Kombinasi Elektroporasi dan Aspirin Menghambat Aktivasi Nuclear Factor Kappa B (NFkB) pada Kultur Sel Mononuklear Darah Tepi Pasien Leukemia Akut
Zuly Vita Aulya*,  Maimun Z. Arthamin**, Syahrul Chilmi***, Moch. Aris Widodo****, Hidayat Sujuti***

## ABSTRAK
Leukemia  akut  (LA)  adalah  keganasan  klonal  akibat  mutasi  gen  somatik  pada  progenitor  sel hematopoietik.  Mutasi  ini  menyebabkan  pertumbuhan  sel  hematopoietik  berhenti.  Penangganan  LA  saat  ini masih menggunakan protokol kemoterapi standar dengan angka kekambuhan yang tinggi sehingga diperlukan peningkatan  dosis  yang  secara  tidak  langsung  meningkatkan  efek  samping. Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  efektifitas  dan  efisiensi  kombinasi  antara  elektroporasi  dan  aspirin  pada  kultur  sel  mononuklear darah  tepi  pasien  LA.  Penelitian  ini  adalah  studi  eksperimental  menggunakan randomized  post  test  only controlled  group  design. Sampel  penelitian  adalah  isolat  sel  mononuklear  darah  tepi  (PBMC)  pasien  LA  yang diambil dari lab PK RSSA dengan studi ex vivo yang dibagi dalam 4 kelompok dengan pemberian paparan listrik sebesar 200 Hz selama 5 detik dan aspirin dalam tiga variasi dosis (PA1 = 2,5 mmol ; PA2 = 5 mmol ; PA3 = 10 mmol). Ekspresi NFkB diidentifikasi dengan metode imunositokimia . Data yang diperoleh  dianalisis dengan uji analysis of varian (ANOVA). Adanya perbedaan ekspresi NFkB pada keempat kelompok tersebut diuji dengan post  hoc multiple  comparison  test. Penelitian  ini    menunjukkan  bahwa  pada  kelompok  PA3  ekspresi  NFkB menurun  paling  tinggi  dibandingkan  dengan  kelompok    PA1  dan  PA2.  Penelitian  ini  menyimpulkan  bahwa kombinasi  elektroporasi    dan  aspirin    dapat  meningkatkan  jumlah  kultur  sel  mononuklear  darah  tepi  pasien leukemia akut yang mengalami apoptosis setelah diberikan perlakuan dengan melihat penurunan ekspresi NFkB secara signifikan.
Kata kunci: Apoptosis, Aspirin, Leukemia akut (LA), Listrik pulsasi, NFkB.

## Combination of Elecroporation and Aspirin Inhibit Activation of Nuclear Factor Kappa B (NFkB) in Mononuclear Cell Culture of Patient Acute Leukemia’s Peripheral Blood

## ABSTRACT
Acute leukemia (AL) is a clonal malignancy caused by a somatic mutation in hematopoietic progenitor cells.  This  mutation  can  stop  hematopoietic  cells  growth.  Nowdays,  the  treatment  of  AL  used  a  standard chemotherapy  protocol  with  a  high  recurrence  rate,  hence  increased  doses  are  needed  and  consequently enhance  the  side  effects  as  well.  The  research  aimed  to  determine  the  effectiveness  and  efficiency  of electroporation  and  aspirin  combination  in  PBMCs  of  AL  patients.  Aspirin  works  by  inhibiting  NFkB  as  a transcription  factor  that  regulate  proliferation  and  apoptosis  in  cells,  whereas  transient  permeabilized  by electroporation can be used to incorporate molecules with varying sizes. Electroporation was done by expose the cells to a certain amount of electricity  therefore the uptake of aspirin  increased in minimal dose and became more effective. This research was an experimental study used post test only randomized controlled group design . The samples were peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of AL patients which taken from laboratory of clinical pathology in RSSA. The ex vivo studied was design in 4 groups by administering electric exposure at 200 Hz for 5 seconds and 3 aspirin doses (PA1 = 2,5 mmol; PA2 = 5 mmol; PA3 = 10 mmol). The expression of NFkB was  measured  by  using  immunocytochemistry.  The  amount  cells  which  expressed  NFkB  expression  were analyzed by ANOVA and the differences in the expression of NFkB within groups were then determined by using the  post  hoc  multiple  comparison  test  .  The  results  showed  that  the  PA3  had  the  lowest  expression  of  NFkB compared to PA1 and PA2. To conclude,  the combination of electroporation and aspirin were able to increase PBMCs apoptosis of AL patients by measuring the expression of NFkB.
Keywords: Acute leukemia (AL), Aspirin, Apoptosis, Electrical pulsation, NFkB.
* Program Studi Pendidikan Dokter, FKUB
**  Lab Patologi Klinik, RSSA - FKUB
***  Lab Biokimia Biomolekuler, FKUB
****  Lab Farmakologi, FKUB

## PENDAHULUAN
Leukemia  akut  merupakan  keganasan klonal pada sumsum tulang yang bisa terjadi pada  prekursor  seri  limfoid  (limfoblas)  atau myeloid (myeloblas) dengan akibat terhentinya perkembangan ( arrest of development ) sel hematopoietik normal pada sumsum  tulang.  Pada  leukemia  akut didapatkan kelainan proliferasi dan apoptosis yang  ditandai  dengan  adanya  ekspresi nuclear  factor  kappa-B (NFkB)  yang berlebihan di inti sel. 1 Berdasarkan  data  epidemiologi  WHO didapatkan  insiden  leukemia  akut  di  dunia terjadi sekitar 2,4 kasus pada setiap 100.000 populasi  per  tahun.  Sementara  di  Indonesia, insiden  leukemia  akut  diprediksi  sekitar  3,4 kasus  setiap  100.000  populasi  per  tahun. Leukemia  akut  menduduki  10  %  dari keseluruhan  kanker  pada  manusia  dan menyebabkan kematian pada anak-anak dan dewasa dibawah usia 35 tahun. 2
Saat  ini,  hanya  sekitar  20-30  %  dari pasien  LA  dewasa  saja  yang  mengalami remisi  komplit  dengan  regimen  kemoterapi standar. Sementara pada anak, sebanyak 30 %  mengalami  kegagalan  terapi.  Protokol kemoterapi  terdiri  atas  4  komponen  antara lain  fase  induksi,  konsolidasi, maintenance , dan  profilaksis  sistem  saraf  pusat.  Pada masing-masing  fase  terapi  menggunakan kombinasi agen kemoterapi dan kortikosteroid. Namun, terapi kombinasi yang ada  saat  ini  memiliki  banyak  efek  samping. Selain  harga  yang  mahal  dan  angka relaps yang  masih  tinggi,  pemberian  kemoterapi dosis  tinggi  mengakibatkan  keterlibatan sistemik  yang  menyebabkan  sel-sel  sehat yang  memiliki  proliferasi  cepat  misalnya rambut akan ikut terganggu. 3
Sejak  tahun  1999  banyak  ilmuwan  yang bereksperimen dengan menggunakan medan listrik  untuk  berbagai  macam  kepentingan medis.  Hal  ini  dikarenakan  kemampuan medan  listrik  dengan  besaran  tertentu  (yang tidak  menimbulkan  efek  kerusakan  jaringan maupun nyeri)  dalam  merubah  permeabilitas membran  sel  baik reversible maupun irreversibel bergantung  besar  voltase  yang diberikan. 4 Perubahan permeabilitas  tersebut disebabkan  oleh  pembentukan  lubang  atau pori  akibat  induksi  listrik  atau  biasa  disebut
elektroporasi.  Elektroporasi  telah  digunakan dalam banyak penelitian untuk meningkatkan uptake obat-obatan kemoterapi ke dalam sel target (sel kanker). 5
Selain  elektroporasi,  aspirin  dan  obat anti-inflamasi  non-steroid  (OAINS)  yang  lain juga diketahui mampu menginduksi apoptosis pada  sel  leukemia  kronik  dan  beberapa  sel kanker  lain.  Dari  hasil  penelitian  yang  telah dilakukan  oleh Unitat  de  Bioquimica menyatakan  bahwa  aspirin    bekerja  dengan menghambat  enzim inhibitor kappa B kinase yang  merupakan  enzim  pendegradasi  ikatan antara  inhibitor  kappa  B  pada  sitoplasma tempat NFkB dalam bentuk tidak aktif terikat. Karena  enzim  tersebut  dihambat,  maka proses  degradasi  inhibitor  kappa  B  tidak terjadi  dan  NFkB  tetap  tidak  aktif.  Dengan menekan  aktivasi  NFkB  maka  aktifitas  gen supresor  tumor  p53  yang  mengalami  mutasi dan COX-2 yang mengalami aktifasi berlebih juga terhambat dan mengakibatkan terjadinya regulasi  proliferasi  dan  apoptosis  dari  sel yang  mengalami  keganasan  tersebut. 6 Kombinasi  elektroporasi  dengan  paparan listrik  menggunakan  besaran  tertentu  dalam penelitian ini  diharapkan akan meningkatkan uptake aspirin  ke  dalam sel  target, sehingga dapat  menurunkan  dosis  terapi  aspirin dengan  menurunnya  barier  absorbsi  obat  ke intrasel.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  ini  merupakan  penelitian kuantitatif  menggunakan  eksperimen  murni pada sampel darah tepi pasien leukemia akut. Rancangan  eksperimental  yang  digunakan adalah post  test  only  randomized  controlled group design dengan subjek dibagi menjadi 4 kelompok  (K+,  PA1,  PA2,  dan  PA3)  secara random.  Kelompok  K+  adalah  sel  kultur leukemia akut yang tidak diberikan perlakuan kombinasi  listrik  pulsasi  sebesar  200  Hz selama  5  detik  dan  aspirin.  Kelompok perlakukan  terdiri  dari  PA1,  PA2,  dan  PA3 yang masing-masing diberi dosis 2,5 mmol, 5 mmol, dan 10 mmol yang disertai pemberian pulsasi listrik sebesar 200 Hz selama 5 detik. Prosedur  penelitian  yang  digunakan  adalah sebagai berikut:

## Pengumpulan  Sampel  PBMC  Pasien
Leukemia Akut Sampel sel mononuklear darah tepi atau PBMC  diambil  dari  lab  sentral  RSSA menggunakan  protokol  plebotomi  dengan spuit  steril  dan  vacutainer  3  ml  berisi antikoagulan EDTA.

## Isolasi PBMC Pasien Leukemia Akut
Sampel  dari  vacutainer  diambil  dengan mikropipet  untuk  dipindahkan  ke  tabung sentrifus.  Kemudian  ditambahkan  PBS  NaCl dengan perbandingan 1:1 dengan darah dan dikocok.  Setelah  itu  ditambahkan  ficoll dengan perbandingan 1:1 dengan darah dan disentrifugasi  selama  30  menit  dengan kecepatan  6000  rpm.  Hasil  sentrifugasi adalah sel mononuklear yang akan ditanam di media kultur.
Kultur  Sel  Hasil  Sentrifugasi  Pasien Leukemia Akut Sel hasil sentrifugasi dikultur menggunakan  media  RPMI  ditambah  PBS dan antibiotik spektrum luas pada sumuran.
Perlakuan,  Panen,  dan  Fiksasi  Sel  Kultur Leukemia Akut Kultur  sel  lalu  diperlakukan  dengan paparan  kombinasi  listrik  sebesar  200  Hz selama 5 detik dan aspirin yang terbagi dalam tiga  dosis.  Paparan  listrik  yang  digunakan adalah direct  current dengan  menempelkan anoda  dan  katoda  pada  cuvet  tempat  sel kultur  diletakkan.  Setelah  itu  sel  diinkubasi selama  3  hari  dan  dipanen  untuk  dilakukan fiksasi menggunakan formaldehid 4 %.

## Pengukuran  Tingkat  Apoptosis  Kultur  Sel Leukemia Akut
Pengukuran  tingkat  apoptosis  kultur  sel menggunakan  antibodi rabbit  polyclonal antibody NFkB  p65  dengan  metode imunositokimia  sesuai  protokol  internasional. Hasil pengukuran tingkat apoptosis kultur sel leukemia akut yang diperoleh dari pengkuran ekspresi  NFkB  dianalisis  secara  statistic dengan oneway (ANOVA). Tingkat
signifikansi  sebesar  (p  <    0,05)  dan  taraf kepercayaan 95 % (α= 0,05).

## HASIL
Penelitian  ini  menggunakan  kultur  sel mononuklear darah tepi pasien leukemia akut
dengan kriteria inklusi dan ekslusi yang telah ditentukan untuk mengetahui ekspresi NFkB. Dalam penelitian ini, sel monuklear darah tepi pasien  leukemia  akut  yang  dilakukan  kultur dibagi  menjadi  empat  kelompok,  yaitu kelompok  kontrol  positif  dan  tiga  kelompok perlakuan    yang  kemudian  dilakukan pengecatan  imunohistokimia  menggunakan antibodi  anti  NFkB  p65  dan  diamati menggunakan  mikroskop  inverted  dengan perbesaran 400x (Gambar 1). Data diperoleh dengan cara menghitung ekspresi NFkB pada inti  dibagi  keseluruhan  jumlah  sel  dikalikan 100  %  per  sepuluh  lapang  pandang. Berdasarkan  Gambar    2  didapatkan  bahwa pada  kelompok  K+  yang  tidak  diberikan perlakuan  apapun,  jumlah  NFkB  yang terekspresi pada inti adalah sebesar 49,12 %. Pada  kelompok  PA1  sebesar    24,62  %, kelompok  PA2  sebesar    12,46  %,  dan  pada kelompok PA3 sebesar  4,96 %. Dari Gambar 2  tersebut  dapat  dilihat  bahwa  terdapat penurunan  ekspresi  NFkB  pada  kelompok perlakuan  yang  menunjukkan  semakin tingginya  apoptosis  pada  kelompok  tersebut setelah diberikan perlakuan.
Hasil  analisis  data  untuk  mengetahui apakah  terdapat  perbedaan  persentase ekspresi NFkB antar kelompok menggunakan ANOVA  didapatkan  nilai  p  =  0,000. Sementara untuk mengetahui korelasi antara dosis  aspirin  yang  digunakan  dengan persentase  ekspresi  NFkB  menggunakan  uji korelasi Pearson didapatkan p = 0,000 dan R = -0,948.

## PEMBAHASAN
Leukemia  akut  merupakan  keganasan klonal  pada  sumsum  tulang  yang  ditandai dengan  terjadinya  perkembangan  yang berhenti  ( arrest  of  development )  seri  limfoid atau  seri  myeloid  pada  tahap  awal perkembangannya  (sel  blas).  Hal  ini disebabkan  oleh  ekspresi  gen  tertentu  yang abnormal  sebagai  akibat  dari  translokasi kromosom.  Akibatnya,  terjadi  kelainan proliferasi  dan  apoptosis  yang  ditandai dengan tingginya ekspresi NFkB dan COX-2. 6 NFkB  merupakan  faktor  transkripsi  yang mengontrol berbagai macam respon biologis. NFkB  memerankan  fungsi  regulasi  dari respon  imun,  inflamasi  dan  onkogenesis
dengan meregulasi ekspresi gen yang terlibat dalam pembentukan dan progresifitas kanker seperti  proliferasi,  migrasi  ,  dan  apoptosis. Pada  beberapa  kanker,  NFkB  mengalami mutasi  sehingga  menyebabkan  kegagalan apoptosis  pada  sel  yang  mengalami keganasan tersebut. 7
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Unitat  de  Bioquimica pada  kultur  sel kanker  colon,  menyatakan  bahwa  aspirin
bekerja dengan menghambat  enzim inhibitor kappa  B  kinase  yang  merupakan  enzim pendegradasi ikatan antara inhibitor kappa B dan  NFkB  pada.  Karena  enzim  tersebut dihambat,  maka  proses  degradasi  inhibitor kappa  B  tidak  terjadi  dan  NFkB  tetap  tidak aktif,  sehingga  tidak  bisa  melakukan fungsinya dalam proteksi sel yang mengalami keganasan  dari  apoptosis  dan  berakhirlah dengan apoptosis sel tersebut. 8
Gambar  1.  Hasil  imunohistokimia  pada  sel  kultur  mononuklear  darah  tepi  pasien  leukemia  akut Keterangan: K = kontrol. PA1 = aspirin 2,5 mmol dan pulsasi listrik sebesar 200 Hz selama 5 detik; PA2 = aspirin 5 mmol dan pulsasi listrik sebesar 200 Hz selama 5 detik; PA3 = aspirin 10 mmol dan pulsasi listrik sebesar 200 Hz selama 5 detik.
Gambar 2.  Persentase rata-rata ekspresi NFkB pada tiap-tiap kelompok penelitian
Sebuah  penelitian  yang  menggunakan dosis  aspirin  1  sampai  15  mmol/L  untuk menginduksi  apoptosis  dan  aktivasi  caspase pada B-CLL lymphocyte menunjukkan bahwa efek yang dapat diobservasi yaitu pada dosis aspirin  2,5  sampai  15  mmol/L.
9 Sementara pada  penelitian  ini  menggunakan  kombinasi antara aspirin dan elektroporasi menggunakan  paparan    listrik  dan didapatkan  rata-rata  persentase  NFkB sebesar  K+  :  49,12 %,  PA1: 24,62 %  (dosis aspirin  2,5  mmol),  PA2:  12,46  %  (dosis
aspirin  5  mmol),  dan  PA3:  4,96  %  (dosis aspirin  10  mmol).  Hal  tersebut  menunjukkan bahwa  dengan  penambahan  perlakuan terhadap kutur sel berupa elektroporasi akibat paparan listrik sebesar 200 Hz selama 5 detik mengakibatkan terjadinya penurunan ekspresi NFkB pada sel kultur leukemia akut. Ditunjang  dengan  teori  yang  menyatakan bahwa dengan menggunakan listrik intensitas rendah (2 V/cm) serta frekuensi sedang (100– 300  kHz),  menyebabkan  perubahan  medan listrik yang diinduksi oleh elektroda sehingga
0 20 40 60 K+ PA1 PA2 PA3 K+ PA1 PA2 PA3 (%) Kelompok perlakuan
membuka pori membran akibat induksi listrik atau  biasa  disebut  elektroporasi  sehingga dapat  meningkatkan uptake obat-obatan  ke dalam  sel  dan  obat  dapat  bekerja  dengan maksimal tanpa melalui membran barrier sel. Secara  otomatis  pada  akhirnya  diperlukan dosis  obat  yang  lebih  sedikit  untuk mendapatkan  efektifitas  yang  sama. 10
Pemberian  aspirin  yang  dikombinasikan dengan  pulsasi  listrik  pada  kultur  sel mononuklear  darah  tepi  penderita  leukemia akut  akan  memicu  proses  apoptosis  dengan memodulasi sinyal NFkB. Pada penelitian ini terbukti didapatkan penurunan ekspresi NFkB yang  bermakna  antar  kelompok.  Ekpresi NFkB  paling  rendah  berada  pada  perlakuan PA3  dengan  dosis  aspirin  10  mmol/L  dan pulsasi  listrik  200Hz  selama  5  detik  (p  = 0,000).
Pada  hasil  analisis  korelasi  Pearson, didapatkan  hasil  yang  cukup  kuat  (R  =  - 0,948)  dan  signifikan  (p  =  0,000)  mengenai hubungan  antara  peningkatan  dosis  aspirin yang  diberikan  dengan  persentase  ekspresi NFkB pada kultur sel mononuklear darah tepi pasien  leukemia  akut.  Dapat  disimpulkan bahwa  semakin  besar  dosis  aspirin,  maka semakin  kecil  ekspresi  NFkB  yang menunjukkan semakin meningkatnya apoptosis  pada  sel  yang  mengalami keganasan tersebut. Sementara pada analisis regresi  linier  didapatkan  hubungan  negative yang  bermakna  antara  dosis  aspirin  dan ekspresi  NFkB,  yaitu  ekspresi  NFkB dipengaruhi  oleh  pemberian  dosis  aspirin  95 %.  Apoptosis  sel  kutur  mononuklear  yang ditandai  dengan  penurunan  ekspresi  NFkB dapat diprediksi dengan rumus:
Eksprei NFkB = 58,950 – 14,464 x (dosis aspirin)
Namun, tampaknya penurunan jumlah sel ini dapat  juga  diperankan  oleh  faktor  selain mempengaruhi  ekspresi  NFkB.  Hal  tersebut menunjukkan bahwa penghambatan apoptosis  sel  mononuklear  pada  leukemia akut tidak hanya diperankan oleh NFkB, tapi juga  diperankan  oleh  beberapa  faktor  lain yang  saling  berinteraksi  antara  lain, peningkatan  ekspresi  pro-apoptosis  Bax  dan Bcl-2,  penurunan  ekspresi  anti-apoptosis kaspase  3,  dan/atau  faktor  proliferasi  NFkB
. 11
Selain  dari  jalur  apoptosisnya  sendiri, terdapat  pula  berbagai  faktor  yang  ikut mempengaruhi  apoptosis  sel  mononuklear leukemia  akut  tersebut  yang  dapat disebabkan  karena  adanya  respon  individual pasien  yang  berbeda-beda  seperti: staging kanker  pasien,  usia,  fenotipe  dan  genotipe pasien, status gizi, dan sebagainya yang tidak mungkin  diseragamkan  pada  penelitian  ini. Penelitian  ini  menunjukkan  peran  NFkB sebagai suatu faktor transkripsi yang mampu memodulasi  gen  apoptosis  p53  dalam peningkatan sel mononuklear yang mengalami  apoptosis  sehingga  dapat dipertimbangkan sebagai terapi leukemia akut melalui jalur penghambatan NFkB ini. 12
Terdapat  keterbatasan  pada  penelitian ini,  yaitu:  (1)  pemeriksaan  hanya  dilakukan sekali  setelah  dilakukan  paparan  kombinasi aspirin  dan  pulsasi  listrik,  (2)  penentuan  sel mononuklear berupa limfosit hanya berdasarkan  morfologi  (tidak  menggunakan petanda/ marker limfosit  sehingga  tidak diketahui  subset  limfosit  yang  diamati,  (3) terdapat keterbatasan sampel sehingga tidak terdapat  kelompok  perlakuan  aspirin  atau pulsasi  listrik  saja,  (4)  pemberian  pulsasi listrik pada penelitian ini masih bersifat asistif, dimana  tidak  terdapat  perubahan  frekuensi dan  lama  paparan,  dan  (5)  fakor-faktor  lain yang mempengaruhi apoptosis dan proliferasi sel  mononuklear  yang  tidak  diperiksa  (6) terdapat  respon  individual,  seperti  usia pasien,  staging  kanker  pasien,  fenotipe  dan genotipe  pasien,  status  gizi,  serta  hal  lain yang  tidak  mungkin  diseragamkan  pada penelitian ini.
Dengan  keterbatasan  tersebut  perlu dilakukan  penelitian  lanjutan  dengan:  (1) penambahan  kriteria  inklusi  dan  eksklusi untuk  mendapat  sampel  yang  seragam,  (2) pemeriksaan secara serial mulai dari sebelum paparan sampai dengan setelah paparan, (3) pemeriksaan  petanda  ( marker )  limfosit  untuk menentukan  subset  limfosit  (terutama  sel  T CD 4+ ),  (4)  pemeriksaan  dengan  teknik western  blot atau flowcytometry untuk mengukur  ekspresi  Bcl-2  dan  marker  pro- apoptosis  p53,  serta  (5)  pemeriksaan  faktor- faktor  lain  yang  mungkin  mempengaruhi apoptosis limfosit, antara lain: IFN-γ, Fas/Fas-
L,  Bcl-2  Bax,  protein  pro  apoptosis  dan  anti apoptosis, serta protein proliferasi.

## KESIMPULAN
Pembentukan  elektroporasi  dengan pemberian  paparan  listrik  sebesar  200  Hz selama  5  detik  dengan  aspirin  dosis tertentu dapat    meningkatkan  apoptosis  sel  kultur leukemia akut melalui penurunan  persentase ekspresi  NFkB.  Selain  itu,  pemberian perlakuan  pada  sel  kultur  tersebut  memiliki korelasi negatif sangat kuat terhadap ekspresi NFkB  yang  menunjukkan  semakin  tinggi dosis aspirin  maka  semakin  rendah  ekspresi NFkB dan menunjukkan semakin meningkatnya  jumlah  sel  yang  mengalami apoptosis.

## SARAN
1. Pengamatan sitopatologi dan biomolekuler sel-sel leukemia akut yang telah dikultur sehingga efek peningkatan apoptosis sel yang mengalami keganasan tersebut akan lebih  jelas  secara  sitologi  maupun biomolekuler.
2. Penelitian  lanjutan  dengan  menambah jumlah  sampel  serta  kelompok  perlakuan sehingga dapat memperoleh hasil yang lebih baik lagi.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Evans WE, Relling MV. Chemotherapy for acute  lymfoblatic  leukemia  in  children. Nature . 2008; 429:426-6.
2. Chandrayani W. Epidemiologi,prevalalensi dan  insiden  leukemia  akut  pada  anak. Jurnal  Kesehatan  Nasional .  2009;  3(24). doi:10.1186/1477-7800-3.
3. Conter et  al. Epidemiology,  prevalence, incident,  and  therapy  in  acute  leukemia.
Hematology  Oncology .  2004;  3(24). doi:10.1186/1477-7800-3-24.
4. Damijan M, Natasa P, Francis XH. Electric Properties  of  Biological  Tissues .  Wiley
Encyclopedia  of  Biomedical  Engineering.
2006. p 6.
5. Beebe  SJ, et  al .  Nanosecond  Pulsed Electric Field (Nspef) Effects on Cells and Tissues:  Apoptosis  Induction  and  Tumor
Growth Inhibition. IEEE Trans Plasma Sci . 2002; 30:286–292.
6. Shimizu  D, et  al .  NFkB  and Cyclooxygenase-2  (COX-2)  Mediated Anti-Apoptosis May Occur Via Bcl-2 in the Progression  of  Barrett’s  Esophagus  to Adenocarcinoma. J  Clin  Oncol .  2004; 22(14):9529.
7. Gillmore, K. Nuclear Factor Kappa B as A Transcriptional  Factorin  Regulation  of Apoptotic and Proliferation. 2007.
8. Daniel IS, et al . Aspirin Induces Apoptosis in  Human  Leukemia  Cells  Independently of  NF-Kappa  B  and  MAPKs  Through Alteration  of  the  Mcl-1/Noxa  Balance. Apoptosis. 2010; 15(2):219-29.
9. Blanchard  K.  New  Anti-Cancer  Hybrid Aspirin  Developed.  2012.  (online). http://digitaljournal.com/article/320418. Diakses 22 September 2012. 10. Heller. Electrochemoteraphy in Melanoma Maligna .  Denmark:  Herlev  Hospital  in University of Copenhagen. 1998.
11. Vousden  KH,  Gehl  J et  al. Internal  and Eksternal  Apoptotic  Pathways.  Denmark: Herlev  Hospital  in  University  of Copenhagen. 2009.
12. Samuel  DE,  Kathleen  MS.  Topic  of Pediatric  Leukemia-Acute  Lymfoblastic And  Myeloblastic  Leukemia. Medscape General Medicine. 2009 ; 7(1):53.