Pengaruh Jintan Hitam ( Nigella sativa ) pada Histopatologi

## Hepar dan Ginjal Tikus Putih yang Dipapar Organofosfat
The Effect of Black Cumin (Nigella sativa) on Histopathology of Liver and Kidney in Albino Rats with Organophosphate Exposure
Viski Fitri Hendrawan 1 *, Yudit Oktanella 1 , Aulia Firmawati 1 , Galuh Chandra Agustina 1
1 Laboratorium Reproduksi Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya, Puncak Dieng Ekslusif, Dau, Malang, Jawa Timur, 65151, Indonesia.
* Corresponding author : viski@ub.ac.id

## Abstrak
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak jintan hitam ( Nigella sativa )  terhadap  gambaran  histopatologi  hepar  dan  ginjal  pada  tikus  putih  yang  terpapar  organofosfat. Penelitian ini menggunakan 20 ekor mencit jantan dibagi menjadi lima kelompok perlakuan, yakni (K-) tanpa organofosfat  dan  jintan  hitam,  (K+)  diinduksi  organofosfat  40  mg/kgBB,  kelompok  perlakuan  diinduksi organofosfat 40 mg/kgBB dan ekstrak jintan hitam sebagai terapi (P1) 200 mg/kgBB, (P2) 400 mg/kgBB, dan (P3) 600 mg/kgBB. Pemberian organofosfat selama delapan minggu dan terapi ekstrak jintan hitam diberikan selama tiga minggu kemudian mencit dieutanasia, organ hepar dan ginjal diambil untuk dilakukan pengamatan histopatologi  menggunakan  Haematoxylin-Eosin  (HE).  Data  dianalisis  dengan  uji OneWay ANOVA dilanjutkan  uji  Tukey.  Hasil  penelitian  menunjukkan  adanya  perbedaan  signifikan  kelompok  perlakuan terhadap  kerusakan  hati  dan  ginjal  (p<0,05).  Degenerasi  dan  nekrosis  hepar  kelompok  P2  dan  P3  berbeda dengan K+ dengan rata-rata 2,24±0,9, pada ginjal dengan rata-rata 2,52±0,8. Dapat disimpulkan ekstrak jintan hitam berpengaruh nyata memperbaiki hepar dan ginjal pada kelompok P3 (600 mg/kgBB).
Kata kunci: organofosfat, jintan hitam, Nigella sativa , hepar, ginjal

## Abstract
This study aimed to determine the effect of black cumin extract (Nigella sativa) on the histopathological of the liver and kidneys in albino rats exposed to organophosphates. This study used 20 male mice divided into five treatment groups, i.e. (K-) without organophosphate and black cumin, (K+) induced by organophosphate 40 mg/kg BW, treatment group induced by organophosphate 40 mg/kg BW and black cumin extract as therapy (P1 ) 200 mg/kg BW, (P2) 400 mg/kg BW, and (P3) 600 mg/kg BW. Organophosphate administration for eight weeks and black seed extract therapy was given for three weeks then the mice were euthanized, the liver and kidney  organs  were  taken  for  histopathological  observation  using  Haematoxylin-Eosin  (HE).  Data  were analyzed using OneWay ANOVA test followed by Tukey test. The results showed that there were significant differences  between  the  treatment  groups  for  liver  and  kidney  damage  (p<0,05).  Hepatic  degeneration  and necrosis in the P2 and P3 groups differed from K+ with an average of 2,24±0,9, in the kidneys with an average of 2,52±0,8. It can be concluded that black cumin extract has a significant effect on improving the liver and kidneys in groups P3 (600 mg/kgBW).
Keywords: organophosphate, black cumin, Nigella sativa, liver, kidney
Received: 18 September 2022
Revised: 11 November 2022 Accepted: 12 December 2022

## PENDAHULUAN
Penanggulangan  hama  yang  mengganggu aktivitas pertanian paling sering yaitu menggunakan pestisida, namun pada penggunaaannya  pestisida  memiliki  dampak
buruk  yaitu  akumulasi  residu  pada  produk pertanian, pencemaran lingkungan, serta masalah kesehatan  pada  manusia  dan  hewan  akibat  efek toksik  non-target  dari  penggunaan  pestisida (Dagg et  al .,  2019).  Pestisida  yang  sering digunakan  di  Indonesia  ialah  jenis  organofosfat
(Mendes et  al .,  2018).  Organofosfat  merupakan golongan pestisida yang dianjurkan Kementerian Pertanian  Indonesia  dan  disukai  oleh  petani karena sifatnya lebih cepat dan signifikan dalam membasmi  hama  dibanding  golongan  pestisida lainnya (Tuhumury et al ., 2012). Salah satu jenis organofosfat yang paling banyak digunakan ialah diazinon.  Diazinon  bersifat  neurotoksik  karena bertindak  sebagai  inhibitor  aktivitas  enzim asetilkolinesterase yang menyebabkan akumulasi asetilkolin (ACh) pada sinapsis dan neuromuscular  junction , namun  dalam  beberapa penelitian  diketahui  bahwa  diazinon  dapat menyebabkan  efek  lain  seperti  lipid  peroksidasi dan gangguan terhadap enzim-enzim antioksidan (Du et  al .,  2015).  Keracunan  organofosfat menunjukkan gambaran yang heterogen berkaitan dengan  krisis  kolinergik  serta  kerusakan  fungsi organ hepar dan ginjal.
Penelitian in vitro ditemukan bahwa sel yang diinduksi  diazinon  menunjukkan  peningkatan produksi Reactive  Oxygen  Species (ROS) intraseluler yang menyebabkan gangguan keseimbangan redoks sel dan memicu kerusakan pada protein, lipid, dan DNA hingga kematian sel, pada  tinjauan  jaringan  akan  dijumpai  kerusakan struktur histologi terutama pada hepar dan ginjal. Temuan  ini  terkonfirmasi  dengan  gambaran histopatologi hepar dan ginjal sebagai organ yang bertugas untuk memetabolisme dan mengekskresi diazinon (Gaudette et al ., 2020).
Hepar adalah kelenjar terbesar di tubuh dan memainkan  fungsi  paling  penting  tidak  hanya dalam  penyimpanan  dan  pelepasan  nutrisi  tetapi juga dalam netralisasi dan eliminasi berbagai zat beracun.  Ginjal  merupakan  organ  kadang menerima  dampak  yang  tidak  dinginkan  akibat dari penggunaan obat, seperti toksisitas terhadap nefron  (Jannat et  al .,  2018).  Organofosfat  dapat meningkatkan stres oksidatif, pembentukan ROS, menginduksi cedera seluler dan nekrosis melalui penurunan  tingkat  aktivitas  enzim  antioksidan non-enzimatik  dan  enzimatik  yang  mengarah pada  produksi  berlebihan  ROS,  sehingga  dapat menyebabkan  kerusakan  pada  lipid  membran, protein  dan  asam  nukleat,  yang  menyebabkan toksisitas,  disfungsi,  dan  cedera  pada  hepar
(Galaly et  al .,  2014;  Almohawes,  2017;  Rashid dan Khan, 2017).
Cedera  pada  hepar  dan  ginjal  yang disebabkan  oleh  organofosfat  dapat  dilihat dengan  perubahan  makroskopis  berupa  nekrosis dan  degenerasi,  sedangkan  secara  mikroskopis ditemukan  pembesaran  sinusoid,  terbentuknya vakuola pada sel hepatosit, portal inflamasi, serta hemoragi  hepar,  sedangkan  pada  hepar  yaitu adanya  degenerasi  hidrofik,  perubahan  histologi tubulus dan glomerulus (Ko et al ., 2019).
Obat  tradisional  adalah  bahan  atau  ramuan bahan  yang  berupa  bahan  tumbuhan,  bahan hewan,  bahan  mineral,  sediaan  sarian  (galenik) atau  campuran  dari  bahan  tersebut  yang  secara turun temurun telah digunakan untuk pengobatan, dan  dapat  diterapkan  sesuai  dengan  norma  yang berlaku  di  masyarakat  (Qian et  al .,  2014).  Ada berbagai  macam  tanaman  yang  digunakan sebagai  tanaman  obat  diantaranya  jintan  hitam ( Nigella  sativa ),  tanaman  ini  sering  digunakan oleh masyarakat sebagai anti-inflamasi, antikanker, antiparasit, antibakteri, dan antioksidan (Ping et al ., 2014). Senyawa lain yang dikandung  jintan  hitam  yakni  resin,  alkaloid, flavonoid,  asam  organic,  tannin,  saponin  dan protein, dalam reproduksi jintan hitam membantu memodulasi siklus repoduksi pada hewan betina, meningkatkan  spermatogenesis,  meningkatkan karakteristik  semen  dan  mengurangi  radikal bebas pada plasma seminalis, meningkatkan kerja Gonadotropine  Releasing  Hormone (GnRH), Luteinizing  Hormone (LH)  dan  testosterone (Parandin,  2012).  Tujuan  dari  penelitian  ini adalah  untuk  mengetahui  pengaruh  pemberian ekstrak jintan hitam terhadap gambaran histopatologi  hepar  dan  ginjal  pada  tikus  putih yang terpapar organofosfat.

## METODE PENELITIAN

## Pembuatan Ektrak Jintan Hitam
Proses  ekstraksi  jintan  hitam  kering, kemudian dibuat serbuk, ditambahkan etanol 70% sampai  terendam,  dilanjutkan  maserasi  satu minggu  dengan  penggantian  pelarut,  kemudian filtrasi  diperoleh  filtrat  dan  residu.  Filtrat  yang terkumpul hingga filtrat jernih akan diteruskan ke
tahap evaporasi menggunakan Rotatory Evaporator suhu 40 o C sehingga diperoleh ekstrak jintan  hitam.  Ekstrak  hasil  evaporasi  yang berbentuk  cair  dikeringkan  menggunakan  freeze dryer (Linianti et al ., 2017).

## Pemberian Organofosfat
Pemberian  organofosfat  dilakukan  setelah aklimatisasi  tujuh  hari  secara  per  oral  dengan sonde lambung pada minggu ke-2 hingga minggu ke-8  dosis  40  mg/kgBB  (Pratama et  al .,  2019), kelompok P1, P2, dan P3 diberikan terapi ekstrak jintan  hitam  dengan  dosis  200  mg/kgBB,  400 mg/kgBB dan 600 mg/kgBB mulai minggu ke-5 hingga  minggu  ke-8  (Hadi et  al .,  2018).  Semua prosedur penelitian berjalan sesuai dengan uji etik (Universitas Brawijaya No. 935-KEP-UB).

## Pembuatan Preparat Histopat
Pembuatan  preparat  menggunakan  metode parafin  yaitu  fiksasi  menggunakan  NBF  10%, kemudian  dehidrasi  alkohol  bertingkat  50% selama 24 jam, etanol 70% selama dua jam, etanol 80%,  95%  dan  absolut  20  menit,  kemudian clearing larutan xylol I 20 menit dan xylol II 30 menit.  Kemudian  infiltrasi  dan  embedding, dilanjut  section/trimming,  diletakkan  di  atas object  glass  yang  telah  diolesi  entellan  dan dilakukan pewarnaan Haematoxylin-Eosin (HE). Preparat  diamati  jaringan  hepar  dan  ginjal menggunakan mikroskop cahaya Olympus DP20 perbesaran 400x yang dilengkapi camera Optilab (Aulanni’am et al ., 2012).

## Analisis Data
Analisis  data  menggunakan  uji OneWay ANOVA,  dengan  tingkat  kepercayaan  95% (α=0,05)  dilanjutkan  dengan  uji  Tukey (Sukestiyarno, 2014).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Skoring  kerusakan  jaringan  hepar  di  tiap perlakuan  akan  dinilai  menurut  Knodell  (2000) dan  Klopfleisch  (2013)  yang  telah  dimodifikasi. Berdasarkan uji OneWay ANOVA menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan pada rata-rata degenerasi  dan  fokal  nekrosis  hepatosit  dari
kelima  kelompok  yang  diuji  (p<0,05).  Nilai tersebut  menunjukkan  bahwa jintan  hitam memiliki  efek  protektif  terhadap  gambaran histopatologi  hepatosit  pada  hepar  tikus  putih yang diinduksi organofosfat. Pada K+ 3,28±1,13 nilai  degenerasi  dan  fokal  nekrosis  dengan  nilai lebih  tinggi  dibanding  K-  0,88±1,54  (Tabel  1), kemudian  nilai  degenerasi  dan  fokal  nekrosis hepatosit P3 yaitu 2,04±0,38 memiliki nilai lebih rendah  dibanding  P1  yaitu  2,84±0,62,  hal  ini sesuai  dengan  Khan  dan  Afzal,  2016  yang menyatakan bahwa pemberian organofosfat lebih dari  tujuh  hari  menyebabkan  perubahan  berupa pembengkakan  hepatosit,  degenerasi  inti  sel, kongesti serta pendarahan jaringan (Gambar 1).
Sedangkan  pemberian  organofosfat  dosis berlebih ditambah ekstrak jintan hitam menunjukkan  hasil  berupa  kerusakan  hepatosit dan  nekrosis  yang  lebih  sedikit  dibandingkan dengan  pemberian  organofosfat  tanpa  ekstrak jintan hitam karena ekstrak jintan hitam memiliki efek  hepatoprotektif  yaitu  thymoquinone  yang menghambat aktivitas hepatic isozim CYP1A1/A2 yang terlibat dalam biotransformasi dari xenobiotic sebagai pemicu genotoksik. Sifat- sifat antioksidan thymoquinone juga bertanggung jawab terhadap nekrosis hingga kerusakan kronis pada sel-sel hepar, selain itu thymoquinone dapat mengurangi  dampak  dari  ROS  yang  diproduksi, mampu  meningkatkan  aktivitas  katalase  dan sebagai  protektor  terhadap  jaringan  hepar  dari jejas (Afdin et al ., 2018).
Hepatosit  yang  mengalami  nekrosis  akan melepaskan  berbagai  mediator  yang  akan memulai proses inflamasi dan menarik datangnya sel-sel radang. Adanya sel radang tersebut dapat diamati  pada  kelompok  hewan  coba  yang  diberi paparan organofosfat secara terus menerus (Aqil et  al ,  2018).  Kerusakan  hepatosit  akibat pemberian  organofosfat  secara  terus-menerus diduga  akibat  stres  oksidatif.  Pada  hewan  coba yang dipaparkan organofosfat terjadi peningkatan malondialdehid  (MDA)  dan  penurunan  enzim pengikat radikal bebas endogen. Khan et al ., 2016 melaporkan  bahwa  organofosfat  menginduksi peroksidasi lipid membran. Paparan organofosfat yang terus menerus akan membentuk  ROS yang menyebabkan peroksidasi lipid.
Tabel 1. Hasil pemeriksaan skoring degenerasi dan fokal nekrosis hepar tikus putih
Kelompok Rata-Rata±Simpangan Baku K+ 3,28 a ±1,13 K- 0,88 a ±1,54 P1 2,84 a ±0,62 P2 2,32 a ±0,57 P3 2,04 a ±0,38
Kelompok K+, K-, P1, P2, P3 memiliki notasi yang sama (p>0,05).
Tabel 2 . Hasil pemeriksaan skoring tubulus ginjal tikus putih Kelompok Rata-Rata±Simpangan Baku K+ 2,76 a ±0,47 K- 1,00 a ±0,93 P1 2,20 a ±0,52 P2 2,00 a ±1,48 P3 1,96 a ±1,29
Kelompok K+, K-, P1, P2, P3 memiliki notasi yang sama (p>0,05).
Tabel 3 . Hasil pemeriksaan skoring glomerulus ginjal tikus putih Kelompok Rata-Rata±Simpangan Baku K+ 2,80 a ±0,44 K- 0,84 a ±0,68 P1 2,20 a ±0,83 P2 1,84 a ±0,80 P3 1,68 a ±0,26
Kelompok K+, K-, P1, P2, P3 memiliki notasi yang sama (p>0,05).
Gambar 1 . Kerusakan jaringan hepar tiap perlakuan (400x, pewarnaan HE). Infiltrasi sel radang PMN Degenerasi hepatosit
Nekrosis sel
Gambar 2 . Kerusakan jaringan ginjal tiap perlakuan (400x, pewarnaan HE).
Nekrosis sel
Infiltrasi sel radang PMN
Hemoragi
Efek toksik dan inflamasi dari organofosfat pada  hepar  dapat  dinetralisir  oleh  antioksidan. Beberapa  penelitian  menunjukkan  berbagai antioksidan yang terdapat dalam ekstrak tanaman obat  dapat  digunakan  untuk  menekan  stres oksidatif yang diinduksi organofosfat pada hewan percobaan  diantaranya  jintan  hitam.  Ekstrak jintan hitam utamanya berperan sebagai pembersih/penyapu  radikal  bebas,  membentuk kompleks  dengan  logam  ( metal  chelation ), serta menstabilkan  sistem  membran  (Kooti et  al ., 2016).  Biokomponen  jintan  hitam  berperan sebagai antioksidan, memulihkan fungsi sel hepar yang  rusak  akibat  radikal bebas  yang  dihasilkan oleh  organofosfat.  Sifat  antioksidan  ini  terdapat dalam  jintan  hitam  dengan  timoquinon  sebagai komponen aktif terbesarnya (Wang et al ., 2020), selain itu juga mengandung karoten yang diubah oleh hepar menjadi vitamin A sebagai penghancur sel-sel rusak pemicu kanker, sebagai antibakteri, dan  memiliki  kandungan  kalsium,  sodium, potassium,  magnesium,  selenium  dan  zat  besi yang dibutuhkan dalam jumlah membantu fungsi enzim sebagai stimulus imunitas tubuh (Mahdavi et  al .,  2015).  Jintan  hitam  mampu  menekan
perubahan  patologis  dan  kerusakan  jaringan hepar akibat jejas (Molazadeh et al ., 2017). Jintan hitam  dengan  dosis  250-500  mg/kgBB  juga mampu melindungi hepar dari induksi organofosfat (Hu et al ., 2019).
Dari  uji OneWay ANOVA  didapatkan perbedaan  rata-rata  skor  kerusakan  histologis nefritis  interstitial  tubulus  ginjal  yang  bermakna antara  kelompok  K+,  K-,  P1,  P2  dan  P3.  Pada kelompok  P3  memiliki  nilai  kerusakan  tubulus lebih rendah dengan nilai 1,96±1,29 pada nefritis interstitialis  tubulus  medulla,  dibanding  P1 dengan rata-rata 2,2±0,52 (Tabel 2). Nilai tersebut menunjukkan  bahwa  jintan  hitam  memiliki  efek protektif terhadap  gambaran  nefritis  interstitialis tubulus ginjal tikus.
Analisis rata-rata pada kerusakan glomerulus, yaitu nampak adanya degenerasi dan fokal nekrosis. Pada perlakuan K+ memiliki nilai rata-rata tertinggi yaitu 2,8±0,44, kemudian pada kelompok  P1  yaitu  2,2±0,83  daripada  P3  yaitu perlakuan  pemberian  organofosfat  40  mg/kgBB dan  terapi  ekstrak  jintan  hitam  600  mg/kgBB selama  delapan  minggu  +  terapi  ekstrak  jintan hitam  200  mg/kgBB  yaitu  1,68±0,26  (Tabel  3).
Nilai  tersebut  menunjukkan  bahwa  jintan  hitam memiliki  efek  protektif  terhadap  gambaran histopatologi degenerasi dan focal nekrosis pada tubulus ginjal tikus putih.
Mekanisme  kerusakan  ginjal  berawal  dari adanya proses pengeluaran toksin dari organofosfat yang memberikan efek nefrotoksik, sehingga  memicu acute  kidney  injury ,  individu yang terpapar organofosfat memiliki resiko 6,17 kali  lebih  tinggi  terdampak acute  kidney  injury . Kerusakan  ginjal  karena  zat  toksik  dapat diidentifikasi  berdasarkan  perubahan  struktur histologinya, yaitu nefritis interstitial, degenerasi tubular  dan  glomerular  yang  secara  morfologi ditandai  dengan  nekrosis  sel  yang  ditunjukkan pada  Gambar  2  (Suhita,  2013).  Perbedaan  nyata juga nampak pada pemberian terapi jintan hitam dengan berbagai dosis, karena tiap dosis memiliki efek  protektif  terhadap  gambaran  histopatologi yang  berbeda.  Hal  tersebut  sesuai  teori  bahwa antioksidan  pada  ekstrak  jintan  hitam  dapat mengurangi  degenerasi  sel  akibat  radikal  bebas. Antioksidan  dapat  ditemukan  pada  jintan  hitam yang  telah  diketahui  sebagai  antioksidan  yang mampu mempertahankan integritas membran sel. Pemberian terapi ekstrak jintan hitam dosis tinggi dapat  memberikan  proteksi  terhadap  kerusakan sel  pada  ginjal.  Sebagai  antioksidan,  vitamin  E berfungsi  sebagai  donor  ion  hidrogen  yang mampu  mengubah  radikal  peroksil  menjadi radikal  tokoferol  yang  kurang  reaktif,  sehingga tidak  mampu  merusak  rantai  asam  lemak Indrianita (2013).

## KESIMPULAN
Pemberian  ekstrak  ekstrak  biji  jintan  hitam dapat  mempengaruhi  perbaikan  jaringan  hepar dan ginjal tikus putih yang diinduksi organofosfat.  Dosis  terbaik  ekstrak  biji  jintan hitam  yang  dapat  digunakan  sebagai  alternatif hepatoprotektor  dan  renaloprotektor  tikus  akibat induksi organofosfat adalah 600 mg/kgBB.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terimakasih  kami  sampaikan  pada  pihak terkait  yang  telah  berkontribusi  pada  penelitian
ini  diantaranya  peneliti  dan  Laboratorium
Embriologi Fakultas
Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.

## DAFTAR PUSTAKA
Afdin,  Rizky,  &  Quzwain,  F.  (2018).  Efek Hepatoprotektor  Ekstrak  Jintan  Hitam ( Nigella  sativa )  terhadap  kerusakan  Hepar Tikus Putih ( Rattus norvegicus ) Jantan Galur Sparague  Dawley  yang  Diinduksi  Etanol. Jurnal Kedokteran dan Kesehatan , 6, 36-44.
Almohawes,  Z.  N.  (2017).  Protective  Effect  of
Melatonin on Gentamicin Induced Hepatotoxicity in Rats. Journal Pharmacology Toxicology , 12(3), 129-135.
Aqil,  K.,  Khan,  M.  U.,  Aslam,  A.,  Javeed,  A., Qayyum,  R.,  &  Yousaf,  F.  (2018).  In  vitro Antiviral  Activity  of Nigella  sativa against Peste  des  Petits  Ruminants  (PPR)  Virus. Pakistan Journal Zoology , 50(6), 2223-8.
Aulanni’am,  Roosdiana,  A.,  &  Rahmah,  N.  L.
(2012). The Potency of Sargassum duplicatum  Bory  Extract  on  Inflammatory Bowel Disease Therapy in Rattus norvegicus . Journal of Life Sciences, 6, 144- 154.
Dagg,  K.,  Irish,  S.,  Wiegand,  R.  E.,  Shililu,  J., Yewhalaw, D., & Messenger, L. A. (2019). Evaluation  of  toxicity  of  clothianidin (neonicotinoid)  and  chlorfenapyr  (pyrrole) insecticides  and  cross-resistance  to  other public  health  insecticides  in  Anopheles arabiensis  from  Ethiopia. Malaria  Journal , 18(1), 49.
Du, L., Dong, F., Guo, L., Hou, Y., Yi, F., Liu, J., &  Xu,  D.  (2015).  Interleukin-1β  increases permeability and upregulates the expression of  vascular  endothelialcadherin  in  human renal glomerular endothelial cells.
Molecular Medical Report , 11, 3708–3714.
Galaly, S. R., Ahmed, O. M., & Mahmoud, A. M. (2014).  Thymoquinone  and  Curcumin Prevent Gentamicin-Induced Liver Injury by attenuating  Oxidative  Stress,  Inflammation, and  Apoptosis. Journal  of  Physiology  and Pharmacology , 65(6), 823-832.
Gaudette,  S.,  Hughes,  D.,  &  Boller,  M.  (2020). The  endothelial  glycocalyx:  Structure  and function in health and critical illness. Journal Veterinary Emerging Critical Care , 30, 117– 134.
Hadi,  S.,  Mirmiran,  P.,  Daryabeygi-Khotbesara,
R.,  &  Hadi,  V.  (2018).  Effect  of Nigella sativa oil  extract  on  inflammatory  cytokine response and oxidative stress among people with type 2 diabetes mellitus: a randomized, double-blind,  placebo  controlled  trial. Progress in Nutrition , 20(1-S), 127-33.
Indrianita,  A.  (2013).  Efek  Kombinasi Jus  Buah
Jambu  Biji  (Psidium  guajava)  dan  Perasan
Daun  Murbei  ( Morus  indica  Auct.  Non.  L. )
Terhadap  Gangguan  Toleransi  Glukosa
Darah Tikus Putih Jantan ( Rattus novergicus ) Akibat Efek Samping Deksametason. Jurnal  Ilmiah  Mahasiswa Universitas Surabaya , 2(1).
Jannat, N., Amin, T., Sultana, N., Jahan, M. R., & Islam, M. R. (2018). Long term administration of gentamicin affects hemato- biochemical parameters and liver architecture  of  Swiss  Albino  mice. Journal Advance Biotechnology , 1(2), 29-35.
Khan,  M.  A.,  &  Afzal,  M.  (2016).  Chemical composition  of Nigella  sativa  Linn :  part  2 recent  advances. Inflammopharmacology , 24, 67-79.
Klopfleish,  R.  (2013).  Multiparametric  and
Semiquantitative  Scoring  Systems  for  the Evaluation of Mouse Model Histopathology -  A  Systematic  Review. BMC  Veterinary Research , 1(1), 1-6.
Ko, S. Y., Wang, S. E., Lee, H. K., Jo, S., Han, J.,
Lee,  S.  H.,  &  Son,  H.  (2019).  Transient receptor  potential  melastatin  2  governs stress-induced  depressive-like  behaviors. Proceeding  Natural  Academy  Science ,  116, 1770–1775.
Kooti,  W.,  Hasanzadeh-Noohi,  Z.,  Sharafi- Ahvazi,  N.,  Asadi-Samani,  M.,  &  Ashtary- Larky, D. (2016). Phytochemistry,
pharmacology, and therapeutic uses of black seed  ( Nigella  sativa ). Chinese  Journal Natural Medicine , 14(10), 732-45.
Linianti, L., Nur, I., Maulidiyah, M., & Yusnaini,
Y. (2017). Potensi Ekstrak Etanol Biji Jintan Hitam  ( Nigella  sativa )  untuk  Pengendalian Bakteri  Vibrio  harveyi  Penyebab  Penyakit pada Udang Vaname ( Litopenaeus vannamei ). Jurnal  Sains  dan  Inovasi Perikanan, 1(1), 25-29.
Mahdavi,  R.,  Namazi,  N.,  Alizadeh,  M.,  & Farajnia, S. (2016). Nigella sativa oil with a calorie-restricted diet can improve biomarkers  of  systemic  inflammation  in obese  women:  A  randomized  double-blind, placebo-controlled  clinical  trial. Journal Clinical Lipid , 10(5), 1203-1211
Mendes, P. A., Pereira, T. C., Pina, R., & Santos, R.  (2018).  Chlorpyrifos-Induced  Delayed Neurotoxicity  with  A  Rare  Presentation  of
Flaccid Quadriplegia: A Diagnostic
Challenge. European  Journal  Case  Report Internal Medicine , 5(1), 000751.
Molazadeh, M., Ahmadzadeh, H., Pourianfar, H., Lyon, S., & Rampelotto, P. (2019). The Use of  Microalgae  for  Coupling  Wastewater Treatment With CO2 Biofixation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology , 7, 42.
Ping, N. C., Noor, H. H., & Durriyyah, S. H. A. (2014).  Effects  of Nigella  sativa (Habbatus sauda) Oil and Nicotine Chronic Treatments on Sperm Parameters and Testis Histological
Features of Rats. Evidence-Based
Complementary  and  Alternative  Medicine , 2014: 1-7.
Parandin, R., Namdar, Y., & Rostam, G. (2012). The  Enhancing  Effect  of  Alcoholic  Extract of Nigella sativa Seed on Fertility Potential, Plasma Gonadothropins and Testosterone in Male  Rats. Iranian  Journal  Reproduction Medicine, 10(4), 355-362.
Pratama,  Kirmani,  D.,  &  Asif,  M.  (2019). Biochemical  Effects  of Nigella  sativa L
Seeds in Diabetic Rats, India, Indian Journal of Experimental Biology , 12(1).
Qian, W., Xiong, X., Fang, Z., Lu, H., & Wang,
Z. (2014). Protective effect of tetramethylpyrazine on
myocardial ischemia-reperfusion injury. Evidence Based Complementary Alternative Medicine , 2014, 2014.
Rashid, U., & Khan, M. R. (2017). Fagonia oliveri prevented hepatorenal injuries induced with
gentamicin in rat. Biomedicine and Pharmacotherapy , 88, 469- 479.
Suhita,  N.  L.  P.  R.  (2013).  Histopatologi  Ginjal
Tikus  Putih  Akibat  Pemberian  Ekstrak Pegagan (Centella asiatica) Peroral.
Denpasar: Buletin  Veteriner  Universitas Udayana , 8(2).
Sukestiyarno,  Y.  L.  (2014).  Statistika  Dasar. Penerbit Andi, Yogyakarta.
Tuhumury, G. N. C., Leatemia, J. A., Rumthe, R. Y., & Hasinu, J. V. (2012). Residu Pestisida Produk  Sayuran  Segar  di  Kota  Ambon. Agrologia , 1(2), 99-105.
Wang, J. Z., Zhang, R. Y., & Bai, J. (2020). An anti-oxidative  therapy  for  ameliorating cardiac  injuries  of  critically  ill  COVID-19- infected  patients. International  Journal
Cardiology , 31(2), 137-8.
***