Pengembangan dan validasi metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) untuk estimasi kadar simultan antiemetik piridoksin hidroklorida dan piratiazin teoklat dalam bentuk sediaan tablet
Fikri Alatas 1 , Hernandi Sujono 2 , Woro Artati Sucipto 2
1 Departemen Farmasetika dan Teknologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Jenderal Achmad Yani, Jl. Terusan Jenderal Sudirman, Cimahi, Jawa Barat, Indonesia
2 Kelompok Keahlian Kimia Analisis, Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Informatika Universitas Jenderal Achmad Yani, Jl. Terusan Jenderal Sudirman, Cimahi, Jawa Barat, Indonesia Corresponding author e-mail:fikri.alatas@lecture.unjani.ac.id

## Abstrak
Metode  kromatografi  cair  kinerja  tinggi  (KCKT)  dengan  detektor  ultra  lembayung  telah dikembangkan  dan  divalidasi  untuk  estimasi  kadar  secara  simultan  campuran  piridoksin hidroklorida  (PH)  dan  piratiazin  teoklat  (PT)dalam  sediaan  tablet  antiemetik.  Proses pemisahan  terjadi  dalam  kolom  Inertsil®  ODS-3  pada  panjang  gelombang  280  nm  dengan laju alir 1,0 mL/menit. Fase gerak yang optimal untuk pemisahan adalah campuran methanol- asam  asetat  1%  (20:80)  dengan  waktu  retensi  PH  dan  PT  berturut-turut  adalah  1,2  dan  9,8 menit. Perolehan kembali PH dan PT berturut-turut adalah 100,13 dan 99,78 %. Batas deteksi untuk PH dan PT berturut-turut adalah 0,21 dan 0,22 µg/mL, sedangkan batas kuantisasinya berturut-turut  adalah  0,70  dan    0,72  µg/mL.  Metode  ini  dapat  diterapkan  sebagai  metode untuk  estimasi  kadar  campuran  piridoksin  hidroklorida  dan  piratiazin  teoklat  dalam  bentuk sediaan tablet secara simultan.
Kata kunci: Piridoksin hidroklorida, piratiazin teoklat, KCKT, tablet
Development and validation of high performance liquid chromatography (HPLC) method for simultaneous estimation of antiemetic pyridoxyne hydrochloride and pyrathiazine theoclate in tablet dosage form

## Abstract
The  high  performance  liquid  chromatography  (HPLC)  method  with  an  ultra  violet  detector has  been  developed  and  validated  for  simultaneous  estimation  of  pyridoxine  hydrochloride (PH)  and  pyrathiazine  theoclate  (PT)  in  antiemetic  tablet  preparations.  The  separation process occurs in the Inertsil® ODS-3 column at a wavelength of 280 nm with a flow rate of 1.0  mL  /min.  The  optimal  mobile  phase  for  separation  is  a  mixture  of  methanol-acetic  acid 1%  (20:80)  with  the  retention  times  of  PH  and  PT  1.2  and  9.8  minutes  respectively.  The recoveries of PH and PT were 100.13 and 99.78%, respectively. The detection limits for PH and PT were 0.21 and 0.22 µg / mL respectively, while the quantisation limits were 0.70 and 0.72  µg  /  mL,  respectively.  This  method  can  be  applied  as  a  method  for  simultaneous estimating the levels of pyridoxine hydrochloride and pyrathiazine theoclate in tablet dosage form.
Keywords: Pyridoxine hydrochloride, pyrathiazine theoclate, HPLC, tablet

## Pendahuluan
Kombinasi  obat  di  dalam sediaan farmasi yang beredar di pasaran umumnya bertujuan untuk  meningkatkan  efektivitas  pengobatan dan  pemakaian  yang  praktis.  Diantara sediaan  yang  ada  di  pasaran  adalah  obat golongan  anti  emetik,  yaitu  obat  yang mengurangi  rasa  mual  dan  muntah.  Salah satu obat antiemetik yang banyak digunakan pada wanita hamil adalah piridoksin hidroklorida  (PH)  yang  dikombinasikan dengan  antihistamin,  antara  lain  doksilamin suksinat,  proklorperazin  maleat,  meklizin hidroklorida  dan  piratiazin  teoklat  (Fantasia, 2014; Koren et al., 2010; Matok et al., 2014).
Proses pemisahan dua atau lebih zat aktif, antara lain dengan ekstraksi umumnya harus dilakukan  sebelum  menetapkan  kadar  lebih dari  satu  zat  aktif  di  dalam  sediaan  farmasi dengan  metode  spektrofotometri  ultraviolet, sehingga  waktunya  menjadi  kurang  efisien. Pada  saat  ini,  hampir  semua  buku-buku resmi,  seperti  Farmakope  Indonesia  (FI), United  State  Pharmacopeia  (USP)  dan British  Pharmacopeia  (BP),  menggunakan metode  kromatografi  cair  kinerja  tinggi (KCKT) untuk penetapan kadar sediaan obat. KCKT  merupakan  metode  yang  mampu memisahkan  sekaligus  menetapkan  kadar lebih  dari  satu  zat  aktif  di  dalam  sediaan farmasi dengan hasil yang optimal. Keunggulan  KCKT  adalah  memberikan pemisahan  cepat,  efisien  dan  resolusi  tinggi. Pesatnya  penemuan  obat  baru,  komposisi obat yang semakin kompleks (lebih dari dua komponen  zat  aktif),  pengaruh  matriks  pada sediaan/sampel  memerlukan  validasi  metode untuk  menunjang  penelitian  di  bidang kefarmasian.
Penetapan kadar secara simultan kombinasi piridoksin hidroklorida dan doksilamin suksinat sudah banyak dilakukan secara  kromatografi  cair  kinerja  tinggi (KCKT) (Ravichandran, Selvakumar, Afreen,  &  Banu,  2018;  Richards  &  Kumar, 2017),  begitu  pula  dengan  kombinasinya dengan  proklorperazin  maleat  (Khanage, Mohite,  Dudhade,  &  Deshmukh,  2014)  dan meklizin hidroklorida (Nawaz, 2013), namun hingga  saat  ini  belum  ditemukan  literatur
tentang  metode  penetapan  kadar  simultan campuran piridoksin hidroklorida dan piratiazin  teoklat  secara  KCKT.  Penetapan kadar  piratiazin  teoklat  dengan  piridoksin hidroklorida yang telah dikembangkan sebelumnya dilakukan secara TLC- Densitometri
(Widiretnani,
Wahyuni, Kartinasari, & Indrayanto, 2009). Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan  metode  penetapan  kadar campuran piridoksin hidroklorida dan piratiazin  teoklat  secara  simultan  dalam sediaan  tablet  dengan  menggunakan  metode KCKT yang mudah, cepat dan valid.

## Metode
Bahan. Bahan-bahan penelitian ini adalah baku  pembanding  piratiazin  teoklat,  baku pembanding  piridoksin  hidroklorida,  tiga jenis  tablet  di  pasaran    (mengandung piratiazin  teoklat  dan  piridoksin  HCl), metanol  grade  HPLC,  air,  amilum,  Avicel® pH  102,  magnesium  stearat,  Starch®  1500, dan talk.
Alat.  Alat-alat  penelitian  ini  adalah seperangkat  instrumen  KCKT  (Shimadzu LC10-ADvp pump dilengkapi dengan detektor  SPD-10A  dan  perangkat  lunak Shimadzu LC Solution, seperangkat instrumen spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-1601), kolom inertsil® ODS- 3  C18,  4,6  x  250  mm,  timbangan  analitik (Shimadzu  ATX224,  kapasitas  10-220  mg, ketelitian d=0,1 mg), alat sonifikasi (Branson 3510), seperangkat penyaring vakum, pompa vakum.
Optimasi
panjang gelombang menggunakan spektrofotometer UV. Optimasi  panjang  gelombang  yang  dipakai untuk  deteksi  pada  system  KCKT  dilakukan dengan  membuat  masing-masing  kurva serapan  larutan  10  μg/  mL  PH  dan  PT  di dalam  air  menggunakan  spektrofotometer ultraviolet  pada  rentang  panjang  gelombang 200-350 nm. Kedua kurva serapan ditumpangtindihkan  (overlay)  dan  panjang gelombang  optimal  ditentukan  berdasarkan serapan kedua zat yang memungkinkan dapat terdeteksi pada sistem KCKT.
Sistem
Kromatografi. Sistem kromatografi  yang  digunakan  adalah  LC column  Inertsil®ODS-2  panjang  250  mm  × diameter  dalam  4,6  mm,  ukuran  partikel 5μm,  fase  gerak  campuran  metanol-asam asetat  1%,  laju  alir  1,0  mL/menit,  detektor spektrofotometer  ultraviolet,  dan  volume injeksi 20 µL.
Optimasi Fase Gerak. Optimasi komposisi  fase  gerak  dilakukan  dengan menyuntikan campuran larutan PH 10 μg/mL dan PT 10 μg/mL dalam air ke dalam sistem KCKT  dengan  variasi    fase  gerak  campuran metanol-asam  asetat  1%  (20:80),  (30:70), dan  (40:60).  Fase  gerak  optimal  ditetapkan berdasarkan  bentuk  puncak-puncak  PH  dan PT  yang  diperoleh  dari  kromatogram  dan nilai  resolusi  (R)  dari  kedua  puncak  zat tersebut.  Waktu  retensi  masing-masing  zat ditentukan  dengan  menyuntikkan  masing- masing    larutan  baku  10  μg/mL  PH  dan  PT ke dalam sistem KCKT.
Uji Linearitas, Batas Deteksi (BD), dan Batas Kuantisasi (BK) . Parameter validasi  linearitas,  BD,  dan  BK  ditentiukan berdasarkan  kurva  kalibrasi  masing-masing zat  yang  diperoleh  pada  sistem  KCKT dengan  komposisi  fase  gerak  optimal. Larutan  standar  masing-masing  PH  dan  PT dibuat  dengan  konsentrasi  6,  8,  10,  12,  16 dan  20  µg/mL  dalam  pelarut  air.  Masing- masing  larutan  disaring  dengan  penyaring miliphore (0,45 µm) dan filtratnya disuntikkan  sebanyak  20  µL  ke  dalam instrumen KCKT dengan fase gerak campuran metanol dan asam asetat 1% yang optimal. Parameter linearitas dihitung berdasarkan  nilai  koefisien  korelasi  yang diperoleh  dari  kurva  kalibrasi.  Nilai  BD dihitung  dengan  persamaan,  BD=  3  x  sb/b, sedangkan  nilai BK  dihitung dengan persamaan,  BK=  10  x  sb/b  berdasarkan International  Council  for  Harmonisation  of Technical Requirements  for Pharmaceuticals for  Human  Use  (ICH)  Guideline.  Sb  adalah simpangan  baku  dari  larutan  blanko  dan  b adalah slop dari kurva kalibrasi.
Uji  Kecermatan  dan  Keseksamaan. Parameter kecermatan (akurasi) dan keseksamaan  (presisi)  ditentukan  dengan
metode  spiked  placebo  recovery,  yaitu dengan  pembuatan  tablet  simulasi  yang mengandung  piratiazin  teoklat  40  mg  dan piridoksin  HCl  37,5  mg,  serta  ditambahkan matrik  tablet.  Matrik  tablet  terdiri  dari campuran  amilum,  Avicel®  pH  102, magnesium stearat, starch®1500, talk, hingga  bobot  tablet  200 mg.  Tablet  simulasi ini  dibuat  tiga  konsentrasi  yaitu  80%,  100% dan 120% untuk masing-masing zat. Sejumlah sampel simulasi ditimbang, dilarutkan  dengan  20  mL  metanol  ke  dalam labu  takar  100  mL,  disonifikasi,  kemudian diencerkan  sampai    tanda  batas  dengan  air dan  disaring.  Filtrat  dipipet  sebanyak  0,8 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, diencerkan  dengan  air  hingga  tanda  batas, disaring  dengan  penyaring  miliphore  (0,45 µm), dan sejumlah  20 µL filtrat diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan perbandingan  fase  gerak  campuran  metanol dan asam asetat 1% yang optimal. Pengukuran  dilakukan  sebanyak  tiga  kali untuk masing-masing konsentrasi. Kecermatan  dihitung  berdasarkan  perolehan kembali (persen recovery), Sedangkan simpangan baku relatif atau koefisien variasi digunakan  sebagai  dasar  untk  menentukan keseksamaan.
Penerapan Metode KCKT untuk Estimasi  Kadar  Simultan  PH  dan  PT pada  Sediaan  Tablet  yang  Beredar  di Pasaran. Estimasi kadar dilakukan pada tiga produk  Tablet  (A,  B,  dan  C)  yang mengandung  piridoksin  hidroklorida  dan piratiazin  teoklat  yang  beredar  di  pasaran. Estimasi kadar PH dan PT dilakukan dengan menimbang  masing-masing  10  buah  tablet dan  digerus  di  dalam  mortar  hingga homogen.  Serbuk  tablet  ditimbang  setara bobot  rata-rata  tablet,  dimasukkan  ke  dalam labu  takar  100  ml  ditambahkan  20  mL metanol,  disonifikasi,  diencerkan  dengan hingga  tanda  batas,  dan  disaring.  Filtrat diambil  sebanyak  0,8  mL,  dimasukkan  ke dalam  labu  ukur  25  mL,  diencerkan  dengan air,  disaring  dengan  penyaring  miliphore (0,45  µm),  dan  sejumlah  20  µL  disuntikkan ke dalam sistem KCKT dengan perbandingan  fase  gerak  campuran  metanol
dan  asam  asetat  1%  paling  optimal. Pengukuran  dilakukan  dengan  replikasi  tiga kali untuk masing-masing tablet.
Hasil dan Pembahasan Pemilihan Panjang Gelombang Serapan Optimal. Pemilihan panjang gelombang  serapan  optimal  bertujuan  untuk memperoleh  satu  panjang  gelombang  yang dapat  mendeteksi  kedua  senyawa  tersebut dengan  maksimal.  Tablet  yang  beredar  di pasaran  mengandung  piratiazin  teoklat  (PT) 40  mg  dan  piridoksin  hidroklorida  (PH)  37, mg,  sehingga  untuk  menentukan  panjang gelombang  optimal  digunakan  perbandingan konsentrasi  yang  sama.    Gambar  1 merupakan  kurva  serapan  tumpang  tindih dari PT dan PH. Gambar tersebut menunjukkan  kurva  serapan  maksimum larutan piratiazin teoklat lebih kecil dari pada larutan piridoksin HCl pada konsentrasi yang sama.  Panjang  gelombang  deteksi  tidak dapat  ditentukan  pada  panjang  gelombang serapan  maksimum  PT  maupun  PH,  karena pada  panjang  gelombang  serapan  maksium PT,  serapan  PH  sangan  rendah,  begitupula sebaliknya. Oleh karena itu panjang gelombang  optimal  yang  digunakan  adalah 280  nm,  dimana  pada  panjang  gelombang tersebut kedua zat dapat memberikan serapan yang  optimal,  sehingga  dapat  terdeteksi menggunakan KCKT.
Gambar 1.   Kurva  serapan  tumpang  tindih larutan piridoksin hidroklorida (PH) 10  μg/mL  dan  piratiazin  teoklat (PT) 10 μg/mL di dalam air.
Optimasi  Fase  Gerak. Penetapan  kadar pirodoksin  hidroklorida  di  dalam  campuran vitamin  B  sebelumnya  telah  dilakukan menggunakan  fase  diam    kolom  C18  dan
fase  gerak  campuran  metanol  dan  asam asetat  1%  (Yantih,  Widowati,  &  Aryani, 2011), sedangkan penetapan kadar campuran piridoksin hidroklorida dan piratiazin teoklat menggunakan  KCKT  hingga  saat  ini  belum ditemukan.  Untuk  itu  sistem  kromatografi yang  digunakan  pada  penetapan  kadar campuran piridoksin hidroklorida dan piratiazin teoklat, berdasarkan sistem kromatografi yang digunakan pada penetapan  kadar  piridoksin  hidroklorida yang  dimodifikasi.  Pasangan  pelarut  yang paling  sering  dipakai  dalam  kromatografi fase  terbalik  adalah  air-metanol  dan  air- asetonitril.  Metanol  adalah  pelarut  sangat murni,  mudah  didapat,  dan  berhasil  baik pada  banyak  pemisahan.  Ada  beberapa kekurangannya,  seperti:  viskositasnya  yang tinggi  cenderung  menurunkan  efisiensi kolom,  sukar  bercampur  dengan  cuplikan non  polar,  dan  volume  campur  kecil (Johnson,  Stevenso,  &  Terjemahan  K. Padmawinata.,  1991).  Penentuan  fase  gerak optimal  sangat  penting  untuk  memastikan bahwa  puncak  kromatogram  PT  dan  PH sudah  terpisah  secara  baik  dan  memenuhi parameter  selektivitas.  Pada  komposisi  fase gerak  dengan  jumlah  metanol  lebih  tinggi, yaitu  campuran  metanol-asam  asetat  1% (30:70) dan (40:60) menghasilkan pemisahan yang  baik,  namun  puncak  PT  terpecah menjadi  dua  bagian,  sehingga  komposisi tersebut  tidak  bisa  digunakan.  Komposisi fase  gerak  yang  paling  optimal  diperoleh pada  campuran  metanol-asam  asetat  1% (20:80)  seperti  ditampilkan  pada  Gambar  2. Pada  komposisi  tersebut,  waktu  retensi  PH dan  PT  berturut-turut  adalah  1,3  dan  9,9 menit  dengan  nilai  resolusi  (R)=  11,2.  Nilai resolusi tersebut menegaskan bahwa, puncak-puncak PH dan PT sudah menunjukkan  pemisahan  yang  cukup  baik yaitu  memenuhi  persyaratan  nilai  R  ≥  1,5 dan  puncak  PT  tidak  terpecah  menjadi  dua bagian.
Gambar 2.   Kromatogram campuran larutan piridoksin  hidroklorida  (PH)  10 μg/mL  dan  piratiazin  teoklat  (PT) 10  μg/mL  pada  perbandingan  fase gerak  metanol-asam  asetat  1% (20:80).
Linearitas,  Batas  Deteksi  dan  Batas Kuantisasi. Linearitas menyatakan kemampuan suatu metode untuk mendapatkan  hasil  yang  sebanding  dengan kadar analit dalam suatu sampel pada kisaran konsentrasi  tertentu.  Linearitas  dinyatakan dengan koefisiensi korelasi (r), yang menunjukkan adanya hubungan linear antara luas  kromatogram  dan  konsentrasi.  Nilai koefisien korelasi memenuhi kriteria penerimaan  yang  telah  ditentukan,  yaitu  r ≥0,997.  Kurva  kalibrasi  PH  memberikan garis  lurus  dengan  persamaan  regresi  linear, y=29936x + 25214 dan koefisien korelasi (r) =0,999,  sedangkan  persamaan  regresi  linear PT, y=25709x + 4734,5 dan r =0,999. Hal ini menunjukkan  konsentrasi  kedua  zat  tersebut mempunyai  hubungan  yang  linear  dengan respon instrumen, sehingga tingkat kesalahan kurva  sangat  kecil.  Batas  deteksi  (BD)  dan batas  kuantisasi  (BK)  PT  secara  berurutan adalah  0,21  µg/mL  dan  0,70  µg/mL, sedangkan  BD  dan  BK  untuk  PT  secara berurutan  adalah  0,22  µg/mL  dan  0,72 µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi  piridoksin  hidroklorida  dan piratiazin teoklat terkecil yang dapat terdeksi oleh  instrumen  adalah  0,21µg/mL  dan  0,22 µg/mL.  Konsentrasi  piridoksin  HCl  dan piratiazin teoklat terkecil  yang  dapat ditentukan  kadarnya  dengan  kecermatan  dan keseksamaan  yang  dapat  di  terima  adalah 0,70 µg/mL dan 0,72 µg/mL
Uji  Kecermatan  dan  Keseksamaan. Kecermatan dinyatakan dengan nilai perolehan  kembali  (persen  recovery),  nilai perolehan  kembali  yang  dapat  diterima tergantung  pada  jumlah  analit  dalam  matrik sampel,  sedangkan  keseksamaan  dinyatakan dengan, koefien variasi (KV), dengan kriteria KV  ≤  2,0  %.  Kecermatan  dan  keseksamaan analisis  campuran  piridoksin    hidroklorida dan    piratiazin    teoklat    dalam    tablet simulasi    menggunakan          spiked  placebo recovery  method,  menghasilkan  rata-rata perolehan  kembali  PH  adalah  100,13% dengan  KV  0,82%  dan  rata-rata  perolehan kembali  PT    99,78%  dengan  KV    0,60% seperti  ditampilkan  pada  Tabel  1.  Hasil pengujian  validasi  metode  KCKT  untuk penetapan piridoksin hidroklorida dan piratiazin  teoklat  dalam  sediaan  tablet menunjukkan  bahwa  metode  analisis  ini memenuhi  persyaratan  validitas,  karena mempunyai ketepatan, ketelitian, dan linieritas yang dapat diterima.
Tabel 1.   Hasil Uji Kecermatan dan Keseksamaan Analisis Campuran dalam Tablet Simulasi Berat Sebenarnya (mg) Berat diperoleh (mg) Recovery (%) PH PT PH PT PH PT 30,00  32,50  29,59 32,24 98,62  100,75 30,00  32,50  29,77 31,78 99,24  99,30 30,00  32,50  30,05 31,83 100,16  99,47 37,50  40,00  38,15 40,28 101,73  100,70 37,50  40,00  37,16 40,03 99,10  100,09 37,50  40,00  38,21 39,75 101,90  99,37 45,00  48,00  45,13 47,79 100,28  99,56 45,00  48,00  45,04 47,55 100,10  99,06 45,00  48,00  45,02 47,88 100,05  99,75 Rata-rata Recovery (%) 100,13  99,78 Simpangan Baku  (%) 1,11 0,61 Koevisien Variasi (%) 1,11 0,61 Penerapan Metode KCKT untuk Estimasi  Kadar  Simultan  PH  dan  PT pada  Sediaan  Tablet  yang  Beredar  di Pasaran. Metode KCKT ini diterapkan pada tiga  sampel  tablet  yang  tersedia  di  pasaran yaitu tablet A, B, dan C. Hasil analisis tablet A  mengandung  kadar  rata-rata  piridoksin
hidroklorida  101,26  dan  piratiazin  teoklat, 100,21 %. Tablet B mengandung kadar rata- rata  piridoksin  hidroklorida  88,40%  dan piratiazin  teoklat  99,33%.    Tablet  C mengandung  kadar  rata-rata  piridoksin hidroklorida  94,06%  dan  piratiazin  teoklat 95,83%. Metode KCKT ini dapat diterapkan dengan  baik  karena  dapat  mengestimasi kadar  piridoksin  hidroklorida  dan  piratiazin teoklat sesuai dengan kadar yang tertera pada etiket.

## Kesimpulan
Pengembangan  metode  untuk  estimasi kadar simultan campuran piridoksin hidroklorida  dan  piratiazin  teoklat  dalam sediaan tablet bisa dikerjakan dengan metode kromatografi  cair  kinerja  tinggi  (KCKT) dengan  sistem  fase  terbalik,  kolom  Inertsil ODS-3  C18,  fase  gerak  campuran  metanol- asam  asetat  1%  (20:80),  laju  alir  1,0 mL/menit,  dan  detektor  spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 280 nm. Hasil uji validasi metode analisis memberikan  validitas  yang  teruji,  sehingga metode dalam penelitian ini dapat diterapkan untuk  estimasi  kadar  campuran  piridoksin hidroklorida  dan  piratiazin  teoklat  dalam sediaan tablet.

## Daftar Pustaka
Fantasia, H. C. (2014). A New
Pharmacologic Treatment  for Nausea  and
Vomiting  of  Pregnancy. Nursing  for Women’s Health , 18 (1), 73–77.
Johnson,  E.  L.,  Stevenso,  R.,  &  Terjemahan K. Padmawinata. (1991). Dasar Kromatografi Cair . Bandung: ITB.
Khanage,  S.,  Mohite,  P.,  Dudhade,  M.,  &
Deshmukh,  V.  (2014).  Separation  and Determination of
Prochlorperazine
Maleate  and Pyridoxine  Hydrochloride in
Tablet  Formulation  by  RP-HPLC. Austin Journal of Analytical and Pharmaceutical Chemistry , 1 (3), 1–5.
Koren,  G.,  Clark,  S.,  Hankins,  G.  D.  V., Caritis,  S.  N.,  Miodovnik,  M.,  Umans,  J. G., & Mattison, D. R. (2010).
Effectiveness
Of
Delayed-Release Doxylamine  and  Pyridoxine  for  Nausea
and Vomiting of Pregnancy: A Randomized  Placebo  Controlled  Trial. American  Journal  of  Obstetrics  and Gynecology , 203 (6), 571.e1-571.e7.
Matok,  I.,  Clark,  S.,  Caritis,  S.,  Miodovnik, M., Umans, J. G., Hankins, G., … Koren, G. (2014). Studying the Antiemetic Effect of  Vitamin  B6  for  Morning  Sickness: Pyridoxine  and  Pyridoxal  are  Prodrugs. Journal of Clinical Pharmacology , 54 (12), 1429–1433.
Nawaz,  M.  S.  (2013).  A  New  Validated
Stability Indicating RP-HPLC Method for Simultaneous  Estimation  of  Pyridoxine Hydrochloride and Meclizine Hydrochloride  in  Pharmaceutical  Solid Dosage Forms. Chromatography Research International , 2013 , 1–7. Ravichandran, S., Selvakumar, S., Afreen, & Banu,  N.  (2018).  RP-HPLC  Method Development  and  Validation  for  The Doxylamine  Succinate  and  Pyridoxine HCl in Its Pure and Pharmaceutical Tablet Dosage Form. Indian Journal of Pharmaceutical  Science  &  Research ,
8 (1), 35–43.
Richards, P., & Kumar, V. K. (2017). A New RP-HPLC  Method  Development  And Validation  For  Simultaneous  Estimation Of Pyridoxine Hydrochloride And Doxylamine Succinate In Bulk Drug And
Pharmaceutical  Tablet  Dosage  Form.
IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences , 12 (5), 74–79. Widiretnani, D., Wahyuni,  S. I., Kartinasari, F., & Indrayanto, G. (2009). Simultaneous Determination  of  Pyrathiazine  Theoclate and Pyridoxine HCl by TLC-
Densitometry  in  Commercial  Tablets: Validation  of  the  Method. Journal  of Liquid  Chromatography  and  Related Technologies , 32 (1), 154–165.
Yantih,  N.,  Widowati,  D.,  &  Aryani,  T. (2011).  Validation  of  HPLC  Method  for Determination of Thiamine
Hydrochloride,  Riboflavin,  Nicotinamide, and  Pyridoxine  Hydrochloride  in  Syrup Preparation. Canadian Journal on Scientific  and  Industrial  Research , 2 (7),
269–278.