## Pengembangan Metode PCR Multipleks untuk Analisis Genotipe Null Gen GSTM1/GSTT1 pada Pasien Tuberkulosis
Kinasih Prayuni 1 , Intan Razari 2 , Silviatun Nihayah 3 , Syafrizal 4 , Rika Yuliwulandari 5*
1) Pusat Penelitian Genetik, Lembaga Penelitian Terpadu, Universitas YARSI, kinasih.prayuni@yarsi.ac.id
2) Lembaga Penelitian Terpadu, Universitas YARSI, intan.razari@yarsi.ac.id
3) Lembaga Penelitian Terpadu, Universitas YARSI, silviatun.nihayah@yarsi.ac.id
4) Rumah Sakit Umum Pasar Rebo, osyafrizal@gmail.com
5) Departemen Farmakologi, Fakultas Kedokteran Universitas YARSI, rika.yuliwulandari@yarsi.ac.id

## ABSTRAK
Penyakit  tuberkulosis  (TB)  masih  menjadi  penyakit  infeksi  terbesar  di  Indonesia.  Hepatotoksisitas  menjadi  efek samping yang paling sering dialami oleh pasien TB karena terapi obat lini pertama TB. Gen glutathione S-transferase (GST)  GSTM1  dan  GSTT1  terlibat  dalam  detoksifikasi  dari  berbagai  zat  beracun,  seperti  obat-obatan. Pengembangan  metode  yang  cepat  dan  sederhana  untuk  analisis  genotype  null  dapat  memfasilitasi  besar  studi farmakogenetik  dan  aplikasi  klinis  penyesuaian  dosis  obat  secara  personal  sesuai  dengan  profil  genetik  pasien. Tujuan penelitian adalah mengembangkan metode PCR multiple untuk amplifikasi simultan gen GSTM1/GSTT1 untuk analisis molekuler. Sebanyak 25 sample pasien TB digunakan untuk validasi metode tersebut yang terdiri dari pasien TB dengan hepatotoksisitas dan pasien TB tanpa hepatotoksisitas. Berdasarkan hasil validasi PCR pasien TB dengan hepatotoksisitas menunjukkan frekuensi genotype null gen GSTM1 sebesar 90% dan pasien TB tanpa hepatotoksisitas sebesar 100%. Frekuensi genotype null gen GSTT1 pada pasien TB dengan hepatotoksisitas sebesar 90% , sedangkan pada pasien TB tanpa hepatotoksisitas sebesar 80%. Hasil sekuensing pada sampel positif menunjukkan similaritas sebesar 99% pada data genbank NCBI. Penelitian ini berhasil mengidentifikasi genotipe null gen GSTM1 dan GSTT1 dengan metode PCR multipleks pada pasien TB. Penelitian ini perlu dilanjutkan dengan jumlah sampel yang lebih besar untuk melihat hubungan menyeluruh antara genotype null GSTM1 dan GSTT1 dengan hepatotoksisitas akibat pengobatan TB.
Kata kunci: Genotipe null, GSTM1, GSTT1, Hepatotoksisitas, Tuberkulosis

## ABSTRACT
Tuberculosis (TB) remains Indonesia's leading infectious disease. Hepatotoxicity is the most common side effect of TB  first-line  medication  therapy  in  TB  patients.  GSTM1  and  GSTT1  are  glutathione  S-transferase  (GST)  genes involved in the detoxification of various toxic compounds such as drugs. The development of fast and simple methods for null genotyping of GSTM1/GSTT1 could facilitate large pharmacogenetic studies and the clinical application of personalized drug dose adjustment according to the patient's genetic profile. The aim of this research was to develop a multiple PCR method for simultaneous amplification of GSTM1/GSTT1 genes for molecular analysis. A total of 25 samples of TB patients were used to validate the method consisting of TB patients with hepatotoxicity and without hepatotoxicity. Our result showed the genotype frequency of the GSTM1 null genotype was 90% in TB patients with hepatotoxicity  and  100%  in  TB  patients  without  hepatotoxicity.  The  frequency  of  the  GSTT1  null genotype  in  TB patients with hepatotoxicity was 90%, whereas in TB patients without hepatotoxicity was 80%. The sequencing results on the positive samples showed a similarity of 99% to the GenBank NCBI. Our study was successful  in detecting GSTM1 and GSTT1 null genotypes using the multiplex PCR method in TB patients. Further study needs to be done with larger sample of TB patients.
Keywords: null genotype, GSTM1, GSTT1, Hepatotoxicity, Tuberculosis
*Correspondence  Author:  Rika  Yuliwulandari,  Departemen  Farmakologi,  Fakultas  Kedokteran Universitas YARSI, rika.yuliwulandari@yarsi.ac.id . +62 877-8206-5501

## I. PENDAHULUAN
Penyakit tuberkulosis (TB) masih menjadi  penyakit  infeksi  terbesar  di  Indonesia dan menempati peringkat ketiga setelah India dan Cina.  Jumlah  kasus  yang  ditemukan pada  tahun 2022 sebanyak 824 ribu dan kematian 93 ribu per
tahun atau setara dengan 11 kematian per jam. Di Indonesia jumlah kasus TB terbanyak yaitu pada kelompok  usia  produktif  terutama  pada  usia  45 sampai 54 tahun. 1 Hepatotoksisitas menjadi efek samping  yang  paling  sering  dialami  oleh  pasien TB  karena  terapi  obat  lini  pertama  TB,  yaitu
isoniazid,  rifampisin  dan  pirazinamid. 2 Insiden hepatotoksisitas  yang  diinduksi  oleh  obat  TB bervariasi  antara  2%  sampai  28%  dan  sering menambah morbiditas penyakit karena penghentian pengobatan. 3
Glutathione  S-transferase  (GST)  adalah salah  satu  enzim  fase  2  dan  merupakan  famili enzim multifungsional yang memiliki kemampuan untuk detoksifikasi senyawa beracun  yang  terdapat  pada  pestisida,  obat- obatan,  komponen  makanan  dan  sebagainya. Enzim GST yang telah diketahui berperan dalam detoksifikasi senyawa xenobiotik adalah GSTM1 dan GSTT1. 4,5
GSTM1  merupakan  enzim  kelas  Mu yang dikode oleh enzim GSTM1, Glutathione S- transferase  Mu  1,  yang  berfungsi  untuk detoksifikasi  senyawa  elektrofilik,  termasuk karsinogen, obat, racun lingkungan serta produk dari  stres  oksidatif,  melalui  konjugasi  dengan glutation.  Gen  GSTT1  mengkode  enzim Glutathione S-transferase theta-1 yang berfungsi untuk  katalisis  konjugasi  glutation  tereduksi  ke berbagai  senyawa  elektrofilik  dan  hidrofobik. Dalam  beberapa  penelitian,  polimorfisme  null pada  gen GSTM/GSTT1  ini dikaitkan  dengan hepatotoksisitas  akibat  obat  anti-TB,  yaitu isoniazid 6–8 dan  peningkatan  resiko  terhadap penyakit kanker, seperti kanker pankreas, kanker kandung  kemih,  kanker  paru-paru,  kanker esofagus, dan kanker melanoma. 9
Polimorfisme  GST  dapat  dinilai  dengan analisis PCR untuk mendeteksi adanya genotype null.  Dalam  upaya  meningkatkan  efesiensi deteksi,  kami  mengembangkan  PCR  multipleks untuk  amplifikasi  simultan  gen  GSTM1/GSTT1 untuk  analisis  molekuler.  Pengembangan  ini diharapkan dapat berkontribusi untuk mendukung  pengobatan  yang  dipersonalisasi ( personalize  medicine )  pada  pasien  TB  seperti dalam  penentuan  dosis  obat  pada  pasien  yang memiliki genotype null gen GSTM1/GSTT1.

## II. METODOLOGI Pengumpulan Sampel
Sebanyak  25  sampel  pasien  TB dikumpulkan dari RS Pasar Rebo, Jakarta. Pasien yang termasuk dalam penelitian adalah laki-laki dan perempuan, berusia 17-84 tahun, didiagnosis
dengan  TB  menurut  standar  Organisasi Kesehatan  Dunia,  dan  dalam  pengobatan  yang dipantau  dengan  obat  anti-TB,  yaitu  selama  2 bulan diberikan Isoniazid, Rifampicin, Ethambutol,  Pyrazinamide  dan  4  bulan selanjutnya diberikan Isoniazid dan Rifampicin. 10 Kriteria  inklusi  pasien  untuk  kontrol adalah  sebagai  berikut:  1)  pasien  yang  tidak mengembangkan  AT-DILI  selama  periode  6 bulan terapi anti-TB; 2) pasien yang sembuh atau telah  menyelesaikan  pengobatan  sesuai  kriteria WHO;  3)  pasien  dengan  hasil  tes  fungsi  hati dalam  kisaran  normal  selama  kunjungan  tindak lanjut pada bulan 2 dan 6; dan 4) pasien dengan kepatuhan  pengobatan  yang  sangat  baik  sesuai informasi  Program  Nasional  Pengendalian  TB Berbasis  DOTS. Kriteria  eksklusi  untuk  kontrol adalah sebagai berikut: (1) pasien dengan riwayat penyakit  hati,  seperti  hepatitis  A,  B,  dan  C; hepatoma; sirosis hati, dan cholelithiasis; dan (2) pasien  dengan  hasil  tes  fungsi  hati  abnormal (alanine transaminase, aspartate aminotransferase,  dan  total  bilirubin)  sebelum pengobatan anti-TB. Kriteria inklusi untuk kasus hepatotoksisitas adalah pasien dengan peningkatan  alanin  (ALT)  atau  aspartat transaminase  (AST)  3  kali  batas  atas  kisaran normal  (ULN)  dan  setidaknya  satu  gejala hepatitis, seperti anoreksia, kelelahan, mual dan muntah,  demam  ringan,  nyeri  tekan  dan/atau pembesaran  hati,  penyakit  kuning,  dan  urin berwarna gelap. AT-DILI, sebagaimana didefinisikan  menurut  kriteria  Council  for International Organizations of Medical Sciences (Geneva, Switzerland). 11 Pasien menandatangani informed  consent untuk  keikutsertaannya  dalam studi ini. Sebanyak 3 mL darah dikumpulkan dari pasien.

## Ekstraksi DNA
Darah  EDTA  yang  dikumpulkan  di  ekstraksi menggunakan Maxwell  RSC  Whole  Blood DNA kit (Promega) sesuai instruksi manual alat menggunakan Maxwell automatic instrument (Promega).  Kualitas  dan  kuantitas DNA diukur dengan Tecan MPro 200 (Tecan).

## Amplifikasi genotype null GSTM1/GSTT1
Desain  Primer  untuk  deteksi  gen GSTM1/GSTT1 dilakukan dengan free software MP_Primer (http://biocompute.bmi.ac.cn/MPprimer/). 12
Primer untuk deteksi gen GSTM1 null adalah: F: 5’-TGAGGACAGATTCAGGGACAGCA-3’ R: 5’-ACCCTGAGCAAAGGACTGACCC-3’ Sedangkan  primer  yang  akan  digunakan  untuk deteksi gen GSTT1 null adalah: F: 5’-TCCCGACTTTGCCTGCCCAATC-3’ R: 5’-AGGACGGTGCAAGGGTGAGGTT-3’ Dalam penelitian ini digunakan kontrol internal, yaitu gen HBB dengan primer sebagai berikut: F:5’-
TCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGC-3’

## R:5’-
GAAATTGGACAGCAAGAAAGCGAGC-3’ Primer  tersebut  kemudian  dilakukan optimasi  suhu  dan  ditemukan  bahwa  suhu 68°C adalah  suhu  optimum  dari  kesemua  primer multipleks.  Campuran  PCR  memiliki  volume akhir  sebesar  25  μl  yang  mengandung  20  ng genomic  DNA,  1X  KAPA  2  G  Fast  Multiplex master  mix  (KAPA  Biosystem,  Cape  Town, Afrika  Selatan),  dan  10  pM  setiap  primer. Amplifikasi  PCR  dilakukan  pada  mesin  PCR konvensional  T-100  (BioRad,  CA,  USA).  Profil reaksi  amplifikasi  pada  mesin  adalah  3  menit pada suhu 95°C; 30 siklus dari proses denaturasi selama  15  detik  pada  suhu  95°C,  proses annealing  selama  30  detik  pada  suhu  68°C, dan proses elongasi selama 30 detik pada suhu 72°C; serta  proses  elongasi  akhir  selama  1  menit  pada suhu 72°C.
Visualisasi  PCR  dilakukan pada  gel 2% dengan  PeqGreen  yang  dilihat  pada  Gel Documentation. Produk hasil dari PCR multipleks sebesar gen GSTM1, GSTT1, dan β- globin  berukuran  800-bp,  632-bp,  dan  180-bp secara berurutan. Genotipe sampel yang memiliki Gen  GSTM1/GSTT1  null  tidak  akan  memiliki pita DNA pada hasil PCRnya dan sampel tersebut hanya menunjukkan gen β-globin sebesar 180-bp sebagai kontrol. Sampel dengan gen GSTM1 dan GSTT1  yang  positif  kemudian  disekuensing untuk  memastikan  apakah  primer  spesifik mengamplifikasi gen target yang diinginkan.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengembangan protokol PCR multipleks untuk  menganalisis  beberapa  gen  secara signifikan  akan  meningkatkan  penerapan skrining  genetik  sebagai  alat  untuk  deteksi  dini hasil  kesehatan  yang  terkait  dengan  lingkungan paparan, dalam penelitian ini pada pasien TB. 13,14 Untuk memvalidasi prosedur PCR multipleks ini, kami menggunakan 25 pasien TB untuk analisis dari setiap gen.
Optimasi  primer  dilakukan  dengan gradien  suhu  menggunakan  mesin  PCR  T-100 (BioRad).  Gradien  PCR  dilakukan  dengan peningkatan  suhu annealing (Ta)  dari  60 o C – 70 o C  berdasarkan  suhu  melting  dari  masing- masing primer (Tm). Optimasi Ta sangat penting untuk  kesuksesan  reaksi  PCR.  Suhu annealing adalah suhu ketika primer akan berikatan secara spesifik dengan target gen. Dalam penelitian ini juga  digunakan  metode  PCR  multiplex  dengan mencampurkan  3  pasang  primer  dalam  satu tabung,  sehingga  Ta  yang  sesuai  sangat diperlukan untuk mendeteksi secara spesifik gen yang ditargetkan dalam penelitian ini. 15,16 Jika Ta terlalu  rendah  maka  fragmen  DNA  yang diamplifikasi  menjadi  tidak  spesifik  Fragmen sehingga  menyebabkan  munculnya  banyak  pita pada visualisasi gel agarosa. Sebaliknya, jika Ta terlalu  tinggi  maka  akan  mempengaruhi yield produk PCR serta mengurangi kemurnian produk PCR. 15 Hasil optimasi menunjukkan bahwa suhu optimum  dari  ketiga  pasang  primer  dalam penelitian ini adalah 68 o C.
Gambar 1. Hasil visualisasi primer deteksi genotipe null gen GSTM1/GSTT1 Keterangan:  M,  100  bp  ladder;  NTC, non- template control , lajur 1-6, representasi sampel.
Gambar  1  menunjukkan  representasi hasil  visualisasi  primer  deteksi  genotipe  null
GSTM/GSTT1.  Berdasarkan  hasil  visualisasi tersebut  primer  dapat  mendeteksi  genotype  null gen  GSTM1/GSTT1.  Pada  sampel  1,  4,  dan  5 terdeteksi  bahwa  sampel  tersebut  memiliki genotipe  null  untuk  GSTM1  dan  GSTT1  dan hanya  menunjukkan  amplifikasi  gen β-globin . Sampel  2  dan  3  menunjukkan  amplifikasi  gen GSTT1 sebesar 632-bp dan gen β-globin sebesar 180-bp,  namun  tidak  ada  amplifikasi  gen GSTM1, yang mengindikasikan bahwa genotipe tersebut  adalah  GSTM1  null.  Sampel  6 menunjukkan amplifikasi  gen  GSTM1  sebesar 800-bp dan gen β-globin sebesar 180-bp, namun tidak  ada  amplifikasi  gen  GSTT1,  yang mengindikasikan bahwa genotipe tersebut adalah GSTT1 null.
Berdasarkan hasil PCR kami mentabulasikan  frekuensi  genotype  null  gen GSTM1  dan  GSTT1  pada  25  sampel  pasien (Tabel  1).  Pasien  TB  dengan  hepatotoksisitas menunjukkan  frekuensi  GSTT1  null  yang  lebih besar di bandingkan pasien TB tanpa hepatotoksisitas,  yaitu  90%  vs  80%. Sebaliknya genotipe  null  gen  GSTM1  lebih  banyak  pada sampel  pasien  TB  tanpa  hepatotoksisitas  di bandingkan dengan pasien TB dengan hepatotoksisitas  yaitu  100%  vs  90%.  Merujuk pada penelitian sebelumnya pada suku Jawa dan Sunda,  genotype  null  gen  GSTM1  dan  GSTT1 ditemukan cukup besar yaitu 99% dan 67%. 17
Sample  pasien  yang  kami  kumpulkan dari  Rumah  Sakit  Pasar  Rebo  tidak  kami  ambil secara  spesifik  berdasarkan  suku,  namun demikian  data  ini  sejalan  dengan  data  pada normal  populasi,  khususnya  suku  Jawa-Sunda. Hal  ini  bisa  menjadi  rujukan  untuk  dilakukan penelitian yang lebih lanjut terkait genotype null gen GSTM1/GSTT1 pada pasien TB di Indonesia dengan  jumlah  yang  lebih  besar.  Hasil sekuensing pada s ampel dengan gen GSTM1 dan GSTT1 yang positif menunjukkan hasil similaritas  sebesar  99%  dengan  data gen  bank NCBI  yang  menunjukkan  bahwa  desain  primer pada  metode  PCR  multipleks  ini  spesifik terhadap gen GSTM1 dan GSTT1.
Tabel 1. Frekuensi Genotipe Gen
GSTM1/GSTT1 Genotipe Pasien TB dengan hepatotoksisitas (n=10) Pasien TB tanpa hepatotoksisitas (n=15) GSTM1 Present 1 (10%) 0 (0%) Null 9 (90%) 15 (100%) GSTT1 Present 1 (10%) 3 (20%) Null 9 (90%) 12 (80%) Beberapa  penelitian  telah  mengamati hubungan antara genotipe GST dan hepatotoksisitas  yang  diinduksi  oleh  obat antituberkulosis. 6,18–20 Namun  demikian  hasil penelitian tersebut masih kontradiktif, Roy et al. melaporkan  bahwa  hubungan  yang  signifikan antara  genotipe  null  homozigot  GSTM1  dan hepatotoksisitas  yang  diinduksi  obat  anti- tuberkulosis pada pasien tuberkulosis India. 18 Hal ini  menunjukkan  bahwa  resiko  pasien  untuk mengembangkan hepatotoksisitas karena pengobatan  TB  meningkat  karena  memiliki genotipe  null  homozigot  GSTM1.  Namun demikian Roy et al.  tidak menemukan hubungan yang  signifikan  antara  genotipe  null  GSTT1 dengan peningkatan resiko terhadap hepatotoksisitas  akibat  pengobatan  TB. 18 Hasil penelitian  Huang  et  al.  pada  populasi  Cina mendukung hasil penelitian Roy et al.  Huang et al.  melaporkan  juga  bahwa  genotipe  null homozigot GSTM1 meningkatkan resiko hepatotoksisitas  pada  pasien  TB. 21 Penelitian meta-analisis yang dilakukan oleh Chanhom et al. menunjukkan  bahwa  genotipe  null  GSTM1 meningkatkan  resika  terhadap  hepatotoksisitas pada  individu  di  populasi  Asian  Selatan dibandingkan  individu  pada  populasi  Caucasia, Asia Timur maupun Asia Tenggara. 22
Hasil  penelitian  pada  pasien  TB  di Spanyol  menunjukkan  bahwa  genotipe  null GSTT1  homozigot  dilaporkan  meningkatkan resiko  hepatotoksisitas yang diinduksi obat anti- TB,  dan  tidak  ada  hubungan  signifikan  yang ditemukan  antara  genotipe  null  homozigot GSTM1  dan  hepatotoksisitas. 19 Penelitian  lain pada  populasi  Kaukasia  menunjukkan  bahwa genotipe  null  GSTT1  juga  meningkatkan  resito terhadap  hepatotoksisitas  daripada  genotipe  null GSTM1. 19 Namun  demikian  hasil  penelitian
Singla et al. justru melaporkan bahwa kombinasi genotipe doble null  GSTM1  dan  GSTT1  terkait dengan  resiko  lebih  besar  pasien  TB  untuk mengenbangkan hepatotoksisitas akibat pengobatan TB. 20
Namun  demikian  terdapat  beberapa penelitian yang tidak menemukan hubungan yang signifikan  antara  genotipe  null  GSTM1  maupun GSTT1 dengan hepatotoksisitas akibat pengobatan TB. Penelitian terbaru pada pasien di Peru  melaporkan  hasil  yang  kontra  dengan penelitian  sebelumnya  dan  tidak  menemukan hubungan  yang  signifikan  antara  genotipe  null GSTM1 maupun GSTT1 dengan hepatotoksisitas akibat obat anti-tuberkulosis. 23 Studi lain di India juga  menunjukkan  tidak  ada  hubungan  yang signifikan  antara  GSTM1  dan  GTT1  dengan hepatotoksisitas. 2 Penelitian  lain  pada  populasi CIna  juga  menunjukkan  tidak  ada  resiko peningkatan hepatotoksisitas pada pasien dengan genotipe  null  GSTM1  maupun  GSTT1. 24
Perbedaan ini dapat dijelaskan karena konsentrasi obat  anti-tuberkulosis  dan  polimorfisme  genetik sangat  bervariasi  antara  populasi  dan/atau individu. 23
Gambar 2. Kromatogram hasil sekuensing Konfirmasi  dengan  metode  sekuensing diperlukan  untuk  memastikan  bahwa  fragmen yang  diamplifikasi  adalah  betul  fragmen  gen target. Dalam penelitian ini dilakukan konfirmasi sekuensing pada sampel yang tidak menunjukkan genotype null baik pada gen GSTM1 maupun gen GSTT1. Hasil sekuensing berupa data basa-basa nukleotida  yang  diwakili  sebagai  grafik  dengan warna tertentu yang dikenal sebagai kromatogram  (Gambar  2).  Dalam  studi identifikasi single  nucleotide  polymorphism (SNP)  pemisahan  grafik  kromatogram  sangat menentukan hasil interpretasi. Urutan kromatogram  dapat  diklarifikasi  secara  manual dan  harus  menunjukkan  tidak  ada  puncak  yang tumpang  tindih,  yang  mungkin  menunjukkan  2
genotipe  yang  terkait  erat  atau  menunjukkan pengikatan  primer  nonspesifik  pada  DNA sampel. Jika setelah dilakukan analisis terdeteksi bahwa  ada  primer  nonspesifik  maka  roses amplifikasi dan sekuensing harus diulang. 25
Gambar 3. Hasil penyejajaran (alignment) hasil sekuensing gen A. Tubulin, B. GSTM1, C.
GSTT1 dengan program BioEdit
Basa  nukleotida  hasil  sekuensing konfirmasi kemudian dianalisis dengan software BioEdit.    Saat  ini,  BioEdit  menjadi tool bioinformatika  yang  sangat  penting  dalam  studi biologi molekuler. Fitur dari BioEdit yang paling umum  digunakan  adalah  fitur  penyejajaran ( alignment ).  Penyejajaran  basa  nukleotida  hasil sekuensing konfirmasi gen Tubulin, gen GSTM1 dan  gen  GSTT1  dapat  di  lihat  pada  Gambar  3. Hasil  penyejajaran  amplifikasi  primer forward maupun  primer reverse menunjukkan  bahwa ketiga  gen  yang  diteliti  sejajar  dengan  sekuen referensi dari GenBank.
Sekuen  konsensus  hasil  penyejajaran kemudian  diverifikasi  dengan  basis  data ( database )  genomik  melalui  fitur  Basic  Local Alignment  Search  Tool  (BLAST).  Basis  data yang  umum  digunakan  adalah  National  Center for  Biotechnology  Information  (NCBI)  yang dikembangkan  oleh  peneliti  dari  National Institutes  of  Health  (NIH).  Algoritma  BLAST memungkinkan  perbandingan  urutan  basa  yang didapatkan  peneliti  dengan  data  library  pada GeneBank. BLAST mendeteksi kesamaan antara urutan  basa  nukleotida  atau  protein  sampel  uji dengan  membandingkan  urutan  basa  nukleotida atau  protein  pada  urutan  basa  nukleotida  atau protein pada database dan menghitung signifikansi  statistik  dari  temuan  tersebut. Perangkat lunak ini dirancang untuk mendeteksi hubungan  fungsional  dan  evolusi  antara  urutan basa nukleotida serta untuk membantu
mengidentifikasi  anggota family  gene . 25 Hasil BLAST menunjukkan bahwa kesamaan ( similarity ) urutan basa gen Tubulin, gen GSTM1 dan gen GSTT1 sebesar 99% dengan urutan basa database  GenBank. Hal ini menunjukkan bahwa primer  yang dikembangkan dalam  penelitian  ini spesifik  mendeteksi  gen  target  dan  mendeteksi genotipe null dari gen GSTM1 dan gen GSTT1.

## IV. SIMPULAN DAN SARAN
Penelitian  ini  berhasil  mengidentifikasi genotipe  null  gen  GSTM1  dan  GSTT1  dengan metode  PCR  multipleks  pada  pasien  TB. Interpretasi  hasil  dapat  dilakukan  dengan  jelas karena  produk  PCR  teramplifikasi  dengan  baik. Penelitian  ini  perlu  dilanjutkan  dengan  jumlah sampel yang lebih besar untuk melihat hubungan menyeluruh  antara  genotype  null  GSTM1  dan GSTT1 dengan hepatotoksisitas akibat pengobatan TB.

## V. UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terimakasih
kepada  pasien  yang  telah  berpartisipasi  dalam penelitian ini. Dukungan dana berasal dari Hibah
Internal Universitas YARSI (No. 135/INT/UM/WRII/UY/VII/2017)

## REFERENSI
1.   World  Health  Organization(WHO).  Global Tuberculosis Report 2021. Geneva, Switzerland; 2021.
2.   Chatterjee S, Lyle N, Mandal a, Kundu S. GSTT1 and  GSTM1  gene  deletions  are  not  associated with  hepatotoxicity  caused  by  antitubercular drugs. J Clin Pharm Ther [Internet].
2010;35(4):465–70. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20853551
3.   Tostmann  A,  Boeree  MJ,  Aarnoutse  RE,  De Lange WCM, Van Der Ven AJ a M, Dekhuijzen R. Antituberculosis drug-induced hepatotoxicity: Concise up-to-date review. Journal of Gastroenterology  and  Hepatology  (Australia). 2008;23(2):192–202.
4.   Da  Fonseca  RR,  Johnson  WE,  O’Brien  SJ, Vasconcelos V, Antunes A. Molecular evolution and the role of oxidative stress in the expansion and  functional  diversification  of  cytosolic glutathione  transferases.  BMC  Evol  Biol. 2010;10(1).
5.   Saitou M, Ishida T. Distributions of the GSTM1 and  GSTT1  null  genotypes  worldwide  are characterized by latitudinal clines. Asian Pacific
Journal  of  Cancer  Prevention.  2015;16(1):355– 61.
6.   Huang  YS.  Genetic  polymorphisms  of  drug- metabolizing  enzymes  and  the  susceptibility  to antituberculosis drug-induced liver injury. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2007;3(1):1–8.
7.   Li C, Long J, Hu X, Zhou Y. GSTM1 and GSTT1 genetic  polymorphisms  and  risk  of  anti- tuberculosis  drug-induced  hepatotoxicity:  An updated  meta-analysis.  European  Journal  of Clinical  Microbiology  and  Infectious  Diseases. 2013;32(7):859–68.
8.   Ambreen  K,  Sharma  R,  Singh  KP,  Abbas1  M, Kumar  S.  Association  of  GSTM1,  GSTT1  and
CYP2E1 Gene Polymorphisms with
Antituberculosis Drug Induced Hepatotoxicity in North  Indian  Population.  Int  J  Health  Sci  Res. 2014;4:149–60.
9.   Kasthurinaidu  SP,  Ramasamy  T,  Ayyavoo  J, Dave  DK,  Adroja  DA.  GST  M1-T1  null  allele frequency  patterns  in  geographically  assorted human  populations:A  phylogenetic  approach. PLoS One. 2015;10(4): e0118660 .
10.   World  Health  Organization.  Treatment  of tuberculosis. Geneva, Switzerland; 2010. 160 p.
11.   Benichou  C.  Criteria  of  drug-induced  liver disorders  Report  of  an  International  Consensus Meeting. J Hepatol. 1990;11:272–6.
12.   Shen Z, Qu W, Wang W, Lu Y, Wu Y, Li Z, et al. MPprimer: a program for reliable multiplex PCR primer design. BMC Bioinformatics. 2010;11(1):143.
13.   Hawkins  SFC,  Guest  PC.  Multiplex  analyses using real-time quantitative PCR. In: Methods in Molecular Biology. Humana Press Inc.; 2017. p. 125–33.
14.   Kim MS, Kang HJ, Park HJ, Yook YJ, Han BD, Kim  CW, et  al. Development  of multiplex PCR method  for  the  analysis  of  glutathione  S- transferase  polymorphism.  Mol  Diagn  Ther. 2011;15(5):285–92.
15.   Rychlik W, Spencer W, Rhoads R. Optimization of  the  annealing  temperature  for  DNA amplification  in  vitro.  Vol.  18,  Nucleic  Acids Research. 1990.
16.   Park M, Won J, Choi BY, Lee CJ. Optimization of primer sets and detection protocols for SARS- CoV-2 of coronavirus disease 2019 (COVID-19) using  PCR  and  real-time  PCR.  Exp  Mol  Med. 2020 Jun 1;52(6):963–77.
17.   Prayuni  K,  Razari  I, Yuliwulandari  R. Glutathione S-transferase M1  and T1 null allele frequencies  among  Indonesian  ethnics  toward improved  disease  risk  assessment.  Environ Toxicol Pharmacol. 2019;65:14-17.
18.   Roy B, Chowdhury a, Kundu S, Santra a, Dey B, Chakraborty  M,  et  al.  Increased  risk  of antituberculosis  drug-induced  hepatotoxicity  in individuals  with  glutathione  S-transferase  M1 “null”  mutation.  J  Gastroenterol  Hepatol. 2001;16(9):1033–7.
19.   Leiro  V,  Fernanndez-Villar  A,  Valverde  D, Constenla  L,  Vazzquez  R,  Pineiro  L,  et  al. Influence of glutathione S-transferase M1 and T1 homozygous  null  mutations  on  the  risk  of antituberculosis drug-induced hepatotoxicity in a Caucasian population. Liver International. 2008;28(6):835–9.
20.   Singla  N,  Gupta  D,  Birbian  N,  Singh  J. Association  of  NAT2,  GST  and  CYP2E1 polymorphisms  and  anti-tuberculosis  drug- induced hepatotoxicity. Tuberculosis. 2014;94(3):293–8.
21.   Huang YS, Su WJ, Huang YH, Chen CY, Chang
FY,  Lin  HC,  et  al.  Genetic  polymorphisms  of manganese
superoxide dismutase, NAD(P)H:quinone  oxidoreductase,  glutathione S-transferase M1 and T1, and the susceptibility to drug-induced liver injury. J Hepatol. 2007;47(1):128–34.
22.   Chanhom  N,  Udomsinprasert  W,  Chaikledkaew USA,  Mahasirimongkol  S,  Wattanapokayakit  S,
Jittikoon  J.  GSTM1  and  GSTT1  genetic polymorphisms  and  their  association  with antituberculosis drug-induced liver injury. Biomed Rep. 2020;12(4):153–62.
23.   Jaramillo-Rangel G, Ortega-Martínez M, Cerda- Flores RM, Barrera-Saldaña H a. Polymorphisms in GSTM1, GSTT1, GSTP1, and GSTM3 genes and  breast  cancer  risk  in  northeastern  Mexico.
Genetics
and Molecular Research.
2015;14(2):6465–71.
24.   Tang  SW,  Lv  XZ,  Zhang  Y,  Wu  SS,  Yang ZR, Xia  YY,  et  al.  CYP2E1,  GSTM1  and  GSTT1 genetic  polymorphisms  and  susceptibility  to antituberculosis  drug-induced  hepatotoxicity:  A nested  case-control  study.  J  Clin  Pharm  Ther.
2012;37(5):588–93.
25.   Crossley BM, Bai J, Glaser A, Maes R, Porter E, Killian  ML,  et  al.  Guidelines  for  Sanger sequencing  and  molecular  assay  monitoring. Journal  of  Veterinary  Diagnostic  Investigation.
2020 Nov 1;32(6):767–75 .