ISSN: 1410-8917 Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (3) (2010) : 80 – 87

## Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi
Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Studi Filogeni dan Uji Potensi Enzim Ekstraseluler (amilase, β - galaktosidase, protease, katalase) Isolat Alicyclobacillus sp . Gedong Songo
Mahreta suhartanti a , Purbowatiningrum Ria Sarjono a* , Agustina L. N. Aminin a
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275
* Corresponding author: purbowatining@live.undip.ac.id Art ic le   Info Ab s t rac t Keywords: thermophilic bacteria,
Alicyclobacillus sp ., Extracellular enzym
Previous research on Gedong Songo hot springs has isolated 5 isolates of Alicyclobacillus sp . which were ATSae10, ANBae10, AYTae7, AYTae31 and AYTae33 with growth conditions of 55°C and pH 4. The purpose of this study was  to obtain the phylogeny tree and obtain information  about  extracellular  enzyme  potential  of  three  isolates Alicyclobacillus  sp . including  amylase, β -galactosidase,  proteases  and  catalase.  The  construction  of phylogeny  trees  was  performed  using  Phylip  3.68  ed  program  with  parsimony  method. Extracellular  enzyme  potential  test  of Alicyclobacillus  sp .  was  conducted  qualitatively. Amylase activity test used starch as substrate, β -galactosidase activity test used ONPG as substrate and on protease test used gelatin as substrate. The catalase test was carried out qualitatively  by observing the presence of O 2 bubbles generated by the catalase activity. The  results  showed  that  all  three  isolates  of Alicyclobacillus  sp .  (AYTae7,  AYTae31  and AYTae33) were in one kinship group and have the closest kinship level to Alicyclobacillus sp .  KI, Alicyclobacillus  sp .  T127, Alicyclobacillus  acidocaldarius strains  DSM  454  and uncultured bacterium clone351. The three isolates of Alicyclobacillus sp . has thermostable enzyme extracellular amylase and β -galactosidase.

## Ab s t rak
Kata kunci:
Bakteri termofilik, Alicyclobacillus sp .,
enzim ekstraseluler
Penelitian  terdahulu  pada  sumber  air  panas  Gedong  Songo,  telah  diisolasi  5  isolat Alicyclobacillus  sp .  yaitu:  ATSae10,  ANBae10,  AYTae7,  AYTae31  dan  AYTae33  dengan kondisi  pertumbuhan  55°C  dan  pH  4.  Tujuan  penelitian  ini  yaitu  untuk  mendapatkan pohon filogeni dan mendapatkan informasi mengenai potensi enzim ekstraseluler ketiga isolat Alicyclobacillus sp .  yang  meliputi  amilase, β -galaktosidase, protease  dan  katalase. Konstruksi  pohon  filogeni  dilakukan  menggunakan  program  Phylip  3.68  ed  dengan metode  parsimony.  Uji  potensi  enzim  ekstraseluler  isolat Alicyclobacillus  sp .  dilakukan secara kualitatif. Uji aktifitas amilase menggunakan amilum sebagai substrat, uji aktifitas β -galaktosidase  menggunakan  ONPG  sebagai  substrat  dan  pada  uji  protease menggunakan  gelatin  sebagai  substrat.  Uji  katalase  dilakukan  secara  kualitatif  dengan melihat  adanya  gelembung  O 2 yang  dihasilkan  oleh  aktifitas  katalase.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp .  (AYTae7,  AYTae31  dan  AYTae33) berada dalam satu kelompok kekerabatan dan mempunyai tingkat kekerabatan terdekat dengan Alicyclobacillus sp . KI, Alicyclobacillus sp . T127, Alicyclobacillus acidocaldarius strain DSM  454  dan  Uncultured  bacterium  clone351.  Ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp .  memiliki enzim termostabil ekstraseluler amilase dan β -galaktosidase.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (3) (2010) : 80 – 87 81

## 1. Pendahuluan
Mikroorganisme termofilik merupakan
mikroorganisme  yang  tahan  terhadap  suhu  tinggi dengan suhu optimum pertumbuhan mencapai lebih dari 60°C [1]. Mikroorganisme termofilik dapat diisolasi dari sumber  air  panas  seperti Bacillus  thermocatenulatus dengan suhu optimum antara 40-70°C [2], Alicyclobacillus dan Geobacillus dengan  suhu  optimum 55°C [3].
Telah  diketahui  bahwa  lebih  dari  99%  bakteri  di alam  belum  dikultivasi  [4].  Keragaman  bakteri  yang belum  dikultivasi  menunjukkan  kelompok  gen  yang sangat  luas  untuk  eksploitasi  bioteknologi  dan merupakan  sebuah  kesempatan  yang  sangat  besar  bagi ilmu  mikrobiologi  untuk  mempelajari  hubungan filogenetik dan arti ekologi.
Enzim  termostabil  adalah  enzim  yang  stabil  dan aktif pada suhu yang lebih tinggi dari pada suhu optimum untuk  pertumbuhan  mikroorganisme  yaitu  40°C  [5]. Enzim  termostabil yang  telah  digunakan  antara  lain α - amilase  yang  dapat  menghidrolisis  pati  (amilum), protease yang biasa digunakan dalam deterjen [6] dan β - galaktosidase  yang  berfungsi  untuk  mengurangi  kadar laktosa  dalam  susu  serta  katalase  yang  berfungsi menguraikan  hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 )  menjadi molekul  oksigen  (O 2 )  dan  air  (H 2 O).  Enzim-enzim termostabil  saat  ini  sedang  mendapat  perhatian  besar, karena  enzim-enzim  ini  sangat  cocok  untuk  proses- proses  industri  yang  memerlukan  suhu  tinggi. Penggunaan  enzim  termostabil  pada  beberapa  aplikasi sangat  efektif  dan  menguntungkan  misalnya  pada proses-proses  yang  menggunakan  suhu  tinggi, peningkatan  kecepatan  reaksi,  dan  mengurangi kontaminasi  mikroba-mikroba  mesofilik.  Kemajuan dalam  bidang  bioteknologi  memungkinkan  semakin meluasnya  penggunaan  enzim  termostabil  dalam berbagai  produk  komersil  dan  industri  di  Indonesia  [7]. Namun,  kebutuhan  terhadap  enzim  termostabil hampir 100% masih bergantung pada produk impor [8].
Berdasarkan  penelitian  [9]  pada  sumber  air  panas Gedong  Songo  telah  diisolasi  5  isolat Alicyclobacillus  sp. yaitu Alicyclobacillus  sp. AYTae-7, Alicyclobacillus  sp. AYTae-31, Alicyclobacillus sp. AYTae-33, Alicyclobacillus sp. ATSae-10 dan Alicyclobacillus sp. ANBae-10. Kelima isolat tersebut telah ditentukan urutan nukleotidanya dari gen 16S  rRNA  dan  telah  dimasukkan  dalam database Genebank ,  namun  belum  diketahui  konstruksi  pohon filogeni dan potensi ekstraseluler enzimnya.
Penelitian  ini  merupakan  kelanjutan  identifikasi bakteri  termofilik  sumber  air  panas  Gedong  Songo  [9]. Pada penelitian ini dilakukan studi filogeni bakteri isolat Alicyclobacillus sp. AYTae7, AYTae31 dan AYTae33 Gedong Songo.  Dilakukan  pula  uji  potensi  ekstraseluler  enzim meliputi  amilase,  ß-galaktosidase,  protease  dan katalase.

## 2. Metode

## Bahan dan Cara Kerja
Bahan. isolat  bakteri  termofilik Alicyclobacillus  sp . AYTae7,  31  dan  33;  media  DSMZ  261  pH  4;  media  agar; larutan H 2 O 2 0,5N; HCl 2N; NaOH 2N; etanol 70%; gelatin; laktosa; pati amilum dan akuades.
Alat. inkubator  (Memmert  model  300),  pH  meter, alat  pendingin,  botol  semprot,  alat-alat  kultur  sel, Spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu), autoklaf (Clinical Autoclave  Prestige  Medical  series  2100),  mikroskop, erlenmeyer, gelas beker, tabung reaksi, labu ukur, botol vial, corong kaca, mikropipet, pipet  tetes, kertas  saring dan pengaduk.

## Konstruksi Pohon Filogeni
Konstruksi  pohon  filogeni  menggunakan  urutan nukleotida  gen  16S  rRNA  isolat Alicyclobacillus  sp. yang didapat  dari database  Genebank. Urutan  nukleotida tersebut  kemudian  dianalisis  dan  dibandingkan  dengan data  dalam Genebank menggunakan  program  BLAST  N pada website National  centre of  Biotechnologi  Information (NCBI),  sehingga  diperoleh  100  spesies  bakteri  yang memiliki  tingkat  kekerabatan  yang  dekat  (Lampiran  C). Dilakukan  edit  data  urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA terhadap  ke  seratus  bakteri  tersebut  dengan  cara mengambil subject dan  menghapus query pada  data penjajaran  nukleotida  untuk  masing-masing  spesies bakteri  dan meng-copy pada  notepad.  Selanjutnya dilakukan  penjajaran  urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA dari isolat Alicyclobacillus sp. dan bakteri lainnya dengan program  Clustal  W  sehingga  dihasilkan  4  data output dengan  format  '.aln',  '.msf',  '.dnd'  dan  '.phy'. Output dengan format '.phy digunakan untuk tahap selanjutnya. Konstruksi pohon filogeni terhadap isolat Alicyclobacillus sp. dilakukan  dengan  program  Phylip (Phylogeny Inferense  Package) 3.68  ed.  Pada  paket  program  phylip, dipilih  program  seqboot,  DNApars  dan  consense.  Hasil penjajaran  Clustal  W  dengan  program  '.phy'  dijadikan data input pada  program  seqboot,  output  dari  program seqboot menjadi input pada program DNApars dan output dari  DNApars  menjadi input pada  program  consense. Output dari  program  consense  berupa  data newick dimasukkan pada phylodendron secara online , sehingga didapatkan pohon filogeni.

## Peremajaan Bakteri
DSMZ  261  pH  4  (Deutsche  Sammlung  von Mikroorganismen  und  Zellkulturen)  tersusun  dari komposisi  (per  liter)  sebagai  berikut:  4,5  gram Na 2 HPO 4 .2H 2 O;  1,5  gram  KH 2 PO 4. 2H 2 O;  1,0  gram  NH 4 Cl; 0,01 gram MnSO 4 .H 2 O; 0,2 gram MgSO 4 .7H 2 O; 0,01 gram CaCl 2 .2H 2 O; 5,0 mg FeCl 3 .6H 2 O dan 3,0 mL trace element solution SL-6  (0,1  gram  ZnSO 4 .7H 2 O;  0,03  gram MnCl 2 .4H 2 O; 0,3 gram H 3 BO 3 ; 0,2 gram CoCl 2 .6H 2 O; 0,01 gram  CuCl 2 .2H 2 O,  0,02  gram  NiCl 2 .6H 2 O  dan  0,03  gram Na 2 MoO 4 .2H 2 O). Media DSMZ 261 tersebut dibuat dengan pH  4.  Media  cair  ini  disterilisasi  dengan  menggunakan autoklaf selama 20 menit. Media cair ini digunakan untuk peremajaan  isolat  bakteri.  Isolat  Bakteri  murni  diambil dengan menggunakan jarum ose kemudian
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (3) (2010) : 80 – 87
diinokulasikan  kedalam  100mL  media  DSMZ  261  dan diinkubasi pada suhu 55°C selama 24 jam.

## Uji Pewarnaan gram
Pewarnaan  gram  dilakukan  dengan  menambahkan pewarna  gram  secara  bertahap.  Kaca  preparat  yang digunakan  dibersihkan  dengan  alkohol  kemudian dipanaskan di dekat nyala api. Selanjutnya isolat bakteri diambil dengan menggunakan mikropipet dan diratakan pada  kaca  preparat,  kemudian  dipanaskan  di  dekat  api sambil  digoyang-goyangkan  hingga  isolat  kering.  Pada saat  pemanasan  diusahakan  agar  api  tidak  terkena langsung, setelah itu isolat bakteri ditetesi dengan kristal ungu, didiamkan selama 1 menit, dicuci dengan akuades dan  dikeringkan  dengan  cara  diangin-anginkan.  Hasil pewarnaan kristal ungu ditetesi iodin, didiamkan selama 1  menit,  dicuci  dengan  akuades  dan  dikeringkan.  Hasil pewarnaan iodin ditetesi dengan decolorize agent (etanol absolut),  didiamkan  selama  30  detik,  dicuci  dengan akuades  dan  dikeringkan.  Langkah  terakhir,  hasil  yang diperoleh  dari  pewarnaan  dengan decolorize  agent ditetesi  dengan  safranin  kemudian  dicuci  dengan akuades.  Setelah  itu  dikeringkan  dan  hasilnya  diamati dengan mikroskop.

## Uji Aktivitas Enzim Amilase Secara Kualitatif
Uji amilase dilakukan dengan membuat media DSMZ 261 (pH 4) padat yang mengandung pati kanji. Sebanyak 30  mL  media  dituang  ke  dalam  cawan  Petri  dan didiamkan  hingga  memadat,  kemudian  isolat  bakteri diteteskan  pada  media,  lalu  diinkubasi  pada  suhu  55°C selama  48  jam.  Kemudian  cawan  digenangi  dengan larutan lugol (1 g kristal iodin, 2 g KI, 300 mL akuabides) dan  didiamkan  sekitar  1  menit  agar  iodin  bereaksi. Adanya  daerah  tak  berwarna  di  sekitar  koloni menunjukkan aktivitas enzim amilase.
Uji Aktivitas Enzim β -Galaktosidase Secara Kualitatif
Isolat  bakteri  murni  di  ambil  dengan  menggunakn mikro  pipet  kemudian  diinokulasikan  kedalam  media cair DSMZ 261 (pH 4) yang mengandung 1% laktosa dan diinkubasi  pada  suhu  55°C  selama  24  jam,  kemudian inokulum ditambah dengan larutan ONPG dan diinkubasi selama 3-5 jam. Adanya β -Galaktosidase ditandai dengan perubahan warna yaitu menjadi berwarna kuning.

## Uji Aktivitas Enzim Protease Secara Kualitatif
Uji  protease  dilakukan  dengan  menghidrolisis gelatin. Bakteri yang diuji diinokulasikan ke dalam media DSMZ  261  (pH  4)  yang  ditambah  dengan  gelatin kemudian  diinkubasi  pada  55°C  selama  24  jam  hingga media sedikit keruh, setelah itu media disimpan di dalam lemari  es  selama  15  menit.  Apabila  media  tetap  cair menunjukkan  adanya  hidrolisis  gelatin  oleh  bakteri sedangkan  bila  media  me  memadat  maka  tidak  terjadi hidrolisis gelatin oleh bakteri.

## Uji Aktivitas Enzim Katalase Secara Kualitatif
Isolat  bakteri  yang  telah  diremajakan  diambil dengan menggunakan mikro pipet kemudian diinokulasikan  ke  dalam  media  DSMZ  261  (pH  4)  untuk mendapatkan stater. Media tersebut diinkubasi pada 55°
C hingga keruh. Media yang telah keruh diteteskan pada kaca preparat kemudian ditetesi H 2 O 2. Aktivitas katalase pada  mikroba  dapat  diketahui  dengan  terbentuknya gelembung-gelembung gas O 2 .

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Studi Filogeni
Hubungan  kekerabatan  isolat Alicyclobacillus  sp . dengan  bakteri  lain  dilakukan  dengan  pembandingan urutan  nukleotida data  base  Gen  Bank menggunakan program  Blast-N.  Berdasarkan  hasil  pembandingan Blast-N dari data Gene Bank dengan urutan DNA gen 16S rRNA,  terdapat  100  spesies  bakteri  yang  memiliki kemiripan  91-98%  dengan  ketiga  isolat Alicyclobacillus sp.. 100  spesies  bakteri  tersebut  terdiri  dari  84  spesies Alicyclobacillus, 8 spesies Bacillus dan 8 spesies uncultured bacterium .
Studi  filogeni  dilakukan  untuk  mengetahui  tingkat kekerabatan  dari  ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp. ,  yaitu AYTae-7,  AYTae-31  dan  AYTae-33  khas  Gedong  Songo. Analisis  filogenetik  ini  didasarkan  pada  sekuen  parsial gen  16S  rRNA  yang  merupakan  penanda  molekuler dengan  fungsi  yang  identik  pada  seluruh  organisme. Molekul  16S  rRNA  mempunyai  beberapa  daerah  yang memiliki  urutan  basa  yang  relatif  konservatif  dan beberapa  daerah  urutan  basanya  variatif.  Perbandingan urutan  basa  yang  konservatif berguna  untuk mengkonstruksi  pohon  filogenetik  universal  karena mengalami perubahan relatif lambat dan mencerminkan kronologi  evolusi  bumi.  Sebaliknya,  urutan  basa  yang bersifat  variatif  dapat  digunakan  untuk  melacak keragaman  dan  menempatkan  galur-galur  dalam  satu spesies [10].
Penjajaran  urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA  dari ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp. dilakukan  dengan program Clustal W.Data hasil penjajaran diketahui bahwa pada  penjajaran  urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA  dari ketiga Alicyclobacillus  sp. terdapat  delesi  dan  substitusi. Delesi  terjadi  pada  awal  dan  akhir  dari  data  penjajaran gen  16S  rRNA,  delesi  terbanyak  ditemukan  pada  awal penjajaran.  Delesi  merupakan  pengurangan  satu  atau lebih  pasangan  nukleotida  pada  suatu  gen.  Substitusi adalah  perubahan  urutan  nukleotida  pada  suatu  gen. Substitusi  terjadi  pada  awal  dan  tengah  dari  data penjajaran  gen  16S  rRNA,  substitusi  terbanyak ditemukan  pada  awal  penjajaran.  Delesi  dan  substitusi spesifik tersebut menunjukkan bahwa ketiga Alicyclobacillus  sp. mempunyai  perbedaan  antar  ketiga spesies  bakteri  tersebut,  yang  menunjukkan  bahwa bakteri  Gedong  Songo  adalah  khas.  Dari  data  tersebut bisa  dilihat  bahwa Alicyclobacillus  sp. AYTae-7  mirip dengan Alicyclobacillus sp. AYTae-31.
Konstruksi  pohon  filogeni  dilakukan  dengan program  Phylip  ( Phylogeny  Inference  Package )  3,68  ed dengan metode parsimony , dan dihasilkan pohon filogeni yang  menunjukkan  kekerabatan  dari  ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp. dengan  97  spesies  bakteri  lainnya. Pohon  filogeni  dari  100  bakteri  diambil  20  bakteri terdekat  untuk  dibuat  pohon  filogeni  lagi  seperti  pada gambar 1.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (3) (2010) : 80 – 87
Berdasarkan  gambar 1 dapat diketahui  bahwa  ketiga isolat Alicyclobacillus sp . Gedong Songo berada dalam satu kelompok kekerabatan yang dekat. Kedekatan kekerabatan  tersebut  menunjukkan  kemiripan  sifat  pada ketiga isolat Alicyclobacillus sp ., dibuktikan dengan adanya kemiripan  data  potensi  enzim  ekstraseluler  dari  ketiga isolat Alicyclobacillus  sp .  yang  telah  didapatkan  pada penelitian ini.
Spesies  lain  yang  memiliki  tingkat  kekerabatan yang  dekat  dengan  ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp. adalah Alicyclobacillus_sp._K1  dan  A-sp-T127 yang ditemukan  oleh  Stoot  (NCBI.
Accession  Number AM749794, AM749785 2009), Alicyclobacillus_acidocaldarius_DSM454
yang ditemukan  oleh  Goto,K.,  Mochido,K.M.,  Asahara,M., Suzuki,M  dan  Yokota,A  (NCBI. Accession  Number AB059665, 2009).
Gambar 1. Pohon filogeni 20 bakteri terdekat dengan warna merah=AYTae7, 31, 33 dan warna biru merupakan bakteri terdekat
Berdasarkan  potensi  spesies  bakteri  yang mempunyai kekerabatan yang dekat dengan Alicyclobacillus_sp. Gedong  Songo,  maka  potensi  lain dari Alicyclobacillus_sp. dapat  ditelusuri.  Bakteri  yang mempunyai  hubungan  kekerabatan  yang  dekat, diperkirakan sifat-sifat dari mikroorganisme tersebut relatif sama, sehingga kemungkinan memiliki potensi yang  sama  pula.  Selain  itu  dapat  pula  diketahui mikroorganisme  alternatif  untuk  masing-masing isolat dalam pemanfaatannya. Pada penelitian ini akan dieksplorasi  lebih  lanjut  potensi  enzim  ekstraseluler terhadap  amilase, β -galaktosidase,  katalase  dan protease.

## Peremajaan Isolat Bakteri Alicyclobacillus
Hasil peremajaan bakteri ditunjukkan pada gambar 2. Pada gambar 2 dapat dilihat bahwa isolat bakteri telah tumbuh.  Hal  ini  ditandai  dengan  keruhnya  media  yang telah ditambahkan bakteri setelah diinkubasi, sedangkan kontrol  negatif  tetap  bening  sebelum  maupun  sesudah inkubasi.  Tahap  peremajaan  isolat Alicyclobacillus  sp. bertujuan untuk mendapatkan isolat bakteri Alicyclobacillus  sp. yang  lebih  muda  dan  produktif sehingga aktivitas yang dilakukan lebih optimal.
Gambar 2. Hasil peremajaan bakteri AYTae-33
Tiga isolat Alicyclobacillus sp. Gedong Songo meliputi Alicyclobacillus AYTae-7, Alicyclobacillus AYTae-31,  dan Alicyclobacillus AYTae-33 diambil dengan mikro pipet dan diinokulasikan ke dalam media cair DSMZ 261 dengan pH 4,  yaitu  pH  optimum Alicyclobacillus  sp. [11].  Media  cair akan  memberikan  ruang  gerak  yang  lebih  leluasa  pada bekteri  untuk  mendapatkan  nutrisinya.  Nutrisi  yang ditambahkan  pada  media  DSMZ  261  pada  AYTae-7, AYTae-31,  AYTae-33  adalah  Nutrient  Yeast  Tripton/YT (yeast  ekstrak  dan  tripton).  Nutrisi  tersebut  digunakan bakteri sebagai sumber karbon, nitrogen dan enzim [11].
Media  yang  telah  ditanami Alicyclobacillus  sp. diinkubasi  pada  suhu  55°C,  yaitu  suhu  optimum  yang digunakan  untuk  menginkubasi Alicyclobacillus  sp. hasil isolasinya [9], setelah diinkubasi selama  48 jam, media yang telah ditanami bakteri berubah menjadi keruh, hal ini membuktikan bahwa kedelapan isolat Alicyclobacillus sp. telah tumbuh pada media DSMZ 261 yang baru.

## Hasil Pengamatan Morfologi dan Pewarnaan Gram
Bakteri  koloni  tunggal  yang  telah  diperoleh  dari hasil  peremajaan,  kemudian  diamati  bentuk  morfologi dan  sifat  gramnya.  Pada  uji  ini Alicyclobacillus AYTae-7, AYTae-31  dan  AYTae-33  berbentuk  batang  dan merupakan bakteri gram positif karena berwarna ungu.
A B C
Gambar 3. Hasil uji morfologi dan pewarnaan gram A: AYTae7, B: AYTae31, C: Aytae33
Pada  gambar  3  di  atas,  dapat  terlihat  bahwa  isolat bakteri  yang  digunakan  merupakan  bakteri  dengan bentuk  batang  (basil)  dan  gram  positif.  Hal  ini  ditandai dengan  pembentukan  warna  ungu  pada  bakteri  setelah penambahan  safranin.  Pewarnaan  awal  dengan  kristal violet akan mewarnai baik bakteri gram positif maupun negatif.  Ion  CV + berinteraksi  dengan  muatan  negatif komponen sel bakteri dan memberikan warna ungu. Pada
Kontrol - AYTae33
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (3) (2010) : 80 – 87
saat penambahan iodin terjadi interaksi antara iodin dan kristal  violet  membentuk  komplek  besar  kristal  violet- iodin.  Dekolorisasi  dengan  campuran  alkohol-aseton akan melarutkan lipid dan membran luar sel bakteri gram negatif. Alkohol akan berinteraksi dengan lipid membran sel. Sel gram negatif akan kehilangan membran luarnya dan  lapisan  peptidoglikan  terbuka.  Lapisan  tipis peptidoglikan pada dinding sel bakteri gram negatif tidak mampu mempertahankan komplek violet-iodin sehingga akan tampak berwarna merah [12]. Pada bakteri gram positif akan berwarna ungu karena sel bakteri gram positif  menjadi  terdehidrasi  oleh  penambahan  alkohol, pori-pori  akan  menutup  dan  dinding  sel  akan  menciut selama dehidrasi. Komplek kristal violet-iodin terperangkap di dalam sel oleh multilayer peptidoglikan dinding sel dan tidak terdekolorisasi.
Hasil Uji Aktivitas Enzim β -Galaktosidase Secara Kualitatif
Hasil uji kualitatif enzim β -Galaktosidase ekstraseluler  yang  telah  dilakukan  menunjukkan  ada perubahan  warna  dari  kuning  pucat  menjadi  kuning terang. Hal ini dapat dilihat pada gambar 4 membuktikan bahwa  ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp. menghasilkan enzim β -Galaktosidase ekstraseluler.
E. coli AYTae7 AYTae31 Kontrol-
Gambar 4. Hasil uji enzim β -Galaktosidase ekstraseluler pada Alicyclobacillus sp. AYTae7 dan AYTae31
Untuk  meyakinkan  uji  kualitatif  yang  telah dilakukan, maka digunakan E.coli sebagai kontrol positif. Bakteri E.coli digunakan  sebagai  kontrol  positif,  karena E.coli dapat  menghasilkan  enzim β -Galaktosidase  [13- 15].
Uji  kualitatif  enzim β -Galaktosidase  ekstraseluler bertujuan  untuk  mengetahui  kemampuan  ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp. Gedong  Songo  dalam  menghasilkan enzim β -Galaktosidase  ekstraseluler.  Uji  ini  dilakukan dengan cara menumbuhkan tiga isolat Alicyclobacillus sp. dalam  media  DSMZ  261  cair  yang  mengandung  1% laktosa.  Laktosa  yang  ditambahkan  tersebut  berfungsi
sebagai  induser  [16].  Keberadaan  dari  enzim β - Galaktosidase  dapat  diketahui  dengan  menggunakan ONPG (o-nitrofenol- β -D-Galaktosidase) sebagai substrat. Substrat ONPG ditambahkan pada ketiga media yang  telah  ditumbuhi  isolat Alicyclobacillus  sp. setelah media  sedikit  keruh,  menandakan  bahwa  bakteri  telah tumbuh [17]. Ganbar 4 di atas menunjukkan bahwa ketiga isolat Alicyclobacillus  sp. menghasilkan  enzim β - Galaktosidase. Hal ini ditandai dengan warna ONP yang terbentuk  semakin  terang.  Ini  berarti  menandakan bahwa  terjadi  aktivitas  enzim β -Galaktosidase  yang menghidrolisis  ONPG  menjadi  ONP  dan  galaktosa  pada media Alicyclobacillus  sp. tersebut,yang  menyebabkan perubahan warna pada media menjadi kuning terang.

## Hasil Uji Aktivitas Enzim Protease Secara Kualitatif
Hasil uji kualitatif enzim protease ekstraseluler yang telah dilakukan menunjukkan hasil yang negatif. Hal ini ditunjukkan  pada  gambar  5  dari  masing-masing  media DSMZ  261-gelatin  memadat  setelah  pendinginan (tabung  A,  B,  C),  begitu  juga  media  DSMZ  261-gelatin yang  tidak  ditumbuhi  isolat Alicyclobacillus  sp. menjadi beku  (tabung  D).  Hal  ini  berbanding  terbalik  dengan kontrol  positif  (tabung  E)  yang  tetap  cair  ketika didinginkan dalam lemari es.
Uji kualitatif enzim protease ekstraseluler bertujuan untuk mengetahui potensi ketiga isolat Alicyclobacillus sp. dalam menghasilkan enzim protease ekstraseluler. Uji ini dilakukan  dengan  cara  menumbuhkan  ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp. pada  media  DSMZ  261  cair  yang mengandung  gelatin.  Ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp. yang  telah  diremajakan  diinokulasikan  ke  dalam  media DSMZ  261  yang  ditambah  dengan  gelatin  kemudian diinkubasi  pada  55°C  selama  24  jam.  Setelah  24  jam media  menjadi  sedikit  keruh.  Hal  ini  disebabkan  isolat Alicyclobacillus  sp. telah  tumbuh  pada  media  tersebut. Setelah  itu  masing-masing  media  disimpan  di  dalam lemari es selama 15 menit [18].
Gelatin  merupakan  protein  yang  diperoleh  dari hidrolisis kalogen yang secara alami terdapat pada tulang atau  kulit  binatang.  Gelatin  meleleh  bila  dipanaskan, namun  akan  segera  menjadi  padat  lagi  apabila didinginkan.  Bila  bercampur  dengan  air,  gelatin  akan membentuk  larutan  dengan  viskositas  tinggi  yang  juga akan menjadi padat (gel) bila mendingin . Dengan adanya protease,  gelatin  akan  terurai  menjadi  asam-asam aminonya  karena  ikatan  peptida  pada  gelatin  terputus yang  menyebabkan  gelatin  terdegradasi.  Efek  dari degradasi  gelatin  adalah  gelatin  tidak  memadat  pada proses  pendinginan.  Gelatin  pada  media  berfungsi sebagai  induser  yang  memicu bakteri  mengeluarkan enzim  protease.  Apabila  enzim  berpotensi  protease, maka  dengan  keberadan  gelatin  dalam  media pertumbuhan  akan  menginduksi  bakteri  untuk mengeluarkan enzim protease [19].
Gambar 5. A= AYTae-7, B=AYTae-31, C=AYTae-33, D=Kontrol negatif, E=Kontrol Positif
Dari  gambar  5  dapat  diketahui  bahwa  gelatin  pada media  DSMZ  261  tidak  terhidrolisis  menjadi  asam amino-asam amino penyusunnya, yaitu asam amino non esensial  (glisin  dan  prolin)  [19].  Oleh  sebab  itu  media yang telah ditumbuhi isolat Alicyclobacillus sp . membeku setelah  pendinginan  sebab,  ikatan  peptida  pada  gelatin tidak  terputus  sehingga  tidak  menyebabkan  gelatin terdegradasi.  Hal  ini  membuktikan  bahwa  tidak  terjadi aktivitas  protease  pada  ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp . pada media tersebut.

## Hasil Uji Aktivitas Enzim Amilase Secara Kualitatif
Hasil penelitian gambar 6 menunjukkan disekeliling ketiga isolat Alicyclobacillus sp. terdapat zona bening yang menandakan  terdapat  enzim  amilase.  Hal  ini menunjukkan bahwa amilum yang  terdapat pada media disekitar  isolat Alicyclobacillus  sp. telah  terhidrolisis menjadi monosakaridanya, yaitu glukosa [20].
Uji kualitatif enzim amilase ekstraseluler bertujuan untuk mengetahui kemampuan ketiga isolat Alicyclobacillus sp. yaitu  AYTae-7, AYTae-31  dan  AYTae- 33  Gedong  Songo  dalam  menghasilkan  enzim  amilase ekstraseluler.  Uji  ini  dilakukan  dengan  cara  membuat media DSMZ 261 padat yang mengandung 1% pati kanji dan menumbuhkan isolat bakteri Alicyclobacillus sp. pada media tersebut. Pati kanji yang ditambahkan pada media padat  tersebut  berperan  sebagai  substrat  yang  dapat diuraikan oleh enzim amilase.
Media  DSMZ  261  padat  dibuat  dengan  cara menambahkan  bakto  agar  dan  pati  kanji  pada  media DSMZ 261 cair, dan diautoklaf untuk mensterilkan media tersebut.  Media  yang  telah  steril  dituang  pada  cawan petri  sebagai  tempat  tumbuhnya  bakteri.  Setelah  media memadat,  isolat Alicyclobacillus  sp. yang  telah diremajakan  ditanam  pada  media  tersebut  kemudian diinkubasi  pada  suhu  55°C,  yaitu  suhu  optimum pertumbuhan Alicyclobacillus sp. [3] .
Setelah  48  jam, bagian  media  padat  yang  ditanami ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp. terlihat  keruh.  Hal  ini
menunjukkan bahwa ketiga isolat Alicyclobacillus sp. telah tumbuh  pada  masing-masing  media  padat  yang mengandung 1% pati kanji. Untuk membuktikan apakah ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp. menghasilkan  enzim amilase ekstraseluler, maka media yang telah ditumbuhi bakteri di tetesi iodin [5].
AYTae7 AYTae31 AYTae33

## Gambar 6 Hasil uji enzim amilase ekstraseluler
Alicyclobacillus sp.
Gambar  6  membuktikan  bahwa  ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp. dapat  menghasilkan  enzim  amilase yang  disekresikan  ke dalam  medium.  Zona  bening  yang terbentuk  pada  ketiga  isolat  bakteri  ini  diakibatkan adanya  aktifitas  amilolitik  enzim α -amilase  yang dihasilkan  oleh  bakteri.  Zona  bening  terjadi  karena amilum  telah  terhidrolisis  menjadi  glukosa  sehingga iodium tidak terjerap pada aliran spiral amilum (amilosa) sedangkan  warna  biru  terjadi  karena  adanya  molekul iodin yang masuk dalam aliran spiral amilum [21].

## Hasil Uji Enzim Katalase Secara Kualitatif
Hasil uji kualitatif enzim katalase ekstraseluler yang telah dilakukan menunjukkan hasil yang negatif (gambar 7).  Hal  ini  ditandai  dengan  tidak  adanya  gelembung- gelembung gas pada masing-masing isolat Alicyclobacillus sp. yang ditetesi H 2 O 2 dimana mengindikasikan  bahwa Alicyclobacillus  sp. merupakan bakteri  penghasil  katalase  negatif,  yaitu  bakteri  yang tidak dapat menghasilkan enzim katalase.
Kontrol Positif dengan S. aureus Alicyclobacillus sp.AYTae
31
Gambar 7. Hasil uji katalase pada Alicyclobacillus sp.
AYTae 31
Uji  ini  dilakukan  dengan  cara  membuat  stater  dari ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp. Gedong Songo yang  telah diremajakan.  Isolat  Bakteri  yang  telah  diremajakan diambil  dengan  menggunakan  mikro  pipet,  dan diinokulasikan  kedalam  media  DSMZ  261  yang  baru untuk  mendapatkan  stater,  dan  kemudian  diinkubasi pada  suhu  55°C.  Setelah  48  jam,  media  sudah  terlihat keruh,  yang  menandakan  bahwa  bakteri Alicyclobacillus sp. sudah tumbuh pada media DSMZ 261 tersebut. Stater
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (3) (2010) : 80 – 87
diambil  dengan  menggunakan  mikro  pipet  kemudian diteteskan pada kaca preparat, dan ditetesi H 2 O 2 .
Adanya  aktivitas  katalase  dapat  diketahui  dengan terbentuknya  gelembung-gelembung  gas  O 2 .  Hidrogen peroksida  (H 2 O 2 )  dapat  terdekomposisi  oleh  enzim katalase  yang  dapat  dihasilkan  suatu  mikroorganisme [22].
2H 2 O 2 → 2H 2 O + O 2
Pada  mikroorganisme,  H 2 O 2 dapat  didekomposisi oleh  katalase  dalam  mitokondria  sel  [23].  Katalase tersebut berfungsi untuk melindungi sel dari efek toksik hidrogen peroksida [22]. Kontrol positif yang digunakan adalah bakteri S.aureus yang merupakan penghasil enzim katalase. S.aureus diteteskan  pada  kaca  preparat  dan ditambah  setetes  H 2 O 2 .  Gelembung-gelembung  gas  O 2 pada sel S.aureus tersebut timbul setelah 5 detik.
Hasil  penelitian  tidak  menunjukkan  adanya gelembung-gelembung  gas  pada  masing-masing  isolat Alicyclobacillus sp. yang ditetesi H 2 O 2 dimana mengindikasikan  bahwa Alicyclobacillus  sp. merupakan bakteri  bukan  penghasil  enzim  katalase.  Ketiga  isolat Alicyclobacillus  sp. merupakan  bakteri aerob.  Kebanyakan bakteri  aerob  menghasilkan  katalase  positif,  namun menurut  hasil  penelitian  ketiga  isolat Alicyclobacillus sp. merupakan penghasil katalase negatif.
Organisme  aerob  penghasil  katalase  negatif biasanya  mempunyai  enzim  lain  yang  dapat  diproduksi secara  alamiah,  sehingga  dapat  menguraikan  bentuk radikal  bebas  superoksida.  Enzim  yang  berperan  dalam hal ini dinamakan Superoksida dismutase (SOD).
Superoksida  dismutase  adalah  enzim  yang bertanggung  jawab  untuk  peruraian  khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat katalase negatif, diproduksi secara alamiah oleh organisme yang mengkonsumsi oksigen dan berperan sebagai salah satu mekanisme  pertahanan  terhadap  spesi  oksigen  reaktif yang diproduksi sebagai efek samping metabolisme dan respi1rasi [24]

## 4. Kesimpulan
Pohon filogeni terhadap ketiga isolat Alicyclobasillus sp. Gedong  Songo (AYTae7,  AYTae31,  AYTae33)  berada dalam satu kelompok kekerabatan dan memiliki tingkat kekerabatan  terdekat  dengan Alicyclobacillus_sp._KI, Alicyclobacillus_sp._TI27, Alicyclobacillus  acidocaldarius DSM454, dan Uncultured-bacterium-clone531 tetapi spesies  terdekat  itu  belum  dilaporkan  potensi biomolekulnya.  Ketiga  isolat Alicyclobasillus  sp. Gedong Songo (AYTae-7,  AYTae-31, AYTae-33)  memiliki  enzim termostabil  ekstraseluler  amilase  dan β -galaktosidase, namun  tidak  memiliki  enzim  termostabil  ekstraseluler protease dan katalase.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Trismilah,  Mahyudin  A.R,  Pemanfaatan  Kulit  Buah Pisang  Nangka  Sebagai  Substrat  Fermentasi  Padat Pada Produksi Xilanase, Jurnal Rekayasa Lingkungan , 5, 1, (2009) 13-23
[2]  Claudia  Schmidt-Dannert,  Helena  Sztajer,  Walter Stöcklein, Ulrich Menge, Rolf D. Schmid, Screening, purification  and  properties  of  a  thermophilic  lipase from  Bacillus  thermocatenulatus, Biochimica  et Biophysica  Acta  (BBA)  -  Lipids  and  Lipid  Metabolism , 1214,  1,  (1994)  43-53 https://doi.org/10.1016/0005- 2760(94)90008-6
[3]  Agustina L. N. Aminin, Fida Madayanti Warganegara,
Pingkan Aditiawati, Akhmaloka, Culture-
Independent  and  culture-dependent  approaches  on microbial community analysis at Gedongsongo (GS- 2)  hot  spring, International  Journal  of  Integrative Biology , 2, 3, (2008) 145-152
[4]  Rudolf  I  Amann,  Wolfgang  Ludwig,  Karl-Heinz Schleifer,  Phylogenetic  identification  and  in  situ detection  of  individual  microbial  cells  without cultivation, Microbiological reviews , 59, 1, (1995) 143- 169
[5]  Jusuf Ginting, Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Enzim Amilase  Kasar  Termofilik  Dari  Sumber  Air  Panas Semangat Gunung Kabupaten Karo, Sumatera Utara, Universitas Sumatera Utara, Medan
[6]  Ryan  D.  Martinus,  Graeme  P.  Garth,  Tracie  L. Webster,  Peter  Cartwright,  Dean  J.  Naylor,  Peter  B. Høj, Nicholas  J.  Hoogenraad, Selective  Induction  of Mitochondrial Chaperones in Response to Loss of the Mitochondrial  Genome, European  Journal  of Biochemistry , 240, 1, (1996) 98-103
http://dx.doi.org/10.1111/j.1432-1033.1996.0098h.x
[7]  Elidar  Naiola,  Nunuk  Widhyastuti,  Semi  Purifikasi dan  Karakterisasi  Enzim  Protease  Bacillus  sp, Berkala Penelitian Hayati , 13, 1, (2007) 51-56
[8]  Rosliana Pakpahan, Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Protease  Termofilik  dari  Sumber  Air  Panas Sipoholon Tapanuli Utara Sumatera Utara, (2009)
[9]  Agustina L. N. Aminin, Fida Madayanti Warganegara, Pingkan  Aditiawati,  Simple  enrichment  and independent cultures to expand bacterial community analysis  from  gedongsongo  hot  spring, Journal  of Bioscience and Bioengineering , 106, 2, (2008) 211-214
[10] E.  Stackebrandt,  B.  M.  Goebel,  Taxonomic  Note:  A Place  for  DNA-DNA  Reassociation  and  16S  rRNA Sequence Analysis in the  Present Species Definition in  Bacteriology, International  Journal  of  Systematic and Evolutionary Microbiology , 44, 4, (1994) 846-849 http://dx.doi.org/10.1099/00207713-44-4-846
[11]  Agustina  L.  N.  Aminin,  F.  Madayanti,  P.  Aditiawati, Akhmaloka,  Isolation  of  Thermophiles  From Gedongsongo Hot Spring Using A Simple Enrichment Medium,  in:    International  Seminar  Advance  in Biological Science, 2007.
[12] Michael  T.  Madigan,  John  M.  Martinko,  Brock Biology of Microorganisms, 11 ed., Pearson Prentice Hall, 2006.
[13] Hans  G.  Schlegel,  General  Microbiology,  7  ed., Cambridge University Press, 1986.
[14] Agnes  Ullmann,  Roots:  Complementation  in β - galactosidase:  From  protein  structure  to  genetic engineering, BioEssays ,  14,  3,  (1992)  201-205 http://dx.doi.org/10.1002/bies.950140311
[15] Necmettin  Yildirim,  Michael  C.  Mackey,  Feedback Regulation  in  the  Lactose  Operon:  A  Mathematical Modeling Study and Comparison with Experimental
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 13 (3) (2010) : 80 – 87
Data, Biophysical  Journal ,  84,  5,  2841-2851 http://dx.doi.org/10.1016/S0006-3495(03)70013-7
[16] Sophie  Drouault,  Jamila  Anba,  Gérard  Corthier,
Streptococcus  thermophilus  is  able  to produce  a β - galactosidase active during its transit in the digestive tract  of  germ-free  mice, Applied  and  environmental microbiology , 68, 2, (2002) 938-941 http://dx.doi.org/10.1128/AEM.68.2.938-941.2002
[17] Joseph Sambrook, David William Russell, Molecular cloning:  a  laboratory  manual, Coldspring-Harbour Laboratory Press, UK , (2001)
[18] Tuti  Susilawati,  Isolasi  dan  karakterisasi  enzim protease  dari  isolat  bakteri  termofilik  sumber  air panas Gedong Songo Bawen, Skripsi, Jurusan Kimia, Universitas Diponegoro, Semarang
[19] David M Ward, Diversity, Ecology, and Evolution  of Microorganisms  Inhabiting  Hot  Spring  Microbial Mats, Journal of NSF Frontiers of Integrative Biologycal Research , (2003)
[20] Ruth Melliawati, Ricky Setiadi Suherman, Bambang Subardjo,  Pengkajian  Kapang  Endofit  dari  Taman Nasional  Gunung  Halimun  sebagai  Penghasil Glukoamilase, Berkala  Penelitian  Hayati ,  12,  (2006)
19-25
[21] John  M.  DeMan,  Principles  of  Food  Chemistry, Springer, 1999.
[22] L Luhova, A Lebeda, D Hedererová, P Pec, Activities of  amine  oxidase,  peroxidase  and  catalase  in seedlings  of  Pisum  sativum  L.  under different  light conditions, Plant soil and environment , 49, 4, (2003) 151-157
[23] Ventsislava  Yankova  Petrova,  Tanya  Vassileva Rasheva,  Anna  V  Kujumdzieva,  Catalase  enzyme  in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae,
Electronic Journal of Biotechnology , 5, 1, (2002) 11-12
[24] Marini Wijayanti, Produksi, isolasi dan karakterisasi superoksida dismutase dari Spirulina platensis yang dibiakkan dalam serum lateks Production, isolation, and characterization of superoxyde dismutase from Spirulina  platensis  cultured  on  latex  serum, E- Journal Menara Perkebunan , 77, 1, (2016)