Efek  pemberian  ekstrak  klorofil  daun  pepaya  (carica  papaya,  linn.) terhadap kadar ast dan alt serum
Kusmadewi Eka Damayanti 1 , Noor Wijayahadi 2 , Niken Puruhita 2

## ABSTRACT
Background: Pharmacological therapy is one of the therapy modalities which carries the hepatic injury as one of its side effects. Nowadays,  curcuma  tablets  has  become  choice  of  hepatoprotector.  Other  substance  which  has  the  possibilities  of hepatoprotection  activities  is  chlorophyll.  The  study  is  aimed  to  investigate  the  effect  of  papaya  leaves  chlorophyll  extracts towards the serum AST and serum ALT levels on high-dose-paracetamol-induced Wistar rats.
Materials and methods: This was an experimental study applying pretest-posttest controlled group design. Twenty eight Wistar rats 8-12 weeks age and weighted 185-220 grams assigned into four groups, namely group I (control), group II (paracetamol 750 mg/kg bw + no hepatoprotector agent), group III (paracetamol 750 mg/kg bw + curcuma 100 mg/kg bw), and group IV (paracetamol 750 mg/kg bw + papaya leaves chlorophyll extracts 300 mg/kg bw). The hepatoprotector agents were administered for a week, while the high dose paracetamol was administered for three consecutive days (day 5, 6, and 7). The pretest samples were drawn on the fifth day before the administration of high dose paracetamol, and the posttest samples were drawn on eightth day.
Results: There were no difference among four groups on serum AST and serum ALT levels before the administration of high dose paracetamol, p=0.522 dan p=0.682, respectively. After the administration of high dose paracetamol, there were differences among four groups on both variables, both p=0.000. The post-hoc test showed that differences happened on all four groups (p<0.05).
Conclusion: Chlorophyll extract of papaya leaves can inhibit liver injury on high-dose-paracetamol-induced-Wistar rats.
Keywords: Hepatoprotection; chlorophyll extracts; papaya leaves; serum AST; serum ALT

## ABSTRAK
Latar belakang: Penggunaan obat merupakan salah satu modalitas terapi yang salah satu efek sampingnya adalah kerusakan hepar. Dewasa ini, tablet kurkuma diberikan sebagai usaha pencegahan kerusakan hepar akibat obat-obatan. Zat lain yang sangat dimungkinkan memiliki aktivitas hepatoproteksi adalah klorofil. Studi ini bertujuan untuk membuktikan efek pemberian ekstrak klorofil daun pepaya terhadap kadar AST dan ALT serum tikus Wistar yang diinduksi paracetamol dosis tinggi. Metodologi penelitian: Studi ini merupakan studi eksperimental dengan rancangan pretest-posttest controlled group. Dua puluh delapan hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus strain Wistar) berusia 8-12 minggu dengan berat badan antara 185-220 gram dialokasikan dalam empat kelompok, yaitu  kelompok I (kontrol), II (paracetamol 750 mg/kg bb), III (paracetamol 750 mg/kg  bb  dan  kurkuma  100 mg/kg  bb),  dan IV  (paracetamol  750  mg/kg bb dan  ekstrak  klorofil  daun  pepaya  300mg/kg  bb). Perlakuan proteksi hepar dengan kurkuma, ekstrak klorofil daun pepaya maupun placebo (minyak jagung) dilakukan selama 7 hari, sedangkan perlakuan perusakan hepar dengan paracetamol atau placebo (normal saline) dilakukan selama 3 hari, yaitu pada  hari  ke-5,6,  dan  ke-7.  Pengambilan  darah  untuk pemeriksaan  AST  dan  ALT  serum  dilakukan  pada  hari  ke-5  (sebelum pemberian paracetamol atau placebo) dan hari ke-8.
Hasil  penelitian: Tidak  didapatkan  perbedaan  bermakna  antara  keempat  kelompok  pada  kadar  AST  dan  kadar  ALT  serum sebelum perlakuan perusakan hepar, p=0.522 dan p=0.682, secara berurutan. Setelah perlakuan perusakan hepar, didapatkan perbedaan bermakna antara keempat kelompok pada kadar AST dan kadar ALT serum, p=0.000 pada kedua variabel. Uji post- hoc menunjukkan bahwa perbedaan terjadi pada setiap kelompok terhadap kelompok lainnya (p<0.05).
Simpulan: Pemberian ekstrak klorofil daun pepaya dapat mencegah kerusakan hepar tikus Wistar yang diinduksi paracetamol dosis tinggi.
Kata kunci: Hepatoproteksi; klorofil; daun pepaya; AST serum; ALT serum

## PENDAHULUAN
Penggunaan  obat-obatan  merupakan  salah  satu modalitas  terapi  yang  digunakan  secara  luas  dalam praktek  kedokteran.  Meskipun  demikian,  penggunaan obat-obatan  bukan  tanpa  risiko  efek  samping.Salah satu  efek  samping  obat  yang  sering  ditemui  adalah
terjadinya  hepatotoksisitas,  karena  hepar  merupakan organ utama yang berperan dalam proses metabolisme obat. Obat-obatan yang sering menyebabkan hepatotoksisitas antara lain obat-obatan yang zat aktif atau metabolitnya berefek langsung terhadap sel hepar sehingga  sel  mengalami  disfungsi.Pemeriksaan  AST dan ALT serum dilakukan secara periodik, khususnya pada pasien dalam terapi farmakologis yang berpotensi merusak  hepar  atau  penggunaan  obat-obatan  yang bersifat hepatotoksik 1,2 .
1. Jurusan Gizi Fakultas Kedokteran UNS
2. Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro
Kejadian DILI ( Drug-Induced  Liver  Injury ) merupakan salah satu efek samping terapi farmakologis.  Di  negara  barat,  kejadian DILI secara umum  hanya  sebesar  1-2  kasus  per  100.000  orang tahun,  namun  di  Jerman  diketahui  bahwa  40%  dari seluruh kasus gagal hepar akut merupakan kasus DILI 3 . Suatu  studi  menunjukkan  bahwa  terjadi  6.5  episode morbiditas  akibat  obat  di  setiap  100  rumah  sakit. Beberapa studi juga menunjukkan bahwa banyak kasus rawat inap  yang  merupakan  akibat  dari  efek  samping obat 4.
Berbagai penelitian dilakukan untuk memperoleh jalan keluar sehingga kejadian hepatotoksisitas  obat  dapat  diminimalkan,  misalnya melalui  penelitian  dengan  menggunakan  hewan  coba yang  menggunakan  substansi  penginduksi jejas  hepar berupa karbon tetraklorida 5 , parasetamol dosis tinggi 6,7 , halotan,  amodiaquin,  atau  lipopolisakarida 8 .  Induksi hepatotoksisitas  dengan  paracetamol  dosis  tinggi merupakan  metode  yang  paling  sering  digunakan karena  mekanisme  kerusakannya  telah  diketahui, bahannya  mudah  diperoleh,  dan  pada  dosis  tertentu mampu  menghasilkan  kerusakan  hepar  yang  cukup dengan risiko mortalitas hewan coba yang minimal 9,10 . Dalam  hal  pencegahan  atau  pengobatan hepatotoksisitas  yang  diakibatkan  obat,  kurkuma merupakan  salah  satu  zat  yang  memiliki  peran penting 11,12 .  Kurkuma  memiliki  banyak  aktivitas biologis yang salah satunya sebagai agen anti-oksidan. Penggunaan  kurkuma  sebagai  anti-oksidan  terbukti dapat  mengoptimalkan  ekspresi  gen  enzim-enzim antioksidan misalnya superoksid dismutase, glutathion peroxidase, dan katalase. Melalui optimalisasi enzim- enzim  antioksidan  tersebut  produksi  spesies  oksigen reaktif ( Reactive Oxygen Species , ROS) di hepar dapat ditekan  sehingga  kerusakan  oksidatif  sel-sel  hepar dapat  dicegah.  Hal  tersebut  juga  berlaku  pada pencegahan kerusakan hepar akibat metabolit obat 12 .
Zat  lain  yang  juga  diduga  memiliki  aktivitas anti-oksidan  tinggi  adalah  klorofil.  Klorofil  banyak dijual  bebas  dan  diklaim  memiliki  berbagai  khasiat meskipun belum cukup didukung dengan studi ilmiah. Belum ada penelitian yang secara khusus menunjukkan bukti  ilmiah  atas  efektivitas  klorofil  sebagai hepatoprotektor, meskipun beberapa tulisan menjelaskan kemampuan klorofil sebagai hepatoprotektor  berdasarkan  fungsinya  di  hepar. Berdasarkan  hal  tersebut  di  atas,  peneliti  bermaksud membuktikan  efek  ekstrak  klorofil  daun  pepaya terhadap kadar AST dan ALT serum tikus putih strain Wistar yang diinduksi parasetamol dosis tinggi.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental  dengan  rancangan pretest-posttest controlled group . Hewan coba yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  tikus  putih  ( Rattus  norvegicus ) strain Wistar berusia 8-12 minggu dengan kisaran berat badan  185-220  gram  yang  diperoleh  dari  Unit Pemeliharaan  Hewan  Percobaan  (UPHP)  Universitas Gadjah  Mada  Yogyakarta.  Sebelum  masa  perlakuan, hewan coba diaklimatisasi dalam lingkungan laboratorium  selama  tujuh  hari.  Selama  masa aklimatisasi,  ekstrak  klorofil  disiapkan  dengan  teknik maserasi  dalam  ruang  gelap  menurut  cara  Dikio  dan Isabirye 13 dengan menggunakan pelarut aseton. Setelah diperoleh  ekstrak  klorofil,  aseton  diuapkan  dalam evaporator.  Ekstrak  klorofil  kemudian  dilarutkan dalam 2 ml minyak jagung sebelum diberikan kepada hewan coba.
Dua puluh delapan ekor tikus putih dialokasikan secara  acak  ke  dalam  empat  kelompok,  yaitu Kelompok  I  (kontrol),  II  (mendapatkan  Parasetamol 750 mg/kg bb saja), III (mendapatkan Parasetamol 750 mg/kg  bb  dan  kurkuma  100  mg/kg  bb),  dan  IV (mendapatkan Parasetamol 750 mg/kg bb dan ekstrak klorofil  daun  pepaya  300  mg/kg  bb).  Pada  hari  ke-0 sampai  hari  ke-5,  hewan  coba  mendapatkan  agen hepatoprotektor berupa kurkuma, ekstrak klorofil daun pepaya, atau minyak jagung sebagai placebo. Pada hari ke-5,  sampel  darah  diambil  dari  vena  retroorbitalis sebagai  sampel darah  pra-perlakuan ( pretest ).  Setelah sampel  darah  diambil,  pada  hari  ke-5,  6,  dan  ke-7 hewan  coba  mendapatkan  agen  hepatoprotektor  dan parasetamol  dosis  tinggi  dengan  selang  waktu pemberian  30  menit.  Pada  hari  ke-8,  sampel  darah diambil  melalui  vena  retroorbitalis  sebagai  sampel darah  pasca-perlakuan  ( posttest ).  Pemeriksaan  kadar AST  dan  ALT  serum  dilakukan  dengan  metode spektrofotometri.
Data kadar AST dan ALT sebelum dan sesudah perlakuan  perusakan  hepar  (hari  ke-5  dan  hari  ke-8, secara berurutan) diuji normalitasnya menggunakan uji Shapiro-Wilk, karena besar sampel kurang dari 50 dan skala data rasio. Uji Shapiro-Wilk menunjukkan nilai p >  0,05  pada  kedua  variabel,  sehingga  dapat disimpulkan  bahwa  variabel  kadar  AST  dan  ALT terdistribusi  normal.  Berdasarkan  hasil  uji  normalitas data  di  atas,  maka  uji  yang  digunakan  untuk  menguji perbedaan  keempat  kelompok  pada  sebelum  dan sesudah perlakuan adalah uji ANOVA. Pada hasil uji dengan perbedaan yang signifikan secara statistik (p < 0,05) dilanjutkan dengan uji post-hoc LSD.

## HASIL
Hasil  analisis  data  kadar  AST  dan  ALT  serum sebelum  perlakuan  menunjukkan  bahwa  tidak  ada perbedaan  yang  bermakna  antara  keempat  kelompok (F=0,768, p=0,522 dan F=0,505, p=0,682, berurutan). Hal  ini  menunjukkan  bahwa  keempat  kelompok memiliki  kadar  AST  dan  ALT  serum  yang  sama sebelum perlakuan.
Hasil  analisis  data  kadar  AST  dan  ALT  serum setelah  perlakuan  menunjukkan  bahwa  terdapat perbedaan  yang  bermakna  antara  keempat  kelompok (F=5,991 x 10 3 , p=0,000 dan F=6,982 x 10 3 , p=0,000, berurutan).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  keempat kelompok  memiliki  kadar AST  dan  ALT  serum  yang berbeda  setelah  perlakuan  perusakan  hepar  dengan parasetamol  dosis  tinggi.  Perbedaan  ini  kemudian diteliti lebih lanjut dengan uji post-hoc LSD. Uji post- hoc menunjukkan bahwa terdapat perbedaan bermakna pada semua kelompok.

## PEMBAHASAN
Penelitian  ini  menemukan  bahwa  klorofil memiliki  efek  terhadap  kadar  AST  dan  ALT  serum pada  tikus  putih  yang  diinduksi  parasetamol  dosis tinggi. Efek klorofil dalam hal ini mampu memberikan efek berupa kadar AST dan ALT yang rendah. Hal ini menunjukkan  bahwa  klorofil  mampu  mencegah kerusakan  hepar  lebih  baik  dibandingkan  kurkuma. Hasil di atas sejalan dengan penelitian Saputri dkkyang secara  histopatologis  menunjukkan  bahwa  pemberian klorofil mampu mencegah kerusakan sel hepar dengan lebih baik dibandingkan kurkuma 14 .
Mekanisme  klorofil  dalam  hepatoproteksi sampai saat ini belum diketahui secara pasti. Selama ini klorofil dipercayai memiliki aktivitas antioksidan dan mampu melindungi sel-sel tubuh dari pengaruh buruk ROS.  Hal  ini  didukung  dengan  pemahaman  bahwa tetrapirol (termasuk klorofil) mampu membentuk suatu kelompok  metaloenzim  prostetik  seperti  sulfite reduktase,  katalase,  peroxidase,  dan  nitrit  reduktase yang  mampu  melakukan berbagai reaksi oksidasi dan reduksi  di  dalam  tubuh.  Mekanisme  klorofil  sebagai antioksidan  dan  kemampuannya  dalam  membentuk metaloenzim  prostetik  inilah  yang  dimungkinkan berperan  dalam  pencegahan  kerusakan  hepar  oleh metabolit parasetamol 15 .
Proses kerusakan sel hepar oleh zat asing (obat, metabolisme  xenobiotik)  diperantarai  oleh  sitokrom P450 yang berperan sangat penting dalam metabolisme fase 1 yang utamanya merupakan suatu reaksi oksidasi. Pada  metabolisme  parasetamol,  reaksi  utama  yang berperan  adalah  reaksi  konjugasi  yang  menyebabkan sebagian  besar  metabolit  parasetamol  menjadi  lebih polar  dan  mudah  diekskresikan  bersama  urin,
sementara  sebagian  kecil  metabolit  parasetamol dimetabolisme  oleh  sitokrom  P450  2E1  untuk kemudian  berikatan  dengan  glutathione  untuk diekskresikan melalui ginjal. Pada keadaan intoksikasi parasetamol,  jumlah  yang  harus  dimetabolisme  oleh sitokrom  P450  2E1  ini  menjadi  sangat  besar  dan akibatnya jumlah glutathione intraseluler menjadi tidak seimbang dengan metabolit yang harus diikat. Hal ini menyebabkan  metabolit  reaktif  dari  parasetamol,  N- acetyl  benzoquinone-imide  atau  NAPQI,  banyak beredar  di  dalam  sel  hepar  dan  merusak  sel  hepar. Tingginya NAPQI yang tidak seimbang dengan jumlah glutathione  inilah  yang  menyebabkan  kerusakan  sel hepar, karena glutathione juga bersifat hepatoprotektan intraseluler 16 .

## SIMPULAN
Mekanisme  klorofil  sebagai  antioksidan  dan kemampuannya  dalam  membentuk  metaloenzim prostetik, khususnya glutathione, sangat dimungkinkan berperan  dalam  pencegahan  kerusakan  hepar  oleh metabolit parasetamol. Seperti dijelaskan di atas bahwa proses  metabolisme  parasetamol  melibatkan  peran glutathione dalam mengikat metabolit reaktif parasetamol,  sehingga  adanya  metaloenzim  prostetik akan  membantu  sel  hepar  dalam  mengeliminasi metabolit  parasetamol  dan  meminimalkan  kerusakan sel hepar.
Keterbatasan dalam penelitian ini salah satunya adalah  tidak  ada  gradasi  dosis  ekstrak  klorofil  daun pepaya  yang  dibandingkan,  sehingga  tidak  dapat menunjukkan  dosis  optimal  untuk  pencegahan kerusakan  hepar.  Selanjutnya  diharapkan  dapat menginspirasi penelitian lanjutan untuk mengidentifikasi  dosis  optimal  ekstrak  klorofil  dari daun pepaya.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Sturgill  MG  dan  Lambert  GH.  Xenobiotic- induced hepatotoxicity: mechanism of liver injury and  methods  of  monitoring  hepatic  function. Clinical Chemistry 1997;43:8(B):1512-1526.
2. Bissel DM, Gores GJ, Laskin DL, dan Hoofnagle JH.  Drug-Induced  Liver  Injury:  mechanism  and test system. Hepatology Apr 2001;33(4):1009-13.
3. Altinbas A, Bechman LP, Akkiz H, Gerken G, dan Canbay  A.  Acute  Liver  Failure.  In  Mauss,  Berg, Rockstroh, Sarrazin, dan Wedemeyer. Hepatology 2014: A Clinical Textbook 5th edition. Germany: Druckhaus-Sued. 2014
4. Morris CJ, Cantrill JA, Hepler CD, dan Noyce PR Preventing  drug-related  morbidity  –  determining valid indicators. International Journal for Quality Health Care 2002;14(3):183-198.
5. Young TH, Tang HS, Chao YC, Lee HS, Hsiong CH, Pao LH, dan Hu OYP. Quantitative rat liver function  test  by  galactose  single  point  method. Laboratory Animals 2008;42:495-504.
6. Ishida  Y,  Kondo  T,  Tsuneyama  K,  Lu  P, Takayashu  T,  dan  Mukaida  N.  The  pathogenic roles of  tumor necrosis factor p55 in acetaminophen-induced  liver  injury  in  mice. Journal of Leukocyte Biology 2004;75:59-67.
7. Zhu  JH,  McClung  JP,  Zhang  X,  Aregullin  M, Chen  C,  Gonzalez  FJ,  Kim  TW,  dan  Lei  XG. Comparative  impacts  of  knock-outs  of  two antioxidant  enzymes  on  acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. Experimental Biology and Medicine 2009;234:1477-1483.
8. Uetrecht J. Role of animal models in the study of drug-induced  hypersensitivity  reactions. The AAPS Journal 2006;7(4):E914-E921.
9. Placke ME, Ginsberg GL, Wyand DS, dan Cohen
SD. Ultrastructural changes during acute acetaminophen-induced  hepatotoxicity  in  mouse: a  time  and  dose  study. Toxicological  Pathology 1987;15(4):431-438
10. Katyare dan Satav. Impaired mitochondrial oxidative energy metabolism following paracetamol-induced hepatotoxicity in the rat. Br J Pharmacol 1989;96:51-58.
11. Kumar  GVS.  An  emphasis  on  global  use  of traditional medicinal system and herbal
hepatoprotective drugs. Journal of Pharmacologic Research 2014;8(1):28-37.
12. Somchit MN, Sulaiman MR, Noratunlina R, dan Ahmad  Z. Hepatoprotective  effect  of  Curcuma longa  rhizome  in  paracetamol-induced  liver damage  in  rats .  Proceeding  of  the  Regional Symposium  on  Environment  and  Natural Resources.  Kuala  Lumpur,  10-11 th Apr  2002. Vol.1:698-702.
13. Dikio  ED  dan  Isabirye  DA.  Isolation  of Chlorophyll  a  from  spinach  leaves. Bulletin  of Chemical  Society  of  Ethiopia 2008;22(2):301- 304.
14. Saputri D, Suyatmi, dan Damayanti KE. Pengaruh ekstrak  klorofil  daun  pepaya  (Carica  papaya, Linn.)  terhadap  struktur  histologis  hepar  tikus putih  yang  diinduksi  parasetamol  dosis  tinggi . Skripsi.  Universitas  Sebelas  Maret  Surakarta. 2014 15. Smith AG dan Witty M.  Laboratory methods for the  study  of  tetrapyrrols.  Dalam  Smith  AG  dan Witty  M  (eds). Heme,  chlorophyll,  and  billins: methods  and  protocols .  New  Jersey:  Humana Press. 2002.
16. Maddrey WC. Drug Induced Hepatotoxicity 2005. Journal  of  Gastroenterology 2005;39(Supp 2):S85-S89.