Eliminasi Onion yellow dwarf virus melalui Kultur Meristem Tip pada Bawang Merah ( Allium ascalonicum L.)
Elimination of Onion yellow dwarf virus through Meristem Tip Culture in Shallot (Allium ascalonicum L.)
Aqlima 1 , Bambang S. Purwoko 2 , Sri Hendrastuti Hidayat 3 , dan Diny Dinarti 2*
Diterima 19 Oktober 2016/Disetujui 08 Februari 2017

## ABSTRACT
Meristem  tip  culture  is  culture  of  isolated  meristem  with  1-2  leaf  primordia  on  suitable medium.  This  method  is  generally  used  to  obtain  free  virus  plant.  Optimation  of  plant  growth regulators  (PGRs)  was  done  to  accelerate  explant  growth  without  callus  formation  and  to  avoid somaclonal  variation  in  meristem  tip  culture.  The  aims  of  this  study  were  to  achieve  the  best combination  of  PGR  for  meristem  tip  growth  and  to  evaluate  meristem  tip  culture  potential  for Onion yellow dwarf virus (OYDV) elimination in shallot. This study used combination of PGRs 0.25 mg  L -1 (2-ip,  BAP,  GA 3, kinetin)  with  or  without  0.1  mg  L -1 IAA  and  medium  without  PGR.  This research consisted of two experiments conducted separately. In experiment I, cv. Bima Brebes  was used  and  experiment  II  cv.  Tiron  was  used.  Each  experiment  was  arranged  in  completely randomized block design with single factor (PGR combination) that has 8 combination levels and 3 replications.  The  result  showed  that  medium  without  PGR  was  the  most  efficient  for  meristem  tip growth. Primary shoot was growing without callus formation. RT-PCR analysis showed that all of the tested samples were still infected by OYDV. Meristem tip culture method did not eliminate OYDV in both cultivars.
Keywords: Auxin, cytokinin, GA 3 , OYDV, RT-PCR

## ABSTRAK
Kultur meristem tip merupakan kultur meristem  yang  diisolasi 1-2 primordia daun dan pada media yang sesuai. Metode ini umum digunakan untuk mendapatkan tanaman bebas virus. Optimasi terhadap  zat  pengatur  tumbuh  (ZPT)  dilakukan  untuk  mempercepat  pertumbuhan  eksplan  tanpa disertai pembentukan kalus untuk menghindari terjadinya variasi somaklonal pada kultur meristem tip . Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kombinasi ZPT terbaik bagi pertumbuhan meristem tip dan  untuk  mengevaluasi  potensi  kultur meristem  tip dalam  mengeliminasi  virus Onion  yellow dwarf virus (OYDV) pada tanaman bawang merah. Penelitian ini menggunakan 0.25 mg L -1 (2-ip, BAP,  GA 3 ,  kinetin)  dengan  penambahan  atau  tanpa  0.1  mg  L -1 IAA  serta  media  tanpa  ZPT. Penelitian  ini  terdiri  atas  2  percobaan  terpisah.  Percobaan  1  menggunakan  cv.  Bima  Brebes  dan Percobaan  2  menggunakan  cv.  Tiron.  Masing-masing  percobaan  disusun  berdasarkan  rancangan kelompok  lengkap  teracak  (RKLT) dengan 1  faktor,  yaitu  kombinasi  ZPT  yang terdiri  atas 8  taraf kombinasi  dan  3  ulangan.  Hasil  yang  didapat  menunjukkan  bahwa  media  tanpa  penambahan  ZPT merupakan media yang paling efisien untuk pertumbuhan tunas meristem tip . Tunas utama tumbuh tanpa disertai pembentukan kalus. Hasil analisis RT-PCR menunjukkan bahwa seluruh sampel yang dideteksi  masih  terinfeksi  OYDV.  Metode  kultur meristem  tip belum  dapat  mengeliminasi  virus OYDV pada kedua kultivar bawang merah.
Kata kunci: Auksin, GA 3 , OYDV, RT-PCR, sitokinin
1 Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680
2 Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor Jl. Meranti, Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680
3 Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor Jl. Kamper, Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680 Email: dinydinarti@gmail.com (*penulis korespondensi)

## PENDAHULUAN
Bawang merah ( Allium ascalonicum L.) merupakan  salah  satu  komoditas  pertanian penting yang memiliki potensi hasil tinggi dan dibudidayakan  di  berbagai  wilayah  Indonesia. Perbanyakan  bawang  merah  pada  umumnya dilakukan  secara  vegetatif,  karena  dianggap lebih  praktis.  Perbanyakan  secara  vegetatif dapat  menyebabkan  berbagai  infeksi  virus terbawa  oleh  benih  dan  terakumulasi  dari generasi  ke  generasi  (Gunaeni et  al .,  2011). Onion yellow dwarf virus (OYDV) merupakan salah  satu  jenis  virus  yang  sering  ditemukan menginfeksi  tanaman  bawang  (Shahraeen et al ., 2008). Virus ini berperan dalam penurunan ukuran  umbi,  memperpendek  masa  dormansi umbi  dan  menyebabkan  kehilangan  hasil panen  (Brewster,  2008).  Infeksi  OYDV  pada bawang bombay dan bawang putih di wilayah Giza dilaporkan menurunkan bobot umbi yang mencapai  42-58%  (Elnagar et  al .,  2009).
Gunaeni et al . (2011) melaporkan bahwa 85% dari  kultivar  bawang  merah  yang  diperoleh dari  sentra  produksi  daerah  Jawa  Barat  dan Jawa Tengah juga telah terinfeksi OYDV. Penggunaan bahan perbanyakan tanaman yang sehat merupakan salah satu cara yang  dapat  dilakukan  untuk  mencegah kehilangan  hasil  panen  akibat  infeksi  virus (Perotto et  al ., 2010).  Kultur meristem  tip merupakan  metode  yang  umum  digunakan untuk  mendapatkan  tanaman  bebas  virus.  Hal ini  didasari  oleh  asumsi  bahwa  bagian  kubah apikal bebas dari infeksi virus atau mengandung  sedikit  konsentrasi  virus  (Wang dan Hu, 1980). Metode ini telah diaplikasikan oleh  Verbeek et  al. (1995)  dan  Taşkin et  al. (2013)  pada  bawang  putih  dan  berhasil mendapatkan tanaman yang bebas dari infeksi OYDV.  Penelitian  Kasutjianingsih et  al . (2011)  menunjukkan  bahwa  aplikasi in  vitro Rizobakteri sebagai agen hayati dapat menurunkan keparahan penyakit layu Fusarium.  Namun  sejauh  ini,  penelitian  yang mengkaji  eliminasi  virus  pada  bawang  merah masih terbatas, sehingga perlu dikembangkan. Pemilihan  dan  penentuan  konsentrasi zat  pengatur  tumbuh  (ZPT)  pada  kultur meristem tip bergantung pada jenis dan ukuran eksplan yang digunakan (Bhojwani dan Dantu, 2013).  Pemberian  NAA  dan  GA 3 pada konsentrasi  0.3  mg  L -1 mampu  mempercepat pertumbuhan tunas meristem tip bawang putih
(Ma et  al .,  1994).  GA 3 juga  mampu menginduksi  pertumbuhan  tunas  yang  normal tanpa  adanya  multiplikasi  pada  tanaman anyelir (Ashnayi et al ., 2012). Pada umumnya, sitokinin digunakan dalam kultur meristem tip . Aplikasi sitokinin (2-ip, BA dan kinetin) pada konsentrasi  tinggi  dengan  kisaran  0.5-2.0  mg L -1 dilaporkan  dapat  menginduksi  terjadinya multiplikasi  tunas  pada meristem  tip bawang putih, baik pemberian dalam bentuk kombinasi auksin-sitokinin  ataupun  sitokinin  tunggal (Taşkin et al ., 2013; Gull et al ., 2014). Penelitian ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  kombinasi ZPT  yang  paling  baik  untuk  pertumbuhan meristem  tip dan  mengevaluasi  potensi  kultur meristem  tip dalam  mengeliminasi  virus OYDV pada bawang merah.

## BAHAN DAN METODE

## Pesiapan Bahan Tanam dan Sterilisasi
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman 3, dan Laboratorium Mikroteknik, Departemen Agronomi dan Hortikultura IPB serta Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi  Tanaman  IPB  pada  bulan  Juni  2015 sampai Juni 2016. Percobaan ini menggunakan bawang  merah  kultivar Bima  Brebes  dan Tiron.  Umbi  bibit  yang  digunakan  telah mengalami  dua  bulan  penyimpanan  dan diperoleh  dari  petani  penyedia  bibit  bawang merah di Kabupaten Brebes dan Bantul.
Persiapan  eksplan  diawali  dengan membuang  kulit  terluar  dan  mencuci  bersih umbi  bawang  merah,  selanjutnya  umbi  dicuci bersih  menggunakan  deterjen  selama  7  menit sebanyak  2  kali,  dan  dibilas  dengan  air mengalir,  kemudian  umbi  direndam  dalam larutan  0.04%  streptomisin  sulfat  dan  0.16% mankozeb  selama  semalam,  dan  dibilas dengan akuades steril sebanyak 2-3 kali. Umbi disterilisasi  dengan  1.05%  NaOCl  selama  20 menit.  Tahapan  selanjutnya  dilakukan  di laminar  air  flow (LAF).  Umbi  dikupas  1-2 lapisan, kemudian disterilisasi dengan 0.525% NaOCl  selama  25  menit.  Eksplan  dipotong hingga  berukuran  0.5-1.0  cm  dan  dikulturkan pada media MS serta diinkubasi selama 1 hari (24  jam).  Eksplan  yang  sudah  dikulturkan pada media MS disterilisasi kembali menggunakan 0.263% NaOCl selama 5 menit.
Isolasi eksplan meristem tip berukuran kurang dari  1  mm  dilakukan  di  bawah  mikroskop binokular  dengan  bantuan  pinset  dan  jarum diseksi.

## Rancangan Percobaan dan Pelaksanaan
Eksplan dikulturkan pada media Murashige dan Skoog (MS) yang mengandung zat  pengatur  tumbuh  (ZPT)  dan  tanpa  ZPT (kontrol)  serta  dengan  penambahan  30  g  L -1 sukrosa dan 2 g L -1 Gelrite dengan pH 5.8-6.0. ZPT  yang  digunakan,  terdiri  atas  0.25  mg  L -1 GA 3 ,  0.25  mg  L -1 (2-ip,  BAP,  kinetin) dikombinasikan  dengan  dan  tanpa  0.1  mg  L -1
IAA.  Eksplan  diinkubasi  di  ruang  kultur dengan  intensitas  cahaya  2000  lux  selama  24 jam pada suhu 25 ± 1 0 C. Penelitian ini terdiri atas  2  percobaan  terpisah.  Percobaan  1 menggunakan cv. Bima Brebes dan Percobaan 2  menggunakan  cv.  Tiron.  Masing-masing percobaan  disusun  berdasarkan  rancangan kelompok  lengkap  teracak  (RKLT)  dalam faktor  tunggal,  yaitu  kombinasi  ZPT  untuk pertumbuhan  tunas meristem  tip yang  terdiri atas  8  taraf  kombinasi.  Masing-masing perlakuan  diulang  sebanyak  3  kali,  sehingga terdapat  24  satuan  percobaan.  Satu  satuan percobaan  terdiri  atas  4  tabung  kultur  dan masing-masing tabung ditanam satu eksplan.
Eksplan  steril  dikulturkan  pada  media perlakuan selama 3 minggu, selanjutnya tunas yang tumbuh dipindahkan ke media multiplikasi tunas berupa media MS + 2 mg L -1 2-ip  + 0.3  mg  L -1 GA 3 dan  disimpan  di ruang kultur  dengan  kondisi  yang  sama.  Subkultur dilakukan  3-4  minggu  sekali  sebanyak  3  kali. Tunas  yang  tumbuh  selanjutnya  dipindahkan ke  media  induksi umbi  mikro (Dinarti, 2012), yaitu media MS + vitamin B5 + sukrosa 120 g L -1 dan  diinkubasi  di  ruang  kultur  dengan intensitas cahaya 2000 lux selama 24 jam pada suhu 30 ± 1 0 C selama 8 minggu, hingga tunas menjadi planlet.
Tahapan  persiapan  dan  aklimatisasi planlet.  Planlet  umbi  lapis  mikro  dibersihkan dari  sisa-sisa  media  dan  direndam  dalam larutan  bakterisida  dan  fungisida  masing- masing  2  g  L -1 selama  5  menit,  kemudian dikeringkan  dengan  kertas  tisu.  Umbi  lapis mikro ditanam dalam wadah gelas plastik yang telah  diberi  media  dengan  campuran  tanah steril, arang sekam dan pupuk kandang (1:1:1). Penyiraman  menggunakan  media  ½  MS
dilakukan  2  hari  sekali  dan  pemberian  pupuk daun ( Gandasil D ) 2 g L -1 dilakukan 1 minggu sekali.  Aklimatisasi  dilakukan  di  kotak  kasa yang  ternaung  dari  sinar  matahari  langsung selama 2-3 minggu.

## Ekstraksi RNA dan RT-PCR
Ekstraksi RNA dilakukan secara manual menggunakan  metode  CTAB  (Doyle  dan Doyle,  1987)  yang  telah  modifikasi.  Sintesis complementary DNA  ( C DNA)  dilakukan dengan  10  μl  volume  yang  mengandung  3  μl RNA, 1 μl primer poty, 2 μl 50 mM DTT, 2 μl 5x buffer RT,  1  μl  10  mM  dNTP,  0.5  μl Ribolock ,  0.35  μl  M  MuLV,  0.15  μl Water free-nuclease .  Reaksi  terdiri  atas  65 0 C  (5 menit), 42 0 C (60 menit) dan 70 0 C (10 menit). Primer  untuk  amplifikasi  PCR  berdasarkan Mahmoud et al. (2007), dengan primer forward 5’-  CGAAGCAAATTGCCAAGCAG  -3’  dan reverse 5’- CGATTAGCTGCCCCTCTAAC -3’. Reaksi  PCR  dilakukan  dengan  25  μl  volume larutan yang mengandung 9.5 μl dH 2 0, 12.5 μl GTG master  mix ,  1  μl  untuk  masing-masing primer  ( forward - reverse )  dan  1  μl C DNA. Amplifikasi  dilakukan  sebanyak  satu  siklus pada  94 0 C  (3  menit),  selanjutnya  35  siklus dengan  tahapan  denaturasi  pada  94 0 C  (30 detik), annealing pada  52 0 C  (1  menit),  dan sintesis pada 72 0 C (1 menit), serta satu siklus pada 72 0 C (7 menit). Amplifikasi DNA target dilakukan  menggunakan  mesin GeneAMP PCR  System  9700 ( PE Applied  Biosystems ).
Pada penelitian ini, kontrol positif menggunakan  RNA  tanaman  yang  positif terinfeksi  OYDV,  sedangkan  kontrol  negatif menggunakan Water  free  nuclease. DNA dielektroforesis  menggunakan  1%  gel  agarosa yang dilarutkan dalam buffer 0.5x Tris-Borate EDTA (TBE) pada tegangan 50 volt selama 50 menit,  kemudian  direndam  dalam  larutam etidium  bromida  selama  30  menit.  Penanda ukuran  DNA  yang  digunakan  adalah  1  kb DNA Ladder ( Thermo  Scientific ,  USA).
Visualisasi  DNA  dilakukan  di  bawah UV transluminator dan  didokumentasikan  dengan kamera digital.

## Deteksi  Awal  Infeksi  Virus  pada  Umbi Bawang Merah
Deteksi  awal  hanya  dilakukan  pada bawang  merah  cv.  Tiron,  karena  diasumsikan Bima  Brebes  telah  terinfeksi  OYDV  yang
merujuk  pada  laporan  Wulandari  (2016), bahwa  umbi  yang  dideteksi  100%  telah terinfeksi  virus.  Deteksi  awal  menggunakan umbi  Tiron  yang  diperoleh  dari  penangkar bawang merah di Kabupaten Bantul. Penanaman  umbi  dilakukan  dengan  cara mengambil  100  umbi  secara  acak  dari  2  ikat benih umbi  (satu  ikat benih beratnya  ± 2  kg). Ujung umbi  dipotong sekitar 1/3 bagian  umbi yang bertujuan untuk mempercepat perkecambahan.  Selanjutnya,  umbi  ditanam pada  media  air  selama  2  minggu  dengan bantuan styrofoam yang  telah  dilubangi sebagai penyangga umbi. Pengambilan sampel daun dari umbi yang ditanam dilakukan secara acak,  yaitu  sebanyak  49  dari  100  umbi  yang ditanam.  Pendeteksian sampel  daun dilakukan dengan  metode dot  immune  binding  assay (DIBA) menggunakan antibodi OYDV berdasarkan  metode  Mahmoud et  al .  (1997) yang telah dimodifikasi.

## Pengamatan dan Analisis Data
Pengamatan  terhadap  eksplan  yang diberi perlakuan ZPT dilakukan setiap minggu hingga  3  minggu  setelah  tanam  (MST). Peubah  yang  diamati  dari  percobaan  ini meliputi persentase tumbuh eksplan, persentase eksplan berdaun, persentase eksplan  abnormal,  jumlah  daun,  tinggi  tunas, dan persentase eliminasi virus. Data penelitian dianalisis menggunakan analisis ragam
(ANOVA).  Uji  lanjut  dilakukan  terhadap perlakuan yang berpengaruh nyata
menggunakan Duncan’s  Multiple  Range  Test (DMRT) pada tingkat kepercayaan 95%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pertumbuhan  awal meristem  tip setelah dikultur pada media perlakuan memperlihatkan pemanjangan primordia daun dan pembengkakan bagian cakram umbi ( basal plate ) yang terlihat pada  1  MST. Keberhasilan  tumbuh  eksplan dilihat dari kemampuan eksplan untuk tumbuh dan  membentuk  daun  (Gambar  1.  a-c). Persentase tumbuh eksplan Bima Brebes yang paling  tinggi  diperoleh  dari  perlakuan  kinetin serta  kombinasi  2-ip  dan  IAA,  dengan persentase  tumbuh  yang  mencapai  100% (Gambar 2). Sementara itu, persentase tumbuh eksplan  yang  paling  rendah  (58%)  terdapat pada  perlakuan  GA 3 ,  serta  kombinasi  kinetin dan  IAA.  Persentase  eksplan  tumbuh  yang paling  tinggi  pada  Tiron  yaitu  91%  terdapat pada  perlakuan  BAP  dan  kombinasi  kinetin dengan IAA.
Rata-rata  persentase  eksplan  Bima Brebes  dan  Tiron  yang  mengalami  gagal tumbuh masing-masing sebesar 19% dan 28%. Kegagalan pertumbuhan eksplan yang diisolasi dari meristem  tip (0.6-1.0  mm)  bawang  putih sebesar  29%  juga  dilaporkan  Verbeek et  al.
(1995).  Gagalnya  eksplan  tumbuh  tidak disebabkan oleh media, akan tetapi dipengaruhi oleh  kontaminasi,  perlukaan  akibat  isolasi eksplan maupun akibat proses sterilisasi.
Gambar 1. Tahapan kultur meristem tip , pengumbian in vitro , dan aklimatisasi pada cv. Bima Brebes dan  Tiron.  a.  Isolasi meristem yang  disertai  1-2  primordia  daun, bar =  200  µm,  b. Pertumbuhan meristem  tip pada  1  MST,  c.  Pertumbuhan meristem  tip 3  pada  MST,  d. Perbanyakan tunas, e. Umbi lapis mikro, dan f. Aklimatisasi
a b c d e f
Eksplan  Bima  Brebes  yang  telah berhasil  tumbuh  dapat  membentuk  daun dengan  rata-rata  100%,  sedangkan  persentase berdaun  eksplan  Tiron  13%  lebih  rendah  dari Bima  Brebes.  Hasil  analisis  statistik  terhadap persentase  eksplan  berdaun  pada  cv.  Tiron menunjukkan  bahwa  perlakuan  ZPT  tidak memberikan pengaruh yang nyata.
Selama tiga minggu pengamatan ditemukan  eksplan  dengan  morfologi  yang tidak  normal,  seperti  daun  atau  tunas  yang mengalami  vitrifikasi  maupun  klorosis  pada
cv. Tiron. Persentase eksplan abnormal antara 0-22%.  (Gambar  3).  Sebagian  besar  eksplan mengalami vitrifikasi atau disebut juga dengan hyperhidricity memperlihatkan morfologi daun yang  tembus  cahaya.  Eksplan  cenderung mengalami  pertumbuhan  yang  lambat  dan bahkan tidak mampu bertahan hidup. Wu et al. (2009)  menyatakan  bahwa  tanaman  yang mengalami hyperhydric memiliki  kandungan air  yang  lebih  tinggi,  sehingga  menyebabkan kandungan  oksigen,  protein  dan  klorofil  pada tanaman rendah.
Keterangan: M0 = Kontrol, M1 = 0.25 mg L -1 2-ip, M2 = 0.25 mg L -1 BAP, M3 = 0.25 mg L -1 GA 3 , M4 = 0.25 mg L -1 kinetin, M5 = 0.25 mg L -1 2-ip + 0.1 mg L -1 IAA, M6 = 0.25 mg L -1 BAP + 0.1 mg L -1 IAA, M7 = 0.25 mg L -1 kinetin + 0.1 mg L -1 IAA
Gambar 2. Persentase tumbuh eksplan pada dua kultivar bawang merah pada 3 MST
Keterangan: M0 = Kontrol, M1 = 0.25 mg L -1 2-ip, M2 = 0.25 mg L -1 BAP, M3 = 0.25 mg L -1 GA 3, M4 = 0.25 mg L -1 kinetin, M5 = 0.25 mg L -1 2-ip + 0.1 mg L -1 IAA, M6 = 0.25 mg L -1 BAP + 0.1 mg L -1 IAA, M7 = 0.25 mg L -1 kinetin + 0.1 mg L -1 IAA
Gambar 3. Persentase eksplan berdaun dan abnormal pada cv. Bima Brebes dan Tiron
0 20 40 60 80 100 120 140 M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 E k sp lan T u m b u h ( % ) Media Bima Brebes Tiron 0 20 40 60 80 100 M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 % E k sp lan
B er d au n d an ab n or m al Media
Eksplan berdaun (Bima Brebes)
Eksplan berdaun (Tiron)
Eksplan abnormal (Tiron)
Tabel 1. Respon eksplan ( meristem tip ) terhadap perlakuan ZPT
ZPT Bima Brebes Tiron Jumlah Daun (Helai) Tinggi Tunas (cm) Jumlah Daun (Helai) Tinggi Tunas (cm) Kontrol 2.11 2.46 1.89 1.58  a 0.25 mg L -1 2-ip 1.75 2.18 1.67 1.32  ab 0.25 mg L -1 BAP 2.22 2.11 2.14 1.23  ab 0.25 mg L -1 GA 3 1.75 2.74 1.83 1.20  ab 0.25 mg L -1 Kinetin 2.00 2.68 1.88 1.45  a 0.25 mg L -1 2ip + 0.1 mg L -1 IAA 2.00 1.73 1.50 0.68  bc 0.25 mg L -1 BAP + 0.1 mg L -1 IAA 2.17 1.43 1.33 0.56  c 0.25 mg L -1 kinetin + 0.1 mg L-1 IAA 1.89 1.97 1.47 0.86  abc KK (%) 12.80 18.37 5.12 16.63 Uji F tn tn tn *
Keterangan: tn = tidak berbeda nyata, * = berbeda nyata, angka yang diikuti huruf kecil yang sama pada kolom yang sama artinya tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf α = 0.05.
Eksplan  cv.  Bima  Brebes  dan  Tiron yang dikulturkan pada media dengan perlakuan ZPT tidak memperlihatkan pengaruh  yang  berbeda  nyata  pada  jumlah daun.  Perlakuan  ZPT  berpengaruh  nyata  pada tinggi tunas cv. Tiron (Tabel 1). Eksplan yang dikulturkan  pada  media  tanpa  ZPT  (kontrol) memiliki  tinggi  tunas  yang  nyata  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  eksplan  pada  media yang  mengandung  2-ip  +  IAA  dan  BAP  + IAA, namun tinggi tunas eksplan kontrol tidak berbeda nyata dengan eksplan yang dikulturkan pada media yang diberi 2-ip, BAP, GA 3 ,  kinetin,  dan  kombinasi  kinetin  +  IAA.
Gull et al . (2014) melaporkan bahwa meristem tip bawang putih yang dikulturkan pada media MS  tanpa  ZPT  tetap  dapat  tumbuh  dan membentuk tunas. Bhojwani dan Dantu (2013) menyatakan bahwa eksplan dapat tumbuh dan berkembang  menjadi  planlet  disebabkan  oleh meristem tip memiliki 1-2 primordia daun yang dapat  mensuplai  auksin  dan  sitokinin  untuk mendukung pertumbuhan eksplan yang normal.
Tinggi  tunas  Bima  Brebes  pada  semua perlakuan ZPT tidak berbeda nyata. Penambahan  IAA  dalam  kombinasi  ZPT diperkirakan  dapat  menghambat  pemanjangan tunas.  Ma et  al. (1994)  menyatakan  bahwa pemberian  auksin  dengan  konsentrasi  rendah pada kombinasi auksin-sitokinin pada bawang putih  dapat  mendukung  pertumbuhan  tunas, akan  tetapi  menyebabkan  tunas  menjadi pendek dan tebal.
Eksplan yang dikulturkan pada komposisi ZPT  yang  berbeda  mampu  menginduksi pertumbuhan tunas utama tanpa diikuti proses pembentukan  kalus.  Ashnayi et  al .  (2012) melaporkan  bahwa  aplikasi  GA 3 0.5  mg  L -1 pada kultur meristem tip tanaman anyelir dapat mempercepat  pertumbuhan  tunas.  Tunas  yang dihasilkan  tumbuh  normal  tanpa  disertai multiplikasi,  diduga  karena  konsentrasi  ZPT yang diberikan cukup rendah. Menurut Gull et al. (2014),  aplikasi  sitokinin  berpotensi menginduksi multiplikasi tunas pada konsentrasi 0.5 mg L -1 .

## Deteksi Virus
Hasil  deteksi  virus  terhadap  sampel daun  bawang  merah  cv.  Tiron  menunjukkan bahwa  infeksi  virus  OYDV  mencapai  100%. Deteksi virus terhadap tanaman hasil kultur in vitro menggunakan metode RT-PCR dikarenakan  tingkat  sensitivitasnya  tinggi, sehingga  dapat  mendeteksi  jaringan  tanaman dengan  konsentrasi  virus  yang  sedikit.  Hasil RT-PCR tanaman yang terinfeksi oleh OYDV ditunjukkan  oleh  amplifikasi  pita  yang panjangnya  601  bp.  Sampel  daun  yang digunakan  untuk  deteksi  virus  berasal  dari tanaman  kultur in  vitro yang  telah  melewati tahapan  aklimatisasi  (Gambar  1.  d-f).  Deteksi virus  dilakukan  pada  cv.  Bima  Brebes  dan Tiron.  Setiap  kultivar  diambil  tiga  sampel daun  komposit  dan  masing-masing  komposit mewakili  3  tanaman.  Hasil  analisis  RT-PCR memperlihatkan fragmen DNA virus teramplifikasi  pada  seluruh  sampel  daun
komposit  yang  berasal  dari  kedua  kultivar bawang merah (Gambar 4). Hal ini menunjukkan  bahwa  tanaman  hasil  kultur meristem tip masih mengandung virus OYDV.
Gambar 4. Amplifikasi fragmen cDNA dengan RT-PCR  menggunakan  spesifik primer  OYDV  terhadap  tanaman hasil kultur meristem tip . M = 1 kb DNA Ladder ,  P  =  kontrol  positif,
N  =  kontrol  negatif,  1-3  =  sampel komposit  (setiap  komposit  terdiri dari 3 sampel tanaman) hasil kultur meristem tip
Hasil ini mengindikasikan bahwa metode kultur meristem tip masih belum dapat mengeliminasi  virus  OYDV  pada  cv.  Bima Brebes  maupun  Tiron.  Eksplan meristem  tip berukuran  kurang  dari  1  mm  yang  digunakan pada penelitian ini diduga masih mengandung virus. Meristem tip merupakan bagian tanaman yang  aktif  membelah  dan  belum  memiliki jaringan  pembuluh  yang  menjadi  jalur  cepat penyebaran  virus  pada  tanaman  (Wang  dan Hu, 1980). Namun, virus dapat menginvasi sel melalui  plasmodesmata  yang  terdapat  pada sel-sel meristem  tip (Ayabe  dan  Sumi,  2001) dan penyebaran virus juga dilaporkan berasosiasi dengan kemampuan plasmodesmata dalam  mendukung  pergerakan  virus  (Wang et al ., 2008).
Keberhasilan eliminasi virus juga dapat dipengaruhi  oleh  beberapa  hal,  seperti  ukuran meristem tip (Verbeek et al ., 1995; Ashnayi et al ., 2012; Hu et al ., 2012), konsentrasi virus di dalam jaringan tanaman (Pramesh dan Baranwal, 2015),  genotipe  tanaman,  jenis  ZPT  yang digunakan pada kultur in vitro (Ashnayi et al ., 2012)  dan  metode  eliminasi  (Bhojwani  dan Dantu,  2013).  Termoterapi  merupakan  salah satu  metode  yang  cukup  efisien  digunakan untuk  eliminasi  virus.  Pramesh  dan  Baranwal (2015)  melaporkan  bahwa  eliminasi  virus OYDV  dan  virus  lainnya  pada  tanaman bawang putih berhasil  dilakukan. Termoterapi yang  digunakan,  yaitu  aplikasi  udara  panas dan  panas  matahari  yang  dipaparkan  secara
langsung  pada  umbi  bawang,  kemudian dilanjutkan  dengan  kultur meristem  tip . Bhojwani  dan  Dantu  (2013)  menyatakan bahwa  aplikasi  termoterapi  secara in  vivo berguna  untuk  menekan  replikasi  virus, menghambat coat  protein (CP)  dan  bagian virus  yang  mengkode movement  protein pada virus,  yang  berguna  untuk  pergerakan  virus dari  sel  ke  sel.  Oleh  karena  itu,  efisiensi eliminasi  virus  menggunakan  kultur meristem tip dapat ditingkatkan dengan cara mengkombinasikan kultur meristem tip dengan metode  lainnya,  agar  dapat  mengeliminasi OYDV  secara  efektif  pada  tanaman  yang terinfeksi.

## KESIMPULAN
Media tanpa penambahan ZPT
merupakan  media  yang  paling  efisien  untuk pertumbuhan tunas meristem tip. Tunas utama tumbuh  tanpa  disertai  pembentukan  kalus. Hasil  analisis  RT-PCR  menunjukkan  bahwa seluruh sampel yang dideteksi masih terinfeksi virus  OYDV.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa kultur meristem tip
belum dapat mengeliminasi  virus  OYDV  pada  kedua kultivar bawang merah.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada  Laboratorium  Virologi  Tumbuhan (IPB)  yang  telah  banyak  membantu  dan mendukung  pendeteksian  virus  OYDV  pada tanaman bawang merah. Penulis juga mengucapkan  terima  kasih  Laboratorium Pemuliaan Tanaman (IPB) atas izin penggunaan kotak kasa bebas serangga.

## DAFTAR PUSTAKA
Ashnayi,  M.,  M.  Kharrazi,  A.  Sharifi,  M. Mehrvar.  2012. Carnation etched  ring virus elimination  through  shoot  tip culture.  J.  Biol.  Environ.  Sci.  6(17): 175-180.
Ayabe,  M.,  S.  Sumi.  2001.  A  novel  and efficient  culture  method  ‘stem-disc dome  culture’  for  producing  virus-free
M   P    N    1    2    3     M   P    N    1    2    3 Bima Brebes Tiron 601 bp
garlic  ( Allium  sativum L.).  Plant  Cell Rep. 20: 503-507.
Brewster,  J.L.  2008.  Interactions  with  other organisms.  p.  171-249. In :  Onions  and Other  Vegetable  Alliums.  2 nd Edition.
UK, Cabi.
Bhojwani,  S.S.,  P.K.  Dantu. 2013. Production of virus-free plants. p. 227-243. In : S.S.
Bhojwani,  P.K.  Dantu  (Eds).  Plant Tissue  Culture:  an  Introduction  Text. ID, Springer India. doi:10.1007/978-81- 322-1026-9.
Dinarti,  D.  2012.  Perbanyakan  dan  induksi umbi  lapis  mikro bawang  merah secara in  vitro .  [Disertasi].  Sekolah  Pasca sarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor. 94 hal.
Doyle,  J.J.,  J.J.  Doyle.  1987.  A  rapid  DNA isolation  of  procedure  for  small quantities of fresh leaf tissue.
Phytochem Bull. 19: 11-19.
Elnagar,  S.,  M.A.K.  El-Sheikh,  A.S.  Abdel- Wahed. 2009. Effect of natural infection with Onion yellow dwarf virus (OYDV) on  yield  of  onion  and  garlic  crops  in Egypt.  p.  34-39.  4 th Conference  on
Recent  Technologies  in  Agriculture. www.conf2009.agr.cu.edu.eg/res/5.pdf. [17 Maret 2016].
Gunaeni, N., A.W. Wulandari, A.S. Duriat, A. Muharam.  2011.  Penyakit  tular  virus umbi  pada  tiga  belas  varietas  bawang merah  asal  Jawa  Barat  dan  Jawa Tengah. J. Hort. 21(2): 164-172.
Gull,  I.,  A.  Noreen,  M.S.  Aslan,  M.A.  Athar. 2014.  Comperative  effect  of  different pytohormones  on  the  micropropagation Allium  sativum .  Pak.  J.  Biochem.  Mol. Biol. 47(1-2): 121-124.
Hu, G.J., N. Hong, L.P. Wang, H.J. Hu, G.P. Wang. 2012. Efficacy of virus elimination  from  in  vitro-cultured  sand pear ( Pyrus pyrifolia ) by chemotherapy combined  with  thermotherapy.  Crop Protection. 37: 20-25.
Kasutjianingati,  R.  Poerwanto,  Widodo,  N. Khumaida , D. Efendi. 2011. Efektifitas aplikasi in  vitro Rizobakteri  sebagai agen  antagonis  layu  fusarium  pada pisang Rajabulu/AAB di rumah kaca. J. Hort. Indonesia. 2(1): 34-42.
Ma,  Y.,  H.L.  Wang,  C.J.  Zhang,  Y.Q.  Kang. 1994.  High  rate  of  virus-free  planlet regeneration via garlic scape-tip culture. Plant Cell Report. 14: 65-68.
Mahmood,  T.,  G.L.  Hein,  R.C.  French.  1997. Development  of  serological  procedures for rapid and reliable detection of Wheat streak  mosaic  virus in  a  single  Wheat curl. mite. Plant Dis. 81: 250-253.
Mahmoud, S.Y.M., S.A.  Abo-El Maaty,  A.M. El-Borollosy, M.H. Abdel-Ghaffar. 2007.  Identification  of onion  yellow dwarf Potyvirus as  one  of  the  major viruses  infecting  garlic  in  Egypt. American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci. 2(6): 746-755.
Pramesh, D., V.K. Baranwal. 2015. Production of  virus-free  garlic  ( Allium  sativum L.) through  meristem  tip  culture after solar or  hot  air  treatment  of  cloves.  J.  Hort. Sci. & Biotech. 90(2): 180-186.
Perotto,  M.C.,  E.E.  Cafrune,  V.C.  Conci. 2010.  The  effect  of  additional  viral infection  on  garlic  plants  initially infected with Allexiviruses. Eur. J. Plant Pathol. 126: 489-495.
Shahraeen,  N.,  D.E.  Lesemann,  T.  Ghotbi. 2008.  Survey  for  viruses  infecting onion,  garlic,  and  leek  crops  in  Iran. Bull. OEPP/EPPO Bull. 38: 131-135.
Taşkin,  H.,  G.  Baktemur,  M.  Kurul,  S. Büyükalaca. 2013. Use of tissue culture techniques  for  producing  virus-free plant  in  garlic  and  their  identification through real-time PCR. Research Article.  The  Scientific  World  Journal. Hindawi. 1-5.
Verbeek  M.,  P.  van  Dijk,  M.A.  van  Well. 1995.  Efficiency  of  eradication  of  four viruses from garlic ( Allium sativum ) by
meristem-tip culture. European J. Pathol. 101:231-239.
Wang,  P.J.,  C.Y.  Hu.  1980.  Regeneration  of virus-free  plants  through in  vitro culture. Advances in BioMed. Engineer. 18: 61-99.
Wang,  Q.,  W.J.  Cuellar,  M-L.  Rajämaki,  Y. Hirata, J.P.T. Valkonen. 2008. Combined thermotherapy  and  cryotherapy  for efficient  virus  eradication:  relation  of virus  distribution,  subcellular  changes, cell survival and viral RNA degradation
in  shoot  tips.  Mol  Plant  Pathol.  9(2): 237-250.
Wu,  Z.,  L.J.  Chen,  Y.J.  Long.  2009.  Analysis of  ultrastructure  and  reactive  oxygen species  of  hyperhydric  garlic  ( Allium sativum L.) shoots . In Vitro Cell. Dev.- Plant. 45: 438-490.
Wulandari,  A.W. 2016.  Deteksi  dan  eliminasi virus pada umbi bawang merah. [Tesis]. Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor. 38 hal.