ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 14 (1) (2011) : 4 – 7

## Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi
Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Isolasi, Identifikasi dan Uji Toksisitas Senyawa Steroid dalam Ekstrak Kloroform Daun Ketapang ( Terminalia catappa Linn)
Candra Dewa Pramana Putra a , Enny Fachriyah a , Dewi Kusrini a*
a Organic Chemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
* Corresponding author: dewi.kusrini@live.undip.ac.id
Art ic le   Info Ab s t rac t Article history: Keywords: steroid, chloroform extract, yellow ketapang leaves.
The  isolation, identification  and  steroid  toxicity  test  of  chloroform  extract  of  ketapang leaf  ( Terminalia  catappa Linn)  has  been  conducted.  Steroids  were  isolated  by  the sokletation  method  of  the  yellowing  of  ketapang  leaves  using  chloroform  solvent. Separation of chloroform extract was done by TLC method and column chromatography. Toxicity  tests  were  performed  using  the  Brine  Shrimp  Lethality  Test  (BSLT)  method. Purification  was  performed  using  the  preparative  TLC  method.  Purity  was  tested  using TLC with various solvents and 2 dimension TLC. Further analysis of steroid compounds was accomplished using GC-MS method. The results obtained showed chloroform extract containing steroids, triterpenoids and flavonoids. Separation by column chromatography method yielded 11 fractions (fractions A, B, C, D, E, F, G, H, I, J and K). Toxicity test results showed that chloroform extract has potential as a pesticide with LC 50 value of 775.90 ppm and the result of fraction of column C potentially as antibacterial with LC 50 value of 99.43 ppm.  Based  on  the  results  of  phytochemical  screening,  C  fraction  contained  steroid compounds. Separation of steroids from fraction C was accomplished by using preparative TLC. The mass spectrogram data from the preparative result of the stain at Rf 0.125 shows the compounds contained therein are norethisterone and drostanolone propionate.

## Ab s t rak
Kata kunci: steroid, ekstrak kloroform, daun ketapang berwarna kuning.
Telah dilakukan isolasi, identifikasi dan uji toksisitas steroid dari ekstrak kloroform daun ketapang ( Terminalia catappa Linn.). Steroid diisolasi dengan metode sokletasi dari daun ketapang  yang  sudah  menguning  menggunakan  pelarut  kloroform.  Pemisahan  ekstrak kloroform  dilakukan  dengan  metode  KLT  dan  kromatografi  kolom.  Uji  toksisitas dilakukan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Pemurnian dilakukan menggunakan  metode  KLT  preparatif.  Kemurnian  diuji  menggunakan  KLT  dengan berbagai pelarut dan KLT 2 dimensi. Analisis senyawa steroid lebih lanjut menggunakan metode  GC-MS.  Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan  ekstrak  kloroform  mengandung senyawa  golongan  steroid,  triterpenoid  dan  flavonoid.  Pemisahan  dengan  metode kromatografi kolom menghasilkan 11 fraksi (fraksi A, B, C, D, E, F, G, H, I, J dan K). Hasil uji  toksisitas  menunjukkan  bahwa  ekstrak  kloroform  mempunyai  potensi  sebagai pestisida  dengan  nilai  LC 50 sebesar  775,90  ppm  dan  hasil  fraksi  kolom  C  berpotensi sebagai antibakteri dengan harga LC 50 99,43 ppm. Berdasarkan hasil penapisan fitokimia, fraksi C mengandung senyawa steroid. Pemisahan steroid dari fraksi C dilakukan dengan menggunakan  KLT  preparatif.  Data  spektrogram  massa  dari  hasil  preparatif  dari  noda pada Rf 0,125 menunjukkan senyawa yang terkandung di dalamnya adalah norethisterone dan drostanolone propionate.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 14 (1) (2011) : 4 – 7 5

## 1. Pendahuluan
Keanekaragaman  tumbuhan  di  Indonesia  dapat dimanfaatkan sebagai obat tradisional, yang khasiatnya telah  dibuktikan  oleh  masyarakat  luas.  Senyawa  obat dapat  diproduksi  dengan  berbagai  cara,  yaitu  isolasi langsung dari bahan alam, sintesis sempurna dari bahan sederhana  atau  melalui  sintesis  sebagian  dari  senyawa alam  yang  berstruktur  hampir  sama  dengan  senyawa obat.  Pemanfaatan  zat-zat  kimia  dalam  tumbuhan sangat  penting  karena  senyawa  bahan  alam  yang  aktif farmakologik yang digunakan sebagai obat ini umumnya tidak  ada  atau  ringan  efek  sampingnya  dibandingkan dengan  obat  dari  senyawa  hasil  sintetik.  Selain  itu, sebagai  bahan  awalnya  mudah  diperoleh  dan  mudah diperbaharui [1].
Terminalia  catappa  L  (tanaman  ketapang)  telah diketahui  dengan  baik  penggunaannya  sejak  lama sebagai  obat  tradisional  seperti  obat  alergi,  obat  sesak napas,  obat  peremajaan  kulit,  obat  iritasi  dan  obat hiperpigmentasi  [2],  obat  penyakit  liver  [3], obat  diare, sakit  kepala,  penyakit  kulit,  antioksidan  dan  pencegah kanker  [4].  Selain  itu,  daun  ketapang  juga  berpotensi memiliki  toksisitas antidiabetes [5]. Banyak penelitian- penelitian  yang  telah  dilakukan  menunjukkan  bahwa tanaman ketapang berfungsi sebagai anti-inflamantori, antikanker, antihepatotoksik, antigenotoksik, antikistogenik [2].
Hasil  penelitian  mengenai  daun  ketapang  hijau menggunakan  pelarut  kloroform  telah  dilakukan  uji pendahuluannya  dengan  BSLT  sebagai  antibakteri  [6]. Pada  penelitian  yang  telah  dilakukan  sebelumnya, diketahui  bahwa  daun  ketapang  yang  sudah  berwarna kuning  memiliki  toksisitas  sebagai  antibakteri  lebih besar  dibandingkan  daun  ketapang  yang  masih menempel di pohon [7] namun senyawa-senyawa kimia yang  berperan  belum  dipaparkan  sehingga  yang  ingin diteliti pada penelitian ini adalah mengisolasi senyawa- senyawa  dalam  ekstrak  kloroform  daun  ketapang  yang sudah berwarna kuning, pemisahan senyawa steroid, uji toksisitas  dan  mengidentifikasi  serta  menganalisis komponen-komponen  steroid  menggunakan  alat  GC- MS.
Penelitian  kali  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi, mengidentifikasi  dan  menganalisis  senyawa  kimia golongan  steroid  ekstrak  kloroform  daun  ketapang (Terminalia  catappa  Linn)  berwarna  kuning  yang berpotensi  sebagai  antibakteri,  uji  toksisitas  dengan metode  Brine  Shrimp  Lethality  Test  (BSLT)  dan menganalisis  komponen  kimia  dengan  kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS)

## 2. Alat, Bahan dan Metode

## Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  yaitu  daun  ketapang yang  sudah  berwarna  kuning,  asam  sulfat  pekat  p.a., kalium  iodida  p.a.,  asam  klorida  pekat  p.a.,  serbuk magnesium  p.a.,  amil  alkohol  p.a.,  ferri  klorida  (FeCl3) 1%, anhidrida asam asetat p.a., ammonia 25%, kloroform p.a.  dan  akuades  digunakan  untuk  skrining  fitokimia.
Kloroform  teknis  digunakan  sebagai  pelarut  dalam proses  sokletasi.  Etil  asetat  p.a.,  kloroform  p.a.  dan  n- heksana  p.a.  digunakan  sebagai  fase  gerak  dalam kromatografi  lapis  tipis  (KLT).  n-heksana  teknis,  etil asetat  teknis  dan  kloroform  teknis  digunakan  sebagai fase  gerak  dalam  kromatografi  kolom.  Fase  diam  yang digunakan  meliputi  silika  gel  60  GF254  untuk  KLT  dan silika  gel  60  G  untuk  kromatografi  kolom.  Plat  KLT dengan silika gel 60 (tanpa indikator fluoresen) ukuran 5x20 cm dengan ketebalan silika sebesar 0,25 mm untuk preparatif. BSLT dilakukan dengan menggunakan tween 20 p.a. dan larutan garam laut 3,80%.

## Alat
Peralatan  yang  digunakan  yaitu  seperangkat  alat soklet,  shaker,  cawan  petri  (petri  dish),  timbangan analit,  kertas  saring,  aluminium  foil,  penguap  putar (rotary  evaporator)  Buchi,  peralatan  gelas,  statif  dan klem, kapas, tissue, penangas, pemanas listrik, penjepit, mikropipet, pipa kapiler, plat tetes, lampu UV, chamber KLT,  kromatografi  kolom,  pipet  tetes,  tabung  reaksi, cawan penguapan, botol vial, akuarium, lampu neon 20 watt, labu takar 10 ml, 100 ml dan 1 L serta seperangkat alat analisis GC-MS.

## Prosedur Penelitian
Daun ketapang yang sudah berwarna kuning dicuci sampai  bersih  kemudian  diangin-anginkan  hingga kering. Setelah kering dihaluskan hingga menjadi serbuk. Sebanyak  80  gram  serbuk  daun  ketapang  yang  sudah berwarna  kuning  dibungkus  dengan  kertas  saring  dan dimasukkan  ke  dalam  soklet  yang  telah  dilengkapi dengan kondensor serta pelarut kloroform ke dalam labu alas  bulat,  proses  sokletasi  dilakukan  selama  ±  8  jam, hasil sokletasi kemudian diuapkan pelarutnya menggunakan  evaporator  Buchi,  selanjutnya  ekstrak kloroform  yang  masih  mengandung  pelarut  diuapkan dengan  cara  diangin-anginkan.  Untuk  mengetahui kandungan  kimia  dari  ekstrak  kloroform  dan  fraksinya yang  paling  aktif  dilakukan  uji  penapisan  fitokimia. Penapisan  ini  meliputi  uji  golongan  senyawa  alkaloid, steroid/triterpenoid,  flavonoid,  saponin,  kuinon  dan fenolik.
Terhadap ekstrak kloroform dilakukan kromatografi lapis  tipis  untuk  mendapatkan  pemisahan  terbaik dengan  fase  gerak  campuran  n-heksana  p.a., etil  asetat p.a. dan kloroform p.a. dengan perbandingan 2:0,1:3 dan fase diam berupa silika gel 60 GF254. Ekstrak koroform dilakukan kromatografi kolom dengan fase gerak berupa kloroform:n-heksana  dengan  perbandingan  1:2.  Fraksi kecil  hasil  kromatografi  kolom  ditampung  setiap  10  mL dalam  botol  vial.  Masing-masing  fraksi  kecil  dianalisis dengan  metode  KLT.  Fraksi-fraksi  kecil  dengan  pola pemisahan noda yang sama digabung menjadi satu fraksi besar,  dipekatkan  dan  diberi  notasi  A,  B,  C,  D  dan seterusnya.
Ekstrak kloroform daun ketapang dan fraksi-fraksi hasil  kromatografi  kolom  diuji  toksisitasnya  dengan metode BSLT. Pembuatan larutan konsentrasi 1000, 100 dan 10 ppm dengan penambahan tween 20. Uji toksisitas tersebut dilakukan dengan 3 kali replikasi.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 14 (1) (2011) : 4 – 7 6
Pemisahan  steroid  dari  fraksi  C  hasil  kromatografi kolom  menggunakan  KLT  preparatif,  dengan  eluen campuran  pelarut  n-heksana  dan  kloroform  dengan perbandingan  2:1.  Hasilnya  kemudian  dilakukan  uji fitokimia untuk mengetahui golongannya. Uji kemurnian dilakukan  dengan  menggunakan  metode  KLT  berbagai pelarut  serta  menggunakan  KLT  dua  dimensi.  Hasil preparatif  padatan  putih  diidentifikasi  dengan  alat  GC- MS.

## 3. Hasil dan Diskusi
Hasil  sokletasi  serbuk  daun  ketapang  berwarna kuning berupa ekstrak yang berwarna coklat kekuningan dengan  randemen  5,832%,  dari  hasil  uji  fitokimia menunjukkan  adanya  kandungan  senyawa  flavonoid, steroid dan triterpenoid. Pemisahan dengan menggunakan  kromatografi  kolom  dihasilkan  11  fraksi. Tabel  1  menunjukkan  hasil  uji  toksisitas  dengan menggunakan metode BSLT.
Tabel 1 Hasil uji toksisitas menggunakan metode BSLT
Sampel uji BSLT LC 50 (ppm) Aktivitas Ekstrak Kloroform 775,896 Pestisida Fraksi A 19,236 Antikanker Fraksi B 20,837 Antikanker Fraksi C 99,434 Antibakteri Fraksi D 17,826 Antikanker Fraksi E 28,205 Antikanker Fraksi F 11,011 Antikanker Fraksi G 55,054 Antibakteri Fraksi H 45,866 Antibakteri Fraksi I 542,755 Pestisida Fraksi J 9,790 Antikanker Fraksi K 39,484 Antibakteri
Dari hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa ada 4 fraksi yang berpotensi sebagai antibakteri (fraksi C, G, H dan  K).  Masing-masing  fraksi  tersebut  kemudian dilakukan  uji  fitokimia,  hasil  dari  uji  fitokimia menunjukkan  bahwa  fraksi  C  mengandung  senyawa steroid.  Selanjutnya  fraksi  C  dipisahkan  dengan menggunakan KLT preparatif. Isolat pada Rf 0,125 yang dihasilkan  dari  KLT  preparatif  berupa  padatan  putih dianalisis dengan menggunakan GC-MS.
Gambar 1 Kromatogram hasil GC padatan putih hasil KLT preparatif.
Dari  hasil  kromatografi  GC,  ternyata  ada  9  puncak yang menunjukkan bahwa padatan putih yang dihasilkan belum murni.

## Gambar 2 Senyawa Norethisterone
Spektrogram massa yang ditampilkan pada gambar 2 menunjukkan bahwa puncak pada waktu retensi 20,398 menit dengan kelimpahan sebesar 24,08% dan memiliki kemiripan  dengan  spektrogram  massa  dari  pusat  data GC-MS sebesar 96% merupakan senyawa norethisterone dengan pola fragmentasi sebagai berikut:
Gambar 3. Spektrogram massa puncak pada waktu retensi 20,398 menit
Gambar 4. Senyawa Drostanolone propionate
Sedangkan  spektrogram  massa  yang  ditampilkan pada gambar 3 menunjukkan bahwa puncak pada waktu retensi 25,434 menit dengan kelimpahan sebesar 10,17% dan memiliki kemiripan dengan spektrogram massa dari pusat  data  GC-MS  sebesar  98%  merupakan  senyawa drostanolone  propionate  dengan  pola  fragmentasi sebagai berikut:
Gambar 5. Spektrogram massa puncak pada waktu retensi 25,434 menit

## 4. Kesimpulan
Ekstrak  kloroform  daun  ketapang  yang  sudah berwarna  kuning  mengandung  senyawa  flavonoid, steroid  dan  triterpenoid  serta  berpotensi  sebagai pestisida dengan harga LC 50 sebesar 775,896 ppm. Fraksi C  hasil  kromatografi  kolom  ekstrak  kloroform mengandung  senyawa  steroid  dan  berpotensi  sebagai antibakteri dengan harga LC 50 sebesar 99,434 ppm. Hasil
analisis dengan GC-MS menunjukkan bahwa noda pada Rf  0,125  hasil  preparatif  pada  fraksi  C  diduga mengandung  dua  senyawa  steroid  yaitu  norethisterone dan drostanolone propionate.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  P Tarigan, Beberapa Aspek Kimia Sapogenin Steroid pada  Tumbuhan  di  Indonesia, Alumni,  Bandung ,
(1980)
[2]  Rahmanullah  Siddiqi,  Syed  Asad  Sayeed,  In  vitro antibacterial  activity  of  the  extracts  derived  from Terminalia catappa, Research Journal of Microbiology ,
2, 2, (2007) 180-184
[3]  Nien-Yung  Chiu,  Kuang-hsiung  Chang,  The illustrated  medicinal  plants  of  Taiwan,  Southern Materials Center, 1992.
[4]  H  Babayi,  I  Kolo,  JI  Okogun,  UJJ  Ijah,  The antimicrobial  activities  of  methanolic  extracts  of Eucalyptus  camaldulensis  and  Terminalia  catappa against some pathogenic microorganisms, (2004)
[5]  K  Anam,  RM  Widharna,  D  Kusrini, α -Glucosidase inhibitor  activity  of  Terminalia  species, IJP- International  Journal  of  Pharmacology ,  5,  4,  (2009) 277-280
[6]  Indri  Mandasari,  Isolasi  dan  Identifikasi  Senyawa Alkaloid  dalam  Ekstrak  Kloroform  Daun  Ketapang (Terminalia  cattapa  L.), Skripsi,  Jurusan  Kimia Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam, Universitas Diponegoro, Semarang, hal , 33, (2006)
[7]  Elin  Yulinah  Sukandar,  Asep  Gana  Suganda,  Gemi Utami Pertiwi, Uji aktivitas antijamur salep dan krim ekstrak  daun  ketapang  Terminalia  cattapa  L.  pada kulit  kelinci, Majalah  Farmasi  Indonesia ,  17,  2006,
(2006)