Karakteristik Antioksidan pada Kelopak Bunga Rosella (Hibiscus sabdariffa Linn.)

## Maria Inggrid, Yansen Hartanto dan Jesslyn Fedora Widjaja
Program Studi Teknik Kimia, Fakultas Teknologi Industri, Universitas Katolik Parahyangan Bandung Email: inggrid@unpar.ac.id

## ABSTRAK
Bunga rosella mengandung senyawa bioaktif dengan kadar antosianin yang tinggi. Antosianin termasuk golongan  senyawa  flavonoid  yang  dapat  berperan  sebagai  antioksidan  alami,  mampu  menghambat radikal  bebas  serta  dapat  mencegah  terjadinya  degeneratif  sel  dan  penyakit  lain.  Tujuan  penelitian adalah  mempelajari  pengaruh jenis pelarut dan temperatur pada ekstraksi  rosella terhadap aktivitas dan  kadar  antosianin.  Manfaat  penelitian  ini  adalah  menerapkan  hasil  peneliti  ekstraksi  antioksidan pada  rosella  bagi  dunia  usaha.  Metode  penelitian  terdiri  dari  persiapan  bahan  baku,  ekstraksi antosianin  dan  analisis.  Rosella  yang  telah  dikeringkan  diekstraksi  masing-masing  menggunakan campuran  pelarut  etanol:air  dengan  variasi    0:100,  50:50  dan  70:30  %  v/v  ,  ekstraksi  dilakukan masing-masing  pada  temperatur  30  ˚C,  45  ˚C,  dan  60  ˚C.  Analisis  kimia  meliputi    penentuan  kadar antosianin dengan metode pH differensial,  penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH  (1,1-difenil-2  pikrilhidrazil).  Hasil  penelitian  pada  kondisi  optimum  ekstraksi  adalah menggunakan  pelarut  etanol:air  (50:50  v/v)  pada  temperatur  45  ˚C,  kadar  antosianin  dan  rendemen tertinggi  masing-masing  adalah  88,9  mg/L  dan  53,2  %.  Aktivitas  antioksidan  tertinggi  ditunjukan dengan  nilai  IC 50 yaitu  67,3  ppm.  Penentuan  kestabilan  antosianin  dilakukan  dengan  memberi perlakuan termal pada temperatur 30 ˚C, 45 ˚C, dan 60 ˚C, dari persamaan Arhenius diperoleh nilai energi aktivasi 18,3 kJ/mol.
Kata Kunci: Rosella, ekstraksi, pelarut, temperatur, analisis, antioksidan

## ABSTRACT
Roselle contains bioactive compounds and has high quantity of anthocyanin. Anthocyanins, including flavonoid compounds that can be used as natural antioxidants, that has the ability to inhibit free radical reaction,  in  human  body  can  prevent  degenerative  cell  and  various  diseases.  The  objective  of  this research  is  to    study  the  effect  of  solvent  and  temperature  in  a  batch  extraction  of  roselle  to  the anthocyanin product. The benefit of this research is to give the transfer of extraction product for the benefit  of    industry.  Method  used    in  this  research  consisting  of  the  preparation  of  size  reduction  of roselle into smallest size followed by drying process, and extraction of roselle. Extraction can be done by  two  variables,  namely    ratio  ethanol  and  water    of    0:100  ;  50:50  ;  70:30  v/v  respectively  and temperature  of    30 o C,  45 o C  and  60 o C.  Analysis  anthocyanin  content  was  evaluated  by    the  pH differential  method,  and  the  activity  of  antioxidant  using  a  method  of    DPPH  ( 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazil ).  The  research  results  can  be  shown  that  the  optimum  condition  of  temperature  45 o C and  ethanol  water  ratio  of  50:50  followed  by  total  anthocyanin  of  88.9  mg/L,  and  yield  content  of 53.2%. The highest antioxidant activity indicated by IC 50 value of 67.3 mg/L. The effect of temperature in a batch extraction process followed Arrhenius  equation with energy activation of 18.3 kJ/mol.
Keywords: Roselle, extraction,  solvent, temperature, analysis, antioxidant
Rosella ( Hibiscus sabdariffa L. ) merupakan tanaman famili Malvaceae yang banyak tumbuh di daerah tropis  seperti  Pulau  Jawa  dan  Kalimantan.  Rosella  mengandung  antosianin  yang  berperan  sebagai antioksidan  alami  dan  dapat  menangkal  radikal  bebas.  Antioksidan  merupakan  senyawa  yang  dapat mendonorkan elektron pada senyawa oksidan untuk menghambat aktivitas oksidan tersebut. Aktivitas antioksidan dapat dianalisis dengan metode DPPH ( 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil ). DPPH merupakan senyawa radikal bebas yang dapat direduksi dengan menerima atom hidrogen dari antosianin, sehingga menyebabkan  perubahan  warna  dari  ungu  tua  menjadi  kuning  pucat  (Mohamed,  2016),  perubahan warna tersebut menunjukkan bahwa sampel yang diuji memiliki aktivitas antioksidan (Sayuti, 2015).
Selain  sebagai  antioksidan,  antosianin  juga  dapat  digunakan  sebagai  zat  warna  alami.  Antosianin banyak  terdapat  dalam  tanaman,  buah-buahan,  dan  sayur-sayuran.  Antosianin  berpotensi  sebagai pewarna  alami  yang  memberikan  warna  merah,  orange,  biru,  dan  ungu.  Antosianin  merupakan kelompok flavonoid yang terdiri dari dua cincin benzena yang dihubungkan dengan tiga atom karbon. Struktur antosianin yang terdapat pada rosella adalah sianidin-3-glukosida.
Gambar 1. Struktur antosianin rosella (Aurelio, et al., 2008)
Selama  proses  pengolahan  dan  penyimpanan,  antosianin  dapat  teroksidasi  akibat  perlakuan  termal, sehingga  antosianin  mengalami  degradasi.  Kestabilan  warna  antosianin  dipengaruhi  oleh  beberapa faktor, antara lain pH, temperatur dan cahaya. Laju degradasi antosianin cenderung meningkat seiring dengan kenaikan temperatur, sehingga intensitas warna antosianin menurun (Sipahli, 2016).
Antosianin  dapat  diperoleh  dari  proses  ekstraksi  padat  cair.  Prinsip  ekstraksi  adalah  perpindahan massa  komponen  zat  ke  dalam  pelarut.  Faktor  yang  mempengaruhi  proses  ekstraksi  adalah  ukuran partikel padatan, jenis pelarut, temperatur, pengadukan, waktu ekstraksi, dan rasio zat padat terhadap pelarut. Pelarut yang digunakan harus memenuhi syarat yaitu bersifat selektif, tidak bereaksi dengan bahan, stabil secara kimia dan termal. Pelarut yang digunakan harus memiliki kepolaran yang sesuai dengan senyawa yang akan diekstraksi, senyawa  yang polar akan mudah larut ke dalam pelarut yang bersifat polar. Pelarut yang banyak digunakan untuk ekstraksi antosianin yaitu aseton, kloroform, dan metanol,  namun  penggunaan  pelarut  tersebut  tidak  disarankan  karena  mengandung  bahan  yang berbahaya  jika  dikonsumsi,  sehingga  pada  penelitian  ini  dipilih  pelarut  etanol  dan  air  yang  tidak beracun dan aman untuk digunakan (Hadi, Humam, 2017).
Penelitian  yang  dilakukan  Boeing  et  al  (2014)  menunjukan  bahwa  penggunaan  pelarut  dapat mempengaruhi  kadar  antosianin  dan  aktivitas  antioksidan  yang  diekstraksi.  Ekstraksi  dengan menggunakan  kombinasi  pelarut  etanol-air  akan  menghasilkan  kadar  antosianin  dan  aktivitas antioksidan lebih tinggi. Gonzales et.al (2012) melaporkan kadar antosianin tertinggi  diperoleh pada ekstrak  dengan  menggunakan  pelarut  etanol:air  (70:30  v/v)  dan  kapasitas  antioksidan  tertinggi diperoleh dengan pelarut etanol:air (50:50 v/v), sedangkan penelitian yang dilakukan oleh Oancea et.al

## PENDAHULUAN 1.
(2012)  menyatakan pada jenis pelarut yang sama, kenaikan temperatur ekstraksi akan meningkatkan kadar  antosianin  yang  diperoleh.  Berdasarkan  uraian  tersebut,  maka  perlu  dilakukan  penelitian terhadap kondisi optimum ekstraksi dengan menggunakan variasi jenis pelarut etanol-air pada sampel kelopak  bunga  rosella,  dan  variasi  temperatur  untuk  menghasilkan  kadar  antosianin  dan  aktivitas antioksidan yang lebih tinggi, tetapi tidak menyebabkan degradasi.

## 2. METODE PENELITIAN
Pada penelitian ini digunakan bahan serta metode sebagai berikut:

## 2.1 Bahan penelitian
Bahan  baku  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  yaitu  kelopak  bunga  rosella  kering  ( Hibiscus sabdariffa Linn. ) dari Indofun Solution dari Kecamatan Kayen Kidul, Kabupaten Kediri. Bahan kimia yang digunakan untuk analisis adalah DPPH (1,1-difenil-2 pikrihidrazil) , larutan buffer HCl-KCl pH 1,0, buffer natrium asetat-HCl pH 4,5, sebagai pelarut digunakan etanol teknis 96% dan air.

## 2.2 Metode penelitian
Kelopak  bunga  rosella  dipotong  kecil,  dikeringkan  sampai  kadar  air  dibawah  10%.  Rosella dimasukkan kedalam ekstraktor batch 1,0 L yang dilengkapi dengan kondensor. Ekstraksi dilakukan menggunakan  pelarut  etanol:air  (0:100,  50:50,  70:30  %v/v)  pada  temperatur  30,  45,  60  ˚C,    dengan perbandingan  F:S=  1:10.  Ekstrak  dan  rafinat  dipisahkan  kemudian  dianalisa  dengan  menggunakan spektrofotometer sinar tampak dan spektrofotometer inframerah.

## 2.3 Metode analisis
Analisis Kadar Antosianin
Kadar  antosianin  ditentukan  dengan  metode  pH  differential,  yaitu  penentuan  kadar  antosianin berdasarkan perubahan struktur molekul antosianin pada pH 1,0 dan pH 4,5. Absorbansi larutan diukur pada  panjang  gelombang  520  nm  dan  700  nm  dengan  spektrofotometer  UV-VIS.  Kadar  antosianin yang diperoleh ekivalen dengan pigmen antosianin Sianidin-3 glukosida dengan Mr = 449,2 g/mol,  Ɛ= 26900 L/mol.cm (Mahmudatussa'adah, A, et al, 2014).
A = (A 520nm – A 700nm ) pH 1,0 - (A 520nm – A 700nm ) pH 4,5

## Analisis Aktivitas Antioksidan
Analisis  aktivitas  antioksidan  bunga  rosella  dilakukan  dengan  menggunakan  metode  DPPH.  Ekstrak bunga hasil evaporasi dilarutkan dengan etanol pada berbagai konsentasi, ditambahkan larutan DPPH (1:1),  kemudian  diinkubasi  dan  diukur  absorbansinya  pada  panjang  gelombang  517  nm.  Aktivitas antioksidan dihitung dengan rumus % Aktivitas antioksidan = 1- (A sampel / A DPPH ) x 100%

## Kinetika Degradasi
Pengaruh temperatur terhadap kestabilan dan kinetika degradasi antosianin dilakukan pada temperatur (30,  45,  dan  60  °C).  Ekstrak  dipanaskan  dengan  menggunakan  waterbath  yang  dilengkapi  dengan shaker, kadar antosianin diukur setiap satu jam.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN

## Kadar antosianin
Berdasarkan  hasil  analisis  pada  Tabel  1,  kadar  antosianin  tertinggi  diperoleh  pada  temperatur  45˚C dengan pelarut etanol:air (50:50 v/v), yaitu sebesar 88,9 mg/L, sedangkan kadar terendah yaitu pada kondisi temperatur 60˚C dengan pelarut etanol:air (0:100 v/v) sebesar 66,8 mg/L. Menurut Boeing et al (2014), ekstraksi dengan menggunakan campuran pelarut organik dan air lebih efektif dibandingkan dengan  pelarut  air  saja.  Hal  ini  disebabkan  adanya  kesesuaian  tingkat  polaritas  antara  antosianin dengan campuran etanol-air, sedangkan pelarut air bersifat sangat polar.
Tabel 1. Pengaruh temperatur dan jenis pelarut terhadap kadar antosianin, IC 50 , dan rendemen
Suhu (°C) Kadar antosianin (mg/L) IC 50 (ppm) Rendemen (%) Pelarut (etanol:air) Pelarut (etanol:air) Pelarut (etanol:air) 0:100 (v/v) 70:30 (v/v) 50:50 (v/v) 0:100 (v/v) 70:30 (v/v) 50:50 (v/v) 0:100 (v/v) 70:30 (v/v) 50:50 (v/v) 30 71,40  76,40  81,65 83,8 85,1 69,7 47,17  48,34  49,92 45 82,06  83,40  88,88 89,9 77,2 67,3 46,07  50,47  53,18 60 66,80  73,15  80,43 97,4 97,1 81,7 46,70  45,09  53,06
Gambar 1. Grafik kadar antosianin pada berbagai temperatur dan jenis pelarut
Gambar  1  menunjukkan  grafik  kadar antosianin  pada  berbagai  temperatur  dan  jenis  pelarut .  Pada temperatur  60˚C  terjadi  penurunan  intensitas  warna  antosianin,  sehingga  kadar  antosianin  menurun. Hal  ini  disebabkan    pemanasan  pada  suhu  relatif  tinggi  dapat  menyebabkan  sebagian  antosianin mengalami  degradasi  akibat  terjadinya  hidrolisis  pada  ikatan  glikosidik  antosianin,  sehingga menghasilkan aglikon yang bersifat tidak stabil dan membuka cincin aglikon, kemudian membentuk gugus carbinol dan chalcone yang tidak berwarna.

## Aktivitas antioksidan
Ekstrak rosella yang direaksikan dengan larutan DPPH akan berubah warna dari ungu menjadi kuning. Aktivitas antioksidan didapatkan dengan membandingkan nilai absorbansi larutan blanko dengan nilai absorbansi sampel, kemudian dihitung nilai IC 50 . Perolehan nilai IC 50 ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 2. Grafik Nilai IC 50 pada berbagai temperatur dan jenis pelarut
Dari  hasil  perhitungan,  ekstraksi  yang  dilakukan  pada  temperatur  45˚C  dengan  pelarut  etanol:air (50:50 v/v) mempunyai nilai IC 50 paling kecil yaitu 67,3 ppm, semakin kecil nilai IC 50 menunjukkan bahwa kemampuan antioksidan untuk meredam radikal bebas semakin besar.  Menurut Lase (2013), antioksidan  yang  kuat  mempunyai  nilai  IC 50 antara  50  ppm-100  ppm.  Pada  temperatur  60˚C didapatkan nilai IC 50 yang paling tinggi, yaitu 97,4 ppm, hal tersebut menunjukkan bahwa kemampuan aktivitas  antioksidan  untuk  meredam  radikal  bebas  semakin  berkurang  pada  temperatur  lebih  tinggi, karena antosianin yang terekstrak mengalami degradasi (Chumsri et al, 2007).

## Rendemen
Analisis rendemen dilakukan dengan membandingkan massa ekstrak yang dihasilkan terhadap massa sampel  rosella  yang  digunakan  saat  ekstraksi.  Rendemen  yang  diperoleh  pada  setiap  variasi  dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Perolehan rendemen pada berbagai temperatur dan jenis pelarut
Berdasarkan  hasil  penelitian,  rendemen  terbesar  diperoleh  pada  temperatur  ekstraksi  45˚C  dengan pelarut etanol:air (50:50 v/v), yaitu sebesar 53,2%. Pada grafik diatas dapat dilihat pada temperatur 45 ˚C  dan  60  ˚C  rendemen  yang  diperoleh  lebih  tinggi  dibandingkan  temperatur  30˚C.  Hal  ini menunjukkan  pada  temperatur  lebih  tinggi  laju  difusi  meningkat,  sehingga  komponen  dalam  bahan lebih  mudah  terekstraksi  (Mastuti  et  al,  2013).  Pada  temperatur  60  ˚C  diperoleh  rendemen  cukup tinggi,  tetapi  kadar  antosianin  dan  aktivitas  antioksidan  relatif  lebih  rendah.  Ekstraksi  dengan campuran  pelarut  etanol-air  (1:1)  menghasilkan  rendemen  yang  lebih  besar  dibandingkan  dengan pelarut air, karena antosianin bersifat relatif polar, sehingga lebih mudah terekstraksi pada campuran etanol-air dengan polaritas yang sesuai.

## Kinetika Degradasi Antosianin
Pada proses pengolahan dan penyimpanan, antosianin mudah mengalami degradasi. Kestabilan warna antosianin  dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor,  antara  lain  pH,  temperatur  dan  cahaya.  Laju  degradasi antosianin pada penelitian ini diukur pada temperatur 30, 45, 60 ˚C. Dengan menggunakan persamaan reaksi kinetika orde 1 (Wu, Hai Yao, et al., 2018), data ln C/Co dialurkan terhadap waktu, diperoleh konstanta laju reaksi pada Tabel 2.
Tabel 2. Pengaruh temperatur terhadap konstanta laju reaksi Temperatur (˚C) k (mol/L jam) 30 0,019 45 0,034 60 0,036
Dari hasil penelitian didapat nilai konstanta laju reaksi makin meningkat dari temperatur pemanasan 30˚C sampai 60˚C, intensitas warna antosianin pada temperatur 60˚C menurun, hal ini menunjukkan antosianin  mengalami  degradasi  pada  temperatur  yang  lebih  tinggi,  struktur  antosianin  cenderung berubah menjadi carbinol menjadi chalcone tidak berwarna.

## Analisa FTIR
Dari  hasil  analisis  FTIR  yang  ditunjukkan  pada  Gambar  4,  didapatkan  beberapa  puncak  pada  hasil ekstraksi kelopak bunga rosella. Pada ekstrak rosella menunjukkan adanya gugus fenol pada puncak serapan  3302,13  cm -1 ,  gugus  C=O  stretching  keton  terbaca  pada  1735,93  cm -1 ,  gugus  O-H  alkohol terbaca pada 1381,03 cm -1 dan gugus C-H alkana (metil) pada 1327,03 cm -1 . Gugus C-O-C stretching eter terbaca pada 1087,85 cm -1 . Gugus C-O stretching alkohol terbaca pada 1049,26 cm -1 . Sedangkan pada 879,54 dan 709,80 cm -1 menunjukan adanya gugus   C-H aromatik. Berdasarkan hasil spektrum FTIR  dapat  disimpulkan  bahwa  dalam  ekstrak  kelopak  bunga  rosella  mengindikasikan  adanya senyawa antosianin.
Gambar 4. Grafik FTIR 0 20 40 60 80 100 120 400 900 1400 1900 2400 2900 3400 3900 %T 1/λ

## 4. KESIMPULAN
Dari hasil perhitungan dengan anova, terdapat pengaruh signifikan pada temperatur dan jenis pelarut terhadap  kadar  antosianin  dan  aktivitas  antioksidan,  sedangkan  rendemen  dipengaruhi  oleh  jenis pelarut. Kondisi optimum ekstraksi adalah pada temperatur 45˚C dengan campuran pelarut etanol:air (50:50  v/v),  dengan  perbandingan  F:S  =  1:10.  Konstanta  laju  kinetika  degradasi  tertinggi  pada pemanasan  dengan  temperatur  60˚C.  Dari  hasil  analisis  gugus  fungsi  dengan  FTIR  menunjukkan bahwa terdapat gugus-gugus yang identik pada senyawa antosianin bunga rosella.

## SARAN
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui komponen lain yang terkandung pada ekstrak rosella.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Aurelio,  D.L.  et  al.,  2008.  Thermal  kinetic degradation  of  anthocyanins  in  a  roselle  (Hibiscus sabdariffa L. cv. ‘Criollo’) infusion. International Journal of Food Science and Technology, pp. 322-325.
[2] Boeing, J. S. et al., 2014. Evaluation of solvent effect on the extraction of phenolic compounds and  antioxidant  capacities  from  the  berries:  application  of  principal  component  analysis. Chemistry Central Journal, pp. 1-9.
[3] Chumsri,  P.,  Sirichote,  A.  &  Itharat,  A.,  2007.  Studies  on  the  optimum  conditions  for  the extraction  and  concentration  of  roselle  (Hibiscus  sabdariffa  Linn.)  extract.  Songklanakarin Journal of Science and Technology, pp. 133-139.
[4] González, C. S., Balderas, T. V. F., Regules, A. E. O. & Beltrán, J. Á. G., 2012. Antioxidant properties and color of Hibiscus sabdariffa extracts. Ciencia e Investigacion AGRARIA, pp. 79- 90.
[5] Hadi,  Humam  T.  &  Ahmed  R.,  2017.  Extraction  and  determination  of  anthocyanin  pigment from  Hibiscus  sabdariffa  calyx  by  the  use  of  UV  and  HPTLC  method.  World  Journal  of Pharmacy and Pharmaceutical Scinces, vol 6, pp. 130-135.
[6] Lase, I., 2013. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Beras merah (Oryza sativa L. var Kuku Balam Merah) dengan Berbagai Cara Pemasakan, Medan: s.n.
[7] Mahmudatussa'adah,  A.,  Fardiaz,  D.,  Andarwulan,  N.  &  Kusnandar,  F.,  2014.  Karakteristik Warna  dan  Aktivitas  Antioksidan  Antosianin  Ubi  Jalar  Ungu.  Jurnal  Teknologi  dan  Industri Pangan, pp. 176-184.
[8] Mohamed, Rasha K. et al., 2016. Extraction of anthocyanin pigments from Hibiscus sabdariffa L. and evaluation of their antioxidant activity. Middle East Journal of Applied Sciences, vol 6, pp. 856-866.
[9] Oancea,  S.,  Stoia,  M.  &  Coman,  D.,  2012.  Effects  of  extraction  conditions  on  bioactive anthocyanin  content  of  Vaccinium  corymbosum  in  the  perspective  of  food  applications. Procedia Engineering, pp. 489-495.
[10] Sayuti,  K.  &  Yenrina,  R.,  2015.  Antioksidan  Alami  dan  Sintetik.  Padang:  Andalas  University Press.
[11] Sipahli,  S.,  Mohanlall,  V.  &  Mellem,  J.  J.,  2016.  Stability  and  degradation  kinetics  of  crude anthocyanin extracts from H. sabdariffa. Food Science and Technology.
[12] Wu, Hai Yao, et al., 2018. Roselle Anthocyanins: Antioxidant Properties and Stability to Heat and pH. Molecules, 23.