## KEDELAI HITAM (
Glycine soja ) TERHIDROLISIS

## SEBAGAI SUMBER FLAVONOID TOTAL
Muammar Fawwaz 1 , Diana Syam Muliadi, A. Muflihunna Fakultas Farmasi, Universitas Muslim Indonesia
1 muammar.fawwaz@umi.ac.id

## ABSTRACT
Flavonoids are natural phenolic compounds found in almost all plants that have potential as antioxidants. Based  on previous  research,  stating  that  black  soybeans  contain  compounds  of  flavonoids.  This  analysis aims  to establish  the  levels  of  total  flavonoids  on  ethanol  extract  of  black  soybean  hydrolyzed.  Determination  of  total flavonoid  levels  of  ethanol  extract  of  black  soybean  hydrolyzed  has  been  made  with  UV-Vis  spectrophotometry method. Black soybean hydrolyzed using HCl and extracted using ethanol 70%. The extracts obtained were analyzed qualitative  by  the  method  of  coloring  reaction  and  quantitative  analysis  using  UV-Vis  spectrophotometer,  where quercetin is used as a reference standard. Measurements were performed at maximum wavelength of 444.45 nm. The research showed the average level of total flavonoids is 11.83 mgQE / g extract or 1,163 % . In conclusion extract of black soybean hydrolyzed rich of total flavonoids, and it is related to the activity as antioxidant.
Keywords: Flavonoid, black soybean, hydrolysis, UV-Vis Spectrophotometry.

## I. PENDAHULUAN
Di  Indonesia  jumlah  varietas  kedelai  hitam yang yang dikembangkan sangat minim. Padahal dari segi syarat tumbuh kedelai hitam ( Glycine soja ) lebih cocok ditanam di 7 daerah tropis. Cikuray dan Merapi merupakan  dua  varietas  unggul  kedelai  hitam  yang memiliki  kadar  protein  cukup  tinggi,  akan  tetapi ukuran  bijinya  tergolong  kecil.  Sedangkan  pada Mallika,  varietas  kedelai  hitam  yang  dilepas  tahun 2007,  memiliki  biji  kecil  (9,50  g/100  biji)  dengan kadar protein lebih rendah (37%) (Ginting E, 2009).
Kedelai  hitam  memiliki  kandungan  protein 40,4g/100g  dan  antioksidan  yakni  antosianin  dan isoflavon.  Kandungan  total  polifenol,  flavonoid  dan antosianin yang lebih tinggi daripada kedelai kuning, yakni  masing-masing  6,13  mg/g  ;  2,19  mg/g  ;  0,65 mg/g.  Isoflavon  merupakan  antioksidan  golongan flavonoid  yang  biasa  terdapat  pada  kedelai  dan memiliki  efek  bermanfaat  pada  penderita  Diabetes Melitus  dengan  meningkatkan  serum  insulin  dan komponen insulin pankreas (Mueller, 2012).
Kedelai  memiliki  kandungan  isoflavon (golongan  flavonoid)  begitu  juga  kedelai  hitam. Isoflavon  merupakan  suatu  zat  dalam  kedelai  yang mempunyai  kemampuan  sebagai  antioksidan  serta mencegah terjadinya kerusakan akibat radikal bebas. Kedelai hitam memiliki kandungan antioksidan lebih tinggi dibandingkan kedelai kuning (Dajanta, 2013).
Isoflavon jenis genistein pada kedelai hitam ( Glycine  soja )  sebesar  4.99%  (b/b)  pada  ekstrak kedelai  yang  telah  mengalami  hidrolisis  secara enzimatik  dengan  menggunakan  bakteri  probiotik Lactobacillus  bulgaricus ,  begitupula  penelitian selanjutnya yang menggunakan bakteri Lactobacillus
acidophilus diperoleh kadar genistein sebesar 3.46% (b/b) (Fawwaz, 2014).
Kadar flavonoid total yang tekandung dalam Kedelai hitam sebesar 1,78 mg RE /g yang jelas lebih tinggi dari kadar flavonoid total yang terkandung pada kedelai  kuning  yaitu  sebesar  0,57  mg  RE  /g  (Shun- Cheng Ren, 2011). Kadar genistein pada ekstrak biji kedelai hitam terhidrolisis sebanyak 6,574% dan non- hidrolisis sebanyak 3,007% (Fawwaz, 2016).
Berdasarkan  uraian  diatas  maka  dilakukan penelitian  mengenai penetapan kadar  flavonoid total pada  ekstrak  etanol  kedelai  hitam  ( Glycine  soja ) terhidrolisis  dengan  metode  spektorofotometri  UV- Vis.
II. METODE PENELITIAN
A. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah seperangkat alat  gelas  ( pyrex ),  magnetic  stirrer  ( As  One ), mikropipet ( Dragon Lab ), oven ( memmert ), seperangkat alat maserasi, spektrofotometer ultraviolet-visible ( Thermo Scientific E.201 ), timbangan  analitik  ( Ohaus ),  dan  timbangan  Neraca ( Ohaus ). Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian  ini  adalah  alumunium  foil,  aluminium klorida  10%,  aquades,  FeCl 3, ekstrak  dari  kacang kedelai hitam ( Glycine soja ), etanol 70%, etanol 96%, (p.a, Merch), HCl 2 N (p.a, Merck), kalium asetat 1 M (p.a,  Merck),  kuersetin  (p.a,  Merck),  dan  serbuk magnesium.

## B. Pengambilan dan pengolahan Sampel
Sampel  kedelai  hitam  ( Glycine  soja ) dibersihkan  dari  kulit  ari  yang  melekat  pada  kacang kedelai menggunakan air hangat. Setelah dibersihkan,
sampel  kedelai  hitam  dikeringkan  dalam  wadah bersih  dan  dihaluskan,  kemudian  sampel  kedelai hitam ( Glycine soja ) siap untuk di ekstraksi.

## C. Metode Ekstraksi
Biji  kedelai  dihaluskan  dan  ditambahkan cairan  penyari  etanol  70%  dengan  perbandingan  1:2 g/mL, hasil campuran ini kemudian dipanaskan pada suhu  90 o C,  diaduk  secara  konstan  selama  2  jam. Campuran dipisahkan dari zat terlarutnya menggunakan vakum filter. Filtrat ditambahkan 37% HCl hingga pH campuran mencapai 3. Campuran ini kemudian dipanaskan pada suhu 90 o C, diaduk secara konstan  selama  2  jam.  Campuran  selanjutnya ditambahkan  aquades  dengan  perbandingan  1:1 mL/mL dan diaduk secara konstan pada suhu kamar. Endapan  yang  terbentuk  dipisahkan  menggunakan vakum filter. Hasil endapan yang diperoleh kemudian disimpan didalam Freezer (Zhang, 2007).

## D. Analisis Kualitatif Flavonoid
Sebanyak  100  mg  ekstrak  ditambahkan etanol  96%.  Kemudian  dipanaskan.  Lapisan  atas dipipet dan ditambahkan dengan HCl pekat 2 N dan serbuk  Mg.  Flavonoid:  terbentuknya  warna  merah menunjukkan  adanya  senyawa  flavonoid  (Ditjen POM, 1989).
Sebanyak 1 gram sampel diekstraksi dengan menggunakan  pelarut  etanol  96%.  Larutan  yang dihasilkan  diambil  sebanyak  1  mL  larutan  uji, kemudian  ditambahkan  2  tetes  larutan  FeCl 3 . Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa flavonoid dalam bahan (Harbone, 1987).

## E. Analisis Kuantitatif Flavonoid
1. Pembuatan Kalium asetat 1 M
Ditimbang  sebanyak  0,982  gram  Kalium asetat kemudian dilarutkan dengan air suling hingga 10 mL.
2. Pembuatan Aluminium klorida 10%
Ditimbang  sebanyak  1  gram  Aluminium klorida kemudian dilarutkan dengan air suling hingga 10 mL.
3. Pembuatan Larutan Stok Kuersetin
Ditimbang  sebanyak  10  mg  kuersetin kemudian  dilarutkan  dengan  etanol  96%  hingga  10 mL (1000 ppm). Kemudian dipipet sebanyak 0,5 mL
dan dicukupkan dengan etanol 96 %hingga 5 mL (100 ppm).  Kemudian  dilakukan  beberapa  pengenceran lagi dengan beberapa seri konsentrasi.
Untuk  membuat  konsentrasi 6 ppm, 8 ppm, 10 ppm, 12 ppm, dan 14 ppm masing-masing larutan stok dipipet  0,4 mL, 0,5 mL, 0,6 mL dan 0,7 mL, lalu dicukupkan dengan etanol 96% sampai volume akhir 5 mL (Chang et al ., 2002).
4. Penentuan λ maks Panjang  gelombang  maksimum  kuersetin dilakukan  dengan running larutan  kuersetin  pada range  panjang  gelombang  400-600nm.  Absorbansi maksimum  yang  diperoleh  pada  panjang  gelombang tertentu  merupakan  panjang  gelombang  maksimum kuersetin.
5. Pengukuran larutan standar kuersetin
Pada seri konsentrasi 6 ppm, 8 ppm, 10 ppm, 12 ppm, dan 14 ppm masing-masing dipipet sebanyak 1,5 mL dan ditambahkan dengan 1,5 mL etanol 96%, 0,1 mL larutan AlCl 3 10%,  dan 0,1 Kalium asetat 1 M, kemudian dicukupkan  hingga 5  mL  aquades dan didiamkan selama 30 menit pada suhu ruangan. Ukur serapan pada panjang gelombang serapan maksimum 444,45 nm, dengan larutan blanko campuran 1,5 mL etanol 96%, 0,1 mL AlCl 3 dan 0,1 mL Kalium asetat, selanjutnya  dihomogenkan  dan  dicukupkan  dengan aquades hingga 5,0 mL. Kemudian dibuat kurva baku dan  didapatkan  persamaan  garis  lurus  (Chang et  al ., 2002).
6. Pentapan Kadar Flavonoid Total
Kandungan flavonoid total ditentukan sesuai dengan  prosedur  Chang  (2002)  menggunakan kuersetin  sebagai  standar  referensi.  Ditimbang ekstrak  Kedelai  terhidrolisis  5  mg  dilarutkan  dalam etanol 96% hingga 5 mL (1000 ppm). Larutan uji (1,5 mL) ditambahkan dengan 1,5 mL etanol 96%, 0,1 mL Aluminium klorida 10%, 0,1 mL Kalium asetat 1 M, dan  di  cukupkan  hingga  5  mL  dengan  aquades, kemudian  diinkubasi  selama  30  menit  pada  suhu ruangan.  Selanjutnya,  absorbansi  sampel  tersebut diukur pada panjang gelombang 444,45 nm. Larutan dibuat dalam 3 kali replikasi sehingga kadar flavonoid yang di peroleh didapat sebagai ekuivalen kuersetin/g ekstrak.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Penelitian Tabel 1. Hasil Analisis Kualitatif ekstrak etanol kedelai hitam terhidrolisis
Sampel Pereaksi Warna Ket Ekstrak Etanol Kedelai Hitam Terhidrolisis Serbuk Mg + HCl pekat Merah (+) FeCl 3 Hijau keruh (+) Keterangan:
(+) = Menunjukkan adanya flavonoid
Tabel 2 . Hasil penetapan kadar flavonoid total % (b/b) pada ekstrak etanol kedelai hitam terhidrolisis.

## B. Pembahasan
Kedelai hitam adalah salah satu tanaman yang dapat  digunakan  sebagai  obat  berasal  dari  genus Glycine. Tumbuhan  ini  mempunyai  peranan  yang sangat  penting  dalam  budaya  Asia  baik  sebagai makanan,  minuman  maupun  sebagai  obat.  Khasiat yang memiliki kadar protein cukup tinggi, akan tetapi ukuran bijinya tergolong kecil.
Sebagian  besar  kandungan  Flavonoid  total dalam  kedelai  hitam  ataupun  jenis-jenis  lain  dari produk  olahan  kedelai  hitam  terdapat  dalam  bentuk glikosida  yang  berkonjugasi  dengan  mengikat  satu molekul  gula.  Untuk  menarik  senyawa  aglikon  yang terkandung  dalam  kacang  kedelai  hitam  perlu dilakukan  ekstraksi  hidrolisis.  Pada  penelitian  ini metode  ekstraksi  hidrolisis  yang  digunakan  adalah cara  kimia  dengan  menggunakan  salah  satu  bahan kimia yaitu asam (HCl) yang dapat mengurai glikosida menjadi glikon dan aglikon.
Kacang  kedelai  hitam  yang  sudah  halus ditimbang  sebanyak  125  gram.  Kemudian  sampel ditambahkan  cairan  penyari  etanol  70%  dengan perbandingan 1:2 g/mL, agar sampel terendam semua. Pelarut  etanol  dapat  menembus  semua  jaringan tanaman  untuk  menarik  senyawa  aktif  keluar  dari jaringan  sel  sampel,  etanol  tidak  menyebabkan pembengkakan pada membrane sel dan memperbaiki stabilitas  bahan  terlarut.  Proses  ekstraksi  ini dipanaskan  pada  suhu  90 o C,  diaduk  secara  konstan selama  2  jam  untuk  menarik  senyawa  kimia  dari
sampel  secara  sempurna.  Campuran  dipisahkan  dari zat terlarutnya menggunakan vakum filter.
Filtrat  ditambahkan  37%  HCl  hingga  pH campuran  mencapai  3  untuk  mengurai  glukosa menjadi aglikon. Campuran ini kemudian dipanaskan pada suhu 90 o C, diaduk secara konstan selama 2 jam. Campuran  selanjutnya  ditambahkan  aquadest  dengan perbandingan  1:1  mL/mL  dan  diaduk  secara  konstan pada  suhu  kamar.  Pada  saat  ditambahkan  aquades, campuran langsung berubah menjadi keruh keputihan yang  menandakan  proses  hidrolisis  berhasil,  dimana komponen  glikon  larut  dalam  air  sementara  aglikon tidak  larut  sehingga  membentuk  endapan.  Endapan yang terbentuk dipisahkan menggunakan vakum filter. Kemudian  hasil  endapan  di  simpan  didalam  Freezer. Dari  proses  tersebut  diperoleh  berat  ekstrak  kedelai terhidrolisis sebanyak 1,5975 gram dengan rendamen sebanyak  1,278%.  Rendamen  merupakan  persentase bagian  bahan  baku  yang  dapat  digunakan  atau dimanfaatkan  dengan  total  bahan  baku.  Rendamen yang  semakin  besar  menandakan  bahwa  bahan  baku tersebut  memiliki  peluang  untuk  dimanfaatkan  lebih besar  dibandingkan  bahan  baku  yang  memiliki  nilai rendamen rendah atau kecil.
Uji  kualitatif  dilakukan  untuk  mengetahui komponen kimia pada tanaman dengan menggunakan reaksi  warna  dengan  pereaksi  tertentu.  Uji  flavonoid ekstrak  etanol  kedelai  hitam  terhidrolisis  dilakukan dengan dua pengujian yaitu: pertama, diujikan dengan serbuk  Mg  ditambahkan  beberapa  tetes  HCl  pekat,
Replikasi Absorbansi (y) Kandungan Flavonoid total awal (mg/L) Kandungan Total Flavonoid (mgQE/g Ekstrak) Rata-rata Kandungan Flavonoid total mgQE/g % Kadar Flavonoid 1 0,474 11.9444 11,485 11, 8317 1,1837% 2 0,496 12,5555 11,8448 3 0,517 13,1388 12,1655
terbentuk  warna  merah.  Kedua,  diujikan  dengan FeCL 3 terbentuk warna hijau tua atau hijau kotor. Hasil identifikasi menunjukkan ekstrak kedelai terhidrolisis positif mengandung senyawa flavonoid.
Uji  kuantitatif  flavonoid  total  dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri UV-Vis untuk mengukur  seberapa  besar  kandungan  flavonoid  yang terdapat  pada  ekstrak  etanol  kedelai  terhidrolisis, dimana Flavonoid mengandung sistem aromatis yang terkonjugasi dan dapat menunjukkan pita serapan kuat pada daerah UV-Vis. Pada pengujian Spektrofotometri UV-Vis  digunakan  larutan  standar  kuersetin.  Yang terlebih  dahulu  dilakukan runni ng  dari  panjang gelombang 400-600 nm. Hasil runni ng  menunjukkan panjang  gelombang  maksimal  standar  baku  kuersetin berada  pada  panjang  gelombang  444,45  nm.  Alasan digunakan  panjang  gelombang  maksimal  dalam pengukuran spektofotometri yaitu karena pada panjang gelombang  maksimal  memiliki  kepekaan  maksimal dimana  perubahan  absorbansi  untuk  setiap  satuan konsentrasi adalah  yang paling besar. Selain itu pada panjang gelombang maksimal bentuk kurva absobansi memenuhi hukum Lambert-Beer.
Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas  antara  absorban  dengan  konsentrasi  larutan analit  dan  berbanding  terbalik  dengan  transmitan. Larutan standar  kuersetin dibuat dalam beberapa seri konsentrasi yaitu 6 ppm, 8 ppm, 10 ppm, 12 ppm, dan 14  ppm.  Pada  rangkaian  seri  konsentrasi  tersebut, masing-masing ditambahkan 1,5 mL etanol 96% yang berfungsi  sebagai  pelarut  dan  ditambahkan  0,1  mL aluminium  klorida  10%  yang  berfungsi  untuk memberikan  efek  batokromik,  sehingga  reaksi  warna yang  terbentuk  dapat  diamati  dan  dapat  diukur  pada daerah visible. Kemudian ditambahkan 0,1 mL kalium asetat 1 M, yang berfungsi sebagai penstabil, agar efek batokromik  yang  telah  terjadi  dapat  dipertahankan. Lalu  kemudian  dicukupkan  dengan  penambahan aquades hingga  5 mL, dan diinkubasi selama 30 menit pada  suhu  ruangan  dengan  tujuan  agar  reaksi  antara larutan  standar  kuersetin  dan  pereaksi  dapat berlangsung  dengan  sempurna.  Kemudian  diukur masing-masing seri konsentrasi tersebut pada panjang gelombang  maksimum  444,45  nm.  Hasil  absorbansi dari  rangkaian  konsentrasi  yang  tercatat  kemudian dihasilkan  kurva  kalibrasi  linear  kuersetin  yaitu  y  = 0.037x + 0.039 dengan nilai koefisien determinasi (R 2 ) yang diperoleh sebesar 0.999 (gambar 4).
Begitupula  pada  pengukuran  absorbansi sampel  ekstrak  etanol  kedelai  hitam  terhidrolisis masing-masing  dibuat  dalam  tiga  replikasi,  dimana larutan sampel ditambahkan AlCl 3 terjadi pembentukan  kompleks  warna  flavonoid  dan  AlCl 3 yang  berwarna  kuning  yang  memberikan  efek batokromik. Selain itu digunakan pula pereaksi kalium asetat  dan  aquades  sebagai  pentabil  agar  didapat
larutan  berwarna  kuning  konstan  (gambar  8).  Efek batokromik pada sampel diharapkan mampu membuat senyawa  falvonoid  terdeteksi  secara  spesifik  pada spektrofotometri  sehingga  hasil  pengukuran  lebih akurat.  Kuvet  yang  digunakan  dalam  analisis  ini adalah kuvet kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas  yang  lebih  baik.  Hal  ini  disebabkan  karena kuvet  terbuat  dari  kaca  dan  plastik  yang  dapat menyerap  UV  sehingga  penggunaannya  hanya  pada spektrofotometer  sinar  tampak  (VIS).  Cuvet  kuarsa biasanya  berbentuk  persegi  panjang  dengan  lebar  1 cm.
Dari hasil penelitian ini kandungan flavonoid total ekstrak etanol kedelai terhidrolisis adalah 11,638 mgQE/g ekstrak, yang berarti tiap berat ekstrak etanol kedelai hitam terhidrolisis terkandung 11,638 mg atau 1,163% flavonoid yang setara dengan kuersetin.

## IV. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dan analisis data yang  dilakukan  dapat  disimpulkan  bahwa,  kadar flavonoid  total  dari  ekstrak  etanol  kedelai  hitam terhidrolisis  yaitu  11,638 mgQE/g ekstrak atau 1,163 %.

## DAFTAR PUSTAKA
Astuti,  S.,  2008.  Isoflavon  Kedelai  dan  Potensinya sebagai  Penangkap  Radikal  Bebas. Jurnal Teknologi  Industri  dan  Hasil  Pertanian.
13 (2): 126-136.
Chang,  C.,  Yang,  M.,  Wen,  H.,  and  Chern,  J.,  2002.
Estimation  of  total  flavonoid  content  in Propolis by two complementary colorimetric methods. Journal of Food and Drug Analisis , 10 (3): 178-182.
Cheng, S. R., Liu2, Z. L., Wang, P., 2011. Proximate composition  and  flavonoids  content  and  in vitro  antioxidant  activity  of  10  varieties  of legume  seeds  grown  in  China. Journal  of Medicinal  Plants  Research Vol. 6 (2),  pp.
301-308.
Dajanta,  K.,  Janpum,  P.  &  Leksing,  W.  2013. Antioxidant  Capacities,  Total  Phenolics  and Flavonoids  in  Black  and  Yellow  Soybeans Fermented by Bacillus subtilis: A Comparative  Study  of  Thai  Fermented Soybeans  (thuanao). International  Food Research Journal. Vol. 20 (6): 3125-3132. Ditjen POM., 1989. Materia Medika Indonesia Jilid V .
Departemen Kesehatan RI: Jakarta.
Fawwaz,  M.,  Wahyudin,  E.,  Djide,  N,M.,  2014.  The Effect of Isoflavon Soybean ( Glycine max (L) Merill) Fermentation Result by Lactobacillus bulgaricus Toward  In  Vitro  Osteoblast  Cell Proliferation, International Journal of PharmTech , ISSN: 0974-4304.
Fawwaz,  M.,  Akbar.  N.,  Pratama  M.,  Saleh,  A  and Baits,  M.  2016.  High  Performance  Liquid
Chromatographic  Analysis  Of  Isoflavones Aglycone In
Indonesian
Soybean.
International  Journal  of  Pharmaceutical Sciences  and  Research .  IJPSR  ;  Vol.  7(10): 4230-4233. Ginting, E. dan M.M, Adie., 2007 . Sifat fisik dan kimia lima galur kedelai hitam serta kualitas kecap yang dihasilkan . hlm. 495−510.Bogor. Harbone, J.B., 1987. Metode fitokimia : Penuntun cara modern  menganalisa  tumbuhan. Terbitan Kedua.  Terjemahan  Kosasih  Padmawinata dan Iwang Soediro. ITB: Bandung. Mueller. 2012. Soy intake and risk of type 2 diabetes mellitus in Chinese Singaporeans. Soy intake and risk of type 2 diabetes. Eur J nutr .; 51(8): 1022-40.