Licensed: Creative Commons Attribution 4.0 International License. (CC-BY)
Pengaruh konsentrasi enzim chitosanase dan waktu inkubasi terhadap karakteristik chito oligosakarida dan aktivitas prebiotik dari cangkang kepiting bakau
Effect of chitosanase enzyme concentration and incubation time on chitooligosaccharide characteristic and prebiotic activity from mangrove crab shell
Nanda Oktavia 1)* , Sri Winarti 1) , Anugerah Dany Priyanto 1)
1 Program Studi Teknologi Pangan, Universitas Pembangunan Nasional “Veteran” Jawa Timur *E-mail korespondensi : noktavia817@gmail.com
Informasi Artikel: Dikirim: 10/03/2022; disetujui: 28/07/2022; diterbitkan: 30/09/2022

## ABSTRACT
Mangrove crab shells are one of the wastes that are poorly utilized because it is usually only  used  for  animal  feed  mixtures.  Mangrove  crab  shells  have  a  high  enough  chitin content so that it can be used as  chitosan and then used as chitooligosaccharides that have the potential to have prebiotic activity. The study aimed to determine the effect of enzyme concentration and length of incubation time on the prebiotic characteristics and activity of chitooligosaccharides. Completely Randomized Design was used as a design experiment  with  a  variable  chitosanase    enzyme  concentration  (0.5%,  1%,  and  1.5%) and  incubation  time  (1  hour,  3  hours,  and  5  hours).  The  study  shows  that  there  is  an interaction  between  the  two  variables  in  the  viscosity  parameter,  degree  of deacetylation, molecular weight, and degree of polymerization. The results showed that the best treatments were an enzyme concentration of 0.5% and a long incubation time of 5%, which resulted in chitooligosaccharides with characteristics: viscosity of 2.75 cPs, degree  of  deacetylation  of  97.68%,  the  molecular  weight  of  546.99  Da, and  degree  of polymerization  of  2.67.  The  best  treatment  tested  the  prebiotic  activity  of  1,18  for Lactobacillus  acidophilus  bacteria  and  1,33  for  Bifidobacterium  breve  bacteria.  Hope this  research  would  be  an  innovation  in  the  production  of  a  crabs  shell  or  chitin’s source into prebiotic chitooligosaccharide and could boost the immune system. Keywords: Chitosanase enzyme, Chitooligosaccharide, Prebiotic activity

## ABSTRAK
Cangkang  kepiting  bakau  merupakan  salah  satu  limbah  yang  kurang  dimanfaatkan dengan baik karena biasanya hanya dijadikan untuk campuran pakan ternak. Cangkang kepiting  bakau  memiliki  kandungan  kitin  yang  cukup  tinggi,  sehingga  dapat dimanfaatkan menjadi  kitosan kemudian dijadikan chito oligosakarida  yang berpotensi memiliki  aktivitas  prebiotik.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh konsentrasi  enzim chitosanase dan  waktu  inkubasi  terhadap  karakteristik  dan  aktivitas prebiotik dari chito oligosakarida. Rancangan Acak Lengkap (RAL) digunakan sebagai desain percobaan dengan variabel konsentrasi enzim chitosanase (0,5%, 1% dan 1,5%) dan waktu inkubasi (1 jam, 3 jam dan 5 jam). Penelitian menunjukkan terjadi interaksi (P<0.05)  antara  kedua  variabel  terhadap  parameter  rendemen,  viskositas,  kelarutan, derajat deasetilasi, berat molekul, dan derajat polimerisasi. Perlakuan terbaik diperoleh pada  kondisi  konsentrasi  enzim chitosanase 0,5%  dan  waktu  inkubasi  5  jam,  yang menghasilkan  chito  oligosakarida  dengan  karakteristik:  rendemen  8,64%,  viskositas
2,75  cPs,  kelarutan  93,5%,  derajat  deasetilasi  97,68%,  berat  molekul  546,99  Da,  dan derajat  polimerisasi  2,67.  Pada  perlakuan  terbaik  uji  aktivitas  prebiotik  sebesar  1,18 untuk  bakteri Lactobacillus  acidophilus dan 1,33 untuk  bakteri Bifidobacterium breve . Harapannya  dengan  adanya  penelitian  ini  menjadi  sebuah  inovasi  dalam  mengolah cangkang kepiting atau sumber kitin menjadi chito oligosakarida yang bersifat prebiotik serta dapat meningkatkan sistem imun.
Kata kunci: Enzim c hitosanase , Chitooligosakarida, Aktivitas prebiotik.

## PENDAHULUAN
Industri  pengolahan crustacea meng- hasilkan  sejumlah  besar  produk  sampingan seperti  cangkang crustacea yang  me- nyumbang  50–70%  dari  bahan  baku  awal. Pembuangan  cangkang crustacea yang  tidak tepat  mengakibatkan  masalah  lingkungan yang  parah  seperti  bau  tak  sedap  dan sedimentasi  mineral  di  tempat  pembuangan sampah.  Oleh  karena  itu,  konversi  bahan limbah  cangkang  menjadi  produk  yang bernilai  dan  bermanfaat  adalah  salah  satu strategi  untuk  mengurangi  masalah  ling- kungan  (Mohan et  al. ,  2021).  Cangkang crustacea terdiri  dari  tiga  komponen  utama yaitu  kitin,  protein,  dan  kalsium  karbonat serta  dengan  berbagai  komponen  minor termasuk  proteoglikan,  lipid,  dan  bahan anorganik lainnya (Nagasawa, 2012). Komponen  utama  pada  cangkang crustacea (udang,  kepiting,  lobster,  squilla,  dan  krill) adalah  kitin  (15–40%),  protein  (20–40%), kalsium  dan magnesium karbonat  (20–50%), serta  dengan  komponen  minor  lainnya. Komponen tersebut seperti lipid, astaxanthin, dan mineral  (Khoushab  & Yamabhai,  2010). Kitin  merupakan  polisakarida  yang  mem- bentuk  arsitektur  berserat,  yang  menjadi scaffold untuk pengendapan kalsium karbonat  (Nagasawa,  2012).  Kitin  dan turunannya  merupakan  biopolimer  yang ditinjau  dengan  baik  dengan  banyak  aplikasi yang bermanfaat. Preparat kitin dan turunannya  sebagai  biomaterial  bervariasi sesuai  dengan  kondisi  proses  dan  aplikasi potensial (Abidin et al ., 2020), tetapi aplikasi kitosan  dan  kitooligosakarida  lebih  potensial karena aplikasi kitin lebih terbatas dibandingkan  kitosan  karena  kitin  bersifat inert  secara  kimia  dan  bersifat  tidak  larut baik  dalam  air  maupun  asam,  sedangkan
kitosan  relatif  reaktif  dan  dapat  diproduksi dalam  berbagai  bentuk.  Kitosan  biasanya tidak larut dalam kondisi pH netral atau basa sedangkan  larut  dalam  pH  asam.  Kelarutan kitosan  tergantung  pada  distribusi  gugus amino dan N-asetil bebas. Dalam asam encer (pH  <  6),  gugus  amino  bebas  terprotonasi dan  molekul  menjadi  larut  (Lodhi et  al. , 2014).
Kitosan  dihasilkan  dari  deasetilasi kitin  yang  menghasilkan  beberapa  manfaat baik  karena  aspek  fisikokimia  dan  bio- loginya  (Islam et  al .,  2020).  Kelemahan senyawa  ini  adalah  karena  kelarutannya dalam  air  rendah  dengan  viskositas  tinggi (Tanasale et al ., 2019). Strategi  yang umum dilakukan adalah dengan memotong ikatan - 1,4  glikosidik  dan  produk  degradasi  kitosan yang dibuat dengan hidrolisis enzimatik atau kimia kitosan, produk ini disebut kitooligosakarida (COS) (Akbari-Alavijeh et al .,  2020;  Lodhi et  al .  .,  2014),  produk terhidrolisisnya dan COS mudah larut dalam air  karena  panjang  rantainya  yang  lebih pendek  dan  gugus  amino  bebas  dalam  unit D-glukosamin.  Viskositas  rendah  dan  kela- rutan  COS  yang  lebih  besar  pada  pH  netral telah  menarik  minat  banyak  peneliti  untuk memanfaatkan  kitosan  dalam  bentuk  oligo- sakaridanya.  Khususnya  penelitian  tentang COS  di  bidang  pangan  dan  gizi  telah menekankan  kemampuannya  untuk  mening- katkan  kualitas  pangan  dan  kemajuan kesehatan  manusia  karena  COS  memiliki manfaat  yang  baik,  dalam  hal  makanan, kosmetik,  biomedis  atau  farmasi,  pertanian, perlindungan  lingkungan,  dan  pengelolaan air  limbah  (Lodhi et  al .,  2014;  Arias et  al ., 2018).
Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi  karakteristik  COS,  seperti konsentrasi enzim, suhu, dan waktu inkubasi
(Gao et  al .,  2012).  Chito  Oligosakarida adalah  produk  kitosan  yang  dibuat  dengan hidrolisis  enzimatik  biasanya  menggunakan enzim  spesifik chitosanase .  Larutan  kitosan 1%  dengan  enzim chitosanase dan  waktu inkubasi  180  menit  memberikan  kondisi optimal  untuk  produksi  COS  (Jeon  &  Kim, 2000). Konsentrasi enzim dan waktu inkubasi  dapat  mempengaruhi  proses  hidro- lisis  (Fawzya et  al., 2009).  COS  mampu bersifat  antimikroba,  menurunkan  kadar  ko- lesterol, imunostimulan, dan prebiotik hewani  alami  (Harti,  2011).  Beberapa  pene- litian  menunjukkan  kitooligosakarida  dapat menghambat  pertumbuhan  bakteri  patogen dan  meningkatkan  pertumbuhan  bakteri probiotik.  Pengaruh  oligosakarida  kitosan terhadap  pertumbuhan B.  bifidum ATCC 11863  dan B.  breve ATCC  15700  dan pertumbuhan  meningkat  secara  signifikan dalam  waktu  48  jam  inkubasi  (Nurhayati et al. ,  2016).  Diantara  dua  strain  bakteri Bifidobacterium, Bifidobacterium  bifidum ATCC  11863  pertumbuhannya  lebih  tinggi dibandingkan Bifidobacterium  breve ATCC 15700  tetapi  hasilnya  tidak  menunjukkan perbedaan  yang  nyata  pada  jam  0  dan  24 yaitu  5,22  ±  0,02  dan  5,18  ±  0,07  untuk  0 jam  kemudian  untuk  24  jam  adalah  5,21  ± 0,1  dan  4,98  ±  0,01.  Pertumbuhan  pada  dua strain bakteri Lactobacillus yaitu, Lactobacillus acidophilus KCTC 3111 pertumbuhannya  lebih  tinggi  dibandingkan Lactobacillus  brevis KCTC  3498.  Pertum- buhan Lactobacillus acidophilus KCTC 3111 adalah 0,576 ± 0,066 dan untuk Lactobacillus  brevis KCTC  3498  adalah
0,420 ± 0,012 (Lee et al ., 2002). COS dapat menghambat  pertumbuhan Escherichia  coli karena  terjadi  penurunan  pertumbuhan (Fernandes et  al .,  2008).  Oleh  karena  itu, tujuan  penelitian  ini  untuk  menentukan kombinasi perlakuan terbaik terhadap kecukupan  kondisi  proses  sehingga  dapat menghasilkan  karakteristik  chito  oligo- sakarida dan aktivitas prebiotik yang baik.

## METODE

## Bahan penelitian
Bahan  yang  digunakan  dalam  pene- litian ini antara lain cangkang kepiting bakau yang  diperoleh  dari  Rumah  Makan  Seafood Sari  Laut  Kapasan,  Surabaya  Jawa  Timur, NaOH,  HCl,  akuades,  enzim chitosanase (Merk  Genofocus,  Korea  Selatan),  dan buffer asetat.

## Alat penelitian
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  antara  lain  hot  plate,  thermometer, erlenmeyer,  blender,  loyang,  oven,  cabinet dryer,  ayakan  100  mesh,  neraca  analitik, timbangan, gelas ukur, pengaduk, water bath shaker.

## Rancangan penelitian
Jumlah  perlakuan  dalam  penelitian  ini sebanyak  9  perlakuan.  Penelitian  ini  meng- gunakan metode Rancangan  Acak   Lengkap (RAL)  yang  terdiri  dari  dua  faktor  yaitu faktor  1:  konsentrasi  enzim chitosanase 0,5%,  1%  dan  1,5%  (b/v);  faktor  2:  waktu inkubasi 1 jam, 3 jam, dan 5 jam.

## Tabel 1. Kombinasi Perlakuan
Konsentrasi Enzim Chitosanase Waktu Inkubasi L 1 1 jam L 2 3 jam L 3 5 jam K 1 1% K 1 L 1 K 1 L 2 K 1 L 3 K 2 2% K 2 L 1 K 2 L 2 K 2 L 3 K 3 3% K 3 L 1 K 3 L 2 K 3 L 3
Keterangan:
K 1 L 1 : konsentrasi enzim chitosanase 0,5%; waktu inkubasi 1 jam K 1 L 2 : konsentrasi enzim chitosanase 0,5%; waktu inkubasi 3 jam K 1 L 3 : konsentrasi enzim chitosanase 0,5%; waktu inkubasi 5 jam K 2 L 1 : konsentrasi enzim chitosanase 1%; waktu inkubasi 1 jam K 2 L 2 : konsentrasi enzim chitosanase 1%; waktu inkubasi 3 jam K 2 L 3 : konsentrasi enzim chitosanase 1%; waktu inkubasi 5 jam
K 3 L 1 : konsentrasi enzim chitosanase 1,5%; waktu inkubasi 1 jam K 3 L 2 : konsentrasi enzim chitosanase 1,5%; waktu inkubasi 3 jam K 3 L 3 : konsentrasi enzim chitosanase 1,5%; waktu inkubasi 5 jam

## Metode pelaksanaan
Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium Program  Studi  Teknologi  Pangan  UPN “Veteran”  Jawa  Timur,  Laboratorium Terpadu  dan  Halal  Center  Universitas  Islam Malang, dan Laboratorium FMIPA Universitas  Negeri  Malang.  Parameter  yang diamati  meliputi  viskositas  (Fawzya et  al. , 2009), derajat deasetilasi (Czechowska, et al. 2012),  berat  molekul  (Ridho et  al. ,  2017), derajat  polimerisasi  (Ridho et  al .,  2017), serta  uji  perlakuan  terbaik  menggunakan analisis  aktivitas  prebiotik  (Huebner et  al ., 2007).

## Proses pembuatan kitosan
Penelitian diawali dengan pengeringan, penghancuran,  dan  pengayakan  100  mesh, lalu  pembuatan  kitosan.  Kitosan  dibuat dengan  cara  hidrolisis  secara  kimiawi. Pertama  dilakukan  deproteinasi  dengan NaOH 1M (1:10) lalu diaduk dan dipanaskan dengan  suhu  65°C  selama  2  jam,  kemudian didinginkan  dan  disaring  hingga  netral menggunakan aquades. Selanjutnya dikeringkan. Kedua dilakukan demineralisasi dengan  HCl  2N  (1:10)  lalu  diaduk  dan dipanaskan dengan suhu 30°C selama 1 jam, kemudian  didinginkan  dan  disaring  hingga netral  menggunakan  aquades.  Selanjutnya dikeringkan.  Ketiga  dilakukan  deasetilasi dengan  NaOH  50%  (1:20)  lalu  diaduk  dan dipanaskan  dengan  suhu  90-100°C  selama  2 jam,  kemudian  didinginkan  dan  disaring hingga netral menggunakan aquades. Selanjutnya  dikeringkan  (Yanti et  al .,  2018,
Trisnawati et al. , 2013, Sartika et al. , 2016).

## Proses pembuatan chito oligosakarida
Pembuatan larutan kitosan 1% (kitosan dilarutkan  dalam  1M buffer asetat  pH  4,5) dan ditambahkan enzim chitosanase sebanyak  0,5%,  1%,  dan  1,5%.  Lalu dihidrolisis  dalam waterbath  shaker dengan suhu  45°C  selama  1  jam,  3  jam,  dan  5  jam. Reaksi  dihentikan  untuk  inaktivasi  enzim dengan  suhu  80°C  selama  10  menit.
Kemudian  chito  oligosakarida  dikeringkan dengan freeze  dryer suhu  -54°C  selama  24 jam  (Jeon, et  al. ,  2001,  Ratanavaraporn  dan Damrongsakkul, 2011)

## Aktivitas prebiotik
Media  MRS broth modifikasi  dibuat kemudian  pada  masing-masing  media  MRS broth modifikasi ditambahkan chito oligosakarida  atau  glukosa.  Kemudian  pada media-media tersebut di inokulasikan probiotik  yakni Bifidobacterium  breve dan Lactobacillus  acidophilus ,  lalu  diinkubasi pada  suhu  37°C  selama  0  dan  24  jam. Selanjutnya  diinokulasikan    pada  media MRS  agar  untuk Lactobacillus  acidophilus dan  BSA  untuk Bifidobacterium  breve , kemudian  koloni  bakteri  yang  tumbuh dihitung.
Perhitungan  Skor  Aktivitas  Prebiotik untuk  menggambarkan  kemampuan  suatu strain  bakteri  dalam  menggunakan  substrat tertentu  untuk  mendukung  pertumbuhannya. Skor  Aktivitas  Prebiotik  =  {(probiotik  log cfu  mL -1 pada  prebiotik  pada  24  jam  - probiotik log cfu mL -1 pada prebiotik pada 0 jam)  /  (probiotik  log  cfu  mL -1 pada  glukosa pada  24  jam  -  probiotik  log  cfu  mL -1 pada glukosa pada 0 jam)} – {(enterik log cfu mL - 1 pada  prebiotik  pada  24  jam  -  enterik  log cfu  mL -1 pada  prebiotik  pada  0  jam)  / (enterik  log  cfu  mL -1 pada  glukosa  pada  24 jam - enterik log cfu mL -1 pada glukosa pada 0 jam)}.

## Analisis data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan ANOVA (Analysis of Variance )  pada  α  5%.  Apabila  terdapat perbedaan  nyata  maka  dilanjutkan  dengan uji  DMRT  ( Duncan’t  Multiple  Range  Test) pada α 5%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik chitooligosakarida viskositas
Viskositas  adalah  ukuran  kekentalan cairan  atau  fluida  yang  dapat  menyatakan kecepatan  bergerak  suatu  fluida  untuk mengalir. Molekul-molekul yang membentuk suatu  fluida  tersebut  akan  saling  bergesekan ketika fluida mengalir, hal tersebut disebabkan  karena  adanya  gaya  kohesi  pada zat cair (Hananto, 2013).
Rata-rata viskositas chito oligosakarida dengan perlakuan konsentrasi enzim chitosanase dan  waktu  inkubasi  antara  2,75 cPs  hingga  3,35  cPs  (Tabel  2).  Hasil pengujian  viskositas  menunjukkan  bahwa semakin tinggi konsentrasi enzim chitosanase dari  0,5%  hingga  1,5% dan semakin  lama  waktu  inkubasi  dari  1  jam hingga  3  jam  memiliki  kemampuan  baik dalam  menurunkan  viskositas.  Penurunan viskositas terjadi akibat aktivitas enzim yang tinggi dan lamanya proses hidrolisis memberikan kesempatan enzim untuk bereaksi  dengan  substrat  sehingga  semakin banyak  substrat  kitosan  yang  terhidrolisis menjadi  senyawa  yang  lebih  kecil.  Secara otomatis, bertambahnya enzim maka semakin banyak  terbentuk  kompleks  dan  semakin banyak  ikatan  polimer  yang  terpotong  maka berat  molekul  semakin  turun,  sehingga kekuatan  tarik-menarik  antar  ikatan  juga menurun  dan  ditandai  dengan  menurunnya viskositas  senyawa  tersebut  (Handayani et al .,  2013;  Rokhati et  al., 2015).  Selain  itu, semakin lama waktu inkubasi yang diberikan akan  menyebabkan  daya  kerja  enzim  untuk melakukan proses hidrolisis semakin panjang dan  akan  menghasilkan  glukosamin  dengan berat  molekul  yang  lebih  rendah,  dan mengakibatkan penurunan viskositas (Anggraini & Yunianta, 2015).
Konsentrasi  enzim  yang  terlalu  tinggi serta  diiringi  dengan  waktu  inkubasi  yang lama  dapat  membuat  proses  hidrolisis mengalami kejenuhan karena seluruh substrat telah terhidrolisis sehingga tidak terdapat lagi substrat yang dapat menempel pada sisi aktif enzim  dan  menghasilkan  viskositas  yang
cenderung  konstan  pada  perlakuan  enzim chitosanase 0,5%  hingga  1,5%  dan  waktu inkubasi  5  jam.  Sesuai  dalam  penelitian Yunianta et al. (2010) dan Fennema (2006), bahwa  jika  produk  yang  dihasilkan  sudah sampai titik batas dan setelah itu terlampaui maka  produk  yang  dihasilkan  tidak  akan bertambah atau konstan meskipun konsentrasi  enzim  ditambahkan.  Hal  ini terjadi  karena  sisi  aktif  enzim  telah  jenuh oleh substrat sehingga tidak ada lagi substrat yang dapat melekat pada sisi aktif dan waktu inkubasi  terlalu  lama  menghasilkan  produk yang  cenderung  konstan  karena  enzim mengalami kejenuhan (Kurniadewi, 2016).

## Derajat deasetilasi
Derajat  deasetilasi  merupakan  proses penghilangan  gugus  asetil  yang  besar  pada gugus  asetamida  (Mursida  &  Tasir,  2018). Rata-rata derajat deasetilasi chito oligosakarida  dengan  perlakuan  konsentrasi enzim chitosanase dan  waktu  inkubasi antara 86,16% hingga 97,68% (Tabel 2).
Hasil  pengujian  derajat  deasetilasi menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi  enzim chitosanase dari  0,5% hingga  1,5% dan  semakin  lama  waktu inkubasi  dari  1  jam  hingga  3  jam  mampu meningkatkan  derajat  deasetilasi.  Hal  ini disebabkan  semakin  tinggi  konsentrasi enzim  yang  ditambahkan  dan  semakin  lama waktu  inkubasi  memberikan  kesempatan enzim  untuk  bereaksi  dengan  substrat  maka semakin  banyak  gugus  asetil  pada  substrat kitosan yang dihidrolisis. Menurut Rahmawati  &  Yunianta  (2015)  dan  Ridhay (2016),  semakin  banyak  konsentrasi  enzim, substrat  yang  dipecah  dan  terhidrolisis  juga semakin  banyak.  Kemudian,  semakin  lama waktu  yang  digunakan  dalam  proses,  maka semakin lama proses reaksi, yang menyebabkan  semakin  banyak  gugus  asetil yang tereduksi.
Konsentrasi  enzim  yang  terlalu  tinggi serta  diiringi  dengan  waktu  inkubasi  yang lama  dapat  membuat  proses  hidrolisis mengalami kejenuhan karena seluruh substrat  telah  terhidrolisis  sehingga  tidak terdapat  lagi  substrat  yang  dapat  menempel pada  sisi  aktif  enzim  dan  menghasilkan
viskositas  yang  cenderung  konstan  pada perlakuan  enzim chitosanase 0,5%  hingga 1,5%  dan  waktu  inkubasi  5  jam.  Sesuai dalam  penelitian  Yunianta et  al. (2010)  dan Fennema  (2006),  bahwa  jika  produk  yang dihasilkan  sudah  sampai  titik  batas  dan setelah  itu  terlampaui  maka  produk  yang dihasilkan tidak akan bertambah atau konstan
meskipun  konsentrasi  enzim  ditambahkan. Hal  ini  terjadi  karena  sisi  aktif  enzim  telah jenuh  oleh  substrat  sehingga  tidak  ada  lagi substrat  yang  dapat  melekat  pada  sisi  aktif dan waktu inkubasi terlalu lama menghasilkan produk yang cenderung konstan karena enzim mengalami kejenuhan (Kurniadewi, 2016). Tabel 2. Analisa karakteristik chitooligosakarida pada berbagai kombinasi perlakuan Kombinasi Perlakuan Viskositas (cPs) Derajat Deasetilasi (%) Berat Molekul (Da) Derajat Polimerisasi K 1 L 1 3,05 ± 0,071 c 91,06 ± 0,002 b 1150,01 ± 79,355 f 4,81 ± 0,014 g K 1 L 2 3,05 ± 0,071 c 91,23 ± 0,000 b 1039,87 ± 25,360 e 4,70 ± 0,000 f K 1 L 3 2,75 ± 0,071 a 97,68 ± 0,000 g 546,99 ± 44,653 a 2,67 ± 0,000 a K 2 L 1 3,35 ± 0,071 d 86,16 ± 0,000 a 1909,39 ± 149,878 g 10,70 ± 0,007 h K 2 L 2 2,80 ± 0,141 a 96,20 ± 0,004 f 658,59 ± 23,977 a 3,31 ± 0,007 b K 2 L 3 3,00 ± 0,141 b 92,72 ± 0,002 c 787,18 ± 18,441 c 4,07 ± 0,000 d K 3 L 1 2,95 ± 0,071 a 96,12 ± 0,000 e
691,80 ± 22,985 b 3,51 ± 0,014 c K 3 L 2 3,05 ± 0,071 c 94,63 ± 0,002 d
860,64 ± 24,225 d 4,51 ± 0,014 e K 3 L 3 2,75 ± 0,071 a 97,59 ± 0,007 g 562,24 ± 23,087 a 2,69 ± 0,000 a
Keterangan: Angka  yang  diikuti  dengan  huruf  berbeda  pada  satu    kolom  yang  sama  menunjukkan perbedaan yang signifikan (α = 5%)

## Berat molekul
Rata-rata  berat  molekul  chito  oligo- sakarida dengan perlakuan konsentrasi enzim chitosanase dan  waktu  inkubasi  antara 546,99  Da  hingga  1909,39  Da  (Tabel  2). Hasil  pengujian  berat  molekul  menunjukkan bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi  enzim chitosanase dari  0,5%  hingga  1,5% dan semakin  lama  waktu  inkubasi  dari  1  jam hingga  3  jam  memiliki  kemampuan  dalam menurunkan  berat  molekul.  Hal  ini  dise- babkan  karena  aktivitas  enzim  yang  tinggi dan  lama  inkubasi  dapat  memberikan kesempatan  enzim  dalam  proses  pemutusan ikatan  polimer  semakin  tinggi  dan  semakin banyak  ikatan  polimer  yang  terpotong menjadi monomer. Menurut Putri (2016) dan Rokhati et  al. (2015),  semakin  tinggi  kon- sentrasi  enzim  maka  kecepatan  reaksi  akan meningkat.  Bertambah  banyak  enzim  yang mengkatalis  reaksi  pemutusan  ikatan  gliko- sida  pada  rantai  kitosan.  Semakin  banyak ikatan polimer yang terpotong maka semakin turun  berat  molekul  dari  kitosan  oligomer. Waktu  inkubasi  yang  lebih  lama  menye- babkan  hidrolisis  berlangsung  lebih  lama
sehingga  semakin  banyak  ikatan  polimer yang  terhidrolisis  (Wijaya  &  Yunianta, 2015).
Konsentrasi  enzim  yang  terlalu  tinggi serta  diiringi  dengan  waktu  inkubasi  yang lama  dapat  membuat  proses  hidrolisis mengalami kejenuhan karena seluruh substrat  telah  terhidrolisis  sehingga  tidak terdapat  lagi  substrat  yang  dapat  menempel pada  sisi  aktif  enzim  dan  menghasilkan viskositas  yang  cenderung  konstan  pada perlakuan  enzim chitosanase 0,5%  hingga 1,5%  dan  waktu  inkubasi  5  jam.  Sesuai dalam  penelitian  Yunianta et  al. (2010)  dan Fennema  (2006),  bahwa  jika  produk  yang dihasilkan  sudah  sampai  titik  batas  dan setelah  itu  terlampaui  maka  produk  yang dihasilkan  tidak  akan  bertambah  atau konstan meskipun konsentrasi enzim ditambahkan. Hal ini terjadi karena sisi aktif enzim  telah  jenuh  oleh  substrat  sehingga tidak  ada  lagi  substrat  yang  dapat  melekat pada  sisi  aktif  dan  waktu  inkubasi  terlalu lama  menghasilkan  produk  yang  cenderung konstan karena enzim mengalami kejenuhan (Kurniadewi, 2016).

## Derajat polimerisasi
Derajat polimerisasi adalah jumlah unit monomer  pada  makromolekul  atau  molekul oligomer  dalam  suatu  blok  atau  rantai.  Nilai derajat polimerisasi diperoleh dari kadar total gula per kadar gula pereduksi (Mangunwidjaja et al. , 2014).
Rata-rata berat molekul chito oligosakarida  dengan  perlakuan  konsentrasi enzim chitosanase dan waktu inkubasi antara 2,67 hingga 10,70 (Tabel 2). Hasil pengujian derajat  polimerisasi  menunjukkan  bahwa semakin tinggi konsentrasi enzim chitosanase dari  0,5%  hingga  1,5% dan semakin  lama  waktu  inkubasi  dari  1  jam hingga  3  jam  mampu  menurunkan  derajat deasetilasi.  Penurunan  derajat  polimerisasi terjadi akibat aktivitas enzim yang tinggi  dan lamanya waktu inkubasi memberikan kesempatan  enzim  dalam  proses  hidrolisis kitosan  yang  berupa  polimer  menjadi  COS yang memiliki 2 hingga  10 monomer karena banyaknya  ikatan  polimer  yang  terpotong. Secara  tidak  langsung,  semakin  tinggi aktivitas  enzim  yang  ditambahkan  dalam produksi  oligosakarida  maka  semakin  tinggi retensi  yang  dihasilkan  dan  semakin  kecil nilai  DP  dan  penambahan  enzim  dari berbagai  konsentrasi  enzim  berhasil  meng- hasilkan oligosakarida dengan nilai DP tidak lebih  dari  10  monosakarida  (Afni et  al., 2017).  Selain  itu,  semakin  lama  waktu inkubasi menghasilkan rantai monomer  yang pendek,  semakin  lama  hidrolisis  makin rendah nilai DP yang dihasilkan ( Sarni et al. , 2016;  Yeni et  al .,  2018).  Semakin  banyak ikatan  yang  terpotong  maka  semakin  turun DP (Handayani L et al. , 2013).
Konsentrasi  enzim  yang  terlalu  tinggi serta  diiringi  dengan  waktu  inkubasi  yang lama  dapat  membuat  proses  hidrolisis mengalami kejenuhan karena seluruh substrat telah terhidrolisis sehingga tidak terdapat lagi substrat yang dapat menempel pada sisi aktif enzim  dan  menghasilkan  viskositas  yang cenderung  konstan  pada  perlakuan  enzim chitosanase 0,5%  hingga  1,5%  dan  waktu inkubasi  5  jam.  Sesuai  dalam  penelitian Yunianta et  al. (2010)  dan  Fennema  (2006), bahwa  jika  produk  yang  dihasilkan  sudah
sampai titik batas dan setelah itu terlampaui maka  produk  yang  dihasilkan  tidak  akan bertambah atau konstan meskipun konsentrasi  enzim  ditambahkan.  Hal  ini terjadi  karena  sisi  aktif  enzim  telah  jenuh oleh substrat sehingga tidak ada lagi substrat yang dapat melekat pada sisi aktif dan waktu inkubasi  terlalu  lama  menghasilkan  produk yang  cenderung  konstan  karena  enzim mengalami kejenuhan (Kurniadewi, 2016).

## Aktivitas prebiotik
Aktivitas  prebiotik  merupakan  ke- mampuan  prebiotik  untuk  membantu  per- tumbuhan  organisme  yang  dihubungkan dengan  organisme  lain  dan  dibandingkan dengan glukosa (Roberfroid,  2007). Pertum- buhan  bakteri  probiotik  dan  patogen  dapat dilihat  pada  Gambar  1,  sedangkan  aktivitas prebiotik  chito  oligosakarida  dengan  perla- kuan konsentrasi  enzim 0,5% dan  waktu  in- kubasi 5 jam disajikan pada Tabel 3.
Gambar 1. Pertumbuhan bakteri probiotik dan patogen
Tabel 3. Hasil analisa aktivitas prebiotik Bakteri Aktivitas prebiotik L. acidophilus 1,18 B. breve 1,33
Gambar  1  menunjukkan  bahwa  media yang  ditambah  dengan  chito  oligosakarida dapat  menumbuhkan  bakteri  probiotik  dan menghambat  pertumbuhan  bakteri  patogen. Nilai  dari  pertumbuhan  bakteri  tersebut menghasilkan  aktivitas  prebiotik  sebesar
2.06 2.31 1.74 0 0.5 1 1.5 2 2.5 L . ac idophi lus B. bre ve E. c oli P ertumbuha n ba kter i Jenis bakteri
1,18 pada bakteri L. acidophilus dan sebesar 1,33 B. Breve .  Aktivitas  prebiotik  pada bakteri  probiotik B.  breve lebih  tinggi dibandingkan L. acidophilus, hal ini disebabkan B. breve memiliki enzim N-asetil glukosamida  sehingga  dapat  memetabolisme N-asetilglukosamin  pada  chito  oligosakarida dan menjadi sumber energi pada pertumbuhan.  Sesuai  dengan  pernyataan Zuniga et  al. (2018),  bahwa B.  breve memiliki  gen  yang  mengkode  N-asetil glukosamidase  dalam  metabolisme  N-asetil glukosamin  yang  merupakan  sumber  karbon dan  energi  bagi  bakteri,  sedangkan  pada bakteri L. acidophilus dengan genus lactobacillus tidak memiliki enzim tersebut.
Penghambatan pertumbuhan pada bakteri E.coli disebabkan  bahwa  salah  satu monomer  COS  yaitu  N-asetil  glukosamin melekat  pada  lektin  bakteri  sehingga  dapat mengganggu  adanya  pelekatan  ligan  target pada  reseptor.  Hal  ini  sesuai  dengan pernyataan  Quintero-Villegas et  al. (2013), bahwa  mekanisme  COS  dapat  menghambat pertumbuhan bakteri
EPEC
( Enteropathogenic  Escherichia  Coli ),  secara khusus  salah  satu  monomer  COS  yaitu GlcNAc atau N-asetilglukosamin mengganggu  pelekatan  ligan  target  pada reseptor  (lektin  bakteri)  untuk  melakukan adhesi atau pertahanan hidup.

## KESIMPULAN
Chito  Oligosakarida  dengan  perlakuan konsentrasi  enzim  0,5%  dan  lama  waktu inkubasi  5  jam  menunjukkan  hasil  karak- teristik  terbaik,  dengan  memiliki  nilai  visko- sitas 2,75 cPs, nilai berat molekul 546,99 Da, nilai  derajat  polimerisasi  2,67,  dan  derajat deasetilasi  97,68%.  Chito  Oligosakarida  ini memiliki  aktivitas  prebiotik  pada Lacto- bacillus  acidophilus dengan  nilai  sebesar 1,18  dan  sebesar  1,33  pada  bakteri Bifido- bacterium breve .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terimakasih  ditujukan  kepada Universitas  Pembangunan  Nasional  “Vete-
ran”  Jawa  Timur  yang  telah  berkenan  me- nyediakan tempat untuk pelaksanaan penelitian  selama  pandemi  COVID-19  dan kepada  pembimbing  tugas  akhir,  serta  ke- luarga  dan  teman-teman  yang  sudah  mem- berikan  motivasi  dalam  pelaksanaan  tugas akhir ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Abidin, N. A. Z., Kormin, F., Abidin, N. A.
Z., Anuar, N. A. F. M., & Bakar, M. F. A.  (2020).  The  potential  of  insects  as alternative  sources  of  chitin:  An overview  on  the  chemical  method  of extraction from various sources. International  Journal  of  Molecular Sciences. 21(14), 1–25.
Afni, F. S., Purwaningsih, S., Nurilmala, M.,
dan Peranginangin, R. (2017).
Produksi alginate oligosaccharides (aos) sebagai bahan probiotik menggunakan  enzim  alginat  lyase. Jphpi . 20, 109–122.
Akbari-Alavijeh, S., Shaddel, R., & Jafari, S. M.  (2020).  Encapsulation  of  food bioactives and nutraceuticals by various  chitosan-based  nanocarriers.
Food Hydrocolloids . 105.
Arias,  J.  L.  de  O.,  Schneider,  A.,  Batista- Andrade,  J.  A.,  Vieira,  A.  A.,  Caldas, S. S., & Primel, E. G. (2018). Chitosan from  shrimp  shells:  A  renewable sorbent applied to the clean-up step of the  method  in  order  to  determine multi-residues  of  veterinary  drugs  in different types of milk. Food Chemistry . 240, 1243–1253.
Atma Y, Ramdhani H, Mustopa AZ, Pertiwi M,  Maisarah  R.  (2018).  Karakteristik fisikokimia  gelatin  tulang  ikan  patin (Pangasius  sutchi)  hasil  ekstraksi menggunakan  limbah  buah  nanas (Ananas comosus). Agritech . 38(1):56- 63.
Czechowska-Biskup,  D.,  Jarosinska,  D., Rokita,  B.,  Ulanski,  P.,  Rosiak,  J.M. (2012).  Determination  of  degree  of deacetylation  of  chitosan-comparison of  methods. Progress  on  Chemistry
and Application of Chitin . 17:5-20.
Fawzya, Y. N., Sihotang, M. Y., Syarmalina, S.,  &  Pratitis,  A.  (2009).  Produksi kitooligosakarida  menggunakan  selu- lase  dari  trichoderma  reesei  dan bioaktivitasnya  sebagai  antibakteri.  In Jurnal  Pascapanen  dan  Bioteknologi Kelautan dan Perikanan. 4(2), 105.
Fawzya, Y. N., Sihotang, M. Y., Syarmalina, S.,  &  Pratitis,  A.  (2009).  Produksi kitooligosakarida  menggunakan  selu- lase  dari  Trichoderma  reesei  dan bioaktivitasnya  sebagai  antibakteri.  In Jurnal  Pascapanen  dan  Bioteknologi Kelautan dan Perikanan 4(2), 105. Fernandes, J. C., Tavaria, F. K., Soares, J. C., Ramos,  Ó.  S.,  João  Monteiro,  M., Pintado,  M.  E.,  &  Xavier  Malcata,  F. (2008). Antimicrobial effects of chitosans  and  chitooligosaccharides, upon Staphylococcus aureus and Escherichia  coli,  in  food  model systems. Food  Microbiology .  25(7), 922–928.
Fiamingo  A,  Delezuk  JADM,  Trombotto  S, David  L,  Campana-Filho  SP.  (2016). Extensively deacetylated high molecular  weight  chitosan  from  the multistep  ultrasound-assisted  deace- tylation  of  beta-chitin.  Ultrasonics Sonochemistry. 32:79–85.
Gao,  X.  A.,  Zhang,  Y.  F.,  Park,  R.  D., Huang,  X.,  Zhao,  X.  Y.,  Xie,  J.,  & Jin,  R.  De.  (2012).  Preparation  of chitooligosaccharides  from  chitosan using  crude  enzyme  of  Bacillus cereus  D-11. Journal  of  Applied Biological Chemistry . 55(1), 13–17. Hananto,  F.  H.  (2013).  Rancang  bangun sensor  viskositas  cairan  menggunakan strain  gauge  dengan  prinsip  silinder konsentris. Jurnal Neutrino . 87–94. Handayani  L,  H.  P.,  Siwi,  P.  R.,  &  Rokhati, N.  (2013).  Depolimerisasi  kitosan dengan hidrolisis enzimatik menggunakan  enzim  α-amilase. Jurnal Teknologi  Kimia  Dan  Industri .  2(4), 55–64.
Harti,  A.  S.  (2011).  Kajian  efek  sinergik antara  chito-oligosakarida  (cos)  dan
probiotik  (Lactobacillus  acidophilus FNCC  0051)  terhadap  penurunan kadar  kolesterol  secara in  vivo . Jurnal Teknologi Hasil Pertanian Universitas Setia Budi Surakarta. 4(1).
Huebner,  J.,  Wehling,  R.  L.,  &  Hutkins,  R. W.  (2007).  Functional  activity  of commercial  prebiotics. International Dairy Journal . 17(7), 770–775.
Islam,  M.  M.,  Shahruzzaman,  M.,  Biswas, S.,  Nurus  Sakib,  M.,  &  Rashid,  T.  U.
(2020).  Chitosan  based  bioactive materials in tissue engineering applications-A review. Bioactive Materials . 5(1), 164–183.
Jeon, Y. J., & Kim, S. K. (2000). Production of  chitooligosaccharides  using  an ultrafiltration  membrane  reactor  and their antibacterial activity. Progressive Fish-Culturist . 41(11), 133–141. Khoushab,  F.,  &  Yamabhai,  M.  (2010).
Chitin  research  revisited. Marine Drugs . 8(7), 1988–2012.
Lee,  H.W,  Park,  Y.S,  Jung,  J.S,  &  Shin,
W.S. (2002). Chitosan Oligosaccharides,  dp  2-8,  have  a prebiotic effect on the Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus sp.
Anaerobe . 8 319.
Lodhi,  G.,  Kim,  Y.,  Hwang,  J.,  Kim,  S., Jeon,  Y.,  Je,  J.,  Ahn,  C.,  Moon,  S., Jeon, B., & Park, P. (2014). Chitooligosaccharide and its derivatives : preparation and biological applications. IBoMed Research
International . 2014.
Mangunwidjaja,  D.,  Rahayuningsih,  M.,  &
Suparwati, R. (2014). Pengaruh konsentrasi enzim dan waktu hidrolisis enzimatis terhadap mutu frukto- oligosakarida  dari  inulin  umbi  dahlia (Dahlia pinata). Agroindustri Indonesia . 3(1), 190–199.
Mohan, K., Muralisankar, T., Jayakumar, R., &  Rajeevgandhi,  C.  (2021).  A  study on  structural  comparisons  of  α-chitin extracted from marine crustacean shell waste. Carbohydrate
Polymer Technologies and Applications . 2(May
2020), 100037.
Mursida,  &  Tasir,  S.  (2018).  Efektifitas larutan  alkali  pada  proses  deasetilasi dari  berbagai  bahan  baku  kitosan. JPHPI. 21, 356–366.
Nagasawa, H. (2012). The crustacean cuticle: Structure, composition and mineralization. Frontiers  in  Bioscience – Elite . 4 E(2), 711–720.
Noviary,  H.  (2013).  Pengaruh  derajat deasetilasi kitosan dari cangkang belangkas  (tachypleus  gigas)  yang diikat silang dengan modifikasi genipin.  [Tesis].  Medan:  Universitas Sumatera Utara.
Nugraheni,  N.  T.,  Kusuma,  K.  N.,  Sari,  R. Y.,  Sugiharto,  A.,  Janah,  R.,  Nisa,  K., &  Humam,  A.  Z.  (2014).  Penentuan berat  molekul  (Mn)  polimer  dengan metode  viskositas. Fisika  Eksperi- mental Lanjut (Berat Molekul). 1-18. Nurhayati, Y., Abdul, A., Osman, H., Bakar, A.,  &  Abdullah,  C.  (2016).  Effect  of chitosan oligosaccharides on the growth  of  Bifidobacterium  species. Malaysian Journal of Applied Sciences . 1(1), 13–23.
Putri, S. (2016). Karakterisasi enzim selulase yang  dihasilkan  oleh  Lactobacillus plantarum  pada  variasi  suhu,  ph,  dan konsentrasi  substrat.  [Tugas  Akhir] . Malang: Universitas Islam Malang. Quintero-Villegas,  M.  I.,  Aam,  B.  B., Rupnow,  J.,  Sørlie,  M.,  Eijsink,  V.  G. H.,  &  Hutkins,  R.  W.  (2013). Adherence inhibition
of
enteropathogenic  Escherichia  coli  by chitooligosaccharides with specific degrees of acetylation and
polymerization. Journal of Agricultural and  Food  Chemistry , 61 (11),  2748– 2754.
Rahmawati, A., & Yunianta. (2015). hidrolisis  enzimatik  pati  jahe  emprit (Zingiber  officinale  var  .  rubrum) dengan  enzim  αlfa  amilase  (kajian pengaruh konsentrasi enzim dan waktu inkubasi  terhadap  sifat  fisik  dan  kimia dekstrin)  enzymatically  hydrolysis  of emprit  ginger  (Zingiber  office). Jurnal Pangan Dan Agroindustri . 3(3), 1252–
1262.
Ratanavaraporn,  J.,  &  Damrongsakkul,  S.
(2011).  Osteogenic  differentiation  of bone-marrow-derived stem cells cultured  with  mixed  gelatin  and chitooligosaccharide
scaffolds.
Journal  of  Biomaterials  Science, Polymer Edition . 22(November 2014),
1083–1098.
Ridhay,  A.  (2016).  Pengaruh  waktu  proses deasetilasi  kitin  dari  cangkang  bekicot (Achatina  fulica)  terhadap  derajat deasetilasi [effect of chitin deacetylation  processing  times  from shells  of  snails  (Achatina  fulica)  to degree  of  deacetylation]. Kovalen . 2(1), 1–7.
Ridho,  F.A.,  Bambang  R.,  Uju.  (2017).
Kitooligosakarida melalui depolimerisasi kitosan dengan
hidrogen  peroksida  untuk  aplikasi biopreservatif pindang tradisional.
JPHPI . 20(3).
Roberfroid,  M.  (2007).  Prebiotics:  The concept revisited. Journal of Nutrition . 137(3).
Rokhati,  N.,  Pramudono,  B.,  Istirokhatun,
T., Sulchan, M., Dyah,
Kresnianingrum,  A.,  &  Dewi,  L.  K.
(2015).  Enzim  endo-glucanase  dan cellobiohydrolase. Reaktor . 15(4),
261–267.
Sarni,  Natsir,  H.,  &  Dali,  S.,  (2016). Produksi oligomer kitosan dari limbah udang  windu  (Penaeus  monodon) menggunakan  enzim  kitosanase  dari isolat  bakteri  Klebsiella  sp. Jurnal Techno 4(2).
Sartika, I. D., Amin, M., Noor, A., Nasution, E.,  Perikanan,  F.,  &  Airlangga,  U. (2016). Isolasi dan karakterisasi kitosan dari cangkang rajungan (Portunus  pelagicus). Jurnal  Biosains Pascasarjana . 18(2), 98–112.
Souripet,  A.  (2016).  Potensi  prebiotik  nasi ungu. AGRITEKNO: Jurnal  Teknologi Pertanian , 5 (1), 18.
Tanasale,  M.  F.  J.  D.  P.,  Bijang,  C.  M.,  & Rumpakwara,  E.  (2019).  Preparation of  chitosan  with  various  molecular
weight and its effect on depolymerization  of  chitosan  with hydrogen  peroxide  using  conventional technique. International  Journal  of ChemTech Research . 12 (1), 112–120. Trisnawati,  E.,  Andesti,  D.,  &  Saleh,  A. (2013). Pembuatan kitosan dari limbah cangkang  kepiting  sebagai bahan pengawet  buah  duku  dengan  variasi lama pengawetan. Jurnal Teknik Kimia ,
19 (2), 17–26.
Van Der Meulen, T., Schipper, H., Van Den
Boogaart,  J.  G.  M.,  Huising,  M.  O.,
Kranenbarg, S.,  &  Van  Leeuwen, J.  L. (2006). Endurance exercise differentially stimulates heart and axial muscle development in zebrafish (Danio  rerio). American  Journal  of Physiology  -  Regulatory  Integrative and  Comparative  Physiology . 291 (4),
1040–1048.
Wahyuni,  I.,  Rojul,  A.  B.,  Nasocha,  E., Rosyi,  N.  F.,  Nurul,  Khusnia,  & Ningsih, O. R. (2013). Penentuan berat molekul  (Mn)  polimer  dengan  metode viskositas. 1–5.
Wijaya,  J.  C.,  &  Yunianta,  Y.  (2015). Pengaruh  penambahan  enzim  bromelin terhadap  sifat  kimia  dan  organoleptik tempe  gembus  (kajian  konsentrasi  dan waktu  inkubasi  dengan  enzim). Jurnal
Pangan  Dan  Agroindustri. 3 (1),  96– 106.
Yanti, R., Drastinawati, & Yusminar. (2018). Sintesis  kitosan  dari  limbah  cangkang kepiting dengan variasi suhu dan waktu pada proses deasetilasi. Jom FTEKNIK ,
5 (2), 1–7.
Yeni, G., Silfia, S., & Hermianti, W. (2018).
Pengembangan potensi
tepung
bengkuang (Pachyrhizus erosus)
sebagai  matriks  enkapsulasi  yang dimodifikasi melalui proses lintnerisasi untuk  bahan  baku  kosmetik. Prosiding Seminar  Nasional  I  Hasil  Litbangyasa Industri , Issn 2654 - 8550 , 155–161.
Yunianta, Sulistyo, T., Estiasih, T., & Wulan, N.  (2010).  Hidrolisis  secara  sinergis pati  garut  (Maranta  arundinacea  L.) oleh  enzim  a-amilase,  glukoamilase,
dan  pullulanase  untuk  produksi  sirup glukosa. Jurnal  Teknologi  Pertanian .
11 (2), 78–86.
Zuniga,  M.,  Monedero,  V.,  &  Yebra,  M.  J. (2018).  Utilization  of  host-derived glycans by intestinal Lactobacillus and Bifidobacterium  species. Frontiers  in Microbiology , 9 (AUG), 1–23.