http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
EKSPLORASI JENIS DAN POTENSI DNA BARCODE ANGGREK Thrixspermum SECARA IN SILICO
Siti Rohimah 1 , Luluk Mukarramah 2 , Vita Sindiya 3 , Veren Yuliana S. 4 , Gita Ayu K. 5 , Mukhamad Su’udi* 6
1, 3, 4, 5, 6 Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember e-mail: 1 srohimah24@gmail.com, 2 lulukmukarramah07@gmail.com, 3 vitasindiya@gmail.com,
4 verenyulianas11@gmail.com, 5 gitaayukhoirunnisa24@gmail.com, 6 msuudi.rda@gmail.com
Diterima :30 Oktober 2018 Disetujui : 25 November 2018
e -ISSN : 2541-4208 p-ISSN : 2548-1606
DOI: 10.15575/biodjati.v3i2.3409 Abstrak. Thrixspermum  merupakan  anggrek  yang  memiliki  ciri  khas  ber- bunga  dalam  waktu  yang  singkat.  Akibatnya,  dalam  pengklasifikasian menggunakan  morfologi  cenderung  sulit  untuk  dilakukan.  Sehingga  perlu adanya  pengklasifikasian  menggunakan  cara  alternatif  misalnya  dengan marka  molekuler  menggunakan  DNA.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah mencari barkode DNA dari beberapa spesies Thrixspermum yang ada pada GenBank  NCBI.  Berdasarkan  data  dari  NCBI,  hanya  terdapat  19  spesies dari  genus  Thrixspermum  yang  telah  diteliti  sekuennya.  Dari  total  19 spesies  tersebut,  setelah  dilakukan  pensejajaran  sekuen  menunjukkan bahwa  pada  lokus  matK  dan  rbcL  memiliki  tingkat  homologi  yang  tinggi, sementara  pada  lokus  ITS  menunjukkan  lebih  banyak  variasi  genetik. Terdapat  dua  spesies  yakni  T.  annamense  dan  T.  marguense  yang berpotensi memiliki barcode pada lokus ITS. Selain itu, didapatkan pohon filogenetik dari 19 spesies Thrixspermum yang telah diketahui senkuennya pada NCBI.
Kata Kunci : Thrixspermum, ITS, pohon filogenetik
Abstract. Thrixspermum  is  an  orchid  that  has  the  characteristic  of flowering  in  a  short  time.  As  a  result,  classification  using  morphology tends  to  be  difficult  to  perform.  Therefore,  an  alternative  method  such  as molecular  markers  using  DNA  is  needed  for  classification  purpose.  This study  was  performed  to  identify  DNA  barcodes  of  several  Thrixspermum species  found  in the NCBI  database.  Based  on  data from  NCBI,  there  are only  19  species  of  the  genus  Thrixspermum  with  sequence  have  been explored.  Of  total  19  species,  after  sequence  alignment  showed  that  the matK  and  rbcL  loci  had  high  homology  level,  while  at  the  ITS  locus showed more genetic variant. There are two species namely T. annamense and  T.  marguense  posses  potential  barcodes  at  ITS  locus.  In  addition,  a phylogenetic tree from 19 species of Thrixspermum was constructed based on the sequences deposited in NCBI.
Keywords : Thrixspermum, ITS, phylogenetic tree
Cara Sitasi
Rohimah,  S.,  Mukarramah,    L.,  Sindiya,  V.,  S.  Yuliana,  V.,    K.  Ayu,  A.  & Su’udi,  M.  (2018). Eksplorasi  Jenis  Dan  Potensi  DNA Barcode Anggrek Thrixspermum Secara In  Silico . Jurnal Biodjati , 3 (2), 148- 156.
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati

## PENDAHULUAN
Anggrek  merupakan  kelompok  tumbu- han  berbunga  yang  memiliki  variasi  tinggi, aktif  berevolusi,  sangat  terspesialisasi  dan  be- radaptasi  untuk  menarik  polinator.  Terdapat 17.000-35.000  spesies  anggrek  di  dunia  (De- stri  et  al , 2015).  Anggrek  termasuk  dalam  fa- mili  Orchidaceae  yang  terbagi  menjadi  5  sub- famili  dan  tumbuh  di  dataran  tinggi  hingga dataran  rendah  (Kartikaningrum  et  al,  2017). Salah  satu  genus  anggota  Orchidaceae  adalah Thrixspermum. Kata Thrixspermum berasal dari bahasa latin, yaitu kata thrix (rambut) dan sperma (biji). Thrixspermum memiliki beberapa  manfaat  diantaranya  selain  dapat dijadikan sebagai tanaman hias juga berpotensi sebagai  obat,  diantaranya  yaitu Trixspermum centipede Lour  dan Thrixspermum  pardale (Ridl.)  Schlecht. Thrixspermum  centipede di Thailand digunakan untuk mengobati penyakit asma  dengan  memanfatkan  seluruh  bagian  ta- naman  (Teoh,  2016). Thrixspermum  pardale oleh  penduduk  Malaysia  digunakan  sebagai obat  untuk  mengobati  bisul  pada  hidung  den- gan cara  menumbuknya  bersama dengan  daun Hetaeria  obliqueto (Teoh,  2016).  Penelitian tentang  anggrek Thrixspermum belum  banyak dilakukan,  baik  karakterisasi  maupun  poten- sinya. Keterbatasan literatur mengenai anggrek Thrixspermum disebabkan  karena  minimnya informasi  ilmiah  atau  publikasi  tentang anggrek ini.
Thrixspermum termasuk anggrek mono- podial dan  memiliki ciri khas  berbunga dalam waktu yang singkat. Thrixspermum tersebar di wilayah  tropis  dan  subtropis  mulai  dari  Asia hingga Australia dan Pasifik (O’Byrne, 2016). Cara  hidupnya  epifit  dengan  menempel  pada batang  pohon  (Nurfadilah,  2015).  Karakter morfologi  daun  dan  bunga Thrixspermum menjadi  dasar  penanda  secara  fenotipik  untuk membedakan  kelompok  tanaman  tersebut
(Wulanesa  et  al, 2017).  Namun,  spesies anggrek  ini  memiliki  morfologi  yang  mirip dengan  kerabat  terdekatnya,  contohnya T.  tsii memiliki  ciri  vegetatif  yang  mirip  dengan T. centipeda ,  namun  struktur  bunganya  mirip dengan T. subulatum (Chen  &  Shui,  2005). Selain  itu,    spesies  anggrek Thrixspermum juga  memiliki banyak nama lain atau sinonim, diantaranya Thrixspermum  centipeda yang memiliki  sinonim Thrixspermum  arachnites; Thrixspermum  papillosum; dan Sarcochilus arachnites .  Hal  tersebut  merupakan  salah  satu kelemahan  dalam  identifikasi  berdasarkan  ka- rakter  morfologi.  Padahal  identifikasi  sangat penting  dalam  penentuan  suatu  spesies, terutama  pada  spesies  yang  memiliki  peranan penting  seperti  berfungsi  sebagai  obat,  atau yang  lainnya.  Berdasarkan  studi  literatur  yang telah  dilakukan,  artikel-artikel  tentang  peneli- tian Trixspermum sebagian  besar  melaporkan karakter morfologi dan persebarannya (Song et al,  2009;  O’Byrne,  2016).  Sehingga  perlu adanya  alternatif  identifikasi  lain,  selain identifikasi  berdasarkan  morfologi  untuk menentukan spesies dari Thrixspermum . Salah satu alternatif identifikasi yang dapat digunakan adalah menggunakan marka molekuler dengan DNA barcoding.
DNA barcoding memiliki  prinsip  dasar yaitu  identifikasi  menggunakan  sekuen  DNA pendek  “ barcode ”  dari  bagian  standar  genom dari  spesimen  yang  sedang  diteliti.  Urutan barcode yang tidak diketahui akan dibandingkan  dengan  pustaka  sekuen barcode yang  telah  diketahui  identitasnya.  Apabila hasil  perbandingan  antara  sekuen  yang  diteliti sesuai  dengan  pustaka,  maka  spesimen tersebut  diidentifikasi  sebagai  spesimen  dari pustaka.  Namun  jika  tidak  sesuai,  maka  dapat mengarah  kepada  sekuen  baru  untuk  spesies baru (Hajibabaei  et al, 2007). Identifikasi spe- sies  berbasis  DNA  merupakan  metode  yang cepat dan konsisten sehingga dapat dipertang
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
gungjawabkan  (Irawan  et  al,  2016).  Hal tersebut dikarenakan  karakter DNA  yang  rela- tif lebih konstan dibandingkan karakter morfo- logi  (Hidayat  et  al,  2008).  Sekuen  DNA  yang diperoleh  dapat  digunakan  untuk  mengetahui hubungan  kekerabatan  dari  suatu  spesies dengan cara mengkonstruksi pohon filogenetik.
Pohon  filogenetik  merupakan  suatu gambaran evolusi yang terjadi pada sekelompok  makhluk  hidup  yang  berasal  dari nenek  moyang  yang  sama  (Ochieng  et  al, 2007).  Filogenetik  mengkombinasikan  teknik biologi  molekuler  dengan  statistik  untuk  me- rekonstruksi  hubungan  filogenetik.  Penggu- naan sekuen DNA sangat penting karena dapat mengetahui  perubahan  basa  nukleotida  menu- rut waktu dan dapat memperkirakan kecepatan evolusi  yang  terjadi.  Hal  tersebut  dapat  dire- konstruksi  hubungan  evolusi  antara  satu  spe- sies dengan spesies lainnya (Hidayat & Panco- ro,  2008).  DNA  kloroplas  banyak  digunakan untuk mengetahui hubungan kekerabatan anta- ra spesies angiospermae dengan tanaman  lain- nya,  namun  memiliki  tingkat  evolusi  yang rendah.  Sehingga  ada  keterbatasan  dalam mengamati hubungan intraspesifik (Harsono et al, 2015).  Sedangkan  DNA  nukleus  lebih  ba- nyak  memiliki  variasi  genetik  karena  tingkat rekombinan yang tinggi.

## BAHAN DAN METODE

## Koleksi Sampel Penelitian
Sekuen  DNA  dikoleksi  dari GenBank NCBI dengan cara menulis nama spesies diser- tai gen yang diinginkan (Contoh: Trixspermum subulatum matK/  ITS/  rbcL ).  Data-data  yang meliputi  aksesi,  panjang  nukleotida,  sekuen parsial  atau  lengkap  ( full ),  serta  asal  anggrek disimpan ke dalam Microsoft Excel . Sementara susunan  nukleotida  disimpan  ke  dalam
Notepad yang  nantinya  akan  dianalisis menggunakan CLUSTALX.

## Pensejajaran Menggunakan CLUSTALX
Semua sekuen DNA yang telah dikoleksi dari  NCBI  disejajarkan.  Pensejajaran  sekuen DNA dilakukan dengan menggunakan software CLUSTALX. Hal ini bertujuan untuk mengetahui  tingkat  homologi  dan  identifikasi sekuen  yang  berpotensi  sebagai barcode . Sekuen  yang  berpotensi  sebagai barcode adalah  sekuen  yang  berbeda  dan  khas dibandingkan yang lain.

## Pembuatan Pohon Filogenetik
Data  sekuen  DNA  hasil  pensejajaran kemudian  digunakan  untuk  membuat  pohon filogenetik  menggunakan  software  MEGA7 dengan  metode Neighbour - Joining .  Pohon filogenetik bertujuan untuk mengetahui tingkat kekerabatan dari setiap anggrek
Thrixspermum . Selain itu, juga dapat digunakan untuk melihat laju evolusinya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Koleksi sampel penelitian
Hasil penelusuran jenis anggrek Thrixspermum menunjukkan  bahwa  terdapat perbedaan  yang  signifikan  antara  jumlah spesies yang dikoleksi dari GeneBank database (NCBI)  dan yang  disebutkan O’Byrne  dalam  bukunya.  Berdasarkan  grafik dapat  diketahui  bahwa  dari  total  130  spesies anggrek  yang  diketahui,  hanya  terdapat  19 jenis  anggrek  yang  diketahui  aksesinya    di NCBI (Gambar 1). Jumlah tersebut menunjukkan  bahwa  masih  terdapat  banyak jenis  anggrek Thrixspermum yang  belum  di- eksplorasi  sekuennya.  Hal  ini  dapat  menjadi peluang  bagi  para  peneliti  untuk  mencari sekuen dari anggrek jenis ini yang kemudian
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
dapat  digunakan  sebagai  data  dalam  analisis bioinformatika.
Sinonim  merupakan  istilah  atau  nama lain yang digunakan untuk menyebut jenis sua- tu spesies. Pemahaman terhadap sinonim suatu tumbuhan  akan  sangat  membantu  masyarakat akademik  untuk  tujuan  identifikasi  spesies. Anggrek  merupakan  tumbuhan  yang  memiliki banyak sinonim pada beberapa spesiesnya. Da- ri  total  130  jenis  anggrek Thrixpermum yang diketahui,  terdapat  39  jenis  anggrek Thrixper- mum yang  memiliki  sinonim  (Tabel  1). Apabila sinonim pada anggrek-anggrek tersebut  tidak  dipublikasikan,  maka  masyara- kat  cenderung  akan  membedakan  spesies- spesies  anggrek  yang  memiliki  sinonim menjadi  spesies  yang  berbeda.  Sehingga penting  sekali  adanya  publikasi  mengenai sinonim  dan  nama  yang  telah  diterima  secara luas pada suatu spesies.
Hasil  penelusuran  juga  menunjukkan bahwa  dari  130  spesies  anggrek  jenis Thrixspermum yang  diketahui,  hanya  terdapat 19  spesies  yang  sekuennya  telah  didepositkan di NCBI. Hal ini menjadi peluang besar dalam identifikasi  molekuler  anggrek  jenis  ini. Apabila  pada  identifikasi  morfologi  terdapat 39  spesies  anggrek  yang  memiliki  sinonim, tidak  menutup  kemungkinan  pada  identifikasi molekuler,  akan  terdapat  spesies  anggrek  lain yang  belum  memiliki  sinonim  menjadi memiliki  sinonim.  Selain  itu,  akan  ditemukan adanya peluang perbedaan antara spesies yang telah  memiliki  sinonim  dengan  spesies anggrek  lainnya  menurut  urutan  sekuen  basa
nukleotidanya.  Berdasarkan  hasil  penelurusan aksesi  jenis  anggrek Thrixspermum pada NCBI , dapat  diketahui  bahwa  anggrek  yang diteliti  sebagian  besar  berasal  dari  dataran China  dan  Malaysia,  hanya  sebagian  kecil yang  didapatkan  dari  negara  lain  seperti Jepang, Polland, USA, dan Korea.
Aksesi  dalam  penelitian  ini  merupakan hasil  penelurusan  menggunakan  lokus  gen matK , rbcL ,  dan ITS (Tabel  2). Consortium Barcode  Of  Life (CBOL)  merekomendasikan rbcL yang  secara  umum  dikombinasikan  den- gan matK sebagai barcode untuk  identifikasi tumbuhan.  Gen rbcL dan matK digunakan  ka- rena eksistensi, efektifitas, dan kelestarian laju mutasi kedua gen tersebut yang ditemukan pa- da  hampir  semua  tumbuhan.  Gen rbcL dan matK juga  dapat  digunakan  dalam  analisis  fi- logenetik dan kekerabatan tanaman dalam satu genus. Laju mutasi rbcL yang rendah dari gen- gen kloroplas lainnya, seperti trnH, trnM, trnS, rps18,  psbH, dan ORF31 ,  menyebabkan rbcL masih  dapat  membawa  informasi  gen  dari  ne- nek  moyang  terdahulu  (Suparman,  2012). Akibat  laju  mutasi  yang  rendah  tersebut,  apa- bila terdapat spesiasi pada suatu populasi, ma- ka  sekuen  yang  mengalami  perubahan  akan terlihat  dan  kemungkinan  dapat  menjadi  se- buah barcode bagi  spesies  baru  tersebut.  Na- mun,  laju  mutasi  yang  rendah  pada  gen rbcL juga  mengakibatkan  tingkat  homologi  yang tinggi pada spesies dalam  satu genus terutama jika  spesies  tersebut  ditemukan  dalam  ling- kungan, habitat, atau asal yang sama.
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
Gambar 1. Grafik perbandingan jumlah spesies dari genus Thrixpermum yang di- koleksi  dari GeneBank  database (NCBI)  dan  yang  disebutkan O’Byrne dalam bukunya, serta yang memiliki sinonim
Tabel 1. Jenis anggrek Thrixpermum yang memiliki sinonim Nama Sinonim Thrixspermum acuminatissimum Thrixspermum notabile ; Thrixspermum affine (subsp); Sarcochilus acuminatissimus Thrixspermum adenotrichum Cleisostoma congestum;  Thrixspermum congestum Thrixspermum amplexicaule Thrixspermum oeonioides ; Sarcochilus amplexicaulis Thrixspermum annamense Thrixspermum devolium ; Ascochilus annamensis Thrixspermum batuense Sarcochilus carinatifolius; Dendrocolla carinatifolia ; Thrixspermum carinatifolium Thrixspermum bicristatum Thrixspermum merguense Thrixspermum centipeda Thrixspermum arachnites ;  Thrixspermum papillosum ; Thrixspermum arachnites ; Sarcochilus arachnites Thrixspermum ciliatum Thrixspermum clavatum Thrixspermum falcilobum Thrixspermum subulatum Thrixspermum fantasticum Thrixspermum neglectum Thrixspermum formosanum Thrixspermum pricei ; Thrixspermum sasaoi ; Sarcochilus formosanus Thrixspermum fragrans Thrixspermum simondii Thrixspermum graeffei Thrixspermum oreadum Thrixspermum merguense Thrixspermum bicristatum; Thrixspermum comans; Thrixspermum comans var. bicristatum ;Thrixspermum kusuku- sense; Sarcochilus merguensis) Thrixspermum neo-hibernicum Thrixspermum platystachys Thrixspermum pensile Thrixspermum pendulicaule Thrixspermum raciborskii Thrixspermum raciborskii var. hamatum Thrixspermum rubrocallosum Thrixspermum clavatum Thrixspermum xanthanthum Thrixspermum pygmaeum

## http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
Tabel 2. Aksesi anggrek berdasarkan locus matK, rbcL , dan ITS dari NCBI
Nama Spesies Lokus ITS Lokus rbcL Lokus MatK Aksesi Length (bp) Asal Aksesi Length (bp) Asal Aksesi Length (bp) Asal Thrixspermum centipede KY966674 644 P CH KX784194 717 P MLY AB217767 1803 F JP Thrixspermum formosanum KJ733460 647 P CH DQ195035 823 P CH KJ733620 1626 F CH Thrixspermum tsii KJ733459 646 P CH KJ733615 1623 F CH Thrixspermum laurisilvaticum KJ733457 646 P CH KJ733613 1622 F CH Thrixspermum saruwatarii KJ733458 646 P CH KJ733614 1575 F CH Thrixspermum merguense KX679334 838 F MLY KX784196 718 P MLY Thrixspermum triangulare KX679348 826 F MLY KX784210 609 P MLY Thrixspermum linusii KX679333 791 F MLY KX784195 718 P MLY Thrixspermum amplexicaule KF545882 645 P CH KX784193 725 P MLY KF545892 1621 F CH Thrixspermum tortum KX679347 781 F MLY KX784209 720 P MLY Thrixspermum elongatum DQ091674 682 P USA Thrixspermum annamense KF545883 654 P CH KF545893 1627 F CH Thrixspermum japonicum KT338782 645 P KR KF296714 561 P MLY KF262105 736 P KR Thrixspermum caudatum KX679331 854 F MLY Thrixspermum raciborskii MF349945 824 P US A Thrixspermum ventricosum KX784211 662 P MLY Thrixspermum pensile KX784197 721 P MLY Thrixspermum arachnites EF065572 1312 P PL Thrixspermum subulatum AB217592 650 P JP Keterangan: F= Full P= Parsial MLY= Malaysia CH= China PL= Polland KR= Korea
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati

## Pensejajaran sekuen DNA
Gambar 2. Hasil alignment sekuen ITS , tanda (*) menunjukkan homologi, gap menggambarkan adanya delesi atau in- sersi. Setiap warna menandai basa nitrogen tertentu.
Hasil alignment menggunakan lokus ITS memperlihatkan  bahwa  spesies T.  subulatum, T. merguense dan T. annamense memiliki uru- tan  sekuen  yang  unik  dan  berpotensi  sebagai barcode, karena  berbeda  dengan  spesies  lain- nya.  Sekuen T.  merguense dan T.  annamense memiliki urutan yang mirip yaitu AAAAG dan T.  subulatum memiliki  sekuen  GGTGG  pada urutan nukleotida 187-191  yang tidak dimiliki
oleh spesies lainnya. Sekuen tersebut memiliki persentase  keunikan  sebesar  0.89%.  Selain  itu pada  urutan  basa  95-96  spesies T.  merguense mengalami  delesi. T  annamense mengalami insersi  basa C dan G pada urutan basa 78 dan 111.  Meskipun  sekuen ITS banyak  digunakan untuk  mengidentifikasi  atau  mencari barcode pada fungi, namun tidak menutup kemungkinan bahwa ITS juga dapat digunakan
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
untuk  menemukan barcode spesifik  pada tumbuhan.

## Pembuatan Pohon Filogenetik
Hasil  rekonstruksi  pohon  filogenetik Thrixspermum menunjukkan bahwa T. annamense dan T. merguense memiliki kekerabatan  dekat  dengan T. formosanum dan T. linusii .  Berdasarkan  data  dari  pohon
filogenetik,  maka  keempatnya  diduga  kuat memiliki nenek moyang yang sama.
Sementara  nenek  moyang  keempat  spesies tersebut berkerabat dengan dengan T . subulatum .  Selain  itu,  dapat  diketahui  pula bahwa  kemungkinan  besar T . amplexicaule merupakan spesies tertua dari genus Thrixspermum pada pohon filogenetik tersebut.
Gambar  3.  Hasil  rekonstruksi  pohon  filogenetik Thrixspermum menggunakan MEGA7 dengan metode Neighbour - Joining .

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terimakasih  kepa- da LPPM Universitas Jember  yang telah  men- danai  penelitian  ini  melalui  skema  Hibah  Ke- Ris tahun 2018.

## DAFTAR PUSTAKA
Chen,  W.  H.  &  Shui,  Y.  M.  (2005).  A  New Spesies  of  Thrixspermum  (Orchidaceae) from China. Brittonia, 57.
Destri,  Fudola  A.,  Harto  &  Kusnadi.  (2015). Survei  Keanekaragaman  Anggrek  (Orchi- daceae) di Kabupaten Bangka Tengah dan Belitung, Provinsi Kepulauan Bangka Be-
litung. PROS  SEMNAS  MASY  BIODIV INDON, 1(3), 509-514.
Hajibabaei,  M.,  Singer,  G.  A.  C.,  Hebert1,  P.
D.  N.  &  Hickey,  D.  A.  (2007).  DNA Barcoding: How it Complements
Taxonomy,  Molecular  Phylogenetics  and Population  Genetics. Trends  in  Genetics,
23(4). Harsono, T., Pasaribu, N., Sobir, Fitmawati  & Prasetya,  E.  (2015).  Variasi  Intraspesifik Berdasarkan DNA Kloroplas (CPDNA) Pada Bouea macrophylla Griffit. Prosiding Seminar Nasional
Biodiversitas dan Ekologi  Tropika  Indo- nesia.
http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati
Hidayat,  T.  &  Pancoro,  A.  (2008).  Kajian  Fi- logenetik  Molekuler  dan  Peranannya  da- lam  Menyediakan  Informasi  Dasar  untuk Meningkatkan  Kualitas  Sumber  Genetik Anggrek. Jurnal  Agro  Biogen. 4(1),  35- 40.
Hidayat, T., Kusumawaty, D., Kusdianti., Yati,
D.  D.,  Muchtar,  A.  A.  &  Mariana,  D. (2008).  Analisis  Filogenetik  Molekuler pada Phyllanthus niruri L.
(Euphor-
biaceae) Menggunakan Urutan Basa DNA
Daerah Internal  Transcribed Spaces (ITS). Jurnal Matematika dan Sains, 13(1), 16-21.
Irawan, P. D., Tallei, T. E. & Kolondam, B. J.
(2016). Analisis Sekuen dan Filoge-
netik  Beberapa  Tumbuhan  Syzygium (Myrtaceae)  di  Sulawesi  Utara  berdasar- kan Gen matK. Jurnal Ilmiah Sains , 16(2), 43-50.
Kartikaningrum,  S.,  Pramanik,  D.,  Dewanti, M.,  Soehendi,  R.  &  Yufdy,  M.P.  (2017). Konservasi Anggrek Spesies Alam Meng- gunakan  Eksplan  Biji  pada  Media  Vacin &  Went. Buletin  Plasma  Nutfah, 23(2), 109-118.
Nurfadilah,  S.  (2015).  Diversity  of  Epiphytic Orchids  and  Host  Trees  (Phorophytes)  in Secondary  Forest  of  Coban  Trisula,  Ma-
lang  Regency,  East  Java,  Indonesia. Bio- tropia, 22(2), 120-128.
O’Byrne,  P.  (2016).  Trixspermum  in  Borneo; 24  New  and  Old  Spesies. Malesian  Orc- hid Journal, 18, 5-74. Ochieng, J.  W., Murigai,  A.  W.  T. & Ude, G. N. (2007). Review: Phylogenetics in Plant Biotechnology:  Principles,  Obstacles,  and Opportunities  for  Resource  Poor. African Journal of Biotechnology, 6(6), 639-649. Suparman.  (2012).  Markah  Molekuler  Dalam Identifikasi  Dan  Analisis  Kekerabatan Tumbuhan  Serta  Implikasinya  Bagi  Mata Kuliah Genetika (Telaah  Keilmuan Gene- tika  Molekuler  Tumbuhan), Jurnal  Bio- edukasi, 1(1), 59-68.
Song,  X.  Q.,  Meng,  Q.  W.,  Wing,  Y.  T.  & Luo,  Y.  B.  (2009). Thrixspermum  odora- tum (Orchidaceae),  a  New  Species  from Hainan  Island,  China. Ann.  Bot.  Fennici,
46, 595-598.
Teoh, E. S. (2016). Medicinal Orchids of Asia . Switzerland:  Springer  International  Pub- lishing.
Wulanesa,  W.  O.  S.,  Soegianto,  A.  &  Basuki, N.  (2017).  Eksplorasi  dan  Karakterisasi Anggrek  Epifit  di  Hutan  Coban  Trisula- Kawasan Taman Nasional Bromo Tengger Semeru. Jurnal  Produksi  Tanaman, 5(1), 125-131.