Menara Perkebunan , 2006, 74(1), 23-31.

## Karakterisasi gen penyandi lipase dari
kapang Rhizopus oryzae dan Absidia corymbifera
Characterization of gene encoding lipase from Rhizopus oryzae and Absidia corymbifera
Riza A. PUTRANTO , Djoko SANTOSO, TRI-PANJI, SUHARYANTO & Asmini BUDIANI
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia

## Summary
Lipase is a group of enzymes which catalyze fat hydrolysis. Lipase is recently used to produce diacylglycerol (DAG) from triacylglycerol (TAG). Lipase    can  be  used  to  produce  healthy  oil. Having  a  rich  biodiversity,  Indonesia  has  the opportunity  to  produce  lipase  using  indigenous microbes, such as molds. This research aimed to detect  LIPASE  gene on several strains of molds employing  PCR  technique.  Genomic  DNAs  were isolated from four strains of molds ( M. sitophila, R.  oryzae,  R.  microsporus ,  and A.  corymbifera ). Heterologous primers for LIPASE  were designed based  on  the  conserved  region  of  12  LIPASE sequences  accessed  from  GenBank  and  used  to amplify  the  genomic  DNA  resulted  in  a  466  bp fragment. BLAST analysis showed that the bands of DNAs have high homology with common lipase protein in several strains of Rhizopus . [ Key  words : LIPASE gene,  molds,  PCR,  DNA detection ]

## Ringkasan
Lipase  merupakan  kelompok  enzim  yang berfungsi  sebagai  biokatalis  hidrolisis  lemak. Lipase  banyak  digunakan  untuk  konversi triasilgliserol (TAG) menjadi diasilgliserol (DAG).  Penggunaan  lipase  penting  untuk produksi  minyak  sehat  ( healthy oil ).  Indonesia dengan keanekaragaman hayati tinggi berpeluang besar   mengembangkan   produksi   lipase   dari mikroba  lokal,  salah  satunya  adalah  kapang. Deteksi  gen  merupakan  langkah  awal  dalam
upaya  peningkatan  produksi  lipase  melalui rekayasa  genetika.  DNA  genomik  empat  galur kapang  ( M.  sitophila,  R.  oryzae,  R.  microsporus, dan A.  corymbifera )  telah  berhasil  diisolasi.
Sepasang  primer  heterologous  telah  berhasil dirancang  berdasarkan  daerah  terkonservasi  12 sekuen  gen LIPASE dari GenBank .  Amplikon DNA  yang  diperoleh  pada  PCR  menggunakan pasangan  primer RLP memiliki  panjang  466  bp. Analisis BLAST memperlihatkan bahwa amplikon  PCR  memiliki  homologi  yang  tinggi dengan protein LIPASE beberapa galur Rhizopus .

## Pendahuluan
Lipase  merupakan  kelompok  enzim yang  secara  umum  berfungsi  dalam  hidro- lisis lemak, mono-,di-, dan trigliserida untuk menghasilkan asam lemak bebas dan gliserol (Suzuki et  al ,.  1988;  Kosugi et  al .  1990). Enzim  ini  juga  digunakan  dalam  hidrolisis triasilgliserol  (TAG)  menghasilkan  diasil- gliserol  (DAG)  dan  asam  lemak  bebas (Winarno,  1986). DAG  adalah ester gliserol dengan  dua  molekul  asam  lemak.  DAG digunakan  sebagai  bahan  pengemulsi  dan penstabil  produk-produk  makanan,  kosme- tika, dan farmasetika. Lipase  terbukti dapat digunakan sebagai biokatalis  untuk  mening- katkan  kualitas crude  palm  oil (CPO)  yang lebih  baik  yaitu  minyak  sehat  ( healthy  oil ). Healthy Econa Cooking Oil telah diproduksi
Putranto et al.
massal pada tahun 2001 oleh Kao Industries of  Japan  bekerjasama  dengan  Novozymes, Co. Bahan utama yang terkandung di dalam minyak  ini  adalah  DAG  yang  dibuat  secara enzimatik  menggunakan  minyak  murni. Dalam  jangka  panjang  minyak  ini  mampu mencegah peningkatan lemak tubuh, terutama lemak yang terdeposit dalam organ internal  (Kao  Corporation,  2004).  Contoh lain  dari healthy  oil yang  telah  beredar  di pasaran  internasional  adalah Evona  Oil dan Bio-Oil . Produksi  lipase  telah  dilakukan  di beberapa  negara  maju.  Harga  lipase  impor relatif  mahal,  misalnya  harga  lipase  dengan merk  dagang Lipozyme  IM , BIO-lipase, dan Lipolase mencapai  25  juta  rupiah  per  kg (Kao  Corporation,  2004).  Indonesia  dengan keanekaragaman hayatinya berpeluang besar untuk  mengembangkan  produksi  lipase  dari mikroba  lokal.  Eksplorasi  mikroba  lipolitik lokal telah banyak dilakukan, namun hingga saat  ini  lipase  komersial  belum  terdapat  di pasaran.  Kondisi  kultur  optimum  untuk mikroba sumber belum ditemukan, sehingga penggunaan  isolat  alami  sebagai  sumber lipase  memiliki  daya  hasil  yang  relatif rendah.  Kapang  merupakan  mikroba  yang 80%  kebutuhan  substratnya  dipenuhi  oleh makromolekul yang memiliki rantai karbon. Beberapa  jenis  kapang  diketahui  tumbuh pada  habitat  yang  mengandung  minyak, misalnya  tandan  kelapa  sawit.  Beberapa kapang  penghasil  lipase  antara  lain  adalah Aspergillus  niger,  Mucor  miehei,  Monilia sitophila, Rhizopus delemar, dan R. javanicus (Onions et al ., 1981 & Yamane, 1987).
Nining  (2005)  memperlihatkan  bahwa
M.  sitophila mampu  mengubah  CPO menjadi  DAG  dan  produk  samping  asam lemak.  Lipase  yang  berasal  dari  mikroba umumnya  bersifat  ekstraseluler.  Isolasi  gen yang  menyandi  protein  lipase    merupakan
salah  satu  langkah  awal  produksi  lipase dalam skala besar melalui rekayasa genetika. White et  al .  (1990)  mengemukakan  bahwa
Polymerase Chain
Reaction (PCR) merupakan  metode  deteksi  yang  tergolong mudah  untuk  mengetahui  keberadaan  gen target  di  dalam  organisme  uji.  Pasangan primer  heterologous  yang  dirancang  ber- dasarkan  daerah  terkonservasi  pada  gen target dapat digunakan dalam PCR tersebut. Tujuan penelitian ini  untuk mendeteksi dan mengkarakterisasi  gen LIPASE pada beberapa galur kapang.

## Bahan dan Metode
Bahan  yang  digunakan  adalah  mise- lium  empat  galur  kapang  koleksi  Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia  yaitu Monilia  sitophila,  Rhizopus oryzae,  R.  microsporus, dan Absidia corymbifera yang  berumur  48-72  jam inkubasi  pada  suhu  37°C  dalam  kultur  cair Yeast  Malt  Extract .  Reagen  PCR  yang digunakan  diperoleh  dari  Promega  (WI, USA). Primer  PCR ( ITS-4, ITS-5 , dan RLP ) dan  bahan-bahan  kimia  lain  diperoleh  dari Sigma Chem. Co. dan perusahaan lokal.

## Perancangan  primer  heterologous  dengan menggunakan pendekatan bioinformatika
Pengumpulan  data  sekuen  nukleotida lipase  berbagai  kapang  diperoleh  dari  data- base di situs www.ncbi.nlm.nih.gov . Konver- si  sekuen  nukleotida  menjadi  sekuen  asam amino  dilakukan  menggunakan  program Bioedit  7.0  dengan  memperhatikan  adanya mekanisme splicing (penghilangan  intron).
Pencarian     daerah    konservatif      (homologi tinggi)  berdasarkan  penjajaran  sekuen  asam amino, yang dianalisis menggunakan
Karakterisasi gen penyandi Lipase dari kapang....
algoritma  Clustal-W.  Setelah  diperoleh output dari program Clustal-W, sekuen asam amino  kembali  dikonversi  menjadi  sekuen nukleotida. Sekuen yang mengandung daerah  konservatif,  diproses  dengan  meng- gunakan  program  Primer3  untuk  peran- cangan  primer.  Dari  program  Primer3 diperoleh beberapa pasang sekuen primer.

## Isolasi DNA genomik
Isolasi  DNA  genomik  empat  galur kapang  dilakukan  menggunakan  metode Moller et  al .  (1992)  yang  dimodifikasi.  Di dalam  mortar,  sebanyak  1-2  gram  miselium ditambahkan  0,1-  0,2  gram  Polyvinylpirro- lidone  (PVPP)  dan  N 2 cair  kemudian digerus.  Serbuk  halus  yang  dihasilkan dimasukkan  ke  dalam  tabung  yang  berisi 5-10  mL  bufer  ekstraksi  (1  M  Tris-HCl  pH 8,0;  0,5  M  EDTA  pH  8,0,  10%  SDS)  dan ditambahkan  0,1  gram  Proteinase  K  kemu- dian  diinkubasi  pada  suhu  60°C  selama 60  menit.  Dalam  kurun  waktu  inkubasi dilakukan dua kali vortex. Setelah dicampur dengan  1,4  mL  5N  NaCl  dan  650  µL  10% CTAB kemudian diinkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit.
Pemisahan  protein  dilakukan  dengan penambahan  1  volume  kloroform  :  isoamil- alkohol  (24:1),  diinkubasi  di  dalam  es selama  30  menit,  kemudian  disentrifugasi pada  13000  rpm  dengan  suhu  4°C  selama 10  menit.  Ekstraksi  diulang  sebanyak  tiga kali.  Supernatan  (600  µL)  diambil  secara hati-hati  dan  dipindahkan  ke  dalam  tabung mikro-sentrifugasi  baru  yang  telah  mengan- dung 2,25 mL5M Ammonium asetat pH 7,0, kemudian    diinkubasi    semalam pada  suhu 4°C.  Setelah  itu  pengendapan  DNA  dilaku- kan  dengan  sentrifugasi  pada  13000  rpm dengan  suhu  4°C  selama  10  menit.  Setelah
supernatan  dibuang,  pelet  dicuci  dengan 500  µL  isopropanol  kemudian  dibolak-balik beberapa  kali,  dan  didiamkan  dalam  es selama  10  menit.  Sentrifugasi  dilakukan pada 13000 rpm dengan suhu 4°C selama 10 menit. Ke dalam pelet ditambahkan 1  volume  70%  ethanol  dingin  untuk pengendapan  DNA.  Kemudian  endapan DNA  dipisahkan  dengan  sentrifugasi  pada 8000  rpm  dengan  suhu  4°C  selama  lima menit.  Sisa  etanol  dibuang,  dan  pelet dikering  anginkan  hingga  bau  etanol  tidak tercium  lagi.  Pelet  DNA  diresuspensikan kembali  dalam  5  µL  H 2 O  bebas  nuklease. Penentuan kuantitas DNA dilakukan dengan spektrofotometer.

## Reaksi PCR
Analisis  PCR  dilakukan  dengan  total reaksi  25  µL,  yang  mengandung  1,5  µL MgCl 2 ,  2,5  bufer  ekstraksi  10X,  0,5  dNTPs 10µM, 0,5 µL Taq DNA Polymerase 5u/µL,
17  µL  ddH 2 O,  2  µL  primer  ( reverse dan forward ).  Program  PCR  terdiri  dari pre- denaturation suhu  95°C  selama  lima  menit, dan  35  siklus  reaksi  yang  terdiri  dari denaturasi pada suhu 95 °C selama 30 detik, penempelan  pada  suhu  50  °C  selama 30  detik  dan  ekstensi  pada  suhu  72  °C selama  90  detik.  Pada  tahap  akhir  proses PCR  dilakukan  ekstensi  akhir  pada  suhu 72°C  selama  lima  menit.  Sebanyak  5  µL hasil  PCR  dianalisis  dengan  elektroforesis gel agarosa 1,2 %.
Sekuensing dan Analisis BLAST
Sekuensing dilakukan di BPPT
Puspiptek Serpong. Analisis BLAST dilaku- kan  menggunakan  program  pada  situs http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
Putranto et al.

## Hasil dan Pembahasan

## Isolasi DNA genomik
DNA  genomik  telah  berhasil  diisolasi dari  empat  galur  kapang  yaitu M.  sitophila,
R. oryzae, R. microsporus, dan A.  corymbifera .  DNA  hasil  isolasi  dengan prosedur  Moller et  al. (1992)  yang dimodifikasi disajikan pada Gambar 1. Hasil pengujian spektrofotometri (Tabel 1) menunjukkan bahwa DNA memiliki kualitas yang  baik  dengan  tingkat  kemurnian  tinggi. Rasio  serapan  A260/280  ≥  1,80  menunjuk- kan bahwa DNA murni dari protein sedang- kan  rasio  A260/230  ≥  1,00  menunjukkan bahwa DNA murni dari polisakarida (Moller et  al .,  1992;  Cote et  al .,  2004).  Pada
penelitian  ini  DNA  dari R.  oryzae mem- punyai rasio A260/280 diatas 1,80 dan rasio A260/230  diatas  satu,  ini  menunjukkan bahwa  DNA  tersebut  memiliki  tingkat  ke- murnian yang tinggi. Keempat DNA kapang tersebut memiliki rasio A260/230 diatas satu yang menunjukkan bahwa DNA telah berha- sil  dimurnikan  dari  polisakarida.  Prosedur ini memiliki tingkat konsistensi yang tinggi, sehingga  percobaan  ulangan  selalu  mem- berikan hasil isolasi yang konsisten. Tingkat kesulitan    tertinggi    dalam    isolasi  DNA kapang  adalah  pada  tingginya  kandungan polifenol  dan  polisakarida  yang  harus  di- pisahkan.  Secara  sederhana  kesulitan  ini dapat  diatasi  dengan  ekstraksi  kloroform: isoamilalkohol
(24:1) yang diulang
Tabel 1.Kualitas dan kuantitas DNA genomik yang diisolasi dari empat galur kapang.
Table 1. Quantity and quality genomic DNA isolated from four strains of molds.
Rasio serapan Absorbance ratio (nm) Galur kapang ( Strains) A260/280 A260/230 Kuantitas ( Quantity) (µg/mL) M. sitophila 1,798 1,330 2456 R. oryzae 1,991 1,391 2440 R. microsporus 1,761 1,237 2435 A. corymbifera 1,489 1,067 3445

## 10 kb

## M         1            2           3           4            M
Gambar 1. Profil DNA genomik  empat  galur  kapang. (M) marka DNA 1 kb; (lajur 1) M. sitophila (24,560 µg),
(2) R. oryzae (24,400 µg), (3) R. Microsporus ( 24,350 µg), (4) A. corymbifera (34,450 µg).
Figure 1.  Genomic DNA  profile of  four mold  strains. (M) 1 kb marker ladder; (lane 1) M. sitophila , ( 24.560 µg ),
(2) R. oryzae ( 24.400 µg), (3) R. microsporus (24.350 µg), (4) A. corymbifera (34.450 µg).
Karakterisasi gen penyandi Lipase dari kapang....
sebanyak  tiga  kali.  Masalah  lain  yang dihadapi  adalah  DNA  sukar  mengendap dengan  sempurna.  Masalah  ini  dapat  diatasi dengan  penambahan  senyawa  organik  5  M ammonium  asetat  pH  7.  Secara  kuantitas, rendemen  DNA  yang  diperoleh  cukup tinggi, yaitu 2000-3500 µg/mL per 1-2 gram sampel miselium.

## Perancangan primer heterologous
Dua  belas  sekuen  gen LIPASE dari dua belas  galur  kapang  dengan  nomer  assesi DQ080073, AY513724, AF229435, E11105, D13206,  AB013496,  E03934,  AY303124, D90315, AF330635, AF288219, dan AF288685  digunakan  untuk  mendesain primer RLP untuk amplifikasi gen LIPASE . Hasil penjajaran ( alignment ) dengan Clustal- W  memperlihatkan  bahwa  sekuen-sekuen gen LIPASE tersebut  memiliki  daerah terkonservasi yang relatif panjang.
Perancangan  primer  disesuaikan  dengan mengambil  daerah  terkonservasi  (Hughes et al ., 2000). Pemilihan melting temperature (Tm)  dan  kandungan  GC  diusahakan  tidak berbeda  jauh.  Tabel  2.  menunjukkan  karak- teristik primer RLP hasil rancangan berdasarkan  dua  belas    sekuen  gen LIPASE dari GenBank .

## Amplifikasi gen LIPASE
Untuk  lebih  memastikan  kualitas DNA genomik kapang maka dilakukan PCR dengan primer universal ITS-4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) dan ITS-5  (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACA AGG-3’)  (White et  al .,  1990).  Amplifikasi DNA M.  sitophila dan R.  oryzae dengan pasangan  primer  tersebut  menghasilkan fragmen  DNA  yang  sangat  jelas  dengan ukuran  sekitar  650  bp  (Gambar  2).  Kedua kapang  lain R.  microsporus dan A.  corym- bifera juga  menunjukkan  hasil  yang  sama (data  tidak  ditampilkan).  Fragmen  ITS tersebut  digunakan  sebagai  marka  positif reaksi PCR.
Amplifikasi DNA keempat galur kapang  diuji  dengan  pasangan  primer  RLP hanya  menghasilkan  fragmen  DNA  pada DNA R. oryzae dan A. corymbifera (Gambar
3.).  Sekuensing  kedua  amplikon R.  oryzae dan A. corymbifera telah berhasil dilakukan. Sekuen  protein  selanjutnya  disebut  AcLIP dan  RoLIP.  Hasil  analisis  BLASTx  menun- jukkan bahwa kedua protein tersebut  memi- liki  homologi  tinggi  (90-99%  asam  amino) dengan  protein Rhizopus  niveus  lipase
Tabel 2.  Karakteristik pasangan primer RLP hasil rancangan berdasarkan 12  sekuen gen LIPASE dari GenBank.
Table 2.  Characteristics RLP primer pair design based on 12 sequences LIPASE gene from GenBank. Sekuen/ Sequences Tm (°C) Konsentrasi Quantity (nmol) %GC Produk/ Product size (bp) RLP-F : 5’-ACTTGGTTGGTGGCATGACTTT-3’ 66,5 46,9 45,45 RLP-R : 5’-TGTTCTTGGACGACAGGGAAT-3’ 66,6 41,8 45,45 466
Putranto et al.
RNL (AAC60540.2), lipase Rhizopus niveus (BAA31548.1),  lipase precursor R.  oryzae (AAF32408.1),    dan  lipadyou-2 R.  oryzae
(AAS84458.1) (Gambar 4). Hasil penjajaran protein  menunjukkan  bahwa  urutan  asam amino  berbeda  di  tiga  posisi  yaitu  asam amino  ke-257,  348,  dan  377  (Gambar  4). Fadılo˘glu  &  Erkmen  (1999)  mengemuka- kan  perbedaan  pada  asam  amino  kemung- kinan  berpengaruh  pada  bentuk,  struktur, dan reaktivitas protein tersebut.
Dari  dua  fragmen  gen  penyandi protein lipase  yang  telah  diketahui  identitasnya (AcLIP dan RoLIP), pohon filogenetis lebih memperjelas  hubungan  kekerabatan  kedua- nya.  Keduanya  berada  dalam cluster yang sama (Gambar 5). AcLIP lebih dekat dengan cluster R.  niveus dan  RoLIP  lebih  dekat dengan R.  oryzae .  Meskipun  demikian  hasil penjajaran  Clustal-W  sebelumnya  memper- lihatkan   tingkat   homologi   yang    tinggi (96-99%)  antara  kedua    gen-gen    dalam cluster. Boleh  dikatakan  kedua  gen  tersebut adalah satu jenis protein yang sama apabila
ditranslasikan.  Lipase  merupakan  enzim yang  memiliki  karakter  spesifik  tergantung organisme  penghasilnya.  Beberapa  lipase yang dihasilkan organisme-organisme dalam satu  genus  juga  memiliki  karakter  berbeda meskipun secara umum memiliki motif asam amino  yang  sama  untuk  tiap  organisme. Motif  asam  amino  ini  berupa  urutan  asam amino  Glisin-X-Serin-X-Glisin  (G-X-S-X- G)  yang  juga  merupakan  sisi  aktif  dari enzim  ini,  dimana  X  dapat  digantikan  oleh Histidin,  Leusin,  atau  Tirosin  (Salomon, 2003).  Pengaruh  lingkungan  kemungkinan turut  memberikan  peranan  terhadap  orga- nisme penghasil lipase.
Usaha  untuk  mendapatkan  produk healthy  oil memerlukan  spesifitas  kinerja enzim  lipase.  Penggunaan  lipase  yang  lebih spesifik akan   memperkecil  kemungkinan
1 kb

## 500 bp 650 bp

## M         1           2
Gambar 2. Amplifikasi  DNA kapang  dengan primer ITS-4  dan ITS-5  (M)  marka  DNA 1 kb (1) M. sitophila (2) R. oryzae. Figure 2. Amplification of mold DNA  using ITS-4 and  ITS-5 primers (M) 1 kb marker ladder, (1) M. sitophila, (2) R .oryzae . 5 kb 1 kb 650 bp
466 kb
M   -     +     1   2     3   4 Gambar 3. Amplifikasi    DNA  kapang    dengan pasangan primer RLP , suhu penempelan 60°C (M) marka  DNA 1 kb, (-) kontrol negatif, (+) kontrol positif (1) M. sitophila
(2) R. oryzae ,  (3) R. microsporus
(4) A. corymbifera.
Figure 3. Amplification mold with  pair of RLP primers, annealing  at  60°C (M) 1 kb marker ladder, (-)  negative   control,
(+)  positive   control, (1.) M.sitophila,
(2) R.oryzae, (3.) R.microsporus, (4)
A.corymbifera
Karakterisasi gen penyandi Lipase dari kapang....
Gambar 4. Penjajaran asam amino dari AcLIP, RoLIP dan homolognya (untuk nomor asessi , lihat text). RNL = lipase Rhizopus niveus ; RnLIP3 = lipase-3 R. niveus ; RnLIP = lipase prekursor R. niveus ; RoLIPdy2 = lipadyou-2 R. oryzae ; RoLIP2 = lipase prekursor R. oryzae .
Figure 4.  Amino acid alignment of AcLIP and its closest   homologoues (for accession numbers, see the text). RNL = Rhizopus niveus lipase;  RnLIP3 = R. niveus lipase-3;  RnLIP  = R. niveus lipase precursor; RoLIPdy2= R. oryzae Lipadyou-2; RoLIP2 = R. oryzae lipase precursor.
0.1 PeLIP AtLIP PcMDGL GzLIP YlLIP2 CdLIP RsLIPRs RNL RoLIP Putranto et al.
kesalahan  pada  produk  diperoleh.  Rekayasa secara  molekuler  lebih  mudah  dilakukan daripada  melakukan  perubahan  secara  fisik menggunakan enzim regiospesifik (Elisabeth et  al .,  1998).  Penggunaan  enzim  regio- spesifik  memerlukan  biaya  yang  tidak sedikit  sehingga  nilai  penting  menemukan gen  lipase  spesifik  dalam  genom  sangat tinggi.  Sebagai  contoh, LIPASE 1,3-diglise- rida  merupakan  gen  yang  menyandi  1,3- diasilgliserol  (1,3-DAG).  Produk  spesifik healthy oil yang  sekarang  ini  beredar  di pasaran  luar  negeri  memiliki  kandungan DAG sekitar 60-80% (AOCS, 2004). AcLIP dan  RoLIP  merupakan  fragmen  gen  yang menyandi  lipase  non-spesifik.  Berdasarkan pohon  filogenetis,  fragmen  gen LIPASE nampaknya memiliki homologi yang rendah
dengan gen PcMDGL ( Penicillium camembertii mdlA untuk mono-  dan  DAG lipase)  yang  menyandi  lipase  spesifik  1,3- digliserida (Gambar 5). Yamaguchi & Mase (1990)  mengemukakan  bahwa  lipase  yang dihasilkan  dari  gen PcMDGL memiliki  dua bentuk yaitu tipe A dan tipe B dengan berat molekul  yang  hampir  sama  (37,000–39,000 Da).  Motif  asam  amino  kedua  tipe  lipase tersebut identik, namun tipe B lebih spesifik dalam  menghasilkan  DAG.  Amplifikasi  gen PcMDGL akan  memberikan  informasi  yang baik  dalam  usaha  mendapatkan  produk lipase  spesifik.  Sesuai  hasil  pada  penelitian ini,  nampaknya  homologi  merupakan  faktor yang  penting  untuk  mendapatkan  ampli- fikasi produk yang diinginkan.
Gambar 5. Pohon  filogenetis  dari RoLIP  terhadap  beberapa  protein  lipase  pada  beberapa  galur  mikroba terdekat.  RNL=  lipase Rhizopus  niveus ;  RoLIP = lipase prekursor R. oryzae ; RsLIPRs = lipase lipRs R.stolonifer ;  CdLIP = lipase Candida  deformans untuk DAG; YILIP2 = Yarrowia  lipolytica YlLIP2; PeLIP= lipase prekursor Penicillium expansum ; GzLIP = lipase Gibberella zeae; PcMDGL = lipase Penicillium camembertii mdlA untuk mono- dan DAG; AtLIP = lipase Aspergillus tubingensis
Figure 5. Phylogenetic  tree  of  RoLIP  and  several  lipase protein of closest microbe strains.RNL= Rhizopus niveus lipase;  RoLIP = R. oryzae lipase  precursor; RsLIPRs = R. stolonifer lipase lipRs;   CdLIP = Candida   deformans DAG  lipase; YILIP2= Yarrowia   lipolytica YlLIP2;   PeLIP = Penicillium expansum lipase precursor; GzLIP = Gibberella zeae lipase; PcMDGL  = Penicillium  camembertii mdlA for mono- and DAG lipase; AtLIP = Aspergillus tubingensis lipase.
0,1
Karakterisasi gen penyandi Lipase dari kapang....

## Kesimpulan dan Saran
Fragmen DNA gen penyandi lipase dari kapang R. oryzae dan A. corymbifera dengan panjang  466  bp  telah  berhasil  diamplifikasi menggunakan  pasangan  primer  PCR RLP . Analisis  BLAST  memperlihatkan  bahwa fragmen  tersebut  memiliki  homologi  yang tinggi dengan protein lipase  beberapa galur Rhizopus . Deteksi  untuk  mendapatkan  amplifikasi gen PcMDGL memerlukan  pendekatan  ke arah  homologi  sekuen  antara  lain  dengan penggunaan  kapang  yang  dekat  secara taksonomi.  Langkah  ini  merupakan  pen- dekatan  yang  sebaiknya  dilakukan  untuk tahap penelitian selanjutnya.

## Daftar Pustaka
Kao  Corporation.  (2004).  General  properties  and cooking  characteristic  of  diacylglycerol  as an  adible  oil In Y.  Katsuragi  (ed.) Diacylglycerol  Oil .  Chapter  19-22,  AOCS Press. p. 197-252.
Cote,  M.  J.,  M.C.  Tardif    &  A.  J.  Meldrum. (2004). Identification of Monilinia fructigena,  M.  fructicola,  M.  laxa, and Monilia  polystroma on  inoculated  and naturally infected fruit using multiples PCR. Plant Dis ., 88, 1219-1225.
Elisabeth,  J.,  A.  Jatmika  &  E.  Nainggolan,
(1998). Preparasi mono- dan digliserida dari minyak  sawit  dengan  proses  gliserolisis enzimatik. J. Penel. Kelapa Sawit, 6 (1), 79- 87.
Fadılo˘glu,  S.  &  O.  Erkmen  (1999).  Lipase production  by Rhizopus  oryzae  g rowing  on different carbon and nitrogen sources. J. Sci. Food Agric., 79, 1936-1938.
Hughes, K. J. D., C. E. Fulton,  D. McReynold & C.  R.  Lane.  (2000).  Development  of  new PCR  primers  for  identification  of Monilinia species. In EPPO Conference on Diagnostic Techniques  for  Plant  Pests .  Wageningen. NL. pp. 2000-2004.
Kosugi  Y.,  H.  Tanaka  &  N.  Tomizuka.  (1990). Continuous hydrolysis of oil by immobilized
lipase in a countercurrent reactor. Biotechnol. & Bioengin ., 36 (6), 617-622.
Moller,  E.  M.,  G.  Bahnweg,  H.  Sandermann  & H. H. Geiger (1992). A simple and efficient protocols  for  isolation  of  high  molecular weight  DNA  from  filamentous  fungi,  fruit bodies,  and  infected  plant  tissues. Nucleic Acids Res ., 20,  6115-6116.
Nining, A. (2005). Isolasi dan penapisan mikroba penghasil  lipase  spesifik  -gliserida  serta penentuan kondisi optimum produksi diasilgliserol  menggunakan  minyak  sawit mentah. Tesis . Jakarta, Universitas Indonesia.  60 p.
Onions,  A.H.S.,  D.  Allsopp  &  H.O.W.  Eggins (1981). Smith’s  Introduction  to  Industrial Mycology .  7 th (eds.).  British,  Edwards Arnold.   p. 140-142.
Salomon,  S.  (2003). A  Secreted  Lipase  as  a Virulence  Factor  of Fusarium  grami- nearum.  Hamburg,  Dept  Molecular  Phyto- patology  &  Genetics.  Univ.of  Hamburg.  19
p.
Suzuki, T., Y. Mushiga, T. Yamane & S. Shimizu
(1988).  Mass  production  of  lipase  by  fed- batch  culture  of Pseudomonas  fluorescens. Appl. Microbiol.Technol. , 27, 417-422.
White, T. J., T. Burns, S. Lee & J. Taylor (1990).
Amplification  and  direct  sequencing  of fungal  ribosomal  RNA  genes  for  phylo- genetics. In M.  A.  Innis,  D.  H.  Gefland, J.  J.  Sninsky  &  T.  J.  White  (eds). PCR Protocols . San Diego, Academic Press. CA. p. 315-322.
Winarno,  F.G.  (1986 ).  Kimia  Pangan  dan  Gizi.
Jakarta,  PT. Gramedia. 253 p.
Yamaguchi,  S.  &  T.  Mase.  (1990).  Purification and characterization of mono-and diacylglycerol lipase isolated from Penicillium camembertii U-150. Appl. Microbiol. Technol. , 34 (6), 720-725.
Yamane,  T.  (1987).  Enzyme  technology  for  the lipids industry: An Engineering overview. In Applewhite,  T.  H.  (ed.). Proceeding  of World  Conference  on  Biotechnology  for  the Fats  and  Oils  Industry.  AOAC . Champaign, p.17-22.