## ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL)
DARI BUAH MANGGA ( Mangifera indica L . )
Submitted : 25 Nov 2015 Edited : 15 Des 2015
Accepted : 21 Des 2015
Arsyik Ibrahim, Aditya Fridayanti, Fila Delvia
Laboratorium Penelitian dan Pengembangan FARMAKA TROPIS Fakultas Farmasi Universitas Mulawarman, Samarinda, Kalimantan Timur Email : achie.ibrahim@gmail.com; aditya@farmasi.unmul.ac.id ila.liing@yahoo.co.id

## ABSTRACT
The  research  has  been  done  for  the  isolation  and  identification  of  lactic  acid  bacteria  (LAB)  from mango  (Mangifera  indica L .).  This  research  aimed  to  isolated  of  lactic  acid  bacteria  that  is  in  mango (Mangifera  indica L. )  and  determine  the  characteristics  of  lactic  acid  bacteria  isolate  (LAB)  of  mango (Mangifera indica L .). The method used is spoiled  technique of mango (Mangifera indica L .) and isolation using selective media MRS Broth and MRS Agar. The identification isolate of lactic acid bacteria (LAB) used methods  macroscopically  and  microscopically  with  indirect  coloring,  gram  staining  and  used  biochemical with  katalase  testing.  The  results  obtained  in  the  form  of  characteristic  isolate  of  lactic  acid  bacteria displayed  form  of  bacteria  with  circle,  smooth  surface,  curve,  entire  side  and  white.  The  microscopically displayed stick form of bacteria and purple with gram coloring.
Keywords : Mangifera indica L., lactic acid bacteria, spoiled, isolation

## PENDAHULUAN
Bakteri  asam  laktat  adalah  bakteri  yang memiliki  kontribusi  yang  besar  dalam  dunia pangan.  Bakteri  asam  laktat  selain  biasanya digunakan  sebagai  pangan  fungsional  juga  sering digunakan  sebagai  pengawet  alami  dari  suatu produk  pangan  fermentasi.  Penggunaan  bakteri asam  laktat  sebagai  pengawet  alami  dengan metode  biopreservatif  telah  banyak  dikembangkan dengan  menggunakan  bakteri  asam  laktat  secara langsung  atau  menggunakan  metabolitnya  sebagai agen antimikroba.
Penggunaan  BAL  ini  dikarenakan  bakteri asam laktat disebut sebagai food grade microorganisms yang  merupakan  mikroba  yang tidak  beresiko  terhadap  kesehatan  karena  tidak menghasilkan racun berbahaya pada bahan pangan melainkan mempunyai fungsi sebaliknya yang baik bagi  kesehatan.  Hal  ini  karena  bakteri  asam  laktat dapat menghambat secara alami mikroba patogen (1) .
Beberapa  metabolit  aktif  yang  dihasilkan oleh  bakteri  asam  laktat  yaitu  asam  laktat,  etanol, hidroperoksida  dan  bakteriosin.  Metabolit  yang dihasilkan  oleh  bakteri  tersebut  merupakan  agen yang  dapat  digunakan  dalam  membunuh  bakteri. Salah  satu  yang  digunakan  sebagai  antimikroba yaitu  bakteriosin  yang  merupakan  suatu  senyawa peptida.  Dilaporkan  bahwa  bakteriosin  memegang peranan  paling  penting  dalam  menanggulangi infeksi  akibat  mikroorganisme. Selain  itu  asam laktat  yang  di  produksi  oleh  BAL  dapat menurunkan pH lingkungan. pH yang rendah dapat menghambat  kontaminasi  mikroba  pembusuk  dan juga  membunuh  mikroba  patogen  terutama  yang ada didalam tubuh (2) .
Penelitian tentang isolasi BAL telah banyak dilakukan  terutama  pada  produk-produk  daging mentah  ataupun  kalengan,  produk  susu  (yoghurt, keju,  dadih),  fermentasi  (tape,  tempe,  beer). Namun  belum  begitu  banyak  yang  diisolasi  dari buah-buahan  dan  sayur-sayuran  tropis.  Beberapa sumber memaparkan bahwa pada buah-buahan dan
sayuran seperti durian, nanas, sirsak, cacao, pisang, mangga, tomat, kubis, asinan sawi, selada, kacang panjang  dan  lain  sebagainya  adalah  potensial sebagai sumber BAL (3) .
Kalimantan  terkenal  dengan  produksi  buah mangga  yang  berlimpah.  Beberapa  jenis  mangga dapat  ditemui  di  sini.  Dilaporkan  bahwa  di Kalimantan terdapat 31 jenis Mangifera indica dan 3  jenis  diantaranya  adalah  endemik.  Dilaporkan bahwa  di  Kalimantan  ditemukan  23  jenis Mangifera  yang  merupakan  tumbuhan  asli  dan  4 jenis yang merupakan tumbuhan endemik. Sehingga  dapat  dikatakan  bahwa  Kalimantan merupakan  pusat  persebaran  jenis-jenis  mangga ( Mangifera spp.) (4) .
Berdasarkan  kemungkinan  adanya  bakteri asam  laktat  yang  terdapat  pada  buah  mangga ( Mangifera  indica L.)  dan  besarnya  manfaat  yang dihasilkan  dari  bakteri  asam  laktat.  Maka dilakukan  penelitian  untuk  mengisolasi  bakteri asam  laktat  dari  buah  mangga  ( Mangifera  indica L.)  serta  mengidentifikasi  karakteristik  bakteri asam laktat (BAL) yang diperoleh.

## METODE PENELITIAN
Bahan
Penelitian ini menggunakan objek penelitian yaitu buah mangga matang dengan jenis mangga  yang  diteliti  yaitu  mangga  kweni ( Mangifera  odorata ).  Bagian  yang  akan  diteliti adalah  buah  mangga  kuweni    masak  yang  telah menimbulkan  aroma  khas  dan  tidak  cacat  yang diperoleh dari desa Sekolaq Darat Kubar, medium de  Men  Rogrosa  Sharpe  (MRS)  agar  oxoid,  dan medium  de  Men  Rogrosa  Sharpe  (MRS)  broth oxoid, pepton  water ,  medium  Potato  Dektrosa Agar (PDA) dan Nutrient Agar (NA) Merck, NaCl 0,9%, larutan H 2 O 2 3% , cat kristal violet, cat lugol iodin,  alcohol  96%  dan  safranin  yang  diperoleh dari laboratorium Farmasi Universitas Mulawarman.

## Peralatan
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini yaitu  toples,  pisau cutter ,  timbangan  analitik,  labu ukur,  labu  Erlenmeyer,  cawan  Petri,  incubator, laminar  air  flow ,  autoklaf,  kaca  objek, hot  plate , pinset,  bunsen,  cawan  porselin,  spatel  logam,  ose gores, rak tabung, mikroskop listrik.

## Pelaksanaan Penelitian
1. Penyiapan Sampel
Sampel  buah  mangga  diambil  di  daerah Sekolaq  Darat  Kubar.  Buah  mangga  merupakan buah mangga masak dan tidak cacat, dicuci dengan air  mengalir  dan  dikeringkan.  Setelah  kering dikupas kulitnya dengan pisau staines steel steril. 2. Proses pembusukan
Sampel  buah  mangga  yang  telah  dikupas dan  dipotong  dimasukkan  ke  dalam  daun  pisang steril dan dibungkus. Setelah dibungkus dimasukkan  ke  dalam  wadah  berupa  toples  kedap udara  dan  cahaya.  Dilakukan  pembusukan  selama 72 jam pada suhu ruangan.
3. Pengenceran Sampel Sampel hasil pembusukan di ambil pulp nya, dicampurkan  lalu dimasukkan sebanyak 1 gram ke dalam  tabung  reaksi  yang  berisikan  9  mL MRS broth .  Setelah  dimasukkan  di  inkubasi  selama  48 jam  pada  suhu  37  ºC.  Kemudian  hasil  inkubasi diambil  dan  dilakukan  pengenceran  dengan mengambil 100 µL hasil inkubasi ditambahkan ke dalam  900  µL pepton  water sehingga  diperoleh pengenceran
10 -1 . Kemudian hasil dari pengenceran  10 -1 diambil  kembali  100  µL  dan dimasukkan kembali ke dalam tabung berisi pepton water 900 µL. Pengenceran terus dilakukan sampai didapat pengenceran 10 -9 .
4. Isolasi bakteri asam laktat (BAL)
Pengenceran  10 -9 yang  diperoleh  diambil dengan  menggunakan  ose  bulat  sebanyak  1  ose. Kemudian  dilakukan  inokulasi  ke  dalam  medium MRS agar dengan membagi cawan Petri ke dalam empat kuadran yaitu kuadran 1, kuadran 2, kuadran 3  dan  kuadran  4  dilakukan    metode  gores membentuk zig  zag bersambung  tiap  kuadran. Diinkubasi cawan petri selama 7 hari pada suhu 37 ºC.  Setelah  proses  inkubasi  selesai  dilanjutkan dengan  mengisolasi  koloni-koloni  yang  tumbuh masing-masing  berdasarkan  perbedaan  morfologi koloni  bakteri  dalam  cawan  Petri  setiap  kuadran. Dilakukan  isolasi  sampai  diperoleh  isolat  atau koloni tunggal dari tiap cawan petri.
5. Identifikasi bakteri asam laktat (BAL) Isolat yang diperoleh diidentifikasi menggunakan uji katalase dan metode makroskopik  serta  mikroskopik.  Uji  katalase dengan meneteskan larutan H 2 O 2 pada objek glass ,
kemudian diambil olesan bakteri dengan menggunakan ose dan dioleskan pada larutan pada objek glass , dilihat reaksi yang terbentuk jika tidak terbentuk  gelembung  menandakan  reaksi  positif. Metode  makroskopik  dengan  melihat  langsung morofologi  isolat  bakteri  yang  tumbuh  pada medium  meliputi  bentuk  dan  warna  bakteri.  Dan metode mikroskopik dengan menggunakan mikroskop  dengan  metode  pewarnaan  gram. Pewarnaan  gram  dilakukan  dengan  mengoleskan bakteri  diatas objek  glass ,  difikasasi  lalu  ditetesi cat  gram  A,  diamkan  selama  1  menit,  ditetesi  cat gram B, diamkan selama 1 menit, ditetesi cat gram C,  diamkan  selama  30  detik,  ditetesi  cat  gram  D, diamkan 2  menit. Kemudian ditutup dengan cover glass dan  ditetesi  dengan  minyak  emersi  lalu diamati bentuk dan warna sel.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Isolasi bakteri asam laktat (BAL)
Isolasi  bakteri  merupakan  sebuah  teknik untuk  mendapatkan  koloni  tunggal  suatu  bakteri. Isolasi  bakteri  asam  laktat  melalui  proses pembusukan  untuk  mendapatkan  bakteri  asam laktat  dan  dengan  menggunakan  media  selektif de Men Rogrosa Sharpe yang bertujuan mengoptimalkan  pertumbuhan  dan  mendapatkan koloni bakteri asam laktat yang diharapkan.
Proses  isolasi  dilakukan  proses plating , kultur  dari  pengenceran  10 -9 diinokulasikan  pada media  MRS  Agar  dengan  metode  gores  dengan dibagi dalam empat kuadran dan diinkubasi dalam inkubator.  Koloni  BAL  tunggal  yang  tumbuh dimurnikan kembali dengan cara menginokulasikan kembali koloni ke dalam media MRS  Agar  (Merck)  secara  gores  dan  diinkubasi pada  suhu  selama  37 0 C  48  jam  dalam  suasana anaerob (3) .  Hasil  isolasi  BAL  dapat  dilihat  pada Gambar 1.
Dari  hasil  isolasi  yang  dilakukan  diperoleh koloni  tunggal  dari  buah  mangga  kuweni  yang disebut  sebagai  isolat  sebanyak  satu  isolat  yang memiliki  bentuk  dan  warna  yang  sama  pada masing-masing kuadran goresan.
1. Identifikasi Isolat Hasil Isolasi Identifikasi bakteri bertujuan untuk menentukan  karakteristik  khusus  yang  dimiliki oleh  isolat  yang  diperoleh  yang  mempunyai karakteristik sama dengan bakteri yang diinginkan. Beberapa cara yang digunakan untuk
mengidentifikasi  BAL  pada  penelitian  ini  yaitu dilakukan  secara  makroskopik,  mikroskopik  dan uji katalase.
a. Identifikasi Makroskopik
Identifikasi  makroskopik  dilakukan  dengan melihat  langsung  isolat  yang  tumbuh  pada  media agar meliputi warna, bentuk, tepi, permukaan serta sudut  elevasi  yang  terbentuk  pada  isolat.  Hasil identifikasi  mikroskopik  dapat  di  lihat  pada  Tabel 1.
Dari  hasil  identifikasi  secara  makroskopik memperlihatkan hasil berupa isolat yang mempunyai  warna  putih  susu,  bentuk  bulat,  tepi entire ,  permukaan  halus  dan  elevasi  yang cembung.  Hasil  ini  selanjutnya  di  sesuaikan dengan  standar  BAL  hasil  penelitian  yang dilakukan  sebelumnya (1) ,  BAL  hasil  isolasi  dari buang mangga kuweni yang diperoleh menunjukkan  gambaran  morfologi  makroskopik yang  sama  dengan  BAL  standar  yang  diperoleh pada penelitian sebelumnya.
b. Identifikasi Mikroskopik
Identifikasi  secara  mikroskopik  dilakukan dengan  menggunakan  mikroskop  listrik  untuk melihat bentuk dari sel bakteri. Identifikasi bakteri asam  laktat  secara  mikroskopik  dilakukan  dengan menggunakan  pewarnaan  tidak  langsung  dan pewarnaan gram.  Morfologi BAL hasil pewarnaan dapat dilihat pada Gambar 2.
Pengamatan pada mikroskop dengan pewarnaan  gram  menunjukkan  hasil  pengujian bahwa  sel  bakteri  berwarna  ungu,  hal  ini menunjukan  bakteri  asam  laktat  (BAL)  yang diisolasi  termasuk  dalam  golongan  bakteri  gram positif dengan bentuk bulat bergandengan/berantai diduga  dari  genus Streptococcus .  Bakteri  gram positif  mempunyai  ciri  dinding  sel  dengan peptidoglikon    yang  lebih  tebal  sehingga penyerapan  warna  dari  cat  kristal  violet  yang terserap  dalam  sel  akan  bertahan  walaupun dilakukan  pencucian  menggunakan  cat  peluntur (larutan  alkohol-lugol)  yang  diharapkan  dapat melunturkan cat warna pertama. Dengan bertahannya cat warna kristal violet yang berwarna ungu  ini  di  dalam  sel  bakteri  maka  cat  gram  D (safranin)  sebagai  cat  lanjutan  tidak  akan  bisa terserap  lagi,  sehingga  warna  sel  akan  tetap berwarna  seperti  warna  cat  yang  dipakai  pertama (cat kristal violet). Pengamatan secara mikroskopik tidak  langsung  menunjukkan  hasil  berupa  bentuk
sel  dari  isolat  bakteri  yaitu  berbentuk  batang dengan  dinding  sel  (a)  dan    selubung  sel  (b)  serta
bentuk  sel  yang  bergerombol  membentuk  rantai antara satu sel dengan sel yang lainnya.
Gambar 1. Hasil isolasi pada media MRS agar
Tabel 1. Identifikasi Isolat secara Makroskopik
No. Isolat Warna Bentuk Tepi Permukaan Elevasi 1. M 1 Putih susu Bulat Entire Halus mengkilap Cembung
Gambar 2 .  Identifikasi pewarnaan tak langsung dan gram secara Mikroskopik dengan perbesaran 100x Keterangan : a = selubung sel
b = sel bergerombol
Gambar 3. Hasil uji katalase
c. Identifikasi Uji Katalase
Uji  katalase  dilakukan  dengan  meneteskan larutan H2O2 3% pada kultur muda (umur 24 jam). Sifat reaksi terhadap uji katalase ditentukan dengan pemunculan  gelembung  gas  yang  memberikan indikasi  pembentukan  gas  CO2 (4) .  Pengujian katalase  adalah  pengujian  secara  biokimiawi  yang memperlihatkan  aktivitas  dari  bakteri  yang menghasilkan  enzim  katalase  ditandai  dengan terbentuknya  gelembung  pada  pengujian  yang menandakan  reaksi  positif.  Hasil  ujikatalase  dapat dilihat pada Gambar 3.
Uji  katalase  menunjukkan  bahwa  isolat bakteri asam laktat (BAL) yang diuji menunjukkan hasil  uji  berupa  katalase  negatif  dimana  tidak terbentuknya  gelembung  pada object  glass yang terdapat  cairan  H 2 O 2 saat  diolesi  dengan  bakteri. Hal  ini  dikarenakan  bakteri  asam  laktat  tidak memproduksi enzim katalase yang dapat mengubah  hidrogen  peroksida  menjadi  air  dan oksigen  dan  berkaitan  dengan  kemampuan  bakteri asam  laktat  yang  hanya  membutuhkan  sedikit oksigen untuk dapat hidup.

## SIMPULAN
1. Isolat  bakteri  asam  laktat dari buah  mangga mempunyai karakteristik secara
makroskopik yaitu warna putih susu, bentuk bulat,  tepi entire ,  permukaan  halus  dan elevasi cembung.
2. Hasil  identifikasi  bakteri  asam  laktat  dari buah  mangga  kweni  ( Mangifera  odorata ) menunjukkan  hasil  reaksi  negatif  terhadap uji katalase, merupakan bakteri gram positif bentuk bulat bergandengan/berantai ( Streptococcus )

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terimakasih  kepada Dekan Fakultas Farmasi Universitas Mulawarman,
Kepala
Laboratorium Penelitian dan
Pengembangan  FARMAKA  TROPIS  Fakultas Farmasi atas izin melaksanakan penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Daeschel MA.1989. & Schillinger U & Lucke FK  .1990.  Citasi  Fitriyani,  Ida.  Isolasi, Karakterisasi,  Identifikasi  Bakteri  Asam Laktat  (BAL)  dari  Buah  Mangga  Matang Yang  Berpotensi  Menghasilkan  Antimikroba. [Skripsi].  Yogyakarta,  UIN  Sunan  Kalijaga; 2010.
2. Lawalata,  Helen,  J,  Sembiring,  L.,  Rahayu, E.,S. Bakteri Asam Laktat Pada Bakasang dan Aktivitas Penghambatannya Terhadap Bakteri Patogen  dan  Pembusuk.  Prosiding  Seminar Nasional  Biologi  Fakultas  Biologi  UGM. Yogyakarta. 2010 : 1163 -1166.
3. Yuni  Nurisva  Sari  Maya.,  YN.,  Syukur.  S., Sari, J., Isolasi, Karakterisasi, dan Identifikasi DNA  Bakteri  Asam  Laktat  (BAL)  Yang
Berpotensi Sebagai Antimikroba dari
Fermentasi Markisa Kuning ( Passiflora edulis var. flavicarpa ). J. Kimia Unand. 2013. (ISSN No. 2303-3401), 2 (2): 81-91.
4. Noor,  A.,  ,  Ningsih,  D.R.,  Hasbianto,  A., Sabur,  A.,  Sebaran  Dan  Keragaman  Plasma Nutfah  Mangga  Di  Kalimantan  Selatan, Prosiding  Seminar  Nasional  Sumber  Daya Genetik Pertanian "Pengelolaan Sumber Daya Genetik  Lokal  sebagai  Sumber  Pertumbuhan Ekonomi Daerah". Kalimantan Selatan. 2015 : p. 2080218
5. Mirza Nuryady, M., Istiqomah. T., Faizah. R., Ubaidillah,  S.,  Mahmudi.  Z.,  Sutoyo.  Isolasi dan  Identifikasi  Bakteri  Asam  Laktat  Asal Youghurt. J. UNEJ. 2013, I (5): 1-11.