Menara Perkebunan 2009, 77(1), 1-12.
Isolasi fragmen gen LIPASE dari kapang Absidia corymbifera, Rhizopus oryzae dan Rhizopus oligosporus
Isolation of LIPASE gene fragment  from Absidia corymbifera , Rhizopus oryzae and Rhizopus oligosporus fungi
Riza A. PUTRANTO & Asmini BUDIANI Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia

## Summary
Diversification of oil palm products, such as  healthy  oil,  needs  lipase  sustainability  as  a biocatalist. Many attempts have been developed  to  produce  lipase,  including intensive  exploration  and  screening  of  several species of molds. Genetic engineering for over expression  of LIPASE gene  in  the  selected mold  is  considered  to  be  the  potential approach  for  efficient  production  of  this enzyme. This research was aimed to isolate the
LIPASE gene fragment of Indonesian indigenous fungi, namely Absidia corymbifera, Rhizopus oryzae and R. oligosporus by means of RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain  Reaction)  technique  using  heterologous primers.  The  result  showed  that  a  cDNA fragment  of  462  bp  has  been  amplified  and isolated  from  the  three  fungi  with  different concentration.  The  highest  quantity  was  found from A.  corymbifera .  The  RT-PCR  products isolated  from A.  corymbifera was  cloned, sequenced and analyzed for its homology to the sequence  of LIPASE gene  from  other  species. BLAST analysis showed that the DNA sequence of  the  cloned  RT-PCR  product  derived  from A.  corymbifera was  highly  homologous  with LIPASE gene from Rhizopus niveus.
[ Keywords : Rhizopus  niveus ,  lipase,  genetic engineering,  RT-PCR,  indigenous fungi].

## Ringkasan
Diversifikasi  produk  kelapa  sawit,  seperti minyak  sehat  ( healthy  oil )  memerlukan ketersediaan lipase sebagai biokatalis. Berbagai upaya  untuk  produksi  lipase  telah  dikembang- kan, termasuk eksplorasi dan skrining terhadap beberapa  spesies  kapang  secara  intensif. Rekayasa  genetika  untuk  mengover-ekspresi- kan  gen LIPASE pada  kapang  hasil  skrining tersebut dipandang merupakan satu pendekatan potensial  untuk  produksi  enzim  ini  secara efisien. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi  fragmen  gen LIPASE dari  tiga kapang indigenous Indonesia, yaitu
A.  corymbifera , R.  oryzae dan R.  oligosporus, menggunakan teknik RT-PCR ( Reverse Transcriptase Polymerase  Chain  Reaction ). Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  fragmen cDNA  sepanjang  462  bp  dari  ketiga  kapang telah diisolasi, masing-masing dengan kuantitas  yang  berbeda.  Hasil  tertinggi diperoleh  dari  kapang A.  corymbifera .  Produk RT-PCR  dari A.  corymbifera diklon,  disekuen kemudian  dianalisis  homologinya  dengan sekuen  gen LIPASE dari  spesies  lain.  Analisis BLAST menunjukkan bahwa sekuen DNA dari produk  RT-PCR  terklon  yang  berasal  dari A.  corymbifera memiliki  homologi  tinggi dengan gen LIPASE dari Rhizopus niveus .

## Putranto & Budiani

## Pendahuluan
Lipase  merupakan  biokatalis  yang secara  umum  diperlukan  untuk  hidrolisis lemak,  mono-  dan  di-gliserida  yang  akan menghasilkan  asam  lemak  bebas  dan gliserol (Suzuki et al. , 1988; Kosugi et al ., 1990) dan sebaliknya pada kondisi tertentu lipase  juga  mengkatalisis  reaksi    sintesis gliserida  dari  gliserol  dan  asam  lemak (Suzuki et  al. ,  1988;  Hoq et  al .,  1985). Aplikasinya  dapat  dijumpai  antara  lain pada  industri  makanan  dan  minuman, deterjen, farmasi, agrokimia, dan oleokimia  (Saxena et  al. ,  1999;  Yang  & Xu,  2001).  Biokatalis  ini  memiliki  arti yang  semakin  penting  dalam  kaitannya dengan diversifikasi produk sawit, mengingat  Indonesia  merupakan  negara penghasil  dan  pengekspor  CPO  ( crude palm  oil )  terbesar  di  dunia,  dengan produksi  CPO  sebesar  17  juta  ton  pada tahun  2007  dan  pada  tahun  mendatang diperkirakan  produksi  CPO  akan  terus meningkat (Pradana, 2007).
Penggunaan  lipase  dalam  industri makanan  memiliki  keunggulan  karena hidrolisis yang dikatalisis bersifat spesifik. Modifikasi  oleh  enzim  lipase  yang memiliki  spesifisitas  reaksi  1,3-gliserida menghasilkan  gliserida  dengan  produk utama  diasilgliserol  (DAG)  dan  produk samping  monoasilgliserol  (MAG)  serta asam  lemak  bebas  dan  gliserol.  Yasunaga et  al .  (2001)  melaporkan  bahwa  minyak kaya  DAG  dapat  berfungsi  sebagai minyak  sehat  karena  antara  lain  dapat mengurangi trigliserida (TG) dalam serum darah,  mencegah  akumulasi  lemak  dalam tubuh  dan  memperbaiki  rasio  kolesterol serum darah.
Minyak  sehat  nabati  dipasarkan pertama  kali  di  pertokoan  pusat  kota Atlanta  dan  Chicago  pada  awal  tahun
2003.  Minyak  goreng  dengan  merk dagang Enova Oil mengandung DAG 50% dijual di swalayan dengan harga US$ 4,79 per  20  ons  atau  US$  8,45  per  kg.  Harga minyak  ini    kira-kira  empat  kali  lebih tinggi  dari  pada  minyak  goreng  biasa (Dunford, 2002). Indonesia belum memiliki  minyak  goreng  jenis  ini  di pasaran.  Kendala  pengembangan  proses biokonversi enzimatis dalam skala industri adalah  ketersediaan  dan  harga  lipase impor  yang  mahal,  mencapai  25  juta rupiah  per  kg  karena  hanya  ada  beberapa produsen  lipase  saja  di  seluruh  dunia (Suzuki et  al. ,  1988;  Elisabeth,  2003). Bahkan  pada  tahun  2007,  harga  lipase  di pasaran  internasional  telah  meningkat menjadi  30  juta  rupiah  per  kg  (AOCS Press, 2007).
Rekayasa genetika  untuk  mem- produksi senyawa bernilai ekonomi tinggi telah  banyak  dikembangkan,  terutama dalam  industri  makanan  dan  farmasi (Murooka  &  Imanaka,  1993;  van  Dijck, 1999).  Pendekatan  produksi  lipase  yang umum dilakukan dan telah berkembang ke tingkat  komesialisasi  adalah  eksplorasi dan  skrining  strain  kapang  secara  intensif yang  diikuti  dengan  rekayasa  genetika. Salah satu contoh adalah Lipolase. Lipase rekombinan  yang  diproduksi  oleh  Novo Nordisk  ini,  menggunakan  gen LIPASE yang berasal dari Humicola yang kemudian  diekspresikan  di  dalam  sel inang  baru  yaitu Aspergillus oryzae (Hoq et al. , 1985) Eksplorasi  dan  skrining  kapang  yang berpotensi  tinggi  sebagai  penghasil  lipase merupakan tahapan penting dalam rekayasa genetika produksi lipase.
Beberapa kapang diketahui mampu menghasilkan  lipase  yaitu Aspergillus niger,  Mucor  miehei,  Monilia  sitophila, Rhizopus     delemar dan R. javanicus
Isolasi fragmen gen LIPASE dari kapang Absidia corymbifera .........
(Onions et al ., 1981; Yamane, 1987). Pada penelitian sebelumnya, deteksi gen LIPASE secara  molekuler  pada  kapang A.  corymbifera dan R.  oryzae telah dilakukan  menggunakan  PCR  spesifik. (Putranto et  al., 2006).  Di  samping  itu, enzim-enzim hidrolitik lemak juga ditemukan pada genus Rhizopus (Tri-Panji, 1997;  Tri-Panji et  al., 2007).    Dengan demikian A.  corymbifera dan R.  oryzae diharapkan  menjadi  sumber  gen LIPASE untuk  produksi  lipase  menggunakan teknik rekayasa genetika. Sebagai langkah awal dalam usaha rekayasa genetika untuk memproduksi lipase, penelitian ini bertujuan  untuk  mengisolasi  fragmen  gen LIPASE dari  tiga  kapang  indigenous Indonesia, yaitu A. corymbifera, R. oryzae, dan R. oligosporus

## Bahan dan Metode

## Kultur dan penyiapan miselium  kapang
Kapang yang digunakan adalah A.  corymbifera AC001, R.  oryzae R.211 , dan R.  oligosporus R213  koleksi  Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan
Indonesia  yang  dipelihara  dalam yeast malt  agar (YMA)  miring.  Satu ose dari kultur aksenik dicelupkan pada permukaan medium.  Miselium  kapang  ditumbuhkan selama  72  jam  pada  suhu  kamar  dalam medium yeast malt broth (YMB) ditambah 2% minyak sawit (CPO).

## Isolasi RNA kapang
RNA  total  diisolasi  dari  miselium kapang  menggunakan  gabungan  metode Chang et. al. (1993) dan Liu et. al. (1998). Miselium kapang  dipanen  menggunakan ose steril dan dicuci dengan akuades steril,
kemudian  digerus  dalam  mortar  dengan menambahkan  nitrogen  cair  hingga  ber- bentuk  serbuk  beku.  Ke  dalam  2,5  g serbuk miselium beku ditambahkan 10 mL bufer  ekstraksi  (Trizma  Base  0,2  M,  LiCl 0,3  M,  EDTA  0,01  M,  PVP  MW  36,000 1%,  tiourea  5  mM,  aurintrikarboksilat 1  mM,  dan  2-Merkaptoetanol  2%). Campuran  dikocok  kuat,  ditambahkan 1  volume  campuran  fenol:kloroform: isoamilalkohol  (25:24:1),  divorteks  3x30 detik, kemudian disentrifus pada kecepatan  15.000  rpm,  suhu  4°C  selama 15  menit.  Supernatan  diekstraksi  sekali lagi  menggunakan  kloroform  :  isoamil- alkohol  (24:1)  sebanyak  1  volume dilanjutkan dengan sentrifus kembali pada kecepatan,  suhu  dan  waktu  yang  sama. Supernatan  dipindahkan  ke  dalam  tabung sentrifus  baru,  kemudian  ditambahkan 1/30  volume  Na  asetat  3,3  M  pH  5,2  dan 1/10  volume  etanol  absolut.  Setelah campuran  diinkubasi  dalam  es  selama  30 menit,  RNA  diendapkan  melalui  sentri- fugasi  (15.000  rpm,  4°C,  25  menit). Endapan RNA dicuci menggunakan etanol 70%  dingin  dilanjutkan  dengan  sentri- fugasi  (8000  rpm,  4°C,  25  menit). Endapan  RNA  dilarutkan  dengan  DEPC- dH 2 O. RNA dipisahkan dari DNA dengan menambahkan LiCl 8 M ke dalam larutan RNA  hingga  konsentrasi  akhir  2  M. Campuran  didiamkan  selama  4-16  jam pada  suhu  4°C,  kemudian  disentrifus (13.000  rpm,  4°C,  20  menit).  Endapan RNA  dibilas  menggunakan  etanol  dingin 70%,  dilanjutkan  dengan  sentrifugasi (5000  rpm,  4°C,  5  menit).  Endapan  RNA dilarutkan menggunakan 50-100µL DEPC-dH 2 O.  RNA  yang  diperoleh  diuji kualitas dan   kuantitasnya   menggunakan elektroforesis  pada  gel  agarosa  0,8%  dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 260 dan 280 nm.

## Putranto & Budiani
Amplifikasi fragmen gen LIPASE
Amplifikasi  fragmen  daerah  konser- vatif gen LIPASE dilakukan menggunakan teknik  RT-PCR  ( Reverse  Transcriptase-
Polymerase Chain Reaction ). Utas pertama  cDNA  disintesis  menggunakan kit SuperScript TM II First-Strand Synthesis System  for  RT-PCR (Invitrogen)  dengan templat  RNA  dari  miselium  kapang, masing-masing 2 µg, menggunakan primer oligo(dT) yang tersedia di dalam kit. Utas tunggal  cDNA  selanjutnya  dijadikan templat  dalam  sintesis  utas  ganda  cDNA menggunakan primer heterologous. Primer tersebut  dirancang  dengan  terlebih  dahulu menjajarkan  sekuen  gen LIPASE dari berbagai  spesies  menggunakan  program ClustalW dari BioEdit 5.0. Dari penjajaran tersebut  diketahui  daerah  konservatif sebagai  target  amplifikasi.  Selanjutnya perancangan primer  dilakukan  dengan program Primer3 .
Analisis  PCR  dilakukan  dengan  total reaksi  25  µL,  yang  mengandung  MgCl 2 1,5  mM,  2,5  µL  bufer  ekstraksi  10X, 0,5  µL  dNTPs  10  µM,  0,5  µL Taq  DNA Polymerase 5u/µL,  17  µL  ddH 2 O,  1  µL templat first  strand  cDNA hasil  sintesis, dan  2  µL  primer  LIP4F  ( 5’-GCCAAAGT TCATGCTGGT )  dan LIP4R ( 5’- CTCA AGTGGTCAAGGATAGAGG ). Program
PCR terdiri dari satu siklus pra denaturasi (95°C, 5 menit), dan 35 siklus reaksi yang terdiri  dari  denaturasi  (95  °C,    30  detik), penempelan (50 °C, 30 detik) dan ekstensi (72 °C, 90 detik). Pada tahap akhir proses PCR  dilakukan  ekstensi  akhir  pada  suhu 72  °C  selama  lima  menit.  Sebanyak  5  µL hasil  PCR  di  cek  dengan  elektroforesis pada gel  agarosa 0,8 %.   Intensitas  hasil
PCR dikuantifikasi menggunakan program UN-SCAN-IT Gel 6.1 pada alat Gel Doc.

## Analisis sekuen DNA produk RT-PCR
Fragmen  hasil  RT-PCR  diisolasi  dan dimurnikan dari gel agarosa menggunakan kit QIAquick Gel Extraction dari QIAGEN, kemudian  diklon  ke  dalam E.  coli XL1 Blue  menggunakan  vektor  pGEM-T (Promega).  Proses  ligasi  dan  transformasi dilakukan  sesuai  prosedur  yang  direko- mendasikan dalam buku petunjuk. Seleksi sel  transforman  dilakukan  pada  medium padat  LB  yang  mengandung  kanamisin 50  mg/L  dan  X-Gal  40  mg/L.  Analisis adanya fragmen terklon pada koloni putih dilakukan  dengan  PCR  menggunakan primer  spesifik  LIP4F  dan  LIP4R.  Hasil PCR  koloni  dicek  dengan  elektroforesis pada  gel  agarosa  0,8  %.  Plasmid rekombinan  diisolasi  dari  sel E.  coli rekombinan  menggunakan High  Pure Plasmid  Isolation  Kit (Roche)  dan  dicek ukurannya  dengan  elektroforesis  pada  gel agarosa 0,8%.
Keberadaan  fragmen  gen  dalam plasmid  dipastikan  dengan  cara  digesti plasmid  menggunakan  enzim  restriksi Eco RI.  Untuk  mengkonfirmasi  bahwa fragmen  DNA  hasil  RT-PCR  adalah  frag- men  gen LIPASE ,  dilakukan  sekuensing dengan  templat  plasmid  rekombinan menggunakan  primer  M13.  Sekuensing dilakukan  di  Lembaga  Biologi  Molekuler Eijkman,  Jakarta.  Sekuen  DNA  hasil sekuensing dianalisis homologinya dengan gen  yang  sama  dari  berbagai  spesies menggunakan  BLAST  yang  diakses  pada situs  hhtp:  //  www.  ncbi.  nlm.  nih.  gov/ BLAST/.
Isolasi fragmen gen LIPASE dari kapang Absidia corymbifera .........

## Hasil dan Pembahasan

## Isolasi RNA kapang
Gambar  1  dan  Tabel  1  menunjukkan kualitas dan kuantitas RNA hasil diisolasi dari  ketiga  jenis  kapang  penghasil  lipase yang  potensial  yaitu R.  oligosporus, A.  corymbifera dan R.  oryzae .  Selain konsentrasinya yang cukup tinggi, nampak bahwa  RNA  yang  dihasilkan  dari  ketiga kapang  juga  memiliki  tingkat  kemurnian tinggi  yang  ditunjukkan  dengan  rasio A260/280  dan  A260/230 ≥ 1.800    (Tabel 1) dan secara  visual ditunjukkan  oleh  dua pita  ribosomal  RNA  yaitu  28S  dan  18S yang jelas (Sambrook et al ., 1989). Kunci keberhasilan  untuk  mendapatkan  RNA kapang  dengan  kuantitas  yang  tinggi adalah  umur  pertumbuhan  yang  sekaligus menentukan jumlah miselium yang dipanen.  Kapang   yang   dipanen   untuk isolasi    RNA    umumnya    mengandung sekitar 6 x 10 8 sel  atau  ekivalen  dengan
1– 1,5 gram  biomassa   miselium,    yang menunjukkan  bahwa  metabolisme  kapang sedang  berada  pada  laju  eksponensial.  Di samping  itu  prosedur  isolasi  RNA  yang dikembangkan  dari  gabungan  metode Chang et. al. (1993) dan Liu et. al. (1998) untuk  mengatasi  kandungan  senyawa polisakarida  yang  tinggi  nampaknya sangat  efektif  untuk  isolasi  RNA  dari kapang.  Kapang  dengan  dinding  sel  yang 80%  terdiri  dari  polisakarida  lebih  mudah mengalami  lisis  sehingga  jumlah  RNA yang diperoleh sangat tinggi. RNA kapang yang  diperoleh  selanjutnya  digunakan untuk sintesis cDNA.

## Amplifikasi fragmen gen LIPASE
Hasil amplifikasi fragmen gen LIPASE dari  ketiga  kapang  ditunjukkan pada Gambar 2. Nampak bahwa ketiganya menghasilkan   fragmen   DNA   berukuran sedikit  lebih  rendah  dari  500  bp.  Untuk mengetahui    secara  pasti    panjang    dan

## 1 kb

## M        1          2          3
Gambar 1. Profil RNA total  tiga galur kapang. (M)  1kb  plus  DNA  ladder;  (1) R.  oligosporus ;  (2) A.  corymbifera ; dan  (3) R.  oryzae dengan  konsentrasi masing-masing 250 ng
Figure 1.  Total RNA profile from three strains of  fungi.  (M)  1kb plus DNA    ladder ; (1) R.  oligosporus ;  (2 )  A.  corym- bifera ;  and  (3) R.  oryzae ,  each quantity  250 ng.
1 2 3 M 462 pb 1 kb 500 bp Gambar  2.  Profil  RT-PCR  kapang Rhizopus oligosporus (1), A.  corymbifera
(2), dan R. oryzae (3) menggunakan  pasangan  primer LIP4F/R. (M) 1kb DNA ladder.
Figure 2.   T-PCR profile from R. oligosporus (1),  A.  corymbifera  (2) and R.  oryzae(  3) using  LIP4F/R primers. (M)1kb DNA ladder.

## Putranto & Budiani
susunan  nukleotida  fragmen  produk  RT- PCR  tersebut,    dilakukan  isolasi  dan pemurnian  fragmen  dari  gel,  kloning  dan isolasi  plasmid  rekombinan,  dilanjutkan dengan  sekuensing.  Kuantifikasi  hasil amplifikasi  tersebut  dengan  program UN- SCAN-IT Gel 6.1 dirangkum pada Tabel 2.
Prinsip kerja program ini adalah membandingkan pixel gambar  masing- masing  sampel  dengan  menggunakan marka  DNA  sebagai  standar  konsentrasi. Baik  secara  visual  maupun  secara kuantitatif nampak hasil RT-PCR tertinggi diperoleh  dari A.  corymbifera (348  ng), sedangkan R.  oligosporus memberikan hasil terendah dengan konsentrasi  sebesar 47 ng (Tabel 2)
Perbedaan  kuantitas  hasil  RT-PCR tersebut  dapat  mencerminkan  perbedaan tingkat ekspresi  gen LIPASE dari  ketiga kapang yang dianalisis. A. corymbifera
paling  kuat  mengekspresikan LIPASE dibanding dua kapang lainnya. Apabila hal ini benar, maka A. corymbifera merupakan kandidat yang  baik untuk  produksi  lipase, baik  langsung  maupun  dengan  rekayasa genetika. Namun perbedaan kuantitas hasil RT-PCR  juga  dapat  disebabkan  oleh perbedaan  spesifisitas  primer  terhadap sekuen  gen LIPASE dari ketiga  kapang. Semakin  tinggi  spesifisitas  primer,  maka semakin  tinggi  produk  RT-PCR  yang dihasilkan.  Ekstrasi  dan  analisis  aktivitas lipase dari ketiga kapang akan mengkonfirmasi  apakah  kuantitas  produk RT-PCR  disebabkan  oleh  perbedaan tingkat  ekspresi  atau  karena  perbedaan spesifisitas primer.
Produksi  lipase  oleh  kapang  pada umumnya dipengaruhi kondisi lingkungan Minyak  sawit  yang  terkandung  dalam medium   menginduksi   kapang     untuk
Tabel 1. Kualitas dan kuantitas RNA total yang diisolasi dari tiga galur kapang.
Table 1. Quality and quatity of  total RNA  isolated from three strains of fungi.

## Rasio serapan
Absorbance ratio (nm) Galur kapang Strains A260/280 A260/230 Kuantitas Quantity (ng/ µ L) R. oligosporus 1,8 1,9 350 A. corymbifera 2,0 1,9 1030 R. oryzae 1,9 1,8 1250
Tabel 2. Kuantitas hasil RT-PCR  dari tiga galur kapang.
Table 2. Quantity of RT-PCR product from three strains of molds.
Galur kapang Strains Kuantitas  ( Quantity ) ng R. oligosporus 47 A. corymbifera 348 R. oryzae 304
Isolasi fragmen gen LIPASE dari kapang Absidia corymbifera .........
menghasilkan  lipase  ekstraseluler  sebagai biokatalis untuk mencerna lemak.
Perakitan  sel  rekombinan  memerlukan enzim  lipase  dengan  sekresi  tinggi, sehingga perbedaan kuantitas cDNA yang dihasilkan  oleh  ketiga  jenis  kapang melalui  RT-PCR  dalam  penelitian  ini merupakan  informasi  berharga,  terutama apabila  teknik  yang  sama  akan  digunakan dalam  isolasi  gen  lengkapnya  untuk rekayasa  genetika.  Karena  kuantitasnya yang  tinggi,  maka  fragmen  produk  RT- PCR dari A.  corymbifera ( Ac_LIP4 ) dipilih  untuk  kloning  ke  dalam E.  coli dilanjutkan  dengan  analisis  DNA  untuk mengkonfirmasi  kebenaran  produk  RT- PCR sebagai fragmen gen LIPASE .

## Isolasi  dan  analisis  fragmen  DNA
Ac_LIP4 hasil RT-PCR
Koloni putih hasil transformasi E. coli XL1Blue  menggunakan  fragmen  DNA produk  RT-PCR  asal A.  corymbifera ( Ac_LIP4 )  dianalisis  untuk  memastikan ada tidaknya sisipan fragmen DNA produk RT-PCR  terklon,  dengan  teknik  PCR koloni  menggunakan  primer  LIP4F/R
(Gambar  3).  Dari  12  koloni  yang dianalisis,  lima  koloni  menunjukkan  hasil positif,  yang  ditunjukkan  oleh  adanya sisipan  DNA  berukuran  sekitar  462  pb. Isolasi plasmid kemudian dilakukan untuk mendapatkan  plasmid  yang  telah  tersisipi fragmen Ac_LIP4. Gambar  4  memper- lihatkan  plasmid  hasil  isolasi  dari E.  coli rekombinan.  Digesti  plasmid  membukti- kan  kembali  keberadaan  DNA  sisipan pada plasmad rekombinan (Gambar 4 lajur 2).
Sekuensing  DNA  yang  dilanjutkan dengan  analisis  BLAST  VecScreen  untuk menghilangkan  kontaminasi  sekuen  DNA yang berasal dari vektornya, menghasilkan sekuen  DNA  sepanjang  462  bp  (Gambar 5).  Hasil  analisis  BLASTn  secara  jelas menunjukkan skor yang tinggi (435 - 773) dan E  value yang  sangat  rendah  (6e-119 sampai  0.0)  antara  fragmen Ac_LIP4 produk  RT-PCR  terklon  dengan  gen LIPASE dari R.  oryzae , R.  niveus , R. delemar , R. microsporus dan R.  Stolonifer (Tabel  3).  Dengan  demikian dapat  dipastikan  bahwa  fragmen  tersebut adalah fragmen gen LIPASE .
Gambar 3. Profil PCR koloni dari E. coli rekombinan yang membawa fragmen Ac_LIP4, (M) 100 bp DNA ladder; lajur (1-12)  koloni terpilih untuk PCR.
Figure 3.  Profile of colony PCR from recombinant E. coli carrying Ac_LIP4 fragment,  (M) 100 bp
DNA ladder; lane (1-12) selected colonies for PCR.
M  8      9     10     11    12 1     2      3       4       5      6     7
462 pb
Putranto & Budiani
GCCAAAGTTCATGCTGGTTTCCTTTCCTCTTATGAGCNNTTGTCAATGACTATTTCCCTGT C GTCC AAGAACAATTGACCGCCCACCCTACTTATAAGGTCATCGTTACCGGTCACTCACTCGGTGGTGCAC AAGCTTTGCTTGCCGGTATGGATCTCTACCAACGTGAACCAAGATTGTCTCCCAAGAATTTGAGCG TCTTCACTGTCGGTGGTCCTCGTGTTGGTAACCCCACCTTTGCTTACTATGTTGAATCC AC C GGTA TCCCTTTCCAACGTACCGTTCACAAGAGAGATATCGTTCCTCACGTTCCTCCTCAATCC TT CGGAT TCCNTTCATCCCGGTGTTGAATCTTGNATCAAGTCTGGTACTTCCAACGTTCAANTCTGTA C TTCT GAATTTGAAACCAAGGANTGCATNAACTCTATCGTTCCTTTCNCCTCTATCCTTGACCA CT TTGAG
Gambar 5.  Sekuen DNA fragmen Ac-LIP4 produk RT-PCR terklon. Anak panah penunjukkan posisi primer LIP4F (             ) dan LIP4R (            )
Figure 5. DNA  sequence  of  the  cloned  RT-PCR  product  of Ac_LIP4 fragment. Arrows showed position of primer LIP4F ( ) and primer LIP4R ( )
Gambar 4. Profil elektroforesis plasmid hasil isolasi dari E. coli rekombinan yang membawa fragmen Ac_LIP4 .  (M) 1 kb   DNA   ladder; (1)  pGEMT-Ac_LIP4; (2)   Plasmid   yang   didigesti menggunakan Eco RI .
Figure 4.  Electrophoretic  profile  of   plasmid  isolated  from   recombinant E. coli carrying Ac_LIP4 fragment. (M1) 1 kb DNA  ladder;  lane (1)  pGEMT-Ac_LIP4;  lane (2)  Digested  plasmid using Eco RI .
462 pb 1 2 M 500 bp
Isolasi fragmen gen LIPASE dari kapang Absidia corymbifera .........
Tabel 3. Gen LIPASE dari berbagai spesies yang mempunyai homologi tinggi dengan fragmen Ac_LIP4 produk RT-PCR.
Table 3. LIPASE genes  from  several species which are  highly  homologous with  RT-PCR product of Ac_LIP4 fragment.
No. Aksesi Deskripsi ( Description ) Skor (bit) E- value AB433531.1 R. oryzae ROL gene for lipase preproprotein, complete cds 773 0.0 D13206.1 R. niveus gene for lipase, complete cds 773 0.0 AY513724.1 R. oryzae Lipadyou-2 gene, partial cds 773 0.0 AB013496.1 R. niveus gene for lipase, complete cds 773 0.0 M38352.1 R. delemar carboxyl ester hydrolase mRNA, complete cds 773 0.0 S39525.1 RNL=lipase [ Rhizopus niveus , mRNA Partial, 958 nt] 769 0.0 D12680.1 R. niveus mRNA for lipase, partial cds 769 0.0 DQ489719.1 R. oryzae lipase precursor, gene, partial cds 755 0.0 DQ080073.1 R. oryzae lipase precursor (Liprbs-1) gene, partial cds 724 0.0 AF229435.1 R. oryzae lipase precursor gene, complete cds 715 0.0 EF405962.2 R. microsporus var. chinensis lipase gene, complete cds 435 6e-119 DQ139862.1 R. stolonifer lipase lipRs mRNA, complete cds 402 4e-109
Gambar  6  menyajikan  hasil  pen- jajaran  sekuen  DNA  fragmen Ac_LIP4 dengan  gen LIPASE dari R.  niveus ( Rn_LIP )  yang  diakses  pada  bank  gen, dan  fragmen  DNA  produk  PCR  genomik dari R.  oryzae ( Ro_LIP )  yang  dihasilkan dari penelitian sebelumnya (Putranto et al., 2006).  Dari  gambar  tersebut  dapat  dilihat bahwa fragmen
Ac_LIP4 terklon mempunyai  homologi  tinggi  dengan Rn_LIP pada  nukleotida  ke-920  sampai 1380,  serta  dengan  fragmen  gen  yang sama  dari R.  oryzae ( Ro_LIP )  pada nukleotida ke-400 hingga 860.  Perbedaan dapat  dideteksi  pada  nukleotida  ke-198, yaitu  G    (Guanine)  pada Ac_LIP4 dan A  (Adenine)  pada Rn_LIP dan Ro_LIP , nukleotida  ke-400,  yaitu  T  (Thymine) pada Ac_LIP4 ,  dan  A  pada Rn_LIP dan Ro_LIP serta  nukleotida  ke-419,  yaitu  T pada Ac_LIP4 ,  dan  G  pada Rn_LIP dan
Ro_LIP. Sedangkan perbedaan  nukleotida lain  yang  terdeteksi  adalah  hilangnya  G pada    posisi  antara  nukleotida  ke-39  dan ke-40, penambahan satu T pada posisi ke- 336  dan  posisi  ke-359  serta  beberapa nukleotida  yang  tidak  dapat  dibaca  oleh mesin sekuensing yang dinyatakan sebagai N  (pada  posisi  ke-  38,  39,  334,  357,  385, 414,  421  dan  440).  Perlu  analisis  lebih lanjut untuk mengetahui apakah perbedaan nukleotida  yang  terdeteksi  adalah  akibat mutasi  atau  hanya  kesalahan  pembacaan mesin sekuensing yang sering terjadi, serta untuk mendapatkan pembacaan nukleotida yang  benar  pada  beberapa  posisi  yang ditunjukkan sebagai N. Sekuen DNA yang diperoleh dari penelitian ini akan dijadikan dasar  untuk  merancang  primer  spesifik yang  diperlukan  dalam  mendapatkan  gen lengkapnya  dengan  teknik  RACE  ( Rapid Amplification of cDNA Ends ).
Putranto & Budiani
Gambar 6. Penjajaran sekuen DNA fragmen Ac_LIP4 dengan  sekuen   DNA dari Rn_LIP ( gen LIPASE dari R. niveus) dan Ro_LIP (fragmen DNA gen LIPASE hasil PCR genomik dari R. oryzae ).
Figure 6.  Alignment of DNA sequence of Ac_LIP 4   fragment  with Rn_LIP gene  ( LIPASE gene  from R. niveus ) and Ro_LIP ( DNA  fragment of LIPASE gene  produced  by   genomic PCR  from R. oryzae).
Ac_LIP4 --------------------------------------- GCCAAAGTTCATGCTGGTTTCCTTTCCTCTTATGAGC NN- T 40 Rn_LIP CTACAAGCCTGTCAAGGGCGCCAAAGTTCATGCTGGTTTCCTTTCCTCTTATGAGC AA GT 960 Ro_LIP CTACAAGCCTGTCAAGGGCGCCAAAGTTCATGCTGGTTTCCTTTCCTCTTATGAGC AA GT 440
Ac_LIP4 TGTCAATGACTATTTCCCTGTCGTCCAAGAACAATTGACCGCCCACCCTACTTATAAGGT 100 Rn_LIP TGTCAATGACTATTTCCCTGTCGTCCAAGAACAATTGACCGCCCACCCTACTTATAAGGT 1020 Ro_LIP TGTCAATGACTATTTCCCTGTCGTCCAAGAACAATTGACCGCCCACCCTACTTATAAGGT 500 Ac_LIP 4 CATCGTTACCGGTCACTCACTCGGTGGTGCACAAGCTTTGCTTGCCGGTATGGATCTCTA 160 Rn_LIP CATCGTTACCGGTCACTCACTCGGTGGTGCACAAGCTTTGCTTGCCGGTATGGATCTCTA 1080 Ro_LIP CATCGTTACCGGTCACTCACTCGGTGGTGCACAAGCTTTGCTTGCCGGTATGGATCTCTA 560
Ac_LIP4 CCAACGTGAACCAAGATTGTCTCCCAAGAATTTGAGC G TCTTCACTGTCGGTGGTCCTCG 220 Rn_LIP CCAACGTGAACCAAGATTGTCTCCCAAGAATTTGAGC A TCTTCACTGTCGGTGGTCCTCG 1140 Ro_LIP CCAACGTGAACCAAGATTGTCTCCCAAGAATTTGAGC A TCTTCACTGTCGGTGGTCCTCG 620
Ac_LIP4 TGTTGGTAACCCCACCTTT GCTTACTATGTTGAATCCAC CGGTATCCCTTTCCAACGTAC 280 Rn_LIP TGTTGGTAACCCCACCTTT GCTTACTATGTTGAATCCAC CGGTATCCCTTTCCAACGTAC 1200 Ro_LIP TGTTGGTAACCCCACCTTT GCTTACTATGTTGAATCCAC CGGTATCCCTTTCCAACGTAC 680
Ac_LIP4 CGTTCACAAGAGAGATATCGTTCCTCACGTTCCTCCTCAATC CTTCG GATTCC N TTCATC 340 Rn_LIP CGTTCACAAGAGAGATATCGTTCCTCACGTTCCTCCTCAATC CTTCG GATTCC T T -- CATC 1259
Ro_LIP CGTTCACAAGAGAGATATCGTTCCTCACGTTCCTCCTCAATC CTTCG GATTCC T T -- CATC 739
Ac_LIP4 CCGGTGTTGAATCTTG N ATCAAGTCTGGTACTTCCAACGTTCAA N TCTGTACTTCT GAA T    400 Rn_LIP CCGGTGTTGAATCTTG G ATCAAGTCTGGTACTTCCAACGTTCAA A TCTGTACTTCT GAA A   1319 Ro_LIP CCGGTGTTGAATCTTG G ATCAAGTCTGGTACTTCCAACGTTCAA A TCTGTACTTCT GAA A   799
Ac_LIP4 TTGAAACCAAGGA N TGCA TN AACTCTATCGTTCCTTTC N CCTCTATCCTT  GACCACTTTG 460 Rn_LIP TTGAAACCAAGGA T TGCA GT AACTCTATCGTTCCTTTC A CCTCTATCCTT  GACCACTT -- G 1378 Ro_LIP TTGAAACCAAGGA T TGCA GT AACTCTATCGTTCCTTTC A CCTCTATCCTT  GACCACTT -- G 858 Ac_LIP4 AG ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------    462 Rn_LIP AGTTACTTTGATATCAACGAAGGAAGCTGTTTGTAAAACACTTGACGTGTTACTCTAATT 1438 Ro_LIP AGTTACTTTGATATCAACGAAGGAAGCTGTTTGTAA ------------------------------------------------    894
Isolasi fragmen gen LIPASE dari kapang Absidia corymbifera .........

## Kesimpulan dan Saran
Fragmen  DNA  berukuran  462  bp telah  diisolasi  dari  tiga  kapang  potensial penghasil  lipase,  yaitu A.  corymbifera, R.  oryzae, dan R.    oligosporus. Fragmen tersebut  telah  terkonfirmasi  sekuennya sebagai  fragmen  gen LIPASE. Ketiga kapang mengakumulasikan fragmen DNA tersebut  dengan  kuantitas  yang  berbeda. Akumulasi tertinggi diperoleh dari A. corymbifera , diikuti oleh R. oryzae dan terendah adalah R.  oligosporus.

## Daftar Pustaka
AOCS  Press  (2007).  Diacylglycerol  Oil  & Lipases. Chapter 19-22: 197-252.
Chang,  S.,  J.  Puryear  &  J.  Cairney  (1993). A  simple  and  efficient  method  for isolating RNA from pine trees. Plant Mol. Biol. Rep., 11 , 98 – 100.
Dunford,  N.  (2002). ADM  Launches  Fat- Fighting Cooking Oil. Food & Agricultural  Products  Center .  December 17,  2002.  Taken  from  http://www.fapc. okstate.edu/FAPC-Flash/newcooking oil.pdf.
Elisabeth,  J.  (2003).    Roadmap  dan  agenda Rusnas  kelompok  kerja  farmasi  dan nutrasetikal. Dalam : Panduan Lokakarya Nasional. Identifikasi  agenda  riset strategis  dalam  rangka  pengembangan industri  hilir  kelapa  sawit.  Jakarta, Masyarakat Perkelapa-Sawitan Indonesia.
Hoq , M . M , T . Yamane , S . Shimizu , T . Funada, & S . Ishida (1985). Continuous hydrolysis of  olive  oil by  lipase  in  microporous hydrophobic membrane bioreactor. J . Am . Oil Chem . Soc ., 62 , 1016 - 1021 .
Kosugi, Y., H. Tanaka & N. Tomizuka (1990).
Continous hydrolysis of oil by immobilized  lipase  in  a  countercurrent reactor. Biotech. Bioeng ., 36, 617-622.
Liu, J.J., C.J Goh, C.S Loh, Liu P. & E.C. Pua
(1998).  A  method  for  isolation  of  total RNA  from  fruit  tissues  of  banana. Plant Mol. Biol. Rep., 16, 1-6.
Murooka, Y. & T. Imanaka (1993).
Recombinant  Microbes  for  Industrial  and Agricultural  Applications .  New  York, Marcel Deker Pub. 896 pp.
Nining,  A.  (2005).  Isolasi  dan  penapisan mikroba  penghasil  lipase  spesifik  - gliserida serta penentuan kondisi optimum produksi diasilgliserol menggunakan minyak sawit mentah.
Jakarta,
Universitas Indonesia. Tesis . 60 p.
Onions,  A.H.S.,  D.  Allsopp  &  H.O.W.  Eggins (1981). Smith’s  Introduction  to  Industrial Mycology. 7 th eds.  London,  Edwards Arnold British. P.140-142.
Pradana, R. (2007). Nyiur Melambai, Nusantara.  Mediacare.  Diunduh  dari http://www.mailarchive.com/mediacare@ yahoogroups.com/msg25408.html.
Putranto, R.A., D. Santoso, Tri-Panji, Suharyanto  &  A.  Budiani  (2006).
Karakterisasi  gen  penyandi  Lipase  dari kapang R.  oryzae dan A.  corymbifera . Menara Perkebunan , 74 (1), 1-5.
Sambrook, J.E, F. Fritsch & T. Maniatis (1989).
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd  ed. New  York,  Cold  Spring  Harbor Lab. Press.
Saxena,  R.K.,  P.K.  Ghosh,  R.  Gupta,
W.  S.  Davidson,  S.  Bradoo  &  R.  Gulati (2000). Microbial lipases: Potential biocatalysts for the future industry .  Curr.
Sci ., 77 , 101–115.
Suzuki,  T.,  Y.  Mushiga,  T.  Yamane  &
S.  Shimizu  (1988).  Mass  production  of lipase by fed-batch culture of Pseudomonas fluorescens, Appl. Microbiol. Biotechnol., 27, 417-422.
Tri-Panji  (1997).    Growth  and  the  content  of polyunsaturated fatty acids of Absidia

## Putranto & Budiani
corymbifera biomass on media containing  crude  palm  oil. Menara Perkebunan , 65 (3) 104-110 . Tri-Panji, Suharyanto, A.W. Paulus & K. Syamsu (2007). Optimasi pertumbuhan dan  aktivitas  desaturase A.  corymbifera dan R.  oryzae dalam    medium  basal dengan  beberapa  variasi  sumber  karbon. Jurnal  Teknologi  Pertanian, 11 (3),  101- 107.
Van  Dijck,  P.W.M.  (1999).  Chymosin  and Phytase. Made by genetic engineering (No. 10  in  a  series  of  articles  to  promote  a better understanding of  the use  of genetic engineering). J. Biotechnol ., 67 ,77-80.
Yamane, T. (1987). Enzyme technology for the lipids industry : An Engineering overview. In Applewhite, T. H. (ed.). Proceeding of World  Conference  on  Biotechnology  for the  Fats  and  Oils  Industry . AOAC Champaign . p.17-22.
Yang,  T.  &  X.  Xu  (2001).  Enzymatic modification of palm oils: useful products with  potential  processes. In: Proceedings of  International  Palm  Oil  Congress: Chemistry and Technology , MPOB, Kuala
Lumpur, p. 45-64
Yasunaga,  K.,  Y.  Katsuragi  &  T.  Yasukawa
(2001).    Nutritiolal  characteristics  of diacylglycerol. In: 2001 PIPOC International  Palm  Oil  Congress .  p.  149-
155.