Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology Journal Homepage : http://jurnal.unpad.ac.id/ijpst/

## UNPAD
Comparative Study of Antioxidant Phycocyanin Extracts Activity between

## S. platensis with S. fusiformis Using DPPH Method
Dwi Margiati*, Danni Ramdhani, Asri P. Wulandari

## Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran, Jatinangor, Sumedang - Indonesia
Submitted 17 April 2017; Revised 5 August 2017; Accepted 28 June 2018; Published 27 June 2019 *Corresponding author: dwimargiati1302@gmail.com

## Abstract
Phycocyanin is Spirulina’s content which has antioxidant activity to inhibit oxidation process or formation of free radicals that play a role in the initiation high-degenerative diseases. This research is aim to determine the best antioxidant activity of S. platensis with S. fusiformis through the best extraction methods of Spirulina cell between distilled water and PBS (Phosphate Buffer Solution). This research method existed Spirulina cell extraction used distilled water and PBS, and then followed by fractionation and dialysis phycocyanin extract, afterward tested the antioxidant activity used DPPH method. The result of extraction used PBS with a salt concentration of ammonium sulfate 30% produced the best purity value of phycocyanin extract of both types of Spirulina. Results of tested the antioxidant activity, S. fusiformis has the best antioxidant activity compared with S .platensis with a value of 311.43 ppm and 387.36 ppm, respectively.
Keywords: Antioxidant, DPPH, Phycocyanin extracts, S. fusiformis , S. platensis .
Studi Komparatif Aktivitas Antioksidan Ekstrak Fikosianin S. platensis dengan S. fusiformis Menggunakan Metode DPPH

## Abstrak
Fikosianin merupakan kandungan dalam Spirulina yang memiliki aktivitas antioksidan untuk menghambat proses oksidasi atau pembentukan radikal bebas yang berperan tinggi dalam inisiasi penyakit degeneratif. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan terbaik antara jenis S. platensis dengan S. fusiformis melalui metode ekstraksi terbaik sel Spirulina antara aquadest dan PBS (Phosphate Buffer Solution). Metode penelitian ini meliputi ekstraksi sel Spirulina dengan menggunakan aquadest dan PBS, lalu dilanjutkan dengan fraksinasi dan dialisis ekstrak fikosianin, serta pengujian aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH. Hasil ekstraksi menggunakan PBS dengan konsentrasi garam Ammonium sulfat 30% menghasilkan nilai kemurnian ekstrak fikosianin terbaik dari kedua jenis Spirulina. Hasil pengujian aktivitas antioksidan, ekstrak fikosianin S. fusiformis memiliki aktivitas antioksidan terbaik dibandingkan dengan S. platensis dengan nilai 311,43 ppm dan 387,36 ppm masing-masingnya.
Kata Kunci: Antioksidan, DPPH, Ekstrak Fikosianin, S. fusiformis , S. platensis .

## 1.  Pendahuluan
Antioksidan adalah zat yang mampu mencegah pembentukan reaksi radikal bebas (peroksida) dalam oksidasi lipid atau senyawa yang menunda, memperlambat dan mencegah proses oksidasi. 1 Proses oksidasi tersebut dikenal sebagai tekanan oksidatif ( oxidative stress )  yang  dapat  menyebabkan  kerusakan sel-sel jaringan dan enzim-enzim. Keadaan tersebut dapat menginisiasi terjadinya penyakit degeneratif seperti jantung koroner, katarak, gangguan kognisi dan kanker. 2 Radikal bebas yang merupakan molekul yang tidak stabil karena kehilangan elektronnya akan menerima elektron dari antioksidan. Secara alami, tubuh memiliki kemampuan untuk menghasilkan antioksidan, namun jika jumlah antioksidan tidak cukup melindungi sel tubuh dari jumlah radikal bebas yang tinggi  maka kita memerlukan antioksidan dari luar seperti makanan. 3
Salah satu contoh sumber antioksidan dari luar adalah Spirulina karena mengandung  fikosianin. 4 Spirulina terdiri dari beberapa jenis dan Spirulina yang sedang dikembangkan di Universitas Padjadjaran yaitu Spirulina platensis dan Spirulina fusiformis . Berdasarkan penelitian Wang et. al . menyatakan bahwa perbedaan jenis spesies Spirulina mempengaruhi kandungan komponen fikosianin sehingga mempengaruhi aktivitas antioksidannya. 5 Aktivitas antioksidan S. platensis pernah dilaporkan oleh Barus dengan metode DPPH ( 1,1-diphenyl-2-piceylhydrazyl )  memberikan aktivitas rendah karena tidak dilakukan ekstraksi terlebih dahulu saat analisis dan tidak  melakukan  pemurnian  fikosianin. 6
Penelitian lain yang dilakukan terhadap S. fusiformis juga mendapatkan hasil aktivitas antioksidan dengan kategori rendah yaitu memiliki persen penghambatan 5,920% pada konsentrasi ekstrak biomassa Spirulina 2000 ppm. 7 Sedangkan  pada  dasarnya  fikosianin yang  berperan sebagai antioksidan merupakan kandungan pigmen tertinggi dalam Spirulina sp. yang mencapai 14-20% dari berat kering. 8 Maka  dari  itu,  dilakukan  pengujian  lebih lanjut mengenai aktivitas antioksidan dari kedua jenis Spirulina tersebut.
Pengujian aktivitas antioksidan pada penelitian ini menggunakan metode DPPH sebagai radikal bebas dan melihat perbandingan aktivitas antioksidannya. Metode  DPPH  merupakan  metode  yang sederhana, cepat dan mudah untuk screening aktivitas penangkap radikal beberapa senyawa. 9 Penelitian ini dilakukan dengan memperbaiki metode sebelumnya melalui proses ekstraksi menggunakan pelarut aquades dan PBS ( Phosphate Buffer Solution ), lalu dilajutkan dengan fraksinasi ekstrak fikosianin  sehingga  diharapkan  kemurnian ekstrak fikosianin dapat lebih tinggi dan dapat menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih besar dari kedua jenis Spirulina tersebut Penelitian ini dilakukan pada bulan  November  2015  hingga  Maret  2016 di Laboratorium Pusat Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat departemen Analisis  Farmasi  dan  Kimia  Medisinal Universitas Padjadjaran.

## 2.  Metode
2.1.  Alat dan Bahan Pada penelitian ini alat yang digunakan adalah Freeze dryer (Christ Alpha 1-2 LD),  Sentrifugator  (Hettich  EBA  20), timbangan analitik (Dragon 204 dan Ohaus), spektrofotometer UV-VIS (Specord 200 analytik  jena),  Ultrasonik  (Neyo),  plastik selofan Shaker (IKA  @260  Basic)  dan alat-alat gelas yang umum digunakan di Laboratorium. Bahan yang digunakan adalah S pirulina platensis dan Spirulina fusiformis , aquades, DPPH ( 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) (Merck),  Ammonium  sulfat  (Merck), Potassium  dihidrogen  fosfat  (Merck), disodium  hidrogen  fosfat  (Merck),  Vitamin C, dan metanol pro analisis (Merck).
2.2.  Ektraksi Sel Spirulina Proses  ekstraksi  fikosianin  dilakukan dengan menggunakan pelarut 0,1 M PBS dan aquades. Ekstraksi dan pemurnian fikosianin Spirulina  dilakukan  berdasarkan  modifikasi metode yang dikembangkan oleh Hayashi et. al . dan Silveira et. al . 10,11 Spirulina yang telah dikeringkan
menjadi serbuk kering dilarutkan dengan masing-masing pelarut ekstraksi yang digunakan dengan konsentrasi masing- masing pelarut 4% (0,04 g/mL). Selanjutnya larutan disonikasi selama 30 menit dan shaker selama 24 jam. Larutan tersebut disentrifugasi 12.000 rpm, suhu 4 0 C selama 25 menit hingga menghasilkan suatu endapan dan supernatan. Fikosianin yang merupakan komponen yang terlarut dalam pelarut akan  terakumulasi dalam supernatan yang dihasilkan. Kemudian, supernatan tersebut dipisahkan.

## 2.3.  Penyiapan Fraksi-fraksi Protein
Kompleks
Supernatan yang dihasilkan selanjutnya dilarutkan dengan larutan 0,025 M PBS untuk diendapkan dalam 30% dan 70% (NH 4)2 SO 4 . Prinsip pengendapan dengan ammonium sulfat berdasarkan pada kelarutan protein yang merupakan interaksi antara gugus polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam dan daya tolak-menolak protein yang bermuatan sama. 12 Endapan protein yang salah satu proteinnya adalah fikosianin  dipisahkan  melalui  sentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm dengan suhu 4 0 C selama 10 menit. Kemudian, endapan tersebut dilarutkan dengan menggunakan 0,025  M  PBS  pH  7  untuk  didialisis  dengan menggunakan kantong selofan yang direndam dalam PBS 0,025 M pH 7 diatas penangas es. Dialisat yang dihasilkan dikeringbekukan menggunakan freeze dryer .
2.4.  Uji Rendemen dan Kemurnian Ekstrak Fikosianin dalam Fraksi Protein Kompleks
Seluruh filtrat dari kedua jenis Spirulina ditimbang 0,05 g dan dilarutkan dengan 0,025 M PBS pH 7 sebanyak 500 µl  (konsentrasi 0,1 µg/ml). Setelah itu diencerkan menggunakan 0,001 M PBS pH 7 dengan pengenceran 10X. Uji  kemurnian  dan  konsentrasi  fikosianin ini dilakukan dengan melihat absorbansi pada panjang gelombang 280, 615, 620, dan 652 nm. Untuk mengetahui rendemen dan kemurnian  ekstrak  fikosianin  dapat  diukur berdasarkan rumus berikut ini:
PC : Phycocyanin Concentration PP : Phycocyanin Purity
Untuk menghitung hasil rendemen ekstraksi digunakan rumus :
V  adalah  volume  pelarut  (mL),  dan massa adalah berat serbuk kering hasil pengendapan yang telah dikeringbekukan (mg). 11
2.5.  Uji Aktivitas Antioksidan Pengujian aktivitas antioksidan S. platensis dan S. fusiformis dilakukan dengan menggunakan DPPH mengacu pada  metode  Molyneux. 13 Sampel uji yang merupakan hasil dari pengendapan yang telah dikeringbekukan ditimbang 0,05  g dan dilarutkan dalam metanol p.a 50 mL lalu diencerkan menjadi 200, 400, 600, dan 800 ppm. Sebagai pembanding, vitamin c 2,5 mg dilarutkan dalam metanol p.a 50 mL dan diencerkan menjadi 2,4,6, dan 8 µg/mL. Pengukuran absorbansi sampel dilakukan dengan mencampurkan 2 mL larutan uji kedua jenis Spirulina dalam berbagai konsentrasi dengan larutan DPPH 40 ppm sebanyak 3 mL, dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yaitu 515 nm. Harga IC 50 dihitung dari kurva regresi linier antara % inhibisi serapan dengan berbagai konsentrasi larutan uji dengan rumus :

## 3.  Hasil
3.1.  Hasil Rendemen Ekstrak Fikosianin pada S. platensis dan S. fusiformis Setelah melakukan ekstraksi sel S.
platensis dan S. fusiformis yang dilakukan dengan menggunakan berbagai macam pelarut, perhitungan rendemen dan kemurnian  fikosianin  dapat  ditentukan melalui absorbansi yang dihasilkan pada panjang gelombang 620 nm yang merupakan karakteristik panjang gelombang fikosianin. 13
Hasil rendemen ekstrak fikosianin pada kedua Spirulina ditampilkan pada Gambar 1. Dan hasil  kemurnian  fikosianin  ditunjukan  pada Gambar 2.
Hasil perhitungan kemurnian yang berasal dari rumus perbandingan abosbansi pada 620 nm dan abosrbansi 280 nm ekstrak fikosianin dapat dilihat Gambar 2.

## 3.2.  Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dari
Fikosianin S. platensis dan S. fusiformis
Hasil perhitungan nilai IC 50 dari sampel  ekstrak  fikosianin S. platensis dan S. fusiformis , dengan pembanding sebagai kontrol positif adalah larutan vitamin C dapat dilihat pada Tabel 1.
4.  Pembahasan
4.1.  Rendemen Ekstrak Fikosianin pada S . platensis dan S. fusiformis Berdasarkan pada Gambar 1, S.
fusiformis mengandung rendemen fikosianin dalam protein kompleks hasil fraksinasi lebih tinggi dibandingkan S. platensis pada kedua pelarut yang digunakan dengan konsentrasi pengendapan (NH 4)2 SO 2 30% dibandingkan (NH 4)2 SO 4 70%. Pelarut aquades dan PBS tidak memberikan perbedaan rendemen yang jauh dalam mengekstrak sel S. platensis maupun S. fusiformis untuk  menghasilkan  fikosianin dalam komplek protein yang diekstrak. Hal ini disebabkan karena kedua sifat pelarut tersebut adalah polar sesuai dengan sifat biomassa Spirulina yang juga polar sehingga kedua pelarut tersebut memiliki kemampuan yang hampir sama dalam mengekstrak sel Spirulina. 14
Ammonium sulfat yang bersifat menarik air menjauh dari protein akan meningkatkan jumlah protein yang saling berinteraksi dan mengendap pada konsentrasi yang optimum.  Meningkatnya  jumlah  konsentrasi ammonium sulfat juga meningkatkan jumlah protein yang mengendap, namun dengan bertambahnya konsentrasi ammonium sulfat tersebut tidak memberikan rendemen yang lebih baik. Konsentrasi ammonium sulfat 30% merupakan konsentrasi yang lebih
Gambar 1. Hasil  rendemen  ekstrak  fikosianin  dalam  protein  kompleks  pada  S.  plantesis  dan  S. fusiformis
Ket: 30% : konsentrasi amonium sulfat yang digunakan adalah 30% 70% : konsentrasi amonium sulfat yang digunakan adalah 70% Aquadest : pelarut yang digunakan adalah aquadest PBS : pelarut yang digunakan adalah PBS
S. plantesis : Spirulina yang diekstrasi adalah S. plantesis S. fusiformis : Spirulina yang diekstraksi adalah S. fusiformis
optimum dalam tahap awal fraksinasi ekstrak protein komplek yang mengandung fikosianin dibandingkan konsentrasi 70%.
4.2.  Hasil Perhitungan Kemurnian Ekstrak Fikosianin pada S. platensis dan S. fusiformis Panjang gelombang 620 nm merupakan karakteristik  panjang  gelombang  fikosianin sedangkan panjang gelombang 280 nm merupakan panjang gelombang dari protein. 11
S. fusiformis memiliki kemurnian  ekstrak fikosianin  lebih  tinggi  dibandingkan S.
platensis pada kedua pelarut yang digunakan dengan konsentrasi pengendapan (NH 4)2 SO 2 30% dibandingkan (NH 4)2 SO 4 70%. Kemurnian  ekstrak  fikosianin  pada kedua jenis Spirulina  menghasilkan nilai yang lebih tinggi pada pelarut PBS dibandingkan aquades.  Ini menunjukan bahwa pelarut PBS menarik fikosianin lebih murni dibandingkan pelarut aquades pada kedua jenis Spirulina. Hal ini didukung oleh Satyantini, et al . yang menyatakan bahwa pelarut buffer fosfat adalah pelarut terbaik untuk ekstraksi fikosianin. 15 Apabila dibandingkan dengan nilai
Gambar 2. Hasil perhitungan kemurnian ekstrak fikosianin dari S. plantesis dan S. fusiformis
Tabel 1. Nilai IC50 Sampel dan Pembanding
Sampel Uji Kons. (ppm) Persen Inhibisi (%) Persamaan Regresi Linier IC50 (ppm) Spirulina plantesis 200 33,16 y = 0,0856x + 16,842 387,36 400 52,09 600 68,74 R= 0,9985 800 84,69 Spirulina fusiformis 200 44 y = 0,0823x + 24,369 311,43 400 55,94 600 67,91 R= 0,9558 800 94,54 Vitamin C (Pembanding) 2 12,59 y = 11,429x – 7,2743 5,011 4 37,87 6 71,33 R= 0,9442 8 77,61
kemurnian  ekstrak  fikosianin  dari  penelitian yang dilakukan oleh Satyantini, et al . yang mendapatkan hasil sebesar 0,9024 pada S. platensis dengan pelarut PBS, nilai kemurnian esktrak fikosianin yang diperoleh dari S. platensis maupun S. fusiformis pada pelarut PBS memberikan nilai yang lebih tinggi. Satyantini, et al. melakukan ekstraksi fikosianin  pada  suhu  ruang. 16 Sedangkan penelitian ini dilakukan pada suhu yang dijaga tetap rendah (±4 0 C).  Hal  tersebut  diduga karena fikosianin merupakan pigmen protein yang kestabilannya sangat dipengaruhi oleh suhu dan pH dan sifat fikosianin yang tidak stabil pada suhu tinggi sehingga ekstraksi fikosianin  pada  suhu  rendah  lebih  efisien dibandingkan suhu ruang yang lebih tinggi. 17

## 4.3.  Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dari
Fikosianin S. platensis dan S. fusiformis Optimasi pengukuran senyawa antiradikal DPPH dilakukan dengan penentuan panjang gelombang maksimum yang diperoleh yaitu pada 515 nm, operating time larutan DPPH dalam methanol  yaitu 35- 40 menit, dan waktu inkubasi untuk vitamin C dan fikosianin adalah 90 menit.
Parameter yang digunakan dalam aktivitas antioksidan dengan menggunakan DPPH adalah IC 50 atau Inhibition Concentration yaitu konsentrasi ekstrak  yang mampu meredam aktivitas DPPH sebanyak 50%. Berdasarkan hasil tersebut S. fusiformis yang memiliki kemurnian ekstrak fikosianin lebih tinggi dibandingkan S. platensis juga memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi. Sedangkan vitamin c menghasilkan IC 50 yang jauh lebih kecil dibandingkan kedua jenis Spirulina tersebut, hal ini disebabkan karena vitamin C merupakan senyawa yang murni dibandingkan dengan zat aktif fikosianin dari Spirulina.
Hasil aktivitas antioksidan pada S. fusiformis pada penelitian ini menghasilkan nilai yang lebih besar dibandingkan penelitian sebelumnya yang dilakukan Saputra dengan hasil persen inhibisi 5,920% pada konsentrasi 2000 ppm. Sedangkan pada penelitian ini persen inhibisi sudah mencapai >30% pada
konsesntrasi 200 ppm. Hal ini disebabkan karena pada penelitian ini dilakukan tahap awal pemurnian fikosianin melalui fraksinasi ekstrak  fikosianin  dengan  menggunkan (NH 4)2 SO 2 dan dialisis sehingga memberikan aktivitas antioksidan yang jauh lebih besar dan dilakukan  pula  tahap  pemurnian  fikosianin sehingga memberikan aktivitas antioksidan yang jauh lebih besar

## 5.  Simpulan
Metode ekstraksi menggunakan pelarut PBS ( Phosphate  Buffer  Solution ) 0,1 M pH 7 merupakan metode yang paling efektif dengan pengendapan ammonium sulfat 30% yang menghasilkan nilai kemurnian ekstrak  fikosianin  tertinggi  yaitu  1,5604 pada Spirulina fusiformis dan 1,0327 pada Spirulina platensis . Berdasarkan pengujian aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH, Spirulina fusiformis memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan dengan Spirulina platensis dengan nilai 311,43 ppm dan 387,36 ppm masing-masingnya.

## Daftar Pustaka
1.  Winarsi, H. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas: Potensi dan Aplikasinya dalam Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius. 2007 : 13-15
2.  Kumalaningsih, Sri. Antioksidan Alami- Penangkal Radikal Bebas. Surabaya: Trubus Agrisarana. 2006;7-86.
3.  Benedetti S, Benvenuti F, Pagliarani S, Francogli S, Scoglio S, Canestrari F. Antioxidant properties of a novel phycocyanin extract from blue-green alga  Aphanizomenon  flos-aquae.  Life Sciences. 2004;75: 2353-2362.
4. Chopra K, Bishnoi M. Antioxidant profile of Spirulina: a blue green microalga. Perancis: CRC Press. 2007;100:1137- 1143
5. Wang  L,  Pan  B,  Sheng  J,  Xu  J,  Hu  Q. Antioxidant activity of Spirulina platensis extracts by supercritical carbon dioxide extraction. Food Chemistry. 2007;105:
36-41.
6.  Barus, Dita Agustina. Kandungan

## Fikosianin, Protein, Dan Antioksidan
Spirulina platensis Yang Ditumbuhkan Dalam  Media  Dan  Umur  Kultivasi Berbeda.  (Skripsi).  Bogor:  Program Studi Teknologi Hasil Perikanan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor.  2013.
7.  Saputra, Andika Tri. Komposisi Kimia Dan Pigmen Spirulina Fusiformis Pada Umur  Panen  Yang  Berbeda.  (Skripsi). Bogor: Program Studi Teknologi Hasil Perikanan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor. 2009.
8. McCarty,  M.F.  Clinical  potential  of spirulina as a source of phycocyanobilin. Journal  of  Medicinal  Food.  2007;10(4): 566-570.
9. Marxen,  K.,  Heinrich,  K.,  Lippemeier, S., Hintze, R., Ruser, A., dan Hansen,U. Determination of DPPH Radical Oxidation Caused by Methanolic Extracts of Some Microalgal Species by Linear Regression Analysis of Spectrophotometric Measurements.  Sensors.  2007;7:2080-
2095.
10. Hayashi, O., S. Ono, K. Ishii, Y.H. Shi, T. Hirahashi and T Katoh. Enhancement of proliferation  and  differentiation  in  bone marrow hematopoietic cells by Spirulina (Arthrospira) platensis in mice. Journal of Applied Phycology. 2006;18:47-56.
11. Silveira,  S.T.,  J.F.M  Burkert,  J.A.V Costa, C.A.V Burkert and S.J Kalil.
Optimization of phycocyanin extraction from Spirulina platensis using factorial design. Bioresources Technology. 2007;98: 1629-1634.
12. Lehninger, Albert. Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga. 2008; 877-939 13. Molyneux P. The use of stable free radical diphenylpicrylhydrazyl  (DPPH)  for sstimating antioxidant activity. Journal of Science Technology. 2004;26: 211-219.
14. Boussiba, S; Richmod, A. Isolation and Purification  of  Phycocyanin  from  the Blue Green Alga Spirulina platensis. Arch Microbiol. 1979;120:155-159.
15. Arlyza, I.S. Isolasi Pigmen Biru Phicocyanin  dari  Mikroalga  Spirulina platensis. Oseanologi dan Limnoogi. Indonesia. 2005;38:79-92
16. Satyantini, Woro H., Sukenda, Enang Harris, dan Nur Bambang P. Teknik Produksi, Ekstraksi Dan Karakterisasi Fikosianin Spirulina platensis Sebagai Bahan Imunostimulan. Oseanologi dan Limnologi di Indonesia. 2014;40(2): 119- 131
17. Yan,  S.,  Zhu  LP,  Su  HN,  Zhang  XY, Chen XL, Zhou BC, Zhang YZ. Single- step chromatography for simultaneous purification  of  C-phycocyanin  and allophycocyanin with high purity and recovery  from  Spirulina  (Arthrospira) platensis. J. Appl. Phycol. 2011.; 23: 1-6.