Jurnal Nukleus Peternakan (Desember  2021) Volume 8, No. 2:150-160                    pISSN : 2355-9942,    eISSN:2656-792X Marlize et al .: Pengaruh Waktu Ekuilibrasi…..

## PENGARUH WAKTU EKUILIBRASI TERHADAP KUALITAS SEMEN BEKU BABI LANDRACE DALAM PENGENCER DURASPERM TERMODIFIKASI
(EFFECT OF EQUILIBRATION TIME ON THE QUALITY OF LANDRACE BOAR FROZEN SEMEN IN MODIFIED DURASPERM EXTENDER)
Sofia Marlize * , Thomas M. Hine, Wilmientje M. Nalley Fakultas Peternakan, Universitas Nusa Cendana, Jln. Adisucipto Penfui, Kupang 850001
* Correspondent author, email: sofiamarlize80@gmail.com

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  waktu  ekuilibrasi  terhadap  kualitas  spermatozoa  babi landrace  baik  pada  pra-  maupun  pasca-  pembekuan  serta  menemukan  waktu  ekuilibrasi  terbaik.  Materi  yang digunakan  adalah  semen  segar  yang  ditampung  dari  seekor  babi  landrace  yang  berumur  2,5  tahun. Penampungan  dilakukan  dua  kali  per-minggu  dengan  menggunakan  glove  hand  method.  Semen  yang berkualitas baik (motilitas  sperma  ≥70%,  konsentrasi sperma  ≥200 x 106 sel/ml,  dan persentase abnormalitas sperma  ≤15%)  diencerkan  dengan  durasperm  yang  telah  dimodifikasi  dengan  air  buah  lontar,  sedangkan krioprotektannya menggunakan gliserol dan sukrosa. Holding time dilakukan selama 2 jam pada suhu 27-28°C, disentrifuge  dengan  kecepatan  2000  rpm  selama  15  menit,  dan  endapan  spermatozoa  diencerkan  dengan pengencer yang sama. Setelah itu, semen cair tersebut dikemas dalam straw 0.5 mL dan diekuilibrasi pada suhu 3-5°C  selama  1  (P1),  2  (P2),  atau  3  jam  (P3).  Pembekuan  semen  dilakukan  di  atas  permukaan  nitrogen  cair berjarak 5 cm selama 10 menit, dan selanjutnya disimpan di dalam container nitrogen cair. Thawing dilakukan dengan menempatkan straw semen beku ke dalam air hangat (37°C) selama 30 detik. Data penelitian dianalisis dengan  analisis  ragam  dan  dilanjutkan  dengan  uji  Duncan.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  waktu ekuilibrasi  pada  perlakuan  2  jam  (P2)  memberikan  hasil  terbaik  (P<0,05)  dengan  rerata  persentase  motilitas, viabilitas,  abnormalitas,  membran  plasma  utuh  dan  recovery  rate  sperma  secara  berturut-turut  adalah  30,62%, 58,21%,  4,68%,  58,94%  dan  43,74%.  Disimpulkan  bahwa  waktu  ekuilibrasi  tidak  memengaruhi  kualitas spermatozoa  pra-pembekuan,  namun  berpengaruh  terhadap  kualitas  spermatozoa  pasca-pembekuan,  dengan waktu ekuilibrasi terbaik untuk mempertahankan kualitas semen beku babi landrace adalah 2 jam.
Kata-kata kunci : waktu ekuilibrasi, kualitas semen beku, babi landrace, durasperm modifikasi

## ABSTRACT
This study aims to determine  the effect of equilibration time on the quality of landrace spermatozoa both pre- and post-freezing and to find the best equilibration time. The materials used is fresh semen collected from a 2,5 years old landrace boar. Collecting was carried out twice per week using the glove hand method. Semen of good quality (sperm motility ≥70%, sperm concentration ≥200 x 106 cells/ml, and percentage of sperm abnormalities ≤15%) was diluted with durasperm that had been modified with lontar fruit juice, while the cryoprotectants used glycerol  and  sucrose.  Holding  time  was  carried  out  for  2  hour  at  27-28°C,  centrifuged  at  2000  rpm  for  15 minutes, and the sperm sediment was diluted with the same diluent. After that, the liquid semen was packed in a 0.5 mL straw and equilibrated at 3-5°C for 1 (P1), 2 (P2), or 3 hours (P3). The freezing of semen was carried out on  the  surface  of  liquid  nitrogen  at  a  distance  of  5  cm  for  10  minutes,  and  then  stored  in  a  liquid  nitrogen container.  Thawing  is  done  by  placing  the  frozen  semen  straws  in  warm  water  (37°C)  for  30  seconds.  The research data were analyzed with analysis of variance and continued with the Duncan test. The results showed that the equilibration time at 2 hours (P2) gave the best results (P<0,05) with the mean percentage of motility, viability,  abnormality,  intact  plasma  membrane  and  recovery  rate  respectively  were  30,62%,  58,21%,  4,68%, 58,94%  and  43,74%.  It  was  concluded  that  the  equilibration  time  did  not  affect  the  quality  of  pre-freezing spermatozoa,  but  it  did  affect  the  quality  of  post-freezing  spermatozoa  with  the  best  equilibration  time  to maintain the quality of frozen semen of landrace boar was 2 hours.
Keywords: equilibration time, frozen semen quality, landrace boar, modified durasperm

## PENDAHULUAN
Babi  merupakan  salah  satu  komoditas ternak  penghasil  daging  yang  memiliki  potensi
besar untuk dikembangkan. Hal ini dikarenakan ternak babi memiliki sifat dan kemampuan yang
Jurnal Nukleus Peternakan (Desember  2021) Volume 8, No. 2:150-160                    pISSN : 2355-9942,    eISSN:2656-792X Marlize et al .: Pengaruh Waktu Ekuilibrasi…..
menguntungkan  antara  lain  pertumbuhan  yang cepat dan jumlah anak per kelahiran (litter size) yang  tinggi.  Jenis  bangsa  babi  yang  umum dikonsumsi  di  Indonesia  adalah  babi  landrace, babi duroc, dan babi hasil persilangan lainnya.
Jenis  usaha  peternakan  babi  di  Nusa Tenggara  Timur  (NTT)  masih  merupakan peternakan  rakyat  bersakal  kecil  atau  skala rumah  tangga,  dimana  upaya  peningkatan  mutu genetik terutama populasi masih kurang diperhatikan. Menurut Ardana dan Putra (2008), sistem  pemeliharaan  yang  masih  tradisional dapat  memengaruhi  peningkatan  produktivitas ternak  babi  baik  usaha  penggemukan  maupun pembibitan.  Salah  satu  upaya  yang  dapat dilakukan  untuk  meningkatkan  populasi  dan mutu  genetik  ternak  babi  adalah  dengan menerapkan program inseminasi buatan.
Inseminasi  buatan  merupakan  salah  satu teknologi  yang  sangat  populer  pada  ternak  saat ini.  Menurut  Arifiantini  (2012),  IB  merupakan salah satu teknik perkawinan buatan menggunakan  semen  dari  pejantan  terseleksi untuk memperoleh ternak unggul serta mencegah  inbreeding  dan  penyebaran  penyakit pada ternak. Teknologi ini telah diterapkan pada ternak  sapi,  kambing,  kuda,  ayam,  begitu  juga dengan ternak babi. Inseminasi pada ternak babi dengan  menggunakan  semen  cair  telah  sangat luas  diterapkan,  namun  inseminasi  dengan menggunakan  semen  beku  sangat  jarang diterapkan  karena  sensitivitas  spermatozoa  babi terhadap  suhu  dingin  (cold  shock)  sangat  tinggi sehingga dapat mengakibatkan kerusakan bahkan  kematian  pada  sel  akibat  proses kristalisasi es. Semen babi hanya dapat bertahan
pada  suhu  berkisar  15-20°C  (Sumardani et  al ., 2008).  Oleh  karena  itu,  upaya  dalam  mengatasi hal  tersebut  adalah  dengan  cara  menambahkan krioprotektan ke dalam pengencer.
Krioprotektan  merupakan  zat  kimia  non- elektrolit  yang  berfungsi  mereduksi  proses pemaparan  kriopreservasi  sel  dari  efek  larutan maupun  pembentukan  kristal  es  secara  ekstra maupun  intraseluler  sehingga  motilitas  sel setelah  kriopreservasi  dapat  terjaga.  Selain dengan  penambahan  krioprotektan  ke  dalam pengencer,  waktu  ekuilibrasi  juga  merupakan faktor  yang  sangat  menentukan  keberhasilan pembekuan  semen,  khususnya  ternak  babi. Waktu  ekuilibrasi  merupakan  periode  yang diperlukan  spermatozoa  sebelum  pembekuan untuk  menyesuaikan  diri  dengan  pengencer supaya pada saat pembekuan kematian spermatozoa  yang  berlebihan  dapat  dicegah. Waktu  ekuilibrasi  didefinisikan  sebagai  waktu yang  dibutuhkan  oleh  krioprotektan  untuk mencapai  keseimbangan  osmosis  pada  kedua sisi  membran  plasma  spermatozoa  (Bearden et al ., 2004).
Informasi  tentang  waktu  ekuilibrasi  pada semen  ternak  lain  telah  banyak  diketahui, sedangkan  pada  semen  babi  masih  sangat minim.  Untuk  itu,  telah  dilakukan  penelitian tentang  “Pengaruh  waktu  ekuilibrasi  terhadap kualitas  semen  beku  babi  landrace  dalam pengencer durasperm modifikasi”. Penelitian ini bertujuan  untuk  menguji  pengaruh  waktu ekuilibrasi  terhadap  kualitas  semen  beku  babi landrace dalam pengencer durasperm modifikasi.

## METODE PENELITIAN
Materi Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan  semen  yang  ditampung  dari seekor  babi  landrace  jantan  berumur  2,5  tahun, kondisi sehat, organ reproduksi normal dan telah terlatih  untuk  penampungan  semen.  Ternak tersebut dipelihara dalam kandang individu yang dilengkapi dengan tempat pakan dan air minum. Pakan  yang  diberikan  berupa  konsentrat sebanyak  3  kg/hari  dan  air  minum  diberikan secara ad libitum.

## Metode Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  metode rancangan  acak  lengkap  (RAL),  dengan  tiga perlakuan  dan  empat  ulangan  (penampungan
semen)  sehingga  terbentuk  12  unit  percobaan. Yang menjadi perlakuan adalah waktu ekuilibrasi sperma sebelum dilakukan pembekuan,  sedangkan  ulangannya  adalah waktu penampungan semen.

## Pembuatan Pengencer Durasperm Modifikasi
Persiapan  kuning  telur,  yaitu:  (1)  telur ayam  dicuci  bersih  dan  dikeringkan  dengan menggunakan tissue, (2) bersihkan telur dengan alkohol  70%,  (3)  pecahkan  telur  dan  pisahkan antara  putih  dan  kuning  telurnya,  (4)  kuning telur  dipindahkan  ke  atas  kertas  saring  agar menyerap  sisa  putih  telur,  (5)  pecahkan  selaput vitelinnya,  masukkan  kuning  telur  ke  dalam
Jurnal Nukleus Peternakan (Desember  2021) Volume 8, No. 2:150-160                    pISSN : 2355-9942,    eISSN:2656-792X Marlize et al .: Pengaruh Waktu Ekuilibrasi…..
gelas  ukur  (20  ml)  dan  kuning  telur  siap digunakan sesuai kebutuhan.
Tahap  selanjutnya  adalah  pembuatan pengencer durasperm modifikasi sebagai pengencer  dasar  yakni  dengan  cara:  50  g durasperm dilarutkan dalam 1000 mL aquabidest  dan  dihomogenkan.    Kemudian, ambil 94 mL pengencer durasperm tambahkan 6 mL  air  buah  lontar  lalu  homogenkan.  Untuk pengencer  perlakuan  dibuat  dengan  cara: sukrosa  ditimbang  sebanyak  0,03  gram  (3%), kemudian  dituang  dalam  tabung  elenmeyer. Selanjutnya,  tuangkan  100  mL  pengencer  dasar ke  dalam  tabung  elenmeyer  yang  berisi  sukrosa dan dihomogenkan. Tahap terakhir adalah ambil 97  mL  pengencer  dasar  +  sukrosa,  tambahkan gliserol sebanyak 3% lalu dihomogenkan.

## Penampungan Semen
Semen  ditampung  dua  kali  seminggu dengan  menggunakan  metode  manual/glove hand  method.  Semen  yang  diperoleh  kemudian dievaluasi  secara  makroskopis  (volume,  warna, konsistensi dan pH) dan mikroskopis (konsentrasi,  motilitas,  viabilitas,  abnormalitas dan membran plasma utuh spermatozoa). Semen segar  yang  akan  digunakan  harus  memenuhi syarat, yaitu memiliki motilitas sperma minimal 70%,  konsentrasi  sperma  minimal  200  x  106 sel/mL,  dan  persentase  abnormalitas  tidak  lebih dari  15%.  Semen  yang  telah  memenuhi  syarat kemudian  diencerkan  dengan  menggunakan pengencer dasar durasperm modifikasi.

## Pengenceran Semen dan Ekuilibrasi
Semen segar yang telah memenuhi syarat kemudian  diencerkan  menggunakan  pengecer dasar dengan perbandingan 1:1. Proses pengenceran  semen  dilakukan  dengan  cara meneteskan  sperma  ke  dalam  tabung  pengencer melalui  dinding  tabung  secara  perlahan  agar spermatozoa tidak terkejut dan dapat menyesuaikan diri dengan pengencer.
Semen yang telah diencerkan kemudian di holding  time  selama  2  jam  pada  suhu  27-28°C. Setelah holding time, semen disentrifuge dengan kecepatan  2000  rpm  selama  15  menit.  Cairan supernatant  dibuang  dan  pellet  diencerkan kembali dengan pengencer dasar 1:1. Setelah itu, semen  diencerkan  dengan  pengencer  perlakuan kemudian  di  packing  dalam  straw  0.50  mL (mengandung  500  x  106  sel  spermatozoa)  dan diberi label untuk diekuilibrasi pada suhu 3-5°C selama 1 jam, 2 jam, atau 3 jam.

## Pembekuan dan Penyimpanan Semen
Pembekuan  semen  dilaksanakan  dengan menempatkan  rak  yang  berisi  straw  semen  di atas  permukaan  N2  cair  (suhu  ±  -110°C) berjarak  5  cm  selama  10  menit.  Setelah  itu, straw  tersebut  dicemplungkan  dalam  N2  cair (suhu ± -196°C) dan disimpan selama 24 jam.

## Evaluasi Kualitas Semen Beku
Evaluasi  kualitas  semen  beku  dilakukan dengan  cara  mengeluarkan  straw  semen  beku dari  dalam  container  nitrogen  cair  dan menempatkannya  ke  dalam  air  hangat  bersuhu 37°C  selama  30  detik.  Evaluasi  kualitas sperma dilakukan  di  bawah  pengamatan  mikroskop dengan pembesaran 400 kali.

## Variabel Penelitian
Variabel penelitian meliputi: (1) motilitas spermatozoa (%): pemeriksaan gerakan spermatozoa  yang  bergerak  aktif  ke  depan (progresif).  Penilaian  dilakukan  di  bawah mikroskop  pada  pembesaran  400  kali  secara subjektif  pada  lapang  pandang  yang  berbeda. Nilai  yang  diberikan  berkisar  antara  0-100% dengan skala 5%.
(2) Viabilitas spermatozoa (%): perbandingan  jumlah  spermatozoa  yang  hidup dengan  total  spermatozoa.  Evaluasi  viabilitas spermatozoa dilakukan dengan pewarnaan eosin dan  diamati  di  bawah  mikroskop  pada pembesaran  400  kali.  Spermatozoa  hidup ditandai  dengan  kepala  berwarna  putih  (tidak menyerap  zat  warna  eosin),  sedangkan  yang mati  berwarna  merah  atau  merah  muda (menyerap  zat  warna  eosin)  (Herdis  &  Rizal, 2008).
(3) Abnormalitas spermatozoa (%): perbandingan antara spermatozoa yang abnormal  dengan  total  spermatozoa.  Evaluasi abnormalitas  spermatozoa  dilakukan  dengan cara  pewarnaan diferensial  eosin dan  diamati  di bawah  mikroskop  dengan  pembesaran  400  kali. Spermatozoa  yang  abnormal  ditandai  dengan kelainan  pada  kepala  dan  ekor  yakni  berupa kepala mengecil atau membesar, ekor putus atau hilang.
(4)  Membran  plasma  utuh  (MPU) spermatozoa  (%):  perbandingan  antara  jumlah spermatozoa  yang  memiliki  membran  plasma utuh  dengan  total  spermatozoa.  Keutuhan membran  plasma  spermatozoa  divaluasi  dengan metode  osmotic  resistance  test  (ORT)  atau hypoosmotic  swelling  (HOS)  test.  Spermatozoa yang  memiliki  membran  plasma  yang  utuh
Jurnal Nukleus Peternakan (Desember  2021) Volume 8, No. 2:150-160                    pISSN : 2355-9942,    eISSN:2656-792X Marlize et al .: Pengaruh Waktu Ekuilibrasi…..
ditandai dengan ekor melingkar atau menggelembung,  sedangkan  yang  memiliki membran yang rusak ditandai dengan ekor lurus dan panjang tanpa ujung.
(5)  Recovery  rate  (%):  merupakan kemampuan  pemulihan  spermatozoa  setelah pembekuan  dengan  membandingkan  persentase
spermatozoa  motil  pasca  thawing  dengan spermatozoa motil pada semen segar.
Data  penelitian  dianalisis  menggunakan Analisis  of  Variance (Anova)  dan  dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program SPSS versi 22.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik Semen Segar
Kualitas  semen  segar  babi  landrace ditampilkan  pada  Tabel  1.  Hasil  evaluasi terhadap  kualitas  semen  segar  babi  landrace selama empat kali penampungan cukup baik dan memenuhi syarat untuk dibekukan.
Rataan  volume  semen  yang  diperoleh dalam  penelitian  ini  cukup  rendah  jika dibandingkan  dengan  hasil  penelitian  Foeh (2015),  yakni  volume  semen  berkisar  139-205 mL  dengan  rerata  176±4,85  ml  dan  Feka et  al . (2016)  yang  memperoleh  volume  semen sebanyak  200  mL.  Meskipun  demikian,  hasil
penelitian  ini  masih  tergolong  normal  dan  tidak berbeda  jauh  dengan  hasil  penelitian  Ax et  al . (2000)  yang  menyatakan  bahwa  volume  semen babi berkisar 100-450 mL. Beberapa faktor yang memengaruhi  karakteristik  secara  makroskopis adalah  variasi  umur  dari  pejantan,  tingkat stimulasi, kualitas pakan dan frekuensi ejakulasi. Hal ini sesuai dengan pernyataan Parker (2000), bahwa  adanya  variasi  dalam  volume  semen dipengaruhi oleh umur ternak, metode penampungan,  jumlah  sampel  dan  frekuensi penampungan.
Tabel 1. Karakteristik Semen Segar Babi Landrace Karakteristik semen Nilai rataan Volume (mL) 119,50±20,49 Warna Putih susu Konsistensi Encer pH 6,62±0,15 Konsentrasi spermatozoa (x10 6 sel/mL) 250,50±32,56 Motilitas spermatozoa (%) 70,00±0,00 Viabilitas spermatozoa (%) 85,50±3,57 Abnormalitas spermatozoa (%) 3,54±0,38 MPU spermatozoa (%) 86,31±3,47
Warna  semen  yang  diperoleh  dari penelitian  adalah  putih  susu  dengan  konsistensi encer. Warna semen dan konsistensi semen yang diperoleh  dalam  penelitian  ini  berbeda  dengan hasil  penelitian  Subrata et  al .  (2014),  yang melaporkan  bahwa  warna  semen  babi  adalah putih  keabuan  dan  Foeh et  al .  (2017),  yang memperoleh  warna  semen  babi  putih  keruh. Sedangkan, pH yang diperoleh dalam penelitian ini adalah 6,62 dan masih dalam kategori normal menurut  Garner  dan  Hafez  (2000),  yakni berkisar antara 6,4-7,8. Adapun beberapa faktor yang memengaruhi perbedaan warna, konsistensi  dan  pH  semen  ialah  umur,  tingkat rangsangan,  frekuensi  ejakulasi,  kualitas  pakan dan lingkungan (Johnson et al ., 2000).
Hasil  pemeriksaan  secara  mikroskopis menunjukkan  bahwa  motilitas  spermatozoa adalah  70,00%.  Hasil  tersebut  lebih  tinggi  dari
hasil  penelitian  Sumardani  (2007),  yang melaporkan bahwa motilitas spermatozoa adalah 65,56%.  Sedangkan,  konsentrasi  spermatozoa yang  diperoleh  dari  hasil  penelitian  ini  adalah 250,50  x  106  sel/ml  dan  tidak  jauh  berbeda dengan hasil penelitian Garner dan Hafez (2000) serta Knox (2006), yakni konsentrasi spermatozoa  berkisar  antara  200-600  x  106 sel/ml.  Beberapa  faktor  yang  memengaruhi motilitas  dan  konsentrasi  spermatozoa  antara lain  ialah  umur,  jumlah  ejakulat,  interval penampungan,  kondisi  pejantan  dan  lingkungan (Sumardani et  al .,  2019  dan  Johnson et  al ., 2000).
Hasil  pemeriksaan  viabilitas  spermatozoa yang  hidup  diidentifikasikan  dengan  tidak menyerap  warna  (transparan)  pada  bagian kepala  spermatozoa,  sedangkan  spermatozoa yang  mati  ditandai  dengan  menyerap  warna
Jurnal Nukleus Peternakan (Desember  2021) Volume 8, No. 2:150-160                    pISSN : 2355-9942,    eISSN:2656-792X Marlize et al .: Pengaruh Waktu Ekuilibrasi…..
merah  pada  bagian  kepala  spermatozoa  karena permeabilitas  spermatozoa  yang  meningkat. Rataan viabilitas spermatozoa dari penelitian ini adalah  85,32%.  Hasil  ini  tidak  berbeda  jauh dengan yang dilaporkan Sumardani et al . (2008) bahwa  rataan  viabilitas  spermatozoa  adalah 87,76% dan hasil penelitian ini lebih tinggi dari hasil  penelitian  Kaka  (2020)  yang  melaporkan rataan  viabilitas  spermatozoa  babi  landrace adalah  79,19%.  Perbedaan  kualitas  semen  ini dipengaruhi oleh umur ternak, tingkat rangsangan,  frekuensi  ejakulat,  lingkungan  dan kualitas pakan (Feradis, 2010).
Pemeriksaan  spermatozoa  yang  abnormal penting  dilakukan  sebab  abnormalitas  yang tinggi  akan  mengganggu  fertilitas  pejantan secara  umum  (Garner  dan  Hafez,  2000).  Hasil penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  presentase abnormalitas  spermatozoa  adalah  3,54%.  Hasil ini  tergolong  sangat  baik  karena  menurut Johnson et  al .  (2000),  persentase  abnormalitas spermatozoa  babi  perejakulat  tidak  lebih  dari 20%. Secara umum, abnormalitas pada spermatozoa  dapat  disebabkan  oleh  berbagai faktor antara lain genetik, stres, suhu lingkungan, penyakit dan bahkan perlakuan pada saat pembekuan semen (Arifiantini dan Ferdian, 2006).
Hasil  pemeriksaan  keutuhan  membran plasma (MPU) spermatozoa diidentifikasi dengan  ekor  menggelembung  atau  melingkar, sedangkan  untuk  yang  rusak  ditandai  dengan ekor lurus dan panjang tanpa ujung. Nilai rataan membran  plasma  utuh  spermatozoa  yang diperoleh  dari  penelitian  ini  adalah  86,31%. Hasil  ini  lebih  tinggi  dari  yang  dilaporkan  oleh Sangma et  al .  (2020)  yang  melaporkan  bahwa nilai  rataan  membran  plasma  utuh  spermatozoa adalah 81,74%. Metabolisme sel akan berlangsung  baik  jika  membran  plasma  sel berada dalam keadaan yang utuh (Surachman et al ., 2009).

## Motilitas  Spermatozoa  Pra-  dan  Pasca Pembekuan
Motilitas  adalah  pergerakan  spermatozoa secara  progresif  atau  pergerakan  aktif  maju  ke depan. Kemampuan spermatozoa untuk bergerak progresif  memiliki  korelasi  positif  terhadap tingkat  fertilitas  spermatozoa.  Oleh  karena  itu, penilaian  motilitas  digunakan  sebagai  ukuran kesanggupan  spermatozoa  dalam  membuahi  sel telur  atau  ovum.  Motilitas  spermatozoa  pada berbagai  waktu  ekuilibrasi  ditampilkan  pada Tabel 2.
Tabel 2. Motilitas Spermatozoa Babi Landrace pada berbagai Waktu Ekuilibrasi Tahapan pengamatan Waktu ekuilibrasi (jam) 1 2 3 Sesudah pengenceran 70,00±0,00 70,00±0,00 70,00±0,00 Sesudah ekuilibrasi 65,62±3,75 a 64,38±3,14 a 65,62±2,39 a Sesudah thawing 21,88±3,75 ab 30,62±8,51 b 18,75±4,33 a
Superskrip yang sama pada baris yang sama menunjukkan perbedaan yang tidak nyata (P>0,05)
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa waktu  ekuilibrasi  memberikan  pengaruh  yang tidak nyata (P>0,05) terhadap motilitas spermatozoa  sebelum  pembekuan  (sesudah ekuilibrasi),  namun  memberikan  pengaruh  yang nyata  (P<0,05)  terhadap  persentase  motilitas spermatozoa setelah pembekuan (pasca thawing) (Tabel 2).
Berdasarkan  hasil  uji  lanjut,  ditemukan bahwa  waktu  ekuilibrasi  1  jam  berbeda  tidak nyata (P>0,05) dengan waktu ekuilibrasi selama 2 dan 3 jam, sedangkan waktu ekuilibrasi 2 jam berbeda nyata (P<0,05) dengan waktu ekuilibrasi  3  jam.  Waktu  ekuilibrasi  selama  2 jam  sesudah  thawing  menghasilkan  persentase motilitas yang lebih tinggi (30,62%) dibandingkan  dengan  ekuilibrasi  selama  1  jam (21,88%) dan 3 jam (18,75%). Hal ini didukung
juga  dengan  tingkat  penurunan  persentase motilitas spermatozoa sejak pengenceran hingga thawing,  dimana  waktu  ekuilibrasi  2  jam menghasilkan laju penurunan motilitas spermatozoa  yang  lebih  rendah  (39,38%) dibandingkan  dengan  ekuilibrasi  selama  1  jam (48,12%) dan 3 jam (51,25%).
Ekuilibrasi merupakan waktu yang dibutuhkan oleh spermatozoa sebelum pembekuan  agar  dapat  menyesuaikan  diri dengan pengencer, sehingga pada saat pembekuan kematian spermatozoa yang berlebihan  dapat  dicegah.  Perbedaan  waktu ekuilibrasi  menyebabkan  motilitas  spermatozoa setelah  pembekuan  juga  berbeda.  Pada  waktu ekuilibrasi  yang  optimum  maka  akan  dicapai nilai  motilitas  spermatozoa  yang  tinggi,  karena waktu ekuilibrasi yang optimum akan
Jurnal Nukleus Peternakan (Desember  2021) Volume 8, No. 2:150-160                    pISSN : 2355-9942,    eISSN:2656-792X Marlize et al .: Pengaruh Waktu Ekuilibrasi…..
memberikan  kesempatan  terbaik  bagi  gliserol untuk  melindungi  spermatozoa  dari  pengaruh cold  shock  dan  pembentukan  kristal  es  selama proses  pembekuan.  Sebaliknya,  jika  waktu ekuilibrasi  belum  optimum  maka  motilitas spermatozoa  yang  dihasilkan  kurang  baik.  Pada saat  ekuilibrasi,  selain  terjadi  keseimbangan konsentrasi  gliserol,  juga  komponen  ekstender osmosis  lainnya  akan  berada  dalam  keadaan yang  seimbang  antara  di  luar  sel  dan  di  dalam sel (Salamon dan Maxwell, 2000).
Motilitas tertinggi terdapat pada perlakuan  dengan  waktu  ekuilibrasi  2  jam;  hal ini  mengindikasikan  bahwa  waktu  tersebut merupakan waktu yang optimum bagi spermatozoa  untuk  menyesuaikan  diri  dengan pengencer.  Pada  tahap  ini,  gliserol  telah  secara sempurna  berdifusi  ke  dalam  sel  spermatozoa dan  berhasil  menciptakan  konsentrasi  intra  dan ekstraseluler  yang  seimbang  (Salamon  dan Maxwell,  2000).  Pada  waktu  ekuilibrasi  1  jam, persentase  motilitas  spermatozoa  lebih  rendah dibandingkan  ekuilibrasi  selama  2  jam  diduga karena  proses  pengeluaran  air  dari  dalam  sel masih  sedikit  yang  diakibatkan  karena  gliserol belum  berdifusi  secara  optimal  ke  dalam  sel, sehingga  pada  saat  pembekuan  terjadi  proses kristalisasi  es  yang  berakibat  pada  kematian spermatozoa.  Pendapat  ini  didukung  oleh Pangestu  (2002),  yang  menyatakan  bahwa apabila suatu sel didinginkan terlalu cepat, maka air  yang  ada  di  dalam  sel  akan  keluar  dalam jumlah  yang  sedikit  sehingga  belum  mencapai tahap  ekuilibrium  yang  sempurna.  Sebaliknya, pada  waktu  ekuilibrasi  3  jam  persentase motilitas spermatozoa lebih rendah dibandingkan dengan ekuilibrasi selama 1 dan 2 jam  diduga  karena  kontak  antara  gliserol  dan spermatozoa  terjadi  secara  berlebihan,  sehingga menyebabkan  gliserol  berubah  menjadi  toksik dan mengakibatkan kematian pada spermatozoa. Pendapat ini didukung oleh Umar dan Maharani (2005), yang menyatakan bahwa waktu ekuilibrasi yang terlalu lama akan menyebabkan kontak  antara  gliserol  dan  spermatozoa  terjadi secara  berlebihan  sehingga  gliserol  akan menjadi toksik bagi spermatozoa.
Hasil  dari  penelitian  ini  tidak  berbeda jauh  dengan  yang  dilaporkan  oleh  Yusuf et  al . (2017), dimana persentase motilitas spermatozoa babi  pasca  thawing  yang  diekuilibrasi  selama  2 jam  menghasilkan  rerata  motilitas 30,00±4,47% dalam  pengencer  BTS-gliserol-Trehalosa,  dan hasil  dari  penelitian  ini  lebih  tinggi  dari  yang dilaporkan  oleh  Foeh  (2015)  yakni  persentase
motilitas  spermatozoa  babi  setelah  thawing adalah  20,92±0,91%  dalam  pengencer  BTS- DMA.  Namun,  jika  dibandingkan  dengan kualitas  semen  beku  ternak  lainnya,  kualitas semen beku babi masih tergolong sangat rendah. Pada  ternak  sapi,  kualitas  semen  beku  yang diekuilibrasi  selama  5  jam  cukup  tinggi  yakni motilitas  pasca  thawing  mencapai  44,15% (Febriani et  al .,  2014),  pada  kambing  51,20% (Naing et  al .,  2010),  pada  ternak  domba  49,0% hingga  58,4%  (Bag et  al ., 2001), dan  pada rusa motilitas  pasca  thawing  mencapai  52,50% dengan  waktu  ekuilibrasi  4  jam  (Nalley et  al ., 2011).  Rendahnya  motilitas  pasca  thawing  ini kemungkinan  berhubungan  dengan  komposisi asam  lemak  dan  phospholipid  yang  berbeda dengan ternak lainnya, yaitu komposisi phosphatidylethanolamine  dan  sphingomyelin pada  membran  plasma  spermatozoa  babi mencapai  24%  dan  14%  (Garner  dan  Hafez, 2000),  jauh  lebih  tinggi  daripada  spermatozoa sapi  yaitu  9,7%  dan  11,5%.  Hal  ini  yang membuat permeabilitas membran plasma spermatozoa makin menurun dan mengakibatkan spermatozoa mudah mati. Komposisi  protein  plasma  semen  dan  membran spermatozoa yang bervariasi antar individu juga menyebabkan  hilangnya  daya  gerak  dan viabilitas  dari  spermatozoa  karena  pengaruh pembekuan.

## Viabilitas  Spermatozoa  Pra-  dan  Pasca Pembekuan
Viabilitas spermatozoa merupakan indikator untuk menilai kualitas semen. Semakin tinggi  persentase  viabilitas  spermatozoa  maka semakin  baik  kualitas  semen  tersebut  (Herdis dan  Rizal,  2008).  Penilaian  viabilitas  dilakukan secara obyektif menggunakan pewarnaan diferensial.  Spermatozoa  yang  hidup  ditandai dengan  kepala  spermatozoa  yang  transparan karena tidak menyerap warna (eosin), sedangkan kepala  spermatozoa  yang  mati  akan  berwarna merah karena menyerap warna (eosin). Pemeriksaan  viabilitas  spermatozoa  penting dilakukan karena berpengaruh terhadap motilitas spermatozoa. Semakin tinggi viabilitas spermatozoa,  semakin  tinggi  pula  motilitas spermatozoa  karena  hanya  spermatozoa  yang hidup yang dapat bergerak. Walaupun demikian, persentase  viabilitas  spermatozoa  lebih  tinggi daripada  spermatozoa  motil  karena  jumlah spermatozoa  yang  hidup  belum  tentu  semuanya motil progresif (Kostaman dan Sutama, 2006).
Jurnal Nukleus Peternakan (Desember  2021) Volume 8, No. 2:150-160                    pISSN : 2355-9942,    eISSN:2656-792X Marlize et al .: Pengaruh Waktu Ekuilibrasi…..
Berdasarkan hasil analisis statistik, waktu ekuilibrasi  memberikan  pengaruh  yang  tidak nyata  (P>0,05)  terhadap  viabilitas  spermatozoa
sebelum pembekuan (setelah ekuilibrasi), namun berpengaruh  nyata  (P<0,05)  terhadap  viabilitas spermatozoa pasca thawing (Tabel 3).
Tabel 3. Viabilitas Spermatozoa Babi Landrace pada berbagai Waktu Ekuilibrasi Tahapan pengamatan Waktu ekuilibrasi (jam) 1 2 3 Sesudah pengenceran 85,32±3,21 85,32±3,21 85,32±3,21 Sesudah ekuilibrasi 80,24±5,03 a 81,72±4,54 a 82,39±3,84 a Sesudah thawing 42,02±5,56 a 58,21±12,70 b 37,90±9,04 a
Superskrip yang sama pada baris yang sama menunjukkan perbedaan yang tidak nyata (P>0,05)
Viabilitas  spermatozoa  pasca  thawing pada  waktu  ekuilibrasi  2  jam  berbeda  nyata (P<0,05)  dengan  1  dan  3  jam,  namun  waktu ekuilibrasi  1  jam  berbeda  tidak  nyata  (P>0,05) dengan  3  jam.  Hal  ini  didukung  juga  dengan adanya penurunan persentase viabilitas spermatozoa  yang  lebih  rendah  pada  waktu ekuilibrasi  selama  2  jam  yaitu  27,11%, dibandingkan dengan waktu ekuilibrasi selama 1 jam (43,30%) dan 3 jam (47,42%).
Perlakuan  dengan  waktu  ekulibrasi  2 jam sesudah thawing menghasilkan persentase viabilitas  yang  lebih  baik  dibandingkan  dengan perlakuan lainnya. Pada waktu ekuilibrasi 2 jam, krioprotektan  gliserol  sudah  secara  optimal masuk  ke  dalam  sel  spermatozoa  dan  berhasil menciptakan  keseimbangan  elektrolit  antara  di dalam  dan  di  luar  sel  sehingga  spermatozoa dapat  terlindungi  dari  kematian.  Selain  itu, sukrosa  yang  terkandung  di  dalam  pengencer telah  optimal  dalam  mengatur  keseimbangan pasase  air  yang  masuk  dan  keluar  sel  sehingga spermatozoa  dapat  terhindar  dari  kematian akibat  penggembungan  atau  pengkerutan  yang berlebihan pada saat thawing.
Rendahnya  viabilitas  spermatozoa  pasca thawing  pada  waktu  ekuilibrasi  selama  1  jam disebabkan  gliserol  belum  berdifusi  secara optimal ke dalam sel dan proses pengeluaran air masih  sedikit  sehingga  belum  mencapai  tahap ekuilibrium  yang  sempurna  (Pangestu,  2002). Air  yang  masih  berada  dalam  sel  tersebut akhirnya berubah bentuk menjadi es atau disebut intracellular  ice  formation  (IIF)  yang  akan merusak  sel  spermatozoa  dan  mengakibatkan kematian  sel.  Sebaliknya,  penyebab  rendahnya viablitas spermatozoa pasca thawing pada waktu ekuilibrasi 3 jam disebabkan proses pengeluaran air  oleh  gliserol  terjadi  secara  berlebihan  yang mengakibatkan  sel  mengalami  dehidrasi  dan akhirnya  mengkerut  sehingga  berakibat  pada kematian  sel  spermatozoa.  Penyebab  lainnya adalah  kontak  antara  gliserol  dan  spermatozoa
terjadi secara berlebihan sehingga menyebabkan gliserol  menjadi  toksik  bagi  spermatozoa  dan mengakibatkan  kematian  pada  sel  itu  sendiri. Pendapat ini didukung oleh Umar dan Maharani (2005), yang menyatakan bahwa waktu ekuilibrasi yang terlalu lama akan menyebabkan kontak  antara  gliserol  dan  spermatozoa  terjadi secara  berlebihan  sehingga  gliserol  akan menjadi toksik bagi spermatozoa.
Viabilitas  spermatozoa  pasca  thawing pada penelitian ini sedikit lebih rendah dari hasil penelitian  Yusuf et  al .  (2017),  yakni  persentase viabilitas  spermatozoa  babi  pasca  thawing  yang diekuilibrasi  selama  2  jam  mencapai  68,20- 70,80%, namun lebih tinggi dari hasil penelitian Foeh et  al .  (2017)  yang  melaporkan  viabilitas spermatozoa  pasca  thawing  sebesar  44,84% dalam  pengencer  BTS-gliserol-SDS  (Sodium dodecyl sulphate).

## Abnormalitas  Spermatozoa  Pra-  dan  Pasca Pembekuan
Abnormalitas  spermatozoa  merupakan salah  satu  indikator  dalam  menentukan  kualitas spermatozoa  karena  struktur  sel  yang  abnormal dapat  menyebabkan  gangguan  dan  hambatan pada saat fertilisasi (Afiati et al ., 2015).
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa  waktu  ekuilibrasi  berpengaruh  tidak nyata (P>0,05) terhadap abnormalitas spermatozoa pra-pembekuan (ekuilibrasi), namun  berpengaruh  nyata  (P<0,05)  terhadap abnormalitas spermatozoa pasca thawing. Persentase  abnormalitas  spermatozoa  pasca thawing  pada  waktu  ekuilibrasi  2  jam  secara nyata (P<0,05) lebih rendah (4,68%) dibandingkan  dengan  waktu  ekuilibrasi  1  jam (5,53%)  dan  3  jam  (6,72%)  (Tabel  4);  namun tidak  terdapat  perbedaan  yang  nyata  (P>0,05) antara  waktu  ekuilibrasi  1  jam  dengan  2  jam. Hal  ini  didukung  oleh  tingkat  peningkatan abnormalitas  pada  ekuilibrasi  2  jam  dari pengenceran  sampai  thawing  yang  tidak  terlalu
Jurnal Nukleus Peternakan (Desember  2021) Volume 8, No. 2:150-160                    pISSN : 2355-9942,    eISSN:2656-792X Marlize et al .: Pengaruh Waktu Ekuilibrasi…..
tinggi  (1,24%)  dibandingkan  pada  ekuilibrasi  1 jam (2,09%) dan 3 jam (3,44%).
Tingginya abnormalitas spermatozoa pada ekuilibrasi  3  jam  mungkin  disebabkan  oleh karena  gliserol  telah  banyak  menarik  air  dari dalam  sel  yang  menyebabkan  sel  mengalami dehidrasi  dan  mengkerut,  sehingga  terjadi
kerusakan  sel  secara  mekanik  yang  berdampak pada  tingkat  abnormalitasnya.  Pendapat  ini didukung  oleh  Best  (2006)  yang  menyatakan bahwa  gliserol  akan  menarik  air  dari  dalam  sel spermatozoa  yang  menyebabkan  dehidrasi  dan selanjutnya terjadi kerusakan pada sel spermatozoa. Tabel 4. Abnormalitas Spermatozoa Babi Landrace pada berbagai Waktu Ekuilibrasi Tahapan pengamatan Waktu ekuilibrasi (jam) 1 2 3 Sesudah pengenceran 3,44±0,36 3,44±0,36 3,44±0,36 Sesudah ekuilibrasi 3,46±0,20 a 3,51±0,24 a 3,60±0,41 a Sesudah thawing 5,53±1,00 a 4,68±0,31 a 6,72±0,61 b
Superskrip yang sama pada baris yang sama menunjukkan perbedaan yang tidak nyata (P>0,05)
Hasil  dari  penelitian  ini  tergolong  sangat baik  jika  dibandingkan  dengan  hasil  penelitian Bebas  dan  Gorda  (2020)  bahwa  abnormalitas spermatozoa  babi  yang  diekuilibrasi  selama  2 jam  pada  suhu  4°C  adalah  27,60%  dalam pengencer Astaxanthin fosfat kuning telur bebek dengan  kadar  krioprotektan  gliserol  sebanyak 4%.

## Membran  Plasma  Utuh  Spermatozoa  Pra- dan Pasca Pembekuan
Keutuhan  membran  plasma  mutlak  harus dimiliki  oleh  spermatozoa  supaya  terjamin kelangsungan hidupnya dan tercapai keberhasilan  pada  saat  proses  fertilisasi.  Selain berfungsi  untuk  melindungi  organel-organel yang berada di dalam sel, membran plasma juga berfungsi  untuk  mengatur keluar  masuknya  zat- zat  makanan  serta  keseimbangan  elektrolit  intra maupun ekstraseluler. Spermatozoa yang memiliki  membran  plasma  yang  utuh  ditandai oleh  ekor  melingkar  atau  menggelembung setelah  dipaparkan  pada  larutan  hipoosmotik menggunakan metode hypoosmotik swelling test
(HOST).  Hal  ini  dapat  terjadi  karena  medium yang  masuk  ke  dalam  sel  dapat  dipertahankan oleh  membran  plasma  yang  utuh  tersebut. Sebaliknya, membran plasma spermatozoa yang tidak  utuh  ditandai  dengan  ekor  spermatozoa yang  lurus,  yang  disebabkan  oleh  adanya medium yang tertahan di dalam sel.
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa waktu ekuilibrasi menunjukkan pengaruh yang  tidak  nyata  (P>0,05)  terhadap  MPU spermatozoa sesudah ekuilibrasi, tetapi berpengaruh  nyata  (P<0,05)  terhadap  MPU spermatozoa sesudah thawing.
Waktu  ekuilibrasi  2  jam  menghasilkan MPU  spermatozoa  pasca  thawing  yang  lebih tinggi (P<0,05) daripada ekuilibrasi 1 jam dan 3 jam,  namun  antara  ekuilibrasi  1  jam  dan  3  jam menunjukkan  perbedaan  yang  tidak  nyata (P>0,05)  (Tabel  5).  Hal  ini  terjadi  karena  MPU spermatozoa  pada  waktu  ekuilibrasi  2  jam mengalami  penurunan  yang  lebih  rendah (27,29%) dibandingkan dengan ekuilibrasi 1 jam (43,28%) dan 3 jam (47,58%).
Tabel 5. Membran plasma utuh (MPU) spermatozoa babi landrace pada berbagai waktu ekuilibrasi Tahapan pengamatan Waktu ekuilibrasi (jam) 1 2 3 Sesudah pengenceran 86,23±3,39 86,23±3,39 86,23±3,39 Sesudah ekuilibrasi 81,37±5,21 a 81,55±6,17 a 83,58±3,74 a Sesudah thawing 42,95±5,21 a 58,94±12,60 b 38,65±9,14 a
Superskrip yang sama pada baris yang sama menunjukkan perbedaan yang tidak nyata (P>0,05)
Tingginya MPU spermatozoa pasca thawing  pada  waktu  ekuilibrasi  2  jam  diduga karena  gliserol  telah  secara  optimal  masuk  ke dalam membran plasma sel dan mengikat gugus fosfolipid sehingga mampu mengatasi ketidakstabilan membran.
Pada  waktu  ekuilibrasi,  gliserol  akan memasuki  sel  spermatozoa  untuk  menggantikan sebagian air yang ada di dalam sel, tetapi dengan waktu ekuilibrasi yang lebih lama kemungkinan gliserol  akan  bersifat  toksik  sehingga  akan merusak  membran  plasma  spermatozoa.  Akibat
Jurnal Nukleus Peternakan (Desember  2021) Volume 8, No. 2:150-160                    pISSN : 2355-9942,    eISSN:2656-792X Marlize et al .: Pengaruh Waktu Ekuilibrasi…..
efek toksik dari gliserol, maka membran plasma spermatozoa akan mengalami modifikasi struktur dan mengakibatkan terganggunya transport  aktif  zat-zat  yang  menjadi  sumber energi  bagi  spermatozoa  seperti  glukosa,  asam amino  dan  asam  lemak  (Aku et  al .,  2007). Akibat terganggunya mekanisme ini, spermatozoa  akan  kekurangan  energi  sehingga viabilitas serta motilitasnya juga ikut menurun.
Hasil  dari  penelitian  sedikit  lebih  tinggi daripada yang dilaporkan oleh Bebas dan Gorda (2020),  dimana  MPU  spermatozoa  ternak  babi yang  diekuilibrasi  selama  2  jam  pada  suhu  4ºC adalah  sebesar  53,80%  dalam  pengencer Astaxanthin  fosfat  kuning  telur  bebek  dengan kadar krioprotektan gliserol sebanyak 4%.
Recovery Rate Spermatozoa
Recovery rate (RR) merupakan kemampuan  pemulihan  spermatozoa  setelah pembekuan dengan cara membandingkan motilitas  spermatozoa  pasca  thawing  dengan motilitas semen segar (Garner dan Hafez (2000). Recovery  rate  merupakan  salah  satu  indikator penting  untuk  menilai suatu  keberhasilan  dalam kriopreservasi  semen.  Selain  itu,  RR  juga menunjukkan  efisiensi  dari  proses  pembekuan yang  dilakukan.  Semakin  tinggi  nilai  RR,  maka proses pembekuan yang dilakukan semakin baik.
Rerata RR spermatozoa tertinggi dihasilkan  pada  waktu  ekuilibrasi  2  jam  yaitu
43,74%,  diikuti  oleh  waktu  ekuilibrasi  1  jam yaitu  31,25%,  dan  terendah  pada  waktu ekuilibrasi  3  jam  yakni  26,78%  (Gambar  1). Hasil  analisis  statistik  menunjukkan  bahwa waktu  ekuilibrasi  berpengaruh  nyata  (P<0,05) terhadap RR spermatozoa.
Gambar  1. Recovery  Rate Spermatozoa  Babi Landrace
Tingginya  RR  pada  waktu  ekuilibrasi  2 jam  tersebut  menandakan  bahwa  jumlah spermatozoa  pasca  thawing  yang  motil  juga tinggi.  Hal  ini  berkaitan  dengan  tingkat keutuhan  membran  plasma  spermatozoa  yang mendukung proses metabolisme untuk menghasilkan  pergerakan  spermatozoa  secara baik.  Jika  motilitas  menurun,  maka  RR  juga akan  menurun.  Pernyataan  ini  didukung  oleh pernyataan  Suherlan et  al .  (2015)  bahwa tingginya RR bergantung pada jumlah spermatozoa yang motil progresif.

## SIMPULAN
Disimpulkan  bahwa  waktu  ekuilibrasi tidak  memengaruhi  kualitas  spermatozoa  pra- pembekuan, namun berpengaruh terhadap kualitas spermatozoa pasca- pembekuan, dengan waktu ekuilibrasi terbaik untuk mempertahankan kualitas semen beku babi landrace adalah 2 jam.

## DAFTAR PUSTAKA
Afiati  F.  Yulnawati,  Riyadi  M,  Arifiantini  RI.
2015.  Abnormalitas  spermatozoa  domba dengan  frekuensi  penampungan  berbeda. Prosiding  Seminar  Nasional  Masyarakat Biodiversitas Indonesia 1(4): 930-934.
Aku  AS,  Sandiah  N,  Sadsoeitoeboen  PD,  Amin
MR, Herdis. 2007. Manfaat Lesitin Nabati pada Preservasi dan Kriopreservasi
Semen:  Suatu  Kajian  Pustaka. Animal Production 9(1): 49-52.
Ardana  I,  Putra  D.  2008.  Ternak  Babi (Manajemen  Reproduksi,  Produksi  Dan Penyakit). Udayana University Perss.
Arifiantini  R.  2012.  Teknik  Koleksi  Dan Evaluasi  Semen  Pada  Hewan.  PT. Penerbit IPB Press.
Arifiantini  R,  Ferdian  F.  2006.  Tinjauan  aspek morfologi  dan  morfometri  spermatozoa kerbau  rawa  ( Bubalus  bubalis )  yang dikoleksi  dengan  tekni  masase. Jurnal Veteriner 7(2): 83-91.
Ax  R,  Dally  M,  Didion  B,  Lenz  R,  Love  C, Varner  D,  Hafez  B,  Bellin  M.  2000. Semen  Evaluation. (B.  Hafez  &  E.  Hafez (eds.);  7th  ed.).  Lippincott  Williams  and Wilkins.
Bag S, Joshi A, Rawat P, Mittal J. 2001. Effect of  Initial  freezing  temperature  on  the
Jurnal Nukleus Peternakan (Desember  2021) Volume 8, No. 2:150-160                    pISSN : 2355-9942,    eISSN:2656-792X Marlize et al .: Pengaruh Waktu Ekuilibrasi…..
semen  characteristics  of  frozen-thawed ram  spermatozoa  in  a  semi-arid  tropical environment. Small  Ruminant  Research 43: 23-29.
Bearden H, Fuquay J,  Willard S. 2004. Applied Animal  Reproduction  (6th  ed.).  Pearson Prentice Hall.
Bebas W,  Gorda W. 2020. Kadar Krioprotektan gliserol  dan  dimethylsulfoxide  terbaik pada  pengencer  astaxanthin  fosfat  kuning telur  bebek  terhadap  kualitas  semen  beku babi. Jurnal Veteriner 21(1): 115-123.
Best B. 2006. Viability, Cryoprotectants toxicity and chilling injury in cryonics. https://www.benbest.com/cryonics/viable. html.
Febriani  G,  Hamdan,  Melia  J.  2014.  Pengaruh waktu ekuilibrasi terhadap kualitas semen kerbau  lumpur  (Bubalus  bubalis)  setelah thawing. Jurnal Medika  Veterinaria 8(1): 1-3.
Feka  W,  Dethan  A,  Beyleto  V.  2016.  Pengaruh lama waktu penyimpanan terhadap viabilitas  dan  pH  semen  babi  landrace yang  diencerkan  menggunakan  bahan pengencer  sitrat  kuning  telur. Journal  of Animal Science 1(3): 34-35.
Feradis M. 2010. Bioteknologi Reproduksi pada
Ternak (1st ed.). Alfabeta.
Foeh  NDFK.  2015.  Kualitas  semen  beku  babi
dalam pengencer BTS dan MIII menggunakan  krioprotektan  dimethyl- acetamide  dan  gliserol  dengan  sodium dedocyl sulphate. Institut Pertanian Bogor.
Foeh  NDFK,  Arifiantini  RI,  Yusuf  TL.  2017.
The  quality  of  boar  frozen  semen  diluted in  bts®  and  mii®  with  different cryoprotectant supplemented with sodium dodecyl  sulphate. Jurnal  Kedokteran Hewan 11(1): 6-10.
Garner DL, Hafez ESE. 2000. Spermatozoa and seminal  plasma.  Reproduction  in  Farm Animals, 96-109.
Herdis,  Rizal  M.  2008.  Inseminasi  Buatan  pada Domba. Rineka Cipta.
Johnson  LA,  Weitze  KF,  Fiser  P,  Maxwell WMC.  2000.  Storage  of  boar  semen. Animal  Reproduction  Science 62(1-3): 143-172.
Kaka  A.  2020.  Karakteristik  dan  daya  fertilitas spermatozoa  babi  peranakan  landrace. Jurnal  Peternakan  Indonesia 22(3):  277- 283.
Knox R. 2006. Semen  Processing, Extending &
Storage  For  Artificial  Insemination  In Swine.  Departement  of  Animal  Sciences University of Illinois Publications, 1-7.
Kostaman  T,  Sutama  IK.  2006.  Studi  motilitas dan  daya  hidup  spermatozoa  kambing boer  pada  pengencer  tris-sitrat-fruktosa. Jurnal Sains Veteriner 1(24): 58-64. Naing  SW,  Wahid  H,  Azam  KM,  Rosnina  Y, Zuki AB, Kazhal S, Bukar MM, Thein M, Kyaw T, San MM. 2010. Effect of sugars on  characteristics  of  Boer  goat  semen after cryopreservation. Animal Reproduction Science 122(1-2): 23-28. Nalley WM, Handarini R, Yusuf TL, Purwantara  B,  Semiadi  G.  2011.  The effect  of  glycerol  concentration  in  Tris glucose  egg  yolk  extender  on  the  quality of  Timor  Deer  frozen  semen. Journal  of the Indonesian Tropical Animal Agriculture 36(2): 91-96.
Pangestu M. 2002. Preservation of spermatozoa:
methods  and  applications.  indonesian forum  on  reproduction. Journal  on Reproduction 1(2): 55-56.
Parker  J.  2000.  Reproductive  Physiology  In Poultry  (E.  Hafez  (ed.)).  Lippincott Williams & Wilkins.
Salamon  S,  Maxwell  W.  2000.  Storage  of  ram semen. Animal  Reproduction  Science 62(1-3): 77-111.
Sangma TFM, Kutubuddin A, Mitali DC, Galib UZ,  Nekibuddin  A,  Arunoday  D.  2020. Characteristics of fresh crossbred Hampshire boar semen. Haryana Veterinarian 59(1): 98-101.
Subrata I, Artiningsih N, Sumardani N, Putra W, Umiarti  A.  2014.  Pengaruh  bahan pengencer  biologis  terhadap  kualitas semen babi Hampshire. Prosiding. Fakultas Peternakan Universitas Udayana.
Suherlan  NE,  Soeparna,  Hidajat  K.  2015.
Pengaruh  penambahan  berbagai  tingkat DMF  (dimethylformamide)  sebagai  agen krioprotektan terhadap keutuhan membran plasma  dan  recovery  rate  semen  beku domba lokal. Jurnal
Ilmu-Ilmu
Peternakan 4(4): 1-12.
Sumardani  N.  2007.  Viabilitas  dan  fertilitas spermatozoa  dalam  modifikasi  pengencer BTS  dan  zorlesco  dengan  penyimpanan berbeda  dalam  rangkaian  inseminasi buatan pada babi. Thesis. Institut Pertanian Bogor.
Jurnal Nukleus Peternakan (Desember  2021) Volume 8, No. 2:150-160                    pISSN : 2355-9942,    eISSN:2656-792X Marlize et al .: Pengaruh Waktu Ekuilibrasi…..
Sumardani N, Budaarsa K, Putri TI, Puger AW.
2019.  Umur  memengaruhi volume  semen dan  motilitas  spermatozoa  babi  landrace di  Balai  Inseminasi  Buatan  Baturiti, Tambanan,  Bali. Jurnal  Veteriner 20(3): 324-329.
Sumardani  N,  Tuty  L,  Siagian  P.  2008. Viabilitas spermatozoa babi dalam pengencer  BTS  (Beltsville  Thawing Solution) yang dimodifikasi pada penyimpanan  berbeda. Media  Peternakan 31(2): 81-86.
Surachman  M,  Herdis,  Yulnawati,  Rizal  M,
Maheshwari H. 2009. Kualitas semen cair
asal  epididimis  kerbau  belang  dalam bahan pengencer andromed yang mendapat  penambahan  sukrosa. Media Peternakan 32(2): 88-94.
Umar  S,  Maharani M.  2005.  Pengaruh  berbagai waktu  ekuilibrasi  terhadap  daya  tahan sperma sapi limousin dan uji kebuntingan. Jurnal Agribisnis Peternakan 1(1): 17-21. Yusuf  T,  Arifiantini  R,  Dapawole  R,  Nalley WM.  2017.  Kualitas  semen  beku  babi dalam pengencer komersial yang disuplementasi  dengan  trehalosa. Jurnal Veteriner 18(1): 69-75.