Pengaruh Desinfektan dan Lama Perendaman pada Sterilisasi Eksplan Daun Sukun ( Artocarpus altilis (Parkinson ex. F.A Zorn) Fosberg)
Nur Asni Setiani 1)* , Fitri Nurwinda 1) , Dewi Astriany 1)
1) Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia, Jl. Soekarno Hatta No. 354, Bandung, Jawa Barat
*) Alamat korespondensi: nur.asni@stfi.ac.id

## ABSTRAK
Daun  sukun  ( Artocarpus  altilis )  merupakan  herbal  yang  banyak  dimanfaatkan  untuk pengobatan.  Kultur  jaringan  menjadi  alternatif  dalam  meningkatkan  produktivitas  daun  sukun  dan metabolit  sekunder  yang  dihasilkannya.  Tahap  pertama  yang  menentukan  keberhasilan  perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan adalah teknik sterilisasi. Penelitian ini bertujuan mendapatkan metode sterilisasi terbaik dengan melihat pengaruh penggunaan natrium hipoklorit 5,25% dan alkohol 70% serta waktu  perendaman  terhadap  penurunan  kontaminasi.  Pada  penelitian  ini  terdapat  10  kelompok  yang terdiri  dari  kelompok  kontrol  positif,  kontrol  negatif,  perendaman  dengan  alkohol  70%  selama  5  menit dan  10  menit,  perendaman  dengan  natrium  hipoklorit  5,25%  selama  5  menit  dan  10  menit,  serta kombinasi  natrium  hipoklorit  5,25%  dan  alkohol  70%  selama  5  menit  dan  10  menit.    Parameter pengamatan  meliputi  waktu  pertama  kontaminasi,  persentase  kontaminasi  jamur  dan  bakteri,  dan penampilan  eksplan  yang  diamati  selama  40  hari.  Hasil  penelitian  pada  penggunaan  masing-masing desinfektan,  baik  alkohol  70%  maupun  natrium  hipoklorit  5,25%  dengan  waktu  perendaman  10  menit menunjukkan  tidak  adanya  kontaminasi  jamur  dan  bakteri,  tetapi  pada  perlakuan  natrium  hipoklorit 5,25%  terjadi  perubahan  warna  eksplan  menjadi  kecoklatan.  Kombinasi  dari  kedua  desinfektan menunjukkan adanya kontaminasi jamur dan bakteri serta adanya perubahan warna eksplan. Sterilisasi eksplan daun sukun yang terbaik dapat dilakukan dengan cara perendaman menggunakan alkohol 70% selama 10 menit.
Kata Kunci: alcohol, daun sukun (Artocarpus altillis), eksplan, natrium hipoklorit, sterilisasi
The Effect of Disinfectants and Soaking Time on the Sterilization of Breadfruit ( Artocarpus altilis (Parkinson ex. F.A Zorn) Fosberg) Leaf Explants
Nur Asni Setiani 1)* , Fitri Nurwinda 1) , Dewi Astriany 1)
1) College of Pharmacy Indonesia, Jl. Soekarno Hatta No. 354, Bandung, West Java
*) Email: nur.asni@stfi.ac.id

## ABSTRACT
Breadfruit  leaves  ( Artocarpus  altilis )  is  a  herb  that  is  widely  used  for  herbal  medicine.  Tissue culture  becomes  an  alternative  method  to  enhance  the  productivity  of  breadfruit  leaves  and  secondary metabolites  that  it  produces.  The  success  of  plant  propagation  through  tissue  culture  is  determined  by sterilization technique. This study aimed to obtain sterilization method by determining the effect of 5.25% sodium  hypochlorite  and  70%  alcohol  and  soaking  time  on  the  decrease  of  contamination.  In  this  study there  were  10  groups  consisting  of  positive  control,  negative  control,  immersion  with  70%  alcohol  for  5 and  10  minutes,  immersion  with  5.25%  sodium  hypochlorite  for  5  and  10  minutes,  and  combination  of 5.25  %  sodium  hypochlorite  and  70%  alcohol  for  5  minutes  and  10  minutes.  Parameters  observed  were first time of contamination, percentage of fungal and bacterial contamination, and appearance of explants observed  for  40  days.  The  results  of  the  use  of  each  disinfectant,  70%  alcohol  and  5.25%  sodium hypochlorite with 10 minutes immersion time showed no presence fungal and bacterial contamination, but in the treatment of sodium hypochlorite 5.25%, the explants become brownish. The combination of both disinfectants  indicated  the  presence  of  fungal  and  bacterial  contamination  and  the  changes  of  explants color. The best sterilization technique of  breadfruit leaves can be done  by  immersion using  70% alcohol for 10 minutes.
Keywords: alcohol, breadfruit leaves ( Artocarpus altilis ), explants, sodium hypochlorite, sterilization

## PENDAHULUAN
Daun  sukun  ( A.  altilis )  adalah  salah  satu obat  tradisional  yang  telah  banyak  dikenal masyarakat  Indonesia.  Secara  tradisional  daun sukun  telah  dimanfaatkan  sebagai  obat penyembuh  sariawan,  sakit  gigi,  gatal-gatal, rasa  nyeri  pada  tulang  sendi,  infeksi  telinga dan  penyakit  lainnya.  Kandungan  kimia  pada daun  sukun  berupa  saponin,  tanin,  flavonoid, polifenol,  asam  hidrosianat,  asetilkolin  dan riboflavin [1]. Penelitian yang pernah dilakukan menggunakan daun sukun ( A. altilis ) ialah  aktivitas  penangkap  radikal  bebas  dari ekstrak  fenolik  daun  sukun  ( A.  altilis )  [2]  dan pengujian  ilmiah  tentang  efek  analgesik ekstrak  etanol  daun  sukun  ( A.  altilis )  pada tikus  putih  jantan  galur  wistar  ( Rattus norvegicus ) [3].
Produktivitas  dari  daun  sukun  dapat ditingkatkan  dengan  cara  kultur  jaringan. Teknik kultur jaringan merupakan perbanyakan tumbuhan secara vegetatif. Kultur jaringan  meliputi  penanaman  sel  atau  agregat sel, jaringan, dan organ tanaman pada medium yang  mengandung  gula,  vitamin,  asam-asam amino, garam-garam organik, air, zat pengatur tumbuh,  dan  bahan  pemadat.  Komposisi medium  tumbuh  tersebut  ternyata  sangat menguntungkan pula bagi pertumbuhan cendawan  dan  bakteri.  Oleh  karena  itu, sterilisasi  eksplan  menjadi  faktor  penting dalam  menentukan  keberhasilan  program kultur  jaringan.  Apabila  eksplan  yang  kurang steril  maka  dimungkinkan  mikroorganisme yang  terbawa  oleh  eksplan  tersebut  akan tumbuh  dengan  cepat  dan  dalam  waktu  yang singkat  akan  menutupi  permukaan  medium pada eksplan yang ditanam atau yang biasanya disebut dengan kontaminasi, selanjutnya mikroorganisme  tersebut  akan  menyerang eksplan  melalui  luka-luka  akibat  pemotongan. Disamping  itu  beberapa  mikroorganisme melepaskan  senyawa  beracun  ke  dalam medium  kultur  yang  dapat  menyebabkan kematian jaringan [4].
Pemilihan  metode  sterilisasi  eksplan  yang tepat  didasarkan  pada  jenis  desinfektan  dan lamanya  waktu  perendaman.  Desinfektan merupakan bahan kimia yang digunakan untuk membunuh atau menurunkan jumlah mikroorganisme yang tidak diharapkan, misalnya  bakteri,  jamur,  dan  virus  [5]. Desinfektan  yang  biasa  digunakan  dalam kultur jaringan diantaranya natrium hipoklorit,
alkohol, bakterisida, dan fungisida [6]. Namun, desinfektan  dan  waktu  perendaman  memiliki pengaruh  yang  berbeda  pada  setiap  spesies tanaman.  Oleh  karena  itu,  pada  penelitian  ini dilakukan  sterilisasi  menggunakan  natrium hipoklorit  5,25%  dan  alkohol  70%  pada eksplan  daun  sukun  ( Artocarpus  altilis (Parkinson  ex.  F.A.  Zorn)  Fosberg )  dengan waktu  perendaman  yang  berbeda  untuk mendapatkan  metode  sterilisasi  terbaik  yang dapat menurunkan kontaminasi.

## METODE PENELITIAN
Determinasi  tanaman. Daun  sukun  hijau segar  ( A.  altilis  (Parkinson  ex.  F.A.  Zorn) Fosberg ) yang diperoleh dari daerah Cilampeni,  Kabupaten  Bandung  dideterminasi di  Laboratorium  Farmakognosi  Fitokimia, Universitas Padjajaran Bandung.
Pembuatan  media. Komponen  yang digunakan  untuk  membuat  media  dibuat larutan  stoknya  terlebih  dahulu.  Media pertumbuhan terdiri dari media Murashige and Skoog (MS – Caisson) dengan penambahan zat pengatur  tumbuh Benzilaminopurine (BAP  – BBI Life  Sciences ).  Sebanyak  4,43  g  MS ditambahkan  30  g  gula  dan  dilarutkan  dengan akuades sampai 1000 mL. Larutan dikondisikan pada pH 5,6-5,8 dengan menambahkan KOH 1 N untuk menaikkan pH dan  HCL  1  N  untuk  menurunkan  pH.  Larutan ditambah  agar-agar  7  g,  kemudian  diaduk dengan magnetic  stirrer dan  dipanaskan hingga  mendidih. Benzilaminopurine dengan konsentrasi akhir 1 ppm ditambahkan ke dalam media.  Larutan  dituangkan  ke  dalam  botol kultur  ±  25  mL/botol  dan  ditutup  dengan alumunium foil .
Persiapan  eksplan. Sumber  eksplan berupa daun sukun hijau segar ( A. altilis) yang dipetik  langsung  dari  pohonnya  dan  telah dibersihkan  permukaannya.  Daun  dipotong- potong menjadi bagian kecil berukuran 2-3 cm.
Sterilisasi eksplan. Penelitian ini menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap (RAL) dengan faktor perlakuan yaitu perbedaan  desinfektan  dan  lama  perendaman. Perlakuan dilakukan untuk desinfektan tunggal maupun  kombinasi  yang  dibagi  ke  dalam  10 kelompok  seperti  pada  Tabel  1  dan  masing- masingnya dilakukan triplo.
Tabel  1. Konsentrasi  desinfektan  dan  lama perendaman eksplan daun sukun Sampel Perlakuan Tahap I: Natrium hipklorit 5,25% Tahap II : Alkohol 70% S0a (kontrol positif) kontrol media yang disterilisasi, tidak ada eksplan S0b (kontrol negatif) kontrol media disterilisasi, eksplan tidak disterilisasi S1 5 menit 5 menit S2 10 menit 5 menit S3 5 menit 10 menit S4 10 menit 10 menit S5 - 5 menit S6 - 10 menit S7 5 menit - S8 10 menit -
Penanaman  eksplan  dan  penyimpanan kultur. Penanaman  eksplan  dilakukan  dalam LAF  ( Laminar  Air  Flow) .  LAF  dibersihkan dengan  alkohol  70%,  disinari  lampu  UV selama  1  jam,  dan  udara  dibiarkan  mengalir selama  30  menit.  Tahap  penanaman  eksplan dilakukan  secara  aseptik  di  dekat  api  bunsen. Pada  masing-masing  botol  medium  ditanam satu potong eksplan daun sukun.
Variabel  yang  diamati. Variabel  yang diamati  meliputi  waktu  pertama  kontaminasi muncul,  persentase  kontaminan (bakteri/ jamur)  dan  warna  eksplan  (hijau/coklat). Pengamatan dilakukan selama 40 hari.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Determinasi  tanaman. Hasil  determinasi menunjukkan  bahwa  tanaman  yang  digunakan termasuk  famili Moraceae dengan  nama spesies (A.  altilis  (Parkinson  ex.  F.A  Zorn) Fosberg) . Waktu
pertama kontaminasi.
Kontaminasi berasal dari kontaminan eksternal berupa jamur maupun bakteri yang berasal dari lingkungan  dan  cenderung  terbawa  lewat  alat
maupun  eksplan  yang  digunakan  dalam penelitian,  ataupun  kontaminan  internal  yang pada  umumnya  berasal  dari  bakteri  yang tumbuh di dalam jaringan tanaman. Kontaminasi  yang  sering  terjadi  pada  kultur jaringan  tanaman  terdiri  atas  kontaminasi bakteri  dan  jamur.  Bila  terkena  kontaminasi bakteri  maka  tanaman  akan  basah  dan menyebabkan adanya lendir, sedangkan kontaminasi  jamur  tanaman  akan  lebih  kering dan  akan  muncul  hifa  jamur  pada  tanaman yang  terserang  dan  biasanya  dapat  dicirikan dengan  garis-garis  (seperti  benang)  yang berwarna putih sampai abu-abu.
Tabel  2. Waktu  pertama  kontaminasi  pada
eksplan Sampel Waktu Pertama Kontaminasi Jamur Bakteri S0a 10 HST Tidak ada S0b 5 HST 2 HST S1 3 HST 5 HST S2 14 HST Tidak ada S3 7 HST 7 HST S4 Tidak ada 28 HST S5 10 HST 10 HST S6 Tidak ada Tidak ada S7 2 HST Tidak ada S8 Tidak ada Tidak ada
Berdasarkan  pengamatan  yang  dilakukan selama  40  hari  menunjukkan  bahwa  rata-rata waktu  pertama  kontaminasi  bervariasi  seperti pada  Tabel  2.  Sampel  yang  menunjukkan waktu  pertama  kontaminasi  tercepat  adalah perlakuan kontrol negatif (S0b) tanpa sterilisasi  yaitu  2  Hari  Setelah  Tanam  (HST). Waktu  kontaminasi  pertama  yang  paling  lama adalah  28  HST  pada  sampel  S4  dengan kombinasi  perendaman  natrium  hipoklorit 5,25%  dan  alkohol  70%  masing-masing selama  10  menit.  Sedangkan  penggunaan tunggal  natrium  hipoklorit  5,25%  selama  10 (S8)    dan  alkohol  70%  selama  10  menit  (S6), pada  keduanya  tidak  ditemukan  adanya kontaminasi  hingga  hari  ke-40.  Penggunaan desinfektan  tunggal  maupun  kombinasi  serta lamanya  waktu  perendaman  memengaruhi waktu kontaminasi.
Persentase kontaminasi. Tingkat kontaminasi  eksplan  dipengaruhi  oleh  banyak faktor  seperti  media  tanam,  lingkungan  kerja, alat  eksplan, dan asal  eksplan khususnya yang berasal  dari  lapangan.  Berdasarkan  Gambar  1, pada kontrol S0b menunjukkan angka persentase  eksplan  terkontaminasi  terbesar
yaitu  sebesar  100%,  baik  jamur  maupun bakteri. Hal ini menunjukkan bahwa penggunaan  bahan  sterilisasi  eksplan  sangat dibutuhkan untuk keberhasilan teknik kultur in vitro .  Tanpa  penggunaan  bahan  sterilisasi maka  eksplan  akan  terkontaminasi  sehingga perbanyakan  tanaman  sukun  secara in  vitro tidak akan berhasil.
Gambar 1 . Tingkat  kontaminasi  eksplan  daun sukun (A.  altilis). Keterangan: merah = bakteri, biru = jamur
Sterilisasi dengan  menggunakan  natrium hipoklorit  5,25%  dengan  perendaman  5  menit (S7) menunjukkan  kontaminasi sebanyak 33% sedangkan perendaman dengan natrium hipoklorit  5,25%  selama  10  menit  (S8)  tidak menunjukkan  adanya  kontaminasi  (0%).  Hal ini  menunjukkan  bahwa  lamanya  perendaman dapat  memengaruhi  tingkat  kontaminasi. Natrium  hipoklorit  banyak  digunakan  karena sangat  efektif  membunuh  bakteri  dengan  cara merusak  membran  sel  bakteri.  Senyawa hipoklorit mampu membersihkan mikroorganisme  yang  ikut  dalam  bahan tanaman, menghilangkan pertikel-partikel tanah,  debu  dan  lain-lain.  Jika  senyawa  ini diberikan  dalam  konsentrasi rendah  dan  lama perendaman singkat tidak terlalu efektif dalam mengendalikan  kontaminasi  pada  eksplan  [7]. Semakin  singkat  waktu  perendaman  dengan natrium  hipoklorit    maka  eksplan  semakin rentan  terhadap  patogen.  Namun,  apabila semakin  lama  perendaman  dengan  natrium hipoklorit maka perkembangan jaringan eksplan  menjadi  terhambat  yang  ditandai dengan browning (warna  kecoklatan)  pada eksplan [8]. Alkohol  membunuh  bakteri dengan  mekanisme  denaturasi  protein  sel bakteri.  Penggunaan  alkohol  70%  selama  5 menit  (S5)  menunjukkan  kontaminasi  jamur sebesar  100  %  dan  bakteri  33%,  sedangkan penggunaan alkohol 70% selama 10 menit (S6) tidak menunjukkan adanya kontaminasi, sedangkan  untuk  penggunaan  kombinasi
desinfektan  alkohol  70%  dengan  natrium hipoklorit  5,25%  dengan waktu  perendaman  5 menit  dan  10  menit  menunjukkan  rata-rata kontaminasi sebesar 33,3%. Hasil ini menunjukkan bahwa jenis desinfektan memengaruhi  tingkat  kontaminasi,  begitupun dengan lamanya waktu perendaman.
Persentase penampilan eksplan. Pemberian  berbagai  macam  desinfektan  dan lamanya perendaman memang dapat menurunkan  tingkat  kontaminasi,  tetapi  dapat juga  memengaruhi penampilan eksplan seperti pada Gambar 2.
Gambar 2 . Persentase Warna  Eksplan (A. altilis). Keterangan:  hijau  =  eksplan  berwarna hijau,  coklat  =  eksplan  berwarna coklat.
Pada  Gambar  2  terlihat  eksplan  sampel kontrol  negatif  yang  tidak  diberi  bahan sterilisasi  berwarna  hijau  segar  walaupun penuh kontaminasi. Ketiadaan bahan sterilisasi ternyata  tidak  mengubah  warna  dan  tekstur eksplan. Hal ini menunjukkan bahwa desinfektan  memengaruhi  warna  eksplan. Pada  sampel  yang  menggunakan  natrium hipoklorit  5,25%,  terlihat  adanya  perubahan warna  eksplan.  Eksplan  dengan  perendaman selama  10  menit  mempunyai  warna  lebih coklat  dibandingkan  dengan  perendaman  5 menit.  Hal  ini  disebabkan  senyawa  natrium hipoklorit  5,25%    yang  dapat  mengubah struktur  dan  tekstur  eksplan.  Eksplan  dengan perendaman  natrium  hipoklorit  yang  lebih lama menyebabkan permukaannya memar atau mengalami pencoklatan. Semakin lama perendaman eksplan dengan natrium hipoklorit 5,25%  maka semakin luas permukaan eksplan yang  mengalami  pencoklatan  dan  semakin banyak jumlah eksplan yang berwarna menjadi coklat [8].
Pada  perlakuan  sterilisasi  eksplan  dengan menggunakan  alkohol  70%  menghasilkan eksplan yang berwarna hijau dan segar. Waktu
perendaman  menggunakan  alkohol  70%  tidak mengubah warna dari eksplan.
Pemaparan  eksplan  yang  lebih  lama dengan  alkohol  70%  dan  natrium  hipoklorit 5,25%  akan  menyebabkan  kerusakan  pada eksplan  yang  tidak  dapat  balik  ( irreversible ).
Pemaparan  eksplan  dengan  bahan  sterilan dalam  periode  waktu  yang  panjang  akan menyebabkan  eksplan  mengalami  pencoklatan ( browning ) bahkan dapat menyebabkan kematian  pada  eksplan  [7].    Pada  kelompok perlakuan  yang  menggunakan  kombinasi bahan sterilisasi natrium  hipoklorit  5,25%  dan alkohol 70%, eksplan terlihat hijau agak coklat dan agak segar.
Berdasarkan penelitian, perlakuan perendaman menggunakan alkohol 70% selama  10  menit  (S6)  menunjukkan  hasil terbaik  yaitu  dapat  menekan  munculnya kontaminasi serta lamanya perendaman eksplan pun tidak mengubah warna eksplan.

## KESIMPULAN
Jenis  desinfektan  yang  digunakan  serta lamanya  perendaman  berpengaruh  terhadap penurunan  kontaminasi  serta  penampilan warna eksplan. Sterilisasi menggunakan alkohol  70%  dengan  lama  perendaman  10 menit  mampu  menghilangkan  kontaminan pada eksplan tanpa mengubah warna eksplan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  Sekolah  Tinggi Farmasi  Indonesia  yang  telah  menyediakan berbagai fasilitas penunjang penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Mardiana  L  (2012) Daun  ajaib  tumpas penyakit .  Penebar  Swadaya,  Jakarta,
Hal.172.
[2] Suryanto  E,  Wehantouw  F  (2009) Aktivitas  penangkap  radikal  bebas  dari ekstrak  fenolik  daun  sukun  ( A.  altilis ).
Chemistry Progress 2(1): 1-7.
[3] Bakarbessy  WH,  Wullur  AC,  Lolo  WA (2016)  Uji  efek  analgesik  ekstrak  etanol daun  sukun (A.  altilis) pada  tikus  putih galur wistar ( Rattus norvegicus ). PHARMACON  Jurnal  Ilmiah  Farmasi 5(1): 220-227.
[4] Zulkarnain (2009) Kultur jaringan tanaman.  PT  Bumi  Aksara,  Jakarta,  Hal.
20-35.
[5] Rismana  (2002)  Sanitasi  dan  desinfektan, langkah  awal  yang  efektif  mencegah penyakit. Infomedia, Jakarta, Hal. 169.
[6] Purwanto  AW  (2008)  Sansievera  flora cantik penyerap racun . Kanisius, Yogyakarta.
[7] Farooq  SA,  Farooq  TT,  Rao  TV  (2002) Micropropagation of Annona squamosa L. using  nodal  explants.  Pakistan  Journal  of Biological Sciences 5(1): 43-46.
[8] Rismayanti,  Hamzah  F  (2010) Pengaruh pemberian chlorox (NaOCl) pada sterilisasi permukaan untuk perkembangan  bibit  Aglaonema  ( Donna carmen )  secara in  vitro .  Prosiding Seminar  Ilmiah  dan  Pertemuan  Tahunan PEI  dan  PFI  XX  Komisariat  Daerah Sulawesi Selatan.