## KONJUGASI ANHIDRAT KlORAMFENIKOL-PROTEIN (CAP-BSA DAN CAP-KLH) UNTUK PRODUKSI IgG DARI SERUM KELINCI
Musyirna Rahmah Nst 1) Tri Budhi Murdiati 2)
1)
Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Riau (STIFAR) 2)BALITVET BOGOR .

## Abstrak
Dalam  pengembangan  metoda  analisis  residu  antibiotik  pada  produk  pangan  hewani secara  immunokimia  telah  dilakukan  sintesis  imunogen  kloramfenikol  (CAP)  dengan  protein Bovine  Serum  Albumin (BSA)  dan Keyhole  Limpet  Hemocyanin (KLH)  dengan  metoda konjugasi mixed  anhidrad. Hasil  sintesis  digunakan  untuk  produksi  antibodi.Antigen  dan antibodi  yang  dihasilkan  dijadikan  prangkat  analisis  residu  antibiotik  dengan Competitive Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA kompetitif). Hasil penelitian menunjukkan bahwa metoda  konjugasi mixed  anhidrad pada  preparasi  imunogen  dengan  jumlah  CAP  yang terkonjugasi ke grup amino bebas dari molekul protein BSA (CAP-BSA) adalah 18 unit dan ke protein KLH (CAP-KLH) adalah 782 unit. Antibodi poliklonal CAP-BSA dan CAP-KLH  yang diproduksi  dengan  rata-rata  kandungan  IgG  CAP-BSA  2,07  mg/ml  dan  IgG  CAP-KLH  2,21 mg/ml.

## Kata kunci : CAP, imunogen, antibodi, metoda konjugasi mixed anhidrad
1. PENDAHULUAN
Residu antibiotika dalam produk peternakan  telah  ditemukan  dan  dilaporkan baik  di  Indonesia  maupun  di  negara  lain (Bahri et al, 1990., FAO, 1990., Komar et al, 1990.,  Salysbury et  al,  1990).  Kloramfenikol dilarang pemakaiannya pada ternak di banyak negara karena efek toksik yang ditimbulkannya  yaitu  aplastik  anemia  ketika kandungan kloramfenikol meningkat melebihi  25  µg/ml.  Pemakaian  antibiotika dalam bidang peternakan tidak dapat dihindarkan, karena antibiotika dalam bidang peternakan  tidak  hanya  digunakan  untuk pengobatan  tetapi  juga  untuk    pemacu pertumbuhan. Dalam usaha mencapai produksi  semaksimal  mungkin,  antibiotika telah digunakan secara tidak tepat baik dalam memilih  jenis  antibiotika  maupun  dosis  serta lama  pemakaiannya  (Sudarwanto,  1990., Murdiati dan Bahri, 1991). Tindakan tersebut telah memperluas peluang terdapatnya  residu antibiotika dalam produk peternakan.
Walupun  efek  residu  antibiotika  tidak  akan terlihat  langsung  akan  tetapi  konsumsi  yang dilakukan  secara  terus  menerus  dalam  dosis kecil akan membahayakan kesehatan manusia,  seperti  reaksi  allergi,  resistensi  dan keracunan (Schlatter, 1990).
Analisis residu antibiotik dapat dilakukan  secara  kimia,  mikrobiologi  dan immunokimia.  Analisis  residu  antibiotika dengan  metoda  immunokimia  makin  banyak mendapatkan  perhatian.  Umumnya  ELISA (Enzyme  Link  Immunosorbent  Assay)  yang dikembangkan  adalah  ELISA  kompetitif sedangkan teknik ELISA sandwich umumnya tidak  digunakan  untuk  molekul  kecil  karena faktor  halangan  sterik  (Haagsma  and  Water, 1992).  Dixon  dan  Deborah  pada  1992  telah melakukan  pengembangan  metoda  ELISA untuk  analisa  antibiotik  sulfonamida,  - laktam dan aminoglikosida. Kelebihan metoda  ELISA  adalah  spesifik,  sensitif, hemat, cepat dan mudah.
Hal  yang  perlu  diperhatikan  dalam pengembangan  metoda  ELISA  untuk  deteksi residu  antibiotika  ataupun  cemaran  kimia lainnya  adalah  bahwa  umumnya  residu antibiotik  merupakan  senyawa  dengan  berat molekul  kecil  yang  biasa  disebut  hapten. Hapten  bersifat  tidak  imunogen  artinya  tidak dapat  menstimulasi  terbentuknya  antibodi (Szurdoki et  al.,  1995).  Oleh  karena  itu, antibiotika harus dibuat menjadi immunogenik secara konjugasi dengan enyawa yang mempunyai berat molekul yang besar umumnya protein.
Oleh  karena  itu  dalam  penelitian  ini dilakukan sintesa immunogen yaitu kloramfenikol-protein  konjugat  yaitu  BSA dan  KLH  dengan  metoda konjugasi  mixed anhidrat dan  produksi  antibodi  poliklonal untuk deteksi kloramfenikol.

## 2. METODOLOGI  PENELITIAN
Sintesis  Imunogen  CAP-BSA  dan  CAP KLH dengan Metoda  Mixed anhhidrat
Immunogen (CAP-protein konjugat) disintesa  dari  kloramfenikol  dan  protein membentuk CAP-BSA dan CAP-KLH dengan metoda mixed anhidrad.
Kloramfenikol  suksinat  (CAP  suksinat) dilarutkan  sebanyak  15  gr  kedalam  1ml  tetra hidro  furan  (THF)  dan  diaduk.  Lalu ditambahkan  10  l  tributilamin,  6  l Isobutilkloroformat  secara  perlahan-lahan pada  suhu  4 o C sambil  terus  diaduk  secara cepat  selama  20  menit  (Larutan  A).  Larutan protein  pdisiapkan  dengan  cara    melarutkan 50  mg  protein  bovine  serum  albumin  (BSA) atau  keyhole  limpet  hemocyanin  (KLH) dalam  8,5  ml  THF.  Larutan  protein ditambahkan secara tetes demi letes ke dalam larutan  A  sambil  terus  diaduk  secara perlahan-lahan  hingga  larut  selama  1  jam. Campuran  ini  dibiarkan  selama  24  jam  lalu dimurnikan  dengan  cara  dialisa  pada  suhu
4 o C  selama  2-3  hari  dengan  menggunakan larutan PBS.

## Uji  Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi (KCKT)
Larutan  imunogen  dianalisa  kandungan CAP  yang  tersisa  dengan  menggunakan metoda  KCKT.  Larutan  standar  dan  larutan imunogen CAP dibuat dengan konsentrasi 10 ppm  dalam  metanol  40%.  KCKT  disiapkan dengan  mengatur  kecepatan  alir  fase  gerak (metanol 40 %) dan dikondisikan selama 15- 30  menit.  Sebanyak  20  µl  CAP  standar disuntikan kedalam injektor dengan menggunakan  penyuntik  hamilton  25µl, kemudian ditunggu hingga puncak CAP yang terdeteksi  muncul  seluruhnya  pada  detektor. Ulangi penyuntikan 2-3 kali untuk mendapatkan  waktu  retensi  yang  stabil.  Lalu 20  µl  larutan  imunogen  disuntikan  ke  dalam injektor. CAP yang terdeteksi diamati dengan membandingkan  waktu  retensi  puncak  yang terdapat  dalam  larutan  imunogen    dengan standar.

## Penentuan Grup Amino Bebas dari CAP - Protein dengan Metode Habeeb
Sebanyak  1ml  larutan  konjugat  CAP- Protein  (CAP-BSA,  CAP-KLH)  dengan konsentrasi  0,6  mg/ml  dalam  bufer  sodium asetat  10mM,  pH  4,5  ditambahkan  ke  dalam 1ml sodium hidrogen karbonat 4% (W/V) pH 9,  1ml  PSA  0,1%  diaduk hingga  homogen lalu diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 o C. Setelah  itu  ditambahkan  1ml  SDS  (hati-hati jangan  sampai  terbentuk  endapan)  dan  0,5ml HCl 1M dan diaduk hingga rata.  Absorbansi dibaca  pada  panjang  gelombang  340  nm. Larutan blanko dan standar disiapkan dengan tahapan  yang  sama  seperti  diatas.  Blanko hanya  mengandung    sodium  asetat  10mM sedangkan    standar  protein  adalah  BSA  dan KLH  (0,6  mg/ml  dalam  bufer  sodium  asetat 10mM).

## Produksi Antibodi
Hewan percobaan yang digunakan untuk produksi  antibodi adalah  dua  ekor  kelinci New Zealand White yang diperoleh dari balai penelitian  peternakan.  Antibodi  diproduksi dengan  cara  mengimunisasi  kelinci  dengan immunogen.  Kelinci  disuntik  dengan  larutan konjugat CAP-KLH (0,67 mg/ml) atau CAP- BSA  (1mg/ml)  sebanyakl  0,25-1ml  secara subkutan.  Pengambilan  contoh  darah  untuk pengujian  titer  antibodi  dilakukan  10  hari setelah boster pada intravena telinga sebanyak  ±50  ml.  Darah  disentrifus  pada 3000 rpm selama 15 menit. Serum dikeluarkan dengan pipet pastur lalu disimpan pada suhu -20 o C. Purifikasi antibodi dilakukan dengan metoda kromatografi kolom  protein  A  sepharose  dan  konsentrasi antibodi  (IgG)  ditentukan  dengan  metoda spektrofotometri  pada  panjang  gelombang 280 nm.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Keberhasilan  sintesa  immunogen  dalam penelitian  ini  dapat  diketahui  dari  jumlah grup amino bebas pada molekul kloramfenikol-protein.  Hasil  penentuan  grup amino  bebas  dari  konjugat  CAP-BSA  dan CAP-KLH dengan Metoda Habeeb diperoleh untuk  CAP-BSA  sebanyak  41  unit  grup amino bebas dan untuk CAP-KLH  sebanyak 1218  unit.  Data  ini  menunjukkan  bahwa sebanyak  18  unit  molekul  CAP  yang terkonjugasi  pada  1molekul  BSA  yang mempunyai  grup  amino  bebas  sebanyak  59 unit. Sedangkan jumlah CAP yang terkonjugasi  pada  1  molekul  KLH  yang mempunyai  2000  grup  amino  bebas  adalah sebanyak  782  unit.  Pada  Tabel  1  disajikan hasil  analisa  Metoda  Habeeb  dan  pada Lampiran  2  dapat  dilihat  contoh  perhitungan analisa data Metoda Habeeb.
Tabel 1. Hasil analisa Metoda Habeeb terhadap konjugasi CAP-BSA dan CAP-
KLH N o Immunoge n BM Jumlah Group Amino Bebas Jumlah hapten yang terkonjugas i ke protein 1 BSA 68.000 59 2 CAP-BSA 41 18 3 KLH 4,5 10exp5 2000 4 CAP-KLH 1218 782
Sejumlah  besar  molekul  hapten  yang terkonjugasi  pada  molekul  protein  belum tentu  akan  bertindak  sebagai  immunogen yang  baik  dalam  produksi  antibodi.  Antibodi dapat  juga  diproduksi  dengan  menggunakan immunogen  yang  hanya  mengandung  dua molekul  hapten  per  mol  protein.  Menurut Chu (1990), jumlah hapten  yang terikat pada protein  yang  diharapkan  akan  menghasilkan respon  imun  yang  baik  umumnya  antara  10- 20 mol per mol protein.
Prinsip reaksi Metoda Habeeb
merupakan  reaksi  Kalorimeteri  yaitu  reaksi antara  molekul  PSA  dengan  group  amino bebas dari protein sehingga akan memberikan warna  kuning  dan  diukur  pada  panjang gelombang  340  nm.  Semakin  sedikit  CAP yang  terkonjugasi  ke  molekul  protein  (BSA dan  KLH)  maka  group  amino  bebas  dari protein  yang  bereaksi  dengan  PSA  akan semakin banyak sehingga absorbansi semakin besar  (lihat  gambar  1a).  Begitu  juga sebaliknya  pada  gambar  2b  menunjukkan semakin  banyak  CAP  terkonjugasi  ke molekul protein maka group amino bebas dari protein  yang  bereaksi  dengan  PSA  akan semakin  sedikit  sehingga  absorbansi  yang dihasilkan pun semakin kecil.
P r o te i n N -C = O N -C = O N -C = O 2 H N P r o te in N -C = O N -C = O N -C = O PS A-- N +  PSA Pr o te in N -C = O 2 HN N H 2 2 H N +  PSA P ro t ei n N -C = O PSA- - N P SA- -N N -- PS A ( a) ( b)
Gambar 1. Prinsip Reaki Metoda Habeeb
Faktor  yang  penting  dalam  menentukan efektivitas  reaksi  konjugasi  pada  sintesa imunogen  adalah  posisi  ikatan  dan  gugus aktif  yang  dimiliki  molekul  hapten  yang terkonjugasi  ke  molekul  protein.  Molekul anhidrida  dibentuk  dari  asam  karboksilat
(kloramfenikol  natrium  suksinat)  dengan molekul klorida asam seperi isobutil kloroformat.  Pada  gambar  2  dan  3  dapat diketahui  mekanisme  sintesa  CAP-suksinat dan mekanisme reaksi konjugasi
kloramfenikol terhadap protein.
O 2 N OH NH O CL OH O O HO Na+-O Na-Suksi nat Kloramf enikol H + O H CL O NH OH O 2 N Na+-O HO O + O 2 N NH O CL O H O O O -Na+ O O O O O H CL O NH O 2 N OH HCl C AP-Suksi nat (C AP)
Gambar 2. Mekanisme Sintesa CAP-suksinat
P N H O H 2 N O O O O O O H C L O N H O 2 N G a ra m A s i l A m o n i u m O N + - R 3 C L O O O O H C L O N H O 2 N O H C A P -S u k s i n a t C A P - K o n ju g a t P r o te i n O 2 N N H O C L O H O O O N H O P N H P r o te i n : B S A /K L H A n h i d ri d a Ik a ta n A m i d a

## Gambar 3. Mekanisme Reaksi Sintesa Kloramfenikol Protein Konjugat
Pereaksi  tributil  amin  merupakan  suatu amina  tersier.  Pereaksi  ini  tidak  dapat membentuk amida dengan klorida asam akan tetapi  membentuk  molekul  antara  reaktif yaitu  “garam  asil  amonium”  yang  bersifat tidak  stabil.  Molekul  ini  tidak  mengganggu pembentukan  amida  antara  klorida  asam dengan  NH 2 ,  RNH 2 ,  R 2 NH  atau  molekul protein. Konjugasi hapten-protein pada metoda mixed anhidrad, ikatan peptida terjadi
pada  gugus  amin  terminal  residu  lysine  atau pada  gugus  karboksil  (asam  glutamat  dan asam  aspartat    pada  sisi  protein)  juga  pada terminal  residu  sistein  yaitu  grup  sulfuhidril (-SH) bebas (Tijsen,1990)
Hasil  analisa  metoda  KCKT  dari  10 ppm  larutan  immunogen  (CAP-BSA  dan CAP-KLH)  diketahui  bahwa  kedua  larutan immunogen  tidak  mengandung  CAP  bebas karena puncak CAP tidak terlihat pada menit
ke  9,2.  Tinggi  puncak  CAP  standar  pada konsentrasi  10  ppm  adalah  22  mm  dengan waktu  retensi  9,2  menit.  Pada  Lampiran  3 disajikan  kromatogram  KCKT  larutan  CAP- BSA  dan  CAP-KLH.  Analisa  ini  dilakukan untuk memastikan bahwa  molekul CAP telah terpisah  dari  larutan  imunogen  setelah dilakukan  pemurnian  dengan  cara  Dialisa. Immunogen  ini  akan  digunakan  untuk penyuntikan  kelinci  dan    analisa  ELISA kompetitif.
Hasil uji kesesuaian sistem berdasarkan  penyuntikan    CAP  standar sebanyak  20  µl  pada  konsentrasi  10  ppm yang dilakukan Senta (2003) diperoleh waktu retensi  CAP  selama  11,6  menit.  KCKT merupakan salah satu metoda yang digunakan untuk  memisahkan  campuran  senyawa- senyawa kimia menjadi komponen- komponennya.  Pada  KCKT,  fase  gerak mengalir  ke  kolom  dengan  cara  dipompa. Larutan  contoh  disuntikan  melalui  katup penyuntik  akan  terbawa  oleh  fase  gerak  dan masuk  ke  dalam  kolom,  dan  dengan  fase gerak  akan  berjalan  melewati  detektor. Detektor  akan  mendeteksi  secara  terpisah senyawa-senyawa  yang  ada  alam  contoh  dan disajikan  oleh  rekorder  berupa  kurva  dan puncaknya.  Pemilihan  pelarut  pada  KCKT dapat  dilakukan  berdasarkan  sifat  kepolaran dari  contoh  dan  fase  gerak  yang  dipakai (CCM, 2002).
Imunogen  hasil  sintesis  disuntikan  ke kelinci New  Zealand  White secara  subkutan. Pengambilan  darah  untuk  pengujian  titer  dan penentuan  kandungan  IgG  dilakukan  10  hari setelah booster pada intravena teling sebanyak    50  ml.  Darah  yang  diperoleh kemudian di sentrifus  pada 3000 rpm selama 15  menit  sehingga  diperoleh  serum.    Serum kemudian  di  dialisis  dengan  buffer  phosfat dan  dipurifikasi  dengan  kromatografi  kolom protein  A  sepharose.  Kondisi  buffer  sangat mempengaruhi kesuksesan purifikasi antibodi
karena  kondisi  buffer  dapat  memperbaiki affinitas pengikatan kolom dan mempertahankan aktivitas pengikatan antibodi.  Antibodi  spesifik  diperoleh  dari hasil elusi kolom protein A sepharose dengan buffer sitrat dengan pH  4. pH fraksi  antibodi yang  diperoleh  harus  dijadikan  netral  untuk memaksimalkan  integritas  antibodi  (Burgess, 1995).  Antibodi  yang  telah  dipurifikasi kemudian  ditentukan  konsentrasi  antibodi secara spektrofotometri pada panjang gelombang 280 nm.
Pada tabel 2 disajikan data konsentrasi  IgG  dari  hasil  purifikasi  serum darah kelinci yang diukur dengan spektrofotometer  pada  panjang  gelombang 280  nm.  Kandungan  IgG  dalam  serum ditentukan  untuk  menghitung  konsentrasi pelapisan  antibodi  pada  lempeng  mikro  dan perhitungan konsentrasi penambahan antibodi pada saat pengujian ELISA. Metoda purifikasi bertujuan untuk memisahkan senyawa-senyawa  lipid  dan  protein-protein lainnya  sehingga  preparasi  IgG  akan  lebih murni 85%.

## Tabel 2. Data konsentrasi IgG dari hasil purifikasi serum darah kelinci
Pengambilan Darah Kandungan IgG mg/ml CAP – BSA CAP – KLH 2 2,75 2,63 3 2,65 2,82 4 1,28 2,77 5 1,56 2,82 6 2,11 5.36 Rata-rata 2,07 2,21
Faktor yang menentukan dalam produksi  antibodi    diantaranya  adalah  sifat imunogen,  adjuvan,  pemilihan  hewan,  rute injeksi,  dan  dosis.  Efekitivitas  imunogen dapat  ditingkatkan  dengan  adjuvan.  Adjuvan dapat memodifikasi imunogen dengan menyebabkan  perubahan  struktural  atau elektrostatik sehingga meningkatkan imunogenisitas.  Adjuvan  juga  bekerja  pada
tingkat  sel  dari  sistim  imun  inang  dengan membentuk depot imunogen sehingga memperlambat  pelepasannya  dari  lokasi inokulasi,  menarik  sel-sel  mononuklear  ke lokasi  inokulasi,  meningkatkan  sirkulasi limfosit  dan  merangsang  fagositosis  oleh makrofag.
Dalam penelitian ini digunakan adjuvan  freund  yaitu  terdiri  atas  campuran minyak mineral dan pengemulsi, baik dengan mikobakteria  (adjuvan  lengkap  freund:  FCA, Freund’s  Complete  Adjuvan)  ataupun  tanpa mikobakteria  (adjuvan  tak  lengkap  freund  : FIA,  Freund’s  Incomplete  adjuvant).  FCA masih  dianggap  sebagai  salah  satu  dari adjuvan  paling  kuat  (Dalsgaard,  1987).  FCA merangsang  respon  antibodi  yang  kuat  untuk waktu yang lama dengan jalan memperlambat pelepasan emulsi. Beberapa peneliti menganjurkan  bahwa  jika  dosis  pertama diberikan  dalam  FCA,  maka  boster  harus diberikan  dalam  FIA  untuk  menghindari reaksi  hipersensitivitas  yang  hebat  (Goding, 1986).
Menurut  Lelliot  dan  Stead  (1987), antibodi  dapat  diproduksi  dengan  baik  pada kelinci.  Hal  ini  didukung  oleh  pendapat  Ball et  all  (1990)  bahwa  kelinci paling  sering digunakan, karena hewan ini mudah diperlihara,  mudah  penanganannya  dan  juga tidak  mahal.  Selain  itu  Klement  (1990) mengemukakan bahwa kelinci dapat menghasilkan  antibodi  dengan  presipitasi yang  sangat  baik,  sangat  stabil  dalam penyimpananya, fraksi immunoglobulin mudah  dimurnikan,  aviditas  dan  affinitas tinggi untuk menguji antigen spesifiknya.
Teknik  injeksi  imunogen  ke  dalam tubuh  kelinci  yang  digunakan  adalah  secara subkutan. Teknik ini bertujuan untuk memperlambat  pelepasan  immunogen  ke dalam  aliran  darah  (Lelliot  dan  Stead  1987). Jalur secara subkutan adalah jalur yang paling sering digunakan oleh karena teknik ini lebih
mudah, dapat dilakukan dengan volume yang lebih  banyak  per  satu  tempat  injeksi. Kecepatan  absorbsi  tergantung  pada  aliran darah  pada  area  injeksi,  aktivitas  otot  dan kontak area (Bratawidjaja, 2002).
Antibodi yang diproduksi pada penelitian  ini  adalah  antibodi  poliklonal karena  serum  yang  dikumpulkan  dari  hewan yang diimunisasi mengandung antibodi terhadap antigen yang dipakai untuk imunisasi  tetapi  juga  antibodi  terhadap antigen  lingkungan  lainnya  yang  mungkin telah  masuk  ke  tubuh  hewan.  Antibodi  ini mempunyai  isotipe  yang  berbeda-beda  dan afinitas berbeda-beda. Sifat antibodi poliklonal  ini  kurang  spesifik  akan  tetapi dapat  mempertahankan  sensitivitasnya  serta relatif stabil.

## 4. KESIMPULAN
Metoda  konjugasi  andhidrad  dapat digunakan  pada  preparasi  immunogen,  dan jumlah  kloramfenikol  yang  terkonjugasi  ke asam amino bebas dari molekul protein untuk antigen  CAP-BSA  adalah  18,38  dan  untuk CAP-KLH adalah 781,82. Antibodi poliklonal  CAP-BSA  dan  CAP-KLH  yang diproduksi  dengan  rata-rata  kandungan  IgG CAP-BSA  2,07  mg/ml  dan  IgG  CAP-KLH 2,21 mg/ml.

## 5. SARAN
Antigen dan Antibodi hasil sintesa dapat digunakan sebagai prangkat analisa pengembangan  metoda  ELISA  kompetitif  pada pemeriksaan residu kloramfenikol.

## DAFTAR PUSTAKA
Bahri,  S.  Murdiati,  T.B.,  Maryam,  R  dan Yuningsih.  1990.  Senyawa  Golongan Tetrasiklin  pada  Susu  Sapi  Rakyat  di Beberapa Desa di Kabupaten
Pasuruan, Jawa Timur. Laporan Intern Balitvet.
Beyzari,  K.,  Hampton,  S.,  Kwasowski,P., Fickling,S. 1987. Comparison of hors- radish peroxidase and alkaline
phosphatase-labelled  antibodies  in enzyme-immunoasay.
J.
Immunoassay. 187-4.
Chu, F.S. 1990. Immunoassay; Principles and General  considerations.  Department of Food Microbiology and Toxicology University of Wisconsin, Madison.USA
Crowther,  J.R.  1995.  Methods  in  Molecular
Biology.  ELISA Theory and Practice.
Humana Press .42:34-99.
Dalsgaard,
K. 1987. Adjuvants.
Immunolpath.17:145-152.
Dixon-Holland  D,E  and  Deborah.  1992.
ELISA  and  its  Application  for Residue  Analysis  of  Antibiotics  and Drugs in Products of Animal origin.
FAO.  1990.  Residue  of  Some  Veterinary Drugs  in  Animals  and  Foods.  FAO, Food  and  Nutrition  paper  no  41/2.
Monograph  prepared  by  the  34 th meeting  on  the  joint  FAO/WHO expert  committee  on  food  additives.
Geneva.
Haagsma,  N.,  Water  der  Water,  C.  1992. Immunochemical  Methods  in  the
Analysis of Veterinary Drugs
Residues.Plenum Press. 81-93.
Klement,  Z.K.,  and  Rudolph,  D.C.  1990.
Methods in Phytobacteriology.
Academic Kiado. 518.
Komar,  M.,  Marinsch,  J.,  Marinsch,  J., Somogk-Gaemol,  K.,  Ivanic,S.  and Milohnoja,  M.  1990.  Survey  Of Sulphonamide  Residues  in  Urine
Smaples, Animal Tissues and Food of Animal  Origin  in  Solvenia  In  1986,
1987  and  1988.In  Residues  of Veterinary Drugs in Food. Proceedings of Euro Residue Conferce, Noordwijkerhout. The
Netherlands. 246-7.
Lelliot, R.  A and Stead,  D.E. 1987. Methods for Diagnosis of Bacterial Diseases of Plants.  Plant  Pathology .  Melbourne. 216
Murdiati,  T.B  and  Bahri,  S.  1991.  Pola Penggunaan
Antibiotika dalam Peternakan  Ayam  di  Jawa  Barat, Kemukinan Hubungan dengan
Masalah Residu. Proceedings Kongres ilmiah ke-8 ISFI, Jakarta. 445-8.
Seameo  Biotrop,  2002.  ELISA  Workshop:
Analysis  of  Aflatoxin  B1  in  Peanuts. Organised  by  University  of  Sydney. Bogor.
Salybury,  C.D.C.,  Chan,  W.,  Peterson,  J.R., Macneil,  J.D  and  Krenendonk,  C.A. 1990.  Case  Report:  An  Investigation of Chlortetracycline and Oxytetracycline  Residues  in  Suspect Swine  Slaughtered  in  Manitoba, Canada.  1988.  Food  Additive  and Contaminants. 7:363-373.
Schlatter,  C.  1990.  Toxicological  Assesment of  Xenobiotics  in  Foods  of  Animal Origin.  In  Residues  of  Veterinary Drugs  in  Food.  Proceedings  of  the
Euro Residue Conferece Noordwijkerhout,  The  Netherlands. 65-75.
Sudarwanto,  M.  1990.  Residu  Antibiotika  di dalam Air Susu Ditinjau dari
Kesehatan Masyarakat
Veteriner dalam  Kumpulan  Makalah  Seminar Nasional.  Penggunaan  Antibiotika
dalam  Bidang  Kedokteran  Hewan.
Jakarta.
Szurdoki,  F., Bekheit,  K.M.,  Marco,  M.P.,
Goodrow,  M.H  and  Hammock,  D. 1995.  Important  Factor  in  Hapten Design and Enzyme Linked
Immunosorbent  Assay  Development. In  New  Frontier  in  Agr  chem Immunoasssays. 39-64.