## Studi Diagnostik Menggunakan PCR untuk Mendeteksi Virus Hepatitis C Dalam Cairan Air Mata Pasien Hemodialisis

## Petty Purwanita*, Novia Natsir
Departemen Ilmu Kesehatan Mata, Fakultas Kedokteran, Universitas Sriwijaya, Palembang, Indonesia E-mail: pettypurwanita@yahoo.com

## Abstrak
Virus hepatitis C (HCV) adalah virus hepatotropik dan limfotropik. Pasien yang terinfeksi HCV setidaknya terdapat satu manifestasi ekstrahepatik okular dan di kantung lakrimal selama perjalanan penyakit mereka. Penularan HCV terjadi melalui paparan darah yang terkontaminasi dengan faktor risiko tinggi pada pasien hemodialisis sekitar 70%. Deteksi RNA  HCV  lebih  sensitif  dan  spesifik  dengan  PCR  (Reaksi  Polymerase  Chain).  Studi  ini  mengevaluasi  sensitivitas  dan spesifisitas  virus  hepatitis  C  PCR  pada  pasien  hemodialisis  air  mata  di  Mohammad  Hoesin  Palembang.  Dengan menggunakan studi diagnostik observasional dari 25 sampel dari air mata dan darah pada pasien hemodialisis. PCR diperiksa oleh RT-PCR. Data yang diperoleh dianalisis dengan tes diagnostik. Didapatkan hasil dari 25 sampel HCV-RNA terdeteksi oleh PCR dalam air mata 11 kasus positif (44%) dan 20 kasus positif (80%) dalam plasma. Nilai sensitivitas air mata adalah 72,73% dan spesifisitasnya 13,33%. Spesimen air mata cukup sensitif tetapi tidak spesifik, oleh karena itu pemeriksaan PCR dapat digunakan untuk skrining virus hepatitis C pada pasien hemodialisis.
Kata kunci : Air Mata, Hemodialisis, Reaksi Rantai Polimerase, Virus Hepatitis C (HCV)

## Abstract
Diagnostic Study Using PCR to Detect Hepatitis C Virus in Tears Fluid of Hemodialysis . Patients Hepatitis C virus (HCV) is  a  hepatotropic  and  lymphotropic  virus.  Patients  infected  with  HCV  might  develop  at  least  one  extrahepatic manifestation  ocular  and  in  the  lacrimal  sac  during  the  course  of  their  disease.  HCV  transmission  occurs  through exposure to blood contaminated with high risk factor in hemodialysis patients about 70%. Detection RNA HCV more sensitive and specific by PCR (Polymerase Chain Reaction). This study evaluated the sensitivity and specificity of PCR hepatitis c virus in tears hemodialysis patients at Mohammad Hoesin Palembang. This is an observational diagnostic study of 25 samples from tears and blood in hemodialysis patients. PCR examined by RT-PCR. The data obtained were analyzed by a diagnostic test. Of 25 samples HCV-RNA was detected by PCR in the tears 11 cases were positive (44%) and 20 cases were found positive (80%) in plasma. The value of the sensitivity of the tears is 72.73% and the specificity was 13.33%. Tears fluid specimen quite sensitive but not specific, therefore PCR examination can be used for screening for hepatitis C virus in hemodialysis patients.
Keywords: Tears, Hemodialysis, Polymerase Chain Reaction, Hepatitis C Virus (HCV)

## 1. Pendahuluan
Virus  Hepatitis  merupakan  masalah kesehatan  yang  secara  umum  dapat menyebabkan morbiditas dan mortalitas yang signifikan  diseluruh  dunia. 1 Menurut  data WHO  tahun  1999  kira-kira  sekitar  170  juta orang  di  dunia  terinfeksi  hepatitis  C  atau  3% dari populasi dunia dan secara kronis beresiko berkembang  menjadi  sirosis  hati  dan  atau
kanker  hati.  Data  di  Indonesia  menunjukkan tingkat  prevalensi  hepatitis  C  berkisar  antara 0,5%-3,4%  atau  sekitar  1–7  juta  penduduk Indonesia  mengidap  infeksi  virus  C.  Virus hepatitis  C  (HCV)  paling  berbahaya dibandingkan  dengan  virus  hepatitis  lainnya, karena  70%-90%  penderita  yang  terinfeksi akan  menjadi  infeksi  yang  menahun  dan berkembang menjadi hepatitis kronik
kemudian  sirosis  hati,  kanker  hati  dan kematian.  HCV  adalah  virus  RNA  yang digolongkan  dalam  klasifikasi Flaviviridae , genus hepacivirus yang merupakan virus RNA rantai tunggal. Patogenesis dimulai sejak virus hepatitis  C  masuk  ke  dalam  darah  dan  terus beredar  di  dalam  darah  menuju  hati, menembus  dinding  sel  dan  masuk  ke  dalam sel,  lalu  berkembang  biak  (terjadi  proses replikasi virus), hati menjadi meradang dan sel hati mengalami kerusakan, terjadilah gangguan  fungsi  hati.  HCV  merupakan  virus hepatotropic dan sekaligus virus lymphotropic . Virus  hepatitis  C  ini  sering  menimbulkan komplikasi  ekstra  hepatic  yang  salah  satunya dapat ditemukan di mata, seperti keratokonjungtivitis sicca ,  sindrom  mata kering,  ulkus  mooren,  dan  retinopati. Transmisi  HCV  terjadi  terutama  melalui paparan  darah  yang  tercemar  virus,  dengan insiden  terbanyak  pada  pengguna  narkoba suntik  sekitar  >  80%,  pada  penderita  dengan riwayat transfusi dan hemodialisis sekitar 70%.
Penularan  dapat  juga  terjadi  melalui transmisi  seksual,  maternal-neonatal  dan kelahiran  dari  ibu  yang  terinfeksi  walaupun efisiensi  dan  frekuensinya  rendah.  Transmisi virus  hepatitis  C  selain  melalui  darah,  dapat juga melalui cairan tubuh seperti air mata.  Air mata  memainkan  peranan  penting  sebagai proteksi/  pelindung  mata.  Cairan  air  mata menpunyai  komposisi  yang  unik,  dengan beberapa  komponen  yang  secara  signifikan berbeda dengan komposisi dari plasma darah. Tidak  hanya  berbeda  dari  beberapa  jumlah variasi di komponennya, tetapi terdapat suatu substansi yang hanya ada di air mata dan tidak ada di plasma darah, seperti lisozim dan tear specific  pre-albumin  (lipocalin). Analisis  kimia dari air mata menunjukkan bahwa konsentrasi garam didalamnya mirip dengan komposisi di dalam  plasma  darah. 2 Pada  air  mata konsentrasi  K+,  Na+,  Cl-  memiliki  konsentrasi lebih  tinggi  dibandingkan  dari  plasma  darah, dan  laktoferin,  fosfolipase  A2,  serta  tumor
nekrosis  factor-α  lebih  tinggi  pada  air  mata. 1 Sedangkan albumin dan transferin lebih tinggi pada  plasma.  Pada  kelenjar  lakrimal  normal juga  mengandung  sel  plasma  dan  limfosit  T, serta  beberapa  sel  dendrit,  sel  B,  dan makrofag. Virus hepatitis C juga terdapat pada air  mata.  Beberapa  studi  penelitian  juga menunjukkan  kemungkinan  transmisi  melalui air mata yang terkontaminasi virus hepatitis C tersebut.  Deteksi  yang  biasa  dilakukan  untuk mengetahui  adanya  infeksi  virus  adalah dengan  penanda  serologi.  Pada  hepatitis  C, diagnosis  didasarkan  pada  adanya  anti  HCV dalam  serum  darah,  menggunakan  teknik ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assay ). Cara  deteksi  yang  lebih  sensitif  dan  spesifik adalah  dengan  mendeteksi  RNA  HCV  dengan teknik  PCR  ( Polymerase  Chain  Reaction ). 3 Metode  ini  dikembangkan  untuk  mengatasi kelemahan  metode  diagnosis  konvensional seperti imunologi dan mikrobiologi. Metode ini sangat penting terutama pada window period , suatu  periode  dimana  telah  terjadi  infeksi hepatitis  tetapi  antibodi  belum  terbentuk/ terdeteksi.  Sehingga  PCR  merupakan  metode diagnostik  standar  untuk  infeksi  HCV  akut maupun kronik. 3 PCR merupakan tehnik cepat untuk mengamplifikasi fragmen DNA atau RNA spesifik secara in vitro dengan menggunakan 2 primer untai tunggal pendek. Dengan tehnik ini sejumlah  kecil  fragmen  DNA/RNA  akan diamplifiksasi  sampai  jutaan  kali. 4 Dalam praktek  oftalmologi,  sampel  untuk  PCR biasanya  diperoleh  dari swab konjungtiva, parasintesis anterior  chamber atau  aspirasi vitreous,  cairan  air  mata,  dan  kerokan  epitel kornea. 5,6 PCR dari cairan air mata merupakan salah  satu  tehnik  yang non-invasive bila dibandingkan dengan pengambilan dari darah, selain  itu  secara  tehnis  lebih  mudah,  efisien dan sederhana. 5 Ansari et al (2006) melakukan penelitian untuk mendeteksi virus hepatitis C pada pasien hemodialisis dengan membandingkan  metode  Elisa  (EIA)  dengan PCR dari darah, hasilnya didapatkan pada EIA
positif  5  kasus  (41,6%)  dan  pada  PCR didapatkan  12  kasus  positif  (100%)  dari  12 kasus  hepatitis  yang  diteliti. 7 Heinz et  al , melakukan penelitian dengan membandingkan virus  hepatitis  C  di  darah  dengan  di  air  mata menggunakan  PCR,  hasilnya  HCV  pada  darah dan pada air mata ditemukan 33 kasus positif (100%),  tetapi  PCR  pada  air  mata  memberi sinyal  yang  lebih  kuat  dibandingkan  dari plasma  darah,  dikarenakan  pada  air  mata hanya  didapatkan  sejumlah  kecil  enzim degradasi. 8 Amal et al (2011) juga melakukan penelitian dengan mendeteksi virus hepatitis c pada air mata pada penderita hepatitis kronik dengan 26 kasus positif dari 50 kasus (52%). 9

## 2. Metode
Penelitian ini merupakan suatu penelitian observasional  yang  bersifat  analitik  dengan desain  uji  diagnostik  untuk  mengetahui sensitivitas  dan  spesifisitas  pemeriksaan  PCR virus  hepatitis  C  pada  air  mata  pasien hemodialisis  di  RSUP  Mohammad  Hoesin Palembang. 10 Penelitian ini dilakukan di RSUP Mohammad Hoesin, dan Instalasi Hemodialisis RSUP Mohammad Hoesin. Keseluruhan waktu pelaksanaan  terhitung  mulai  bulan  Agustus 2014  sampai  dengan  Agustus  2015. Pemeriksaan  PCR  dilakukan  di  Mikrobiologi Klinik FK UNSRI Palembang dan Laboratorium Biologi  Molekuler  Balai  Besar  Laboratorium Kesehatan  (BBLK)  Palembang.  Populasi  studi adalah  semua  penderita  baru  yang  akan dilakukan  tindakan  hemodialisis  di  RSUP Mohammad  Hoesin  Palembang  dengan  hasil ELISA Anti HCV (+) maupun (-) serta bersedia diikutsertakan dalam penelitian ini. Sampel di rekrut  secara  konsekutif,  yaitu  semua  pasien baru yang datang berobat ke unit hemodialisis di masukkan sebagai subyek, penderita dengan faktor resiko, seperti: riwayat transfusi darah, riwayat  tattoo,  dan  bersedia  ikut  penelitian dengan  menandatangani informed  consent. 11
Sedangkan  pasien  yang  sedang  menderita infeksi okular yang mempengaruhi kualitas dan
kuantitas  air  mata  tidak  dimasukkan  sebagai sampel studi. Setelah mendapatkan penjelasan secara  rinci  mengenai  tujuan  serta  manfaat penelitian. Penderita juga dijelaskan mengenai pemeriksaan  yang  akan  dilakukan,  dan penderita  diminta  untuk  menandatangani surat  pernyataan  bersedia  untuk  ikut  dalam penelitian.  Pada  pemeriksaan  awal,  semua penderita telah menjalani pemeriksaan tajam penglihatan,  pemeriksaan  segmen  anterior menggunakan loupe ,  pemeriksaan  segmen posterior  dengan  oftalmoskop  direk , dan kemudian  dilakukan  pengambilan  sampel untuk  bahan  pemeriksaan  PCR. 12 Teknik pengambilan  sampel  untuk  mendeteksi  HCV yang  dilakukan  dengan  mengambil  sampel spesimen  darah  sebanyak  2  cc  dan  sampel spesimen air mata yang dikumpulkan dengan menggunakan kertas filter Schirmer test strip. 5 Kertas schirmer kemudian ditempatkan dalam botol  steril  dan  disimpan  pada  -20°C  sampai pengolahan  dan  semua  sampel  spesimen dilakukan  pemeriksaan PCR: metode ekstraksi RNA,  pembentukan  cDNA,  proses  amplifikasi DNA dan elektroforesis gel agarosa, kemudian dilakukan proses visualisasi. 13
Gambar 1. Pengambilan sampel air mata dengan schirmer strip

## 3. Hasil
Dari  25  sampel  penelitian,  pada pemeriksaan  dengan  menggunakan  primer CRABP2 gen HCV GP2 didapatkan pada sampel plasma darah terdapat 20 sampel (80%) positif virus  hepatitis  C,  dan  pada  sampel  air  mata didapatkan  11  sampel  (44%)  positif  virus hepatitis C.
Pada  pita  amplikon  DNA  HCV  dengan sampel no.3,8,9,11,12,13,14,15,19, 22, 23, dan 25 ditemukan pita DNA positif virus hepatitis C pada  darah  sedangkan  pada  air  mata didapatkan hasil HCV negative (gambar 2 dan 3).
Gambar 2. Amplikon dengan primer untuk mendeteksi virus hepatitis c dengan sampel air mata no.1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, dan 15, dengan pita DNA berkisar 250 bp menggunakan sepasang primer CRABP2 gen HCV GP2. Pada amplikon dengan primer sampel air mata no. 16, 17, 18, 20, 21, dan no. 24 juga didapatkan positif pita terdeteksi virus hepatitis c di 250 bp.
Pada  uji  diagnostik  PCR  virus  hepatitis  C pada  air  mata  dan  plasma  darah,  didapatkan nilai sensitivitas pada air mata adalah 72,73%, nilai  spesifisitasnya  adalah  13,  33%,  dengan nilai  prediksi  positif  adalah  40%,  dan  nilai prediksi  negatif  adalah  40%  seperti  yang terlihat pada tabel 1.
Gambar 3. Amplikon dengan primer untuk mendeteksi virus hepatitis c dengan sampel air mata no.4, 24, 25, dan amplikon dengan sampel plasma darah no 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, dan 11 dengan pita DNA berkisar 250 bp menggunakan sepasang primer CRABP2 gen HCV GP2. Begitu juga dengan amplikon sampel plasma darah no.12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 22, 23, 24, dan
25 didapatkan positif pita dengan pita DNA berkisar 250 bp menggunakan sepasang primer CRABP2 gen HCV GP2.
Tabel 1. Perbandingan sensitifitas dan spesifisitas PCR air mata dengan PCR plasma darah pada penelitian ini
dengan kejadian hepatitis C Darah Air Mata Positif Negatif Jumlah Positif 8 12 20 Negatif 3 2 5 Jumlah 11 14 25

## 4. Pembahasan
Pada  penelitian  ini  didapatkan  44% sampel  air  mata  terdeteksi  adanya  virus hepatitis  C.  Hal  ini  menunjukkan  adanya viremia di dalam darah sampel pasien dan virus hepatitis  C  yang  masuk  ke  kantung  lakrimal pasien  sampel  penelitian  sesuai  dengan penelitian Heinz dkk (1994), Ansari dkk (2006), Amal  dkk  (2011),  dan  penelitian  Mochamad Yusuf  dkk  (2012).  Menurut  penelitian  Feucht dkk  dalam  studi  di  Jerman,  menemukan adanya  reaksi  positif  HCV  RNA  PCR  di  dalam plasma,  air  mata  dan  swabs  dari  mata, sehingga  air  mata  juga  merupakan  spesimen yang bermakna atau material diagnostik yang layak  untuk  mendeteksi  adanya  HCV  RNA. 14
Seperti  diketahui  bahwa  pasien  hemodialisis merupakan  faktor  resiko  tinggi  untuk tertularnya  virus  hepatitis  C. 15 Karena  pada penderita  hemodialisis  memiliki  sistim  imun yang rendah sehingga untuk terjadinya infeksi sangat  mudah.  Pada  penelitian  ini  terdeteksi virus  RNA  HCV  lebih  banyak  pada  sampel plasma darah, hal ini diduga karena virus yang masuk  ke  kantung  lakrimal  lebih  sedikit dibandingkan  dengan  viremia  yang  ada  di darah. 16,17 Pada penelitian yang dilakukan oleh Mendel  dkk,  ditemukan  juga  RNA  HCV  yang terdeteksi  lebih  banyak  pada  darah  (76,  5%) dibandingkan  RNA  HCV  di  air  mata  (9,  8%). Mendel  juga  mengemukan  adanya  RNA  di dalam  air  mata  tergantung  dengan  derajat keparahan  dari  hepatitis  dan viral  load yang diukur  dengan branched  DNA  assay. 18 Pada penelitian  ini  didapatkan  pita  amplikon  DNA
HCV dengan sampel
no.3,8,9,11,12,13,14,15,19,  22,  23,  dan  25 ditemukan  pita  DNA  positif  virus  hepatitis  C pada  darah  sedangkan  pada  air  mata didapatkan hasil HCV negative (gambar 2 dan 3).  Hal  ini  disebabkan  viremia  yang  terjadi dimulai  dari  darah  dulu,  sedangkan  virus tersebut  belum  masuk  ke  kantung  lakrimal. 19 Sedangkan  pada  amplikon  pita  DNA  HCV sampel  no.  16,17,  dan  21  didapatkan  hasil positif virus hepatitis C di air mata dan di darah negatif. 20 Hal  ini  dikarenakan  masa  akut viremia hepatitis C telah terlewati, tetapi virus tersebut masih ada di kantung lakrimal. Selain itu  pada  air  mata  didapatkan  sejumlah  kecil enzim degradasi seperti RNAse, laktoferin dan lipokalin  yang  memberikan  stabilitas  tinggi  di air  mata  sehingga  masih  memberikan  hasil yang positif. 21 Pada  beberapa  subjek  sampel  penelitian ditemukan  adanya  variasi  dari  signal  positif pita DNA HCV, ini di duga terdapat beberapa kemungkinan  yang  timbul,  (1)  karena perbedaan  konsentrasi viral  load yang  ada, dimana  pengukuran viral  load ini  dapat dilakukan  dengan  pemeriksaan  PCR  secara
kuantitatif melalui pemeriksaan branched DNA assay dan juga pemeriksaan TMA
( Transcriptionmediated Amplication ). 22 Tes ini dapat  mengukur  jumlah  virus  sampai sekecilnya  (5-10  IU/ml).  Adanya  hubungan antara HCV RNA di air mata dengan viral load HCV  di  dalam  darah,  dan  berkaitan  juga dengan  beratnya  viremia,  seperti  yang dikemukan oleh Amal dkk (2011). 21 Jacobi dkk (2007) mengemukakan bahwa level HCV RNA di sampel air mata ( mean , 1.0 x 10 4 copies/ ml) lebih rendah dari sampel di darah ( mean , 5.3 x 10 5 copies/ ml),  (2)  adanya mismatch ,  yaitu adanya  ikatan  yang  tidak  spesifik  antara DNTP,s  dengan  primer.  Pada  uji  diagnostik virus  hepatitis  C  dengan  menggunakan  PCR pada  air  mata  dan  plasma  darah,  didapatkan nilai sensitivitas pada sampel air mata adalah 72,73%  yang  berarti  pemeriksaan  ini  cukup sensitif  untuk  mendeteksi  HCV  di  air  mata. Pada  uji  diagnostik,  nilai  sensitivitas  harus cukup  tinggi  sehingga  dapat  memperlihatkan kemampuan  untuk  mendeteksi  penyakit, sedangkan  nilai  spesifisitas  pada  sampel  air mata adalah 13,33% yang berarti spesimen air mata tidak cukup spesifik untuk membedakan antara  subjek  yang  benar-benar  tidak  sakit dengan  subjek  yang  di  duga  menderita penyakit. Pada penelitian ini, didapatkan nilai akurasi  sensitifitas  air  mata  cukup  tinggi  dan nilai  spesifisitasnya  rendah,  sehingga  uji diagnostik  pada  penelitian  ini  baik  untuk keperluan  skrining.  Skrining  dilakukan  untuk mencari  penyakit  pada  subjek  yang asimptomatis,  sehingga  dapat  dilakukan pemeriksaan lanjutan agar diagnosis dini dapat ditegakkan.  Sedangkan  nilai  akurasi  untuk spesifisitasnya  rendah,  ini  berarti  air  mata merupakan spesimen yang tidak spesifik untuk virus  hepatitis  C,  karena  ternyata  virus hepatitis  C  ini  dapat  juga  terdeteksi  di spesimen  yang  lain  seperti  darah,  saliva  dan humor akuos. 23 Mendel dkk juga mengemukakan  bahwa  spesimen  air  mata dapat  sebagai  transmisi  HCV  tetapi  sebagai
sumber  RNA  HCV  di  air  mata  masih memerlukan pemahaman lebih lanjut. 18,24 Nilai prediksi  positifnya  adalah  40%,  yang  berarti kemungkinan  seorang  yang  menderita penyakit  hepatitis  C  sekitar  40%  padahal penderita  sebenarnya  tidak  sakit  (positif semu).  Nilai  prediksi  negatifnya  adalah  40%, yang  berarti  probabilitas  seorang  yang  tidak menderita  penyakit  hepatitis  C  sekitar  40% padahal sebenarnya subjek tersebut menderita hepatitis C. Pada nilai akurasi positif semu dan negatif semu didapatkan nilai sekitar 40%  (cukup  tinggi).  Hal  ini  dikarenakan  pada penderita hemodialis mempunyai sistim imun yang  rendah  sehingga  tubuh  penderita  tidak mampu  memproduksi  kadar  antibodi  yang cukup untuk terdeteksi didalam darah. 25 Keuntungan  pada  metode  tehnik  PCR adalah  sangat  sensitif.  Tehnik  PCR  dengan sampel  plasma  darah  mempunyai  nilai sensitifitas  dan  spesifisitas  100%  karena merupakan gold standar . PCR bertujuan untuk mengatasi  kelemahan  metode  diagnosis konvensional  seperti  imunologi  dengan sensitivitasnya sekitar 80%-90. Metode PCR ini sangat penting terutama pada window period , suatu  periode  dimana  telah  terjadi  infeksi hepatitis tetapi antibodi belum terbentuk/terdeteksi, sehingga tehnik PCR ini dapat  mendeteksi  RNA  HCV  satu  hingga  dua minggu setelah infeksi. 26,27 Pada penelitian ini terdapat  kelemahan,  dimana  penelitian  ini bersifat  kualitatif  (semi  kuantitatif),  sehingga hanya bisa mendeteksi keberadaan HCV tetapi tidak  mampu  untuk  mengukur viral  load . 28
Disamping  itu,  kemungkinan  adanya  faktor kesulitan dalam tehnik pemeriksaan, penyimpanan  sampel  yang  kurang  baik  juga ikut mempengaruhi hasil yang didapat.

## 5. Kesimpulan
Pada  uji  diagnostik  dengan  pemeriksaan PCR virus hepatitis C pada air mata, didapatkan nilai  sensitivitasnya  sebesar  72,73%  dan  nilai spesifisitasnya  sebesar  13,33%  sehingga  air
mata merupakan spesimen yang cukup sensitif tetapi tidak spesifik, oleh sebab itu tehnik ini dapat dipakai untuk skrining virus hepatitis C pada pasien hemodialisis.

## Daftar Pustaka
1. Andri  S,  Soewignjo  S  D.  Hepatitis  viral akut, Hepatitis B kronik, Hepatitis C. In: Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam. V. 2009. p. 644–66.
2. Hans G  et al. The Chemical Composition of  Normal  Human  Red  Blood  Cells, including Variability among Centrifuged Cells. 2014;10:370–6.
3. Lina,  MR,  Budiman  B  DS.  Uji  PCR (Polymerase  Chain  Reaction)  untuk deteksi  virus  hepatitis  C.  In:  Risalah Seminar lmiah Penelitian dan
Pengembangan  Aplikasi  lsotop  dan Radiasi. 2004.
4. John  MS    et  al.  Methods  in  Molecular Biology.  In:  PCR  Protocols.  Second. 2003. p. 29–43.
5. Andreas  P    et  al.  Schirmer  Strip  vs. Capillary  tube  method:  Non-invasive methods of obtaining proteins from tear fluid. Ann. Anatomy. 2013. 1–6 p.
6. Dutta Parthopratim M  et al. Polymerase Chain Reaction in Ophthalmology. AIOS, C Ser. 2012;22:11–6.
7. M, Ansari  et al. Evaluation of Diagnostic value  of  Elisa  method  (EIA)  &  PCR  in Diagnosis  of  Hepatitis  C  virus  in Hemodialysis  Patients.  Hepat  Mon. 2006;(6):19–23.
8. Heinz-HF  et al. Greater Amount of HCV-
RNA  in  Tears  Compared  to  Blood.
1994;38(2):157–8.
9. Francesco N. Uji PCR (Polymerase Chain Reaction)  untuk  deteksi  virus  hepatitis C.  Nat  Rev  Gastroenterol  Hepatol. 2014;(11):77–8.
10.   Rekam  Medik  Instalasi  Hemodialisa RSUP  Mohammad  Hoesin.  Palembang; 2011.

## 11.   Puspo Negoro H D. Uji Diagnostik. In: S
S,  S  I,  editors.  Buku  Dasar-Dasar Metodologi  Penelitian  Klinis.  Ketiga. Jakarta: Sagung Seto; 2008.
12.   Yuwono. Paduan Eksperimen PCR Untuk Memecahkan  Masalah  Biologi  Terkini. In: Dheweberta Hardjono, editor. Buku Teori  dan  Aplikasi  Polymerase  Chain Reaction.  Yogyakarta;  2006.  p.  1,  33, 169.
13.   Jonathan  P.  The  Polymerase  Chain Reaction  (PCR)  for  Human  Viral Diagnosis.  PCR  Detect  Anal  Hepat viruses. 1995;(5):60–5.
14.   H Feucht  et al. Tear Fluid of Hepatitis C Virus carriers could be Infectious. J Clin Microbiol. 1995;33:2202–3.
15.   G,  Alessandra    et  al.  Extrahepatic Manifestations of Chronic HCV
Infection.  J  Gastrointestin  Liver  Dis. 2007;16(1):65–73.
16.   Akintunde  J    et  al.  Tears  Production: Implication  for  Health  Enhancement. Open Access Sci Reports. 2012;(1):476.
17.   Joukar F  et al. Distribution of Hepatitis C  Virus  Genotypes  in  Haemodialysis Patients  of  Gulian,  Northern  Islamic Republic  Iran.  East  Mediterr  Heal  J. 2012;18(3):236–9.
18.   Mendel  et al. Detection and genotyping of the hepatitis C RNA in tear fluid from patients with chronic hepatitis C. J Med Virol. 1997;51(3):231–3.
19.   Monica. A  et al. Dry Eye Disease Caused by  Viral  Infection:  Review.  Arq  Bras Oftalmol. 2013;76(2):129–32.
20.   Debnath  et al. Prevalence of Hepatitis B and  C  among  Hemodialysis  Patient  of Tripura,  India.  Euroasian  J  Hepato- Gastroenterology. 2012;2(1):10–3.
21.   Atta Amal  et al. Detection of Hepatitis C virus  in  Tear  Fluid  of  Patients  with Chronic  Hepatitis  C.  Egypt  J  Med Microbiol. 2011;20:183–9.
22.   J Christopher, Reed S. Detection of the
Hepatitis C virus by RT-PCR. 2008;24:301–6.
23.   A.Tsoumani  et al. Treatment and non- treatment related ocular manifestations in patients with chronic hepatitis B or C. Eur  Rev  Med  Pharmacol  Sci. 2013;17:1123–31.
24.   Komatsu  H    et  al.  Tears  from  Children with  Chronic  Hepatitis  B  Virus  (HBV)
Infection Are Infectious Vehicles of HBV Transmission: Experimental
Transmission  of  HBV  by  Tears,  using mice  with  Chimeric  Human  Livers.  J Infect Dis. :1–8.
25.   Moini    et  al.  Hepatitis  C  Virus  (HCV) Infection  Rate  among  Seronegative Hemodialysis Patients Screened by Two Methods;  HCV  Core  Antigen  and Polymerase Chain Reaction. Hepat Mon. 2013;13(6):1–5.
26.   Reddy  AK    et  al.  Utility  of  HCV  Core Antigen  Elisa  in  The  Screening  for Hepatitis C Virus Infection in Patients on Hemodialysis.  Indian  J  Med  Microbiol. 2006;24(1):55–7.
27.   Sharifi    et  al.  .  The  Usefulness  of  Anti- HCV Signal to Cut-off Ratio in Predicting Viremia  in  Anti-HCV  in  Patients  With Hepatitis C Virus Infection. J Microbiol. 2015;8(4):1–3.
28.   Amin  M    et  al.  The  Prevalence  and Subtype Distribution of Hepatitis C Virus Infection  among  Hemodialysis  Patients in  a  Private  Hospital  in  Surabaya, Indonesia.
Microbiology. 2012;6(4):173–9.