CHITOSAN OLIGOMER PRODUCTION FROM WASTE TIGER SHRIMP ( Penaeus monodon ) USING ENZYMES CHITOSANASE OF BACTERIAL

## ISOLATES Klebsiella sp
Produksi Oligomer Kitosan dari Limbah Udang Windu ( Panaeus monodon ) Menggunakan Enzim Kitosanase dari Isolat Bakteri Klebsiella sp
Sarni 1 , Hasnah Natsir 2 , Seniwati Dali 2
1 Midwifery Academic of National Healting Fondation, Jl. Palagimata, Baubau-Indonesia
2 Department of Chemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Hasanuddin, Jl. Perintis Kemerdekaan 90245, Makassar-Indonesia
*Corresponding author,  Email: sarni_malik@yahoo.com
Received:  Dec 2015 Published: Jan 2016

## ABSTRACT
Chitosan is a biopolymer that is the main content of D-glucosamine and several parts of N-acetyl-D-glucosamine bound  to  β-  (1-4)  glucoside.  Chitosan  receive  special  attention  as  functional  biopolymers  for  applications  in various fields. Chitosan is more effectively absorbed into the human body when it gets converted into chitosan oligomer form. Chitosan oligomer is a mixture of oligomers of D-glucosamine  are formed through a process of severing ties depolymerization of chitosan with β-glycosidic. This study aims to produce chitosan oligomer of waste  tiger  shrimp  (Penaeus  monodon)  using  enzyme  kitosanase  of  bacteria  Klebsiella  sp. Chitosan  oligomer produced by using the enzyme chitosanase at a temperature of 40 °C and pH 8 with the activity of 0.309 U/mL (5,235 U/mg) obtained in the form of a mixture of monomer to octamer, which  soluble in acetic acid 0.25% to 0.5%,  having  intrinsic  viscosity  decreases  with  increasing  time  of  incubation  is  0.195  (1  hour  incubation);  0.9 (incubation 2 hours) and 0.7 (incubation 3 hours) with molecular weight range of 4103.12 g/mol (incubation 1 hour) ; 1483.48 g/mol (incubation 2 hours) and 1065.79 g/mol (incubation 3 hours).
Keywords : Waste Tiger Shrimp,chitosan, chitosanase,chitosan oligomer.

## PENDAHULUAN
Indonesia  memiliki  potensi  sumber  daya alam  laut  yang  sangat  melimpah,  salah  satu diantaranya  adalah  budidaya  udang.  Udang merupakan  komoditas  sektor  perikanan  yang mempunyai  nilai  ekonomis  tinggi  dan  menjadi salah  satu  komoditas  eksport  unggulan  (Arif, 2013).  Data  statistik  Dirjen  Perikanan  Budidaya Kementerian  Kelautan  dan  Perikanan,  produksi total  udang  nasional  tahun  2014  mencapai 592.219  ton  dan  jumlah  ekspor  udang  dalam bentuk  beku  tanpa  kepala  dan  kulit  tahun  2014 mencapai  250.000  ton  ke  pasar  dunia  (DJPB- KKP.htm, 2015). Hasil samping proses pembekuan  sekitar  40  –  50%  dari  berat  udang menjadi  limbah  (kulit  dan  kepala)  yang  saat  ini masyarakat  hanya  menggunakan  sebagai  bahan perasa  pada  pembuatan  kerupuk  dan  terasi (Natsir  dkk.,  2004).  Kulit  udang  yang  hanya menjadi  limbah  mengandung  senyawa  kimia
yang  berpotensi  menjadi  bahan  yang  sangat bermanfaat  yaitu  kitin  dan  kitosan.  Oleh  sebab itu  untuk  mengatasi  masalah  lingkungan  dari limbah  ini  diperlukan  penanganan  yang  serius agar  limbah  tersebut  dapat  memiliki  nilai ekonomis.
Kitosan  merupakan  suatu  poli-(2-amino-2- deoksi-β-(1-4)-D-glukopiranosa)  dengan  rumus molekul  (C 6 H 11 NO 4 ) n (Arief,  2013)  yang  dapat diperoleh  dari  deasetilasi  sempurna  atau  parsial kitin. Kitosan adalah biopolymer yang kandungan utamanya D-glukosamin dan beberapa  bagian  N-asetil-D-glukosamin  yang berikatan  pada  β-(1-4)  glukosida  (Mahae  dkk., 2011). Kitosan dapat dihidrolisis menjadi bentuk oligomernya  yang  dikenal  dengan  oligomer kitosan.
Kitosan  mendapat  perhatian  khusus  sebagai biopolimer  fungsional  untuk  aplikasi  diberbagai bidang.  Penelitian  dan  pemanfaatan  kitosan  dan
oligomernya mengalami peningkatan yang signifikan  di  berbagai  bidang  terutama  dalam bidang farmasi, kesehatan dan industri makanan. Kitosan  lebih  efektif  terserap  kedalam  tubuh manusia  bila  dikonversi  dulu  dalam  bentuk oligomer kitosan (Qin Caiqin dkk., 2002).
Oligomer  kitosan  merupakan  campuran oligomer  dari  D-glukosamin  yang  terbentuk melalui  proses  depolimerisasi  kitosan  dengan memutus  ikatan  β-glikosidik.  Kitooligomer merupakan  kitosan  yang  telah  terdepolimerisasi sehingga  memiliki  ukuran  dan  bobot  molekul yang  lebih  kecil.  Berkurangnya  bobot  molekul dari kitosan ini menjadikan sifatnya lebih mudah larut di dalam air dibanding sebelum terdepolimerisasi  (Srijanto  dkk.,  2006;  Julianti dkk., 2012).
Pengembangan  aplikasi  oligomer  kitosan pada  saat  ini  dikarenakan  sifatnya  yang  dapat larut  dalam  air  dan  ramah  lingkungan  sehingga penggunaanya  relatif  aman.  Kitooligomer  saat ini  di  terapkan  secara  luas  dalam  bidang kesehatan  karena  memiliki  bioaktivitas  sebagai anti  bakteri,  anti  jamur,  anti  virus,  suplement makanan  untuk  meningkatkan  sistem  imun terhadap  penyakit,    anti  koagulasi  darah  dan hipokolesterolmik, anti kanker, anti diabetes dan lain-lain  (Srijanto  dkk.,  2006).  Aktivitas  biologi dari kitooligosakarida diketahui bergantung pada struktur  kimia  yang  dimilikinya  (Cabrera  dkk., 2013).
Oligomer  kitosan  dapat  dihasilkan  dengan iradiasi  sonik,  hidrolisis  secara  kimiawi  dan hidrolisis  secara  enzimatis.  Hidrolisis  secara kimiawi  dan  iradiasi  sonik  bersifat  acak,  tidak terkontrol, efisiensi yang rendah dan menghasilkan oligomer dengan derajat polimerisasi  (DP)  yang  rendah  dengan  lebih banyak  monomer  D-glukosamin.  Sedangkan, hidrolisis  secara  enzimatis  bersifat  spesifik, terkontrol, menghasilkan oligomer kitosan dengan  DP  yang  lebih  tinggi  dan  sedikit glukosamin yang dihasilkan serta ramah lingkungan  (Jeon  dkk.,  2000;  Meidina  dkk., 2005;  Wahyuni  dkk.,  2006;  Liu  dkk.,  2007; Chasanah,  2010),  sehingga  cara  enzimatis  ini lebih  baik  dan  umumnya  digunakan  dalam memproduksi  kitooligosakarida.  Salah  satu enzim yang dapat digunakan untuk menghidrolisis  kitosan  adalah  enzim  kitosanase (Choi dkk., 2004).
Kitooligosakarida  dari  limbah  senyawa berkitin  yang  belakangan  ini  telah  menarik
perhatian  industri  karena  manfaatnya  untuk pangan  dan  medis  menunjukkan  nilai  ekonomis yang  cukup  tinggi.  Pasar  dunia  untuk  produk turunan  kitin  menunjukkan  bahwa  kitooligomer adalah produk yang termahal, misalnya kitobiose (Sigma) mencapai 952 USG 10 mg. Oleh karena itu  kajian dan penelitian tentang  aplikasi  kitosan dan oligomernya dipandang sangat penting untuk usaha  produksi  senyawa  bioaktif  yang  dapat diaplikasikan  sebagai  pangan  fungsional  dan nutraceutical (Wahyuni dkk., 2006).
Beberapa  penelitian  melaporkan  potensi oligomer  kitosan  dari  bahan  berkitin,  misalnya Pae  (2001)  melaporkan  terjadinya  induksi granulositik  pada  sel promyelocytic  leukemia (HL-60)  oleh water-soluble  chitosan  oligomer (WSCO).  Caiqin  Qin  dkk  (2002)  melaporkan kitosan  larut  dalam  air  secara  enzimatik  dan aktivitasnya sebagai anti tumor. Sri Wahyuni dkk (2006) melaporkan aktivitas anti kanker senyawa-senyawa  kitooligomer.  Qingsong  Xu dkk  (2007)  melaporkan  kitooligosakarida  dapat menginduksi apoptosis cell kanker hepatocellular pada manusia. Sanaa T. El-Sayed dkk  (2012)  melaporkan  kitooligosakarida  yang dihasilkan  dengan  kitosanase  dari Capsicum annuum efektif dalam menghambat sel karsinoma hepatocellular (HEP-G2),  sel  kanker usus  dan  sel  kanker  payudara  (MCF7)  pada konsentrasi yang berbeda.
Berdasarkan  latar  belakang  dan  mengacu pada  data-data  penelitian  sebelumnya  tentang pemanfaatan limbah udang dengan mengeksploitasi potensi kitosan dan oligomernya dari limbah berkitin, sehingga pada penelitian ini bertujuan  untuk  produksi  oligomer  kitosan  dari limbah kulit udang windu ( Penaeus monodon ) di dengan  menggunakan  enzim  kitosanase  dari bakteri Klebsiella sp.

## METODOLOGI

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  diantaranya  serbuk kulit  udang  windu  ( Panaeus  monodon ),  isolate bakteri Klebsiella  sp (koleksi  laboratorium biokimia Jurusan kimia UNHAS), kitosan DD 85 %  (Sigma),  yeast  ekstrak,  bakto  pepton, glukosamin  (Sigma),  n-Propanol  p.a  (Merck), Amoniak  p.a  (Merck),  Ninhidrin  p.a  (Merck), HCl  37  %  p.a  (Merck),  NaOH  p.a  (Merck), NaOCl  0,5  %,  CH 3 COOH  glasial  p.a  (Merck), NaCl (Merck), CaCl 2 (Merck), K 2 HPO 4 (Merck), MgSO 4 .7H 2 O (Merck).
Alat
Alat  yang  digunakan  adalah  hotplate  stirer Velp,  neraca  analitik,  inkubator, autoclave , lemari  pendingin,  magnetic  stirer, wrist  action shaker , vortex mixer, shaker inkubator , sentrifus dingin, oven (Eyela NDO-400, Jepang), penyaring  Buchner, Freezedryer ,  kertas  saring whatman, penangas,  pinset, waterbath  shaker , pompa  vakum,  spektronik  20D+, Fourier Transform  Infra  Red (FTIR)  Spectroscopy (Shimazu),  Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT), viscometer Oswald serta  beberapa  peralatan gelas ( pyrex ).
Prosedur Kerja
A. Isolasi  Kitosan  dari  Kulit  Udang  Windu ( Panaeus monodon )
Proses  isolasi  kitosan  dari  limbah  kulit udang  dilakukan  secara  kimiawi  yang  diawali dengan  isolasi  kitin  dari  kulit  udang  windu ( Paneus  monodon )  terdiri  dari  tiga  tahap  antara lain  demineralisasi,  dekolorisasi,  deproteinasi. Selanjutnya kitosan dihasilkan dengan deasetilasi kitin  secara  kimiawi  menggunakan  NaOH  50  % pada suhu 80 °C selama 90  – 100 menit dengan perbandingan    1  :  10  untuk  kitin  dan  larutan NaOH (Manurung, 2011).
B. Karakterisasi  Kitosan  dari  Kulit  Udang Windu ( Panaeus monodon ) Karakterisasi kitosan yang diperoleh meliputi  kadar  air,  kadar  abu,  kadar  N-total, berat  molekul,  derajat  deasetilasi  dan  analisis gugus fungsi menggunakan FTIR.

## C. Produksi Enzim Kitosanase
Produksi  enzim  kitosanase  dimulai  dengan pembuatan medium inokulum untuk  starter yang mengandung  0,5%  koloidal  kitosan,  kemudian bakteri Klepsiella sp yang diremajakan sebelumnya  diinokulasikan  dalam  media  starter dan  diinkubasi  pada  shaker  incubator  pada  suhu 37  ºC,  180  –  200  rpm  selama  24  jam.  Medium starter    sebanyak  10%  (v/v)  diinokulasikan  ke dalam  medium  produksi  kemudian  diinkubasi selama  60  jam  pada  suhu  40  ºC  dan  kecepatan yang  sama  untuk  medium  starter . Enzim  yang dihasilkan disentrifugasi dingin pada  4  ºC 3500 rpm  selama  30  menit  yang  diikuti  dengan mengukur  aktivitas  kitosanase  serta  ditentukan kadar proteinnya dengan metode Lowry, dimana
BSA  ( Bovine  Serum  Albumin )  sebagai  larutan standar (Chasanah, 2009 ; Sarni dkk, 2015).

## D. Uji Aktivitas Enzim Kitosanase
Uji  aktivitas  kitosanase  dilakukan  dengan menggunakan  metode Schales yang  digunakan oleh  Yoon  dkk  (2001),  Jo  dkk  (2003)  dan Chasanah dkk (2009). Aktivitas enzim ditentukan  berdasarkan  jumlah  glukosamin  yang dibebaskan  selama  hidrolisis  substrat  kitosan. Satu  unit  aktivitas  enzim  didefinisikan  sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menghasilkan µmol residu glukosamin per menit setelah diinkubasi dengan larutan kitosan

## E. Produksi Oligomer Kitosan dengan Enzim Kitosanase
Kitosan  terlarut  1%  dipersiapkan  sebagai substrat.  Oligomer  kitosan  dihasilkan  dengan mereaksikan enzim dan substrat pada perbandingan  volume  1  :  1  dilakukan  pada  pH dan  suhu  optimum  enzim  dan  diinkubasi  pada inkubator goyang selama 1, 2, dan 3 jam. Reaksi hidrolisis  enzimatis  untuk  tiap  waktu  inkubasi dihentikan  dengan  membekukan  campuran reaksi selama 15 menit, kemudian panaskan pada penangas  air  suhu  100  °C  selama  10  menit. Larutan  kitooligosakarida  kemudian  dikeringkan dengan freeze  drying (Choi  dkk.,  2004;  Assis dkk.,  2010).  Hidrolisat  diidentifikasi  dengan Kromatografi  Lapis  Tipis  berdasarkan  metode yang  digunakan  oleh  Choi  dkk  (2004)  dan Mourya  dkk  (2011).  Oligomer  kitosan  yang diperoleh  tiap  waktu  inkubasi  juga  ditentukan berat  molekulnya  dengan  metode  viskometri yang  digunakan  oleh  Mourya  dkk  (2011)  dan Julianti dkk (2012).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Isolasi  dan  Karakterisasi  Kitin  dan Kitosan dari Kulit Udang Windu ( Panaeus monodon )
Proses  sintesis  kitosan  diawali  dengan isolasi  kitin  dari  kulit  udang  windu  yang  telah dihaluskan  dengan  ukuran  60  hingga  80  mesh. Kitin  yang  diperoleh  pada  tahap  ini  sebesar 20,25%.  Hasil  ini  sesuai  dengan  teori  yang mengatakan  kadar  kitin  dalam  kulit  udang sebesar 15 – 20% (Purwatiningsih, 2009).
Hasil karakterisasi kitin yang diperoleh pada Tabel  1  menunjukkan  bahwa  kitin  yang
dihasilkan  memiliki  standard  mutu  yang  baik berdasarkan standard laboratorium.
Tabel 1. Perbandingan karakteristik kitin hasil isolasi dari limbah udang windu ( Penaeus monodon ) dengan kitin standar (Menurut Protan
Laboratories) Jenis Sampel Kadar Air (%) Kadar Abu (%) N-Total (%) Derajat deasetilasi (%) Kitin Udang Windu 4,5 0,45 5,3 41,42 Kitin standar (Protan Lab.)* ≤ 10 ≤2 6 - 7 15 – 70
* nilai karakteristik kitin dari pustaka
Gambar 1. Spektrum FTIR (a) kitin dan (b) kitosan hasil isolasi dari limbah udang windu ( Penaeus monodon )
Hasil  analisis  FTIR kitin dari  limbah  udang windu diperoleh spektrum seperti pada Gambar 1 dan  identifikasi  puncak  serapan  spektrum  infra merah  diperoleh  interpretasi  gugus  fungsi  yang menyerap  pada  senyawa  kitin  hasil  isolasi  dapat dilihat pada Table 2.
Tabel 2. Spektra FTIR kitin hasil isolasi dari limbah udang windu ( Penaeus monodon )
Gugus Fungsi Frekuensi (cm -1 ) N-H strech 3479,3446 O-H strech 3265 C-H strech alifatik 2929 C=O (amida I) 1658, 1625 N-H bend (amida II) 1554 CH 3 sym 1377 C-N strech 1317 C-O-C dlm siklik 1203, 1259 C-O-C strech pada dialkil 1157, 1116 C-OH strech 1072
Setelah  kitin  diperoleh  tahap  selajutnya adalah  proses  deasetilasi  untuk  menghasilkan
kitosan  sebagai  turunan  kitin.  Proses  deasetilasi bertujuan  untuk  menghilangkan  gugus  asetil pada  kitin  sehingga  menghasilkan  derajat kereaktifan kimia dari gugus amino yang tinggi. Kitosan  yang  dihasilkan  pada  proses  ini  sebesar 16,1  gram  dari  bobot  awal  (sampel  kulit  udang) dengan  kadar  16,1%.  Terjadi  penyusutan sebanyak 4,15% setelah proses deasetilasi.
Hasil  karakterisasi  kitosan  dari  limbah udang  windu  ( Panaeus  monodon )  dapat  dilihat pada Tabel 3. Dari Tabel 3 menunjukkan bahwa kitosan  yang  dihasilkan  secara  kimiawi  pada penelitian  ini  ditinjau  dari  parameter  kadar  air dan  kadar  abu  telah  memenuhi  standar,  namun kadar  N-total  dan  derajat  deasetilasinya  belum memenuhi standar ideal kitosan, jika dibandingkan dengan kitosan protan laboratories. Dimana  kadar  N-total  yang  diperoleh  hanya 6,4%, sedangkan kitosan standar yang ditetapkan memiliki kadar N-total 7–8%. Derajat deasetilasi kitosan yang diperoleh pada penelitian ini hanya sebesar  65,6%  dan  idealnya  menurut  standar protan laboratories adalah diatas 70%.
Tabel 3. Karakteristik kitosan dari limbah udang windu ( Penaeus monodon ) secara kimiawi Parameter Nilai Kadar air (%) 4,5 Kadar Abu (%) 0,45 Kadar N-Total (%) 6,4 Berat Molekul (g/mol) 25.410 Derajat Deasetilasi (%) 65,6
Tabel 4. Spektra FTIR kitosan hasil isolasi dari limbah udang windu ( Penaeus monodon ) secara kimiawi
Gugus Fungsi Frekuensi (cm -1 ) N-H strech 3444 C-H strech alifatik 2883 C=O (amida I) 1658 N-H bend (amida II) 1579 CH 3 sym 1379 C-N strech 1421 C-O-C dlm siklik 1257 C-O-C strech pada dialkil 1155 C-OH strech 1031
Namun  menurut  Muzzareli  (1985)  dalam Manurung  (2011)  mengatakan  bahwa    kadar minimal derajat deasetilasi  supaya dikategorikan kitosan  secara  umum  ialah  diatas  50%.  Oleh karena  itu,  hasil  yang  diperoleh  pada  proses
0 25 50 75 100 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 cm -1 % T (b) (a) 2 8 8 3 3 4 4 4 3 1 0 5 2 9 2 9 3 2 6 5 3 4 4 6 3 4 7 9
deasetilasi  dalam  penelitian  ini  tergolong kitosan,  namun  belum  kitosan  ideal  artinya masih berupa campuran kitin-kitosan.
Hasil  analisis  FTIR  kitosan  dari  limbah udang  windu  diperoleh  spektrum  seperti  pada Gambar  1  dan  identifikasi  puncak  serapan spektrum  infra  merah  diperoleh  interpretasi gugus  fungsi  yang  menyerap  pada  senyawa kitosan hasil isolasi dapat dilihat pada Table 4.
B. Produksi dan Uji Aktivitas Enzim Kitosanase Enzim kitosanase diawali dengan menumbuhkan klebsiella  sp pada  medium fermentasi  yang  mengandung  koloidal  kitosan sebagai  substratnya  untuk  mengetahui  kondisi optimal  produksi.  Waktu  yang  optimal  untuk memproduksi  enzim  kitosanase  dari Klebsiella sp dalam  medium  yang  mengandung  0,5% kitosan  adalah  selama  60  jam  dengan  nilai aktivitas 0,309 U/mL.
Selain  pengukuran  terhadap  nilai  aktivitas enzim, pengukuran kadar protein juga diperlukan untuk  mengetahui  nilai  aktivitas  spesifik  suatu enzim. Pengukuran kadar protein yang terbentuk selama  masa  produksi  enzim  menggunakan metode Lowry .  Kadar  protein  enzim  kitosanase pada  aktivitas  optimum  pada  penelitian  ini adalah  0,059 mg/mL,  sehingga  aktivitas  spesifik enzim  yang  diperoleh  sebesar  5,235  U/mg (Tabel 5).
Tabel 5. Kadar protein, aktivitas dan aktivititas spesifik crude enzim kitosanase
dari Klebsiella sp. Sampel Kadar protein (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas spesifik (U/mg) Kitosanase 0,059 0,309 5,235

## C. Produksi  dan  Identifikasi  Oligomer Kitosan Enzimatis
Pada  penelitian  ini  produksi  oligomer kitosan  dilakukan  secara  enzimatis  yaitu  dengan menggunakan  enzim  kitosanase  dari  isolat bakteri Klebsiella  sp yang  telah  diproduksi. Enzim  kitosanase  dapat  menghidrolisis  kitosan dan kitin, namun yang paling baik adalah dalam bentuk soluble kitosan.
Hidrolisis  kitosan menjadi oligomer kitosan secara  enzimatis  dipengaruhi  oleh  konsentrasi kitosan,  suhu  dan  pH  serta  agitasi  pada  saat reaksi.
Oligomer
kitosan diproduksi
menggunakan soluble kitosan 1% yang direaksikan  dengan  enzim  kitosanase  pada  suhu 40  ºC  dan  pH  8  selama  1,  2  dan  3  jam  dalam inkubator bergoyang. Hal ini dilakukan agar tiap variasi  waktu memiliki kondisi awal  yang  sama. Sehingga diharapkan dapat menghasilkan oligomer-oligomer  dengan  derajat  polimerisasi yang  berbeda-beda.  Oligomer  kitosan  kering yang  diperoleh  setelah  dikeringkan  dengan freezedryer memiliki kadar 57% dan larut dalam asam asetat 0,25% hingga 0,5%.
Tabel 6. Data nilai viskositas Intrinsik oligomer
kitosan tiap waktu inkubasi Jenis Sampel Viskositas Intrinsik [ ɳ ] Berat Molekul (g/mol) Oligomer kitosan 1 jam 0,195 4.103,12 Oligomer kitosan 2 jam 0,09 1.483,48 Oligomer kitosan 3 jam 0,07 1.065,79 Berdasarkan pengamatan hasil KLT (Gambar  2),  produk  hasil  hidrolisis  kitosan dengan  enzim  kitosanase  dari  isolate  bakteri Klebsiella  sp terdiri  dari  monomer  hingga oktamer khususnya oligomer kitosan pada waktu 2  dan  3  jam  inkubasi.  Sedangkan  pada  1  jam inkubasi tidak terpisah dengan baik karena rantai monomernya  masih lebih  panjang.  Hasil pemotongan  oligomer  yang  kurang  spesifik  dan beragam  ini,  dipengaruhi  oleh  larutan  enzim yang  digunakan  berupa  ekstrak  kasar  dan substratnya  adalah  kitosan  dengan  derajat deasetilasi yang rendah.

## A B  C
Gambar 2. Hasil KLT hidrolisis kitosan dengan kitosanase dari Klebsiella sp pada kondisi 40 ºC,
pH 8,0 selama  3 jam inkubasi (B), 2 jam inkubasi (C) dengan standar monomer glukosamin (A)
Monomer glukosamin
Deretan kitooligosakarida
(≥dimer)
Oligomer  kitosan  yang  telah  diperoleh  tiap waktu  inkubasi  diukur  viskositasnya  sehingga kisaran  berat  molekul  kitooligomer  yang diperoleh dapat ditentukan dengan menggunakan persamaan Mark-Kun-Houwik. Dari pengukuran viskositas  pada  Tabel  6,  diperoleh  viskositas intrinsik kitooligosakarida pada inkubasi 1 jam, 2 jam  dan  3  jam  berturut-turut  yaitu  0,195;  0,09 dan  0,07.  Dalam  hal  ini  telah  terjadi  penurunan nilai  viskositas  intrinsik  dari  kitosan  setelah inkubasi  selama  1  jam  (75  %),  2  jam  (88,5%) dan  3  jam  (95%).  Oleh  karena  viskositas intrinsik berbanding lurus dengan berat molekul, sehingga dengan menurunnya viskositas intrinsik dari  oligomer  kitosan  maka  terjadi  pula penurunan  berat  molekulnya,  dimana  persentasi penurunan berat molekul dari berat  kitosan  awal setelah  inkubasi  1  hingga  3  jam  berturut-turut sekitar  84%;  94,2%,  95,8%  .  Hal  ini mengindikasikan  bahwa  telah  terjadi  pemutusan ikatan rantai panjang pada kitosan, tepatnya pada ikatan  β(1-4)  glukosida  membentuk  rantai kitosan yang lebih pendek.

## KESIMPULAN
Hasil  penelitian  menunjukan  oligomer kitosan  yang  diperoleh  berupa  campuran  antara monomer hingga oktamer yang dapat larut dalam asam  asetat  0,25%  hingga  0,5%,  memiliki viskositas  intrinsik  yang  semakin  menurun dengan  bertambahnya  waktu  inkubasi  yaitu 0,195  (inkubasi  1jam);  0,9  (inkubasi  2  jam)  dan 0,7    (inkubasi  3  jam)  dengan  kisaran  berat molekul  4103,12  g/mol  (inkubasi  1  jam); 1483,48  g/mol  (inkubasi  2  jam)  dan  1065,79 g/mol (inkubasi 3 jam).
.

## DAFTAR PUSTAKA
Arif,  R.A.,  2013. Potensi  Kitin  Deasetilase  dari Bacillus  licheniformis  HSA3-1A  Untuk Produksi Kitosan dari Limbah Udang Putih (Penaeus  merguiensis)  Sebagai  Bahan Pengawet Bakso Ikan . Tesis tidak Diterbitkan. Program Pascasarjana Universitas Hasanuddin, Makassar. Assis, C.F., Araúnjo, N.K., Pagnoncelli, M.G.B., Pedrini, M.R.S., Macedo, G.R.,Santos, E.S., 2010. Chitooligosaccharides Enzymatic Production by Metharhizium anisoliae . Bioprocess  Biosyst.  Eng. DOI 10.1007/s00449-010-0412
Cabrera  J.C.  &  Cutsem  P.V.,  2005.  Preparation of  Chitooligosaccharides  with  Degree  of Polymerizationn  Higher  than  6  By  Acid  or Enzimatic degradation of Chitosan. Laboratorio de Oligosacarinas
Departamento  de  Fisiologia  Y  Bioquimica vegetal,  INCA,  Cuba. Biochem.  Eng.  J . 25 :165 – 172
Chasanah  E.,  Zilda,  S.D.,  dan  Uria  A.R.,  2009. Screening  and  Characterization  of  Bacterial Chitosanase  From  Marine  Environment. J. Coastal Development .  Vol. 12 (2) : 64-72.
Chasanah  E.,  2010.  Pengembangan  Produk Kitooligosakarida  dari  Limbah  Industri Perikanan Udang Secara Enzimatis Prospek dan  Kendala.  Balai  Besar  Riset  Pengolahan Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan  dan Perikanan. J. Squalen Vol 5 (2).
Choi  J.Y.,  Kim  E.J.,  Piao  Z.,  Yun  Y.C.,  Shin
Y.C., 2004. Purification and Characterization of Chitosanase from Bacillus  sp.  Strain  KCTC  0377BP  and  Its Application  for  the  Production  of  Chitosan Oligosaccharides.  American  Society  for Microbiology, Applied  and  Environmental Microbiology . Vol. 70 (8) : 4522-4531
El-Sayet,  S.,  El-Sayat,  M.,  Shousha,  W.G.,
Shehata, A.N., Omar, N.I., 2012. Production of  Novel  Antitumor  Chitooligosaccharides by  Using  Purified  Chitosanases  from Capsium annuum Leaves. Australian Journal  of  Basic  and  Applied  Sciences , 6(4):1-15
Jeon  Y.J.  &  Kim  S.K.,  2000.  Production  of Chitooligosaccharides  Using  Ultrafiltration Membran  Reactor  and  Their  Antibacterial Activity. Carb. Polymer 41: 133-141. Jo  Yu-Young,  Jo  K.J.,  Jin  Y.L.,  Kuk  J.H.,  Kim K.Y.,  Kim  T.H.,  Park  R.D.,  2003. Charakterization of Endochitosanases Producing Bacillus cereus P16. J.Microbiol.Biotechnol 13 (6) : 960-968 Julianti  S.,  Agusnar  H.,  Alfian  z.,  2012.
Pembuatan  Kitosan  Oligomer  Melalui Metode Degradasi Oksidatif dan Pengaruhnya Terhadap Viskositas dan Berat Molekul.  Universitas Sumatera  Utara,
Medan , J. Saintia Kimia Vol.1(1)
Liu  B.  ,  Wan-Shun  Liu,  Bao-Qin  Han,  Yu-Ying Sun,    2007.    Anti    diabetic  effects    of chitooligosaccharides    on  pancreatic    islet cells    in  streptozotocin-induced  diabetic
rats. World  J.  Gastroenterol 13  (5):    725– 731.
Mahae  N.,  Chalat  C.,  Muhammud  P.,  2011. Antioxidant  and  antimicrobial  Properties  of Chitosan  Sugar  Complex. Int.  Food Research J. 18(4): 1543 – 1551.
Manurung,  M.,  2011.  Potensi  Kitin/Kitosan  dari Kulit Udang sebagai Biokoagulan Penjernih Air. J. Kimia 5(2): 182 - 188 Meidina,  2005. Aktivitas  Antibakteri  Oligomer Kotosan  yang  Diproduksi  menggunakan Kitosanase dari Isolat B. Licheniformis MB- 2 ,  Tesis  tidak  Diterbitkan.  Pasca  Sarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Mourya,  V.K.,  Inamdar,  N.N.,  Choudari,  Y.M.,
2011.  Chitooligosacharides  :  Synthesis,
Caracterization and Applications. Goverment  Pharmacy  Collage,  Osmanpura,
Aurangabad,  India. Polimer  Science.  Ser.  A 53 (7): 583 – 612.
Natsir,  H.,  Noor,  A.,  Asfari,  N.,  2004.  Konversi Kitin  dari  Kulit  Kepiting  ( Scylla  serrata ) menjadi  Kitosan  dengan  Enzim  Kitin Deasetilase. Marine  Chimica  Acta 6  (1), 6–9.
Pae,  Ho,  2001.  Introducton  ofGranulocytic
Differentiation  in  Acute  Promyelocytic Leukemia  Cell  (HL-60)  by  Water-Soluble chitosan oligomer. Leukemia Res . 25: 339 – 346. Purwatinigsih,  S.,  Wukirsari,  T.,  Sjahriza,  A.,
Wahyono,  D.  2009. Sumber  Biomaterial
Masa Depan . IPB Press. Bogor.
Qin Caiqin, Du Yumin, Xiao Ling, Li Zhan, Gao
Xiao  hai,  2002.  Enzymic  Preparation  Of Water-Soluble Chitosan and Their
Antitumor  Activity.  Wuhan  University, China. Int.  J.  Biological  Macromolecules
31(2002):111-117.
Sarni,  Natsir,  H.,  Dali,  S.,  2015.  Produksi  dan Karakterisasi  Enzim  Kitosanase  dari  Isolat Bakteri Klebsiella  sp. Jurnal  Techno Vol. 04 No. 02 Srijanto B., Paryanto I., Masduki,
Purwatiningsih,  2006.  Pengaruh  Derajat Deasetilasi Bahan Baku Pada Depolimersasi Kitosan.  Pusat  Pengkajian  dan  Penerapan Teknologi  Farmasi  dan  Medika-BPPT, Bogor, Akta Kimia Indonesia Vol.1 (2) : 67- 72.
Wahyuni  S.,  Zakaria  F.,  Witarto  A.B.,  Syah  D., Suhartono  M.T.,  2006.  Aktivitas  Anti Kanker  Senyawa-Senyawa  Kitooligomer . J. Teknologi  dan  Industri  Pangan Vol  XVII (1).
Xu,  Q.,  Dou, J.,  Wei, P.,  Tan,  C.,  Yun,  X., Wu, Y.,  Bai,  X.,  Ma,  X.,  Du,  Y.,  2007. Chitooligosaccharides  Induce  Apoptosis  of Human  Hepatocellular  Carcinoma  Cell  via Up-regulation of Bax. Elsevier Since Direct. Carbohydrat Polimers 71