Isolasi dan Karakterisasi Bakteri pada Ikan Kembung ( Rastrelliger sp.) Asin Berkitosan
Isolation and Characterization of Bacteria on Dried-Salted Mackerel ( Rastrelliger sp.) with Chitosan Addition
Diana AGUSTINA 1 , Cut YULVIZAR 2 dan Risa NURSANTY 3
Email: Yunda_mnz@yahoo.com
1,2,3, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Syiah Kuala
Darussalam - Banda Aceh (23111)
Abstract . Chitosan as antibacterial can be used to preserve fish. The research aims to isolate and characterize bacteria on dried-salted mackerel ( Rastrelliger sp.) with addition of chitosan as an edible coating. We conducted the research from May to  August 2012 at  Laboratory  of Microbiology  Syiah  Kuala  University,  Banda  Aceh.  Descriptive  method  were  used  in  this research. The result showed that there were six isolates varied morphological colony and cell. The forms  of colony  and  cell  morphology  were  circular  (50%),  convex  elevation  (33,3%), entire  margin  (50%),  yellow  color  (66,7%),  gram  positive  (66,7%),  cocci  shape  (100%), nonspore (66,7%) and motile (66,7%).
Keywords: Chitosan concentrations, Rastrelliger sp., isolate and characterize
Abstrak .  Kitosan  memiliki  sifat  antibakteri  sehingga  dapat  dimanfaatkan  sebagai  bahan pengawet ikan. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Universitas Syiah Kuala, Banda Aceh dari bulan Mei sampai Agustus 2012, untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri pada ikan kembung ( Rastrelliger sp.) asin berkitosan. Metode yang digunakan dalam penelitian  ini  deskriptif. Dari  hasil  isolasi  didapat  enam  isolat  yang  memiliki morfologi  koloni dan sel  yang berbeda. Isolat  yang memiliki bentuk bundar (50%),  elevasi cembung (33,3%), tepian  licin  (50%)  warna  kuning  (66,7%),  sel  bakteri  gram  positif  (66,7%),  bentuk  sel  bulat (100%), tidak berspora (66,7%) dan bersifat motil (66,7%).
Kata kunci : konsentrasi kitosan, Rastrelliger sp., isolasi dan karakterisasi

## PENDAHULUAN
Perairan
Indonesia
memiliki
potensi
perikanan  yang  besar  sekitar  7,6  juta ton/tahun.  Ikan  kembung  ( Rastrelliger sp.) merupakan  salah  satu  ikan  yang  tersebar  di seluruh  laut  Indonesia  (Heruwati,  2002).  Ikan ini umumnya banyak terdapat di perairan laut Jawa,  Selat  Malaka  dan  Selat  Sunda (Wudianto et al. , 2004). Tubuh ikan mengandung 80%  kadar air dan mempunyai pH > 5,3.  Kondisi  ini  sangat  baik  untuk pertumbuhan  bakteri  pembusuk,  untuk  itu perlu dilakukan pengawetan pada ikan segar. Pengawetan tradisional yang sering dilakukan oleh masyarakat yaitu dengan cara
penggaraman  dan  pengeringan  atau  yang lebih  dikenal dengan  ikan  asin  (Afrianto  dan Liviawaty, 1989).
Masyarakat  sering  menambahkan  larutan formalin  sebagai  pengawet  yang  bertujuan agar  memiliki  daya  simpan  yang  lebih  lama dan  tidak  membuat  ikan  menjadi  rusak. Pemakaian  formalin  tidak  dianjurkan  karena mengandung  zat  formaldehid  yang  bersifat racun bagi manusia (Purwani dan Muwakhidah,  2008).  Salah  satu  pengganti pengawet  kimia  yang  aman  dan  ramah lingkungan adalah kitosan.
Kitosan sebagai edible coating dapat berfungsi
sebagai
antimikroba
yang digunakan  pada  pengawetan  ikan. Edible coating merupakan  bahan  pelapis  makanan yang dapat langsung dimakan. Lapisan edible yang  terbentuk  pada  permukaan  ternyata dapat  memperpanjang  masa  simpan  dengan cara menahan laju respirasi dan pertumbuhan mikroba (Suptijah et al. , 2008).
Penggunaan  kitosan  sebagai edible  coating pada  produk  perikanan  khususnya  ikan  asin masih  sangat  terbatas,  berdasarkan  hal tersebut penting dilakukan isolasi dan karakterisasi  morfologi  bakteri pada ikan kembung ( Rastrelliger sp.) asin berkitosan.

## METODOLOGI
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan kembung ( Rastrelliger sp.)  dengan ukuran rata-rata 18 cm, garam dapur, NaCl 10%, serbuk kitosan, larutan  asam  asetat  (CH 3 COOH)  2%  (v/v), media Nutrient  Agar (NA),  media Sulfid  Indol Motility (SIM),  ungu  kristal-iodium,  alkohol 95%,  safranin, lugol, malachite  green , akuades,  minyak  emersi,  kapas,  aluminium foil dan plastik pembungkus .
Alat-alat  yang digunakan dalam penelitian ini adalah  cawan  petri,  tabung  reaksi,  blender, erlenmeyer, magnetic  stirer , pinset,  pipet tetes,  gelas  kimia,  gelas  ukur,  kaca  objek, kaca  penutup,  jarum  inokulasi,  bunsen, autoklaf, inkubator, hot plate , mortar porselen,  mikroskop  cahaya,  timbangan digital,  baskom  plastik,  jaring  kawat,  plastik mika bening, tampah dan kamera digital.

## Sterilisasi alat dan bahan
Alat-alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini seperti, cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer,  gelas  ukur,  beserta  media  yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri disterilisasi  dengan  menggunakan  autoklaf dengan  suhu  121 0 C  selama  15  menit (Hadioetomo, 1993).
Pengolahan  ikan  kembung  ( Rastrelliger sp.) asin
Proses pengolahan ikan kembung ( Rastrelliger sp.)  asin  terlebih  dahulu  dengan memilih  ikan  kembung  sebanyak  15  ekor dengan  ukuran  rata-rata  18  cm.  Selanjutnya ikan  dibersihkan  dengan  membuang  isi  perut dan  usus  ikan.  Kemudian  ikan  dibelah menjadi dua bagian tanpa terputus selanjutnya  dicuci  sampai  bersih.  Ikan  yang sudah  bersih  ditiriskan  dalam  keranjang dengan  bagian  dalam  ikan  menghadap  ke bawah agar air tidak mengendap dan sampai tidak  ada  lagi  air  yang  menetes.  Selanjutnya proses  penggaraman  ikan  dimulai  dengan membuat  garam  10%,  dengan  menimbang sebanyak  100  g  garam  dapur  dan  dilarutkan dalam  air    hingga  mencapai  volume  1  liter. Setelah  terlarut  sempurna,  kotoran  yang terdapat  dalam  larutan  garam  dibuang.  Ikan dan  larutan  garam  dicampur  rata  dalam ember  sampai  semua  ikan  terendam  dalam larutan  garam,  selanjutnya  ditutup  dan  ikan dibiarkan terendam dalam larutan garam kira- kira  8  jam.  Setelah  proses  penggaraman selesai,  ikan  diletakkan  di  atas  tampah  dan ditutup dengan plastik agar tidak terkontaminasi  dengan  lingkungan  luar  dan bagian atas plastik dilubangi agar mengurangi  proses  penguapan.  Selanjutnya ikan  dijemur  dibawah  sinar  matahari  sampai setengah  kering  kira-kira  2  hari  (Sedjati  and Agustini, 2007).

## Proses pencelupan ikan dalam larutan kitosan
Penelitian  ini  menggunakan  ikan  kembung ( Rastrelliger sp.)  asin  berkitosan  1,5%  dan 3%  serta  tanpa  kitosan.  Sebanyak  1,5  g  dan 3  g  serbuk  kitosan  dihaluskan  menggunakan blender dan dicampur dengan 100 ml larutan asam  asetat  2%    kemudian  diaduk  sampai terlarut. Selanjutnya ikan  yang sudah dijemur setengah  kering  dicelupkan  ke  dalam  larutan kitosan  1,5%    dan  sebagian  lagi  dicelupkan pada  konsentrasi  3%  selama  1  menit kemudian ditiriskan. Ikan yang sudah dicelupkan  larutan  kitosan  dijemur  kembali dibawah sinar matahari    kira-kira 8 jam.

## Isolasi dan karakterisasi morfologi bakteri
Koloni-koloni  bakteri  yang  terpisah  dan tampak  berbeda  masing-masing  diambil sebanyak satu jarum inokulasi dan dikulturkan  ke  media  NA  (yang  telah ditambahkan  NaCl  sebanyak  10%)  meng- gunakan  metode  cawan  gores.  Kemudian diinkubasi  pada  suhu  37 0 C  selama  48  jam (Savitri,  2006).  Tahapan  berikutnya  adalah pengamatan  terhadap  morfologi  koloni  yang meliputi  bentuk,  warna,  ukuran,  tepian  dan elevasi  koloni.  Pengamatan  morfologi  sel meliputi  uji  pewarnaan  Gram,  pewarnaan spora,  bentuk  sel  dan  uji  pergerakan  bakteri atau motilitas (Hadioetomo, 1993).
Pengamatan bentuk sel dilakukan bersamaan dengan  hasil  pewarnaan  Gram.  Tahapan pewarnaan  Gram  dilakukan  sebagai  berikut, sebanyak  satu  sampai  dengan  dua  tetes akuades diteteskan pada kaca objek, selanjutnya  diambil  koloni  tunggal  dari masing-masing  isolat  bakteri  menggunakan jarum  inokulasi  kemudian  disebar  secara merata.  Olesan  bakteri  dibiarkan  kering  dan difiksasi.  Selanjutnya  olesan  bakteri  ditetesi dengan  larutan  ungu  kristal-iodium  selama satu  menit  dan  dibilas  dengan  akuades. Olesan  kemudian  ditetesi  larutan  iodium selama  dua  menit  serta  dibilas  kembali dengan  akuades.  Olesan  selanjutnya  ditetesi alkohol  95%  selama  10  detik  sampai  zat warna  tidak  luntur  lagi  dan  dibilas  dengan akuades. Tahap akhir dari proses pewarnaan adalah  dengan  menambahkan  pewarnaan pembanding  yaitu  safranin  selama  10-15 detik dan dibilas dengan akuades. Selanjutnya  ditetesi  dengan  minyak  emersi, lalu  dilihat  bentuk  dan  warna  sel  bakteri di bawah mikroskop dengan pembesaran 40x10 (Hadioetomo,1993).
Tahapan  selanjutnya  adalah  pewarnaan spora.  Sebanyak  satu  sampai  dua  tetes akuades diteteskan pada kaca objek, selanjutnya  diambil  koloni  tunggal  dari masing-masing isolat bakteri dengan menggunakan  jarum  inokulasi  kemudian disebar  secara  merata.  Olesan  bakteri dibiarkan  kering  dan  difiksasi.  Selanjutnya ditetesi pewarna malachite green dan dibiarkan  kering  selama  dua  menit  dengan pemanasan  dan  dijaga  agar  pewarna  tidak
menguap  atau  mendidih.  Dibilas  dengan menggunakan  akuades.  Selanjutnya  ditetesi safranin  selama  30  detik  dan  dibilas  kembali menggunakan  akuades  dan  dikeringkan dengan menggunakan tissue . Ditetesi minyak emersi dan dilihat dibawah mikroskop dengan pembesaran 40x10 (Sunatmo, 2007).
Uji pergerakan bakteri atau motilitas dilakukan  dengan  cara  mengambil  isolat bakteri menggunakan  jarum  inokulasi  yang lurus  bagian  ujungnya.  Selanjutnya  isolat bakteri  ditusukkan  ke  dalam  media Sulfid Indol  Motility (SIM) . Kemudian  diinkubasi pada  suhu  37 0 C  selama  24  jam.  Bila pertumbuhan  jauh  menyebar  dari  daerah bekas tusukan pada media, artinya pergerakan positif (Fardiaz, 1992).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa sebanyak  6  isolat  berhasil  diisolasi  dari sampel  ikan  kembung  ( Rastrelliger sp.)  asin berkitosan. Keenam isolat tersebut menunjukkan  karakterisasi  morfologi koloni dan  sel  yang  berbeda-beda.  Jumlah  isolat yang  diperoleh  tidak  berbeda  jauh  dengan hasil penelitian-penelitian sebelumnya.
Pada Tabel 1 dapat dilihat adanya tiga koloni isolat (50%) dengan bentuk bundar dan  yang tidak  beraturan,  sebanyak  tiga  isolat (50%) koloni dengan tepian licin, dan sebanyak dua isolat  (33,3%)  dengan  tepian  berombak  dan satu  isolat  (16,7%)  dengan  tepian  yang  tidak beraturan.  Dua  koloni  isolat  (33,3%)  dengan elevasi  cembung,  diikuti dengan  satu  koloni isolat  (16,7%)  dengan  elevasi koloni  timbul dan  elevasi  datar.  Sebanyak  empat  isolat (66,7%)  dengan  warna  kuning  dan  sebanyak dua  isolat  (33,3%)  dengan  warna  krem. Koloni  bakteri  yang  memiliki  warna  kuning diduga memiliki pigmen karatenoid. Sedangkan  koloni  bakteri  yang  memiliki warna krem  diduga  bahwa  koloni  tersebut tidak mempunyai pigmen. Menurut Sudarsono (2008),  warna  pada koloni bakteri disebabkan  karena  adanya  pigmen  yang dihasilkan  oleh  bakteri.  Pigmen  karatenoid salah  satunya  akan  memberikan  warna kuning (Sudarsono, 2008).

## Tabel 1. Karakterisasi morfologi koloni bakteri
Morfologi Koloni dan Sel Bakteri No Kode isolat Bentuk Elevasi Tepian 1 IAK 01 Bundar Cem bung Licin 2 IAK 02 Bundar Cem bung Licin 3 IAK 03 Bundar Timbul Licin 4 IAK 04 Tidak beraturan Timbul Berombak 5 IAK 05 Tidak beraturan Datar Tidak beraturan 6 IAK 06 Tidak beraturan Datar Berombak
Tabel 2 menunjukkan bahwa dari enam isolat yang  diperoleh,  empat  isolat diantaranya (66,7%)  bersifat  gram  positif;    dua  isolat
(33,3%)  termasuk  bakteri  gram  negatif Sunatmo  (2007);  Madigan et  al. (2011);  dan Hadioetomo  (1993)    menyatakan bahwa perbedaan reaksi pewarnaan Gram berdasarkan  komposisi  dinding  sel  bakteri. Dinding sel bakteri gram negatif terdiri dari 5- 20% peptidoglikan, selebihnya adalah polisakarida,  sedangkan  dinding  sel  bakteri gram  positif  mengandung  90%  peptidoglikan selebihnya  adalah  asam  teikoat.  Sel  bakteri gram  positif  terlihat  berwarna  ungu  karena dapat  membentuk  ikatan    komplek  dengan pewarna  pertama  yaitu  komplek  ungu  kristal- iodium.  Pada  sel  bakteri  gram  negatif pemberian larutan alkohol 95% dapat meningkatkan  porositas  dinding  sel  dengan melarutkan lipid pada membran luar sehingga komplek  ungu  kristal-iodium  akan  terlepas dan  sel  menjadi  tidak  berwarna. Selanjutnya sel  akan  berwarna  merah  karena  terwarnai oleh warna pembanding yaitu safranin.
Pada Tabel  2  juga  dapat  dilihat  adanya empat  isolat  (66,7%)  yang  tidak  berspora. Hal  ini kemungkinan  disebabkan  karena  sel vegetatif    bakteri  tersebut  masih  berumur sangat  muda  dan  sel  vegetatif  belum melepaskan endospora menjadi spora bebas. Sedangkan  sebanyak  dua  isolat  (33,3%) yang  berspora.  Spora  bakteri  adalah  bentuk bakteri  dalam  mempertahankan  diri  dari pengaruh  lingkungan  luar.  (Fardiaz,  1992), jika  sel  semakin  tua  maka  sel  vegetatif  akan pecah  sehingga  endospora  akan  terlepas menjadi spora bebas. Spora akan lebih tahan lama  dalam  keadaan  yang  ekstrim,  misalnya dalam  keadaan  kering,  panas  atau  adanya bahan kimia yang beracun. Menurut
Hadioetomo (1993), spora juga tahan terhadap  pewarnaan.  Spora  yang telah berhasil  diwarnai  akan  sulit  melepaskan  zat warna  yang  telah  diserap  sehingga  tidak dapat  mengikat  zat  warna  yang  diberikan berikutnya.  Hal  ini  disebabkan  karena  spora memiliki  selubung  yang  keras  dan  tebal. (Sunatmo,  2007).  Zat  warna  yang  digunakan dalam  pewarnaan  spora  adalah malachite green yang  akan  tetap  diikat  oleh  spora bakteri  setelah  pencucian  dengan  larutan safranin. Spora yang bebas  akan  berwarna hijau-biru  dan  sel  vegetatif  akan  berwarna merah.

## Tabel 2. Morfologi sel bakteri
Morfologi Koloni dan Sel Bakteri No Kode isolat Gram Ben- tuk Spora Moti Litas 1 IAK 01 Negatif Kokus Ber spora Non Motil 2 IAK 02 Positif Kokus Tidak ber Spora Motil 3 IAK 03 Negatif Kokus Tidak ber spora Motil 4 IAK 04 Positif Kokus Tidak ber spora Non Motil 5 IAK 05 Positif Kokus Tidak ber spora Motil 6 IAK 06 Positif Kokus Ber spora Motil Keterangan : 
IAK : Ikan Asin Kitosan
 01, 02, 03,...........,06 : sistematika penomoran
Hasil pengamatan lanjutan  dengan uji motilitas dapat  dilihat pada  Tabel  4.2. Sebanyak empat isolat (66,7%) bersifat motil. Hal ini ditunjukkan dengan adanya penyebaran bakteri pada media. Bakteri yang bersifat  motil  disebabkan  bakteri  tersebut mempunyai  flagella.  Sedangkan  sebanyak dua  isolat  (33,3%)  yang  bersifat  non-motil. Hal  ini  disebabkan  karena  bakteri  tersebut tidak  memiliki  flagella.  Kebanyakan  bentuk sel  bakteri  kokus  memiliki  flagella.  Flagella merupakan  salah  satu  struktur  utama  di  luar sel  bakteri  yang berfungsi  dalam  pergerakan (motilitas)  pada  sel  bakteri. Tetapi,  menurut Ristiati  (2000),  tidak  semua  bakteri  memiliki flagella.    Banyak  spesies Bacillus dan Spirilum memiliki  flagella  pada  sel  nya  tetapi jarang dijumpai pada sel kokus

## KESIMPULAN
Jumlah isolat yang diperoleh dari sampel ikan kembung  ( Rastrelliger sp.)  asin  berkitosan sebanyak  6  isolat  dengan  karakteristik  yang berbeda-beda. Karakterisasi morfologi koloni menunjukkan hasil yang berbeda-beda. Sebanyak  tiga  (50%)  bentuk  bundar;  tiga isolat  (50%)  tepian  licin;  dua  koloni  isolat (33,3%)  elevasi  cembung;  tiga  isolat (50%) warna  kuning. Karakterisasi  morfologi  sel yang  diperoleh: empat  isolat  (66,7%)  bersifat gram  positif;  empat  isolat  (66,7%)  tidak berspora; dan empat  isolat  (66,7%)  bersifat motil.

## REFERENSI
Afrianto E dan Liviawaty E. 1989.
Pengawetan  dan  Pengolahan  Ikan . Penerbit Kanisius. Yogyakarta.
Fardiaz  S .  1992. Mikrobiologi  Pangan 1.  PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Hadioetomo  RS .  1993. Mikrobiologi  Dasar Dalam  Praktek  Teknik  dan  Prosedur
Dasar Laboratorium . Penerbit Gramedia, Jakarta. Heruwati ES. 2002. Pengolahan Ikan Secara Tradisional  :  Prospek  dan  Peluang Pengembangan. Jurnal Penelitian Perkembangan Pertanian, 21(3).
Madigan  MT,  Martinko JM,  Stahl DA,  and Clark D .  2011. Biology  of  Micro- organisms Thirteenth  Edition.  Pearson Education International. USA.
Purwani  E  dan  Muwakhidah .  2008.  Efek Berbagai  Pengawet  Alami  Sebagai pengganti  Formalin  Terhadap  Sifat Organoleptik dan Masa Simpan
Daging  dan  Ikan. Jurnal  Penelitian
Sains dan Teknologi . 9 (1): 1-14.
Ristiati  PN .  2000. Pengantar  Mikrobiologi Umum . Departemen Pendidikan Nasional.
Savitri SDN .  2006.  Isolasi  dan  Karakterisasi Bakteri  Halotoleran  pada  Peda  Ikan
Kembung  ( Rastrelliger sp.). Skripsi . Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Sedjati S and Agustini WT . 2007. The Effect of Chitosan Concentration and Storage Time  and  The  Quality  of  Salted-  Dried Anhovy ( Stolephorus heterolobus ). Jurnal of Coastal Development . 10 (2): 63-71.
Suptijah P,  Gushagia P,  dan  Sukarsa DR . 2008.  Kajian    Efek  Daya  Hambat Kitosan  Terhadap  Kemunduran  Mutu
Fillet Ikan Patin ( Pangasius hypopthalmus )  Pada  Penyimpanan
Suhu  Ruang. Buletin  Teknologi  Hasil Perikanan. XI (2): 89-100. Sudarsono A . 2008. Isolasi dan Karakterisasi  Bakteri  pada  Ikan  Laut dalam Spesies
Ikan Gindara ( Lepidocibium flavobronneum ). Skripsi . Bogor: Institut Pertanian Bogor
Sunatmo TI .  2007. Eksperimen  Mikrobiologi Dalam  Laboratorium . Penerbit  Ardy Agency, Bogor.
Wudianto,  Mahiswara  dan  Anugrah PA . 2004. Memancing  di  Perairan  Tawar dan  di  Laut .  Penebar  Swadaya. Jakarta.