# Korespondensi:  Balai  Besar  Riset  Budidaya  Laut  dan Penyuluhan  Perikanan.  Jl.  Br.  Gondol  Kec.  Gerokgak Kab.  Buleleng,  Kotak  Pos  140,  Singaraja,  Bali  88180,  Indonesia. Tel.  +  62  362  92272 E-mail:  kmahardika@yahoo.com
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra

## APLIKASI  VAKSIN  BIVALEN  (VNN  DAN  GSDIV)  PADA  PEMELIHARAAN  LARVA IKAN KERAPU SUNU, Plectropomus leopardus
Ketut  Mahardika # ,  Indah  Mastuti,  Sudewi,  Yasmina  Nirmala  Asih,  Ahmad  Muzaki,  dan I  Nyoman  Adiasmara  Giri
Balai Besar Riset Budidaya Laut dan Penyuluhan Perikanan Jl. Br. Gondol Kec. Gerokgak Kab. Buleleng, Kotak Pos 140, Singaraja 81101, Bali
(Naskah diterima: 6 Maret 2018; Revisi final: 10 Desember 2018; Disetujui publikasi: 10 Desember 2018)

## ABSTRAK
Beta-nodavirus  sebagai  agen penyebab  VNN  (virus  nervous  necrosis)  dan infeksi  GSDIV  (grouper  sleepy disease  iridovirus,  isolat  dari  genus Megalocytivirus)  merupakan  penyakit  yang  menyebabkan  mortalitas yang tinggi pada larva dan juvenil ikan kerapu dan kakap di Indonesia. Pencegahan infeksi virus tersebut menjadi prioritas utama dalam budidaya ikan tersebut. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efektivitas  vaksin  bivalen  dalam  mencegah  infeksi  virus  VNN  dan  GSDIV  pada  pemeliharaan  larva  ikan kerapu  sunu,  Plectropomus  leopardus.  Sebanyak  5  mL  vaksin  bivalen  (kombinasi  antara  vaksin  protein rekombinan VNN dan GSDIV dengan rasio 1:1 v/v) di bio-enkapsulasi ke dalam 30 liter pakan alami Rotifera dan Artemia (2 x 10 4 individu/mL). Aplikasi vaksin pada larva ikan kerapu sunu dilakukan melalui pakan alami Rotifera dari umur 5-24 hari dan Artemia dari umur 25-50 hari. Hasil penelitian menunjukkan bahwa vaksin bivalen  tidak  berpengaruh  terhadap  pertumbuhan  dan  sintasan  larva  kerapu  sunu  (panjang:  1,8-2,2  cm dan sintasan: 1,05%-4,07%). Hasil uji tantang dengan VNN dan GSDIV menunjukkan bahwa vaksin tersebut dapat menginduksi gen imunitas larva (MHC-I).
KATA KUNCI: kerapu sunu; Megalocytivirus; VNN; vaksin bivalen
ABSTRACT: Effectiveness of bivalent vaccine (protein recombinant VNN and GSDIV) to prevent VNN and GSDIV infections in seed of coral trout grouper, Plectropomus leopardus. By: Ketut Mahardika, Indah Mastuti, Sudewi, Yasmina Nirmala Asih, Ahmad Muzaki, and I Nyoman Adiasmara Giri
Beta-nodavirus as the causative agent of VNN (viral nervous necrosis) and GSDIV infection (grouper sleepy disease iridovirus, isolate from the genus Megalocytivirus) has caused high mortality of cultured grouper and sea bass larvae and juvenile in Indonesia. The prevention of this virus infection on grouper and sea bass culture has become one of the national priority. The purpose of this research was to study the effectiveness of the bivalent vaccine in preventing VNN and GSDIV infections to seed of coral trout grouper, Plectropomus leopardus reared in hatchery. Applications of bivalent vaccine (a combination of protein recombinant VNN and GSDIV vaccine with a ratio of 1:1 v/v) were done by bio-encapsulation using the fish natural diet, Rotifera and Artemia, with a dose of 5 mL vaccine in 30 liters of natural diet (2 x 104 ind./mL). Vaccines were given once a day from the larval age of 5-24 days after hatching using Rotifera and 25-50 day after hatching using Artemia. The results showed that the bivalent vaccine did not influence the growth and survival rate of coral trout grouper larvae (ranged of total length: 1.8-2.2 cm and survival rate: 1.05%-4.07%). The challenge test with VNN and GSDIV revealed that the vaccine had positively induced gene related immunity of larvae MHC-I.
KEYWORDS: coral trout grouper; Megalocytivirus; VNN; bivalent vaccine

## PENDAHULUAN
Perikanan budidaya laut mengalami kemajuan yang sangat pesat di Asia. Budidaya menjadi minat utama bagi praktisi perikanan semenjak terjadinya penurunan
hasil tangkapan dari laut. Perkembangan budidaya yang semakin meningkat menyebabkan banyaknya usaha perbenihan  maupun  pembesaran  yang  tidak memperhatikan daya dukung lingkungan. Hal ini dapat berakibat buruk pada lingkungan sekitarnya, seperti limbah budidaya yang dibuang secara langsung ke laut dapat memengaruhi kelangsungan hidup biota laut dan menimbulkan  pencemaran  lingkungan.  Pencemaran lingkungan  menjadi  salah  satu  penyebab  suburnya
mikroorganisme patogen. Seperti kejadian kematian ikan akibat infeksi beta-nodavirus (penyebab penyakit VNN/viral  nervous  necrosis)  dan  infeksi  virus  dari  ge- nus  Megalocytivirus  (grouper  sleepy  disease  iridovirus/ GSDIV)  pada  perbenihan  ikan  kerapu  dan  kakap. Pemutusan siklus hidup dari virus ini di perairan sudah tidak memungkinkan lagi untuk dilakukan. Beberapa ikan liar, plankton, dan krustasea kecil disinyalir dapat menjadi inang perantara bagi virus ini di samping faktor cuaca, lingkungan, dan stres yang membuat kondisi ikan  lemah  atau  rentan  terhadap  infeksi  penyakit (Cherif & Fatma, 2017; Yahunar et al., 2016).
Pencegahan  infeksi  virus  tersebut  menjadi  salah satu upaya alternatif yang diawali dengan melakukan inventarisasi  penyakit  dan  penyediaan  vaksin  yang mempunyai efektivitas yang baik dalam pencegahan infeksi  penyakit  virus  pada  ikan  laut  dan  dapat diproduksi  secara  komersial  di  Indonesia.  Vaksin komersial  untuk  budidaya  ikan  laut  sebagian  besar masih  diimpor  dari  luar  negeri.  Vaksin  virus  isolat lokal masih belum banyak diperoleh di pasaran. Vaksin yang  tersedia  merupakan  produk  rekayasa  genetik seperti  DNA  vaksin  dan  protein  rekombinan. Penggunaan vaksin rekombinan dalam budidaya ikan masih menimbulkan pro dan kontra karena disinyalir dapat  menimbulkan  residu  pada  manusia  setelah mengonsumsi  ikan  tersebut.  Namun  demikian, pemilihan vaksin rekombinan menjadi usaha alternatif karena  vaksin  inaktif  dari  perbanyakan  virus  secara invitro sangat sulit, tidak stabil, dan biaya pemeliharaan isolat  virus  yang  mahal.  Vaksin  rekombinan merupakan hasil penyisipan gen virus ke dalam vektor yang diekspresikan ke dalam  sel bakteri kompeten. Biaya  untuk  proses kloning  memang  mahal,  namun selanjutnya  biaya  produksi  menjadi  murah  karena pemeliharaan dan perbanyakannya dengan mengkultur sel bakteri pembawa gen rekombinan dapat dilakukan secara kontinu.
Aplikasi inaktif vaksin VNN pada larva ikan kerapu lumpur, Epinephelus coioides melalui perendaman dan juvenil ikan Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus, dan kerapu bebek, Cromileptes altivelis melalui injeksi intramuskular telah dilakukan dan mampu menekan kematian larva dan juvenil setelah dilakukan uji tantang dengan virus VNN (Kai & Chi, 2008; Sommerset et al., 2005;  Mahardika  et  al.,  2002).  Vaksin  rekombinan kapsid protein striped jack VNN (salah satu isolat dari piscine  Nodavirus)  juga  dilaporkan  mampu meningkatkan level dari spesifik antibodi-rT2 selama 20 hari pasca-vaksinasi (Husgaro et al., 2001). Vaksin rekombinan  VNN  dilaporkan  efektif  meningkatkan imunitas larva kerapu lumpur dengan RPS: 64,2%-69,5% setelah  diuji  tantang  dengan  virus  VNN  (Lin  et  al.,
2007). Rekombinan vaksin kapsid protein VNN isolat dari  Indonesia  juga  telah  diuji  secara  laboratorium dan dikembangkan, serta dilaporkan mampu mencegah kematian massal ikan kerapu bebek terhadap infeksi VNN  (Mahardika  et  al.,  2016b;  Murwantoko  et  al., 2008).
Vaksin protein rekombinan dari dinding sel maupun MCP  (major  capsid  protein)  virus  GSDIV  juga  telah berhasil  diaplikasikan  secara  laboratorium.  Vaksin tersebut mampu meningkatkan daya tahan tubuh ikan kerapu  bebek  terhadap  infeksi  virus  GSDIV  yang ditunjukkan dari nilai RPS (relative percentage survival) yang diperoleh yaitu 40%-58% tanpa adjuvant dan 50%- 70%  dengan  penambahan  adjuvant  (Mahardika  & Mastuti, 2015; Mahardika et al., 2016a). Aplikasi vaksin rekombinan  GSDIV  yang  dikombinasikan  dengan vaksin polivalen Vibrio sp. mampu meningkatkan titer antibodi  dan  nilai  RPS  ikan  kerapu  macan,  E. fuscoguttatus sampai 84% setelah di uji tantang dengan virus GSDIV (tiga bulan pasca-vaksinasi) (Zafran, 2016).
Penerapan vaksin-vaksin tersebut pada stadia awal ikan yang dibudidayakan di unit pembenihan (hatch- ery) dipandang perlu untuk meningkatkan ketahanan ikan  sebelum  ditebar  di  tambak  maupun  keramba jaring  apung.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  efektivitas  vaksin  bivalen  (kombinasi antara  vaksin  protein  rekombinan  VNN  dan  GSDIV) dalam mencegah infeksi virus VNN dan GSDIV pada pemeliharaan larva ikan kerapu sunu.

## BAHAN DAN METODE
Perbanyakan dan Inaktivasi Sel Bakteri Escherichia coli strain BL-21 Pembawa Protein Rekombinan RNA2- VNN dan MCP-GSDIV.
Bakteri  E.  coli  BL-21  yang  pembawa  protein rekombinan  RNA2-VNN  dan  MCP-GSDIV  masing- masing  dikultur  dalam  500  mL  media  LB  yang mengandung kanamycin hingga mencapai nilai OD (op- tical density) 1 (satu) pada panjang gelombang 600 nm. Kemudian kedua kultur E. coli BL-21 tersebut diinduksi dengan  0,1  mM  IPTG  agar  protein  rekombinan terproduksi.  Adanya  produksi  protein  pada  BL-21 dikonfirmasi  dengan  analisis  SDS-page  mengikuti metode  yang  telah  dilakukan  sebelumnya  oleh Mahardika & Mastuti (2015).
Inaktivasi  E.  coli  BL-21  yang  telah  diketahui menghasilkan protein rekombinan dilakukan dengan menambahkan  formalin  hingga  konsentrasi  akhir adalah  0,03%  selama  satu  malam  pada  suhu  ruang. Formalin dibersihkan dengan sentrifugasi 6.000 rpm selama lima menit. Pelet yang dihasilkan diencerkan kembali  hingga  kepadatan  E.  coli  BL-21  ekuivalen
dengan kepadatan (10 8 CFU/mL). Kedua vaksin (VNN dan  GSDIV)  dicampur  menjadi  satu  dengan perbandingan 1:1 v/v (vaksin bivalen).

## Aplikasi  Vaksin  Bivalen  pada  Pemeliharaan Larva  Kerapu  Sunu
Aplikasi  vaksin  bivalen  pada  pemeliharaan  larva kerapu  dilakukan  melalui  pakan  alami  dengan mengikuti metode yang sebelumnya dilaporkan oleh Lin  et  al.  (2007).  Pakan  alami  yang  digunakan  yaitu Rotifera  dan  Artemia.  Sebanyak  5  mL  vaksin  bivalen diberikan pada 30 L kultur Rotifera atau Artemia (2 x 10 4 individu/mL) bersama-sama dengan bahan pengkaya yaitu 6,0 g algamac®; 3,9 g vitamin C; dan 0,075 g taurin. Pemberian vaksin bivalen dan bahan pengkaya pada  kultur  Rotifera/Artemia  dilakukan  empat  jam sebelum digunakan. Pemberian vaksin bivalen melalui Rotifera pada umur 5 HSM hingga 24 HSM, sedangkan pemberian vaksin melalui Artemia dimulai pada umur 25 HSM hingga 50 HSM (saat grading).
Sebagai kontrol, dilakukan pula pemeliharaan larva kerapu  sunu  dengan  metode  yang  sama  tanpa pemberian vaksin bivalen. Pemeliharaan larva dengan perlakuan vaksin dan non-vaksin tersebut dilakukan dalam tiga kali percobaan dengan waktu yang berbeda yaitu  bulan  Januari,  Februari,  dan  Agustus.  Setiap perlakuan terdiri atas dua ulangan bak. Sintasan juvenil ikan kerapu sunu umur 50 hari dari perlakuan tersebut dianalisis dengan RAK (rancangan acak kelompok).

## Pemeliharaan  Larva  Kerapu  Sunu
Pemeliharaan  larva  kerapu  sunu  mengikuti prosedur  pembenihan  yang  sebelumnya  telah dilaporkan oleh Aslianti et al. (2008) dengan beberapa modifikasi.  Manajemen  pemberian  pakan  dan pergantian air dilakukan seperti disajikan pada Tabel 1. Secara ringkas, larva dipelihara menggunakan bak beton warna  kuning dengan  kapasitas 6.000  L. Bak dilengkapi dengan plastik transparan sebagai penutup untuk  menjaga  suhu  lebih  stabil.  Intensitas  cahaya berkisar antara 1.000-1.200 lux pada permukaan air. Air yang digunakan adalah air yang telah ditampung dalam bak di hatchery untuk aklimatisasi suhu dan telah disterilisasi dengan lampu UV selama 4-5 jam.
Deteksi  Immunitas  Larva  Kerapu  Sunu dengan  PCR

## Isolasi  total  RNA benih  ikan  kerapu  sunu
Langkah  awal  dalam  deteksi  respons  imunitas menggunakan PCR adalah mengisolasi total RNA dari larva kerapu sunu umur yang berbeda, yaitu dari umur 5 HSM hingga 50 HSM dengan interval waktu selama
lima hari (vaksinasi dan tanpa vaksinasi). Sebanyak 350- 400  µg  larva  diekstraksi  menggunakan  Trizol®  LS (Invitrogen)  sesuai  protokol.

## Sintesis  cDNA  dari RNA  benih ikan kerapu sunu
Genom RNA disintesis menjadi cDNA dengan kit reverse transcription system (Promega) sesuai protokol. Sampel diinkubasi pada suhu 70°C selama lima menit, dilanjutkan pada suhu 42°C selama 60 menit. Reaksi dihentikan dengan pemanasan selama lima menit pada suhu 95°C. Sampel cDNA disimpan pada suhu -20°C sampai digunakan.

## Deteksi  respons  imunitas  pada  benih  ikan kerapu
Deteksi ada tidaknya respons imunitas larva kerapu oleh perlakuan (aplikasi kombinasi vaksin rekombinan VNN  dan  GSDIV,  dan  tanpa  vaksinasi),  dianalisis menggunakan PCR dengan primer reseptor MHC-I dari red seabream (Gen Bank no. AY190713), dan antigen MHC-II (Gen Bank no. AY190712) mengikuti prosedur yang sebelumnya dilaporkan oleh Caipang et al. (2006).  -actin (Gen Bank no. AY190686) digunakan sebagai internal kontrol pada semua sampel yang dideteksi. Dua  mikroliter  sampel  cDNA  digunakan  untuk  PCR dalam reaksi 25 mL. Siklus suhu dan waktu amplifikasi PCR adalah sebagai berikut: denaturasi awal pada 95°C untuk  tiga  menit,  diikuti  30  siklus  denaturasi  pada suhu 95°C selama 30 detik, annealing pada 55°C selama 30  detik,  dan  perpanjangan  pada  72°C  selama  satu menit, dan tahap perpanjangan terakhir pada suhu 72°C selama lima menit. Produk PCR (5 µL) divisualisasikan pada 1,5% gel agarose yang diwarnai dengan etidium bromide,  diamati  dengan  UV  transilluminator  dan didokumentasikan dengan kamera gel.

## Pengukuran  Efektivitas  Vaksinasi  pada  Larva Kerapu  Sunu
Efektivitas aplikasi vaksin bivalen pada larva kerapu sunu  dilakukan  hanya  pada  percobaan  ketiga  yaitu melalui uji tantang dengan isolat virus VNN dan GSDIV. Uji tantang dengan kedua virus tersebut dilakukan pada benih  umur  50  HSM  dan  dilakukan  secara  terpisah melalui  perendaman  pada  masing-masing  50  ekor benih  kerapu  yang  divaksin  maupun  tidak  divaksin (kontrol).  Setelah  diinfeksi  dengan  virus  VNN  dan GSDIV (perendaman selama dua jam dengan 5 mL vi- rus/50 L air laut), masing-masing 10 benih dipisahkan dan ditempatkan dalam 100 L bak plastik yang berbeda (masing-masing perlakuan diulang sebanyak lima kali). Analisis  data  sintasan  setelah  uji  tantang  virus dilakukan dengan menggunakan One Way Anova dengan program R Commander versi R.3.3.2 for Windows.

## Pengukuran  Kualitas  Air  dan  Populasi  Bakteri
Kualitas  air  meliputi  suhu,  pH,  ammonium,  dan nitrit, serta populasi bakteri air dan larva diukur setiap 10 hari sampai umur  50 HSM.

## HASIL DAN BAHASAN

## Perkembangan  dan  Sintasan  Larva
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pemberian vaksin bivalen dalam pemeliharaan larva kerapu sunu tidak berpengaruh (P>0,05) terhadap sintasan selama 50  hari  pemeliharaan  (Tabel  2).  Hasil  pemeliharaan larva kerapu sunu selama penelitian ini sejalan dengan
hasil  penelitian  yang  dilaporkan  sebelumnya  oleh Suwirya  &  Giri  (2010)  yang  menyatakan  bahwa pemeliharaan  larva  kerapu  sunu  selama  45-55  hari menghasilkan benih dengan ukuran panjang 2-3 cm, dengan sintasan berkisar antara 0,5%-3,0%. Lebih lanjut dilaporkan bahwa kendala utama yang dihadapi dalam pemeliharaan larva adalah ukuran bukaan mulut yang relatif  lebih  kecil  dibandingkan  dengan  larva  ikan kerapu bebek, Cromileptes altivelis dan kerapu macan, E. fuscoguttatus. Pemberian pakan alami sebagai pakan awal  pada  pemeliharaan  larva  kerapu  sunu  harus diberikan lebih dini. Kurang sesuainya sediaan pakan alami  dengan  perkembangan  larva  baik  dari  segi
Tabel 1. Skema pemberian pakan alami dan buatan, serta sistem pergantian air selama pemeliharaan larva kerapu sunu
Table 1. Schematic representation of natural feed, artificial feed, and water changes management in reared coral trout larvae
Tabel 2. Sintasan  larva  kerapu  sunu  P.  leopardus  yang  diberi  vaksin  bivalen  melalui pakan alami selama 50 hari pemeliharaan
Table 2. Survival rate of coral trout grouper P. leopardus larvae with bivalent vaccine through natural feed for 50 days rearing 2 3 5 7 9 10 11 12 13 14 16 17 20 25 30 40 50 Plankton (Nannochloropis oculata ) * * * * * * * * * * * * * * * * Minyak ikan (Fish oil ) * * * Rotifera (Brachionus  sp.) * * * * * * * * * * * * * * * * Nauplii kopepod (Nauplii of copepod ) * * Pakan buatan (Artificial diet ) * * * * * * * * * * Artemia  (Nauplii of  Artemia ) * * * * * Ganti air 5%-10% (Water changes 5%-10% ) * * Ganti air 10%-25% (Water changes 10%-25% ) * * * *
Ganti air ≥ 25% ( Water changes ≥ 25% ) Gradual  air 100% (Gradual till 100% ) Sipon (Siphon ) * * * * * * * * *
Hari setelah penetasan (Day after hatching )
Manajemen pakan (Feed management )
Manajemen air (Water management )
* * * * *
Vaksin (Vaccine ) Tanpa vaksin (Non Vaccine ) 1 4.07 3.17 2 1.53 1.49 3 1.05 1.60 Rata-rata (Mean ) 2.22 a 2.09 a
Percobaan Trial Perlakuan (Treatments )
ukuran,  jenis,  maupun  kandungan  nutrisi,  juga merupakan  penyebab  utama  kematian  larva  secara massal (Melianawati et al., 2006).
Larva  kerapu  sunu  dengan  pemberian  vaksin bivalen maupun tanpa pemberian vaksin menunjukkan pertumbuhan  panjang  yang  sama  selama  50  hari pemeliharaan (Gambar 1). Hal tersebut menunjukkan bahwa  vaksin  bivalen  tidak  berpengaruh  terhadap pertumbuhan panjang larva kerapu sunu.

## Deteksi  Respons  Imun  Gen  pada  Ikan  yang Diberikan  Vaksin
Hasil analisis PCR menunjukkan bahwa larva kerapu sunu yang diberi vaksin bivalen mampu menginduksi gen MHC-I, namun tidak menunjukkan adanya induksi gen MHC-II. Hal sebaliknya terjadi pada larva kerapu sunu  yang  tidak  diberi  vaksin  menunjukkan  tidak adanya induksi gen MHC-I (Gambar 2). Hasil penelitian ini  sejalan  dengan  hasil  penelitian  yang  dilaporkan sebelumnya oleh  Kai et al.  (2014) yang  menyatakan bahwa benih ikan kerapu lumpur, E. coioides umur 40 HSM  yang  diberi  inaktif  vaksin  VNN  melalui  pakan Artemia  mampu  meningkatkan  ekspresi  MHC-I. Menurut Caipang et al. (2006), inaktif vaksin RSIV (red sea bream iridovirus) yang diberikan pada ikan kakap (red sea bream) ukuran 3-7 g mampu meningkatkan ekspresi  MHC-I  walaupun  tingkat  ekspresinya bervariasi. Ekspresi MHC-I diregulasi dalam ikan yang divaksinasi walaupun vaksin yang diberikan dianggap sebagai  antigen  eksogen.  MHC-I  pada  ikan  yang
divaksinasi  mungkin  merupakan  hasil  asosiasi  anti- gen eksogen ke beberapa struktur yang pada akhirnya tertranslokasi ke dalam sitoplasma. Dengan demikian, antigen yang teralokasi pada sitoplasma dapat berlaku sebagai peptida endogen dan disintesis oleh molekul MHC-I. Dengan meningkatnya induksi pada gen MHC- I diduga berkaitan dengan respons imunitas sel pada larva-benih ikan untuk melawan infeksi virus.
Gen MHC-II terdeteksi pada awal perkembangan larva yang tidak diberi vaksin (5 dan 10 HSM). Larva ikan  pada  awal  perkembangannya  sangat  rentan terhadap penyakit karena hanya mengandalkan sistem kekebalan  maternal sedangkan  sistem imun  adaptif masih  berkembang  (Magnadottír,  2006).  Menurut Wedekind  et  al.  (2004),  terdapat  hubungan  antara kerentanan ikan Coregonus sp. terhadap infeksi bakteri Pseudomonas  ûuorescens  dengan  induksi  MHC-II  dari imunitas maternal dan paternal. Demikian pula Uribe et  al.  (2011)  menyatakan  bahwa  benih  ikan  teleost menunjukkan  respons  yang  kuat  terhadap  infeksi bakteri,  dengan  aktivasi  aktif  imunitas  spesifik  hu- moral  (MHC-II/CD4+)  beserta  sel  fagositik,  dan peptida antimikroba. Hal yang sama mungkin terjadi pada stadia awal perkembangan larva kerapu sunu. Pada larva kerapu sunu yang diberi vaksin tidak terpengaruh dengan adanya bakteri karena vaksin yang diberikan merupakan vaksin protein rekombinan yang disisipkan dalam sel bakteri E. coli (Mahardika & Mastuti, 2015). Escherichia  coli  BL-21  pembawa  protein  rekombinan VNN/GSDIV mungkin direspons sekaligus oleh sel T
Gambar 1. Panjang total larva kerapu sunu P. leopardus dengan pemberian vaksin bivalen melalui pakan alami selama 50  hari pemeliharaan pada percobaan ke-III
(n= 20 ekor).
Figure 1. Total  length  of  coral  trout  grouper  P.  leopardus  larvae  treated  with  bivalent vaccine through natural feed for 50 days observation in third trial (n= 20 fish).
0 5 10 15 20 25 D5 D10 D15 D20
D25 D35 D40 D45 D50 Pa n ja n g t o ta l
T ot al le ng th (m m ) Umur larva setelah menetas (hari) Days after hatching (days) Tanpa vaksin (Non Vaccine) Vaksin (Vaccine) Tanpa vaksin (Non vaccine) Vaksin (Vaccine)
sitotoksik sehingga hanya ekspresi MHC-I saja yang terdeteksi pada ikan yang diberi vaksin.
Aplikasi vaksin rekombinan protein melalui pakan alami  Artemia  juga  dilaporkan  telah  dilakukan  pada larva kerapu lumpur, E. coioides (Lin et al., 2007). Nau- plii  Artemia  yang  diberi  vaksin  rekombinan  dan diinkubasi selama tiga jam sebelum diberikan ke larva, secara imunohistokimia dilaporkan mampu membawa vaksin  tersebut  dalam  tubuhnya.  Lebih  lanjut dilaporkan bahwa antigen VNN NP masuk dan diserap dalam usus larva untuk selanjutnya menginduksi anti- VNN VP spesifik antibodi setelah tujuh hari pemberian. Larva yang divaksinasi menunjukkan tingkat proteksi yang lebih tinggi (RPS: 64,2% dan 69,5%) setelah diuji tantang dengan virus VNN. Analisis PCR dengan primer F-2  dan  R-3  (Novriadi  et  al.,  2015)  terhadap  infeksi virus  VNN  pada  larva  kerapu  sunu  umur  5-50  HSM pada  kelompok  vaksin  maupun  kontrol  tidak
menunjukkan adanya kontaminasi ataupun infeksi vi- rus  VNN,  dan  pada  gel  agarosa  tidak  terlihat  garis/ pita sesuai target (570 bp).

## Efektivitas  Vaksinasi  pada  Larva  Kerapu  Sunu
Hasil  uji  tantang  dengan  virus  VNN  dan  GSDIV menunjukkan bahwa pada perlakuan aplikasi vaksin bivalen pada larva kerapu sunu melalui pakan alami Rotifera dan Artemia mampu menunjukkan sintasan yang lebih tinggi dan berbeda nyata (P<0,05) dibandingkan dengan larva yang tidak diberi vaksin (Tabel 3). Namun, sintasan yang diperoleh dalam uji tantang ini masih rendah (<50%). Hal tersebut disebabkan benih kerapu sunu ukuran 1,5-2,5 cm (50 HSM) masih sensitif dan cepat stres, pada saat dipindahkan ke dalam wadah uji, akibat adanya perbedaan lingkungan pemeliharaan dan penanganan yang tidak nyaman bagi benih. Apalagi dalam hal uji tantang virus yang dilakukan dalam ruang
Gambar 2. Hasil amplifikasi PCR pada larva kerapu sunu P. leopardus yang diberi vaksin (A) dan tidak diberi vaksin (B) pada umur 5-50 hari setelah menetas (HSM), menggunakan primer MHC-I, MHC-II, dan b-actin. M= marker 100 bp; D5-D50= umur larva 5-50
HSM.
Figure 2. The  results  of  PCR  amplification  on  coral  trout  grouper,  P.  leopardus  larvae: vaccinated (A) and without vaccinated (B) on day-5 to day-50 days after hatching, using
MHC-I, MHC-II, and â-actin primers. M= 100 bp DNA ladder marker.
A. Vaksin (Vaccine)  actin M   D5   D10  D15   D20   D25   D30   D35   D40  D45   D50 MHC-I MHC-II 500 bp 310 bp M     D5    D10   D15  D20   D25   D30   D35   D40   D45   D50 B. Tanpa vaksin (Non vaccine) MHC-I MHC-II  actin 500 bp 310 bp B. Tanpa vaksin (Non vaccine) A. Vaksin (Vaccine)
tersendiri  dalam  bak  tanpa  air  mengalir,  sehingga seringkali kualitas air menjadi faktor pembatas. Hal ini  seperti  dilaporkan  oleh  Suwirya  &  Giri  (2010) bahwa larva kerapu sunu relatif lebih sensitif terhadap guncangan  kondisi  lingkungan  sehingga  diperlukan penanganan yang lebih hati-hati. Namun demikian, hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa pemberian vaksin protein rekombinan VNN dan GSDIV benih ikan kerapu sunu mampu bertahan hidup dengan adanya infeksi virus VNN dan GSDIV.
Vaksin  inaktif  E.  coli  BL-21  pembawa  protein rekombinan  telah  digunakan  untuk  mengimunisasi beberapa  spesies  ikan  untuk  pencegahan  terhadap infeksi  VNN.  Rekombinan  protein  (rT2)  dari  SJNNV (stripped  jack  nervous  necrosis  virus)  dilaporkan mampu  meningkatkan  proteksi  juvenil  ikan  turbot, Scopthalmus  maximus  setelah  terpapar  oleh  SJNNV, walaupun  kematian  ikan  pada  kelompok  kontrol rendah.  Vaksin  tersebut  juga  mampu  menginduksi antibodi spesifik pada ikan  turbot dewasa dan ikan Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus (Husgaro et al., 2001; Sommerset et al., 2005). Peningkatan titer antibodi dan sintasan juga ditunjukkan oleh ikan Eu- ropean sea bass, Dicentrarchus labrax yang diberi vaksin rekombinan baculovirus yang mengekspresikan virus- like  partikel  (VLPs)  dari  betanodavirus  MGNNV (malabaricus grouper nervous necrosis virus) (Thie´ry et al., 2006). Demikian pula dengan vaksin inaktif E. coli  pembawa  protein  rekombinan  dinding  virus (capsid)  RSIV  (351R),  18R,  dan  MCP  (mayor  capsid protein) mampu meningkatkan daya tahan ikan kakap merah (red sea bream/Pagrus major) dan kerapu bebek terhadap  infeksi  iridovirus  (Shimmoto  et  al.,  2010; Mahardika & Mastuti, 2015).

## Kualitas  Air  dan  Populasi  Bakteri
Hasil pengamatan suhu pada pagi hari pukul 8:00- 9:00 berkisar antara 29°C-29,5°C; sedangkan pada sore hari pukul 3:00-4:00 berkisar antara 29°C-30°C (Tabel 4).  pH  air  pemeliharaan  larva  dari  kedua  perlakuan memperlihatkan kisaran nilai yang sama yaitu 8-8,5.
Nilai  nitrit  berada  di  bawah  10  mg/L  pada  air pemeliharaan larva di 20 hari pertama, namun terjadi sedikit peningkatan sampai hari ke-30. Kadar amonium meningkat  sampai  10  hari  pemeliharaan  larva  yang disebabkan belum adanya pergantian air sedangkan pemberian plankton sebagai peneduh dan pakan alami setiap hari mungkin ikut berperan dalam peningkatan kadar  amonium  dalam  air.  Nilai  amonium  mulai menurun  setelah  dilakukan  pergantian  air  secara perlahan.  Nilai  dissolve  oxygen  (DO)  selama pemeliharaan  larva  masih  dalam  kisaran  normal. Menurut Ismi (2014), lingkungan pemeliharaan larva harus dijaga dengan baik di musim penghujan maupun musim  kemarau.  Kondisi  lingkungan  pemeliharaan larva yang harus dijaga kestabilannya terutama suhu berkisar  antara  28°C-30°C,  pH  berkisar  8,  salinitas antara 32-34 ppt, dan DO berkisar antara 4,5-6 mg/L. Tingginya kadar amonium dalam air dapat diturunkan melalui pergantian air dengan memperhitungkan umur larva (>9 HSM).
Hasil isolasi total bakteri dalam air pemeliharaan larva  kerapu sunu  yang  diberi  vaksin maupun  tidak diberi vaksin (kontrol) menunjukkan hasil yang sama. Demikian pula dengan total Vibrio sp. memiliki nilai yang sama di kedua perlakuan (Tabel 4). Hal tersebut menunjukkan  bahwa  pemberian  vaksin  tidak memengaruhi  populasi  bakteri  dalam  air.  Vaksin berhubungan langsung terhadap imunitas larva kerapu sunu  seperti  yang  diterangkan  sebelumnya. Peningkatan total bakteri terjadi di awal pemeliharaan larva (10 hari) yaitu berkisar antara 3,3 x 10 4 -3,2 x 10 5 CFU/mL. Populasi bakteri menurun setelah pergantian air,  namun  meningkat  kembali  seiring  dengan peningkatan  umur  larva.  Populasi  bakteri  pada  air pemeliharaan larva juga dilaporkan berkisar antara 1,1 ± 0,6 x 10 4 -9,8 ± 0,5 x 10 6 CFU/mL. Populasi bakteri pada telur adalah 2,4 ± 0,4 x 10 5 -8,6 ± 1,6 x 10 6 CFU/ mL, dan pada larva adalah 2,5 ± 1,4 x 10 4 -1,6 ± 1,0 x 10 8 CFU/mL (Phatapekar et al., 2002). Bakteri tersebut didominasi oleh bakteri gram negatif.
Tabel 3. Sintasan benih kerapu sunu L. leopardus setelah di uji tantang dengan virus VNN dan GSDIV melalui perendaman selama 10 hari pengamatan
Table 3. Survival rate of coral trout grouper L. leopardus fry after challenged with VNN and GSDIV for 10 days observation
Setelah uji tantang dengan inokulum VNN After challenged with VNN Setelah uji tantang dengan inokulum GSDIV After challenged with GSDIV Tanpa vaksin (Non vaccine ) 18 ± 1.52 a 22 ± 1.67 a Vaksin (Vaccine ) 28 ± 0.89 b 35 ± 1.0 b Perlakuan Treatments Sintasan larva (Larval survival rate ) (%)

## KESIMPULAN
Aplikasi  vaksin  bivalen  (kombinasi  antara  vaksin protein  rekombinan  VNN  dan  GSDIV)  pada pemeliharaan larva kerapu sunu belum memberikan perbedaan yang nyata pada sintasan dan pertumbuhan. Hasil uji tantang VNN dan GSDIV menunjukkan bahwa vaksinasi mampu menginduksi imunitas non-spesifik pada gen MHC-I larva dan benih kerapu sunu dengan memberikan sintasan yang berbeda.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini dibiayai dari APBN dalam DIPA Balai Besar Riset Budidaya Laut dan Penyuluhan Perikanan, Gondol tahun 2017. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Sri Suratmi, Bapak Ketut Arya M. Sudewa, Bapak Putu Suarjana, Bapak  Gusti Oka Suarjana, Bapak
Made  Sulandra,  Bapak  Karyanto,  dan  Bapak  Dedi Rohaniawan  selaku  teknisi  litkayasa  pada  hatchery kerapu sunu dan Laboratorium Patologi, BBRBLPP yang telah  membantu  dalam  pelaksanaan  penelitian  ini. Terima kasih pula penulis ucapkan atas masukan, sa- ran, dan perbaikan  yang diberikan  oleh Bapak  Prof. Dr. Ketut Sugama.

## DAFTAR  ACUAN
Aslianti, T., Suwirya, K., & Asmanik. (2008). Teknologi pemeliharaan  larva  kerapu  sunu  (Plectropomus leopardus)  secara  massal.  Jurnal  Riset  Akuakultur, 3(1), 1-11.
Caipang,  C.M.A.,  Takano,  T.,  Hirono,  I.,  &  Aoki,  T. (2006).  Genetic  vaccine  protect  red  sea  bream iridovirus, Pagrus major, upon challenge with red
Tabel 4. Nilai kualitas air dan populasi bakteri air selama 50 hari pemeliharaan larva kerapu suhu di hatcheri Table 4. The water quality value and bacterial population in the larval rearing of coral trout grouper in hatchery for 50 days
~10 ~20 ~30 ~40 ~50 Vaksin (Vaccine ) 29-29.5 29.3-29.5 29-29.5 29-29.5 29-29.5 Tanpa vaksin Non vaccine 29-29.5 29-29.5 29-29.5 29-29.5 29-29.5 Vaksin (Vaccine ) 29.3-30 29.5-30 29.3-30 29.5-30 29.5-30 Tanpa vaksin Non vaccine 29.5-30 29.5-30 29-30 29.5-30 29.5-30 Vaksin (Vaccine ) 8.3-8.5 8-8.5 8.2-8.5 8.3-8.5 8.5 Tanpa vaksin Non vaccine 8.2-8.5 8-8.5 8.2-8.5 8.3-8.5 8.5 Vaksin (Vaccine ) 0-0.5 0-0.8 0.5-1.8 0.5 0.5 Tanpa vaksin Non vaccine 0-0.5 0-0.6 0.7-1.8 0.7-0.8 0.5 Vaksin (Vaccine ) 0-1 0.5-1.2 0.4-0.8 0.3-0.4 0.4 Tanpa vaksin Non vaccine 0-1 0.7-1.3 0.3-0.7 0.3 0.4 Vaksin (Vaccine ) 6-6.2 5.6-6.1 4.8-5.6 5.6-6 6.2 Tanpa vaksin Non vaccine 6-6.2 5.6-.2 4.6-5.6 5.6-6 6.2 Vaksin (Vaccine ) 3.3x10 4 -3.2x10 5 2-3x10 4 1.8-5.6x10 4 6x10 4 -4.4x10 5 4.5-7.4x10 5 Tanpa vaksin Non vaccine 6.7x10 4 -2.3x10 5 1-2.8x10 4 1.9-4.7x10 4 3x10 4 -6.7x10 5 4-7.6x10 5 Vaksin (Vaccine ) 1.2-9x10 2 2.3x10 2 -3.7x10 3 1.9-2.5x10 3 2.4-2.8x10 3 2.2-4.5x10 3 Tanpa vaksin Non vaccine 2.5-8.2x10 2 2.9x10 2 -2.4x10 3 2.1-2.3x10 3 2.3-2.7x10 3 2.5-4.3x10 3 Oksigen terlarut
Dissolved oxygen /DO (mg/L)

## Total bakteri air
Total bacteri in the water (CFU/mL)
Total Vibrio  sp.
Total  Vibrio  sp. in the water
(CFU/mL) pH Nitrit (Nitrite ) (NO 2 : mg/L) Amonium (Ammonium ) (NH 4 : mg/L)
Parameter uji Parameter Hasil pengamatan per 10 hari (Result among 10 days observation )

## Suhu air pagi
Water temperature in the morning  (°C) Suhu air sore Water temperature in the afternoon  (°C) Perlakuan Treatments
sea bream iridovirus (RSIV). Fish and Shellfish Im- munology, 21, 130-138.
Cherif, N. & Fatma, A. (2017). Nodavirus in wild fish population collected around aquaculture cage sites from coastal area of Tunisia. Fisheries and Aquacul- ture Journal, 8(3), 1-6.
Husgaro,  S.,  Grotmol,  S.,  Hjeltnes,  B.K.,  Rodseth, O.M., & Biering, E. (2001). Immune response to a recombinant  capsid  protein  of  striped  jack  ner- vous necrosis virus (SJNNV) in turbot Scophthalmus maximus  and  Atlantic  halibut  Hippoglossus hippoglossus, and evaluation of a vaccine against SJNNV. Dis. Aquat. Org., 45, 33-44.
Ismi, S. (2014). Aplikasi teknologi pembenihan kerapu untuk mendukung pengembangan budidaya laut. Jurnal  Ilmu  dan  Teknologi  Kelautan  Tropis,  6(1), 109-119.
Kai, Y-H. & Chi, S-C. (2008). Efficacies of inactivated vaccines against betanodavirus in grouper larvae (Epinephelus  coioides)  by  bath  immunization.  Vac- cine, 26, 1450-1457.
Kai, Y-H., Wu, Y-C., & Chi, S-C. (2014). Immune gene expressions in grouper larvae (Epinephelus coioides) induced by bath and oral vaccinations with inacti- vated betanodavirus. Fish & Shellfish Immunology, 40, 563-569.
Lin, C-C., Lin, J.H-Y., Chen, M-S., & Yang, H-L. (2007). An  oral  nervous  necrosis  virus  vaccine  that  in- duces  protective  immunity  in  larvae  of  grouper (Epinephelus coioides). Aquaculture, 268, 265-273.
Magnadottír, B. (2006) Innate immunity of fish (over- view). Fish and Shellfish Immunology, 20, 137-151. Mahardika,  K.,  Koesharyani,  I.,  &  Tridjoko.  (2002). Upaya pencegahan penyakit viral nervous necro- sis pada juvenil kerapu bebek (Cromileptes altivelis) melalui vaksinasi. Jurnal Penelitian Perikanan Indo- nesia (Edisi Akuakultur), 8(5), 1-7.
Mahardika, K. & Mastuti, I. (2015). The effects of crude recombinant  viral  protein  vaccine  against  grou- per  sleepy  disease  iridovirus  (GSDIV)  on  hump- back grouper (Cromileptes altivelis). Indonesian Aquac- ulture Journal, 10(2), 163-172.
Mahardika,  K.,  Mastuti,  I.,  Muzaki,  A.,  &  Sudewi. (2016a). Addition of adjuvants in recombinant sub- unit vaccines for the prevention of grouper sleepy disease iridovirus (GSDIV) infection in humpback grouper, Cromileptes altivelis. Indonesian Aquaculture Journal, 11(2), 87-95.
Mahardika,  K.,  Mastuti,  I.,  Sudewi,  Muzaki,  A.,  & Zafran (2016b). Uji efektivitas vaksin rekombinan dalam pencegahan infeksi virus pada ikan kerapu.
Laporan Teknis Akhir Kegiatan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Budidaya Laut, Gondol, Bali. hlm. 1-18.
Melianawati, R., Andamari, R., & Suwirya, K. (2006).
Penggunaan kuning telur ayam sebagai alternatif pakan  awal  bagi  larva  ikan  kerapu  sunu (Plectropomus leopardus). J. Aquacultura Indonesiana, 7(1), 27-35.
Murwantoko, Widada, J., & Nuraini, Y.L. (2008). Clon- ing and sequence analysis of coat protein gene of betanodavirus,  the  causative  agent  of  viral  ner- vous necrosis of grouper. Indonesian Journal of Bio- technology, 13(1), 1048-1054.
Novriadi,  R.,  Agustatik,  S.,  &  Dwi,  T.O.N.  (2015). Identifikasi keberadaan viral nervous necrosis dan iridovirus pada budidaya ikan laut di wilayah kerja Balai  Perikanan  Budidaya  Laut  Batam.  Omni- Akuatika, 14(20), 54-62.
Phatapekar, P.V., Kenkre, V.D., Spreepada, R.A., Desai, U.M., & Achuthankutty, C.T. (2002). Bacterial flora associated with larval rearing of the giant fresh- water prawn, Macrobrachium rosenbergii. Aquacul- ture, 203, 279-291.
Sommerset, I., Skern, R., Biering, E., Bleie, H., Fiksdal, I.U.,  Grove,  S.,  &  Nerland,  A.H.  (2005).  Protec- tion against Atlantic halibut nodavirus in turbot is induced by recombinant  capsid protein vacci- nation  but  not  following  DNA  vaccination.  Fish Shellfish Immunology, 18, 13-29.
Suwirya, K. & Giri, N.A. (2010). Usaha pengembangan budidaya ikan kerapu sunu, Plectropomus leopardus di  Indonesia.  Prosiding  Forum  Inovasi  Teknologi Akuakultur  (hlm.  307-314).  Pusat  Penelitian  dan pengembangan  Perikanan,  Badan  Penelitian  dan Pengembangan Kelautan dan Perikanan.
Shimmoto,  H.,  Kawai,  K.,  Ikawa,  T.,  &  Oshima,  S. (2010). Protection of red sea bream Pagrus major against red sea bream iridovirus infection by vac- cination with a recombinant viral protein. Micro- biology and Immunology, 54, 135-142.
Thie´ry,  R.,  Cozien,  J.,  Cabon,  J.,  Lamour,  F.,  Baud, M., & Schneemann, A. (2006). Induction of a pro- tective  immune  response  against  viral  nervous necrosis  in  the  European  sea  bass  Dicentrarchus labrax by using betanodavirus virus-like particles. Journal of Virology, 80(20), 10201-10207.
Uribe, C., Folch, H., Enriquez, R., & Moran, G. (2011). Innate  and  adaptive  immunity  in  teleost  fish:  a review. Vet. Med., 56, 486-503.
Wedekind,  C.,  Walker,  M.,  Portmann,  J.,  Cenni,  B., Mu, R., & Binz, T. (2004). MHC-linked susceptibil-
ity  to  a  bacterial  infection,  but  no  MHC-linked cryptic  female  choice  in  whiteûsh.  J.  Evol.  Biol., 17, 11-18.
Yahunar,  U.,  Musa,  M.,  Rahayu,  D.T.,  &  Arfiati,  D. (2016). Identification of plankton on fish pond of Oreochromis niloticus infected by viral nervous ne-
crosis.  Research  Journal  of  Life  Science,  03(02), 119-128.
Zafran. (2016).  Efektivitas  kombinasi  vaksin  bakteri polivalen dengan vaksin anti grouper sleepy dis- ease iridovirus (GSDIV) pada  ikan kerapu macan (Epinephelus  fuscoguttatus).  Berita  Biologi,  15(1), 95-100.