FUNGSI  SEL IMUN  INTERLEUKIN-4 (IL-4) PADA IKAN KERAPU TIKUS ( Cromileptes altivelis ) DENGAN INDUKSI   PROTEIN IMUNOGENIK Vibrio harveyi
The FUNCTION OF INTERLEUKIN-4 (IL-4) IMMUNE CELLS ON HUMPBACK GROUPER ( Cromileptes altivelis ) BY INDUCTION OF IMMUNOGENIC PROTEIN OF Vibrio harveyi
Uun Yanuhar, Asus Maizar SH dan Ita Fitria  S
Fakultas Perikanan Dan Ilmu Kelautan, Universitas Brawijaya  Malang Jl. Veteran Malang , 65144 Telp. 081931892262

## Abstract
Humpback grouper (Cromileptes altivelis) is a commodity to be cultivated because it has a high price, but the grouper highly susceptible to Vibriosis (Vibrio harveyi). The research objective was to see the  function  of  immune  cells  of  interleukin-4  (IL-4)  are  formed  due  to  the  induction  of  immunogenic proteins  of  Vibrio  harveyi.  Research  procedures  include  Vibrio  harveyi  immunogenic  protein  isolation, SDS-PAGE  electrophoresis,  elektroelusi  and  dialysis,  clinical  exam  of  Vibrio  harveyi  immunogenic proteins, and immunohistochemical to look at immune cells (cells IL-4) with using a secondary antibody labeling  of  anti  IL-4  biotin  conjugate.  The  results  showed  that  Vibrio  harveyi  protein  found  have immunogenic properties is 51.16 kDa. This protein is an adhesin protein. Protein 51.16 kDa was purified by  electroelution  and  the  protein  will  be  used  as  a  vaccine  administered  by  intraperitoneal  injection  in grouper (Cromileptes altivelis) at a dose of 31.6 ug protein / 150 g of fish weight. In organ tissues of the brain, eyes and kidneys of induced fish by immunohistochemical examination, It was detected  Immune cells (cells IL-4) using a secondary antibody labeling of anti IL-4 biotin conjugate. Tues formed IL-4 can be  seen  on  the  network  grouper  indicated  by  a  change  in  tissue  color  with  an  inverted  microscope examination  of  the  golden  brown  color  is  formed  on  the  IL-4  immune  cells.  It  show the  cross-reaction between 51.16 kDa immunogenic protein induced in fish with anti IL-4 biotin conjugate. The conclusions is  the  protein  of  Vibrio  harveyi  with  molecular  weight  of  51.16  kDa  is  an  immunogenic  protein  which able to induce formation of IL-4 in grouper.
Keywords : Cromileptes altivelis , Immunohistochemistry,  IL-4 cells, V. harveyi

## Pendahuluan
Ikan  kerapu  tersebar  luas  di  perairan pantai  baik di daerah tropis  maupun  sub tropis, dan  termasuk  jenis  ikan  yang  hidup  di  perairan berkarang  sehingga  sering  dikenal  sebagai  ikan karang  ( coral  reef    fish). Beberapa  jenis  ikan kerapu  yang  banyak  terdapat  di  Indonesia seperti  kerapu  bebek  atau  tikus  ( Cromileptes altivelis ), kerapu macan ( Epinephelus fuscoguttatus ),  kerapu  sunu  ( Plectropomus leopardus ), kerapu lumpur ( Epinephelus coioides ), kerapu malabar ( Epinephelus malabaricus ),  dan  kerapu  bintik  atau  batik ( Epinephelus  bleekeri ),  merupakan  komoditas andalan  untuk  dibudidayakan  karena  memiliki nilai jual yang tinggi (Aslianti, et al. , 2003). Vibrio merupakan patogen oportunistik yang  dalam  keadaan  normal  ada  dalam lingkungan pemeliharaan, kemudian
berkembang  dari  sifat  yang  saprofitik  menjadi patogenik jika kondisi lingkungannya memungkinkan.  Bakteri  vibrio  yang  patogen dapat hidup di bagian tubuh organisme lain baik di  luar  tubuh  dengan  jalan  menempel,  maupun
pada  organ  tubuh  bagian  dalam  seperti  hati, usus dan sebagainya (Feliatra, 1999). Salah satu spesies dari Vibrio yang menyebabkan Vibrio sis adalah bakteri Vibrio harveyi (Jun et al, 2003). Respon  yang  diakibatkan  oleh  bakteri Vibrio  harveyi khususnya  pada  ikan  kerapu tikus (Cromileptes  altivelis) perlu  dilakukan penelitian mengenai respon ekstraseluler protein reseptor  untuk  meningkatkan  sistem  kekebalan tubuh  ikan  yang  tahan  terhadap  penyakit. Respon  molekul  tubuh  dalam  mengeliminasi antigen  diantaranya  adalah  dengan  membentuk sel  imun  baik  interleukin  maupun  MHC  (Abas & Lichtman, 2005).
MHC ( Major Hstocompatibility
Complex )  merupakan  salah  satu  molekul  yang berperan  penting  dalam  sistem  pertahanan adaptif.  Ketika  antigen  dipresentasikan  oleh MHC,  antigen  akan  ditangkap  oleh  reseptor pada sel T helper (2), dan sel T helper (2) akan mensekresikan  sitokin  yaitu  IL-2,  4,  6  yang bertujuan  untuk  diferensiasi  dan  proliferasi  sel B,  diferensiasi  sel  B  akan  menghasilkan  sel plasma dan sel  memori. Selanjutnya sel plasma
akan  mensintesis  antibodi  yang  spesifik  yang akan  mengikat  antigen  sehingga  mencegah pergerakannya,  dan  memudahkan  fagositosis (Baratawidjaja, 1996).
Salah satu sitokin yang berperan dalam menstimulasi  proliferasi  dan  diferensiasi  sel  B adalah  interleukin  4  (IL-4).  Oleh  karena  itu, dalam penellitian ini akan dilakukan pengamatan  ekspresi  IL-4  pada  ikan  kerapu tikus  ( Cromileptes  altivelis )  yang  dipapar protein adesin Vibrio harveyi.

## Metodologi
Materi  penelitian  adalah  ikan  kerapu tikus ( Cromileptes altivelis ), protein imunogenik  bakteri Vibrio  harveyi 51,6  kDa dan sel interleukin-4.
Peralatan yang digunakan dalam penelitian  ini  meliputi pH  meter, refraktometer, temometer,  pembakar  bunsen,  pipet  tetes, beaker  glass,  erlenmeyer,  mortar,  laminary  air flow,  sectio  set,  masker,  gloves, eppendorf 1,5 ml, falcon 15  ml dan 50  ml, mikropipet 20 μl,
200 μl dan 1000 μl, blue tip , yellow tip , freezer - 80 0 C, aluminium  foil ,  kapas,  kertas  label, sentrifuge 4 0 C, refrigerator 4 0 C, spuit 1  cc, timbangan  analitik,  tabung  reaksi,  cawan  petri, magnetik  stirrer ,  sendok  erlenmeyer, chamber dot  blot ,  seperangkat elektroforesis (SDS- PAGE),  baki/nampan,  kotak  penyimpan  gel, kamera digital.
Bahan  yang  digunakan  adalah  ikan kerapu  tikus  ( Cromileptes  altivelis )  normal  dan ikan kerapu tikus  yang positif terinfeksi  bakteri Vibrio  Harveyi, buffer  ekstrak ,  PBS  ( Phospat Buffer  Saline ), alkaline  phospatase  subtrat (chromogen  NBT)  dan  aquadest, stacking  gel 5%  yang  meliputi  :  akrilamid  30%,  Tris  HCL 1.5  M  pH  6.8,  dH 2 O,  SDS  ( Sodium  Dodecyl Sulfate ) 10%, APS ( Ammonium Persulfat ) 10%, TEMED  ( tetra  ethylene  diamine ); separating gel 12,5%  dengan  komposisi  meliputi  : acrilamid 30%, Tris HCL 1.5 M pH 8.8, dH 2 O, SDS  ( Sodium  Dodecyl  Sulfate )  10%,  APS ( Ammonium  Persulfat )  10%,  TEMED  ( tetra ethylene  diamine );  RSB  ( Reducing  Sampel Buffer )  dengan  perbandingan  1:1  (RSB  : sampel); marker PRO-STAIN TM ; staining solution (commasie  blue)  dan destaining solution (metanol; asam asetat glasias; aquades), running buffer , es batu dan aquades.
Metode yang digunakan adalah metode eksplorasi laboratorium, dengan prosedur penelitian seperti berikut.
Aklimatisasi  Ikan  Kerapu  Tikus  ( Cromileptes altivelis ) Ikan  uji  yang  digunakan  yaitu  ikan kerapu  tikus  ( Cromileptes  altivelis )  yang didatangkan  dari  Balai  Pembenihan  Air  Payau (BPAP)  di  Situbondo.  Ikan  kerapu  tikus ( Cromileptes altivelis ) yang digunakan berukuran  antara  10-15  cm.  Benih  ikan  kerapu tikus  ( Cromileptes  altivelis )  yang  baru  datang tidak  langsung  diberikan  pakan,  karena  benih ikan  kerapu  tikus  ( Cromileptes  altivelis ) memerlukan adaptasi terhadap media
pemeliharaannya  yang  baru.  Adaptasi  ini dibutuhkan  selama  12  jam,  pakan  diberikan setelah  ikan  terlihat  sehat  dan  agresif.  Pakan yang  digunakan  berupa  ikan  kembung  segar yang  dicacah  kecil-kecil.  Pemberian  pakan dilakukan sebanyak dua kali per hari, yaitu pada jam  08.00  dan  15.00  WIB.  Selain  itu  setiap harinya dilakukan pengukuran parameter pendukung seperti suhu, salinitas dan pH untuk menjaga  agar  kondisi  lingkungan  Ikan  kerapu tikus  ( Cromileptes  altivelis )  tetap  normal. Adapun  pengukuran  parameter  pendukung kualitas  air  yang  secara  otomatis  terkontrol antara lain suhu,  Sali nitas dan pH.
Isolasi Bakteri Vibrio harveyi Isolasi Bakteri Vibrio harveyi didatangkan dari Jepara dan dilakukan perbanyakan kultur di laboratorium
mikrobiologi  Fak.  Kedokteran    Universitas Brawijaya. Bakteri dikultur pada medium TCBS dan  BHI  kemudian  dilakukan  penentuan konsentrasi  bakteri  dengan  spektrofotometer untuk pengujian lebih lanjut.
Isolasi Crude Protein Vibrio harveyi Crude  protein Vibrio  harveyi diisolasi dari kultur bakteri  dengan metode isolasi crude protein  untuk mendapatkan homogenat protein.
Homogenat    protein  yang  didapat selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 50.000 rpm  selama  1  jam  pada  suhu  4 0 C  dan dilanjutkan  dengan  150.000  rpm  selama  3  jam pada suhu 4 0 C dengan menggunakan Ultrahigh centrifuge  (Optima TM MAX-XP,  Beckman Coulter,  USA).  Crude  protein Vibrio  harveyi dan  ikan  normal  disimpan  dalam  deepfreezer  - 80 0 C hingga untuk pengujian selanjutnya. Pellet yang dihasilkan merupakan whole cell sedangkan  supernatan  adalah crude  protein bakteri Vibrio harveyi .
Elektroforesi Protein dengan SDS-Page
Untuk isolasi protein dilakukan metode elekroforesis menggunakan SDS-PAGE (Biorad).  Gel  terdiri  dari  dua  lapis  yaitu separating  gel (gel  sebagai  media  pemisah
protein)  dan stacking  gel (gel  pengumpul
sampel).  Dalam separating  gel komposisi  yang dipakai  acrilamide  30%,  Tris  HCL  1.5  M  pH 8.8, dH 2 O, SDS ( Sodium Dodecil Sulfate ) 10%, APS  ( Ammonium  Persulfat )  10%,  TEMED ( tetra  ethylene  diamine ).  Sedangkan  dalam stacking  gel acrilamide    30%,  Tris  HCL  1.5  M pH  6.8,  dH 2 O,  SDS  ( Sodium  Dodecil  Sulfate ) 10%,  APS  ( Ammonium  Persulfat )  10%, TEMED  ( tetra  ethylene  diamine ).  Larutan separating  gel yang  telah  dibuat  dalam Erlenmeyer dituangkan ke dalam plate pembentuk  gel  menggunakan  pipet  (dijaga jangan  sampai  terbentuk  gelembung  udara) sampai  tiga  perempat  tinggi plate .  Perlahan dituangkan air diatas larutan gel agar permukaan  gel  tidak  bergelombangm  dan dibiarkan  memadat  selama  kurang  lebih  10 menit.  Setelah  itu  air  yang  menutup separating gel dibuang.  Selama  menunggu separating  gel memadat ,  stacking  gel disiapkan  kedalam erlenmeyer.  Selanjutnya  segera  dituangkan larutan kedalam plate pembentuk gel menggunakan  pipet  sampai plate penuh.
Perlahan  diselipkan  sisir  pembentuk  sumur sampel  kedalam stacking  gel segera  setelah dituang.  Setelah  gel  memadat  sekitar  15  menit, sisir diangkat.
Sampel  protein  dipanaskan  100 0 C selama  5  menit,  sebagai  bahan  warna  adalah RSB dengan perbandingan 1:1 . Sampel dimasukkan sumuran gel menggunakan mikropipet  per  sumuran  masing  –  masing  18µl kemudian dielektroforesis dengan Voltage 90 V, 400  mA,  selama  120  menit.  Selanjutnya  gel diangkat  dari  chamber,  pewarnaan  dilakukan dengan  merendam  dalam staining  solution selama  1  jam  sambil  di shaker atau  digoyang- goyang  secara  manual.  setelah  itu  di  hentikan pewarnaan  dengan destaining  solution dan kemudian diamati.
Gel hasil SDS PAGE dianalisa dengan cara  menghitung  band  yang  muncul.  Dari  hasil pewarnaan gel akan diperoleh hasil elektrogram yang berupa pita-pita protein. Pada elektrogram diukur  jarak  pergerakan  masing-masing  protein standar  ( marker )  dan  dicatat  nilai  Rf-nya dimana  Rf  merupakan  perbandingan  antara jarak  pergerakan  pita  dari  tempat  awal  dengan jarak pergerakan warna dari tempat warna.
Selanjutnya untuk membuat kurva kalibrasi berat  molekul,  nilai  Rf  ditempatkan  sebagai sumbu  Y  dan  berat  molekul  yang  biasanya dinyatakan  sebagai  fungsi  dari  log  berat molekul  ditempatkan  sebagai  sumbu  X.  Grafik yang  didapatkan  berupa  grafik  linier  dengan persamaan garis y = a + bx. Mobilitas dari suatu protein  yang  belum diketahui  berat  molekulnya dapat  diukur  dengan  rumus  diatas  dan  berat
molekulnya  dapat  dicari  dengan  mengeplotkan langsung pada kurva standart berat molekul atau dapat dihitung dengan menggunakan persamaan garis dari kurva standart berat molekul.
Berat  molekul  pita  protein  yang  telah dihitung  menggunakan  persamaan  linear  dari jarak  sparating  gel.  Kemudian  pita  protein  dari Vibrio  harveyi diseleksi  untuk  digunakan sebagai  kandidat  protein  adhesin  berdasarkan dari  pita  major  yang  muncul  dan  tidak bergandeng dengan pita protein yang lain ( non- dimer ).  Pemotongan  pita  protein  meggunakan pemotong  gel.  Gel  yang  telah  dipotong disimpan  dalam  larutan  running  buffer  untuk dilakukan elusi.
Elektroelusi dan Dialisa Protein Kandidat protein adhesin Vibrio harveyi
pada  pita  protein  dipisahkan  dengan  metode elektroelusi menggunakan horisontal
electroforesis  (Biorad).  Potongan-potongan  gel dari  masing-masing  kandidat  protein  adhesin dimasukkan  dalam  membran  celofan  kemudian dielektroforesis  pada  120  V,  400  mA  selama 120 menit.
Protein  selanjutnya  didialisa  dalam larutan  PBS  pH  7,4  pada  suhu  4 0 C  selama  48 jam.  Cairan  dalam  kantung  selofan  selanjutnya diambil  dan  dimasukkan  dalam  mikrotube  dan dipresipitasi  dengan  menginkubasi  pada  larutan aceton  (1:1  v/v)  semalam  pada  suhu  4 0 C. Campuran  protein  dan  aceton  selanjutnya disentrifus  pada  12.000  rpm  selama  20  menit pada  suhu  4 0 C.  Protein  didapatkan  dalam bentuk  pellet,  dikeringanginkan  dan  dilarutkan dalam  100  µl  tris  HCl  0,5  M,  pH  8,6. Selanjutnya  dilakukan  pengukuran  konsentrasi protein menggunakan Nanodrop Spectrophotometry ND 1000 dengan
Absorbansi 1 pada 280 nm.
Pengujian  Protein  Imunogenik  Pada  Ikan Kerapu Tikus (Cromileptes altivelis) Protein yang menunjukkan nilai hemaglutinasi  paling  tinggi  dari Vibrio  harveyi selanjutnya  dilakukan  uji  klinis  pada  ikan kerapu  tikus (Cromileptes  altivelis) untuk mendapatkan  antibodi  anti-protein  adhesin Vibrio  harveyi .  Uji  klinis  dilakukan  dengan menggunakan  4  ekor  ikan  kerapu  (ukuran  150- 200 g) untuk protein imunogenik Vibrio harveyi serta  4  ekor  lainnya  digunakan  untuk  kontrol (ikan  normal).  Sebelum  perlakuan  injeksi,  ikan diaklimatisasi terlebih dahulu selama 1 bulan.
Protein  imunogeik  dari Vibrio  harveyi disuntikkan  secara  intra  peritoneal  (i.p)  dengan konsentrasi 33 g/150 g ikan dengan volume 0,1 ml/ikan. Penyuntikan dilakukan dengan mencampurkan protein adhesin dengan
Complete  Freund’s  adjuvant (CFA)  (1:1  v/v). Tujuh hari  setelah  penyuntikan  pertama dilakukan  penyuntikan  kedua  ( booster )  dengan volume  dan  konsentrasi  protein  yang  sama dengan  penambahan Incomplete  Freund’s adjuvant (IFA).  Ikan  dipelihara  selama  14  hari dengan  pemberian  pakan  menggunakan  ikan rucah  hingga  kenyang  ( ad  libitum )  dengan aerasi  dan  pergantian  air  sekitar.  Serum  dari masing-masing  ikan  perlakuan  dan  kontrol didapatkan  dengan  mengambil  darahnya  pada hari  ke-14  setelah  injeksi  pertama.  Darah disentrifus  pada  10.000  rpm  selama  10  menit pada  suhu  4 0 C  untuk  mendapatkan  serumnya. Serum  disimpan  dalam  -20 0 C  hingga  untuk pengujian berikutnya.
Pemeriksaan Imunohistokimia dengan Pelabelan Secondary  Antibodi  Anti  IL-4 Conjugate Biotin
Uji  Imunohistokimia  untuk  deteksi antigen  dengue  pada head  squash (apusan sel/jaringan).  Preparat  head  squash  (apusan sel/jaringan)  difiksasi  dengan  methanol  dingin 3-5  menit,  selanjutnya  ditetesi Peroxidase blocking  solution (H 2 O 2 )  10  menit.    Diberi prediluted  blocking serum (protein blocker) 15 menit,  kemudian  dikeringkan.  Dan  inkubasi dengan  Antibodi  primer  (antibodi  monoklonal DSSC7)  semalam  pada  4 0 C.  Selanjutnya  cuci dengan  PBS (phospat  buffer  saline) segar  3x masing-masing  2  menit  kemudian  keringkan dengan  tisu  langsung  tungkan  objek  glass  ke atas  tisu.  Diinkubasi  lagi  dengan Biotinylated universal secondary antibody (antibodi sekunder  anti  tikus)  20  menit  pada  suhu  ruang, selanjutnya  cuci  dengan  PBS  segar  3x  masing- masing  2  menit  kemudian  keringkan,  ditetesi dengan Trekavidin- HRP 10  menit. Cuci dengan PBS segar 3x masing-masing 2 menit kemudian keringkan  selama  3  menit.  Siapkan    betazoid DAB chromogen solution dengan mencampur 1 μl DAB chromogen dengan substrat buffer 100 μl  kemudian  teteskan  pada  preparat  selama  5 menit  cuci  dibawah  air  kran,  kemudian keringkan selama 3 menit. Tetesi dengan Mayer hematoxilen 1  menit  sebagai  counterstain  inti berwarna biru.  cuci dibawah air  kran, selanjutnya  dehidrasi  dengan  ethanol  100  % sekali, clearing dengan Xylen atau Xylol sekali. Tetesi dengan entelan sebagai Mounting media, tutup  dengan cover  slip ,  periksa  dibawah mikroskop  cahaya  perbesaran  lemah,  sedang dan kuat.

## Hasil dan Pembahasan
Hasil  penelitian  ini  meliputi  hasil elektroforesis  pita  protein Vibrio  harveyi dengan Sodium  Dodecyl  Sulfate  Polyacrylamid Gel  Elektrophoresis (SDS-PAGE)  sehingga diperoleh  protein  imunogenik  dari  Vibrio harveyi  (  Yanuhar,  2008).  Protein  imunogenik yang  dihasilkan  akan  digunakan    untuk pembosteran pada ikan kerapu tikus ( Cromileptes altivelis ) untuk menentukan ekspresi  sel  imun  yakni  sel  IL-4.  Fungsi  sel imun  yakni    terbentuknya  sel  IL-4  dilakukan dengan  melakukan    preparasi  jaringan  dengan menggunakan  teknik  IHC  dan  pelabelan seconadary antibody anti CD4 conjugate biotin pada jaringan dari organ yang ditentukan  yakni mata ,otak dan ginjal.
Hasil  Elektroforesis  Pita  Protein  Imunogenik Vibrio harveyi
Ekspresi  infeksi V  harveyi pada  level protein  akan  terdeteksi  dengan  menggunakan SDS-PAGE. Hasil elektroforesis dengan menggunakan gel poliakrilamid 12.5% terhadap crude  protein  Vibrio  harveyi memberikan gambaran  pita  protein  yang  terdiri  dari  enam belas pita protein dengan berat molekul masing- masing  yaitu  160.06  kDa,  129.58  kDa,  114.16 kDa, 109.44 kDa, 100.57 kDa, 96.41 kDa, 88.60 kDa,  81.42  kDa,  78.05  kDa,  74.82  kDa,  65.92 kDa,  58.07  kDa,  51.16  kDa,  49.04  kDa,  38.06 kDa dan 36.49 kDa. Gambar hasil elektroforesis tersebut disajikan pada Gambar 1.
Protein  imunogenik  adalah  protein yang  bila  dimasukkan  dalam  suatu  sel  atau organism  akan  membangkitkan  fungsi  dalam system  imun  komplek.  Sistem  imun  ini berfungsi  untuk  memproteksi  diri  pada  ikan yang  telah  di  imunisasi  terhadap  antigen  yang bersifat pathogen yang telah masuk.
Pita-pita  protein  tersebut  di  atas  dipotong untuk dilakukan elektroelusi untuk memisahkan protein  dari  matriks  gel.  Protein  yang  telah dipisahkan  dari  matriks  gel  didialisa  untuk pencucian dengan PBS dan dipresipitasi dengan aceton. Protein-protein spesifik tersebut disimpan  dalam  freezer  -20 0 C  hingga digunakan  sebagai  protein  imunogenik  dari Vibrio harveyi untuk pemboosteran ikan kerapu tikus.
Gambar 1.   Hasil  elektrofresis  pita  protein imunogenik Vibrio harveyi
Keterangan:   a. Marker Pro STAIN TM b. Berat molekul (BM) crude protein V.harveyi Pita  protein  51.162  kDa  adalah  potein imunogenik dari Vibrio harveyi yang digunakan untuk pemboosteran Ikan kerapu tikus
(Cromileptes altivelis) Imunisasi  Ikan  Kerapu  Tikus  ( Cromileptes altivelis ) Secara Invivo Dengan Protein Imunogenik Betak Moleku 51,16 kDa Protein imunogenik dari Vibrio harveyi
disuntikkan  secara  intra  peritoneal  (i.p)  dengan konsentrasi 33 g/150 g ikan dengan volume 0,1 ml/ikan. Penyuntikan dilakukan dengan mencampurkan protein adhesin dengan
Complete  Freund’s  adjuvant (CFA)  (1:1  v/v). Tujuh hari  setelah  penyuntikan  pertama dilakukan  penyuntikan  kedua  ( booster )  dengan volume  dan  konsentrasi  protein  yang  sama dengan  penambahan Incomplete  Freund’s adjuvant (IFA).  Ikan  dipelihara  selama  14  hari dengan  pemberian  pakan  menggunakan  ikan rucah  hingga  kenyang  ( ad  libitum )  dengan aerasi  dan  pergantian  air  sekitar.  Serum  dari masing-masing  ikan  perlakuan  dan  kontrol didapatkan  dengan  mengambil  darahnya  pada hari  ke-14  setelah  injeksi  pertama.  Darah disentrifus  pada  10.000  rpm  selama  10  menit pada  suhu  4 0 C  untuk  mendapatkan  serumnya.
Serum  disimpan  dalam  -20 0 C  hingga  untuk pengujian berikutnya Pemboosteran  pada  ikan  kerapu  tikus ( Cromileptes  altivelis )  dilakukan  sebanyak  tiga kali  yaitu  pemboosteran  1  selama  7  hari, pemboosteran 2 selama 14 hari, pemboosteran 3 selama 21 hari, seperti Gambar 2.
Gambar 2. Proses Penyuntikan Ikan Dosis yang digunakan dalam penyuntikan ikan sebanyak 31,6 µL. banyaknya dosis  yang  disuntikkan  ini  tergantuk  dari kepadatan protein dan berat badan ikan.
Gejala  yang  timbul  adalah  ikan menunjukkan  gejala  stres,  hilangnya  nafsu makan,  perubahan  warna  kulit  menjadi  lebih gelap  serta  perubahan  perilaku.  Infeksi  ini bertujuan  untuk  mendapatkan  antibodi  ikan secara maksimal yang akan digunakan untuk uji pathogenesis selanjutnya.
Penggunaan  ikan  kerapu  tikus  dengan ukuran sekitar 150 g dalam uji klinis diharapkan bahwa ikan pada ukuran tersebut telah memiliki sistem  imun  yang  sempurna  sehingga  produksi sel-sel  dan  molekul-molekul  yang  berperan dalam  sistem  imun  ikan  kerapu  ikan  dilakukan secara optimal. Disamping itu, penggunaan ikan dengan  ukuran  besar  akan  memudahkan  dalam pengambilan darah dan jaringan organ.
Pemeriksaan  Sel  Interleukin-4  (IL-4)  Pada Jaringan  Dengan  Teknik  Imunohistokimiam (IHC)
Preparasi  jaringan  ikan  kerapu  tikus ( Cromileptes  altivelis yang  terinfeksi Vibrio harveyi untuk mendeteksi sel IL-4 diperlakukan dengan  menggunakan  PFA  4%  dan  dilakukan pencucian  dengan  PBS  sebanyak  3  kali menggunakan DEPC dan secara steril, kemudian  dilanjutkan  dengan  inkubasi  pada larutan  DEPC-sukrose  20%,  agar  protein  yang terekspresi  tidak  terkontaminasi,  selanjutnya sampel  siap  dipotong  dengan  mikrotom  dan diletakan  pada  preparat,  dan  penyimpanan dilakukan  pada  -20  derajat  Celsius  hingga sampel digunakan
dengan teknik imunohistokimia.
Ekspresi    sel  imun  (molekul  sel  Il-4) dapat  dilihat  dengan  teknik  imunohistokimia melalui pelabelan secondary antibody conjugate biotin pada  jaringan  ikan  yang  telah  dipapar protein  imunogenik Vibrio  harv eyi  secara invivo  .  Hasil  uji  IHC    menunjukkan  adanya perubahan  struktur  sel  yakni  bagian  lisosom melalui  pemeriksaan  mikroskop  inverted  dapat dilihat pada Gambar 3.
a. ginjal b. Mata c. Otak
Dari  hasil  uji  imunohistokimia  dapat  terlihat perubahan  struktur  sel  yang  ditandai  dengan warna  coklat  keemasan,  ini  menunjukkan adanya  reaksi  silang  antara  protein  imunogenik yang dipapar pada ikan kerapu tikus ( Cromileptes  altivelis )  dalam  bentuk  sel  imun (sel IL-4) dengan seconadary antibody anti IL-4 conjugate  biotin pada  organ  otak,  mata  dan ginjal.
Pada  organ  mata,  serangan Vibrio harveyi tersebut  menyebabkan exopthalmia
yaitu  menurunnya  kemampuan  kornea  (Austin, 2007). Pada ginjal, akan menyebabkan kemampuan  sistem  imun  menurun  sedangkan pada  otak  akan  timbul  gejala  klinis  berupa wierling atau  berenang memutar  karena keseimbangan ikan terganggu Pada mata, interaksi reseptor diperankan  oleh  oleh  Laminin.  Laminin ditemukan  pada  permukaan  ephitelia  dan  di retina.  Laminin  adalah  komponen  ECM  yang termasuk  kelompok  Glikoprotein  yang  menjadi komponen utama dari semua Basement Membrane  (BM),  sedangkan  ECMs  digunakan oleh  sel  untuk  adhesi,  migrasi,  dan  selain  itu hubungan  ini  akan  meregulasi  phenotype  dan tingkah laku sel. Fungsi regulatori  ini dimediasi oleh matrik sel reseptor pada sel, yang bertindak sebagai  ikatan  dan  signal  sel.  Yang  pada akhirnya terjadi exopthalmia (Austin, 2007)
Ginjal  ikan  memiliki  bagian  ginjal yang  terpenting  adalah  head  kidney  (ginjal cranial) yang sebagian besar terdiri atas lympo- myeloid compartment. Head kidney  merupakan organ haematopoietic yang mempunyai peranan penting,  seperti  halnya  pada  sumsum  tulang belakang  vertebrata tingkat tinggi. Head kidney juga  bertindak  sebagai  lympoid  sekunder  yang berperan  penting  dalam  induksi  dan  elaborasi respon  imun.  Parenkim  dari  head  kidney diedarkan diantara sistem sinusoid dan didukung  oleh  stroma  dari  ginjal.  Stroma  dari head  kidney  berfungsi  untuk  mendukung jaringan  haematopoietic  tetapi  juga  berperan penting dalam kekebalan spesifik dan membersihkan  sel-sel  yang  rusak.  Makrofag sinusoidal dan sel endothelial pada head kidney berpartisipasi  dalam  menangkap  partikel  dan substansi  lain  dari  aliran  darah,  dimana  renal berperan  dalam  filtrasi  untuk  menghilangkan partikel  lain  di  darah.  Head  kidney  adalah produsen  antibodi  dan  mengakumulasikan melanomakrofag  yang  mampu  menyimpan  dan memelihara  antigen  dalam  waktu  yang  lama (immunological memory) ( Press.C.McL, 1999) Organ  otak  ikan  terdiri  dari  5  bagian utama  yaitu  lobus  olfaktorius  (olfactory  bulb), Otak  kecil  (cerebrum),  optik  lobe,  otak  besar (cerebellum), dan medulla oblongata. Dimungkinkan  bahwa V  harveyi menyerang bagian  CNS  (Central  Nervous  System)  atau sistem  saraf  pusat  sehingga  gejala  berupa wierling terjadi.  Bakteri  masuk  dengan  melalui beberapa    cara  yakni    :  1.  Invasi  (penembusan) melawan  penghalang  anatomi  berupa  epitelium luar  dan  dalam  yang  dikenal  dengan  kulit.  2. Transport  axonal  oleh  neuron  dari  bagian perifer.  3.  Masuk  melalui  saluran  pernafasan atas  kemudian  melalui  epitel  olfactorius.
Selanjutnya  bakteri  mengadakan  multiplikasi dengan bantuan dari unsur-unsur bakteri sendiri dan  unsur  dari  hospes/inang    berupa  biokimia untuk  pertahanan,  interaksi  antara  keduanya akan  bersifat  toksik  bagi  inang.  CNS  tersebut tersusun  atas  neuron  dan  sel  glia  (Virela  and Gabriel, 2007).
Dijelaskan  lebih  lanjut  bahwa  setiap antigen  ekstraseluler  yang  masuk  ke  dalam tubuh    termasuk  bakteri  V.  alginolyticus  akan ditangkap  oleh  APC  ( antigen  presenting  cells ) yang  selanjutnya  antigen  tersebut  dipecah menjadi molekul-molekul yang lebih kecil.
Molekul-molekul  tersebut  selanjutnya diekspresikan  oleh  molekul  MHC  II  ke permukaan  sel  APC  untuk  dipresentasikan kepada  sel  Th2.  Sel  Th2  yang  teraktivasi selanjutnya  akan  memproduksi  sitokin-sitokin diantaranya  IL2,  IL4,  IL6,  dan  IL10  untuk dijadikan  sebagai  sinyal  kepada  sel  B.  Sel  B yang  teraktivasi  oleh  sitokin-sitokin  tersebut selanjutnya  akan  mengadakan  proliferasi  dan diferensiasi  menjadi  sel  B  plasma  dan  sel  B memori.  Sel  plasma  akan  berperan  untuk mensekresi  antibodi  yang  spesifik  terhadap antigen  yang  masuk  sedangkan  sel  B  memori akan  mengekpresikan  reseptor-reseptor  yang spesifik terhadap antigen tersebut di permukaannya  yang  berperan  untuk  lebih mengenali  antigen  pada  infeksi  berikutnya (Abbas and Lichtman, 2005).

## Kesimpulan
Hasil  induksi  protein  imunogenik Vibrio harveyi  pada  ikan kerapu tikus uji  dapat berfungsi untuk meningkatkan ekspresi sel imun yakni  sel    interleukin-4  (IL-4)  yang  ditandai dengan  warna  coklat  keemasan    pada  jaringan ikan  hasil  uji  dengan  pemeriksaan  secara kualitatif.  Hal  ini  membuktiokan  adanya  reaksi silang antara protein imunogenik yang diinduksikan pada ikan kerapu tikus ( Cromileptes  altivelis )  secara  in  vivo  dan membentuk respon  imun  yakni  sel IL-4 dengan yang  ditandai  dengan  pelabelan  sel  imun  (sel IL-4(  dengan seconadary  antibody  anti  IL-4 conjugate  biotin pada  jaringan  otak,  mata  dan ginjal  ikan  kerapu  secara  visual  kualitatif. Rekomkendasi  penelitian  ini  adalah  untuk melanjutkan  penbelitian  pada  tingkat  ekspresi genetik  sel  imun  IL-4  untuk  pengembangan diagnostik  vibriosis  secara  cepat,  walaupun telah digunakan analisis imunohistokimia.
Ucapan  Terima  kasih  disampaikan  kepada Kementrian Negara Riset Dan Teknologi    yang telah  mendanai  riset  ini  melalui  Program
Insentif  Riset  Dasar  Tahun    penelitian  2008- 2009.

## Daftar Pustaka
Abbas,  A.  K.  and  A.  H.  Lichtman.  2005. Cellular  and  Molecular  Immunology, fifth  edition,  updated  edition .  Elsevier saunders, Pennsylvania.
Aslianti, T, B. Slamet dan G.S. Prasetyo. 2003. Aplikasi  Budidaya Ikan  Kerapu  Bebek (Cromileptes  altivelis)  di  Teluk  Ekas Kabupaten  Lombok  Timur . Badan Riset Kelautan dan Perikanan, Jakarta. Austin,B.,and D.A  Austin,  2007. Bacterial  Fish Pathogen.2 nd edition.  Ellis  Horwood Ltd., Chishester. Bandung. Baratawidjaja, Karnen Garna, 1996. Immunologi Dasar. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Gaya Baru. Jakarta.
Jun L,  Norman Y.S.  Woo.,2003. Pathogenicity of  Vibrios    in  Fish:  an  Overview,
Journal  of  Ocean  University  of Qingdao  (Oceanic  and  Coastal    Sea Research)  October  31,2003,  Vol.2, No.2
Press  C.  Mcl.  and  Evensen,  1998.  The Morphology of The Immune System in Teleost  Fshes.  Fish  &  Shellﬁsh Immunology 1999. 9, 309–318. Academic Pres Yanuhar,  U.  2008  Pengembangan  Vaksin Berbasis  Peptida  untuk  Penyiapan Bibit  Unggul  Ikan  Kerapu  Tikus  .
Laporan  Penelitian  Program  Insentif Riset  Dasar  .  KMNRT.    Tidak Dipublikasikan .
Virella,  Gabriel.  2007.  Basic  Immunology  In Virella,  G.  (Ed). Medical  Immunology sixth edition . Informa Healthcare, New York.