Bacterial  Recombinants:  Strategies and Preventing False Positives. Molecular Cloning- Selected Applications in Medicine and Biology.
Pearson,  W.R.  (2014).  An  Introduction  to  Sequence and Series. International Journal of Research, 1(10), 1286-1292.
Rajendran, K.V., Shivam, S., Ezhil Praveena, P., Joseph Sahaya Rajan, J., Sathish Kumar, T., Avunje, S., & Vijayan,  K.  K.  (2016).  Emergence  of Enterocytozoon  hepatopenaei  (EHP)  in  farmed Penaeus  (Litopenaeus)  vannamei  in  India.  Aqua- culture, 454, 272-280.
Rùz¡ièka,  M.,  Kulha´nek,  P.,  Radova´,  L.,  Èechova´, A., S¡paèkova´, N., & Fajkusova´, L. (2017). DNA mutation motifs in the genes associated with in- herited diseases, PLoS ONE, 12(8), 1-16.
Selvin,  J.,  Ninawe, A.,  Ramu,  M.,  & Kiran,  S.  (2015). Control of Pathogenic Vibrios in Shrimp Aquacul- ture  using  Antiinfectives  from  Marine  Natural Products. Conference Papper, p .102-141.
Tang,  K.F.J.,  Aranguren,  L.F.,  Piamsomboon,  P.,  Han, J.E., Maskaykina, I.Y., & Schmidt, M.M. (2017). De- tection  of  the  microsporidian  Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) and Taura syndrome virus in Penaeus vannamei cultured in Venezuela. Aquacul- ture, 480, 17-21.
Tang,  K.F.J.,  Han,  J.E.,  Aranguren,  L.F.,  White-Noble, B., Schmidt, M.M., Piamsomboon, P., & Hanggono, B.  (2016).  Dense  populations  of  the microsporidian  Enterocytozoon  hepatopenaei (EHP)  in  feces  of  Penaeus  vannamei  exhibiting white feces syndrome and pathways of their trans- mission to healthy shrimp. Journal of Invertebrate Pathology, 140, 1-7.
Tangprasittipap,  A.,  Srisala,  J.,  Chouwdee,  S., Somboon,  M.,  Chuchird,  N.,  Limsuwan,  C.,  & Sritunyalucksana,  K.  (2013).  The  microsporidian Enterocytozoon  hepatopenaei  is  not  the  cause of  white  feces  syndrome  in  whiteleg  shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei. BMC Veterinary Research, 9.
Tourtip, S., Wongtripop, S., Stentiford, G.D., Bateman, K.S.,  Sriurairatana,  S.,  Chavadej,  J.,  & Withyachumnarnkul,  B.  (2009).  Enterocytozoon hepatopenaei  sp.  nov.  (Microsporida: Enterocytozoonidae),  a  parasite  of  the  black  ti- ger  shrimp  Penaeus  monodon  (Decapoda: Penaeidae): Fine structure and phylogenetic rela- tionships. Journal of Invertebrate Pathology, 102(1), 21-29.
Yang, D., Dang, X., Tian, R., Long, M., Li,C., Li, T., & Zhou, Z. (2014). Development of an approach to analyze the interaction between Nosema bombycis (microsporidia) deproteinated chitin spore coats and  spore  wall  proteins.  Journal  of  Invertebrate Pathology, 115(1), 1-7.