UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT, KLOROFORM, PETROLEUM ETER, DAN N-HEKSANA HASIL HIDROLISIS EKSTRAK METANOL MIKROALGA Chlorella sp .

## Ony Novia Anggraeni, A. Ghanaim Fasya, Munirul Abidin, A. Hanapi
Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang

## ABSTRACT
Qur'an surah Luqman verse 10 says that God created plants that are beneficial to humans. Chlorella sp. was  kind  of  microalgae  that  contains  bioactive  antioxidant  components.  Purpose  of  this  research  was  to determine  the  antioxidant  activity  of  fraction  of  ethyl  acetate,  chloroform,  petroleum  ether  and  n-hexane  as results of hydrolysis of the methanol extract of microalgae Chlorella sp., and active compound of Chlorella sp . that identification by reagents test and thin layer chromatography (TLC).
Chlorella sp . was cultivated in Tauge Extract Medium (TEM) 4 % and harvesting at 10 th day. Chlorella sp. macerated  using  methanol  and  hydrolyzed  with  HCl  2N  as  catalyst.  Furthermore,  partitioned  using  the solvent: n-hexane, petroleum ether, chloroform, and ethyl acetate. Antioxidant activity  was estimated by DPPH assay with spectrofotometry UV-Vis. Identification of the active compound groups conducted with test reagents and TLC.
The  results  showed  that  the  EC 50 value  of  methanol  extract , the  fraction  of  ethyl  acetate,  chloroform, petroleum  ether,  n-hexane,  and  the  aqueous  phase  as  follows  1,334;  332.7; 182;  27.26; 173.7;  and  1,411  ppm. The  identification  result  of  active  compound  showed  that  the  extract of  Chlorella  sp. containing  steroids  and ascorbic acid. Good eluents of TLC for steroids are hexane:acetone (7:3) and n-hexane:ethyl acetate (7:3). The best eluent for TLC for ascorbic acid is ethanol: 10% acetic acid (9:1).
Keywords : Chlorella sp ., Hydrolysis, Antioxidant, DPPH, TLC

## ABSTRAK
Al  Qur’an  surat  Luqman  ayat  10  menyebutkan  bahwa  Allah  menciptakan  tumbuh-tumbuhan  yang bermanfaat  bagi  manusia. Chlorella  sp. merupakan  jenis  mikroalga  yang  mengandung  komponen  bioaktif sebagai  antioksidan.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  aktivitas  antioksidan  fraksi  etil  asetat, kloroform,  petroleum  eter  dan  n-heksana  hasil  hidrolisis  ekstrak  metanol  mikroalga Chlorellasp., serta mengetahui  golongan  senyawa  yang  terdapat  pada  ekstrak  mikroalga Chlorellasp. hasil  identifikasi  dari  uji reagen dan kromatografi lapis tipis.
Chlorella  sp .  dikultivasi  dalam  MET  4  %  dan  pemanenan  dilakukan  pada  hari  ke-10. Chlorella  sp . dimaserasi  menggunakan  metanol  dan  dihidrolisis  dengan  katalis  HCl  2N.  Selanjutnya  dipartisi  menggunakan pelarut n-heksana, petroleum eter, kloroform, dan etil asetat.Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH  secara  spektrofotometri UV-Vis .  Identifikasi  golongan  senyawa  aktif  dilakukan  dengan    uji  reagen  dan KLTA.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  nilai  EC 50 ekstrak  metanol Chlorella  sp .,  fraksi  etil  asetat, kloroform, petroleum eter, n-heksana, danfasa air berturut-turut 1.334; 332,7; 182; 27,26; 173,7; dan 1.411 ppm. Hasil identifikasi golongan senyawa aktif  dengan uji reagen dan KLTA menunjukkan bahwa  ekstrak Chlorella sp .  mengandung  steroid  dan  asam  askorbat.  Eluen  yang  baik  untuk  KLT  steroid  adalah  n-heksana:aseton  (7:3) dan n-heksana:etil asetat (7:3). Eluen terbaik untuk KLT asam askorbat adalah etanol p.a.:asam asetat 10% (9:1).
Kata kunci : Chlorella sp ., Hidrolisis, Antioksidan, DPPH, KLT
.

## I. PENDAHULUAN
Firman  Allah  Swt.  surat  Luqman  ayat 10 menjelaskan bahwa Allah telah menciptakan  berbagai  macam  binatang  dan tumbuh-tumbuhan yang dapat dimanfaatkan oleh  manusia  dalam  berbagai  keperluan. 1

## Salah  satunya  adalah  mikroalga  jenis
Chlorella sp..
Chlorella  sp. merupakan  tumbuhan ganggang hijau bersel tunggal yang tumbuh dapat  di  air  tawar,  air  payau,  dan  air  asin.
Berdasarkan cara pembudidayaan, Chlorella sp . memiliki beberapa keunggulan  diantaranya  berkembang  biak dengan cepat, mudah
dalam membudidayakannya 2 karena  hidupnya
tidak  tergantung  musim,  tidak  memerlukan tempat  yang  luas  dan  tidak  memerlukan waktu yang lama untuk memanennya 3 . Pembudidayaan Chlorella  sp .  dapat dilakukan  dengan  cara  kultivasi  dalam Medium  Ekstrak  Tauge  (MET).  MET  ini merupakan  salah  satu  media  alami  untuk pertumbuhan mikroalga. MET mengandung nutrient organik seperti karbohidrat, protein, vitamin dan lemak yang dibutuhkan  sebagai  sumber  energi  bagi pertumbuhan mikroalga. MET juga memberikan  pertumbuhan yang  pesat terhadap  mikroalga  dibandingkan  pada MAL  (Medium  Air  Laut)  dan  MG (Medium Guillard). 4
Chlorella sp . yang telah dibudidayakan dapat  dimanfaatkan  di  berbagai  keperluan diantaranya sebagai sumber energi alternatif,  pangan  sehat  dan  suplemen. Chlorella sp. mengandung berbagai nutrien seperti protein, karbohidrat, asam lemak tak jenuh,  vitamin,  klorofil,  enzim,  dan  serat yang tinggi. 5 Chlorella sp. juga mengandung  klorofil a ,  klorofil b ,  serta karotenoid.  Klorofil  dan  karotenoid  ini dapat berfungsi sebagai antioksidan.
Antioksidan  memiliki  peranan  penting dalam  mencegah  oksidasi  radikal  bebas yang dapat menyebabkan berbagai penyakit seperti  karsinogenik  dan  penuaan. 6 Saat  ini antioksidan yang umum digunakan merupakan  antioksidan  sintetik  diantaranya Butylated hydroxyanisole (BHA), Butylated hydroxytoluene (BHT), Propylgallate (PG)
dan Tert-Butylhydroquinone (TBHQ). 7
Akan  tetapi,  senyawa  tersebut  dicurigai dapat  menyebabkan  keracunan  dan  efek karsinogenik. 8,9,10
Oleh karena itu, pengembangan serta pemanfaatan antioksidan alami yang lebih efektif penting untuk dilakukan . 11 Senyawa
antioksidan dalam Chlorella  sp. kebanyakan  berasal  dari senyawa-senyawa  metabolit  sekunder  yang dihasilkan  pada  fase  stationer.  Fase stasioner pada kurva pertumbuhan Chlorella  sp. yaitu  hari  ke-10  memiliki bioaktivitas  tertinggi  dibandingkan  dengan fase lainnya. 12
Ekstrak metanol Chlorella sp. mempunyai  nilai  EC 50 yang  kecil  yaitu 18,610 ppm 13 menunjukkan bahwa
Chlorella sp. berpotensi sebagai antioksidan.  Senyawa-senyawa  antioksidan yang terkandung dalam mikroalga Chlorella sp. umumnya merupakan senyawa  metabolit  sekunder.  Metabolit sekunder  ini  kebanyakan  di  alam  berupa glikosida.  Penelitian  aktivitas  antioksidan terhadap  mikroalga Eucheuma  spinosum dengan  metode  DPPH  dengan  parameter EC 50 menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan  ekstrak  yang  telah  dihidrolisis adalah  lebih  besar  dibandingkan  sebelum dihidrolisis. 14

## II. METODOLOGI Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kimia Organik,
Laboratorium  Bioteknologi  Jurusan  Kimia dan  Laboratorium  Fisiologi  Tumbuhan Jurusan  Biologi  Universitas  Islam  Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang pada bulan November 2013 – April 2014.
Alat
Seperangkat alat gelas, autoklaf, inkubator,  neraca  analitik,  cawan  porselen, desikator, shaker , rotary evaporator vacuum ,  kuvet,  aluminium  foil, sentrifuse , spektofotometer UV-Vis Varian Carry , dan spektronik 20+ .

## Bahan
Isolat  mikroalga Chlorella  sp. dari Laboratorium  Fisiologi  Tumbuhan  jurusan Biologi    UIN    Maulana  Malik  Ibrahim Malang.  Bahan-bahan  lain  yang  digunakan adalah  metanol p.a ,  etil  asetat p.a , kloroform p.a ,  petroleum  eter,  n-heksana p.a ,  tauge  (kacang  hijau),  akuades,  larutan DPPH  0,2  mM,  HCl  2  N,  anhidrida  asetat, asam  sulfat  pekat,  serbuk  Mg,  HCl  37  %, HCl 2 %, etanol 95 %, etanol 99 %, natrium karbonat, reagen  Dragendorff, reagen Mayer, reagen Limberman-Burchard,
vitamin C, dan BHT.
Metode Penelitian A. Kultivasi Mikroalga Chlorella sp.
1. Sterilisasi Alat
Alat-alat  yang  akan  disterilkan  ditutup dengan alumunium foil. Kemudian dimasukkan  ke  dalam  autoklaf  dan  diatur pada  suhu  121 o C  dengan  tekanan  15  psi (per square inchi) selama 15 menit. 15

## 2. Pembuatan Medium Ekstrak Tauge
Pembuatan  medium  ekstrak  tauge diawali  dengan  pembuatan  larutan  stok MET  yaitu  100  gram  tauge  direbus  dalam 500  mL  akuades  yang  mendidih  selama  1 jam  hingga  volume  ekstrak  200  mL. Medium  ekstrak  tauge  4  %  (v/v)  sebanyak 600  mL  dibuat  dengan  cara  melarutkan  24 mL ekstrak tauge ke dalam akuades 576 mL dalam erlenmeyer 1000 mL, tanpa perlakuan pH. 16
3. Kultivasi Chlorella sp. dalam Media Ekstrak Tauge
Sebanyak  100  ml  isolat Chlorella  sp. diinokulasikan  ke  dalam  masing-masing 600  mL  MET  dalam  erlenmeyer  1000  mL yang  ditempatkan  pada  rak  yang  telah dilengkapi dengan
pencahayaan
menggunakan lampu TL 36 watt (intensitas cahaya 1000 – 4000 lux) dan fotoperiodisitas  14  jam  terang  dan  10  jam gelap selama 10 hari. 16
B. Pemanenan Biomassa Chlorella sp . Media kultur Chlorella sp.
disentrifugasi  selama  15  menit  dengan kecepatan  3000 rpm .  Biomassa Chlorella sp . dipisahkan dari supernatannya.

## C. Preparasi Sampel
Sampel biomassa Chlorella sp . diambil seluruhnya kemudian dikeringanginkan pada suhu ruang, 25 – 30 0 C selama 48 jam.
D. Penentuan Kadar Air
Cawan yang akan digunakan dipanaskan  dahulu  dalam  oven  suhu  100– 105  °C  selama  15  menit,  kemudian  cawan disimpan  dalam  desikator  10  menit, ditimbang  dan  dilakukan  perlakuan  yang
sama  hingga  diperoleh  berat  cawan  yang konstan.  Biomassa Chlorella  sp. ditimbang 1  mg  kemudian  dimasukkan  ke  dalam cawan dan dikeringkan di dalam oven suhu 100  –  105  ºC  selama  30  menit,  kemudian dimasukkan dalam desikator, ditimbang dan dilakukan  perlakuan  yang  sama  hingga diperoleh berat cawan yang konstan. Kadar air dihitung menggunakan rumus:
Kadar air  = (b - c) b - a × 100%
Dimana: a = bobot cawan kosong
b = bobot sampel + cawan sebelum dipanaskan
c = bobot cawan + sampel setelah dipanaskan

## E. Ekstraksi Senyawa Aktif Mikroalga
Chlorella sp.
Biomassa Chlorella sp. kering 50 gram dimaserasi  dengan  pelarut  metanol p.a 250 mL  selama  24  jam  dan  di shaker selama  5 jam.  Maserasi  dilakukan  tiga  kali.  Setelah itu  dipisahkan  antara  filtrat  dengan  residu. Filtrat  yang  diperoleh  dipekatkan  dengan rotary  evaporator  vacuum dan  dialiri  gas N 2 hingga diperoleh ekstrak pekat metanol, kemudian  dihitung  rendemennya  dengan rumus:
Rendemen = Berat ekstrak kasar yang diperoleh Berat sampel yang digunakan ×100 %
F. Hidrolisis dan Partisi Ekstrak Pekat Metanol Mikroalga Chlorella sp.
Ekstrak  pekat  metanol  sebanyak  1 gram  dihidrolisis  dengan  katalis  HCl  2N sebanyak  2  mL  dan  distirrer  selama  1  jam dengan hot  plate  stirrer .  Selanjutnya ditambahkan  natrium  bikarbonat  hingga pH-nya  netral.  Kemudian  dipartisi  secara bertingkat dengan pelarut n-heksana, petroleum  eter,  kloroform,  dan  etil  asetat. Masing-masing  fraksi  pelarut  (hasil  partisi) dipekatkan  dengan rotary  evaporator dan dialiri gas N 2 . Selanjutnya dihitung rendemennya dengan rumus:
Rendemen = Berat ekstrak kasar yang diperoleh Berat sampel yang digunakan × 100 %

## G. Uji Aktivitas Antioksidan dengan
DPPH ( 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ) 1. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Etanol  95  %  dipipet  sebanyak  6,75 mL  kemudian  ditambahkan  larutan  DPPH 0,2 mM sebanyak 2,25 mL, dimasukkan ke dalam  tabung  reaksi  kemudian  dimasukkan ke  dalam  kuvet  hingga  penuh.  Selanjutnya dicari  λ maks larutan  dan  dicatat  hasil pengukuran  λ maks untuk  digunakan  pada tahap selanjutnya. 17

## 2. Penentuan Waktu Kestabilan Pengukuran Antioksidan
Larutan  tiap  fraksi  30  ppm  dipipet sebanyak 6,75 mL dan ditambahkan larutan DPPH  0,2  mM  sebanyak  2,25  mL. Kemudian  waktu  kestabilan  dicari  tanpa inkubasi dan setelah inkubasi pada suhu 37 ºC  dan  rentangan  waktu  5  –  100  menit dengan  interval  5  menit.  Sampel  diukur menggunakan  spektronik  20+  pada  λ maks yang telah diketahui pada tahap sebelumnya. 13

## 3. Pengukuran Potensi Antioksidan Pada Sampel
Sampel ekstrak dilarutkan dalam etanol 95 % dengan konsentrasi  5, 10, 15, 20, 25, dan  30  ppm.  Ekstrak  masing-masing konsentrasi dipipet 6,75 mL dan ditambahkan  2,25  mL  DPPH  0,2  mM kemudian  diinkubasi  dengan  suhu  37 o C pada waktu  kestabilan  yang diperoleh pada tahap sebelumnya, kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang gelombang  518,0  nm.  Data  absorbansinya yang  diperoleh  dari  tiap  konsentrasi masing-masing ekstrak dihitung nilai persen (%) aktivitas antioksidannya: 18 == ( A kontrol–A sampel A kontrol ) × 100 %
Kontrol  yang  digunakan  yaitu  Larutan DPPH  0,2  mM  sebanyak  2,25  mL  dalam 6,75  mL  etanol  95  % . Pembanding  BHT dan asam askorbat (Vitamin C) diperlakukan seperti sampel.
H. Identifikasi Golongan Senyawa Aktif

## Secara Kualitatif dengan Reagen
1. Uji Terpenoid dan Steroid
Ekstrak  kasar  diambil  dan  dilarutkan dengan  kloroform  sebanyak  0,5  mL,  lalu ditambah  dengan  0,5  mL  anhidrida  asetat. Selanjutnya  ditambah  dengan  1  –  2  mL H 2 SO 4 pekat  melalui  dinding  tabung tersebut.
Warna hijau kebiruan menunjukkan  adanya  steroid,  jika  berupa cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut menunjukkan adanya triterpenoid. 19

## 2. Uji Flavonoid
Ekstrak  dilarutkan  dalam  1  –  2  mL metanol  panas  50  %,  kemudian  ditambah logam Mg dan 0,5 mL HCl pekat. Senyawa flavonoid  akan  menimbulkan  warna  merah atau jingga. 20

## 3. Uji Alkaloid
Ekstrak  kasar  ditambah  0,5  mL  HCl  2 %,  selanjutnya  larutan  dibagi  dalam  dua tabung.  Tabung  I  ditambahkan  2  –  3  tetes reagen Dragendorff, tabung II ditambahkan 2  –  3  tetes  reagen  Mayer.  Jika  tabung  I terbentuk  endapan  jingga  dan  pada  tabung II  terbentuk  endapan  kekuning-kuningan menunjukkan adanya alkaloid. 20

## 4. Uji Asam Askorbat
Masing-masing ekstrak dilarutkan dalam  akuades  kemudian  ditambahkan larutan KMnO 4 0,1 %. Jika terbentuk warna cokelat  maka  menunjukkan  adanya  asam askorbat. 21 13

## I. Uji Senyawa Aktif dengan KLTA
Uji  senyawa  aktif  dengan  KLT dilakukan terhadap golongan senyawa yang positif  dari  hasil  uji  senyawa  aktif  dengan uji  reagen  dan  memiliki  nilai  EC 50 paling rendah. Identifikasi dengan KLT digunakan plat  silika  gel  F 254 yang  sudah  diaktifkan dengan  pemanasan  dalam  oven  pada  suhu 60-80 ○ C  selama  30  menit.  Masing-masing plat  dengan  ukuran  1x10  cm 2 .  Ekstrak Chlorella sp. ditotolkan pada jarak  ± 1 cm dari  tepi  bawah  plat  dengan  pipa  kapiler. Noda/bercak  hasil  pemisahan  kemudian diamati  di  bawah  sinar  UV  pada  panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.
Aktivitas antioksidan
KLTA  untuk golongan  senyawa steroid menggunakan eluen n-
heksana:aseton (7:3), 22 n-heksana:etil asetat (9:1), 23 n-heksana:etil  asetat  (8:2), 24 n- heksana:etil  asetat  (6:4), 24 n-heksana:etil asetat  (7:3), 25 dengan  pereaksi  Lieberman Buchard dideteksi di bawah lampu UV 366 nm.  KLTA  asam  askorbat  menggunakan eluen    etanol  :  asam  asetat  10  %    (9:1), 20 etanol : asam asetat glasial (9:1), etanol:asam asetat 1% (9:1), 26 etanol : asam asetat  glasial  :  toluen  (5,5:1:1,5), 27 etil asetat  :  asam  asetat  glasial  :  asam  format  : air  (6:1:1:2), 28 dilihat  dibawah  lampu  UV 254  nm  menghasilkan  spot  biru  gelap- hitam.  Tetapi  sebagai  perbandingan,  hasil elusi  juga  dideteksi  di  bawah  lampu  UV 366 nm.

## J. Analisis Data
Analisis data dilakukan dengan menghitung persen (%) aktivitas antioksidan  dari  data  absorbansi  masing- masing  ekstrak  dan  pembanding  asam askorbat  (vitamin  C)  dan  BHT.  Nilai  EC 50 dihitung  dengan  menggunakan software “ GraphPad  prism6  software” dengan persamaan  regresi  non  linear  “ Regression for  analyzing  dose-response  data” yang menyatakan    hubungan    antara  log konsentrasi  ekstrak  (x)  dengan  persen  (%) aktivitas  antioksidan  (y). 13 Semakin  kecil nilai EC 50 maka semakin tinggi kemampuan ekstrak sebagai antioksidan.

## III.  HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Kultivasi Mikroalga Chlorella sp. Kultivasi Chlorella  sp. dilakukan dalam  Medium  Ekstrak  Tauge  (MET). MET mengandung unsur makro dan mikro, vitamin,  mineral  serta  asam  amino  yang dibutuhkan  bagi  pertumbuhan  mikroalga Chlorella  sp.. Unsur  hara  yang  terkandung dalam  MET  seperti  K,  P,  Ca,  Mg,  Fe,  Na, Zn,  Mn,  dan  Cu  sedangkan  vitamin  yang terkandung dalam media tersebut diantaranya  karoten,  thiamin,  riboflavin, niasin, dan vitamin C. 29
Chlorella  sp. dikultivasi  dalam MET  4  %  selama  10  hari.  Pencahayaan
menggunakan  lampu  TL  ( Tube  Lamp ) sebagai  pengganti  sinar  matahari  dengan fotoperiodisitas  14  jam  terang  dan  10  jam gelap  yang  bertujuan  untuk  mengatur pencahayaan dalam fotosintesis.
Temperatur selama kultivasi
Chlorella sp . adalah temperatur ruang  (25–
30  ºC).  Rostini  (2007) 30 menumbuhkan Chlorella sp. menggunakan medium air laut dengan  temperatur  berkisar  antara  20  –  27 ºC.
Penelitian  ini  menggunakan  MET  4 % tanpa perlakuan pH (pH ± 7) . Kisaran pH yang  sesuai  untuk  pertumbuhan  mikroalga yaitu 4,5 – 9,3. 16
Selama masa kultivasi terjadi perubahan  warna  kultur  yang  semula berwarna  hijau  kekuningan  menjadi  hijau tua  hingga  pada  hari  ke-10  kultivasi. Gradasi  warna  hijau  selain  menunjukkan peningkatan populasi sel Chlorella sp. , juga mengindikasikan peningkatan kadar klorofil yang  merupakan  pigmen  utama  yang terdapat dalam sitoplasma sel.
Gambar 1 Warna kultur Chlorella sp. pada hari berbeda
B. Pemanenan Mikroalga Chlorella sp. Pemanenan  biomassa Chlorella  sp. dilakukan pada hari ke-10 yang merupakan fase  stasioner  dari  fase  pertumbuhan Chlorella sp.. Kurva pertumbuhan mikroalga Chlorella  sp. menunjukkan bahwa  fase  stasioner  hari  ke-10  kepadatan sel Chlorella  sp. berada  dalam  jumlah  sel tertinggi,  yaitu  4.880.000  sel/mL  dengan aktivitas antibakteri yang tertinggi dibandingkan dengan fase lainnya. 12 Pada fase stasioner terjadi metabolisme  sekunder  yang  merupakan keseluruhan
proses sintesis dan perombakan  produk  metabolit  primer. 31 Contoh produk senyawa metabolit sekunder seperti senyawa fenol, alkaloid,
triterpenoid. 32
Gambar 2 Biomassa Chlorella sp. hasil pemanenan
C. Preparasi Sampel Preparasi  sampel  biomassa Chlorella sp. dilakukan  dengan  pengeringanginan selama  48  jam  menggunakan  kipas  angin. Pengeringanginan dengan kipas angin tidak menimbulkan  panas  dan  dapat  membawa uap  air yang  lebih  besar  daripada pengeringan  AC  dan blowerheat ,  sehingga proses pengeringan berlangsung lebih cepat sebelum  terjadinya  kerusakan  bahan. 33
Hasil yang diperoleh dari proses pengeringan adalah 12,0423 gram biomassa kering  dari  total  423,2000  gram  biomassa basah dan rendemennya 2,8455 %.

## D. Analisis Kadar Air
Penentuan  kadar  air  dilakukan  untuk mengetahui  kadar  air  yang  terkandung dalam  sampel.  Semakin  rendah  nilai  kadar air bahan maka akan semakin memudahkan pelarut  untuk  mengekstrak  komponen senyawa  aktif  yang  diinginkan.  Maksimum kadar  air  yang  disyaratkan  agar  proses ekstraksi dapat berjalan lancar yaitu sebesar 11%. 34 Kadar  air  dari  biomassa  kering Chlorella sp. adalah 7,8099 %.

## E. Ekstraksi Senyawa Aktif Mikroalga
Chlorella sp.
Ekstraksi Chlorella  sp. dilakukan dengan  metode  maserasi  menggunakan pelarut  metanol p.a. Hasil  rendemen ekstraksi  maserasi  ditunjukkan  pada  Tabel 2.
Tabel 2 Rendemen Ekstraksi Chlorella sp.

## Biomassa
(gram) Ekstrak (gram) Rendemen (%) (b/b) Warna Ekstrak Pekat 10,0001 1,3607 13,6069 Hijau tua pekat F. Hidrolisis dan Partisi Ekstrak Pekat Metanol Mikroalga Chlorella sp.
Senyawa-senyawa  antioksidan  yang terkandung  dalam  mikroalga Chlorella  sp. umumnya  merupakan  senyawa  metabolit sekunder.  Metabolit  sekunder  kebanyakan di  alam  berupa  glikosida  (mengandung komponen gula dan bukan gula). Pemutusan ikatan glikosida dapat dilakukan dengan  reaksi  hidrolisis  menggunakan katalis asam.
Ekstrak  pekat  metanol Chlorella  sp. dihidrolisis  dengan  katalis  HCl  2  N untuk mempercepat  pemutusan  ikatan  glikosida antara  senyawa  glikon  dan  aglikon.  Asam kuat  lebih  mudah  melepas  ion  H + secara sempurna  didalam  air.  Konsentrasi  ion  H + inilah yang mempengaruhi kecepatan reaksi pemutusan ikatan glikosida.
HCl
menghasilkan garam (NaCl) pada
penetralan yang tidak menimbulkan
gangguan.  Penetralan  hidrolisat  NaHCO 3 bertujuan  menghentikan  reaksi  hidrolisis yang reversible (dapat  balik).  Jika  reaksi tidak  dihentikan  maka  akan  terbentuk kembali  ikatan  glikosida  antara  glikon  dan aglikon. 35
Proses partisi dilakukan secara bertingkat  yaitu  dengan  pelarut  n-heksana, petroleum  eter,  kloroform  dan  etil  asetat. Proses  partisi  dengan  pelarut  yang  berbeda kepolaran  ini  dimaksudkan  agar  senyawa- senyawa  yang  memiliki  kepolaran  yang berbeda  dapat  terekstrak  ke  dalam  pelarut yang sesuai.
Pada  saat  proses  partisi  terbentuk  2 lapisan  yang  tidak  saling  bercampur  yaitu lapisan  fasa  air  yang  bersifat  polar  dan lapisan  fasa  organik  yang  bersifat  semi polar  atau  nonpolar.  Fasa  air  mengekstrak komponen  gula  (glikon)  sedangkan  fasa organik  mengekstrak  metabolit  sekunder (aglikon).  Hasil  rendemen  masing-masing fraksi terlihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Rendemen  masing-masing  fraksi  hasil partisi Fraksi Warna ekstrak pekat Rendemen (%) (b/b) n-Heksana Hijau kehitaman 45,6132 Petroleum eter Hijau kehitaman 8,1854 Kloroform Hijau kecoklatan 7,5573 Etil asetat Hijau 7,4377 Air Hijau 10,0897
Pelarut  n-heksana  memiliki  hasil rendemen  tertinggi  yaitu  sebesar  45,6132 %.  Hasil  memberikan  informasi  bahwa sebagian  besar  senyawa  pada  ekstrak metanol Chlorella sp. yang telah dihidrolisis  memiliki  kepolaran  sesuai dengan kepolaran n-heksana (non polar). G. Uji  Aktivitas  Antioksidan  dengan DPPH ( 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl )
1. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Hasil  penentuan  panjang  gelombang DPPH 0,2 mM diperoleh panjang gelombang maksimum sebesar 518,0 nm.
2. Penentuan Waktu Kestabilan Pengukuran Antioksidan
Pengukuran  waktu  kestabilan  penting dilakukan  karena  untuk  mengetahui  waktu sampel  dan  DPPH  sudah  bereaksi  secara stabil  yang  ditunjukkan  dengan  tidak adanya  lagi  penurunan  absorbansi.  Setiap senyawa  memiliki  waktu  kestabilan  yang berbeda  untuk  dapat  bereaksi  secara sempurna. 36
Penentuan  waktu  kestabilan  pada ekstrak  metanol,  hasil  partisi  fraksi  n- heksana,  petroleum  eter,  kloroform,  etil asetat, fasa air, serta pembanding BHT dan vitamin  C  dilakukan  tanpa  inkubasi  dan dengan inkubasi pada suhu 37 ºC selama 5 –  100  menit  (atau  sampai  diperoleh  batas atas waktu kestabilannya) dengan interval 5 menit.  Hasil  penentuan  waktu  kestabilan masing-masing  ekstrak  terhadap  DPPH menggunakan inkubasi pada suhu 37 ºC dan tanpa inkubasi disajikan pada Tabel 4.
Hasil  penentuan  waktu  kestabilan masing-masing  ekstrak  waktu  kestabilan yang  lebih  cepat  dicapai  dan  nilai absorbansi  yang  lebih  stabil  dibandingkan
tanpa inkubasi.
Sampel dengan menunjukkan bahwa sampel yang ditambahkan  DPPH  dengan  inkubasi  pada suhu  37  ºC  memiliki  inkubasi  cenderung lebih  stabil  dan  memiliki  penurunan  nilai absorbansi  yang lebih rendah dibandingkan tanpa inkubasi. 37
Tabel 4 Waktu kestabilan masing-masing ekstrak Sampel Waktu kestabilan dengan inkubasi (menit) tanpa inkubasi (menit) Vitamin C 25-50 40-65 BHT 35-75 65-90 Metanol 15-65 60-95 n-Heksana 45-90 55-85 Petroleum Eter 55-85 65-95 Kloroform 55-90 75-105 Etil Asetat 60-90 85-120 Fasa Air 55-95 75-120 3. Pengukuran Potensi Antioksidan pada Mikroalga Chlorella sp.
Uji  kuantitatif  potensi  antioksidan pada  ekstrak Chlorella  sp. dilakukan dengan  uji  DPPH  secara  spekrofotometri sinar  tampak.  Metode  ini  didasarkan  pada perubahan  warna  radikal  DPPH  dari  ungu menjadi  kuning  yang  disebabkan  oleh reaksi  antara  radikal  bebas  DPPH  dengan satu  atom  hidrogen  yang  dilepaskan senyawa  yang  terkandung  dalam  bahan  uji untuk  membentuk  senyawa 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazin yang berwarna kuning. Pada metode  ini  absorbansi  yang  diukur  adalah absorbansi  larutan  DPPH  sisa  yang  tidak bereaksi dengan senyawa antioksidan. 38 Pengujian potensi antioksidan dilakukan  pada  semua  fraksi  ekstrak Chlorella  sp. dan  pembanding  yaitu  BHT dan vitamin C (asam askorbat). Pengukuran potensi  antioksidan  dari  masing-masing sampel dilakukan dengan variasi konsentrasi  5,  10,  15,  20,  25,  dan  30  ppm, diinkubasi  sesuai  waktu  kestabilan  yang telah  didapatkan  pada  masing-masing ekstrak  dan  diukur  serapannya  pada panjang gelombang 518,0 nm.
Parameter  yang  digunakan  untuk mengetahui  potensi  antioksidan  dalam ekstrak Chlorella  sp. yaitu  persen  (%) aktivitas antioksidan dan nilai EC 50 . Persen aktivitas  antioksidan  (%)  menunjukkan banyaknya  atom  hidrogen  dari  senyawa
antioksidan yang menangkap radikal DPPH sehingga  tereduksi  menjadi  DPPH-H  ( 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyn ). 39 Data  hasil  % aktivitas  antioksidan  ditunjukkan  pada Tabel 5.
Tabel 5 Persen aktivitas antioksidan dan nilai EC 50 ekstrak Chlorella sp . dan pembanding No. Sampel % aktivitas antioksidan 5 ppm  10 ppm  15 ppm  20 ppm  25 ppm 30 ppm 1. Ekstrak Metanol 0,6098 0,6646 0,8864 1,2065 1,8387 2,0957 2. Ekstrak n-Heksana 0,1480 0,4425 0,4901 0,5234 0,6388 1,7564 3. Ekstrak Petroleum eter 0,7068 1,8652 2,5287 7,8273  37,6118 64,8839 4. Ekstrak Kloroform 0,8342 0,8476 4,8666 5,3512 7,9819 8,0472 5. Ekstrak Etil asetat 0,8618 4,6571 4,7180 5,7809 7,1768 9,4496 6. Fasa Air 0,9902 1,2737 1,6327 1,7731 2,5699 3,4392 7. Asam askorbat 71,2814  76,0809  94,4278  94,8744  95,4452 95,9923 8. BHT 9,9193  20,6979  34,0538  38,1616  40,1994 51,1178 Ekstrak fraksi petroleum eter Chlorella  sp. pada  konsentrasi  30  ppm memiliki  persen  (%)  aktivitas  antioksidan yang  paling  besar  dibandingkan  ekstrak Chlorella  sp. lainnya.  Persen  aktivitas antioksidan  ekstrak  fraksi  petroleum  eter pada  konsentrasi  30  ppm  lebih  tinggi dibandingkan pembanding BHT tetapi lebih kecil dibandingkan dengan vitamin C (pada konsentrasi 30 ppm). Semakin besar persen aktivitas  antioksidannya  maka  semakin besar  kemampuan  ekstrak  dalam  meredam radikal DPPH.
Parameter EC 50 ( effective concentration )
didefinisikan sebagai
konsentrasi  larutan  sampel  yang  akan menyebabkan  reduksi  terhadap  aktivitas DPPH  sebesar  50  %.  Semakin  kecil  nilai EC 50 maka aktivitas antioksidannya semakin  tinggi. 40 Nilai  EC 50 diperoleh dengan  mengolah  data  persen  aktivitas antioksidan  dan  dianalisis  menggunakan persamaan  regresi  non  linear  dengan menggunakan “GraphPad prism6 software, Regression  for  analyzing  dose-response data” .  Data  hasil  nilai  EC 50 ditunjukkan pada Gambar 4.
Gambar 4 Nilai EC 50 ekstrak Chlorella sp. dan pembanding 0 500 1000 1500 1334 173.7 27.26 182 332.7 1411 2.643  30.66 Nilai EC 50 (ppm) ekstrak Chlorella sp. dan pembanding
EC 50 (ppm)
Ekstrak  petroleum  eter  memiliki  nilai  EC 50 terkecil  diantara  masing-masing  ekstrak Chlorella sp.. Nilai EC 50 ekstrak petroleum eter  adalah  27,26  ppm  artinya  dengan penambahan antioksidan dari ekstrak sebanyak  27,26  ppm  larutan  uji  akan menangkap  radikal  bebas  sebanyak  50  % dari  total  radikal  bebas.  Hasil  ini  juga menunjukkan  bahwa  ekstrak Chlorella  sp. setelah  dihidrolisis  dan  dipartisi  dengan petroleum eter memiliki potensi antioksidan yang  lebih  kuat  dibandingkan  dengan ekstrak sebelum dihidrolisis (ekstrak metanol).  Hal  ini  terlihat  dari  nilai  EC 50 ekstrak petroleum eter lebih kecil
dibandingkan dengan EC 50 ekstrak metanol. Semakin kecil EC 50 suatu senyawa uji maka senyawa  tersebut  semakin  efektif  sebagai penangkal radikal bebas. 41
H. Uji  Fitokimia  Ekstrak Chlorella  sp. dengan Reagen Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui  kandungan  senyawa  aktif  pada bahan  uji secara  kualitatif.  Uji  fitokimia pada  penelitian  ini  dilakukan  terhadap ekstrak Chlorella sp. yang meliputi  ekstrak metanol,  fraksi  n-heksana,  petroleum  eter, kloroform, etil asetat dan fasa air.  Hasil uji fitokimia mikroalga Chlorella sp. ditunjukkan dalam Tabel 6.
Tabel 6 Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Mikroalga Chlorella sp. No. Golongan Senyawa Hasil Pengujian Tiap Ekstrak Metanol  n-Heksana Petroleum eter Kloroform Etil asetat Air 1. Alkaloid - - - - - - 2. Flavonoid - - - - - - 3. Steroid + + + + + + 4. Terpenoid - - - - - - 5. Asam askorbat + + + + + + Keterangan  : tanda + : terkandung senyawa/warna muda tanda - : tidak terkandung senyawa/tidak terbentuk warna 1. Steroid Identifikasi adanya golongan
senyawa  steroid  pada  ekstrak Chlorella  sp. menggunakan  reaksi  Liebermann-Burchard (anhidrida  asetat-H 2 SO 4 pekat).  Steroid akan mengalami dehidrasi akan menghasilkan produk oksidasi yang memberikan reaksi warna hijau kebiruan.
Semua ekstrak Chlorella sp. memberikan  warna  hijau  kebiruan  pada  uji golongan senyawa steroid yang menunjukkan bahwa ekstrak tersebut mengandung  golongan  senyawa  steroid. Senyawa  steroid  cenderung  bersifat  non polar  atau  semi  polar,  namun  dapat terekstrak  dalam  pelarut  metanol  yang bersifat polar. Hal ini diduga karena steroid masih  terikat  pada  glikosidanya  sehingga ikut  terekstrak  dalam  pelarut  metanol  yang bersifat  polar.  Beberapa  senyawaan  steroid mengandung  gugus  –OH  yang  sering
disebut  dengan  sterol,  sehingga  sifatnya cenderung lebih polar. 42

## 2. Asam Askorbat
Asam  askorbat  positif  terkandung dalam  ekstrak Chlorella  sp. yaitu  adanya perubahan  warna  dari  pereduksi  kalium permanganat  yang  semula  berwarna  ungu berubah menjadi cokelat.
I. Pemisahan Senyawa Aktif dengan KLTA
KLTA  digunakan  untuk  mengetahui eluen  terbaik  dalam  memisahkan  senyawa. KLTA  dilakukan  terhadap  ekstrak  yang menghasilkan  nilai  EC 50 terkecil  yaitu ekstrak  petroleum  eter Chlorella  sp. yang positif  mengandung  steroid  dan  asam askorbat.
1. KLTA Steroid
Hasil  elusi  KLTA  senyawa  golongan steroid ditampilkan pada Tabel 7. Berdasarkan  5  variasi  eluen  tersebut, terdapat  dua  macam  campuran  eluen  yang
menunjukkan  hasil  pemisahan  baik  yaitu KLT  dengan  eluen  heksana  :  aseton  (7:3)
dan n-heksana : etil asetat (7:3).
Tabel 7 Data penampakan noda senyawa  steroid dari hasil KLTA  fraksi petroleum eter Chlorella sp. dengan lampu UV 366 nm
No. Fase Gerak Jumlah noda dengan pendeteksi Lieberman-Buchard Nilai Rf 1. heksana:aseton (7:3) 13 0,03; 0,06; 0,13; 0,21; 0,31; 0,36; 0,5; 0,69; 0,79; 0,84; 0,93; 0,96; 0,99 2. heksana:etil asetat (9:1) 6 0,04; 0,08; 0,1; 0,14; 0,44; 0,65 3. heksana:etil asetat (8:2) 8 0,03; 0,05; 0,09; 0,15; 0,51; 0,55; 0,59; 0,77 4. heksana:etil asetat (6:4) 3 0,03; 01375; 1 5. heksana:etil asetat (7:3) 12 0,03; 0,13; 0,25; 0,46; 0,53; 0,58; 0,73; 0,74; 0,79; 0,85; 0,93; 0,96 A B
Gambar 5 Hasil  KLT  senyawa  steroid  pada  fraksi  petroleum  eter Chlorella  sp. pada  eluen  n-heksana:aseton (7:3)  dideteksi  dibawah  lampu  UV  366  nm  (a)  hasil  elusi  sebelum  disemprot  reagen  Lieberman- Burchard (b) hasil elusi setelah disemprot reagen Lieberman-Burchard
Tabel 8 Hasil  KLT  senyawa  steroid  pada  fraksi  petroleum  eter Chlorella  sp. pada  eluen  n-heksana:aseton
(7:3) dideteksi di bawah lampu UV 366 nm No. Rf tiap noda Warna noda di bawah sinar UV pada λ 366 nm Dugaan senyawa Sebelum disemprot reagen Liebermann-Buchard Setelah disemprot reagen Liebermann-Buchard 1 0,03 Merah muda Orange - 2 0,06 Hijau Orange - 3 0,13 Ungu Merah muda Steroid 4 0,21 Merah Ungu Steroid 5 0,31 Merah Ungu Steroid 6 0,36 Merah Ungu Steroid 7 0,50 Merah muda-ungu Ungu Steroid 8 0,69 - Ungu Steroid 9 0,79 Merah muda-ungu Ungu Steroid 10 0,84 Orange Hijau Steroid 11 0,93 Orange Ungu Steroid 12 0,96 Kuning Hijau Steroid 13 0,99 - Hijau Steroid
Hasil identifikasi dengan KLT golongan  senyawa  steroid  dalam  fraksi petroleum  eter Chlorella  sp. dengan  eluen n-heksana  :  aseton  (7:3)  menghasilkan pemisahan  yang  baik  karena  dihasilkan  13 spot  atau  noda  jelas  dan  tidak  terjadi tailing .  Pemisahan  dikatakan  baik  apabila menghasilkan  komponen  senyawa  berupa noda  yang  banyak,  noda  yang  terbentuk bulat tidak berekor, dan pemisahan nodanya jelas. 43
Noda yang berhasil dipisahkan memiliki rentang nilai  Rf antara 0,03−0,99 dengan noda 1 dan 2 berwarna orange, noda 3  berwarna  merah  muda,  noda  4−9  dan
noda 11 berwana ungu, kemudian noda 10, 12,  13  berwarna  hijau.  Pada  hasil  KLT  ini yang  diduga  senyawa  golongan  steroid adalah  noda  dengan  merah  muda,  ungu 23 dan  hijau 44 setelah  disemprot  reagen Liebermann-Burchard  dan  dideteksi  di bawah lampu UV 366 nm.
Hasil  pemisahan  senyawa  golongan steroid pada fraksi petroleum eter Chlorella sp. dengan  eluen  n-heksana  :  etil  asetat (7:3).  Hasil  elusi  dapat  ditunjukkan  pada Gambar  6.    dengan  rincian  keterangan warna  dan  nilai  Rf  ditampilkan  pada  Tabel 9.
A B
Gambar 6 Hasil KLT senyawa steroid pada fraksi petroleum eter Chlorella sp. pada eluen n-heksana:etil asetat (7:3)  dideteksi  dibawah  lampu  UV  366  nm  (a)  hasil  elusi  sebelum  disemprot  reagen  Lieberman- Burchard (b) hasil elusi setelah disemprot reagen Lieberman-Burchard
Tabel 9 Hasil  KLT  senyawa  steroid  pada  fraksi  petroleum  eter Chlorella  sp. pada  eluen  n-heksana:etil  asetat (7:3) dideteksi di bawah lampu UV 366 nm
Hasil  KLT  golongan  senyawa  steroid dengan  eluen  n-heksana:etil  asetat  (7:3)
menghasilkan  pemisahan  yang  baik  karena dihasilkan 12 spot atau noda jelas dan tidak
No. Rf tiap noda
Warna noda di bawah sinar UV pada λ 366 nm Dugaan senyawa Sebelum disemprot reagen Liebermann-Buchard Setelah disemprot reagen Liebermann-Buchard 1 0,03 Orange Orange - 2 0,13 Ungu Hijau Steroid 3 0,25 Ungu Merah muda Steroid 4 0,46 Merah muda Merah muda Steroid 5 0,53 - Hijau Steroid 6 0,58 Merah muda Merah muda Steroid 7 0,63 Merah muda Ungu Steroid 8 0,74 Merah muda Ungu Steroid 9 0,79 Hijau Hijau Steroid 10 0,85 Hijau Ungu Steroid 11 0,93 Orange Hijau Steroid 12 0,96 - Hijau Steroid
terjadi tailing . Noda yang berhasil dipisahkan memiliki rentang nilai Rf antara 0,03−0,96 dengan noda 1 berwarna orange; noda 3, 4, 6 berwarna merah muda; noda 2, 5, 9, 11, 12 berwarna hijau; dan noda 7, 8, 10  berwana  ungu.  Noda  yang  diduga senyawa  golongan  steroid  adalah  noda dengan warna merah muda, ungu dan hijau. Hasil  pemisahan  dengan  eluen  n-heksana  : aseton (7:3) dengan rentang Rf 0,13 − 0,99 dan  n-heksana  :  etil  asetat  (7:3)  dengan  Rf 0,13−0,96  memiliki hasil warna yang sama
untuk  noda  yang  diduga  senyawa  steroid yaitu warna merah muda, hijau dan ungu.

## 2. KLTA Asam Askorbat
Senyawa  yang  juga  positif  terdeteksi dalam  fraksi  petroleum  eter Chlorella  sp. adalah  asam  askorbat.  Hasil  KLTA  asam askorbat menunjukkan eluen dengan pemisahan  terbaik  adalah  eluen    etanol  : asam  asetat  10  %    (9:1), 20 Hasil  elusi  dari tiap eluen ditunjukkan pada Tabel 10.
Tabel 10 Data penampakan  noda senyawa  asam askorbat dari hasil  KLTA  fraksi petroleum eter Chlorella sp. dengan lampu UV 254 nm dan 366 nm
No. Fase Gerak Pada 254 nm Pada 366 nm Noda Rf Noda Rf 1. Etanol:asam asetat 10 %  (9:1) 2 0,80; 0,91 4 0,80; 0,86; 0,89; 0,91 2. Etanol:asam asetat glasial (9:1) 1 0,94 2 0,91; 0,96 3. Etanol:asam asetat 1% (9:1) 2 0,79; 0,89 3 0,79; 0,84; 089 4. Etanol:asam asetat glasial:toluen (5,5:1:1,5) 1 0,96 1 0,96 5. Etil asetat:asam asetat glasial:asam format:air (6:1:1:2) 1 0,94 1 0,95
Hasil  KLT  dari  pemisahan  asam askorbat fraksi petroleum eter Chlorella sp.
dengan eluen etanol:asam asetat 10 %  (9:1)
ditunjukkan pada Gambar 7. dengan rincian keterangan  warna  dan  nilai  Rf  ditampilkan pada Tabel 11. A B
Gambar 7 Hasil KLT asam askorbat pada fraksi petroleum eter Chlorella sp. pada eluen etanol:asam asetat 10 %  (9:1) (a) hasil elusi dideteksi dengan lampu UV 254 nm  (b) hasil elusi dideteksi dengan lampu UV 366 nm
Tabel 11 Hasil KLT asam askorbat pada fraksi petroleum eter Chlorella sp. dengan eluen etanol:asam asetat 10 %  (9:1)
No Rf Warna noda pada 254 nm  Warna noda pada 366 nm Dugaan senyawa 1 0,80 Coklat-hitam Orange-coklat - 2 0,86 - Merah muda-ungu - 3 0,89 - Orange - 4 0,91 Hitam kuning Asam askorbat
Hasil  KLT  asam  asskorbat  dengan eluen  etanol:asam  asetat  10  %  (9:1) terdeteksi 2 spot berwarna coklat hitam dan hitam pada panjang gelombang 254 nm dan 4  spot  pada  366  nm  dengan  warna  orange kecoklatan,  merah  muda-ungu,  orange  dan kuning.  Noda  yang  diduga  senyawa  asam askorbat  adalah  noda  4  dengan  Rf  0,91 karena  dilihat  dibawah  lampu  UV  pada panjang  gelombang  254  nm  menghasilkan spot  biru  gelap.  Asam  askorbat  yang bersifat  polar  lebih  terdistribusi  ke  fasa geraknya  (etanol:asam  asetat  10  %  (9:1)) yang bersifat lebih polar dari pada plat KLT sehingga  memiliki  Rf  yang  besar  yaitu 0,91.

## IV. PENUTUP Kesimpulan
Nilai  EC 50 dari  fraksi  etil  asetat, kloroform,  petroleum  eter,  n-heksana,  air dan  ekstrak  metanol  berturut-turut  yaitu 332;  182;  27,26;  173,7;  1.411;  dan  1.334
ppm.  Fraksi  petroleum  eter Chlorella  sp . memiliki  aktivitas  antioksidan  yang  paling tinggi  karena  mempunyai  nilai  EC 50 paling kecil.
Ekstrak  mikroalga Chlorella  sp . mengandung  senyawa  steroid  dan  asam askorbat. Hasil KLTA fraksi petroleum eter mikroalga Chlorella  sp .  menunjukkan bahwa  eluen  yang  baik  untuk  pemisahan golongan senyawa steroid adalah heksana:aseton  (7:3)  dan  n-heksana:etil asetat (7:3). Eluen terbaik dalam pemisahan asam askorbat adalah etanol:asam asetat 10 % (9:1).

## Saran
Penelitian  ini  dapat  dilanjutkan  dengan KLTP  untuk  pemisahan  senyawa  yang berpotensi  sebagai  antioksidan.  Kemudian dapat dilanjutkan dengan identifikasi dengan menggunakan LC-MS.

## V. DAFTAR PUSTAKA
1 Shihab,  M.Q.  2002. Tafsir  Al  Mishbah  : pesan,  kesan  dan  keserasian  Al Quran. Jakarta : Lentera Hati.
2 Sidabutar,  E.A..  1999.  Pengaruh  Medium
Pertumbuhan  Mikroalga Chlorella sp. terhadap  Aktivitas  Senyawa Pemacu Pertumbuhan yang Dihasilkan. Skripsi Tidak Diterbitkan. Institut Pertanian
Bogor.
3 Borowitzka, M. A. dan Lesley, J. B. 1988. Microalgae Biotechnology .  London: Cambridge University Press.
4 Wulandari,  A.P.,  Frida  N.,  Annisa  E.P.,
dan Dilaekha R.P.. 2010. Identifikasi  Mikroalgae  di  Sekitar Pantai  Pangandaran  dan  Potensi Pertumbuhannya  pada  Formulasi Medium  Ekstrak  Tauge  (MET). Prosiding Seminar Nasional Limnologi, V. 5 Kawaroe,  M.  2008.  Mikroalga  sebagai
Bahan Baku Biofuel. Surfactant and Bioenergy Research Centre, Lembaga Pengabdian Pada
Masyarakat, Institut Pertanian
Bogor.
6 Yan,  X.,  Nagata,  T.,  and  Xiao,  F..  1998. Antioxidative  Activities  in  Some Common  Seaweeds.  Journal  of Plant  Foods  for  Human  Nutrition Institute of Oceanology, LII.
7 Sherwin, F.R., 1990. Antioxidant. In: Food Additive (ed. Branen R). New York: Marcel Dekker.
8 Grillo,  C.A.  and  F.N.  Dulout.  1995. Cytogenetic Evaluation of Butylated Hydroxytoluene. Mutat.  Res., (345) : 73–85.
9 Safer,  A.M.  dan  A.L.  Nughamish.  1999.
Hepatotoxicity  Induced  by  the
Antioxidant
Food Additive Butylated Hydroxytoluene (BHT) in Rats:  An  Electron  Microscopical
Study. Histol.  Histopathol., XIV: 391–406.
10 Shanab,  S.M.M..  2007. Antioxidant  and Antibiotic Activities of Some Seaweeds (Egyptian Isolates). Agriculture  and  Biology ,  IX  (2):
220–225.
11 Oktay, M., I. Gulcin, and O., Kufrevioglu,
2003. Determination o f  In  Vitro Antioxidant Activity of Fennel (Foeniculum Vulgare) Seed Extract . Lebensmittel-Wissenchaft and Technology, XXXVI: 263-271. 12 Khamidah,  U.  2013.  Uji  Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol Mikroalga Chlorella sp. Hasil
Kultivasi  dalam  Medium  Ekstrak Tauge  Terhadap Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus.  Skripsi
Tidak Diterbitkan . Malang : Universitas  Islam  Negeri  Maulana Malik Ibrahim Malang.
13 Bariyyah,  S.K.  2013.  Uji  Aktivitas Antioksidan  Terhadap  DPPH  dan Identifikasi Golongan Senyawa Aktif  Ekstrak  Kasar  Mikroalga
Chlorella  sp. Hasil  Kultivasi  dalam Medium  Ekstrak  Tauge. Skripsi
Tidak Diterbitkan. Malang : Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas  Islam  Negeri  Maulana Malik Ibrahim Malang.
14 Mardiyah, U. 2012. Ekstraksi Uji
Aktivitas Antioksidan Terhadap DPPH  dan  Identifikasi  Golongan Senyawa Aktif Alga Merah Eucheuma  spinosum dari  Perairan Banyuwangi. Skripsi Tidak Diterbitkan.  Malang:  Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang.
15 Hidayati,  Nurul.  2009.  Uji  Efektivitas Antibakteri Ekstrak Kasar Daun The ( Camellia  sinensis L,  v.  assamica)
Tua  Hasil  Ekstraksi  Menggunakan
Pelarut  Akuades  dan Etanol . Skripsi Tidak Diterbitkan.
Malang:
Universitas  Islam  Negeri  Maulana
Malik Ibrahim Malang.
16 Prihantini,  N.H,  Putri  B.,  dan  Yuliati  R..
2005. Pertumbuhan Chlorella  sp. dalam  Medium  Ekstrak  Tauge
(MET) dengan Variasi pH
Awal . Makara, Sains , IX (1): 1-6.
17 Hanani, E., M. Abdul dan Ryany, S. 2005.
Identifikasi  Senyawa  Antioksidan dalam  Spons Callyspongia  sp. dari Kepulauan  Seribu. Majalah  Ilmu Kefarmasian , II (3): 127-133.
18 Arindah, D. 2010. Fraksinasi dan Identifikasi Golongan Senyawa Antioksidan  pada  Daging  Buah Pepino (Solonum  Muricatum  aiton) yang Berpotensi sebagai Antioksidan. Skripsi Tidak Diterbitkan.  Malang:  Jurusan  Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas  Islam  Negeri  (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang.
19 Harborne,  J.B.  1996. Metode  Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan . Bandung :
Penerbit ITB.
20 Indrayani,  L.,  Soetjipto,  H.,  dan  Sihasale, L. 2006. Skrining Fitokimia dan Uji Toksisitas Ekstrak Daun Pecut Kuda ( Stachytarpheta jamaicensis L. Vahl) terhadap Larva Udang Artemia salina Leach. Berk.
Penelitian. Hayati, Vol. XII: 57-61.
21 Auterhoff,  H.  dan  Kovar,  K.A.  1987. Identifikasi  Obat ,  Terbitan  Kelima. Terjemahan N.C. Sugiarso. Bandung: Penerbit ITB.
22 Syamsudin.,  Tjokrosonto,  S.,  Wahyuono, S  dan  Mustofa.  2007.  Aktivitas Antiplsmodium  dari  dua  Fraksi Ekstrak  n-Heksana  Kulit  Batang
Asam  Kandis  ( Garcinia  parvifolia Miq ). Majalah Farmasi . Yogyakarta: Universitas Gajah Mada.
23 Sulastry,  T  dan  Kurniawati,  N.  2010. Isolasi Steroid dari Ekstrak Metanol daun  Bluntas  (Plucea  indica  L). Jurnal  Chemica  Vol.  II .  FMIPA
UNM.
24 Reveny,  J.  2007.  Daya  Antimikroba Ekstrak  dan  Fraksi  Daun  Sirih Merah (Piper  betle L. ). Fakultas Farmasi  Universitas  Sumatra  Utara . Jurnal  Ilmu  Dasar . Vol.12  No.1:  6-
12.
25 Hayati,  K.,  Jannah,  A.,  Ningsih  R.  2012.
Identifikasi  Senyawa  dan  Aktivitas
Antimalaria In  Vivo Ekstrak  Etil Asetat Tanaman Anting-Anting ( Acalypha  Indica L.). Molekul.  Vol 7  No  1 .  Malang  :  Jurusan  Kimia
UIN Maulana Malik Ibrahim Malang.
26 Himesh, S., Singhai, A.K., dan Sarvesh S.
2012.  Quantification  of  Ascorbic Acid in Leaves of Annona squamosa .  International  Journal  of Pharmacy and Pharaceutical Sciences. ISSN. 0975-1491 Vol.4. Prihantini,  N.H,  Putri  B.,  dan Yuliati R.. 2005. Pertumbuhan Chlorella sp. dalam Medium Ekstrak Tauge (MET) dengan Variasi pH Awal . Makara, Sains , IX (1): 1-6.
27 Kondawar,  M.S.,  Kamble,  K.G.,  dan Mali, D.S. 2011. Quantitative estimation  of  Gallic  acid  in  a Marketed Herbal Medicine: Triphala Churna  by  High  Perfomance  Thin Layer Chromatography.
International  Journal  of  Pharm Tech  Research.  ISSN  :  0974-4303. Vol. 3., No. 3.
28 Patel,  N.V.,  dan  Telange,  D.R.  2011.
Qualitative and Quantitative Estimation  of  Gallic  Acid  and Ascorbic Acid in Polyherbal Tablet. International Journal of Pharaceutical Sciences and Reasearch . ISSN:  0975-8232.  Vol.
2. India  :  School  of  Pharmacy  and Technology Management.
29 Persagi  (Persatuan  Ahli  Gizi  Indonesia). 2009. Tabel  Komposisi  Pangan Indonesia .  Jakarta:  PT.  Elex  Media Komputindo.
30 Rostini,  I..  2007.  Kultur  Fitoplankton
( Chlorella sp. dan Tetraselmis chuii ) pada  Skala  Laboratorium. Karya Ilmiah . UNPAD.
31 Herbert  RB.  1995. Biosintesis  Metabolit Sekunder .  Bambang  Srigandono,
penerjemah. Edisi kedua. Semarang: IKIP Semarang Press.
32 Yudha,  A.P..  2008.  Senyawa  Antibakteri dari  Mikroalga Dunaliella  sp. pada Umur  Panen  yang  Berbeda. Skripsi Tidak  Diterbitkan.  Bogor  :  Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
33 Mohammad,  J.  2007.  Produksi  dan Karakterisasi  Biopigmen  Fikosianin dari Spirulina fusiformis serta
Aplikasinya sebagai
Pewarna
Minuman. Thesis Tidak Diterbitkan.
Bogor:  Program  Studi  Teknologi Hasil  Pertanian  Institut  Pertanian Bogor.
34 Nurmillah, Ovi, Y. 2009. Kajian Aktivitas Antioksidan dan Antimikroba Ekstrak Biji, Kulit Buah, Batang dan Daun Tanaman Jarak Pagar ( Jatropha curcas L.). Skripsi diterbitkan. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian IPB. 35 Handoko, D.S.P. 2006. Kinetika
Hidrolisis  Maltosa  pada  Variasi Suhu  dan  Jenis  Asam  sebagai Katalis.  Jurnal. Jember:  Jurusan Kimia  FMIPA  Universitas  Jember . SIGMA.Vol.9 No.1 ISSN 1410-5888. 36 Brand-Williams,  W.  1995. Use  of  Free Radical Method to Evaluate Antioxidant activity .  Lebensmettel  – Wissenschaft and Technologie. Dalam Ratmo. 2007. Potensi Ekstrak  Daun  Sirih  Merah  ( Piper crocotum ) sebagai Antioksidan. www.kimiabrawijaya.ac.id.
37 Suroso,  H.C.  2011. Uji  Antioksidan  dan Identifikasi  Senyawa  Aktif  pada Tanaman  Anting-anting  (Achalypha Indica L.) . Skripsi Tidak Diterbitkan.  Malang:  Jurusan  Kimia Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas  Islam  Negeri  Maaulana Malik Ibrahim Malang. 38 Josephy, P.D. 1997. Molecular Toxicology .  New  York:  Oxford University Press.
39 Rahayu,  D.S.,  Dewi,  K.,  Enny,  F.  2010.
Penentuan Aktivitas  Antioksidan
dari Ekstrak Etanol Daun Ketapang
( Terminalia  catappa L) dengan Metode  1,1  difenil  2  Pikrilhidrazil
( DPPH ).
Skripsi Diterbitkan.
Semarang:  Jurusan  Kimia  FMIPA
Universitas Diponegoro.
40 Molyneux,  P..  2003.  The  Use  of  The
Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH), for
Estimating  Antioxidant  Activity. Science  and  Technology,  Vol.  26. No. 2: 211-219.
41 Rohman,  A.,  Riyanto.  2005.  Aktivitas
Antioksidan Ekstrak Buah Mengkudu (Morinda  Citrifolia  L,) . Agritech , Vol. 25. No. 3: 131-136.
42 Sriwahyuni,  I.  2010.  Uji  Fitokimia Ekstrak  Tanaman  Anting-Anting (Acalypha  Indica  Linn) Dengan
Variasi  Pelarut  Dan  Uji  Toksisitas Menggunakan Brine Shrimp (Artemia  Salina  Leach).  Skripsi Tidak  Diterbitkan.  Malang:  Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi, UIN Malang. 43 Gandjar,  I.B.,  dan  Rohman,  A.  2007. Kimia Farmasi Analisis . Yogyakarta: Pustaka Pelajar. 44 Handayani D., N. Sayuti dan
Dachriyanus.  2008.  Isolasi  dan Karakterisasi  Senyawa  Antibakteri
Epidioksi  Sterol dari  Spon  Laut Petrosia  nigrans ,  Asal  Sumatera
Barat. Prosiding  Seminar  Nasional Sains  dan  Teknologi- II  2008 .
Lampung: Universitas Lampung.