PENYISIHAN SENYAWA KLOROLIGNIN oleh Phanerochaete Chrysosporium dengan PENAMBAHAN JERAMI SEBAGAI

## CO-SUBSTRAT
Dwina Roosmini 1) , V Sri Harjati Suharti 2) ,  Kevin Triadi 3) ,  Junianti Roslinda 3)
1) Kelompok Keahlian Teknologi Pengelolaan Lingkungan, FTSL – ITB (droosmini@bdg.centrin.net.id)
2) Sekolah Ilmu Teknologi dan Hayati ITB
3) Program Studi Teknik Lingkungan, FTSL-ITB

## ABSTRACT
White  rot  fungi  Phanerochaete  chrysosporium  strain  BKM-F-1767  are  known  to  have  extra cellular enzyme that able to degrade chlorolignin. Previous study showed that high delignification ability of the fungi is not supported by dehalogenase processes. This study is done by using rice straw as carbon source  for  chloroklorolignin  degradation.  The  study  is  conducted  in  batch  culture  with  straw concentration of 3.2 g/L and 0.3 g/L for chloroklorolignin.  The straws are varies in form of powder and chips.  The  enzymes  activity  are  identified  in  liquid,  solid  and  SDS-PAGE.    By  using  SDS-PAGE  the enzymes  identified  are  molecular  weight  42  kD  and  29  kD  which  is  indicating  the  occurrence  of Klorolignin  peroxidase  (LiP)  and  active  endoglucanse  in  11th  day.    Positive  result  from  solid  media showed  that  Phanerochaete  chrysosporium  has an ability  to  degrade  high  molecular  chloroklorolignin through enzymatic mechanism resulting from secondary metabolism reaction in generating H 2 O 2 .
Keywords: Chlorolignin compound, Phanerochaete chrysosporium, LiP, rice straw, batch culture.,

## INTISARI
Jamur  Phanerochaete  chrysosporium  strain  BKM-F-1767  diketahui  memiliki  enzim  ekstraseluler yang  mampu  untuk  mendegradasi  senyawa  khloroklorolignin.  Studi  terdahulu    menunjukkan  bahwa kemampuan  delignifikasi  yang  tinggi  oleh  jamur  ini  tidak  selalu  didukung  oleh  proses  dehalogenase. Selain  itu,  jamur  sangat  tergantung  pada  keberadaan  glukosa  sebagai  co-substrat  utama  untuk pertumbuhan.  Dengan  penambahan  jerami  diharapkan  konsentrasi  glukosa  dapat  dikurangi  karena keberadaan  senyawa  selulosa  yang  dapat  dijadikan  sumber  karbon  bagi  jamur.  Pada  penelitian  ini digunakan sistem  kultur batch   dengan variabel tetap yaitu  jumlah  jerami  sebesar  3,2 g/L dan  substrat yang  digunakan  yaitu  klorolignin  dengan  konsentrasi  0,3  g/L.  Variabel  bebas  yang  digunakan  adalah konsentrasi  co-substrat  glukosa  dan  tipe  perlakuan  jerami  yang  berbeda  yaitu  potongan  (chips)  dan serbuk.  Aktivitas-aktivitas  enzim  ekstraseluler  diuji  melalui  media  padat,  cair,  dan  SDS-  PAGE. Percobaan  dengan  SDS-PAGE  diperoleh  enzim  dengan  berat  molekul  42  kD  dan  29  kD  yang mengindikasikan adanya enzim LiP dan endoglucanase yang masih aktif hingga akhir hari ke-11. Hasil positif    yang  diperoleh  pada  media  padat  menunjukkan  bahwa  jamur  Phanerochaete  chrysosporium memiliki kemampuan untuk  mendegradasi  senyawa  klorolignin berat  molekul  tinggi  melalui  mekanisme sistem enzimatik yang dihasilkan oleh reaksi metabolisme sekunder dalam sistem generasi H 2 O 2 .
Kata  Kunci  :  Senyawa  klorolignin,  jamur  Phanerochaete  chrysosporium,  Lip,  jerami,sSistem  kultur batch..

## PENDAHULUAN
Pada  proses  pemutihan  di  industri  pulp dan  kertas  akan  dihasilkan  air  buangan  yang mengandung  senyawa  klorolignin.  Pengolahan biologis  konvensional  sudah  banyak  dilakukan untuk  mendegradasi  senyawa  klorolignin  yang
mempunyai  berat  molekul  tinggi.  Penelitian menunjukkan    bahwa    jamur Phanerochaete chrysosporium merupakan  jenis  jamur  pelapuk putih yang dapat mengoksidasi senyawa polimer 14 C  klorolignin  secara  sempurna  menjadi  CO 2
BK Jamur pada BJ=32 gr/l BK Jamur pada BJ= 3,2 gr/l BK Jamur pada BJ=1,6 gr/l 0,2 0,4 0,6 0,8 1,2 1,4 0 1 0 2 4 6 8 10 Hari Berat Kering (BK) Jamur (gr/l)
melalui  aktivitas  enzim  ekstraseluler  dalam kondisi nitrogen terbatas.
Dalam  penelitian  ini  digunakan  jerami sebagai co-substrat dalam proses degradasi yang penggunaannya  diikuti  dengan  penambahan beberapa  variasi  konsentrasi  glukosa.  Dengan adanya  kandungan  selulosa  pada  jerami,  maka jerami diharapkan dapat dijadikan sebagai media karbon  selain  glukosa  bagi  proses  metabolisme jamur dalam mendegradasi senyawa klorolignin. Mekanisme  yang  terjadi  menyangkut  enzim ekstraseluler seperti enzim selulase , cellobiohidrola se,  dan endoglucanase yang dapat  mengkonversi  senyawa  selulosa  menjadi senyawa glukosa.

## BAHAN DAN METODA
Pada  penelitian  ini digunakan konsentrasi substrat  klorolignin  sebesar  0,3  g/L  sedangkan konsentrasi co-substrat glukosa yang ditambahkan  akan  divariasikan  dengan  bentuk jerami.Pada tahap persiapan dilakukan pembenihan jamur dan persiapan jerami sebagai co-substrat. Pada penelitian pendahuluan dilakukan perhitungan matematis untuk menentukan  konsentrasi  jerami  yang  akan digunakan,  setelah  itu  dilakukan  percobaan dengan  beberapa  variasi  konsentrasi  jerami tersebut  yang  dicampurkan  dengan  inokulum jamur  dan  media.  Penelitian  utama  terdiri  dari biodegradasi senyawa klorolignin dan
identifikasi enzim-enzim ekstraseluler. Biodegradasi senyawa
klorolignin dilakukan  melalui  2  tahap  dengan  perlakuan jerami  yang  berbeda.  Tahap  pertama  dilakukan dengan  konsentrasi  klorolignin  0,3  g/L  dan glukosa  konsentrasi  5  g/L  dan  10  g/L  dengan bentuk  jerami  adalah  potongan.  Tahap  kedua dilakukan  setelah  tahap  pertama  selesai  dengan konsentrasi  co-substrat  glukosa  5  g/L  dan  2,5 g/L dengan bentuk jerami adalah serbuk. Tahap pertama dilakukan dengan menggunakan erlenmeyer  125  mL  dengan  jumlah  media  30 mL. Tahap kedua dilakukan pada erlenmeyer 2L dengan jumlah media 500 mL.
Identifikasi  enzim-enzim  ekstraseluler pada  jamur Phanerochaete  chrysosporium dilakukan pada media padat dengan menggunakan senyawa-senyawa seperti syringaldazine,  guaiacol,  ABTS  (diammonium 2,2’-azinobis(3-etil-6-benzotiazolin sulfonat)), dan    RBBR  (Rhemazol  Brilliant  Blue  R).  Pada penelitian  ini,  media  padat  yang  digunakan
adalah    media  basal  dengan  kadar  glukosa  10 g/L;  5  g/L;  dan  2,5  g/L  yang  masing-masing ditambahkan  senyawa  klorolignin  BM>  10000 sebesar 0,3 g/L dan jerami serbuk 3,2 g/L.
Selain  itu  dilakukan  juga  uji  aktivitas enzim  pada  media  cair  dan  SDS-PAGE  untuk membandingkan  hasil  pada  media  padat. Identifikasi  enzim  pada  media  cair  dilakukan pada  sampel  hari  ke-11  untuk  konsentrasi glukosa 5 g/L dan 2,5 g/L.
SDS-PAGE  digunakan  untuk  memeriksa aktivitas enzim ekstraseluler berdasarkan perbedaan berat molekul protein yang membentuk enzim-enzim tersebut. Sampel yang digunakan  adalah  sampel  pada  hari  ke-11 dengan kadar glukosa 5 g/L. Sebelumnya sampel dipekatkan  dengan  proses  dialisis  setelah  itu konsentrasi  protein  dipekatkan  dengan  TCA precipitation .  Pada  TCA precipitation seluruh kadar protein akan diendapkan melalui reaksinya dengan  senyawa trichloro  acetic  acid dimana sampel  diendapkan  dengan  kandungan  minimal 5 μg/mL.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Dengan hasil dari asumsi dan perhitungan matematis  dilakukan  percobaan  dengan  variasi konsentrasi  jerami  sebesar  32  g/L;  3,2  g/L; dan 1,6  g/L.  Hasil  pengukuran  berat  kering  jamur dan jerami dilihat pada Gambar 1 dan Gambar 2.
Gambar 1. Pola Pertumbuhan Jamur Phanerochaete    chrysosporium pada  Substrat Jerami Ditambah Glukosa  10 g/L  dan Klorolignin 0,3 g/L
Pada konsentrasi jerami 3,2 g/L dan 1,6 g/L, laju pertumbuhan eksponensial terjadi pada 1-3  hari.  Laju  pertumbuhan  spesifik  masing- masing  konsentrasi  3,2  g/L  dan  1,6  g/L  adalah 0,91  hari -1 dan  1,28  hari -1 .  Dari  hasil  tersebut dapat  dilihat  bahwa  laju  pertumbuhan  spesifik lebih tinggi ditunjukkan pada konsentrasi jerami 1,6g/L.
0 5 10 15 20 25 30 35 0 2 4 6 8 10 Hari B era t Keri ng ( B K) Jera mi ( gr/ l) BK Jerami pada BJ= 32 gr/l BK Jerami pada BJ= 3,2 gr/l BK Jerami  pada BJ= 1,6 gr/l
Gambar 2 Perubahan Berat Kering Jerami pada Kultur  dengan  Kadar  Glukosa  10  g/L  dan Konsentrasi  Klorolignin 0,3 g/L
Berdasarkan  hasil  pengamatan,  jamur lebih  banyak  melekat  pada  jerami  dengan konsentrasi  3,2  g/L,    sedangkan  jamur  tidak melekat  terlalu  banyak  pada  jerami  dengan
konsentrasi 1,6 g/L. Dengan demikian konsentrasi jerami yang terpilih untuk digunakan pada penelitian utama adalah 3,2 g/L.
Pada  Gambar 2 dapat  dilihat  bahwa  berat kering jerami tidak mengalami perubahan terlalu banyak.  Hal  ini  dapat  disebabkan  jamur  hanya mendegradasi  jerami  sebagian  kecil.  Adanya pertambahan  berat  pada  jerami  mungkin disebabkan  melekatnya  jamur  pada  jerami  yang tidak terambil dalam sampling.

## 1. Penyisihan  Klorolignin  Pada  Substrat Jerami Potong dan Jerami Serbuk
Proses  penyisihan  klorolignin  diukur dengan  mengamati  perubahan  warna  pada panjang gelombang ultraviolet 280 nm.

## Tabel. 1 Persentase Penyisihan Klorolignin Pada Substrat Jerami Potong
Tabel. 2 Persentase Penyisihan Klorolignin Pada Substratr Jerami Serbuk
Tabel. 3 Penyisihan COD Pada Substrat Jerami Potong
Konsentrasi Glukosa (g/L) Konsentrasi Klorolignin (g/L) % Penyisihan Awal (H-0) Akhir (H-1) 10 0,261 0,128 50,96 5 0,225 0,131 41,78 Kontrol (H-0) (H-7) 10 0,245 0,131 46,53 5 0,212 0,124 41,51 Konsentrasi Glukosa (g/L) Konsentrasi Klorolignin (g/L) % Penyisihan Awal (H-0) Akhir (H-1) 5 0,257 0,115 55,25 2,5 0,247 0,176 28,74 Konsentrasi Glukosa (g/L) Konsentrasi COD (mg/L) % Penyisihan Awal (H-0) Akhir (H-1) 10 3976 1297 67,37 5 3199 1421 55,58 Kontrol (H-0) (H-7) 10 3625 1380 61,93 5 3125 1224 60,83
Tabel 4 Persentase Penyisihan COD Pada Substrat Jerami Serbuk
Penyisihan  klorolignin  dilakukan  pada konsentrasi  glukosa  10  g/L  dan  5  g/L  dengan jerami  potong.  Kemudian  dilakukan  perubahan konsentrasi  glukosa  menjadi  5  g/L  dan  2,5  g/L, serta jerami yang digunakan dalam bentuk serbuk. Hal ini dilakukan karena kecenderungan penyisihan pada tahap pertama tidak jauh berbeda antara  glukosa  10  g/L  dan  5  g/L  dan  untuk mengetahui    apakah jerami  dalam  bentuk  serbuk masih  dapat  berfungsi  sebagai  co-substrat  pada proses metabolisme jamur.
Pada  penelitian  tahap  pertama,  penyisihan senyawa  klorolignin  pada  konsentrasi  glukosa  5 g/L lebih besar terjadi pada substrat jerami serbuk daripada  jerami  potong.  Hal  ini  mungkin disebabkan  pola  konsumsi  glukosa  oleh  jamur pada  glukosa  5  g/L  +  jerami  serbuk  sehingga proses  metabolisme  primer  lebih  cepat  tercapai dan  proses  metabolisme  sekunder  dapat  segera berlangsung.

## 2. Penyisihan COD Pada Substrat Jerami Potong dan Jerami Serbuk
Penyisihan  COD  oleh  jamur Phanerochaete chrysosporium menunjukkan  peningkatan  sejalan dengan meningkatnya konsentrasi co-substrat. Hal tersebut dapat dilihat pada Tabel 3 dan Tabel 4.
Hasil  yang  diperoleh  pada  konsentrasi glukosa 5 g/L dengan jerami serbuk menunjukkan persentase  penyisihan  COD  yang  lebih  besar dibandingkan  konsentrasi  glukosa  10  g/L  dan  5 g/L  dengan  penambahan  jerami  potong.  Hal  ini disebabkan adanya peningkatan penyisihan klorolignin yang semakin tinggi dengan menggunakan  jerami  serbuk  yang  kemudian meningkatkan kandungan senyawa organik berberat  molekul  rendah.  Keadaan  tersebut  akan menyebabkan  kebutuhan  oksigen  akan  semakin tinggi sehingga nilai COD yang semakin naik.
3. Identifikasi Enzim-enzim Ekstraseluler

## a. Media Padat
Uji    aktivitas  enzim  ekstraseluler  dapat dilihat dari reaksi positif terhadap substrat melalui perubahan warna. Hasil identifikasi kadar glukosa menunjukkan aktivitas enzim terdeteksi pada hari kedua  masa  inkubasi.  Pada  media  padat  aktivitas baru  muncul  setelah  hari  ketiga  masa  inkubasi. Dari  hasil  penelitian  diperoleh  bahwa  dengan kadar  glukosa  10  g/L  lebih  kuat  dibandingkan dengan  kadar  glukosa  5  g/L  dan 2,5  g/L.  Hal ini menunjukkan bahwa kadar glukosa yang berlebih akan meningkatkan aktivitas enzim.

## b. Media Cair
Pada  pemeriksaan  media  cair  ini  sampel dihilangkan  kadar  garamnya  terlebih  dahulu dengan  dialisis  dan  kemudian  dipekatkan  dengan menghilangkan  kadar  air  pada  larutan  glukosa. Setelah  proses  pemekatan,  sampel  kemudian diteteskan dengan substrat yang sama pada media padat.  Hasil  identifikasi  menunjukkan  bahwa sebagian tes terhadap substrat tidak menunjukkan adanya  aktivitas  enzim,  kecuali  untuk  kadar glukosa  5  g/L  dimana  terdapat  perubahan  warna yang  sedikit  guaiakol  menjadi  coklat  kemerahan. Hal ini  dapat disebabkan  karena enzim ekstraseluler  umumnya  memiliki  produktivitas yang  rendah  hingga  hari  ke-11  sehingga pemeriksaan  pada  sampel  cair  tidak  akan menunjukkan hasil yang positif.

## c. SDS-PAGE
Hasil penelitian menunjukkan bahwa marker pada sampel berada pada berat molekul 42 kDa  dan  29  kDa.  Dengan  hasil  tersebut  maka diketahui  bahwa  untuk  berat  molekul  42  kDa adalah  berat  molekul  yang  dimiliki  enzim  LiP (Suhardi, 1995)  sedangkan  dengan  berat  molekul 29  kDa  adalah  nilai  yang  berada  pada  rentang enzim endoglucanase , yaitu 28-37 kDa. Dari hasil
Konsentrasi Glukosa (g/L) Konsentrasi COD (mg/L) % Penyisihan Awal (H-0) Akhir (H-1) 5 2001,68 517,64 74,14 2,5 2009,06 1100,56 45,22
ini  dapat  diketahui  bahwa  aktivitas  enzim  pada hari  ke-11  masih  diproduksi  dengan  hadirnya enzim LiP dan enzim endoglucanase .

## KESIMPULAN
1. Jamur Phanerochaete  chrysosporium dapat mendegradasi  senyawa  klorolignin  yang ditunjukkan dengan turunnya nilai konsentrasi klorolignin dan COD. 2. Jamur  masih  mampu  melakukan  proses degradasi senyawa klorolignin pada
konsentrasi  co-substrat  glukosa  2,5  g/L  + jerami  serbuk  dengan  persentase  penyisihan klorolignin 28,74%.
3. Perbedaan  konsentrasi  glukosa  pada  proses biodegradasi senyawa klorolignin oleh
Phanerochaete chrysosporium akan
memberikan pengaruh terhadap hasil degradasi pada persentase penyisihan klorolignin dan COD.
4. Jerami  memiliki  peranan  sebagai co-substrat pendukung  glukosa  pada  bentuk  potongan yang ditandai dengan naiknya nilai konsentrasi  glukosa  pada  hari  ke-3  sampai hari ke-4.
5. Jamur Phanerochaete chrysosporium memiliki aktivitas enzim-enzim ekstraseluler yang  terdiri  dari  enzim  kloroligninolitik, peroksidase , lakase ,  dan selulase .  Hal  ini ditunjukkan  dengan  hasil  positif  pada  uji aktivitas  enzim  pada  media  padat  dan  SDS- PAGE.
6. Analisa  enzim  dengan  menggunakan  SDS- PAGE  menunjukkan  aktivitas  enzim  LiP dengan berat molekul 42 kDa dan endoglucanase dengan berat molekul 29 kDa oleh  jamur Phanerochaete  chrysosporium pada hari ke-11.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Abramovitz,  J  and    A  Martoon.,  199, Paper Cuts:  Recovering the  Paper  Landscape . Worldwatch Institute Paper.
2. Barclay,  C.D.,  G.F  Farquhar,  R.  L.  Legge., 1995, Biodegradation  and  Sorption  of Polyaromatic Hydrocarbons by Phanerochaete chrysosporium. Applied
Microbiology Biotechnology.Canada.
3. Diniari,  R.  Dian.,  2000,  Studi Penyisihan Senyawa  Klorolignin  oleh  Phanerochaete chrysosporium  dalam  Biorekator  Unggun Terfluidisasi . Laporan Tugas Akhir Penelitian
Departemen Teknik Lingkungan. ITB-
Bandung. 4. Roosmini, Dwina., 2001, Biodegradasi klorolignin  Berat  Molekul  Tinggi .  Disertasi.
ITB-Bandung.
5. Suhardi,  Sri  Harjati.,  2000, Penggunaan Jamur  White-Rot untuk  Penghilangan  Warna dan  Deklorinasi  Limbah  Pulp  dan  Kertas: Immobilisasi  Jamur  White-Rot  pada  Reaktor Fluidised  Bed  (FBR) .  Laporan  Hasil  Riset RUT VI.