Jurnal Farmasi Galenika ( Galenika Journal of Pharmacy ) 2019; 5 (1): 93 - 100 ISSN : 2442-8744 (electronic) http://jurnal.untad.ac.id/jurnal/index.php/Galenika/index
DOI : 10.22487/j24428744.2019.v5.i1.12036
Analisis  Cemaran  DNA  Tikus  pada  Bakso  Daging  Sapi  yang  Beredar  di Makassar dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)
(Analysis  of  Rat  DNA  Contamination  on  Beef  Meatballs  Circulating  in  Makassar  by Polymerase Chain Reaction (PCR) Method)

## Aminah, Ristieyen Ramadini, Tadjuddin Naid
Fakultas Farmasi,Universitas Muslim Indonesia, Makassar, Indonesia
Article Info: Received: 03 March 2019 in revised form: 23 March 2019 Accepted: 31 March 2019
Available Online: 31 March 2019

## ABSTRACT
Analysis  of  rat  DNA  contamination  in  meatball  meat  circulating  in Makassar  by  PCR  (Polymerase  Chain  Reaction)  method  has  been  carried out. In this study, a polymerase chain reaction method will be developed to analyze the presence of rat meat contamination in beef meatballs. There are three  stages  in  the  PCR  amplification  process  carried  out  with  30  cycles, which  are  95 o C  temperature  denaturation,  51 o C  attachment,  and  72 o C extension. DNA analysis included agarose gel electrophoresis, measurement of concentration and purification, and analysis of  rat  DNA using PCR. The results  of  PCR  amplification  using  mouse-specific  primers  namely  primary ND1 (NADH dehydrogenase 1) showed no bands seen in UV light. So that it can  be  proven  that  beef  meatball  samples  in  the  Makassar  region  did  not contain rat DNA.
Keywords : Rat meat Beef meatballs DNA ND1
Polymerase Chain Reaction
Corresponding Author:
Aminah
FakultasFarmasi Universitas Muslim Indonesia Makassar Indonesia Email: aminah.aminah@umi.ac.id
Copyright © 2019 JFG-UNTAD
This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.

## How to cite (APA 6th Style):
Aminah., Ramadini, R., Naid, T. (2019). Analisis Cemaran DNA Tikus pada Bakso Daging Sapi yang Beredar di Makassar dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Jurnal Farmasi Galenika (Galenika Journal of Pharmacy) , 5(1), 93-100. doi:10.22487/j24428744.2017.v3.i1.12036

## ABSTRAK
Analisis  cemaran  DNA  tikus  pada  daging  bakso  yang  beredar  di  Makassar  dengan  metode  PCR ( Polymerase  Chain  Reaction )  telah  dilakukan.  Pada  penelitian  ini,  akan  dikembangkan  metode polymerase  chain  reaction  untuk  menganalisis  adanya  cemaran  daging  tikus  dalam  bakso  sapi .  Ada tiga  tahapan  dalam  proses  amplifikasi  PCR  yang  dilakukan  dengan  30  siklus,  yaitu  denaturasi  suhu 95 o C,  penempelan  51 o C,  dan  perpanjangan  72 o C.  Analisis  DNA  meliputi  elektroforesis  gel  agarosa, pengukuran  konsentrasi  dan  pemurnian,  serta  analisis  DNA  Tikus  menggunakan  PCR.  Hasil amplifikasi  PCR  menggunakan  primer  spesifik  tikus  yaitu  primer  ND1(  NADH  dehydrogenase  1) menunjukkan tidak ada pita terlihat dalam cahaya UV, sehingga dapat dibuktikan bahwa sampel bakso sapi di wilayah Makassar tidak mengandung DNA tikus .
Kata Kunci : Daging tikus, Bakso sapi, DNA, ND1, Polymerase Chain Reaction .

## PENDAHULUAN
Makanan  adalah  kebutuhan  pokok  manusia  yang secara  langsung  berperan  meningkatkan  kesehatan sehingga  mampu  melakukan  kegiatan  sehari-hari secara  baik.  Untuk  itulah  keamanan  makanan menjadi  sangat  penting  agar  tidak  menimbulkan gangguan  kesehatan.  Tetapi  belakangan  ini  banyak makanan  yang  beredar  di  masyarakat  tidak  terjamin lagi keamanannya (Agustina, 2010).
Identifikasi  spesies  hewan  ditambahkan  ke  produk daging  olahan  adalah  perhatian  konstan,  baik  bagi konsumen  maupun  pihak  yang  berwenang  (Ballin, 2010).  Tujuannya  adalah  untuk  mengotentikasi identitas standar produk yang terkait dengan labelnya yang  benar,  sehingga  melindungi  konsumen  dari kemungkinan  kehadiran  dari  jenis  daging  yang  tidak diketahui  dan  tidak  diinginkan.  Namun  produk daging  adalah  makanan  paling  banyak  tunduk  pada kecurangan  karena  kesulitan  dalam  pengukuran  dan manfaat  ekonomi  pengolahannya  terutama  dalam produk akhir (Arslan et al , 2006).
Metode  yang  kini  terkenal  sangat  akurat,  cepat, mudah digunakan, dan dapat menentukan spesies asal pangan  yakni  metode  Polymerase  Chain  Reaction (PCR).  Selain  itu,  teknik  PCR  ini  dapat  dilakukan meski  sampel  yang  digunakan  berjumlah  sedikit ataupun  berukuran  sangat  kecil.  Deoxyribo  nucleic acid  (DNA)  yang  berada  pada  sampel  kemudian dapat  dilipat  gandakan  jumlahnya  dan  hasilnya dilihat sebagai pita yang jelas (Arslan et al , 2006).
Penggunaan  teknik Polymerase  Chain  Reaction (PCR)    pada  kasus  pemalsuan  pangan  pernah dilakukan  pada  pendeteksian  daging  tikus,  kucing, anjing,  babi,  ayam,  sapi,  domba  dewasa  dan  kuda, baik  dalam  bentuk  olahan  maupun  produk  pangan (Martin et al , 2007).
Polymerase  Chain  Reaction (PCR)  adalah  suatu teknik  sintesis  dan  amplifikasi  DNA  secara  in  vitro. Teknik  ini  pertama  kali  dikembangkan  oleh  Karry Mullis  pada  tahun  1985.  Teknik Polymerase  Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk mengamplifikasi  segmen  DNA  dalam  jumlah  jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Dengan diketemukannya  teknik Polymerase  Chain  Reaction (PCR)  di  samping  juga  teknik-teknik  lain  seperti sekuensing  DNA,  telah  proses Polymerase  Chain Reaction (PCR) melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi  DNA  templat;  (2)  denaturasi  DNA templat;  (3)  penempelan  primer  pada  templat ( annealing ); (4) pemanjangan primer ( extension ) dan (5)  pemantapan  ( post  extension ).  Tahap  (2)  sampai dengan  (4)  merupakan  tahapan  berulang  (siklus),  di mana  pada  setiap  siklus  terjadi  duplikasi  jumlah DNA.  Proses  PCR  secara  umum  berlangsung  dalam tiga tahap, yakni tahap denaturasi, tahap penempelan ( annealing ),  dan  tahap  pemanjangan  ( extension ) (Handoyo et al , 2000).
PCR  memiliki  beberapa  keunggulan,  diantaranya dapat  memperbanyak  DNA  pada  bagian  yang spesifik sesuai yang diharapkan, memiliki sensitivitas tinggi,  dapat  digunakan  untuk  melakukan  pengujian hingga  manipulasi  DNA,  mampu  memberikan  hasil
dalam  waktu  singkat,  dapat  digunakan  untuk mendeteksi  sampel  yang  terkontaminasi  maupun menyeleksi  sampel  negatif,  dapat  mengidentifikasi organisme  secara  mendetail  hingga  tingkat  spesies bahkan  serotipe  yang  bahkan  tidak  dapat  dilakukan menggunakan  sistem  konvensional,  dapat  bekerja pada  materi  genetik  dari  berbagai  sel,  serta  dapat dilakukan  pada  sampel  yang  berupa  campuran kompleks.  Namun  demikian,  PCR  juga  memiliki beberapa  kelemahan,  diantaranya  DNA  sel  bakteri yang  mati  ikut  terdeteksi  pula  (Prayoga et  al ,  2014). Oleh  karena  itu,  metode  PCR  ini  telah  dilakukan untuk  mengidentifikasi  adanya  cemaran  DNA  tikus pada bakso sapi yang beredar di Kota Makassar

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  gel agarose (CBS Scientific), microwave (Panasonic NN- ST324M),  mikropipet,  tube  eppendrotf,  sentrifuge sorvall  legend  micro  17R  (Thermo  Scientific,  USA), translaminator (IVA), neraca analitik (Kern ABT 220 5DM), PCR CFX 96 (Biorad, USA), shaker EFM 60 (OSK, Seiwariko CO,Ltd), spektrofotometer  UV-Vis (Thermo  Scientefic),  vortex  (Ika  Genius  3),  dan waterbath (Memert).
Bahan  yang  digunakan  adalah  daging  sapi,  daging tikus  (Gambar  1)  dan  sampel  bakso  sapi  yang diperoleh  dari  lima  pedagang  di  kota  Makassar. Sampel bakso sapi yang digunakan dapat dilihat pada Gambar  2,  ultrapure  agarosa  (Roche),  aqua bidestillata  steril,  aqua  bebeas  nuclease,  dapar  lisis TNE, dapar pemuat, dapar TE, dapar TBE (Roche), 1 Kb  DNA  ladder  (Vivantis),  etanol  absolut,  etanol 70%,  etidium  bromide  (EtBr),  fenol,  kloroform, proteinase  K  (Roche),  RNAse  (Roche)  dan  Enzim Dream  Taq  Green  PCR  Master  Mix,  Primer mitokondria  gen NDI (forward  primer  Forward  5'- CGG  CAT  CCT  ATT  ACA  ACC  TGC-3')  (reverse primer 5'- CGG CTC CTC GTA AAG CGA A-3').
Gambar 2. Foto sampel (1) Sampel A, (2) Sampel B, (3) Sampel C, (4) Sampel D, dan (5) Sampel E
Primer yang digunakan untuk amplifikasi DNA tikus yaitu  primer  ND1  (NADH  dehydrogenase  1)  dalam Tabel 1.
Tabel 1. Sekuens primer yang digunakan
Primer                         Sekuens Forward                      5'- CGG CAT CCT ATT ACA ACC TGC-3 '
Reverse                      5'- CGG CTC CTC GTA AAG CGA A-3'
(Primer didesain oleh Raharjo et al , 2018)

## Prosedur Kerja Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi  alat  dan  bahan  dengan  cara  membungkus alat-alat,  kemudian  alat-alat  yang  tahan  terhadap pemanasan  disterilkan  pada  oven  pada  suhu  180 0 C selama  2  jam,  sedangkan  alat  yang  tidak  tahan terhadap pemanasan disterilkan pada autoklaf dengan tekanan 1 atm selama 15 menit

## Preparasi sampel jaringan segar
Jaringan/daging  disiapkan  dari  2  spesies  (tikus  dan sapi)  yang  telah  diverifikasi  spesimen  jenisnya. Masing-masing  daging  dicuci  bersih  dengan  air mengalir,  ditiriskan  lalu  dicincang  hingga  halus  dan disimpan pada suhu -20 0 C hingga siap digunakan

## Preparasi sampel bakso sapi
Sampel bakso masing-masing terdiri dari lima produk bakso  sapi    yang  dikumpulkan  di  wilayah  kota Makassar. Tiap sampel sebanyak 0.2 g diambil dari 5 titik  yang  tersebar  pada  sampel.  Selanjutnya dimasukkan  ke  dalam  tabung  2  mL.  Semua  sampel
3
B A
1 2
3 4 5
Gambar 1.  (A) daging tikus , (B) daging sapi
pasaran  diberi  label  dan  disimpan  pada  suhu  -20 0 C hingga digunakan untuk penyiapan isolasi DNA.
Tahapan Isolasi DNA (Sambrook et al . 1989)

## Isolasi DNA jaringan hewan
Jaringan hewan sebanyak 0,2 g dimasukkan ke dalam lumpang,  ditambahkan  0,5  mL  dapar  lisis,  dan digerus  hingga  halus.  Kemudian,  jaringan  hewan dimasukkan ke dalam tabung 2 mL, ditambahkan 0,5 mL  dapar  lisis  lalu  divortex  selama  ±  4  menit. Setelah  itu,  jaringan  hewan  ditambahkan  15  µL Proteinase-K  (20  µg/  µL)  divortex  ±  1  menit, kemudian  diinkubasi  dalam waterbath pada  suhu 60 0 C  selama  1  jam  (setiap  15  menit  dibolak-balik). Selanjutnya jaringan hewan disentrifus menggunakan mikrosentrifus  dengan  kecepatan  13.000  rpm  selama 5  menit,  lalu  supernatan  dipindahkan  ke  tube2  mL baru.  Supernatan  ditambahkan  fenol  dingin  1:1, kemudian  dishaker  cepat  ±  30  menit.  Selanjutnya, supernatan  disentrifus  menggunakan  mikrosentrifus dengan  kecepatan  13.000  rpm  selama  10  menit,  lalu supernatan  dipindahkan  ke  tube  2  mL  baru. Kemudian Supernatan ditambahkan kloroform dingin 1:1,  lalu  dishaker  lambat  ±  15  menit.  Selanjutnya supernatan  disentifus  menggunakan  sentrifus  dengan kecepatan  13.000  rpm  selama  10  menit  lalu dipindahkan  ke  tube  eppendorf  1,5  mL  baru. Kemudian  supernatan  ditambahkan  etanol  absolute dingin  1:2,  dibolak-balik  perlahan  hingga  terbentuk benang, dan apabila tidak terbentuk benang, disimpan pada suhu -80 o C selama 1 jam. Supernatan kemudian disentrifus  menggunakan  mikrosentrifus  dengan kecepatan  13.000  rpm  selama  15  menit,  supernatan dibuang  dan  endapan  ditambahkan  0,5  mL  etanol 70%.  Kemudian  endapan  disentrifus  menggunakan mikrosentrifus  dengan  kecepatan  13.000  rpm  selama 10  menit,  supernatan  dibuang  dan endapan dikeringkan  ±  2  jam.  Setelah  endapan  kering, ditambahkan  40  µL  dapar  TE,  disimpan  pada  suhu 4 o C semalam.
Kemudian endapan kering ditambahkan  3  µL  RNase  (20  µg/  µL),  diinkubasi dalam waterbath suhu  37 o C  selama  1  jam.  Lalu disimpan pada suhu -20 o C sampai siap digunakan.

## Isolasi DNA bakso sapi
Jaringan  sebanyak  0,2  g  dimasukkan  ke  dalam lumpang,  ditambahkan  0,5  mL  dapar  lisis,  dan digerus  hingga  halus.  Kemudian,    jaringan  hewan dimasukkan ke dalam tabung 2 mL, ditambahkan 0,5 mL  dapar  lisis  lalu  divortex  selama  ±  4  menit. Setelah  itu,  jaringan  hewan  ditambahkan  15  µL Proteinase-K  (20  µg/  µL)  divortex  ±  1  menit,
kemudian  diinkubasi  dalam waterbath pada  suhu 60 0 C  selama  1  jam  (setiap  15  menit  dibolak-balik). Selanjutnya jaringan hewan disentrifus menggunakan mikrosentrifus  dengan  kecepatan  13.000  rpm  selama 5  menit,  lalu  supernatan  dipindahkan  ke  tube  2  mL baru.  Supernatan  ditambahkan  fenol  dingin  1:1, kemudian  dishaker  cepat  ±  30  menit.  Selanjutnya, supernatan  disentrifus  menggunakan  mikrosentrifus dengan  kecepatan  13.000  rpm  selama  10  menit,  lalu supernatan  dipindahkan  ke  tube  2  mL  baru. Kemudian Supernatan ditambahkan kloroform dingin 1:1,  lalu  dishaker  lambat  ±  15  menit.  Selanjutnya supernatan  disentifus  menggunakan  sentrifus  dengan kecepatan  13.000  rpm  selama  10  menit  lalu dipindahkan  ke  tube  eppendorf  1,5  mL  baru. Kemudian  supernatan  ditambahkan  etanol  absolute dingin  1:2,  dibolak-balik  perlahan  hingga  terbentuk benang, dan apabila tidak terbentuk benang, disimpan pada suhu -80 o C selama 1 jam. Supernatan kemudian disentrifus  menggunakan  mikrosentrifus  dengan kecepatan  13.000  rpm  selama  15  menit,  supernatan dibuang  dan  endapan  ditambahkan  0,5  mL  etanol 70%.  Kemudian  endapan  disentrifus  menggunakan mikrosentrifus  dengan  kecepatan  13.000  rpm  selama 10  menit,  supernatan  dibuang  dan endapan dikeringkan  ±  2  jam.  Setelah  endapan  kering, ditambahkan  40  µL  dapar  TE,  disimpan  pada  suhu 4 o C semalam. Kemudian endapan kering ditambahkan  3  µL  RNase  (20  µg/  µL),  diinkubasi dalam waterbath suhu  37 o C  selama  1  jam.  Lalu disimpan pada suhu -20 o C sampai siap digunakan .
Analisis DNA (Sambrook et al . 1989)

## Elektroforesis gel agarosa
Isolasi DNA sebanyak 10 µL yang telah ditambahkan 2  µL  dapar  pemuat,  dianalisis  secara  elektroforesis pada gel agarosa 0,8% menggunakan dapar TBE dan telah  diwarnai  dengan  etidium  bromide  (untuk  1  L larutan dapar terdiri dari 10,8 g Tris base, 5,5 g asam borat,  4  mL  EDTA  0,5  M  pH  8)  dengan  arus  90  V selama  60  menit.  Gel  agarosa  hasil  elektroforesis tersebut  divisualisasi  dengan  UV-transluminator  dan gambar didokumentasikan.

## Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA
DNA  sebanyak  2  µL  ditambahkan  998  µL aqua bidestillata  steril (dalam  tube),  dihomogenkan. Kemudian  diukur  dengan  spektrofotometer  UV  pada panjang  gelombang  260  dan  280nm.  Konsentrasi DNA hasil isolasi dihitung dari  A 260 dikalikan faktor pengencerannya  dan konstanta  serapan  DNA (serapan  DNA  murni  pada  panjang  gelombang  260
nm dengan 1 absorbansi unit mengandung 50 µg/mL DNA)
Analisis DNA Tikus dengan PCR Amplifikasi dengan PCR dilakukan dengan penggunaan campuran reaksi 20 µL yang  terdiri dari 2  µL  (50  ng)  isolate  DNA  ,  1  µL  masing-masing primer forward dan reverse (500 nm), dan 6 µL aqua bebas  nuclease .  Pengujian  mengikuti  kondisi  suhu 95 o C  untuk  aktivasi  enzim/  denaturasi  awal, selanjutnya diikuti dengan 30 siklus ; 95 o C selama 5 detik  (tahapan  denaturasi),  62 o C  selama  10  detik (tahap  hibridisasi/ annealing ),  dan  72 o C  selama  10 detik (tahap lanjutan/ extension ).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Polymerase  Chain  Reaction (PCR)  adalah  adalah suatu  metode  enzimatis  untuk  amplifikasi  DNA dengan  cara  in  vitro.  Pada  proses  PCR  diperlukan beberapa  komponen  utama,  yaitu  DNA  cetakan, Oligonukleotida primer, Deoksiribonukelotida trifosfat  (dNTP),  Enzim  DNA  Polimerase,  dan Komponen  pendukung  lain  adalah  senyawa  buffer. Metode  PCR  ( Polymerase  Chain  Reaction )  sekarang sudah  umum  dan  sering  digunakan  teknik  yang sangat  diperlukan  yang  digunakan  dalam  medis  dan laboratorium  penelitian  biologi  untuk  berbagai aplikasi.  Reaksi  berantai  polimerase  adalah  teknik kuat  yang  dengan  cepat  menjadi  satu  teknik  yang paling  banyak  digunakan  dalam  molekul  biologi karena cepat, dansederhana (Gaurav, 2012).
Pada  produk  makanan  olahan  tertentu  terbuat  dari daging,  akhir  -akhir  ini  tidak  jarang  ditayangkan  di media masa elektronik akan adanya campuran produk makanan  olahan  untuk  konsumsi  manusia  yang tercampur  dengan  daging  dari  jenis  (spesies)  lain selain  bahan  utamanya  berupa  daging  sapi  misalnya. Campuran tersebut dapat berupa daging tikus.
Pendeteksian  DNA  daging  tikus  pada  sampel  bakso sapi  yang  beredar  di  kota  Makassar  dengan menggunakan  daging  tikus  sebagai  kontrol  positif dan  bakso  sapi  sebagai  kontrol  negatif  serta menggunakan 5 jenis bakso sapi yang berada di kota Makassar  dengan  merek  yang  berbeda  yaitu  bakso dewi sinta, bakso mba nur, bakso tanpa  nama, bakso nikmat  dan  bakso  joko.  Pendeteksian  dilakukan dengan  menggunakan  metode  PCR  ( Polymerase Chain Reaction ). Metode analisis pencemaran daging
tikus pada produk makanan bakso dan sampel daging telah dilakukan dengan analisis molekuler menggunakan  teknik  PCR  ( Polymerase  Chain Reaction ).
Tahap pertama isolasi DNA dilakukan menggunakan lysis  buffer, bahan lysis  buffer terdiri  dari  Tris  HCl pH  8,  EDTA  pH  8,  NaCl  dan  SDS,  penghancuran membran  sel  (lisis)  dengan  menambahkan  detergen untuk membuat  sel menjadi rusak dan mengeluarkan komponen–  komponennya  yaitu  protein,  lipid, karbohidrat,  DNA  dan  RNA  ,  detergen  yang  biasa digunakan yaitu SDS. SDS ( Sodium Dodecyl Sulfate ) adalah  detergen  yang  mempunyai  muatan  negatif yang  sangat  besar  sehingga  SDS  akan  mengikat muatan  positif  dari  protein  dan  dengan  demikian mengakibatkan  pergerakan  protein  kearah  elektroda positif  .  Tris  adalah  dapar  yang  di  gunakan  untuk menjaga kestabilan pH, EDTA ( Etylene diamine tetra acetic acid) berfungsi sebagai penghelat menyebabkan  membran  sel  tidak  stabil  karena mengandung  ion  pengkelat  Mg +2 yang  di  kombinasi dengan  enzim  pendegradasi  membrane  sel  yaitu enzim  lisozim,  dan  NaCl  berfungsi  membantu pengendapan  protein  karena  adanya  fenomena salting-out.
Sampel diiinkubasi dalam waterbath pada suhu 55ºC selama  1  jam  untuk  menginaktifasi  enzim  yang mendegradasi  DNA.  Proses  degradasi  protein diperlukan kondisi yang optimal pada suhu 50 - 55ºC dan ditambahkan proteinase K sebagai reagen pelisis supaya  komponen  DNA  dalam  sitoplasma  sel  bisa keluar dan diisolasi. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi.  Prinsip  utama  dari  sentrifugasi  adalah memisahkan  substansi  berdasarkan  berat  jenis molekul sehingga di peroleh DNA dengan kemurnian yang cukup tinggi dan dapat dilihat dari penampakan hasil  elektroforesis  yang  baik.  Pada  tahap  purifikasi supernatan  dari  hasil  sentrifuge  ditambahkan  fenol dingin  (1:1)  untuk  mengendapkan  komponen  protein lain yang tidak dikehendaki. Ditambahkan kloroform karena  kloroform  merupakan  pelarut  organik  yang dapat  mendenaturasi  dan  memisahkan  kontaminasi protein.  Tahap  dengan  menggunakan  etanol  70% untuk  membersihkan  DNA  dari  zat  –  zat  pengotor. Ditambahkan  RNase  karena  RNase  merupakan endoribonuklease  yang  secara  khusus  mendegradasi C dan U pada untai tunggal RNA. RNase memotong rantai  fosfodiester  antara  5’-  ribosa  pada  nukleotida dan  kelompok  fosfat  pada  3’-  ribosa  pirimidin  yang saling berdekatan.
Hasil isolasi kemudiaan di analisis dengan menggunakan  elektroforesis. Elektroforesis  pada dasarnya bekerja berdasarkan migrasi atau perpindahan partikel-partikel bermuatan dalam lingkungan  yang  memiliki  medan  listrik  dan kemudian  terpisahkan oleh  gel elektroforesis. Semua molekul  atau  fragmen  DNA  bermuatan  negatif, sehingga fragmen DNA akan bergerak menuju kutub positif (anoda) dengan perpindahan yang sama dalam medan listrik.
Dalam  pembuatan  gel  agarosa  di  tambahkan  dengan etidium bromide yang berfungsi untuk visualisasi gel. Menurut  Gaffar  (2007) etidium  bromide akan  masuk di  antara  ikatan  hidrogen  pada  DNA,  sehingga  pita fragmen  DNA  akan  kelihatan  dibawah  lampu  UV. Gel  agarosa  yang  telah  memadat  diberi  larutan  TBE buffer  1x  hingga  terendam.  Kemudian  dilakukan proses  loading  sampel  ke  dalam  sumur-sumur  yang terdapat pada gel dan dilakukan elektroforesis. Setelah  proses  elektroforesis  selesai,  gel  agarosa diamati dibawah sinar ultraviolet yang akan terbentuk pita – pita berwarna kuning-merah.
Gambar 3. Hasil elektroforesis DNA daging sapi segar (1)
Gambar 4. Hasil elektroforesis sampel bakso Sapi
Setelah dilakukan elektroforesis selanjutnya dilakukan  pengukuran  konsentrasi  dan  kemurniaan
dengan  menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis dengan  menggunakan  panjang  gelombang  A 260 dan A 280 .  Panjang  gelombang  260  nm  digunakan  dalam penelitian  ini,  karena  pada  panjang  gelombang tersebut  daya  serapan  sinar  oleh  nukleotida maksimal.  Sedangkan  penyerapan  maksimal  oleh protein  dicapai  pada  panjang  gelombang  280  nm (Tenriulo et al , 2001). Hasil pengujian menunjukkan adanya  DNA  daging  sapi  pada  masing-masing sampel bakso sapi (Gambar 3 dan 4).
Tabel  2 . Hasil  uji  kuantitatif  spektrofotometer  UV-

## VIS isolat DNA daging segar
NO. Sampel     Kemurnian(A 260 /A 280 ) Konsentrasi (µg/mL) 1   Sapi                2,066                            775
2   Tikus              1,594                          2750
Tabel  3. hasil  uji  kuantitatif  spektrofotometer  UV- VIS isolat sampel bakso sapi
NO.  Kode Isolat   Kemurnian(A 260 /A 280 )     Konsentrasi (µg/mL)
1            F 9 2                           100 2            E 7 1.909 525 3 I 5 1.658 1.700 4           G 10 1.705 725 5           H 10 1.5                          675
Pada  tabel  2  sampel  daging  sapi  segar  memiliki konsentrasi 775  µg/mL  dan  tikus memiliki konsentrasi  2750  µg/mL.  Pada  tabel  3  masing  – masing sampel bakso sapi yang di beli dari berbagai pasar  tradisional  berkisaran  konsentrasi  100-1700 µg/mL,  sedangkan  untuk  nilai  kemurnian  yang diperoleh  dari  masing  –  masing  sampel  yaitu  1.5-2. Sampel  di  bawah  nilai  kemurnian  1,8,  masing  – masing  ada  3  sampel  yaitu  sampel  H 10 1.5,  sampel G 10 1.705,  dan  sampel  I 5 1.658  yang  artinya terkandung  zat  –  zat  pengotor  seperti  protein  dan fenol.
Proses  amplifikasi  DNA  mitokondria  menggunakan alat Polymerse Chain Reaction (PCR) . Pada MtDNA mempunyai  jumlah  cetakan  yang  tinggi  yaitu  sekitar 1000-10000  cetakan,  sehingga  mtDNA  dapat digunakan  untuk  analisis  sampel  dengan  walaupun jumlah DNA yang sangat terbatas. Untuk melakukan proses  PCR  ( Polymerase  Chain  Reaction )  masing  – masing  disiapkan  campuran  reaksi  total  PCR sebanyak 20 µL yang terdiri dari ddH 2 O 6 µL, enzim dream  Taq  green  PCR  master  mix 10  µL,  masing  –
Keterangan: (1) Bakso Nikmat (E 7 ), (2) Bakso Tanpa Nama (I 5 ) , (3) Bakso Joko (G 10 ), (4) Bakso Mba Nur (F 9 ), (5) Bakso Dewi Sinta (H 10 ).
masing 1 µL primer forward dan reverse , serta DNA sampel 2 µL masukkan kedalam tabung effendorf lalu di PCR. Pada proses ini amplifikasi dilakukan dengan 30  siklus  karena  dapat  menghasilkan  amplicon  yang lebih jelas dan tebal. Ada tiga tahapan penting dalam proses  PCR  yang  selalu  terulang  dalam  30  siklus yang  pertama  denaturasi, annealing (penempelan primer), extention (pemanjangan primer). Pada tahap denaturasi  terjadi  proses  pembukaan  DNA  untai ganda  menjadi  DNA  untai  tunggal  biasanya berlangsung selama 3 menit pada suhu 95ºC, adapun waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas  enzim Taq  green  polymerase .  Enzim  DNA polimerase,  yaitu  enzim  yang  melakukan  katalisis reaksi  sintesis  rantai DNA. Enzim ini tahan terhadap pemanasan  berulang-ulang  yang  akan  membantu melepaskan  ikatan  primer  yang  tidak  tepat  dan meluruskan  wilayah  yang  mempunyai  struktur sekunder.  Tahap  kedua  annealing  (penempelan primer),  primer  yang  di  gunakan  yaitu  primer  ND1 karena  dapat    mendeteksi  kontaminasi  daging  tikus pada  daging  lain  sampai  level  kontaminasi  1%. Waktu  annealing  yang  biasa  digunakan  dalam  PCR adalah  30  –  45  detik.  Semakin  panjang  ukuran primer,  semakin  tinggi  temperaturnya.  Temperatur penempelan  DNA  yang  digunakan  adalah  51ºC karena  suhu  annealing  harus  5ºC  di  bawah tm (melting  temperature) yang  sebenarnya  pada  primer yang  digunakan.  Tahap  yang  terakhir extention (pemanjangan  primer)  selama  tahap  ini  enzim green Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang  DNA  primer  dari  ujung  3’. Kecepatan  penyusunan  nukleotida  oleh  enzim tersebut  pada  suhu  72ºC  diperkirakan  35  –  100 nukleotida/detik,  bergantung  pada  buffer,  pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target.  Dengan demikian  untuk  produk  PCR  dengan  panjang  2000 pasang  basa,  waktu  1  menit  sudah  lebih  dari  cukup untuk  tahap  perpanjangan  primer  ini.  Biasanya  di akhir  siklus PCR waktu  yang digunakan untuk tahap ini  diperpanjang  sampai  5  menit  sehingga  seluruh produk  PCR  diharapkan  terbentuk  DNA  untaian ganda.
Produk  PCR  ( Polymerase  Chain  Reaction )  dapat diidentifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan  elektroforesis  gel  agarosa.  Pada gambar  5,  daging  tikus  terdapat  pita  yang  tebal  dan jelas  pada  hasil  elektroforesis  setelah  di  PCR ( Polymerase Chain Reaction ). Sedangkan tidak
Gambar 5. Hasil elektroforesis daging tikus setelah di PCR ( Polymerase Chain Reaction ) menggunakan primer ND1
terlihat pita yang muncul pada bakso sapi yang tidak berlogo  MUI  yaitu  sampel  A,  sampel  B,  sampel  C, sampel  D,  sampel  E.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa primer  ND1  (NADH  dehydrogenase  1)  yang digunakan  dapat  mengamplifikasi  DNA  daging  tikus yang terdapat pada pembanding maupun sampel yang telah  diujikan.  Tidak  adanya  pita  yang  terlihat  pada kelima  sampel  bakso  sapi  menunjukkan  bahwa  dari sampel  tersebut  tidak  mengandung  DNA  daging tikus,  sehingga  layak  di  konsumsi  khususnya  bagi masyarakat muslim.

## KESIMPULAN
Primer  ND1  (NADH  hydrogenase  1)  dapat digunakan  untuk  menganalisis  cemaran  DNA  tikus pada  makanan  yang  berbahan  daging.  Dari  hasil penelitiaan  yang  telah  dilakukan  dapat  diberikan saran perlu adanya monitoring  terhadap produk  asal hewan  dan  turunannya  terhadap  kemungkinan adanya kasus-kasus pencampuran daging yang tidak lazim dikonsumsi.

## DAFTAR PUSTAKA
Agustina,  T.  (2010).  Kontaminasi  logam  berat  pada makanan  dan  dampaknya  pada  kesehatan, Teknobuga ,  2(2), 53-65.
Arslan,  A.,  O.  I.  Ilhak,  and  Calicioglu,  M.  (2006). Effect  of  method  of  cooking  on  identification of heat processed beef using polymerase chain reaction  (PCR)  technique. Meat  Science .  72, 326-330.
Ballin, N.Z. (2010). Authentication of meat and meat products. Meat Science , 3, 577-587.
DNA Tikus
Sampel
Gaffar,  S.  (2007).  Buku  Ajar  Bioteknologi  Molekul , FMIPA UNPAD, Bandung
Gaurav,  S.  (2012).  Polymerase  Chain  Reaction,
International  Journal  of  Pharmacological
Research, 2 (3), 98.
Handoyo,  D., & Rudiretna, A. (2000). Prinsip umum dan  pelaksanaan  polymerase  chain  reaction (PCR)  [general  principles  and  implementation of  polymerase  chain  reaction], Unitas , 9( 1), 17-29.
Martín  I, García  T, Fajardo  V, Rojas  M, Hernández PE, González  I, Martín  R.  (2007).  Technical Note  :  Detection  of  Cat,  Dog,  and  Rat  or Mouse  Tissues  in  Food  and  Animal  Feed Using  Spesies-Specific  Polymerase  Chain reaction, J Anim Sci . 85(10), 2734-2739
Prayoga,  W.,  &  Wardani,  A.K.  (2014).  Polymerase
Chain  Reaction  Untuk  Deteksi Salmonella  sp ,
Kajian Pustaka , Jurnal Pangandan Agroindustri , 3( 2), 483-488.
Sambrook,  J.,  &  Russell,  D.W.  (1989). Molecular Cloning:  A  Laboratory  Manual  3rd  edition,
New  York,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory
Press.
Raharjo, T., & Nuryanti,  I., Patria, F.P., & Swasono, R. (2018). Mitochondrial ND-1 gene-specific primer polymerase chain reaction to determine  mice  contamination  in  meatball. International  Food  Research  Journal ,  25,
638-642.
Tenriulo, A., Suryati, E., Parenrengi, A., & Rosmiati.
(2001).  Ekstraksi  DNA  Rumput  Laut
Rappaphycus alvarezil dengan metode  Fenol Kloroform  , Marina  Chimica  Acta, 2(2),  6- 10.