ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 20 (1) (2017) : 37 – 41
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Pengaruh Garam Monovalen (NaCl dan KCl) dan Divalen (CaCl 2 dan MgCl 2 ) Terhadap Aktivitas Protease Ekstraseluler Bakteri Halofilik Isolat Bittern Tambak Garam Madura
Siti Anisa a , Nies Suci Mulyani a , Mukhammad Asy’ari a,*
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275
* Corresponding author: asyari@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o A b s t r a c t
Keywords: halophilic bacteria, halostable proteases, bittern,
monovalence and divalence salts
Halophilic bacteria grows and survives on the environment with high salinity value, for example is the bittern. Halophilic bacteria can produce enzymes which resist to salt, one of  the  enzyme  is  halostable  proteases.  The  halostable  proteases  can  be  used  to  waste degradation process on the saline area. This research is to get the extracellular proteases from halophilic bacteria isolated from bittern at Madura salt pond and to determine the effect of monovalence salts (NaCl and KCl) and divalence salts (CaCl 2 and MgCl 2 ) in activity and its profile activity of proteases halostable. Based on this experiment, it is found that protease halostable has the highest activity in the first fraction (0-20%) with the specific activity  about  220,83  unit/mg  of  protein.  The  present  of  salts  such  as  NaCl,  CaCl 2 and MgCl 2 increase the proteases activity, while KCl decreases the protease activity. The effect of salt addition to protease activity is increasing in KCl, NaCl, CaCl 2 , MgCl 2 respectively.

## A b s t r a k
Kata kunci: bakteri halofilik, protease halostabil,
bittern , garam monovalen dan divalen
Bakteri  halofilik  mampu  tumbuh  dan  bertahan  hidup  pada  lingkungan  dengan  kadar garam  tinggi,  seperti  dalam  air  pekatan  sisa  tambak  garam  ( bittern ).  Bakteri  halofilik dapat  menghasilkan  enzim  protease  yang  tahan  terhadap  garam  (halostabil).  Protease halostabil  dapat  dimanfaatkan  pada  proses  degradasi  limbah  pada  kawasan  yang mengandung garam. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh protease ekstraseluler bakteri halofilik isolat bittern tambak garam Madura dan menentukan pengaruh garam monovalen (NaCl  dan KCl)  dan  divalen (CaCl 2 dan  MgCl 2 )  terhadap  aktivitas  dan  profil aktivitas  protease  halostabil.  Berdasarkan  penelitian  diperoleh  protease  halostabil memiliki  aktivitas  spesifik  tertinggi  pada  fraksi  1  (0-20%)  sebesar  220,83  Unit/mg protein. Pengaruh garam NaCl, CaCl 2 dan MgCl 2 akan cenderung meningkatkan aktivitas proteasenya  sebaliknya  KCl  akan  menurunkan  aktivitas  protease.  Profil  pengaruh penambahan  garam  terhadap  aktivitas  protease  semakin  meningkat  sesuai  dengan urutan KCl. NaCl, CaCl 2 , MgCl 2 .

## 1. Pendahuluan
Bakteri  halofilik  merupakan  jenis  bakteri  yang membutuhkan  konsentrasi garam  tinggi  untuk  tumbuh dan  bertahan  hidup  [1].  Salah  satu  habitat  bakteri halofilik  adalah  di  dalam  pekatan  air  garam  yang  biasa disebut bittern [2, 3]. Bakteri ini mampu menghasilkan
enzim  hidrolitik  yang  salah  satunya  adalah  protease. Protease berfungsi mengkatalisis reaksi hidrolisis ikatan peptida  protein  menjadi  oligopeptida  dan  asam  -  asam amino [4]. Protease halostabil dapat dimanfaatkan pada degradasi  limbah  pada  kawasan  yang  mengandung garam [1].
Penelitian  sebelumnya  telah  berhasil  mengisolasi dan  mengkarakterisasi  protease  bakteri  halofilik- alkalofilik  dari  habitat  yang  mengandung  kadar  garam sedang  di  wilayah  Coastral  Gujarat,  India.  Bakteri halofilik-alkalofilik ditumbuhkan pada media Enrichment  Halophile  Broth (EHB)  dengan  konsentrasi NaCl  10%  [3].  Norberg  dan  Hofsten  [5]  juga  berhasil mengisolasi  protease  dari Halobacterium  Salinarum  sp hasil fermentasi saus ikan yang ditumbuhkan pada media M73 dengan menggunakan substrat azokasein.
Aktivitas  protease  halostabil  dipengaruhi  oleh beberapa faktor, salah satunya adalah adanya garam [6, 7]. Kation dari garam akan mempertahankan kestabilan struktur protease halostabil. Penstabilan struktur protein terjadi  melalui  ikatan  antara  kation  garam  dengan muatan-muatan  negatif  pada  permukaan  protein  [1]. Selain  itu,  adanya  kation  juga  dapat  memberikan  efek perlindungan  ( shielding  effect )  protein  terhadap pengaruh  kondisi  lingkungannya  [1].  Pada  konsentrasi garam  NaCl  (3,4  M),  CaCl 2 (100  mM)  dan  MgCl 2 (1mM) dapat meningkatkan aktivitas protease serin ekstraseluler  dari  bakteri Halogeometricum  borinquense strain TSS101 sebesar 100%, 121%, dan 62% [8]. Kation- kation lain yang diketahui dapat mempengaruhi aktivitas enzim  adalah  K + ,  Rb + ,  Cs + ,  Zn 2+ ,  Hg 2+ ,  Mn 2+ ,  Ba 2+ ,  Cu 2+ , Fe 2+ ,  Co 2+ ,  dan  Ni 2+ [8].  Pada  umumnya  ion-ion ditambahkan dalam bentuk garamnya.
Berdasarkan  terdahulu  diketahui  bahwa  kestabilan enzim  bakteri  halofilik  dipengaruhi  oleh  jenis  dan konsentrasi garamnya [1, 8].  Sehingga dalam penelitian ini  perlu  dilakukan  penentuan  pengaruh  jenis  garam yaitu garam monovalen (NaCl dan KCl) dan divalen (CaCl 2 dan  MgCl 2 )  terhadap  aktivitas  dan  profil  aktivitas protease  ekstraseluler  bakteri  halofilik  isolat bittern tambak garam Madura.

## 2. Metode Penelitian
Sampel  stok  bakteri  halofilik  koloni  tunggal  isolat bittern tambak garam Madura.

## Pembuatan Artificial Sea Water (ASW)
Sebanyak 2,4 g NaCl; 1,1g MgCl 2. 6H 2 O; 0,2 g Na 2 SO 4 ; 0,07 g KCl; 0,02 g NaHCO 3 ; 0,01 g KBr; 4,0 mg SrCl 2 .6H 2 O; 0,5  mg Na 2 SiO 3 .9H 2 O ; 0,3 mg NaF  kemudian  diencerkan kedalam 100 mL aquades
Pembuatan Media Halophile Synthetic Broth (HSB)
Sebanyak  1  g  glukosa;  0,5  g  tripton;  0,5  g  ekstrak ragi; 0,5 g NaHPO 4 ; 10 g NaCl; 10 mL ASW dan diencerkan kedalam 100 mL aquades kemudian di autoklaf.
Peremajaan  Isolat  Bakteri  Halofilik  pada  Media Enrichment Halophile Broth (EHB)
Proses peremajaan dilakukan terhadap stok bakteri halofilik  isolat bittern tambak  garam  Madura.  Bakteri koloni  tunggal  tersebut  ditumbuhkan  pada  media Enrichment  Halophile  Broth (EHB)  agar  diperoleh  kultur bakteri pada kondisi yang aktif. Pada media ini terdapat bittern  untuk  pengkondisian  lingkungan  alamiah  dari bakteri halofilik yaitu pada kadar garam tinggi. Selain itu juga diberikan bahan  tambahan sebagai  nutrien  seperti
glukosa,  tripton,  ekstrak  ragi,  KH2PO4,  dan  NaCl  10% yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri. Penginkubasian  dilakukan selama 24 jam pada 250 rpm dan  37 O C.  Kekeruhan  pada  media  menunjukkan  adanya pertumbuhan bakteri.
Adaptasi bakteri pada media Halophile Synthetic Broth (HSB)
Sebanyak  10  μL  stok  bakteri  halofilik  hasil peremajaan pada media EHB ditumbuhkan ke dalam 100 mL media HSB [9]. Penginkubasian dilakukan pada 250 rpm dan temperatur 37 O C selama 24 jam. Kekeruhan pada media  menunjukkan  adanya  pertumbuhan  bakteri halofilik.

## Uji morfologi dan pewarnaan gram
Sebanyak  2-3  tetes  kultur  bakteri  halofilik diteteskan di atas slide mikroskop yang sudah disterilkan dengan  alkohol.  Slide  kemudian  dikeringkan  dengan melewatkan  di  atas  api  dan  mengangin-anginkannya sehingga diperoleh preparat. Sebanyak 2-3 tetes larutan kristal  ungu  ditambahkan  ke  dalam  preparat  dan diamkan selama 1 menit. Preparat dicuci dengan akuades dan diangin-anginkan sampai kering. Tambahkan 1 tetes reagen gram’s iodin dan diamkan selama 1 menit. Setelah itu  preparat  dicuci  dengan  akuades  dan  dikeringkan. Larutan  alkohol-aseton  ditambahkan  sebanyak  2  tetes. Setelah pendiaman 2-3 menit preparat dibilas dengan air kemudian  ditambahkan  1  tetes  safranin  dan  diamkan selama  30  detik.  Pengamatan  morfologi  menggunakan mikroskop dengan perbesaran 1500x [10].

## Produksi, Isolasi dan Pemurnian Protease Halostabil
Sebanyak  200  μL  kultur  hasil  peremajaan diinokulasikan  ke  dalam  1  L  media  HSB dan  diinkubasi dalam  shaker  inkubator  pada  250  rpm,  37 O C  selama  32 jam  dan  penambahan  induser  kasein  setelah  12  jam. Kemudian  diisolasi  enzim  ekstraselulernya.  Enzim ekstraseluler  kemudian  dimurnikan  dengan  fraksinasi amonium  sulfat  bertingkat  dan  dilanjutkan  dengan dialisis.

## Uji aktivitas enzim

## Penentuan aktivitas protease
Untuk larutan sampel, sebanyak 2,25 mL bufer fosfat 0,05  mM  pH  8  ditambahkan  aquades  0,625  mL  dan dicampurkan  dengan  0,125  mL  larutan  azokasein  2%, kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37 O C selama  5  menit dalam shaker  water  bath inkubator ,  kemudian ditambahkan  0,5  mL  larutan  enzim,  dan  diinkubasi kembali  pada  kondisi  optimum  yaitu  37 O C  selama  30 menit  dalam shaker  water  bath  inkubator .  Setelah  itu ditambahkan 1,5 mL larutan TCA 10%. Campuran dikocok dan didiamkan didalam air es. Untuk larutan blanko (t 0 ), sebanyak  2,25  mL  Bufer  fosfat  0,05  mM  pH  8 ditambahkan  dengan  aquades  0,625  mL  dicampurkan dengan  0,125  mL  larutan  azokasein  2%,  kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit dalam shaker water bath inkubator , setelah itu ditambahkan 1,5 mL TCA 10%  dan  0,5  mL  larutan  enzim  yang  sudah  dimatikan dengan  cara  pemanasan.  Campuran  dikocok dan didiamkan  didalam  es.  Larutan  blanko  dan  larutan
sampel  disentrifus  pada  6000  rpm  selama  30  menit. Masing-masing  supernatan  diukur  absorbansinya  pada 440 nm [11, 12].
Pengaruh garam NaCl, KCl, CaCl 2 , dan MgCl 2 terhadap aktivitas protease
Penambahan  larutan  garam  NaCl,  KCl,  CaCl 2 ,  dan MgCl 2 dengan  variasi  konsentrasi  0,7; 1,4;  2,1;  2,8  mM. Setelah itu dilakukan pengukuran aktivitas pada sampel dan blankonya.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Adaptasi Bakteri Halofilik pada Media Halophile Synthetic Broth (HSB)
Bakteri halofilik  koloni  tunggal dari bittern tambak garam  Madura  ditumbuhkan  pada  media Enrichment Halophile Broth (EHB) agar diperoleh kultur bakteri pada kondisi  yang  aktif  kemudian  diadaptasikan  pada  media Halophile  Shynthetic  Broth (HSB).  Komposisi  media  HSB dibuat  mirip  dengan  media  EHB.  Namun  pada  media HSB,  digunakan artificial  sea  water (ASW)  sebagai pengganti bittern . Komposisi mineral yang terkandung di dalamnya dibuat mirip seperti komposisi bittern .
Proses  adaptasi  pertumbuhan  bakteri  halofilik dilakukan  secara  bertahap  sampai  semua bittern dalam media  dapat  digantikan  dengan  ASW.  Keberhasilan pertumbuhan bakteri  pada media HSB ditunjukkan oleh adanya  kekeruhan  pada  media.  Bakteri  yang  tumbuh selanjutnya dilakukan uji morfologi dan pewarnaan gram [13, 14], untuk memastikan bahwa bakteri yang tumbuh pada media HSB sama dengan bakteri halofilik stok awal. Berdasarkan  penelitian  diperoleh  bakteri  halofilik berbentuk kokus dan bersifat gram negatif sama dengan bakteri stok awal.

## Produksi Enzim Protease halostabil
Produksi  enzim  protease  dari  bakteri  halofilik dilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri halofilik pada  media  HSB  kemudian  diinkubasi  selama  32  jam sesuai dengan kurva pertumbuhan bakteri halofilik dan ditambahkan  induser  kasein  setelah  inkubasi  24  jam. Protease  diisolasi  dengan  cara  disentrifugasi  dengan kecepatan 6000 rpm selama 30 menit. Kemudian diambil supernatannya  yang  merupakan  enzim  ekstrak  kasar yang selanjutnya dilakukan proses pemurnian protease.

## Pemurnian Protease Halostabil
Pemurnian enzim dilakukan dengan cara fraksinasi amonium  sulfat  bertingkat  dilanjutkan  dengan dialisis.Enzim ekstrak kasar yang diperoleh dimurnikan dengan  mengendapkan  protein  menggunakan  garam amonium  sulfat  dengan  tingkat  kejenuhan  berbeda untuk  memisahkan  protein  enzim  dari  protein  lainnya sehingga diperoleh fraksi-fraksi protein [15, 16]. Cara ini berdasarkan  prinsip salting  out .  Proses  pemurnian berikutnya  adalah  dialisis  menggunakan  membran selofan  dengan  perbedaan  konsentrasi  bufer  fosfat  di luar  dan  di  dalam  membran  0,05x10 -2 M  dan  0,05M hingga semua garam amonium sulfat terbebaskan.

## Penentuan Unit Aktivitas dan Aktivitas Spesifik Protease halostabil
Protease  halostabil  hasil  isolasi  ditentukan aktivitasnya  dengan  mereaksikan  enzim  tersebut menggunakan  substrat  azokasein.  Penentuan  aktivitas protease  halostabil  dilakukan  melalui  identifikasi bertambahnya  produk  hasil  hidrolisis  azokasein. Degradasi dari azokasein akan membebaskan warna yang terikat  pada  azokasein  sehingga  dapat  diukur absorbansinya  dengan  spektrofotometer  UV-Vis  pada pajang  gelombang  440nm.  Satu  unit  aktivitas didefinisikan  sebagai  sejumlah  enzim  yang  dibutuhkan untuk menghidrolisis azokasein sehingga menghasilkan perubahan absorbansi sebesar 1% per mL pada panjang gelombang  440  nm  pada  kondisi  percobaan  [12]. Kemudian  ditentukan  kadar  protein  pada  tiap  fraksi dengan metode Lowry dan dihitung aktivitas spesifiknya.
Tabel 1 hasil uji aktivitas dan aktivitas spesifik protease
Fraksi enzim Aktivitas enzim (unit/mL) Kadar protein (mg/mL) Aktivitas spesifik (Unit/mg protein) (EK) 4,5 0,080 56,25 F 1 5,3 0,024 220,83 F 2 6,3 0,070 90,57 F 3 4,7 0,106 44,34 F 4 4,1 0,100 41,00 F 5 4,2 0,069 60,87
Berdasarkan  tabel  1,  aktivitas  spesifik  tertinggi protease halostabil pada fraksi F1 (0-20%) sebesar 209,2 unit/mg  protein.  Hal  ini  menunjukan  bahwa  komposisi protease pada F1 lebih tinggi dibandingkan fraksi enzim yang lain.

## Pengaruh Garam Terhadap Aktivitas Protease Halostabil
Penentuan  pengaruh  garam  terhadap  aktivitas protease  halostabil  dilakukan  dengan  menentukan aktivitas  protease  dengan  penambahan  berbagai  garam dengan  variasi  konsentrasi  tertentu,  kemudian dibandingkan dengan aktivitas protease halostabil tanpa penambahan garam (kontrol). Garam yang ditambahkan yaitu garam monovalen NaCl dan KCl dan garam divalen MgCl 2 dan CaCl 2 dengan variasi konsentrasi 0,7 mM; 1,4 mM; 2,1 mM, dan 2,8 mM.

## Pengaruh penambahan garam monovalen NaCl dan KCl terhadap aktivitas protease halostabil
NaCl  dan  KCl  merupakan  garam  monovalen  yang kationnya  mempunyai  muatan  +1.  Kation  pada  garam akan  berikatan  dengan  gugus-gugus  asam  (muatan negatif) pada permukaan enzim sehingga struktur enzim menjadi  lebih  stabil  dan  akan  berpengaruh  terhadap aktivitasnya. Garam NaCl dan KCl memberikan pengaruh yang berbeda terhadap aktivitas protease halostabil. Pada konsentrasi  yang  sama,  NaCl  cenderung  meningkatkan aktivitas  protease  halostabil  sedangkan  KCl  akan menurunkan aktivitas (Gambar 1).
Penurunan  aktivitas  protease  halostabil  pada penambahan  K + ini  dikarenakan  ikatan  antara  muatan negatif pada permukaan enzim dengan ion K + lebih lemah dibandingkan ikatan dengan ion Na + . Hal ini dikarenakan tarikan muatan inti dari K + lebih lemah sehingga ikatan antara K + dengan anion lebih mudah lepas. Jari-jari ion K + yang besar juga menyebabkan ukuran ion K + semakin besar  sehingga  berpengaruh  pada  banyaknya  muatan negatif  yang  mampu  dinetralkan  oleh  kation  tersebut. Pada konsentrasi garam yang sama, muatan negatif pada permukaan protease halostabil yang dinetralkan oleh ion K + lebih  sedikit  (dibandingkan  oleh  ion  Na + ),  sehingga struktur  menjadi  kurang  stabil  dan  aktivitasnya menurun.
Gambar 1 Profil pengaruh penambahan garam monovalen NaCl dan KCl terhadap aktivitas protease halostabil.
Pengaruh penambahan garam divalen CaCl 2 dan MgCl 2 terhadap aktivitas protease halostabil
Garam  divalen:  CaCl 2 dan  MgCl 2 memiliki  muatan positif  lebih  banyak  daripada  monovalen.  Berdasarkan hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  penambahan garam  divalen  dapat  meningkatkan  aktivitas  protease halostabil dan mencapai  konsentrasi  optimum  pada  2,1 mM (Gambar 2).
Gambar 2 Profil pengaruh penambahan CaCl 2 dan MgCl 2 terhadap aktivitas protease halostabil
Pada konsentrasi yang sama, garam monovalen dan divalen  memiliki  profil  aktivitas  relatif  yang  mirip. Keunikan  terjadi  pada  penambahan  garam  MgCl 2 yaitu dapat  meningkatkan  aktivitas  protease  lebih  tinggi dibandingkan  CaCl 2 .  Hal  ini  dikarenakan  ikatan  antara ion  Mg 2+ dengan  muatan  negatif  pada  permukaan protease  lebih  kuat  dibandingkan  dengan  ion  Ca 2+ .  Ion Mg 2+ mempunyai  jari-jari  ion  lebih  kecil  daripada  Ca 2+ sehingga tarikan muatan intinya lebih kuat. Sebaliknya, ikatan  ion  Ca 2+ dengan  muatan  negatif  permukaan protease lebih lemah sehingga akan menyebabkan ikatan lebih  mudah  lepas  dan  membuat  struktur  protease menjadi kurang stabil.
Pengaruh penambahan garam monovalen (NaCl dan KCl), dan garam divalen (CaCl 2 dan MgCl 2 ) terhadap aktivitas protease halostabil
Pengaruh  penambahan  garam  monovalen  dan divalen  dengan  berbagai  konsentrasi  secara  umum memperlihatkan  profil  aktivitas  yang  sama  terhadap kontrol (Gambar 3). Penambahan garam NaCl, CaCl 2 dan MgCl 2 menunjukkan profil aktivitas protease meningkat, sedangkan KCl profil aktivitasnya menurun. Peningkatan aktivitas paling tinggi pada penambahan MgCl 2 .
Gambar 3 Profil pengaruh penambahan berbagai garam terhadap aktivitas protease
Garam  monovalen  NaCl  dan  KCl  memiliki  muatan kation  lebih  sedikit  dibandingkan  garam  divalen  CaCl 2 dan MgCl 2 sehingga pada konsentrasi yang sama, anion pada  permukaan  enzim  yang  ternetralkan  oleh  ion  Na + maupun  ion  K + akan  lebih  sedikit.  Konsentrasi  garam untuk uji aktivitas adalah 0,7 - 2,8 mM yang didasarkan pada rentang konsentrasi optimal CaCl 2 dan MgCl 2 .
Pengaruh  variasi  konsentrasi  NaCl  terhadap aktivitas protease menunjukkan profil yang linear. yaitu dengan semakin tinggi konsentrasi NaCl semakin tinggi pula aktivitasnya. Perbedaan linearitas profil [konsentrasi  garam-aktivitas]  antara  garam  NaCl,  KCl, MgCl 2 dan  CaCl 2 menunjukkan  bahwa  pola  adaptasi protease  halostabil  terhadap  NaCl  lebih  baik  daripada garam  lainnya.  Hal  ini  diprediksi  berkaitan  dengan kondisi  alami  dari  bakteri  halofilik  yang  mampu  hidup pada konsentrasi garam NaCl tinggi.

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan  penelitian  yang  dilakukan,  diperoleh protease ekstraseluler dari bakteri halofilik isolat bittern tambak garam Madura memiliki aktivitas spesifik 220,83 unit/mg  protein  pada  fraksi  1  (0-20%).  Pengaruh penambahan  garam  NaCl,  CaCl 2 ,  dan  MgCl 2 dapat meningkatkan  aktivitas  protease  halostabil,  sedangkan penambahan  KCl  cenderung  menurunkan  aktivitas protease  halostabil.  Profil  aktivitas  protease  halostabil semakin  meningkat  sesuai  dengan  urutan  KCl.  NaCl, CaCl 2 , MgCl 2 .

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Aharon  Oren,  Halophilic  Microorganisms  and  their Environments,  Springer  Science  &  Business  Media, 2002.
[2]  Shiladitya  DasSarma,  Priya  DasSarma,  Halophiles, in: Encyclopedia of Life Science, Wiley, 2006.
[3]  Mital S. Dodia, Rupal H. Joshi, Rajesh K. Patel, Satya P.  Singh,  Characterization  and  stability  of extracellular alkaline proteases from halophilic and alkaliphilic  bacteria  isolated  from  saline  habitat  of coastal  Gujarat,  India,  Brazilian  Journal  of Microbiology, 37, (2006) 276-282 http://dx.doi.org/10.1590/S1517- 83822006000300015
[4]  Neil  D.  Rawlings,  Protease  Families,  Evolution  and Mechanism of Action, in: K. Brix, W. Stöcker (Eds.) Proteases: Structure and Function, Springer Vienna, Vienna, 2013, pp. 1-36.
[5]  P. Norberg, B. V. Hofsten, Proteolytic Enzymes from Extremely  Halophilic  Bacteria,  Microbiology,  55,  2, (1969) 251-256
http://dx.doi.org/10.1099/00221287-55-2-251
[6]  Janos  K.  Lanyi,  Salt-dependent  properties  of proteins  from  extremely  halophilic  bacteria, Bacteriological Reviews, 38, 3, (1974) 272-290
[7]  Janos  K.  Lanyi,  Joann  Stevenson,  Studies  of  the Electron  Transport  Chain  of  Extremely  Halophilic Bacteria:  IV.  Role  of  Hydrophobic  Forces  in  The Structure  of  Menadione  Reductase,  Journal  of Biological Chemistry, 245, 16, (1970) 4074-4080
[8]  Malashetty Vidyasagar, S Prakash, Carol Litchfield, K Sreeramulu,  Purification  and  characterization  of  a thermostable,  haloalkaliphilic  extracellular  serine protease  from  the  extreme  halophilic  archaeon Halogeometricum  borinquense  strain  TSS101,
Archaea, 2, 1, (2006) 51-57
[9]  Ronald M. Atlas, Richard Bartha, Microbial Ecology: Fundamentals and Applications, 3 ed.,
Benjamin/Cummings Publishing Company, 1993.
[10] John  P.  Harley,  Lansing  M.  Prescott,  Laboratory Exercises in Microbiology, 5 ed., McGraw-Hill, 2001.
[11]  Werasit  Kanlayakrit,  Preeyanuch  Bovornreungroj, Takuji  Oka,  Masatoshi  Goto,  Production  and characterization  of  protease  from  an  extremely halophilic  Halobacterium  sp.  PB407,  Kasetsart Journal: Natural Science, 38, 5, (2004) 15-20
[12] J.  Charney,  R.  M.  Tomarelli,  A  colonmetric  method for  the  determination  of  the  proteolytic  activity  of duodenal juice, Journal of Biological Chemistry, 171,
(1947) 501-505
[13] Terry J. Beveridge, Structures of Gram-Negative Cell Walls and Their Derived Membrane Vesicles, Journal of Bacteriology, 181, 16, (1999) 4725-4733
[14] R. McClelland, Gram's stain: the key to microbiology, MLO Med Lab Obs, 33, 4, (2001) 20-22, 25-28; quiz 30-21
[15] Clive Dennison, A Guide to Protein Isolation, Kluwer Academic Publishers, 1999.
[16] Tim  Bugg,  Introduction  to  Enzyme  and  Coenzyme Chemistry, John Wiley & Sons, 2004.