## EFEKTIVITAS CAMPURAN PROTOKSIN BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP . AIZAWAI DAN KONIDIA BEAUVERIA BASSIANA TERHADAP ULAT GRAYAK SPODOPTERA LITURA
F.
Eka Sukmawati*
*)Dosen Tetap Non-PNS Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknolgi UIN Aluddin Makassar
Abstract: Armyworm  or  (Lepidoptera:Noctuidae)  is  one  of  main  pest in plant crop. This pest might cause damage on the leaves and stems and  reduce  of  crop  production.  Bacillus  thuringiensis  subsp.  aizawai and Beauveria bassiana  have been known as biocontrol agent to this pest.  This  research  was  aimed  to  observe  the  production  time  of  B. thuringiensis subsp. aizawai toxin, measure the effect of toxin against Be.  bassianaconidia,    to  test  the  activity  of  their  mixture  against  S. litura. B. thuringiensis subsp. aizawai was grown on specific medium for  B.  thuringiensis.  Toxin  production  of  the  isolate  was  measured every  4  hours  up  to  48  hours  incubation.  Be.  bassianawas  grown  on the  white  rice  medium  and  its  conidia  was  grown  on  the  Potato Dextrose Agar medium. containing toxin. The activity test was done by spraying  them  to  S.  litura  larvae.  The  stasionary  phase  of  B. thuringiensis  was  obtained  at  16  hours  incubation  and  the  maximal toxin  production  at  48  hours..  The  highest  mortality  caused  the mixture of toxin thuringiensis and conidia Be. bassiana was 96,7%.
Key words: Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Beauveria bassiana, toxin, mortality,Spodoptera litura. .

## I. PENDAHULUAN
erangan  hama  merupakan  salah  satu  faktor  penghambat  dalam  usaha peningkatan produksi pertanian baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Grayak  ( Spodoptera  litura )  merupakan  salah  satu  jenis  hama  penting yang menyerang tanaman palawija dan sayur-sayuran. Grayak bersifat polifag dan menyebabkan  defoliasi  daun  tanaman  (Rao dkk .  1993).  Hama  ini  menyerang berbagai macam tanaman penting  yang bersifat  ekonomis seperti beras,  kentang, tembakau,  tomat,  jagung,  cabai,  kubis,  padi,  tebu,  buncis,  jeruk,  bawang  merah, terung,  kacangkacangan  (kedelai,  kacang  tanah),  kangkung,  bayam,  pisang, tanaman  hias  juga  gulma Limnocharis sp., Passiflora  foetida , Ageratum sp.,
S
20 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 1, Januari 2014 , hlm. 19 – 30
Cleome sp., Clibadium sp., dan Trema sp. (Dirjen Perlindungan Tanaman Pangan 2012).  Selain  di  Indonesia,  grayak  ditemukan  di  India,  Pakistan,  Banglades,  Sri Lanka, China, Australia, Kepulauan Pasifik, Hawaii, dan Fiji (Hill 1993).
Hama S.  litura menyerang  tanaman  budidaya  pada  fase  vegetatif  dan generatif.Pada  fase  vegetatif  larva  memakan  daun  tanaman  yang  muda  sehingga tinggal tulang daun saja dan fase generatif dengan memakan polong-polong muda. Serangan S. litura menyebabkan kerusakan sekitar 12,5% dan lebih dari 20% pada tanaman umur lebih dari 20 hari setelah tanam. Serangan berat akan menyebabkan tanaman mati (Hennie dkk . 2003).
Usaha  pengendalian  oleh  petani  selama  ini  ialah  dengan  menggunakan insektisida  kimia.  Pengendalian  hama  dengan  insektisida  kimia  dapat menimbulkan  banyak  masalah  lingkungan  antara  lain  resistensi  hama  terhadap insektisida  kimia  meningkat,  ledakan  populasi  serangga  hama  sekunder,  resiko keracunan pada manusia dan hewan ternak, air tanah terkontaminasi, biodiversitas menurun  dan  bahaya  lain  yang  berkaitan  dengan  lingkungan  (Soetopo  dan Indrayani  2007).  Masalah-masalah  yang  tersebut  memicu  penemuan  alternative penanggulangan  hama  yang  ramah  lingkungan  sehingga  kerusakan  lingkungan secara  umum  dapat  dihindari  sehingga  konsep  pertanian  ekologi  atau  pertanian berkelanjutan dapat diwujudkan.
Salah  satu  bioinsektisida  asal  mikroorganisme  yang  telah  digunakan  di beberapa  negara  yaitu Bacillus  thuringiensis. Bakteri  ini  termasuk  bakteri  Gram positif  yang  menghasilkan  kristal  inklusi  pada  saat  bersporulasi  yang  terdiri  atas satu atau lebih protein insektisidal yang dikenal sebagai δ-toksin atau protein Cry (Boncheva dkk . 2006). Protein Cry mempunyai kisaran spektrum yang sempit dan spesifik  pada  serangga  dari  ordo  Lepidoptera,  Coleoptera,  Diptera,  dan Hymenoptera (Schenepf dkk . 1998). Salah satu alternatif pengendalian hama yang cukup  potensial  ialah  menggunakan  patogen  serangga  seperti  cendawan Beauveria  bassiana yang  merupakan  fase  anamorf  dari Cordyceps  bassiana . Cendawan  ini  memiliki  kisaran  inang  serangga  yang  sangat  luas,  meliputi  ordo Lepidoptera,  Coleoptera,  dan  Hemiptera.Selain  itu,  infeksinya  juga  sering ditemukan  pada  serangga-serangga  Diptera  maupun  Hymenoptera  (Soetopo  dan Inrayani 2007).dan Indrayani 2007).
Campuran B. thuringiensis dan cendawan insektisida seperti Be. Bassiana dapat dijadikan strategi untuk mengatasi masalah hama yang lebih kompleks dan meningkatkan  aktivitas  insektisida  baik  secara  langsung  maupun  tidak  langsung (Navon 2003). Kerja sinergis keduanya dapat menekan populasi Colarado potato bettle pada  tanaman  tomat, Ostrinia  nubilalis ,  dan  serangga  Lepidoptera  (Lewis
Eka Sukmawati , Efektivitas Campuran Protoksin Bacillus Thuringiensis Subsp. Aizawai …_ 21
etal. 1996;  Wright  dan  Ramos  2005;  Rukmini dkk .  2000  dalam  Ma dkk.
2008).Penelitian ini bertujuan efektivitas campuran protokxin B. thuringiensis dan Be.bassiana terhadap ulat grayak Spodopteral litura F.

## II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Grayak ( Spodoptera litura )
Grayak  teramasuk  dalam  ordo  Lepidoptera,  famili  Noctuidae.  Sayap ngengat  bagian  depan  berwarna  coklat  atau  keperakan,  dan  sayap  belakang berwarna  keputihan  dengan  bercak  hitam.  Telur  berbentuk  hampir  bulat  dengan bagian  dasar  melekat  pada  daun,  berwarna  coklat  kekuningan,  diletakkan berkelompok masing-masing 25-500 butir.Telur diletakkan pada bagian daun atau bagian  tanaman  lainnya.  Kelompok  telur  tertutup  bulu  seperti  beludru  yang berasal  dari  bulu-bulu  tubuh  bagian  ujung  ngengat  betina,  berwarna  kuning kecoklatan.  Larva  mempunyai  warna  yang  bervariasi,  memiliki  kalung  berwana hitam  pada  segmen  abdomen  keempat  dan  kesepuluh.  Pada  sisi  lateral  dorsal terdapat  garis  kuning.  Ulat  yang  baru  menetas  berwarna  hijau  muda,  bagian  sisi coklat tua atau hitam kecoklatan dan hidup berkelompok (Marwoto dan suharson, 2008).
Ulat  grayak tersebar luas di  beberapa negara seperti Jepang, Cina, Mesir, India,  rilanka,  Filipina,  Thailand,  dan  Indonesia.  Daerah  penyebaran  hama  ini  di Indonesia  meliputi  Jawa  Barat,  Jawa  Timur,  Sulawesi  Selatan,  dan  Sumatera Selatan (Marwoto dkk . 2005). Kisaran tanaman inang ulat grayak sangat beragam meliputi cabai, kubis, padi, jagung, tomat, tebu, buncis, jeruk, tembakau, bawang merah,  terung,  kentang,  kacang-kacangan  (kedelai,  kacang  tanah),  kangkung, bayam,  pisang,  dan  tanaman  hias.  Hama  ini  juga  menyerang  berbagai  gulma seperti Limnocharis sp. Cleome sp., Clibadium sp., Passiflora foetida , Ageratum sp., dan Trema sp. (Marwoto dan Suharsono 2008).

## B. Bacillus thuringiensis
Bacillus  thuringiensis telah  dikenal  sebagai  agen  biokontrol  sejak  tahun 1950-an.  Bakteri  ini  tersebar  dihampir  seluruh  penjuru  dunia.  Perbedaan B. thuringiensis dengan spesies Bacillus lainnya yaitu produksi protein kristalin yang bersifat  toksik  pada  berbagai  invertebrata  khususnya  pada  serangga.  Protein  ini sering  disebut  δ  -  endotoksin  merupakan  protoksin  yang  jikalarut  dalam  usus serangga  akan  berubah  menjadi  polipeptida  yang  lebih  pendekdengan  berat molekul berkisar dari 25 sampai 140 kDa (Bobrowski dkk . 2002).
22 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 1, Januari 2014 , hlm. 19 – 30
Gen  protein  insektisida  ini  telah  diidentifikasi  dan  dibagi  menjadi  dua jenis, gen cry untuk kristal dan gen cyt untuk sitolitik (Hofte dan Whitely 1989). Lereclus dkk. (1993)  mengusulkan  suatu  sistem  tata  nama  dan  klasifikasi  δ  - endotoksin  berdasarkan  sifat  insektisidalnya  serta  hubungan  molekulernya menjadi  empat  kelas  utama  δ  -  endotoksin  (Cry  I,  II,  III  dan  IV)  serta  sitolisin (Cyt).  Secara  umum  protein-protein  tersebut  bersifat  toksik  pada  jenis  serangga tertentu.  Cry  I  toksik  terhadap  Lepidoptera,  Cry  II  toksik  terhadap  Lepidoptera dan  Diptera,  Cry  III  toksik  terhadap  Coleoptera,  Cry  IV  toksik  terhadap  Diptera dan Cyt sitolitik terhadap serangga. Secara morfologi, protein Cry dikelompokkan menjadi  lima  yaitu  bentuk  bipiramid  ditemukan  pada  protein  Cry  I,  kuboid ditemukan  pada  protein  Cry  II,  amorfus  komposit  pada  protein  Cry  IV  dan  Cyt dan bentuk batang ditemukan pada protein Cry III (Lopez dan Ibarra 1996).

## C. Cendawan Entomopatogen Beauveria bassiana
Secara taksonomi Beauveria bassiana termasuk dalam filum
Deuteromycota,  kelas  Hypomycetes,  ordo  Moniliales  dari  family  Clavicipitaceae (U.S  Environmental  Protection  Agency  2006).Cendawan  ini  mempunyai  kisaran inang  serangga  yang  sangat  luas  meliputi  ordo  Lepidoptera,  Coleoptera  dan Hemiptera.  Infeksi  cendawan  ini  ditemukan  pada  serangga-serangga  Diptera maupun  Hymenoptera  (Soetopo  dan  Indrayani  2007). Beauveria  bassiana dapat diisolasi  dari  bangkai  serangga  maupun  tanah  karena  tanah  merupakan  tempat terbaik untuk propagul infektif dan bertahan hidup dalam bentuk kondia atau hifa saprofit.  Cendawan  ini  akan  melakukan  dormansi  jika  kondisi  lingkungan  tidak menguntungkan dan aktif apabila mendapatkan inang yang cocok untuk diinfeksi (Dhuyo  dan  Naheed  2008).  Serangga  inangtama Be.  Bassiana antara  lain  kutu pengisap (aphid), kutu putih ( Whitefly ), belalang, hama pengisap, lalat, kumbang, ulat,  thrips,  tungau  dan  beberapa  spesies  uret.  Habitat  tanamannya  mulai  dari kedelai, sayur-sayuran, kapas, jeruk, buah-buahan, tanaman hias, hingga tanaman hutan (Soetopo dan Indrayani 2007).
Bebassiana memproduksi toksin beauvericin yang menyebabkan gangguan pada  fungsi  hemolimfa  dan  nukleus  serangga.  Spesies Be.  Bassiana juga  dapat menginfeksi  serangga  melalui  inokulasi  atau  kontaminasi  pangan  (Soetopo  dan Indrayani  2007).Konidia  yang  telah  berkecambah  membentuk  tabung  kecambah dengan  mengambil  makanan  dari  integumen  serangga,  setelah  itu  menembus integument dan masuk ke dalam hemosel. Cendawan membentuk tubuh hifa yang kemudian  ikut  beredar  dalam  hemolimpfa  dan  membentuk  hifa  sekunder  untuk menerang  jaringan  lain  seperti  jaringan  lemak,  sistem  syaraf,  trakea  dan  saluran pencernaan.  Konidia  berkembang  dalam  saluran  penceranaan  dalam  waktu  72
Eka Sukmawati , Efektivitas Campuran Protoksin Bacillus Thuringiensis Subsp. Aizawai …_ 23
jam,  setelah  itu  hifa  melakukan  penetrasi  pada  dinding  usus  sekitar  60-72  jam. Kerusakan  saluran  pencernaan  terjadi  dengan  hancurnya  pencernaan,  kemudian masuk  ke  hemosel  dan  engubah  pH  hemolimfa,  setelah  itu  serangga  akan kehabisan nutrisi dan mati (Tanada dan Kaya 1993).

## III. METODOLOGI
1. Penentuan  Kurva  Tumbuh  dan  Produksi  Kristal  Protoksin B. thuringiensis
Isolat B.  thuringiensis diinkubasi  pada  250  ml  medium  pertumbuhan B. Thuringiensis (Atlas 1997) pada suhu 37 °C dengan kecepatan 120 rpm. Setiap 4 jam  dilakukan  pengambilan  kultur  sebanyak  10  ml  untuk  dilakukan  pengukuran absorbansi sel pada panjang gelombang 600 nm yang berlangsung sampai 48 jam.
2. Pewarnaan Morfologi Kristal (Fadel dkk . 1988)
Biakan  bakteri  dibuat  preparat  dengan  cara  mengoleskan  satu  ose  biakan pada objek gelas dan diwarnai dengan larutan Commasie Briliant Blue selama tiga menit,  kemudian  dibilas  dengan  air  mengalir,  dan  diamati  dibawah  mikroskop cahaya dengan minyak emersi tanpa gelas penutup.
3. Produksi Protoksin Bacillus thuringiensis (Ma dkk. 2008)
Koloni B.  thuringiensis diinokulasi  ke  dalam  media  pertumbuhan  dan diinkubasi  pada  suhu  28  °C  selama  waktu  optimum  pembentukan  protoksin kemudian  disentrifugasi  dengan  kecepatan  8000  g  4  0C  selama  10  menit. Supernatan  dibuang  dan  pelet  dicuci  empat  kali  dengan  akuades  steril.  Pelet disimpan  dalam  bufer  alkalin  (bufer  Glisin  -  NaOH,  pH  10,5)  pada  suhu  28  °C selama  1  jam  sampai  protein  kristal  terlarut  kemudian  disentrifugasi  8000  g selama  15  menit.  Supernatan  dikumpulkan  dan  pH  diatur  menjadi  5-6  dengan penambahan  1  M  HCl  dan  disimpan  selama  semalam  pada  suhu  4  °C  untuk mengendapkan  protoksin.  Protoksin  yang  telah  mengendap  kemudian dikumpulkan  dengan  sentrifugasi  dan  dicuci  tiga  kali  dengan  akuades.  Protoksin yang dipakai untuk pengujian diproduksi pada jam ke-24 dan-48. Kadar protoksin diukur dengan metode Bradford dan menggunakan bovine serum albumin sebagai standar (Bobrowski dkk . 2002).
4. Penyiapan Isolat Be. bassiana
Cendawan Be.  bassiana ditumbuhkan  pada  media Potato  Dextrose Agar (PDA)  yang  mengandung  kloramfenikol  dengan  konsentrasi  250  mg  dalam 500 ml media dan diinkubasi selama 14 hari pada suhu ruang untuk bersporulasi.
24 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 1, Januari 2014 , hlm. 19 – 30

## 5. Media Kultur Beras
Media  kultur  beras  (MKB)  disiapkan  dengan  cara  merendam  beras  yang telah dicuci selama 6 jam, ditiriskan kemudian dimasukkan dalam kantong plastic dan  ditutup  dengan  sumbat  kapas.  Selanjutnya,  MKB  disterilisasi  selama  15 menit.

## 6. Produksi Konidia Be. bassiana
Inokulum  cendawan  ditambahkan  ke  dalam  MKB  yang  telah disiapkan.  Selanjutnya  MKB  diinkubasi  selama  14  hari  pada  suhu  ruang  untuk memproduksi  konidia.  Inokulum  diperiksa  setiap  dua  hari  sekali  sambil  diaduk- aduk  dengan  menggoyang-goyangkannya.  Suspensi  konidia  dibuat  dengan mengambil  konidia  dari  permukaan  media  dengan  cara  digoyang  dengan  pelan dalam larutan Tween 80 0,2% dalam akuades steril dan dihomogenkan. Suspensi konidia dibuat berseri 10 7 dan 10 8 konidia ml -1 (Hasyim dkk . 2005).
7. Pengujian Protoksin B. thuringiensis terhadap Konida Be. bassiana .
Pengujian  protoksin  terhadap  konidia  dilakukan  dengan  dengan mencampurkan  1  ml  protoksin  kedalam  20  ml  PDA  yang  mengandung kloramfenikol  dengan  konsentrasi  250  mg  dalam  500  ml  PDA.  Kemudian sebanyak  1  ml  suspensi  cendawan Be.  Bassiana diinokulasikan  di  atas  media tersebut. Perhitungan jumlah koloni dan konidia yang dihasilkan dilakukan setelah 15 hari perlakuan.
8. Uji Antagonis B. thuringiensis dan Protoksin terhadap Be. bassiana Uji antagonis B. thuringiensis terhadap Be. Bassiana dilakukan dengan uji antagonis  koloni B.  thuringiensis terhadap  koloni Be.  Bassiana .  Uji  protoksin dengan metode difusi cakram  kertas terhadap koloni Be. bassiana . Uji  antagonis koloni tunggal dilakukan dengan menggoreskan isolat B.thuringiensis pada cawan yang  berisi  media  PDA.  Kemudian  inokulum Be.bassiana diinokulasikan disamping  goresan  isolat B.  thuringiensis dengan  jarak  1cm.  Pengamatan antagonisme  dilakukan  setelah  masa  inkubasi  2  minggu.Uji  difusi  cakram  kertas dilakukan  dengan  meneteskan  protoksin  sebanyak  0,1  ml  pada  kertas  cakram kosong  dan  ditunggu  sampai  kering.  Kemudian  kertas  cakram  diletakkan  diatas media  PDA  yang  telah  diinokulasikan  0,1  ml  konidia Be.bassiana .  Pengamatan dilakukan setelah 2 minggu masa inkubasi.
9. Pengujian Efektivitas Insektisida
Insektisida  kombinasi B.  thuringiensis dan B e .  Bassiana dibuat  dengan perbandingan  yang  sama,  yaitu  50  ml  protoksin  dicampurkan  dengan  50ml suspensi Be.  bassiana .  Setiap  insektisida  disemprotkan  sebanyak  5  kalisemprot
Eka Sukmawati , Efektivitas Campuran Protoksin Bacillus Thuringiensis Subsp. Aizawai …_ 25
untuk  setiap  larva.  Perlakuan  dibagi  menjadi  7  kelompok.  Masing-masing kelompok  terdiri  atas  3  wadah  berisi  10  larva.  Kelompok  pertama  disemprotkan dengan protoksin B.thuringiensis . Kelompok kedua disemprotkan dengan konidia B.  bassiana .  Kelompok  ketiga  disemprotkan  dengan  campuran  insektisida protoksin B.Thuringiensis yang  diproduksi  pada  jam  24  dan  konidia Be. bassiana 107.  Kelompok  keempat  disemprotkan  dengan  campuran  insektisida protoksin B.Thuringiensis yang diproduksi pada jam 48 dan konidia Be. Bassiana 107,  Kelompok  kelima  disemprotkan  dengan  campuran  insektisida  protoksin B.Thuringiensis yang  diproduksi  pada  jam  24  dan  konidia Be.  Bassiana 108, Kelompok  keenam  disemprotkan  dengan  campuran  insektisida  protoksin B.Thuringiensis yang  diproduksi  pada  jam  48  dan  konidia Be.  Bassiana 108, kelompok  ketujuh  sebagai  kontrol  dan  disemprot  dengan  akuades.  Efektivitas kedua  bioinsektisida  tersebut  dilihat  dari  waktu  yang  diperlukan  untuk menyebabkan  moralitas  serta  banyaknya  mortalitas  yang  ditimbulkan  pada  larva grayak.

## IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
1. Pertumbuhan dan Produksi Protoksin B. thuringiensis subsp. aizawai.
Ciri-ciri morfologi Bacillus thuringiensis subsp. a izawai berdasarkan hasil pengamatan  mikroskop  yaitu  berbentuk  basil  dengan  panjang  sekitar  5  μm, membentuk  endospora  yang  terletak  subterminal,  kristal  protein  terletak berdampingan dengan endospora dan berukuran lebih kecil dari endospora.
Gambar 1.Sel B. thuringiensis subsp. aizawai . (a) Pengamatan dengan pewarnaan kristal,
(b) pengamatan dengan mikroskop fase kontras dengan perbesaran 1000 x. Keterangan:
(1) endospora yang terlepas, (2)endospora dalam sel, dan (3) kristal protein.
26 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 1, Januari 2014 , hlm. 19 – 30
Kurva  pertumbuhan B.  thuringiensis dengan  mengunakan  medium selektifmemperlihatkan fase logaritmik mulai pada umur kultur 4 jam sampai jam 12 jamdengan jumlah sel  yang meningkat terus menerus. Memasuki umur  kultur 16 jamsampai 32 jam kurva pertumbuhan menunjukkan fase stasioner selanjutnya padaumur  kultur  36  jam  jumlah  sel  cenderung  menurun  hingga  umur  kultur  48 jam  pengamatan.  Pembentukan  protein  protoksin  memperlihatkan  peningkatan pada umur kultur 48 jam pengamatan sebesar 1,05 mg/ml.

## 2. Produksi Konidia Be. bassiana
Produksi  konidia Be.  Bassiana dilakukan  pada  media  beras  yang  telah disterilisasi  setelah  ditumbuhkan  pada  media  PDA  selama  dua  minggu.  Hasil produksi  konidia  yang  didapatkan  setelah  masa  inkubasi  selama  dua  minggu dengan berat media 180 g yaitu 3,6 x 10 8 konidia/ml.
3. Pengujian Protoksin B. thuringiensis terhadap Konida Be. Bassiana
Hasil  uji  protoksin  terhadap  konidia Be . Bassiana menunjukkan  bahwa protoksin  menghambat  pertumbuhan  konidia Be.  bassiana. Koloni  yang  tumbuh pada medium  yang mengandung protoksin  yang  diproduksi  pada umur kultur 24 jam  lebih  sedikit  dibandingkan  dengan  koloni  yang  tumbuh  pada  pada  medium yang  mengandung  protoksin  yang  diproduksi  pada  umur  kultur  48  jam.  Dari konidia  yang  dihasilkan  terlihat  bahwa  protoksin  tidak  berpengaruh  pada  spora yang diproduksi, tetapi ada kecenderungan jumlah spora Be. Bassiana meningkat dengan protoksin yang dipakai pada umur kultur 48 jam.
Tabel 1. Pengaruh protoksin B. thuringiensis yang diproduksi pada umur kultur 24 jam dan umur kultur 48 jam terhadap konidia Be. bassiana
4. Uji Antagonis B. thuringiensis dan Protoksin terhadap Be. Bassiana
Hasil  uji  antagonis  koloni B.  thuringiensis terhadap  koloni Be.  Bassiana menunjukkan  bahwa  miselium Be.  Bassiana dapat  tumbuh  menutupi  koloni bakteri B. thuringiensis setelah masa inkubasi selama 2 minggu. Hal yang berbeda ditunjukkan  pada  uji  cakram  kertas  yang  menunjukkan  bahwa  protoksin B.
Produksi protoksin B. thuringiensis jam ke
Jumlah koloni Be. bassiana
(koloni/ml) Jumlah spora Be. bassiana (spora/ml) 24 9 2,4 x 10 7 48 21 4,5 x 10 7 Kontrol Negatif 45 3,2 x 10 7
Eka Sukmawati , Efektivitas Campuran Protoksin Bacillus Thuringiensis Subsp. Aizawai …_ 27
thuringiensis mengurangi  jumlah  konidia Be.  Bassiana yang  tumbuh dibandingkan dengan kontrol.
5. Pengujian  Campuran  Protoksin B.  thuringiensis dan  konidia Be. bassiana
Hasil  uji  pengujian  daya  insektisida  kombinasi  keduanya B.  thuringiensis dan  konidia Be.  Bassiana menunjukkan  bahwa  campuran  protoksin  dan  konidia menyebabkan kematian pada larva S. litura instar 3 . Aplikasi campuran protoksin dan  konidia  pada  pakan  setelah  24  jam  menunjukkan  terjadinya  penurunan aktivitas makan dan bergerak. Pada perlakuan Bt 24 + Bb 10 7 dan Bt 48 + Bb 10 7 belum  memperlihatkan  terjadinya  kematian  pada  hari  pertama  dan  hari  ke-2, sementara  pada  perlakuan  Bt  24  +  Bb  10 8 dan  Bt  48  +  Bb  10 8 kematian  sudah mulai  terjadi  pada  hari  ke-2.  Kematian  total  yang  diamati  pada  hari  ke-7  yang disebabkan  perlakuan  Bt  24  +  Bb  10 7 sebesar  76,7%,  perlakuan  Bt  48  +  Bb  10 7 menyebabkan  kematian  total  sebesar  80%,  perlakuan  Bt  24  +  Bb  10 8 menyebabkan  kematian  total  sebesar  86,7%,  dan  perlakuan  Bt  48  +  Bb  10 8 menyebabkan  kematian  ulat  grayak  paling  banyak  dibandingkan  dengan perlakuan yang lain sebesar 96,7%.

## B. Pembahasan
Bacillus  thuringiensis subsp. aizawai yang  ditumbuhkan  pada  medium selektif  menunjukkan  jumlah  sel  tertinggi  mulai  umur  kultur  16  jam  dan  mulai turun pada umur kultur 36 jam. Waktu pertumbuhan ini berbeda dengan penelitian sebelumnya  yang  menjelaskan  bahwa  jumlah  sel  tertinggi  mulai  setelah  3  hari masa  inkubasi  dengan  menggunakan  media  NB  (Wiwat dkk. 2000).  Perbedaan waktu  stasioner  dan  waktu  pembentukan  endospora B.  thuringiensis diakibatkan pada  perbedaan  nutrisi  pada  media  yang  digunakan.  Media  yang  digunakan mengandung  garam-garam  organik  yang  diperlukan  untuk  menstimulasi pertumbuhan dan pembentukan endospora B. thuringiensis . Nutrisi minimal yang diperlukan  untuk  pertumbuhan B.  thuringiensis diantaranya  garam-garam  dasar (KH2PO4,  (NH4)2HPO4,  MgSO4,  CaCl2,  MnSO4,  FeSO4,  dan  ammonium molibdata)  (Rivera  1999).  Menurut  Yussof dkk (2003)  penambahan  (NH4)2SO4 sebagai  sumber  nitrogen  anorganik  pada  medium  mampu  meningkatkan persentase  pembentukan  spora B . thuringiensis subsp. aizawai. Keberadaan  ion amonium NH4  dan beberapa ion sulfat SO4 ke dalam medium dilaporkan dapat menstimulasi  pembentukan  endospora.  Medium  yang  mengandung  ammonium sulfat  juga  dilaporkan  meningkatkan  produksi  biomassa  dan  endoprotoksin dibandingkan dengan sumber nitrogen lainnya seperti pepton (Zuoari dkk. 1990).
28 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 1, Januari 2014 , hlm. 19 – 30
Pengamatan  mikroskop  dengan  mikroskop  fase  kontras  dan  pewarna Commasie  Briliant  Blue pada  umur  kultur  24  jam  menunjukkan  terbentuknya kristal  protein.  Berdasarkan  kurva  tumbuh  yang  diperoleh  waktu  ini  masih merupakan  fase  stasioner  dari  pertumbuhan B.  thuringiensis .  Pada  pengamatan inikristal  protein  hanya  terlihat  sebagai  bulatan  dengan  ukuran  yang  lebih  kecil dibandingkan  dengan  ukuran  endospora B.  thuringiensis dan  tidak  bisa  terlihat bentuk morfologinya.
Pengukuran protoksin memperlihatkan peningkatan konsentrasi pada umur kultur  48  jam  yang  diperoleh  dari  pengukuran  absorbansi  protein.  Peningkatan terus  menerus  ini  diasumsikan  akibat  protein  lain  selain  protein  Cry  yang disekresikan  oleh Bacillus  thuringiensis juga  ikut  terukur  pada  panjang gelombang  595  nm  dengan  menggunakan  reagen Commasie  Briliant  Blue G-250 (Bradford  1976).  Namun  pada  jam  ke-32  terlihat  produksi  protoksin  menurun. Halini  mungkin  disebabkan  karena B.  thuringiensis juga  memproduksi enzimprotease alkalin.Vu dkk. (2009) menyebutkan bahwa Bacillus thuringiensis memproduksi protease alkalin dan produksi protease tersebut meningkat setalah24 jam.  Produksi  protease  alkalin  pada  jam  tersebut  kemungkinan  menyebabkan protoksin yang dihasilkan menjadi terdegradasi.
Uji  protoksin  terhadap  konidia Be.  Bassiana menunjukkan  bahwa protoksin  berpengaruh  pada  jumlah  koloni  konidia Be.  Bassiana yang  tumbuh pada media  yang mengandung protoksin B. thuringiensis, namun  protoksin tidak berpengaruh  pada  jumlah  konidia  yang  diproduksi  dari  koloni  yang  tumbuh tersebut.  Hasil  ini  dikuatkan  dengan  hasil  yang  diperoleh  dari  metode  cakram kertas.  Pertumbuhan  koloni Be.  Bassiana tidak  dapat  menutupi  cawan  setelah masa inkubasi 15 hari. Tidak adanya pengaruh protoksin terhadap jumlah konidia diakibatkan  protoksin  yang  ada  telah  ternetralisir  sehingga Be.  Bassiana masih dapat menghasilkan konidia yang baik seperti pada kontrol.
Uji antagonis sel B. thuringiensis dengan koloni Be.bassiana menujukkan koloni Be.  Bassiana mampu  melewati  koloni  dan  menghambat  pertumbuhan B. thuringiensis .  Kemampuan Be.  Bassiana dalam  menghambat  pertumbuhan B. thuringiensis karena Be.  Bassiana menghasilkan  senyawa  metabolit  sekunder yang  bersifat  antimikrob  seperti  beauverisin  dan  bassianolida.  Beauverisin  telah dilaporkan  mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri  Gram  positif  dan  Gram negatif di antaranya Bacillus spp , Staphylococcus haemolyticus , Escherichia coli , dan Mycobacterium tuberculosis (Wang dan Xu2012).
Ulat  yang  matiakibat  perkaluan  Perlakuan  campuran  protoksin B. thuringiensis dan  konidia Be.  Bassiana menunjukkan  gejala  berwarna  coklat
Eka Sukmawati , Efektivitas Campuran Protoksin Bacillus Thuringiensis Subsp. Aizawai …_ 29
akibat  kerja  dari  beauverisin  tapi  tidak  mengeras  seperti  pada  perlakuan  konidia tunggal. Tubuh ulat mengkerut dan berwarna hitam di bagian tengah yang diduga akibat  kerja  protoksin Bacillusthuringiensis yang  menyebabkan  lisis  pada  usus serangga serangga. Ma dkk. (2008) yang menyebutkan bahwa antara toksin Cry Ac dan Be.  Bassiana bekerja  secara  antagonis  atau  aditif.  Interaksi  aditif  dapat dijelaskan berdasarkan gejala perhari yang ditimbulkan terlihat bahwa gejala yang ditimbulkan  oleh  protoksin B.  thuringiensis konidia Be.  Bassiana tidak  muncul bersamaan.Hal  ini  diduga  karena  jalur  infeksi  keduanya  berbeda  dan  terpisah  di dalam tubuh larva. Konidia Be. Bassiana menginfeksi dari kutikula dan memasuki hemosel  dan  mengeluarkan  beberapa  senyawa  protoksin  seperti  beauverisin, bassianolide dan oosporein sedangkan toksin B. thuringiensis menginfeksi melalui pencernaan  dan  mengikat  pada  reseptror  glikoprotein  epitel  usus  serangga, mengganggu  membrane  sitoplasmik  dan  menyebabkan  lisis.  Penelitian  lainnya dilakukan oleh Costa dkk. (2008) bahwa antara Cry 1Ac dan Be. Bassiana bekerja secara sendiri-sendiri.

## DAFTAR RUJUKAN
Atlas  RM,  Parks  LC,  editor.  1997. Handbook  of  microbiological  media. Ed  ke-
2 . Florida: Crc press.
Bobrowski VL, Pasquali G, Bodanese-Zanettini MH, Pinto LM, Fiuza LM. 2002. Characterization  of  two Bacillus  thuringiensis isolate  from  South Braziland  their  toxicity  against Anticarsia  gemmitalis (Lepidoptera: Noctuidae). Biol Control 25:129-135.
Boncheva  R,  Dukiandjiev  S,  Minkov  I,  Ruud  A.  Naimov  S.  2006.  Activity of Bacillus  thuringiensis δ-endotoxin  againt  codling  moth  ( Cydis pomonella L) larvae. J Invert Pathol 92:84-87.
Bradford  MM.  1976.A  rapid  and  sensitive  method  for  the  quantification ofmicrogram  quantities  of  protein  utilizing  the  principle  of  protein dyebinding. Anal Biochem 72: 248–254.
Dhuyo  AR,  Naheed  MS.  2008.  Pathonegenity  of beauveria  bassiana (Deuteromycota:  Hypomycetes)  against  the  yellow  rice  stem  borer,
Sciicpophaga incertulas (Lepidoptera: Pyrilidae) under laboratorycondition. Pakist Entomol 30:37-42.
Hennie  J,  Puspita  F,  Hendra.  2003.  Kerentanan  larva Spodoptera  litura terhadap virus nuclear polyhedrosis. J Natur Indones 15:145-151.
30 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 1, Januari 2014 , hlm. 19 – 30
Hill  DS.  1993. Agricultural  insect  pests  of  the  tropics  and  their  control . :Cambridge : Cambridge University Press.
Lewis  LC.  Berry  EC.  Obrycki  JJ.  Bing  LA.  1996.  Aptness  of  insecticides (Bacillus  thuringiensis and  carbofuran)  with  endophytic Beauveria bassiana in  suppressing  larval  populations  of  European  corn  borer. Agric EcosystEnviron 57: 27–34.
Lopez MJ, Ibarra JE.1996. Characterization of novel strain of Bacillusthuringiensis . Appl Environ Microbiol 62:1306-1310.
Ma X , Liu X, Ning X, Zhang B, Han F, Xiu M, Tang YF. 2008. Effect of Bacillus thuringiensis toxin Cry1Ac and Beauveria bassiana on Asiaticcorn borrer (Lepidoptera: Crambidae). J Invert Pathol 9:123-128.
Marwoto,  Suharsono.  2008.  Strategi  dan  komponen  teknologi  pengendalian ulatgrayak  ( Spodoptera  litura  fabricus) pada  tanaman  kedelai. J  Lit Pertan 27:131-136.
Navon  A.  2003. Bacillus  thuringiensis insecticides  in  crop  protection  –  reality andprospect. Crop Protect 19:669-676.
Rao  GVR,  Wightman  JA,  Ranga  Rao  DV.  1993.  World  review  of  the naturalenemies  and  diseases  of Spodoptera  litura (F.)  (Lepidoptera: Noctuidae).
Schenepf  E et  al .  1998. Bacillus  thuringiensis and  its  pesticidal  cristal protein. Microbiol Mol Biol 62: 705-806.
Soetopo  D,  Indrayani  I.  2007.  Status  teknologi  dan  prospek Beauveria bassiana untuk  pengendalian  serangga  hama  tanaman  perkebunan  yang ramahlingkungan. Perpesktif 6:29-46.
Tanada  Y,  Kaya  HK.  1993 .  Insect  Pathology .  San  Diego:Academic  Press.Wang Q,  Xu  L.  2012.  Beauvericin  ,  a  bioactive  compound  produced  by fungy. Molecule 17:2367-2377.
Yussof  WM,  Mazmira  MM,  Mei  CC.  2003.  Effect  of  ammonium  sulphate  on thesporulation  of Bacillus  thuringiensis sbsp. aizawai SN2  (a  local isolate)during batch fermentation. J Teknol 39:53-60.
Zouari  N,  Dhouib  A,  Allouz  R,  Jaoua  S.  1990.  Nutritional  requirements  of  a strainof Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki and use of gruel hydrolysate forthe  formulation  of  a  new  medium  for  δ-endotoxin  production. ApplBiochem Biotech 69: 41-52.