## RESEARCH ARTICLE

## J. Islamic Pharm. Online ISSN: 2527-6123
Penetapan Kadar Flavonoid Total dan Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Makadamai (Macadamia integrifolia) dengan Metode DPPH
Novika Purwati 1 dan Eka Fitri Yanti 1*
1 Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Harapan Bangsa Jember , Indonesia
*Corresponding Author. E-mail: rofi3k4@gmail.com

## ABSTRAK
Tanaman makadamia termasuk famili Protaceae yang berasal dari Australia. Tanaman kacang makadamia memiliki sifat sebagai antioksidan yang dihasilkan oleh tocopherols, tocotrienols dan squalen. Senyawa fitokimia genus makadamia memiliki aktivitas sebagai antioksidan, antiinflamasi, antidislipidemia dan antimikroba. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan kadar flavonoid total ekstrak etanol daun makadamia dan uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH. Sampel daun makadamia dimaserasi menggunakan pelarut etanol 96%. Analisis kadar flavonoid total dilakukan dengan metode spektrofotometer UV-Vis dan dinyatakan dalam Quercetin Equivalent (QE). Uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH dengan menghitung nilai IC50. Hasil analisis menunjukkan bahwa kadar flavonoid total ekstrak etanol 25,39 ± 0,22 mg QE/g ekstrak, sedangkan aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun makadamia (Macadamia integrifolia) memiliki  nilai IC50 24,99 µg/mL dan termasuk intensitas sangat kuat.
Kata Kunci: Daun makadamia, kadar flavonoid total, antioksidan

## ABSTRACT
Macadamia plants belong to the Proteaceae family originating from Australia. Macadamia nuts have antioxidant properties produced by tocopherols, tocotrienols, and squalene. Phytochemical compounds of the macadamia genus have antioxidant, anti- inflammatory, antidyslipidemi, and antimicrobial activities. This study aimed to determine the total flavonoid content of the ethanol extract macadamia leaf and to test the antioxidant activity using the DPPH method. Macadamia leaf samples were macerated using 96% ethanol of solvent. Analysis of total flavonoid content was carried out using UV- Vis spectrophotometer method. Content was expressed in Quercetin Equivalent (QE). The antioxidant activity was tested the DPPH method by calculating the IC50 value. The analysis showed that a total flavonoid content of the ethanol extract was 25.39 ± 0.22 mg QE/g extract, while the antioxidant of the ethanol extract macadamia leaf (Macadamia Integriflolia) activity of the IC50 was 24.99 µg/mL and included moderate very strong intensitity.
Keywords: Macadamia leaf, total flavonoid content, antioxidants.
Submitted: September 25 th 2022 | Accepted: December 14 th 2022  | Published: December 31 st 2022
kaya  akan  unsur-unsur  penting  bagi  kesehatan  seperti kalsium,  besi,  fosfor,  magnesium  dan  vitamin  seperti  tiamin (B1),  riboflavin  (B2),  retinol  (A1)  dan  niasin  (B3)  [2]. Selain karakteristik nutrisi kacang makadamia juga memiliki sifat  sebagai  antioksidan  yang  dihasilkan  oleh  tocopherols, tocotrienols  dan  squalen.  Sedangkan  yang  biasa  digunakan dalah minyak makadamia karena mengandung Vitamin E yang merupakan antioksidan alami. Antioksidan alami berasal dari setiap bagian tumbuhan seperti kulit, buah, biji, kayu, batang, bunga, akar, dan daun [3].
Tujuan  dari  penelitian  ini  untuk  mengetahui  kadar flavonoid  total  dan  aktivitas  antioksidan  ekstrak  etanol  daun makadamia ( Macadamia integrifolia )  dengan  metode  DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil).
Antioksidan  adalah  senyawa  yang  dapat  menghalangi proses reaksi oksidasi melalui pengikatan dengan molekul dan radikal bebas yang sangat reaktif (Winarsi, 2007). Salah satu

## Pendahuluan
Tanaman makadamia yang mempunyai nama Queensland (Australia)  termasuk  famili  Proteaceae  merupakan  pohon asli  dari  daerah  sub  tropis  Australia.  Untuk  jenis  yang  bisa dimakan adalah bijinya yang dikenal dengan nama Macadamia integrifolia dengan permukaan tempurung atau batok halus. Tinggi tanaman makadamia bisa sampai mencapai 18 meter. Di Indonesia tanaman makadamia tumbuh di Cibodas, Lembang, dan  Blawan  (Kawasan  Pegunungan  Ijen)  yang  memiliki ketinggian  ±  1.000  mdpl  dengan  suhu  ≤  32˚C.  Tanaman makadamia  dapat  tumbuh  dengan  baik  dan  berbuah  banyak. Tetapi tanaman  makadamia yang ditanam di dataran rendah ±  50  mdpl  dengan  suhu  yang  tinggi  dan  ditanam  dimusim kemarau yang panjang seperti di pasuruan (Jawa Timur) maka tanaman makadamia tidak dapat berbuah [1]
Maguire et al., (2004) menyebutkan kacang makadamia
sumber antioksidan alami berasal dari tumbuhan. Tumbuhan yang  mengandung  senyawa  dan  memiliki  aktivitas  sebagai antioksidan  adalah  flavonoid.  Flavonoid  adalah  golongan polifenol terbesar dan sangat efektif digunakan sebagai antioksidan. Sifat antioksidan sebagai penangkap radikal bebas karena mengandung gugus hidroksil. Hubungan antara flavonoid  dan  antioksidan  diketahui  melalui  pernyataan bahwa semakin tinggi kandungan flavonoid total suatu bahan maka  aktivitas  antioksidan  semakin  tinggi  [4].  Penentuan kadar  flavonoid  total  dilakukan  dengan  menggunkan  larutan kuersetin. Kuersetin termasuk dalam senyawa yang berpotensi paling tinggi dalam golongan fenolik [5].
Selain itu kuersetin merupakan golongan flavonoid yang membentuk senyawa kompleks dengan adanya AlCl3 [6]. Pada penelitian  ini  yang  digunakan  adalah  daun  makadamia  tua. Semakin tua daun maka hijau warna daun akan semakin tinggi kandungan klorofilnya. Proses fotosintesis pada tumbuhan hijau menyusun senyawa organik dari karbondioksida dan air. Pada daun tua laju fotosintesisnya lebih cepat dari pada daun muda. Dan  untuk  mengetahui  kadar  flavonoid  total  dalam  ekstrak etanol daun makadamia dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis sedangkan pada pengujian aktivitas antioksidan  dilakukan  dengan  metode  DPPH (1,1  difenil-2- pikrilhidrazil) .  Metode DPPH juga merupakan metode yang sensitiv untuk menguji sebuah aktivitas antioksidan (Yuniwati et  al.,  2018).  Metode  DPPH  merupakan  metode  yang  sering dipilih karena sederhana, mudah, peka dan hanya memerlukan sedikit sampel.

## Bahan dan Metode

## Alat
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah batang pengaduk (Pyrex), blender (Miyako), Oven (Memmert), Erlenmeyer (Pyrex), cawan porselin, beker gelas (Pyrex), kuvet (Pyrex),  vial  (Sanbe),  pipet  tetes  (Pyrex),  penjepit  tabung, rak tabung reaksi, kertas saring, kertas perkamen, timbangan analitik (Sartorius), rotary evaporator (Steroglass 300), corong (Herma),  labu  ukur  (Pyrex),  Aluminium  Foil,  seperangkat alat  maserasi,  pengayak  60  mesh  (ASTME),  mikropipet (Socorex),  vortex  (Thermo  Scientific),  ultrasonic  (Elma),  pit dan spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-1280).

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun makadamia tua yang berwarna hijau berasal dari PT Perkebunan Nusantara XII desa Blawan, etanol 96% (OneMed), metanol (OneMed),  Kuersetin  (sigma),  AlCl3  (Merck),  aquadest, Natrium  asetat  (Merck),  1,1-difenil-2-pikrilhidrazil  (DPPH) (PT. Smartlab Indonesia

## Metode
Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium  Kimia  Analisis Fakultas Farmasi Universitas Jember. 1.  Pengambilan  Sampel:  Daun  makadamia  yang  diperoleh dari PT Perkebunan Nusantara XII desa Blawan dengan karakteristik  daun  yang  berwarna  hijau  tua.  Kemudian daun disortir dan dikeringkan dipanas matahari dengan ditutupi  kain  berwarna  hitam,  di  oven  dengan  suhu rendah (500) sampai beratnya stabil, diblender dan diayak menggunakan ukuran 60 mesh. Serbuk simplisia di
remaserasi dan maserasi.
2.  Pembuatan  ekstrak  sampel  dengan  metode  maserasi  : 200  gram  serbuk  simplisia  dimasukkan  kedalam  bejana toples kaca ditambahkan dengan 1000 mL etanol 96% lalu ditutup dan diremaserasi. Maserat diekstraksi kembali dengan  etanol  96%.  Hal  ini  dilakukan  sebanyak  2  kali 24  jam  selama  3  hari  terlindung  dari  cahaya  matahari. Ekstrak  etanol  yang  diperoleh  kemudian  di  pekatkan dengan menggunakan rotary evaporator dengan suhu 500C hingga dihasilkan ekstrak kental.
3.  Penetapan  Kadar  Flavonoid  Total  dengan  Metode Spektrofotometer UV-Vis
a.   Larutan  Induk  Standar  Kuersetin  :  10mg  kuersetin dilarutkan dengan 10 mL etanol sebagian larutan standar kuersetin  1000  µg/mL  dengan  konsentrasi  20  µg/mL, 30 µg/mL, 40 µg/mL, 50 µg/mL, 60 µg/mL, 70 µg/mL. sebanyak  0,5mL  larutan  standar  kuersetin  ditambahkan dengan 0,5 mL etanol 96%, ditambahkan 0,1 mL AlCl3, ditambahkan  0,1  mL  natrium  asetat  1  M  dan  2,8  mL aquadest  dibiarkan  selama  30  menit.  Selanjutnya  ukur absorbansi panjang gelombang 400 nm – 800 nm. b.   Penentuan  Serapan  Larutan  Blanko:  Larutan  Kuarsetin sebanyak 1 mL dengan pelarut etanol 96% sampai volume 5 mL labu ukur. Di vortex dan dibiarkan selama 60 menit. Ukur absorbansi panjang gelombang 400 nm – 800 nm.
c.   Penentuan  Kadar  Flavonoid  Pada  Ekstrak  Etanol  Daun Makadamia: 20 mg sampel dilarutkan dalam 10 mL etanol sehingga  diperoleh  konsentrasi  1000  µg/mL.  Sebanyak 0,5 mL sampel uji ditambah 1,5 mL etanol 96% ditambah 0,1 mL AlCl3, ditambah 0,1 mL natrium asetat 1 M dan 2,8  mL  aquadest.  Kemudian  kocok  sampai  homogen. Pembuatan ekstrak uji dilakukan 3 kali replikasi. Larutan dibiarkan selama 30 menit. Selanjutnya ukur absorbansi panjang gelombang 400 nm – 800 nm.
d.   Kandungan  Flavonoid  total  diperoleh  dengan  cara memasukkan data absorbansi sampel kedalam persamaan kurva  baku  kuersetin,  absorbansi  dimasukkan  dalam persamaan kurva baku kuersetin sebagai nilai y, dimana nilai  x  yang  diperoleh  merupakan  konsetrasi  kuersetin dalam µg/mL. Kadar kuersetin dalam ekstrak etanol daun makadamia dihitung dengan rumus :

## 4.  Penentuan  Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Etanol  Daun Makadamia
a.   Pembuatan Larutan Stok DPPH: 4 mg DPPH dilarutkan dengan 25 mL metanol menghasilkan larutan DPPH 160 µg/mL.  Disimpan  dalam  suhu  ruang  dan  terhindar  dari cahaya matahari.
b.  Pembuatan  Larutan  Sampel  :  100  mg  sampel  masing- maing dilarutkan dengan 10 mL metanol dalam labu ukur 10 mL. Dilakukan pengenceran dalam labu ukur 10 mL dengan menambahkan metanol dengan konsentrasi 50 µg/ mL, 100 µg/mL, 150 µg/mL, 200 µg/mL, 250 µg/mL, 300 µg/mL.
c.  Penentuan  Panjang  Gelombang  Maksimal  :  0,75  mL larutan  DPPH  ditambahkan  0,25  mL  metanol,  diukur panjang gelombang scan 400 nm – 800 nm  menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
d.  Penentuan  Aktivitas  Antioksidan  :  Masing-masing konsentrasi  larutan  uji  sebanyak  0,25  mL  dimasukkan
C = C 1 x
dalam  tabung  reaksi,  ditambahkan  0,75  mL  DPPH  dan dihomogenkan menggunakan vortex, kemudian diinkubasi dalam oven selama 30 menit dengan suhu 370C. Diukur absorbansinnya  dengan  spektrofotometer  UV-Vis  pada panjang gelombang dari 400 nm – 800 nm.
e.  Penentuan Persentase Peredaman: Aktivitas penangkapan radikal bebas (persen inhibisi) dihitung sebagai persentase berkurangnya warna DPPH dengan rumus :
f.  Nilai  IC50  merupakan  bilangan  yang  menunjukkan konsentrasi  sampel  uji  yang  memberikan  peredaman sebesar  50%.  Nilai  IC50  ditentukan  dengan  cara  dibuat kurva linier antara konsentrasi larutan uji (sumbu x) dan % peredaman (sumbu y) dari persamaan y = a + bx dapat di hitung nilai IC50 dengan rumus :

## Analisa Data
Deskriptif  kuantitatif.  Data  yang  diperoleh  dari  uji flavonoid  total  dan  uji  aktivitas  antioksidan  ekstrak  etanol daun  makadamia  dibuat  dalam  bentuk  tabel,  diagram,  kurva kemudian  di  deskripsikan.  Aktivitas  antioksidan  dihitung dengan rumus :
Persen  inhibisi  aktivitas  antioksidan  dari  berbagai konsentrasi ekstrak dan kuarsetin dibuat persamaan regresi linier. Dimana sumbu x adalah konsentrasi sampel dan Sumbu y adalah persen inhibisi aktivitas antioksidan, sehingga y=ax+b. Nilai IC50 dihitung ketika persen aktivitas antioksidan sebesar 50%  yaitu  konsentrasi  larutan  yang  mampu  memberikan peredaman DPPH sebesar 50% (Molyneux, 2004).

## Hasil
Tabel 1. Hasil Ekstrak Etanol Daun Makadamia Sampel Simplisia Ekstrak Kental Rendemen (%) Daun Makadamia 200 gram 13,95 gram 6,975 %
Gambar 1. Uji Flavonoid Dengan Beberapa Konsentrasi Keterangan : A : Blanko; B, C, D, E, F, G : Standart Quarsetin 20 µg/mL, 30 µg/mL, 40 µg/mL, 50 µg/mL, 60 µg/mL, 70 µg/ mL; H, I, J : Sampe l
% Inhibisi = X 100 % Inhibisi DPPH = X 100 % IC 50 =
Gambar 2. Grafik Regresi Linier Standart Kuersetin
Tabel 2. Hasil Penetapan Kadar Flavonoid Total Replikasi Absorbansi (y) Kadar flavonoid total (mg QE/g ekstrak) Rata-rata Kandungan flavonoid total (mg QE/g ekstrak) 1 0,431 26,21 25,39 ± 0,22 2 0,427 25,24 3 0,426 24,72
Gambar 3. Warna  Sampel  ekstrak  etanol  daun  makadamia akibat peredaman DPPH
Tabel 3. Data  Konsentrasi  dan  Absorbansi  Ekstrak  Etanol Daun Makadamia Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi (y) % Peredaman 12,5 0,456 35,86 37,5 0,250 64,83 50 0,164 76,93 62,5 0,076 89,31
Gambar 4. Grafik % peredaman vs konsentrasi ekstrak  etanol etanol daun macadamia
Tabel  4.  Data  perhitungan  IC50  dari  ekstrak  etanol  daun
makadamia Konsentrasi (µg/ mL) % Pereda- man Persamaan Garis Linier IC 50 µg/mL 12,5 35,86 37,5 64,83 y = 1,0706x + 23,239 24,99 50 76,93 R² = 0,9978 62,5 89,31

## Pembahasan
Serbuk kering daun makadamia ( Macadamia integrifolia ) yang telah di remaserasi dan maserasi kemudian di oven sampai beratnya  stabil,  sehingga  dihasilkan  ekstrak  kental  sebesar 13,95gram  dengan  rendemen  6,975%.  Penentuan  rendemen ini berfungsi untuk mengetahui kadar metabolit sekuder yang terbawa  oleh  pelarut  namun  tidak  dapat  menentukan  jenis senyawa  yang  terbawa  oleh  pelarut  [7].  Dapat  dilihat  pada Tabel 1.
Untuk  penetapan  kadar  flavonoid  total  ekstrak  etanol daun  makadamia  menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis. Panjang  gelombang  maksimum  kuarsetin  yang  didapatkan yaitu  439  nm.  Larutan  standar  kuarsetin  dengan  konsentrasi 20 µg/mL, 30 µg/mL, 40 µg/mL, 50 µg/mL, 60 µg/mL, dan 70  µg/mL.  Dari  data  pengukuran  standar  kuarsetin  dan  data absorbansi  menunjukkan  bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi maka  semakin  tinggi  pula  absorbansi  yang  diperoleh.  Dapat dilihat dalam Tabel 2. Nilai absorbansi bergantung pada kadar zat  yang  terkandung  didalamnya  sehingga  semakin  banyak kadar zat yang terkandung dalam suatu sampel maka semakin banyak  molekul  yang  akan  menyerap  cahaya  pada  panjang gelombang tertentu. Dapat dilihat pada Gambar 1.
Berdasarkan  kurva  standar  didapatkan  persamaan regresi  linier  y  =  0,0096x  –  0,0485  dengan  nilai  kolerasi  (r) sebesar 0,9938. Hasil kadar flavonoid total ekstrak etanol daun makadamia yaitu 25,39 ± 0,22 mg QE/g Ekstrak.  Dapat dilihat pada Gambar 2 dan Tabel 2.
Panjang gelombang maksimum DPPH yang di dapatkan yaitu 516 nm. Penentuan aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun  makadamia  dengan  konsentrasi  50  µg/mL,  100  µg/ mL,  150  µg/mL,  200  µg/mL,  250  µg/mL  dan  300  µg/mL. ketika  penelitian  ini  berlangsung  sampel  yang  digunakan mengakibatkan  terjadinya  perubahan  warna  pada  larutan DPPH dari ungu pekat menjadi kuning pucat, bisa dilihat pada Gambar 3.
Hal  tersebut  menunjukkan  bahwa  pada  ekstrak  etanol daun  makadamia  memiliki  aktivitas  sebagai  antioksidan. Selanjutnya  pengukuran  absorbansi  ekstrak  etanol  daun makadamia pada setiap konsentrasi untuk menghasilkan persen peredaman. Hasil konsentrasi dan absorbansi ekstrak etanol daun makadamia dapat dilihat pada Tabel 3.
Berdasarkan dari data terdapat penurunan absorbansi DPPH pada larutan uji dapat dihitung peredaman DPPH (%). Setelah diperoleh hubungan antara konsentrasi larutan uji dan persen  peredaman  DPPH,  sehingga  didapatkan  persamaan regresi yaitu y = 1,0706x + 23,239 dengan koefisien kolerasi sebesar  0,9978.  Hasil  regresi  linier  ini  menunjukkan  adanya kolerasi  yang  baik  antara  konsentrasi  larutan  uji  dan  persen
peredaman DPPH. Dapat dilihat pada Gambar 4.
Aktivitas  antioksidan  ekstrak  etanol  daun  makadamia, digunakan nilai IC50 sebagai parameter karena IC50 menunjukkan  nilai  konsentrasi  yang  mampu  meredam  50% radikal  bebas  DPPH.  Nilai  diperoleh  dari  mensubsitusi  nilai Y dari persamaan regresi linier antara konsentrasi larutan uji dan persen peredaman DPH dengan nilai 50. Besarnya aktivitas antioksidan ditandai dengan nilai IC50 yaitu konsentrasi larutan sampel yang dibutuhkan untuk menghambat 50% radikal bebas DPPH.
Nilai  IC50  yang  diperoleh  dari  ekstrak  etanol  daun makadamia adalah 24,99 µg/mL. Menurut (Lung & Destiani, 2017)  [8]  kategori  kekuatan  senyawa  antioksidan  yaitu <50 sangat kuat, 50 - 100 kuat, 100 - 250 sedang, 250 - 500 lemah dan >500 tidak aktif. Sehingga dari hasil di atas dapat digolongkan sebagai aktivitas antioksidan sangat kuat karena hasil kurang dari 50. Dapat dilihat pada tabel 4 . Semakin kecil nilai IC50 maka semakin tinggi aktivitas antioksidan.

## Kesimpulan
Hasil kadar flavonoid total ekstrak etanol daun makadamia (Macadamia integrifolia) sebesar  25,39  ±  0,22  mg  QE/g Ekstrak. Aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun makadamia (Macadamia integrifolia) memiliki  nilai  IC50  sebesar  24,99 µg/mL termasuk dalam kategori golongan antioksidan sangat kuat.

## Referensi
[1]  Puspitojati,  T.,  Siarudin,  M.,  &  Widiyanto,  A.  2017. Mengenal  Hasil  Hutan  Bukan  Kayu:  18  Jenis  Tanaman Penghasil Minyak Lemak. Bogor: Forda Press. Halaman 41-43.
[2]   Maguire, L. S., S.M. O’sullivan, K. Galvin, T.P. O’connor, dan  N.M.  O’brien.  2004. Fatty  acid  profile,  tocopherol, squalene and phytosterol content of walnuts, almonds, peanuts, hazelnuts and the Macadamia nut. International journal of food sciences and nutrition. 55(3) : 171-178. [3]  Pratt,  D.E.  1992. Natural Antioxidants From Plant Material. Didalam : M.T. Huang, C.T. Ho, Dan C.Y. Lee, Editor. Phenolic Compounds In Food And Their Effects On Helath H. American Society, Washington DC.
[4]  Erukainure OL., Oe OV., Ajiboye AJ., Okafor OY. 2011. Nutritional qualities and phytochemical constituents of clerodendrumvolubile, a tropical nonconventional vegetable.  International  Food  Research  Journal .  18  (4): 1393-1399.
[5]  Prior, R.I. 2003. Fruit And Vegetables In The Prevention Of  Cellular  Oxidative  Damage. Am.  J.  Clin.  Nutr.  78
(1Prior, R.I. 2003. Fruit And Vegetables In The Prevention Of  Cellular  Oxidative  Damage .  Am.  J.  Clin.  Nutr.  78 (1Prakash  O,  Kumar  A,  Kumar  P,  Ajeet. Anticancer Potential of Plants and Natural Products: A Review. Am J Pharmacol Sci . 2013;1(6):104-15. doi:10.12691/ajps-1-6-
1 [6]  Kelly, S.G. 2011. Q uercetin. Alternative Medicine Review. 16 (2).
[7]  Markham,  1988,  Cara  Identifikasi  Flavonoid.  Hal  1-20, Penerbit ITB, Bandung.
[8]  Lung,  J.  K.  S.,  &  Destiani,  D.  P.  2017.  Uji  Aktivitas Antioksidan  Vitamin  A,  C,  E  dengan  Metode  DPPH. Farmaka Suplemen. 15(1): 53-56.