J. Teknol. dan Industri Pangan Vol. 27(1): 40-50 Th. 2016  ISSN: 1979-7788 Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012

## VALIDASI  METODE  ANALISIS  ASAM  LEMAK  TRANS  DALAM  MAKANAN BERDASARKAN  AOCS OFFICIAL  METHOD
Ce 1h-05
[Validation of Trans Fatty Acid in Foods Analysis Method Based on AOCS Official Method Ce 1h-05]
Maria Fransisca Njoman 1) , dan Nuri Andarwulan 1,2) *
1) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Southeast Asian Food and Agricultural Science and Technology Center, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Diterima 14 Februari 2016 / Disetujui 06 Juni 2016

## ABSTRACT
Cardiovascular disease is related to the high consumption of trans fatty acid. This issue has driven SEAFAST IPB Lab oratory to develop a trans fatty acid analysis method for gas chromatography b ased on AOCS  Official  Method  Ce  1h-05.  This  research  was  aimed  to  validate  the  method  via  three  steps: preparation step, procedure orientation test, and method validation. During instrument performance testing in the preparation step, linearity, limit of detection (LoD), limit of quantitation (LoQ), range, and precision parameters  were  validated  for  FAME  9t-C18:1  and  C18:2  isomer  mixed standard solution. During the method  validation  step,  specificity,  precision  and  accuracy  parameters  were  validated  for  9t-C18:1 compound attached to food matrix,  i.e. doughnut. The instrument validation result of 9t-C18:1 standard solution  had  fulfilled  the  criteria  of linearity (r 2 =1, requirement r 2 > 0.990) within the range of 0.0020 to 0.1200  mg/mL;  precision  (RSD)  0.24%;  LoD  0.0007  mg/mL  and  LoQ  0.0020 mg/mL. The instrument validation result for each isomer in C18:2 standard solution also met the criteria of linearity (r 2 = 0.9999, requirement r 2 > 0.990) with precision (RSD), LoD and LoQ respectively; 1) 9t,12t-C18:2: 1.40%; 0.0033 mg/mL; 0.0100 mg/mL; 2) 9t,12c-C18:2: 1.89%; 0.0015 mg/mL; 0.0045 mg/mL; 3) 9c,12t-C18:2: 2.39%; 0.0015 mg/mL; 0.0044 mg/mL; 4) C18:2 cis: 3.39%; 0.0006 mg/mL; 0.0019 mg/mL. The validation result for 9t-C18:1 in 100 mg fat extract of doughnut suggested that the modified method is validated in term of specificity  (Rs  =  1.2),  precision  (RSD  fatty  acid  content  (mg/g)  =  1.78%; RSD percentage of fatty acid content towards total fatty acid = 0.72%) and accuracy (as percentage of recovery) 80.54-94.25%.
Keywords: gas chromatography, method validation, trans fatty acid

## ABSTRAK
1
Meningkatnya  isu  kesehatan  terkait  penyakit  kardiovaskuler  yang  dihubungkan  dengan  tingkat konsumsi  asam  lemak  trans mendorong laboratorium SEAFAST IPB untuk  mengembangkan metode analisis asam lemak trans dengan kromatografi gas berdasarkan AOCS Official Method Ce 1h-05 (AOCS, 2005). Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode tersebut melalui tiga tahap: tahap persiapan, orientasi  prosedur  uji  dan  validasi  metode.  Selama  pengecekan  unjuk  kerja  instrumen  pada  tahap persiapan dilakukan validasi linieritas, batas deteksi ( LoD ) dan batas kuantitasi ( LoQ ), rentang kerja, serta presisi pada larutan baku FAME 9t-C18:1 dan campuran isomer C18:2. Sementara pada tahap validasi metode dilakukan validasi spesifisitas, presisi dan akurasi untuk senyawa 9 t-C18:1 dalam matriks produk pangan, dalam hal ini donat. Hasil validasi instrumen pada baku 9t-C18:1 memenuhi kriteria linieritas (r 2 = 1,00, syarat r 2 > 0,990) pada rentang kerja 0,0020 sampai 0,1200 mg/mL, dengan presisi ( RSD ) 0,24%, LoD 0,0007 mg/mL, dan LoQ 0,0020 mg/mL. Hasil validasi untuk setiap isomer dalam baku campuran isomer C18:2 juga memenuhi kriteria linieritas (r 2 = 0,9999, syarat r 2 > 0,990) dengan presisi ( RSD ), LoD dan LoQ masing-masing; 1) 9t,12t-C18:2: 1,40%; 0,0033 mg/mL 0,0100 mg/mL; 2) 9t,12c-C18:2: 1,89%; 0,0015  mg/mL;  0,0045  mg/mL;  3)  9c,12t-C18:2:  2,39%;  0,0015  mg/mL;  0,0044  mg/mL; 4) C18:2 cis: 3,39%;  0,0006  mg/mL;  0,0019  mg/mL.  Hasil validasi metode untuk senyawa 9t-C18:1 dalam 100 mg ekstrak  lemak  donat menunjukkan bahwa metode tervalidasi untuk parameter spesifisitas (Rs = 1,2), presisi ( RSD kadar asam lemak (mg/g) = 1,78%; RSD persen kadar asam lemak terhadap asam lemak total = 0,72%) dan akurasi (persen rekoveri) 80,54-94,25%.
Kata kunci: asam lemak trans , kromatografi gas , validasi metode
*Penulis Korespondensi: E-mail: nuri@seafast.org

## PENDAHULUAN
Peningkatan  konsumsi  asam  lemak  trans  (ALT) berbanding  lurus  dengan  peningkatan  prevalensi penyakit  jantung  koroner  ( corronary  heart  disease , CHD ),  diabetes  mellitus  tipe  2,  gangguan  saraf  dan ingatan,  apoptosis  sel  endotel  serta  obesitas  (De Souza et  al., 2015;  Ganguly  dan  Pierce,  2015). Berdasarkan  hasil  penelitian  Harvey et  al. (2008), dan  Xu et  al. (2006),  konsumsi  ALT  memiliki  korelasi positif  dengan  peningkatan  risiko  atherosklerosis. Hal  ini  didukung  oleh  data  Mosley et  al. (2005)  yang menunjukkan  kelompok  orang  dengan  asupan  ALT 5,7  g/hari  memiliki  risiko CHD 50%  lebih  tinggi dibandingkan  kelompok  yang  mengonsumsi  2,4 g/hari.  Asam  lemak  jenuh  dan  ALT  sama-sama meningkatkan  rasio low  density  lipoprotein / high density  lipoprotein ( LDL/HDL )  yang  memicu CHD (Gebauer et  al., 2015;  Siri-Tarino et  al., 2010), namun  efek  negatif  yang  ditimbulkan  ALT  mendekati dua  kali  lebih  besar  dibandingkan  asam  lemak  jenuh karena  asam  lemak  jenuh  hanya  meningkatkan kadar LDL ,  sementara  ALT  meningkatkan  kadar LDL dan  juga  mengurangi HDL dalam  darah (Sartika,  2008;  Hunter et  al., 2010).  Pada  tingkat berlebih,  ALT  dapat  menginduksi  penyakit  diabetes mellitus  tipe  2.  dengan  menurunkan  sensitivitas insulin  (Hamilton et  al., 2015;  Kavanagh et  al., 2007).  Kelebihan  ALT  disimpan  dalam  jaringan lemak  yang  dalam  jangka  panjang  dapat  terakumu- lasi  dan  menyebabkan  obesitas  (Stachowska et  al., 2010).
Sekitar  80-90%  konsumsi  ALT  berasal  dari produk hidrogenasi parsial, seperti margarin, shortening,  dan deep  frying  fats ,  sementara  sisanya berasal  dari  sumber  alami  hewan  ruminansia (Sartika,  2008;  Zhang et  al., 2015).  Hidrogenasi adalah  proses  penambahan  atom  hidrogen  pada ikatan  rangkap  asam  lemak  tidak  jenuh  sehingga mengubahnya  menjadi  asam  lemak  jenuh  (Vahmani et  al., 2015).  Proses  ini  bertujuan  untuk  meningkat- kan  titik  leleh  minyak  nabati  sehingga  bewujud  padat pada  suhu  ruang.  Selain  meningkatkan  derajat kejenuhan  minyak  nabati,  proses  hidrogenasi  ber- potensi  menginduksi  isomerisasi  pada  asam  lemak tidak  jenuh  yang  alaminya  berbentuk  cis  menjadi trans.  Produk  dominan  hasil  isomerisasi  ini  adalah senyawa  9t-C18:1  yang  lebih  sulit  dimetabolisme dan  memiliki  prevalensi  terakumulasi  dalam  sel  lebih tinggi  dibandingkan  ALT  alami  (Vahmani et  al., 2015).  Produk  isomerisasi  lainnya  adalah  9t,12t- C18:2  yang  memiliki  dampak  lebih  besar  terhadap peningkatan  risiko CHD dibandingkan  9t-C18:1 (Sun,  2007;  Merchant et  al., 2008).  Mengingat tingginya  risiko  kesehatan  akibat  konsumsi  ALT , pada  Januari  2006,  US Food  and  Drug  Administra- tion (FDA)  merilis final  rule tentang  pelabelan  ALT pada  produk  pangan    yang  menyatakan  bahwa
jumlah  asam  lemak  trans dalam  satu  kali  penyajian dicantumkan  dalam  satu  baris  terpisah  persis  di bawah  lemak  jenuh  (Delmonte  dan  Rader,  2007). Profil  asam  lemak  dapat  dianalisis  menggunakan metode  spektroskopi  IR,  kromatografi  gas  (KG), spektroskopi  resonansi  magnetik  karbon  nuklir, kromatografi  lapis  tipis,  atau High  Performance Liquid Chromatography ( HPLC )  (Delmonte  dan Rader,  2007).  Kromatografi  gas merupakan  metode yang  paling  banyak  digunakan,  karena  kemampuan- nya  memisahkan  asam  lemak  dalam  jumlah  besar (Delmonte  dan  Rader,  2007;  Song et al., 2015).
Analisis  profil  asam  lemak  dengan  KG  sudah diterapkan  di  laboratorium Southeast  Asia  Food  and Agriculture  Science  and  Technology (SEAFAST) IPB  menggunakan  kolom  DB-23  (Supelco,  USA) dengan acuan  AOAC Official  Method 991.39 termodifikasi , namun  kolom  dan  metode  ini  tidak ditujukan  untuk  analisis  ALT.  Oleh  karena  itu SEAFAST  mengadopsi  metode  analisis  ALT  yang diakui  secara  internasional  yaitu  AOCS Official Method Ce  1h-05  (AOCS,  2005).  Pelaksanaan metode  ini  terkendala  oleh  tidak  tersedianya  kolom yang  diminta,  yaitu  kolom  kapiler  SP-2560  atau  CP- Sil  88.  Ketidaktersediaan  kolom  tersebut  diatasi dengan  penggunaan  kolom  SP-2340  yang  dirujuk oleh  AOAC Official  Method 996.06  (AOAC,  2000). Perbedaan  kapabilitas  dan  kapasitas  kolom  serta instrumen  KG  yang  digunakan  di  laboratorium SEAFAST  menuntut  dilakukannya  modifikasi  me- tode  untuk  penyesuaian.  Sebelum  diaplikasikan, mtode  termodifikasi  perlu  divalidasi  untuk  menjamin performa  data  hasil  analisis.  Penelitian  ini  bertujuan untuk  memvalidasi  metode  analisis  ALT  hasil modifikasi  AOCS Official  Method Ce  1h-05  agar dapat  diterapkan  di laboratorium  SEAFAST.

## BAHAN  DAN METODE

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  adalah  donat,  baku metil  ester  asam  lemak  ( fatty  acid  methyl  esther, FAME ) campuran  (C8-C22)  25  mg/ml  dalam  larutan metilena  klorida  (Supelco),  baku  FAME  9t-C18:1 (Supelco),  baku  FAME  campuran  isomer  C18:2 (9t,12t-C18:2  (50%);  9c,12t-C18:2  (20%);  9t,12c- C18:2  (20%);  dan  C18:2  cis  (10%)  (Sigma-Aldrich), asam  margarat  sebagai  baku  internal  (Sigma Aldrich).

## Tahap persiapan
Tahap  persiapan  meliputi  penyiapan  larutan baku  eksternal  dan  pengecekan  unjuk  kerja  ins - trumen  KG.  Larutan  baku  eksternal  terdiri  dari FAME campuran  isomer  C18:2  yang  di  dalamnya  mengan- dung 9t,12t-C18:2 (50%); 9c,12t-C18:2  (20%); 9t,12c-C18:2  (20%);  dan  C18:2  cis  (10%).  Larutan
baku FAME campuran  isomer  C18:2  dengan konsentrasi  25  mg/mL  dalam  metilena  klorida diencerkan  menjadi  2,5  mg/mL  dengan  pelarut heksana,  lalu  dicampurkan  dengan  larutan  baku FAME campuran  (C8-C22)  konsentrasi  10  mg/mL dalam  heksana  dengan  perbandingan  1:1.  Larutan baku  eksternal  dianalisis  dengan  kromatografi  (KG- 2100  Series,  Shimadzu  Cor-poration,  Japan)  untuk mengidentifikasi  waktu  retensi  dan  nilai response factor ( RF )  masing-masing  asam  lemak  dalam  baku eksternal.
100 Keterangan:
Alx      =  konsentrasi asam lemak tertentu dalam contoh
(mg/g)
Aalx    =  area  asam  lemak  tertentu  pada  kromatogram contoh
ASI     =  area baku internal pada kromatogram contoh BSI =  berat  baku  internal  yang  ditambahkan  pada contoh (mg)
BS     =  berat contoh yang dimetilasi (mg) RF     = Response Factor
Keterangan: RF = Response Factor
ASI =  area  baku  internal  pada  kromatogram  baku eksternal
Aalx    =    area  asam  lemak  tertentu pada kromatogram baku eksternal
BSI =  konsentrasi baku internal dalam komposisi baku eksternal
Balx   =  konsentrasi asam lemak dalam komposisi baku eksternal
Pengecekan unjuk kerja instrumen KG dilakukan  untuk  melihat  kinerja  instrumen  dan menentukan  modifikasi  metode  yang  akan  divalidasi pada  tahap  selanjutnya.  Metode  analisis  mengacu pada  AOCS Official  Method Ce  1h-05  yang  terdiri dari  tiga  tahapan  yaitu  tahap  ekstraksi  lemak, derivatisasi  asam  lemak  dan  analisis  KG.  Metode ekstraksi  lemak  dan  derivatisasi  asam  lemak  yang dirujuk  oleh  AOCS Official  Method Ce  1h-05  adalah AOCS Official  Method  Ce  2-66  ( AOCS,  1997) . Metode  ekstraksi  diubah  menjadi  metode  Folch et al. (1957),  sementara  metode  derivatisasi  dimodifi- kasi  pada  parameter  volume  dan  rasio  reagen (Tabel  1).  Metode  analisis  KG  dimodifikasi  pada parameter  pengaturan  gas  pembawa,  suhu  kolom, suhu  detektor,  kolom  kapiler,  dan  nisbah  pemeca- han  dalam  mode  injeksi.  Modifikasi  metode  secara lengkap  dapat  dilihat  pada  Tabel  2,  sementara kondisi  operasional  KG  secara  lengkap  dapat  dilihat pada  Tabel  3.  metode  ini  dipilih  berdasarkan pertimbangan  efisiensi  dan  kemudahan  penerapan- nya di laboratorium.
Tabel  1. Modifikasi  metode  derivatisasi  asam lemak
Parameter AOCS Official Method Ce-2 66 Metode Modifikasi Massa sampel 100-250 mg 100 mg Volume NaOH 0,5 N 4 mL 2 mL Volume BF3- metanol 5 mL 2 mL Volume NaCl jenuh 15 mL 3 mL Pelarut 2-5 mL heptana 1,5 mL heksana Tabel  2.   Modifikasi  metode  analisis  asam  lemak trans Parameter AOCS Ce1h-05 Metode Modifikasi Derivatisasi asam lemak AOCS Ce 2-66 AOCS Ce 2-66 termodifikasi Suhu kolom   Isotermal 180 o C Terprogram Suhu awal: 120 o C
(6 menit), laju: 3 o C/menit,
Suhu akhir: 230 o C (25 menit) Suhu injektor 250 o C 250 o C Suhu detektor 250 o C 260 o C Kolom kapiler Fused silica capillary , SP-2560 phase (Supelco) atau CP-Sil 88 (Chrompack), 100 m x  0,25 mm, ketebalan film 0,20 µm Fused silica capillary , SP-2340 phase, panjang 60
m, diameter dalam 0,25 mm,
ketebalan film 0,20 µm (Supelco) Gas pembawa He, tekanan: 286 kPa, laju alir: 1,0 mL/menit, kecepatan linier: 19 cm/s He, tekanan: 165,9 kPa, laju alir: 1,0 mL/menit, kecepatan linier: 23,1 cm/s Mode injeksi Split injection (100:1) Split injection (30:1)
Pada  tahap  pengecekan  unjuk  kerja  instrumen dilakukan  uji  linieritas,  presisi,  rentang  kerja,  batas deteksi  ( Limit  of  Detection,  LoD) dan  batas kuantitasi  ( Limit  of  Quantitation,  LoQ) untuk  larutan baku FAME 9t-C18:1  dan  baku FAME campuran isomer  C18:2.  Pada  uji  linieritas,  masing-masing larutan baku dibuat dalam lima konsentrasi. Pemilihan  konsentrasi  terendah  dilakukan  dengan uji  coba  sehingga  diperoleh  konsentrasi  dengan  luas area  yang  terdeteksi  cukup  baik  dan  dapat  terukur oleh  KG.  Larutan  baku  9t-C18:1  dibuat  dengan konsentrasi  0,0040;  0,0100;  0,0400;  0,0500;  dan 0,1000  mg/mL,  sementara  larutan  baku  C18:2 dibuat  dengan  konsentrasi  0,0025;  0,0050;  0,0100; 0,0250;  dan  0,7500  mg/mL.  Validasi  linieritas  dilaku- kan  untuk  memetakan  hubungan  antara  konsentrasi senyawa  analit,  sebagai  sumbu  x,  dengan  luas  area, sebagai  sumbu  y.  Suatu  metode  dikatakan  memiliki
linieritas yang baik  apabila  persamaan  kurva memiliki  koefisien  korelasi  r  >  0,995  atau  r 2 >  0,990 (AOAC,  2012).  Selanjutnya  berdasarkan  analisis d t   simp ng n  b ku  (σ)  d n  kemiring n  kurv   ( ) dari  kurva  linieritas,  dianalisislah  nilai LoD (3,3  σ/ ) dan LoQ (10  σ/ )  ( CH,  2005).  Karena  akan  diguna- kan  pada  tahap  validasi  metode  untuk  sampel,  nilai rentang  kerja  juga  ditentukan  untuk  senyawa  9t- C18:1,  di  mana  berdasarkan  panduan  validasi metode  Eurachem  (Magnusson  dan  Ornemark, 2014)  nilai  batas  bawah  diperoleh  dari  hasil  per- hitungan  LoQ,  sementara  batas  atas  ditentukan pada  konsentrasi  20%  lebih  tinggi  dibandingkan konsentrasi  tertinggi  pada  uji  linieritas.
Tabel  3.   Kondisi  operasional  KG
Komponen Deskripsi Instrumen utama KG-2100 Series Shimadzu Corporation Monitor panel Hewlett Packard Flat Panel Monitor Kolom Fused silica capillary , SP-2340, panjang 60 m, diameter dalam 0,25 mm, ketebalan film 0,20 µm Detektor Flame Ionization Detector (FID) Penyuntik SGE, Penyuntik mikro 10 µL Gas pembawa   Helium (kemurnian 99,999%, Global Gases Indonesia) Laju alir gas pembawa 1,00 mL/menit Make up gas N 2 (UHP, Alphagaz) Make up flow 30,0 mL/menit Aliran H 2 40,0 mL/menit Aliran udara 400,0 mL/ menit Volume injeksi   1 µL Suhu detektor 260 o C Suhu injektor 250 o C
Salah  satu  konsentrasi  dari  lima  konsentrasi larutan  dalam  uji  linieritas  digunakan  untuk  validasi instrumen  parameter  presisi.  Presisi  adalah  tingkat kesesuaian  antara  hasil  analisis  individual  jika prosedur  dilakukan  berulang  kali  terhadap  sampel yang  homogen.  Konsentrasi  terpilih  untuk  larutan  9t- C18:1  adalah  0,1000  mg/mL  karena  merepre- sentasikan  konsentrasi  9t-C18:1  pada  sampel  spike untuk  uji  akurasi,  sementara  untuk  larutan  baku C18:2  adalah  0,0250  mg/mL  karena  merepre- sentasikan  nilai  tengah  dari  lima  konsentrasi  dari tahap  uji  linieritas.  Larutan  terpilih  dianalisis  dengan KG  sebanyak  enam  kali.  Presisi  metode  analisis dinyatakan  sebagai  simpangan  baku  relatif  ( relative standard  deviation,  RSD ),  di  mana  metode  dikata- kan  menghasilkan  data  yang  presisi  apabila  data pengukuran pada minimal 6 sampel dengan konsentrasi  sama  yang  dilakukan  oleh  satu  orang memiliki RSD kurang  dari  atau  sama  dengan  2/3 RSD Horwitz  ( RSDH )  (ICH,  2005).  Nilai RSDH diperoleh  dengan  rumus  sebagai  berikut:
RSDH = 2 (1-0,5 log C)
di  mana  C  adalah  fraksi  konsentrasi  dari  analit  yang terukur  dalam  sampel.

## Tahap orientasi prosedur  uji
Tahap  orientasi  prosedur  uji  bertujuan  untuk mempersiapkan  larutan  uji  yang  akan  digunakan pada  tahap  validasi.  Tahap  ini  meliputi  dua  tahap utama,  yaitu  ekstraksi  lemak  dan  derivatisasi  asam lemak.
Tahap ekstraksi lemak bertujuan untuk memisahkan  komponen  lemak  dari  matriks  produk pangan.  Proses  ekstraksi  diawali  dengan  pen- campuran  3  g  sampel  donat  yang  telah  dihancurkan dengan 20 mL campuran kloroform (Merck,
Germany)  dan  metanol  (Merck,  Germany)  dengan perbandingan  2:1.  Campuran  dihomogenisasi  meng- gunakan stirrer selama  1  jam  kemudian  disaring dengan  kertas  saring.  Suspensi  hasil  penyaringan diambil  kemudian  ditambahkan  4  mL  NaCl  (Merck, Germany)  0,88%  dan  divorteks.  Setelah  terbentuk dua  lapisan,  lapisan  atas  dibuang  sementara  lapisan bawah  disaring  dengan  kertas  saring  yang  di atasnya  diberi  Na 2 SO 4 anhidrat  (Merck,  Germany). Hasil  penyaringan  dipekatkan  dengan  gas  N 2 teknis (CV.  Krakatau  Raya,  Indonesia)  hingga  mencapai berat  konstan.  Massa  yang  tersisa  setelah  peng- hembusan  dengan  gas  N 2 adalah  ekstrak  lemak  dari sampel  yang  kemudian  disimpan  dalam  botol  gelap di refrigerator.
Tahap  derivatisasi  bertujuan  untuk  mengubah asam  lemak  hasil  hidrolisis  menjadi FAME yang mudah  menguap  agar  dapat  dianalisis  dengan instrumen  KG.  Tahap  ini  diawali  dengan  penimba- ngan  ekstrak  lemak  sebanyak  100,00  mg  dalam tabung  reaksi  bertutup,  yang  dilanjutkan  dengan penambahan  1  mL  larutan  baku  internal  (C17:0) dengan  konsentrasi  1,0  mg/mL  dalam  heksana (Merck,  Germany).  Larutan  dihomogenisasi  dengan vorteks  kemudian  ditambahkan  2  mL  NaOH  (Merck, Germany)  metanolik  0,5  N.  Penambahan  NaOH- metanolik  bertujuan  menghidrolisis  lemak  menjadi asam  lemak.  Larutan  dihomogenisasi  kembali  lalu dihembus  dengan  gas  N 2 selama  60  detik.  Tabung yang  telah  dihembus  ditutup  rapat,  dan  dipanaskan pada  suhu  80°C  selama  5  menit.  Setelah  dipanas- kan,  tabung  didinginkan  pada  suhu  ruang,  kemudian dilakukan  penambahan  2  mL  BF 3 -metanol  yang terdiri  atas  20%  BF 3 (Merck,  Germany)  dalam metanol  (Merck,  Germany).  Tahapan  ini  dilanjutkan dengan  proses  homogenisasi  dan  penghembusan gas  N 2 .  Tabung  dipanaskan  pada  suhu  80°C  selama 30  menit.  Setelah  itu  tabung  didinginkan  di  bawah air  mengalir  hingga  mencapai  suhu  ruang.  Ke- mudian  ke  dalam  larutan  ditambahkan  1,5  mL heksana  dan  3  mL  NaCl  jenuh.  Larutan  dihomogeni- sasi  dengan  vorteks,  kemudian  didiamkan  hingga
terbentuk  dua  lapisan.  Lapisan  atas,  yang  merupa- kan FAME ,  dipipet  dan  dimasukkan  ke  dalam  vial amber  berisi  Na 2 SO 4 anhidrat,  kemudian  disimpan dalam freezer .  Tahap  derivatisasi  ini  dilakukan sebanyak  enam  ulangan,  di  mana  larutan  uji  yang dihasilkan  kemudian  dianalisis  dengan  KG  pada tahap  validasi  metode.

## Tahap validasi metode
Tahap  validasi  metode  bertujuan  untuk  me- ngukur  performa  data  hasil  analisis  dengan  metode AOCS Official  Method Ce1h-05  termodifikasi  untuk senyawa  9t-C18:1  pada  matriks  donat  yang  telah diekstraksi  dan  diderivatisasi.  Parameter  yang  di- ukur  adalah  presisi, akurasi,  dan  spesifisitas.

## Presisi
Validasi  presisi  dilakukan  dengan  melakukan analisis  KG  sesuai  prosedur  AOCS Official  Method Ce1h-05  termodifikasi  terhadap  enam  larutan  uji  dari tahap  orientasi  prosedur  uji  secara  duplo.  Sebanyak 1  µL FAME diinjeksikan  ke  dalam  KG  dengan menggunakan SGE microliter syringe (Sigma Aldrich,  USA)  kapasitas  10  µL.  Kromatogram  hasil analisis  memiliki  waktu  retensi  sebagai  sumbu  x  dan intensitas  sebagai  sumbu  y.  Kuantifikasi  asam lemak  dilakukan  dengan  menggunakan  rumus  per- hitungan  Alx  seperti  tercantum  di  bagian  Tahap Persiapan.  Hasil  analisis  dikatakan  presisi  jika  nilai RSD sampel  kurang  dari  atau  sama  dengan  2/3 RSDH .

## Akurasi
Akurasi  menunjukkan  derajat  kedekatan  hasil analisis  dengan  kadar  analit  sebenarnya.  Validasi akurasi  dilakukan  dengan  metode  penambahan baku  atau  menggunakan  sampel spik e .  Metode  ini dieksekusi  dengan  menambahkan  baku  9t-C18:1 konsentrasi  0,05  mg/mL  ke  dalam  larutan  uji  pada tahap  validasi  presisi.  Baku  9t-C18:1  konsentrasi 0,05  mg/mL  dibuat  dengan  melarutkan  0,1  mL larutan  9t-C18-1  konsentrasi  25  mg/mL  ke  dalam  2,4 mL  heksana,  sehingga  konsentrasinya  menjadi  1 mg/mL.  Kemudian  larutan  hasil  pengenceran  ter- sebut  diambil  sebanyak  25  µL  lalu  dicampurkan dalam  475  µL  sampel,  sehingga  konsentrasinya menjadi  0,05  mg/mL.  Konsentrasi  ini  dipilih  karena ketika  ditambahkan  dalam  sampel,  respon  area yang  dihasilkan  tidak  terlalu  kecil  sehingga  tidak terdeteksi  penambahannya,  ataupun  tidak  terlalu besar sehingga menyebabkan area menyatu
dengan  C18:1  cis.  Akurasi  dinyatakan  sebagai derajat  perolehan  kembali  (rekoveri)  baku  yang ditambahkan  ke  dalam  sampel . Persyaratan  rekoveri berdasarkan  AOAC  (2012)  pada  konsentrasi  10  µg/g adalah 80-115%.

## Spesifisitas
Uji  spesifisitas  dilakukan  untuk  mengetahui kemampuan metode dalam merespon secara khusus  analit  tertentu  tanpa  terpengaruh  oleh komponen  lain  dalam  matriks.  Validasi  spesifisitas dilakukan  dengan  mengukur  nilai  resolusi  (Rs) senyawa  9t-C18:1  pada  baku  eksternal  serta membandingkan  kromatogram  larutan  sampel  dari tahap  validasi  presisi  dengan  kromatogram  larutan sampel spik e dari  tahap  validasi  akurasi.  Spesifisitas metode  analisis  dapat  diterima  jika  nilai  Rs  lebih  dari 1,0,  puncak  setiap  asam  lemak pada  kromatogram terpisah  dengan  baik  dan  penambahan  analit berupa  baku  9t-C18:1  menimbulkan  respon  signi- fikan  pada  kromatogram.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Unjuk  kerja instrumen
Pengecekan  unjuk  kerja  instrumen  diawali dengan  analisis  KG  untuk  larutan  baku  eksternal yang  terdiri  dari  larutan  baku FAME campuran  (C8- C22,  19  asam  lemak)  dan  larutan  baku FAME campuran  isomer  C18:2  (9t,12t-C18:2  (50%);  9c,12t- C18:2  (20%);  9t,12c-C18:2  (20%);  dan  C18:2  cis (10%).  Analisis  ini  dilakukan  untuk  mengetahui waktu  retensi  dan RF setiap  asam  lemak  yang  ada dalam  larutan,  yang  selanjutnya  dapat  digunakan sebagai  acuan  identifikasi  dan  kuantifikasi  asam lemak  dalam  sampel.  Kromatogram  hasil  analisis baku  eksternal  dapat  dilihat  pada  Gambar  1.  Data analisis RF dapat  dilihat  pada  Tabel  4.  Nilai RF seharusnya  berada  pada  kisaran  0,90  sampai  1,00, namun  terjadi  penyimpangan  pada  senyawa  C18:3 dan  C20:0  yang  masing-masing  memberikan  respon luas  area  tidak  normal  sehingga  memiliki  nilai RF 4,0117  dan  0,4427.  Penyimpangan  ini  terjadi  akibat ko-elusi FAME C18:3  dan  C20:1  pada  kolom  SP- 2340  setelah  114  kali  injeksi  yang  ternyata  juga mengakibatkan  penyimpangan  pada  C20:0.  Nilai  ini menyebabkan  data  menyimpang  jika  dimasukkan dalam  kuantifikasi  profil  asam  lemak  untuk  C18:3, C20:0,  dan  C20:1.
Gambar  1.   Kromatogram  baku eksternal

## Tabel  4. Analisis nilai RF
Asam Lemak Luas Area SI Luas Area Asam Lemak Bobot Asam Lemak (mg) Bobot SI (mg) RF C8:0 63877 23437 0,0951 0,1600 1,6200 C10:0 63877 58848 0,1596 0,1600 1,0827 C12:0 63877 134413 0,3277 0,1600 0,9733 C13:0 63877 67374 0,1598 0,1600 0,9466 C14:0 63877 68839 0,1597 0,1600 0,9262 C14:1 63877 38166 0,0948 0,1600 0,9916 C15:0 63877 38609 0,0948 0,1600 0,9803 C16:0 63877 290431 0,6489 0,1600 0,8920 C16:1 63877 143111 0,3196 0,1600 0,8914 C17:0 63877 63877 0,1600 0,1600 1,0000 C18:0 63877 138420 0,3243 0,1600 0,9353 9t-C18:1 63877 41560 0,1298 0,1600 1,2469 C18:1 cis 63877 471457 0,9780 0,1600 0,8282 9t,12t-C18:2 63877 342339 0,6250 0,1600 0,7289 9t,12c-C18:2 63877 121510 0,2500 0,1600 0,8214 9c,12t-C18:2 63877 127217 0,2500 0,1600 0,7845 C18:2 cis 63877 435240 0,7739 0,1600 0,7099 C18:3 63877 31766 0,3192 0,1600 4,0117 C20:0 63877 85497 0,0948 0,1600 0,4427 C20:1 63877 42261 0,0951 0,1600 0,8984 C22:0 63877 41379 0,0952 0,1600 0,9180 C22:1 63877 38133 0,0948 0,1600 0,9925
Fenomena  ini  sesuai  dengan  peringatan  yang tertulis  pada  AOAC  (2000)  terkait  penggunaan kolom  SP-2340.  Karena  keterbatasannya,  metode ini  tidak  diperuntukkan  bagi  sampel  yang  mengan- dung  C18:3,  C20:0,  dan  C20:1.  Pada  tahap  ini  juga dilakukan  evaluasi  untuk  menentukan  linieritas, rentang  kerja,  batas  deteksi  dan  kuantitasi,  serta presisi.  Senyawa  yang  dianalisis  adalah  larutan baku FAME 9t-C18:1  dan FAME campuran  isomer C18:2.  Hasil  uji  linieritas  larutan  baku  9t-C18:1  dan FAME campuran  isomer  C18:2  beserta  rentang konsentrasi  ujinya  dapat  dilihat  pada  Tabel  5.  Kurva linieritas  larutan  baku  9t-C18:1  dapat  dilihat  pada Gambar  2.  Data  simpangan  baku  dan  kemiringan kurva  dari  uji  linieritas  digunakan  untuk  menganalisis LoD dan LoQ masing-masing  senyawa  yang  secara rinci  dapat  dilihat  pada  Tabel  6.  Pada  Tabel  6  juga
ditampilkan  nilai  rentang  kerja  untuk  9t-C18:1,  yaitu sebesar  0,0020  sampai 0,1200  mg/mL.
Gambar  2.   Kurva  linieritas baku  9t-C18:1
C 8 :0
C 1 0 :0 C 1 2 :0 C 1 3 :0 C 1 4 :0 C 1 4 :1 C 1 5 :0 C 1 6 :0 C 1 6 :1 C 1 7 :0 C 1 8 :0 C 1 8 :1 t C 1 8 :1 c 9 t, 1 2 t- C 1 8 :2 9 t, 1 2 c -C 1 8 :2 9 c ,1 2 t- C 1 8 :2 C 1 8 :2 c C 1 8 :3 C 2 0 :0 C 2 0 :1 C 2 2 :0 C 2 2 :1
10 20
30
40 Menit 2500 0 5000 0 7500 0 In te n s ita s y = 473947x - 882,84 R² = 1 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 0.00 0.05 0.10 0.15
Konsentrasi (mg/m L)
50 45 40 35
30 25 20 15 10 5 L u a s A re a x 1 0 0 0
Parameter presisi juga diuji pada  tahap pengecekan  unjuk  kerja  instrumen,  di  mana  larutan baku  9t-C18:1  0,1000  mg/mL  dan  larutan  baku C18:2  0,0250  mg/mL  dari  tahap  validasi  linieritas instrumen  dianalisis  dengan  KG  sebanyak  enam kali.  Data  hasil  analisis  menunjukkan  bahwa  semua data  memiliki RSD kurang  dari  2/3 RSDH ,  sehingga metode  modifikasi  dinyatakan  mampu  menghasilkan data  yang  presisi.  Data  hasil  analisis  presisi  dapat dilihat  pada  Tabel  7.
Tabel  5. Hasil uji linieritas Senyawa Konsentrasi (mg/mL) Persamaan Kurva R 2 9t-C18:1 0,0040-0,1000 y = 473947x – 882,4 1 9t,12t- C18:2 0,00125-0,3750  y = 889122x + 4237,7 0,9999 9t,12c- C18:2 0,0005-0,1500 y = 915416x + 2043,1 0,9999 9c,12t- C18:2 0,0005-0,1500 y = 949792x + 2158,8 0,9999 C18:2 cis 0,00025-0,0750  y = 782406x + 760,66 0,9999

## Orientasi  prosedur  uji
Orientasi  prosedur  uji  merupakan  tahap  pem- buatan  larutan  uji  yang  terdiri  dari  tahap  ekstraksi lemak  dan  derivatisasi  asam  lemak.  Donat  merupa- kan  produk  yang  berpotensi  mengandung  asam lemak  trans  karena  diolah  menggunakan  bahan- bahan  hasil  hidrogenasi  parsial,  seperti  margarin dan  shortening.  Ekstraksi  lemak  metode  Folch dilakukan  pada  10,0494  g  donat  dan  menghasilkan 2,0071  g  lemak,  sehingga  diperoleh  kadar  lemak
donat  sebesar  19,97%.  Ekstrak  lemak  donat kemudian  dihidrolisis  dan  diderivatisasi,  lalu  diencer- kan  sebanyak  20  kali  untuk  dijadikan  larutan  uji pada  tahap  validasi  presisi  dan  akurasi  metode. Pembuatan    larutan  uji  ini  dilakukan  sebanyak  enam ulangan  dengan  metode  AOCS Official  Method Ce 2-66  termodifikasi.  Kromatogram  asam  lemak  dalam sampel  donat  dapat  dilihat pada  Gambar  3.

## Presisi
Data  hasil  validasi  presisi  dapat  dilihat  pada Tabel  8.  Semua  data  memenuhi  persyaratan  presisi dengan RSD kurang  dari  2/3 RSDH ,  baik  untuk kadar  asam  lemak  (mg/g  lemak)  maupun  persen asam  lemak  terhadap  asam  lemak  total,  kecuali untuk  senyawa  C14:0.  Hal  ini  disebabkan  oleh  kadar C14:0  yang  terlalu  rendah  dalam  sampel  sehingga perubahan baseline sedikit  saja  dapat  berpengaruh besar  pada  luas  area.  Berdasarkan  data  yang diperoleh,  asam  lemak  dominan  yang  terkandung dalam  donat  adalah  C16:0  dengan  kadar  180,66 ±2,42  mg/g  lemak  atau  39,50±0,35%  dari  total  asam lemak,  dan  C18:1  dengan  kadar  180,03±3,08  mg/g lemak  atau  39,36±0,26%  dari  total  asam  lemak. Donat  juga  mengandung  asam  lemak  9t-C18:1 sebanyak  33,03±0,59  mg/g  lemak  atau  7,22±0,05% dari  total  asam  lemak.  Dengan  takaran  saji  40  g serta  kandungan  lemak  sebesar  19,97%,  kandu- ngan  asam  lemak  9t-C18:1  dalam  donat  dapat dinyatakan  sebagai  0,26  g/takaran  saji.  Karena mengandung  kurang  dari  0,5  g  ALT/takaran  saji, sesuai  aturan  FDA,  donat  ini  dikategorikan  bukan sebagai  sumber  ALT.
Tabel  6.   Hasil  analisis LoD dan LoQ Senyawa Simpangan Baku (σ) Kemiringan Kurva (S) LoD (mg/mL) LoQ (mg/mL) Rentang Kerja (mg/mL) 9t-C18:1 94,8611 473947,0540 0,0007 0,0020 0,0020-0,1200 9t,12t-C18:2 889,3804 889122,1858 0,0033 0,0100 9t,12c-C18:2 410,6763 915416,2449 0,0015 0,0045 9c,12t-C18:2 421,1015 949792,2860 0,0015 0,0044 C18:2 cis 150,3350 782406,2539 0,0006 0,0019 Tabel  7.   Kuantifikasi  data  presisi baku  9t-C18:1  dan  C18:2 Ulangan 9t-C18:1 0,1000 mg/mL 9t,12t-C18:2 0,0125 mg/mL 9t,12c-C18:2 0,0050 mg/mL 9c,12t-C18:2 0,0050 mg/mL C18:2 cis 0,00125 mg/mL Luas Area Luas Area Luas Area Luas Area Luas Area 1 48595 21962 9845 10326 4088 2 48805 21534 9506 9983 3848 3 48863 21647 9509 10157 3956 4 48604 21964 9618 10078 3985 5 48838 22306 9922 10673 4203 6 48721 21544 9536 10168 3867 Rata-rata 48737,67 21826,17 9656,00 10230,80 3991,17 SD 117,31 304,88 182,44 244,44 135,23 RSD 0,24 1,40 1,89 2,39 3,39
Gambar  3.   Kromatogram  asam lemak dalam  sampel  donat
Tabel  8.   Data  validasi  presisi Asam Lemak mg/g Lemak SD RSD (%) 2/3 RSDH % AL SD RSD (%) 2/3 RSDH C14:0 4,09 0,26 6,40 3,05 0,89 0,05 5,89 2,71 C16:0 180,66 2,42 1,34 1,73 39,50 0,35 0,89 1,53 C18:0 33,92 0,57 1,68 2,22 7,42 0,07 0,89 1,97 Total SFA 218,67 2,92 1,34 1,68 47,82 0,34 0,72 1,49 9t-C18:1 33,03 0,59 1,78 2,23 7,22 0,05 0,72 1,98 C18:1 cis 180,03 3,08 1,71 1,73 39,36 0,26 0,66 1,53 Total MUFA 213,06 3,58 1,68 1,68 46,59 0,26 0,56 1,50 C18:2 cis 25,60 0,57 2,24 2,31 5,60 0,10 1,80 2,06 Total PUFA 25,60 0,57 2,24 2,31 5,60 0,10 1,80 2,06 Total area 457,33 6,27 1,37 1,50 100,00 0,00 0,00 1,33
Keterangan: a SFA= Saturated Fatty Acid (Asam Lem k Jenuh), MUFA= Monounsaturated Fatty Acid (Asam Lemak Tidak Jenuh Tunggal), PUFA= Polyunsaturated Fatty Acid (Asam Lemak Tidak Jenuh Jamak), %AL = % asam lemak dari total asam lemak

## Akurasi
Metode  yang  digunakan  untuk  uji  akurasi adalah  metode  penambahan  baku  atau  mengguna- kan  sampel spik e .  Sampel spik e merupakan  sampel dari  tahap  validasi  presisi  ditambahkan  dengan  baku 9t-C18:1  0,05  mg/mL.  Kadar  9t-C18:1  pada  sampel spik e dibandingkan  dengan  kadar  9t-C18:1  pada sampel  murni,  di  mana  nilai  akurasi  dapat  dinyata- kan  sebagai  persen  rekoveri  kadar  baku  9t-C18:1. Pada  proses  validasi  akurasi,  sebelum  analisis rekoveri,  perlu  dilakukan  penyetaraan  data  antara sampel  dan  sampel spik e .  Penyetaraan  ini  dilakukan dengan  menghitung  luas  area  sampel  bila  luas  area baku  internalnya  sama  dengan  luas  baku  internal pada  sampel spik e .  Data  hasil  penyetaraan  dapat dilihat  pada  Tabel  9.  Setelah  dilakukan  penyetaraan, persen  rekoveri  dapat  dihitung  dengan  memban- dingkan  konsentrasi  baku  terukur  dari  kurva  linieritas dengan  konsentrasi  baku  yang  ditambahkan.  Hasil analisis  rekoveri  (Tabel  10)  menunjukkan  bahwa dari  enam  ulangan  larutan  uji  yang  dianalisis  secara duplo  diperoleh  data  rekoveri  dengan  rata-rata  85,98 ±5,41%  pada  rentang  80,54-94,25%.  Hasil  ini  me- menuhi  persyaratan  rekoveri  pada  konsentrasi  10 µg/g  yaitu 80-115%  (AOAC,  2012).

## Spesifisitas
Uji  spesifisitas  dilakukan  untuk  mengetahui  ke- mampuan  metode  dalam  merespon  secara  khusus
analit  tertentu  tanpa  terpengaruh  oleh  komponen lain  dalam  matriks.  Spesifisitas  yang  baik  dari metode  dapat  dilihat  dari  nilai  resolusi  asam  lemak 9t-C18:1  pada  baku  eksternal  sebesar  1,2,  puncak - puncak  analit  yang  terpisah  pada  kromatogram, serta  respon  peningkatan  luas  area  puncak  9t-C18:1 setelah  penambahan  baku  0,05  mg/mL.  Perbandi- ngan  kromatogram  sampel  dan  sampel spik e dapat dilihat  pada  Gambar  4  dan  Gambar  5.  Hasil  validasi keseluruhan  pada  senyawa  target  9t-C18:1  ditampil- kan pada  Tabel  11.
Keunggulan, keterbatasan dan aplikasi metode Metode modifikasi dari  AOCS  Ce  1h-05 memiliki  keunggulan  dibandingkan  dengan  metode AOCS Ce 1h-05 standar. Disebutkan dalam dokumen  AOCS  Ce  1h-05  bahwa  penggunaan  suhu isotermal  dan  kolom  SP-2560  atau  CP-Sil  88  dapat menyebabkan  ko-elusi  pada  senyawa  C18:1,  C18:3, dan  C20:1  (AOCS,  2005).  Ko-elusi  pada  isomer- isomer  C18:1  sangat  tidak  diharapkan,  karena  selain menjadi  senyawa  target  dalam  validasi  metode  ini, 9t-C18:1  merupakan  ALT  yang  paling  banyak terakumulasi  dalam  produk  pangan.  Fenomena  ko- elusi  pada  senyawa  C18:1  dapat  dihindari  dengan penggunaan  metode  modifikasi  yang  menggunakan kolom  SP-2340  dengan  pengaturan  suhu  kolom terprogram.
C 1 4 :0 C 1 6 :0 C 1 7 :0 C 1 8 :0 C 1 8 :1 t C 1 8 :1 c C 1 8 :2 c 10 20 30 Menit 25000 50000 In te n s ita s
Tabel  9.   Penyetaraan  luas area  antara  sampel dan  sampel spik e Ulangan Sampel Sampel Spike Sampel (Konversi) L. Area SI L. Area 9t-C18:1 Rasio L. Area 9t-C18:1 : SI Rata-rata Rasio L. Area SI L. Area 9t-C18:1 L. Area 9t-C18:1 1 11717 33515 2,8604 2,8817 10815 49480 31166 11689 33934 2,9031 10940 50266 31526 2 13707 35373 2,5807 2,5843 11044 47151 28541 13109 33925 2,5879 11985 49602 30973 3 12140 33859 2,7890 2,8250 11356 52046 32081 11638 33296 2,8610 10824 48780 30578 4 14627 41629 2,8460 2,8039 14208 58131 39837 14134 39034 2,7617 14321 58946 40154 5 15693 41379 2,6368 2,6090 14548 58418 37956 15533 40095 2,5813 14625 59610 38157 6 14911 41140 2,7590 2,7296 14050 59385 38350 14568 39335 2,7001 13469 58161 36765
Keterangan: a Luas area sampel konversi digunakan untuk analisis rekoveri di mana data sampel konversi menjadi luas area 9t-C18:1
Tabel  10.   Analisis rekoveri
Sampel L.area 9t-C18:1 pada Sampel Murni L. area 9t-C18:1 pada Sampel Spike Selisih L.Area Konsentrasi baku 9t-C18:1 terukur (mg/mL) Rekoveri (%) 1 31166 49480 18314 0,0405 81,01 31526 50266 18740 0,0414 82,81 2 28541 47151 18610 0,0411 82,26 30973 49602 18629 0,0412 82,34 3 32081 52046 19965 0,0440 87,98 30578 48780 18202 0,0403 80,54 4 39837 58131 18294 0,0405 80,92 40154 58946 18792 0,0415 83,02 5 37956 58418 20462 0,0450 90,07 38157 59610 21453 0,0471 94,25 6 38350 59385 21035 0,0462 92,49 36765 58161 21396 0,0470 94,02 Rata-rata 85,98 SD 5,41 Rentang 80,54-94,25 Tabel  11.   Hasil validasi  metode  pada  senyawa  9t-C18:1 Parameter Data/Rerata SD RSD (%) 2/3 RSDH Persyaratan Linieritas R 2 = 1 R 2 > 0,990 (AOAC,  2012) Rentang kerja (mg/mL) 0,0020-0,1200 Presisi (mg/g) 33,03 0,59 1,78 2,23 RSD < 2/3 RSDH (ICH, 2005) Presisi (%AL) 7,22 0,05 0,72 1,98 RSD < 2/3 RSDH (ICH, 2005) Rekoveri (%) 80,54-94,25 5,41 6,29 10 µg/g, 80-115% (AOAC,  2012) Spesifisitas Rs = 1,2 LoD (mg/mL) 0,0007 LoQ (mg/mL) 0,0020
Metode  modifikasi  juga  memiliki  keterbatasan yang  terkait  dengan  peristiwa  koelusi.  Setelah  114 kali  injeksi,  ditemukan  bahwa  terjadi  ko-elusi senyawa  C18:3,  C20:0,  dan  C20:1  yang  ditandai dengan  penyimpangan  nilai  RF  pada  kuantitasi  baku eksternal  (Tabel  5).  Temuan  ini  menjadi  pembatas penggunaan  metode,  di  mana  penggunaan  metode ini  tidak  dianjurkan  untuk  sampel  yang  mengandung C18:3,  C20:0,  dan  C20:1.  Meskipun  demikian,  bila
dibandingkan dengan  metode  standar,  metode modifikasi  ini  dinilai  lebih  implementatif  untuk identifikasi  profil  ALT,  karena  tidak  dibatasi  untuk sampel  yang  mengandung  9t-C18:1  sebagai  produk ALT  utama  pada  produk  pangan.
Mengingat  karakteristik  kolom  SP-2340  yang rentan  terhadap  kontaminasi,  perawatan  kolom menjadi  faktor  penting  dalam  mempertahankan performa  data  analisis  dan  memperpanjang  umur
kolom.  Berdasarkan  pengalaman  selama  penelitian, disusunlah  beberapa  poin  prosedur  operasi  standar untuk  memaksimalkan  umur  dan  performa  kolom:  1) Kolom harus melalui tahap  pemanasan  atau conditioning setiap  hari,  satu  jam  di  awal  sebelum injeksi  sampel  pertama  dan  satu  jam  di  akhir sesudah  injeksi  sampel  terakhir;  2).  Sebaiknya dalam  satu  hari  tidak  diinjeksi  lebih  dari  6  sampel. Jika  harus  lebih  daripada  jumlah  tersebut,  setiap injeksi  2  sampel,  proses  diselingi  dengan  injeksi heksana  yang  bertujuan  memberi  jeda  waktu  antar sampel  sehingga  kolom  tidak  jenuh;  3)  Kolom  harus dipanaskan  selama  12-24  jam  satu  kali  seminggu. Hal  ini  dilakukan  untuk  membersihkan  sekaligus meregenerasi  kolom  secara  periodik,  sehingga  laju penurunan  performa  kolom  dapat  dihambat;  4) Untuk  meminimalkan  kontaminasi  sampel  pada injektor,  dilakukan  penggantian  septum  setiap  injeksi 30  sampel;  5)  Untuk  menjamin  bahwa  kuantifikasi data  dari  kromatogram  sesuai  dengan  kondisi  terkini kolom,  baku  eksternal  sebaiknya  diinjeksi  secara periodik  setiap  10 sampel.
Gambar  4.  Kromatogram asam lemak dalam sampel  donat
Gambar  5.  Ko-kromatogram  asam  lemak  dalam sampel donat  dengan  penambahan baku  9t-C18:1  0,05 mg/mL

## KESIMPULAN
Hasil  validasi  menunjukkan  bahwa  metode Folch  dapat  digunakan  untuk  ekstraksi  lemak, AOCS  Official  Method  Ce  2-66  termodifikasi  dapat digunakan  untuk  derivatisasi  asam  lemak,  serta AOCS Official  Method Ce  1h-05  termodifikasi  dapat digunakan untuk analisis  KG  di  laboratorium SEAFAST  untuk  menganalisis  profil  asam  lemak, termasuk  komponen  asam  lemak  trans  pada  bahan pangan.  Hasil  validasi  instrumen  telah  memenuhi kriteria  linieritas  dan  presisi  untuk  senyawa  9t-C18:1 dan  C18:2  (9t,12t-C18:2;    9t,12c-C18:2,  9c,12t- C18:2,  dan  9c,12c-C18:2)  pada  rentang  kerja  yang telah  ditentukan.  Validasi  metode  dilakukan  untuk analisis  senyawa  9t-C18:1  dalam  100  mg  ekstrak lemak  donat.  Hasil  validasi  menunjukkan  bahwa metode modifikasi tervalidasi untuk parameter spesifisitas,  presisi  dan  akurasi  dengan  data spesifisitas  (Rs  =  1,2),  presisi  ( RSD kadar  asam lemak    1,78%; RSD persen  asam  lemak  terhadap asam  lemak  total  0,72%)  dan  akurasi  (persen rekoveri)  80,54-94,25%.  Hasil  analisis  profil  asam lemak  donat  menunjukkan  bahwa  asam  lemak dominan  yang  terkandung  dalam  donat  adalah C16:0  dengan  kadar  180,66  ±  2,42  mg/g  lemak  atau 39,50±0,35%  dari  total  asam  lemak,  dan  asam lemak  C18:1  dengan  kadar  180,03±3,08  mg/g  lemak atau  39,36±0,26%  dari  total  asam  lemak.  Donat  juga mengandung  asam  lemak  9t-C18:1  dengan  kadar 33,03±0,59  mg/g  lemak,  7,22±0,05%  dari  total  asam lemak, atau  0,26 g/takaran  saji.

## DAFTAR PUSTAKA
[AOAC]  Association  of  Official  Agricultural  Chemists. 2012.  Official  Methods  of  Analysis,  Appendix  K: Guidelines  for  Single  Laboratory  Validation  of Chemical  Methods  for  Dietary  Supplements  and Botanical. 19th edition, p.1-17. AOAC International,  Gaithersburg,  MD.
[AOAC]  Association  of  Official  Agricultural  Chemists , Official  Method.  2000.  AOAC  Official  Method 996.06:  Fat  (Total,  Saturated,  and  Unsaturated) in  Foods.  18th  Edition,  p.  20 –24.  Official
Methods  of  Analysis of AOAC International. [AOCS] meric n  Oi   Chemist’s   ociety,  Offici Method.  2005.  AOCS  official  method  Ce  1h-05: Determination of cis-, trans-, Saturated, Monounsaturated  and  Polyunsaturated  fatty acids  in  Vegetable  or  Non-Ruminant  Animal Oils  and  Fats  by  Capillary  Gas-Liquid  Chro- matography.  Sampling  and  Analysis  of  Com- mercial  Fats and Oils, p. 1-29.
[AOCS] meric n  Oi   Chemist’s   ociety,  Offici Method.  1997.  AOCS  official  method  Ce  2-66: Preparation  of  Methyl  Esters  of  Fatty  Acids.
C 1 4 :0 C 1 6 :0 C 1 7 :0 C 1 8 :0
C 1 8 :1 t C 1 8 :1 C is C 1 8 :2 C is Menit 20 30 10000 20000 In te n s ita s In te n s ita s 10000 20000 Menit 20 30 C 1 8 :0 C 1 4 :0
C 1 6 :0 C 1 7 :0
C 1 8 :1 t C1 8: 1C is C1 8: 2 Ci s
Sampling  and  Analysis  of  Commercial  Fats  and Oils, p. 1-2.
De  Souza  RJ,  Mente  A,  Maroleanu  A,  Cozma  AI,  Ha V,  Kishibe  T,  Uleryk  E,  Budylowski  P, Schunemann  H,  Beyene  J,  Anand  SS.  2015. Intake  of  saturated  and  trans  unsaturated  fatty acids and risk of all cause mortality, cardiovascular  disease,  and  type  2  diabetes: Systematic review and meta-analysis of observational studies. BMJ (Online) 351: h3978:  1-16.  DOI:  10.1136/bmj.h3978.
Delmonte  P,  Rader  J.  2007.  Evaluation  of  gas chromatographic  methods  for  the  determination of  trans  fat.  Anal    Bioanal  Chem  389:  77-85. DOI:  10.1007/s00216-007-1392-y.
Folch  J,  Lees  M,  dan  Sloane-Stanley  GH.  1957.  A simple  method  for  the  isolation  and  purification of  total  lipids  from  animal  tissues.  J  Bio  Chem 226:  497-509.
Gebauer  SK,  Destaillats  F,  Dionisi  F,  Krauss  RM, Baer  DJ.  2015.  Vaccenic  acid  and  trans  fatty acid  isomers  from  partially  hydrogenated  oil both  adversely  affect LDL cholesterol:  A double-blind,  randomized  controlled  trial.  Am  J Clin  Nutr   102:  1339-1346.  DOI: 10.3945/ajcn. 115.116129.
Ganguly  R,  Pierce  GN.  2015.  The  toxicity  of  dietary trans  fats.  Food  Chem  Toxicol  78:  170-176. DOI:  10.1016/j.fct.2015.02.004.
Hamilton  M,  Hopkins  LE,  AlZahal  O,  MacDonald  TL, Cervone  DT,  Wright  DC,  McBride  BW,  Dyck  DJ. 2015.  Feeding  butter  with  elevated  content  of trans-10,  cis-12  conjugated  linoleic  acid  to obese-prone  rats  impairs  glucose  and  insulin tolerance.  Lipids  Health  Dis  14:  119  DOI: 10.1186/s12944-015-0122-2.
Harvey  KA,  Arnold  T,  Rasool  T,  Antalis  C,  Miller  SJ,
Siddiqui  RA . 2008.  Trans ‑ fatty  acids  induce  pro ‑ inflammatory  responses  and  endothelial  cell dysfunction.  Br J Nutr  99: 723 –731.
Hunter  JE,  Zhang  J,  Kris-Etherton  PM.  2010. Cardiovascular  disease  risk  of  dietary  stearic acid  compared  with  trans,  other  saturated,  and unsaturated  fatty  acids:  A  systematic  review. Am J Clin  Nutr   91: 46-63.
[ICH]  International  Conference  on  Harmonisation  of Technical  Requirements  for  Registration  of Pharmaceuticals for Human Use. 2005.
Validation  of  Analytical  Procedures:  Text  and Methodology  Q2(1).http://www.ich.org/fileadmin /Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Qu ality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline. pdf
[28 Januari  2015].
Kavanagh  K,  Jones  KL,  Sawyer  J,  Kelley  K,  Carr  JJ,
Wagner  JD.  2007.  Trans  fat  diet  induces
abdominal  obesity  and  changes  in  insulin sensitivity  in  monkeys.  Obesity  (Silver  Spring) 15: 1675-1684.
Magnusson,  Ornemark  U.  2014.  Eurachem  guide: The  fitness  for  purpose  of  analytical  methods-a laboratory  guide  to  method  validation  and related  topics,  (2nd  ed.  2014).  ISBN  978-91- 87461-59-0. p.27-28. https://www.eurachem. org/images/stories/Guides/pdf/MV_guide_2nd_ ed_EN.pdf.  [10  Januari  2015].
Merchant  AT,  Kelemen  LE,  de  Koning  L,  Lonn  E, Vuksan  V,  Jacobs  R.  2008. Share  and  Share ‑ AP  investigators:  Interrelation  of  saturated  fat, trans  fat,  alcohol  intake,  and  subclinical atherosclerosis.  Am J Clin  Nutr  87: 168 –174.
Sartika  RAD.  2008.  Pengaruh  asam  lemak  jenuh, tidak  jenuh  dan  asam  lemak  trans  terhadap kesehatan . J  Kesehatan  Masyarakat  Nasional 2: 154-160.
Siri-Tarino  PW,  Sun  Q,  Hu  FB,  Krauss  RM.  2010. Meta-analysis  of  prospective  cohort  studies evaluating  the  association  of  saturated  fat  with cardiovascular  disease.  Am  J  Clin  Nutr  91:  535- 546.  DOI:  10.3945/ajcn.2009.27725.
Song  J,  Park  J,  Jung  J,  Lee  C,  Gim  SY,  Ka  H,  Yi B,
Kim  MJ,  Kim  CI,  Lee  JH.  2015.  Analysis  of trans  fat  in  edible  oils  with  cooking  process . Toxicol  Res  31:  307-312.  DOI:  10.5487/TR. 2015.31.3.307.
Stachowska  E,  Jamiol  D,  Chlubek  D.  2010.  Trans fatty  acids  and  their  role  in  inflammation  and cardiovascular  disease.  Ann  Acad  Med  Stetin 56: 30-38.
Sun  Q . 2007.  Comparison  between  plasma  and erythrocyte  fatty  acid  content  as  biomarkers  of fatty  acid  intake  in  US  women.  Am  J  Clin  Nutr 86: 74 –81.
Vahmani  P,  Meadus  WJ,  Turner  TD,  Duff  P,  Rolland DC,  Mapiye  C,  Dugan  MER.  2015.  Individual trans  18:1  isomers  are  metabolised  differently and  have  distinct  effects  on  lipogenesis  in  3T3- L1  adipocytes.  Lipids  50:  195-204.  DOI: 10.1007/s11745-014-3982-8.
Xu  J,  Eilat ‑ Adar  S,  Loria  C,  Coldbourt  U,  Howard BV,  Fabsitz  RR.  2006.  Dietary  fat  intake  and risk  of  coronary  heart  disease:  the  strong  heart study . Am J Clin Nutr  84: 894 –902.
Zhang  Q,  Qin  W,  Lin  D,  Shen  Q,  Saleh  ASM.  2015.
The  changes  in  the  volatile  aldehydes  formed during  the  deep-fat  frying  process.  J  Food  Sci Technol  52:  763-769.  DOI:  10.1007/s13197- 015-1923-z.