## VALIDASI METODE ANALISIS KLORFENIRAMIN MALEAT DAN GUAIFENESIN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI SERTA APLIKASINYA DALAM SEDIAAN SIRUP
Aqnes Budiarti 1) , Ira Afifah 1)
1) Fakultas Farmasi, Universitas Wahid Hasyim Semarang

## INTISARI
Kombinasi  klorfeniramin  maleat  (CTM)  dan  guaifenesin  (GG)  digunakan  untuk meringankan  gejala  batuk  dan  pilek.  Kadar  CTM  dan  GG  dalam  sirup  sangat  kecil  sehingga penetapan  kadarnya  memerlukan  metode  yang  valid.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  memvalidasi metode penetapan kadar CTM dan GG dan mengaplikasikannya dalam beberapa sediaan sirup di pasaran.
Penetapankadar CTM dan GG menggunakan KCKTJascoLc-Net II/ADC dengandetektor UV-Visible.  Fase  diam  berupa  C 18 Li  Chospher  dan  fase  gerak  adalah  campuran asetonitril:metanol:air  (15:10:75  v/v),  waktu  alir  1  mL/menit  pada  panjang  gelombang  270  nm. Validasi  metode  meliputi  akurasi,  presisi,  selektivitas,  linieritas  dan  sensitivitas.  Metode  analisis diaplikasikan terhadap 3 merk sirup dari pabrik yang berbeda.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  validasi  metode  penetapan  kadar  CTM  dan  GG memenuhi  persyaratan  yaitu:  uji  presisi  menghasilkan  %RSD  untuk  CTM    0,18%  dan  GG 0,17%;ujiakurasi  menghasilkan  perolehan  kembali  yang  memenuhi  persyaratan  baikuntuk  CTM maupun  GG  pada  sirup  ketigamerksirup.  Selektivitasnya  baik;  linieritas  memenuhi  syarat;  LOD CTM dan GG masing masing sebesar 2,40 µg/mL dan 3,07 µg/mL; LOQ CTM dan GG masing- masing  sebesar  8,00  µg/mL  dan  10,24  µg/mL.  Kadar  rata-rata  CTM  dan  GG  pada  ketiga  sirup memenuhi persyaratan kadar yang ditetapkan oleh Farmakope Indonesia Edisi V.
Kata kunci : validasi, klorfeniramin maleat, guaifenesin, KCKT

## ABSTRACT
The  combination  of  CTM  and  GG  is  often  used  as  an  active  substances  to  relieve symptoms of cough and cold. The concentration of CTM and GG in syrup are very low, so that it need validated determination method to ensure therapeutic dose. The purposes of this study were to validate determination method of CTM and GG and to apply the method to some syrups.
Determination of CTM and GG in syrup using HPLC JascoLc-Net II/ADC equipped with a UV-Visible detector at a wavelength of 270 nm. The stationary phase used was C 18 Li Chosphera nd the mobile phase usedwas a mixture of acetonitrile:methanol:water (15:10:75 v/v) with a flow rate  of  1  mL/minutes.Validation  test  was  conducted  on  precision  test,  accuracy,  selectivity, linearity and sensitivity. The method of analysis was applied to syrups fromthree different factories.
The  result  of  this  research  showed  that  validation  tests  of  CTM  and  GG  met  the requirements,  were:  %  RSD  of  precision  test  for  CTM  was  0.18%  and    for  GG  was  0.17%; accuracy test  resulted  good  recovery  for CTM  and for  GG  in  syrups.  Good  selectivity;  linearity with a correlation coefficient 0.999; LOD for CTM and GG were 2.40 and 3.07 µg/mL; LOQ for CTM  and  GG  were  8.00µg/mL  and  10.24  µg/mL.  The  level  of  CTM  and  GG    in  syrups  were compliance with the requirements by the Indonesian Pharmacopeia Edition V. Keywords: validation, chlorfeniramin maleat, guaifenesin, HPLC

## PENDAHULUAN
Kadar  CTM  dalam  sediaan  sirup sangat  kecil  yaitu  1mg  tiap  5  ml  sirup  dan kadar  GG  adalah  50  mg  tiap  5  ml  sirup sehingga  membutuhkan  metode  analisis
yang tepat untuk menentukan kadar masing- masing  obat.  BerdasarkanFI  edisi  V,  kadar CTM  dapat  ditentukan  secara  kromatografi gas menggunakan helium kering sebagai gas pembawa.  Sedangkan  GG  dapat  ditetapkan
kadarnya  menggunakan  KCKT  dengan  fase gerak  berupa  campuran  air:asam  asetat glasial  dengan    perbandingan  (990:10  v/v), laju  alir  1  mL/menit,  kolom    L1  pada panjang gelombang 276 nm.
CTM  memiliki  gugus  kromofor berupa  cincin  pirimidin,  cincin  benzen,  dan ikatan  –C=C-  yang  mengandung  elektron  pi ( π )  terkonjugasi  yang  dapat  mengasorbsi sinar  pada  panjang  gelombang  tertentu didaerah  UV,  sehingga  dapat  memberikan nilai  serapan  (Siswandono,  1998).  GG mempunyai gugus auksokrom yang menjadikannya bersifat polar sehingga dapat dipisahkan  dengan  metode  KCKT  dan memiliki  gugus  kromofor  yang  dapat dianalisis oleh detektor UV (Epstein, 2004).
Chaudhary et  al. ,  (2015)  telah berhasil  mengembangkan  metode  KCKT untuk  penetapan  kadar  GG,  CTM  dan bromhexin  HCl  dalam  sediaan  tablet menggunakan  fase  gerak  asam  ortho fosfat:asetonitril  (40:60  v/v),  fase  diam kolom C 18 dengan laju alir 1,5 mL/menit dan menggunakan  panjang  gelombang  254  nm yang bukan merupakan titik isobastiknya.
Kolhal et al. , (2014) telah menetapkan  kadar  GG,  CTM,  parasetamol, ambroxol dan fenileprin HCl dengan metode KCKT  yang  diaplikasikan  pada  sediaan tablet.  Fase  gerak  yang  digunakan  adalah asetonitril:air  (5:5  v/v),  fase  diam  berupa kolom C 18 dengan laju alir 1,5 mL/menit dan menggunakan  panjang  gelombang  228  nm. Penelitian  menghasilkan  linieritas  yang bagus namun waktu retensi lambat.
Nalini et  al .,  (2014)  menetapkan kadar kombinasi obat GG, CTM, parasetamol,  fenileprin  HCl  dan  bromhexin HCl  dengan  metode  KCKT  pada  sediaan tablet menggunakan fase gerak metanol:asetonitril  (3:2  v/v),  fase  diam berupa kolom C-8 simetri dengan laju alir 1 mL/menit dan menggunakan panjang gelombang 220 nm. Penelitian menghasilkan parameter validasi yang memenuhi syarat. Penelitian yang dilakukan Abdulbari  and  Ihsan  (2013)  telah  berhasil menetapkan kadar CTM, parasetamol, fenilpropanilamin  HCl  dan  kafein  pada sediaan tablet menggunakan metode tervalidasi  dengan  alat  KCKT.Fase  gerak berupa campuran asetonitril:metanol:air (15:10:75  v/v),  fase  diam  menggunakan
kolom  C 18 dengan  laju  alir  1  mL/menit  dan panjang gelombang 220 nm.
Berdasarkan latar  belakang  permasalahan  di atas  maka  peneliti  melakukan  validasi metode  penetapan  kadar  CTM  dan  GG dengan  metode  KCKT  meliputi  parameter ketelitian,  ketepatan,  linieritas,  selektifitas dan sensitifitas. Metode tervalidasi diaplikasikan dalam sediaan sirup.

## METODE PENELITIAN

## 1. Alat
Seperangkat  KCKT  (JascoLc-Net II/ADC)  yang  dilengkapidengandetektor UV-Visible  (2070  plus,  injektor  (PU- 2080  plus),  kolom  C 18 LiChospher  100 RP-18    (5µm),  syringe  (Hamilton), penangasultrasonik (Jeken) , membranpenyaring nylon 0,2 µm (GVS),timbangananalitik ( Ohaus ), spektrofotometer UV-Vis (1800 Shimadzu) danmikropipetukuran 50- 1000 µL (Accumax). 2. Bahan Baku pembanding CTM (Changshu  Huagang  Pharmaceuticals Co., Ltd), GG (Akash Ganga, Telangana
India),  sirup  A,  B  dan  C  yang  berasal dari  pabrik  yang  berbeda,  metanol  pro HPLC  (J.T.  Baker),  asetonitril  (Merck) dana quabidestilata (PT. Ikapharmindo).
3. Jalannya Penelitian a. Larutan Baku CTM dan GG CTM  dan  GG  masing-masing ditimbang  seksama  100  mg,  lalu dimasukkan  ke  dalam  labu  takar  100 mL  masing-masing  dan  dilarutkan dengan  aquadest  5  mL,  kemudian ditambahkan  aquadest  sampai  garis tanda  batas  sehingga  diperoleh  dua larutan CTM dan GG dengan konsentrasi masing-masing 1000 µg/mL.
b.  Penentuan  Panjang  Gelombang

## Untuk Analisis
Larutan  CTM  dan  GG  masing- masing  20  µg/mL  dalam  aquadest di scan menggunakan  spektrofotometer UV  pada  panjang  gelombang  200-400 nm.  Selanjutnya  ditentukan  panjang gelombang  maksimal  berupa  titik isobastik. Menurut FI Edisi V, panjang gelombang CTM pada 265 nm dan GG pada 276 nm.

## c.  Optimasi Komposisi Fase Gerak
Optimasi  fase  gerak  terdiri  dari campuran asetonitril: metanol: air dengan perbandingan 15:10:75; 10:10:80 dan 5:10:85 v/v. Selanjutnya dipilih fase gerak  yang  memberikan  data  terbaik. Laju  alir  yang  digunakan  adalah  1 mL/menit. d.  Kurva Baku CTM dan GG
Larutan CTM dan GG dengan konsentrasi  20,  40,  80,  100,  120  µg/mL disuntikkan  ke  dalam  sistem  KCKT dengan  volume  20  µL  pada  kondisi optimum. Konsentrasi larutan versus luas area kromatogram dibuat kurva baku dan dihitung  persamaan  regresi  liniernya. Replikasi  3  kali  dan  persamaan  regresi linier  terpilih  adalah  yang memiliki nilai korelasi (r) terbesar.
e.   Validasi
1) Uji Presisi
Larutan  yang  mengandung  CTM  dan GG  100  µg/mL  diinjeksikan  ke  alat KCKT  lalu  dihitung luas  area,  waktu retensi dan tinggi puncak kromatogram.  Percobaan  direplikasi 6  kali  lalu  dihitung  persentase koefisien variasinya. 2)  Uji Akurasi
Metode  penambahan  baku  ( standard addition method ) melalui uji perolehan kembali  pada  sampel  yang ditambah  baku  dengan  konsentrasi meliputi 80, 100 dan 120%. Replikasi
3 kali.
3)  Uji Selektivitas Berdasarkan kromatogram ditentukan nilai resolusi puncak analit CTM dan
GG  dan  komponen  lain  dalam  sirup terpisah sempurna. 4)  Uji Linieritas Menggunakan persamaan regresi linier kurva baku. 5)  Uji Sensitivitas Meliputi uji batas deteksi (LOD) dan uji batas kuantifikasi (LOQ) menggunakan persamaan garis regresi linier pada uji linieritas.
6)  Penetapan  Kadar  CTM  dan  GG dalam sirup
Sampel  sirupA  dipipet  1000  µL setara  dengan  0,20  mg  CTM  dan  10 mg  GG.  Sampel  dimasukkan  ke dalam  labu  takar  10  mL,  dilarutkan dengan fase gerak sampai garis tanda, kemudian  larutan  disonikasi  selama 10  menit.  Larutan  disaring  dengan membrane penyaring nylon 0,20  µm kemudian  diinjeksikan  ke  sistem KCKT pada kondisi optimum. Replikasi  penetapan  kadar  6  kali. Prosedur  yang  sama  juga  dilakukan terhadap sampel B dan C

## HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Penentuan Panjang Gelombang untuk Analisis
Hasil scanning larutan CTM dan GG menghasilkan panjang gelombang maksimal  untuk  CTM  pada  261,50  nm dan  GG  pada  273,20 nm.  Titik  isobastik pada  270  nm  dan    digunakan  sebagai panjang  gelombang  operasional,  terlihat pada pada Gambar 1.
Gambar 1. Hasil Scanning Penentuan Panjang Gelombang ( ƛ )
ƛ 270 nm
2. Optimasi Fase Gerak Optimasi fase gerak untuk menentukan  polaritas  fase  gerak  yang mampu  memisahkan  zat  aktif  dengan baik  sehingga  mampu  meningkatkan selektivitas  dan  sensitivitas  metode analisis. Optimasi fase gerak dengan cara merubah perbandingan fase gerak sehingga  mampu  ditemukan  komposisi fase  gerak  yang  tepat.  Hasil  optimasi dapat dilihat pada Gambar 2. (a) (b) (c)
Komposisi  fase  gerak  optimum dipilih  berdasarkan  parameter  waktu retensi  dan  luas  puncak.  Dilihat  dari waktu  retensi,  semakin  cepat  waktu retensi  maka  semakin  cepat  waktu analisis  yang  diperlukan.  Sedangkan untuk  luas  puncak,  dipilih  luas  puncak yang  lebih  sempit  dan  lancip  (Gandjar dan  Rahman,  2007).  Fase  gerak  berupa asetonitril:metanol:air (5:10:85, v/v)
menghasilkan  kromatogram  dengan  area yang  luas,  waktu  retensi  yang  lama  dan peak  yang  dihasilkan  simetris.  Pada  fase gerak berkomposisi asetonitril:metanol:air  (10:10:80,  v/v), area  puncak  yang  dihasilkan  luas, peaknya  tidak  simetris  dan  waktu retensinya  lama.  Waktu  retensi  yang lama menyebabkan waktu yang dibutuhkan untuk analisis lama, sehingga kedua fase gerak ini tidak dipilih.
Sedangkan  fase  gerak  dengan perbandingan asetonitril:metanol:air (15:10:75,  v/v)  menghasilkan  waktu retensi  yang  relative  cepat,  luas  puncak relative sempit dan peak yang dihasilkan simetris  sehingga  fase  gerak  ini  dipilih sebagai  komposisi  fase  gerak  yang optimum.
3.  Validasi Metode Analisis
a.   Presisi (ketelitian)
Uji presisi atau keterulangan ( repeatability ) ditentukan berdasarkan  nilai  RSD  ( Relative Standar  Deviasi ),  waktu  retensi,  luas puncak dan tinggi puncak kromatogram. Hasil uji yang
diperoleh  sebesar  0,18  dan  0,17%.
Hasil  ini  memiliki  ketelitian  yang baik  karena  semua  nilai  memenuhi persyaratan.  Nilai  RSD  yang  dapat diterima  yaitu  kurang  dari  2% (Harmita, 2004).
Gambar 2.  Kromatogram Hasil Optimasi Komposisi Fase Gerak
(a) Fase gerak setonitril:metanol:air (5:10:85 v/v)
(b) Fase gerak setonitril:metanol:air (10:10:80 v/v) (c) Fase gerak setonitril:metanol:air (15:10:75 v/v)
b.  Akurasi (ketepatan) Akurasi menunjukkan kedekatan hasil  penetapan  kadar  dengan  kadar yang  sebenarnya.  Uji  ketepatan dilakukan dengan metode penambahan  bahan  baku  ( standard addition  method )  dengan  sejumlah bahan  baku  sebesar  80,  100,  120% dari  kadar  analit target. Nilai perolehan  kembali  dari  uji  akurasi CTM  dan  GG  dalam  sediaan  sirup berada  pada rentang nilai  yang  dapat
diterima  yaitu  90  -  107  %  (Gonzales et al., 2010). c.   Selektivitas Selektivitas metode ditentukan berdasarkan  nilai  resolusinya  (R). Semakin besar nilai ini menunjukkan pemisahan komponen-komponen dalam  sirup  yang  terelusi  dengan waktu retensi yang berdekatan semakin  efisien.  Kromatogram  CTM dan  GG  dalam  sediaan  sirup  dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Contoh Kromatogram CTM dan GG dalam Sediaan Sirup
Gambar  3  memperlihatkan  tidak adanya  komponen  lain  pada  sirup yang ikut terukur. Selain itu pemisahan CTM dan GG menghasilkan  nilai  R  =  2,05yang memenuhi  persyaratan  pemisahan yang  baik,  yaitu  R ≥  2,00  (Snyder et al., 1997)  Maka  dapat  disimpulkan bahwaa  metode  analisis  KCKT  yang digunakan memiliki selektivitas yang baik  dan  mampu  menganalisis  CTM dan  GG  tanpa  gangguan  komponen lain dalam sirup. d.   Linearitas Uji linearitas didasarkan pada hubungan  linier  antara  konsentrasi dengan  luas  puncak  kromatogram pada pembuatan kurva baku.
Persamaan  garis  regresi  linier  CTM terbaik  berdasarkan  besarnya  nilai  r adalah  Y=  5337,18x  +  37725,53  dan GG  terbaik  berdasarkan  besarnya nilai r adalah Y= 22807,73x+327828,73  dengan  r  = 0,999. Replikasi 3 kali pada pembuatan  kurva  baku  dapat  dilihat pada Tabel I.
Tabe II. Kurva Baku CTM dan GG
e.   Sensitivitas Sensitivitas metode analisis dinyatakan  dengan  nilai  LOD  dan LOQ.  Semakin  kecil  nilai  LOD  dan LOQ  maka  semakin  sensitif  suatu metode analisis (Gandjar dan Rahman, 2007). Berdasarkan  perhitungan  dari  kurva baku, diperoleh nilai LOD pada CTM dan GG masing-masing yaitu sebesar 2,40 µg/mLdan 8,00 µg/mL. Sedangkannilai LOQ adalah3,07
µg/mL dan10,24 µg/mL.

## 4.   Penetapan Kadar CTM dan GG
Kadar  rata-rata  CTM  pada  sirup  A,  B dan  C  masing-masing  sebesar  99,54; 99,30;  99,70%  dan  GG  pada  sirup  A,  B dan  C  adalah  100,96;  100,91;  101,01%.
Hasil  yang  telah  didapat  memenuhi persyaratan  kadar  yang  tertera  pada Farmakope  Indonesia  Edisi  V,  yaitu kadar CTM 98,00%-100,50% dari jumlah  yang  tertera  pada  etiket  dan kadarGG yaitu 98,00%-102,00% terhitung  terhadap  zat  yang  telah dikeringkan.

## KESIMPULAN
1. Validasi metode penetapan kadar CTM dan  GG  menggunakan  metode  KCKT dapat  dilakukan  dengan  fase  diam  C 18 dan  fase  gerak  terdiri  dari  campuran asetonitril:metanol:air  (15:10:75,  v/v), laju  alir  1  mL/menit  pada  panjang gelombang 270 nm dan volume injeksi 20 µL.
2. Hasil  uji  validasi  metode  penetapan kadar  CTM  dan  GG  memenuhi persyaratan.
3. Metode  analisis  yang  tervalidasi  dapat diaplikasikan  dalam  sediaan  sirup  dan kadar  rata-rata  CTM  dan  GG  pada ketigamerksirup memenuhi persyaratan kadar  yang  ditetapkan  Farmakope Indonesia Edisi V.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdulbari  and  Ihsan.,  2013,  Simulation
Determination  and  Validation  of Chlorfeniramine Maleat, Acetaminophen, Phenylpropanolamine  Hydrochloride and  Caffein  in  Tablet  Dosage  Form by  Using  Reverse  Phase  High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC), International Journal  of
No Konsentrasi (µg/mL) Luas Puncak PersamaanRegresi CTM GG CTM GG 1. 20 141298 762846  a = 41329,13 a = 182126,73 40 274961 1111825  b = 4923,22 b = 25390,34 60 303810 1690654  r = 0,988 r = 0,992 80 413224 2128239 100 521977 2915172 120 660456 3147969 2. 20 144101 751427  a = 62903,80 a = 311962,13 40 253041 1132768  b = 4851,07 b = 21346,40 60 399029 1621550  r = 0,987 r = 0,999 80 451123 2009232 100 507307 2450588 120 660273 2871694 3. 20 144286 750817  a = 37725,53 a = 327828,60 40 252812 1194285  b = 5337,18 b = 22807,73 60 356453 1688917  r = 0,999 r = 0,999 80 460580 2308266 100 578714 2668330 120 675125 2935602
Pharmaceutical  Sciences ,  Iraq,  666-
670. Chaudhary  Ankit  B.,  Shweta  M.  Bhadani., Chintal M. Shah., 2015, Development  and  Validation  of  RP- HPLC  Method  for  Simultaneous Estimation of Bromhexine Hydrochloride, Guaifenesin and
Chlorfeniramine  Maleate  in  Tablet,
World  Journal  of  Pharmacy  and Pharmaceutical sciences, 1679-1694. Depkes  RI.,  2004, Farmakope  Indonesia , Edisi V, DepartemenKesehatanRepublik Indonesia, Jakarta. Epstein,  N.A.,  2004,  Validation  of  HPLC Techniques for Pharmaceutical
Analysis. J  Pharm  Chemistry .,  222-
223. Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis , Cetakan II,
PustakaPelajar, Yogyakarta, 378-394, 456-474. Gonzales,  A.G.,  Herrador,  M.A.,  and Asuero, A.G., 2010, Intra-Laboratory Assesment  of  Method  Accuracy (Trueness  and  Precision)  by  Using Validation Standard, Talanta . Harmita,2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya , Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No. 3, 117-135
Kolhal,  Surekha.,  Rama,  Lokhade.,  Rajiv,
Sutar., Sanjay, Pednekar., and Sanket,  Gudekar.,  2014,  RP-HPLC Method for Simultaneous Determination of Paracetaamol, Guaifenesin, Ambroxol, Phenylephrine  Hydrochloride,  and Chlorfeniramine Maleate in Bulk and Pharmaceutical  Dosage  Form, Int.  J.
Pharm. Sci , 105-111. Nalini,  K.,  Narmada.,  Laksmi,  G.  Vijaya.,
Gowtham,  Y.,  Jogi,  K.  V,  2014, Simultaneous Estimation of Paracetamol, Guaiphenesin, Phenylephrine HCl, Chlorpheniramine Maleate and Bromhexine HCl in Combined Tablet Dosage Form by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography, International Journal  of  Pharmaceutical  Science and Research , Vol I, No. 2, 410-416.
Siswandono, 1998, Prinsip- prinsip Rancangan Obat , Airlangga University  Press, Surabaya, 33-37 Snyder,  R.L.,  Kirkland,  J.J.,  and  Glajch,
J.L., 1997, Practical HPLC Method
Development ,  2nd  Edition,  John Wiley & Son, Inc., New York, 686- 697.