## AKTIVITAS PROTEOLITIK BAKTERI ASAM LAKTAT DALAM FERMENTASI SUSU KEDELAI
[Proteolytic Activities of Lactic Acid Bacteria in Fermentation of Soymilk]
Yusmarini 1,2) *, R. Indrati, 1) T. Utami 1) dan Y. Marsono 1)
1) Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Gadjah Mada
2) Program Studi Teknologi Hasil Pertanian, Universitas Riau
Diterima  04 Januari 2010 / Disetujui  8 Desember 2010

## ABSTRACT
Some lactic acid bacteria (LAB) strains had been isolated from spontaneously fermented soymilk which have proteolytic system. The purpose of  this  research  was  to  study  ability  of  isolates  in  fermentation  of  soymilk.  The  changes  in  bacterial  growth,  pH,  titrable  acidity,  and  proteolytic activities during fermentation were examined. Isolates of Lactobacillus plantarum 1 R.1.3.2; L. plantarum 1 R.11.1.2 and L. acidophilus FNCC 0051 (as a control) were capable growing in soymilk. The results indicated that initial pH of soymilk was 6,6 and decreased to 4,6 after fermentation and titrable acidity of 0.11 increased to 0.34 after fermentation. The proteolytic activities were 0.352 U/ml – 0.468 U/ml. The electrophoretic pattern of the proteins showed changes during fermentation of soymilk.
Key words : fermented soymilk, lactic acid bacteria, proteolysis

## PENDAHULUAN
1
Produk  fermentasi  susu  kedelai  dibuat  dengan menambahkan  bakteri  asam  laktat  (BAL),  namun  tidak  semua BAL  dapat  hidup  dengan  baik  pada  susu  kedelai.  Hal  ini disebabkan  karena  tidak  semua  BAL  menghasilkan  enzim  α- galaktosidase  yang  dibutuhkan  untuk  menghidrolisis  rafinosa dan stakiosa yang banyak terdapat pada susu kedelai. Connes et al . (2004) menyatakan bahwa 40% gula yang terdapat pada kedelai adalah rafinosa dan stakiosa. Hanya BAL yang mampu memanfaatkan  karbohidrat  yang  ada  pada  kedelai  terutama rafinosa  dan  stakiosa  yang  dapat  hidup  dan  berkembang  biak dengan  baik.  Bordignon et  al .  (2004)  menyatakan  bahwa Bifidobacterium  bifidum  JCM  1255,  B.breve  JCM  1192, B.infantis JCM 1222 serta L. casei subsp. rhamnosus IFO 3425 dapat memanfaatkan rafinosa dan stakiosa yang terdapat pada kedelai.  Kemampuan  BAL  untuk  memanfaatkan  karbohidrat pada susu kedelai bervariasi. Bifidobacterium adolescentis JCM 1275 dapat memanfaatkan sukrosa, rafinosa maupun stakiosa, namun B.bifidum JCM  1255  dan B.  breve JCM  1192  dapat memanfaatkan rafinosa dan stakiosa.
Beberapa  strain  bakteri  asam  laktat  diketahui  mempunyai sistem  proteolitik  sehingga  memungkinkan  mereka  tumbuh pada substrat yang kaya akan protein seperti susu (Kwok dan De  Vos,  1994).  Enzim  proteolitik  dihasilkan  di  sekitar  dinding sel,  membran  sitoplasma,  ataupun  di  dalam  sel. Lactobacillus acidophilus selama  proses  fermentasi  selain  memanfaatkan peptida  atau  asam  amino  bebas  untuk  pertumbuhannya  juga mampu  menghidrolisis  kasein  dengan  menggunakan  protease yang disekresikan di sekitar permukaan dinding selnya (Thomas dan Pritchard, 1987).
*Korespondensi penulis : E-mail : marini_thp@yahoo.co.id
Proteolisis  dapat  meningkatkan  jumlah  peptida  dan  asam amino  bebas  dalam  produk  fermentasi.  Peningkatan  jumlah peptida  merupakan  hasil  aktivitas  proteolitik  mikroba.  Mikroba yang  digunakan  akan  menghasilkan  protease  dan  peptidase ekstraseluler  untuk  memecah  protein  menjadi  peptida  dan asam-asam  amino  yang  dapat  melewati  membran  yang selanjutnya  akan  digunakan  untuk  keperluan  sel.  Sifat-sifat proteolitik  dan  kapasitas  menghasilkan  asam  laktat  dari  gula merupakan  faktor  utama  dalam  seleksi  strain  bakteri  asam laktat sebagai kultur starter bagi industri fermentasi.
Berdasarkan  hal  tersebut  pada  tahap  pertama  telah dilakukan  isolasi  BAL  proteolitik  dari  susu  kedelai  yang terfermentasi  secara  spontan.  Dari  hasil  penelitian  tersebut diperoleh dua isolat BAL proteolitik yakni L. plantarum 1 R.1.3.2 dan L. plantarum 1 R.11.1.2. Tujuan penelitian tahap kedua ini adalah  untuk  mengkaji  kemampuan  isolat L.  plantarum 1 R.1.3.2 dan L. plantarum 1 R.11.1.2 dalam memfermentasi susu kedelai.

## METODOLOGI

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah  kacang kedelai  varietas  Anjasmoro  yang  diperoleh  dari  Balai  Benih Tanaman  Palawija  –  Wonosari  Daerah  Istimewa  Yogyakarta. Isolat  bakteri  asam  laktat L.  plantarum 1 R.1.3.2  dan L. plantarum 1 R.11.1.2  hasil  isolasi  dari  susu  kedelai  yang terfermentasi  spontan  (Yusmarini et  al .,  2009). Lactobacillus acidophilus FNCC  0051  (koleksi  Laboratorium.  Mikrobiologi  – Pusat Studi Pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada). Bahan- bahan  kimia analytical  grade diantaranya  MRS  broth  (Merck), NaCl (Merck), serta bahan-bahan lainnya yang diperlukan untuk pengukuran total asam tertitrasi,  uji aktivitas proteolitik, protein terlarut  dan  berat  molekul  protein  dengan  menggunakan  gel elektroforesis.

## Pembuatan susu kedelai
Susu  kedelai  dibuat  dengan  menggunakan  metode  Pusat Pengembangan  Teknologi  Pangan  Institut  Pertanian  Bogor (Nisa et al. , 2006) dengan sedikit modifikasi . Biji kedelai kering disortir dan direndam dalam air selama 8 jam, kemudian dicuci dan  ditiriskan  lalu  direbus  hingga  matang  dan  dicuci.  Kedelai matang  dihancurkan  dengan  blender  sambil  ditambahkan  air panas  dengan  perbandingan  1:6,  lalu  disaring  dengan menggunakan kain bersih yang  telah dicuci dengan air panas. Susu  kedelai  yang  dihasilkan  kemudian  dimasukkan  ke  dalam erlenmeyer  dan  ditutup  dengan  aluminium  foil  dan  plastik. Setelah  itu  susu  kedelai  disterilisasi  pada  suhu  115 0 C  selama 10 menit.

## Fermentasi susu kedelai dengan isolat BAL
Proses fermentasi susu kedelai mengacu pada Yusmarini et al. (2001).  Susu  kedelai  yang  telah  disterilisasi  pada  suhu 115 0 C  selama  10  menit  didinginkan  dengan  cepat  hingga mencapai suhu 45 0 C). Setelah itu diinokulasi dengan isolat BAL sebanyak 1% (mengandung sekitar 10 6 cfu /ml) dan diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 20 jam. Selama inkubasi (0, 4, 8, 12, 16  dan  20  jam)  dilakukan  penghitungan  jumlah  koloni  bakteri (metode plating ) dan kemudian diukur nilai pH (pH meter) dan total asam tertitrasi (metode titrasi). Pada akhir fermentasi juga dilakukan  pengukuran  protein  terlarut  (metode  Lowry),  dan penentuan pola protein (SDS-PAGE elektroforesis).

## Penghitungan total bakteri asam laktat
Penghitungan  total  bakteri  asam  laktat  menggunakan metode plating (Rahayu  dan  Margino,  1997).  Sampel diencerkan  dalam  beberapa  seri  pengenceran,  kemudian diinokulasi pada media MRS agar yang ditambah 0,2% CaCO 3 secara tuang ( pour plate). Penambahan CaCO 3 bertujuan untuk membedakan bakteri asam laktat dengan mikroba kontaminan. Jumlah BAL dihitung untuk setiap seri pengenceran.

## Pengukuran total asam tertitrasi
Pengukuran  total  asam  tertitrasi  (%  asam  laktat)  mengacu pada Nout et al. (1989). Sampel sebanyak 10 ml dipipet secara aseptis  dan  dimasukkan  ke  dalam  erlenmeyer  dan  kemudian ditambahkan 2 tetes indikator fenolftalien 1%. Kemudian dititrasi dengan 0,1N larutan NaOH hingga timbul warna merah muda. Total asam dihitung sebagai persen asam laktat dengan rumus :
ml NaOH X Normalitas NaOH X 1/10 x 90 (%) asam laktat = ---------------------------------------------------------- ml sampel

## Pengukuran aktivitas proteolitik
Pengukuran  aktivitas  proteolitik  secara  kuantitatif  mengacu pada Walter (1984) yakni 1 ml casein 2% ditambah 1 ml bufer Tris – HCl 0,2 M pH 8. Kemudian ditambah 0,5 ml larutan enzim yang  merupakan  supernatan  yang  diperoleh  dari  hasil sentrifugasi MRS broth yang telah diinokulasi dengan isolat BAL dan  diinkubasi  selama  20  jam  (sampel);  0,5  ml  akuades (blanko) dan 0,5 ml larutan tyrosin 0,5 mMol/L (standar). Semua perlakuan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 50 0 C. Setelah itu  ditambahkan  2  ml  TCA  10%  dan  0,5  ml  akuades  untuk
sampel dan 0,5 ml larutan enzim untuk blanko maupun standar. Larutan  digojog  dan  diinkubasi  selama  10  menit  pada  suhu 37 0 C,  dan  kemudian  disentrifugasi  10.000  rpm  (89.440  g) selama  10  menit  pada  suhu  kamar.  Supernatan  sebanyak  1,5 ml ditambah 5 ml Natrium Karbonat 0,4M dan larutan folin (1:2) sebanyak 1 ml. Larutan diinkubasi selama 20 menit pada suhu 37 0 C dan kemudian absorbansi diukur pada panjang gelombang 578  nm.  Aktivitas  enzim  dinyatakan  dalam  unit  (U)  yang didefenisikan sebagai milliliter larutan enzim yang dipakai untuk membentuk 1 mikromol tirosin per menit.
Pengukuran  aktivitas  proteolitik  secara  semi  kuantitatif dilakukan  dengan  menumbuhkan  koloni  isolat  pada  medium skim milk agar. Adanya zona jernih (clear zone) di sekitar koloni menunjukkan  aktivitas  proteolitik  yang  sebanding  dengan lebarnya zona jernih di sekitar koloni.

## Penentuan profil protein
Penentuan  profil  dan  berat  molekul  protein  dilakukan dengan  menggunakan  SDS  PAGE  yang  didasarkan  pada metode Laemli (1970). Sampel yang akan digunakan ditentukan terlebih dahulu kadar protein terlarutnya dengan metode Lowry (Sudarmadji et al. , 1997).
Proses  elektroforesis  dilakukan  pada  40mA  dan  proses berakhir apabila tanda warna biru dari bromophenol biru sudah berada pada bagian bawah gel (± 1 cm dari bagian bawah gel). Gel  diambil  dari  unit  elektroforesis  dan  kemudian  dilakukan pewarnaan  dengan  larutan  comassie brilliant  blue R250  untuk mengetahui  keberadaan  protein.  Gel  yang  telah  mengalami pewarnaan  kemudian  direndam  dalam  larutan destaining sampai  latar  belakang  gel  berwarna  jernih  kembali  dan  pita ( band )  yang  terdapat  pada  gel  kelihatan  jelas.  Untuk mengetahui  berat  molekul  dari  masing-masing  pita  protein sampel,  setiap  pita  protein  sampel  dibandingkan  dengan  pita standar protein (marker) yang telah diketahui berat molekulnya yakni 32.000 – 244.000 Da.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Total bakteri asam laktat
Penghitungan  total  bakteri  asam  laktat  bertujuan  melihat kemampuan  isolat  untuk  tumbuh  pada  susu  kedelai  dengan memanfaatkan  gula  yang  ada  pada  susu  kedelai  dan  melihat pola pertumbuhan selama waktu inkubasi yakni 0, 4, 8, 12, 16, dan 20 jam. Hasil pengamatan disajikan pada Gambar 1.
Pola  pertumbuhan  isolat L.  plantarum  1 R.1.3.2. L. plantarum 1 R.11.1.2 dan L. acidophilus FNCC 0051 (Gambar 1) dari jam ke 0 hingga jam ke 8 hampir sama, namun setelah jam ke 8 hingga jam ke 20 isolat L. plantarum 1 R.1.3.2 dan L. plantarum  1 R.11.1.2  menunjukkan  pertumbuhan  yang  lebih cepat  dibandingkan  dengan L.  acidophilus FNCC  0051. Kombinasi  isolat  ( L.  acidophilus FNCC  0051  + L.  plantarum  1 R.1.3.2 ; L. acidophilus FNCC 0051 + L. plantarum 1 R.11.1.2 ; L.  plantarum  1 R.1.3.2  + L.  plantarum  1 R.11.1.2)  tidak memperlihatkan  perbedaan  pola  pertumbuhan  yang  signifikan dengan isolat tunggal L. plantarum 1 R.1.3.2 atau L. plantarum 1 R.11.1.2. Dari informasi tersebut dapat dikatakan bahwa tidak terjadi  simbiosis  mutualisme  antar  isolat.  Isolat L.  plantarum  1
R.1.3.2 maupun L. plantarum 1 R.11.1.2 diduga lebih dominan tumbuh pada susu kedelai dibanding L. acidophilus FNCC 0051. Pada  akhir  fermentasi  terlihat  bahwa  jumlah  koloni L. acidophilus FNCC  0051  satu log  cycle lebih  rendah  (10 9 ) dibandingkan  dengan  isolat L.  plantarum  1 R.1.3.2  maupun L. plantarum 1 R.11.1.2 (10 10 ). Data tersebut menunjukkan bahwa isolat L. plantarum 1 R.1.3.2 dan L. plantarum 1 R.11.1.2 dapat tumbuh  lebih  baik  pada  susu  kedelai  dibandingkan  dengan L. acidophilus FNCC 0051.
Gambar 1.   Total  bakteri  asam  laktat  selama  periode  fermentasi Keterangan : LA  (susu kedelai yang difermentasi oleh L. acidophilus FNCC  0051  ;  R.1.3.2  (  susu  kedelai  yang difermentasi oleh L. plantarum 1 R.1.3.2) ; R.11.1.2 ( susu kedelai  yang  difermentasi  oleh L.plantarum  1 R.11.1.2); LA+R.1.3.2  (  susu  kedelai  yang  difermentasi  oleh L. acidophilus FNCC  0051  + L.plantarum  1 R.1.3.2); LA+R.11.1.2  (susu  kedelai  yang  difermentasi  oleh L. acidophilus FNCC  0051  + L.plantarum  1 R.11.1.2)  dan R.1.3.2+R.11.1.2  (susu  kedelai  yang  difermentasi  oleh
L.plantarum 1 R.1.3.2 + L.plantarum 1 R.11.1.2)
Nilai pH dan total asam tertitrasi Gambar  2  memperlihatkan  perubahan  nilai  pH  dan  total asam  tertitrasi  selama  periode  fermentasi  susu  kedelai  oleh isolat L. plantarum 1 R.1.3.2. ; L. plantarum 1 R.11.1.2 dan L. acidophilus FNCC 0051 baik secara individu maupun gabungan dari  masing-masing  isolat  tersebut.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  selama  periode  fermentasi  akan  terjadi penurunan nilai pH susu kedelai yang awalnya mempunyai pH 6,7  menjadi  sekitar  4,6  –  4,8  pada  akhir  fermentasi.  Hal  ini selaras dengan hasil pengukuran total asam tertitrasi (dihitung sebagai  persen  asam  laktat)  yakni  semakin  lama  periode fermentasi akan terjadi peningkatan jumlah total asam tertitrasi yakni  dari  0,11%  menjadi  0,31%  -  0,34%  seperti  terlihat  pada Gambar 2.
Selama  proses  fermentasi  akan  terjadi  hidrolisis  gula  oleh bakteri  asam  laktat.  Gula  yang  terdapat  pada  kedelai  seperti sukrosa,  glukosa,  rafinosa  maupun  stakiosa  akan  dihidrolisis menjadi senyawa-senyawa penyusunnya. LeBlanc et al. (2004) menyatakan  bahwa  enzim  invertase  akan  menghidrolisis sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa, sedangkan rafinosa dan stakiosa  akan  dihidrolisis  oleh  enzim  α-galaktosidase  dan invertase  menjadi  glukosa,  fruktosa  dan  galaktosa.  Hasil metabolisme gula oleh bakteri asam laktat berupa energi yang dibutuhkan  untuk  pertumbuhan  sel  bakteri  dan  asam-asam
organik  terutama  asam  laktat  dan  asam-asam  organik  lainnya seperti  asam  suksinat  dan  asam  sitrat.  Asam-asam  organik tersebut akan menyebabkan terjadinya penurunan pH ataupun peningkatan  total  asam  tertitrasi  pada  susu  kedelai  selama proses  fermentasi.  Connes et  al. (2004)  menyatakan  bahwa dalam  proses  fermentasi  kedelai,  nilai  pH  yang  pada  awalnya mendekati  netral  akan  mengalami  penurunan  selama  proses fermentasi yang disebabkan karena terjadinya perubahan gula menjadi asam-asam organik.
Gambar 2.   Nilai  pH  dan  total  asam  tertitrasi  susu  kedelai  selama periode  fermentasi.  Keterangan  :  LA  (susu  kedelai  yang difermentasi  oleh L.  acidophilus FNCC  0051  ;  R.1.3.2  ( susu  kedelai  yang  difermentasi  oleh L.  plantarum  1 R.1.3.2) ; R.11.1.2 ( susu kedelai yang difermentasi oleh L.plantarum 1 R.11.1.2); LA+R.1.3.2 ( susu kedelai yang difermentasi  oleh L.  acidophilus FNCC  0051  + L.plantarum  1 R.1.3.2);  LA+R.11.1.2  (susu  kedelai  yang difermentasi  oleh L.  acidophilus FNCC  0051  + L.plantarum  1 R.11.1.2)  dan  R.1.3.2+R.11.1.2  (susu kedelai  yang  difermentasi  oleh L.plantarum  1 R.1.3.2  + L.plantarum 1 R.11.1.2)
Kemampuan isolat L. plantarum 1 R.1.3.2 dan L. plantarum 1 R.11.1.2 untuk memfermentasi gula yang terdapat pada susu kedelai tidak jauh berbeda. Hal ini terlihat dari nilai pH maupun total asam tertitrasi yang nilainya tidak jauh berbeda, namun jika dibandingkan dengan L. acidophilus FNCC 0051 secara statistik terdapat perbedaan yang signifikan.
Nilai pH yang terukur pada susu kedelai yang difermentasi dengan L. acidophilus FNCC 0051 (4,87) lebih tinggi dan total asam  tertitrasi  (0,316%)  lebih  rendah  dibandingkan  dengan susu  kedelai  yang  difermentasi  dengan  isolat L.  plantarum  1 R.1.3.2  dan L.  plantarum  1 R.11.1.2.  Nilai  pH  dan  total  asam laktat pada susu kedelai yang difermentasi oleh L. plantarum 1 R.1.3.2  secara  berurutan  adalah  4,66  dan  0,342%  sedangkan yang  difermentasi  oleh L.  plantarum  1 R.11.1.2.  adalah  4,67 dan  0,333%.  Kombinasi  isolat  tidak  menunjukkan  pengaruh yang  signifikan  terhadap  penurunan  nilai  pH  maupun peningkatan total asam tertitrasi jika dibandingkan dengan isolat tunggal L. plantarum 1 R.1.2.3 dan L. plantarum 1 R.11.1.2.

## Aktivitas proteolitik
Hasil  pengukuran  aktivitas  proteolitik  secara  kuantitatif disajikan  pada  Gambar  3  dan  dari  gambar  tersebut  terlihat bahwa isolat L. plantarum 1 R.1.3.2 dan L. plantarum 1 R.11.1.2
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0 1 2 3 4 5 6 7 0 4 8 12 16 20 To ta l a sa m (%) N ila i p H Periode Fermentasi (jam) LA R.1.3.2. R.11.1.2 LA+R.1.3.2 LA+R.11.1.2 R.1.3.2+R.11.1.2 pH                    asam 4 5 6 7 8 9 10 11 0 4 8 12 16 20 LA R.1.3.2 R.11.1.1 LA+R.1.3.2 LA+R.11.1.2 R.1.3.2+R.11.1.2
Lo g (c fu /m l)
Periode  fermentasi   (jam)
mempunyai  kemampuan  proteolitik  lebih  tinggi  dibandingkan L.acidophilus FNCC 0051.
Gambar 3.   Aktivitas  proteolitik  dari L.  acidophilus FNCC  0051, L. plantarum 1 R.1.3.2 dan L. plantarum 1 R.11.1.2. Notasi dengan  huruf  yang  berbeda  menunjukkan  perbedaan yang nyata pada taraf kepercayaan 5%
Dari  Gambar  3  terlihat  bahwa  ketiga  isolat  yakni L. plantarum 1 R.1.3.2; L. plantarum 1 R.11.1.2 dan L. acidophilus FNCC 0051 mempunyai aktivitas proteolitik berturut-turut 0,468 U/ml  dan  0,418  U/ml  dan  0,352  U/ml.  Yusmarini et  al. (2009) menyatakan  bahwa  aktivitas  proteolitik  isolat L.  plantarum 1 R.1.3.2, L.  plantarum 1  R.11.1.2  secara  semi  kuantitatif (pengukuran  zona  jernih  pada  media  skim  milk  agar)  berturut- turut 0,825 cm dan 0,750 cm. Hal ini menunjukkan bahwa isolat yang berbeda mempunyai aktivitas yang  hampir sama. Namun kadangkala  isolat  yang  berada  dalam  1  spesies  mempunyai aktivitas proteolitik yang berbeda.
Nakazawa dan Hasono (1992) menyatakan bahwa aktivitas proteolitik  dari  BAL  yang  berada  dalam  satu  spesies  mungkin saja  sama  ataupun  berbeda.  Hasil  penelitian  Gobbetti  et  al. (1996)  menunjukkan  bahwa  aktivitas  spesifik  dari  enzim protease yang dihasilkan oleh L. plantarum DC400 lebih besar dibanding L.acidophilus BF4  maupun L.  fermentum CC5. Selanjutnya Garabal et al. (2007) menyatakan bahwa Lactococ- ci mempunyai aktivitas proteolitik yang lebih tinggi dibandingkan dengan Lactobacilli.

## Protein terlarut
Hasil  pengukuran  menunjukkan  terjadinya  penurunan konsentrasi  protein  terlarut  setelah  susu  kedelai  difermentasi selama  20  jam  seperti  terlihat  pada  Gambar  4.  Pada  awal fermentasi  jumlah  protein  terlarut  lebih  tinggi  yakni  berkisar antara  35,13mg/ml  hingga  38,83mg/ml.  Setelah  susu  kedelai difermentasi  selama  20  jam  jumlah  protein  terlarut  mengalami penurunan  yakni  berkisar  antara  30,43mg/ml  -  32,33  mg/ml. Isolat yang digunakan untuk memfermentasi susu kedelai akan menghidrolisis  protein  kedelai  menjadi  protein/peptida  yang berukuran  lebih  kecil  seperti  terlihat  pada  Gambar  5,  namun kandungan  protein  terlarut  mengalami  penurunan.  Hal  ini disebabkan  karena  selama  proses  fermentasi,  bakteri  asam laktat  akan  memetabolisme  karbohidrat  yang  terdapat  pada susu  kedelai  dan  menghasilkan  asam  organik  terutama  asam laktat yang menyebabkan terjadinya penurunan nilai pH. Pada pH  rendah  akan  terjadi  koagulasi  protein  kedelai  (Liu et  al. , 2006). Koagulasi protein kedelai dapat terjadi pada pH di sekitar titik  isoelektrisnya  yakni  sekitar  4,2  -  4,6.  Hasil  pengamatan
menunjukkan  bahwa  pH  susu  kedelai  setelah  difermentasi adalah  4,6  –  4,8.  Pada  pH  tersebut  kelarutan  protein  akan berkurang.  Wolf  dan  Cowan  (1971)  menyatakan  bahwa kelarutan  protein  kedelai  minimal  pada  pH  4,2  –  4,6  yang merupakan titik isolektrisnya.
Yumiko et al. (2008) menambahkan bahwa protein kedelai komersil  menunjukkan  kelarutan  minimum  52%  pada  pH  4,0 dan maksimum kelarutan 62% pada pH 10.
Gambar 4.   Protein terlarut pada susu kedelai fermentasi. Keterangan :  LA  (susu  kedelai  yang  difermentasi  oleh L.  acidophilus FNCC  0051  ;  R.1.3.2  (  susu  kedelai  yang  difermentasi oleh L. plantarum 1 R.1.3.2) ; R.11.1.2 ( susu kedelai yang difermentasi  oleh L.plantarum  1 R.11.1.2);  LA+R.1.3.2  ( susu kedelai yang difermentasi oleh L. acidophilus FNCC 0051 + L.plantarum 1 R.1.3.2); LA+R.11.1.2 (susu kedelai yang  difermentasi  oleh L.  acidophilus FNCC  0051  + L.plantarum  1 R.11.1.2)  dan  R.1.3.2+R.11.1.2  (susu kedelai  yang  difermentasi  oleh L.plantarum  1 R.1.3.2  + L.plantarum 1 R.11.1.2)
Penggunaan  beberapa  isolat  secara  statistik  tidak mempengaruhi  jumlah  protein  terlarut  pada  susu  kedelai  dan kecenderungan penurunan protein terlarut untuk masing-masing isolat yang digunakan juga tidak berbeda nyata.

## Profil protein
Profil  protein  pada  susu  kedelai  non  fermentasi  dan  susu kedelai fermentasi dapat diketahui dengan menggunakan teknik elektroforesis  yakni  dengan  SDS-PAGE.  Gel  disusun  oleh akrilamid  dan  bis  akrilamid  yang  berpolimerisasi  melalui mekanisme  radikal  bebas  dengan  bantuan  N,N,N’,N’, tetrametilen diamina (TEMED) dan inisiator ammonium persulfat (Dunn,  1989).  Prinsip  analisis  dengan  SDS  –  PAGE  adalah pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul.
Hasil penelitian yang terlihat pada Gambar  5 menunjukkan bahwa  ada  perbedaan  pola  protein  pada  susu  kedelai  non fermentasi dan susu kedelai fermentasi.
Pada  Gambar  5  terlihat  bahwa  proses  fermentasi  susu kedelai  oleh  bakteri  asam  laktat  menyebabkan  terjadinya perubahan pola protein secara signifikan.
Pada susu kedelai terfermentasi (pita nomor 2 – 7) dijumpai peptida  yang  berukuran  163.830  Da,  109.572  Da,  77.392  Da dan  25.888  Da.143Da  (pita  berwarna  merah)  dan  peptida tersebut  tidak dijumpai pada susu kedelai  non fermentasi (pita nomor 1). Hal ini menunjukkan bahwa selama proses fermentasi isolat yang digunakan akan menghasilkan enzim protease yang menghidrolisis  protein  menjadi  protein/peptida  yang  lebih sederhana.
Gambar 5.   Pola  Protein  dari  susu  kedelai  non  fermentasi  dan  susu  kedelai  fermentasi  Keterangan  :  (1)  susu  kedelai  (2)  susu  kedelai  yang difermentasi oleh L. acidophilus FNCC 0051 (LA) (3) susu kedelai yang difermentasi oleh L.plantarum 1 R.1.3.2 (4) susu kedelai yang difermentasi oleh L.plantarum 1 R.11.1.2 (5) susu kedelai yang difermentasi oleh L. acidophilus FNCC 0051 + L.plantarum 1 R.1.3.2 (6) susu kedelai yang difermentasi oleh L. acidophilus FNCC 0051 + L.plantarum 1 R.11.1.2 dan (7) susu kedelai yang difermentasi oleh L.plantarum 1 R.1.3.2 + L.plantarum 1 R.11.1.2 (8) marker protein.
Gobetti et  al. (1996)  menyatakan  bahwa  beberapa  strain Lactobacillus  menghasilkan  enzim  protease  yang  mampu menghidrolisis  protein  seperti  casein  maupun  gluten  dengan aktivitas yang berbeda-beda. Meskipun ada perbedaan aktivitas proteolitik dari isolat yang digunakan namun pemecahan protein oleh enzim protease tersebut relatif sama. Hal ini terlihat pada Gambar  5  yang  menunjukkan  bahwa  penggunaan  masing- masing  isolat  maupun  kombinasi  isolat  menghasilkan pemecahan protein yang sama.
Yusmarini et  al. (2001)  menyatakan  bahwa  selama  proses fermentasi susu kedelai oleh L. acidophilus dan Streptococcus thermophilus akan  terjadi  hidrolisis  protein  kedelai  menjadi molekul yang lebih sederhana dan profil peptida yang dihasilkan juga hampir sama.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa isolat L.plantarum 1 R.1.3.2 ; L.plantarum 1 R.11.1.2 dapat memfer- mentasi  susu  kedelai  yang  ditandai  dengan  terjadinya  pening- katan  jumlah  koloni  bakteri  dan  penurunan  nilai  pH  serta peningkatan  total  asam  tertitrasi  selama  proses  fermentasi. Aktivitas proteolitik isolat L.plantarum 1 R.1.3.2 (0,468 U/ml) dan L.plantarum 1 R.11.1.2  (0,418  U/ml)  lebih  besar  dibanding aktivitas proteolitik L.acidophilus FNCC 0051 (0,352 U/ml). Hasil  analisa  profil  protein/peptida  dengan  menggunakan SDS-PAGE  menunjukkan  bahwa  pola  pemecahan  protein selama fermentasi oleh ketiga isolat dan kombinasi antar isolat tidak menunjukkan perbedaan yang nyata.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  LPPM Universitas  Gadjah  Mada  dan  program  I-MHERE  Universitas Riau yang telah membantu mendanai penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Bordignon  JR,  Nakahara  K,  Yoshihashi  T,  Nikkuni  S.  2004. Hydrolysis of isoflavone and consumption of oligosacharides during lactic acid fermentation of soybean milk. JARQ 38 (4) 259- 265.
Connes C, Silvestron A, Leblanc JG, Juillard V, Savoy de Giori,
G, Sesma F, Piard JC. 2004. Towards probiotic lactic acid bacteria  strains  to  remove  raffinose-type  sugars  present  in soy-derived product. Review. INRA, EDP Science.
Dunn  MJ.  1989.  Electrophoretic  Analysis  Methods.  di  dalam Harris ELV, Angal S. Editor. Protein Purification Methods. A Practical Approach. IRL Press. Oxford.
Garabal JI,  Alonso PR, Centeno JA. 2007.  Characterization of lactic  acid  bacteria  isolated  from  raw  cow’s  milk  cheeses currently  produced  in  Galicia  (  NW  Spain).  Swiss  Soc.  of Food Sci. And Technol.
Gobbetti  M,  Smacchi  E,  Fox  P,  Stepaniak  L,  Corsetti  A.1996. The  Sourdough  Microflora.  Cellular  Localization  and Characterization  of  Proteolytic  Enzymes  in  Lactic  Acid Bacteria. Academic Press Limited.
Kwok  J,  De  Vos  WM.  1994.  The  Proteolytic  System  of  Lacic Acid Bacteria. in : Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria. Ed Gasson and De Vos. 1994. Blackie Academic & Professional. Glasgow.
LeBlanc  JG,  Garro  MS,  Silvestroni  A,  Connes  C,  Piard  J-C., Sesma  F,  Savoy  de  Giori  G.  2004.  Reduction  of  α- galactooligosaccharides  in  soyamilk  by Lactobacillus fermentum CRL  722  :  in  vitro  and  in  vivo  evaluation  of fermented soyamilk. J. Appl. Microbiol. 97: 876-881.
Laemmli  UK.  1970.  Cleavage  of  structural  proteins  during  the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227 ; 680 -685
Liu DM, Li Li, Yang XQ, Liang SZ, Wang JS. 2006. Survivability of Lactobacillus  rhamnosus during  the  preparation  of  soy cheese.  Food  Thecnol.  Biotechnology.  44  (3)  :  417-
422.Nakazawa  Y,  Hosono  A.  1992.  Function  of  fermented milk. Challenges for the health sciences. 180-184S
Nisa  FZ,  Marsono  Y,  Harmayani  E.  2006.  Efek hipokolesterolemik  susu  kedelai  fermentasi  steril  pada model hewan coba. Agrosains, 19(1) : 41-53
Nout  MJR,  Rombouts  FM,  Havelaar  A.  1989,  Effect  of accelerated  natural  lactic  acid  fermentation  of  infant  food ingredients on some phatogenic microorganism. Int. J. Food Micribiol. 84 : 351-354
Rahayu ES, Margino S. 1997. Bakteri Asam Laktat : Isolasi dan Identifikasi.  Materi  Workshop,  diselenggarakan  oleh  PAU Pangan  Gizi.  Universitas  Gadjah  Mada  13-14  Juni  1997.
Yogyakarta
Sudarmadji  S,  Haryono  B,  Suhardi.  2007.  Prosedur  Analisa untuk Bahan Makanan dan Pertanian. Liberty. Yogyakarta.
Thomas  TD,  Pritchard  GG.  1987.  Proteolytic  enzymes  from
dairy  starter  cultures.  Fed.  Eur.  Microbiol.  Soc.Microbiol.
Rev. 46: 245
Walter  HE.  1984.  Method  with  Haemoglobin,  Casein  and Azocoll as Subtrate, in : Bergmeyer, H.U. (ed). Methods of Enzymatic  Analysis.  Verlag  Chemie.  Deerfield  Beach Florida Basel.
Wolf  WJ,  Cowan  JC.  1971.  Soybean  as  a  Food  Source.  The Chemical Rubber Co. Cleveland, Ohio.
Yumiko YS, Wada Y, Wäsche A. 2008. Chemical composition, functional  properties,  and  bioactivities  of  rapeseed  protein isolat. Food Chemistry 107: 32-39
Yusmarini,    Adnan  M,  Hadiwiyoto  S.  2001.  Perubahan  nilai cerna  dan  fraksi  protein  pada  susu  kedelai  dalam  proses pembuatan soygurt. Agritech Vol. 21 No.3. 95-98.
Yusmarini,  Indrati  R,  Utami  T,  Marsono  Y.  2009.  Isolasi  dan identifikasi  bakteri  asam  laktat  proteolitik  dari  susu  kedelai yang  terfermentasi  spontan.  Jurnal  Natur  Indonesia 12.1. 28-33.