Proteolytic Activity of The Entomopathogenic Fungi ( Penicillium sp. ) of Cockroaches ( Periplaneta americana )
Ahmad Ikhsanudin * , Emantis Rosa, C.N Ekowati
Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung, Jl. Soemantri Brojonegoro, Gedung Meneng, Bandar Lampung, 35145, Lampung, Indonesia *Email: ahmadikhsanudin21@yahoo.com

## ABSTRACT
Cockroaches (Periplaneta americana) were the insect vectors of disease that caused adverse effects on  human  health.  Control  cockroch  excessive  use  of  insecticides  can  lead  to  residus  in  the environment  and  resistance  cockroach.  Therefore  it  was  necessary  to  use  an  alternatives  such  as such  as  entomopathogenic  fungal  as  biologycal  agents. The  entomopathogenic  fungi  penetrated  via the integument of an cockroach to reach the hemocoel. Proteins  were the molecules responsible for integument  strength  in  cockroach,  It  was  synthesis  the  proteases  to  degrading  proteins.  The  study begins with the isolation of entomopathogenic fungi using the moist chamber method with cockroach as  insect  bait.  Fungus  that  grow  on  cockroches  are  cultured  and  purifed  on  Potato  Dextrose  Agar (PDA)  medium  then  identified.  Identification  was  carried  out  through  macroscopic  observations including  colony  color  and  diameter  and  microscopic  observations  including  conidia,  conidiophores, hyphae, vesicles, fialids, and leg cells. The result of isolation and identification obtained as Penicillium sp. Proteases enzimatic activity tested on PDA with anlene 1%. The clear zone formed is measured to show the activity of proteases produced by Penicillium sp.
Keywords : cockroaches, entomopathogenic fungal, Penicillium sp., proteases.

## PENDAHULUAN
Kecoa  merupakan  serangga  yang  termasuk phylum  Arthropoda  dari  Ordo  Orthoptera dan    termasuk  salah  satu  serangga  yang hidup  pada  kisaran  habitat  yang  luas (kosmopolitan).    Sama  seperti  serangga lainnya,  kecoa  mempunyai  daya  reproduksi yang  cukup  tinggi.  Dalam  seminggu  dapat menghasilkan  kira-kira  15-90  ootecha  yang berisi  sekitar  15  butir  telur  untuk  setiap ootecha (WHO,1970).
Kecoa dalam kehidupannya berperan sebagai vektor mekanis atau pembawa bibit penyakit  baik  berupa  parasit,  cacing  dan bakteri seperti Salmonella sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp., yang dapat menyebabkan berbagai masalah kesehatan  pada  manusia.  (Cornwell,1968). Cara  pengendalian  yang  biasa  digunakan untuk  mengatasi  populasi  kecoa  adalah secara kimiawi yang menggunakan insektisida  kimia.  Berdasarkan  data  dari World Health Organization (WHO), insektisida  yang  sering  digunakan  dalam mengendalikan kecoa diantaranya Prophetamphos, Permethrin, Dichlorvos, Diazinon,  dan  insektisida  kimia  lainnya.
Kelebihan  pengendalian  secara  kimiawi antar  lain  dapat  membunuh  dalam  jumlah yang  banyak,  tidak  membutuhkan  waktu yang  lama  dan  hasil  lebih  cepat  terlihat. Namun  pengendalian  cara  kimia  ini  dapat menimbulkan masalah lain seperti mencemari lingkungan, menimbulkan resistensi terhadap vektor dan menyebabkan  matinya  hewan  yang  bukan sasaran.
Oleh karena itu, diperlukan upaya pengendalian  hayati  dengan  memanfaatkan bahan  alami  yang  lebih  ramah  lingkungan. Salah  satu  alternatif  yang  bisa  dilakukan yaitu pemanfaatan cendawan entomopatogen sebagai agen hayati pengendali
kecoa. Cendawan
entomopatogen merupakan golongan cendawan  yang  mengakibatkan  kematian pada  serangga.  Hal  ini  disebakan  karena cendawan entomopatogen dapat menghasilkan  toksin,  selain  itu  endawan entomopatogen
juga menghasilkan beberapa enzim ekstraselluler seperti kitinase, protease, dan lipase yang digunakan oleh cendawan pada waktu untuk menginvasi tubuh serangga target.
Mekanisme  infeksi    jamur  entomopatogen pada tubuh serangga menurut  Kanga et  al., (2003)  yaitu  dengan  cara  menempelnya propagul  jamur  pada  tubuh  serangga, selanjutnya  propagul  berkecambah  pada integumen  serangga,  berikutnya  tabung kecambah  melakukan  penetrasi  masuk  ke tubuh serangga.
Proses penetrasi dimulai dengan pertumbuhan  spora  pada  kutikula  serangga selanjutnya  hifa  akan  mengeluarkan  enzim kitinase,  lipase,  dan  protenase  untuk mendegradasi  kutikula  serangga  (Suntoro, 1991).    Pada  penelitian  ini,  akan  berfokus pada  cendawan  entomopatogen  penghasil protease.  Salah  satu  jenis  protease  yang dihasilkan cendawan entomopatogen adalah substilisin protease yang mampu mendegradasi  integumen  dari  serangga [Shaukat,2011].
Untuk  itu,  dilakukan  penelitian  untuk mengisolasi  cendawan  entomopatogen  asal kecoa yang mampu menghasilkan protease.

## METODE PENELITIAN

## Persiapan Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya  cawan  Petri,  tabung  reaksi, neraca  analitik  digital,  ose  jarum,  bunsen, erlenmeyer,  beaker  glass,  gelas  ukur, mikroskop,  vortex  mixer,  haemocytometer, autoclave, Biologycal  Safety  Cabinet (BSC) dan inkubator.
Bahan-bahan  yang  digunakan  diantaranya kecoa,  media Potato  Dextrose  Agar (PDA), antibiotik chloramphenicol , Lactophenol Cotton  Blue (LCB),  susu  anlene,  aquades, alkohol  70%,  spritus,  kapas,  tissue,  kain kasa, dan cling wrap.

## Isolasi Cendawan Entomopatogen
Isolasi cendawan entomopatogen menggunakan  metode Moist  Chamber . Yang  dilaukuan  sebagi  berikut:  Kecoa  yang telah  disiapkan  dibiarkan  mati  kemudian diletakkan  pada  cawan  Petri  yang  sudah berisi  tissue  yang  sebelumnya  sudah dilembabkan  menggunakan  aquades  steril. Lalu  cawan  yang  sudah  berisi  kecoa diinkubasi pada suhu 25-28 o C selama 7 hari di inkubator.

## Pemurnian Cendawan Entomopatogen
Cendawan  yang  tumbuh  pada  tubuh  kecoa dimurnikan  menggunakan  media  PDA. Selanjutnya      cendawan  yang  mempunyai warna yang berbeda di inokulasikan kedalam  media  PDA  menggunakan  ose jarum.  Lalu  diinkubasi  pada  suhu  25-28 o C selama  7  hari  diinkubator.  Pemurnian dilakukan  sampai  mendapatkan  cendawan yang hanya mempunyai satu warna.
Gambar 1 . Isolasi cendawan entomopatogen menggunakan metode Moist Chamber

## Identifikasi Cendawan Entomopatogen
Cendawan entomopatogen yang telah murni diamati  secara  mikroskopis  menggunakan metode slide  culture (Sundari,  2012). Metode  ini  menggunakan  potongan  media PDA  yang  diletakkan  dalam object  glass dalam cawan Petri. Lalu, cendawan entomopatogen  dititik  menggunakan  ose jarum  pada  media  PDA  dan  ditutup menggunakan cover  glass .  Selanjutnya diinkubasi  selama  3-4  hari  pada  suhu  25- 28 o C.  Setelah  isolat  tumbuh,  cover  glass diangkat  dan  diletakkan  pada  object  glass baru yang telah ditetesi menggunakan LCB, lalu diamati menggunakan mikroskop. Selanjutnya, diidentifikasi menggunakan buku identifikasi menurut Barnett dan Hunter (1998).
Uji Proteolitik
Isolat Cendawan

## Entomopatogen
Uji  proteolitik  menggunakan  media  PDA (200 g kentang, 20 g dextrose, 15 g agar, 1 l aquades).  Lalu  disterilisasi  dalam  autoclave selama  15  menit.  Selanjutnya  ditambahkan antibiotik chloramphenicol (500  mg/l)  dan susu anlene 1%. Cendawan entomopatogen diinokulasikan  dalam  cawan  Petri  yang sudah  berisi  media  uji  menggunakan  ose
jarum. Lalu diinkubasi selama 3-4 hari pada suhu  25-28 o C.  Aktivitas  proteolitik  diamati dari  terbentuknya  zona  jernih  yang  terdapat disekitar koloni.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  isolasi  cendawan  entomopatogen  asal kecoa yang telah dilakukan  didapatkan satu genus  cendawan entomopatogen (kode P2) yang termasuk dalam genus Penicillium .
Gambar 2.
Hasil pemurnian cendawan entomopatogen asal kecoa ( P. americana ) pada media PDA.
Berdasarkan  hasil  pengamatan  secara makroskopis,  menunjukkan  adanya  koloni cendawan dengan ciri – ciri sebagai berikut: koloni  cendawan    yang  berwarna  abu-abu. Sedangkan berdasarkan pengamatan secara  mikroskopis,  terlihat  ciri-  ciri  koloni cendawan mempunyai konidia yang berbentuk:  koloni    bulat    atau  globose, konidiofor    mempunyai  cabang,  mempunyai hifa  bersekat,  tidak  mempunyai  vesikel  dan sel  kaki,    mempunyai  fialid  tunggal  yang dapat dilihat pada (Gambar 3).
Gambar 3 . Hasil pengamatan mikroskopis Penicillium sp.
Selanjutnya  isolat Penicillium sp.  yang sudah  didapatkan  kemudian  diuji  aktivitas proteolitiknya  menggunakan  media  uji  yang sudah disediakan dan dari hasil pengamatan
yang dilakukan disekitar koloni    didapatkan luas zona jernih sebesar 1,5 cm yang dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 . Hasil Uji Proteolitik Penicillium sp. (a) koloni Penicillium sp. (b) zona jernih yang terbentuk
Terbentuknya  zona  jernih  disekitar  koloni menurut    Susanti  (2002)      disebabkan karena  adanya  aktivitas  enzim  protease yang  dihasilkan  oleh Penicillium sp.  itu sendiri, yang dapat menyebabkan terjadinya degredasi  kasein  dalam  skim  milk  sebagai substrat  protease  sehingga  terbentuk  zona jernih disekitar koloni cendawan.
Selain  itu  cendawan  proteolitik  mampu memproduksi enzim protease yang berperan dalam  proses  hidrolisis  kasein  menjadi peptida-peptida dan asam-asam amino yang larut  dalam  media.  Terjadinya  aktivitas proteolitik  yang  semakin  tinggi  ditunjukkan dengan  semakin  luas  zona  jernih  yang terbentuk (Irena, 2010).

## KESIMPULAN
Hasil  isolasi  cendawan  entomopatogen yang sudah dilakukan didapatkan cendawan  entomopatogen    yang  termasuk golongan Penicillium sp.  yang  mempunyai aktivitas proteolitik sebesar 0,6.

## DAFTAR PUSTAKA
Ali, Shaukat. (2011). Production and Regulation  of  Extracelluler  Proteases from  the  Entomopathogenic  Fungus Metarhiziumanisopliae
(Cordycipitaceae;  Hipocreales)  in  the Presence of Diamondback Moth Cuticule. Pakistan. J. Zool ., vol. 43 (6), pp. 1203-1213.
b a
Cornwell PB. (1968). The cockroach . Vol. 1. London. Hutchinson
Irena,  A.  (2010). Isolasi  dan  Optimasi Protease Bakteri Termofilik dari Sumber Air Panas Tangkuban Perahu Bandung. Unpublished Thesis, Departemen  Biokimia  FMIPA  IPB. Bogor.
Kanga, L.B.B., W.A. Jones, and R.R. James. (2003).  Field  trials  using  fungal pathogen, Metarhizium anisopliae
(Deuteromycetes:Hyphomycetes) to control  the  ectoparasiticmite,  Varroa destructor  (Acari:Varroidae)  inhoney bee, Apis mellifera (Hymenoptera:Apidae) colonies. J.
Entomol. (96):1091−1099
Steven. (2013). Entomological notes .
Department of Entomology.  The
Pennsylvania State University.
Sundari. (2012). Suatu Model Pengembangan  Media  Pembelajaran Slide  Culture untuk  Pengamatan Struktur  Mikroskopis  Kapang  pada Mata Kuliah Mycology. Jurnal Bioedukasi. 1(1): 39-47
Susanti,  E.  (2002). Petunjuk  Praktikum Biokimia .  Jurusan  Kimia  FMIPA  UM.
Malang Suntoro.  (1991).  Uji  Efikasi Beauveria bassiana (Balls) Vuill Terhadap Hypothenemus  hampai  (Ferr).  Tesis. Fakultas Pascasarjana UGM. Yogyakarta World Health Organization. (1970). Tentative instructions for determinng the susceptibility or resistance of cockroaches to
insecticides.
Technical  Report  Series .  No.  443. Geneva. 130-133.