Respon Humoral terhadap Protein Kelenjar Saliva Nyamuk Anopheles maculatus dan Anopheles sundaicus
Humoral Response to Anopheles maculatus and Anopheles sundaicus Salivary Gland Proteins
Yunita Armiyanti 1 , Widodo 2 , Loeki Enggar Fitri 3 , Teguh Wahju Sardjono 3
1 Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Jember
2 Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya
3 Departemen Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Jalan Kalimantan No. 37 Kampus Tegalboto, Jember 68121 e-mail korespondensi: yunita.fk@unej.ac.id

## Abstrak
Kelenjar  ludah  nyamuk Anopheles betina  memiliki  peranan  penting  dalam  transmisi  malaria  melalui  protein- protein  saliva  yang  meningkatkan  transmisi Plasmodium .  Saliva  nyamuk  mengandung  komponen vasomodulator  dan  imunomodulator  yang  menghambat  respons  fisiologis  inang,  sehingga  patogen  dapat menginfeksi  inang  tanpa  ada  perlawanan.  Protein  saliva  juga  menginduksi  produksi  antibodi  IgG  di  inang setelah  terpapar  gigitan  nyamuk Anopheles berulang  kali.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengukur  respon antibodi penduduk yang hidup di daerah endemik malaria (desa Kalirejo, Kokap, Kulonprogo) terhadap protein kelenjar  saliva Anopheles  maculatus dan Anopheles  sundaicus .  Tingkat  respon  antibodi  diukur  dengan  ELISA dan dianalisis dengan uji T atau uji Anova untuk distribusi data normal dan uji Mann Whitney atau uji Kruskal Wallis untuk data yang tidak terdistribusi secara normal. Hasil penelitian menunjukkan bahwa respon IgG anti- homogenat kelenjar saliva dari serum penduduk yang tinggal di daerah endemik malaria secara signifikan lebih tinggi  daripada  orang  yang  hidup  di  daerah  non-endemik  malaria  dan  kontrol  negatif  (p  <0,05).  Serum  dari penduduk yang tinggal di desa Kalirejo menunjukkan adanya respons antibodi terhadap homogenate kelenjar saliva An.sundaicus maupun An.maculatus tidak berbeda  nyata  (p <0,05).  Berdasarkan hasil penelitian  dapat disimpulkan  bahwa  paparan  gigitan  nyamuk An.maculatus dan An.sundaicus berulang  kali  dapat  memicu produksi  antibodi  IgG  anti-protein  kelenjar  saliva  yang  mengenali  protein-  protein  antigenik  dari  kelenjar saliva.
Kata kunci: kelenjar ludah, Anopheles , antibodi, paparan

## Abstract
The  salivary  gland  of  female Anopheles mosquito  has  important  role  in  malaria  transmission  by  salivary proteins  that  enhancing Plasmodium transmission.  The  mosquito  saliva  contains  vasomodulatory  and immunomodulatory components that inhibit the physiological response of the host. Therefore, the pathogen infects the host without any resistance. The salivary proteins also induce the production of antibody IgG in the host  after  exposed  by  the Anopheles mosquito  bites  repeatedly.  This  study  aims  to  measured  the  antibody response of inhabitants living in malaria endemic areas (Kalirejo viilages, Kokap, Kulonprogo) to salivary gland proteins  of An.  maculatus and An.sundaicus .  The  level  of  antibody  response  was  measured  by  ELISA  and analyzed with  T test  or Anova  test  for normal distribution of data and Mann Whitney test  or Kruskal Wallis test  for  the  data  were  not  normally  distributed.  The  result  showed  that  the  level  of  anti-salivary  gland homogenate IgG from sera of people living in malaria endemic area was significantly higher than people living in  non-malaria  endemic  area  and  negative  control  (p<0.05).  Sera  from  inhabitants  living  in  Kalirejo  village showed  that  the  level  of  antibody  response  to  both  salivary  gland  homogenate  of An.sundaicus and An.maculatus were  not  significantly  different  (p<0.05).  It  was  concluded  that  exposure  to An.maculatus and An.sundaicus bites repeatedly could trigger the production of anti-salivary gland proteins IgG antibodies that recognized antigenic proteins from the salivary glands.
Keywords: salivary gland, Anopheles , antibody, exposure

## Pendahuluan
Kelenjar saliva nyamuk betina Anopheles berperan penting  dalam  transmisi  patogen  ke  tubuh  inang. Bila nyamuk betina menggigit inang, kelenjar ludah mengeluarkan zat  dalam saliva yang menghambat respons fisiologis host, seperti hemostasis, respons inflamasi  dan  imunologis.  Kondisi  ini  memberi manfaat  bagi  patogen  untuk  menginfeksi  inang tanpa  adanya  resistensi  (Fontaine  et  al.,  2011a). Komponen  imunomodulator  dalam  saliva  akan menekan  respon  imunologis  inang  baik  respon imun  alami  dan  adaptif.  Respon  imun  alami ditekan  melalui  penghambatan  sekresi  mediator pro-inflamasi  oleh  sel  endotel,  leukosit,  sel  mast, neutrofil,  dan  trombosit.  Respon  imun  adaptif dimodulasi  dengan  menghambat  sekresi  sitokin Th1  seperti  IFN- γ  dan  IL -2,  sehingga  respon  imun bergeser  ke  respons  Th2  dengan  menghasilkan antibodi.  Polarisasi  respon  imun  terhadap  Th2 tidak hanya bermanfaat untuk proses penghisapan darah,  namun  juga  memungkinkan  terjadinya transmisi  patogen  (Fontaine  et  al.,  2011a). Respons  kekebalan  Th2  di  lokasi  gigitan  kurang efektif  melawan  patogen  dibandingkan  dengan respons kekebalan seluler yang dimediasi oleh Th1 (Andrade et al., 2005).
Injeksi  saliva  ke  kulit  inang  juga  mempengaruhi respons  humoral  inang  dengan  menginduksi produksi antibodi terhadap protein saliva. Paparan berulang  terhadap  gigitan  nyamuk  betina  akan memicu produksi antibodi anti-protein saliva (King et al., 2011). Beberapa penelitian telah menunjukkan  antigenisitas  protein  saliva  dengan adanya  IgG,  IgM  dan  IgE  terhadap  protein  saliva dalam  darah  individu  yang  terpapar  gigitan nyamuk Anopheles betina  yang  diukur  oleh  ELISA (Peng  dan  Simon,  2004;  Remoue  et  al  .,  2006; Waitayakul et al., 2006). Produksi IgE berhubungan dengan  reaksi  alergi  yang  disebabkan  oleh  gigitan nyamuk  seperti  reaksi hipersensitivitas tipe I yang dimediasi  oleh  IgE.  Reaksi  alergi  menyebabkan pembengkakan  dan  kemerahan  ditempat  gigitan (Peng  dan  Simons,  2004).  Produksi  IgM  dan  IgG anti-protein  saliva  juga  ditemukan  pada  pasien malaria  dan penduduk  di daerah endemik  malaria dengan  titer  yang  signifikan  lebih  tinggi  daripada populasi  yang  tinggal  di  daerah  non-endemik malaria,  namun  titer  IgG  lebih  tinggi  pada  pasien
dengan  infeksi  malaria  akut  (Waitayakul  et  al., 2006).
Respon  antibodi  IgG  terhadap  protein  saliva dipengaruhi oleh paparan gigitan nyamuk. Tingkat respon  antibodi  IgG  anti-WSE  ( whole  salivary extract )  memiliki  hubungan  positif  dengan intensitas  paparan  gigitan  nyamuk  di  Senegal sesuai dengan hasil evaluasi menggunakan metode entomologi  konvensional  (Remoue  et  al.,  2006). Korelasi  positif  juga  ditunjukkan  oleh  hubungan antara  tingkat  respon  IgG  anti-ekstrak  kelenjar saliva Aedes  caspius dengan  densitas  nyamuk tersebut,  yaitu  rata-rata  tingkat  respon  IgG meningkat  secara  siknifikan  pada  puncak  paparan nyamuk Ae.caspius (Fontaine et  al .,  2011b). Respon  IgG  spesifik  terhadap  gSG6-P1,  protein rekombinan  gSG6,  bahkan  dapat  mendeteksi paparan  gigitan  nyamuk An.gambiae pada  tingkat yang sangat rendah (Poinsignon et al., 2009). Fakta ini  mendasari  pengembangan  protein  saliva nyamuk Anopheles sebagai  biomarker  terhadap paparan  gigitan  nyamuk Anopheles ,  sebagai evaluasi  keberhasilan    program  pengendalian vektor malaria yang efektif, efisien dan aman serta menjadi  indikator  risiko  malaria  (  Drame  et  al., 2010).  Berdasarkan  uraian  di  atas,  penelitian  ini bertujuan untuk mendeteksi dan mengukur respon IgG  pada  serum  penduduk  yang  tinggal  di  daerah endemik  malaria  terhadap  protein  kelenjar  saliva vektor  malaria  utama  di  Indonesia,  yaitu An.maculatus dan An.sundaicus .

## Metode
Preparasi  Nyamuk Anopheles  maculatus dan Isolasi Kelenjar Saliva
Nyamuk Anopheles maculatus betina dikoleksi dari landing  collection dengan  menggunakan  umpan sapi di Desa Kalirejo, Kecamatan Kokap, Kabupaten Kulonprogo,  DIY.  Nyamuk Anopheles  maculatus merupakan  vektor  utama  malaria  di  wilayah tersebut.  Nyamuk  yang  didapat  dimasukkan  ke dalam paper  cup .  Nyamuk  diidentifikasi  secara morfologi  menggunakan  kunci  identifikasi  Reid, (1968)  dalam  keadaan  teranestesi  dengan kloroform  dan  di  bawah  mikroskop  stereo. Nyamuk  dipelihara  pada  kondisi  standar,  yaitu pada  suhu  27⁰C  ±  2⁰C  dengan  70%±10%
kelembapan relatif dan diberi larutan sukrosa 10% di  dalam  kandang  di  Laboratorium  Entomology, Departemen  Parasitologi,  Fakultas  Kedokteran, Universitas  Gajah  Mada.  Kelenjar  saliva  nyamuk diisolasi  dengan  menggunakan  jarum  entomologi di  bawah  mikroskop  stereo  (M=4x)  dan dikumpulkan    dalam eppendorf steril  yang  telah diisi  100µL phosphate  buffer  saline (PBS)  dalam phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)  steril  dan disimpan dalam -80ºC sampai digunakan.
Homogenisasi  Kelenjar  Saliva  dan  Pengukuran Protein
Kelenjar saliva sebanyak 50-100 pasang yang telah diisolasi dimasukkan dalam epppendorf yang berisi PMSF  dalam  PBS  100  uL  (  perbandingan  1:1). Selanjutnya buffer  lysis [1.5  mM  magnesium klorida  (MgCl2),  10  mM  Tris-HCl,  10  mM  natrium klorida (NaCl),dan 1% Nonidet P-40)] ditambahkan pada  kelenjar  saliva  tersebut.  Campuran  tersebut dihomogenisasi  dengan micropistile dan  sonikator dalam  es- water  bath selama  30  menit.  Campuran tersebut  disentrifus  dengan  kecapatan12.690  rpm selama 15 menit pada suhu 4º Celcius, selanjutnya supernatan diambil dan dipindahkan ke eppendorf baru. Supernatan dipekatkan dengan menggunakan  eppimembran  ( spin  concentrator ) dengan cutt-off 10 kDa dan disimpan sebagai stok dalam  suhu  -80º  Celcius.  Konsentrasi  protein dalam homogenat kelenjar saliva diukur menggunakan  nanophotometer  (Nanophotometer Implen P 360, Germany).

## Preparasi Sampel Serum
Serum  diambil  dari  24  penduduk  Desa  Kalirejo, Kecamatan Kokap, Kabupaten Kulonprogo,
Yogyakarta  dengan  metode  sntrifugasi.  Protokol terhadap subyek manusia pada penelitian ini telah disetujui  oleh  Komite  Etik  Penelitian  Kedokteran, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya.
Individu  yang  akan  diambil  darahnya  mendapat penjelasan  lebih  dahulu  mengenai  tindakan  yang akan dilakukan dan tujuannya  ( informed consent ).
Darah  diambil  dengan  cara  aseptis  menggunakan spuit  disposable 3  mL  sebanyak  3mL  dan dimasukkan  dalam  vakutainer  steril    tanpa antikoagulan.  Darah  didiamkan  sampai  terpisah antara  serum  dan  sel-sel  darah.  Serum  diambil
secara steril dengan menggunakan micropipet dan dimasukkan  ke  dalam  tabung  untuk  disentrifugasi dengan  kecepatan  3000  rpm  selama  10  menit. Supernatan diambil dan disimpan dalam suhu – 20 ºC sampai digunakan.

## ELISA
Untuk  mengoptimasi  kondisi  ELISA,  dilakukan titrasi checkerboard menggunakan  homogenat kelenjar  saliva An.sundaicus dengan  konsentrasi 1,2,4  dan  7  µg/ml  serta  sampel  serum  yang diencerkan  secara  serial  (1:25,  1:50,  dan  1:100).
Hasilnya  didapatkan  hasil  optimal  dengan konsentrasi  antigen  7  µg/ml    dan  perbandingan antibodi  primer  1:25. Microplate  (microtiter immunoplates) dilapisi dengan homogenat kelenjar  saliva  nyamuk An.maculatus (konsentrasi
1,139  mg/ml)  atau An.sundaicus (konsentrasi 2,039  mg/ml) yang  diencerkan  dengan  bufer bikarbonat  0,1  M  (pH  9,6)  sampai  mencapai konsentrasi 7 µg/ml
(50µl/ sumuran)
menggunakan rumus V1.M1=V2.M2 dan diinkubasi semalam (overnight )  pada  suhu  4ºC.  Selanjutnya dicuci  dengan  memasukkan  250  µl  PBS-Tween (0,05%)  ke  dalam  sumuran microplate dan langsung  dibuang  sebanyak  empat  kali.  Setelah pencucian  yang  terakhir, microplate dikeringkan dengan  diketuk-ketukan  di  atas  tisu  yang  dilipat pada  posisi  dibalik.  Pencucian  dilakukan  diantara inkubasi. Microplate diblok  selama  tiga  jam  pada suhu 37ºC dengan 200 µL blocking solution buffer yang terdiri dari PBS, 0,1% Tween dan 0,05% BSA. Serum  diencerkan  dengan blocking  buffer dengan perbandingan  1:25  dan  dimasukkan  ke  dalam sumuran sebanyak 50µl, kemudian diinkubasi pada suhu  4ºC  selama  semalam.  Selanjutnya  50µl antibodi  sekunder  ( horse  radish  peroxidase- conjugated rabbit anti-human IgG) yang diencerkan dalam blocking buffer dengan perbandingan  1:5000  ditambahkan  ke  dalam sumuran  dan  diikuti  dengan  inkubasi  selama  satu jam  pada  suhu  ruang.  Substrat tetrametilbenzidin
(TMB)    ditambahkan  sebanyak  50µl  ke  dalam sumuran  dan  diinkubasi  selama  10  menit  pada suhu ruang. Reaksi dihentikan dengan ditambahkan  50µl  H 2 SO 4 1  M.  Densitas  optik diukur  dengan    ELISA reader dengan  panjang gelombang 450 nm. Tingkat ( level ) respon IgG anti- homogenat  kelenjar  saliva  dinyatakan  dengan
adjusted Optical  Density (aOD)  yang  dihitung berdasarkan rumus nilai rata-rata OD sampel yang direaksikan  dengan  homogenat  kelenjar  saliva dikurangi  dengan  nilai  OD  dari  sumuran  kontrol yaitu  yang  tidak  direaksikan  dengan  homogenat kelenjar saliva. Data sampel serum yang digunakan adalah sampel serum yang duplikasinya menunjukkan koefisien variasi dibawah 20%.

## Hasil
Pengambilan  sampel  serum  di  wilayah  Desa Kalirejo, Kecamatan Kokap, Kabupaten Kulonprogo mendapatkan 24 sampel serum dengan karakteristik seperti pada tabel 1.
Tabel  1. Jenis  Kelamin  dan  Distribusi  Usia
Penduduk Desa Kalirejo Jenis Kelamin Penduduk Desa Kalirejo Wanita 16 Laki-laki 8 Jumlah 24 Distribusi Usia (tahun) 17 – 20 3 21 – 30 3 31 – 40 5 41 – 50 8 51 – 60 5 Jumlah 24
Hasil pengukuran tingkat respon antibodi IgG anti- homogenat  kelenjar  saliva An.maculatus dari serum penduduk Desa Kalirejo,  Kecamatan Kokap, Kabupaten  Kulonprogo,  DIY  sebagai  wilayah endemis  malaria  yang    terpapar  gigitan  nyamuk An.  maculatus menunjukkan  rerata  yang  lebih tinggi  dibandingkan  dengan  rata-rata  IgG  pada serum    individu  yang  tinggal  di  wilayah  non- endemis  malaria  dan  kontrol  negatif  (Gambar  1).
Rata-rata  tingkat  IgG  berdasarkan  angka  OD kelompok wilayah endemis malaria adalah sebesar 0.423  ±  0.1985,    rata-rata    IgG  kelompok  wilayah non  endemis  malaria  sebesar  0.251  ±  0.1196  dan rata-rata  IgG  kelompok  kontrol  negatif  sebesar 0.059 ± 0.0060 (Tabel 2).
Tabel  2.  Rerata  OD  IgG  Anti-homogenat  kelenjar Saliva Anopheles  maculatus pada  Kelompok Wilayah  Endemis  Malaria  (Desa  Kalirejo),  Non-
endemis Malaria dan Kontrol Negatif Kelompok Rata-rata OD Kontrol negatif 0.059 ± 0.0060 Non endemis malaria 0.251 ± 0.1196 Endemis malaria 0.423 ± 0.1985
Hasil  pengujian  normalitas  Shapiro  Wilk (lampiran)  didapatkan  nilai  siknifikansi  kelompok wilayah  non  endemis  (0.069)  dan  kontrol  negatif (0.817)  lebih  besar  dari  α  5%,  tetapi  kelompok wilayah  endemis  (0.012)  lebih  kecil  dari  α  5%, maka  dapat  disimpulkan  bahwa  data  tidak berdistribusi  normal  dan  dilanjutkan  ke  uji pengganti dengan Kruskal Wallis.
Hasil pengujian Kruskal Wallis didapatkan nilai  siknifikansi  lebih  kecil  dari  α  (0.010  <  0.05), maka  terdapat  perbedaan  nyata  antara  rata-rata angka  OD  kelompok  wilayah  non  endemis, endemis  malaria,  dan  kontrol  negatif.  Hasil  uji beda antara dua kelompok dengan Mann-Whitney menunjukkan  bahwa  terdapat  perbedaan  yang siknifikan  antara  kelompok  wilayah  non  endemis malaria dengan kelompok kontrol negatif (p=0.034), demikian juga antara kelompok wilayah endemis  malaria  dan  kelompok  kontrol  negatif terdapat  perbedaan  yang  siknifikan  (p=0.007). Hasil  uji  antara  kelompok  wilayah  non  endemis dan  endemis  malaria  menunjukkan  perbedaan yang tidak siknifikan (p=0.152).
Gambar 1.   Boxplot hasil pengukuran OD IgG anti- homogenat  kelenjar  saliva Anopheles maculatus pada  serum  penduduk  di wilayah endemis malaria (Desa
Kalirejo)  dan  non-endemis  malaria dibandingkan  dengan  kontrol  negatif. Boxplot  menunjukkan  nilai  median OD,  persentil  25  pada  kuartil  bawah dan  persentil  75  pada  kuartil  atas. Whiskers  menunjukkan  persentil  0- 100.
Hasil pengukuran OD IgG anti-homogenat kelenjar saliva  pada  serum  penduduk  Desa  Kalirejo,  Kokap terhadap  homogenat  kelenjar  saliva  (SGH) An. maculatus dan An. sundaicus mendapatkan rerata OD  IgG  anti-homogenat  kelenjar  saliva An. maculatus sebesar  0.395  ±  0.2503  dan  rerata  OD IgG  anti-homogenat  kelenjar saliva An.  sundaicus sebesar  0.363 ± 0.1264.
Hasil  uji  normalitas  dengan  Shapiro  Wilk menunjukkan distribusi yang normal antara OD IgG terhadap SGH An.maculatus dan SGH An.sundaicus dari  serum  penduduk  Desa  Kalirejo,  Kokap, sehingga  dilanjutkan  dengan  uji  T.  Hasil  uji  T menunjukkan  diantara  kedua  kelompok  tersebut tidak berbeda bermakna (p=0.752) (Gambar 2). Hal ini berarti antibodi IgG anti-protein  kelenjar saliva dari serum penduduk desa Kalirejo dapat bereaksi dengan kedua jenis antigen tersebut.
Gambar  2.  Boxplot  respon  IgG  terhadap  antigen yang  berbeda  (homogenat  kelenjar saliva Anopheles  maculatus dan Anopheles  sundaicus) pada  serum penduduk Desa Kalirejo, Kokap. Boxplot  menunjukkan  nilai  median OD,  persentil  25  pada  kuartil  bawah dan  persentil  75  pada  kuartil  atas. Whiskers  menunjukkan  persentil  0- 100.

## Pembahasan
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  penduduk  yang tinggal  di  wilayah  endemis  malaria  dan  terpapar dengan  gigitan  nyamuk Anopheles ,  secara  alami akan memicu respon humoral dengan diproduksinya  antibodi IgG anti-protein  saliva. Hal ini  dibuktikan  dengan  kadar  IgG  anti-homogenat kelenjar saliva  dari serum penduduk  Desa  Kalirejo lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  individu  di wilayah  non-endemis  malaria  dan  kontrol  negatif. Hasil  penelitian  ini  sesuai  dengan  penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Waitayakul et al .,
(2006)  yang  membuktikan  bahwa  IgG-anti  protein saliva Anopheles terdeteksi  pada  pasien  malaria akut  dan  orang  sehat  yang  tinggal  di  wilayah endemis malaria.
Paparan  gigitan  nyamuk Anopheles secara berulang  telah  banyak  dibuktikan  dapat  memicu produksi  antibodi  anti-protein  saliva  pada  inang. Hewan coba  yang dipapar dengan gigitan nyamuk An.gambiae selama  tiga  atau  enam  minggu serumnya  mengandung  IgG-anti  saliva  yang  bisa mengenali protein SGS sebagai protein imunogenik (King et  al .,  2011).  Pada  anak-anak  usia  enam minggu sampai dengan lima tahun di Senegal yang
merupakan  wilayah  endemis  malaria,  didapatkan 70,2%  anak-anak  menunjukkan  respon  IgG  anti- saliva An.gambiae yang  positif  terutama  pada anak-anak  usia  1-2  tahun  dengan  respon  yang paling  tinggi  (Remoue et  al .,  2006).  Beberapa penelitian  lain  bahkan  membuktikan  adanya respon  antibodi  spesifik  terhadap  protein  saliva, yaitu protein gSG6 dari An.gambiae yang juga bisa bereaksi  dengan  bentuk  rekombinannya,  yaitu gSG6-P1 (Poinsignon et al., 2010; Rizzo et al ., 2011; Badu et  al. ,  2012).  Respon  IgG  terhadap  protein saliva nyamuk An.gambiae juga dapat memprediksi  kasus  klinis  malaria  karena  pada anak-anak  yang  terkena  malaria  mempunyai tingkat  IgG  yang  lebih  tinggi  sejak  tiga  bulan sebelum  sakit  (Remoue et  al .,  2006).  Penelitian lain  menggunakan  respon  IgG  untuk  mengetahui intensitas paparan An.gambiae setelah pemakaian kelambu berinsektisida ( insecticide-treated nets /ITN)  (Drame et  al .,  2010).  Oleh  karena  itu, protein saliva nyamuk Anopheles bisa dikembangkan  sebagai  biomarker  paparan  gigitan nyamuk  dan  risiko  penyakit  malaria  serta  alat evaluasi  program-program  pengendalian  vektor malaria.
Paparan  gigitan  nyamuk Anopheles betina  dapat memicu  produksi IgG  merupakan fakta yang telah banyak dibuktikan, namun bagaimana mekanismenya dikaitkan dengan transmisi patogen  dan  patogenesis  malaria  masih  belum jelas.  Berdasarkan  tahapan-tahapan  respon  imun fisiologis  pada  orang  yang  digigit  nyamuk  (lima tahapan), produksi antibodi kemungkinan merupakan  bagian  dari  respon  imun  tersebut. Pada  tahapan  ketiga  dan  kelima    paparan  antigen protein saliva menyebabkan respon imun humoral berupa aktivasi sel-sel limfosit B yang memproduksi  IgE  dan  IgG.  Pada  tahapan  ketiga respon  IgE  berkaitan  dengan  reaksi  alergi  melalui degranulasi  sel  mast  yang  berikatan  dengan  IgE (Andrade et  al .,  2005).  Pada  tahapan  kelima paparan  antigen  protein  saliva  di  kulit  yang  terus berlanjut  menyebabkan  maturasi  respon  imun menjadi subtipe IgG yang berbeda, yaitu IgG1 dan IgG4  yang  sudah  dibuktikan  kadarnya  meningkat pada orang yang digigit nyamuk (Peng and Simons,
2004).
Pada  penelitian  ini  respon  IgG  penduduk  Desa Kalirejo  lebih  tinggi  dari  respon  IgG  individu  dari wilayah non-endemis malaria, tetapi berbeda tidak siknifikan.  Hal  ini  bisa  disebabkan  karena  saat pengambilan  sampel  serum  yaitu  di  bulan  April 2014,  densitas  nyamuk An.maculatus dalam keadaan  turun.  Kepadatan  populasi  tertinggi nyamuk An.maculatus ditemukan  sekitar  bulan Juni-Agustus atau awal musim kemarau (Barodji et al ., 2003).
Adanya pemanasan global menyebabkan  perubahan  iklim,  sehingga  waktu peralihan  dari  musim  hujan  ke  musim  kemarau dan  sebaliknya  juga  berubah.  Pada  bulan  April 2014  yang  seharusnya  sudah  memasuki  musim kemarau,  masih  terjadi  hujan,sehingga  belum terbentuk tempat perindukan nyamuk An.maculatus berupa  genangan-genangan  air  di sekitar  sungai.  Kepadatan  nyamuk An.maculatus yang  rendah  menyebabkan  paparan  gigitan An.maculatus juga  turun,  sehingga  respon  IgG yang terbentuk juga rendah.
Respon  IgG  pada  individu  dari  wilayah  non- endemis  malaria  yang  berbeda  tidak  siknifikan dengan  Desa  Kalirejo  bisa  disebabkan  oleh  reaksi silang    dengan  protein  saliva  dari  spesies  nyamuk yang    lain.  Saliva  nyamuk  merupakan  campuran berbagai  komponen  molekuler  dengan  fungsi biologi  yang  berbeda.  Beberapa  komponen bersifat  spesifik  pada  nyamuk Anopheles ,  namun komponen  yang  lain  bisa  terdistribusi  dalam genus,  famili,  ordo  atau  kelas  dari  Diptera penghisap  darah  atau  Artropoda  (Drame et  al.,
2013).  Beberapa  protein  saliva Anopheles bisa ditemukan  di  genus  nyamuk  yang  lain  seperti Aedes dan Culex karena  memang  terkonservasi  di tingkat nyamuk (Calvo et al ., 2009).  Individu yang berasal  dari  wilayah  non-endemis  malaria  bisa terpapar  gigitan  nyamuk  lain  seperti Culex atau Aedes sehingga  memicu  respon  IgG  terhadap protein  saliva  yang  bisa  bereaksi  dengan  protein yang  sama  dari  nyamuk Anopheles .  Hal  ini  bisa terjadi  karena  pada  penelitian  ini  antigen  yang digunakan  merupakan  keseluruhan  kelenjar  saliva yang dihomogenisasi, sehingga berpotensi terjadinya  reaksi  silang  dengan  epitop  protein saliva  dari  serangga  hematofagi  lainnya  (Remoue et al ., 2006; Drame et al ., 2013).
Respon  IgG  terhadap  homogenat  kelenjar  saliva An.  maculatus dan An.  sundaicus pada  serum penduduk  Desa  Kalirejo  tidak  berbeda  siknifikan. Hal ini membuktikan bahwa terdapat reaksi silang antara  protein  kelenjar  saliva An.  maculatus dengan An.  sundaicus. Hasil  yang  sama  juga didapatkan  pada  respon  IgG  penduduk  Desa Bangsring  terhadap  homogenat  kelenjar  saliva An.maculatus dan An.  sundaicus. Hasil  penelitian ini  sesuai  dengan  penelitian  sebelumnya  yang membuktikan  bahwa  protein  gSG6-P1,  protein rekombinan  dari  gSG6  yang  berasal  dari  kelenjar saliva An.gambiae ,  bisa  bereaksi  positif  dengan respon  IgG  pada  anak-anak  yang  terpapar  gigitan nyamuk An.funestus di  Senegal.  Penelitian tersebut  dilaksanakan  sebelum  musim  hujan dengan An.funestus sebagai  satu-satunya  vektor. Lebih jauh dijelaskan respon spesifik IgG terhadap gSG6-P1  tersebut  meningkat  selama  musim paparan gigitan nyamuk An.funestus dan terdapat hubungan positif antara tingkat respon IgG dengan tingkat paparan gigitan (Poinsignon et al ., 2010).
Reaksi  silang  antara  protein  kelenjar  saliva An.maculatus dan An.sundaicus bisa terjadi karena beberapa  protein  saliva  nyamuk Anopheles ada yang  terkonservasi  di  tingkat  genus,  subgenus, spesies  kembar  ( species  complex )  dan  spesies.
Tingkat konservasi suatu protein saliva tergantung kepada  seberapa  besar  presentase  kesamaan identity atau  homologinya . Reaksi  silang  dapat terjadi  apabila  protein  antigenik  mempunyai kesamaan identity asam  amino  lebih  dari  70% (Aalberse,  2000).  Pada  protein  saliva  yang terkonservasi  di  tingkat  spesies  kembar,  tingkat homologinya  sangat  tinggi  yaitu  mencapai  90%, seperti  protein  saliva  dari An.gambie dan An.arabiensis .  Keduanya  mempunyai  kelenjar saliva  dengan  profil  protein  dan  kandungan protein  yang  sangat  mirip  (Fontaine et  al .,  2012).
Oleh  karena  itu,  bisa  terjadi  reaksi  silang  diantara keduanya dengan antigen gSG6 (Rizzo et al ., 2011).
Pada  tingkat  subgenus,  protein  saliva  mempunyai kesamaan  identity  sekuen  asam  amino  sebesar antara  70%-90%.  Kesamaan  identity  sekuen  asam amino  di  tingkat  genus  lebih  rendah  lagi  yaitu kurang dari 70%, sehingga menurunkan kemungkinan  adanya  epitop  yang  terkonservasi pada Genus Anopheles , Demikian halnya di tingkat spesies,  protein  saliva  yang  tidak  mempunyai
ortholog  dengan  protein  spesies Anopheles yang lain  adalah  protein  dengan  identity  sekuen  asam amino  pada  batas  yang  paling  rendah  yaitu  40%
(Fontaine et al ., 2012).
Nyamuk An.maculatus
dan
An.sundaicus
meruapakan satu subgenus, yaitu Subgenus Cellia . Dengan  kesamaan  identity  sekuen  asam  amino dari  protein  saliva  di  tingkat  subgenus  sebesar 70%-90%,  maka  bisa  terjadi  reaksi  silang  pada protein-protein  saliva  yang  bersifat  imunogenik pada  kedua  spesies  tersebut.  Reaksi  silang tersebut merupakan hasil dari kesamaan ( sharing ) epitop  diantara  protein-protein  yang  ortholog. Beberapa  protein  yang  terkonservasi  di  tingkat Subgenus Cellia adalah apyrase,  anophensin, protein D7 dan protein TRIO. Hasil penelitian pada nyamuk  vektor  malaria  di  Afrika  Subgenus Cellia , yaitu An.gambiae,  An.funestus dan An.stephensi dengan  analisis in  silico menunjukkan  protein famili gSG2 dan gSG6 sangat terkonservasi dengan identity  minimal  67%  dan  77%  (Fontaine et  al .,
2012).  Protein  gSG6  dari An.gambiae merupakan kandidat  protein  yang  dapat  dipercaya  untuk biomarker  paparan  gigitan  nyamuk An.gambiae dan  juga  merupakan  indikator  yang  baik  untuk paparan  gigitan  terhadap  tiga  nyamuk  vektor utama  malaria  di  Afrika,  yaitu An.gambiae, An.arabiensis dan An.funestus dari Subgenus Cellia (Rizzo et  al .,  2011).  Nyamuk  A nopheles vektor malaria  di  wilayah  Asia  yang  termasuk  dalam Subgenus
Cellia seperti An.maculatus, An.balabacensis, An.dirus,
An.annularis,
An.aconitus,  An.subpictus dan An.sundaicus sampai  saat  masih  belum  ada  laporannya  tentang tingkat konservasi protein gSG6 karena transkriptom  dan  proteom  nyamuk-nyamuk tersebut banyak yang belum diteliti.
Reaksi  silang  antara  protein  kelenjar  saliva An.maculatus dan An.sundaicus memberikan keuntungan untuk pengembangan protein kelenjar saliva  sebagai  biomarker  paparan  gigitan  nyamuk Anopheles maupun  sebagai  vaksin.  Reaksi  silang tersebut  menunjukkan  bahwa  protein  saliva  bisa bersifat  universal,  yaitu  bisa  diterapkan  pada beberapa  spesies  nyamuk Anopheles, paling  tidak pada  tingkat  subgenus  yang  sama.  Untuk mendukung  tujuan  tersebut,  protein  saliva  yang bisa  menjadi  kandidat  biomarker  maupun  vaksin
merupakan  protein  yang  terkonservasi  di  tingkat genus  atau  subgenus  dan  spesifik  untuk  nyamuk Anopheles , sehingga tidak akan terjadi reaksi silang dengan serangga hematofagus yang lain.

## Kesimpulan
Paparan  gigitan  nyamuk Anopheles betina  secara berulang  dapat  memicu  terbentuknya  antibodi spesifik  terhadap  protein-protein  saliva  nyamuk. Kadar antibodi tersebut dipengaruhi oleh intensitas paparan yang tergantung pada populasi nyamuk.  Fakta  ini  mendasari  pengembangan protein  saliva  nyamuk Anopheles betina  sebagai antigen  atau  biomarker  untuk  mendeteksi  ada tidaknya  paparan  gigitan  dari  nyamuk Anopheles .
Biomarker  tersebut  bisa  diaplikasikan  untuk mengevaluasi  keberhasilan  program  pengendalian vektor malaria yang bertujuan mencegah terjadinya penularan malaria.

## Daftar Pustaka
Aalberse R.C. 2000. Structural biology of allergens. J Allergy Clin Immunol , 106(2): 228-238.
Andrade,  B.B,  Teixeira,  C.R.,  Barral,  A.,  Barral- Netto,M.  2005.  Haematophagous  arthropod saliva and host defense system: a tale of tear and  blood. An  Acad  Bras  Cienc .  77(4),  665- 693.
Andrade  B.B.,  Rocha  B.C.,  Reis-Filho  A.,  Camargo L.M.A., Barral A., Barral-Netto M. 2009. Anti- Anopheles  darlingi saliva  antibodies  as marker  of  Plasmodium  vivax  infection  and clinical  immunity  in  the  Brazilian  Amazon. Malaria Journal 8:121
Badu K., Siangla J., Larbi J., Lawson B.W., Afrane Y., Ong’echa  J.,  Remoue  F.,  Zhou  G.,  Githeko A.K.,  Yan  G.  Variation  in  exposure  to Anopheles  gambiae salivary  gland  peptide (gSG6-PI) across
different malaria
transmission  settings  in  the  western  Kenya highlands. Malaria Journal , 11:318.
Barodji,  Boewono  D.T.,  Boesri  H.,  Sudini  dan
Sumarti.  2003.  Bionomik  Vektor  dan  Situasi Malaria  di  kecamatan  Kokap,  Kabupaten Kulonprogo,  Yogyakarta.  Jurnal  Ekologi
Kesehatan, 2(2): 209-216.
Calvo  E.,  Pham  V.M.,  Marinotti  O.,  Andersen  J.F., Ribeiro  J.M.C.  2009.  The  salivary  gland transcriptome  of  the  neotropical  malaria vector Anopheles darlingi reveals accelerated evolution  of  genes  relevant  to  hemophagy. BMC Genomics , 10:57.
Drame  P.M.,  Poinsignon  A.,  Besnard  P.,  Mire  J.L.,
Dos-Santos  M.A.,  Sow  C.S.,  Cornelie  S., Foumane V., Toto J., Sembene M., Boulanger D.,  Simondon  F.,  Fortes  F.,  Carnevale  P., Remoue  F.  2010.  Human  antibody  response to  Anopheles  gambiae  saliva:  an  immuno- epidemiological  biomarker  to  evaluate  the efficacy of insecticide-treated nets in malaria vector  control. American  Journal  of  Tropical Medicine Hygiene , 83(1): 115-121.
Drame  P.M.,  Poinsignon  A.,  Marie  A.,  Noukpo  H.,
Doucoure  S.,  Cornelie  S.,  Remoue  F.  2013. New Salivary Biomarkers of Human Exposure to  Malaria  Vector  Bites  in Anopheles
Mosquitoes-  New  Insights  Into  Malaria Vectors.  Edited  by  Sylvie  Manguin.  In  Tech,
Croatia, pp: 755-795.
Fontaine  A.,  Diouf    I.,  Bakkali  N., et  al .  2011a. Implication  of  haematophagous  salivary proteins in host-vector interactions. Parasites
& Vectors , 4: 1-17.
Fontaine  A.,  Pascual  A.,  Orlandi-Pradines  E.,  Diouf I.,  Remoue  F.,  Pages  F.,  Fusai  T.,  Rogier  C., Almeras  L.  2011b.  Relationship  between exposure  to  vector  bites  and  antibody response to mosquito salivary gland extracts. PLoS ONE , 6(12): e29107.
Fontaine  A.,  Fusai  T.,  Briolant  S.,  Buffet  S.,  Villard C.,  Baudelet  E.,  Pophillat  M.,  Granjeaud  S., Rogier C., Almeras L. 2012. Anopheles salivary gland  proteomes  for  major  malaria  vectors. BMC Genomics , 13:614.
King  J.G.,  Vernick  K.D.,  Hillyer  J.F.  2011.  Members of  the  salivary  gland  surface  protein  family (SGS) are major immunogenic components of mosquito  saliva. JBC  Papers  in  Press .
Manuscript M111.280552.
Peng Z., and Simon F.E.R. 2004. Mosquito Allergy: Immune  Mechanisms  and  Recombinant Salivary  Allergens. Internasional  Archives  of Allergy and Immunology , 133: 198-209.
Poinsignon A., Cornelie S., Ba F., Boulanger D., Sow C.,  Rossignol  M.,  Sokhna  C.,  Cisse  B.,
Simondon  F.,  Remoue  F.  2009.  Human  IgG respon  to  a  salivary  peptide,  gSG6-P1,  as  a new immuno-epidemiological tool for evaluating  low-level  exposure  to  Anopheles bites. Malaria Journal ., 8:198.
Poinsignon  A.,  Samb  B.,  Doucoure  S.,  Drame  P., Sarr J.B., Sow C., Cornelie S., Maiga S., Thiam C.,  Rogerie  F.,  Guindo  S.,  Hermann  E., Simondon  F.,  Dia  I.,  Riveau  G.,  Konate  L., Remoue F. 2010. First attempt to validate the gSG6-PI  salivary  peptide  as  an  immuno- epidemiological  tool  for  evaluating  human exposure  to Anopheles  funestus bites.
Tropical  Medicine  and  International  Health , 15(10): 1198-1203.
Reid  J.A.  1968.  Anopheline  Mosquitoes  of  Malaya and Borneo. Government of Malaysia. Staples Printers Limited, England, pp: 41-52.
Remoue  F.,  Cisse  B.,  Ba  F.,  Sokhna  C.,  Herve  J-P., Boulanger  D.,  Simondon  F.  2006.  Evaluation of  antibody  respone  to  Anopheles  salivary antigens  as  a  potential  marker  of  risk  of malaria. Royal  Society  of  Tropical  Mediceine and Hygiene , 100: 363-370.
Rizzo  C.,  Ronca  R.,  Fiorentino  G.,  Verra  F., Mangano V., Poinsignon A., Sirima S.B., Nebie I.,  Lombardo  F.,  Remoue  F.,  Coluzzi  M., Petrarca  V.,  Modiano  D.,  Arca  B.  2011. Humoral Response to the Anopheles gambiae Salivary Protein gSG6: A Serological Indicator of  Exposure  to  Afrotropical  Malaria  Vectors.
PLoS ONE , 6(3): e17980.
Waitayakul  A.,  Somsri  S.,  Sattabongkot  J.,
Looraesuwan  S.,  Cui  L.,  Udomsangpetch  R. 2006.  Natural  human  humoral  response  to salivary gland protein of Anopheles mosquitoes  in  Thailand. Acta  tropica 98:  66-
73