OPTIMASI  KONDISI  PEMURNIAN  ASAM  LEMAK  OMEGA-3 DARI  MINYAK  HASIL  SAMPING PENEPUNGAN  TUNA ( Thunnus sp) DENGAN  KRISTALISASI  UREA
[Optimizing Conditions for the Purification of Omega-3 Fatty Acids from By-product of Tuna ( Thunnus sp) Meal Processing by Urea Crystallization
Teti Estiasih 1)* , Kgs. Ahmadi 2) , Fithri Choirun Nisa 1) , dan Fitriyah Kusumastuti 1)
1) Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Brawijaya, Jl Vetera Malang
2) Jurusan Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Tribhuwana, Jl. Tlogowarna, Tlogomas Malang
Diterima  29 Januari  2009 / Disetujui  27 Desember  2009

## ABSTRACT
Omega-3 fatty acids (  -3) are proven to have health beneficial effects.  Some effort had been done to obtained oil high in  -3 fatty acids.  Among the methods developed, urea crystallization was preferred because it is simple, economic, and result in high purity of fatty acids. A source that had not been widely explored for  -3 fatty acids production is the by-product of tuna meal processing. This research studied the optimization condition for separation and purification of  -3 fatty acids from the by-product of tuna meal processing by urea crystallization. Crystallization reaction conditions of urea inclusion were optimized using the response surface methodology, and the model was developed.Optimization result showed a quadratic polynomial regression equation of  Y=  140,52677X 1 +  8,38203X 2 –  19,85850X 12 –  0,12173X 22 –  0,74000X 1 X 2 –  240,33546  with  X 1 =urea  to  fatty  acid  ratio  and  X 2 =crystallization  time. Maximum response was obtained at urea to fatty acid ratio of 3,07:1,crystallization time of 25,10 hours, and predicted response was 80,60%.  Analysis of variance showed that urea to fatty acid ratio and crystallization time affected response.  Under optimal conditions, the product was 3.89 times concentrated and  the  purity  of  -3  fatty  acids  was  81,98%.  Verification  result  revealed  that  the  predicted  value  from  this  model  was  reasonably  close  to  the experimentally observed value.  Urea crystallization process changed quality parameters that were oxidation level (peroxide value, anisidin value, and totox value), Fe and Cu content, P content, and water content.  The changes were caused by adsorption of primary and secondary oxidation products, part of metals, and phosphoric compound onto unsaponifiable matters or soluble into water.
Key words :  -3 fatty acids, concentrate, urea crystallization, optimization

## PENDAHULUAN
Indonesia  merupakan  negara  pengimpor  asam  lemak  -3, walaupun  sebenarnya  mempunyai  potensi  lokal  sumber  asam lemak  -3 yang belum dimanfaatkan optimum.  Salah satu sumber asam  lemak  -3  tersebut  adalah  minyak  hasil  samping penepungan  tuna.  Produksi  tuna  di  Indonesia  mencapai 2.163.880,056 ton pada tahun 2007 (Suseno dan Perbowo, 2009). Pada  penepungan  tersebut  dihasilkan  minyak  ikan  sebagai  hasil samping  proses  yang  masih  mengandung  asam  lemak  -3  tinggi (Estiasih et al ., 2006).
Minyak  tinggi  asam  lemak  -3  dapat  dibuat  dengan  berbagai metode  yaitu  kristalisasi  pelarut  suhu  rendah  (Ahmadi,  2006), pemadatan  cepat  (Moffat et  al , 1992;  Estiasih et  al. ,  2005,  2006), ekstraksi cairan superkritis (Tatum and Chow, 2000), kromatografi (Bimbo,  1998),  enzimatis  (Sridhar  dan  Lakhsminarayana,  1992; Yamane et  al ,  1992;  Carvalho et  al ,  2002;  Lee et  al ,  2003),  dan kristalisasi urea (Haagsma et al ., 1982; Ackman et al ., 1988; * Ganga et  al .,  1998;  Wanasundara and Shahidi,  1999;  Hwang and Liang, 2001;  Liu et  al .,  2006).    Diantara  berbagai  teknik  pembuatan konsentrat  asam  lemak  -3,  teknik  yang  paling  sederhana  dan
* Korespondensi penulis : HP. 08123304966 Email : teties@yahoo.co.id
efisien  adalah  kristalisasi  urea.  Konsentrat  asam  lemak  -3  yang dihasilkan ada dalam struktur kimia asam lemak bebas.
Kristalisasi  urea  merupakan  teknik  yang  efektif  untuk mendapatkan konsentrat  PUFA  dalam  bentuk asam lemak bebas. Teknik  dapat  menghilangkan  asam  lemak  jenuh  dan  asam monoenoat  (Wu et  al., 2008).    Asam  lemak  yang  jenuh  dan  tidak jenuh dapat dipisahkan dengan kristalisasi urea karena perbedaan linearitas  rantai  alkil  keduanya.  Asam  lemak  jenuh  mempunyai rantai  alkil  yang  lurus.  Asam  lemak  yang  tidak  jenuh  karena mempunyai  ikatan  rangkap  mempunyai  lekukan  pada  ikatan rangkap (Guil-Guerrero and Belarbi, 2001; Hayes, 2002).
Yeo  dan  Harris  (1999)  menyebutkan  bahwa  pada  kompleks inklusi  urea,  molekul  urea  yang  berikatan  hidrogen  membentuk saluran ( tunnel ) yang paralel. Struktur saluran urea tersebut bersifat stabil  jika  saluran  tersebut  diisi  oleh  senyawa  tamu  ( guest compound )  dengan  susunan  yang  rapat.    Saluran  urea  tersebut mempunyai  diameter  berdasarkan  radius  ikatan  van  der  Waals yang  bervariasi  yaitu  antara  5,5  dan  5,8A  .    Hanya  molekul  yang sesuai  yang  dapat  menjadi  senyawa  tamu  membentuk  kompleks inklusi.
Beberapa  faktor  yang  mempengaruhi  proses  kristalisasi  urea dengan  asam  lemak  adalah  suhu  kristalisasi,  rasio  urea:asam lemak,  dan  lama  proses.    Ketiga  faktor  tersebut  mempengaruhi pembentukan  kompleks  inklusi  urea-asam  lemak  sehingga
mempengaruhi  kadar  asam  lemak  -3  dalam  konsentrat  yang dihasilkan  (Wanasundara and Shahidi,  1999;  Hwang and Liang, 2001).
Untuk  minyak  hasil  samping  pengalengan  tuna,  hasil  terbaik yang  diperoleh  dari  penelitian  Elizabeth  (1992)  adalah  kadar EPA+DHA  46,07%  dengan  faktor  yang  dikaji  adalah  suhu kristalisasi  dan  rasio  urea:minyak.    Konsentrat  asam  lemak  -3 yang  dihasilkan  bukan  pada  kondisi  proses  optimum.    Adapun minyak  hasil  samping  penepungan  tuna  sebagai  bahan  baku pembuatan konsentrat asam lemak  -3 dengan metode kristalisasi urea belum pernah dikaji.  Oleh karena itu, belum diketahui kondisi proses  kristalisasi  yang  dapat  menghasilkan  kadar  EPA+DHA maksimum.    Pendekatan  metodologi  permukaan  respon  (RSM, response surface methodology ) dapat menentukan secara simultan kondisi  proses  optimum  dari  berbagai  faktor  yang  dikaji  sehingga penentuannya bersifat efisien (Wanasundara dan Shahidi, 1999).
Oleh  karena  itu  penting  untuk  menentukan  kondisi  optimum proses  kristalisasi  urea  pada  pemurnian  asam  lemak  -3  dari minyak hasil samping penepungan tuna.  Kondisi optimum penting ditentukan  supaya  proses  kristalisasi  efisien  dalam  menghasilkan konsentrat  asam  lemak  -3  dengan  kadar  asam  lemak  -3 tertinggi .

## METODOLOGI
Bahan dan alat Bahan  baku  terdiri  limbah  padat  pengolahan  tuna  yang digunakan  untuk  penepungan  tuna  ( Thunnus  sp )  dari  PT  Maya Muncar – Banyuwangi.  Adapun minyak hasil samping penepungan tuna diperoleh dengan cara pengukusan limbah padat suhu 100  C selama  15  menit  dilanjutkan  dengan  pengepresan  mekanis  dan dekantasi.
Bahan-bahan  kimia  yang  digunakan  adalah  standar  asam lemak  (C12:0,  C14:0,  C16:0,  C16:1-  9,  C18:0,  C18:1-  9,  C18:2-  6,  C18:3-  3,  C20:0,  C22:1  -9,  C20:5-  3,  C22:6-  3,  C24:0), standar  internal  metil  ester  C19:0  (Sigma  Co.),  metanol,    etanol, urea  (teknis);  NaOH,  heksana,  etanol,  KOH,  metilen  klorida,  BF 3 - metanol,  isooktana,  p-anisidin,  benzena,  BaCl 2 ,  FeSO 4 ,  amonium tiosianat, FeCl 2 , HNO 3 , H 2 O 2 , FeCl 3 , fenolftalein, asam asetat, HCl, Na 2 EDTA,  KI,  pati,  kloroform,  kalium  tiosianat,  toluena,  urea  ( pro- analysis ),  kertas  saring  Whatman  No.1,  kertas  saring  kasar,  gas hidrogen, gas nitrogen, dan gas helium.
Peralatan  yang  digunakan  adalah  kromatografi  gas  (GC-14B, Shimadzu),  integrator  (Chromatopac  C-RGA,  Shimadzu),  neraca analitik,  refrigerator,  alat-alat  gelas,  pengaduk  magnet,  dan rotavapor (Buchi).

## Metode penelitian
Prosedur pembuatan konsentrat asam lemak  -3 (Haagsma et al ., 1982)
Saponifikasi
Sebanyak  1000  g  minyak  hasil  samping  pengolahan  ikan dicampur  dengan    2000  ml  larutan  NaOH    dalam  air/etanol  dan
diaduk  selama  30  menit  pada  suhu  60  C.    Setelah  saponifikasi ditambahkan  400  ml  air.    Larutan  NaOH  disiapkan  dengan  cara melarutkan 480 g NaOH dan 5 g Na 2 EDTA dalam 1600 ml air.  Ke dalam larutan ini ditambahkan 1600 ml etanol.

## Ekstraksi asam lemak
Heksana sebanyak 4000 ml ditambahkan dan diaduk selama 1 jam.  Lapisan  atas  (sekitar  1600  ml)  mengandung  bahan  tidak tersabunkan  dan  dibuang.  HCl  pekat  ditambahkan  pada  lapisan bawah  dan  diaduk  sampai  pH  mencapai  1.  Dua  lapisan  akan terbentuk.  Lapisan  bawah  dibuang  dan  lapisan  atas  (lapisan heksana)  diambil  dan  dievaporasi  sampai  semua  pelarut  habis pada suhu 30  C.

## Kristalisasi urea
Asam  lemak  ditambahkan  pada  larutan  urea  panas  (suhu  60- 65  C)  dalam  metanol  dengan  diaduk  pada  kecepatan  konstan. Jumlah  urea  yang  dilarutkan  sesuai  dengan  perbandingan urea:asam  lemak  menurut  perlakuan.  Volume  metanol  yang digunakan  adalah  200  ml  untuk  minyak  ikan  asal  sejumlah  25  g. Pada  tahap  ini  dilakukan  optimasi  rasio  urea:asam  lemak  bebas. Jika  diperlukan  larutan  dipanaskan  sampai  jernih.  Urea  dibiarkan membentuk  kristal  dengan  asam  lemak  pada  lama  kristalisasi sesuai  perlakuan.  Pada  tahap  kristalisasi  urea  ini  dilakukan optimasi  lama  kristalisasi  sesuai  dengan  rancangan  percobaan yang akan digunakan.  Kristal urea yang terbentuk dipisahkan dari larutan  induk  dengan  penyaringan.    Asam  lemak  dalam  filtrat kemudian diekstraksi.
Ekstraksi asam lemak  -3 Untuk setiap 3 liter filtrat, ditambahkan 1 liter heksana dan 0,5 liter HCl pekat.  Campuran diaduk selama 1 jam.  Lapisan heksana dipisahkan.  Sebanyak  1,5  liter  air  ditambahkan  pada  lapisan bawah.  Lapisan  ini  kemudian  diekstrak  kembali  dengan  1  liter heksana. Kedua ekstrak tersebut kemudian dicampurkan.  Heksana dipisahkan dengan asam lemak melalui evaporasi pada suhu 30  C.

## Optimasi dengan metodologi permukaan respon
Teknik  optimasi  dengan  menggunakan  metode  permukaan respon  diaplikasikan  pada  kristalisasi  urea  dengan  tujuan mendapatkan konsentrat asam lemak  -3 dengan kadar EPA+DHA tertinggi.  Faktor  yang  diteliti  pada  penelitian  ini  adalah  rasio urea:minyak (X 1 ) dan lama kristalisasi (X 2 ) dengan respon (Y) kadar EPA+DHA  dalam  konsentrat  asam  lemak  -3  yang  dihasilkan. Respon  yang  dioptimasi  untuk  semua  jenis  minyak  ikan  adalah kadar EPA+DHA.  Kombinasi dari perlakuan (X 1 dan X 2 ) (Tabel 2) sesuai  dengan  rancangan  Komposit  Pusat  Ordo  Dua  dengan  dua kali ulangan.
Pengulangan  dua  kali  dilakukan  untuk  semua  kombinasi perlakuan  kecuali  untuk  titik  pusat  (0,0)  dilakukan  ulangan  5  kali. Seluruh  percobaan  dilakukan  dengan  cara  acak  untuk meminimumkan  bias.  Model  regresi  polinomial  kuadratik diasumsikan  untuk  memprediksi  respon.  Dugaan  model  tersebut digambarkan dengan persamaan:
Y = β o +  β i X i +  β ii X i2 +  β ij X i X j
Dengan β o ,  β i ,  β ii ,  βij merupakan  intersep,  koefisien  regresi linear,  kuadratik  dan  interaksi,  sedangkan X i dan X j merupakan variabel  bebas.  Analisis  data  dilakukan  dengan  program Design Expert DX 6.0.10 ( trial version ).   Analisis  statistik yang digunakan adalah  analisis  regresi  atau  pemilihan  model,  analisis  ragam,  dan analisis kanonik.
Analisis  statistik  diawali  dengan  pemilihan  model  atau  analisis regresi yang sesuai berdasarkan sequential model sum of square, uji simpangan model, dan  ringkasan model secara statistik.  Model yang dievaluasi meliputi model linear, interaksi (2FI), kuadratik, dan kubik.  Model  yang  memenuhi  ketiga  dasar  pemilihan  tersebut adalah model yang terpilih. Selanjutnya dilakukan uji analisis ragam untuk  mengetahui  signifikansi  pengaruh  kedua  faktor  yang  dikaji terhadap respon.
Berdasarkan  model  yang  terpilih  dan  persamaan  yang diperoleh, dilakukan analisis terhadap  permukaan respon dan plot kontur.  Titik optimum untuk kedua faktor yang dioptimasi diperoleh berdasarkan  analisis  kanonik.    Verifikasi  dilakukan  pada  kondisi optimum untuk mengetahui ketepatan model.
Karakterisasi  minyak,  asam  lemak  hasil  hidrolisis,  dan konsentrat asam lemak  -3 dari kondisi kristalisasi urea optimum
Minyak  hasil  samping  penepungan  tuna,  asam  lemak  hasil hidrolisis,  dan  konsentrat  asam  lemak  -3  yang  dihasilkan  pada kondisi  proses  kristalisasi  optimum  dianalisis  untuk  mengetahui karakteristiknya dengan mengacu pada standar food grade fish oil dari International  Association  of  Fishmeal  and  Oil  Manufacturers (IFOMA) (Tabel 8).
Analisis  yang  dilakukan  meliputi  profil  asam  lemak  (metilasi metode  Park  dan  Goin,  1994)  dengan  kuantifikasi  dilakukan berdasarkan persentase relatif dan persentase berat menggunakan standar internal metil ester C19:0; tingkat oksidasi dengan bilangan peroksida (Hiels dan Thiel modifikasi Champan dan Mackey dalam Adnan,  1980),  bilangan  anisidin  (IUPAC,  1979),  bilangan  totoks
(IUPAC, 1979); kadar air (AOCS, 1990); viskositas; berat jenis; dan rendemen.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Profil    asam  lemak  minyak  hasil  samping  penepungan tuna
Profil  asam  lemak  minyak  hasil  samping  penepungan  tuna dapat dilihat pada Tabel 1.  Tabel 1 menampilkan komposisi asam lemak  dengan  dua  cara  yaitu  berdasarkan  berat  (%  b/b)  dengan perhitungan  menggunakan  standar  internal  metil  ester  C19:0  dan persentase  relatif.    Perbedaan  komposisi  dari  kedua  perhitungan tersebut  disebabkan  persentase  relatif  sangat  dipengaruhi  oleh jumlah  dan  luas  area  puncak  asam  lemak  yang  muncul  pada kromatogram.    Penggunaan  persentase  berat  lebih  menunjukkan jumlah (dalam berat) asam lemak yang sebenarnya.
Minyak  hasil  samping  penepungan  tuna  menunjukkan  kadar EPA dan DHA sebesar 8,68% dan 27,76% berdasarkan persentase relatif.  Visentainer et  al., (2007)  menyebutkan  bahwa  minyak  ikan tuna ( Thunnus thynnus ) mempunyai kadar EPA dan DHA 4,7% dan 36,3.Howe et al ., (2002) melaporkan bahwa minyak ikan tuna dari limbah penepungan mengandung EPA 4,8% dan DHA 22,4%.
Bahan baku yang digunakan untuk proses penepungan adalah limbah  padat  pengalengan  dan  pen- fillet -an  tuna  yaitu viscera , daging  merah,  sirip,  ekor,  dan  kepala.  Mata,  bantalan  mata,  dan otak  merupakan  bagian  dari  kepala  ikan  tuna  yang  kaya  dengan asam  lemak  -3  terutama  DHA.  Yuwono  (1993)  menunjukkan bahwa minyak ikan yang diekstrak dengan pelarut dari limbah mata dan bantalan mata ikan tuna mempunyai kadar EPA 5,1% dan DHA 26,2% untuk tuna jenis  Yellowfin serta kadar EPA 5,9% dan DHA 24,1% untuk tuna jenis Skipjack.
Banyak  faktor  yang  mempengaruhi  komposisi  asam  lemak dalam minyak ikan.  Visentainer et al., (2007) menyebutkan bahwa fluktuasi  kualitas  makanan  ikan  yaitu  fitoplankton  mempengaruhi kadar asam lemak  -3 dalam minyak ikan.
Tabel 1.    Profil asam lemak minyak dari hasil samping penepungan tuna dan konsentrat asam lemak  -3 yang diperoleh dari kondisi kristalisasi urea optimum Jenis Asam Lemak MHS Penepungan Tuna Konsentrat asam lemak  -3 Tingkat Pengayaan* % (b/b) % relatif % (b/b) % relatif C14:0 2,51 4,35 0,53 0,51 C16:0 13,68 23,67 0,06 0,06 C16:1  -9 7,11 12,30 2,96 2,85 C18:0 0,60 1,03 0 0 C18:1  -9 9,13 15,80 16,48 15,88 C18:2  -6 1,30 2,25 0 0 C18:3  -3 0,25 0,44 1,79 1,73 C20:0 0,84 1,45 0 0 C22:1  -9 1,31 2,27 0 0 EPA 5,02 8,68 14,93 14,39 2,97 DHA 16,04 27,76 67,05 64,59 4,18 EPA+DHA 21,06 36,44 81,98 78,98 3,89
Keterangan: MHS (Minyak Hasil Samping) % (b/b) menunjukkan berat asam lemak yang diukur dengan membandingkan dengan berat standar internal metil ester C19:0 % relatif merupakan persentase luas area puncak asam lemak terhadap total luas area puncak asam lemak teridentifikasi yang muncul pada kromatogram *Tingkat pengayaan dihitung dengan cara membagi kadar EPA+DHA dalam konsentrat asam lemak  -3 dari kondisi kristalisasi urea optimum dengan kadar EPA+DHA dalam minyak hasil samping penepungan tuna
Lebih lanjut dijelaskan bahwa faktor yang mempenaruhi komposisi asam  lemak  adalah  spesies,  jenis  kelamin,  kematangan  seksual, ukuran tubuh, lokasi penangkapan, suhu perairan, jenis makanan, dan  musim.    Faktor-faktor  tersebut  yang  menyebabkan  variasi komposisi  minyak  tuna  dibandingkan  penelitian-penelitian sebelumnya.

## Respon  kadar  EPA+DHA  pada  optimasi  dengan  metodologi permukaan respon
Minyak  hasil  samping  penepungan  tuna  mempunyai  kadar EPA+DHA  sebesar  21,06%  (b/b).    Hasil  analisis  respon  terhadap konsentrat  asam  lemak  -3  dari  hasil  samping  penepungan  tuna dengan  menggunakan  Rancangan  Komposit  Pusat  dapat  dilihat pada  Tabel  2  dengan  kadar  EPA+DHA  antara  61,16-82,77%. Tingkat  pengayaan  EPA+DHA  dari  minyak  ikan  asal,  yaitu  kadar EPA+DHA  dalam  konsentrat  asam  lemak  -3  dibagi  kadar EPA+DHA  dalam  minyak  ikan  hasil  samping  penepungn  tuna, adalah 2,90-3,93 kali.
Hasil penelitian Yuwono (1993) menunjukkan kadar EPA+DHA yang  diperoleh  dalam  konsentrat  minyak  mata  dan  bantalan  mata tuna sebesar 83,9% dengan kadar EPA+DHA awal 31,3% sehingga tingkat pengayaan 2,62 kali.  Adapun optimasi minyak kepala tuna hasil  hidrolisis  enzim  oleh  Liu et  al., (2006)  menunjukkan  kadar 85,02% (persentase relatif) tetapi kadar asam lemak  -3 awal tidak disebutkan.  Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  tingkat  pengayaan yang  lebih  tinggi  dari  penelitian  Yuwono  (1993)  yang  diduga disebabkan  kadar  EPA+DHA  dalam  minyak  hasil  samping penepungan  tuna  yang  lebih  rendah.    Kadar  EPA  dan  DHA  yang rendah  berarti  asam  lemak  yang  lebih  jenuh  yang  mempunyai preferensi  membentuk  kompleks  lebih  tinggi  sehingga pembentukan kompleks inklusi urea lebih banyak.  EPA dan  DHA
merupakan asam lemak yang mempunyai preferensi rendah untuk membentuk  kompleks  inklusi  sehingga  tetap  berada  dalam  filtrat. Akibatnya, pengayaan EPA dan DHA lebih tinggi.

## Model yang sesuai
Metode permukaan respon digunakan untuk menentukan model yang  sesuai.    Model  yang  dievaluasi  mencakup  linear,  2FI (interaksi),  kuadratik,  atau  kubik.  Pemilihan  model  berdasarkan sequential  model  sum  of  square (Tabel  3)  menunjukkan  bahwa model  yang  signifikan  (P<0,05)  adalah  kuadratik  dan  disarankan oleh program.  Model lain yaitu linear, interaksi (2FI) dan kubik tidak signifikan (P>0,05), sehingga model terpilih adalah kuadratik.
Proses  pemilihan  model  berikutnya  berdasarkan  ringkasan model  secara  statistik  ( model  summary  statistics )  (Tabel  5). Parameter yang digunakan untuk memilih model yang tepat adalah standar  deviasi  terendah, R-square tertinggi, Adjusted  R-square tertinggi, Predicted R-square tertinggi, dan PRESS ( Prediction Error Sum of Square ) terendah.  Diantara model  yang memenuhi kriteria yang disarankan adalah model kuadratik.
Berdasarkan  ringkasan  statistik,  model  kuadratik  mempunyai standar deviasi terkecil dibandingkan model lain dengan nilai Adj.R 2 tertinggi sebesar 0,7574.  Berarti variabel rasio pelarut:minyak dan lama  ekstraksi  berpengaruh  terhadap  keragaman  respon  sebesar 75,74% sedangkan sisanya sebesar 25,26% dipengaruhi faktor lain yang tidak dijadikan variabel yang diteliti.
Berdasarkan tiga proses pemilihan model tersebut model yang sesuai untuk minyak hasil samping penepungan tuna adalah model kuadratik.  Hasil  analisis  ragam  dari  permukaan  respon  kuadratik menunjukkan  model  kuadratik  mempunyai  pengaruh  yang  nyata terhadap respon (Tabel 6).
Tabel  2.  Rancangan  komposit  pusat  ordo  kedua  untuk  kristalisasai  urea  pada  pembuatan  konsentrat  asam  lemak  -3  dari  minyak  hasil  samping penepungan tuna dan respon kadar EPA+DHA
No. Variabel Kode Variabel Asli Respon Kadar EPA+DHA (% b/b) X1 X2 Rasio urea:asam lemak Lama (jam) 1 -1 -1 2,5:1 18 61,16 2 -1 1 2,5:1 30 70,51 3 1 -1 3,5:1 18 72,28 4 1 1 3,5:1 30 72,75 5 0 0 3:1 24 80,65 6 0 0 3:1 24 82,33 7 0 0 3:1 24 77,77 8 0 0 3:1 24 80,22 9 0 0 3:1 24 80,51 10 -1,414 0 2,293:1 24 71,75 11 1,414 0 3,707:1 24 72,53 12 0 -1,414 3:1 15,516 71,36 13 0 1,414 3:1 31,07 75,25
Tabel 3.  Uraian jumlah kuadrat dari urutan model ( Sequential Model Sum of Square ) untuk minyak hasil samping penepungan tuna
Sumber Jumlah Kuadrat db
Kuadrat Tengah F hit Prob>F Keterangan Rata-rata 72232,99 1 72232,99 Linear 55,49 2 27,75 0,80 0,4761 2FI 19,71 1 19,71 0,54 0,4802 Kuadratik 270,16 2 135,08 16,61 0,0022 Suggested Kubik 21,11 2 10,56 1,47 0,3140 Aliased Residu 35,82 5 7,16
Tabel 4. Uji simpangan model ( lack of fit test ) untuk kristalisasi urea minyak hasil samping penepungan tuna
Sumber Jumlah Kuadrat db Kuadrat Tengah Fhit Prob>F Keterangan Linear 336,09 6 56,01 20,90 0,0055 2FI 316,37 5 63,27 23,61 0,0045 Kuadratik 46,21 3 15,40 5,75 0,0621 Suggested Kubik 25,10 1 25,10 9,37 0,0376 Aliased Galat 10,72 4 2,68
Tabel 5. Ringkasan model secara statistik  ( model summary statistics ) untuk kristalisasi urea minyak hasil samping penepungan tuna
Sumber Standar deviasi R-Squared Adjusted R Squared Predicted R-Squared PRESS Keterangan Linear 5.89 0.1379 -0.0345 -0.4503 583.44 2FI 6.03 0.1869 -0.0841 -1.3984 964.84 Kuadratik 2.85 0.8585 0.7574 0.1416 345.35 Suggested Kubik 2.68 0.9110 0.7863 -3.0345 1623.06 Aliased Tabel  6.  Analisis ragam untuk kristalisasi urea minyak hasil samping penepungan tuna Sumber Jumlah Kuadrat db Kuadrat Tengah Nilai F p-value Prob > F Keterangan Model 345,37 5 69,07 8,49 0,0069 Signifikan A-Rasio 26,15 1 26,15 3,22 0,1161 B-Lama 29,34 1 29,34 3,61 0,0993 AB 19,71 1 19,71 2,42 0,1634 A2 171,46 1 171,46 21,08 0,0025 Signifikan B2 133,59 1 133,59 16,43 0,0049 Signifikan Residual 56,93 7 8,13 Lack of Fit 46,21 3 15,40 5,75 0,0621 Tidak signifikan

## Permukaan respon dan titik optimum
Persamaan  kuadratik  dapat  digunakan  untuk  memprediksi respon  dari  berbagai  taraf  rasio  urea:asam  lemak  dan  lama kristalisasi.  Persamaan  kuadratik  yang  diperoleh  adalah:  Y= 140,52677X 1 +  8,38203X 2 –  19,85850X 12 –  0,12173X 22 – 0,74000X 1 X 2 –  240,33546 dengan X 1 = rasio urea:asam lemak dan X 2 =lama kristalisasi.
Tanda – (minus) dari variabel X 12 dan X 22 menunjukkan bahwa grafik respon yang diperoleh adalah maksimum seperti dapat dilihat pada  Gambar  1.  Berdasarkan  analisis  ragam  (Tabel  6),  rasio urea:asam  lemak  (kuadrat)  dan  lama  kristalisasi  (kuadrat) berpengaruh nyata terhadap respon.
Pengaruh  variabel  rasio  urea:asam  lemak  terhadap  respon dapat dilihat dengan mengikuti garis horizontal putus-putus sejajar sumbu  X  (Gambar  2).  Respon  akan  terus  meningkat  dengan meningkatnya  rasio  urea:asam  lemak  sampai  diperoleh  respon tertinggi.  Jika  rasio  urea:asam  lemak  terus  ditingkatkan,  respon akan  mengalami  penurunan.    Pada  rasio  urea:asam  lemak  yang lebih tinggi dari titik maksimum terjadi penurunan respon.
Rasio  urea:asam  lemak  rendah  (jumlah  urea  terbatas  dan jumlah  asam  lemak  banyak)  menyebabkan  kadar  EPA  dan  DHA yang  rendah.  Menurut  Hayes  (2002),  pembentukan  kompleks inklusi  urea  terjadi  karena  urea  membentuk  struktur  kristal heksagonal  yang  terdiri  dari  enam  molekul  urea.    Akibatnya  pada jumlah urea yang terbatas pembentukan struktur heksagonal urea yang memerangkap senyawa tamu menjadi terbatas.  Hal ini yang menyebabkan pada rasio urea:asam lemak yang rendah, sebagian asam lemak tidak dapat membentuk kompleks inklusi dengan urea. Dampaknya  adalah  kadar  EPA+DHA  dalam  konsentrat  menjadi rendah.
Menurut  Liu et  al .,  (2006)  ada  preferensi  asam  lemak  untuk membentuk  kompleks  inklusi  dengan  urea.    Penghilangan  secara sempurna  asam  lemak  jenuh  dari  minyak  pada  kristalisasi  urea bersifat  tidak  mungkin  karena  sebagian  asam  lemak  jenuh  tidak dapat membentuk kompleks dengan urea selama kristalisasi. Guil- Guerrero  dan  Belarbi  (2001)  menambahkan  bahwa  penurunan pembentukan  kompleks  dengan  urea  terjadi  dengan  peningkatan ketidakjenuhan  dan  penurunan  panjang  rantai.    Oleh  karena  itu, asam  lemak  jenuh  rantai  panjang  lebih  disukai  untuk  membentuk kompleks  dibandingkan  asam  lemak  jenuh  rantai  pendek.    Asam lemak  yang  mempunyai  ketidakjenuhan  tinggi  mempunyai kecenderungan untuk tidak membentuk kompleks dengan urea.
Design-Expert® Software Total Omega3 Design points above predicted value Design points below predicted value
82.33 61.16 X1 = A: Rasio Urea X2 = B: Lama 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 18.00 21.00 24.00 27.00 30.00 61 66.5 72 77.5 83 T o ta l O m e g a 3 A: Rasio Urea B: Lama Gambar  1.  Grafik  respon  kristalisasi  urea  minyak  hasil  samping penepungan tuna Ka da r EPA+D H A Lama kristalisasi (jam) Rasio urea:asam lemak
Design-Expert® Software
Total Omega3
Design Points 82.33 61.16 X1 = A: Rasio Urea X2 = B: Lama 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 18.00 21.00 24.00 27.00 30.00 Total Omega3 A: Rasio Urea B : L a m a 67.6016 70.2 72.7984 75.3968 75.3968 77.9952 5
Gambar 2. Kurva respon kristalisasi urea minyak hasil samping penepungan tuna
Pada  jumlah  urea  berlebih  dan  jumlah  asam  lemak  terbatas (rasio urea:asam lemak tinggi) terdapat kemungkinan pembentukan kompleks  inklusi  yang  intensif.      Kelebihan  urea  menyebabkan banyak terbentuk struktur heksagonal urea dalam metanol dengan saluran  yang  dapat  memerangkap  senyawa  tamu.      Ketersediaan struktur  heksagonal  urea  yang  tinggi  menyebabkan  kesempatan asam  lemak  untuk  membentuk  kompleks  inklusi  menjadi  tinggi. Ada  kemungkinan  asam  lemak  -3  membentuk  kompleks  inklusi dengan urea sehingga kadarnya dalam konsentrat menjadi rendah.
Menurut  Liu et  al .,  (2006),  EPA  mempunyai  preferensi  yang lebih tinggi untuk membentuk kompleks inklusi dengan urea.  Hasil penelitian  Hwang  dan  Liang  (2001)  menunjukkan  bahwa  EPA terdapat  dalam  fraksi  yang  membentuk  kompleks  dengan  urea (UCF= Urea Complexing Fraction ) yang menunjukkan bahwa pada kondisi tertentu, seperti ketersediaan urea yang tinggi,  EPA dapat membentuk kompleks dengan urea.
Fenomena  yang  sama  terjadi  pada  lama  kristalisasi  urea. Respon  meningkat  sampai  lama  kristalisasi  urea  maksimum. Perpanjangan  lama  kristalisasi  menyebabkan  penurunan  respon. Pembentukan  kompleks  inklusi  urea  merupakan  reaksi kesetimbangan  yang  bersifat  reversibel.    Kompleks  inklusi  yang terbentuk dapat terurai menjadi urea heksagonal dan asam lemak. Akan  tetapi  faktor  yang  mempengaruhi  kesetimbangan  tersebut yaitu suhu dibuat konstan sehingga tidak berpengaruh.
Pada minyak hasil samping penepungan tuna, tingkat oksidasi minyak  lebih  tinggi  dibandingkan  pengalengan.  Adanya  produk oksidasi  dalam  minyak  merupakan  inisiator  proses  autooksidasi sehingga dapat terjadi oksidasi terhadap asam lemak  -3 sebagai asam  lemak  yang  sangat  tidak  jenuh.    Walaupun  Stout  (1990) melaporkan bahwa kristal urea yang terbentuk berperan melindungi asam lemak dari proses oksidasi, tapi efek protektif tersebut terjadi pada asam lemak yang membentuk kompleks inklusi dengan urea. Akibatnya  peningkatan  lama  kristalisasi  sampai  batas  tertentu menyebabkan  penurunan  kadar  EPA+DHA  yang  diduga disebabkan  oleh  oksidasi.  Cho et  al. ,(1987)  melaporkan  bahwa
asam lemak  -3 dalam bentuk  asam lemak bebas sangat mudah teroksidasi  walaupun  suhu  penyimpanan  yang  digunakan  4  C. Pada  penelitian  ini,  suhu  kristalisasi  yang  digunakan  adalah  10  C sehingga memungkinkan proses oksidasi terhadap asam lemak  - 3 terjadi.
Letak  titik  stasioner  dapat  diprediksi  dari  grafik  respon.    Nilai sebenarnya untuk titik stasioner diperoleh dari hasil analisis kanonik yaitu rasio urea:asam lemak  3,07:1 dan lama kristalisasi 25,10 jam atau 25 jam 6 menit.  Respon pada kondisi optimum ini diprediksi sebesar 80,60%.

## Verifikasi kondisi optimum
Verifikasi  kondisi  optimum  dilakukan  dengan  membuat konsentrat asam lemak  -3 pada rasio urea:asam lemak dan lama kristalisasi optimum yaitu 3,07:1 dan 25,10 jam.  Tujuan verifikasi ini adalah  untuk  mengetahui  ketepatan  prediksi  menggunakan  model persamaan  kuadratik  yang  telah  diperoleh.  Tingkat  pengayaan untuk  minyak  hasil  samping  penepungan  tuna  hasil  verifikasi (81,98%)  hampir  sama  dengan  hasil  prediksi  berasarkan perhitungan  dengan  model  yang  sudah  diperoleh  (80,60%), sehingga  model  polinomial  kuadratik  yang  diperoleh  dapat digunakan untuk memprediksi respon.   Rendemen yang diperoleh adalah sebesar 30,40% (b/b).
Komposisi asam lemak dalam konsentrat yang dihasilkan pada kondisi kristalisasi urea optimum dapat dilihat pada Tabel 1.  Tabel 1 menunjukkan tingkat pengayaan EPA lebih rendah dari DHA.  Hal ini  berkaitan  dengan  jumlah  urea  yang  banyak  akibat  rasio urea:asam  lemak  yang  tinggi  sehingga  EPA  mempunyai kecenderungan  membentuk  kompleks  inklusi  setelah  asam  lemak yang  lain  membentuk  kompleks.    Proses  kristalisasi  urea  hampir secara sempurna menghilangkan asam lemak jenuh (C14:0; C16:0; C18:0;  C22:0).    Asam  monoenoat  C18:1  mengalami  peningkatan, tetapi  asam  monoenoat  yang  lain  (C16:1  dan  C22:1)  mengalami penurunan.  Hwang  dan  Liang  (2001)  menyebutkan  bahwa  urea dapat  membentuk  kristal  dengan  asam  lemak  jenuh  dan  asam monoenoat.  Peningkatan C18:1 diduga urea mempunyai preferensi membentuk kristal dengan asam lemak yang lebih pendek (Hwang dan  Liang,  2001),  sehingga  asam  lemak  C16:1  lebih  mudah membentuk  kompleks  inklusi  dibandingkan  C18:1.    Untuk  asam lemak  C22:1,  karena  jumlahnya  dalam  minyak  asal  sedikit,  maka penghilangan asam lemak ini mudah terjadi.
Karakteristik  mutu  minyak  hasil  samping  penepungan tuna,  asam  lemak  hasil  hidrolisis,  dan  konsentrat  asam lemak  -3 dari kondisi kristalisasi urea optimum Minyak  hasil  samping  penepungan  tuna  berwarna  coklat  tua dan keruh.  Minyak hasil samping penepungan diperoleh dari ikan afkir, viscera , dan daging merah sehingga warnanya menjadi gelap. Daging merah tuna mengandung protein heme yang berwarna lebih gelap  (Karmas,  1982).  Lebih  lanjut  Karmas  (1982)  menyatakan bahwa  pada  proses  pemasakan  terjadi  perubahan  warna  daging merah menjadi lebih gelap.  Hal ini yang menyebabkan minyak hasil samping penepungan tuna mempunyai warna gelap.
Minyak hasil samping penepungan tuna berdasarkan parameter mutu  yang  telah  dianalisis  mempunyai  standar  mutu  yang memenuhi  syarat food  grade  fish  oil dari  IFOMA  sehingga  layak
Rasio urea:asam lemak Kadar EPA+DHA La m a kr istalisasi ( jam )
digunakan  untuk  produk  pangan.    Asam  lemak  bebas  merupakan produk  antara  pada  proses  kristalisasi  urea  yang  diperoleh  dari hasil penyabunan.
Penurunan  densitas  dan  viskositas  terjadi  akibat  saponifikasi. Densitas  minyak  merupakan  fungsi  berat  molekul.    Penurunan densitas  terjadi  karena  trigliserida  yang  mempunyai  tiga  asam lemak  dalam  strukturnya  mengalami  hidrolisis  sehingga  terjadi penurunan  berat  molekul.  Viskositas  minyak  dipengaruhi  oleh panjang  rantai  dan  kejenuhan.    Keduanya  menentukan  titik  leleh ( melting point ) minyak.  Titik leleh minyak dalam bentuk trigliserida lebih  tinggi  dibandingkan  bentuk  asam  lemak  bebas  (Gunstone, 1996).    Pada  suhu  yang  sama,  asam  lemak  yang  terikat  dengan struktur gliserol dalam trigliserida mempunyai titik leleh yang lebih tinggi  dibandingkan  asam  lemak  bebasnya.    Berhubung  proses saponifikasi  menghasilkan  asam  lemak  bebas,  minyak  dalam bentuk asam lemak bebas mempunyai viskositas yang lebih rendah dibandingkan minyak asal.
Mutu  konsentrat  asam  lemak  -3  yang  dihasilkan  dari  kondisi proses  kristalisasi  urea  optimum  memenuhi  standar  mutu  minyak ikan  konsumsi  dari  IFOMA  kecuali  untuk  kadar  Cu  (Tabel  7). Dibandingkan  minyak  ikan  asal,  proses  kristalisasi  urea menurunkan tingkat oksidasi minyak, kadar P, dan sebagian logam, serta  menghasilkan warna minyak menjadi lebih terang dan jernih. Perubahan  tersebut  disebabkan  produk  hasil  oksidasi  primer maupun  sekunder,  sebagian  logam,  pigmen,  serta  fosfor teradsorpsi  pada  fraksi  tidak  tersabunkan  atau  larut  pada  fase  air pada proses penyabunan dalam tahapan kristalisasi urea.  Densitas dan  viskosita  minyak  ikan  menurun  akibat  peningkatan ketidakjenuhan dan perubahan struktur kimia minyak ikan.

## KESIMPULAN
Minyak  hasil  samping  penepungan  tuna  memenuhi  standar mutu  minyak  ikan  untuk  konsumsi  dari  IFOMA  sehingga  layak digunakan untuk bahan pangan. Minyak ikan tersebut mengandung asam lemak  -3 dalam kadar tinggi dengan keunikan tinggi DHA.
Kadar  EPA+DHA  pada  minyak  hasil  samping  penepungan  tuna adalah 21,04%.
Proses  kristalisasi  urea  dapat  meningkatkan  kadar  EPA  dan DHA  dalam  minyak  ikan.    Proses  tersebut  dipengaruhi  oleh  rasio urea:asam  lemak  dan  lama  kristalisasi.    Model  persamaan  yang diperoleh  untuk  memprediksi  kadar  EPA+DHA  berdasarkan  rasio urea:asam  lemak  dan  lama  kristalisasi  adalah  kuadratik  dengan respon maksimum.
Respon  kuadratik  yang  diperoleh  adalah  Y=  140,52677X 1 + 8,38203X 2 –  19,85850X 12 –  0,12173X 22 –  0,74000X 1 X 2 – 240,33546,    Respon  pada  kondisi  kristalisasi  optimum,  yaitu  rasio urea:asam  lemak  3,07:1  dan  lama  kristalisasi  25,10  jam  adalah 80,60%. Hasil verifikasi menunjukkan bahwa respon yang diperoleh tidak berbeda jauh dengan repon hasil prediksi yaitu 81,98% (b/b), dengan tingkat pengayaan 3,89 kali

## UCAPAN  TERIMAKASIH
Ucapan  terimakasih  disampaikan  kepada  Kementerian  Negara Riset  Teknologi    yang  telah  membiayai  penelitian  ini  melalui Program  Insentif  Riset  Dasar  No.  Kontrak  15/RD/Insentif/PPK/II/ 2008 tangal 15 Februari 2008.

## DAFTAR PUSTAKA
Ackman RG, WMN Ratnayake, B Olsson.  1988.  The “basic”: fatty acid composition of Atlantic fish oils: potential similarities useful for  enrichment  of  polyunsaturated  fatty  acids  by  urea complexation.  J. Am. Oil Chem. Soc. 65(1): 136-138.
Adnan M. 1980.  Lipid Properties and Stability of Partially Defatted Peanuts.  PhD Thesis.  Univ. of Illinois, Urbana-Champaign.
Ahmadi  K.  2006.    Optimasi  kristalisasi  pelarut  suhu  rendah  pada pembuatan  minyak  kaya  asam  lemak  -3  dari  hasil  samping pengalengan ikan lemuru ( Sardinella longiceps ).  Agritek 14(3): 580-593.
Tabel 7. Karakteristik mutu minyak hasil samping penepungan tuna, asam lemak bebas hasil hidrolisis, dan konsentrat asam lemak  -3 dari kondisi kristalisasi urea optimum
Parameter Mutu Standar IFOMA MHS Penepungan Tuna Asam Lemak Hasil Hidrolisis Konsentrat Asam Lemak  -3 Kadar ALB, % oleat 1-7 2,01 - - Air dan kotoran, % 0,5-1 td - td Bilangan peroksida mek/kg 3-20 10,83 0,4775 0,14 Bilangan anisidin 6-40 28,14 28,14 5,39 Bilangan totoks 10-60 41,80 29,10 6,03 Warna, Gardner <14 - - - Warna (Lovibond) - >250 - 2 Fe, ppm 0,5-0,7 0,5652 - 0,0083 Cu, ppm <0,3 0,0895 - 0,366 P, ppm 5-100 0,15 - 0,0014 Densitas (g/ml) - 0,8792 0,8259 0,8408 Viskositas (cp) - 0,235 0,11 0,083 td = tidak terdeteksi
MHS = minyak hasil samping IFOMA = International Association of Fishmeal and Oil Manufacturers (Bimbo, 1998)
Bimbo AP.  1998.  Guidelines for characterizing food-grade fish oil. INFORM 9(5): 473-483.
Carvalho  PO,  PRB  Campos,  MD  Noffs,  DHM  Bastos,  JG  de Oliveira.  2002.  Enzymic enhancement of ω-3 polyunsaturated fatty  acids  content  in  Brazilian  sardine  oil.  Acta  Farm. Bonaerense 21(2): 85-88.
Cho  SY,  K  Miyashita  ,T  Miyazawa,  K  Fujimoto,  T  Kaneda.  1987. Autooxidatioon  ethyl  eicosapentaenoic  and  docosahexaenoic. J. Am. Oil Chem. Soc. 64(6): 876-879.
Elizabeth  J.    1992.    Isolasi  Asam  Lemak  Omega-3  dari  Hasil Limbah Industri Pengalengan Ikan Tuna.   Thesis S 2 .  Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Estiasih  T,  FC  Nisa  K.  Ahmadi.  2005.  Optimasi  pemadatan  cepat pada  pengayaan  minyak  ikan  hasil  samping  pengalengan lemuru  dengan  asam  lemak  -3  menggunakan  metode permukaan respon. Jurnal Teknol. dan Industri Pangan XVI(3): 222-229.
Estiasih T, FC Nisa K. Ahmadi. 2006.  Optimasi Pemadatan Cepat pada  Pembuatan  Minyak  Kaya  Asam  Lemak  -3  dari  Minyak Hasil  Samping  Penepungan  Ikan  Lemuru.    Agritek  14(3):  681- 694.
Ganga A, S Nieto, J Sanhuez, C Romo, H Speisky, A Valenzuela. 1998.    Concentration  and  stabilization  of  -3  polyunsaturated fatty acids from sardine oil.  J. Am. Oil Chem. Soc. 75(6): 233- 235.
Guil-Guerrero  JL  EH  Belarbi.    2001.    Purification  process  for  cod liver  oil  polyunsaturated  fatty  acids.  J.  Am.  Oil  Chem.  Soc. 78(5): 472-484.
Gunstone  FD.    1996.    Fatty  Acid  and  Lipid  Chemistry.    Blackie Academic & Professional, Glasgow.
Haagsma N, CM van Gent, JB Luten, RW de Jong, E van Doorn. 1982.    Preparation  of  an  n-3  fatty  acids  concentrate  from  cod liver oil.  J. Am. Oil Chem. Soc. 59(3): 117-118.
Hayes DG. 2002.  Urea inclusion compound formation.   INFORM, 13: 781-783.
Hodgson  AS.    1995.    Refining  and  Bleaching.    In  Y.H.  Hui  (ed.). Bailey’s  Industrial  Oil  and  Fat  Products.  Edible  Oil  and  Fat Products:  Processing  Technology.    John  Wiley  &  Sons  Inc., New York.
Howe  PRC,  JA  Downing,  BFS  Grenyer  EM  Grigonis-Deane,  WL Bryden.  2002. Tuna fishmeal as a source of DHA for n-3 PUFA enrichment of pork, chicken, and eggs.  Lipids 37: 1067-1076.
Hwang LS, J-H Liang. 2001. Fractionation of urea-pretreated squid visceral oil ethyl esters.  J. Am. Oil Chem. Soc. 78(5): 473-476.
IUPAC.  1979.  Standard Methods for the Analysis of Oils, Fats and Derivatives.  6 th ed.  Pergamon Press, Oxford.
Karmas E.  1982. Meat, Poultry, and Seafood Technology. Recent Development.  Noyes Data Corporation, New Jersey.
Lee H, Kizito SA, Weeseem SJ, Craig-Schmidt, MC Lee, Y Wei, CI,
HAn. 2003. Analysis of headspace volatile and oxidized volatile compounds  in  DHA-enriched  fish  oil  on  accelarated  oxidative storage. J.  Food Sci., 68(7): 2169-2177.
Liu  S,  C  Zhang,  P  Hong,  H  Ji.    2006.  Concentration  of docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) of  tuna  oil  by  urea  complexation:  optimization  of  process parameters.  J. of Food Engineering 73: 203-209.
Moffat  CF,  McGill  AS,  Hardy  R,  RS.  Anderson.  1993.    The production  of  fish  oils  enriched  in  polyunsaturated  fatty  acid- containing triglycerides.  J. Am. Oil Chem. Soc. 70(2): 133-138.
Park PW, RE Goins. 1994.  In situ preparation of fatty acids methyl ester for analysis of fatty acids  composition in foods.  J. Food Sci. 59: 1262-1266.
Sridhar  R,  G  Lakhsminarayana.  1992.  Incorporation  of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acid into groundnut oil by  lipase-catalyzed  ester  interchange.    J.  Am.  Oil  Chem.  Soc. 69(10): 1041-1042 .
Stout  VF,  WB  Nilsson,  J  Krzynowek,  H  Schlenk.    1990. Fractionation of Fish Oil and Their Fatty Acids.  In M.E. Stansby (ed.).  Fish Oil in Nutrition. Van Norstand Reinhold, New York.
Suseno N. Perbowo.  2009.  Indonesia Lebih Aktif Turut Mengelola Perikanan  Tuna  di  Samudera  Hindia. http://mukhtar- api.blogspot.com/2009/03/indonesia-lebih-aktif-turut- mengelola_31.html .  Diakses [5 Januari 2010].
Tatum CK Chow. 2000. Fat in Food and Their Health Implication 2 nd Edition. Marcell Dekker Inc. New York.
Visentainer  JV,  MD  Noffs,  PO  Carvalho,  VV  de  Almeida,  CC  de Oliveira,  NE  de  Souza.  2007.    Lipid  cintent  and  fatty  acid composition of 15 marine fish species from the southest coast of Brazil.  J. Am. Oil Chem. Soc. 84: 543-547.
Wanasundara  UN,  F  Shahidi.    1999.    Concentration  of  omega-3 polyunsaturated  fatty  acids  of  seal  bubbler  oil  by  urea complexation:  optimization  of  reactions  conditions.    Food Chemistry 65: 41-49.
Wu M, H Ding, S Wang S Xu.  2008.  Optimizing conditions for the purification  of  linoleic  acid  from  sunflower  oil  by  urea  complex fraction.  J. Am. Oil Chem. Soc. 85(7): 677-684.
Yamane  T,  T  Suzuki,  Sahashi,  L  Vikersveen,  T  Hoshino.    1992.
Production of n-3 polyunsaturated fatty acid-enriched fish oil by lipase-catalyzed  acidolysis  without  solvent.    J.  Am.  Oil  Chem. Soc. 69(11): 1104-1107.
Yeo  L,  KDM  Harris.    1999.    Temperature-dependent  structural properties of a solid urea inclusion compound containing chiral guest molecules: 2-bromotetradecane/urea.  Can. J. Chem. 77: 2105-2118.
Yuwono S.  1993.  Pemanfaatan Limbah Mata Ikan Tuna sebagai Sumber  Asam  Lemak  Omega-3.    Skripsi.    Fakultas  Teknologi Pertanian, IPB, Bogor.