## BIOINFORMATIK DAN ANALISIS GENETIK MIKROPROPAGASI
Cibotium barometz
Devi Anugrah 1) , Susilo 2) , Hilman Faruq 3)
Pendidikan Biologi, Universitas Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka email: devi.anugrah@uhamka.ac.id

## BIOINFORMATICS AND GENETIC ANALYSIS OF MICROPROPAGATION
Cibotium barometz

## ABSTRACT
In  vitro  culture  is  very  important  for  the  development  of  Simpei  ( Cibotium barometz ) cultivars. Nitrogen could affect the sustainability of breeding traits. The aims of the study is to investigate the effect of variations in nitrogen concentration (KNO 3 ) to the genetic diversity of the Cibotium barometz planlet from in vitro culture. Buds were collected  and  cultured  in  Murashige  and  Skoog  (MS)  medium  with  different  nitrogen concentrations (KNO 3 ). In this study, RAPD analysis was applied to identify 4 Cibotium barometz planlets.  Five  RAPD  primers  were  prepared  for  this  analysis.  The  results showed that the DNA band pattern polymorphism produced from 5 RAPD primers shows very high diversity up to 100%. The results of the RAPD band pattern clustering analysis using the UPGMA method on the similarity coefficient of 0.68 and the analysis of the main components were able to be clearly differentiated into 3 groups.
Key words : Cibotium barometz, Genetic Diversity, Micropropagation, Nitrogen,  PCR- RAPD

## ABSTRAK
Kultur  in  vitro  sangat  penting  untuk  pengembangan  kultivar  Simpei  ( Cibotium barometz )  yang  jumlahnya  semakin  langka.  Penggunaan  nitrogen  dapat  berpengaruh terhadap  keberlanjutan  sifat  pemuliaan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  lebih menginvestifigasis  pengaruh  pemberian  variasi  konsentrasi  nitrogen  (KNO 3 )  terhadap keragaman genetic plantet Cibotium barometz yang dihasilkan dari kultur in vitro. Tunas tunas  dikumpulkan  dan  dikultur  pada  medium  Murashige  dan  Skoog  (MS)  dengan konsentrasi  nitrogen  (KNO 3 )  yang  berbeda  untuk  pembentukan  kultur  in  vitro.  Dalam penelitian  ini,  analisis  RAPD  diterapkan  untuk  mengidentifikasi  4  planlet Cibotium barometz .  Lima  primer  RAPD  disusun  untuk  analisis  ini.  Hasil  penelitian  kami menunjukkan bahwa Polimorfisme pola pita DNA yang dihasilkan dari 5 primer RAPD menunjukkan  keberagaman  yang  sangat  tinggi  hingga  mencapai  100%.  Hasil  analisis klustering pola pita RAPD menggunakan metode UPGMA pada koefisien kemiripan 0.68 dan analisis komponen utama mampu dibedakan dengan tegas menjadi 3 kelompok.
Kata Kunci : ; Cibotium barometz, Keragaman Genetik, Micropropagation, Nitrogen,

## PCR-RAPD

## PENDAHULUAN
Pakis simpei ( Cibotium barometz ) sering dikenal sebagai pakis hias yang memiliki aktivitas  sebagai  anti-peradangan  dan  anti-osteoporosis.  Karena  memiliki  banyak manfaat pakis simpei banyak dicari oleh masyarakat hingga akhirnya jumlah tanaman ini semakin sulit  untuk  ditemukan. Pakis  simpei  terdaftar sebagai  tanaman  yang terancam punah  dari  Perlindungan  Nasional  Kelas  II,  dan  dalam  Lampiran  II  dari  Konvensi Perdagangan Internasional Spesies Fauna dan Flora Liar yang Terancam Punah (CITES 2017). Oleh karena itu, perolehan seluruh genom kloroplas (cp) dari Pakis simpei akan berkontribusi terhadap perlindungan sumber daya dan filogenetik.
Pakis simpei merupakan salah satu jenis paku pohon yang telah dikenal sejak lama sebagai tumbuhan obat. Paku ini juga dikenal dengan sebutan pakis emas atau pakis wol, pakis  monyet,  gou  ji  (Cina)  dan  lain-lain.  Tumbuhan  ini  merupakan  tanaman  asli  dari China yang tersebar dari Tiongkok Selatan hingga Malaya termasuk Sumatera dan Jawa. Pakis  simpei  dapat  hidup  pada  hutan  tropika  basah  dengan  ketinggian  600-800  mdpl (Jennifer et  al .,  2013). Cibotium  barometz di  Asia  Tenggara  digunakan  untuk  tujuan pengobatan,  baik  pengobatan  tradisional  maupun  pengobatan  modern  (Zhang et  al ., 2008). Rimpang dan akar tumbuhan ini dapat digunakan untuk bahan obat rematik, typus , dan untuk mempercepat pembekuan darah. Selain itu, tanaman ini juga dapat dijadikan sebagai tanaman hias karena memiliki morfologi yang unik dan khas (Yu et al. , 2016).
Untuk  memenuhi  permintaan  pakis  simpei  dan  menjaga  kelestariannya  di  alam, perlu adanya upaya budidaya tanaman. Salah satu upaya budidaya yang dapat dilakukkan adalah dengan teknik kultur jaringan (Lestari, 2008; Mikula et al ., 2017). Kultur jaringan atau teknik in vitro pakis simpei telah dilakukan oleh beberapa peneliti seperti Isnaini dan Praptosuwiryo (2015) yang menggunakan media dasar MS (Murashige & Skoog) dengan penambahan berbagai konsentrasi ZPT (Zat Pengatur Tumbuh). Penelitian lainnya adalah yang  dilakukan  Rahayu  dkk.  (2015)  dan  Mikula et  al .,  (2017)  dengan  menggunakan berbagai konsentrasi media MS (Murashige & Skoog) dengan tujuan untuk menginduksi pembentukkan sporofit pada massa prothallus 4 genotipe . Hasil penelitian Rahayu dkk. (2015) menunjukkan bahwa sporofit yang paling banyak tumbuh adalah pada media 1/12
MS untuk semua genotip dan jika dibandingkan antar genotip. Tetapi dari hasil penelitian tersebut sporofit yang dihasilkan perawakannya kurang subur dan diduga penyebabnya adalah kurangnya nutrisi yaitu nitrogen yang menyebabkan daun mengalami klorosis atau menguning.  Gardner  et  al.  (2008)  menyatakan  bahwa  defisiensi  N  akan  membatasi pembesaran  dan  pembelahan  sel.  Gejala  defisiensi  meliputi  pertumbuhan  umum  yang tidak normal atau terbantut (kerdil) dan kuning, terutama di bagian-bagian tanaman yang lebih tua (Gabryszewska, 2011).
Penambahan  unsur  nitrogen  memang  diperlukan  untuk  media  yang  masih kekurangan nutrisi (Razaq et al ., 2017). Namun penambahan nitrogen  yang tidak tepat dapat mempengaruhi pertumbuhan dan bahkan dapat menyebakan kelainan pada generasi sporofitnya. Kelainan yang pernah terjadi adalah pada warna daun.  Apabila media atau tanah mengandung banyak nitrogen maka daun akan berwarna hijau tua solid, sedangkan bila media kekurangan unsur nitrogen maka daun akan keriting, menguning atau coklat (nekrosis)  yang  berarti  jaringan  telah  rusak  atau  mati  (Liu et  al .,  2014;  Rahayu  & Praptosuwiryo,  2017).  Gejala  ini  biasanya  sering  dikaitkan  dengan  penyakit  yang disebabkan oleh virus. Padahal daun menguning dapat disebabkan oleh kurangnya unsur nitrogen  pada  media  atau  tanah.  Perubahan  jaringan  akibat  kekurangan  nitrogen  dapat menyebabkan mutasi atau perubahan genetic (Movahedi et al ., 2013).
Untuk menguji suatu tanaman terjadi mutasi atau tidak dapat dilakukan dengan cara analisis  DNA  (Muladno,  2010).  Analisis  DNA  pada  tanaman  dapat  dilakukan  dengan berbagai teknik seperti ELISA, RFLP, ISSR, dan RAPD. Zulkarnain (2014) menjelaskan bahwa kemampuan regenerasi setiap genotip sangat berbeda dan pengaruh genotip pada proliferasi sel dapat terlihat dari kapasitas regeneratifnya. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui variasi genetik pada generasi sporofit tanaman pakis Sempei hasil kultur in vitro yang diberi perlakuan dosis nitrogen yang berbeda. Untuk mengetahui variasi yang terjadi,  kami  mencoba  menggunakan  metode  RAPD  ( Random  amplified  polymorphic DNA ) untuk analissis DNA tanaman pakis Simpei hasil kultur in vitro.

## MATERIAL DAN METODE
Subyek Penelitian
DNA Cibotium barometz

## Alat dan Bahan yang Digunakan
Alat  yang  digunakan  :  mortar, sentrifuse ,  mesin  PCR.  Bahan  yang  digunakan  : Cibotium barometz , nitrogen cair, larutan CTAB, larutan CI.

## Prosedur penelitian
Isolasi  DNA  pada  penelitian  ini  mengacu  pada  prosedur  yang  dilakukan  oleh Banting (2017). Langkah kerjanya sebagai berikut: 100 mg jaringan sampel ditambahkan dengan  nitrogen  cair  secukupnya  pada  mortar.  Campuran  digerus  hingga  jaringan berubah menjadi serbuk yang kering. Serbuk sel dipindahkan ke dalam tabung eppendorf dan ditambahkan dengan 600 µl larutan CTAB. Larutan kemudian ditambahkan 600 µl larutan CI (24:1) dan dibolak-balik 8 hingga 10 kali. Sentifugasi tabung dengan kecepatan 10000  rpm  selama  10  menit  pada  suhu  4 0 C.  Supernatan  yang  terbentuk  dipisahkan  ke dalam  tabung  yang  baru  dan  ditambahkan  PCI  (25:24:1)  sebanyak  1  kali  volume supernatan.  Tabung  dibolak  balik  hingga  homogen  dan  disentrifugasi  kembali  pada dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 0 C. supernatan dipisahkan ke dalam tabung baru. Supernatan ditambahkan alkohol absolut sebanyak dua kali volume dan NaOAc sebanyak 0.1 kali volume. Tabung diinkubasi pada lemari pendingin selama minimal 2 jam. Setelah diinkubasi, tabung disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 0 C. Supernatan dibuang sedangkan pellet ditambahkan 500 µl alkohol 70%. Sentrifugasi kembali dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 0 C. Supernatan dibuang dan pellet dikeringkan. Setelah pellet kering, ditambahkan ddH2O sebanyak 20 serta 0,4 µl RNAse. Tabung diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 10 menit dan 70 0 C selama 10 menit.
5µl  DNA  genom  ditambahkan  1µl  Loadyng  dye  sampai  tercampur.  Amplifikasi segmen DNA dilakukan dengan menggunakan primer tunggal dekanukleotida. 15 μl total DNA sample yang terdiri atas 0,2 nM dNTPs; 1,5 ml bufer reaksi; 2mM MgCl2; 10 ng DNA sample; 5 pmole primer; dan 1unit Taq DNA polymerase (Promega) diamplifikasi pada Thermalcycler (Takara Gradient PCR) yang diprogram selama 45 siklus. Kondisi PCR untuk RAPD adalah sebagai berikut: pemanasan pertama pada suhu 94 0 C selama 5 menit, kemudian diikuti oleh 45 siklus yang terdiri atas denaturasi 94 0 C selama 1 menit, annealing  36 0 C  selama  1  menit,  dan  ektensi  72 0 C  selama  2  menit.  Setelah  45  siklus
selesai,  kemudian  dilanjutkan  proses  ekstensi  fragmen  DNA  72 0 C  selama  4  menit. Kemudian  larutan  pembebanan  pewarna  ditambahkan  untuk  menambah  berat  molekul DNA. Hasil amplifikasi PCR divisualisasikan menggunakan gel agarose 1% dalam buffer TEA  ( Tris-EDTA )  elektroforesis  horizontal.  Gel  agarose  dicelupkan  ke  dalam  larutan EtBr dengan konsentrasi akhir 1ml/100 ml selama 10 menit. Hasil pemisahan fragmen DNA  dideteksi  dengan  menggunakan  UV  transluminator  di  bawah Geldoc ultraviolet, kemudian digambar dengan menggunakan kamera polaroid. Sebagai standar ukuran DNA digunakan 100 bp DNA ladder (Promega) untuk menetapkan ukuran pita hasil amplifikasi DNA.

## Analisis dan Intepretasi Data
Hasil  yang  diperoleh  di  analisis  secara  deskriptif  kualitatif.  Data  ini  dilakukan berdasarkan skoring pita DNA yang muncul pada hasil elektroforesis, baik pada agarose 1,2% maupun agarose 1%. Pita-pita yang terlihat pada agarose dianggap sebagai satu alel. Pita-pita  DNA  yang  memiliki  laju  migrasi  yang  sama  diasumsikan  sebagai  lokus homolog. Pada laju migrasi yang sama, setiap pita yang tampak diberi nilai 1, sedangkan pita yang tidak tampak diberi nilai 0 sehingga hasil dari skoring pita berupa data biner. Data  hasil  skoring  dianalisis  dengan  menggunakan  program Sequential  Agglomerative Hierarchial  and  Nested (SAHN)-UPGMA  ( Unweighted  Pair-Group  Method  With Arithmetic ) pada perangkat lunak menggunakan NTSYS versi 2.1. hasil analisis disajikan dalam bentuk dendogram.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Empat  planlet  pakis  simpei  kami  pilih  sebagai  sample  untuk  dianalisis  dengan RAPD. Lima primer PCR-RAPD terpilih diujikan pada empat sampel Cibotium barometz yang  menghasilkan  produk  PCR.  Proses  PCR  pada  penelitian  ini  hanya  membutuhkan sedikit DNA template untuk dapat memperbanyak fragmen-fragmen DNA. Deteksi DNA dilakukan dengan mencampurkan media agarose 5 µl DNA genom  yang ditambah 2µl Loading  dye .  Campuran  dimasukan  kedalam  tiap  lubang  ependoft  yang  terdapat  pada agarose  1,2%  lalu  di  running  selama  20  menit.  Agarose  dikeluarkan  dari  alat elektroforesis  kemudian  direndam  dalam  larutan  Etidhium  Bromida  selama  10  menit,
kemudian direndam dengan air selama 5 menit. Pergerakan DNA diamati dibawah sinar UV dengan menggunakan Chemidoc .
Tahap  selanjutnya,  kami  melakukan  uji  kualitas  dan  konsentrasi  DNA  dengan menggunakan Nanodrop  yang memakai  sinar UV dengan panjang  gelombang 260 dan 280  nm.  Perbandingan  dalam  pengujian  menggunakan  sinar  UV  dengan  panjang gelombang 260/280 nm memberikan suatu ukuran terhadap kontaminasi protein dalam suatu DNA. Sementara itu, penggunaan sinar UV dengan panjang 260 nm berfungsi untuk menghitung  konsentrasi  dari  suatu  DNA  sample  yang  akan  diuji  konsentrasi  dan kemurniannya.  2µl  DNA  genom  masing-masing  planlet  diletakkan  keatas  lubang Nanodrop  2010  yang  sebelumnya  telah  dimasukan  2µl  TE.  Hasil  pengujian  kuantitas DNA dengan Nanodrop  ternyata menunjukkan hasil  yang beragam.  Hasil uji kuantitas DNA menggunakan Nanodrop selengkapnya disajikan pada Tabel 1. Hasil uji kuantitas dan kemurnian DNA tertinggi terdapat pada sampel CB2 dengan kemurnian 1,93 µg/µl dan  konsentrasi  168,3  nm  sedangkan  CB3  menunjukkan  nilai  terendah  yaitu  dengan kemurnian 1,79 µg/µl dan konsentrasi 118,1 nm.
Tabel 1. Hasil uji kuantitas DNA menggunakan Nanodrop 2010

## Polimorfisme yang terbentuk oleh penanda RAPD
Amplifikasi PCR dengan lima primer RAPD (OPT01, OPT02, OPT03, OPT04 dan OPT05) berhasil memproduksi 27 pita DNA dengan variasi  ukuran antara 100 sampai 500 bp (Tabel 2). Dua puluh pita adalah polimorfik dan tujuh pita bersifat monomorfik. Pita polimorfik yang tertinggi yaitu primer OPT04 dengan ukuran fragmen antara 100 bp hingga 400 bp dengan presentase polimorpik 100% disusul dengan OPT02 dengan ukuran fragmen antara 91 sampai 340 dengan presentase polimorpik sebesar 90%. Primer yang bersifat polimorpis terdapat pada primer OPT01, OPT02, OPT04, dan OPT05 sedangkan OPT03 bersifat monomorpis yang menghasilkan 4 pita.

## SAMPEL
KEMURNIAN (µg/µl) KONSENTRASI (nm) CB0 1,81 125,4 CB1 1,88 154,2 CB2 1,93 168,3 CB3 1,79 118,1
Hasil  dari  analisis  menggunakan  program GelAnalyzer  t erlihat  jelas  DNA  yang banyak  muncul  terdapat  pada  primer  OPT02,  OPT03,  OPT04  (Gambar  2).  Pita  DNA didominasi  oleh  primer  OPT04,  hal  ini  menunjukan  bahwa  kecocokan  primer  dapat dilihat  dari  banyaknya  pita  DNA  yang  muncul.  Primer  OPT02  dan  OPT04  dapat mengamplifikasi  semua  planlet Cibotium  barometz dengan  jelas.  Sedangkan  primer OPT01  dan  OPT05  memperlihatkan  pita  yang  tidak  jelas.  Pada  penelitian  ini menunjukkan bahwa adanya pita DNA yang muncul pada suatu primer berbanding lurus dengan kecocokan sample pakis  Simpei  dengan  primer tersebut.  Hal ini  berarti primer tersebut  dapat  menjadi  acuan  untuk  tanaman  pakis  Simpei  ataupun  sejenisnya.  Hasil skoring  dilakukan  dengan  melihat  pola  pita  hasil  dari  PCR  kemudian  dianalisis menggunakan program NTSYS untuk menampilkan dendogram. Hasil skoring Pita DNA ditunjukkan pada Tabel 3.
Analisis skoring menunjukan pemisahan tumbuhan pakis Simpei ke dalam primer yang  mengelompok  berdasarkan  muncul  dan  tidaknya  DNA.  Ditandai  muncul  atau tidaknya dengan simbol ‘1’ berarti muncul dan ‘0’ berarti tidak muncul. Tiap DNA yang muncul memiliki besaran yang beragam (MV). Nilai koefisien kesamaan genetik empat aksesi  pakis  Simpei  berkisar antara 25% hingga  100%. Hasil elektroforesis  pada pakis Simpei  dengan penggunakan primer OPT-02, OPT-03, dan OPT-04 menunjukan bahwa CB1  terdapat  perbedaan  dengan  sampel  lainya,  sedangkan  sampel  CB0  dan  CB2 cenderung  sama  dan  untuk  sampel  CB03  menunjukan  perbedaan  pada  tiga  primer tersebut.  Pada  primer  OPT-01  dan  OPT-05  tidak  menunjukan  adanya  perbedaan  antar sampel yang sudah di uji. Hasil dari skoring kemudian dianalisis dengan menggunakan program  NTSYSPC,  SAHN,  SIM,  dan  NTED.  Program  itu  banyak  digunakan  untuk mencari  tahu  kedekatan  antar  sampel.  Hasil  analisis  dendogram  pada  penelitian  ini membentuk  tiga  kluster  (I,  II,  dan  III).  kluster  I  terdiri  atas  pakis  Simpei  CB1  (pakis emas), kluster II terdiri atas CB2 (pakis coklat) dan CB0 (pakis induk), dan kluster III terdiri  atas  CB3  (pakis  bule).  Untuk  melihat  kekerabatan  terdekat  diantara  CB0,  CB1, CB2, dan CB3 dapat dilihat pada dendogram Gambar 1.
Gambar 1. Kekerabatan antara CB0, CB1, CB2, dan CB3
Pakis  Simpei  (Indonesia)  atau golden  chicken  fern ( Cibotium  barometz ),  secara ekologi  merupakan tanaman langka karena jumlahnya  yang terbatas dan dicari banyak orang untuk obat-obatan (Huang et all , 2018). Oleh karena itu, usaha pemulihan tanaman dengan  mikropropagasi  menjadi  sangat  penting  untuk  memenuhi  kebutuhan  pasar. Cibotium  barometz dari  family  Dicksoniaceae  ini  memiliki  perkembangan  yang  sulit tergantung dari kondisi lingkungan dan tahap perkembangan. Pada penelitian kami telah melakukan  perbanyakan  induk Cibotium  barometz dengan  membedakan  konsentrasi nitrogen  pada  media  dan  menghasilkan  3  genotip  planlet.  Planlet  dari  3  genotip  dan  1 induk kami uji secara melekular dengan RAPD untuk mengetahui kemungkinan variasi genetik  yang  terjadi.  Amplifikasi  PCR-RAPD  pada  4  planlet  telah  berhasil  dilakukan dengan  menggunakan  lima  primer  yang  telah  dipilih.  Dalam  karya  ini,  kami menggunakan  primer  yang  sama  yang  dilaporkan  oleh  Escandón et  al .  (2007),  yang mengidentifikasi enam varietas baru dari Nierembergia linariaefolia .
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  penanda  RAPD  berguna  dalam menentukan  hubungan  intra-genetik  dalam  genotip Cibotium  barometz .  Hasil  dari penyinaran  sinar  UV Chemidoc dengan  lima  primer  pada  program GelAnalyzer dapat dilakukan  skoring  dengan  jelas.  Pita  polimorfis  DNA  terdeteksi  pada  tiap-tiap  primer dengan marker berkisar antara 100 hingga 500 bp. Sifat polimorpis nampak pada primer OPT01,  OPT02,  OPT04,  dan  OPT05.  Primer  OPT03  memiliki  sifat  monomorpis,  hal tersebut  menunjukan  bahwa  primer  OPT03  tidak  mampu  membedakan  sampel  satu dengan lainya sehingga tidak cocok untuk aplifikasi pakis Simpei. Pada Gambar 2 dapat dilihat pita DNA yang paling sedikit muncul terdapat pada primer OPT01 dibandingkan OPT03. Namun dilihat dari sifatnya, primer OPT02 justru lebih baik dibandingkan primer OPT03.  Primer  OPT02  bersifat  polimorpis,  sehingga  dapat  membedakan  DNA  pada
primer  tersebut  dibandingkan  dengan  OPT03  yang  lebih  banyak  mengeluarkan  DNA namun tidak dapat membedakan planlet CB0 hingga CB3.
Mengenai hubungan genetik dari genotip Cibotium barometz , penilaian koefisien kemiripan  genetik  dan  penggabungan  genotip  mengakibatkan  terpaparnya  variabilitas genetik  diantara  genotip  empat  planlet.  Gambar  3  merupakan  penjelasan  mengenai kekerabatan antar sampel CB0, CB1, CB2, dan CB3 dengan bantuan program NTSYSPC, SAHN, SIM, dan NTED dalam bentuk dendogram. Pada koefisien korelasi kemiripan (r = 0.68), dendogram digambar menggunakan metode cluster UPGMA yang menghasilkan tiga kelompok. Satu kelompok besar terdiri atas pakis Simpei CB2 (pakis coklat) dan CB0 (pakis induk), dan dua akses independen individu yaitu CB3 (pakis bule) dan CB1 (pakis emas). Sample CB1, CB2, dan CB3 secara morfologi hampir tidak memiliki perbedaan, hanya warna pada bulu yang membedakan yaitu kecoklatan, keemasan, dan bule. Dilihat dari  pola  pita  DNA  mereka  memiliki  perbedaan  ukuran,  letak  bp  dan  sifat.  Secara morfologi, CB1, CB2, CB3 miliki kesamaan satu dengan lainya, namun dengan pengujian keragaman DNA dan tingkat kekerabatan, mereka justru memiliki perbedaan satu sama lain.
Kemiripan  genetik  antara  CB0  dan  CB2  cenderung  lebih  dekat  (Gambar  3), meskipun  genotipe  memiliki  karakteristik  morfologi  yang  berbeda.  Zhao et  al .  (2007) melaporkan bahwa genotip yang sama mengandung perbedaan meskipun mereka berasal dari  ekotip  yang  sama.  Ini  adalah  fakta  yang  diketahui  bahwa  keberlangsungan  setiap populasi tanaman bergantung pada keragaman genetik mereka. Selain itu, faktor-faktor seperti isolasi populasi, pergeseran genetik, sistem perkawinan, aliran gen, seleksi, dan pergeseran  distribusi  bertanggung  jawab  untuk  perubahan  dalam  pembentukan  genetik yang kompleks dan selanjutnya menyebabkan variasi dalam multiplisitas herediter dalam populasi.
Studi  kami  mendukung  pandangan  ini  sampai  batas  tertentu;  Namun,  mengingat sejumlah kecil genotip dan penanda yang digunakan untuk analisis ini, penelitian dengan berbagai  jenis  penanda  dan  sejumlah  genotip  yang  lebih  tinggi  perlu  dilakukan.  Hasil penelitian ini, memvalidasi sekali lagi bahwa RAPD adalah penanda yang berguna dalam studi keragaman genetik, karena tingkat polimorfisme yang dapat terdeteksi oleh primer. Selain  itu,  ketika  dasar  genetik  dari  spesies  atau  genus  yang  akan  dianalisis  tidak
diketahui dengan baik dan hasil yang cepat dan kuat diperlukan, teknik ini sangat berguna karena sederhana dan memiliki biaya rendah. Kemungkinan karakterisasi setiap individu diperiksa,  menawarkan  perspektif  yang  menjanjikan  sebagai  alat  molekuler  untuk identifikasi varietas dan aplikasi program pemuliaan.

## KESIMPULAN
Penelitian  ini  merupakan  upaya  untuk  lebih  memahami  pengaruh  pemberian nitrogen  (KNO 3 )  terhadap  keragaman  genetik Cibotium  barometz .  Meskipun  ada kesamaan  genetik  yang  tinggi  di  antara  mayoritas  genotip Cibotium  barometz ,  empat kelompok  yang  berbeda  dapat  diidentifikasi  berdasarkan  penanda  molekuler  RAPD. Polimorfisme  pola  pita  DNA  yang  dihasilkan  dari  5  primer  RAPD  menunjukkan keberagaman  yang sangat tinggi hingga mencapai 100%. Hasil analisis klustering pola pita RAPD menggunakan metode UPGMA pada koefisien kemiripan 0.68 dan analisis komponen  utama  terhadap  4  genotipe Cibotium  barometz hasil  kultur  in  vitro  mampu dibedakan  dengan  tegas  menjadi  3  kelompok.  Studi  kami  menunjukkan  bahwa penggunaan  penanda  DNA  RAPD  yang  diturunkan  untuk  mengotentikasi  Cibotium barometz  hasil  kultur  in  vitro  dapat  membantu  memperjelas  keragaman  genetik  yang terjadi.
Ucapan Terima Kasih disajikan secara singkat; semua sumber dana penelitian perlu disebutkan, dan setiap potensi konflik kepentingan disebutkan.

## DAFTAR PUSTAKA
Cuong NX, et al . 2009. Inhibitors of Osteoclast Formation from Rhizomes of Cibotium barometz . Journal of  J. Nat. Prod . Vol. 72(9):1673-1677.
Fu  C, et  al .  2017. Cibotium  barometz Polysaccharides  Stimulate  Chondrocyte Proliferation  in  Vitro  by  Promoting  G1/S  Cell  Cycle  Transition. Journal  of Molecular Medicine Reports .  Vol. 15:3027-3034.
Gabryszewska,  E.  2011.  Effect  of  Various  Levels  of  Sucrose,  Nitrogen  Salts  and Temperature  on  The  Growth  and  Development  of Syringa  Vulgaris  L .  Shoots  in Vitro. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research . Vol. 19(2):133-148.
Govarthanan, et  al .  2011.  Genetic  Variability  among Coleus  sp .  Studied  by  RAPD Banding  Pattern  Analysis. International  Jurnal  Biotechnology  and  Molecular Biology Research . Vol. 2(12): 202-208.
Khumaida  &  Handayani.  2010.  Induksi  dan  Proliferasi  Kalus  Embriogenik  pada Beberapa Genotipe Kedelai. Jurnal Argon Indonesia 38 (1): 19-24.
Krizman,  M, et  al .  2007.  Robust  CTAB-Activated  Charcoal  Protocol  for  Plant  DNA Extraction. Journal of Acta Culture . Vol. 87(2): 427-433.
Jennifer,  MO,  Geigerpetra,  KA,  Ranker,  AC.  2013.  Molecular  Phylogenetic Relationships  of Cibotium and  Origin  of  The  Hawaiian  Endemics. Journal  of American Fern Journal . Vol. 103(3):141-152.
Lestari, EG. 2008. Kultur Jaringan . Bogor: Akademia.
Liu,  CW,  Sung,  Y,  Chen,  BC,  Lai,  HY.  2014.  Effects  of  Nitrogen  Fertilizers  on  the Growth and Nitrate Content of Lettuce ( Lactuca sativa L .). Journal of Int. J. Environ. Res. Public Health . Vol. 11:4427-4440.
Langga,  Fajarwati,  I,  Restu,  M.,  Kuswinanti,  T.  2012.  Optimalisasi  Suhu  dan  Lama Inkubasi dalam Ekstraksi DNA Tanaman Bitti ( Vitex coffasus reinw ) serta Analisis Keragaman Genetik dengan Teknik RAPD-PCR. Jurnal Sains dan Teknologi . Vol. 12(3) : 265-276.
Mai, W, Chen, D, Li, X. 2012. Antioxidant Activity of Rhizoma cibotii in vitro. Journal of Advanced Pharmaceutical Bulletin . Vol. 2(1):107114.
Mendes, R, Neto, RA, Nascimento, M, Lima, P. 2014. RAPD Analysis of The Genetic Diversity  among  Accessions  of  Fabaceous  Forages  ( Poincianella spp)  from  the Caatinga. Embrapa  Meio-Norte-Artigo  em  periódico  indexado  (ALICE) .  13(3):  p. 5832-5839.
Mikula, A, Pozoga, M, Tomiczak, K, Rybczynski, JJ. 2014. Somatic Embryogenesis in Ferns: A New Experimental System. Journal of Plant Cell Rep .
Movahedi, Z, Moieni, A, Soroushzadeh, A. 2013. The Effects of Different Concentrations of  Nitrogen  Sources  on  Growth  of  Micropropagated  Potato  Cultivars. Journal  of Plant Physiology and Breeding . Vol. 3(1):35-44.
Mukaromah  L, et  al .  2013.  Pengaruh  Sumber  dan  Konsentrasi  Nitrogen  terhadap Pertumbuhan  dan  Perkembangan  Biji Dendrobium  laxiforum  J.J  Smith secara  in Vitro. Jurnal  Sains  dan  Seni  Pomits 2(1):  2337-3520.  Fakultas  MIPA  Institut Teknologi Sepuluh November.
Muladno.  2010. Teknologi  Rekayasa  Genetika  Edisi  Kedu a.  Kampus  IPB  Taman Kencana Bogor : IPB Press.
Rahayu, EMD, Isnaini, Y, Praptosuwiryo, TN. 2015. Induksi Pembentukan Sporofit pada Masa Prothallus Pakis Simpei ( Cibotium barometz ) secara in Vitro. Journal of  Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon . Vol. 1(4):814-818.
Razaq, M, Heikrujam, M, Chetri, SK, Agrawal, V. 2013. In Vitro Clonal Propagation and Genetic Fidelity of The Regenerants of Spilanthes Calva DC Using RAPD and ISSR Marker. Physiology and Molecular Biology of Plants . 19(2): p. 251-260.
Razaq, M, Zhang, P, Shen, HL, Salahuddin. 2017. Influence of Nitrogen and Phosphorous on The Growth and Root Morphology of Acer Mono. Journal of Plos One .
Ravi et al . 2014. In Vitro Spore Germination and Gametophytic Growth develovment of a Critically Endangered Fern Pteris tripartite SW. African Journal of Biotechnology 13 (23): 2350-2358.
Sasmito, DEK, dkk. 2014. Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk  Sekuensing  DNA  :  Mini  Review.    Seminar  Nasional  Informatika  Medis (SNIMed) V. Vol. 1: 93-102.
Yu, R et al . 2016. In Vitro Propagation of The Endangered Tree Fern Cibotium barometz through Formation of Green Globular Bodies. Journal of Plant Cell Tiss Organ Cult .
Zhang et  al .  2008.  Non-Detriment  Finding  for Cibotium  barometz in  China.  NDF Workshop Case Studies. WG 2-perennials.
Zhao,  X et  al .  2011.  Anti-Osteoporosis  Activity  of Cibotium  barometz Extract  on Ovariectomy-Induced  Bone  Loss  in  Rats. Journal  of  Ethnopharmacology .  Vol. 137:1083-1088.
Zulkarnain. 2014. Kultur Jaringan Tanaman: Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya . Jakarta :  Bumi Aksara.