ISSN: 1907-9931 (print), 2476-9991 (online)
Fitofarmaka Daun Sambung Nyawa ( Gynura procumbens ) Untuk Meningkatkan Imunitas Ikan Kerapu Macan ( Epinephelus fuscoguttatus Forsskal 1775) Terhadap Serangan Bakteri Vibrio alginolyticus
Phytopharmaca Sambung Nyawa Leaves (Gynura procumbens) To Increase Immunity of Tiger Grouper (Epinephelus fuscoguttatus Forssk 1775) Against Bacterial Attack Vibrio alginolyticus
Etika Oktaviani 1,* , Esti Harpeni 2 , Wardiyanto 1
1 Program Studi Budidaya Perairan, Universitas Lampung
2 Program Studi Ilmu Kelautan, Universitas Lampung
*Corresponding author e-mail: etikaokta@gmail.com
Submitted: 21 Februari 2019 / Revised: 25 Juni 2019 / Accepted: 27 Juni 2019
http://doi.org/10.21107/jk.v12i1.4997

## ABSTRACT
Fitopharmaca  in  Indonesia  is  already  familiar  and  is  widely  used  for  traditional  treatments.  Gynura procumbens is  one  of  the  plants  that  has  been  widely  used  for  human  medicine  because  it’s secondary  metabolites  content  that  have  medicinal  properties.  These  ingredients  are  flavonoids, tannins  and  saponins.  In  addition  to  human  medicine,  the  leaves  of  Gynura  procumbens  also  have the potential to be used as fish medicine in order to prevent disease. Vibriosis is a bacterial disease caused  by  Vibrio  alginolyticus  and  is  susceptible  to  attacking  tiger  groupers.  The  use  of  synthetic antibiotics has been widely used but has many adverse effects, so it needs new alternatives for the prevention of vibriosis. One of them  is the use of  Gynura procumbens leaf extract, this  is  supported because  of  its  potential.  This  study  aims  to  examine  the  effect  of  Gynura  procumbens  extract  to improve  the  body  resistance  of  tiger  grouper  so  that  it  can  prevent  the  attack  of  Vibrio  alginolyticus bacteria. The method carried out included material extraction, phytopharmaca test, in vitro test, in vivo test,  hematology  test,  and  histopathology  test.  The  most  effective  dose  of  Gynura  procumbens  leaf extract to increase the body resistance of tiger grouper and prevent the attack of Vibrio alginolyticus is a dose of 700 ppm.
Keyword: Sambung Nyawa Leaves, prevention, vibriosis

## ABSTRAK
Fitofarmaka  di  Indonesia  sudah  tidak  asing  lagi  dan  banyak  dimanfaatkan  untuk  pengobatan- pengobatan  tradisional.  Tanaman  Sambung  Nyawa  merupakan  salah  satu  tanaman  yang  sudah banyak  dimanfaatkan  untuk  pengobatan  manusia  karena  memiliki  kandungan  senyawa  metabolit sekunder  yang  berkhasiat  obat.  Kandungan-kandungan  tersebut  seperti  flavonoid,  tannin,  dan saponin. Selain untuk pengobatan manusia, daun Sambung Nyawa juga berpotensi untuk digunakan sebagai  obat  ikan  dalam  rangka  pencegahan  penyakit.  Vibriosis  merupakan  salah  satu  penyakit bakterial  yang  disebabkan  oleh  Vibrio  alginolyticus  dan  rentan  menyerang  ikan  kerapu  macan. Penggunaan  antibiotik  sintetik  telah  banyak  digunakan  tetapi  menimbulkan  banyak  dampak  buruk, sehingga  perlu  alternatif  baru untuk pencegahan  vibriosis.  Salah  satunya  yaitu  dengan  penggunaan ekstrak  daun  Sambung  Nyawa,  hal  ini  didukung  karena  potensinya.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengkaji pengaruh ekstrak daun Sambung Nyawa untuk meningkatkan ketahanan tubuh ikan kerapu macan  sehingga  dapat  mencegah  serangan  bakteri  Vibrio  alginolyticus.  Metode  yang  dilakukan meliputi  ekstraksi  bahan,  uji  fitofarmaka,  uji  in  vitro,  uji  in  vivo,  uji  hematologi,  dan  uji  histopatologi. Dosis  ekstrak  daun  Sambung  Nyawa  yang  paling  efektif  untuk  meningkatkan  ketahanan  tubuh  ikan kerapu macan dan mencegah serangan Vibrio alginolyticus adalah dosis 700 ppm.
Kata kunci : daun Sambung Nyawa, pencegahan, vibriosis

## PENDAHULUAN
Dewasa  ini  pengobatan  tradisional  dengan fitofarmaka menjadi perhatian dunia. Darminto et  al., (2011)  menyatakan  bahwa  di  Thailand dan  Filipina  fitofarmaka  telah  dimanfaatkan sebagai bakterisida, fungisida, algasida, virusida,  herbisida,  dan  pestisida.  Fitofarmaka adalah  sediaan  obat  yang  berasal  dari  bahan herbal  dan  sudah  teruji  klinis  (Irmawati  & Primiani, 2017). Di Indonesia fitofarmaka telah dimanfaatkan  untuk  pengobatan  manusia, tetapi belum banyak digunakan dalam budidaya  perikanan.  Salah  satu  bahan  herbal yang  dapat  digunakan  sebagai  fitofarmaka adalah  daun  Sambung  Nyawa.  Nirwan  (2007) melaporkan  bahwa  daun  Sambung  Nyawa merupakan tanaman  obat  yang  banyak dimanfaatkan  karena  banyak  khasiatnya. Secara  tradisional  daun  Sambung  Nyawa telah banyak digunakan sebagai obat antikanker.
Daun  Sambung  Nyawa  berpotensi  dapat menjadi antimikrobial karena memiliki kandungan  flavonoid  dan  minyak  atsiri.  Telah dibuktikan oleh Rahman (2010) pada penelitiannya  bahwa  daun  Sambung  Nyawa dengan  konsentrasi  10%  paling  efektif  dalam menghambat  pertumbuhan Candida  albicans. Rivai et  al., (2011)  melaporkan  bahwa  daun Sambung  Nyawa  mengandung  67,094µg/mL flavonoid.
Berdasarkan  kandungan  senyawa  metabolit sekunder  yang  dimilikinya,  daun  Sambung Nyawa  berpotensi  untuk  digunakan  sebagai fitofarmaka dalam pencegahan penyakit vibriosis pada ikan kerapu macan. Ikan kerapu macan  merupakan  komoditas  unggul  air  laut, bahkan saat harga tinggi harga jualnya dapat berkisar  antara  Rp250.000,00/kg  hingga Rp350.000,00/kg bergantung pada kualitasnya  (Saputra,  2018).  Sementara, vibriosis  menjadi  kendala  utama  dalam budidaya  ikan  kerapu  macan  karena  dapat menyebabkan  kematian  lebih  dari  70%  dalam suatu musim (Sahari, 2018), sehingga berdampak  buruk  pada  produksi  ekonomi. Penelitian  yang  dilakukan  Hastari et  al., (2014) di Teluk Hurun Lampung  menunjukkan bahwa Vibrio  alginolyticus menjadi  salah satu agen vibriosis yang berbahaya.
Penggunaan antibiotik untuk penyakit bakterial seperti  vibriosis  sudah  banyak  dilakukan, tetapi  memiliki  dampak  yang  buruk.  Seperti yang  telah  dilaporkan  oleh  Andayani  (2009) bahwa ternyata banyak dari antibiotik tersebut menimbulkan resistensi bakteri dalam penanggulangan penyakit. Selain itu,
Sumayani  &  Cahyoko  (2008)  menambahkan bahwa  penambahan    antibiotik    yang  tidak terkontrol  dan  secara  berkelanjutan  dapat menyebabkan  residu  antibiotik  pada  produk perikanan  yang  dapat  berdampak  buruk  bagi manusia.  Alternatif  lain  yang  dapat  dilakukan yaitu  menggunakan  produk  fitofarmaka  untuk penanggulangan  penyakit  bakterial.  Dengan demikian penelitian ini bertujuan untuk mengkaji  pengaruh  ekstrak  daun  Sambung Nyawa  untuk  meningkatkan  ketahanan  tubuh ikan kerapu macan sehingga dapat mencegah serangan bakteri Vibrio alginolyticus .

## MATERI DAN METODE Rancangan Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  Rancangan  Acak Lengkap  (RAL)  dengan  4  perlakuan  dan asumsi individu sebagai ulangan. Ikan uji yang digunakan  adalah  benih  ikan  kerapu  macan yang  berukuran  panjang  rata-rata  15  cm dengan  bobot  rata-rata  40  gr  sebanyak  20 ekor  setiap  wadah  percobaan  berukuran  60 cm  x  40  cm  x  40  cm.  Pengujian  ekstrak dilakukan  secara  oral  kepada  ikan  uji  melalui pakan  kemudian  diuji  tantang  dengan  bakteri Vibrio alginolyticus . Kepadatan Vibrio
alginolyticus yang  diinjeksikan  yaitu  10 8 CFU/mL  sebanyak  0,1 mL/ekor  secara intramuscular.Penentuan  dosis  ekstrak  daun Sambung  Nyawa  pada  pakan  mengacu  pada hasil  uji in  vitro .  Sehingga  diperoleh  dosis setiap perlakuan pada uji in vivo yaitu:
A  : 0 ppm B  : setengah dari dosis terbaik uji in vitro C  : dosis terbaik uji in vitro
D  : dua kali lipat dari dosis terbaik uji in vitro

## Ekstraksi Serbuk Daun Sambung Nyawa
Ekstraksi  daun  Sambung  Nyawa  dilakukan dengan  menggunakan  metode  maserasi. Metode yang dilakukan mengacu pada Riadini (2015).  Filtrat  yang  diperoleh  kemudian dipekatkan dengan cara penguapan menggunakan vacuum  rotary  evaporator IKA RV  10  produksi  Jerman  pada  suhu  50 o C dengan  kecepatan  putaran  75  rpm  hingga diperoleh ekstrak kental berupa pasta.

## Uji Fitokimia
Uji  fitokimia  dilakukan  pada  enam  parameter, yaitu  saponin,  steroid,  terpenoid,  tannin, alkaloid, dan flavonoid. Sebelum dilakukan uji, ekstrak pasta daun Sambung Nyawa diencerkan terlebih dahulu dengan menggunakan  pelarut  methanol.  Metode  yang
dilakukan  yaitu  memodifikasi  pada  Tasmin et al., (2014) dan (Robinson, 1991).
Uji In Vitro
Uji in  vitro yang  dilakukan  yaitu    uji  zona hambat  dan  uji  MIC  ( Minimum  Inhibitory Concentration ). Dosis ekstrak yang digunakan yaitu 500, 600, 700, 800, 900, 1000, dan 1500 ppm.  Uji  zona  hambat  dilakukan  dengan metode paper  disc  diffusion  agar dengan paper  disc produksi  Jepang  ukuran  8mm, sedangkan uji MIC mengacu pada Soelama et al., (2015)

## Uji Toksisitas
Uji  toksisitas  mengacu  pada  Sari, et  al.,,
(2016)  dan  Kaban et  al., (2016)  dengan penggunaan  dosis  ekstrak  mengacu  pada hasil  terbaik  uji in  vitro .  Data  pengujian toksisitas  diperoleh  dari  analisis  LC 50 yang dilakukan dengan analisis regresi (Arief et al., , 2017).

## Uji In Vivo
Pakan  uji  dibuat  dengan  menyemprotkan ekstrak  daun  Sambung  Nyawa  dengan  dosis berbeda  sebanyak  100  mL  ke  dalam  masing- masing  pakan  komersil  ikan  kerapu  macan sebanyak  1  kg.  Kemudian  dicampur  hingga rata  dan  dijemur  hingga  kering.  Pemberian pakan  uji  dilakukan  selama  14  hari  kemudian diuji tantang pada hari ke 15 dan pemeliharaan  hewan  uji  dilakukan  hingga  hari ke  21  dengan  pemberian  pakan  yang  sama sesuai  dosis  perlakuan.  Pemeliharaan  hewan uji dikontrol pada kondisi kualitas air optimum. Parameter  yang  diamati  meliputi  gejala  klinis, survival  rate (SR), relative  percent  survival (RPS),  profil  hematologi  dan  histopatologi. Pengamatan  gejala  klinis  memodifikasi  pada Hastari et al., 2014 dan diamati setelah ikan uji diuji tantang.
Pengamatan  SR  dan  RPS  juga  dilakukan setelah ikan uji diuji tantang dengan perhitungan  mengacu  pada  Amend et.  el. 1981.

## [
]
Keterangan: SR: Tingkat kelangsungan hidup (%) Nt:  Jumlah  ikan  yang hidup  pada  akhir pemeliharaan (ekor) N0:  Jumlah  ikan  yang  hidup  pada  awal pemeliharaan (ekor) RPS : Relative Percent Survival
Pengamatan  hematologi  meliputi  pengamatan total  leukosit,  total  eritrosit,  dan  diferensial leukosit.  Metode  pengamatan  yang  dilakukan yaitu meliputi pengambilan sampel darah yang mengacu pada Lestari et al., (2017), perhitungan jumlah eritrosit perhitungan jumlah  leukosit,  dan  perhitungan  diferensial leukosit  yang  mengacu  pada (Pal  &  Pal, 2006).  Rumus  perhitungan  jumlah  eritosit yaitu:
N = n x 10 4
Keterangan : n  :  jumlah  sel  darah  merah  yang  terdapat dalam 80 kotak kecil N  :  jumlah  sel  darah  merah  dalam  1  mm 3 darah
Rumus perhitungan jumlah leukosit yaitu: N = nx50 Keterangan : n : jumlah sel darah putih yang terdapat dalam 64 kotak N : jumlah sel darah putih dalam 1 mm 3 darah
Perhitungan diferensial leukosit menurut Hartika (2014) yaitu sebagai berikut:
Pengamatan  profil  histopatologi  dilakukan pada  organ  insang,  hati,  limfa,  dan  usus dengan metode yang mengacu pada Sumantri et al., (2017).

## HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Uji Fitokimia
Senyawa metabolit sekunder yang terkandung di  dalam  ekstrak  daun  Sambung  Nyawa sangat  potensial  sebagai  fitofarmaka  untuk ikan. Senyawa saponin menyebabkan tegangan  permukaan  menurun,  sehingga mengakibatkan  naiknya  permeabilitas  atau kebocoran  sel  dan  mengakibatkan  senyawa intraseluler  akan  keluar,  begitulah  saponin bekerja  sebagai  antibakteri  (Nuria et  al., , 2009).

## Tabel 1. Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Daun Sambung Nyawa
No. Jenis Uji Kualitatif Fitokimia Pereaksi Hasil Positif Hasil Uji 1 Saponin Akuades, kemudian dikocok Terdapat busa + 2 Steroid Asam asetat glacial dan H 2 SO 4 Warna menjadi biru atau ungu - 3 Terpenoid Asam asetat glacial dan H 2 SO 4 Warna menjadi merah atau kuning - 4 Tanin FeCl 3 10% Warna menjadi hitam kebiruan + 5 Alkaloid Kloform dan pereaksi Meyer Warna menjadi putih kecoklatan - 6 Flavonoid Serbuk Mg dan HCl pekat Warna menjadi merah atau kuning +
Menurut  Middleton  (2000),  efek  konsumsi flavonoid antara lain antiinflamasi, antimikroba, dan  antivirus  yang  sangat  berpotensi  untuk menjadi  fitofarmaka  bagi  ikan.  Pernyataan tersebut sejalan dengan Robinson (1991) yang menyatakan bahwa flavonoid tertentu mengandung  komponen  aktif  untuk  menjadi antimikroba dan antivirus. Kemudian keberadaan  tannin  dalam  ekstrak  daun Sambung  Nyawa  juga  berpotensi  sebagai antibakteri.    Sari  &  Sari  (2011)  menjelaskan bahwa tannin mempunyai target pada polipetida  diding  sel  sehingga  pembentukan diding  sel  menjadi  kurang  sempurna.  Hal tersebut mengakibatkan sel bakteri lisis karena tekanan  fisik  maupun  osmotik  sehingga  sel bakteri mati.
Hasil Uji In Vitro
Hasil  diameter  zona  hambat  yang  terbentuk berbeda-beda  dari  setiap  perlakuan.  Yadav  & Bishe  (2004)  menjelaskan  daya  hambat antibakteri berdasarkan diameter zona hambatnya digolongkan dalam empat kategori, yaitu sangat kuat (>20 mm), kuat (10- 20  mm),  sedang  (5-  10  mm),  dan  tergolong lemah  (<  5mm).  Berdasarkan  hasil  penelitian, ekstrak daun Sambung Nyawa yang tergolong memiliki  daya  hambat  antibakteri  yang  lemah yaitu  konsentrasi  600  ppm,  800  ppm,  900 ppm,  dan  1000  ppm.  Kemudian  konsentrasi 500  ppm  dan  1500  ppm  tergolong  memiliki daya  hambat  sedang,  sedangkan  konsentrasi 700 ppm tergolong memiliki daya hambat kuat (Gambar 1) dan merupakan hasil terbaik untuk acuan uji toksisitas dan uji in vivo .
Gambar 1. Diameter Uji Zona Hambat Ekstrak Daun Sambung Nyawa
Terbentuknya  zona  hambat  pada  uji  ini menunjukkan  bahwa  terdapat  senyawa  anti bakteri yang terkandung di dalam ekstrak daun Sambung  Nyawa.  Sesuai  dengan  hasil  uji fitokimia  yang  telah  dilakukan  sebelumnya (Tabel  1),  ekstrak  daun  Sambung  Nyawa mengandung  saponin,  tanin,  dan  flavonoid.
Menurut Adila et al ., (2013) senyawa flavonoid mampu merusak dinding sel sehingga menyebabkan kematian sel. Selain itu dijelaskan  pula  bahwa  senyawa  flavonoid dapat  menghambat  pembentukan  protein sehingga  menghambat  pertumbuhan  mikroba. Flavonoid  bekerja  dengan  cara  denaturasi
e 21,13±1,23 c 7,40±0,36 ab 3,60±0,7 d 10,47±0,6 a 3,30±0,56 b
4,57±0,45 ab 3,70±0,46 c 6,97±0,45 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 K+ 500 600 700 800 900 1000 1500 D ia m et er Z o n a H am b at ( m m )
Konsentrasi (ppm)
protein  dan  terjadi  peningkatan  permeabilitas membaran  sitoplasma.  Denaturasi  protein menyebabkan  gangguan  dalam  pembentukan atau  fungsi  molekul  protein  sehingga  terjadi perubahan  struktur  protein  dan  menyebabkan terjadinya koagulasi protein. Membran sitoplasma yang terganggu
dapat
menyebabkan meningkatnya permeabilitas  sel sehingga  nukleotida  pirin,  pirimidin,  dan protein akan keluar dari sel dan mengakibatkan  terhambatnya  pertumbuhan sel atau matinya sel.
Selain  flavonoid  kandungan  senyawa  lain seperti  senyawa  tanin  juga  dapat  merusak
membran  sel.  Cowan  (1999)  menyatakan bahwa senyawa tanin dapat merusak pembentukan  konidia  jamur.  Selanjutnya, senyawa saponin termasuk senyawa polifenol, yang  mana  senyawa  ini  dapat  menghambat bakteri  dengan  cara  merusak  membran sitoplasma  pada  bakteri.  Kerusakan  pada membran sitoplasma dapat mencegah masuknya  bahan-bahan  makanan  atau  nutrisi yang  diperlukan  bakteri  untuk  menghasilkan energi  akibatnya  bakteri  akan  mengalami hambatan pertumbuhan dan bahkan kematian (Fadlian et al. , 2016).
Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

## Gambar 2. Uji MIC
Konsentrasi 500 ppm dinyatakan sebagai nilai MIC,  hal  ini  karena  500  ppm  merupakan konsentrasi terendah yang tidak dapat menumbuhan  bakteri Vibrio  alginolyticus . Pernyataan  ini  sesuai  dengan  hasil  penelitian El  Mahmood et  al., (2010),  yang  menyatakan bahwa tabung yang sudah mulai menunjukkan kejernihan  berarti  tidak  ada  pertumbuhan bakteri dan dikatakan sebagai nilai MIC. Hal ini diperkuat oleh Pratiwi (2008) yang menyatakan  bahwa  apabila  media  jernih berarti antibiotik efektif menghambat pertumbuhan  bakteri  (bersifat  bakteriostatik), sedangkan  apabila  media  keruh  maka  bakteri masih  tumbuh  yang  berarti  antibiotik  tidak efektif  menghambat  pertumbuhan  bakteri. Semakin  rendah  nilai  MIC  suatu  bahan  aktif
maka  efektivitas  bahan  tersebut  semakin tinggi, demikian pula sebaliknya (Muliani et al., 2015).
Uji Toksisitas ( Brine Shrimp Lethality Test )
Penghitungan nilai LC 50 ekstrak daun Sambung
Nyawa dilakukan dengan memasukkan  nilai  log  konsentrasi  dan  nilai probit  pada  grafik  linear  menggunakan program Microsoft  excel  2007 sehingga diperoleh  hasil  pengolahan  data  persamaan regresi  y  =0,923x+1,822  dengan  R²  =0,758. Nilai  R 2 tersebut  menunjukkan  bahwa  lebih dari 70% variasi tingkat nilai probit larva udang dapat  diterangkan  dengan  adanya  perubahan log konsentrasi (Tabel 2).
Tabel 2. Brine Shrimp Lethality Test
Konsentrasi (ppm) Log Konsentrasi Rata-rata Mortalitas (%) Angka Probit Persamaan Garis LC 50 (ppm) 0 dosis - 0 - y  =  0,923x  + 1,822 R² = 0,758 2388 ½ dosis terbaik 2,54 23,33 2,54 Dosis terbaik 2,84 23,33 2,84 2× dosis terbaik 3,15 43,33 3,15
Nilai  y  tersebut  digunakan  untuk  mencari  nilai LC 50 .  Dengan  memasukkan  nilai  y  =  5,  maka akan  diperoleh  nilai  x  =  3,443.  Untuk menghitung  nilai  LC 50 yaitu  didapatkan  dari Antilog  x.  Hasil  LC 50 yang  diperoleh  yaitu
sebesar  2388  ppm.  Nilai  tersebut  berarti konsentrasi 2388 ppm ekstrak daun Sambung Nyawa  mampu  mematikan  50% Artemia salina . Tingkat  toksisitas suatu  ekstrak menurut Meyer (1982) adalah
500 ppm
600 ppm 700 ppm 800 ppm 900 ppm 1500 ppm K+ K- 900 ppm 1000 ppm
LC 50 ≤  30  ppm  =  Sangat  Toksik;  31  ppm  ≤ LC 50 ≤  1000  ppm  =  Toksik;  dan  LC 50 ≥  1000 ppm  =  Tidak  Toksik.  Mengacu  pada  Meyer (1982)  dapat  dikatakan  bahwa  ekstrak  daun Sambung Nyawa termasuk ekstrak yang tidak beracun,  karena  nilai  LC 50 ekstrak  tersebut yaitu lebih dari 1000 ppm.

## Gejala Klinis
Berdasarkan  pengamatan  gejala  klinis,  dapat diketahui  bahwa  secara  umum  ikan  kerapu macan  yang  telah  diinfeksi  bakteri Vibrio alginolyticus mengalami gerakan renang pasif, nafsu makan berkurang, memuntahkan makan,  gerakan  operkulum  melambat,  mata memerah  hingga  menonjol,  tubuh  berlendir, haemoragi  bagian  mulut,  sisik  mengelupas,
pembengkakan  lambung,  dan  terdapat  luka pada bekas infeksi (Tabel 3). Penurunan nafsu makan  pada  ikan  diduga  disebabkan  oleh stress  sebagai  akibat  perlakuan  uji  tantang dan  masuknya  bahan  atau  benda  asing  yang masuk dalam tubuh.
Kondisi  gejala  klinis  ikan  yang  serupa  juga dilaporkan oleh Nursyirwani et al., (2015) yang menyatakan  bahwa  ikan  kerapu  macan  yang diinfeksi bakteri Vibrio alginolyticus menunjukkan  gejala  tidak  nafsu  makan, berenang  pasif,  bergerak  lambat,  dan  terjadi haemoragi pada sirip dan ekornya. Pang et al., (2018)  melaporkan  hal  serupa  bahwa  ikan kerapu  yang  diinfeksi Vibrio  alginolyticus mengalami  hemoragi,  tidak  nafsu  makan,  dan mengalami pembengkakan.
Tabel 3. Gejala Klinis Ikan Uji Pasca Infeksi Bakteri Vibrio alginolyticus
Hari  Ke-  (Pasca Infeksi) Perlakuan (ppm) 0 dosis ½ dosis terbaik Dosis terbaik 2× dosis terbaik 1 ++ ++ ++ ++ 2 ++++ ++++ ++++ ++++ 3 ++++ ++++ +++ ++++ 4 ++++ +++ ++ ++ 5 ++++ +++ ++ ++ 6 +++ ++ + + 7 +++ + - - Keterangan:
-
:  Ikan normal
+ :  Berenang normal, nafsu makan kurang, mata baik, dan gerakan operkulum normal ++ :  Berenang  pasif,  tidak  nafsu  makan,  mata  memerah  hingga  menonjol,  gerakan  operkulum lambat, pembengkakan lambung, dan warna tubuh memucat
+++ :  Berenang  pasif,  makan  dimuntahkan,  mata  menonjol,  gerakan  operkulum  lambat, pembengkakan lambung, haemoragi, dan warna tubuh memucat
++++   :  Berenang  pasif,  makan  dimuntahkan,  mata  menonjol,  gerakan  operkulum  lambat, pembengkakan  lambung,  haemoragi,  kerusakan  sisik,  terdapat  luka  bekas  infeksi,  dan kematian (Modifikasi Hastari et al. , 2014)
Survival  Rate (SR)  dan Relative  Percent Survival (RPS)
Berdasarkan  data  pengamatan  kelangsungan hidup  ikan  uji,  dapat  dijelaskan  bahwa persentase  SR  terbaik  yaitu  perlakuan  dosis terbaik dengan persentase nilai 95% (Tabel 4). Perlakuan  tersebut    merupakan  perlakuan dosis  ekstrak  700  ppm,  hasil  ini  sama  seperti hasil  uji in  vitro .  2xdosis  terbaik  tidak
menunjukkan  hasil  yang  lebih  baik  diduga karena  dosis  yang  diberikan  terlalu  tinggi. Andayani et  al., (2018)  menjelaskan  bahwa dosis  yang  terlalu  tinggi  tidak  meningkatkan efek immune  stimulant dalam  meningkatkan imunitas.  Karena  tubuh  ikan  tidak  mampu merespon  mekanisme  respon  seluler  dan humoral, antibodi tidak terbentuk dan mungkin akan dihasilkan efek racun.
Tabel  4. Survival  Rate (SR)  dan Relative  Percent  Survival (RPS)  Ikan  Kerapu  Macan  Pasca  Infeksi Vibrio alginolyticus
Perlakuan (ppm) Σ Ikan Awal Mortalitas SR (%) RPS (%) 0 dosis 20 7 65 - ½ dosis terbaik 20 6 70 14,28 Dosis terbaik 20 1 95 85,71 2× dosis terbaik 20 6 70 14,28
Nilai  RPS  sangat  dipengaruhi  oleh  tingkat kematian benih perlakuan dan kontrol. Secara keseluruhan,  nilai  rataan  tingkat  kematian perlakuan  lebih  rendah  dibandingkan  kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak daun  Sambung  Nyawa  dapat  menurunkan angka  kematian  ikan  uji  setelah  diuji  tantang dibandingkan dengan kontrol.Berdasarkan data yang telah diperoleh, angka RPS tertinggi yaitu  perlakuan  C  dengan  nilai  85,71%  (Tabel
4).  Angka  tersebut  menunjukkan  bahwa penggunaan  ekstrak  daun  Sambung  Nyawa dengan konsentrasi 700 ppm sudah efektif dan dapat  memberikan  proteksi  terhadap  ikan  uji. Hal ini mengacu pada pendapat Amend (1981) yang menyatakan bahwa perlakuan dinyatakan  efektif  apabila  dapat  menimbulkan proteksi  terhadap  ikan  uji  yang  ditandai dengan  nilai  RPS  di  atas  60%  saat  dilakukan uji tantang.

## Profil Darah
Perlakuan dosis 0 ppm berbeda nyata dengan ketiga  perlakuan  lainnya,  sedangkan  ketiga perlakuan lainnya tidak berbeda nyata (Gambar  3).  Dangeubun  &  Metungun  (2017) menjelaskan  bahwa  pada  ikan  yang  tidak
sehat  mengalami  penurunan  jumlah  eritrosit karena tubuh melawan agen patogen. Penjelasan  tersebut  diperkuat  oleh  Sadikin (2002)  yang  menyatakan  bahwa  penurunan jumlah eritrosit mengindikasikan adanya serangan  agen  asing  ke  dalam  tubuh organisme. A B Gambar 3. (A) Total eritrosit, (B) Total leukosit
Meskipun mengalami penurunan, tetapi kisaran  eritrosit  pada  setiap  perlakua  masih dalam  kisaran  normal.  Hal  ini  sesuai  dengan pendapat  Robert  (2001)  yang  menyatakan bahwa  kisaran  normal  total  eritrosit  ikan teleostei  yaitu  1,05x10 6 –  3,00x10 6 sel/mm 3 . Selain itu, Andayani (2007) juga membuktikan bahwa  total  eritrosit  ikan  kerapu  macan mencapai  3,35x10 6 .  Hasil  ini  diduga  berkaitan dengan  pengaruh  ekstrak  daun  Sambung Nyawa yang  mampu  menurunkan  tingkat stress  atau  sebagai  anti  depresan  pada  ikan kerapu  macan.  Soetarno et  al. (1996), melaporkan bahwa kandungan senyawa metabolit  sekunder  yang  terdapat  pada tanaman  memberi  pengaruh  biologi  terhadap daya  tahan  tubuh,  antistress,  antibakteri, antijamur, dan perangsang lainnya.
Peningkatan jumlah leukosit yang terjadi pada perlakuan menunjukkan bahwa adanya respon imunitas  ikan  terhadap  infeksi  bakteri Vibrio alginolyticus .  Hal  ini  sesuai  dengan  pendapat Aonullah et  al., (2013)  yang  menyatakan bahwa  peningkatan  jumlah  total  leukosit diduga sebagai respon ikan dalam mempertahankan  hidupnya  dari  serangan
Vibrio  alginolyticus .  Moyle  &  Cech  (1988), menyatakan kenaikan leukosit pada umumnya terjadi  pada  ikan  yang  mengalami  gangguan dari  luar  tubuhnya,  termasuk  infeksi  patogen karena fungsi leukosit sebagai sistem pertahanan  tubuh ikan.  Hasil  ini  menunjukkan bahwa ekstrak daun Sambung Nyawa memiliki kemampuan  sebagai  imunostimulan  yang mampu  memberikan  rangsangan  terhadap respon  imun  non  spesifik  pada  ikan  yaitu ditandai adanya kenaikan pada total leukosit.
Hasil  perhitungan  diferensial  leukosit  yang diperoleh  menunjukkan  bahwa  secara  umum jumlah  limfosit  pada  hewan  uji  mengalami penurunan dibandingkan dengan awal pemeliharaan, sedangkan jumlah  monosit dan neutrofil meningkat (Gamabr 4).  Dangeubun &
Metungun (2017) menjelaskan bahwa penurunan  persentase  jumlah  limfosit  terjadi ketika  terjadi  infeksi  sedangkan  jumlah monosit  dan  neutrofil  meningkat  dan  ketiga komponen  sel  darah  putih  tersebut  saling memengaruhi  satu  sama  lain.  Hal  tersebut didukung  dengan  pendapat  Alamanda et  al.,
(2007)  bahwa  penurunan  jumlah  limfosit  pada infeksi membuat neutrofil dan monosit
meningkat  sebagai  pertahanan  utama,  yang berkerja  secara  efektif  melawan  infeksi. Setelah  infeksi,  neutrofil  akan  menjadi  lebih aktif  dari  pada  limfosit  karena  limfosit  akan aktif setelah neutrofil selesai bekerja.
Dibandingkan dengan jumlah monosit, persentase jumlah neutrofil pada penelitian ini lebih tinggi. Hal ini diduga karena neutrofil aktif memfagosit  pada  awal  terjadinya  infeksi, setelah  itu  kemudian  digantikan  oleh  monosit yang  lebih  kuat.  Kumar  &  Sharma  (2010)
menjelaskan  bahwa  sel-sel  yang  pertama  kali diproduksi dan meningkat dalam  jumlah besar pada peradangan adalah neutrofil. Sel tersebut  bergerak  lebih  cepat  dari  pada monosit  dan  dapat  mencapai  pada  area  yang terinfeksi  dalam  2-4  jam.  Pada  tahap  ini,  sel pertahanan  atau  fagositosis  didominasi  oleh neutrofil.  Baratawidjaja  (2006)  menegaskan bahwa  sirkulasi  neutrofil  hanya  terjadi  dalam sirkulasi  kurang  dari  48  jam  sebelum mencapai area infeksi.
A B C
Gambar 4. Diferensial leukosit (A) Persentase limfosit, (B) Persentase monosit, (C) Persentase neutrofil
Profil Histopatologi
A
B
C D K
Gambar 5. Profil histopatologi insang ikan uji (A) dosis  0 ppm, (B) ½ dosis terbaik (350 ppm), (C) dosis terbaik (700 ppm), (D) 2× dosis terbaik (1400 ppm), (K) ikan normal;
(   ) Edema , (    ) Fusi , (    ) Hiperplasia , (    ) Nekrosis , (    ) Struktur lamella sekunder hilang. Pewarnaan H.E. Perbesaran 400x
Perubahan patologis yang paling umum terjadi pada insang adalah hiperplasia sel-sel lamella insang,  yaitu  peningkatan  jumlah  sel  lamella. Priosoeryanto et  al., (2010)  menjelaskan bahwa  hiperplasia  terjadi  pada  tingkat  iritasi
yang  lebih  rendah  dan  biasanya  disertai peningkatan  jumlah  sel-sel  mukus  di  dasar lamela  dan  mengakibatkan  fusi  dari  lamela. Fusi  adalah  pendempetan  sel  antar  lamella sekunder  yang  satu  dengan  yang  lainnya.
5 1

## Oktaviani et al., Fitofarmaka Daun Sambung Nyawa (Gynura procumbens)
Selanjutnya,  Parameswari et  al., (2013)  juga menerangkan  bahwa  fusi  terjadi  karena lamella mengalami pembengkakan atau hiperplasia  sehingga  proses  pernapasan terganggu. Keadaan ini mengakibatkan ukuran rongga (kapiler lumen) mengalami penyempitan  dan  sel  yang  berada  di  tengah lamella  sekunder  bergeser,  sehingga  terjadi pendempetan. Fusi lamella sekunder umumnya  terjadi  sebagai  respon  terhadap infeksi parasit dan bakteri yang kronis ataupun adanya  iritasi  yang  disebabkan  bahan  kimia (Efrizal et  al .,  1998).  Sedangkan,  hiperplasia lamella  sekunder  pada  insang  terjadi  akibat adanya  pembelahan  sel  epitel  yang  tidak terkontrol dan pada lamella primer disebabkan oleh  pembelahan  sel-sel  chlorid  secara berlebihan (Sipahutar et al ., 2012).
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh,  dapat diketahui  bahwa  semua  hati  dari  setiap perlakuan  mengalami  kerusakan  yang  sama, yaitu adanya nekrosis, inflamasi, dan degenerasi  melemak.  Hal  ini  sebagai  akibat dari  adanya  gangguan  yang  disebabkan  oleh infeksi  bakteri  pada  setiap  hewan  uji.  Kondisi tersebut juga pernah dilaporkan oleh Sarjito et. al .  (2007).  Hastari et  al. (2014)  menjelaskan bahwa  nekrosis  merupakan  sel-sel  yang mempunyai  aktivitas  yang  sangat  rendah  dan akhirnya  mengalami  kematiaan  sel  jaringan sehingga menyebabkan hilangnya fungsi pada daerah  yang  mengalami  nekrosis.  Nekrosis dapat  dilihat  pada  bentuk  dan  warna  sel  yang mati dengan warna pudar dan bentuk sel yang tidak utuh (hancur)  sehingga  jaringan  menjadi rapuh.
A B C D K
Gambar 6.  Profil histopatologi hati ikan uji (A) dosis  0 ppm, (B) ½ dosis terbaik (350 ppm), (C) dosis terbaik (700 ppm), (D) 2× dosis terbaik (1400 ppm), (K) ikan normal;
(    ) nekrosis , (    ) degenerasi lemak , (    ) inflamasi. Pewarnaan H.E. Perbesaran 400x
Rahman et  al., (2018)  menjelaskan  bahwa nekrosis dapat disebabkan oleh trauma, agen- agen  biologis  (bakteri,  virus,  jamur  dan penyakit),  agen-agen  kimia  atau  terjadi gangguan pada penyediaan darah pada suatu daerah  khusus.  Plumb  (1994)  menjelaskan bahwa degenerasi melemak adalah akumulasi substansi  sel  secara  tidak  normal  yang diakibatkan oleh virus, bakteri dan toksik yang dikeluarkan  di  perairan.  Selanjutnya  Rahman et al., (2018) enjelaskan bahwa inflamasi atau peradangan ditandai dengan adanya jendolan- jendolan darah serta jaringan berwarna merah karena  terdapat  banyak  eritrosit  yang  keluar dari  pembuluh  darah.  Respon  peradangan  ini
bertujuan memulihkan jaringan serta menekan agen penyebab nekrosis.
Uji  histopatologi  limpa  ikan  uji  menunjukkan bahwa  terdapat  hemosiderin  pada  limpa  ikan uji.  Hemosiderin  ditandai  dengan  adanya warna  kecoklatan  pada  jaringan.  Hemosiderin adalah  senyawa  besi  yang  mengandung pigmen  kuning  kecoklatam  turunan  dari pemecahan molekul hemoglobin selama destruksi atau daur ulang sel darah merah. Hal ini  jelas  pada  jaringan  dari  pergantian  sel darah  merah  selama  kondisi  hemolitik  pada ikan dan terakumulasi pada pusat melanomakrofag (Mumford, et al. , 2007).
1
A
B
C D K
Gambar 7. Profil histopatologi limpa ikan uji (A) dosis  0 ppm, (B) ½ dosis terbaik (350 ppm), (C) dosis terbaik (700 ppm), (D) 2× dosis terbaik (1400 ppm), (K) ikan normal;
(    ) Kongesti , (    ) hemosiderin , (    ) Melano macrofag center . Pewarnaan H.E. Perbesaran 400x
Perubahan  histopatologi  yang  terjadi  pada usus  ikan  kerapu  dalam  penelitian  ini  yaitu proliferasi  sel  goblet.  Menurut  Nursyirwani et al., (2015),  sel  goblet  merupakan  bagian  dari lapisan mukosa usus yang berfungsi memproduksi mukus yang membantu memerangkap  bakteri  yang  masuk  ke  dalam usus. Berdasarkan hasil tersebut dapat diduga bahwa  ikan  uji  mengalami  gangguan  patogen yang  telah  diinfeksikan  ke  dalam  tubuhnya. Peningkatan  sel  goblet  dari  masing-masing perlakuan  sebagai  respon  terhadap  patogen
yang  masuk  tersebut  untuk  melawan  bakteri patogen.
Menurut  Robert  (2001),  pada  kondisi  toksik akut  yang  disebabkan  oleh  toksin  bakteri, virus,  parasit,  zat  kimia  atau  alga,  mukosa usus dapat terangkat seluruhnya. Sel-sel epitel mukosa usus individu dapat menggulung yang disertai  penebalan  kromatin  dan  sitoplasma eosinofil  yang  dapat  terjadi  akibat  kelaparan dan  kondisi  kaheksia.  Pada  bentuk  khusus terjadi  pelepasan  mukosa  ke  dalam  lumen, kadang-kadang  disertai  hemoragi  dan  edema submukosa.
A B C

## D
E
Gambar 8. Profil histopatologi usus ikan uji (A) dosis  0 ppm, (B) ½ dosis terbaik (350 ppm), (C) dosis terbaik (700 ppm), (D) 2× dosis terbaik (1400 ppm), (K) ikan normal;
(    ) proliferasi sel goblet , (    ) edema , (    ) hemoragi. Pewarnaan H.E. Perbesaran 400x

## KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan  yang  dapat  ditarik  dari  penelitian ini  yaitu,  dosis  terbaik  untuk  meningkatkan ketahanan  tubuh  ikan  kerapu  macan  dan mencegah serangan Vibrio alginolyticus secara in vitro dan in vivo yaitu dosis 700 ppm.

## DAFTAR PUSTAKA
Abed,  S.  A.,  Sirat,  H.  M.,  &  Taher,  M.  (2013). Total  phenolic,  antioxidant,  antimicrobial activities and toxicity study of Gynotroches axillaris Blume (Rhizophoraceae). EXCLI  journal , 12 , 404-412.
Adila,  R.,  &  Agustien,  A.  (2013).  Uji antimikroba curcuma spp. terhadap pertumbuhan candida albicans,
staphylococcus  aureus  dan  escherichia coli. Jurnal Biologi UNAND , 2 (1).
Alamanda, I. E., Handajani, N. S., & Budiharjo,
A. (2007). Penggunaan metode hematologi  dan  pengamatan  endoparasit darah  untuk  penetapan  kesehatan  ikan lele  dumbo  (Clarias  gariepinus)  di  kolam budidaya  desa  Mangkubumen  Boyolali.
Biodiversitas , 8 (1), 34-38.
Amend, D. F. (1981). Potency Testing of Fish Vaccines. Developments  in  Biological Standardization, 49 ,447 –454.
Andayani,  S.  (2009).  Respon  Non-Spesifik
Ikan  Kerapu  Macan  ( E.  fuscoguttatus ) terhadap  Immunostimulan  Senyawa  Aktif Alkaloid  Ubur-ubur  ( Bougainvillia sp.)
Melalui  Pakan. Berk.  Penel.  Hayati  Edisi
Khusus, 3B , 67 –73.
Andayani,  S.  (2007).  Effect  of  Bioactive jellyfish ( Bougainvellia sp.) as a Immunostimulan  of  Bactericidal  Activity,
Non-specific immune response as well as Survival Rate of Tiger Grouper ( Epinephelus  fuscoguttatus ). Dissertation
Graduate  School  University  of  Brawijaya . Malang. 122 p.
Andayani,  S.,  Fajar,  M.,  &  Rahman,  M.  F.
(2018,  April).  Effect  of  alkaloids  derived from  jellyfish  ( Aeginura sp.)  on  the intestinal  histopathology  and  relative percentage  survival  (RPS)  of  tiger grouper ( Epinephelus fuscoguttatus ) infected  by Vibrio  harveyi .  In IOP Conference Series: Earth and Environmental  Science (Vol.  137,  No.  1,
p. 012006). IOP Publishing.
Aonullah,  A.  A.,  &  Prayitno,  S.  B.  (2013). Pengaruh  Penggunaan  Ekstrak  Daun Jeruju  (Acanthus  Ilicifolius)  Terhadap Kelulushidupan Ikan Kerapu Macan (Epinephelus Fuscogutattus) Yang Diinfeksi  Vibrio  Alginolyticus. Journal  of Aquaculture Management and Technology , 2 (1), 126-135.
Arief,  D.  A.,  Sangi,  M.,  &  Kamu,  V.  S.  (2017).
Skrining  fitokimia  dan  uji  toksisitas ekstrak biji aren (Arenga pinnata MERR.). Jurnal MIPA , 6 (2), 12-15.
Cowan,  M.  M.  (1999).  Plant  products  as antimicrobial agents. Clinical microbiology reviews , 12 (4), 564-582.
Dangeubun,  J.  L.,  &  Metungun,  J.  (2017). Hematology of Vibrio alginolyticus- infected  humpback  grouper  Cromileptes altivelis,  under  treatment  of  Alstonia acuminata  shoot  extract. Aquaculture, Aquarium,  Conservation  &  Legislation , 10 (2), 274-284.
Ali,  A.,  &  Dini,  I.  (2013).  Skrining  Senyawa Bioaktif  pada  Tumbuhan  Mangrove  yang Dapat Menghambat Pertumbuhan Bakteri Penyebab  Penyakit  Red  Spot  Disease. CHEMICA , 12 (1), 33-39.
Efrizal,  T.,  Setijanto,  H.,  Tumpal,  D.,  &  Sukra, Y.  (1998). Pengaruh  kadar  Sub  Lethal Phosphamidon terhadap Kersakan Jaringan  Ikan  Nila (Doctoral  dissertation,
Tesis.  Fakultas  Perikanan  Universitas Riau, Pekanbaru).
El-Mahmood, A. M., Ogbonna, O. B., & Raji, M.
(2010).  The  antibacterial  activity  of Azadarichta  indica  (neem)  seeds  extracts against  bacterial  pathogens  associated with eye and ear infections. J. Med. Plants Res , 4 (14), 1414-1421.
Fadlian,  F.,  Hamzah,  B.,  &  Abram,  P.  H. (2016).  Uji  Efektivitas  Ekstrak  Tanaman Putri  Malu  (mimosa  pudica  linn)  Sebagai Bahan  Pengawet  Alami  Tomat. Jurnal
Akademika Kimia , 5 (4), 153-158.
Hastari,  I.  F.,  &  Prayitno,  S.  B.  (2014). Karakterisasi Agensia Penyebab Vibriosis Dan  Gambaran  Histologi  Ikan  Kerapu Macan  (Epinephelus  Fuscoguttatus)  Dari Karamba  Jaring  Apung  Teluk  Hurun Lampung. Journal of Aquaculture
Management  and  Technology , 3 (3),  86- 94.
Irmawati,  F.,  &  Primiani,  C.  N.  (2017). Perbandingan  Uji  Toksisitas  Fitoestrogen Pada  Ginjal  Tikus  (Sprangue  Dawley) Yang Diinduksi Daidzein Dan Air Perasan Umbi  Bengkuang  (Pachyrhizus  erosus).
Bioeksperimen:  Jurnal  Penelitian  Biologi , 3 (2), 52-60.
Kaban, A. N., Tarigan, D., & Saleh, C. (2016). Uji  Fitokimia,  Toksisitas  dan  Aktivitas Antioksidan  Fraksi  n-heksan  dan  Etil Asetat  terhadap  Ekstrak  Jahe  Merah (Zingiber  officinale  var.  amarum). Jurnal Kimia Mulawarman , 14 (1), 24-28.
Kumar,  V.,  &  Sharma,  A.  (2010).  Neutrophils: Cinderella  of  innate  immune  system. International immunopharmacology , 10 (11), 1325-1334.
Lestari,  E.,  Setyawati,  T.R.,  &Yanti,  A.H. (2017).  Profil  Hematologi  Ikan  Gabus ( Channa  striata Bloch,  1793). Protobiont, 6(3), 283-289.
Middleton, E., Kandaswami,
C., &
Theoharides, T. C. (2000). The effects of plant  flavonoids  on  mammalian  cells:
implications for inflammation, heart disease,  and  cancer. Pharmacological reviews , 52 (4), 673-751.
Moyle,  P.  B.  &  Chech,  J.  J.  (1988). An Introduction  to  Ichtyology .  Prentice  Hall Inc.  A  Division  of  Simon  and  Schuster Engelwood Cliffs, New Jersey. 597 ps.
Muliani,  M.,  Nurhidayah,  N.,  &  Kurniawan,  K. (2015).  HERBAL  MANGROVE  SEBAGAI
SUMBER  ANTI  BAKTERI  Vibrio  harveyi PENYEBAB  PENYAKIT  PADA  UDANG WINDU  Penaeus  monodon. Jurnal  Riset Akuakultur , 10 (3), 405-414.
Mumford,  S.,  Heidel,  J.,  Smith,  C.,  Morrison, J.,  MacConnell,  B.,  &  Blazer,  V.  (2007). Fish Histology and Histopathology . United States. USFWS-NCTC.
Nirwan.  ( 2007).  Produksi  flavonoid  Daun Dewa  ( Gynura  pseudochina (L.)  DC) Asal  Kultur  pada  Kondisi  Naungan  dan Pemupukan. Disertasi .  Instiut  Pertanian Bogor, Bogor.
Nuria,  M.C.,  A. Faizatun.,  &  Sumantri.  (2009). Uji Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Jarak Pagar  ( Jatropha  cuircas L)  terhadap Bakteri Staphylococcus  aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, dan Salmonella typhi ATCC 1408. Jurnal Ilmu
– ilmu Pertanian, 5 ,26-37.
Nursyirwani,  Asmara,  W.,  Wahyuni,  A.  E.  T. H.,  &  Triyanto.  (2015).  Histopatologi  Ikan Kerapu  Macan  yang  Diimbuhi  Bakteri Asam  Laktat  dan  Diuji  Tantang Vibrio alginolyticus . Jurnal Veteriner , 16 (4), 505- 512.
Pal,  G.  K.  &  Pal,  P.  (2006). Textbook  of Practical  Physiology .  Orient  Longman Private Limited. Hyderabat
Pang,  H.,  Qiu,  M.,  Zhao,  J.,  Hoare,  R., Monaghan,  S.  J.,  Song,  D.,  ...  &  Jian,  J. (2018). Construction of a Vibrio alginolyticus  hopPmaJ  (hop)  mutant  and evaluation  of  its  potential  as  a  live attenuated  vaccine  in  orange-spotted grouper  (Epinephelus  coioides). Fish  & shellfish immunology , 76 , 93-100.
Parameswari,  W.,  Sasanti,  A.S.  &  Muslim.
(2013). Populasi Bakteri, Histologi, Kelangsungan  Hidup  dan  Pertumbuhan
Benih  Ikan  Gabus  ( Channa  Striata )  yang Dipelihara dalam Media dengan Penambahan Probiotik. Jurnal Akuakultur Rawa Indonesia , 1 (1), 76-89.
Pratiwi,  S.  T.  (2008). Mikrobiologi  Farmasi . Jakarta: Erlangga
Priosoeryanto,  B.  P.,  Ersa,  I.  M.,  Tiuria,  R.,  & Handayani,  S.  U.  (2010).  Gambaran Histopatologi lnsang,  Usus  dan  Otot  Ikan Mujair (Oreochromis  mossambicus) yang Berasal  dari  Daerah  Ciampea,  Bogor. Indonesian Journal of Veterinary Science
& Medicine , 2 (1), 1-8.
Rahman,  E.  F.  (2010).  Efektivitas  Ekstrak Daun Dewa ( Gynura pseudochina (Lour.)
DC)  Terhadap  Pertumbuhan Candida
albicans pada  Plat  Dasar  Gigi  Tiruan Resin  Akrilik .  Majalah  Ilmiah  Sultan Agung, 48 (123), 32-45. Rahman, I. S., Maftuch, & Sanoesi, E. (2018). Efektifitas  Imunostimulan  Ekstrak  Kasar Daun  Jambu  Biji  ( Psidium  guajava ) Terhadap  Histopatologi  Hati  Ikan  Patin ( Pangasius sp.)  yang  Diuji  Tantang Bakteri Aeromonas hydrophila . Journal of Fisheries  and  Marine  Science , 2 (2),  47- 55.
Riadini,  R.  K. (2015). Uji Aktivitas  Antioksidan Ekstrak  Daun  Sambung  Nyawa (Gynura procumbens  (Lour.)  Merr.) Berdasarkan Perbedaan  Metode  Ekstraksi  dan  Umur Panen. Disertasi. Universitas  Atma  Jaya Yogyakarta.
Rivai,  H.,  Femiwati,  F.,  &  Krisyanella,  K.
(2011).      Karakterisasi  Ekstrak  Air  Daun Dewa  ( Gynura  pseudochina (L.)  DC  dan Penetapan  Kadar  Flavonoid  Totalnya.
Jurnal Farmasi Higea, 3 (1), 16-24. Robert,  R.  J.  (2001). Fish  Pathology .  W.  B. Saunders, USA.
Robinson,  T.  (1991). Kandungan  Organik Tumbuhan Tinggi . (Penerjemah: K. Padmawinata). ITB, Bandung.
Sahari, P. Y. (2018).  Perubahan Histopatologi Ginjal  dan  Hati  Ikan  Kerapu  Cantang (Epinephelus fuscoguttatus× Epinephelus lanceolatus) dan  Cantik (Epinephelus fuscoguttatus×Epinephelus polyphekadion) yang  Terinfeksi  Bakteri
Vibrio  vulnificus . Thesis .  Universitas Airlangga. Surabaya Saputra, B. (2018). Implementasi Pemberdayaan Masyarakat Melalui Program Corporate  Social  Responsibility Konservasi  Kawasan  Laut  Badak  LNG  di Kota Bontang. eJournal Sosiatri- Sosiologi , 6 (1), 46-60.
Sari, F.  P.  &  Sari,  S.  M.  (2011). Ekstraksi  Zat Aktif  Antimikroba  dari  Tanaman  Yodium (Jatropha  multifida  Linn)  sebagai  Bahan
Baku  Alternatif  Antibiotik  Alami .  Fakultas Teknik Universitas Diponegoro,
Semarang.
Sari,  I.,  Miranda,  T.,  &  Sadli.  (2016).  The
Cytotoxic  Activity  of  n-Hexane  Extract  of
Kersen ( Muntingia calabura Linn.) Leaves Using  the  Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT) Method. Jurnal Natural, 16 (2), 37- 44.
Sarjito,  Prayitno,  S.  B.,  Radjasa,  O.  K.,  & Hutabarat,  S.  (2007).  Karakterisasi  dan Patogenitas  Agensia  Penyebab  Vibriosis pada Kerapu Macan ( Epinephelus fuscoguttatus ) dari Karimunjawa. Aquacultura Indonesiana, 8 (2), 89-95.
Sipahutar, Wahyu, L., Aliza, D., Winaruddin, &
Nazaruddin. (2012). Gambaran Histopatologi Insang Ikan Nila
( Oreochromis  niloticus )  yang  Dipelihara dalam  Temperatur  Air  di  Atas  Normal. J. Medika Veterinaria , 0852-1943.
Soelama,  H.  J.  J.,  Kepel,  B.  J.,  &  Siagian, K.V.  (2015).  Uji Minimum  Inhibitory Concentration (MIC)  Ekstrak  Rumput
Laut ( Eucheuma cottonii ) Sebagai Antibakteri Terhadap Streptococcus mutans . Jurnal e-GiGi , 3 (2), 374-379.
Soetarno, S., Suganda, A. G., Sugihartina, G.,
&  Sukrasno,  S.  (2000).  Flavonoid  dan Asam-asam  Fenolat  dari  Daun  Dewa [ Gynura  Procumbens (Lour.)  Merr.].
Warta Tumbuhan Obat Indonesia , 6 (1).
Sumantri,  A.,  Mulyana,  &  Mumpuni,  F.S.
(2017). Pengaruh Perbedaan Suhu Pemeliharaan terhadap Histopatologi Insang  dan  Kulit  Ikan  Komet (Carassius auratus) . Jurnal Mina Sains , 3 (1), 1-7.
Sumayani, R. K., & Cahyoko, Y. (2008). Daya Antibakteri  Perasan  Rimpang  Lengkuas ( Alpinia    galanga )    dengan    Konsentrasi
Berbeda Terhadap Pertumbuhan
Aeromonas  hydrophilia  S ecara  I n  Vitro . Jurnal Berkala Ilmiah Perikanan, 3 (1), 83- 87.
Tasmin,  N.,  Erwin,  &  Kusuma,  I.  W.  (2014). Identifikasi  dan  Uji  Toksisitas  Senyawa Flavonoid  Fraksi  Kloroform  dari  Daun Terap ( Artocarpus Odoratissimus Blanco). Jurnal Kimia Mulawarman , 12 (1), 45-52.
Yadav, A. V., & Bhise, S. B. (2004). Chitosan: A  potential  biomaterial  effective  against typhoid. Current  Science , 87 (9),  1176-
1178.