ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 18 (2) (2015) : 62 – 66
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Pengaruh Berat Molekul Kitosan terhadap Efisiensi Enkapsulasi BSA ( Bovine Serum Albumin ) Menggunakan Agen Crosslink Asam
Sitrat
Bani Amanullah Prasojo a , Parsaoran Siahaan a*
a Physical Chemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
* Corresponding author: siahaan.parsaoran@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o A b s t r a c t
Keywords: chitosan, BSA,
molecular interaction, molecular weight, encapsulation The research about the effect of chitosan molecular weight on the encapsulation efficiency of BSA (Bovine Serum Albumin) using citric acid crosslink agent has been done. This study aims  to  determine  the  encapsulation  efficiency  (EE)  BSA  with  the  effect  of  chitosan molecular  weight  and  crosslink  citric  acid  and  determine  the  energy  of  interaction between chitosan and BSA through ab initio methods and docking. The method used in this  study  were  chitosan  hydrolysis  with  HCl,  BSA  encapsulation  and  calculations  of interaction  energy  with  ab  initio  and  docking.  The  results  showed  the  encapsulation efficiency  (EE)  BSA  by  the  initial  chitosan  and  hydrolyzed  chitosan  was  52.06%  and 66.63%. Citric acid as a crosslink agent could also increase the efficiency of encapsulation. Encapsulation efficiency of chitosan and chitosan plus citric acid was 52.06%, and 52.79. The results showed the molecular weight and crosslink agent might affect the efficiency of encapsulation. The results of ab initio calculations showed that the interaction between chitosan  trimer  segments  with  the  amino  acids  aspartic  acid  on  the  BSA  with  the interaction energy -91.3871 kJmol -1 with an optimum distance of 1.799 Å, while docking showed the interaction energy was -18,244 kJmol -1 . The interaction was also conducted between chitosan trimer segments with A chain of BSA result energy -5,565 kJmol -1 and interaction energy between chitosan trimer segments with B chain BSA is -18,704 kJmol -
1 .

## A b s t r a k
Kata Kunci: kitosan, BSA, interaksi molekul, berat molekul, enkapsulasi
Telah  dilakukan  penelitian  tentang  pengaruh  berat  molekul  kitosan  terhadap  efisiensi enkapsulasi  BSA  ( Bovine  Serum  Albumin )  menggunakan  agen  crosslink  asam  sitrat. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menentukan  efisiensi  enkapsulasi  (EE)  BSA  dengan pengaruh  berat  molekul  kitosan  dan crosslink asam  sitrat  dan  menentukan  energi interaksi antara kitosan dengan BSA melalui metode ab initio dan docking . Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah hidrolisis kitosan dengan HCl, enkapsulasi BSA, dan perhitungan energi interaksi secara ab initio dan docking . Hasil penelitian menunjukkan Efisiensi enkapsulasi (EE) BSA oleh kitosan awal dan kitosan terhidrolisis yaitu 52,06% dan  66,63%.  Asam  sitrat  sebagai  agen crosslink juga  dapat  memperbesar  efisiensi enkapsulasi. Efisiensi  enkapsulasi  kitosan  awal  dan  kitosan awal ditambah asam sitrat yaitu 52,06% dan 52,79%. Hasil perhitungan ab initio menunjukan bahwa terjadi interaksi antara segmen trimer kitosan dengan asam amino asam aspartat pada BSA dengan energi interaksi  sebesar  -91,3871  kJ  mol -1 dengan  jarak  optimum  1,799  Å,  sedangkan docking menghasilkan energi interaksi -18,244 kJmol -1 . Interaksi juga dilakukan antara segmen trimer kitosan dengan rantai A BSA menghasilkan energi -5,565 kJmol -1 dan energi antara segmen trimer kitosan dengan rantai B BSA -18,704 kJmol -1 .
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 18 (2) (2015) : 62 – 66

## 1. Pendahuluan
Kitosan  merupakan  polisakarida  kationik  yang diperoleh  dari  deasetilasi  alkalin  kitin.  Kitosan  telah banyak  digunakan  di  berbagai  bidang,  seperti  farmasi dan medis, biokompatibilitas, dan anti kanker [1].
Berat  molekul  kitosan  dapat  dikelompokkan menjadi tiga macam, yaitu berat molekul rendah ( low ), medium  ( med ),  dan  tinggi  ( high ).  Kitosan low lebih menguntungkan  daripada  kitosan high dari  segi biodegradasi. Efisiensi transfer substrat oleh kitosan low lebih  tinggi  dibandingkan dengan  kitosan high. Kitosan low juga  lebih  banyak  digunakan dibidang drug  delivery [2].  Peran  kitosan  dalam  sistem drug  delivery ini  yaitu untuk mengirimkan ke tempat sasaran lalu mengontrol pelepasan  dari  obat  khususnya  gen  atau  protein  [3]. Bovine  Serum  Albumin  (BSA)  merupakan  polipeptida yang  mudah  tersedia  dan  sering  digunakan  sebagai model  peptida  pada  studi  sifat-sifat  kimia  fisik.  BSA mengandung kedua puluh asam amino esensial [4], yang tersusun atas 585 residu asam amino, termasuk 35 sistein (17 jembatan disulfida), yang memberikan stabilitas yang relatif  kuat  untuk  protein  [5].  Protein  dapat dienkapsulasi  kedalam  matriks  polimer biodegradable [6].
Enkapsulasi  merupakan  teknik  penyalutan  suatu bahan sehingga bahan yang disalut dapat dilindungi dari pengaruh lingkungan. Bahan penyalut disebut enkapsulan  sedangkan  yang  disalut/dilindungi  disebut core [7].  Enkapsulasi  dapat  dilakukan  oleh  kitosan melalui  situs  aktifnya.  Situs  aktif  kitosan  terletak  pada permukaan  polimer,  tepatnya  pada  gugus  amina  [8]. Pada  proses  enkapsulasi,  berat  molekul  kitosan  juga berpengaruh. Efisiensi enkapsulasi dari kitosan low lebih tinggi  dibandingkan  dengan  kitosan med dan  kitosan high [2].
Selain  berat  molekul  rendah,  enkapsulasi  kitosan dapat ditingkatkan dengan memodifikasinya menggunakan  agen crosslink [9].  Asam  sitrat  dapat digunakan sebagai agen crosslink . Peran dari asam sitrat ini  untuk  menggabungkan  kelompok  -COOH  reaktif asam  sitrat  ke  rantai  polimer  kitosan.  Substitusi  ini diharapkan  dapat  meningkatkan  situs  aktif  pada permukaan polimer tersebut [8].
Kitosan  dapat  mengenkapsulasi  obat  atau  protein karena adanya interaksi diantara keduanya. Interaksi ini dapat  dimodelkan  secara  komputasi.  Molekul-molekul kecil  biasanya  diinteraksikan  secara ab  initio [10] sedangkan untuk molekul biasanya diinteraksikan secara docking .  Hasil  yang  akan  diperoleh  dari  kedua  metode diatas yaitu berupa energi interaksi dari kedua molekul.

## 2. Metode Penelitian

## Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian ini adalah kitosan dari IPB (DD=85%), asam sitrat p.a dari Sigma- Aldrich,  NaOH  p.a  dari  Sigma-Aldrich,  HCl  p.a,  asam asetat  glasial  p.a,  BSA  dari  Sigma-Aldrich,  kitosan low dari  Merck.  Peralatan  yang  digunakan dalam  penelitian
ini adalah peralatan gelas laboratorium kimia, magnetic stirer ,  viskometer  Ostwald,  sentrifus  ( Centrific-228 ), Spektrofotometer UV-Vis T60U  PG  Instrument,  FTIR Shimadzu , neraca  analitik,  seperangkat  komputer berbasis linux dan windows

## Hidrolisis Kitosan
Larutan  kitosan  dari  IPB  (awal)  2%  (w/v)  dibuat menggunakan  pelarut  asam  asetat  glasial  1%.  Proses hidrolisis  menggunakan  asam  klorida  (HCl)  1N  dengan waktu  hidrolisis  selama  1  jam.  Penambahan  larutan NaOH  1N  sampai  pH  larutan  menjadi  7  dan  dilakukan proses dekantasi dan pengukuran konduktivitas sampai konduktivitas  larutan  mendekati  komnduktivitas aquades.
Penentuan berat molekul kitosan dengan mengukur viskositas  menggunakan  viskometer  oswald.  Kitosan yang  akan  diukur  viskositas  dilarutkan  dalam  pelarut campuran  antara  asam  asetat  glasial  1%  dan  NaCl  2M (3:1)

## Enkapsulasi BSA
Proses  ekapsulasi  BSA  ini  dilakukan  dengan perbandingan volume larutan BSA dan kitosan adalah 1:1, dan  larutan  campuran  diaduk  selama  10  menit  dengan kecepatan  600rpm.  Penambahan  NaOH  sampai  pH menjadi  7  untuk  mendapatkan  kitosan  yang  telah mengenkapsulasi molekul BSA dan dilakukan sentrifuse selama  30  menit  dengan  kecepatan  6000rpm.  Dan dilakukan  proses  enkapsulasi  BSA  2000ppm  dengan menambahkan  asam  sitrat  0,4%  sebagai  agen crosslink pada  larutan  kitosan.  Efisiensi  enkapsulasi  di  hitung dengan:
100% awal sisa awal C C EE x C − =
Dimana  konsentrasi/banyaknya  BSA  sisa  ini diperoleh dengan mengukur banyaknya BSA yang ada di filtrat hasil pemisahan dengan spektofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 278nm.

## Pemodelan Molekul
Pemodelan  molekul  dilakukan  dengan  software gaussian  (QM)  dan  autodock  (MM),  yang  dihitung adalah  energi  interaksi  antara  trimerkitosan  dengan asam amino asam aspartat (salah satu  penyusun BSA). Basis set yang digunakan pada software gaussian adalah RHF  6-31G(d,p)  dan  dengan  software  autodock  asam aspartat  berperan  sebagai  ligan  dan  trimer  kitosan sebagai makromolekul, running dilakukan 150x.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Hidrolisis Kitosan
Kitosan  merupakan  polisakarida  yang  sukar  larut dalam  air.  Kitosan  ini  mudah  larut  dalam  asam  lemah seperti  asam  asetat.  Larutan  kitosan  kemudian dihidrolisis  atau  diputus  ikatan  polimernya  dengan tujuan agar mendapatkan kitosan dengan rantai polimer yang  lebih  pendek.  Hidrolisis ini  menggunakan HCl  1N. Berat  molekul  kitosan  awal  yaitu  1,67  x  10 5 g/mol,
sedangkan  kitosan  yang  sudah  dihidrolisis  berat molekulnya  1130 g/mol. Sebagai  pembanding dilakukan juga pengukuran berat molekul kitosan low (Merck) 1081 gram/mol.  Penurunan  berat  molekul  ini  menunjukkan bahwa  HCl  dapat  menghidrolisis  atau  memutus  ikatan glikosida dari kitosan sehingga rantainya memendek.

## Enkapsulasi BSA
Enkapsulasi  BSA  dilakukan  dengan  variasi  berat molekul  kitosan,  yaitu  kitosan  awal  dengan  berat molekul  1,67.10 5 gram/mol,  kitosan low (Merck)  1081 gram/mol  dan  kitosan  hidrolisis  dengan  berat  molekul 1130  gram/mol.  Tujuannya  agar  diperoleh  perbedaan efisiensi enkapsulasi dari kedua jenis kitosan tersebut.
Interaksi antara kitosan dengan asam sitrat maupun BSA  dapat  diketahui  dari  perubahan  kondutivitasnya. Konduktivitas  dari  kitosan  hidrolisis,  asam  sitrat,  dan BSA  yaitu  629  µS,  1243  µS,  dan  3345  µS.  Setelah penambahan  asam  sitrat,  konduktivitas  kitosan hidrolisis menjadi 623 µS, dan setelah ditambahkan BSA menjadi 439 µS. Menurunnya konduktivitas dari kitosan menandakan  adanya  interaksi  antara  kitosan  dengan senyawa yang ditambahkan.
Gambar 1. Efisiensi enkapsulasi kitosan
Setelah
enkapsulasi dilakukan, kemudian dipisahkan  endapan  kitosan  dengan  filtratnya  dengan sentrifus.  Filtrat  tersebut  kemudian  diukur  konsentrasi sisa BSA yang masih terkandung dengan menggunakan spektrofotometer  UV-Vis.  Konsentrasi  sisa  BSA didapatkan dari substitusi nilai absorbansi ke persamaan yang telah didapat dari kurva standar BSA.
Perbedaan  berat  molekul  menyebabkan  efisiensi enkapsulasi yang berbeda pula. Gambar 1. menunjukkan bahwa kitosan awal dengan berat molekul besar memiliki efisiensi enkapsulasi lebih rendah dibandingkan dengan kitosan  dengan  berat  molekul  rendah.  Gambar  1.  juga menunjukkan  efisiensi  enkapsulasi  dari  kitosan  yang tanpa  asam  sitrat  dengan  yang  menggunakan  asam sitrat.  Efisiensi  enkapsulasi  dari  kitosan  dengan menggunakan  agen crosslink yang  berupa  asam  sitrat lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  kitosan  tanpa  asam sitrat. Hal ini dikarenakan efek dari crosslinker yang dapat membuka  interaksi  antar  rantai  kitosan  sehingga terdapat  ruang  yang  lebih  besar  agar  BSA  dapat  masuk lebih  banyak  dan  berinteraksi  dengan  rantai  kitosan tersebut.

## Analisis FTIR
Kitosan yang telah dihidrolisis maupun kitosan awal memiliki struktur yang sama. Hal ini dapat ditunjukkan dari hasil FTIR beberapa sampel kitosan, baik yang tanpa hidrolisis, terhidrolisis, dan berat molekul rendah. Hasil analisis FTIR terdapat pada gambar 2.
Gambar 2. Hasil FTIR (a) Kitosan Low , (b) Kitosan tanpa Hidrolisis, (c) Kitosan terhidrolisis
Terdapat  puncak  pada  bilangan  gelombang  antara 3300-3500 cm -1 yang menunjukkan adanya ikatan N-H pada  kitosan.  Puncak  selanjutnya  ada  pada  bilangan gelombang  3000-2850  cm -1 yang  menunjukkan  ikatan C-H. Selain itu terlihat puncak pada 1120-1140 cm -1 yang menunjukkan  adanya  ikatan  antara  C-O.  Hasil  FTIR diatas  menunjukkan  bahwa  sampel  kitosan  yang terhidrolisis memiliki struktur yang masih sama dengan kitosan yang lainnya.
Keberadaan  BSA  dan  asam  sitrat  pada  kitosan  juga dapat diketahui dari analisis FTIR, sesuai gambar 3.
Gambar 3. Hasil FTIR (a) Kitosan Terhidrolisis, (b) Kitosan Terhidrolisis ditambah BSA, (c) Kitosan Terhidrolisis ditambah Asam Sitrat dan BSA
Grafik (a) menunjukkan bahwa kitosan yang belum tercampur  apa-apa,  hanya  kitosan  hasil  hidrolisis  HCl 1N. Pada kitosan yang sudah tercampur dengan BSA (b), terlihat muncul puncak baru pada 1500-1600 cm -1 yang menunjukkan  adanya  ikatan  C=C  aromatis  dan  sekitar 1400 cm -1 yang menunjukkan ikatan C-C aromatis. BSA terdiri dari banyak asam amino dan terdapat asam amino yang memiliki struktur cincin aromatis sehingga terlihat pada  puncak  yang  menunjukkan  cincin  aromatis tersebut.

## Pemodelan Molekul
Senyawa  yang  akan  diinteraksikan  yaitu  trimer kitosan  dengan  salah  satu  asam  amino  yaitu  asam aspartat.  Trimer  kitosan  merupakan  model  kitosan dengan  rantai  polimer  yang  terdiri  dari  3  senyawa
glukosamin. Sedangkan asam aspartat merupakan asam amino yang terdapat pada BSA dan posisinya pada rantai luar BSA.
Secara ab  initio didapatkan  energy  interaksi  dan jarak interaksi dari kedua senyawa tersebut.
Gambar 4. Hasil interaksi trimer kitosan dan asam aspartate secara ab initio
Energi yang diperoleh yaitu -91,3871 kJ mol -1 dengan jarak interaksi antara O13-H27 sebesar 2,083 Å dan O14- H33 sebesar 2,356 Å.
Perhitungan  energi  interaksi  antara  trimer  kitosan degan  asam  aspartat  juga  dilakukan  secara docking. Segmen  trimer  kitosan  berlaku  sebagai  makromolekul dan  asam  aspartat  sebagai  ligan  nya.  Interaksi ditunjukkan pada gambar 5.

## Gambar 5. Hasil interaksi trimer kitosan dan asam aspartate secara docking
Hasil  energi  interaksi  yang  didapat  yaitu  -18,244 kJmol -1 .  Energi  yang  dihasilkan  dari  perhitungan Autodock ini  lebih  kecil  jika  dibandingkan  dengan Gaussian .  Hal  ini  terjadi  karena  pada Autodock tidak memperhitungkan setiap elektron yang ada, tidak seperti pada Gaussian yang  memperhitungkan  semua  elektron, sehingga energi yang dihasilan lebih negatif.
Interaksi  antara  rantai  A  dan  trimer  kitosan kemudian  dilakukan,  dimana  rantai  A  berlaku  sebagai makromolekul dan trimerkitosan sebagai ligan. Interaksi ini  difokuskan  ke  tempat  dimana  asam  aspartat  itu berada. Hasil interaksi terlihat pada gambar 6.
Gambar 6. Hasil interaksi trimer kitosan dan asam aspartate pada rantai A BSA secara docking
Hasil  energi  interaksi  yang  didapat  yaitu  -5,565  kJ mol -1 . Interaksi ini dilakukan pada asam aspartat urutan ke 37 dan didapatkan energi paling negatif berada pada perhitungan ke-97. Sehingga pada konfigurasi 97 trimer kitosan memiliki kestabilan paling tinggi.
Interaksi yang selanjutnya yaitu antara rantai B pada BSA  dengan  trimer  kitosan,  dimana  rantai  B  berlaku sebagai makromolekul dan trimerkitosan sebagai ligan. Hasil interaksi terlihat pada gambar 7.
Gambar 7. Hasil interaksi trimer kitosan dan asam aspartate pada rantai B BSA secara docking
Hasil energi interaksi yang didapat yaitu -18,704 kJ mol -1 . Interaksi ini dilakukan pada asam aspartat urutan ke  1  dan  didapatkan  energi  paling  negatif  berada  pada perhitungan  ke-4.  Sehingga  pada  konfigurasi  4  trimer kitosan memiliki kestabilan paling tinggi.

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan  serangkaian  penelitian  yang  telah dilakukan,  dapat  diketahui  bahwa  kitosan  dapat mengenkapsulasi  BSA  dan  asam  sitrat  dapat  bertindak sebagai agen crosslink . Berat molekul  dan agen crosslink berpengaruh  terhadap  efsiensi  enkapsulasi.  Efisiensi enkapsulasi  dari  kitosan  awal  dan  kitosan  terhidrolisis yaitu 52,06% dan 66,63%. Sedangkan kitosan awal dan kitosan  awal  dengan  penambahan crosslink asam  sitrat 52,06%  dan  52,79%.  Trimer  kitosan  diinteraksikan dengan  asam  aspartate  yang  merupakan  asam  amino penyusun  BSA  dengan  menggunakan ab  initio menghasilkan energi interaksi sebesar -91,3871 kJ mol -1 , sedangkan dengan menggunakan docking -18,244 kJmol - 1 .  Interaksi  antara  rantai  A  dengan  trimerkitosan menggunakan software Autodock menghasilkan energy -
5,565 kJmol -1 sedangkan interaksi antara rantai B dengan trimerkitosan
menggunakan software Autodock menghasilkan energy -18,704 kJ mol -1 .

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Jae  Hyung  Park,  Gurusamy  Saravanakumar, Kwangmeyung  Kim,  Ick  Chan  Kwon,  Targeted delivery of low molecular drugs using chitosan and its derivatives, Advanced Drug Delivery Reviews , 62, 1,
(2010)
28-41
http://dx.doi.org/10.1016/j.addr.2009.10.003
[2]  Hui-Chia Yang, Min-Hsiung Hon, The effect of the molecular  weight  of  chitosan  nanoparticles  and  its application on drug delivery, Microchemical Journal ,
92,
1, (2009) 87-91 http://dx.doi.org/10.1016/j.microc.2009.02.001
[3]  Quan  Gan,  Tao  Wang,  Chitosan  nanoparticle  as protein delivery carrier — Systematic examination of fabrication  conditions  for  efficient  loading  and release, Colloids  and  Surfaces  B:  Biointerfaces ,  59,  1,
(2007)
24-34
https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2007.04.009
[4]  Rolando Antonio Curvale, Buffer capacity of bovine serum  albumin  (BSA), J.  Argent.  Chem.  Soc ,  97,  1,
(2009) 174-180
[5]  Leandro  R.  S.  Barbosa,  Maria  Grazia  Ortore, Francesco Spinozzi, Paolo Mariani, Sigrid
Bernstorff,  Rosangela  Itri,  The  Importance  of Protein-Protein  Interactions  on  the  pH-Induced Conformational Changes of Bovine Serum Albumin: A  Small-Angle  X-Ray  Scattering  Study, Biophysical
Journal , 98, 1, (2010) 147-157 http://dx.doi.org/10.1016/j.bpj.2009.09.056
[6]  Xinjian  Cheng,  Ruilan  Liu,  Yinghe  He,  A  simple method  for  the  preparation  of  monodisperse protein-loaded microspheres
with high encapsulation  efficiencies, European  Journal  of Pharmaceutics  and  Biopharmaceutics ,  76,  3,  (2010) 336-341 http://dx.doi.org/10.1016/j.ejpb.2010.07.013
[7]  E  Triana,  E  Yulianto,  N  Nurhidayat,  Uji  viabilitas Lactobacillus sp. Mar 8 terenkapsulasi, Biodiversitas , 7, 2, (2006) 114-117
[8]  Retno  Ariadi  Lusiana,  Dwi  Siswanta,  Mudasir, Takashi  Hayashita,  The  Influence  of  Pva.Cl.Citric Acid/Chitosan  Membrane  Hydrophicility  on  The Transport of Creatinine and Urea, Indonesian Journal of Chemistry , 13, 3, (2013) 262-270
[9]  Devika R. Bhumkar, Varsha B. Pokharkar, Studies on effect  of  pH  on  cross-linking  of  chitosan  with sodium  tripolyphosphate:  A  technical  note, AAPS PharmSciTech ,
7, 2, (2006) E138-E143 http://dx.doi.org/10.1208/pt070250
[10] A. White, F. J. Zerilli, H. D. Jones, Ab initio calculation of  intermolecular  potential  parameters  for  gaseous decomposition  products  of  energetic  materials,  in, DSTO  Aeronautical  and  Maritime  Research Laboratory, Melbourne, Victoria, Australia, 2000.