Isolasi dan Karakterisasi Fungi Endofit dari Daun Tanaman Bintaro ( Cerbera odollam ) yang Berpotensi sebagai Antibakteri Suwandi Wonowijaya (a*) , Lisa Soegianto a
Suwandi Wonowijaya* (a) dan Lisa Soegianto (a)
a Fakultas Farmasi Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya
Kebutuhan  antibiotik  yang  semakin  meningkat  memacu  untuk  menemukan  senyawa  yang  mempunyai  aktivitas antimikroba dari bahan alam. Salah satu cara untuk mendapatkan senyawa antimikroba adalah melalui fungi endofit. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi fungi endofit yang didapat dari daun tanaman Bintaro ( Cerbera odollam ) yang berpotensi sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Eschericia coli. Permukaan daun disterilisasi dengan cara direndam dalam alkohol 70% selama 2 menit, natrium hipoklorit 5,3% selama 5 menit, alkohol 70% selama 1 menit, dibilas menggunakan akuades steril dan dikeringkan menggunakan tisu steril. Daun Bintaro yang sudah disterilisasi ditanam pada media Potato Dextrose Agar (PDA) kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 7- 14 hari. Fungi yang tumbuh diinokulasikan pada media Potato Dextrose Yeast (PDY) selama 7-14 hari pada suhu ruang berdasarkan  perbedaan  makroskopisnya.  Fungi  endofit  yang  sudah  murni  secara  makroskopis  diuji  aktivitas antibakterinya  pada  bakteri Staphylococcus  aureus dan Escherichia  coli dilanjutkan  pengamatan  makroskopis  dan mikroskopisnya.  Diperoleh  tiga  jenis  fungi  endofit  yang  diisolasi  dari  daun  tanaman  bintaro  ( Cerbera  odollam )  dengan kode  EB  1,  EB  2,  dan  EB  3  yang  diduga  genus  Fusarium,  Geotrichum  dan  Aspergillus.  Hasil  uji  aktivitas  antibakteri menunjukkan ketiga fungi endofit yang diperoleh tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Eschericia coli .
Kata Kunci: Fungi endofit, daun bintaro, Cerbera odollam.

## Isolation and Characterization of Endophytic Fungi from Bintaro

## ( Cerbera odollam ) Leaves as a Potential Antibacterial Agent Suwandi
The  need  of  antibiotics  is  increasing,  spurred  to  find  compounds  that  have  antimicrobial  activity from natural ingredients.  One  way  to  obtain  antimicrobial  compounds  is  through  endophytic  fungi.  This  study  aimed  to  isolate  and characterize  endophytic  fungi  obtained  from  the  leaves  of  the  plant  Bintaro  ( Cerbera  odollam )  that  potential  as  an antibacterial against Staphylococcus aureus and Escherichia coli . Leaf surface was sterilized by soaking in 70% alcohol for 2 minutes, 5.3% sodium hypochlorite for 5 minutes, 70% alcohol for 1 minute, rinsed with sterile distilled water and dried using sterile wipes. Bintaro leaf that have been sterilized was puton Potato Dextrose Agar (PDA) and then incubated at room temperature for 7-14 days. The growing fungi was inoculated in Potato Dextrose Yeast (PDY) for 7-14 days at room temperature based on the macroscopic difference. Endophytic fungi that have been purein macroscopic way was tested antibacterial  activity  on Staphylococcus  aureus and Escherichia  coli and  continued  to  macroscopic  and  microscopic observation. Obtained three types of endophytic fungi were isolated from bintaro leaves ( Cerbera odollam ) with the code EB 1, EB 2 and EB 3 that suspected from genus Fusarium, Geotrichum and Aspergillus. The antibacterial activity test show that results of three endophytic fungi obtained has no antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Escherichia coli .
Keywords : Endopytic fungi, Bintaro leaves, Cerbera odollam .
* Corresponding  author:  Fakultas  Farmasi  Universitas  Katolik  Widya  Mandala  Surabaya,  Jl.  Raya  Kalisari Selatan No. 1 Surabaya, e-mail: suwandi097@gmail.com

## PENDAHULUAN
Kebutuhan antibiotik yang semakin meningkat,  memacu  untuk  menemukan  senyawa yang  mempunyai  aktivitas  antimikroba  pada  bahan alam . Salah satu caranya ialah dengan mengisolasi fungi  endofit.  Endofit  adalah  mikroorganisme yang  tinggal  dalam  jaringan  tanaman  dan bersimbiosis  dengan  tanaman  tersebut.  Senyawa yang  dihasilkan  oleh  mikroba  endofit  bisa berpotensi  sebagai  antidiabet,  antimikroba, antifungi,  antivirus,  antioksidan,  antiinflamasi, dan antimalaria (Kumala, 2014).
Salah  satu  tanaman  yang  berpotensi menghasilkan senyawa antimikroba ialah tanaman dari familia Apocynaceae yaitu tanaman Bintaro  yang  memiliki  fungsi  sebagai  antibakteri (Cheenpracha et  al ., 2004). Penelitian yang telah dilakukan pada tanaman Bintaro antara lain yaitu memiliki  daya  insektisida  yang  kuat  terhadap larva Spodoptera  litura (Utami,  Syaufina  dan Haneda,  2010).Pada  penelitian  yang  lainnya dilakukan  uji  potensi  antibakteri  dari  ekstrak etanol  daun  bintaro  terhadap Salmonella  typhi dan Staphylococcus  aureus .  Hasil  yang  didapat, ekstrak etanol dari daun bintaro pada konsentrasi 4% mampu memberikan Kadar Hambat Minimum  (KHM)  pada  kedua  bakteri  tersebut, tetapi  pada  konsentrasi  tersebut  belum  dapat memberikan Kadar Bunuh Minimum (KBM) yang ditandai  dengan  masih  adanya  pertumbuhan (Wulandari, 2014).
Fungi  endofit  akan  diisolasi  dari  daun tanaman  Bintaro  dengan  proses  sterilisasi permukaan.  Tujuan  dari  penelitian  ini  untuk mengisolasi  dan  mengkarakterisasi  fungi  endofit yang didapat dari daun tanaman Bintaro ( Cerbera odollam )  yang  berpotensi  sebagai  antibakteri terhadap Staphylococcus  aureus dan Eschericia coli .

## METODE PENELITIAN
Alat
Alat-alat  yang  digunakan  yaitu  gunting,  pisau bedah,  kamera  mikroskop,  vortex,  jangka  sorong, timbangan  analitis,  oven, autoclave , Laminar  Air Flow , penangas air, cawan petri, gelas ukur dan alat gelas lainnya.

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini adalah Daun tanaman Bintaro yang didapatkan dari Surabaya  Timur,  akuades,  natrium  hipoklorit (NaOCl)  5,3%,  NaCl,  etanol  96%  teknis,  etanol 70%  teknis, Mc  Farland  I,  spiritus,  larutan iodium,  larutan  laktofenol,  susu  skim, oleum coccos ,  tisu  steril, Eschericia  coli ATCC 8739, Staphylococcus  aureus ATCC  6538, Potato Dextrose  Agar dan  media-media  pertumbuhan lainnya.
Proses Determinasi, Pengamatan
Makroskopis  dan  Mikroskopis  pada  Daun Tanaman Bintaro ( Cerbera odollam )
Daun  tanaman  Bintaro  dideterminasi  oleh UPT  Materia  Media,  Batu,  Jawa  Timur  untuk penetuan kunci determinasi. Pengamatan makroskopis  meliputi  bentuk  daun,  tulang  daun, warna  daun,  ukuran  daun  dan  filotaksis  daun. Pengamatan mikroskopis meliputi bagian epidermis  atas,  stomata,  jaringan  palisade, jaringan  bunga  karang,  berkas  pembuluh  dan saluran getah.
Isolasi  Fungi  Endofit  Daun  Tanaman Bintaro ( Cerbera odollam ) Metode  yang  digunakan  ialah  sterilisasi permukaan  daun  dimana  daun  Bintaro  dipotong menjadi  5  bagian  kemudian  direndam  dalam alkohol  70%  selama  ±2  menit,natrium  hipoklorit 5,3%  selama  5  menit,alkohol  70%  selama  1  menit, dibilas  menggunakan  akuades  steril  kemudian dikeringkan.  Potongan  tersebut  ditanam  dalam media Potato  Dextrose  Agar ,  diinkubasi  pada  suhu 27ºC-30ºC selama 2-14 hari.

## Pemurnian  Fungi  Endofit  Daun  Tanaman Bintaro (Cerbera odollam)
Fungi  yang  tumbuh  dan  teramati  berbeda secara  makroskopis  dipindahkan  ke dalam tabung reaksi  yang  berisi  media Potato  Dextrose  Yeast sebanyak 5 ml lalu diinkubasi selama 2-14 hari . Fungi endofit  yang  tumbuh  dalam Potato  Dextrose  Yeast diinokulasikan  ke  dalam  media Potato  Dextrose Agar . Proses ini dilakukan berulang kali sampai fungi yang didapatkan benar-benar murni.

## Persiapan Bakteri Uji
Suspensi bakteri dibuat dengan mensuspensikan Eschericia  coli ATCC  8739  dan Staphylococcus  aureus ATCC  6538  dalam  larutan NaCl  0,9%  yang  setara  dengan  larutan Mc Farland I (± 1,5.10 8 m.o/ml) yang sudah dipastikan kemurniannya  dengan  pengamatan  makroskopis dan  mikroskopis  dengan  pengecatan  Gram  pada larutan NaCl 0,9% yang kekeruhannya disetarakan  dengan  larutan
Mc  Farland I  (±
1,5.10 8 m.o/ml).

## UjiAktivitas Antibakteri Fungi Endofit Daun
Tanaman Bintaro ( Cerbera odollam ) Eschericia coli ATCC 8739
dan Staphylococcus  aureus ATCC  6538  yang  setara dengan  larutan Mc  Farland I  dipipet  0,1  ml kemudian  dimasukkan  ke  dalam  10  ml Plate  Count Agar , dihomogenkan dengan divortex lalu dituang ke dalam cawan petri dan dilakukan pra inkubasi selama 1,5-2  jam  pada  suhu  37 o C.Fungi  endofit  yang  sudah tumbuh  pada  media Potato  Dextrose  Yeast diinokulasikan  pada  media Plate  Count  Agar tersebut. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang (27ºC- 30ºC) selama 24 jam, dilakukan pengamatan Daerah Hambatan Pertumbuhan (DHP) di sekitar fungi yang ditandai  dengan  daerah  jernih  dan  ukur  diameter Daerah  Hambatan  Pertumbuhan  (DHP)  yang terbentuk.

## Karakterisasi Fungi Endofit
Karakterisasi  fungi  meliputi  pengamatan makroskopis,  mikroskopis,  uji  biokimia  (uji hidrolisa  amilum,  uji  hidrolisa  gelatin,  uji hidrolisa  kasein,  dan  uji  hidrolisa  lemak)  dan skrining fitokimia.

## Analisis Data
Rasio diameter Daerah
Hambatan
Pertumbuhan  (DHP)  ditandai  dengan  terbentuknya daerah  jernih  di  sekitar  fungi  endofit,  diamati  dan diukur  diameternya  dengan  menggunakan  jangka sorong. Nilai rasio didapatkan dengan cara membagi diameter DHP dengan diameter kapang. Karakterisasi  disesuaikan  dengan  data  dari  hasil pengamatan  yang  didapat  dengan  pustaka  dari Watanabe (2002).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Daun  tanaman  Bintaro  dideterminasi  oleh UPT  Materia  Medika,  Batu,  Jawa  Timur. Pengamatan  makroskopis  daun  tanaman  Bintaro bisa  dilihat  pada  Tabel  1.  Pada  pengamatan mikroskopis, daun memiliki tipe berkas pembuluh bikolateral,  stomata  dengan  tipe  parasitik  dan memiliki kristal yang berbentuk prisma. Dari hasil isolasi diperoleh 3 jenis fungi endofit yang berasal dari  daun  tanaman  Bintaro  ( Cerbera  odollam ) yang bisa dilihat pada Gambar 1. Menurut Kumala (2014),  fungi  endofit  yang  diperoleh  dari  daun lebih  banyak  dari  bunga  karena  daun  memiliki permukaan  yang  luas  dan  lapisan  kutikula  yang tipis.
Pengamatan  makroskopis  dan  mikroskopis dilakukan  pada  fungi  endofit  yang  diperoleh  dari proses  isolasi.  Pengamatan  mikroskopis  dilakukan dengan cara membuat preparat hidup dengan larutan laktofenol  yang  isotonis  terhadap  fungi  dan  bersifat antiseptik  kemudian  diamati  di  mikroskop.  Isolat fungi dengan kode EB 1 memiliki makroskopis seperti tipe  koloni  filamen,  sifat  permukaan  seperti  kapas, warna putih abu-abu, usia 5 hari dan ukuran koloni 7,85  cm.  Isolat  fungi  dengan  kode  EB  2  memiliki makroskopis  seperti  tipe  koloni  filamen,  sifat permukaan seperti kapas, warna putih jingga, usia 5 hari dan ukuran koloni 8,35 cm. Isolat fungi dengan kode  EB  3 memiliki makroskopis  seperti  tipe  koloni filamen, sifat permukaan seperti beludru, warna hijau lumut, usia 5 hari dan ukuran koloni 5,35 cm. Pada pengamatan  mikroskopis  fungi  endofit  dengan  kode EB 1 memiliki mikrokonidia, EB 2 memiliki konidia dan spora, dan EB 3 memiliki fialid dan konidia.
Ketiga  fungi  yang  diperoleh  dilakukan  uji biokimianya  meliputi  uji  hidrolisa  amilum,  uji hidrolisa gelatin, uji hidrolisa kasein dan uji hidrolisa lemak.  Dari  hasil  pengujian  hidrolisa  amilum diperoleh bahwa fungi endofit dengan kode EB 1, EB 2 dan EB 3 menunjukkan hasil hidrolisa positif yang bisa  dilihat  pada  Tabel  2.  Ketiga  fungi  tersebut mampu menghasilkan enzim amilase. Pada pengujian
hidrolisa gelatin, fungi endofit dengan kode EB 1 dan 3  menghasilkan  hasil  hidrolisa  positif  yang  ditandai dengan adanya daerah jernih di sekitar fungi setelah dituangi  larutan  HgCl 2 12,6%.  Ketiga  fungi  pada  uji hidrolisa kasein mampu menghasilkan enzim kasease dimana terbentuk daerah jernih di sekitar fungi pada media Skim Milk Agar . Pada uji hidrolisa lemak, EB 1 dan EB 2 mampu menghasilkan enzim lipase dimana enzim  ini  mampu  mengubah  trigliserida  menjadi gliserol  dan  3  molekul  asam  lemak.  Hasil  skrining fitokimia menunjukkan fungi endofit dengan kode EB 2  menghasilkan  alkaloid  sedangkan  EB  3 menghasilkan saponin yang bisa dilihat pada Tabel 3.
Tabel 1. Hasil pengamatan makroskopis daun tanaman Bintaro ( Cerbera odollam ). Parameter Hasil Pengamatan *Pustaka Warna permukaan atas Warna permukaan bawah
Ukuran panjang Ukuran lebar Tulang daun Tepi daun Hijau tua
Hijau muda
26-32 cm 5-7 cm Menyirip Rata Hijau Hijau 15-20 cm 3-5 cm
Menyirip
Rata *Pranowo, 2010
Tabel  2. Hasil  pengamatan  uji  biokimia  fungi endofit  dari  daun  tanaman  Bintaro  ( Cerbera odollam ).
Fungi Endofit Hidrolisa Amilum Gelatin Kasein  Lemak EB 1 + + + + EB 2 + - + + EB 3 + + + -
Keterangan :
+: Hidrolisa positif - : Hidrolisa negatif
Tabel  3. Hasil  pengamatan  skrining  fitokimia fungi endofit dari daun tanaman Bintaro ( Cerbera odollam ).
Fungi Endofit A S F  Ta  St  T EB 1 - - - - - - EB 2 + - - - - - EB 3 - + - - - -
Ket:  A:Alkaloid;  S:Saponin;  F:Flavonoid;Ta:  Tanin;  St:Sterol;

## T:terpen
Pengamatan  mikroskopis  pada  fungi  endofit  yang diperoleh  dengan  kode  EB  1,  EB  2  dan  EB  3 disesuaikan  dengan  pustaka  Watanabe  (2002). Diduga  fungi  endofit  dengan  kode  EB  1  termasuk dalam genus Fusarium, EB 2 termasuk dalam genus Geotrichum,  dan  EB  3  termasuk  dalam  genus Aspergillus.
a b c
Fungi  endofit  yang  diperoleh  dari  proses isolasi  diuji  aktivitasnya  menggunakan  bakteri Eschericia  coli ATCC  8739  dan Staphylococcus aureus ATCC 6538. Pemilihan kedua bakteri tersebut karena sebagai perwakilan dari bakteri Gram negatif dan Gram positif. Hasil uji aktivitas antibakteri dari 3 fungi  endofit  hasil  isolasi  dari  tanaman  Bintaro ( Cerbera  odollam )  tidak  menunjukkan  daya antibakteri terhadap Eschericia coli ATCC 8739 dan Staphylococcus aureus ATCC 6538. Hal ini ditandai dengan  tidak  terbentuknya  daerah  jernih  di  sekitar fungi endofit sehingga rasio DHP untuk ketiga fungi tersebut adalah 0. Hasil uji aktivitas antibakteri bisa dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Hasil pengukuran uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri Eschericia coli ATCC 8739 dan Staphylococcus aureus ATCC 6538.
Kode Fungi Rasio Diameter DHP Eschericia coli Staphylococcus aureus EB 1 0 0 EB 2 0 0 EB 3 0 0

## KESIMPULAN
Fungi endofit yang dapat diisolasi dari daun tanaman  Bintaro  adalah  genus  Fusarium, Geotrichum  dan  Aspergillus.  Ketiga  fungi  endofit tersebut  tidak  memiliki  aktivitas  antibakteri terhadap Eschericia  coli ATCC  8739  dan Staphylococcus aureus ATCC 6538.
Gambar 1. Kultur fungi endofit murni dari daun tanaman Bintaro ( Cerbera odollam ) pada usia 5 hari pada media Potato Dextrose Agar . Keterangan : (a) EB 1, (b) EB 2, (c) EB 3.

## Daftar Pustaka
Cheenpracha, S., Karalai, C., Ratapa, Y., Ponglimanont, C. and Chantrapromma,  K.  2004,  New  Cytotoxic  Cardenolide Glycoside from the Seeds of Cerbera manghas , Chem. Pharm. Bull . 52(8): 1023-1025.
Kumala,  S.  2014, Mikroba  Endofit,  Pemanfaatan  Mikroba Endofit dalam Bidang Farmasi, ISFI Penerbitan, Jakarta. Pranowo, D. 2010, Bintaro Tanaman Penghasil Minyak Nabati, Tree , 1(23): 91.
Utami,  S.,  Syaufina,  L.  dan  Haneda,  N.F.  2010,  Daya  Racun Ekstrak  Kasar  Daun  Bintaro  ( Cerbera  odollam Gaertn.)
Terhadap  Larva Spodoptera  litura Fabricius, Jurnal  Ilmu Pertanian Indonesia , 15(2), 96-100.
Watanabe,  T.  2002, Pictorial  Atlas  of  Soil  and  Seed    Fungi Morphologies  of  Cultured  Fungi  and  Key  to  Species ,  2 nd ed., CRC Press, USA.
Wulandari,  M.A.  2014,  Potensi  Antibakteri  dan  Bioautografi Ekstrak  Etanol  Daun  Bintaro  ( Cerbera  odollam Gaertn.) terhadap Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus , Skripsi Fakultas  Farmasi  Universitas  Muhammadiyah  Surakarta, Surakarta.