Studi Awal Pertumbuhan dan Induksi Mikroalga Haematococcus Pluvialis
Judy Retti B. Witono, Y.I.P. Arry Miryanti, Herry Santoso, Angela Justina Kumalaputri, Valine Novianty dan Alvin Gunadi Program Studi Teknik Kimia, Fakultas Teknologi Industri, Universitas Katolik Parahyangan Bandung Email: judy@unpar.ac.id

## ABSTRAK
Munculnya  makanan  cepat  saji  dan  polusi  udara  mendatangkan  kerusakan  tubuh  akibat  radikal bebas. Untuk melawan radikal bebas, antioksidan menjadi semakin populer di berbagai kalangan dan salah satunya astaxanthin. Haematococcus pluvialis merupakan sumber astaxanthin alami tertinggi. Tujuan penelitian ini untuk mempelajari pertumbuhan H. Pluvialis. Sebagai variabel dalam penelitian ini  adalah  (1)  konsentrasi  inoculum  awal  yang  berbeda  (yaitu  10%-v/v  dan  20%-v/v)  terhadap kepadatan  dan  jumlah  sel;  (2)  penambahan  garam  NaCl  dan  induksi  cahaya  terhadap  rasio karotenoid  dan  klorofil.  Mikroalga  H.  pluvialis  secara  fotoautotrof  selama  sembilan  hari. Karotenogenesis diinduksi oleh penambahan NaCl 0,8%-b/v, diikuti oleh induksi di bawah intensitas cahaya tinggi. Kadar klorofil dan total karotenoid dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pertumbuhan  H.  pluvialis  lebih  baik  dikulturkan  dengan konsentrasi inokulum 10% dan diperoleh jumlah 70 x 10 5 sel/mL. Penambahan garam NaCl 0,8%-b/v disertai induksi intensitas cahaya tinggi dapat meningkatkan rasio kadar karotenoid terhadap klorofil sebesar 28,9%.
Kata kunci: ,Haematococcus pluvialis, induksi cahaya, karotenoid, klorofil, mikroalga.

## ABSTRACT
Fast food and air pollution lead to the production of free radicals in our body. To fight those, it is needed  anti-oxidant.  That  is  the  reason  why  antioxidant  become  a  popular  supplement  for  many people  and  one  of  them  is  astaxanthin.    Haematococcus  pluvialis  is  the  highest  source  of  natural astaxanthin. The goal of this study is to observe the cell growth of H. pluvialis. The variables used in this  research  are  (1)  a  different  initial  inoculum  concentrations  (i.e.  10%-v/v  and  20%-v/v)  to  the density  and  number  of  cells;  (2)  the  addition  of  salt  NaCl  and  light  induction  to  the  ratio  of carotenoids to chlorophyll. Microalgae H. pluvialis was cultured in batch mode and photoautotrophic cultivation for nine days. The carotenogenesis was induced by addition of NaCl 0.8%-b/v, followed by induction under high-light intensity. Chlorophyll levels and total carotenoids were analyzed using a spectrophotometer.  It  was  observed  that  growth  of  H.  pluvialis  was  preferable  cultured  with  10% inoculum concentration and obtained 70 x 105 cells/mL. The addition of NaCl 0.8%-b/v salt followed by  high  light  intensity  induction  could  increase  the  ratio  of  carotenoids  to  chlorophyll  levels  by 28.9%.
Keywords: carotenoid, chlorophyll, Haematococcus pluvialis, light induction, microalgae.

## 1. PENDAHULUAN
Mikroalga  hijau  terdiri  lebih  dari  7000  spesies  yang  tumbuh  di  berbagai  habitat. Haematococcus pluvialis merupakan  alga  hijau  uniseluler  yang  tergolong  dalam  kelas  Chlorophyceae,  ordo Volvocales,  famili  Haematococcaceae  (Lorenz,  1999). H.  pluvialis dapat  mengakumulasi  astaxantin hingga  sebesar  4%  dari  berat  kering,  paling  tinggi  di  antara  semua  organisme  yang  dapat memproduksi  astaxantin  (Zhang  et  al.,  2016;  Butler  et  al.,  2017).  Dengan  demikian H.  pluvialis dikenal sebagai organisme penghasil utama astaxantin yang merupakan produk komersial.
Astaxantin ( 3,3′-dihydroxy-ß-carotene-4,4′-dione ) adalah karotenoid sekunder berwarna merah terang dari keluarga yang sama dengan likopen, lutein, dan ß -karoten. Astaxantin disintesis secara de novo oleh beberapa mikroalga, tanaman, ragi, bakteri. Astaxantin juga terkandung dalam banyak makanan laut  seperti  salmon,  ikan  trout,  ikan bream laut  merah,  udang,  lobster,  dan  telur  ikan  (Shah  et  al., 2016).  Astaxantin  alami  memiliki  bioaktivitas  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  astaxantin  yang disintesis (Zhang et al., 2016). Saat ini, lebih dari 95% astaxantin yang tersedia di pasar diproduksi secara sintetik sementara astaxantin alami yang berasal dari H. pluvialis jumlahnya kurang  dari 1%. Dalam hal aktivitas antioksidan, astaxantin 65 kali lebih kuat dari vitamin C, 54 kali lebih kuat dari β- karoten, 10 kali lebih ampuh dari β-karoten, canthaxantin , zeaxanthin , dan lutein; dan 100 kali lebih efektif daripada α-tokoferol (Shah et al., 2016). Di bidang kesehatan peran aktif karotenoid terutama astaxantin  dan  lutein  telah  terbukti  dapat  mencegah  penyakit  degeneratif,  anti  inflamasi  (reumatik arthritis, kejang otot, inflamasi kulit oleh radiasi UV), kanker, liver, Alzheimer’s , dan stroke (Muzaki et  al.,  2008).  Selain  itu,  astaxantin  memiliki  potensi  besar  di  pasar  global  karena  berdaya  nilai  jual tinggi ($2500–7000/kg) (Shah et al., 2016).
Sel H.  pluvialis berwarna  hijau  dan  vegetatif  di  bawah  kondisi  lingkungan  yang  sesuai  (intensitas cahaya rendah dan nutrisi yang cukup). Namun, H. pluvialis menunjukkan penurunan dramatis dalam tingkat proliferasi sel dan peningkatan sel cyst di bawah tekanan intensitas cahaya tinggi. Akumulasi karotenoid sekunder terjadi pada sel-sel cyst di bawah  kondisi lingkungan yang tidak sesuai seperti intensitas cahaya tinggi, kekurangan nutrisi, penambahan garam dan stres oksidatif. Morfologi sel H. pluvialis dalam siklus hidupnya dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Sel mikroskopis H. pluvialis dalam siklus hidupnya. (A) Sel motil vegetatif hijau; (B) Sel palmella vegetatif hijau; (C) Sel palmella mulai mengakumulasi astaxantin dalam transisi ke aplanospore ; (D) Sel aplanospore mengakumulasi astaxantin (Shah et al., 2016).
Parameter  budidaya  seperti  konsentrasi  inokulum  akan  menentukan  produktivitas  biomassa.  Selain itu, dalam tahap haematocyst kandungan karotenoid total meningkat dan pola karakteristik karotenoid utama tahap vegetatif digantikan oleh karotenoid sekunder. Rasio karotenoid terhadap klorofil adalah sekitar  0,2  pada  tahap  hijau  dan  meningkat  pada  tahap  merah  mencapai  sekitar  2–9  (Shah  et  al., 2016).  Oleh  karena  itu,  untuk  menguji  hipotesis  tersebut,  pada  penelitian  ini  diuji  rasio  kadar karotenoid terhadap klorofil yang juga dapat menunjukkan keberadaan astaxantin.

## 2. METODE PENELITIAN
2.1 Budidaya Mikroalga H. pluvialis dengan Konsentrasi Inokulum yang Berbeda Mikroalga H.  pluvialis diperoleh  dari  Ugo  Plankton,  Purworejo,  Jawa  Tengah  dalam  bentuk  media cair. Media tumbuh atau nutrisi yang digunakan adalah media WALNE’S (tanpa vitamin B 12 ). Media tumbuh  diautoklaf  pada  121 0 C  selama  15  menit  dan  diatur  pada  pH  7  dengan  0,5  M  sodium hidroksida steril. Kultur H. pluvialis ditumbuhkan pada botol Schott Duran 1000 mL. Air tawar untuk kultur yang digunakan adalah air minum mineral VIT dalam kondisi steril. Selanjutnya 10%-v/v dan 20%-v/v  inokulan H.  pluvialis dimasukkan  dalam  larutan  kultur  tersebut.  Jumlah  nutrisi  yang ditambahkan  adalah  1mL/L  kultur.  Kultur H.  pluvialis ditumbuhkan  selama  sembilan  hari  dalam kondisi  fotoautotrof  yang  dilengkapi  dengan  aerasi,  intensitas  cahaya  3.200  lux  dengan  siklus gelap/terang  10:14  jam.  Setiap  hari  dilakukan  pengamatan  kepadatan  sel H.  pluvialis (absorbansi) menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang λ = 680 nm dan pengamatan jumlah sel H. pluvialis menggunakan haemacytometer.
2.2 Induksi Mikroalga H. pluvialis dengan NaCl 0,8%-b/v Pada kultur sel hijau dengan kepadatan 75 x 10 4 sel/mL ditambahkan garam NaCl 0,8%-b/v. Setelah proses penambahan garam NaCl, mikroalga H. pluvialis disimpan kembali dalam botol Schott Duran 250 mL diberi aerasi dan intensitas cahaya 6800 lux dengan siklus gelap/terang 10:14 jam selama dua hari.

## 2.3 Ekstraksi Karotenoid dan Klorofil
Kultur mikroalga H. pluvialis sel hijau dan yang telah diinduksi dibekukan dan dikeringkan dengan freeze  dryer -86 0 C.  Satu  gram  sampel  kering  ditumbuk  dengan  sedikit  aseton  100%  dalam  mortar kemudian  ditambah  aseton  hingga  50  mL.  Larutan  ekstrak  sampel  yang  sudah  homogen  disaring kemudian  disentrifugasi  pada  2500  rpm  selama  sepuluh  menit.  Supernatan  dipisah  dan  diukur absorbansinya  dengan  spektrofotometer.  Absorbansi  diukur  pada  panjang  gelombang  λ  =  662  nm untuk analisi klorofil a, λ = 645 nm untuk analisi klorofil b, dan λ = 470 nm untuk analisis karotenoid. Jumlah  pigmen  tersebut  dihitung  berdasarkan  rumus  Lichtentaler  dan  Wellburn  (1985)  yang ditunjukkan pada Tabel 1 (Dere et al., 1998; Zawiślak dan Wierdak, 2014).
Tabel 1. Rumus untuk perhitungan kadar klorofil a, klorofil b, dan total karotenoid
C a = 11,75 A 662 - 2,350 A 645 C b = 18,61 A 645 - 3,960 A 662
C x+c = 1000 A 470 - 2,270 C a - 81,4 C b /227
C a = klorofil a, C b = klorofil b, C x+c = total k arotenoid

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Pertumbuhan Mikroalga H. pluvialis dengan Konsentrasi Inokulum yang Berbeda Hasil  pertumbuhan kultur mikroalga H. pluvialis dengan konsentrasi inokulum 10%-v/v dan 20%-v/v menunjukkan  pola  pertumbuhan  sel  yang  relatif  sama  diamati  dari  kepadatan  selnya  namun  relatif berbeda  terhadap  jumlah  sel  (Gambar  2).  Dapat  dilihat  bahwa  pada  hari  ke-8  untuk  konsentrasi inokulum  10%-v/v  dan  pada  hari  ke-7  untuk  konsentrasi  inokulum  20%-v/v  kepadatan  sel  mulai konstan. Namun, jika dilihat dari jumlah selnya untuk konsentrasi inokulum 10%-v/v pada hari ke-9 terjadi peningkatan mencapai 70 x 10 5 sel/mL sedangkan untuk konsentrasi inokulum 20% pada hari ke-8 jumlah selnya menurun dan mengalami penurunan lagi pada hari ke-9.
Hal ini disebabkan kepadatan sel yang diwakili oleh absorbansi dapat menunjukkan bahwa baik sel yang hidup maupun yang mati dapat terukur semuanya sedangkan jumlah sel yang dihitung dengan haemacytometer hanya mengukur sel yang hidup saja. Sehingga terjadi perbedaan pola pertumbuhan antara kepadatan sel dan terhadap jumlah sel. Kultur dengan konsentrasi inokulum 20%-v/v pada hari ke-4 sampai ke-7 mengalami pembelahan sel yang lebih cepat sehingga laju perkembangbiakan hari selanjutnya  cenderung  menurun.  Oleh  karena  itu  konsentrasi  inokulum  10%-v/v  menunjukkan pertumbuhan sel H. pluvialis yang lebih baik.
3.2 Induksi Mikroalga H. pluvialis dengan NaCl 0,8%-b/v
Pada penambahan garam NaCl 0,8%-b/v dan selanjutnya aplikasi intensitas cahaya yang lebih tinggi menunjukkan sel H. pluvialis mengalami stres yang diikuti dengan perubahan morfologis (Gambar 3). Sel-sel  motil  hijau  kehilangan  flagella  dan  motilitas  mereka  dan  kemudian  berubah  menjadi  sel-sel non-motil yang lebih besar selama dua hari pertama (fase transformasi sel).
Nampak dari hasil perhitungan (Tabel 2) rasio kadar karotenoid terhadap klorofil pada kultur sel hijau didapatkan sebesar 0,29 μg/gram fresh weight sedangkan pada kultur sel setelah diinduksi selama 2 hari didapatkan rasio kadar karotenoid terhadap klorofil sebesar 0,38 μg/gram fresh weight . Terjadi peningkatan rasio kadar karotenoid terhadap klorofil sebesar 28,9%. Karotenoid sekunder terbentuk karena asam 3-fosfogliserat (3PGA) yang dihasilkan pada tahap fiksasi siklus Calvin sebagian besar dialihkan  ke  tahap  glikolisis  untuk  memproduksi  asetil-CoA  guna  memenuhi  kebutuhan  besar  akan kerangka karbon bagi sintesis asam lemak dan karotenoid (Gu et al., 2014). Berdasarkan parameter kinetik bahwa rute yang paling menguntungkan untuk menghasilkan astaxantin adalah melalui 4,4'- oksigenase  pada  β-karoten  menjadi  echinenone  kemudian  canthaxanthin  dan  konversi  berikutnya menjadi  phoenicoxanthin  kemudian  astaxantin  oleh  hidroksilase.  Rute  tersebut  ditunjukkan  pada Gambar  4.  Hal  ini  juga  didukung  oleh  hasil  penelitian  Fan  et  al.  (1995)  dari  hasil  identifikasi biosintesis  astaxantin  dalam  H.  pluvialis  terdapat  sejumlah  echinenone  dan  canthaxanthin  yang signifikan.
Gambar 2. Pola pertumbuhan mikroalga H. pluvialis yang diwakili oleh kepadatan sel (absorbansi) dan jumlah sel (sel/mL) pada konsentrasi inokulum 10%-v/v dan 20%-v/v
Gambar 3. (A) Sel H. pluvialis motil vegetatif hijau; (B) Sporocyst melepaskan zoospores ; (C) Sel H. pluvialis non-motil palmella
Tabel 2. Kadar klorofil a, klorofil b, total karotenoid, dan rasio kadar karoten terhadap klorofil
Kultur sel vegetatif hijau Kultur setelah diinduksi Kadar klorofil a 5,77 μg/g fw 0,59 μg/g fw Kadar klorofil b 2,16 μg/g fw 0,3 μg/g fw Kadar total karotenoid 2,35 μg/g fw 0,34 μg/g fw Rasio kadar karotenoid thd klorofil 0,29 0,38
Gambar 4 . Rute enzimatik untuk pembentukan astaxanthin; reaksi dikatalisis oleh 4,4′-oksigenase (●), reaksi dikatalisis oleh 3,3'-hidroksilase (■) (Fraser et al., 1998).
Sel vegetatif hijau menunjukkan aktivitas karotenoid hidroksilase/BHY yang tinggi sehingga mampu membentuk lutein dan zeaxantin yang merupakan karotenoid primer walaupun kekurangan aktivitas β-karoten  ketolase/BKT  (oksigenase).  Karena  hal  tersebut  pula  sel  vegetatif  hijau  tidak  mampu mensintesis  astaxantin  yang  merupakan  karotenoid  sekunder.  Dikarenakan  ketolase  (oksigenase) diketahui lebih menyukai cincin β-ionone yang tidak tersubstitusi, sintesis astaxantin hanya mungkin terjadi  jika  konsentrasi  ketolase  secara  signifikan  lebih  tinggi  daripada  tingkat  hidroksilase endogennya. Jalur biosintesis untuk astaxantin dapat dilihat pada Gambar 5 (Zhong et al., 2011).

## Gambar 5. Jalur biosintesis astaxantin dan lutein
Pada  hari  kedua  sel  baru  mulai  mengalami  perubahan  menjadi  sel-sel  non-motil palmella .  Hal  ini menyebabkan  konsentrasi  ketolase  yang  terproduksi  belum  secara  signifikan  lebih  tinggi  daripada konsentrasi  hidroksilase.  Kondisi  ini  mungkin  menyebabkan  sintesis  astaxantin  belum  maksimal sehingga peningkatan rasio kadar karotenoid terhadap klorofil belum terlalu besar.

## 4. KESIMPULAN
• Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pertumbuhan H.  pluvialis lebih  baik  dikulturkan  dengan konsentrasi inoculum awal 10% dengan perolehan jumlah kultur 70 x 10 5 sel/mL atau mengalami penggandaan kelipatan 10.
• Penambahan garam NaCl 0,8%-b/v disertai induksi intensitas cahaya tinggi dapat meningkatkan rasio kadar karotenoid terhadap klorofil sebesar 28,9%.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Butler  TO,  McDougall  GJ,  Campbell  R,  Stanley  MS,  Day  JG.  2017.  Media  screening  for obtaining Haematococcus  pluvialis red  motile  macrozooids  rich  in  astaxanthin  and  fatty  acids. Biology 7 (1), 2. 15 pp.
[2] Dere S, Güneş T, Sivaci R. 1998. Spectrophotometric determination of chlorophyll – A, B and total  carotenoid  contents  of  some  algae  species  using  different  solvents.  Turkish  Journal  of Botany 22(1):13-17.
[3] Fan  L,  Vonshak  A,  Gabbay  R,  Hirshberg  J,  Cohen  Z,  Boussiba  S.  1995.  The  biosynthetic pathway of astaxanthin in a green alga Haematococcus pluvialis as indicated by inhibition with diphenylamine. Plant and Cell Physiology 36(8):1519-1524.
[4] Fraser PD, Shimada H, Misawa N. 1998. Enzymic confirmation of reactions involved in routes to astaxanthin  formation,  elucidated  using  a  direct  substrate in  vitro assay.  European  Journal  of Biochemistry 252(2):229-236.
[5] Gu W, Li H, Zhao P, Yu R, Pan G, Gao S, Xie X, Huang A, He L, Wang G. 2014. Quantitative proteomic analysis of thylakoid from two microalgae ( Haematococcus pluvialis and Dunaliella salina ) reveals two different high light-response strategies. Scientific Reports 4(1): 1-12.
[6] Lorenz  RT.  1999.  A  technical  review  of Haematococcus algae.  NatuRose  Technical  Bulletin #060. 12 pp.
[7] Muzaki  A,  Fahrudin,  Wardana  IK,  Haryanti.  2008.  Kultur  mikroalga Haematococcus  pluvialis untuk menghasilkan astaxantin. Jurnal Riset Akuakultur 3(3):351-361.
[8] Shah  MMR,  Liang  Y,  Cheng  JJ,  Daroch  M.  2016.  Astaxanthin-producing  green  microalgae Haematococcus pluvialis : from single cell to high value commercial products. Frontiers in Plant Science 7:531. 28 pp.
[9] Zawiślak  G,  Wierdak  RN.  2014.  Evaluation  of  the  yield  and  biological  value  of  tarragon (Artemisia  dracunculus  L.)  in  the  bunch  harvest  cultivation.  Acta  Sci.  Pol.,  Hortorum  Cultus 13(4):185-198.
[10] Zhang Z, Wang B, Hu Q, Sommerfeld M, Li Y, Han D. 2016. A new paradigm for producing astaxanthin  from  unicellular  green  alga Haematococcus  pluvialis .  Biotechnology  and Bioengineering 113(10):2088-2099.
[11] Zhong Y-J, Huang J-C, Liu J, Li Y, Jiang Y, Xu Z-F, Sandmann G, Chen F. 2011. Functional characterization  of  various  algal  carotenoid  ketolases  reveals  that  ketolating  zeaxanthin efficiently  is  essential  for  high  production  of  astaxanthin  in  transgenic Arabidopsis .  Journal  of Experimental Botany 62(10):3659-3669.