CURRENT BIOCHEMISTRY
ISSN: 2355-7877 Journal homepage: biokimia.ipb.ac.id/cb Journal E-mail: current.biochemistry@ipb.ac.id

## Pemanfaatan Bakteri Pereduksi Emisi Gas Metana Pada Limbah Cair Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.)
Nisa Widya Amanda 1* , I Made Artika 1 , Iman Rusmana 2
1 Department of Biochemistry, IPB University, Bogor, 16680, Indonesia
2 Department of Biology, IPB University, Bogor, 16680, Indonesia
Received: 2 February 2018 ; Accepted: 11 July 2019
Corresponding author : Nisa Widya Amanda, Departemen Biokimia IPB; e-mail: nswamanda@gmail.com

## ABSTRACT
Palm  trees  are  one  of  the  largest  oil-producing  plants  in  Indonesia.    Processing  palm fruit  into  oil  has  a  negative  impact,  such  as  the  generation  of  methane  gas.  It  is  known  that methane gas is one of the greenhouse gases known to cause global warming. Therefore a method to  reduce  the  amount  of  methane  gas  emission  is  needed.  The  present  study  is  aimed  to  use bacteria    to  reduce  methane  emission  in  palm  oil mill  effluent  (POME).   Bacteria  were  isolated from  liquid  palm  oil  mill  effluent.  The  isolates  were  tested  for  activity  soluble  methane monooxygenase  (sMMO)  and  particulate  methane  monooxygenase  (pMMO).  Based  on  methane monooxygenase  activity,  one  isolate  was  selected  for  DNA  sequencing  and  phylogenetic  tree analysis. The bacterial isolation process resulted in 13 single colony isolates. The sMMO activity test showed that none of the isolates has sMMO activity.  On the other hand,  the pMMO activity tests showed that the isolates have different levels of pMMO activity ranging between 0.10 – 0.22 M/mL  culture/  day.    DNA  sequence  analysis  showed  that  the  chosen  isolate  was  Klebsiella  sp. Based  on  Gram  test  it  was  a  Gram  negative  bacterium.    Bacteria  have  the  potential  to  be employed to reduce methane emission in the palm oil mill effluent.
Keywords: Klebsiella sp, 16S rRNA, Methane, pMMO, sMMO.

## ABSTRAK
Kelapa  sawit  merupakan  salah  satu  tumbuhan  penghasil  minyak  terbesar  di  Indonesia.  Proses pengolahan  buah  kelapa  sawit  menjadi  minyak  memiliki  dampak  negatif,  yakni  terciptanya  gas metana. Gas metana merupakan salah satu gas penyumbang efek rumah kaca yang menyebabkan pemanasan global. Oleh karena itu, diperlukan cara untuk menurunkan emisi gas metana. Tujuan penelitian ini adalah penggunaan bakteri untuk menurunkan emisi gas metana pada limbah cair pemrosesan buah kelapa sawit.  Bakteri diisolasi dari limbah cair kelapa sawit. Terhadap isolat tunggal  yang  diperoleh  dilakukan  uji  aktivitas  enzim  soluble  methane  monooxygenase  (sMMO) dan  particulate  methane  monooxygenase  (pMMO).  Isolat  dengan  aktivitas  methane
monooxygenase  tertinggi  dipilih  untuk  analisis  sekuen  DNA  dan  konstruksi  pohon  filogenetika. Tahap  isolasi  bakteri  menghasilkan  13  isolat  koloni  tunggal.  Uji  aktivitas  methane monooxygenase  menunjukkan  bahwa  semua  isolat  tidak  memiliki  aktivitas  sMMO.    Sebaliknya, semua isolat memiliki aktivitas pMMO dengan tingkat berbeda yaitu dengan rentang nilai antara 0.10  –  0.22  M/mL  kultur/hari.    Analisis  sekuen  DNA  menunjukkan bahwa  isolat  terpilih  adalah Klebsiella sp. Berdasarkan uji Gram diketahui bahwa bakteri ini termasuk bakteri Gram negatif. Bakteri  berpotensi  digunakan untuk  menurunkan  emisi  gas  metan pada  limbah  cair  pemrosesan buah kelapa sawit.
Kata kunci: Klebsiella sp, 16S rRNA, Metana, pMMO, sMMO.

## 1. PENDAHULUAN
Minyak  kelapa  sawit  berasal  dari buah pohon kelapa sawit ( Elaeis guineensis  Jacq), suatu  spesies  tumbuhan tropis  yang  berasal  dari  Afrika  Barat, namun  kini  tumbuh  sebagai  hibrida  di banyak  belahan  dunia,  termasuk  di  Asia Tenggara  dan  Amerika  Tengah  (Fricke 2009).  Kelapa  sawit  merupakan  tanaman perkebunan  yang  berperan  penting  dalam peningkatan  devisa  negara,  penyerapan tenaga kerja dan peningkatan perekonomian  di  Indonesia.  Akhir–akhir ini  luas  areal  tanam  kelapa  sawit mengalami peningkatan.
Namun, peningkatan ini dihadapkan dengan keterbatasan  lahan  subur  karena  lahan yang  tersedia  didominasi  lahan  marginal seperti  Ultisol  (Sembiring et  al. 2013). Akibat  semakin  meningkatnya  konsumsi dunia,  ekspor Crude  Palm  Oil  ( CPO) dalam 5 tahun terakhir cenderung meningkat, rata–rata
mengalami peningkatan sebesar 11%. Eksportir terbesar  minyak  kelapa  sawit  adalah negara  Malaysia  dan  Indonesia  karena kedua  negara  tersebut  menguasai  sebesar 91% pasar dunia minyak kelapa sawit. Hal ini menyebabkan Indonesia menjadi salah satu negara eksportir terbesar kelapa sawit (Masykur 2013).
Peningkatan  jumlah  perusahaan kelapa  sawit  memiliki  hubungan  yang sangat  kuat  dengan  jumlah  limbah  yang dihasilkan.  Limbah  pengolahan  minyak kelapa  sawit  terbagi  menjadi  dua,  yaitu limbah  padat  dan  limbah  cair.  Limbah padat  yang  dihasilkan  antara  lain  berupa tandan  janjang  kosong,  sisa  pengolahan serta  buah  yang  terlepas.  Limbah  cair yang  dihasilkan  berupa  minyak  CPO  dan air.  Limbah  cair  banyak  mengandung  zat organik  (Widarti et  al. 2015)  dan  unsur hara  makro  seperti  N,  P  dan  K.  Apabila kandungan  bahan  organik  dalam  limbah tinggi,  maka  semakin  banyak  oksigen yang  dibutuhkan  oleh  mikroorganisme untuk mendegradasi bahan organik tersebut, sehingga nilai Biological Oxygen Demand (BOD)  dan Chemical  Oxygen Demand (COD)  limbah  juga  akan  tinggi. Kebutuhan  oksigen  biokimia  ( Biological Oxygen Demand/ BOD) merupakan jumlah  oksigen  yang  dibutuhkan  oleh mikroorganisme  didalam  lingkungan  air untuk memecah atau mendegradasi ataupun mengoksidasi bahan organik yang ada  di  dalam  limbah.  Semakin  tinggi kandungan  bahan  organik  dalam  limbah cair  maka  semakin  banyak  oksigen  yang dibutuhkan oleh mikroba untuk menguraikan  senyawa  organik  tersebut,
sehingga  diperlukan  perlakuan  khusus sebelum  dibuang  ke  lingkungan  untuk menghindari  pencemaran  (Widarti et  al. 2015).
Limbah cair industri minyak sawit banyak mengandung mikroorganisme yang  mempunyai  potensi  melakukan hidrolisis  terhadap  lemak  dan  minyak (Swandi et al. 2015). Kandungan ini yang menimbulkan  bau  yang  tidak  sedap  pada limbah  kelapa  sawit.  Bau  yang  dihasilkan dari  limbah  ini  harus  dihilangkan  agar ketika dibuang tidak meresahkan lingkungan di sekitar tempat pembuangan limbah  kelapa  sawit.  Salah  satu  cara menghilangkan  bau  ini  adalah  dengan menurunkan emisi metana yang dihasilkan dari  mikroorganisme  tersebut.    Metana (CH 4 ) dan kabondioksida (CO 2 )
merupakan gas rumah kaca yang berperan penting dalam pemasanan global. Sebagai  gas  rumah  kaca,  metana  84  kali lebih  poten  dibandingkan  karbondioksida (Ross  dan  Rosenzweig  2017).  Kadar  CH 4 di  permukaan  bumi  setiap  tahunnya mengalami  kenaikan  sebesar  0.8%.  Bila ini  tidak  ditangani  secara  cepat  dan  tepat dimasa  mendatang  efek  rumah  kaca  akan semakin  berbahaya.  Kenaikan  ini  antara lain  diakibatkan  oleh  kurang  tepatnya penanganan  dan  pengelolaan  gas  metana (Lilik 2001).  Metana merupakan senyawa karbon  yang  paling  stabil  yang  ada  di lingkungan anaerob dan merupakan senyawa  antara  dalam  mineralisasi  materi organik.    Metana  akan  terlepas  dari lingkungan  anaerob  menuju  atmosfir  jika tidak  dioksidasi  oleh mikroba  metanotrof. Lepasnya metan
ke atmosfir meningkatkan  laju  pemanasan  global  dan mengubah  komposisi  kimia  atmosfir (Hanson dan Hanson 1996).
Bakteri  metanotrof  adalah  bakteri  yang mampu  mengoksidasi  metana  menjadi methanol  dan  memiliki  potensi  aplikasi dalam bioremediasi dan penghilangan gas rumah  kaca.    Bakteri  metanotrof  sanagat membutuhkan  tembaga  karena  enzim utama dalam metabolismenya yaitu particulate methane monooxygenase (pMMO),  aktivitasnya  bergantung  pada tembaga.    Proporsi  protein  enzim  pMMO adalah sekitar 20% dari protein sel bakteri metanotrof.  Enzim  ini  mengkatalisis reaksi  pertama  dalam  lintas  metabolisme yaitu  oksidasi  metana  menjadi  methanol. Dalam  keadaan  keterbatasan  tembaga, beberapa  metanotrof  memproduksi  enzim alternative yaitu soluble methane monooxygenase (sMMO)  yang  memiliki diiron  pada  situs  aktifnya.    Pada  strain bakteri metanotrof dengan sifat seperti ini, keberadaan  tembaga  bersifat  menekan transkripsi  gen  sMMO  dan  sebaliknya meningkatkan ekspresi gen pMMO
(Balasubramanian et al . 2011).
Pengolahan gas metana dari limbah  cair  kelapa  sawit  hasil  samping industri  kelapa  sawit  merupakan  hal penting  dalam  penanganan  lingkungan industri  agar  tidak  terjadi  pencemaran lingkungan selain bisa meningkatkan nilai tambah  limbah  tersebut    (Purwanti et  al . 2014).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengisolasi  bakteri  yang  terkandung dalam  limbah  cair  kelapa  sawit  dan menentukan  isolat  bakteri  terbaik  yang dapat mereduksi emisi metana.

## 2. METODOLOGI Pengambilan Sampel
Sampel limbah kelapa sawit berasal  dari  perusahaan  PT.  Fajar  Agro Sejahtera  yang  berlokasi  di  Batulicin,
Kota Baru, Kalimantan Selatan. Pengolahan  kelapa  sawit  menghasilkan limbah  yang  kemudian  dibuang  ke  dalam 8 kolam. Kolam 1 dan 2 merupakan kolam cooling pound , kolam 3 dan 4 merupakan kolam mixing  pound ,  kolam  5  dan  6 merupakan kolam yang mendapat perlakuan  anaerob  dan  kolam  7  dan  8 merupakan kolam yang mendapat perlakuan  aerob.  Sampel  yang  digunakan berasal  dari  kolam  5  yang  diambil  dari  4 titik yang berbeda, yaitu pojok kanan atas, pojok  kanan  bawah,  pojok  kiri  atas,  dan pojok  kiri  bawah.  Pengambilan  sampel pada  setiap  titik  dilakukan  dengan  3  kali pengulangan. Sampel limbah kelapa sawit kemudian ditempatkan dalam botol plastik.
Isolasi  Bakteri  (Rusmana  dan  Akhdiya 2009)
Isolasi  bakteri  dilakukan  dengan menggunakan  teknik  pengayaan  pada media Nitrate  Mineral  Salt (NMS). Sebanyak 1 mL sampel limbah diinokulasikan  ke  dalam  50  mL  media NMS  dalam  100  mL  botol  yang  ditutup dengan karet septum butil. Botol headspace akan diisi dengan 50% metana dan  50%  udara.  Inkubasi  dilakukan selama  5  -  6  hari  pada  suhu  kamar menggunakan shaker .  Selanjutnya,  isolat dimurnikan  dengan  menggunakan  teknik pelat berseri  pada medium NMS agar.
Seleksi  Isolat  Berdasarkan  Aktivitas
Soluble Methane Monooxygenase
(sMMO) (Graham et al. 1992)
Seleksi  pada  tahap  ini  dilakukan dengan metode kolorimetri, yaitu masing- masing  isolat  ditumbuhkan  pada  media NMS  +  1  µM  CuSO 4 . Setelah  diinkubasi
10-14  hari  cawan  diletakkan  pada  posisi terbalik lalu dibuka dengan cara mengangkat  bagian  cawan  yang  berisi koloni, lalu cawan penutup ditaburi kristal naftalena  selanjutnya  ditutup  kembali tetap  pada  posisi  terbalik  dan  diinkubasi selama  15  menit.  Setelah  15  menit permukaan  koloni  disemprot  dengan larutan o-dianisidin (5 mg/ml) lalu ditutup dengan  penutup  cawan  yang  baru  dan diinkubasi  kembali  selama  15  menit (cawan tidak dibalik). Selanjutnya diamati koloni  yang  warnanya  berubah  menjadi ungu menandakan positif terhadap aktivitas sMMO.

## Seleksi  Isolat  Berdasarkan  Aktivitas Particulate  Methane  Monooxygenase
(pMMO) (Zhan et al. 2010)
Seleksi  pada  tahap  ini  dilakukan dengan  cara  menumbuhkan  bakteri  pada media cair NMS di tabung reaksi. Tabung reaksi  dibuat  dalam  kondisi headspace yang  ditambahkan  dengan  gas  metana sebanyak 12 mL dan ditutup dengan karet septum  butil.  Sampel  diinkubasi  selama 7 hari  pada shaker .  Selanjutnya,  sampel diukur  menggunakan  spektrofotometer pada  panjang  gelombang  481  nm. Pengukuran dilakukan dengan cara mengambil  sampel  sebanyak  0.1  mL ditambahkan  reagen  SNP  sebanyak  0.6 mL dan ditambahkan akuades hingga total volume  1.5  mL.  Selanjutnya,  sampel  di vortex  pada  kecepatan  maksimum  selama 10-20  detik  dan  didiamkan  selama  15 menit.

## Uji Pewarnaan Gram (Beveridge, 2001;
Coico, 2005)
S atu tetes akuades diletakkan pada kaca  objek  yang  ditambahkan  satu  ose
biakan  sampel  lalu  difiksasi  di  atas  api. Kristal  violet  ditambahkan  dan  dibiarkan selama  1  menit,  dicuci  dengan  air mengalir  kemudian  lugol  diteteskan  pada sampel  selanjutnya  dibiarkan  selama  satu menit  dan  kembali  dicuci  dengan  air mengalir.  Alkohol  95%  diteteskan  dan dibiarkan selama 10-20 detik cuci dengan air  mengalir  dan  ditambahkan  safranin selanjutnya  dibiarkan  selama  20-30  detik kemudian cuci dengan air mengalir. Tahap berikutnya, dikeringkan dengan menggunakan  kertas  serap  dan  minyak emersi  ditambahkan  dan  sampel  diamati di  bawah  mikroskop.  Bila  dari  hasil pewarnaan  diperoleh  bakteri  berwarna merah maka bakteri tersebut adalah Gram negatif,  sedangakan  bila  diperoleh  bakteri berwarna  ungu  maka  bakteri  tersebut bersifat Gram positif.
Isolasi,  Amplifikasi,  dan  Visualisasi DNA (Agung et al. 2009)
DNA hasil isolasi digunakan untuk amplifikasi gen 16S- rRNA menggunakan
Polymerase Chain Reaction (PCR).
Amplifikasi  gen  16S-rRNA  dilakukan dengan  memakai  DNA  templat  yang diamplifikasi  dengan  kit Presto TM Mini gDNA  Bacteria dengan  menggunakan primer  go Taq .  Kondisi  PCR  yang digunakan  adalah  Pra-PCR  pada  suhu  94 ᵒC  selama  2  menit,  denaturasi  pada  suhu 92  ᵒC  selama  45  detik, Annealing primer pada  suhu  55  ᵒC  selama  45  detik, elongation atau perpanjangan primer pada suhu 72 ᵒC selama 45 detik, dan Post PCR pada suhu 72 ᵒC selama 10 menit, dengan jumlah siklus sebanyak 30 kali.
Pemisahan  DNA  produk  PCR  dilakukan pada elektroforesis mini-gel dengan menggunakan  gel  agarosa  1%  (b/v)  pada
tegangan  listrik  85  volt  selama  45  menit. Visualisasi menggunakan etidium bromida  dan  dilihat  di  bawah  UV
Transluminator.

## Sekuensing DNA
Sekuensing DNA dilakukan dengan  menggunakan  penyedia  jasa sekuen  DNA. Hasil  sekuen  kemudian dijajarkan dengan data GenBank menggunakan  program  BLAST-N  ( Basic Local  Alignment  Search  Tool-Nucleotida ) dari  situs  NCBI  ( National  Center  for Biotechnology Information ) untuk mengetahui  kemiripan,  identitas,  fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dari isolat yang diuji.

## 3. HASIL

## Isolat Bakteri Hasil Pemurnian
Isolasi  bakteri  bertujuan  untuk memperoleh  bakteri  dari  limbah  cair pengolahan  buah  kelapa  sawit  yang mampu  menurunkan  konsentrasi  gas metana pada limbah cair pemrosesan buah kelapa sawit.
Pemurnian bakteri dilakukan  pada  medium  cair Nitrate Mineral  Salt (NMS)  anaerob  yang mengandung gas metana kemudian diinkubasi  selama  kurang  lebih  satu minggu.  Perubahan  warna  cairan  yang menjadi  lebih  keruh  menunjukkan  bahwa bakteri tersebut telah tumbuh. Selanjutnya, bakteri ditumbuhkan kembali pada  medium  agar  hingga  didapatkan koloni  tunggal.  Berikut  hasil  pemurnian bakteri ini dapat dilihat pada Tabel 1.

## Morfologi Isolat dan Aktivitas sMMO
Enzim Soluble Methane Monooxygenase (sMMO) merupakan salah  satu  enzim  yang  dimiliki  oleh
bakteri  yang  mampu  menggunakan  gas metana  sebagai  sumber  karbon  dan energinya. Ciri khas dari enzim ini adalah hanya  larut  dalam  sitosol.  Uji  enzim sMMO dilakukan dengan menyemprotkan larutan CuSO 4 ke permukaan bakteri yang berada  pada  medium  agar.  Hasil  seleksi isolat  bakteri,  karakterisasi  morfologi  dan uji  aktivitas  sMMO  ditunjukkan  pada Tabel  2.    Pada  semua  isolat  yang  diuji tidak terdeteksi adanya aktivitas sMMO.

## Aktivitas pMMO
Enzim lain  yang  diuji aktivitasnya pada bakteri hasil isolasi adalah
Particulate Methane Monooxygenase
(pMMO).  Enzim  pMMO  ini  merupakan enzim partikulat yang dimiliki oleh semua bakteri  yang  memanfaatkan  gas  metana sebagai  sumber  energi  dan  karbon. Pengujian  dilakukan  dengan  mengukur aktivitas    enzim  pMMO  sampel  dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang  gelombang  481  nm.  Hasil pengukuran  enzim  pMMO  ditunjukkan pada  Tabel  3.    Berdasarkan  aktivitas tertinggi pMMO, selanjutnya dipilih isolat AMD13  untuk  dikarakterisasi  lebih  lanjut melalui  uji  pewarnaan  Gram  dan  analisis sekuen DNA.
Tabel 1 Hasil isolasi pada kolam anaerob pengolahan limbah kelapa sawit
No Titik Sampel Jumlah Sampel Isolat yang diperoleh 1 Pojok Kanan Atas 1 4 2 Pojok Kanan Bawah 1 2 3 Pojok Kiri Atas 1 3 4 Pojok Kiri Bawah 1 4 Jumlah 13

## Tabel 2 Karakterisasi isolat bakteri hasil isolasi dari limbah kelapa sawit
No Kode Isolat Morfologi Koloni sMMO 1 AMD1 Bulat, Besar, Merah - 2 AMD2 Bulat, Kecil, Putih - 3 AMD3 Bulat, Kecil, Putih - 4 AMD4 Bulat, Kecil, Merah - 5 AMD5 Bulat, Kecil, Putih - 6 AMD6 Bulat, Besar, Merah - 7 AMD7 Bulat, Sangat Kecil, Putih - 8 AMD8 Bulat, Sangat Kecil, Putih - 9 AMD9 Bulat, Sangat Kecil, Putih - 10 AMD10 Bulat, Sangat Kecil, Putih - 11 AMD11 Bulat, Besar, Merah - 12 AMD12 Bulat, Besar, Merah - 13 AMD13 Bulat, Kecil, Putih -
Keterangan        + : terdeteksi aktivitas enzim sMMO
- : tidak terdeteksi aktivitas enzim sMMO

## Tabel 3 Hasil pengukuran sampel uji pMMO
No Kode Isolat Rata-Rata Konsentrasi (mM) Aktivitas Oksidasi Metana per hari (mM)/0.1mL kultur 1 AMD1 0.263 1.08 0.15 2 AMD2 0.265 1.09 0.16 3 AMD3 0.226 0.78 0.11 4 AMD4 0.275 1.18 0.17 5 AMD5 0.320 1.54 0.22 6 AMD6 0.264 1.09 0.16 7 AMD7 0.299 1.37 0.20 8 AMD8 0.297 1.35 0.19 9 AMD9 0.275 1.18 0.17 10 AMD10 0.287 1.27 0.18 11 AMD11 0.213 0.67 0.10 12 AMD12 0.289 1.29 0.18 13 AMD13 0.301 1.39 0.20
Gambar 1 Hasil Uji Gram AMD13

## Hasil Pewarnaan Gram
Uji  pewarnaan  Gram  digunakan
untuk mengetahui morfologi isolat bakteri.    Hal  ini  dilakukan  untuk mengetahui isolat yang diperoleh termasuk  bakteri  Gram  negatif  atau positif. Pengujian Gram dilakukan dengan menggunakan larutan Kristal violet, lugol, safranin  dan  minyak  emersi.  Pengamatan dilakukan  pada  perbesaran  100.    Hasil pengamatan  disajikan  pada  Gambar  1. Berdasarkan hasil pengamatan
disimpulkan  bahwa  isolat  AMD13  adalah bakteri Gram negatif.

## Amplikon  dan  Sekuen  Gen  16S  rRNA Isolat AMD13
Berdasarkan  hasil  uji  aktivitas pMMO,  isolat  AMD13  dipilih  untuk analisis  molekuler  yaitu  amplifikasi  dan penentuan sekuen nukleotida gen penyandi 16S rRNA. Amplikon hasil PCR gen 16S rRNA disajikan pada Gambar 2.
Gambar 2.  Amplikon hasil PCR gen 16S rRNA isolat AMD13
Gambar 3. Pohon filogenetik isolat AMD13
Amplikon  yang  dihasilkan  berukuran sekitar  1300  pasang  basa.    Fragmen  ini selanjutnya ditentukan urutan nukleotidanya. Sekuen DNA gen penyandi 16S rRNA dianalisis
menggunakan  program  BLAST-N  dan NCBI  guna  mengidentifikasi  spesies bakteri  tersebut.  Proses  pencarian  nama spesies  yang  dimiliki  dilihat  dari  nilai indent dengan  nama-nama  spesies  yang ditampilkan pada NCBI. Nilai indent yang semakin  tinggi  menandakan  kekerabatan yang  sangat  dekat  dengan  spesies  yang dianalisis.  Selain  mendapatkan  nama spesies  secara  pasti,  informasi  dari  hasil sekuensing  ini  memberikan  informasi
taksonomi  bakteri  sampel  bakteri  yang dimiliki.

## Pohon Filogenetik Isolat AMD13
Filogenetik  merupakan  suatu  cara untuk  memastikan  kekerabatan  yang dimiliki  oleh  isolat  yang  kemudian dibandingkan  dengan  sekuens  DNA  lain yang  berada  di  data  GenBank  melalui pohon filogenetik. Hasil pohon filogenetik ini  akan  memperlihatkan  seberapa  besar kedekatan  isolat  yang  dimiliki  yang diperlihatkan  dengan  jarak  kekerabatan. Semakin besar nilai kekerabatannya, maka semakin  besar  kemiripan  isolat  yang dimiliki  dengan  sekuens  yang  dimiliki pada  data GenBank .  Hasil  analisis
filogenetik  isolat  AMD13  menggunakan aplikasi  MEGA  5.0  disajikan  pada Gambar 3.

## 4. PEMBAHASAN
Pemurnian bakteri ditujukan untuk mendapatkan  isolat  tunggal  dari  sampel yang diambil. Pengambilan sampel dilakukan  pada  4  titik  masing-masing  di pojok  kolam.    Tahap  pemurnian  isolat dimulai dengan menambahkan gas metana pada  medium  cair  yang  yang  dilanjutkan dengan  inkubasi  selama  kurang  lebih  7 hari  menggunakan shaker pada  suhu ruang.  Setelah  masa  inkubasi  selesai, dilakukan penggoresan  bakteri  pada medium  padat Nitrate  Minaeral  Salt (NMS).    Penggoresan  dilakukan  hingga mendapatkan  koloni  tunggal  dari  masing- masing  titik  pengambilan  sampel.    Hasil proses  pemurnian  bakteri  menunjukkan bahwa dari masing-masing titik didapatkan  sejumlah  isolat.  Sampel  yang diambil  dari  pojok  kanan  menghasilkan  4 isolat, pojok kanan bawah menghasilkan 2 isolat,  pojok  kiri  atas  menghasilkan  3 isolat dan pojok kiri bawah  menghasilkan 4  isolat.  Total  isolat  murni  yang  didapat berjumlah  13  isolat  dengan  karakterisitik dan  morfologi  yang  berbeda-beda  seperti disajikan pada Tabel 1.
Hasil  uji  aktivitas  sMMO  pada  13 isolat  yang  diteliti  menunjukkan  bahwa semua  isolat  tidak  memiliki  aktivitas enzim  sMMO.  Seperti  disajikan  pada Tabel  2,  semua  isolat  menunjukkan  hasil negatif.  Menurut  Hanson  dan  Hanson (1996),  bakteri  yang  mengandung  enzim sMMO pada membran sel akan mengalami  perubahan  menjadi  ungu. Namun,  hal  ini  tidak  didapatkan  di  13 isolat tersebut setelah penambahan
naftalena pada media pertumbuhan setelah penambahan  o-dianisidin.  Hal  ini  juga mengindikasikan bahwa 13 isolat tersebut tidak  dapat  memanfaatkan  NADH + dan H + .
Oksidasi  metana  diinisiasi  enzim metan  monoksigenase  (MMO)  yaitu enzim  yang  secara  spesifik  memecah ikatan  O-O  dioksigen.  Salah  satu  atom oksigen  direduksi  untuk  membentuk  H 2 O dan  atom  lainnya  digunakan  untuk membentuk CH 3 OH. Enzim MMO terbagi menjadi dua macam, salah satunya adalah soluble methane monooxygenase (sMMO) yang  terdapat  pada  sitoplasma,  dan memanfaatkan  NADH + dan  H + sebagai pendonor  elektron.  Karakteristik  enzim sMMO adalah tidak ditemukannya kofaktor  heme  ataupun  kofaktor  lainnya pada  membran  bakteri  (Hanson  dan Hanson1996).    Enzim  sMMO  terdiri  dari tiga komponen, yakni hidrosilase (MMOH)  yang  merupakan  sisi  aktifnya, reduktase  (MMOR)  yang  bertugas  untuk mengangkut  elektron  dari  NADH  ke bagian  sisi  aktif  MMO  dan  protein regulator  (MMOB)  merupakan  bagian yang  penting  untuk  aktivitas  enzim (Amanda dan Rosenzwig 2007).
Enzim sMMO dapat mengoksidasi berbagai  macam  hidrokarbon,  seperti  C1- C8  n-alkana,  alkana  dan  substrat  besar lainnya seperti benzana, naftanelna, etilbenzena  dan  sikloheksana.  Selain  itu, sMMO  mengoksidasi  sejumlah  halogen hidrokarbon,  seperti  polutan  trikloroetilen (Sirajudin dan Rosenzweig 2015).
Karakteristik  lain  enzim  sMMO  yaitu memiliki  substrat  yang  sangat  spesifik. Hal  ini  dapat  diketahui  pada  beberapa bakteri  yang  tumbuh  pada  media  yang ditambahkan sedikit tembaga dari
naftalena.  Sel  bakteri  yang  mengandung enzim sMMO secara cepat akan mengoksidasi  naftalena  dari  1-  dan  2- naphtols,  yang  dapat  ditemukan  dengan penambahan  tetrazoitized o -dianisidin. Reaksi  enzim  sMMO  ini  menunjukkan aktivitas  dari  enzim  sMMO  pada  koloni bakteri  yang  ditumbuhkan  pada  medium agar  dengan  konsentrasi  tembaga  yang rendah. Hasil positif yang didapatkan jika bakteri tersebut mengandung enzim
sMMO adalah terjadinya perubahan warna menjadi ungu (Hanson dan Hanson 1996).
Enzim lain  yang  diuji aktivitasnya adalah particulate
methane monooxygenase (pMMO).  Pengukuran aktivitas  enzim  pMMO  menunjukkan bahwa  rata-rata  konsentrasi  pMMO  dari ke-13  isolat  berkisar  antara  0.010  M  – 0.022  M.    Kurva  standar  yang  dibuat memiliki  nilai  regeresi  sebesar  0.99.  Hal ini mengindikasikan bahwa variasi konsentrasi  yang  digunakan  memiliki hubungan  yang  linear.  Hasil  pengukuran enzim  pMMO  pada  bakteri  dapat  dilihat pada Tabel 3.  Enzim pMMO terdiri dari 3 bagian  yaitu  subunit  α,  β  dan  γ  (Amanda dan Rosenzweig 2007). Fungsi dari ketiga bagian  tersebut  adalah  sebagai  sisi  aktif untuk  mengkatalisis  CH 4 (Mohammadi et al. 2017).  Enzim  pMMO  ini  diketahui hampir  dapat  ditemukan  di  setiap  bakteri yang  memanfaatkan  gas  metana  sebagai sumber energi dan karbon. Enzim pMMO tidak dapat mengoksidasi naftalena menjadi  naphtols  seperti  yang  dilakukan oleh  enzim  sMMO.  Aktivitas  enzim pMMO dapat diketahui melalui pengujian methane monooxygenase (MMO) activity . Aktivitas pMMO diuji dengan mengetahui jumlah propilen epoksidasi melalui NADH sebagai reduktan aktivitas spesifik
pMMO  dapat  meningkatkan  konsentrasi ion tembaga pada bakteri yang ditumbuhkan  pada  media.  Enzim  ini terdapat pada membran dalam sitoplasma. Ukuran  substrat  yang  dimiliki  enzim pMMO  lebih  kecil  dibandingkan  dengan enzim sMMO dan enzim monooksigenase lainnya. Enzim  monooksigenase  memiliki peran  dalam  mereduksi  ikatan  O=O menjadi  ikatan  dioksigen  (Lipscomb 1994).
Mekanisme  kerja  enzim  pMMO melibatkan  aktivasi  molekul  oksigen  oleh Cu  (I).  Interaksi  antara  molekul  oksigen dengan Cu (I) menghasilkan kompleks (µ- η2  :η2  -peroxo)Cu(II)2  yang  dapat diisomerasi  menjadi  bis(µ-oxo)Cu(III)2. Hasil isomerasi tersebut merupakan senyawa yang mampu memecah ikatan C- H  alkana  (Silva et  al. 2016).  Proses selanjutnya  adalah  konversi  metanol menjadi  formaldehid,  yang  merupakan senyawa antara utama sebelum memasuki jalur metabolisme berikutnya. Enzim yang berperan  dalam  proses  ini  adalah  metanol dehidrogenase (MDH) (Knief et al. 2003). Proses  konversi  oleh  MDH  merupakan proses  kunci  (Hanson  dan  Hanson  1996) dalam jalur metabolisme bakteri pengguna karbon  tunggal  (C1)  seperti  metilotrof. Formaldehid  dapat  memasuki  dua  jalur metabolisme  yaitu  jalur  metabolisme ribulosa  monofosfat  (RuMP)  dan  jalur serin.  Hasil  asimilasi  formaldehid  berupa CO 2 dan  senyawa  multikarbon.    Jalur RuMP  digunakan  oleh  bakteri  metanogen tipe I. Oksidasi formaldehida melalui jalur ini  tidak  membutuhkan  kekuatan  reduksi sehingga  seluruh  sumber  karbonnya digunakan  sebagai  bahan  untuk  membuat materi  sel.  Dua  enzim  unik  pada  jalur  ini adalah  heksulose-6-fosfat  sintase  dan
heksulose  fosfat  isomerase  (Hanson  dan Hanson 1996). Jalur RuMP membutuhkan satu molekul ATP untuk setiap pembentukan satu molekul gliseraldehida- 3-fosfat.  Bakteri  yang  terolong  tipe  I memiliki  jumlah  sel  yang  lebih  banyak dibandingkan  dengan  tipe  II  karena perbedaan penggunaan
energi (Balasubramanian  et  al.  2011).  Menurut Hanson  dan  Hanson  (1996),  jalur  serin membutuhkan  dua  molekul  NADH  dan ATP  sebagai  sumber  energi  untuk pembentukan satu molekul asetil KoA dan satu  molekul  CO 2 .  Asetil  KoA  kemudian digunakan  untuk  membentuk  materi  sel yang baru. Enzim spesifik yang teridentifikasi pada jalur serin adalah serin hidroksimetil transferase (STHM),
hidroksipiruvat  reduktase  (HPR),  dan malil koenzim A liase (MCI).
Uji  Gram  bertujuan  untuk  mengetahui isolat  yang  diperoleh  termasuk  kedalam bakteri Gram negatif atau positif. Berdasarkan  hasil  yang  didapat  dari pengujian Gram dan pengamatan dibawah mikroskop  pada  perbesaran  100  kali, diketahui  bahwa  isolat  yang  diperoleh merupakan kelompok bakteri Gram negatif. Hal ini berdasarkan hasil pengamatan  dibawah  mikroskop  setelah penambahan larutan safranin dan dikeringkan,  isolat  menunjukkan  warna merah. Uji Gram yang dikembangkan oleh Hans  Christian  Gram  pada  tahun  1884 merupakan metode yang umum digunakan untuk  membedakan  bakteri  Gram  positif dan  bakteri  Gram  negatif.    Bakteri  Gram positif  menyerap  zat  pewarna  primer (kristal  violet)  sehingga  berwarna  ungu atau  biru.    Sebaliknya,  bakteri  Gram negatif  melepas  zat  warna  (kristal  violet) setelah  dicuci  dengan  alkohol  dan
kemudian  menyerap  zat  warna  terakhir yang diberikan yaitu safranin atau fuchsin sehingga  berwarna  merah.    Perbedaan sifat  dalam  menyerap  warna  terkait dengan perbedaan struktur dan komponen dinding  sel  kedua  jenis  bakteri  tersebut. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang  tebal  tersusun  oleh  peptidoglikan dan  polimer  sekender  serta  bersifat  relatif impermeable  sehingga  tahan  terhadap dekolorisasi dan mempertahan zat pewarna  primer.    Sebaliknya,  bakteri Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan  tipis  yang  diselaputi  oleh membran luar berupa lapisan ganda lipid- protein  yang  mengalami  kerusakan  pada tahap  dekolorisasi  (Beveridge,  2001; Coico, 2005). Morfologi yang ditunjukkan adalah berbentuk batang yang dapat  dilihat  pada  Gambar  1.    Berbeda halnya dengan pengamatan yang dilakukan  oleh  Drancourt et.al (2001), bakteri Klebsiella sp. menunjukkan bentuk  yang  tidak  berkapsul,  sel  bakteri berbentuk  Gram  negatif,  bersifat  non- motil.  Bakteri  ini  satu  familia  dengan bakteri Enterobakter.
Analisis  molekuler  untuk  identifikasi isolat bakteri dimulai dengan isolasi DNA dari kultur bakteri baik dari medium padat maupun  dari  medium  cair.  Kemudian DNA  yang  diperoleh  dijadikan  cetakan dalam tahap amplifikasi dengan PCR. Saat menggunakan PCR primer yang digunakan  adalah  primer  16S  rRNA  yang bersifat universal yang diharapkan menghasilkan  amplikon  berukuran  sekitar 1500  bp.  Hasil  amplifikasi  gen  penyandi 16S rRNA menunjukkan bahwa amplikon berukuran sekitar 1300 bp seperti disajikan  pada  Gambar  2.  Primer  yang digunakan  dapat  mengamplifikasi  daerah
16S  rRNA  dari  seluruh  bakteri.  Setelah produk  PCR  dimurnikan  dengan  kit komersial, selanjutkan produk PCR tersebut  diurutkan  nukleotidanya  dengan metode  sekuensing  DNA.  Primer  yang digunakan saat PCR juga digunakan untuk sekuensing  DNA  tetapi  yang  digunakan hanya  salah  satu  ( forward atau reverse ) untuk  setiap  reaksi  sekuensing  DNA. Pembacaan  sekuen  DNA  berdasarkan produk  hasil  sekuensing  dengan  ukuran yang  berbeda-beda.  Hal  ini  disebabkan pada saat sekuensing ditambahkan
dideoxyribonuclease triphosphate
(ddNTP)  atau  dNTP  terminator  yang dilabel  dengan  zat  warna  (Janda  dan Abbott 2008). Dalam satu siklus terminator  ini  akan  berikatan  secara  acak dan  menghentikan  proses  pemanjangan.
Tiap  terminator  memiliki  zat  warna fluoresen yang berbeda-beda dalam menyerap  panjang  gelombang.  Sekuens DNA  terbentuk  dari  hasil  pensejajaran pembacaan forward dan reverse yang disebut  sekuens  konsensus.  Sekuens konsensus  ini  kemudian  dibandingkan dengan  data  sekuens  yang  tersedia  di database (Rinanda 2011).
Isolat yang digunakan untuk analisis  sekuens  DNA  adalah  isolat AMD13.  Pemilihan  isolat  ini  berdasarkan aktivitas pMMO yang relatif tinggi.  Hasil sekuensing  ini  memiliki  nilai  indent sebesar  98%  dengan Klebsiella  sp. strain SR-18, Klebsiella  sp. strain  SR-13, Klebsiella  sp. strain  SO4, Klebsiella oxytoca CAU543, Klebsiella  oxytoca CAU1559,    dan Klebsiella  oxytoca CAU3466.  Dengan  nilai  indent  yang mendekati  100%  diketahui  bahwa  isolat AMD13 merupakan Klebsiella sp. Sekuen  DNA  yang  diperoleh  kemudian
dianalisis  menggunakan  aplikasi  MEGA untuk mengetahui kekerabatannya.
Sekuen  DNA  disejajarkan  dengan  dengan data  sekuens  yang  berada  pada  data GenBank .  Tujuan  pensejajaran  adalah mencocokkan karakter-karakter yang homolog.  Hasil  pensejajaran  tersebut selanjutnya digunakan untuk mengkonstruksi pohon filogenetika. Proses pensejajaran tersebut memperlihatkan  beberapa  gap.  Gap  ini menunjukkan  adanya  perubahan  (mutasi) sekuens  seperti  insersi,  delesi  atau penyusunan ulang materi genetik. Beberapa metode mengabaikan
keberadaan  gap  ini  tetapi  ada  juga  yang hanya  memfokuskan  kepada  pensejajaran yang  tidak  memiliki  gap  sama  sekali (Dharmayanti 2011).
Pohon  filogenetik  menampilkan jarak  antara  isolat  yang  diperoleh  dengan sekuens  yang  diambil  dari  data  GenBank. Jarak ini mencerminkan jumlah perubahan diantara  masing-masing  pasangan  yang menentukan  konstruksi pohon filogenetik. Pasangan sekuens yang memiliki perubahan  yang  kecil  atau  bisa  juga disebut  memiliki  jarak  yang  kecil  disebut dengan neighbours. Pohon  filogenetika menggunakan  satu  titik    atau  posisi common ancestor dan dihubungkan dengan  titik  oleh  sebuah  cabang.  Tujuan dari  mengetahui  jarak  ini  adalah  untuk sebisa  mungkin  memberikan  data  yang akurat  mengenai  kekerabatan  isolat  yang dimiliki dengan sekuens yang didapat dari data GenBank (Dharmayanti 2011). Berdasarkan analisis pohon filogenetik diketahui bahwa isolat
AMD13  memiliki  kekerabatan  yang sangat dekat dengan spesies Klebsiella sp. Hal  ini  dapat  dilihat  bahwa  jarak
kekerabatannya yang bernilai 100
berdasarkan  pada  Gambar  3.    Isolat bakteri  AMD13  tersebut  disimpulkan merupakan bakteri Klebsiella sp .   Sekuen gen  16S  rRNA  merupakan  sekuen  DNA yang  paling  sering  digunakan  untuk  studi filogeni dan taksonomi bakteri. Alasannya  antara  lain:  1)  sekuen  ini  ada pada hamper semua bakteri; 2) fungsi gen 16S  rRNA  tidak  berubah  selama  rentang evolusi; 3) ukuran gen 16S rRNA (sekitar 1500  pb)  memberikan  informasi  yang cukup  untuk  tujuan  studi  filogeni  dan taksonomi (Janda dan Abbott 2007).
Bakteri Klebsiella  sp. mampu menurunkan  konsentrasi  senyawa  emisi gas  rumah  kaca,  khususnya  CH 4 (Zhao et.al 2009).  Menurut  Murrell  dan  Dalton (1992), Klebsiella  sp. memiliki  kesamaan dengan bakteri metanotrof dalam mereduksi  gas  metana,  terutama  dengan bakteri  metanotrof  tipe  II.  Namun, pemanfaatan  gas  metana  oleh Klebsiella sp belum  diketahui  secara  mendalam. Bakteri  metanotrof  memanfaatkan  gas metana dan merubahnya menjadi metanol. Bakteri  metanotrof  merupakan  kelompok bakteri yang menggunakan metan sebagai sumber  karbon  dan  energi.  Bakteri  ini dapat  ditemukan  di  lingkungan  yang cukup  ekstrim  dan  pada  lingkungan  yang mengandung tanah (Amanda 2007).
Keberadaan oksigen di lingkungan
merupakan  faktor  penting  dalam  aktivitas pertumbuhan  bakteri  metanotrof  begitu juga  dengan Klebsiella  sp. (Alshareedah dan Sallis 2016.). Organisme ini memiliki peran  yang  cukup  penting  dalam  siklus karbon dan kemampuannya dalam membatasi gas metana yang menyebabkan pemanasan global (Amanda 2007).
5. UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis menyampaikan terima kasih  kepada  Laboratorium  Mikrobiologi, Departemen  Biologi,  FMIPA  IPB  atas dukungan fasilitas yang diberikan. Penulis juga  menyampaikan  terima  kasih  kepada Ir  Antonius  Krisdawanto,  SE,  MBA  atas dukungan  dalam  pelaksanaan  penelitian ini.

## 6. DAFTAR PUSTAKA
Agung  P,  Suarsini  E  dan  Amin  M.  2009.
Isolasi DNA genom bakteri potensial  pengkelat  logam  berat kadmium dari limbah cair penapungan  agar.  Seminar  Nasional
Pendidikan dan Saintek.
Alshareedah  A  dan  Sallis  P.  2016. Methanotropic  oxygen  dependency and availability for sustained oxidation. Int  J  Waste  Resources. 6(3): 1-11.
Amanda H dan Rosenzweig C. 2007. The biochemistry  of  methane  oxidation. Annu Rev Biochem. 76: 223-241.
Balasubramanian R, Enney G E, Rosenzweig  A  C.  2011.  Dual pathways  for  copper  uptake  by methanotropic  bacteria. J  Biol
Chem. 286 (43): 37313-37319.
Beveridge  TJ.    2001.    Use  of  the  Gram stain  in  microbiology. Biotech Histochem . 76(3):111-8
Coico  R.    2005.    Gram  staining. Curr Protoc  Microbiol .    Appendix  3C. doi:10.1002/9780471729259.mca03 cs00.
Dharmayanti  N  L  P.  2011.  Filogenetika
molekuler: Metode taksonomi organisme berdasarkan sejarah
evolusi. Wartazoa. 21(1): 1-10
Drancourt  M,  Bollet  C,  Carta  A  dan Rousselier  P.  2001.  Phylogenetic analyses of Klebsiella species
delineate Klebsiella and Raoutella gen.  nov.,  with  description  of
Raoutella ornithinolytica comb. nov., Raoutella  terrigena comb. nov. Int  J  Syst  Evol  Microbiol. 51: 925-932.
Fricke  T.  2009.  Studi  Latar  Belakang: Penggunaan  Limbah  dan  Produk Sampingan  Kelapa  Sawit  Secara Berkelanjutan. USAID-Indonesia.
Graham  DW,  Korich  DG,  Leblanc  RP,
Sinclair  NA,  Arnold  RG.  1992.
Applications  of  a  colorimetric  plate assay for soluble methane monooxygenase activity. Appl Environ Microbiol. 58(7): 2231-
2236.
Hanson  RS  dan  Hanson  TE.  1996. Methanotrophic  bacteria. Microbiol
Rev . 60(2):439-471.
Janda  J  M  dan  Abbott  S  L.  2007.  16S rRNA gene sequencing for bacterial identification  in  the  diagnostic laboratory: pluses, perils and pitfalls. J.  Clin.  Microbiol.. 45(9):
2781-2784.
Knief  C,  A  Lipski,  PF  Dunfield.  2003.
Diversity and activity of methanotrophic  bacteria  in  different upland soils. Appl. Environ.
Microbiol . 69:6703-6714.
Lilik  S  S.  2001.  Pemanfaatan  gas  metana sebagai sumber energi. Berita
Dirgantara. 2(1): 31-34.
Lipscomb  JD.  1994.  Biochemistry  of  the soluble  methane  monoxygenase. Annu Rev Microbiol. 48:371–399.
Masykur  2013.  Pengembangan  industri kelapa  sawit  sebagai  penghasil energi  bahan  bakar  alternatif  dan mengurangi pemanasan global (studi di  Riau  sebagai  penghasil  kelapa sawit  terbesar  di  Indonesia). J
Reform. 3(2): 96-107.
Mohammadi S, Pol A, Alen T van, Jetten
M  S  M,  Camp  H  J  M  den.  2017.
Ammonia  Oxidation  and  Nitrite Reduction  in  the  Verrucomicrobial Methanotroph
Methylacidiphilum fumariolicum SolV. Front.Microbial.
8: 1-11.
Murrel  J  C,  Dalton  Howard.  1992.
Methane  and  Methanol  Utilezers. England (EN): Plenum Press.
Purwanti,  Elystia  Shinta  dan  Sasmita  A. 2014.  Pengolahan  Limbah  Cair Pabrik Kelapa Sawit dengan Metode Fitoremediasi  Menggunakan Typha latifolia. Jom Fteknik. 1(2): 1-9.
Rinanda T. 2011. Analisis sekuensing 16S rRNA di bidang mikrobiologi. J Ked Syiah Kuala. 11(3): 172-177.
Ross MO, Rosenzweig AC.  2017.  A tale of  two  methane  monooxygenases.
J  Biol  Inorg  Chem 22(2-3):  307– 319.  doi:10.1007/s00775-016-1419-
y.
Rusmana  I,  Akhdiya  A.  2009.  Isolation and characterization of methanotrophic  bacteria  from  rice fields. Biotropia. 16(2): 71-78.
Sembiring  J  V,  Nelvia,  Arnis  E  Y.  2015.
Pertumbuhan  kelapa  sawit  ( Elaeis guineensis Jacq)  di  pembibitan
utama  pada  medium  sub  soil  ultisol yang diberi asam humat dan kompos tandan  kosong  kelapa  sawit. J Agrotek. 6(1): 25-32.
Silva  J  C.S,  Pennifold  Rt  C  R,  Harvey  J dan  Rocha  W.  2016.  A  radical rebound mechanism for the methane oxidation  reaction  promoted  by  the docopper  center  of  a  pMMO
enzyme: a
computational perspective. Dalton  Trans. 45:
2492-2504.
Sirajuddin  S  dan  Rosenzweig  A  C.  2015. Enzymatic  oxidation  of  methane.
Biochem J. 54 (14): 2283-2294.
Swandi M K, Periadnadi, Nurmiati. 2015. Isolasi  bakteri  pendegradasi  limbah cair  industri  minyak  sawit. J  Bio Univ Andalas. 4(1): 71-76.
Widarti  B  N,  Septian  H  D,  Edhi  S.  2015. Degradasi  COD  limbah  cair  dari pabrik  kelapa  sawit  dalam  proses pembentukan  biogas. JIPs. 5(3): 138-141.
Zhan  Y-Y,  Zhang  Y,  Li  Q-M,  Du  X-Z. 2010.
A novel visible spectrophotometric  method  for  the determination  of  methanol  using sodium nitroprusside as spectroscopic probe. Biotechnol
Bioeng. 57 (2): 230-235.
Zhao CG Zheng J, Li HP, Wen GM, Yang SP,  Dong  C,  Choi  MM.  2009. Characterization  of  a  methane- utilizing  strain  and  its  application for  monitoring  methane. J  Appl Microbiol . 106(6): 2024-2030.