EISSN: 2407-7690 https://ejournal3.undip.ac.id/index.php/jmr

## Pengaruh Fermentasi Gracilaria verrucosa dengan Penambahan Starter
Lactobacillus plantarum pada Profil Metabolit dan Aktivitas Biologisnya
Pola Risda Aswita Silitonga 1,2 , Wilis Ari Setyati 1 , AB Susanto 1 , Mada Triandala Sibero 1,2 *
1 Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro
2 Laboratorium Natural Product, UPT Laboratorium Terpadu, Universitas Diponegoro Jl. Prof. H. Soedarto S.H, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia *Corresponding author, e-mail: madatriandalasibero@lecturer.undip.ac.id
ABSTRAK:  Gracilaria  verrucosa merupakan  salah  satu  spesies  penting  Rhodophyta  yang  telah banyak  dimanfaatkan  dalam  berbagai  industri.  Hasil  penelitian  sebelumnya  menunjukkan  bahwa G.  verrucosa memiliki  aktivitas  biologis  sebagai  antioksidan,  namun  laporan  mengenai  potensi sebagai  antibakteri  dan  antikanker  masih  sedikit  dilaporkan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  pengaruh  fermentasi  menggunakan L.  plantarum terhadap  aktivitas  antibakteri, toksisitas,  dan  karakteristik  metabolit  ekstrak  rumput  laut G.  verrucosa dengan  waktu  fermentasi yang berbeda. Metode dalam penelitian ini adalah preparasi, fermentasi, ekstraksi, uji antibakteri, uji  toksisitas,  dan  karakterisasi  metabolit.  Uji  aktivitas  antibakteri  dengan  metode agar  well diffusion terhadap  bakteri foodborne  disease sedangkan  uji  toksisitas  dengan  metode  BSLT. Karakterisasi  metabolit  dilakukan  menggunakan  KLT  dengan  eluent  kloroform:  etil  asetat  (9:1), serta  visualisasi  metabolit  dengan  reagen  Dragendorff,  dan  Ninhidrin.  Hasil  analisis  KLT menunjukkan  ekstrak G.  verrucosa yang  difermentasi  menggunakan L.  plantarum menghasilkan senyawa yang diduga senyawa alkaloid dan asam amino bebas. Uji aktivitas antibakteri ekstrak G. verrucosa menunjukkan hasil negatif dan tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri MDR E.  coli dan S.  typhi .  Analisis  toksisitas  menunjukkan  bahwa  setiap  ekstrak  rumput  laut dikategorikan toksik terhadap larva A. salina L. dengan nilai LC 50 ETA (73,26 μg/mL), EDA (218,09 μg/mL), Fr 24 (316,69 μg/mL), Fr 48 (316,69 μg/mL), dan Fr 72 (316,69 μg/mL). Berdasarkan hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  fermentasi  menggunakan L.  plantarum tidak  dapat  meningkatkan aktivitas biologis rumput laut G. verrucosa.
Kata kunci: G. verrucosa ; L. plantarum ; Metabolit; Antibakteri; Toksisitas
Effect of Gracilaria verrucosa Fermentation with the Addition of Starter Lactobacillus plantarum on Metabolite Profiles and Biological Activities
ABSTRACT: Gracilaria verrucosa is one of the most important Rhodophyta species that has been widely used in various industries. The results of previous studies showed that G. verrucosa has a weak antioxidant activity, however, reports on its potential as antibacterial and anticancer are still under explored. This study aimed to determine the effect of fermentation using L. plantarum in G. verrucosa ’s  metabolites  and  biological  activities with  different  fermentation  times.  This  study consisted  of  preparation,  fermentation,  extraction,  antibacterial  test,  toxicity  test,  and  metabolite characterization.  The  antibacterial  activity  assay  was  conducted  by  agar  well  diffusion  method against  foodborne  disease  bacteria  while  toxicity  test  using  BSLT  method.  Metabolite characterization was carried out using TLC with chloroform : ethyl acetate (9:1) as the eluent, spot visualization was conducted by the addition of Dragendorff, and Ninhydrin reagents. The result of TLC analysis showed that G. verrucosa produced alkaloids and amino acids derivative compounds after fermentation. G. verrucosa extracts had no antibacterial activity against MDR  E. coli and S. typhi.  Toxicity  assay  showed  that  each  seaweed  extract  was  categorized  as  toxic  to  A.  salina  L. larvae with an LC 50 value of ETA (73.26 ug/mL), EDA (218.09 ug/mL), Fr 24 (316.69 ug/mL), Fr 48 (316.69  ug/mL),  and  Fr  72  (316.69  ug/mL).  Based  on  the  results  of  the  study  showed  that fermentation using L. plantarum could not elevate the antimicrobial and toxicity of G. verrucosa.
Keywords: G. verrucosa; L. plantarum; Metabolite; Antibacterial; Toxicity

## PENDAHULUAN
Rumput  laut  merah  ( Gracilaria  verrucosa) kaya  akan  kandungan  metabolit  primer  dan sekunder dibandingkan jenis rumput laut hijau dan coklat, seperti 75% senyawa alkaloid dan 89% senyawa poliketida ditemukan di Rhodophyta (Leal et al., 2013). Gracilaria verrucosa merupakan salah  satu  spesies  penting  Rhodophyta  penghasil  agar  -  agar  yang  telah  banyak  dimanfaatkan dalam berbagai industri. Menurut Arunkumar et al . (2014) bahwa G. verrucosa memiliki kandungan klorofil total serta pigmen aksesoris yang lebih tinggi dibandingkan spesies Rhodophyta lainnya. G. verrucosa memiliki  kandungan  senyawa  bioaktif  alkaloid,  fenolik,  tanin,  flavonoid  (Maftuch et  al ., 2016),  saponin  (Arsianti et  al., 2018).  Hasil  penelitian  sebelumnya  menunjukkan  bahwa G. verrucosa memiliki  aktivitas  biologis  seperti  antioksidan,  namun  laporan  mengenai  potensinya sebagai  antibakteri  masih  sedikit  dilaporkan.  Hal  ini  diduga  karena  rumput  laut  ini  memang  tidak terlalu potensial sebagai agen antibakteri maupun antikanker.
Penelitian  Prasad et  al . (2012)  melaporkan  bahwa  ekstrak  kasar G . verrucosa memberikan hasil  negatif  pada  bakteri  patogen  makanan Salmonella  typhi .  Sebelumnya,  Widodo et  al . (2019) juga  menyebutkan  bahwa  rumput  laut G . verrucosa asal  BBPBAP  Jepara  tidak  memiliki  aktivitas antibakteri  melawan  bakteri  patogen  manusia.    Lebih  lagi,  kajian  toksisitas  dari  rumput  laut  ini belum  banyak  dilaporkan.  Salah  satu  metode  yang  dapat  dilakukan  untuk  meningkatkan  potensi aktivitas  biologi  ialah  melalui  fermentasi.  Fermentasi  merupakan  proses  perubahan  secara biokimiawi pada bahan pangan yang melibatkan aktivitas mikroorganisme dan aktivitas enzim oleh mikroorganisme.  Pada  beberapa  produk  fermentasi  dilaporkan  adanya  peningkatan  kandungan vitamin,  antioksidan  dan  senyawa  lainnya  yang  bermanfaat  bagi  kesehatan  manusia  (Setiarto, 2020).
Bakteri asam laktat telah banyak digunakan dalam fermentasi makanan karena sifatnya yang tidak  berbahaya.  Salah  satu  spesies  BAL  yang  menjanjikan  adalah Lactobacillus  plantarum atau yang  baru  ini  disebut Lactiplantibacillus plantarum berdasarkan  publikasi  Zheng et  al. (2020). Spesies L.  plantarum telah  diakui  aman  “ Generally  Recognized  As  Safe ”  (GRAS)  oleh  FDA  dan telah memenuhi status praduga keselamatan yang memenuhi syarat (QPS) (Behera et al ., 2018). Penelitian  Ambarsari et  al .  (2018)  melaporkan  bahwa  fermentasi  dengan starter L.  plantarum meningkatkan  aktivitas  antioksidan  dan  total  fenol  rumput  laut Ulva  lactuca .  Rianingsih  dan Sumardianto (2020) dalam penelitiannya menunjukkan bahwa proses fermentasi menggunakan L. plantarum dapat  meningkatkan  aktivitas  antioksidan  dari  rumput  laut Sargassum sp.  meski  tidak secara  signifikan.  Chye et  al .  (2018)  mengungkapkan  bahwa Gracilaria  fisheri yang  difermentasi menggunakan L.  plantarum memiliki  aktivitas  antikanker  dan  aktivirus.  Rendahnya  aktivitas antibakteri  dan  belum  banyaknya  laporan  toksisitas G.  verrucosa serta  adanya  potensi peningkatan  aktivitas  biologis  melalui  fermentasi  menggunakan L.  plantarum sehingga  penelitian ini sangat penting untuk dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh fermentasi menggunakan L. plantarum terhadap aktivitas antibakteri dan toksisitas serta pengaruh fermentasi menggunakan L.  plantarum terhadap  karakterisasi  metabolit  ekstrak  rumput  laut G.  verrucosa dengan waktu fermentasi yang berbeda.

## MATERI DAN METODE
Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium  Natural  Product,  UPT  Laboratorium  Terpadu Universitas  Diponegoro  pada  bulan  Februari –  Agustus  2021.  Isolat Lactobacillus  plantarum (Murwani et al ., 2021) diremajakan dalam 10 ml media MRS Broth (Himedia)  steril dalam tabung reaksi. Biakan bakteri kemudian diinkubasi pada inkubator shaker dengan suhu 37 o C dan 150 rpm selama 24 jam (Irwanto et al ., 2018).
Rumput  laut G.  verrucosa diperoleh  dari  BBPBAP  (Balai  Besar  Perikanan  Budidaya  Air Payau) Jepara. Sampel rumput laut diambil dengan keadaan segar dengan tujuan agar senyawa metabolit  yang  terkandung  pada  sampel  tidak  mengalami  perubahan.  Rumput  laut  segar selanjutnya dicuci dengan air tawar mengalir untuk membersihkan sampel dari epifit, sedimen, dan pengotor lainnya. Rumput laut kemudian ditiriskan.
Journal of Marine Research Vol 11, No.2 Mei 2022, pp. 309-319
Metode fermentasi rumput laut mengacu pada Wandansari et al . (2013) dengan beberapa modifikasi.  Sampel  rumput  laut G.  verrucosa dipotong  kecil-kecil  hingga  ukuran  0,5  cm  dan selanjutnya  diblender.  Rumput  laut  halus  diambil  sebanyak  40  gram  dan  ditambahkan  100  ml aquades, 5 % glukosa, 0,5% yeast extract , dan 0,5% peptone .  Selanjutnya disterilisasi pada 121 o C  selama  30  menit.  Setelah  sterilisasi  selesai,  sampel  diinokulasikan  10%  inokulum.  Sampel inkubasi  pada  suhu  37 o C  dan  150  rpm.  Pada  24  jam,  48 jam  dan  72 jam  dilakukan  pengamatan fermentasi meliputi pengukuran pH dan total bakteri laktat pada awal dan akhir fermentasi.
Sebanyak 5 sampel rumput laut G. verrucosa yang digunakan terdiri dari 200 gram sampel rumput  laut  segar,  200  gram  sampel  rumput  laut  autoklaf,  dan  3  sampel  hasil  fermentasi. Ekstraksi  dilakukan  dengan  metode  Marraskuranto et  al .  (2021)  yang  telah  dimodifikasi,  metode maserasi  menggunakan  pelarut  tunggal  yaitu  etil  asetat.  Penggunaan  pelarut  etil  asetat  karena pelarut  yang  ini  tidak  akan  melarutkan  garam,  mudah  menguap,  dan  bersifat  semipolar  dengan toksisitas rendah. Maserasi dilakukan dengan menambahkan pelarut etil asetat kedalam masing- masing  erlenmeyer  sampel  dengan  rasio  berat  sampel  terhadap  pelarut  1:2  (b/v)  selanjutnya erlenmeyer  diletakkan  di  atas orbital shaker 100  rpm  agar  proses  maserasi  semakin  cepat  dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Hasil penyaringan filtrat atau ekstrak larutan maserasi selanjutnya  dilakukan  pemekatan  sampel  menggunakan rotary  evaporator. Selanjutnya  ekstrak kasar ( crude extract ) ditimbang massanya (mg) dan dilapisi menggunakan pelapis alluminium foil kemudian disimpan dalam cold storage -20 o C.
Metode  Uji  KLT  sebagai  berikut  ekstrak  kasar  rumput  laut  ditotolkan  pada  Silica  Gel (Merck, F254) sebagai fase diam dan fase gerak yang digunakan kombinasi pelarut kloroform dan etil  asetat  dengan  perbandingan  9:1  (v/v).  Noda  pada  plat  silika  diobservasi  di  bawah  lampu  UV 366  nm  dan  nilai R f dihitung.  Plat  KLT  disemprot  dengan  pereaksi Dragendorff (Ahmad et  al ., 2017) dan Ninhidrin (Sinhababu, 2013) dan diamati pada sinar tampak.
Untuk  mengetahui  potensi  antibakteri  ekstrak  rumput  laut  untuk  menghambat  pertumbuhan bakteri  patogen  Foodborne  Disease  MDR,  aktivitas  antibakteri  dari  setiap  ekstrak  diuji  dilakukan terhadap  bakteri  Foodborne  Disease  MDR Escherichia  coli dan Salmonella  typhi yang  diperoleh dari  Laboratorium  Natural  Product.  Metode  uji  antibakteri  mengacu  pada  Balouiri et  al .  (2016) dengan  beberapa  modifikasi.  Kultur  patogen  diremajakan  ke  dalam  Nutrien  Agar  (NA,  HiMedia) diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam sebelum pengujian dilakukan. Agar well diffusion adalah metode  yang  digunakan  dalam  pengujian  aktivitas  antibakteri.  Kelima  ekstrak  kasar  rumput  laut masing  -  masing  diencerkan  dalam  DMSO  pada  konsentrasi  2000  ug/mL,  Amoxicilin  100  ug/mL digunakan sebagai kontrol positif, dan DMSO tanpa ekstrak sebagai kontrol negatif. Setiap bakteri patogen  usia  24  jam  diencerkan  menjadi  0,5  McFarland  dalam  Mueller  Hinton  Broth  (MHB, HiMedia).  Pengenceran  bakteri  MDR  diinokulasikan  pada  Mueller  Hinton  Agar  (MHA,  HiMedia). Media uji MHA dilubangi menggunakan borer . Setiap ekstrak rumput laut konsentrasi 2000 ug/mL, Amoxicilin,  dan  DMSO  sebanyak  40  uL  diinokulasikan  pada  media  uji.  Inkubasi  dilakukan  pada 37 o C  selama  24  jam.  Adanya  zona  bening  menunjukkan  aktivitas  antibakteri  dari  esktrak  rumput laut negatif (Sibero et al ., 2018).
Uji  toksisitas  ekstrak  rumput  laut  dilakukan  dengan  menggunakan  metode  BSLT  (Meyer  et al.,  1982).  Tahapan  uji  toksisitas  meliputi  penetasan  larva  udang,  penyiapan  larutan  uji,  dan  uji toksisitas ekstrak. Metode tahap penyiapan larva udang dan larutan uji mengacu pada Puspitasari et  al .  (2018)  dan  metode  tahap  uji  toksisitas  mengacu  pada  Puspasari et  al .  (2020)  dengan beberapa modifikasi. Sebanyak 1 gram kista udang Artemia salina L. direndam dalam air laut 100 mL dan diberikan penerangan lampu 20 Watt serta diaerasi selama 48 jam.  Setiap ekstrak kasar rumput  laut G.  verrucosa dilarutkan  dalam  pelarut  metanol  dan  didapat  larutan  uji  dengan konsentrasi 1000  μg/mL,  500  μg/mL,  250  μg/mL,  125  μg/mL,  dan  62,5  μg/mL.  Setiap  ekstrak masing-masing  konsentrasi  diambil  5  ml  dan  dimasukkan  ke  dalam  vial  10  mL  kemudian dievaporasi untuk menghilangkan pelarutnya dan selanjutnya ditambahkan dengan 1% DMSO.
Larutan  uji  dengan  konsentrasi  1000  μg/mL,  500  μg/mL,  250  μg/mL,  125  μg/mL,  dan  62,5 μg/mL  yang telah  dilarutkan  menggunakan  1% DMSO  selanjutnya  ditambahkan  10  ekor  larva A. salina L.  yang  berumur  48  jam  (nauplius)  dan  air  laut  hingga  mencapai  volume  5  mL.  Setiap konsentrasi  dilakukan  3  replikasi  untuk  setiap  konsentrasi.  Setiap  vial  diinkubasi  selama  24  jam
pada  suhu  ruang  (26 o C)  dibawah  penerangan  lampu  20  Watt.  Pengamatan    dilakukan  setelah inkubasi  24  jam  dan  dihitung  jumlah  larva A.  salina L.  yang  mati/tidak  bergerak  selama  10  detik observasi.  Data  hasil  pengamatan  toksisitas  diolah  dan  dianalisis  dengan  analisis  probit menggunakan Ms. Excel untuk mencari regresi linearnya berdasarkan grafik garis.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Total Plate Count dan Perubahan pH Fermentasi G. verrucosa
Jumlah total BAL dan pH pada awal dan akhir fermentasi sampel yang difermentasi selama 24,  48,  72  jam  dihitung  untuk  mengetahui  kurva  pertumbuhan  pada  proses  fermentasi. Penambahan  starter Lactobacillus  plantarum pada  sampel  rumput  laut Gracilaria  verrucosa dan lama  waktu  fermentasi  berpengaruh  terhadap  jumlah  bakteri  asam  laktat  dan  pH  akhir  produk fermentasi  rumput  laut.  Hasil  pengukuran  total  bakteri  dan  pH  pada  awal  dan  akhir  fermentasi ditunjukkan pada Gambar 1.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  jumlah  sel  bakteri  mengalami  peningkatan  selama proses fermentasi Fr 0 sampai Fr 48 jam dan selanjutnya mengalami penurunan/ kematian. Pada awal  fermentasi  Fr  0  tercatat  jumlah  bakteri  2,7  10 8 CFU/mL,  setelah  fermentasi  Fr  24  jumlah bakteri  mengalami  peningkatan  menjadi  2,4  ×  10 9 CFU/mL  selanjutnya  fermentasi  Fr  48  jumlah bakteri menjadi 3,5  10 9 CFU/mL dan jumlah bakteri mengalami penurunan setelah fermentasi Fr 72  menjadi  4,9  ×  10 8 CFU/mL.  Penambahan  jumlah  bakteri  pada  waktu  inkubasi  menandakan pertumbuhan pada fase logaritmik (pertumbuhan) pada Fr 0 – Fr 24 jam, fase stasioner pada Fr 24 – Fr 48, dan selanjutnya memasuki fase kematian pada Fr 48 - Fr 72 jam.  Pada akhir fermentasi, jumlah  bakteri  mengalami  penurunan  diduga  bakteri  berada  pada  fase  kematian  yang  dapat disebabkan  oleh  kadar  nutrisi  berkurang  atau  akumulasi  produk  asam  yang  mengganggu  proses pembelahan  sel  (Mangalisu et  al .,  2015).  Menurut  Ambarsari et  al .  (2017)  bahwa  pertumbuhan bakteri  asam  laktat  meningkat  dengan  bertambahnya  waktu  inkubasi,  optimalisasi  suhu, kelembaban,  cahaya,  pH,  dan  nutrisi.  Fermentasi  yang  dilakukan  pada  suhu  37 o C  mendukung pertumbuhan bakteri.
Gambar 1. Grafik Total  Plate  Count Bakteri  dan  pH  Rumput  Laut  Fermentasi  Dengan  Waktu Fermentasi Berbeda

## Journal of Marine Research Vol 11, No.2 Mei 2022, pp. 309-319
Berdasarkan  Gambar  1  menunjukkan  bahwa  nilai  pH  semua  perlakuan  fermentasi  tercatat mengalami penurunan. Nilai pH tercatat terus menurun dari Fr 0 jam sebesar 7,01 kemudian turun menjadi 3 pada Fr 24 jam, menurun menjadi 2,9 pada Fr 48 jam, dan semakin asam 2,77 pada Fr 72  jam.  Menurut  Alhaag et  al .  (2019)  mengatakan  bahwa  penurunan  pH  terjadi  karena  adanya aktivitas  mikroorganisme  menghasilkan  asam  laktat  dari  hasil  metabolisme,  asam  laktat  yang terbentuk terakumulasi dan menyebabkan nilai pH menjadi menurun selama proses fermentasi. L. plantarum memilki  kemampuan  untuk  meningkatkan  produksi  asam  laktat  dan  menurunkan  pH lingkungan fermentasi dengan cara mengubah karbohidrat/gula dalam bahan/ rumput laut menjadi asam  laktat  (metabolit  primer)  (Rianingsih et  al .,  2021). L.  plantarum dapat  mencerna  senyawa kompleks  menjadi  senyawa  sederhana  dengan  hasil  akhir  berupa  asam  laktat  (Ambarsari et  al ., 2017).
Penurunan  pH  pada  fermentasi  yang  dilakukan  berkaitan  dengan  reaksi  fermentasi  yang terjadi.  Proses  fermentasi  asam  laktat  diawali  dengan  glikolisis  yang  pemecahan  karbohidrat menjadi  2  molekul  asam  piruvat.  Pada  glikolisis  NAD + direduksi  menjadi NADH  dan  ion  hidrogen (H+) (Elving et al., 1982). Ketika oksigen tidak tersedia, asam piruvat akan direduksi menjadi asam laktat  dan  reoksidasi  NADH  menjadi  NAD + untuk  digunakan  kembali  dalam  glikolisis.  Semakin banyak asam laktat yang dihasilkan di media, ion hidrogen (H+) yang terbentuk dan terakumulasi juga semakin banyak, hal tersebut diduga menyebab penurunan pH media fermentasi.

## Profil Metabolit Ekstrak G. verrucosa
Karakterisasi  senyawa  metabolit  pada  KLT  dilakukan  dengan  penyemprotan  reagen Dragendorff  dan  Ninhidrin  pada  plat  KLT.  Penyemprotan  reagen  Dragendorff  dilakukan  untuk mengetahui  keberadaan  alkaloid  pada  sampel  (Raal et  al .,  2020).  Plat  KLT  yang  disemprotkan dengan  Dragendroff  akan  menunjukkan  bercak  noda  kuning  ke  oranye,  merah  hingga  coklat dengan  latar  belakang  kuning  pada  pengamatan  dengan  sinar  tampak.  Uji  Ninhidrin  dilakukan untuk mendeteksi komponen asam amino pada ekstrak. Hasil positif plat KLT yang disemprotkan dengan  Ninhidrin  akan muncul  bercak  noda  berwarna merah muda  atau  ungu  pada  pengamatan dengan sinar tampak.
Analisis  metabolit  menggunakan  KLT  terhadap  ekstrak  rumput  laut  segar,  autoklaf,  dan fermentasi menggunakan eluent klorofom: etil asetat (9:1) di bawah sinar UV 366 nm menunjukkan bahwa  proses  fermentasi  menghasilkan  metabolit  yang  berbeda  dengan  rumput  laut  segar  dan autoklaf. Pemisahan senyawa dengan KLT pada ekstrak rumput laut yang diamati di bawah sinar UV 366 nm menghasilkan bercak noda senyawa dengan nilai R f berbeda.
Berdasarkan Tabel 2 menunjukkan bahwa ekstrak rumput laut segar dan fermentasi memiliki bercak  noda  berwarna  kuning  setelah  disemprotkan  dengan  reagen Dragendorff .  Warna  kuning yang  muncul  pada  plat  KLT  yang  disemprotkan  dengan  reagen Dragendorff diduga  adalah senyawa alkaloid (Ahmad et al ., 2017). Noda kuning pada ekstrak rumput laut segar (ETA) diduga senyawa alkaloid, karena rumput laut G. verrucosa mengandung metabolit sekunder alkaloid
Tabel 1. Nilai R f ekstrak  kasar G.  verrucosa menggunakan  eluen  kloroform:  etil  asetat=  9:1 pengamatan di sinar UV.
Keterangan:  ETA:  Ekstrak  Tanpa  Autoklaf;  EDA:  Ekstrak  Dengan  Autolaf;  Fr  24:  Ekstrak Fermentasi 24 jam; Fr 48: Ekstrak Fermentasi 48 jam; Fr 72: Ekstrak Fermentasi 72 jam;  : tidak ada;  : ada.
Ekstrak Retention (R f ) Value 0,07 0,11 0,13 0,17 0,39 0,40 0,43 0,47 0,67 0,76 0,85 ETA            EDA            Fr 24            Fr 48            Fr 72           
(Widowati et  al .,  2014;  Cyril et  al .,  2017).  Pada  ekstrak  dengan  autoklaf  (EDA)  tidak  ditemukan noda  yang  diduga  senyawa  alkaloid,  hal  ini  diduga  disebabkan  oleh  proses  pemanasan  atau sterilisasi yang merusak kandungan senyawa metabolit sekunder pada rumput laut. Pada ekstrak Fr  24,  Fr  48  dan  Fr  72  ditemukan  noda  kuning,  hal  ini  menunjukkan  bahwa  rumput  laut  yang difermentasi  menggunakan  bakteri L.  plantarum dapat  menghasilkan  senyawa  yang  diduga senyawa alkaloid.
Hasil  penyemprotan  Ninhidrin  pada  plat  KLT  (Tabel  3)  menunjukkan  adanya  bercak  noda ungu  pada  ekstrak  rumput  laut  fermentasi  Fr  24,  Fr  48,  dan  Fr  72  jam  dengan  nilai R f yang berbeda-beda.
Tabel 2. Nilai R f ekstrak kasar G. verrucosa dengan penyemprotan reagen Dragendorff
Ekstrak Retention ( R f ) Value 0,13 0,17 0,25 0,33 ETA     EDA     Fr 24     Fr 48     Fr 72     Warna Kuning Kuning-jingga Hijau Kuning Dugaan Alkaloid (Raal et al ., 2020) Alkaloid (Raal et al ., 2020) - Alkaloid (Raal et al ., 2020) Keterangan:  ETA:  Ekstrak  Tanpa  Autoklaf;  EDA:  Ekstrak  Dengan  Autolaf;  Fr  24:  Ekstrak Fermentasi 24 jam; Fr 48: Ekstrak Fermentasi 48 jam; Fr 72: Ekstrak Fermentasi 72 jam;  : tidak ada;  : ada.
(a)
(b)
(c)
Gambar 2. Hasil analisis KLT masing masing ekstrak G. verrucosa menggunakan eluen kloroform: etil  asetat  (9:1)  (a)  pengamatan  di  sinar  UV  366  nm;  (b)  penyemprotan  reagen Dragendorff; (c) penyemprotan reagen Ninhidrin
Tabel 3. Nilai R f ekstrak kasar G. verrucosa dengan penyemprotan reagen Ninhidrin.
Ekstrak Retention ( R f ) Value 0,18 0,20 0,30 ETA    EDA    Fr 24    Fr 48    Fr 72    Warna Ungu Ungu Ungu Dugaan Asam amino (Sinhababu, 2013). Asam amino (Sinhababu, 2013). Asam amino (Sinhababu, 2013).
Keterangan:  ETA:  Ekstrak  Tanpa  Autoklaf;  EDA:  Ekstrak  Dengan  Autolaf;  Fr  24:  Ekstrak Fermentasi 24 jam; Fr 48: Ekstrak Fermentasi 48 jam; Fr 72: Ekstrak Fermentasi 72 jam;  : tidak ada;  : ada.
Berdasarkan  uji  Ninhidrin  ini  menunjukkan  bahwa  proses  fermentasi  berlangsung  dan terbentuk  asam  amino  bebas.  Menurut  Mangalisu et  al. (2015)  bakteri L.  plantarum bersifat proteolitik. Selama pertumbuhan , bakteri memetabolisme nutrisi dalam medium, memecah protein menjadi asam amino dan peptida sehingga dapat mendukung pertumbuhan dan pembelahan sel.

## Analisis Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kasar G. verrucosa
Pengujian  antibakteri  dilakukan  untuk  mengetahui  sensitivitas  bakteri  uji  terhadap  sampel esktrak uji. Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak rumput laut segar, autoklaf dan fermentasi dengan menunjukkan  bahwa  ekstrak tidak memiliki  efek  antibakteri terhadap mikroba  patogen  uji.  Hal  ini dapat dilihat dari tidak terbentuknya zona hambat pada media uji (Gambar 3).
Penelitian  Widowati et  al .  (2014)  melaporkan  bahwa  ekstrak  rumput  laut  memiliki  aktivitas menghambat pertumbuhan E. coli, namun hasil penelitian ini tidak menunjukkan hasil yang sama. Menurut  Muharni et  al. (2017)  hal  tersebut  kemungkinan  disebabkan  ekstrak  memiliki  banyak senyawa  lain  yang  mempengaruhi  kemampuannya  untuk  menghambat  pertumbuhan  bakteri patogen  uji.  Kemampuan  aktivitas  antibakteri  ekstrak  dipengaruhi  oleh  kandungan  senyawa  aktif yang terkandung dalam ekstrak.
Bakteri uji yang digunakan adalah foodborne disease Multidrug Resistant (MDR) E.coli dan S. typhi yang termasuk kelompok bakteri gram negatif. Bakteri gram negatif diketahui kurang lebih resisten  terhadap  beberapa  senyawa  antibakteri/antibiotik.  Hal  tersebut  disebabkan  struktur dinding  sel  bakteri  gram  negatif  lebih  kompleks  dibanding  dengan  bakteri  gram  positif.  Lapisan lipopolisakarida  pada  dinding  sel  bakteri  gram  negatif  memperkuat  kekakuan  sel  melalui  ikatan silang  kationik  sehingga  menyebabkan  bakteri  gram  negatif  lebih  kokoh  dan  sulit  ditembus  oleh beberapa  senyawa  antibakteri/antibiotik  (Nurhayati et  al .,  2020).  Selain  itu,  kedua  bakteri  uji  ini merupakan  isolat  MDR  artinya  bakteri  ini  memiliki  kemampuan  resistensi  terhadap  beberapa golongan senyawa antibiotik (Nikaido, 2009). Hal ini juga diduga berpengaruh terhadap sensitifitas kedua bakteri ini terhadap ekstrak yang digunakan. Salah satu mekanisme resistensi bakteri MDR E.  coli dan S.  typhi yang  diduga  membuat  ekstrak  sampel  tidak  aktif  adalah efflux  pump (Soto, 2013).  Pratiwi  (2017)  menyatakan  bahwa  bakteri  dengan efflux  pump aktif  dapat  mengeliminasi senyawa  antibakteri  atau  mengeluarkan  senyawa  toksik  yang masuk  ke dalam  sel  dengan  cepat sebelum senyawa tersebut berdifusi, sehingga senyawa tersebut menjadi tidak efektif.
Foodborne disease merupakan penyakit yang disebabkan oleh kontaminasi mikroorganisme patogen  pada  bahan  makanan.  Bakteri  patogen  penyebab foodborne  disease biasanya  bersifat toksik  dan  atau  infeksius.  Beberapa  bakteri  penyebab foodborne  disease adalah E.  coli dan S. tyhpi . Secara alami E. coli merupakan flora normal yang dapat ditemukan pada usus manusia dan kebanyakan  tidak  berbahaya.  Namun  strain E.  coli tertentu  dapat  menginfeksi  daerah  usus  dan menyebabkan  penyakit  diare  (Yang et  al., 2017). S.  typhi bakteri  yang  dapat  mengkontaminasi

## Journal of Marine Research Vol 11, No.2 Mei 2022, pp. 309-319
makanan  dan  minuman.  Bakteri  ini  dapat  menginfeksi  dan  menyebabkan  penyakit  tipus  dan gastroenteritis.  Menurut  Eng et  al .  (2015) Salmonella sebagai  patogen  makanan  paling  sering ditemukan pada unggas, produk susu. Menurut Yogita et  al. (2018) kasus infeksi bakteri S. typhi cukup tinggi di Indonesia, bakteri ini diketahui resistensi terhadap agen antibiotik seperti Ampisilin, Kloramfenikol dan Trimetoprim-sulfametoksazol.

## Analisis Toksisitas Ekstrak Kasar G. verrucosa
Pengujian  terhadap  toksisitas  ekstrak  rumput  laut  segar  (ETA),  autoklaf  (EDA),  dan fermentasi  (Fr  24,  Fr  48,  dan  Fr  72)  terhadap  larva A.  salina L.  menunjukkan  nilai  LC 50 yang berbeda.  Berdasarkan  Tabel  4  dapat  diketahui  bahwa  kelima  ekstrak  rumput  laut  memiliki  nilai LC 50 di bawah 1000 μg/mL. Merujuk Meyer et al. (1982) jika nilai LC 50 1000 μg/mL dikategorikan toksik dan berpotensi sebagai antikanker. Berdasarkan Tabel 4 diketahui bahwa ETA memiliki sifat toksik yang lebih kuat dibandingkan dengan keempat ekstrak EDA, Fr 24, Fr 48, dan Fr 72.
Ekstrak  rumput  laut  autoklaf  (EDA)  dan  fermentasi  (Fr  24,  Fr  48,  dan  Fr  72)  menunjukkan penurunan  toksisitas.  Hal  ini  diduga  disebabkan  proses  pemanasan  (sterilisasi)  yang menyebabkan  kerusakan  senyawa  bioaktif  pada  rumput  laut.    Berdasarkan  hasil  uji,  tingkat toksisitas  terendah  ditemukan  pada  ekstrak  rumput  laut  fermentasi.  Fermentasi  dengan menggunakan L.  plantarum justru  memperlemah  toksisitas  rumput  laut.  Melemahnya  toksisitas diduga disebabkan senyawa yang dihasilkan saat fermentasi bersifat antagonis dan mengganggu fungsi  senyawa  pada  rumput  laut  yang  memiliki  aktivitas  antikanker.  Niksic et  al .  (2021) menyatakan  bahwa  penggunaan  BSLT  dalam  pengujian  toksisitas  suatu  senyawa  berkorelasi positif terhadap aktivitas sitotoksiknya, sehingga dapat digunakan dalam pengujian awal toksisitas.
Gambar 3. Hasil uji antibakteri ekstrak rumput laut
Tabel 4. LC 50 ekstrak G. verrucosa.
Sampel Ekstrak Nilai LC 50 (μg/mL) a ETA 73,26 EDA 218,09 Fr 24 316,69 Fr 48 316,69 Fr 72 316,69
Keterangan: a: pengolahan data menggunakan Ms. Excel;  ETA:  Ekstrak  Tanpa  Autoklaf,  EDA: Ekstrak Dengan Autolaf; Fr 24: Ekstrak Fermentasi 24 jam; Fr 48: Ekstrak Fermentasi 48 jam; Fr 72: Ekstrak Fermentasi 72 jam
Escherichia coli
Salmonella typhi
Pengujian  toksisitas  pada  penelitian  ini  dilakukan  dengan  metode  BSLT.  Penggunaan A. salina L. sebagai hewan uji yang efektif dalam toksikologi karena mudah ditetaskan, pertumbuhan yang cepat, dan mudah diperoleh (Sorgeloos et al ., 1978; Yunianto et al., 2014). Larva udang ini memiliki  kulit  yang  tipis  dan  peka  terhadap  perubahan  lingkungannya  (Jelita et  al .,  2020). Pengujian  BSLT  menggunakan  larva Artemia  salina L.  pada  fase  nauplius.  Pada  fase  nauplius larva  paling  aktif  membelah  secara  mitosis  dan  sesuai  dengan  sel  kanker  yang  aktif  melakukan pembelahan secara mitosis (Puspa et al ., 2017).
Hasil  penyemprotan  Dragendorff  pada  plat  KLT  menunjukkan  bahwa  ekstrak  ETA  dan fermentasi (Fr 24, Fr 48, dan Fr 72) mengandung senyawa alkaloid. Eksplorasi metabolit sekunder sebagai  antikanker  telah  banyak  dilakukan  dan  alkaloid  menunjukkan  efek  antikanker  dan kemopreventif  yang  menjanjikan  (Ballout et  al .,  2019).  Senyawa  alkaloid  diduga  toksik  pada konsentrasi  tertentu  dan  mekanisme  toksik  alkaloid  yaitu  bertindak  sebagai stomach  poisoning (racun  perut).  Alkaloid  yang  masuk  ke  dalam  tubuh  larva  akan  mengganggu  alat  pencernaan, mengganggu  stimulus  rasa  sehingga  larva  tidak  dapat  mengenali  makanannya  dan  berakhir dengan  mati  kelaparan  (Puspa et  al .,  2017).  Menurut  Jelita et  al. (2020)  bahwa  suatu  zat  atau senyawa asing yang ada di lingkungan secara difusi terserap kedalam tubuh dan mempengaruhi metabolisme udang. Larva udang akan mati apabila suatu senyawa asing tersebut bersifat toksik. Ekstrak yang bersifat toksik dapat masuk melalui mulut larva A. salina L. dan diabsorbsi ke dalam saluran pencernaan, kemudian terdistribusi ke dalam tubuh, dan metabolisme menjadi terganggu. Perbedaan  gradien  konsentrasi  antara  membran  sel  larva  dengan  lingkungan  di  luar  sel menyebabkan  senyawa  toksik  dapat  menyebar  dengan  baik  ke  tubuh  larva,  sehingga  dalam  24 jam dapat menyebabkan 50% kematian larva A. salina L. (Ningdyah et al ., 2015).

## KESIMPULAN
Pengujian  aktivitas  biologis  menunjukkan  bahwa  perlakuan  fermentasi  tidak  dapat meningkatkan  aktivitas  antibakteri  maupun  toksisitas  ekstrak  kasar  rumput  laut G . verrucosa . Karakterisasi  metabolit  sekunder  ekstrak  kasar G.  verrucosa menunjukkan  bahwa  fermentasi menggunakan L. plantarum menghasilkan metabolit yang berbeda dan ditemukannya senyawa yang diduga sebagai turunan alkaloid dan asam amino.

## DAFTAR PUSTAKA
Alhaag,  H.,  Yuan,  X.,  Mala,  A.,  Bai,  J.    Shao,  T.  2019.  Fermentation  characteristics  of Lactobacillus  plantarum and Pediococcus species  isolated  from  sweet  sorghum  silage  and their  application  as  silage  inoculants .  Applied  Sciences, 9(6):p.1247  DOI:  10.3390/app 9061247
Ambarsari,  N.D.,  Rushanti,  I.R.P.A.,  Setyaji,  A.,  Ningsih,  T.R.,  Nurhana,  N.,  Subekhi,  I.    Dewi, E.N. 2018. The Influenced of Lactobacillus plantarum Starter  Addition and the Length Time of  Fermentation  Process  on  the  Activity  of  Seaweed  Antioxidant  Ulva  lactuca  from  Krakal Beach,  Yogyakarta. IOP  Conference  Series:  Earth  and  Environmental  Science ,  116(1):  p. 012074. DOI: 10.1088/1755-1315/116/1/012074
Arunkumar,  K.,  Palanivelu,  A.    Darsis,  A.  2014.  Proximate  Composition,  Nutraceutical Constituents  and  Fatty  Acid  Profile  on  GCMS  Of  Seaweeds  Collected  From  Balk  Bay (Thondi), India. International Journal of Current Science Research and Review , 12:57-71 Ballout,  F.,  Monzer,  A.,  Habli,  Z.,  Rahal,  O.N.,  Fatfat,  M.    Muhtasib,  H.G.    2019.  Anticancer Alkaloids: Molecular Mechanisms and Clinical Manifestations. In: Sharma A. (eds) Bioactive Natural  Products  for  the  Management  of  Cancer:  from  Bench  to  Bedside. Springer, Singapore. DOI: 10.1007/978-981-13-7607-8_1 Chye,  F.Y.,  Ooi,  P.W.,  Young  Ng,  S.    Sulaiman,  M.R.  2018.  Fermentation-Derived  Bioactive Components  from  Seaweeds:  Functional  Properties  and  Potential  Applications. Journal  of Aquatic Food Product Technology, 27(2): 144 –164. DOI: 10.1080/10498850.2017.1412375
Cyril, R., Lakshmanan, R.  Thiyagarajan, A. 2017. In vitro bioactivity and phytochemical analysis of two marine macro-algae. Journal of Coastal Life Medicine , 5(10):427 –432. DOI: 10.12980/ jclm.5.2017J7-124
Elving, P.J., Bresnahan, W.T., Moiroux, J.  Samec, Z. 1982. 524-_NAD/NADH as A Model Redox System:  Mechanism,  Mediation,  Modification  by  The  Environment. Journal  of Electroanalytical  Chemistry  and  Interfacial  Electrochemistry, 141(3):365-378.  DOI:  10.1016/ 0022-0728(82)85223-6
Eng, S.K., Pusparajah P., Mutalib, N.S.A., Ser, H.L., Chan, K.G.  Lee, L.H. 2015. Salmonella : A review  on  Pathogenesis,  Epidemiology  and  Antibiotic  Resistance. Frontiers  in  Life  Science , 8(3):284 –293. DOI: 10.1080/21553769.2015.1051243
Irwanto,  D.,  Wiratni,    Rochmadi.  2018.  Effect  of  Alkaloids  on  Lactic  Acid  Fermentation  from Cocoa  Pod  Husk  using Lactobacillus  plantarum . Reaktor ,  18(1):51-56.  DOI:  10.14710/ reaktor.18.1.51-56
Jelita,  S.F., Setyowati, G.W., Ferdinand, M.  Zuhrotun, A. 2020. Uji Toksisistas Infusa Acalypha Simensis Dengan Metode Brine Shrip Lethality Test (BSLT). Jurnal Farmaka, 18(1):14 –22. Leal,  M.C.,  Munro,  M.H.G.,  Blunt,  J.W.,  Puga,  J.,  Jesus,  B.,  Calado,  R.,  Rosa,  R.    Madeira,  C. 2013.  Biogeography  and  biodiscovery  hotspots  of  macroalgal  marine  natural  products. Natural Product Reports , 30(11):1380 –1390. DOI: 10.1039/c3np70057g
Maftuch, Kurniawati, I., Adam, A.  Zamzami, I. 2016. Antibacterial effect of Gracilaria verrucosa bioactive on fish pathogenic bacteria. Egyptian Journal of Aquatic Research , 42(4):405 –410. DOI: 10.1016/j.ejar.2016.10.005 Mangalisu, A., Nahariah  Hatta, W. 2015. Kemampuan Fermentasi Lactobacillus plantarum Pada Telur  Infertil  dengan  Waktu  Inkubasi  yang  Berbeda. Jurnal Ilmu  dan  Teknologi  Peternakan , 4(2):70-73.
Marraskuranto,  E.,  Nursid,  M.,  Utami,  S.,  Setyaningsih,  I.    Tarman,  K.  2021.  Kandungan Fitokimia,  Potensi  Antibakteri  dan  Antioksidan  Hasil  Ekstraksi Caulerpa  racemosa dengan Pelarut Berbeda. Jurnal Pascapanen Dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan , 16(1):1 –10. DOI: 10.15578/jpbkp.v16i1.696 Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nichols, D.E.,  McLaughlin, J.L. 1982. Brine  Shrimp :  A  convenient  General  Bioassay  for  Active  Plant  Constituents. Journal  of Medicinal Plant Research , 45(3):31 –34. DOI: 10.1055/s-2007-971236
Muharni,  Fitrya    Farida,  S.  2017.  Uji  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  Etanol  Tanaman  Obat  Suku Musi  di  Kabupaten  Musi  Banyuasin,  Sumatera  Selatan. Jurnal  Kefarmasian  Indonesia , 7(2):127-135. DOI: 10.22435/jki.v7i2.6070.127-135
Murwani,  R.,  Sibero,  M.T.,  Silitonga,  P.R.A.    Ambariyanto,  A.  2021.  Bioprospecting  of  Cow's Ruminal  Microbiota  From  A  Slaughterhouse  in  Ambarawa,  Central  Java,  Indonesia. Biodiversitas, 22(11):5030-5038. DOI: 10.13057/biodiv/d221139 Nikaido,  H.  2009.  Multidrug  Resistance  in  Bacteria. Annual  review  of  biochemistry ,  78:119 –146. DOI: 10.1146/annurev.biochem.78.082907.145923 Niksic,  H.,  Becic,  F.,  Koric,  E,  Gusic,  I.,  Omeragic,  E.,  Muratovic,  S.,  Miladinovic,  B.    Duric,  K. 2021.  Cytotoxicity  screening  of Thymus  vulgaris L.  essential  oil  in  brine  shrimp  nauplii  and cancer cell lines. Scientific Reports ,11(1):1-9. DOI: 10.1038/s41598-021-92679-x Ningdyah, A.W., Alimuddin, A.H.  Jayuska, A. 2015. Uji Toksisitas Dengan Metode BSLT ( Brine Shrimp  Lethality  Test )  Terhadap  Hasil  Fraksinasi  Ekstrak  Kulit  Buah  Tampoi  ( Baccaurea macrocarpa ). Jurnal Kimia Khatulistiwa , 4(1):75 –83.
Nurhayati,  L.S.,  Yahdiyani,  N.    Hidayatulloh,  A.  2020.  Perbandingan  Pengujian  Aktivitas Antibakteri  Starter  Yogurt  Dengan  Metode  Difusi  Sumuran  Dan  Metode  Difusi  Cakram. Jurnal Teknologi Hasil Peternakan , 1(2):41-46. DOI: 10.24198/jthp.v1i2.27537 Pratiwi,  R.H.  2017.  Mekanisme  Pertahanan  Bakteri  Patogen  Terhadap  Antibiotik. Jurnal  Pro-Life , 4(3):418-428.
Puspa, O.E., Syahbanu, I.  Wibowo, M.A. 2017. Uji Fitokimia Dan Toksisitas Minyak Atsiri Daun Pala ( Myristica fragans Houtt) Dari Pulau Lemukutan. Jurnal Kimia Khatulistiwa , 6(2):1 –6.
Puspasari,  S.,  Nurhamidah,  N.    Amir,  H.  2020.  Uji  Sitotoksik  Dan  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak Daun  Pandan  Laut  ( Pandanus  Odorifer )  Terhadap  Bakteri Staphylococcus  aureus . Alotrop , 4(1):42 –50. DOI: 10.33369/atp.v4i1.13708 Puspitasari,  E.,  Rozirwan    Henri,  M.  2018.  Uji  Toksisitas  dengan  Menggunakan  Metode Brine Shrimp  Lethality  Test (BSLT)  Pada  Ekstrak  Mangrove  ( Avicennia  Marina,  Rhizophora Mucronata,  Sonneratia  Alba dan Xylocarpus  Granatum )  yang  Berasal  dari  Banyuasin, Sumatera Selatan. Jurnal Biologi Tropis , 18(1):91-103. DOI: 10.29303/jbt.v18i1.733 Raal,  A., Meos,  A.,  Hinrikus,  T.,  Heinämäki,  J., Romāne,  E., Gudienė, V., Jakštas,  V.,  Koshovyi,
O.,  Kovaleva,  A.,  Fursenco,  C.,  Chiru,  T.    Nguyen,  H.T.  2020. Dragendorff’s reagent: Historical  perspectives  and  current  status  of  a  versatile  reagent  introduced  over  150  years ago at the University of Dorpat, Tartu, Estonia. Pharmazie , 75(7):299 –306.
Rianingsih,  L.    Sumardianto.  2020.  Antioxidant  activity  in  seaweed  ( Sargassum sp.)  extract fermented  with Lactobacillus  plantarum and Lactobacillus  acidophilus. IOP  Conference Series:  Earth  and  Environmental  Science ,  530(1):p.012011.  DOI:  10.1088/1755-1315/530/ 1/012011 Rianingsih,  L.,  Sumardianto  Riyadi,  P.H.,    Romadhon,  A.A.D.  2021.  Phenol  content  and antioxidant  activity  in  seaweed  fermented  with  lactic  acid  bacteria. Food Research ,  5:7 –13. DOI: 10.26656/fr.2017.5(S3).006
Setiarto,  R.H.B.  2020.  Teknologi  Fermentasi  Pangan  Tradisional  dan  Produk  Olahannya.
Guepedia.
Sibero,  M.T.,  Radjasa,  O.K.,  Sabdono,  A.,  Trianto,  A.,  Triningsih,  D.W.    Hutagaol,  I.D.  2018. Antibacterial  activity  of  indonesian  sponge  associated  fungi  against  clinical  pathogenic multidrug resistant bacteria. Journal of Applied Pharmaceutical Science , 8(2):088 –094. Sinhababu,  A.  2013.  Modified  Ninhidrin  reagent  for  the  detection  of  amino  acids  on  TLC  plates.
Journal of Applied and Natural Science , 5 (1):125-127. DOI: 10.31018/jans.v5i1.292 Sorgeloos, P., Remiche-Van Der Wielen, C.  Persoone, G. 1978. The use of Artemia nauplii for toxicity  tests-A  critical  analysis. Ecotoxicology  and  Environmental  Safety ,  2(3 –4):249–255. DOI: 10.1016/S0147-6513(78)80003-7
Soto,  S.M.  2013.  Role  of  efflux  pumps  in  the  antibiotic  resistance  of  bacteria  embedded  in  a biofilm. Virulence , 4(3):223 –229. DOI: 10.4161/viru.23724
Wandansari,  B.D.,  Agustina,  L.N.A.,    Mulyani,  N.S.  2013.  Fermentasi  Rumput  Laut Eucheuma cottonii oleh Lactobacillus plantarum , 1(1):64 –69.
Widodo,  R. W., Subagiyo,  S.,  Pramesti, R. 2019. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol Rumput Laut Gracilaria  verrucosa ,  Greville,  1830  (Florideophyceae :  Gracilariaceae)  di  Balai  Besar Perikanan  Budidaya  Air  Payau  Jepara. Journal  of  Marine  Research ,  8(3):285 –290.  DOI: 10.14710/jmr.v8i3.25271
Widowati,  I.,  Lubac,  D.,  Puspita,  M.    Bourgougnon,  N.  2014.  Antibacterial  and  Antioxidant Properties of The Red Alga Gracilaria verrucosa from The North Coast of Java, Semarang, Indonesia. International  Journal  of  Latest  Research  in  Science  and  Technology ,  3(3):179 – 185.
Yang,  S.C.,  Lin,  C.H.,  Aljuffali,  I.A.,    Fang,  J.Y.  2017.  Current  pathogenic Escherichia  coli foodborne outbreak cases and therapy development. Archives of Microbiology , 199(6):811 – 825. DOI: 10.1007/s00203-017-1393-y
Yogita, S.P., Agus, H.  Sukrama, I.D.M. 2018. Pola Kepekaan Bakteri Salmonella typhi Terisolasi dari Darah Terhadap Siprofloksasin dan Seftriakson di RSUP Sanglah Periode Januari 2015- Maret 2017. E-Jurnal Medika , 7(12):1 –6.
Yunianto,  H.P.,  Widowati,  I.    Radjasa,  O.K.  2014.  Skrining  Antibakteri  Ekstrak  Rumput  Laut Sargassum  plagyophyllum dari  Perairan  Bandengan  Jepara  Terhadap  Bakteri  Patogen Enterobacter , Pseudomonas  aeruginosa dan Staphylococus  aureus . Diponegoro  Journal  of Marine Research , 3(3):165 –172.