Research Article

## UNPAD

## Phenolics and Flavonoids Content of Epiphyllum oxypetalum (DC.) Leaves Fractions using Microplate Based Assay

## Ni P.E. Hikmawanti*, Agustin Yumita, Muhammad Rafiq, Lusiana Lusiana
Departemen Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi dan Sains, Universitas Muhammadiyah Prof. DR. HAMKA,
DKI Jakarta 13460, Indonesia
Submitted 22 September 2021; Revised 7 January 2022; Accepted 14 January 2022; Published 20 February 2023 *Corresponding author: ermy0907@uhamka.ac.id

## Abstract
Epiphyllum oxypetalum (DC.) or Wijaya Kusuma (Cactaceae) is an ornamental plant which is known to contain polyphenol compounds. The purpose to determine the levels of total phenolic and flavonoid compounds in the fractions of Wijaya Kusuma leaves using microplate-based assay. Each sample was determined phenolic content with Folin-ciocalteu reagent and flavonoid content using AlCl3 on the microplate. Absorption was measured using a microplate reader. Screening of DPPH radical scavenging activity was identified using the TLC method. The results showed that the extract and fractions of the leaves of Wijaya Kusuma contained phenolic and flavonoid compounds. The ether fraction had the  highest  phenolic  content  (35,912±0,54776  mgGAE/g)  and  flavonoids  (0,773±0,008  mgQE/g) compared to other fractions (ether>water>ethyl acetate fraction). There is one yellow spot with an Rf value of 0,85 in the ether fraction which is thought to be a compound capable of scavenging the DPPH radicals. The ether fraction of Wijaya Kusuma leaves has potential as a source of polyphenols with antioxidant activity. However, further research is needed to evaluate the antioxidant capacity in the ether fraction of Wijaya Kusuma leaves.
Keywords: Antioxidant, Epiphyllum oxypetalum (DC.) Haw, Flavonoids, Fraction, High-throughput Microplate Assay, Phenolics.

## Kadar Fenolik dan Flavonoid Fraksi Daun
Epiphyllum oxypetalum (DC.) menggunakan Pengujian Berbasis Microplate
Abstrak Epiphyllum oxypetalum (DC.) atau Wijaya Kusuma (Cactaceae) merupakan tanaman hias yang diketahui memiliki kandungan senyawa polifenol. Tujuan untuk menentukan kadar senyawa fenolik dan flavonoid total pada fraksi-fraksi daun Wijaya Kusuma menggunakan pengujian berbasis microplate . Masing-masing sampel ditentukan kadar fenolik dengan pereaksi Folin-ciocalteu dan kadar flavonoid menggunakan AlCl 3 pada microplate . Serapan diukur menggunakan microplate reader . Penapisan aktivitas peredaman radikal DPPH diidentifikasi dengan menggunakan metode KLT. Hasil menunjukan ekstrak dan semua fraksi daun Wijaya Kusuma mengandung senyawa fenolik dan flavonoid. Fraksi eter memiliki kadar fenolik (35,912±0,54776 mgGAE/g) dan flavonoid (0,773±0,008 mgQE/g) tertinggi dibandingkan fraksi lainnya (fraksi eter>air>etil asetat). Terdapat satu bercak berwarna kuning dengan nilai Rf 0,85 pada fraksi eter yang diduga merupakan senyawa yang mampu meredam radikal DPPH. Fraksi eter daun Wijaya Kusuma berpotensi sebagai sumber polifenol dengan aktivitas antioksidan. Namun, diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mengevaluasi kapasitas antioksidan dalam fraksi eter daun Wijaya Kusuma.
Kata Kunci: Antioksidan, Epiphyllum oxypetalum (DC.) Haw, Flavonoid, Fraksi, High-throughput Microplate Assay, Fenolik.

## 1.  Pendahuluan
Tanaman hias Epiphyllum oxypetalum (DC.) merupakan kelompok kaktus yang di Indonesia dikenal dengan nama Wijaya Kusuma. Beberapa aktivitas farmakologi dari ekstrak etanol daun Wijaya Kusuma telah berhasil dilaporkan, antara lain sebagai  antiinflamasi1 , penyembuh luka pada mencit diabetes 2 , anti radikal bebas 3 , dan lain sebagainya. Daun Wijaya Kusuma mengandung senyawa metabolit sekunder seperti  tanin,  fenolik,  alkaloid,  flavonoid, sterol, dan saponin 4 . Dandekar et al. (2015) melaporkan bahwa secara dominan daun Wijaya Kusuma mengandung senyawa steroid 5.  Fenolik  dan  flavonoid  merupakan sumber antioksidan alami yang dapat diperoleh dari tanaman 6,7 , termasuk Wijaya Kusuma. Ekstrak etanol daun Wijaya Kusuma telah dilaporkan memiliki aktivitas peredaman radikal bebas DPPH dan penghambatan dari kapasitas penangkap Hidrogen Peroksida (H 2 O 2 ) dibandingkan ekstrak airnya 3 . Potensi daun Wijaya Kusuma untuk dikembangkan dan dimanfaatkan sebagai tanaman obat belum banyak dikaji serta masih terbatas pada bentuk ekstraknya, sementara bentuk fraksinya belum banyak diteliti. Penelitian ini bertujuan menentukan kadar  total  fenolik  dan  flavonoid  sebagai senyawa antioksidan pada ekstrak dan fraksi-fraksi daun Wijaya Kusuma dengan menggunakan pengujian berbasis microplate . Teknik ini mampu menganalisis kadar senyawa polifenolik dengan jumlah sampel yang banyak dalam sekali pengujian sehingga memperoleh hasil yang cepat dan akurat jika dibanding cara konvensional menggunakan spektrofotometri UV-Vis. Penapisan cepat dengan jumlah sampel yang banyak untuk memperoleh kadar senyawa menggunakan metode sederhana dengan hasil yang akurat tentu sangat diperlukan untuk menghemat waktu dan biaya penelitian 8,9 . Melalui penelitian ini, fraksi dari ekstrak etanol daun Wijaya Kusuma dengan kadar fenolik dan  flavonoid  tertinggi  kemudian  dilakukan penapisan untuk mengetahui kemampuannya dalam meredam radikal DPPH menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT).
2.1.  Alat Wadah maserasi berupa toples kaca, vacuum rotary evaporator (Eyela), timbangan analitik (Ohaus), microplate 96-sumuran (Iwaki), mikropipet (Eppendorf), iMark™ Microplate Absorbance Reader (BioRad), Chamber KLT  (Duran),  dan  alat- alat gelas (Pyrex) yang umum digunakan di laboratorium.
2.2.  Bahan Daun Wijaya Kusuma yang diperoleh dari Desa Ciapus, Kecamatan Ciomas, Kabupaten Bogor, Jawa Barat. Daun dipanen pada bulan Januari 2021 saat musim penghujan. Tanaman kemudian dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor dengan nomor surat: B-246/IV/DI.01/2/2021. Pembanding yang digunakan yaitu: asam galat (MarkHerb) dan kuersetin (Sigma- aldrich). Pelarut-pelarut yang digunakan antara lain: etanol 96% (Merck), metanol p.a (Merck), etil asetat p.a (Merck), eter p.a (Merck), n-heksana p.a (Merck) dan aquades. Bahan kimia yang digunakan antara lain: pereaksi Dragendorff,  Mayer,  Bouchardat, Lieberman Burchard , FeCl 3 5%, gelatin 10%, H 2 SO 4 pekat, HCl 2N, Folin-ciocalteu, AlCl 3 10%, natrium asetat 1M, natrium karbonat (100  g/L)  dan  radikal  bebas  2,2- diphenyl- 1picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma-aldrich). Bahan lain seperti plat silika GF 254 (Merck).
2.3.  Prosedur
2.3.1. Pembuatan serbuk simplisia daun Wijaya Kusuma Daun Wijaya Kusuma yang telah disortasi basah dan dicuci bersih kemudian dirajang dan dikering-anginkan selama ±6-7 hari. Simplisia daun kemudian disortasi kering. Simplisia diblender dan diayak dengan ayakan no 40. Serbuk simplisia ditimbang dan siap untuk diekstraksi 10 .
2.3.2. Pembuatan ekstrak etanol 96% daun Wijaya Kusuma Proses ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi pada suhu ruang. Sebanyak 1500 g serbuk daun direndam dalam etanol

## 96% dengan perbandingan 1:10 bagian.
Setelah  24  jam,  filtrat  dipisahkan  dengan ampasnya dan diremaserasi kembali sebanyak 5 kali. Filtrat dikumpulkan dan diuapkan pelarutnya menggunakan vacuum rotary  evaporator  pada  suhu  50ᵒC  dengan putaran 500 rpm. Pemekatan dilanjutkan pada  waterbath  pada  suhu  50ᵒC  hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental ditimbang bobotnya dan dihitung persentase rendemennya terhadap bobot serbuk daun yang diekstraksi 10 .
2.3.3. Pembuatan fraksi-fraksi dari ekstrak etanol 96% daun Wijaya Kusuma Ekstrak etanol 96% sebanyak 25 g ditambahkan 15 mL etanol lalu ditambahkan aquades dengan volume akhir adalah 100 mL. Selanjutnya campuran dimasukan ke dalam corong  pisah  250  mL  dan  ditambahkan 100 mL  eter,  dilakukan  penggojogan.  Setelah terbentuk 2 lapisan, kedua lapisan ditampung di wadah terpisah. Fase air (lapisan bawah) dimasukan kembali ke dalam corong pisah. Proses fraksinasi diulang sebanyak 5 kali dengan pelarut eter baru. Setelah itu, fraksinasi fase air dilanjutkan dengan menggunakan pelarut etil asetat dengan prosedur yang sama. Fase eter dan etil asetat yang telah diperoleh kemudian dikumpulkan dan diuapkan pelarutnya menggunakan vacuum rotary  evaporator  pada  suhu  50ᵒC  dengan putaran 500 rpm. Pemekatan dilanjutkan pada waterbath  pada  suhu  50ᵒC  hingga  diperoleh fraksi eter dan fraksi etil asetat kental. Fase air sisanya, dipekatkan langsung di waterbath pada  suhu  50ᵒC  hingga  diperoleh  fraksi air kental. Masing-masing fraksi kental ditimbang bobotnya dan dihitung persentase rendemennya terhadap bobot ekstrak yang diekstraksi.
2.3.4. Identifikasi kandungan kimia Identifikasi kandungan kimia simplisia, ekstrak, dan fraksi-fraksi daun Wijaya Kusuma mengikuti prosedur yang tertera pada Hanani (2016), meliputi pengujian keberadaan  fenolik,  flavonoid,  tannin, saponin dan steroid. Hasil deteksi ditunjukan dengan perubahan warna tertentu (uji fenolik,
flavonoid),  terbentuknya  endapan  (uji alkaloid dan tanin) serta buih yang stabil (uji saponin) 11 .
2.3.5. Penentuan kadar fenolik total Penentuan kadar fenolik dilakukan pada microplate 96-sumuran yang diadaptasi dari Sembiring et al (2018) 12 . Masing-masing sebanyak 25 µL larutan uji (larutan ekstrak, fraksi eter, fraksi etil asetat, dan fraksi air) dan pembanding (asam galat) pada konsentrasi tertentu  ditambahkan  dengan  100  µL  Folin- ciocalteu (1:4), goyang dengan pelan selama 60 detik. Biarkan campuran selama 240 detik dalam kondisi terlindung dari cahaya. Selanjutnya,  tambahkan  75  µL  natrium karbonat  (100  g/L),  goyang  dengan  pelan selama 1 menit. Setelah inkubasi selama 2 jam pada suhu kamar, dilakukan pembacaan absorbansi pada 750 nm. Konsentrasi larutan asam galat yang digunakan adalah 62,5; 125; 250; dan 500 ppm. Konsentrasi ekstrak dan fraksi diujikan adalah 10.000 ppm. Kadar fenolik total dinyatakan sebagai mgGAE per g ekstrak atau fraksi.
2.3.6. Penentuan kadar flavonoid total Penentuan  kadar  flavonoid  dilakukan pada microplate 96-sumuran yang diadaptasi dari  Sembiring  et  al  (2018) 12 . Masing- masing  sebanyak  50  µL  larutan  uji  (larutan ekstrak, fraksi eter, fraksi etil asetat, dan fraksi air) dan pembanding (kuersetin) pada konsentrasi tertentu ditambahkan dengan 10  µL  AlCl3 10%. Campuran ditambahkan 150 µL metanol, 10 µL natrium asetat 1 M, dan selanjutnya diinkubasi dalam kondisi terlindung dari cahaya selama 40 menit pada suhu kamar. Setelah inkubasi selesai, dilakukan pembacaan absorbansi pada 415 nm. Konsentrasi larutan kuersetin yang digunakan adalah 7,8125; 15,625; 31,25; 62,5; dan 125 ppm. Konsentrasi ekstrak, fraksi etil asetat, dan air yang diujikan adalah 5000 ppm, fraksi eter  yaitu  1250  ppm.  Kadar  flavonoid  total dinyatakan sebagai mg ekivalen kuersetin (mgQE) per g ekstrak/fraksi.
2.3.7. Penapisan aktivitas antioksidan fraksi

## eter menggunakan metode KLT
Penapisan aktivitas antioksidan pada fraksi eter dilakukan dengan menggunakan metode  KLT.  Fase  diam  yang  digunakan adalah plat silika gel GF 254 . Fase gerak yang digunakan adalah n-heksana:etil asetat (1:9) dan beberapa tetes asam formiat. Pembanding yang  digunakan  adalah  asam  galat.  Larutan fraksi (1250 ppm) dan asam galat (10 ppm) ditotolkan  pada  plat  KLT  dan  dielusi  dalam chamber yang sudah jenuh oleh uap fase gerak. Proses deteksi bercak dilakukan di bawah UV 254 nm dan disemprot menggunakan larutan radikal DPPH. Keberadaan senyawa dengan aktivitas antioksidan ditunjukan dengan bercak yang berwarna kuning 13 .
2.  Hasil Hasil rendemen ekstrak dan fraksi dapat dilihat pada Tabel 1. Fraksi air memiliki rendemen paling tinggi (25,36%) terhadap 25 g ekstrak yang difraksinasi. Sedangkan fraksi etil asetat memiliki rendemen yang paling rendah (3,76%) dibanding fraksi lainnya. Hasil  skrining  fitokimia  simplisia,  ekstrak dan fraksi-fraksi daun Wijaya Kusuma dapat dilihat pada Tabel 2. Senyawa fenolik dan flavonoid terkandung di semua sampel. Tanin ditemukan pada simplisia, ekstrak etanol dan fraksi air. Steroid terdapat dalam simplisia, ekstrak etanol dan fraksi eter. Berdasarkan kurva kalibrasi dari asam galat pada konsentrasi 62,5-500 ppm diperoleh persamaan  yaitu  y  =  0,002x  +  0,1225  (R²
= 0,9925), sedangkan kurva kalibrasi dari kuersetin  pada  konsentrasi  7,8125-125  ppm diperoleh persamaan garis yaitu y = 0,0056x +  0,1125  (R²  =  0,9964).  Kadar  fenolik  dan flavonoid tertinggi ditemukan pada fraksi eter dibanding fraksi lainnya (fraksi eter>air>etil asetat).  Kadar  fenolik  dan  flavonoid  dari masing-masing ekstrak dan fraksi dapat dilihat pada Tabel 3. Skrining aktivitas antioksidan hanya dilakukan pada fraksi dengan kandungan fenolik tertinggi, yaitu fraksi eter. Berdasarkan Gambar 1, fraksi eter mengandung senyawa dengan aktivitas peredam radikal DPPH secara kualitatif yang ditunjukan dengan bercak yang berwarna kuning  pada  plat  KLT.  Bercak  asam  galat sebagai peredam radikal DPPH berada pada nilai Rf 0,75, sedangkan bercak yang muncul pada fraksi eter ada pada nilai Rf 0,85.

## 3.  Pembahasan
Fraksinasi merupakan prosedur pemisahan menggunakan teknik cair- cair berdasarkan polaritas pelarut yang digunakan 14 . Proses fraksinasi pada penelitian ini menggunakan pelarut eter (nonpolar), etil asetat (semi polar), dan air (polar). Polaritas eter mirip dengan n-heksana dengan kemampuannya dalam menarik senyawa kurang polar seperti lemak, asam lemak, klorofil,  fitosterol  dan  lainnya.  Sedangkan pelarut etil asetat dengan polaritas medium mampu menarik beberapa alkaloid, aglikon,
Gambar 1. Skrining aktivitas antioksidan fraksi eter terhadap radikal DPPH dengan metode KLT Tabel 1. Hasil ekstrak dan fraksi-fraksi daun Wijaya Kusuma Sampel Bobot Rendemen Ekstrak etanol 96% 86,30 g 5,75 % Fraksi eter 5,21 g 20,82 % Fraksi etil asetat 0,94 g 3,76 % Fraksi air 6,34 g 25,36 % Sampel Kandungan kimia Alkaloid Fenolik Flavonoid Tanin Saponin Steroid Simplisia - + + + - + Ekstrak etanol 96% - + + + - + Fraksi eter - + + - - + Fraksi etil asetat - + + - - - Fraksi air - + + + - -
Tabel 2. Hasil skrining fitokimia simplisia, ekstrak dan fraksi-fraksi daun Wijaya Kusuma
Keterangan: (+) = terdeteksi; (-) = tidak terdeteksi
dan beberapa glikosida dengan sedikit gula. Air memiliki polaritas paling tinggi dengan kemampuannya dalam menarik senyawa sakarida, asam amino, serta glikosida- glikosida dengan banyak gugus gula 14 . Berdasarkan penelitian Dandekar et al (2015), ekstrak daun Wijaya Kusuma didominasi oleh senyawa steroid seperti ethanone, 1-(2-hydroxy-5-methylphenyl)-; 4-Hydroxy- 2-methylacetophenone; Megastigmatrienone; Cycloocta-1,3,6-triene,2,3,5,5,8,8,- hexamethyl; 4-((1E)-3-Hydroxy-1- propenyl)-2- methoxyphenol; 2,5-Dihydroxy- 4-isopropyl-2,4,6-cycloheptatrien-1-one; n-Hexadecanoic acid; Octadecanoic acid; Phytol; 6-octen-1-ol,3,7-dimethyl; Stigmasterol; Cholesta-22,24-dien-5-ol,4,4- dimethyl; 22-stigmasten-3-one 5.  Klorofil pada batas tertentu juga dapat terekstraksi dalam etanol dan dapat terpartisi dalam pelarut non polar seperti n-heksana dan eter 14 . Hasil penelitian yang diperoleh menunjukan fraksi eter yang merupakan fraksi kurang polar memiliki nilai rendemen cukup tinggi dibandingkan dengan fraksi etil asetat. Hal ini diduga berkaitan dengan kandungan klorofil dan steroid dalam daun Wijaya Kusuma yang banyak tersari dalam eter. Namun, demikian, perlu studi lebih lanjut untuk memastikan hal ini. Fenolik  dan  flavonoid  ditemukan dengan kadar yang tinggi pada fraksi eter daun Wijaya Kusuma dibandingkan dengan fraksi lainnya (fraksi eter>fraksi air>fraksi etil asetat). Polifenol pada tanaman terdapat dalam bentuk bebas (aglikon) dan glikosida. Polifenol pada tanaman disintesis dari jalur sikimat 15 . Stabilitas polifenol bervariasi karena distribusinya yang tidak seragam pada tumbuhan. Beberapa fenolik merupakan senyawa stabil, sedangkan lainnya lebih rentan terhadap oksidasi maupun suhu. Sifat kelarutan dan pemisahan polifenol dipengaruhi oleh perbedaan struktur
kimianya 16 . Berkaitan dengan banyaknya hidroksil pada strukturnya, biasanya polifenol bersifat cenderung polar dan lebih suka larut dalam pelarut dengan polaritas yang lebih tinggi 16 seperti etanol-air 14 . Namun, pada studi ini, justru fenolik dan flavonoid dalam fraksi nonpolar berada pada kadar yang tinggi. Nawaz et al (2020) melaporkan bahwa ekstrak yang diperoleh dengan pelarut polar memberikan hasil rendemen yang tinggi dari biji Phaseolus vulgaris . Namun demikian, kadar  fenolik  dan  flavonoid  total  lebih rendah pada ekstrak tersebut dibandingkan dengan ekstrak yang diperoleh dari pelarut nonpolar (heksana dan petroleum eter). Hal ini mengindikasikan bahwa biji tanaman tersebut mengandung senyawa fenolik yang dominan bersifat non-polar 17 . Studi literatur membuktikan bahwa tidak ada pelarut yang secara umum dapat diterima sebagai pelarut terbaik untuk ekstraksi dan pemisahan polifenol pada tanaman. Pengaruh besar pada proses  deteksi  dan  kuantifikasi  polifenol dalam tanaman sebagai zat terlarut mengacu pada jenis senyawa polifenol didalamnya 16 . Penentuan kadar fenolik menggunakan Folin-ciocalteu memiliki keunggulan dibanding dengan metode lain seperti Folin-Denis, titrasi permanganat, maupun kolorimetri dengan garam besi 7 . Metode ini memiliki sensitivitas dan reproduksibilitas yang baik dan sangat mudah untuk dilakukan 18 . Pengujian Folin-ciocalteu bergantung pada transfer elektron dalam medium alkali dari senyawa fenolik untuk membentuk kompleks fosfomolibdat/asam fosfotungstat untuk membentuk kompleks biru (PMoW 11 O 40 ) 4− ) yang serapannya dapat diukur sekitar 760 nm. Alkalinitas akibat reaksi dengan natrium karbonat menyebabkan proses oksidasi fenol menjadi lebih cepat 19 . Reaksi ini sangat dipengaruhi oleh suhu.  Pada suhu yang lebih tinggi akan menyebabkan terbentuknya warna biru yang lebih cepat 18 . Flavonoid merupakan
Sampel Kadar fenolik total (mgGAE/g) Kadar flavonoid total (mgQE/g) Ekstrak etanol 96% 18,383±1,36329 1,198±0,811 Fraksi eter 35,912±0,54776 0,773±0,008 Fraksi etil asetat 8,325±1,01765 0,066±0,036 Fraksi air 16,442±0,27423 0,106±0,007
Tabel 3. Kadar fenolik dan flavonoid total ekstrak dan fraksi-fraksi daun Wijaya Kusuma
turunan dari senyawa fenolik. Senyawa ini memiliki sistem cincin aromatis terkonjugasi yang memiliki serapan pada sinar UV. Pengujian kadar flavonoid dilakukan dengan menggunakan pereaksi AlCl 3 yang dapat diukur pada rentang panjang gelombang 410- 423 nm 20 . Gugus hidroksil pada C nomor 3 atau 5 serta keto pada C nomor 4 bereaksi dengan pereaksi ini untuk membentuk kompleks warna kuning cerah yang stabil dalam suasana asam 11 . Meskipun metode pengujian kadar polifenol dengan microplate ini cepat, hemat biaya karena penggunaan pelarut dan pereaksi yang minimal serta hasil yang akurat, namun penting untuk diperhatikan bahwa ada kemungkinan terbentuk gelembung maupun presipitasi selama seluruh pengujian yang menyebabkan pengukuran menjadi tidak stabil 8 . Selain itu, penggunaan sampel dengan jumlah yang sangat sedikit harus ditangani dengan segera selama proses pengujian untuk menghindari penguapan pelarut yang tinggi di dalam tiap sumuran yang dapat menyebabkan kendala dalam proses pembacaan absorbansi (serapan). Peredaman radikal DPPH oleh senyawa antioksidan  pada  plat  KLT  dapat  terdeteksi dengan munculnya bercak berwarna kuning yang stabil selama 30 menit setelah dilakukan penyemprotan 21 . Hasil menunjukan keberadaan senyawa yang mampu meredam radikal DPPH pada fraksi eter. Namun, diduga jenis fenoliknya bukanlah suatu asam galat karena bercak kuning yang muncul tidak sejajar dengan bercak asam galat (Rf = 0,75). Aktivitas antioksidan pada sampel dapat diperankan oleh fenolik, flavonoid7 atau bahkan senyawa steroid 22 . Meskipun kandungan fenolik dan flavonoid tinggi pada ekstrak dalam pelarut nonpolar, ternyata aktivitas antioksidannya belum tentu lebih baik dibanding ekstrak dalam pelarut polar. Sebagian besar aktivitas antioksidan yang tinggi ditunjukan pada ekstrak atau fraksi yang diperoleh dari pelarut polar seperti etanol maupun metanol 17 . Dengan demikian, pengujian antioksidan secara kuantitatif lebih lanjut dan penelusuran senyawa yang berperan terhadapnya pada fraksi daun Wijaya Kusuma masih perlu dilakukan. Penelitian
yang dilakukan Artini dan Aryasa dinyatakan bahwa senyawa yang terkandung dalam ekstrak bunga wijaya kusuma pada lapisan petroleum eter adalah alkaloid, triterpenoid, dan saponin sehingga hal ini menguatkan kebaruan dari penelitian ini bahwa kandungan flavonoid  yang  sebelum  belum  ditetapkan dalam daun Wijaya Kusuma memiliki peran dalam aktivitas antioksidan 23 .
4.  Kesimpulan Fraksi eter daun Wijaya Kusuma mengandung  kadar  fenolik  dan  flavonoid tertinggi dibandingkan fraksi lainnya (fraksi eter>fraksi air>fraksi etil asetat). Kandungan senyawa pada fraksi eter memiliki aktivitas peredaman terhadap radikal DPPH yang ditapis menggunakan metode KLT.
Ucapan Terimakasih Penulis mengucapkan terima kasih  kepada  Lembaga  Penelitian  dan Pengembangan UHAMKA yang telah mendukung penelitian pada batch 1 tahun 2020, dengan nomor: 159/F.03.07/2021.

## Daftar Pustaka
1.  Dandekar R, Fegade B, Naik A. Evaluation of Anti Inflammatory Activity of Alcohol and Aqueous Extract of Epiphyllum oxypetalum Leaves. World J Pharm Pharm Sci. 2015;4(07):851–8.
2. Dwita LP, Hasanah F, Srirustami R, Repi, Purnomo R, Harsodjo S. Wound healing properties of Epiphyllum oxypetalum (DC.) Haw. leaf extract in streptozotocin- induced diabetic mice by topical application. Wound Med. 2019;26(1):1– 5.
3.  Dandekar R, Fegade B, Bhaskar VH. In vitro evaluation of free radical scavenging activities of Epiphyllum oxypetalum. World J Pharm Res. 2015;4(07):1301–9.
4. Devi  KRS,  Narayana  SL,  Menghani P, Georgekutty J. Microscopic, pharmacognostic and phytochemical screening of Epiphyllum oxypetalum (DC) haw leaves. J Pharmacogn Phytochem. 2018;7(6):972–80.
5.  Dandekar R, Fegade B, Bhaskar VH.
GC-MS analysis of phytoconstituents in alcohol extract of Epiphyllum oxypetalum leaves. J Pharmacogn Phytochem.
2015;4(1):149–54.
6.  Moharram HA, Youssef MM. Methods for Determining the Antioxidant Activity: A Review. Alexandria J Food Sci Technol. 2014;11(1):31–42.
7.  Dai J, Mumper RJ. Plant phenolics: Extraction, analysis and their antioxidant and anticancer properties. Molecules. 2010;15:7313–52.
8. Bobo-García G, Davidov-Pardo G, Arroqui C, Vírseda P, Marín-Arroyo MR, Navarro M. Intra-laboratory validation of microplate methods for total  phenolic  content  and  antioxidant activity  on  polyphenolic  extracts, and comparison with conventional spectrophotometric methods. J Sci Food Agric. 2015;95(1):204–9.
9.  Herald TJ, Gadgil P, Perumal R, Bean SR, Wilson JD. High-throughput micro-plate HCl-vanillin assay for screening tannin content in sorghum grain. J Sci Food Agric. 2014;94(10):2133–6.
10. Kementerian Kesehatan RI. Farmakope Herbal Indonesia (FHI). 2nd ed. Jakarta: Kementerian Kesehatan RI; 2008.
11. Hanani E. Analisis Fitokimia. Jakarta: Buku Kedokteran EGC; 2015. 34–45 p.
12. Sembiring EN, Elya B, Sauriasari R. Phytochemical Screening, Total Flavonoid and Total Phenolic Content and  Antioxidant  Activity  of  Different Parts of Caesalpinia bonduc (L.) Roxb. Pharmacogn J . 2018;10(1):123–7.
13. Irianti T, Murti YB, Kanistri DN, Pratiwi DR, Kuswandi, Kusumaningtyas RA. DPPH Radical Scavenging Activity of Aqueous Fraction from Ethanolic Extract of Talok Fruit (Muntingia calabura L.).
Tradit Med J. 2016;21(1):38–47. 14. Houghton PJ, Raman A. Laboratory Handbook for the Fractionation of Natural Extracts. 1st ed. Laboratory Handbook for the Fractionation of Natural Extracts. Springer-Science+Business Media, B.V.; 1998. 14–16, 24–31, 39–52 p.
15. Quideau  S,  Deffieux  D,  Douat-Casassus
C,  Pouysøgu  L. Plant Polyphenols:
Chemical Properties, Biological Activities, and Synthesis. Angew Chemie Int Ed . 2011;50(3):586–621.
16. Alara OR, Abdurahman NH, Ukaegbu CI. Extraction of phenolic compounds: A review. Curr Res Food Sci. 2021;4(March):200–14.
17. Nawaz H, Shad MA, Rehman N, Andaleeb H, Ullah N. Effect  of  solvent  polarity on extraction yield and antioxidant properties of phytochemicals from bean (Phaseolus  vulgaris)  seeds.  Brazilian  J Pharm Sci. 2020;56:e17129.
18. Singleton  VL,  Orthofer  R,  Lamuela- Raventos RM. Analysis of Total Phenols and Other Oxidation Substrates and Antioxidants by Means of Folin-Ciocalteu Reagent. In: Methods in Enzymology. Elsevier Inc .; 1999. p. 152–78.
19. Cicco  N,  Lanorte  MT,  Paraggio  M, Viggiano M, Lattanzio V. A reproducible, rapid and inexpensive Folin-Ciocalteu micro-method in determining phenolics of plant methanol extracts. Microchem J. 2009;91(1):107–10.
20. Khoddami A, Wilkes MA, Roberts TH, Khoddami A, Wilkes MA, Roberts TH. Techniques for analysis of plant phenolic compounds. Molecules. 2013;18(2):2328–75.
21. Sethiya NK, Raja MKMM, Mishra SH. Antioxidant markers based TLC-DPPH differentiation  on  four  commercialized botanical sources of Shankhpushpi (A Medhya Rasayana): A preliminary assessment. J Adv Pharm Technol Res. 2013;4(1):25–30. 22. Mooradian AD. A ntioxidant properties of steroids. J Steroid Biochem Mol Biol. 1993;45(6):509–11.
23. Artini NPR, Aryasa IWT. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Bunga Wijaya Kusuma ( Epiphyllum oxypetalum ). J Ilm Medicam. 2018;4(2):2356–4818.