## AUTENTIKASI TUNA STEAK KOMERSIAL DENGAN METODE PCR-SEQUENCING

## Authentication Of Commercial Tuna Steak With PCR-Sequencing Based Methods
Asadatun Abdullah * , Nurjanah, Nanang Kurnia
Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
*Korespondesi: Jalan Lingkar Akademik Kampus IPB Dermaga Kabupaten Bogor 16680 Telp (0251) 8622915 Fax (0251) 8622916 email: sasa_thp@yahoo.com

## Abstract
Tuna is one of the  shery commodities which are susceptible to mislabeling and substituted with similar species, but lower price. Consumer as a purchaser will incur a loss (economical fraud) so it is needed a way to overcome  these  problems.  This  study  aimed  to  optimized  extraction  of  DNA  obtained  from  the  tuna  and  tuna exporter companies of modern markets, identi cation of DNA-based species-speci c primers with a target gene cyt  b ,  and  characterization  of  DNA  tuna  authentication  results. This  study  consisted  of  several  steps  beginning with the characterization  of tuna, DNA extraction using CTAB method and Vivantis kit, ampli cation  by PCR, electrophoresis, and nucleotide sequencing. The samples tested were successfully extracted and ampli ed with the appropriate size of 750 base pairs. PCR sequencing using cyt b gene targets resulted in the identi cation of tuna raw material. PCR sequencing of the nucleotide sequence of results which have been  tted to the NCBI data, which does not show any fraud in the form of substitution with other species. Species of yellow  n ( Thunnus albacore ), Albacore ( Thunnus alalunga ), big eye ( Thunnus obesus ) and blue  n ( Thunnus macoyyi ) has the highest homology i.e 99%, 99%, 99%, 100%, respectively.
Keywords: authentication, cyt b , mt-DNA, PCR, tuna’s steaks

## Abstrak
Ikan  tuna  merupakan  salah  satu  komoditas  perikanan  yang  rawan  pemalsuan  berupa  substitusi  dengan daging ikan dari spesies yang mirip namun memiliki harga yang lebih rendah. Autentikasi produk dengan metode berbasis DNA  dapat  menjadi  salah satu  cara mengatasi  permasalahan  pemalsuan  bahan  baku  daging  ikan tuna. Penelitian ini  bertujuan  untuk kstraksi  DNA ikan tuna  yang diperoleh dari  perusahaan  eksportir  tuna  dan  pasar modern, identi kasi spesies berbasis DNA dengan primer spesi k dengan gen target cyt b, dan karakterisasi DNA ikan tuna hasil autentikasi. Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan yang diawali dengan karakterisasi ikan tuna, ekstraksi DNA menggunakan metode CTAB dan kit vivantis, proses ampli kasi dengan PCR, elektroforesis, dan penentuan urutan nukleotida. Sampel yang diuji berhasil diekstraksi dan terampli kasi dengan ukuran yang sesuai yaitu 750 pasang basa. Hasil PCR sequencing menggunakan gen target cyt b berhasil mengidenti kasi bahan baku ikan tuna. Urutan nukleotida hasil PCR sequencing yang telah dicocokkan ke bank data menunjukkan tidak ada pemalsuan berupa subsitusi dengan spesies lain. Tingkat homologi merupakan persentase kesamaan spesies yang diuji dengan data yang tersedia di bank data. Spesies yellow  n ( Thunnus albacores ), albacore ( Thunnus alalunga ) , big eye ( Thunnus obesus ) , dan blue  n ( Thunnus macoyyi ) memiliki tingkat homologi berturut-turut adalah 99%, 99%, 99%, 100%.
Kata Kunci: autentikasi, cyt b , mt-DNA, PCR, steak ikan tuna

## PENDAHULUAN
Produk perikanan mengalami permintaan yang cukup tinggi dari dalam dan luar negeri baik dalam bentuk segar maupun olahan. Seiring dengan laju pertumbuhan  penduduk  dan  meningkatnya  taraf pendapatan serta pendidikan, masyarakat semakin
peduli  kesehatan  dan  selektif  terhadap  makanan, untuk itu diperlukan adanya suatu sistem jaminan keamanan pangan.
Salah  satu  masalah  dalam  jaminan  keamanan pangan  adalah  adanya  pemalsuan.  Produk perikanan  yang  dikemas  rawan  mengalami
pemalsuan  berupa  substitusi  dengan  daging  ikan dari  spesies  yang  mirip  namun  memiliki  harga yang  lebih  rendah.  Konsumen  sebagai  pembeli akan mengalami kerugian ( economical fraud ) dari pemalsuan  sehingga  diperlukan  suatu  cara  untuk mengatasi  masalah  tersebut.  Salah  satu  produk yang  menjadi  primadona  baik  untuk  konsumsi maupun ekspor adalah ikan tuna.
Tuna,  ikan  yang  termasuk  dalam  keluarga Scombridae ini  merupakan  salah  satu  sumber utama  devisa  perikanan  Indonesia.  Tuna  sebagai komoditas  ekspor  menduduki  peringkat  terbesar kedua  setelah  udang  (Trilaksani et  al .  2010). Permintaan  ekspor  tuna  dari  tahun  ke  tahun terus  mengalami  peningkatan.  Menurut  data Ditjen  Perikanan  dalam  Badan  Riset  Kelautan dan  Perikanan  (BRKP)  2009  volume  ekspor mulai  tahun  2005  sampai  2009  terus  mengalami peningkatan  yaitu  pada  tahun  2005  sebesar 121.136 ton pada tahun 2009 menjadi 134.673 ton.
Autentikasi  atau  pengujian  keaslian  produk dengan  metode  berbasis  DNA  dapat  menjadi salah  satu  cara  mengatasi  masalah  pemalsuan bahan  baku  daging  ikan  tuna.  Ikan  tuna  yang diautentikasi merupakan ikan tuna yang memiliki nilai  ekspor  tinggi.  Metode  berbasis  DNA memiliki kelebihan dibandingkan dengan metode berbasis  protein  diantaranya  dapat  mendeteksi keaslian suatu produk walaupun telah mengalami proses  pengolahan  berupa  panas  (Less  2003). Proses  pengujian  keaslian  juga  bisa  digunakan untuk menilai bahan baku yang belum mengalami proses pengolahan yaitu bahan baku dalam bentuk segar  yang  akan  dikemas  sebagai  produk  olahan (Civera 2003).
Metode berbasis DNA dapat digunakan untuk mengetahui  keaslian  suatu  produk  sehingga pemalsuan  yang  merugikan  konsumen  dapat dihindari  (Rasmussen  dan  Morrisey  2008). Metode  autentikasi  label  dengan  identi kasi berbasis  DNA  merupakan  metode  alternatif  dari metode  identi kasi  spesies  berbasis  protein.  Hal tersebut disebabkan karena metode berbasis DNA merupakan  metode  spesi k,  sensitif  dan  hasil yang akurat baik pada sampel segar, beku maupun pada pengolahan suhu tinggi (Civera 2003).
Berdasarkan kelebihan metode berbasis DNA, maka  dapat  dikembangkan  beberapa  metode untuk identi kasi spesies produk perikanan. Salah satu  metode  autentikasi  berbasis  DNA  adalah menggunakan  alat Polymerase  chain  reaction atau  PCR  (Mafra et  al .  2007).  Autentikasi  ikan tuna  dengan  metode  PCR- sequencing .  Penelitian ini  bertujuan  untuk  memperoleh  ekstrak  DNA ikan  tuna  yang  diperoleh  dari  perusahaan eksportir tuna dan pasar modern, mengidenti kasi spesies  berbasis  DNA  dengan  gen  target cyt  b , dan  karakterisasi  produk  PCR  gen cyt  b hasil autentikasi.

## MATERIAL DAN METODE

## Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  pada  preparasi  bahan baku antara lain nitrogen cair sedangkan alat yang digunakan  adalah  talenan,  plastik,  aluminium foil, kertas label lalu tempat penyimpanan dingin ( freezer ). Alat yang digunakan pada ekstraksi DNA menggunakan metode CTAB  antara lain  mortar dan  penggerus  steril,  wadah  es  batu, ice  maker , microtube 1,5 ml, water bath , pipet mikro, pipette tips , sentrifuse, dan vortex. Bahan yang digunakan pada ekstraksi DNA menggunakan metode CTAB adalah ikan tuna ( Thunnus sp), es batu, nitrogen cair, larutan Buffer TE, larutan lisis, kloroform, larutan presipitasi,  larutan  NaCl  1,2  M,  etanol  dingin, dan  Aquabidestilata.  Bahan  baku  berupa steak tuna ( Thunnus obesus , T. alalunga , T. macoyyi , T. albacores )  berasal  dari  PT.  Samudra  Besar  Bali dan PT. Lautan Bahari Sejahtera Muara Baru serta berasal pasar swalayan Bogor dalam bentuk steak . Steak tuna  beku  merupakan  produk  olahan  hasil perikanan  dengan  bahan  baku  tuna  segar  atau beku yang mengalami perlakuan sebagai berikut: penerimaan  bahan  baku,  pencucian,  penyiangan, pembuatan loin, pengulitan dan perapihan, sortasi mutu,  pembungkusan,  pembekuan,  pembentukan steak,  penggelasan,  penimbangan,  pengepakan, pengemasan  dan  penyimpanan. Steak yang berasal dari pasar swalayan Bogor dalam keadaan beku Bahan yang digunakan pada ekstraksi DNA menggunakan  metode  kit  (Vivantis)  antara  lain ikan tuna ( Thunnus sp), buffer STL, OB protease, buffer  BL,  buffer equlibration ,  buffer  HB,  DNA
wash buffer , dan buffer elution sedangkan alat yang digunakan  antara  lain  mikrotube  1,5  ml,  vortek, water bath , sentrifuse, colum , dan collection tube .
Alat  yang  digunakan  pada  proses  PCR  antara lain  pipet  mikro,  wadah  es  batu, ice  maker , pipette  tips , marker  pen ,  tabung  PCR  50  µl sedangkan Bahan yang digunakan adalah es batu, aquabidestilata  (ddH 2 O),  primer forward dan primer reverse ,  DNA  hasil  ekstraksi,  dan  larutan mix (PCR kit commercial ).
Alat  yang  digunakan  pada  pembuatan gel  agarosa  antara  lain  gelas  ukur,  labu  ukur, timbangan  digital, microwave ,  cetakan  agar, electrophoresis  comb , dan  alumunium  foil. Bahan  yang  digunakan  adalah  bubuk  Agarosa dan larutan Buffer TBE 1x. Alat yang digunakan pada elektroforesis antara lain casting tray , pisau bedah,  seperangkat  alat  katoda-anoda,  alat  sinar UV.  Bahan  yang  digunakan  adalah  gel  agarosa, larutan  buffer  TBE, loading  dye ,  DNA marker , ethidium bromida, aquades.

## Koleksi Sampel
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitan  ini menggunakan  ikan  tuna  yang  diperoleh  dari perusahaan ekportir ikan tuna  maupun dari pasar swalayan di daerah Bogor. Bahan yang digunakan dan asal bahan baku disajikan pada Tabel 1.

## Metode Penelitian

## Ekstraksi DNA
Ekstraksi  DNA  dapat  dilakukan  dengan menggunakan metode manual (CTAB). Ekstraksi DNA menggunakan CTAB diawali dengan melisis dinding  sel  menggunakan  nitrogen  cair  yang selanjutnya dilakukan penambahan larutan CTAB 500 µl. Sampel yang digunakan sebanyak 0,1-0,5 gram. Kemudian ditambahkan 14 µL proteinase K dan  diinkubasi  pada  suhu  55 0 C  selama  dua  jam kemudian disentrifuse selama sepuluh menit pada 13000 rpm (putaran per menit). Sampel yang telah disentrifuse  diberi  500  µL  PCI  dikocok  sekitar lima  menit  agar  larutan  tercampur,  kemudian disentrifuse  selama  lima  menit  pada  13000 rpm  (putaran  permenit).  Kemudian  larutan  PCI dibuang  dan  ditambahkan  400  µL  kloroform isoamilalkohol  dan  disentrifuse  selama  lima
menit pada 13000 rpm (putaran permenit). Bagian yang  mengandung  kloroform  isoamilalkohol dibuang lalu ditambahkan 600 µL isopropanol dan dipresipitasi  pada  suhu  4 0 C  selama  satu  malam, disentrifus selama sepuluh menit pada 13000 rpm kemudian  bagian  yang  mengandung  isopropanol dibuang  dan  ditambahkan  500  µL  etanol  70  % kemudian disentrifuse selama sepuluh menit pada 13000  rpm  lalu  bagian  yang  mengandung  etanol dibuang dan selanjutnya dikeringkan kurang lebih selama  satu  jam  kemudian  ditambahkan  100  µL Tris EDTA dan disimpan pada suhu 4 0 C.
Bahan baku yang telah diekstraksi menggunakan  CTAB  ditempatkan  dalam  tabung PCR  lalu  dilakukan  proses  ampli kasi  dengan kondisi  optimum  serta  melalui  beberapa  siklus antara 25-35 siklus. Produk hasil PCR selanjutnya dilakukan  visualisasi  dengan  elektroforesis  dan dilihat di bawah sinar UV, jika hasil elekroforesis berhasil  maka  ditandai  dengan  adanya pita  DNA yang  spesi k  lalu  dilakukan  PCR sequencing untuk  penentuan  urutan  nukleotida.  Proses analisis produk PCR berupa sequencing dilakukan oleh lembaga yang berkompeten (Macrogen) yang hasilnya dicocokan dengan bank data (www.ncbi. nlm.nih.gov). Hasil berupa urutan nukleotida akan dicocokan  dengan  data  yang  tersedia  sehingga akan diketahui spesies yang diuji.

## Metode PCR
Sampel  yang  telah  diekstraksi  dipersiapkan untuk  PCR  sebanyak  2  µL  Bahan  untuk  PCR adalah  air,  DNA  polimerase,  primer,  DNA, dan  dNTP  dicampur  dalam  tabung  PCR.  Air berfungsi  untuk  melarutkan  komponen  PCR
Tabel 1 Jenis dan asal bahan baku ikan tuna
Bahan baku Asal bahan baku Yellow  n PT Samudera Besar Bali dan PT Lautan Bahari Sejahtera Albacore PT Samudera Besar Bali Big eye PT Samudera Besar Bali dan PT Lautan Bahari Sejahtera Blue  n PT Samudera Besar Bali Tuna steak Pasar swalayan Bogor
agar  bercampur  setelah  itu  primer  baik forward maupun reverse masing-masing  1,5  µL  yang berfungsi  untuk  proses  penggandaan  pada  PCR, primer yang telah dimasukkan dalam tabung PCR kemudian ditambahkan DNA sebanyak 2 µL dan yang terakhir adalah mix ,  terdiri dari dNTP yang berfungsi  agar  pada  proses  PCR  dapat  membuat untai  baru  serta Taq polimerase.  Komponen yang  berada  pada  tabung  PCR  dimasukkan  ke thermocycle yang  sebelumnya  harus  diatur  suhu dan siklus yang akan digunakan.
Proses PCR akan menghasilkan jutaan salinan DNA  dan  saat  proses  pengerjaan  PCR  dilakukan dengan memperhatikan kontaminasi. Volume yang digunakan dalam PCR yaitu 25 µL. Keberhasilan proses PCR dapat dilakukan dengan optimasi dan diperlukan  suhu  penempelan  ( annealing) yang tepat  agar  primer  dapat  menempel  pada  DNA untai  tunggal  yang  sudah  didenaturasi,  tanpa adanya optimasi maka kemungkinan berhasil pun akan semakin kecil.

## Analisis Produk PCR
Ampli kasi  gen  target  menggunakan  gen sitokrom  b  menghasilkan  750  pasang  basa. Analisis produk PCR dilakukan penentuan urutan nukleotida dengan metode Sanger yang didasarkan pada pendekatan sintesis molekul DNA baru dan pemberhentian sintesis tersebut pada basa tertentu. Hasil  ampli kasi  yang  telah  berhasil  kemudian dikirim  ke  lembaga  yang  berkompeten  yaitu Macrogen  untuk  disekuensing.  Hasil  sekuensing berupa  gra k  yang  menyatakan  kandungan adenin,  timin,  guanin,  dan  sitosin  yang  terdapat pada  fragmen  DNA  yang  telah  dilabel.  Hasil sekuensing  berupa  urutan  nukleotida  dicocokkan ke bank data dengan metode BLAST-n.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Produk steak tuna  dikemas  dengan  plastik dalam  keadaan  vakum.  Pengemasan  dengan bahan  pengemas  yang  cocok  sangat  bermanfaat untuk  mencegah  kemunduran mutu. Pengemasan digunakan  untuk  melindungi  bahan  dari  proses pengeringan.  Daya  simpan  maksimum  produk perikanan dapat dicapai bila menggunakan bahan mentah  yang  benar-benar  segar,  menggunakan bahan  pengemasan  yang  cocok  dan  benar-benar
melekat  pada  produk  yang  dibekukan.  Selama pembekuan secara umum produk akan mengalami tiga  jenis  kerusakan  ( loss ),  yaitu  kerusakan karena  aspek  mekanis,  hal  ini  disebabkan  oleh produk  yang  menempel  atau  terjatuh  dari  rak atau conveyor ,  kemunduran  mutu,  pengeringan ( dehydration ),  yaitu  berkurangnya  kadar  air selama  produk  dibekukan  dan  disimpan  beku yang  ditunjukkan  oleh  adanya  lapisan  es  di  atas produk beku atau memutihnya permukaan produk beku  itu.  Produk steak tuna  yang  berasal  dari pasar swalayan Bogor dalam keadaan yang masih memiliki  ciri-ciri  produk  segar  yang  ditandai dengan  warna  daging  yang  cerah  serta  setelah melalui  proses thawing tekstur tuna steak masih padat dan elastis jika ditekan dengan jari.
Pembekuan pada tuna steak untuk menghambat kemunduran  mutu  pada  produk  yang  disebabkan oleh  mikroorganisme,  proses  kimiawi  dan   sik, sehingga dapat memperpanjang daya simpan dan mempertahankan mutu produk. Karakteristik steak ikan  tuna  meliputi  tekstur  dan  warna.  Ikan  tuna merupakan  ikan  yang  berlemak  tinggi  sehingga perlu  penanganan  hati-hati  agar  diperoleh bahan  baku  yang  segar  (Suptijah  1996).  Proses penanganan  yang  baik  dan  benar  meliputi quick , cold , clean ,  dan carefully harus  diterapkan  dari awal  ikan  ditangkap  hingga  proses  pengolahan. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan bahan baku yang  masih  memiliki  kriteria  ikan  segar  ketika ikan  telah  ditangkap  maupun  melalui  proses pengolahan.  Karakteristik steak tuna  dengan sumber  pembanding  Standar  Nasional  Indonesia (SNI) disajikan pada Tabel 2.

## Ekstraksi DNA
Ekstraksi  DNA  pada  dasarnya  untuk  melisis jaringan dan mendapatkan DNA yang berkualitas, terpisah  dengan  komponen  lain.  Proses  ekstraksi dilakukan untuk memperoleh DNA yang berkualitas  yaitu  DNA  yang  diekstraksi  sudah terpisah  dengan  komponen  lain  sehingga  jika divisualisasi menghasilkan pita yang jelas. Proses ekstraksi  DNA  terdiri  atas  tiga  tahapan  yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan lain, dan permurnian DNA ( Ardiana 2009).
Proses  ekstraksi  DNA  dapat  menggunakan
beberapa  cara  antara  lain  dengan  CTAB  ataupun menggunakan  kit  komersial.  Bahan  baku  berupa tuna steak yang  diekstraksi  menggunakan  CTAB dan  kit  Vivantis.  Elektroforegram  DNA  genom disajikan pada Gambar 1.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Gambar  1.  Elektroforegram  DNA  genom. 1  =  Yellow  n; 2 = Albacore ; 3 = Big eye ; 4 = Blue  n ; 5 = Big eye; 6 = Yellow  n; 7 = Steak tuna pasar swalayan Bogor; 8 = Steak tuna pasar swalayan Bogor; 9 = Marker

## Ampli kasi Gen Sitokrom b
Ampli kasi  dilakukan  menggunakan  proses PCR  yaitu  suatu  reaksi  berantai  Polimerase. Primer oligonukleotida sintetik berukuran pendek menempel  pada  daerah  komplementer  DNA dupleks  dan  secara  langsung  mensintesis  jutaan kopi dari molekul DNA (Gil 2007).
Ampli kasi gen cyt b menggunakan pasangan primer  dengan  target  750  pasang  basa.  Hasil
elektroforegram  pada  produk  PCR  di  bawah sinar  UV  memiliki  kecepatan  yang  berbeda- beda.  Kecepatan  migrasi  DNA  di  dalam  agarosa ditentukan oleh beberapa faktor antara lain ukuran molekul  DNA,  konsentrasi  agarosa,  konformasi DNA,  voltase  yang  digunakan,  adanya  ethidium bromida dalam gel serta komposisi larutan buffer. Semakin besar ukuran DNA maka bergerak lebih lambat  dibandingkan  dengan  molekul  berukuran kecil (Baker 2000).
Penggunaan DNA yang berasal dari
mitokondria  memiliki  beberapa  alasan  seperti jumlah yang lebih banyak dibandingkan pada inti sel.  Penggunaan cyt  b didasarkan  karena  dapat digunakan  untuk  identi kasi  spesies  vertebrata yang mengandung informasi spesies yang spesi k dan dapat digunakan untuk  logenetik (Parson et al. 2000).
Laju  mutasi  pada  mitokondria  5-10  kali  lebih cepat  dibandingkan  pada  inti,  disebabkan  mt- DNA  tidak  memiliki  mekanisme  DNA repair yang  e sien,  tidak  memiliki  protein  histon,  dan terletak  berdekatan  dengan  membran  dalam mitokondria tempat berlangsungnya reaksi fosforilasi  oksidatif  yang  menghasilkan  radikal oksigen  sebagai  produk  samping.  Penggunaan gen cyt  b mitokondria  efektif  untuk  identi kasi spesies  dan  analisis   logenetik  (Biswas et  al . 2005).Visualisasi hasil ampli kasi gen cytb dalam
Tabel 2. Karakteristik steak tuna yang digunakan pada penelitian
Sampel Warna Tekstur SNI Nilai organoleptik Yellow  n (BL 1) Daging berwarna merah muda pucat Elastis, padat, kurang kompak, 7530.1-2009 7 Albacore (BL 2) Daging berwarna putih dengan guratan merah muda Elastis, kurang padat, dan kurang kompak 7530.1-2009 7 Bige eye (BL 3) Daging berwarna merah muda pucat Elastis, padat, kurang kompak 7530.1-2009 7 Blue  n (BL4) Daging berwarna merah kehitaman Elastis, padat, kurang kompak 7530.1-2009 7 Bige eye (MB 1) Daging berwarna merah muda pucat Elastis, padat dan kompak 7530.1-2009 9 Yellow  n (MB 5) Daging berwarna merah muda pucat Elastis, padat dan kompak 7530.1-2009 9 Tuna steak (G3) Warna daging krem, cerah dan mengkilap Tekstur kompak, padat dan elastis 01-4485.-2006 8 Tuna steak (E1) Warna daging krem, sangat cerah dan sangat mengkilap Tekstur kompak, padat dan elastis 01-4485.-2006 8
bentuk  analisis  migrasi  produk  PCR  dari  sampel Tuna disajikan pada Gambar 2.
Analisis  migrasi  gen cyt  b dari  sampel  Tuna steak menunjukkan ukurannya adalah 750 pasang basa (pb) dan telah sesuai dengan ukuran teoritis gen cyt  b berdasarkan  pasangan  primer  yang digunakan. Optimasi proses PCR dilakukan untuk menentukan primer dan suhu penempelan primer yang “conserved” ,  yang  berarti  dapat  digunakan untuk  berbagai  spesies  (Akasaki et  al.  2006 ). Hal tersebut penting sebagai bagian dari langkah validasi metode pengujian autentikasi bahan baku hasil perikanan serta deteksi pencampuran daging ikan  pada  produk  olahan  terutama  ikan  kaleng. Hasil  optimasi  pada  penelitian  ini  menunjukkan bahwa  suhu  optimum  penempelan  primer ( annealing ) adalah pada kisaran suhu 55-60 ºC.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Gambar  2.  Elektroforegram  produk PCR. 1  =  kontrol negatif; 2 =  Yellow   n; 3  = Albacore ; 4 = Big eye ; 5 = Blue  n ; 6 = Big eye; 7 = Yellow   n; 8  = Steak tuna  pasar  swalayan Bogor;  9  = Steak tuna  pasar  swalayan Bogor; 10 = Marker

## Penentuan Urutan Nukleotida Gen Sitokrom b
Proses  sekuensing  merupakan  suatu  metode untuk  memperoleh  urutan  nukleotida  dari  suatu spesies.  Metode  sekuensing  yang  digunakan adalah  metode  Sanger.  Prinsip  metode  Sanger berdasarkan  pendekatan  sintesis  molekul  DNA baru  dan  pemberhentian  sintesis  tersebut  pada basa  tertentu. Hasil  sekuensing  spesies  ikan tuna disajikan pada Tabel 3.
Hasil  sekuensing  berupa  urutan  nukleotida akan  dibandingkan  dengan  bank  data NCBI menggunakan  metode  BLAST.  Berdasarkan data  hasil  sekuensing  pada  Tabel  3  tidak  terjadi
Tabel 3 Hasil sekuensing spesies ikan tuna Kode Spesies hasil blast Nomor akses NCBI Homologi BL1 T. albacares DQ080284.1 99% BL2 T. alalunga GU256526.1 99% BL3 T. obesus DQ080280.1 100% BL4 T. macoyyi EF141183.1 99% MB1 T. obesus DQ080280.1 99% MB5 T. albacares DQ080287.1 99% G3 T. albacares DQ080287.1 99%
pemalsuan  bahan  baku  yang  terlihat  dari  sampel yang  digunakan  dengan  hasil sekuensing menggunakan  metode  BLAST  telah  sesuai.  Ikan tuna  dengan  spesies yellow   n ( T.  albacores ), albacore ( T.  alalunga ) ,  big  eye ( T.  obesus ) ,  dan blue  n ( T. macoyyi ) menggunakan gen target cyt b berhasil  diidenti kasi.  Hasil  sekuensing  selain berupa  urutan  nukleotida  juga  dapat  melihat tingkat homologi spesies yang diuji.
Tingkat  homologi  merupakan  persentase kesamaan  spesies  yang  diuji  dengan  data  yang tersedia  di  bank  data.    Spesies yellow   n ( T. albacares ), albacore ( T.  alalunga ) ,  big  eye ( T. obesus ) ,  dan  blue   n ( T.  macoyyi )  memiliki tingkat homologi berturut-turut adalah 99%, 99%, 99%,  100%.  Perbedaan  pada  tingkat  homologi ini  disebabkan  adanya  ketidaksamaan  dengan bank data yaitu sebesar 1% yang bisa disebabkan adanya perbedaan urutan nukleotida pada spesies.

## KESIMPULAN
Pengujian  berbasis  DNA  dapat  dilakukan pada  bahan  baku  yang  telah  mengalami  proses penghilangan  ciri  morfologi  seperti  sirip. Karakteristik  daging  yang  digunakan  dalam keadaan  segar  dengan  memperhatikan  warna dan  tekstur.  Hasil  pengujian  sampel  ikan  tuna didapatkan  fragmen  DNA  dengan  ukuran  750 pasang  basa  (pb)  menggunakan  primer  spesi k berhasil  mengampli kasi  dengan  gen  target cyt b .  Hasil  sekuensing  berupa  urutan  nukleotida menunjukkan  tuna steak yang  berasal  dari perusahaan  dan  pasar  swalayan  Bogor  tidak  ada pemalsuan atau substitusi bahan baku dengan jenis spesies  lain.  Hasil  sekuensing  yang  dicocokkan ke bank data memiliki tingkat homologi rata-rata yang masih dapat diterima.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada Direktorat  Jenderal  Perguruan  Tinggi  (DIKTI) yang  telah  membiayai  penelitian  ini  melalui Program Hibah Penelitian Strategis Nasional 2011

## DAFTAR PUSTAKA
Ardiana DW. 2009. Teknik isolasi DNA genom tanaman pepaya  dan  jeruk  menggunakan  modi kasi  buffer CTAB. Buletin Teknik Pertanian 14:12-16
Akasaki T, Yanagimoto T, Yamakami K, Tomonaga H,
Sato S. 2006. Species identi cation and PCR-RFLP analysis  of  cytochrome b gene  in  cod   sh  (order Gadiformes)  products. Journal  of  Food  Science 71(3): C190
[BSN] Badan Standar Nasional. 2006. Tuna steak beku . Jakarta: Dewan SNI.
[BSN] Badan Standar Nasional. 2009. Tuna loin segar. Jakarta: Dewan SNI.
[BRKP]  Badan  Riset  Kelautan  dan  Perikanan.  2009. Potret  dan  Strategi  Pengembangan  Perikanan Tuna,  Udang  dan  Rumput  Laut .  Jakarta:  Badan Riset Kelautan dan Perikanan
Baker  JA.  2000. Molecular  Methods  in  Ecology . Blackwell Science: Australia
Biswas SK, Li Wang, Yokoyama K, Nishimura K. 2005.
Molecular phylogenetics of the genus Trichosporon
inferred  from  mitochondrial cytochrome b gene sequences. Journal  of  Clinical  Biology 43:  5171-
5178
Civera T. 2003. Species identi cation and safety of  sh products. Vet Research Communication . 27: p. 481 Gil  L.A.  2007.  PCR-based  methods  for   sh  and  shery products authentication. J Food science and Technology 18:p. 558-566
Less  M.  2003. Food  Authenticity  and  Traaceability . England: Woodhead Publishing Limited Mafra  I,  Ferreira  IM,  Oliveira  MB.  2007.  Food authentication  by  PCR-based  methods. Eur  Food Res Technol. published online: 30 October 2007.
Parson W, Pegoraro K, Niederstatter H, Foger M. 2000.
Spesies identi cation by means of the cytochrome b gene. Journal of  Legal Med 114: p. 23-28.
Rasmussen  RS,  Morrissey  MT.  2008.  DNA-Based methods  for  identi cation  of  commercial   sh  and seafood  species. Comprehensive  reviews  in  food science and food safety Journal . Vol.7. 2008-IFT. Suptijah  P.  1996.  Ekstraksi  Insulin  dari  Ikan  dan  Uji Kemurniannya. Buletin Teknologi Hasil Perikanan , 2(2):.103-121
Trilaksani  W,  Bintang  M,  Monintja  DR,  Hubeis M.  2010.  Analisis  Regulasi  Sistem  Manajemen Keamanan  Pangan  Tuna  di  Indonesia  dan  Negara Tujuan Ekspor. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia 13(1): 62-80.