Optimizing Thin Layer Chromatography (TLC) Eluent Composition for Compound Content Separation the Ethanolic Extract of Sponge and Ascidia (Optimasi Komposisi Eluen Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Untuk Pemisahan Kandungan Senyawa Ekstrak Etanol Spons dan Ascidia)
Rosita A. J. Lintang 1* , Fitje Losung 1 , Febry I. S. Menajang 2 , Deiske A. Sumilat 1
1 Marine Science Study Program, Faculty of Fisheries and Marine Sciences, Sam Ratulangi University, Manado 95115 North Sulawesi, Indonesia
2 Aquatic Resources Management Study Program, Faculty of Fisheries and Marine Sciences, Sam Ratulangi University, Manado 95115 North Sulawesi, Indonesia
*Corresponding author: rositalintang@unsrat.ac.id
Manuscript received: 27 April 2024. Revision accepted: 15 July 2024

## Abstract
An optimization study of the KLT eluent composition was carried out on the ethanolic extracts of 3  ascidian  samples (Ascd-2,  Ascd-3,  Ascd-4)  and  2  sponge  samples  (Spons-2  and  Spons-3). The Ascidia and Sponge marine invertebrate samples were collected from Malalayang, Manado City's coastal waters, and were not identified. This research is a preliminary test to determine the best eluent composition to separate the compounds in the ascidian and sponge sample extracts. Extracted samples with ethanol solvent using the maceration method for 3 x 24 hours at room temperature followed by evaporation at 40 0 C to obtain a thick ethanol extract. The composition of  the  eluent  used  is  as  follows:  Hexane:  Ethyl  Acetate  =  3:  7,  Hexane:  Ethyl  Acetate  = 2:  3, Hexane: Ethyl Acetate = 1: 9, Methanol: Ethyl Acetate = 1:1, and 100% Methanol. KLT analysis of the extracts from the ascidia and sponge samples showed that most of the variations in eluent composition used could not separate the compound components in the extracts, except the 100% methanol composition which could separate the compounds in the spongs 3 samples.
Keywords : Eluent ; Marine Invertebrate; Optimation ; Thin Layer Chromatography (TLC)

## Abstrak
Telah  dilakukan  studi  optimasi  komposisi  eluen  KLT  terhadap  ekstrak  etanol  dari  3  sampel Ascidia  (Ascd-2,Ascd-3,Ascd-4)  dan  2  sampel  Spons  (Spons-2  dan  Spons-3).  Sampel avertebrata laut Ascidia dan Spons berasal dari perairan pantai Malalayang, Kota Manado  dan belum  diidentifikasi  jenisnya.  Penelitian  ini  merupakan  suatu  uji  pendahuluan  yang  bertujuan menentukan  komposisi  eluen  terbaik  untuk  memisahkan  senyawa  yang  terkandung  dalam ekstrak  sampel  ascidian  dan  spons.  Ekstraksi  sampel  dengan  pelarut  etanol  menggunakan metode  maserasi  selama  3  x  24  jam  pada  suhu  ruang  dan  kemudian  dievaporasi  pada  suhu 40 0 C untuk mendapatkan ekstrak etanol kental. Adapun komposisi eluen yang digunakan adalah sebagai berikut: Heksana : Etil Asetat= 3 : 7, Heksana : Etil Asetat = 2 : 3, Heksana : Etil Asetat = 1 : 9, Metanol : Etil Asetat = 1 : 1, dan Metanol 100%. Analisis KLT terhadap ekstrak sampel ascidia  dan  spons  memperlihatkan  bahwa  sebagian  besar  variasi  komposisi  eluen  yang digunakan  tenyata  tidak  dapat  memisahkan  komponen  senyawa  dalam  ekstrak,  kecuali komposisi 100% methanol yang dapat memisahkan senyawa pada sampel Spons-3.
Kata Kunci : Avertebrata Laut; Eluen; KLT: Optimasi

## PENDAHULUAN
Ascidia dan spons merupakan avertebrata  laut  yang  diketahui  sangat prospektif  dalam  menghasilkan  berbagai metabolit alami seperti terpenoid, alkaloid, steroid,  tannin,  peptide  dan  lain-lain. Senyawa-senyawa  ini  memiliki  berbagai
aktivitas  biologis  yang  bermanfaat  bagi kehidupan  manusia,  seperti  antibakteri, antivirus,  antioksidan,  antiinflamasi,  dan lain sebagainya (Blunt et al., 2017 ; Carroll et  al.,  2019).  Berbagai  jenis  Ascidia  dan Spons  tersebar  pada  perairan  Sulawesi Utara  (Palit  et  al.,  2022  ;  Malintoi  et  al., 2020)  banyak  di  antaranya  memiliki
aktivitas  antibakteri  (Sumilat  et  al.,  2022  ; Losung et al., 2022 ; Pasodung et al, 2018 ; Opa et al., 2018 ; Maradou et al., 2019). Metode  Kromatografi  Lapis  Tipis (KLT)  merupakan  salah  satu  metode analisis  sederhana  yang  dapat  digunakan untuk  mengetahui  ada  tidaknya  senyawa yang terkandung dalam ekstrak (Kowalska
& Sajewicz,
2022).
Perbandingan komposisi  eluen  sangat  menentukan terjadinya  pemisahan  senyawa  dengan baik  dimana  komposisi  dan  jenis  eluen memiliki pengaruh signifikan dalam pemisahan dan analisis KLT. Eluen adalah cairan yang digunakan untuk menggerakkan  fasa  diam  pada  plat  KLT, membawa senyawa-senyawa dalam sampel sehingga terjadi pemisahan senyawa-senyawa tersebut. Optimasi eluen (solven) dalam analisis Kromatografi Lapis  Tipis  (KLT)  merupakan  langkah penting untuk memastikan pemisahan yang optimal  dari  senyawa-senyawa  dalam sampel  (Rachmawati,  2015  ;  Saputri, 2016).  Perbandingan  eluen,  yang  juga dikenal  sebagai  rasio  campuran  pelarut atau  fase  gerak,  merujuk  pada  proporsi relatif dari berbagai komponen eluen yang digunakan dalam Kromatografi Lapis Tipis (KLT).  Pengaruh  perbandingan  eluen  ini sangat signifikan dalam proses pemisahan dan  analisis.  Komposisi  eluen  merupakan salah  satu  factor  yang  mempengaruhi keberhasilan  peroses  pemisahan  dalam
metode  KLT,  sehingga  perlu  dilakukan optimasi komposisi eluen ( Obradović et al . 2017).
Penelitian ini merupakan suatu kajian awal yang bertujuan menentukan komposisi eluen terbaik untuk memisahkan senyawa  yang  terkandung  dalam  ekstrak sampel spons dan ascidian menggunakan teknik pemisahan KLT.

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian yang meliputi pengambilan sampel,  ekstraksi  dan  analisis  data dilaksanakan  selama  bulan  Maret-Mei 2023. Sampel Ascidian dan Spons berasal dari  pantai  Malalayang  Kota  Manado (Gambar  1).  Kegiatan  ekstraksi  dan analisis data dilakukan pada Laboratorium Biologi  Molekuler  dan  Farmasetika  Laut, Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan, Universitas Sam Ratulangi.

## Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah beberapa jenis sampel Ascidia dan Spons. Selain itu digunakan beberapa bahan kimia seperti Pelarut Etanol, Metanol,  Heksana, Etil  Asetat  dan  Air.  Alat  yang  digunakan adalah seperangkat peralatan gelas seperti gelas ukur, gelas piala, toples kaca, rotary evaporator ,  erlenmeyer,  labu  ukur,  batang pengaduk, silica gel 60 F254 (merck), pipa kapiler, lampu UV.

## Preparasi dan Ekstraksi Sampel
Pengambilan sampel dilakukan pada kedalaman  5  m  -  10  m  menggunakan seperangkat  alat  selam.  Sampel  yang diambil  selanjutnya  dipotong  kecil-kecil berbentuk  kubus/dadu,  direndam  dalam larutan  etanol  95%  dan  dibawa  ke Laboratorium Biologi Molekuler dan Farmasetika Laut, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Sam Ratulangi.
Ekstraksi  dilakukan  dengan  metode maserasi selama 3 x 24 jam menggunakan pelarut etanol selanjutnya dilakukan proses evaporasi  sehingga  didapatkan  ekstrak kental (Gambar 2).

## Proses Kromatografi Lapis Tipis

## Persiapan plat KLT
Pemisahan  senyawa  ekstrak  kasar dilakukan menggunakan plat silica sebagai fase  diam  dengan  ukuran  1cm  x  10cm. Selanjutnya diberi pananda garis pada tepi bawah plat pada jarak 1 cm sebagai posisi awal totolan dan 0,5 cm dari tepi atas plat untuk  menunjukkan  batas  akhir  proses elusi. Setelah itu plat silica diaktivasi pada suhu  100 0 C  selama  15  menit  untuk
menghilangkan  kadar  air  yang  terdapat pada plat KLT.
Persiapan Fase gerak (eluen) Sebelum dilakukan pengelusian, eluen  dalam  bejana  dijenuhkan  terlebih dahulu  untuk  menyamakan  tekanan  uap pada  seluruh  bagian  bejana.  Setiap campuran eluen dimasukkan dalam Chamber  dan  ditutup  rapat  selama  60 menit. Adapun komposisi eluen pengembang  yang  digunakan  adalah sebagai berikut: Heksana : Etil Asetat= 3 : 7, Heksana : Etil Asetat = 2 : 3,  Heksana: Etil Asetat = 1 : 9, Metanol : Etil Asetat = 1 : 1, dan Metanol 100%. Sebelum  dilakukan  penotolan,  ke dalam  semua  ekstrak  masing-masing dicampurkan dengan larutan methanol dan ditotolkan sebanyak 10 totolan menggunakan  pipet  kapiler  pada  tempat yang  telah  ditandai,  kemudian  dikering- anginkan.  Pendeteksian  bercak  hasil kromatografi  dilakukan  dengan  dengan menggunakan sinar ultraviolet pada panjang gelombang λ 254 nm dan  λ 366 nm.
Gambar 2 . Ekstrak Sampel (Asc-2, Asc-3, Asc-4, Spn-2, Spn-3)

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Ekstraksi
Metode  ekstraksi  yang  digunakan adalah  maserasi  dingin  dengan  pelarut etanol  70%.  Metode  ini  dipilih  karena metode  cara  dingin  dapat  mencegah terurainya  metabolit  sekunder  yang  tidak tahan pemanasan. Pelarut etanol
digunakan karena memiliki kepolaran yang baik untuk mengekstrak berbagai komponen  yang  bersifat  polar  seperti flavonoid,  saponin,  steroid,  tanin  dan alkaloid. Maserat diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator tujuannya untuk menguapkan pelarut yang digunakan selama proses ekstraksi sehingga didapatkan ekstrak kental dari ke-5 ekstrak
Ascidia dan Spons. Prinsip dari alat rotary evaporator adalah vakum destilasi dengan menguapkan  pelarut  di  bawah  titik  didih sehingga  zat  yang  terkandung  di  dalam pelarut  tidak  rusak  oleh  suhu  yang  tinggi. Metode  ekstraksi  cara  dingin  juga  telah digunakan  oleh  para  peneliti  sebelumnya (Opa et al., 2018 ; Pasodung et al, 2018 ; Maradou et al., 2019 ; Losung et al., 2022 ; Sumilat et al., 2022).

## Pengujian  dengan  Kromatografi  Lapis Tipis (KLT)
Analisis  Kromatografi  Lapis  Tipis (KLT) dapat memberikan informasi tentang
komponen-komponen  kimia  terkandung yang  dapat  memberikan  gambaran  awal tentang komposisi senyawa yang terkandung dalam sampel tersebut (Rachmawati, 2015). Gambar 3
memperlihatkan bahwa ekstrak spons dan ascidia tidak dapat terpisah pada komposisi pelarut  Heksan  :  Etil  asetat.  Namun  pada pelarut  Etil  asetat  yang  dikombinasikan dengan  Metanol  terlihat  ada  sedikit pergerakan  dari  ekstrak  yang  diuji. Heksana merupakan pelarut yang memiliki sifat  non  polar,  Etil  asetat  dan  Metanol merupakan pelarut bersifat polar (Harborne, 1996).
Gambar 3. Perbandingan konsentrasi pelarut Heksan : Etil Asetat : Metanol Keterangan (Spot : Kiri -> Kanan) : Ascd 2- Ascd 3-Ascd 4-Spn 2-Spn 3 a. tanpa uv  b. uv λ 254 nm  c. uv λ 366 nm
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh maka  perlakuan  difokuskan  pada  pelarut polar  yakni  Metanol  yang  dikombinasikan dengan  Air.  Hasil  pengamatan  terhadap 5 ekstrak  yang  diujikan,  walaupun  belum sempurna terlihat 1 ekstrak yakni Spons-3 yang  dapat  terpisah  dengan  komposisi
yang  diterapkan  dan  pemisahan  hanya terjadi  oleh  pelarut  100  %  methanol. Perbandingan  eluen,  yang  juga  dikenal sebagai  rasio  campuran  pelarut  atau  fase gerak,  merujuk  pada  proporsi  relatif  dari berbagai komponen eluen yang digunakan dalam  Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT).
Pengaruh  perbandingan  eluen  ini  sangat signifikan  dalam  proses  pemisahan  dan analisis.
Gambar 4. Perbandingan Konsentrasi Pelarut Air : Metanol Keterangan  (Spot : Kiri -> Kanan) : Ascd 2- Ascd 3-Ascd 4-Spn 2-Spn 3 a. tanpa uv b. uv λ 254 nm c. uv λ 366 nm
Pengamatan  bercak  menggunakan sinar  ultraviolet  digunakan  untuk  senyawa yang  tidak  berwarna  karena  beberapa senyawa organik
dapat bersinar (berfluoresensi)  jika  disinari  dengan  sinar ultraviolet pada panjang gelombang pendek (254 nm) atau gelombang panjang (366  nm).  Hasil  yang  diperoleh  apabila tidak dapat terdereksi maka harus disemprot menggunakan pereaksi tertentu sehingga  bercak  tersebut  tampak  yaitu pertama  tanpa  pemanasan,  kemudian dapat  juga  dengan  pemanasan.  Hasil kromatografi  dipengaruhi  oleh  fase  diam, fase gerak (eluen), dan teknik kerja. Teknik kerja  meliputi  atmosfer  bejana,  jenis pengembang,  cara  dan  jumlah  penotolan,
pembuatan cuplikan, dan deteksi senyawa yang dipisahkan (Harborne, 1996).

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Komposisi  eluen  100%  methanol  dapat memisahkan  senyawa  yang  terkandung dalam  ekstrak  Spons-3,  sehingga  hampir dapat  dipastikan  bahwa  senyawa  bioaktif yang  terkandung  dalam  ekstrak  tersebut bersifat polar.

## Saran
Perlu  dilakukan  analisis  lanjut  untuk mendapatkan  perbandingan  konsentrasi yang  lebih  tepat  dalam  memisahkan ekstrak dengan metode KLT dan pengujian
zookimia untuk mengetahui jenis senyawa yang terkandung dalam ekstrak.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih kepada Rektor
Universitas  Sam  Ratulangi  dan  Pimpinan Lembaga  Penelitian  dan  Pengabdian Kepada  Masyarakat  (LPPM)  yang  telah membantu  penelitian  ini  dengan  dana PNBP Unsrat tahun 2023 skim RDUU K-2.

## DAFTAR PUSTAKA
Blunt,  J.W.,  Copp,  B.R.,  Keyzers.  R.A., Munro,  M.H.G.  &  Prinsep,  M.R. (2017).  Marine  Natural  Products, Nat.Pro Rep, Issue 3. ( 34) : 235-294. Carroll,  A.R.,  Copp,  B.R.,  Davis,  R.A., Keyzers, R.A. & Prinsep, M.R. (2019). Marine  Natural  Products. Nat.  Prod. Rep. ( 36) : 122-173 Harborne,  J.B.  (1996).  Metode  Fitokimia: Penentuan Cara Modern Menganalisa Tumbuhan.(Edisi Kedua).  Terjemahan  oleh  Kosasih Padmawinata  dan  Iwang  Soediro.
Bandung: ITB.
Kowalska,  T.  &  Sajewicz,  M.  (2022)  Thin- Layer  Chromatography  (TLC)  in  the
Screening of Botanicals –Its Versatile Potential  and  Selected  Applications. Molecules 27, 6607. https://doi.org/10.3390/ molecules27196607
Luissandy, Sumilat D,A. &  Lintang, R.A.J.
(2017). Bioaktivitas Antibakteri Fraksi ODS Spons Agelas sp. dari Perairan Pangalisang  Pulau  Bunaken. Jurnal Pesisir dan Laut Tropis. 2(1): 22-30. Losung,  G.,  Losung  F.,  Lintang,  R.A.J., Wullur,  S.  &  Manoppo,  H.  (2022). Aktivitas Antibakteri Dari Spons Asal Perairan  Pulau  Bantong  Bolaang Mongondow Timur. Jurnal Pesisir dan Laut Tropis. 10 (1), 81-88
Malintoi,    A.,  Rumengan,  I.F.M.,  Roeroe, K.A.,  Warouw,  V.,  Rondonuwu,  A.B.
&  Ompi,  M.  (2020).  Komunitas Ascidia  di  Pesisir  Malalayang      Dua, Teluk        Manado,  Sulawesi      Utara.
Jurnal   Pesisir   dan Laut Tropis, 8(1): 39-46
Maradou,  R.B.,  Losung,  F.,  Mangindaan,
R.E.P., Lintang, R.A.J., Pelle, W.E. & Sambali,  H.  (2019).  Uji  Aktivitas Antibakteri  Beberapa  Spons  dari Perairan Salibabu Kepulauan Talaud. Jurnal  Pesisir  dan  Laut  Tropis. 7(3):234-241 Opa,  L.S.,  Bara,  R.A.,  Gerung,  G.S., Rompas,  R.M.,  Lintang,  R.A.J.  &
Sumilat,  D.A.  (2018).  Uji  Aktivitas Antibakteri Fraksi N-Heksana, Metanol dan Air dari Ascidia
Lissoclinum sp. Jurnal  Pesisir  dan Laut Tropis. 1(1): 69-80 Obradović,  D.,  Oljačić,  S.,  Nikolić,  K.  & Agbaba,  D.  (2017)  Influence  of selected  mobile  phase  properties  on the  TLC  retention  behavior  of ziprasidone and its impurities, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies,  40:5-6,  247-251,  DOI: 10.1080/10826076.2017.1298026 Obradović, D. Filipić, S. Nikolić, K. Čarapić, M. &  Agbaba, D. (2016). Optimization of  TLC  Method  for  Separation  and Determination  of  Ziprasidone  and  its Impurities. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 39 , 271 –276
Pasodung, A., Losung, F., Angkouw, E.D., Lintang,  R.A.J.,  Mantiri,  D.H.M., Sumilat,  D.A.  (2018).  Uji  Aktivitas Antibakteri  Spons Plakortis sp.  yang Dikoleksi  dari  Perairan  Bunaken. Jurnal  Pesisir  dan  Laut  Tropis. 1(1):44-51.
Palit, C., Sumilat, D. A., Rumengan, A. P.,
Boneka, F. B., Sinjal, C. A. and Lalita, J. (2022). Komunitas dan Keanekaragaman  Ascidia  di  Pesisir Minanga,  Malalayang  Satu,  Kota Manado, JURNAL PESISIR DAN LAUT TROPIS , 10(2), pp. 115 –121.
Rachmawati, F. (2015). Optimasi Penggunaan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)  Pada  Pemisahan  Senyawa Alkaloid Daun Pulai ( Alstonia scholaris L.R.Br). Skripsi. UIN Maulana Malik Ibrahim. Malang.
Rompas,  R.  (2011).  Farmakognosi  Laut (Sumber  Baru  Ekonomi  Kelautan). Dewan Kelautan Indonesia, Jakarta. Saputri,  N.  D.  (201)6.  Analisis  Kadar Flavonoid pada Benalu kopi
( Dendrophthoe pentandra ) menggunakan  Teknik  Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri. Skripsi. FMIPA-Universitas Jember Sumilat, D.A., Lintang, R.A.J., Undap, S.L., Adam,  A.A.,  &  Tallei,  T.E.  (2022) Phytochemical, antioxidant, and antimicrobial analysis of Trichoderma asperellum  Eudistoma  isolated  from ascidian  sp.  J  Appl  Pharm  Sci, 12(04):090 –095.