Intek Akuakultur. Volume 1. Nomor 1. Tahun 2017. Halaman 71-76
Pengaruh  Pemberian  Probiotik  Terhadap  Aktivitas  Letupan  Respirasi  Leukosit dalam Darah Ikan Nila ( Oreochromis niloticus )
Rika Wulandari 1
1 Jurusan Budidaya Perairan, Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan, Universitas Maritim Raja Ali Haji
INFO NASKAH
ABSTRAK Kata Kunci: Probiotik, Imunologi ikan, Imunitas selular Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengevaluasi  aktivitas  letupan  respirasi  leukosit dalam  darah  ikan  nila  ( Oreochromis  niloticus )  menggunakan  uji nitroblue tetrazolium (NBT) sebagai tolak ukur produksi radikal  oksigen (reactive oxygen species / ROS). Penelitian dirancang dengan 4 perlakuan dan 3 kali ulangan. Ikan diaklimatisasi  selama  dua  minggu,  kemudian  diberi  perlakuan  pakan  yang ditambah probiotik dalam kurun waktu  yang sama, dengan ikan tanpa perlakuan sebagai kontrol. Aktivitas letupan respirasi tertinggi ditunjukkan oleh perlakuan B (12 x 10 8 CFU/mL). Berdasarkan hasil uji tersebut menunjukkan bahwa ikan nila yang diberi perlakuan probiotik melalui pakan efektif meningkatkan laju aktivitas imunogenik letupan respirasi.
Gedung  FIKP  Lt.  II  Jl.  Politeknik  Senggarang,  29115,  Tanjungpinang,  Telp  : (0771-8041766, Fax. 0771 - 7004642. Email: rika.wulandaridwan@yahoo.com
The Effect of Probiotic Treatment to Leukocyte Respiratory Burst Activity in Nile Tilapia’s Blood ( Oreochromis niloticus )
Rika Wulandari 1
1 Department of Aquaculture, Faculty of Marine Science and Fisheries, Raja Ali Haji Maritime University
ARTICLE INFO ABSTRACT Keywords probiotic, fish immunologi, cellular immunity This  study  aimed  to  evaluate  the  respiratory  burst  activity  of  leukocytes  in  the blood  of  nile  tilapia  (Oreochromis  niloticus)  using  nitroblue  tetrazolium  test (NBT) as a measure of the reactive oxygen species production (ROS). The study was designed with 4 treatments and 3 times of evaluation to review the result of the test. Some fishes acclimatized for two weeks, then three groups of fish were treated  with  probiotics  feed  and  one fish  group  without  treatment  as  a  control.
The highest respiratory burst activity shown by the  B treatment (12 x 108 CFU/ mL). Based on the results showed that nile tilapia who treated through probiotics feed effectively increase the rate of respiratory burst as an immunogenic activity.
Gedung  FIKP  Lt.  II  Jl.  Politeknik  Senggarang,  29115,  Tanjungpinang,  Telp  : (0771-8041766, Fax. 0771 - 7004642. Email: rika.wulandaridwan@yahoo.com

## PENDAHULUAN
Sistem  pertahanan  tubuh  non  spesifik  memiliki  peranan  penting  pada mekanisme pertahanan tubuh ikan. Menurut Misra dkk (2006), dalam satu dekade terakhir telah terjadi peningkatan minat penelitian terhadap sistem modulasi imun non  spesifik  pada  ikan,  baik  sebagai  tindakan  pencegahan  terhadap  penyakit maupun pengobatannya.
Intek Akuakultur. Volume 1. Nomor 1. Tahun 2017. Halaman 71-76
Kegiatan  budidaya  perikanan  saat  ini  rentan  akan  ancaman  penyakit. Timbulnya  penyakit  yang  timbul  akibat  agen  penyakit  dapat  berasal  dari lingkungan  maupun  akibat  tindakan  rekayasa  pada  fase  pembesaran  ikan  secara intensif.  Selain  itu,  sistem  kekebalan  tubuh  ikan  juga  erat  kaitannya  dengan kualitas  air.  Kondisi  perairan  yang  buruk  akan  berakibat  kronis  dan  menekan kesehatan  ikan,  mengubah  parameter  biokimia,  serta  menekan  respon  imun bawaan dan adaptif ikan.
Penggunaan  antibiotik  terhadap  ikan  sakit  sering  menimbulkan  efek resistensi,  meningkatkan  virulensi  bakteri,  menimbulkan  residu  pada  daging  dan mencemari lingkungan. Untuk mengurangi ketergantungan penggunaan antibiotik, penggunaan  probiotik  sebagai  imunomodulator  perlu  dikembangkan.  Beberapa jenis bakteri, mikroalga dan ragi telah diteliti potensinya sebagai probiotik, seperti Tetraselmis, Debaryomyces, Phaffia, Saccharomyces, Lactococcus, Micrococcus, Carnobacterium, Aeromonas, Alteromonas, Photorhodobacterium, Pseudomonas dan Vibrio (Gastesoupe,  1999.,  Villamil dkk, 2002.,  Rusmiati dkk, 2008.,  dan Naim dan Ahmed, 2012).
Aktivitas  letupan  respirasi  dalam  leukosit  merupakan  parameter  pertama yang  pernah  diteliti  sebagai  indikator  imunitas  selular.  Zat  yang  disekresi fagolisosom seperti hidrogen peroksida (H 2 O 2 ), anion superoksida (O 2 - ,) dan nitrit oksida  (NO)  memicu  penghancuran  antigen  dalam  darah menggunakan  oksigen. Menurut  Baldridge  dan  Gerard  (1933)  dalam  Rieger dkk (2010),  sistem  fagosit antigen  dalam  leukosit  berhubungan  dengan  tinggi  rendahnya  konsumsi  oksigen oleh sel. Produksi oksigen radikal akibat proses letupan respirasi tersebut  diukur menggunakan nitroblue tetrazolium (NBT).
Bertitik  tolak  dari  masih  sedikitnya  penelitian  mengenai  efek  pemberian probiotik  terhadap  aktivitas  letupan  respirasi  pada  ikan,  maka  perlu  dilakukan suatu penelitian untuk melihat aktivitas imunogenik tersebut.

## BAHAN DAN METODE
Wadah penelitian yang digunakan berupa akuarium yang telah disterilkan berukuran 50 x 40 x 35 cm dengan kapasitas 45 L dan dilengkapi dengan aerator. Sebanyak  120  ekor  ikan  nila  ( O.niloticus )  dengan  panjang  tubuh  8-14  cm  dan bobot berkisar 20-41 gram didistribusikan pada dua belas akuarium (10 ekor ikan per  akuarium).  Ikan  diaklimatisasi  selama  14  hari,  dengan  pemberian  pakan  dua kali sehari secara at satiation .
Setelah  diaklimatisasi,  ikan  dipuasakan  selama  48  jam,  kemudian  di  beri perlakuan pakan yang ditambah dengan probiotik jenis Bacillus sp selama 14 hari dengan  perlakuan  A  sebagai  kontrol  ( Buffer  Pepton  Water +  Minyak  Ikan), perlakuan  B  (BAL  12x10 8 CFU/mL),  perlakuan  C  (BAL  24x10 8 CFU/mL)  dan perlakuan  D  (BAL  30x10 8 CFU/mL).  Setelah  pemberian  pakan  berprobiotik selama  2  minggu,  sampel  darah  pada  ikan  diambil  dan  segera  diproses  untuk dianalisis aktivitas letupan respirasinya.
Pengujian  aktivitas  letupan  respirasi  mengikuti  metode  Anderson  & Siwicki  (1995).  100  µL  heparin  ditambahkan  ke  dalam  100  µL  0,2%  larutan
Intek Akuakultur. Volume 1. Nomor 1. Tahun 2017. Halaman 71-76
nitroblue  tetrazolium  (NBT,  Sigma,  St.  Louis,  MO,  USA),  kemudian dihomogenkan    dan  diinkubasi  selama  30  menit  pada  suhu  25°C.  Solusi  NBT disiapkan di dalam  phosphate buffered saline (PBS) pH 7,4. Setelah inkubasi dan homogenisasi,  50  µL  dari  larutan  ditambahkan  1  ml  N,  formamida  N-dimetil (DMF, Sigma, St.  Louis,  MO, USA) dalam tabung kaca. Solusi disentrifus pada 3000  RPM  selama  5  menit.  Nilai  OD  dari  supernatan  ditentukan  pada spektrofotometer (Beckman DU-70S) pada 540 nm. Data dianalisis menggunakan One Way ANOVA untuk melihat pengaruh pemberian probiotik terhadap aktivitas letupan  respirasi.  Jika  diperoleh  nilai  signifikan  dengan  p<0,05,  data  diuji  lanjut dengan uji LSD/Tukey.

## HASIL
Berikut merupakan hasil analisis aktivitas letupan respirasi :
Gambar 1. Aktivitas letupan respirasi leukosit pada ikan nila ( O.niloticus ) Berdasarkan  Gambar  1  di  atas,  tampak  bahwa  aktivitas  NBT  tertinggi ditunjukkan pada perlakuan B (12 x 10 8 CFU/mL), kemudian perlakuan C (24 x 10 8 CFU/mL),  lalu  perlakuan  D  (24  x  10 8 CFU/mL).  Walaupun  data  yang dianalisis menggunakan sidik ragam menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata dimana  p>0,05,  namun  ketiga  perlakuan  menunjukkan  nilai  aktivitas  NBT  lebih tinggi terhadap kontrol.

## PEMBAHASAN
Penelitian  ini  mengevaluasi  efek  pemberian  probiotik  terhadap  aktivitas imunogenik  letupan  respirasi  leukosit  ikan  nila  ( O.niloticus ).  Nilai Reactive Oxygen Species (ROS) yang terukur oleh indikator NBT dilepaskan oleh sel imun untuk merusak membran patogen yang menginfeksi ikan.
0.0000 0.0500 0.1000 0.1500 0.2000 0.2500 A B C D A kt iv it as NBT p ad a O D 5 4 0 n m Perlakuan (CFU/mL/kg diet) Keterangan : A = Kontrol B = 12 x 10 8 CFU/mL
C = 24 x 10 8 CFU/mL D = 30 x 10 8 CFU/mL 0,14 ± 0.02 0,17 ± 0.05 0,16 ± 0.02 0,15 ± 0.03
Intek Akuakultur. Volume 1. Nomor 1. Tahun 2017. Halaman 71-76
Menurut Neumann dkk (2000a,b) dan Mathias dkk (2009), sel monosit dan neutrofil  adalah  sel  yang  berperan  sebagai  fagosit  terhadap  benda  asing  melalui membran reseptor. Saat peradangan dan terdapat luka pada jaringan, sitokin akan dilepaskan oleh sel fagosit sebagai sinyal dari inflamasi yang akan memicu proses kemotaksis jaringan dan penyembuhan luka.
Cara kerja leukosit, baik monosit maupun neutrofil dalam darah cenderung meningkatkan  konsumsi  oksigen  melalui  proses  oksidasi  NADPH  dan  akan membentuk  oksigen  radikal  dalam  bentuk  anion  superoksida  (O 2 - ),  hydroxyl radikal ( - OH), hydrogen peroksida (H 2 O 2 ), dan lipid peroksida (ROOH). Senyawa tersebut  merupakan  antibakteri  potensial  yang  akan  menjaga  tubuh  ikan  dari infeksi patogen.
ROS  dihasilkan  secara  intraselular  sebagai  suatu  produk  saat  transpor elektron  di  mitokondria.  Terbentuknya  ROS  distimulasi  oleh  aktivitas  fagosit yang selanjutnya disebut sebagai ledakan respirasi (Irani dkk, 1997., Joneson dan Sagi,  1998.,  Arnold  dkk,  2001).  Fagosit  mengekspresikan  multikomponen oksidase  NADPH  (NOX)  yang  dipisahkan  oleh  sitosol  dan  membran  plasma. Ketika sel-sel terstimulasi, sitosol ditranslokasi ke membran plasma, membentuk komplemen  bersama  flavocytochrome.  Rangkaian  oksidasi  tersebut  kemudian memanfaatkan  sitosol  NADPH  untuk  membatasi  produksi  O 2 menjadi  O 2 - (Lassegue  dkk,  2001.,  Cheng  dkk,  2001.,  Arnold  dkk,  2001).  Ketika  terjadi ekspresi yang berlebih, NOX mampu meningkatkan produksi O 2 - (Suh dkk, 1999., Lambeth  dkk,  2000).  Sebagai  NADPH  oksidase  fagosit,  NOX  merupakan komponen  protein  yang  berperan  dalam  membunuh  mikroba  dan  dapat  juga berperan  penuh  sebagai  makrofag  dan  menjadi  sumber  kedua  dalam  menerima sinyal sel (Griendling dkk, 2000).

## KESIMPULAN
Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan,  dapat  disimpulkan  bahwa pemberian  probiotik  melalui  pakan  pada  ikan  nila  ( Oreochromis  niloticus ) menunjukkan  hasil  yang  efektif  meningkatkan laju aktivitas imunogenik  letupan respirasi  leukosit  terhadap  kontrol.  Selain  itu,  ROS  yang  merupakan  produk aktivitas letupan respirasi dapat memodulasi respon fisiologis sel imun. ROS tidak hanya  berperan  dalam  membunuh  patogen,  namun  juga  sebagai  reseptor  dan penyembuhan luka.

## DAFTAR PUSTAKA
Anderson  D.P,  Siwicki  A.K.  1995.  Basic  Haematology  And  Serology  For  Fish Health Programs. In Shariff M, Arthur Jr, Subasinghe, Rp. (Eds). Diseases In  Asian  Aquaculture  II.  Fish  Health  Section.  Manila:  Asian  Fisheries Society. P. 185-202.
Arnold R.S, Shi J, Murad E, Whalen A.M, Sun C.Q, Polavarapu R, Parthasarathy S,  Petros  J.A,  Lambeth,  J.D.  2001.  Hydrogen  Peroxide  mediates  the  cell
Intek Akuakultur. Volume 1. Nomor 1. Tahun 2017. Halaman 71-76
growth And Transformation Caused By The Mitogenic Oxidase Nox1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 : 5550–5555.
Baldridge  C.W,  Gerard  R.W.  1933.  The  Extra  Respiration  Of  Phagocytosis. American Journal Of Physiology. Vol. 103. No. 1. P. 235-6.
Cheng G, Cao Z, Xu X, Meir E.G, Lambeth J.D. 2001. Homologs Of Gp91phox : Cloningand Tissue expression Of Nox3, Nox4, And nox5. Gene 269, 131– 140.
Gastesoupe  F.J.  1999.  The  Use  Of  Probiotic  In  Aquaculture.  Aquaculture.  180  : 147-165.
Griendling,  K.K,  Sorescu  D,  Ushio  Fukai  M.  2000.  NAD(P)H  Oxidase:  Role  In Cardiovascular Biology And Disease. Circ. Res. 86, 494–501.
Irani  K,  Xia  Y,  Zweier  J.L,  Sollott  S.J,  Der  C.J,  Fearon,  E.R,  Sundaresan  M, Finkel  T,  Goldschmidt  Clermont  P.J.  1997.  Mitogenic  Signaling  Mediated By Oxidants In Ras Transformed Broblasts. Science 275. 1649–1652.
Joneson  T,  Bar  Sagi  D.  1998.  A  Rac1  effector  site  controlling  mitogenesis through superoxide production. J. Biol. Chem. 273. 17991–17994.
Lambeth  J.D,  Cheng  G,  Arnold  R.S,  Edens  W.A.  2000.  Novel  Homologs  Of Gp91phox. Trends Biochem. Sci. 25. 459–461.
Lassegue B, Sorescu D, Szocs K, Yin Q, Akers M, Zhang Y, Grant S.L, Lambeth J.D,  Griendling  K.K.  2001.  Novel  Gp91phox  Homologues  In  Vascular Smooth  Muscle  Cells:  Nox1  Mediates  Angiotensin  II-Induced  Superoxide Formation  and  Redox  Sensitive  Signaling  Pathways.  Circ.  Res.  88.  888– 894.
Mathias  Jr,  Dodd  Me,  Walters  K.B,  Yoo  S.K,  Ranheim  EA,  Huttenlocher  A. 2009.  Characterization  Of  Zebrafish  Larval  Inflammatory  Macrophages. Developmental  and  Comparative  Immunology.  Vol.  33.  No.  11.  P.  1212- 1217.
Misra  C.K,  Das  BK,  Mukherjee  SC,  Pattnaik  P.  2006.  Effect  Of  Longterm Administration  Of  Dietary  Β-Glucan  On  Immunity,  Growth  And Resistance Of Labeo Rohita Fingerlings. Aquac 255 : 82-92.
Naim Uddin, Ahmed H. Al Harbi. 2012. Bacterial Flora Of Polycultured Common Carp ( Cyprinus Carpio ) and African Catfish (Clarias Gariepinus) . Natural Resources And Environment Research Institute. Saudi Arabia. International Aquatic Research. 4:10.
Intek Akuakultur. Volume 1. Nomor 1. Tahun 2017. Halaman 71-76
Neumann  N.F,  Barreda  D.R,  Belosevic  M.  2000a.  Generation  And  Functional Analysis Of Distinct Macrophage Subpopulations From Goldfish ( Carassius auratus L.)  Kidney  Leukocyte  Cultures.  Fish  And  Shellfish  Immunology.
Vol. 10. No. 1. P. 1-20.
Neumann  N.F,  Stafford  J.L,  Barreda  D,  Ainsworth  A.J,    Belosevic  M.  2000b. Antimicrobial  Mechanisms  Of  Fish  Phagocytes  And  Their  Role  In  Host Defense. Developmental And Comparative Immunology. Vol. 25. No. 8-9. P. 807-825.
Rieger  A.M,  Hall  Be,  Barreda  D.R.  2010.  Macrophage  Activation  Differentially Modulates  Particle  Binding,  Phagocytosis  and  Downstream  Antimicrobial Mechanisms.  Developmental  and  Comparative  Immunology.  Vol.  34.  No. 11. P. 1144-1159.
Rusmiati Dewi, Sulistiyaningsih, Tiana Milanda, Sri Agung  Fitri Kusuma. 2008. Penyuluhan  Pentingnya  Konsumsi  Yoghurt  Dan  Metode  Pembuatannya Dengan Cara Sederhana Dalam Rangka Peningkatan Derajat Kesehatan Dan Ekonomi  Masyarakat  Di  Kelurahan  Sukaluyu  Kota  Bandung.  Universitas Padjajaran. Bandung.
Suh  Y.A  ,  Arnold  R.S,  Lassegue  B,  Shi  J,  Xu  X,  Sorescu  D,  Chung  A.B, Griendling  K.K,  Lambeth  J.D.  1999.  Cell  Transformation  By  The Superoxide Generating Oxidase Mox1. Nature 401. 79–82.
Villamil  L,  Tafalla  C,  Figueras  A,  Novoa  B.  2002.  Evaluation  Of Immunomodulatory  Effects  Of  Lactic  Acid  Bacteria  In  Turbot (Scophthalmus Maximus). Clin Diagn Lab Immunol 2002;9:1318-1323.