## Jurnal Sains dan Teknologi
Volume 12 Number 1, Tahun 2023, pp. 95-101 P-ISSN: 2303-3142 E-ISSN: 2548-8570 Open Access: https://doi.org/10.23887/jstundiksha.v12i1.53704

## A R T I C L E   I N F O
Article history: Received November 03, 2022 Revised November 08, 2022 Accepted February 20, 2023 Available online April 25, 2023
Kata Kunci: CIDR1 α , E. coli BL21(DE3), malaria, PfEMP1, transformasi
Keywords: CIDR1 α , E. coli BL21(DE3), malaria, PfEMP1, transformation
This is an open access article under the CC BY-SA license.
Copyright © 2023 by Author. Published by Universitas Pendidikan Ganesha.

## Optimasi  Transformasi  Gen  CIDR1α -PfEMP1  pada  Eschericia coli BL21(DE3) dengan Metode Heat-shock
Dicky Dewantoro 1 , Erma Sulistyaningsih 2* , Rosita Dewi 3
1,2,3 Fakultas Kedokteran, Universitas Jember, Jember, Indonesia

## A B S T R A K
Malaria  masih  menjadi  masalah  kesehatan  dunia  terutama  di  negara-negara berkembang.  Data World  Malaria  Report 2020,  kasus  malaria  di  dunia  tahun 2019  mencapai  229  juta  kasus  dengan  total  kematian  mencapai  409.000  jiwa. Kematian  tertinggi  terjadi pada  pasien  usia  balita  yang  mencapai  272.000  jiwa. Angka  kematian  akibat  malaria  berat  di  dunia  sangat  tinggi  sehingga  perlu berbagai pendekatan penanganan termasuk vaksin malaria. Domain Cysteine-rich Interdomain Regions 1α -Plasmodium falciparum Erythrocyte Membrane Protein 1 (CIDR1α -PfEMP1) merupakan kandidat vaksin malaria karena berperan penting dalam  pathogenesis  malaria . Pengembangan  vaksin  malaria  berbasis  CIDR1α - PfEMP1  dilakukan  melalui  teknologi  rekombinan  DNA  dimana  tahapan  yang sangat  penting  adalah  transformasi.  Tujuan  penelitian  ini  untuk  mengoptimasi kondisi  transformasi  gen  CIDR1α -PfEMP1  pada Escherichia  coli BL21(DE3) menggunakan  metode heat  shock guna  mendapatkan  efisiensi  transformasi tertinggi. Variable yang dianalisis adalah durasi heat shock selama 30, 50, dan 70 detik  dan  volume plating 100  µL  dan  200  µL.  Hasil  penelitian  menunjukkan efisiensi  transformasi  tertinggi  sebesar  1,9  x  10 2 CFU/µg  dicapai  pada  kondisi heat  shock selama  50  detik  dan  volume plating 200  µL.  Ini  adalah  kondisi optimum  transfomasi  gen  CIDR1α -PfEMP1  yang  dapat  digunakan  untuk penelitian lanjutan guna mengembangkan vaksin malaria.

## A B S T R A C T
Malaria  is  still  a world  health problem,  especially  in  developing  countries. Data  from  the  World  Malaria  Report  2020, malaria cases in the world in 2019 reached 229 million cases with a total death of 409,000 people. The highest mortality occurred  in  patients  under  five,  which  reached  272,000  people.  The  high  mortality  rate  of  severe  malaria  worldwide needs multiple approaches including the malaria vaccine. Cysteine- rich Interdomain Regions 1α -Plasmodium falciparum Erythrocyte  Membrane  Protein  1  (CIDR1α -PfEMP1)  is  a  candidate  for  malaria  vaccine  due  to  its  important  role  in mal aria  pathogenesis.  The  development  of  CIDR1α -PfEMP1-based  malaria  vaccine  is  conducted  by  DNA  recombinant technology where transformation is a pivotal step. The study aimed to optimize the transformation of CIDR1α -PfEMP1 into Escherichia coli BL21(DE3) using heat shock method to find out the highest transformation efficiency. The variables were duration of heat shock in 30, 50, and 70 secs and plating volume of 100 µL and 200 µL. The results showed that the highest transformation efficiency was 1.9 x 10 2 CFU/µg, it was achieved by 50 secs heat shock and 200 µL plating volume. This was an optimum transformation condition that can be used further for cloning of CIDR1α -PfEMP1 gene to develop a malaria vaccine.

## 1. PEMBAHASAN
Malaria  masih  menjadi  masalah  kesehatan  dunia  terutama  di  negara-negara  berkembang.  Data World  Malaria  Report 2020,  kasus  malaria  di  dunia  tahun  2019  mencapai  229  juta  kasus  dengan  total kematian  mencapai  409.000  jiwa.  Kematian  tertinggi  terjadi  pada  pasien  usia  balita  yang  mencapai 272.000 jiwa (WHO., 2020). Prevalensi malaria di Indonesia tahun 2018 mencapai 202.176 kasus dengan penyebab  utama  adalah Plasmodium  falciparum. Prevalensi  malaria  menunjukkan  sedikit  peningkatan pada  tahun  2019,  tetapi  terdapat  penurunan  sejak  tahun  2020  sampai  2021.  Beberapa  program pengendalian  malaria  sesuai  rekomendasi  WHO  antara  lain  diagnosis  dini,  terapi  yang  tepat  dan  cepat, pengendalian  vektor,  surveillans  dan  advokasi  telah  dilakukan  oleh  pemerintah  Indonesia  tetapi  tujuan eliminasi malaria masih belum tercapai. Pendekatan pengunaan vaksin malaria sebagai salah satu upaya pencapaian  eliminasi  malaria  belum  dilakukan  karena  tantangan  pengembangan  vaksin  malaria  yang kompleks (Riskesdas.,  2018;  WHO.,  2020) . Pengembangan  vaksin  malaria  dilakukan  dengan menggunakan protein penting dalam proses patogenesis dan progresivitas malaria. Progresivitas malaria yang  mengakibatkan  kematian  pasien  sering  disebabkan  oleh  malaria berat  dengan  manifestasi  klinis berupa  asidosis  metabolik,  koma,  anemia  berat,  hipoglikemia,  gagal  ginjal  akut,  dan  edema  paru  akut
(Nureye  &  Assefa,  2020;  Wassmer  et  al.,  2015). Patogenesis  malaria  berat  diinduksi  oleh  mekanisme cytoadherence, yaitu  adhesi Infected Red Blood Cell (IRBC) pada endotel  pembuluh  darah,  dan rosetting, kondisi  IRBC  yang  berikatan  dengan  eritrosit  normal  lainnya,  yang  mengakibatkan  obstruksi mikrosirkulasi  organ  vital (Gay  et  al.,  2012;  Goel  et  al.,  2015;  Lee  &  Hsueh,  2020;  Niang  et  al.,  2014). Mekanisme  patogenesis  ini  diperantarai  oleh  protein Plasmodium  falciparum  Erythrocyte  Membrane Protein 1 (PfEMP1). PfEMP1 merupakan suatu protein antigen yang diekspresikan pada permukaan IRBC (Cutts  et  al.,  2017;  De  Koning-Ward,  Dixon,  Tilley,  &  Gilson,  2016). Protein  ini  memperantarai cytoadherence dan rosetting melalui pembentukan ikatan dengan berbagai reseptor pada tubuh manusia (Githinji  &  Bull,  2017;  Jensen,  Adams,  &  Hviid,  2020;  Jespersen  et  al.,  2016;  Mkumbaye  et  al.,  2017). Individu  dengan  antibodi  spesifik  terhadap  PfEMP1  secara  signifikan  mengalami  penurunan  risiko terjadinya malaria simtomatis sehingga PfEMP1 berpotensi menjadi kandidat vaksin malaria. Akan tetapi, pengembangan  vaksin  malaria  berbasis  PfEMP1  menghadapi  beberapa  tantangan,  antara  lain kompleksitas  dan  variabilitas  struktur  PfEMP1  karena  protein  ini  merupakan  protein  kompleks  yang dikode oleh var gene family, sekelompok gen yang terdiri dari kurang lebih 60 var gene (Bull & Abdi, 2016; Claessens  et  al.,  2014). Tantangan  kompleksitas  dan  variabilitas  struktur  PfMEP1  dapat  dipecahkan dengan menggunakan bagian conserved protein ini, yang dapat ditemukan pada head structure PfEMP1. Salah satu bagian conserved head structure PfEMP1 yang selalu diekspresikan pada setiap variasi struktur PfEMP1  adalah  domain  ekstraseluler Cysteine- rich  Interdomain  Regions  1α (CIDR1α) (Jespersen  et  al., 2016; Rask, Hansen, Theander, Pedersen, & Lavstsen, 2010). Sekuens gen pengkode CIDR1α -PfEMP1 dari isolat Indonesia telah diidentifikasi sepanjang 525 bp dan memiliki tingkat similaritas tinggi dengan isolat lain yang menginfeksi manusia & hewan (Dewi, Ratnadewi, Sawitri, Rachmania, & Sulistyaningsih, 2018; Sulistyaningsih,  Fitri,  Löscher,  &  Berens-Riha,  2013). Oleh  karena  itu,  domain  ini  menjadi  kandidat potensial untuk pengembangan vaksin malaria yang bersifat universal dalam pencegahan malaria berat.
Saat  ini  pendekatan  pengembangan  vaksin  sering  dilakukan  dengan  menggunakan  teknik rekayasa genetika. Pengembangan vaksin malaria berbasis CIDR1α -PfEMP1 dilakukan melalui kloning gen dengan salah satu tahapan penting adalah mentransformasikan gen CIDR1α -PfEMP1 pada Escherichia coli BL21(DE3).  Proses  ini  sangat  esensial  untuk  memasukkan  gen  target  ke  dalam  sel  inang  guna mendapatkan klon yang diinginkan. Ada beberapa teknik proses transformasi gen dan teknik yang sering digunakan adalah heat shock method karena memiliki prosedur sederhana, murah, serta dapat dilakukan dalam  jumlah  banyak  sekaligus (Ren,  Karna,  Lee,  Yoo,  &  Na,  2019). Beberapa  faktor  mempengaruhi keberhasilan  transformasi  gen.  Tingkat  keberhasilan  proses  transformasi  diukur  dengan  menghitung efisiensi transformasi yang dinyatakan dalam satuan CFU/µg (Chan, Verma, Lane, & Gan, 2013). Efisiensi transformasi  dipengaruhi  oleh  jenis  kation,  suhu  dan  durasi heat  shock ,  ukuran  DNA  yang ditransformasikan,  serta  volume plating kultur  bakteri  transforman (Rivera,  Gomez-Lim,  Fernadez,  & Loske,  2014). Beberapa  penelitian  sebelumnya  menunjukkan  pentingnya  proses  optimasi  untuk  setiap proses  transformasi  terutama  berkaitan  dengan  durasi heat  shock dan  volume plating kultur  bakteri transforman (Chan et al., 2013; Rahimzadeh, Sadeghizadeh, Najafi, Arab, & Mobasheri, 2016; Singh, Yadav, Ma,  &  Amoah,  2010;  Zhou  et  al.,  2018). Tujuan  penelitian  ini  adalah  melakukan  optimasi  proses transformasi  gen  CIDR1α -PfEMP1  pada E.  coli BL21(DE3)  untuk  melakukan  kloning  gen  rekombinan CIDR1α -PfEMP1 menggunakan metode heat shock. Variabel proses transformasi yang digunakan adalah durasi heat shock dan volume plating sedangkan indikator keberhasilan transformasi adalah nilai efisiensi transformasi tertinggi. Kondisi optimum transformasi gen CIDR1α -PfEMP1 sangat penting dalam tahapan pengembangan vaksin malaria terutama yang berbasis protein rekombinan.

## 2. METODE
Penelitian  dilaksanakan  di  UPT  Laboratorium  Terpadu  dan  Sentra  Inovasi  Teknologi  (CDAST) Universitas  Jember  dan  Laboratorium  Biokimia  Fakultas  Kedokteran  Universitas  Jember  pada  bulan Januari-Maret 2021. Penelitian ini telah memperoleh perizinan etik dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan Fakultas  Kedokteran  Universitas  Jember  dengan  Nomor:  1.114./H25.1.11/KE/2017  dan 1.506/H25.1.11/KE/2021.  Alat-alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah autoclave , water  bath , spectrophotometry , Laminar  Air  Flow (LAF), incubator, shaker  incubator , Hitachi  CF15RXII  centrifuge, horizontal  electrophoresis ,  dan ultraviolet  transluminator .  Bahan-bahan  yang  digunakan  pada  penelitian ini adalah bakteri E. coli BL21(DE3) dari Thermofisher Scientific, plasmid kontrol pUC19 (Thermofisher) , plasmid  klon  pET-30a –CIDR1α, Super  Optimal  broth  with  Catabolite  repression (SOC) medium (Thermofisher) ,  Lactose  Broth (LB) medium (Merck) , Agar  Bacto (Merck ), kanamisin  &  ampisilin (Thermofisher) ,  Zyppy  Plasmid  Miniprep  Kit (Zymo  Research) , enzim  endonuklease BamHI dan XhoI (Thermofisher) ,  agarose  gel (Thermofisher) , DNA Ladder CSL-mDNA-1Kb  (Cleaver  Scientific) , dan ethidium bromide (Thermofisher).  Pembuatan sel kompeten E. coli BL21(DE3) (Thermofisher  Scientific)
dilakukan dengan metode CaCl 2 (Mandel & Higa, 1970). Empat tube E. coli BL21(DE3) (6 x 10 8 CFU/mL) digunakan  pada transformasi plasmid klon pET-30a –CIDR1α dan plasmid kontrol  pUC19 menggunakan metode heat shock sesuai protokol  transformasi ( Thermofisher Scientific) dengan  modifikasi durasi heat shock dan volume plating kultur bakteri transforman . Sebanyak 1 µL pUC19 (10 pg/µL) ditransformasikan pada tube 1 dengan pemberian heat shock 42 o C selama 30 detik. Sebanyak 1,5 µL pET-30a –CIDR1α (100 ng/µL) ditransformasikan pada tube 2, 3, dan 4 dengan pemberian heat shock 42 o C selama 30, 50, dan 70 detik berturut-turut (Chan et al., 2013; Dewi et al., 2018; Rahimzadeh et al., 2016; Singh et al., 2010; Zhou et  al.,  2018) .  Bakteri  transforman  dikultur  pada  media  LB-agar  selektif  dengan  penambahan  antibiotik ampisilin  dan  kanamisin  menggunakan  dua  volume plating (100  µL  &  200  µL)  sesuai  protokol Thermofisher  Scientific .  Kultur  bakteri  transforman  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  16  jam.  Koloni bakteri transforman dihitung dengan colony counter dan dikonversi menjadi nilai  efisiensi transformasi menggunakan rumus pada protokol transformasi Thermofisher Scientific sebagai berikut:
Efisiensi Transformasi (CFU/µg) = Jumlah Koloni DNA rekombinan (pg) x 1 x 106 pg µg x 300 µL Volume 𝑃𝑙𝑎𝑡𝑡𝑖𝑛𝑔 .
Konfirmasi  kloning  dilakukan  pada  empat  koloni  bakteri  transforman  dari  media  LB-agar kanamisin dengan nilai efisiensi transformasi tertinggi. Isolasi plasmid klon pET-30a –CIDR1α dilakukan sesuai protokol Zyppy Plasmid Miniprep Kit (Zymo Research). Sebagian plasmid klon hasil isolasi dipotong pada  satu  titik  restriksi  menggunakan BamHI (Thermofisher  Scientific)  dan  sebagian  lainnya  dipotong pada dua titik restriksi menggunakan BamHI (Thermofisher Scientific) dan XhoI (Thermofisher Scientific) . Plasmid klon hasil isolasi dan hasil pemotongan secara enzimatik divisualisasikan menggunakan agarose gel DNA electrophoresis 1%.

## 3. HASIL DAN BAHASAN
Hasil Bakteri E. coli BL21(DE3) hasil transformasi plasmid klon pET-30a –CIDR1α dan plasmid kontrol pUC19 kemudian dikultur pada media LB-agar selektif. Hasil perhitungan koloni bakteri transforman pada media LB-agar kemudian dikonversi menjadi nilai efisiensi transformasi dan diurutkan dari nilai tertinggi hingga terendah, hal ini dapat dilihat pada Tabel 1 .
Tabel 1 . Nilai Efisiensi Transformasi
No Bakteri Transforman Jumlah Koloni Efisiensi Transformasi 1 Tube 1, plating 200 µL 298 4,47 x 10 7 CFU/µg 2 Tube 1, plating 100 µL 136 4,08 x 10 7 CFU/µg 3 Tube 2 , plating 200 µL 5 5 x 10 CFU/µg 4 Tube 2, plating 100 µL 1 2 x 10 CFU/µg 5 Tube 3, plating 200 µL 19 1,9 x 10 2 CFU/µg 6 Tube 3, plating 100 µL 2 4 x 10 CFU/µg 7 Tube 4, plating 200 µL 0 0 CFU/µg 8 Tube 4, plating 100 µL 0 0 CFU/µg
Keterangan: Tube 1: pUC19, heat shock 30 detik Tube 2: pET-30a –CIDR1α, heat shock 30 detik Tube 3: pET-30a –CIDR1α, heat shock 50 detik Tube 4: pET-30a –CIDR1α, heat shock 70 detik

## Konfirmasi Kloning
Konfirmasi  kloning  dilakukan  pada  empat  koloni  bakteri  transforman  dari  media  LB-agar kanamisin  dengan  nilai  efisiensi  transformasi  tertinggi.  Visualisasi electrophoresis plasmid  klon  hasil isolasi  yang  terdapat  pada Gambar  2a ,  menunjukkan  keberadaan  pET-30a –CIDR1α  berupa band DNA pada lane 1, 2, 3 dan 4. Pada lane 2 didapatkan visualisasi single band , sedangkan pada lane 1, 3, dan 4 didapatkan  visualisasi double  band. Visualisasi  hasil electrophoresis plasmid  klon  dengan  pemotongan satu enzim terlihat pada Gambar 2b , menunjukkan band DNA dengan ukuran ± 5900 bp pada lane 1, 2, 3
dan 4 yang sesuai dengan ukuran pET-30a –CIDR1α (5913 bp). Sebagian plasmid klon juga dipotong pada dua titik restriksi menggunakan enzim restriksi BamHI (Thermofisher Scientific) dan XhoI (Thermofisher Scientific) dengan tujuan memisahkan plasmid pET- 30a dengan gen CIDR1α sesuai map pET-30a –CIDR1α. Visualisasi hasil electrophoresis, yang dapat diamati pada Gambar 2c menunjukkan keberadaan dua band DNA  berukuran  ±5400  (plasmid  pET- 30a)  dan  ±525  bp  (CIDR1α)  pada  seluruh lane .  Untuk Map DNA rekombinan  pET-30a –CIDR1α.  Konfirmasi  kloning  dila kukan  restriksi  DNA  rekombinan  pada  titik pemotongan BamHI (689 bp) dan XhOI (158 bp) dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 2 . Visualisasi Hasil Konfirmasi Kloning dengan Electrophoresis pada Agarose Gel 1%

## Pembahasan
Transformasi gen adalah proses introduksi atau memasukkan gen target dari satu organisme ke organisme lain yang memungkinkan munculnya sifat gen yang dibawa ke dalam organisme baru tersebut. Prose ini sangat krusial dalam rekayasa genetika. Tingkat keberhasilan proses transformasi dapat diukur dengan  nilai  efisiensi  transformasi (Rahimzadeh  et  al.,  2016). Pada  penelitian  ini  variabel  transformasi dari  metode heat-shock yang  diuji  adalah  durasi heat-shock dan  volume plating .  Hasil  penelitian menunjukkan  adanya  perbedaan  nilai  efisiensi  transformasi  akibat  perlakuan  yang  berbeda.  Perbedaan nilai  efisiensi  transformasi  pada  masing-masing  perlakuan  menunjukkan  adanya  pengaruh  durasi heat shock dan  volume plating terhadap  efisie nsi  transformasi  gen  CIDR1α -PfEMP1  pada E.  coli BL21(DE3). Hasil tersebut didukung penelitian sebelumnya yang menyatakan nilai efisiensi transformasi dipengaruhi durasi heat shock dan volume plating (Chai & Kong, 2017; Kelechi et al., 2021) Durasi heat shock sangat menentukan keberhasilan transformasi. Durasi heat shock yang terlalu singkat menyebabkan kurang terbukanya membran sel dengan  baik sehingga  DNA eksogen tidak dapat masuk  ke  dalam  sel  dengan  maksimal,  akan  tetapi  pemberian heat  shock yang  terlalu  lama  juga  dapat menyebabkan stress dan kerusakan membran sel bakteri (Singh et al., 2010). Efisiensi transformasi gen CIDR1α -PfEMP1 pada E. coli BL21(DE3) paling optimum didapatkan pada kombinasi heat shock selama 50 detik  dan  volume plating 200  µL  dengan  nilai  efisiensi  transformasi  mencapai  1,9  x  102  CFU/µg.  Nilai efisiensi tersebut lebih tinggi daripada kondisi heat shock 30 detik dan volume plating 200 µL yang hanya mencapai  5  x  10  CFU/µg.  Pada  pemberian heat  shock 70  detik  tidak  didapatkan  pertumbuhan  bakteri pada volume plating 200 µL ataupun 100 µL. Paparan heat shock 70 detik telah menyebabkan stress dan kerusakan membran sel E. coli BL21(DE3) sehingga bakteri mengalami kematian. Hasil tersebut didukung beberapa  penelitian  sebelumnya  yang  menyatakan  nilai  efisiensi  transformasi  terbaik  pada E.  coli didapatkan pada durasi heat shock 30-50 detik dan mulai menurun pada pemberian heat shock lebih dari 60 detik (Singh et al., 2010; Wang et al., 2020). Faktor lain yang mempengaruhi nilai efisiensi transformasi adalah volume plating kultur bakteri transforman.  Semakin  besar  volume plating maka  semakin  banyak  bakteri  transforman  yang  dikultur pada  media,  akan  tetapi  apabila  densitas  koloni  terlalu  tinggi  juga  dapat  menurunkan  pertumbuhan bakteri akibat adanya kompetisi dalam mendapatkan nutrisi.  Pada penelitian ini digunakan dua volume plating (100 µL dan 200 µL) pada masing-masing perlakuan sesuai protokol Thermofisher Scientific . Hasil penelitian  menunjukkan  nilai  efisiensi  transformasi  yang  lebih  tinggi  pada  volume plating 200  µL daripada 100 µL, sesuai dengan teori yang menyatakan jumlah koloni sebanding dengan volume plating Penelitian ini menunjukkan nilai efisiensi transformasi gen CIDR1α yang paling optimum didapatkan pada kombinasi  durasi  paparan heat  shock 50  detik  dan  volume plating 200  µL  dengan  nilai  efisiensi transformasi 1,9 x 102 CFU/µg, sedangkan nilai efisiensi transformasi kontrol (pUC19) sebesar 4,47 x 107 CFU/µg. Perbedaan nilai efisiensi transformasi kontrol dan perlakuan disebabkan oleh perbedaan ukuran pET-30a –CIDR1α (5913 bp) dan pUC19 (2686 bp), Plasmid  klon pET-30a –CIDR1α yang berukuran dua kali  lipat  plasmid  kontrol  pUC19  lebih  sulit  menembus  membran  sel  sehingga  memiliki  nilai  efisiensi transformasi  yang  lebih  rendah,  sesuai  dengan  penelitian  sebelumnya  yang  menyatakan  bahwa penurunan  nilai  efisiensi  transformasi  terjadi  seiring  dengan  peningkatan  ukuran  DNA  yang ditransformasikan (Inoue, H., & Okayama, n.d.; Kuo, Walker, Schroder, & Belland, 2014). Hasil konfirmasi kloning melalui visualisasi electrophoresis (tanpa restriksi enzim) menunjukkan keberadaan  pET-30a –CIDR1α  berupa single  band DNA  dengan  ukuran  yang  sesuai  pET-30a –CIDR1α (5900  bp)  dan double  band DNA  dengan  ukuran  yang  lebih  pendek.  Visualisasi  double  band  tersebut terjadi  akibat  konformasi  plasmid  klon  pET-30a –CIDR1α  yang  berbentuk circular  supercoiled DNA, dimana circular supercoiled DNA dapat tervisualisasi dengan ukuran band yang lebih pendek dari ukuran yang sebenarnya akibat konformasi DNA pada agarose gel yang  menyebabkan circular supercoiled DNA bergerak  lebih  cepat  dibanding linear DNA (Cebrián  et  al.,  2015;  Stellwagen  &  Stellwagen,  2009). Keberadaan circular supercoiled DNA dapat menyebabkan bias karena ukuran band yang terbentuk tidak sesuai  dengan  ukuran  yang  sebenarnya.  Oleh  sebab  itu,  dilakukan  pemotongan  plasmid  klon  pada  satu titik  restriksi  menggunakan  enzim  restriksi BamHI ( Thermofisher  Scientific )  guna  mengubah  bentuk plasmid  klon  yang circular menjadi linear .  Visualisasi  hasil electrophoresis plasmid  klon  dengan pemotongan satu enzim menunjukkan band DNA dengan ukuran ± 5900 bp pada seluruh lane yang sesuai dengan ukuran pET-30a –CIDR1α (5913 bp). Sebagian plasmid klon juga dipotong pada dua titik restriksi menggunakan enzim  restriksi BamHI ( Thermofisher Scientific ) dan XhoI ( Thermofisher Scientific ) dengan tujuan tujuan memisahkan plasmid pET- 30a dengan gen CIDR1α sesuai map pET-30a –CIDR1α ( Gambar 3 ). Visualisasi hasil electrophoresis dengan restriksi dua enzim ( BamHI & XhoI ) menunjukkan keberadaan dua band DNA  berukuran  ±5400  (plasmid  pET- 30a)  dan  ±525  bp  (CIDR1α)  pada  seluruh lane .  Hasil tersebut mengonfirmasi bahwa koloni rekombinan mengandung insert gene CIDR1α -PfEMP1.

## 4. SIMPULAN
Kondisi  optimum  transformasi  gen  CIDR1α -PfEMP1  pada E.  coli BL21(DE3)  menggunakan metode heat shock dicapai pada kombinasi durasi paparan heat shock 50 detik dan volume plating bakteri transforman 200 µL yang  menghasilkan nilai efisiensi transformasi tertinggi sebesar 1,9  x 102 CFU/µg. Kondisi optimum transformasi ini dapat digunakan untuk penelitian lanjutan biomolekuler dalam rangka pengembangan vaksin malaria.

## 5. UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian  ini  didanai  oleh  Hibah  internal  Universitas  Jember  tahun  2020  melalui  skema  Hibah Kelompok Riset Malaria Fakultas Kedokteran Universitas Jember  No. 2757/UN25.3.1/LT/2020.

## 6. DAFTAR PUSTAKA
Bull, P. C., & Abdi, A. I. (2016). The role of PfEMP1 as targets of naturally acquired immunity to childhood malaria: Prospects
for a vaccine.
Parasitology. , 143 (2), 171 – 186.
https://doi.org/10.1017/S0031182015001274.
Cebrián,  J.,  Kadomatsu-Hermosa,  M.  J.,  Castán,  A.,  Martínez,  V.,  Parra,  C.,  Fernández- Nestosa,  M.  J.,  … Schvartzman,  J.  B.  (2015).  Electrophoretic  mobility  of  supercoiled,  catenated  and  knotted  DNA molecules. Nucleic Acids Res , 43 (4), e24. https://doi.org/10.1093/nar/gku1255. Chai, C. S., & Kong, S.-C. (2017). Professional learning for 21st century education. Journal of Computers in Education , 4 (1), 1 – 4. https://doi.org/10.1007/s40692-016-0069-y.
Chan, W. T., Verma, C. S., Lane, D. P., & Gan, S. K. E. (2013). A comparison and optimization of methods and factors  affecting  the  transformation  of  Escherichia  coli. Biosci  Rep , 33 (6),  e00086. https://doi.org/10.1042/BSR20130098.
Claessens,  A.,  Hamilton,  W.  L.,  Kekre,  M.,  Otto,  T.  D.,  Faizullabhoy,  A.,  Rayner,  J.  C.,  &  Kwiatkowski,  D. (2014).  Generation  of  Antigenic  Diversity  in  Plasmodium  falciparum  by  Structured Rearrangement  of  Var  Genes  During  Mitosis. PLoS  Genet , 10 (12),  e1004812. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004812.
Cutts,  E.  E.,  Laasch,  N.,  Reiter,  D.  M.,  Trenker,  R.,  Slater,  L.  M.,  Stansfeld,  P.  J.,  &  Vakonakis,  I.  (2017). Structural analysis of P. falciparum KAHRP and PfEMP1 complexes with host erythrocyte spectrin suggests  a  model  for  cytoadherent  knob  protrusions. PLoS  Pathog , 13 (8),  e1006552. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006552.
De  Koning-Ward,  T.  F.,  Dixon,  M.  W.  A.,  Tilley,  L.,  &  Gilson,  P.  R.  (2016).  Plasmodium  species:  Master renovators of their host cells. Nat Rev Microbiol , 14 (8), 494 – 507. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2016.79.
Dewi, R., Ratnadewi, A. A. I., Sawitri, W. D., Rachmania, S., & Sulistyaningsih, E. (2018). Cloning, sequence analysis, and expression of CIDR1α -pfEMP1 from Indonesian plasmodium falciparum isolate. Curr Top Peptide Prot Res , 19 , 95-104. Retrieved from
http://www.researchtrends.net/tia/article_pdf.asp?in=0&vn=19&tid=26&aid=6269.
Gay, F., Zougbédé, S., N’Dilimabaka, N., Rebollo, A., Mazier, D., & Moreno, A. (2012). Cerebral malaria: What is  known  and  what  is  on  research.  https://doi.org/. Rev  Neurol  (Paris) , 166 (3),  239-256. https://doi.org/10.1016/j.neurol.2012.01.582.
Githinji, G., & Bull, P. C. (2017). A re-assessment of gene-tag classification approaches for describing var gene  expression  patterns  during  human  Plasmodium  falciparum  malaria  parasite  infections. Wellcome Open Res , 2 , 86. https://doi.org/10.12688/wellcomeopenres.12053.1.
Goel,  S.,  Palmkvist,  M.,  Moll,  K.,  Joannin,  N.,  Lara,  P.  R.,  Akhouri,  R.,  …  Wahlgren,  M.  (2015).  RIFINs  are adhesins  implicated  in  severe  Plasmodium  falciparum  malaria. Nat  Med  21(4): , 21 (4),  314-317. https://doi.org/10.1038/nm.3812.
Inoue,  H.,  H.,  N.,  &  Okayama,  H.  (n.d.).  High  efficiency  transformation  of  Escherichia  coli  with  plasmids. Gene , 96 (1), 23 – 28. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90336-P. Jensen, A. R., Adams, Y., & Hviid, L. (2020). Cerebral Plasmodium falciparum malaria: The role of PfEMP1 in its pathogenesis and immunity, and PfEMP1-based vaccines to prevent it. Immunol Rev , 293 (1), 230-252. https://doi.org/10.1111/imr.12807. Jespersen, J. S., Wang, C. W., Mkumbaye, S. I., Minja, D. T., Petersen, B., Tur ner, L., … Lavstsen, T. (2016). Plasmodium  falciparum  var  genes  expressed  in  children  with  severe  malaria  encode  CIDR  α1 domains. EMBO Mol Med , 8 (8), 839 – 850. https://doi.org/10.15252/emmm.201606188.
Kelechi, A. H., Alsharif, M. H., Oluwole, D. A., Achimug u, P., Ubadike, O., Nebhen, J., … Uthansakul, P. (2021). The  Recent  Advancement  in  Unmanned  Aerial  Vehicle  Tracking  Antenna:  A  Review. Sensors,
21 (6), 5662. https://doi.org/10.3390/s21165662. Kuo, Y. C., Walker, A. E., Schroder, K. E. E., & Belland, B. R. (2014). “Interaction, Internet Self -Efficacy, and Self-Regulated Learningas Predictors of Student Satisfaction in Online Education Courses. Internet and Higher Education , 20 , 35 – 50. https://doi.org/10.1016/jiheduc.2013.10.001.
Lee,  P.-I.,  &  Hsueh,  P.-R.  (2020).  Lee,  P.  I.,  &  Hsueh,  P.  R.  (2020).  Emerging  Threats  From  Zoonotic Coronaviruses-From  SARS  And  MERS  To  2019-Ncov. Journal  of  Microbiology,  Immunology  and Infection. , 53 (3), 365 – 367. https://doi.org/10.1016/j.jmii.2020.02.001. Mkumbaye, S. I., Wang, C. W., Lyimo, E., Jespersen, J. S., Manjurano, A., Mosha, J., … Lavstsen, T. (2017). The severity  of  Plasmodium  falciparum  infection  is  associated  with  transcript  levels  of  var  genes encoding endothelial protein C receptor-binding P. falciparum erythrocyte membrane protein 1. Infect Immun , 85 (4), e00841. https://doi.org/10.1128/IAI.00841-16. Niang, M., Bei, A. K., Madnani, K. G., Pelly, S., Dankwa, S., Kanjee, U., … Preiser, P. R. (2014). The variant STEVOR protein of Plasmodium falciparum is a red cell binding protein important for merozoite invasion  and  rosetting  HHS  Public  Access. Ell  Host  Microbe , C16 (1),  81 – 93. https://doi.org/10.1016/j.chom.2014.06.004.
Nureye,  D.,  &  Assefa,  S.  (2020).  Old  and  Recent  Advances  in  Life  Cycle,  Pathogenesis,  Diagnosis, Prevention,  and  Treatment  of  Malaria  Including  Perspectives  in  Ethopia. Hindawi  Sci  World  J , 2020: , 1295381. https://doi.org/10.1155/2020/1295381. Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S. S., & Mobasheri, H. (2016). Impact of heat shock on bacterial  transformation  efficiency. Mol  Biol  Res  Commun , 5 (4),  257-261.  Retrieved  from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5326489/pdf/mbrc-5-257.pdf. Rask, T. S., Hansen, D. A., Theander, T. G., Pedersen, A. G., & Lavstsen, T. (2010). Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 diversity in seven genomes - divide and conquer. PLoS Comput Biol , 6 (9), e1000933. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000933.
Ren,  J.,  Karna,  S.,  Lee,  H.  M.,  Yoo,  S.  M.,  &  Na,  D.  (2019).  Artificial  transformation  methodologies  for improving  the  efficiency  of  plasmid  DNA  transformation  and  simplifying  its  use. Appl  Microbiol Biotechnol , 103 (23 – 24), 9205 – 9215. https://doi.org/10.1007/s00253-019-10173-x. Riskesdas. (2018). Hasil Utama Riset Kesehatan Dasar. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia.
Rivera,  A.  L.,  Gomez-Lim,  M.,  Fernadez,  F.,  &  Loske,  A. M.  (2014).  Genetic  Transformation  of  Cells  using Physical Methods. J Genet Syndr Gene Ther , 5 , 4. https://doi.org/10.4172/2157-7412.1000237. Singh, M., Yadav, A., Ma, X., & Amoah, E. (2010). Plasmid DNA transformation in Escherichia Coli: effect of heat  shock  temperature,  duration,  and  cold  incubation  of  CaCl2  treated  cells. Int  J  Biotechnol Biochem , 6 (4), 561-568. Retrieved from http://www.ripublication.com/ijbb.htm.
Stellwagen,  N.  C.,  &  Stellwagen,  E.  (2009).  Effect  of  the  matrix  on  DNA  electrophoretic  mobility. J Chromatogr A , 1216 (10), 1917-1929. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2008.11.090.
Sulistyaningsih,  E.,  Fitri,  L.  E.,  Löscher,  T.,  &  Berens-Riha,  N.  (2013).  Diversity  of  the  var  gene  family  of Indonesian Plasmodium falciparum isolates. https://doi.org/. Malar J , 12 (80). https://doi.org/10.1186/1475-2875-12-80.
Wang, Y., Wang, X., Yu, L., Tian, Y., Li, S., Leng, F., … Chen, J. (2020). Effects of Sr2+ on the preparation of Escherchia  coli  DH5α  competent  cells  and  plasmid  transformation. PeerJ , 8 ,  e9480. https://doi.org/10.7717/peerj.9480.
Wassmer, S. C., Taylor, T. E., Rathod, P. K., Mishra, S. K., Mohanty, S., Herrera, M. A., … Smith, J. . (2015). Investigating  the  Pathogenesis  of  Severe  Malaria:  A  Multidisciplinary  and  Cross-Geographical Approach. :. https://doi.org/. Am J Trop Med Hyg , 93 ((3 Suppl)), 42 – 56. https://doi.org/10.4269/ajtmh.14-0841.
WHO. (2020). World Malaria Report 2020. World Health Organization.
Zhou, J., Li, X., Xia, J., Wen, Y., Zhou, J., Yu, Z., & Tian, B. (2018). The role of temperature and bivalent ions in preparing competent Escherichia coli. 3 Biotech , 8 (5), 222. https://doi.org/10.1007/s13205-018- 1243-x.