Potensi Fraksi Etanol Benalu Mangga (Dendrophthoe pentandra) sebagai Agen Anti Kanker Kolon pada Mencit (Mus musculus Balb/c) setelah Induksi Dextran Sulvat (DSS) danAzoxymethane (AOM)
Moch Hardi Baramada Wicaksono, Sofy Permana
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya Jalan Veteran Malang, Jawa Timur, Indonesia
Alamat Korespondensi: hardi.blackhat@gmail.com

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  kemampuan Dendrophthoe  pentandra dalam  memperbaiki perubahan  jaringan  akibat kanker  kolon. Fraksi  etanol  benalu manga  diberikan  pada  tiga  kelompok mencit  dengan  dosis  0,125  mg/gram  BB,  0,250  mg/gram  BB  dan  0,500  mg/gram  BB  yang  sudah diinduksi  kanker  kolon  dengan  10  mg/kg  AOM  dan  5  %  DSS dan setelah  11  minggu  organ  kolon diisolasi  dan  dibuat  preparat  jaringan  dengan  metode  parafin  H&E.  Parameter  yang  diamati  meliputi jumlah  sel  goblet  dan  abnormalitas  struktur  jaringan  (dysplasia).  Data diuji secara statistik menggunakan  uji  normalitas dan  uji  homogenitas.Hasil  penelitian  menunjukan  terjadi perbaikan  sel goblet  pada  perlakuan  dosis  fraksi  etanol  benalu  mangga  0,500  mg/gram  BB.Fraksi  etanol benalu mangga  mampu  memperbaiki  abnormalitas  jaringan  kolon  yang  ditunjukkan  dengan  tidak  terjadinya dysplasia pada  perlakuan  fraksi  etanol  benalu  mangga  0,250  mg/gram  BB  dan  0,500  mg/gram BB.Benalu mangga berpotensi sebagai agen anti kanker kolon.
.Kata kunci :AOM, benalu mangga, DSS, kanker kolon,nitrotyrosine, sel goblet,

## ABSTRACT
The  purpose  of  this  study  was  to  determine  the  ability  of Dendrophthoe  pentandra in  tissue  that  are repairing by colon cancer. The ethanol fraction of mango parasite was given to three groups of mice by oral single dosages of 0.125 mg/g B W, 0.250 mg/g B W and 0.500 mg /g B W which is induced colon cancer by 10 mg/kg AOM and 5 % DSS and after 11 weeks of organ colon was isolated and was made preparations  by  methodsof paraffin with H  &  E staining.  Parameters were observed  from  H  &  E staining include the number of goblet cells and tissue structure abnormalities (dysplasia), the data were statistically analyzed using a normality test and homogeneity tests. The results showed an recovery of goblet  cells  in  the  treatment  of  ethanol  fraction  of  mango  parasite  dose of  0.500  mg  /  g  BB.  Ethanol fraction of mango parasite is able to repair abnormalities mango colonic tissue indicated by the absence of dysplasia in the treatment of parasites mango ethanol fraction 0.250 mg / g BB and 0.500 mg / g BB. The mango parasite has a potency as the agent of anti colon cancer.
Keywords: AOM, colon cancer, DSS, mango parasite, goblet cell, Nitrotyrosine

## PENDAHULUAN
Kanker  kolon  merupakan  kanker  yang sering  menyerang  manusia  diantara  jenis kanker lainnya  dan  penyakit  ini  sering terjadi di  negara-negara  maju  [1].Tahun  2003-2007 jumlah  pasien  kanker kolon di  Indonesia dengan kisaran usia dibawah 40 tahun rata-rata telah mencapai 28,17% [2].
Kanker    merupakan penyakit yang disebabkanoleh abnormalitas sel yang
diakibatkanoleh adanya mutasi pada DNA. Sel abnormal    membentuk klon  dan  berproliferasi
secara tidak normal [3]. Abnormalitas jaringan pada  kanker kolon dapat  dilihat  dari  beberapa ekspresi  protein  seperti Nitric  oxide  synthases (iNOS) dan Nitrotyrosine[4].Ekspresi nitrotyrosine dapat menunjukan adanya inflamasi pada perkembangan sel kanker kolon [4].
Perkembangan  industri  farmasi  yang sangat  pesat  dalam  menciptakan  obat-obat sintetis saat ini bertujuan untuk mencegah dan mengobati  penyakit kanker,  namun  sebagian besar  bersifat  toksik.Teknologi  pengobatan seperti pembedahan, kemoterapi dan
radioterapi dapat  memberikan  efek  samping pada penderita  serta  memerlukan  biaya  yang relatif mahal [5].Hal ini menyebabkan pengobatan  kanker  menjadi  tidak efektif  dan memerlukan biaya yang relatif mahal. Beberapa obat herbal telah dikembangkan  untuk  menggantikan  peranan obat  sintetis  yang    memiliki  kemungkinan efektif, namun masih perlu dilakukan
eksplorasi  dan  keefektifan  obat  herbal  untuk meningkatkan  daya tahan  bagi  pasien  kanker [6]. Hasil Uji farmakologis flavonoid menunjukan benalu mangga memiliki aktivitas penghambatan  pertumbuhan  kanker  pada mencit [7].Berdasarkan haltersebut,  penelitian ini  dilakukan  untuk  mengetahui  dan  memberi informasi  baru  tentang kemampuan fraksi etanol benalu  mangga dalam memperbaiki strukturjaringan kanker kolon.

## METODE

## Rancangan Penelitian.
Penelitian ini dilakukan dengan rancangan true experimental-post  test  onlycontrol  group design.Digunakan  70  ekor Mus  musculus Balb/c  jantan  umur  8-10  minggu,  berat  antara 25-30  gram  yang  diperoleh  dari  PUSVETMA Surabaya diaklimatisasi selama  satu minggu sebelum perlakuan.Rancangan penelitian induksi kanker usus pada Mus musculus Balb/c berdasarkan Kohno et  al.,  (2005)  dan  lowe et al.,(2010) [8, 9].

## Preparasi JaringanMetode Paraffin.
Usus  mencitdidehidrasi  dengan  menggunakan serialkohol bertingkat  dimulai  dari  30  %,  40 %,  50  %,  60  %,  70  %,  80  %,  90  %,  95  % (masing-masing 20 menit) dan 100 % (masing- masing 60  menit). Usus  mencit  dibersihkan melaluiproses clering dengan  menggunakan alkohol  absolut:  xilol, xilol  1  dan  xilol  2 (masing-masing 15 menit), kemudian dilanjutkan dengan proses infiltrasi
menggunakan  parafin:  xilol  (1:1) (masing- masing30  menit),  parafin  1  dan  parafin  2 (masing-masing60  menit). Kotak  dari  kertas atau  karton dengan  disiapkan  untuk  proses Embedding,  lalu organdiletakkan didalam karton  dan  dituangkan  parafin  kedalam block (hingga mengeras).

## Pewarnaan Hematoksilin dan Eosin.
Organ  diiris dengan microtom 4-5  µm lalu dimasukan kedalam  xylol  selama  10  menit, kemudian dilakukan seri alkohol 100 %, 95 %, 90 %, 80% dan 70 % (masing-masing 5 menit). Irisan  organ  usus  mencit direndam  dalam Hematoxylin dan  dicuci  dengan  air  mengalir selama  5  menit.Potongan  usus  dicelupkan  ke dalamakuades, kemudian dilakukan seri alkohol 30  %,  40  %,  50  %,  60  %  dan  70  % (masing-masing 3  menit)  dan  direndam dalam Eosin. Preparatdirendam  dalamseri  alkohol 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %(masing-masing 5 menit),  kemudian  direndam dalam  xylol  10 menit  dan mountingmenggunakan entelan dan diamati pada mikroskop (Olympus BX51).

## Pengamatan.
Spesimen organ  kolon  diobservasi  dengan mengambil  5  bidang  pandang  secara  acak,
kemudian pada masing-masing bidang pandang  tersebut  dihitung  jumlah  total selgoblet dan  selanjutnya  di  rata-rata.  Hasil rata-rata  digunakan  sebagai  referensi  jumlah total  sel  pada  setiap  bidang  pandang.  Jumlah penghitungan sel goblet dan hasilnya dikonversi  menjadi  bentuk  persen.Spesimen organ kolon juga diamati abnormalitas jaringan yang terjadi  (grade dysplasia).Organ  kolon yang  mengalami  kerusakan  dianalisis  secara deskriptif[10].

## Analisis Data.
Pengamatan  histopatologi  dengan  pewarnaan Hematoxilin-Eosin difokuskan pada gradedysplasia atau  tingkat  kerusakan kanker kolon yang  diamati  secara  deskriptif  dan  diuji statistik menggunakan Oneway Anova.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengamatan pada  perlakuan  kontrol positif  menunjukan  tidak  adanya  sel  goblet yang  diikuti  perubahan  struktur  histologi mukosa dibandingkan dengan perlakuan kontrol negatif.Perlakuan pada kelompok B, C dan  D dibandingkan  dengan kontrol  positif terdapat perbedaan pada jumlah sel goblet.Perlakuan  E  (5  %  dextran  sulfate sodium  salt)  selama  ±  1  minggu  tidak menunjukan adanya perubahan secara histologi seperti  pada  kontrol  positif,  tetapi  memiliki perbedaan jumlah sel goblet.
(A)
(B)
Gambar 1.Sel Goblet pada organ kolon Mus musculus Balb/cjantan perlakuan: (A) Kontrol positif (10 mg/kg  Azoxymethane    dan  5%    Dextran  Sulfate  Sodium  Salt),  (B) fraksi  etanol  benalu mangga  0,125  mg/gram  BB, (C) fraksi  etanol  benalu  mangga  0,250 mg/gram  BB, (D)fraksi etanol benalu mangga 0,500 mg/gram BB, (E) 5%  Dextran Sulfate Sodium Salt (F) Aquades. Pewarnaan H&E. Perbesaran 400x skala 500 µm (A-F). Sel goblet
( ) Analisis statistika lebih lanjut
menunjukan  bahwa  terdapat  perbedaan yang sangat  nyata  antara perlakuan  fraksi etanol benalu  mangga  0,125  mg/gram  BB,  fraksi etanol  benalu  mangga  0,250  mg/gram  BB, fraksi  etanol  benalu  mangga  0,500  mg/gram BB  dengan  kontrol  positif  (p<0,05) (Gambar 1B).  Perlakuan  fraksi  etanol  benalu  mangga 0,500  mg/gram  BB  dengan  kontrol  negatif tidak menunjukan bedanyata (p>0,05)
(Gambar 1B).Hal ini menunjukan fraksi etanol benalu  mangga  0,500  mg/gram  BB  memiliki efek  dalam recovery sel  goblet  pada  kanker kolon.
Tahapan  awal  pada  prosestumorigenesis kolon  ditunjukan  dengan  terjadi perubahan patologi  pada  bentuk  crypt  dan penurunan jumlah  dari  sel  goblet  pada  kolon  [11,12].  Sel goblet  pada  kolon  memiliki  fungsi  sebagai barier  pada  bagian mukosa  kolon dengan mengeluarkan  senyawa  mucin.Keberadaan  sel goblet berhubungandengan  sekresi  senyawa mucin  khususnya  Muc2 [13].Muc2merupakan ekspresi yang keberadaannya dipengaruhi oleh kondisi  kank er  kolon.Teraktivasinya  jalur  β - catenin merupakan salah satu mekanisme pada kanker  kolon, β -catenin  dapat  menghambat keberadaan ekspresi Muc2 dari sel goblet [13]. Fungsi barrier dari sel goblet untuk melindungi
terhadap zat kimia dari makanan atau zat kimia berbahaya  dan  mencegah  penempelan  bakteri patogen  yang  akan  masuk  ke  dalam  sel  epitel [14].
Pengamatan  yang  telah  dilakukan  pada masing-masing perlakuan menunjukkan bahwa telah  terjadi  dysplasia  atau  abnormalitas jaringan  kolon.Penentuan  tingkat  dysplasia pada  jaringan  kolon  berdasarkan Riddel  dkk. (1983)  di  dalam  Noam  &  Alexandros  (2010) dari hasil pengamatan ditandai dengan ciri dari masing-masing  perlakuan yaitu  (A)  mukosa rusak,  hilangnya  crypt  dan  sel  goblet  serta terjadi pleumorphic dan hilanngya polaritas sel (HGD), (B) pemanjangan
crypt dan berkurangya sel goblet (LGD), (C) normal, (D) normal, (E) pemanjangan crypt dan berkurangya sel goblet disertai
mildpleomorphic (LGD),  (F)  normal (Gambar
2 B 1 ).
a (0.00) b (9.20) d (19.00) e (24.13) c (13.21) e (25.04) 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 A B C D E F R a ta r a ta J u m la h S el G o b le t (% ) Perlakuan
(A 1 )(Noam & Alexandros, 2010) (B 1 )
Gambar  2.  Grade  Dysplasia  Pada  histologi organ kolon Mus  musculus Balb/cjantan;  (A 1 ):  Grade dysplasia:  High  Grade  Dyslasia  (A-C),  Low  Grade  Dysplasi  (D-F),  (B 1 ): (A)  mukosa rusak, hilangnya crypt dan sel goblet serta terjadi pleumorphic dan hilanngya polaritas sel (HGD),  (B)  pemanjangan crypt dan berkurangya  sel  goblet  (LGD),  (C)  normal,  (D) normal,  (E)  pemanjangan crypt dan  berkurangya  sel  goblet  disertai mildpleomorphic (LGD), (F) normal. Pewarnaan H&E. Perbesaran 400x skala 500 µm (A-F)
Berdasarkan  pada  pengamatan  penam- pang histologi yang telah dilakukan,
didapatkan  hasil  bahwa  terdapat  perbedaan tingkat perubahan abnormalitas struktur jaringan  kolon.  Perubahan  struktur  jaringan atau dysplasiamerupakan perubahan neoplastic (massa  abnormal  jaringan  sebagai  akibat  dari proliferasi  abnormal)  tanpa  diikuti  oleh  invasi [15]. Dysplasia dibagi menjadi 2 katagori yaitu berdasarkan  pada  tingkat pleumorphicdan polaritas  sel  yaitu Low  Grade  Dysplasia
(LGD)  dan High  Grade  Dysplasia (HGD).
Klasifikasi  tingkatan  dysplasia  menurut  noam and  alexandros  (2010) Low  Grade  Dysplasia (LGD): terjadi Pemanjangan pada crypt dan sel epitel, mild  pleomorphic dan  inti  memadat, pemanjangan  pada Crypt,  tidak  adanya  sel goblet  dan High  Grade  Dysplasia (HGD): terjadi pleomorphic dan  hilangnya  polaritas sel,  rusaknya  mukosa  dan  hilangya  polaritas sel sebagian pada sel epitel, pemanjangan crypt di  sertai  rusaknya  mukosa  dan  hilangya  sel Goblet (Gambar 2 A 1 )[15,16].

## KESIMPULAN
Perlakuan  fraksi  etanol  benalu  mangga 500  mg/gram  BB  mampu recovery  sel goblet serta  dosis  0.250 mg/gram  BB dan 500
mg/gram  BB mampu memperbaki perubahan struktur jaringan kanker kolon (dysplasia).

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan  terimakasih  yang  sebesar-sebesarnya penulis  ucapkan  kepada Ibu  Agustina  Tri Endharti  sebagai  pimpinan  peneliti dan  Sri Widyarti  sertaAris Soewondo atas  saran  dan masukan selama penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Ferlay, J, Bray,  F, Bray, P.& Parkin, D. M. 2002. Cancer Incidence, Mortality and  Prevalence  Worldwide  IARC
CancerBase  No.  5.  version  2.0, IARCPress, Lyon. [2] Roche. 2012. Kanker Kolorektal. http://www.roche.co.id/fmfiles/re717 5008/Indonesian/media/lembar.infor masi/Onkologi/Avastin/Lembar.Infor masi.Kanker.Kolorektal.pdf. Diakses tanggal 10 Juni 2012. [3] Garrett,  M.  D.    2001.    Cell Cycle Control and Cancer. Current Science.81(5).
[4] Gochman, E.,  Mahajna, J.,  Shenzer, P., Dahan, A.,  Blatt, A.,  Elyakim, R.
&Reznick, A. Z. 2012. The expression of iNOS and nitrotyrosine in  colitis  and  colon  cancer in  hum- ans.Acta  Histochem; 114(8):82735 [5] Fityana,  I. N.  2011.  Aktivitas  Ekstrak Mentimun  Laut stichopus  horrens dalam Menginduksi P53-Independent Apoptosis  pada  Sel  Hela.  Jurusan
Biologi.Fakultas Matematika  dan
Ilmu  Pengetahuan  Alam.  Universitas Brawijaya. Malang. Skripsi.
[6] Kun  Li,  Q.,  Li,    Z., Han,    J.,    Li,    D., Gao,  Z.& Liu,  F. Z.  2008.  Alkaloid from    Angelicae    dahuricae    Inhibits HeLa    Cell    Growth    by  Inducing Apoptosis  and  Increasing  Caspase- 3  Activity. Labmedicine.39(9).
[7] Sukardiman.  1999.  Efek  Antikanker
Isolat  Flavonoid  dari  Herba  Benalu Mangga  (Dendrophtoe    petandra ). Fakultas Farmasi Universitas Airlangga. Surabaya. Skripsi [8] Kohno, H.,  Suzuki,  R,  Sugie, S.  & Tanaka T.  2005.  Suppression  of colitis-related mouse colon carcinogenesis  by  a  COX-2  inhibitor and PPAR  ligands.BMC  Cancer.
5:46.
[9] Lowe,  E. L.,  Crother,  T. R.,  Rabizadeh, S., Hu, B. & Wang, H. 2010 Toll-like receptor  2  signaling  protects  mice from  tumor  development  in  a  mouse model  of  colitis-induced  cancer. PLoS ONE.5(9).
[10] Soni A, Widyarti S, Soewondo A. 2013. Study  of  Necrosis    in  the  Liver  of
orm aldehyde  and  Benzo(α)Pyrene
Exposured-Mice. The  Journal of Tropical  Life  Science;  Vol.  3,  No.  1, pp. 58- 62.
[11] Pinto D, Gregorieff A, Begthel H. 2003. Canonical  Wnt  signals  are  essential for homeostasis  of  the  intestinal epithelium. Genes Dev.17:1709-13
[12] Grady  W.M.  2004.  Genomic  instability and  colon  cancer.  Cancer  Metastasis Rev, 23, 11-27.
[13] Yang Q, Bermingham NA, Finegold MJ. 2001.  Requirement  of  Math1for secre- tory  cell  lineage  commitment in  the  mouse intestine. Science. 294:2155-58.
[14] Young,  S.  K.  &  Samuel,  B.  H.  2010. Intestinal Goblet Cells and Mucins in Health  and  Disease:  Recent  Insights and  Progress. Curr  Gastroenterol. 2(5): 319-330.
[15] Riddell  R.H,  Goldman  H,  Ransohoff DF. 1983. Dysplasia in inflammatory bowel  disease:  standardized  clas- sification  with  provisional  clinical applications. Hum Pathol: 14(11):931 – 968.
[16] Noam, H.&  Alexandros, D.  2010.
Colorectal  Dysplasia  in  Chronic Inflammatory  Bowel  Disease.Arch
Pathol Lab Med. Vol 134.