PENGARUH TEGANGAN ELEKTROPORASI TERHADAP EFISIENSI TRANSFORMASI PLAMID pND968 BAKTERI ASAM LAKTAT KE E. coli HB101 1)
[The Effect of Electroporation Voltage on Transformation Efficiency of  Plasmid pND968 of Lactic Acid Bacteria Into E. coli HB101]
Widodo 2)
1 ) Makalah dipresentasikan pada Seminar Nasional PATPI, Semarang 9-10 Oktober 2001
2) Laboratorium Teknologi Pengolahan Susu, Fakultas Peternakan UGM – Yogyakarta

## ABSTRACT
The research was conducted to examine the effect of different electroporation voltage on transformation efficiency of plasmid pND968. This was carried out by exposing the mixture of plasmid pND968 and competent cells of E. coli  HB101 on  a difference level of electroporation voltage at 1500, 2000 and 2500 Volts. After electroporation, the cells were resuspended in a recovery medium and then poured into ampicilin- containing LB agar. Transformants appeared after 48-72 hours were then recorded. The results showed that electroporation voltage of 2500 Volts with resistance 200 Ohm and capacitor 25 uF resulted in the highest electroporation efficiency at 7.72 x 10 4 CFU / ug DNA. Transformants confirmation by means of plasmid pND968 isolation showed that all of  the ampicillin-resistant transformants harbored the intended pND968 with the expected size.
Key words : Electroporation, transformation efficiencies, and plasmid

## PENDAHULUAN
Transformasi DNA dapat terjadi secara alami maupun buatan.  Transformasi  secara  alami,  biasanya  terjadi  pada sebagian  siklus  hidup  setiap  mikroorganisme  khususnya bakteri.  Terjadinya  transformasi  secara  alami  berkaitan dengan  kondisi  kompeten  sel  selama  sel  tumbuh.  Kondisi ini  biasanya  terjadi  menjelang  phase  sel  stasioner ( stationery  phase )  dimana  sel  mencapai  densitas  tertinggi sepanjang  pertumbuhannya.  Kompeten  sel  sangat memungkinkan  DNA  luar  masuk  kedalam  sel  bakteri. Transformasi  DNA  secara  alami,  frekuensinya  sangat rendah  dikarenakan  adanya  syarat  tertentu  seperti  kontak antar  sel,  homologi  dari  DNA  yang  bersangkutan,  adanya proses  modifikasi  dalam  inang,  kondisi  morphologi (kemampuan  membentuk  rambut/phili)  dan  perlunya  gen khusus  seperti  gen tra untuk  proses  konjugasi  (Brown, 1986; Old and Primrose, 1989). Kelemahan mendasar dari transformasi  secara  alami  bahwa  DNA  yang  dapat dipindahkan dengan metode alami ini hanyalah DNA yang berbentuk  linear  atau  DNA  kromosom,  sedangkan  DNA plasmid  tidak  dapat  dipindahkan  (Snyder  dan  Campness, 1987 cit Old and Primrose, 1989). Hal ini dikatakan sebagai kelemahan  mendasar  karena  banyak  sifat  genetik  bakteri sangat  ditentukan  oleh  gen  yang  dibawa  pada  DNA plasmid.  Dengan  demikian,  teknik  transformasi  buatan yang  memungkinkan  transfer  DNA  plasmid  sangat  perlu dikembangkan.
Salah  satu  teknik  transformasi  buatan    yang memungkinkan DNA dapat dipindahkan ke dalam sel inang adalah  teknik  elektroporasi.  Elektroporasi  telah  berhasil digunakan  untuk  memindahkan  berbagai  plasmid  DNA  ke dalam  berbagai  bakteri  inang  baik  yang  bersifat  Gram positip  maupun  negatif.  Fielder  dan  Wirth  (1988) melaporkan tingkat elektroporasi 10 4 - 10 5 transforman per ug  DNA  plasmid  dari Enterococcus  faecalis .  Sedangkan dengan  teknik  yang  sama  tingkat  efisiensi  yang  diperoleh pada Escherichia  coli dan Pseudomonas  putida masing- masing  adalah  1  x  10 3 dan  3  x  10 4 transforman  per  ug DNA.
Berbagai  faktor  menentukan  tingkat  efisiensi elektroporasi.  Diantara  faktor-faktor  tersebut  adalah konsentrasi  DNA,  medan  listrik  (voltase,  hambatan  listrik dan  kapasitor)  yang  digunakan  serta  lamanya  ekposisi medan listrik (Sambrook et al., 1989). Tingkat efisiensi 10 9 - 10 10 transforman  per  ug  DNA  dapat  dicapai  dengan kombinasi ketiga faktor tersebut. Dower et al.,(1988) seperti disitir Sambrook et al., (1989) melaporkan tingkat efisiensi 10 10 transforman  per  ug  DNA  diperoleh  ketika  melakukan transformasi  plasmid  pUC18  ke  dalam  sel E.  coli strain LE392 atau MC1061. Secara umum, efisiensi transformasi dengan  elektroporasi  dapat  mencapai  10-20  kalinya dibandingkan  dengan  transformasi  dengan  kompeten  sel yang  disiapkan  dengan  bahan  kimia.  Lebih  lanjut, Sambrook et al.,(1989) menyatakan bahwa plasmid dengan ukuran 25 - 130 kb dapat ditransfer dengan efisiensi yang sama.  Penyiapan  kompeten  sel  bakteri  inang  juga  relatif
lebih mudah. Sel bakteri ditumbuhkan sampai pertengahan phase  logaritmit,  didinginkan,  dipanen  dan  dicuci  dengan buffer dengan kandungan garam rendah untuk menurunkan tegangan ion dari suspensi sel (Sambrook et al., 1989).
Plasmid  pND968  adalah  salah  satu  bentuk cloning vector yang food-grade (non  antibiotik)  dan  berperan penting  dalam  pengembangan  bakteri  asam  laktat (Leelawatcharamas  et  al.,  1997).  Plasmid  ini  mempunyai ukuran  17,7  kb  dengan  membawa  gen  resisten  terhadap tembaga  ( copper ).  Sebagai  kloning  vektor  yang  sifatnya shuttle ,  plasmid  ini  dapat  dipindahtukarkan  baik  kedalam sistem  genetik  bakteri E  coli maupun  bakteri  asam  laktat. Adanya  penanda  seleksi  seperti  ampisilin,  resistensi tembaga  dan  nisin  akan  sangat  memudahkan  seleksi transforman  hasil  transformasi.  Beberapa  lokasi  ensim restriksi seperti Sac I dan Apa I  yang sifatnya tunggal dapat dipakai untuk menghilangkan komponen bakteri E. coli dari plasmid  ini  sehingga  persyaratan food-grade terpenuhi (Leelawatcharamas  et al., 1997).
Plasmid  pND968  dikonstruksi  dengan  melakukan kloning gen resisten tembaga ( cop ) plasmid pND951 pada plasmid    pND628.  Plasmid  pND628  sendiri  tersusun  atas 7,1  kilobasa  dengan  gen  resisten  terhadap  nisin  dan ampisilin    yang  diperoleh  dari  tetuanya  yaitu  plasmid pGEM-7Zf(+)  (Promega).  Replikon  plasmid  pND628 diperoleh  dari L.  lactis FG2.  Replikon  ini  termasuk  dalam tipe  theta  yang  diketahui  mempunyai  stabilitas  tinggi. Tampilan  plasmid  pND968  dapat  dilihat  pada  Gambar  1 berikut:
Penelitian  ini  bertujuan  mengkaji  perbedaan tegangan  elektroporasi  terhadap  tingkat  efisiensi transformasi  plasmid  pND968.  Untuk  itu,  selama elektroporasi dicoba berbagai tegangan elektroporasi
berbeda      dan    diamati  pengaruhnya  terhadap  efisiensi transformasi.

## METODOLOGI
Bahan dan Alat Lactococcus  lactis subspesies lactis yang membawa  plasmid  pND968  dan  bakteri Eschericia  coli HB101  diperoleh  dari  laboratorium  bioteknologi, Departemen Bioteknologi, University of New South Wales , Australia.
Bahan  penelitian  yang  diperlukan  diantaranya  M17 medium  (untuk  pertumbuhan L.  lactis ),  LB  medium  (untuk E.  coli ),  Larutan  25%  sukrosa  dengan  lisosim  30  mg/ml, Larutan  3%SDS  0,2N  NaOH,  3  M  sodium  asetat,  Larutan I(Tris/Glukosa/EDTA),  Larutan  II  (1%  SDS;  0,2%NaOH), Larutan III (5 M potasium asetat), loading dye (terdiri atas bromophenol  biru, xylene  cyanol ,  dan  sukrosa), Isopropanol,  es  pendingin,  1%  agarose  gel  untuk elektrophoresis, 1 X bufer TAE (Tris/Asetat/EDTA), RNase, Tris/EDTA  bufer  plus  RNase,  ensim  lisosim,  antibiotik eritromisin dan ampisilin, nisin dan tembaga sulfat (CuSO 4 ), larutan  EtBr  untuk  pengecatan  dan  akuades  untuk pembilasan.
Alat  yang  diperlukan  meliputi  sentrifus  14000  rpm, pipet,  tabung  ependof, rotary  shaker dengan  pengontrol suhu,  seperangkat  alat  unruk  pembuatan  gel  agarose, seperangkat  alat  elektrophoresis  dan  kamera  untuk pemotretan  plasmid  DNA,  dan  seperangkat  alat  untuk elektroporasi ( electrophoration chamber ).
Gambar 1. Tampilan plasmid pND968 hasil rekayasa plasmid oleh Leelawatcheramas et al., (1997)

## Teknik  penelitian
Elektroporasi dilakukan menurut metode Well, et al., (1993).  Elektroporasi  dilaklukan  dengan  volume  sel kompeten  50  ul  ditambah  5  ul  DNA  plasmid  (dengan kisaran konsentrasi 20 - 200 ng DNA).  50 ul kompeten sel + 5 ul plasmid DNA ditempatkan dalam kuvet elektroporasi, didinginkan  dalam  es,  dilanjutkan  dengan    elektroporasi pada tegangan 1500, 2000, 2500 volt pada 25 uF dan 200 ohm.  Setelah  elektroporasi,  1  ml  medium  M17G  dingin ditambahkan dalam kuvet dan diinkubasi 30 0 C selama 2-3 jam. Setelah inkubasi, 200 ul suspensi sel ditaburkan pada medium M17G agar plus ampisilin sebagai penanda seleksi dan  diinkubasi  selama  24-48  jam.  Jumlah  koloni  yang tumbuh  dicatat  sebagai  transforman.  Sel  kompeten  tanpa tambahan  plasmid  pND968  digunakan  sebagai  kontrol negatif.
Metode isolasi plasmid DNA dari transforman E.coli didasarkan atas metode yang telah dilakukan oleh Birnboim dan  Dolly  (1979)  dan  Sambrook  et  al.,  (1989)  dengan berbagai pengembangan untuk mendapatkan hasil plasmid DNA  yang  paling  layak.  Metode  isolasi  plasmid  pND968 dari Lactococcus  lactis dilakukan  berdasar  metode O'Sullivan  dan Klaenhammer (1993).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Koloni  bakteri E.  coli HB101  yang  tumbuh  pada medium  LB  agar  plus  ampisilin  dihitung  sebagai transforman. Kontrol yang ditumbuhkan pada medium yang sama dijadikan ukuran apakah koloni yang tumbuh benar- benar  transforman  atau  kontaminan.  Tidak  adanya  koloni yang  tumbuh  pada  kontrol  menunjukkan  bahwa  tidak  ada kontaminan  yang  tumbuh  sebagai  sel  resisten  ampisilin. Hasil  perhitungan  tingkat  efisiensi  didasarkan  per  5  ul plasmid  DNA  yang  ditambahkan  atau  sekitar  200  ng/5  ul. Hasil perhitungan tersebut dapat dilihat pada Tabel 1.
tersebut  betul-betul  transforman  pembawa  plasmid pND968,  maka  ekstraksi  plasmid  dilakukan  diikuti  dengan elektroporesis  untuk  mengetahui  ukuran  plasmid  hasil elektroporasi.  Plasmid  pND968  hasil  elektroporasi  dapat dilihat pada Gambar 2 berikut:
Keterangan:  M : DNA penanda ( marker ) dari Hin dIII No 1, 2 dan 3 : Plasmid DNA pND968
Gambar  2.  Plasmid  pND968  hasil  transformasi  dengan elekroporasi
Tabel 1. Tingkat efisiensi transformasi plasmid pND968 dengan berbagai tegangan listrik yang elektroporasi  berbeda.
Perlakuan Ulangan I Ulangan II Rerata 2500 V, 200 Ohm, 25 uF 1.45 x 10 5 CFU/ug 9.34 x 10 3 CFU/ug 7.72  x 10 4 CFU/ug 2000 V, 200 Ohm, 25 uF 1.25 x 10 5 CFU/ug 3.45 x 10 3 CFU/ug 6.42 x 10 4 CFU/ug 1500 V, 200 Ohm, 25 uF 8.54 x 10 3 CFU/ug 2.43 x 10 3 CFU/ug 5.48 x 10 3 CFU/ug Kontrol 0 0 0 Dari Tabel 1 diatas diketahui bahwa perlakuan 2500
V,  200  Ohm,  25  uF  menghasilkan  tingkat  efisiensi transformasi  tertinggi  dibandingkan  dengan  perlakuan lainnya. Untuk mengetahui lebih detail apakah transforman
Dari  Gambar  2  diatas  dapat  diketahui  bahwa transforman  yang  diperoleh  hasil  elektroporasi  memang benar  transforman  yang  diharapkan.  Maksudnya transforman  ini  membawa  plasmid  pND968  seperti  yang
diharapkan. Keberadaan plasmid dalam transforman E. coli HB101  inilah  yang  menyebabkan E.  coli mempunyai kemampuan  tumbuh  pada  medium  LB  plus  antibiotik ampisilin. Dengan demikian  dapat dikatakan bahwa proses transfer  plasmid  pND968  dengan  elektroporasi  dapat dikatakan berhasil dan perlakuan pada tegangan 2500 kV, 200  Ohm  dan  25  uF  memberikan  hasil  efisiensi transformasi yang terbaik.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  tegangan elektroporasi  2500  Volts  dapat  digunakan  untuk memindahkan  plasmid  pND968  dengan  tingkat  efisiensi sekitar  10 3 sampai  10 4 transforman  per  ug  DNA. Keberhasilan  transfer  plasmid  DNA  pada  tegangan  listrik tinggi  ini    disebabkan  terbentuknya  distorsi  membran  sel sehingga  memungkinkan  DNA  masuk  ke  dalam  sel  pada saat  sel  ditempatkan  pada  medan  listrik.  Tingkat  efisiensi transformasi  10 3 –  10 4 transforman  per  ug  DNA  memang dibawah  tingkat  efisiensi  transformasi  seperti  yang dilakukan  oleh  Sambrook  et  al.,  (1989)  namun  menyamai tingkat  efisiensi  transformasi Streptococcus  sp yang dilakukan  oleh  Powell  et  al.,(1988)  maupun  Fieldler  and Wirth  (1988).  Tingkat  efisiensi  transformasi  ini  sangat dipengaruhi banyak faktor seperti medan listrik (tegangan, hambatan,  dan  kapasitor),  struktur  sel,  konsentrasi  DNA, penyiapan kompeten sel  dan  keberadaan sistem restriksi DNA (Powell  et al., 1988).
Pengaruh  medan  listrik  diteliti  pada  penelitian  ini. Hasilnya  menunjukkan  bahwa  tingkat  tegangan  2500  V relatif  menghasilkan  tingkat  efisiensi  transformasi  yang paling baik dibandingkan tegangan 1500 V dan 2000 V. Hal ini dimungkinkan bahwa tingkat tegangan yang lebih tinggi akan  lebih  mampu  membentuk  pori-pori  pada  dinding  sel dan  membran  plasma  sehingga  jumlah  DNA  yang  masuk akan  jauh  lebih  tinggi  (Fieldler  and    Wirth,  1988).  Namun demikian  tingkat  tegangan  yang  tinggi  juga  akan mengakibatkan  tingkat  kematian  sel  yang  tinggi  jika  tidak dilakukan  pada    rentang  waktu  yang  tepat.  Kematian  sel biasanya  disebabkan  oleh  adanya  perpecahan  dalam sitoplasma  sehingga  fungsi  metabolisme  dalam  sel  akan rusak dan berakibat matinya sel bakteri (Fieldler and Wirth, 1988).  Konsentrasi DNA plasmid juga sangat menentukan keberhasilan  transformasi.  Konsentrasi  DNA  (ng/ul)  yang terlalu  tinggi  (misalnya  >100  ng  DNA  per  40  ul  sel)  akan menghasilkan  tingkat  efisiensi  yang  rendah  (Sambrook  et al., 1989). Untuk transformasi E. coli , transformasi dengan 1  ul  DNA  (  konsentrasi  sekitar  50  ng/ul)  sudah  lebih  dari cukup untuk menghasilkan tingkat transformasi yang baik.

## KESIMPULAN
Transformasi
plasmid pND968 dengan menggunakan  tegangan  elektroporasi    2500  Volts,  200
Ohm  dan  kapasitor  25  uF  mampu  menghasilkan  tingkat efisiensi  transformasi  7,72  x  10 4 CFU/ug  DNA.  Hasil  ini berada pada kisaran tingkat efisiensi yang lazim diperoleh oleh  beberapa  peneliti  sebelumnya.  Setelah  ekstraksi plasmid,  setiap  transforman  yang  diperoleh  menunjukkan membawa plasmid pND968 pada ukuran yang sama.

## UCAPAN TERIMA  KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  atas  bantuan dana  penelitian  dari  Pemerintah  Australia  lewat  AusAID dan Prof. Noel Dunn, Direktur CRC ( Cooperative Research Center ) for  Food  Industry  and  Innovation yang  telah membantu penulis selama melakukan penelitian.

## DAFTAR  PUSTAKA
Brown, T.A. 1986. Gene Cloning: an introduction. P. 74-99. Chapman & Hall.
Birnboim,  H.C.  and  Dolly,  J.  1979. A  rapid  alkaline extraction  procedure  for  screening  recombinant plasmid DNA. Nucleic Acid Research. 6(7):1513- 1514
Fieldler,  S.  and    Wirth,  R.  1988 .  Transformation  of bacteria  with  Plasmid  DNA  by  electroporation. Anal. Biochem. 170:38-44
Leelawatcharamas,  V.,  Chia,  L.G.,    Charoenchai,  P., Khunajakr, N.,  Liu, C.Q., and Dunn, N.W. 1997.
Plasmid-encoded copper
resistance in Lactococcus lactis . Biotech. Lett. 19(7):639-643
Old,  R.W.  and  Primrose,  S.B.  1989 .  Principles  of  Gene Manipulation:  An  introduction  to  genetic engineering.  P.  11-15.  Blackwell  Scientific Publications.
O'Sullivan,  D.J.  and.  Klaenhammer,  T.R.  1993 .  Rapid mini-prep  isolation  of  high-quality  plasmid  DNA from Lactococcus and lactobacillus  spp .  Appl. Environ. Microbiol. 59(8):2730-2733
Powell,  I.B.,    Achen,  M.G.,  Hillier,  A.J.  and  Davidson, B.E.    1988. A  simple  and  rapid  method  for genetic  transformation  of  Lactic  streptococci  by electroporation . Appl. Environ. microbiol. 54:655- 660
Sambrook,  J.,  Fritsch,  E.F.,  and    Maniatis,  T.  1989. Molecular  cloning:  A  laboratory  manual (2 nd edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Watson,  J.D.,  Tooze,  T.,  and    Kentz,  O.T.  1983. DNA Rekombinan  (terjemahan  oleh  Wisnu  Gunarso). Penerbit Erlangga. Well,  J.M.,  P.W.  Wilson  and  R.W.F  Le  Page  (1993).
Improved  cloning  vectors  and  transformation procedure  for  Lactococcus  lactis. J.  Appl. Bacteriol. 74:629-636