## Metabolit sekunder pada ekstrak Chlorella sp. yang dikultur pada media limbah ternak ayam
Devy Susanty* 1 , Ade Ayu Oksari 2 , Rizky Izani 1
1 Program Studi kimia, FMIPA, Universitas Nusa Bangsa
2 Program Studi Biologi, FMIPA, Universitas Nusa Bangsa, Jl. KH. Sholeh Iskandar Km. 4, Tanah Sareal, Bogor e-mail: * 1 dvsusanty@gmail.com
Diterima: 10 September 2019 / Disetujui: 7 Desember 2019 / Dipublikasi online: 31 Desember 2019 DOI: https://doi.org/10.22437/chp.v4i2.7615

## ABSTRAK
Pencemaran  lingkungan  yang  berasal  dari  limbah  ternak  ayam  broiler  dapat dikurangi  dengan  memanfaatkan  kotoran  ayam  sebagai  media  tumbuh.  Pada penelitian ini, Chlorella sp (inaCC M39) dikultur pada media limbah ternak ayam Broiler dengan konsentrasi 20 gram/L. Limbah yang digunakan merupakan kotoran ayam broiler yang telah dikeringkan. Kadar Nitrogen (N), Fospor (P), dan Kalium (K) dianalisis menggunakan metode kjeldahl (N), dan metode spektrofotometri (P dan K). Kadar N pada limbah kotoran ayam yaitu 0,8%, kadar P sebesar 0,041%, dan kadar K sebesar 112,58 mg/L.  Pertumbuhan Chlorella sp diamati selama 16 hari setiap 48 jam dengan spectrofotometer pada panjang gelombang 680 nm. Jumlah sel  tertinggi  terdapat  pada  hari  ke-14.  Biomassa  Chlorella  sp  diekstrak  dengan pelarut  kloroform  dan  dilanjutkan  dengan  pelarut  metanol,  lalu  dilakukan  uji fitokimia. Ekstrak metanol Chlorella sp memiliki kandungan steroid dan saponin.
Kata Kunci : limbah, ayam broiler, media, Chlorella sp., ekstrak

## ABSTRACT
Environmental  pollution  from  broiler  chicken  waste  can  be  reduced  by  utilizing chicken manure as a growing medium. In this study, Chlorella sp (inaCC M39) was cultured on Broiler chicken waste media with a concentration of 20 grams/L. The waste  used  is  dried  broiler  chicken  manure.  Nitrogen  (N),  Phosphorus  (P),  and Potassium  (K)  levels  were  analyzed  using  the  Kjeldahl  (N)  method,  and  the spectrophotometric method (P and K). N level in chicken manure waste is 0.8%, P level  is  0.041%,  and  K  level  is  112.58  mg  /  L.  The  growth  of  Chlorella  sp.  was observed for 16 days every 48 hours with a spectrophotometer at a wavelength of 680  nm.  The  highest  number  of  cells  was  found  on  the  14 th day.  Chlorella  sp. biomass was extracted with chloroform solvents and followed by methanol solvents, then  phytochemical  tests  were  performed.  The  methanol  extract  of  Chlorella  sp. contains steroids and saponins.
Keywords: waste, broiler chicken, media, Chlorella sp., extract

## PENDAHULUAN
Mikroalga merupakan mikroorganisme yang banyak terdapat di perairan dan tanah.  Metabolisme  yang  mirip  dengan  tumbuhan  tingkat  tinggi  dan  kompleks menjadikan mikroalga menarik untuk diteliti kebermafaatannya dalam berbagai aspek. Senyawa metabolit yang dihasilkan oleh mikroalga menjadi faktor penting
dalam  menentukan  kegunaan  mikroalga  tersebut.  Manfaat  mikroalga  telah banyak  diteliti  untuk  beberapa  aspek  diantaranya  sebagai  sumber  energi terbarukan  (Chisti,  2008;  Brennano  dan    Owende,  2010;  Li  et  al.,  2011), antioksidan (Guedes et al., 2011; Guedes et al., 2013), antikanker (Sheih et al., 2010;  Samarakoon  et  al.,  2013),  dan  antimikroba  (Hamawi,  2015;  Pane  et  al., 2015).
Media kultur menjadi salah satu faktor yang penting dalam pertumbuhan dan metabolisme mikroalga. Pemilihan media kultur sebaiknya mempertimbangkan  biaya  yang  dibutuhkan  sehingga  pemanfaatan  mikrolaga khususnya Chlorella sp. tidak mengeluarkan biaya yang besar. Salah satu solusi dalam  menekan  biaya  kultur  mikroalga  yaitu  dengan  memanfaatkan  limbah. Beberapa limbah telah diteliti mampu menjadi media kultur mikroalga (Djaghoubi et al., 2015; Azhar et al., 2017; Farooq et al., 2013).
Perkembangan  jenis  makanan  yang  diolah  dari  ayam  broiler  memberikan efek pada meluasnya peternakan ayam broiler di Bogor. Hal ini berdampak pada semakin  banyaknya  limbah  kotoran  yang  dihasilkan.  Limbah  kotoran  ternak ayam broiler menjadi salah satu limbah yang diharapkan mampu sebagai media kultur  mikroalga  karena  diduga  kuat  mengandung  unsur  hara  utama  yang dibutuhkan  mikroalga  yatiu  Nitrogen (N),  Fosfor  (P),  dan  Kalium (K).  Untuk  itu perlu dilakukan penelitian pemanfaatan limbah ayam broiler sebagai media kultur Chlorella  sp.  dengan  harapan  dapat  mengurangi  dampak  limbah  terhadap lingkungan dan mampu menekan biaya produksi Chlorella sp.
Pada  penelitian  ini,  kandungan  N,  P,  dan  K  pada  kotoran  ayam  broiler dianalisis dan kultivasi Chlorella sp dilakukan pada media kotoran ayam broiler dengan  konsentrasi  20  gram/L.  Biomassa  Chlorella  sp  diekstrak  dengan kloroform, dilanjutkan dengan methanol dan dilakukan uji fitokimia.

## METODOLOGI PENELITIAN

## Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  yaitu  kotoran  ayam  broiler  yang  diperoleh  dari kandang ayam di Cijeruk, Chlorella sp (InaCC M39), Kloroform, Metanol (SMART- LAB), CuSO 4 . 5H 2 O, Na 2 SO 4 anhidrat, H 2 SO 4 pekat, NaOH, HCl, akuades, pereaksi Mayer,  Pereaksi  Wagner,  Pereaksi  Dragendorf,  Mg,  HClO 4 .  Peralatan  yang digunakan  yaitu  Buchi  Scrubber  K-415,  Buchi  Distillation  unit K350,  ICP-OES Perkin Elmer, Spectrofotometer UV-Vis Agilent, dan peralatan gelas lainnya.

## Penentuan Kadar Nitrogen (N) pada kotoran ayam
Penentuan  kadar  N  dilakukan  dengan  metode  kjeldahl  menggunakan  0,5 gram kotoran ayam kering serta penambahan natrium sulfat, tembaga sulfat, dan asam sulfat pekat. Larutan yang telah dipanaskan pada labu ditambahkan NaOH 0,5N. Proses destilasi dilakukan dengan HCl, selanjutkan kelebihan HCl dititrasi dengan NaOH.
%Nitrogen = (𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑡𝑖𝑡𝑟𝑎𝑡 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜−𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑡𝑖𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙) 𝑥 1,4 𝑥 𝑁𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑁 𝑥 𝐹 𝑘 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑔𝑟𝑎𝑚)

## Penentuan Kadar Fosfor (P) pada kotoran ayam
Limbah  kotoran  ayam  broiler  kering  yang  telah  dihaluskan  ditimbang sebanyak 1 gram. Sampel ditambahkan HNO 3 , didihkan dan ditambahkan HClO 4 . Kadar P ditentukan dengan metoda spektrofotometri pada panjang gelombang 400 nm.

## Penentuan Kadar Kalium (K) pada kotoran ayam
Penentuan kadar K dilakukan dengan penambahan HNO 3 dan HClO 3 pada 0,5  gram  sampel  limbah  kotoran  pada  labu  Kjeldahl.  Serangkaian  proses dekstruksi  dilakukan  untuk  mendapatkan  ekstrak  jernih.  Kadar  K  diukur menggunakan Inductively Couple Plasma (ICP).

## Kultivasi dan Pertumbuhan Chlorella sp pada media limbah kotoran ternak ayam
Limbah  kotoran  ternak  ayam  broiler  dilarutkan  dengan  akuades  dengan konsentrasi 20 gram/L sebagai media tumbuh. Kultivasi Chlorella sp  dilakukan pada media kotoran ayam dengan suhu 30 o C dan menggunakan pencahayaan dari 2 lampu TL 18 watt (3000 Lux). Densitas sel dihitung dengan spectrofotometer pada panjang gelombang 680 nm.

## Ekstraksi metabolit sekunder dari Chlorella sp.
Chlorella  sp.  yang  dikultur  selama  14  hari  dikumpulkan  dengan  cara disentrifius (1500 rpm, 10 menit), kemudian biomassa dilarutkan dengan pelarut klorofom dengan perbandingan biomassa sel dengan pelarut 1:10 (b/v). Larutan ditempatkan  pada  Erlenmeyer  250  mL,  lalu  dikocok  menggunakan  shaker  (72 jam),  disaring  sehingga  diperoleh  Ekstrak  kloroform.  Biomassa  sisa  ekstraksi pertama, diekstrak lagi dengan Metanol dan diperoleh ektrak methanol. Pelarut diuapkan hingga diperoleh ekstrak kental.

## Uji Kualitatif Fitokimia Ekstrak Chlorella sp
Uji  kandungan  bioaktif  alkaloid,  terpenoid,  flavonoid,  saponin  dan  tanin (metode uji fitokimia) dilakukan berdasarkan Harborne (1984) yang dimodifikasi.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Unsur  N,  P  dan  K  umumnya  diperlukan  oleh  tumbuhan,  termasuk mikroalga.  Limbah  kotoran  ternak  diketahui  memiliki  nutrisi  untuk  media tumbuh  mikroalga.  Kotoran  Ayam  broiler  yang  merupakan  salah  satu  Limbah Ternak  Ayam  Broiler  diperkirakan  mengandung  unsur  N,  P,  dan  K  sehingga mampu dijadikan media untuk kultivasi  Chlorella sp. Menurut  Hariatik (2014), unsur  N,  P  dan  K  banyak  terdapat  pada  feses  ternak.  Pancapalaga  (2011) menyatakan pupuk kandang yang berasal dari feses ayam mengandung Nitrogen sebesar  1%,  Fosfor  0,8  %  dan  Kalium  0,4%.  Kandungan  zat  hara  pada  pupuk kandang yang berasal dari feses ayam lebih tinggi dari feses sapi (Lingga, 1999). Berdasarkan hasil penelitian, sampel kotoran ayam Broiler memiliki kandungan N, P,dan K seperti Tabel 1.
Tabel 1. Kadar N, P, dan K pada kotoran ayam broiler
Unsur Kadar Nitrogen 0,8 % Fosfor 0,041% Kalium 112,58 mg/L
Secara  umum,  mikroalga  tumbuh  seperti  mikroba  dengan  melalui  4  fase (Zhao et al., 2014). Chlorella sp. Memiliki kemampuan untuk hidup pada media limbah ternak ayam broiler dengan konsentrasi 20 gram/L (Gambar 1). Fase lag atau adaptasi tidak begitu terlihat, ini menandakan bahwa Chlorella sp mampu beradaptasi dengan baik dan mampu tumbuh dalam media limbah ternak ayam broiler. Pertumbuhan yang lebih cepat dimulai dari hari ke delapan dan mencapai puncak  pada  hari  ke-14  Penurunan  tumbuh  atau  fase  kematian  Chlorella  sp. terjadi  setelah  14  hari.  Hal  ini  disebabkan  semakin  berkurangnya  nutrisi  yang tersedia pada media.
Mikroalga membutuhkan nitrogen dalam jumlah tertentu, khususnya untuk proses  transportasi,  katabolisme,  asimilasi,  dan  khusunya  biosintesis  protein (Agustini  dan  Kabinawa,  2002  dalam  Manalu,  2010).  Fosfor  berperan  dalam pempentukan  sel  mikroalga  dan  transport  energi,  sedangkan  kalium  berperan dalam pembentukan karbohidrat (Manalu, 2010). Limbah kotoran ayam broiler mengandung  0,8%  Nitrogen  total,  dengan  perbandingan  N  dan  P  yaitu  20:1.
Perbadingan N dan P tersebut dianggap sesuai untuk pertumbuhan mikroalga. Chlorella  sp.  dapat  tumbuh  pada  media  POME  dengan  perbandinga  N  dan  P sebesar 16: 1 (Mahdi et al., 2012). Menurut Paes et al. (2016), Chlorella sp. mampu tumbuh pada media tanpa nitrogen namun berpengaruh pada konsentrasi lipid. Susanty  (2017)  menyatakan  konsentrasi  nitrogen  pada  media  mempengaruhi pertumbuhan  mikroalga.  Toleransi  mikroalga  terhadap  nitrogen  dalam  bentuk amonium menjadi faktor penentu kemampuan bioremediasi mikroalga terhadap amonium  yang  terdapat  pada  limbah  (Wang,  2019).  Mikroalga  memiliki kemampuan menyerap nutrisi yang ada pada limbah atau sebagai bioremediasi sejalan dengan pertumbuhannya (azhar et al., 2017).
Gambar 1. Pertumbuhan Chlorella sp pada media kotoran ayam broiler 20 g/L
Tabel 2. Uji fitokimia ekstrak Chlorella sp.
Keterangan: (+) : ada (-) : Tidak ada
Uji  fitokimia  menunjukkan  adanya  steroid  dan  saponin  pada  ekstrak metanol,  sedangkan  pada  ekstrak  kloroform  tidak  menunjukkan  keberadaan senyawa metabolit sekunder. Hasil negatif pada semua uji fitokimia pada ekstrak
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 A bso rb an si Hari ke- Nama Uji
Hasil Ekstrak Kloroform Ekstrak Metanol Alkaloid (-) (-) Flavonoid (-) (-) Terpenoid/Steroid (-) (+) Saponin (-) (+) Tanin (-) (-)
kloroform  dapat  disebabkan  oleh  ketidaksesuaian  pelarut  ekstraksi  dengan senyawa metabolit sekunder. Ekstraksi dengan pelarut methanol diketahui lebih mampu  mengekstrak  senyawa  metabolit  sekunder  yang  ada  pada  Chlorella  sp. Fithriani et al. (2015) memperoleh hasil ekstrak etanol Chlorella sp. menggandung tanin, flavonoid,  steroid,   glikosida, saponin  dan   alkaloid.  Senyawa  golongan steroid juga diketahui ada pada ekstrak metanol Chlorella sp. yang dikultur pada Media Ekstrak Tauge (Bariyyah, et al., 2013; Fasya, 2013).
Adanya  steroid  dan  saponin  pada  ekstrak  metanol  Chlorella  sp. memungkinkan  ekstrak  tersebut  dapat  dimanfaatkan  dalam  berbagai  aspek. Steroid  yang  terdapat  pada  mikroalga  umumnya  berupa  fitosterol  yang  dapat berfungsi sebagai antidiabetes, antioksidan, dan antiinflamasi (Sathasivam et al., 2019).    Keberadaan  fitosterol  pada  mikroalga  berdampak  pada  pengembangan kultur mikroalga untuk industri makanan dan obat (Luo et al., 2015). Wu et al. (2017) memperoleh senyawa fitosterol pada ekstrak C. vulgaris berupa ergosterol. Ergosterol  memiliki  boaktivitas  sebagai  antikanker,  antikolestrol  dan antiinflamasi (Luo et al., 2015).

## Gambar 2. Ergosterol (Luo et al., 2015)
Saponin  merupakan  golongan  senyawa  yang  memiliki  berbagai  aktivitas terkait  dengan  struktur  dan  jenis  senyawa  tertentu.    Saponin  terdiri  dari  unit aglikon  yang  terhubung  dengan  satu  atau  lebih  banyak  rantai  karbohidrat (Savage, 2003).

## Gambar 3. Struktur saponin dari kacang kedelai (Savage, 2003)
Selain pada Chlorella sp., saponin pada dasarnya banyak ditemukan pada kacang-kacangan,  seperti  buncis  dan  kacang  kedelai  (Fenwick  dan  Oakenfull, 1983). Berdasarkan penelitian mengenai saponin pada kacang-kacangan, saponin diketahui memiliki aktivitas dalam mengurangi tingkat kolesterol plasma dalam diri manusia (Savage, 2003; Murphy et al., 2018). Beberapa studi menunjukkan bahwa saponin dapat mengurangi kolesterol melalui pembentukan dari kompleks yang  tidak  larut  dengan  kolesterol,  sehingga  mencegah  penyerapannya  dalam usus  (Murphy  et  al.,  2018).  Saponin  pada  tumbuhan  juga  memiliki  aktivitas antimikroba.  Beberapa  senyawa  steroid  saponin  yang  diisolasi  dari  Paullinia pinnata  diketahui  memiliki  aktivitas  antibakteri  dan  antifungal  (Lunga  et  al., 2014).

## KESIMPULAN
Pada  limbah  kotoran  ayam  broiler  kering  terdapat  N  sebanyak  0,8%,  P sebanyak 0,041 % dan  K sebanyak 112,58 mg/L.  Chlorella sp dapat beradaptasi dan  hidup  dengan  baik  pada  media  limbah  ternak  ayam  broiler  dengan konsentrasi 20 gram/L. Pertumbuhan Chlorella sp. mencapai puncak pada hari ke-14. Ekstrak Metanol Chlorella sp. Mengandung steroid dan saponin.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Bagian  dari  penelitian  ini  didanai  oleh  Kementerian  Riset,  Teknologi  dan Pendidikan Tinggi Republik Indonesia.

## DAFTAR PUSTAKA
Azhar,  A.,  A.  Dharma,  N.  Nasir,  dan  Z.  Chaidir.  2017.  Integrasi  bioremediasi limbah  peternakan  sapi  dan  kultivasi  mikroalga  chlorella  vulgaris  dan chlorella pyrenoidosae. J Katalisator. 2 (2):67-78.
Bariyyah,  S.K.,  A.  G.  Fasya,  M.  Abidin,  dan  A.  Hanapi.  2013.  Uji  Aktivitas Antioksidan  Terhadap  DPPH  dan  Identifikasi    Golongan  Senyawa  Aktif Ekstrak Kasar Mikralga Chlorella sp. Hasil Kultivasi  dalam Medium Ekstrak Tauge. ALCHEMY. 2(3): 150-204.
Brennano,  L.,  dan  P.  Owende.  2010.  Biofuels  from  microalgae-A  review  of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co- products. Renew Sustain Energy Rev. 14:557-557.
Chisti, Y. 2008. Biodiesel from microalgae beats bioethanol. Trends Biotechnol. 26 (3):126-131.
Djaghoubi, A., M. D. Bouhoun, S. H. Said, A. Saggaï, S. Sobti, dan B. H. Aissa. 2015.  Growth  and  Nitrogen  Removal  Efficiency  as  Protein  Content  of Spirulina  from  Tertiary  Municipal  Wastewater  in  Ouargla  (Algerian  Bas- Sahara). Energy Procedia. 74:1402-1409.
Farooq,  W.,  Y.  C.  Lee,  B.  G.  Ryu,  B.H.  Kim,  H.  S.  Kim,  Y.  E.  Choi,  dan  J.  W. Yang. 2013.  Two-stage  cultivation  of  two  Chlorella  sp.  strains  by simultaneous  treatment  of  brewery  wastewater  and  maximizing  lipid productivity. Bioresour Technol. 132: 230-238.
Fasya,  A.  G.,  U.  Khamidah,  S.  Amaliyah  S,  S.  Khairul,  dan  Romaidi.  2013.  Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol Mikroalga Chlorella sp. Hasil Kultivasi dalam  Medium  Ekstrak  Tauge  (MET)  Pada  Setiap  Fase  Pertumbuhan. Alchemy. 2(3):162-169.
Fenwick, D. E., dan D. Oakenfull. 1983. Saponin content of food plants and some prepared foods. Journal of the Science of Food and Agriculture. 34(2): 186– 191.
Fithriani,  D.,  S.  Amini,  S.  Melanie,  dan  R.  Susilowati.  2015. Uji  Fitokimia, Kandungan Total Fenol dan Aktivitas Antioksidan Mikroalga Spirulina sp., Chlorella sp., dan Nannochloropsis sp. JPB Kelautan dan Perikanan. 10(2): 101–109.
Guedes, A. C., H. M. Amaro, dan F. X. Malcata. 2011. Microalgae as sources of carotenoids. Mar Drugs. 9:625-644.
Guedes, A. C., M. S. Gião, R. Seabra, et al. 2013. Evaluation of the antioxidant activity of cell extracts from microalgae. Mar Drugs. 11:1256-1270.
Hamawi, M.  2015. Uji Metabolit Sekunder Trichoderma sp. Sebagai Antimikroba Patogen  Tanaman  Pseudomonas  solanacearum  Secara  In  Vitro.  Gontor AGROTECH Sci J. 2(1):19.
Harborne,  J.  B.  2006.  Metode  Fitokimia:  Penuntun  Cara  Modern  Menganalisis Tumbuhan  (alih  bahasa:  Kosasih  Padmawinata  &  Iwang  Soediro).  Institut Teknologi Bandung. Bandung.
Hariatik. 2014. Perbandingan Unsur NPK pada Pupuk Organik Kotoran Sapi dan Kotoran  Ayam  dengan  Pembiakan  Mikro  Organisme  Lokal  (MOL)”.

## Conference paper
Li, Y., Y. F. Chen, P. Chen, M. Min, W. Zhou, B. Martinez, J. Zhu, dan R. Ruan. 2011. Characterization of a microalga  Chlorella sp. well adapted to highly concentrated  municipal  wastewater  for  nutrient  removal  and  biodiesel production. Bioresour Technol. 102: 5138-5144.
Lingga, P.1999. Petunjuk Penggunaan Pupuk. Penebar Swadaya. Jakarta.
Luo, X., P. Su, dan W. Zhang. 2015. Advances in Microalgae-Derived Phytosterols for Functional Food and Pharmaceutical Applications. Marine Drugs. 13(7): 4231–4254.
Mahdi,  M.  Z.,  Y.  N.  Titisari,  dan  Hadiyanto.  2012.  Evaluasi  Pertumbuhan Mikroalga  dalam  medium  POME:  Variasi  Jenis  Mikroalga,  Medium,  dan Waktu Penambahan Nutrient. Jurnal Teknologi Kimia dan Industri. 1(1): 284- 291.
Manalu,  S.  2010.  Karakterisasi  Pertumbuhan  Mikroalga  Dan  Eliminasi  Nutrien Dari  Limbah  Cair  Peternakan  Dengan  Sistem  Semi  Kontinu.  Skripsi. Jurusan  Teknologi  Industri  Pertanian,  Fakultas  Teknologi  Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Murphy, K. J., I. Marques-Lopes, dan A. Sánchez-Tainta. 2018. The Prevention of Cardiovascular  Disease  Through  the  Mediterranean  Diet.  Cereals  and Legumes. 111–132.
Paes, C. R. P. S., G. R. Faria, N. A. B. Tinoco, D. J. F. A. Castro, E. Barbarino, dan S. O. Lourenco. 2016. Growth, nutrient uptake and chemical composition of Chlorella  sp.  and  Nannochloropsis  oculata  under  nitrogen  starvation.  Lat. Am. J. Aquat. Res. 44(2): 275-292.
Pancapalaga, W. 2011. Pengaruh Rasio Penggunaan Limbah Ternak Dan Hijauan Terhadap Kualitas Pupuk Cair. GAMMA. 7 (1): 61-58.
Pane, G., G. Cacciola, E. Giacco, G. L. Mariottini, dan E. Coppo. 2015. Assessment of  the  antimicrobial  activity  of  algae  extracts  on  bacteria  responsible  of external otitis. Mar Drugs.
Samarakoon, K. W., J. Y. Ko, M. M. R. Shah, J. H. Lee, J. B. Lee, dan Y. J. Jeon. 2013.  In  vitro  studies  of  anti-inflammatory  and  anticancer  activities  of organic solvent extracts from cultured marine microalgae. Algae. 28(1):111- 119.
Sathasivam,  R.,  R.  Radhakrishnan,  A.  Hashem,  dan  E.  F.  Abd_Allah.  2019. Microalgae Metabolites: A rich source for food and medicine. Saudi Journal of Biological Sciences. 26: 709-722.
Susanty,  D.  2017.  Isolasi  dan  Analisis  Asam  Lemak  Scenedesmus  quadricauda yang Diisolasi dari Air Kolam. Jurnal Sains Natural. 7 (1): 8-22.
Sheih,  I.  C.,  T.  J.  Fang,  T.  K.  Wu,  P.  H.  Lin.  2010.  Anticancer  and  antioxidant activities of the peptide fraction from algae protein waste. J Agric Food Chem. 58:1202-1207.
Wang,  J.,  W.  Zhou,  H.  Chen,  J.  Zhan,  C.  He,  dan  Q.  Wang.  2019.  A mmonium Nitrogen  Tolerant Chlorella Strain  Screening  and  Its  Damaging  Effects  on Photosynthesis. Front. Microbiol. 9:1-13.
Wu, J., C. Liu, dan Y. Lu. 2017. Preparative separation of phytosterol analogues from  green  alga  Chlorella  vulgaris  using  recycling  counter-current chromatography. Journal of Separation Science. 40(11): 2326–2334.
Zhao, B. dan Y. Su. 2014. Process effect of microalgal-carbon dioxide fixation and biomass production. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 31: 121- 132.