## UJI AKTIVITAS IMUNOMODULATOR FERMENTASI TEH HITAM JAMUR KOMBUCHA TERHADAP FAGOSITOSIS MAKROFAG MENCIT GALUR BALB/C SECARA IN VITRO
Amalia Nurul ‘Ulum 1) , Maria Ulfah 1) , Ediati Sasmito 2)
1) Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang
2) Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta

## INTISARI
Teh hitam dan kombucha adalah minuman kesehatan yang diketahui mampu meningkatkan sistem  kekebalan  tubuh.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  membuktikan  aktivitas  imunomodulator fermentasi  teh  hitam  jamur  kombucha  (FTHJK)  terhadap  fagositosis  makrofag  mencit  galur Balb/C secara in vitro .
Fermentasi kombucha dilakukan selama 5, 10 dan 15 hari menggunakan media seduhan teh hitam  yang  telah  ditambahkan  gula.  Hasil  FTHJK  dibuat  beberapa  seri  konsentrasi  yaitu  6,25; 12,5; 25; 50, 100 µg/mL dan sebagai kontrol positif digunakan lipopolisakarida (LPS) 10 µg/mL untuk diujikan aktivitas fagositosis makrofag secara in vitro pada mencit jantan galur Balb/C usia 2  bulan.  Data  yang  diperoleh  berupa  nilai  Indeks  Fagositosis  (IF)  (jumlah  lateks  yang  dimakan oleh  100  sel  makrofag)  dan  Kapasitas  Fagositosis  (jumlah  sel  makrofag  yang  memakan  lateks). Hasil  IF  dan  kapasitas  dianalisis  secara  statistik  menggunakan SPSS  16 for  windows metode Friedman test, dilanjutkan uji Mann Withney .
Hasil  penelitian  menunjukkan,  FTHJK  memiliki  aktivitas  imunomodulator  terhadap peningkatan fagositosis makrofag pada konsentrasi 6,25; 12,5; 25; 50 dan 100 µg/mL dengan lama fermentasi 5, 10 dan 15 hari. Aktivitas imunostimulator tertinggi ditunjukkan pada konsentrasi 100 µg/mL  dengan  lama fermentasi 10 hari berdasarkan nilai IF.
Kata kunci:    Imunomodulator,    IF  (Indeks  Fagositosis),    Kapasitas  Fagositosis,  Fermentasi teh hitam jamur kombucha.

## ABSTRACT
Black tea and kombucha is beverage drink was known that can increase immunity. This study aims  to  not  only determine  the fermented  black  tea  kombucha  as  an  immunomodulatory againts macrophages cell phagocytic of mice strains Balb/C in vitro, but also to determine concentration with duration fermentation that produces the highest activity
Fermentation kombucha was carried out for 5, 10 and 15 days with steeping black tea has been given sugar. Fermented black tea kombucha was made to any series concentrations of 6,25; 12,5; 25; 50 and 100 µg/mL, as a positive control used lipopolysaccharide (LPS) 10 mg/mL there were  tested  in  vitro  on  activity  phagocytic  macrophage  cell  of  mice  strains  Balb/C.    Value  of Phagocytic  Index  (phagocytic  of  latex in 100  macrophage)   and phagocytic capacity  (amount  of macrophage  that  phagocytic  latex)  were  analyzed  using  SPSS  16    for  windows  with  methode Friedman test followed by Mann Withney test.
The results showed that fermented black tea kombucha has the highest as immunostimulatory activity  on  macrophage  phagocytic  at  the  concentration  of  100  µg/mL  and  10  days  duration fermentation.
Keywords:  Immunomodulatory,  Phagocytic  Index,  Phagocytic  Capacity,  Fermented  black  tea kombucha.

## PENDAHULUAN
Sistem  kekebalan  tubuh  berperan penting dalam menghadapi paparan antigen. Ketika  sistem  imun  tidak  bekerja  optimum dan gagal mempertahankan keseimbangannya, tubuh akan rentan terhadap  penyakit  (Suhirman  dan  Christina, 2011). Upaya untuk mempertahankan
keseimbangan  dilakukan  oleh  sistem  imun spesifik dan non spesifik. Makrofag sebagai sistem  imun  non  spesifik  berperan  sebagai mekanisme  pertahanan  tubuh  saat  pertama kali  terpapar  antigen  seperti  bakteri,  virus, parasit  atau  zat-zat  yang  berbahaya  bagi tubuh (Smit et al ., 2009). Agen imunomodulator diperlukan untuk mengatasi keadaan  ketidakseimbangan  sistem  imun akibat  paparan  antigen  (Baratawidjaja, 2002). Agen imunomodulator dapat merangsang bahkan meningkatkan fagositosis sel makrofag. Agen imunomodulator  dapat  berasal  dari  alam seperti  tanaman  yang  mengandung  senyawa flavonoid, seperti teh. Teh  hitam  mengandung  senyawa katekin  yang  dioksidasi  secara  enzimatis menjadi theaflavin dan thearubigin (Hartoyo,  2003).  Theflaviin    merupakan senyawa polifenol, yang dapat meningkatkan  sistem  pertahanan  tubuh melalui  mekanisme  peningkatan  fagositosis makrofag  (Susilaningsih et  al., 2005). Mengkonsumsi  teh  hitam  dapat  dengan berbagai  cara  dan  membuatnya  menjadi lebih  awet  melalui  metode  fermentasi. Fermentasi  teh  dapat  dilakukan  dengan menambahkan  agen  fermentasi  dari  bahan alam  seperti  jamur  kombucha.  Kombucha dihasilkan  dari  simbiosis  antara yeast dan bakteri-bakteri  yang  berkoloni  (Naland, 2008).  Proses  fermentasi  kombucha  paling baik  dilakukan  selama  8  hari  (Goh et  al., 2012). Dan selama 10 hari tetap mengandung senyawa polifenol yang berperan  sebagai  agen  imunomodulator (Suprijono dkk. , 2012).
Bakteri-bakteri yang ada pada kombucha juga berperan dalam memodulasi sistem  imun  (Kozyrovska et  al .,  2012) seperti  bakteri  asam  laktat  yang  mampu meningkatkan  sistem  imun  seluler  dan humoral  melalui  peningkatan  produksi beberapa  sitokin  seperti  IFN- Ɣ  dan  IL -12 (Gackowska et  al .,  2006)  yang  dapat mengaktifkan  makrofag  (Abbas et  al.,
2007).
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui  mekanisme  imunomodulator fermentasi  teh  hitam  jamur  kombucha melalui  pengamatan  fagositosis  makrofag. Penelitian  Ulfah  dan  Arifin  (2013)  terbukti bahwa  teh  hijau  mampu  meningkatkan fagositosis  makrofag  dan  proliferasi  sel
limfosit.  Seduhan  teh  hitam  juga  telah diteliti  oleh  Pantas  (2009)  hasilnya  terbukti mampu  meningkatkan  aktivitas  fagositosis makrofag. Perbedaan metode pengolahan teh dan metode penelitian menggunakan kontrol inokulasi dari bakteri Salmonella
thypimurium yang  mendasari    penelitian  uji aktivitas  imunomodulator  fermentasi  teh hitam  jamur  kombucha  terhadap  fagositosis makrofag  mencit  galur  Balb/C  secara in vitro dengan kontrol positif Lipopolisakarida guna menjadikannya sebagai tambahan bukti ilmiah  mengenai  manfaat  teh  hitam  dalam bidang imunoterapi.

## METODE PENELITIAN A. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah serbuk kering teh  hitam  merk  X  dan  Jamur  Kombucha, diperoleh  dari  pembibitan  jamur  kombucha Karanganyar,  Jawa  Tengah,  aquadestilata, gula pasir, mencit jantan galur Balb/c usia 2 bulan, etanol 70%(Merck), Medium Rosewell  Park  Memorial  Institude (RPMI) 1640  (Gibco),  RPMI  1640  media  komplit berisi  FBS  ( Fetal  Bovine  Serum )  10%  (v/v) (Caisson),  metanol(Brataco),  2%  Giemsa (v/v)(Merck),  LPS  ( Lipopolysaccharide , Merck), penicillin-streptomicin(Gibco), fungizon/amphoterisin B (Gibco).
Alat  yang  digunakan  adalah  toples gelas,  kompor  listrik  dan  termometer  suhu, timbangan  elektrik  (Mettler  Toledo),  alat- alat bedah steril (Smicss), tabung mikropipet (Gibco), eppendrof    tube (Extragan), sentrifugase (Sorvall), pipet pasteur (Brand), petri dish steril 50 mm (Costar), spuit injeksi 10  ml  (Terumo),  tabung  sentrifugasi  15  ml (Nunc), vortex (Bio-Rad), Laminar Air Flow (LAF) (Nuaire). H aemocytometer (Neubeur) ,  inverted  microscope (Olympus) , inkubator  CO 2 5%  (Heracus ® ), microplate 24 well (Costar), coverslip ,  mikropipet (Gibson), eppendrof  tube (Extragen), vortex (Bio-Rad), Laminar  Air  Flow (Nuaire), yellow tip (Brand), dan blue tip (Brand) .
B. Jalannya penelitian
1. Pembuatan Teh Hitam Jamur Kombucha
Sebanyak 4  kantong teh hitam  dibuka,
lalu  ditimbang  sebanyak  8  gram  dan tambahkan  1L  air  mendidih  dan  diamkan selama  15  menit.  Setelah  suhu  menjadi hangat  disaring,  dan  tambahkan  100  gram
gula  pasir  diaduk  hingga  bercampur  rata. Kemudian Air seduhan dimasukan ke dalam stoples  gelas  steril  dan  tunggu  hingga  suhu ruang.  Dan  tambahkan  1  lapis  jamur kombucha  pada  ke-3  stoples  gelas  steril tersebut lalu ditutup dengan kain kasa bersih kemudian  diikat  dengan  karet  gelang.  Dan disimpan  dalam  suhu  ruang  selama  5,  10, dan  15  hari.  Setelah  hari  yang  ditentukan dipisahkan  “jamur”  yang  berkembang  biak di  dalam  media  air  teh  hasil  fermentasi kemudian  disaring.  Fermentasi  Teh  Hitam Jamur Kombucha (FTHJK).
2. Uji Aktivitas Imunomodulator
a. Pembuatan Larutan Uji dan Kontrol Positif (LPS) Larutan  uji  (FTHJK)  dengan  stok konsentrasi  8  mg/mL.  Kemudian  dibuat seri  konsentrasi  yaitu  6,25;  12,5;  25;  50 dan  100    µg/mL.  Larutan  stok  LPS konsentrasi 1 mg/mL dibuat dengan cara melarutkannya  dalam  larutan phosphate buffer  saline hingga  konsentrasi  yang diinginkan (10 µg/mL).
b. Tahap  Isolasi  dan  Inkubasi  Sel Makrofag Sel makrofag diisolasi secara aseptis  dari  mencit  jantan  galur  Balb/C. Mencit  dikorbankan  menggunakan  eter. Kulit  bagian  abdomen  disemprot  etanol 70%. Dan dibuat irisan kecil menggunakan  gunting,  lalu  dirobek  ke arah  dada  dan  paha  dibantu  dengan ditarik  menggunakan  pinset  sehingga kulit  terlepas  dan  bagian  peritoneum mencit  terlihat.  Media  RPMI  10mL diinjeksikan  dalam  rongga  peritoneum dengan  ujung  jarum  menghadap  ke ventral dan jangan sampai melukai organ lain.  Setelah  itu  bagian  perut  ditepuk- tepuk  ±  3  menit  agar  seluruh  makrofag tersuspensi  di  dalam  media  RPMI.
Cairan dalam rongga peritoneum kemudian disedot kembali lalu dimasukkan  ke  dalam  konikel  dan disentrifuge  1.200 rpm  suhu  4°C  selama 10  menit.  Supernatan  yang  diperoleh dibuang  dan  ditambahkan  3  ml  medium RPMI  komplit  yang  berisi  RPMI, penicillin,  streptomycin,  fungizon, dan FBS.  Jumlah  sel  dihitung  dengan
hemositometer, dan diresuspensikan dengan RPMI komplit sehingga diperoleh suspensi sel kepadatan 2,5×10 6 /ml.  Suspensi  sel  dimasukkan dalam plate 24 sumuran yang telah diberi coverslip bulat.  Setiap  sumuran  berisi 200 µl (5×10 5 sel). Kemudian diinkubasi dengan  incubator  CO 2 5%  suhu  37°C selama  30  menit,  lalu  dicuci  3  kali dengan  250  µl  medium  komplit  dan diinkubasi  selama  2  jam.  Sel  yang didapat  dicuci  dengan  RPMI  2  kali,  dan ditambahkan  medium  RPMI    komplit  1 ml/sumuran  dan  inkubasi  dilanjutkan sampai 24 jam.
c. Tahap Uji Fagositosis  Lateks disuspensikan dalam PBS dengan konsentrasi  2,5×10 6/ mL.  Sel  makrofag yang  telah  dikultur  selama  24  jam sebelumnya, media diambil
menggunakan  pipet  tetes  kemudian  sel dicuci  2  kali  dengan  RPMI.  FTHJK sebanyak  100  µL  ditambahkan  ke  tiap- tiap sumuran dan direplikasi 3 kali untuk setiap  konsentrasi,  dan  diinkubasi  dalam inkubator  CO 2  5 %  suhu  37°C  selama  4 jam.    Lateks  yang  telah  diresuspensikan dengan  RPMI  ditambahkan  ke  dalam tiap-tiap  sumuran  sebanyak  200  µl  dan inkubasi  dilanjutkan  dalam    inkubator CO 2  5 %  suhu  37°C  selama  1  jam,  Sel kemudian dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali  dan  dikeringkan  pada  suhu  ruangan dan  difiksasi  dengan  metanol  selama  30 detik.  Selanjutnya  metanol  dibuang  dan coverslip didiamkan  sampai  kering. Setelah kering,  coverslip  dipulas  dengan giemsa 2% (v/v) selama 20 menit, dicuci dengan  aquadest,  diangkat  dari  sumuran kultur dan dikeringkan pada suhu kamar. Seratus  sel  makrofag  diamati  dan dihitung jumlah makrofag yang memfagositosis  partikel  lateks  diamati dan  dihitung  dengan  menggunakan mikroskop  cahaya  dengan  perbesaran 400x ( Leijh dkk (1986). Hasil perhitungan  jumlah  latek  digunakan untuk menghitung nilai Indeks Fagositosis (IF) dan kapasitas fagositosis. menggunakan rumus berikut:
(Jensch-Junior et al. , 2006).
Indeks Fagositosis = jumlah partikel yang terfagositosis Jumlah makrofag yang aktif (100)
Kapasitas Fagositosis = jumlah makrofag yang memfagositosis   x100% Jumlah makrofag yang dihitung(100)
3. Analisis Data
a. Uji Aktivitas Fagositosis Makrofag Data  IF  dan  Kapasitas  Fagositosis, dianalisis  secara  statistik  menggunakan program SPSS 16 for windows. Nilai IF dan kapasitas  bersifat  proposional  terhadap jumlah sel yang aktif.
HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Pembuatan Teh Hitam Jamur Kombucha Teh  hitam  jamur  kombucha  dibuat menggunakan metode fermentasi.. Kombucha merupakan kumpulan khamir dan  mikrobia  yang  hidup  berkoloni membentuk lapisan-lapisan selulosa. Mikrobia  yang  terdapat  di  dalam kombucha  adalah  kelompok Acetobac ter ( Acetobac ter xylinum dan  khamir  yaitu Saccharomyces cerevisiae ) (Jayabalan et al ,  2014).  Khamir  berperan  merombak gula (sukrosa) menjadi alkohol kemudian alkohol  dioksidasi  oleh  bakteri  asam asetat seperti Acetobacter dengan bantuan enzim asetaldehid dehidrogenase menghasilkan asam laktat, asam  asetat,  asam  malat,  asam  oksalat, asam  glukonat,  asam  butirat,  asam nukleat,  asam  amino)  (Frank,  1995)  dan bermanfaat meningkatkan imunitas tubuh  dan  memicu  proses  regenerasi  sel (Naland,  2008).  Penyeduhan  teh  pada suhu 100°C menyebab kandungan senyawa  (pilofenol)  teh  tersari  lebih banyak,  (Bijaksana,  2012).  Fermentasi dilakukan  selama  5,  10  dan  15  hari,  hal ini mempengaruhi
pertumbuhan
mikrobia dan khamir penyusun kombucha  (Ardheniati,  2008).  Naland (2008)  mengatakan  proses  fermentasi dilakukan selama 7-10 hari.
2. Uji Aktivitas Imunomodulator Lateks beads digunakan karena ukurannya  mirip  dengan  bakteri,  penelitian ini menggunakan lateks berukuran 3 µm, hal
ini  sesuai  dengan  rentang  ukuran  bakteri yaitu  1-10  µm  (Nester,  2004)  dan  ukuran makrofag adalah 100-225 µm (Abbas et al. , 2007;  Baratawidjaja  dan  Rengganis,  2012). Hasil pengamatan secara mikroskopis terlihat  pada  Gambar  1,  bahwa  partikel lateks yg dimakan oleh makrofag berbentuk bulatan  kuning  yang  berpendar.  Sedangkan makrofag  yang  kosong  artinya  tidak memakan lateks. Kontrol positif Lipopolisakarida  (LPS)  suatu  endotoxin yang  dapat  menstimulasi  respon  imun  dari inang (Baratawidjaja  dan  Rengganis,  2012). Uji aktivitas fagositosis makrofag menggunakan  parameter  indeks  fagositosis yaitu  jumlah  partikel  lateks  yang  dapat difagositosis  oleh  100  makrofag  aktif  dan kapasitas  fagositosis  yaitu  jumlah  makrofag yang  mampu  memakan  partikel  lateks. Lateks  yang  dimakan  menandakan  proses fagositosis terjadi. Penelitian ini menggunakan  dua  variabel  yaitu  perbedaan seri konsentrasi dan lamanya hari fermentasi.  Hasil  yang  didapatkan  dari variasi konsentrasi terlihat pada Tabel I.
Analisis  statistik  non  parametrik  uji Kruskal  Wallis (p<0.05)  dilanjutkan  dengan uji Mann  Withney terhadap  nilai  Kapasitas Fagositosis  menunjukkan  bahwa  aktivitas imunostimulator baru terjadi pada
konsentrasi  50  dan  100  µg/mL  karena menunjukkan  hasil  yang  signifikan  apabila dibandingkan dengan kontrol normal, kontrol  positif  dan  semua  konsentrasi. Semakin  tinggi  konsentrasi  yang  digunakan akan  semakin  banyak  pula  polifenol  yang tersari  (Astill et  al., 2001),  kandungan polifenol  tersebut  berperan  dalam  aktivitas fagositosis  makrofag  (Susilaningsih et  al., 2005) melalui produksi IL-12 yang nantinya akan  mengaktifkan  sel  NK  sehingga mensekresi  IFN- Ɣ  dan  kemudian  makrofag dapat  teraktivasi  dan  membunuh  antigen melalui 2 mekanisme oxygen dependent dan oxygen independent (Abbas et al. , 2007).
Gambar 1. Profil Fagositosis Makrofag secara Mikroskopis
b e c a g d f Kelompok FTHJK konsentrasi 25 µg/mL (E) Kelompok FTHJK konsentrasi 50 µg/mL
(F) Kelompok FTHJK konsentrasi 100 µg/mL : Fagositosis makrofag
Keterangan :
(A) Kelompok kontrol sel  makrofag
(B) Kelompok kontrol positif: lipopolisakarida konsentrasi 10 µg/mL
(C) Kelompok FTHJK konsentrasi 6,25 µg/mL
(D) Kelompok FTHJK konsentrasi 12,5 µg/mL
Tabel I.    Aktivitas Imunomodulator FTHJK terhadap Fagositosis Makrofag Mencit Galur Balb/C, dilihat dari Nilai Kapasitas Fagositosis
Replikasi Kapasitas Fagositosis I II HARI KE-5 HARI KE-10 HARI KE-15
A B C D E A B C D E A B C D E 1 96% 100% 99% 99% 95% 100% * 100% * 98% 97% 96% 99% * 100% * 98% 98% 99% 100% * 99% * 2 99% 100% 100% 100% 99% 100% * 100% * 95% 100% 98% 99% * 98% * 96% 96% 99% 100% * 100% * 3 99% 96% 97% 98% 100% 100% * 100% * 97% 97% 99% 99% * 100% * 96% 96% 100% 100% * 100% * Rata-rata 0.98 0.99 0.99 0.99 0.98 1.00* 1.00* 0.97 0.98 0.98 0.99* 0.99* 0.97 0.97 0.99 1.00* 1.00* SD 0.02 0.02 0.02 0.01 0.03 0.00 0.00 0.02 0.02 0.02 0.00 0.01 0.01 0.01 0.01 0.00 0.01
Selain  berdasarkan  nilai  kapasitas fagositosis,  nilai  indeks  fagositosis  juga digunakan sebagai  parameter  aktivitas fagositosis  makrofag.  Hasil  nilai  IF  secara statistik dapat dilihat pada Tabel II.
Nilai  indeks  fagositosis  menggambarkan jumlah  lateks  yang  dimakan  makrofag. berdasarkan hasil analisis statistik
parametrik one  way ANOVA  setelah dilanjutkan  menggunakan  uji Tukey seri konsentrasi menunjukkan perbedaan bermakna  terhadap  kontrol  normal  tetapi tidak  menunjukkan  perbedaan  bermakna
antar  konsentrasi  maupun  untuk  kontrol positif, sehingga aktivitasnya dianggap sama dengan  kontrol  positif.  Setelah  dilihat  dari kolom mean  difference ternyata  konsentrasi 100  µg/mL  yang  memberikan  aktivitas paling  baik  jika  dibandingkan  dengan kelompok  konsentrasi  6,25;  12,5;  25;  50 µg/mL dan kontrol positif yaitu LPS dengan konsentrasi  10  µg/mL.  Lama  waktu  hari fermentasi juga dianalisis untuk mengetahui pengaruhnya  terhadap  aktivitas  fagositosis makrofag.  berdasarkan  nilai  IF  pengaruh lama  waktu  hari  fermentasi  dapat  dilihat pada Gambar 2.
Tabel.  II  Aktivitas  imunomodulator  FTHJK  terhadap  fagositosis  makrofag  mencit  galur  Balb/C, dilihat dari nilai IF
Replikasi
IF I II HARI KE-5 HARI KE-10
HARI KE-15
A B C D E A B C D E A
B C D E
1 4.93*
5.04 5.00 4.99 5.24 5.98 5.83 4.90 5.54 4.56 6.45 6.86 4.87 5.19 4.48 4.46 5.10 2 3.67* 4.76 5.61 6.02 4.82 4.83 5.80 5.79 5.64 6.25 4.95 5.29 5.13 4.72 5.00 4.58 5.04 3 3.96* 5.06 4.46 4.36 4.84 5.40 5.90 4.49 5.59 5.57 5.03 5.94 4.71 5.20 4.57 4.92 4.91 Rata-rata 4.19* 4.95 5.02 5.12 4.97 5.40 5.84 5.06 5.59 5.46 5.48 6.03 4.90 5.04 4.68 4.65 5.02 SD 0.66 0.17 0.58 0.84 0.24 0.58 0.05 0.66 0.05 0.85 0.84 0.79 0.21 0.27 0.28 0.24 0.10 Keterangan : I = Kontrol Normal
II  = Kontrol Positif (LPS) A  = Kelompok perlakuan sampel uji dengan konsentrasi 6,25 µg/mL
B  = Kelompok perlakuan sampel uji dengan konsentrasi  12,5 µg/mL
C = Kelompok perlakuan sampel uji dengan konsentrasi 25 µg/mL
D = Kelompok perlakuan sampel uji dengan konsentrasi 50 µg/mL
E = Kelompok perlakuan sampel uji dengan konsentrasi 100 µg/mL
Keterangan :
I = Kontrol Normal II = Kontrol Positif (LPS) A = Kelompok perlakuan sampel uji dengan konsentrasi 6,25 µg/mL
B = Kelompok perlakuan sampel uji dengan konsentrasi 12,5 µg/mL
C  = Kelompok perlakuan sampel uji dengan konsentrasi 25 µg/mL
D  = Kelompok perlakuan sampel uji dengan konsentrasi 50 µg/mL
E =  Kelompok perlakuan sampel uji dengan konsentrasi 100 µg/mL
Gambar 2. Grafik Mean nilai Indeks Fagositosis Berdasarkan Lama Hari Fermentasi
Hasil  yang  ditunjukkan  pada  grafik tersebut  bahwa  semakin  bertambahnya jumlah  hari  fermentasi  maka  akan  semakin turun aktivitasnya. Pengujian pengaruh lama hari fermentasi terhadap aktivitas fagositosis yang  dinyatakan  dengan nilai  IF  secara non parametrik  menggunakan Kruskal  Wallis
ternyata  terdapat  perbedaan  antar  kelompok hari,  kemudian  dilakukan  uji  lanjutan menggunakan Mann  Whitney  test untuk melihat  letak  perbedaannya,  hasil  yang didapatkan  digambarkan  pada  Tabel  III sebagai berikut: Tabel III.  Signifikansi Indeks Fagositosis Variabel Lama Fermentasi dengan Mann Whitney Test Lama Fermentasi Hari ke-5 Hari ke-10 Hari ke-15 Hari ke-5 - TB TB Hari ke-10 TB - B Hari ke-15 TB B - Tabel  tersebut  menunjukkan  bahwa terdapat perbedaan pada lama hari fermentasi  ke-10  dan  15.  Jika  diamati  pada grafik  terlihat  bahwa  aktivitas  dimulai  pada hari  ke-5  sampai  tertinggi  pada  hari fermentasi ke-10, FTHJK terbukti mengandung  senyawa  polifenol  sampai fermentasi hari ke-10 (Suprijono dkk ., 2012) selain  itu  senyawa  aktif  pada  teh  tidak mengalami perubahan selama proses
fermentasi,  justru  kombinasi  teh  hitam  dan jamur  kombucha  menghasilkan  manfaat yang  lebih  baik  dalam  peningkatan  sistem imun tubuh (Dufresne and Franworth, 2000) kombinasi  antara  kombucha  dengan  media teh yang mengandung gula, khamir yang ada pada  kombucha  memecah  sukrosa  menjadi glukosa  dan  fruktosa,  glukosa  diubah  oleh enzim  menjadi  alkohol,  sedangkan  bakteri Acetobacter mengubah  alkohol  menjadi asam  asetat,  khamir  dan  bakteri  juga menghasilkan asam glukonat dan glukoronat (Karyantina dan Suhartatik, 2008) efek asam glukoronat dapat meningkatkan sistem imun tubuh (Rinihapsari and Richter, 2008).
Fermentasi  hari  ke-15  menunjukkan penurunan aktivitas fagositosis hal ini terjadi karena  kandungan  gula  telah  berkurang akibat  reduksi  di  awal  fermentasi,  yang dapat  mempengaruhi  produksi  alkohol  dan asam  oleh  bakteri.  Asam  asetat  banyak diproduksi  pada  hari  ke-10  hal  ini  terkait pada proses pematangan jamur pada hari ke- 10  (Suhartatik et  al., 2011).  Goh et  al.
(2012),  menyatakan  hari  fermentasi  yang paling baik untuk memperoleh kultur bakteri yang  optimal  yaitu  selama  8  hari.  Pada penelitian  Ardheniati  (2008),  diperoleh fermentasi yang optimal dilakukan selama 5 hari.  Lama  fermentasi  akan  berkontribusi terhadap aktivitas perubahan pH, pembentukan asam dan alkohol. Pembentukan asam inilah yang mempengaruhi aktivitas fagositosis
makrofag.  Sedangkan  jika  dilihat  dari  nilai kapasitas  fagositosis  lama  waktu  hari fermentasi  tidak  berpengaruh  terhadap jumlah  makrofag  yang  aktif  memakan lateks.  Lama  fementasi  hanya  berpengaruh pada  nilai  Indeks  Fagositosis.  Hal  ini berbeda  pada  penelitian  Ulfah  dan  Arifin
(2013)  dengan  konsentrasi  yang  sama  6,25 µg/mL;  12,5  µg/mL;  25  µg/mL;  50  µg/mL dan  100  µg/mL  dengan  jenis  teh  berbeda yaitu  teh  hijau  ternyata,  lama  fermentasi tidak berpengaruh signifikan terhadap aktivitas fagositosis berdasarkan nilai Indeks Fagositosis.  Perbedaan  ini  kemungkinan disebabkan  kandungan  senyawa  polifenol teh  hitam  tidak  berubah  selama  proses fermentasi hingga  hari  ke-10  (Dufresne  and Franworth,  2000;  Suprijono  dkk ., 2012). Berdasarkan uraian diatas dapat disimpulkan bahwa  teh  hitam  jamur  kombucha  dapat meningkatkan  aktivitas  fungsi  makrofag dimana  kemampuannnya  sama  baiknya dengan kontrol positif, yaitu LPS 10 µg/mL.

## KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan 1. FTHJK mempunyai aktivitas imunostimulator  pada  konsentrasi  50 µg/mL dan  100 µg/mL (p<0,05) berdasarkan kapasitas fagositosis.
2. Konsentrasi  yang menunjukkan  aktivitas terbaik ada pada 50 µg/mL.
3. Hari  fermentasi  mempengaruhi  aktivitas fagositosis  makrofag,  lamanya  hari fermentasi  yang  paling  baik  ada  pada hari  ke-10  berdasarkan  nilai  Indeks Fagositosis
B. Saran
1. Perlu  dilakukan  orientasi  konsentrasi terlebih  dahulu  untuk  mengetahui  dosis optimum  dari  aktivitas  imunomodulator terhadap fagositosis makrofag fermentasi teh hitam jamur kombucha.
2. Pelu dilakukan penelitian tentang identifikasi  dan  isolasi  senyawa  aktif fermentasi  teh  hitam  jamur  kombucha yang berperan dalam aktivitas fagositosis makrofag

## DAFTAR PUSTAKA
Abbas,  A.K.,  Lichtman,  A.H.  and  Pillai,  S., 2007, Cellular and Molecular Immunologi 6 th Ed.,  Saunders  Elsevier, Philadelphia, 11-16.
Ardheniati,  M.,  2008,  Kinetika  Fermentasi pada  Teh  Kombucha  dengan  Variasi Jenis  Teh  Berdasarkan  Pengolahannya, Skripsi, Universitas  Sebelas  Maret, Surakarta.
Astill,  C.,  Birch,  M.  R.,  Dacombe,  C., Philip, G., Humphrey., and Martin, P. T., 2001,  Factors  affecting  the  caffeine  and polyphenol  content  of  black  and  green tea  infusions, J.  Agric.  Food  Chem , 49 : 5340-5347 cited  in Bijaksana,  M.  I., 2012,  Pengaruh  Suhu  dan  Waktu Penyeduhan Teh Hitam ( Camellia sinensis )  serta  Proses  Pencernaan In Vitro terhadap Aktivitas Inhibise Lipase, Skripsi ,  Fakultas  Teknologi  Pertanian
Institut Pertanian Bogor.
Baratawidjaja, K.G., 2002, Imunologi Dasar ,  Edisi  Kelima,  hal.  12,  374,  194- 195,  Fakultas  Kedokteran  Universitas
Indonesia, Jakarta. Baratawidjaja, K.G. dan Rengganis, I., 2012, Imunologi  Dasar, edisi  ke-10,  Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta, 29-32, 39, 93-147. Bijaksana,  M.  I.,  2012,  Pengaruh  Suhu  dan
Waktu Penyeduhan Teh Hitam ( Camellia sinensis )  serta  Proses  Pencernaan In Vitro terhadap Aktivitas Inhibise Lipase,
Skripsi ,  Fakultas  Teknologi  Pertanian Institut Pertanian Bogor.
Dufresne,  C.  &  Farnworth,  E.,  2000,  Tea, Kombucha  and  Health:  a  Review, Food Research International , 33 , 409-421. Frank,  G.  W.,  1995,  Kombucha  Healthy
Beverages  and  Natural  Remedy  From The  Far  East,  diterjemahkan  oleh Surjosuparto N., Publishing W. Eenstaler Cosp Germany. http://www.kombu.de/anl-ind.htm diakses tanggal 2 Maret 2014. Gackowska, L., Mitchalkiewicz, J., Krotkiewski,  M.,  Helmin  Basa,  A., Kubiszewska, I. and Dzierzanowska, D., 2006, Combiner effect of different lactic acid  bacteria  strain  on  the  mode  of cytokines  pattern  expression  in  human peripheral  blood  mononuclearcells, J Physiol and Pharmacol , 57 (9); 13-21. Goh, W.N., Rosma A., Kaur, B., Fazilah, A., Karim  A.A.,  and  Rajeev,  B.,  2012, Fermentation  of  Black  Tea  Broth (Kombucha)  :  I.  Effects  of  Sucrose Concentration and Fermentation Time on The  Yield  of  Microbial  Cellulose, Internasional Food Research Journal , 19 (1), 109-117.
Hartoyo, A., 2003, Teh dan Khasiatnya bagi Kesehatan , Penerbit Kanisius, Yogyakarta, 11-22. Jayabalan,  R.,  Malbasa,  R.V,  Loncar,  E.S., Vitas,  J.S.,  and  Sathiskumar,  M.,  2014, Review on Kombucha Tea- Microbiology, Composition, Fermentation, Beneficial Effects, Toxicity, and Tea Fungus, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety , 13 , 538-550.
Jensch-Junior,  B.E.,  Pressinotil,  N.,  Borges,
J.C.S. and Cunha da Silva, J.R.M., 2006, Characterization of Macrophage Phagocytosis  of  the  Tropical  Fish Prochilodus scrofa (Steindachner, 1881),
Aquaculture,  251; 509-515, cited Difita, L.,  2014,  Uji  Aktivitas  Fagositosis Makrofag  Kombinasi  Ekstrak  Etanol Herba  Meniran  ( Phyllanthus  niruri L.) Daun  Sirih  Merah  ( Piper  crocatum Ruiz.&  Pav.),  dan  Umbi  Keladi  Tikus ( Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume) secara In Vitro, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Karyatina,  M.,  dan  Suhartatik,  N.,  2008, Kombucha  dengan  Variasi  Kadar  Gula Kelapa  Sebagai  Sumber  Karbon, J. Teknologi  &  Industri  Pangan , 19 ,  165- 169.
Kozyrovska,  N.O.,  Reva,  O.M.,  Goginyan, V.B. and Vera, J.-P.d., 2012, Kombucha Microbiome  as  A  Probiotic  :  A  View From The Perspektive of Post-Genomics and Synthetic Ecology. Biopolymers and Cell ,  ISSN  0233-7657. 28 ,  N2.  P,  103- 113.
Leijh,  P.J.C.,  Furth,  R.V.  &  Zwet,  T.L.V., 1986, In Vitro Determination of Phagocytosia and Intercellular Killing by Polymorphonuclear  and  Mononuclear
Phagocytes,  In:  Weir  DM,  Editor,
Celluler  Immunology,  2 ,  Blackwell
Scientific Publication, London, 74-85
Naland,  H.,  2008, Kombucha  Teh  Ajaib Pencegah dan Penyembuh Aneka
Penyakit , Agromedia Pustaka, Jakarta, 1- 3, 9-16.
Nester,  E.W.,  Anderson,  D.  G.,  Roberts,  C. E., Pearsall, N.N. & Nester, M. T., 2004, Microbiology  a  Human  Perspective, Edisi IV, Mc. Graw-Hill, New York, 13. Pantas,  F.M.,  2009,    Pengaruh  Pemberian
Seduhan  Teh  Hitam  ( Camellia  sinensis )
Dosis  Bertingkat  terhadap  Aktivitas Fagositosis  Makrofag  Mencit  Balb/C yang Diinokulasi Salmonella typhimurium , Skripsi, Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang. Rinihapsari,  E.  &  Richter,  C.A.,  2008, Fermentasi  Kombucha  dan  Potensinya
Sebagai  Minuman  Kesehatan, Media Farnasi Indonesia, 3 (2), 241-246. Suhartatik  N,  Karyantina  M,  Marsuno  Y,
Rahayu ES, Kuswantoro KR: Kombucha as  Hypercholesterolemic  agent  (in  vitro study using SD rats). ’’Proceeding of the 3rd International Conference of Indonesian  Society  for  Lactic  Acid Bacteria  (3rd  IC-ISLAB):  Better  Life with  Lactic  Acid  Bacteria:  Exploring Novel  Function  of  Lactic  Acid  Bacteria,
2011, Yogyakarta, Indonesia. Suhirman,  S.  dan  Christina,  W.,  2011, Prospek  dan  Fungsi  Tanaman  Obat Sebagai Imunomodulator, Balai Penelitian Tanaman  Obat  dan  Aromatik, http://balittro.litbang.deptan.go.id/ , diakses tanggal 7 Januari 2014.
Suprijono,  A.,  Gresti,  K.P.  dan  Eka, S.Hp.,2012, Pengaruh Fermentasi Kultur Kombucha terhadap Aktivitas Antioksidan  Infus  Daun  Teh  Hitam Camellia  sinensis O.K.  var.assamica
(mast))  dengan  metode  DPPH  (1,1- difenil-2-pikrilhidrazil). Media  Farmasi Indonesia . 6 (2), 92-94, http://journal.stifar.ac.id/, tanggal 7 Januari 2014. Susilaningsih,  N.,  Johan,  A.,  Gunardi.  dan Winarto.,  2005,  Pengaruh  polifenol  teh hijau  dan  komponen  aktifnya  terhadap aktifitas  fagositosis  makrofag  dalam membunuh bakteri, Media Medika Indonesia ; 40 : 76-81.
Smit, E., Oberholzer, HM., and Pretorius , E., 2009,  A  review  of  Immunomodulators with  reference  to  Canova, Homeopathy , 98 , 169–176.
Ulfah,  M.,  dan  Arifin,  I.,  2013,  Teh  Jamur Kombucha Sebagai Imunomodulator Terhadap Proliferasi Sel Limfosit Mencit
Galur  Balb/c  Secara In  Vitro , Prosiding Simposium  Nasional “Peluang dan
Tantangan  Obat  Tradisional  dalam Pelayanan Kesehatan Formal”, 95-100.