Perubahan Morfologi Staphylococcus aureus Akibat Paparan Ekstrak Etanol Biji Kakao ( Theobroma cacao ) secara In Vitro
The Morphological Changes of Staphylococcus Aureus Caused by Ethanol extracts of Cocoa Beans (Theobama Cacao) through In Vitro
Dafista Diyantika 1 , Diana Chusna Mufida 2 , Misnawi 3
1 Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Jember
2 Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Jember Jalan Kalimantan No. 37 Kampus Tegalboto Jember 68121
3 Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia Jalan PB Sudirman No. 90, Jember 68118 e-mail korespondensi: dianachusna@yahoo.com

## Abstrak
Staphylococcus aureus (S. aureus) adalah bakteri Gram positif yang sering menginfeksi manusia. Penggunaan antibiotik  sebagai  terapi  adalah  faktor  terjadinya  resistensi. S.  aureus resisten  terhadap  banyak  antibiotik misalnya  tetrasiklin,  streptomisin,  kloramfenikol,  ampisilin,  eritromisin,  dan  penisilin.  Seiring  dengan meningkatnya  resistensi  bakteri  harus  diimbangi  dengan  penemuan  obat  baru.  Ekstrak  etanol  biji  kakao memiliki  daya  hambat  terhadap  pertumbuhan S.  aureus secara in  vitro .  Walaupun  efek  antibakteri  ekstrak etanol  biji  kakao  telah  dapat  dibuktikan,  namun  belum  dapat  ditunjukkan  perubahan morfologi  yang  terjadi pada S.  aureus setelah  diberikan  ekstrak  etanol  biji  kakao.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  mengkaji perubahan  morfologi S.  aureus setelah  diberikan  ekstrak  etanol  biji  kakao.  Jenis  penelitian  yang  digunakan adalah Quasi  Experimental dengan  rancangan Posttest  Only  Control  Group  Design .  Sampel  yang  digunakan adalah S. aureus dengan bahan uji yaitu ekstrak etanol biji kakao konsentrasi 31,2 mg/mL; 15,6 mg/mL; dan 7,8 mg/mL sedangkan kontrol negatifnya adalah aquades steril dan kontrol positifnya adalah suspensi sefaleksin 4 µg/mL.  Metode  yang  digunakan  untuk  pengamatan  perubahan  morfologi S.  aureus adalah  uji scanning electron microscope . Hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol biji kakao pada konsentrasi 15,6 mg/mL  dan  7,8  mg/mL  menyebabkan  terjadinya  perubahan  morfologi S.  aureus berupa  pembesaran  ukuran diameter  sel  dan  tidak  terpisahnya  septum.  Pada  konsentrasi  31,25  mg/mL  juga  tampak  adanya  penonjolan pada dinding sel bakteri.
Kata Kunci: Antimikroba, Kakao, SEM, Staphylococcus aureus

## Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) is positive gram bacteria which often infect humans. The use of antibiotic for therapy  is  the  factor  of  resistance.  S.  aureus  resistant  towards  some  biotic  like   tetracycline,  streptomycin, chloramphenicol, ampicilin, eritromisin and penicillin. The increase of the resistance demands more findings on new drugs. Ethanol extracts of cocoa beans has a block capacity towards the growth of  S. aureus via in vitro. The effect of antibacterial of ethanol extracts has already been proved. However, its morphology changes on S. aureus  after  given  ethanol  extracts  of  cocoa  beans  is  not  found  yet.  This  research  is  aimed  at  studying  the morphological changes on S. aureus after given ethanol extracts of cocoa beans. The research design is  Quasi Experimental with Posttest Only Control Group Design. The sample used is S. aureus whereas the material tests is ethanol extracts of cocoa beans in concentration of 31.2 mg/ mL ; 15.6 mg/ mL and 7.8 mg/ mL . The negative control is sterile aquades and the positive control is cephalexin suspension 4 ug/ mL . The method for observing the S. aureus morphology change is scanning electronic microscope. The research result shows that there is a morphology change. Given ethanol extracts of cacao seed at 7,8 mg/ mL and 15,6 mg/ mL , there is enlargement of wall cell and the unity of septum. And at 31,25 mg/ mL , there is protrusion at the wall cell and enlargement of wall cell.
Keywords: Antimikrobial, Cacao, SEM, Staphylococcus aureus.

## Pendahuluan
Penyakit  infeksi  masih  menjadi  masalah  yang mendominasi  dalam  bidang  kesehatan.  Penyakit infeksi  adalah  salah  satu  penyakit  yang penularannya cukup mudah dan dapat disebabkan oleh bakteri, virus, jamur, dan parasit. Salah  satu  infeksi  yang  cukup  sering  dan  hampir menyerang  semua  manusia  adalah  infeksi  oleh Staphylococcus  aureus .  Menurut  Tally  (dalam Ernawati,  2005), S.  aureus merupakan  bakteri patogen  Gram  positif  yang  mudah  tumbuh  pada kebanyakan medium bakteriologis dalam keadaan aerob maupun anaerob fakultatif. Staphylococcus aureus banyak  ditemukan  di  sekitar  lingkungan hidup  manusia  penyebab  penyakit  infeksi  di dunia.  Hal  ini  disebabkan  oleh  kemampuan S. aureus yang mudah beradaptasi dengan lingkungan  melalui  ketahanannya  terhadap antimikrobial  yang  dimilikinya.  Bakteri  ini terutama  ditemukan  pada  kulit,  kelenjar  kulit, selaput  lendir,  luka  dan  umumnya  merupakan penyebab radang tenggorokan, infeksi kulit (bisul) serta  infeksi  sistem  saraf  pusat  dan  paru-paru. Manifestasi dari infeksi S. aureus ini dapat berupa impetigo, scalded  skin  syndrome ,  pneumonia, osteomielitis, pioartrosis, endokarditis, metastasis staphylococcal,  keracunan  makanan,  sindrom syok  toksik,  meningitis,  dan  sepsis  (Joklik et  al ., 1992;  Emmerson,  1994;  Ena et  al .,  1994  dalam Khusnan 2008).
Terdapat  sekitar  18.650  kasus  infeksi  oleh S. aureus yang  mengalami  kematian  dari  94.000 kasus  infeksi  yang  terjadi  secara  keseluruhan  di Amerika  (Todar,  2008).  Infeksi  S.  aureus  juga cukup  tinggi  di  Asia,  yaitu  mencapai  70%  pada tahun  2007.  Sementara  di  Indonesia  pada  tahun 2006 mencapai 23,5% (Farmacia, 2007).
Solusi  untuk  mengatasi  infeksi  oleh S.  aureus adalah  dengan  memberikan  antibiotik  untuk bakteri Gram positif. Namun akhir-akhir ini sudah banyak  laporan  mengenai  resistensi  obat. Penyebab  terjadinya  resistensi  antibiotik  antara lain  karena  pemilihan  antibiotik  yang  kurang tepat, pemberian dosis yang kurang adekuat, atau lama  penggunaan  obat  yang  tidak  disiplin. Resistensi S.  aureus terhadap  antibiotik  tertinggi berturut-turut  untuk  ampisilin,  asam-klavulanat, amoksisilin, penisilin G, sulbenisilin, kloramfenikol, dan siprofloksasin (Refdanita et al .,
2002).  Pola  kepekaan  kuman S.  aureus terhadap enam  jenis  antibiotik  di  wilayah  Jakarta  Timur
menunjukkan  bahwa  kuman  ini  telah  resisten terhadap  antibiotik  dengan  urutan  tetrasiklin 53,3%,  streptomisin  44,8%,  kloramfenikol  23,6%, ampisilin  18,1%,  eritromisin  6,6%,  dan  penisilin 4,2% (Refdanita et al ., 2002).
MRSA  atau Metichilin-resistant  S.  aureus ialah bakteri  yang  mengalami  kekebalan  terhadap antibiotik  jenis  metisilin  (Denis et  al .,  2007:  1-4).
Kuman  MRSA  pada  awalnya  hanya  resisten terhadap  antibiotik  bercincin  β-laktam,  namun dalam  perkembangannya  muncul  kekebalan  juga terhadap  golongan  quinolon,  aminoglikosida, tetrasiklin, bahkan vankomisin (Wang, 2007: 209- 20).  Akibat  tingginya  angka  resistensi  tersebut, perlu  dicari  obat  alternatif  untuk  infeksi  oleh S. aureus tersebut.  Berbagai  bahan  antibiotik  alami menjadi  pilihan  solusi  terhadap  pengobatan  oleh infeksi S.  aureus ini.  Salah  satu  bahan  antibiotik alami  yang  murah  dan  mudah  didapat  tersebut adalah polifenol biji kakao.
Tanaman  kakao  ( Theobroma  cacao )  merupakan salah  satu  tanaman  perkebunan  yang  tumbuh subur di daerah tropis yang  berasal dari  Amerika Selatan,  tepatnya  tumbuh  di  hutan  hujan  tropis. Produk olahannya yang dikonsumsi oleh manusia adalah  coklat.  Tanaman  kakao  terdiri  atas  akar, batang,  daun,  bunga,  dan  buah.  Buah  kakao terdiri  atas  tiga  komponen  terbesar  utama  yaitu kulit buah, plasenta, dan biji. Biji kakao kaya akan komponen-komponen  senyawa  fenolik  atau polifenolik. Berdasarkan beberapa hasil penelitian didapatkan  bahwa  polifenol  pada  biji  kakao diketahui  mempunyai  potensi  sebagai  bahan antioksidan  alami,  antara  lain  mempunyai kemampuan untuk memodulasi sistem imun, efek kemopreventif  untuk  pencegahan  penyakit jantung  koroner,  dan  kanker  (Othman et  al ., 2007;  Weisburger,  2001;  Keen,  2005).  Selain  itu, polifenol  kakao  bersifat  antimikroba  terhadap beberapa  bakteri  patogen  dan  bakteri  kariogenik (Osawa et  al .,  2000;  Bounchers,  2002;  Lamuela- Raventos,  2005).  Senyawa  polifenol  dalam  biji kakao  terdiri  dari  flavonoid,  katekin,  prosianidin, antosianin, dan tanin kompleks.
Flavan-3-ol  (katekin)  adalah  senyawa  polifenol alami  dan  termasuk  dalam  penyusun  golongan tanin. Menurut Wahluyo (dalam Setiadevi, 2010), katekin  memiliki  sifat  sebagai  antimikroba, memperkuat  pembuluh  darah,  melancarkan  air seni  dan  menghambat  pertumbuhan  sel  kanker. Katekin  dalam  keadaan  murni  sedikit  tidak  larut
dalam  air  dingin  tetapi  sangat  larut  dalam  air panas,  alkohol  dan  etil  asetat,  namun  katekin tidak  larut  dalam  kloroform.  Tanin  adalah senyawa  lain  dalam  polifenol  yang  mengganggu permeabilitas  sel  dengan  mengkerutkan  dinding sel  atau  membran  sel.  Akibat  terganggunya permeabilitas  sel,  sel  tidak  dapat  melakukan aktivitas hidup sehingga pertumbuhannya terhambat atau bahkan mati (Ajizah, 2004).
Flavonoid  juga  diketahui  memiliki  kemampuan sebagai  antibakteri,  antioksidan,  antiinflamasi, dan  mencegah  kanker  (Stauth,  2007).  Flavonoid dapat  menghambat  fungsi  DNA  gyrase  bakteri dengan  merusak  membran  sitoplasma  dari bakteri  dan  menyebabkan  kerusakan  pada dinding  sel  bakteri.  Flavonoid  merupakan senyawa polar  sehingga akan larut dalam pelarut polar  seperti  etanol,  metanol,  dan  air.  Pelarut etanol  adalah  salah  satu  pelarut  yang  lebih menguntungkan  karena  bersifat  polar  sehingga dapat melarutkan senyawa polifenol biji kakao.
Berdasarkan  penelitian  terdahulu,  disebutkan bahwa  aktivitas  antibakteri  ekstrak  etanol  biji kakao  terhadap  pertumbuhan  bakteri S.  aureus dalam media Muller Hinton dengan menggunakan metode  difusi  sumuran  ditunjukkan  dengan adanya  zona  bening  atau  zona  hambat  di  sekitar area  sumuran  yang  terbentuk  pada  konsentrasi 15,6  mg/mL  hingga  konsentrasi  1000  mg/mL (Tamarizki,  2011).  Walaupun  efek  antibakteri ekstrak  etanol  biji  kakao  telah  dapat  dibuktikan, namun  belum  dapat  ditunjukkan  perubahan morfologi apa yang terjadi pada S. aureus setelah dilakukan  paparan  terhadap  ekstrak  etanol  biji kakao.  Sehubungan  dengan  hal  tersebut  maka peneliti  ingin  mengkaji  gambaran  perubahan morfologi S. aureus akibat paparan ekstrak etanol biji kakao secara in vitro .
Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji perubahan  morfologi  bakteri S.  aureus setelah diberikan  ekstrak  etanol  biji  kakao  pada konsentrasi  31,25  mg/mL,  15,6  mg/mL  dan  7,8 mg/mL secara in vitro .

## Metode Penelitian
Jenis penelitian ini menggunakan Quasi Eksperimental  Design dan  rancangan  penelitian yang  digunakan  adalah Posttest  Only  Control Group  Design. Metode  yang  digunakan  untuk
pengamatan  perubahan  morfologi  bakteri S. aureus adalah  dengan  uji scanning  electron microscope .  Sampel  pada  penelitian  ini  adalah koloni bakteri S. aureus yang disesuaikan dengan standar  0,5 Mc  Farland (106  CFU/mL)  yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas  Kedokteran  Universitas  Jember.  Teknik analisis data yang digunakan adalah
menggunakan  metode  deskriptif.  Pada  penelitian ini dilakukan 5 perlakuan : 1) S. aureus yang diberi aquades  steril,  2) S.  aureus yang    diberi  ekstrak etanol  biji  kakao  konsentrasi  7,8  mg/mL,  3) S. aureus yang    diberi  ekstrak  etanol  biji  kakao konsentrasi 15,6 mg/mL, 4) S. aureus yang  diberi ekstrak  etanol  biji  kakao  konsentrasi  31,25 mg/mL,  5) S.  aureus yang    diberi  suspensi sefaleksin 4µg/mL. Tahapan pada penelitian ini: 1) Pembuatan  ekstrak  etanol  biji  kakao  dengan metode  maserasi  2)  Pengamatan  perubahan morfologi S.  aureus dengan Scanning  Electron Microscopy (SEM)
Pembuatan konsentrasi ekstrak etanol biji kakao
Pembuatan  ekstrak  etanol  biji  kakao  dilakukan dengan  proses  maserasi  hingga  didapatkan  170 gram  polifenol  serbuk.  Serbuk  ekstrak  etanol  biji kakao  ditimbang  sebanyak  2000  mg  kemudian ditambahkan aquades steril panas 2  mL sehingga didapatkan  konsentrasi  ekstrak  etanol  biji  kakao 1.000 mg/mL kemudian divortex selama 60 detik. Setelah itu larutan tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi I, kemudian dilakukan pengenceran bertingkat  dengan  kelipatan  setengahnya  sampai didapatkan  larutan  konsentrasi  7,8  mg/mL kemudian  divortex  selama  60  detik.  Dari  tabung reaksi  I  diambil  sebanyak  1  mL  dimasukkan  ke dalam  tabung  reaksi  II yang  sudah  diisi  dengan  1 mL  aquades  steril  panas  kemudian  divortex selama  60  detik.  Dari  tabung  reaksi  II  diambil sebanyak  1  mL  dimasukkan  ke  dalam  tabung reaksi  III  yang  sudah  diisi  dengan  1  mL  aquades steril  panas  kemudian  divortex  selama  60  detik. Beri  label  pada  tabung  untuk  setiap  kali pengenceran  sesuai  dengan  konsentrasinya (Suswati and Mufida, 2009).

## Alur penelitian
Ke  dalam  5  tabung  yang  berisi  media  muller hinton  broth  dimasukkan  masing-masing  100µl
aquades  steril,  100µl  ekstrak  etanol  biji  kakao konsentrasi  7,8mg/mL,  100µl  ekstrak  etanol  biji kakao  konsentrasi  15,6mg/mL,  100µl  ekstrak etanol  biji  kakao  konsentrasi  31,25mg/mL,  dan 100µl  suspensi  sefaleksin  4µg/mL.  Kemudian  di vortex  selama  60  detik.  Selanjutnya  ke  dalam  5 tabung  tersebut  masing-masing  dimasukkan  10µl suspensi bakteri S. aureus yang telah distandartkan  dengan  larutan 0,5  Mac  Farland kemudian  diinkubasi  pada  suhu  35°C  selama  15- 20 jam.
Pengamatan dengan SEM
Setelah  diinkubasi  15-20  jam,  perlu  dilakukan preparasi  sampel  (membuat  sediaan)  untuk dilihat  dengan  menggunakan  SEM.  Tahapan pembuatan  sampel  tersebut  yaitu:  bakteri  hasil dari  perlakuan  tersebut  dimasukkan  ke  dalam larutan  fiksasi  glutaraldehyde  2%  selama  2-3  jam suhu  4°C  (sentrifuge  dengan  kecepatan  rendah selama  15  menit).  Kemudian  sediaan  dicuci dengan larutan buffer phosphate pH 7,4 selama 3 x 5 menit suhu 4°C (sentrifuge dengan kecepatan rendah  selama  15  menit).  Post  fiksasi  dengan larutan  Osmic  Acid  1%  selama  1-2  jam  suhu  4°C (sentrifuge  dengan  kecepatan  rendah  selama  15 menit).  Kemudian  sediaan  dicuci  dengan  larutan buffer phosphate pH 7,4 selama 3 x 5 menit suhu 4°C (sentrifuge dengan kecepatan rendah selama 15  menit).  Lalu  dehidrasi  dengan  alkohol bertingkat  :  30%,  50%,  70%  masing-masing selama  15-20  menit  suhu  4°C  (sentrifuge  dengan kecepatan  rendah  selama  15  menit).  Dilanjutkan dehidrasi dengan alkohol 80%, 90%, absolute dua kali  masing-masing  selama  15-20  menit  suhu ruangan  (sentrifuge  dengan  kecepatan  rendah selama 15 menit). Kemudian diganti dengan amyl acetate  absolute  (sebagai  pengawet  sampai menunggu  waktu  pengeringan).  Bakteri  yang  aka dikeringkn  dipipet  dengan  pipet  Pasteur  dan diteteskan pada gelas objek dengan luas 16 mm2 yang sudah dibersihkan dengan alkohol.
Kemudian  dilakukan  pengeringan  dengan  alat Critical  Point  Drying (CPD).  Setelah  itu  dilakukan penempelan pada stub dengan menggunakan lem khusus.  Langkah  berikutnya  adalah  melakukan pelapisan  dengan  alat  vacuum  evaporator  dan bahan  pelapisnya  adalah  emas  murni  atau karbon.

## Hasil Penelitian
Total  polifenol  dihitung  berdasarkan  hasil absorbansi  ekstrak  polifenol  kasar  dibagi  0,25 gram bahan yang digunakan untuk analisa. Untuk mengukur  total  polifenol,  terlebih  dahulu dilakukan  pengukuran  berdasarkan  standard  (+)- katekin dan diukur menggunakan spektrofotometer  dengan  panjang  gelombang 765  nm.  Pada  perhitungan  tersebut  didapatkan hasil  pengukuran  absorbansi  pada  (+)-katekin yang  direaksikan  dengan  Follin  ciocalteau  seperti yang tercantum pada tabel.
Tabel 1 Absorbansi (+)-Katekin Konsentrasi (mg/mL) Absorbansi 0 0.0001 100 0.0800 200 0.1194 400 0.2462 600 0.3372 800 0.4046 1000 0.4365
Dari  data  tersebut  dihasilkan  kurva  katekin dengan  persamaan  yaitu    Y=4,945335e-04*x. Kemudian  hasil  dari  absorbansi  sampel  ekstrak etantol biji kakao pada  penelitian ini dimasukkan ke dalam persamaan tersebut sehingga diperoleh nilai  x,  lalu  dikali  50  sebagai  faktor  pengenceran lalu  dibagi  0,25  gram  yang  merupakan  berat ekstrak  yang  dianalisa,  kemudian  dibagi  10.000 untuk  dijadikan  persentase.  Dari  perhitungan tersebut  diperoleh  hasil  total  polifenol  sebesar 21,9% (219 gr/Kg). Sedangkan nilai rendemen dari ekstrak etanol biji kakao ini adalah 2,43%.
Hasil pengamatan perubahan morfologi S. aureus akibat  paparan  ekstrak  etanol  biji  kakao konsentrasi  31,25  mg/mL,  15,6  mg/mL,  dan 7,8mg/mL  adalah  adanya  pembesaran  ukuran diameter  sel  dan  terbentuknya  tonjolan  pada permukaan sel bakteri.
Gambar 1. Perubahan  morfologi
S.  aureus akibat paparan ekstrak etanol biji kakao. A, S. aureus yang  tidak  diberi  perlakuan,  B, S. aureus yang  diberi  ekstrak  etanol  biji  kakao konsentrasi  7,8  mg/mL,  C, S.  aureus yang diberi  ekstrak  etanol  biji  kakao  konsentrasi 15,6 mg/mL, D, S. aureus yang diberi  ekstrak etanol  biji  kakao  konsentrasi  31,25  mg/mL, dan  E, S.  aureus yang  diberi  suspensi sefaleksin 4μg/mL.
Gambaran S.  aureus yang  tidak  diberi  perlakuan (gambar A) menunjukkan gambaran yang normal, yaitu:  ukuran  sel  hampir  seragam  yaitu  diameter 0,43μm,  bentuk  sel  utuh  bulat  ( coccus )  kecil, dinding  sel  tampak  bagus,  tebal,  berbatas  tegas, dan  tersusun  bergerombol  (Lavlinesia,  2007). Pada  gambaran  di  atas,  tampak S.  aureus tersusun  berkoloni  sesuai  cara  hidupnya  namun tidak  terlalu  banyak  bakteri  dalam  satu  koloni sehingga  bentukan  gerombolan  seperti  anggur kurang  tampak.  Gambaran  perubahan  morfologi S.aureus (gambar B) setelah diberi ekstrak etanol biji  kakao  konsentrasi  7,8  mg/mL.  Terjadi pembengkakan  pada  bakteri  sehingga  ukuran bakteri S. aureus membesar menjadi berdiameter 0,57μm.  Dinding  sel  bakteri  tidak  menebal ataupun  menipis  dan  permukaan  dindingnya tetap  rata.  Bentuk  sel S.  aureus tampak  bulat halus  namun  terjadi  pembesaran  ukuran.  Selain perubahan  tersebut,  pada  sel  septum  tetap terpisah  jelas  dan  tidak  terjadi  penonjolan  pada permukaan  sel.  Perubahan  yang  tampak  pada S. aureus yang  telah  terpapar  ekstrak  etanol  biji
kakao konsentrasi 15,6 mg/mL (gambar C) adalah adanya  perubahan  pada  bentuk  dan  ukuran  sel.
Pada gambar tersebut tampak adanya
pembengkakan  pada  dinding  sel  juga  perubahan bentuk  yang  sudah  tidak  bulat  lagi.  Ukuran bakteri  lebih  besar  dari  normal  yaitu  diameter 0,714μm.  Permukaan  dinding  ada  yang  tampak rata  dan  ada  yang  tidak.  Sedangkan  batas  antar dua  sel  (septum)  tidak  dapat  dinilai  karena S. aureus pada  perlakuan  ini  susunan  selnya terpisah,  tidak  bergerombol  seperti  normalnya. Tidak terbentuk tonjolan pada permukaan dinding sel.  Gambaran S.  aureus yang  sebelumnya  telah diberi ekstrak  etanol biji kakao konsentrasi 31,25 mg/mL (Gambar D) tampak adanya pembengkakan  pada  dinding  sel  dan  perubahan bentuk  yang  tidak  bulat  lagi,  serta  terdapat kerusakan  pada  dinding  sel  (membran  sel). Bakteri  ini  memiliki  ukuran  yang  lebih  besar  dari normal,  yaitu  diameter  0,714μm.  Dinding mengalami  sedikit  penebalan  dan  permukaan dinding  tidak  rata.  Tampak  terbentuk  tonjolan pada  permukaan  dinding  salah  satu  sel  bakteri. Sedangkan S.  aureus yang  sebelumnya  telah dikontakkan dikontakkan dengan suspensi antibiotik sefaleksin konsentrasi 4 µg/mL (gambar E) memberikan gambaran adanya pembengkakan pada dinding sel bakteri dan perubahan bentuk.
Tabel 2. Diameter S.  aureus akibat  paparan  ekstak etanol biji kakao secara in vitro
Konsentra si Ekstrak (mg/mL)
Diameter S. aureus Foto
Positif (mm) Diameter S. aureus Foto Negatif (mm) Diameter S. aureus (µm) K (-) 3 3 0,43 7,8 5,25 2 0,57 15,6 6,5 2,5 0,714 31,25 5,75 2,5 0,714 K (+) 4,25 2 0,57
K (+)    : sefaleksin, K (-)     : aquades steril
Bentuk S.  aureus yang  secara  normal  adalah coccus pada gambar tampak sudah tidak bulat lagi namun  terlihat  agak  lonjong.  Ukuran  bakteri membesar menjadi diameter 0,57μm. Dinding sel bakteri  tampak  ada  yang  menebal  dan  ada  yang
menipis  namun  permukaan  dinding  sedikit terlihat  tidak  rata  pada  beberapa  sel.  Terdapat beberapa  sel  yang  memiliki  tonjolan  pada permukaan dindingnya.
Gambar  2.  Grafik  hubungan  antara  konsentrasi ekstrak  etanol  biji  kakao  dengan  diameter S. aureus . Terjadi peningkatan ukuran diameter
S. aureus yang diberi ekstrak etanol biji kakao konsentrasi  7,8  mg/mL,  15,6  mg/mL,  dan 31,25 mg/mL..
Perubahan  morfologi S.  aureus yang  diberi aquades steril (kontrol negatif), suspensi sefaleksi 4µg (kontrol positif), dan ekstrak etanol biji kakao konsentrasi  31,25  mg/mL,  15,6  mg/mL,  dan  7,8 mg/mL dapat dilihat pada tabel 2 berikut.
Tabel 3.
Perubahan  morfologi
S.  aureus akibat paparan ekstak etanol biji kakao
K (-) 7,8 mg/mL 15,6 mg/mL 31,25 mg/mL K (+) Diamete r 0,43 µm 0,57 µm  0,714 µm 0,714 µm 0,57 µm Septum  Terpis ah jelas Terpisah jelas Tidak dapat dinilai Tidak terpisah Tida k terpi sah Tonjolan - - - + - Bentuk sel Coccus Coccus Coccus Coccus Pipih
(-)  : tidak terbentuk, (+) : terbentuk

## Pembahasan
Pada penelitian didapatkan bahwa ekstrak etanol biji kakao dapat memberikan perubahan morfologi  yang  berarti  pada S.  aureus secara in vitro .  Hal  ini  disebabkan  oleh  polifenol  dari ekstrak  etanol  biji  kakao  yang  bersifat  sebagai antibakteri. Berdasarkan hasil penelitian didapatkan perubahan  ukuran  yang  berbeda  diantara  5 sampel  yang  telah  diberi  perlakuan.  Pada S. aureus yang  tidak  diberi  perlakuan  didapatkan ukuran  sel  adalah  0,43µm.  Ukuran  diameter  sel bakteri S.  aureus yang  diberi  ekstrak  etanol  biji kakao  konsentrasi  7,8  mg/mL  yaitu  0,57µm, S.
aureus yang  diberi  ekstrak  etanol  biji  kakao konsentrasi 15,6 mg/mL yaitu 0,714µm, S. aureus yang  diberi  ekstrak  etanol  biji  kakao  konsentrasi 31,25  mg/mL  yaitu  0,714µm  dan S.  aureus yang diberi suspensi sefaleksin 4 µg/mL adalah 0,57µm. Berdasarkan  hasil  tersebut  diketahui  bahwa pembesaran  ukuran S.  aureus pada  penelitian mengalami peningkatan. Ukuran bakteri S. aureus yang diberi suspensi sefaleksin 4 µg/mL lebih kecil dibandingkan  dengan S.  aureus yang  diberi ekstrak  etanol biji kakao konsentrasi 15,6 mg/mL dan 31,25 mg/mL karena bentuk selnya berbeda.
Pada S.  aureus yang  diberi  ekstrak  etanol  biji kakao  konsentrasi  15,6  mg/mL  dan  31,25  mg/mL bentuk  selnya  bulat  dan  membesar,  sedangkan pada S.  aureus yang  diberi  suspensi  sefaleksin  4 µg/mL  bentuk  selnya  sedikit  lonjong  (memipih) sehingga diameter sel lebih kecil.
Staphylococcus  aureus yang diberi  ekstrak  etanol biji  kakao  konsentrasi  7,8  mg/mL  tampak membesar  dengan  ukuran  diameter  sel  yaitu 0,57µm,  namun  secara  visual  pada  monitor didapatkan  kesan  jumLah  sel  yang  tidak  jauh berbeda  dengan  kesan  jumLah S.  aureus yang tidak  diberi  perlakuan.  Sedangkan  kesan  jumLah S. aureus yang diberi perlakuan ekstrak etanol biji kakao  konsentrasi  15,6  mg/mL  dan  31,25  mg/mL tampak  berkurang.  Selain  adanya  penurunan kesan  jumLah  secara  visual  pada  kedua  gambar tersebut,  juga  didapatkan  adanya  pembesaran ukuran yaitu 0,714µm pada S. aureus yang diberi ekstrak  etanol biji kakao konsentrasi 15,6 mg/mL dan adanya tonjolan pada permukaan dinding sel serta pembesaran ukuran sel yaitu 0,714 µm pada S.  aureus yang  diberi  ekstrak  etanol  biji  kakao konsentrasi  31,25  mg/mL.  Dari  ketiga  gambar tersebut  walau  tidak  didapatkan  perubahan
morfologi  yang  tidak  berbeda  jauh  namun  dapat disimpulkan  bahwa  kadar  hambat  minimum ekstrak  etanol  biji  kakao  terhadap  pertumbuhan S. aureus adalah 15,6 mg/mL.
Terjadinya  perubahan  morfologi  yang  tidak berbeda  jauh  pada  tiga  konsentrasi  tersebut mungkin  karena  konsentrasi  ekstrak  yang diberikan  terlalu  rendah  yaitu  ½  KHM,  KHM,  dan 2x  KHM  sehingga  tidak  didapatkan  perubahan morfologi  yang  sangat  drastis  antara  masing- masing  konsentrasi.  Perubahan  morfologi  yang terjadi  adalah  akibat  ekstrak  etanol  biji  kakao yang  mengandung  polifenol  yang  sebagian  besar mengandung  flavonoid,  katekin,  prosianidin, antosianin, dan tanin kompleks dimana komponen  tersebut  diketahui  bersifat  sebagai antimikroba. Penelitian secara in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa polifenol biji kakao memiliki antioksidan  yang  mampu  menekan  hydrogen peroksida  dan  anion  superoksida,  melindungi lemak  dari  kerusakan  oksidasi,  bertindak  sebagai antiulserik, antimikroba, antikarsinogenik, antimutagenik, menghambat pertumbuhan tumor dan  kanker,  serta  mengurangi  penyakit-penyakit karena oksidasi low density lipoprotein (Kattenberg,  2000;  Osakabe et  al .,  2000,  1998a, 1998b).
Polifenol biji kakao yang terdiri dari katekin, tanin, antosianin  dan  flavonoid  ini  secara  keseluruhan mampu  menghambat  dan  membunuh  bakteri dengan  mekanisme  kerja  yang  berbeda-beda. Staphylococcus  aureus yang diberi  ekstrak  etanol biji kakao konsentrasi 7,8 mg/mL dan 15,6 mg/mL menunjukkan adanya pembesaran ukuran. Pembesaran  ukuran  ini  dapat  terjadi  akibat pengaruh  katekin,  tanin,  dan  flavonoid  yang terkandung  dalam  polifenol.  Katekin  dapat merusak  membran  sitoplasma  mikroba  sehingga menyebabkan  kebocoran  metabolit  penting  yang dapat  menginaktifkan  sistem  enzim  bakteri. Kandungan  polifenol  lain  yaitu  tanin  yang mempunyai  target  pada  polipeptida  dinding  sel dapat  menyebabkan  kerusakan  pada  dinding  sel. Terjadinya  kerusakan  pada  dinding  sel  bakteri tersebut  menyebabkan sel bakteri menjadi tanpa dinding  yang  disebut  protoplasma  (Jawetz,  2001 dalam  Hayati,  2006).  Sehingga  akan  terjadi kerusakan  dinding  sel  dan  menyebabkan kerusakan pada membran sel yang mengakibatkan  hilangnya  sifat  permeabilitas membran  sel,  sehingga  keluar  masuknya  zat-zat
seperti  air,  nutrisi,  dan  enzim  tidak  terseleksi. Polifenol yang bersifat menarik protein juga dapat menyebabkan pembesaran ukuran ini.
Sedangkan  pada S.  aureus yang  mendapatkan ekstrak etanol biji kakao konsentrasi 31,25 mg/mL selain  terjadi  pembesaran  ukuran,  terdapat  sel yang  mengalami  penonjolan  pada  permukaan selnya.  Perubahan  yang  terjadi  karena  sifat polifenol  yang  merusak  dinding  sel  sehingga material-material  di  dalam  sel  dapat  mudah keluar. Flavonoid yang dapat menghambat fungsi DNA gyrase juga dapat menjadi penyebab terjadi penonjolan  tersebut.  Penghambatan  pada  fungsi DNA gyrase dilakukan dengan merusak membran sitoplasma bakteri yang terdiri atas lipid dan asam amino  dengan  mereaksikannya  dengan  gugus alkohol  pada  senyawa  flavonoid.  Proses  ini  akan menyebabkan dinding sel rusak sehingga senyawa tersebut  dapat  masuk  ke  dalam  inti  sel  bakteri yang  dapat  mengubah  bentuk  sel  bakteri tersebut.  Selanjutnya  senyawa  tersebut  kontak dengan  DNA  pada  inti  sel  bakteri.  Perbedaan kepolaran  antara  lipid  penyusun  DNA  dengan gugus  alkohol  pada  senyawa  flavonoid  tersebut akan  menyebabkan  rusaknya  struktur  lipid  dari DNA  bakteri  sehingga  bakteri  akan  mengalami lisis dan mati.
Tidak  terpisahnya  septum  dapat  terjadi  karena pengaruh  tanin  yang  terdapat  dalam  polifenol. Mekanisme  kerja  tanin  sebagai  antibakteri berhubungan dengan kemampuannya menginaktivasi  adhesi  sel  mikroba  (molekul  yang menempel  pada  sel  inang)  yang  terdapat  pada permukaan sel, enzim yang terikat pada membran sel  dan  polipeptida  dinding  sel  (Jambang,  2004). Sehingga  tidak  terjadi  pemisahan  septum  yang sempurna. Pada S. aureus yang resisten rerhadap metisilin  dapat  ditemukan  14 coccus dengan septum yang tidak terpisah setelah diberi ekstrak air  teh  hijau  ( Camellia  sinensis )  konsentrasi  256 µg/L (1/2 MIC).
Sehingga  perubahan  morfologi  bakteri S.  aureus yang  sudah  dapat  dibuktikan  pada  pemberian ekstrak  etanol  biji  kakao  konsentrasi  31,25 mg/mL,  15,6  mg/mL,  dan  7,8  mg/mL  terhadap S. aureus semakin memperkuat bukti bahwa ekstrak etanol  biji  kakao  memiliki  daya  antibakteri terhadap S. aureus secara in vitro .

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan bahwa ekstrak etanol biji kakao pada konsentrasi 15,6  mg/mL  dan  7,8  mg/mL  menyebabkan terjadinya perubahan morfologi S. aureus berupa pembesaran  ukuran  diameter  sel  dan  tidak terpisahnya  septum.  Pada  konsentrasi  31,25 mg/mL  juga  tampak  adanya  penonjolan  pada dinding  sel  bakteri.  Dari  hasil  penelitian  yang diperoleh,  perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut tentang  :  1)  uji  aktivitas  antibakteri  ekstrak  biji kakao terhadap S. aureus dengan metode pelarut yang lain 2) uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol biji  kakao  terhadap S.  aureus secara in  vivo 3) perubahan  morfologi S.  aureus akibat  paparan ekstrak  etanol  biji  kakao  secara in  vitro dengan metode TEM ( Transmission Electron Microscope ).

## Ucapan Terima Kasih
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada Fakultas  Kedokteran  Universitas  Jember  yang telah  memberikan  fasilitas  demi  terlaksananya penelitian  ini.  Penulis  juga  mengucapkan terimakasih  kepada  Pusat  Penelitian  Kopi  dan Kakao  Indonesia  yang  telah  memberikan  fasilitas dan dukungan finansial dalam penelitian ini.

## Daftar Pustaka
Ajizah,  Bioscientiae.  2004. Sensitvitas  Salmonella typhimurium terhadap Ekstrak Daun Psidium guajava L . Vol. 1 No.1: 31-38.
D.  Stauth.  2011. Studies  force  New  View  on Biology of Flavonoids . Oregon: Oregon State University. http://eurakalert.org.htm .  [1 November 2011].
E.  Jawetz,  Melnick  &  E.A.  2008.  Adelberg, Mikrobiologi  Kedokteran .  Terjemahan  Staf
Pengajar  Mikrobiologi  Fakultas  Kedokteran Universitas Airlangga dari Medical
Microbiology .  Jakarta:  EGC.  Halaman  225- 232.
E.  Suswati,  dan  D.  Mufida.  2009. Petunjuk Praktikum  Mikrobiologi .  Jember:  Fakultas Farmasi Universitas Jember.
Farmacia.  2007.  4th  symposium  of  Indonesia Antimicrobial  Resistance  Watch.  [serial
online]. http://www.majalah- farmacia.com.[19 Desember 2011]
H.R.  Kattenberg,  2000. Nutritional  Function  of Cocoa  and  Chocolate .  The  Manufacturing Confectioner. Vol. 80 No.2 : 33-37.
K.  Osawa,  K.  Miyazakil.  I.  Shimura,  J.  Okuda,  M.
Matsumoto, and T. Oshima. 2001. Identification of Cariostatic Substances in the Cacao Bean Husk: Their Antiglucosyltransferase  and  Antibacterial Activities. Dent. Res. Vol. 80 (11): 2000-2004
K. Othman, K. Miyazakil. I. Shimura, J. Okuda, M.
Matsumoto, and T. Oshima. 2001. Identification  of  Cariostatic  Substances  in The Cacao Bean Husk: Their Antiglucosyltransferase  and  Antibacterial Activities . Dent . Res . Vol. 90 (11):2000-2004
Khusnan,  I.O.S  Siti,  dan  Soegiyono,  2008. Isolasi, Identifikasi dan Karakterisasi Fenotip Bakteri Staphylococcus aureus dari Limbah Penyembelihan  dan  Karkas  Ayam  Potong .
Jurnal Veteriner Maret. Vol. 9 No.1 : 45-51
L.  Wang,  J.F.  Barrett.  2007.  Control  and Prevention  of  MRSA  Infections.  Dalam: Yinduo  Ji  (editor),  Methods  in  Molecular Biology: Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus  Protocols .  Totowa-New  Jersey; Humana Press Inc.,: 209-20
M. Tamarizki. 2011. “Uji Daya Antibakteri Ekstrak
Polifenol  Biji  Kakao  ( Theobroma  cacao ) terhadap Pertumbuhan Staphylococcus aureus Secara In Vitro”. Jember.
N.  Jambang.  2004.“Study  Aktivitas  Antibakteri dan  Antioksidan  pada  10  Merk  Teh  Hitam yang Beredar di Pasaran Kota Malang”. Tidak Diterbitkan.  Skripsi.  Jurusan  Teknologi Pertanian,  Fakultas  Teknologi  Pertanian, Universtas Brawijaya Malang.
O. Denis, B. Jans, A. Deplano. 2007. Epidemiology of  MRSA  Among  Residents  of  Nursing  in Belgium .  Department  of  Microbiology.
Erasmus Hospital Brussei; Belgia,: 1-4
Refdanita. 2004. Pola  Kepekaan Kuman terhadap Antibiotika  Di  Ruang  Rawat  Intensif  Rumah Sakit  Fatmawati  Tahun  2001-2002 . Mak. Kes . Vol. 8 No.2 : 41-48
Setiadevi,  Shinta.  2010.  “Karakterisasi  Ekstrak Polifenol  Biji  Kakao  Non  Fermented  dari
Berbagai  Macam  Metode  Ekstraksi”.  Tidak Diterbitkan.  Skripsi.  Jember:  Jurusan  Teknik Hasil  Pertanian,  Fakultas  Teknik  Pertanian Universitas Jember.
Todar,  Kenneth.  2008. Staphylococcus  and Staphylococcal  Diseases .  [serial  online].
http://www.textbookofbacteriology.net .  [9 April 2009]