## ARTIKEL PENELITIAN
EFEK EKSTRAK ETANOL AKAR PASAK BUMI ( Eurycoma longifolia, Jack ) TERHADAP EKSPRESI HRAS PADA ORGAN HATI TIKUS GALUR Sprague Dawley

## PADA PEMBERIAN DOXORUBICIN
EFFECTS OF PASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE
Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
Noval 1* , Raihana 2
1 Department of Pharmacy, Health Faculty, Sari Mulia University Banjarmasin
2 Department of Pharmacy, Pharmacy Faculty, Ahmad Dahlan University Yogyakarta e-mail: novalhalim10@gmail.com

## ABSTRAK
Agen  kemoterapi  doxorubicin  menimbulkan  efek  samping  yang  serius  pada  sel  normal, terutama  pada  organ  hati  dan  jantung  yang  disebabkan  oleh  radikal  bebas.  RAS  merupakan komponen penting dari jalur transduksi sinyal yang mengontrol proliferasi sel, diferensiasi dan kelangsungan  hidup.  Akar  pasak  bumi  (Eurycoma  longifolia,  Jack)  telah  dilaporkan  memiliki aktivitas  sebagai  antioksidan  dan  hepatoprotektor.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol akar pasak bumi terhadap ekspresi HRAS pada tikus sehat yang diberi doxorubicin.
Penelitian ini dilakukan dengan membagi hewan uji menjadi 7 kelompok yaitu Kelompok I kontrol  doxorubicin  4,67  mg/kgBB,  kelompok  II  kontrol  ekstrak  etanol  akar  pasak  bumi  200 mg/kgBB,  kelompok  III,  IV  dan V adalah  kelompok perlakuan  yang  diberikan doxorubicin 4,67 mg/kgBB  dengan ekstrak etanol  akar pasak bumi  masing-masing 50  mg/kgBB;  100  mg/kgBB; 200  mg/kgBB,  kelompok  VI  kontrol  pelarut  dan  kelompok  VII  kontrol  sehat.  Penelitian dilanjutkan  dengan  melakukan  pengecatan  menggunakan  metode  imunohistokimia  untuk melihat  ekspresi  HRAS  pada  tiap  kelompok  percobaan.  Analisis  data  dilakukan  dengan menghitung persen ekspresi, kemudian dilanjutkan dengan uji statistik menggunakan SPSS.
Hasil  uji  statistik  menunjukkan  bahwa  terdapat  perbedaan  bermakna  antara  kelompok kontrol doxorubicin (18,56 ± 1,85) dengan perlakuan kelompok 5 (10,43 ± 1,71) dan tidak ada perbedaan  bermakna  antara  kelompok  kontrol  doxorubicin  (18,56  ±  1,85)  dengan  perlakuan kelompok 3 (17,80 ± 4,23) dan perlakuan kelompok 4 (16,70 ± 1,97).
Dari hasil penelitian diperoleh kesimpulan bahwa ekstrak etanol akar pasak bumi dengan dosis 200 mg/KgBB dapat menurunkan ekspresi HRAS pada pemberian doxorubicin.
Kata kunci: Doxorubicin, Eurycoma longifolia Jack, HRAS

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN

## ABSTRACT
Doxorubicin chemotherapy agents cause serious side effects in normal cells, especially in  the  liver  and  heart  caused  by  free  radicals.  RAS  is  an  important  component  of  the  signal transduction pathway that controls cell proliferation, differentiation and survival. The pasak bumi root  (Eurycoma  longifolia,  Jack)  has  been  reported  to  have  activity  as  an  antioxidant  and hepatoprotector. This study aims to determine the effect of giving ethanol extract of pasak bumi root on HRAS expression in healthy mice given doxorubicin.
This  research  was  conducted  by  dividing  the  test  animals  into  7  groups,  namely doxorubicin control group 4.67 mg / kgBB, group II control ethanol extract of pasak bumi roots 200  mg  /  kgBB,  group  III,  IV  and  V  were  the  treatment  groups  given  doxorubicin  4.67  mg  / kgBW with ethanol extract of the pasak bumi root, each 50 mg / kgBB; 100 mg / kgBB; 200 mg / kgBW,  group  VI  solvent  control  and  group  VII  healthy  control.  The  study  was  continued  by painting  using  an  immunohistochemical  method  to  see  the  expression  of  HRAS  in  each experimental  group.  Data  analysis  was  performed  by  calculating  percent  expressions,  then proceed with statistical tests using SPSS.
The results of statistical tests showed that there were significant differences between the doxorubicin control group (18.56 ± 1.85) and the treatment of group 5 (10.43 ± 1.71) and there were no significant differences between the doxorubicin control group (18.56 ± 1, 85) with group 3 treatment (17.80 ± 4.23) and group 4 treatment (16.70 ± 1.97).
From the results of the study concluded that the ethanol extract of pasak bumi roots at a dose of 200 mg / KgBB can reduce the expression of HRAS in the administration of doxorubicin.
Keywords : Doxorubicin, Eurycoma longifolia Jack, HRAS

## PENDAHULUAN
Doxorubicin merupakan salah satu obat kemoterapi  yang  umum  digunakan  untuk menangani  berbagai  jenis  kanker  [1]  seperti kanker payudara, ovarium, sarkoma, limfoma, dan  leukemia  akut  [2],    serta  kanker  hati  [3]. Ada  dua  mekanisme  yang  diusulkan  dimana doxorubicin  bertindak  pada  sel  kanker  yaitu interkalasi ke dalam DNA dan penghambatan topoisomerase  II  dan  generasi  radikal bebas. Spesies  oksigen  reaktif  dapat  menyebabkan peroksidasi  lipid  dan  kerusakan  membran, kerusakan  DNA,  stres  oksidatif,  dan  memicu jalur kematian sel (apoptosis) [4]. Doxorubicin dapat menginduksi apoptosis pada sel normal
dan  sel  kanker  melalui  mekanisme  yang berbeda,  yaitu  melalui  jalur  p53  pada  sel kanker dan H2O2 pada sel normal [5]. Protein RAS  bertindak  sebagai  pengatur  jalur  sinyal yang memodulasi proliferasi sel, kelangsungan hidup, dan apoptosis. [6].
Doxorubicin  dapat  menyebabkan  efek samping  yang  parah  pada  jaringan  normal, seperti jantung, hati, dan ginjal.
Kardiotoksisitas dan hepatotoksisitas terhadap  doxorubicin  disebabkan  karena adanya radikal bebas [7]. Pemberian doxorubicin  memicu  hepatotoksisitas  yang ditandai  oleh  perubahan  patologis  parah  dan inflamasi  [8].  Gambaran  histopatologis  pada hati menunjukkan bahwa doxorubicin memicu

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
hepatotoksisitas,  ditandai  dengan  perubahan histopatologi  organ  hati  seperti  nekrosis, degenerasi  hepatosit,  dilatasi  sinusoidal, hemoragi, dan dilatasi serta kongesti vaskular [9]. Perbedaan toksisitas doxorubicin pada sel kanker  dan  sel  normal  perlu  diselidiki  untuk meningkatkan  efek  antitumor  doxorubicin melalui pendekatan kombinasi untuk melindungi sel-sel normal [10].
Tumbuhan  telah  lama  kita  ketahui merupakan  sumber  yang  sangat  penting dalam  upaya  mempertahankan  kesehatan masyarakat  [11].  Pasak  bumi  (Eurycoma longifolia,  Jack)  adalah  salah  satu  tumbuhan pohon  yang  memiliki  khasiat  farmakologis yang  meliputi  semua  bagian  tumbuhannya mulai  dari  akar,  batang,  daun,  bunga,  dan buahnya.  Tumbuhan  ini banyak  ditemukan di Indonesia,  Malaysia,  Filipina,  Vietnam,  dan Thailand  [12].  Tumbuhan  ini  merupakan pohon  kecil  dengan  ketinggian  mencapai  20 m.  Pasak  bumi  juga  adalah  salah  satu  jenis tumbuhan obat yang telah digunakan sebagai obat  untuk  detoksikasi,  antioksidan  radikal bebas,  obat  kuat,  dan  peningkat  imunitas serta antikanker [13].
Senyawa  kuasinoid  yang  terkandung dalam  akar  pasak  bumi  dimungkinkan  dapat melindungi  sel-sel  hati  dari  radikal  bebas dengan kemampuan menghambat peroksidasi  lipid  [14].  Pemberian  antioksidan dapat menyebabkan aktivasi Akt [15].
Fosforilasi  Akt  mempromosikan  HRAS  [16]. Keluarga  protein  RAS  berperan  dalam pertahanan  kelangsungan  hidup  sel.  Oleh karena  itu  akar  pasak  bumi  diduga  dapat menurunkan toksisitas dari doxorubicin dengan  menghambat  pembentukan  radikal bebas,  sehingga  apoptosis  pada  sel  normal tidak terjadi.
Tujuan dari penelitian ini untuk mengetahui  pengaruh  pemberian  ekstrak etanol  akar  pasak  bumi  terhadap  ekspresi HRAS pada tikus sehat yang diberi doxorubicin.  Sehingga  nantinya  pasak  bumi dapat  dijadikan  sebagai  tambahan  alternatif pada pasien yang diberikan doxorubicin untuk melindungi  sel-sel  hati  dari  radikal  bebas, karena  aktivitas  antioksidan  dari  pasak bumi.Berdasarkan  latar  belakang  tersebut, perlu  dilakukan  penelitian  tentang  pengaruh pemberian akar pasak bumi terhadap ekspresi  HRAS  pada  tikus  sehat  yang  diberi doxorubicin.

## METODOLOGI
1.  Rancangan Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium  Farmasi,  Universitas  Sari  Mulia Banjarmasin  dalam  waktu  kurang  lebih selama 3 bulan. Metodologi dari penelitian ini menggunakan metode eksperimental. Metode eksperimental  yaitu  suatu  penelitian  dengan melakukan kegiatan percobaan yang bertujuan  untuk  mengetahui  gejala  atau

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
pengaruh  yang  timbul,  sebagai  akibat  dari adanya  perlakuan  tertentu  atau  eksperimen
tersebut[17].
Adapun rancangannya sebagai berikut,
2.  Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian ini  adalah  spuit per oral,  spuit  injeksi,  corong Buchner,  timbangan  analitik,  alat-alat  bedah, meja  operasi,  pisau  scalpel,  mikroskop,
kamera,  alat-alat  gelas,  sarung  tangan, masker,  toples  maserasi,  magnetic  stirrer, kertas saring, penangas air, rotary evaporator,  karet  pengikat,  pot  tempat ekstrak,  batang  pengaduk,  cawan  porselen dan  mikropipet  20;200;1000  µl,  Sedangkan

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah serbuk akar pasak bumi yang berasal dari  Banjarmasin,  Kalimantan Selatan,  etanol 70 %, tikus Galur Sprague dawley, Aquadest, Doxorubicin, CMC-Na, formalin. 3.  Cara Kerja Pelaksanaan penelitian terdiri atas beberapa tahap, yaitu:
a.  Ekstraksi serbuk akar pasak bumi
Serbuk  akar  pasak  bumi  sebanyak 1000  g  diekstraksi  menggunakan  metode maserasi dengan pelarut etanol sebanyak 3L, kemudian diaduk dengan mengunakan  magnetic  stirer  selama  tiga jam.  Setelah  itu,  diamkan  selama  24  jam yang  bertujuan  untuk  mengoptimalkan maserasi dari akar pasak bumi, kemudian disaring  menggunakan  corong  buchner yang  telah  dilapisi  kertas  saring.  Filtrat yang  diperoleh  kemudian  dievaporasi dengan  mengunakan rotary  evaporator hingga  diperoleh  maserat  yang  kental kemudian  dimasukkan  dalam  cawan porselin  lalu  dipanaskan  diatas  penangas air hingga diperoleh ekstrak yang kental. b.  Perhitungan dosis dan pembuatan larutan uji 1)  Dosis doxorubicin
Dosis yang digunakan pada penelitian ini adalah 4,67 mg/KgBB (Ikawati, 2010). Tikus dengan berat badan ± 200 gram, maka dosis
doxorubicin yang diperlukan adalah sebagai berikut:
Dosis doxorubicin = 4,67 mg/KgBB Volume Obat = 5ml (injeksi) Konsentrasi doxorubicin = 50mg/5ml Berat rata-rata tikus = 200 gram Perhitungannya menjadi = VOA = 4,67 mg x 0,2 kg 50 mg/ ml = 0,095 ml
Pemberian  injeksi doxorubicin pada  1  ekor  tikus  dengan  berat  200 gram  adalah  0,095  ml.  Jadi  untuk membuat  larutan  injeksi doxorubicin , serbuk  obat  ditambah  dengan  WFI ( Water  For  Injection )  sebanyak  5ml dan  diambil  0,095ml  untuk    tiap  200 gram tikus.
2)  Dosis ekstrak akar pasak bumi
Dosis  ekstrak etanol  akar pasak bumi  yang  akan  diberikan  kepada tikus secara  peroral adalah 50 mg/KgBB,  100  mg/kgBB  dan  200 mg/kgBB dengan konsentrasi 20mg/ml.  Misal,  tikus  dengan  berat badan  200  gram,  maka  dosis  ekstrak etanol akar pasak bumi yang diperlukan adalah

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
Dosis 50mg/kgBB  VOA = 50 𝑚𝑔 𝑥 0,2 𝑘𝑔 20 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = 0,5 ml
Dosis 100 mg/kgBB  VOA = 100 𝑚𝑔 𝑥 0,2 𝑘𝑔 20 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = 1 ml
Dosis 200 mg/kgBB 
VOA = 200 𝑚𝑔 𝑥 0,2 𝑘𝑔 20 𝑚𝑔/𝑚𝑙 = 2  ml
Pemberian  peroral  pada  1  ekor tikus  dengan  dosis  50mg/kg  BB, 100mg/kg    BB  dan  200mg/kg  BB adalah 0,5 ml, 1 ml dan 2 ml. Ekstrak yang dibutuhkan  per hari untuk  setiap kelompok tikus adalah:
Kontrol akar pasak bumi (200mg/kgBB)
 2,0ml x 7
tikus = 14 ml
Dosis 50 mg/kgBB
 0,5ml x 7 tikus = 3,5 ml Dosis 100mg/kgBB
 1,0ml x 7 tikus = 7,0 ml
Dosis 200mg/kgBB
 2,0ml x 7 tikus = 14 ml
3)  Persiapan hewan uji
Hewan uji yang digunakan dalam percobaan ini adalah tikus galur Sprague  Dawley dengan  bobot  ±  200 gram yang berumur 3 minggu. Kondisi fisik  hewan  sehat  dan  tidak  tampak cacat secara anatomi. Tikus dipelihara dalam  kandang,  tiap  kandang berisi  7 ekor  tikus,  dan  diberi  makan  serta
diberi minum secukupnya. Tikus diadaptasikan  selama  7  hari,  setelah itu diberi perlakuan.
Selama penelitian tikus ditimbang setiap harinya untuk mengetahui perkembangan berat badan.  Empat  puluh  sembilan  tikus umur  3  minggu  secara  acak  dibagi menjadi 7 kelompok.
Pengelompokan  Hewan  Uji  dan Uji  Efek  Ekstrak  Etanol  Akar  Pasak Bumi  Terhadap  ekspresi  HRAS  Pada Tikus Galur SD. Empat puluh sembilan  ekor  tikus  umur  tiga  minggu secara acak dibagi menjadi 7 kelompok.  Kelompok  tersebut  diberi perlakuan sebagai berikut:
Kelompok 1 :   Kelompok  kontrol doxorubicin , hewan uji diberikan doxorubicin dengan dosis 4,67  mg/kgBB  sebanyak  5  kali  dalam  2 minggu.
Kelompok 2 :   Kelompok  kontrol  ekstrak etanol  akar  pasak  bumi,  hewan  uji  diberikan ekstrak etanol akar pasak bumi  dengan dosis 200  mg/kgBBsecara  per  oral  setiap  hari selama 2 minggu.
Kelompok 3 : Kelompok perlakuan, hewan  uji  diberikan doxorubicin dosis    4,67 mg/kgBB secara i.m sebanyak 5 kali dalam 2 minggu,  dengan  penambahan  ekstrak  etanol akar pasak bumi dosis 50 mg/kgBB.

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
Kelompok 4 : Kelompok perlakuan, hewan  uji  diberikan doxorubicin dosis    4,67 mg/kgBB secara i.m sebanyak 5 kali dalam 2 minggu,  dengan  penambahan  ekstrak  etanol akar pasak bumi dosis 100 mg/kgBB. Kelompok 5 : Kelompok perlakuan, hewan  uji  diberikan doxorubicin dosis    4,67 mg/kgBB secara i.m sebanyak 5 kali dalam 2 minggu,  dengan  penambahan  ekstrak  etanol akar pasak bumi dosis 200 mg/kgBB. Kelompok 6 :   Kelompok kontrol pelarut, hewan uji diberi CMC-Na 0,5 %.
Kelompok 7 :   Kelompok kontrol sehat, hewan uji hanya diberi pakan dan minum saja.
4)  Pengambilan organ hati hewan uji
Empat puluh sembilan ekor tikus galur Sprague  Dawley yang  telah diberi  perlakuan  selama  dua  minggu kemudian dibunuh dengan cara dikorbankan untuk dilakukan pembedahan dengan mengambil organ hati. Organ yang ambil tersebut kemudian  dibersihkan  dengan  larutan NaCl  fisiologis  agar  jaringan  tersebut tidak mati kemudian dimasukan dalam pot  untuk  difiksasi  dengan  larutan formalin 10%.
5)  Pembuatan preparat histopatologi
Organ  hati  yang  telah  difiksasi dibawa ke laboratorium patologi kedokteran  hewan  UGM.  Pembuatan preparat diawali dengan trimming yaitu
pemotongan  jaringan  setebal  3-5  mm dan  1  x  1  cm  menggunakan  pisau skapel  kemudian  dimasukkan  dalam embedding cassette. Selanjutnya yaitu dehidrasi yang bertujuan untuk menghilangkan air dari jaringan.
Dehidrasi dilakukan dengan menggunakan etanol secara
bertingkat. Larutan etanol yang digunakan berturut-turut adalah etanol 80 % sekali selama 2 jam, etanol 95% sebanyak 2 kali, masing-masing 2 jam dan  etanol  100%  sebanyak  3  kali masing-masing  1  jam.  Kemudian cleaning menggunakan xylene sebanyak  3  kali  yang  bertujuan  untuk membersihkan  jaringan  dari  cairan dehidrasi.  Setelah  dilakukan cleaning, pembuatan dilanjutkan dengan impregnasi yaitu  penggunaan  reagen pembersih paraffin dengan cara penetrasi dalam jaringan dan dilakukan  sebanyak  3  kali  masing- masing 60  menit.  Jaringan  yang  telah dimasukkan dalam embedding cassette dipindahkan  ke  dalam base mold dan  diisi  dengan  paraffin  cair. Setelah itu jaringan dipotong menggunakan pisau konvensional dan mikrotom  sliding  ( cutting) dengan ketebalan
5-7 mikron. Hasil pemotongan  selanjutnya  direndam

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
dengan  air  hangat  di  atas hot  plate selama 0,5 jam.
6)  Uji imunohistokimia (IHC)
Langkah  pertama  deparafinasi preparat  (blok  parafin)  dengan  xylol sebanyak  2  kali  masing-masing  5 menit.  Rehidrasi  preparat  dengan menggunakan  etanol  100%,  etanol 95%  dan  etanol  70%  sebanyak  2  kali masing-masing  selama  5  menit  dan terakhir  dicuci  dengan buffer  citrate .
Kemudian  masing-masing  preparat ditambahkan  300  μl  metanol  dingin dan  diamkan  selama  10  menit, kemudian  cairan  dibuang.  Lalu  cuci preparat dengan larutan PBS sebanyak  2  kali  masing- masing  500μl selama 5 menit, larutan dibuang. Cuci preparat dengan aquades sebanyak 2 kali  masing- masing  500μl  selama  5 menit lalu buang larutan dan bersihkan.
Lakukan perendaman dalam peroxidaxe  blocking  solution (larutan H 2 O 2 1:9)  masing-masing  sebanyak 100μl  selama  5-10  menit  untuk menghilangkan  aktivitas  peroxidase endogen,  kemudian  buang  larutan. Cuci  dengan  larutan  PBS  sebanyak 2 kali  masing- masing  500μl  selama  5 menit,  buang  larutan.  Tambahkan blocking  serum masing- masing  100μl
dan  ikubasi  pada  suhu  kamar  (25°C) selama  10-15  menit,  buang  larutan. Tambahkan  antibodi  primer  HRAS yang  telah  disiapkan  ditambahkan sebanyak  30- 50μl  pada  preparat (disesuaikan  sampai  semua  bagian tergenang)  kemudian  diinkubasi  pada suhu  kamar  (25°C).  Preparat  sampel diinkubasi  dengan  antibodi  HRAS, selanjutnya dicuci dengan PBS (segar) masing-masing sebanyak
500μl selama 5 menit, buang larutan.
Ditambahkan  antibodi  sekunder
( Trakkle Link .) masing-masing sebanyak  100μl  dan  inkubasi  pada suhu  kamar  selama  20  menit.  Cuci dengan  larutan  PBS  segar  masing- masing  500μl  selama  5  menit. Kemudian  jaringan  pada  preparat diberi label ( Trak Avidin-HRP ) masing- masing sebanyak 100μl dan diinkubasi  pada  suhu  kamar  selama 10 menit. Cuci selama 5 menit dengan larutan  PBS  sebanyak  2  kali  dan masing- masing 500μl. Preparat diinkubasi dalam peroxidase
substratesolution (DAB)  100  μl  (1:50) per preparat selama 5 menit. Preparat dicuci dengan aquades masing- masing  2  kali  sebanyak 500μl  selama 5 menit, buang cairan.

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
Pada preparat tersebut ditambahkan Mayer
hematoxylin(counterstrain) sebanyak 100μl  selama  5  menit,  kemudian dicuci dengan aquades sampai bersih dan  dikeringkan.  Preparat  selanjutnya dicelupkan  ke  dalam  alkohol  100%, dibersihkan  dan  dicelupkan  ke  dalam xylol .  Preparat  selanjutnya  ditetesi dengan mounting  media kemudian ditutup  dengan cover  slip .  Setelah kering,  preparat  siap  diperiksa  di bawah mikroskop cahaya.
7)  Analisis hasil
Analisis  hasil  dilakukan  dengan menghitung  persen  ekspresi  dari HRAS. Persen ekspresi diperoleh dari perbandingan  sel  yang  terekspresi dengan yang tidak terekspresi. Persen ekspresi diperoleh dengan rumus:
Setelah diperoleh persen ekspresi dari tiap perlakuan dilanjutkan  dengan  analisis  statistik. Analisis statistik dengan SPSS diawali dengan  uji  normalitas  dengan  uji Kolmogorov
Smirnov
untuk
menentukan data tersebut terdistribusi normal atau tidak dan uji homogenitas
dengan uji Levene . Jika data
terdistribusi normal dan varian homogen maka dilanjutkan dengan uji Parametrik dengan menggunakan ANOVA satu jalur dan analisis dengan uji Post  Hoc .  Apabila  data  tersebut tidak memenuhi salah satu persyaratan  analisis  parametrik  maka dapat  dilanjutkan  uji  statistik  Non Parametrik  menggunakan  uji Kruskal Wallis dan Mann  Whitney untuk mengetahui  ada  tidaknya  perbedaan persen ekspresi HRAS antar kelompok perlakuan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Perlakuan
dengan doxorubicin padatikus  sehat  menunjukkan  kehilangan massa tubuh, selain itu juga terlihat penurunan  kelangsungan  hidup  lima  hari setelah pemberian doxorubicin [18]. Penghambatan  proliferasi  sel  normal  juga terlihat  pada  penggunaan  kemoterapi  [19], penghambatan  proliferasi  dan  penurunan kelangsungan  hidup  ini  dapat  dilihat  dengan menurunnya  ekspresi  HRAS  sebagai  salah satu  gen  yang  terlibat  dalam  pengaturan kelangsungan  hidup  sel  setelah  pemberian doxorubicin .  Secara empiris akar  pasak  bumi ( Eurycoma  longifolia, Jack)  dapat  berpotensi sebagai  antioksidan  radikal  bebas,  peningkat imunitas  serta  antikanker  [20].  Pemberian antioksidan  dapat  menyebabkan  aktivasi

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
Aktdan telah menunjukkan peningkatan aktivitas  Akt  sehingga  dapat  meningkatkan kelangsungan hidup sel dengan menghambat apoptosis  melalui  inaktivasi caspase -9  dan caspase -3 [15]. Fosforilasi
Akt
mempromosikan  HRAS  [16].  Protein  HRAS menghambat  aktivasi  nuklease  yang  memicu apoptosis dan mengarah langsung ke penurunan  yang  signifikan  dalam  kematian sel [21]. Ekspresi HRASdiharapkan meningkat  dengan  adanya  ekstrak  etanol akar pasak  bumi  ( Eurycoma  longifolia, Jack). Peningkatan  ekspresi  HRAS  menunjukkan semakin meningkatnya kemampuan sel untuk mempertahankan  kelangsungan  hidup  dan mencegah  terjadinya  apoptosis  pada  sel
normal  pada  tikus  sehat  yang  diberikan doxorubicin.
Ekspresi HRAS diamati setelah pemberian  ekstrak  etanol  akar  pasak  bumi dan doxorubicin menggunakan  mikroskop dengan  perbesaran  400x  yang  dilengkapi optilab. Pengamatan terhadap ekspresi HRAS dilakukan pada empat bidang pandang.  Persen  ekspresi  dihitung  dari jumlah  sel  yang  terekspresi  per  jumlah  sel seluruhnya dikali dengan  100%. Hasil pengamatan  ekspresi  HRAS  pada  jaringan hepar  setelah  diberi  perlakuan  dengan doxorubicin dan  ekstrak  etanol  akar  pasak bumi dapat dilihat pada Gambar 2 .
a) b)
Gambar 2. Kel.1 kontrol doxorubicin 4,67 mg/KgBB (a). Kel.5 perlakuan doxorubicin 4,67 mg/KgBB + eks. APB  200 mg/KgBB (b). Panah merah menunjukkan HRAS yang terekspresi, sedangkan panah hitam menunjukkan HRAS yang tidak terekspresi.
Gambar tersebut menunjukkan penurunan  ekspresi  HRAS  pada  perlakuan doxorubicin 4,67  mg/KgBB  +  eks.  Akar pasak bumi dosis 200 mg/KgBB dibandingkan dengan kelompok
doxorubicin .  Persen  rata-rata  ekspresi
HRAS  dari  tiap  kelompok  percobaan  efek esktrak  etanol  akar  pasak  bumi  terhadap ekspresi HRAS pada pemberiaan doxorubicin dapat  dilihat  pada  Tabel  1  dan Gambar 3.
Tabel 1.  Persen rata-rata ekspresi HRAS dari tiap kelompok percobaan hewan uji pada percobaan efek esktrak etanol akar pasak bumi terhadap ekspresi HRAS pada pemberian
doxorubicin Kelompok Rata-rata ekspresi HRAS ± SD (%) Kel.1 : Kelompok doxorubicin 4,67mg/KgBB 18,56 ± 1,85 Kel.2 : Kelompok ekstrak APB 200 mg/KgBB 7,58 ± 3,06 Kel.3 : Perlakuan doxorubicin 4,67 mg/KgBB + ekst. APB 50 mg/KgBB 17,80 ± 4,23 Kel.4 : Perlakuan doxorubicin 4,67 mg/KgBB + ekst. APB 100 mg/KgBB 16,70 ± 1,97 Kel.5 : Perlakuan doxorubicin 4,67 mg/KgBB + ekst. APB 200 mg/KgBB 10,43 ± 1,71 Kel.6 : Kontrol pelarut CMC –Na 6,76 ± 2,00 Kel.7 : Kontrol sehat 6,73 ± 1,52
Gambar 3. Diagram batang rata-rata ekspresi HRAS (%) pada tiap kelompok percobaan hewan uji pada percobaan efek esktrak etanol akar pasak bumi terhadap ekspresi HRAS pada pemberiaan doxorubicin.
Analisis  data  dilakukan  dengan  uji statistik  dari  persen  ekspresi  yang  diperoleh dari  masing-masing  perlakuan.  Pertama  kali
yang  dilakukan  adalah  menguji  normalitas dan homogenitas data dengan taraf kepercayaan  95%.  Untuk  uji  normalitas
0 5 10 15 20 kel.1 kel.2 kel.3 kel.4 kel.5 kel.6 kel.7 % rat a -r at a e k sp re si H R A S kelompok  perlakuan  hewan  uji % rata-rata ekspresi h-ras

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
digunakan Kolmogorof-Smirnov ,  sedangkan unutk  uji  homogenitas  digunakan  metode Lavene .  Tujuan  dari  dua  uji  tersebut  adalah untuk mengetahui apakah data yang diperoleh  terdistribusi  normal  atau  tidak  dan untuk  mengetahui  apakah  data  tersebut homogen  atau  tidak.  Apabila  data-data tersebut  terdistribusi  normal  dan  homogen langkah selanjutnya dianalisis dengan menggunakan  metode  statistika  parametrik dengan  menggunakan  uji  ANOVA.  Apabila data tersebut tidak terdistribusi secara normal atau  tidak  homogen  langkah  berikutnya adalah  data  dianalisis  dengan  menggunakan metode  statistik  non  parametrik  dengan  uji Kruskal-Walis dan  dilanjutkan  dengan  uji Mann  Whitney dengan  taraf  kepercayaan 95%.
Hasil uji normalitas dengan menggunakan  metode Kolmogorof-Smirnov diperoleh asymp.Sig 0,16  (p>0,05)  yang berarti  data  tersebut  terdistribusi  secara normal. Untuk uji homogenitas yang menggunakan  uji Lavene diperoleh  nilai asymp.Sig 0,00  (p<0,05)  yang  berarti  data tidak  homogen.  Dengan  demikian  data tersebut  termasuk  data  non  parametrik  yang selanjutnya  diuji  dengan  metode Kruskal- Walis untuk  melihat  apakah  ada  perbedaan antar  kelompok  dalam  percobaan  atau  tidak. Hasil dari uji ini diperoleh asymp.Sig sebesar 0,00  (p<0,05)  yang  menyatakan  bahwa terdapat  perbedaan  antar  kelompok  dalam percobaan.  Kemudian  dilanjutkan  dengan  uji Mann  Whitney untuk  melihat  dimana  letak perbedaannya. Hasil uji SPSS tersebut dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel  2.  Tabel  Ringkasan  hasil  analisis  uji  SPSS  dengan  taraf  kepercayaan  95%  dari  tiap kelompok  percobaan efek  esktrak  etanol  akar  pasak  bumi  terhadap ekspresi  HRAS pada pemberiaan doxorubicin
kelompok 2 3 4 5 6 7 1 S TS TS S S S 2 S S S TS TS 3 TS S S S 4 S S S 5 S S 6 TS Ket : S : Berbeda signifikan
TS : Tidak berbeda signifikan
Dari  data  pada  Gambar  3  dan  Tabel  2 terlihat  bahwa ekspresi  HRAS pada  kelompok doxorubicin mengalami peningkatan

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol  sehat dan  ekstrak  etanol  akar  pasak  bumi    dapat menurunkan ekspresi HRAS jika dibandingkan dengan  kelompok  kontrol doxorubicin .    Hasil ini  tidak  sesuai  dengan  yang  diperkirakan. Pada  kelompok  kontrol doxorubicin terlihat ekspresi  HRAS  yang  meningkat,  peningkatan ekspresi  HRAS  ini  diduga  karena  keterlibatan radikal bebas yang dihasilkan oleh doxorubicin .  ROS  bertindak  sebagai second messenger dan  dapatmempengaruhi  berbagai proses  seluler  termasuk  tanggapan  faktor pertumbuhan  dan  kelangsungan  hidup  sel. Hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 )  baru-baru  ini  telah ditunjukkan untuk mempromosikan kelangsungan  hidup  sel.  Aktivasi  RASdiatur oleh  produksi  superoksida  dan  hidrogen peroksida  [16].  Hidrogen  peroksida,terlibat dalam  aktivasi  membran  reseptor  kinase  [22]. Peningkatan HRAS ini menggambarkan pertahanan hidup sel sebagai respon terhadap stress  yang  disebabkan  oleh  pemberian doxorubicin pada tikus sehat.
Selanjutnya kelompok kontrol doxorubicin dibandingkan  dengan  kelompok perlakuan  ekstrak  etanol  akar  pasak  bumi dosis  200mg/KgBB  juga  menunjukkan adanya perbedaan  yang  signifikan  atau  berbeda bermakna. Data persen ekspresi menunjukkan ekspresi  HRAS  pada  kelompok  perlakuan dengan dosis 200mg/KgBB lebih kecil dibandingkan  dengan  kontrol doxorubicin
sehingga  dapat  dikatakan  bahwa  ekstrak etanol  akar  pasak  bumi  dengan  dosis  200 mg/kgBB  dapat  menurunkan  ekspresi  HRAS pada pemberian doxorubicin pada tikus sehat. Kelompok perlakuan dengan dosis 50 mg/KgBB  dan  100mg/KgBB  dibandingkan dengan  kelompok  kontrol doxorubicin tidak menunjukkan  perbedaan  yang  bermakna.  Hal ini menggambarkan bahwa ekstrak etanol akar pasak  bumi  dengan  dosis  50mg/KgBB  dan 100mg/KgBB  belum  mampu  meningkatkan ekspresi HRAS secara signifikan.  Begitu juga pada  kelompok  kontrol  pelarut  dan  kelompok kontrol sehat juga tidak menunjukkan perbedaan bermakna,  hal  ini  menggambarkan bahwa  pelarut  yang  digunakan  yaitu  CMC-Na tidak mempengaruhi sel dan tidak mempengaruhi efek ekstrak etanol akar pasak bumi. Kelompok yang diberikan ekstrak etanol akar  pasak  bumi  saja  dengan  dosis  200 mg/kgBB  menunjukkan  ekspresi  yang  tidak berbeda  signifikan  dengan  kelompok  kontrol pelarut  dan  kelompok  kontrol  sehat.    Hal  ini menggambarkan  bahwa  pemberian  ekstrak etanol  akar  pasak  bumi  pada  tikus  dalam keadaan sehat tidak begitu berpengaruh pada sel normal. Dalam percobaan ini ekstrak etanol akar pasak bumi berefek menurunkan ekspresi HRAS  pada  dosis  200  mg/kgBB  hanya  pada tikus  sehat  yang  diberi doxorubicin ,  yaitu karena  terjadinya  suatu  stress  terhadap  sel,

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
sedangkan  pada  sel  normal  sendiri  tidak berpengaruh.
Dengan  penurunan  ekspresi  HRAS  ini, dapat  dikatakan  bahwa  ekstrak  etanol  akar pasak bumi dengan dosis 200 mg/kgbb belum mampu meningkatkan kelangsungan hidup sel normal  dengan  mengurangi  efek  apoptosis dari doxorubicin terhadap  sel  normal.  Tetapi bahkan semakin memacu terjadinya apoptosis pada sel-sel normal. Peningkatan apoptosis ini selain  dilihat  dari  penurunan  ekspresi  HRAS, juga  didukung  dari  peningkatan  ekspresi caspase-3 [23]  dan caspase-9 [24]  pada pemberian  bersama doxorubicin dengan  akar pasak bumi ( Eurycoma longifolia, Jack),menunjukkan bahwa ekstrak etanol akar pasak  bumi  dengan  dosis  200  mg/kgBB semakin  meningkatkan  terjadinya  apoptosis (kematian sel) pada sel normal yang diberikan doxorubicin .  Hal  ini  dapat  dimungkinkan karena  adanya  beberapa  senyawa  yang terkandung  di  dalam  ekstrak  tersebut  dan salah  satunya  adalah  senyawa  alkaloid  yang bersifat  toksik  sehingga  menghambat  kerja enzim  yang  terlibat  dalam  metabolisme  lipid intraseluler  dan  mengakibatkan  kematian  sel (apoptosis)  [25].  Selain  itu  juga  adanya senyawa  kuasinoid  yaitu  eurikomanon  yang terkandung di dalam ekstrak etanol akar pasak bumi  yang  telah  diketahui  memacu  terjadinya apoptosis  pada  sel  kanker  (26)  dimungkinkan
juga dapat memacu terjadinya apoptosis pada sel normal.
Dengan  demikian,  dari  penelitian  ini dapat  disimpulkan  bahwa  ekstrak  etanol  akar pasak  bumi  pada  dosis  200  mg/kgbb  belum mampu  untuk  meningkatkan  kelangsungan hidup  sel  dengan  mengurangi  apoptosis  pada sel  normal  pada  penggunaan doxorubicin , karena ternyata ekspresi HRAS pada kombinasi doxorubicin dengan  ekstrak  etanol akar  pasak  bumi  dengan  dosis  200  mg/kgBB semakin  menurun  saat  diberikan  pada  tikus sehat.  Penghambatan  aktivitas  RAS  telah ditunjukkan untuk mengaktifkan respon apoptosis.  Ekstrak  etanol  akar  pasak  bumi dosis  200  mg/kgBB  semakin  meningkatkan terjadinya  apoptosis  pada  sel  normal  dengan parameter  penurunan  ekspresi  HRAS  dan peningkatan  ekspresi caspase -3  [23]    dan caspase-9 (24)    pada  sel  normal  yang  diberi doxorubicin .

## KESIMPULAN
Ekstrak etanol akar pasak bumi ( Eurycoma  longifolia ,  Jack)  pada  dosis  200 mg/kgBB  dapat  menurunkan  ekspresi  HRAS pada  tikus  sehat  yang  diberi  perlakuan doxorubicin .

## DAFTAR PUSTAKA

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
1.  Lewis, R.,  2003, Human  Genetics:
Concepts  and  Application ,  McGraw-Hill,
New York.
2.  Jacksonw,  T.  L.,  2003,  Intracellular Accumulation and Mechanism of Action of Doxorubicin  in  a  Spatio-temporal  Tumor Model, J. theor. Biol, 220: 201 –213.
3.  Yuan,  J.,  Chao,  Y.,  Lee,  W.P.,  Li,  C.P., Lee,  R.C.,  Chang,  F.Y.,  Yen,  S.H.,  Lee, S.D., and Whang-Peng, J., 2008, Chemotherapy with
etoposide, doxorubicin,  cisplatin,  5-fluorouracil,  and leucovorin  for  patients  with  advanced hepatocellular  carcinoma, Med  Oncol, 25:
201-6.
4.  Caroline, F., Thorna., Connie, O., Sharon, M.,  Tina,  H.,  Howard,  Mc.L.,Teri,  E.,
Kleina., and Russ, B.A., 2011, Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects, Pharmacogenet
Genomics, 21(7): 440-446.
5.  Wang,  S.,  Konorev,  E.  A.,  Kotamraju,  S., Joseph, J., Kalivendi, S., and Kalyanaraman,  B.,  2004,  Doxorubicin Induces  Apoptosis  in  Normal  and  Tumor Cells  via  Distinctly  Different  Mechanisms, Journal  of Biological  Chemistry, 279  :  24- 43
6.  Barbier,  J.,  Martin,  D.,  Danielle,  B.,
Gabriel, S., Lise, G., Pierre, de la Grange., and  Didier,  A.,  2007,  Regulation  of  H-ras Splice  Variant  Expression  by  Cross  Talk
between the p53 and Nonsense-Mediated mRNA  Decay  Pathways, Molecular  And Cellular  Biology ,  Vol.  27,  No.  20:  7315 –
7333.
7.  Wang,  G.,  Zhang,  J.,  Liu,  L.,  Sharma,  S., and Dong, Q., 2012, Quercetin Potentiates Doxorubicin  Mediated  Antitumor  Effects against  Liver  Cancer  through  p53/Bcl-xl,
PloS ONE 7(12): e51764. doi:10.1371/journal.pone.0051764.
8.  Putri,  H.,  Standie,  Nagadi.,  Yonika,  A.  L.,
Nindi, W., dan Adam, H., 2013, Cardioprotective and hepatoprotective effects  of  Citrus  hystrix  peels  extract  on rats  model, Asian  Pacific  Journal  of Tropical Biomedicine, 3(5): 371-375.
9.  Yagmurca,  M.,  and  O,  Bas.,  2007,
Protective effects of erdosteine on doxorubicin-induced hepatotoxicity  in  rats,
Archives  of  medical  research 38(4):  380- 385.
10. Wang,  G.,  Zhang,  J.,  Liu,  L.,  Sharma,  S., and Dong, Q., 2012, Quercetin Potentiates Doxorubicin  Mediated  Antitumor  Effects against  Liver  Cancer  through  p53/Bcl-xl,
PloS ONE 7(12): e51764. doi:10.1371/journal.pone.0051764. 11. Lisdawati., Vivi., 2007, Isolasi dan
Elusidasi  Struktur  Senyawa  Lignan  dan Asam  Lemak  dari  Ekstrak  Daging  Buah Phaleria Macrocarp, Bul. Penel.
Kesehatan, 35, 3: 115 – 124.

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
12. L.A.M. Siregar, C.L. Keng, B.P. Lim, J.
Plant Biotechnol. 2. 2003. 131.
13. Ang,  H.,  and  K.  Lee  .,  2002,  Effect  of Eurycoma  longifolia  on  libido  in  middle- aged  male  rats, Abstract  Journal  of  Basic Clinical  Physiology  Pharmacology ,  13(3):
249-254.
14. Panjaitan,  R.G.P.,  Wasmen,  M.,  Ekowati, H., and Chalrul., 2011 , Pengaruh pemberian  akar  pasak  bumi (Eurycoma longifolia Jack.)  pada  fungsi  hepar. Majalah  Farmasi  Indonesia,  22(1)15-20 2011. Fakultas Farmasi UGM.
15.  Volkova,  M.,  and  Raymond,  R.,  2011, Anthracycline  Cardiotoxicity:  Prevalence, Pathogenesis  and  Treatment, Current Cardiology Reviews , 7: 214-220.
16. Hole, P.S., Pearn, L., Tonks, A.J., James, P.E.,  Burnett,  A.K.,  Darley,  R.L.,  and Tonks,  A.,2010,  Ras-induced  reactive oxygen  species  promote  growth  factor- independent proliferation in human CD34+ hematopoietic  progenitor  cells, Blood,
115(6): 1238-46.
17. Notoatmodjo. 2012. Promosi Kesehatan dan Perilaku Kesehatan. Jakarta
18. Yang.,  J.,  Maity,  B.,  Huang,  J.,  Gao,  Z.,
Stewart, A., Weiss, R.M., Anderson, M.E., and Fisher, R.A., 2013, G-protein inactivator RGS6 mediates myocardial cell apoptosis  and  cardiomyopathy  caused  by doxorubicin, Cancer Res.
19. King,  R. J. B., 2000, Cancer  Biology , 2nd ed, Pearson Eduation Limited, London.
20. Ang, H., Y. Hitotsuyanagi, Fukaya, H., and Takeya,  K.,  2002,  Quassinoids  from Eurycoma longifolia . Phytochemistry,
59(8): 833-837.
21. Overmeyer,  J.H.,  and  Maltese,  W.A., 2011,  Death  pathways  triggered  by activated Ras in cancer cells, Front Biosci , 16: 1693-1713.
22. Droge, W., 2002,  The  plasma  redox  state and ageing, Division of Immunochemistry, German Cancer Research Center (DKFZ) ,
Volume 1(Issue 2): Pages 257-278.
23. Emelda.,  2013,  Efek  Ekstrak  Etanol  Akar Pasak  Bumi  ( E.longifolia Jack.)  Terhadap Ekspresi Caspase 3  pada  Organ  Hati
Tikus Galur SD yang Diberikan Doxorubicin , skripsi, Fakultas  Farmasi Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta.
24. Ningrum,  E.C., 2013, Efek  Ekstrak  Etanol Akar  Pasak  Bumi  ( Eurycoma  longifolia, Jack) Terhadap Ekspresi Caspase-9 Pada Organ  Hati  Tikus  Galur Sprague  Dawley
Yang Diberi Perlakuan Doxorubicin , Skripsi ,  Fakultas  Farmasi  universitas
Ahmad Dahlan, Yogyakarta.
25. Agungpriyono, D.R., Esti, R., dan Praptiwi, 2008,  Uji  Toksikopatologi  Hati  dan  Ginjal Mencit  pada  Pemberian  Ekstrak  Pauh Kijang ( Irvingia MalayanaOliv ex A. Benn),

## EFFECTS OFPASAK BUMI ROOTS(Eurycoma longifolia, Jack) EXTRACTS ETHANOLON THE EXPRESSION OF HRAS IN HEART ORGANS OF GALUR MICE Sprague Dawley ON GIVING DOXORUBICIN
Majalah  Farmasi  Indonesia ,  19(4):  172-
177.
26. Nurkhasanah  and  Azimahtol,  H.  L.  P.,
2007,  Apoptotic  cell  death  induced  by eurycomacone  ( Eurycoma  longifolia Jack) on human cervical carcinoma cells (HeLa), Proceeding  of  international  conference  on
chemical sciences(ICCS)
2007 ,
Yogyakarta, Indonesia.