# Korespondensi:  Pusat  Riset  Perikanan.  Gedung  Balitbang  KP  2, Jl.  Pasir  Putih  2,  Ancol  Timur,  Jakarta  Utara,  Indonesia.
Tel.:  +  (021)    64700928 E-mail:    istisugama@yahoo.com
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/ma

## APLIKASI  REAL  TIME–QUANTITATIVE  POLYMERASE  CHAIN  REACTION  (RT-qPCR) DALAM KUANTIFIKASI KOI HERPES VIRUS PADA IKAN MAS (Cyprinus carpio)
Isti  Koesharyani *)# ,  Lila  Gardenia **) ,  Tatik  Mufidah **) ,  dan  Ayi  Santika ***)
*) Pusat Riset Perikanan
**) Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar dan Penyuluhan Perikanan
***) Balai Budidaya Perikanan Air Tawar Sukabumi
(Naskah diterima: 7 April 2017; Revisi final: 21 Juli 2017; Disetujui publikasi: 21 Juli 2017)

## ABSTRAK
Koi Herpes Virus (KHV) di Indonesia sejak tahun 2002 merupakan penyakit mematikan yang menyerang ikan koi Cyprinus carpio koi dan ikan mas Cyprinus carpio carpio, dan sampai saat ini, infeksi KHV dilaporkan sudah menyebar hampir di seluruh dunia. Untuk mengetahui adanya infeksi KHV perlu cara diagnosa yang sangat akurat/sensitif, sehingga keberadaan KHV dapat diketahui secara pasti dengan tingkat sensitivitas yang lebih baik pada ikan budidaya. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengaplikasikan teknik deteksi dengan real time quantitative polymerase chain reaction (RT- qPCR/qPCR) guna mengetahui adanya infeksi KHV secara kuantitatif pada ikan mas dengan mengetahui kandungan virus (viral load). Sebanyak masing-masing 3 ekor sampel diperoleh dari sentra budidaya ikan mas di Cirata-Jawa Barat, Maninjau-Sumatera Barat, dan Banjarmasin-Kalimantan Selatan. Sampel-sampel tersebut selanjutnya dianalisa keberadaan KHV-nya dengan RT-qPCR menggunakan SYBR Green. Hasil pengujian menunjukkan bahwa jumlah tertinggi (viral load) diperoleh dari ikan mas asal Cirata-3 dengan nilai Threshold Cycle (Ct.) 18,24 atau setara dengan 3,4 x 10 7 kopi, dan terendah dari ikan mas asal Banjarmasin-3 dengan nilai Ct. 33,39 atau 1,8 x 10 2 kopi. Dua standar yang digunakan dalam pengujian ini berupa plasmid dengan jumlah kopi 2 x 10 4 (Ct 27,24) dan 2 x 10 3 (Ct 30,24) dan kontrol atau Non Template Control (NTC) adalah 3,1 x 10 atau dengan nilai Ct 35,65. Uji aplikasi deteksi KHV dengan metode RT-qPCR ini memberikan hasil yang lebih sensitif, di mana sampel yang tidak terdeteksi dengan metode PCR konvensional dapat dideteksi dan dihitung jumlah kopi DNA (DNA copy).
KATA KUNCI: ikan mas; Koi Herpesvirus; Real Time–Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR); SYBR Green
ABSTRACT:
Detection of KHV in carp (Cyprinus carpio) by SYBR Green Quantitative-Real Time Polymerase Chain Reaction (Q-RT PCR). By: Isti Koesharyani, Lila Gardenia, Tatik Mufidah, and Ayi Santika
Since 2002,  Koi herpesvirus (KHV) in Indonesian has been a malignant diseases,  now recognized as a worldwide cause of mortality among populations of koi Cyprinus carpio koi and common carp Cyprinus carpio carpio. To determine the presence of infection  is required the KHV diagnosis method with highly accurate and sensitive, so that the existence KHV can be known exactly with high sensitivity level in fish farming.The objective of this study was to develop and evaluate the infection by Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT- qPCR/qPCR). Sample were taken from Carp culture in West Java, West Sumatra, and South Kalimantan.  The assay was done by SYBR Green RT-qPCR. The analysis result of KHV in carp revealed that the carp from Cirata-3 had the highest viral load with Ct. value 18.24 equal with 3.4 x 10 7 copies, and the lowest one was the carp from Banjarmasin-3 at Ct. value 33.39 (1.8 x 10 2 copies), while two standards plasmid and Non Template Control (NTC)  had Ct value of 27.24 (2 x 10 4 copies),30.24 (2 x 10 3 copies), and 35.65  (3.1 x 10 copies),  respectively. Application KHV test  by q-PCR has more  advantages and sensitive than that of conventional PCR, and it can be used to detect and calculate the copy number of DNA.
KEYWORDS: Cyprinus carpio carpio; Koi Herpesvirus; Real Time–Quantitative Polymerase Chain Reaction
(RT-q PCR), SYBR Green

## PENDAHULUAN
Koi  Herpesvirus  (KHV)  pertama  kali  terjadi  di United  Kingdom  (UK)  pada  tahun  1996,  kemudian secara definitif kasus ini terjadi di Israel dan German pada  tahun  1998  (OIE,  2016).  KHV  ini  selanjutnya menyebar ke beberapa negara dan dilaporkan sampai saat ini ada sekitar 28 Negara meliputi Eropa, Amerika, dan Asia (Hedrick et al., 2000; OIE, 2016) dan Canada (Garver et al., 2010). Di Asia kasus KHV ini ditemukan di  China  (Hong  Kong),  Chinese  Taipei,  Indonesia, Jepang, Korea, Malaysia, Singapore (melalui ikan yang diimpor dari  Malaysia) dan Thailand (Haenen et al., 2004; Ilouze et al., 2011; Pikulkaew et al., 2009; Sano et al., 2004; Sunarto, 2004, OIE, 2016). Sedangkan di Indonesia KHV mulai terjadi di Blitar-Jawa Timur pada tahun 2002 yang selanjutnya menyebarluas ke seluruh Pulau Jawa, Bali, Sumatera Selatan, Kalimantan Timur, dan Sulawesi Tengah (Sunarto et al., 2005). Gejala khas infeksi  KHV  ini  adanya  necrosis/haemorrhages/ inflamasi pada insang, sirip, ekor, luka pada permukaan kulit,  letarghic,  dan  kehilangan  lendir.  Secara histopatologi,  kerusakan  virion  sel  yang  ditandai dengan adanya vakuolasi akibat KHV ini sama seperti yang dilaporkan oleh negara yang mengalami outbreak KHV  (Sunarto  et  al.,  2005,  Sunarto  et  al.,  2011). Cepatnya penyebaran virus ini salah satunya disebabkan oleh transportasi perdagangan ikan mas dan koi antar daerah  atau  pulau  di  Indonesia  dan  total  kerugian akibat adanya KHV pada tahun 2002 dan 2003 berturut- turut mencapai lebih dari US$ 10 juta dan US$ 15 juta (Sunarto,  2005).  Ikan  mas  merupakan  sumber  pro- tein masyarakat yang relatif murah yang dimanfaatkan untuk  memenuhi  gizi  masyarakat  di  Indonesia. Sedangkan penghobi ikan hias koi yang mempunyai harga mahal dengan adanya kasus infeksi KHV ini, bisa menimbulkan  kerugian  yang  mencapai  ratusan  juta rupiah.  Kasus  KHV  ini  biasanya  sering  terjadi  pada saat perubahan musim atau pada saat suhu air rendah berkisar 18-28°C. Suhu tersebut merupakan suhu per- missive utuk berkembangbiaknya virus KHV (Gilad et al., 2004). Di Indonesia biasanya outbreak KHV sering terjadi pada perubahan musim. Dengan diketahuinya suhu permissive KHV tersebut maka pola budidaya/waktu budidaya perlu diperhatikan dengan cermat dan baik untuk  menghindari  infeksi  KHV.  Di  samping  itu  di dalam budidaya, yang perlu diperhatikan adalah kualitas induk  dan  bibit  yang  sehat  dan  bebas  infeksi  KHV. Untuk  mengetahui  adanya  infeksi  KHV  ini  dapat dilakukan dengan berbagai metode atau cara. Metode diagnosis yang umum dan sudah banyak diaplikasikan adalah dengan teknik Polimerase Chain Reaction (PCR) berbasis DNA molekuler menggunakan spesifik primer KHV (Gray et al., 2002; Yuasa et al., 2005; Gilad et al., 2002).  Metode  ini  relatif  cepat,  tepat,  dan  sensitif dibandingkan metode lain. Diagnosa PCR merupakan
teknik perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa  menggunakan  organisme.  Dalam  proses amplifikasi PCR digunakan sepasang spesifik sekuen primer  atau  oligonukleotida.  Proses  PCR  ini berlangsung  dengan  tiga  tahap  siklus  berbasis temperatur  yang  berurutan  yaitu  denaturation  pada suhu (94 o C–95 o C), annealing (penempelan) pasangan primer pada untai ganda DNA target pada suhu (50 o C– 60 o C) dan pemanjangan (72 o C). Dengan berkembangnya metode  diagnosa,  akhir-akhir  ini  ada  metode  yang lebih sensitif dibandingkan dengan PCR konvensional dan  masih  berbasis  DNA  molekuler  yaitu  dengan metode Real Time Quantitative-Polymerase Chain Reac- tion (RT-qPCR) atau sering disebut sebagai metode q- PCR. Diagnosa dengan q-PCR mempunyai keunggulan yang  lebih  yaitu  tingkat  sensitivitasnya  yang  lebih tinggi dan mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi (Gilad et al., 2004). Analisa q-PCR ini reaksinya  hampir  sama  dengan  PCR  menggunakan sepasang primer dan hasilnya dapat diamati pada saat reaksi  masih  berlangsung,  keberadaan  DNA  hasil amplifikasi  dapat  diamati  pada  grafik  yang  muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari penanda SYBR Green,  di  samping  itu  tahap  elektroforesis  yang menggunakan bahan karsinogenik (ethidum bromida) tidak  perlu  lagi  dilakukan.  Dengan  berbagai keunggulannya yang lebih ini maka dilakukan penelitian tentang  percobaan  aplikasi  diagnosis  KHV  berbasis molekuler yang lebih sensitif menggunakan Real Time- Quantitative PCR dengan SYBR Green pada budidaya ikan  mas.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk mengaplikasikan  teknik  deteksi  dengan  real  time quantitative polymerase chain reaction (RT- qPCR/qPCR) guna mengetahui adanya infeksi KHV secara kuantitatif pada ikan mas dengan mengetahui kandungan virus (viral  load).  Diharapkan  penelitian  ini  dapat diaplikasikan untuk pencegahan  dengan melakukan deteksi  dini  guna  menghindari  timbulnya  penyakit sehingga KHV dapat ditekan penyebarannya.

## METODOLOGI

## Sampel  Ikan
Sampel ikan mas “sehat” masing-masing diambil 3 ekor yang diperoleh dari lokasi budidaya jaring apung di Danau Cirata-Jawa Barat, Maninjau-Sumatra Barat, dan Banjarmasin-Kalimantan Selatan, dengan ukuran bobot  berkisar  antara  150-1000  g.  Sampel  berupa jaringan  (insang)  disimpan  dalam  larutan  pengawet ethanol  95%.  Untuk  selanjutnya  dianalisa  di laboratorium. Menurut Gilad et al. (2004), insang, limfa, dan ginjal adalah target organ yang sangat baik untuk pengujian KHV.

## Ektraksi DNA
Masing-masing dari sampel ikan uji diambil jaringan insang  seberat  ±  10  mg,  dilisis/dihancurkan  dalam (2 mL) mikro tube Precellys Ceramic ditambahkan 250 µL Lysis uffer ( mole product), kemudian di hancurkan (stroked) dengan alat Homogenization PeqLab dengan kekuatan 5000 rpm selama 3 menit sebanyak 3 kali, inkubasikan pada suhu 37°C selama 1 jam. Tambahkan 10  µLRNase  A  (DNase  &  Protease  Free)  10mg/mL untuk  menghilangkan  RNA  dan  protein  sebagai penghambat  amplifikasi,  inkubasikan  kembali  pada suhu  37°C  selama  kurang  dari  1  jam.  Lysate (supernatan) diproses selanjutnya untuk mendapatkan DNA  dalam  Gen  Mole  secara  Robotik,  proses  ini memakan waktu selama 45 menit, kemudian DNA di eluated dengan  100  µL  pelarut  DNA.  Selanjutnya kuantitas DNA diukur menggunakan nanodrop, dan kemurnian DNA-nya diukur pada panjang gelombang antara  (OD 260/280 =  1,8–2,0).  Di  samping  itu  untuk memastikan  mendapatkan  kualitas  DNA  yang  baik, maka  dilakukan  elektroforesis  DNA  pada  1,5% Agarose campuran (5 µL DNA hasil ekstraksi + 4 µL Loading Dye + 2 µL H 2 O) dalam 1 x TAE (Triss-EDTA), selama 45 menit, marker yang digunakan adalah EcoRI + HindIII (546 bp–21226 bp). Hanya gambaran DNA dengan garis tegas saja yang selanjutnya digunakan dalam  uji  PCR  dan  Real-Time  PCR.  DNA  kemudian diukur secara pasti untuk diencerkan dengan pelarut DNA atau H 2 O sampai menjadi 10 ng -25 ng/µL setiap sampel.

## Polymerase  Chain  Reaction  (PCR)  KHV
Analisa  PCR  konvensional  KHV  dilakukan menggunakan sepasang primer spesifik yaitu Sph 1-5 dari Gray et al. (2002) yang telah disempurnakan oleh Yuasa  et  al.  (2005).  Adapun  susunan  sekuen  primer forward:  5’gAC  ACC  ACA  TCT  gCA  Agg  Ag  3’  dan primer reverse: 5’ gAC ACA TgT TAC AAT ggT CgC 3’, dengan  target  berat  molekul  290  bp.  Sedangkan konsentrasi primer yang digunakan adalah 20 pMol.

## Amplifikasi  &  Elektrophoresis  PCR
Siapkan  total  10  µL  mastermix  yang  terdiri  atas (2 µL) 5x Green Go Taq Flexi (Promega), (1,4 µL) 25 mM MgCl 2 , (0,2 µL) 10 mM dNTP mix, (0,1 µL) Go Taq DNA polymerase, (2 µL) primer reverse/forward 290 bp. (20 pMol),(1 µL) DNA template dan ditambahkan H 2 O sampai 10 µL. Campuran selanjutnya diamplifikasi atau  diperbanyak  dengan  mesin  Speedy  Cycler-Jena dengan kondisi siklus: Intial denaturasi pada suhu 94°C selama 120 detik, 40 kali: denaturasi 94°C selama 10 detik; annealing 63°C selama 10 detik; extensión 72°C selama 20 detik, selanjutnya final extensión 1 x dengan
suhu  72°C  selama  120  detik.  Hasil  amplifikasi  atau perbanyakan DNA target selanjutnya dielektroforesis pada  2%  agarose  menggunakan  1  X  TAE  Buffer  dan diamati menggunakan UV-Transilluminator.

## Real-Time  Quatitative  PCR-SYBR  Green
Analisa  Real-Time  Quatitative  PCR-SYBR  Green menggunakan  IQ  SYBR  Green  Supermix  2x  (Biorad). Campuran atau mastermix yang yang digunakan untuk setiap sampel adalah dengan total 25 µL. terdiri atas: 12,5 IQ SYBR Green supermix 2x (100 mM KCL, 40 mM tris HCk, pH 8, 0,4 mM masing-masing dNTP (dATP, dGTP, dan dTTP, Taq Polymerase 50 units/mL, 6 mM MgCl 2 , SYBR Green I, 20 nM flourescen dan stabilizer) masing-masing 1 µL primer reverse dan forward (20 pMol), 2 µL DNA template dan ditambahkan H 2 O sampai dengan  25  µL.  Campuran  tersebut  disiapkan  sesuai dengan jumlah sampel dan ditambah kontrol sampel yang  terukur  (20.000,  2.000  copy  DNA)  serta  blank sampel  atau  Non  Template  Control  (NTC).  Tes dilakukan dengan dua kali pengulangan (duplo) untuk setiap sampel uji, selanjutnya dimasukkan dalam mesin Real-Time PCR: Rotor Gene Q 5-plex (Qiagen). Profil Cycle condition Real-Time PCR: Intial denaturasi pada suhu 94°C selama 30 detik, 45 kali : denaturasi 94°C selama  30  detik;  annealing  63°C  selama  30  detik; extensión  72°C  selama  30  detik,  selanjutnya  final extensión 1 x dengan suhu 72°C selama 7 menit. Analisa data  berupa  jumlah  copy  DNA  dari  masing-masing sampel dihubungkan dengan nilai Ct.

## HASIL DAN BAHASAN
Ikan  sampel  yang  diperoleh  dalam  pengujian  ini mempunyai ukuran yang bervariasi dan kondisi ikan semua terlihat ’sehat’. Sampel ikan dari Waduk Cirata berukuran sekitar (150 g), sedangkan ikan mas yang berasal dari Maninjau berukuran (300 g). Sampel ikan dari kedua lokasi Waduk Cirata dan Maninjau pada saat itu  terindikasi  sudah  mulai  terjadi  kematian  tetapi belum diketahui penyebabnya. Sedangkan ikan yang berasal dari Banjarmasin berukuran relatif lebih besar (± 1 kg) yang merupakan ikan sisa wabah KHV yang masih bertahan hidup (Gambar 1).

## Ektraksi DNA
DNA  hasil  ektraksi  diukur  konsentrasi  dan kemurniannya  secara  kuantitatif  dengan  Nanodrop pada panjang gelombang (OD 260/280 = 1,8–2,0), kualitas DNA hasil ekstraksi dapat dilihat pada Tabel 1. Hasil ektraksi DNA telah memenuhi syarat untuk dilakukan uji PCR  selanjutnya. Sedangkan  untuk kualitas  DNA secara  kualitatif  bisa  juga  dilakukan  dengan
Gambar 1. Lokasi sampling di Sungai Awangbangkal di Kecamatan Karangintan, Banjarmasin, Kalimantan Selatan (A), pengambilan sampel  jaringan insang (B), ikan mas yang berukuran ±1 kg (C).
Figure 1. Sampling  location  in  Awangbangkal  River at  Karangintan,  Banjarmasin  district  South  Kalimantan (A), gill tissue sampling (B), common carp with weighting 1 kg (C).
Tabel 1. Jumlah dan kualitas ektraksi DNA dari sampel ikan mas dari  berbagai  daerah  diukur  dengan  Nanodrop  pada panjang gelombang (OD 260/280 = 1,8–2,0) Table 1. Quantity  and  quality  DNA  carp  from  different  area  by Nanodropat wavelength (OD 260/280 = 1.8–2.0) Sampel Quantity (ng/µL) Quality (OD 260/280 ) Cirata 1 165.3 1.85 Cirata 2 225.8 1.85 Cirata 3 147.4 1.84 Banjarmasin1 133.5 1.87 Banjarmasin2 169.2 1.85 Banjarmasin3 134.0 1.82 Manijau 1 203.4 1.84 Manijau 2 213.4 1.88 Manijau 3 260.2 1.85
Gambar 2. Kualitas DNA ikan mas yang berasal dari berbagai daerah (M: Marker EcoRI + HindIII (564 bp-21 226 bp); (1). Cirata 1, (2). Cirata 2, (3). Cirata 3, (4). Banjarmasin 1, (5). Banjarmasin 2, (6). Banjarmasin 3, (7). Maninjau 1, (8). Maninjau 2, (9). Maninjau 3.
Figure 2. DNA quality of carp from different area (M: Marker EcoRI + HindIII (564 bp-21 226 bp); (1). Cirata 1, (2). Cirata 2, (3). Cirata 3, (4). Banjarmasin 1, (5). Banjarmasin 2, (6). Banjarmasin 3,  (7).  Maninjau  1,  (8).  Maninjau  2,  (9).  Maninjau  3.
bp 21226 5148 4973 4268 3530 2027 1904 1584 1375 947 831 564 0.5  g/lane, 8 cm length gel, 1X TAE, 7 V/cm, 45 min

## A                                                  B                                                  C
mengelektroforesis DNA pada 1,5% agarose, di mana garis band yang yang terlihat tegas pada ukuran sekitar 5000 bp. Dengan marker EcoRI + HindIII (Gambar 2, dengan lingkaran merah).

## Analisa  PCR
Dari  semua  sampel  uji  ikan  yang  terlihat  ‘sehat’ setelah dilakukan tes PCR konvensional ternyata ada dua sampel dari  Cirata positif KHV dari  tiga sampel ikan  yang  diuji,  kondisi  ini  karena  pada  saat pengambilan sampel di daerah tersebut sudah mulai terjadi  kematian  tanpa  diketahui  penyebabnya. Kemungkinan pada saat itu infeksi virus sudah mulai terjadi walaupun belum terjadi outbreak yang parah, Infeksi  sekunder  bakteri  sepertinya  terlihat  karena ditemukan adanya luka pada permukaan tubuh ikan dan kematian ikan yang tidak massal pada kawasan budidaya  di  Waduk  Cirata  sehingga  dapat mempengaruhi  kondisi  ikan  yang  menjadi  lemah sehigga infeksi virus sangat mudah masuk. Sedangkan sampel uji yang berasal dari Banjarmasin menunjukkan ada 2 ekor terlihat positif KHV, keadaan ini disebabkan ikan mas tersebut adalah survivor dari outbreak yang pernah  terjadi  sehingga  virus  KHV  masih  terdapat dalam tubuh ikan walau tidak mematikan karena ukuran ikan  relatif  besar  yaitu  sekitar  1  kg  sehingga pertahanan  diri  adanya  infeksi  lebih  baik.  Tetapi keadaan ini sangat membahayakan di mana bila terjadi perubahan lingkungan terutama suhu air 23-28°C yang merupakan  suhu  permissive  untuk  KHV  (Gilad  et  al., 2004) dapat menjadi sumber penyakit. Akibat lanjut kondisi  ini  bisa  menyebabkan  outbreak  dan menyebarkan  virus  pada  suatu  kawasan  budidaya seperti  lokasi  budidaya  di  Karangintan  di  mana sepanjang  sungai  terdapat  keramba  yang membudidayakan ikan mas. Sedangkan sampel uji yang berasal dari Maninjau hanya ada satu sampel uji ikan
mas  yang  positif  KHV,  di  mana  di  daerah  tersebut merupakan daerah endemi KHV. Gambaran hasil PCR dengan  spesifk  primer  KHV  dapat  dilihat  pada Gambar 3.

## Real-Time  Quantitative  PCR
Analisa dengan metode Real-Time PCR ada dua cara yaitu bisa menggunakan dye flourescent yang berbeda seperti SYBR Green dan menggunakan Probe (seutas oligonukleotida  yang  dilabel  dengan  flourescent tertentu).  Diagnosa  atau  deteksi  Real-Time  yang menggunakan SYBR Green ternyata lebih sederhana dan murah,  cepat  serta  sensitif  dibandingkan menggunakan  probe  karena  tidak  perlu  melakukan labeling oligonukleotida. Dalam melakukan analisa RT- qPCR  ini  syaratnya  harus  selalu  mempunyai  positif kontrol  yang  terukur  sebagai  standar,  karena  hasil kuantifikasi sampel uji akan selalu dibandingkan dengan positif  kontrol  yang  terukur.  Dalam  uji  ini  sebagai positif kontrol digunakan DNA KHV yang berasal dari CEFAS England yang sudah terukur dalam satuan 20.000 copies dan 2.000 copies DNA. Hasil analisa deteksi dan kuantifikasi KHV dari berbagai daerah budidaya ikan mas, ternyata sampel yang berasal dari Banjarmasin-3 Kalimantan  yang  negatif  pada  PCR  konvensional ternyata  dapat  terdeteksi  dengan  metode  q-PCR dengan jumlah viral load 1,8 x 10 2 (Ct 33,39) yang dapat dilihat  dari  hasil  gel  profil  pada  Gambar  4.  Uji sensitivitas  Real-Time  yang  pernah  dilakukan  pada deteksi dan sensitivitas virus udang IHHNV dan WSSV menggunakan SYBR Green dapat mendeteksi 100–2000 kali  lebih  sensitif  dibandingkan  dengan  PCR konvensional  (Dhar  et  al.,  2001).  Aplikasi  q-PCR menggunakan SYBR Green ini juga dapat digunakan untuk mendeteksi virus dan bakteri (Nam et al., 2005; Granja et al., 2006; Dhar et al., 2001).
290 bp 200 bp
Gambar 3. Amplifikasi  PCR  menggunakan  primers  dengan  target  berat  molekul  290  bp. Marker Low Range Molekul Ladder, (1). Cirata 1 , (2). Cirata 2, (3). Cirata 3, (4).
Banjarmasin 1, (5). Banjarmasin 2, (6). Banjarmasin 3, (7). Maninjau 1, (8). Maninjau 2, (9). Maninjau 3), dan negatif kontrol.
Figure 3. Amplificationof PCR by using primers molecular targetat 290 bp. Marker Low Range Molekul  Ladder,  (1).  Cirata  1,  (2).  Cirata  2,  (3).  Cirata  3,  (4).  Banjarmasin  1,  (5). Banjarmasin 2, (6). Banjarmasin 3, (7). Maninjau 1, (8). Maninjau 2, (9). Maninjau
3), and negative control.
400 bp
200 bp

## Analisa Real-Time Quantitative PCR - SYBR Green
Data  sampel  uji  setelah  dianalisa  dengan menggunakan  softwear  dan  dibandingkan  dengan standar kopi  DNA yang  digunakan, diperoleh  grafik berupa amplification curve, standart curve dan melting curve (Gambar 4). Hasil pengujian ini mempunyai batas deteksi untuk seluruh sampel terendah adalah 1,8 x 10 2 copies (Ct= 33,39) sampai dengan tertinggi 3,4 x 10 7 (Ct=  18,24), dengan  nilai  R 2 =  0,979  pada  nilai slop (Y= -2.880). Di mana dilaporkan bahwa analisa dikatakan  valid  jika  memiliki  nilai  koefisien  (R 2 )  > 0,95.  Pada  pengujian  ini  standar  copies  20000  dan 2000 mempunyai nilai Ct berturut-turut 27,54 (2,0 x 10 4 copies) dan 30,24 (2,0 x 10 3 copies). Pada pengujian ini hanya menggunakan 2 standar kopi, tetapi untuk hasil yang lebih akurat sedikitnya harus menggunakan 3 standar kopi sehingga didapat nilai kurva standar yang lebih baik. Sebaiknya standar dibuat selalu baru setiap  saat  melakukan  pengujian,  standar  pada pengujian  dengan  q-PCR  ini  sangat  penting  karena dapat mempengaruhi tingkat sensitivitas diagnosa itu sendiri  (Sritunyalucksana  et  al.,  2006).  Hasil  analisa kuantitatif dari beberapa sampel uji ikan mas ini dapat dilihat pada Tabel 2. Analisa q-PCR ini ternyata lebih sensitif,  ini  dibuktikan  dari  data  di  Tabel  2  bahwa sampel dari Banjarmasin 3 terlihat positif pada analisa q-PCR  tetapi  pada  hasil  konvensional  PCR  hasilnya negatif. Oleh karena itu diagnosa dengan metode ini sangat baik diterapkan untuk mendeteksi adanya KHV pada taraf infeksi awal atau pada ikan karier. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Bergmann et al. (2009),
ada beberapa  jenis ikan  yang bersifat  karier seperti ikan  gold  fish  (C.  auratus),  grass  carp (Ctenopharyngodon  idella),  dan  Ancistrus  sp.,  hasil  uji coba infeksi  buatan bahwa  ikan-ikan tersebut  tidak bisa terinfeksi oleh KHV tetapi bisa terdeteksi adanya DNA KHV dengan menggunakan nested-PCR. Dalam hal ini  analisa  q-PCR  bisa  juga  diaplikasikan  pada  ikan karier yang ada di Indonesia, seperti banyak dilaporkan bahwa  ikan  nila,  gurame,  dan  ikan-ikan  lain  yang dibudidayakan  kemungkinan  menjadi  karier  adanya KHV. Indonesia saat ini banyak juga melakukan impor ikan koi yang kebanyakan didatangkan dari negara Asia terutama  Jepang,  kondisi ini  harus  selalu  dilakukan uji adanya KHV menggunakan metode q-PCR yang lebih sensitif.  Mekanisme  penularan  KHV  bisa  melalui beberapa  cara  seperti,  paparan  dengan  air  yang mengandung  ikan  yang  terinfeksi  berat,  ikan  sehat dicampur  dengan  ikan  yang  terinfeksi  dan  melalui penyuntikan atau perendaman supernatan kultur sel KHV (Bergmann et al., 2009). Jenis KHV yang ada di Indonesia  dari  hasil  analisa  pilogenitas  atau kekerabatan KHV menggunakan gen Thymidin kinase, ternyata  isolat  KHV  yang  ada  di  Indonesia  ini kekerabatannya  lebih  dekat dengan  isolat  KHV  asal Asia dari pada isolat asal Eropa (Sunarto et al., 2011). Sehingga dapat disimpulkan kemungkinan penyebaran KHV ke Indonesia ini melalui lalu lintas perdagangan ikan  koi  terutama  yang  digunakan  untuk  pameran Internasional sehingga mekanisme  penyebaran KHV yang telah disebutkan di atas bisa terjadi di Indone- sia  dan akhirnya  KHV menyebar  ke seluruh  penjuru Indonesia.  Secara  ekonomi  metode  deteksi
Gambar 4. Hasil amplifikasi Real-Time Quantitative PCR-SYBR Green gambaran pada agarose gel menggunakan primers KHV dengan target berat molekul 290 bp. Marker Low Range Molekul Ladder, (1). Cirata 1, (2). Cirata 2, (3). Cirata 3, (4). Banjarmasin 1, (5). Banjarmasin 2, (6). Banjarmasin 3, (7). Maninjau 1, (8). Maninjau 2, (9). Maninjau
3, Standar 20.000 kopi, Standar 2.000 kopi dan negatif kontrol (NTC). Figure 4. Agarose  Gel  profile  amplificated  SYBR  Green  Real-Time  by  using  primers  molecular target  290  bp.  Marker  Low  Range  Molekul  Ladder,  (1).  Cirata  1,  (2).  Cirata  2,  (3). Cirata 3, (4). Banjarmasin 1, (5). Banjarmasin 2, (6). Banjarmasin 3, (7). Maninjau 1, (8).  Maninjau 2,  (9). Maninjau  3, Standar  20,000 copies,  Standard 2,000  copies and negative control (NTC). 200 bp 400 bp 400 bp 200 bp
Tabel 2. Nilai  rata-rata  Ct,  copy  DNA  serta  profile  produk  Real-Time  PCR  dan  PCR konvensional pada agaroe dari sampel KHV ikan mas dari berbagai daerah budidaya
Table 2. Averrage Ct value of copy DNA and profile product Real-Time PCR and conventional PCR  sample KHV from different carp culture area on gel agarose
Gambar 5. Kurva/grafik hasil analisa Real Time Quantitatif Polymerase Chain Reaction, (a) kurva amplifikasi dan (b) kurva standar (c) kurva melting sampel ikan mas dari berbagai daerah budidaya.
Figure 5. Analized curves/chart of Real Time Quantitatif Polymerase Chain Reaction, (a) amplification curve  and (b) standard curve (c) melting curve carp samplefrom different culture area.
a. Cycling Curve b. Standar Curve c. Melting Curve Cirata N0. 3 3,4x10 7 Cycle18,24 dimmers KHV N o rm F lu o ro 10 -05 10 -10 10 -15 10 -20 10 -25 10 -30 5      10     15      20      25     30      35      40      45 Cycle F lu o re sc e n ce 1 0 5 Threshold Cirata  No.  3 3.4  x  10 7 Cycle  18.24 5       10     15      20      25      30      35      40      45 Cycle dimmers KHV 75              80               85              90               95 °C 10 2 10 4 10 6 Concentration a. Cycling curve b. Standart curve b. Melting curve
Sample CT value Copies DNA Gel-Profile q-PCR Gel-Profile PCR Cirata 1 35.17 4.5 x 10 - - Cirata 2 27.24 2.1 x 104 + + Cirata 3 18.24 3.4 x 107 + + Banjarmasin 1 27.85 1.5 x 104 + + Banjarmasin 2 32.46 3.9 x 102 + + Banjarmasin 3 33.39 1.8 x 102 + - Manijau 1 34.81 6.3 x 10 - - Manijau 2 35.05 5.2 x 10 - - Manijau 3 26.81 3.6 x 104 + + Standar 20 000 copies 27.54 2.0 x 104 + NT Standar 2 000 copies 30.24 2.0 x 103 + NT NTC 35.65 3.1 x 10 - NT NT: No Tested
menggunakan qPCR ini relatif lebih mahal dibandingkan dengan PCR konvensional, akan tetapi metode ini lebih sensitif, terkuantifikasi dan terhindar dari kontaminasi silang selama proses deteksi pada proses post PCR.
Data-data analisa Real-Time disajikan dalan bentuk kurva/grafik terlihat jelas status dari masing-masing setiap sampel uji. Sampel yang mempunyai kandungan atau loading DNA virus terbanyak dapat dilihat garis/ line kurva muncul  di awal,  seperti pada  Gambar 5a, bahwa pada Ct 18,24 sudah terbentuk garissigmoid dan ini  terjadi pada sampel  No. 3 yang  berasal dari Waduk Cirata. Sedangkan standar curve  (Gambar 5b) dapat diketahui dari  nilai R 2 pada 0,979  di mana  di setiap titik adalah hubungan antara konsentrasi DNA dan nilai Ct. Sedangkan pada Gambar 5c berupa data Melting  curve  di  mana  terdapat  dua  puncak  yang dominan. Pada uji ini puncak yang tinggi merupakan nilai  melting  curve  amplifikasi  untuk  spesifik  KHV terjadi pada suhu sekitar 91°C, ini sesuai dengan melt- ing amplifikasi standar KHV yang digunakan. Sedangkan puncak  melting  curve  untuk  primer-dimer  yang merupakan non-spesifik amplifikasi terjadi pada suhu di bawah 80°C.

## KESIMPULAN
Dengan metode qPCR ini diketahui bahwa secara kuantitatif infeksi KHV tertinggi diperoleh dari ikan mas Cirata-3 dengan nilai Ct 3,4 x 10 7 kopi sedangkan kuantifikasi  KHV  terendah  diperoleh  dari  ikan  mas asal Banjarmasin-3 dengan nilai 1,8 x 10 2 kopi. Metodae qPCR ini lebih sensitif dibandingkan PCR konvensional di samping itu hasilnya lebih cepat diketahui karena secara real time bisa dilihat langsung dan terhindar dari kontaminasi silang.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada seluruhnya  yang  mendukung  dalam  pelaksanaan penelitian ini, yaitu HKI Germany yang memfasilitasi dalam  melakukan  ekstraksi  dan  pengujian  DNA, kemudian  team  patologi  BBAT,  Sukabumi  dalam melakukan pengujian terutama penggunaan alat Real Time  PCR  dan  teman-teman  patologi  P4  yang membantu dalam pelaksanaan penelitian ini.

## DAFTAR  ACUAN
Bergmann,  S.M.,  Schütze,  H.,  Fischer,  U.,  Fichtner, D.,  Riechardt,  M.,  Meyer,  K.,  Schrudde,  D.,  & Kempter, J. (2009). Detection of koi herpes virus (KHV) genome in apparently healthy fish. Bull. Eur. Ass. Fish Pathol., 29(5), 145-152.
Dhar,  A.K.,  Roux,  M.M.,  &  Klimpel,  K.R.  (2001).  De- tection and quantification of Infection Hypoder- mal and Hematopoietic Necrosis Virus and White
Spot  Virus  in  shrimp  using  Real-Time  Quantita- tive  PCR  and  SYBR  Green  chemistry.  Journal  of Clinical Microbiology, 39(8), 2835-2845.
Gilad,  O.,Yun,  S.,  Andree,  K.B.,  Adkitson,  M.A.,
Zlotkin,  A.,  Bercovier,  H.,  Eldar,  A.,  &  Hedrick, R.P. (2002). Initial characteristics of koi herpesvi- rus and development of a polymerase chain reac- tion assay to detect the virus in koi, Cyprinus carpio koi. Dis. Aquat. Org., 48, 101-108.
Gilad, O., Yun, S., Zagmutt-Vergara, F.J., Leutenegger, C.M.,  Bercovier,  H.,  &  Hedrick  R.P.  (2004).  Con- centrations  of a  Koi  herpesvirus (KHV)  intissues of  experimentally  infected  Cyprinus  carpio  koi  as assessed  by  real-time  TaqMan  PCR.  Diseases  of Aquatic Organisms, 60, 179-187.
Gray,  W.L.,  Mullis,  L.,  La  Patra,  S.E.,  Groff,  J.M.,  & Goodwin,  A.  (2002).  Detection  of  koi  herpesvi- rus DNA in tissues of infected fish. Journal of Fish Diseases, 25, 171-178.
Garver, K.A., Al-Hussinee, L., Hawley, L.M., Schroeder, T.,  Edes,  S.,  LePage,  V.,  Contador,  E.,  Russell,  S., Lord,  S.,  Stevenson,  R.M.W.,  Souter,  B.,  Wright, E., & Lumsden, J.S. (2010). Mass Mortality Asso- ciated  With  Koi  Herpesvirus  In  Wild  Common Carp In Canada. Journal of Wildlife Diseases, 46(4), 1242–1251.
Granja, C.B., Vidal, O.M., Parra, G., & Salazar, M. (2006). Hyperthermia  reduces  viral  load  of  white  spot syndrome  virus  in  Penaeus  vannamei  Diseases  of Aquatic Organisms, 68, 175–180.
Haenen, O.L.M., Way, K., Bergmann, S.M., & Ariel, E. (2004). The emergence of koi herpesvirus and its significance  to  European  aquaculture.  Bull.  Eur. Assoc. Fish Pathol., 24, 293–307.
Hedrick,  R.P.,  Gilad,  O.,  Yun,  S.,  Spangenberg,  J.V., Marty,  G.D.,  Nordhausen,  R.W.,  Kebus,  M.J., Bercovier,  H.,  &  Eldar,  A.  (2000).  A  herpesvirus associated with mass mortality of juvenil and adult koi,  a  strain  of  common  carp.  Journal  of  Aquatic Animal Health, 12, 44-57.
Ilouze, M., Davidovich, M., Diamant, A., Kotler, M., & Dishon, A. (2011). The outbreak of carp disease caused by CyHV-3 as a model for new emerging viral diseases in aquaculture: a review. Ecol. Res., 26, 885–892.
Nam,  H.M.,  Srinivasan,  V.,  Gillespie,  B.E.,  Murinda, S.E., & Oliver, S.P. (2005). Application of SYBR green real-time PCR assay for specific detection of Sal- monella spp. in dairy farm environmental samples. International Journal of Food Microbiology, 102, 161– 171.
OIE. (2016). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals.
Pikulkaew,  S.,  Meeyam,  T.,  &  Banlunara,  W.  (2009). The  outbreak  of  Koi  herpesvirus  (KHV)  in  Koi (Cyprinus  carpio  koi)  from  Chiang  Mai  Province, Thailand. Thai J. Vet. Med., 39, 53–58.
Sano,  M.,  Ito,  T.,  Kurita,  J.,  Yanai,  T.,  Watanabe,  N., Miwa, S., & Iida, T. (2004). First detection of koi herpesvirus  in  cultured  common  carp  Cyprinus carpio in Japan. Fish Pathol., 39, 165–167.
Sunarto, A. (2004). Eidemiology, diagnostic and pre- ventive  practices  for  Koi  Herpesvirus  (KHV)  in Indonesia.  KHV:  Present  status  and  future  pros- pects for prevention. Tokyo University of Marine Science and Technology, Tokyo-Japan, 32 pp.
Sunarto, A., Rukyani, A., &  Itami, T. (2005). Indone- sian experience on the outbreak of koi herpesvi-
rus in koi and carp (Cyprinus carpio). Bull Fish Res Agen, 2, 15-21.
Sunarto,  A.,  Mccoll,  K.A.,  Crane,  M.S.,  Sumiati,  T., Hyatt,  A.D.,  Barnes,  A.C.,  &  Walker,  P.J.  (2011). Isolation and characterization of koi herpesvirus (KHV)  from  Indonesia:  identification  of  a  new genetic lineage. J. Fish. Dis., 34, 87 101.
Sritunyalucksana,  K.,  Srisala,  J.,  McColl,  K.,  Nielsen, L., & Flegel, T.W. (2006). Comparison of PCR test- ing  methods  for  white  spot  syndrome  virus (WSSV) infections in penaeid shrimp. Aquaculture. 255, 95–104.
Yuasa, K., Sano, M., Kurita, J., Ito, T. & Iida, T. (2005). Improvement  of  a  PCR  method  with  sph  1-5 primer set for detection of koi herpesvirus (KHV). Fish Pathology, 40(1), 37-39, 3.