BioEksakta: Jurnal Ilmiah Biologi Unsoed Volume 3, Nomor 2 (2021): 112-120 E-ISSN: 2714-8564

## Penambahan IAA dan BAP terhadap Pertumbuhan Kalus Eksplan Daun Anggrek Coelogyne pandurata
Lindl

## Johanes De Britto, Kamsinah, Lucky Prayoga
Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman Jalan dr. Soeparno 63 Purwokerto 53122 Email: johanesdebritto19@gmail.com
Rekam Jejak Artikel: Diterima  : 27/05/2021
Disetujui  : 06/04/2022

## Abstract
Orchid Coelogyne pandurata Lindl or black orchid is one of the endemic orchid from borneo Island. This orchid flower who have an unique that is have a green cephal and black labellum. Naturally propagation have a small chance of succsess so it needs to be done culture in vitro. One  of  the  culture  ways  is  use  explaned  leaf  for  making  callus’s  growth.  Callus  growth  can spurred  on  with  auxin  (IAA)  and  cytokinins  (BAP).  A  balanced  blend  of  auxin  concetracion and  cytokinins  are  expected  can  touch  callus  growth  up.  The  purpose  of  this  research  is  to know  addition  effect  of  IAA  and  BAP  for  Orchid C.  pandurata Lindl’s  growthed  and  know interaction  the  best  IAA  and  BAP  for  Orchid C.  pandurata Lindl’s  growth.  The  method  of research done by experiment with the completely randomized used factorial pattern. Factor 1 concentracion IAA  with 4 level : 0, 1, 2, 3 mg/L. and the next factor, concentracion of BAP with 4 level : 0, 1 , 2, 3 mg/L, so there are 48 experimental units. Observed parameter is: when the callus appears, the data obtained in the analysis with ANOVA and carried out DMRT test with believeable level 95%. The result of the research showed giving interaction of IAA and BAP can give a affect callus growth of Orchid C pandurata Lindl. The interaction effect is on the  callus  appearance,  callus  thickness,  and  callus  live  percentage.  As  well  as  being  able  to spur the development of callus in a proliferative directon. While giving IAA personally could stimulate callus thickening. The best interaction in callus’s growth explan the orchid flower is A2B2 (IAA 2 mg/L and BAP 2 mg/L) and A2B3 (IAA 2 mg/L and BAP 3 mg/L). Key words: BAP, Callus Growth, Coelogyne pandurate , IAA

## Abstrak
Anggrek Coelogyne  pandurata  Lindl atau  anggrek  hitam  merupakan  anggrek  endemik  dari Kalimantan.  Anggrek  tersebut  mempunyai  keunikan  yakni  sepal  berwarna  hijau  dan  labelum yang  berwarna  hitam.  Perbanyakan  secara  alami  tingkat  keberhasilannya  sangat  kecil  maka perlu di lakukan kultur in vitro . Kultur in vitro merupakan kultur yang menggunakan eksplan daun  untuk  memacu  pertumbuhan  kalus.  Pertumbuhan  kalus  dapat  dipacu  dengan  auksin (IAA) dan sitokinin (BAP). Perpaduan antara konsentrasi auksin dan sitokinin yang seimbang diharapkan  bisa  memacu  pertumbuhan  kalus.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk mengetahui  pengaruh  penambahan  IAA  dan  BAP  terhadap  pertumbuhan  kalus  anggrek C. pandurata Lindl dan mengetahui interaksi IAA dan BAP yang terbaik terhadap pertumbuhan kalus  anggrek C.  pandurata Lindl.  Metode  penelitian  dilakukan  yang  digunakan  adalah eksperimental  dengan  rancangan  acak  lengkap  menggunakan  pola  faktorial,  faktor  pertama adalah  kosentrasi  IAA  dengan  4  taraf:  0,  1,  2,  3  mg/L.  Dan  faktor  kedua  adalah  konsentrasi BAP  dengan  4  taraf  perlakuan:  0,  1,  2,  3  mg/L,  sehingga  ada  16  perlakuan,  masing-masing perlakuan  diulang  3  kali  sehingga  ada  48  unit  percobaan.  Parameter  yang  diamati  adalah: waktu munculnya kalus, tebal kalus, jenis kalus, berat kalus dan presentasi terbentuknya kalus. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan ANOVA dan dilakukan uji lanjut DMRT dengan tingkat  kepercayaan  95%.  Hasil  penelitian  menunjukkan  pemberian  IAA  dan  BAP  dapat mempengaruhi pertumbuhan kalus eksplan daun anggrek C. pandurata Lindl. Pengaruh secara interaksi terdapat pada wantu munculnya kalus, tebal kalus dan Prosentase hidup kalus. Serta mampu  memacu  perkembangan  kalus  ke  arah  proliferatif.  Sedangkan  pemberian  IAA  secara mandiri  dapat  memacu  penebalan  kalus.  Interaksi  yang  terbaik  dalam  pertumbuhan  kalus eksplan  daun  anggrek Coelogyne  pandurata Lindl.  adalah  A2B2  (IAA  2  mg/L  dan  BAP  2 mg/L) dan A2B3 (IAA 2 mg/L dan BAP 3 mg/L). Kata kunci: Anggrek Coelogyne pandurata , BAP, IAA, Pertumbuhan kalus

## PENDAHULUAN
Anggrek  hitam  atau Coelogyne  pandurata Lindl  merupakan  anggrek  yang  tumbuh  di  daerah Kalimantan,  Sumatera  dan  Semenanjung  Malaya, hidup  secara  epifit  dan  merupakan  anggrek sympodial,  mempunyai  lidah  (labellum)  berwarna hitam  dengan  sedikit  garis-garis  berwarna  hijau dan berbulu, namun sepal dan petal berwarna hijau muda, kelopak bersegitiga, ujung runcing. Bunganya  berada  pada  posisi  basal,  perbungaan menggantung,  bunga  7-10  kuntum  dan  tangkai pendek  dan  dapat  mekar  2x  selama  1  tahun. C. pandurata Lindl  memiliki  umbi  semu  dan  daun melonjong,  lebar  di  bagian  tengah  ke  ujung,  dan kaku  (Managanta,  2014).  Keunikan  inilah  yang membuat  anggrek  ini  mempunyai  nilai  ekonomi yang  tinggi.  Labelum  berwarna  hitam  ini  yang menjadi  daya  tarik  bagi  peneliti  sebagai  sumber silangan  baik  intergenerik  maupun  intragenerik. Namun,  keberadaan  anggrek  ini  sudah  sedikit  di alam,  maka  perlu  di  budidayakan  secara in  vitro yakni  salah  satunya  dengan  kalus  (Hartati et  al ., 2017).
Keberhasilan kultur in vitro ditentukan oleh zat  pengatur  tumbuh  (ZPT),  ZPT  yang  sering digunakan  adalah  auksin  dan  sitokinin.  Fungsi IAA  adalah  mendorong  pembentangan  sel  akibat dari  meningkatkan  potensial  air  jaringan  yang menyebabkan  sel  akan  mengalami  pembentangan. IAA  sebagai  auksin  dan  BAP  (Benzyl  amino purine)  sebagai  sitokinin  dapat  mendorong  sel untuk membelah secara terus menerus (Agustian et al .,  2010).  BAP  merupakan  sitokinin  sintetik  dari turunan  adenin  yang  aktif  dalam  pembelahan  sel, yang  merupakan  senyawa  relatif  stabil.  Fungsi BAP  sendiri  adalah  merangsang  pembelahan  sel, perkembangan sel meristem samping dan pembentukan kalus (Pratomo et al ., 2016).
Kalus  adalah  sekumpulan  sel  amorphus yang  berasal  dari  sel-sel  jaringan  awal  yang membelah diri secara terus menerus secara in vitro . Kalus dapat diperoleh dari bagian tanaman seperti akar, batang dan daun (Sudarmadji, 2003).   Pertumbuhan  kalus  di  tandai  dengan pembengkakan  atau  munculnya  jaringan  berwarna putih  bening  seperti  titik-titik  air/lendir  pada bagian  yang  dilakukan  perlukaan  yang  kemudian berkembang  menjadi  bulatan-bulatan.  Jenis  kalus di bagi menjadi dua yakni embriosomatik dan non embriosomatik.  Inisiasi  kalus  dapat  dilakukan dengan  penambahan  zat  pengatur  tumbuh  seperti auksin  dan  sitokinin.  Kalus  dapat  terbentuk  jika konsentrasi  antar  auksin  dan  sitokinin  seimbang (Ramdan & Hendra, 2015).
Perbanyakan  anggrek  dapat  dilakukan secara  konvensional  namun  dapat  dilakukan perbanyakan  menggunakan  kultur in  vitro .  Kultur in  vitro memiliki  keuntungan  yakni  waktu  yang relatif cepat dan hasil yang mirip dengan induknya (Mahadi,  2017).  Kombinasi  antara  pemberian Auksin  dan  sitokinin  yang  tepat  dapat  memacu pertumbuhan  kalus.  Efek  pemberian  auksin  (IAA)
dan sitokinin (BAP) dapat memacu perkembangan kalus.  Efektifitas  dalam  pemberian  zat  pengatur tumbuh  eksogen  seperti  IAA  dan  BAP  akan bergantung  pada  zat  pengatur  tumbuh  endogen atau fitohormon (Syahid et al ., 2010).
Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui  pengaruh  pemberian  IAA  dan  BAP terhadap pertumbuhan kalus eksplan daun anggrek C. pandurata Lindl dan mengetahui Interaksi IAA dan BAP yang terbaik terhadap pertumbuhan kalus eksplan  daun  anggrek C.  pandurata Lindl, sedangkan  manfaat  dari  penelitian  ini  diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai efek penamambahan IAA dan BAP terhadap pertumbuhan  eksplan  dan  mengetahui  konsentrasi yang  terbaik  dalam  memacu  pertumbuhan  kalus. Kedepannya kalus yang didapatkan dapat dilakukan  untuk  penelitian  lanjutan  dari  kalus menuju tunas.

## MATERI DAN METODE
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah  Media  MS,  Agar,  ZPT  IAA  dan  BAP, Akuades  serta  Alkohol.  Sedangkan  alat  yang digunakan untuk penelitian ini meliputi mikroskop, kamera, pH meter, timbangan analitik, dan  Laminar  air  flow.  Penelitian  ini  dilakukan  di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Fakultas Biologi  Universitas  Jenderal  Soedirman  pada bulan Mei sampai dengan September 2020.
Penelitian  dilakukan  secara  eksperimental dengan  menggunakan  rancangan  acak  lengkap (RAL)  pola  perlakuan  faktorial.  Faktor  pertama adalah penambahan IAA (A) dengan 4 taraf, yaitu: A1:  0  mg/L,  A2:  1  mg/L,  A3:  2  mg/L,  dan  A4:  3 mg/L.  Faktor  kedua  adalah  BAP  (B)  dengan  4 taraf, yaitu: B1: 0 mg/L, B2: 1 mg/L, B3: 2 mg/L, dan  B4:  3  mg/L,  sehingga  terdapat  16  perlakuan, masing-masing  perlakuan  dilakukan  3  kali pengulangan, sehingga total percobaan terdapat 48 unit  percobaan.  Variabel  dan  Parameter  yang diamati adalah variabel terikat yakni perkembangan  kalus  anggrek  hitam Coelogyne pandurata Lindl dan variabel bebas yakni IAA dan BAP.  Parameter  yang  di  amati  adalah:  Waktu munculnya  kalus,  Tebal  kalus,  Jenis  kalus,  Berat kalus dan Prosentase terbentuknya kalus.
Media yang digunakan untuk tiap perlakuan adalah  10  mL  pada  setiap  botol  kultur  dengan  16 kombinasi,  sehingga  total  media  yang  dibutuhkan yaitu  800  mL.  Setiap  beaker  glass  yang  sudah berisi  media  ditambah  IAA  dan  BAP  sesuai dengan perlakuan. Masing-masing dengan menambahkan  IAA  dari  stok  IAA  100  ppm  yang sudah  dihitung  dengan  rumus  pengenceran masing-masing  untuk  perlakuan  A1  sebanyak  0 mL,  A2  0,9  mL,  A3  1,8  mL,  A4  2,7  mL  dan ditambahkan  BAP  dari  stok  BAP  100  ppm  yang sudah  dihitung  dengan  rumus  pengenceran masing-masing  pada  perlakuan  B1  sebanyak  0 ppm, B2 0,9 mL, B3 1,8 mL, B4 2,7 mL. Larutan
media dihomogenkan dan pH media diukur hingga 5,2  menggunakan  pH  meter,  jika  pH  ≤  5,2  maka ditambahkan  NaOH  sebaliknya  jika  pH  ≥  5,2. ditambahkan  HCl.  Media  ditutup  dan  direkatkan dengan  wrapper  kemudian  diberi  label  sesuai perlakuan.  Parameter  yang  diamati  meliputi:  1. Waktu  munculnya  kalus  (hari).  Waktu  munculnya kalus di hitung dari hari mulai terbentuknya kalus. Pengambilan  data  dilakukan  setiap  hari.  2.  Tebal kalus  (mm).  Tebal  kalus  diukur  mengunakan mikroskop stereo. dengan mikrometer okuler yang sudah  dikalibrasi  terlebih  dahulu.  Pengambilan data dilakukan setiap minggu. 3. Jenis kalus. Jenis kalus di amati dan di bandingkan dengan referensi. Pengambilan  data  dilakukan  setiap  minggu.  4. Berat  Kalus  (g).  Berat  kalus  dihitung  dengan menimbang  cawan  yang  sudah  berisi  media  dan eksplan  daun.  Pengambilan  data  dilakukan  setiap minggu.  5.  Prosentase  terbentuknya  kalus  (%). Prosentase  terbentuknya  kalus  di  hitung  pada mulai  dari  munculnya  kalus  hingga  akhir penelitian. Data  yang  diperoleh  dianalisis dengan Analisis Ragam dengan tingkat kepercayaan  95%  dan  99%,  yang  dilanjutkan dengan  uji  Duncan  Multiple  Range  Test  (DMRT) pada tingkat kepercayaan 95%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Perlakuan IAA dan BAP terhadap pertumbuhan kalus eksplan daun anggrek Coelogyne  pandurata memberikan  dampak  pada pertumbuhan  kalus.  Hal  ini  disebabkan  oleh beberapa  faktor  seperti  eksplan  daun  anggrek C. pandurata yang tipis dan pemberian IAA dan BAP yang  beragam  kosentrasi  sehingga  memberikan dampak  yang  berbeda.  Hal  ini  sesuai  dengan pendapat  Ambarwati  (2001)  bahwa  kalus  dapat tumbuh pada konsentrasi auksin dan sitokinin yang seimbang.  Adapun  pembahasan  parameter  yang diamati sebagai berikut:
Pengaruh penambahan IAA dan BAP terhadap waktu  munculnya  kalus  (hari)  eksplan  daun anggrek C. pandurata
Pertumbuhan kalus sangat dipengaruhi oleh kombinasi  dan  konsentrasi  ZPT  yang  diberikan pada  suatu  media.  Berdasarkan  hasil  Analisis ragam  menunjukkan  bahwa  interaksi  IAA  dan BAP  berpengaruh  nyata,  BAP  dan  IAA  secara mandiri  berpengaruh  nyata.  Hasil  uji Duncan’s New Multiple Range Test (DNMRT) interaksi IAA dan  BAP  terhadap  waktu  munculnya  kalus  (Tabel
1).
Hasil  uji  lanjut  menunjukkan  bahwa perlakuan  A2B2  (IAA  2  mg/L  dan  BAP  2  mg/L) dan  A2B3  (IAA  2  mg/L  dan  3  mg/L)  paling berpengaruh  nyata  dibandingkan  perlakuan  lain. Namun  kedua  perlakuan  A2B2  dan  A2B3  tidak berbeda nyata. Pada perlakuan A2B2 (IAA 2 mg/L dan  BAP  2  mg/L)  cenderung  lebih  cepat pertumbuhannya  6,89  hst.  (Gambar  1)  dibanding
dengan perlakuan A2B3 (Konsentrasi IAA 2 mg/L dan  3  mg/L)  pada  7,84  hst.  Kalus  yang  tidak mampu  tumbuh sama  sekali  (Gambar  2) disebabkan  oleh  kandungan  nutrisi  pada  media yang  sudah  mulai  berkurang  (Rianawati,  2009). Untuk  meningkatkan  pertumbuhan  eksplant  maka perlu  adanya  penambahan  ZPT  dalam  media tanam.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  pertumbuhan kalus  daun C.  pandurata masih  membutuhkan penambahan  auksin  dan  sitokinin  secara  eksogen. Hal  ini  di  perkuat  oleh  Markal et  al .  (2015) Pemberian  auksin  dan  sitokinin  yang  seimbang mampu  memacu  perkembangan  kalus.  Pemberian sitokinin yang kurang dapat menghambat perkembangan  sel.  Pemberian  auksin  serta sitokinin  harus  mencukupi  agar  kalus  dapat terbentuk dengan baik. Kalus muncul pertama kali tumbuh  di  daerah  yang  mengalami  perlukaan  atau dekat irisan daun. Hal ini sesuai dengan pernyataan dari  Lestari et  al .  (2013).  Kalus  muncul  melalui pembengkakan  yang  dipengaruhi  oleh  interaksi antara hormon auksin dan sitokinin. Waktu muncul kalus  yang  terbaik  adalah  yang  memiliki  hari muncul  tercepat.  Kalus  muncul  pertama  kali melalui  irisan  dari  eksplan  daun  anggrek C. pandurata yang  kemudian  ditandai  dengan pembengkakan sel disekitar irisan daun anggrek.
Tabel  1. Hasil  uji Duncan  Multiple  Range  Test (DMRT)  terhadap  waktu  munculnya  kalus
(hari) eksplan daun anggrek C. pandurata
No. Perlakuan Rata-rata munculnya kalus (hari) 1. A0B0 0,7071 b 2. A0B1 0,7071 b 3. A0B2 0,7071 b 4. A0B3 0,7071 b 5. A1B0 0,7071 b 6. A1B1 0,7071 b 7. A1B2 0,7071 b 8. A1B3 0,7071 b 9. A2B0 0,7071 b 10. A2B1 0,7071 b 11. A2B2 6,8987 a 12. A2B3 7,8442 a 13. A3B0 0,7071 b 14. A3B1 2,5397 b 15. A3B2 3,1897 b 16. A3B3 0,7071 b DMRT 5% = 1.31
Keterangan:  angka  yang  diikuti  huruf  yang  sama tidak  berpengaruh  nyata  pada  DMRT 95%. Menurut  Kuo et  al. (2005)  pembentukan kalus pada setiap anggrek akan berbeda tergantung pada  hormon  auksin  dan  sitokininnya.  Pemberian TDZ  2  mg/L  dan  2,4-D  2  mg/L  sangat  cocok dengan  anggrek Phalaenopsis ‘Little Steve’ dalam perkembangan  kalus.  Kemunculan  kalus  anggrek Phalaenopsis  ‘Little  Steve’ dimulai  pada  30  hst dan  setelah  45  hst.  kalus  menghitam  dan  menuju
kearah  kematian  atau  senence.  Namun  menurut penelitian  Utami et  al .  (2007)  Kalus  anggrek Phalaenopsis  amabilis tumbuh  pada  minggu  ke  6 setelah  tanam  dengan  pemberian  NAA  0.5  mg/L dan  BA  1  mg/L  kombinasi  antara  NAA  dan  BA ternyata  memberikan  efek  yang  terbaik  bagi pertumbuhan  kalus  anggrek P.  amabilis. Kalus dapat  tumbuh  pada  bekas  luka  irisan  daun  bagian pangkal.  Pertumbuhan  kalus  anggrek  oncidium paling baik menggunakan perlakuan TDZ dan 2,4- D  seperti  pada  penelitian  Chen  &  Chang  (2006) menunjukkan pemberian TDZ 1 mg/L dan 2,4-D 1 mg/L  dapat  menumbuhkan  kalus  pada  waktu  2 minggu atau 14 hst.
Pengaruh penambahan IAA dan BAP terhadap berat  kalus  (mg)  eksplan  daun  anggrek C. pandurata
Berdasarkan  hasil  analisis  ragam  perlakuan interaksi  IAA  dan  BAP  maupun  BAP  secara mandiri  tidak  berpengaruh  nyata  terhadap  berat eksplan,  namun  perlakuan  IAA  secara  mandiri berpengaruh  nyata.  Berat  basah  kalus  meningkat bergantung  pada  kecepatan  membelahnya  sel  dan terjadi pembesaran sel. Auksin memiliki kemampuan  untuk  memperbesar  sel  lebih  baik  di bandingkan dengan sitokinin (Indah & Ermavitalini, 2013). Penelitian Utami et al . (2007) eksplan daun yang digunakan untuk menghasilkan embrio  somatic  adalah  bagian  pangkal  daun  yang lebih  muda  secara  fisiologis.  Pernyataan  tersebut di perkuat oleh penelitian Tokuhara  &  Mii (2001) untuk  melakukan  kultur  yang  mengharapkan pertumbuhan kalus, bagian tanaman yang digunakan  adalah  bagian  daun  yang  masih melakukan  perkembangan  vegetative  termuda. Selain itu pengaruh media juga dapat mempengaruhi hasil pertumbuhan kalus.
Pemberian  IAA  atau  auksin  secara  mandiri dapat memberikan efek pada berat kalus (Tabel 2), hal  ini  menunjukkan  penambahan  auksin  eksogen
dapat  memacu  pembelahan  sel  dan  memacu penambahan  berat  kalus.  Hal  ini  sesuai  dengan pernyataan Rahayu & Anggarwulan (2003) auksin dapat  menambah  berat  kalus  karena  dapat mempengaruhi kecepatan sel untuk membelah diri dan  mengarah  kepada  pembesaran  kalus.  Menurut Astuti et  al. (2019)  pemberian  2,4-D  sebagai sumber  auksin  eksogen  dapat  menginisiasi pembentukan  kalus.  Pemberian  Auksin  pada konsentrasi  yang  tepat  dapat  memberikan  efek terbaik,  namun  konsentrasi  auksin  yang  terlalu tinggi  tidak  akan  memberikan  efek  bagi  berat kalus. Perlakuan konsentrasi 2,4-D 3 mg/L - 2,4-D 2  mg/L  merupakan  konsentrasi  terbaik  yang menghasilkan  berat  kalus  lebih  tinggi.  Sebaliknya Khalida et al . (2019) yang melakukan penambahan 1 mg/L 2,4-D dan mampu memberi pengaruh yang signifikan  terhadap  berat  basah  kalus  anggrek Aerides  odorata. Pemberian  auksin  mandiri mampu memacu perkembangan berat basah kalus. Semakin  tinggi  pemberian  auksin  akan  terus memacu  penambahan  berat  basah  kalus  hingga titik optimalnya. Pemberian terlalu banyak hormon auksin  maupun  sitokinin  mampu  menghambat terbentuknya  kalus  karena  akumulasi  zat  pengatur tumbuh yang terlalu tinggi pada eksplan.
Pengaruh penambahan IAA dan BAP terhadap tebal  kalus  (mm)  eksplan  daun  anggrek C. pandurata.
Hasil analisis ragam tebal kalus menunjukkan  bahwa  interaksi  IAA  dan  BAP maupun secara mandiri berpengaruh nyata terhadap tebal kalus. Hasil uji lanjut DMRT (Tabel 3)  menunjukkan  perlakuan  A2B2  (IAA  2  mg/L dan  BAP  2  mg/L)  memberikan  hasil  ketebalan kalus  paling  tebal  berkisar  1,56  mm  sedangkan A2B3  (IAA  2  mg/L  dan  3  mg/L)  ketebalan  kalu berkisar  1,36  mm  (Gambar  3).  Perlakuan  A2B2 (IAA 2 mg/L dan BAP 2 mg/L) dan A2B3 (IAA 2 mg/L dan 3 mg/L) tidak berbeda nyata.
Gambar 1. Pertumbuhan Kalus A2B2 pada umur 5 mst (I). dan pertumbuhan kalus A2B2 pada umur 8 mst (II)
Gambar 2.  Pertumbuhan Kalus A0B2 pada umur 5 mst (I). dan pertumbuhan kalus A0B2 pada umur 8 mst (II)
Tabel 2. Berat kalus pada eksplan daun anggrek C.
pandurata setelah 12 mst No. Perlakuan Berat kalus 1. A0 0 b 2. A1 0 b 3. A2 8,375 a 4. A3 1,833 b DMRT 5% = 1.31
Keterangan  :  angka  yang  diikuti  huruf  yang  sama tidak  berpengaruh  nyata  pada  DMRT 95%
Ketebalan  kalus  sejalan  dengan  waktu munculnya  kalus  diperlukan  perlakuan  IAA  2 mg/L  dan  BAP  2  mg/L.  Perlakuan  auksin  dan sitokinin  akan  memberikan  dampak  yang  berbeda pada  jenis  anggrek  yang  lain.  Hasil  penelitian Nilahayati  (2011),  perlakuan  NAA  1  mg/L  dan BAP 1 mg/L memberikan pengaruh nyata terhadap tebal  kalus  pada  anggrek  dendrobium.  Pemberian BAP 3 mg/L  memberikan pengaruh terbaik dalam pertumbuhan  tinggi  atau  tebal  kalus  protocorm anggrek dendrobium dengan  rata  -  rata  sebesar 1,67 mm pada  minggu ke 12 (Bakar et al ., 2016).
Pemberian  sitokinin  dan  auksin  dalam  konsentrasi kecil  (NAA  0,1  mg/L  dan  TDZ  0,01  mg/L) ternyata  dapat  memberikan  hasil  tebal  kalus  yang baik  pada  anggrek  cymbidium  sebesar  0,2  cm (Takamura & Tanaka., 2004). Menurut Chen et al .
(2000)  pemberian  TDZ  0,5  mg/L  dan  2,4-D  0,5 mg/L  memberikan  hasil  tebal  kalus  anggrek phalaenopsis sebesar  0,4  mm.  Penelitian  Melisa
(2018)  melakukan  penelitian  dengan  penambahan 2,4-D  dan  kinetin  ternyata  mampu  memacu panjang kalus anggrek Grammatophyllum scriptum ,  konsentrasi  yang  terbaik  untuk  memacu perkembangan  protocom  adalah  4  mg/L  Auksin (2,4-D)  dan  2  mg/L  Sitokinin  (Kinetin).  Berbeda dengan  penelitian  Fithriyandini et  al .  (2015) perlakuan  BAP  2,5  mg/L  mampu  memberikan hasil  berbeda  pada  tebal  kalus  pada  anggrek Phalaenopsis  amabilis. Lebih  lanjut  dikatakan bahwa  penggunaan  BAP  yang  lebih  tinggi  akan meningkatkan  perkembangan  kalus  karena  BAP mempunyai kemampuan untuk melakukan pembelahan sel.
Tabel  3. Hasil  uji Duncan  Multiple  Range  Test (DMRT) terhadap tebal kalus (mm) eksplan daun anggrek C. pandurata setelah 12 mst. No. Perlakuan Rata-rata tebal kalus (mm) 1. A0B0 0,7071 c 2. A0B1 0,7071 c 3. A0B2 0,7071 c 4. A0B3 0,7071 c 5. A1B0 0,7071 c 6. A1B1 0,7071 c 7. A1B2 0,7071 c 8. A1B3 0,7071 c 9. A2B0 0,7071 c 10. A2B1 0,7071 c 11. A2B2 1,5681 a 12. A2B3 1,3695 a 13. A3B0 0,7071 c 14. A3B1 1,0705 b 15. A3B2 1,0089 b 16. A3B3 0,7071 c DMRT 5% = 1,31
Keterangan:  angka  yang  diikuti  huruf  yang  sama tidak  berpengaruh  nyata  pada  DMRT 95%

## Pengaruh penambahan IAA dan BAP terhadap Persentase terbentuknya kalus (%)
Hasil
analisis ragam persentase terbentuknya  kalus  menunjukkan  bahwa  interaksi IAA  dan  BAP  mapun  perlakuan  secara  mandiri berpengaruh  nyata.  Selanjutnya  pada  uji  DMRT interaksi  IAA  dan  BAP  terhadap  terbentuknya kalus  (Tabel  4.),  menunjukkan  hasil  paling  tinggi persentase  terbentuknya  kalus  pada  perlakuan A2B2  (IAA  2  mg/L  dan  BAP  2  mg/L)  memiliki nilai  tertinggi  60.19%,  akan  tetapi  perlakuan  ini tidak  berbeda  nyata  dengan  A2B3  (IAA  2  mg/L dan BAP 3 mg/L) yang memiliki nilai 45.2%.
Persentase  terbentuknya  kalus  sejalan dengan  waktu  munculnya  kalus dan tebal kalus di mana  diperlukan  auksin  dan  sitokinin  untuk pertumbuhan  kalus  pada  perlakuan  A2B2  (IAA  2 mg/L  dan  BAP  2  mg/L)  dan  A2B3  (IAA  2  mg/L dan  BAP  3  mg/L).  Perlakuan  A2B2  (IAA  2  mg/L dan BAP 2  mg/L) adalah perlakuan  terbaik dalam mempercepat  pertumbuhan  kalus,  tebal  kalus  dan persentase  kalus.  Hal   ini  menunjukkan    bahwa
konsentrasi  perlakuan  tersebut  memberikan  hasil yang  terbaik  karena  memiliki  nilai  60,19%. Meskipun  tidak  berbeda  nyata  dengan  perlakuan A2B3 (IAA 2 mg/L dan BAP 3 mg/L). Pemberian IAA  secara  eksogen  dapat  menambah  auksin endogen  untuk  membentuk  kalus  embriogenik (Kusmianjani et  al .,  2013).  Pada  penelitian Tokuhara & mii (2001) kalus anggrek
Phalaenopsis sp. mengalami pertumbuhan maksimal  kalus  pada  bulan  ke  4  atau  minggu  16 dengan  pemberian  NAA  0,5  mg/L  dan  BA  4,4 mg/L.  setelah  bulan  ke  7  kalus  mengalami senensce atau kematian. Sebaliknya pada penelitian  Samala et  al (2014)  pada  anggrek Grammatophylum  speciosus mendapatkan  kalus pada waktu yang lebih singkat dengan pemberian 1 mg/L  BA  dan  0,5  mg/L  NAA  menghasilkan  63% kalus  terbentuk  pada  3  bulan  setelah  tanam.  Hasil penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  perlakuan A2B2 (IAA 2 mg/L dan BAP 2 mg/L) mempunyai konsentrasi  yang  seimbang  dan  A2B3  (IAA  2 mg/L  dan  BAP  3  mg/L)  membentuk  kalus sebanyak  >50%  selama  3  bulan  pengamatan. Penelitian  ini  sesuai  dengan  penelitian  menurut Hoesen et  al (2008)  pemberian  TDZ  1  mg/L  dan
2,4-D  1  mg/L  pada  anggrek Dendrobium  lineale Rolfe dapat  memberikan  persentase  pertumbuhan kalus terbaik yakni >70% dalam 12 minggu setelah tanam.  Pemberian  sitokinin  dan  auksin  yang seimbang  akan  meningkatkan  memberikan  hasil pertumbuhan  kalus  yang  baik.  Berdasarkan penelitian  Lestari et  al. (2013)  interaksi  antara auksin  dan  sitokinin  yang  seimbang  dapat menumbuhkan kalus dengan baik. Konsentrasi 2,4- D  1  mg/L  dan  BAP  2  mg/L  dapat  menumbuhkan kalus Dendrobium  laxiflorum sebesar  36%.  Hal serupa  menurut  Naing et  al (2011)  pada  anggrek Coelogyne cristata yang diberikan 2,4 – D 2 mg/L dan  BA  2  mg/L  memberikan  hasil  yang  sangat signifikan  pada  persentase  terbentuknya  kalus sebesar 40% dan pemberian 2,4-D 3 mg/L dan BA 1 mg/L juga memberikan hasil yang berbeda nyata yakni 36%. Rineksane (2019) melakukan percobaan dengan memberikan 1 mg/L BAP + 0,1 mg/L  NAA  dan  2  mg/L  BAP  +  0,1  mg/L  NAA mampu  menumbuhkan  kalus  pada  eksplan  daun anggrek Vanda tricolor sebanyak <50%.
Persentase  hidup  kalus  yang  rendah  disebabkan penghambat  pertumbuhan  eksplan.  Hambatan  ini berasal  dari  kandungan  fenolik  yang  kuat  pada daun  anggrek  yang  menyebabkan  kematian  pada eksplan.  Menurut  Chen et  al .  (2000)  Anggrek cukup  sulit  dilakukan  pertumbuhan  pada  media karena  anggrek  mempunyai  metabolit  sekunder yang  cukup  besar  dan  sifat  dasar  anggrek  yang sangat sulit melakukan pertumbuhan klonal.
Tabel  4. Hasil  uji Duncan  Multiple  Range  Test (DMRT)  terhadap  Persentase  terbentuknya kalus  (%)  eksplan  daun  anggrek C. pandurata setelah 12 mst
No. Perlakuan Rata-rata Persentase terbentuknya kalus (%) 1. A0B0 4,055 b 2. A0B1 4,055 b 3. A0B2 4,055 b 4. A0B3 4,055 b 5. A1B0 4,055 b 6. A1B1 4,055 b 7. A1B2 4,055 b 8. A1B3 4,055 b 9. A2B0 4,055 b 10. A2B1 4,055 b 11. A2B2 60,191 a 12. A2B3 45,286 a 13. A3B0 4,055 b 14. A3B1 17,799 b 15. A3B2 17,799 b 16. A3B3 4,055 b
DMRT 5% = 1,31
Keterangan  :  angka  yang  diikuti  huruf  yang  sama tidak berpengaruh nyata pada DMRT 95%
Pengaruh penambahan IAA dan BAP terhadap bentuk  kalus  eksplan  daun  anggrek C. pandurata
Indah  &  Ermavitalini  (2013)  mengatakan bahwa  indikator  dalam  menentukan  bentuk  kalus salah  satunya  adalah  warna  kalus, yang  akan menentukan apakah kalus tersebut masih berkembang  atau  kalus  yang  mati.  Kalus embriogenik adalah kalus yang berwarna hijau dan berbentuk  globular,  mampu  berkembang  kearah organ maupun embrisomatik (Riyadi et al ., 2019). Sedangkan  kalus  proliferatif  adalah  kalus  yang masih  terus  berkembang  melakukan  pembesaran namun bukan kearah organ maupun embrio. Kalus senence  adalah  kalus  yang  tidak  mengalami perkembangan  lagi  dan  berwarna  hitam  (Nisa  & Rodinah, 2018).
Tabel 5. Jenis kalus pada eksplan daun anggrek C. pandurata setelah 12 mst
No. Perlakuan Jenis Kalus 1. A2B2 Proliferatif 2. A2B3 Proliferatif 3. A3B1 Proliferatif 4. A3B2 Proliferatif
Hasil  pengamatan  pertumbuhan  kalus  pada penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  kalus  akan mengalami  pertumbuhan  dengan  baik  hingga minggu  ke  7  setelah  tanam  (Gambar  4), pertumbuhan  selanjutnya  kalus  mulai  berwarna coklat,  yang  akan  mengalami  pertumbuhan senencen. Menurut Riyadi et al . (2019).
Gambar 4.  Kalus pada minggu ke 7 atau 49 hst pada perlakuan A2B2 (I) dan pada perlakuan A2B3 (II)
Gambar 5.  Kalus pada minggu ke 12 atau 84 hst pada perlakuan A2B2 (I) dan pada perlakuan A2B3 (II)
Perkembangan  warna  kalus  dari  krem  kekuningan dapat  menuju  warna  hijau  yang  baik.  Pada  awal pertumbuhan  kalus  yang  muncul  pada  penelitian ini merupakan kalus berwarna putih dan bertekstur kompak, hal ini menunjukkan bahwa pertumbuhan kalus  pada  awal  pertumbuhan  cukup  baik,  namun pada  perkembangan  selanjutnya  akan  mengalami senescen  yang  berwarna  coklat.  Hanya  pada perlakuan tertentu yang dapat tumbuh kalus (Tabel 5).
Kalus  yang  berwarna  hijau  adalah  kalus yang baik karena mengandung banyak klorofil dan kalus ini memiliki peluang yang cukup besar untuk terus berkembang menuju arah organ (Astuti et al ., 2019).  Pemberian  BAP  1  mg/L  akan  merangsang pembentukan  kalus  dan  pemberian  BAP  3  mg/L akan menghasilkan kalus berwarna hijau (Wirmasari  &  Isda,  2019).  Namun  pemberian auksin  yang  tinggi  akan  menyebabkan  penurunan klorofil.
Kalus  pada  penelitian  ini  berwarna  putih dan tidak menunjukkan ciri-ciri kalus embriosomatik.  Setelah  melewati  minggu  ke  7, kalus  mengalami  perubahan  warna  menjadi kecoklatan  dan  menuju  kearah  kematian  atau senence  (Gambar  5).  kecoklatan  ini  disebabkan oleh 2 hal yang pertama adalah senyawa metabolit sekunder  pada  daun  yang  terlalu  kuat  dan  dapat membuat lapisan disekitar kalus sehingga berakibat  terhambatnya  pertumbuhan  kalus  (Nisa &  Rodinah,  2018).  Toksisitas  fenol  disebabkan oleh  ikatan  reversible  antara  protein  dan  hidrogen sehingga  terjadi  penghambatan  dan  pertumbuhan kalus  tidak  dapat  terjadi  (Hutami,  2008).  Kalus yang  sudah  lama  didalam  cawan  harus  dilakukan subkultur  ke  media  baru.  Kalus  yang  terlalu  lama didalam  cawan  akan  mengalami  kekurangan kebutuhan  hara  untuk  melakukan  perkembangan kalus.  Serta  kandungan  CO 2 dalam  cawan  lebih tinggi dibandingkan dengan O 2, menyebabkan kalus tidak dapat berkembang (Yudiawan, 2015).

## SIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  penambahan IAA  dan  BAP  terhadap  pertumbuhan  eksplant daun anggrek C. pandurate Lindl. dapat disimpilkan  bahwa  :  pemberian  IAA  dan  BAP dapat  mempengaruhi  pertumbuhan  kalus  eksplan daun  anggrek  C.  pandurata  Lindl.  pada  waktu munculnya kalus, tebal kalus dan prosentase hidup kalus.  Serta  mampu  memacu  perkembangan  kalus ke  arah  proliferatif.  Interaksi  IAA  dan  BAP  yang terbaik  dalam  pertumbuhan  kalus  eksplan  daun anggrek  C.  pandurata  Lindl.  adalah  A2B2  (IAA  2 mg/L  dan  BAP  2  mg/L)  dan  A2B3  (IAA  2  mg/L dan BAP 3 mg/L).

## DAFTAR REFERENSI
Agustian, A., Nuriyani, N., Maira, L. & Emalinda, O., 2010.
Rhizobakteria penghasil fitohormon  IAA  pada  rhizosfir  tumbuhan semak  karamunting,  titonia,  dan  tanaman pangan. Jurnal Solum , 7(1), pp. 49-60.
Ambarwati,  A.D.  2001. Induksi  kalus  dan differensiasi  pada  kultur  jaringan  Gnetum gnemon  L .  Fakultas  Biologi.  Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Astuti,  A.T.,  Noli,  Z.A.  &  Suwirmen,  S.,  2019. Induksi Embriogenesis Somatik Pada Anggrek  Vanda  Sumatrana  Schltr.  dengan Penambahan  Beberapa  Konsentrasi  Asam 2,  4-Diklorofenoksiasetat  (2,  4-D). Jurnal Biologi Universitas Andalas , 7(1), pp. 6-13.
Bakar,  M.,  Mandang,  J.,  Kojoh,  D.  &  Demasabu, S., 2016, June. Penggunan BAP dan Kineti Pada  Induksi  Tunas  Dari  Protocorm Anggrek  Dendrobium  ( Dendrobium  Sp ) Pada Kultur In Vitro. In Cocos , 7 (4).
Chen, J.T. and Chang, W.C., 2006. Direct somatic embryogenesis and plant regeneration  from leaf  explants  of  Phalaenopsis  amabilis. Biologia Plantarum , 50(2), pp. 169-173.
Chen,  Y.C.,  Chang,  C.  &  Chang,  W.C.,  2000.  A reliable protocol for plant regeneration from callus  culture  of  Phalaenopsis .  In  vitro Cellular  &  Developmental  Biology-Plant , 36(5), pp. 420-423.
Fithriyandini,  A.,  Maghfoer,  M.D.  &  Wardiyati, T.,  2015.  Pengaruh  media  dasar  dan  6- benzylaminopurine (BAP) terhadap pertumbuhan  dan  perkembangan  nodus tangkai bunga Anggrek Bulan ( Phalaenopsis amabilis ) dalam perbanyakan secara  in vitro .  Jurnal Produksi Tanaman , 3(1).
Hartati,  S.,  Nandariyah,  N.,  Yunus,  A.  &  Djoar,
D.W.,  2017.  Cytological  studies  on  black orchid hybrid ( Coelogyne pandurata Lindley). Biodiversitas Journal of
Biological Diversity , 18(2), pp.555-559.
Hoesen, D.S.H., Witjaksono, W. & Sukamto, L.A., 2008.  Induksi  kalus  dan  organogenesis kultur  in  vitro Dendrobium  lineale Rolfe .
Berita Biologi , 9(3), pp.333-341.
Hutami,  S.,  2008.  Ulasan  Masalah  Pencolatan Pada Kultur Jaringan. AgroBiogen 4(2), pp. 83-88.
Indah,  P.N.  and  Ermavitalini,  D.,  2013.  Induksi kalus daun nyamplung ( Calophyllum inophyllum Linn.) pada beberapa kombinasi konsentrasi  6-Benzylaminopurine  (BAP) dan 2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2, 4- D). Jurnal Sains dan Seni ITS , 2(1), pp. E1- E6.
Kasi,  P.D.  and  Semiarti,  E.,  2017.  Pengaruh
Thidiazuron  Dan  Naphtalene  Acetic  Acid Untuk Induksi Embriogenesis Somarik Dari Daun Anggrek Phalaenopsis “Sogo
Vivien”. Dinamika , 7(1), pp.31-40.
Khalida,  A.,  Suwirmen,  S.  dan  Noli,  Z.A.,  2019.
Callus  Induction  of  Aerides  odorata  Lour. by  Adding  2,  4  Dichlorophenoxyacetic Acid  (2,  4-D). Jurnal  Biologi  UNAND , 7(2), pp. 109-117.
Kusmianjani, E., Revandy, I. D., Luthfi, A., 2015.
Pengaruh Pemberian 2,4-D Terhadap
Pertumbuhan  dan  Metabolisme  Kalus Kedelai  Pada  Kondisi  Hipoksida  Secara  In vitro. Jurnal  Agroteknologi ,  4(1),  pp.1673- 1680.
Kuo,  H.L.,  Chen,  J.T.  and  Chang,  W.C.,  2005. Efficient  plant  regeneration  through  direct somatic  embryogenesis  from  leaf  explants of  Phalaenopsis  ‘Little  Steve’. In  vitro Cellular  &  Developmental  Biology-Plant , 41(4), pp.453.
Mahadi, I., 2017. Multifikasi Tunas Anggrek Larat ( Dendrobium  phalaenopsis Fitzg)  Dengan Pemberian Hormon IAA Dan BAP
Terhadap  Pertumbuhan  Secara  In  vitro.
EKSAKTA , 2, pp.1-6.
Managanta,  A.A.,  2014.  Studi  Habitat  Dan Inventarisasi Anggrek Hitam ( Black Orchid )  Di  Kawasan  Hutan  Cagar  Alam Bancea Kecamatan Pamona Selatan,
Kabupaten  Poso. Jurnal  Ilmiah  AgroPet , 11(1).
Markal,  A.,  Isda,  M.N.  &  Fatonah,  S.,  2015. Perbanyakan  anggrek Grammatophyllum scriptum (Lindl.) BL. melalui induksi tunas secara  in  vitro  dengan  penambahan  BAP dan  NAA. Doctoral  dissertation ,  Riau University.
Melisa,  A.O.,  2018.  Pemberian  Kombinasi  2,  4-D
Dan  Kinetin  Terhadap  Induksi  Protocorm Like Bodies (PLB) Anggrek
Grammatophyllum scriptum Secara In vitro. Journal Of Biology Education , 1, pp. 34.
Naing, A.H., J.D Chung dan K.B. Lim. 2011. Plant Regeneration  throuhgt  Indirect  Somatic Embryogenesis in Coelogyne cristata Orchids. American  Journal  of  Plant Science , 2, pp. 262-267.
Nilahayati,  N.,  2011.  Regenerasi  Kalus  Anggrek (Dendrobium  sp)  dengan  Menggunakan NAA dan BAP dalam Media MS Secara In vitro. Jurnal Agrium , 8(1), pp.18-23.
Nisa,  C.  and  Rodinah,  R.,  2018.  Kultur  Jaringan beberapa  Kultivar  Buah  Pisang  (Musa paradisiaca L.) dengan Pemberian Campuran NAA dan Kinetin . BIOSCIENTIAE , 2(2).
Pratomo, B., C. Hanum., dan L. A. P. Putri., 2016. Pertumbuhan okulasi tanaman karet ( Hevea brassiliensis Muell  arg.)  dengan  tinggi penyerongan batang bawah dan benzilaminopurin  (BAP)  pada  pembibitan polibag. Jurnal  Pertanian  Tropik. 2  (13):
119-123.
Rahayu,  B.E.K.T.I.  and  Anggarwulan,  E.,  2003.
Pengaruh asam 2, 4-diklorofenoksiasetat (2,
4-D) terhadap
pembentukan dan
pertumbuhan kalus serta kandungan flavonoid  kultur  kalus Acalypha  indica L. Biofarmasi , 1(1), pp.1-6.
Ramdan,  R.  R  dan  H.  Hendra.,  2015.  Induksi Kalus  Chrysanthemum  indicum  untuk Meningkatkan Keragaman Genetik dari Sel Somatik. Pros  sem  nas  masy  biodiv  indon .
1 (1). pp: 167-170.
Rianawati, S. Purwito, A. Marwoto, B. Kurniati, R dan Suryanah. 2009. Embriogenesis somatik  dari  eksplan  daun  Phalaenopsissp L. J . Argon Indonesia . 37(3), pp. 240-248.
Rineksane, I.A., 2019. Regenerasi Anggrek Vanda tricolor Pasca Erupsi Merapi Melalui Kultur In  vitro. Prosiding  Seminar Nasional Universitas PGRI. Yogyakarta.
Riyadi, I., Efendi, D., Purwoko, B.S. and Santoso, D.,  2019.  Embriogenesis  somatik  tidak
langsung  pada  tanaman  sagu  (Metroxylon sagu  Rottb.)  menggunakan  sistem  kultur suspensi,  perendaman  sesaat,  dan  media padat. Jurnal AgroBiogen 12(1), pp. 37-44
Samala,  Sainiya.,  Te-chato,  Sompong.,  Yenchon, Sureerat.,  Thammasiri,  Kanchit.,  2014.
Protocorm-like body Proliferation of Grammatophyllum speciosum Through Asymbiotic  Seed  Germination. Science Asia , 40, pp. 379-383.
Santoso,  U,.dan  Fatimah,  N.,  2004. Kultur Jaringan Tanaman . UMM press: Malang.
Serliana,  M.  and  Linda,  R.,  2017.  Pertumbuhan Anggrek  Hitam  ( Coelogyne  pandurata Lindl.) secara In vitro Dengan Penambahan Ekstrak  Tomat  ( Solanum  lycopersicum L) Dan Benzyl Amino Purine (BAP). Protobiont, 6(3).
Sudarmadji.  2003.  Penggunaan  Benzil  Amino Purine  pada  Pertumbuhan  Kalus  Kapas Secara In vitro. Buletin Teknik Pertanian . 8 (1).
Syahid  SF,  Kristina  NN,  &  Seswita  D.  2010. Pengaruh komposisi media terhadap petumbuhan  kalus  dan  kadar  tannin  dari daun  jati  belanda  ( Guazuma  ulmifolia Lamk.)  secara  in  vitro. Jurnal  LITTRI 16 (1), pp. 1-5.
Takamura,  T.  and  Tanaka,  M.,  2004.  Callus formation  and  plant  regeneration  from callus through somatic embryo structures in Cymbidium  orchid . Plant  Science ,  166(6), pp. 1443-1449.
Tokuhara,  K.  and  Mii,  M.,  2001.  Induction  of embryogenic  callus  and  cell  suspension culture from shoot tips excised from flower stalk  buds  of  Phalaenopsis  (Orchidaceae). In vitro Cellular & Developmental Biology- Plant , 37(4), pp. 457-461.
Utami,  E.S.W.,  Soemardi,  I.,  Taryono  dan Semiarti,  E.  2007.  Embriogenesis  somatik anggrek  bulan Phalaenopsis  amabilis (L.) Bl.:  Struktur  dan  pola  perkembangan, Berkala Penelitian Hayati 13: 33-38.
Wirmasari,  R.  and  Isda,  M.N.,  2019.  Response  of
Protocorm Grammatophyllum
stapeliiflorum  (Teijsm.  &  Binn.)  JJ  Sm. Orchid  in  Growth  on  Several  Media Composition. Jurnal Biologi UNAND , 7(2), pp.118-125.
Yudiawan,K.  F.,  2015.  Pengaruh  2,4-D  &  Kinetin pada  Pembentukan  Kalus  dalam  Kultur Anthera Kecipir (Psophocarpus
tetragonolobus  L). Skripsi .  Universitas Jenderal Soedirman.