Pelita Perkebunan 29(1)  2013, 31-43

## Identifikasi Tanaman Potensial Penghasil Tanin-protein Kompleks
Untuk  Penghambatan Aktivitas  -amylase Kaitannya Sebagai

## Pestisida Nabati
Identification  of  Potential  Plants  Producing  Tannin-protein  Complex for  -amylase  as  Botanical  Pesticide
Asriyah Firdausi 1) , Tri Agus Siswoyo 1*) , dan Soekadar Wiryadiputra 2*)
1) Pascasarjana  Program  Agronomi,  Fakultas  Pertanian,  Universitas  Jember
2) Pusat  Penelitian  Kopi  dan  Kakao  Indonesia,  Jl.  PB.  Sudirman  No.  90,  Jember,  Indonesia
*) Alamat  penulis  ( corresponding  author ):  siswoyo.triagus@gmail.com;  soekadar@yahoo.com Naskah  diterima  ( received )  16  November  2012,  disetujui  ( accepted )  11  Januari  2013

## Abstrak
Penelitian  tentang  pestisida  nabati  perlu  dikembangkan  melalui  metode baru, di antaranya melalui penghambatan aktivitas enzim pencernaan oleh senyawa metabolit sekunder. Penelitian bertujuan untuk mengidentifikasi tanaman potensial penghasil  bahan  aktif  tanin  protein  kompleks  untuk  penghambatan  aktivitas  - amylase sebagai  langkah  awal  untuk merakit pestisida nabati.  Penelitian dibagi menjadi  tiga  tahap:  1)  identifikasi  tanaman  potensial  penghasil  bahan  aktif  tanin, 2)  isolasi  tanin  protein  kompleks,  dan  3)  pengujian  tanin  protein  kompleks  pada aktivitas  - amylase .  Beberapa  tanaman  yang  digunakan antara  lain daun  sidaguri ( Sida rhombifolia ), daun melinjo ( Gnetum gnemon ), daun gamal ( Gliricidia sepium ), daun lamtoro ( Leucaena leucocephala ), biji pinang ( Areca catechu ) dan  simplisia gambir  ( Uncaria  gambir )  komersial.  Biji  melinjo  digunakan  sebagai  sumber  pro- tein. Berdasarkan penelitian  ini diketahui bahwa dari berbagai jenis tanaman yang telah  diidentifikasi  didapatkan  bahan  yang  berpotensi  sebagai  sumber  tanin-pro- tein  kompleks,  yakni  biji  pinang  yang  diinteraksikan  dengan  biji  melinjo.  Tanin- protein kompleks  ini  memiliki kandungan tanin  sebesar  1,77 mg TAE/mL dengan aktivitas  antioksidan  sebesar  90%,  kemampuan  untuk  menghambat  aktivitas  - amylase sebesar 95% dengan nilai IC 50 sebesar 10 mg/mL.
Kata  kunci: Tanin,  protein,  -amylase ,  pestisida  nabati, Areca  catechu,  Gnetum  gnemon.

## Abstract
Research  on  the  development  of   botanical  pesticides  should  be developed  through  new  methods,  such  as  by  inhibiting  the  activity  of  digestive enzymes  by  secondary  metabolites.  The  aim  of  this  study  was  to  identify some  of  potential  plants  as  a  source  of  tannin-protein  complexes  to  inhibit the  activity  of  - amylase .  The  study  of   identification  of   potential  plants producing  the  active  ingredient  tannin-protein  complex  was  divided  into  three stages,  1)  identification  of  potential  plants  producing  tannin,  2)  isolation  of tannin-protein  complexes,  and  3)  in  vitro  test  of  tannin-protein  complexes effect  of  the  -amylase activity.  Some  of  the  observed  plants  were  sidaguri  leaf (Sida rhombifolia) , melinjo leaf (Gnetum gnemon) , gamal leaf (Gliricidia sepium) , lamtoro  leaf (Leucaena  leucocephala) ,  betel  nut (Areca  catechu) ,  and  crude gambier (Uncaria  gambir) as  a  source  of  tannins  and  melinjo  seed  was  used  as protein  source.  Betel  nut  and  melinjo  seed  were  the  best  source  of  tannin-pro-
Firdausi et  al.
tein  complex,  tannin  content  1.77  mg  TAE/mL  with  antioxidant  activity  of  90%, the  ability  to  inhibit  the  activity  of  -amylase by  95%  with  IC 50 values  of 10  mg/mL.
Key words: Tannin, protein,  - amylase , botanical pesticides, Areca catechu, Gnetum gnemon.

## PENDAHULUAN
Hama  tanaman  kakao  yang  paling berperan  dalam  menurunkan  hasil  hingga 80%  adalah  hama  penggerek  buah  kakao (PBK, Conopomorpha cramerella (Snell.)) (Lepidoptera: Gracillariidae) (Wiryadiputra, 2009; Wahyudi et al., 2008 ). Pengendalian hama  ini  yang  umum  dipraktekkan  oleh petani adalah menggunakan pestisida, baik pestisida nabati, misalnya limbah tembakau (Wiryadiputra, 2003) maupun pestisida kimia yang telah diketahui menyebabkan dampak yang cukup serius terhadap keseimbangan ekosistem (Ramasoota, 2001). Oleh karena itu diperlukan terobosan baru sebagai upaya perakitan pestisida yang lebih berwawasan lingkungan yakni dengan mengembangkan pestisida nabati yang cara kerjanya melalui penghambatan terhadap enzim pencernaan serangga.
Alfa amylase (  - 1, 4-glucan-4-glucano- hydrolases, EC 3.2.1.1 ) merupakan enzim yang menghidrolisis ikatan  -D-(1,4)-glukan pada komponen pati, glikogen dan jenis yang berhubungan  dengan  karbohidrat  untuk diubah menjadi energi yang dapat digunakan oleh  serangga  untuk  pertumbuhannya, bertahan hidup dan beraktivitas (Xiao et al ., 2009). Alfa  amylase merupakan  enzim penting dalam pencernaan yang berdampak pada daya hidup serangga. Hama serangga selalu  hidup  pada  kondisi  yang  kaya polisakarida  dan  kelangsungan  hidupnya sangat  tergantung  pada  keefektifan  enzim  - amylase . Pencernaan pati oleh  - amylase serangga telah ditunjukkan dan dideskripsikan pada beberapa jenis serangga, termasuk ordo
Coleoptera, Hymenoptera, Diptera, Lepi- doptera, dan Hemiptera. (Mehrabadi  & Bandani,  2009; Jimenez et al. , 2008).
Penghambatan pada enzim  - amylase akan  menurunkan  kemampuan  untuk mencerna  pati  yang  merupakan  sarana penyedia energi. Penelitian yang dilakukan oleh Mcdougall et al. (2003) menunjukkan bahwa  senyawa  fenolik  dari  beberapa tanaman  mampu  menghambat  aktivitas enzim  - amylase .  Secara  alami,  tanaman menghasilkan  senyawa-senyawa  metabolit sekunder,  antara  lain  terpentin,  fenolik, glikosida, dan alkaloid (Hopkins & Huner, 2004; Wang et al., 2009). Senyawa metabolit sekunder memiliki kemampuan proteksi yakni sebagai  penghambat  aktivitas  makan ( antifeedant ) , antioksidan serta antibakteri sehingga  berpotensi  untuk  dimanfaatkan sebagai  pestisida  nabati  (Turkmen et  al., 2007; Misnawi  &  Wahyudi,  2008).  Salah satu  senyawa  metabolit  sekunder  dari golongan polifenol adalah tanin.
Tanin  merupakan  senyawa  makro molekul  yang  dihasilkan  oleh  tanaman dan  berperan  sebagai  penolak  nutrisi ( antinutrient )  dan  penghambat  enzim ( enzyme inhibitor ) sehingga mengakibatkan rendahnya hidrolisis pati  dan menurunkan respons  terhadap  gula  darah  pada  hewan (Matsushita et al., 2002). Jenis tanaman yang mengandung tanin antara lain adalah daun sidaguri ( Sida rhombifolia L.) yang diketahui mengandung  tanin  cukup  tinggi  dan  telah digunakan sebagai pestisida nabati pembunuh ulat  ( larvasidal )  (Kusuma et  al., 2009; Islam et al., 2003). Daun melinjo ( Gnetum
gnemon L.) juga mengandung tanin. Daun gamal ( Gliricidia sepium Jacq.) dan lamtoro ( Leucaena leucocephala Lamk.) mempunyai kandungan  tanin  8-10%  (Suharti,  2005; Sulastri,  2009).  Biji  pinang  ( Areca catechu L.) dan simplisia gambir ( Uncaria gambir Roxb.)  telah  dikenal  luas  sebagai penghasil  tanin  dengan  kandungan  tanin masing-masing sebesar 26,6% dan 30-40% (Pambayun, 2007; Hadad et al ., 2007).
Senyawa  tanin  yang  terdapat  dalam tanaman secara alami memiliki kemampuan untuk  berinteraksi  dengan  protein  dan membentuk protein kompleks, demikian pula dengan senyawa pati (Makkar et al ., 2007).
Senyawa kompleks tersebut bersifat racun yang  dapat  berperan  dalam  menghambat pertumbuhan dan mengurangi nafsu makan herbivora melalui  penghambatan  aktivitas enzim  pencernaan  yakni  - amylase . Terhadap  penghambatan  aktivitas  enzim  - amylase belum banyak dilakukan peng- amatan.  Tulisan  ini  menyajikan  hasil identifikasi tanaman potensial penghasil tanin- protein kompleks, penghambatan aktivitas  - amylase sebagai langkah awal perakitan pestisida nabati untuk mengendalikan hama kakao yang ramah lingkungan.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Analisis  Tanaman  Jurusan  Budidaya Pertanian  Fakultas  Pertanian  Universitas Jember,  sedangkan  bahan  lain  yang digunakan  berstandar  kualitas  untuk analisis  ( analitical  grade) .  Penelitian dilakukan dengan menggunakan rancangan acak  lengkap  dengan  enam  perlakuan dan tiga ulangan. Perlakuan berupa contoh jaringan tanaman yaitu daun sidaguri ( Sida rhombifolia L.),  biji,  dan  daun  melinjo ( Gnetum gnemon L), daun gamal ( Gliricidia sepium Jacq . ),  daun  lamtoro  ( Leucaena leucocephala Lamk.), biji pinang ( Areca cate-
chu L.),  dan  simplisia  gambir  ( Uncaria gambir Roxb.).  Bahan  penelitian  yang digunakan  antara  lain  adalah Diphenil Picrilhydrazil (DPPH), asam galat ( Gallic acid), asam  askorbat ( Ascorbic  acid ), Bovine Serum Albumin (BSA), dan enzim  -amylase porcine pancreatic (Sigma), serta bahan pendukung lain dengan kualitas untuk analisis ( analitical grade ) .
Sepuluh gram contoh dilarutkan dengan 50 mL 50% metanol, kemudian disentrifusi dengan kecepataan 10.000 rpm ( rotary per minute ) untuk dipisahkan antara supernatan dan pelet, supernatan akan digunakan pada proses berikutnya.

## Total Protein Terlarut
Kandungan protein total diukur dengan metode Bradford (1976).  Sepuluh (10) µL contoh  ditambah  dengan  990  µL  larutan Bradford, diinkubasi selama 15 menit pada suhu  ruang,  kemudian  diukur  nilai  absor- bansinya pada panjang gelombang 595 nm. Hasil pengukuran dibandingkan dengan 1 mg/ mL Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standar untuk mengetahui kandungan total protein terlarut.

## Flavonoid
Penentuan kandungan flavonoid meng- gunakan  metode  AlCl 3 ,  yaitu  50  µL  pada masing-masing  ekstrak  contoh  dilarutkan pada  500  µL  air  deionisasi  ( deionized water ),  30  µL  5%  NaNO 2 ditambahkan, didiamkan selama lima menit, lalu ditambah- kan 30 µL 10% AlCl 3 , didiamkan kembali selama  enam  menit.  Setelah  enam  menit, 200  µL  1N  NaOH  ditambahkan  dengan diikuti penambahan 240 µL air deionisasi. Besarnya  konsentrasi  flavonoid  yang dihasilkan  pada  masing-masing  ekstrak contoh  ditentukan  dengan  mengukur  nilai absorbansinya  pada  panjang  gelombang
Firdausi et  al.
Sebanyak 2,5 g agarose ditambahkan dengan 250 mL  0,05 M  bufer asetat  pH 5,0 yang mengandung  60  µM  asam  askorbat,  di- panaskan  dengan microwave ,  kemudian diinkubasi pada suhu 45 o C selama 15 menit, selanjutnya ditambahkan BSA dan diletak- kan pada petridis. Pada gel di dalam petridis dibuat  beberapa  lubang  sebagai  tempat untuk  menguji  contoh,  dan  contoh  yang dimasukkan sebanyak 7µg GAE ( gallic acid equivalent ).
Tanin-protein kompleks didapat melalui metode presipitasi protein berdasarkan pH. Sumber  protein  yang  digunakan  pada penelitian  ini  adalah  biji  melinjo  yang dilaporkan mempunyai kandungan protein cukup tinggi  yakni sekitar  10% (Siswoyo, 2011). Untuk mendapatkan sumber protein dari biji melinjo, 4 g biji melinjo dihaluskan dengan  menggunakan  20  mL  air,  larutan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm, dan  supernatan  akan  digunakan  sebagai sumber protein dalam membentuk tanin-pro- tein kompleks. Sepuluh (10) mL contoh yang menjadi  sumber  tanin  diinteraksikan dengan protein biji melinjo pada perbandingan 1:2,  kemudian  diukur  pH-nya.  Untuk mendapatkan pH rendah (2,4), contoh diberi larutan  1  N  HCl  dengan  cara  diteteskan, sampai sesuai dengan pH yang diinginkan sedangkan untuk pH tinggi (  8) diberi larutan 1 N  NaOH. Contoh  disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit untuk diambil peletnya dan digunakan pada proses selanjutnya [Hoon et al . (1980) dalam Neves et al. (1997)].
Penghambatan Aktivitas  -amylase
Pengujian aktivitas  - amylase secara in vitro dilakukan  berdasarkan  hambatan aktivitas enzim  - amylase yang berasal dari porcine pancreatic  -amylase , sedangkan gula  reduksi  yang  dihasilkan  dianalisis
415  nm  dengan  menggunakan  1  mg/mL Quercetin sebagai standar.

## Polifenol
Kandungan senyawa polyphenol diukur menggunakan Folin-Cicalteau  Reagent dengan menggunakan 1 mg/mL asam galat sebagai standar. Seratus (100) µL ekstrak contoh dilarutkan dalam 2 mL 2% Na 2 CO 3 , yang kemudian diikuti dengan penambahan pereaksi  100  µL  50% Folin-Cicalteau Reagent . Larutan dicampur sampai homogen, lalu didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar.  Absorbansi  dari  larutan  tersebut diukur  dengan  menggunakan  spektrofoto- meter U-2001 dengan panjang gelombang 750 nm.

## Interaksi Tanin Protein
Pengujian  kandungan tanin  dilakukan dengan  metode  yang  dikemukakan  oleh Hagerman  (2002)  dengan  menggunakan tannic  acid sebagai  standar.  Pengujian kandungan protein dilakukan dengan metode Bradford menggunakan BSA ( Bovine Serum Albumin ) sebagai standar dan untuk pengujian aktivitas antioksidan menggunakan DPPH ( 1,1-diphenil-2-picrylhydrazil ).
Aktivitas antioksidan dihitung dengan rumus :
Nilai RF ( rate of flow ) dihitung dengan rumus:
Keterangan ( Note ): abs  (DPPH)  =  absorbansi  (nm)  pada  DPPH,  dan  RF  =  laju alir  ( rate  of  flow )  senyawa antioksidan.
Metode Radial  Difusion  Assay ini dikemukakan  oleh  Hagerman  (2002).
Aktivitas Antioksidan  =
abs  (DPPH)–abs  (DPPH+contoh)
x 100% abs  (DPPH)
Jarak  yang  ditempuh  oleh  senyawa
RF =
Jarak  yang  ditempuh  pelarut
menggunakan metode DNS ( dinitrosalisilyc acid, asam dinotrosalisilat) dengan 1 mg/mL maltose sebagai standar. Dua puluh (20) µL  - amylase , 100 µL 1% pati terlarut ( soluble starch ), dan 400 µL bufer diinkubasikan pada suhu  37 o C  selama  30  menit.  Lima  ratus (500) µL  DNS ditambahkan  untuk  meng- akhiri reaksi. Larutan diinkubasikan pada air yang mendidih selama lima menit, absorban diukur  dengan  spektrofotometer  dengan panjang gelombang 540 nm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Identifikasi tanaman potensial penghasil bahan akif tanin-protein kompleks dilakukan pada  beberapa  tanaman  yang  berada  di daerah dekat dengan kebun kakao, dengan harapan  mudah  diperoleh  petani  kakao sebagai  langkah  awal  untuk  membuat pestisida nabati. Hasil uji kandungan protein, fenolik dan tanin dari sampel yang digunakan, dapat dilihat pada Tabel 1. Fenolik merupakan senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan tanaman.  Secara  umum,  senyawa  ini merupakan senyawa yang disintesis dari gula sederhana  dan  memiliki  cincin  benzen hidrogen  dan  oksigen,  sedangkan  tanin merupakan bagian dari fenolik yang berfungsi sebagai pengikat protein, enzim, penghambat
proses  pencernaan  serta  bersifat  sebagai antioksidan.
Pada  dasarnya  setiap  tanaman  meng- hasilkan tanin sebagai metabolit sekunder, hanya  jumlahnya  berbeda  pada  setiap tanaman,  begitu  pula  pada  setiap  bagian tanaman  (Frutos et al ., 2004; Taiz & Zieger, 2002). Kandungan tanin dan protein berbeda untuk setiap contoh, hal ini disebabkan karena metabolit sekunder yang disintesis oleh setiap tanaman mempunyai distribusi yang terbatas pada  famili  tertentu,  genera,  dan  bahkan spesies. Hal ini disebabkan oleh lingkungan tempat  tanaman  itu  tumbuh  (Hopkins  & Huner,  2004;  Kayani et  al., 2007).  Tidak hanya  itu,  bahkan  penelitian  yang  telah dilakukan oleh Morris et al . (1993), dengan menggunakan tanaman Lotus corniculatus var. japonicas menunjukkan bahwa distribusi tanin pada bagian dari tiap tanaman tersebut juga berbeda.

## Aktivitas Antioksidan
Pengujian aktivitas antioksidan secara kualitatif dilakukan dengan metode dot blot –DPPH. Metode ini relatif mudah, sederhana dan sensitif untuk seleksi antioksidan pada tanaman,  kemudian  dilanjutkan  dengan metode  TLC-DPPH  untuk  menentukan
Tabel  1. Kandungan protein, fenolik, dan tanin pada beberapa jenis tanaman
Table  1. Protein, phenol, and tannin content in several species of plants
Daun sidaguri (S. rhombifolia leaves ) 0 2.41 ± 0.02 d 4.18 ± 0.02 a 5.91 ± 0.02 a Daun melinjo (G. gnemon leaves ) 0 3.18 ± 0.05 c 12.11 ± 0.07 d 14.50 ± 0.19 c Daun gamal (G. sepium leaves ) 0 0.97 ± 0.05 e 7.37 ± 0.03 c 7.21 ± 0.09 ab Daun lamtoro (L. leucocephala leaves ) 0 0.13 ± 0.03 f 4.69 ± 0.06 b 14.90 ± 0.06 c Simplisia gambir ( Crude gambier ) 12.13 ± 0.02 b 74.77 ± 0.10 e 26.90 ± 0.06 e Biji pinang ( Arecanut fruit ) 14.87 ± 0.06 a 74.38 ± 0.04 e 20.74 ± 0.09 d Sampel Tanaman ( Plant species ) Protein ( Protein ) mg/g Fenolik ( Phenolic ) mg  GAE/g Tanin  ( Tannin ) mg  TAE/g
Catatan ( Notes ): BSA  =  ( Bovine  serum  albumin );  GAE  =  Ekuivalen  asam  galat  ( Gallic  acid  equivalent );  QE  =  Ekuivalen kuersetin ( Quercetin equivalent ); TAE = Ekuivalen asam tanat ( Tannin acid equivalent ) .
Angka-angka  di  dalam  kolom  yang  sama  dan  diikuti  dengan  huruf  yang  sama  menunjukkan  tidak  berbeda nyata  dengan  uji  jarak  Duncan  5%  ( Numbers  within  the  column  followed  with  the  same  letters  are  not significantly different according to DMRT test at 5% level ).
Firdausi et  al.
secara  spesifik senyawa-senyawa yang ber- potensi sebagai antioksidan. Pengujian ini dilakukan menggunakan GA ( gallic acid ) dan BHT  ( butylated  hydroxytoluene )  sebagai kontrol.
Dari  Gambar  1  (A)  dapat  diketahui bahwa semua contoh yang digunakan pada penelitian  ini  mempunyai  kemampuan sebagai  antioksidan.  Hal  ini  tampak  pada reduksi warna ungu yang berubah menjadi putih atau coklat. Warna ungu merupakan senyawa  DPPH yang  merupakan  senyawa radikal  bebas  dan  akan  berubah  menjadi putih  atau  coklat  apabila  senyawa  DPPH berikatan dengan senyawa yang merupakan antioksidan. Pada Gambar 1 (B) yakni hasil dari metode TLC-DPPH menunjukkan bahwa terdapat  banyak  senyawa  yang  berfungsi sebagai  antioksidan  pada  masing-masing contoh,  namun  terdapat  pita  ( band) yang menunjukkan  bahwa  senyawa  tersebut merupakan antioksidan utama. Senyawa ini mempunyai nilai laju alir ( rate of flow = RF)
yang berbeda untuk setiap tanaman. Hal ini menunjukkan  bahwa  terdapat  beberapa senyawa  berbeda  yang  terkandung  pada contoh yang bersifat sebagai antioksidan.
Metode  berikutnya  yaitu  dengan perendaman dalam DPPH yang digunakan untuk  mengetahui  aktivitas  antioksidan secara kuantitatif pada setiap tanaman dan hasilnya tampak pada Gambar 2.
Pada  penelitian  ini  diketahui  bahwa contoh memiliki aktivitas antioksidan yang berbeda. Pada konsentrasi 10 mg GAE/mL, contoh  sudah  menunjukkan  aktivitas antioksidan  yang  tinggi,  yaitu  pada  biji pinang, simplisia gambir, daun melinjo, daun lamtoro, dan daun gamal, namun pada daun sidaguri  baru  menunjukkan  aktivitas antioksidan dalam konsentrasi yang tinggi yakni 40 mg GAE/mL. Hal ini menunjukkan bahwa  semua  bahan  tanaman  yang  diuji mempunyai potensi untuk dijadikan sebagai sumber antioksidan, namun biji pinang dan simplisia gambir memiliki potensi yang lebih
Gambar 1. (A) Pengujian  aktivitas  antioksidan dengan  metode dot  blot ,  (B) penentuan  aktivitas  penangkal radikal  dengan  TLC-DPPH.  GA  = gallic  acid ;  ME  =  metanol;  BHT  = butil  hidroksitoluen ; S  =  daun  sidaguri;  M  =  daun  melinjo;  G  =  daun  gamal;  L  =  daun  lamtoro;  P  =  biji  pinang; GB  = simplisia  gambir.
Figure 1. ( A ) Antioxid ant  activity  test  using  dot  blot  method , ( B ) TLC-DPPH . GA  =  gallic  acid ; ME =  metanol ; BHT =  butil hidrositoluen ; S = Sida  rhombifolia L .; M = Gnetum gnemon L .; G = Gliricidia sepium; L = Leucaena leucocephala; P = Areca catechu; GB = Uncaria gambir .
RF :  0,86 RF :  0,85 RF :  0,79 RF :  0,76 A B S M G L P GB
besar untuk dijadikan sebagai sumber tanin. Hasil penghitungan nilai IC 50 ( inhibitory con- centration ) dari biji pinang 4,1; simplisia gambir 6,4; daun melinjo 20,0; daun gamal 41,0; dan daun lamtoro 72,4 mg/mL GAE (Gambar 2). Untuk daun sidaguri tidak dapat ditentukan  nilai  IC 50 -nya,  hal  ini  karena aktivitas penghambatannya terhadap DPPH tidak  mencapai  50%.  Hasil  tersebut menunjukkan bahwa dengan meningkatnya aktivitas antioksidan, maka nilai IC 50 akan semakin rendah dan contoh tersebut sangat berpotensi untuk dijadikan sebagai sumber pestisida nabati.

## Interaksi Tanin Protein
Tanin secara alami memiliki kemampuan untuk  berikatan  dengan  protein  yang kemudian  membentuk  tanin  protein kompleks.  Secara  umum,  interaksi  tanin protein-kompleks  yang  dapat  diendapkan
dapat  terjadi  jika  perbandingan  jumlah protein  dan  tanin lebih  dari  satu.  Apabila kandungan  tanin  lebih  besar  daripada kandungan  protein  maka  tanin-protein kompleks  yang  terbentuk  lebih  mengarah pada  tanin-protein  kompleks  yang  tidak diendapkan. Tanin protein kompleks dapat disintesa secara turbidimetrik berdasarkan gradien  pH.  Tidak  semua  tanaman  mem- punyai  nilai  pH  yang  sama  dalam  pem- bentukan tanin protein kompleks.
Pada  Tabel  2,  dapat  dilihat  bahwa masing-masing  contoh  memiliki  pH  yang berbeda dalam pembentukan tanin-protein kompleks.  Ada  yang  terbentuk  pada  pH asam  yakni  melinjo pada pH  4,  pH netral yakni gambir pada pH 6, dan yang terbanyak adalah  pH basa,  yaitu  daun  sidaguri  pada pH 8; daun gamal pada pH 10; daun lamtoro pada pH 10 dan biji pinang pada pH 8. Hal ini  dipengaruhi  oleh  jenis  protein  yang terdapat pada setiap tanaman. Kelarutan tanin
Gambar 2. Pengaruh pemberian contoh ekstrak tanaman dengan berbagai  konsentrasi pada  DPPH.
Figure 2. Effect of plant samples with different concentrations on DPPH.
100 80 60 40 20 0 0 10 20
30 40 50 60 Konsentrasi contoh GAE ( GAE concentration ), mg/mL H a m b a ta n D P P H ( D P P H i n h ib it io n ), % Pinang ( Areca catechu ) Gambir  ( Uncaria  gambier) Gamal ( Gliricidia sepium ) Lamtoro ( Leucaena leucocephala )
Melinjo  ( Gnetum gnemon L.) Sidaguri ( Sida rhombifolia L.)
Firdausi et  al.
protein yang paling rendah terjadi pada nilai isoelektrik dari protein (Shahidi & Marian, 2004).
Kemampuan tanin untuk mengendapkan protein dapat terjadi pada pH di bawah 8, kemudian akan menurun tajam pada pH di atasnya  disebabkan  tanin  tidak  dapat berikatan dengan protein pada pH tinggi. Pada kondisi tersebut, tanin akan terionisasi dan tidak  tersedia  untuk  ikatan  hidrogen. Meskipun  demikian,  hal  ini  tidak  berlaku untuk  daun  gamal  dan  daun  lamtoro disebabkan protein yang terdapat di dalam- nya  tidak  seluruhnya  tergantung  pada pembentukan  ikatan  hidrogen  dengan kelompok  fenolik  yang  tidak  terionisasi (Hagerman & Butler, 1978).
Pengujian  afinitas  contoh  untuk  ber- interaksi dengan protein dilakukan melalui uji radial  difusi  tanin.  Tanin  yang  berasal  dari masing-masing contoh diletakkan pada aga- rose yang mengandung BSA ( Bovine  Serum Albumin ), hasilnya tampak pada Gambar 3.
Gambar 3. Difusi radial tanin dari tiap contoh pada protein BSA: P = biji pinang; S = daun sidaguri;  M =  daun  melinjo;  G =  daun gamal; L = daun lamtoro; GB = simplisia gambir; GA = asam galat.
Figure 3. Rad ial  d iffusion  of  sample  in  BSA protein:  P  =  Arecanut  fruit;  S  = Sida rhombifola leaves;  M = Gnetum gnemon leaves;  G  = Gliricidia  sepium leaves; L  = Leucaena  leucocephala leaves; GB = Crude gambier; GA = Gallic acid.
Kemampuan  contoh  sebagai  sumber tanin  berinteraksi  dengan  protein  tampak pada hasil uji difusi radial ( radial diffusion
GB S G A M G L P
Tabel  2. Kandungan protein, fenolik, dan tanin protein kompleks pada beberapa tanaman contoh
Table  2. Protein, phenolic, and tannin-protein complex contents in several of plant species
Catatan ( Notes ) : TPT  =  Total  protein  terlarut  ( Total  of  soluble  protein );  P/T  =  Rasio  antara  protein  dan  tanin  ( protein- tannin ratio ).
Angka-angka  di  dalam  kolom  yang  sama  dan  diikuti  dengan  huruf  yang  sama  menunjukkan  tidak  berbeda nyata  dengan  uji  jarak  Duncan  5  %  ( Numbers  in  the  same  column  followed  with  the  same  letters  are  not significantly different according to DMRT test at 5 % level ). Daun sidaguri 8 2.30 ± 0.08 ab 0 1.63 ± 0.02 b 0.91 ± 0.13 ab 13.62 ± 0.27 ab 2.52 S. rhombifolia leaves Daun melinjo 4 2.05 ± 0.15 ab 1.39 ± 0.03 b 0.37 ± 0.00 a 18.44 ± 0.23 cd 5.54 G. gnemon leaves Daun gamal 10 5.66 ± 0.66 c 0.83 ± 0.00 ab 0.65 ± 0.13 ab 11.76 ± 0.50 a 8.71 G. sepium leaves Daun lamtoro 10 1.49 ± 0.02 ab 12.76 ± 5.74 c 0.96 ± 0.02 ab 16.13 ± 0.59 bc 1.55 L. leucocephala leaves Simplisia  gambir 8 1.01 ± 0.01 a 0.33 ± 0.01 a 0.55 ± 0.09 ab 32.07 ± 0.23 e 1.84 Crude gambier Biji  pinang 6 4.96 ± 0.68 c 43.55 ± 7.78 d 2.79 ± 0.06 c 86.70 ± 0.05 f 1.78 Arecanut fruit Jeneis tanaman Plant species pH TP T
Total  soluble protein mg/ml
Fenolik
Phenolic mg  GAE/ml Tanin Tannin mg  TAE/ml
Hambatan DPPH
DPPH inhibition
% P/T
kuat dibandingkan dengan ikatan ion (Shahidi & Marian, 2004) dan setiap tanaman memiliki karakteristik tanin yang berbeda.
Dari Tabel 3 dapat diketahui bahwa tanin protein kompleks yang berasal dari simplisia gambir dan biji melinjo memiliki kandungan tanin yang lebih rendah dibandingkan dengan tanin protein komplek yang berasal dari biji pinang  dan  biji  melinjo.  Demikian  pula dengan kemampuan anti-oksidannya. Oleh karena itu, contoh yang akan dipilih sebagai bahan pestisida tanin protein komplek adalah yang berasal dari biji pinang dan biji melinjo.
Aktivitas Penghambatan  -amylase
Telah  banyak  penelitian  yang  me- nyatakan bahwa aktivitas pencernaan akan terganggu  dengan  adanya  - amylase inhibitor (Narayanan, 2004; Obame et al ., 2007; Vinayaka et al ., 2009). Sebagai contoh, aktifitas  - amylase larva Tecia solanivora menurun  sebesar  80%  dengan  adanya  biji Amaranthus hypocondriacus . Mekanisme penghambatan  tanin  terhadap  bakteri  dan beberapa enzim belum diketahui secara pasti. Ada  pendapat  yang  menyatakan  bahwa strategi penghambatan  - amylase serangga antara lain melalui penghambatan interaksi antara  sisi  substrat  yang  seharusnya  ber- ikatan  dengan  enzim,  menjadi  berikatan dengan tanin. Akibatnya terbentuk subsite yang  menciptakan  molekul-molekul  lain sehingga struktur yang seharusnya terlibat
assay ),  sebagai  tampak  pada  Gambar  3. Interaksi tanin dengan protein terlihat dari lingkaran  cincin  ( visible  ring )  yang terbentuk. Semakin lebar visible ring yang terbentuk,  maka  kemampuan  tanin  untuk berinteraksi  dengan  protein  juga  semakin besar  (Makkar et  al. ,  2007).  Hasil  radial difusi  menunjukkan  bahwa  sampel  yang berasal dari biji pinang dan gambir mempunyai afinitas yang tinggi untuk berikatan dengan protein dibandingkan dengan sampel yang lain. Hal ini menunjukkan bahwa biji pinang dan  gambir  berpotensi  untuk  dijadikan sebagai sumber tanin.
Pada penelitian ini, biji melinjo dipilih untuk  digunakan  sebagai  sumber  protein, karena biji melinjo mempunyai kandungan protein yang cukup tinggi yakni mencapai 10%  untuk  tiap  butir  bijinya  (Siswoyo, 2011). Selain itu biji melinjo dikenal memiliki kemampuan  sebagai  antioksidan  dan karakteristik  protein  pada  biji  melinjo telah  diketahui.  Penginteraksian  antara sumber  tanin  dengan protein yang  berasal dari  biji  melinjo  diharapkan  dapat meningkatkan  penghambatan  aktivitas  - amylase . Kandungan protein, fenolik, dan tanin pada tanin protein kompleks disajikan dalam Tabel 3.
Interaksi antara tanin dan protein untuk membentuk  tanin  protein  komplek  di- pengaruhi oleh ikatan antara keduanya. Tanin protein kompleks yang terjadi karena ikatan hidrofobik memiliki kemampuan yang lebih
Tabel  3. Kandungan protein, fenolik, dan tanin dalam tanin protein kompleks
Table  3. Protein, phenolic, and tannin content in tanin protein complex
P-M 5.30 ± 0.02 b 1.77 ± 0.01 b 0.31 ± 0.001 a 90.05 ± 0.37 b Gb-M 1.43 ± 0.01 a 0.52 ± 0.00 a 0.27 ± 0.001 a 46.74 ± 0.89 a Contoh Sample Fenolik Phenolic mg  GAE/mL Tanin Tannin mg  TAE/mL TP T Total soluble protein mg/mL
Hambatan DPPH/Aktivitas antioksidan
DPPH Inhibition / antioxidant activity
%
Catatan ( Notes ): BSA = Bovine Serum  Albumin ; GAE = Gallic acid equivalent ; QE = Quercetin equivalent ;  TAE = Tannic acid equivalent.
P  =  Biji  pinang  ( Arecanut  fruit );  Gb  =  Simplisia  gambir  ( Crude  gambier );  M  =  Biji  melinjo  ( Gnetum gnemon bean ).
Firdausi et  al.
dalam  proses,  menjadi  berikatan  dengan struktur molekul yang bebas yang merupakan molekul inhibitor, hasilnya proses terhambat (Payan,  2004).  Selain  itu  ada  yang  ber- pendapat  bahwa  kemampuan  tanin  untuk berikatan  dengan  protein  mampu  meng- hambat  -amylase , glucosyl transferase, dan hal  ini  menyebabkan  enzim  tersebut kehilangan  fungsi  dan  terdistorsi  menjadi struktur tersier (Miller, 2001).
Penghambatan aktivitas  - amylase dari tanin-protein kompleks yang berasal dari biji pinang-melinjo  sebagaimana  terlihat  pada Gambar 4. Pemberian tanin-protein kompleks ternyata  berpengaruh  positif  terhadap penghambatan aktivitas  - amylase . Pemberi- an  tanin  yang  berasal  dari  ekstrak  buah pinang  dan  protein  yang  berasal  dari  biji
melinjo  ternyata  mampu  menghambat aktivitas  - amylase dengan nilai IC 50 masing- masing sebesar 11 mg/mL dan 51 mg/mL. Namun  dengan  membentuk  tanin  protein kompleks yang berasal dari kedua bahan ini ternyata mampu meningkatkan penghambatan terhadap aktivitas  -amylase , yakni sebesar 95% dengan nilai IC 50 sebesar 10 mg/mL.
Korelasi antara aktivitas penghambatan  - amylase dan  aktivitas  antioksidan  biji pinang-melinjo tampak pada Gambar 5. Dari hasil penelitian ini tampak bahwa terdapat korelasi  positif  antara  antioksidan  dan aktivitas  penghambatan  - amylase. Pada tanin-protein kompleks yang berasal dari biji pinang-melinjo,  peningkatan  aktivitas antioksidan ternyata sejalan dengan mening- katnya penghambatan aktivitas  - amylase.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 P e n g h a m b a ta n ( In h ib it io n ), % Protein ( Protein ), mg 0 20 40 60 80 100 120 Pinang-melinjo ( Areca catechu- Gnetum gnemon L.)
Gambar 4. Aktivitas penghambatan  -amylase oleh tanin-protein kompleks dari biji  pinang dan  biji  melinjo.
Figure 4.  - amylase inhibition activity by tannin protein complex from Arecanut fruit and Gnetum gnemon seed.
Pinang ( Areca catechu )
Melinjo  ( Gnetum gnemon L.)

## KESIMPULAN
Bahan yang berpotensi sebagai sumber tanin-protein  kompleks,  yakni  biji  pinang yang  diinteraksikan  dengan  biji  melinjo. Tanin-protein  kompleks  ini  memiliki kandungan tanin sebesar 1,77 mg TAE/mL dengan aktivitas antioksidan sebesar 90%, kemampuan  untuk  menghambat  aktivitas  - amylase sebesar  95%  dengan  nilai  IC 50 sebesar 10 mg/ml.

## DAFTAR PUSTAKA
Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the prin-
ciple of dye binding. Analytical Bio- chemistry , 72, 248—254.
Fr utos,  P.;  G.  Hervas;    F.J.  Gir aldez  & A.R. Mantecon (2004). Review. Tanins and  r uminant  nutr ition . Spanish Journal of Agricultural Research, 2,
191—202.
Hadad,  M.;  N.R.  Ah madi;  M.  Her man ; H. Supriadi & A.M. Hasibuan (2007). Teknologi Budidaya dan Pengolahan Hasil  Gambir .  Balai  Penelitian Tanaman Rempah dan Aneka Tanaman
Industri.
Hagerman,  A.E.  (2002). Tanin  Chemistry . Miami University, Oxford, USA.
Hagerman, A.E. & L.G. Butler (1978). Protein precipitation method for the quantita-
Gambar 5. Korelasi  antara  aktivitas  penghambatan  -amylase dan  aktivitas  antioksidan  dari  tanin  protein kompleks  asal  biji  Pinang-biji  Melinjo.
Figure 5. Correlation between  -amylase inhibition activity and antioxidant activity from tannin protein complex derived from Areca catechu-Gnetum gnemon seeds.
120 100 80 60 40 20 0 -20 H a m b a ta n D P P H ( D P P H In h ib it io n ), % Hambatan  - amylase (  -amylase inhibition ), %
y = -0.008x 2 + 1.941x - 1.334 R 2 = 0.980 0 20 40
60 80 100
Firdausi et  al.
tive determination of tannins. Journal of Agricultural and Food Chemistry ,
26, 809—812.
Hopkins, W.G. & N.P.A Huner (2004). Intro- duction  to  Plant  Physiology .  John
Wiley  and  Sons, Inc.  Third  Edition. London.
Islam, M.D.;  N.A. Khatune;   M.I.I.  Waheed
&  M.D.  Haque  (2003).  Larvacidal activity  of  a  new  glucocide,  phenyl ethyl D-glucopiranoside from the stem of  plan t Sida  rhumbifolia Lin n . Pakistan  Journal  of  Biological Science, 6, 73—75.
Jimenez., A.V.; J.W. Arboleda; A. Lo´pez A´ vila & M.F. Rossi-de-Sa´ (2008). Diges- tive  -amylases from Tecia solanivora larvae  (Lepidoptera:  Gelechiidae): response to pH, temperature and plant amylase inhibitors. Bulletin of Ento- mological Research, 98, 575—579.
Kayani,  S.A.;  M.  Ayeesha;  K.H.  Abdul; Achakzai & A. Shahla (2007). Distri- bution  of  secondary  metabolites  in plants of Quetta-Balochistan. Pakistan Journal Botany , 39, 1173—1179.
Kusuma, F.; K. Dewi & F. Enny (2009). Isolasi, Identifikasi, dan Uji Toksisitas Minyak Atsiri Daun Sidaguri (Sida rhombifolia Linn ). Jurusan Kimia FMIPA UNDIP. Semarang.
Makkar, H.P.S.; P. Shiddurajju & K. Becker (2007). Plant Secondary Metabolites . Humana Press. New Jersey.
Matsushita, H.; T. Mio & O. Haruko (2002). Porcine pancreatic  -amylase  shows bin ding  activity  toward  N-lin ked oligosaccharides  of  glycoproteins. The Journal of Biological Chemistry , 277, 4680—4686.
Mcdougall, G.; S. Faina; D. Patricia; S. Pauline;
B. Alison & S. Derek (2003). Differ Polyphenolic  Components  of  Soft Fruit  Inhibit  -Amylase  and  -Glu- cosidase. Scottish  Crop  Research Institute. United Kingdom.
Mehrabadi, M. & A.R. Bandani (2009). Assess- ing of  -amylase activity of midgut in wheat bug Eurygaster Maura. Ameri- can  Journal  of  Applied  Sciences, 6,
478—483.
Miller, J.M.T. (2001). Anti-cariogenic proper- ties of tea ( Camellia sinensis ). Jour- nal  of  Medical  Microbiology, 50, 299—302.
Misnawi & T.Wahyudi (2008). Potential uses of  cocoa  bean  infested  by Cono- pomorpha cramerella for polyphenol extraction. ASEAN Food Journal, 15,
27—34.
Morris; T.R. Carron; M.P Robbin; & K.J. Webb (1993).  Distributions  of  condensed tannins  in flowering  plants  of Lotus corniculatus  var  japonicas an d tannin accumulations by transformed root cultures. Journal of Experimen- tal Botany, 43, 221—231.
Narayanan,  K.  (2004).  Insect  defense:  its impact on microbial control of insect pest. Current Science , 86, 6-12.
Neves, V.A.; E.J. Lourenco & M.A.M. Silva (1997). Effect of tannins on albumin hydrolysis by tripsin. Ciência e Tecno- logia de Alimentos, 17, 208—212.
Obame,  L.C.;  J.  Koudou;  B.S.  Kumulungui;
I.H.N. Bassolé; P. Edou; A.S. Ouattara
& A.S. Traoré (2007). Antioxidant and antimicrobial activities  of Canarium schweinfurthii Engl. Essential oil from Centrafrican Republic. African Journal Biotechnology , 6, 2319—2323.
Pambayun,  R.;  G.  Murdijadi;  S.  Slamet  & R.K. Kapti (2007). Kandungan fenol dan sifat antibakteri dari berbagai ekstrak produk gambir ( Uncaria gambir Roxb.). Majalah  Farmasi  Indonesia ,  18, 141—146.
Payan,  F.  (2004).  Structural  basis  for  the inhibition  of  mammalian  and  insect  - amylase by plant protein inhibitors.
Biochimica et Biophysica Acta, 1696, 171—180.
Ramasoota, J. (2001). Chemical and botanical pesticide  in   Vor th ern   Thailan d. Journal of Health Science , 10, 1—7.
Shahidi, F. & N. Marian (2004). Phenolics in Food  and  Neutraceuticals .  CRC Press. Washington D.C.
Siswoyo, T.A. (2011). Biji melinjo tingkatkan daya tahan. Harian Kompas , 27 Januari 2011.
Suharti, F.M. (2005). Proteksi Protein Daun Lamtoro (Leucaena  leucocephala) Menggunakan  Tanin,  Saponin, Minyak  dan  Pengaruhnya  Terhadap RUDP dan Sintesis Protein Mikroba Rumen. Fakultas Peternakan, Univer- sitas Jendral Soedirman. Purwokerto.
Sulastri, T. (2009). Analisis kadar tanin ekstrak air dan ekstrak ethanol pada biji pinang sirih. Jurnal Chemical , 10, 59—63.
Taiz, L. & E. Zieger (2002). Plant Physiology . Sin auer   Associates.  3 th edition . Sunderland.
Turkmen, N.; Y.S. Velioglu; F. Sari & G. Polat (2007). Effect of extraction condition on measured total polyphenol content and antioxidant and antibacterial activities of black tea. Molecules , 12, 484—496.
Vinayaka, S.; S.P. Swarnalatha;  H.R. Preethi; K.S. Surabhi; R. Prashith & S.J. Sudhar- shan (2009). Studies on in vitro anti- oxidant, antibacterial, and insecticidal activity of methanolic extract of Abrus pulchellus wall  ( Fabaceae ). African Journal of Basic & Applied Sciences , 1, 110—116.
Wahyudi,  T.;  T.R.  Panggabean  &  Pujiyanto (2008). Panduan  Lengkap  Kakao Manajemen  Agribisnis  dari  Hulu hingga  Hilir .  Pen ebar   Swadaya.
Jakarta.
Wang,  J;  H. Liu;  J.  Zhao;  H.  Gao;  L. Zhou; Z. Liu; Y. Chen & P. Sui (2009). Anti- microbial and antioxidant activities of the root bark essential oil of Periploca sepium and its main component 2-Hy- dr oxy-4- Meth oxy-ben zal deh yde. Molecules , 15, 5807—5817.
Wiryadiputra, S. (2003).  Keefektifan  limbah tembakau  sebagai  insektisida  nabati untuk  mengendalikan  hama Helo- pheltis sp.  pada  kakao. Jurnal  Per- lindungan  Tanaman  Indonesia, 9, 35—45.
Wiryadiputra,  S.  (2009). Diagnosis  Hama Utama Tanaman Kakao . Bahan Ajar Program  Pascasarjana  Universitas Jember. Jember.
Xiao, Z.; R. Storms & A. Tsang (2009). A Quan- titative  Starch-iodine  Method  for Measuring  -amylase  and  Gluco- amylase  Activities .  Biotechnology Research Institute. Canada.
*********.