www.jtkl.polinema.ac.id
Corresponding author: Jurusan Teknik Kimia
Diterima: 29 September 2017 Politeknik Negeri Malang Disetujui: 8 Oktober 2017 Jl. Soekarno-Hatta No.9, Malang, Indonesia © 2017 Politeknik Negeri Malang
E-mail: rulianahpolinema@yahoo.com

## Produksi Crude Selulase dari Bahan Baku Ampas Tebu Menggunakan Kapang Phanerochaete chrysosporium
Sri Rulianah , Zakijah Irfin , Mufid , Prayitno
Jurusan Teknik Kimia, Politeknik Negeri Malang, Jl. Soekarno-Hatta No.9, Malang, Indonesia
*E-mail: rulianahpolinema@yahoo.com

## ABSTRAK
Bagasse mengandung selulosa yang cukup tinggi sehingga berpotensi sebagai bahan baku produksi crude selulase menggunakan  kapang Phanerochaete  chrysosporium .  Kapang  ini  memiliki  kemampuan  untuk memproduksi enzim selulase dari substrat yang mengandung selulosa dan juga menghasilkan enzim yang dapat memecah lignin sehingga tidak perlu dilakukan proses delignifikasi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk  memanfaatkan  limbah  ampas  tebu  sebagai  bahan  baku  pembuatan crude selulase  menggunakan kapang Phanerochaete  chrysosporium dan  mengetahui  pengaruh  penambahan  konsentrasi  substrat  dan waktu fermentasi terhadap aktivitas crude selulase yang dihasilkan. Penelitian ini dilakukan dengan cara mengeringkan dan memperkecil ukuran ampas tebu, meremajakan kapang Phanerocheate chrysoporium , membuat inokulum dalam media cair, memfermentasi ampas tebu sesuai dengan variabel, dengan media Nitrogen  Limited  Media  (NLM)  menggunakan  kapang Phanerocheate  chrysoporium .  Hasil  fermentasi disaring, dan filtratnya dianalisa aktivitasnya sebagai crude selulase. Variabel dalam penelitian ini adalah waktu fermentasi  9, 11, 13, 15 dan 17 hari dan konsentrasi ampas tebu sebagai media: 5, 6, dan 7 % b/v. Ekstrak  kasar  selulase  ( crude )  yang  dihasilkan  disaring  menggunakan  filter  vakum,  dan  aktivitas  filtrat ( crude cellulase ) diuji dengan pereaksi DNS ( dinitro salicylic acid ) dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  aktivitas  selulase  tertinggi  diperoleh  pada  variabel konsentrasi ampas tebu sebesar 7% b/v dan waktu inkubasi selama 17 hari yaitu sebesar 91.304 U/mL.
Kata kunci : bagasse , crude selulase , fermentasi, Phanerochaete chrysosporium

## ABSTRACT
Bagasse contain high cellulose which potentially to be used to raw material for producing cellulase enzyme using  fungi Phanerochaete  chrysosporium .  This  fungus  has  ability  to  produce  cellulase  enzymes  from substrates which contain cellulose and also produce enzymes that can degrade lignin content so it didn’t need the delignification process. The objective of this study was to convert cellulose in bagasse to be crude cellulase  enzymes  by  using Phanerochaete  chrysosporium and  determine  the  effect  of  substrate concentration and fermentation time to the enzyme activity. This research was conducted by drying and reducing the bagasse particle size, rejuvenating mold Phanerocheate chrysoporium , making inoculum in liquid  medium,  fermenting  bagasse  in  accordance  with  the  variable, with  media  NLM  (nitrogen  limited media)  using Phanerocheate  chrysoporium .  Fermentation  results  were  filtered,  and  it  was  analyzed  the activity of crude cellulase. The variable in this study was the time of fermentation  9, 11, 13, 15, and 17 days  and  substrate  concentration:  5,  6,  and  7  %  b/v.  Crude  cellulose  was  filtered  and  was  analyzed  the enzyme activity by DNS (dinitro salicylic acid) reagent, using UV-Vis spectrophotometer. The best result of this study was the crude cellulase with highest activity 91,304 U/mL for 7 % substrate concentration with fermentation time 17 days.
Keywords : bagasse, crude cellulase, fermentation, Phanerochaete chrysosporium

## 1.  PENDAHULUAN
Bahan berlignoselulosa merupakan komponen organik berlimpah di alam, yang terdiri dari tiga polimer yaitu selulosa, hemiselulosa dan lignin. Komponen terbesar adalah selulosa (35- 50%),  hemiselulosa  (20-35%)  dan  lignin  (10-25%)  [1].  Komponen  ini  merupakan  sumber utama untuk menghasilkan produk seperti glukosa dari hasil fermentasi, bahan kimia, bahan bakar cair, sumber karbon dan energi. Konversi bahan lignoselulosa banyak dilakukan oleh mikroba selulolitik maupun xilanolitik [2]. Ampas tebu ( bagasse ) merupakan limbah padat pabrik gula hasil perasan cairan tebu. Dari satu pabrik dihasilkan ampas tebu sekitar 35-40 % dari  berat  tebu  yang  digiling.  Tetapi  sebanyak  sekitar  60  %  dari  ampas  tebu  telah dimanfaatkan untuk bahan bakar pabrik gula, bahan baku kertas, dan yang lainnya sehingga masih sekitar 40 % yang belum dimanfaatkan [3]. Ampas tebu mengandung hemiselulosa 20- 32,2 %, selulosa (40,3-55,35 %, dan lignin 11,2-15,7% [4]. Melihat dari kandungan selulosa yang cukup tinggi tersebut maka ampas tebu mempunyai potensi yang cukup bagus untuk bahan baku produksi crude selulase yang mempunyai nilai ekonomi tinggi. Pada sisi lain, kapang Phanerochaete chrysosporium memiliki kemampuan untuk menghasilkan enzim selulase dari substrat yang mengandung selulosa dan sekaligus menghasilkan enzim yang bisa  memecah  lignin  [5],  [6].  Sehingga  tidak  perlu  adanya  proses  delignifikasi  untuk memecah lignin yang ada pada jaringan bagasse .
Pada  penelitian  yang  dilakukan  oleh  referensi  [7]  yang  menggunakan bagasse sebagai substrat  untuk  pembuatan crude selulase  dengan  rentang    waktu  5,  7,  9  hari,  dan konsentrasi substrat 1-5 %, maka diperoleh waktu terlama yaitu 9 hari dan  konsentrasi substrat  5  %,    diperoleh crude selulase  yang  aktivitasnya  tertinggi  sehingga  pada kesempatan  ini  peneliti  akan  melanjutkan  penelitian  tersebut  dengan  menggunakan variabel rentang waktu  9, 11, 13,  15 dan 17 hari, dan konsentrasi substrat 5, 6, dan 7 dengan harapan bisa diperoleh hasil dengan aktivitas yang lebih tinggi.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  pengaruh  waktu  fermentasi    dan konsentrasi  substrat bagasse terhadap crude selulase  yang  dihasilkan,  dan  untuk memperoleh kondisi operasi yang terbaik dari variabel yang digunakan supaya diperoleh crude selulase yang mempunyai aktivitas tertinggi.
Penelitian  tentang  produksi  selulase  dari  ampas  tebu  sudah    dilakukan  oleh  beberapa peneliti  diantaranya  oleh  referensi  [8]  yang  membuat  enzim  selulase  dari  ampas  tebu dengan menggunakan kapang Trichoderma viride dengan perlakuan konsentrasi bagasse (1, 2, dan 3%) yang ditambahkan dan waktu fermentasi (5, 7, dan 9 hari) dan diperoleh aktivitas tertinggi pada konsentrasi penambahan 3 % dan waktu fermentasi 7 hari dengan aktivitas  spesifik  selulase  2,94  Unit/mg  protein.  Untuk  produksi crude selulase  dari jerami  padi  dengan  kapang Aspergilus  niger diperoleh  aktivitas  tertinggi  pada  waktu fermentasi 9 hari. Referensi [9] melakukan penelitian produksi selulase dengan substrat serbuk  kayu  mahoni  dengan  kapang Aspergilus  niger ,  dengan  variabel  konsentrasi penambahan  substrat  (2,3,4,5,6  %)  dan  suhu  delignifnifikasi  (100  dan  120 o C)  dan diperoleh  hasil  terbaik  pada  suhu  delignifikasi  120 o C  dan  penambahan  substrat  5%. Referensi [7] juga melakukan penelitian tentang pembuatan enzim selulase dari bagasse dengan kapang P hanerochaete chrysosporium dengen perlakuan lama fermentasi (5, 7, 9 hari) dan jumlah penambahan substrat (1,2,3,4,5%) dan diperoleh kondisi terbaik pada waktu fermentasi 9 hari dan jumlah substrat yang ditambahkan 5%.
Penelitian tentang produksi crude selulase dengan kapang P hanerochaete chrysosporium masih belum banyak dilakukan karena selama ini kapang P hanerochaete chrysosporium masih  dikhususkan  untuk  degradasi  lignin.  Namun  dalam  perkembangannya  setelah dicoba  untuk  menghasilkan  enzim  selulase  ternyata  bisa  menghasilkan  enzim  selulase yang lebih tinggi dibandingkan dengan kapang Aspergilus niger.
Enzim  selulase  adalah  suatu  enzim  yang  bisa  memecah  selulosa  (menghirolisis  ikatan β(1-4)  pada  selulosa)  [10].  Selulase  merupakan  enzim  extra  seluler  yang  terdiri  atas complex endo β-1,4-glukonase, ekso β-1,4-glukonase, dan β-1,4-glukosidase.
Selulase  dapat  diproduksi  oleh  fungi,  bakteri,  dan  ruminansia.  Produksi  enzim  secara komersial  biasanya  menggunakan  fungi  atau  bakteri.  Fungi  yang  bisa  menghasilkan selulase  antara  lain  genus Tricoderma,  Aspergillus,  dan  Penicillium .  Jenis  fungi  yang biasa  digunakan  dalam  produksi  selulase  adalah Aspergillus  niger [11], Aspergillus fumigates , Aspergillus  nidulans [11], Neurospra  sitophila , Tricoderma  viride [10], Tricoderma  longibrachiatum ,  dan Saccharomyces  cerevisiae [12],  dan Phanerochaete chrysosporium [7].  Sedangkan  bakteri  yang  bisa  menghasilkan  selulase  adalah Pseudomonas , Cellulomonas , Bacillus, Micrococcus , Cellovibrio, dan Sporosphytophaga. Inokulasi  biasanya  dilakukan  pada  medium  PDA/ Potato  Dextrose Agar atau  pada  medium Czapek  Dox  Liquid [13].  Enzim  selulase  bekerja  dengan  cara memecah  ikatan  β1,4-glikosidik  pada  selulosa.  Hidrolisis  enzimatik  yang  sempurna memerlukan  aksi  sinergis  dari  tiga  tipe  enzim  ini,  yaitu  :2.  Exo-1,4-β-D-glucanase (cellobiohydrolase), 3. β–glucosidase (cellobiase), Endo-1,4-β-D-glucanase  [10].
Phanerochaete  chrysosporium termasuk  dalam  divisio Mycota, sub  divisio Eumycota , klas Bacidiomycetes ,  famili Hymenomycetaceae ,  genus Phanerochaete, dan  Spesies Phanerochaete  chrysosporium . Phanerochaete  chrysosporium mempunyai  suhu pertumbuhan optimum 37 o C, pH 4-7, dan aerob [14].
Phanerochaete chrysosporium merupakan salah satu mikroorganisme yang mempunyai kemampuan  mendegradasi  lignoselulosa  secara  selektif  yaitu  mendegradasi  komponen lignin  terlebih  dahulu  diikuti  dengan  komponen  selulosa.  Selulosa  dan  hemiselulosa dimanfaatkan oleh kapang sebagai sumber karbon. Kapang ini cocok digunakan dalam proses  fermentasi  yang  banyak  menghasilkan  panas.  Efisiensi  degradasi  lignin  yang tinggi dan minimal dalam memanfaatkan polimer selulosa dibanding fungi pelapuk putih lain  menjadikan P.  chrysosporium sebagai  pilihan  terbaik  dalam  perlakuan  degradasi lignin [14].
Enzim  selulase  yang  dihasilkan Phanerochaete  chrysosporium mempunyai  aktivitas tertinggi  antara  suhu  25 o C  sampai  40 o C  karena  aktivitas  enzim  pendegradasi  selulosa akan  meningkat  seiring  dengan  meningkatnya  suhu.  Stabilitas  enzim  dipengaruhi  oleh suhu,  penggunaan  suhu  yang  lebih  tinggi  menyebabkan  pertambahan  aktivitas  dan penurunan  stabilitas  tergantung  pada  periode  waktu  inkubasi  enzim. Phanerochaete chrysosporium mendegradasi  selulosa  tertinggi  pada  pH  5  karena  aktivitas  selulase Phanerochaete  chrysosporium maksimum  terjadi  pada  pH  substrat  yang  mendekati netral.
Proses pemecahan lignin dilakukan melalui reaksi pembelahan. Enzim ekstraselular ini melepaskan  radikal  bebas  untuk  memicu  pemecahan  spontan  menjadi phenyl  propane unit dalam metabolisme sekunder atau fase stasioner [14].
Tebu  ( Saccharum  officinarum )  adalah  tanaman  yang  ditanam  untuk  bahan  baku  gula. Tanaman ini hanya dapat tumbuh di daerah beriklim tropis. Tanaman ini termasuk jenis rumput-rumputan. Umur tanaman sejak ditanam sampai bisa dipanen mencapai kurang lebih 1 tahun. Di Indonesia tebu banyak dibudidayakan di pulau Jawa dan Sumatra.
Ampas tebu atau lazimnya disebut bagasse , adalah hasil samping dari proses ekstraksi (pemerahan) cairan tebu. Dari  satu pabrik  dihasilkan ampas  tebu  sekitar 35–  40%  dari berat  tebu  yang  digiling.  Referensi  [3]  menambahkan,  berdasarkan  data  dari  Pusat Penelitian Perkebunan Gula Indonesia (P3GI) ampas tebu yang dihasilkan sebanyak 32% dari berat tebu giling. Ampas tebu sebagian besar mengandung ligno-cellulose. Panjang seratnya antara 1,7 sampai 2 mm dengan diameter sekitar 20 mikro. Bagasse mengandung air 48 - 52%, gula rata-rata 3,3 % dan serat rata-rata 47,7%. Serat bagasse tidak dapat larut dalam air dan sebagian besar terdiri dari selulosa, pentosan dan lignin [3].

## 2.  METODE PENELITIAN
Penelitian dilakukan di Laboratorium Bioproses dan Laboratorium Analisa Instrumentasi – Jurusan Teknik Kimia- Politeknik Negeri Malang.
Alat  dan  bahan  yang  digunakan: Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  antara  lain: erlenmeyer,  gelas  ukur,  labu  ukur,  tabung  reaksi,  corong, beaker  glass ,  sentrifuge, spatula, water bath , kaca arloji, thermostat , oven, shaker , kawat ose, bunsen, autoklaf , pipet ukur, ball pipet, desikator, spektrometer uv vis, kulkas, neraca digital, ph meter, furnace, seperangkat peralatan reflux, pompa vakum.
B ahan    yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  meliputi,  antara  lain:  Kapang Phanerochaete  chrysosporium , media  NLM,  glukosa , PDA  ( Potato  Dextrosa  Agar ), bagas, tauge, ekstrak kamir, polipepton, K 2 HPO 4 ,  MgSO 4 .7H 2 O, KMnO 4 , H 2 SO 4 72%, gula putih, reagen DNS, yeast extract , alkohol, spiritus, CTAB, aquades, aquades bebas reduktor, kertas pH universal, kapas berlemak, aluminium foil, kain kasa, kertas saring whatman no. 41, CMC.
Penelitian diawali dengan pretreatment bahan (ampas tebu) yaitu dengan mengeringkan ampas tebu dan mengecilkan ukuran partikel sampai sampai 42 mesh, serta analisa awal bahan  baku  yaitu  kadar  air,  kadar  lignin  dan  kadar  selulosa.  Tahap  berikutnya meremajakan starter dengan  cara  mengembangkan  bibit  dalam  media  cair  dengan menggunakan media NLM yang sudah diadaptasikan dengan bagas. Tahap selanjutnya membuat kurva pertumbuhan. Pada pembuatan kurva pertumbuhan dilakukan dengan cara: Membuat suspensi spora Phanerochaete chrysosporium , kemudian suspensi spora tersebut  diinokulasikan  ke  dalam   masing-masing erlemeyer yang sudah diisi  dengan media NLM sebanyak 20 erlemeyer. Suspensi yang ditambahkan jumlahnya 10 % dari media. Setelah diinokulasi, semua erlemeyer diinkubasi sesuai dengan waktunya mulai dari  1  hari  sampai  20  hari.  Kemudian  dianalisa  massa  sel  kering    kapang  tiap-  tiap erlemeyer, yang kemudian datanya untuk membuat kurva pertumbuhan.
Langkah selanjutnya adalah pembuatan crude selulase: bagasse yang sudah dikeringkan dan  dihaluskan  dimasukkan  ke  dalam  media  NLM  sesuai  dengan  variasi  konsentrasi, yaitu 5, 6, dan 7 % b/v dari volume media, kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoclave ,  setelah  dingin,  diinokulasi  dengan  starter Phanerochaete  chrysosporium kemudian diinkubasi dengan lama waktu sesuai dengan variabel penelitian (9, 11, 13, 15, dan 17 hari). Hasil fermentasi  dihomogenkan kemudian  disaring menggunakan  pompa vacuum,  filtratnya  merupakan  ekstrak  kasar  enzim  selulase  yang  kemudian  dianalisa aktivitas  selulasenya untuk tiap variabel.

## 3.  HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1  KURVA PERTUMBUHAN
Kurva Pertumbuhan Phanerochaete chrysosporium dalam media bagasse dibuat  dengan tujuan untuk mengetahui waktu yang paling baik untuk proses fermentasinya. Untuk itu diperlukan pemahaman terhadap proses pertumbuhan mikroorganisme yang digunakan. Pada  penelitian  ini  digunakan  metode  analisis  berat  kering  untuk  membuat  kurva pertumbuhan Phanerochaete  chrysosporium .  Metode  analisis  massa  sel  kering  ini mencakup perhitungan massa sel kering karena pada penelitian ini menggunakan kapang yang hanya bisa dihitung dengan menggunakan perhitungan massa sel kering.
Berdasarkan  hasil  percobaan,  kurva  pertumbuhan Phanerochaete  chrysosporium , ditunjukkan  pada  gambar  1,  pada  kurva  pertumbuhan  dengan  media bagasse tersebut Phanerochaete  chrysosporium mengalami  fase lag atau  fase  adaptasi  pada  hari  ke  1 sampai  hari  ke  2,  pada  fase  ini  terjadi  proses  adaptasi Phanerochaete  chrysosporium terhadap bahan pertumbuhannya, peningkatan ukuran sel terjadi tapi sangat lambat.  Fase log atau fase eksponensial pada Bagasse terjadi pada hari ke 3 sampai hari ke 5. Pada fase ini sel mengalami peningkatan yang sangat pesat, dimana sel tumbuh lebih banyak dua kali dari fase lag, karena pada fase ini sel sudah beradaptasi dengan lingkungan dan nutrisi masih cukup tersedia pada media yang disediakan.
Fase stationer pada media Bagasse terjadi pada hari ke 6 sampai hari  ke 20. Pada fase ini keadaan  pertumbuhan Phanerochaete  chrysosporium mendekati  seimbang  tetapi  tetap mengalami  kenaikan  meskipun  sedikit,  dimana  laju  pertumbuhan  dan  laju  kematian hampir  sama. Sehingga jumlah keseluruhan Phanerochaete chrysosporium yang hidup akan mendekati konstan. Pada fase stationer ini juga dihasilkan metabolit sekunder yang mengaktifasi keadaan lignolitik Phanerochaete chrysosporium [15].
Gambar 1. Kurva Pertumbuhan Phanerochaete chrysosporium pada media ampas tebu
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021 Be rat Keri ng (g ram) * Waktu (Hari)
Gambar  1  menunjukkan  bahwa  mulai  hari  ke  6  sampai  hari  ke  20  tersebut  kapang Phanerochaete  chrysosporium masih  mengalami  fase  stasioner,  sehingga  berdasarkan gambar 1  kapang tersebut masih mengasilkan enzim-enzim pendegradasi lignin, selulosa, dan hemiselulosa. Hal ini juga dibuktikan bahwa pada pembuatan kurva pertumbuhan, disamping  dianalisa  massa  sel  keringnya  juga  dianalisa  aktivitas  enzimnya  setiap  hari. Dan  terbukti  semakin  lama  waktu  inkubasi  akan  semakin  tinggi  aktivitas  enzimnya seperti  pada  gambar  3.  Ini  membuktikan  bahwa  fase  stasioner  dari Phanerochaete chrysosporium masih  bisa  lebih  lama  lagi  dari  20  hari.  Penelitian  ini  sesuai  dengan penrnyataan  yang  disampaikan  oleh  referensi  [16]  yang  menyatakan  bahwa  penurun kadar lignin yang tertingi diperoleh pada waktu fermentasi yang terlama yaitu 30 hari.

## 3.2  PENGUKURAN KADAR GLUKOSA
Pada  proses  hidrolisis bagasse dengan  katalis  enzim  selulase  akan  menghasilkan  gula reduksi  dalam  bentuk  glukosa.  Dalam  penelitian  ini  dilakukan  pembuatan  kurva  baku glukosa dengan menyiapkan beberapa sampel glukosa yang memiliki konsentrasi dari 10 ppm yang setara dengan 10 μg/mL.
Hasil  pengukuran  kadar  glukosa  pada  masing-masing  sampel  yang  dilakukan  dengan menggunakan  metode  DNS  ( Dinitrosalicylic  Acid )  dan  diukur  absorbansinya  dengan panjang gelombang 540 nm.
Pereaksi  ini  umum  digunakan  untuk  mengukur  gula  reduksi  yang  diproduksi  dengan biokatalisator crude selulase  karena  tingkat  ketelitiannya  yang  tinggi  sehingga  bisa diaplikasikan pada gula dengan kadar kecil sekalipun.
Referensi  [17],  dalam  suasana  alkali  gula  pereduksi  akan  mereduksi  asam  3,5– dinitrosalisilat  (DNS)  membentuk  senyawa  yang  dapat  diukur  absorbansinya  dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540–550 nm.
Dari  kurva  baku  glukosa,  konsentrasi  glukosa  setiap  sampel  dapat  diketahui.  Dengan menggunakan  absorbansi  yang  diperoleh  digunakan  untuk  menentukan  kadar  gula dengan rumus persamaan regresi linier Y = a + bx. a dan b diperoleh dari perhitungan gula standar, Y merupakan nilai absorbansi pada panjang gelombang 540 nm dan x adalah kadar glukosa yang dihasilkan. Satu unit dari aktivitas selulase diartikan sebagai jumlah dari  enzim  yang  melepaskan  μmol  glukosa  dalam  satu  menit  pada  kondisi  pengujian. Gambar 2 menunjukkan konsentrasi glukosa dari variasi waktu inkubasi dan konsentrasi penambahan  substrat  yang  berbeda.  Dari  grafik  tersebut  menunjukkan  bahwa  semakin lama waktu inkubasi dan semakin besar konsentrasi penambahan substrat, maka semakin besar konsentrasi glokosa yang dihasilkan.
Gambar 2. Grafik hubungan antara waktu inkubasi (Hari) terhadap konsentrasi glukosa

## (μg/mL)

## 3.3  PENGUKURAN KADAR GLUKOSA
Pada penelitian ini aktifitas enzim dilakukan berdasarkan aktivitas CMCase dalam satuan Internasional Unit (IU) dengan metode DNS ( Dinitrosalicylic acid ) diuji dengan metode CM Case . Pengujian aktivitas enzim dilakukan pada masing-masing perlakuan dimana uji dilakukan dua kali pengulangan.
Pengujian  aktivitas  ini  dilakukan  berdasarkan  jumlah  glukosa  yang  dihasilkan  tiap perlakuan. Jumlah kadar glukosa yang dihasilkan dilihat berdasarkan parameter panjang gelombang  yang  diukur  menggunakan  spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  540 nm.
Analisis  kadar  glukosa  dilakukan  dengan  metode  DNS  ( Dinitrosalicylic  acid )  yaitu sampel  hasil  hidrolisis  enzimatik  dalam  keadaan  jernih  dipipet  sebanyak  0,2  ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang bersih. Selanjutnya ditambahkan 1,8 mL CMC 1% dan 2 mL reagen DNS. Tabung reaksi dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit agar terjadi reaksi antara glukosa dalam sampel dengan DNS.
Tabung didinginkan hingga mencapai suhu ruang, selanjutnya absorbansi sampel diukur pada  panjang  gelombang  540  nm  dengan  spektrofotometer  UV-Vis.  Pereaksi  DNS ( Dinitrosalicylic  acid )  ini  umum  digunakan  untuk  mengukur  gula  reduksi  yang diproduksi  oleh  mikroba  karena  tingkat  ketelitiannya  yang  tinggi  sehingga  bisa diaplikasikan  pada  gula  dengan  kadar  kecil  sekalipun.  Menurut  referensi  [17],  dalam suasana  alkali  gula  pereduksi  akan  mereduksi  asam  3,5–dinitrosalisilat  (DNS) membentuk  senyawa  yang  dapat  diukur  absorbansinya  dengan  spektrofotometer  pada panjang gelombang 540–550 nm.
Gambar  3  merupakan  grafik  pengaruh  konsentrasi  substrat  terhadap  aktivitas crude selulase yang dihasilkan. Pada Gambar 3 terlihat bahwa konsentrasi substrat  berpengaruh terhadap besar kecilnya aktivitas crude enzim  selulase yang dihasilkan. Dari konsentrasi substrat 5%, 6% dan 7% b/v, aktivitas tertinggi diperoleh dari konsentrasi substrat 7 % b/v sebesar 91.304 U/mL Sehingga semakin besar konsentrasi substrat , dari 5 sampai 7
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 7 9 11 13 15 17 Konsen tra si Glukosa (μ g/mL ) Waktu Inkubasi (Hari) 5% bagas 6% bagas 7% bagas
%,  semakin  naik  aktivitas crude selulasenya.  Demikian  juga  dengan  waktu  inkubasi, semakin  lama  waktu  inkubasi  dari  9  hari  sampai  17  hari, maka  semakin  naik  aktivitas crude selulasenya.  Hal  ini  dapat  terjadi  karena  enzim  selulase  dihasilkan  oleh  kapang Phanerochaete  chrysosporium pada  metabolit  sekundernya.Sesuai  dengan  kurva pertumbuhan  yang  telah  dibuat  bahwa  fase  stasioner  terbentuk  mulai  hari  ke  6  sampai hari  ke  20  sehingga  apabila  waktu  inkubasi  diperpanjang,  masih  ada  kemungkinan aktivitas crude selulase akan meningkat.  Pada penelitian sebelumnya oleh referensi [7], pada bahan baku yang sama dengan kapang yang sama dihasilkan aktivitas crude selulase semakin lama waktu, semakin naik aktivitasnya (dari waktu 5 sampai 9 hari).
Gambar 3. Hubungan antara waktu inkubasi dan aktivitas crude selulase pada berbagai konsentrasi substrat
Kompleks  enzim  substrat  mengalami  kesesuaian  bila  sisi afinitas  enzim  sesuai  dengan jumlah  molekul  substrat  pada  bagian  aktifnya.  Jika  %  penambahan  substrat  terus diperbesar maka akan terjadi penambahan aktivitas [18].Tapi sebenarnya apabila substrat terlalu besar bisa menjadi penghambat bagi enzimnya, sehingga perlu dicari kondisi yang optimum.
Ketika penambahan substrat melebihi titik optimal maka terjadi kompetisi antara bagian aktif  substrat  dalam  memperebutkan  sisi  afinitas  enzim,  dan  akibatnya  terjadi penghambatan  pada  proses  penggabungan  enzim-substrat.  Bila  terjadi  demikian  maka aktivitas  enzim  yang  terukur  menjadi  rendah  karena  proses  pengikatan  enzim-substrat tidak lagi berlangsung efisien, yang disebut dengan substrate inhibition [19]. Oleh karena itu,  penambahan  substrat  secara  menerus  menyebabkan  aktivitas  enzim  akan  menaik, kemudian mencapai konstan, namun akhirnya aktivitas mengalami penurunan [19].Untuk mengetahui  pengaruh  waktu  inkubasi  terhadap  produk crude selulase  yang  dihasilkan pada berbagai persen penambahan bagas, maka bisa dilihat pada gambar 4.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 7 9 11 13 15 17 19 Aktifit as Enz im (U/mL) Waktu Inkubasi (Hari) 5% Bagasse 6% Bagasse 7% Bagasse
Gambar 4. Hubungan antara waktu inkubasi (Hari) terhadap aktivitas crude enzim selulase (U/mL) untuk berbagai konsentrasi substrat .
Gambar  4,  menunjukkan  grafik  pengaruh  waktu  inkubasi  terhadap  aktivitas crude selulase yang dihasilkan. Pada gambar tersebut menunjukkan  waktu inkubasi dari 9 hari, 11 hari, 13 hari, 15 hari dan 17 hari. Dari waktu 9 hari sampai 17 hari, semakain lama waktu inkubasi semakin tinggi aktivitas crude selulasenya. Hal ini disebabkan semakin lama waktu inkubasi sampai dengan waktu 17 hari, Phanerochaete chrysosporium masih berada dalam fase stasioner sehingga masih terus menghasilkan enzim selulase. Hasil ini juga sesuai dengan data yang diperoleh pada percobaan pembuatan kurva pertumbuhan bahwa sampai dengan hari ke 20 fase stasioner masih tetap berlangsung. Gambar 4 juga menunjukkan  bahwa  dari  tiap  waktu  akan  terlihat  kenaikan  aktivitas  enzim  pada penggunaan  konsentrasi bagasse yang  bervariasi.  Semakin  besar  konsentrasi  substrat bagas, semakin tinggi aktivitas crude seluosanya. Hal ini menunjukkan bahwa semakin besar penambahan substrat yang mengandung selulosa akan semakin menaikkan aktivitas enzim  selulosa  yang  dihasilkan.  Dan  aktivitas  enzim  terbaik  diperoleh  pada  waktu inkubasi selama 17 hari, dan konsentrasi substrat bagasse 7 %, yaitu 91.30 U/mL.

## 4.  KESIMPULAN
Dari  penelitian  yang  telah  dilakukan,  dapat  disimpulkan  bahwa  semakin    lama  waktu inkubasi, maka semakin tinggi hasil aktivitas crude selulase yang dihasilkan untuk waktu inkubasi:    9,11,  13,  15  dan  17  hari,  dan    semakin  besar  konsentrasi  substrat  yang digunakan,  maka  semakin  besar  pula  aktivitas  enzim  yang  dihasilkan  dengan  batasan variabel 5%, 6% dan 7%. Aktivitas crude selulase tertinggi dihasilkan pada konsentrasi substrat  7 %  dan waktu inkubasi selama 17 hari yaitu sebesar 91.304 U/mL.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Disampaikan ucapan terima kasih pada Politeknik Negeri Malang yang telah memberikan dana untuk pelaksanaan penelitian ini melalui anggaran DIPA 2016.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] B.C.  Saha.  Lignocellulose  Biodegradation  and  Application  in  Biotechnology, American Chemical Society , hal. 2-14, 2004.
[2] P. Pason, K. Ratanakhanokchai, K.L. Kyu, Multiple Cellulases and Xylanases of Bacillus  circulans  B-6, Biotechnology  for  Sustainable  Utilization  of  Biological Resources in the Tropics Vol. 16 Proceedings of Project Seminars in 2000-2003 for JSPS-NCRT/DOST/LIPI/VCC . IC Biotech, Japan, hal. 305-310. 2003.
[3]   Husin. Analisis Serat Bagas, (http:www.free.vlsm.org/), 2007.
[4]    S. Stefanus, H. A. R. Tarmidi, Efek dosis dan lama biokonversi ampas tebu sebagai pakan  oleh  jamur  tiram  putih  ( Plaurotus  ostreatus )  terhadap  kadar  protein  dan komponen serat, www.pustaka.unpad.ac.id, 2005.
[5]   S. Rulianah, P. H. Suharti, Y. Maryanty, B. Irawan, The Effect of Fermentation Time  and  Addition  of  CMC  to  Decrease  of  Lignin  Content  in  Fermentation  of Patchouli Leaves Using Phanerochaete chrysosporium. Advanced Science Letters, vol. 23, hal. 5666–5668, 2017.
[6] P. H. Suharti, S. Rulianah, Y. Maryanty, B. Irawan, F. Chen, and M. J. Tsai, The Degradation  of  Cellulose  in  the  Fermentation  of  Patchouli  Leaves  Using Phanerochaete  chrysosporium , Advanced  Science  Letters, vol.  23,  hal.  5669– 5671, 2017.
[7]   S. Rulianah, H. Hardjono, R. Imron, A. D. R. Mila, Pemanfaatan Bagas sebagai Crude Selulase Menggunakan Kapang Phanerochaete chrysosporium, Prosiding Seminar Rekayasa Kimia dan Proses, UNDIP Semarang, ISSN: 1411-4216 , 2014.
[8]   I.  B.  W.  Gunam,  K.  Buda,  I.  M.  Y.  S.  Guna,  Pengaruh  Perlakuan  Delignifikasi dengan  Larutan  NaOH  dan  Konsentrasi  Substrat  Jerami  Padi  terhadap  Produksi Enzim Selulase dari Aspergillus niger nrrl a-ii, 264, Jurnal Biologi XV, vol. 2, hal. 29-33, 2011.
[9]    S.  Rulianah,  D.  Moentamaria,  D.  Meilany,  Pengaruh  Suhu  Delignifikasi  dan Konsentrasi    Penambahan    Substrat  Kayu  Mahoni  Terhadap  Aktivitas  Crude Selulase  yang  Dihasilkan  pada  Proses  Fermentasi  dengan  Kapang Aspergillus niger. Prosiding Propoltek. Diseminasi Hasil Penelitian. ISSN : 2089-2144 , 2013.
[10]   I.  Ulhaq,  M.  M.  Javed,  T.  S.  Khan,  Z.  Siddiq,  Cotton  Saccharifying  Activity  of Cellulases  Produced  by  Co-culture  of  Aspergillus  nigerand  Trichoderma  viride, Res. J. Agric & Biol . Sci., vol. 1, no. 3, hal. 241-245, 2005.
[11]   U.F.  Ali,  H.  S.  S.  El-Dein,  Production  and  Partial  Purification  of  Cellulase Complex by Aspergillus nigerand A. nidulans Grown on Water Hyacinth Blend, Journal of Applied Sciences Research , vol. 4, no. 7, hal. 875-891, 2008.
[12]   O. Omojasola, P. Folakemi, O. P. Jilani, S. A. Ibiyemi, Cellulase Production by some Fungi Cultured on Pineapple Waste , Nature & Science, vol. 6, no. 2 , hal. 64- 75, 2008.
[13]   G. Narasimha, A. Sridevi, B. Viswanath, S. Chandra, B. R. Reddy, Nutrient Effects on Production of Cellulolytic Enzymes by  Aspergillus niger, African Journal of Biotechnology, vol. 5, no. 5 , hal. 472-476, 2006.