## Eksplorasi Bakteri Pemfiksasi Nitrogen Non Simbiotik Penghasil IAA dan Pelarut Fosfat Asal Rhizosfer Tanaman Apel Kota Batu, Jawa Timur
Ratna Fadhilah Israwan 1) , Tri Ardyati 2) , Suharjono 3)
1,2,3) Jurusan Biologi , Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
1) ratna.fadhilah@gmail.com , 2) tri_ardyati@yahoo.com dan 3) calitus@ub.ac.id

## ABSTRAK
Biofertilizer  adalah  pupuk  yang  mengandung  mikroba dan  mikroba tersebut  membantu  penyediaan nutrisi dalam  tanah sehingga dapat  dimanfaatkan  langsung oleh  tanaman.  Bakteri  pemfiksasi  nitrogen  non simbiotik  telah  banyak  digunakan  sebagai  agen  biofertilizer.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah mengetahui isolat bakteri asal rhizosfer  Tanaman Apel, Kota Batu, Jawa Timur yang  memiliki kemampuan  memfiksasi nitrogen,  menghasilkan  IAA  serta  melarutkan  fosfat . Isolasi  dilakukan  dengan  pengenceran  menggunakan sampel  tanah  rhizosfer  tanaman  Apel.  Kemampuan  fiksasi  nitrogen  menggunakan  media Nitrogen  Free Bromothymol  Blue (Nfb)  yang  diperkaya  triptofan dan  kit visocolour  alpha  ammonium. Produksi  IAA  oleh bakteri  secara  kualitatif  dan  kuantitatif  pada  media Luria  Bertani diperkaya  triptofan  serta  reagen Salkowski.  Deteksi pelarutan fosfat dilakukan  menggunakan  media Pikovskaya dan reagen Mo-Blue.  Empat isolat diisolasi dari rhizosfer tanaman Apel (isolat TR1, TR2, TR4 dan TR5), semuanya memiliki kemampuan memfiksasi nitrogen dan menghasilkan IAA. Isolat TR5 tertinggi dalam memfiksasi nitrogen sebesar 1 mg/L. Isolat TR1 tertinggi dalam menghasilkan IAA yakni pada jam ke-48 sebesar 793,55 µg/mL. Sedangkan Isolat TR4 melarutkan fosfat tertinggi sebesar 31,28 ppm dengan indeks pelarutan fosfat sebesar 1,21. Ketiga isolat TR1, TR4 dan TR5 berpotensi sebagai agen biofertilizer.

## Kata kunci : Biofertilizer, fiksasi nitrogen, fosfat, IAA, rhizosfer

## ABSTRACT
Biofertilizer is fertilizer contain microbes that help provide available nutriens for plants. Non symbiotic nitrogen fixing bacteria has been widely utilized as a biofertilizer agent. The objective of this research was to explore bacteria have ability in fixing nitrogen, producing IAA (indole acetic acid) and solubilizing phosphate from rhizosfer of Apple tree in Batu City. East Java. Isolation of soil sample from Apple tree rhizosphere was carried  out  using  serial  dilution.  Nitrogen  fixation  ability  was  assayed  qualitatively  using  nitrogen  free bromothymol  blue  (Nfb)  medium  enriched  with  tryptophan.  Quantitative  measurement  of  Nitrogen  fixation was  done  by  Visocolor  ammonium  alpha  detection  kit.  IAA  production  was  observed  in  Luria  Bertani medium  enriched  with  tryptophan  and  Salkowski  reagent.  Detection  of  phosphate  solubilization  was  done using Pikovskaya agar and Mo-blue reagent. Four isolates were obtained, isolates TR1, TR2, TR4 and TR5. All  isolates  have  ability  to  fix  nitrogen  and  to  produce  IAA.  Isolate  TR5  has  the  highest  ability  of  nitrogen fixing (1 mg/L). Isolate TR1 produce maximum IAA concentration (793,55 µg/mL)  at 48 hours. Isolate TR4 has the highest ability to solubilize phosphate (31,28 ppm) with  index of phosphate solubization 1,21. Isolate TR1, TR4 and TR5 are potential as biofertilizer agents.
Keywords: Biofertilizer, IAA, nitrogen fixation, phosphate, rhizosphere

## PENDAHULUAN
Apel  menjadi  produk  pertanian  unggulan dari Kota Batu, Jawa Timur. Namun akibat hama penyakit  dan  berkurangnya  bahan  organik  tanah di  perkebunan  Apel mengakibatkan  penurunan
produksi Apel Batu.Maka solusi untuk memperbaiki  ketersediaan  bahan  organik  tanah adalah dengan penggunaaan biofertilizer. Biofertilizer adalah  pupuk  yang  mengandung
mikroba  dan  mikroba  tersebut  membantu penyediaan  nutrisi  dalam  tanah  sehingga  dapat dimanfaatkan secara langsung oleh tanaman [1]. Mikroba yang berpotensi sebagai agen biofertilizer adalah  bakteri  pengikat  nitrogen yang  mampu  menghasilkan  IAA  (indole  acetic acid)  dan  melarutkan  fosfat.  Kombinasi  dari bakteri  tersebut  akan  menyediakan  unsur  hara penting  hingga  dapat  diserap  oleh  tanaman dengan mudah.
Bakteri pemfiksasi nitrogen non simbiotik merupakan  bakteri  yang  mampu  melakukan pengikatan atau fiksasi nitrogen tanpa melakukan  simbiosis  dengan  tanaman. Nitrogen digunakan  sebagai  penyusun  nukleotida  dan nukleosida.  Nitrogen  merupakan  nutrisi  yang sedikit  tersedia  dalam  tanah  sehingga  perlu adanya  sumber  nitrogen  eksogen  dari  atmosfer [2]. Pemanfaatan bakteri pemfikasi nitrogen non simbiotik sebagai agen biofertilizer telah banyak dikembangkan dalam bidang pertanian. Penelitian  ini  akan  menguji  kemampuan  bakteri pemfiksasi  nitrogen  non  simbiotik  yang  berasal dari  rhizosfer  tanaman  Apel  Kota  Batu,  Jawa timur  yang  berpotensi  sebagai  agen biofertilizer berdasarkan kemampuan fiksasi nitrogen, menghasilkan IAA dan pelarutan fosfat.

## METODE PENELITIAN
Pengambilan  sampel  tanah.  Sampel tanah  diambil  dari  rhizsofer  tanaman  Apel  dari perkebunan Apel Dusun Junggo, Desa Tulungrejo,  Kecamatan  Bumiaji,  Kota  Batu, Jawa  Timur. Rhizosfer  merupakan  tanah disekitar  perakaran  tanaman  yang  aktif. Sampel tanah  diambil  pada  beberapa  titik  yang berbeda dengan  metode  komposit  dan  digunakan  tanah sekitar  perakaran  tanaman  yang  aktif dari pertanian organik. Bersamaan dengan pengambilan  sampel  dilakukan  pengukuran faktor  fisik  dan  kimia  tanah  seperti  temperatur tanah,  ketinggian,  letak  koordinat,  intensitas cahaya.  Selain  itu  dilakukan  pengukuran  pH tanah,  bahan  organik  dan  kelembaban  tanah  di Laboratorium.
Isolasi  bakteri. Sampel  tanah  seberat  25 gram dimasukkan dalam larutan garam fisiologis 225  ml.  Dilakukan  metode  dilusi  hingga seri pengenceran 10 -6 . Selanjutnya dari  masing-
masing  pengenceran diinokulasikan  secara aseptis  pada  media Nitrogen  Free  Bromothymol Blue (Nfb)  semi  solid yang  diperkaya triptofan. Dilakukan  inkubasi  5-6  hari dan  perubahan warna media dari hijau menjadi biru mengindikasikan  adanya  bakteri  pemfiksasi nitrogen.  Tabung  dengan  media  yang  berubah warna diinokulasikan pada media Nfb solid yang diperkaya  triptofan dan yeast  extract. Bakteri yang tumbuh  dilakukan  karakteristik  morfologi. Bakteri  dilakukan  pemurnian  dengan  metode serial  dilusi  dan spread  plate.  Stok  bakteri disimpan  pada  media Nutrient agar pada suhu - 4 o C.
Uji  kuantitatif  kemampuan  fiksasi nitrogen. Bakteri ditumbuhkan pada media NFB broth selama  5-6  hari. Kultur  dilakukan sentrifugasi  Supernatan  dilakukan  uji dengan penambahan  larutan  pada kit  visocolor  alpha ammonium. Perubahan  warna  yang  terjadi  pada sampel  menjadi  acuan  adanya  kandungan  unsur nitrogen dalam bentuk ammonium (NH 4 + ).
Uji  kualitatif  kemampuan  produksi IAA. Masing-masing  isolat  ditumbuhkan  pada
Luria  Bertani (LB) Broth yang  diperkaya triptofan. Kultur  diinkubasi dan diambil  0,1  ml kemudian dilakukan spread plate pada LB agar. Setiap  cawan  yang  telah  diinokulasi  dilapisi membran nitroselulosa  dan diinkubasi  hingga bakteri tumbuh. Lalu, membran direndam dalam reagen  Salkowski. Membran  yang  berubah warna  menjadi  merah  atau  merah  muda merupakan indikasi adanya IAA yang diproduksi bakteri.
Uji  kuantitatif  kemampuan  produksi IAA. Masing-masing  isolat  ditumbuhkan  pada
LB Broth yang  diperkaya  triptofan  dan  Kultur diinkubasi. 1 % kultur isolat diinokulasikan pada media  LB  baru  yang  diperkaya  triptofan. Kemudian diinkubasi pada suhu 28 o C. Sampling dilakukan  pada  jam ke  0,24,48  dan  72. Kultur hasil sampling dilakukan sentrifugasi.
Supernatan ditambahkan reagen  Salkowski  dan dinkubasi  pada  suhu  ruang.  Lalu  diukur absorbansinya  dengan  spektrofotometer  pada ʎ 530 nm. Jumlah IAA yang dihasilkan didapatkan dengan  mengkonversi  absorban  pada  regresi
kurva baku IAA. Kurva baku IAA dibuat dengan konsentrasi 10-70 µg/ml.
Uji  kualitatif  kemampuan  pelarut fosfat. Masing-masing  isolat  diinokulasikan pada Pikovskaya agar (PKV) kemudian diinkubasi  pada  suhu  30 o C. Isolat  dikatakan dapat  melarutkan  fosfat  apabila  terdapat  zona bening disekitar koloni. Lalu dilakukan penghitungan  indeks  zona  bening  yakni  dengan rumus  total  diameter  (zona  bening)  /  diameter koloni.
Uji  kuantitatif  kemampuan  pelarut fosfat.  Masing-masing  isolat  ditumbuhkan  pada PKV broth Kemudian  0,2  ml  kultur diinokulasikan  pada  media PKV broth baru  dan diinkubasi.  Kultur  dilakukan  filtrasi.  Filtrat dilakukan sentrifugasi. Supernatan ditambahkan perekasi  P  (reagen Mo-blue) dan  diinkubasi. Lalu diukur absorbansinya dengan spektrofotometer  pada ʎ 693  nm.  Jumlah  fosfat terlarut yang  dihasilkan  didapatkan  dengan mengkonversi absorban pada regresi kurva baku fosfat  (KH 2 PO 4 ).  Kurva  baku  fosfat  dibuat dengan konsentrasi 0- 4,5 ppm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi  dan  Seleksi  Bakteri  Pemfiksasi Nitrogen. Isolasi  bakteri  dari  rhizosfer  tanaman apel  didapatkan  4  isolat  yakni  TR1,  TR2,  TR4 dan  TR5.  Pemilihan  keempat  isolat  didasarkan pada  perbedaan  morfologi  koloni. Perubahan warna  pada  media  Nfb dikarenakan  hadirnya NH 3 yang  bersifat  basa,  menyebabkan  indikator bromothymol  blue berubah  menjadi  biru. Isolat kemudian dideteksi kemampuan fiksasi nitrogen menggunakan kit  visocolor  alpha  ammonium. Isolat  TR5  terdeteksi  NH 4 + tertinggi  yakni  1 mg/L.  Kemudian  sebesar  0,2  mg/L  oleh  isolat TR1,TR2  dan  TR4.  Proses  fiksasi  nitrogen  oleh bakteri  akan  menghasilkan  ammonia  (NH 3 )  [3].
Kehadiran  ion  hidrogen  akan  membentuk ammonium (NH 4 + ) [4].
Ammonium yang terdeteksi  oleh  isolat tersebut  dikatakan  rendah  apabila  dibandingkan dengan Alcaligenes sp. yang terdeteksi ammonium sebesar 3 mg/L [5].
Gambar  1.Perubahan  warna  supernatan  setelah ditetesi  larutan kit (a)  isolat  TR1  (0,2 mg/L)  (b)  isolat  TR2  (0,2  mg/L)  (c) isolat TR4 (0,2 mg/L) (d) isolat TR5 (1 mg/L) (e) Spektrum warna Kit Visocolor Alpha  Ammonium yang  menunjukkan kadar NH 4 +
Uji  kualitatif  kemampuan  produksi IAA. Keempat  isolat  yang  didapatkan  diuji kemampuannya dalam menghasilkan IAA. Hasil yang  didapatkan bahwa keempat  isolat  mampu menghasilkan IAA ditandai dengan terbentuknya warna  merah  pada  membran  nitroselulosa. Warna  merah  merupakan  indikasi  terdeteksinya indol dari  IAA [6]. Semakin  merah  warna  yang terbentuk  maka  semakin  tinggi  konsentrasi  IAA yang dihasilkan oleh bakteri.
Gambar 2.Perubahan warna pada membran nitroselulosa yang mengandung masing- masing  isolat  setelah  direndam  dalam reagen Salkowski.
Uji  kuantitatif  kemampuan  produksi IAA. Uji kuantitatif didasarkan pada isolat yang mampu memberikan warna merah pada membran  nitroselulosa.  Produksi  IAA  dihitung dengan  satuan  µg/ml.  Hasil  uji  menunjukkan bahwa  produksi  IAA  tertinggi  dihasilkan  oleh isolat  TR1  yakni pada  jam  ke-48 sebesar 793,5 µg/ml  dan  berada  pada  fase  stasioner.    Isolat Isolat  TR1,  TR2,  TR4  mengalami  penurunan
jumlah IAA pada jam ke-72 yakni ketika bakteri berada pada fase akhir logaritmik atau stasioner. Namun isolat TR5 terus mengalami peningkatan konsentrasi  IAA  seiring  bertambahnya  jumlah sel. Bakteri  menghasilkan  IAA  maksimal  pada jam ke-24 atau 48 dan menurun pada jam ke-72. Hal  tersebut  diakibatkan  karena  pada  jam tersebut  bakteri  berada  pada  fase  akhir logaritmik  sehingga  kandungan  enzim  perubah triptofan  menjadi  IAA  dihasilkan  dalam  jumlah banyak  [7].  Konsentrasi  IAA  berlebih  akan diregulasi  bakteri  dengan  pembentukan  IAA oksidase dan peroksidase [8].
Gambar  3. Produksi  IAA  isolat  bakteri  pemfiksasi nitrogen  non  simbiotik  penghasil  IAA jam  ke-0,  24,48  dan  72.  Keterangan: perbedaan  notasi  menunjukkan  beda nyata pada uji Anova (α=0,05).
Produksi  IAA  yang  meningkat  ketika  jumlah sel  menurun  diduga akibat adanya  regulasi produksi  IAA  yang  dipengaruhi  oleh stationary phase  sigma  factor  RpoS yakni  gen  yang meregulasi  respon  bakteri  ketika  dalam  kondisi stress [9]. Penambahan  triptofan  diduga  mampu meningkatkan  jumlah  IAA  yang  dihasilkan. Jumlah  IAA  yang  dihasilkan  isolat  tersebut tinggi dibandingkan dengan Pseudomonas flourescens dengan triptofan 100 µg/ml menghasilkan IAA 8 µg/ml [10].
Uji kemampuan  pelarut  fosfat. Isolat  yang didapatkan  dilakukan  pengamatan  kemampuan pelarutan fosfat yang ditandai dengan terbentuknya  zona  bening  disekitar  koloni
dilanjutkan  dengan  penghitungan indeks  pelarut fosfat  dan  penghitungan  fosfat  terlarut  secara kolorimetrik. Hasil  uji  menunjukkan  bahwa isolat TR1, TR2 dan TR4 mampu menghasilkan zona  bening  dengan  hasil  tertinggi  oleh  isolat TR4  sebesar 1,21  dengan  jumlah  fosfat  terlarut 31,28 ppm. Zona bening terbentuk akibat bakteri mampu memanfaatkan trikalsium fosfat (Ca 3 (PO 4 ) 3 OH)  dalam  media  sebagai  sumber fosfat [11].
Tabel  4. Uji  Kualitatif  dan  Kuantitatif  Pelarutan Fosfat  oleh  Isolat  Bakteri.    Keterangan  : perbedaan notasi menunjukkan beda nyatapada uji Anova (α=0,05) Isolat Kualitatif (Zona Bening) Kuantitatif Indeks pelarut fosfat Fosfat terlarut (ppm) TR1 1,12 a 28,44 B TR2 1,09 a 23,98 A TR4 1,21 a
31,28 C
Kemampuan pelarut fosfat oleh isolat tersebut dikatakan  rendah  apabila  dibandingkan  dengan Bacillus sp.  (S9)  mampu  melarutkan  fosfat sebesar 122,36 ppm dengan indeks pelarut fosfat sebesar  1,6  [12]. Semakin  tinggi  indeks  pelarut fosfat semakin tinggi jumlah fosfat yang mampu dilarutkan. Pembentukan zona bening diakibatkan karena adanya enzim fosfatase yang dihasilkan bakteri [13].Pelepasan fosfat berkaitan  dengan  terbentuknya  asam  organik oleh  bakteri untuk  melarutkan  fosfat  terikat dalam  tanah.  Sehingga  fosfat  akan  terlepas dalam  bentuk  ion  H 2 PO 4 - dan  HPO 4 2- yang merupakan  bentuk  fosfat  yang  mampu  diserap oleh tanaman [14].
TR2 TR1 TR4 TR5

## KESIMPULAN
Terdapat  empat  isolat  yang  berhasil diisolasi  dari  rhizosfer  tanaman Apel  dan keempatnya  yakni  isolat  TR1,  TR2,  TR4  dan TR5  memiliki  kemampuan dalam  memfiksasi nitrogen  dan menghasilkan  IAA. Fiksasi nitrogen  tertinggi  oleh  isolat  TR5  (1mg/l). Produksi IAA tertinggi oleh isolat TR1 pada jam ke  48  yakni  793,55  µg/ml.  Pelarutan  fosfat tertinggi  oleh  isolat  TR4  yakni  sebesar  31,28 ppm.
Berkaitan  dengan  potensinya  sebagai biofertilizer maka  kemampuan  keempat  isolat dalam  memfiksasi  nitrogen,  menghasilkan  IAA dan  melarutkan  fosfat  dipaparkan  dalam  tabel dibawah  ini.  Isolat  yang  paling  berpotensi sebagai biofertilizer adalah TR1, TR4 dan TR5.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  diucapkan  kepada Dr.  Suharjono,  dalam  proyek  penelitian  yang didanai  oleh  DPP/SPP,  sehingga  penelitian  ini dapat terselesaikan dengan baik.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Tamil  Nadu  Agricultural  University. 2008.  Organic  Farming  :  Biofertilizers Technology. http:  //  agritech.tnau.ac.in
/org_farm/orgfarm_biofertilizertechnolog
y.html. Diakses 23 Desember 2014.
[2] Dey,  P.M  dan  Harborne,  J.B.  1997.  Plant Biochemistry. Academic Press. London
[3] Sylvia,  D.  M,  Fuhrmann,  J.J,  Hartel  P.G dan  Zuberer,  D.A.  1999. Principles  and applications of soil microbiology. Prentice Hall. New Jersey.
[4] Hidayat, A.T. 2009. Potensi Pelepasan N- NH 4 + dan  N-NO 3 - Tanah  andisol  yang ditanami sayuran di daerah dataran tinggi. Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
[5] Latt, Z.K., Yu, S.S dan Lynn, T.M. 2013. Enhancement  of  Cellulolytic  Nitrogen Fixing  Activityof Alcaligenes sp.  by MNNG Mutagenesis. International Journal  of  Innovation  and Applied Studies. 4 (3): 979 - 986.
[6] Singh,P.  Kumar,V  dan  Agrawal,  S.  2014. Evaluation  of  Phytase  Producing  Bacteria for  Their  Plant  Growth  Promoting
Activities.http://www.hindawi.com/journa ls/ijmicro/2014/426483/. Diakses 26 November 2014.
[7] Andanawarih,S.  2008.  Optimasi  produksi Asam  Indolasetat  oleh Rhizobium sp. dalam  medium  serum  lateks hevea brasiliensis dengan
suplementasi triptofan. http://repository.ipb.ac.id/bitstream/handle /123456789/18016/G08san.pdf?sequence= 2. Diakses 20 Desember 2014.
[8] Datta  C.  dan  Basu,  P.S.  2000.  Indole acetic  acid  production  by  a Rhizobium species from root nodules of a leguminois shrub, Cajanus  cajan. Microbiology Research. 155 :123-127.
[9] Patten,  C.L  dan  Glick,  B.R,  2002. Regulation of indoleacetic acid production in Pseudomonas  putida Gr12-2  by tryptophan and the stationary phase sigma factor  Rpos. Can  J  microbiol 48  (7)  :42- 635.
[10]  Prakash,  P.  dan  Karthikeyan,  B.  2013. Isolation  and  Purification  of  Plant  growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) from the Rhizosphere  of Acorus  calamus grown soil. Indian  Streams  Research  Journal.  7 (3) : 1-11.
[11] Thakuria,  D.,  Talukdar,  N.C,  Goswami, C.,  Hazarika,  S.,  Boro,  R.C  dan  Khan  , M.R.  2004.  Charcterization  and  screening of bacteria from rhizosphere of rice grown in acidic soils of Assam. Current Science. 7 (86) : 978-985.
[12] Tripti,  Kumar,  V.  dan  Anshumali.  2012. Phosphate  Solubizing  Activity  of  Some Bacterial  Strains  Isolated  from  Chemical Pesticide Exposed Agriculture Soil. International  Journal  of  Engginering research and Development. 3 (9) : 1-6.
[13] Goldstein,  A.H.  1995.  Recent  Progress  in understanding  the  molecular  genetics  and biochemistry of calcium phosphate solubization  by  Gram  negative  bacteria. Biological  Agriculture  and  Horticulture. 12 : 185-193.
[15] Elfiati, D. 2005. Peranan Mikroba Pelarut Fosfat  Terhadap  Pertumbuhan  Tanaman. http://library.usu.ac.id/download/fp/hutan- deni%20elfiati.pdf .  Diakses  22  November 2014