## Keragaan dan Karakter Fase Pertumbuhan In VitroPutatif  Mutan  Anggrek  Hitam Kalbar Hasil Induksi Mutasi Secara Kimia
Performance and Characteristics of the In Vitro Growth Phase Putative Mutant Black Orchid in West Kalimantan Results of Chemical Induction of Mutations

## Asnawati dan Agustina Listiawati
Program Studi Agroteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Tanjungpura email : asnawati@faperta.untan.ac.id

## Abstract
Putatif  mutants  of  West  Kalimantan  black  orchids  obtained  through  mutation activities  need  to  be  evaluated  for  their  growth  character  and  performance  early,  starting from the vegetative phase at the in vitro stage. This study aims to determine the performance and character of the in vitro putatif growth phase of West Kalimantan black orchid mutants. The research was carried out at the Biotechnology Laboratory of the Faculty of Agriculture, Tanjungpura  University  from  April-October  2023.  The  experiment  was  conducted  using Complete Randomized Design. As a treatment were 6 in vitro bud clones of black anggtek (5 putatif mutant clones derived from 5 EMS concentration levels and 1 wild type plant clone as kontrol). The clones are K (as kontrol plant) and M, N, O, P and Q clones each resulting from EMS concentration 0; 0,25; 0,50; 0,75; 1.00 and 1.25%.  The treatment was repeated 5 times and  each  repetition  consisted  of  5  samples,  resulting  in  a  total  of  150  experimental  units. Variabels  observed  include:  Changes  in  plant  weight,  time  of  emergence  of  shoots,  time  of emergence of roots, increase in the number of leaves, number of shoots and number of roots. The  results  of  the  study  showed  that  the  mutant  mutant  M  clone  had  the  best  fertility compared to other clones and control plants. There was a  difference in vitro  growth phase characteristics  in all mutant clones of black orchids compared to control plants, except that the clone O still showed the same growth characteristics as the control plants.
Keywords : Black orchid, In vitro, Performance, Putatif Mutant, Vegetative growth

## Abstrak
Putatif mutan anggrek hitam Kalimantan Barat yang diperoleh melalui kegiatan mutasi perlu  dievaluasi  keragaan  dan  karakter  pertumbuhannya  sejak  dini,    yang  dimulai  dari  fase vegetative  pada  tahap  in  vitro.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  keragaan    dan karakter  fase  pertumbuhan  in  vitro  putatif  mutan  anggrek  hitam  Kalbar.  Penelitian dilaksanakan  di  Laboratorium  Bioteknologi  Fakultas  Pertanian  Uniersitas  Tanjungpura  dari bulan  April-Oktober  2023.  Percobaan  dilakukan  menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap. Sebagai  perlakuan  adalah  6  klon  tunas  in  vitro  anggtek  hitam  (  5  klon  putatif  mutan  yang berasal  dari  5  taraf  konsentrasi  EMS  dan  1  klon  tanaman  wild  type  sebagai  kontrol).  Klon- klon tersebut adalah K (sebagai tanaman kontrol) dan klon M, N, O, P dan  Q yang masing- masing  dihasilkan  dari  konsentrasi  EMS  0;  0,25;  0,50;  0,75;  1,00  dan  1,25%.    Perlakuan diulang sebanyak 5 kali dan tiap ulangan terdiri dari 5 sampel, sehingga keseluruhan terdapat 150  unit  percobaan.  Variabel  yang  diamati  meliputi  :  Perubahan  bobot  tanaman,  waktu
muncul tunas, waktu muncul akar, pertambahan jumlah daun, jumlah tunas dan jumlah akar. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  putatif  mutan  klon  M  memiliki  keragaan  yang  terbaik dibanding  klon-klon  lainnya  maupun  tanaman  kontrol.  Terdapat  perbedaan  karakter  fase pertumbuhan in  vitro pada  semua  klon  putatif  mutan  anggrek  hitam  dbanding  tanaman kontrol,  kecuali  klon  O  masih  menunjukkan  karakter  pertumbuhan  yang  sama  dengan tanaman kontrol.
Kata Kunci : Anggrek hitam, In vitro, Keragaan, Pertumbuhan vegetatif, Putatif  Mutan

## PENDAHULUAN
Tanaman  anggrek  termasuk  dalam famili Orchidaceae yang  merupakan  salah satu  keluarga  tanaman  bunga-bungaan yang  paling  besar.  Karakteristik  anggrek yang  unik  menjadi  daya  tarik  tersendiri, sehingga  banyak  diminati  oleh  konsumen, termasuk anggrek hitam. Tanaman anggrek hitam  memerlukan  kondisi  kelembaban yang  cukup  tinggi  untuk  pertumbuhan yang  optimal  (Maimunah  dan  Syahbudin 2020). Selain memiliki keindahan, anggrek hitam  juga  memiliki  kehususan  tertentu sebagai  tanaman  endemik  di  suatu  daerah sehingga  rentang  keragaman  genetiknya sempit, termasuk anggrek hitam Kalimantan  Barat  (Kalbar).    Oleh  karena itu,  sangat  perlu  untuk  melakukan  upaya- upaya  untuk  meningkatkan  keragaman karakteristik  dari  anggrek  hitam  tersebut, salah satunya melalui kegiatan mutasi.
Perubahan  genetik  yang  terjadi  akibat adanya  mutasi  bukanlah  disebabkan  oleh perubahan  rekombinasi,  melainkan  terjadi secara acak berupa eleminasi, penambahan gen-gen  tertentu  pada  tempat  tidak seharusnya, sehingga kejadiannya unpredictable (Lestari,  2016).  Hal  ini berbeda dengan pemuliaan melalui persilangan, pemuliaan mutasi dapat digunakan  untuk  memperoleh  varietas
unggul dengan memperbaiki beberapa sifat yang diinginkan, tanpa mengubah sebagian besar sifat baiknya.
Kegiatan    mutasi  dapat  dilakukan secara  kimia  menggunakan  bahan  kimia tertentu  seperti ethyl  metano  sulfonate (EMS) maupun secara fisik melalui radiasi.
Selanjutnya  individu-individu  baru  yang diduga  telah  mengalami  mutasi  perlu dilakukan  evaluasi  untuk  mengidentifikasi perubahan  yang  terjadi.  Secara  dini evaluasi  dapat  dilakukan  ditingkat in  vitro pada fase vegetatif untuk menilai keragaan pertumbuhan  atau  performa  putatif  mutan yang  dihasilkan,  misalnya  perubahan karakter morfologinya.
Identifikasi  morfologi  adalah  proses yang digunakan untuk mengetahui karakter fenotip dari suatu tanaman. Identifikasi ini dapat dilakukan melalui proses karakterisasi  pada  tanaman  yang  telah diperlakukan dengan EMS tersebut. Karakterisasi  membantu dalam memahami perbedaan morfologi yang dimiliki tanaman.  Walaupun  banyak  pendekatan yang  dipakai  dalam  sistem  klasifikasi, namun semuanya berpangkal pada karakter morfologi (Brando & Darmawan, 2019).
Karakterisasi  secara  morfologi  dapat dilakukan  dengan  mengamati  karakter- karakter  morfologi  yang  ditunjukkan  oleh tanaman  sejak  fase  vgetatif,  bahkan  saat
tanaman  masih  didalam  botol  atau  secara in  vitro (Hartati  dan  Darsana.  2015).
Kegiatan  ini  akan  banyak  menghemat waktu,  terutama  untuk  tanaman-tanaman yang secara genetik memang pertumbuhannya  lambat,  seperti  pada tanaman anggrek termasuk  anggrek  hitam. Karakterisasi  anggrek  dilakukan  dengan mengamati  ciri  morfologi  yang  terdapat pada  masing-masing  anggrek  dengan menggunakan panduan karakterisasi tanaman hias dari Komisi Nasional Plasma
Nutfah  (2004).  Karakterisasi  berdasarkan karakter  morfologi  (daun,  batang,  umbi, buah,  akar)  dapat  menentukan  jenis pemanfaatan dari tanaman yang dikarakterisasi.  Beberapa  varian  hasil induksi  mutasi  melalui  perendaman  dalam EMS  mengalami  perubahan  morfologi daun,  yaitu  berbentuk  kipas,  memanjang, dan  perubahan  lainnya  pada pseudobulb dan performa pertumbuhannya (Tran, et al 2022).  Hasil  keragaan  dan  karakterisasi salah  satunya  dapat  digunakan  untuk mendiskripsikan  keragaman  sifat  atau karakter  morfologi  pada  mutan-mutan yang dihasilkan.
Beberapa  varian  hasil  induksi  mutasi melalui perendaman dalam EMS mengalami  perubahan  morfologi  daun, yaitu  berbentuk  kipas,  memanjang,    dan perubahan  lainnya  pada pseudobulb dan performa  pertumbuhannya  (Tran, et  al 2022).  Hasil  keragaan  dan  karakterisasi salah  satunya  dapat  digunakan  untuk mendiskripsikan  keragaman  sifat  atau karakter  morfologi  pada  mutan-mutan yang dihasilkan.
Dari penelitian yang dilakukan sebelumnya,  dengan  menginduksi  mutasi pada  anggrek  hitam  Kalbar  menggunakan beberapa konsentrasi EMS, sudah
dihasilkan  tanaman-tanaman  yang  diduga sudah  mengalami  perubahan  (putative mutan). Untuk itu perlu dilakukan evaluasi awal  berupa  penilaian  keragaan  fase pertumbuhan  vegetatifnya  dimulai  pada fase in  vitro .  Pengamatan  dapat  dilkukan dengan  menilai  keragaan  dan  karakter morfologi  dari  tanaman  putatif  mutan tersebut. Berdasarkan uraian tersebut maka penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui keragaan dan kerakter fase pertumbuhan in vitro putatif mutan Anggrek Hitam Kalbar.

## METODOLOGI

## Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian adalah: laminar air flow cabinet, autoclave,  pH  meter ,  timbangan  analitik, hot  plate,  magnetic  strirer,  botol  kultur, glass  ware ,  dissection  set,  dan  peralatan lain yang mendukung penelitian
Bahan yang digunakan adalah tunas in  vitro  putatif  mutan anggrek  hitam , komposisi  bahan  media Murashige  and Skoog (MS),  ZPT  (BAP  &  NAA),  KOH dan  HCL, detergen ,  bayclin, alumunium foil ,  spritus,  alkohol  70  %  dan  96  %, sukrosa, agar-agar , aquades steril , betadine , tissue , karet gelang, plastik tahan panas,  masker,  sarung  tangan,  dan  lain- lain.
Metode Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Tanjugpura Pontianak. Pelaksanaan penelitian
berlangsung  dari  bulan  April  sampai dengan Oktober 2023.
Rancangan  yang  digunakan  adalah Rancangan  Acak  Lengkap  satu  faktor, yang  terdiri  dari  6  klon  hasil  penelitian
sebelumnya.  klon-klon  yang  dimaksud adalah sebagai berikut : K, M, N, O P dan Q  (  hasil  dari  perlakuan  EMS  0%,  0,25%, 0,5%,0,75%  1,25%).  Perlakuan  diulang sebanyak  5  kali  dan  masing-masing ulangan  terdiri  dari  5  individu  sebagai sampel.    Keseluruhan  terdapat  150  satuan percobaan.
Pelaksanaan penelitian diawali dengan  proses  sterilisasi  lingkungan  kerja umum  (ruang  kutur)  dan  pada  lingkungan spesifik laminar  air  flow  cabinat (LAFC).
Permukaan  meja  kerja  pada  LAFC  selalu dibersihkan dengan alcohol 70%, kemudian  diberikan  cahaya  dengan  lampu ultra  violet  (UV)  selama  1  jam  sebelum bekerja.  Demikian  pula  dengan  peralatan dissection  set  selalu  disterilkan  dengan autoclave selama 1 jam sebelum digunakan,  dan  direndam  dalam  larutan alkohol  96%  selama  bekerja  dalam laminar.  Apabila  kegiatan  telah  selesai dilakukan  maka  LAFC    dibersihkan kembali menggunakan alkohol 70%.
Sterilisasi  alat  dan  media  yang digunakan  dimulai  dengan  pencucian peralatan  sampai  bersih  menggunakan detergen dan disenfektan lalu  dibilas  dan ditiriskan sampai kering. Aquades disterilisasi  dengan  cara  dimasukkan  ke dalam  wadah  botol  yang  ditutup  dengan penyumbat  botol  serta  plastik  tahan  panas lalu  dikencangkan  dengan  karet  gelang begitu  pula  dengan  media.    Sterilisasi  alat dan  aquades  menggunakan autoclave membutuhkan  waktu selama  60  menit sedangkan  media  membutuhkan  waktu  15 menit  dengan  suhu  121 o C  pada  tekanan 17,5 psi .
Selanjutnya adalah pembuatan media yang  digunakan  untuk  menumbuhkan eksplan.  Media  dasar  yang  digunakan
adalah  media  Murashige  dan  Skoog  (MS) dengan  penambahan  sukrosa  30  g/l.  Cara yang dilakukan untuk memudahkan pembuatan  media  MS  adalah  dengan membuat  larutan  stok  seperti  hara  makro, yaitu  Stok    A  (NH 4 NO 3 ),  stok  B  (KNO 3 ), stok C (CaCl 2 .2H 2 O), stok D,
(MgSO 4 .7H 2 O)  dan  (KH 2 PO4),  stok  E (FeSO4.7H 2 O  dan  Na  EDTA.2H 2 O).  Stok hara  mikro,  yaitu  stok  F  (MnSO 4 .H2O, ZnSO4.H 2 O,  H 3 BO 3 ,  KI,  Na 2 MoO 4 .2H 2 O, 1 mg CoCl 2 .6H 2 O, dan 1 mg CuSO 4 .5H 2 O).  selain  itu,  dibuat  juga  stok vitamin  (Tiamin  HCl,  Piridoksin  HCl,
Asam  Nikotinat,  dan  Glisin),  stok  Myo- inositol dan stok hormon (NAA dan BAP). Khusus  stok  besi  (Fe)  dibungkus  dengan alumunium  foil.    stok  vitamin  yang  terdiri dari  serta Myoinositol. Semua larutan stok diberi label tanggal pembuatan dan jumlah yang diperlukan untuk setiap liter media.
Media  tumbuh  dibuat  dengan mencampur  larutan  larutan  stok,  vitamin, Myo-inositol  dan  hormon  kedalam  gelas piala  sesuai  dengan  ketentuan  masing- masing  kemudian  ditambahkan  dengan aquadest  steril  sampai  mendekati  volume yang diinginkan, dan kemudian pH diukur dengan pH meter.  Bila media terlalu basa maka  ditambahkan  HCl  1  N  dan  bila terlalu  asam  ditambahkan  KOH  1  N sehingga  didapatkan  pH  5,8.    Setelah  itu ditambah  aquadest  steril  sampai  volume yang  diinginkan,  selanjutnya  tambahkan agar-agar sebagai pemadat sebanyak 7g/liter,  dan  sukrosa  30  gram/liter  dan ditambah 0,1 ppm NAA dan 0,5 ppm BAP.
Media dimasak diatas pemanas dan untuk melarutkan agar digunakan pengaduk  atau  magnetik  stirer.    Selama pemanasan  media  diaduk  secara  teratur sampai  larutan  mendidih  dan  terlihat
jernih.    Selanjutnya  media  yang  masih panas  dituangkan  kedalam  botol-botol kultur yang sudah steril, masing masing 25 ml/botol.    Botol  -botol  tersebut  ditutup dengan  plastik  tahan  panas  dan  diikat menggunakan  karet  gelang.  Selanjutnya disterilkan  ke  dalam autoclave dengan tekanan  17,5 psi dengan  suhu  121 o C selama 20 menit.
Penanaman tunas in vitro dilakukan dengan  cara tunas in  vitro dari  masing- masing klon dipisah-pisahkan per individu sehingga menjadi satu tunas saja, kemudian ditanam pada media yang sudah disiapkan.    Tunas  yang  digunakan  adalah tunas yang seragam dengan jumlah daun 5 lembar.  Botol-botol  yang  telah  ditanami eksplan  ditempatkan  pada  rak  kultur  atau rak  tumbuh  yang  diberi  cahaya  lampu  TL 40  watt.    Penyinaran  dilakukan  selama  16 jam/hari  dengan  suhu  ruangan  diatur hingga  mencapai  suhu  antara  24-25%. Peletakan botol-botol kultur  tersebut disesuaikan  dengan  denah  penelitian  yang sudah dibuat untuk RAL sebelumnya
Eksplan  yang  sudah  ditanam  pada media akan dipelihara pada ruang thermostatic  dengan  pengaturan  suhu  23 o C dan fotoperiodesitas 16 jam gelap dan 8 jam  terang.  Setiap  individu  akan  diamati pertumbuhan  dan  perkembangannya  dan akan  dicatatkan  sesuai  variabel  yang diamati. Variabel yang akan diamati dalam penelitian  ini  adalah  Pertambahan  bobot tanaman  (g),  Pertambahan  jumlah  daun (helai),  Waktu  terbentuk  tunas  (minggu), Jumlah  tunas,  Waktu  munculnya  akar, Jumlah Akar.

## Analisis Data
Untuk mengetahui pengaruh perlakuan  yang  diberikan,  maka  data pengamatan  semua  variabel  akan  duji dengan  Analysis  of  Variance  (ANOVA). Jika  hasil  ANOVA  berpengaruh    nyata maka akan dilanjutkan dengan uji Duncan’s  Multiple  Range  Test  (DMRT) pada taraf 5% untuk mengetahui perbedaan antar taraf perlakuan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengamatan terhadap variabel- variabel  pertumbuhan  tanaman  putatif mutan anggrek hitam dilakukan setiap hari, namun  pencatatan  hasil  dilakukan  setiap minggu. Data hasil pengamatan selanjutnya dianalisis keragamannya menggunakan RAL. Hasil analisis keragaman  menunjukkan  bahwa  klon-klon putatif  mutan  berpengaruh  nyata  terhadap keragaan  tanaman  yang  dihasilkan  yaitu pada  variabel  pertambahan  jumlah  daun, bobot  tanaman,  jumlah  tunas  dan  jumlah akar. Klon-klon putatif mutan berpengaruh tidak  nyata  pada  pengamatan  waktu muncul  tunas  dan  akar  Untuk  melihat perbedaan  keragaan  antar  klon  tersebut, maka  dilakukan  uji  lanjut  menggunakan Duncan’s  Multiple  Range  Test  (DMRT) 5%  pada  variabel  pertambahan  jumlah daun,  bobot  tanaman,  jumlah  tunas  dan jumlah  akar.  Hasil  DMRT  5  %  terhadap variabel  pengamatan  pertumbuhan  klon- klon putatif mutan anggrek hitam disajikan pada Tabel 1.

## Tabel 1.  Keragaan pertumbuhan putatif mutan anggrek hitam Kalbar
konsentrasi EMS (%) Rerata Pertambahan Jumlah daun Bobot Tanaman Jumlah Tunas Jumlah Akar K 3,250 b 1,081 c 1,889 a 1,778 a M 3,621 a 1,181a 1,556 ab 1,333 b N 3,352 b 1,134 b 1, 222 bc  1,222 b O 2,592 b 1,056 cd 1,000 c 1,111 b P 2,388 cd 1,0267 d 1,000 c 1,000 b Q 2,221 d 1,0211 d 1,000 c 1,000 b
Keterangan :  Angka  yang  diikuti  oleh  huruf  yang  sama,  pada  kolom  yang  sama, menunjukkan berbeda tidak nyata pada uji DMRT 5%
Tabel 2. Deskripsi klon-klon putatif mutan Anggrek hitam Kalbar
Keragaan  klon  putatif  mutan  diukur melalui variabel pertambahan jumlah daun, bobot  tanaman,  jumlah  tunas  dan  jumlah akar,  serta  kecepatan  waktu  muncul  tunas dan  akar.  Performa  kecepatan  muncul tunas  dan  akar  relatif  sama  pada  semua klon  putatif  mutan  dengan  tanaman kontrol.
Tabel  1  menunjukkan  bahwa  untuk pertambahan  jumlah  daun  dan  bobot
tanaman, klon N putatif mutan menghasilkan  pertambahan  jumlah  daun tertinggi  dan  berbeda  nyata  dengan konsentrasi  lainnya  termasuk  tanaman kontrol. Sebaliknya untuk jumlah akar dan jumlah tunas tanaman kontrol (K) menghasilkan  tunas  dan  akar  yang terbanyak  dan  berbeda  nyata  dengan semua klon putatif mutan (klon M, N, O, P dan  Q).  Perbedaan  tersebut  merupakan
Bagian
Tanaman Perlakuan Kontrol (K) Klon (M) Klon (N) Klon (O) Klon (P) Klon (Q) ukuran sedang Kecil kecil sedang sedang sedang Bentuk pertumbuhan sympodial sympodial sympodial  sympodial  Monopodial memanjat sympodial Panjang Daun sedang Sedang Sedang Sedang pendek Pendek Lebar Daun sedang sempit sempit sedang sedang sedang Bentuk daun pita pita pita pita pita pita Bentuk ujung daun lancip Meruncing  Meruncing lancip lancip lancip
Simetri daun simetris simetris simetris simetris simetris simetris Susunan daun Tergulung bersama Tergulung bersama Tergulung bersama Tergulung bersama Tergulung bersama Tergulung bersama
akibat  dari  perbedaan  konsentrasi  EMS yang  diberikan  untuk  menginduksi  mutasi pada  tunas  in  vitro  anggrek  hitam  pada percobaan sebelumnya.
Percepatan  penbentukan  daun  dan tunas  pada  klon  M  putatif  mutan dibandingkan  tanaman  kontrol  dan  klon lainnya  menunjukkan  mutasi  yang  terjadi brsifat  positif  bagi  tanaman.  Sebaliknya, pada klon N, O, P dan Q cenderung terjadi perlambatan  pertumbuhan  seiring  dengan meningkatnya  konsentrasi  EMS  yang mereka  terima  sebelumnya,  selama  proses induksi  mutasi.  Hal  ini  juga  ditunjukkan dari  terjadinya  penurunan  bobot  tanaman, walaupun  tanaman  menambah  daun  baru. menurut  Priyono  &  Agung  (2002),  mutasi menyebabkan terjadinya perubahan struktuk  nukleutida  pada  bagian  tanaman akibat  pemberian  mutagen  kimia  (EMS) sehingga  turut  pula  merubah  system fisiologi  pada  tanaman.  Ditambahkan Purwati et  al (2008),  adanya  penurunan bobot  massa  tanaman,  padahal  terjadi pertumbuhan,  dapat  disebabkan  adanya perubahan  struktur  jaringan  penyusun organ  (daun),  sehingga  merubah  ketebalan daun, akar, dan seterusnya.
Menurut  Nurhayani  (2017)  EMS  yang bersifat  sebagai  agen  pengkelat  dapat menyebabkan  terjadinya  mutasi  titik, sehingga mereduksi sifat fertilasi, penghambatan kemampuan jaringan membentuk  tunas  dan  pada  akhirnya mengalami kematian. Sebelumnya, Qosim,
et al (2015) telah mengatakan bahwa setiap sel  meristem  yang  terdapat  dalam  eksplan yang  digunakan mempunyai  potensi  untuk membentuk  tunas  baru,  namun  pemberian mutagen  kimia  EMS  dapat  menyebabkan perubahan  fisiologis  dari  sel-sel  tersebut yang perubahannya bergantung dari
sensitivitas  sel-sel  meristem  penyusun eksplan tersebut yang menimbulkan perubahan  potensi  sel  di  dalam  jaringan eksplan  untuk  meregenerasikan  tunas sehingga  menimbulkan  perbedaan  respons eksplan.
Seperti yang dikemukakan Qosim, et al (2017) bahwa kematian sel tanaman akibat mutagen  kimia  EMS  dapat  terjadi  secara langsung,  yaitu  kerusakan  DNA  atau akibat  tidak  langsung,  yaitu  adanya pengaruh  toksik  sehingga  mengakibatkan sel tidak mampu meregenerasi membentuk tunas.  Diduga    pengaruh  perlakuan konsentrasi  EMS  yang  diberikan  yang diberikan  sudah  menyebabkan  kerusakan pada jaringan eksplan yang dapat menyebabkan perubahan susunan nukleotida walaupun dalam skala kecil.
Konsentrasi  yang  terlalu  tinggi dalam  penggunaan  EMS  pada  eksplan dapat  mempengaruhi  regenerasi  sel  dan dapat menyebabkan kematian sel. Letalitas yang  terjadi  akibat  pekatnya  larutan  EMS yang  diserap  oleh  eksplan  sehingga menyebabkan  regenerasi  tunas  mengalami penurunan.  Menurut  Bhagwat  &  Duncan (1998)  dalam  pemuliaan  mutasi  pada umumnya  frekuensi  mutasi  meningkat dengan meningkatnya konsentrasi mutagen kimia. Handayati, et al (20070 mengatakan bahwa  dri  hasil  penelitian  pada  beberapa jenis tanaman menunjukkan metode regenerasi  yang  telah  ada  belum  tentu dapat  diaplikasikan  pada  jenis  lainnya walaupun dalam spesies yang sama.
Tabel 2, menunjukkan terjadi perubahan karakter pertumbuhan pada klon M  dan  N  ukuran  pertumbuhan  tanaman menjadi  katagori  kecil,  sementara  klon  P tipe  pertumbuhannya  menjadi  monopodial memanjat.  Untuk  karakter  daun,  terjadi
perubahan Panjang daun
menjadi memendek  pada  klon  P  dan  Q,  serta  lebar daun  menjadi  menyempit  dan  ujung  daun menjadi  meruncing  pada  klon  M  dan  N. pada  karakter  bentuk  daun,  simetri  daun dan  susunan  daun  tidak  terjadi  perubahan pada  semua  klon.  Perubahan  morfologi yang  yang  terjadi  pada  klon-klon  putatif mutan  ini  menunjukkan  sudah  terjadi perubahan  stukruk  gen  pada  putatif  mutan anggrek  hitam  akibat  terjadinya  mutasi yang disebabkan oleh mutagen EMS.
Perubahan karakter pertumbuhan morfologi  ini  perlu  waktu  yang  panjang untuk membuktikan fenomena yang berlangsung  apakah  bersifat  menetap  atau dapat  balik.  Menurut  Van  Harten,  1998, penggunaan  EMS  pada  konsentrasi  yang rendah banyak digunakan untuk menstimulasi  perubahan  fisiologi  dan mungkin  juga  morfologi  dari  tanaman anggrek  dan  meningkatkan  deferensiasi sel.  Menurut  Purwati, et  al (2008),
konsentrasi  EMS  yang  terlalu  tinggi  dapat mengakibatkan  toksisitas  pada  tanaman akibat  dari  terhambatnya  pembelahan  sel tanaman yang dapat menyebabkan letalitas pada tanaman dan terhambatnya pembetukan tunas tanaman.

## KESIMPULAN
Dari hasil penelitian yang dilakukan  dapat  dikesimpulkan  bahwa putatif  mutan  klon  M  memiliki  keragaan yang  terbaik  dibanding  klon-klon  lainnya maupun tanaman kontrol. Terdapat perbedaan  karakter  fase  pertumbuhan in vitro pada  semua  klon  putatif  mutan anggrek  hitam  dbanding  tanaman  kontrol, kecuali  klon  O  masih  menunjukkan karakter pertumbuhan yang sama.

## DAFTAR PUSTAKA
Baghwat,  B.,  dan  E.J.  Duncan.  1998. “Mutation  breeding  of  Highgate (Musa  acuminata,  AAA)  for tolerance  to Fusarium  oxysporum f.  sp.  cubense  using  gamma irradiation.” Jurnal  Euphytica, Edisi 101
hlm. 143-150. DOI :10.1007/BF00042311 Brando  Renzo  Marganda  Purba  dan Darmawan Saptadi. 2019. Karakterisasi Beberapa Jenis Anggrek  Berdasarkan  Karakter Morfologi. Jurnal Produksi Tanaman Vol. 7 No. 7, Juli 2019: 1258–1263 ISSN: 2527- 8452. DOI :10.21776/ub.protan.20 23.010.01.01 Handayati, W.D., I. Mariska, R. Purnamaningsih, dan Darliah. 2007.  Peningkatan  keragaman genetik  mawar  mini  melalui kultur  in  vitro  dan  iradiasi  sinar gamma. Jurnal  Berita  Biologi , 5(4):365-371.
DOI : 10.14203/ beritabiologi .v21i1.409
0
Hartati.  S  dan  L.  Darsana.  2015.
Karakterisasi Anggrek Alam secara  Morfologi  dalam  Rangka Pelestarian Plasma Nutfah . Jurnal Agronomi  Indonesia .  43  (2):  133- 139.
DOI :
10.24831/ija.v51i1.45161
Lestari  EG.  2016.  Pemuliaan  Tanaman Melalui  Induksi  Mutasi  Dan Kultur In  Vitto .  Jakarta.  IAARD
PRESS
Maimunah,  S.  dan  Syahbudin,  A.  2020.
Anggrek
Hutan Kerangas
Kalimantan  Tengah .  Palangka Raya: FPK Universias Muhamadiah Palangka Raya. Nurhayani, S. 2017. Pengaruh Konsentrasi dan  Durasi  Perendaman  Ethyl Methane Sulphonate (EMS) Terhadap  Pertumbuhan  Bambusa balcooa  Roxb.  Dan  Bambusa beecheyana Munro Melalui Kultur In Vitro. Jurnal Mathematical  and  Fundamental
Science .  6(2):139-148. DOI: 10.5614/j.math.fund.sci.
Purwati,  RD.,  Sudjindro,  KE.,  Sudarsono.
2008. Keragaman Genetika Varian  Abaka  Yang  Diinduksi Dengan Ethyl Methane Sulphonate  (EMS). Jurnal  Littri . Vo14(1):16-24. DOI : 10.21082/ littri .v23n2.2017.72-82
Priyono  &  Agung,  SW  2002,  Respon regenerasi  in  vitro  eksplan  sisik mikro Kerk Lily ( Lilium longiflorum ) terhadap Ethyl Methane Sulfonate (EMS). Jurnal.  Ilmu  Dasar .  vol.  3,  no.  2, hlm. 74-79. DOI : 10.19184/jid.v24i1.16792 Purwati,  RD.,  Sudjindro,  KE.,  Sudarsono. 2008. Keragaman Genetika Varian  Abaka  Yang  Diinduksi Dengan Ethyl Methane Sulphonate  (EMS). Jurnal  Littri .
Vo14(1):16-24. DOI: 10.21082/jlittri.v14n1.2008.1
6-24
Qosim,  WA.,  Istifadah,  N.,  Yunitasari.
2012.  Pengaruh  Mutagen  Etil Metan Sulfonat Terhadap Kapasitas Regenerasi Tunas
Hibrida  Phalaenopsis  In  Vitro.
Jurnal Hort. 22(4):360-365. DOI : 10.29244/jhi.14.1.33-39
Qosim,  WA.,  Yuwariah,  Y.,  Hamdani.,
Rachmadi,  M.,  Perdani,  SM.,. 2015.  Pengaruh  Mutagen  Etil Metan Sulfonat terhadap Regenerasi  Tunas  Pada  Dua Genotip Manggis Asal Purwakarta dan Pandeglang. Jurnal Hort Ind. 25(1):9-14. DOI : 10.29244/jhi.14.1.33-39
Tran  T  K  P,  Minh  H  P,  Thi  Huong  T, Sasanti  W,  Viet  T  H.  2022. Investigation  Of  The  Genetic Diversity  of  Jewel  Orchid  In Vietnam  Using  RAPD  and  ISSR markers. Jurnal  BIODIVERSITAS Volume 23, No 9: hal 4816-4825. DOI : 10.13057/biodiv/d160101 Van Harten AM. 1998. Mutation Breeding. Theory  and  Practical  Aplication . UK : Press Syndicate of the Univ of Cambridge .