Optimasi prosedur sterilisasi permukaan eksplan stek mikro karet ( Hevea brasiliensis
Muell. Arg)
Optimization of surface sterilization procedure on Hevea brasiliensis Muell. Arg microcutting explant
Irfan MARTIANSYAH *) , Deden Dewantara ERIS, NURHAIMI-HARIS & Darmono TANIWIRYONO
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jl. Taman Kencana No. 1 Bogor 16128, Indonesia
Diterima tanggal 4 Januari 2013/disetujui tanggal 14 Maret 2013

## Abstract
An  increasing  number  of  explants  is  necessary  to obtain plantlets in large quantities, for mass propagation of rubber  plants.  However,  high  level  of  contamination  at  the primary  culture  stage  is  still  a  major  constraint  in in  vitro microcutting of rubber. The aim of this study was to optimize surface  sterilization  procedures  to  reduce  micro-bial contamination  at  the  primary  culture.  Sterilization experiment was conducted in two steps. The first step was to determine  the  effect  of  washing  the  explants  with  running water  prior  to  sterilization  and  then  using  Deso-germe, ethanol  or  H 2 O 2 ,  while  the  second  step  was  to  identify  the suitable  sterilization  process  on  reducing  the  level  of contamination.  The  results  showed  that  the  surface sterilization  with  only  one  type  of  sterilization  agent  could not reduce contamination level caused either by bacteria or fungi, while sterilization with three types of sterilizing agents increased  the  number  of  dead  explants.  The  best  treatment for  surface  sterilization  was  the  direct  sterilization  of explants using 70% ethanol for one minute and 17.6% H 2 O 2 for  20  minutes  without  washing  with  tap  water  (A-CD treatment).  The  percentage  of  viable  and  sterile  explants  of this  treatment  was  76.7%,  which  was  significantly  higher than  those  of  other  treatments.  This  treatment  reduced contamination level to 21.7%.
[ Keywords:  Contamination ,  primary  culture, rootstock, micropropagation, clonal propagation ]

## Abstrak
Peningkatan  jumlah  eksplan  sangat  diperlukan  untuk memperoleh  planlet  dalam  jumlah  besar  pada  perbanyakan massal  tanaman  karet  secara in  vitro .  Namun,  tingginya tingkat  kontaminasi  pada  tahap  kultur  primer  masih  me- rupakan  kendala  utama  dalam  kultur  stek  mikro tanaman karet.  Tujuan  penelitian  adalah  mengoptimasi  prosedur sterilisasi  permukaan  eksplan  untuk  mengurangi  jumlah eksplan  yang  terkontaminasi  mikroba  pada  tahap  kultur primer.  Percobaan  sterilisasi  dilaksanakan  dalam  dua  tahap, tahap  pertama  untuk  mengetahui  pengaruh  pencucian eksplan  dengan  air  mengalir  pada  awal  sterilisasi  serta penggunaan  Desogerme,  etanol  dan  H 2 O 2 ,  sedangkan  tahap kedua  untuk  mendapatkan  proses  sterilisasi  yang  paling sesuai  dalam  menurunkan  tingkat  kontaminasi.  Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan sterilisasi permukaan yang menggunakan satu jenis bahan sterilan tidak dapat  mengurangi  kontaminasi,  baik  oleh  bakteri  maupun cendawan.  Perlakuan  sterilisasi  eksplan  dengan  tiga  jenis bahan  sterilan  meningkatkan  kematian  eksplan.  Perlakuan sterilisasi  permukaan  terbaik  adalah  sterilisasi  langsung
eksplan  menggunakan  etanol  70%  selama  satu  menit  dan H 2 O 2 17,6%  selama  20  menit,  tanpa  pencucian  dengan  air mengalir  (perlakuan  A-CD).  Persentase  eksplan  steril  yang hidup  sebesar  76,7%,  berbeda  nyata  dibandingkan  dengan perlakuan  lainnya.  Perlakuan  tersebut  dapat  mengurangi kontaminasi menjadi sebesar 21,7%.
[Kata  kunci:  Kontaminasi , kultur  primer , batang  bawah, mikropropagasi, perbanyakan klonal]

## Pendahuluan
Beberapa  tahun  belakangan  ini,  perbanyakan klonal  batang  bawah  tanaman  karet  ( Hevea  brasi- liensis Muell. Arg.) melalui teknik stek mikro ( in vitro microcutting )  dilakukan  secara  rutin  di  Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI).  Pengadaan  batang  bawah  tanaman  karet secara  klonal  sangat  diperlukan  karena  batang  bawah yang  selama  ini  digunakan  berasal  dari  biji,  sehingga ketersediaannya  dibatasi  oleh  musim  dan  viabilitas biji. Di samping itu,  meskipun digunakan  klon batang atas  yang  sama,  tanaman  karet  dengan  batang  bawah asal  biji  menunjukkan  variasi  morfologi  dan  produksi yang  cukup  tinggi  antar  tanaman.  Hal  ini  berdampak pada produksi dalam suatu luasan areal tertentu.
Stek  mikro  yang  digunakan  untuk  perbanyakan klonal  batang  bawah  karet,  merupakan  hasil  mikro- propagasi  aseptik  dengan  menggunakan  potongan batang muda yang memiliki mata tunas aksiler sebagai eksplan (Nurhaimi Haris et al., 2009). Teknik ini telah digunakan  untuk  menghasilkan  planlet  karet  di laboratorium  hingga  menjadi  bibit  tanaman  untuk batang  bawah,  setelah  melalui  tahapan  aklimatisasi. Namun,  perbanyakannya  dalam  skala  besar  masih menghadapi  beberapa  kendala,  antara  lain  adalah tingginya  tingkat  kontaminasi  eksplan,  terutama  pada tahap  awal  eksplan  dikulturkan.  Kontaminasi  dapat terjadi  karena  kurang  tepatnya  sterilisasi  permukaan eksplan  dan  adanya  bakteri  endogen  dalam  jaringan eksplan terutama bagian akar (Colgecen et al ., 2011). Eksplan  yang  terkontaminasi  tidak  dapat  diper- tahankan  karena  kultur  akan  dipenuhi  oleh  konta- minan,  terutama  apabila  kontaminan  tersebut  adalah fungi. Kontaminan berupa bakteri, meskipun pertumbuhannya  lebih  lambat  dapat  memproduksi metabolit  yang  toksik  terhadap  eksplan,  memodifikasi Ph  media  sehingga  eksplan  mengalami  nekrosis  dan
*) Penulis korespondensi:imartiansyah6311@yahoo.com
Optimasi prosedur sterilisasi permukaan eksplan stek mikro karet …….( Martiansyah et al.)
menghambat penyerapan nutrisi oleh eksplan (Singh et al., 2011).  Kontaminan  akan  menghambat  pertum- buhan  eksplan  dan  menyebabkan  kehilangan  eksplan yang  jumlahnya  bisa  sangat  besar  sehingga  mem- perlambat  proses  perbanyakan  serta  meningkatkan biaya produksi kultur jaringan skala komersial (Marino et al., 2009).
Kontaminasi oleh  mikroorganisme  dapat dicegah dengan  mengoptimalkan  proses  sterilisasi  permukaan eksplan.  Sterilisasi  dapat  dilakukan  menggunakan lebih dari satu bahan sterilan seperti NaOCl dan etanol 70%  (Odutayo et  al., 2007),  NaOCl  dan  HgCl 2 (Badoni  &  Chauhan,  2010),  NaOCl,  HgCl 2 dan  H 2 O 2 (Srivastava et al., 2010). Di sampaing itu penggunaan Nano-Silver Particles untuk menghilangkan kontaminasi  telah  dilaporkan  pada  kultur  jaringan tanaman olive (Rostami  &  Shahsavar,  2009).  Pada kultur in vitro tanaman karet, bahan sterilan yang biasa digunakan antara lain tween  20 (surfaktan) dan etanol 70% (Dickson et al., 2011), serta etanol 70% dan H 2 O 2 (Carron et  al .,  2005).  Proses  sterilisasi  permukaan eksplan  karet  pada  teknik  stek  mikro  cukup  panjang, yang  diawali  dengan  pencucian  eksplan  dengan  air mengalir.  Namun,  proses  pencucian  tersebut  diduga dapat  menyebarkan  mikroorganisme  yang  terdapat  di permukaan  jaringan  tanaman,  sehingga  meningkatkan risiko kontaminasi. Pengamatan yang dilakukan dalam beberapa  periode  waktu  menunjukkan  bahwa  tingkat kontaminasi  pada  tahap  awal  kultur  ( primary  culture ) cukup  tinggi  antara  10  –  50%,  tergantung  musim (Nurhaimi-Haris et  al .,  2009).  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mengoptimasi  prosedur  sterilisasi  permukaan eksplan  karet  yang  akan  digunakan  pada  kultur  stek mikro sehingga tingkat kontaminasi dapat dikurangi.

## Bahan dan Metode

## Sumber eksplan
Bahan  tanam  yang  digunakan  sebagai  eksplan adalah batang karet muda pada tahap pertumbuhan dua payung  daun  yang  berasal  dari  biji  yang  telah terseleksi  dan  dipelihara  di  rumah  kaca.  Sehari sebelum  diambil,  batang  karet  diolesi  dengan  dithane 0,5%  yang  berfungsi  sebagai  fungisida.  Pengambilan eksplan  dilakukan  dengan  memotong  batang  muda sekitar  10–15  cm  dari  pertautan  okulasi,  kemudian dibawa ke laboratorium untuk proses sterilisasi.

## Prosedur standar sterilisasi permukaan eksplan
Batang  karet  yang  akan  digunakan  sebagai eksplan  dicuci  dengan  air  mengalir  hingga  bersih, kemudian dicuci dengan larutan Desogerme 0,5% (v/v) yang  merupakan  larutan  bakterisida  dan  fungisida dengan  bahan  aktif quaternary  alkyl  chloride dan garam polyiminobiguanidide .  Selanjutnya  eksplan direndam  selama  lebih  kurang  satu  menit  dalam larutan  etanol  70%  (v/v),  lalu  direndam  dalam  larutan
H 2 O 2 (hidrogen  peroksida)  17,6%  (v/v)  selama  20 menit.  Setelah  itu  eksplan  dibilas  menggunakan aquades  steril  hingga  seluruh  eksplan  bersih  dari larutan sterilan.

## Optimasi sterilisasi permukaan eksplan
Pada  tahap  awal  dilakukan  pengujian  sterilisasi menggunakan 13 perlakuan, seperti yang terdapat pada Tabel  1.  Selanjutnya  dipilih  tujuh  cara  yang memberikan  hasil  paling  baik  untuk  melakukan optimasi  proses  sterilisasi  tersebut.  Sebagai  kontrol digunakan proses sterilisasi standar seperti diuraikan di atas.

## Parameter yang diamati dan analisis data
Parameter  yang  diamati  adalah  jumlah  eksplan steril  yang  hidup,  eksplan  mati,  eksplan  terkontami- nasi  bakteri  dan  eksplan  terkontaminasi  cendawan. Pengamatan  dilakukan  mulai  minggu  pertama  sejak eksplan dikulturkan sampai minggu ke enam. Analisis data  dilakukan  dengan  menggunakan  ANOVA  (SPSS 11.0), dilanjutkan dengan uji Duncan pada taraf uji α = 5%.

## Hasil dan Pembahasan
Pengujian  tingkat  kontaminasi  eksplan  karet dengan  berbagai  perlakuan  sterilisasi  dilakukan  untuk memilih  beberapa  perlakuan  sterilisasi  yang  akan dioptimasi.  Hasil  pengamatan  berupa  kontaminasi eksplan  oleh  bakteri  dan  cendawan  pada  beberapa perlakuan  sterilisasi  sampai  pada  pengamatan  minggu ke-6  disampaikan  pada  Tabel  2.  Pada  minggu  ke-1, rerata  kontaminasi  bakteri  untuk  semua  perlakuan sebesar  19,6%,  kemudian  meningkat  menjadi  37,7% pada  minggu  ke-3  dan  menjadi  39,6%  pada  akhir pengamatan. Sama halnya dengan kontaminasi bakteri, kontaminasi  yang  disebabkan  cendawan  mengalami peningkatan  pada  minggu  ke-3  dari  9,1%  menjadi 24,9%.  Dari  hasil  ini  diketahui  bahwa  peningkatan kontaminasi yang signifikan terjadi selama minggu ke- 2  dan  minggu  ke-3  baik  kontaminasi  oleh  bakteri ataupun cendawan (Tabel 2). Kontaminasi pada kultur in vitro biasanya terjadi pada awal penanaman eksplan ke  dalam  media.  Pada  tahap  ini  eksplan  yang  berasal dari  luar  (lingkungan  tidak  steril)  dibawa  ke  dalam lingkungan laboratorium sehingga kemungkinan eksplan  terkontaminasi  sangat  besar.  Menurut  Akin- Idowu et  al. (2009),  kontaminasi  pada  kultur  jaringan terjadi  pada  awal  inisiasi  eksplan  yang  terkait  dengan tempat  dan  waktu  pengambilan  eksplan.  Kontaminasi mikroba terutama bakteri menjadi masalah utama pada kultur  jaringan  tanaman  (Marino et  al., 2009). Kontaminasi  bakteri  seringkali  sulit  dideteksi  pada awal  kultur  karena  berada  di dalam  jaringan  tanaman. Beberapa tanaman yang terkontaminasi tidak menunjukkan  gejala  penghambatan  tumbuh,  tetapi terlihat  dari  laju  multiplikasi  yang  berkurang  dan
banyaknya planlet yang mati (Sharifkhani et al., 2011). Selain  bakteri,  Omamor et  al. (2007)  melaporkan bahwa  di  daerah  yang  beriklim  tropis  kontaminasi cendawan  sangat  sering  terjadi  dan  mengakibatkan kerugian  besar  pada  kultur  jaringan.  Keberadaan mikroba  pada  media  kultur  biasanya  meningkatkan kematian  eksplan  sehingga  eksplan  menguning,  serta menghambat pertumbuhan tunas dan perakaran (Singh et al., 2011).
Kontaminasi  bakteri  yang  sangat  berat  terdapat pada  perlakuan  A+C  sebesar  62,5%,  A-C  sebesar  75 %,  A+BC  sebesar  65  %  dan  A-BC  sebesar  66,3%,
sedangkan  tingkat  kontaminasi  bakteri  yang  paling ringan  (12,5%)  terdapat  pada  perlakuan  A-CD  yang menggunakan dua bahan sterilan etanol 70% dan H 2 O 2 tanpa  dicuci  air  mengalir.  Tingkat  kontaminasi cendawan  yang  sangat  berat  terdapat  pada  perlakuan A+B dan A-B, masing-masing 58,8% dan 67,5%. Pada perlakuan  tersebut,  bahan  sterilan  yang  digunakan hanya  Desogerme.  Nampak  bahwa  sterilisasi  yang menggunakan  alkohol  70%  saja,  dan  yang  digabung dengan  perlakuan  Desogerme,  baik  eksplan  dicuci maupun  tidak  dicuci  terlebih  dahulu  dengan  air mengalir  tidak  cukup  efektif  untuk  mengatasi

## Tabel 1. Perlakuan sterilisasi eksplan karet

## Table 1. Treatments of sterilization on rubber explants
Perlakuan sterilisasi Treatment of sterilization Keterangan ( Note )
A+BCD* (Kontrol/ control )  A+ : Dicuci dengan air mengalir/ Washed with running water A- : Tidak dicuci / Unwashed B : Dicuci dengan Desogerme 0,5% / Washed with 0.5% Desogerme C : Direndam satu menit dengan etanol 70% / Soaked in 70% ethanol for one minute D : Direndam 20 menit dengan H 2 O 2 17,6% / Soaked in H 2 O 2 17.6% for 20 minutes
Pada tahap akhir proses sterilisasi seluruh eksplan dicuci dengan akuades steril ( At the end of sterilization process, all explants were washed with sterile aquadest )
*Perlakuan untuk optimasi tahap lanjut masing-masing menggunakan 20 eksplan, dan diulang sebanyak empat kali ( Treatment for advanced stage of optimization e ach used 20 explants for four times and repeated ) .
A+B A+C A+D* A+BC
A+BD* A+CD* A-BCD* A-B A-C A-D* A-BC A-BD*
A-CD*
Perlakuan sterilisasi Treatments of sterilization Persentase eksplan terkontaminasi ( Percentage of contaminated explants ) Minggu ke-1 First week Minggu ke-3 Third week Minggu ke-6 Sixth week Bakteri Bacteria Cendawan Fungi Bakteri Bacteria Cendawan Fungi Bakteri Bacteria Cendawan Fungi A ⁺ BCD (Kontrol/ control ) 17,5 3,8 32,5 7,5 32,5 10,0 A+B 23,8 33,8 40,0 57,5 41,3 58,8 A+C 40,0 0 62,5 6,3 62,5 8,8 A+D 3,8 6,3 26,3 33,8 32,5 35,0 A+BC 36,3 3,8 63,8 12,5 65,0 12,5 A+BD 5,0 7,5 21,3 27,5 21,3 31,3 A+CD 16,3 1,3 38,8 12,5 42,5 15,0 A-BCD 7,5 2,5 22,5 10,0 23,8 11,3 A-B 20,0 41,3 32,5 66,3 32,5 67,5 A-C 53,8 2,5 73,8 10,0 75,0 10,0 A-D 15,0 12,5 26,3 52,5 28,8 53,8 A-BC 27,5 3,8 63,8 11,3 66,3 11,3 A-BD 2,5 7,5 12,5 33,8 17,5 37,5 A-CD 5,0 1,3 11,3 7,5 12,5 13,8 Rerata ( Average ) 19,6 9,1 37,7 24,9 39,6 26,9
Tabel 2. Persentase eksplan karet yang terkontaminasi bakteri dan cendawan pada berbagai perlakuan sterilisasi.
Table 2. Percentage of rubber explants contaminated by bacteria and fungi on various sterilization treatments.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Ek spl an ya ng t er kont am ina si (% ) Pe rc en ta ge o f e xp la nt co nt am in at ed ( % ) Perlakuan  sterilisasi Treatment  of sterilization cendawan
bakteri
kontaminasi.  Perlakuan  sterilisasi  dengan  satu  bahan sterilan  saja  diketahui  tidak  dapat  menghilangkan mikroba sumber kontaminan pada permukaan eksplan, bahkan  pada  perlakuan  A+B  dan  A-B  eksplan terkontaminasi  bakteri  dan  cendawan  hingga  100% (Gambar  1).  Menurut  Traore et  al. (2005),  jenis  dan jumlah  bahan  sterilan  pada  proses  kultur  jaringan mempengaruhi  tingkat  kontaminasi,  misalnya  kultur tanaman  pinus  di  Amerika  Utara  memerlukan  lima jenis  bahan  sterilan.  Prosedur  sterilisasi  permukaan dengan  menggabungkan  etanol  dengan  NaOCl,  atau H 2 O 2 terbukti  dapat  mengurangi  kontaminasi  pada beberapa  jenis  tanaman  (Oyebanji et  al., 2009). Kontaminasi  dapat  diminimalkan  apabila  dilakukan dua  tahap  sterilisasi  atau  digunakan  dua  jenis  bahan sterilan (Benazir et al ., 2013).
Apabila  digabungkan  secara  total,  baik  konta- minasi  yang  disebabkan  oleh  bakteri  ataupun cendawan, tingkat  kontaminasi terendah  terdapat pada eksplan  karet  yang  tidak  dicuci  dengan  air  mengalir, namun  langsung  direndam  sesaat  dengan  etanol  70% dan disterilisasi menggunakan H 2 O 2 (Gambar 1A-CD). Konsentrasi  H 2 O 2 yang  digunakan  untuk  sterilisasi permukaan eksplan biasanya berkisar 3-20% tergantung pada jenis bahan tanaman yang digunakan. Hidrogen  peroksida  dapat  menghambat  pertumbuhan bakteri  dan  cendawan  dengan  cara  menghidrolisis  sel atau  menggumpalkan  protein  yang  terdapat  pada protoplasma. Protein yang telah menggumpal kehilangan  fungsinya  sehingga  bakteri  dan  cendawan mengalami  kematian.  Dibandingkan  dengan  bahan kimia  lainnya,  H 2 O 2 merupakan  bahan  yang  ramah lingkungan  karena  mudah  terurai  menjadi  air  dan oksigen (Srivastava et al., 2010).
Perlakuan  A-CD  dapat  menekan  kontaminasi secara  siginifikan  yaitu  sebesar  26,3%,  jauh  lebih rendah  dibandingkan  dengan  kontrol  dan  perlakuan lainnya  (Tabel  3).  Eksplan  yang  mati  sebesar  12,4%, lebih  tinggi  dari  perlakuan  yang  hanya  menggunakan satu  bahan  sterilan,  tetapi  masih  lebih  rendah  dari kontrol.  Persentase  eksplan  steril  yang  hidup  pada
perlakuan  A-CD  sebesar 61,3% berbeda nyata dengan perlakuan-perlakuan lainnya. Eksplan steril yang hidup tersebut  lalu  diperbanyak  dengan  proses  subkultur setiap  empat  minggu  dengan  laju  multiplikasi  sebesar 1,6 kali yang berasal dari bagian pucuk tunas dan ruas batang (Gambar 2).
Pada  tahap  selanjutnya  optimasi  sterilisasi  per- mukaan  eksplan  dilaksanakan  dengan  mengurangi beberapa  perlakuan  yang  terlihat  kurang  efektif mengatasi  kontaminasi  pada  percobaan  sebelumnya (Tabel  4).  Berdasarkan  perlakuan  terbaik  A-CD,  di- ketahui  bahwa  penggunaan  sterilan  H 2 O 2, diperlukan untuk  mencapai  hasil  sterilisasi  terbaik  sehingga  pada percobaan  tahap  lanjutan,  H 2 O 2 digunakan  dalam seluruh perlakuan sterilisasi tersebut. Secara keseluruhan  terlihat  bahwa  pencucian  eksplan  dengan air  mengalir  sebelum  proses  sterilisasi  dilaksanakan menghasilkan  tingkat  kontaminasi  yang  lebih  tinggi, terutama  kontaminasi  yang  disebabkan  oleh  bakteri. Sterilisasi  menggunakan  Desogerme  ternyata  tidak membantu  menurunkan  tingkat  kontaminasi  pada kultur stek mikro tanaman karet. Selain itu, Desogerme tidak  tersedia  di  Indonesia  sehingga  biaya  penyediaan desinfektan  ini  tergolong  mahal  dan  sulit  didapatkan. Oleh  karena  itu,  peng-gunaan  Desorgeme  dapat dihilangkan  dalam  proses  sterilisasi  seperti  yang selama ini dilakukan.
Hasil  terbaik  tetap  diperoleh  dari  perlakuan  A- CD  dengan  persentase  eksplan  sehat  mencapai  76,7% dan  tingkat  kontaminasi  rendah  sebesar  21,7%  (Tabel 4).  Dengan  penurunan  tingkat  kontaminasi  eksplan hingga  di  bawah  30%,  maka  terbuka  peluang  untuk melangkah  ke  tahap  produksi  massal  batang  bawah karet  secara  klonal  karena  selama  ini  kontaminasi merupakan  salah  satu  faktor  pembatas  utama perbanyakan  massal  bahan  tanam  karet  tersebut (Nurhaimi-Haris et  al .,  2009).  Di  samping  itu  dengan menghilangkan beberapa tahap dalam proses sterilisasi,  seperti  pencucian  eksplan  dengan  air  dan Desogerme,  maka  efisiensi  dalam  hal  penggunaan waktu dan bahan akan meningkat.
5 cendawan/ fungi bakteri/ bacteria
Perlakuan sterilisasi/ Sterilization treatment
Gambar 1. Pengaruh perlakuan sterilisasi permukaan eksplan terhadap persentase eksplan yang terkontaminasi oleh bakteri atau cendawan pada enam minggu setelah dikultur. (A+: dicuci dengan air mengalir, A-: tidak dicuci, B: dicuci dengan  Desogerme  0,5%,  C:  direndam  satu  menit  dengan  etanol  70%,  D:  direndam  20  menit  dengan  H 2 O 2 17,6%)
Figure 1.   Effect of surface sterilization treatment on the percentage of explants contaminated by bacteria and fungi at six weeks  after  cultured. (A+:  washed  with  running  water,  A-:  unwashing  B:  washed  with  0.5%  Desogerme,  C: soaked in 70% ethanol for one minute, soaked in H 2 O 2 17.6% for 20 minutes)
Gambar  2.  Kondisi  eksplan  pada  akhir  minggu  ke-6  pengamatan  a)  eksplan  steril  yang  hidup  b)  eksplan  terkontaminasi cendawan c) eksplan terkontaminasi bakteri d) eksplan mati (mencoklat).
Figure  2.      Condition  of  explants  at  the  end  of  sixth  week  a)  viable  and  aseptic  explants  b)  explants  contaminated  by  fungi c) explants contaminated by bacteria d) dead explant (browning)
Tabel 3. Kondisi eksplan karet pada akhir minggu ke-enam.
Table 3. Condition of rubber explants at the end of sixth week.
Perlakuan sterilisasi Sterilization treatments
Kondisi akhir eksplan ( Final condition of explants ) (%) Eksplan steril yang hidup Viable sterile explants Eksplan mati Dead explants Total eksplan terkontaminasi Total contaminated explants A ⁺ BCD (Kontrol/ control ) 32,5 bc 25,0 a 42,5 gh A+B 0,0 f 0,0 e 100,0 a A+C 18,8 cde 10,0 bcd 71,3 bcd A+D 26,3 cd 6,2 bcde 67,5 cde A+BC 18,8 cde 3,7 cde 77,5 bc A+BD 41,3 b 6,2 bcde 52,5 fg A+CD 28,8 bcd 13,7 b 57,5 def A-BCD 32,5 bc 32,5 a 35,0 hi A-B 0,0 f 0,0 e 100,0 a A-C 11,3 ef 3,7 cde 85,0 b A-D 17,5 de 0,0 e 82,5 b A-BC 20,0 cde 2,5 de 77,5 bc A-BD 42,5 b 2,5 de 55,0 efg A-CD 61,3 a 12,4 bc 26,3 i
Tabel 4. Kondisi eksplan karet pada perlakuan sterilisasi terseleksi.
Table 4. Conditions of rubber explants on selected-sterilization treatments.

## Perlakuan sterilisasi
Sterilization treatments
Kondisi akhir eksplan ( Final condition of explants ) (%) Eksplan steril yang hidup Viable sterile explants Eksplan mati Dead explants Total eksplan terkontaminasi Total contaminated explants A ⁻ CD 76,7 a 1,6 a 21,7 a A ⁻ BCD 46,7 b 3,3 a 50,0 b A ⁻ BD 36,7 b 1,6 a 61,7 b A ⁻ D 36,7 b 0,0 a 63,3 b A ⁺ BD 18,3 c 0,0 a 81,7 c A ⁺ D 16,7 c 0,0 a 83,3 c A ⁺ BCD (Kontrol/ control ) 6,7 c 5,0 a 88,3 c A ⁺ CD 3,3 c 1,7 a 95,0 c
*)  Angka-angka  dalam  kolom  yang  sama  yang  diikuti  huruf  yang  sama  tidak  berbeda  nyata  berdasarkan  uji Duncan  pada  taraf  5%.  ( The  numbers  in  the  same  column  followed  by  the  same  letters  are  not  significantly different at 5% level according to Duncan test).
*  Angka-angka  dalam  kolom  yang  sama  yang  diikuti  huruf  yang  sama  tidak  berbeda  nyata  berdasarkan  uji Duncan pada taraf 5%.
*  The  numbers  in  the  same  column  followed  by  the  same  letters  are  not  significantly  different  at  5%  level according to Duncan test.
d c b a
Optimasi prosedur sterilisasi permukaan eksplan stek mikro karet …….( Martiansyah et al.)

## Kesimpulan
Optimasi  perlakuan  pada  proses  sterilisasi  per- mukaan  yang  dilakukan  pada  penelitian  ini  mampu mengurangi kontaminasi pada tahap kultur primer stek mikro  tanaman  karet.  Perlakuan  yang  menggunakan satu  jenis  bahan  sterilan  tidak  dapat  mengurangi kontaminasi,  baik  oleh  bakteri  ataupun  cendawan, sedangkan  perlakuan  dengan  tiga  jenis  bahan  sterilan meningkatkan  kematian  eksplan  sehingga  dapat disimpulkan perlakuan dengan dua jenis bahan sterilan merupakan  perlakuan  terbaik.  Eksplan  yang  tidak dicuci dengan air mengalir, tetapi langsung disterilisasi menggunakan etanol 70% selama satu menit dan H 2 O 2 17,6% selama 20  menit (A-CD)  merupakan perlakuan terbaik  dengan  persentase  eksplan  hidup  sebesar 76,7%, yang berbeda nyata dengan perlakuan lainnya. Perlakuan  A-CD  dapat  menurunkan  kontaminasi  dari 88,3% pada kontrol menjadi sebesar 21,7%.

## Daftar Pustaka
Akin-Idowu  PE,  DO  Ibitoye  &  OT  Ademoyegun  (2009). Tissue  culture  as  a  plant  production  technique  for horticultural crops . African J Biotech 8 (16), 372-378.
Badoni  A  &  JS  Chauhan  (2010). In  vitro sterilization protocol  for  micropropagation  of Solanum  tuberosum cv Kufri Himalini. Acad Arena 2 (4), 24-27.
Benazir  JF,  R  Suganthi,  P  Chandrika  &  B  Mathithumila (2013). In vitro regeneration and transformation studies on Pelargonium grave-olens (geranium) - an important medicinal  and  aromatic  plant. J  Medicine  Plant  Res 7(38), 2815-2822.
Carron  MP,  L  Lardet  &  P  Montoro  (2005).  Hevea  micro- cutting. Technical Notes on The Process . CIRAD.
Colgecen  H,  U  Koca  &  G  Toker  (2011).  Influence  of different  sterilization  methods  on  callus  initiation  and production  of  pigmented  callus  in Arnebia  densiflora
Ledeb. Turk J Biol 35, 513-520.
Dickson  I,  A  Okere,  J  Elizabeth,  O  Mary,  F  Olatunde  &  S Abiodun (2011). In-vitro culture of Hevea brasiliensis (rubber  tree)  embryo. J  Plant  Breed  Crop  Sci 3(9), 185-189.
Marino  G, F  Gaggia, F  Saiano, B  Biavati  &  B  Marangoni (2009).  Elimination  of in  vitro bacterial  contaminants
in shoot cultures of MRS 2/5 plum hybrid by the use of Melia  azadarach extracts. Eur  J  Plant  Pathol 123, 195-205.
Nurhaimi-Haris, Sumaryono & MP Carron (2009). Pengaruh bahan  pra  sterilan,  tutup  tabung  kultur,  dan  musim terhadap  tingkat  kontaminasi  eksplan  pada  kultur microcutting karet. Menara Perkebunan 77(2), 84-93.
Odutayo  OI,  NA  Amusa,  OO  Okutade  &  YR  Ogunsanwo (2007).  Sources  of  microbial  contamination  in  tissue culture laboratories in Southwestern Nigeria. African J Agric Res 2 (3), 67-72.
Omamor  IB,  AO  Asemota,  CR  Eke  &  EI  Eziashi  (2007). Fungal  contamination  of  the  oil palm  tissue  culture  in Nigerian  Institute  for  Oil  Palm  Research  (NIFOR). African J Agric Res 2(10), 534-537.
Oyebanji  OB,  O  Nweke,  O  Odebunmi,  NB  Galadima  MS Idris,  UN  Nnodi,  AS  Afolabi  &  GH  Ogbadu (2009). Simple,  effective  and  economical  explant-surface sterilization  protocol  for c owpea,  rice  and  sorghum seeds. African J Biotech 8 (20), 5395-5399.
Rostami  AA  &  A  Shahsavar  (2009).  Nano-silver  particles eliminate the in vitro contaminations of Olive’mission’ explants. Asian J of Plant Sci 8(7), 505-509.
Sharifkhani  A,  HM  Saud  &  MBA  Aziz  (2011).  An alternative  safer  sterilization  method  for  explants  of Aloevera  barbadensis Mill. In :  2 nd International  Conf on  Chemical  Engineering  and  Applications IPCBEE 23, 32-36.
Singh  AT,  PK  Chauhan,  P  Kumari  &  S  Kaushal  (2011). Identification  and  prevention  of  bacterial  contami- nation  on  explant  used  in  plant  tissue  culture  labs. Internat J Pharm & Pharmaceutic Sci 3(4), 160-163.
Srivastava N, B Kamal, V Sharma, YK Negi,  AK Dobriyal,
S  Gupta  &  VS  Jadon  (2010).  Standardization  of sterilization protocol for micro-propagation of Aconitum  heterophyllum an  endangered  medicinal herb. Acad Arena 2 (6), 62-66.
Traore A, Z Xing, A Bonser & J Carlson (2005). Optimizing a protocol for sterilization and in vitro establishment of vegetatives buds from mature douglasfir tree. Hort Sci 40(5), 1464-1468.