EFEKTIFITAS MIKROSATELIT INRA-23 DAN INRA-32 SEBAGAI PENANDA GENETIK KERBAU ( Bubalus bubalis )

## Roisatul Ainiyah
Fakultas Pertanian Universitas Yudharta Pasuruan Email: ininn_uniquegirl@yahoo.com

## ABSTRAK
Penanda  molekuler  didefinisikan  sebagai  segmen  DNA  tertentu  yang  mewakili perbedaan  pada  tingkat  genom.  Mikrosatelit  adalah  salah  satu  penanda  genetik. Mikrosatelit  adalah  sekuen  DNA  yang  berulang,  dimana  satu  motif  mengandung  satu sampai  enam  pasang  basa  yang  diulang  secara  tandem  dalam  sejumlah  waktu.  Saat  ini banyak  sekali  penelitian  yang  dalam  prosesnya  melibatkan  Penanda  mikrosatelit. Informasi  tentang  keefektifan  dan  keinformatifan  suatu  mikrosatelit  sangat  dibutuhkan untuk membantu para peneliti dalam menentukan Penanda yang sesuai dengan kebutuhan penelitian  mereka.  Oleh  karena  itu  penelitian  bertujuan  untuk  mengetahui  tingkat efektifitas antara mikrosatelit INRA -23 dengan INRA-32.
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah darah kerbau, terdiri dari 16 sampel dari dua populasi kerbau yang berbeda. Penelitian laboratorium dilakukan dengan pendekatan  molekuler  analisis  DNA,  meliputi  kegiatan  isolasi  DNA,  elektroforesis agarosa,  PCR,  dan  elektroforesis  poliakrilamid  menggunakan  dua  macam  primer,  yaitu INRA-23,  dan  INRA-32.  Data  hasil  pengamatan  berupa  pita  ( band) DNA  dianalisis menggunakan GENEPOP ver3.1d option 3-1 dan 3-3.
Hasil  penelitian  menunjukkan  frekuensi  alel  pada  lokus  INRA-23  populasi  2 lebih tinggi dibanding populasi 1, sedangkan frekuensi alel pada lokus INRA-32 populasi 1 lebih tinggi daripada populasi 2. Rerata nilai heterozigositas populasi 1 yang diharapkan lebih  tinggi  (60%)  dibandingkan  dengan  nilai  heterozigositas  yang  teramati  (50%) (tingkat  heterozigositas  rendah).  Sedangkan,  rerata  nilai  heterozigositas  populasi 2  yang teramati lebih tinggi (62,5) dari pada nilai heterozigositas yang diharapkan (56%) (tingkat heterozigositas  tinggi).  nilai  polimorfisme  (PIC)  pada  populasi  1  (0,49%)  lebih  rendah dari  pada  populasi  2  (0,51%).  Dari  sini  dapat  dikatakan  bahwa  lokus  INRA-23  lebih informatif  dibanding    lokus  INRA-32.  Tetapi  selisih  nilai  polimorfisme  kedua  lokus tersebut tidak terlalu tinggi, sehingga keduanya merupakan lokus yang cukup informatif untuk digunakan.
Kata Kunci : Mikrosatelit, INRA-23, INRA-32 .

## PENDAHULUAN
Penanda molekuler didefinisikan  sebagai  segmen  DNA tertentu  yang  mewakili  perbedaan pada tingkat
genom.
DNA merupakan sumber informasi genetik
yang  potensial  dan  akurat.  Penanda molekuler  ini  memiliki  keuntungan
dibandingkan dengan penanda
morfologi,  yaitu  stabil  dan  dapat dideteksi  dalam  semua  jaringan organisme,  serta  tidak  dipengaruhi oleh lingkungan.
Penanda  DNA  yang  ideal memiliki  kriteria  sebagai  berikut:  a) memiliki  tingkat  polimorfisme  yang sedang sampai tinggi, b) terdistribusi merata diseluruh genom, c)
memberikan resolusi perbedaan genetik  yang  cukup,  d)  pewarisan bersifat kodominan (dapat membedakan  kondisi  homozigot  dan heterozigot dalam
organisme diploid),  e)  berprilaku  netral,  f) secara  teknik  sederhana,  cepat  dan murah,  g)  butuh  sedikit  jaringan  dan DNA  sampel,  h)  berkaitan  erat dengan fenotipe, i) tidak memerlukan informasi  tentang  genom  organisme. j)  data  mudah  dipertukarkan  antar laboratorium.  Tidak  ada  satu  jenis penanda  yang  dapat  memenuhi semua  kriteria  tersebut,  bagaimana pun juga kita dapat memilih diantara berbagai  penanda  yang  ada  dan
saling dikombinasikan
untuk
mencapai semua kriteria tersebut. Penanda mikrosatelit
memiliki  nama  lain  SSR  ( simple
sequence  repeats ), short  tandem repeat (STR), variable  number
tandem  repeat (VNTR)  dan simple sequence length polymorphism
( SSLP).  Mikrosatelit  adalah  sekuen
DNA  yang  berulang,  dimana  satu motif mengandung satu sampai enam pasang  basa  yang  diulang  secara tandem dalam sejumlah waktu
(Navascues  dan  Emerson  dalam
Zulfahmi 2013). Jika ulangan
tersebut  cukup  panjang  dan  tidak terpotong-potong ( uninterrupted ),
mereka sangat baik digunakan sebagai  penanda  genetik  karena tingkat  polimorfisme  mereka  yang tinggi  (Hancock  dalam  Zulfahmi 2013).
Saat ini banyak sekali
penelitian  yang  dalam  prosesnya melibatkan  Penanda  mikrosatelit. Informasi  tentang  keefektifan  dan keinformatifan  suatu  mikrosatelit sangat  dibutuhkan  untuk  membantu para  peneliti  dalam  menentukan Penanda yang sesuai dengan kebutuhan  penelitian  mereka.  Oleh karena itu penelitian bertujuan untuk mengetahui  tingkat  efektifitas  antara mikrosatelit INRA -23 dengan INRA-32.

## METODE PENELITIAN
Darah  kerbau  diambil  melalui vena  jugularis  di  leher  dengan menggunakan venoject dan  tabung vacum .  Tabung  yang  sudah  berisi darah kemudian diberi EDTA dengan perbandingan  antara  EDTA  dan sampel 1:5 agar darah tidak membeku.  Darah  yang  dicampur dengan EDTA kemudian diberi label yang berisi nomor sampel dan lokasi
diteliti yang individu jumlah
N lokus dalam i - ke alel jumlah A i - ke alel frekuensi f(A) : dimana 2n A f(A)     1998) (Hartl,
pengambilan sampel. Darah kemudian  disimpan  di  dalam  termos
es  pada  suhu  ±2 0 C  dan  selanjutnya disimpan  pada  lemari  es  untuk
dipergunakan dalam penelitian laboratorium. Sampel yang digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  darah  kerbau,  terdiri  dari  16
sampel  dari  dua  populasi  kerbau
yang berbeda. Penelitian laboratorium dilakukan dengan pendekatan
molekuler  analisis  DNA,  meliputi kegiatan  isolasi  DNA,  elektroforesis agarosa,  PCR,  dan  elektroforesis poliakrilamid menggunakan dua macam  primer,  yaitu  INRA-23,  dan INRA-32.  Kedua  penanda  tersebut memiliki karakteristik dijelaskan
pada Tabel 1.
Tabel 1 Karakteristik Primer Penanda Mikrosatelit INRA-23 dan INRA-32
INRA023 F 5’-GAG TAG AGC TAC AAG ATA AAC TTA-3’ R 5’-TAA  CTA CAG GGT GTT AGA TGA ACT C-3’ 56 0 C INRA032 F 5’-AAA CTG TAT TCT CTA ATA GCT AC-3’ R 5’-GCA AGA CAT ATC TCC ATT CCT TT-3’ 56 0 C Data hasil pengamatan berupa  pita  ( band) DNA  dianalisis menggunakan GENEPOP  ver3.1d
option 3-1 dan 3-3 . Selain
menggunakan GENEPOP , dapat pula dianalisis  secara  manual  dengan menggunakan  pita  ( band) DNA
produk  PCR  dengan  primer  yang ukurannya  ditentukan  berdasarkan jumlah pasangan basa (bp) dan dicari nilai  rata-rata,  kemudian  dari  hasil rata-rata  dideskripsikan  bagaimana gambaran pola DNA kerbau.
a. Menghitung Frekuensi Alel
Frekuensi alel setiap lokus, dapat dihitung dengan rumus:
2001) (Renwick, sampel individu jumlah n i - ke lokus alel frekuensi P(i) lokus sitas heterozigo h : dimana ) Pi (1 1 n n h K 1 k 2         2004) al, et (Meta alel jumlah k j - ke dan i - ke alel frekuensi Pj dan Pi : dimana Pj 2Pi Pi 1 PIC k 1 i k 1 i 2 2 2         
b. Menghitung Nilai Heterozigositas
Nilai heterozigositas dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut.
c. Menghitung Nilai Polimorfisme (PIC) dalam setiap lokus
Adapun rumusnya, yaitu:
HASIL PENELITIAN

## DAN

## PEMBAHASAN
1) Frekuensi Alel Analisis data frekuensi alel lokus
mikrosatelit  INRA-23  dan  INRA-32
pada populasi 1 dan populasi 2 dapat dilihat pada Tabel 2 berikut.

## Tabel 2. Frekuensi Alel Pada Kerbau Populasi 1 dan Populasi 2
Lokus Alel ( base pair) Populasi  1 Populasi 2 INRA-23 50 60 70 80 0,13 0,13 0,75 0,00 0,13 0,31 0,44 0,13 INRA-32 50 90 100 120 0,00 0,44 0,25 0,31 0,81 0,19 0,00 0,00
Dari  hasil  analisis  diketahui bahwa lokus INRA-23 dan INRA-32 yang  digunakan  pada  sampel  kerbau memiliki  4  alel.  Analisis  data frekuensi  alel  menunjukkan  pada
lokus  INRA-23  populasi  2  lebih
tinggi dibanding populasi 1.
Sedangkan  frekuensi  alel  pada  lokus INRA-32  populasi  1  lebih  tinggi daripada populasi 2.
2) Heterozigositas Perhitungan nilai heterozigositas  menggunakan  data frekuensi  alel  yang ada pada tabel  2. Hasil  perhitungan  disajikan  pada Tabel 3 berikut.
Tabel 3. Nilai Heterozigositas Setiap Populasi Kerbau
Lokus Populasi 1 Populasi 2 Obs. Het 1 Expc. Het 2 Obs. Het Expc. Het INRA-23 50% 46% 87,5% 77% INRA-32 50% 74% 37,5% 35% Rerata 50% 60% 62,5% 56% Keterangan:
1 Observed Heterozygosity (Heterozigositas yang Teramati)
2 Expected Heterozygosity (Heterozigositas yang Diharapkan) Analisis data nilai
heterozigositas  pada  kerbau  populasi 1 memiliki nilai heterozigositas yang teramati  masing-masing  lokus,  yakni 50%  dengan  nilai  rata-rata  50%.
Pada  kerbau  populasi  2  memiliki nilai  heterozigositas  yang  teramati 87,5%  dan  37,5%  pada  setiap  lokus dengan  nilai  rata-rata  lebih  tinggi dari  populasi  1,  yaitu  62,5%.  Rerata nilai  heterozigositas  populasi  1  yang diharapkan lebih tinggi dibandingkan dengan  nilai  heterozigositas  yang
teramati (tingkat heterozigositas rendah).  Sedangkan,  rerata  nilai heterozigositas  populasi  2  yang teramati  lebih  tinggi  dari  pada  nilai heterozigositas yang diharapkan
(tingkat heterozigositas tinggi). 3) Polymorphism Information Content (PIC)
Polimorfisme  dapat  diketahui dengan  menghitung  nilai  PIC.  Hasil perhitungan  nilai  PIC  disajikan  pada Tabel 4 berikut.

## Tabel 4. Nilai PIC Pada Setiap Populasi Kerbau
Lokus Populasi 1 Populasi 2 Rerata INRA-23 0,40 0,65 0,53 INRA-32 0,57 0,36 0,47 0,49 0,51
Berdasarkan  Tabel  4  diatas nilai PIC berada pada rentangan 0,36 sampai dengan 0,57. Pada populasi 1, nilai  PIC  tertinggi  pada  lokus INRA032. Pada populasi 2, nilai PIC
tertinggi  diperoleh  dari  lokus  INRA- 23.  Lokus  INRA-23  memiliki  nilai PIC lebih tinggi  yaitu 0.53 dari pada lokus  INRA-32  yaitu  sebesar  0,47. Nilai  polimorfik  (PIC)  menunjukkan
baha  tingkat  polimorfisme  lokus
INRA-23 (0,53%) lebih tinggi dibandingkan dengan INRA-32 (0,47%).  Dari  sini  dapat  dikatakan bahwa lokus INRA-23 lebih informatif  dibanding    lokus  INRA- 32.  Tetapi  selisih  nilai  polimorfisme kedua  lokus  tersebut  tidak  terlalu tinggi, sehingga keduanya merupakan lokus yang cukup
informatif untuk digunakan.
Sedangkan, nilai polimorfisme  (PIC)  pada  populasi  1 (0,49%)  lebih  rendah  dari  pada populasi 2 (0,51%). Hal ini
berbanding lurus dengan perhitungan
nilai  herozigositas.  Lestari  2013 mengungkapkan bahwa nilai heterozigositas akan selalu berbanding  lurus  dengan  nilai  PIC. Nilai informasi polimorfik
berbanding  lurus  dengan  jumlah  alel dalam  setiap  lokusnya,  semakin tinggi  jumlah  alel,  maka  nilai informasi  polimorfik    juga  semakin tinggi.  Tingginya  polimorfisme  dari suatu  populasi  bisa  diartikan  bahwa variasi  alel  serta  sifat  spesifik  dari populasi  juga  cukup  tinggi.  Lokus yang  polimorfik  menggambarkan adanya  heterozigositas  dalam  suatu individu (Riyanto 2010).

## KESIMPULAN
1. Ada perbedaan nilai frekuensi alel kerbau  pada  kedua  lokus  (INRA- 23 dan INRA-32). Variasi genetik kerbau  populasi  2  lebih  tinggi dibanding  populasi  1  pada  lokus INRA-23,  dan  variasi  genetik populasi  1  lebih  tinggi  dibanding populasi 2 pada lokus INRA-32.
2. Ada perbedaan tingkat heterozigositas pada kerbau
populasi  1 dan  kerbau  populasi 2. Kerbau  populasi 2 memiliki tingkat heterozigositas lebih tinggi
(62,5%) dibanding dengan kerbau
populasi 1 (50%).
3. Ada perbedaan tingkat
polimorfisme  pada  lokus  INRA- 23 dan INRA-31. Tingkat
polimorfisme lokus INRA-23
(0,53%)  lebih  tinggi  dibanding dengan  INRA-32  (0,47%).  Dari sini  dapat  dikatakan  bahwa  lokus
INRA-23 lebih informatif dibanding  lokus INRA-32.

## DAFTAR RUJUKAN
Anantyarta,  P.  2013.  Identifikasi
Variasi Genetik Kerbau (Bubalus bubalis) Pacitan dan Tuban  Berbasis  Mikrosatelit untuk Pengembangan Multimedia  pada  Matakuliah Teknik Analisis Biologi
Molekuler di Universitas Negeri  Malang.  Tesis  tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang. Borghese, A. 2005. Buffalo Production  and  Research. Roma:  Istituto  Sperimentale Per La Zootecnia. Dudi, 2007. Peningkatan Produktivitas Kerbau Lumpur (Swamp Buffalo) di Indonesia  melalui  Kegiatan Pemuliaan Ternak Berkelanjutan (Online), (http://www.google.com/url?s a=t&rct=j&q=&esrc=s&sourc e=web&cd=7&cad=rja&sqi=
2&ved=0CFAQFjAG&url=ht tp%3A%2F%2Fwww.nuffiel dbioethics.org%2Fsites%2Fd efault%2Ffiles%2FGM%252 0crops%2520%2520full%252 0report.pdf&ei=7WHjUejpL8
TwrQfl_YGoDw&usg=AFQj CNFJ_ezNEIF3D4bL4vIviH QFNmWKew&bvm=bv.4870 5608,d.bmk, diakses Juli 2013). Fatchiyah. 2011. Biologi Molekular - Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Penerbit Eelangga. Hasinah,  H.,  &  Handiwirawan,  E. 2010.  Keragaman  Genetik Ternak  Kerbau  di  Indonesia. Makalah disajikan dalam Lokakarya  Nasional  Usaha Ternak  Kerbau  Mendukung Program  Kecukupan  Daging Sapi. Bogor 2006. Hardjosubroto, W. 1994. Aplikasi Pemuliaan Ternak di Lapangan. Jakarta: Gramedia. Junitia, F. A.N. 2008. Studi Craniometrics Dan Pendugaan Jarak Genetik Kerbau  Sungai,  Rawa  Dan Silangannya Di Sumatera Utara. (online) (http://www.google.co.id/), diakses pada 01 Juli 2014. Juwita, S.A., & Anggraeni,  A. 2008. Karakterisasi  Morfologi  dan Estimasi Jarak Genetik Kerbau Rawa, Sungai (Murrah)  dan  Silangannya  di Sumatera  Utara.  Seminar  dan Lokakarya  Nasional  Usaha
Ternak Kerbau 2008. (online) (http://peternakan.litbang.dept an.go.id), diakses pada 01 Juli
2013.
Kabar  Lumajang.  2013.  Budaya
Kerapan  Kerbau  Belum  Jadi Perhatian Pemerintah Lumajang.  Kabar  Lumajang, (online),(www.kabarlumajang .net), diakses pada tanggal 09 Oktober 2013. Katalog BPS. 2013. Angka Sementara Hasil Sensus Pertanian  2013.  Badan  Pusat Statistik Kabupaten Lumajang. Leksono, A.S. 2013. Keanekaragaman  Hayati.  UB Press Lestari,  F.  2013.  Identifikasi  Variasi Genetik Kerbau (Bubalus bubalis) Lokal Sumatera Selatan  Berbasis  Mikrosatelit Sebagai Pengembangan Media Interaktif Untuk Pembelajaran Teknik Analisis Biologi Molekuler Di Universitas  Negeri  Malang.
Tesis tidak diterbitkan. Malang:  Universitas  Negeri Malang. Memo  Timur  Biro  Lumajang.  2013. Populasi  Kerbau  Lumajang Terbaik  se-Jatim.  Memo  Tiur Biro Lumajang, (online), (memobirolmj.blogspot.com),
diakses  pada  09  Oktober 2013.
Mirhabibi,  S.,  Manafiazar,  G.H.,
Qaravisi,  S.H.  &  Mahmoodi, B.  2007. Inbreeding  and  its effect  on  some  productive traits  in  buffaloes  of  South Iran . Journal Animal Science, Vol 06 (suppl, 2): 372-374.
Mufidah, N., Nur, I. M., & Nugroho, H. Tanpa Tahun . Produktivitas  Induk  Kerbau Rawa (Bubalus bubalis carabanesis)  Ditinjau  Dari Aspek  Kinerja  Reproduksi dan Ukuran Tubuh di Kecamatan Tempursari Kabupaten Lumajang . Fakultas Peternakan, Universitas Brawijaya. Murti,  2002. Ilmu  Ternak  Kerbau .
Yogyakarta: Kanisius.
Navani,  N.,  Jain,  P.K.,  Gupta,  S., Sisodia,  B.S.    &  Kumar,  S.
2001. A Set of cattle
microsatellite DNA Penandas for genome analysis of riverine buffalo (Bubalus bubalis) . Animal  Genetics , Vol 33: 149-154.
Puslitbangnak.  2013. Estimasi  Jarak Genetik  Kerbau  Rawa  Lokal Melalui  Pendekatan  Analisis Morfologi . (online), (http://peternakan.litbang. deptan.go.id) , diakses pada 01 Juli 2014. Riyanto.  2010. Identifikasi  Variasi Genetik  Kerbau  Lokal  Jawa Timur (Bubalus Bubalis) dari Wilayah yang Berbeda berbasis  Mikrosatelit  sebagai Pengembangan  Bahan  Ajar Mata  Kuliah  Genetika .  Tesis tidak diterbitkan.
Sadiman A., Rahardjo R., Haryno A.,
&  Rahardjito.    2008. Media
Pembelajaran. Jakarta:  PT.
Raja Grafindo Persada. Sensus Pertanian.  2013. Angka Sementara Hasil Sensus Pertanian  2013 .  Badan  Pusat Statistik Kabupaten Lumajang. Sukri,  A.  2011. Identifikasi  Variasi Genetik Kerbau Lokal (Bubalus  Bubalis)  Lombok Tengah Nusa Tenggara Barat,  Berbasis  Mikrosatelit sebagai  Bahan  Ajar  Mata Kuliah  Genetika .  Tesis  tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang.
Sulandari, S. & Zein, M.S.A.  2003.
Panduan Praktis
Laboratorium DNA. Bogor:
Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indoneia. Sutanto, Arif Dwi. 2013. Perancangan Aplikasi Edukasi  “Smart  Brain  Kids” Berbasis  Android  Sebagai Media  Pembelajaran  untuk Anak  Usia  Dini .  Naskah
Publikasi. Sekolah tinggi manajemen  informatika  dan komputer Amikom Yogyakarta. Thiagarajan,S.  Semmel,  D.  S  & Semmel, M. I. 1974. Instructional Development For  Trainingg  Teachers  Of Expectional Children . Indiana: Morana University. Tim Penyusun. 2011. Buku Petunjuk teknis Pelaksanaan Praktikum . Program Studi S1
Agribisnis FMIPA-UT.
Triwulaningsih,  E.  2008. Kerbau
Sumber  Daging  dan  Susu,
Mungkinkah?,
(Online), (http://www.pustaka- deptan.go.id/publikasi- wr274055.pdf,  diakses  10 Maret 2010). Winaya, A. 2008. Petunjuk Praktikum Bioteknologi Peternakan .  Malang:  Pusat Pengembangan  Bioteknologi, Universitas  Muhammadiyah
Malang.
Zulfahmi. 2013. Penanda DNA Untuk Analisis Genetik
Tanaman . Jurnal Agroteknologi. Vol. 3 No. 2 41-51.