## ISOLASI MIKROBA DARI AIR ASAM TAMBANG PADA AREA PERTAMBANGAN TEMBAGA DI PULAU WETAR, PROVINSI MALUKU
Isolation of Microbes from Mine Acid Water on Copper Mine Area in Wetar Island, Maluku Province
Yusthinus T. Male 1, *, Deddy W.S. Modok 1 , Cecilia A. Seumahu 2 , Dominggus Malle 3
1 Department of Chemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences Pattimura University, Kampus Poka, Jl. Ir. M. Putuhena, Ambon 97134
2 Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences Pattimura University, Kampus Poka, Jl. Ir. M. Putuhena, Ambon 97134
3 Department of Animal Husbandry, Faculty of Agriculture Pattimura University, Kampus Poka, Jl. Ir. M. Putuhena, Ambon 97134
*Corresponding author, e-mail: yusmale@fmipa.unpatti.ac.id
Received: Dec. 2018 Published: Jan. 2019

## ABSTRACT
This  research    was  conducted  to  find  bacteria  from  the  genus Acidithiobacillus which  isolated  from  mine  acid water  in  the  copper  mining  area  on  Wetar  Island,  Maluku  Province.  This  bacterium  will  be  utilized  in  the biohidrometallurgical  process  (bioleaching)  for  copper  extraction  in  mining  area.  The  results  of  this  study indicate  that  bacteria  can  be  isolated  from  mine  acid  water  samples  by  enrichment  method  that  was  use  liquid media from Leathen which is optimized using Trypton Soya Broth (TSB) and bacterial growth on solid media. The  presence  of Thiobacillus  sp bacteria  was  confirmed  by  the  results  of  gene  analysis  using  a  16S  rRNA sequence showing the presence of mixed bacterial colonies but not a single colony.
Keywords : Bacteria, acid mine water, Thiobacillus sp., copper,bioleaching, Wetar Island.

## PENDAHULUAN
Indonesia dikenal memiliki potensi sumberdaya  tambang yang  besar  dengan beragam jenis bahan tambang yang tersebar dari Sabang  Sampai  Merauke.  Kawasan  Timur Indonesia,  khususnya  Papua  dan  Kepulauan Maluku  banyak  mengandung  deposit  tembaga yang  potensial.  Untuk  Propinsi  Maluku,  deposit terbesar  terdapat  di  Pulau  Wetar,  Kab.  Maluku Barat Daya.
Dewasa  ini,  tantangan  investasi  di  sektor pertambangan  semakin  berat  untuk  daerah- daerah  yang  memiliki  cadangan  tembaga  yang relatif  kecil.  Investor  tidak  tertarik  karena menghadapi  banyak  kendala,  diantaranya  nilai keekonomian cadangan, ketidak-jelasan pengaturan kewenangan penanganan sumberdaya mineral  di  era  otonomi  daerah,  diperlukan peralatan  yang  kapasitasnya  besar  sehingga memerlukan  modal  yang  besar  pula (Sudarsono, 2003).  Mencermati  hal  di  atas,  diperlukan terobosan  teknologi  pertambangan,  khususnya eksplorasi  tembaga  sehingga  deposit  tembaga yang relatif kecil di daerah dapat di
dimanfaatkan  secara  optimal  dan  berkelanjutan oleh  perusahaan  lokal,  dengan  memperhatikan lingkungan sosial, fisik dan biologi.
Telah lama diketahui bahwa mikroorganisme berperan dalam pelarutan logam sulfida, tatapi baru pada tahun 1947, Colmer dan Hinkle  berhasil  mengisolasi  bakteri  genus Acidithiobacillus  ferrooxidans dan Thiobacillus thiooxidans dari air tambang asam. Sejak periode 1950-1980,  teknologi  biohidrometalurgi  atau bioleaching telah  dijadikan  pilihan  utama  untuk pemisahan  tembaga  dan  logam  lainnya  dari pembuangan (damps) atau dari mineral berkadar rendah.  Jika  dilihat,  proyek  biohidrometalurgi besar yang sukses justru berada di negara-negara berkembang. Hal ini dimungkinkan karena selain negara-negara  berkembang  banyak  memiliki cadangan  mineral,  teknologi  biohidrometalurgi cocok  dikembangkan  karena  mudah  serta biayanya ringan (Acevedo, 2002).
Bioleaching merupakan  suatu  proses  untuk melepaskan  atau  mengekstraksi  logam  dari mineral atau sedimen dengan bantuan organisme hidup  atau  untuk  mengubah  mineral  sulfida
sukar  larut  menjadi  bentuk  yang  larut  dalam  air dengan memanfaatkan
mikroorganisme.
Bioleaching menyebabkan proses asidifikasi dan kelarutan logam berat, sehingga proses bioleaching  menjadi  metode  yang  menjanjikan untuk  menghilangkan  logam  berat  dari  sedimen atau  lingkungan  terkontaminsasi  (Chen  and  Lin, 2001.  Bakteri Acidithiobacillus  ferrooxidans memiliki  kemampuan  untuk  melarutkan  logam berat  dan  telah  lama  digunakan  pada  proses bioleaching tembaga dan emas. Selain itu bakteri A.  ferrooxidans mampu  melarutkan  sulfide logam  (MS)  menjadi  ion  sulfat  (SO 4 2- )  dan  ion logam  senyawa  logam  sulfat  (MSO 4 ).  Dari proses  tersebut  logam  dapat  dipisahkan  dan diperoleh kembali secara bioleaching (Pradhan et al. , 2008).
Pada  penelitian  ini,  akan  dilakukan  studi jenis  koloni/genus  dari  mikroba  yang  secara alamiah terdapat pada area penambangan, kolam bekas tambang (cair) serta limbah padat (tailing) tembaga  untuk  menemukan  bakteri  turunan (strain) Acidithiobacillus ) ferrooxidans isolat lokal.  Lokasi  pengambilan  sampel  adalah  area penambangan  PT.  Batutua  Tembaga  Raya,  di Pulau Wetar, Kab. Maluku Barat Daya, Provinsi Maluku.  Isolat  lokal  digunakan  karena  diduga bahwa  genus Acidithiobacillus  ferrooxidans isolat lokal telah mengalami mutasi dan adaptasi sehingga  lebih  sesuai  untuk  daerah  tambang tersebut.
Media  yang  digunakan  dalam  isolasi  ini adalah  media  cair  dari  Leathen et  al .  (1956) dalam Putro (2008), karena media ini merupakan media yang paling optimum untuk menumbuhkan  bakteri Thiobacillus  sp .  Hal  ini terjadi karena kandungan besi Fe 2+ Fe 3+ pada media ini optimal (1 g per liter). Keadaan inilah diduga  menyebabkan  isolat-isolat  bakteri  lebih mampu  menyesuaikan  diri  pada  media  tumbuh tersebut.  Media  Leathen  ini  digunakan  karena lebih  mudah  menekan  terjadinya  oksidasi  besi secara  kimia  karena  semakin  tinggi  kandungan besi  ferronya  maka  kemungkinan  terjadinya oksidasi  secara  kimia  juga  semakin  besar (Nurseha, 2000).

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat Penelitian
Pengambilan sampel dilakukan pada delapan) titik  sampel  (kode  sampel:  A1,  A2,A3, B1,B2,B3,  C1dan  C2)  pada  areal processing heap  leach pertambangan  tembaga  Lurang Kecamatan  Wetar  Utara  (Gambar  1).  Proses isolasi dan identifikasi dilakukan di Laboratorium  Mikrobiologi  Jurusan  Biologi FMIPA Universitas Pattimura Ambon.

## Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah: Sampel  Air  asam  tambang,  Alkohol  95%, spirtus, kapas, akuades, FeSO 4 .7H 2 O ( E. Merck ), (NH 4 ) 2 SO 4 ( E.  Merck ),  K 2 HPO 4 ( E.  Merck ), MgSO 4 .7H 2 O  ( E.  Merck ),  KCl  ( E.  Merck ), Ca(NO 3 ) 2 ( E.  Merck ),  Agar  2%  dan Tryptone Soya Broth (TSB).

## Alat
Alat-alat  yang  digunakan  adalah:  Alat-alat gelas  ( pyrex ),  spatula,  botol  sampel  polietilen, Autoklaf  (TOMY  ES-215),  Inkubator  Shaker (SHEL  LAB),  Bunsen, Hot  plate ( cimarec  2 ), timbangan  analitik  ( Adventure  Pro,  OHAUS ), LAF  ( Laminar  Air  Flow )  (Lab Culture  class  II Type  B  ESCO ),  GPS  ( Global  Positioning System ), dan Sekuensi 16S rRNA.

## Penyiapan media
Pada penelitian ini digunakan media cair 9K dari  Leathen  dkk . (1956) dalam Putro  (2008) dengan pH 3,5. Komposisi media disajikan pada Tabel 1.
Semua  bahan  tersebut  dicampurkan  ke dalam  800  mL  akuades  kecuali  FeSO 4 .7H 2 O, diaduk  dan  disterilkan  pada  suhu  121˚C kemudian  didinginkan.  Untuk  FeSO 4 .7H 2 O, dipersiapkan  akuades  yang  telah  steril  dan  telah ditetapkan  pHnya  ,  yaitu  pH  3,5,  sebanyak  200 mL,  setelah  itu  dimasukkan  FeSO 4 .  7H 2 O  dan dipanaskan sampai suhu 50˚C, lalu didinginkan. Kedua  larutan  dicampur  secara  aseptik.  Media kemudian  dibagi-bagi  ke  dalam  tabung  isolasi yang telah disterilkan.

## Isolasi bakteri dari air asam tambang
Isolasi  mikroba/bakteri  dilakukan  dengan cara  memasukkan  10  mL  sampel  Air  Asam    ke dalam  media  steril  yang  langsung  diinkubasi. Medium  isolasi  yang  digunakan  berupa  medium cair  yang  selektif  untuk  pertumbuhan  bakteri, yaitu  media  9K.  Media  tersebut  kemudian diinkubasi pada suhu kamar dengan cara dikocok dengan menggunakan shaker 250 rpm, selanjutnya  disimpan  pada  ruangan  yang  tidak terlalu  banyak  cahaya.  Apabila  telah  terjadi perubahan  warna  menjadi  kuning  atau  kuning karat,  maka  di  dalam  sumber  tersebut  diduga terdapat Thiobacillus sp.

## Tabel 1. Komposisi Medium Cair (tiap 800 ml)
Bahan Medium T. ferrooxidans (9K) K 2 HPO 4 0,15 gram
(NH 4 ) 2 SO 4 0,01 gram
Ca(NO 3 ) 2 0,01 gram
MgSO 4 .7H 2 O 0,50 gram KCl 0.05 gram FeSO 4 . 7H 2 O 1,00 gram
Sumber: (Nurseha, 2000 dalam Putro, 2008)
Karakterisasi bakteri Thiobacillus sp. Setelah isolat diperoleh maka perlu dilakukan  pemindahan  isolat  dari  media  cair  ke media  padat  yang  selektif.  Pemindahan  isolat dari media cair ke media padat dilakukan dengan cara  memasukkan  media  agar  yang  telah dipersiapkan  sebanyak  10  mL  ke  dalam  cawan petri  yang  sudah  steril.  Isolat  pada  medium  cair tersebut  kemudian  disebar  sebanyak  200  μm  ke
atas media padat yang telah disiapkan, kemudian diinkubasi  sampai  terbentuk  koloni  dari  bakteri yang diinginkan. Pengamatan mikroskopis dengan  menggunakan  mikroskop  dilakukan setelah  koloni  terbentuk,  kemudian  dianalisis untuk mengetahui morfologi dan sifat-sifat yang melekat  pada  bakteri  tersebut.  Komposisi  media agar (padat) disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Komposisi Media Padat (agar)
tiap 800 mL Bahan Medium T. ferrooxidans (9K) K 2 HPO 4 0,15 g
(NH 4 ) 2 SO 4
0,01 g Ca(NO 3 ) 2. 0,01 g MgSO 4 .7H 2 O 0,50 g KCl 0.05 g FeSO 4 . 7H 2 O 1,00 g Agar 12,00 g
Sumber  :  Leathen  dkk.  (1956)  dalam  Putro (2008)
Isolat yang sudah tumbuh pada media padat ini  kemudian  dapat  dipergunakan  selain  untuk pemurnian  isolat  pada  medium  yang  sama  juga digunakan  untuk  pewarnaan  gram diferensial . Pewarnaan  gram diferensial bertujuan  untuk melihat  bakteri  secara  mikroskopik  dengan bantuan  mikroskop  untuk  membedakan  antara bakteri gram positif dengan bakteri gram negatif. Karakterisasi dari bakteri yang telah didapatkan, dilakukan  setelah  mendapatkan  hasil  dari pewarnaan gram diferensial tersebut. Selanjutnya identifikasi  dilakukan  di  PT.  Genetika  Sains
Gambar 1. Peta pulau Wetar dan lokasi pengambilan sampel
Jakarta  dengan  menggunakan  sekuensi  gen  16s rRNA.

## HASIL PENELITIAN
Isolasi Bakteri dari Air Asam Tambang Isolasi  bakteri  dilakukan  pada  delapan sampel  air  asam  dari  tiga  lokasi  yang  berbeda dengan perlakuan yang sama yaitu menumbuhkan  mikroba Thiobacillus sp. Dari kedelapan  sampel, terlihat  bahwa  sampel A 1 ,A 2 ,  dan  A 3 memiliki  hasil  yang  lebih bagus.  Hal  ini  ditandai  dengan  berubahnya warna  media  cair  tersebut  dari  warna  hijau muda menjadi kuning keruh yang menandakan keberadaan bakteri Thiobacillus sp.  (Putro,  2008).  Hasil  ini  sesuai  dengan lokasi pengambilan sampel A tepat di lokasi Intermediet  Leach  Solution  ( ILS).  Dari ketiga  sampel  tersebut  kemudian  dipilih sampel  A 1 yang  menunjukkan  pertumbuhan yang paling bagus,  namun setelah dilakukan penyebaran  media  cair  diatas  media  padat ternyata hasilnya tidak begitu baik dikarenakan  media  cair  ini  mengandung sedikit  bahan  organik  sebagai  nutrisi  dan oksigen agar berlangsungnya reaksi aerob.
Gambar 2. Hasil inkubasi sampel A pada media padat
Thiobacillus
tergolong bakteri kemoautotrof,  yang  mana  proses  metabolisme bakteri  ini  memanfaatkan  energi  dari  reaksi kimia  untuk  membuat  makanan  sendiri  dari bahan  organik  dan  juga  menggunakan  bahan kimia  dari  oksidasi  molekul  organik  untuk menyusun makanannya, perlu dilakukan modifikasi  pada  media  cair  untuk  mendapatkan hasil  yang  lebih  baik.  Pada  proses  modifikasi media  cair,  disiapkan  media  cair  yang  baru
dengan komposisi yang sama kemudian ditambah Trypton  Soya  Broth (TSB)  sebagai penyedia  asam  amino  dan  substansi  nitrogen lainnya  sebagai  penambah  nutrisi  pada  media untuk pertumbuhan mikroba. Hasil inkubasi dari sampel tersebut dapat dilihat pada Gambar 2.
Isolat-isolat  bakteri  pada  media  cair kemudian  dipipet  200  µL  di  atas  media  padat yang  komposisinya  sama  dengan  media  cair, namun  ada  penambahan  agar  sebanyak  2% kemudian  diinkubasi  sampai  terbentuk  koloni dari  bakteri  yang  diinginkan.Hasil  penumbuhan isolat  bakteri  dari  media  cair  ke  media  padat dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Hasil pertumbuhan isolat bakteri pada media padat
Isolat  bakteri  yang  dapat  tumbuh  pada media cair belum tentu dapat tumbuh pada media padat,  dalam  hal  ini  media  agar.  Bakteri  yang diisolasi adalah bakteri asidofi yang membutuhkan senyawa anorganik untuk pertumbuhan  dan  perbanyakan,  bukan  pada senyawa organik seperti agar (Nurseha, 2000).

## Analisis gen 16S rRNA
Hasil  inkubasi  media  padat  menunjukkan ada  koloni  yang  diduga  adanya  pertumbuhan bakteri.  Hasil  ini  kemudian  digores  dan dicampurkan  dengan  garam  fisiologi  dan disentrifuge agar campuran homogen. Campuran homogen  tersebut  dipipet  ke  dalam  FTA Card dan  dianalisis  untuk  mencari  identitas  koloni bakteri. Hasil analisis gen menggunakan sekuensi 16S rRNA dapat dilihat pada Gambar 4.
Hasil  analisis  gen  16S  rRNA  mununjukan bahwa  koloni  bakteri  bukan  berasal  dari  koloni tunggal.    Pada  penelitian  ini  dilakukan  metode isolasi  bakteri  dengan  cara  pengayaan  bakteri yang  umumnya  cocok  untuk  sampel  air  asam. Bakteri Thiobacillus kebanyakan  terdapat  pada
sedimen  yang  bisa  dilakukan  dengan  metode tidak  langsung,  sedangkan  untuk  memperoleh Thiobacillus yang terdapat dalam air asam dapat dilakukan isolasi secara langsung ditempat, yaitu metode  pengisolasian  mikroorganisme  secara langsung  dari  sampel  dengan    proses  pengayaan terlebih  dahulu.  Isolasi  tersebut  dapat  didahului dengan  pengenceran  atau  tidak.  Metode  tidak langsung  adalah  metode  yang  dilakukan  untuk meningkatkan  jumlah  mikroorganisme  yang diinginkan  sehingga  menjadi  lebih  banyak daripada mikroorganisme lainnya dalam inokulum asli (Casida, 2001).
Gambar 4. Hasil sekuensi
Dari hasil analisis gen 16S  rRNA menunjukkan  bahwa  koloni  yang  diperoleh masih  berupa  koloni  campuran  dan  bukan berasal dari koloni tunggal. Terbentuknya koloni bakteri  merupakan  tanda  bahwa  bakteri  mampu hidup pada media padat tersebut dengan ciri-ciri membentuk  koloni  karat  di  permukaan  media, berlendir dan mencembung di permukaan media agar.
Pada  penelitian  ini,  sampel  yang  dianalisis menggunakan  sekuensi  gen  16S  rRNA  tidak dapat  dilanjutkan  untuk  mendapatkan  koloni tunggal.  Hal  ini  karena  bakteri  yang  terdapat dalam  sampel  tersebut  tidak  dikultur  untuk waktu  yang  lama.  Dengan  demikian  jumlah nutrisi yang tersedia tidak lagi dapat mendukung pertumbuhan  bakteri  ataupun  karena  akumulasi produk    samping  metabolisme  yang  bersifat toksik.  Pada  kondisi  ini  laju  kematian  bakteri lebih  besar  dari  pada  laju  pertumbuhan  bakteri sehingga  jumlah  populasi  bakteri  jauh  menurun (Kamil, 2008).

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah dilakukan  dapat  disimpulkan  bahwa  bakteri Thiobacillus sp.  dapat  diisolasi  dari  sampel  air asam  tambang  dengan  metode  pengayaan  yaitu menggunakan  media  cair  dari  Leathen  yang dioptimalkan menggunakan Trypton Soya Broth (TSB)  dan  dilakukan  penumbuhan  bakteri  pada media padat. Keberadaan bakteri Thiobacillus sp. dipastikan dengan hasil analisis gen menggunakan sekuensi 16S rRNA yang menunjukkan  ada  aktifitas  koloni  bakteri campuran dan bukan merupakan koloni tunggal.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  Lembaga  Penelitian dan  Pengabdian  Kepada  Masyarakat  (LP2M) Universitas  Pattimura  yang  telah  membiayai penelitian ini melalui kegiatan Penelitian Produk Unggulan  Daerah  Tahun  2017  dengan  nomor kontrak: 08.74.2H/SPK-PJ/UN13-PPBJ/PUD- LP2M/2017

## DAFTAR PUSTAKA
Acevedo,  F.,  2002,  Present  and  Future  of Bioleaching  in  Developing  Countries, Electronic  Journal  of  Biotechnology, 5(2), 196-199.
Casida  J.L.E.,  2001, Industrial  Microbiology , New Age Int. Ltd. Pub. New Delhi.
Chen,  S-Y,  Lin,  J-G.,  2001,  Bioleaching  of
Heavy Metals from Sediment: Significance  of  pH, Chemosphere, 44(5), 1093-1102. Kamil, I., 2008, Pemanfaatan Bakteri
Thiobacillus  thioparus untuk  Mendegradasi Kandungan  Sulfur  dalam  Gas  Alam., Skripsi , Departemen Teknik Kimia, Fakultas  Teknik,  Universitas  Indonesia, Jakarta.
Nurseha, 2000, Isolasi dan Uji Aktivitas Bakteri
Asidofilik Pengoksidasi Besi dan Sulfur dari Ekosistem Air Hitam, Tesis, Program Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Pradhan,  N.,  Nathsarma,  K.C.,  Rao,  K.S.,
Sukla,  L.B,  Mishra,  B.K.,  2008,  Heap Bioleaching of Chalcopyrite: A Review, Mineral Engineering, 21(5), 355-365
Putro, B. I. K. E., 2008. Isolasi dan Karakterisasi Thiobacillus  ferrooxidans dari  Berbagai Jenis  Tanah, Skripsi, Departemen  Ilmu
Tanah  Dan  Sumberdaya Lahan,  Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Sudarsono, A.S., 2003, Pengantar Pengolahan  dan  Ekstraksi  Biji  Emas. Departemen Pertambangan ITB, Bandung.