Jurnal Ilmu Produksi dan Teknologi Hasil Peternakan
ISSN 2303-2227  eISSN 2615-594X Accredited by National Journal Accreditation No. 30/E/KPT/2019
DOI: https://doi.org/10.29244/jipthp.10.2.91-97
Available online at https://journal.ipb.ac.id/index.php/ipthp/index
Desain Primer Gen Virulensi invA untuk Identifikasi dan Sekuensing Salmonella pada Sampel Karkas Ayam
Primary Design of invA Virulence Gene for Identification and Sequencing of Salmonella in Chicken Carcass Samples
R. P. Melati 1 , S. Nurjanah 1,2* , & W. P. Rahayu 1,2 1 Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor
2 Southeast Asian Food and Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center ,
Institut Pertanian Bogor
Kampus IPB Darmaga Bogor 16680, Indonesia *Corresponding author: sity_nr@apps.ipb.ac.id
(Received 03-02-2022; Revised 09-03-2022; Accepted 31-03-2022)

## ABSTRACT
Identification and sequencing of Salmonella require a specific primer as well as a virulence marker. Invasion gene ( invA ) is a gene found in all types of Salmonella , specific to Salmonella , and has a low mutation rate so that it can be used as a target gene for Salmonella identification. This study aimed to design a primer of invA gene of Salmonella spp. with long amplicons, has broad serovar coverage, and get an optimum PCR condition. Primers were designed and checked its specificity in silico using Primer-BLAST  and  then  selected.  Selected  primer  was  evaluated  for  annealing  temperature  and primer concentration. Based on the sequential selection, it was obtained a set of invA gene primer with forwarding sequences GCCGGTGAAATTATCGCCAC (started at base 297) and reverses sequences CTCGTAATTCGCCGCCATTG  (started at base 1763). Based on Primer-BLAST analysis, the primer gave an amplicon size of 1486 bp, has annealing temperature of 58 °C, capable of detecting at least 110 Salmonella serovars, capable to detect Salmonella contamination in chickens, and unable to detect the presence of Klebsiella sp ., Citrobacter sp ., Serratia sp ., Hafnia sp ., and E. coli . This primer can detect Salmonella very well with annealing temperature of 58 o C and primer concentration of 1.2 µM.
Keywords: chicken, invA, PCR, primer, Salmonella

## ABSTRAK
Identifikasi  dan  sekuensing Salmonella memerlukan  primer  spesifik  dan  sekaligus  sebagai  penanda virulensi. Gen invasi ( invA ) merupakan gen yang terdapat pada semua jenis Salmonella , spesifik terhadap Salmonella , serta memiliki laju mutasi yang rendah sehingga dapat dijadikan gen target untuk identifikasi Salmonella . Penelitian ini bertujuan untuk mendesain primer gen invA Salmonella spp . dengan amplikon panjang,  mempunyai  coverage  serovar  yang  luas  serta  mendapatkan  kondisi  PCR  optimal.  Primer didesain, dicek spesifisitasnya secara in silico menggunakan program Primer-BLAST serta diseleksi. Primer terpilih dievaluasi suhu annealing dan konsentrasi primer. Berdasarkan seleksi bertahap diperoleh 1  pasang  primer  spesifik  gen invA , dengan urutan basa forward GCCGGTGAAATTATCGCCAC (dimulai pada basa ke-297) dan urutan basa reverse CTCGTAATTCGCCGCCATTG (dimulai pada basa ke-1763). Berdasarkan hasil Primer-BLAST, primer tersebut memberikan ukuran amplikon sebesar 1486 bp, memiliki suhu annealing 58 °C, mampu mendeteksi setidaknya 110 serovar Salmonella , mampu mendeteksi cemaran Salmonella pada ayam, serta tidak dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan Klebsiella sp. , Citrobacter sp ., Serratia sp ., Hafnia sp ., dan E. coli . Primer tersebut dapat mendeteksi Salmonella dengan baik pada suhu annealing 58 °C dan konsentrasi primer sebesar 1.2 µM.
Kata kunci: ayam, invA, PCR, primer, Salmonella

## PENDAHULUAN
Daging ayam merupakan sumber protein hewani yang paling banyak dikonsumsi di Indonesia (Kementan 2020). Salah satu cemaran patogen yang sering ditemukan pada karkas ayam adalah Salmonella spp. Cemaran Salmonella yang berasal dari ayam mampu menyebabkan Non-Typhoidal Salmonellosis (NTS) pada manusia (Eng et al. 2015). Menurut CDC (2021), Salmonella diestimasi menyebabkan 1.350.000 kasus infeksi, 26.500 orang dirawat di rumah sakit, dan 420 orang meninggal di Amerika Serikat setiap tahunnya. Estimasi biaya akibat penyakit yang disebabkan oleh NTS setiap tahunnya di Amerika Serikat mencapai US$ 3.309.000. Biaya tersebut mencakup estimasi biaya perawatan, kerugian akibat kematian dini, dan hilangnya produktivitas penderita infeksi. Biaya ini merupakan biaya yang paling tinggi jika dibandingkan dengan biaya akibat infeksi bakteri patogen lainnya (Hoffmann et al. 2012). Identifikasi Salmonella pada sampel dapat dilakukan dengan pendekatan molekuler. Pendekatan ini mempercepat perolehan  hasil  identifikasi  serta  lebih  sensitif  sehingga mampu membedakan berbagai jenis Salmonella dengan lebih baik. Salah satu teknik yang populer adalah dengan melakukan sekuensing DNA dari isolat Salmonella yang berasal dari karkas ayam. Hasil sekuensing isolat Salmonella kemudian dapat dibandingkan dengan data sekuen Salmonella yang terdapat pada pusat data yang salah satunya adalah GenBank pada  laman  NCBI.  Identifikasi dilakukan berdasarkan kesamaan sekuen gen, sehingga apabila terdapat perbedaan gen akibat mutasi, maka hasil identifikasi  juga  akan  berbeda.  Untuk  dapat  mendeteksi sebanyak mungkin mutasi gen yang ada, dibutuhkan sekuen gen yang selengkap mungkin. Hal ini dapat dilakukan dengan melakukan sekuensing whole  genome  sequencing (WGS) (Franco-Duarte et al. 2019). Namun WGS membutuhkan biaya yang tinggi dan waktu pengerjaan yang lebih lama. Oleh sebab itu, dipilih sekuen gen tertentu.
Sekuen gen yang umum digunakan untuk identifikasi organisme adalah 16s rRNA dengan panjang sekitar 1500 bp. Namun, sekuen gen ini hanya dapat membedakan dengan baik hingga tingkat spesies. Maka dipilih sekuen gen lain yang terdapat pada semua jenis Salmonella namun bersifat spesifik agar gen tersebut dapat mendeteksi berbagai jenis Salmonella namun tidak akan mendeteksi gen mikroba lainnya, memiliki laju mutasi yang rendah sehingga tidak terdapat kesalahan homoplas akibat adanya pergantian gen kembali (contohnya basa nukleotida A yang berubah menjadi T kemudian berubah kembali menjadi A), serta umum digunakan sehingga telah banyak data yang tersedia tentang gen tersebut di pusat data. Gen yang memenuhi kriteria tersebut adalah gen invA (Lilic et al. 2010). Namun, ketersediaan primer dengan target gen invA dengan amplikon panjang (lebih dari 1000 bp, seperti 16S rRNA) dengan spesifikasi yang baik sulit ditemukan. Oleh karena itu dibutuhkan desain primer baru dengan spesifikasi yang baik dan dapat mengamplifikasi gen invA dengan amplikon yang panjang. Penelitian ini bertujuan untuk mendesain primer gen invA Salmonella spp. dengan amplikon panjang,
mempunyai coverage serovar yang luas serta melakukan optimasi kondisi PCR.

## MATERI DAN METODE
Materi Sampel yang digunakan adalah kultur murni Salmonella Typhimurium (ATCC 14028) dari Laboratorium Mikrobiologi SEAFAST Center, IPB Bogor dan isolat Salmonella spp. asal karkas ayam.
Metode Desain Primer dengan Analisis In Silico Sekuen gen yang digunakan untuk mendesain primer didapatkan dari GenBank pada laman NCBI (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/). Sekuen gen yang digunakan sebagai template dicari pada GenBank dari NCBI dengan kata kunci ‘ invA ’ dan ‘ Salmonella ’. Sekuen gen invA dari S . Typhimurium (kode aksesi M90846.1) dipilih. Primer didesain dan dianalisis menggunakan program Primer- BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Primer dicek spesifisitasnya secara in silico menggunakan BLAST  pada  laman  NCBI.    Pengecekan  spesifisitas dilakukan dengan membuka laman https://www.ncbi.nlm. nih.gov/tools/primer-blast/, menyalin primer pada kolom ‘ use my own forward/reverse primer’ , kemudian melakukan klik ‘ Get  primer’ .  Spesifisitas  dicek  juga    untuk  bakteri Klebsiella sp ., Citrobacter sp ., Serratia sp ., Hafnia sp ., dan E. coli yang memiliki tingkat kemiripan sekuen gen yang tinggi dengan sekuen gen invA pada Salmonella spp. dengan memasukkan nama bakteri-bakteri tersebut pada kolom ‘ Organism’ (Resendiz-Nava et al. 2019). Pengecekan start dan stop point primer pada target gen dilakukan menggunakan program Primer-BLAST pada laman NCBI. Target gen yang digunakan adalah gen invA Salmonella Typhimurium strain Egypt/poultry/2014 (kode aksesi KR185982.1) yang merupakan sekuen gen yang didapat dari hasil penelitian El-Sebay et al. (2017) dan gen invA Salmonella Typhimurium (kode aksesi M90846.1) yang merupakan target gen yang digunakan pada saat mendesain primer. Hasil tersebut kemudian dibandingkan dengan hasil cek start dan stop point primer pada target gen yang dilakukan menggunakan primer dari Rahn et al. (1992) yang sering dipakai pada penelitian deteksi Salmonella menggunakan PCR.
Amplifikasi Ekstrak DNA Isolat Salmonella dengan invA Sebanyak 1 ose isolat Salmonella diinokulasi ke dalam 5 mL BPW kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C. DNA sampel kemudian diekstrak menggunakan Presto™ Mini gDNA Bacteria Kit dari Geneaid. Seluruh proses sentrifus dilakukan dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu ruang (30 ° C). Sebanyak 2 mL isolat uji yang telah disegarkan dipindahkan ke tabung mikrosentifus 2 mL. Sampel kemudian disiapkan sehingga terjadi lisis pada sel bakteri dengan larutan GT buffer , Proteinase K, GB buffer , dan RNAse A. Setelah itu, proses ekstraksi selanjutnya dibantu dengan membran GD column. DNA kemudian dilarutkan dengan larutan etanol absolut sehingga DNA dapat terikat pada membran dan terpisah dengan
Jurnal Ilmu Produksi dan Teknologi Hasil  Peternakan 10 (2): 91-97
Tabel 1. Kondisi running PCR (Wulan et al . 2021) Tahap Suhu ( o C) Waktu (menit) Jumlah siklus Pra denaturasi 95 3 1 Denaturasi 95 1 30 Annealing 55, 55.6, 56.6, 58, 59.4, 60.6, 62, 63.3, 64.3, 65 1 Ekstensi 72 1.5 Ekstensi akhir 72 5 1 Tabel 2. Komposisi reagen PCR (Promega 2021) Reagen Konsentrasi  Konsentrasi Volume (µL) awal akhir Master mix 2 x 1 x 15 Primer forward - Optimasi suhu annealing 10 µM 0.4 µM 1.2 - Sekuensing 10 µM 1.2 µM 3.6 Primer reverse - Optimasi suhu annealing 10 µM 0.4 µM 1.2 - Sekuensing 10 µM 1.2 µM 3.6 Template DNA * Min. 50 ng * NFW - - * Total 30 Keterangan: * = disesuaikan dengan konsentrasi template DNA yang didapatkan
kontaminan yang larut etanol yang terikat pada supernatan. Larutan W1 buffer dan larutan wash  buffer ditambahkan untuk memisahkan DNA dengan kontaminan lainnya. Larutan elution buffer ditambahkan untuk mengikat DNA. Hasil yang didapat berupa ekstrak DNA yang terdapat pada supernatan hasil pemisahan.Ekstrak DNA diukur kemurnian serta konsentrasinya menggunakan NanoDrop di IPB Culture Collection (IPBCC).
Optimasi Kondisi PCR dengan Primer InvA Amplifikasi  segmen  DNA  dari  isolat  uji  dilakukan menggunakan metode PCR. Terdapat dua alat PCR yang digunakan, yakni PCR Eppendorf Mastercycler® X50 untuk optimasi suhu annealing primer dan untuk yang selain optimasi suhu annealing menggunakan Applied Biosystem Thermal Cycler 2720. Kondisi running PCR ditujukkan pada Tabel 1 dan komposisi reagen yang ditunjukkan pada Tabel 2.
Suhu annealing yang  digunakan  untuk  amplifikasi gen invA merupakan gradien dari Tm primer ± 5 °C. Komposisi  reagen  yang  digunakan  untuk  amplifikasi  gen invA berdasarkan panduan penggunaan PCR GoTaq Green Master Mix (Geneaid).  Hasil  amplifikasi  divisualisasi menggunakan gel elektroforesis. Sebanyak 1 µL hasil amplifikasi  yang  didapatkan  diinjeksikan  ke  1.2  %
agarosa  (ThermoFischer  Scientific)  dan  dielektroforesis menggunakan set elektroforesis (Bio-Rad) pada tegangan 45 V selama 90 menit. Hasil visualisasi berupa terbentuknya pita tebal pada kisaran 1500 bp (hasil amplifikasi gen invA , dilihat dari DNA ladder ), tidak terdapat pita pada panjang bp lainnya (tidak ada yang teramplifikasi selain invA dan/ atau produk invA tidak terpotong), serta tidak terdapat primer dimer .

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Pemilihan Primer
Berdasarkan hasil desain primer awal dari laman Primer-BLAST, didapatkan sebanyak 22 buah primer forward dan 22 buah primer reverse (22 set primer). Pasangan primer tersebut kemudian diseleksi berdasarkan panjang amplikon (lebih dari 1000 bp) agar didapatkan amplikon sepanjang mungkin sehingga perbedaan basa nitrogen semakin terlihat dan hubungan kekerabatan terlihat lebih jelas serta kriteria primer yang baik. Selain itu, primer dipilih berdasarkan perbedaan Tm (kurang dari 1 °C), terdapatnya ujung G atau C, menghindari adanya sekuen berulang dengan jumlah sekuen berulang maksimal 4 (contoh: TCTCTCTC), menghindari sekuen run atau maksimal 3 nukleotida (contoh: TAAAAGC), dan self  complementarity serta self 3’ complementarity yang mendekati 0 (Arenas & Salazar 2019).
Pemeriksaan spesifisitas dilakukan untuk mengetahui jumlah dan jenis Salmonella yang dapat dideteksi menggunakan primer tersebut serta organisme lain yang juga dapat dideteksi oleh primer tersebut. Pengecekan kembali dilakukan karena hasil BLAST terbatas hanya hingga 1000 sekuen, sedangkan jumlah serovar dan strain yang terdapat pada Salmonella berjumlah 2654 jenis (Issenhuth-Jeanjean et al. 2014). Hal tersebut menyebabkan kecocokan yang lebih rendah dengan bakteri lain dibandingkan dengan Salmonella , tidak akan ditampilkan.
Berdasarkan persyaratan tersebut, didapatkan tujuh (7) pasang primer. Ketujuh kandidat primer tersebut dapat dilihat pada Tabel 3. Satu pasang primer dipilih berdasarkan amplikon terpanjang yakni 1486 bp. Primer terdiri dari primer forward yang dimulai pada basa ke-297 dan primer reverse yang dimulai pada basa ke-1763. Primer tersebut memiliki  spesifikasi  dan  spesifisitas  yang  dapat  dilihat masing-masing pada Tabel 4 dan Tabel 5.
Berdasarkan hasil data pada Tabel 4, diketahui bahwa perbedaan Tm hanya sebesar 0.07, sehingga kemungkinan kedua primer dapat menempel pada target gen pada suhu annealing yang sama dengan baik. Perbedaan Tm ini lebih kecil dibandingkan primer yang didesain oleh El-Sebay et al. (2017) yang memiliki desain primer dengan panjang amplikon yang lebih panjang (2058 bp). Angka self complementarity dan self 3’ complementarity belum mencapai 0 atau angka yang mendekati 0 sehingga masih terdapat kemungkinan primer membentuk hairpin maupun primer  dimer . Pengujian lebih lanjut dilakukan untuk  mengetahui  kemampuan  amplifikasi  primer  pada suhu annealing yang sama dan kemampuan primer untuk tetap dapat teramplifikasi dengan baik meskipun memiliki
Tabel 4. Spesifikasi primer terpilih Primer Sekuen Tm ΔTm %GC Self Complementarity Self 3’ Complementarity Forward GCC GGT GAA ATT ATC GCC AC 59.97 0.07 55 6 2 Reverse CTC GTA ATT CGC CGC CAT TG 60.04 55 4 2 Tabel 3. Spesifikasi calon kandidat primer Set Primer Panjang ΔTm %GC Self complementarity Self 3’ complementarity 1 Forward 1486 0.07 55 6 2 Reverse 55 4 3 2 Forward 1215 0.48 55 3 1 Reverse 55 4 3 3 Forward 1222 0.56 55 3 2 Reverse 55 4 3 4 Forward 1109 0.51 55 3 0 Reverse 55 4 3 5 Forward 1119 0.69 55 4 2 Reverse 55 4 2 6 Forward 1139 0.76 55 4 2 Reverse 50 5 3 7 Forward 1149 0.12 55 2 0 Reverse 50 4 3
kemungkinan terbentuknya hairpin dan primer dimer. Pengujian dilakukan dengan melakukan amplifikasi dengan PCR serta memvisualisasi hasil amplifikasi tersebut dengan gel elektroforesis.
Berdasarkan hasil data pada Tabel 5, diketahui bahwa primer tersebut mampu mendeteksi setidaknya 110 jenis serovar S. enterica subsp. enterica dan mencakup 19 jenis Salmonella yang menjadi penyebab utama kasus salmonellosis di Amerika Serikat (CDC 2016). Berdasarkan data pada Tabel 5, dapat diketahui juga bahwa primer tersebut  spesifik  terhadap Salmonella karena tidak dapat mendeteksi sekuen bakteri yang memiliki kemiripan sekuen DNA yang tinggi dengan invA pada Salmonella spp. Primer yang didesain pada penelitian ini lebih panjang dari desain primer yang paling umum digunakan
Tabel 5. Spesifisitas primer terpilih
Spesies Subspesies Jenis serovar Jumlah strain Keterangan Salmonella Enterica 110 1000 Terdapat 54 sekuen yang tidak diketahui serovarnya Klebsiella sp. 0 0 Citrobacter sp. 0 0 Serratia sp. 0 0 Hafnia sp. 0 0 Escherichia Coli 0 0 dan memang hanya digunakan untuk mendeteksi keberadaan gen invA Salmonella (disitasi sebanyak 1158 kali) yaitu 429 bp (Rahn et al. 1992). Primer ini lebih pendek dibandingkan primer yang didesain oleh El-Sebay et al. (2017), yaitu sepanjang 2058 bp.
Hasil cek start dan stop  point ditunjukkan oleh Gambar 1. Berdasarkan Gambar 1 tersebut diketahui bahwa primer yang didesain oleh El-Sebay et al. (2017) mampu mendeteksi sekuen yang dapat dideteksi dengan primer yang didesain pada penelitian ini dan primer dari Rahn et al. (1992). Berdasarkan Gambar 1, primer yang didesain pada penelitian ini mampu mendeteksi sekuen yang dapat dideteksi dengan primer yang didesain Rahn et al. (1992). Terdapat bagian dari gen yang dapat dideteksi oleh primer yang didesain oleh El-Sebay et al. (2017) namun tidak dapat dideteksi oleh primer yang didesain pada penelitian ini. Namun apabila dibandingkan spesifisitasnya, tidak terdapat perbedaan.
Berdasarkan hasil sekuensing dan analisis sekuen gen pada penelitian yang dilakukan oleh El-Sebay et al. (2017), terdapat dua perbedaan basa nukleotida yang dapat mengubah deduksi asam amino pada gen invA tersebut. Perbedaan tersebut terdapat pada situs ke-1470 dan 1590 (dapat dilihat pada Gambar 1(A)). Kedua perbedaan tersebut dapat terdeteksi oleh primer yang didesain pada penelitian ini, sedangkan primer yang didesain oleh Rahn et al. (1992) hanya dapat mendeteksi salah satu perbedaan basa tersebut.
Optimasi Kondisi PCR Optimasi suhu annealing dilakukan menggunakan template DNA yang berasal dari kultur murni Salmonella .
Jurnal Ilmu Produksi dan Teknologi Hasil  Peternakan 10 (2): 91-97
Gambar 1. Perbandingan sekuen gen yang dapat diamplifikasi oleh tiga jenis primer berbeda pada A: gen invA dari Salmonella Typhimurium strain Egypt/ poultry/2014 (KR185982.1); dan B: gen invA dari Salmonella Typhimurium (M90846.1)
Hasil optimasi suhu annealing untuk primer terpilih dapat dilihat pada Gambar 2. Berdasarkan Gambar 2, diketahui bahwa  amplifikasi  dapat  terjadi  dengan  baik  pada  suhu annealing 55-64.3 °C. Hasil tidak menunjukkan pita pada kontrol negatif yang menunjukkan bahwa tidak terjadi kesalahan positif. Pita terlihat paling tebal pada suhu annealing 58 °C sehingga suhu tersebut dipilih sebagai suhu annealing . Tidak terlihat produk yang terlihat seperti kabut pada panjang di bawah 100 bp yang menunjukkan bahwa gangguan primer dimer akibat interaksi kedua primer pada saat amplifikasi tidak tervisualisasi.
Suhu annealing merupakan suhu pada saat primer menempel pada target gen. Primer yang berbeda memiliki kemungkinan untuk memiliki suhu annealing yang berbeda sehingga perlu dilakukan optimasi suhu annealing pada primer baru. Suhu annealing berkaitan erat dengan Tm. Umumnya suhu annealing berkisar antara 5 °C di atas dan di bawah Tm (Arenas & Salazar 2019). Primer memiliki Tm ±60 °C sehingga optimasi suhu annealing dilakukan pada suhu antara 55-65 °C.
Hasil optimasi tersebut kemudian diujikan pada ekstrak DNA yang berasal dari isolat uji.  Hasil pengujian pada  isolat  uji  menunjukkan  hasil  amplifikasi  DNA  tidak dapat tervisualisasi. Hal ini mungkin disebabkan oleh ekstrak dari isolat uji yang mungkin masih mengandung DNA yang berasal bukan dari Salmonella serta kemungkinan terdapat zat-zat lain dari sampel yang dapat mengganggu amplifikasi DNA. Kondisi yang kurang efektif dapat menyebabkan sedikitnya jumlah amplikon yang terbentuk sehingga pita tidak dapat terlihat/ terlihat samar pada saat divisualisasi menggunakan gel elektroforesis (Schrader et al . 2012). Hal tersebut dapat diselesaikan dengan beberapa langkah yang dapat meningkatkan jumlah amplikon. Langkah-langkah tersebut antara lain mengubah komposisi reagen dan meningkatkan jumlah siklus (untuk proses denaturasi, annealing , dan ekstensi). Perubahan komposisi reagen, selain template DNA dan primer, membutuhkan pembelian bahan tambahan. Peningkatan template DNA dan konsentrasi primer mampu meningkatkan jumlah amplikon karena semakin banyak jumlah template DNA dan primer,
Jurnal Ilmu Produksi dan Teknologi Hasil  Peternakan 10 (2): 91-97
Gambar  2.  Visualisasi  hasil  amplifikasi  DNA menggunakan elektroforesis optimasi suhu annealing primer line 1: ladder 100 bp; 2: kontrol negatif; 3-12: suhu annealing 55, 55.6,
56.6, 58, 59.4, 60.6, 62, 63.3, 64.3, dan 65 °C
semakin besar kemungkinan template DNA dan primer tersebut  berinteraksi  sehingga  amplifikasi  dapat  terjadi. Jumlah template DNA yang didapatkan terbatas sehingga langkah optimasi pertama yang dilakukan adalah dengan mengubah konsentrasi primer.
Penggunaan primer dengan konsentrasi 0.8 dan 1 µM menghasilkan pita yang tipis (Gambar 3 dan 4), meskipun dilakukan pada jumlah siklus yang tinggi (35 dan 40 siklus). Hasil tersebut kemungkinan dapat mengganggu hasil sekuensing. Gangguan tersebut antara lain tidak adanya sinyal penunjuk basa nukleotida serta sinyal yang terlalu lemah sehingga tidak dapat dibedakan dari noise (Fisher Scientific).
Gambar  3.  Visualisasi  hasil  amplifikasi  DNA menggunakan elektroforesis optimasi jumlah siklus line 1: ladder 100 bp; 2: kontrol positif, 35 siklus; 3: kontrol negatif, 35 siklus; 4-5: isolat uji, 35 siklus, konsentrasi DNA 50 ng, konsentrasi primer (0.8, 1.0 µM); 6-7: isolat uji, 35 siklus, konsentrasi DNA 100 ng, konsentrasi primer (0.8, 1.0 µM); 8: kontrol positif, 40 siklus; 9: kontrol negatif, 40 siklus; 10-11: isolat uji, 40 siklus, konsentrasi DNA 50 ng, konsentrasi primer (0.8, 1.0 µM); 12-13: isolat uji, 40 siklus konsentrasi DNA 100 ng, konsentrasi primer (0.8, 1.0 µM)
Gambar  4.  Visualisasi  hasil  amplifikasi  DNA menggunakan elektroforesis optimasi konsentrasi primer line 1: ladder 100 bp; 2: kontrol positif; 3: kontrol negatif; 4: konsentrasi DNA 50 ng, konsentrasi primer 1.2 µM; 5: konsentrasi DNA 100 ng, konsentrasi primer 1.2 µM.
Konsentrasi primer optimum terlihat pada Gambar 4, penggunaan konsentrasi primer 1.2 µM dengan jumlah siklus sebanyak 30 dapat menghasilkan pita hasil amplifikasi yang tebal dengan konsentrasi template DNA paling sedikit 50 ng. Hasil ini tidak terbentuk multiband serta primer dimer pada hasil amplifikasi. Penggunaan konsentrasi primer 1.2 µM disertai dengan penurunan jumlah siklus menjadi 30 siklus. Penggunaan siklus PCR yang terlalu banyak dapat meningkatkan peluang penempelan primer pada gen non- target yang apabila terakumulasi dapat menyebabkan terbentuknya multiband serta adanya primer dimer (Innis & Gelfand 2012). Keberadaan pita yang tidak sesuai dapat terbaca pada proses sekuensing dan menunjukkan hasil yang tidak sesuai dengan target gen sehingga mengganggu pembacaan dalam tahap sekuensing. Pita yang tidak sesuai tersebut harus dipisahkan dari pita yang diinginkan untuk disekuensing. Pemisahan pita tersebut memperpanjang dan memperlambat proses sekuensing.

## KESIMPULAN
Hasil seleksi secara bertahap dengan program Primer-BLAST terpilih 1 dari 7 pasang primer yang berasal dari 22 kandidat. Primer dengan urutan forward GCCGGTGAAATTATCGCCAC dan reverse CTCGTAATTCGCCGCCATTG memiliki panjang amplikon 1486. Primer ini dapat mendeteksi cemaran Salmonella pada karkas ayam pada suhu annealing sebesar 58 °C dan konsentrasi primer sebesar 8, 1.0 dan 1.2 µM, untuk sekuensing konsentrasi 1.2 µM memberikan hasil pita yang optimum.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis berterima kasih kepada Kementerian Riset dan Teknologi / Badan Riset dan Inovasi Nasional atas pembiayaan penelitian dalam skema hibah Penelitian Dasar Unggulan Perguruan Tinggi (PDUPT) Tahun Anggaran 2021.

## DAFTAR PUSTAKA
Arenas,  N.  E.,  &  L.  M.  Salazar . 2019. Steps and Tools for PCR-Based Technique Design. Biotechnol Bioeng. doi: 10.5772/INTECHOPEN.83671.
CDC . 2016. National enteric disease surveillance:
Salmonella annual report. https://www.cdc.gov/ nationalsurveillance/pdfs/2016- Salmonella - report-508.pdf.  [21 September 2021].
CDC . 2021. Salmonella outbreaks linked to backyard poultry. https://www.cdc.gov/ Salmonella / backyardpoultry-05-21/index.html. [3 Agustus 2021].
El-Sebay, N. A., H. M. A. Shady, S. A. E. R. El-Zeedy, & A. A. Samy. 2017. InvA gene sequencing of Salmonella Typhimurium isolated from Egyptian poultry. Asian J Sci Res. 10(3):194-202. doi:10.3923/ AJSR.2017.194.202.
Eng, S. K., P. Pusparajah, N. S. A. Mutalib, H. L. Ser, K. G. Chan, & L. H. Lee . 2015. Salmonella : A review on pathogenesis, epidemiology and antibiotic resistance. Front Life Sci. 8(3):284-293. doi:10.1080/21553769.2 015.1051243.
Franco-Duarte R., L. Černáková, S. Kadam, K. S. Kaushik,  B.  Salehi,  A.  Bevilacqua,  M.  R.  Corbo, & et al. 2019. Advances in chemical and biological methods to identify microorganisms-from past to present. Microorganisms. 7(5):130. doi: 10.3390/ microorganisms7050130
Fisher Scientific T . User Bulletin: Troubleshooting Sanger sequencing data (Pub. no. MAN0014435). www. thermofisher.com/mvf .  [27 September 2021].
Innis, M., & D. Gelfand . 2012. Optimization of PCRs. Di dalam: Innis M, Gelfand D, Sninsky J, White T, editor. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, United Kingdom. hlm 3-12.
Issenhuth-Jeanjean, S., P. Roggentin, M. Mikoleit, M. Guibourdenche, E. de Pinna, S. Nair, P. Fields, & F. Weill . 2014. Supplement 2008-2010 (no. 48) to the White-Kauffmann-Le  Minor  scheme.  Res  Microbiol. 165(7):526-530. doi:10.1016/J.RESMIC.2014.07.004.
Kementan RI . 2021. Statistik Peternakan dan Kesehatan Hewan 2021. http://ditjenpkh.pertanian.go.id/userfiles/ file/Buku_Statistik_2021.pdf?time=1633686831406 . [21 Januari 2022].
Lilic, M., C. Quezada, & C. Stebbins . 2010. A conserved domain in type III secretion links the cytoplasmic domain of InvA to elements of the basal body. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66(6):709-713. doi:10.1107/S0907444910010796.
Promega. 2021. GoTaq Green Master Mix Usage Information. https://worldwide.promega.com/-/ media/files/resources/protocols/product-information- sheets/g/gotaq-green-master-mix-protocol. pdf?rev=87143910365a492eb4bd0933f903621a&sc_ lang=en. [1 Maret 2021].
Rahn, K., S.  De  Grandis,  R.  Clarke,  S.  McEwen,  J. Galán, C. Ginocchio, R. Curtiss, & C. Gyles . 1992. Amplification of an InvA gene sequence of Salmonella Typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella . Mol Cell Probes. 6(4):271-279. doi:10.1016/0890-8508(92)90002-F. Resendiz-Nava, C., Y. Esquivel-Hernandez, A. Alcaraz- Gonzalez,  P.  Castaneda-Serrano,  &  G.  M.  Nava . 2019. PCR assays based on invA gene  amplification are not reliable for Salmonella detection. Jundishapur Journal of Microbiology.
12(2). doi: 10.5812/
JJM.68764.
Schrader, C., A. Schielke, L. Ellerbroek, & R. Johne . 2012. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113(5):1014-1026. doi:10.1111/J.1365-2672.2012.05384.X. Wulan, H. A., S. Nurjanah, & W. P. Rahayu. 2021. Sensitivity of enrichment-PCR method for Salmonella enterica serovar Typhimurium and Salmonella enterica serovar Enteritidis analysis in chicken carcasses. Food Research . 5(2):54-61. doi: 10.26656/fr.2017.5(2).429.
Jurnal Ilmu Produksi dan Teknologi Hasil  Peternakan 10 (2): 91-97