## POTENSI MINYAK MIKROALGA DAN KHAMIR SEBAGAI SUMBER ASAM LEMAK ESENSIAL

## POTENTIAL OF MICROALGAE AND YEAST OILS AS NEW SOURCES FOR ESSENTIAL FATTY ACIDS
Erika Rozana 1) , Sri Haryani Anwar 1)* , dan Muhammad Ikhsan Sulaiman 1)
Program Studi Teknologi Hasil Peranian, Fakultas Pertanian, Universitas Syiah Kuala Banda Aceh 23111, Indonesia Email: sri.haryani@unsyiah.ac.id
Makalah: Diterima 9 April 2021; Diperbaiki 7 November 2021; Disetujui 20 November 2021

## ABSTRACT
Edible  oils  as  essential  fatty  acids  sources,  such  as  linolenic  acid,  eicosapentaenoic  acid,  and docosahexaenoic acid, are commonly extracted from plants and seafoods, particularly fish. The productionof fish oil has several drawbacks, including overfishing issues, mercury contamination, and unpleasant smell of fish. Oil production from plants requires extensive land used, long harvest time, and high operational costs. Single-cell oils from  microorganisms  are  the  solution  to  overcome  these problems.  Therefore,  this  study  aimed  to  explore  the potential of microorganisms, i.e. microalga and yeast, which had previously been isolated from mangrove forests in  Aceh  Province, Indonesia,  as  sources  of  essential  fatty  acids.  Two  types  of  microorganisms  used were Thraustochytrium multirudimentale and Rhodotorula mucilaginosa. The results showed that the highest amount of oil was extracted from yeast (17.04 ± 0.78 mg/g), while microoalga produced 4.50 ± 0.49 mg/g only. Based on correlation analysis, the optical density (OD) and biomass, had good correlation with r = 0.990. The spectra of FT-IR analysis from microalga and yeast oils proved that both contained C=O groups which identified as esters of  fatty  acids  and  C=C  groups  identified  as  unsaturated  fatty  acids. Thraustochytrium  multirudimentale and Rhodotorula mucilaginosa are potential as single-cell oil sources containing essential fatty acids.
Keywords: essential oil, fatty acids, microalgae, omega-3, single-cell oil, yeast

## ABSTRAK
Minyak esensial dengan kandungan asam-asam lemakyang penting, seperti asam linoleat, asam linolenat, asam dokosaheksanoat dan asam eikosapentanoat, dapat diekstrak dari sumber nabati dan seafood, khususnya ikan. Namun produksi minyak ikan seringkali terkendala oleh isu overfishing, pencemaran ikan oleh logam berat dan bau amis ikan yang tidak dapat disembunyikan. Ekstraksi minyak esensial dari tumbuhan membutuhkan waktu panen yang lama, lahan yang luas serta biaya operasional yang mahal. Mikroorganisme dapat mengatasi berbagai masalah  tersebut  karena dapat  menghasilkan  minyak dengan  kandungan  asam  lemak  esensial.  Oleh  karena  itu, penelitian ini bertujuan untuk menggali potensi mikroorganisme sebagai sumber minyak esensial. Penelitian ini menggunakan  dua  jenis  mikroorganisme  yaitu  mikroalga Thraustochytrium  multirudimentale dan  khamir Rhodotorula mucilaginosa yang sebelumnya telah diisolasi dari hutan mangrove di Provinsi Aceh-Indonesia. Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  khamir  menghasilkan  rendemen  minyak  tertinggi  yaitu  17,04±0,78  mg/g sedangkan rendemen minyak mikroalga hanya sebesar 4,50±0,49 mg/g. Hasil analisis juga membuktikan bahwa biomassa dan densitas optis kultur memiliki korelasi yang baik (r = 0,990). Analisis FT-IR menunjukkan bahwa kedua jenis minyak mikroorganisme yang dihasilkan memiliki gugus C=O yang diidentifikasi sebagai ester dari asam lemak dan gugus C=C yang mencirikan adanya asam lemak dengan ikatan rangkap atau tidak jenuh. Kedua jenis mikrooganisme, yaitu mikroalga Thraustochytrium multirudimentale dan khamir Rhodotorula mucilaginosa sangat  potensial  sebagai penghasil  minyak  esensial  dengan  kandungan  asam-asam  lemak  yang  penting  bagi kesehatan.
Kata kunci: asam lemak esensial, khamir, mikroalga, minyak mikroorganisme, omega-3

## PENDAHULUAN
Indonesia  adalah  negara  yang  memiliki potensi  sumber  daya  bahari  yang berlimpah.  Salah satu  kekayaan  sumber  daya  perairan  yang  dimiliki adalah kawasan hutan  mangrove. Ekosistem mangrove  yang  kaya  akan  bahan  organik  memiliki peranan  sebagai  sumber  nutrisi  untuk  pertumbuhan makhluk  hidup  disekitarnya.  Salah  satu  makhluk hidup yang  tumbuh  dikawasan  hutan  mangrove
adalah mikroorganisme. Mikroorganisme merupakan makhluk hidup yang berpotensi untuk dikembangkan karena ketersediaannya di alam yang berlimpah.
Sejumlah  mikroorganisme  memiliki  peranan besar dalam berbagai proses industri seperti industri kosmetik,  pangan,  farmasi  serta biodiesel. Mikroorganisme dalam pemanfataannya terus dikembangkan karena dapat diekstrak untuk diambil senyawa-senyawa penting seperti karbohidrat, protein,  zat  warna  dan  minyak.  Telah  banyak
Jurnal Teknologi Industri Pertanian 31 (3): 332-342, Des 2021
DOI: https://doi.org/10.24961/j.tek.ind.pert.2021.31.3.332 ISSN: 0216-3160    EISSN: 2252-3901
dilakukan  penelitian  yang  membuktikan  bahwa minyak  mikroorganisme mengandung  asam  lemak esensial dan berperan penting bagi pertumbuhan dan perkembangan tubuh manusia. Mikroorganisme yang banyak  dimanfaatkan  untuk  diekstrak  minyaknya adalah khamir (yeast), jamur (fungi) dan mikroalga.
Asam linoleat, asam linolenat, asam dokosaheksanoat  (DHA)  dan  asam  eikosapentanoat (EPA)  merupakan  asam-asam  lemak  esensial  yang sangat  penting  bagi  perkembangan  janin  dan membantu  penyembuhan  berbagai  macam  penyakit seperti rheumatoid arthritis, jantung, dan memperbaiki  sistem  metabolisme  tubuh.  Selain  itu, asam-asam lemak  ini dapat membantu melancarkan sirkulasi  darah,  pembentukan  sel  dan  menghambat pertumbuhan sel kanker (D’Eliseo dan Velloti, 2016). Asam-asam  lemak  ini  disebut  esensial  karena  tidak dapat  diproduksi  oleh  tubuh  dan  hanya  dapat diperoleh  dari  konsumsi  makanan  sehari-hari. Beberapa  jenis  asam  lemak  esensial  yang  tergolong dalam omega-3 dan omega-6 diketahui juga memiliki manfaat  yang  baik  untuk  kesehatan  jantung, mencegah  stroke  dan  menurunkan  resiko  terkena kanker (Xu dan Qian, 2014).
Sejauh ini sumber asam-asam lemak omega-3 dan  omega-6  banyak  ditemukan  pada  ikan  dan tumbuhan.  Namun,  ekstraksi  minyak  dari  ikan sebagai  sumber  asam  lemak  memiliki  beberapa kekurangan.  Pertama,  produksi  minyak  dari  ikan dapat  mengakibatkan  terjadinya  eksploitasi  ikan secara  besar-besaran  sehingga    mempengaruhi stabilitas pasar. Kedua, produksi asam lemak esensial tidak  dilakukan  oleh  ikan  akan  tetapi  berasal  dari sumber makanannya yang memiliki kandungan asam lemak  esensial  tersebut  (Barra et  al., 2017).  Ketiga, minyak ikan berpotensi terkontaminasi dengan logam sehingga dapat membahayakan kesehatan konsumen (Sun et  al., 2018).  Selain  itu,  sumber  asam  lemak tidak jenuh lainnya yang berasal dari tumbuhan juga membutuhkan  waktu  panen  yang  lama,  lahan  yang luas dan resiko gagal panen yang tinggi.
Pertumbuhan  mikroorganisme  yang  baik dapat  menghasilkan  biomassa  dengan  kandungan asam  lemak  yang  mirip  dengan  minyak  ikan (Santigosa et al., 2021) dan minyak nabati. Selain itu, beberapa  jenis  mikroorganisme  juga  dilaporkan memiliki  kemampuan  untuk  mengakumulasikan minyak dengan kandungan asam lemak esensial yang tinggi dalam waktu yang singkat (Cerone dan Smith, 2021). Mikroalga dan khamir adalah jenis mikroorganisme yang menarik untuk dikembangkan. Mikroalga dan khamir merupakan sumber bahan baku yang inovatif dan ramah lingkungan yang dapat terus dikembangkan potensinya seiring dengan perkembangan bioteknologi. Kemampuan mikroalga dan  khamir  dalam  menghasilkan  senyawa  metabolit yang  bernilai  secara  terbarukan  dan  berkelanjutan diharapkan  dapat  membantu  memecahkan  masalah
sumber-sumber penghasil asam lemak esensial selain ikan.
Penelitian  sebelumnya  melaporkan  bahwa mikroalga  dari  jenis Thraustochyrid berhasil mengakumulasikan minyak sampai dengan 55% dari berat biomassa kering (Patel et al., 2020).  Selain itu mikrooralga
Schizochytrium
mampu mengakumulasikan  minyak  mencapai  49-67%  dari berat  biomassa  kering  (Chang et  al., 2013).
Kandungan  minyak  yang  tinggi  diduga  dapat membantu  menghasilkan  kandungan  asam  lemak esensial yang lebih banyak. Mikroalga
Thraustochytrids dilaporkan  memiliki  kandungan omega-3  yaitu  1,43-29,67%  dan  omega-6  sebesar 0,03-0,1% (Jaritkhuan dan Suanjit, 2018). Mikroorganisme  lainnya  dari  strain  khamir  seperti Rhodotorula juga  dapat  menghasilkan  minyak.
Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Maza et  al. (2020) menunjukkan  bahwa R.  mucilaginosa menghasilkan minyak  sebanyak  9-48,9%  dari  berat  biomassa kering.  Peneliti  lain  melaporkan  bahwa  khamir R. mucilaginosa dapat menghasilkan omega-3 sebanyak 0,4-0,5%  dan  omega-6  sebesar  0,4%  (Pereira et al.,2019).
Oleh karena potensinya yang begitu menjanjikan,  maka  penelitian  ini  dilakukan untuk mengeksplor
kemampuan
mikroorganisme khususnya mikroalga dan khamir untuk menghasilkan minyak dengan kandungan asam-asam lemak  esensial.  Mikroorganisme  yang  digunakan telah  diisolasi  dari  perairan  hutan  mangrove  di Provinsi Aceh berdasarkan hasil penelitian Anwar et al. (2013). Kedua isolat ini telah diidentifikasi secara morfologi  dan  genetik  dan  diketahui  sebagai mikroalga Thraustochytrium  multirudimentale dan khamir Rhodotorula mucilaginosa.
Penelitian ini terdiri atas 2 tahapan yaitu tahap pertama merupakan tahap penyegaran kembali kultur mikroalga dan khamir pada media padat. Setelah sel- sel  kultur  dewasa  kemudian  dilanjutkan  dengan kultivasi pada media cair untuk melihat pertumbuhan optimum. Tahap kedua dilakukan untuk menganalisis perolehan biomassa dan minyak yang dihasilkan oleh mikroorganisme, yaitu minyak mikroalga dan minyak khamir.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini adalah kultur mikroalga Thraustochytrium multirudimentale dan  khamir  (yeast) Rhodotorula mucilaginosa, yang diisolasi dari  perairan  hutan bakau,  air  laut  alami,  air  destilasi,  antibiotik, yeast extract (Merck), pepton (Himedia), glukosa (Himedia),  agar  (Merck),  Heksan  (Merck  p.a).  Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah gelas ukur, pipet  ukur,  erlenmeyer 250  mL,  ose,  spatula, timbangan  analitik, autoclave,  inkubator, shaker
incubator, rotary  vacuum  evaporator,  sentrifuse, biosafety  cabinet,  refraktometer,  spektrofotometer, rangkaian  alat  sokhlet,  dan  instrumen  FT-IR (IRPrestige-21 Shimadzu).

## Metode
Pembuatan Media Padat YPG (yeast extract peptone glucose)
Media  pertumbuhan  menggunakan  larutan YPG  sebanyak  1000 mL  yang  ditambahkan  agar. Bahan  pembuatan  media  ditimbang  masing-masing sebanyak  0,1% yeast  extract, 1%  pepton,  0,2% glukosa,  1,3%  agar.  Pembuatan  media  padat dilakukan  dengan  mensuspensikan  bahan-bahan dalam  1  L  air  laut  alami  15  ppt.  Selanjutnya  media disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121ºC selama 15 menit pada tekanan 2 atm. Setelah media disterilisasi,  ditunggu hingga  suhu  media  turun  ± 40°C  untuk  penuangan  media.  Selanjutnya  media diinkubasi  pada  suhu  37ºC  selama  48  jam  untuk melihat  ada  atau  tidaknya  kontaminasi  pada  media sebelum proses inokulasi.

## Pembuatan Media Cair YPG (Yeast Extract Peptone Glucose)
Bahan pembuatan  media  cair  ditimbang masing-masing  sebanyak  0,1% yeast  extract, 0,1  % pepton, 1% glukosa. Pembuatan media cair dilakukan dengan mensuspensikan media YPG dan 1 L air laut alami 15 ppt ke dalam gelas beaker berukuran 1000 mL.  Media  kemudian  dituangkan ke  dalam  10 buah erlenmeyer  masing-masing  sebanyak  100  mL menggunakan  gelas  ukur.  Erlenmeyer  ditutup menggunakan  kapas  berbalut  kasa  dan alumunium foil lalu  dibungkus  menggunakan  plastik wrap. Selanjutnya media disterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121ºC selama 15 menit pada tekanan 2 atm. Kemudian media diinkubasi pada suhu 37ºC selama 48 jam untuk melihat ada atau tidaknya kontaminasi pada media sebelum inokulasi.

## Penyegaran Kultur Mikroorganisme
Thraustochytrium multirudimentale dan Rhodotorula  mucilaginosa yang  digunakan  adalah kultur  murni  yang  diisolasi  dari  perairan  hutan mangrove di Provinsi Aceh dan telah diisolasi secara morfologi  dan  genetik  (Anwar et  al., 2021).  Kultur ditumbuhkan pada media padat YPG. Ose dipijarkan diatas  nyala  bunsen  kemudian  diangin-anginkan, kemudian  diambil  sebanyak  1  koloni  tunggal  untuk digoreskan  pada  media  padat  YPG  dengan membentuk 3 kuadran. Selanjutnya pinggiran cawan petri  dibungkus  dengan  plastik wrap. Media kemudian diinkubasi pada suhu 25°C selama 48 jam.

## Pembuatan Starter
Kultur  mikroorganisme  (baik  mikroalga  atau khamir) yang telah berumur 2 hari pada media padat YPG  diambil  sebanyak  2  gores  koloni  (3  mm  x  10 mm) menggunakan ose dan diinokulasikan ke dalam 100  mL  media cair.  Selanjutnya  kultur  diinkubasi
menggunakan shaker  incubator pada  suhu  25°C selama 48 jam.

## Pertumbuhan Optimum
Starter  kultur  yang  telah  berumur  48  jam selanjutnya diinokulasikan pada media cair pertumbuhan optimum. Penambahan starter dilakukan sebanyak 10% dalam setiap 100 mL media cair pertumbuhan optimum. Selanjutnya media kultur diinkubasi menggunakan shaker incubator pada suhu 25°C  selama  8  hari  dengan  penyinaran  lampu  neon 2000 lux.

## Analisis Densitas Optis (Li et al., 2008)
Kultivasi  mikroorganisme  pada  media  cair untuk  pertumbuhan  dan  menghasilkan  biomasa dilakukan  selama  8  hari.  Selama  masa  kultivasi tersebut, dilakukan pengukuran densitas optis kultur setiap  2  hari  sekali  menggunakan  spektrofotometer. Sampel  media  cair  yang  mengandung  biomassa sebanyak  1  mL  dimasukkan  ke  dalam  kuvet kemudian  diukur  absorbansinya  pada  panjang gelombang 600 nm. Penggunaan panjang gelombang 600 nm dianggap optimal untuk mengukur kekeruhan larutan  yang  berwarna  kuning  hingga kecoklatan. Hasil pengukuran absorbansi dicatat sebagai OD undil. Pada  sampel  dengan  nilai  OD>0,4 harus diencerkan terlebih  dahulu  menggunakan  teknik  pengenceran bertingkat.  Sampel  hasil  pengenceran  selanjutnya diukur  kembali  absorbansinya  dan  hasilnya  dicatat sebagai OD dill . Pengukuran OD dill dilakukan sebanyak 2 kali ulangan (duplo) lalu hasil pembacaan dikalikan dengan  faktor  pengenceran  dan  dicatat  hasilnya sebagai OD corr. Data yang digunakan pada penelitian ini adalah nilai rata-rata OD corr.

## Pemanenan Biomassa
Kultur  yang  sudah berusia  8 hari selanjutnya dipanen menggunakan teknik pemanenan sentrifugasi.  Pemanenan  biomassa  dilakukan  pada kecepatan  3000  rpm  selama  5  menit.  Selanjutnya dilakukan pembilasan menggunakan 50 mL akuades lalu  disentrifugasi  kembali  selama  5  menit  dengan kecepatan  3000  rpm.  Biomassa  basah  kemudian diletakkan di dalam cawan petri. Perolehan biomassa basah  kemudian  dikeringkan  menggunakan  oven pengering  pada  suhu  50 ˚C  selama  12  jam  untuk menjadi  biomassa  kering.  Biomassa  yang sudah dikeringkan selanjutnya ditimbang dan dikonversikan dalam bentuk gram/L.

## Ekstraksi Minyak
Biomassa  kering  diekstrak  menggunakan metode  sokhletasi.  Sebanyak  10  g  biomassa  kering diekstraksi menggunakan 100 mL pelarut n-heksana. Sokhletasi  berlangsung  selama  6  jam  dengan  suhu 70 ˚C.  Hasil  ekstraksi  dan  pelarut  dipisahkan menggunakan rotary  vacuum  evaporator dengan kecepatan  60  rpm  pada  suhu  70 ˚C.  Minyak  yang
diperoleh selanjutnya ditimbang dan dicatat hasilnya dalam bentuk mg/g biomassa kering.
Analisis  Komposisi  Minyak  dengan  FT-IR (Fourier Transform Infrared) Spektroskopi Analisis gugus-gugus penting yang mencirikan asam-asam lemak pada minyak mikroalga dan minyak khamir dilakukan dengan instrumen FT- IR  spektroskopi (IRPrestige-21  Shimadzu).  Sampel dimasukkan  hingga  memenuhi  seluruh  permukaan plat.  Selanjutnya  plat  dimasukkan  ke  dalam holder pada alat, lalu diukur menggunakan instrumen FT-IR. Pengujian dilakukan pada panjang bilangan gelombang 400-4000 cm -1 .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Morfologi Mikroalga Thraustochytrium multirudimentale Thraustochytrids pada awalnya
diklasifikasikan  sebagai  protozoa  dan  fungi. Pengkajian lebih dalam telah dilakukan sebelumnya untuk menunjukkan bahwa Thraustochytrids merupakan salah satu mikroorganisme  yang  dikategorikan  sebagai mikroalga  (Cavalier-smith,  1994).  Pendugaan bahwa Thraustochytrids adalah fungi disebabkan adanya  kemiripan  mitokondria,  flagela  dan  spora yang dihasilkan (Raghukumar, 2002). ). Penampakan koloni mikroalga T. multirudimentale pada  media  padat  yang  ditumbuhkan  pada  petri dish dan sel mikroalga dibawah mikroskop cahaya, dapat dilihat pada Gambar 1.

## (a) (b)

## Gambar 1. Penampakan koloni dan sel mikroalga T.
multirudimentale (pembesaran 100x)
Pengamatan  morfologi  secara  visual  pada media  padat  diketahui  bahwa  mikroalga T. multirudimentale yang ditumbuhkan memiliki bentuk koloni bulat dan berwarna putih.  Pertumbuhan koloni T.  multirudimentale berada  di  atas  permukaan medium  dengan  bentuk  pinggiran  yang  rata  serta permukaan  koloni  yang  licin  dan  elevasi  berbentuk convex. Ciri-ciri  morfologi  ini  mirip  dengan  hasil pengamatan Unagul et al. (2017) yang menyebutkan ciri morfologi serupa pada pertumbuhan Thraustochytrid di  media  padat  yaitu  koloni  bulat
bertepian  rata  berwarna  krim  pucat  dengan  tekstur sedikit berlendir.
Pada  pengamatan  mikroskopis  menggunakan mikroskop  cahaya  (light  microscope)  diketahui bahwa mikroalga T.  multirudimentale memiliki  sel berwarna  kehijauan  berbentuk  bulat  dengan  ukuran sel berkisar antara 1-20 µm.  Berbeda dari penelitian yang  dilakukan  oleh  Jaseera et  al. (2019)  dalam penelitiannya yang melaporkan bahwa sel Thraustochytrid memiliki  ukuran  yang  lebih  besar berkisar 10-20 µm. Perbedaan ukuran sel dapat terjadi karena sel memiliki ukuran yang berbeda pada setiap fase  pertumbuhannya.  Sel  pada  fase  amoboid umumnya berukuran 1-5 µm dan dapat terus tumbuh hingga berukuran 30 µm pada fase eksponensial dan stasioner (Yokoyama et al., 2007). Berdasarkan hasil pengamatan mikroskopis membuktikan bahwa kultur mikroalga T.  multirudimentale yang  ditumbuhkan adalah kultur murni yang telah homogen (axenic).

## Morfologi Khamir Rhodotorula mucilaginosa
Khamir  merupakan  mikroorganisme  yang paling  beragam  jenisnya  dan  memiliki  pengaruh besar  pada  suatu  ekosistem.  Khamir  diketahui dapat  hidup  pada  lingkungan  ekstrim  seperti perairan  dengan  salinitas  yang  tinggi  maupun rendah (Silva et al., 2003) bahkan dengan kondisi suhu  yang  ekstrim  (Lane  dan  Morrissey,  2010; Redónet et al., 2011). Beberapa strain khamir kini telah dikembangkan untuk pemanfaatannya dalam bidang  bioteknologi.  Perkembangan  khamir terlihat meningkat secara signifikan pada aplikasinya  dalam bidang  bioteknologi  seperti industri makanan, industri farmasi, kosmetik, dan juga  pada  proses  bioremediasi  lingkungan.  Salah satu  spesies  khamir  yang  menarik  untuk dikembangkan  adalah Rhodotorula  mucilaginosa karena khamir ini dilaporkan dapat mengakumulasikan  asam-asam  lemak  esensial dalam jumlah tinggi didalam sel-selnya (Saenge et al. 2011). Selain itu, R mucilaginosa juga memiliki tingkat  pertumbuhan  yang  cepat  pada  kondisi pertumbuhan optimum sehingga jumlah biomassa yang  dihasilkan  juga  tinggi  (Li et  al.,  2007). Bentuk  koloni  dan  sel  khamir Rhodotorula mucilaginosa dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Bentuk koloni dan sel khamir Rhodotorula mucilaginosa (pembesaran 100x)
Pengamatan koloni Rhodotorula
mucilaginosa pada media padat menunjukkan bahwa koloni berbentuk bulat berwarna oranye. Permukaan koloni licin, membentuk elevasi convex dan pinggiran koloni yang rata. R. mucilaginosa memiliki bentuk sel yang bulat dengan variasi ukuran sel berdiameter 5- 30  µm.  Lau et  al.  (2018)  dalam  penelitiannya menyebutkan bahwa R. mucilaginosa yang ditumbuhkan pada media PDA (potato dextrose agar) juga memiliki ciri koloni yang serupa. Pertumbuhan R.  mucilaginosa pada  media  PDA  menghasilkan koloni berbentuk bulat, berwarna oranye atau merah muda,  berlendir  dan  tidak  memiliki  hifa.  Selain  itu, pada pengamatan mikroskopis juga ditemukan bahwa R. mucilaginosa bereproduksi secara aseksual melalui pertunasan.

## Biomassa Mikroorganisme
Biomassa  dapat didefinisikan  sebagai material organik yang terbarukan karena bersumber  dari  berbagai  variasi  bahan  organik yang  tersedia  di  alam.  Mikroorganisme  adalah salah satu sumber penghasil biomassa yang paling potensial.  Mikroorganisme  memiliki  kemampuan mensintesis  beberapa  komponen  penting  seperti minyak  di  dalam  sel  yang  akan  diakumulasikan sebagai  biomassa  (Aratboni et  al., 2019). Perolehan  biomassa  basah  pada  mikroalga T.
multirudimentale dan  khamir R.  mucilaginosa selama  masa  pertumbuhan  dapat  dilihat  pada Gambar 3.
Biomassa  mikroalga  dan  khamir  pada penelitian ini diperoleh melalui proses sentrifugasi media  cair  yang  mengandung  biomassa  setelah hari  ke-8  pertumbuhan.  Endapan  pada  tabung sentrifus  dicuci  dengan  aquades  dan  dipisahkan. Biomassa  basah  yang  dihasilkan  selama  masa pertumbuhan mikroalga dan khamir menunjukkan peningkatan.  Mikroalga  menghasilkan  biomassa basah  lebih  banyak  dan  mencapai  30,8  g/L dibandingkan dengan khamir yang hanya menghasilkan  biomassa  basah  sebesar  21,5  g/L pada  hari  ke-8  (Gambar  3). Akumulasi  biomassa yang  dihasilkan  oleh  mikroalga  dan  khamir selanjutnya dikeringkan sehingga diperoleh biomassa  kering.  Perolehan  biomassa  kering selama masa pertumbuhan disajikan pada Tabel 1. Berdasarkan  Tabel  1  dapat  dilihat  bahwa perolehan  biomassa  basah  (seperti  yang  dapat dilihat  pada  Gambar  3)  sejalan  dengan  perolehan biomassa  kering. Mikroalga T.  multirudimentale menghasilkan  biomassa  kering  yang  terus meningkat sejak awal pertumbuhan hingga hari ke- 8  dan  berjumlah  lebih  tinggi  dibandingkan biomassa khamir R. mucilaginosa.
Gambar 3. Perolehan biomassa basah dari mikroalga dan khamir selama masa pertumbuhan
Tabel 1. Perolehan biomassa kering selama masa pertumbuhan
Hari Biomassa Kering (g/L) Mikroalga Khamir 0 0,75±0,07 0,55±0,07 2 2,90±0,57 1,55±0,21 4 4,65±0,35 3,15±0,21 6 7,25±0,78 3,55±0,07 8 8,90±0,57 4,20±0,28
0 5 10 15 20 25 30 35 0 1 2 3 4 5 6 7 8 B io m as sa B as ah ( g /L ) Waktu Pertumbuhan (hari) Mikroalga Khamir
Hasil penelitian  sebelumnya  yang  dilakukan oleh  Anwar et  al.  (2018)  menghasilkan  rendemen biomassa  kering  mikroalga  yang  lebih  rendah  jika dibandingkan  dengan  rendemen  pada  penelitian  ini. Pada kondisi optimum pertumbuhan 9 hari, Anwar et al. (2018) melaporkan, diperoleh 4,41 g/L biomassa kering  jika  sumber  nitrogen  yang  digunakan  adalah monosodium  glutamat  (MSG).  Jumlah  biomassa kering yang dihasilkan sedikit lebih rendah (4,22 g/L) pada  saat  sumber  nitrogen  berupa yeast  extract. Penurunan  jumlah  biomassa  yang  signifikan  juga dilaporkan  jika  sumber  nitrogen  yang  digunakan adalah sodium nitrat (2,58 g/L).
Perbedaan  perolehan  biomassa  mikroalga dapat  terjadi  karena  adanya  perbedaan  kondisi pertumbuhan.  Mikroalga  adalah  mikroorganisme fototrof yang membutuhkan cahaya untuk menghasilkan  energi  pada  reaksi  fotosintesis (Lehmuskero et  al., 2018).  Pemberian  intensitas cahaya sebanyak 2000 lux pada penelitian ini diduga menghasilkan biomassa mikroalga yang lebih tinggi dari  penelitian Anwar et  al.  (2018).  Sebelumnya, Mata et  al., (2012)  juga  menyebutkan  bahwa mikroalga dengan intensitas cahaya 12.000 lux dapat menghasilkan 0,9 g/L biomassa kering selama 9 hari masa  pertumbuhan.  Hasil  perolehan  biomassa  pada penelitian  Mata et  al. (2012)  tersebut  jauh  lebih sedikit  jika  dibandingkan  dengan  biomassa  pada penelitian  ini.  Pemberian  intensitas  cahaya  yang terlalu  tinggi  juga  dapat  menghambat  pertumbuhan sel karena klorofil mengalami kerusakan akibat foto- oksidasi  (Liao et  al., 2018) dan  juga  menyebabkan overheating pada  permukaan  media  (Huang et  al., 2017).  Agar  pertumbuhan  lebih  optimal,  Pal et  al. (2013)  menyarankan  pemberian  intensitas  cahaya sebesar  1000  lux  pada  pertumbuhan  menggunakan tabung  erlenmeyer  dan  5000-10.000  lux  untuk pertumbuhan dalam skala besar.
Selain  itu,  pada  penelitian  ini  dapat  dilihat bahwa  produktivitas  biomassa  mikroalga  jauh  lebih tinggi  dibandingkan  dengan  khamir.  Hal  ini  diduga akibat  adanya  perbedaan  kondisi  metabolisme  pada mikroorganisme. Dalam pertumbuhannya, mikroalga memerlukan CO 2 untuk proses fotosintesis. Penelitian Norbawa et  al. (2013)  membuktikan  aerasi CO 2 memungkinkan mikroalga lebih cepat untuk melakukan proses fotosintesis, sehingga ketersediaan nutrisi  pada  fase  pertumbuhan  selanjutnya  (fase eksponensial)  masih  terpenuhi. Nutrisi  tersebut kemudian dimanfaatkan untuk meningkatkan kelimpahan  sel  sehingga  akumulasi  biomassa mikroalga meningkat. Selain itu, rendahnya produktivitas  khamir  dalam  menghasilkan  biomassa diduga  karena  adanya  kondisi  pertumbuhan  khamir dalam  kondisi  anaerob  dan  menyebabkan  terjadinya proses  fermentasi  pada  medium.  Hasil  samping proses fermentasi dapat menghambat laju pertumbuhan  dan  pembelahan  sel-sel  khamir (Richmond, 2003).

## Densitas Optis Kultur
Densitas  optis  dari  kultur  cair  merupakan salah satu metode yang digunakan untuk mengukur pertumbuhan sel mikroorganisme saat pertumbuhan.  Pertumbuhan  sel  mikroorganisme pada  media  cair  dapat  diindikasikan  dengan adanya  peningkatan  nilai  densitas  optis  kultur (Myers et  al., 2013). Pengukuran  nilai  densitas optis  dapat  dilakukan  dengan  mengukur  nilai absorbansi yang dihasilkan dari medium pertumbuhan mikroorganisme menggunakan spektrofotometer  (Alam et  al.,  2018).  Densitas optis kultur cair dari mikroalga dan khamir selama masa pertumbuhan dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4.  Densitas  optis  kultur  mikroalga  dan khamir selama masa pertumbuhan
Gambar  4  menunjukkan  bahwa  kedua  jenis mikroorganisme mengalami peningkatan nilai densitas  optis.  Mikroalga  mengalami pertumbuhan yang  lebih  signifikan  dibandingkan  dengan  khamir selama masa inkubasi. Perbedaan densitas optis pada kedua  jenis  mikroorganisme  diduga  dapat  terjadi akibat  adanya  perbedaan  ukuran  sel  dari  kedua mikroorganisme  ini.  Koch  dan  Ehrenfeld  (1968) menyebutkan  bahwa  bentuk  dan  ukuran  sel  dapat berpengaruh  pada  nilai  densitas  optis.  Penelitian terbaru yang dilakukan oleh Stevenson et al. (2016) juga membuktikan pengukuran densitas optis bakteri dan  khamir  dapat  menunjukkan  hasil  berbeda  pada setiap fase pertumbuhan. Pertumbuhan yang optimal memungkinkan  mikroorganisme  memiliki  diameter sel yang besar. Ukuran diameter sel yang besar dapat menyebabkan penyerapan cahaya oleh sel lebih besar sehingga  meningkatkan  nilai  absorbansi  saat pengukuran (Zamani dan Muhaemin, 2016).
Korelasi Biomassa dan Densitas Optis Mikroorganisme Laju pertumbuhan dan produktivitas mikroorganisme dalam memproduksi biomassa dapat diproyeksikan  melalui  analisis  densitas  optis mikroorganisme. Hubungan linear keduanya diterjemahkan menggunakan diagram pencar sehingga  diperoleh  model  persamaan.  Keeratan hubungan antara produktivitas biomassa dan densitas
0 5 10 15 20 25 30 -2 3 8 A b so rb an si Waktu Pertumbuhan (hari) Mikroalga Khamir
optis kultur dapat diketahui melalui analisis korelasi. Hasil  analisis  korelasi  biomassa  kering  dan  densitas optis  kultur  mikroorganisme  dapat  dilihat  pada Gambar 5.
Gambar 5.  Analisis  korelasi  biomassa  kering  dan densitas optis kultur mikroorganisme
Hasil  analisis  korelasi  antara  biomassa  dan densitas  optis  kultur  menunjukkan  bahwa  adanya hubungan  yang erat  diantara  keduanya.  Biomassa yang  dihasilkan  oleh  mikroorganisme  berkorelasi secara  positif  terhadap  densitas  optis  kultur  dengan nilai  korelasi  0,990.  Berdasarkan  hal  ini  dapat diketahui  bahwa  semakin  banyak  biomasa  yang dihasilkan oleh mikroalga dan khamir selama periode kultivasi pada media cair, maka akan meningkat pula nilai  densitas  optis  kultur  yang  terukur  melalui spektrofotometer.

## Minyak Mikroorganisme
Minyak  mikroorganisme  atau  sering  disebut dengan istilah single-cell oil, semakin intensif untuk diteliti. Saat ini telah banyak ditemukan mikroorganisme  yang  memiliki  kemampuan  untuk memproduksi minyak di dalam sel-sel mikroorganisme tersebut. Namun, kondisi pertumbuhan,  nutrisi  dan  faktor-faktor  penunjang lainnya  juga  merupakan  hal  penting  yang  perlu diperhatikan dalam membantu meningkatkan produktivitas  mikroorganisme  dalam  menghasilkan minyak.  Mikroorganisme  seperti  mikroalga  dan khamir  merupakan  mikroorganisme  yang  memiliki kemampuan mengakumulasikan minyak dengan baik di  dalam  sel-selnya.  Hasil  ekstraksi  minyak mikroorganisme  yang  dihasilkan  penelitian  ini disajikan pada Tabel 2.
Tabel  2  memperlihatkan  rendemen  dan karakteristik fisik minyak yang dihasilkan oleh kedua
mikroorganisme pada penelitian ini. Biomassa kering yang  diperoleh  setelah  8  hari  masa  kultivasi selanjutnya  diekstrak  minyaknya  menggunakan metode  Sokhletasi.  Produksi  minyak  tertinggi dihasilkan  oleh  khamir  dengan  jumlah  17,04  mg/g, sedangkan pada mikroalga produksi minyaknya jauh lebih  rendah  yaitu  hanya  4,50  mg/g.  Adanya perbedaan jumlah minyak yang cukup signifikan ini dapat terjadi karena setiap mikroorganisme memiliki mekanisme  pertumbuhan  yang  berbeda.  Mikroalga memproduksi  biomassa  melalui  proses  fotosintesis (Masojídek et  al.,  2021)  sedangkan  khamir menghasilkan  biomassa  melalui  proses  biokimia seperti fermentasi (Andrade et al., 2020). Perubahan metabolisme juga dapat terjadi jika mikroorganisme kekurangan nutrien yang berupa nitrogen, karbon dan fosfor  serta  paparan  cahaya,  aerasi  dan  kemiripan kondisi tumbuh dengan habitat aslinya.
Kandungan nutrisi sangat berpengaruh terhadap  proses  akumulasi  lipid  di  dalam  sel-sel mikroorganisme.  Secara  teori,  jumlah  ketersediaan nutrisi seperti glukosa dan nitrogen serta hubungannya  dengan  produksi  biomasa  dan  minyak di  dalam  sel-sel  mikroorganisme,  dapat  dilihat  pada Gambar 6.
Berdasarkan  Gambar  6 tersebut  dapat diketahui  bahwa  nitrogen  bersama-sama  dengan glukosa  merupakan  nutrisi  yang  dibutuhkan  diawal masa pertumbuhan. Secara teori, nitrogen lebih cepat diserap selama periode awal pertumbuhan mikroorganisme  dan  akan  habis  kira-kira  pada sepertiga  bagian  awal  dalam  periode  kultivasi. Sementara  itu,  glukosa  sebagai  sumber  karbon diserap  lebih  lambat  selama  periode  pertumbuhan. Sel-sel  mikroorganisme  sudah  mulai  menghasilkan biomassa  sejak  awal  pertumbuhan  dan  terus meningkat hingga dapat terakumulasi sebanyak 60% sampai  sumber  glukosa  habis.  Sebaliknya,  minyak atau  lipid  didalam  sel-sel  mikroorganisme  mulai diproduksi  kurang  dari  10%  dan  stabil  diawal  masa pertumbuhan.  Akumulasi  lipid  mulai  meningkat beberapa saat setelah nitrogen habis yaitu saat tidak tersedia  lagi  sumber  N  bagi  pembelahan  sel-sel mikroorganisme. Jumlah lipid maksimum yang dapat dihasilkan  adalah  ±  53%  pada  akhir  masa  kultivasi (Wynn dan Retledge, 2005). Pemberian nitrogen yang sesuai  juga  dapat  membantu  meningkatkan  laju pertumbuhan  sel  mikroorganisme  karena  nutrisi untuk pertumbuhan sel terpenuhi
Tabel 2. Hasil ekstraksi minyak mikroorganisme
Mikroorganisme Yield Minyak (mg/g) Karakteristik Fisik Minyak Mikroalga T. multirudimentale 4,50±0,49 - Berbentuk cair - Berwarna kuning kehijauan Khamir R. mucilaginosa 17,04±0,78 - Berbentuk cair - Berwarna kuning oranye
y = 0,8967x + 0,5696 r = 0,990 0 0,5 1 1,5 2 0 0,5 1 1,5 L aj u P em b en tu k an B io m assa K er in g ( g /L /h ar i) Densitas Optis
Gambar 6. Grafik ketersediaan nutrisi pada medium pertumbuhan (Wynn dan Retledge, 2005)
Hendrawan et al. (2017) dalam penelitiannya membutikan bahwa perolehan minyak yang diproduksi mikrooganisme  pada  fase  stasioner  lebih tinggi  dibandingkan  dengan  fase  logaritmik.  Dalam penelitian  ini laju  pertumbuhan  sel  mikroalga  yang tinggi pada medium diproyeksikan dengan nilai OD yang  terus  meningkat  hingga  hari  ke-8.  Diduga pertumbuhan sel mikroalga yang aktif dapat menunda fase  stasioner, yang  menyebabkan  produksi  minyak pada mikroalga menjadi rendah.
Berbeda  pada  khamir,  kondisi  pertumbuhan yang  lambat  pada  khamir R.  mucilaginosa diduga diakibatkan adanya penurunan sumber nitrogen pada media  pertumbuhan.  Selain  itu,  terbentuknya  hasil samping  berupa  senyawa  metabolit  juga  dapat menghambat  pertumbuhan  mikroorganisme  pada medium (Zhao et al., 2012). Namun, agar dapat terus bertahan  hidup,  khamir R.  mucilaginosa mulai mengkonversikan  karbon  menjadi  lipid  sehingga produktivitas  minyak  khamir R.  mucilaginosa jauh lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  mikroalga T. multirudimentale (Xenopoulos et al., 2020).

## Analisis Minyak Mikroorganisme dengan FT-IR Spektroskopi
Analisis FTIR pada penelitian ini dilakukan untuk mendeteksi gugus fungsi yang terkandung di dalam  minyak  mikroorganisme  yaitu  minyak mikroalga  dan  minyak  khamir. Selain  itu, dilakukan juga analisis FTIR terhadap minyak ikan (yang  ada  dipasaran)  sebagai  pembanding dari kedua  minyak  mikroorganisme  karena  minyak ikan memiliki kandungan asam lemak tidak jenuh sehingga dapat menjadi parameter untuk mendeteksi  gugus  fungsi  dari  minyak  mikroalga dan  khamir.  Hasil  analisis  FTIR  pada  minyak mikroalga,  khamirdan  ikan  dapat  dilihat  pada Gambar 7.
Gambar 7. Hasil Analisis FTIR Minyak Mikroorganisme dan Minyak Ikan
Minyak  merupakan  senyawa  yang  terbentuk dari  proses  esterifikasi  dari  komponen  utamanya yaitu  asam-asam  lemak  dan  gliserol.  Berdasarkan Gambar  7 dapat terlihat bahwa hasil analisis spektra pada minyak mikroalga dan khamir sangat mirip dan tidak  jauh  berbeda.  Hal ini  disebabkan  keduanya memiliki  komposisi  dan  karakteristik  umum  dari minyak yang sama. Hasil analisis gugus fungsi pada minyak  mikroorganisme  dan  minyak  ikan  dapat dilihat pada Tabel 3.
Hasil  pembacaan  menunjukkan  bahwa minyak mikroalga pada bilangan gelombang 1647 cm -1 dan  pada  khamir1651  cm -1 terdapat renggangan  gugus  C=C  yang  teridentifikasi sebagai  alkena  dari  asam  lemak  tidak jenuh. Selanjutnya  minyak  mikroalga  pada  panjang gelombang  1747  cm -1 dan  pada  khamir  1751cm -1 terdapat renggangan gugus C=O yang diidentifikasi sebagai  ester  dari  trigliserida  dan asam  lemak. Ikatan  rangkap  yang  terdapat  pada daerah serapan ini mengindikasikan bahwa kedua jenis minyak memiliki kandungan asam lemak tak jenuh (Dali et al., 2017).
1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000
Bilangan Gelombang (cm -1 ) Mikroalga Khamir Ikan

## Tabel 3. Hasil analisis gugus fungsi pada minyak mikroorganisme dan minyak ikan
Sumber Penghasil Minyak Gugus Fungsi Bilangan Gelombang cm -1 C=C (Alkena) C=O (Ester) C-H (Alkana) Mikroalga 1647 1747 2858 Khamir 1651 1751 2858 Ikan 1666 1745 2858
Selanjutnya  pada  masing-masing  minyak mikroorganisme  ditemukan adanya  renggangan pada bilangan gelombang 2824, 2858 dan 2958 cm - 1 yang  mengindikasikan  adanya  gugus  metil  dari lipid. Vongsvivut et  al.  (2013) juga  melakukan analisis FT-IR pada minyak mikroalga dan khamir. Berdasarkan  hasil  analisis  tersebut diketahui bahwa  terdapat  renggangan  pada  bilangan gelombang 1743 yang juga teridentifikasi sebagai ester dari asam lemak dan gugus metil pada rentang bilangan gelombang 2872-2960 cm -1 .
Hasil  analisis  FT-IR  menunjukkan  bahwa minyak  mikroalga,  khamir  dan  ikan  sama-sama memiliki  gugus  fungsi  alkena  yang  diidentifikasi sebagai  asam  lemak  tidak  jenuh.  Namun,  hasil pembacaan  menunjukkan  bahwa  masing-masing minyak memiliki intensitas yang berbeda pada daerah serapan yang sama. Hasil penelitian ini hampir serupa dengan  hasil  penelitian  sebelumnya  yang  juga dilaporkan  oleh  Haryani et  al.  (2017)  bahwa  daerah serapan  untuk  gugus  C=O  pada  mikroalga T. Multirudimentale memiliki  intensitas  yang  lebih rendah dibandingkan dengan minyak ikan dan khamir R.  mucilaginosa. Hal  ini  didukung  oleh penelitian sebelumnya  dimana  Vongsvivut et  al. (2012)  juga telah melakukan analisis FTIR terhadap minyak ikan, yang  menunjukkan  bahwa  minyak  khamir R. mucilaginosa memiliki  persamaan  dengan  minyak ikan  pada  daerah  serapan  dan  intensitas  serapannya dibandingkan dengan minyak mikroalga T. multirudimentale.

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Perbedaan
jenis mikroorganisme menghasilkan rendemen biomassa dan minyak yang berbeda. Densitas optis kultur mikroalga dan khamir berkorelasi  positif  terhadap  biomassa  basah  dan kering  yang  dihasilkan  (r  =  0,990). Khamir menghasilkan  rendemen  minyak  tertinggi  yaitu 17,04±0,78  mg/g  sedangkan  rendemen  minyak mikroalga  hanya  sebesar  4,50±0,49  mg/g.    Hasil analisis  FT-IR  terhadap  kedua  jenis  minyak mikroorganisme ini menunjukkan bahwa kedua jenis minyak  memiliki  gugus  C=O  sebagai  ester  asam lemak  dan  C=C  yang  teridentifikasi  sebagai  alkena dari  asam  lemak  tidak  jenuh.  Kedua  jenis mikrooganisme  yaitu  mikroalga Thraustochytrium multirudimentale dan khamir Rhodotorula
Mucilaginosa sangat berpotensi menghasilkan minyak dengan kandungan asam lemak esensial.

## Saran
Berdasarkan hasil penelitian, sebaiknya pada penelitan  selanjutnya  perlu  dilakukan  optimasi pertumbuhan  dan  analisis  lebih lanjut  pada  kedua jenis mikroorganisme.

## DAFTAR PUSTAKA
Adarme-Vega TC, Thomas HSR, Schenk PM. 2014.
Towards sustainable sources for omega-3 fatty acids  production. Curr  Opin  Biotechnol.  26: 14-18.
Alam,  M,  Jayanth  JK,  Daniel  JW,  Egan  HD,  Abbas K.  2018. A portable  sensor  for  cell  optical density  measurement  in  microfluidic  chips. Measurement and Control. 51(8): 213 – 222.
Andrade  APC,  Silva,  HI,  Pinto  GAS.  2020.  Yeast biomass  production  with  potential  for biological  control:  process  strategies  for increasing  yield. Res.  Soc.  Dev. 9(4):  1- 16.Anwar  SH,  Rinanda,  T,  Ramadhani,  R. 2021.  Phylogeny  analysis  of  omega-3  fatty acids  producing  microalgae  isolated  from mangrove area in Banda Aceh Indonesia based on  18S  rDNA  gene. IOP  Conf.  Ser.:  Earth Environ. Science. 667-012082.
Anwar  SH,  Harzaki,  S,  Sulaiman,  M  I,  Rinanda,  T.
2018. Utilization of different nitrogen sources for  the  growth  of  microalgae  isolated  from mangrove  leaves  in  Banda  Aceh — Indonesia. IOP  Conf  Ser.:  Earth  Environ.  Science. 207- 012049.
Anwar  SH,  Sulaiman,  MI,  Rohaya,  S,  Safriani,  N. 2013. Isolation and identification of microalgae as omega-3 sources from mangrove area in Aceh Province. Proc of The Annual Int Conf, Syiah Kuala University - Life Sci Eng Chapter, 3.
Aratboni  HA.  Rafiei  N, Garcia  GR,  AlemzadehA, Morones  RJR.  2019. Biomass  and  lipid induction strategies in microalgae for biofuel production  and  other  applications. Microbial Cell Factories. 18(178): 1-17.
Barra M, Rivera AL, Cruzat F, Maureira NP, Saldia GRR.  The  marine  fungi Rhodotorula sp. (strain cnyc4007) as a potential feed source for fish  larvae  nutrition. Marin Drugs. 15(12): 369.
Cavalier-Smith  T,  Allsopp  MTEP,  Chao  EE.  1994.
Thraustochytrids are chromist not Fungi: 18s
rRNA signatures
of Heterokonta. Philosophical  Transactions  of  the  Royal Society. 346(1318):387 – 97.
Cerone M and Smith TK. 2021. A brief journey into the history of and future sources and uses of fatty acids. Front Nutr. 8:570401.
Chang G, Luo Z, Gu S, Wu Q, Chang M, Wang X. 2013. Fatty acid shifts and metabolic activity changes of Schizochytrium sp. S31 cultured on glycerol. Bioresour Technol. 142: 255 – 260.
D’Eliseo D dan Velotti F. 2016. Omega-3 fatty acids and  cancer  cell  cytotoxicity:  implications  for multi-targeted cancer therapy. Journal Clinical Medicine. 5(2):15
Dali  S,  Firdaus,  Rusman  HJ.  2017.  Produksi  DAG dari  virgin  coconut  oil  melalui  reaksi transesterfikasi  menggunakan  enzim  lipase dedak  padi  (Oriza  sativa  L) spesifik  C18-20 terimobilisasi karbon aktif sebagai biokatalis. Indonesia Journal Chemical Research . 5(1): 37-46.
Haryani  S,  Dewi  Y, dan Novia  ME.  2017. Optimization  of  condition  for  the  growth  of microalgae  and  characterization  of  fatty  acid using  FTIR  spectroscopy.  Laporan  Akhir Penelitian Berbasis H-Index Scopus. Lembaga Penelitian  dan  Pengabdian  pada  Masyarakat, Universitas Syiah Kuala.
Jaritkhuan  S  dan  Suanjit  S.  2018.  Species  diversity and  polyunsaturated  fatty  acid  content  of thraustochytrids from fallen mangrove leaves in Chon Buri province, Thailand. Agriculture and Natura. 52(1):24-32.
Jaseera KV, KaladharanP, Vijayan KK, Sandhya SV,
Antony ML, Pradeep MA. 2019. Isolation and phylogenetic  identification  of  heterotrophic thraustochytrids  from  mangrove  habitats along  the  southwest  coast  of  India  and prospecting their PUFA accumulation. Journal Appliend Phycol. 31: 1057 – 1068.
Koch AL dan Ehrenfeld E. 1968. The size and shape of bacteria by light scattering measurements. Biochim Biophys Acta . 165(2): 262 – 273.
Lane  MM  dan  Morrissey  JP.  2010. Kluyveromyces marxianus : A yeast emerging from its sister’s shadow. Fungal Biology Reviews . 24(1): 17 – 26.
Lau WX, Octavio CZ,Cirilo NH, Mizuno K , Zayn A, Abdullah  MO,  Toh  SH,  Lihan  S.  2018. Production  of  pigments  by Rhodotorula mucilaginosa. Malaysian Journal Microbiol. 14(4): 344-350.
Lehmuskero A, Chauton MS, dan Boström T. 2018. Light  and  photosynthetic  microalgae:  A review of cellular- and molecular-scale optical
processes. Progress  in Oceanography.  168: 43-56.
Li Y, Horsman M, Wang B,  Wu N. 2008. Effect of nitrogen  sources  on  cell  growth  and  lipid accumulation  of  green  alga Neochloris oleoabundans. Applied Microbiol Biotechnol.
81(4):629-36
Li  Y,  Zhao  Z,  (Kent),  Bai  F.  2007.  High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium  toruloides  Y4  in  fed-batch culture. Enzyme  and  Microbial  Technol. 41(3): 312 – 317.
Liao  Q,  Chang  HX,  FuQ,  HuangY,  Xia  A,  Zhu  X, Zhong  N.  2018. Physiological-phased  kinetic characteristics of microalgae Chlorella vulgaris growth and lipid synthesis considering synergistic effects of light, carbon and  nutrients. Bioresource  Technology. 250: 583 – 590.
Masojídek J, Ranglová K,  Lakatos GE, Silva BAM, Torzillo  G.  2021.  Variables  governing photosynthesis and growth in microalgae mass cultures. Processes. 9: 820.
Mata TM, Melo AC, Simoes M, Caetano NS. 2012. Parametric  study  of  a  brewery  effluent treatment by microalgae Scenedesmus obliquus. Bioresource Technology. 107: 151- 158.
Maza  DD,  Viñarta  SC,  Su  Y,  Guillamón  JM,Aybar MJ.  2020. Growth  and  lipid  production  of Rhodotorula  glutinis r4,  in  comparison  to other  oleaginous  yeast. Journal Biotechnol. 310: 21-31.
Myers A, Brandon SC, Wayne RC. 2013. Improving accuracy of cell and chromophore concentration  measurements  using  optical density. BMC Biophysics. 6(4): 2-15.
Norbawa  P,  Yudiati  E, dan Widianingsih.  2013. Pengaruh perbedaan periode aerasi karbondioksida  terhadap  laju  pertumbuhan dan kadar total lipid pada kultur Nannochloropsis oculata.
Journal Marine Research. 2(3): 6-14.
Pal SW, Singh NK, dan Azam K. 2013. Evaluation of Relationship  between  Light  Intensity  (Lux) and  Growth  of Chaetoceros  muelleri. Journal Oceanography and Marine  Science. 1(3):1-4.
Patel  A,  Liefeldt  S,  Rova  U,  Christakopoulos  P, Matsakas L. 2020. Co-production of DHA and squalene  by Thraustochytrid from  forest biomass. Scientific Reports. 1992(10): 1-12.
Pereira  RN,  Silveira  JM,  Burkert  JFM,  Ores  JC, Burkert  CAV.  2019.  Simultaneous  lipid  and carotenoid  production  by  stepwise  fed-batch cultivation of Rhodotorula mucilaginosa with crude  glycerol. Brazilian  Journal Chemical Engineering. 36(3): 1099-1108.
RaghukumarS. 2002. Ecology of the marine protists,
the Labyrinthulomycetes  (Thraustochytrids and Labyrinthulids). European Journal of Protistology . 38: 127 – 145.
Ratledge  C.  2013. Microbial  oils:  an  introductory overview  of  current  status  and  future prospects. Journal OCL. 20(6): 1-7.
Redón  M,  Guillamón  JM,  Mas  A,  Rozès  N. 2011. Effect  of  growth  temperature  on  yeast lipid  composition  and  alcoholic  fermentation at low temperature. European Food
Research and Technology . 232(3): 517 – 527. Saenge C, Cheirsilp B,  Suksaroge TT, Bourtoom T.
2011.  Potential  use  of  oleaginous  red  yeast Rhodotorula glutinis for the bioconversion of crude  glycerol  from  biodiesel  plant  to  lipids and carotenoids. Process Biochemistry. 46(1): 210 – 218.
Silva  GM  dan  Lucas  C.  2003.  Physiological  studies on  long-term  adaptation  to  salt  stress  in  the extremely halotolerantyeast Candida versatilis CBS 4019 (syn. C.
halophila). FEMS Yeast Res. 3(3): 247 – 260 Sun SX, HuaX, Deng M, Zhang YY, Li YN, Wu Z,
Du  ZY. 2018. Tracking  pollutants  in  dietary fish  oil:  From  ocean  to  table. Environmental Pollution 240: 733 – 744.
Stevenson  K,  Alexander  FM,  Ivan  BNC,  Peter  SS, Teuta  P.  2016.  General  calibration  of microbial  growth  in  microplate  readers. Scientific Reports. 6:38828 : 1-7.
Santigosa  E,    Brambilla  F, dan Milanese  L.  2021. Microalgae  oil  as  an  effective  alternative source  of  epa  and  dha  for  gilthead  seabream (Sparus  aurata)  aquaculture. Animals. 11:  1- 17.
Unagul  P,  Suetrong  S,  Preedanon  S,  Klaysuban  A,
Gundool  W,    Suriyachadkun  C,  Sakayaroj  J. 2017. Isolationfatty acid profiles and cryopreservation  of  marine Thraustochytrids from mangrove habitats in Thailand. Botanica Marina . 60(4): 363 – 379.
Vongsvivut  J,  Heraud  P,  Gupta  A,  Puri  M,
McNaughton D, Barrow CJ. 2012.
Quantitative  determination  of  fatty  acid
composition  in  micro-ecapsulated  fish-oil supplements using Fourier transform infrared (FTIR)  spectroscopy. Food  Chemical.  135: 603-609.
VongsvivutJ,  Heraud  P,  Gupta  A,  Puri  M, McNaughton  D,  Barrow  CJ.  2013.  FTIR microspectroscopy  for  rapid  screening  and monitoring  of  polyunsaturated  fatty  acid production  in  commercially  valuable  marine yeasts  and  protists. Analyst.  138(20):  6016 – 6031.
Wynn  JP  dan  Ratledge  C.  2005. Microbial Production of Oils and Fat. Boca Raton: CRC

## Press.
Xenopoulos  E,  Giannikakis  I,  Chatzifragkou  A, Koutinas  A,  Papanikolaou  S.  2020.  Lipid production by yeasts growing on commercial xylose  in  submerged  cultures  with  process water  being  partially  replaced  by  olive  mill wastewaters. Processes.8(7):819
Xu Y dan Qian SY. 2014. Anti-cancer a ctivities of ω - 6 polyunsaturated fatty acids. Biomed
Journal.37(3):112-119.
Yokoyama R, Salleh B, dan Honda D. 2007. Taxonomic rearrangement of the genus Ulkenia  sensu  lato  based  on  morphology, chemotaxonomical  characteristics,  and  18S rRNA  gene  phylogeny  (Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes): emendation for Ulkenia and  erection  of Botryochytrium, Parietichytrium,  and Sicyoidochytrium gen. Mycoscience.48(6): 329 – 341.
Zamani  NP dan Muhaemin  M.  2016.  Penggunaan spektrofotometer sebagai pendeteksi kepadatan  sel  mikroalga  laut. Maspari Journal. 8(1):39 – 48.
Zhao X, Peng F, Du W, Liu C, Liu D. 2012. Effects of some inhibitors on the growth and lipid accumulation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides and preparation of biodiesel by enzymatic transesterification of the lipid. Bioprocess and Biosystems Engineering.
35(6): 993 – 1004.