## UNPAD

## In Vivo Study: Hypnotic-Sedative Activity and Acute Toxicity of the Ethyl Acetate Fraction of Polypodium feei
Deden W. Suwandi 1 , Imas Siti 1 , Muhammad Akbar 1 , Nurul Auliasari 1 , Siva Hamdani 1*
1Program Studi Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Garut, Garut Submitted 29 December 2022; Revised 24 March 2023; Accepted 05 April 2023; Published 07 June 2024 *Corresponding author: siva@uniga.ac.id

## Abstract
Polypodium feei is a plant that is used by the community as traditional medicine. Previous research reported that the ethyl acetate fraction of P. feei root has strong analgesic activity at a dose of 200 mg/ kg BW. The acute toxicity of its extract is a depressant by reducing motor activity. This study aims to determine the effective and safe dose of P. feei root fraction as a hypnotic-sedative. This research began with testing the sedative hypnotic activity animals induced by interperitoneal phenobarbital as well as testing acute toxicity through observing animal behavior, macropatology, and the LD50 value. The results of testing the hypnotic-sedative activity of the ethyl acetate fraction at doses of 50, 100, and 200 mg/kg BW had hypnotic-sedative activity in experimental animals. This test showed that increasing  the  dose  could  increase  the  hypnotic-sedative  activity  which  was  significantly  different when compared to the control group (P<0.05). Acute toxicity testing resulted in a decrease in motor activity. The highest dose, namely 5,000 mg/kg BW, can cause fatty liver disease (Steatosis). Based on these tests, the use of the ethyl acetate fraction has hypnotic-sedative activity with an effective dose of 50 mg/kg BW which is safe in experimental animals.
Keywords: Acute toxicity, Ethyl acetate fraction, Polypodium feei root, Sedative-hypnotic
Studi In Vivo: Aktivitas Hipnotik-Sedatif dan Toksisitas Akut dari Fraksi Etil Asetat Akar Pakis Tangkur ( Polypodium feei )

## Abstrak
Tanaman  pakis  tangkur  merupakan  tanaman  yang  dimanfaatkan  oleh  masyarakat  sebagai  obat tradisional. Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa fraksi etil asetat akar pakis tangkur memiliki aktivitas analgetik kuat pada dosis 200 mg/kg BB. Pengujian toksisitas akut ekstrak akar pakis tangkur bersifat depresan dengan menurunkan aktivitas motorik dan jumlah jengukan hewan. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan dosis efektif dan aman dari fraksi akar pakis tangkur sebagai hipnotik- sedatif. Penelitian ini diawali dengan pengujian aktivitas hipnotik sedatif dari fraksi etil asetat akar pakis tangkur berdasarkan parameter jumlah jatuh, onset dan durasi tidur pada hewan yang diinduksi fenobarbital  secara  interaperitoneal  serta  pengujian  toksisitas  akut  melalui  pengamatan  perilaku hewan,  penentuan  bobot  badan,  indeks  organ  dan  pengamatan  makroskopik  organ,  serta  penetuan nilai LD50. Hasil pengujian aktivitas hipnotik-sedatif fraksi etil asetat akar pakis tangkur dosis 50, 100,  dan  200  mg/kg  BB  memiliki  aktivitas  hipnotik-sedatif  pada  hewan  percobaan.  Pengujian  ini diperoleh  adanya  peningkatan  dosis  dapat  meningkatkan  aktivitas  hipnotik-sedatif  yang  berbeda bermakna apabila dibandingkan kelompok kontrol (P<0,05). Pengujian toksisitas akut menyebabkan penurunan aktivitas motorik dan jumlah jengukan hewan. Dosis tertinggi yaitu 5.000 mg/kg BB dapat menimbulkan perlemakan (Steatosis) organ hati. Berdasarkan pengujian tersebut penggunaan fraksi etil  asetat  memiliki  aktivitas  hipnotik-sedatif  dengan  dosis  efektif  50  mg/kg  BB  yang  aman  pada hewan percobaan.
Kata Kunci: Toksisitas akut, Fraksi etil asetat, Akar pakis tangkur, Hipnotik-sedatif

## 1.  Pendahuluan
Tumbuhan Pakis tangkur ( Polypodium feei., METT) merupakan salah satu tanaman herbal yang rebusan akarnya digunakan oleh masyarakat  sebagai  obat  reumatik,  tekanan darah,  sakit  pinggang,  memperlancar  buang air kecil dan sebagai afrodiasiaka. Tumbuhan ini banyak ditemukan di sekitar pegunungan vulkanik salah satunya di gunung tangkuban perahu, Bandung. 1
Kandungan  senyawa  kimia  yang terdapat  dalam  akar  pakis  tangkur  yaitu kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside-7-O- α-L-rhamno pyranoside, flavonoid glycoside, (-)-4β-carboxymethyl epiafzelechin (3′-deoxydryopteric  acid),  (+)-afzelechin-O- β-4′-D-glucopyranoside,  dan  Selligueain  A and selligueain B yang dilaporkan memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi. 2,3 Selliguean  A  merupakan  senyawa yang  diisolasi  dalam  fraksi  etil  asetat  akar pakis  tangkur  yang  aktif  sebagai  analgetika dan  antiinflamasi  dengan  mekanisme  kerja menghambat  enzim  Siklooksigenase  (COX) dan inducible Nitric Oxide Sinthase (iNOS). 1 Uji toksisitas akut ekstrak akar pakis tangkur dilaporkan  dapat  bersifat  depressant  pada psikomotor  hewan  mencit. 4 Obat  yang memiliki aktivitas analgetik kuat   biasanya disertai efek mengantuk dan menenangkan. 5 Berdasarkan  latar  belakang  di  atas, maka  perlu  dilakukan  pengujian  aktivitas fraksi etil asetat sebagai hipnotik-sedatif dan pengujian  keamanannya.  Tujuan  penelitian ini adalah menguji aktivitas hipnotik-sedatif dan  menguji  toksisitas  akut  dari  fraksi  etil asetat pada hewan percobaan.
2.  Metode 2.1.  Alat Alat  yang  digunakan  pada  penelitian ini  adalah rotarod ( Intralab ,  Indonesia), evaporator (Buchi R-3 HB, Switzerland ), pH meter  (Hanna,  Indonesia), moisture balance (Sartorius,  Indonesia),  dan flowability  tester (Hanna, Indonesia).
2.2.  Bahan Bahan yang digunakan pada penelitian ini  adalah  akar  pakis  tangkur  ( Herbarium
voucher number :  5266/11.CO2.2/PL/2020), fenobarbital  injeksi  (Phapros,  Indonesia), tragakan  1%,  etanol  70%  ( Bratachem , Indonesia), etil asetat ( Bratachem , Indonesia).
2.3.  Hewan
Hewan  uji  yang  digunakan  pada penelitian ini adalah  mencit jantan putih galur swiss  webster  berumur  2-3  bulan  dengan bobot  badan  rata-rata  20-30  gram  yang diperoleh  dari  Institut  Teknologi  Bandung (ITB).
2.4.  Prosedur
2.3.1. Pembuatan Ekstrak dan Fraksi Ekstraksi  dilakukan  dengan  cara maserasi  terhadap  serbuk  simplisia  akar pakis  tangkur  diekstraksi  dengan  etanol 70%  (3x24  jam)  pada  temperatur  ruangan hingga diperoleh ekstrak encer. Ekstrak encer selanjutnya diuapkan pelarutnya dengan alat rotary evaporator dengan  suhu  50ºC  untuk mendapatkan ekstrak kental.
Ekstrak  kental  difraksinasi  dengan dengan  pelarut  n-heksan,  etil  asetat,  dan aquadest.  Selanjutnya  diuapkan  pelarutnya menggunakan alat rotary evaporator hingga kental, kecuali fase air dihilangkan pelarutnya dengan cara kering beku ( freeze dry ).
2.3.2. Pengujian Hipnotik-Sedatif Pengujian  aktivitas  hipnotik-sedatif dilakukan  pada  kelompok  hewan  yang terdiri  dari  kelompok  kontrol  negatif  diberi aquadest  secara  oral,  kelompok  kontrol positif  diberi  larutan  tragakan  1%  secara oral,  dan  kelompok  uji  diberi  Fraksi  Etil Asetat  Akar  Pakis  Tangkur  (FEAPT)  dosis 50,  100,  dan  200  mg/kg  BB  secara  oral. Kemudian 30 menit setelah perlakuan, semua kelompok  hewan  kecuali  kontrol  negatif, diinjeksikan  larutan  fenobarbital  dosis  90 mg/kg  BB  secara  intraperitoneal.  Setelah satu  jam  pemberian  fenobarbital,  jumlah jatuh hewan dihitung pada mesin rotarod (10 rpm) selama 3 menit dengan interval 1 menit, kemudian diamati onset dan durasi tertidurnya hewan  melalui  pengamatan righting  reflex yaitu  ketika  hilangnya  refleks  mencit membalikkan kembali posisi tubuhnya ketika
diterlentangkan karena terjadinya penurunan kesadaran  sebagai  efek  senyawa  hipnotik seperti senyawa fenobarbital. 6
2.3.3. Pengujian Toksisitas Akut Pengujian  dilakukan  secara in vivo terhadap  hewan  coba  mencit  betina  yang diambil secara acak dengan pemilihan hewan berdasarkan  kriteria  inklusi  hewan  sehat, bobot badan 20-30 gram, umur 6-8 minggu, dikelompokkan menjadi 5 kelompok masing- masing kelompok terdiri dari 4 ekor dengan 4 kelompok uji dan 1 kelompok kontrol. Pada penelitian  ini,  hewan  dipuasakan  3-4  jam sebelum pemberian sediaan uji dengan dosis tunggal dari dosis terendah sampai tertinggi (300, 1000, 2000, dan 5000 mg/kg BB) dan uji kontrol PGA 1%. Parameter yang diamati yaitu  perilaku  hewan,  bobot  badan,  indeks organ dan kematian untuk menentukan LD50. Waktu  pengamatan  hewan  dilakukan  setiap hari selama 14 hari.
Pada  waktu  satu  hari  pengamatan  (30 menit setelah pemberian obat), respon hewan diamati diantaranya aktivitas motorik, straub, piloereksi,  ptosis,  refleks  pineal,  refleks kornea  dan  lakrimasi, retablisment, fleksi, hafner, mortalitas, grooming, defekasi, urinasi, salivasi, vokalisasi, pernafasan, writhing, dan katalepsi. Setelah pengamatan hewan berakhir (14  hari),  perilaku  hewan  diamati  kembali. Selanjutnya,  hewan  dikorbankan/ euthanasia secara  fisik  menggunakan  teknik  dislokasi leher dengan cara ekor mencit ditarik secara berlawanan  dari  bagian  badannya  dengan leher  diberi  penahan  batang  logam  hingga mencit meregangkan badannya dan terbunuh.
Selanjutnya,  dilakukan  pembedahan  dan diiisolasi  organ-organ  vitalnya  untuk diidentifikasi  secara  makroskopis  dan bobotnya,  untuk  memperoleh  indeks  organ setiap  kelompok  uji  (Persetujuan  etik  uji toksisitas akut: 956/UN6.KEP/EC/2022). 7
2.3.4. Analisis Data Data  yang  diperoleh  dianalisis  secara statistik dengan menggunakan software SPSS ( Statistical Product and Service Solution ), menggunakan metode ANOVA dan uji lanjut LSD dengan P<0,05.
2.3.5. Persetujuan Etik Pengujian aktivitas hipnotik-sedatif ini disetujui  dan  memperoleh  rekomendasi  dan komite etik Fakultas Kedokteran Universitas Padjadjaran  dengan  Nomor:  956/UN6.KEP/ EC/2022.
3.  Hasil Simplisia  serbuk  akar  pakis  tangkur sebanyak  4,52  Kg  dimaserasi  menggunakan pelarut  etanol  70%.  Ekstrak  kental  yang diperoleh sebanyak 1.232,7 gram (rendemen 27,27%). Hasil fraksinasi akar pakis tangkur dengan  pelarut  etil  asetat  diperoleh  513,75 gram. Pengujian  fraksi  etil  asetat  akar  pakis tangkur,  pertama-tama  dilakukan  pengujian aktivitas  hipnotik-sedatif.  Hasil  pengamatan dapat dilihat pada Gambar 1, 2, dan 3.
Fraksi  etil  asetat  akar  pakis  tangkur, selanjutnya  dilakukan  pengujian  keamanan melalui  uji  toksisitas  akut  terhadap  mencit putih  betina  galur swiss webster. Parameter
Gambar 1. Jumlah jatuh mencit setelah perlakuan (Keterangan:  *=  Berbeda  bermakna terhadap kelompok kontrol (P<0,05))
Gambar 2. Onset tidur mencit setelah perlakuan (Keterangan:  *=  Berbeda  bermakna dengan kontrol positif (p<0,05))
pengamatan uji toksisitas akut yang pertama adalah  pengamatan  bobot  badan  mencit (Gambar  4)  yang  dilakukan  penimbangan setiap  hari  selama  14  hari  pemeliharaan sejak  awal  pemberian  sediaan  uji  hingga berakhirnya  masa  pengamatan.  Hasil pengujian  menunjukkan  semua  hewan  uji memiliki  bobot  badan  yang  stabil,  bahkan mengalami  peningkatan  bobot  badan meskipun tidak berbeda bermakna (P>0,05). Pengamatan berikutnya adalah perilaku hewan  sebelum  dan  sesudah  pemberian fraksi akar pakis tangkur dalam dosis sekali pemberian.  Parameter  yang  diamati  yaitu aktivitas motorik dan jumlah jengukan pada meja  platform,  piloereksi,  refleks  hewan diantaranya  ptosis,  pineal,  korneal, haffner dan fleksi, grooming , lakrimasi, retablisment, straub , aktivitas defekasi dan urinasi, salivasi, vokalisasi, writhing , dan katalepsi. Data yang diperoleh  ditetapkan  sebagai  persen  jumlah
hewan  yang  menimbulkan  respon  setelah pemberian  sediaan  uji  (Hasil  pengamatan tidak  ditampilkan).  Serta  hewan  uji dikorbankan  untuk  menentukan  nilai  indeks organ. Hasilnya dapat dilihat pada Tabel 1.
Selanjutnya  dilakukan  pengamatan makroskopik organ-organ vital untuk melihat efek  yang  ditimbulkan  oleh  sediaan  uji terhadap kondisi visual dari organ-organ vital mencit. Hasilnya dapat dilihat pada Gambar 5a dan 5b.
4.  Pembahasan Pengujian  hipnotik-sedatif  dilakukan pada  hewan  mencit  yang  diinduksi  dengan senyawa  fenobarbital  9  mg/kg  BB  hingga hilangnya righting  refleks .  Fenobarbital bekerja  dengan  berikatan  pada  komponen- komponen  molekular  reseptor  GABA  pada membran  neuron  SSP,  ikatan  ini  dapat menyebabkan kanal ion klorida terbuka dan
Gambar 3. Durasi tidur mencit setelah perlakuan (Keterangan:  *=  Berbeda  bermakna terhadap kelompok kontrol (P<0,05))
Gambar 4. Rata-rata Bobot Badan Mencit Kelompok hewan mg/ kg BB Indeks organ vital mencit Ginjal Limpa Uterus Paru-paru Otak Hati Jantung Lambung Kontrol 1,34 ±0,12 0,99 ±0,22 0,98 ±0,16 1,11 ±0,12 0,95 ±0,10 6,84 ±0,25 0,54 ±0,11 1,02 ±0,12 FEAPT 300 1,31 ±0,11 1,04 ±0,23 1,05 ±0,17 0,91 ±0,13 0,78 ±0,14 6,82 ±0,25 0,66 ±0,13 0,91 ±0,14 FEAPT 1000 1,35 ±0,10 1,10 ±0,22 0,94 ±0,19 0,93 ±0,15 0,81 ±0,10 6,98 ±0,19 0,50 ±0,08 0,88 ±0,12 FEAPT 2000 1,30 ±0,12 1,09 ±0,21 0,99 ±0,18 0,94 ±0,12 1.05 ±0,13 6,12 ±0,42* 0,42 ±0,06 0,98 ±0,11 FEAPT 5000 1,21 ±0,13 1,12 ±0,20 1,01 ±0,22 0,89 ±0,12 0,88 ±0,12 6,03 ±0,82* 0,44 ±0,05 0,97 ±0,13
*Berbeda bermakna dengan kelompok kontrol (p<0,05) FEAPT = Fraksi Etil Asetat Akar Pakis Tangkur

## Tabel 1. Indeks Organ Vital Mencit
masuk  ke  dalam  sel  dan  memicu  terjadinya hiperpolarisasi  dan  menurunkan  aktivitas neuron. 8 Aktivitas hipnotik-sedatif fraksi etil  asetat  akar  pakis  tangkur  ditunjukkan oleh  dosis  100  dan  200  mg/kg  BB.  Jumlah jatuh  dosis  tersebut  berbeda  bermakna  bila dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol positif  (p<0,05). Aktivitas  hipnotik  ditandai dengan  adanya  kehilangan righting  refleks. Hilangnya righting refleks merupakan ketidak mampuan  mencit  untuk  kembali  ke  posisi normal atau berdiri dengan keempat kakinya dari posisi terlentang pada saat disentuh. 9
Onset  tidur  paling  cepat  yaitu  18,8 menit  serta  durasi  tidur  paling  lama  yaitu 122,68 menit ditunjukkan oleh dosis 200 mg/ kg  BB.  Dapat  dikatakan  dosis  200  mg/kg BB merupakan dosis yang berefek hipnotik- sedatif  kuat.  Fraksi  etil  asetat  akar  pakis tangkur  mengandung  metabolit  sekunder flavonoid,  steroid,  triterpenoid,  tannin,  dan steroid. 10 Metabolit  triterpenoid,    Salah satu  senyawa  aktif  yang  berperan  sebagai depresan  sistem  saraf  pusat  (SSP)  adalah senyawa  golongan  triterpenoid. 11 Senyawa tannin  dilaporkan  juga  sebagai  depresan SSP. 12 Senyawa  steroid  dapat  memodulasi ikatan  GABA  dengan  reseptornya  sehingga bersifat hipnotik-sedatif. 13 Fraksi  etil  asetat  akar  pakis  tangkur mengandung selligueain A  yang  merupakan senyawa  golongan  flavonoid  dimana dilaporkan bahwa senyawa tersebut memiliki aktivitas  analgetika  kuat. 14 Efek  penyerta dari  analgetika  kuat  biasanya  bersifat depresan  dan  hipnotik  sedatif.  Analgetika
kuat  terutama  bekerja  dengan  mengikat reseptor  µ  di  sistem  saraf  pusat  yang  akan meningkatkan nilai ambang nyeri. Ikatan ini juga, akan menghasilkan efek hiperpolarisasi pada  saraf  dengan  cara  mengaktivasi  kanal ion kalsium melalui proses yang melibatkan G-protein.  Reseptor  GABA  merupakan asam  amino  yang  bertindak  sebagai neurotransmitter  dalam  penyampaian  sinyal antar sel saraf. GABA dikategorikan sebagai neurotransmitter penghambat karena bekerja dengan  menghambat  sinyal  tertentu  ke  otak dan mengurangi aktivitas di sistem saraf. 15 Pada pengujian toksisitas akut diamati perilaku  hewan  ketika  sebelum  pemberian sediaan  uji  (0  menit)  ataupun  setelah pemberian sediaan uji (30 menit), Semua dosis uji menunjukkan adanya penurunan aktivitas motorik  dan  jumlah  jengukan  sebanyak  3 hingga 4 ekor (75-100%). Penurunan aktivitas motorik  dan  jumlah  jengukan  merupakan parameter  efek  depresan  pada  mencit. 16 Pengamatan perilaku hewan pada parameter lain seperti straub, piloereksi, ptosis, pineal, kornea,  lakrimasi,  retablismen,  fleksi, hafner, grooming, defekasi, urinasi, salivasi, vokalisasi, pernafasan, tremor, writhing, dan katalepsi,  tidak  terdapat  kelainan  ataupun penyimpangan aktivitas. Penemuan ini dapat dijadikan pendahuluan untuk menilai aktivitas depresan  hewan  seperti  efek  hipnotik- sedativ pada dosis yang aman kepada hewan percobaan.
Pengamatan terhadap mortalitas hewan uji  yaitu  melihat  jumlah  kematian  setelah pemberian fraksi etil asetat akar pakis tangkur untuk  menentukan  nilai  LD50.  Dari  semua

## A

## B
Gambar 5. (A) Organ Hati Normal, (B) Organ Hati (tanda panah kuning menunjukkan steatosis)
kelompok  hewan  uji  tidak  diperoleh  hewan yang mati setelah pemberian sediaan uji hingga dosis 5.000 mg/kg BB. Nilai LD50 di atas dosis 5.000 mg/kg BB merupakan kategori praktis tidak toksik. 17 Hasil perhitungan indeks organ bahwa indeks organ hati pada dosis 2.000 dan 5.000 mg/kg BB mengalami penurunan yang nilainya  berbeda  bermakna  dibandingkan dengan  kelompok  kontrol  (<0,05),  indeks organ merupakan perbandingan bobot organ terhadap  bobot  badan.  Organ-organ  vital lainnya seperti lambung, uterus, otak, ginjal, limpa dan jantung tidak ditemukan perubahan indeks organ yang berbeda bermakna apabila dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol. Pengamatan  makroskopik  menunjukkan adanya kelainan organ hati hanya pada dosis tinggi yaitu 5000 mg/kg BB, kerusakan hati berupa  perlemakan/steatosis  berupa  massa putih.  Steatosis ini terjadi disebabkan karena adanya  efek  samping  dari  zat  kimia  atau adanya  kelainan  metabolisme  karbohidrat dan lemak. 18,19
Timbulnya  toksisitas  dan  kelainan organ pada hewan disebabkan oleh suatu zat aktif  secara  farmakologi  dengan  dosis  yang besar ataupun frekuensi pemakaian lama. 20,21
5.  Kesimpulan Berdasarkan  pengujian  di  atas  dapat disimpulkan  bahwa  fraksi  etil  asetat  akar pakis  tangkur  memiliki  aktivitas  hipnotik- sedatif  terhadap  mencit  putih  galur  s wiss webster dengan  dosis  efektif  50  mg/kg  BB. Penggunaan dosis yang aman dari fraksi etil asetat adalah maksimal 1.000 mg/kg BB.
Referensi 1.  Suwandi DW, Rostinawati T, Muchtaridi M,  Subarnas  A.  In  vitro  evaluation of  selligueain  A  effects  on  the  pro- inflammatory  mediators  production in  RAW264.7  murine  macrophages.  J HerbMed  Pharmacol.  2021;10(3):313- 318. doi:10.34172/jhp.2021.36
2.  Suwandi DW, Rostinawati T, Muchtaridi M,  Subarnas  A.  Safety  assessment  of the  Polypodium  feei  root  extract: Acute and subchronic studies. Toxicol Reports. 2021;8(December 2019):696-704.
doi:10.1016/j.toxrep.2021.03.013 3.  Fu  C,  Wang  H,  Ng  WL,  Song  L,
Huang  D.  Antioxidant  Activity  and Proanthocyanidin Profile of Selliguea feei Rhizomes. 2013:4282-4292. doi:10.3390/ molecules18044282
4.  Sujana  D,  Suwandi  DW,  Rusdiana  T, Subarnas A. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Akar Pakis Tangkur (Polypodium Feei  Meet)  Dari  Gunung  Talaga  Bodas Pada Mencit Swiss Webster. J Ilm Farm Bahari.  2020;11(2):167.  doi:10.52434/ jfb.v11i2.856
5.  Gertler,  R.,  Brown,  C.,  Mitchell.  DH., Dexmedetomidine:  A  Novel  Sedative- Analgesic  Agent,  journal  of  Baylor Scott  &  White  Health,  2017,  BUMC PROCEEDINGS 2001;14:13–21.
6.  Samson E, Ridwan WAH, Baszary CDU. Potensi  Sedatif-Hipnotik  Daun  Kayu Galala  (Erythrina  Lithosperma)  Sebagai Kandidat Obat Insomnia. J Mat Sains dan Teknol. 2019;20(2):84-94. doi:10.33830/ jmst.v20i2.166.2019
7.  Peraturan  Kepala  BPOM  Republik Indonesia  nomor  7.  Pedoman  Uji Toksisitas  Nonklinik  Secara  In  Vivo.
2014;(No. 875). http://ditjenpp. kemenkumham.go.id/arsip/bn/2014/ bn875-2014.pdf.
8.  AlDawsari,  A.,  et  al.,  Use  of  sedative- hypnotic  medications  and  risk  of dementia: Asystematic review and meta- analysis, 2021, British journal of Clinical Pharmacology, 8 (4), 1399-1946.
9.  Bhosale  U,  Yegnanarayan  R,  Pophale P,  Zambare  M,  Somani  R.  Study  of central  nervous  system  depressant  and behavioral activity of an ethanol extract of Achyranthes aspera (Agadha) in different animal  models.  Int  J  Appl  Basic  Med Res.  2011;1(2):104.  doi:10.4103/2229- 516x.91154
10. Aliya  NH.  Jutty  Levita  ED  and  AS. Analyzing the Interaction of Shellegueain A :  A  Bioactive  Compound  of  Pakis Tangkur  (  Selliguea  feei  or  Polypodium feei  )  to  Cyclooxygenase  Enzyme  by Molecular  Docking.  2011;23(7):3093- 3096.
11. Siddiqui  SA,  Rahman  A,  Rahman MO,  et  al.  A  novel  triterpenoid 16-hydroxy  betulinic  acid  isolated  from Mikania  cordata  attributes  multi-faced pharmacological  activities.  Saudi  J  Biol Sci.  2019;26(3):554-562.  doi:10.1016/j. sjbs.2018.03.002
12. Sarquís  PE,  Menéndez-Aguado  JM, Mahamud  MM,  Dzioba  R.  Tannins: The  organic  depressants  alternative  in selective  flotation  of  sulfides.  J  Clean Prod. 2014;84(1):723-726. doi:10.1016/j. jclepro.2014.08.025
13. Rachmawati, E., Ulfa, EU., Uji Toksisitas Subkronik  Ekstrak  Kayu  Kuning (Arcangelisia flava Merr) terhadap Hepar dan  Ginjal,  2018,  Global  Medical  and Health Communication, 6(1), 1-6.
14. Suwandi DW, Rostinawati T, Muchtaridi M,  Subarnas  A.  Aktivitas  Analgetik Ekstrak  dan  Fraksi-fraksi  Akar  Pakis Tangkur  (Polypodium  feei.,  METT) Dari  Gunung  Talaga  Bodas  Secara  In Vivo. Kartika  J Ilm Farm. 2021;8(1):52. doi:10.26874/kjif.v8i1.280
15. Farrar  FC,  Darnell  L.  Pharmacologic  In t erv ent i o n s f o r P ai n Management. Crit Care Nurs Clin NA. 2017;29(4):427- 447. doi:10.1016/j.cnc.2017.08.004
16. Erjon1,  Putri  Widya  Ningsih  YR.  Efek Sedatif  Ekstrak  Etanol  Umbi  Wortel (Daucus  Carota  L.)  Pada  Mencit  Putih Jantan Galur Swiss-Webster. 2019;(2):17-
26.
17. Musila  MF,  Dossaji  SF,  Nguta  JM, Lukhoba  CW,  Munyao  JM.  In  vivo antimalarial  activity,  toxicity  and phytochemical  screening  of  selected antimalarial  plants.  J  Ethnopharmacol. 2013;146(2):557-561. doi:10.1016/j.
jep.2013.01.023
18. Renaud  HJ,  Cui  JY,  Lu  H,  Klaassen CD.  Effect  of  diet  on  expression  of genes  involved  in  lipid  metabolism, oxidative  stress,  and  inflammation  in mouse liver-insights into mechanisms of hepatic  steatosis.  PLoS  One.  2014;9(2). doi:10.1371/journal.pone.0088584 19. Baharuddin,  Steatosis  Pada  Hepar dan  Fruktosa  Dosis  Tinggi  Pada
Penelitian  Fruktosa,  Jurnal  Kesehatan dan  Kedokteran,  2019;  Vol.  1(1),  27-
30, https://doi.org/10.24123/kesdok.
V1i1.2484.
20. Irfayanti, NA., Handayani, NA., Sangka A.,  Uji  Toksisitas  Subkronis  Ekstrak Herba Suruhan (Peperomia pellucida (L.) Kunth)  Terhadap  Parameter  Hematologi Tikus  Putih  (Rattus  norvegicus),  Jurnal Mandala  Pharmacon  Indonesia,  2023, 9(2), 345-351.
21. Wahyuni, FS., Putri, IN., Arisanti, D., Uji Toksisitas  Subkronis  Fraksi  Etil  Asetat Kulit Buah Asam Kandis (Garcinia cowa Roxb.)  terhadap  Fungsi  Hati  dan  Ginjal Mencit Putih Betina, Jurnal Sains Farmasi dan Klinis, 2017, 3(2), 202-212.