## DETEKSI MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSPECIES PARATUBERCULOSIS PADA SUSU FORMULA LANJUTAN DI BOGOR
[Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis Formula Milk in Bogor]
Widagdo Sri Nugroho 1,2) Mirnawati Sudarwanto 3) , Denny Widaya Lukman 3) , Rochman Naim 3) , Surachmi Setyaningsih 3) , Abdulwahed Ahmed Hassan 4) , dan Ewald Usleber 4)
1) Fakultas Kedokteran Hewan  Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia
2) Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Indonesia
3) Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor, Indonesia
4) Professur für Milchwissenschaften Institut für Tierärzliches Nahrungsmittelkunde der Justus-Liebig Universitat, Giessen, Germany.
Diterima  2 Januari 2008 / Disetujui  21 Mei  2008

## ABSTRACT
Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) becomes a public health concern in developed countries which  is usually associated to Crohn’s disease (CD) in human. The disease  shows similarities in clinical signs and pathology characteristic with John’s  disease  (JD)  in  ruminants  which  is  infected  by  MAP.  Researchers  in  Europe,  USA,  and  Australia  detected  MAP  in  their  dairy products  and  showed  the  relationship  among  MAP,  CD,  and  JD.  Meanwhile  Indonesia  imported  milk  and  milk  products  from  those countries to cover the national demand. This situation keeps MAP as potential-problem in national dairy herd and human health in the future. The aim of this study was to detect MAP in the formla milk for todler. Fifty samples from five established milk producers were taken on August 2006 at the supermarket in Bogor. Two seperate diagnostic methods were used parallel in this study i.e.: polymerase chain reaction method (PCR) with insertion sequence F 57 as the primer and the Mycobacterial Growth Indicator Tube (MGIT). Neither MAP grew in MGIT after 20 weeks of incubation period but 5 samples were found positive by nested PCR. Although there was no evidence weather MAP grew from the samples in this study, the comprehensive and sustainable studies on MAP should be carried out with more extensive and varied samples, as well as in human to provide data on MAP in Indonesia.
Key words : Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis, growing up milk formula, PCR F57

## PENDAHULUAN
Infeksi Mycobacterium  avium  subspecies paratuberculosis (MAP)  menjadi  perhatian  kesehatan masyarakat di Eropa dan Amerika. Mycobacterium avium subspecies  paratuberculosis termasuk  bakteri  dalam keluarga Mycobacteriaceae ,  spesies Mycobacterium avium  complex (Harris  &  Barletta,  2001).  Mikroba  ini merupakan bakteri yang dapat ditemui di alam, tergolong Gram positif, berbentuk batang dengan ukuran 0.2-0.7 X 1-10  μm,  non-motil,  tahan  asam  dan  alkohol,  suhu pertumbuhuan  25-45 o C  dan  optimal  39 o C,  tumbuh lambat 4 -24 minggu (Anonim, 2000) dan membutuhkan mycobactin J yaitu senyawa hidroksimat pengikat besi, mampu tumbuh pada konsentrasi garam < 5 % pada pH 5.5  atau  lebih  (Griffiths,  2003).  Bakteri  MAP  mampu bertahan  dalam  sel  makrofag  dan  patogen  intraseluler yang  menyerang  sel  epitel  sapi  dan  hewan  mamalia lainnya (Bannantine & Stabel, 2002). Selain tahan asam bakteri  ini  juga  tahan  terhadap  alkohol  dan  suhu  tinggi yang  merupakan  faktor  penting  terkait  dengan  peran MAP  dalam  penyebaran  penyakit  melalui  makanan
( foodborne disease ) yaitu yang dikenal sebagai Crohn's disease (CD) (Chiodini, 1989; Sung & Collins, 2003). Crohn's  disease adalah  keradangan  usus granuloma  pada  manusia.  Tampilan  keradangan  ini memiliki banyak kemiripan dengan Johne’s disease (JD) yaitu  penyakit  kronis  saluran  pencernaan  pada ruminansia  karena  infeksi  MAP  (Chiodini,  1989;  Bull  et al.,  2003;  Harris  and  Barletta,  2001).  Kedua  penyakit tersebut  berpengaruh  pada  ekonomi  dan  kesehatan manusia  seperti  yang  dilaporkan Europe  Scientific Comittee on Animal Health and Animal Welfare bahwa di Swedia  biaya  pengobatan  kasus  CD  pada  tahun  1994 mencapai  4  juta  €  dan  tingkat  kejadian  penyakit  ini  di Eropa mencapai 5,6 kasus per 100.000 orang per tahun (Anonim,  2000).  Di  sisi  lain  JD  menimbulkan  kerugian pada peternakan sapi perah di Amerika Serikat hingga $ 1,5  miliar  pada  tahun  1998  dan  peternakan-peternakan yang  mengalami  kasus  tersebut  meningkat  hingga  70% di  beberapa  negara    Eropa,  AS,  dan  Kanada  (Stabel, 1998). Kemungkinan adanya keterkaitan antara MAP, JD,  dan  CD  memacu  para  peneliti  untuk  menggali
informasi  dalam  rangka  memahami  dan  mengantisipasi permasalahan ini. Hewan-hewan penderita JD meskipun dalam  kondisi  subklinis  dapat  mengeluarkan  MAP melalui  susu,  sehingga  hal  ini  memungkinkan  menjadi media penularan MAP pada manusia. Cara penularan ini menjadi perhatian serius meskipun belum ada bukti-bukti yang disepakati untuk mengaitkan bakteri ini dengan CD (Hermon-Taylor  &  Bull,  2002).  Beberapa  data memperlihatkan  adanya  MAP  di  dalam  susu  dan  hasil olahannya,  7%  susu  pasturisasi  yang  dijual  dipasar swalayan  di  Inggris  dan  Wales  terdeteksi  mengandung MAP  (Millar  et  al.,  1996).  Di  Inggris  bakteri  tersebut terdeteksi pada 2% susu segar, 2,1% susu pastuerisasi,
1,4%  susu  skim  dan  tidak  ditemukan  pada  susu Ultra Heat  treatment (UHT)  (Griffits,  2003).  Kondisi  serupa juga  ditemui  pada  produk  pasturisasi,  keju,  dan  susu formula instan di Irlandia, Amerika, Republik Ceko (Grant et al., 2002; Stabel, 1998; O’Reilly et al., 2004; Donaghy et  al.,  2004;  Hruska  et  al.,  2005;  Ikonomopoulos  et  al., 2005),  bahkan  di  Australia  MAP  dapat  terdeteksi  dalam air  susu  ibu  (Whittington  et  al.,  2000)  sehingga  fakta- fakta ini memperkuat dugaan penularan bakteri tersebut pada  manusia  dapat  terjadi  melalui  makanan (Chamberlin et al., 2001).
Semua fakta tersebut memperlihatkan kejadian di  negara-negara  Eropa,  Amerika,  dan  Australia sementara sebagian besar komponen susu formula yang dijual di Indonesia diimpor dari negara - negara tersebut. Bayi dan anak-anak merupakan target konsumen utama dari produk industri susu,  sehingga resiko keterpaparan anak-anak  dengan  bakteri  MAP  menjadi  lebih  besar sementara  patogenesis  penyakit  berlangsung  sangat lambat  dan  akan  terekspresi  pada  saat  anak-anak  itu menginjak remaja atau dewasa. Pada saat usia produktif inilah kerugian yang bertingkat ditimbulkan akibat infeksi MAP,  kerugian  karena  gangguan  kesehatan  dan kerugian ekonomi karena turunnya produktivitas sumber daya manusia.
Deteksi  adanya  bakteri  MAP  pada  produk pangan  khususnya  susu  formula  lanjutan  belum  pernah dilakukan  di  Indonesia  sehingga  penelitian  ini  bertujuan untuk mendeteksi MAP pada susu formula lanjutan yang dijual di pasar swalayan  Bogor.

## METODOLOGI

## Pengumpulan sampel
Lima  puluh  kotak  susu  formula  (120- 200g/kotak)  dikumpulkan  selama  bulan  Agustus  2006. Sampel berupa susu formula lanjutan yang diperuntukan bagi bayi usia 6 bulan hingga 2 tahun, diproduksi oleh 5 produsen yang berbeda. Seluruh sampel dibeli di pasar swalayan di wilayah Bogor. Pengujian sampel dilakukan di  laboratorium  kesehatan  susu  Universitas  Justus Liebig, Jerman.
Penyiapan  sampe l:  duapuluh  (20)  gram  dari  masing- masing  sampel  dilarutkan  dalam  100  ml  aquades  steril dan  dihomogenkan.  Seluruh  larutan  setiap  sampel kemudian  dituang  ke  dalam  2  buah  tabung  gelas sentrifus steril (ukuran 50 ml ) dan disentrifus (Hereaeus Multifuge 3-SR Centrifuge, Kendro Laboratory Products, Osterode Germany) pada kecepatan 2500xg selama 15 menit  4 0 C.  Fraksi  krim  dan whey dibuang  sedangkan pelet pada masing-masing tabung diresuspensi dengan 1 ml  aquadest  steril  dan  selanjutnya  disatukan  (dari  asal sampel  yang  sama)  dan  diaduk  hingga  rata,  satu  ml larutan  diambil  dan  ditempatkan  pada  tabung  ependorf 1,5 ml untuk analisis PCR sedangkan sisanya digunakan untuk analisis MGIT.

## Deteksi MAP dari susu formula lanjutan dengan metode Mycobacterial  Growth  Indicator  Tube
(MGIT) Dekontaminasi  dan  proses  inokulasi : satu  ml suspensi seperti dijelaskan di atas dipindahkan ke dalam tabung  gelas  steril  dan  ditambahkan  10  ml  0.75% hexadecilpyridinium chloride (HPC) dan didiamkan pada suhu  kamar  selama  5  jam.  Suspensi  disentrifus  pada kecepatan  2500xg  selama  15  menit,  selanjutnya supernatan dibuang dan pelet diresuspensi dengan 500 µl  sterile  PBS  mengandung  0.05% Tween  20 (PBS-T) (Sigma,  Steinheim,  Germany).  Sebanyak  250  µl diinokulasikan ke dalam 1 tabung Mycobacterial Growth Incubator  Tube (MGIT)  dan  diinkubasi  pada  suhu  37 o C selama  20  minggu  untuk  mengetahui  adanya pertumbuhan  bakteri  dalam  media.  Pengamatan dilakukan  setiap  minggu  mulai  4  minggu  pertama menggunakan  transluminator/sinar  ultra  violet  (UV). Semua  koloni  terduga  positif  pada  media  MGIT  dibuat preparat  dan  diwarnai  dengan Ziehl-Neelsen  acid  fast stain (Becton Dickinson) untuk konfirmasi spesies.
Deteksi MAP dengan analisis PCR F57 Ekstraksi  DNA : sebanyak 500  µl  suspensi yang diperoleh dari tahap di atas, dipindahkan ke dalam tabung  ependorf  2  ml  dan  disentrifus  pada  kecepatan 10.000xg selama 30 menit. Supernatan dibuang dan 400 ml  larutan  penyangga  TE lysis ditambahkan  pada  pelet dan  divorteks  hingga  homogen.  Selanjutnya  suspensi dimasukkan ke dalam freezer -80 o C selama 5 menit dan segera  dipindahkan  ke  dalam  penangas  air  suhu  95 o C selama  1  menit,  tahap  ini  diulang  satu  kali  kemudian suspensi  diinkubasi  di  dalam  penangas  air  suhu  80 o C selama  20  menit.  Kemudian  suspensi  didinginkan  pada suhu 4 o C dan selanjutnya ditambahkan 35 µl proteinase K dan 400 µl AL Lysis buffer (Qiagen, Hilden, Germany), dikocok  rata  dengan  vortek  dan  diinkubasi  pada  suhu 56 o C  selama  satu  malam.  Tahap  selanjutnya  suspensi diekstraksi  menggunakan  DNeasy ® Tissue  Kit  (Qiagen, Hilden, Germany) sesuai petunjuk dari perusahaan.
Amplifikasi  PCR  menggunakan  primer  DNA  spesifik F 57
Metode  PCR  dengan  primer  spesifik  F57 dilakukan  dengan  menggunakan  primer  oligonukletotida F57/R57  dan  dilanjutkan  dengan  PCR  semi-nested dengan  primer  F57  and  F57Rn  seperti  dijelaskan  oleh Vansnick  et  al.,  (2004).  Amplifikasi  PCR  F57  dilakukan dengan  menformulasikan  50  µl  larutan  reaksi  yang tersusun  dari: 1.5  µl  masing-masing  primers (10 pmol/µl),  1.5  µl  dNTP-mix  (10 mmol/  µl)  (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany), 5 µl GeneAmp 10x PCR  Gold  Buffer  (150  mM  Tris-HCL,  500  mM  KCL,  pH 8.0)  (Applied  Biosystem,  Darmstadt,  Germany),  3.0  µl MgCl 2 (25  mM)  (Applied  Biosystem),  0.35  µl  AmpliTaq Gold ® polymerase (5 U/µl, Applied Biosystem), 32.15 µl aquades  steril,  dan  ditambahkan  5.0  µl  DNA  template. Kondisi  amplifikasi  PCR  F57  putaran  pertama  yang digunakan  adalah  1  siklus    pada  94°C  selama  10  min kemudian  40  siklus  pada  94°C  selama  1  min,  58°C selama 1 min, dan 72 °C selama 3 min, dan dilanjutkan dengan 1 siklus pada 72 °C selama 7 min. Pada putaran kedua  digunakan    1  siklus  pada  94°C  selama  10  min kemudian  30  siklus  pada  94°C  selama  1  min,  58°C selama 1 min, dan 72°C selama 3 min, dan dilanjutkan dengan  1  siklus  pada  72°C  selama  7  min.  Amplifikasi dilakukan  menggunakan  mesin  PCR i Cycler-Biorad thermocycler (Biorad, Munich, Germany).
Produk  PCR  (amplikon)  F57  (13  µl)  dicampur dengan  2  µl loading  dye  solution (MBI  Fermentas)  dan
sebagai  marker  digunakan  100  bp  DNA  ladder  (MBI Fermentas,  St.  Leon-Rot,  Germany)  selanjutnya diseparasi  menggunakan  2%  gel  agarose  electroforesis (Biozym,  Hessisch-Oldendorf, Germany) pada tegangan 120  V  di  dalam  larutan  1x  TAE buffer  (0.04  mol/l  Tris, 0.001  mol/l  EDTA,  pH  7.8).  Seteleh  dielektroforesis selama  50  menit,  gel  agarose  direndam  dalam  larutan pewarna ethidium bromide 5 µl/ml (Sigma, Taufkirchen, Germany) selama 5 menit, dan gambar didokumentasikan  dengan  menggunakan  UV  (245  nm) trans-illuminator (Biorad).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Setelah  MGIT  diinkubasi  selama  20  minggu, tidak  ditemukan  adanya  pertumbuhan  bakteri Mycobacterium .  Hal  tersebut  terlihat  dengan  tidak adanya  cairan  yang  berpendar  dalam  tabung  (Gambar 1). Hasil analisis PCR dapat dilihat pada Gambar 2, PCR konvensional  menggunakan  primer  F57  menunjukkan tidak  adanya  pita  DNA  MAP  dari  semua  sampel  yang diperiksa tetapi pada nested PCR dihasilkan pita spesifik DNA MAP dari beberapa sampel yaitu dari produsen 2 (2 sampel),  produsen  3  (1sampel),  dan  produsen  4  (2 sampel). Hasil ini menunjukkan jejak keberadaan bakteri MAP  pada  sampel  tersebut.  Hasil  analisis  lengkap sampel  dengan  metode  MGIT  dan  PCR  dapat  dilihat pada Tabel 1.
Gambar 1. Hasil pengamatan pertumbuhan bakteri mycobacterium pada media MGIT dengan sinar UV pada minggu ke 8 (a) dan minggu ke 19 (b), seluruh sampel tidak ada yang positif (berpendar). Kontrol positif (tanda panah 1) dan kontrol negatif (tanda panah 2).
a b 1 1 2 2
Table 1. Hasil analisis MAP menggunakan MGIT dan PCR F57 pada susu formula lanjutan di Bogor
Produsen (Jumlah sampel) MGIT F57 F57 nested + - + - + - 1 (10) 0 10 0 10 0 10 2 (10) 0 10 0 10 2 8 3 (10) 0 10 0 10 1 9 4 (10) 0 10 0 10 2 8 5 (10) 0 10 0 10 0 10 Total  (50) 0 50 0 50 5 45
Penelitian  ini  tidak  menemukan  bakteri  MAP yang  tumbuh  pada  media  MGIT  dan  tidak  mendeteksi DNA MAP dengan metode PCR F57 konvensional tetapi dengan uji nested PCR ditemukan pita DNA MAP dari 5 sampel.  Munculnya  pita  pada  hasil  nested  PCR memperlihatkan  adanya  fragmen  DNA  target  hasil amplifikasi dari amplikon PCR konvensional. Keberadaan fragmen  DNA  ini  berarti  membuktikan  adanya  jejak bakteri MAP pada sampel tersebut. Dapat dipahami pula bahwa  bakteri  MAP  mencemari  produk  susu  formula lanjutan  tersebut  dalam  kondisi  mati  atau  keberadaan bakteri sangat sedikit sehingga tidak dapat berkembang yang  terbukti  dengan  tidak  tumbuhnya  bakteri  pada media MGIT. Temuan ini memiliki kemiripan dengan hasil penelitian  Hruska  et  al.,  (2005)  yang  menguji  cemaran MAP pada susu formula di Republik Ceko menggunakan primer  IS  900  dan  F57.  Penelitan  tersebut  melaporkan, dari  51  sampel  susu  formula  bayi  terdeteksi  25  sampel mengandung  MAP  berdasarkan  PCR  dengan  primer  IS 900  sedangakan  hasil  pengujian  dengan  primer  F57 diperoleh 18 sampel yang positif.
Kemampuan bakteri MAP yang tahan terhadap panas  diteliti  oleh  Sung  et  al.,  (2004)  yang mengindikasikan  adanya  3  protein  terkait  dengan kemampuan  tersebut  yaitu GroES  heat  shock  protein, antigen  85  complex  B, dan alpha  antigen .  Informasi  ini
dapat menjelaskan temuan beberapa peneliti yang masih mendapatkan  MAP  pada  beberapa  produk  susu  olahan seperti  susu  pasturisasi,  susu high  temperature  short time (HTST). Pada skala laboratorium Grant et al., (1996) melakukan  pasturisasi  terhadap  susu  yang  telah dikontaminasi  MAP  dengan  dosis  10 4 –  10 7 cfu/ml. Pasturisasi  dilakukan  dengan  metode high  temperature short time (HTST) dan low temperature long time (LTLT) dan hasilnya mampu mengurangi 4-50% bakteri. Hal ini berarti  masih  ada  bakteri  yang  mampu  bertahan  dalam susu  yang  telah  dipasturisasi.  Hasil  penelitian  tahun 1996  diketahui  bahwa  susu  pasturisasi  yang  dijual  di supermarket  di  Inggris  dan  Wales  ternyata  masih mengandung  bakteri  MAP  (Millar  et  al.,  1996).  Metode diagnosis MAP menggunakan PCR dapat meningkatkan kepekaan diagnosis, khususnya untuk pemeriksaan susu dan  produk  olahannya.  Berdasarkan  metode  PCR  dan isolasi  bakteri  dapat  terdeteksi  MAP  pada  susu pasturisasi  di  United  Kingdom  (Grant  et  al.,  2002),  di Irlandia pada susu segar dan pasturisasi (O’Reilly et al ., 2004)  dan  pada  keju cheddar (Donaghy  et  al.,  2004). Data menunjukkan bahwa frekuensi cemaran MAP yang cukup tinggi terjadi pada susu dan produk olahannya, hal ini  memperkuat  alasan  untuk  menghubungkannya dengan kasus Crohn’s disease (CD) pada manusia.
Gambar 2. (A) Hasil PCR F57 konvensional (A1: produsen 4, A2: produsen 3) tidak ada pita DNA, kolom 12 kontrol positif, kolom 1 dan 14 marker bp 100 ladder.
(B) Hasil nested PCR F57, ada pita DNA pada kolom 2 dan 6 (B1: produsen 4) dan kolom 3 (B2: produsen 3), kolom 12 (B1) dan kolom 10 (B2) kontrol positif, kolom1 & 12 (B1) dan kolom 13 (B2) marker DNA mid range
A 1 B 1 B 2 A 2 1    2   3   4   5   6   7   8   9  10 11 12 13 14
1     2   3   4     5   6    7    8    9  10  11  12  13  14 1   2    3    4   5   6    7   8   9  10  11 12 13
1    2   3   4   5   6   7   8   9  10 11 12 13 14
Hasil  kajian  ini  juga  memperkuat  pendapat bahwa  primer  F57  memiliki  sensitivitas  yang  tinggi seperti  dikemukakan  oleh  Vansnick  et  al.,(2004)  bahwa primer  ini  memilki  kinerja  yang  sangat  baik  dengan sensitivitas  uji  yang  mampu  mendeteksi  MAP  hingga  1 CFU  namun  untuk  menguatkan  hasil  perlu  dilakukan simulasi program PCR agar spesifisitasnya juga tinggi.
Penggunaan  sekuen  IS  900  sebagai  primer MAP  dilaporkan  oleh  Vary  et  al.,  yang  diacu  Harris  & Barletta  (2001)  diketahui  meningkatkan  sensitivitas  dan spesifisitas diagnosis PCR terhadap MAP bahkan dapat membedakannya  dengan  subspesies  lain  dari M  avium complex dan M.  silvaticum .  Bull  et  al.,  (2003) memperlihatkan  sekuen  IS  900  (primer  TJ1-4)  memiliki tingkat  akurasi  yang  cukup  tinggi  namun  beberapa peneliti  masih  mendapati  beberapa  hasil  positif  palsu sehingga  pengembangan  primer  untuk  meningkatkan ketepatan diagnosis primer IS 900 terhadap bakteri MAP tetap  dilakukan.  Primer  F57  merupakan  satu  hasil pengembangan  dari  sekuen  yang  sudah  ada.  Tasara  & Stephan (2005) menguji primer ini dengan metode real- time PCR  dan  mampu  mendeteksi  MAP  di  dalam  susu yang  di  kontaminasi  dengan  MAP  sebanyak  10  sel/ml. Metode  ini  direkomendasikan  untuk  digunakan  sebagai metode  rutin  pengujian  MAP  pada  susu  dan  akan  lebih akurat  apabila  diparalel  dengan  penggunaan  primer  IS 900.
Hasil  nested  PCR  kajian  ini  paralel  dengan hasil  uji  serologis  yang  mengindikasikan  penyebaran penyakit  JD  pada  sapi  perah  nasional.  Tiga  ekor  sapi perah  di  Jawa  Barat  dilaporkan  seropositif  pada  tahun 2004 (Adji, 2004) dan pada tahun 2007 ditemukan 6 ekor seropositif dari kelompok sapi perah di daerah lain (hasil survei  Balai  Besar  Veteriner  Bogor,  tidak  dipublikasi). Kedua  data  di  atas  walaupun  tidak  dapat  dikaitkan secara langsung telah memberikan informasi dini bahwa masalah  MAP  di  bidang  usaha  sapi  perah,  susu  dan hasil  olahannya  adalah  nyata  dan  sangat  potensial berkembang di Indonesia.
Kajian  lanjut  secara  komprehensif  terhadap keberadaan MAP baik dari aspek kesehatan hewan dan ekonomi peternakan, keamanan pangan serta kesehatan manusia  harus  dilakukan  dalam  rangka  menjamin kesehatan  masyarakat  pada  umumnya.  Kajian  lanjutan dapat  dilakukan  dengan  mendeteksi/mengisolasi  MAP dari hewan, produk pangan asal hewan seperti susu dan olahannya dengan memperbesar jumlah sampel, variasi jenis  sampel  baik  komoditas,  spesies  hewan  serta lingkungan  seperti  air,  tanah,  khususnya  di  lingkungan peternakan.
Kajian  MAP  pada  manusia  perlu  mulai dikembangkan mengingat bakteri ini masih satu keluarga dengan Mycobacterium  tuberculosis yang  kasusnya hingga  saat  ini  menempatkan  Indonesia  pada  posisi  ke tiga  di  dunia  (Anonim,  2003).  Kondisi  ini  memperkuat kecurigaan  bahwa  kasus  CD  juga  terjadi  di  Indonesia namun  belum  menjadi  perhatian  pemerintah  dan masyarakat  secara  lebih  baik.  Isolasi  MAP  dapat
dilakukan terutama pada pasien-pasien penderita radang usus bagian bawah ( inflammatory bowel dieases ) data ini akan  sangat  bermanfaat  dalam  mengungkap  penyakit CD. Langkah tersebut mengacu pada penelitian Naser et al.,  (2004)  yang  mendeteksi  MAP  dari  darah  14  orang dari 28 penderita CD, 2 orang penderita ulcerative colitis tetapi  tidak  menemukannya  pada  15  orang  yang  tidak menderita  infeksi  usus  bagian  bawah.  Sejalan  dengan data  tersebut,  Bull  et  al.,  (2003)  mendeteksi  MAP  pada 34 dari 37 (92%) pasien CD dan 9 dari 34 (26%) orang bukan  penderita  CD.  Informasi  mengenai  status  bakteri MAP  pada  manusia  ini  akan  sangat  membantu  dalam melacak  sumber  dan  proses  penularannya  di  Indonesia sehingga  dapat  diketahui  cara  penanganan  dan penanggulangannya yang efektif di masa mendatang.

## KESIMPULAN
Tidak  ditemukan Mycobacterium  avium subspecies  paratuberculosis (MAP)  yang  tumbuh  dari susu  formula  lanjutan  di  wilayah  Bogor  meskipun diperoleh  indikasi  adanya  bakteri  MAP  di  dalamnya. Penelitian  lanjutan  harus  dilakukan  untuk  memperoleh data yang lengkap dan komprehensif mengenai MAP di Indonesia  dalam  rangka  mengantisipasi  permasalahan ini  di masa mendatang.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terimakasih  disampaikan  kepada  Direktorat Jenderal  Pendidikan  Tinggi  Departemen  Pendidikan Nasional yang membiayai pendidikan pascasarjana bagi penulis  pertama  serta  kepada Deutsche  Akademische Austauschdienst (DAAD)  yang  telah  membantu membiayai penelitian ini melalui program sandwich.

## DAFTAR PUSTAKA
Adji  RS.  2004. Isolasi  dan  uji  serologi  terhadap Mycobacterium  paratuberculosis pada  sapi  perah. Prosiding  Seminar  Nasional  Teknologi  Peternakan dan  Veteriner  4-5  Agustus  2004.  Pusat  Penelitian dan  Pengembangan  Peternakan.  Badan  Penelitian dan  Pengembangan  Pertanian.  Departemen Pertanian, pp.281-284.
Anonim 2000 . Possible Links Between Crohn’s Disease and  Paratuberculosis.  Scientific  Committee  Health and  Animal  Welfare,  European  Commission, Directorate-General Health & Consumer Protection.
Anonim  2003 .  Increasing  Investments  in  Health Outcomes  for  The  Poor.  Second  Consultation  on Macroeconomics  and  Health.  World  Health Organisation.
Bannantine  JP,  and  Stabel  JR.  2002. Killing  of Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis within
macrophages.  http://www.biomedcentral.com/1471- 2180/2/2 [15 Juli 2005]
Bull,  T.J.,  E.J.  McMinn,  K.  Sidi-Boumedine,  A.  Skull, D. Durkin, P. Neild, G. Rhodes, R. Pickup And J. Hermon-Taylor . 2003 .  Detection  and  verification  of Mycobacterium  avium  subsp.  paratuberculosis  in fresh  ileocolonic  mucosal  biopsy  specimens  from individuals with and without Crohn’s disease. J. Clin. Microbiol. 41: 2915-2923
Chamberlin W, Graham DY, Hulten K, El-Zimaity MT, Schwartz MR, Naser S, Shafran I, El-Zataari FAK. 2001. Review  article:  Mycobacterium  avium  subsp. paratuberculosis as one cause of  Chron’s diseases.
Aliment Pharmacol. Ther. 15: 337-346
Chiodini  RJ,  1989. Crohn’s  disease  and  the Mycobacterioses:  review  and  comparison  of  two desease entities. Clin. Microbiol. Review. 2: 90-177
Donaghy JA, Totton NL, Rowe MT. 2004. Persistence of Mycobacterium paratuberculosis during manufacture  and  ripening  of  cheddar  cheese.  Appl. Environ. Microbiol. 8:4899-4905
Grant  IR,  Ball  HJ,  Neill  SD,  Rowe  MT.  1996. Inactivation  of  Mycobacterium  paratuberculosis  in cows’ milk at pasteurization temperatures. Appl. and Environ. Microbiol. 62:631-636
Grant  IR,  Ball  HJ,  Rowe  MT.  2002. Incidence  of Mycobacterium  paratuberculosis  in  bulk  raw  and commercially  pasteurized  cows  milk  from  approved dairy  processing  establishments  in  the  United Kingdom. Appl. Environ. Microbiol. 68:2428-2435
Griffiths  M.  2003. Mycobacterium  paratuberculosis.  Di dalam:  Food-borne  Pathogenes,  1 st ed.  Woodhead Pub.Ltd. and CRC press. pp. 489-500
Harris  NB,  and  Barletta  RG.  2001. Mycobacterium avium  subsp.  paratuberculosis  in  veterinary medicine. Clin. Microbiol. Rev. 14: 489-512
Hermon-Taylor  J  and  Bull  TJ.  2002. Crohn’s  disease caused by Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis  :  a  public  health  tragedy  whose resolution is long overdue. J.M. Microbiol. 51: 3-6
Hruska  K,  Bartos  M,  Kralik  P,  Pavlik  I.    2005 . Mycobacterium  avium  subsp.  paratuberculosis  in powdered  infant  milk:  Paratuberculosis  in  catlle-the public health problem to be solved. Vet. Med. Czech. 50. 8: 327-335
Ikonomopoulos, J., I. Pavlik, M. Bartos, P. Svastova, W.Y. Ayele, P.  Roubal, J. Lukas, N. Cook and M.
Grazouli.  2005. Detection  of  Mycobacterium  avium subspecies  paratuberculosis  in  retail  cheeses  from Greece  and  the  Czech  Republic.  Apll.  Environ. Microbiol. 12:8934-8936
Millar, D., J. Ford, J. Sanderson, S. Withey, M. Tizard, T. Doran and J. Hermon-Taylor. 1996. IS 900 PCR to  detect  Mycobacterium  paratuberculosis  in  retail supplies of whole pasteurised cows‘ milk in England and Wales. Appl. Environ. Microbiol. 62:3446-3452
Naser SA, Ghobrial G, Romero C, Valentine JF. 2004 . Culture  of  Mycobacterium  avium  subspecies paratuberculosis  from  the  blood  of  patients  with Chron’s disease. Lancet 364: 1039-1044
O’Reilly, C.E.,  L. O’connor, W. Anderson, P. Harvey, I.R.  Grant,  J.  Donaghy,  M.  Rowe  and    P. O’Mahony,  P.  2004. Surveillance  of  bulk  raw  and commercially  pasteurized  cows’  milk  from  approved irish liquid-milk pasteurization plants to determine the incidence  of  Mycobacterium  paratuberculosis.  Appl. Environ. Microbiol. 70:5138-5144
Stabel  J.R.  1998. Johne’s  disease:  a  hidden  threat.  J. Dairy. Sci. 81:283-288
Sung N, and Collins MT. 2003. Variation in resistance of
Mycobacterium
paratuberculosis to acid environments as a function of culture medium. Appl. Environ. Microbiol. 69: 6833-6840
Sung  N,  Takayama  K,  Collins  MT.  2004. Possible associatin of GroES and antigen 85 protein with heat resistance of Mycobacterium paratuberculosis .  Appl. Environ. Microbiol. 70:1688-1697
Tasara T, and Stephan R. 2005. Development of an F 57  sequence-based  real-time  PCR  assay  for detection  of  Mycobacterium  avium  subspecies paratuberculosis.  Appl.  Environ.  Microbiol.  10:5957- 5968.
Vansnick, E., P. De Rijk, F. Vercammen, D. Geysen, L. Rigouts  And F.  Portaels.  2004. Newly  developed primers  for  detection  of Mycobacterium  avium subspecies paratuberculosis . Vet. Microbiol. 100:197-204
Whittington  RJ,  Hope  AF,  Marshall  DJ,  Taragel  CA, Marsh  I.  2000. Molecular  epidemiology  of Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis : IS900 restriction fragment length polymorphism and IS1311 polymorphism analyses of isolates from animals and human in Australia. J. Clin. Microbiol. 38:3240-3248