## Pengaruh Autoclave terhadap Properti Fisik dan Histopatologi Tulang: Sebuah Penelitian Dasar Rekonstruksi
I GEDE EKA WIRATNAYA 1 , ACHMAD FAUZI KAMAL 1 , RINO PATTIATA 2 , EVELINA KODRAT 2 1 Department of Orthopaedic and Traumatology, Cipto Mangunkusumo Hospital Faculty of Medicine Universitas Indonesia
2 Department of Patology AnatomyCipto Mangunkusumo Hospital Faculty of Medicine Universitas Indonesia
Diterima 19 Februari 2014; Direview 18 Maret 2014; Disetujui 27 Maret 2014

## ABSTRACT
Background: Autoclave autograft is a promising alternative procedure in surgical treatment of bone tumors. A minimum effective autoclaving time of 15 minutes at 134°C to devitalise tumour cells. This study aims to know the effect of autoclave to physical properties and histopathology of bone.
Methods: We performed experimental study in 28 femoral bone of goat (Capra Aergagus circus) at age 1−2 year old. We divide into two groups with simple random sampling to be 14 autoclave and 14 control group. Autoclaving was performed to the bone at 134°C for 15 minute. We examined physical properties each 7 autoclave group to axial and bending force compared with physical properties of the control group. We also examined histopatology of the bone both groups. Independent t-test statistical analysis to evaluate the difference of axial and bending force between autoclave and control group.
Results: There were significant difference between autoclave and control group in axial force (p = 0.000) and bending force (p = 0.03). Physical properties of autoclave bone decreased 58.58 % in axial force and 20.33% bending force to control group. Histopathology examination revealed that all osteocytes were death in autoclave group but without matrix changes. Conclusion: Autoclave at 134°C for 15 minute caused physical properties of bone decrease and statistically significant difference. It also made all osteocytes died but without matrix disturbance.
Keyword: Autoclave bone, Physical properties of bone.

## ABSTRAK
Autograft yang mendapat pajanan autoclave merupakan salah satu prosedur alternatif dalam penatalaksanaan bedah tumor tulang. Pemanasan autoclave efektif untuk devitalisasi sel tumor pada suhu 134°C dalam waktu minimal 15 menit. Studi ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh autoclave terhadap properti fisik dan histopatologi tulang.
Penelitian ini merupakan studi eksperimental terhadap 28 tulang kambing ( Capra Aergagus circus) usia 1−2 tahun. Kami membagi menjadi dua kelompok dengan simple random sampling menjadi 14 kelompok autoclave dan 14 kelompok kontrol. Autoklave dilakukan untuk tulang pada suhu 134°C selama 15 menit. Evaluasi properti fisik dilakukan terhadap masing-masing kelompok 7 sampel tulang untuk gaya axial dan gaya bending. Kami juga memeriksa histopatologi tulang kedua kelompok. Analisis t-test independent statistik untuk mengevaluasi perbedaan axial dan gaya bending antara autoclave dan kelompok kontrol.
Hasil penelitian menunjukkan terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok autoclave dengan kelompok kontrol pada uji gaya axial (p = 0,000) dan gaya bending (p = 0,03). Properti fisik tulang diautoclave menurun 58,58% pada gaya axial dan 20,33% pada gaya bending. Pemeriksaan histopatologi menunjukkan kematian osteosit pada kelompok autoclave. Penelitian ini menyimpulkan bahwa autoclave mengurangi kekuatan mekanik tulang, baik terhadap gaya axial maupun gaya bending dan bermakna secara statistik, serta menyebabkan kematian seluruh osteosit.
Kata Kunci: tulang autoclave, properti fisik tulang.

## KORESPONDENSI:
Dr. dr. Achmad Fauzi Kamal, Sp.OT (K) Departemen Orthopaedi & Traumatologi FKUI/ RSCM. Jl. Diponegoro No. 71 Jakarta Pusat. Email: fauzikamal@yahoo.com

## PENDAHULUAN
P ilihan rekonstruksi limb salvage surgery (LSS) dapat berupa endoprostesis, biological recons- truction (massive allograft, autograft, bone transfer, bone transport), atau kombinasi endoprostesis dengan metode biological reconstruction. Penggunaan prostesis pada pasien berusia muda (dengan indikasi LSS) mempunyai luaran jangka panjang yang kurang baik. Hal tersebut merupakan salah satu pertimbangan untuk kembali menggunakan bioloogical reconstruction dengan autograft. 1,2 Tindakan rekonstruksi dengan recycling autograft dengan autoclave merupakan reimplantasi tulang autograft yang terkena tumor setelah dilakukan devitalisasi tumor dengan cara pemanasan autoclave pada suhu tertentu. Dibandingkan dengan tulang massive allograft, recycling tulang autograft memiliki kelebihan karena tidak terjadi reaksi penolakan, dapat terhindar dari transmisi penyakit, dan lebih mudah direimplantasikan ke dalam defek tulang yang ada. 3-5 Selain itu, metode autoclave  untuk  recycling autograft merupakan prosedur yang murah dan efisien, dan masih sering dilakukan di negara yang sedang berkembang. Hal itu dikarenakan kurang terjangkaunya harga prosthesis, tidak tersedianya fasilitas radiasi dan sulitnya mencari allograft, serta masih dapat mempertahankan bone stock. 6-9 Fruh dkk., (1990) pada penelitiannya menyimpulkan proses pemanasan tulang dengan autoclave mampu membunuh semua sel tumor, walaupun pemanasan yang lama akan melemahkan kekuatan mekanik tulang. 10 Di samping itu, peningkatkan suhu dan penambahan waktu pajanan autoclave akan menyebabkan ber- kurang nya potensi osteoinduktif tulang. 10 Penggunaan metode recycling autograft dengan autoclave telah banyak diteliti. Di Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo (RSCM), metode ini juga telah dilakukan pada beberapa kasus osteosarkoma dengan indikasi LSS, tetapi data tentang kekuatan mekanik dan gambaran histologis tulang yang mendapat pajanan autoclave belum di evaluasi secara lengkap. Atas dasar latar belakang tersebut, penelitian tentang pengaruh autoclave terhadap kekuatan mekanik dan histopatologi pada tulang perlu dilakukan. Penelitian ini dapat menjadi dasar pengetahuan biomekanik tulang penggunaan recycling autograft dengan autoclave  pada rekonstruksi LSS.

## MATERI DAN METODE
Penelitian ini merupakan studi eksperimental dengan desain post control group menggunakan
model tulang femur kambing ( Capra Aegagrus hircus), berjenis kelamin jantan dengan rerata umur 1−2  tahun.  Besar  sampel  pada  penelitian  ini ditentukan dengan menggunakan rumus Federer: (n-1) (t-1) > 15. Dengan n sebagai jumlah sampel untuk setiap perlakuan, t adalah jumlah kelompok sebanyak 2, yaitu kelompok yang mendapat perlakuan autoclave dan kelompok control. Jumlah sampel yang diperlukan 14 untuk setiap kelompok sehingga total sampel yang diperlukan 28.
Tulang femur diambil segera setelah kambing disembelih sehingga didapatkan tulang dalam keadaan segar. Dilakukan pengukuran diameter diafisis dan metafisis tulang femur kambing. Tulang tersebut dimasukkan ke dalam alat transpor berisi pendingin. Pada kelompok perlakuan tulang diberi pemanasan dengan autoclave pada suhu 134 0 C selama 15 menit sesuai rekomendasi Paul Bohm dkk., dengan alat autoclave Mocom Type Prima (U) (Italia) tahun 2000 berdaya 1700 watt (Gambar 1A). 10 Selanjutnya dilakukan pengambilan sampel jaringan tulang dari kelompok perlakuan dan kelompok kontrol (tanpa pemanasan) untuk pemeriksaan histopatologi di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Tulang yang telah mengalami autoclave  di- masukkan kembali ke dalam alat transport untuk persiapan uji kekuatan mekanik. Uji kekuatan mekanik dilakukan pada tulang kelompok autoclave dan kontrol dengan memberikan gaya kompresi/ axial dan bending menggunakan alat merek Schenk-Trebe tipe RME 100 buatan Jerman dengan pencatat Yokogawa X-Y recorder tipe 3023 melalui amplifier KWS  tipe 3073 buatan Jepang. Gaya axial dan bending diberikan pada tulang kelompok autoclave dan kontrol secara kontinu sehingga terjadi fraktur ( break event point). (Gambar 1.B-C)
Analisis data dilakukan dengan program komputer SPSS versi 16.0 dengan uji independent t-test dan dianggap bermakna bila nilai bila p < 0,005.

## HASIL
Kekuatan Mekanik terhadap Gaya Axial Semua sampel tulang pada kelompok autoclave dan kontrol yang diberikan gaya axial mengalami fraktur di daerah metafisis. Rerata besarnya gaya axial yang menyebabkan fraktur (break point) pada kelompok autoclave adalah 3035,7 Newton, sedangkan pada kelompok kontrol rerata break point sebesar 7328,6 Newton. Tulang pada kelompok perlakuan
Pengaruh Autoclave terhadap Properti Fisik dan Histopatologi Tulang: Sebuah Penelitian Dasar Rekonstruksi 23-28
autoclave mengalami penurunan kekuatan mekanik rata-rata sebesar 58,58% dibandingkan kelompok kontrol. Pada uji statistik dengan menggunakan uji independentt-test didapatkan perbedaan bermakna kekuatan mekanik tulang terhadap gaya axial antara tulang yang di- autoclave dengan kontrol (p = 0,000).
Kekuatan Mekanik terhadap Gaya Bending Rerata besarnya gaya bending yang menyebabkan fraktur ( break point) pada kelompok autoclave adalah 2421,43 ± 677,53 Newton, sedangkan pada kelompok kontrol rerata break point sebesar 3057,14 ± 156,60 Newton. Tulang pada kelompok perlakuan autoclave mengalami penurunan kekuatan mekanik rata-rata sebesar 20,33% dibandingkan kelompok kontrol. Pada uji statistik menggunakan uji independent-test didapatkan perbedaan bermakna kekuatan mekanik tulang terhadap gaya bending antara tulang yang di- autoclave dengan kontrol (p = 0,032). Karakteristik tulang dan data penelitian kekuatan mekanik terhadap gaya axial dan bending dirangkum pada tabel 1.
Gambaran Histopatologi Penilaian histopatologi dengan melihat gambaran matriks dan morfologi sel tulang. Pada kelompok tulang yang mengalami pemanasan dengan autoclave didapatkan kematian seluruh osteosit yang terdapat pada metafisis dan diafisis. Gambaran tersebut ditandai dengan lakuna yang kosong (gambar 3). Sebaliknya, pada kelompok kontrol didapatkan osteosit yang viable. Pada kedua kelompok tidak terjadi perubahan matriks tulang.

## PEMBAHASAN
Pemanasan dengan autoclave pada penelitian ini menggunakan suhu 134 0 C selama 15 menit, sesuai yang direkomendasikan dari penelitian Paul Bohm dkk., dari University Hospital, Tilbingen, Jerman, 1994. 10 Dengan cara tersebut diharapkan dapat membunuh semua sel tumor, tetapi mendapatkan scaffold tulang autograft yang cukup kuat terhadap pembebanan gaya axial dan bending. Menurut beberapa studi, komplikasi yang sering terjadi pada penggunaan recycling  autograft yang dilakukan autoclave pada operasi rekontruksi tumor tulang ganas adalah rekuren lokal, fraktur graft, infeksi, dan non union. Pada penelitian Jamil dkk., (2006) terhadap 19 pasien tumor ganas primer tulang
yang dilakukan LSS dan rekonstruksi dengan recycling autograft dengan autoclave pada suhu 120 0 C selama 10 menit, kejadian angka lokal rekuren dan infeksi paling banyak (10,5 %), komplikasi non union dan implant failure lebih kecil. 11 Temuan tersebut berbeda dengan penelitian Asada dkk., (1997) setelah dilakukan follow up 1−8  tahun  dari  23  pasien  tumor  yang dilakukan rekonstruksi dengan autograft yang di- autoclave dan allograft pada suhu 135 0 C selama 10 menit, tidak ditemukan lokal rekuren, tetapi 10 orang (43,4%) mengalami infeksi, resorpsi graft, fraktur dan loosening implant. 12
Hal itu menunjukkan pemanasan dengan autoclave di bawah suhu 134 0 C dan kurang dari 15 menit akan berisiko terjadinya lokal rekuren lebih tinggi, tetapi menurunkan kejadian non union dan implant failure. Pada penelitian ini digunakan femur tulang kambing dengan harapan dapat menggambarkan kekuatan tulang femur seorang remaja. Untuk menghilangkan pengaruh faktor perancu dilakukan upaya penyeragaman faktor-faktor yang mungkin memengaruhi kekuatan mekanik tulang seperti diameter metafisis dan diafisis tulang, jenis kelamin, dan usia kambing.
Hasil penelitian ini menunjukkan perlakuan autoclave telah menurunkan kekuatan mekanik tulang pada uji pembebanan gaya axial maupun bending. Penurunan kekuatan mekanik lebih besar terjadi pada gaya axial dibandingkan gaya bending. Hasil penelitian ini serupa dengan yang dilaporkan oleh Kohler dkk., (1986), yang menunjukkan tulang yang dilakukan autoclave mengalami penurunan kekuatan mekanik sebesar 23% terhadap gaya torsi. 13 Sedangkan penelitian Currey dkk., menunjukkan bahwa tulang yang mengalami autoclave menunjukkan penurunan kekuatan mekanik terhadap gaya bending secara signifikan. 10
Terjadinya penurunan kekuatan mekanik tulang disebabkan oleh hilangnya komponen air pada tulang dan kerusakan matriks organik tulang (denaturasi protein). Hal tersebut dilaporkan oleh Gocclawska yang menyatakan bahwa kadar air akan memengaruhi kekuatan mekanik tulang. Semakin banyak air hilang pada proses devitalisasi, semakin besar penurunan kekuatan mekanik tulang. 14 Komponen utama matriks organik adalah kolagen tipe I yang menyusun 90% berat kering matriks tulang. Di samping itu, matriks organik juga mengandung proteoglikan, glikoprotein, dan protein non-kolagen, dan growth factor. 14-17 Kolagen bertanggung jawab terhadap gaya tarik pada tulang ( tensile strength), sedangkan proteoglikan berperan pada kekuatan
I GEDE EKA WIRATNAYA, ACHMAD FAUZI KAMAL, RINO PATTIATA, EVELINA KODRAT 23-28
kompresi tulang. Dengan demikian, dapat diduga bahwa di samping hilangnya komponen air, denaturasi protein (kerusakan matriks organik) juga memengaruhi penurunan kekuatan mekanik tulang.
Pada proses liofilisasi dan pajanan radiasi 25 kGy, kekuatan mekanik tulang turun sebesar 40%,
sementara tulang segar yang mendapat pajanan radiasi 50 kGy mengalami penurunan kekuatan mekanik sebesar 30%. 18
Uji kekuatan mekanik dilakukan untuk menilai properti biomekanik tulang yang mencerminkan peran struktur tulang. 18 Properti ekstrinsik tulang
Pengaruh Autoclave terhadap Properti Fisik dan Histopatologi Tulang: Sebuah Penelitian Dasar Rekonstruksi 23-28
Gambar 1: (A) alat autoclave Mocom TypePrima ( U ) (Italia) tahun 2000 berdaya 1700 watt; (B) Tulang yang diberikan gaya axial ; (C) Tulang yang diberikan gaya bending
Tabel 1: Karakteristik tulang dan kekuatan mekanik terhadap gaya axial Panjang (mm) Diameter (mm) Break Point (N) Gaya axial Gaya bending Gaya axial Gaya bending Metafisis Diafisis Metafisis Diafisis Autoclave Mean 100 22,8± 1,34 20,3± 1,12 21,8± 1,01 19,6 ± 0,48 3035,71 2421,43 Kontrol Mean 100 22,1± 1,09 19,7± 0,38 22,7± 1,86 19,6 ± 0,48 7328,57 3057,14
Gambar 3: Gambaran histopatologi dari sediaan kelompok autoclave menunjukkan lakuna kosong, tidak tampak osteosit (panah putih). Pewarnaan HE, pembesaran obj. 40 x.
A B C
dinilai dari maximum flexure force atau ultimate force, yaitu gaya bending maksimal hingga terjadinya fraktur. 19
Penurunan kekuatan tulang secara signifikan sangat jelas terjadi, terutama setelah diberi gaya axial. Sedangkan secara histopatologi tidak ditemukan perubahan pada matriks tulang dengan menggunakan mikroskop cahaya. Hasil penelitian tersebut hampir sama dengan penelitian Kohler dkk., (1986), yang menyatakan bahwa pemanasan dengan autoclave menyebabkan penurunan kekuatan, kekakuan, dan berat tulang. Walaupun demikian, tulang yang mendapat perlakuan autoclave cukup adekuat secara mekanik digunakan sebagai substitusi tulang. 20 Hal ini menunjukkan tidak ada hubungan antara kekuatan mekanik dan gambaran histopatologi pada tulang yang mengalami pemanasan dengan autoclave karena kekuatan mekanik tulang ditentukan oleh komposisi jaringan kolagen dan kalsium hidroksiapatit pada matriks, bukan oleh kematian seluruh sel osteosit. Pada tulang normal, jaringan kolagen akan meningkatkan tensile strength dan menurunkan compressive strength tulang, sedangkan kalsium hidroksiapatit mempunyai sifat stiff  pada tulang sehingga meningkatkan compressive strength tulang. 13,21
Pemanasan tulang dengan autoclave pada suhu di atas 60 0 C akan menyebabkan denaturasi dan degradasi jaringan kolagen pada matriks tulang sehingga menurunkan kekuatan mekanik tulang. 13 Pada penelitian ini, tidak ditemukan perubahan matriks tulang secara histopatologi menggunakan mikroskop cahaya sehingga diperlukan metode lain untuk menilai secara kuantitatif dan kualitatif jaringan kolagen serta kalsium hidroksiapatit pada matriks tulang.
Hal yang berlawanan ditemukan pada penelitian Jose Moreno dan Francisco Forriol (2001) yang mendapatkan bahwa tulang yang dipanaskan dengan autoclave pada suhu 134 0 C selama 8 menit, kekuatan mekaniknya tidak menurun secara signifikan. Penelitian ini menyarankan agar dilakukan penelitian mengenai perubahan jaringan kolagen, kandungan mineral (Calcium, Magnesium, Phosphorus), dan hidroxyproline pada tulang yang dipanaskan dengan autoclave. 22

## KESIMPULAN
Devitalisasi dengan autoclave mengurangi kekuatan mekanik tulang, baik terhadap gaya axial maupun gaya bending, dan bermakna secara statistik serta menyebabkan kematian seluruh osteosit.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Bohm P, Fritz J, Thiede S, Budach W. Reimplantation of Extracorporeal Irradiated Bone Segments in Musculoskeletal Tumors. Langenbeck Arch Surg. 2002;387(9-10): 355-65.
2. Hong A, Stevens G, Stalley P, Pendlebury S, Ahem V, Ralston A, Estoesta E, et al. Extracorporeal Irradiation for Malignant Bone Tumors. Int J Radiation Onco Biology and Physics. 2001;
50(2): 441-7.
3. June M, Refaat A, Kawagoshi N, Matosumoto S, Kuroda H. Pasteurized Autologous Bone Graft in Surgery for Bone and Soft Tissue Sarcoma . Clin Orthop Relat Res. 2004;419:258-66.
4. Araki N, Myoui A, Kuratsu S, Hashimoto N, Inoue T, Kudawara I, et al. Intra Operative Extracorporeal Autogenous Irradiated Bone Graft in Tumor Surgery . Clin Orthop Relat Res. 2002; 368:196-206.
5. Tsuchiya H, Yamamoto H, Nishida N, Tomita K, Wan S, Sakayama K. Reconstruction Using an Autograft Containing Tumour Treated by Liquid Nitrogen. J Bone Joint Surg Br. 2005;
87-B(2):218-25.
6. El-Wahidi GF, Eldesoky l, Kotb S, Awad I, Thabet M, Thaleh Y. Neoadjuvant Chemoterapy & Low Dose Extracorporeal Irradiation for Treatment of Osteosarcoma. J Clin Oncol. 2005;23:
9074.
7. Davies NM, Stalley PD. Extracorporeal Irradiation and Its Rolein the Treatment of Primary Pelvic Bone Tumours. J Bone Joint Surg. 2003; 85B: 174.
8. Sanjay BKS. Limb Salvage Surgery in Bone Tumor. J Bone Joint Surg. 2002;84B:213.
9. Muscolo DL, Ayerza MA, Aponte-Tinao L, Ranalletta M, Abalo E. Intercalary Femur and Tibia Segmental Allografts Provide an Acceptable Alternative in Reconstructing Tumor Resections. Clin Orthop Relat Res. 2004;426:97–102.
10.  Bohm P, Stihler Jorge. Intraosseus Temperature during Autoclaving. J Bone Joint Surg. 1995; 77B:174.
11.  Khattak MJ, Umer M, Haroon-ur-Rasheed, Umar M. Autoclaved tumor bone for reconstruction: an alternative in developing countries. Clin Orthop Relat Res. 2006;447:138-44.
12.  Asada N, Tsuchiya H, Kitaoka K, Mori Y, Tomita K. Massive Autoclaved Allografts and Autografts for Limb Salvage Surgery. Acta Orthop. 1997; 68: 392-5.
13.  Kohler P, Kreclberg A,Stromberg L. Physical Properties of Autoclaved Bone. Acta Orthop. 1986;57(2):141-5.
14.  Dziedzic-Goclawska A. The Application of ionising radiation to sterilise connective tissue allografts. In: Phillips GO, editor. Radiation and tissue banking. 1st ed. Singapore: World Scientific;
2000.pp.57-99.
15.  Salter RB. Normal Structure and Function of Musculoskeletal Tissues. In: Diagnosis of disorders and injuries of musculoskeletal system. 3 rd edition. Philadelphia: Lippincott-Williams-Wilkins;
1999.pp.7-28.
16.  Isma SPP, Kamal AF, Gumay S. Efek iradiasi 50, 150, dan 300 gray terhadap gambaran histopatologi, kekuatan mekanik terhadap gaya axial dan bending, serta vickers microhardness, sebuah uji eksperimental pada femur kambing (Capra Aegagrus Hircus). Maj Orthop Indones. 2011;39(1):87-91.
17.  Rosier RN, O’Keefe RJ, Hicks DG. The potential role of transforming growth factor beta in fracture healing. Clin Orthop Relat Res. 1998;355:294-300.
18.  Reddy GK, Stehno-Bittel L, Hamade S, Enwemeka CS. The biomechanical integrity of bone in experimental diabetes. Diabetes Res Clin Pract. 2001;54:1-8.
19.  Estai MA, Suhaimi F, Shuid AN, Das S, Abdullah S, Soelaiman. Biomechanical evaluation of fracture healing following administration of piper sarmentosum in ovariectomised rats. Af J Phar Pharmacol. 2012;63:148-56.
20.  Young TQ, Matsuda M,Takekawa M, OhtsuboS, Tsuyama K, Kita S. Morphological changes of autoclaved autogenic bone implantation and autoclaved autogenic bone supplemented with allogenic demineralized bone matrix in rat parietal bone. Histol Histopathol. 1996;11-361-9.
21.  Brinker R, O’Connor P. Basic Science. In: Review Of Orthopaedic. 5 th Ed. Philadelphia: Saunders Elsevier; 2008:1-9.
22.  Eurotherm-lifesciences. Autoclave sterilization. Available at : http://www.eurotherm-lifesciences.com/applications/sterilization/. Oct.2007.