## APLIKASI MICRO MORR E-3360 SEBAGAI BAHAN BIOREMEDIAN TUMPAHAN MINYAK DI LAUT
Application of Micro Morr E-3360 as Bioremediation Material for Marine Oil Spill
Endar Marraskuranto * , Hedi Indra Januar, dan Asri Pratitis
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, Balitbang KP, KKP. Jl. K.S. Tubun Petamburan VI, Jakarta Pusat 10260.
* Korespondensi Penulis: endar_l15@yahoo.com

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk menguji kelayakan Micro Morr E-3360 sebagai bahan bioremedian tumpahan minyak di laut pada skala laboratorium. Kelayakan didasari pada efektivitas pengurangan kadar Total Petroleum Hydrocarbon (TPH), toksisitas air laut hasil bioremediasi dan residu media imobilisasi dari produk. Analisis kadar TPH dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan tingkat toksisitas diukur menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Identifikasi konsorsium bakteri dilakukan pada media imobilisasi dengan analisis sekuens gen 16S rDNA. Penelitian dilakukan dengan lima uji coba dalam beaker, yaitu air laut dan minyak 2% w/w dari air laut (M); air laut, minyak 2% w/w dari air laut, bioremedian 10% w/w dari minyak, dan nutrien (P); kontrol air laut (AL); kontrol air laut dan bioremedian 10% w/w dari minyak (B); serta air laut dan nutrien (K). Hasil analisis menunjukkan bahwa konsorsium bakteri terdiri dari 3 spesies bakteri, yaitu Bacillus licheniformis , B. thermoamylovorans , dan Geobacillus pallidus . Bioremedian ini mampu menurunkan kadar TPH dalam air sebesar 77% dan tingkat toksisitas sebesar 88% selama 20 hari. Kadar residu minyak dalam media imobilisasi juga rendah, yaitu di bawah 2 ppm. Namun, penurunan kadar oksigen dan peningkatan turbiditas yang signifikan (P<0,05) dapat menjadi faktor utama kematian 50% populasi A. salina .
KATA KUNCI:   micro morr E-3360, bioremediasi, uji BSLT, konsorsium bakteri

## ABSTRACT
This research was aimed to test the feasibility of Micro Morr E-3360 as bioremediation material for marine oil spill at laboratory scale. Feasibility was based on its effectiveness to decrease Total Petroleum Hydrocarbon (TPH) content, toxicity of seawater sample after bioremediation and its immobilization media residue. TPH content analysis was conducted using UV-Vis spectrophotometry method and toxicity was measured using Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) method. Identification of the bacterial consortium in the bioremediation media was conducted using 16 S rDNA gene sequensing analysis. Research was conducted in five experiments in beakers which are seawater and oil 2% (w/w) of seawater (M); seawater, oil 2% (w/w) of seawater, bioremediant 10% (w/w) of oil, and nutrient (P); seawater as control (AL); seawater and bioremediant 10% (w/w) of oil (B) and seawater and nutrient (K). Identification result showed that bacteria consortium consisted of three species, they were Bacillus licheniformis , B. thermoamylovorans and Geobacillus pallidus . Bioremediant was able to decrease TPH concentration in sea water by 77% and toxicity level by 88% in 20 days. Oil content in immobilization media residue was also low, that was 2 ppm. However, significant oxygen depletion and turbidity increment could be the principal factor causing 50% lethality of A. salina population.
KEYWORDS: micro morr E-3360, bioremediation, BSLT, bacterial consortium

## PENDAHULUAN
Minyak, mentah maupun minyak olahan, yang tertumpah ke wilayah perairan merupakan polutan sangat berbahaya bagi keberlangsungan ekologis
biota perairan, terutama jika tumpahan minyak telah sampai ke wilayah terumbu karang. Kerusakan terumbu karang yang terjadi di Taman Nasional Laut Kepulauan Seribu, sebesar 40% diklaim terjadi sebagai akibat pencemaran minyak (Anon., 2004).
Upaya penanggulangan polusi tersebut di wilayah laut relatif lebih sulit jika dibandingkan dengan oil waste treatment yang berada di darat/tanah. Aplikasi bioremedian di badan air yang merupakan medium bergerak memerlukan akurasi modelling yang tepat agar penyelesaiannya optimal. Salah satu cara penanggulangan tumpahnya minyak mentah adalah menggunakan metode bioremediasi yang memanfaatkan kemampuan mikroorganisme (bakteri dan/atau kapang) untuk mendegradasi residu tumpahan minyak.
Berdasarkan environmental fate , tumpahan minyak di ekosistem laut meliputi pemindahan dan perubahan berbagai senyawa minyak menjadi berbagai fase di permukaan, badan air hingga sedimentasi (Patin, 2009). Kandungan senyawa hidrokarbon dalam minyak hanya berkisar 1% saja, namun memiliki tingkat toksisitas terhadap ikan berkisar pada level antara 16–28 ppm (Anon., 2003). Bahan bioremedian yang efektif mampu menurunkan kandungan komponen minyak di air hingga berada pada level tidak berbahaya bagi ikan dan biota laut lainnya.
Di laboratorium, pengujian cara cepat toksisitas paparan suatu bahan polutan terhadap lingkungan laut dapat dilakukan dengan menggunakan biota brine shrimp atau udang renik (Anon., 2003; George-Ares et al., 2003). United States-Environmental Protecting Agencies (US-EPA) secara rutin mempergunakan Artemia salina sebagai biota indikator ekotoksisitas tumpahan minyak selain crustacea dan ikan (Persoone & Wells, 1987). Sanchez et al. (1995) in Khairunnuur et al . (2009) menerangkan bahwa brine shrimp ( A. salina ) merupakan invertebrata yang memiliki peran penting dalam aliran energi di rantai makanan ekosistem laut. Hal ini yang mendasari penggunaan A. salina dalam penelitian ini.
Pada prinsipnya, bioremediasi adalah penggunaan mikroorganisme yang telah dipilih untuk ditumbuhkan pada polutan tertentu untuk menurunkan kadar polutan tersebut. Enzim-enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme tersebut yang memegang peranan dalam memodifikasi struktur polutan beracun menjadi tidak kompleks sehingga menjadi metabolit yang tidak beracun dan tidak berbahaya (Priadie, 2012). Aplikasi bioremedian dapat dilakukan dengan menggunakan bakteri indigenous dan bakteri komersial. Bakteri indigenous dapat diperoleh dengan melakukan isolasi bakteri dari tempat yang tercemar, sedangkan bakteri komersial (ataupun enzim) sudah mudah diperoleh di pasaran berkat perkembangan iptek bioremediasi (Priadie, 2012), di antaranya adalah Micro Morr-E3360, yang berupa konsorsium bakteri dalam inokulum (media imobilisasi) terapung di permukaan air laut
sehingga diharapkan dapat merombak tumpahan minyak dengan efektif. Namun dampak ekologis dan tingkat toksisitas bahan tersebut belum diketahui. Hal ini yang mendasari dilaksanakannya penelitian ini. Penelitian ini bertujuan memberikan gambaran kelayakan Micro Morr-E3360 sebagai bioremedian, yang akan diverifikasi dari sisi efektivitasnya dalam menurunkan kadar minyak di laut dan ekotoksisitas bagi biota laut.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan yang digunakan antara lain air laut diperoleh dari Lembaga Oseanografi Nasional (LON) LIPI yang bersumber dari air laut Teluk Jakarta, produk bioremediasi komersial MM EM-3360 diperoleh dari Dr. Edison Effendi (Universitas Trisakti, Jakarta), minyak mentah diperoleh dari kilang minyak Balongan, Indramayu, Jawa Barat, dan urea serta NPK teknis diperoleh dari Toko Tanaman TRUBUS.

## Metode

## Sterilisasi wadah dan media air laut
Pada tahap awal, agar penurunan tingkat Total Petroleum Hydrocarbon (TPH) hanya didasari oleh aktivitas biologis mikroba yang diujicobakan, maka wadah dan media air laut disterilisasi terlebih dahulu sebelum digunakan. Proses sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoclave . Wadah yang digunakan adalah beaker glass 2 L. Sedangkan media yang dipergunakan adalah air laut yang diambil dari kawasan Teluk Jakarta. Untuk persiapan sterilisasi, air laut terlebih dahulu disaring menggunakan penyaring bakteri 0,22 µm.

## Identifikasi konsorsium bakteri pada bahan remediasi
Identifikasi dilakukan dengan uji biokimia, yaitu mengisolasi bakteri yang terkandung dalam inokulum (media imobilisasi) menggunakan media lactose broth (LB) dan diinkubasi pada suhu 55 o C selama semalam. Media LB yang sudah ditumbuhi bakteri disuspensi pada media padat dengan pengenceran lalu diinkubasi pada suhu yang sama selama 24 jam. Koloni yang telah ditumbuhkan kemudian digoreskan pada media sampai mendapatkan isolasi murni. Isolat murni diekstraks DNA-nya untuk diidentifikasi dengan metode 16S rDNA-Based Analysis menggunakan polymerase chain reaction (PCR) dan hasilnya dibandingkan dengan bank data. Viabilitas perkembangan isolat dalam lingkungan sebenarnya
dilakukan dengan menumbuhkan konsorsium bakteri dalam air laut dari Kepulauan Seribu, yaitu perairan Pulau Sebaru.

## Rancangan percobaan dan parameter kimiawi air laut
Percobaan penurunan kadar cemaran minyak dalam air laut dilakukan secara simulasi dalam penampang beaker glass 2 L yang diaerasi secara terus menerus selama penelitian berlangsung. Masing- masing penampang berisikan variasi antara air laut, cemaran minyak 2%, dan nutrien pertumbuhan bakteri konsorsium, untuk mengetahui efektivitas kinerja dari konsorium minyak dalam menurunkan kadar cemaran minyak. Tiap perlakuan masing-masing dibuat dengan ulangan sebanyak tiga kali, dengan kode tiap perlakuan adalah M, P, AL, K, dan B, yang merupakan:
M : Air laut 2 L dan minyak 2% w/w dari air laut.
P : Air laut 2 L, minyak 2% w/w dari air laut, bahan bioremedian 10% w/w dari minyak, serta nutrien urea NPK  yang beratnya sebanyak 45% dan 15% w/w dari bahan bioremedian.
AL : Kontrol Air laut 2 L
K : Kontrol air laut 2 L dan nutrien Urea-NPK dengan jumlah yang sama seperti perlakuan (P)
B : Air laut dan bahan bioremedian dengan jumlah yang sama seperti perlakuan (P)
Konsentrasi bahan bioremedian yang dipergunakan tersebut (10% w/w dari minyak) dibuat sesuai dengan petunjuk yang terdapat pada bahan bioremedian. Setiap lima hari sekali selama 20 hari dilakukan pengambilan air dari beaker glass sebanyak masing-masing 50 ml dari bagian permukaan (a), tengah (t), dan dasar (b) beaker glass untuk uji toksisitas (10 ml) dan efektivitas pengurangan kadar hidrokarbon dalam minyak (10 ml), serta 1 mg minyak di permukaan. Berdasarkan kombinasi antara perlakuan dan titik pengambilan tersebut, maka sampel yang dianalisis diberi kode sebagai:
MA (bagian permukaan perlakuan M); MT (bagian tengah perlakuan M); MB (bagian dasar perlakuan M); PA (bagian permukaan perlakuan P); PT (bagian tengah perlakuan P); PB (bagian dasar perlakuan P); AL (kontrol air laut saja);
K (kontrol nutrien); dan B (kontrol bioremedian).
Analisis parameter kualitas air yang meliputi kadar karbon terlarut (TOC), kadar fosfat (P), dan nitrogen inorganik (jumlah ammonia, nitrat, dan nitrit) dilakukan menggunakan kolorimeter Hach DR-890.

## Tingkat toksisitas perlakuan bioremediasi terhadap udang renik
Penentuan toksisitas hasil perlakuan bioremediasi terhadap udang renik dilakukan berdasarkan metode Persoone & Wells (1987) terhadap air laut dan padatan residu bioremedian. Penentuan toksisitas diketahui dari nilai persentase kematian udang renik yang dilakukan dengan menghitung jumlah udang renik yang mati selama ditumbuhkan dalam air sampel dari setiap perlakuan selama 24 jam.

## Tingkat efektivitas bahan bioremedian
Pengkajian tingkat efektivitas pemecahan hidrokarbon dan residunya dilakukan dalam waktu yang sama dengan bagian sebelumnya, yaitu lima hari sekali selama 20 hari. Analisis Total Petroleum Hydrocarbons (TPH) dalam media air laut dan padatan residu dilakukan menggunakan metode spektro- fotometri visibel. Pada tahap awal, dilarutkan 1 mg minyak mentah dalam 10 ml n-heksana untuk membuat kurva standar absorbansi sinar visibel maksimum terhadap konsentrasi TPH. Deret konsentrasi TPH yang dipilih adalah 3,125 ppm hingga 50 ppm dengan panjang gelombang 340 nm berdasarkan Deshpande et al. (2005). Setiap 5 hari, 10 ml sampel cair dan 1 mg padatan diekstrak dengan 10 ml n-heksana untuk mengetahui penurunan TPH akibat penambahan bahan bioremedian.

## Pengolahan Data Hasil
Pengolahan data meliputi korelasi antara variabel dependen kematian A. salina terhadap variabel independen parameter kimia air laut dalam wadah uji. Pengujian dilakukan secara parametrik menggunakan regresi keseluruhan ( enter ) dan bertingkat ( stepwise ).

## HASIL DAN BAHASAN
Hasil identifikasi konsorsium bakteri telah selesai dilaksanakan dan mendapatkan hasil yang sangat baik, yaitu memiliki kesamaan/kemiripan sebesar 99% terhadap data yang ada di dalam bank data. Jenis-jenis bakteri tersebut terdapat pada Tabel 1.
Genus Bacillus merupakan golongan bakteri yang telah banyak dipublikasikan yang memiliki kemampuan untuk mendegradasi minyak mentah maupun minyak olahan. Hal yang menarik dalam konsorsium adalah terdapatnya jenis Geobacillus yang merupakan jenis bakteri thermofilik baru yang diketahui memiliki aktivitas degradator minyak. Zheng et al. (2011) mengungkapkan dua strain XS2 dan XS3, yang memiliki homolog 100% dengan Geobacillus pallidus , diisolasi dari tanah yang tercemar minyak

## Tabel 1. Spesies bakteri pada produk konsorsium bakteri bioremediasi
Table 1. Bacterium species in bioremediation bacteria consortium
Kode / Code Spe sie s/ Species Kode  Akse s Ba nk Da ta / Data Bank  A ccess Code Pe rse nta se  Sim ila rita s/ Sim ilarty Percentage 1 Bacillus licheniformis FN556452.1 99 2 Bacillus thermoamylovorans AB360824.1 99 3 Geob acillus pallidus AB543491.1 99
Gambar 1. Grafik perubahan turbiditas (A), oksigen terlarut (B), fosfat (C), TOC (D), dan nitrogen (E) selama 20 hari.
Figure 1. Graphics of turbidity (A), DO (B), phosphate (C), TOC (D) and nitrogen (E) changes for 20 days.
Keterangan/ Note : M (Air laut dan minyak 2% w/w air laut); M (seawater and oil 2% (w/w) of seawater);
P (air laut, minyak 2% w/w dari air laut, bioremedian 10% w/w dari minyak, dan nutrien);
P (seawater, oil 2% (w/w) of seawater, bioremediant 10% (w/w) of oil and nutrient);
MA (bagian permukaan perlakuan M); MA (surface section for treatment M); MT (bagian tengah perlakuan M); MT (middle section for treatment M); MB (bagian dasar perlakuan M); MB (bottom section for treatment M);
PA (bagian permukaan perlakuan P); PA (surface section for treatment P) ; PT (bagian tengah perlakuan P); PT (middle section for treatment P); PB (bagian dasar perlakuan P); PB (bottom section for treatment P); AL (kontrol air laut); AL (control seawater); K (kontrol nutrien); dan K (control nutrient); and B (kontrol bioremedian) B (control of bioremediant)
Turbiditas / T urb idity 0 10 20 30 40 50 60 0 5 10 15 20 Hari/ D ays U n it T u rb id ita s / T u rb id ity U n it (F A U ) MA MT MB PA PT PB A L K B A Oks igen Terlarut/ D is s olved O x ygen 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 0 5 10 15 20 Hari/ D ays K ons entr as i/ C onc entr at io n (m g /L ) MA MT MB PA PT PB A L K B B Fos f at/ Phos phorous 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 0 5 10 15 20 Hari/ D ays K ons ent ra s i/ C o nc ent ra tion (m g/ L) MA MT MB PA PT PB A L K B C D i  a ta s   lim it  a la t Total Karbon Organik/ T otal O rganic  C arb on 0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 Hari/ D ays K o ns ent ras i/ Co n c e n tr a tio n ( m g/ L) MA MT MB PA PT PB A L K B D D i  a ta s   lim it  a la t Total Nitrogen A norganik/ T otal Inorganic  N itrogen 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 5 10 15 20 Hari/ D ays K o ns ent ras i/ C o nc entr ati o n (m g /L ) MA MT MB PA PT PB A L K B E Di atas  limit alat
di kilang minyak Yumen, Cina, dan ditumbuhkan pada media yang mengandung Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) dan minyak mentah. Berdasarkan perlakuan tersebut, kedua strain menunjukkan aktivitasnya yang mampu mendegradasi senyawa hidrokarbon dan menghasilkan bioemulsifier yang terdiri dari kompleks karbohidrat, lipid, dan protein. Isolat ST3, yang teridentifikasi sebagai Bacillus pallidus , diketahui mampu mendegradasi isopropil alkohol atau 2-propanol (IPA) hingga 24 g/l. Dalam hal ini, IPA dimanfaatkan sebagai satu-satunya sumber karbon oleh strain tersebut di dalam media miskin garam (Bustard et al ., 2002).
Secara visual terlihat terjadinya emulsifikasi dan agregatasi di permukaan yang diikuti dengan pelarutan bahan polar ke air laut percobaan sewaktu minyak dicampurkan ke dalam wadah uji. Dapat diduga bahwa cepatnya agregat yang terbentuk diakibatkan suhu ruang pencobaan yang rendah, yaitu 25 o C. Hasil analisis parameter kimiawi terdapat pada grafik dalam Gambar 1.
Analisis titik 0 dimulai 2 jam setelah penambahan minyak, yaitu setelah agregat minyak terbentuk. Kandungan DO dipertahankan dengan aerator untuk memenuhi kebutuhan oksigen konsorsium bakteri aerobik dalam merombak minyak. Namun penurunan kadar DO tetap terjadi, kondisi ini menunjukkan peningkatan aktivitas mikroba dalam merombak minyak. Hal yang sama juga terjadi pada kontrol, masing-masing air laut, nutrien, dan bahan bioremedian, yang diduga diakibatkan oleh pengayaan bakteri kontaminan, yang sulit dihindari karena sistem wadah yang terbuka. Selain itu, efek penambahan bioremedian ternyata secara visual meningkatkan kekeruhan.
Peningkatan kekeruhan, terutama pada perlakuan yang ditambahkan bahan bioremedian, kemungkinan besar diakibatkan oleh peningkatan karbon terlarut dalam air hasil aktivitas bakteri dalam menguraikan rantai karbon dalam minyak mentah menjadi bentuk karbon inorganik dan terlepas ke udara. Inokulum konsorsium bakteri berupa kapas berwarna coklat, yang dapat menjadi sumber turbiditas karena teraduk oleh aerator di dalam wadah beaker glass percobaan. Hal ini memperlihatkan kelemahan aplikasi bahan bioremedian yang diuji, karena jika diaplikasikan pada wilayah terumbu karang, media kapas yang turun dan mengendap dapat menutupi wilayah terumbu karang sehingga menutupi kebutuhan karang akan sinar matahari.
Kandungan kadar TOC yang tinggi pada setiap perlakuan dan kontrol yang hanya ditambahkan nutrien menunjukkan peningkatan karbon organik yang dirombak dari bentuk minyak (Gambar 1 (D)). Selain
itu, secara keseluruhan hasil analisis P dan N berada di atas limit alat. Hal ini dapat diduga karena penambahan nutrien hasil rekomendasi produsen bioremedian berlebih dan mengakibatkan terjadinya eutrofikasi. Jika diaplikasikan pada kondisi sesungguhnya di laut, maka HAB ( harmful algal bloom ) dapat terjadi dan menimbulkan kerentanan akumulasi biotoksin pada biota laut. Oleh karena itu, penambahan nutrien harus dilakukan dengan tepat sesuai dengan kondisi air laut dan kebutuhan mikroba bioremedian yang akan diaplikasikan.
Hasil uji toksisitas terhadap brine shrimp terdapat pada Gambar 2 yang memperlihatkan kemampuan inokulum bakteri bioremedian dalam mengurangi toksisitas bahan. Jika dirata-ratakan dari tiga titik (air pada bagian permukaan, tengah, dan bawah), maka penambahan bioremedian telah mengurangi toksisitas pada wadah uji sebesar 88%.
Pada Gambar 2, perlakuan M memperlihatkan kecenderungan toksisitas yang terus meningkat. Peningkatan diduga karena dalam keadaan tanpa bioremedian, peningkatan kandungan senyawa hidrokarbon dari minyak terus meningkat hingga mencapai titik kesetimbangan dalam fase air yang ditandai dengan penurunan slope mulai hari ke-10. Pada perlakuan P, sisi permukaan air yang memiliki kontak dengan agregat dan emulsi minyak memiliki tingkat toksititas yang cenderung stasioner. Namun pada bagian tengah dan dasar, terjadi fluktuasi. Pada hari ke-5 hingga ke-10, persentase kematian menunjukkan kecenderungan menurun, namun setelah itu terjadi peningkatan kembali mulai hari ke- 10 hingga hari ke-20.
Jika hal tersebut hanya berhubungan dengan peningkatan jumlah minyak terlarut dalam air, maka ini berhubungan dengan pertumbuhan bakteri. Pada pengamatan hari ke-0 hingga ke-5 diperkirakan terjadi fase lag dari bakteri bioremedian, sehingga jumlah minyak terlarut dan kematian A. salina meningkat. Selanjutnya, pada pengamatan hari ke-5 hingga ke- 10 terjadi fase log , sehingga jumlah minyak terlarut dan A. salina menurun. Pada pengamatan hari ke-10 hingga ke-20 terjadi fase stasioner atau bahkan lisis bakteri bioremedian. Jika minyak larut dalam air laut dan belum mencapai kesetimbangan, maka persentase kematian A. salina meningkat kembali. Hasil analisis terhadap padatan bioremedian menunjukkan bahwa terjadi sedikit peningkatan kematian A. salina selama perlakuan. Namun dalam selang 20 hari, tingkat toksisitasnya kembali seperti semula sebelum perlakuan. Selain itu, kecenderungan peningkatan toksisitas pada kontrol, yaitu K (air laut dan nutrien), B (air laut, nutrien, dan bahan bioremedian), dan AL (air laut kontrol), memunculkan dugaan baru bahwa variabel kematian A. salina tidak
Gambar 2. Grafik persentase kematian A. salina.
Figure 2. Graphic of A. salina mortality percentage .
K eterangan/ Note : M (Air laut dan minyak 2% w/w air laut); M (seawater and oil 2% (w/w) of seawater); P (air laut, minyak 2% w/w dari air laut, bioremedian 10% w/w dari minyak, dan nutrien);
P (seawater, oil 2% (w/w) of seawater, bioremediant 10% (w/w) of oil and nutrient);
MA (bagian permukaan perlakuan M); MA (surface section for treatment M); MT (bagian tengah perlakuan M); MT (middle section for treatment M); MB (bagian dasar perlakuan M); MB (bottom section for treatment M);
PA (bagian permukaan perlakuan P); PA (surface section for treatment P) ; PT (bagian tengah perlakuan P); PT (middle section for treatment P); PB (bagian dasar perlakuan P); PB (bottom section for treatment P); AL (kontrol air laut); AL (control seawater); K (kontrol nutrien); dan K (control nutrient); and B (kontrol bioremedian) B (control of bioremediant)
hanya karena kadar minyak terlarut. Kadar minyak terlarut dihitung melalui analisis kandungan TPH ( Total Petroleum Hydrocarbon) yang terdapat pada Gambar 3.
Kecenderungan yang sama pada kematian A. salina juga terlihat pada perlakuan P dan M, yaitu kadar minyak untuk MA, MT, dan MB terlihat meningkat dengan pertambahan hari. Sementara pada perlakuan P dan ekstrak padatan bioremedian terjadi penurunan kandungan TPH. Jika antara perlakuan M dan P dibuat rata-rata, maka penambahan bioremedian telah mengurangi kandungan minyak terlarut di air wadah percobaan sebesar 77,7% selama 20 hari. Hal ini selaras dengan penurunan toksisitas terhadap A. salina yang terhitung sebelumnya sebesar 88%. Sesuai dengan uji toksisitas, keberadaan minyak dalam sekam juga rendah, yaitu hanya sebatas rata- rata perlakuan kontrol.
Penurunan jumlah minyak terlarut dalam air, sesuai dengan hasil uji toksisitas, terjadi pada hari ke-5 hingga ke-10. Hal ini membuktikan dugaan bahwa pada kurun waktu tersebut terjadi fase log dari pertumbuhan bakteri bioremedian sehingga laju reaksi pemecahan minyak terlarut lebih besar dibandingkan dengan laju kelarutan senyawa polar dalam agregat minyak di permukaan air ke dalam kolom air dalam
wadah uji. Namun setelah hari ke-10, gradien yang landai dari kandungan minyak di bagian permukaan, tengah, maupun dasar, diperkirakan terjadi akibat fase statis atau lisis pertumbuhan bakteri sehingga laju pemecahan minyak menurun.
Kadar minyak dalam air laut, setelah hari ke-10 dalam perlakuan penambahan bioremedian, menunjukkan kecenderungan statis namun toksisitasnya menunjukkan kecenderungan meningkat. Hal ini memperkuat dugaan bahwa kematian A. salina tidak hanya disebabkan kadar minyak terlarut, namun juga disebabkan oleh variabel yang lain.

## Korelasi Penambahan Bioremedian pada
Toksisitas Air Laut terhadap A. salina
Hasil analisis korelasi Spearman menunjukkan bahwa secara individual, variabel yang berkorelasi kuat secara signifikan terhadap kematian A. salina adalah kadar minyak dan oksigen terlarut. Hubungan antara kematian A. salina dan kadar minyak menunjukkan korelasi positif sedangkan terhadap oksigen terlarut berkorelasi negatif.
Untuk mengetahui koefisien determinasi dari hasil analisis, dilakukan analisis regresi. Hal ini dilakukan
Perlakuan/ Treatment -10 0 10 20 30 40 50 0 5 10 15 20 25 Hari/ Days P e rs ent as e K e m a ti an/ Mo rt a li ty P e rc ent age (% ) Media MT MB PA PT PB Kontrol/ Control -10 0 10 20 30 40 50 0 5 10 15 20 25 Hari/ Days P e rs ent as e K e m a ti an/ Mo rt a li ty P e rc ent age (% ) AL K B
-1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 0 5 10 15 20 Hari/ Days K ons ent ra s i/ C o nc ent rat io n ( m g/ L) A B C D E F G
untuk mengetahui sejauh mana variasi dependen kematian A. salina dapat diprediksi dari variabel independen yang diuji. Uji regresi menunjukkan bahwa kadar kelarutan minyak dalam wadah uji tidak secara signifikan (P>0,05) berperan sebagai prediktor kematian A. salina . Hal ini memperkuat dugaan bahwa produk Micro Morr E-3360 telah secara efektif mengurangi kandungan berbahaya dalam minyak sehingga kadar minyak tidak secara signifikan berperan dalam kematian A. salina. Variabel yang berpengaruh adalah kadar oksigen terlarut dan turbiditas dengan model matematis:
Kematian A. salina = 2.208 – 0,335[DO] – 0,005 [turbiditas]  ......(R 2 = 0,532)
Hasil ini menunjukkan bahwa 53,2% kematian A. salina disebabkan oleh perubahan oksigen terlarut dan interaksinya dengan kenaikan turbiditas. Kurva ini layak karena hasil uji residu regresinya tidak berbeda secara signifikan terhadap kurva normal, yang merupakan syarat validitas persamaan regresi (Anon., 2006). Koefisien determinasi 53,2%, jika ditinjau dari analisis kimiawi adalah sangat rendah, namun pada
uji biologis, determinasi yang tepat berkorelasi (di atas 95%) sangat jarang terjadi karena banyak faktor yang mungkin tidak terkontrol dan mempengaruhi variasi antar organisme yang di uji (Fowler & Cohen, 1992). Oleh karena itu, uji regresi variabel biologis secara umum dilakukan untuk mengetahui seberapa jauh variabel dependen dapat diprediksi dari variabel independen yang diuji serta seberapa besar variabilitas dalam pengujian.
Dengan demikian, jika didasarkan pada nilai R 2 , diketahui bahwa penelitian ini baru mampu mengetahui prediktor yang dapat memprediksi penyebab kematian 50% populasi A. salina. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat variabilitas lain pada kematian A. salina yang tidak termasuk dalam persamaan regresi, misalnya dapat diduga karena kerapatan dan hasil sekresi metabolit dari bakteri lain yang juga berkembang. Dugaan ini terjadi karena seperti yang terlihat pada perlakuan kontrol yang juga menyebabkan A. salina mati. Faktor lainnya seperti kejenuhan kandungan nutrien yang tidak dapat teruji karena mencapai limit deteksi alat, maupun faktor ketidakpastian dan galat selama percobaan. Namun, penyebab kematian 50%
Keterangan/ Note :
M =Air laut dan minyak 2% w/w air laut;
M =seawater and oil 2% (w/w) of seawater;
P =air laut, minyak 2% w/w dari air laut, bioremedian 10% w/w dari minyak, dan nutrien;
P =seawater, oil 2% (w/w) of seawater, bioremediant 10% (w/w) of oil, and nutrient;
A = MA (bagian permukaan perlakuan M)/ MA (surface section for treatment M);
B = MT (bagian tengah perlakuan M)/ MT (middle section for treatment M);
Gambar 3. Penurunan kandungan TPH pada minyak, bahan bioremedian, dan ekstrak padatannya. Figure 3. TPH content decline in oil, bioremediation material, and its extract.
C =MB (bagian dasar perlakuan M)/
MB (bottom section for treatment M); D =PA (bagian permukaan perlakuan P)/
PA (surface section for treatment P) ; E =PT (bagian tengah perlakuan P)/ PT (middle section for treatment P);
F = PB (bagian dasar perlakuan P)/ PB (bottom section for treatment P);
G =Ekstrak 5 g padatan bioremedian dalam 10 mL n- heksana/
Extract of 5 g-bioremediant residue in 10 mL n- hexane
populasi A. salina dapat diprediksi, maka dapat diasumsikan bahwa antaraksi independen dapat menjadi komponen utama prediktor dependen pada kematian A. salina.
Oleh karena itu, berdasarkan analisis ini, dapat diketahui bahwa kandungan minyak yang terlarut dalam air selama percobaan secara tidak langsung membunuh A. salina . Namun, kematian 50% populasi A. salina dapat diakibatkan oleh antaraksi dari peningkatan turbiditas akibat keberadaan sekam atau kerapatan bakteri dengan aktivitas bakteri bioremedian maupun bakteri lainnya secara aerobik di dalam wadah uji yang menurunkan kadar oksigen, sehingga membuat air laut dalam wadah uji menjadi tidak optimal bagi kehidupan A. salina.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil pengujian maka dapat disimpulkan bahwa bahan bioremedian Micro Morr- E3360 efektif dalam merombak cemaran minyak menjadi bahan-bahan tidak berbahaya bagi A. salina dalam skala laboratorium. Namun, permasalahan yang dapat terjadi dari aplikasi bioremedian ini adalah peningkatan turbiditas dan kadar nutrien yang berlebih jika sesuai petunjuk penggunaan bioremedian. Oleh karena itu, walaupun Micro Morr-E3360 memiliki aktivitas yang sangat baik, namun untuk diaplikasikan saat ini sebagai produk bioremedian dalam penanganan kasus tumpahan minyak di laut terdapat hal-hal yang harus diteliti lebih lanjut agar tidak menimbulkan permasalahan baru terhadap lingkungan laut.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Kukuh Adyana dari Pusat Pengkajian dan Perekayasaan Teknologi Kelautan dan Perikanan untuk penyediaan minyak mentah yang diuji cobakan, serta Dr. Edison Effendi atas pengadaan bahan bioremedian Micro Morr E-3360 yang diuji serta rekomendasi penambahan nutrien yang dipergunakan di dalam penelitian ini, dan Gintung Patantis untuk bantuan analisis pada
identifikasi konsorsium bakteri pada media imobilisasi bahan bioremedian.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2003. Robust Summary of Information on Crude Oil (CAS Number 8002-05-9) . American Petroleum Institute.
Anonim. 2004. Tumpahan minyak terus ancam Kepulauan Seribu. Republika . 10-November-2004. Anonim. 2006. Help on SPSS Ver. 15. SPPS Inc. Bustard, M.T., Whiting, S., Cowan, D. A., and Wright, P. C. 2002. Biodegradation of high-concentration isopropanol by a solvent-tolerant thermophile, Bacillus pallidus . Extremophiles. 6: 319–323.
Deshpande, N., Chandrasekar, S., Sorial, G.A., and Weaver, J.W. 2005. Dispersant Effectiveness on Oil Spills - Impact of Environmental Factors. 2005 Annual Science Conference, International Council for the Exploration of the Sea, Aberdeen, Scotland.
Fowler, J. and  Cohen, L. 1992. P ractical Statistics for Field Biology. John Wiley and Sons, Chichester, New York, Brisbane, Toronto. 227 pp.
George-Ares, A., Febbo, E.J., Letinski, D.J., Yarusinsky, J., Safadi, R.S., and Aita, A.F. 2003. Use of brine shrimp ( A. salina ) in dispersant toxicity tests- some caveats. Proceedings of the 2003 International Oil Spill .
Khairunnuur, F.A., Zulkhairi, A., Azrina, A., Moklas, M.A.M., Khairullizam, S., Zamree, M.S., dan Shahidan, M.A. 2009. Nutritional composition, in vitro antioxidant activity and A. salina L. lethality of pulp and seed of Tamarindus indica L. extracts. Mal J Nutr . 15(1): 65– 75.
Priadie, B. 2012. Teknik bioremediasi sebagai alternatif upaya pengendalian pencemaran air. J. Ilmu Lingkungan . 10(1): 135–145.
Patin, S. 2009. Environmental Impact of The Offshore and Gas Industry , Ecomonitoring Publishing, USA. Persoone, G. dan Wells, P.G. 1987. A. salina in aquatic toxicology: a review. In Sargeloos, P., Bengson, D.A., Declair, W., dan Jaspers, E. (eds). A. salina research and Its Application. Vol 1: Morphology, Genetics, Strain Characteristics, Toxicology .  Universa Press, Weneren, Belgium.
Zheng, C., He, J., Wang, Y., Wang, M., and Huang, Z. 2011. Hydrocarbon degradation and bioemulsifier production by thermophilic Geobacillus pallidus strains. Bioresource Technology. 102: 9155–9161.