## KANDUNGAN VINKRISTIN PADA KULTUR KALUS
Catharaanthus roseus (L) G. DON YANG DIBERI PERLAKUAN

## TRIPTOFAN DAN VINDOLIN
Ellen Lombonbitung 1) , W. Tilaar 1) , Dingse Pandiangan 2)
1) Program Studi Agronomi, Pasca Sarjana Universitas Sam Ratulangi Manado
2) Jurusan Biologi Fak. MIPA Universitas Samratulangi Manado.

## ABSTRACT
Catharanthus roseus (L) G. Don also called Tapak dara plant is cultivated plant, besides its function as ornamental plant but also can be functioned as medicinal plant. Alkaloid compounds from this plant has been isolated and used as an anti cancer drug, are  vinblastine  and  vincristine.  Vinblastin  and  vincristine  were  poor  alkaloid compounds  produced  in  plants.  Vincristine  made  from  joined  catharantine  and vindolin,  cause  it  is  expected  that  vindolin  be  able  to  increase  the  content  of vincristine.  The  research  was  carried  out  to  knew  the  vincristine  content  of    callus culture  were  given  tryptophan  treatment  and  vindolin.  The  research  plan  used  was completely  random  design,  by  tryptophan  combination  (0,  75  and  150  mg/L)  and Vindolin (0, 0,2, 0,4 and 0,6 mg/L), factorial. The vincristine content was determined by  high  performance  liquid  chromatography  (HPLC).  Based  on  HPLC  data,  it  was made  standar  curve  and  regression  linear  equation  that  describe  the  relationship between standar vincristine concentration of area. The obtained result from the research proved  the  tryptophan  and  vindoline  treatment  affecting  the  vincristine  content.  The highest vincristine content was showed to T1V0 treatment (Tryptophan 150 mg/L and Vindolin 0 mg/L), is 2,352 µg/g dw.
Keywords : Vincristine, Tryptophan, Vindolin

## ABSTRAK
Catharanthus roseus (L)  G.  Don yang  disebut  juga  tanaman  tapak  dara merupakan  tanaman  yang  banyak  dibudidayakan  selain  sebagai  tanaman  hias  juga berkhasiat  obat.  Senyawa  kelompok  alkaloid  dari  tanaman  ini  telah  diisolasi  dan dijadikan  obat  anti  kanker,  yaitu  vinblastin  dan  vinkristin.  Vinblastin  dan  vinkristin adalah senyawa alkaloid yang sangat kecil dihasilkan dalam tanaman. Produksi alkaloid dari Catharanthus  roseus (L)  G.  Don      Vinkristin  terbentuk  dari  gabungan  katarantin dengan vindolin, karena itu diharapkan dengan vindolin dapat meningkatkan kandungan vinkristin.  Penelitian  dilakukan  untuk  mengetahui  Kandungan    Vinkristin  pada  Kultur Kalus Catharanthus  roseus (L)  G.  Don  yang  diberi  Perlakuan  Triptofan  dan  Vindolin. Rancangan  penelitian  yang  digunakan  adalah  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  secara faktorial  dengan    perlakuaan  kombinasi  triptofan  (0,  0,75  dan  150  mg/L)  dan  vindolin (0,  0,2,  0,4  dan  0,6  mg/L).  Kandungan  Vinkristin  ditentukan  dengan  menggunakan metoda  Kromatografi  Cair  Kinerja  Tingggi  (KCKT).  Berdasarkan  hasil  KCKT  dibuat kurva  standar            dan  persamaan  regresi  yang  menggambarkan  hubungan  antara konsentrasi vinkristin standar terhadap luas area. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini membuktikan  perlakuan  triptofan  dan  vindolin  mempengaruhi  kandungan  vinkristin.
Kandungan  vinkristin  tertinggi  berada  pada  perlakuan  T1V0  (Triptofan  75  mg/L  dan Vindolin 0 mg/L), yaitu sebesar 2,352 µg/g bk.
Kata Kunci : Vinkristin, Triptofan, Vindolin

## PENDAHULUAN
Catharanthus  roseus (L)  G.  Don yang  disebut  juga  tanaman  tapak  dara merupakan tanaman perdu tahunan yang banyak  dibudidayakan  selain  sebagai tanaman  hias  juga  berkhasiat  obat. Tanaman  tapak  dara  ini  kaya  akan kandungan  alkaloid.  Beberapa  senyawa kelompok  alkaloid  dari  tanaman  ini telah  diisolasi  dan  dijadikan  obat  anti kanker  yaitu  vinblastin  dan  vinkristin (Anonim, 2014, Dewick, 2009, Crozier, et  al 2006).      Mariska  (2013) menyatakan  vinblastin  dan  vinkristin adalah  senyawa  metabolit  sekunder yang  diproduksi  dari  bunga  tapak  dara dan  merupakan  alkaloid  untuk  obat leukemia.
Penyakit kanker adalah suatu penyakit yang disebabkan oleh pertumbuhan  sel  jaringan  tubuh  yang tidak  normal.  Sel  yang  tidak  normal bermultifikasi tanpa kontrol yang kemudian  tumbuh  dan  be i rkembang menjadi tumor/kanker ( Suiraoka, 2012). Pandiangan (2012) mengemukakan sel mengalami
spesialisasi  ada  hubungannya  dengan kandungan  IAA  dan  katarantin  yang meningkat  setelah  diberi  perlakuan triptofan.  Menurut  Oksman, et  al, ( 2007) vinblastin dan vinkristin terbentuk  dari  gabungan  katarantin  dan vindolin,  sehingga  diharapkan  dengan penambahan vindolin dapat meningkatkan juga vinkristin. Penelitian  ini  dilakukan  untuk menganalis  kandungan  vinkristin  pada kultur  kalus C.  roseus yang  diberi perlakuan triptofan dan vindolin.
Diduga dengan pemberian triptofan dan vindolin  akan  memberikan  pengaruh terhadap  kandungan  vinkristin  pada kultur kalus C. roseus .

## METODE PENELITIAN BAHAN DAN ALAT
Bahan  yang  digunakan  adalah tanaman  tapak  dara    ( Catharanthus roseus, (L)  G.Don  ) berbunga  putih sebagai    sumber  eksplan.  Bahan  Kimia yang  digunakan  adalah  medium  MS (Lampiran.1), desinfektan,etanol, 2,4-D, NAA,  Kinetin,  HCl,  NaOH  ,aquades steril, methanol  HPLC,  methanol  Pa, asetonitril,  diamonium  hidrogen  fosfat, vinkristin    standar,  triptofan dan
vindolin. Alat-alat yang digunakan timbangan  analitik,  autoclave,  laminar air  flow  cabinet , alat-alat  gelas  standar (labu  takar,  beker  gelas,  pipet  volume, erlenmeyer,  gelas  piala,  labu  pisah, pengaduk dan wadah kultur) , pH meter , scalpel,  pinset,  cawan  petridish,  rak kultur,  aluminuium  foil,  oven,  mortar, centrifuse, HPLC.

## RANCANGAN PERCOBAAN
Penelitian akan dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak
Lengkap (RAL) secara faktorial, dengan perlakuan  kombinasi  Triptofan  dan Vindolin.  Setiap  perlakuan  diulang sebanyak  3  kali.  Triptofan,  terdiri  atas control  0 mg/L  (T0), 75  mg/L (T1) dan 150  mg/L  (T2).  Vindolin,  terdiri  atas control    0  mg/L  (V0),    0,2  mg/L  (V1), 0,4 mg/ l  (V2),  0,6 mg/L(V3)

## ANALISIS DATA
Data  yang  diperoleh  pada  tahapan produksi kalus dianalisis secara Analisis Varian  dan  bila  berbeda  nyata  akan dilanjutkan  dengan  uji  BNT.  Pada tahapan  analisis  kandungan  vinkristin data kuantitatif dianalisis melalui persamaan  regresi  yang  diperoleh  dari kalibrasi kurva larutan standar.

## PROSEDUR KERJA
1. Persiapan dan Pembuatan media
Media  awal  untuk  induksi  kalus  adalah medium dasar  MS dengan penambahan 2  mg/L    2,4  D  dan  Kinetin  0,2  mg/L. Media  dibuat  sebanyak  1  Liter  untuk sekitar 40 botol kultur.

## 2. Persiapan dan sterilisasi eksplan
Daun ke 3 atau 4 diambil dari pucuk tapak  dara,  kotoran  daun  dibersihkan dengan  membersihkannya  dalam  air mengalir,  kemudian  masukkan  dalam erlenmeyer  250  ml  dan  beri  akuades. Eksplan  direndam  dalam  etanol  70% selama  1  menit  dan  dibilas  dengan akuades steril. Pemutih atau desinfektan 70%  dimasukkan ke dalam botol berisi eksplan  sekitar  25  ml  digoyang-goyang dan  ditunggu  15  menit  kemudian dituangkan  dan  bilas  dengan  akuades steril  dan  dilakukan  beberapa  kali (minimal 3 kali) hingga bersih.
3   Inokulasi eksplan pada media.
Eksplan yang sudah steril di ambil 1  helai  daun  (dengan  pinset  steril). Daun dipotong-potong sekitar 0,5 mm x 0,5 mm, dan diusahakan tulang daunnya yang besar dikeluarkan. Satu daun dapat menghasilkan 5 atau 6 potongan daun Potongan daun tapak dara diinokulasikan dalam media yang sudah di sediakan. Variabel pengamatan keberhasilan adalah  adanya  kalus  yang  tumbuh dengan warna kuning keputihan.
Setelah  berumur  4  minggu,  kalus dipisahkan  dari  eksplan  daun  dan dipindahkan  ke  medium  baru  dengan komposisi  yang  sama  dengan  medium sebelumnya.    Ketika  kalus  berusia  8 minggu,  kalus  dipindahkan  ke  dalam medium  produksi,  yaitu  MS padat  yang ditambahkan  zpt  2  mg/L  NAA  dan  0,2
mg/L  kinetin.  Setelah  berumur  12 minggu,  kalus  disubkultur  ke  dalam medium yang mengandung triptofan dan vindolin    yaitu  medium  MS  padat ditambah dengan komposisi ZPT dengan  NAA  2  mg/L  dan  kinetin  0,2 mg/L  yang  sama  dengan  medium produksi  sebelumnya.  Parameter  yang diamati  adalah  penampakan  morfologi dan  berat basah  kalus.
4. Identifikasi Vinkristin
Identifikasi  kandungan  vinkristin dilakukan dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).    Analisis  kualitatif  dilakukan dengan  membandingkan  waktu  retensi sampel  dengan  vinkristin  standar  dalam kondisi  yang  sama.  Bila  terdapat senyawa  yang  memiliki  waktu  retensi yang  sama  dengan  vinkristin  standar, maka  senyawa  tersebut  merupakan vinkristin. Analisis kuantitatif dilakukan dengan  cara  mengkonversi  luas  area sampel  dengan  luas  area  standar  yang telah diketahui konsentrasinya (Pandiangan, 2010).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## A. INDUKSI KALUS
Pada  tahap  induksi  kalus , media yang  digunakan  adalah  Media  MS (Murashige  dan  Skoog)    dengan penambahan  Zat  Pengatur  Tumbuh (ZPT)  2,4  D  mg/L  dan  Kinetin  0,2 mg/L.  Kalus  mulai  terbentuk  pada  hari ke-8  setelah  kultur.  Kemunculan  awal kalus  pada  daerah  tepi  atau  bekas sayatan  dimungkinkan  sebagai    salah satu  bentuk  respon  tumbuhan  terhadap terjadinya pelukaan pada jaringan ataupun  selnya  (Pitoyo,  dkk,  2002).
Hasil penelitian Pandiangan dan
Nainggolan (2006a) menyatakan pembentukan  kalus  pada  hari  ke-8 setelah  penanaman  umumnya  diikuti
oleh  pertumbuhan  kalus  yang  makin membesar . Hasil  pengamatan  secara visual,  kalus  yang  terbentuk  berwarna
putih  kekuningan  dengan  struktur  kalus meremah, seperti pada Gambar berikut:

## Sub Kultur Kalus
Kalus  Kalus  yang  terbentuk  pada  tahap induksi,  setelah  berumur  4  (empat) minggu  dipindahkan  ke  media  yang baru yang sama dengan media sebelumnya  yaitu  Media  MS  yang ditambahkan  dengan  Zat  Pengatur Tumbuh  (ZPT)  2,4  D  2  mg/L  dan Kinetin 2 mg/L. Pada tahap ini sel kalus dalam  proses  pertumbuhan  dengan pembelahan selnya yang ditandai dengan bertambahnya ukuran kalus. Hal
ini diduga  adanya aktivitas zat pengatur tumbuh  2,4  D  dan  Kinetin  yang bersinergi  dalam  proes  pertumbuhan kalus. Gardner, et al (1991) menyatakan bahwa  auksin  merupakan  substansi pertumbuhan  khususnya  merangsang perpanjangan  sel  sedangkan  sitokinin merupakan substansi pertumbuhan yang khususnya  merangsang  pembelahan  sel. Hasil  Pengamatan  secara  visual  pada tahap ini kalus berwana putih kekuningan dengan struktur kalus meremah.
Gambar 2. Gambar.  Kalus subkultur  pada Media MS yang diberi 2,4 D + Kinetin
Produksi Kalus Kalus berumur 8 (delapan) minggu disubkultur pada media
produksi  yaitu  media  dasar  MS  yang ditambahkan  Zat  Pengatur  Tumbuh
(ZPT)  NAA  2  mg/L  dan  Kinetin  0,2 mg/L.  Pada  tahap  ini  kalus  masih melakukan pembelahan dan
pembesaran sel diikuti struktur sel  yang makin  padat  sehingga  tampak  menjadi kompak.    Hasil  Pengamatan  secara visual pada tahap ini struktur kalus yang awalnya  meremah  menjadi  kompak, inipun  sesuai  dengan  hasil  penelitian Pandiangan, dkk  (2006a)  induksi  kalus dengan penambahan zat pengatur tumbuh  NAA  2  mg/L  dan  Kinetin  0,2
Gambar 1. Tahap Induksi Kalus
mg/L  dihasilkan  kalus  tipe  kompak. Menurut  Hirata,  dkk  (1995)  kalus  yang embrionik mempunyai sifat kalus kompak, bernodul dan terlihat berwarna putih  kehijauan  .  Hasil  akhir  Kalus  di tahap  ini  pada  umur  12  (dua  belas) minggu dihasilkan kalus    dengan warna kalus putih agak keruh.

## Kalus pada Media Perlakuan
Kalus  dari  hasil  produksi  pada umur  12  minggu  kalus  disubkulturkan pada media perlakuan yaitu media dasar MS (Murashige & Skoog) yang ditambahkan    2  mg/L  NAA  dan  0,2 mg/L    Kinetin  dan  diberi  perlakuan kombinasi  triptofan  dengan  vindolin sebagai  berikut  ,  Triptofan  :    T0  =  0 mg/L,  T1=75  mg/L,  T2=150  mg/L  dan Vindolin  :  V0  =  0  mgl,  V1  =0,2  mg/L, V2  =0,4  mg/L  dan  0,6  mg/L.  Dari
perlakuan  diatas  maka  terdapat  12 kombinasi perlakuan. Hasil pengamatan diperoleh    kalus  berwarna  putih  kuning agak kecoklatan sampai putih kecoklatan  agak  kemerahan  dengan struktur  kalus  kompak.  Adanya  kalus yang  berwarna  kecoklatan  diduga  pada fase  ini  mulai  terbentuk  metabolit sekunder.
Pitoyo, dkk (2002)
menyatakan    bahwa  kalus  diusia  diatas 21  hari  mulai  mengalami  perlambatan pertumbuhan  sampai  akhirnya  konstan dan  diikuti  pencoklatan.  Pencoklatan yang  terjadi  pada  kalus  dalam  kondisi ini dimungkinkan karena terakumulasinya  senyawa  fenol  dalam kalus. Pencoklatan
umumnya berasosiasi  dengan  kenaikan  masukan percabangan  jalur  sikimat,  yang  akan meningkatkan sintesis asam  fenolik dan fenilpropanoid  yang  akan be rkompetisi dengan percabangan Indol. Tabel 1. Data rata-rata berat basah kalus (g)  yang diberi perlakuan triptofan dan vindolin Vindolin Triptofan V0 (0 mg/L) V1 (0,2 mg/L) V2 (0,4 mg/L) V3 (0,6 mg/L) T0 (0 Mg/L) 1,33 b 1,27 b 1,27 b 1,46 d T1 (75 mg/L) 1,27 b 1,37 c 1,13 a 1,30 b T2 (150 mg/L) 1,70 e 1,83 f 1,50 d 1,80 f
Ket. Angka yang diikuti huruf yang sama berbeda tidak  nyata pada α 0,05  (0,06282)
Dari hasil analisis statistik  maka pengaruh perlakuan kombinasi triptofan dan  vindolin  memberikan  pengaruh yang  sangat  berbeda  nyata  terhadap rata-rata  berat  basah  kalus.  Rata-rata semua jenis perlakuan mengalami kenaikan  berat  basah  kalus  dari  berat awal + 1 g . Perlakuan T2V1 ( Triptofan
175  mg/L  dan  Vindolin  0,2  mg/L)
memiliki  rata-rata  berat  basah  tertinggi yaitu  1,  83  g  dengan  kenaikan  83  %.
Kontrol (T0V0) juga mengalami kenaikan sebesar 33 % atau 1,33 g.
Peningkatan berat basah kalus disebabkan  kondisi  kultur  yang  sesuai dapat  mendorong  pertumbuhan  kalus. Pandiangan  dan  Nainggolan,  (2006a) menyatakan  bahwa  optimasi  kondisi kultur  diarahkan  pada  pertambahan biomassa dan produksi metabolit sekunder.
.
Tabel 2 . Data rata-rata berat kering kalus (g) yang diberi perlakuan triptofan  dan  vindolin Vindolin Triptofan V0 (0 mg/L) V1 (0,2 mg/L) V2 (0,4 mg/L) V3 (0,6 mg/L) T0 (0 mg/L) 0,15 f 0,12 c 0,12 c 0,13 d T1 (75 mg/L) 0,12 c 0,09 a 0,11 b 0,11 b T2 (150 mg/L) 0,14 e 0,15 f 0,14 e 0,16 g
Ket . Angka yang diikuti huruf yang sama berbeda tidak nyata pada  α 0,05  (0,00920)
Seperti halnya berat basah kalus, berat  kering  kalus  dari  analisis  statistik dari  berbagai  perlakuan  kombinasi triptofan  dan  vindolin  juga  menunjukan perbedaaan  nyata  sedangkan  perlakuan dengan hanya triptofan maupun vindolin menunjukan  perbedaan  sangat  nyata,
walaupun  dari  hasil  pengukuran  berat kering  kalus  mengalami  penurunan. Adanya  kadar  air  di  dalam  kalus  yang mempengaruhi  berat  basah  kalus  dan pada  saat  proses    pengeringan  terjadi penguapan.
Dari  Tabel  1  dan  Tabel  2,  hubungan antara  triptofan  dan  vindolin  terhadap
berat basah kalus dan berat kering kalus dapat dilihat pada gambar dibawah ini :
Gambar 3. Berat basah kalus(g) dengan perlakuan triptofan (0;75;150 mg/L) dan vindolin (0;02;0,4;0,6 mg/L)
Gambar  4.  Berat  kering  kalus  (g) dengan  perlakuan  triptofan  (0;75;150 mg/L)dan vindolin (0;02;0,4;0,6 mg/L)
Kandungan vinkrisrtin yang diberi triptofan dan vindolin
Data  hasil  kromatogram  dapat dilihat pada Tabel.4 di bawah ini.
Tabel  4.  Data hasil KCKT standar vinkristin
Gambar 5. Kurva standar vinkristin y = 13455x R² = 0,9634 0 500000 1000000 1500000 0 50 100 150
Konsentrasi Standar vinkristin Luas Area Waktu Retensi 0 ppm 0 0 5 ppm 152742 8,363 10 ppm 308831 8,371 50 ppm 706269 8,364 100 ppm 1306976 8,789
Konsentrasi
L u a
s A re a
Analisis kandungan vinkristin dilakukan dengan  metoda  Kromatografi  Cair Kinerja  Tinggi  (KCKT)  sebagaimana prosedur  kerja  dengan  membandingkan retensi  time  larutan  standar  dengan sampel.  Hasil  kromatogram  capaian retensi  time  larutan  standar  berada
disekitar  menit  8,    dapat  dilihat  pada tabel.4 di atas.  Berdasarkan kurva baku standar  vinkristin    maka  diperoleh  nilai R²  =  0,963  atau  berada  pada  tingkat ketepatan  96,3  %  dengan  persamaan regresinya, Y= 13455x .
Tabel 5. Data Kandungan Vinkristin (µg/bk g) pada Kultur Kalus C.roseus yang diberi perlakuan KombinasiTiptofan dan Vindolin
Vindolin Triptofan V0 (0 mg/L) V1 (0,2 mg/L) V2 (0,4 mg/L) V3 (0,6 mg/L) T0 (0 mg/L) 0,005 0,013 0,035 0,104 T1 (75 mg/L) 2,352 0,203 0,116 0,110 T2 (150 mg/L) 0,136 0,343 0,105 0,078 Berdasarkan data di atas,
kandungan  vinkristin  tertinggi  ada  pada perlakuan T1V0 (triptofan 75 mg/L dan vindolin  0  mg/L)  yaitu  2,352  µg/g  bk. Kalus  pada  perlakuan  ini  berasal  dari kalus yang pertumbuhannya lebih rendah  dari  kontrol.    Ini  berarti  nutrisi pada  media  banyak  digunakan  untuk sintesis  alkaloid.    Hal  ini  menunjukkan bahwa  perlakuan  triptofan  dengan konsentrasi  75  mg/L    berpengaruh terhadap peningkatan produksi
vinkristin.
Perlakuan  dengan  triptofan  dan vindolin  (T1V1,  T1V2,  T1V3,  T2V1, T2V2  dan  T2V3)  diperoleh  kandungan vinkristin  paling  tinggi  pada  T2V1 (triptofan  150  mg/L  dan  vindolin  0,2 mg/L)  yaitu  0,343  µg/g  bk.  Kalus  pada
perlakuan  ini  memiliki  pertumbuhan yang sama dengan kontrol.  Pandiangan, dkk (2006) menyatakan bahwa Produksi katarantin akan maksimal apabila pertumbuhan sel (biomassa) dan kandungan  katarantin  berada  pada kondisi  optimal . Kandungan  vinkristin pada  T2V3  diperoleh  paling  rendah akan tetapi memiliki pertumbuhan kalus paling tinggi. Hal ini disebabkan nutrisi pada  media  banyak  digunakan  untuk pertumbuhan kalus bukan untuk sintesis vinkristin.
Kontrol  sebagai  perbandingan, kandungan  vinkristin  sangat  kecil  yaitu 0,005  µg/g  bk.  Dari  hasil  penelitian  ini sangat  jelas  bahwa  triptofan  dan vindolin sangat mempengaruhi kandungan vinkristin pada sel C. roseus
akan  tetapi  ada  konsentrasi  yang optimum  untuk  pencapaian  produksi maksimum vinkristin.
Pengaruh  perlakuan  triptofan  dan vindolin terhadap kandungan vinkristin , dapat dilihat pada gambar di bawah ini : Gambar 6. Pengaruh triptofan (0;75;150 mg/L) pada taraf vindolin (0;02;0,4;0,6 mg/L) terhadap kandungan vinkristin (µg/g bk) Gambar 8. Pengaruh vindolin (0;02;0,4;0,6 mg/L) terhadap kandungan vinkristin (µg/g bk) Gambar 7. Pengaruh vindolin
(0;02;0,4;0,6 mg/L) pada taraf triptofan (0;75;150 mg/L) terhadap kandungan vinkristin (µg/g bk)
Gambar 9. Pengaruh triptofan (0;75;150 mg/L)  terhadap kandungan vinkristin (µg/g bk)

## KESIMPULAN
Perlakuan  Triptofan  dan  Vindolin mempengaruhi  kandungan  vinkristin pada  kultur  kalus Catharanthus  roseus (L)  G.Don.  Hasil  penelitian  diperoleh kandungan  vinkristin  tertinggi  pada perlakuan  T1V0  (Triptofan  75  mg/L dan Vindolin 0 mg/L), yaitu 2,352 µg/g
bk.    Ini  berarti peningkatan kandungan vinkristin disebabkan hanya oleh perlakuan  triptofan.    Dengan  demikian perlakuan  triptofan  75  mg/L    adalah yang optimal untuk peningkatan kandungan vinkristin.

## SARAN
Dapat  dilakukan  penelitian  sejenis dengan cara pemberian perlakuan triptofan  dan  vindolin  dalam  waktu yang berbeda. Triptofan dapat diberikan pada awal perlakuan dan vindolin selang
beberapa  waktu  setelah  pemberian triptofan.  Untuk  mengukur  kandungan vinkristin  pada  kalus  perlu  optimasi faktor-faktor yang mempengaruhi mulai dari  persiapan  ekstrak  sampel  sampai pengaturan kondisi HPLC.

## DAFTAR   PUSTAKA
Anonim,  2014,  Sehat  alami  dengan herbal, 250 Tanaman herbal berkhasiat  obat  +  60  Resep  menu kesehatan.  Pusat    studi  Biofarmaka
LPPM  IPB  dan  Gagas  Ulung.  PT. Gramedia Pusat, Jakarta.
Crozier,  A,  M.N,  Chifford  ,  H, Ashihara. Plant Secondary Metabolites .  Occurrence, Structure and Role in the Human Diet. 2006.
Blackwell  Publishing,Ltd.  P.102-
133.
Dewick, M.P. Medicinal Natural
Product  A  Biosynthetic  Approach .
3 rd Edition.  2009.  A  John  Wiley and Son, Ltd, Publication. P. 366 – 385.
Gardner,P.F,  R.B,  Pearce  and    R.L, Mitcel,  1985. Physiologi  of  Crop Plants .The  Low  State  University Press.  Penerjemah Susilo, H, 1991. UI-PRESS.Jakarta.
Hirata,Y,  Hirata,  K,  N,  Kurano,  K, Mijamoto  dan  K,  Uchida.  1995. Formation    of  vinblastine  in multiple  shoot  culture Catharantus
roseus . In Press.
Mariska,I,  2013,  Metabolit  Sekunder  : Jalur Pembentukan dan kegunaannya, http://
biogen.litbang.pertanian.go.id/inde x.php/2013.08,  diakses  tanggal  24 Juli 2015.
Oksman-Caldentey,K.M.S.T,  Hakkinen and  H.Rischer,  2007. Metabolic engineering  of    the  alkaloid biosynthesisbin  plants  :  functional genomic approaches , in
R.Verpoorte, A.W, Alfermann, T,S, Johnson (Eds). Application of Plant Metabolic Enginering . pp. 109-127. Published  by  Springer,  P.O,  BOX 17, 3300 AA Dordrecht, Netherlands. Pitoyo,  A,  Solichatun,E,Anggarwulan, 2002. Optimalisasi Produksi
Alkaloid  Indol  Terpenoid  pada Kultur  Kalus  dan  Suspensi  Sel Catharanthus  roseus (L),  G,Don. dengan  Pemberian  HCL  dan Variasi  Triptofan  dalam  Media Kultur.  Journal  Bio  Smart  Vol.  5 No.  1.ISSN.1411-321X,    April 2003. Hal :25 – 32.
Pandiangan,  D,  2010,  Kandungan  IAA dengan Pertumbuhan dan Kandungan Katarantin Kultur
Agregat  Sel Catharanthus  roseus yang  diberi  perlakuan  Triptofan dalam  Labu  Erlenmeyer.  Jurnal Ilmiah Sains Vol.10 No.2, Oktober 2010. ISSN 1412 – 3770. Pandiangan, D & N, Nainggolan, 2006a, Produksi Alkaloid dari Kalus
Tapak    Darah.  Jurnal  Ilmiah Sains,6, 48 -54.
Pandiangan. D  &  N, Nainggolan, 2012, Peningkatan Produksi
Katarantin pada Kultur Kalus
C.roseus yang diberi NAA. Jurnal
Hayati 13; 3, p. 90 – 94.
Suiroka,IP,  2012.  Penyakit  Degeneratif Mengenal, mencegah dan mengurangi faktor resiko 9 penyakit degenerative, Nuha Medica, Yogyakarta
Lampiran 1. Tabel Komposisi Medium MS ( 1962 ) untuk Induksi kalus Catharanthus roseus (L) Don G . ( Pandiangan, D , 2011) No Kode stok Komponen MS Konsentrasi Mg/L Stok 10 L Dalam 100
ML
I. Unsur makro
1 2 3 4 5 A B C
D E NH 4 NO 3 KNO 3 CaCl 2 2HO MgSO 4 7H 2 O KH 2 PO 4 1650 1900 440 170 370 16500 19000 4400 1700 3700 II. Unsur Mikro 6 7 F FeSO 1 7H 2 O NaEDTA 37,3 27,8 373 278 8 9 10 11 12 13 14 G MnSO 4 4H 2 O ZnSO 4 7H 2 O H 3 BO 3 KI NaMoO 4 2H 2 O CuSO 4 7H 2 O CoCl 2 6H 2 O 22,3 8,6 6,2 0,83 0,25 0,025 0,025 223 86 62 8,3 2,5 0,25 0,25 III. Vitamin-Vitamin 15 16 H I Glisin Inositol 2 100 20 1000 17 18 19 J Asam nikotin (Nicotin Acid) Pirydoxin-HCl Thiamin-HCl 0,5 0,5 0,1 5 5 1 20 NAA Kinetin 2 0,2 20 2 21 Sukrosa(Gula) 30.000 22 Agar 8.000