## Deteksi Gen Latent Membrane Protein-1 Epstein-Barr Virus Sebagai Biomarka Diagnosis Pada Karsinoma Nasofaring
Uli Nurjanah*, P. Maria Hendrati*, Anton Budi Dharmawan**, Nur Signa Aini Gumilas** *)Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto **)Fakultas Kedokteran, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto
Korespondesi :  Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Jl. Dr. Soeparno No. 63, Telp. (0281) 638794,Grendeng Purwokerto 53112
E-mail : ulinurjanah@gmail.com

## Abstract
This research aimed to identify LMP-1 EBV gene as a biomarker in NPC diagnosis. Cross-sectional study with  consecutive  sampling  technique  was  applied.  Samples  were  the  whole  blood  of  NPC  WHO-3 patients collected from those untreated since 2014 in the Department of Otorhinolaryngologica, Prof. dr. Margono  Soekarjo  Hospital,  Purwokerto.  A  total  of  22  research  subjects  for  NPC WHO-3  patients  were completed  with  informed  consent.  The  samples  were  subjected  to  DNA  isolation  by  using  Purelink® DNA/RNA viral (Invitrogen) kit protocols to obtain  100µL DNA solution, which were then stored for a long period of time at -80°C. Conventional PCR technique was performed to detect LMP1 gene to amplify the DNA of LMP1 gene resulting in a DNA amplicon of 142 bp.   Analysis of the PCR method sensitivity and the results of LMP-1 gene identification were carried out descriptively by comparing the detection results obtained in this study with the results of previous ones related. The sensitivity of LMP1 gene is 77.27%, indicating a high sensitvity.The results show that LMP-1 gene as a biomarker in the diagnosis of NPC can be  detected  using  conventional  PCR  technique.  Conventional  PCR  sensitivity  in  the  detection  of  LMP- 1gene shows higher sensitivity in compare to LMP-1 EBV gene deletion of 30 bp and LMP2A.
Keywords : Epstein-Barr Virus, LMP-1 gene, Diagnosis, Nasopharyngeal Carcinoma

## Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi gen LMP-1 EBV sebagai biomarka diagnosis KNF. Desain penelitian ini adalah studi cross-sectional dengan teknik consecutive sampling . Sampel adalah darah total pasien  KNF  WHO-3  yang  dikumpulkan  dari  pasien  yang  belum  menjalani  terapi  dari  tahun  2014  pada Departemen  Telinga  Hidung  Tenggorok  -  Kepala  Leher,  Rumah  Sakit  Prof.  dr.  Margono  Soekarjo, Purwokerto.  Total  subyek  penelitian  adalah  22  orang  untuk  NPC  WHO-3  pasien  dengan informed consent .  Sampel  diisolasi  dengan  protokol  kit Purelink®  DNA  /  RNA (Invitrogen)  untuk  mendapatkan larutan  DNA  100μL  dan  disimpan  dalam  waktu  lama  pada  suhu  -80  °  C.  Teknik  PCR  konvensional dilakukan untuk mendeteksi gen LMP1 dengan mengamplifikasi DNA gen EBV LMP1 yang menghasilkan amplikon  DNA  berukuran  142  bp.  Analisis  sensitivitas  metode  PCR  dan  hasil  identifikasi  gen  LMP-1 dilakukan  menggunakan  metode  deskriptif  dengan  membandingkan  hasil  deteksi  yang  diperoleh  pada penelitian  ini  dengan  hasil  penelitian  terdahulu  yang  terkait.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  gen LMP-1  EBV  sebagai  biomarka  diagnosis  KNF  dapat  dideteksi  menggunakan  teknik  PCR  konvensional yang  menghasilkan  amplikon  DNA  berukuran  142  bp.  Sensitivitas  gen  LMP1  adalah  77,27%,  yang menunjukkan  sensitivitas  tinggi.  Sensitivitas  PCR  konvensional  dalam  mendeteksi  gen  EBMP  LMP-1 lebih tinggi bila dibandingkan dengan  gen EBMP LMP-1  30 bp dan LMP-2A EBV.
Kata kunci : Epstein-Barr Virus, gen LMP-1, Diagnosis, Karsinoma Nasofaring

## Pendahuluan
Karsinoma  nasofaring  (KNF)  adalah  tumor ganas  sel  epitel  nasofaring  yang  berlokasi  pada daerah  cekungan  Rosenmuelleri  dan  tempat bermuaranya saluran eustachii (Roezin & Adham, 2007).    Insidensi  KNF  di  wilayah  Indonesia sebesar  6,2  per  100.000  penduduk  per  tahun (Steven  et  al.,  2006).  Insidensi  KNF  di  wilayah Kabupaten Banyumas pada tahun 2009
menunjukkan  peningkatan  3,3  kali  dibandingkan tahun 2008 dengan jumlah pasien baru KNF pada
tahun 2009
sebanyak
119 orang
(Hafiidhaturrahmah,  2010).  Berdasarkan  rekam medis  RSUD  Prof.  Dr.  Margono  Soekarjo  jumlah kunjungan  pasien  KNF  pada  tahun  2013  sebesar 371 pasien,sedangkan pada tahun 2014
sebanyak 332 pasien (Dinas Kesehatan Banyumas, 2014).
KNF  merupakan  penyakit  yang  bersifat multifaktor  dengan  infeksi  virus  Epstein-Barr (EBV)  sebagai  faktor  penyebab  utama  selain faktor  genetik  dan  faktor  lingkungan.  Penelitian terdahulu  membuktikan  bahwa  infeksi  EBV
konsisten  dengan  timbulnya  KNF.Pada  infeksi laten, EBV  tidak memproduksi  virion  baru. Infeksi laten  dapat  membuat  sel  normal  menjadi  sel tumor,  karena  EBV  menginfeksi  sel  tanpa membunuhnya tetapi merangsang sel untuk terus tumbuh tanpa terkendali dan dapat terlindungi dari proses  apoptosis  sel.  Infeksi  EBV  pada  KNF menunjukkan  pola  infeksi  fase  laten  II  yang mengekspresikan  EBNA-1  dan  LMP-1,  sehingga ekspresi  kedua  gen  ini  sering  digunakan  sebagai petanda biologi infeksi EBV pada KNF (Barnes et al., 2005).
LMP-1  adalah    gen  yang  paling  berperan dalam  transformasi sel normal menjadi sel tumor, karena  gen  LMP1  ini  menjadi  perantara  untuk sinyal TNF ( tumor necrosis factor ),  meningkatkan regulasi  sitokin  IL-10  yang  memproliferasi  sel  B, dan menghambat respon imun lokal. Oleh karena itu,  gen  LMP-1    merupakan  gen  yang  berperan penting dalam proses onkogenesis dan transformasi  limfosit  B    (Middledorp  et  al.,  2003). Hasil penelitian terdahulu menunjukkan positivitas ekspresi  LMP-1  EBV  cukup  tinggi,  terutama positivitas  ekspresi  LMP-1  EBV  dengan  teknik RT-PCR  pada  penderita  KNF  WHO-3    sebesar 91,3 % (Wahyono, 2012).
Berdasarkan  latar  belakang  yang  telah diuraikan  tersebut  di  atas,  maka  permasalahan yang  perlu  dikaji  adalah    apakah  pada  penderita KNF  dpat  diidentifikasi  gen  LMP1  EBV  dengan teknik PCR (Polimerase Chain Reaction) konvensional dan apakah metode PCR konvensional  sensitive  untuk  mendeteksi  gen LMP1 EBV. Penelitian bertujuan untuk melakukan identifikasi  gen  LMP-1  EBV  sebagai  petanda molekuler  penapisan  awal  infeksi  Epstein-Barr virus    pada  penderita  Karsinoma  Nasofaring dengan teknik PCR konvensional dan mengetahui sensitivitas metode PCR konvensional  dalam  mendeteksi  genlaten  LMP-1 EBV  sebagai  petanda  biologi  molekuler  yang potensial untuk diagnosis KNF. Hasil penelitian ini diharapkan  dapat  memberikan  informasi  tentang metode berbasis biologi molekuler untuk mendeteksi  eksistensi  gen  laten  LMP-1  EBV sebagai  pemeriksaan  penunjang  dalam  diagnosis KNF,  terutama  penapisan  awal  infeksi  Epstein- Barr Virus pada KNF.

## Materi dan Metode

## Lokasi dan waktu penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium Genetika  dan  Biologi  Molekuler  Fakultas  Biologi Unsoed,  sedangkan  pengambilan  sampel  darah vena  dilakukan  di  Poli  THT  RSUD  Prof.dr. Margono  Soekarjo  Purwokerto.  Penelitian  ini dilaksanakan  dari  bulan  April  sampai  Agustus 2015.
Rancangan penelitian
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  belah lintang  ( cross  sectional ).  Dalam  hal  ini,  variabel bebas dan variabel tergantung diukur pada waktu yang  bersamaan.  Pengambilan  sampel  dilakukan secara consecutive  sampling dari  penderita  KNF yang  terdiagnosis  pasti  dari  hasil  biopsi  oleh  unit Patologi Anatomi  yang diambil di Poli THT RSUD Prof. dr. Margono Soekarjo, Purwokerto. Penelitian ini menggunakan data nominal. Berdasarkan  atas  proporsi  jumlah  pasien  KNF dibandingkan  dengan  kanker  lain  adalah  5,46 persen  ( Incidency  Primary  Cancer  in  Indonesia Pathology  Base ,  1990),  maka  besar  sampel minimal  yang  diperlukan  dalam  penelitian  ini adalah  22 orang.

## Variabel penelitian
Variabel  yang  digunakan  adalah  variabel bebas  dan  tergantung.  Variabel  bebas  yang diamati  dalam  penelitian  ini  adalah  ukuran amplikon  DNA  fragmen  gen  LMP-1,  sedangkan variabel  tergantung  dalam  penelitian  ini  adalah eksistensi gen LMP-1 EBV.

## Pengambilan sampel
Pengambilan  sampel  darah  pasien  KNF dilakukan  di  Poli  THT  RSUD  Prof.  dr.  Margono Soekarjo –  Purwokerto.  Sampel  sebanyak  3  cc diambil berdasarkan hasil pemeriksaan histopatologi  jaringan  biopsi.  Plasma  darah diambil  dari  darah  vena  pada  lengan  tangan  dan disimpan  pada  tabung vacutainer yang  telah terdapat antikoagulan (EDTA).

## Karakterisasi sampel penelitian
Sampel
penelitian dikarakterisasi berdasarkan faktor risiko yang diderita pasien dari hasil wawancara dan data diri serta kuisioner.

## Isolasi DNA virus
Sampel  darah  vena  (tepi)  sebanyak  3  cc pada  tabung vaccuteiner diisolasi  sesuai  dengan protokol  kit  Purelink®  DNA/RNA  viral  (Invitrogen) hingga  diperoleh  50  µl  DNA  virus.  DNA  yang diperoleh  kemudian  disimpan  dalam freezer dengan  suhu  -20 o C  dan  selanjutnya  dilakukan pengukuran kuantitas DNA.

## Pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA
Kemurnian  dan  konsentrasi  DNA  diukur menggunakan  metode  spektrofotometri  nanodrop dengan  cara  sebanyak  2  µL  DNA  dibaca  nilai optical  density (OD  )nya.  Nilai  kemurnian  DNA diketahui  dari  pembacaan  pada  λ260  nm  dibagi dengan pembacaan  pada  λ280  nm  dan pembacaan  pada  λ260  nm  dibagi  dengan pembacaan  pada  λ230  nm.  Apabila  pada  hasil λ260/λ280  didapatkan  angka  1,8-2,0,  maka  DNA dinyatakan  murni.  Rasio  OD  akan  lebih  besar atau  lebih  kecil  dari  nilai  1,8-2,0  jika  ditemukan kontaminasi    dari  protein  atau  RNA.  Konsentrasi DNA  dapat  diketahui  dari  pembacaan  pada  λ260 nm.

## Amplifikasi  gen  LMP-1  menggunakan  teknik PCR konvensional (Wahyono, 2010)
Teknik  PCR  dua  tahap  digunakan  untuk mendeteksi  gen  LMP-1  EBV.  Primer  yang digunakan  pada  PCR  tahap  I  dan  II  untuk  gen LMP-1  EBV  akan  menghasilkan  amplikon  DNA berukuran  142  pb.  Primer  sisi  kiri (left/forward primer) adalah 5’-GGAGATTCTCTGGCGACTTG- 3’  dan  primer  sisi  kanan (right/reverse  primer) adalah 5’-GAGCCAAAGGAGATCAACCA-3’.
Campuran  PCR  (PCR  mix)  pada  amplifikasi tahap  I  dibuat  dalam  volume  15  μL    yang komposisinya terdiri dari 7,5  μL Dream Taq PCR MasterMix –Thermo  Scientific  (Dream  Taq  DNA Polymerase, 2X Dream Taq Buffer, 4 mM MgCl2, 0,4 mM dGTP, 0,4 mM dATP, 0,4 mM dCTP, 0,4 mM  dTTP),  1  µL  15  μM  primer  forward  dan reverse, 1-2 µL (50-100 ng/µL) cetakan DNA, dan 3,5-4,5  µL  ddH2O  (PCR  grade).  Campuran  PCR diamplifikasi  pada  mesin  PCR (thermocycler) pada  kondisi  PCR  sebagai  berikut:  denaturasi awal  95°C  selama  5  menit,  diikuti  dengan  35 siklus denaturasi 95°C selama 30 detik, penempelan 55°C selama 30 detik, dan pemanjangan 72°C selama 30 detik. Selanjutnya, tahap  pemanjangan  akhir  dilakukan  pada  suhu 72°C selama 7 menit.
Campuran PCR (PCR mix) pada amplifikasi tahap  II  dibuat  dalam  volume  15  μL    yang komposisinya terdiri atas 7,5  μL Dream Taq PCR Master  Mix –Thermo  Scientific  (Dream  Taq  DNA Polymerase, 2X Dream Taq Buffer, 4 mM MgCl2, 0,4 mM dGTP, 0,4 mM dATP, 0,4 mM dCTP, 0,4 mM  dTTP),  1  µL  15  μM  primer  forward  dan reverse, 0,5 µL cetakan DNA (amplikon DNA PCR tahap  I),  dan  5  µL  ddH2O  (PCR  grade). Amplifikasi dilakukan pada mesin PCR (thermocycler) dengan  kondisi  PCR  sama  seperti pada amplifikasi tahap I.
Visualisasi hasil deteksi gen LMP-1
menggunakan elektroforesis gel agarosa
Hasil amplifikasi gen divisualisasikan menggunakan  metode  elektroforesis  gel  agarosa 2%. Running dilakukan  selama  60  menit  dengan voltase  90  V  dan  kuat  arus  500  mA.  Hasil elektroforesis  divisualisasikan  menggunakan  Gel- Doc 1000 yang dapat dilihat pada layar komputer.

## Analisis data
Hasil  identifikasi  gen  LMP-1  dan  senstivitas metode  PCR  konvensional  yang  didapatkan dianalisis  dengan  metode  deskriptif  dengan  cara membandingkan  hasil  deteksi  yang  didapatkan dengan  hasil  penelitian-penelitian  sebelumnya yang berkaitan.

## Hasil dan Pembahasan

## Karakteristik sampel penelitian
Dari  22  sampel  yang  didapatkan,  sebanyak 21  sampel  merupakan  KNF  tipe  WHO-III, sedangkan  1 sampel merupakan KNF tipe WHO- II  seperti  pada  Gambar  1.  yang  menunjukkan distribusi tipe KNF berdasarkan atas histopatologinya.
Gambar 1. Distribusi  tipe  KNF  berdasarkan  atas histopatologinya  (Sumber data primer: catatan  medis    RSUD  Prof.  dr. Margono  Soekarjo  yang  diolah  oleh peneliti).
Gambar  1.  menunjukkan  proporsi  sampel penelitian  pasien  KNF  WHO-III  lebih  dominan daripada  KNF  WHO-II,  sedangkan  pasien  KNF WHO-I  tidak  ditemukan  pada  Poli  THT  -  RSUD Prof.  dr.  Margono  Soekarjo.  Menurut  Marks  et al. (1998)  KNF  WHO-II  dan  WHO-III  mempunyai keterkaitan  yang  lebih  tinggi  dengan  infeksi  EBV daripada  KNF  WHO-I,  terutama  pada  daerah nonendemik.  Penelitian yang  lebih terbaru menunjukkan bahwa hampir semua kasus KNF di daerah  endemik  memiliki  komorbiditas  dengan infeksi  EBV,  yang  membuktikan  bahwa  EBV merupakan  etiologi  dari  KNF.  Menurut  Adham (2014),  gambaran  histopatologi  KNF  WHO-III adalah  tipe  KNF  yang  paling  sering  ditemukan pada  daerah  dengan  prevalensi  KNF  yang  tinggi. Negara-negara  di  Asia  Tenggara,  termasuk Indonesia,  termasuk  daerah  endemik  KNF.  KNF WHO-III  merupakan  tumor  yang  paling  banyak ditemukan  dengan  insidensi  6,2  per  100.000  per tahun  pada  kelompok  laki-laki  dan  4,6  per 100.000  per  tahun  pada  kelompok  perempuan dengan  rerata  insidensi  adalah  3,9  per  100.000 per tahun (Fachiroh et al., 2004).
Tabel 1.   Distribusi  sampel  penelitian  pasien  KNF  berdasarkan  usia  (Sumber  data  primer:  catatan medis  RSUD Prof. dr. Margono Soekarjo yang diolah oleh peneliti)
Kelompok Usia Pasien Jumlah (n) Persentase (%) < 30 tahun 3 13,64 30-40 tahun 1 4,55 40-50 tahun 7 31,82 50-60 tahun 8 36,36 >60 tahun 3 13,64 Jumlah 22 100,00 Usia (rerata±SD) 49,67±14,79
Tabel  1.  menunjukkan  bahwa  pasien  KNF memiliki  distribusi  umur  yang  berbeda.  Dari  22 sampel  penelitian,  kelompok  usia  penderita  KNF yang  dominan  adalah  50-60  tahun, yaitu sebanyak  8  pasien  (36,36%)  dan  kelompok  usia 40-50  tahun,  yaitu  sebanyak  7  pasien  (31,82%). selanjutnya,  kelompok  usia  <30  tahun  dan  >60 tahun  adalah  masing-masing  sebanyak  3  pasien (13,64%) dan kelompok usia 30-40 tahun hanya 1 pasien  (4,55%).  Data  tersebut  menunjukkan bahwa 18 pasien (81,82%) berusia >40 tahun dan merupakan  kelompok  usia  berisiko  terkena  KNF, sedangkan  4  pasien  (18,18%)  berusia  <40  tahun yang  merupakan  kelompok  usia  tidak  berisiko terkena  KNF.  Kecenderungan  penderita  KNF pada  usia  diatas  40  tahun  berhubungan  dengan sistem  imunitas  yang  menurun  pada  umur
tersebut  sehingga  antigen  EBV  penyebab  tumor tidak  dapat  dieliminasi  secara  baik  oleh  sistem imun  tubuh.  Usia  rerata  sampel  penelitian  ini adalah  50  tahun.  Penelitian  Ondrey  &  Wright (2003)  menunjukkan  usia  rerata  penderita  KNF adalah  50  tahun.  Penelitian  Adham  (2014), menunjukkan bahwa proporsi usia penderita KNF adalah > 40 tahun. Kajian literatur menggambarkan  distribusi  usia  bimodal  di negara-negara Barat dan Amerika, dengan angka kejadian  tertinggi  pada  usia  10  hingga  20  tahun, kemudian  40  hingga  60  tahun.  Namun,  pola distribusi  tersebut  tidak  dijumpai  di  daerah endemik.  Henny  (2006),  menyatakan  bahwa insiden  KNF  tertinggi  pada  kelompok  usia  41-50 tahun,yaitu 30,4% dari 79 kasus.
Tabel 2.   Distribusi  sampel  penelitian  pasien  KNF  berdasarkanjenis  kelamin(Sumber  data  primer: catatan medis  RSUD Prof. dr. Margono Soekarjo yang diolah oleh peneliti)
Kelompok Jenis Kelamin Jumlah (n) Persentase (%) Laki-laki 18 81.82 Perempuan 4 18.18 Total 22 100.0
Tabel  2. menunjukkan  bahwa  sebanyak  18 pasien  KNF  (81,82%)  berjenis  kelamin  laki-laki, sedangkan  4  pasien  KNF  (18,18%)  berjenis kelamin perempuan. Oleh karena itu, rasio antara kelompok pasien laki-laki dan perempuan sebesar 4,5:1.  Rasio  tersebut  memberikan  gambaran bahwa  jumlah  pasien  laki-laki  lebih  dominan dibandingkan dengan perempuan. Hal ini disebabkan  pasien  laki-laki  memiliki  pola  hidup yang lebih berisiko terkena KNF seperti kebiasaan merokok,  paparan  debu,  dan  paparan  asap dibandingkan dengan pasien perempuan.
Penelitian  terdahulu  menunjukkan  bahwa  KNF lebih sering ditemukan pada laki-laki dibandingkan dengan perempuan dengan perbandingan  2-3:1  (Steven  et  al.,  2006).  Hasil studi di Tiongkok dan Pakistan yang menunjukkan proporsi  pasien  KNF  laki-laki  1,8  lebih  banyak dibandingkan dengan perempuan. Demikian pula, hasil  penelitian  proporsi  pasien  KNF  di  Brunei Darussalam  pada  etnis  populasi  Cina,  India,  dan Melayu  juga  menunjukkan  hasil  yang  sama dengan proporsi di Tiongkok dan Pakistan (Chang & Adami, 2006).
Tabel 3.   Distribusi  sampel  penelitian  pasien  KNF  berdasarkan  faktor  risiko  (Sumber  data  primer: catatan medis  RSUD Prof. dr. Margono Soekarjo yang diolah oleh peneliti)
Kebiasaan hidup JumlahLaki-laki(%) Jumlah Perempuan (%) Merokok 9 (40,91%) 1 (4,55%) Terpajan asap 10 (45,45%) 2 (9,09%) Terpajan debu 11 (50%) 0 (0%) Terpajan bahan kimia 1 (4,55%) 1 (4,55%) Riwayat keluarga 3 (13,64%) 1 (4,55%)
Tabel  3.  menunjukkan  faktor  risiko  pasien KNF  sebagai  berikut.  dari  jumlah  kesuluruhan sampel  penelitian,  yaitu  22  pasien,  sebanyak  11 pasien  (50%)  laki-laki  terpajan  debu,  10  pasien (45,45%)  terpajan  asap,  9  pasien  (40,91%) merokok,  3  pasien  (13,64%)  memiliki  riwayat keluarga  penderita  KNF,  dan  1  pasien  (4,55%) terpajan  bahan  kimia.  Kebiasaan  hidup  pada pasien  perempuan  lebih  sehat,  yaitu  yang merokok,  terpajan  bahan  kimia,  dan  riwayat keluarga  penderita  KNF  hanya  terdapat  1  pasien (4,55%),  sedangkan  yang  terpajan  asap  hanya  2 pasien  (9,09%).  Friborg  et al.  (2007) menyatakan bahwa  orang  yang  merokok  jauh  lebih  berisiko terkena KNF daripada orang  yang tidak merokok. Sejak  tahun  1950  sudah  dinyatakan  bahwa merokok  menyebabkan  kanker  dan  kematian sekitar  4  sampai  5  juta  orang  per  tahunnya.. Kanker  akbibat  merokok  diperkirakan  mengalami peningkatan  menjadi  10  juta  orang  per  tahunnya pada  2030.  Rokok  mengandung  >4000  bahan karsinogenik, termasuk nitrosamin yang meningkatkan  risiko  terkena  KNF.  Penelitian Chang  &  Adami  (2006)  menunjukkan  merokok meningkatkan risiko KNF sebesar 2 sampai 6 kali. Demikian  pula,  60%  KNF  WHO-I  berhubungan dengan  kebiasaan  merokok,  sedangkan  risiko KNF WHO-II dan KNF WHO-III tidak berhubungan dengan  kebiasaan  merokok.  Perokok  dengan tingkat  konsumsi  >30  bungkus  per  tahun mempunyai  risiko  tinggi  terkena  KNF.  Umumnya, penderita  KNF  memiliki  kebiasaan  merokok selama minimal 15 tahun (51%) dan
mengkonsumsi  tembakau  dalam  bentuk  lain (47%). Kebiasaan merokok >25 tahun meningkatkan  risiko  terkena  KNF  dan  >40  tahun meningkatkan  2  kali  lipat  risiko  terkena  KNF (Friborg et al., 2007).
Beberapa  peneliti menyatakan bahwa insidensi  KNF  yang  tinggi  di  wilayah  Tiongkok Selatan  dan  Afrika  Utara  disebabkan  oleh  asap dari  pembakaran  kayu  bakar  (Chang  &  Adami, 2006).  Sebanyak  93%  penderita  KNF  tinggal  di rumah  dengan  ventilasi  buruk  dan  mempunyai riwayat  terkena  asap  hasil  bakaran  kayu  bakar. Pajanan  asap  hasil  kayu  bakar  >10  tahun  akan meningkatkan  6  kali  lipat  risiko  terkena  KNF (Ondrey  &  Wright,  2003).  Riwayat  infeksi  kronik telinga,  hidung,  tenggorok  dan  saluran  napas
bawah  meningkatkan  risiko  KNF  sebanyak  dua kali  lipat.  Bakteri  yang  menginfeksi  saluran  nafas dapat  mengurai  nitrat  menjadi  nitrit,  kemudian dapat membentuk bahan N-nitroso yang karsinogenik.  Kebiasaan  mengunyah  betel  nut (Areca  catechu) di  Taiwan  selama  lebih  dari  20 tahun  berhubungan  dengan  peningkatan  70% risiko KNF. Sebuah penelitian ekologi di Tiongkok Selatan  menemukan  2  sampai  3  kali  lipat  kadar nikel pada nasi, air minum, dan rambut penduduk yang  tinggal  di  wilayah  yang  tinggi  insiden KNFnya.  Penelitian  lain  menyatakan  bahwa kandungan  nikel,  zink  dan  cadmium  pada  air minum  lebih  tinggi  di  wilayah  dengan  angka insidensi  KNF  tinggi.  Risiko  KNF  juga  meningkat berkaitan  dengan  makanan  yang  mengandung bahan  pengawet  lain  seperti  daging  dan  telur terutama  di  Tingkok  Asia  Tenggara,  Afrika Utara/Timur  Tengah  dan  penduduk  asli  Artik (Chang & Adami, 2006).
Kerabat pertama, kedua, ketiga pasien KNF lebih  berisiko  terkena  KNF  (Ondrey  &  Wright, 2003). Orang yang mempunyai hubungan kekerabatan  tingkat  pertama  KNF  mempunyai risiko terkena KNF sebesar 4-10 kali dibandingkan  dengan  yang  tidak  berhubungan kekerabatan.  Risiko  kanker  kelenjar  air  liur  dan serviks  uterus  juga  meningkat  pada  keluarga dengan  kasus  KNF.  Faktor  risiko  lingkungan seperti  mengkonsumsi  ikan  asin,  kebiasaan merokok,  dan  paparan  pada  produk  kayu meningkatkan level antibodi anti-EBV dan beberapa polimorfasi genetik. Kasus KNF WHO-II dan  KNF  WHO-III  biasanya  berkaitan  dengan kekerabatan dalam keluarga (familial), sedangkan KNF WHO-I berisifat nonfamilial (Chang & Adami, 2006).

## Isolasi DNA virus
Hasil pengukuran konsentrasi DNA berkisar antara  5-286  ng/µl.  Kemurnian  DNA  diukur berdasarkan  atas  rasio λ260/280  berkisar  antara 1,3  (nilai  minimum)-2,3  (nilai  maksimum)  dan pada  nilai  absorbansi    λ260/230  berkisar  antara 0,13  (nilai  minimum)-0,9  (nilai  maksimum).  Pada beberapa sampel, kemurnian DNA tidak terdeteksi  walaupun  nilai  konsentrasi  DNAnya diketahui.  Metode  isolasi  DNA  virus  sudah  cukup baik  karena menghasilkan  konsentrasi  DNA  yang
tinggi.  Namun,  berdasarkan  atas  nilai  kemurnian sampel  terindikasi  bahwa  beberapa  sampel penelitian masih terkontaminasi, baik oleh  protein maupun  bahan  organik  lain.  Sambrook  &  Russel (2001)  menyatakan  bahwa  DNA  dengan  rasio λ260  nm/280  nm  pada  kisaran  1,8-2,0  memiliki kemurnian  sesuai  dengan  persyaratan  kemurnian dalam  analisis  molekuler.  Menurut  Tenriulo  et  al. (2001),  kontaminasi  protein  dan  bahan  organik lainnya  pada  larutan  DNA  ditunjukkan  dengan nilai  rasio  λ260  nm/280  nm  <1,8.  Sebaliknya, kontaminasi  fenol  ditunjukkan  oleh nilai  λ260 nm/280 nm >2,0.
Hasil  deteksi  gen  LMP-1  menggunakan  teknik PCR konvensional
Amplifikasi  atau  perbanyakan  DNA  target dimaksudkan  untuk  meningkatkan  jumlah  DNA gen  target  dengan  teknik  PCR  konvensional sehingga  DNA  dapat  dideteksi  menggunakan teknik  elektroforesis.  Metode  PCR  konvensional dua  tahap  bertujuan  untuk  memperoleh  hasil amplikon DNA yang positif lebih optimal jumlahnya  karena  konsentrasi  DNA  virus  yang relatif  rendah  pada  larutan  darah  (Haryanto  & Sofia,  2012).  Hasil  primer-blast  menunjukkan bahwa primer yang digunakan dalam penelitian ini merupakan  primer  spesifik  untuk  mengamplifikasi fragmen gen LMP-1.
Hasil
analisis PCR dua tahap divisualisasikan  dengan  menggunakan  teknik elektroforesis  pada  gel  agarosa  2%  dengan  Gel- Doc 1000. Pita DNA yang terbentuk dibandingkan ukurannya  dengan DNA  ladder 100  bp.  Gambar
2.  menunjukkan  hasil  positif  fragmen  DNA  gen LMP-1 EBV setelah PCR dua tahap menggunakan  primer  spesifik  dengan  produk PCR (amplikon) berukuran 142 bp dan menunjukkan  bahwa  gen  LMP-1  telah  berhasil diamplifikasi.
Gambar 2.   Visualisasi produk PCR gen LMP-1 EBV (M =  DNA Marka 100 bp; Sampel no 3, 2, 1, 17, 12, 5, 8, 9, 20,
22; - = Kontrol Negatif)
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  dari 22 sampel DNA pasien KNF, sebanyak 17 sampel
(77,27%) menunjukkan hasil positif atau terdeteksi gen LMP-1 EBV,  sedangkan 5 sampel (22,73%)  menunjukkan  hasil  negatif  atau  tidak terdeteksi gen LMP-1 EBV. Infeksi EBV pada KNF menunjukkan  pola  infeksi  fase  laten  II  yang  akan mengekspresikan  LMP-1  sehingga  ekspresi  gen ini sering  digunakan untuk petanda biologi  infeksi EBV  pada  KNF  (Barnes  et  al.,  2005).  Gambar  3. menunjukkan  grafik  persentase  hasil  deteksi  gen LMP-1  EBV  pada  penderita  KNF  menggunakan metode PCR konvensional.
Gambar 3.  Persentase sensitivitas deteksi gen  LMP-1  dengan  metode  PCR konvensional
Teknik  PCR  konvensional  yang  dilakukan merupakan  metode yang  digunakan  untuk mendeteksi  DNA  genom  EBV  secara  kualitatif. Teknik  PCR  konvensional  yang  digunakan  dalam penelitian  dapat  mendeteksi  17  sampel  (77,27%) dari  22  sampel.  Penelitian  terdahulu  yang dilakukan  oleh  Hsu  et  al.  (2009)  menunjukkan positivitas deteksi gen LMP-1 yang terdelesi 30 bp pada  penderita  KNF  tipe  WHO-III  sebesar  56%. Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  positivitas  gen LMP-1 EBV yang lebih tinggi daripada gen LMP-1 EBV  terdelesi  30  bp.  Penelitian  terdahulu  yang dilakukan  oleh  Azizah  (2015)  menunjukkan positivitas  deteksi  gen  LMP-2A  pada  penderita KNF  sebesar  72,73%.  Hasil  penelitian  ini menunjukkan  positivitas  gen  LMP-1  yang  lebih tinggi daripada gen LMP-2A EBV. Oleh karena itu, gen  LMP-1  dapat  digunakan  sebagai  petanda biologi molekul dalam penapisan (screening) awal infeksi EBV pada penderita KNF.
Gen  LMP-1  tidak  dapat  terdeteksi  pada  5 sampel penelitian (22,73%)
KNF yang diamplifikasi menggunakan metode PCR konvensional  dengan  kondisi  PCR  yang  sama. Hal  ini  dapat  disebabkan  oleh  beberapa  hal sebagai berikut.
1.  Konsentrasi dan kemurnian DNA EBV rendah
77,27% 22,73% 0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00% 70,00% 80,00% 90,00% Sampel DNA Positif Negatif
Salah  satu  penyebab  tidak  terdeteksinya amplikon  fragmen  DNA  genom  EBV  dengan teknik  PCR  konvensional  adalah  konsentrasi DNA  virus yang  rendah  pada  sampel penelitian yang digunakan, karena konsentrasi DNA yang tepat akan menghasilkan amplifikasi yang  baik.  Besarnya  volume  DNA  yang digunakan  dalam  PCR  disesuaikan  dengan masing-masing  konsentrasi  DNA  yang  telah diketahui pada tahap spektrofotometri. Gray et al.  (2002),  dalam  penelitiannya  menggunakan DNA template dengan  konsentrasi  150  ng/μL. Konsentrasi  DNA template yang  tepat  akan menghasilkan  produk  amplifikasi  yang  baik. Menurut  Wilkerson  et  al.  (1993),  konsentrasi yang baik untuk PCR berkisar  dari 0,5 sampai 6,5  μg/mL.  Sampel  DNA  yang  memiliki konsentrasi  yang  tinggi  diencerkan  sampai konsentrasi  tertentu  agar  dapat  digunakan untuk  proses  PCR,  sedangkan  sampel  DNA yang  memiliki  konsentrasi yang  rendah ditambah  volumenya  dalam  PCR  sampai konsentrasinya memenuhi.
2.  Jumlah EBV dalam darah rendah Sampel  yang  digunakan  dalam  penelitian adalah  darah  vena  pasien  KNF.  Menurut Adham (2014), kandungan virus  yang diisolasi dari sikat nasofaring menunjukkan nilai spesifik tinggi  dan  merupakan  alat  diagnostik  primer untuk  KNF  yang  minimal  invasif,  dengan sensitivitas yang hampir sama dengan serologi IgA EBV dan lebih baik dari pengukuran kadar DNA  EBV  di  darah.  Kandungan  DNA  EBV darah mencerminkan fragmen DNA mengalami apoptosis,  yang  akan  dibersihkan  dengan cepat  dari  sirkulasi.  Kadar  DNA  EBV  darah yang  tinggi  mencerminkan  proses  apoptosis dan  nekrosis  tumor  yang  masih  berlangsung dan bukan massa tumor yang membesar.
3.  Tipe KNF Hubungan  antara  KNF  dan  infeksi  EBV  telah banyak dinyatakan oleh berbagai peneliti. KNF
WHO-II  dan  WHO-III  telah  terbukti  konsisten dengan infeksi EBV, bahkan KNF tipe WHO-III dianggap  100%  berasosiasi  dengan  infeksi EBV  (Barnes  et  al.,  2005).  Penelitian  yang dilakukan  Ariwibowo  (2013)  menunjukkan bahwa  KNF  WHO-I  dianggap  tidak  konsisten dengan infeksi EBV dan sekitar 60% berhubungan dengan kebiasaan merokok.
4.  Variasi genetik Salah  satu  variasi  genetik  adalah  mutasi  basa nukleotida pada ujung 3’ di lokasi penempelan primer.  Hal  ini  menyebabkan  gen  LMP-1  EBV tidak terdeteksi saat visualisasi karena amplifikasi  fragmen  gen  ini  tidak  dapat berlangsung  akibat  gangguan  pada  tahap penempelan  primer.  Ketidaksesuaian  satu basa  pada  ujung  3’  akan  menghambat penempelan  primer  pada    DNA template karena  primer  hanya  akan  menempel  pada fragmen  DNA  yang  benar-benar  spesifik sehingga  terjadi  proses  amplifikasi  (Welsh  & Bunce, 1999).

## Simpulan
Teknik  PCR  konvensional  dapat  digunakan untuk mendeteksi gen LMP-1 EBV, sehingga gen LMP-1  EBV  dapat  digunakan  sebagai  biomarka diagnosis KNF. Sensitivitas teknik PCR konvensional  dalam  mendeteksi  gen  LMP-1  EBV menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi daripada  LMP-1  EBV  delesi  30  pb  dan  LMP-2A EBV.

## Ucapan Terima Kasih
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepada Direktorat  Penelitian  &  Pengadian  Masyarakat- Kemenristekdikti  atas  pendanaan  penelitian  ini melalui  Hibah  Penelitian  Fundamental  Tahun 2014  dan  LPPM  Unsoed  sebagai  pengelola pendanaan penelitian ini.

## Daftar Referensi
Adham,  M.,  2014. The  Role  of  EBV  Markers  in
Diagnosis,  Treatment  and  Monitoring  of Nasopharyngeal  Carcinoma  in  Jakarta,
Indonesia. Laporan Penelitian.
Amsterdam : Vrije Universiteit.
Alex,  T.  &  Hal,  B.  J.,  2006. Epstein-Barr  Virus . New York : Taylor & Francis Group.
Ariwibowo,  H.,  2013.  Faktor  Risiko  Karsinoma Nasofaring. CDK-204 , 40(5), pp. 348-251.
Barnes, L., Eveson, J.W., Reichart, P.,
&Sidransky, D.,2005. World Health Organization Classification of Tumours.Pathology and Genetics of Head and Neck Tumours . France : IARC Press. Cacais, A.O.G., 2008. Immunological consequences  of  Epstein-  Barr  virus replication. Laporan  Penelitian.  Sweden: Department  of  Microbiology  Tumor  and Cell Biology, Karolinska Institutet,
Stockholm.
Carter,  J.B.  &  Saunders,  V.A.,  2007. Virology: Principle  and  Applications .  West  Sussex,
England: John Wiley & Sons Ltd.
Chang, E.T., & Adami, H.O., 2006. The Enigmatic Epidemiology of Nasopharyngeal
Carcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers
Prev 15(1), pp.65-77.
Eliopoulos,  A.G.,  Gallagher,  N.J.,  Blake,  S.M., Dawson,  C.W.,  &  Young,  L.S.,  1999. Activation  of  the  p38  mitogen-activated protein  kinase  pathway  by  Epstein-Barr virus-encoded  latent  membrane  protein  1 coregulates interleukin-6 and interleukin-8 production. Journal  Biology  Chemistry,
274(1), pp.85-96.
Fachiroh,  J.,  Schouten,  T.,  Hariwiyanto,  B.,
Paramita,  D.K.,  Harijadi,  A.,  Haryana, S.M.,  Ng.Mun,  H.,  &  Middeldorp,  J.M.,
2004.  Molecular  Diversity  of  Epstein-Barr Virus IgG and IgA antibody Responses in Nasopharyngeal Carcinoma : A
Comparison  of  Indonesia,  Chinese,  and European  Subjects. The  Journal  of Infectious Diseases, 190(1), pp.53-62.
Friborg,  J.T.,  Yuan,  J.M.,  Wang,  R.,  Koh,  W.P., Lee,  H.P.,  &  Yu,  M.C.,  2007.  A
Prospective  Study  of  Tobacco  and Alcohol Use as Risk Factors for Pharyngeal  Carcinomas  in  Singapore Chinese. Cancer, 109(6), pp.1183-91.
Hafiidhaturrahmah,  D.A.B.,  2010.  Distribusi  Data
Kanker  Nasofaring  Di  RSUD  Margono Soekarjo Purwokerto Tahun 2009. Referat .  Purwokerto  :  SMF  Telinga Hidung dan Tenggorokkan (THT) Fakultas Kedokteran Universitas Jenderal Soedirman.
Haryanto,  A.,  &Sofia  M.,  2012.  Isolasi  dan
Amplifikasi  Gen  Penyandi  Domain  C-
Terminus Latent Membrane Protein (LMP-
I) Epstein-barr Virus (EBV) dari Penderita Karsinoma  Nasofaring  (KNF).  J  Sain  Vet, 18(2), pp. 1-7.
Henny, F., 2006.Ekspresi Protein Mutan p53 pada
Karsinoma  Nasofaring.  Tesis,  Medan:FK USU .[Accessed 23 Juni 2015].
Setiawan,  H.,  T.  Prasetyorini,  &  H.  Djajaningrat.,
2010. Polim orfisme Gen Tcrβ : Hubungan dengan  suseptibilitas  individu  terhadap Karsinoma Nasofaring (KNF) pada beberapa suku/etnis di Indoonesia. Jurnal
Madya, 8 (1), pp.39-49.
Hsu,  W.L.,  Chen,  J.Y.,  &  Chien,  Y.C.,  2009.
Independent  Effect  of  EBV  and  Cigarette Smoking  on  Nasopharyngeal  Carcinoma: A  20-Year  Follow-Up  Study  on  9,622 Males  without  Family  History  in  Taiwan. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev , 18(1), pp. 18-26.
Iwatsuki,  K.,  Yamamoto,  T.,  Tsuji,  K.,  Suzuki,  D.,
Fujii,  K.,  Maztsuura,  H.,  et  al.,  2005.  A spectrum  of  clinical  caused  by  immune responses  againts  Epstein-Barr  virus infection. Acta  Med  Okayama ,  58(1), pp.69-80.
Jia-Ping, N., Mimi, C.Y., Qing-Sheng, W. & Brian, E.,  1990.  Consumtion  of  Salted  Fish  and Other  Risk  Factor  for  Nasopharyngeal Carcinoma  (NPC)  in  Tianjin,  a  Low  Risk Region  for  NPC  in  the  People’s  Republic of  China. Journal  of  the  National  Cancer Institute , 82(4), pp. 291-6.
Tenriulo,  A.,  Suryati,  E.,  Parenrengi,  A.  & Rosmiat,  2001. Ekstraksi  DNA  Rumput Laut Kappaphycus alvarezii dengan Metode Fenol Kloroform . Laporan Penelitian.  Makassar:  Jurusan  Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Hasanuddin.
Marks,  J.E.,  Phillips,  J.L.,  &  Menck,  H.R.,  1998.
The  National  Cancer  Data  Base  Report on The Relationship of Race and National Origin to The Histology of Nasopharyngeal Carcinoma. Cancer ,
83(3), pp.582 –588.
Masrin,  I.,  2006 . Proporsi  hasil  pemeriksaan serologi  virus  Epstein-Barr  pada  pasien karsinoma nasofaring menggunakan reagen NPC REAAD INFLECTION dengan  metode  ELISA.  PPDS  Bidang Studi  Ilmu  Penyakit  THT  FKUI  Jakarta, pp.4.
Middeldorp,  J.M.,  Brink,  A.A.T.P.,  van  den  Brule,
A.J.C., &Meijer, C.J.L.M., 2003.Pathogenic  roles  for  Epstein-Barr virus  (EBV)  gene  products  in  EBV- associated  proliferative  disorders. Crit  Rev Oncol Hematol , 45(1), pp.1-36.
Murray,  P.G.  &  Young,  L.S.,  2001.  Epstein-Barr virus  infection:  basis  of  malignancy  and potential  for  therapy. Expt  Rev  Mol  Med , 3(1), pp.1-20.
Mutirangura,  A.,  2000.  Molecular  mechanism  of nasopharyngeal  carcinoma  development.
Res  Advance  Res  Updated  Med, 1(1), pp.18-27.
Ondrey,  F.G.  &  Wright,  S.K.,  2003.Neoplasms  of the Nasopharynx.Ballenger’s Otorhinolaryngology  Head  and  Neck Surgery. 16th ed. pp 1407-22. Pahala, H.M.,  2009.  Expresi  Vascular  Endothelial Growth Factor Pada Karsinoma Nasofaring. Available from: http://repository.usu.ac.id/handle/1234567 89/6425 [Accessed 24 Desember 2014].
Perkins,  R.S.,  Sahm,  K.,  Marando,  C.,  Witmer,
D.D.,  Pahnke,  G.R.,  Mitchell,  M.,  et  al., 2006.  Analysis  of  Epstein-Barr  virus reservoirs  in  paired  blood  and  breast cancer  primary  biopsy  specimens  by  real time  PCR. Breast  Cancer  Research, 8(6), pp.1-8.
Roezin, A. & Adham, M.,2007.Karsinoma Nasofaring.  In  Soepardi  E.A.,  Iskandar, N., Bashiruddin,  J., &Restuti, R.D., editor. Buku  Ajar  Ilmu  Kesehatan:  Telinga Hidung  Tenggorok  Kepala  dan  Leher Edisi ke 6 . Jakarta : Balai Penerbit FKUI.
Sambrook  J.,  &  Russel,  D.W.,  2001. Molecular Cloning:  A  Laboratory  Manual (Third Edition).    New  York  :  Cold  Spring  Harbor Laboratory Press.
Sastroasmoro, S. & Ismael, S., 2002. Dasar-dasar Metodologi  Penelitian  Klinis.  Edisi  ke-2. Jakarta: CV Sagung Seto.
Shotelersuk,  K.,  Khorprasert,  C.,  Sakdikul,  S., Pornthanakasem,  W.,  Voravud,  N.  & Mutirangura,  A.,  2000.  Epstein-Barr  virus DNA  in  serum/plasma  as  a  tumor  marker for nasopharyngeal cancer. Clinical Cancer Research , 6(1), pp. 46-51.
Steven, S.J.C., Verkuijlen, S.A.W.M., Hariwiyanto,
B., Harijadi, Paramita, D.K. & Fachiroh, J., 2006. Noninvasive diagnosis of nasopharyngeal carcinoma:
nasopharyngeal  brushing  reveal  high Epstein-Barr  virus  (EBV)  DNA  load  and carcinoma-specific  viral  BARF1  mRNA. International  Journal  Cancer, 119(6), pp.8-14.
Stevens, C.R. & Rassekh, C., 1998. Nasopharyngeal Carcinoma . Department.of
Otolaryngology-UTMB: Galveston-TX.
Thompson,  M.P.  &  Kurzrock,  R.,  2004.  Epstein- Barr  Virus  and  Cancer. Clinical  Cancer Research , 10(1), pp.803-821.
Wahyono, D.J. 2012. Ekspresi Relatif Gen BRLF1
Epstein-Barr Virus (EBV) sebagai Petanda  Progresivitas  Tumor  Karsinoma Nasofaring (KNF) : Hubungannya  dengan Polimorfisme  Gen Reseptor  Sel  Tβ (TCRβ) dan Gen Reseptor Sel Tγ (TCRγ) Penjamu (Disertasi). Program Doktor Ilmu Biomedik, FKUI, Jakarta ( Unpublished ).
Wahyono,  D.J.,  2010.  Ekspresi  Gen  Litik  EBV  : Manfaatnya  untuk  Penegakan  Diagnosa KNF. Oto Rhino Laryngologica
Indonesiana, 40(2), pp. 1-8.
Welsh,  K.  I.  &  Bunce,  M.,  1999.  Molecular TTyping  for  the  MHC  with  PCR-SSP.
Immunogenetics , 1(1), pp. 156 –176.
Wilkerson,  R.C.,  Parsons,  T.J.  &  Klern,  T.A.,
1993.  Diagnosis  by  Random  Amplified Polymorphic  DNA  Polymerase  Chain Reaction  of Four Cryptic Species Related to  Anopheles  nyssorhynchus  albitarsis (Diptera: Culicidae) from Paraguay, Argentina. Journal  Medical  Etomology,
32(5), pp. 6531-6534.